CN114008069A - 外来体和aav的组合物 - Google Patents

外来体和aav的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN114008069A
CN114008069A CN202080044190.0A CN202080044190A CN114008069A CN 114008069 A CN114008069 A CN 114008069A CN 202080044190 A CN202080044190 A CN 202080044190A CN 114008069 A CN114008069 A CN 114008069A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aav
protein
seq
fold
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080044190.0A
Other languages
English (en)
Inventor
亚伦·诺伊斯
拉塞尔·E·麦康内尔
许可
乔纳森·费恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evox Therapeutics Ltd
Original Assignee
Codiak Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Codiak Biosciences Inc filed Critical Codiak Biosciences Inc
Publication of CN114008069A publication Critical patent/CN114008069A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A61K9/0051—Ocular inserts, ocular implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5184—Virus capsids or envelopes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01059—Protein geranylgeranyltransferase type I (2.5.1.59)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

本公开涉及包含AAV和支架蛋白的细胞外囊泡，例如，外来体。在一些方面，所述AAV在所述细胞外囊泡的腔内。在一些方面，所述AAV与所述细胞外囊泡的腔表面缔合。在一些方面，所述AAV与所述细胞外囊泡的外表面缔合。本文还提供了用于产生所述外来体的方法和使用所述外来体治疗和/或预防疾病或病症的方法。

Description

外来体和AAV的组合物
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2019年4月17日提交的美国临时申请第62/835,425号；2019年4月17日提交的第62/835,432号；2020年3月2日提交的第62/984,161号；和2020年3月2日提交的第62/984,173号的优先权权益，所述美国临时申请的每一个都通过引用以其整体并入本文。
通过EFS-WEB电子提交的序列表的引用
本申请中提交的电子提交的序列表(名称：4000_033PC02_Seqlisting_ST25.txt，大小：231,249字节；和创建日期：2020年4月17日)的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及包含腺相关病毒(AAV)的细胞外囊泡(EV)，例如外来体。在本公开的某些方面，细胞外囊泡还包含支架蛋白。
技术背景
AAV已经成为用于基因疗法应用的有用载体。然而，尽管有许多优点，AAV刺激体液、抗体介导的免疫反应。在所有可能受益于AAV介导的基因疗法的潜在患者中，多达一半的患者无法接受治疗，因为他们拥有在野外接触AAV血清型后产生的预先存在的中和抗体。此外，在AAV疗法的初始剂量后，患者产生针对该治疗的抗体，并且不能再次给药，排除了剂量递增方案来寻找能够达到所需治疗效果的剂量。如果施用的转基因在患者的一生中失去表达(这经常通过细胞分裂、转基因失活或转导细胞的丢失而发生)，则不能再给药是个主要问题。
外来体是由真核细胞自然产生的小细胞外囊泡。外来体包含包围内部空间(即，腔)的膜。作为药物递送媒介物，EV(例如，外来体)作为许多治疗领域中的新治疗方式，提供了优于常规药物递送方法的许多有利方面。特别是，外来体固有地具有低免疫原性。与外来体缔合的AAV比游离AAV具有更好的递送特性，包括转导效率。Maguire等人，MolecularTherapy 20(5):960-71(2012)；
Figure BDA0003414407670000021
等人，Biomaterials 35(26):7598-7609(2014)。然而，使用目前的方法在外来体中包装AAV是非常低效的，这限制了外来体在AAV递送中的潜在用途。因此，本领域仍然需要开发更高效地将AAV与外来体缔合的技术。
发明内容
本公开的某些方面涉及包含AAV和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)。在一些方面，AAV在EV的腔内。在一些方面，AAV与EV(例如，外来体)的膜缔合。在一些方面，AAV与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些方面，与单独的游离AAV相比，与外来体缔合的AAV具有改变的特性。
本公开的某些方面涉及包含AAV蛋白和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)，其中AAV在EV的腔内，并且其中与单独的游离AAV相比，外来体中的AAV具有改变的特性。
在一些实施方案中，改变的特性包括比单独的AAV更好的治疗效果。在一些实施方案中，更好的治疗效果包括更高的活性、增加的转导、增加的转导效率、更大的效力、更快的转导动力学和逃避免疫反应中的一种或多种。
在一些实施方案中，AAV的改变的特性允许AAV通过两个或更多个剂量向受试者施用，其中AAV的活性在后续剂量中得到保留。
本公开的某些方面涉及包含AAV的EV(例如，外来体)，其中EV包含支架蛋白和至少1个AAV，其中至少1个AAV在EV(例如，外来体)的腔内。
在一些方面，EV(例如，外来体)包含至少1个AAV、至少2个AAV、至少3个AAV、至少4个AAV或至少5个AAV。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含在EV的腔内的至少6个AAV、至少7个AAV、至少8个AAV、至少9个AAV、至少10个AAV、至少11个AAV、至少12个AAV、至少13个AAV、至少14个AAV、至少15个AAV、至少16个AAV、至少17个AAV、至少18个AAV、至少19个AAV、至少20个AAV、至少201个AAV、至少22个AAV、至少23个AAV、至少24个AAV、至少25个AAV、至少26个AAV、至少27个AAV、至少28个AAV、至少29个AAV、至少30个AAV、至少35个AAV、至少40个AAV、至少45个AAV、至少50个AAV、至少60个AAV、至少70个AAV、至少80个AAV、至少90个AAV或至少100个AAV。
在一些方面，EV(例如，外来体)包含至少1个AAV至至少约100个AAV。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含在EV的腔内的至少约5个AAV至至少约100个AAV、至少约5个AAV至至少约75个AAV、至少约5个AAV至至少约50个AAV、至少约5个AAV至至少约45个AAV、至少约5个AAV至至少约40个AAV、至少约5个AAV至至少约35个AAV、至少约5个AAV至至少约30个AAV、至少约5个AAV至至少约25个AAV、至少约5个AAV至至少约20个AAV、至少约5个AAV至至少约15个AAV、至少约5个AAV至至少约10个AAV、至少约10个AAV至至少约100个AAV、至少约10个AAV至至少约75个AAV、至少约10个AAV至至少约50个AAV、至少约5个AAV至至少约45个AAV、至少约10个AAV至至少约40个AAV、至少约10个AAV至至少约35个AAV、至少约10个AAV至至少约30个AAV、至少约10个AAV至至少约25个AAV、至少约10个AAV至至少约20个AAV或至少约10个AAV至至少约15个AAV。
在一些方面，EV(例如，外来体)包含至少约1个AAV至至少约20个AAV。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含至少约5个AAV至至少约20个AAV。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含双脂质膜，所述双脂质膜包含腔表面和外表面，其中AAV中的至少一个不与EV的腔表面连接。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含双脂质膜，所述双脂质膜包含腔表面和外表面，其中AAV中的至少一个与EV的腔表面连接。
在一些实施方案中，至少一个AAV通过共价键或非共价键与EV的腔表面连接。
在一些实施方案中，至少一个AAV通过共价键和非共价键与EV的腔表面连接。
本公开的某些方面涉及细胞外囊泡(EV)，例如外来体，其包含(i)AAV和(ii)支架蛋白，其中AAV与EV外表面上的支架蛋白缔合。在一些实施方案中，支架蛋白包含胞外结构域，并且其中AAV与支架蛋白的胞外结构域缔合。在一些实施方案中，支架蛋白还包含跨膜区，其中该跨膜区锚定到EV(例如，外来体)的膜。在一些实施方案中，支架蛋白还包含胞内结构域。
在一些实施方案中，支架蛋白包含异源多肽，其中异源多肽与支架蛋白的胞外结构域融合，并且其中异源多肽与AAV缔合。在一些实施方案中，支架蛋白是I型跨膜蛋白或II型跨膜蛋白。在一些实施方案中，异源多肽与支架蛋白的胞外结构域的N端或C端融合。
在一些实施方案中，异源多肽包括受体、配体、抗原结合部分、底物、其片段或其组合；并且其中异源多肽特异性地与AAV表面上的一种或多种蛋白相互作用。在一些实施方案中，异源多肽包含选自由以下组成的组的抗原结合部分：抗体的抗原结合片段、骆驼科抗体或其抗原结合片段、单链FAB、纳米抗体、鲨鱼IgNAR及其组合。在一些实施方案中，抗原结合部分包括纳米抗体。在一些实施方案中，抗原结合部分特异性结合AAV表面上的一种或多种蛋白。
在一些实施方案中，AAV表面上的一种或多种蛋白包括选自由以下组成的组的衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3及其任意组合。在一些实施方案中，AAV表面上的一种或多种蛋白是与AAV的衣壳蛋白融合的非AAV序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白选自VP1、VP2、VP3及其任意组合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP2融合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP2的N端融合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP2的暴露于内表面的环融合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP3融合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP3的N端融合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP3的暴露于内表面的环融合。在一些实施方案中，非AAV序列与VP1融合。
在一些实施方案中，非AAV序列与VP1的暴露于内表面的环融合。
在一些实施方案中，亲和配体(受体、配体、抗原结合部分)之间的相互作用在某些条件下是可逆的，所述条件包括pH的变化(例如溶酶体内区室的pH降低)、氧化还原条件的变化(氧化的增加或减少)、离子条件的变化或二价或三价阳离子或阴离子分子浓度的变化。
在一些实施方案中，(i)支架蛋白与包含Fc受体的异源多肽融合；以及(ii)AAV包含至少一种与免疫球蛋白恒定区(Fc)的Fc区融合的衣壳蛋白。在一些实施方案中，Fc受体是选自Fcγ受体I(FcγR1)、FcγRIIA、FcγIIB、FcγIIIA和FcγIIIB的Fcγ受体；并且其中所述Fc是IgG的Fc。在一些实施方案中，Fc受体是FcγR1，并且Fc是IgG的Fc。在一些实施方案中，Fc受体是Fcα受体I(FcαR1)，并且其中Fc是IgA的Fc。在一些实施方案中，Fc受体是选自Fcε受体I(FcεRI)和FcεRII的Fcε受体，并且其中Fc是IgE的Fc。
在一些实施方案中，(i)支架蛋白与包含纳米抗体的异源多肽融合；以及(ii)AAV包含至少一种与免疫球蛋白恒定区(Fc)的Fc区融合的衣壳蛋白。在一些实施方案中，纳米抗体特异性结合与衣壳蛋白融合的Fc。
在一些实施方案中，至少一种衣壳蛋白选自由VP1、VP2和VP3组成的组。在一些实施方案中，AAV包含至少一个与Fc融合的VP2。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与Fc融合的VP2。在一些实施方案中，Fc与至少一个VP2的N端融合。在一些实施方案中，Fc与至少一个VP2的暴露于内表面的环融合。在一些实施方案中，AAV包含至少一个与Fc融合的VP3。在一些实施方案中，AAV包括至少一个不与Fc融合的VP3。在一些实施方案中，Fc与至少一个VP3的N端融合。在一些实施方案中，Fc与至少一个VP3的暴露于内表面的环融合。在一些实施方案中，AAV包含至少一个与Fc融合的VP1。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与Fc融合的VP1。
在一些实施方案中，Fc与VP1的暴露于表面的环融合。在一些实施方案中，暴露于表面的环包含序列GTTTQSR(SEQ ID NO:43)。在一些实施方案中，暴露于表面的环包含VP1(SEQ ID NO:44)的氨基酸残基453至459。在一些实施方案中，暴露于表面的环的至少一个氨基酸被Fc替代。在一些实施方案中，暴露于表面的环被Fc替代。
在一些实施方案中，支架蛋白与抗原结合部分融合，其中抗原结合部分特异性结合AAV表面上的抗原。在一些实施方案中，支架蛋白与包含AAV受体的异源多肽融合。在一些实施方案中，AAV被设计成在AAV表面上掺入特定的异源序列(表位)，然后该表位被特定的抗原结合部分识别。
在一些实施方案中，AAV还包含含有目标基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，目标基因编码选自由以下组成的组的蛋白：分泌蛋白、受体、结构蛋白、信号传导蛋白、感觉蛋白(sensory protein)、调节蛋白、转运蛋白、储存蛋白、防御蛋白、运动蛋白、凝血因子、生长因子、抗氧化剂、细胞因子、趋化因子、酶、肿瘤抑制基因、DNA修复蛋白、结构蛋白、低密度脂蛋白受体、α葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosistransmembrane conductance regulator)或其任意组合。
在一些实施方案中，目标基因编码因子VIII蛋白或因子IX蛋白。在一些实施方案中，因子VIII蛋白是野生型因子VIII、B结构域缺失的因子VIII、因子VIII融合蛋白或其任意组合。
在一些实施方案中，目标基因编码Rab蛋白香叶基香叶基转移酶组分A1(REP1)。在一些实施方案中，REP1包含与SEQ ID NO:45具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV选自由以下组成的组：AAV 1型、AAV 2型、AAV 3A型、AAV3B型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh74型、AAV rh32.33型、AAV rh10型、AAV Anc80型、AAV PHP型、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、灵长类动物AAV、人AAV、猪AAV、合成AAV、其任意组合。
在一些实施方案中，支架蛋白选自由以下组成的组：前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(neprilysin)(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白是PTGFRN。
在一些实施方案中，AAV与支架蛋白连接。
在一些实施方案中，支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中ND和/或ED与EV的腔表面缔合。在一些实施方案中，支架蛋白包含N端结构域、效应结构域和跨膜结构域，其中ND被肉豆蔻酰化，并且其中N端结构域(ND)和/或效应结构域(ED)与EV的腔表面缔合。
在一些实施方案中，ND通过肉豆蔻酰化与外来体的腔表面缔合。
在一些实施方案中，ED通过离子相互作用与外来体的腔表面缔合。
在一些实施方案中，ED在序列中包含(i)一个碱性氨基酸或(ii)两个或更多个碱性氨基酸，其中碱性氨基酸选自由以下组成的组：Lys、Arg、His及其任意组合。
在一些实施方案中，碱性氨基酸是(Lys)n，其中n为1与10之间的整数。
在一些实施方案中，ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:11)、KKKKK(SEQ IDNO:12)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQ ID NO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQID NO:16)或其任意组合。
在一些实施方案中，ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中X2至X6中的每一个独立地是氨基酸，并且其中X6包括碱性氨基酸。
在一些实施方案中，X2选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；X4选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组；X5选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；X6选自由Lys、Arg和His组成的组；或其任意组合。
在一些实施方案中，ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中G代表Gly；“:”代表肽键；X2是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；X3是氨基酸；X4是选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组的氨基酸；X5是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；以及X6是选自由Lys、Arg和His组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，X3选自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg组成的组。
在一些实施方案中，ND和ED通过接头连接。在一些实施方案中，接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
在一些实施方案中，ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQID NO:17)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:18)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:19)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:20)、(v)GGKLSKK(SEQ ID NO:21)或(vi)其任意组合。在一些实施方案中，ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:22)、(ii)GGKLSKKS(SEQID NO:23)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:24)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:25)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:26)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:27)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:28)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:29)、(ix)GGKLSKKK(SEQ ID NO:30)、(x)GGKLSKKS(SEQ ID NO:31)及(xi)其任意组合。在一些实施方案中，ND包含氨基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方案中，支架蛋白的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个、至少约160个、至少约170个、至少约180个、至少约190个或至少约200个氨基酸。
在一些实施方案中，支架蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:32)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:33)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:34)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:35)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:36)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:37)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:38)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:39)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:40)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:41)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:42)。
在一些实施方案中，支架蛋白不包含在N端处的Met。在一些实施方案中，支架蛋白包含在支架蛋白的N端处的肉豆蔻酰化氨基酸残基。在一些实施方案中，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是Gly。在一些实施方案中，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是合成的。在一些实施方案中，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是甘氨酸类似物。
在一些实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，支架蛋白的C端与AAV的衣壳蛋白连接。在一些实施方案中，EV是外来体。
本公开的某些方面涉及包含衣壳的腺相关病毒(AAV)，其中衣壳包含至少一种选自由VP1、VP2和VP3组成的组的衣壳蛋白；其中所述至少一种衣壳蛋白与支架蛋白连接。
在一些实施方案中，EV进还包含第二支架蛋白，其包含括前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。
在一些实施方案中，AAV包含至少一种与支架蛋白融合的衣壳蛋白。在一些实施方案中，至少一种衣壳蛋白选自由VP1、VP2和VP3组成的组。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包括VP2。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与支架蛋白融合的VP2。在一些实施方案中，支架蛋白与VP2的N端融合。在一些实施方案中，支架蛋白与VP2的C端融合。在一些实施方案中，与支架蛋白融合的VP2的数量少于不与支架蛋白融合的VP2的数量。在一些实施方案中，与支架蛋白融合的VP2的数量比至少一个不与支架蛋白融合的VP2的数量少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约23倍、约24倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约46倍、约50倍或约100倍。
在一些实施方案中，支架蛋白是I型跨膜蛋白或II型跨膜蛋白。在一些实施方案中，I型跨膜蛋白包括前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。
在一些实施方案中，I型跨膜蛋白的C端或II型跨膜蛋白的N端与二聚剂(dimerizing agent)，例如化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。在一些实施方案中，支架蛋白与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。在一些实施方案中，化学诱导的二聚体的结合配偶体包括选自由以下组成的组的结合配偶体中的一种：(i)FKBP和FKBP(FK1012)；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶(CNA)(FK506)；(iii)FKBP和CyP-Fas(FKCsA)；(iv)FKBP和FRB(雷帕霉素)；(v)GyrB和GyrB(香豆霉素)；(vi)GAI和GID1(赤霉素)；(vii)Snap-tag和HaloTag(HaXS)；(viii)eDHFR和HaloTag(TMP-HTag)；以及(ix)BCL-xL和Fab(AZ1)(ABT-737)。在一些实施方案中，化学诱导的二聚体包括FRB-FKBP融合复合物。在一些实施方案中，FRB是mTOR的FRB。在一些实施方案中，AAV包含至少一种衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与化学诱导的二聚体的结合配偶体中的一种融合，从而当结合配偶体与化合物接触时形成二聚体复合物。
在一些实施方案中，至少一种衣壳蛋白选自由VP1、VP2和VP3组成的组。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包括VP2。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与化学诱导的二聚体的结合配偶体融合的VP2。在一些实施方案中，与化学诱导的二聚体的结合配偶体融合的VP2的数量少于至少一个不与化学诱导的二聚体的结合配偶体融合的VP的数量。在一些实施方案中，与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接的VP2的数量比至少一个不与结合配偶体融合的VP2的数量少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约23倍、约24倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约46倍、约50倍或约100倍。
在一些实施方案中，化学诱导的二聚体的结合配偶体被插入AAV衣壳蛋白的内环内。在一些实施方案中，内环包含序列GTTTQSR(SEQ ID NO:43)。在一些实施方案中，内环包含SEQ ID NO:44(AAV2的衣壳蛋白VP1；Uniprot P03135)的氨基酸残基453至459。在一些方面，化学诱导的二聚体的结合配偶体被插入选自AAV2的衣壳蛋白VP2的R585、R587、R588或其任意组合的位点或类似衣壳蛋白中的同源位点(参见，例如，Buning和Srivastava,Methods and Clinical Development 12:248-266(2019年3月)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，内环的至少一个氨基酸被化学诱导的二聚体的结合配偶体替代。在一些实施方案中，支架蛋白通过接头与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白通过接头与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。在一些实施方案中，接头包含共价键或一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头是可裂解的接头。
在一些实施方案中，支架蛋白与特异性结合AAV的亲和剂连接。在一些实施方案中，亲和剂是AAV受体、单结构域抗体、纳米抗体、骆驼科抗体、VHH片段、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、抗体或其抗原结合部分，或其任意组合。在一些实施方案中，其抗原结合部分包含单链Fab。在一些实施方案中，亲和剂与一种或多种AAV衣壳蛋白结合。在一些实施方案中，一种或多种AAV衣壳蛋白是AAV组装激活蛋白。在一些实施方案中，亲和剂不与AAV衣壳蛋白单体结合。在一些实施方案中，亲和剂由AAV受体组成。在一些实施方案中，AAV受体是AAVR或GPR108。
在一些实施方案中，AAV还包含基因盒。在一些实施方案中，基因盒编码选自由以下组成的组的蛋白：分泌蛋白、受体、结构蛋白、信号传导蛋白、感觉蛋白、调节蛋白、转运蛋白、储存蛋白、防御蛋白、运动蛋白、凝血因子、生长因子、抗氧化剂、细胞因子、趋化因子、酶、肿瘤抑制基因、DNA修复蛋白、结构蛋白、低密度脂蛋白受体、α葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜传导调节因子或其任意组合。在一些实施方案中，基因盒编码因子VIII蛋白或因子IX蛋白。在一些实施方案中，因子VIII蛋白是野生型因子VIII、B结构域缺失的因子VIII、因子VIII融合蛋白或其任意组合。
在一些实施方案中，目标基因编码Rab蛋白香叶基香叶基转移酶组分A1(REP1)。在一些实施方案中，REP1包含与SEQ ID NO:45具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV选自由以下组成的组：AAV 1型、AAV2型、AAV 3A型、AAV 3B型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh74型、AAV rh32.33型、AAV rh10型、AAV Anc80型、AAV PHP型、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、灵长类动物AAV、人AAV、猪AAV、合成AAV、其任意组合。
本公开的某些方面涉及本文公开的EV中的AAV。
本公开的某些方面涉及包含与支架蛋白连接的VP2的AAV，所述支架蛋白包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中X2至X6中的每一个独立地为氨基酸，并且其中X6包含碱性氨基酸。在一些实施方案中，支架蛋白是本文公开的支架蛋白。
本公开的某些方面涉及包含与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接的VP2的AAV。在一些实施方案中，化学诱导的二聚体的结合配偶体包括公开的结合配偶体中的任一种。
本公开的某些方面涉及包含一种或多种与本文公开的亲和剂特异性结合的衣壳蛋白的AAV。
本公开的某些方面涉及药物组合物，其包含本文公开的EV(例如，外来体)或AAV，以及药学上可接受的载剂。
本公开的某些方面涉及产生本文公开的EV(例如，外来体)或AAV的细胞。
本公开的某些方面涉及包含编码AAV蛋白的第一核苷酸序列的细胞，所述AAV蛋白与本文公开的支架蛋白连接。在一些实施方案中，细胞还包含含有本文公开的目标基因的第二核苷酸序列。
本公开的某些方面涉及包含编码AAV蛋白的第一核苷酸的细胞，所述AAV蛋白与如本文公开的化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。在一些实施方案中，细胞还包含编码化学诱导的二聚体的相应结合配偶体的第二核苷酸序列，所述相应结合配偶体与本文公开的支架蛋白连接。在一些实施方案中，细胞还包含含有本文公开的目标基因的第三核苷酸序列。
本公开的某些方面涉及包含编码本文公开的亲和剂的第一核苷酸的细胞，所述亲和剂与本文公开的支架蛋白连接。在一些实施方案中，细胞还包含含有本文公开的目标基因的第二核苷酸序列。
本公开的某些方面涉及药盒，其包含本文公开的分离的EV(例如，外来体)以及使用说明。
本公开的某些方面涉及制备EV(例如，外来体)的方法，其包括在合适的条件下培养本文公开的细胞并获得EV。
本公开的某些方面涉及预防或治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用本文公开的EV、AAV或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病选自癌症、血友病、糖尿病、生长因子缺乏症、眼病、庞佩氏病(Pompe disease)、戈谢病、溶酶体贮积病症、粘液粘稠病、囊性纤维化、杜兴和贝克尔肌营养不良症、转甲状腺素蛋白淀粉样变性、血友病A、血友病B、腺苷脱氨酶缺乏症、莱伯先天性黑蒙(Leber’s congenital amaurosis)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良症、异染性脑白质营养不良症、OTC缺乏症、糖原贮积症1A病、Criggler-Najjar综合征、1型原发性高草酸尿症、急性间歇性卟啉症、苯丙酮尿症、家族性高胆固醇血症、VI型粘多糖贮积症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、Retts综合征、Dravet综合征、Angelman综合征、DM1病、脆性X病、亨廷顿病、弗里德赖希共济失调(Friedreichs ataxia)和高胆固醇血症。
本公开的某些方面涉及向受试者递送AAV的方法，其包括向受试者施用本文公开的EV。在一些实施方案中，肠胃外、口服、静脉内、肌内、瘤内、鼻内、皮下或腹膜内施用EV。在一些实施方案中，该方法还包括施用附加的治疗剂。
在一些方面，EV施用是眼内施用。在一些方面，眼内施用是玻璃体内施用、前房内施用、结膜下施用、视网膜下施用、巩膜下施用、脉络膜内施用及其任意组合。在一些方面，眼内施用包括注射EV。在一些方面，眼内施用是玻璃体内注射。在一些方面，眼内施用包括植入包含组合物的递送装置。在一些方面，递送装置是眼内递送装置。在一些方面，眼内递送装置是玻璃体内植入物或巩膜塞。在一些方面，递送装置是持续释放递送装置。在一些方面，递送装置是可生物降解的。在一些方面，EV的眼内施用是为了治疗选自由以下组成的组的疾病：黄斑变性、白内障、糖尿病性视网膜病、青光眼、弱视、斜视、视网膜病变、莱伯先天性黑蒙或其任意组合。
附图说明
图1是与包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端融合的AAV衣壳蛋白(例如，VP1、VP2或VP3)的图。
图2是与二聚剂例如FKBP-雷帕霉素结合(FRB)剂融合的AAV衣壳VP2的图。该结合配偶体与VP2衣壳蛋白的N端融合。相应的结合配偶体(例如，FKBP)与PTGFRN或支架蛋白的C端连接，该支架蛋白包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)。
图3A和图3B是与二聚剂(例如，化学诱导的二聚体FRB的结合配偶体)融合的AAV衣壳蛋白(例如，VP1、VP2或VP3)的图。结合配偶体被插入内环(例如，VP1)内的位置455处。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导FRB的二聚化的雷帕霉素存在的情况下)，在共同产生外来体的细胞中产生AAV。
图4A至图4C示出了与AAV受体(AAVR；图4A)、此处所示的通过支架Y连接的AAV亲和剂(图4C)连接的包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白和与AAV亲和剂连接的支架X蛋白(图4B)。
图5是在胞外结构域与抗原结合结构域(纳米抗体)连接的支架蛋白(例如，PTGFRN)的图。抗原结合结构域(纳米抗体)特异性结合AAV衣壳(诸如VP1、VP2或VP3)上的表位。
图6是与IgG的Fc区连接的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2或VP3)的图。支架蛋白(例如，PTGFRN)与FcγR1或特异性结合Fc的Fc纳米抗体连接。FcγR1或Fc纳米抗体与支架蛋白(例如，PTGFRN)的胞外结构域连接。
图7A显示了与AAV受体(AAVR)连接的支架蛋白(例如，PTGFRN)的图。AAVR与支架蛋白(例如，PTGFRN)的胞外结构域连接，并结合AAV衣壳诸如VP1、VP2或VP3上的表位。AAVR可以是PKD1、PKD2或单链抗体。图7B是图解说明成功构建了具有与支架X蛋白融合的AAV受体的外来体(“AAVR外来体”)的凝胶。
图8A和图8B示出了生物层干涉测量(Octet)数据，该数据显示包含与支架蛋白融合的AAVR的外来体与固定的AAV2结合(如图8A中所图解说明的)，而对照外来体不与固定的AAV2结合。
图9A是装载在变性聚丙烯酰胺凝胶上的等量的来自胞质溶胶(左)和细胞核(右)的细胞裂解物的蛋白质凝胶的图像。图9B示出了使用对αFLAG标签(在所有构建体上表达)特异的抗体对Etp-GFP、Etp-VP2和FRB-VP2进行的蛋白质印迹。图9C示出了在胞质溶胶和细胞核裂解物中使用对α组蛋白H4(细胞核志物)特异的抗体进行的蛋白质印迹。
图10A至图10D示出了转染到HEK293T细胞和适于悬浮培养的HEK293细胞(HEK293SF)中的各种AAV衣壳血清型的结果。图10A至图10D示出了通过蛋白质印迹检测到AAV1、AAV2、AAV3、AAV5和AAV6衣壳。
图11A示出了通过超速离心进行的混合物组分的分离。图11B示出了如图11A的图中指示的收集的级分(1-10)中的NTA(颗粒/mL)和qPCR(基因拷贝/mL(GC/mL))结果。
图12A至图12C示出了使用不同暴露时间测定10个收集的级分的VP1、VP2和VP3蛋白的存在的蛋白质印迹。VP1、VP2和VP3多肽在级分8、9和10中最为突出，在其中它们不与外来体缔合。级分1、2、3和5也具有可检测的VP1、VP2和VP3，并且被发现与这些级分中较高的外来体浓度相关。
图13示出了使用三重转染法用AAV9转染的HEK293T细胞的培养收获物的洗脱液色谱图。分离使用在20个柱体积内NaCl的浓度从150mM NaCl递增至1M NaCl的线性梯度洗脱(LGE)。
图14A示出了如图9中看到的初级洗脱峰中F1-F8级分的收集和由NTA分析得出的数据，以确定外来体计数和粒度。图14B至图14D示出了包含AAV5血清型(图14B至图14C)和AAV9血清型(图14D)的外来体的低温电子显微镜(cryoEM)图像。
图15示出了使用尺寸排阻色谱(SEC)进行的每个单独的F1-F8级分的分离。
图16示出了在抗AAV IgG存在的情况下以固定的GC/孔(固定的MOI：6000)用游离的(“AAV”)或包封的AAV9-GFP(“exo”)转染细胞的实验的结果。图12示出了如通过荧光强度(如在4天的一段时间内每3小时一次所测定的，所述测定以一式三份进行)测量的GFP表达。
图17B是显示在浓度递增的抑制性抗AAV9抗体存在的情况下，细胞培养物中来自外来体缔合的AAV或游离AAV的GFP表达的图示。图17B示出了在不同稀释度的抗AAV单克隆抗体存在的情况下，使用游离或包封的AAV9-GFP的不同样品(Chrom F3–Chrom F9)进行的GFP表达的比较研究。
图18A至图18D示出了来自F7级分的样品的头对头研究(head-to-head study)的结果，该结果显示了在向HeLa细胞培养物中加入样品后的时间点24h(图18A)、48h(图18B)、72h(图18C)和96h(图18D)时测量的使用游离(“AAV”)或包封的AAV9-GFP(“外来体-AAV”)的HeLa细胞培养物中GFP表达荧光强度的比较。
图19示出了响应于浓度递增的静脉内免疫球蛋白(“IVIG”)的使用游离(“游离AAV9”)或包封的AAV(“外来体-AAV”)的荧光素酶表达的比较研究。
图20是图解说明在施用PBS对照、编码分泌型nanoLuc的游离AAV9或包含编码分泌型nanoLuc的AAV9的外来体后2周，经匀浆的小鼠眼睛中nanoLuc表达水平(RLU/mg蛋白质)的条形图。
图21A是图解说明通过AAV与融合至AAV亲和配体的支架Y蛋白的相互作用，AAV与外来体膜的腔表面的缔合的图。图21B和图21C是条形图，显示了使用与AAV亲和配体融合的支架Y对外来体进行腔装载导致表示为释放的总AAV的百分比(图21B)和相对于AAV在缺乏支架Y融合构建体的外来体中的富集(图21C)的AAV至外来体的定位增加。
具体实施方式
本公开的某些方面涉及包含AAV和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)。在一些方面，AAV在EV的腔内。在一些方面，AAV与EV(例如，外来体)的膜缔合。在一些方面，AAV与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些方面，与单独的游离AAV相比，与外来体缔合的AAV具有改变的特性。
本公开的某些方面涉及包含腺相关病毒(AAV)和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)，例如外来体，其中AAV存在于EV的腔内。在某些实施方案中，外来体腔内的AAV数量多于参考EV的腔内的AAV数量，其中参考EV腔内的AAV是在没有支架蛋白的情况下引入的。在某些实施方案中，腔内含有AAV的EV的百分比高于其中AAV是在没有支架蛋白的情况下引入的参考EV的百分比。本公开的某些方面涉及包含在EV的腔内的至少5个AAV的EV(例如，外来体)。本公开的一些方面涉及包含至少一种与支架蛋白连接的衣壳蛋白(例如,VP1、VP2和VP3)的AAV。在一些实施方案中，支架蛋白包如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中X2至X6中的每一个独立地是氨基酸，并且其中X6包括碱性氨基酸。
本公开的某些方面涉及包含腺相关病毒(AAV)和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)，例如外来体，其中AAV与EV外表面上的支架蛋白缔合。在一些实施方案中，支架蛋白包含胞外结构域，并且AAV与支架蛋白的胞外结构域缔合。在某些实施方案中，AAV通过共价键与支架蛋白缔合。在一些实施方案中，AAV通过非共价相互作用与支架蛋白缔合。
本公开的一些方面涉及被工程化成包含AAV亲和配体的EV。
在本公开中示出了各种实施方案的非限制性实例。
I.定义
为了能够更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。在整个详述的说明书中阐述了附加的定义。
应当注意，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”实体是指一个/笚或多个/种该实体；例如，“一个/种(a)核苷酸序列”被理解为代表一个/笚或多个/种核苷酸序列。因此，术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an)”)、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。
此外，本文使用的“和/或”应被视为具体地公开两个指定特征或组分中的每个与或不与另一个一起存在。因此，如在本文中诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)和“B”(单独的)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面的每一方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；和C(单独的)。
应当理解，本文无论在何处用措辞“包含/包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的其它类似方面。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；和the Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(Système International de Unites)(SI)认可的形式表示。数值范围包括限定范围的数值。除非另有说明，否则核苷酸序列从左至右以5’至3’方向书写。氨基酸序列从左到右以氨基至羧基的方向书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述标题可以通过整体参考说明书而获得。因此，通过参考整个说明书更完整地定义了紧接着在下文中定义的术语。
术语“约”在本文中用于意指大约、大致近似地、左右或在......范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到高于和低于所述数值来修饰该范围。一般来说，术语“约”可以修饰高于和低于所述值例如上下(更高或更低)10％的差异的数值。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”和“EV”可互换使用，并且是指包含包封内部空间(即，腔)的膜的细胞源性囊泡。细胞外囊泡包括所有与膜结合的囊泡(例如，外来体、纳米囊泡、微囊泡)，其直径小于其所源自的细胞的直径。在一些实施方案中，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm的范围内，并且可包含在内部空间(即，腔)内、展示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨膜的各种大分子有效载荷，或其组合。在一些实施方案中，所述有效载荷可包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。在某些实施方案中，有效载荷包括AAV。
在一些实施方案中，有效载荷包括AAV和核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。在一些方面，术语细胞外囊泡或EV是指细胞外囊泡(EV)群。
作为示例而非限制，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)获得的细胞源性囊泡、成泡的细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些实施方案中，细胞外囊泡由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
如本文所用，术语“外来体”是指直径在20-300nm之间(例如，在40-200nm之间)的细胞外囊泡(EV)。外来体包含包封内部空间(即，腔)的膜，并且在一些实施方案中，可通过直接质膜出芽或通过晚期内体或多囊体(MVB)与质膜的融合由细胞(例如,生产者细胞)产生。在某些实施方案中，外来体包含支架蛋白。如下文所述，外来体可来源于生产者细胞，并根据其大小、密度、生化参数或其组合从生产者细胞中分离出来。在一些实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。在某些实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)由共产生AAV的细胞产生。在某些方面，术语外来体是指外来体群体。
如本文中所用，术语“纳米囊泡”是指直径在20-250nm之间(例如，在30-150nm之间)的细胞外囊泡，并且通过直接或间接操作由所述细胞(例如,生产者细胞)产生，使得所述纳米囊泡在没有所述操作的情况下不会由所述细胞产生。对细胞进行适当操作以产生纳米囊泡包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在一些实施方案中，纳米囊泡的产生可能导致所述生产者细胞的破坏。在一些实施方案中，本文所述的纳米囊泡群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式从所述细胞得到的囊泡。在某些实施方案中，纳米囊泡包含支架蛋白。一旦纳米囊泡来源于生产者细胞，则其可基于其尺寸、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞中分离。
如本文所用，“微囊泡”是指由膜囊泡从细胞表面向外出芽和分裂产生的细胞外囊泡。
如本文所用，术语“支架蛋白”是指可用于将有效载荷或任何其它目标化合物(例如，AAV)锚定至EV的多肽。在一些方面，支架蛋白是不天然存在于EV中的多肽。在一些实施方案中，支架蛋白包括合成多肽。在一些实施方案中，支架蛋白包括经修饰的蛋白，其中相应的未经修饰的蛋白天然存在于EV(“EV蛋白”)(例如，外来体)中。在一些实施方案中，支架蛋白包括天然存在于EV中的蛋白质或其片段，例如EV蛋白的片段，其中所述蛋白以高于天然存在的水平表达。在一些实施方案中，支架蛋白还包含非多肽部分。在其它实施方案中，支架蛋白还包含脂质和/或碳水化合物。在一些实施方案中，支架蛋白包括融合蛋白，其包含(i)天然存在的EV蛋白或其片段和(ii)异源肽(例如，抗原结合结构域、衣壳蛋白、Fc受体、化学诱导的二聚体的结合配偶体或其任意组合)。
如本文所用，术语“结合配偶体”或“二聚剂”是指至少两种彼此相互作用以形成多聚体(例如，二聚体)的元件中的一种。在一些实施方案中，结合配偶体是与第二结合配偶体相互作用的第一结合配偶体。在一些实施方案中，结合配偶体是与第二结合配偶体和/或第三结合配偶体相互作用的第一结合配偶体。任何结合配偶体或二聚剂都可用于本文公开的组合物和方法中。在一些实施方案中，结合配偶体可以是多肽、多核苷酸、脂肪酸、小分子或其任意组合。在某些实施方案中，结合配偶体(例如，第一结合配偶体和/或第二结合配偶体)选自化学诱导的二聚体的第一和第二结合配偶体，所述第一和第二结合配偶体选自由以下组成的组：(i)FKBP和FKBP(FK1012)；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶(CNA)(FK506)；(iii)FKBP和CyP-Fas(FKCsA)；(iv)FKBP和FRB(雷帕霉素)；(v)GyrB和GyrB(香豆霉素)；(vi)GAI和GID1(赤霉素)；(vii)Snap-tag和HaloTag(HaXS)；(viii)eDHFR和HaloTag(TMP-HTag)；以及(ix)BCL-xL和Fab(AZ1)(ABT-737)。
在一些实施方案中，支架蛋白包括融合蛋白，其包含(i)天然存在于EV中的蛋白(EV蛋白)或其片段和(ii)第二多肽序列。术语“支架X”是指最近在外来体表面鉴定的外来体蛋白。在一些实施方案中，EV蛋白选自美国专利第10,195,290号中描述的EV蛋白，所述美国专利通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，EV蛋白选自由以下组成的组：前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1蛋白、ATP1A2蛋白、ATP1A3蛋白、ATP1A4蛋白、ATP1B3蛋白、ATP2B1蛋白、ATP2B2蛋白、ATP2B3蛋白、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。如本文所用，术语“支架Y”是指在外来体的腔中新鉴定的外来体蛋白或其片段。参见，例如，国际申请第PCT/US2018/061679号，其通过引用整体并入本文。支架Y蛋白的非限制性实例包括选自由以下组成的组的那些：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物(“MARCKS”或“MARCKS蛋白”)；富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物样蛋白1(“MARCKSL1”或“MARCKSL1蛋白”)；和脑酸溶性蛋白1(“BASP1”或“BASP1蛋白”)。
在某些实施方案中，支架Y蛋白包含EV蛋白的片段。在一些实施方案中，支架蛋白包含MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段。在一些实施方案中，支架蛋白包含氨基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，支架蛋白包含氨基酸序列GGKLSKK(SEQ IDNO:17)，其中C端甘氨酸残基被肉豆蔻酰化。在一些实施方案中，支架蛋白包含(a)(i)MARCKS、MARCKSL1或BASP的片段，或(ii)氨基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)和(b)跨膜结构域，其中跨膜结构域与(a)(i)或(a)(ii)的序列的C端连接(例如，通过接头)。在一些实施方案中，支架蛋白包含(a)(i)MARCKS、MARCKSL1或BASP的片段，或(ii)氨基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)、(b)跨膜结构域和(C)胞外结构域，其中跨膜结构域与(a)(i)或(a)(ii)的序列的C端连接(例如，通过接头)，并且其中胞外结构域与跨膜结构域的C端连接。
在一些实施方案中，支架蛋白是跨膜蛋白。如本文所用，“跨膜蛋白”是指包含胞外结构域(例如，至少一个位于EV(例如，外来体)膜外部(例如，囊泡外的)的氨基酸)、跨膜结构域(例如，至少一个位于EV的膜内，例如外来体的膜内的氨基酸)和胞内结构域(例如，至少一个位于EV(例如，外来体)的膜的内部(例如，囊泡内)的氨基酸)的任何蛋白。在一些实施方案中，本文所述的支架蛋白是I型跨膜蛋白，其中跨膜蛋白的N端位于细胞外空间，例如包围EV(例如，外来体)的膜的外部(或在其外部)，例如囊泡外。在一些实施方案中，本文所述的支架蛋白是II型跨膜蛋白，其中跨膜蛋白的N端位于腔内，例如细胞内空间中，例如膜内部，例如在膜的腔侧上，所述膜包围EV(例如，外来体)，例如囊泡内。
如本文所用，术语“细胞外”可与术语“外部的”、“外部”和“囊泡外”互换使用，其中每个术语是指在包围EV的膜的外部的元件。如本文所用，术语“细胞内”可以与术语“内部的”、“内部”和“囊泡内”互换使用，其中每个术语是指在包围EV的膜的内部的元件。术语“腔”是指包围EV的膜的内部的空间。因此，在EV的腔内部的元件在本文中可以称为“位于腔内”或“腔内”。
如本文所用，术语“锚定的”是指与膜缔合的元件。在一些实施方案中，锚定至膜的元件与跨膜蛋白缔合，其中跨膜蛋白将元件锚定至膜。在一些实施方案中，锚定至膜的元件与包含与膜相互作用的基序的支架蛋白(例如，包含GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白)缔合，从而将元件锚定至膜。在一些实施方案中，支架蛋白包含在支架蛋白的N端处的肉豆蔻酰化氨基酸残基，其中肉豆蔻酰化氨基酸将支架蛋白锚定至EV的膜。元件可以直接锚定(例如肽键)至膜或者通过接头锚定至膜。
如本文所用，术语“腔工程化外来体”是指这样的EV(例如，外来体)，其中EV(例如，外来体)膜或腔在其组成上被修饰，使得工程化EV(例如，外来体)的腔不同于修饰前的EV(例如，外来体)或天然存在的EV(例如，外来体)的腔。工程化可以直接存在于EV(例如，外来体)的腔内或膜中，使得EV(例如，外来体)的腔被改变。例如，膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成上被修饰，使得EV(例如，外来体)的腔被修饰。所述组成可以通过化学、物理或生物方法，或者通过从先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞中产生来改变。具体而言，所述组成可通过基因工程来改变，或者通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改变。在一些实施方案中，腔工程化外来体包含外源蛋白(即，EV(例如，外来体)不天然表达的蛋白)或其片段或变体，所述外源蛋白或其片段或变体可以暴露于EV(例如，外来体)的腔内，或者可以是暴露于EV(例如，外来体)的内层上的部分的锚定点(附接)。在其他实施方案中，与非工程化或经修饰的外来体相比，腔工程化EV(例如，外来体)包含天然外来体蛋白(例如，本文所述的任何EV蛋白)或其片段或变体的更高表达，所述外来体蛋白或其片段或变体可以暴露于外来体的腔，或者可以是暴露于外来体的腔内的部分的锚定点(附接)。
如本文所用，术语“外表面工程化外来体”是指这样的EV(例如，外来体)，其中EV(例如，外来体)的膜在其组成上被修饰，使得工程化EV(例如，外来体)的外表面不同于修饰前的EV(例如，外来体)或天然存在的EV(例如，外来体)的外表面。例如，膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成上被修饰，使得EV(例如，外来体)的外表面被修饰。所述组成可以通过化学、物理或生物方法，或者通过从先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞中产生来改变。具体而言，所述组成可通过基因工程改造来改变，或者通过由先前通过基因工程改造修饰的细胞产生来改变。在一些实施方案中，外表面工程化外来体包含外源蛋白(即，EV(例如，外来体)不天然表达的蛋白)或其片段或变体，其可以暴露在EV(例如，外来体)的外表面上，或者可以是暴露在EV(例如，外来体)的外层上的部分的锚定点(附接)。在其它实施方案中，外表面工程化EV(例如，外来体)包含天然外来体蛋白(例如，本文所述的任何EV蛋白)或其片段或变体的更高表达，所述天然外来体蛋白或其片段或变体可以暴露于外来体的外表面，或者可以是外来体的外表面上存在的部分的锚定点(附接)。
术语“经修饰的”，当在本文所述的支架蛋白的背景中使用时，是指蛋白例如EV蛋白的的改变或工程化，使得经修饰的蛋白例如支架蛋白不同于天然存在的蛋白，例如EV蛋白。在一些实施方案中，本文所述的经修饰的蛋白例如支架蛋白包含不同于天然存在的蛋白，例如EV蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的蛋白，例如支架蛋白，相对于天然存在的蛋白(例如，EV蛋白)包含一个或多个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，经修饰的蛋白，例如支架蛋白，是包含EV蛋白(或其片段)和第二肽序列的融合蛋白。在一些实施方案中，经修饰的蛋白，例如支架蛋白，保留了未经修饰的蛋白，例如EV蛋白的一种或多种功能。在一些实施方案中，支架蛋白仅保留未经修饰的蛋白(例如，EV蛋白)与EV膜的腔或外表面(例如，外来体的腔或外表面)缔合的能力。
如本文所用，术语“改变的特性”，当用于本文所述的EV(例如，外来体)和/或AAV的情形中时，是指EV(例如，外来体)和/或AAV的物理和/或功能特性相对于未经修饰的EV(例如，外来体)和/或AAV的变化。在一些实施方案中，改变的特性包括更好的治疗效果。例如，在一些实施方案中，与未经修饰的AAV，例如不存在于本文公开的EV的腔内的AAV相比，本公开的AAV具有更高的感染性、更高的活性、更大的效力、更快的转导动力学和/或降低的免疫原性(例如，增强的对免疫侵入的耐受性)。在一些实施方案中，本公开的AAV对免疫反应的易感性不如未经修饰的AAV，例如不存在于本文公开的EV的腔内的AAV。在一些实施方案中，与未经修饰的AAV，例如不存在于本文公开的EV的腔内的AAV相比，本公开的AAV不太可能诱导受试者的免疫反应。在一些实施方案中，本公开的AAV允许对受试者进行多次给药，其中在第一剂量之后，AAV的感染性和/或活性得以保持。在一些实施方案中，本公开的AAV允许剂量递增研究，而无AAV感染性和/或活性的损失。
如本文所用，术语蛋白质(例如，支架蛋白或治疗性蛋白)的“片段”是指比天然存在的序列短，与天然存在的蛋白质相比缺失N端和/或C端或者缺失蛋白质的任何部分的氨基酸序列。如本文所用，术语“功能性片段”是指保留蛋白质功能的蛋白质片段。因此，在一些实施方案中，包含EV蛋白的功能性片段的支架蛋白保留了将部分锚定在EV(例如，外来体)的腔表面或外表面上的能力。片段是否是功能性片段可通过本领域已知测定EV(例如，外来体)的蛋白质含量的方法来评估，所述方法包括蛋白质印迹、FACS分析和片段与自发荧光蛋白(如例如GFP)的融合。在某些实施方案中，包含EV蛋白的功能性片段的支架蛋白保留了天然存在的EV蛋白的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的能力，例如锚定部分的能力。功能性片段不一定保留全长蛋白质的所有功能。相反，在一些实施方案中，如果片段保留了锚定天然存在的EV蛋白的部分的能力，则所述片段是的功能性片段，即使该片段不再保留全长蛋白的任何其它功能。
如本文所用，术语分子(例如，支架蛋白或治疗性蛋白)的“变体”是指通过本领域已知的方法进行比较后与另一分子共有某些结构和功能属性的分子。例如，蛋白的变体可包括另一蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。
在一些实施方案中，支架蛋白的变体包括与全长成熟的以下蛋白具有至少约70％同一性的变体：PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4、CD13、ANPEP、MME、ENPP1、NRP1、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、MARCKS、MARCKSL1、BASP1，或PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4、CD13、ANPEP、MME、ENPP1、NRP1、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、MARCKS、MARCKSL1或BASP1蛋白的片段(例如，功能片段)。
“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的一个氨基酸被来自同一侧链家族的另一种氨基酸替代，这种取代被认为是保守的。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以被保守地替代为结构相似的串，所述结构相似的串在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸或氨基酸，而不计来自参考序列的核苷酸或氨基酸，所以不计参考序列中存在的空位。
通过以下计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可以各自具有它们自己的序列同一性百分比。请注意，序列同一性百分比值四舍五入到十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可来源于多重序列比对。产生多重序列比对的一个合适的程序是ClustalW2，可从www.clustal.org获得。另一个合适的程序是MUSCLE，可从www.drive5.com/muscle/获得。ClustalW2和MUSCLE可以例如从EBI选择获得。
还应当理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据(诸如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据)整合而产生。整合异构数据以生成多重序列比对的合适程序是可在www.tcoffee.org上获得，以及另选地可以例如从EBI获得的T-Coffee。还应当理解，可以自动或手动策划用于计算序列同一性百分比的最终比对。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。在一个实施方案中，多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失的改变，但不改变所编码多肽的特性或活性。在另一个实施方案中，由于遗传密码的简并性，通过沉默取代产生核苷酸变体。在其它实施方案中，其中以任意组合取代、删除或添加5-10个、1-5个或1-2个氨基酸的变体。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化用于特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为其它密码子，例如，细菌宿主诸如大肠杆菌(E.coli))。
天然存在的变体被称为“等位基因变体”，是指占据生物体的染色体上给定基因座的基因的几种替代形式中的一种(Genes II,Lewin,B.，编辑，John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化，并且包含在本公开中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或直接合成产生。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，能产生变体来改善或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的N端或C端删除一个或多个氨基酸，而基本上不损失生物功能。Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(通过引用整体并入本文)报道了变体KGF蛋白即便是在删除3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性。类似地，干扰素γ在从该蛋白的羧基端删除8-10个氨基酸残基后显示出高达10倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology7:199-216(1988)，通过引用整体并入本文)。
此外，大量的证据表明，变体通常保留着与天然存在的蛋白质相似的生物活性。例如，Gayle及同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，通过引用整体并入本文)对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变生成了3,500多种单独的IL-1a突变体，在分子的整个长度上每种变体平均有2.5个氨基酸的变化。在每个可能的氨基酸位置都检查到多重突变。研究人员发现，“大多数分子可被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响。”(见摘要)。事实上，在检查的3,500多个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生了与野生型活性显著不同的蛋白质。
如上所述，多肽变体包括例如经修饰的多肽。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人，Blood 116:270-79(2010)，其通过引用整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸诸如精氨酰化和遍在蛋白化。在一些实施方案中，可在任何方便的位置修饰支架蛋白。在某些实施方案中，支架蛋白的N端被肉豆蔻酰化。
术语“与......缔合”、“与......连接”或“与......缀合”在本文中可互换使用，指两个或多个元件之间的直接或间接相互作用。两种元件可以通过共价键或非共价键和/或相互作用相互缔合。在一些实施方案中，第一元件，例如AAV，通过肽键与第二元件，例如支架蛋白缔合。在一些实施方案中，第一元件(例如AAV)通过一个或多个二硫键与第二元件(例如支架蛋白)缔合。在一些实施方案中，第一元件(例如AAV)通过非共价相互作用(例如，静电相互作用、氢键、范德瓦尔斯相互作用、疏水相互作用、离子诱导偶极、偶极诱导偶极、离子键、配位键、螯合或其任意组合)与第二元件(例如，支架蛋白)缔合。第一元件与第二元件可以直接缔合，例如，其中支架蛋白通过肽键与AAV衣壳蛋白连接，不存在支架蛋白序列(或其保守修饰)或AAV衣壳蛋白(或其保守修饰)中不存在的任何居间氨基酸；或者第一元件可以通过间接缔合与第二元件缔合，例如，其中AAV通过支架蛋白的相互作用与EV的腔膜缔合，其中支架蛋白的N端与EV的腔膜相互作用，并且支架蛋白的C端与AAV衣壳蛋白共价连接。第一元件与第二个元件“间接连接”，其中至少一个氨基酸的接头位于第一个元件与第二个元件之间。在一些方面，第一元件与第二元件直接缔合，例如，其中支架蛋白通过支架蛋白与AAV衣壳蛋白之间的肽键与AAV缔合；或者第一元件通过间接缔合与第二元件缔合，例如，其中AAV通过支架蛋白与EV的外表面缔合，其中支架蛋白锚定至EV的外表面，并且支架蛋白的C端或N端与AAV衣壳蛋白共价连接。
术语“包封的”，或该术语的语法上不同的形式(例如，包封(encapsulation)或包封(encapsulating))，是指在第二部分(例如，EV，例如，外来体)内具有第一部分(例如，AAV)而两个部分没有化学或物理地连接的状态或过程。在一些实施方案中，术语“包封的”可以与“在……腔中”互换使用。在本文其它地方公开了将第一部分(例如，AAV)包封到第二部分(例如，EV，例如，外来体)中的非限制性实例。在本公开的一些实施方案中，EV包括与EV的外表面缔合的第一AAV和由EV包封的第二AAV。在本公开的一些实施方案中，EV包含与EV的外表面缔合的第一AAV、由EV包封的第二AAV以及与EV的外表面缔合的靶向部分。在本公开的一些实施方案中，EV包含与EV的外表面缔合的AAV和与EV的外表面缔合的靶向部分。在本公开的一些实施方案中，EV包含与EV的腔表面缔合的AAV和与EV的外表面缔合的靶向部分。
如本文所用，术语“生产者细胞”是指用于产生EV(例如，外来体)和/或AAV的细胞。生产者细胞可以是体外培养的细胞，也可以是体内细胞。生产者细胞包括但不限于已知能有效产生EV(例如，外来体)和/或AAV的细胞，例如，HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、间充质干细胞(MSC)、BJ人包皮成纤维细胞、fHDF成纤维细胞、
Figure BDA0003414407670000351
神经元前体细胞、
Figure BDA0003414407670000352
羊水细胞、脂肪间充质干细胞和RPTEC/TERT1细胞、sf9昆虫细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、PER.C6细胞、Vero细胞、NS0细胞、HeLa细胞。在一些实施方案中，用于产生EV的生产者细胞与用于产生AAV的细胞相同。在一些实施方案中，EV是使用第一生产者细胞产生的，并且AAV是使用第二生产者细胞产生的，其中第一生产者细胞的类型不同于第二生产者细胞的类型。在一些实施方案中，EV是使用第一生产者细胞产生的，并且AAV是使用第二生产者细胞产生的，其中第一生产者细胞的类型与第二生产者细胞的类型相同。
如本文所用，术语“分离(isolate)”、“分离的(isolated)”和“分离(isolating)”或“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”和“纯化(purifying)”以及“提取的(extracted)”和“提取(extracting)”可互换使用，是指已经过一个或多个纯化过程的所需EV的制剂状态(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)，所述纯化过程例如是所需EV制剂的选择或富集。在一些实施方案中，本文所用的分离或纯化是从含有生产者细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)EV的过程。在一些实施方案中，分离的EV组合物没有可检测的不希望的活性，或另选地，不希望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其它实施方案中，分离的EV组合物的所需EV的量和/或浓度等于或高于可接受的量和/或浓度。在其它实施方案中，与从中获得组合物的原料(例如，生产者细胞制剂)相比，分离的EV组合物被富集。与原料相比，这种富集可以是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％或至少约99.9999％。在一些实施方案中，分离的EV制剂基本上不含残留的生物产物。在一些实施方案中，分离的EV制剂约100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何污染性生物物质。残留生物产物可包括非生物物质(包括化学物质)或不想要的核酸、蛋白质、脂类或代谢物。基本上不含残留生物产物也可意味着EV组合物不含可检测的生产者细胞，并且只有EV是可检测的。
如本文所用，术语“有效载荷”是指作用于与EV接触的靶标(例如，靶细胞)的剂。可包含在EV(例如，外来体)上的有效载荷的非限制性实例是AAV。可以引入到EV中或EV(例如，外来体)和/或生产者细胞的外表面上的有效载荷包括诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或破坏转录的毒素的核苷酸)、核酸(例如，编码诸如酶等多肽的DNA或mRNA分子，或诸如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA等的具有调节功能的RNA分子)、氨基酸(例如，包含可检测部分或破坏翻译的毒素的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)等剂。在某些实施方案中，有效载荷包括AAV。
如本文所用，“亲和剂”是指能够结合第二部分的部分。在一些实施方案中，亲和剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，亲和剂是受体，例如AAV受体。在一些方面，将编码AAV亲和剂的表达盒与AAV生产质粒一起瞬时转染到靶细胞中。在某些方面，AAV由产生
如本文所用，术语“抗体”涵盖免疫球蛋白(无论是天然产生的还是部分或完全合成产生的)及其片段。该术语还涵盖任何具有与免疫球蛋白结合结构域(例如抗原结合结构域)同源的结合结构域的蛋白质。“抗体”还包括多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的框架区。术语抗体的使用是指包括完整抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、其片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、小鼠-人抗体、小鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、骆驼科抗体、鲨鱼IgNAR、抗独特型抗体、抗体片段(诸如，例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb、单链Fab和Fd片段)、双抗体、微型抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能。在一些方面，抗体或其抗原结合片段是纳米抗体。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，尤其是人。本文描述的组合物和方法适用于人的疗法和兽医应用。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，在其它实施方案中，受试者是人。如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家养动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。
如本文中所用，术语“基本上不含”意指包含EV(例如，外来体)的样品包含按质量/体积(m/v)百分比浓度计少于10％的大分子。一些级分可含有少于约0.001％、少于约0.01％、少于约0.05％、少于约0.1％、少于约0.2％、少于约0.3％、少于约0.4％、少于约0.5％、少于约0.6％、少于约0.7％、少于约0.8％、少于约0.9％、少于约1％、少于约2％、少于约3％、少于约4％、少于约5％、少于约6％、少于约7％、少于约8％、少于约9％或少于约10％(m/v)的大分子。
如本文所用，术语“大分子”意指核酸、污染性蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。
如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、由Gao等人(J.Virol.78:6381(2004))和Moris等人(Virol.33:375(2004))公开的那些AAV血清型和进化枝，以及现在已知或后来发现的任何其它AAV。参见，例如，FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。AAV是指细小病毒科病毒中的副细小病毒(属)。例如，AAV可以是来源于天然存在的“野生型”病毒的AAV、来源于包装在衣壳(来源于由天然存在的cap基因编码的衣壳蛋白)中的重组AAV(rAAV)基因组和/或包装在衣壳(来源于由非天然衣壳cap基因编码的衣壳蛋白)中的rAAV基因组的AAV。如本文所用，“AAV”可用于指病毒本身或其衍生物。除非另有特别指明，否则所述术语涵盖所有亚型以及天然存在形式和重组形式。AAV包括AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛类哺乳动物的AAV等。参见，例如，Fields等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第3版，Lippincott-Raven Publishers)。在一些方面，AAV是不可复制的AAV，例如，不具感染性的AAV。在一些实施方案中，AAV包含病毒载体。
在一些方面，本公开提供了“分离的AAV”。如本文关于AAV所使用的，术语“分离的”是指已经从其自然环境(例如，从宿主细胞、组织或受试者)中分离的或者人工产生的AAV。分离的AAV可用重组方法产生。此类AAV在本文中有时被称为“重组AAV”或“rAAV”。在一些实施方案中，重组AAV具有AAV基因组，其中部分或全部rep和cap基因已被异源序列替代。如本文所用，“rAAV载体”是指包含非AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)(通常为用于细胞的遗传转化的目标序列)的AAV载体。通常，异源多核苷酸由至少一个，通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)侧接。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。重组AAV优选具有组织特异性靶向能力，从而将rAAV的转基因特异性地递送至一个或多个预定组织。AAV衣壳是决定这些组织特异性靶向能力的重要因素。因此，可以选择具有适合于被靶向的组织的衣壳的rAAV。
“不含衣壳”或“无衣壳(capsid-less)”(或其变形)载体或核酸分子是指不含衣壳的载体构建体。在一些实施方案中，无衣壳载体或核酸分子不包含编码例如AAV Rep蛋白的序列。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常由野生型AAV的所有衣壳蛋白)和包封的多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。如果病毒或颗粒包含异源多核苷酸(即，不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则可将其称为“rAAV载体颗粒”。因此，rAAV颗粒的产生必需包括rAAV载体的产生，因为这样的载体包含在rAAV颗粒中。
AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如，野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。本领域已知多种此类AAV辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒和痘病毒诸如痘苗病毒。腺病毒包括许多不同的亚组，尽管最常用的是C亚组的5型腺病毒。人、非人哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒是已知的，并且可以从诸如ATCC的保藏中心获得。疱疹科的病毒包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；其也可从诸如ATCC等保藏中心获得。
如本文所用，“反向末端重复序列”(或“ITR”)是指位于单链核酸序列的5’或3’末端的核酸子序列，其包含一组核苷酸(初始序列)，随后下游是其反向互补序列，即回文序列。初始序列和与反向互补序列之间的核苷酸居间序列可以是任意长度。
如本文所用，术语“向性”是指第一成分靶向第二组分的能力。在一些方面，向性是指AAV载体或病毒粒子转导一种或多种指定的细胞类型的能力，但也可以包括载体如何在一种或多种指定的细胞类型中起转导细胞的作用；即，向性是指AAV载体或病毒粒子优先进入某些细胞或组织类型并且/或者优先与细胞表面相互作用，这有助于进入某些细胞或组织类型，任选地和优选地，随后由AAV载体或病毒粒子携带的序列在细胞中表达(例如，转录和任选的翻译)，例如，对于重组病毒，一个或多个异源核苷酸序列表达。如本文所用，术语“转导”是指AAV载体或病毒粒子感染一种或多种特定细胞类型的能力；即转导是指AAV载体或病毒粒子进入细胞，并将AAV载体或病毒粒子中包含的遗传物质转移到细胞中，以从载体基因组中获得表达。在一些情况下，但不是所有情况下，转导和向性可以相互关联。
在一些方面，EV被特定细胞、组织或器官增强摄取的能力可以通过工程化靶向部分以在EV上表达来修改。如本文所用，术语“靶向部分”是指能够在体内或体外改变细胞外囊泡(例如，外来体、纳米囊泡)分布的剂(即，有效载荷)。在一些方面，当靶向部分在EV(例如，外来体)上表达时，其改变和/或增强EV的自然运动。靶向部分可以是生物分子，诸如蛋白质、肽、脂质或碳水化合物，或合成分子。例如，靶向部分可以是亲和配体(例如，抗体、VHH结构域、噬菌体展示肽、纤连蛋白结构域、骆驼科(camelid)、VNAR)、合成聚合物(例如，PEG)、天然配体/分子(例如，CD40L、白蛋白、CD47、CD24、CD55、CD59)、重组蛋白(例如，XTEN)，但不限于此。可与本公开一起使用的靶向部分的非限制性实例包括那些能结合在树突状细胞(例如，Clec9A或DEC205)或T细胞(例如，CD3)上特异性表达的标志物的部分。
在某些方面，靶向部分展示在EV(例如，外来体)的表面上。靶向部分可通过与支架蛋白(例如，支架X)融合(例如作为遗传编码的融合分子)而被展示在EV表面上。在一些方面，靶向部分可通过将生物靶向部分附接至EV表面分子的化学反应展示在EV表面上。可用于本公开的靶向部分的非限制性实例包括C型凝集素结构域家族9成员A(Clec9a)蛋白、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(DC-SIGN)、CD207、CD40、Clec6、树突状细胞免疫受体(DCIR)、DEC-205、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)、MARCO、Clec12a、DC-无唾液酸糖蛋白受体(DC-ASGPR)、DC免疫受体2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬细胞甘露糖受体(MMR)、BDCA-1(CD303,Clec4c)、Dectin-2、Bst-2(CD317)、CD3或其任意组合。在某些方面，靶向部分是Clec9a蛋白。在一些方面，靶向部分是CD3分子。
如本文所用，术语“C型凝集素结构域家族9成员A”(Clec9a)蛋白质是指作为活化受体起作用并在髓系谱系细胞(例如，DC)上表达的组V C型凝集素样受体(CTLR)。Huysamen等人，J Biol Chem283(24):16693-701(2008)；美国专利第9,988,431B2号，其每一个通过引用以其整体并入本文。Clec9a的同义词是已知的，并且包括CD370、DNGR-1、5B5、HEEE9341和含9A的C型凝集素结构域。在一些方面，Clec9a蛋白在人cDC1细胞上表达。在一些方面，Clec9a蛋白在小鼠cDC1和pDC细胞上表达。除非另有说明，否则如本文所用，Clec9a可以指来自一个或多个物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的Clec9a。
如本文所用，“施用”意指通过药学上可接受的途径向受试者提供包含本文公开的EV(例如，外来体)的组合物。施用途径可以是静脉内的，例如静脉内注射和静脉内输注。其它施用途径包括，例如，皮下、肌内、口服、鼻内和肺部施用。EV(例如，外来体)可以作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
如本文所用，“免疫反应”是指脊椎动物体内针对外来因子或异常因子(例如，AAV)的生物反应，所述反应保护生物体免受这些因子及其引起的疾病的侵害。免疫反应由免疫系统的一种或多种细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞或肝脏中的任一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，所述免疫反应导致对入侵病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性或其它异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，对正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏，并且/或者从脊椎动物体内将其消除。免疫反应包括例如对T细胞，例如效应T细胞、Th细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞或Treg细胞的活化或抑制，或者对免疫系统的任何其它细胞，例如NK细胞的活化或抑制。因此，免疫反应可包括体液免疫反应(例如，由B细胞介导的)、细胞免疫反应(例如，由T细胞介导的)或体液和细胞免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是“抑制性”免疫反应。“抑制性”免疫反应是指阻断或减弱刺激物(例如，AAV疗法)的作用的免疫反应。在某些实施方案中，抑制性免疫反应包括产生针对AAV的抑制性抗体。
如本文所用，术语“治疗性蛋白”是指本领域已知的可施用于受试者的任何多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包括选自凝血因子、生长因子、抗氧化剂、酶、肿瘤抑制基因、DNA修复蛋白、结构蛋白、抗体、其功能性片段或其组合的蛋白。如本文所用，术语“凝血因子”是指天然存在或重组产生的分子或其类似物，其预防或减少受试者出血发作的持续时间。换句话说，其意指具有促凝血活性的分子，即负责将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白网，导致血液凝固或凝结。如本文所用，“凝血因子”包括活化的凝血因子、其酶原或可活化的凝血因子。“可活化的凝血因子”是能够转化为活性形式的呈无活性形式(例如，呈其酶原形式)的凝血因子。术语“凝血因子”包括但不限于因子I(FI)、因子II(FII)、因子V(FV)、FVII、FVIII、FIX、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、因子XIII(FXIII)、血管性血友病因子(Von Willebrand factor,VWF)、前激肽释放酶、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI2)、其酶原、其激活形式，及其任意组合。
如本文所用，凝血活性意指参与一连串生化反应的能力，所述生化反应最终形成纤维蛋白凝块并且/或者减少出血或出血发作的严重程度、持续时间或频率。
如本文所用，“生长因子”包括本领域已知的任何生长因子，包括细胞因子和激素。在一些实施方案中，生长因子选自肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)(例如，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7)、睫状神经营养因子家族成员(例如，睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL-6))、集落刺激因子(例如，巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、表皮生长因子(EGF)、肝配蛋白(例如，肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)(如FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23)、胎牛促生长素(FBS)、GDNF家族成员(例如，神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(neurturin)、persephin、artemin)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤来源的生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(例如，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)或IGF-2)、白细胞介素(IL)(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7)、角质形成细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP或肝细胞生长因子样蛋白(HGFLP))、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经调节蛋白(例如，神经调节蛋白1(NRG1)、NRG2、NRG3、NRG4)、神经营养因子(例如，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、NT-4、胎盘生长因子(PGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肾胺酶(RNLS)、T细胞生长因子(TCGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子(例如，转化生长因子α(TGF-α)、TGF-β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)。
在一些实施方案中，治疗性蛋白由选自以下的基因编码：肌营养不良蛋白X-连锁的MTM1(肌管蛋白)、酪氨酸羟化酶、AADC、环水解酶、SMN1、FXN(共济蛋白)、GUCY2D、RS1、CFH、HTRA、ARMS、CFB/CC2、CNGA/CNGB、Prf65、ARSA、PSAP、IDUA(MPS I)、IDS(MPS II)、PAH、GAA(酸性α-葡糖苷酶)、低密度脂蛋白受体、囊性纤维化跨膜电导调节剂、GBA、MECP2、SCN1A、UBE3A、DMPK、FMR1、GJB1、CaMK2、HTT、ATX3、PMP22、CAPN3、DYSF、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、TNN和AN05或其任意组合。在一些方面，治疗性蛋白由人腺苷脱氨酶基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人A1AT基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人血红蛋白(β链)基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人p53基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人ABCD1基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人CHM基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人腺苷酸环化酶6基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人CTFR基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人肌营养不良蛋白(Dystrophin)基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人α-半乳糖苷酶基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人BDNF途径基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人胞嘧啶脱氨酶基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人因子VIII基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人因子IX基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人LDLR基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人亨廷顿蛋白(Huntingtin)基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人脂蛋白脂酶基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人ND4基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人ARSA基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人IDUA基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人IDS基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人SGSH基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人AADC基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人酸性α-葡糖苷酶基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人Colagen C7基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人RPE65基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人SMN1基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人VEGF基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人WAS基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人MTM1基因编码。在一些方面，治疗性蛋白由人RPGR基因编码。
如本文所用，术语“异源的”或“外源的”是指在给定环境中，例如在细胞或多肽中通常不存在的此类分子。例如，外源或异源分子可被引入细胞中，并且仅在细胞操作(例如通过转染或其它形式的基因工程改造)后存在，或者异源氨基酸序列可以存在于天然不存在的蛋白质中。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”是指不与给定的多核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。在一个实施方案中，异源核苷酸序列编码能够延长治疗性蛋白(例如，凝血因子，例如FVIII)半衰期的多肽。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列编码增加治疗性蛋白的流体动力学半径的多肽，例如凝血因子，例如FVIII。在其它实施方案中，异源核苷酸序列编码如下多肽，所述多肽改善治疗性蛋白的一种或多种药代动力学性质，而不显著影响其生物活性或功能(例如促凝血活性)。在一些实施方案中，治疗性蛋白通过接头与异源核苷酸序列编码的多肽连接或联接。由异源核苷酸序列编码的多肽部分的非限制性实例包括免疫球蛋白恒定区或其一部分、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、转铁蛋白、美国专利申请第20100292130号的PAS多肽、HAP序列、转铁蛋白或其片段、人绒毛膜促性腺激素的β亚单位的C端肽(CTP)、白蛋白结合小分子、XTEN序列、FcRn结合部分(例如，与FcRn结合的完整Fc区或其一部分)，单链Fc区(ScFc区，例如，如US 2008/0260738、WO 2008/012543或WO 2008/1439545中所述的)、多聚甘氨酸接头、多聚丝氨酸接头、选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的两种类型的氨基酸的肽和6-40个氨基酸的肽和短多肽(其中二级结构的程度从小于50％变化至大于50％)，等等，或者其两种或更多种组合。在一些实施方案中，由异源核苷酸序列编码的多肽与非多肽部分连接。非多肽部分的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、白蛋白结合小分子、聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任意组合。
如本文所用，术语“Fc区”被定义为对应于天然Ig的Fc区的多肽的一部分，即如通过其的两条重链的各自Fc结构域的二聚缔合所形成的。天然Fc区与另一个Fc区形成同二聚体。相反，如本文所用，术语“遗传融合的Fc区”或“单链Fc区”(scFc区)是指合成的二聚Fc区，其由在单个多肽链内遗传连接的Fc结构域组成(即，编码在单个连续的遗传序列中)。
在一个实施方案中，“Fc区”是指单个Ig重链的一部分，其始于正好在木瓜蛋白酶裂解位点上游的铰链区(即，IgG中的残基216，取重链恒定区的第一个残基为114)并结束于抗体的C端。因此，完整的Fc结构域至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。
取决于Ig同种型，Ig恒定区的Fc区可包括CH2、CH3和CH4结构域以及铰链区。包含Ig的Fc区的嵌合蛋白赋予嵌合蛋白几种所需特性，包括增强的稳定性、延长的血清半衰期(参见Capon等人，1989,Nature 337:525)以及与Fc受体诸如新生儿Fc受体(FcRn)的结合(美国专利第6,086,875号、第6,485,726号、第6,030,613号；WO03/077834；US2003-0235536A1)，所述专利通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指例如疾病或疾患的严重度降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈所述疾病或疾患。该术语还包括疾病或疾患或其症状的防御或预防。
如本文中所用，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指减少或降低特定结果的发生或严重度。在一些实施方案中，通过防御性治疗来实现预防结果。
II.本公开的组合物
本公开的某些方面涉及包含AAV和支架蛋白的EV(例如，外来体)，其中AAV在外来体的腔内。在一些实施方案中，EV包含在腔内的AAV的数量大于在缺少支架蛋白的参考EV的腔内的AAV的数量。在一些方面，所述EV比缺少支架蛋白的EV更可能摄取AAV，例如，在包含或不包含支架蛋白的混合EV群体中，与仅包含在腔内的AAV的EV相比，更高百分比的EV包含在腔内的支架蛋白和AAV。
II.A.细胞外囊泡(EV)
本文所述的EV(例如，外来体)是直径为约20nm至300nm的细胞外囊泡。在某些实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)的直径为约20nm至约290nm、约20nm至约280nm、约20nm至约270nm、约20nm至约260nm,20nm至约250nm、约20nm至约240nm、约20nm至约230nm、约20nm至约220nm、约20nm至约210nm、约20nm至约200nm、约20nm至约190nm、约20nm至约180nm、约20nm至约170nm、约20nm至约160nm、约20nm至约150nm、约20nm至约140nm、约20nm至约130nm、约20nm至约120nm、约20nm至约110nm、约20nm至约100nm、约20nm至约90nm、约20nm至约80nm、约20nm至约70nm、约20nm至约60nm、约20nm至约50nm、约20nm至约40nm、约20nm至约30nm、约30nm至约300nm、约30nm至约290nm、约30nm至约280nm、约30nm至约270nm、约30nm至约260nm、约30nm至约250nm、约30nm至约240nm、约30nm至约230nm、约30nm至约220nm、约30nm至约210nm、约30nm至约200nm、约30nm至约190nm、约30nm至约180nm、约30nm至约170nm、约30nm至约160nm、约30nm至约150nm、约30nm至约140nm、约30nm至约130nm、约30nm至约120nm、约30nm至约110nm、约30nm至约100nm、约30nm至约90nm、约30nm至约80nm、约30nm至约70nm、约30nm至约60nm、约30nm至约50nm、约30nm至约40nm、约40nm至约300nm、约40nm至约290nm、约40nm至约280nm、约40nm至约270nm、约40nm至约260nm、约40nm至约250nm、约40nm至约240nm、约40nm至约230nm、约40nm至约220nm、约40nm至约210nm、约40nm至约200nm、约40nm至约190nm、约40nm至约180nm、约40nm至约170nm、约40nm至约160nm、约40nm至约150nm、约40nm至约140nm、约40nm至约130nm、约40nm至约120nm、约40nm至约110nm、约40nm至约100nm、约40nm至约90nm、约40nm至约80nm、约40nm至约70nm、约40nm至约60nm、约40nm至约50nm、约50nm至约300nm、约50nm至约290nm、约50nm至约280nm、约50nm至约270nm、约50nm至约260nm、约50nm至约250nm、约50nm至约240nm、约50nm至约230nm、约50nm至约220nm、约50nm至约210nm、约50nm至约200nm、约50nm至约190nm、约50nm至约180nm、约50nm至约170nm、约50nm至约160nm、约50nm至约150nm、约50nm至约140nm、约50nm至约130nm、约50nm至约120nm、约50nm至约110nm、约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约300nm、约60nm至约290nm、约60nm至约280nm、约60nm至约270nm、约60nm至约260nm、约60nm至约250nm、约60nm至约240nm、约60nm至约230nm、约60nm至约220nm、约60nm至约210nm、约60nm至约200nm、约60nm至约190nm、约60nm至约180nm、约60nm至约170nm、约60nm至约160nm、约60nm至约150nm、约60nm至约140nm、约60nm至约130nm、约60nm至约120nm、约60nm至约110nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约300nm、约70nm至约290nm、约70nm至约280nm、约70nm至约270nm、约70nm至约260nm、约70nm至约250nm、约70nm至约240nm、约70nm至约230nm、约70nm至约220nm、约70nm至约210nm、约70nm至约200nm、约70nm至约190nm、约70nm至约180nm、约70nm至约170nm、约70nm至约160nm、约70nm至约150nm、约70nm至约140nm、约70nm至约130nm、约70nm至约120nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约300nm、约80nm至约290nm、约80nm至约280nm、约80nm至约270nm、约80nm至约260nm、约80nm至约250nm、约80nm至约240nm、约80nm至约230nm、约80nm至约220nm、约80nm至约210nm、约80nm至约200nm、约80nm至约190nm、约80nm至约180nm、约80nm至约170nm、约80nm至约160nm、约80nm至约150nm、约80nm至约140nm、约80nm至约130nm、约80nm至约120nm、约80nm至约110nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm、约90nm至约300nm、约90nm至约290nm、约90nm至约280nm、约90nm至约270nm、约90nm至约260nm、约90nm至约250nm、约90nm至约240nm、约90nm至约230nm、约90nm至约220nm、约90nm至约210nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约110nm、约90nm至约100nm、约100nm至约300nm、约110nm至约290nm、约120nm至约280nm、约130nm至约270nm、约140nm至约260nm、约150nm至约250nm、约160nm至约240nm、约170nm至约230nm、约180nm至约220nm或约190nm至约210nm。本文所述的EV(例如，外来体)的尺寸可根据下文所述的方法来测量。
本公开的EV(例如，外来体)包含膜(“EV膜”)，所述膜包括外表面(例如，细胞外表面)和内表面(例如，腔表面)。在某些实施方案中，内表面面向EV(例如，外来体)的内核(即，腔)。在某些实施方案中，外表面可以与生产者细胞的内体、多囊体或膜/细胞质接触。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)膜包括双脂质膜，例如脂质双层。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)膜包含脂质和脂肪酸。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)膜包含磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、甾醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)膜包含内小叶和外小叶。内小叶和外小叶的组成可以通过本领域已知的跨双层分布测定来确定，参见，例如，Kuypers等人，BiochemBiophys Acta 1985 819:170。在一些实施方案中，外小叶的组成为约70-90％的胆碱磷脂、约0-15％的酸性磷脂和约5-30％的磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，内小叶的组成为约15-40％的胆碱磷脂、约10-50％的酸性磷脂和约30-60％的磷脂酰乙醇胺。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)膜包含一种或多种多糖，诸如聚糖。
在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包括在EV(例如，外来体)的腔内的一个或多个多层体。在一些实施方案中，本公开的AAV在多层体内。在一些实施方案中，本公开的AAV不在多层体内。
在一些方面，EV包含抑制巨噬细胞摄取EV的表面抗原。在一些方面，表面抗原与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些方面，表面抗原选自CD47、CD24、其片段及其任意组合。在某些方面，表面抗原包括CD47，例如人CD47(UniProtKB-Q08722)。在一些方面，表面抗原包括CD47，例如人CD47的片段。在某些方面，表面抗原包括CD24，例如人CD24。在一些方面，表面抗原包括CD24例如人CD24的片段。
II.A.1.靶向部分
在一些方面，EV(例如，外来体)被进一步修饰以展示附加的蛋白(或其片段)，所述附加的蛋白或其片段可以帮助指导EV摄取(例如，靶向部分)。在某些方面，本文公开的EV(例如，外来体)还包含能够改变EV在体内或体外的分布的靶向部分。在一些方面，靶向部分可以是生物分子，诸如蛋白质、肽、脂质或合成分子。
在一些方面，本公开的靶向部分与树突状细胞的标志物特异性结合。在某些方面，所述标志物仅在树突状细胞上表达。在一些方面，树突状细胞包括祖先(Pre)树突状细胞、炎性单树突状细胞、浆细胞样树突状细胞(pDC)、髓样/常规树突状细胞1(cDC1)、髓样/常规树突状细胞2(cDC2)、炎性单核细胞源性树突状细胞、朗格汉斯细胞、真皮树突状细胞、表达溶菌酶的树突状细胞(LysoDC)、Kupffer细胞、非经典单核细胞或其任意组合。在这些树突状细胞上表达的标志物是本领域已知的。参见，例如，Collin等人，Immunology 154(1):3-20(2018)。在一些方面，靶向部分是蛋白质，其中蛋白质是能够与选自以下的标志物特异性结合的抗体或其片段：DEC205、CLEC9A、CLEC6、DCIR、DC-SIGN、LOX-1、MARCO、Clec12a、Clec10a、DC-无唾液酸糖蛋白受体(DC-ASGPR)、DC免疫受体2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬细胞甘露糖受体(MMR)、BDCA-2(CD303、Clec4c)、Dectin-2、Bst-2(CD317)、Langerin、CD206、CD11b、CD11c、CD123、CD304、XCR1、AXL、Siglec 6、CD209、SIRPA、CX3CR1、GPR182、CD14、CD16、CD32、CD34、CD38、CD10或其任意组合。在一些方面，可用于本公开有用的标志物包括C型凝集素样结构域。在某些方面，标志物是Clec9a，并且树突状细胞是cDC1。
在一些方面，本文公开的靶向部分可与人和小鼠Clec9a(包括其任何变体)两者结合。在一些方面，本公开的靶向部分可与来自其它物种(包括但不限于黑猩猩、恒河猴、狗、牛、马或大鼠)的Clec9a结合。这种Clec9a蛋白的序列是本领域已知的。参见，例如，美国专利第8,426,565B2号，其通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，本公开的靶向部分与T细胞的标志物特异性结合。在某些方面，T细胞是CD4+T细胞。在一些方面，T细胞是CD8+T细胞。
在一些方面，本文公开的靶向部分与肌肉细胞上的标志物特异性结合。在一些方面，肌肉细胞是平滑肌细胞。在一些方面，肌肉细胞是骨骼肌细胞。在一些方面，肌肉细胞是心肌细胞。在一些方面，肌肉细胞上的标志物选自α-平滑肌肌动蛋白、VE-钙粘蛋白、钙调蛋白结合蛋白/CALD1、钙调理蛋白1(calponin 1)、环六亚甲基二乙酰胺诱导蛋白1(hexim1)、组胺H2 R；胃动素R/GPR38、转凝蛋白(transgelin)/TAGLN及其任意组合。在一些方面，肌肉细胞上的标志物选自α-肌聚糖、β-肌聚糖、钙蛋白酶抑制剂、肌酸激酶MM/CKMM、eIF5A、烯醇酶2/神经元特异性烯醇酶、ε-肌聚糖、FABP3/H-FABP、GDF-8/肌抑素(Myostatin)、GDF-11/GDF-8、整联蛋白α7、整联蛋白α7β1、整联蛋白β1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、肌细胞生成素(myogenin)、肌球蛋白轻链激酶抑制剂、NCAM-1/CD56、肌钙蛋白I及其任意组合。在一些方面，肌肉细胞上的标志物是肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链或其组合。
在一些方面，本公开的靶向部分与对靶组织(诸如肝脏、脑、膀胱、肾脏、肺或眼)特异的标志物特异性结合。在一些方面，本公开的靶向部分与肿瘤细胞上表达的标志物特异性结合。在一些方面，EV(例如，外来体)靶向肿瘤细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、许旺细胞、神经元、肝细胞、Kupffer细胞、髓系细胞(myeloid-lineage cell)(例如，嗜中性粒细胞、髓系来源的抑制细胞(MDSC，例如，单核细胞MDSC或粒细胞MDSC)、肌细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血干细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)或其任意组合。在一些方面，EV(例如，外来体)靶向髓系细胞。在一些方面，EV(例如，外来体)靶向巨噬细胞。在某些方面，EV(例如，外来体)靶向肝脏、心脏、肺、脑、肾脏、中枢神经系统、外周神经系统、肌肉、骨、关节、皮肤、肠、膀胱、胰腺、淋巴结、脾脏、血液、骨髓或其任意组合。
在一些方面，本文公开的靶向部分与人CD3蛋白或其片段结合。人CD3蛋白的序列是本领域已知的。
在一些方面，本文公开的靶向部分可与人和小鼠CD3两者(包括其任何变体)结合。在一些方面，本公开的靶向部分可与来自其它物种(包括但不限于黑猩猩、恒河猴、狗、牛、马或大鼠)的CD3结合。这种CD3蛋白的序列也是本领域已知的。
在一些方面，本文公开的靶向部分能够允许表达对靶向部分特异的标志物的细胞(例如CD3：CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；Clec9a：树突状细胞；或肌肉细胞标志物)更多地摄取EV(例如，外来体)。在一些方面，EV的摄取与参考(例如，不具有靶向部分的相应EV或非EV递送媒介物)相比，增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多。在一些方面，参考包括不表达本文公开的靶向部分的EV(例如，外来体)。
本文公开的靶向部分可包含肽、抗体或其抗原结合片段、化合物或其任意组合。
在一些方面，靶向部分是能够与Clec9a特异性结合的肽。参见，例如，Yan等人，Oncotarget 7(26):40437-40450(2016)。例如，在某些方面，所述肽包含Clec9a的可溶性片段。美国专利第9,988,431B2号(其通过引用以其整体并入本文)中描述了这种肽的非限制性实例。在某些方面，所述肽包含Clec9a的配体(天然的或合成的)，诸如在Ahrens等人，Immunity 36(4):635-45(2012)；和Zhang等人，Immunity 36(4):646-57(2012)中描述的那些。包含Clec9a配体的肽的非限制性实例描述于国际公布第WO 2013/053008 A2号(其通过引用以其整体并入本文)中。
在一些方面，靶向部分是能够与CD3特异性结合的肽。例如，在某些方面，所述肽包含CD3的可溶性片段。在某些方面，所述肽包含CD3的配体(天然的或合成的)。
在一些方面，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。在某些方面，靶向部分是单链Fv抗体片段。在某些方面，靶向部分是单链F(ab)抗体片段。在某些方面，靶向部分是纳米抗体。在某些方面，靶向部分是单体。
在一些方面，本文公开的EV(例如，外来体)包含一种或多种(例如，2种、3种、4种、5种或更多种)靶向部分。在某些方面，一种或多种靶向部分与本文公开的其它外源生物活性分子(例如，治疗性分子、佐剂或免疫调节剂)组合表达。在一些方面，一种或多种靶向部分可以在EV(例如，外来体)的外表面上表达。因此，在某些方面，一个或多个靶向部分与EV(例如，外来体)的外表面上的支架部分(例如，支架X)连接。当一个或多个靶向部分与其它外源性生物活性分子(例如，治疗性分子、佐剂或免疫调节剂)组合表达时，所述它外源性生物活性分子可以在EV(例如，外来体)的表面(例如，外表面或腔表面)或腔内表达。
II.B.腺相关病毒(AAV)
本公开的某些方面涉及包含AAV的EV(例如，外来体)，其中AAV存在于EV的腔内。
AAV是细小病毒科的无包膜单链DNA病毒。与细小病毒科的大多数其它成员相反，AAV具有复制缺陷，只能在辅助病毒诸如腺病毒或疱疹病毒存在的情况下高效复制。
AAV在1960年代中期首次被报道为腺病毒病毒制剂的污染物。参见Atchison等人Science 149(3685),754-756(1965)。从那时起，已经开发出越来越安全和更有效的方法来使用AAV作为重组DNA载体。参见，例如，Hermonat和Muzyczka Proc Natl Acad Sci USA.81(20),6466-6470(1984)；Laughlin等人Gene,23(1),65-73(1983)。Matsushita T.等人GeneTher.5(7),938-945(1998)；Xiao等人Journal of Virology.72(3)2224-2232(1998)。据报道，少量的AAV基因组可以整合到宿主染色体中(Cheung等人J.Virol.1980；33:739–748)。AAV在免疫学上不同于任何已知的腺病毒抗原。AAV衣壳含有单链DNA(ssDNA)基因组(Rose等人Proc Natl Acad Sci USA 1969；64:863–869。
AAV具有4.7kb的单链DNA基因组，其编码复制(rep)基因和衣壳(cap)基因，侧接两个ITR。其主要是非整合的，并在非分裂组织中形成稳定的附加体。尽管其在成年人群体中的血清流行率很高，但其与任何人疾病都没有关联。参见
Figure BDA0003414407670000551
M.Virol.J.2,43(2005)。AAV在组织中的稳定表达、其致病性的缺乏以及其易于高滴度生产使其成为非常有吸引力和受欢迎的基因转移平台。
重组AAV是遗传操纵的AAV，其中部分或全部rep和cap基因已被异源序列替代。就像野生型AAV一样，rAAV可以在有丝分裂后组织中触发长期转基因表达，很可能是因为rAAV的重组基因组在细胞核内主要以环状附加体的形式存在。rAAV用于产生rAAV所需的唯一顺式元件是AAV ITR，然而rep、cap和腺病毒辅助基因可以以反式提供。因此，在本文公开的一些实施方案中，rAAV仅包含侧接ITR的转基因DNA，并且该基因组被包封在血清型特异性衣壳内。
AAV具有独特的特征，所述特征使其作为用于向细胞递送外源DNA的载体而具有吸引力。在培养物中对细胞进行AAV感染通常是非细胞病变的，人和其它动物的自然感染是沉默的且无症状。此外，AAV感染了许多不同类型的哺乳动物细胞，使得体内靶向许多不同组织成为可能。AAV还具有额外优势，所述额外优势使其成为特别有吸引力的用于基因递送的病毒系统，包括与其它形式的基因递送相比促进更温和的免疫反应，以及作为非整合载体在分裂和静止细胞中持续表达。此外，AAV经受住了用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使得基于rAAV的疫苗的冷藏变得不那么关键。
AAV转导和AAV基因组进入靶细胞不需要辅助病毒。此外，由于指导AAV复制、基因组封装和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此基因组的内部约4.7kb(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以被外源DNA(诸如包含启动子、目标DNA和多腺苷酸化信号的基因盒)替代，而不会丧失对AAV用作基因治疗剂至关重要的任何功能。
AAV载体可包括在顺式或反式中起作用的附加元件。在特定实施方案中，包括载体基因组的AAV载体也具有一个或多个侧接供体序列的5’或3’端的ITR序列；驱动供体序列转录的表达控制元件(例如，启动子或增强子)，诸如组成型或可调控的控制元件，或组织特异性表达控制元件；内含子序列、填充子或填充子多核苷酸序列；和/或位于供体序列3’的多腺嘌呤序列。
在一些实施方案中，AAV使用辅助病毒进行复制。本领域已知多种此类AAV辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒和痘病毒诸如痘苗病毒。单个腺病毒类型包括许多不同的亚组，尽管最常用的是C亚组的5型腺病毒。人、非人哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒是已知的，并且可以从诸如ATCC的保藏中心获得。疱疹科的病毒包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；其也可从诸如ATCC的保藏中心获得。
在EV产生过程中，形成性EV附近的生产细胞的胞质溶胶中存在的分子被形成性EV天然捕获。因此，同时产生EV和AAV的细胞天然产生一些在EV的腔内具有至少有一个AAV的EV。本公开的某些方面涉及在EV的腔内具有比由成形性EV天然地(例如，被动地)捕获的更多的AAV的EV。在一些实施方案中，EV腔内的AAV的数量高于参考EV腔内的AAV的数量。在一些实施方案中，参考EV包含通过这种天然过程与AAV缔合的AAV。在形成性EV(例如，缺少支架蛋白的参考EV)的腔内天然捕获的AAV的精确数量将会变化。在一些实施方案中，通过这种机制存在于参考EV中的AAV的数量为约1个AAV/EV、约2个AAV/EV、约3个AAV/EV或约4个AAV/EV。在一些实施方案中，参考EV中存在的AAV的数量少于约7个AAV/EV、少于约6个AAV/EV、少于约5个AAV/EV、少于约4个AAV/EV、少于约3个AAV/EV或少于约2个AAV/EV。
在一些实施方案中，本公开的EV腔内的AAV的数量为参考EV腔内的AAV的数量的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些实施方案中，EV中AAV的数量为参考EV的腔内的AAV数量的约2倍至约10倍、约3倍至约10倍、约4倍至约10倍、约5倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、约2倍至约3倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约3倍至约4倍、约4倍至约9倍、约4倍至约8倍、约4倍至约7倍、约4倍至约6倍、约4倍至约5倍、约5倍至约9倍、约5倍至约8倍、约5倍至约7倍或约5倍至约6倍。在一些实施方案中，本公开的EV中的AAV数量为参考EV的腔内的AAV数量的至少约2倍。在一些实施方案中，本公开的EV中的AAV数量为参考EV的腔内的AAV数量的至少约3倍。在一些实施方案中，本公开的EV中的AAV数量为参考EV的腔内的AAV数量的至少约4倍。在一些实施方案中，EV和参考EV的尺寸大致相同。
在一些方面，至少约0.01％至约100％的EV(例如，外来体)包含在外来体的腔内的AAV。在一些方面，至少约0.1％至约100％、至少约1％至约100％、至少约5％至约100％、至少约10％至约100％、至少约15％至约100％、至少约20％至约100％、至少约25％至约100％、至少约30％至约100％、至少约40％至约100％、至少约50％至约100％、至少约60％至约100％、至少约70％至约100％、至少约80％至约100％、至少约90％至约100％的EV(例如，外来体)包含在外来体的腔内的AAV。在一些方面，至少约0.1％、至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％的EV(例如，外来体)包含在外来体的腔内的AAV。
在一些方面，包含不止一个EV的样品中的包含支架部分和EV(例如，外来体)腔内的至少一个AAV分子的EV(例如，外来体)的百分比相对于包含AAV但缺少支架部分的EV(例如，外来体)的百分比增加。在一些方面，至少约0.01％至约100％的EV(例如，外来体)包含在外来体的腔内的AAV和支架部分。在一些方面，至少约0.1％至约100％、至少约1％至约100％、至少约5％至约100％、至少约10％至约100％、至少约15％至约100％、至少约20％至约100％、至少约25％至约100％、至少约30％至约100％、至少约40％至约100％、至少约50％至约100％、至少约60％至约100％、至少约70％至约100％、至少约80％至约100％、至少约90％至约100％的EV(例如，外来体)包含在外来体的腔内的AAV和支架部分。在一些方面，至少约0.1％、至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％的EV(例如，外来体)包含在外来体的腔内的AAV和支架部分。
在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约2个AAV、至少约3个AAV、至少约4个AAV、至少约5个AAV、至少约6个AAV、至少约7个AAV、至少约8个AAV、至少约9个AAV、至少约10个AAV、至少约11个AAV、至少约12个AAV、至少约13个AAV、至少约14个AAV、至少约15个AAV、至少约16个AAV、至少约17个AAV、至少约18个AAV、至少约19个AAV、至少约20个AAV、至少约21个AAV、至少约22个AAV、至少约23个AAV、至少约24个AAV、至少约25个AAV、至少约26个AAV、至少约27个AAV、至少约28个AAV、至少约29个AAV、至少约30个AAV、至少约35个AAV、至少约40个AAV、至少约45个AAV、至少约50个AAV、至少约60个AAV、至少约70个AAV、至少约80个AAV、至少约90个AAV、至少约100个AAV、至少约150个AAV、至少约200个AAV、至少约250AAV、至少约300个AAV、至少约350个AAV、至少约400个AAV、至少约450个AAV或至少约500个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约600个AAV、至少约700个AAV、至少约800个AAV、至少约900个AAV或至少约1000个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约5个AAV至至少约1000个AAV、至少约5个AAV至至少约900个AAV、至少约5个AAV至至少约800个AAV、至少约5个AAV至至少约700个AAV、至少约5个AAV至至少约600个AAV、至少约5个AAV至至少约500个AAV、至少约5个AAV至至少约400个AAV、至少约5个AAV至至少约300个AAV、至少约5个AAV至至少约200个AAV、至少约5个AAV至至少约100个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约10个AAV至至少约1000个AAV、至少约10个AAV至至少约900个AAV、至少约10个AAV至至少约800个AAV、至少约10个AAV至至少约700个AAV、至少约10个AAV至至少约600个AAV、至少约10个AAV至至少约500个AAV、至少约10个AAV至至少约400个AAV、至少约10个AAV至至少约300个AAV、至少约10个AAV至至少约200个AAV、至少约10个AAV至至少约100个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约100个AAV至至少约1000个AAV、至少约100个AAV至至少约900个AAV、至少约100个AAV至至少约800个AAV、至少约100个AAV至至少约700个AAV、至少约100个AAV至至少约600个AAV、至少约100个AAV至至少约500个AAV、至少约100个AAV至至少约400个AAV、至少约100个AAV至至少约300个AAV或至少约100个AAV至至少约200个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约10个AAV至至少约20个AAV、至少约10个AAV至至少约30个AAV、至少约10个AAV至至少约40个AAV、至少约10个AAV至至少约50个AAV、至少约10个AAV至至少约60个AAV、至少约10个AAV至至少约70个AAV、至少约10个AAV至至少约80个AAV或至少约10个AAV至至少约90个AAV。
在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约5个AAV至至少约75个AAV、至少约5个AAV至至少约50个AAV、至少约5个AAV至至少约45个AAV、至少约5个AAV至至少约40个AAV、至少约5个AAV至至少约35个AAV、至少约5个AAV至至少约30个AAV、至少约5个AAV至至少约25个AAV、至少约5个AAV至至少约20个AAV、至少约5个AAV至至少约15个AAV、至少约5个AAV至至少约10个AAV、至少约10个AAV至至少约100个AAV、至少约10个AAV至至少约75个AAV、至少约10个AAV至至少约50个AAV、至少约5个AAV至至少约45个AAV、至少约10个AAV至至少约40个AAV、至少约10个AAV至至少约35个AAV、至少约10个AAV至至少约30个AAV、至少约10个AAV至至少约25个AAV、至少约10个AAV至至少约20个AAV或至少约10个AAV至至少约15个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约5至至少约20个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约5至至少约10个AAV。
在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约4个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约5个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约6个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约7个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约8个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约9个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约10个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约11个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约12个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约13个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约14个AAV。在一些实施方案中，EV包含在EV的腔内的至少约15个AAV。
在一些实施方案中，与不用支架蛋白制备的参考EV相比，本公开的EV以更均一的方式(例如，EV中的AAV的数量)含有在EV中的AAV。在一些实施方案中，本公开的EV含有在EV中的约5个至约10个、约6个至约10个、约7个至约10个、约8个至约10个AAV，而参考EV中的AAV的数量可以从0变化至5。在其它实施方案中，本公开的EV可通过使用本文公开的支架蛋白来控制EV中的AAV的数量。例如，支架蛋白的使用使得当EV从细胞中产生时，AAV能够附接在EV的腔表面中，并在损伤部位或靶标部位与EV脱离。在其它实施方案中，支架蛋白(例如，化学诱导的二聚体配偶体)的使用使得当EV从细胞中产生时，AAV能够附接在EV的腔表面中，并且在化学物质从EV中去除后，AAV能够与EV脱离。因此，本公开的EV允许在EV中高效且均匀地装载AAV。
本公开的某些方面涉及包含AAV和支架蛋白的EV(例如，外来体)，其中AAV蛋白与EV的外表面缔合。在一些实施方案中，本公开的EV包含以比将AAV(例如，作为腔有效载荷)与EV缔合的其它方法更均匀的方式与AAV的表面缔合的AAV。在一些实施方案中，能够与EV表面缔合的AAV比能够装载在AAV腔内的AAV多，这增加了能够被递送至受试者的AAV数量。在一些实施方案中，至少约100个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约200个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约300个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约400个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约500个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约600个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约700个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约800个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约900个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1000个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1100个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1200个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1300个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1400个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1500个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1600个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1700个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1800个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1900个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约2000个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1至至少约2000个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1至至少约1000个AAV与EV(例如，外来体)的外表面缔合。在一些实施方案中，至少约1至至少约900个AAV、至少约1至至少约800个AAV、至少约1至至少约700个AAV、至少约1至至少约600个AAV、至少约1至至少约500个AAV、至少约1至至少约450个AAV、至少约1至至少约400个AAV、至少约1至至少约350个AAV、至少约1至至少约325个AAV、至少约1至至少约300个AAV、至少约1至至少约275个AAV、至少约1至至少约250个AAV、至少约1至至少约225个AAV、至少约1至至少约200个AAV、至少约1至至少约175个AAV、至少约1至至少约150个AAV、至少约1至至少约125个AAV、至少约1至至少约100个AAV、至少约1至至少约90个AAV、至少约1至至少约80个AAV、至少约1至至少约70个AAV、至少约1至至少约60个AAV、至少约1至至少约50个AAV、至少约1至至少约45个AAV、至少约1至至少约40个AAV、至少约1至至少约35个AAV、至少约1至至少约30个AAV、至少约1至至少约25个AAV、至少约1至至少约20个AAV、至少约1至至少约15个AAV、至少约1至至少约14个AAV、至少约1至至少约13个AAV、至少约1至至少约12个AAV、至少约1至至少约11个AAV、至少约1至至少约10个AAV、至少约10至至少约500个AAV、至少约10至至少约450个AAV、至少约10至至少约400个AAV、至少约10至至少约350个AAV、至少约10至至少约325个AAV、至少约10至至少约300个AAV、至少约10至至少约275个AAV、至少约10至至少约250个AAV、至少约10至至少约225个AAV、至少约10至至少约200个AAV、至少约10至至少约175个AAV、至少约10至至少约150个AAV、至少约10至至少约125个AAV、至少约10至至少约100个AAV、至少约10至至少约90个AAV、至少约10至至少约80个AAV、至少约10至至少约70个AAV、至少约10至至少约60个AAV、至少约10至至少约50个AAV、至少约10至至少约45个AAV、至少约10至至少约40个AAV、至少约10至至少约35个AAV、至少约10至至少约30个AAV、至少约10至至少约25个AAV、至少约10至至少约20个AAV、至少约100至至少约1000个AAV、至少约100至至少约900个AAV、至少约100至至少约800个AAV、至少约100至至少约700个AAV、至少约100至至少约600个AAV、至少约100至至少约500个AAV、至少约100至至少约400个AAV、至少约100至至少约300个AAV、至少约100至至少约200个AAV与EV的外表面缔合。
本领域已知的任何AAV都可用于本公开的组合物。在一些实施方案中，AAV选自由以下组成的组：AAV 1型、AAV 2型、AAV 3A型、AAV 3B型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、Rh10、Rh74、AAV-2i8、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、合成AAV及其任意组合。在某些实施方案中，AAV是AAV 2型，例如AAV2。在某些实施方案中，AAV是AAV 3A型，例如AAV3A。在某些实施方案中，AAV是AAV 3B型，例如AAV3B。在某些实施方案中，AAV是AAV 4型，例如AAV4。在某些实施方案中，AAV是AAV 5型，例如AAV5。在某些实施方案中，AAV是AAV 6型，例如AAV6。在某些实施方案中，AAV是AAV 7型，例如AAV7。在某些实施方案中，AAV是AAV 8型，例如AAV8。在某些实施方案中，AAV是AAV 9型，例如AAV9。在某些实施方案中，AAV是AAV 10型，例如AAV10。在某些实施方案中，AAV是合成AAV。
在一些方面，AAV具有独特的组织靶向能力(例如，组织向性)。在一些实施方案中，与非变体亲本衣壳多肽相比，AAV在一种或多种人干细胞类型中进一步表现出增强的转导或向性。在一些实施方案中，人干细胞类型包括但不限于胚胎干细胞、成体组织干细胞(即，体细胞干细胞)、骨髓、祖细胞、诱导的多能干细胞和重编程干细胞。在一些实施方案中，成体干细胞可包括类器官干细胞(即，来源于体内任何目标器官或器官系统的干细胞)。在一些实施方案中，AAV的靶组织是性腺、隔膜、心脏、胃、肝脏、脾脏、胰腺或肾脏。在一些实施方案中，AAV的身体靶器官包括但不限于皮肤、毛发、指甲、感觉感受器、汗腺、油腺、骨骼、肌肉、大脑、脊髓、神经、垂体腺、松果腺、下丘脑、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、胰腺(胰岛组织)、心脏、血管、淋巴结、淋巴管、胸腺、脾脏、扁桃体、鼻子、咽、喉、气管、支气管、肺、嘴、咽、食管、胃、小肠、大肠、直肠、肛管、牙齿、唾液腺、舌、肝脏、胆囊、胰腺、阑尾、肾脏、输尿管、泌尿膀胱、尿道、睾丸、输精管(vas)、尿道、前列腺、阴茎、阴囊、卵巢、子宫、子宫(输卵管)、阴道、外阴和乳腺(乳房)。身体的器官系统包括但不限于外皮系统(integumentarysystem)、骨骼系统、肌肉系统、神经系统、内分泌系统、心血管系统、淋巴系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统和生殖系统。在一些实施方案中，转导和/或向性增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。在一些实施方案中，转导和/或向性增加至少约5％至至少约80％，至少约10％至至少约70％，至少约20％至至少约60％，或至少约30％至至少约60％。
在一些方面，如本文所公开的，与不与EV缔合的AAV相比，本公开的AAV具有一种或多种改变的特性。在一些实施方案中，改变的特性包括比单独的AAV更好的治疗效果。在一些实施方案中，更好的治疗效果包括改善的免疫逃避、改善的再给药能力、改善的滴定剂量的能力或其任意组合。在一些实施方案中，本公开的AAV不太可能诱发受试者的免疫反应。特别地，这允许将本公开的AAV施用于具有预先存在的中和抗体的受试者。在一些实施方案中，如本文所公开的，与不与EV缔合的AAV相比，本公开的AAV引发更快的摄取和/或改善的转导动力学。
II.B.1.AAV融合构建体
在一些实施方案中，AAV与本文所述的支架蛋白连接。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的蛋白连接。在一些方面，EV(例如，外来体)包含AAV和支架蛋白，其中AAV与外来体的腔表面缔合。
在一些方面，EV(例如，外来体)包含AAV和支架蛋白，其中AAV与外来体的外表面缔合。在一些实施方案中，支架蛋白包含外部结构域(external domain)，例如位于EV膜外部的结构域，其中AAV与支架蛋白的外部结构域缔合。在一些实施方案中，支架蛋白还包含跨膜区，其中该跨膜区锚定至EV的膜。
AAV可以直接或间接与支架蛋白缔合。在一些实施方案中，AAV通过一个或多个共价键与支架蛋白缔合。在其它实施方案中，AAV通过一种或多种非共价相互作用与支架蛋白缔合。
在某些实施方案中，支架蛋白与AAV之间的缔合在支架蛋白与AAV的蛋白之间。
AAV的单链基因组包括三个基因，rep(复制)、cap(衣壳)和aap(组装)。这三个基因通过使用三个启动子、替代的翻译起始位点和差异剪接产生至少九种基因产物，包括三种衣壳蛋白。
Cap基因表达产生病毒衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)，其形成保护病毒基因组的外部衣壳，并积极参与细胞结合和内化。据估计，病毒外壳由60个排列成二十面体结构的蛋白质组成。在一些实施方案中，AAV衣壳由60个拷贝的比例为1:1:10的3种蛋白VP1、VP2和VP3组成，例如5个VP1蛋白、5个VP2蛋白和50个VP3蛋白。
rep基因编码病毒基因组复制和包装所需的四种蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)。aap基因在与cap基因重叠的交替阅读框中编码组装激活蛋白(AAP)。这种核蛋白被认为为衣壳组装提供了支架功能，并在一些AAV血清型中在VP蛋白的核仁定位中起作用。
在一些实施方案中，rep、cap或aap基因中的一个或多个基因是天然存在的，例如rep、cap或aap基因包含全部或部分细小病毒的rep、cap或aap基因。在一些实施方案中，rep、cap或aap基因中的一个或多个包含合成序列。
在一个实施方案中，rep基因包含合成序列。在一个实施方案中，cap基因包含合成序列。在一个实施方案中，aap基因包含合成序列。在一个实施方案中，rep和cap基因包含合成序列。在一个实施方案中，rep和aap基因包含合成序列。在一个实施方案中，cap和aap基因包含合成序列。在一个实施方案中，rep、cap和aap基因包含合成序列。
在一些实施方案中，rep来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其任意组合的AAV基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV1基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV2基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV3基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV4基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV5基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV6基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV7基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV8基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV9基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV10基因组。在特定的实施方案中，rep来自AAV11基因组。
在一些实施方案中，cap来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其任意组合的AAV基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV1基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV2基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV3基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV4基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV5基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV6基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV7基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV8基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV9基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV10基因组。在特定的实施方案中，cap来自AAV11基因组。
在一些实施方案中，aap来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其任意组合的AAV基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV1基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV2基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV3基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV4基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV5基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV6基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV7基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV8基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV9基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV10基因组。在特定的实施方案中，aap来自AAV11基因组。
应当理解，本文描述的特定AAV基因组可以具有来自不同AAV基因组(例如，来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11的基因组)的基因。因此，本文公开了包含rep、cap或aap的任何可能排列的AAV。
在本文公开的一些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因、cap基因和aap基因中的一个或多个。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因。在一些实施方案中，rAAV缺少cap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少aap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因并且缺少cap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因并且缺少aap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少cap基因并且缺少aap基因。在一些实施方案中，rAAV缺少rep基因、cap基因和aap基因。
在本文公开的一些实施方案中，rAAV被修饰，使得rep基因、cap基因和aap基因中的一个或多个被突变，使得一个或多个AAV基因的表达被修饰。在一些实施方案中，rep基因被突变。在一些实施方案中，cap基因被突变。在一些实施方案中，aap基因被突变。在一些实施方案中，rep基因和cap基因被突变。在一些实施方案中，rep基因和aap基因被突变。在一些实施方案中，cap基因和aap基因被突变。在一些实施方案中，cap基因、rep基因和aap基因被突变。
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的衣壳蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少一个VP1蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的5个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的4个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的3个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的2个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的VP1蛋白中的一个连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含一个不与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少一个VP2蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的5个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的4个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的3个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的2个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的VP2蛋白中的一个连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含一个不与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少一个VP3蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的每个VP3蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的一个亚组的VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约40个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约35个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约30个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约25个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约20个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约15个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约10个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约9个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约8个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约7个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约6个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约5个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约4个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约3个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的至少约2个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与AAV的VP3蛋白中的一个连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含至少1个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少2个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少3个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少4个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少5个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少10个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少15个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少20个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少25个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少30个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少35个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少40个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少45个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。
在一些实施方案中，与支架蛋白连接或缔合的VP3的数量比至少一个不与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白的数量少至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍。
在某些实施方案中，AAV包含1个与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与支架蛋白连接或缔合的VP2蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与支架蛋白连接或缔合的VP1蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与支架蛋白连接或缔合的VP3蛋白。
在一些实施方案中，支架蛋白通过一个或多个肽键与AAV，例如AAV的衣壳蛋白连接。支架蛋白可以在衣壳蛋白的N端或C端处或者在衣壳蛋白的N端与C端之间与AAV衣壳蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白与衣壳蛋白的N端连接或缔合。在其他实施方案中，支架蛋白与衣壳蛋白的C端连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白的N端与AAV的衣壳蛋白的C端连接。在其它实施方案中，支架蛋白的C端与AAV的衣壳蛋白的N端连接。
支架蛋白可以直接或间接(例如，通过接头)与AAV的衣壳蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，支架蛋白通过接头与衣壳蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头是可裂解的接头。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是刚性接头。在某些实施方案中，接头是至少约2个氨基酸、至少约3个氨基酸、至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或至少约50个氨基酸。
本公开的某些方面涉及包含AAV和支架蛋白的EV，其中AAV与化学诱导的二聚体的结合配偶体或二聚剂连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的衣壳蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少一个VP1蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的5个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的4个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的3个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的2个VP1蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的VP1蛋白中的一个连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含一个不与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。
在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少一个VP2蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的5个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的4个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的3个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的2个VP2蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的VP2蛋白中的一个连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含一个不与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。
在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少一个VP3蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的一个亚组的VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约40个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约35个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约30个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约25个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约20个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约15个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约10个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约9个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约8个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约7个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约6个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约5个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约4个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约3个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的至少约2个VP3蛋白中的每一个连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与AAV的VP3蛋白中的1个连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含至少约1个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约2个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约3个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约4个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约5个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约10个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约15个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约20个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约25个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约30个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约35个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约40个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约45个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。
在一些实施方案中，与结合配偶体连接或缔合的VP3的数量比至少一个不与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白的数量少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约20倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍。
在某些实施方案中，AAV包含1个与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与结合配偶体连接或缔合的VP2蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与结合配偶体连接或缔合的VP1蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与结合配偶体连接或缔合的VP3蛋白。
在一些实施方案中，结合配偶体与衣壳蛋白的N端连接或缔合。在其它实施方案中，结合配偶体与衣壳蛋白的C端连接或缔合。在其它实施方案中，结合配偶体被插入衣壳蛋白内，例如，在衣壳蛋白的N端与N端之间。在一些实施方案中，结合配偶体被插入衣壳蛋白内。在某些实施方案中，结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内、内环内，例如形成在衣壳蛋白表面上的环结构的一系列氨基酸内。在某些实施方案中，结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内，紧接在氨基酸455(相对于SEQ ID NO:44的编号)的下游。在一些实施方案中，通过替换Gly453(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Thr454(相对于SEQID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Thr455(相对于SEQ ID NO:44的编号)，结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些方面，通过替换Thr456(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Gln457(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Ser458(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Arg459(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换453GTTTQSR459(相对于SEQ ID NO:44的编号)，结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内，或者被插入其它AAV血清型的VP蛋白的同源区域内。在特定的实施方案中，通过替换Thr455(相对于SEQ ID NO:44的编号)，结合配偶体被插入至少一个VP3蛋白内。在特定的实施方案中，通过替换453GTTTQSR459(相对于SEQ ID NO:44的编号)，结合配偶体被插入至少一个VP3蛋白中，或者被插入其它AAV血清型的VP蛋白的同源区域中。在一些方面，相对于AAV2的VP2的氨基酸序列，第一结合配偶体在选自Arg585、Arg587和Arg588或其任意组合的位点处被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些方面，修饰衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3以包含内部肉豆蔻酰化位点。在一些方面，修饰衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3以在内表面环内包含内部肉豆蔻酰化位点。
结合配偶体可直接或间接(例如，通过接头)与AAV的衣壳蛋白连接或缔合。在一些实施方案中，结合配偶体通过接头与衣壳连接或缔合。在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头是可裂解的接头。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是刚性接头。在某些实施方案中，接头是至少约2个氨基酸、至少约3个氨基酸、至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或至少约50个氨基酸。
在一些实施方案中，与AAV衣壳蛋白连接或缔合的结合配偶体选自化学诱导的二聚体的一种结合配偶体，所述化学诱导的二聚体选自由以下组成的组：(i)FKBP和FKBP(FK1012)；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶A(CNA)(FK506)；(iii)FKBP和CyP-Fas(FKCsA)；(iv)FKBP和FRB(雷帕霉素)；(v)GyrB和GyrB(香豆霉素)；(vi)GAI和GID1(赤霉素)；(vii)Snap-tag和HaloTag(HaXS)；(viii)eDHFR和HaloTag(TMP-HTag)；以及(ix)BCL-xL和Fab(AZ1)(ABT-737)。在某些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FKBP连接或缔合。在某些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FRB连接或缔合。在一些实施方案中，FRB是mTOR的FRB。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与钙调神经磷酸酶A连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与CyP-Fas连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GyrB连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与CyP-Fas连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GAI连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GID1连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GAI连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与Snap-tag连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与HaloTag连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GAI连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与eDHFR连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与BCL-xL连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与eDHFR连接或缔合。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与Fab连接或缔合。
在特定实施方案中，AAV包含至少一个与FRB连接或缔合的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其中FRB与衣壳蛋白的N端连接或缔合。在一些实施方案中，AAV包含至少一个与FRB连接或缔合的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其中FRB与衣壳蛋白的C端连接或缔合。在特定实施方案中，AAV包含至少一个与FRB连接或缔合的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其中FRB被插入衣壳蛋白内。在一些实施方案中，FRB在本文公开的任何位置被插入衣壳蛋白中。
II.B.2.AAV核酸分子
本公开的某些方面涉及包含AAV的EV，其中AAV包含基因盒，例如编码目标基因的异源序列。在一些实施方案中，基因盒编码治疗性蛋白。在一些实施方案中，基因盒编码选自由以下组成的组的蛋白：凝血因子、生长因子、细胞因子、趋化因子或其任意组合。在一些实施方案中，目标基因编码抗氧化剂。在一些实施方案中，目标基因编码酶。在一些实施方案中，目标基因编码肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，目标基因编码DNA修复蛋白。在一些实施方案中，目标基因编码结构蛋白。在一些实施方案中，目标基因编码低密度脂蛋白受体(LDLR)。在一些实施方案中，目标基因编码α葡糖苷酶。在一些实施方案中，目标基因编码囊性纤维化跨膜传导调节因子。
II.B.2.a.治疗性蛋白
在一些实施方案中，基因盒编码一种治疗性蛋白。在一些实施方案中，基因盒编码不止一种治疗性蛋白。在一些实施方案中，基因盒编码两个或更多个拷贝的相同治疗性蛋白。在一些实施方案中，基因盒编码相同治疗性蛋白的两种或更多种变体。在一些实施方案中，基因盒编码两种或更多种不同的治疗性蛋白。
在一些实施方案中，EV与至少两个AAV缔合，其中至少两个AAV中的每一个包含不同的基因盒，其中不同的基因盒中的每一个编码不同的治疗性蛋白。在一些实施方案中，EV与至少三个AAV、至少四个AAV或至少五个AAV缔合。
在一些实施方案中，治疗性蛋白包含凝血因子。在一些实施方案中，凝血因子选自由以下组成的组：FI、FII、FIII、FIV、FV、FVI、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII)、VWF、前激肽释放酶、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI2)、其任何酶原、其任何活性形式，及其任意组合。在一个实施方案中，凝血因子包括FVIII或其变体或片段。在另一个实施方案中，凝血因子包括FIX或其变体或片段。在另一个实施方案中，凝血因子包括FVII或其变体或片段。在另一个实施方案中，凝血因子包括VWF或其变体或片段。
II.B.2.a.i.因子VIII
除非另有说明，否则如本文所用，“因子VIII”在整个本申请中缩写为“FVIII”，意指凝血作用正常的功能性FVIII多肽。因此，术语FVIII包括具有功能的变体多肽。“FVIII蛋白”可与FVIII多肽(或蛋白)或FVIII互换使用。FVIII功能的实例包括，但不限于，激活凝血的能力，作为因子IX的辅因子的能力，或在Ca2+和磷脂存在下与因子IX形成液化酶(tenase)复合物，然后将因子X转化为活化形式Xa的能力。FVIII蛋白可以是人、猪、犬、大鼠或鼠FVIII蛋白。此外，对来自人与其它物种的FVIII之间的比较已经鉴定了对于功能可能需要的保守残基(Cameron等人，Thromb.Haemost.79:317-22(1998)；US 6,251,632)。全长多肽和多核苷酸序列是已知的，许多功能片段、突变体和修饰形式也是已知的。各种FVIII氨基酸和核苷酸序列公开在例如美国公布第2015/0158929 A1号、第2014/0308280 A1号和第2014/0370035 A1号以及国际公布第WO 2015/106052 A1号中。FVIII多肽包括，例如，全长FVIII、除去N端处的Met的全长FVIII、成熟FVIII(除去信号序列)、具有N端处的附加的Met的成熟FVIII和/或具有B结构域的完全或部分缺失的FVIII。FVIII变体包括B结构域缺失，无论是部分缺失还是完全缺失。
在一些实施方案中，基因盒包含编码FVIII多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列是密码子优化的。在某些实施方案中，基因盒包含国际申请公布第WO 2019/032898号、第WO/2017/136358号或第WO2017/136358号或美国公布申请第2015-0361158号中公开的核苷酸序，所述申请公布通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，基因盒包含编码FVIII多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化的核苷酸序列编码全长FVIII多肽。在其它实施方案中，密码子优化的核苷酸序列编码B结构域缺失(BDD)的FVIII多肽，其中FVIII的全部或部分B结构域被缺失。
II.B.2.a.ii.因子IX
在一些实施方案中，治疗性蛋白包含FIX多肽。在一些实施方案中，所述FIX多肽包含FIX或其变体或片段，其中所述FIX或其变体或片段具有FIX活性。
人FIX是丝氨酸蛋白酶，其为凝血级联固有途径的重要组分。如本文所用，“因子IX”或“FIX”是指凝血因子蛋白及其种类和序列变体，并且包括但不限于人FIX前体多肽(“prepro”)的461个氨基酸的单链氨基酸序列、成熟的人FIX的415个氨基酸的单链氨基酸序列和R338L FIX(Padua)变体。FIX包括具有凝血FIX的典型特征的任何形式的FIX分子(参见，例如，Choo等人，Nature 299:178-180(1982)；Fair等人，Blood 64:194-204(1984)；和Kurachi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.79:6461-6464(1982)；US 7,939,632，其中的每一篇文献均通过引用以其整体并入本文。
本领域已知许多功能性FIX变体。国际公布第WO 02/040544 A3号在第4页第9-30行和第15页第6-31行中公开了对肝素抑制表现出增强的抗性的突变体。国际公布第WO 03/020764 A2号在表2和表3(第14-24页)和第12页第1-27行中公开了具有降低的T细胞免疫原性的FIX突变体。国际公布第WO 2007/149406 A2号在第4页第1行至第19页第11行中公开了功能性突变FIX分子，其表现出增强的蛋白质稳定性、延长的体内和体外半衰期以及增强的对蛋白酶的抗性。WO 2007/149406 A2还在第19页第12行至第20页第9行公开了嵌合和其它变体FIX分子。国际公布第WO 08/118507 A2号在第5页第14行至第6页第5行中公开了表现出增强的凝血活性的FIX突变体。国际公布第WO 09/051717 A2号在第9页第11行至第20页第2行中公开了具有增加数量的N-连接和/或O-连接糖基化位点的FIX突变体，所述增加的糖基化位点导致延长的半衰期和/或增加的回收。国际公布第WO 09/137254 A2号还在第2页第[006]段至第5页第[011]段以及第16页第[044]段至第24页第[057]段中公开了糖基化位点数量增加的因子IX突变体。国际公布第WO 09/130198 A2号在第4页第26行至第12页第6行中公开了糖基化位点数量增加的功能突变FIX分子，所述糖基化数量增加导致半衰期处长。国际公布第WO 09/140015 A2号在第11页第[0043]段至第13页第[0053]段中公开了功能性FIX突变体，其Cys残基数量增加，可用于聚合物(例如，PEG)缀合。2011年7月11日提交并于2012年1月12日作为WO 2012/006624公布的国际申请第PCT/US2011/043569号中描述的FIX多肽也通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，FIX多肽包括与白蛋白融合的FIX多肽，例如FIX-白蛋白。在某些实施方案中，FIX多肽是
Figure BDA0003414407670000821
或rIX-FP。
在一些实施方案中，FIX选自美国专利第7,404,956号、第9,062,299号或第9,670,475号、美国公布申请第2015-0252345号、第2016-0000888号或第2017-0260516号或国际公布第WO/2017/024060号中公开的FIX。
II.B.2.a.iv.生长因子
在一些实施方案中，治疗性蛋白包括生长因子。生长因子可选自本领域已知的任何生长因子。在一些实施方案中，生长因子是激素。在其他实施方案中，生长因子是细胞因子。在一些实施方案中，生长因子是趋化因子。
在一些实施方案中，生长因子是肾上腺髓质素(AM)。在一些实施方案中，生长因子是血管生成素(Ang)。在一些实施方案中，生长因子是自分泌运动因子。在一些实施方案中，生长因子是骨形态发生蛋白(BMP)。在一些实施方案中，BMP选自BMP2、BMP4、BMP5和BMP7。在一些实施方案中，生长因子是睫状神经营养因子家族成员。在一些实施方案中，睫状神经营养因子家族成员选自睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL-6)。在一些实施方案中，生长因子是集落刺激因子。在一些实施方案中，集落刺激因子选自巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，生长因子是表皮生长因子(EGF)。在一些实施方案中，生长因子是肝配蛋白。在一些实施方案中，所述肝配蛋白选自肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2和肝配蛋白B3。在一些实施方案中，生长因子是促红细胞生成素(EPO)。在一些实施方案中，生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些实施方案中，FGF选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。在一些实施方案中，生长因子是胎牛生长激素(FBS)。在一些实施方案中，生长因子是GDNF家族成员。在一些实施方案中，GDNF家族成员选自神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(neurturin)、persephin和artemin。在一些实施方案中，生长因子是生长分化因子-9(GDF9)。在一些实施方案中，生长因子是肝细胞生长因子(HGF)。在一些实施方案中，生长因子是肝癌来源的生长因子(HDGF)。在一些实施方案中，生长因子是胰岛素。在一些实施方案中，生长因子是胰岛素样生长因子。在一些实施方案中，胰岛素样生长因子是胰岛素样生长因子-1(IGF-1)或IGF-2。在一些实施方案中，生长因子是白细胞介素(IL)。在一些实施方案中，IL选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。在一些实施方案中，生长因子是角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些实施方案中，生长因子是迁移刺激因子(MSF)。在一些实施方案中，生长因子是巨噬细胞刺激蛋白(MSP或肝细胞生长因子样蛋白(HGFLP))。在一些实施方案中，生长因子是肌肉生长抑制素(GDF-8)。在一些实施方案中，生长因子是神经调节蛋白。在一些实施方案中，神经调节蛋白选自神经调节蛋白1(NRG1)、NRG2、NRG3和NRG4。在一些实施方案中，生长因子是神经营养因子。在一些实施方案中，生长因子是脑源性神经营养因子(BDNF)。在一些实施方案中，生长因子是神经生长因子(NGF)。在一些实施方案中，NGF是神经营养因子-3(NT-3)或NT-4。在一些实施方案中，生长因子是胎盘生长因子(PGF)。在一些实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一些实施方案中，生长因子是肾胺酶(renalase)(RNLS)。在一些实施方案中，生长因子是T细胞生长因子(TCGF)。在一些实施方案中，生长因子是促血小板生成素(TPO)。在一些实施方案中，生长因子是转化生长因子。在一些实施方案中，转化生长因子是转化生长因子α(TGF-α)或TGF-β。在一些实施方案中，生长因子是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。在一些实施方案中，生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。
在某些实施方案中，治疗性蛋白包含Rab香叶基香叶基转移酶(GGT酶)复合物的亚单位。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含Rab蛋白GGT酶组分A1(REP1)。在一些实施方案中，REP1包含与SEQ ID NO:45具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。REP1缺乏与脉络膜缺失症(Choroideremia)(CHM)(一种罕见的眼的脉络膜、视网膜色素上皮和眼睛光感受器的X连锁进行性变性)相关联。患病男性的典型自然史是在青少年时期开始出现夜盲症，然后在20余岁和30余岁期间逐渐丧失周边视觉，导致40余岁完全失明。女性携带者有轻微症状，最明显的是夜盲症，但偶尔会有更严重的表型。
表1.REP1氨基酸序列(SEQ ID NO:45)
Figure BDA0003414407670000841
所述疾病是由位于X染色体21q区上的REP1基因(Rab护送蛋白1)突变而引起的。在身体中的大多数细胞中，与REP1具有75％同源性的REP2蛋白弥补了REP1的缺乏。然而，在眼中，由于尚不清楚的原因，REP2不能补偿REP1的缺乏。因此，在眼中，REP多肽活性不足以维持靶蛋白(Rab GTP酶)的正常异戊烯化，导致细胞功能障碍和最终死亡，主要影响外层视网膜和脉络膜。
II.B.2.b.AAV序列
在某些实施方案中，AAV还包括第一ITR，例如5’ITR，和第二ITR，例如3’ITR。典型地，ITR参与细小病毒(例如，AAV)的DNA复制和拯救，或从原核质粒中切除(Samulski等人，1983，1987；Senapathy等人，1984；Gottlieb和Muzyczka,1988)。另外，据报道，ITR是AAV原病毒整合和将AAV DNA包装进病毒粒子所需的最小序列(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989)。这些元件对于细小病毒基因组的高效增殖是必不可少的。
在一些实施方案中，ITR包括天然存在的ITR，例如，ITR包括细小病毒属ITR的全部或一部分。在一些实施方案中，ITR包括合成序列。在一个实施方案中，第一ITR或第二ITR包括合成序列。在另一个实施方案中，第一ITR和第二ITR中的每一个都包括合成序列。在一些实施方案中，第一ITR或第二ITR包括自然存在的序列。在另一个实施方案中，第一ITR和第二ITR中的每一个都包括自然存在的序列。
在一些实施方案中，ITR包括来自AAV基因组的ITR。在一些实施方案中，ITR是选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其任意组合的AAV基因组的ITR。在一个特定的实施方案中，ITR是AAV2基因组的ITR。在某些实施方案中，ITR是AAV2的ITR，并且衣壳蛋白是AAV5的衣壳蛋白。在另一个实施方案中，ITR是经遗传工程改造以在其5’和3’末端包含来源于一个或多个AAV基因组的ITR或其片段的合成序列。在一些实施方案中，ITR来源于同一基因组，例如来自同一病毒的基因组，或者来自不同的基因组，例如来自两种或更多种不同AAV基因组的基因组。在某些实施方案中，ITR来源于同一AAV基因组。在具体实施方案中，本公开的核酸分子中存在的两个ITR是相同的，并且尤其可以是AAV2 ITR、AAV5 ITR或AAV9 ITR。在一个特定的实施方案中，第一ITR和第二ITR是相同的。
在一些实施方案中，ITR形成发夹环结构。在一个实施方案中，第一ITR形成发夹结构。在另一个实施方案中，第二ITR形成发夹结构。仍然在另一个实施方案中，第一ITR和第二ITR均形成发夹结构。
在一些实施方案中，本文所述的核酸分子中的ITR是转录激活的ITR。转录激活的ITR可包含野生型ITR的全部或一部分，所述野生型ITR的全部或一部分已通过包含至少一个转录活性元件而被转录激活。各种类型的转录活性元件适用于这种情况。在一些实施方案中，转录活性元件是组成型转录活性元件。组成型转录活性元件提供持续水平的基因转录，并且当希望转基因持续表达时是优选的。在其它实施方案中，转录活性元件是诱导型转录活性元件。诱导型转录活性元件通常在没有诱导物(或诱导条件)的情况下表现出低活性，并且在诱导物存在的情况下(或转换至诱导条件)被上调。当仅在特定时间或特定位置需要表达时，或者当需要使用诱导剂滴定表达水平时，诱导型转录活性元件可以是优选的。转录活性元件也可以是组织特异性的；也就是说，它们仅在某些组织或细胞类型中表现出活性。
转录活性元件可通过多种方式整合到ITR中。在一些实施方案中，转录活性元件被整合到ITR的任何部分的5’或ITR的任何部分的3’。在其它实施方案中，转录激活的ITR的转录活性元件位于两个ITR序列之间。如果转录活性元件包括两个或更多个必须间隔开的元件，则这些元件可以与ITR的部分交替。在一些实施方案中，ITR的发夹结构被缺失，并被转录元件的反向重复替代。后一种布置会产生模仿结构中被缺失的部分的发夹。在转录激活的ITR中也可以存在多个串联的转录活性元件，并且这些元件可以是相邻的或间隔开的。另外，蛋白结合位点(例如，Rep结合位点)可以被引入到转录激活的ITR的转录活性元件中。转录活性元件可包括使得能够通过RNA聚合酶控制DNA的转录以形成RNA的任何序列，并且可包括例如如下定义的转录活性元件。
转录激活的ITR以相对有限的核苷酸序列长度向核酸分子提供转录激活和ITR功能，这有效地最大化了可由核酸分子携带和表达的转基因的长度。可通过多种方式将转录活性元件整合到ITR中。比较ITR序列与转录活性元件的序列要求可以深入了解在ITR内编码元件的方式。例如，转录活性可以通过在复制转录活性元件的功能性元件的ITR序列中引入特定变化来添加到ITR中。本领域中存在许多技术来高效地添加、缺失并且/或者改变特定位点处的特定核苷酸序列(参见，例如，Deng和Nickoloff(1992)Anal.Biochem.200:81-88)。另一种产生转录激活的ITR的方式涉及在ITR的期望位置处引入限制性位点。另外，使用本领域已知方法，可将多个转录活性元件整合到转录激活的ITR中。
举例来说，转录激活的ITR可以通过包含诸如以下元件中的一种或多种转录活性元件来产生：TATA盒、GC盒、CCAAT盒、Sp1位点、Inr区、CRE(cAMP调控元件)位点、ATF-1/CRE位点、APBβ盒、APBα盒、CArG盒、CCAC盒或本领域已知的任何其它参与转录的元件。
在一些实施方案中，AAV包含编码不止一种治疗性蛋白的基因盒。在编码不止一种治疗性蛋白的AAV中，一些实施方案包括诸如IRES或2A的元件，以从一个启动子共表达它们。在一些实施方案中，AAV包含由IRES元件分隔的蛋白质编码区。在一些实施方案中，AAV包含由2A元件分隔的两个蛋白质编码区。在一些实施方案中，AAV包含在蛋白质编码区之间由IRES元件分隔的三个蛋白质编码区。在一些实施方案中，AAV包含在蛋白质编码区之间由2A元件分隔的三个蛋白质编码区。
在一些实施方案中，AAV包含调控序列。在一些实施方案中，AAV包含非编码调控DNA。在一些实施方案中，AAV基因组包含控制宿主细胞中抗体链基因表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员将理解，AAV的设计，包括调控序列的选择，可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。在一些实施方案中，AAV基因组包含mRNA剪接供体/剪接受体位点。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，诸如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可使用非病毒调控序列，诸如遍在蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。更进一步，由来自不同来源的序列组成的调控元件，例如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列(Takebe等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。在某些实施方案中，调控序列包含组织特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子在选自由以下组成的组的组织中驱动目标基因的表达：心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、肌肉和干细胞。
II.B.2.c.AAV的方法和用途
用于获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域公知的。(参见，例如，US2003/0138772，其内容通过引用以其整体并入本文)。典型地，所述方法包括培养包含如下组分的宿主细胞：编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由AAV ITR和转基因组成的重组AAV载体；以及允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的充足的辅助功能。增加AAV产量的辅助功能可以通过用质粒DNA进行转染或通过与腺病毒共感染来提供。
可将待在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分反式地提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法进行了工程化，以包含一种或多种所需组分。最合适的是，这种稳定的宿主细胞将含有在诱导型启动子的控制下的所需的一种或多种组分。然而，一种或多种所需组分可以在组成型启动子的控制下。本文在适用于转基因的调控元件的讨论中提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在又一个替代方案中，选定的稳定宿主细胞可含有在组成型启动子控制下的一个或多个选定组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的一个或多个其它选定组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其来源于293个细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但其含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可产生其它稳定的宿主细胞。
产生本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能可使用任何合适的遗传元件(载体)递送至包装宿主细胞。所选定的遗传元件可通过任何合适的方法(包括本文所述的那些)进行递送。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作领域的技术人员已知的，并且包括遗传工程化、重组工程化和合成技术。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是公知的，并且选择合适的方法不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher等人，J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利第5,478,745号。
在一些实施方案中，将使用三重转染方法(详细描述于美国专利第6,001,650号)产生重组AAV。典型地，重组AAV通过用待包装到AAV颗粒中的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和辅助功能载体转染宿主细胞来产生。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)，所述序列在生产性AAV复制和包封中反式地发挥功能。优选地，AAV辅助功能载体支持高效的AAV载体产生，而不产生任何可检测的野生型AAV病毒粒子(即，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。适用于本公开的载体的非限制性实例包括美国专利第6,001,650号中描述的pHLP19和美国专利第6,156,303号中描述的pRep6cap6载体，所述两项美国专利的全部内容通过引用并入。辅助功能载体编码非AAV来源的病毒和/或细胞功能(即“辅助功能”)的核苷酸序列，AAV依赖所述功能进行复制。辅助功能包括AAV复制所需的功能，包括但不限于参与AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅助功能可以来源于任何已知的辅助病毒，诸如腺病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒1型除外)、杆状病毒和痘苗病毒。在一些实施方案中，使用本文所述的三重质粒系统瞬时转染HEK293细胞来生产重组AAV。
在一些方面，本公开提供了经转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，并且当外源DNA被引入细胞膜内侧时，细胞已经被“转染”。许多转染技术在本领域中是公知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456,Sambrook等人(1989)MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier和Chu等人(1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，诸如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入合适的宿主细胞。
“宿主细胞”是指含有或者能够含有目标物质的任何细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、辅助功能载体或其它与重组AAV产生相关的转移DNA的受者。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指已用外源DNA序列转染的细胞。在一些实施方案中，使用瞬时或稳定表达来产生AAV。在一些实施方案中，宿主细胞是HEK293、HeLa细胞、BHK细胞或sf9细胞。在特定的实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞。应理解，由于自然突变、偶然突变或有意突变，单个亲代细胞的后代在形态学或基因组或总的DNA互补序列方面不一定与原始亲代完全相同。
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域还知道，在此类克隆群体的储存或转移过程中，染色体组型会发生自发或诱导的变化。因此，源自提及的细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所提及的细胞系包括此类变体。
如本文所用，术语“重组细胞”是指已向其中引入了外源DNA区段(诸如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸(诸如RNA)产生的DNA区段)的细胞。
如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等，所述遗传元件，当与适当的控制元件缔合时能够复制，并且能够在细胞之间转移基因序列。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体被预期是其中待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动基因特异性转录所需的DNA序列。短语“可操作定位的”、“处于控制之下”或“处于转录控制之下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的启动和基因的表达。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的遗传构建体，其中所述核酸编码序列的一部分或全部能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如，以从转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA(例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制剂)。
在一些实施方案中，使用碘克沙醇密度梯度纯化AAV或rAAV。在一些实施方案中，空衣壳以约1.3±0.05g/mL(例如，1.3-1.32g/mL)的密度迁移。在一些实施方案中，含基因组的衣壳以约1.4±0.05g/mL(例如，1.35-1.42g/mL)的密度迁移。
II.C.支架蛋白
在本公开的某些方面，EV包含AAV和一种或多种支架蛋白。在一些实施方案中，本公开的EV包含在其组成上被修饰的膜。例如，可通过改变膜的蛋白质、脂质或聚糖含量来改变它们的膜组成。
在一些实施方案中，通过化学和/或物理方法，诸如PEG诱导的融合和/或超声融合，产生表面工程化EV(例如，外来体)。在其它实施方案中，表面工程化EV(例如，外来体)通过遗传工程产生。从遗传修饰的生产者细胞或遗传修饰的细胞的后代产生的EV(例如，外来体)可以包含改变的膜组成。在一些实施方案中，表面工程化EV(例如，外来体)具有更高或更低密度(例如，更高数量)的支架蛋白，或者包括支架蛋白的变体或片段。
在一些实施方案中，表面工程化EV从用编码支架蛋白(例如，本文公开的外来体蛋白或支架蛋白)或其变体或片段的外源序列转化的细胞(例如，HEK293细胞)产生。包括由外源序列表达的支架蛋白的EV可包括改变的膜组成。
支架蛋白的各种修饰或片段可用于本公开的实施方案。例如，经修饰而对结合剂具有增强的亲和力的支架蛋白可用于产生可使用结合剂纯化的表面工程化EV。可使用经修饰而更有效地靶向EV和/或膜的支架蛋白。还可使用经修饰而包含特异性且有效地靶向外来体膜所需的最小片段的支架蛋白。
支架蛋白可被工程化成表达为融合分子，例如外来体膜蛋白与AAV的融合分子。例如，融合分子可包含本文公开的与AAV的衣壳蛋白直接或通过中间体(例如，化学诱导型二聚体、抗原结合结构域或受体)连接的支架蛋白(例如，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体)。在融合分子的情况下，化学诱导型二聚体、抗原结合结构域和/或受体可以是天然肽、重组肽、合成肽或其任意组合。
在一些实施方案中，与本领域已知的EV相比，本文所述的表面工程化EV表现出优异的特征。例如，表面工程化EV在其表面上包含富集程度比在天然存在的EV或使用常规外来体蛋白产生的EV上的富集程度更高的经修饰的蛋白。此外，本公开的表面工程化EV，与天然存在的EV或使用常规外来体蛋白产生的EV相比，可以具有更大、更特异或更可控的生物活性。
本公开的支架蛋白可用于外部或腔(内部)锚定。在一些实施方案中，支架蛋白能够将异源多肽锚定至EV的外表面，例如，支架蛋白具有胞外结构域。在一些实施方案中，支架蛋白能够将异源多肽锚定至EV的内表面，例如，支架蛋白具有细胞内(腔)结构域。在一些实施方案中，支架蛋白能够将异源多肽锚定至EV的外表面或EV的腔表面或两者，例如，支架蛋白具有胞外结构域和胞内结构域，例如，EV是跨膜蛋白。
II.C.1.跨膜支架蛋白
在一些实施方案中，支架蛋白(例如，支架X)包含前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN多肽)。PTGFRN蛋白也可称为CD9配偶体1(CD9P-1)、含Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白F(EWI-F)、前列腺素F2-α受体调节蛋白、前列腺素F2-α受体相关蛋白或CD315。人PTGFRN蛋白(Uniprot登录号Q9P2B2)的全长氨基酸序列在表3中显示为SEQ ID NO:1。PTGFRN多肽包含信号肽(SEQ ID NO:1的氨基酸1至25)、胞外结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸26至832)、跨膜结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸833至853)和胞质结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸854至879)。成熟PTGFRN多肽由无信号肽的SEQ ID NO:1，即SEQ ID NO:1的氨基酸26至879组成。在一些实施方案中，可用于本公开的PTGFRN多肽片段包含PTGFRN多肽的跨膜结构域。在其它实施方案中，可用于本公开的PTGFRN多肽片段包含PTGFRN多肽的跨膜结构域和(i)在跨膜结构域的N端的至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个氨基酸，(ii)在跨膜结构域的C端的至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个或至少约25个氨基酸，或(i)和(ii)两者。
在一些实施方案中，PTGFRN多肽的片段缺少一个或多个功能或结构结构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:1的氨基酸26至879具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:2(对应于SEQ ID NO:1的位置687至878)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:2的N端和/或C端的1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:186、187、188、189、190或191具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架蛋白包含SEQ ID NO:186、187、188、189、190或191的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:186、187、188、189、190或191的氨基酸序列和在SEQ ID NO:186、187、188、189、190或191的N端和/C端处的1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
表2.示例性支架蛋白序列
Figure BDA0003414407670000951
Figure BDA0003414407670000961
Figure BDA0003414407670000971
Figure BDA0003414407670000981
Figure BDA0003414407670000991
Figure BDA0003414407670001001
Figure BDA0003414407670001011
Figure BDA0003414407670001021
Figure BDA0003414407670001031
Figure BDA0003414407670001041
Figure BDA0003414407670001051
Figure BDA0003414407670001061
Figure BDA0003414407670001071
Figure BDA0003414407670001081
在一些实施方案中，支架蛋白包含由SEQ ID NO:3表示的Basigin(BSG蛋白)。BSG蛋白也称为5F7、胶原酶刺激因子、细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(EMMPRIN)、白细胞活化抗原M6、OK血型抗原、肿瘤细胞来源的胶原酶刺激因子(TCSF)或CD147。人BSG蛋白的Uniprot编号是P35613。BSG蛋白的信号肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至21。SEQ ID NO:3的氨基酸138-323是胞外结构域，氨基酸324-344是跨膜结构域，SEQ ID NO:3的氨基酸345-385是胞质结构域。
在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:3的氨基酸22至385具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BSG多肽的片段缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV，例如SEQ ID NO:3的氨基酸221至315。在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:193、194或195具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架蛋白包含SEQ ID NO:193、194或195的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:193、194、或195的氨基酸序列和在SEQ ID NO:193、194或195的N端和/或C端的1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，支架蛋白包含免疫球蛋白超家族成员8(IgSF8或IGSF8蛋白)，其也被称为CD81配偶体3、含Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白2(EWI-2)、角质形成细胞相关跨膜蛋白4(KCT-4)、LIR-D1、前列腺素调控样蛋白(PGRL)或CD316。全长人IGSF8蛋白在Uniprot中的登录号为Q969P0，并且在本文中显示为SEQ ID NO:4。人IGSF8蛋白具有信号肽(SEQ ID NO:4的氨基酸1至27)、胞外结构域(SEQ ID NO:4的氨基酸28至579)、跨膜结构域(SEQ ID NO:4的氨基酸580至600)和胞质结构域(SEQ ID NO:4的氨基酸601至613)。
在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:4的氨基酸28至613具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGSF8蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，例如IgV。在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:197、198、199或200具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架蛋白包含SEQID NO:197、198、199或200的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:197、198、199或200的氨基酸序列和在SEQ ID NO:197、198、199或200的N端和/或C端的1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，支架蛋白包含包含免疫球蛋白超家族成员3(IgSF3或IGSF3蛋白)，其也被称为含Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白3(EWI-3)，并显示为SEQ ID NO:203的氨基酸序列。人IGSF3蛋白具有信号肽(SEQ ID NO:203的氨基酸1至19)、胞外结构域(SEQ IDNO:203的氨基酸20至1124)、跨膜结构域(SEQ ID NO:203的氨基酸1125至1145)和胞质结构域(SEQ ID NO:203的氨基酸1146至1194)。
在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:203的氨基酸28至613具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGSF3蛋白缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它方面，支架蛋白包含IGSF2蛋白，其包含与SEQ ID NO:202具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，IGSF2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在一些实施方案中，支架蛋白包含整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)(其也被称为纤连蛋白受体亚单位β)、糖蛋白IIa(GPIIA)、VLA-4亚单位β或CD29，并显示为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。人ITGB1蛋白具有信号肽(SEQ ID NO:5的氨基酸1至20)、胞外结构域(SEQ ID NO:5的氨基酸21至728)、跨膜结构域(SEQ ID NO:5的氨基酸729至751)和胞质结构域(SEQ IDNO:5的氨基酸752至798)。
在其它实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:5的氨基酸21至798具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ITGB1蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ITGA4蛋白，其包含与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽(SEQ ID NO:6的氨基酸1至33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，ITGA4蛋白缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含SLC3A2蛋白，其包含与SEQ ID NO:7具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，SLC3A2蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP1A1蛋白，其包含与SEQ ID NO:204具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP1A1蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP1A2蛋白，其包含与SEQ ID NO:205具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP1A2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP1A3蛋白，其包含与SEQ ID NO:206具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP1A3蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP1A4蛋白，其包含与SEQ ID NO:207具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP1A4蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP1B3蛋白，其包含与SEQ ID NO:208具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP1B3蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP2B1蛋白，其包含与SEQ ID NO:209具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP2B1蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP2B2蛋白，其包含与SEQ ID NO:210具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP2B2蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP2B3蛋白，其包含与SEQ ID NO:211具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP2B3蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如IgV。
在其它实施方案中，支架蛋白包含ATP2B4蛋白，其包含与SEQ ID NO:212具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ATP2B4蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
其它支架蛋白的非限制性实例可见于2019年2月5日发布的美国专利第US10195290B1号(其通过引用以其整体并入)中。
在一些实施方案中，所述序列编码支架蛋白的片段，所述支架蛋白的片段从天然蛋白的N端缺少至少约5个、至少约10个、至少约50个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个或至少约800个氨基酸。在一些实施方案中，所述序列编码支架蛋白的片段，所述支架蛋白的片段从天然蛋白的C端缺少至少约5个、至少约10个、至少约50个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个或至少约800个氨基酸。在一些实施方案中，所述序列编码支架蛋白的片段，所述支架蛋白的片段从天然蛋白的N端和C端都缺少至少约5个、至少约10个、至少约50个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个或至少约800个氨基酸。在一些实施方案中，所述序列编码缺少天然蛋白的一个或多个功能性或结构性结构域的支架蛋白的片段。
II.C.2.腔锚定支架蛋白
在一些实施方案中，支架蛋白(例如，支架Y)与EV膜的腔表面相互作用。在一些实施方案中，支架蛋白被锚定至EV膜的腔表面。在一些方面，本公开的支架蛋白包含“N端结构域”(ND)和“效应结构域”，其中ND和/或ED与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。
在一些实施方案中，支架蛋白包含胞内(腔)结构域、跨膜结构域和胞外结构域，其中AAV与支架蛋白的胞外结构域缔合，并且其中支架蛋白的胞内(腔)结构域与EV膜的腔表面相互作用。在一些实施方案中，支架蛋白被锚定至EV膜的腔表面。在一些方面，本公开的支架蛋白包含胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域；其中所述胞内结构域包含“N端结构域”(ND)和“效应结构域”，其中所述ND和/或ED与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。
在一些方面，本公开的支架可以例如通过脂质锚(例如，肉豆蔻酸)和/或与膜磷脂的带负电荷的头部静电相互作用的多碱结构域(polybasic domain)，与EV的腔表面缔合。在其他方面，支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中ND与EV的腔表面缔合，并且ED通过离子相互作用与EV的腔表面缔合，其中ED依次包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续的赖氨酸(Lys)。
在其它实施方案中，支架蛋白(例如，支架蛋白的胞内(腔)结构域)包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中ND与EV的腔表面缔合，并且ED通过离子相互作用与EV的腔表面缔合，其中ED依次包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续赖氨酸(Lys)。
在其它实施方案中，ED还包含一个或多个低复杂度区域，例如，PEST基序。PEST序列是富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的肽序列。在一些实施方案中，ED还包含带负电荷的残基(例如，Glu)和许多经历瞬时磷酸化的Ser和Thr(因此，两者都给ED之外的区域增加负电荷)。
在一些方面，ND通过脂质化，例如通过肉豆蔻酰化，与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，ND具有在N端的Gly。在一些方面，N端Gly是肉豆蔻酰化的。
在一些方面，ED通过离子相互作用与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，ED通过静电相互作用，特别是吸引静电相互作用与EV(例如，外来体)的腔表面缔合。
在一些方面，ED包含(i)一个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)，或(ii)在多肽序列中彼此相邻的两个或更多个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)。在一些方面，碱性氨基酸是赖氨酸(Lys；K)、精氨酸(Arg,R)或组氨酸(His,H)。在一些方面，碱性氨基酸是(Lys)n，其中n为1与10之间的整数。
在一些实施方案中，ED包含(i)ED中的赖氨酸重复或(ii)赖氨酸重复和ND，例如，ND中的C端处的K和ED中的N端处的K，其中ND与ED直接连接，即通过肽键连接。在一些实施方案中，能够将异源部分例如生物活性分子锚定在EV(例如,外来体)的腔内的氨基酸的最小数量，例如为约7个至约15个、约7个至约14个、约7个至约13个、约7个至约12个、约7个至约11个、约7个至约10个、约7个至约9个或约7个至约8个氨基酸的片段。
在其它方面，如果ED的N端直接与ND的C端的赖氨酸连接，即赖氨酸在ED的N端中并与ND的C端的赖氨酸融合，则ED包含至少一个赖氨酸，并且ND包含在C端的一个赖氨酸。在其它实施方案中，当ED的N端通过接头，例如一个或多个氨基酸与ND的C端连接时，ED包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。在一些实施方案中，ED在序列中包含至少两个连续的赖氨酸(Lys)。
在某些方面，ED包含K、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:11)、KKKKK(SEQ ID NO:12)、R、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQ ID NO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:16)或其任意组合。在一些方面，ED包含KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:11)、KKKKK(SEQ ID NO:12)或其任意组合。在一些方面，ED包含Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQ ID NO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:16)或其任意组合。在一些方面，ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中X2至X6中的每一个独立地代表氨基酸，并且其中X6代表碱性氨基酸。在一些方面，X6氨基酸选自由Lys、Arg和His组成的组。在一些方面，X5氨基酸选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组。在一些方面，X2氨基酸选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组。在一些方面，X4选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组。
在一些方面，支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G是甘氨酸，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键；其中X2至X6中的每一个独立地是氨基酸；其中X6包含碱性氨基酸，并且其中ED通过肽键与X6连接，并且在ED的N端包含至少一个赖氨酸。
在一些方面，支架蛋白的ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中G代表Gly；“:”代表肽键；X2代表选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸：X3代表任意氨基酸；X4代表选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组的氨基酸；X5代表选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；并且X6代表选自由Lys、Arg和His组成的组的氨基酸。
在一些方面，X3氨基酸选自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg组成的组。
在一些方面，ND和ED通过接头连接。在一些方面，接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面，可将两个或更多个接头串联连接。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间障碍。接头通常不被裂解；然而，在某些方面，这种裂解可以是想要的。因此，在一些方面，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可以位于接头序列内或接头序列任一端的接头侧翼。当ND和ED通过接头连接时，ED包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
在一些方面，接头是肽接头。在一些方面，肽接头可以包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个，至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
在一些方面，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面，肽接头是根据式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO:46)的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n为1至100的任何整数，m为1至100的任何整数。在其它方面，甘氨酸/丝氨酸接头根据式[(Gly)x-Sery]z(SEQ ID NO:47)，其中x为1至4的整数，y为0或1，z为1至50的整数。在一些方面，肽接头包含序列Gn(SEQ ID NO:48)，其中n可为1至100的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(GlyAla)n(SEQ ID NO:49)，其中n为1与100之间的整数。在其它方面，肽接头可包含序列(GlyGlySer)n(SEQ ID NO:50)，其中n为1与100之间的整数。
在一些方面，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
在其它方面，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在其它方面，肽接头可包含天然存在的氨基酸，其以天然不存在的线性序列存在。在其它方面，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
本公开还提供了分离的EV(例如，外来体)，其包含与支架蛋白连接的生物活性分子，其中支架蛋白包含ND-ED，其中：a.ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中：i.G代表Gly；ii.“:”代表肽键；iii.X2代表选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；iv.X3代表任意氨基酸；v.X4代表选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met组成的组的氨基酸；vi.X5代表选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；vii.X6代表选自由Lys、Arg和His组成的组的氨基酸；以及b.“—”代表任选的接头；以及c.ED是效应结构域，其包含(i)通过肽键或一个或多个氨基酸与X6连接的至少两个连续赖氨酸(Lys)，或(ii)通过肽键直接与X6连接的至少一个赖氨酸。
在一些方面，X2氨基酸选自由Gly和Ala组成的组。在一些方面，X3氨基酸是Lys。在一些方面，X4氨基酸是Leu或Glu。在一些方面，X5氨基酸选自由Ser和Ala组成的组。在一些方面，X6氨基酸是Lys。在一些方面，X2氨基酸是Gly、Ala或Ser；X3氨基酸是Lys或Glu；X4氨基酸是Leu、Phe、Ser或Glu；X5氨基酸是Ser或Ala；并且X6氨基酸是Lys。在一些方面，“—”接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
在一些方面，支架蛋白中的ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:11)、KKKKK(SEQ ID NO:12)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQ ID NO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:16)或其任意组合。
在一些方面，支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQID NO:17)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:18)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:19)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:20)或(v)其任意组合。
在一些方面，支架蛋白中的ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSK(SEQ ID NO:51)、(ii)GAKLSK(SEQ ID NO:52)、(iii)GGKQSK(SEQ ID NO:53)、(iv)GGKLAK(SEQ ID NO:54)或(v)其任意组合，并且支架蛋白中的ED包含(i)K、KK、KKK、KKKG(SEQ IDNO:55)、KKKGY(SEQ ID NO:56)、KKKGYN(SEQ ID NO:57)、KKKGYNV(SEQ ID NO:58)、KKKGYNVN(SEQ ID NO:59)、KKKGYS(SEQ ID NO:60)、KKKGYG(SEQ ID NO:61)、KKKGYGG(SEQID NO:62)、KKKGS(SEQ ID NO:63)、KKKGSG(SEQ ID NO:64)、KKKGSG(SEQ ID NO:65)、KKKGSGS(SEQ ID NO:66)、KKKS(SEQ ID NO:67)、KKKSG(SEQ ID NO:68)、KKKSGG(SEQ IDNO:69)、KKKSGGS(SEQ ID NO:70)、KKKSGGSG(SEQ ID NO:71)、KKSGGSGG(SEQ ID NO:72)、KKKSGGSGGS(SEQ ID NO:73)和KRFSFKKS(SEQ ID NO:74)。
在一些方面，本公开的支架蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:21)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:18)、(iii)GGKQSKK(SEQ IDNO:19)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:20)或(v)其任意组合。
在一些方面，支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQID NO:22)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:23)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:24)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:25)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:26)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:27)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:28)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:29)和(ix)其任意组合。
在一些方面，本公开的支架蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:22)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:23)、(iii)GAKLSKKK(SEQID NO:24)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:25)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:26)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:27)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:28)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:29)和(ix)其任意组合。在一些实施方案中，本公开的支架蛋白在序列中包含至少两个连续的赖氨酸(Lys)。
在一些方面，支架蛋白的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至少约31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约115个、至少约120个、至少约125个、至少约130个、至少约135个、至少约140个、至少约145个、至少约150个、至少约155个、至少约160个、至少约165个、至少约170个、至少约175个、至少约180个、至少约185个、至少约190个、至少约195个、至少约200个、至少约205个、至少约210个、至少约215个、至少约220个、至少约225个、至少约230个、至少约235个、至少约240个、至少约245个、至少约250个、至少约255个、至少约260个、至少约265个、至少约270个、至少约275个、至少约280个、至少约285个、至少约290个、至少约295个、至少约300个、至少约305个、至少约310个、至少约315个、至少约320个、至少约325个、至少约330个、至少约335个、至少约340个、至少约345个或至少约350个氨基酸。
在一些方面，支架蛋白的长度为约5个至约10个、约10个至约20个、约20个至约30个、约30个至约40个、约40个至约50个、约50个至约60个、约60个至约70个、约70个至约80个、约80个至约90个、约90个至约100个、约100个至约110个、约110个至约120个、约120个至约130个、约130个至约140个、约140个至约150个、约150个至约160个、约160个至约170个、约170个至约180个、约180个至约190个、约190个至约200个、约200个至约210个、约210个至约220个、约220个至约230个、约230个至约240个、约240个至约250个、约250个至约260个、约260个至约270个、约270个至约280个、约280个至约290个、约290个至约300个、约300个至约310个、约310个至约320个、约320个至约330个、约330个至约340个或约340个至约250个氨基酸。
在一些方面，支架蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:32)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:33)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:34)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:35)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:36)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:37)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:38)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:39)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:40)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:41)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:42)。
在一些方面，本公开的支架蛋白的多肽序列由以下序列组成：(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:32)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:33)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ IDNO:34)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:35)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:36)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:37)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:38)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:39)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:40)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:41)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:42)。
可用于公开的支架蛋白的非限制性实例列于下面。在一些实施方案中，支架蛋白包含表4中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，支架蛋白由表4中列出的氨基酸序列组成。
表4.示例性支架蛋白
Figure BDA0003414407670001231
Figure BDA0003414407670001241
Figure BDA0003414407670001251
Figure BDA0003414407670001261
在一些方面，本公开的支架蛋白不包含N端Met。在一些方面，支架蛋白包含在支架蛋白的N端的脂质化氨基酸，例如肉豆蔻酰化氨基酸，其用作脂质锚。在一些方面，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是Gly。N端Gly的存在是N-肉豆蔻酰化的绝对要求。在一些方面，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是合成的。在一些方面，支架蛋白的N端的氨基酸残基是甘氨酸类似物，例如烯丙基甘氨酸、丁基甘氨酸或炔丙基甘氨酸。
在其它方面，脂质锚可以是本领域已知的任何脂质锚，例如棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在不寻常的情况下，例如，通过使用限制肉豆蔻酸的培养基，可使一些其它脂肪酸，包括短链和不饱和脂肪酸，附接至N端甘氨酸。例如，在BK通道中，据报道肉豆蔻酸通过羟基酯键联翻译后附接至内部丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基。本领域已知的膜锚示于下表中：
表5：修饰基团
Figure BDA0003414407670001271
在一些实施方案中，支架蛋白选自由以下组成的组：MARCKS、MARKSL1、BASP1、其任何功能片段、变体或衍生物或其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白包含Src蛋白或其片段。在一些实施方案中，支架蛋白包含例如在美国专利第9,611,481号中公开的序列，所述专利通过引用以其整体并入本文。
表6.示例性支架蛋白序列
Figure BDA0003414407670001272
Figure BDA0003414407670001281
在一些实施方案中，本公开的支架蛋白包含MARCKS蛋白或其片段、变体或衍生物。MARCKS蛋白(Uniprot登录号P29966)也被称为蛋白激酶C底物、80kDa蛋白、轻链。全长人MARCKS蛋白的长度为332个氨基酸，并且包含在氨基酸残基152-176处的钙调素结合结构域。在一些方面，本公开的支架蛋白包含成熟的MARCKS蛋白(即，无N端甲硫氨酸)。在一些方面，本公开的支架蛋白来源于成熟的MARCKS蛋白，即，其是成熟MARCKS蛋白的片段、变体或衍生物，因此其缺少非成熟蛋白中存在的N端蛋白。
在一些方面，本公开的支架蛋白包含MARCKSL1蛋白(Uniprot登录号P49006)，也被称为MARCKS样蛋白1和巨噬细胞富含肉豆蔻酰化丙氨酸的C激酶底物。全长人MARCKSL1蛋白的长度为195个氨基酸。MARCKSL1蛋白具有在氨基酸残基87-110处的参与脂质结合和钙调蛋白结合的效应结构域。在一些方面，本公开的支架蛋白包含成熟的MARCKSL1蛋白(即，无N端甲硫氨酸)。在一些方面，本公开的支架蛋白来源于成熟的MARCKSL1蛋白，即其是成熟的MARCKSL1蛋白的片段、变体或衍生物，因此其缺少非成熟蛋白中存在的N端蛋白。
在一些方面，本公开的支架包含BASP1蛋白(Uniprot登录号P80723)，也称为22kDa神经元组织富集酸性蛋白或神经元轴突膜蛋白NAP-22。全长人BASP1蛋白序列(异构体1)的长度为227个氨基酸。通过选择性剪接产生的异构体从异构体1缺失了氨基酸88至141。在一些方面，本公开的支架蛋白包含成熟的BASP1蛋白(即，无N端甲硫氨酸)。在一些方面，本公开的支架蛋白来源于成熟的BASP1蛋白，即其是成熟的BASP1蛋白的片段、变体或衍生物，因此其缺少非成熟蛋白中存在的N端蛋白。
在一些方面，支架蛋白包含与SEQ ID NO:8的成熟形式(MARCKS)(即，无SEQ IDNO:8中存在的N端甲硫氨酸氨基酸)具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白包含与SEQ ID NO:8的成熟形式(MARCKS)(即，无SEQ ID NO:8中存在的N端甲硫氨酸氨基酸)的功能性片段具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，支架蛋白包含与SEQ ID NO:9的成熟形式(MARCKSL1)(即，无SEQ IDNO:9中存在的N端甲硫氨酸氨基酸)具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白包含与SEQ ID NO:9的成熟形式(MARCKSL1)(即，无SEQ ID NO:9中存在的N端甲硫氨酸氨基酸)的功能性片段具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，支架蛋白包含与SEQ ID NO:10的成熟形式(BASP1)(即，无SEQ IDNO:10中存在的N端甲硫氨酸氨基酸)具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白包含与SEQ ID NO:10的成熟形式(BASP1)(即，无SEQ ID NO:10中存在的N端甲硫氨酸氨基酸)的功能性片段具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
II.C.3.支架蛋白融合构建体
在一些实施方案中，支架蛋白与一种或多种异源蛋白连接。一种或多种异源蛋白可以与架部分的N端连接。一种或多种异源蛋白可与支架部分的C端连接。在一些实施方案中，一种或多种异源蛋白与支架部分的N端和C端都连接。在一些实施方案中，异源蛋白是哺乳动物蛋白。在一些实施方案中，异源蛋白是人蛋白。
在一些实施方案中，支架蛋白可用于将任何部分连接至外来体的腔表面和/或外表面。例如，除了EV(例如，外来体)的外表面以外，PTGFRN多肽可用于在腔的内部(例如，在腔表面上)连接AAV，例如AAV的衣壳蛋白。因此，在某些实施方案中，支架蛋白可用于双重目的，例如腔表面上的AAV和EV(例如，外来体外)的外表面上的第二有效载荷，或外来体外表面上的AAV和EV(例如，外来体外)的腔表面上的第二有效载荷。
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV连接。在一些实施方案中，支架蛋白通过接头与AAV，例如AAV的衣壳蛋白连接。在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头是可裂解的接头。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是刚性接头。在某些实施方案中，接头是至少约2个氨基酸、至少约3个氨基酸、至少约4个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或至少约50氨基酸。
在一些实施方案中，支架蛋白与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。在一些实施方案中，支架蛋白与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接，而AAV，例如AAV的衣壳蛋白与相应的结合配偶体连接。在这些实施方案中，支架蛋白和AAV蛋白，例如AAV的衣壳蛋白，在诱导结合配偶体二聚化的化学物质存在下相互缔合。在一些实施方案中，结合配偶体与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，结合配偶体与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，结合配偶体与支架蛋白的腔结构域连接。
在一些实施方案中，与支架蛋白连接的结合配偶体选自化学诱导的二聚体的一种结合配偶体，所述化学诱导的二聚体选自：(i)FKBP和FKBP(FK1012)；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶A(CNA)(FK506)；(iii)FKBP和CyP-Fas(FKCsA)；(iv)FKBP和FRB(雷帕霉素)；(v)GyrB和GyrB(香豆霉素)；(vi)GAI和GID1(赤霉素)；(vii)Snap-tag和HaloTag(HaXS)；(viii)eDHFR和HaloTag(TMP-HTag)；以及(ix)BCL-xL和Fab(AZ1)(ABT-737)；其中如本文所述，AAV，例如AAV的衣壳蛋白与相应的结合配偶体连接。在某些实施方案中，支架蛋白与FKBP连接。在某些实施方案中，支架蛋白与FRB连接。在一些实施方案中，FRB是mTOR的FRB。在一些实施方案中，支架蛋白与钙调神经磷酸酶A连接。在一些实施方案中，支架蛋白与CyP-Fas连接。在一些实施方案中，支架蛋白与GyrB连接。在一些实施方案中，支架蛋白与CyP-Fas连接。在一些实施方案中，支架蛋白与GAI连接。在一些实施方案中，支架蛋白与GID1连接。在一些实施方案中，支架蛋白与Snap-tag连接。在一些实施方案中，支架蛋白与HaloTag连接。在一些实施方案中，支架蛋白与eDHFR连接。在一些实施方案中，支架蛋白与BCL-xL连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与Fab连接。
在某些实施方案中，支架蛋白与FKBP连接，并且AAV的衣壳蛋白与FKBP连接。在某些实施方案中，支架蛋白与FRB连接，并且AAV的衣壳蛋白与FKBP连接。在某些实施方案中，支架蛋白与FKBP连接，并且AAV的衣壳蛋白与FRB连接。在一些实施方案中，支架蛋白与钙调神经磷酸酶A连接，并且AAV的衣壳蛋白与FKBP连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FKBP连接，并且AAV的衣壳蛋白与钙调神经磷酸酶A连接。在一些实施方案中，支架蛋白与CyP-Fas连接，并且AAV的衣壳蛋白与FKBP连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FKBP连接，并且AAV的衣壳蛋白与CyP-Fas连接。在一些实施方案中，支架蛋白与GyrB连接，并且AAV的衣壳蛋白与GyrB连接。在一些实施方案中，支架蛋白与GAI连接，并且AAV的衣壳蛋白与GID1连接。在一些实施方案中，支架蛋白与GID1连接，并且AAV的衣壳蛋白与GAI连接。在一些实施方案中，支架蛋白与Snap-tag连接，并且AAV的衣壳蛋白与HaloTag连接。在一些实施方案中，支架蛋白与HaloTag连接，并且AAV的衣壳蛋白与Snap-tag连接。在一些实施方案中，支架蛋白与eDHFR连接，并且AAV的衣壳蛋白与HaloTag连接。在一些实施方案中，支架蛋白与HaloTag连接，并且AAV的衣壳蛋白与eDHFR连接。在一些实施方案中，支架蛋白与BCL-xL连接，并且AAV的衣壳蛋白与Fab(AZ1)连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与Fab(AZ1)连接，并且AAV的衣壳蛋白与BCL-xL连接。
在一些实施方案中，支架蛋白与亲和剂连接。在一些实施方案中，亲和剂与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，亲和剂与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，亲和剂与支架蛋白的腔结构域连接。在一些实施方案中，亲和剂包括AAV结合多肽。在一些实施方案中，亲和剂包括AAV受体。在一些实施方案中，亲和试剂包括如本文所公开的抗体或抗原结合结构域。在一些实施方案中，亲和剂与一种或多种AAV衣壳蛋白结合。在一些实施方案中，一种或多种AAV衣壳蛋白是AAV组装激活蛋白。在一些实施方案中，亲和剂不与AAV衣壳蛋白单体结合。
在一些实施方案中，亲和剂与AAV之间的相互作用是短暂的。在一些实施方案中，AAV在某些条件下与亲和剂解离。在某些实施方案中，亲和剂对AAV的亲和力取决于pH值。在一些实施方案中，AAV在至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11或至少约12的pH下与亲和剂解离。在一些实施方案中，亲和剂对AAV的亲和力取决于包含AAV和亲和剂的溶液中的钙、镁、硫酸盐、磷酸盐或其任意组合的浓度。在一些实施方案中，亲和剂对AAV的亲和力取决于包含AAV和亲和剂的溶液的盐浓度和/或离子强度。在一些实施方案中，AAV和亲和剂在还原条件下是可离解的。
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV结合多肽连接。在一些实施方案中，AAV结合多肽与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，AAV结合多肽与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，AAV结合多肽与支架蛋白的腔结构域连接。
在一些实施方案中，AAV结合多肽包含“抗原结合结构域”。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括鼠抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括嵌合抗体(例如，小鼠-人、小鼠-灵长类动物或灵长类动物-人单克隆抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括骆驼科抗体、鲨鱼IgNAR或抗独特型抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括骆驼科抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括鲨鱼IgNAR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗独特型抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括(scFv)2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fab’。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括F(ab')2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括F(ab1)2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括dAb。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fd片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括双抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括微型抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体相关多肽。在特定实施例中，抗原结合结构域包括纳米抗体。
在一些实施方案中，支架蛋白与受体连接。在一些实施方案中，受体结合AAV，例如，AAV结合肽是AAV受体。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的腔结构域连接。
在一些实施方案中，受体是AAV受体或其片段(参见，例如，Pillay等人，Nature530(7588):108-12(2016)，其通过引用以其整体并入本文)。本领域已知的任何AAV受体或其AAV结合片段都可以与本文所述的支架蛋白连接。在某些实施方案中，AAV受体是由基因KIAA0319L编码的AAV受体，例如，AAV受体是AAVR(Pillay等人，2016)。AAVR是约150kDa的N-连接糖基化蛋白。全长AAVR是1型跨膜蛋白，其包含五个称为多囊肾病(PKD)结构域的Ig样结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD2结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD5结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1和PKD2结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1、PKD2和PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1、PKD2、PKD3和PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段包含AAVR的PKD1、PKD2、PKD3、PKD4和PKD5结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD2结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD1结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域或PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域、PKD4结构域或PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域、PKD4结构域、PKD3结构域或PKD2结构域。
在一些实施方案中，支架蛋白与Fc受体连接，并且AAV，例如AAV的衣壳蛋白与Fc连接。在某些实施方案中，Fc受体是选自Fcγ受体I(FcγR1)、FcγRIIA、FcγIIB、FcγIIIA和FcγIIIB的Fcγ受体；并且Fc是IgG的Fc。在某些实施方案中，Fc受体是FcγR1，而Fc是IgG的Fc。在一些实施方案中，Fc受体是Fcα受体I(FcαR1)，并且其中Fc是IgA的Fc。在一些实施方案中，Fc受体是选自Fcε受体I(FcεRI)和FcεRII的Fcε受体，并且其中Fc是IgE的Fc。
在一些实施方案中，支架蛋白与纳米抗体连接；并且AAV，例如AAV的衣壳蛋白与免疫球蛋白恒定区(Fc)连接。在某些实施方案中，纳米抗体与Fc特异性结合。
II.C.4.另外的缔合模式
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV(例如AAV的衣壳蛋白)通过中间体缔合。在一些实施方案中，AAV，例如AAV的衣壳蛋白与Fc连接，并且支架蛋白与Fc受体连接，其中支架蛋白的Fc受体与AAV的Fc缔合。在其它实施方案中，AAV包含抗原，并且支架蛋白与特异性结合AAV抗原的抗原结合结构域连接。在其他实施方案中，AAV，例如AAV的衣壳蛋白与Fc连接，并且支架蛋白与特异性结合Fc的抗原结合结构域连接。在其它实施方案中，支架蛋白与受体连接，其中AAV包含受体的配体。在某些实施方案中，支架蛋白与AAV受体连接，其中AAV受体与AAV上的配体特异性相互作用。在一些实施方案中，AAV与抗体或其片段(例如IgG)一起孵育，并且支架结构域与Fc受体连接，其中抗体或其片段结合AAV，并且其中Fc受体结合抗体的Fc部分。
II.C.4.i.配体-受体
在本公开的某些方面，支架蛋白与受体连接，并且AAV与配体连接。可以使用本领域已知的任何配体-受体配对。在一些实施方案中，配体是Fc，并且受体是Fc受体。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的衣壳蛋白连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc，与AAV的至少一个VP1蛋白连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的5个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的4个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的3个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的2个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的VP1蛋白中的一个连接。在一些实施方案中，AAV包含一个不与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与配体例如Fc连接的VP1蛋白。
在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少一个VP2蛋白连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的5个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的4个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的3个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的2个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的VP2蛋白中的一个连接。在一些实施方案中，AAV包含一个不与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与配体例如Fc连接的VP2蛋白。
在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少一个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的每个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的一个亚组VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约40个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约35个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约30个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约25个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约20个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约15个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约10个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约9个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约8个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约7个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约6个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约5个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约4个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约3个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的至少约2个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，配体，例如Fc与AAV的VP3蛋白中的一个连接。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约2个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约3个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约4个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约5个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约10个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约15个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约20个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约25个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约30个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约35个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约40个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约45个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白。
在一些实施方案中，与配体例如Fc连接的VP3的数量比至少一个不与配体例如Fc连接的VP3蛋白的数量少至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍，至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍。
在某些实施方案中，AAV包含1个与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与配体例如Fc连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与配体例如Fc连接的VP2蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与配体例如Fc连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与配体例如Fc连接的VP1蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与配体例如Fc连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与配体例如Fc连接的VP3蛋白。
在一些实施方案中，AAV，例如AAV的衣壳蛋白与Fc连接，并且支架蛋白与Fc受体连接。如本文所用，术语“Fc受体”包括但不限于天然存在的Fc受体的片段，其中该片段保持与Fc缔合的能力。在某些实施方案中，与支架部分连接的Fc受体是Fcγ受体，并且与AAV连接的Fc是IgG的Fc。在一些实施方案中，Fcγ受体选自Fcγ受体I(FcγR1)、FcγRIIA、FcγIIB、FcγIIIA和FcγIIIB。在一些实施方案中，支架蛋白与FcγR1连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgG的Fc连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FcγRIIA连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgG的Fc连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FcγIIB连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgG的Fc连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FcγIIIA连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgG的Fc连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FcγIIIB连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgG的Fc连接。
在一些实施方案中，支架蛋白与Fcα受体I(FcαR1)连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgA的Fc连接。
在一些实施方案中，Fc受体是选自Fcε受体I(FcεRI)和FcεRII的Fcε受体，并且Fc是IgE的Fc。在某些实施方案中，支架蛋白与FcεRI连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgE的Fc连接。在一些实施方案中，支架蛋白与FcεRII连接，并且AAV的衣壳蛋白与IgE的Fc连接。
II.C.4.ii.抗原-抗原结合结构域
在本公开的某些方面，支架蛋白与抗原结合结构域连接，并且AAV包含抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV上的抗原。在一些实施方案中，AAV上的抗原是衣壳蛋白。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV的表面上的VP1。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV的表面上的VP2。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV的表面的VP3。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合VP1和VP2二者。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合VP2和VP3二者。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合VP1和VP3二者。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合VP1、VP2和VP3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV上的抗原，其中AAV上的抗原不是天然存在的AAV蛋白。在一些实施方案中，抗原由AAV异源表达。在一些实施方案中，抗原存在于AAV的衣壳中。在一些实施方案中，抗原与AAV蛋白例如衣壳蛋白连接。
在一些实施方案中，抗原与AAV的至少一个VP1蛋白连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的5个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的4个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的3个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的2个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的VP1蛋白中的1个连接。在一些实施方案中，AAV包含一个不与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与抗原连接的VP1蛋白。
在一些实施方案中，抗原与AAV的至少一个VP2蛋白连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的5个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的4个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的3个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的2个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的VP2蛋白中的一个连接。在一些实施方案中，AAV包含一个不与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与抗原连接的VP2蛋白。
在一些实施方案中，抗原与AAV的至少一个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的每个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的一个亚组的VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约40个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约35个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约30个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约25个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约20个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约15个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约10个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约9个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约8个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约7个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约6个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约5个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约4个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约3个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的至少约2个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，抗原与AAV的1个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约2个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约3个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约4个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约5个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约10个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约15个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约20个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约25个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约30个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约35个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约40个不与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少约45个不与抗原连接的VP3蛋白。
在一些实施方案中，与抗原连接的VP3的数量比至少一个不与抗原连接的VP3蛋白的数量少至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍，至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍。
在某些实施方案中，AAV包含1个与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与抗原连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与抗原连接的VP2蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含3个与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含4个与抗原连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含5个与抗原连接的VP1蛋白。
在某些实施方案中，AAV包含1个与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含2个与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含3个与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含4个与抗原连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含5个与抗原连接的VP3蛋白。
本领域已知的任何抗原结合结构域/抗原配对都可用于本公开。在一些实施方案中，抗原是Fc，并且抗原结合结构域特异性结合Fc。在某些实施方案中，AAV，例如AAV的衣壳蛋白与Fc连接，并且支架蛋白与抗原结合结构域连接，其中抗原结合结构域特异性结合Fc。在一些实施方案中，Fc是IgG的Fc。在一些实施方案中，Fc是IgA的Fc。在一些实施方案中，Fc是IgE的Fc。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括鼠抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括嵌合抗体(例如，小鼠-人、小鼠-灵长类动物或灵长类动物-人单克隆抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括骆驼科抗体、鲨鱼IgNAR或抗独特型抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括骆驼科抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括鲨鱼IgNAR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗独特型抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括(scFv)2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fab’。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括F(ab')2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括F(ab1)2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括dAb。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fd片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括双抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括微型抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体相关多肽。在特定实施方案中，抗原结合结构域包括纳米抗体。
在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV的表面上的构象表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合AAV的表面上的抗原，所述抗原仅在AAV完整和/或具有感染性时存在。
II.C.4.iii.AAV受体
在某些方面，支架蛋白与AAV结合多肽缔合。在一些实施方案中，AAV结合多肽包含AAV受体。在一些实施方案中，支架蛋白通过AAV受体与AAV缔合。在一些实施方案中，AAV受体与支架蛋白连接。在一些实施方案中，AAV受体通过接头与支架蛋白连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的胞外结构域连接。
本领域已知的任何AAV受体或其AAV结合片段可与本文所述的支架蛋白连接。在某些实施方案中，AAV受体是由基因KIAA0319L编码的AAV受体，例如，AAV受体是AAVR(参见，例如，Pillay等人，Nature 530(7588):108-12(2016)，其通过引用以其整体并入)。AAVR是约150kDa的N-连接糖基化蛋白。全长AAVR是1型跨膜蛋白，其包含五个称为多囊肾病(PKD)结构域的Ig样结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD2结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述片段至少包含AAVR的PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述片段至少包含AAVR的PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述片段至少包含AAVR的PKD5结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述片段至少包含AAVR的PKD1结构域和PKD2结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1、PKD2和PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段至少包含AAVR的PKD1、PKD2、PKD3和PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，所述AAVR片段包含AAVR的PKD1、PKD2、PKD3、PKD4和PKD5结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD2结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD1结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域或PKD4结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域、PKD4结构域或PKD3结构域。在一些实施方案中，支架蛋白与AAVR片段连接，其中AAVR片段不包含PKD5结构域、PKD4结构域、PKD3结构域或PKD2结构域。
在一些实施方案中，受体是AAV的对接受体。在一些实施方案中，受体选自硫酸肝素蛋白聚糖、N-连接唾液酸、O-连接唾液酸、N-连接半乳糖、CD9、神经节苷脂GM1、LamR、EGFR、PDGFR、FGFR1、HGFR及其任意组合。
II.C.4.iv.化学诱导的二聚体
本公开的某些方面涉及包含AAV和支架蛋白的EV，其中AAV与化学诱导的二聚体的第一结合配偶体或二聚剂连接，并且支架蛋白与化学诱导的二聚体的第二结合配偶体或二聚剂连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的衣壳蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少一个VP1蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的5个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的4个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的3个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的2个VP1蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的VP1蛋白中的一个VP1蛋白连接。在一些实施方案中，AAV包含一个不与结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与结合配偶体连接的VP1蛋白。
在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少一个VP2蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的5个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的4个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的3个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的2个VP2蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的VP2蛋白中的一个连接。在一些实施方案中，AAV包含一个不与结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含两个不与结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含三个不与结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV包含四个不与结合配偶体连接的VP2蛋白。
在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少一个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的每个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的一个亚组的VP3蛋白的每个VP3蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约40个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约35个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约30个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约25个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约20个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约15个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约10个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约9个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约8个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约7个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约6个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约5个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约4个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约3个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的至少约2个VP3蛋白中的每一个连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体与AAV的VP3蛋白中的一个连接。在一些实施方案中，AAV包含至少一个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少2个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少3个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少4个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少5个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少10个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少15个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少20个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少25个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少30个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少35个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少40个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV包含至少45个不与结合配偶体连接的VP3蛋白。
在一些实施方案中，与第一结合配偶体连接的VP3的数量比至少一个不与结合配偶体连接的VP3蛋白的数量少至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍，至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍。
在某些实施方案中，AVV包含1个与第一结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AVV包含2个与第一结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AVV包含3个与第一结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AVV包含4个与第一结合配偶体连接的VP2蛋白。在一些实施方案中，AVV包含5个与第一结合配偶体连接的VP2蛋白。
在某些实施方案中，AVV包含1个与第一结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AVV包含2个与第一结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AVV包含3个与第一结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AVV包含4个与第一结合配偶体连接的VP1蛋白。在一些实施方案中，AVV包含5个与第一结合配偶体连接的VP1蛋白。
在某些实施方案中，AVV包含1个与第一结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含2个与第一结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含3个与第一结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含4个与第一结合配偶体连接的VP3蛋白。在一些实施方案中，AVV包含5个与第一结合配偶体连接的VP3蛋白。
在一些实施方案中，结合配偶体与衣壳蛋白的N端连接。在其它实施方案中，第一结合配偶体与衣壳蛋白的C端连接。在其它实施方案中，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白内，例如，在衣壳蛋白的N端与C端之间。在一些实施方案中，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白内。在某些实施方案中，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内、内环内，例如形成在衣壳蛋白表面上的环结构的一系列氨基酸内。在某些实施方案中，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内，紧接在氨基酸455(相对于SEQ ID NO:44的编号)的下游。在一些实施方案中，通过替换Gly453(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Thr454(相对于SEQ ID No:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Thr455(相对于SEQ ID No:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些方面，通过替换Thr456(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Gln457(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Ser458(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换Arg459(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在一些实施方案中，通过替换453GTTTQSR459(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入衣壳蛋白例如VP1、VP2和/或VP3内。在特定的实施方案中，通过替换Thr455(相对于SEQ IDNO:44的编号)，第一结合配偶体被插入至少一个VP3蛋白内，或者被插入其它AAV血清型的VP蛋白的同源区域内。在特定的实施方案中，通过替换453GTTTQSR459(相对于SEQ ID NO:44的编号)，第一结合配偶体被插入至少一个VP3蛋白内，或者被插入其它AAV血清型的VP蛋白的同源区域内。
第一结合配偶体可以与AAV的衣壳蛋白连接。在一些实施方案中，第一结合配偶体通过接头与衣壳连接。
在一些实施方案中，第二结合配偶体与支架蛋白连接。在一些实施方案中，AAV受体与支架蛋白连接。在一些实施方案中，AAV受体通过接头与支架蛋白连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，受体与支架蛋白的胞外结构域连接。
在一些实施方案中，与AAV衣壳蛋白连接的第一结合配偶体和与支架蛋白连接的第二结合配偶体选自化学诱导的二聚体的第一和第二结合配偶体，所述化学诱导的二聚体选自由以下组成的组：(i)FKBP和FKBP(FK1012)；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶A(CNA)(FK506)；(iii)FKBP和CyP-Fas(FKCsA)；(iv)FKBP和FRB(雷帕霉素)；(v)GyrB和GyrB(香豆霉素)；(vi)GAI和GID1(赤霉素)；(vii)Snap-tag和HaloTag(HaXS)；(viii)eDHFR和HaloTag(TMP-HTag)；以及(ix)BCL-xL和Fab(AZ1)(ABT-737)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FKBP连接，并且支架蛋白与FKBP连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FKBP连接，并且支架蛋白与钙调神经磷酸酶A(CNA)连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与钙调神经磷酸酶A(CNA)连接，并且支架蛋白与FKBP连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FKBP连接，并且支架蛋白与CyP-Fas连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与CyP-Fas连接，并且支架蛋白与FKBP连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FKBP连接，并且支架蛋白与FRB连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与FRB连接，并且支架蛋白与FKBP连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GyrB连接，并且支架蛋白与GyrB连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GAI连接，并且支架蛋白与GID1连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与GID1连接，并且支架蛋白与GAI连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与Snap-tag连接，并且支架蛋白与HaloTag连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与HaloTag连接，并且支架蛋白与Snap-tag连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与HaloTag连接，并且支架蛋白与eDHFR连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与eDHFR连接，并且支架蛋白与HaloTag连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与BCL-xL连接，并且支架蛋白与Fab(AZ1)连接。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白与Fab(AZ1)连接，并且支架蛋白与BCL-xL连接。
在特定的实施方案中，AAV包含至少一个与FRB连接的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其中FRB与衣壳蛋白的N端连接。在一些实施方案中，AAV包含至少一个与FRB连接的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其中FRB与衣壳蛋白的C端连接。在特定的实施方案中，AAV包含至少一个与FRB连接的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其中FRB被插入衣壳蛋白内。在一些实施方案中，FRB在本文公开的任何位置被插入衣壳蛋白中。
II.C.4.v.亲和剂
在一些实施方案中，支架蛋白与亲和剂连接。在一些实施方案中，亲和剂与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，亲和剂与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，亲和剂与支架蛋白的胞外结构域连接。在一些实施方案中，亲和剂包括AAV结合多肽。在一些实施方案中，亲和剂包括AAV受体。在一些实施方案中，亲和剂包括如本文所公开的抗体或抗原结合结构域。在一些实施方案中，亲和剂与一种或多种AAV衣壳蛋白结合。在一些实施方案中，一种或多种AAV衣壳蛋白是AAV组装激活蛋白。在一些实施方案中，亲和剂不与AAV衣壳蛋白单体结合。
在一些方面，亲和剂能够结合不止一种AAV血清型。在一些方面，亲和剂能够结合不止选自以下的AAV血清型：AAV 1型、AAV2型、AAV 3A型、AAV 3B型、AAV 4型、AAV 5型、AAV6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、Rh10、Rh74、AAV-2i8、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、合成AAV及其任意组合。在一些方面，亲和剂特异性结合AAV9血清型。在一些方面，亲和剂可以结合任何AAV血清型。在一些方面，亲和剂特异性结合AAV2血清型。在一些方面，亲和剂特异性结合AAV4血清型。在一些方面，亲和剂特异性结合AAV5血清型。
在一些实施方案中，亲和剂与AAV之间的相互作用是短暂的。在一些实施方案中，AAV在某些条件下与亲和剂解离。在某些实施方案中，亲和剂对AAV的亲和力取决于pH。在一些实施方案中，AAV在至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11或至少约12的pH下与亲和剂解离。在一些实施方案中，亲和剂对AAV的亲和力取决于包含AAV和亲和剂的溶液中的钙、镁、硫酸盐、磷酸盐或其任意组合的浓度。在一些实施方案中，亲和剂对AAV的亲和力取决于包含AAV和亲和剂的溶液的盐浓度和/或离子强度。在一些实施方案中，AAV和亲和剂在还原条件下是可离解的。
在一些实施方案中，支架蛋白与AAV结合多肽连接。在一些实施方案中，AAV结合多肽与支架蛋白的N端连接。在一些实施方案中，AAV结合多肽与支架蛋白的C端连接。在一些实施方案中，AAV结合多肽与支架蛋白的胞外结构域连接。
在一些实施方案中，AAV结合多肽包含抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括鼠抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括嵌合抗体(例如，小鼠-人、小鼠-灵长类动物或灵长类动物-人单克隆抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括骆驼科抗体、鲨鱼IgNAR或抗独特型抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括骆驼科抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括鲨鱼IgNAR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗独特型抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括(scFv)2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fab’。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括F(ab')2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括F(ab1)2。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括dAb。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单链Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fd片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括双抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括微型抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体相关多肽。在特定实施例中，抗原结合结构域包括纳米抗体。
II.D.接头
如上所述，本公开的EV(例如，外来体和纳米囊泡)可包含一种或多种接头，所述接头将第一元件与第二元件连接(例如，将支架蛋白与衣壳蛋白连接，将支架蛋白与结合配偶体连接，将衣壳蛋白与结合配偶体连接，将支架蛋白与纳米抗体连接，将支架蛋白与受体(例如，Fc受体)连接，将Fc与支架蛋白连接，将支架蛋白与抗原结合结构域连接，将AAVR与支架蛋白连接，将抗原与衣壳蛋白连接，将Fc与衣壳蛋白连接，或其做生意组合)。
接头可以是本领域已知的连接两个元件的任何化学部分。如本文所用，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面，可将两个或更多个接头串联连接。当存在多个接头时，每个接头可以相同或不同。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间障碍。接头通常不被裂解；然而，在某些方面，这种裂解可以是想要的。因此，在一些方面，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可以位于接头序列内或在接头序列任一端侧接接头。在一些方面，可裂解的接头允许释放AAV。
在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，肽接头可以包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个，至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
在一些实施方案中，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
接头可以容易被裂解(“可裂解的接头”)，从而促进AAV蛋白或支架蛋白的释放。在一些实施方案中，支架蛋白通过可裂解的接头与衣壳蛋白连接，其中可裂解的接头的裂解释放AAV。在一些实施方案中，如本文所述，支架蛋白通过可裂解的接头与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接，其中可裂解的接头的裂解从结合配偶体释放支架蛋白。在一些实施方案中，如本文所述，AAV的衣壳蛋白通过可裂解的接头与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接，其中可裂解的接头的裂解从结合配偶体释放衣壳蛋白。在一些实施方案中，支架蛋白通过可裂解的接头与纳米抗体连接，其中可裂解的接头的裂解从纳米抗体释放支架蛋白。在一些实施方案中，如本文所述，支架蛋白通过可裂解的接头与抗原结合结构域连接，其中可裂解的接头的裂解从抗原结合结构域释放支架蛋白。在一些实施方案中，如本文所述，支架蛋白通过可裂解的接头与受体(例如，Fc受体)连接，其中可裂解的接头的裂解从受体(例如，Fc受体)释放支架蛋白。在一些实施方案中，如本文所述，支架蛋白通过可裂解的接头与AAVR连接，其中可裂解的接头的裂解从AAVR释放支架蛋白。在一些实施方案中，如本文所述，AAV的衣壳蛋白通过可裂解的接头与抗原连接，其中可裂解的接头的裂解从抗原中释放衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV的衣壳蛋白通过可裂解的接头与Fc连接，其中可裂解的接头的裂解从Fc释放衣壳蛋白。
在一些方面，接头是“还原敏感型接头”在一些方面，还原敏感型接头包含二硫键。在一些方面，接头是“酸不稳定型接头”。在一些方面，酸不稳定型接头含有腙。合适的酸不稳定型接头还包括，例如，顺式乌头酸接头、酰肼接头、硫代氨甲酰基接头或其任意组合。
在一些方面，可裂解的接头包括二核苷酸或三核苷酸接头、二硫化物、亚胺、酮缩硫醇(thioketal)、val-cit二肽或其任意组合。
在一些方面，可裂解的接头包括缬氨酸-丙氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯、缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯或两者。
在一些方面，可裂解的接头包括氧化还原可裂解的接头、活性氧种类(ROS)可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶促可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化可裂解的接头、自消耗接头或其组合。涉及这些可裂解的接头中的一种或多种的其它公开内容将在下面进一步提供，并且在本领域中也是已知的，参见，例如US 2018/0037639 A1；Trout等人，79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)；Umemoto等人43Int.J.Cancer,677-684(1989)；Cancer Res.77(24):7027-7037(2017)；Doronina等人Nat.Biotechnol.21:778-784(2003)；US 7,754,681 B2；US 2006/0269480；US 2010/0092496；US 2010/0145036；US 2003/0130189；US 2005/0256030，其每一篇都通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，接头组合包括氧化还原可裂解的接头。在某些方面，这种接头可包含氧化还原可裂解的连接基团，所述连接基团在还原时或氧化时被裂解。
在一些方面，氧化还原可裂解的接头包含二硫键，即其为二硫化物可裂解的接头。在一些方面，可以例如通过细胞内硫醇、氧化酶、还原酶或其组合来还原氧化还原可裂解的接头。
在一些方面，接头组合可包含可裂解的接头，所述接头可被活性氧种类(ROS)诸如超氧化物(Of)或过氧化氢(H2O2)裂解，所述活性氧种类例如由炎症过程诸如活化的中性粒细胞产生。在一些方面，ROS可裂解的接头是酮缩硫醇可裂解的接头。参见，例如，美国专利8,354,455B2，其通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，接头是酸不稳定型接头，其包含酸可裂解的连接基团，所述连接基团是在酸性条件下(pH<7)被选择性裂解的连接基团。
在一些方面，酸可裂解的连接基团在酸性环境(例如，约6.0、约5.5、约5.0或更低)中被裂解。在一些方面，pH值为约6.5或更低。在一些方面，接头被诸如可作为通用酸的酶例如肽酶(其可以是底物特异性的)或磷酸酶的剂裂解。在细胞内，某些低pH值的细胞器，诸如内体和溶酶体，可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。虽然人血清的pH值为7.4，但细胞内的平均pH值略低，约为7.1至7.3。内体也有酸性pH，范围为5.5至6.0，并且溶酶体在甚至更加酸性的pH下约为5.0。因此，在本领域中，pH依赖性可裂解的接头有时被称为内体不稳定型接头(endosomically labile linker)。
在一些方面，酸可裂解的基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。在另一个非限制性实例中，当附接至酯氧(烷氧基)的碳附接至芳基、取代的烷基或叔烷基诸如二甲基戊基或叔丁基上时。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于胺、亚胺、氨基酯、苯甲酸亚胺、二原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、缩醛、乙烯基醚、腙、顺乌头酸盐、酰肼、硫代氨甲酰基、亚胺嗪(imizine)、叠氮甲基-甲基马来酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽的内溶剂、梓康酰基或其任意组合。二硫化物键联也容易受到pH值的影响。
在一些方面，接头包含低pH不稳定型腙键。这种酸不稳定型键已广泛用于缀合物领域，例如抗体-药物缀合物。参见，例如，Zhou等人，Biomacromolecules 2011,12,1460-7；Yuan等人，Acta Biomater.2008,4,1024-37；Zhang等人，Acta Biomater.2007,6,838-50；Yang等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.2007,321,462-8；Reddy等人，CancerChemother.Pharmacol.2006,58,229-36；Doronina等人，Nature Biotechnol.2003,21,778-84，其中每一篇都通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，接头包含选自以下的低pH不稳定型键：在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定以形成二醇和酮的缩酮；在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定以形成二醇和醛的缩醛；在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定以形成胺和醛或酮的亚胺或亚胺(iminium)；在酸性条件下不稳定的硅-氧-碳键联；硅-氮(硅氮烷)键联；硅-碳键联(例如芳基硅烷、乙烯基硅烷和烯丙基硅烷)；马来酸酯(由马来酸酐衍生物和胺合成的酰胺键)；原酸酯；腙；设计用于进行酸催化的水解的活化羧酸衍生物(例如，酯、酰胺)；或乙烯基醚。
其它实例可见于美国专利第9,790,494B2号和第8,137,695B2号，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，接头组合可包含可被细胞内或细胞外酶例如蛋白酶、酯酶、核酸酶、酰胺酶裂解的接头。能够裂解接头组合中特定接头的酶的范围取决于接头的特定键和化学结构。因此，肽接头可被例如肽酶(peptidade)裂解，含有酯键联的接头可被例如酯酶裂解；含有酰胺键联的接头可被例如酰胺酶(amidade)裂解；等等。
一些接头被酯酶裂解(“酯酶可裂解的接头”)。只有某些酯能被存在于细胞内部或外部的酯酶和酰胺酶裂解。酯是由羧酸和醇缩合而形成的。简单酯是用简单的醇，诸如脂肪醇，和小的环状醇和小的芳族醇产生的酯。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。
在一些方面，接头组合可包括基于磷酸的可裂解的连接基团，所述基团被降解或水解磷酸基团的剂裂解。裂解细胞内磷酸基团的剂的实例是酶，诸如细胞内磷酸酶。基于磷酸的连接基团的实例是—O—P(O)(OR k)—O—、—O—P(S)(ORk)—O—、—O—P(S)(SRk)—O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-SP(S)(ORk)-O-、-OP(O)(Rk)-O-、-OP(S)(Rk)-O-、-SP(O)(Rk)-O-、-SP(S)(Rk)-O-、-SP(O)(Rk)-S-或-OP(S)(Rk)-S-。
在某些方面，Rk是以下中的何一种：NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳氧基。在一些方面，C1-6烷基和C6-10芳基是未取代的。其它非限制性实例包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-SP(S)(H)-O-、-SP(O)(H)-S-、-OP(S)(H)-S-或-O-P(O)(OH)–O-。
在一些方面，组合接头包括光活化的可裂解的接头，例如硝基苄基接头或包含硝基苄基反应性基团的接头。
在一些方面，接头包括非可裂解的接头。
III.用于生产工程化外来体的生产者细胞
本公开的EV(例如，外来体)可从体外生长的细胞或受试者的体液中产生。当从体外细胞培养物产生外来体时，可使用各种生产者细胞，例如，HEK293细胞、CHO细胞和MSC。在某些实施方案中，生产者细胞不是树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞、源自这些细胞中的任一种的细胞或其任意组合。
生产者细胞可被遗传修饰以包含一个或多个外源序列(例如，编码AAV、支架蛋白或治疗性蛋白)来产生本文所述的外来体。经遗传修饰的生产细胞可通过瞬时或稳定转化来包含外源序列。外源序列可被转化为质粒。可将外源序列在靶向位点处或随机位点中稳定地整合到生产者细胞的基因组序列中。在一些实施方案中，产生稳定的细胞系以用于生产腔工程化外来体。
可将外源序列插入生产者细胞的基因组序列中，位于编码外来体蛋白的内源序列内、其上游(5’-末端)或下游(3’-末端)。本领域已知的各种方法可用于将外源序列引入生产者细胞。例如，使用各种基因编辑方法(例如，使用同源重组、转座子介导的系统、loxP-Cre系统、CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修饰的细胞在本公开的范围内。
外源序列可以包含编码本文公开的支架蛋白或其片段或变体的序列。可引入额外拷贝的编码支架蛋白的序列以产生本文所述的外来体(例如，在EV(例如，外来体)的表面上，例如在腔表面和/或外表面上具有更高密度的支架蛋白)。可引入编码支架蛋白的修饰或片段的外源序列，以产生含有支架蛋白的该修饰或支架蛋白的片段的腔工程化和/或表面工程化外来体。
在一些实施方案中，可用一种或多种载体修饰(例如，转染)生产者细胞，所述载体编码与AAV的衣壳蛋白、AAV受体、化学诱导的二聚体的结合配偶体、抗原结合结构域(例如，纳米抗体)、Fc受体或其任意组合连接的支架蛋白。
在一些实施方案中，本文公开的生产者细胞被进一步修饰以包含附加的外源序列。例如，可以引入附加的外源序列来调节内源基因表达，或产生包含有效载荷(例如，AAV)的外来体。在一些实施方案中，生产者细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码支架蛋白或其变体或片段，另一个编码有效载荷(例如，AAV)。在某些实施方案中，生产者细胞可被进一步修饰以包含赋予外来体附加的功能性的附加外源序列。在一些实施方案中，生产者细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码本文公开的支架蛋白或其变体或片段，另一个编码AAV。在一些实施方案中，生产者细胞被进一步修饰以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个附加的外源序列。
本文所述的任何支架部分都可以从质粒、插入基因组的外源序列或其它外源核酸(诸如合成信使RNA(mRNA))表达。
在一些实施方案中，EV和AAV由单个细胞或单个细胞类型群产生。在一些实施方案中，EV由第一细胞(或第一细胞群)产生，并且AAV由第二细胞(或第二细胞群)产生。在一些实施方案中，第一细胞和第二细胞是同一类型的细胞。在一些实施方案中，第一细胞和第二细胞不是同一类型的细胞。
IV.药物组合物
本文提供了呈适合向受试者施用的形式的药物组合物，其包含具有所需纯度的本公开的EV(例如，外来体)和药学上可接受的载剂或赋形剂。药学上可接受的赋形剂或载剂可以部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，有很多种合适的药物组合物制剂，其包含多种细胞外囊泡。(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.第21版(2005))。药物组合物通常是无菌配制的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规程。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本文所述的外来体。在某些实施方案中，将EV(例如，外来体)与一种或多种附加的治疗剂于药学上可接受的载剂中共施用。在一些实施方案中，在施用附加的治疗剂之前，施用包含EV(例如，外来体)的药物组合物。在其它实施方案中，在施用附加的治疗剂之后，施用包含EV(例如，外来体)的药物组合物。在另外的实施方案中，将包含EV(例如，外来体)的药物组合物与附加的治疗剂同时施用。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苯乙铵；苯酚、丁醇或苄醇)；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或化合物与本文所述的细胞外囊泡不相容，否则考虑其于组合物中的使用。还可将补充治疗剂并入组合物中。通常，将药物组合物配制成可与其预期施用途径相容。EV(例如，外来体)可通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、肌内途径施用或作为吸入剂施用。在某些实施方案中，静脉内施用(例如通过注射)包含外来体的药物组合物。可将EV(例如，外来体)任选地与在治疗所述EV(例如，外来体)所要治疗的疾病、病症或疾患方面至少部分有效的其它治疗剂联合施用。
溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的化合物诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可将制剂封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的话)或分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。组合物通常是无菌的并且具有达到容易注射的程度的流动性。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。微生物作用的防止可通过各种抗细菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。如果需要，可向组合物中加入等渗化合物，例如，糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
可按需要，通过将有效量的EV(例如，外来体)与本文列举的成分中的一种或其组合并入合适的溶剂中来制备无菌注射溶液。一般地，通过将EV(例如，外来体)并入含有基础分散介质和任何所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其预先无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。可将EV(例如，外来体)以贮库注射或植入制剂的形式施用，所述制剂可以以允许EV(例如，外来体)的持续或脉冲释放的方式配制。
包含外来体的组合物的全身性施用还可通过经粘膜手段来进行。对于经粘膜施用，制剂中使用对于待穿透屏障合适的渗透剂。此类渗透剂在本领域中是众所周知的，且例如对于经粘膜施用包括去垢剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜施用可通过使用例如鼻喷雾剂来实现。
在某些实施方案中，将包含外来体的药物组合物静脉内施用到可受益于该药物组合物的受试者中。在某些其它实施方案中，将所述组合物例如通过淋巴内注射或通过结节内注射(参见例如Senti等人，PNAS 105(46):17908(2008))或者通过肌内注射、通过皮下施用、通过瘤内注射、通过直接注射到胸腺或肝脏中来施用至淋巴系统。
在某些实施方案中，将包含外来体的药物组合物作为液体悬浮液施用。在某些实施方案中，将药物组合物以能够在施用后形成贮库的制剂形式施用。在某些优选实施方案中，贮库将EV(例如外来体)缓慢地释放到循环中，或者保持贮库形式。
通常，药学上可接受的组合物是高度纯化的，不含污染物，是生物相容的且无毒的，并且适于向受试者施用。如果水是载剂的成分，则水被高度纯化并处理成不含污染物，例如内毒素。
药学上可接受的载剂可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、增味剂、乳化剂、混悬剂和/或防腐剂。
本文所述的药物组合物包含本文所述的EV(例如，外来体)以及任选的药物活性剂或治疗剂。治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。
提供了包含药物组合物的剂型，所述药物组合物包含本文所述的EV(例如，外来体)。在一些实施方案中，剂型被配制成用于静脉内注射的液体混悬剂。在一些实施方案中，剂型被配制成用于瘤内注射的液体混悬剂。
在某些实施方案中，使外来体的制剂经受辐射，例如X射线、γ射线、β粒子、α粒子、中子、质子、元素核、紫外线，以便破坏残余的有复制能力的核酸。
在某些实施方案中，使用大于约1kGy、约5kGy、约10kGy、约15kGy、约20kGy、约25kGy、约30kGy、约35kGy、约40kGy、约50kGy、约60kGy、约70kGy、约80kGy、约90kGy、约100kGy或大于约100kGy的辐射剂量对外来体的制剂进行γ辐射。
在某些实施方案中，使用大于约0.1mSv、约0.5mSv、约1mSv、约5mSv、约10mSv、约15mSv、约20mSv、约25mSv、约30mSv、约35mSv、约40mSv、约50mSv、约60mSv、约70mSv、约80mSv、约90mSv、约100mSv、约200mSv、约300mSv、约400mSv、约500mSv、约600mSv、约700mSv、约800mSv、约900mSv、约1000mSv、约2000mSv、约3000mSv、约4000mSv、约5000mSv、约6000mSv、约7000mSv、约8000mSv、约9000mSv、约10000mSv或大于约10000mSv的辐射剂量对外来体的制剂进行X射线辐射。
V.药盒
本文还提供了包含一种或多种本文所述外来体的药盒。在一些实施方案中，本文提供了药物包或药盒，其包括一个或多个装有本文所述药物组合物的一种或多种成分(诸如本文提供的一种或多种外来体)的容器、任选的使用说明。在一些实施方案中，药盒包含本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，诸如本文所述的那些。
VI.产生外来体的方法
在一些方面，本公开还涉及产生本文所述的外来体的方法。在一些实施方案中，该方法包括：从生产者细胞获得EV(例如，外来体)，以及任选地分离获得的EV(例如，外来体)。在一些实施方案中，该方法包括：通过引入本文公开的外来体的两种或多种组分(例如，支架蛋白和AAV蛋白)来修饰生产者细胞；从经修饰的生产者细胞获得EV(例如，外来体)；以及任选地分离获得的EV(例如，外来体)。在另外的实施方案中，该方法包括：从生产者细胞获得外来体；分离获得的外来体；以及修饰分离的外来体(例如，通过插入AAV)。在某些实施方案中，该方法还包括将分离的外来体配制成药物组合物。
VI.A.修饰生产者细胞的方法
如上所述，在一些实施方案中，产生外来体的方法包括用一个或多个部分(例如，支架蛋白和/或AAV)修饰生产者细胞。在某些实施方案中，一个或多个部分包括AAV。在一些实施方案中，所述一个或多个部分还包括本文公开的支架蛋白。
在一些实施方案中，生产者细胞可以是哺乳动物细胞系、植物细胞系、昆虫细胞系、真菌细胞系或原核细胞系。在某些实施方案中，生产者细胞是哺乳动物细胞系。哺乳动物细胞系的非限制性实例包括：人胚胎肾(HEK)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT-1080细胞系、HeLa细胞系、PERC-6细胞系、CEVEC细胞系、成纤维细胞细胞系、羊水细胞细胞系、上皮细胞系、间充质干细胞(MSC)细胞系及其组合。在某些实施方案中，哺乳动物细胞系包括HEK-293细胞、BJ人包皮成纤维细胞、fHDF成纤维细胞、
Figure BDA0003414407670001671
神经元前体细胞、
Figure BDA0003414407670001672
羊水细胞、脂肪间充质干细胞、RPTEC/TERT1细胞或其组合。在一些实施方案中，生产者细胞是原代细胞。在某些实施方案中，原代细胞可以是原代哺乳动物细胞、原代植物细胞、原代昆虫细胞、原代真菌细胞或原代原核细胞。
在一些实施方案中，生产者细胞不是免疫细胞，诸如抗原呈递细胞、T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、T辅助细胞或调节性T细胞(Treg细胞)。在其它实施方案中，生产者细胞不是抗原呈递细胞(例如，树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞或来源于任何此类细胞的细胞)。
在一些实施方案中，一个或多个部分可以是转基因或mRNA，并通过转染、病毒转导、电穿孔、挤压、超声处理、细胞融合或本领域技术人员已知的其它方法引入生产者细胞。
在一些实施方案中，通过转染将一个或多个部分引入生产细胞。在一些实施方案中，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分引入合适的生产细胞(Papapetrou等人，Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。在一些实施方案中，阳离子脂质通过电荷相互作用与一个或多个部分形成复合物。在这些实施方案中的一些中，带正电荷的复合物与带负电荷的细胞表面结合，并被细胞通过内吞作用吸收。在一些其它实施方案中，阳离子聚合物可用于转染生产者细胞。在这些实施方案中的一些中，阳离子聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。在某些实施方案中，诸如磷酸钙、环糊精或聚芳烃等的化学物质可用于将一个或多个部分引入生产者细胞。还可使用物理方法将一个或多个部分引入生产者细胞，所述物理方法为诸如粒子介导的转染、“基因枪”、生物弹道技术(biolistics)或粒子轰击技术(Papapetrou等人，Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。报告基因诸如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白可用于评估生产者细胞的转染效率。
在某些实施方案中，通过病毒转导将一个或多个部分引入生产者细胞。许多病毒可用作基因转移媒介物，包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒和泡沫病毒(spumavirus)。病毒介导的基因转移媒介物包括基于DNA病毒诸如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒的载体以及基于逆转录病毒的载体。
在某些实施方案中，通过电穿孔将一个或多个部分引入生产者细胞。电穿孔在细胞膜中产生短暂的孔，允许各种分子引入细胞。在一些实施方案中，在一些方面，可通过电穿孔将DNA和RNA以及多肽和非多肽治疗剂引入生产者细胞。
在某些实施方案中，通过显微注射将一个或多个部分引入生产者细胞。在一些实施方案中，可将玻璃微量移液器用于在显微水平上将一个或多个部分注射到生产者细胞中。
在某些实施方案中，通过挤压将一个或多个部分引入生产者细胞。
在某些实施方案中，通过超声处理将一个或多个部分引入生产者细胞。在一些实施方案中，将生产者细胞暴露于高强度声波，引起细胞膜的瞬时破坏，从而允许装载一个或多个部分。
在某些实施方案中，通过细胞融合将一个或多个部分引入生产者细胞。在一些实施方案中，通过电细胞融合引入一个或多个部分。在其他实施方案中，将聚乙二醇(PEG)用于融合生产者细胞。在另外的实施方案中，将仙台病毒用于融合生产者细胞。
在一些实施方案中，通过低渗裂解将一个或多个部分引入生产者细胞。在此类实施方案中，可将生产者细胞暴露于低离子强度缓冲液，所述低离子强度缓冲液导致它们破裂，从而允许装载一个或多个部分。在其它实施方案中，针对低渗溶液的受控透析可用于使生产者细胞膨胀并在生产者细胞膜中产生孔。随后将生产者细胞暴露于允许膜重新密封的条件下。
在一些实施方案中，通过去垢剂处理将一个或多个部分引入生产者细胞。在某些实施方案中，用温和去垢剂处理生产者细胞，所述去垢剂通过产生孔而暂时损伤生产者细胞膜，从而允许装载一个或多个部分。在对生产者细胞进行装载后，洗掉去垢剂，从而重新密封膜。
在一些实施方案中，通过受体介导的内吞作用将一个或多个部分引入生产者细胞。在某些实施方案中，生产者细胞具有表面受体，其在结合一个或多个部分时诱导受体和相关部分的内化。
在一些实施方案中，通过过滤将一个或多个部分引入生产者细胞。在某些实施方案中，可将生产者细胞和一个或多个部分强制通过孔径小于生产者细胞的过滤器，从而引起生产者细胞膜的暂时破坏并允许一个或多个部分进入生产者细胞。
在一些实施方案中，使生产者细胞经历几次冻融循环，导致细胞膜破裂，从而允许装载一个或多个部分。
VI.B.修饰外来体的方法
在一些实施方案中，产生外来体的方法包括通过将一个或多个部分直接引入EV来修饰分离的外来体。在某些实施方案中，一个或多个部分包括AAV。在一些实施方案中，一个或多个部分包括本文公开的支架蛋白。
在某些实施方案中，通过转染将一个或多个部分引入外来体。在一些实施方案中，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分引入EV(Papapetrou等人，Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。在某些实施方案中，诸如磷酸钙、环糊精或聚凝胺的化学物质可用于将一个或多个部分引入EV。
在某些实施方案中，通过电穿孔将一个或多个部分引入EV。在一些实施方案中，将外来体暴露于电场，所述电场在EV膜中导致瞬时孔，从而允许装载一个或多个部分。
在某些实施方案中，通过显微注射将一个或多个部分引入EV。在一些实施方案中，可将玻璃微量移液器用于在显微水平上将一个或多个部分直接注射到EV中。
在某些实施方案中，通过挤出将一个或多个部分引入EV。
在某些实施方案中，通过超声处理将一个或多个部分引入EV。在一些实施方案中，将EV暴露于高强度声波，导致EV膜的瞬时破坏，从而允许装载一个或多个部分。
在一些实施方案中，可将一个或多个部分与EV的表面缀合。通过本领域已知的方法，可以化学地或酶促地实现缀合。
在一些实施方案中，EV包含一个或多个化学缀合的部分。化学缀合可通过在使用或不使用接头的情况将一个或多个部分与另一个分子的共价键合来完成。此类缀合物的形成在技术人员的技能范围内，并且已知各种技术来实现缀合，其中具体技术的选择由待缀合的材料来指导。在某些实施方案中，将多肽与EV缀合。在一些实施方案中，将非多肽，诸如脂质、碳水化合物、核酸和小分子与EV缀合。
在一些实施方案中，通过低渗裂解将一个或多个部分引入EV。在此类实施方案中，可将EV暴露于低离子强度缓冲液，所述低离子强度缓冲液导致它们破裂，从而允许装载一个或多个部分。在其它实施方案中，针对低渗溶液的受控透析可用于使EV膨胀并在EV膜中产生孔。随后将EV暴露于允许膜重新密封的条件下。
在一些实施方案中，通过去垢剂处理将一个或多个部分引入EV。在某些实施方案中，用温和去垢剂处理细胞外囊泡，所述去垢剂通过产生孔而暂时损伤EV膜，从而允许装载一个或多个部分。在对EV进行装载后，洗掉去垢剂，从而重新密封膜。
在一些实施方案中，通过受体介导的内吞作用将一个或多个部分引入EV。在某些实施方案中，EV具有表面受体，其在结合一个或多个部分时诱导受体和相关部分的内化。
在一些实施方案中，通过机械熔结(mechanical firing)将一个或多个部分引入EV。在某些实施方案中，可用一个或多个附接至重或带电粒子诸如金微载体的部分轰击细胞外囊泡。在这些实施方案中的一些中，粒子可以被机械或电加速，使得其穿过EV膜。
在一些实施方案中，使细胞外囊泡经历几次冻融循环，导致EV膜破裂，从而允许装载一个或多个部分。
VI.C.分离EV(例如，外来体)的方法
在一些实施方案中，本文公开的产生EV的方法包括从生产细胞中分离EV。在某些实施方案中，由生产者细胞释放到细胞培养基中的EV。预计所有已知的分离EV的方式都被认为适用于本文。例如，EV的物理性质可用于将它们从介质或其它源材料中分离出来，包括基于电荷(例如，电泳分离)、尺寸(例如，过滤、分子筛选等)、密度(例如，规则或梯度离心)、Svedberg常数(例如，利用或不利用外力的沉降等)的分离。可选地或另外地，分离可基于一种或多种生物学特性，并且包括可使用表面标志物的方法(例如，用于沉淀、与固相的可逆结合、FACS分离、特异性配体结合、非特异性配体结合、亲和力纯化等)。
分离和富集可以以一般和非选择性方式(通常包括连续离心)进行。另选地，分离和富集可以以更加特异和具选择性的方式(诸如，使用EV或生产者细胞特异性表面标志物)进行。例如，特异性表面标志物可用于免疫沉淀、FACS分选、亲和纯化和利用珠粒结合的配体进行的磁性分离。
在一些实施方案中，尺寸排阻色谱法可用于分离EV。尺寸排阻色谱技术是本领域已知的。本文提供了示例性非限制性技术。在一些实施方案中，分离空隙体积级分，其包含目标EV。此外，在一些实施方案中，如本领域所公知的，可在通过离心技术(对一种或多种色谱级分)进行色谱分离后，进一步分离EV。在一些实施方案中，例如，可将密度梯度离心用于进一步分离细胞外囊泡。在某些实施方案中，可能需要进一步将生产者细胞来源的EV与其它来源的EV分离。例如，通过使用对生产者细胞特异的抗原抗体的免疫吸附捕获，可将生产者细胞来源的EV与非生产者细胞来源的EV分离。
在一些实施方案中，EV的分离可涉及方法的组合，所述方法包括但不限于差速离心、基于尺寸的膜过滤、免疫沉淀、FACS分选和磁力分离。
VII.治疗方法
本公开还提供了预防和/或治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文公开的EV。在一些实施方案中，可以用本发明方法治疗的疾病或病症包括癌症、血友病、糖尿病、生长因子缺乏症、眼病、庞佩氏病、戈谢病、溶酶体贮积病症、粘液粘稠病、囊性纤维化、杜兴和贝克尔肌营养不良症、转甲状腺素蛋白淀粉样变性、血友病A、血友病B、腺苷脱氨酶缺乏症、莱伯先天性黑蒙(Leber’s congenital amaurosis)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良症、异染性脑白质营养不良症、OTC缺乏症、糖原贮积症1A病、Criggler-Najjar综合征、1型原发性高草酸尿症、急性间歇性卟啉症、苯丙酮尿症、家族性高胆固醇血症、VI型粘多糖贮积症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、Retts综合征、Dravet综合征、Angelman综合征、DM1病、脆性X病、亨廷顿病、弗里德赖希共济失调(Friedreichs ataxia)、CMT病(也称为夏科-马里-图斯病、遗传性运动和感觉神经病(HMSN)，或腓骨肌萎缩症)、CMT1X病、儿茶酚胺能多形性室性心动过速、脊髓小脑共济失调3型(SCA3)病、肢带型肌营养不良或高胆固醇血症。在一些实施方案中，治疗是预防性的。
在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症。在一些实施方案中，癌症是晚期、局部晚期或转移性的。在一些实施方案中，癌症是复发性的。在一些实施方案中，癌症对先前的疗法例如先前标准的护理疗法是难治的。
在一些实施方案中，疾病或病症与凝血因子缺乏相关联。在一些实施方案中，疾病或病症是出血性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是血友病。在一些实施方案中，疾病或病症是A型血友病。在一些实施方案中，疾病或病症是B型血友病。在一些实施方案中，疾病或病症是血管性血友病。
在某些方面，疾病或病症是神经变性疾病。在一些方面，神经变性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、朊病毒病、运动神经元病、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩及其任意组合。
在某些方面，疾病或病症包括肌营养不良。在一些方面，肌营养不良选自杜氏型肌营养不良症(DMD)、肌强直性肌营养不良症、面肩胛肱型肌营养不良症(FSHD)、先天性肌营养不良症、肢带型肌营养不良症(包括但不限于LGMD2B、LGMD2D、LGNMD2L、LGMD2C、LGMD2E和LGMD2A)及其任意组合。在某些方面，AAV包含
在一些方面，所述疾病或病症选自AADC缺乏症(CNS)、ADA-SCID、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、β-地中海贫血(严重镰状细胞)、癌症(头颈部鳞状细胞)、Niemman-Pick C型疾病、脑ALD症、脉络膜缺失症(Choroideremia)、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜氏肌营养不良症(DMD)、法布里病、青光眼、神经胶质瘤(癌症)、A型血友病、B型血友病、HoFH(高胆固醇血症)、亨廷顿病、脂蛋白脂肪酶缺乏症、Leber遗传性视神经病变(LHON)、异染性脑白质病变(Metachromatic leukodystrophy)、MPS I(Hurler综合征)、MPS II(Hunter综合征)、MPSIII(Sanfilippo综合征)、帕金森氏病、Pompe病、隐性营养不良性大疱性表皮松解症、RPE65缺乏症(视力丧失)、脊髓性肌萎缩症(SMA I)、湿性AMD(视网膜疾病)、Wiskott Aldrich综合征(WAS)、粘多糖贮积症IIIA型(MPS IIIA)、X连锁肌管肌病、X连锁视网膜色素变性及其任意组合。
在一些方面，疾病或病症选自肾病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、肾病性肾小球肾炎、细菌性或病毒性肾小球肾炎、IgA肾病、亨-舍二氏过敏性紫癜(Henoch-SchonleinPurpura)、膜性增生性肾小球肾炎、膜性肾病、Sjogren综合征、肾病综合征微小病变(nephrotic syndrome minimal change disease)、局灶性肾小球硬化和相关病症、急性肾衰竭、急性肾小管间质性肾炎、肾盂肾炎、GU道炎性疾病、子痫前期(Pre-clampsia)、肾移植排斥、麻疯病、反流性肾病、肾结石、遗传性肾病、髓样囊性肾病、髓质海绵肾病、多囊肾病，常染色体显性多囊肾病、常染色体隐性多囊肾病、结节性硬化症、冯·希佩尔-林道病(vonHippel-Lindau disease)、家族性薄肾小球基底膜病、III型胶原肾小球病、纤连蛋白肾小球病、阿尔波特综合征(Alport's syndrome)、法布里病、指甲-髌骨综合征、先天性泌尿系统异常、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、淀粉样变性和相关病症、发热性疾病、家族性地中海热、HIV感染-AIDS、炎症性疾病、系统性血管炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、多动脉炎、坏死性和中央性肾小球肾炎、多发性肌炎-皮肌炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、痛风、血液病症、镰状细胞病、血栓性血小板减少性紫癜、范科尼综合征(Fanconi's syndrome)、移植、急性肾损伤、肠易激综合征、溶血性尿毒症综合征、急性皮质坏死、肾血栓栓塞、创伤和手术、广泛损伤、烧伤、腹部和血管手术、麻醉诱导、药物使用或药物滥用的副作用、循环系统疾病心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、高血压、冠心病、非动脉粥样硬化性心血管疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、皮肤病、银屑病、系统性硬化症、呼吸性疾病、COPD、阻塞性睡眠呼吸暂停、高海拔低血或内分泌疾病、肢端肥大症、糖尿病和尿崩症或其任意组合。
在一些方面，疾病或疾患包括癌症，例如选自以下的癌症：肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、胃肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿器癌和膀胱癌、黑色素瘤、白血病、脑癌(例如，神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤和具有两种或多种细胞类型混合物的肿瘤，称为混合胶质细胞瘤)、听神经瘤(神经鞘瘤(Neurilemmoma)、许旺细胞瘤、神经鞘瘤(Neurinoma))、腺瘤、星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、巨细胞星形细胞瘤、中高级星形细胞瘤、复发性肿瘤、脑干神经胶质瘤、脊索瘤、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤(原发性恶性淋巴瘤)、囊肿、皮样囊肿、表皮样囊肿、颅咽管瘤、室管膜瘤、间变性室管膜瘤、神经节细胞瘤(Gangliocytoma)(神经节细胞瘤(Ganglioneuroma))、神经节细胞胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、恶性星形细胞瘤、神经胶质瘤、血管母细胞瘤、不能手术的脑肿瘤、淋巴瘤、髓母细胞瘤(MDL)、脑膜瘤、转移性脑肿瘤、混合性神经胶质瘤、神经纤维瘤病、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、松果体区肿瘤、垂体腺瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、脊柱肿瘤、室管膜下瘤和结节性硬化症(布尔奈维尔病)及其任意组合。
在一些实施方案中，疾病或与生长因子缺乏相关联。在一些实施方案中，生长因子选自由以下组成的组：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)(例如，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7)、睫状神经营养因子家族成员(例如，睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL-6))、集落刺激因子(例如，巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、表皮生长因子(EGF)、肝配蛋白(例如，肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)(如FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23)、胎牛促生长素(FBS)、GDNF家族成员(例如，神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(neurturin)、persephin、artemin)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤来源的生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(例如，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)或IGF-2)、白细胞介素(IL)(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7)、角质形成细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP或肝细胞生长因子样蛋白(HGFLP))、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经调节蛋白(例如，神经调节蛋白1(NRG1)、NRG2、NRG3、NRG4)、神经营养因子(例如，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、NT-4、胎盘生长因子(PGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肾胺酶(RNLS)、T细胞生长因子(TCGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子(例如，转化生长因子α(TGF-α)、TGF-β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)。
在一些实施方案中，疾病或病症是糖尿病。在一些实施方案中，疾病或病症是眼疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是脉络膜缺失症(CHM)。
在一些实施方案中，向受试者的循环系统中静脉内施用EV。在一些实施方案中，将EV于合适的液体中输注，并施用到受试者的静脉中。
在一些实施方案中，向受试者的循环系统动脉内施用EV。在一些实施方案中，将EV于合适的液体中输注，并施用到受试者的动脉中。
在一些实施方案中，通过鞘内施用向受试者施用EV。在一些实施方案中，通过向椎管内或蛛网膜下腔内注射的方式施用EV，使其到达脑脊液(CSF)。
在一些实施方案中，向受试者的一个或多个肿瘤瘤内施用EV。
在一些实施方案中，通过鼻内施用向受试者施用EV。在一些实施方案中，可以以局部施用或全身性施用的形式通过鼻吹入EV。在某些实施方案中，以鼻喷雾剂的形式施用EV。
在一些实施方案中，通过腹膜内施用向受试者施用EV。在一些实施方案中，将EV于合适的液体中输注，并注射到受试者的腹膜中。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV分布到淋巴管。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV分布到胸腺、脾脏和/或骨髓。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV分布到一个或多个淋巴结。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV分布到颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、纵隔淋巴结或胸骨淋巴结中的一种或多种。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV分布到胰腺。
在一些实施方案中，通过眼周施用向受试者施用EV(例如，外来体)。在一些实施方案中，将s注射到眼周组织中。眼周药物施用包括结膜下施用、前Tenon囊下施用、后Tenon囊下施用和眼球后施用的途径。
在一些实施方案中，眼内施用EV(例如，外来体)。因此，本公开提供了治疗有需要的受试者的眼病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的包含本公开的细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)的组合物，所述细胞外囊泡包含有效载荷(例如，AVV)，其中组合物的施用是眼内的。
在一些实施方案中，眼内施用选自由以下组成的组：玻璃体内施用、前房内施用、结膜下施用、视网膜下施用、巩膜下施用、脉络膜内施用及其任意组合。在一些实施方案中，眼内施用包括注射本公开的EV，例如外来体。在一些实施方案中，眼内施用是玻璃体内注射。
在一些实施方案中，眼内施用包括植入递送装置，该递送装置包括本公开的EV(例如，外来体)。在一些实施方案中，递送装置是眼内递送装置。在一些实施方案中，眼内递送装置是可生物降解的。在一些实施方案中，眼内递送装置是玻璃体内植入物或巩膜塞。在一些实施方案中，递送装置是持续释放递送装置。
在一些实施方案中，在眼内施用之前，用静脉内免疫球蛋白(IVIg)预处理包含本公开的EV(例如，外来体)的组合物。
在一些实施方案中，眼病或病症选自由以下组成的组：黄斑变性、白内障、糖尿病性视网膜病、青光眼、弱视、斜视、视网膜病变或其任意组合。在一些实施方案中，眼病或病症是例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成(CNV)、视网膜脱离、糖尿病性视网膜病、视网膜色素上皮萎缩、视网膜色素上皮肥大、视网膜静脉阻塞(RVO)疾病、感染、眼内肿瘤、眼外伤、干眼、结膜炎、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病(ROP)、脉络膜视网膜静脉阻塞、黄斑水肿、前新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜下水肿、囊样黄斑水肿、黄斑孔、血管纹、色素视网膜炎、斯图加特病、炎症性眼病、难治性眼异常、圆锥角膜、激光诱发的AMD、视神经病变或老年性白内障。
在一些实施方案中，眼病或病症是眼癌。在一些实施方案中，眼癌是继发性眼癌(例如，由于乳腺癌或肺癌转移)。在一些实施方案中，眼癌是视网膜母细胞瘤、眼内黑色素瘤(例如，虹膜、脉络膜或睫状体的葡萄膜黑色素瘤，或结膜黑色素瘤)、非霍奇金原发性眼内淋巴瘤、髓上皮瘤、脉络膜血管瘤、脉络膜转移瘤、脉络膜痣、脉络膜骨瘤、结膜卡波西氏肉瘤、眼球上皮样瘤、睑裂黄斑、翼状胬肉、鳞状细胞癌或结膜上皮内瘤形成。
在一些实施方案中，AMD是视网膜疾病的任何阶段，包括但不限于2类(早期)、3类(中期)和4类(晚期)AMD。
在一个实施方案中，AMD通常分为两种类型：干型和湿型。术语“干型”是指一种类型的AMD，其中视网膜的改变伴随着黄斑下小的黄色沉积物(玻璃疣(drusen))的形成。在一些实施方案中，干型AMD通常伴随有脉络膜毛细血管萎缩、纤维化、布鲁赫增厚和由于视网膜色素上皮萎缩引起的黄斑萎缩。
术语“湿型”是指具有在黄斑周围视网膜下发生的血管异常的AMD。异常的血管，当破裂和出血时，会损伤黄斑并使黄斑脱离其基底。湿性AMD的症状包括布鲁赫膜破坏、玻璃膜、脉络膜新生血管形成(CNV)、血管侵入视网膜下脉络膜，随后是浆液性或出血性圆环。这包括但不限于黄斑视网膜色素上皮下或上皮下血管侵入，这导致板状脱离并最终成为盘状疤痕。根据临床发现，萎缩型也可以变为湿型。
在一些实施方案中，湿型AMD也被称为脉络膜新血管形成(“CNV”)。CNV(或湿型)可被进一步分为“经典”CNV和“隐匿性”CNV。经典CNV的特征通常在于跨越血管造影过渡期的明亮、高度荧光、清晰的区域，在中后期帧中有渗漏。隐匿性CNV包括纤维血管色素上皮脱离。CNV导致的新生血管形成有渗漏血液和体液的倾向，导致小斑(stigma)和变态的症状。该新血管伴随着纤维组织的生长。这种新生血管和纤维组织的复合体可以破坏光感受器。这种病变可以继续在黄斑区生长，并导致进行性、严重和不可逆的失明。当一个个体的眼睛产生CNV时，另一只眼睛也会出现类似的CNV病变，其中5年内发生的概率约为50％。
在一些实施方案中，本公开的CNV病变包括隐匿性CNV。在一个实施方案中，CNV病变包括经典CNV、基本上由经典CNV组成，或进一步由经典CNV组成。在另一个实施方案中，CNV病变包括经典和隐匿性CNV。
术语“黄斑水肿”是指眼病黄斑囊样水肿(CME)或糖尿病性黄斑水肿(DME)。CME是影响眼睛中央视网膜或黄斑的眼病。当这种情况出现时，黄斑中出现多个囊样(囊样)液体区域，并导致视网膜肿胀或水肿。CME可伴有多种疾病，诸如视网膜静脉阻塞、葡萄膜炎和/或糖尿病。CME通常发生在白内障手术后。当糖尿病患者视网膜中的血管开始漏入黄斑时，就会出现DME。这些渗漏导致黄斑增厚和肿胀，逐渐扭曲灵敏的视觉。虽然肿胀可能不会导致失明，但这种影响会导致中心视力的严重丧失。
术语“青光眼”是指视神经以特征模式受损的眼病。如果不治疗，这可能会永久损害受影响眼睛的视力，并导致失明。其通常与眼内的液体(房水)压力增加相关联。术语高眼压用于眼压(IOP)持续升高且无任何相关视神经损伤的患者。相反，术语正常眼压或低眼压青光眼用于具有视神经损伤和相关视野丧失但具有正常或低IOP的那些患者。神经损伤包括视网膜神经节细胞以特征模式丢失。青光眼有许多不同的亚型，但它们都可以被认为是一种类型的视神经病变。眼压升高(例如，高于21mmHg或2.8kPa)是青光眼最重要且唯一可改变的危险因素。然而，有些人可能会有多年的高眼压，并永远不会出现损伤，而其它人可能会在相对较低的压力下出现神经损伤。未经治疗的青光眼会导致视神经永久性损伤，并导致视野丧失，随着时间的推移，视野丧失会发展为失明。
术语“糖尿病视网膜病变”包括由糖尿病并发症引起的视网膜病变(即，视网膜疾病)，其最终会导致失明。糖尿病视网膜病变会导致无症状、轻度视力问题或者甚至失明。糖尿病视网膜病变是视网膜微血管改变的结果。高血糖症诱发的壁内周细胞死亡和基底膜增厚导致血管壁功能不全。这些损伤改变了血-视网膜屏障的形成，也使视网膜血管变得更加可渗透。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含配制用于眼内施用的本公开的EV(例如，外来体)。本公开还提供了包括药物组合物和任选的根据本文公开的方法的使用说明(例如，施用药物组合物以治疗特定眼病或病症的说明)的药盒，所述药物组合物包含配制用于眼内施用的本公开的EV(例如，外来体)。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook等人，编辑(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人，编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs HarborLaboratory,NY)；D.N.Glover编辑，(1985)DNA Cloning，第I和II卷；Gait，编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins，编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins，编辑(1984)Transcription AndTranslation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)APractical GuideTo Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(ColdSpring Harbor Laboratory)；Wu等人，编辑，Methods In Enzymology，第154和155卷；Mayer和Walker，编辑(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell，编辑，(1986)Handbook Of ExperimentalImmunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；Crooke,Antisense drugTechnology:Principles,Strategies and Applications，第2版CRC Press(2007)和于Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,Baltimore,Md.)中。
上面引用的所有参考文献，以及其中引用的所有参考文献，通过引用以其整体并入本文。
以下实施例是以举例说明的方式而非限制的方式提供的。
实施例
实施例1
使用支架蛋白的腔内装载
产生了经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如，VP1、VP2或VP3)与支架蛋白(例如，PTGFRN)的胞内结构域或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端融合(图1)。支架蛋白(例如，PTGFRN)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白与衣壳蛋白的N端、C端或内部位点融合。AAV是在共同产生外来体的细胞中产生的，有利于AAV定位于外来体。
实施例2
使用化学诱导的二聚体的结合配偶体的腔装载
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体(例如，FRB)的结合配偶体融合(图2)。结合配偶体与衣壳蛋白的N端、C端或内部位点融合(图2)或者在位置455处被插入内环(例如，VP1)中(图3A至图3B)。产生插入，使得FRB替代VP1的氨基酸残基T455(相对于SEQ ID NO:44)。然后将相应的结合配偶体(例如，FKBP)与PTGFRN或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导FRB和FKBP的二聚化的雷帕霉素存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体(例如FKBP、钙调神经磷酸酶A、CyP-Fas、GyrB、GAI、GID1、Snap-tag、HaloTag、eDHFR、BCL-xL或Fab(AZ1))的结合配偶体融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如，(例如，FKBP、钙调神经磷酸酶A、CyP-Fas、GyrB、GAI、GID1、Snap-tag、HaloTag、eDHFR、BCL-xL或Fab(AZ1)))替代VP1的氨基酸残基T455(相对于SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，(例如，FKBP、钙调神经磷酸酶A、CyP-Fas、GyrB、GAI、GID1、Snap-tag、HaloTag、eDHFR、BCL-xL或Fab(AZ1)))与PTGFRN(或其功能片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化的必要化学物质存在的情况下(例如，在诱导FKBP和FKBP的二聚化的FK1012存在的情况下；在诱导FKBP和钙调神经磷酸酶A的二聚化的FK506存在的情况下；在诱导FKBP和CyP-Fas的二聚化的FKCsA存在的情况下；在诱导GyrB和GyrB的二聚化的香豆霉素存在的情况下)；在诱导GAI和GID1的二聚化的赤霉素存在的情况下)；在诱导Snap-tag和HaloTag的二聚化的HaXS存在的情况下)；在诱导eDHFR和HaloTag的二聚化的TMP-HTag存在的情况下)；在诱导BCL-xL和Fab(AZ1)的二聚化的ABT-737存在的情况下)))在共产生外来体的细胞中产生AAV，这有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体(例如第一FKBP)的结合配偶体融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如，第一个FKBP)替代VP1的氨基酸残基T455(相对于SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，第二FKBP)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化的必要化学物质存在的情况下(例如，在诱导第一FKBP和第二FKBP的二聚化的FK1012存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，这有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如，VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，FKBP或钙调神经磷酸酶A)融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如，FKBP或钙调神经磷酸酶A)替代VP1的氨基酸残基T455(相对于SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，FKBP或钙调神经磷酸酶A)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导FKBP和钙调神经磷酸酶A的二聚化的FK506存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，FKBP或CyP-Fas)融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如，FKBP或CyP-Fas)替代VP1的氨基酸残基T455(相对于SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，FKBP或CyP-Fas)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导FKBP和CyP-Fas的二聚化的FKCsA存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，GyrB)融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如，GyrB)替代氨基酸残基T455(相对于VP1的SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，GyrB)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导GyrB和GyrB的二聚化的香豆霉素存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，GAI或GID1)融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如GAI或GID1)替代氨基酸残基T455(相对于VP1的SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，GAI或GID1)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导GAI和GID1的二聚化的赤霉素存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，Snap-tag或HaloTag)融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如Snap-tag或HaloTag)替代氨基酸残基T455(相对于VP1的SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，Snap-tag或HaloTag)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导Snap-tag和HaloTag的二聚化的HaXS存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，eDHFR或HaloTag)融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如eDHFR或HaloTag)替代氨基酸残基T455(相对于VP1的SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，eDHFR或HaloTag)与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导eDHFR和HaloTag的二聚化的TMP-HTag存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
产生经修饰的AAV，其中AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2或VP3)与化学诱导的二聚体的结合配偶体(例如，BCL-xL或Fab(AZ1))融合。结合配偶体要么与衣壳蛋白的N端融合，要么被插入内环中(例如，VP1在位置455处)。产生插入，使得化学诱导的结合配偶体(例如，BCL-xL或Fab(AZ1))替代VP1的氨基酸残基T455(相对于SEQ ID NO:45)。然后将相应的结合配偶体(例如，BCL-xL或Fab(AZ1))与PTGFRN(或其功能性片段)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ IDNO:17)的支架蛋白的C端连接。在诱导二聚化所必需的化学物质存在的情况下(例如，在诱导BCL-xL和Fab(AZ1)的二聚化的ABT-737存在的情况下)，在共产生外来体的细胞中产生AAV，有利于AAV定位至外来体。
实施例3
使用AAV受体的腔装载
产生经修饰的外来体，其中外来体包含与AAV受体(AAVR)连接的支架蛋白(例如，PTGFRN)或包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白。AAVR可以包括PKD1-2和单链抗体(图4)。对于腔装载，将AAVR与支架蛋白(例如，PTGFRN)的胞内结构域或与包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白的胞内结构域连接。外来体在共产生AAV的细胞中产生，使得AAV受体有利于AAV定位至外来体。
实施例4
使用抗原结合多肽的外表面装载
产生了经修饰的外来体，其包含在胞外结构域处与抗原结合结构域(例如，纳米抗体；图5)连接的支架蛋白(例如，PTGFRN)。抗原结合结构域(例如，纳米抗体)特异性结合AAV衣壳上的表位。分别从不同的生产细胞中产生和纯化外来体和AAV。将表达纳米抗体-支架蛋白的纯化的外来体随后与纯化的AAV一起孵育，以有利于AAV定位至外来体。或者，在共同产生AAV的细胞中产生外来体，使得纳米抗体有利于AAV定位至外来体。
实施例5
使用Fc的外表面装载
产生了经修饰的AAV，其包含与IgG的Fc区连接的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2或VP3)。产生经修饰的外来体，其包含与FcγR1或特异性结合Fc的纳米抗体连接的支架蛋白(例如，PTGFRN)(图6)。将FcγR1或纳米抗体与支架蛋白(例如，PTGFRN)的胞外结构域连接。分别从不同的生产细胞中产生和纯化外来体和AAV。然后将表达支架融合蛋白的纯化的外来体与纯化的AAV一起孵育，以促进AAV定位至外来体。或者，在共产生AAV的细胞中产生外来体，使得支架蛋白促进AAV定位至外来体。
实施例6
使用AAV受体的外表面装载
产生了经修饰的外来体，其中外来体包含与AAV受体(AAVR)连接的支架蛋白(例如，PTGFRN)(图7A)。AAVR与支架蛋白(例如，PTGFRN)的胞外结构域连接。分别从不同的生产细胞中产生和纯化外来体和AAV。然后将表达支架融合蛋白的纯化的外来体(图7B)与纯化的AAV一起孵育，以促进AAV定位至外来体。生物层干涉测量(Octet)数据显示，AAVR外来体与固定的AAV2结合，而对照外来体不与固定的AAV2结合(图8A至图8B)。或者，在共产生AAV的细胞中产生外来体，使得支架蛋白促进AAV定位至外来体。
实施例7
AAV融合构建体保留核定位
本文所述的各种技术依赖于肽序列与AAV的衣壳蛋白的融合。为了评估AAV活性，产生了经修饰的AAV，其中将AAV衣壳蛋白VP2的N端与包含最小序列GGKLSKK(SEQ ID NO:17)的支架蛋白(“Etp”)或与化学诱导型结合配偶体FRB或FKBP连接。Etp-GFP是用绿色荧光蛋白(GFP)取代VP2衣壳蛋白的对照。为了证实经修饰的AAV保留定位至生产细胞的细胞核的能力，对从HEK293细胞裂解物中分离的纯化的胞质级分和纯化的核级分进行蛋白质印迹。如图9A所示，将等量的来自胞质溶胶(左)和细胞核(右)的细胞裂解物装载在变性聚丙烯酰胺凝胶上。使用对αFLAG标签(在所有构建体上表达的；图9B)和α组蛋白H4(细胞核标志物；图9C)特异的抗体在胞质溶胶和细胞核裂解物中对Etp-GFP、Etp-VP2和FRB-VP2进行蛋白质印迹证明了这些exotope-VP2构建体被表达并定位至生产细胞的细胞核。具体来说，使用αFLAG抗体探针可以在细胞核裂解物中看到Etp-VP2(图9C)。由于AAV衣壳的组装和基因组装载发生在细胞核中，Etp-VP2在细胞核中富集的证明为产生携带促进外来体装载的肽标签的功能性AAV衣壳提供了机会。此外，携带etp-VP2修饰的AAV应该能够进入受者细胞的细胞核以介导基因转移，因为这种修饰不抑制细胞核进入。
实施例8
外来体-AAV在培养物中的表达
接种HEK293T细胞，并通过三重转染法转染HEK293T细胞以表达AAV。这种方法通常涉及将待包装到AAV颗粒中的基因转移载体(包含侧接ITR元件的转基因)、AAV辅助功能载体和辅助功能载体(accessory function vector)(其包含衣壳蛋白和复制相关蛋白的序列)。图10A至图10D示出了转染到HEK293T细胞和适于悬浮培养的HEK293细胞(HEK293SF)中的各种AAV衣壳血清型的结果。获得用于AAV表达测试的AAV表达构建体。图10A至图10D示出了通过蛋白质印迹检测到AAV1、AAV2、AAV3、AAV5和AAV6衣壳。据报道，所用的抗体探针不识别或识别AAV4，这可以解释AAV4泳道缺乏信号。
使用三重转染方法使AAV9在贴壁HEK293T细胞中生长。过滤收获物以除去细胞碎片，然后浓缩并通过切向流过滤渗滤到缓冲的150mM NaCl溶液中。通过超速离心(133,900xg)沉淀50mL TFF浓缩(约10X)的细胞上清液3小时，并将所得沉淀重悬于1mL PBS中。使用150,000x超速离心将制备物施加于Optiprep密度梯度(基于碘克沙醇的个质)，进行16小时。分离后，收集如图14A中看到的级分1-10，用PBS 10X稀释，以133,900g超速离心沉淀3小时，然后重悬于100uL体积的PBS中。通过蛋白质印迹(以检测AAV衣壳蛋白)、颗粒计数(纳米颗粒跟踪分析(NTA))(以检测外来体)以及qPCR(以检测AAV DNA转基因基因组拷贝)来分析级分。一些级分不含可检测的颗粒(通过NTA分析)。图11A至图11B详细说明了NTA(颗粒/mL)和qPCR(基因拷贝/mL(GC/mL))的结果。在密度较大的级分8-10中，发现大多数AAV转基因DNA存在于不与外来体缔合的游离AAV中。AAV衣壳的蛋白质印迹分析可见于图12A至图12C，显示了可以在级分8、9和10中最显著地看到VP1、VP2和VP3多肽，在所述级分中它们不与外来体缔合。级分1、2、3和5也具有可检测的VP1、VP2和VP3，并且被发现与这些级分中较高的外来体浓度相关。
实施例9
外来体-AAV的纯化
使用三重转染方法使AAV9在贴壁HEK293T细胞中生长。过滤收获物以除去细胞碎片，然后浓缩并使用切向流过滤渗滤到150mM NaCl(pH 7.4)的溶液(约10mS/cm)中。然后通过结合-并-洗脱阴离子交换色谱(bind-and-elute anion-exchange chromatography)纯化该制备物。使用在20个柱体积内NaCl浓度从150mM NaCl升高至1M NaCl的线性梯度洗脱(LGE)。然后，在用1M NaOH清洗和消毒之前，用5个柱体积的2M NaCl(pH 7.4)对该柱进行脱去处理。图13中提供了纯化色谱图。在线性梯度上收集级分，并用NTA进行分析以确定外来体计数和粒度，如图14A所示。级分2、3和4显示了如通过NTA测量的颗粒洗脱的最高浓度。图14B至图14D示出了加载了AAV5(图14B至图14C)和AAV9(图14D)的外来体的示例性图像。然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化每个级分。级分2、3和4在空隙体积附近洗脱为单一峰，几乎没有拖尾，这是颗粒诸如外来体的特征，既不是可溶性蛋白也不是AAV9，所述可溶性蛋白或AAV9已显示在体积＝16.5mL时被洗脱。通过NTA分析，级分2、3和4也含有最高浓度的颗粒(图15)。
实施例10
测定AAV9的效力
如实施例6所述，使用密度梯度超速离心或阴离子交换层析，从用标准AAV三重质粒系统转染的HEK293贴壁细胞培养物中分离出AAV9-GFP和外来体-AAV9-GFP。将每个样品用qPCR定量三次，以确定每mL的病毒基因组(GC/mL)。使HeLa细胞通过标准细胞培养程序生长，并以5000个细胞/孔接种到96孔IncuCyte Zoom平板孔中。然后在抗AAV IgG存在的情况下用游离或包封的AAV9-GFP以固定的GC/孔(固定的MOI：6000)转染细胞。通过在PBS中稀释，系统地改变IgG的浓度，以产生在IgG浓度上以半对数间隔的剂量-滴定研究。向孔中加入样品后，在四天的时间内，每三小时测定一次如通过荧光强度测定的GFP表达。每个条件以一式三份运行。图16描述了从阴离子交换色谱中分离的F7样品的代表性特征谱。
与仅有AAV的样品(“AAV”)相比，对于外来体-AAV样品("exo")观察到更快的转导。在外来体-AAV(“exo”)样品中获得的最大效力也更高，接近40,000个荧光单位，而仅有AAV的样品(“AAV”)产生约15,000个荧光单位。这些效力数据表明，外来体-AAV能够匹配或超过游离AAV9的效力和基因递送能力，即使在通过外来体封装递送时也如此。
实施例11
外来体-AAV对抗体中和的抗性
抗药物抗体(ADA)是生物制品递送的常见问题。需要重复施用(或甚至单次施用)的干预措施可能会受到针对生物制品的宿主免疫反应的阻碍。为了确定与外来体的缔合是否影响对抑制性抗体的抗性，将游离AAV9和表达GFP的外来体缔合的AAV9与HeLa细胞和一系列抗AAV9 nAb一起孵育。在两个时间点和所有nAb浓度下，外来体缔合的AAV9明显优于游离AAV9(图17A)。如实施例10所述，进一步研究了与游离AAV9相比，外来体-AAV构建体(携带GFP转基因)对抗AAV单克隆抗体的抗性，所述抗性可见于图17B。针对抗AAV单克隆抗体(mAb)的系列稀释度测试了单独的AAV的对照样品，并测量GFP信号。GFP信号指示成功的AAV感染和GFP转基因至宿主细胞的递送。结果表明，在1000倍或更低倍的抗AAV mAb的系列稀释度下，游离AAV9显示出显著的感染性。当匹配如通过基因拷贝qPCR分析确定的MOI时，将外来体-AAV样品与游离AAV9-MOI匹配样品进行比较。诸如Chrom.3、Chrom.5和Chrom.7的样品即使在抗AAV mAb 100倍稀释度的情况下也显示出显著的感染性。100小时后，Chrom.3、Chrom.4和Chrom.5均显示远高于20,000的GFP信号，表明具有持续的感染能力。该信号明显大于在游离AAV9-MOI匹配样品中看到的100倍稀释信号，这表明游离AAV9被抗AAV mAb中和，但外来体-AAV构建体未被中和。在图18A至图18D中，提取了来自阴离子交换色谱(F7)的样品中的一种的数据，以使得与仅有AAV的样品的头对头比较能够作为中和抗体滴度的函数。在将样品添加到HeLa细胞培养物后t＝24小时、48小时、72小时和96小时，与AAV相比，外来体-AAV显示出更快速的转导动力学、增强的效力和增强的免疫逃避。
实施例12
玻璃体内施用后AAV9和外来体在大鼠中的生物分布
材料和剂量配方细节:AAV9和外来体为即用型制剂。提供两小瓶40μL AAV9和40μL外来体。静脉内免疫球蛋白(IVIg)(25mg小瓶；粉末形式)也可通过使用以下方法添加到一个AAV9小瓶和一个外来体小瓶中：(i)在0.5mL PBS中复原25mg IVIg粉末(目标浓度为50mg/mL)，以及(ii)从50mg/mL IVIg原液中执行以下操作：将0.8μL IVIg添加到一个AAV小瓶中，通过移吸混合，并在注射前在4℃下孵育至少1小时；并将0.8μL IVIg加入一个外来体小瓶中，通过移吸混合，并在注射前于4℃下孵育至少1小时。
动物模型：CD大鼠(约6–8周龄)将用于研究(购买n＝15，研究中n＝10只)。
成像研究设计：
(1)剂量施用：
a.注射和途径：
i.组1，n＝2：玻璃体内注射(约5μL)的PBS
ii.组2，n＝2：玻璃体内注射(约5μL)的AAV9
iii.组3，n＝2：玻璃体内注射(约5μL)的与IVIg预孵育的AAV9。
iv.组4，n＝2：玻璃体内注射(约5μL)的外来体-AAV9
v.组3，n＝2：玻璃体内注射(约5μL)的与IVIg预孵育的外来体-AAV9。
b.两只眼睛都将注射对照品/测试品(关于具体化合物请参考剂量组)
(2)组织收集：
1.组织收集的最终时间点将是每种对照/试验品注射后2周。将收集以下组织：眼睛(左和右)
2.将从所有动物收集两只眼睛，将其速冻，并在-20℃下储存，直到运送给资助者。
表7：研究设计概述。
Figure BDA0003414407670001931
IVT-玻璃体内
实施例13
通过外来体包封将AAV9与中和抗体隔离
中和抗体限制了可访问的患者群体，因为20％至50％的患者已经存在针对AAV的中和抗体。目前不可能用AAV重新给药，因为AAV暴露后会产生高滴度的交叉反应性抗AAV抗体。因此，通过外来体包封(随机装载，例如随机定位)，使AAV与中和抗体隔离。如图19所示，当AAV9被外来体隔离时，萤光素酶信号不受浓度递增的中和抗体的影响。相反，萤光素酶信号响应于中和抗体浓度的增加而显著衰减。即使在测试的最低抗体浓度下，外来体的保护作用也是显著的，如通过萤光素酶信号的差异所指示的，所述萤光信号在外来体包封的样品中是150倍(约300,000RLU对比约2,000)。
实施例14
向小鼠施用外来体-AAV导致AAV编码的报告基因表达增加
为了测试与外来体缔合的AAV编码的报告基因的表达，对CD大鼠(6-8周龄)玻璃体内注射5ul编码分泌的nanoLuc的游离AAV9或外来体-AAV9(约1e10 vg；图21A中所举例说明的)(n＝4只动物，每只动物2只眼睛)。施用后两周，收集眼睛，冷冻，并随后匀浆。测量萤光素酶和总蛋白质水平。与游离AAV9组相比，在外来体-AAV组中观察到朝向更高的转基因表达的趋势(图21B至图21C)。
***
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的特此通过引用整体并入，其并入程度如同每个单独出版物、专利或专利申请或其它文件被单独地指示出于所有目的通过引用并入一般。
虽然已经示出和描述了各种具体实施方案，但上述说明不是限制性的。应当理解，在不脱离所述一项或多项发明的精神和范围的情况下，可进行各种改变。通过阅读本说明书，许多变化对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
序列表
<110> 科迪亚克生物科学公司
<120> 外来体和AAV的组合物
<130> 4000.033PC02
<150> 62/984,161
<151> 2020-03-02
<150> 62/984,173
<151> 2020-03-02
<150> 62/835,425
<151> 2019-04-17
<150> 62/835,432
<151> 2019-04-17
<160> 216
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 879
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val
20 25 30
Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr
35 40 45
Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly
50 55 60
Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala
65 70 75 80
Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg
85 90 95
Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser
100 105 110
Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val
115 120 125
Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser
130 135 140
Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro
165 170 175
Leu His Thr His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala
180 185 190
Arg Arg Ser Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly
195 200 205
Leu Gly Tyr Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr
210 215 220
Val Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala
225 230 235 240
Asp Gln Gly Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln
245 250 255
Gly Asn Trp Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val
260 265 270
Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser
275 280 285
Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp
290 295 300
Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met
305 310 315 320
Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg
325 330 335
Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp
340 345 350
Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser
355 360 365
Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg
370 375 380
Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly
385 390 395 400
Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys
405 410 415
Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val
420 425 430
Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr
435 440 445
Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu
450 455 460
Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys
465 470 475 480
Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp
485 490 495
Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn
500 505 510
Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp
515 520 525
Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala
530 535 540
Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe
545 550 555 560
Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys
565 570 575
Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro
580 585 590
Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu
595 600 605
Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg
610 615 620
Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr
625 630 635 640
Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met
645 650 655
Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala
660 665 670
Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro
675 680 685
Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly
690 695 700
Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu
705 710 715 720
Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser
725 730 735
Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys
740 745 750
Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu
755 760 765
Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu
770 775 780
Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys
785 790 795 800
Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro
805 810 815
Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro
820 825 830
Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys
835 840 845
Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln
850 855 860
Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp
865 870 875
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile
1 5 10 15
Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala
20 25 30
Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val
35 40 45
His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp
50 55 60
Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu
65 70 75 80
Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly
85 90 95
Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp
100 105 110
Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser
115 120 125
Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys
130 135 140
Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu
165 170 175
Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met
180 185 190
<210> 3
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
His Gly Ala Ser Gly Ala Ala Gly Phe Val Gln Ala Pro Leu Ser Gln
20 25 30
Gln Arg Trp Val Gly Gly Ser Val Glu Leu His Cys Glu Ala Val Gly
35 40 45
Ser Pro Val Pro Glu Ile Gln Trp Trp Phe Glu Gly Gln Gly Pro Asn
50 55 60
Asp Thr Cys Ser Gln Leu Trp Asp Gly Ala Arg Leu Asp Arg Val His
65 70 75 80
Ile His Ala Thr Tyr His Gln His Ala Ala Ser Thr Ile Ser Ile Asp
85 90 95
Thr Leu Val Glu Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Glu Cys Arg Ala Ser Asn
100 105 110
Asp Pro Asp Arg Asn His Leu Thr Arg Ala Pro Arg Val Lys Trp Val
115 120 125
Arg Ala Gln Ala Val Val Leu Val Leu Glu Pro Gly Thr Val Phe Thr
130 135 140
Thr Val Glu Asp Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Cys Ser Leu Asn
145 150 155 160
Asp Ser Ala Thr Glu Val Thr Gly His Arg Trp Leu Lys Gly Gly Val
165 170 175
Val Leu Lys Glu Asp Ala Leu Pro Gly Gln Lys Thr Glu Phe Lys Val
180 185 190
Asp Ser Asp Asp Gln Trp Gly Glu Tyr Ser Cys Val Phe Leu Pro Glu
195 200 205
Pro Met Gly Thr Ala Asn Ile Gln Leu His Gly Pro Pro Arg Val Lys
210 215 220
Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu
225 230 235 240
Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr
245 250 255
Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser
260 265 270
Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly Arg Ser Glu Leu His Ile Glu
275 280 285
Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr
290 295 300
Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser
305 310 315 320
His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Val Ala Glu Val Leu
325 330 335
Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu
340 345 350
Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser
355 360 365
Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser
370 375 380
Ser
385
<210> 4
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Met Gly Ala Leu Arg Pro Thr Leu Leu Pro Pro Ser Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Met Leu Gly Met Gly Cys Trp Ala Arg Glu Val Leu Val
20 25 30
Pro Glu Gly Pro Leu Tyr Arg Val Ala Gly Thr Ala Val Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Asn Val Thr Gly Tyr Glu Gly Pro Ala Gln Gln Asn Phe Glu Trp
50 55 60
Phe Leu Tyr Arg Pro Glu Ala Pro Asp Thr Ala Leu Gly Ile Val Ser
65 70 75 80
Thr Lys Asp Thr Gln Phe Ser Tyr Ala Val Phe Lys Ser Arg Val Val
85 90 95
Ala Gly Glu Val Gln Val Gln Arg Leu Gln Gly Asp Ala Val Val Leu
100 105 110
Lys Ile Ala Arg Leu Gln Ala Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Glu Cys His
115 120 125
Thr Pro Ser Thr Asp Thr Arg Tyr Leu Gly Ser Tyr Ser Gly Lys Val
130 135 140
Glu Leu Arg Val Leu Pro Asp Val Leu Gln Val Ser Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Pro Arg Gly Arg Gln Ala Pro Thr Ser Pro Pro Arg Met Thr Val
165 170 175
His Glu Gly Gln Glu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg Thr Ser Thr
180 185 190
Gln Lys His Thr His Leu Ala Val Ser Phe Gly Arg Ser Val Pro Glu
195 200 205
Ala Pro Val Gly Arg Ser Thr Leu Gln Glu Val Val Gly Ile Arg Ser
210 215 220
Asp Leu Ala Val Glu Ala Gly Ala Pro Tyr Ala Glu Arg Leu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Glu Leu Arg Leu Gly Lys Glu Gly Thr Asp Arg Tyr Arg Met Val
245 250 255
Val Gly Gly Ala Gln Ala Gly Asp Ala Gly Thr Tyr His Cys Thr Ala
260 265 270
Ala Glu Trp Ile Gln Asp Pro Asp Gly Ser Trp Ala Gln Ile Ala Glu
275 280 285
Lys Arg Ala Val Leu Ala His Val Asp Val Gln Thr Leu Ser Ser Gln
290 295 300
Leu Ala Val Thr Val Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ile Gly Pro Gly Glu
305 310 315 320
Pro Leu Glu Leu Leu Cys Asn Val Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Gly
325 330 335
Arg His Ala Ala Tyr Ser Val Gly Trp Glu Met Ala Pro Ala Gly Ala
340 345 350
Pro Gly Pro Gly Arg Leu Val Ala Gln Leu Asp Thr Glu Gly Val Gly
355 360 365
Ser Leu Gly Pro Gly Tyr Glu Gly Arg His Ile Ala Met Glu Lys Val
370 375 380
Ala Ser Arg Thr Tyr Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Arg Pro Gly Asp
385 390 395 400
Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Leu Ala Lys Ala Tyr Val Arg Gly Ser Gly
405 410 415
Thr Arg Leu Arg Glu Ala Ala Ser Ala Arg Ser Arg Pro Leu Pro Val
420 425 430
His Val Arg Glu Glu Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala Trp Leu Ala
435 440 445
Gly Gly Thr Val Tyr Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu Cys Asn Ile
450 455 460
Ser Val Arg Gly Gly Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala Ser Trp Trp
465 470 475 480
Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro Ala Gln Leu
485 490 495
Val Gly Gly Val Gly Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly Val Arg Pro
500 505 510
Gly Gly Gly Pro Val Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg Ser His Arg
515 520 525
Leu Arg Leu His Ser Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys
530 535 540
Ala Pro Ser Ala Trp Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp Tyr Gln Ala
545 550 555 560
Gly Ser Ala Arg Ser Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr Met His Ala
565 570 575
Leu Asp Thr Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly Val Ala Leu
580 585 590
Val Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys Phe Met Lys
595 600 605
Arg Leu Arg Lys Arg
610
<210> 5
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Met Asn Leu Gln Pro Ile Phe Trp Ile Gly Leu Ile Ser Ser Val Cys
1 5 10 15
Cys Val Phe Ala Gln Thr Asp Glu Asn Arg Cys Leu Lys Ala Asn Ala
20 25 30
Lys Ser Cys Gly Glu Cys Ile Gln Ala Gly Pro Asn Cys Gly Trp Cys
35 40 45
Thr Asn Ser Thr Phe Leu Gln Glu Gly Met Pro Thr Ser Ala Arg Cys
50 55 60
Asp Asp Leu Glu Ala Leu Lys Lys Lys Gly Cys Pro Pro Asp Asp Ile
65 70 75 80
Glu Asn Pro Arg Gly Ser Lys Asp Ile Lys Lys Asn Lys Asn Val Thr
85 90 95
Asn Arg Ser Lys Gly Thr Ala Glu Lys Leu Lys Pro Glu Asp Ile Thr
100 105 110
Gln Ile Gln Pro Gln Gln Leu Val Leu Arg Leu Arg Ser Gly Glu Pro
115 120 125
Gln Thr Phe Thr Leu Lys Phe Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Pro Ile Asp
130 135 140
Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Glu
145 150 155 160
Asn Val Lys Ser Leu Gly Thr Asp Leu Met Asn Glu Met Arg Arg Ile
165 170 175
Thr Ser Asp Phe Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe Val Glu Lys Thr Val
180 185 190
Met Pro Tyr Ile Ser Thr Thr Pro Ala Lys Leu Arg Asn Pro Cys Thr
195 200 205
Ser Glu Gln Asn Cys Thr Ser Pro Phe Ser Tyr Lys Asn Val Leu Ser
210 215 220
Leu Thr Asn Lys Gly Glu Val Phe Asn Glu Leu Val Gly Lys Gln Arg
225 230 235 240
Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met
245 250 255
Gln Val Ala Val Cys Gly Ser Leu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr Arg
260 265 270
Leu Leu Val Phe Ser Thr Asp Ala Gly Phe His Phe Ala Gly Asp Gly
275 280 285
Lys Leu Gly Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly Gln Cys His Leu Glu
290 295 300
Asn Asn Met Tyr Thr Met Ser His Tyr Tyr Asp Tyr Pro Ser Ile Ala
305 310 315 320
His Leu Val Gln Lys Leu Ser Glu Asn Asn Ile Gln Thr Ile Phe Ala
325 330 335
Val Thr Glu Glu Phe Gln Pro Val Tyr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ile
340 345 350
Pro Lys Ser Ala Val Gly Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Asn Val Ile
355 360 365
Gln Leu Ile Ile Asp Ala Tyr Asn Ser Leu Ser Ser Glu Val Ile Leu
370 375 380
Glu Asn Gly Lys Leu Ser Glu Gly Val Thr Ile Ser Tyr Lys Ser Tyr
385 390 395 400
Cys Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Gly Glu Asn Gly Arg Lys Cys Ser
405 410 415
Asn Ile Ser Ile Gly Asp Glu Val Gln Phe Glu Ile Ser Ile Thr Ser
420 425 430
Asn Lys Cys Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Phe Lys Ile Arg Pro Leu
435 440 445
Gly Phe Thr Glu Glu Val Glu Val Ile Leu Gln Tyr Ile Cys Glu Cys
450 455 460
Glu Cys Gln Ser Glu Gly Ile Pro Glu Ser Pro Lys Cys His Glu Gly
465 470 475 480
Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Ala Cys Arg Cys Asn Glu Gly Arg Val
485 490 495
Gly Arg His Cys Glu Cys Ser Thr Asp Glu Val Asn Ser Glu Asp Met
500 505 510
Asp Ala Tyr Cys Arg Lys Glu Asn Ser Ser Glu Ile Cys Ser Asn Asn
515 520 525
Gly Glu Cys Val Cys Gly Gln Cys Val Cys Arg Lys Arg Asp Asn Thr
530 535 540
Asn Glu Ile Tyr Ser Gly Ala Ser Asn Gly Gln Ile Cys Asn Gly Arg
545 550 555 560
Gly Ile Cys Glu Cys Gly Val Cys Lys Cys Thr Asp Pro Lys Phe Gln
565 570 575
Gly Gln Thr Cys Glu Met Cys Gln Thr Cys Leu Gly Val Cys Ala Glu
580 585 590
His Lys Glu Cys Val Gln Cys Arg Ala Phe Asn Lys Gly Glu Lys Lys
595 600 605
Asp Thr Cys Thr Gln Glu Cys Ser Tyr Phe Asn Ile Thr Lys Val Glu
610 615 620
Ser Arg Asp Lys Leu Pro Gln Pro Val Gln Pro Asp Pro Val Ser His
625 630 635 640
Cys Lys Glu Lys Asp Val Asp Asp Cys Trp Phe Tyr Phe Thr Tyr Ser
645 650 655
Val Asn Gly Asn Asn Glu Val Met Val His Val Val Glu Asn Pro Glu
660 665 670
Cys Pro Thr Gly Pro Asp Ile Ile Pro Ile Val Ala Gly Val Val Ala
675 680 685
Gly Ile Val Leu Ile Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu
690 695 700
Met Ile Ile His Asp Arg Arg Glu Phe Ala Lys Phe Glu Lys Glu Lys
705 710 715 720
Met Asn Ala Lys Trp Asp Thr Gly Glu Asn Pro Ile Tyr Lys Ser Ala
725 730 735
Val Thr Thr Val Val Asn Pro Lys Tyr Glu Gly Lys
740 745
<210> 6
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val
1 5 10 15
Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg
20 25 30
Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His
35 40 45
Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn
50 55 60
Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala
65 70 75 80
Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn
85 90 95
Pro Gly Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu
100 105 110
Pro Cys Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly
115 120 125
Val Thr Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys
130 135 140
Gly His Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu
145 150 155 160
Pro Thr Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu
165 170 175
Ser Lys Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln Asp Tyr Val Lys Lys Phe Gly
180 185 190
Glu Asn Phe Ala Ser Cys Gln Ala Gly Ile Ser Ser Phe Tyr Thr Lys
195 200 205
Asp Leu Ile Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Gly Ser
210 215 220
Leu Phe Val Tyr Asn Ile Thr Thr Asn Lys Tyr Lys Ala Phe Leu Asp
225 230 235 240
Lys Gln Asn Gln Val Lys Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Gly
245 250 255
Ala Gly His Phe Arg Ser Gln His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala
260 265 270
Pro Gln His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu
275 280 285
Lys Glu Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser
290 295 300
Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe
305 310 315 320
Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu
325 330 335
Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn
340 345 350
Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe
355 360 365
Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu
370 375 380
Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile
385 390 395 400
Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln
405 410 415
Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln
420 425 430
Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val
435 440 445
Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg
450 455 460
Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn
465 470 475 480
Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile
485 490 495
Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr
500 505 510
Ile Val Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu
515 520 525
Ser Pro Pro Arg Phe Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Thr Ser Asp Val Ile
530 535 540
Thr Gly Ser Ile Gln Val Ser Ser Arg Glu Ala Asn Cys Arg Thr His
545 550 555 560
Gln Ala Phe Met Arg Lys Asp Val Arg Asp Ile Leu Thr Pro Ile Gln
565 570 575
Ile Glu Ala Ala Tyr His Leu Gly Pro His Val Ile Ser Lys Arg Ser
580 585 590
Thr Glu Glu Phe Pro Pro Leu Gln Pro Ile Leu Gln Gln Lys Lys Glu
595 600 605
Lys Asp Ile Met Lys Lys Thr Ile Asn Phe Ala Arg Phe Cys Ala His
610 615 620
Glu Asn Cys Ser Ala Asp Leu Gln Val Ser Ala Lys Ile Gly Phe Leu
625 630 635 640
Lys Pro His Glu Asn Lys Thr Tyr Leu Ala Val Gly Ser Met Lys Thr
645 650 655
Leu Met Leu Asn Val Ser Leu Phe Asn Ala Gly Asp Asp Ala Tyr Glu
660 665 670
Thr Thr Leu His Val Lys Leu Pro Val Gly Leu Tyr Phe Ile Lys Ile
675 680 685
Leu Glu Leu Glu Glu Lys Gln Ile Asn Cys Glu Val Thr Asp Asn Ser
690 695 700
Gly Val Val Gln Leu Asp Cys Ser Ile Gly Tyr Ile Tyr Val Asp His
705 710 715 720
Leu Ser Arg Ile Asp Ile Ser Phe Leu Leu Asp Val Ser Ser Leu Ser
725 730 735
Arg Ala Glu Glu Asp Leu Ser Ile Thr Val His Ala Thr Cys Glu Asn
740 745 750
Glu Glu Glu Met Asp Asn Leu Lys His Ser Arg Val Thr Val Ala Ile
755 760 765
Pro Leu Lys Tyr Glu Val Lys Leu Thr Val His Gly Phe Val Asn Pro
770 775 780
Thr Ser Phe Val Tyr Gly Ser Asn Asp Glu Asn Glu Pro Glu Thr Cys
785 790 795 800
Met Val Glu Lys Met Asn Leu Thr Phe His Val Ile Asn Thr Gly Asn
805 810 815
Ser Met Ala Pro Asn Val Ser Val Glu Ile Met Val Pro Asn Ser Phe
820 825 830
Ser Pro Gln Thr Asp Lys Leu Phe Asn Ile Leu Asp Val Gln Thr Thr
835 840 845
Thr Gly Glu Cys His Phe Glu Asn Tyr Gln Arg Val Cys Ala Leu Glu
850 855 860
Gln Gln Lys Ser Ala Met Gln Thr Leu Lys Gly Ile Val Arg Phe Leu
865 870 875 880
Ser Lys Thr Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Ile Lys Ala Asp Pro His
885 890 895
Cys Leu Asn Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu
900 905 910
Ala Ser Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met
915 920 925
Asp Glu Thr Ser Ala Leu Lys Phe Glu Ile Arg Ala Thr Gly Phe Pro
930 935 940
Glu Pro Asn Pro Arg Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala
945 950 955 960
His Val Leu Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg Tyr Phe
965 970 975
Thr Ile Val Ile Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Val Leu
980 985 990
Leu Leu Ile Ser Tyr Val Met Trp Lys Ala Gly Phe Phe Lys Arg Gln
995 1000 1005
Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Glu Asn Arg Arg Asp Ser Trp Ser
1010 1015 1020
Tyr Ile Asn Ser Lys Ser Asn Asp Asp
1025 1030
<210> 7
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Met Glu Leu Gln Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ile Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Pro Gly Ser His Ser Glu Ala Gly Val Gln Gly Leu Ser
20 25 30
Ala Gly Asp Asp Ser Glu Leu Gly Ser His Cys Val Ala Gln Thr Gly
35 40 45
Leu Glu Leu Leu Ala Ser Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gln Asn
50 55 60
Ala Glu Met Ile Glu Thr Gly Ser Asp Cys Val Thr Gln Ala Gly Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Ala Leu Ala Ser Lys Asn Ala
85 90 95
Glu Val Thr Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu
100 105 110
Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala
115 120 125
Ser Gly Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val
130 135 140
Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro
165 170 175
Gly Trp Val Arg Thr Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly
180 185 190
Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro
195 200 205
Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu
210 215 220
Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val
245 250 255
Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val
260 265 270
Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu
275 280 285
Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val
290 295 300
Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser
305 310 315 320
Thr Gln Val Asp Thr Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe
325 330 335
Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn
340 345 350
Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys
355 360 365
Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu
385 390 395 400
Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys
405 410 415
Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser
420 425 430
Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln
435 440 445
Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro
450 455 460
Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro
465 470 475 480
Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe
485 490 495
Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln
500 505 510
Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp
515 520 525
Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe
530 535 540
Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn
545 550 555 560
Glu Arg Phe Leu Val Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala
565 570 575
Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys
580 585 590
Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro
595 600 605
Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu
610 615 620
Arg Phe Pro Tyr Ala Ala
625 630
<210> 8
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Met Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala Ser Ser Pro Ser Lys Ala Asn
20 25 30
Gly Gln Glu Asn Gly His Val Lys Val Asn Gly Asp Ala Ser Pro Ala
35 40 45
Ala Ala Glu Ser Gly Ala Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Gly Ser Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Asp Lys Glu Glu Pro Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ser Ala Ala Glu Lys Gly Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro
85 90 95
Glu Ala Gly Ala Ser Pro Val Glu Lys Glu Ala Pro Ala Glu Gly Glu
100 105 110
Ala Ala Glu Pro Gly Ser Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ala Ser
115 120 125
Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Pro Lys Ala Glu Asp Gly Ala Thr Pro
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe
145 150 155 160
Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys
165 170 175
Glu Ala Gly Glu Gly Gly Glu Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gly
180 185 190
Lys Asp Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Gly
195 200 205
Ala Ala Ser Gly Glu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Glu Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Gly Glu Glu Gly Ala Ala Gly Gly Asp Pro Gln Glu Ala Lys Pro Gln
225 230 235 240
Glu Ala Ala Val Ala Pro Glu Lys Pro Pro Ala Ser Asp Glu Thr Lys
245 250 255
Ala Ala Glu Glu Pro Ser Lys Val Glu Glu Lys Lys Ala Glu Glu Ala
260 265 270
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Cys Glu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Pro Gly
275 280 285
Ala Pro Pro Glu Gln Glu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Pro Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ser Ser Ala Cys Ala Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gln Pro Glu
305 310 315 320
Cys Ser Pro Glu Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ala Glu
325 330
<210> 9
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys Ala Pro Arg Gly Asp Val Thr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Ala Ser Pro Ala Lys Ala Asn Gly Gln Glu Asn Gly
20 25 30
His Val Lys Ser Asn Gly Asp Leu Ser Pro Lys Gly Glu Gly Glu Ser
35 40 45
Pro Pro Val Asn Gly Thr Asp Glu Ala Ala Gly Ala Thr Gly Asp Ala
50 55 60
Ile Glu Pro Ala Pro Pro Ser Gln Gly Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val
65 70 75 80
Pro Pro Lys Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
85 90 95
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg Lys Glu Gly
100 105 110
Gly Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Gln Glu Gln
115 120 125
Gly Glu Ile Gly Ala Cys Ser Asp Glu Gly Thr Ala Gln Glu Gly Lys
130 135 140
Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ser Gln Glu Pro Gln Ala Lys Gly Ala Glu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ala Gly Pro Gln Ala Thr Glu Pro
165 170 175
Ser Thr Pro Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ser Ala Glu
180 185 190
Gln Asn Glu
195
<210> 10
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Thr Glu
20 25 30
Glu Glu Gly Thr Pro Lys Glu Ser Glu Pro Gln Ala Ala Ala Glu Pro
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Glu Gly Lys Glu Lys Pro Asp Gln Asp Ala Glu Gly
50 55 60
Lys Ala Glu Glu Lys Glu Gly Glu Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Glu
65 70 75 80
Glu Ala Pro Lys Ala Glu Pro Glu Lys Thr Glu Gly Ala Ala Glu Ala
85 90 95
Lys Ala Glu Pro Pro Lys Ala Pro Glu Gln Glu Gln Ala Ala Pro Gly
100 105 110
Pro Ala Ala Gly Gly Glu Ala Pro Lys Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Glu Ser Ala Ala Pro Ala Ala Gly Glu Glu Pro Ser Lys Glu
130 135 140
Glu Gly Glu Pro Lys Lys Thr Glu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Glu Thr Lys Ser Asp Gly Ala Pro Ala Ser Asp Ser Lys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Ser Lys Glu Thr Pro Ala Ala Thr Glu Ala
180 185 190
Pro Ser Ser Thr Pro Lys Ala Gln Gly Pro Ala Ala Ser Ala Glu Glu
195 200 205
Pro Lys Pro Val Glu Ala Pro Ala Ala Asn Ser Asp Gln Thr Val Thr
210 215 220
Val Lys Glu
225
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Lys Lys Lys Lys
1
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Lys可以是Arg
<400> 15
Lys Lys Lys Lys
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Lys可以是Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Lys可以是Arg
<400> 16
Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Ser
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Ser
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Ser
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser
1 5
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn
1 5 10
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val
1 5 10
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg
1 5
<210> 44
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 45
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Met Ala Asp Thr Leu Pro Ser Glu Phe Asp Val Ile Val Ile Gly Thr
1 5 10 15
Gly Leu Pro Glu Ser Ile Ile Ala Ala Ala Cys Ser Arg Ser Gly Arg
20 25 30
Arg Val Leu His Val Asp Ser Arg Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Trp Ala
35 40 45
Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Leu Ser Trp Leu Lys Glu Tyr Gln Glu
50 55 60
Asn Ser Asp Ile Val Ser Asp Ser Pro Val Trp Gln Asp Gln Ile Leu
65 70 75 80
Glu Asn Glu Glu Ala Ile Ala Leu Ser Arg Lys Asp Lys Thr Ile Gln
85 90 95
His Val Glu Val Phe Cys Tyr Ala Ser Gln Asp Leu His Glu Asp Val
100 105 110
Glu Glu Ala Gly Ala Leu Gln Lys Asn His Ala Leu Val Thr Ser Ala
115 120 125
Asn Ser Thr Glu Ala Ala Asp Ser Ala Phe Leu Pro Thr Glu Asp Glu
130 135 140
Ser Leu Ser Thr Met Ser Cys Glu Met Leu Thr Glu Gln Thr Pro Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Glu Asn Ala Leu Glu Val Asn Gly Ala Glu Val Thr Gly
165 170 175
Glu Lys Glu Asn His Cys Asp Asp Lys Thr Cys Val Pro Ser Thr Ser
180 185 190
Ala Glu Asp Met Ser Glu Asn Val Pro Ile Ala Glu Asp Thr Thr Glu
195 200 205
Gln Pro Lys Lys Asn Arg Ile Thr Tyr Ser Gln Ile Ile Lys Glu Gly
210 215 220
Arg Arg Phe Asn Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ile Asp Leu Leu Ile Lys Ser Asn Val Ser Arg Tyr Ala Glu
245 250 255
Phe Lys Asn Ile Thr Arg Ile Leu Ala Phe Arg Glu Gly Arg Val Glu
260 265 270
Gln Val Pro Cys Ser Arg Ala Asp Val Phe Asn Ser Lys Gln Leu Thr
275 280 285
Met Val Glu Lys Arg Met Leu Met Lys Phe Leu Thr Phe Cys Met Glu
290 295 300
Tyr Glu Lys Tyr Pro Asp Glu Tyr Lys Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Phe
305 310 315 320
Tyr Glu Tyr Leu Lys Thr Gln Lys Leu Thr Pro Asn Leu Gln Tyr Ile
325 330 335
Val Met His Ser Ile Ala Met Thr Ser Glu Thr Ala Ser Ser Thr Ile
340 345 350
Asp Gly Leu Lys Ala Thr Lys Asn Phe Leu His Cys Leu Gly Arg Tyr
355 360 365
Gly Asn Thr Pro Phe Leu Phe Pro Leu Tyr Gly Gln Gly Glu Leu Pro
370 375 380
Gln Cys Phe Cys Arg Met Cys Ala Val Phe Gly Gly Ile Tyr Cys Leu
385 390 395 400
Arg His Ser Val Gln Cys Leu Val Val Asp Lys Glu Ser Arg Lys Cys
405 410 415
Lys Ala Ile Ile Asp Gln Phe Gly Gln Arg Ile Ile Ser Glu His Phe
420 425 430
Leu Val Glu Asp Ser Tyr Phe Pro Glu Asn Met Cys Ser Arg Val Gln
435 440 445
Tyr Arg Gln Ile Ser Arg Ala Val Leu Ile Thr Asp Arg Ser Val Leu
450 455 460
Lys Thr Asp Ser Asp Gln Gln Ile Ser Ile Leu Thr Val Pro Ala Glu
465 470 475 480
Glu Pro Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Ile Glu Leu Cys Ser Ser Thr
485 490 495
Met Thr Cys Met Lys Gly Thr Tyr Leu Val His Leu Thr Cys Thr Ser
500 505 510
Ser Lys Thr Ala Arg Glu Asp Leu Glu Ser Val Val Gln Lys Leu Phe
515 520 525
Val Pro Tyr Thr Glu Met Glu Ile Glu Asn Glu Gln Val Glu Lys Pro
530 535 540
Arg Ile Leu Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Met Arg Asp Ser Ser Asp Ile
545 550 555 560
Ser Arg Ser Cys Tyr Asn Asp Leu Pro Ser Asn Val Tyr Val Cys Ser
565 570 575
Gly Pro Asp Cys Gly Leu Gly Asn Asp Asn Ala Val Lys Gln Ala Glu
580 585 590
Thr Leu Phe Gln Glu Ile Cys Pro Asn Glu Asp Phe Cys Pro Pro Pro
595 600 605
Pro Asn Pro Glu Asp Ile Ile Leu Asp Gly Asp Ser Leu Gln Pro Glu
610 615 620
Ala Ser Glu Ser Ser Ala Ile Pro Glu Ala Asn Ser Glu Thr Phe Lys
625 630 635 640
Glu Ser Thr Asn Leu Gly Asn Leu Glu Glu Ser Ser Glu
645 650
<210> 46
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中可将Gly重复整数1至100次
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 其中可将所述序列重复1至100的任意整数次
<400> 46
Gly Ser
1
<210> 47
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中可将Gly重复1至4的任意整数次
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 其中可将Ser重复0次或1次
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 其中可将序列重复1与50之间的整数次
<400> 47
Gly Ser
1
<210> 48
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中可将Gly重复1与100之间的整数次
<400> 48
Gly
1
<210> 49
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 其中可将序列重复1至100次
<400> 49
Gly Ala
1
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 其中可将序列重复1与100之间的整数次
<400> 50
Gly Gly Ser
1
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Gly Gly Lys Leu Ser Lys
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Gly Ala Lys Leu Ser Lys
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Gly Gly Lys Gln Ser Lys
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Gly Gly Lys Leu Ala Lys
1 5
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
Lys Lys Lys Gly
1
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Lys Lys Lys Gly Tyr
1 5
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Lys Lys Lys Gly Tyr Asn
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Lys Lys Lys Gly Tyr Ser
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Lys Lys Lys Gly Tyr Gly
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Lys Lys Lys Gly Tyr Gly Gly
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Lys Lys Lys Gly Ser
1 5
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Lys Lys Lys Gly Ser Gly
1 5
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Lys Lys Lys Gly Ser Gly
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Lys Lys Lys Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 67
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Lys Lys Lys Ser
1
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Lys Lys Lys Ser Gly
1 5
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Lys Lys Lys Ser Gly Gly
1 5
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser
1 5
<210> 75
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala
20 25
<210> 76
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 76
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala
20 25
<210> 77
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 77
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly
20 25
<210> 78
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu
20 25
<210> 79
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 79
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala
20 25
<210> 80
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys
20
<210> 81
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys
20
<210> 82
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys Asp
20
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu Lys
20
<210> 84
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Glu
20
<210> 85
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Lys
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 87
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 88
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu
1 5 10 15
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 89
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 90
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn
1 5 10
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 92
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 93
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly
1 5 10
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 95
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 95
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala
20 25
<210> 96
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 96
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu
20 25
<210> 97
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 97
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys
20 25
<210> 98
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 98
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys
20 25
<210> 99
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 99
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn
20 25
<210> 100
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 100
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys
20
<210> 101
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 101
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys
20
<210> 102
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 102
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe
20
<210> 103
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 103
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser
20
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 104
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe
20
<210> 105
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly
<210> 106
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu
<210> 108
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 109
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe
1 5 10 15
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 110
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 111
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 112
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 113
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser
1 5 10
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 114
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe
1 5
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 115
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 116
Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys
1 5
<210> 117
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 117
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala
20 25
<210> 118
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 118
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu
20 25
<210> 119
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 119
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys
20 25
<210> 120
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 120
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys
20 25
<210> 121
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 121
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn
20 25
<210> 122
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 122
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys
20
<210> 123
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 123
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys
20
<210> 124
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 124
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser Phe
20
<210> 125
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 125
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Ser
20
<210> 126
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 126
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe
20
<210> 127
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 127
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser Gly
<210> 128
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 128
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 129
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
Leu
<210> 130
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 130
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys
1 5 10 15
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 131
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe
1 5 10 15
<210> 132
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 132
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser
1 5 10
<210> 133
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 133
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 134
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 135
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe
1 5 10
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 136
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser
1 5 10
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 137
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 138
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg
1 5
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 139
Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys
1 5
<210> 140
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 140
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys
20 25
<210> 141
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 141
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys
20 25
<210> 142
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 142
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe
20 25
<210> 143
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 143
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser
20 25
<210> 144
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 144
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe
20
<210> 145
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 145
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly
20
<210> 146
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 146
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu Ser
20
<210> 147
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 147
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys Leu
20
<210> 148
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 148
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe Lys
20
<210> 149
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 149
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser Phe
<210> 150
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 150
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ser
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 151
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 152
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
<210> 153
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 153
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe
1 5 10 15
<210> 154
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 154
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser
1 5 10
<210> 155
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 155
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe
1 5 10
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 156
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg
1 5 10
<210> 157
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 157
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 158
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 159
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 160
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 161
Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys
1 5
<210> 162
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 162
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg Lys
20 25 30
<210> 163
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 163
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg
20 25
<210> 164
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 164
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn
20 25
<210> 165
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 165
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg
20 25
<210> 166
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 166
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys
20 25
<210> 167
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 167
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe
20 25
<210> 168
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 168
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser
20
<210> 169
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 169
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu
20
<210> 170
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 170
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser Gly
20
<210> 171
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 171
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu Ser
20
<210> 172
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 172
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys Leu
20
<210> 173
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 173
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe Lys
<210> 174
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 174
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro Phe
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 175
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
Pro
<210> 176
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 176
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210> 177
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 177
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys
1 5 10 15
<210> 178
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 178
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe
1 5 10
<210> 179
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 179
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser
1 5 10
<210> 180
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 180
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe
1 5 10
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 181
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 182
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 183
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 184
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 184
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 185
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys
1 5
<210> 186
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 186
Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg Glu Gly Glu Pro
1 5 10 15
Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Thr His
20 25 30
Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala Arg Arg Ser Val
35 40 45
Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly Leu Gly Tyr Glu
50 55 60
Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr Val Gly Ser Asp
65 70 75 80
Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala Asp Gln Gly Ser
85 90 95
Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln Gly Asn Trp Gln
100 105 110
Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val Val Ile Gln Pro
115 120 125
Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser Val Ala Glu Gly
130 135 140
Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp Arg Ala Asp Asp
145 150 155 160
Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met Pro Asp Ser Thr
165 170 175
Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg Asp Ser Leu Val
180 185 190
His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp Ala Arg Ser Tyr
195 200 205
His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr
210 215 220
Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg Ser Trp His Lys
225 230 235 240
Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly Val Thr Trp Leu
245 250 255
Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe
260 265 270
Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val Asp Thr Lys Ser
275 280 285
Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met Asn
290 295 300
Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu Ala Val Met Asp
305 310 315 320
Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala Gln
325 330 335
Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp Thr Phe Asn Phe
340 345 350
Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys Val
355 360 365
Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser Lys
370 375 380
Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser
385 390 395 400
Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser
420 425 430
Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu
435 440 445
Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser
450 455 460
Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val
465 470 475 480
Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln
485 490 495
Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp
500 505 510
Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser
515 520 525
Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala
530 535 540
Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys
545 550 555 560
Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp
565 570 575
Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp
580 585 590
Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr
595 600 605
Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser
610 615 620
Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe
625 630 635 640
Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly
645 650 655
Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr
660 665 670
Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly
675 680 685
Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr
690 695 700
Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg
705 710 715 720
Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp
725 730
<210> 187
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 187
Val Ala Thr Val Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro
1 5 10 15
Lys Asn Val Ser Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn
20 25 30
Ile Thr Thr Asp Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser
35 40 45
Phe Ser Arg Met Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala
50 55 60
Arg Leu Asp Arg Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu
65 70 75 80
Ser His Val Asp Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser
85 90 95
Lys Glu Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro
100 105 110
Gly His Asn Arg Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro
115 120 125
Ala Gly Val Gly Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu
130 135 140
Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Val Val Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr
180 185 190
Ser Glu Leu Leu Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly
195 200 205
Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys
210 215 220
Glu His Thr Asp Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu
225 230 235 240
Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg
245 250 255
Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn
260 265 270
Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln
275 280 285
Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys
290 295 300
Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met
305 310 315 320
Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr
325 330 335
Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr
340 345 350
Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp
355 360 365
Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu
370 375 380
Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp
385 390 395 400
Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln
405 410 415
Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser
420 425 430
Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu
435 440 445
Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe
450 455 460
Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser
465 470 475 480
Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser
485 490 495
Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val
500 505 510
His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr
515 520 525
Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile
530 535 540
His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala
545 550 555 560
Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly
565 570 575
Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys
580 585 590
Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met
595 600 605
Glu Met Asp
610
<210> 188
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 188
Ser Pro Ala Gly Val Gly Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val
1 5 10 15
Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu
20 25 30
Leu Ala Cys Arg Val Val Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg
35 40 45
Phe Thr Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val
50 55 60
Val Thr Ser Glu Leu Leu Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe
85 90 95
Ser Lys Glu His Thr Asp Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr
100 105 110
Glu Glu Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys
115 120 125
Gln Arg Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro
130 135 140
Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala
145 150 155 160
Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr
165 170 175
Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu
180 185 190
Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr
195 200 205
Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn
210 215 220
Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln
225 230 235 240
Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala
245 250 255
Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser
260 265 270
Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp
275 280 285
Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr
290 295 300
Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr
305 310 315 320
Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser
325 330 335
Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu
340 345 350
Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp
355 360 365
Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu
370 375 380
Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser
385 390 395 400
Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala
405 410 415
Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu
420 425 430
Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val
435 440 445
Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys
450 455 460
Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met
465 470 475 480
Ser Met Glu Met Asp
485
<210> 189
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 189
Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val
1 5 10 15
Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu
20 25 30
Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn
50 55 60
Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu
65 70 75 80
Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys
85 90 95
Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser
100 105 110
Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg
115 120 125
Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu
130 135 140
Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser
145 150 155 160
Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile
165 170 175
Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp
180 185 190
Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val
195 200 205
Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg
210 215 220
Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe
225 230 235 240
Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys
260 265 270
Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp
275 280 285
Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser
290 295 300
Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His
305 310 315 320
Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg
325 330 335
Leu Met Ser Met Glu Met Asp
340
<210> 190
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 190
Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro
1 5 10 15
Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val
20 25 30
His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe
35 40 45
Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala
50 55 60
Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala
65 70 75 80
Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser
85 90 95
Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu
100 105 110
Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn
115 120 125
Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp
130 135 140
Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys
145 150 155 160
Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly
165 170 175
Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser
180 185 190
Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg
195 200 205
Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp
210 215
<210> 191
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 191
Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe
1 5 10 15
Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu
20 25 30
Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys
35 40 45
Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu
50 55 60
Met Asp
65
<210> 192
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 192
Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ala Leu Cys Arg Gly
20
<210> 193
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 193
Pro Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp Leu Gly Ser Lys Ile Leu
1 5 10 15
Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr Glu Val Thr Gly His Arg
20 25 30
Trp Leu Lys Gly Gly Val Val Leu Lys Glu Asp Ala Leu Pro Gly Gln
35 40 45
Lys Thr Glu Phe Lys Val Asp Ser Asp Asp Gln Trp Gly Glu Tyr Ser
50 55 60
Cys Val Phe Leu Pro Glu Pro Met Gly Thr Ala Asn Ile Gln Leu His
65 70 75 80
Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn Glu
85 90 95
Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro Val
100 105 110
Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala Leu
115 120 125
Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly Arg
130 135 140
Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly Gln
145 150 155 160
Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile Ile
165 170 175
Thr Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Val Ala Glu Val Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu
195 200 205
Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser
210 215 220
Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn
225 230 235 240
Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser
245
<210> 194
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 194
His Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro
20 25 30
Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala
35 40 45
Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly
50 55 60
Arg Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly
65 70 75 80
Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile
85 90 95
Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu
100 105 110
Gly Ile Val Ala Glu Val Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr
115 120 125
Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly
130 135 140
Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys
145 150 155 160
Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser
165
<210> 195
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 195
Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Val Ala Glu Val
1 5 10 15
Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro
20 25 30
Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser
35 40 45
Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn
50 55 60
Ser Ser
65
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 196
Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
His Gly
<210> 197
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 197
Ala Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Gln Ala Pro Thr Ser Pro Pro Arg
1 5 10 15
Met Thr Val His Glu Gly Gln Glu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg
20 25 30
Thr Ser Thr Gln Lys His Thr His Leu Ala Val Ser Phe Gly Arg Ser
35 40 45
Val Pro Glu Ala Pro Val Gly Arg Ser Thr Leu Gln Glu Val Val Gly
50 55 60
Ile Arg Ser Asp Leu Ala Val Glu Ala Gly Ala Pro Tyr Ala Glu Arg
65 70 75 80
Leu Ala Ala Gly Glu Leu Arg Leu Gly Lys Glu Gly Thr Asp Arg Tyr
85 90 95
Arg Met Val Val Gly Gly Ala Gln Ala Gly Asp Ala Gly Thr Tyr His
100 105 110
Cys Thr Ala Ala Glu Trp Ile Gln Asp Pro Asp Gly Ser Trp Ala Gln
115 120 125
Ile Ala Glu Lys Arg Ala Val Leu Ala His Val Asp Val Gln Thr Leu
130 135 140
Ser Ser Gln Leu Ala Val Thr Val Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ile Gly
145 150 155 160
Pro Gly Glu Pro Leu Glu Leu Leu Cys Asn Val Ser Gly Ala Leu Pro
165 170 175
Pro Ala Gly Arg His Ala Ala Tyr Ser Val Gly Trp Glu Met Ala Pro
180 185 190
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gly Arg Leu Val Ala Gln Leu Asp Thr Glu
195 200 205
Gly Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Tyr Glu Gly Arg His Ile Ala Met
210 215 220
Glu Lys Val Ala Ser Arg Thr Tyr Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Pro Gly Asp Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Leu Ala Lys Ala Tyr Val Arg
245 250 255
Gly Ser Gly Thr Arg Leu Arg Glu Ala Ala Ser Ala Arg Ser Arg Pro
260 265 270
Leu Pro Val His Val Arg Glu Glu Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala
275 280 285
Trp Leu Ala Gly Gly Thr Val Tyr Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu
290 295 300
Cys Asn Ile Ser Val Arg Gly Gly Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala
305 310 315 320
Ser Trp Trp Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro
325 330 335
Ala Gln Leu Val Gly Gly Val Gly Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly
340 345 350
Val Arg Pro Gly Gly Gly Pro Val Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg
355 360 365
Ser His Arg Leu Arg Leu His Ser Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val
370 375 380
Tyr His Cys Ala Pro Ser Ala Trp Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp
385 390 395 400
Tyr Gln Ala Gly Ser Ala Arg Ser Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr
405 410 415
Met His Ala Leu Asp Thr Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly
420 425 430
Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys
435 440 445
Phe Met Lys Arg Leu Arg Lys Arg
450 455
<210> 198
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 198
Ala His Val Asp Val Gln Thr Leu Ser Ser Gln Leu Ala Val Thr Val
1 5 10 15
Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ile Gly Pro Gly Glu Pro Leu Glu Leu Leu
20 25 30
Cys Asn Val Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Gly Arg His Ala Ala Tyr
35 40 45
Ser Val Gly Trp Glu Met Ala Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gly Arg
50 55 60
Leu Val Ala Gln Leu Asp Thr Glu Gly Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Glu Gly Arg His Ile Ala Met Glu Lys Val Ala Ser Arg Thr Tyr
85 90 95
Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Arg Pro Gly Asp Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
Cys Leu Ala Lys Ala Tyr Val Arg Gly Ser Gly Thr Arg Leu Arg Glu
115 120 125
Ala Ala Ser Ala Arg Ser Arg Pro Leu Pro Val His Val Arg Glu Glu
130 135 140
Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala Trp Leu Ala Gly Gly Thr Val Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu Cys Asn Ile Ser Val Arg Gly Gly
165 170 175
Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala Ser Trp Trp Val Glu Arg Pro Glu
180 185 190
Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro Ala Gln Leu Val Gly Gly Val Gly
195 200 205
Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly Val Arg Pro Gly Gly Gly Pro Val
210 215 220
Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg Ser His Arg Leu Arg Leu His Ser
225 230 235 240
Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Ala Pro Ser Ala Trp
245 250 255
Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp Tyr Gln Ala Gly Ser Ala Arg Ser
260 265 270
Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr Met His Ala Leu Asp Thr Leu Phe
275 280 285
Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr
290 295 300
Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys Phe Met Lys Arg Leu Arg Lys Arg
305 310 315 320
<210> 199
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 199
Arg Glu Glu Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala Trp Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Tyr Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu Cys Asn Ile Ser Val
20 25 30
Arg Gly Gly Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala Ser Trp Trp Val Glu
35 40 45
Arg Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro Ala Gln Leu Val Gly
50 55 60
Gly Val Gly Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly Val Arg Pro Gly Gly
65 70 75 80
Gly Pro Val Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg Ser His Arg Leu Arg
85 90 95
Leu His Ser Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Ala Pro
100 105 110
Ser Ala Trp Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp Tyr Gln Ala Gly Ser
115 120 125
Ala Arg Ser Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr Met His Ala Leu Asp
130 135 140
Thr Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly Val Ala Leu Val Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys Phe Met Lys Arg Leu
165 170 175
Arg Lys Arg
<210> 200
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 200
Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys
1 5 10 15
Phe Met Lys Arg Leu Arg Lys Arg
20
<210> 201
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 201
Met Gly Ala Leu Arg Pro Thr Leu Leu Pro Pro Ser Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Met Leu Gly Met Gly Cys Trp Ala
20 25
<210> 202
<211> 1021
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 202
Met Ala Gly Ile Ser Tyr Val Ala Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ile Gly Gln Arg Glu Val Thr Val Gln Lys Gly Pro Leu Phe
20 25 30
Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Val Ser Ile Gly Cys Asn Val Thr Gly His
35 40 45
Gln Gly Pro Ser Glu Gln His Phe Gln Trp Ser Val Tyr Leu Pro Thr
50 55 60
Asn Pro Thr Gln Glu Val Gln Ile Ile Ser Thr Lys Asp Ala Ala Phe
65 70 75 80
Ser Tyr Ala Val Tyr Thr Gln Arg Val Arg Ser Gly Asp Val Tyr Val
85 90 95
Glu Arg Val Gln Gly Asn Ser Val Leu Leu His Ile Ser Lys Leu Gln
100 105 110
Met Lys Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Thr Pro Asn Thr Asp Glu
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Ser Ala Lys Thr Asn Leu Ile Val Ile Pro
130 135 140
Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser Ser Gln Thr Leu Gly Lys Glu Glu
145 150 155 160
Gly Glu Pro Leu Ala Leu Thr Cys Glu Ala Ser Lys Ala Thr Ala Gln
165 170 175
His Thr His Leu Ser Val Thr Trp Tyr Leu Thr Gln Asp Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gln Ala Thr Glu Ile Ile Ser Leu Ser Lys Asp Phe Ile Leu Val
195 200 205
Pro Gly Pro Leu Tyr Thr Glu Arg Phe Ala Ala Ser Asp Val Gln Leu
210 215 220
Asn Lys Leu Gly Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Ile Glu Arg Leu Gln
225 230 235 240
Ser Ser Asp Gln Gly Gln Leu Phe Cys Glu Ala Thr Glu Trp Ile Gln
245 250 255
Asp Pro Asp Glu Thr Trp Met Phe Ile Thr Lys Lys Gln Thr Asp Gln
260 265 270
Thr Thr Leu Arg Ile Gln Pro Ala Val Lys Asp Phe Gln Val Asn Ile
275 280 285
Thr Ala Asp Ser Leu Phe Ala Glu Gly Lys Pro Leu Glu Leu Val Cys
290 295 300
Leu Val Val Ser Ser Gly Arg Asp Pro Gln Leu Gln Gly Ile Trp Phe
305 310 315 320
Phe Asn Gly Thr Glu Ile Ala His Ile Asp Ala Gly Gly Val Leu Gly
325 330 335
Leu Lys Asn Asp Tyr Lys Glu Arg Ala Ser Gln Gly Glu Leu Gln Val
340 345 350
Ser Lys Leu Gly Pro Lys Ala Phe Ser Leu Lys Ile Phe Ser Leu Gly
355 360 365
Pro Glu Asp Glu Gly Ala Tyr Arg Cys Val Val Ala Glu Val Met Lys
370 375 380
Thr Arg Thr Gly Ser Trp Gln Val Leu Gln Arg Lys Gln Ser Pro Asp
385 390 395 400
Ser His Val His Leu Arg Lys Pro Ala Ala Arg Ser Val Val Met Ser
405 410 415
Thr Lys Asn Lys Gln Gln Val Val Trp Glu Gly Glu Thr Leu Ala Phe
420 425 430
Leu Cys Lys Ala Gly Gly Ala Glu Ser Pro Leu Ser Val Ser Trp Trp
435 440 445
His Ile Pro Arg Asp Gln Thr Gln Pro Glu Phe Val Ala Gly Met Gly
450 455 460
Gln Asp Gly Ile Val Gln Leu Gly Ala Ser Tyr Gly Val Pro Ser Tyr
465 470 475 480
His Gly Asn Thr Arg Leu Glu Lys Met Asp Trp Ala Thr Phe Gln Leu
485 490 495
Glu Ile Thr Phe Thr Ala Ile Thr Asp Ser Gly Thr Tyr Glu Cys Arg
500 505 510
Val Ser Glu Lys Ser Arg Asn Gln Ala Arg Asp Leu Ser Trp Thr Gln
515 520 525
Lys Ile Ser Val Thr Val Lys Ser Leu Glu Ser Ser Leu Gln Val Ser
530 535 540
Leu Met Ser Arg Gln Pro Gln Val Met Leu Thr Asn Thr Phe Asp Leu
545 550 555 560
Ser Cys Val Val Arg Ala Gly Tyr Ser Asp Leu Lys Val Pro Leu Thr
565 570 575
Val Thr Trp Gln Phe Gln Pro Ala Ser Ser His Ile Phe His Gln Leu
580 585 590
Ile Arg Ile Thr His Asn Gly Thr Ile Glu Trp Gly Asn Phe Leu Ser
595 600 605
Arg Phe Gln Lys Lys Thr Lys Val Ser Gln Ser Leu Phe Arg Ser Gln
610 615 620
Leu Leu Val His Asp Ala Thr Glu Glu Glu Thr Gly Val Tyr Gln Cys
625 630 635 640
Glu Val Glu Val Tyr Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Asn Asn Arg Pro Pro
645 650 655
Arg Ala Ser Ala Ile Ser His Pro Leu Arg Ile Ala Val Thr Leu Pro
660 665 670
Glu Ser Lys Leu Lys Val Asn Ser Arg Ser Gln Val Gln Glu Leu Ser
675 680 685
Ile Asn Ser Asn Thr Asp Ile Glu Cys Ser Ile Leu Ser Arg Ser Asn
690 695 700
Gly Asn Leu Gln Leu Ala Ile Ile Trp Tyr Phe Ser Pro Val Ser Thr
705 710 715 720
Asn Ala Ser Trp Leu Lys Ile Leu Glu Met Asp Gln Thr Asn Val Ile
725 730 735
Lys Thr Gly Asp Glu Phe His Thr Pro Gln Arg Lys Gln Lys Phe His
740 745 750
Thr Glu Lys Val Ser Gln Asp Leu Phe Gln Leu His Ile Leu Asn Val
755 760 765
Glu Asp Ser Asp Arg Gly Lys Tyr His Cys Ala Val Glu Glu Trp Leu
770 775 780
Leu Ser Thr Asn Gly Thr Trp His Lys Leu Gly Glu Lys Lys Ser Gly
785 790 795 800
Leu Thr Glu Leu Lys Leu Lys Pro Thr Gly Ser Lys Val Arg Val Ser
805 810 815
Lys Val Tyr Trp Thr Glu Asn Val Thr Glu His Arg Glu Val Ala Ile
820 825 830
Arg Cys Ser Leu Glu Ser Val Gly Ser Ser Ala Thr Leu Tyr Ser Val
835 840 845
Met Trp Tyr Trp Asn Arg Glu Asn Ser Gly Ser Lys Leu Leu Val His
850 855 860
Leu Gln His Asp Gly Leu Leu Glu Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Arg Arg
865 870 875 880
His Leu His Cys Tyr Arg Ser Ser Ser Thr Asp Phe Val Leu Lys Leu
885 890 895
His Gln Val Glu Met Glu Asp Ala Gly Met Tyr Trp Cys Arg Val Ala
900 905 910
Glu Trp Gln Leu His Gly His Pro Ser Lys Trp Ile Asn Gln Ala Ser
915 920 925
Asp Glu Ser Gln Arg Met Val Leu Thr Val Leu Pro Ser Glu Pro Thr
930 935 940
Leu Pro Ser Arg Ile Cys Ser Ser Ala Pro Leu Leu Tyr Phe Leu Phe
945 950 955 960
Ile Cys Pro Phe Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ser Leu Leu Cys
965 970 975
Leu Tyr Trp Lys Ala Arg Lys Leu Ser Thr Leu Arg Ser Asn Thr Arg
980 985 990
Lys Glu Lys Ala Leu Trp Val Asp Leu Lys Glu Ala Gly Gly Val Thr
995 1000 1005
Thr Asn Arg Arg Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Gly Asn
1010 1015 1020
<210> 203
<211> 1195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 203
Met Lys Cys Phe Phe Pro Val Leu Ser Cys Leu Ala Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Val Ser Ala Gln Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Gly Pro Leu Tyr Arg
20 25 30
Thr Glu Gly Ser His Ile Thr Ile Trp Cys Asn Val Ser Gly Tyr Gln
35 40 45
Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Gln Trp Ser Ile Tyr Leu Pro Ser Ser
50 55 60
Pro Glu Arg Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Met Asp Ser Ser Phe Pro
65 70 75 80
Tyr Ala Ile Tyr Thr Gln Arg Val Arg Gly Gly Lys Ile Phe Ile Glu
85 90 95
Arg Val Gln Gly Asn Ser Thr Leu Leu His Ile Thr Asp Leu Gln Ala
100 105 110
Arg Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Thr Pro Ser Thr Asp Lys Gln
115 120 125
Tyr Phe Gly Ser Tyr Ser Ala Lys Met Asn Leu Val Val Ile Pro Asp
130 135 140
Ser Leu Gln Thr Thr Ala Met Pro Gln Thr Leu His Arg Val Glu Gln
145 150 155 160
Asp Pro Leu Glu Leu Thr Cys Glu Val Ala Ser Glu Thr Ile Gln His
165 170 175
Ser His Leu Ser Val Ala Trp Leu Arg Gln Lys Val Gly Glu Lys Pro
180 185 190
Val Glu Val Ile Ser Leu Ser Arg Asp Phe Met Leu His Ser Ser Ser
195 200 205
Glu Tyr Ala Gln Arg Gln Ser Leu Gly Glu Val Arg Leu Asp Lys Leu
210 215 220
Gly Arg Thr Thr Phe Arg Leu Thr Ile Phe His Leu Gln Pro Ser Asp
225 230 235 240
Gln Gly Glu Phe Tyr Cys Glu Ala Ala Glu Trp Ile Gln Asp Pro Asp
245 250 255
Gly Ser Trp Tyr Ala Met Thr Arg Lys Arg Ser Glu Gly Ala Val Val
260 265 270
Asn Val Gln Pro Thr Asp Lys Glu Phe Thr Val Arg Leu Glu Thr Glu
275 280 285
Lys Arg Leu His Thr Val Gly Glu Pro Val Glu Phe Arg Cys Ile Leu
290 295 300
Glu Ala Gln Asn Val Pro Asp Arg Tyr Phe Ala Val Ser Trp Ala Phe
305 310 315 320
Asn Ser Ser Leu Ile Ala Thr Met Gly Pro Asn Ala Val Pro Val Leu
325 330 335
Asn Ser Glu Phe Ala His Arg Glu Ala Arg Gly Gln Leu Lys Val Ala
340 345 350
Lys Glu Ser Asp Ser Val Phe Val Leu Lys Ile Tyr His Leu Arg Gln
355 360 365
Glu Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Cys Arg Val Thr Glu Arg Glu Lys Thr
370 375 380
Val Thr Gly Glu Phe Ile Asp Lys Glu Ser Lys Arg Pro Lys Asn Ile
385 390 395 400
Pro Ile Ile Val Leu Pro Leu Lys Ser Ser Ile Ser Val Glu Val Ala
405 410 415
Ser Asn Ala Ser Val Ile Leu Glu Gly Glu Asp Leu Arg Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Arg Thr Ala Gly Arg Pro Gln Gly Arg Phe Ser Val Ile Trp
435 440 445
Gln Leu Val Asp Arg Gln Asn Arg Arg Ser Asn Ile Met Trp Leu Asp
450 455 460
Arg Asp Gly Thr Val Gln Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Glu Arg Ser Ser
465 470 475 480
Phe Gly Gly Val Gln Met Glu Gln Val Gln Pro Asn Ser Phe Ser Leu
485 490 495
Gly Ile Phe Asn Ser Arg Lys Glu Asp Glu Gly Gln Tyr Glu Cys His
500 505 510
Val Thr Glu Trp Val Arg Ala Val Asp Gly Glu Trp Gln Ile Val Gly
515 520 525
Glu Arg Arg Ala Ser Thr Pro Ile Ser Ile Thr Ala Leu Glu Met Gly
530 535 540
Phe Ala Val Thr Ala Ile Ser Arg Thr Pro Gly Val Thr Tyr Ser Asp
545 550 555 560
Ser Phe Asp Leu Gln Cys Ile Ile Lys Pro His Tyr Pro Ala Trp Val
565 570 575
Pro Val Ser Val Thr Trp Arg Phe Gln Pro Val Gly Thr Val Glu Phe
580 585 590
His Asp Leu Val Thr Phe Thr Arg Asp Gly Gly Val Gln Trp Gly Asp
595 600 605
Arg Ser Ser Ser Phe Arg Thr Arg Thr Ala Ile Glu Lys Ala Glu Ser
610 615 620
Ser Asn Asn Val Arg Leu Ser Ile Ser Arg Ala Ser Asp Thr Glu Ala
625 630 635 640
Gly Lys Tyr Gln Cys Val Ala Glu Leu Trp Arg Lys Asn Tyr Asn Asn
645 650 655
Thr Trp Thr Arg Leu Ala Glu Arg Thr Ser Asn Leu Leu Glu Ile Arg
660 665 670
Val Leu Gln Pro Val Thr Lys Leu Gln Val Ser Lys Ser Lys Arg Thr
675 680 685
Leu Thr Leu Val Glu Asn Lys Pro Ile Gln Leu Asn Cys Ser Val Lys
690 695 700
Ser Gln Thr Ser Gln Asn Ser His Phe Ala Val Leu Trp Tyr Val His
705 710 715 720
Lys Pro Ser Asp Ala Asp Gly Lys Leu Ile Leu Lys Thr Thr His Asn
725 730 735
Ser Ala Phe Glu Tyr Gly Thr Tyr Ala Glu Glu Glu Gly Leu Arg Ala
740 745 750
Arg Leu Gln Phe Glu Arg His Val Ser Gly Gly Leu Phe Ser Leu Thr
755 760 765
Val Gln Arg Ala Glu Val Ser Asp Ser Gly Ser Tyr Tyr Cys His Val
770 775 780
Glu Glu Trp Leu Leu Ser Pro Asn Tyr Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Glu
785 790 795 800
Glu Val Ser Gly Arg Thr Glu Val Thr Val Lys Gln Pro Asp Ser Arg
805 810 815
Leu Arg Leu Ser Gln Ala Gln Gly Asn Leu Ser Val Leu Glu Thr Arg
820 825 830
Gln Val Gln Leu Glu Cys Val Val Leu Asn Arg Thr Ser Ile Thr Ser
835 840 845
Gln Leu Met Val Glu Trp Phe Val Trp Lys Pro Asn His Pro Glu Arg
850 855 860
Glu Thr Val Ala Arg Leu Ser Arg Asp Ala Thr Phe His Tyr Gly Glu
865 870 875 880
Gln Ala Ala Lys Asn Asn Leu Lys Gly Arg Leu His Leu Glu Ser Pro
885 890 895
Ser Pro Gly Val Tyr Arg Leu Phe Ile Gln Asn Val Ala Val Gln Asp
900 905 910
Ser Gly Thr Tyr Ser Cys His Val Glu Glu Trp Leu Pro Ser Pro Ser
915 920 925
Gly Met Trp Tyr Lys Arg Ala Glu Asp Thr Ala Gly Gln Thr Ala Leu
930 935 940
Thr Val Met Arg Pro Asp Ala Ser Leu Gln Val Asp Thr Val Val Pro
945 950 955 960
Asn Ala Thr Val Ser Glu Lys Ala Ala Phe Gln Leu Asp Cys Ser Ile
965 970 975
Val Ser Arg Ser Ser Gln Asp Ser Arg Phe Ala Val Ala Trp Tyr Ser
980 985 990
Leu Arg Thr Lys Ala Gly Gly Lys Arg Ser Ser Pro Gly Leu Glu Glu
995 1000 1005
Gln Glu Glu Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp
1010 1015 1020
Asp Asp Asp Asp Pro Thr Glu Arg Thr Ala Leu Leu Ser Val Gly
1025 1030 1035
Pro Asp Ala Val Phe Gly Pro Glu Gly Ser Pro Trp Glu Gly Arg
1040 1045 1050
Leu Arg Phe Gln Arg Leu Ser Pro Val Leu Tyr Arg Leu Thr Val
1055 1060 1065
Leu Gln Ala Ser Pro Gln Asp Thr Gly Asn Tyr Ser Cys His Val
1070 1075 1080
Glu Glu Trp Leu Pro Ser Pro Gln Lys Glu Trp Tyr Arg Leu Thr
1085 1090 1095
Glu Glu Glu Ser Ala Pro Ile Gly Ile Arg Val Leu Asp Thr Ser
1100 1105 1110
Pro Thr Leu Gln Ser Ile Ile Cys Ser Asn Asp Ala Leu Phe Tyr
1115 1120 1125
Phe Val Phe Phe Tyr Pro Phe Pro Ile Phe Gly Ile Leu Ile Ile
1130 1135 1140
Thr Ile Leu Leu Val Arg Phe Lys Ser Arg Asn Ser Ser Lys Asn
1145 1150 1155
Ser Asp Gly Lys Asn Gly Val Pro Leu Leu Trp Ile Lys Glu Pro
1160 1165 1170
His Leu Asn Tyr Ser Pro Thr Cys Leu Glu Pro Pro Val Leu Ser
1175 1180 1185
Ile His Pro Gly Ala Ile Asp
1190 1195
<210> 204
<211> 1023
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 204
Met Gly Lys Gly Val Gly Arg Asp Lys Tyr Glu Pro Ala Ala Val Ser
1 5 10 15
Glu Gln Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys Asp Arg Asp Met
20 25 30
Asp Glu Leu Lys Lys Glu Val Ser Met Asp Asp His Lys Leu Ser Leu
35 40 45
Asp Glu Leu His Arg Lys Tyr Gly Thr Asp Leu Ser Arg Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Ala Arg Ala Ala Glu Ile Leu Ala Arg Asp Gly Pro Asn Ala Leu
65 70 75 80
Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Glu Trp Ile Lys Phe Cys Arg Gln Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Phe Ser Met Leu Leu Trp Ile Gly Ala Ile Leu Cys Phe
100 105 110
Leu Ala Tyr Ser Ile Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp
115 120 125
Asn Leu Tyr Leu Gly Val Val Leu Ser Ala Val Val Ile Ile Thr Gly
130 135 140
Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Glu Ala Lys Ser Ser Lys Ile Met Glu Ser
145 150 155 160
Phe Lys Asn Met Val Pro Gln Gln Ala Leu Val Ile Arg Asn Gly Glu
165 170 175
Lys Met Ser Ile Asn Ala Glu Glu Val Val Val Gly Asp Leu Val Glu
180 185 190
Val Lys Gly Gly Asp Arg Ile Pro Ala Asp Leu Arg Ile Ile Ser Ala
195 200 205
Asn Gly Cys Lys Val Asp Asn Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Glu Pro
210 215 220
Gln Thr Arg Ser Pro Asp Phe Thr Asn Glu Asn Pro Leu Glu Thr Arg
225 230 235 240
Asn Ile Ala Phe Phe Ser Thr Asn Cys Val Glu Gly Thr Ala Arg Gly
245 250 255
Ile Val Val Tyr Thr Gly Asp Arg Thr Val Met Gly Arg Ile Ala Thr
260 265 270
Leu Ala Ser Gly Leu Glu Gly Gly Gln Thr Pro Ile Ala Ala Glu Ile
275 280 285
Glu His Phe Ile His Ile Ile Thr Gly Val Ala Val Phe Leu Gly Val
290 295 300
Ser Phe Phe Ile Leu Ser Leu Ile Leu Glu Tyr Thr Trp Leu Glu Ala
305 310 315 320
Val Ile Phe Leu Ile Gly Ile Ile Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu
325 330 335
Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala
340 345 350
Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly
355 360 365
Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn
370 375 380
Arg Met Thr Val Ala His Met Trp Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala
385 390 395 400
Asp Thr Thr Glu Asn Gln Ser Gly Val Ser Phe Asp Lys Thr Ser Ala
405 410 415
Thr Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val
420 425 430
Phe Gln Ala Asn Gln Glu Asn Leu Pro Ile Leu Lys Arg Ala Val Ala
435 440 445
Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu Leu Lys Cys Ile Glu Leu Cys Cys
450 455 460
Gly Ser Val Lys Glu Met Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Ile Val Glu Ile
465 470 475 480
Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr Gln Leu Ser Ile His Lys Asn Pro
485 490 495
Asn Thr Ser Glu Pro Gln His Leu Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu
500 505 510
Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Ser Ile Leu Leu His Gly Lys Glu Gln
515 520 525
Pro Leu Asp Glu Glu Leu Lys Asp Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu
530 535 540
Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val Leu Gly Phe Cys His Leu Phe Leu
545 550 555 560
Pro Asp Glu Gln Phe Pro Glu Gly Phe Gln Phe Asp Thr Asp Asp Val
565 570 575
Asn Phe Pro Ile Asp Asn Leu Cys Phe Val Gly Leu Ile Ser Met Ile
580 585 590
Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser
595 600 605
Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala
610 615 620
Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr
625 630 635 640
Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn
645 650 655
Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp
660 665 670
Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Asp Ile Leu Lys Tyr His Thr Glu Ile
675 680 685
Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly
690 695 700
Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn
705 710 715 720
Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile
725 730 735
Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp
740 745 750
Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile
755 760 765
Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ser Ile Ala Tyr Thr Leu Thr Ser Asn Ile
770 775 780
Pro Glu Ile Thr Pro Phe Leu Ile Phe Ile Ile Ala Asn Ile Pro Leu
785 790 795 800
Pro Leu Gly Thr Val Thr Ile Leu Cys Ile Asp Leu Gly Thr Asp Met
805 810 815
Val Pro Ala Ile Ser Leu Ala Tyr Glu Gln Ala Glu Ser Asp Ile Met
820 825 830
Lys Arg Gln Pro Arg Asn Pro Lys Thr Asp Lys Leu Val Asn Glu Arg
835 840 845
Leu Ile Ser Met Ala Tyr Gly Gln Ile Gly Met Ile Gln Ala Leu Gly
850 855 860
Gly Phe Phe Thr Tyr Phe Val Ile Leu Ala Glu Asn Gly Phe Leu Pro
865 870 875 880
Ile His Leu Leu Gly Leu Arg Val Asp Trp Asp Asp Arg Trp Ile Asn
885 890 895
Asp Val Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Gln Trp Thr Tyr Glu Gln Arg Lys
900 905 910
Ile Val Glu Phe Thr Cys His Thr Ala Phe Phe Val Ser Ile Val Val
915 920 925
Val Gln Trp Ala Asp Leu Val Ile Cys Lys Thr Arg Arg Asn Ser Val
930 935 940
Phe Gln Gln Gly Met Lys Asn Lys Ile Leu Ile Phe Gly Leu Phe Glu
945 950 955 960
Glu Thr Ala Leu Ala Ala Phe Leu Ser Tyr Cys Pro Gly Met Gly Val
965 970 975
Ala Leu Arg Met Tyr Pro Leu Lys Pro Thr Trp Trp Phe Cys Ala Phe
980 985 990
Pro Tyr Ser Leu Leu Ile Phe Val Tyr Asp Glu Val Arg Lys Leu Ile
995 1000 1005
Ile Arg Arg Arg Pro Gly Gly Trp Val Glu Lys Glu Thr Tyr Tyr
1010 1015 1020
<210> 205
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 205
Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Glu Tyr Ser Pro Ala Ala Thr Thr Ala
1 5 10 15
Glu Asn Gly Gly Gly Lys Lys Lys Gln Lys Glu Lys Glu Leu Asp Glu
20 25 30
Leu Lys Lys Glu Val Ala Met Asp Asp His Lys Leu Ser Leu Asp Glu
35 40 45
Leu Gly Arg Lys Tyr Gln Val Asp Leu Ser Lys Gly Leu Thr Asn Gln
50 55 60
Arg Ala Gln Asp Val Leu Ala Arg Asp Gly Pro Asn Ala Leu Thr Pro
65 70 75 80
Pro Pro Thr Thr Pro Glu Trp Val Lys Phe Cys Arg Gln Leu Phe Gly
85 90 95
Gly Phe Ser Ile Leu Leu Trp Ile Gly Ala Ile Leu Cys Phe Leu Ala
100 105 110
Tyr Gly Ile Gln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp Asn Leu
115 120 125
Tyr Leu Gly Val Val Leu Ala Ala Val Val Ile Val Thr Gly Cys Phe
130 135 140
Ser Tyr Tyr Gln Glu Ala Lys Ser Ser Lys Ile Met Asp Ser Phe Lys
145 150 155 160
Asn Met Val Pro Gln Gln Ala Leu Val Ile Arg Glu Gly Glu Lys Met
165 170 175
Gln Ile Asn Ala Glu Glu Val Val Val Gly Asp Leu Val Glu Val Lys
180 185 190
Gly Gly Asp Arg Val Pro Ala Asp Leu Arg Ile Ile Ser Ser His Gly
195 200 205
Cys Lys Val Asp Asn Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Glu Pro Gln Thr
210 215 220
Arg Ser Pro Glu Phe Thr His Glu Asn Pro Leu Glu Thr Arg Asn Ile
225 230 235 240
<210> 206
<211> 780
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 206
Cys Phe Phe Ser Thr Asn Cys Val Glu Gly Thr Ala Arg Gly Ile Val
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gly Asp Arg Thr Val Met Gly Arg Ile Ala Thr Leu Ala
20 25 30
Ser Gly Leu Glu Val Gly Arg Thr Pro Ile Ala Met Glu Ile Glu His
35 40 45
Phe Ile Gln Leu Ile Thr Gly Val Ala Val Phe Leu Gly Val Ser Phe
50 55 60
Phe Val Leu Ser Leu Ile Leu Gly Tyr Ser Trp Leu Glu Ala Val Ile
65 70 75 80
Phe Leu Ile Gly Ile Ile Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala
85 90 95
Thr Val Thr Val Cys Leu Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys
100 105 110
Asn Cys Leu Val Lys Asn Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr
115 120 125
Ser Thr Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met
130 135 140
Thr Val Ala His Met Trp Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr
145 150 155 160
Thr Glu Asp Gln Ser Gly Ala Thr Phe Asp Lys Arg Ser Pro Thr Trp
165 170 175
Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys
180 185 190
Ala Gly Gln Glu Asn Ile Ser Val Ser Lys Arg Asp Thr Ala Gly Asp
195 200 205
Ala Ser Glu Ser Ala Leu Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Cys Gly Ser
210 215 220
Val Arg Lys Met Arg Asp Arg Asn Pro Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe
225 230 235 240
Asn Ser Thr Asn Lys Tyr Gln Leu Ser Ile His Glu Arg Glu Asp Ser
245 250 255
Pro Gln Ser His Val Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu
260 265 270
Asp Arg Cys Ser Thr Ile Leu Val Gln Gly Lys Glu Ile Pro Leu Asp
275 280 285
Lys Glu Met Gln Asp Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Met Glu Leu Gly Gly
290 295 300
Leu Gly Glu Arg Val Leu Gly Phe Cys Gln Leu Asn Leu Pro Ser Gly
305 310 315 320
Lys Phe Pro Arg Gly Phe Lys Phe Asp Thr Asp Glu Leu Asn Phe Pro
325 330 335
Thr Glu Lys Leu Cys Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro
340 345 350
Arg Ala Ala Val Pro Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile
355 360 365
Lys Val Ile Met Val Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile
370 375 380
Ala Lys Gly Val Gly Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp
385 390 395 400
Ile Ala Ala Arg Leu Asn Ile Pro Met Ser Gln Val Asn Pro Arg Glu
405 410 415
Ala Lys Ala Cys Val Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser
420 425 430
Glu Gln Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala
435 440 445
Arg Thr Ser Pro Gln Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg
450 455 460
Gln Gly Ala Ile Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro
465 470 475 480
Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile Gly Ile Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser
485 490 495
Asp Val Ser Lys Gln Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe
500 505 510
Ala Ser Ile Val Thr Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn
515 520 525
Leu Lys Lys Ser Ile Ala Tyr Thr Leu Thr Ser Asn Ile Pro Glu Ile
530 535 540
Thr Pro Phe Leu Leu Phe Ile Ile Ala Asn Ile Pro Leu Pro Leu Gly
545 550 555 560
Thr Val Thr Ile Leu Cys Ile Asp Leu Gly Thr Asp Met Val Pro Ala
565 570 575
Ile Ser Leu Ala Tyr Glu Ala Ala Glu Ser Asp Ile Met Lys Arg Gln
580 585 590
Pro Arg Asn Ser Gln Thr Asp Lys Leu Val Asn Glu Arg Leu Ile Ser
595 600 605
Met Ala Tyr Gly Gln Ile Gly Met Ile Gln Ala Leu Gly Gly Phe Phe
610 615 620
Thr Tyr Phe Val Ile Leu Ala Glu Asn Gly Phe Leu Pro Ser Arg Leu
625 630 635 640
Leu Gly Ile Arg Leu Asp Trp Asp Asp Arg Thr Met Asn Asp Leu Glu
645 650 655
Asp Ser Tyr Gly Gln Glu Trp Thr Tyr Glu Gln Arg Lys Val Val Glu
660 665 670
Phe Thr Cys His Thr Ala Phe Phe Ala Ser Ile Val Val Val Gln Trp
675 680 685
Ala Asp Leu Ile Ile Cys Lys Thr Arg Arg Asn Ser Val Phe Gln Gln
690 695 700
Gly Met Lys Asn Lys Ile Leu Ile Phe Gly Leu Leu Glu Glu Thr Ala
705 710 715 720
Leu Ala Ala Phe Leu Ser Tyr Cys Pro Gly Met Gly Val Ala Leu Arg
725 730 735
Met Tyr Pro Leu Lys Val Thr Trp Trp Phe Cys Ala Phe Pro Tyr Ser
740 745 750
Leu Leu Ile Phe Ile Tyr Asp Glu Val Arg Lys Leu Ile Leu Arg Arg
755 760 765
Tyr Pro Gly Gly Trp Val Glu Lys Glu Thr Tyr Tyr
770 775 780
<210> 207
<211> 1026
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 207
Met Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ser Tyr Arg Ile Ala Thr Ser Gln Asp
1 5 10 15
Lys Lys Asp Asp Lys Asp Ser Pro Lys Lys Asn Lys Gly Lys Glu Arg
20 25 30
Arg Asp Leu Asp Asp Leu Lys Lys Glu Val Ala Met Thr Glu His Lys
35 40 45
Met Ser Val Glu Glu Val Cys Arg Lys Tyr Asn Thr Asp Cys Val Gln
50 55 60
Gly Leu Thr His Ser Lys Ala Gln Glu Ile Leu Ala Arg Asp Gly Pro
65 70 75 80
Asn Ala Leu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Glu Trp Val Lys Phe Cys
85 90 95
Arg Gln Leu Phe Gly Gly Phe Ser Ile Leu Leu Trp Ile Gly Ala Ile
100 105 110
Leu Cys Phe Leu Ala Tyr Gly Ile Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro
115 120 125
Ser Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ala Ala Val Val Ile
130 135 140
Ile Thr Gly Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Glu Ala Lys Ser Ser Lys Ile
145 150 155 160
Met Glu Ser Phe Lys Asn Met Val Pro Gln Gln Ala Leu Val Ile Arg
165 170 175
Glu Gly Glu Lys Met Gln Val Asn Ala Glu Glu Val Val Val Gly Asp
180 185 190
Leu Val Glu Ile Lys Gly Gly Asp Arg Val Pro Ala Asp Leu Arg Ile
195 200 205
Ile Ser Ala His Gly Cys Lys Val Asp Asn Ser Ser Leu Thr Gly Glu
210 215 220
Ser Glu Pro Gln Thr Arg Ser Pro Asp Cys Thr His Asp Asn Pro Leu
225 230 235 240
Glu Thr Arg Asn Ile Thr Phe Phe Ser Thr Asn Cys Val Glu Gly Thr
245 250 255
Ala Arg Gly Val Val Val Ala Thr Gly Asp Arg Thr Val Met Gly Arg
260 265 270
Ile Ala Thr Leu Ala Ser Gly Leu Glu Val Gly Lys Thr Pro Ile Ala
275 280 285
Ile Glu Ile Glu His Phe Ile Gln Leu Ile Thr Gly Val Ala Val Phe
290 295 300
Leu Gly Val Ser Phe Phe Ile Leu Ser Leu Ile Leu Gly Tyr Thr Trp
305 310 315 320
Leu Glu Ala Val Ile Phe Leu Ile Gly Ile Ile Val Ala Asn Val Pro
325 330 335
Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu Thr Leu Thr Ala Lys
340 345 350
Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn Leu Glu Ala Val Glu
355 360 365
Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu
370 375 380
Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp Phe Asp Asn Gln Ile
385 390 395 400
His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly Thr Ser Phe Asp Lys
405 410 415
Ser Ser His Thr Trp Val Ala Leu Ser His Ile Ala Gly Leu Cys Asn
420 425 430
Arg Ala Val Phe Lys Gly Gly Gln Asp Asn Ile Pro Val Leu Lys Arg
435 440 445
Asp Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu Leu Lys Cys Ile Glu
450 455 460
Leu Ser Ser Gly Ser Val Lys Leu Met Arg Glu Arg Asn Lys Lys Val
465 470 475 480
Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr Gln Leu Ser Ile His
485 490 495
Glu Thr Glu Asp Pro Asn Asp Asn Arg Tyr Leu Leu Val Met Lys Gly
500 505 510
Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr Ile Leu Leu Gln Gly
515 520 525
Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Met Lys Glu Ala Phe Gln Asn Ala
530 535 540
Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val Leu Gly Phe Cys His
545 550 555 560
Tyr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Phe Pro Lys Gly Phe Ala Phe Asp Cys
565 570 575
Asp Asp Val Asn Phe Thr Thr Asp Asn Leu Cys Phe Val Gly Leu Met
580 585 590
Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro Asp Ala Val Gly Lys
595 600 605
Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val Thr Gly Asp His Pro
610 615 620
Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly Ile Ile Ser Glu Gly
625 630 635 640
Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu Asn Ile Pro Val Ser
645 650 655
Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val Ile His Gly Thr Asp
660 665 670
Leu Lys Asp Phe Thr Ser Glu Gln Ile Asp Glu Ile Leu Gln Asn His
675 680 685
Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln Gln Lys Leu Ile Ile
690 695 700
Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val Ala Val Thr Gly Asp
705 710 715 720
Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile Gly Val Ala
725 730 735
Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln Ala Ala Asp Met Ile
740 745 750
Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr Gly Val Glu Glu Gly
755 760 765
Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ser Ile Ala Tyr Thr Leu Thr
770 775 780
Ser Asn Ile Pro Glu Ile Thr Pro Phe Leu Leu Phe Ile Met Ala Asn
785 790 795 800
Ile Pro Leu Pro Leu Gly Thr Ile Thr Ile Leu Cys Ile Asp Leu Gly
805 810 815
Thr Asp Met Val Pro Ala Ile Ser Leu Ala Tyr Glu Ala Ala Glu Ser
820 825 830
Asp Ile Met Lys Arg Gln Pro Arg Asn Pro Arg Thr Asp Lys Leu Val
835 840 845
Asn Glu Arg Leu Ile Ser Met Ala Tyr Gly Gln Ile Gly Met Ile Gln
850 855 860
Ala Leu Gly Gly Phe Phe Ser Tyr Phe Val Ile Leu Ala Glu Asn Gly
865 870 875 880
Phe Leu Pro Gly Asn Leu Val Gly Ile Arg Leu Asn Trp Asp Asp Arg
885 890 895
Thr Val Asn Asp Leu Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Gln Trp Thr Tyr Glu
900 905 910
Gln Arg Lys Val Val Glu Phe Thr Cys His Thr Ala Phe Phe Val Ser
915 920 925
Ile Val Val Val Gln Trp Ala Asp Leu Ile Ile Cys Lys Thr Arg Arg
930 935 940
Asn Ser Val Phe Gln Gln Gly Met Lys Asn Lys Ile Leu Ile Phe Gly
945 950 955 960
Leu Phe Glu Glu Thr Ala Leu Ala Ala Phe Leu Ser Tyr Cys Pro Gly
965 970 975
Met Asp Val Ala Leu Arg Met Tyr Pro Leu Lys Pro Ser Trp Trp Phe
980 985 990
Cys Ala Phe Pro Tyr Ser Phe Leu Ile Phe Val Tyr Asp Glu Ile Arg
995 1000 1005
Lys Leu Ile Leu Arg Arg Asn Pro Gly Gly Trp Val Glu Lys Glu
1010 1015 1020
Thr Tyr Tyr
1025
<210> 208
<211> 1029
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 208
Met Gly Leu Trp Gly Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro His Asp Gln Ser
1 5 10 15
Pro Arg Arg Arg Pro Lys Lys Gly Leu Ile Lys Lys Lys Met Val Lys
20 25 30
Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Met Glu Glu Leu Lys Lys Glu Val Val
35 40 45
Met Asp Asp His Lys Leu Thr Leu Glu Glu Leu Ser Thr Lys Tyr Ser
50 55 60
Val Asp Leu Thr Lys Gly His Ser His Gln Arg Ala Lys Glu Ile Leu
65 70 75 80
Thr Arg Gly Gly Pro Asn Thr Val Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Glu
85 90 95
Trp Val Lys Phe Cys Lys Gln Leu Phe Gly Gly Phe Ser Leu Leu Leu
100 105 110
Trp Thr Gly Ala Ile Leu Cys Phe Val Ala Tyr Ser Ile Gln Ile Tyr
115 120 125
Phe Asn Glu Glu Pro Thr Lys Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ile Val Leu
130 135 140
Ser Val Val Val Ile Val Thr Gly Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Glu Ala
145 150 155 160
Lys Ser Ser Lys Ile Met Glu Ser Phe Lys Asn Met Val Pro Gln Gln
165 170 175
Ala Leu Val Ile Arg Gly Gly Glu Lys Met Gln Ile Asn Val Gln Glu
180 185 190
Val Val Leu Gly Asp Leu Val Glu Ile Lys Gly Gly Asp Arg Val Pro
195 200 205
Ala Asp Leu Arg Leu Ile Ser Ala Gln Gly Cys Lys Val Asp Asn Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Glu Ser Glu Pro Gln Ser Arg Ser Pro Asp Phe Thr
225 230 235 240
His Glu Asn Pro Leu Glu Thr Arg Asn Ile Cys Phe Phe Ser Thr Asn
245 250 255
Cys Val Glu Gly Thr Ala Arg Gly Ile Val Ile Ala Thr Gly Asp Ser
260 265 270
Thr Val Met Gly Arg Ile Ala Ser Leu Thr Ser Gly Leu Ala Val Gly
275 280 285
Gln Thr Pro Ile Ala Ala Glu Ile Glu His Phe Ile His Leu Ile Thr
290 295 300
Val Val Ala Val Phe Leu Gly Val Thr Phe Phe Ala Leu Ser Leu Leu
305 310 315 320
Leu Gly Tyr Gly Trp Leu Glu Ala Ile Ile Phe Leu Ile Gly Ile Ile
325 330 335
Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu
340 345 350
Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn
355 360 365
Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp
370 375 380
Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp
385 390 395 400
Phe Asp Met Thr Val Tyr Glu Ala Asp Thr Thr Glu Glu Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Thr Phe Thr Lys Ser Ser Asp Thr Trp Phe Met Leu Ala Arg Ile
420 425 430
Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Asp Phe Lys Ala Asn Gln Glu Ile Leu
435 440 445
Pro Ile Ala Lys Arg Ala Thr Thr Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu
450 455 460
Leu Lys Phe Ile Glu Gln Ser Tyr Ser Ser Val Ala Glu Met Arg Glu
465 470 475 480
Lys Asn Pro Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr
485 490 495
Gln Met Ser Ile His Leu Arg Glu Asp Ser Ser Gln Thr His Val Leu
500 505 510
Met Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Glu Phe Cys Ser Thr Phe
515 520 525
Leu Leu Asn Gly Gln Glu Tyr Ser Met Asn Asp Glu Met Lys Glu Ala
530 535 540
Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val Leu
545 550 555 560
Gly Phe Cys Phe Leu Asn Leu Pro Ser Ser Phe Ser Lys Gly Phe Pro
565 570 575
Phe Asn Thr Asp Glu Ile Asn Phe Pro Met Asp Asn Leu Cys Phe Val
580 585 590
Gly Leu Ile Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro Asp Ala
595 600 605
Val Ser Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val Thr Gly
610 615 620
Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly Ile Ile
625 630 635 640
Ser Glu Gly Thr Glu Thr Ala Glu Glu Val Ala Ala Arg Leu Lys Ile
645 650 655
Pro Ile Ser Lys Val Asp Ala Ser Ala Ala Lys Ala Ile Val Val His
660 665 670
Gly Ala Glu Leu Lys Asp Ile Gln Ser Lys Gln Leu Asp Gln Ile Leu
675 680 685
Gln Asn His Pro Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln Gln Lys
690 695 700
Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Leu Gly Ala Val Val Ala Val
705 710 715 720
Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile
725 730 735
Gly Ile Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln Ala Ala
740 745 750
Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr Gly Val
755 760 765
Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ser Ile Met Tyr
770 775 780
Thr Leu Thr Ser Asn Ile Pro Glu Ile Thr Pro Phe Leu Met Phe Ile
785 790 795 800
Ile Leu Gly Ile Pro Leu Pro Leu Gly Thr Ile Thr Ile Leu Cys Ile
805 810 815
Asp Leu Gly Thr Asp Met Val Pro Ala Ile Ser Leu Ala Tyr Glu Ser
820 825 830
Ala Glu Ser Asp Ile Met Lys Arg Leu Pro Arg Asn Pro Lys Thr Asp
835 840 845
Asn Leu Val Asn His Arg Leu Ile Gly Met Ala Tyr Gly Gln Ile Gly
850 855 860
Met Ile Gln Ala Leu Ala Gly Phe Phe Thr Tyr Phe Val Ile Leu Ala
865 870 875 880
Glu Asn Gly Phe Arg Pro Val Asp Leu Leu Gly Ile Arg Leu His Trp
885 890 895
Glu Asp Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Glu Asp Ser Tyr Gly Gln Gln Trp
900 905 910
Thr Tyr Glu Gln Arg Lys Val Val Glu Phe Thr Cys Gln Thr Ala Phe
915 920 925
Phe Val Thr Ile Val Val Val Gln Trp Ala Asp Leu Ile Ile Ser Lys
930 935 940
Thr Arg Arg Asn Ser Leu Phe Gln Gln Gly Met Arg Asn Lys Val Leu
945 950 955 960
Ile Phe Gly Ile Leu Glu Glu Thr Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ser Tyr
965 970 975
Thr Pro Gly Met Asp Val Ala Leu Arg Met Tyr Pro Leu Lys Ile Thr
980 985 990
Trp Trp Leu Cys Ala Ile Pro Tyr Ser Ile Leu Ile Phe Val Tyr Asp
995 1000 1005
Glu Ile Arg Lys Leu Leu Ile Arg Gln His Pro Asp Gly Trp Val
1010 1015 1020
Glu Arg Glu Thr Tyr Tyr
1025
<210> 209
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 209
Met Thr Lys Asn Glu Lys Lys Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ala Glu Trp
1 5 10 15
Lys Leu Phe Ile Tyr Asn Pro Thr Thr Gly Glu Phe Leu Gly Arg Thr
20 25 30
Ala Lys Ser Trp Gly Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Leu Val Phe Tyr Gly
35 40 45
Phe Leu Ala Ala Leu Phe Ser Phe Thr Met Trp Val Met Leu Gln Thr
50 55 60
Leu Asn Asp Glu Val Pro Lys Tyr Arg Asp Gln Ile Pro Ser Pro Gly
65 70 75 80
Leu Met Val Phe Pro Lys Pro Val Thr Ala Leu Glu Tyr Thr Phe Ser
85 90 95
Arg Ser Asp Pro Thr Ser Tyr Ala Gly Tyr Ile Glu Asp Leu Lys Lys
100 105 110
Phe Leu Lys Pro Tyr Thr Leu Glu Glu Gln Lys Asn Leu Thr Val Cys
115 120 125
Pro Asp Gly Ala Leu Phe Glu Gln Lys Gly Pro Val Tyr Val Ala Cys
130 135 140
Gln Phe Pro Ile Ser Leu Leu Gln Ala Cys Ser Gly Met Asn Asp Pro
145 150 155 160
Asp Phe Gly Tyr Ser Gln Gly Asn Pro Cys Ile Leu Val Lys Met Asn
165 170 175
Arg Ile Ile Gly Leu Lys Pro Glu Gly Val Pro Arg Ile Asp Cys Val
180 185 190
Ser Lys Asn Glu Asp Ile Pro Asn Val Ala Val Tyr Pro His Asn Gly
195 200 205
Met Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Leu His Val
210 215 220
Gly Tyr Leu Gln Pro Leu Val Ala Val Gln Val Ser Phe Ala Pro Asn
225 230 235 240
Asn Thr Gly Lys Glu Val Thr Val Glu Cys Lys Ile Asp Gly Ser Ala
245 250 255
Asn Leu Lys Ser Gln Asp Asp Arg Asp Lys Phe Leu Gly Arg Val Met
260 265 270
Phe Lys Ile Thr Ala Arg Ala
275
<210> 210
<211> 1258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 210
Met Gly Asp Met Ala Asn Asn Ser Val Ala Tyr Ser Gly Val Lys Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Glu Ala Asn His Asp Gly Asp Phe Gly Ile Thr Leu Ala
20 25 30
Glu Leu Arg Ala Leu Met Glu Leu Arg Ser Thr Asp Ala Leu Arg Lys
35 40 45
Ile Gln Glu Ser Tyr Gly Asp Val Tyr Gly Ile Cys Thr Lys Leu Lys
50 55 60
Thr Ser Pro Asn Glu Gly Leu Ser Gly Asn Pro Ala Asp Leu Glu Arg
65 70 75 80
Arg Glu Ala Val Phe Gly Lys Asn Phe Ile Pro Pro Lys Lys Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Leu Gln Leu Val Trp Glu Ala Leu Gln Asp Val Thr Leu Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Ile Ala Ala Ile Val Ser Leu Gly Leu Ser Phe Tyr Gln
115 120 125
Pro Pro Glu Gly Asp Asn Ala Leu Cys Gly Glu Val Ser Val Gly Glu
130 135 140
Glu Glu Gly Glu Gly Glu Thr Gly Trp Ile Glu Gly Ala Ala Ile Leu
145 150 155 160
Leu Ser Val Val Cys Val Val Leu Val Thr Ala Phe Asn Asp Trp Ser
165 170 175
Lys Glu Lys Gln Phe Arg Gly Leu Gln Ser Arg Ile Glu Gln Glu Gln
180 185 190
Lys Phe Thr Val Ile Arg Gly Gly Gln Val Ile Gln Ile Pro Val Ala
195 200 205
Asp Ile Thr Val Gly Asp Ile Ala Gln Val Lys Tyr Gly Asp Leu Leu
210 215 220
Pro Ala Asp Gly Ile Leu Ile Gln Gly Asn Asp Leu Lys Ile Asp Glu
225 230 235 240
Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Asp His Val Lys Lys Ser Leu Asp Lys
245 250 255
Asp Pro Leu Leu Leu Ser Gly Thr His Val Met Glu Gly Ser Gly Arg
260 265 270
Met Val Val Thr Ala Val Gly Val Asn Ser Gln Thr Gly Ile Ile Phe
275 280 285
Thr Leu Leu Gly Ala Gly Gly Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Glu Lys
290 295 300
Lys Lys Glu Lys Lys Asn Lys Lys Gln Asp Gly Ala Ile Glu Asn Arg
305 310 315 320
Asn Lys Ala Lys Ala Gln Asp Gly Ala Ala Met Glu Met Gln Pro Leu
325 330 335
Lys Ser Glu Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Lys Asp Lys Lys Lys Ala
340 345 350
Asn Leu Pro Lys Lys Glu Lys Ser Val Leu Gln Gly Lys Leu Thr Lys
355 360 365
Leu Ala Val Gln Ile Gly Lys Ala Gly Leu Leu Met Ser Ala Ile Thr
370 375 380
Val Ile Ile Leu Val Leu Tyr Phe Val Ile Asp Thr Phe Trp Val Gln
385 390 395 400
Lys Arg Pro Trp Leu Ala Glu Cys Thr Pro Ile Tyr Ile Gln Tyr Phe
405 410 415
Val Lys Phe Phe Ile Ile Gly Val Thr Val Leu Val Val Ala Val Pro
420 425 430
Glu Gly Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Ser Leu Ala Tyr Ser Val Lys
435 440 445
Lys Met Met Lys Asp Asn Asn Leu Val Arg His Leu Asp Ala Cys Glu
450 455 460
Thr Met Gly Asn Ala Thr Ala Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu
465 470 475 480
Thr Met Asn Arg Met Thr Val Val Gln Ala Tyr Ile Asn Glu Lys His
485 490 495
Tyr Lys Lys Val Pro Glu Pro Glu Ala Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser
500 505 510
Tyr Leu Val Thr Gly Ile Ser Val Asn Cys Ala Tyr Thr Ser Lys Ile
515 520 525
Leu Pro Pro Glu Lys Glu Gly Gly Leu Pro Arg His Val Gly Asn Lys
530 535 540
Thr Glu Cys Ala Leu Leu Gly Leu Leu Leu Asp Leu Lys Arg Asp Tyr
545 550 555 560
Gln Asp Val Arg Asn Glu Ile Pro Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Val Tyr
565 570 575
Thr Phe Asn Ser Val Arg Lys Ser Met Ser Thr Val Leu Lys Asn Ser
580 585 590
Asp Gly Ser Tyr Arg Ile Phe Ser Lys Gly Ala Ser Glu Ile Ile Leu
595 600 605
Lys Lys Cys Phe Lys Ile Leu Ser Ala Asn Gly Glu Ala Lys Val Phe
610 615 620
Arg Pro Arg Asp Arg Asp Asp Ile Val Lys Thr Val Ile Glu Pro Met
625 630 635 640
Ala Ser Glu Gly Leu Arg Thr Ile Cys Leu Ala Phe Arg Asp Phe Pro
645 650 655
Ala Gly Glu Pro Glu Pro Glu Trp Asp Asn Glu Asn Asp Ile Val Thr
660 665 670
Gly Leu Thr Cys Ile Ala Val Val Gly Ile Glu Asp Pro Val Arg Pro
675 680 685
Glu Val Pro Asp Ala Ile Lys Lys Cys Gln Arg Ala Gly Ile Thr Val
690 695 700
Arg Met Val Thr Gly Asp Asn Ile Asn Thr Ala Arg Ala Ile Ala Thr
705 710 715 720
Lys Cys Gly Ile Leu His Pro Gly Glu Asp Phe Leu Cys Leu Glu Gly
725 730 735
Lys Asp Phe Asn Arg Arg Ile Arg Asn Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gln
740 745 750
Glu Arg Ile Asp Lys Ile Trp Pro Lys Leu Arg Val Leu Ala Arg Ser
755 760 765
Ser Pro Thr Asp Lys His Thr Leu Val Lys Gly Ile Ile Asp Ser Thr
770 775 780
Val Ser Asp Gln Arg Gln Val Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn
785 790 795 800
Asp Gly Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Val Gly Phe Ala Met Gly Ile
805 810 815
Ala Gly Thr Asp Val Ala Lys Glu Ala Ser Asp Ile Ile Leu Thr Asp
820 825 830
Asp Asn Phe Thr Ser Ile Val Lys Ala Val Met Trp Gly Arg Asn Val
835 840 845
Tyr Asp Ser Ile Ser Lys Phe Leu Gln Phe Gln Leu Thr Val Asn Val
850 855 860
Val Ala Val Ile Val Ala Phe Thr Gly Ala Cys Ile Thr Gln Asp Ser
865 870 875 880
Pro Leu Lys Ala Val Gln Met Leu Trp Val Asn Leu Ile Met Asp Thr
885 890 895
Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala Thr Glu Pro Pro Thr Glu Ser Leu Leu
900 905 910
Leu Arg Lys Pro Tyr Gly Arg Asn Lys Pro Leu Ile Ser Arg Thr Met
915 920 925
Met Lys Asn Ile Leu Gly His Ala Phe Tyr Gln Leu Val Val Val Phe
930 935 940
Thr Leu Leu Phe Ala Gly Glu Lys Phe Phe Asp Ile Asp Ser Gly Arg
945 950 955 960
Asn Ala Pro Leu His Ala Pro Pro Ser Glu His Tyr Thr Ile Val Phe
965 970 975
Asn Thr Phe Val Leu Met Gln Leu Phe Asn Glu Ile Asn Ala Arg Lys
980 985 990
Ile His Gly Glu Arg Asn Val Phe Glu Gly Ile Phe Asn Asn Ala Ile
995 1000 1005
Phe Cys Thr Ile Val Leu Gly Thr Phe Val Val Gln Ile Ile Ile
1010 1015 1020
Val Gln Phe Gly Gly Lys Pro Phe Ser Cys Ser Glu Leu Ser Ile
1025 1030 1035
Glu Gln Trp Leu Trp Ser Ile Phe Leu Gly Met Gly Thr Leu Leu
1040 1045 1050
Trp Gly Gln Leu Ile Ser Thr Ile Pro Thr Ser Arg Leu Lys Phe
1055 1060 1065
Leu Lys Glu Ala Gly His Gly Thr Gln Lys Glu Glu Ile Pro Glu
1070 1075 1080
Glu Glu Leu Ala Glu Asp Val Glu Glu Ile Asp His Ala Glu Arg
1085 1090 1095
Glu Leu Arg Arg Gly Gln Ile Leu Trp Phe Arg Gly Leu Asn Arg
1100 1105 1110
Ile Gln Thr Gln Met Asp Val Val Asn Ala Phe Gln Ser Gly Ser
1115 1120 1125
Ser Ile Gln Gly Ala Leu Arg Arg Gln Pro Ser Ile Ala Ser Gln
1130 1135 1140
His His Asp Val Thr Asn Ile Ser Thr Pro Thr His Ile Arg Val
1145 1150 1155
Val Asn Ala Phe Arg Ser Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Pro
1160 1165 1170
Glu Ser Arg Ser Ser Ile His Asn Phe Met Thr His Pro Glu Phe
1175 1180 1185
Arg Ile Glu Asp Ser Glu Pro His Ile Pro Leu Ile Asp Asp Thr
1190 1195 1200
Asp Ala Glu Asp Asp Ala Pro Thr Lys Arg Asn Ser Ser Pro Pro
1205 1210 1215
Pro Ser Pro Asn Lys Asn Asn Asn Ala Val Asp Ser Gly Ile His
1220 1225 1230
Leu Thr Ile Glu Met Asn Lys Ser Ala Thr Ser Ser Ser Pro Gly
1235 1240 1245
Ser Pro Leu His Ser Leu Glu Thr Ser Leu
1250 1255
<210> 211
<211> 1272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 211
Met Gly Asp Met Thr Asn Ser Asp Phe Tyr Ser Lys Asn Gln Arg Asn
1 5 10 15
Glu Ser Ser His Gly Gly Glu Phe Gly Cys Thr Met Glu Glu Leu Arg
20 25 30
Ser Leu Met Glu Leu Arg Gly Thr Glu Ala Val Val Lys Ile Lys Glu
35 40 45
Thr Tyr Gly Asp Thr Glu Ala Ile Cys Arg Arg Leu Lys Thr Ser Pro
50 55 60
Val Glu Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro Asp Leu Glu Lys Arg Lys Gln
65 70 75 80
Ile Phe Gly Gln Asn Phe Ile Pro Pro Lys Lys Pro Lys Thr Phe Leu
85 90 95
Gln Leu Val Trp Glu Ala Leu Gln Asp Val Thr Leu Ile Ile Leu Glu
100 105 110
Ile Ala Ala Ile Ile Ser Leu Gly Leu Ser Phe Tyr His Pro Pro Gly
115 120 125
Glu Gly Asn Glu Gly Cys Ala Thr Ala Gln Gly Gly Ala Glu Asp Glu
130 135 140
Gly Glu Ala Glu Ala Gly Trp Ile Glu Gly Ala Ala Ile Leu Leu Ser
145 150 155 160
Val Ile Cys Val Val Leu Val Thr Ala Phe Asn Asp Trp Ser Lys Glu
165 170 175
Lys Gln Phe Arg Gly Leu Gln Ser Arg Ile Glu Gln Glu Gln Lys Phe
180 185 190
Thr Val Val Arg Ala Gly Gln Val Val Gln Ile Pro Val Ala Glu Ile
195 200 205
Val Val Gly Asp Ile Ala Gln Val Lys Tyr Gly Asp Leu Leu Pro Ala
210 215 220
Asp Gly Leu Phe Ile Gln Gly Asn Asp Leu Lys Ile Asp Glu Ser Ser
225 230 235 240
Leu Thr Gly Glu Ser Asp Gln Val Arg Lys Ser Val Asp Lys Asp Pro
245 250 255
Met Leu Leu Ser Gly Thr His Val Met Glu Gly Ser Gly Arg Met Leu
260 265 270
Val Thr Ala Val Gly Val Asn Ser Gln Thr Gly Ile Ile Phe Thr Leu
275 280 285
Leu Gly Ala Gly Gly Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Lys Lys Gly Val
290 295 300
Lys Lys Gly Asp Gly Leu Gln Leu Pro Ala Ala Asp Gly Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ser Asn Ala Ala Asp Ser Ala Asn Ala Ser Leu Val Asn Gly Lys Met
325 330 335
Gln Asp Gly Asn Val Asp Ala Ser Gln Ser Lys Ala Lys Gln Gln Asp
340 345 350
Gly Ala Ala Ala Met Glu Met Gln Pro Leu Lys Ser Ala Glu Gly Gly
355 360 365
Asp Ala Asp Asp Arg Lys Lys Ala Ser Met His Lys Lys Glu Lys Ser
370 375 380
Val Leu Gln Gly Lys Leu Thr Lys Leu Ala Val Gln Ile Gly Lys Ala
385 390 395 400
Gly Leu Val Met Ser Ala Ile Thr Val Ile Ile Leu Val Leu Tyr Phe
405 410 415
Thr Val Asp Thr Phe Val Val Asn Lys Lys Pro Trp Leu Pro Glu Cys
420 425 430
Thr Pro Val Tyr Val Gln Tyr Phe Val Lys Phe Phe Ile Ile Gly Val
435 440 445
Thr Val Leu Val Val Ala Val Pro Glu Gly Leu Pro Leu Ala Val Thr
450 455 460
Ile Ser Leu Ala Tyr Ser Val Lys Lys Met Met Lys Asp Asn Asn Leu
465 470 475 480
Val Arg His Leu Asp Ala Cys Glu Thr Met Gly Asn Ala Thr Ala Ile
485 490 495
Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Thr Asn Arg Met Thr Val Val
500 505 510
Gln Ala Tyr Val Gly Asp Val His Tyr Lys Glu Ile Pro Asp Pro Ser
515 520 525
Ser Ile Asn Thr Lys Thr Met Glu Leu Leu Ile Asn Ala Ile Ala Ile
530 535 540
Asn Ser Ala Tyr Thr Thr Lys Ile Leu Pro Pro Glu Lys Glu Gly Ala
545 550 555 560
Leu Pro Arg Gln Val Gly Asn Lys Thr Glu Cys Gly Leu Leu Gly Phe
565 570 575
Val Leu Asp Leu Lys Gln Asp Tyr Glu Pro Val Arg Ser Gln Met Pro
580 585 590
Glu Glu Lys Leu Tyr Lys Val Tyr Thr Phe Asn Ser Val Arg Lys Ser
595 600 605
Met Ser Thr Val Ile Lys Leu Pro Asp Glu Ser Phe Arg Met Tyr Ser
610 615 620
Lys Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Lys Lys Cys Cys Lys Ile Leu Asn
625 630 635 640
Gly Ala Gly Glu Pro Arg Val Phe Arg Pro Arg Asp Arg Asp Glu Met
645 650 655
Val Lys Lys Val Ile Glu Pro Met Ala Cys Asp Gly Leu Arg Thr Ile
660 665 670
Cys Val Ala Tyr Arg Asp Phe Pro Ser Ser Pro Glu Pro Asp Trp Asp
675 680 685
Asn Glu Asn Asp Ile Leu Asn Glu Leu Thr Cys Ile Cys Val Val Gly
690 695 700
Ile Glu Asp Pro Val Arg Pro Glu Val Pro Glu Ala Ile Arg Lys Cys
705 710 715 720
Gln Arg Ala Gly Ile Thr Val Arg Met Val Thr Gly Asp Asn Ile Asn
725 730 735
Thr Ala Arg Ala Ile Ala Ile Lys Cys Gly Ile Ile His Pro Gly Glu
740 745 750
Asp Phe Leu Cys Leu Glu Gly Lys Glu Phe Asn Arg Arg Ile Arg Asn
755 760 765
Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gln Glu Arg Ile Asp Lys Ile Trp Pro Lys
770 775 780
Leu Arg Val Leu Ala Arg Ser Ser Pro Thr Asp Lys His Thr Leu Val
785 790 795 800
Lys Gly Ile Ile Asp Ser Thr His Thr Glu Gln Arg Gln Val Val Ala
805 810 815
Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Gly Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp
820 825 830
Val Gly Phe Ala Met Gly Ile Ala Gly Thr Asp Val Ala Lys Glu Ala
835 840 845
Ser Asp Ile Ile Leu Thr Asp Asp Asn Phe Ser Ser Ile Val Lys Ala
850 855 860
Val Met Trp Gly Arg Asn Val Tyr Asp Ser Ile Ser Lys Phe Leu Gln
865 870 875 880
Phe Gln Leu Thr Val Asn Val Val Ala Val Ile Val Ala Phe Thr Gly
885 890 895
Ala Cys Ile Thr Gln Asp Ser Pro Leu Lys Ala Val Gln Met Leu Trp
900 905 910
Val Asn Leu Ile Met Asp Thr Phe Ala Ser Leu Ala Leu Ala Thr Glu
915 920 925
Pro Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Arg Lys Pro Tyr Gly Arg Asn Lys
930 935 940
Pro Leu Ile Ser Arg Thr Met Met Lys Asn Ile Leu Gly His Ala Val
945 950 955 960
Tyr Gln Leu Ala Leu Ile Phe Thr Leu Leu Phe Val Gly Glu Lys Met
965 970 975
Phe Gln Ile Asp Ser Gly Arg Asn Ala Pro Leu His Ser Pro Pro Ser
980 985 990
Glu His Tyr Thr Ile Ile Phe Asn Thr Phe Val Met Met Gln Leu Phe
995 1000 1005
Asn Glu Ile Asn Ala Arg Lys Ile His Gly Glu Arg Asn Val Phe
1010 1015 1020
Asp Gly Ile Phe Arg Asn Pro Ile Phe Cys Thr Ile Val Leu Gly
1025 1030 1035
Thr Phe Ala Ile Gln Ile Val Ile Val Gln Phe Gly Gly Lys Pro
1040 1045 1050
Phe Ser Cys Ser Pro Leu Gln Leu Asp Gln Trp Met Trp Cys Ile
1055 1060 1065
Phe Ile Gly Leu Gly Glu Leu Val Trp Gly Gln Val Ile Ala Thr
1070 1075 1080
Ile Pro Thr Ser Arg Leu Lys Phe Leu Lys Glu Ala Gly Arg Leu
1085 1090 1095
Thr Gln Lys Glu Glu Ile Pro Glu Glu Glu Leu Asn Glu Asp Val
1100 1105 1110
Glu Glu Ile Asp His Ala Glu Arg Glu Leu Arg Arg Gly Gln Ile
1115 1120 1125
Leu Trp Phe Arg Gly Leu Asn Arg Ile Gln Thr Gln Ile Glu Val
1130 1135 1140
Val Asn Thr Phe Lys Ser Gly Ala Ser Phe Gln Gly Ala Leu Arg
1145 1150 1155
Arg Gln Ser Ser Val Thr Ser Gln Ser Gln Asp Ile Arg Val Val
1160 1165 1170
Lys Ala Phe Arg Ser Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Pro Glu
1175 1180 1185
Ser Arg Thr Ser Ile His Asn Phe Met Ala His Pro Glu Phe Arg
1190 1195 1200
Ile Glu Asp Ser Gln Pro His Ile Pro Leu Ile Asp Asp Thr Asp
1205 1210 1215
Leu Glu Glu Asp Ala Ala Leu Lys Gln Asn Ser Ser Pro Pro Ser
1220 1225 1230
Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ser Ala Ile Asp Ser Gly Ile Asn Leu
1235 1240 1245
Thr Thr Asp Thr Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ser Ser Pro Gly Ser
1250 1255 1260
Pro Ile His Ser Leu Glu Thr Ser Leu
1265 1270
<210> 212
<211> 874
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 212
Met Gly Asp Met Ala Asn Ser Ser Ile Glu Phe His Pro Lys Pro Gln
1 5 10 15
Gln Gln Arg Asp Val Pro Gln Ala Gly Gly Phe Gly Cys Thr Leu Ala
20 25 30
Glu Leu Arg Thr Leu Met Glu Leu Arg Gly Ala Glu Ala Leu Gln Lys
35 40 45
Ile Glu Glu Ala Tyr Gly Asp Val Ser Gly Leu Cys Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Thr Ser Pro Thr Glu Gly Leu Ala Asp Asn Thr Asn Asp Leu Glu Lys
65 70 75 80
Arg Arg Gln Ile Tyr Gly Gln Asn Phe Ile Pro Pro Lys Gln Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Leu Gln Leu Val Trp Glu Ala Leu Gln Asp Val Thr Leu Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Val Ala Ala Ile Val Ser Leu Gly Leu Ser Phe Tyr Ala
115 120 125
Pro Pro Gly Glu Glu Ser Glu Ala Cys Gly Asn Val Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Glu Asp Glu Gly Glu Ala Glu Ala Gly Trp Ile Glu Gly Ala Ala Ile
145 150 155 160
Leu Leu Ser Val Ile Cys Val Val Leu Val Thr Ala Phe Asn Asp Trp
165 170 175
Ser Lys Glu Lys Gln Phe Arg Gly Leu Gln Ser Arg Ile Glu Gln Glu
180 185 190
Gln Lys Phe Thr Val Ile Arg Asn Gly Gln Leu Leu Gln Val Pro Val
195 200 205
Ala Ala Leu Val Val Gly Asp Ile Ala Gln Val Lys Tyr Gly Asp Leu
210 215 220
Leu Pro Ala Asp Gly Val Leu Ile Gln Ala Asn Asp Leu Lys Ile Asp
225 230 235 240
Glu Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Asp His Val Arg Lys Ser Ala Asp
245 250 255
Lys Asp Pro Met Leu Leu Ser Gly Thr His Val Met Glu Gly Ser Gly
260 265 270
Arg Met Val Val Thr Ala Val Gly Val Asn Ser Gln Thr Gly Ile Ile
275 280 285
Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gly Gly Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Lys
290 295 300
Lys Gly Lys Gln Gln Asp Gly Ala Met Glu Ser Ser Gln Thr Lys Ala
305 310 315 320
Lys Lys Gln Asp Gly Ala Val Ala Met Glu Met Gln Pro Leu Lys Ser
325 330 335
Ala Glu Gly Gly Glu Met Glu Glu Arg Glu Lys Lys Lys Ala Asn Ala
340 345 350
Pro Lys Lys Glu Lys Ser Val Leu Gln Gly Lys Leu Thr Lys Leu Ala
355 360 365
Val Gln Ile Gly Lys Ala Gly Leu Val Met Ser Ala Ile Thr Val Ile
370 375 380
Ile Leu Val Leu Tyr Phe Val Ile Glu Thr Phe Val Val Glu Gly Arg
385 390 395 400
Thr Trp Leu Ala Glu Cys Thr Pro Val Tyr Val Gln Tyr Phe Val Lys
405 410 415
Phe Phe Ile Ile Gly Val Thr Val Leu Val Val Ala Val Pro Glu Gly
420 425 430
Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Ser Leu Ala Tyr Ser Val Lys Lys Met
435 440 445
Met Lys Asp Asn Asn Leu Val Arg His Leu Asp Ala Cys Glu Thr Met
450 455 460
Gly Asn Ala Thr Ala Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Thr
465 470 475 480
Asn Arg Met Thr Val Val Gln Ser Tyr Leu Gly Asp Thr His Tyr Lys
485 490 495
Glu Ile Pro Ala Pro Ser Ala Leu Thr Pro Lys Ile Leu Asp Leu Leu
500 505 510
Val His Ala Ile Ser Ile Asn Ser Ala Tyr Thr Thr Lys Ile Leu Pro
515 520 525
Pro Glu Lys Glu Gly Ala Leu Pro Arg Gln Val Gly Asn Lys Thr Glu
530 535 540
Cys Ala Leu Leu Gly Phe Val Leu Asp Leu Lys Arg Asp Phe Gln Pro
545 550 555 560
Val Arg Glu Gln Ile Pro Glu Asp Lys Leu Tyr Lys Val Tyr Thr Phe
565 570 575
Asn Ser Val Arg Lys Ser Met Ser Thr Val Ile Arg Met Pro Asp Gly
580 585 590
Gly Phe Arg Leu Phe Ser Lys Gly Ala Ser Glu Ile Leu Leu Lys Lys
595 600 605
Cys Thr Asn Ile Leu Asn Ser Asn Gly Glu Leu Arg Gly Phe Arg Pro
610 615 620
Arg Asp Arg Asp Asp Met Val Arg Lys Ile Ile Glu Pro Met Ala Cys
625 630 635 640
Asp Gly Leu Arg Thr Ile Cys Ile Ala Tyr Arg Asp Phe Ser Ala Gly
645 650 655
Gln Glu Pro Asp Trp Asp Asn Glu Asn Glu Val Val Gly Asp Leu Thr
660 665 670
Cys Ile Ala Val Val Gly Ile Glu Asp Pro Val Arg Pro Glu Val Pro
675 680 685
Glu Ala Ile Arg Lys Cys Gln Arg Ala Gly Ile Thr Val Arg Met Val
690 695 700
Thr Gly Asp Asn Ile Asn Thr Ala Arg Ala Ile Ala Ala Lys Cys Gly
705 710 715 720
Ile Ile Gln Pro Gly Glu Asp Phe Leu Cys Leu Glu Gly Lys Glu Phe
725 730 735
Asn Arg Arg Ile Arg Asn Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gln Glu Arg Leu
740 745 750
Asp Lys Val Trp Pro Lys Leu Arg Val Leu Ala Arg Ser Ser Pro Thr
755 760 765
Asp Lys His Thr Leu Val Lys Gly Ile Ile Asp Ser Thr Thr Gly Glu
770 775 780
Gln Arg Gln Val Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Gly Pro
785 790 795 800
Ala Leu Lys Lys Ala Asp Val Gly Phe Ala Met Gly Ile Ala Gly Thr
805 810 815
Asp Val Ala Lys Glu Ala Ser Asp Ile Ile Leu Thr Asp Asp Asn Phe
820 825 830
Thr Ser Ile Val Lys Ala Val Met Trp Gly Arg Asn Val Tyr Asp Ser
835 840 845
Ile Ser Lys Phe Leu Gln Phe Gln Leu Thr Val Asn Val Val Ala Val
850 855 860
Ile Val Ala Phe Thr Gly Ala Cys Ile Thr
865 870
<210> 213
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 213
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys
20 25
<210> 214
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 214
Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 215
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 215
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415
<210> 216
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 216
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415

Claims (204)

1.一种包含腺相关病毒(AAV)和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)，其中所述AAV在所述EV的腔内，并且其中所述EV中的所述AAV与单独的所述AAV相比具有改变的特性。
2.如权利要求1所述的EV，其中所述改变的特性包括比单独的AAV更好的治疗效果。
3.如权利要求1或2所述的EV，其中所述更好的治疗效果包括更高的感染性、更高的活性、更大的效力、更快的转导动力学和对免疫侵入的耐受性中的一种或多种。
4.如权利要求1至3中任一项所述的EV，其中所述AAV的改变的特性允许所述AAV通过两个或更多个剂量向受试者施用，其中所述AAV的感染性和/或活性在后续剂量中得到保留。
5.一种包含AAV的EV，其中所述EV包含支架蛋白和至少5个AAV，其中所述至少5个AAV在所述EV的腔内。
6.如权利要求5所述的EV，其包含在所述EV的腔内的至少6个AAV、至少7个AAV、至少8个AAV、至少9个AAV、至少10个AAV、至少11个AAV、至少12个AAV、至少13个AAV、至少14个AAV、至少15个AAV、至少16个AAV、至少17个AAV、至少18个AAV、至少19个AAV、至少20个AAV、至少201个AAV、至少22个AAV、至少23个AAV、至少24个AAV、至少25个AAV、至少26个AAV、至少27个AAV、至少28个AAV、至少29个AAV、至少30个AAV、至少35个AAV、至少40个AAV、至少45个AAV、至少50个AAV、至少60个AAV、至少70个AAV、至少80个AAV、至少90个AAV或至少100个AAV。
7.如权利要求5所述的EV，其包含在所述EV的腔内的至少约5个AAV至至少约100个AAV、至少约5个AAV至至少约75个AAV、至少约5个AAV至至少约50个AAV、至少约5个AAV至至少约45个AAV、至少约5个AAV至至少约40个AAV、至少约5个AAV至至少约35个AAV、至少约5个AAV至至少约30个AAV、至少约5个AAV至至少约25个AAV、至少约5个AAV至至少约20个AAV、至少约5个AAV至至少约15个AAV、至少约5个AAV至至少约10个AAV、至少约10个AAV至至少约100个AAV、至少约10个AAV至至少约75个AAV、至少约10个AAV至至少约50个AAV、至少约5个AAV至至少约45个AAV、至少约10个AAV至至少约40个AAV、至少约10个AAV至至少约35个AAV、至少约10个AAV至至少约30个AAV、至少约10个AAV至至少约25个AAV、至少约10个AAV至至少约20个AAV或至少约10个AAV至至少约15个AAV。
8.如权利要求5至7中任一项所述的EV，其包含至少约5个AAV至至少约20个AAV。
9.如权利要求1至8中任一项所述的EV，其中所述EV包含双脂质膜，所述双脂质膜包含腔表面和外表面，其中所述AAV中的至少一个不与所述EV的腔表面连接。
10.如权利要求1至8中任一项所述的EV，其中所述EV包含双脂质膜，所述双脂质膜包含腔表面和外表面，其中所述AAV中的至少一个与所述EV的腔表面连接。
11.如权利要求10所述的EV，其中所述至少一个AAV通过共价键或非共价键与所述EV的腔表面连接。
12.如权利要求10或11所述的EV，其中所述至少一个AAV通过共价键和非共价键两者与所述EV的腔表面连接。
13.如权利要求1至12中任一项所述的EV，其中所述AAV与所述支架蛋白连接。
14.如权利要求1至13中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND和/或所述ED与所述EV的腔表面缔合。
15.如权利要求14所述的EV，其中所述ND通过肉豆蔻酰化与所述EV的腔表面缔合。
16.如权利要求14或15所述的EV，其中所述ED通过离子相互作用与所述EV的腔表面缔合。
17.如权利要求14至16中任一项所述的EV，其中所述ED在序列中包含(i)一个碱性氨基酸或(ii)两个或更多个碱性氨基酸，其中所述碱性氨基酸选自由Lys、Arg、His及其任意组合组成的组。
18.如权利要求17所述的EV，其中所述碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是1与10之间的整数。
19.如权利要求14至18中任一项所述的EV，其中所述ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQID NO:11)、KKKKK(SEQ ID NO:12)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQ IDNO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:16)或其任意组合。
20.如权利要求14至19中任一项所述的EV，其中所述ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中所述X2至所述X6中的每一个独立地为氨基酸，并且其中所述X6包含碱性氨基酸。
21.如权利要求20所述的EV，其中：
i.所述X2选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；
ii.所述X4选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组；
iii.所述X5选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；
iv.所述X6选自由Lys、Arg和His组成的组；或者
v.(i)-(iv)的任意组合。
22.如权利要求14至21中任一项所述的EV，其中所述ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中
i.G代表Gly；
ii.“:”代表肽键；
iii.所述X2是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；
iv.所述X3是氨基酸；
v.所述X4是选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组的氨基酸；
vi.所述X5是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；以及
vii.所述X6是选自由Lys、Arg和His组成的组的氨基酸。
23.如权利要求18至22中任一项所述的EV，其中所述X3选自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg组成的组。
24.如权利要求14至23中任一项所述的EV，其中所述ND和所述ED通过接头连接。
25.如权利要求24所述的EV，其中所述接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
26.如权利要求14至25中任一项所述的EV，其中所述ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:17)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:18)、(iii)GGKQSKK(SEQID NO:19)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:20)、(v)GGKLSKK(SEQ ID NO:21)或(vi)其任意组合。
27.如权利要求26所述的EV，其中所述ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:22)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:23)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:24)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:25)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:26)、(vi)GGKQSKKS(SEQ IDNO:27)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:28)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:29)、(ix)GGKLSKKK(SEQ ID NO:30)、(x)GGKLSKKS(SEQ ID NO:31)及(xi)其任意组合。
28.如权利要求14至27中任一项所述的EV，其中所述ND包含氨基酸序列GGKLSKK(SEQID NO:17)。
29.如权利要求1至28中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个、至少约160个、至少约170个、至少约180个、至少约190个或至少约200个氨基酸。
30.如权利要求1至29中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:32)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:33)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ IDNO:34)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:35)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:36)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:37)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:38)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:39)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:40)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:41)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:42)。
31.如权利要求14至30中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白不包含N端处的Met。
32.如权利要求14至31中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白包含所述支架蛋白的N端处的肉豆蔻酰化氨基酸残基。
33.如权利要求32所述的EV，其中所述支架蛋白的N端处的所述氨基酸残基是Gly。
34.如权利要求32或33所述的EV，其中所述支架蛋白的N端处的所述氨基酸残基是合成的。
35.如权利要求33或34所述的EV，其中所述支架蛋白的N端处的所述氨基酸残基是甘氨酸类似物。
36.如权利要求1至35中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白包含与SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
37.如权利要求14至36中任一项所述的EV，其中所述EV还包含第二支架蛋白，其包含括前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。
38.如权利要求1至37中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一种与所述支架蛋白和/或所述第二支架蛋白融合的衣壳蛋白。
39.如权利要求38所述的EV，其中所述至少一种衣壳蛋白选自由VP1、VP2和VP3组成的组。
40.如权利要求38或39所述的EV，其中所述AAV衣壳蛋白包括VP2。
41.如权利要求38至40中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一个不与所述支架蛋白和/或所述第二支架蛋白融合的VP2。
42.如权利要求38至41中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白与所述VP2的N端融合。
43.如权利要求41或42所述的EV，其中与所述支架蛋白融合的所述VP2的数量少于所述至少一种不与所述支架蛋白融合的VP2的数量。
44.如权利要求41或42所述的EV，其中与所述支架蛋白融合的所述VP2的数量比所述至少一个不与所述支架蛋白融合的VP2的数量少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约23倍、约24倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约46倍、约50倍或约100倍。
45.如权利要求1至13中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白是I型跨膜蛋白或II型跨膜蛋白。
46.如权利要求45所述的EV，其中所述I型跨膜蛋白包括前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。
47.如权利要求45或46所述的EV，其中所述I型跨膜蛋白的C端或所述II型跨膜蛋白的N端与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。
48.如权利要求14至37中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接。
49.如权利要求47或48所述的EV，其中所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体包括选自由以下组成的组的结合配偶体中的一种：(i)FKBP和FKBP(FK1012)；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶A(CNA)(FK506)；(iii)FKBP和CyP-Fas(FKCsA)；(iv)FKBP和FRB(雷帕霉素)；(v)GyrB和GyrB(香豆霉素)；(vi)GAI和GID1(赤霉素)；(vii)Snap-tag和HaloTag(HaXS)；(viii)eDHFR和HaloTag(TMP-HTag)；以及(ix)BCL-xL和Fab(AZ1)(ABT-737)。
50.如权利要求47至49中任一项所述的EV，其中所述化学诱导的二聚体包括FRB-FKBP融合复合物。
51.如权利要求50所述的EV，其中所述FRB是mTOR的FRB。
52.如权利要求47至51中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一种衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体中的一种融合，从而当所述结合配偶体与所述化合物接触时形成二聚体复合物。
53.如权利要求52所述的EV，其中所述至少一种衣壳蛋白选自由VP1、VP2和VP3组成的组。
54.如权利要求52或53所述的EV，其中所述AAV衣壳蛋白包括VP2。
55.如权利要求52至54中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一个不与所述化学诱导的二聚体的结合配偶体融合的VP2。
56.如权利要求55所述的EV，其中与所述化学诱导的二聚体的结合配偶体融合的所述VP2的数量少于所述至少一种不与所述化学诱导的二聚体的结合配偶体融合的VP的数量。
57.如权利要求56所述的EV，其中与所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体连接的所述VP2的数量比所述至少一个不与所述结合配偶体融合的VP2的数量少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约23倍、约24倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约46倍、约50倍或约100倍。
58.如权利要求52或53所述的EV，其中所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体被插入所述AAV衣壳蛋白的内环内。
59.如权利要求58所述的EV，其中所述内环包含序列GTTTQSR(SEQ ID NO:43)。
60.如权利要求58所述的EV，其中所述内环包含SEQ ID NO:44的氨基酸453至459。
61.如权利要求59或60所述的EV，其中所述内环的至少一个氨基酸被所述化学诱导的二聚体的结合配偶体替代。
62.如权利要求30至46中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白通过接头与所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体连接。
63.如权利要求38至44或52至62中任一项所述的EV，其中所述AAV衣壳蛋白通过接头与所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体连接。
64.如权利要求62或63所述的EV，其中所述接头包含共价键或一个或多个氨基酸。
65.如权利要求62至64中任一项所述的EV，其中所述接头是可裂解的接头。
66.如权利要求1至37和45至47中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白与特异性结合所述AAV的亲和剂连接。
67.如权利要求66所述的EV，其中所述亲和剂是AAV受体、纳米抗体、骆驼科抗体、IgNAR、单结构域抗体、抗体或其抗原结合部分、其任何功能性片段或其任意组合。
68.如权利要求67所述的EV，其中所述其抗原结合部分包含单链Fab。
69.如权利要求66至68中任一项所述的EV，其中所述亲和剂与一种或多种AAV衣壳蛋白结合。
70.如权利要求69所述的EV，其中所述一种或多种AAV衣壳蛋白是AAV组装激活蛋白。
71.如权利要求70所述的EV，其中所述亲和剂不与AAV衣壳蛋白单体结合。
72.如权利要求1至71中任一项所述的EV，其中所述AAV还包含基因盒，所述基因盒包含编码目标基因的异源序列。
73.如权利要求72所述的EV，其中所述基因盒编码选自由以下组成的组的蛋白：分泌蛋白、受体、结构蛋白、信号传导蛋白、感觉蛋白、调节蛋白、转运蛋白、储存蛋白、防御蛋白、运动蛋白、凝血因子、生长因子、抗氧化剂、细胞因子、趋化因子、酶、肿瘤抑制基因、DNA修复蛋白、结构蛋白、低密度脂蛋白受体、α葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜传导调节因子或其任意组合。
74.如权利要求72或73所述的EV，其中所述基因盒编码因子VIII蛋白或因子IX蛋白。
75.如权利要求74所述的EV，其中所述因子VIII蛋白是野生型因子VIII、B结构域缺失的因子VIII、因子VIII融合蛋白或其任意组合。
76.如权利要求72或73所述的EV，其中所述目标基因编码Rab蛋白香叶基香叶基转移酶组分A1(REP1)。
77.如权利要求76所述的EV，其中所述REP1包含与SEQ ID NO:45具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
78.如权利要求1至77中任一项所述的EV，其中所述AAV选自由以下组成的组：AAV 1型、AAV 2型、AAV 3A型、AAV 3B型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、合成AAV及其任意组合。
79.一种AAV，其在如权利要求1至78中任一项中所述的EV中。
80.一种AAV，其包含与支架蛋白连接的VP2，所述支架蛋白包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中所述X2至所述X6中的每一个独立地是氨基酸，并且其中所述X6包括碱性氨基酸。
81.如权利要求80所述的AAV，其中所述支架蛋白是权利要求14至37中任一项所述的支架蛋白或第二支架蛋白。
82.一种AAV，其包含与化学诱导的二聚体的结合配偶体连接的VP2。
83.如权利要求82所述的AAV，其中所述化学诱导的二聚体的所述结合配偶体包括权利要求49至51中任一项所述的任一种结合配偶体。
84.一种AAV，其包含一种或多种与亲和剂特异性结合的衣壳蛋白。
85.如权利要求84所述的AAV，其中所述亲和剂在权利要求67至71中任一项中阐述。
86.一种细胞外囊泡(EV)，其包含(i)腺相关病毒(AAV)和(ii)支架蛋白，其中所述AAV与所述EV的外表面上的所述支架蛋白缔合。
87.如权利要求86所述的EV，其中所述支架蛋白包含胞外结构域，并且其中所述AAV与所述支架蛋白的所述胞外结构域缔合。
88.如权利要求86或87所述的EV，其中所述支架蛋白还包含跨膜区，其中所述跨膜区被锚定至所述EV的所述膜上。
89.如权利要求86至88中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白还包含胞内结构域。
90.如权利要求86至89中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白包含异源多肽，其中所述异源多肽与所述支架蛋白的胞外结构域融合，并且其中所述异源多肽与所述AAV缔合。
91.如权利要求86至90中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白是I型跨膜蛋白或II型跨膜蛋白。
92.如权利要求90或91所述的EV，其中所述异源多肽与所述支架蛋白的所述胞外结构域的N端或C端融合。
93.如权利要求90至92中任一项所述的EV，其中所述异源多肽包括受体、配体、抗原结合部分、底物、其片段或其组合；并且其中所述异源多肽与所述AAV的表面上的一种或多种蛋白特异性相互作用。
94.如权利要求93所述的EV，其中所述异源多肽包含选自由以下组成的组的抗原结合部分：抗体的抗原结合片段、骆驼科抗体或其抗原结合片段、单链FAB、纳米抗体、鲨鱼IgNAR及其组合。
95.如权利要求93或94所述的EV，其中所述抗原结合部分包括纳米抗体。
96.如权利要求93至95中任一项所述的EV，其中所述抗原结合部分特异性结合所述AAV的表面上的所述一种或多种蛋白。
97.如权利要求93至96中任一项所述的EV，其中所述AAV的表面上的所述一种或多种蛋白包括选自由VP1、VP2、VP3及其任意组合组成的组的衣壳蛋白。
98.如权利要求93至97中任一项所述的EV，其中所述AAV的表面上的所述一种或多种蛋白是与所述AAV的衣壳蛋白融合的非AAV序列。
99.如权利要求98所述的EV，其中所述衣壳蛋白选自VP1、VP2、VP3及其任意组合。
100.如权利要求99所述的EV，其中所述非AAV序列与VP2融合。
101.如权利要求99或100所述的EV，其中所述非AAV序列与VP2的N端融合。
102.如权利要求99或101所述的EV，其中所述非AAV序列与VP2的暴露于内表面的环融合。
103.如权利要求99所述的EV，其中所述非AAV序列与VP3融合。
104.如权利要求99或103所述的EV，其中所述非AAV序列与VP3的N端融合。
105.如权利要求99或103所述的EV，其中所述非AAV序列与VP3的暴露于内表面的环融合。
106.如权利要求99所述的EV，其中所述非AAV序列与VP1融合。
107.如权利要求106所述的EV，其中所述非AAV序列与VP1的暴露于内表面的环融合。
108.如权利要求86至93中任一项所述的EV，其中：
(i)所述支架蛋白与包含Fc受体的异源多肽融合；以及
(ii)所述AAV包含至少一种与免疫球蛋白恒定区(Fc)的Fc区融合的衣壳蛋白。
109.如权利要求108所述的EV，其中所述Fc受体是选自Fcγ受体I(FcγR1)、FcγRIIA、FcγIIB、FcγIIIA和FcγIIIB的Fcγ受体；并且其中所述Fc是IgG的Fc。
110.如权利要求108或109所述的EV，其中所述Fc受体是FcγR1，并且所述Fc是IgG的Fc。
111.如权利要求108所述的EV，其中所述Fc受体是Fcα受体I(FcαR1)，并且其中所述Fc是IgA的Fc。
112.如权利要求108所述的EV，其中所述Fc受体是选自Fcε受体I(FcεRI)和FcεRII的Fcε受体，并且其中所述Fc是IgE的Fc。
113.如权利要求86至93中任一项所述的EV，其中：
(i)所述支架蛋白与包含纳米抗体的异源多肽融合；以及
(ii)所述AAV包含至少一种与免疫球蛋白恒定区(Fc)的Fc区融合的衣壳蛋白。
114.如权利要求113所述的EV，其中所述纳米抗体特异性结合与所述衣壳蛋白融合的所述Fc。
115.如权利要求108至114中任一项所述的EV，其中所述至少一种衣壳蛋白选自由VP1、VP2和VP3组成的组。
116.如权利要求108至115中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一个与Fc融合的VP2。
117.如权利要求116所述的EV，其中所述AAV包含至少一个不与Fc融合的VP2。
118.如权利要求108至117中任一项所述的EV，其中所述Fc与所述至少一个VP2的N端融合。
119.如权利要求108至117中任一项所述的EV，其中所述Fc与所述至少一个VP2的暴露于内表面的环融合。
120.如权利要求108至119中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一个与Fc融合的VP3。
121.如权利要求120所述的EV，其中所述AAV包含至少一个不与所述Fc融合的VP3。
122.如权利要求108至121中任一项所述的EV，其中所述Fc与所述至少一个VP3的N端融合。
123.如权利要求108至121中任一项所述的EV，其中所述Fc与所述至少一个VP3的暴露于内表面的环融合。
124.如权利要求108至123中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一个与Fc融合的VP1。
125.如权利要求108至123中任一项所述的EV，其中所述AAV包含至少一个不与Fc融合的VP1。
126.如权利要求124所述的EV，其中所述Fc与VP1的暴露于表面的环融合。
127.如权利要求102、105、107、119、123和126中任一项所述的EV，其中所述暴露于表面的环包含序列GTTTQSR(SEQ ID NO:43)。
128.如权利要求102、105、107、119、123和126中任一项所述的EV，其中所述暴露于表面的环包含VP1的氨基酸残基453至459。
129.如权利要求102、105、107、119、123和126至128中任一项所述的EV，其中所述暴露于表面的环的所述至少一个氨基酸被所述Fc替代。
130.如权利要求102、105、107、119、123和126至129中任一项所述的EV，其中所述暴露于表面的环被所述Fc替代。
131.如权利要求86至96中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白与抗原结合部分融合，其中所述抗原结合部分特异性结合AAV的表面上的抗原。
132.如权利要求86至93中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白与包含AAV受体的异源多肽融合。
133.如权利要求86至132中任一项所述的EV，其中所述AAV还包含含有目标基因的核苷酸序列。
134.如权利要求133所述的EV，其中所述目标基因编码选自由以下组成的组的蛋白：分泌蛋白、受体、结构蛋白、信号传导蛋白、感觉蛋白、调节蛋白、转运蛋白、储存蛋白、防御蛋白、运动蛋白、凝血因子、生长因子、抗氧化剂、细胞因子、趋化因子、酶、肿瘤抑制基因、DNA修复蛋白、结构蛋白、低密度脂蛋白受体、α葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜传导调节因子或其任意组合。
135.如权利要求133或134所述的EV，其中所述目标基因编码因子VIII蛋白或因子IX蛋白。
136.如权利要求135所述的EV，其中所述因子VIII蛋白是野生型因子VIII、B结构域缺失的因子VIII、因子VIII融合蛋白或其任意组合。
137.52.如权利要求133或134所述的EV，其中所述目标基因编码Rab蛋白香叶基香叶基转移酶组分A1(REP1)。
138.53.如权利要求137所述的EV，其中所述REP1包含与SEQ ID NO:45具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
139.如权利要求86至138中任一项所述的EV，其中所述AAV选自由以下组成的组：AAV 1型、AAV 2型、AAV 3A型、AAV 3B型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、合成AAV及其任意组合。
140.如权利要求86至139中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白选自由以下组成的组：前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。
141.如权利要求86至140中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白是PTGFRN。
142.如权利要求87所述的EV，其中所述支架蛋白包含N端结构域、效应结构域和跨膜结构域，其中所述ND被肉豆蔻酰化，并且其中所述N端结构域(ND)和/或所述效应结构域(ED)与所述EV的腔表面缔合。
143.如权利要求142所述的EV，其中所述ED通过离子相互作用与所述EV的腔表面缔合。
144.如权利要求142或143中任一项所述的EV，其中所述ED在序列中包含(i)一个碱性氨基酸或(ii)两个或更多个彼此相邻的碱性氨基酸，其中所述碱性氨基酸选自由Lys、Arg、His及其任意组合组成的组。
145.如权利要求144所述的EV，其中所述碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是1与10之间的整数。
146.如权利要求142至145中任一项所述的EV，其中所述ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:11)、KKKKK(SEQ ID NO:12)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQ ID NO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:16)或其任意组合。
147.如权利要求142至146中任一项所述的EV，其中所述ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中所述X2至所述X6中的每一个为氨基酸，并且其中所述X6包含碱性氨基酸。
148.如权利要求147所述的EV，其中：
(i)所述X6选自由Lys、Arg和His组成的组：
(ii)所述X5选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；
(iii)所述X2选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；
(iv)所述X4选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组：或者
(v)(i)-(iv)的任意组合。
149.如权利要求142至148中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白的所述ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中
(i)G代表Gly；
(ii)“:”代表肽键；
(iii)所述X2是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；
(iv)所述X3是氨基酸；
(v)所述X4是选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组的氨基酸；
(vi)所述X5是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；以及
(vii)所述X6是选自由Lys、Arg和His组成的组的氨基酸。
150.如权利要求147至149中任一项所述的EV，其中所述X3选自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg组成的组。
151.如权利要求142至150中任一项所述的EV，其中所述ND和所述ED通过接头连接。
152.如权利要求151所述的EV，其中所述接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
153.如权利要求142至152中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:17)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:18)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:19)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:20)、(v)GGKLSKK(SEQ ID NO:21)或(vi)其任意组合。
154.如权利要求153所述的EV，其中所述支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:22)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:23)、(iii)GAKLSKKK(SEQID NO:24)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:25)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:26)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:27)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:28)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:29)、(ix)GGKLSKKK(SEQ ID NO:30)、(x)GGKLSKKS(SEQ ID NO:31)及(xi)其任意组合。
155.如权利要求142至154中任一项所述的EV，其中所述支架蛋白和/或所述第二支架蛋白的C端与所述AAV的衣壳蛋白连接。
156.如权利要求1至78和86至155中任一项所述的EV，其是外来体。
157.一种包含衣壳的腺相关病毒(AAV)，其中所述衣壳包含至少一种选自由VP1、VP2和VP3组成的组的衣壳蛋白；其中所述至少一种衣壳蛋白与支架蛋白连接。
158.如权利要求157所述的AAV，其中所述支架蛋白选自由以下组成的组：前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、氨肽酶N(ANPEP)、脑啡肽酶(膜金属内肽酶；MME)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段及其任意组合。
159.如权利要求157所述的AAV，其中所述支架蛋白包含N端结构域、效应结构域和跨膜结构域，其中所述ND被肉豆蔻酰化，并且其中所述N端结构域(ND)和/或所述效应结构域(ED)与所述EV的腔表面缔合。
160.如权利要求159所述的AAV，其中所述ED通过离子相互作用与所述EV的腔表面缔合。
161.如权利要求159或160中任一项所述的AAV，其中所述ED在序列中包含(i)一个碱性氨基酸或(ii)两个或更多个彼此相邻的碱性氨基酸，其中所述碱性氨基酸选自由Lys、Asp、His及其任意组合组成的组。
162.如权利要求161所述的AAV，其中所述碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是1与10之间的整数。
163.如权利要求159至162中任一项所述的AAV，其中所述ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:11)、KKKKK(SEQ ID NO:12)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:13)；RRRRR(SEQID NO:14)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:15)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:16)或其任意组合。
164.如权利要求159至163中任一项所述的AAV，其中所述ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中所示的氨基酸序列，其中G代表Gly；其中“:”代表肽键，其中所述X2至所述X6中的每一个为氨基酸，并且其中所述X6包含碱性氨基酸。
165.如权利要求164所述的AAV，其中：
(i)所述X6选自由Lys、Asp和His组成的组：
(ii)所述X5选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；
(iii)所述X2选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组；
(iv)所述X4选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组：或者
(v)(i)-(iv)的任意组合。
166.如权利要求160至165中任一项所述的AAV，其中所述支架蛋白的所述ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中
(i)G代表Gly；
(ii)“:”代表肽键；
(iii)所述X2是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；
(iv)所述X3是氨基酸；
(v)所述X4是选自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met组成的组的氨基酸；
(vi)所述X5是选自由Pro、Gly、Ala和Ser组成的组的氨基酸；以及
(vii)所述X6是选自由Lys、Arg和His组成的组的氨基酸。
167.如权利要求164至166中任一项所述的AAV，其中所述X3选自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg组成的组。
168.如权利要求159至167中任一项所述的AAV，其中所述ND和所述ED通过接头连接。
169.如权利要求168所述的AAV，其中所述接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
170.如权利要求157至169中任一项所述的AAV，其中所述支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:17)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:18)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:19)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:20)、(v)GGKLSKK(SEQ ID NO:21)或(vi)其任意组合。
171.如权利要求170所述的AAV，其中所述支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:22)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:23)、(iii)GAKLSKKK(SEQID NO:24)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:25)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:26)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:27)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:28)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:29)、(ix)GGKLSKKK(SEQ ID NO:30)、(x)GGKLSKKS(SEQ ID NO:31)及(xi)其任意组合。
172.如权利要求157至171中任一项所述的AAV，其与细胞外囊泡(EV)的外表面缔合。
173.如权利要求157至172中任一项所述的AAV，其与EV的外表面缔合，其中所述支架蛋白或所述第二支架蛋白与所述EV连接。
174.如权利要求66所述的EV，其中所述支架蛋白通过可裂解的接头与特异性结合所述AAV的亲和剂连接。
175.一种药物组合物，包含权利要求1至78、86至156和174中任一项所述的EV或权利要求79至85和157至173中任一项所述的AAV以及药学上可接受的载剂。
176.一种细胞，其产生权利要求1至78、86至156和174中任一项所述的分离的EV或权利要求79至85和157至173中任一项所述的AAV。
177.一种细胞，其包含编码与权利要求1至78、86至156和174中任一项所述的支架蛋白连接的AAV蛋白的第一核苷酸序列。
178.如权利要求88所述的细胞，其还包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含权利要求72至77和133至156中任一项所述的目标基因。
179.一种细胞，其包含编码与权利要求47至67中任一项所述的化学诱导的二聚体的结合配偶体连接的AAV蛋白的第一核苷酸。
180.如权利要求179所述的细胞，其还包含编码权利要求90所述的化学诱导的二聚体的相应结合配偶体的第二核苷酸序列，所述结合配偶体与权利要求1至47中任一项所述的支架蛋连接。
181.如权利要求180所述的细胞，其还包含含有权利要求72至77中任一项所述的目标基因的第三核苷酸序列。
182.一种细胞，其包含编码权利要求66至71中任一项所述的亲和剂的第一核苷酸，所述亲和剂与权利要求1至47中任一项所述的支架蛋白连接。
183.如权利要求182所述的细胞，其还包含含有权利要求72至77中任一项所述的目标基因的第二核苷酸序列。
184.一种药盒，其包括(i)权利要求1至79、86至156和174中任一项所述的分离的EV或权利要求79至85和157至173中任一项所述的AAV以及(ii)使用说明。
185.一种制备EV的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求179至183中任一项所述的细胞并获得所述EV。
186.一种预防或治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1至78、86至156和174中任一项所述的EV或权利要求79至85或157至173中任一项所述的AAV或权利要求176所述的药物组合物。
187.如权利要求186所述的方法，其中所述疾病选自癌症、血友病、糖尿病、生长因子缺乏症、眼病、庞佩氏病、溶酶体贮积病症、粘液粘稠病、囊性纤维化、杜兴和贝克尔肌营养不良症、转甲状腺素蛋白淀粉样变性、血友病A、血友病B、腺苷脱氨酶缺乏症、莱伯先天性黑蒙、X-连锁肾上腺脑白质营养不良症、异染性脑白质营养不良症、OTC缺乏症、糖原贮积症1A病、Criggler-Najjar综合征、1型原发性高草酸尿症、急性间歇性卟啉症、苯丙酮尿症、家族性高胆固醇血症、VI型粘多糖贮积症、α1抗胰蛋白酶缺乏症和高胆固醇血症。
188.一种将AAV递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1至78、86至156和174中任一项所述的EV。
189.如权利要求186至188中任一项所述的方法，其中所述EV通过肠胃外、口服、静脉内、肌内、瘤内、鼻内、皮下或腹膜内施用。
190.如权利要求186至188中任一项所述的方法，其中所述EV施用是眼内施用。
191.如权利要求190所述的方法，其中所述眼内施用是玻璃体内施用、前房内施用、结膜下施用、视网膜下施用、巩膜下施用、脉络膜内施用及其任意组合。
192.如权利要求190或191所述的方法，其中所述眼内施用包括注射所述EV。
193.如权利要求190至192中任一项所述的方法，其中所述眼内施用是玻璃体内注射。
194.如权利要求190至193中任一项所述的方法，其中所述眼内施用包括植入包含所述组合物的递送装置。
195.如权利要求194所述的方法，其中所述递送装置是眼内递送装置。
196.如权利要求195所述的方法，其中所述眼内递送装置是玻璃体内植入物或巩膜塞。
197.如权利要求194至196中任一项所述的方法，其中所述递送装置是持续释放递送装置。
198.如权利要求194至197中任一项所述的方法，其中所述递送装置是可生物降解的。
199.如权利要求190至198中任一项所述的方法，其中所述EV的所述眼内施用是为了治疗选自由以下组成的组的疾病：黄斑变性、白内障、糖尿病性视网膜病、青光眼、弱视、斜视、视网膜病变或其任意组合。
200.如权利要求186至199中任一项所述的方法，其包括施用附加的治疗剂。
201.一种包含腺相关病毒(AAV)和支架蛋白的细胞外囊泡(EV)，其中所述AAV与所述外来体缔合，并且其中所述AAV与单独的所述AAV相比具有改变的特性。
202.如权利要求201所述的EV，其中所述AAV与所述EV的腔表面缔合。
203.如权利要求201所述的EV，其中所述AAV与所述EV的外表面缔合。
204.如权利要求201至203中任一项所述的EV，其中所述EV是权利要求1至78、86至156和174中任一项所述的EV。
CN202080044190.0A 2019-04-17 2020-04-17 外来体和aav的组合物 Pending CN114008069A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962835432P 2019-04-17 2019-04-17
US201962835425P 2019-04-17 2019-04-17
US62/835,432 2019-04-17
US62/835,425 2019-04-17
US202062984161P 2020-03-02 2020-03-02
US202062984173P 2020-03-02 2020-03-02
US62/984,173 2020-03-02
US62/984,161 2020-03-02
PCT/US2020/028849 WO2020215010A1 (en) 2019-04-17 2020-04-17 Compositions of exosomes and aav

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114008069A true CN114008069A (zh) 2022-02-01

Family

ID=70740740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080044190.0A Pending CN114008069A (zh) 2019-04-17 2020-04-17 外来体和aav的组合物

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220323519A1 (zh)
EP (1) EP3956456A1 (zh)
JP (1) JP2022531095A (zh)
KR (1) KR20220009389A (zh)
CN (1) CN114008069A (zh)
AU (1) AU2020258483A1 (zh)
BR (1) BR112021020668A2 (zh)
CA (1) CA3136720A1 (zh)
IL (1) IL287241A (zh)
MX (1) MX2021012540A (zh)
SG (1) SG11202111290WA (zh)
WO (1) WO2020215010A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL299925A (en) 2020-07-27 2023-03-01 Anjarium Biosciences Ag Compounds of DNA molecules, methods for their preparation and methods of using them
WO2022236080A2 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 Asimov Inc. Compositions and methods for adeno-associated viral production
US20230090654A1 (en) * 2021-08-24 2023-03-23 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus formulations
WO2023091904A1 (en) * 2021-11-16 2023-05-25 West Virginia University Board of Governors on behalf of West Virginia University A novel way for brain-specific delivery of molecules for the treatment of brain diseases
KR20230139529A (ko) * 2022-03-28 2023-10-05 경북대학교 산학협력단 태반유래 양막상피세포에서 포집된 세포외 소포 기반의 안과용 국소 약물전달체
WO2024030514A1 (en) * 2022-08-02 2024-02-08 The Johns Hopkins University Extracellular vesicle-associated adeno-associated virus vectors for inhaled gene therapy

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
AU2002226028A1 (en) 2000-11-14 2002-05-27 Board Of Regents, Unversity Of Texas Systems Mutant human factor ix with an increased resistance to inhibition by heparin
EP1427820A2 (en) 2001-09-04 2004-06-16 MERCK PATENT GmbH Modified factor ix
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
PL220644B1 (pl) 2001-11-13 2015-11-30 Univ Pennsylvania Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza
AU2002316574B2 (en) 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
TW200616604A (en) 2004-08-26 2006-06-01 Nicholas Piramal India Ltd Nitric oxide releasing prodrugs containing bio-cleavable linker
US20060269480A1 (en) 2005-05-31 2006-11-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Multi-triggered self-immolative dendritic compounds
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
TW200804416A (en) 2006-06-19 2008-01-16 Nautilus Technology Llc Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
CN101500548A (zh) 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
US7700734B2 (en) 2007-01-09 2010-04-20 Shu-Wha Lin Recombinant human factor IX and use thereof
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
MX2009012343A (es) 2007-05-14 2010-02-10 Biogen Idec Inc Regiones fc (sc fc) de cadena sencilla, polipeptidos de enlace que comprenden las mismas, y metodos relacionados con ello.
ES2362386T3 (es) 2007-06-21 2011-07-04 Technische Universität München Proteínas activas biológicas que tienen estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro.
WO2009026660A1 (en) 2007-08-30 2009-03-05 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Dendritic cell marker and uses thereof
CA2702363A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill Human factor ix variants with an extended half life
MX2010011345A (es) 2008-04-16 2011-02-23 Bayer Healthcare Llc Polipeptidos modificados del factor ix y usos de los mismos.
CN102065887A (zh) 2008-04-16 2011-05-18 拜耳医药保健有限公司 因子ix的定点修饰
CN102105582A (zh) 2008-04-21 2011-06-22 诺沃-诺迪斯克有限公司 高糖基化人凝血因子ix
US8716448B2 (en) 2009-02-03 2014-05-06 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
FR2950350B1 (fr) 2009-09-24 2013-12-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations
MX356527B (es) 2010-07-09 2018-06-01 Bioverativ Therapeutics Inc Polipeptidos de factor ix y metodos para usarlos.
WO2013053008A2 (en) 2011-10-14 2013-04-18 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Molecules which bind clec9a
CN108465106B (zh) 2012-01-12 2022-05-27 普吉特海湾血液中心 降低经受因子viii疗法的个体中针对因子viii的免疫原性的方法
ES2935489T3 (es) 2012-02-15 2023-03-07 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
AU2013315225B2 (en) 2012-09-14 2018-11-08 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
SI2968477T1 (sl) 2013-03-15 2020-04-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Polipeptidne formulacije faktorja VIII
EP4176894B1 (en) 2014-01-10 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric proteins and uses thereof
IL254589B2 (en) 2015-03-31 2023-11-01 Vhsquared Ltd A peptide structure with a protease-cleavable linker
IL257231B (en) 2015-08-03 2022-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix fusion proteins and methods for their preparation and use
PT3411478T (pt) 2016-02-01 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Genes do fator viii otimizados
WO2017136764A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 The General Hospital Corporation Hybrid system for efficient gene delivery to cells of the inner ear
GB201702863D0 (en) * 2017-02-22 2017-04-05 Evox Therapeutics Ltd Improved loading of EVs with therapeutic proteins
CA3072334A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
MX2020001790A (es) 2017-08-25 2020-07-22 Codiak Biosciences Inc Preparacion de exosomas terapeuticos mediante el uso de proteinas de membrana.
CN111511384A (zh) * 2017-11-17 2020-08-07 科迪亚克生物科学公司 工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法
BR112020019089A2 (pt) * 2018-03-23 2020-12-29 Codiak Biosciences, Inc. Vesículas extracelulares compreendendo agonista de sting
EP3841112A1 (en) * 2018-08-24 2021-06-30 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof
EP3672614B1 (en) * 2018-11-16 2021-10-06 Codiak BioSciences, Inc. Engineered extracellular vesicles and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020258483A1 (en) 2021-11-11
CA3136720A1 (en) 2020-10-22
SG11202111290WA (en) 2021-11-29
JP2022531095A (ja) 2022-07-06
KR20220009389A (ko) 2022-01-24
MX2021012540A (es) 2022-01-18
US20220323519A1 (en) 2022-10-13
WO2020215010A1 (en) 2020-10-22
EP3956456A1 (en) 2022-02-23
IL287241A (en) 2021-12-01
BR112021020668A2 (pt) 2022-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114008069A (zh) 外来体和aav的组合物
KR102511979B1 (ko) 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
CN110770346B (zh) 多倍体腺相关病毒载体及其制备和使用方法
JP4060531B2 (ja) Ａａｖ５ベクターおよびその使用
CN114127089A (zh) 重组腺相关病毒及其用途
JP2021503914A (ja) アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
JP2023126919A (ja) バリアントカプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
JP2016530246A (ja) 脳疾患を処置するための方法および組成物
KR20210008561A (ko) 합성 간-향성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 그의 용도
KR20200098481A (ko) Aav 벡터
KR20230034211A (ko) 변형된 아데노-관련 바이러스 5 캡시드 및 이의 용도
US20240067987A1 (en) Adeno-associated variants, formulations and methods for pulmonary delivery
Kochergin-Nikitsky et al. Tissue and cell-type-specific transduction using rAAV vectors in lung diseases
JP2024514956A (ja) 組織標的化された改変ａａｖカプシドおよびその使用方法
WO2022232327A9 (en) Aav capsids and uses thereof
US20230279065A1 (en) Gene therapy with dysferlin dual vectors
TW202305124A (zh) 具有腦特異性靶向模體的新穎構成物及含有其之組成物
JP2023515795A (ja) Ａａｖカプシド－プロモーター相互作用および細胞選択的遺伝子発現
KR20230029616A (ko) 종간 호환가능한 아데노-관련 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법
WO2020187268A1 (zh) 一种增强基因编辑的融合蛋白及其应用
US20220347315A1 (en) Methods and compositions for increasing transduction efficiency with cell membrane fusion proteins
US11795207B2 (en) Modified plasma clotting factor VIII and method of use thereof
JP2024511851A (ja) 改変血漿凝固第ｖｉｉｉ因子およびその使用方法
WO2022229807A1 (en) Adeno-associated viral vector capsids with improved tissue tropism
WO2023056399A1 (en) Novel aav capsids and compositions containing same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20231102

Address after: Oxfordshire

Applicant after: EVOX THERAPEUTICS Ltd.

Address before: Massachusetts

Applicant before: Codiak BioSciences, Inc.