BR112020019089A2 - Vesículas extracelulares compreendendo agonista de sting - Google Patents

Vesículas extracelulares compreendendo agonista de sting Download PDF

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sting
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Su Chul Jang
Chang Ling Sia
Nuruddeen D. Lewis
Rane A. Harrison
Raymond J. Moniz
Sriram Sathyanarayanan
Douglas E. Williams
Kyriakos Economides
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Codiak Biosciences, Inc.
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Abstract

vesículas extracelulares compreendendo agonista de sting. são fornecidas neste documento composições compreendendo ev, por exemplo, exossomo, agonistas de sting encapsulados e métodos de produção das composições descritas. também são fornecidos neste documento métodos de modulação de uma resposta imunológica por meio da administração de uma quantidade terapêutica de ev, por exemplo, exossomos que encapsulam agonistas de sting. a resposta imunológica pode ser uma resposta ifnß ou ativação de células dendríticas mieloides (mdcs). também são fornecidos neste documento métodos de modulação de uma resposta imunológica que não induz inflamação sistêmica por meio da administração de exossomos que encapsulam agonistas de sting.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VESÍCU- LAS EXTRACELULARES COMPREENDENDO AGONISTA DE STING".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade dos núme- ros de série do Pedido Provisório US 62/647.491, depositado em 23 de março de 2018; 62/680.501, depositado em 4 de junho de 2018; 62/688.600, depositado em 22 de junho de 2018; 62/756.247, deposi- tado em 6 de novembro de 2018; e 62/822.019, depositado em 21 de março de 2019; os conteúdos de cada um dos quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRO- NICAMENTE VIA EFS-WEB
[0002] O conteúdo da listagem de sequência enviada eletronicamen- te em arquivo de texto ASCII (Nome: 4000 0210000 Sedqlisting ST25. txt; Tamanho: 238.061 bytes; e Data de Criação: 20 de março de 2019) depositado com o pedido é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA DESCRIÇÃO
[0003] O estimulador de genes de interferon (STING) é um sensor citosólico de dinucleotídeos cíclicos que é tipicamente produzido por bactérias. Mediante a ativação, leva à produção de interferons do tipo | e inicia uma resposta imune. O agonismo de STING tem se mostrado uma abordagem promissora para gerar uma resposta imunE contra tumores pré-clínicos. Infelizmente, devido ao amplo perfil de expressão de STING, a administração sistêmica dos agonistas de STING leva à inflamação sistêmica. Isso limita a dose que pode ser administrada, o que, por sua vez, limita a eficácia terapêutica. Uma abordagem alter- nativa para a administração sistêmica é injetar o agonista de STING diretamente no tumor. As injeções intratumorais são bastante eficazes; no entanto, elas são limitadas a tumores sólidos que podem ser alcan- çados com uma agulha e podem causar dano ao tecido. Métodos aperfeiçoados de administração dos agonistas de STING são, portan- to, necessários.
SUMÁRIO DA DESCRIÇÃODESCRIÇÃO
[0004] Neste documento são fornecidas composições que com- preendem exossomos que estão encapsulados ou associados a um agonista de STING que pode, mediante administração a um sujeito em necessidade, modular o sistema imune humano. Tais composições podem ser usadas para tratar uma pluralidade de doenças ou condi- ções em que uma modulação da via de sinalização de STING tem um efeito benéfico. Por exemplo, o tratamento de tumores ou lesões can- cerígenas em sujeitos humanos. O encapsulamento de um agonista de STING dentro dos exossomos permite a ativação seletiva de células imunes e fornece um perfil de biodistribuição mais estreito, permitindo assim a administração sistêmica sem as toxicidades associadas à ad- ministração do agonista sozinho.
[0005] Em algumas modalidades, a composição compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinucleotídeo não cíclico.
[0006] Em uma modalidade, a composição compreende uma vesí- cula extracelular e um agonista de STING, em que a vesícula extrace- lular é um exossomo, uma nanovesícula, um corpo apoptótico, uma microvesícula, um lisossoma, um endossomo, um lipossoma, uma na- nopartícula lipídica, uma micela, um estrutura multilamelar, uma vesí- cula revesiculada ou uma célula extrudada.
[0007] Em algumas modalidades, o exossomo superexpressa a proteína PTGFRN. Em uma modalidade, o exossomo é produzido por uma célula que superexpressa PTGFRN.
[0008] Em algumas modalidades, o exossomo superexpressa uma proteína contendo um domínio de IgV. Em uma modalidade, o exos- somo é produzido por uma célula que superexpressa uma proteína contendo um domínio de IgV. Em algumas modalidades, a proteína contendo IgV é Basigin, IGSF2, IGSF3 ou IGSF8. Em outra modalida- de, o exossomo ou a célula produtora de exossomo superexpressa uma proteína de superfície de exossomo descrita em detalhes no Pe- dido de Patente US 62/656.956, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o exos- somo é modificado com glicano. Em uma modalidade, a modificação com glicano compreende uma modificação enzimática ou química. Em outra modalidade, o exossomo é derivado de uma célula produtora modificada com glicano. Em uma modalidade, a modificação com gli- cano da célula produtora compreende uma modificação enzimática ou química. Em uma modalidade, a modificação com glicano da célula produtora compreende o tratamento com kifunensina. Em outra moda- lidade, a modificação com glicano da célula produtora compreende o nocaute de um gene de sialiltransferase ou citidililtransferase. Em uma modalidade, a modificação com glicano da célula produtora compre- ende o nocaute CRISPR de uma sialiltransferase ou gene da citidilil- transferase. Em uma modalidade, o gene é Citidina Monofosfato N- Acetilneuramínico Ácido Sintetase (CMAS). Em outras modalidades, o exossomo é dessialilado ou desglicosilado.
[0009] Em algumas modalidades, o exossomo que superexpressa PTGFRN ou a proteína contendo um domínio de IgV é um exossomo modificado com glicano. Em uma modalidade, o exossomo que supe- rexpressa PTGFRN ou a proteína contendo um domínio de IgV é des- sialilado. Em uma modalidade, o exossomo que superexpressa PTG- FRN ou a proteína contendo um domínio de IgV é desglicosilado. Em algumas modalidades, o exossomo ou célula produtora é desglicosila- do ou dessialilado em cerca de ou mais de 95%, 90-95%, 85-90%, 80- 85%, 75-80%, 70-75%, 65-70%, 60-65%, 50-60%, 40-50%, 30-40%, 20-30%, 10-20% ou 0-10%.
[0010] Em algumas modalidades, o exossomo compreende adici- onalmente um exossomo que expressa um ligante, uma citocina ou um anticorpo. Em uma modalidade, o ligante compreende CD40L, OX40L ou CD27L. Em outra modalidade, a citocina compreende IL-7, IL-12 ou IL-15. Em uma modalidade, o anticorpo compreende um anticorpo an- tagonista ou um anticorpo agonístico.
[0011] Em uma modalidade, o agonista de STING compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinucleotídeo não cíclico que compreende um marcador de ligação a lipídeos. Em outra modalidade, o agonista de STING compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinucleotídeo não cíclico modificado física ou quimicamente, sendo que as modificações compreendem a alteração da polaridade ou carga do agonista. Em outra modalidade, o agonista de STING compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinucleotídeo não cíclico modificado física e/ou quimicamente. Em outras modalidades, o agonista de STING tem uma polaridade e/ou uma carga diferente do agonista de STING anterior à modificação (isto é, o agonista de STING não modificado correspon- dente).
[0012] A concentração do agonista de STING associado ao exos- somo pode ser de cerca de 0,01 uM a 100 uM. Em uma modalidade em que a concentração do agonista de STING associado ao exosso- mo é de cerca de 0,01 uM a 0,1 uM, 0,1 uM a 1 uM, 1 uM a 10 uM, 10 UM a 50 UM ou 50 uM a 100 uM. Em outra modalidade, a concentra- ção do agonista de STING associado ao exossomo é de cerca de 1 UM a 10 uM.
[0013] É fornecido neste documento também um Kkit que compre- ende a composição de qualquer uma das reivindicações e instruções de uso acima.
[0014] Também são fornecidos neste documento métodos de pro- dução de um exossomo que compreende um agonista de STING, sen- do que as etapas compreendem obter um exossomo, misturar o exos- somo com um agonista de STING em uma solução, incubar a mistura do exossomo e do agonista de STING em uma solução que compre- ende um tampão e purificar o exossomo que compreende o agonista de STING.
[0015] Em algumas modalidades, a etapa de incubação compre- ende incubar o exossomo e o agonista de STING durante cerca de 2- 24 horas. Em uma modalidade, a etapa de incubação compreende in- cubar o exossomo e o agonista de STING durante cerca de 6-12 ho- ras. Em uma modalidade, a etapa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING durante cerca de 12-20 horas. Em uma modalidade, a etapa de incubação compreende incubar o exos- somo e o agonista de STING por cerca de 14-18 horas. Em uma mo- dalidade, a etapa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING durante cerca de 16 horas.
[0016] Em algumas modalidades, a etapa de incubação compre- ende incubar o exossomo e o agonista de STING a cerca de 15-90ºC. Em uma modalidade, a etapa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING a cerca de 37ºC. Em uma modalida- de, a etapa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonis- ta de STING a cerca de 15-30ºC. Em uma modalidade, a etapa de in- cubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING a cerca de 30-50ºC. Em uma modalidade, a etapa de incubação com- preende incubar o exossomo e o agonista de STING a cerca de 50- 90ºC.
[0017] Em algumas modalidades, a etapa de incubação compre- ende pelo menos um agonista de STING de 0,01 mM a 100 mM. Em uma modalidade, a etapa de incubação compreende pelo menos um agonista de STING de 1 mM a 10 mM.
[0018] Em algumas modalidades, a etapa de incubação compre- ende pelo menos cerca de 10º a cerca de pelo menos 10º partículas totais de exossomos purificados. Em uma modalidade, a etapa de in- cubação compreende pelo menos cerca de 10º? partículas totais de exossomos purificados.
[0019] Em algumas modalidades, o tampão compreende uma so- lução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0020] Em algumas modalidades, a etapa de purificação compre- ende cromatografia por exclusão de tamanho ou cromatografia iônica. Em uma modalidade, a etapa de purificação compreende cromatogra- fia de troca aniônica. Em algumas modalidades, a etapa de purificação compreende dessalinização, diálise, filtração de fluxo tangencial, ultra- filtração ou diafiltração. Em uma modalidade, a etapa de purificação compreende uma ou mais etapas de centrifugação. Em uma modali- dade, a etapa de purificação compreende uma ou mais etapas de cen- trifugação a cerca de 100.000 x g.
[0021] Também são fornecidos neste documento métodos de in- dução ou modulação de uma resposta imune ou inflamatória em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito em necessidade de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma composição que compreende um exossomo, que compreende um agonista de STING, que induzi ou modula assim a resposta imune ou inflamatória no sujeito.
[0022] Em algumas modalidades, o método ativa células dendríti- cas. Em uma modalidade, o método ativa células dendríticas mieloi- des. Em algumas modalidades, o método resulta na ativação de célu- las de monócitos reduzida em comparação com a administração de níveis semelhantes ou idênticos do agonista de STING livre. Em uma modalidade, o método não induz a ativação de células de monócitos.
[0023] Em algumas modalidades, o método induz a produção de interferon-B (IFN-B).
[0024] Em uma modalidade, o método resulta em inflamação sis- têmica reduzida em comparação com a administração de níveis seme- lhantes ou idênticos do agonista de STING livre. Em algumas modali- dades, o método resulta em quantidades insubstanciais de inflamação sistêmica.
[0025] Em algumas modalidades, a administração é parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou por meio de qualquer outra via de administração apropriada. Em uma mo- dalidade, a administração é intravenosa. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta antitumoral.
[0026] Também são fornecidos neste documento métodos de in- dução ou modulação de uma resposta imune ou inflamatória em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito em necessidade de uma composição que compreende um exossomo, que compreende um agonista de STING em uma quantidade suficiente para induzir IFN- B ou ativar células dendríticas, induzindo ou modu- lando assim a resposta imune ou inflamatória no sujeito. Em uma mo- dalidade, o método ativa células dendríticas mieloides. Em algumas modalidades, o método resulta em ativação de células de monócitos reduzidas em comparação com a administração de níveis semelhantes ou idênticos do agonista de STING livre. Em uma modalidade, em que o método não induz a ativação de células de monócitos. Em uma mo- dalidade, o método resulta em inflamação sistêmica reduzida em com- paração com a administração de níveis semelhantes ou idênticos do agonista de STING livre. Em algumas modalidades, o método resulta em quantidades insubstanciais de inflamação sistêmica.
[0027] Em outro aspecto, também são fornecidos neste documen- to métodos de tratamento de câncer em um sujeito, sendo que o mé-
todo compreende a administração ao sujeito em necessidade de uma composição, que compreende uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um exossomo, que compreende um agonista de STING, indu- zindo ou modulando assim uma resposta imune antitumoral no sujeito.
[0028] Em uma modalidade, o método induz a produção de interfe- ron-B (IFN-B).
[0029] Em algumas modalidades, a administração é parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou por meio de qualquer outra via de administração apropriada.
[0030] Em várias modalidades, o método compreende adicional- mente a administração de um agente terapêutico adicional. Em algu- mas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente imuno- modulador. Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
[0031] Em outro aspecto, também são fornecidos neste documen- to métodos de prevenção de metástases de câncer em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito em ne- cessidade de uma composição que compreende uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um exossomo, que compreende um agornista de STING.
[0032] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do exossomo que compreende um agonista de STING é capaz de impedir que um ou mais tumores em um local no sujeito promovam o crescimento de um ou mais tumores em outro local no sujeito.
[0033] Em uma modalidade, o método induz a produção de interfe- ron-B (IFN-B).
[0034] Em algumas modalidades, a administração é parenteral,
oral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou por meio de qualquer outra via de administração apropriada.
[0035] Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intratumoral em um primeiro tumor em um local, e em que a composição administrada no primeiro tumor impede a metástase de um ou mais tumores em um segundo local.
[0036] Em várias modalidades, o método compreende adicional- mente a administração de um agente terapêutico adicional. Em algu- mas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente imuno- modulador. Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
[0037] Neste documento é fornecido uma composição que com- preende uma vesícula extracelular e um estimulador do agonista da proteína dos genes do interferon (STING). Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é um exossomo, uma nanovesícula, um corpo apoptótico, uma microvesícula, um lisossoma, um endossomo, um |i- possoma, uma nanopartícula de lipídio, uma micela, uma estrutura multilamelar, uma vesícula revesiculada ou uma célula extrudada. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é um exossomo.
[0038] Em algumas modalidades, o agonista de STING está asso- ciado à vesícula extracelular. Em algumas modalidades, o agonista de STING é encapsulado dentro da vesícula extracelular. Em certas mo- dalidades, o agonista de STING está ligado a uma bicamada lipídica da vesícula extracelular, opcionalmente por um ligante.
[0039] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular da pre- sente descrição superexpressa uma proteína PTGFRN. Em certas modalidades, o agonista de STING está ligado à proteína PTGFRN,
opcionalmente por um ligante.
[0040] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é produ- zida por uma célula que superexpressa uma proteína PTGFRN. Em algumas modalidades, a vesícula extracelular é modificada com glica- no. Em certas modalidades, a vesícula extracelular é dessialilada. Em modalidades adicionais, a vesícula extracelular é desglicosilada.
[0041] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular compre- ende adicionalmente uma proteína que se liga ou reage enzimatica- mente com o agonista de STING. Em certas modalidades, a vesícula extracelular compreende adicionalmente um ligante, uma citocina ou um anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante compreende CD40L, OX40L e/ou CD27L. Em algumas modalidades, a citocina compreende IL-7, IL-12 e/ou IL-15. Em certas modalidades, o anticor- po compreende um anticorpo antagonista e/ou um anticorpo agonísti- co.
[0042] Em algumas modalidades, o agonista de STING é um dinu- cleotídeo cíclico. Em outras modalidades, o agonista de STING é um dinucleotídeo não cíclico. Em certas modalidades, o agonista de STING compreende uma marcador de ligação a lipídios. Em algumas modalidades, o agonista de STING é fisicamente e/ou quimicamente modificado. Em certas modalidades, o agonista de STING modificado tem uma polaridade e/ou uma carga diferente do agonista de STING não modificado correspondente.
[0043] Em algumas modalidades, a concentração do agonista de STING associado à vesícula extracelular é de cerca de 0,01 uM a 100 UM. Em certas modalidades, a concentração do agonista de STING associado ao exossomo é de cerca de 0,01 uM a 0,1 uM, 0,1 uM a 1 UM, 1 uM a 10 uM, 10 uM a 50 UM ou 50 uM a 100 uM. Em modalida- des adicionais, a concentração do agonista de STING associado à ve- sícula extracelular é de cerca de 1 uM a 10 UM.
[0044] Em algumas modalidades, o agonista de STING compreen- de: Fórmula 1 Fórmula 2 Fórmula 3 ? r 9 8, 9 B 4 e Tr me / xo TC 3% AS AS 9 o-p-z o O—— A p=0 o O——p=o B, o B, Zz ou B, Zz em que: X é H, OH ou F; X2 é H, OH ou F; Z é OH, OR, SH ou SR, em que: i) R1 é Na ou NH, ou ii) R1 é um grupo lábil a enzima que fornece OH ou SH in vivo, tal como pivaloiloximetilo; Bi e B2 são bases escolhidas a partir de: NH oH o 2 N - N N Cx) AS e O N — NÓUN NO ON Adenina, Hipoxantina ou OH o
O HN N CLS Ox > HM R N nn N Guanina, com a condição de que: - na Fórmula (1): X1 e X2não são OH, - na Fórmula (11): quando X; e X> são OH, B: não é Adenina e B2 não é Guanina, e - na Fórmula (III): quando X; e X>são OH, B: não é Adeni- na, Bz não é Guanina e Z não é OH, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0045] Em algumas modalidades, o agonista de STING é selecio- nado do grupo que consiste em:
NH NH?
NEN 1 N. Ss Hof, o xe 3 E 7 o. NON Ho-P-oO N o &º NE mofo TA er o TES om AO on CY CA SS” e oo SR as, no x Fon E? õ mm do o o CL606 o cen CL602 6'2)c-AIMP (2'27c-AIMP (2',3)c-AIMP.
NH NH Nn "N N- E ste LO 2 EO ". Ss Ag . + ox o A A nof-o Ss Nó Pa No vo eo > N. O io-P-sH o DE o Ps f " É Lo Pon > E? $ OR À PES Y v e CL655 CL6O4 CL6o9 c-AIMP(S) ; CdAMP-dIMP) ; C-(dAMP-2'FdIMP) ; não NÃo " NA E on EO to A e OO estro Io À o. E N > so > PETS so SA PÁ — õn o e o Lo-f-on N E” ES P GC loito E SS xo SS TX? o o 5 o cL614 CL656 CL647 C-(2'FAAMP-2'FAdIMP) CA2'FAAMP(S)-2'FAIMP(S)] (27,3)c(AMP-2'FdIMP) o NH o NA, O Em For SE, tb o o 2 o 2 o. tetos IO a eo > r A AA tt [> Co oo HeNS ANSA o opor NANA o opor “ e 2 2 eso TE EA AE? º mi LA Y o CcL626 CL629 CL603 extitFamP) f e-xti(2'FaGMP) ; C-2'FAGMP-2'FdAMP) '
Nº Ne. x A AN EX o EO o Fo o Esbos QN Hs-Pom NON sor > Fo k 7 e 6 > ER a > For dt Na Cop-s o BN NAO Co-P-sh HANNA otra TS o mo REA SB mA A d 5 CcL632 CcL633 CL659 c-[2'FdGMP(S)-2'FdAMP(S)] c-[2'FAGMP(S)-2'FdAMP(S))(POM): Cc-[2'FdAMP(S)-2'FdIMP(S))(POM); e um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0046] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular associa- da ao agonista de STING exibe uma ou mais das seguintes caracterís- ticas: (i) ativa células dendríticas, por exemplo, células dendríticas mi- eloides; (ii) ativa as células de monócitos em um grau menor do que o agonista de STING sozinho ("agonista de STING livre"); (iii) não ativa células de monócitos; (iv) tem um índice terapêutico mais amplo em comparação com o agonista de STING livre; (v) tem menos toxicidade sistêmica do que o agonista de STING livre; (vi) tem menos morte de células imunes do que o agonista de STING livre; (vii) tem maior sele- tividade celular do que o agonista de STING livre; (viii) fornece imuni- dade protetora do tumor em uma dose mais baixa do que o agonista de STING livre; (ix) induz uma resposta celular específica in vivo em células apresentadoras de antígeno, por exemplo, células dendríticas; (x) é capaz de induzir uma resposta imune em uma região distal após uma administração local; e (xi) é capaz de ser dosada em um nível mais baixo do que o agonista de STING livre.
[0047] Em algumas modalidades, a vesícula extracelular associa- da ao agonista de STING, quando administrada em um mamífero, não esgota as células T e/ou macrófagos no mamífero. Em outras modali- dades, a vesícula extracelular associada ao agonista de STING, quan- do administrada em um mamífero, esgota as células T e/ou macrófa- gos no mamífero em um grau menor do que o agonista de STING livre.
[0048] É divulgado neste documento uma composição farmacêuti- ca compreendendo uma composição (por exemplo, que compreende uma vesícula extracelular descrita neste documento) e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0049] É divulgado neste documento um Kkit que compreende uma composição (por exemplo, que compreende uma vesícula extracelular descrita neste documento) e instruções de uso.
[0050] Também é fornecido neste documento um método de pro- dução de uma vesícula extracelular (EV) (por exemplo, exossomo) que compreende um agonista de STING, sendo que o método compreen- de: (a) obter um EV, por exemplo, exossomo; (b) misturar o EV, por exemplo, exossomo, com um agonista de STING em uma solução; (c) incubar a mistura do EV, por exemplo, exossomo, e o agonista de STING em uma solução compreendendo um tampão sob condições adequadas; e (d) purificar o EV, por exemplo, exossomo, compreen- dendo o agonista de STING.
[0051] Em algumas modalidades, as condições adequadas com- preendem incubar a EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING por cerca de 2-24 horas. Em certas modalidades, as condições adequadas compreendem incubar a EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING a cerca de 15-90ºC. Em algumas modalidades, as condições adequadas compreendem incubar a EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING por cerca de 37ºC.
[0052] Em algumas modalidades, a quantidade do agonista de STING na etapa de mistura compreende pelo menos 0,01 mM a 100 MM. Em certas modalidades, a quantidade do agonista de STING na etapa de mistura compreende pelo menos 1 mM a 10 mM. Em modali- dades adicionais, a quantidade do exossomo na etapa de mistura compreende pelo menos cerca de 10º a pelo menos cerca de 10º par- tículas totais. Em algumas modalidades, a quantidade de EV, por exemplo, exossomo na etapa de mistura compreende pelo menos cer- ca de 10"? partículas totais.
[0053] Em algumas modalidades, o tampão para produzir os EVs divulgados nestes documento, por exemplo, exossomos, compreende uma solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0054] Em algumas modalidades, a purificação dos EVs, por exemplo, exossomos, compreende uma ou mais etapas de centrifuga- ção. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de centrifugação são de cerca de 100.000 x g.
[0055] A presente descrição também fornece um método para in- duzir ou modular uma resposta imune e/ou uma resposta inflamatória em um sujeito com necessidade do mesmo, sendo que o método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade farmaceu- ticamente eficaz da composição ou composição farmacêutica divulga- da neste documento.
[0056] Também é fornecido um método de tratamento de um tu- mor em um sujeito com necessidade do mesmo, sendo que o método compreende administrar ao sujeito a composição ou a composição farmacêutica divulgada neste documento.
[0057] Em algumas modalidades, a administração induz ou modu- la a resposta imune e/ou a resposta inflamatória no sujeito. Em certas modalidades, a administração ativa as células dendríticas. Em algu- mas modalidades, a administração resulta em ativação de células de monócitos reduzida em comparação com o agonista de STING livre. Em modalidades adicionais, a administração não induz a ativação de células de monócitos. Em algumas modalidades, a administração in- duz a produção de interferon-B (IFN-B). Em algumas modalidades, a administração resulta em inflamação sistêmica reduzida em compara- ção com o agonista de STING livre. Em algumas modalidades, a ad- ministração resulta em quantidades insubstanciais de inflamação sis- têmica.
[0058] Em algumas modalidades, a administração é parenteral,
oral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou por meio de qualquer outra via de administração apropriada. Em certas modalidades, a administração é intravenosa.
[0059] Em algumas modalidades, a resposta imune (por exemplo, que pode ser induzida ou modulada pela administração de uma com- posição ou composição farmacêutica divulgada neste documento) é uma resposta imune antitumoral.
[0060] Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, di- vulgada neste documento) está em uma quantidade suficiente para induzir IFN-B e/ou para ativar células dendríticas. Em algumas modali- dades, a composição é administrada por via intratumoral em um pri- meiro tumor em um local, e em que a composição administrada no primeiro tumor impede a metástase de um ou mais tumores em um segundo local.
[0061] Em algumas modalidades, o método de induzir ou modular uma resposta imune e/ou uma resposta inflamatória em um sujeito, ou o método de tratamento de um tumor em um sujeito, sendo que o mé- todo compreende adicionalmente a administração de um agente tera- pêutico adicional. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicio- nal é um agente imunomodulador. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
[0062] Em algumas modalidades, a administração da composição ou composição farmacêutica divulgada neste documento impede a metástase do tumor no sujeito.
MODALIDADES
[0063] Modalidade 1. Uma composição compreendendo uma vesí- cula extracelular e um estimulador de agonista da proteína dos genes do interferon (STING).
[0064] Modalidade 2. A composição da Modalidade 1, em que a vesícula extracelular é um exossomo, uma nanovesícula, um corpo apoptótico, uma microvesícula, um lisossoma, um endossomo, um |i- possoma, uma nanopartícula lipídica, uma micela, uma estrutura multi- lamelar, uma vesícula revesiculada ou uma célula extrudada.
[0065] Modalidade 3. A composição da Modalidade 2, em que a vesícula extracelular é um exossomo.
[0066] Modalidade 4. A composição de qualquer uma das Modali- dades acima, em que o agonista de STING está associado ao exos- somo.
[0067] Modalidade 5. A composição de qualquer uma das Modali- dades acima, em que o agonista de STING está associado a uma bi- camada lipídica do exossomo ou encapsulado dentro do exossomo.
[0068] Modalidade 6. A composição de qualquer uma das Modali- dades acima, em que o exossomo superexpressa a proteína PTGFRN.
[0069] Modalidade 7. A composição de qualquer uma das Modali- dades acima, em que o exossomo é produzido por uma célula que su- perexpressa PTGFRN.
[0070] Modalidade 8. A composição de qualquer uma das Modali- dades acima, em que o exossomo é um glicano modificado.
[0071] Modalidade 9. A composição da Modalidade 8, em que a modificação com glicano compreende uma modificação enzimática ou química.
[0072] Modalidade 10. A composição de qualquer uma das Moda- lidades 1-8, em que o exossomo é derivado de uma célula produtora modificada com glicano.
[0073] A composição da Modalidade 10, em que a modificação com glicano da célula produtora compreende uma modificação enzi- mática ou química.
[0074] Modalidade 12. A composição da Modalidade 10, em que a modificação com glicano da célula produtora compreende o tratamento com kifunensina.
[0075] Modalidade 13. A composição da Modalidade 10, em que a modificação de glicano da célula produtora compreende o nocaute de um gene de sialiltransferase ou citidililtransferase.
[0076] Modalidade 14. A composição da Modalidade 13, em que a modificação com glicano da célula produtora compreende o nocaute de CRISPR de um gene de sialiltransferase ou citidililtransferase.
[0077] Modalidade 15. A composição da Modalidade 13 ou 14, em que o referido gene é Monofosfato de Citidina N-Acetilneuramínico Sintetase (CMAS).
[0078] Modalidade 16. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo é dessialilado.
[0079] Modalidade 17. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo é desdglicosilado.
[0080] Modalidade 18. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo que superexpressa PTGFRN é um exossomo modificado com glicano.
[0081] Modalidade 19. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo superexpressando PTGFRN é dessialilado.
[0082] Modalidade 20. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo que superexpressa PTGFRN é desglicosilado.
[0083] Modalidade 21. A composição de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que o exossomo ou célula produtora é desglico- silado ou dessialilado em cerca de ou mais de 95%, 90-95%, 85-90%, 80-85%, 75-80%, 70-75%, 65-70%, 60-65%, 50-60%, 40-50%, 30- 40%, 20-30%, 10-20% ou 0-10%.
[0084] Modalidade 22. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo compreende adicionalmente uma proteína que se liga a ou reage enzimaticamente com um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinucleo- tídeo não cíclico.
[0085] Modalidade 23. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o exossomo compreende adicionalmente um exossomo que expressa um ligante, uma citocina ou um anticorpo.
[0086] Modalidade 24. A composição da Modalidade 23, em que o ligante compreende CD40L, OX40L ou CD27L.
[0087] Modalidade 25. A composição da Modalidade 23, em que a citocina compreende IL-7, IL-12 ou IL-15.
[0088] Modalidade 26. A composição da Modalidade 23, em que o anticorpo compreende um anticorpo antagonista ou um anticorpo ago- nístico.
[0089] Modalidade 27. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o agonista de STING compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinu- cleotídeo não cíclico.
[0090] Modalidade 28. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que o agonista de STING compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinu- cleotídeo não cíclico compreendendo um marcador de ligação a lipí- deos.
[0091] Modalidade 29. A composição de qualquer uma das moda- lidades acima, em que o agonista de STING compreende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico ou um agonista de STING de dinu- cleotídeo não cíclico, que é fisica ou quimicamente modificado, sendo que as modificações compreendem a alteração da polaridade ou carga do agonista.
[0092] Modalidade 30. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que a concentração do agonista de STING associa- do ao exossomo é de cerca de 0,01 uM a 100 uM.
[0093] Modalidade 31. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que a concentração do agonista de STING associa- do ao exossomo é de cerca de 0,01 uM a 0,1 uM, 0,1 uM a 1 UM, 1 UM a 10 uM, 10 uM a 50 uM ou 50 uM a 100 uM.
[0094] Modalidade 32. A composição de qualquer uma das Moda- lidades acima, em que a concentração do agonista de STING associa- do ao exossomo é de cerca de 1 uM a 10 uM.
[0095] Modalidade 33. Um kit que compreende a composição de qualquer uma das modalidades e instruções de uso acima.
[0096] Modalidade 34. Método de produção de um exossomo que compreende um agonista de STING, sendo que o método compreen- de: a. Obtenção de um exossomo; b. Misturar o referido exossomo com um agonista de STING em uma solução; c. Incubar a mistura do exossomo e do agonista de STING em uma solução compreendendo um tampão; e d. Purificar o exossomo que compreende o agonista de STING.
[0097] Modalidade 35. O método da Modalidade 34, em que a eta- pa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING por cerca de 2-24 horas.
[0098] Modalidade 36. O método da Modalidade 34, em que a eta- pa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING por cerca de 6-12 horas.
[0099] Modalidade 37. O método da Modalidade 34, em que a eta- pa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de
STING por cerca de 12-20 horas.
[00100] “Modalidade 38. O método da Modalidade 34, em que a eta- pa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING por cerca de 14-18 horas.
[00101] “Modalidade 39. O método da Modalidade 34, em que a eta- pa de incubação compreende incubar o exossomo e o agonista de STING por cerca de 16 horas.
[00102] “Modalidade 40. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-39, em que a etapa de incubação compreende incubar o exos- somo e o agonista de STING a cerca de 15-90ºC.
[00103] Modalidade 41. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-39, em que a etapa de incubação compreende incubar o exos- somo e o agonista de STING a cerca de 37ºC.
[00104] “Modalidade 42. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-39, em que a etapa de incubação compreende incubar o exos- somo e o agonista de STING a cerca de 15-30ºC.
[00105] “Modalidade 43. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-39, em que a etapa de incubação compreende incubar o exos- somo e o agonista de STING a cerca de 30-50ºC.
[00106] Modalidade 44. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-39, em que a etapa de incubação compreende incubar o exos- somo e o agonista de STING a cerca de 50-90ºC.
[00107] “Modalidade 45. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-44, em que a etapa de incubação compreende pelo menos o agonista de STING de 0,01 mM a 100 mM.
[00108] Modalidade 46. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-44, em que a etapa de incubação compreende pelo menos o agonista de STING de 1 mM a 10 mM.
[00109] “Modalidade 47. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-46, em que a etapa de incubação compreende pelo menos cerca de 108 a pelo menos cerca de 1016 partículas totais de exos- somos purificados.
[00110] Modalidade 48. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-46, em que a etapa de incubação compreende pelo menos cerca de 1012 partículas totais de exossomos purificados.
[00111] Modalidade 49. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-47, em que o tampão compreende uma solução salina tampo- nada com fosfato (PBS).
[00112] “Modalidade 50. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-49, em que a etapa de purificação compreende cromatografia por exclusão de tamanho ou cromatografia iônica.
[00113] Modalidade 51. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-50, em que a etapa de purificação compreende a cromatografia por troca aniônica.
[00114] Modalidade 52. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-51, em que a etapa de purificação compreende dessalinização, diálise, filtração de fluxo tangencial, ultrafiltração ou diafiltração.
[00115] “Modalidade 53. O método de qualquer uma das Modalida- des 34-49, em que a etapa de purificação compreende uma ou mais etapas de centrifugação.
[00116] Modalidade 54. O método da Modalidade 53, em que a eta- pa de purificação compreende uma ou mais etapas de centrifugação a cerca de 100.000 x g.
[00117] “Modalidade 55. Também são fornecidos neste documento métodos de indução ou modulação de uma resposta imune ou inflama- tória em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito em necessidade de uma quantidade farmaceuticamente efi- caz de uma composição que compreende um exossomo, que compre- ende um agonista de STING, induzindo ou modulando assim a respos- ta imune ou inflamatória no sujeito.
[00118] Modalidade 56.O método da Modalidade 55, em que o mé- todo ativa células dendríticas.
[00119] “Modalidade 57. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-56, em que o método ativa células dendríticas mieloides.
[00120] Modalidade 58. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-57, em que o método resulta em ativação de células de monó- citos reduzida em comparação com a administração de níveis seme- lhantes ou idênticos do agonista de STING livre.
[00121] “Modalidade 59. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-58, em que o método não induz a ativação de células de mo- nócitos.
[00122] “Modalidade 60. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-59, em que o método induz a produção de interferon-B (IFN-B).
[00123] “Modalidade 61. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-60, em que o método resulta em inflamação sistêmica reduzida em comparação com a administração de níveis semelhantes ou idênti- cos do agonista de STING livre.
[00124] “Modalidade 62. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-60, em que o método resulta em quantidades insubstanciais de inflamação sistêmica.
[00125] “Modalidade 63. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-62, em que a administração é parenteral, oral, intravenosa, in- tramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou através de qualquer outra via de administração apropriada.
[00126] Modalidade 64. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-63, em que a administração é intravenosa.
[00127] “Modalidade 65. O método de qualquer uma das Modalida- des 55-64, em que a resposta imune é uma resposta antitumoral.
[00128] Modalidade 66. Também são fornecidos neste documento métodos de indução ou modulação de uma resposta imune ou inflama-
tória em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito em necessidade de uma composição compreendendo um exossomo, que compreende um agonista de STING, em uma quanti- dade suficiente para induzir IFN- B ou ativar células dendríticas, indu- zindo ou modulando assim a resposta imune ou inflamatória no sujeito.
[00129] “Modalidade 67. O método da Modalidade 66, em que o mé- todo ativa células dendríticas mieloides.
[00130] Modalidade 68. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-67, em que o método resulta em ativação de células de monó- citos reduzida em comparação com a administração de níveis seme- lhantes ou idênticos do agonista de STING livre.
[00131] “Modalidade 69. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-67, em que o método não induz a ativação de células de mo- nócitos.
[00132] “Modalidade 70. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-69, em que o método resulta em inflamação sistêmica reduzida em comparação com a administração de níveis semelhantes ou idênti- cos de agonista de STING livre.
[00133] Modalidade 71. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-69, em que o método não induz a inflamação sistêmica signifi- cativa.
[00134] Modalidade 72. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-71, em que a administração é parenteral, oral, intravenosa, in- tramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou através de qualquer outra via de administração apropriada.
[00135] “Modalidade 73. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-71, em que a administração é intravenosa.
[00136] Modalidade 74. O método de qualquer uma das Modalida- des 66-73, em que a resposta imune é uma resposta antitumoral.
[00137] “Modalidade 75. Em outro aspecto, também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de câncer em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito em ne- cessidade de uma composição que compreende uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um exossomo, que compreende um agornista de STING, induzindo ou modulando assim um resposta imune antitu- moral no sujeito.
[00138] Modalidade ?76.O método da Modalidade 75, em que o mé- todo induz a produção de interferon-B (IFN-B).
[00139] “Modalidade 77.O método da Modalidade 75 ou 76, em que a administração é parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, intratu- moral, intraperitoneal ou através de qualquer outra via de administra- ção apropriada.
[00140] “Modalidade 78. O método de qualquer uma das Modalida- des 75-77, compreendendo adicionalmente a administração de um agente terapêutico adicional.
[00141] “Modalidade 79. O método de qualquer uma das Modalida- des 75-78, em que o agente terapêutico adicional é um agente imu- nomodulador.
[00142] “Modalidade 80. O método da Modalidade 79, em que o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00143] Modalidade 81. O método de qualquer uma das Modalida- des 80, em que o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
[00144] “Modalidade 82. Método de prevenção de metástases de câncer em um sujeito, sendo que o método compreende a administra- ção ao sujeito em necessidade de uma composição, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um exossomo compreen- dendo um agonista de STING.
[00145] “Modalidade 83. O método da Modalidade 81, em que a quantidade terapeuticamente eficaz do exossomo que compreende um agonista de STING é capaz de impedir que um ou mais tumores em um local no sujeito promovam o crescimento de um ou mais tumores em outro local no sujeito.
[00146] Modalidade 84. O método da Modalidade 82 ou 83, em que o método induz a produção de interferon-B (IFN-B).
[00147] “Modalidade 85. O método de qualquer uma das Modalida- des 81-84, em que a administração é parenteral, oral, intravenosa, in- tramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou através de qualquer outra via de administração apropriada.
[00148] Modalidade 86. O método de qualquer uma das Modalida- des 81-85, em que a composição é administrada intratumoralmente em um primeiro tumor em um local, e em que a composição adminis- trada no primeiro tumor previne de metástases de um ou mais tumores em um segundo local.
[00149] “Modalidade 87. O método de qualquer uma das Modalida- des 81-86, compreendendo adicionalmente a administração de um agente terapêutico adicional.
[00150] Modalidade 88. O método da Modalidade 87, em que o agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador.
[00151] “Modalidade 89. O método da Modalidade 88, em que o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00152] Modalidade 90. O método da Modalidade 89, em que o agente terapêutico adicional é um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00153] A Figura 1 mostra um diagrama do método de carregamen- to de exossomos com um agonista de STING.
[00154] A Figura 2 mostra uma comparação da resposta de IFNB em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) tratadas com o agonista de STING encapsulado em exossomo e o agonista de STING livre, conforme determinado por luminescência relativa (RLU).
[00155] A Figura3 mostra a comparação da ativação de monócitos em células tratadas com o agonista de STING encapsulado em exos- somo e o agonista de STING livre, conforme determinado pela intensi- dade de fluorescência média de CD86 (MFI).
[00156] A Figura 4 mostra a comparação da ativação de MDC em células tratadas com o agonista de STING encapsulado em exossomo e o agonista de STING livre, conforme determinado pela intensidade de fluorescência média de CD86 (MFI).
[00157] A Figura 5A mostra a ativação de MDC em amostras trata- das com o agonista de STING encapsulado em exossomo (Exo- STING) ou o agonista de STING livre, conforme determinado por colo- ração de CD86 e FIG. 5B mostra a ativação de monócitos em amos- tras tratadas com agonista de STING encapsulado em exossomo (Exo-STING) ou agonista de STING livre, conforme determinado por coloração de CD86.
[00158] As Figuras GA e 6B mostram a porcentagem de células po- sitivas para marcadores de ativação de diferentes populações de tipos de células (mMDC, pDC, monócitos, células NK, células T CD8 + e célu- las B) após o tratamento com um agonista de STING livre (Agonista de STING).
[00159] A Figura 7A mostra a porcentagem de células positivas pa- ra marcadores de ativação de diferentes populações de tipos de célu- las (mMDC, pDC, monócitos, células NK, células T CD8 + e células B)
após o tratamento com o agonista de STING livre (Agonista de STING). A Figura 7B mostra a porcentagem de células positivas para marcadores de ativação de diferentes populações de tipos de células (MDC, pDC, monócitos, células NK, células T CD8 + e células B) após o tratamento com um agonista de STING encapsulado em exossomo (exossomos de STING).
[00160] As Figuras 8A e 8B mostram uma resposta IFN-B depen- dente da dose nas PBMCs de dois doadores após o tratamento com agonista de STING livre, agonista de STING encapsulado em exosso- mo (STING Exo), ou agonista de STING encapsulado em glicano mo- dificado ou exossomos com superexpressão de proteína (deglicosila- dos [Degly], dessialilado [Desialyl], PTGFRN com superexpressão [PTGFRN], desglicosilado e PTGFRN com superexpressão [PTGFRN Degly] ou dessialilado e PTGFRN com superexpressão [PTGFRN De- sialy]).
[00161] A Figura 9 mostra uma comparação do ECso de produção de IFN-B para o agonista de STING livre e os agonistas de STING en- capsulados em exossomo testados na Figura 8.
[00162] As Figuras 10A e 10B mostram uma resposta de expressão de CD86 dependente da dose em monócitos a partir de dois doadores após o tratamento com agonista de STING livre, agonista de STING encapsulado em exossomo (STING Exo), ou agonista de STING en- capsulado em glicano modificado ou exossomos com superexpressão de proteína, como nas Figuras 8A e 8B.
[00163] A Figura 11 mostra uma comparação da ECso de ativação de monócitos para o agonista de STING livre e os agonistas de STING encapsulados em exossomo testados na Figura 10.
[00164] As Figuras 12A e 12B mostram uma resposta de expressão de CD86 dependente da dose em mDCs após o tratamento com ago- nista de STING livre, agonista de STING encapsulado em exossomo
(STING Exo) ou exossomos de agonista de STING encapsulados com glicano modificado ou com superexpressão de proteína, como nas Fi- gura 8A e 8B.
[00165] —AFigura 13 mostra a comparação da ativação de MDC ECso para o agonista de STING livre e os agonistas de STING encapsula- dos em exossomo testados na Figura 12.
[00166] A Figura 14 mostra uma quantificação da concentração do agonista de STING em exossomos.
[00167] As Figuras 15A e 15B mostram uma resposta de IFNB de- pendente da dose em duas amostras de doadores diferentes após o tratamento com exossomos tratados com kifunensina (Exo + Kif) ou exossomos não tratados (Exo) com ou sem agonista de STING encap- sulado.
[00168] As Figuras 16A e 16B mostram uma ativação dependente da dose de monócitos, conforme medida pelo sinal de CD86 em duas amostras de doadores diferentes após o tratamento com exossomos tratados com kifunensina (Exo + Kif) ou exossomos não tratados (Exo) com ou sem agonista de STING encapsulado.
[00169] As Figuras 17A e 17B mostram uma ativação dependente da dose de mDCs, conforme medido pelo sinal de CD86 em duas amostras de doadores diferentes após o tratamento com exossomos tratados com kifunensina (Exo + Kif) ou exossomos não tratados (Exo) com ou sem agonista de STING encapsulado.
[00170] As Figuras 18A e 18B mostram uma resposta de IFNB de- pendente da dose em duas amostras de doadores diferentes após o tratamento com exossomos que foram incubados com agonista de STING por diferentes quantidades de tempo (2h, 6h, durante a noite (O/N)) ou nenhum agonista de STING (exo).
[00171] A Figura 19 mostra uma resposta de IFNB dependente da dose nas PBMCs humanas tratadas com dois agonistas de STING en-
capsulados em exossomo diferentes e agonistas de STING livres (ML RR-S2 CDA e 3-3 cAIMPAdFSH), conforme determinado por lumines- cência relativa (RLU).
[00172] As Figuras 20A-20D mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9, CXCL10 e IFN-y, respectivamente) no tumor de camundongos portadores de tumor B16F10, após uma única inje- ção intratumoral de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exos- somo.
[00173] As Figuras 21A-21C mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no linfonodo de drenagem de camundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 pg de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo.
[00174] As Figuras 22A-22C mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no baço de ca- mundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção in- tratumoral de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR- S2 CDA livre, ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exosso- mo.
[00175] As Figuras 23A-23E mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, TNF-a, IL-6, MCP-1 e IFN-y, respectivamente) no soro de camundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo.
[00176] As Figuras 24A-24D mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9, CXCL10 e IFN-y, respectivamente) no tumor de camundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intratumoral de PBS, 20pug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, 0,2ug de 3-3
CAIMPdAFSH livre ou 0,2ug 3-3 cAIMPAFSH encapsulado em exosso- mo.
[00177] As Figuras 25A-25D mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9, CXCL10 e IFN-y, respectivamente) no linfo- nodo de drenagem de camundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug de 3-3 cAIMP- dFSH livre, 0,2 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, ou 0,2 ug de 3-3 cAIMP- dFSH encapsulado em exossomo.
[00178] As Figuras 26A-26D mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9, CXCL10 e IFN-y, respectivamente) no tumor de camundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intratumoral de PBS, 20pug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, 0,2ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre ou 0,2ug de 3-3 cAIMPAFSH encapsulado em exos- somo.
[00179] As Figuras 27A-27D mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, TNF-a, IL-6 e MCP-1, respectivamente) no soro de camundongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intratumoral de PBS, 20pug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, 0,2ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre ou 0,2ug de 3-3 cAIMPAFSH encapsulado em exos- somo.
[00180] As Figuras 28A-C mostram os perfis de expressão de cito- cinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no tumor de camun- dongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intraperi- toneal de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo, ou uma única injeção intratumoral de 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsu- lado em exossomo.
[00181] As Figuras 29A-C mostram perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no pâncreas de camun- dongos portadores de tumor B16F10 após uma única injeção intraperi-
toneal de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo, ou uma única injeção intratumoral de 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsu- lado em exossomo.
[00182] As Figuras 30A-30C mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no baço de ca- mundongos portadores detumor B16F10 após uma única injeção intra- peritoneal de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR- S2 CDA livre, ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exosso- mo, ou uma única injeção intratumoral de 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo.
[00183] As Figuras 31A-31C mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no pulmão de camundongos naive após uma única injeção intraperitoneal de PBS, ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo ou um número igual de EeXOssomos.
[00184] As Figuras 32A-32C mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no pulmão de camundongos naive após uma única injeção intraperitoneal de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo ou um número igual de EeXOssomos.
[00185] As Figuras 33A-33C mostram os perfis de expressão de citocinas (IFNB, CXCL9 e CXCL10, respectivamente) no pulmão de camundongos naive após uma única injeção intraperitoneal de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo ou um número igual de EeXOssomos.
[00186] As Figuras 34A-34G mostram os perfis de expressão de citocinas (IFN-B, IFN-y, TNF-a, IL-6, MCP-1, IL-1a e I1L-27, respectiva- mente) no soro de camundongos naive, após uma única injeção intra- peritoneal de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR- S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo ou um número igual de exossomos.
[00187] A Figura 35 mostra os perfis de ativação de células imunes no peritônio 24 horas após uma única injeção intraperitoneal de PBS, ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo.
[00188] A Figura 36 mostra os perfis de ativação de células imunes no baço 24 horas após uma única injeção intraperitoneal de PBS, 20 pg de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo.
[00189] A Figura37A mostra as curvas de crescimento de tumor em camundongos portadores de tumor B16F10 ao longo do estudo des- crito no Exemplo 9 (isto é, um estudo de injeção intratumoral compa- rando a eficácia de PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exosso- mo). As Figuras 37B-37E mostram as curvas de crescimento do tumor para cada animal nos diferentes grupos (ou seja, PBS, agonista de STING (20 ug), agonista de STING (0,2 ug) e agonista de Exo STING (0,2 ug), respectivamente).
[00190] A Figura 38A mostra as curvas de crescimento do tumor em camundongos portadores de tumor B16F10 previamente tratados com agonistas de STING, como descrito na Figura 37A, após uma re- exposição com uma segunda inoculação de células tumorais. A Figura 38B mostra as curvas de crescimento do tumor para cada animal nos diferentes grupos. A Figura 38C mostra a viabilidade dos animais no estudo descrito na Figura 37A.
[00191] A Figura 39 mostra as curvas de crescimento do tumor du-
rante o curso do estudo descrito no Exemplo 10 (um estudo de titula- ção de dose de injeção intratumoral comparando a eficácia de 8ng, 40ng e 200ng de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo em ca- mundongos portadores de tumor B16F10).
[00192] As Figuras 40A-40D mostram as curvas de crescimento do tumor para cada animal nos diferentes grupos descritos na Figura 39 (ou seja, PBS, agonista de Exo STING (8 ng), agonista de Exo STING (40 ng) e agonista de Exo STING (200 ng), respectivamente).
[00193] As Figuras 41A-41E mostram um plano experimental e os resultados de um experimento de indução de células T específico para antígenos usando ovalbumina como o antígeno em camundongos naive injetados com 200 ug de ovalbumina misturada com PBS, 20 ug de ML RR-S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo. As porcentagens de célu- las T reativas à ovalbumina e o número de esplenócitos produtores de IFN-y foram medidas.
[00194] A Figura 42 mostra as curvas de crescimento do tumor du- rante o curso do estudo descrito no Exemplo 12 (isto é, um estudo de injeção intratumoral comparando efeitos antitumorigênicos e indução de resposta de memória imune em camundongos portadores de tumor E.G7-OVA tratados com PBS, 20 ug de ML livre RR-S2 CDA, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA encapsulado em exossomo).
[00195] As Figuras 43A-43D mostram as curvas de crescimento do tumor para cada animal nos diferentes grupos (ou seja, PBS, agonista de STING (20 ug), agonista de STING (0,2 ug) e agonista de Exo STING (0,2 ug), respectivamente). A Figura 43E mostra a porcenta- gem de células T de memória reativas à ovalbumina isoladas a partir dos baços dos animais em cada grupo.
[00196] As Figuras 44A-44B mostram a potência do agonista de
STING carregado em exossomos nativos ou exossomos com superex- pressão de PTGFRN em PBMCs preparados de fresco (Figura 44A) ou congelados a -80ºC por sete dias (Figura 44B). A potência é medi- da pela produção de IFNBE. A Figura 44C mostra a redução na potência de STING carregada em exossomos nativos ou exossomos com supe- rexpressão de PTGFRN, após armazenamento a -80ºC por sete dias em comparação com exossomos preparados de fresco.
[00197] A Figura 45A-45D mostra a retenção da cinética de absor- ção em exossomos com superexpressão de PTGFRN após armaze- namento a -80ºC por sete dias em comparação com exossomos pre- parados recentemente. As Figuras 45A e 45B mostram os resultados para exossomos preparados de fresco de dois doadores separados (doadores 1 e 2, respectivamente). As Figuras 45C e 45D mostram os resultados para os exossomos após o armazenamento a partir de dois doadores separados (doadores 5 e 6, respectivamente).
[00198] A Figura 46A mostra as curvas de crescimento do tumor durante o curso do estudo descrito no Exemplo 14 (isto é, um estudo de injeção intratumoral seguido por exposição de metástase pulmonar comparando os efeitos antitumorigênicos em camundongos portadores de tumor B16F10 tratados com PBS, doses altas ou baixas de 3-3 CAIMPdAFSH livre, ou uma das três doses de 3-3 cCAIMPdAdFSH carrega- das em exossomos com superexpressão de PTGFRN). A Figura 46B mostra imagens de pulmões representativos de animais em cada gru- po após a conclusão do estudo.
[00199] A Figura 47 é uma quantificação microscópica de metásta- ses pulmonares dos animais no estudo mostrado nas Figuras 46A e 46B.
[00200] A Figura 48 é uma quantificação histológica de metástases pulmonares dos animais no estudo mostrado nas Figuras. 46A e 46B.
[00201] A Figura 49A mostra as curvas de crescimento do tumor durante o curso do estudo de bloqueio do checkpoint descrito no Exemplo 15 (isto é, um estudo de injeção intratumoral em combinação com a inibição do checkpoint imune sistêmico (tratamento com um an- ticorpo anti-PD-1) em camundongos portadores detumor B16F10 tra- tados com três doses de 30ng de ML RR-S2 CDA carregadas em exossomos com superexpressão de PTGFRN). A Figura 49B mostra as curvas de crescimento do tumor durante o curso do estudo de de- pleção de células T descrito no Exemplo 15 (isto é, um estudo de inje- ção intratumoral em combinação com depleção de células T (tratamen- to com um anticorpo anti-CD-8) em camundongos portadores de tumor B16F10 tratados com três doses de 100 ng de 3-3 cAIMPdAdFSH carre- gados em exossomos com superexpressão de PTGFRN). A Figura 49C mostra os resultados de ELISPOT a partit do estudo descrito no Exemplo 15 (ou seja, um estudo de injeção intratumoral em combina- ção em camundongos portadores de tumor B16F10 tratados com três injeções de ML RR-S2 CDA livre de dose alta ou baixa, ou ML RR-S2 CDA de dose baixa carregado em exossomos com superexpressão de PTGFRN, seguido por ELISPOT específico de células tumorais para medir a reatividade das células T em relação aos antígenos tumorais).
[00202] A Figura 50A mostra uma comparação da resposta de IFNB em PBMCs tratados com 3-3 cAIMPdFSH, 3-3 cAIMPAFSH encapsu- lado em exossomo de tipo selvagem, exossomos com superexpressão de PTGFRN ou exossomos de nocaute PTGFRN, conforme determi- nado por luminescência relativa (RLU). A Figura 50B mostra uma comparação do sinal máximo de IFNB a partir de PBMCs tratados com os exossomos na Figura 50A. A Figura 50C mostra curvas de cresci- mento de tumores de melanoma B16F10 implantados por via subcutã- nea em camundongos após três injeções intratumorais (dias 6, 9 e 12 pós-implantação) de PBS ou 20ng de 3-3 cAIMPdFSH carregado em exossomos de tipo selvagem, PTGFRN com superexpressão de exos-
somos ou exossomos de nocaute PTGFRN.
[00203] A Figura 51A mostra a população percentual positiva de diferentes classes de linfócitos infiltrantes de tumor isolados a partir de tumores subcutâneos injetados com exossomos marcados com Alexa Fluor "Y 488. A Figura 51B mostra a população relativa de células T CDB8* isoladas de tumores subcutâneos injetados com PBS, 200 ng de ML RR-S2 CDA carregados em exossomos com superexpressão de PTGFRN (EXOSTING Tv), 200 ng de ML RR-S2 CDA ou 20 ug de ML RR-S2 CDA. A Figura 51C mostra a população relativa de macrófagos isolados a partir de tumores subcutâneos injetados com PBS, 200 ng de ML RR-S2 CDA carregado em exossomos com superexpressão de PTGFRN (EXOSTING Tv), 200 ng de ML RR-S2 CDA ou 20 ug de ML RR-S2 CDA.A Figura 51D mostra a população relativa de células den- dríticas isoladas de tumores subcutâneos injetados com PBS, 200 ng de ML RR-S2 CDA carregado em exossomos com superexpressão de PTGFRN (EXOSTING Tv), 200 ng de ML RR-S2 CDA ou 20 ug de ML RR-S2 CDA.
[00204] As Figuras 52A-52D mostram resultados de imagem quanti- tativos de transcritos de IFNB (Figura 52A) ou proteína caspase 3 cli- vada (Figura 52B) em células de sarcoma murino injetadas diretamen- te com microdoses de ML RR-S2 CDA livre ou os exossomos indica- dos, com ou sem ML RR -S2 CDA. A Figura 52C-D mostra a análise de resposta radial detranscritos de IFNB (Figura 52C) ou CXCL10 (Fi- gura 52D) após injetados com microdoses de 3-3 cAIMPdFSH livre ou exossomos carregados com 3-3 cAIMPdAdaFSH.
[00205] As Figuras 53A-53G mostram uma comparação da respos- ta de IFNB em células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) tratadas com agonista de STING encapsulado em exossomo e agonis- ta de STING livre, conforme determinado por luminescência relativa (RLU). A Figura 53A mostra os resultados para os exossomos carre-
gados com agonistas de STING ML RR-S2 CDA ("ExoML RR-S2") ou 2-3 cCGAMP ("Exo2-3 cCGAMP"). Os agonistas de STING livres corres- pondentes são indicados como "ML RR-S2 Livre" e "2-3 cCGAMP Livre", respectivamente. A Figura 53B mostra os resultados para exossomos carregados com agonistas de STING 3-3 cAIMPAFSH ("exo3-3 CAIMPdAFSH") ou 3-3 cAIM (PS) 2 ("exo3-3 cAIM (PS) 2"). "3-3 cAIMP- dFSH Livre " e "3-3 cAIM(PS)2 Livre" representam a forma livre dos agonistas correspondentes, respectivamente. A Figura 53C mostra os resultados para exossomos carregados com 3-3 cAIMP ("exo3-3 CAIMP") e 3-3 cAIMPdAF ("exo3-3 cAIMPdF"). Os agonistas de STING livres correspondentes são mostrados como "3-3 cAIMP Livre " e "3-3 CAIMPdF Livre ", respectivamente. A Figura 53D mostra os resultados para o exossomo carregado com o agonista de STING 3-3 cAIMPm- FSH ("exo3-3 cAIMPmMFSH") e o agonista de STING livre 3-3 cAIMPm- FSH ("Livre 3-3 cCAIMPmMFSH"). A Figura 53E mostra os resultados para o exossomo carregado com o agonista de STING CP214 ("Exo-CP214"; diamante aberto) e o agonista de STING livre CP204 ("CP214"; diamante fechado). A Figura 53F mostra os resultados para o exossomo carregado com o agonista de STING CP201 ("Exo-CP201"; quadrado aberto) e a forma livre do agonista de STING CP201 ("CP201"; quadrado fechado). A Figura 53G mostra os resultados para o exossomo carregado com o agonista de STING CP204 ("Exo-CP204'"; triângulo aberto) e o agonis- ta de STING livre CP204 ("CP204"; triângulo fechado). O 3-3 cAIMP- dFSH, 3-3 cAIM (PS) 2, cCAIMPdF, cAIMP são correspondidos ao com- posto 53, 13, 52 e 51 de um artigo (J Med Chem. 2016 Nov 23; 59 (22): 10253-10267), respectivamente. O CP214 é 2-3 cCAMPmFSH. O CP201 e o CP204 são análogos dos compostos das patentes WO?2017/175156 e WO2017/175147, respectivamente.
[00206] As Figuras 54A-54C mostram os perfis de expressão de IFNB em tecidos (tumor, linfonodo de drenagem e baço, respectiva-
mente) de camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 (bar- ras preenchidas) ou camundongosC57BL/6-Tmem4173º*! (barras vazias) após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug de 3-3 cAIMP- dFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cCAIMPAdFSH encapsulado em exossomo.
[00207] As Figuras 55A-55C mostram os perfis de expressão de CXCL9 em tecidos (tumor, linfonodo de drenagem e baço, respectiva- mente) de camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 (bar- ras preenchidas) ou camundongos C57BL /6-Tmem173º' (barras vazi- as) após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug de 3-3 cAIMP- dFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cCAIMPAdFSH encapsulado em exossomo.
[00208] As Figuras 56A-56C mostram perfis de expressão de CXCL10 em tecidos (tumor, linfonodo de drenagem e baço, respecti- vamente) de camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 (barras preenchidas) ou camundongos C57BL /6-Tmem173º' (barras vazias) após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cCAIMPAFSH encapsulado em exos- somo.
[00209] As Figuras 57A-57C mostram os perfis de expressão de IFN-y em tecidos (tumor, linfonodo de drenagem e baço, respectiva- mente) de camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 (bar- ras preenchidas) ou camundongos C57BL/6-Tmem173*% (barras vazi- as) após um único injeção intratumoral de PBS, 20 ug de 3-3 cAIMP- dFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cCAIMPAdFSH encapsulado em exossomo.
[00210] As Figuras 58A-58D mostram os perfis de expressão de citocinas séricas (IFN-B, TNF-a, IL-6 e MCP-1, respectivamente) em camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 (barras preen- chidas) ou camundongos C57BL/6-Tmem173º' (barras vazias) após uma única injeção intratumoral de PBS, 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cCAIMPdFSH encapsulado em exossomo.
[00211] A Figura 59 mostra as curvas de crescimento do tumor em camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 ou camundon- gosC57BL/6-Tmem173º! ao longo do estudo descrito no Exemplo 20 (isto é, um estudo de injeção intratumoral comparando a eficácia de PBS, 20 ug 3-3 cAIMPdFSH livre, 0,2 ug de 3-3 cCAIMPAdFSH encapsu- lado em exossomo em camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10 ou camundongosC57BL/ 6-Tmem 173º).
[00212] A Figura 60 mostra as curvas de crescimento do tumor em camundongos portadores de tumor B16F10 ao longo do estudo des- crito no Exemplo 21.
[00213] As Figuras 61A-61E mostram as curvas de crescimento do tumor para cada animal nos diferentes grupos mostrados na Figura 60 e Exemplo 21. Os diferentes grupos incluem: exossomos (Figura 61A), exoSTING (0,1 ug) (Figura 61B), exoSTING (0,3 ug) (Figura 61C), agonista de STING (30 ug) (Figura 61D) e agonista de STING ( 0,3 ug) (Figura 67E).
[00214] A Figura 62 mostra curvas de crescimento tumoral em ca- mundongos BALB/c portadores de tumor CT26.CT25 ao longo do es- tudo descrito no Exemplo 22.
[00215] A Figura 63 mostra curvas de crescimento tumoral em ca- mundongos BALB/c portadores de tumor CT26.wt ao longo do estudo descrito no Exemplo 22.
[00216] A Figura 64 mostra as curvas de crescimento tumoral do tumor B16F10 injetado ao longo do estudo descrito no Exemplo 23.
[00217] A Figura 65 mostra as curvas de crescimento tumoral do tumor B16F10 contralateral, que não foi injetado, ao longo do estudo descrito no Exemplo 23.
[00218] A Figura 66 mostra uma farmacocinética tumoral de 3-3 CAIMPAFSH após injeção intratumoral de 30 ug de 3-3 cAIMPAFSH livre, 0,2 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre e 0,2 ug de 3-3 cAIMPdAdFSH en- capsulado em exossomo no tumor B16F10. A tabela mostra a meia-
vida de cada amostra.
[00219] A Figura67 mostra uma farmacocinética plasmática de 3-3 CAIMPAFSH após injeção intravenosa de 20 ug de 3-3 cAIMPAFSH livre em camundongos C57BL/6 naive.
[00220] A Figura 68 mostra uma farmacocinética plasmática de 3-3 CAIMPdAFSH após injeção intravenosa de 0,1 ug, 0,3 ug e 0,6 ug de 3- 3 cAIMPdFSH encapsulado em exossomo em camundongos C57BL/6 naive. A tabela mostra a meia-vida de cada amostra.
[00221] As Figuras 69A-69D mostram os perfis de expressão de citocinas (IFN-B, CXCL9, CXCL10 e IFN-y, respectivamente) ao longo do tempo no fígado de camundongos C57BL/6 naive após uma única injeção intravenosa de 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 CAIMPdAFSH encapsulado em exossomo.
[00222] As Figuras 70A-70D mostram perfis de expressão de citoci- nas (IFN-B, CXCL9, CXCL10 e IFN-y, respectivamente) ao longo do tempo no baço de camundongos C57BL/6 naive após uma única inje- ção intravenosa de 20 ug 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 CAIMPdAFSH encapsulado em exossomo.
[00223] As Figuras 71A-71E mostram perfis de expressão de citoci- nas séricas (IFN-B, TNF-a, IL-6, IFN-y e MCP-1, respectivamente) ao longo do tempo após uma única injeção intravenosa de 20 ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 cCAIMPAFSH encapsulado em exos- somo nos camundongos C57BL/6 naive.
[00224] As Figuras 72A-72C mostram perfis de expressão de IFNB em tecidos (linfonodo, baço e fígado, respectivamente) de camundon- gos C57BL/6 naive após uma única injeção subcutânea de PBS, exos- somos, 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 cAIMPAFSH encapsulado em exossomo.
[00225] As Figuras 73A-73C mostram perfis de expressão de CXCL9 em tecidos (linfonodo, baço e fígado, respectivamente) de ca-
mundongos C57BL/6 naive após uma única injeção subcutânea de PBS, exossomos, 20 ug de 3-3 cAIMPdAaFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 CAIMPdAFSH encapsulado em exossomo.
[00226] As Figuras 74A-74C mostram perfis de expressão de CXCL10 em tecidos (linfonodo, baço e fígado, respectivamente) de camundongos C57BL/6 naive após uma única injeção subcutânea de PBS, exossomos, 20 ug 3-3 cAIMPdFSH livre ou 0,2 ug 3-3 cAIMP- dFSH encapsulado em exossomo.
[00227] As Figuras 75A-75C mostram perfis de expressão de IFN-y em tecidos (linfonodo, baço e fígado, respectivamente) de camundon- gos C57BL/6 naive após uma única injeção subcutânea de PBS, exos- somos, 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 cAIMPAFSH encapsulado em exossomo.
[00228] As Figuras. 76A-76E mostram perfis de expressão de cito- cinas séricas (IFNB, TNFa, IL-6, IFN-y e MCP-1, respectivamente) em camundongos C57BL/6 naive após uma única injeção subcutânea de PBS, exossomos, 20 ug 3-3 cAIMPdFSH livre, ou 0,2 ug de 3-3 CAIMPdAFSH encapsulado em exossomo.
[00229] As Figuras 77A e 77B mostram perfis de expressão quanti- tativa de IFNB no tumor (Figura 77A) ou área do estroma (Figura 77B) da seção de tumor B16F10 após a injeção intratumoral de exossomos, ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, 0,1 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,1 pg de 3-3 cAIMPAdFSH encapsulado em exossomo como descrito no Exemplo 28.
[00230] As Figuras 78A e 78B mostram uma série de células positi- vas de CD8 (Figura 78A) e células positivas para F4/80 (Figura 78B) nas seções de tumor após injeção intratumoral de exossomos, 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cAIMPAFSH encapsulado em exossomo, conforme descrito no Exemplo 28.
[00231] —AFigura 79A mostra as curvas de crescimento tumoral pri-
mário em camundongos portadores de tumor B16F10 ao longo do es- tudo descrito no Exemplo 29. As Figuras 79B-79E mostram as curvas de crescimento tumoral para cada animal nos diferentes grupos (ou seja, PBS, exossomos, ADUS100 e exoCL656, respectivamente)
[00232] A Figura 80A mostra as curvas de crescimento tumoral de reexibição em camundongos portadores de tumor B16F10 ao longo do estudo descrito no Exemplo 29. As Figuras 80B-80D mostram as cur- vas de crescimento tumoral para cada animal nos diferentes grupos (ou seja, PBS, ADUS100 e exoCL656, respectivamente).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DESCRIÇÃO
[00233] Antes de a presente invenção ser descrita com mais deta- lhes, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a mo- dalidades particulares descritas, como tal pode, evidentemente, variar. Também se deve entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever somente modalidades em particular, e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente in- venção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.
[00234] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais simila- res ou equivalentes para os descritos neste documento também po- dem ser usados na prática ou teste da presente invenção, materiais e métodos ilustrativos representativos agora são descritos.
[00235] Todas as publicações e patentes citadas nesta especifica- ção, neste documento, são incorporadas por referência como se cada publicação individual ou patente fossem especificamente e individual- mente indicadas para serem incorporadas por referência e são incor- poradas neste documento por referência a divulgar e descrever os mé- todos e/ou materiais em relação ao qual as publicações são citadas.
[00236] Como será evidente para os versados na técnica mediante a leitura desta descrição, cada uma das modalidades individuais des- critas neste documento e ilustradas tem componentes e características distintas que podem ser facilmente separadas ou combinadas com as características de qualquer uma das outras várias modalidades sem sair do escopo ou espírito da presente invenção. Pode efetuar-se qualquer método recitado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível. |. Definições
[00237] Nota-se que, conforme utilizado neste documento e nas rei- vindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados indistintamente neste documento. É observado adi- cionalmente que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e semelhantes em conexão com a reci- tação de elementos da reivindicação, ou uso de uma limitação "negati- va".
[00238] Além disso, "e/ou", sendo usado neste documento, deve ser tomado como a descrição específica de cada uma das duas carac- terísticas ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A e/ou B", neste do- cumento, destina-se a incluir "A e B", "A ou B", "A" (por si só) e "B" (por si só). Da mesma forma, o termo "e/ou" como usado em uma fra- se tal como "A, B e/ou C" destina-se a abranger cada um dos seguin- tes aspectos: A, B, e C; A, B/ ou C; Aou C; AouB; Bou C; AE C;AÃe B; Be C; A (por si só); B (por si só); e C (por si só).
[00239] “Entende-se que onde quer que os aspectos sejam descritos neste documento com a linguagem "compreendendo", aspectos aná- logos de outra forma descritos em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" também são fornecidos.
[00240] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por alguém de conhecimento comum na técnica a que se relaciona esta descrição. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2º ed, 2002, CRC Press.; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3º ed, 1999, Academic Press.; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Mo- lecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem àquele habilitado um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.
[00241] “Unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita pelo Systême International de Unites (Sistema Internacional de Unidades - SI). As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. Quando uma faixa de valores é recitada, deve ser entendido que cada valor inteiro intermediário, e cada fração do mesmo, entre os limites superior e inferior recitados dessa faixa também é especifica- mente divulgado, juntamente com cada subfaixa entre tais valores. Os limites superiores e inferiores de qualquer faixa podem ser indepen- dentemente incluídos ou excluídos da faixa, e cada faixa em que ne- nhum ou ambos os limites estão incluídos também é abrangido na descrição. Assim, as faixas recitadas neste documento são entendidas como uma abreviação para todos os valores dentro da faixa, incluindo os critérios de avaliação recitados. Por exemplo, uma faixa de 1 a 10 é entendida para incluir qualquer número, combinação de números ou subfaixa a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 96 10.
[00242] “Quando um valor é explicitamente recitado, deve ser en- tendido que os valores que são aproximadamente a mesma caracterís-
tica ou quantidade conforme o valor recitado também estão dentro do escopo da descrição. Quando uma combinação é divulgada, cada subcombinação dos elementos dessa combinação também é especifi- camente divulgada e está dentro do escopo da descrição. Por outro lado, onde diferentes elementos ou grupos de elementos são divulga- dos individualmente, combinações dos mesmos também são divulga- das. Onde qualquer elemento de uma descrição é divulgado como tendo uma pluralidade de alternativas, exemplos dessa descrição em que cada alternativa é excluída individualmente ou em qualquer com- binação com as outras alternativas também são divulgados neste do- cumento; mais do que um elemento de uma descrição pode ter tais exclusões, e todas as combinações de elementos com tais exclusões são divulgadas neste documento.
[00243] Os nucleotídeos são referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos. Salvo indicação em contrário, as sequên- cias de nucleótidos são escritas da esquerda para a direita na orienta- ção 5 'para 3. Os nucleotídeos são referidos neste documento por seus símbolos de letra única comumente conhecidos, recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Consequen- temente, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina e U representa uracilo.
[00244] As sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi. Os aminoácidos são referidos neste documento pelos seus símbolos de três letras comu- mente conhecidos ou pelos símbolos de letra única recomendados pe- la Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.
[00245] O termo "cerca de" ou"aproximadamente" é usado neste documento para significar a grosso modo aproximadamente, em torno de ou na região de. Quando o termo “cerca de” é usado em conjunto com uma faixa numérico, ele modifica essa faixa estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. O termo usado neste documento significa dentro de 5% da quantidade referenciada, por exemplo, cerca de 50% é entendido como abrangendo uma faixa de valores de 47,5% a 52,5%.
[00246] Tal como utilizado neste documento, o termo "vesícula ex- tracelular"; ou "EV" refere-se a uma vesícula derivada de uma célula que compreende uma membrana que envolve um espaço interno. As vesículas extracelulares compreendem todas as vesículas ligadas à membrana (por exemplo, exossomos, nanovesículas) que têm um di- âmetro menor do que a célula da qual são derivadas. Geralmente, as vesículas extracelulares variam em diâmetro de 20 nm a 1000 nm e podem compreender várias cargas úteis macromoleculares tanto den- tro do espaço interno (isto é, lúmen), exibidas na superfície externa da vesícula extracelular e/ou abrangendo a membrana. A carga útil pode compreender ácidos nucleicos, proteínas, carboidratos, lipídios, molé- culas pequenas e/ou combinações dos mesmos. Em algumas modali- dades, uma vesícula extracelular compreende uma fração em estrutu- ra em andaime. A título de exemplo e sem limitação, as vesículas ex- tracelulares incluem corpos apoptóticos, fragmentos de células, vesí- culas derivadas de células por manipulação direta ou indireta (por exemplo, extrusão em série ou tratamento com soluções alcalinas), organelas vesiculadas e vesículas produzidas por células vivas (por exemplo, por brotamento direto da membrana plasmática ou fusão do endossoma tardio com a membrana plasmática). As vesículas extrace- lulares podem ser derivadas de um organismo vivo ou morto, tecidos ou órgãos explantados, células procarióticas ou eucarióticas e/ou célu- las em cultura. Em algumas modalidades, as vesículas extracelulares são produzidas por células que expressam um ou mais produtos transgene.
[00247] Tal como utilizado neste documento, o termo "exossomo"
refere-se a uma pequena vesícula derivada de células (entre 20-300 nm de diâmetro, mais preferencialmente 40-200 nm de diâmetro) que compreende uma membrana que envolve um espaço interno (ou seja, lúmen), e que é gerado a partir da referida célula por brotamento direto da membrana plasmática ou por fusão do endossomo tardio com a membrana plasmática. O exossomo é uma espécie de vesícula extra- celular. O exossomo compreende lipídeo ou ácido graxo e polipeptí- deo e, opcionalmente, compreende uma carga útil (por exemplo, um agente terapêutico), um receptor (por exemplo, uma fração de direcio- namento), um polinucleotídeo (por exemplo, um ácido nucleico, RNA ou DNA), um açúcar (por exemplo, um simples açúcar, polissacarídeo ou glicano) ou outras moléculas. Em algumas modalidades, um exos- somo compreende uma fração em estrutura em andaime. O exossomo pode ser derivado de uma célula produtora e isolado a partir da célula produtora com base em seu tamanho, densidade, parâmetros bioquí- micos ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os exossomos da presente descrição são produzidos por células que ex- pressam um ou mais produtos transgene.
[00248] Talcomo utilizado neste documento, o termo "nanovesícu- la" refere-se a uma pequena vesícula derivada de células (entre 20- 250 nm de diâmetro, mais preferencialmente 30-150 nm de diâmetro) que compreende uma membrana que envolve um espaço interno e que é gerada a partir do referido célula por manipulação direta ou indi- reta, de modo que a referida nanovesícula não seja produzida pela re- ferida célula produtora sem a referida manipulação. Manipulações apropriadas da referida célula produtora incluem, mas não estão limi- tadas a extrusão em série, tratamento com soluções alcalinas, sonica- ção ou combinações das mesmas. A produção de nanovesículas po- de, em alguns casos, resultar na destruição da referida célula produto- ra. Preferencialmente, as populações de nanovesículas estão subs-
tancialmente livres de vesículas que são derivadas de células produto- ras por meio de brotamento direto da membrana plasmática ou fusão do endossoma tardio com a membrana plasmática. O exossomo com- preende lipídeo ou ácido graxo e polipeptídeo e, opcionalmente, com- preende uma carga útil (por exemplo, um agente terapêutico), um re- ceptor (por exemplo, uma fração de direcionamento), um polinucleotí- deo (por exemplo, um ácido nucleico, RNA ou DNA), um açúcar (por exemplo, um simples açúcar, polissacarídeo ou glicano) ou outras mo- léculas. Em algumas modalidades, uma nanovesícula compreende uma fração em estrutura em andaime. A nanovesícula, uma vez que é derivada de uma célula produtora, de acordo com a referida manipula- ção, pode ser isolada da célula produtora com base em seu tamanho, densidade, parâmetros bioquímicos ou uma combinação dos mesmos.
[00249] O termo "modificado", quando utilizado no contexto de exossomos descritos neste documento, refere-se a uma alteração ou manipulação de um EV, de modo que o EV modificado seja diferente de um EV de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um EV modificado descrito neste documento compreende uma membrana que difere na composição de uma proteína, um lipídio, um pequeno molecular, um carboidrato, etc. em comparação com a membrana de um EV de ocorrência natural (por exemplo, a membrana compreende uma densidade mais alta ou número de proteínas EV naturais e/ou membrana compreende proteínas que não são encontradas natural- mente em EVs. Em certas modalidades, tais modificações na mem- brana mudam a superfície externa do EV. Em certas modalidades, tais modificações na membrana mudam o lúmen do EV.
[00250] Tal como utilizado neste documento, o termo "fração em estrutura em andaime" refere-se a uma molécula que pode ser usada para ancorar os agonistas de STING, divulgados neste documento, ou qualquer outro composto de interesse (por exemplo, carga útil) para o
EV, seja na superfície luminal ou na superfície externa do EV. Em cer- tas modalidades, uma fração em estrutura em andaime compreende uma molécula sintética. Em algumas modalidades, uma fração em es- trutura em andaime compreende uma fração não polipeptídica. Em ou- tras modalidades, uma fração em estrutura em andaime compreende um lipídio, carboidrato ou proteína que existe naturalmente no EV. Em algumas modalidades, uma fração em estrutura em andaime compre- ende um lipídio, carboidrato ou proteína que não existe naturalmente no exossomo. Em certas modalidades, uma fração em estrutura em andaime é o Arcabouço X. Em algumas modalidades, uma fração em estrutura em andaime é o Arcabouço Y. Em outras modalidades, uma fração em estrutura em andaime compreende tanto oArcabouço X quanto o Y.
[00251] — Conforme usado neste documento, o termo "Arcabouço X" refere-se a proteínas de exossomos que foram recentemente identifi- cadas na superfície de exossomos. Ver, por exemplo, Pat. US
10.195.290, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Exemplos não limitativos de proteínas de Arcabouço X in- cluem: regulador negativo do receptor de prostaglandina F2 ("a proteí- na PTGFRN"); basigina ("a proteína BSG"); membro 2 da superfamília de imunoglobulina ("a proteína IGSF2"); membro 3 da superfamília de imunoglobulina ("a proteína IGSF3"); membro 8 da superfamília de imunoglobulina ("a proteína IGSF8"); integrina beta-1 ("a proteína ITGB1); integrina alfa-4 ("a proteína ITGA4"); cadeia pesada do antí- geno de superfície celular 4F2 ("a proteína SLC3A2 "); e uma classe de proteínas transportadoras de ATP ("a proteína ATP1A1," "a proteí- na ATP1A2", "a proteína ATP1A3", "a proteína ATP1A4", "a proteína ATP1B3", "a proteína ATP2B1", "a proteína ATP2B2", "a proteína ATP2B3", "a proteína ATP2B"). Em algumas modalidades, uma proteí- na Arcabouço X pode ser uma proteína inteira ou um fragmento da mesma (por exemplo, fragmento funcional, por exemplo, o menor fra- gmento que é capaz de ancorar outra fração na superfície externa ou na superfície luminal do EV, por exemplo, exossomo). Em algumas modalidades, uma Arcabouço X pode ancorar uma fração (por exem- plo, agonista de STING) à superfície externa ou à superfície luminal dos EVs, por exemplo, exossomos.
[00252] Tal como utilizado neste documento, o termo "Arcabouço Y" refere-se a proteínas de exossomos que foram recentemente identi- ficadas na superfície luminal de exossomos. Ver, por exemplo, Interna- tional Appl. POCT/US2018/061679, que é incorporado por referência neste documento na sua totalidade. Exemplos não limitativos de prote- ínas Arcabouço Y incluem: substrato de proteína quinase C rico em alanina miristoilada ("a proteína MARCKS"); substrato de proteína qui- nase C rico em alanina miristoilada tipo 1 ("a proteína MARCKSL1"); e proteína 1 solúvel em ácido cerebral ("a proteína BASP1"). Em algu- mas modalidades, uma proteína Arcabouço Y pode ser uma proteína inteira ou um fragmento dela (por exemplo, fragmento funcional, por exemplo, o menor fragmento que é capaz de ancorar uma fração na superfície luminal dos EVs, por exemplo, exossomos). Em algumas modalidades, uma Arcabouço Y pode ancorar uma fração (por exem- plo, agonista de STING) ao lúmen dos EVs, por exemplo, exossomos.
[00253] Tal como utilizado neste documento, o termo "fragmento" de uma proteína (por exemplo, proteína terapêutica, Arcabouço X ou Arcabouço Y) refere-se a uma sequência de aminoácidos de uma pro- teína que é mais curta do que a sequência de ocorrência natural, N- e/ou C- eliminado no terminal ou qualquer parte da proteína eliminada em comparação com a proteína que ocorre naturalmente. Conforme usado neste documento, o termo "fragmento funcional"; refere-se a um fragmento de proteína que retém a função de proteína. Por conse- guinte, em algumas modalidades, um fragmento funcional de uma pro-
teína Arcabouço X retém a capacidade de ancorar uma fração na su- perfície luminal e/ou na superfície externa do EV. Da mesma forma, em certas modalidades, um fragmento funcional de uma proteína Ar- cabouço Y retém a capacidade de ancorar uma fração na superfície luminal do EV. Se um fragmento é um fragmento funcional pode ser avaliado por quaisquer métodos conhecidos na técnica para determi- nar o teor de proteína dos EVs, incluindo Western Blots, análise FACS e fusões dos fragmentos com proteínas autofluorescentes como, por exemplo, GFP. Em certas modalidades, um fragmento funcional de uma proteína Arcabouço X retém pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 100% de ca- pacidade, por exemplo, uma capacidade de ancorar uma fração da proteína Arcabouço X de ocorrência natural. Em algumas modalida- des, um fragmento funcional de uma proteína Arcabouço Y retém pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 100% da capacidade, por exemplo, uma capacidade de ancorar outra molécula, da proteína Y de Arcabouço que ocorre na- turalmente.
[00254] Tal como utilizado neste documento, o termo "variante" de uma molécula (por exemplo, molécula funcional, antígeno, Arcabouço X e/ou Arcabouço Y) refere-se a uma molécula que compartilha certas identidades estruturais e funcionais com outra molécula mediante comparação por um método conhecido na técnica. Por exemplo, uma variante de uma proteína pode incluir uma substituição, inserção, dele- ção, frameshift ou rearranjo em outra proteína.
[00255] Em algumas modalidades, uma variante de uma Arcabouço X compreende uma variante tendo pelo menos cerca de 70% de iden- tidade com as proteínas transportadoras PTGFRN, BSG, IGSF?2,
IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 ou ATP maduras, de compri- mento total ou um fragmento (por exemplo, fragmento funcional) das proteínas transportadoras PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 ou ATP.
Em algumas modalidades, as varian- tes ou variantes de fragmentos de PTGFRN compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cer- ca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com PTGFRN, de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou com um fragmento funcional das mesmas.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fra- gmentos de BSG compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cer- ca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com BSG, de acordo com a SEQ ID NO: 9 ou com um fragmento funcional das mesmas.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de IGSF2 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo me- nos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com IGSF2, de acordo com SEQ ID NO: 34 ou com um fragmento funcional das mesmas.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de IGSF3 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com IGSF3, de acordo com a SEQ ID NO: 20 ou com um fragmento funcional das mesmas.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de IGSF8 com- partilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de se- quência com IGSF8, de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou com um fra- gmento funcional das mesmas.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de ITGB1 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ITGB1, de acordo com a SEQ ID NO: 21 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes dos fra- gmentos de ITGA4 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ITGAA4, de acordo com a SEQ ID NO: 22 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas mo- dalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de SLC3A2 com- partilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de se- quência com SLC3A2Z, de acordo com a SEQ ID NO: 23 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as varian- tes ou variantes dos fragmentos de ATP1A1 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cer-
ca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP1A1, de acordo com a SEQ ID NO: 24 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de frag- mentos de ATP1A2 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP1A2, de acordo com a SEQ ID NO: 25 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de ATP1A3 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cer- ca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP1A3, de acordo com a SEQ ID NO: 26 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as varian- tes ou variantes de fragmentos de ATP1A4 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cer- ca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP1AA, de acordo com a SEQ ID NO: 27 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de frag- mentos de ATP1B3 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP1B3, de acordo com a SEQ ID NO: 28 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de ATP2B1 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cer- ca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP2B1, de acordo com a SEQ ID NO: 29 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as varian- tes ou variantes de fragmentos de ATP2B2 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cer- ca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP2B2, de acordo com a SEQ ID NO: 30 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de frag- mentos de ATP2B3 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP2B3, de acordo com a SEQ ID NO: 31 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de ATP2B4 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cer- ca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com ATP2B4, de acordo com a SEQ ID NO: 32 ou com um fragmento funcional da mesma.
Em algumas modalidades, a variante ou variante de um fragmento da proteína Arcabouço X, divulgada nes- te documento, retém a capacidade de ser especificamente direcionado para os EVs.
Em algumas modalidades, o Arcabouço X inclui uma ou mais mutações, por exemplo, substituições conservativas de aminoá- cidos.
[00256] Em algumas modalidades, uma variante de um Arcabouço Y compreende uma variante com pelo menos 70% de identidade com MARCKS, MARCKSL1, BASP1 ou um fragmento de MARCKS, MAR- CKSL1 ou BASP1. Em algumas modalidades, as variantes ou varian- tes de fragmentos de MARCKS compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo me- nos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com MARCKS, de acordo com a SEQ ID NO: 47 ou com um fragmento funcional das mesmas. Em algumas modalidades, as variantes ou variantes de fra- gmentos de MARCKSL1 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com MARCKSL1, de acordo com a SEQ ID NO: 48 ou com um fragmento funcional da mesma. Em algu- mas modalidades, as variantes ou variantes de fragmentos de BASP1 compartilham pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cer- ca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com BASP1, de acordo com a SEQ ID NO: 49 ou com um fragmento funcional da mesma. Em algumas modalidades, a variante ou variante de um fragmento da proteína Arcabouço Y retém a capaci- dade de ser direcionada especificamente para o lúmen dos EVs. Em algumas modalidades, o Arcabouço Y inclui uma ou mais mutações, por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos.
[00257] Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aque- la na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resí- duos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram defini- das na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspár- tico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cis- teína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leu- cina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, tripto- fano, histidina). Assim, se um aminoácido em um polipeptídeo é substi- tuído por outro aminoácido a partir da mesma família da cadeia lateral, a substituição é considerada conservativa. Em outra modalidade, uma sequência de aminoácidos pode ser substituída conservativamente com uma coluna estruturalmente semelhante que difere em ordem e/ou composição dos membros da família da cadeia lateral.
[00258] O termo "identidade de sequência percentual" entre duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas refere-se ao número de posições correspondentes idênticas partilhadas pelas sequências so- bre uma janela de comparação, tendo em conta as adições ou dele- ções (ou seja, lacunas) que devem ser introduzidas para o alinhamen- to ideal das duas sequências. Uma posição correspondente é qualquer posição em que um nucleotídeo ou aminoácido idêntico seja apresen- tado tanto na sequência-alvo como na sequência de referência. As la- cunas apresentadas na sequência-alvo não são contadas, uma vez que as lacunas não são nucleotídeos ou aminoácidos. Do mesmo mo- do, as lacunas apresentadas na sequência de referência não são con- tadas uma vez que os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência-alvo são contados, não nucleotídeos ou aminoácidos da sequência de refe- rência.
[00259] O percentual de identidade de sequência é calculado de- terminando o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido ou a base de ácido nucleico idênticos ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o nú- mero de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produ- zir o percentual de identidade de sequência. A comparação das se- quências e a determinação da identidade de sequência percentual en- tre duas sequências podem ser realizadas usando softwares pronta- mente disponíveis para uso on-line e para download. Os programas de software adequados estão disponíveis em várias fontes e para o ali- nhamento de ambas as sequências de proteínas e nucleotídeos. Um programa adequado para determinar a identidade de sequência per- centual é bl2seg, parte da série BLAST de programas disponíveis no site da BLAST do National Center for Biotechnology Information (BLAST) do governo dos EUA (blast.ncbi.nlm.nih.gov). O Bl2seg reali- za uma comparação entre duas sequências usando o algoritmo BLASTN ou BLASTP. O BLASTN é usado para comparar sequências de ácidos nucleicos, enquanto que o BLASTP é usado para comparar sequências de aminoácidos. Outros programas adequados são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water ou Matcher, parte da série EM- BOSS de programas de bioinformática e também disponível no Institu- to Europeu de Bioinformática (EBI) em www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
[0100] As diferentes regiões dentro de uma única sequência-alvo de polinucleotídeo ou polipeptídeo que alinha com uma sequência de referência de polinucleotídeo ou polipeptídeo podem ter cada uma sua própria identidade de sequência percentual. Note-se que o valor da identidade de sequência percentual é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13 e 80,14 são arredondados para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 e 80,19 são arredon- dados para 80,2. Nota-se também que o valor do comprimento sempre será um número inteiro.
[00260] — Aquele habilitado na técnica apreciará que a geração de um alinhamento de sequência para o cálculo de uma identidade de se- quência percentual não se limita a comparações de sequência- sequência binárias exclusivamente conduzidas por dados de sequên- cia primária. Os alinhamentos de sequência podem ser derivados de alinhamentos de sequências múltiplas. Um programa adequado para gerar alinhamentos de sequências múltiplas é ClustalW2, disponível em www .clustal.org. Outro programa adequado é o MUSCLE, disponí- vel em www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 e MUSCLE estão alterna- tivamente disponíveis, por exemplo, a partir da EBI.
[00261] Também será apreciado que os alinhamentos de sequên- cias podem ser gerados integrando dados de sequência com dados a partir de fontes heterogêneas tais como dados estruturais (por exemplo, estruturas de proteínas cristalográficas), dados funcionais (por exemplo, localização das mutações), ou dados filogenéticos. Um programa ade- quado que integra dados heterogêneos para gerar um alinhamento de sequência múltipla é T-Coffee, disponível em www.tcoffee.org e, alterna- tivamente, disponível, por exemplo, da EBIl. Também será apreciado que o alinhamento final usado para calcular a identidade de sequência percentual pode ser curado de forma automática ou manualmente.
[00262] As variantes polinucleotídicas podem conter alterações nas regiões de codificação, regiões de não-codificação, ou ambas. Em uma modalidade, as variantes polinucleotídicas contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. Em outra modalidade, as variantes nucleotídicas são produzidas por subs-
tituições silenciosas devido à degeneração do código genético. Em outras modalidades, as variantes nas quais 5-10, 1-5 ou 1-2 aminoáci- dos são substituídas, deletadas ou adicionadas em qualquer combina- ção. As variantes polinucleotídicas podem ser produzidas por uma va- riedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão do códon para um hospedeiro específico (mudam códons no mMRNA humano por outros, por exemplo, um hospedeiro bacteriano, tal como E. coli).
[00263] As variantes de ocorrência natural são chamadas "variantes alélicas" e referem-se a uma de várias formas alternadas de um gene que ocupa um dado locus em um cromossomo de um organismo (Ge- nes Il, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Essas va- riantes alélicas podem variar no nível de polinucleotídeo e/ou de poli- peptídeo e estão incluídas na presente descrição. Alternativamente, as variantes e ocorrência não natural podem ser produzidas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.
[00264] Ao usar os métodos conhecidos de manipulação de proteí- nas e a tecnologia do DNA recombinante, as variantes podem ser ge- radas para melhorar ou alterar as características dos polipeptídeos. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados do termi- nal N ou terminal C da proteína secretada sem perda substancial da função biológica. Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), in- corporado neste documento por referência na sua totalidade, relatou proteínas KGF variantes possuindo atividade de ligação à heparina mesmo após deleção de 3, 8 ou 27 resíduos de aminoácidos do termi- nal amino. De forma semelhante, o Interferon gama exibiu atividade até dez vezes maior deletando 8-10 resíduos de aminoácidos do ter- minal carbóxi desta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7: 199- 216 (1988), incorporado neste documento por referência na sua totali- dade).
[00265] Além disso, ampla evidência demonstra que as variantes muitas vezes retêm uma atividade biológica semelhante àquela da pro- teína de ocorrência natural. Por exemplo, Gayle e outros (J. Biol. Chem 268: 22105-22111 (1993), incorporado neste documento por referência na sua totalidade) conduziram uma extensa análise mutaci- onal da citocina IL-1a humana. Eles usaram mutagênese aleatória pa- ra gerar mais de 3.500 mutantes de IL-1a individuais que tinham uma média de 2,5 mudanças de aminoácidos por variante ao longo do comprimento inteiro da molécula. Várias mutações foram examinadas em todas as posições de aminoácidos possíveis. Os pesquisadores encontraram que "a maior parte da molécula poderia ser alterada com pouco efeito em um ou outro [ligação ou atividade biológica]". (Ver Re- sumo). Na verdade, apenas 23 sequências de aminoácidos únicas, de mais de 3.500 sequências de nucleotídeos examinadas, produziram uma proteína que diferia significativamente em atividade do tipo selva- gem.
[00266] Como afirmado acima, as variantes polipeptídicas incluem, por exemplo, polipeptídeos modificados. As modificações incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação co- valente de flavina, fixação covalente de uma fração heme, fixação co- valente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, fixação cova- lente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, fixação covalente de fosfo- tidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metila- ção, miristoilação, oxidação, peguilação (Mei et al., Blood 116:270-79 (2010), que é incorporado neste documento por referência na sua tota- lidade), processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemiza- ção, selenoilação, sulfatação, adição mediada por transferência de RNA de amino ácidos para proteínas, tais como arginilação e ubiquiti-
nação. Em algumas modalidades, o Arcabouço X e/ou o Arcabouço Y é modificado em qualquer local conveniente.
[00267] Conforme usado neste documento, o termo "célula produ- tora" refere-se a uma célula usada para gerar um EV. Uma célula produtora pode ser uma célula cultivada in vitro ou uma célula in vivo. Uma célula produtora inclui, mas não se limita a, uma célula conhecida por ser eficaz na geração dos EVs, por exemplo, exossomos, por exemplo, células HEK293, células de ovário de hamster chinês (CHO), células-tronco mesenquimais (MSCs), células de fibroblasto do prepú- cio humano BJ, células s9f, células de fibroblastos fHDF, células pre- cursoras neuronais AGE.HNº células de amniócitos CAPº, células- tronco mesenquimais adiposas e células RPTEC/TERT1. Em certas modalidades, uma célula produtora é uma célula apresentadora de an- tígeno. Em algumas modalidades, a célula produtora é uma célula bac- teriana. Em algumas modalidades, uma célula produtora é uma célula dendrítica, uma célula B, um mastócito, um macrófago, um neutrófilo, uma célula de Kupffer-Browicz ou uma célula derivada a partir de qualquer uma dessas células, ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a célula produtora não é uma célula bacte- riana. Em outras modalidades, a célula produtora não é uma célula apresentadora de antígeno.
[00268] Tal como utilizado neste documento, o termo "associado com" refere-se ao encapsulamento de uma primeira fração, por exem- plo, um agonista de STING, em uma segunda fração, por exemplo, vesícula extracelular, ou a uma ligação covalente ou não covalente formada entre uma primeira fração e uma segunda fração, por exem- plo, um agonista de STING e uma vesícula extracelular, respectiva- mente, por exemplo, uma fração de Arcabouço expressa na ou na ve- sícula extracelular e um agonista de STING, por exemplo, Arcabouço X (por exemplo, uma proteína PTGFRN), respectivamente, na superfí-
cie luminal de ou na superfície externa da vesícula extracelular. Em uma modalidade, o termo "associado com" significa uma ligação não peptídica covalente ou uma ligação não covalente. Por exemplo, o aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um grupo tiol em um segundo resíduo de cisteína. Exemplos de ligações covalentes incluem, mas não estão limitados a, uma ligação peptídica, uma ligação de metal, uma ligação de hidrogênio, uma ligação dissulfeto, uma ligação sigma, uma ligação pi, uma ligação delta, uma ligação glicosídica, um ligação agnóstica, uma ligação dobrada, uma ligação dipolar, um ligação Pi, uma ligação dupla, uma ligação tripla, uma ligação quádrupla, uma ligação quíntu- pla, uma ligação sêxtupla, conjugação, hiperconjugação, aromaticida- de, hapticidade ou anti-ligação. Exemplos não limitantes de ligação não covalente incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação cá- tion-pi ou ligação de sal), uma ligação de metal, uma ligação de hidro- gênio (por exemplo, ligação de di-hidrogênio, complexo de di- hidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa-barreira ou ligação de hi- drogênio simétrica), força de van der Walls, força de dispersão de London, uma ligação mecânica, uma ligação de halogênio, aurofilici- dade, intercalação, empilhamento, força entrópica, ou polaridade quií- mica. Em outras modalidades, o termo "associado com" significa um estado de encapsulamento por uma primeira fração, por exemplo, ve- sícula extracelular de uma segunda fração, por exemplo, um agonista de STING. No estado de encapsulamento, a primeira fração e a se- gunda fração podem ser ligadas uma à outra. Em outras modalidades, o encapsulamento significa que a primeira fração e a segunda fração não estão física e/ou quimicamente ligadas uma à outra.
[00269] Tal como utilizado neste documento, o termo "ligado a" ou "conjugado a" é usado indistintamente e refere-se a uma ligação co- valente ou não covalente formada entre uma primeira fração e uma segunda fração, por exemplo, um agonista de STING e uma vesícula extracelular, respectivamente, por exemplo, uma fração em estrutura em andaime expressa na ou na vesícula extracelular e um agonista de STING, por exemplo, Arcabouço X (por exemplo, uma proteína PTG- FRN), respectivamente, na superfície luminal ou na superfície externa da vesícula extracelular.
[00270] O termo "encapsulado", ou formas gramaticalmente dife- rentes do termo (por exemplo, encapsulação ou encapsulamento), re- fere-se a um estado ou processo de ter uma primeira fração (por exemplo, agonista de STING) dentro de uma segunda fração (por exemplo, um EV, por exemplo , exossomo) sem ligar química ou fisi- camente as duas frações. Em algumas modalidades, o termo "encap- sulado"; pode ser usado alternadamente com "no lúmen de". Exem- plos não limitativos de encapsulação de uma primeira fração (por exemplo, agonista de STING) em uma segunda fração (por exemplo, EVs, por exemplo, exossomos) são divulgados em outro lugar neste documento.
[00271] Tal como utilizado neste documento, os termos "isolar," "isolado," e "isolando" ou "pureza," "purificado," e "purificando" as- sim como "extraído" e "extraindo" são usados indistintamente e refe- rem-se ao estado de uma preparação (por exemplo, uma pluralidade de quantidade e/ou concentração conhecida ou desconhecida) dos EVs desejados, que foram submetidos a um ou mais processos de pu- rificação, por exemplo, uma seleção ou um enriquecimento da prepa- ração do EV desejada. Em algumas modalidades, isolar ou purificar como utilizado neste documento é o processo de remoção, remoção parcial (por exemplo, uma fração) dos EVs de uma amostra contendo células produtoras. Em algumas modalidades, uma composição de EV isolada não possui atividade indesejável detectável ou, alternati- vamente, o nível ou a quantidade da atividade indesejada é igual ou inferior a um nível ou quantidade aceitável. Em outras modalidades, uma composição de EV isolada tem uma quantidade e/ou concentra- ção de EVs desejados em ou acima de uma quantidade e/ou concen- tração aceitáveis. Em outras modalidades, a composição de exosso- mo isolado é enriquecida em comparação com o material de partida (por exemplo, preparações de células produtoras) a partir do qual a composição é obtida. Este enriquecimento pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99%, 99,999%, 99,9999% ou mais de 99,9999% em compa- ração com o material de partida. Em algumas modalidades, as prepa- rações dos EV isoladas são substancialmente livres de produtos bioló- gicos residuais. Em algumas modalidades, as preparações do EV iso- ladas são 100% livres, 99% livres, 98% livres, 97% livres, 96% livres, 95% livres, 94% livres, 93% livres, 92% livres, 91% livres ou 90% livre de qualquer matéria biológica contaminante. Os produtos biológicos residuais podem incluir materiais abióticos (incluindo produtos quími- cos) ou ácidos nucleicos, proteínas, lipídios ou metabolitos indeseja- dos. Substancialmente livre de produtos biológicos residuais também pode significar que a composição do EV não contém células produto- ras detectáveis e que apenas os exossomos são detectáveis.
[00272] Tal como utilizado neste documento, o termo "agonista"; refere-se a uma molécula que se liga a um receptor e ativa o receptor para produzir uma resposta biológica. Os receptores podem ser ativa- dos por um agonista endógeno ou exógeno. Exemplos não limitativos de agonista endógeno incluem hormônios, neurotransmissores e dinu- cleotídeos cíclicos. Exemplos não limitativos de agonistas exógenos incluem drogas, pequenas moléculas e dinucleotídeos cíclicos. O ago- nista pode ser um agonista completo, parcial ou inverso.
[00273] Tal como utilizado neste documento, o termo "antagonis- ta"; refere-se a uma molécula que bloqueia ou amortece uma resposta mediada por agonista em vez de provocar uma resposta biológica ao se ligar a um receptor. Muitos antagonistas atingem sua potência competindo com ligantes ou substratos endógenos em sítios de liga- ção estruturalmente definidos nos receptores. Exemplos não limitativos de antagonistas incluem bloqueadores alfa, betabloqueadores e blo- queadores dos canais de cálcio. O antagonista pode ser um antagonis- ta competitivo, não competitivo ou não competitivo.
[00274] O termo "agonista de STING livre", tal como utilizado nes- te documento, significa um agonista de STING não associado a uma vesícula extracelular, mas, de outra forma idêntico, ao agonista de STING associado à vesícula extracelular. Especialmente quando com- parado a uma vesícula extracelular associada a um agonista de STING, o agonista de STING livre é o mesmo agonista de STING as- sociado à vesícula extracelular. Em algumas modalidades, quando um agonista de STING livre é comparado a uma vesícula extracelular compreendendo o agonista de STING em sua eficácia, toxicidade e/ou quaisquer outras características, a quantidade do agonista de STING livre em comparação com o agonista de STING associado à vesícula extracelular é o mesmo que a quantidade do agonista de STING asso- ciado ao EV.
[00275] Conforme usado neste documento, o termo "ligante"; se refere a uma molécula que se liga a um receptor e modula o receptor para produzir uma resposta biológica. A modulação pode ser ativação, desativação, bloqueio ou amortecimento da resposta biológica media- da pelo receptor. Os receptores podem ser modulados por um ligante endógeno ou exógeno. Exemplos não limitativos de ligantes endóge- nos incluem anticorpos e peptídeos. Exemplos não limitativos de ago- nistas exógenos incluem drogas, pequenas moléculas e dinucleotídeos cíclicos. O ligante pode ser um ligante completo, parcial ou inverso.
[00276] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" abran-
ge uma imunoglobulina, seja natural ou parcial ou totalmente sintética produzida, e fragmentos do mesmo. O termo também abrange qual- quer proteína que possua um domínio de ligação que seja homólogo a um domínio de ligação de imunoglobulina. "Anticorpo" inclui ainda um polipeptídeo compreendendo uma região de framework a partir de um gene de imunoglobulina ou fragmentos do mesmo que se liga e reco- nhece especificamente um antígeno. O uso do termo anticorpo deve incluir anticorpos inteiros, anticorpos policlonais, monoclonais e re- combinantes e fragmentos dos mesmos, e inclui adicionalmente anti- corpos de cadeia única, anticorpos humanizados, anticorpos murinos, anticorpos quiméricos, camundongo-humano, camundongo-primata, primata-humano monoclonais, anticorpos anti-idiótipo, fragmentos de anticorpos, como, por exemplo, fragmentos scFv, (scFv)2, Fab, Fab', and F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, e Fd, diacorpos e polipeptídeos relacio- nados a anticorpos. O anticorpo inclui anticorpos biespecíficos e anti- corpos multiespecíficos, desde que exibam a atividade ou função bio- lógica desejada.
[00277] Tal como utilizado neste documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade de reagente ou composto farmacêutico que é suficiente para produzir um efeito terapêutico dese- jado, efeito farmacológico e/ou fisiológico em um sujeito em necessi- dade. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma "quanti- dade profilaticamente eficaz", pois a profilaxia pode ser considerada terapia.
[00278] “Como usado neste documento, o termo "composição far- macêutica" refere-se a um ou mais dos compostos descritos neste documento, como, por exemplo, uma vesícula extracelular misturada ou mesclada com, ou suspensa em um ou mais de outros componen- tes químicos, como carreadores e excipientes farmaceuticamente acei- táveis. Um objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a ad-
ministração de preparações de EVs a um sujeito. O termo "excipien- te": ou "carreador"; refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administra- ção de um composto. O termo "carreador farmaceuticamenteaceitá- vel" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" e variações gra- maticais dos mesmos, abrange qualquer um dos agentes aprovados por uma agência reguladora do governo federal dos EUA ou listados na Farmacopeia dos EUA para uso em animais, incluindo em huma- nos, assim como qualquer carreador ou diluente que não cause a pro- dução de efeitos fisiológicos indesejáveis a um grau que proíbe a ad- ministração da composição a um sujeito e não anule a atividade bioló- gica e as propriedades do composto administrado. Incluídos estão ex- cipientes e carreadores que são úteis na preparação de uma composi- ção farmacêutica e são geralmente seguros, não tóxicos e desejáveis.
[00279] Conforme usado neste documento, o termo "carga útil" re- fere-se a um agente terapêutico que atua em um alvo (por exemplo, uma célula alvo) que é contatada com o EV. As cargas úteis que po- dem ser introduzidas em um EV e/ou em uma célula produtora incluem agentes terapêuticos, como nucleotídeos (por exemplo, nucleotídeos compreendendo uma fração detectável ou uma toxina ou que inter- rompe a transcrição), ácidos nucleicos (por exemplo, moléculas de DNA ou mRNA que codificam um polipeptídeo, como uma enzima, ou moléculas de RNA que possuem função reguladora, como mIiRNA, dsDNA, IncRNA e siRNA), aminoácidos (por exemplo, aminoácidos compreendendo uma fração detectável ou uma toxina ou que inter- rompem a tradução), polipeptídeos (por exemplo, enzimas), lipídios, carboidratos e moléculas pequenas (por exemplo, drogas e toxinas de moléculas pequenas).
[00280] Os termos "administração", "administrar" e suas variantes referem-se à introdução de uma composição, tal como um EV ou agente em um sujeito e inclui a introdução simultânea e sequencial de uma composição ou agente. A introdução de uma composição ou agente em um sujeito é por qualquer via adequada, incluindo intratu- moral, oral, pulmonar, intranasal, parenteral (intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea), retal, intralinfática, intra- tecal, periocular ou tópica. A administração inclui a autoadministração e a administração por outro. Uma via de administração adequada per- mite que a composição ou o agente desempenhe a função pretendida. Por exemplo, se uma via adequada é intravenosa, a composição é administrada através da introdução da composição ou agente na veia do sujeito.
[00281] O termo "tratar", "tratamento" ou "tratando", conforme uti- lizado neste documento, refere-se a, por exemplo, a redução da gravi- dade de uma doença ou condição; a redução na duração do curso de uma doença; a melhoria ou eliminação de um ou mais sintomas asso- ciados a uma doença ou condição; o fornecimento de efeitos benéficos a um sujeito com uma doença ou condição, sem necessariamente cu- rar a doença ou condição. O termo também inclui profilaxia ou preven- ção de uma doença ou condição ou seus sintomas. Em uma modali- dade, o termo "tratar" ou "tratamento" significa induzir uma resposta imune em um sujeito contra um antígeno.
[00282] O termo "evitar" ou "evitando", como usado neste docu- mento, refere-se a diminuir ou reduzir a ocorrência ou gravidade de um resultado particular. Em algumas modalidades, o impedimento de um resultado é alcançado por meio de tratamento profilático.
[00283] Tal como utilizado neste documento, o termo "modular", "modulando" "modificar" e/ou "modulador" geralmente se refere à capacidade de alterar, por aumento ou diminuição, por exemplo, direta ou indiretamente promovendo/estimulando/regulando positivamente ou interferir com/inibir/regular negativamente uma concentração, nível,
expressão, função ou comportamento específico, como, por exemplo, agir como um antagonista ou agonista. Em alguns casos, um modula- dor pode aumentar e/ou diminuir uma certa concentração, nível, ativi- dade ou função em relação a um controle ou em relação ao nível mé- dio de atividade que geralmente seria esperado ou em relação a um nível de atividade de controle.
[00284] “Conforme usado neste documento, "um sujeito mamífero" inclui todos os mamíferos, incluindo, sem limitação, humanos, animais domésticos (por exemplo, cães, gatos e semelhantes), animais de cri- ação (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos e semelhantes) e laboratório animais (por exemplo, macaco, ratos, camundongos, coe- lhos, porquinhos da índia e semelhantes).
[00285] Os termos “indivíduo”, “sujeito”, "hospedeiro" e “pacien- te” são usados de forma intercambiável neste documento e referem-se a qualquer sujeito mamífero para quem o diagnóstico, tratamento ou terapia é desejado, particularmente humanos. Os métodos descritos neste documento são aplicáveis em ambas terapia humana e aplica- ções veterinárias. Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero e, em outras modalidades, o sujeito é um ser humano.
[00286] Como usado neste documento, o termo "substancialmente livre"; significa que a amostra que compreende exossomos compre- ende menos de 10% de macromoléculas por concentração percentual de massa/volume (m/v). Algumas frações podem conter menos que 0,001%, menos que 0,01%, menos que 0,05%, menos que 0,1%, me- nos que 0,2%, menos que 0,3%, menos que 0,4%, menos que 0,5%, menos que 0,6%, menos de 0,7%, menos que 0,8%, menos que 0,9%, menos que 1%, menos que 2%, menos que 3%, menos que 4%, me- nos que 5%, menos que 6%, menos que 7%, menos que 8%, menos que 9% ou menos que 10% (m/v) de macromoléculas.
[00287] “Conforme usado neste documento, o termo "macromolécu-
la" significa ácidos nucleicos, proteínas exógenas, lipídios, carboidra- tos, metabólitos ou uma combinação dos mesmos.
[00288] Conforme usado neste documento, o termo "insubstanci- al", "reduzido" ou "insignificante" refere-se à presença, nível ou quantidade de uma resposta de inflamação em um sujeito após a ad- ministração da amostra compreendendo os EVs encapsulando um agonista de STING em relação à resposta de inflamação da linha de base no sujeito ou em comparação com a resposta da inflamação do sujeito à administração de um agonista de STING livre. Por exemplo, uma presença desprezível ou insubstancial, nível ou quantidade de inflamação sistêmica pode ser menor que 0,001%, menor que 0,01%, menor que 0,1%, menor que 0,2%, menor que 0,3%, menor que 0,4%, menor que 0,5%, menos de 0,6%, menos de 0,7%, menos de 0,8%, menos de 0,9%, menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 6%, menos de 7%, menos de 8%, menos de 9%, menos de 10%, menos de 12%, menos de 15%, menos de 17%, menos de 20% ou menos de 25% da inflamação sistêmica em relação à inflamação de linha de base no sujeito ou em comparação com a resposta imune do sujeito à administração de um agonista de STING livre. Um nível ou quantidade de uma inflamação sistêmica po- de ser inferior a 0,1 vezes, inferior a 0,5 vezes, inferior a 0,5 vezes, inferior a 1 vezes, inferior a 1,5 vezes, inferior a 2 vezes em relação à linha de base ou em comparação com a resposta de inflação à admi- nistração de um agonista de STING livre.
[00289] As faixas recitadas neste documento são entendidas como atalho para todos os valores dentro da faixa, inclusive dos pontos de extremidade recitados. Por exemplo, um intervalo de 1 a 50 é entendi- do como incluindo qualquer número, combinação de números, ou sub- faixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,47,48,49 e 50.
[00290] A menos que indicado de outra forma, a referência a um composto que tem um ou mais estereocentros se refere a cada este- reoisômero e todas as combinações de estereoisômeros dos mesmos. Il. Composições (Vesículas) com Agonista de STING
[00291] O sistema imune inato reconhece padrões moleculares as- sociados a patógenos (PAMP's) por meio de receptores de reconheci- mento de padrões (PRRs) que induzem uma resposta imune. Os PRRs reconhecem uma variedade de moléculas de patógenos, inclu- indo RNA e DNA de fita simples e dupla. Os PRRS, como os recepto- res semelhantes ao gene | indutível por ácido retinóico (RIG-I) (RLRs) e alguns receptores do tipo toll (TLRs), reconhecem ligantes de RNA. Os ligantes de DNA são reconhecidos pela GMP-AMP sintase cíclica (cCGAS), AIM? e outros TLRs. Os TLRs, RLRs e AIM2 interagem dire- tamente com outras proteínas adaptadoras da cascata de sinal para ativar fatores de transcrição, enquanto cCGAS produz CGAMP, uma mo- lécula de dinucleotídeo cíclico que ativa o receptor do gene estimula- dor do interferon (STING). Tanto o STING quanto os RLRs ativam o adaptador quinase TBK1, que induz a ativação dos fatores de transcri- ção IRF3 e NF-«B, e resulta na produção de IFNs tipo | e citocinas pró- inflamatórias.
[00292] Os dinucleotídeos cíclicos (CDNs) foram identificados pela primeira vez como moléculas de sinalização bacteriana caracterizadas por duas ligações fosfodiéster 3', 5', como na molécula c-di-GMP. Em- bora o STING possa ser ativada por CDNs bacterianos, a resposta imune inata em células de mamíferos também é mediada pela molécu- la de sinalização de CDN cGAMP que é produzida por cGAS. O cGAMP é caracterizado por uma ligação de fosfodiéster 2', 5' e 3', 5' mista. Tanto os CDNs bacterianos quanto os de mamíferos interagem diretamente com o STING para induzir a cascata de sinalização pró-
inflamatória que resulta na produção de IFNs tipo |, como IFNa e IFN- B. IL.A. Agonistas de STING
[00293] Os agonistas de STING usados nesta descrição podem ser dinucleotídeos cíclicos (CDNs) ou agonistas de dinucleotídeos não cí- clicos. Os dinucleotídeos de purina cíclicos, tais como, mas não limita- dos a, cCGMP, di-GMP cíclico (c-di-GMP), CAMP, di-AMP cíclico (c-di- AMP), GMP-AMP cíclico (CGAMP), di-cíclico -IMP (c-di-IMP), AMP-IMP cíclico (CAIMP), e qualquer análogo dos mesmos, são conhecidos por estimular ou aumentar uma resposta imune ou de inflamação em um paciente. Os CDNs podem ter ligações 2'2', 2'3', 2'5', 3'3' ou 3'5'ligando os dinucleotídeos cíclicos ou qualquer combinação dos mesmos.
[00294] Os dinucleotídeos de purina cíclicos podem ser modificados por meio de técnicas de química orgânica padrão para produzir análo- gos de dinucleotídeos de purina. Os dinucleotídeos de purina adequa- dos incluem, mas não estão limitados a, adenina, guanina, inosina, hipoxantina, xantina, isoguanina ou qualquer outro dinucleotídeo de purina apropriado conhecido na técnica. Os dinucleotídeos cíclicos po- dem ser análogos modificados. Qualquer modificação adequada co- nhecida na técnica pode ser usada, incluindo, mas não se limitando a, modificações de fosforotioato, bifosforotioato, fluorinato e difluorinato.
[00295] —Agonistas de dinucleotídeo não cíclicos também podem ser usados, tais como ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), ou qualquer outro agonista de dinucleotídeo não cíclico conhecido na téc- nica.
[00296] É contemplado que qualquer agonista de STING pode ser usado. Entre os agonistas de STING estão DMXAA, agonista de STING-1, ML RR-S2 CDA, ML RR-S2c-di-GMP, ML-RR-S2 cGAMP, 2'3'-c-di-AM(PS)2, 2'3-cCGAMP, 2'3-cCGAMPAFHS, 3'3'-cCGAMP, 3'3'- CGAMPdAFSH, cAIMP, cAIM(PS)2, 3'3-cAIMP, 3'3-cAIMPdFSH, 2'2”-
cGAMP, 2'3-cCGAM(PS)2, 3'3'-cCGAMP, c-di-AMP, 2'3'-c-di-AMP, 2'3'-c- di-AM(PS)2, c-di-GMP, 2'3'-c-di-GMP, c-di-IMP, c-di-UMP ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o agonista de STING é 3'3-cAIMPAdFSH, alternativamente denominado 3-3 CAIMPAFSH. Agonistas de STING adicionais conhecidos na técnica também podem ser usados.
[00297] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: Fórmula 1 Fórmula 2 Fórmula 3 9 E o B, o Bo 27p-o 21-oq J 241701 J | o | (o) | Oo. 4 o ty x o xo UC o 6% LA o TA X%xo o—P-z o Lo po o Lo——p=o B, o B, Zz B, Zz em que: X é H, OH ou F; X2 é H,OH,ourF; Z é OH, OR, SH ou SR, em que: i) R1 é Na ou NH, ou ii) R1 é um grupo lábil a enzima que fornece OH ou SH in vivo, tal como pivaloiloximetil; Bi e B2 são bases escolhidas a partir de: NH oH o Cx) do eee QI o E a 7 A E Adenina, Hipoxantina ou OH o NR es a ÉIO ES =—— a ) yY Aa MS He N Guanina,
[00298] Com a condição de que: - na Fórmula (1): X« e X2 não são OH, - na Fórmula (II): quando X: e X> são OH, B,: não é Adenina e B2 não é Guanina, e - na Fórmula (Ill): quando X: e X> são OH, B: não é Adeni- na, B2 não é Guanina e Z não é OH. Ver WO 2016/096174, cujo conte- údo é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
[00299] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende: RES MM Sede Rg > a Era a E o EE BSePaO q NON o SL 16 E? eee o. e a Cod i ê a Lots n. fo doom Si? $ fal > o Non IR&/Sp] N o ss NHo Não CL-656 c-[2FdAMP-2FdIMP], c-[2FdAMP(S)-2FdIMP(S)], o & esmo gm So Nesprog q NON wei-o o x o ER BR A Ntoços A om N ã À õ Ê NH n. do doda 3 CL-655 sal e Roso $ . c-[AMP(S)-IMP(S)], não A CL-659 e-[2FdAMP(S)-2FdIMP(S)]|(POM),, and e ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Ver WO 2016/ 096174A1.
[00300] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: NH? NH, E N. R) " N Ss os. AZ 2 EO o. <A fe) N MOR NONO Ho-brom o NON SÍ ou 7 om CJ ox o CX 6 ; ôM ô ôn ô nm lo rotor A É mo os, FT õ PTS O fon FT> 6 o 5 5 cL6os cuen cL6o2 ('2)c-AIMP (2'27c-AIMP (2137)c-AIMP não não no NA, NÃ 2 EO SL g Sa 9 2 Ho-b-o Ho-b-o Ses 6 > co > o CX õ S af alo tora lo ota SRS o SS xo SS Nº. N N . ' * CcL6ss CL6O04 CL6O09 -AIMP(S) ; CÁAdAMP-AIMP) ; C-(AAMP-2'FAIMP) D NH2 NH2 nº NA NA Bo ato LDO o TO s NA —. otro o IA FER O ee Ty e 6 DZ ES A — É FA ão É X Ô EF f h. OH ô Nos EA PS o io-p-sn e no | o—p=o Ex ER SS nO õ 5 õ o CcL614 CL656 CL647 C-(2'FdAMP-2'FdIMP) CA2'FdAMP(S)-2'FAdIMP(S)] (2',3)c(AMP-2'FdIMP) o o nº
N PAN PTS e o CJ e 6 Cy Pe SA ô É 6 é oo mma fo totos una fo Tobos Ex SS Exa EA o o o cL626 cL62o cL6os exite FamP) ; e-<xi(2'FAGMP) ; e-2'FAGMP.2'FdANP) ; NH: o NHo AN. * - % po DA EO NX. o < TI o Fo No NA o SÓ NLo QN NE —P- N Ro! 0 ETA é > e eo O : > AA SS (O Neo NINO rotrs HANNA To-p-sH HNSANSN 0-p-s fT> o EX 9 DA 9 a NE ú vo o o o CL632 CcL633 CL659 c-2'FdGMP(S)-2'FdAMP(S)] c-[2'FAGMP(S)-2'FdAMP(S))(POM) Cc-[2'FdAMP(S)-2'FdIMP(S)|(POM); ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00301] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: Leo o e Ve
TH . ea Lona é em que cada símbolo é definido em WO 2014/093936, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00302] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: o x 1 R$ UÚ QR HO maca Prvena AX ao Ff
ER A ni a To E d AX O os Ro 1 * L o e x em que cada símbolo é definido em WO 2014/189805, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00303] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: se i Ombro Pr om o, ou EA, & osso se em que cada símbolo é definido em WO 2015/077354, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Ver também Cell reports 11, 1018-1030 (2015).
[00304] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-IMP, c-AMP- GMP, c-AMP-IMP e c-GMP-IMP, descrito em WO 2013/185052 e Sci.
Tradução Med. 283,283ra52 (2015), que são incorporados neste do- cumento por referência em sua totalidade.
[00305] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: solo, * ' ne dl. Si J " Í a em que cada símbolo é definido em WO 2014/189806, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00306] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: & ato, ER AÇO o em que cada símbolo é definido em WO 2015/185565, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00307] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: e | ou 2 em que cada símbolo é definido em WO 2014/179760, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00308] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula:
. O no á a TER of É nã x” fe r os Ro TA Z = o o É Q OS dd Po Ro NA of E os A 5 AMA à AR x de so > oo Re o ó o
NEN AN RI NA AIN A o o o x rs E Ds te E. Se x Ss : 21 CNA R of E o e. RS x dee or sd loz o à. no o Rn o O ANN 2 AN Ro. o õ " em que cada símbolo é definido em WO 2014/179335, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00309] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: e qo ano o uva meo Lo: N m% o A PÁ Oo PA ns Ínça ão Nora À; NH; descrito em WO 2015/017652, cujo conteúdo é incorporado neste do- cumento por referência na sua totalidade.
[00310] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: NH>
NEN Z7 o A NO O. gls) [Nem
AE AI O-P-OH mel A |) o descrito em WO 2016/096577, cujo conteúdo é incorporado neste do- cumento por referência em sua totalidade.
[00311] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula:
AY AP o hs em que cada símbolo é definido em WO 2016/120305, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00312] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: [é ) % Rs aa ó e AA |
DA em que cada símbolo é definido em WO 2016/145102, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00313] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula:
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A xicbo Lo o. Base? R' E» xt RR k em que cada símbolo é definido em WO 2017/0276486, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00314] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: R3 Cs 7 RA. O- o O. SS
SUS BO R2 x À em que cada símbolo é definido em WO 2017/075477, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00315] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: pa | | AR INE Base!
A Ri R' Rº Rº ds x Wah Rs do | feto Base? ta R Re 1a er E IS, k em que cada símbolo é definido em WO 2017/027645, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00316] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula:
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A -O-p-º o “o em que cada símbolo é definido em WO 2018/100558, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00317] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula:
LIDO > FU, j d à à Dx o HI em que cada símbolo é definido no documento WO 2017/175147, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totali- dade.
[00318] Em algumas modalidades, o agonista de STING útil para a presente descrição compreende um composto com a seguinte fórmula: T Q nº RA ; o OR 1 Do Sa oe RR r N R DOS à “OO k. SÊ A / vn t no É e fa A O Vl : : R Rº Re ” o ou em que cada símbolo é definido em WO 2017/175156, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00319] Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a pre-
sente descrição é CL606, CL611, CL602, CL655, CL604, CL609, CL614, CL656, CL647, CL626, CL629, CL603, CL632, CL633, CL659 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em alguns aspec- tos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL606 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL611 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o ago- nista de STING útil para a presente descrição é CL602 ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL655 ou um sal farmaceu- ticamente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL604 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL609 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL614 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL656 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL647 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL626 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL629 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL603 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL632 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL633 ou um sal farmaceuti-
camente aceitável do mesmo. Em alguns aspectos, o agonista de STING útil para a presente descrição é CL659 ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.
[00320] Em alguns aspectos, o EV, por exemplo, exossomo, com- preende um agonista de STING de dinucleotídeo cíclico e/ou um ago- nista de STING de dinucleotídeo não cíclico. Em alguns aspectos, quando vários agonistas de STING de dinucleotídeo cíclico estão pre- sentes em um EV, por exemplo, o exossomo, divulgado neste docu- mento, tais agonistas de STING podem ser iguais ou podem ser dife- rentes. Em alguns aspectos, quando vários agonistas de STING dinu- cleotídicos não cíclicos estão presentes, esses agonistas de STING podem ser iguais ou podem ser diferentes. Em alguns aspectos, um EV, por exemplo, exossomo, composição da presente descrição pode compreender duas ou mais populações de EVs, por exemplo, exos- somos, em que cada população de EVs, por exemplo, os exossomos, compreende um agonista de STING diferente ou uma combinação dos mesmos.
[00321] Os agonistas STING também podem ser modificados para aumentar a encapsulação do agonista em uma vesícula extracelular ou EV (por exemplo, não ligado no lúmen). Em algumas modalidades, os agonistas de STING estão ligados a uma fração em estrutura em andaime, por exemplo, Arcabouço Y. Em certas modalidades, a modi- ficação permite uma melhor expressão do agonista de STING na su- perfície externa do EV, por exemplo, exossomo, (por exemplo, ligado a um fração em estrutura em andaime divulgada neste documento, por exemplo, Arcabouço X). Esta modificação pode incluir a adição de uma marcador de ligação a lipídio tratando o agonista com um produto químico ou enzima, ou alterando física ou quimicamente a polaridade ou carga do agonista de STING. O agonista de STING pode ser modi- ficado por um único tratamento ou por uma combinação de tratamen-
tos, por exemplo, adicionando apenas um marcador de ligação a lipí- dios ou adicionando um marcador de ligação a lipídeos e alterando a polaridade. O exemplo anterior pretende ser uma instância ilustrativa não limitativa. É contemplado que qualquer combinação de modifica- ções pode ser praticada. A modificação pode aumentar o encapsula- ção do agonista no EV entre 2 vezes e 10.000 vezes, entre 10 vezes e
1.000 vezes, ou entre 100 vezes e 500 vezes em comparação com o encapsulação de um agonista não modificado. A modificação pode aumentar a encapsulação do agonista no EV em pelo menos 2 vezes, vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000- vezes, 3.000 vezes, 4.000 vezes, 5.000 vezes, 6.000 ve- zes, 7.000 vezes, 8.000 vezes, 9.000 vezes ou 10.000 vezes em com- paração com o encapsulamento de um agonista não modificado.
[00322] Em algumas modalidades, os agonistas de STING podem ser modificados para permitir uma melhor expressão dos agonistas na superfície externa do EV, por exemplo, o exossomo, (por exemplo, li- gado a uma fração em estrutura em andaime divulgada neste docu- mento, por exemplo, Arcabouço X). Qualquer uma das modificações descritas acima pode ser usada. A modificação pode aumentar o en- capsulamento do agonista no EV entre 2 vezes e 10.000 vezes, entre vezes e 1.000 vezes, ou entre 100 vezes e 500 vezes em compara- ção com o encapsulamento de um agonista não modificado. A modifi- cação pode aumentar a expressão do agonista na superfície externa do EV, por exemplo, o exossomo, em pelo menos cerca de 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1.000 vezes, 2.000 vezes, 3.000 vezes, 4.000 vezes, 5.000 vezes, 6.000 ve-
zes, 7.000 vezes, 8.000 vezes, 9.000 vezes ou 10.000 vezes em com- paração com a expressão de um agonista não modificado.
[00323] A concentração do agonista de STING associado ao EV pode ser de cerca de 0,01 uM a 1000 UM. A concentração do agonista de STING associado pode estar entre cerca de 0,01-0,05 uM, 0,05-0,1 UM, 0,1-0,5 UM, 0,5-1 UM, 1-5 UM, 5-10 UM, 10-15 UM, 15-20 UM, 20- UM, 25-30 UM, 30-35 UM, 35-40 UM, 45-50 UM, 55-60 UM, 65-70 UM, 70-75 UM, 75-80 uM, 80-85 uM, 85-90 uM, 90-95 uM, 95-100 UM, 100-150 UM, 150-200 UM, 200-250 UM, 250-300 UM, 300-350 UM, 250- 400 UM, 400-450 UM, 450-500 UM, 500-550 UM, 550-600 UM, 600-650 UM, 650-700 UM, 700-750 UM, 750-800 uM, 800-850 uM, 805-900 UM, 900-950 uM ou 950-1000 UM. A concentração do agonista de STING associado pode ser igual ou superior a cerca de 0,01 uM, 0,1 uM, 0,5 UM, 1 UM, 5 UM, 10 UM, 15 UM, 20 uM, 25 uM, 30 UM, 35 UM, 40 UM, 45 UM, 50 UM, 55 UM, 60 UM, 65 uM, 70 UM, 75 UM, 80 uM, 85 uM, 90 UM, 95 UM, 100 UM, 150 UM, 200 UM, 250 UM, 300 uM, 350 uM, 400 UM, 450 UM, 500 UM, 550 UM, 600 UM, 650 UM, 700 UM, 750 uM, 800 UM, 850 UM, 900 uM, 950 uM ou 1000 UM.
11.B. EVs manipulados com Arcabouço-X, por exemplo, Exosso- mos
[00324] Em algumas modalidades, os EVs da presente descrição compreendem uma membrana modificada em sua composição. Por exemplo, suas composições de membrana podem ser modificadas al- terando o teor de proteínas, lipídios ou glicanos da membrana.
[00325] Em algumas modalidades, os EVs de superfície manipulada são gerados por métodos químicos e/ou físicos, como fusão induzida por PEG e/ou fusão ultrassônica. Em outras modalidades, os exosso- mos de superfície manipulada são gerados pela manipulação genética. Os EVs produzidos a partir de uma célula produtora geneticamente modificada ou uma progênie da célula geneticamente modificada po-
dem conter composições de membrana modificadas. Em algumas mo- dalidades, os EVs de superfície manipulada, por exemplo, os exosso- mos, têm uma fração em estrutura em andaime (por exemplo, proteína de exossomo, por exemplo, Arcabouço X) em uma densidade maior ou menor (por exemplo, número maior) ou incluem uma variante ou um fragmento da fração em estrutura em andaime .
[00326] Por exemplo, os EVs de superfície manipulada (por exem- plo, os EVs de Arcabouço X manipulados) podem ser produzidos a partir de uma célula (por exemplo, células HEK293) transformadas com uma sequência exógena que codifica uma fração em estrutura em andaime (por exemplo, proteínas de exossomo, por exemplo, Arca- bouço X) ou uma variante ou um fragmento dos mesmos. Os EVs que incluem a fração em estrutura em andaime expressa a partir da se- quência exógena podem incluir composições de membrana modifica- das.
[00327] Várias modificações ou fragmentos da fração em estrutura em andaime podem ser usadas para as modalidades da presente des- crição. Por exemplo, a fração em estrutura em andaime modificada para ter afinidade aprimorada para um agente de ligação pode ser usada para gerar EVs de superfície manipulada que podem ser purifi- cados usando o agente de ligação. Frações de andaime modificadas para serem mais eficazmente direcionadas aos EVs, por exemplo, exossomos e/ou membranas podem ser usadas. As porções de an- daime modificadas para compreender um fragmento mínimo necessá- rio para direcionamento específico e eficaz para os EVs, por exemplo, exossomos, membranas também podem ser usadas.
[00328] Em algumas modalidades, um agonista de STING divulga- do neste documento é expresso na superfície de um EV, por exemplo, exossomo, como uma proteína de fusão, por exemplo, proteína de fu- são de um agonista de STING a um Arcabouço X. Por exemplo, a pro-
teína de fusão pode compreender um STING agonista divulgado neste documento ligado a uma fração em estrutura em andaime (por exem- plo, Arcabouço X). Em certas modalidades, o Arcabouço X compreen- de a proteína PTGFRN, proteína BSG, proteína IGSF2, proteína IGSF3, proteína IGSF8, proteína ITGB1, proteína ITGAA4, proteína SLC3A?2, proteína transportadora de ATP ou um fragmento ou variante das mesmas.
[00329] Em algumas modalidades, os EVs de engenharia de super- fície, por exemplo, exossomos (por exemplo, os EVs de Arcabouço X manipulados, por exemplo, exossomos) descritos neste documento demonstram características superiores em comparação com os EVs, por exemplo, os exossomos, conhecidos na técnica. Por exemplo, a superfície (por exemplo, a Arcabouço X) manipulada contém proteínas modificadas mais altamente enriquecidas em sua superfície do que os EVs de ocorrência natural, por exemplo, os exossomos, ou os EVs, por exemplo, os exossomos, produzidos usando as proteínas de exos- somos convencionais. Além disso, os EVs de superfície manipulada, por exemplo, os exossomos, (por exemplo, os EVs de Arcabouço X manipulada, por exemplo, os exossomos) da presente invenção po- dem ter atividade biológica maior, mais específica ou mais controlada em comparação com os EVs de ocorrência natural, por exemplo, os exossomos ou os EVs, por exemplo, os exossomos, produzidos usan- do proteínas de exossomos convencionais.
[00330] Em outras modalidades, os EVs, por exemplo, exossomos, da presente descrição contêm um agonista de STING e um Arcabouço X, em que o agonista de STING está ligado ao Arcabouço X. Em al- gumas modalidades, os EVs, por exemplo, os exossomos, da presente descrição compreendem um agonista de STING e um Arcabouço X, em que o agonista de STING não está ligado ao Arcabouço X.
[00331] Em algumas modalidades, o Arcabouço X útil para a pre-
sente descrição compreende o regulador negativo do receptor de pros- taglandina F2 (o polipeptídeo PTGFRN). A proteína PTGFRN também pode ser referida como parceira de CD9 1 (CD9P-1), proteína F con- tendo o motivo Glu-Trp-lle EWI (EWI-F), proteína reguladora do recep- tor de prostaglandina F2-alfa, associada ao receptor de prostaglandina F2-alfa proteína ou CD315. A sequência de aminoácidos de compri- mento total da proteína PTGFRN humana (Uniprot No. de Acesso Q9P2B2) é mostrada na Tabela 1 como SEQ ID NO: 1. O polipeptídeo PTGFRN contém um peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO: 1), o domínio extracelular (aminoácidos 26 a 832 da SEQ ID NO: 1), um domínio transmembranar (aminoácidos 833 a 853 da SEQ ID NO: 1) e um domínio citoplasmático (aminoácidos 854 a 879 da SEQ ID NO: 1). O polipeptídeo PTGFRN maduro consiste em SEQ ID NO: 1 sem o peptídeo sinal, ou seja, aminoácidos 26 a 879 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um fragmento de polipeptídeo PTGFRN útil para a presente descrição compreende um domínio transmembranar do PTGFRN polipeptídeo. Em outras modalidades, um fragmento de polipeptídeo PTGFRN útil para a presente descrição compreende o domínio transmembranar do polipeptídeo PTGFRN e (i) pelo menos cinco, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo me- nos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150 aminoáci- dos no terminal N do domínio transmembranar, (ii) pelo menos cinco, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 aminoácidos no terminal C do domínio transmembranar, ou ambos (i) e (ii).
[00332] Em algumas modalidades, os fragmentos de PTGFRN poli- petídeo não possuem um ou mais domínios funcionais ou estruturais, como IgV.
[0100] Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer- ca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntico aos aminoácidos 26 a 879 de SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o Arcabouço X com- preende uma sequência de aminoácido pelo menos de cerca, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo me- nos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 33. Em outras modalidades, o Arca- bouço X compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33, exceto uma mutação de aminoácidos, duas mutações de aminoácidos, três mutações de aminoácidos, quatro mutações de aminoácidos, cin- co mutações de aminoácidos, seis mutações de aminoácidos, ou sete mutações de aminoácidos. As mutações podem ser uma substituição, uma inserção, uma deleção ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o Arcabouço X compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e 1 aminoácido, dois aminoácidos, três aminoácidos, quatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis amino- ácidos, sete aminoácidos, oito aminoácidos, nove aminoácidos, dez aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoácidos, 17 aminoácidos, 18 aminoácidos, 19 aminoácidos ou 20 aminoácidos ou mais no terminal N e/ou terminal C da SEQ ID NO: 33.
[00333] Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo me-
nos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idên- tica à SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Em outras modalidades, o Arca- bouço X compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, exceto uma mutação de aminoácidos, duas mutações de aminoácidos, três mutações de aminoácidos, quatro mutações de aminoácidos, cinco mutações de aminoácidos, seis mutações de ami- noácidos ou sete mutações de aminoácidos.
As mutações podem ser uma substituição, uma inserção, uma deleção ou qualquer combinação das mesmas.
Em algumas modalidades, o Arcabouço X compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4,5, 6 ou 7 e 1 ami- noácido, dois aminoácidos, três aminoácidos, quatro aminoácidos, cin- co aminoácidos, seis aminoácidos, sete aminoácidos, oito aminoáci- dos, nove aminoácidos, dez aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoá- cidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoáci- dos, 17 aminoácidos, 18 aminoácidos ácidos, 19 aminoácidos ou 20 aminoácidos ou mais no terminal N e/ou terminal C da SEQ ID NO: 2, 3,4,5,6 ou 7.
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[00334] Em algumas modalidades, um Arcabouço X útil para a pre- sente descrição compreende Basigin (a proteína BSG), representada pela SEQ ID NO: 9. A proteína BSG também é conhecida como 5F7, fator estimulador de colagenase, indutor de metaloproteinase de matriz extracelular (EMMPRIN), leucócito antígeno de ativação M6, antígeno de grupo sanguíneo OK, fator estimulador de colagenase derivado de células tumorais (TCSF) ou CD147. O número Uniprot para a proteína BSG humana é P35613. O peptídeo sinal da proteína BSG é o amino- ácido 1 a 21 da SEQ ID NO: 9. Os aminoácidos 138-323 da SEQ ID NO: 9 são o domínio extracelular, os aminoácidos 324 a 344 são Oo domínio transmembranar e os aminoácidos 345 a 385 de SEQ ID NO: 9 é o domínio citoplasmático.
[00335] Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer- ca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntico aos aminoácidos 22 a 385 da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, os fragmentos do polipeptídeo Basigin faltam um ou mais domínios funcionais ou estru- turais, tais como IgV, por exemplo, aminoácidos 221 a 315 da SEQ ID NO: 9. Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma se- quência de aminoácidos pelo menos cerca de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo me- nos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idên- tica à SEQ ID NO: 10, 11 ou 12. Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, 11 ou 12, exceto uma mutação de aminoácidos, duas mutações de aminoá-
cidos, três mutações de aminoácidos, quatro mutações de aminoáci- dos, cinco mutações de aminoácidos, seis mutações de aminoácidos ou sete mutações de aminoácidos. As mutações podem ser uma subs- tituição, uma inserção, uma deleção ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o Arcabouço X compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 11 ou 12 e 1 aminoácido, dois aminoácidos, três aminoácidos, quatro aminoácidos, cinco amino- ácidos, seis aminoácidos, sete aminoácidos ácidos, oito aminoácidos, nove aminoácidos, dez aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoácidos, 17 aminoácidos, 18 aminoácidos, 19 aminoácidos, ou 20 aminoácidos ou mais no terminal N e/ou terminal C de SEQ ID NO: 10, 11 ou 12.
[00336] Em algumas modalidades, um Arcabouço X útil para a pre- sente descrição compreende o membro 8 da superfamília de imuno- globulina (I9gSF8 ou a proteína IGSF8), que também é conhecido como parceiro CD81 3, proteína 2 contendo motivo Glu-Trp-lle EWI (EWI-2), proteína transmembranar associada a queratinócitos 4 (KCT-4), LIR- D1, proteína tipo reguladora de prostaglandina (PGRL) ou CD316. À proteína IGSF8 humana de comprimento total é o no. Q969P0 em Uniprot e é mostrado como SEQ ID NO: 14 neste documento. A prote- ína IGSF8 humana tem um peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 27 da SEQ ID NO: 14), um domínio extracelular (aminoácidos 28 a 579 da SEQ ID NO: 14), um domínio transmembranar (aminoácidos 580 a 600 da SEQ ID NO: 14), e um domínio citoplasmático (aminoácidos 601 a 613 de SEQ ID NO: 14).
[00337] Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer- ca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me-
nos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntico aos aminoácidos 28 a 613 de SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a proteína IGSF8 carece de um ou mais domínios funcionais ou estruturais, como IgV. Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo me- nos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 15, 16, 17 ou 18. Em outras modalidades, o Arcabouço X com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, 16, 17 ou 18, exceto uma mutação de aminoácidos, duas mutações de aminoácidos, três mutações de aminoácidos, quatro mutações de aminoácidos, cin- co mutações de aminoácidos, seis mutações de aminoácidos ou sete mutações de aminoácidos. As mutações podem ser uma substituição, uma inserção, uma deleção ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o Arcabouço X compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID 15, 16, 17 ou 18 e 1 aminoácido, dois amino- ácidos, três aminoácidos, quatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis aminoácidos, sete aminoácidos ácidos, oito aminoácidos, nove amino- ácidos, dez aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 amino- ácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 aminoácidos, 17 aminoá- cidos, 18 aminoácidos, 19 aminoácidos, ou 20 aminoácidos ou mais no terminal N e/ou terminal C da SEQ ID NO: 15, 16, 17 ou 18.
[00338] Em algumas modalidades, um Arcabouço X que pode ser usado com agonistas de STING divulgados neste documento compre- ende o membro 3 da superfamília de imunoglobulina (I9SF3 ou a pro- teína IGSF3), que também é conhecido como proteína contendo moti- vo Glu-Trp-lle EWI 3 (EWI-3), e é mostrado como a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 20. A proteína IGSF3 humana tem um peptí-
deo sinal (aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 20), um domínio extra- celular (aminoácidos 20 a 1124 da SEQ ID NO: 20), um domínio transmembranar (aminoácidos 1125 a 1145 da SEQ ID NO: 20), e um domínio citoplasmático (aminoácidos 1146 a 1194 de SEQ ID NO: 20).
[00339] Em outras modalidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer- ca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntico aos aminoácidos 28 a 613 de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, a proteína IGSF3 carece de um ou mais domínios funcionais ou estruturais, como IgV.
[00340] Em algumas modalidades, um Arcabouço X útil para a pre- sente descrição compreende integrina beta-1 (a proteína ITGB1), que também é conhecida como subunidade beta de receptor de fibronecti- na, glicoproteína Ila (GPIIA), subunidade beta de VLA-4 ou CD29, e é mostrada como a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. A proteína ITGB1 humana tem um peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 20 da SEQ ID NO: 21), um domínio extracelular (aminoácidos 21 a 728 da SEQ ID NO: 21), um domínio transmembranar (aminoácidos 729 a 751 da SEQ ID NO: 21), e um domínio citoplasmático (aminoácidos 752 a 798 de SEQ ID NO: 21).
[00341] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer- ca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% ou cerca de 100% idênticos aos aminoácidos 21 a 798 de SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a proteína ITGB1 carece de um ou mais domínios funcionais ou estruturais, como IgV.
[00342] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ITGAA4, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo me- nos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 22 sem o peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 22). Em algumas modalidades, a proteína ITGAA4 carece de um ou mais domínios funcionais ou estruturais, como Igv.
[00343] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína SLC3A2, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 23 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína SLC3A2 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00344] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP1A1, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 24 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP1A1 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00345] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP1A2, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 25 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP1A2 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00346] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP1A3, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 26 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP1A3 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00347] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP1A4, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 27 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP1A4 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00348] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP1A5, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de
97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 28 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP1A5 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00349] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP2B1, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 29 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP2B1 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00350] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP2B2, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 30 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP2B2 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00351] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP2B3, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 31 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP2B3 carece de um ou mais domínios fun-
cionais ou estruturais, como IgV.
[00352] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína ATP2B4, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer- ca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 32 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína ATP2B4 carece de um ou mais domínios fun- cionais ou estruturais, como IgV.
[00353] Em outras modalidades, um Arcabouço X compreende a proteína IGSF2, que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo me- nos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 34 sem o peptídeo sinal. Em algumas modalidades, a proteína IGSF2 carece de um ou mais domínios funci- onais ou estruturais, como IgV.
[00354] “Exemplos não limitativos de outras proteínas Arcabouço X que podem ser usadas para ligar um agonista de STING à superfície dos EVs, por exemplo, os exossomos, podem ser encontrados na Pa- tente US 10.195.290 B1, emitida em 5 de fevereiro de 2019, a qual é incorporada por referência na sua totalidade.
[00355] Em algumas modalidades, uma proteína Arcabouço X útil para a presente descrição carece de pelo menos 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 aminoácidos do terminal N da proteína nativa. Em algumas modalidades, um Arcabouço X carece de pelo menos 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 aminoáci- dos do terminal C da proteína nativa. Em algumas modalidades, um
Arcabouço X carece de pelo menos 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 aminoácidos de ambos os terminais N e C da proteí- na nativa. Em algumas modalidades, um Arcabouço X carece de um ou mais domínios funcionais ou estruturais da proteína nativa.
[00356] Em algumas modalidades, o Arcabouço X descrito neste documento também pode ser usado para ligar um agonista de STING na superfície luminal e/ou na superfície externa dos EVs, por exemplo, exossomos, ao mesmo tempo. Por exemplo, o polipeptídeo PTGFRN pode ser usado para ligar um agonista de STING dentro do lúmen, além da superfície do EV, por exemplo, exossomo. Em algumas moda- lidades, um Arcabouço X pode ser usado para ligar um agonista de STING e um agente terapêutico adicional aos EVs, por exemplo, exos- somos (por exemplo, carga útil). Portanto, em certas modalidades, o Arcabouço X divulgado neste documento pode ser usado para fins du- plos. Os EVs de Arcabouço-Y manipulados, por exemplo, Exossomos
[00357] Em algumas modalidades, osEVs, por exemplo, exosso- mos, da presente descrição compreendem um espaço interno (istoé, o lúmen) que é diferente daquele dos EVs de ocorrência natural, por exemplo, exossomos. Por exemplo, o EV, por exemplo, exossomo, pode ser alterado de modo que a composição no lado luminal do EV, por exemplo, exossomo, tenha o teor de proteína, lipídio ou glicano diferente daquele dos EVs de ocorrência natural, por exemplo, exos- somos.
[00358] Em algumas modalidades, osEVs projetados, por exemplo, exossomos, podem ser produzidos a partir de uma célula transformada com uma sequência exógena que codifica uma fração em estrutura em andaime (por exemplo, proteínas de exossomo, por exemplo, Arca- bouço Y) ou uma modificação ou um fragmento da fração em estrutura em andaime que altera o composição ou teor do lado luminal do EV,
por exemplo, exossomo. Várias modificações ou fragmentos da prote- ína do exossomo que podem ser expressos no lado luminal do EV, por exemplo, exossomo, podem ser usados para as modalidades da pre- sente descrição.
[00359] Em algumas modalidades, um agonista de STING divulga- do neste documento está no lúmen do EV, por exemplo, exossomo (isto é, encapsulado). Em algumas modalidades, um agonista de STING está ligado à superfície luminal do EV, por exemplo, exossomo. Tal como utilizado neste documento, quando uma molécula (por exemplo, um antígeno ou adjuvante) é descrita como " no lúmen"do EV, por exemplo, exossomo, significa que a molécula está localizada dentro do EV, por exemplo, exossomo (por exemplo, associado), mas não está ligado a nenhuma molécula na superfície luminal dos EVs. Em outras modalidades, um agonista de STING é expresso na super- fície luminal do EV, por exemplo, exossomo como uma molécula de fusão, por exemplo, molécula de fusão de um agonista de STING a uma fração em estrutura em andaime (por exemplo, Arcabouço Y). Em certas modalidades, o Arcabouço Y compreende a proteína MARCKS, proteína MARCKSL1, proteína BASP1 ou qualquer combinação das mesmas.
[00360] Em outras modalidades, os EVs, por exemplo, exossomos, da presente descrição contêm um agonista de STING e um Arcabouço Y, em que o agonista de STING está ligado ao Arcabouço Y. Em al- gumas modalidades, os EVs, por exemplo, exossomos, da presente descrição compreendem um agonista de STING e um Arcabouço Y, em que o agonista de STING não está ligado ao Arcabouço Y.
[00361] Em algumas modalidades, as frações de andaime (por exemplo, Arcabouço Y) que podem alterar o lado luminal dos EVs, por exemplo, exossomos , incluem, mas não estão limitados à proteína MARCKS, proteína MARCKSL1, proteína BASP1 ou qualquer combi-
nação das mesmas. Em algumas modalidades, o Arcabouço Y com- preende Proteína Solúvel em Ácido Cerebral 1 (a proteína BASP1). À proteína BASP1 também é conhecida como proteína ácida enriquecida em tecido neuronal de 22 kDa ou proteína de membrana axonal neu- ronal NAP-22. A sequência da proteína BASP1 humana de compri- mento completo (isômero 1) é mostrada na Tabela 2. Um isômero pro- duzido por um splicing alternativo não contém os aminoácidos 88 a 141 da SEQ ID NO: XX (isômero 1). Tabela 2. A proteina BASP1 (SEQ ID NO: 49) MGGKLSKKKKGYNVNDEKAKEKDKKAEGAATEEEGTPKESEPQ
AAAEPAEAKEGKEKPDQDAEGKAEEKEGEKDAAAAKEEAPKAE PEKTEGAAEAKAEPPKAPEQEQAAPGPAAGGEAPKAAEAAAAP AESAAPAAGEEPSKEEGEPKKTEAPAAPAAQETKSDGAPASDSK PGSSEAAPSSKETPAATEAPSSTPKAQGPAASAEEPKPVEAPAA NSDOTVTVKE
[00362] A sequência da proteína BASP1 madura está sem a primei- ra Met da SEQ ID NO: 49 e, portanto, contém os aminoácidos 2 a 227 da SEQ ID NO: 49.
[00363] Em outras modalidades, o Arcabouço Y útil para a presente descrição compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cer- ca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntico aos aminoácidos 2 a 227 de SEQ ID NO: 49. Em outras moda- lidades, o Arcabouço X compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo me- nos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de
96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 50-155. Em outras modalidades, um Arcabouço Y útil para a presente descri- ção compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50-155, exceto uma mutação de aminoácido, duas mutações de aminoácido, três mutações de aminoácido, quatro mutações de aminoácido, cinco aminoácidos mutações, seis mutações de aminoácidos ou sete muta- ções de aminoácidos. As mutações podem ser uma substituição, uma inserção, uma deleção ou qualquer combinação das mesmas. Em al- gumas modalidades, um Arcabouço Y útil para a presente descrição compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50-155 e 1 aminoácido, dois aminoácidos, três aminoácidos, quatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis aminoácidos, sete aminoácidos, oito aminoá- cidos, nove aminoácidos, dez aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 ami- noácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos, 15 aminoácidos, 16 ami- noácidos, 17 aminoácidos, 18 aminoácidos, 19 aminoácidos ácidos, ou aminoácidos ou mais no terminal N e/ou terminal C de SEQ ID NO: 50-155.
[00364] Em algumas modalidades, um Arcabouço Y útil para a pre- sente descrição é a proteína MARCKS, que compreende uma sequên- cia de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo me- nos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 47 sem o peptídeo sinal. Em certas modalidades, a proteína MARCKS carece de um ou mais domínios funcionais ou estruturais.
[00365] Em algumas modalidades, um Arcabouço Y compreende a proteína MARCKSL1, que compreende uma sequência de aminoáci- dos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cer- ca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à SEQ ID NO: 48 sem o peptídeo sinal. Em certas modalidades, a proteína MARCKS carece de um ou mais domí- nios funcionais ou estruturais.
[00366] Em algumas modalidades, um Arcabouço Y útil para a pre- sente descrição compreende um peptídeo com o MGXKLSKKK, onde X é alanina ou qualquer outro aminoácido (SEQ ID NO: 163). Em al- gumas modalidades, um EV, por exemplo, exossomo, compreende um peptídeo com sequência de (M)(G)(m)(8)(&D/mM)(S/A/G/N)(+)(+), em que cada posição entre parênteses representa um aminoácido e em que TT é qualquer aminoácido selecionado do grupo que consiste em (Pro, Gly, Ala, Ser), £ é qualquer aminoácido selecionado do grupo que con- siste em (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg), O é qualquer aminoácido selecionado do grupo que consiste em (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), e (+) é qualquer aminoácido selecionado a partir de o grupo consistindo em (Lys, Arg, His); e em que a posição cinco não é (+) e a posição seis não é nem (+) nem (Asp ou Glu). Em modalidades adicionais, um EV, por exemplo, exossomo, descrito neste documen- to(por exemplo, osEVs manipulados, por exemplo, exossomos) com- preende um peptídeo com a sequência de (M)(G)(m)(X)(&/m)(m)(+)(+), em que cada posição entre parênteses representa um aminoácido, e em que TT é qualquer aminoácido selecionado do grupo que consiste em (Pro, Gly, Ala, Ser), X é qualquer aminoácido, & é qualquer amino- ácido selecionado do grupo que consiste em (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met), e (+) é qualquer aminoácido selecionado do grupo que con- siste em (Lys, Arg, His); e em que a posição cinco não é (+) e a posi- ção seis não é nem (+) nem (Asp ou Glu).
[00367] Em algumas modalidades, um Arcabouço Y que pode ser usado para expressar um agonista de STING na superfície luminal de um EV, por exemplo, exossomo, compreende uma sequência de ami- noácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntico a qualquer uma das SEQ ID NO: 7-
155.
[00368] Os EVs de Arcabouço Y manipulado, por exemplo, exos- somos, descritos neste documento podem ser produzidos a partir de uma célula transformada com uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 47-155. II.C. Ligante
[00369] Os EVs da presente descrição podem compreender um ou mais ligantes que ligam o agonista de STING aos EVs ou a uma fração em estrutura em andaime, por exemplo, Arcabouço X na superfície externa dos EVs. Em algumas modalidades, o agonista de STING está ligado aos EVs diretamente ou em uma fração em estrutura em an- daime nos EVs por um ligante. O ligante pode ser qualquer fração química conhecida na técnica.
[00370] Em algumas modalidades, o termo "ligante" se refere a uma sequência de peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo sin- tético ou sequência de polipeptídeo) ou a um não polipeptídeo. Em al- guns aspectos, dois ou mais ligantes podem ser ligados em tandem. Geralmente, os ligantes fornecem flexibilidade ou evitam/melhoram os obstáculos estéricos. Os ligantes não são tipicamente clivados, no en- tanto, em certos aspectos, tal clivagem pode ser desejável. Por conse- guinte, em alguns aspectos, um ligante pode compreender um ou mais sítios cliváveis por protease, que podem estar localizados dentro da sequência do ligante ou flanqueando o ligante em qualquer extremida-
de da sequência ligadora.
[00371] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante peptídico. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo pode compreender pelo menos cerca de dois, pelo menos cerca de três, pelo menos cer- ca de quatro, pelo menos cerca de cinco, pelo menos cerca de 10, pe- lo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, em pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 55, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 65, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 75, em pelo menos cer- ca de 80, pelo menos cerca de 85, pelo menos cerca de 90, pelo me- nos cerca de 95 ou pelo menos cerca de 100 aminoácidos.
[00372] Em algumas modalidades, o ligante peptídico é sintético, ou seja, não ocorre naturalmente. Em um aspecto, um ligante peptídico inclui peptídeos (ou polipeptídeos) (por exemplo, peptídeos naturais ou não naturais) que compreendem uma sequência de aminoácidos que se liga ou funde geneticamente uma primeira sequência linear de ami- noácidos a uma segunda sequência linear de aminoácidos ao qual não está naturalmente ligado ou geneticamente fundido na natureza. Por exemplo, em um aspecto, o ligante de peptídeo pode compreender polipeptídeos de ocorrência não natural que são formas modificadas de polipeptídeos de ocorrência natural (por exemplo, que compreen- dem uma mutação, como uma adição, substituição ou deleção).
[00373] Os ligantes podem ser suscetíveis à clivagem ("ligante cli- vável"), facilitando assim a liberação do Agonista de STING ou outras cargas úteis. Em alguns aspectos, o ligante é um "ligante sensível à redução". Em alguns aspectos, o ligante sensível à redução contém uma ligação dissulfeto. Em alguns aspectos, o ligante é um "ligante ácido lábil". Em alguns aspectos, o ligante ácido lábil contém hidrazo- na. Os ligantes de ácidos lábeis adequados também incluem, por exemplo, um ligante cis-aconítico, um ligante de hidrazida, um ligante tiocarbamoil ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns aspec- tos, o ligante compreende um ligante não clivável. 1L.D. Células produtoras e modificações
[00374] Os EVs, por exemplo, exossomos, podem ser produzidos a partir de uma célula cultivada in vitro ou de um fluido corporal de um sujeito. Quando os EVs, por exemplo, exossomos, são produzidos a partir de cultura de células in vitro , várias células produtoras, por exemplo, células HEK293, podem ser usadas. Tipos de células adicio- nais que podem ser usados para a produção dos EVs manipulados por lúmen, por exemplo, exossomos, descritos neste documento incluem, sem limitação, células-tronco mesenquimais, células T, células B, célu- las dendríticas, macrófagos e linhas celulares cancerosas. Exemplos adicionais incluem: células de ovário de hamster chinês (CHO), célu- las-tronco mesenquimais (MSCs), células de fibroblastos de prepúcio humano BJ, células de fibroblastos fHDF, células precursoras neuro- nais AGE.HNº, células amniócitos CAPº, células-tronco mesenquimais adiposas e RPTEC/Células TERT1. Em certas modalidades, uma célu- la produtora não é uma célula dendrítica, macrófago, célula B, mastó- cito, neutrófilo, célula de Kupffer-Browicz, célula derivada de qualquer uma dessas células ou qualquer combinação das mesmas.
[00375] — Algumas modalidades também podem incluir a modificação genética do EV, por exemplo, exossomo, para compreender uma ou mais sequências exógenas para produzir EVs modificados que ex- pressam proteínas exógenas na superfície da vesícula. As sequências exógenas podem compreender uma sequência que codifica o EV, por exemplo, exossomo, proteína ou uma modificação ou um fragmento da proteína EV. Uma cópia extra da sequência que codifica o EV, por exemplo, exossomo, proteína pode ser introduzida para produzir um EV de superfície manipulada tendo uma densidade mais alta da prote-
ína EV. Uma sequência exógena que codifica uma modificação ou um fragmento do EV, por exemplo, exossomo, proteína pode ser introdu- zida para produzir um EV modificado contendo a modificação ou o fra- gmento da proteína EV. Uma sequência exógena que codifica uma etiqueta de afinidade pode ser introduzida para produzir um EV modifi- cado, por exemplo, exossomo, contendo uma proteína de fusão que compreende um marcador de afinidade ligada à proteína EV.
[00376] Em algumas modalidades, a sequência exógena codifica para o Arcabouço X (por exemplo, uma proteína PTGFRN, uma prote- ína BSG, uma proteína IGSF2, uma proteína IGSF3, uma proteína IGSF8, uma proteína ITGB1, uma proteína ITGA4, uma proteína SLC3A2, uma proteína transportadora ATP, ou um fragmento ou vari- ante dos mesmos). Em algumas modalidades, o EV modificado, por exemplo, exossomo, superexpressa o Arcabouço X (por exemplo, uma proteína PTGFRN , uma proteína BSG, uma proteína IGSF2, uma pro- teína IGSF3, uma proteína IGSF8, uma proteína ITGB1, uma proteína ITGAA4, uma proteína SLC3A2, uma Proteína transportadora de ATP, ou um fragmento ou variante desta). Em outras modalidades, o EV, por exemplo, exossomo, é produzido por uma célula que superexpres- sa o Arcabouço X (por exemplo, uma proteína PTGFRN , uma proteína BSG, uma proteína IGSF2, uma proteína IGSF3, uma proteína IGSF8, uma proteína ITGB1, uma proteína ITGA4, uma proteína SLC3A?2, uma proteína transportadora de ATP ou um fragmento ou variante des- ta).
[00377] Em algumas modalidades, a sequência exógena codifica o Arcabouço Y (por exemplo, a proteína MARCKS, proteína MARC- KSL1, proteína BASP1 ou um fragmento ou variante desta). Em algu- mas modalidades, o EV modificado, por exemplo, exossomo, superex- pressa o Arcabouço Y (por exemplo, a proteína MARCKS, proteína MARCKSL1, proteína BASP1 ou um fragmento ou variante desta). Em outras modalidades, o EV, por exemplo, exossomo, é produzido por uma célula que superexpressa o Arcabouço Y (por exemplo, a proteí- na MARCKS, proteína MARCKSL1, proteína BASP1 ou um fragmento ou variante desta).
[00378] A sequência exógena pode ser expressa transitoriamente ou estabilizada na célula produtora ou linha celular por meio de trans- fecção, transformação, transdução, eletroporação ou qualquer outro método apropriado de entrega de gene ou combinação dos mesmos conhecido na técnica. A sequência exógena pode ser integrada ao ge- noma da célula produtora ou permanecer extra cromossômica. A se- quência exógena pode ser transformada como um plasmídeo. As se- quências exógenas podem ser integradas de maneira estável em uma sequência genômica da célula produtora, em um sítio alvo ou em um sítio aleatório. As sequências exógenas podem ser inseridas em uma se- quência genômica da célula produtora, localizada dentro, a montante (ex- tremidade 5') ou a jusante (extremidade 3') de uma sequência endógena que codifica o EV, por exemplo, exossomo, proteína. Vários métodos co- nhecidos na técnica podem ser utilizados para a introdução das sequên- cias exógenas na célula produtora. Por exemplo, células modificadas usando vários métodos de edição de gene (por exemplo, métodos usan- do uma recombinação homóloga, sistema mediado por transposon, sis- tema loxP-Cre, CRISPR/Cas9 CRISPR/Cfp1, CRISPR/C2c1, C2c2, ou C2c3, CRISPR/CasY ou CasX, TAL-nuclease efetora ou TALEN, ou sistemas de nuclease de dedo de zinco (ZFN)) estão dentro do escopo de várias modalidades.
[00379] Em algumas modalidades, a célula produtora é adicional- mente modificada para compreender uma sequência exógena adicio- nal. Por exemplo, uma sequência exógena adicional pode ser incluída para modular a expressão do gene endógeno, modular a resposta imune ou sinalização imune, ou produzir um EV, por exemplo, exos-
somo, incluindo um certo polipeptídeo como uma carga útil ou ligante expresso na superfície adicional. Em algumas modalidades, a célula produtora pode ser adicionalmente modificada para compreender uma sequência exógena adicional conferindo funcionalidades adicionais para os EVs, por exemplo, exossomos, por exemplo, capacidades de direcionamento específicas, funções de entrega, funções enzimáticas, meia-vida aumentada ou diminuída in vivo, etc. Em algumas modali- dades, a célula produtora é modificada para compreender duas se- quências exógenas, uma que codifica a proteína do exossomo ou uma modificação ou um fragmento da proteína do exossomo e a outra que codifica uma proteína que confere as funcionalidades adicionais aos EeXOssomos.
[00380] Mais especificamente, o EV, por exemplo, exossomo, do presente pode ser produzido a partir de uma célula transformada com uma sequência que codifica uma ou mais proteínas exógenas adicio- nais, incluindo, mas não se limitando a ligantes, citocinas ou anticor- pos, ou qualquer combinação dos mesmos. Estas proteínas exógenas adicionais podem permitir a ativação ou modulação de sinais estimula- dores imunológicos adicionais em combinação com o agonista de STING. Proteínas exógenas adicionais exemplares contempladas para uso incluem as proteínas, ligantes e outras moléculas descritas em detalhes no Pedido de Patente US 62/611,140, que é incorporado nes- te documento por referência em sua totalidade. Em algumas modali- dades, o EV, por exemplo, exossomo, é adicionalmente modificado com um ligante que compreende CD40L, OX40L ou CD27L. Em algu- mas modalidades, o EV, por exemplo, exossomo, é modificado adicio- nalmente com uma citocina que compreende 1IL-7, IL-12 ou IL-15. Qualquer uma das uma ou mais proteínas de exossomo descritas nes- te documento podem ser expressas a partir de um plasmídeo, uma sequência exógena inserida no genoma ou outro ácido nucleico exó-
geno, como um RNA mensageiro sintético (mMRNA).
[00381] Em algumas modalidades, o EV, por exemplo, exossomo, é modificado adicionalmente para exibir um anticorpo antagonista ou um anticorpo agonístico ou um fragmento dos mesmos no EV, por exem- plo, exossomo, superfície para direcionar a absorção de EV, ativar ou bloquear as vias celulares para aprimorar o efeito combinatório do agonista de STING. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento deste é um anticorpo contra DEC205, CLEC9A, CLEC6, DCIR, DC-SIGN, LOX-1 ou Langerina. A célula produtora pode ser modificada para compreender uma sequência exógena adicional que codifica um anticorpo antagonista ou um anticorpo agonista. Alternati- vamente, o anticorpo antagonista ou anticorpo agonista pode ser cova- lentemente ligado ou conjugado ao EV, por exemplo, exossomo, por meio de qualquer química de ligação apropriada conhecida na técnica. Exemplos não limitativos de química de ligação apropriada incluem grupos reativos com amina, grupos reativos com carboxila, grupos rea- tivos com sulfidrila, grupos reativos com aldeído, grupos fotorreativos, química ClickIT, biotina-estreptavidina ou outra conjugação de avidina, ou qualquer combinação destes.
11.D.1. Modificação de Glicano de células produtoras ou EVs, por exemplo, exossomos
[00382] Em algumas modalidades, o EV, por exemplo, exossomo, é glicano modificado por meio de tratamento enzimático ou químico. Em uma modalidade, o EV, por exemplo, exossomo, é derivado de uma célula produtora modificada com glicano. Em outra modalidade, a mo- dificação com glicano da célula produtora compreende uma modifica- ção enzimática ou química. Em várias modalidades, a modificação com glicano da célula produtora é o tratamento com kifunensina ou nocaute de um gene de sialiltransferase ou citidililtransferase. Em uma modalidade, a modificação com glicano da célula produtora compre-
ende nocaute do gene citidilitransferase Citidina Monofosfato N- Acetilneuramínico Ácido Sintetase (CMAS). Em uma modalidade, a modificação com glicano da célula produtora compreende nocaute do gene de biossíntese de manose Manosidase Alfa Classe 1h Membro 1 (MANT1A1). Em uma modalidade, a modificação com glicano da célula produtora compreende nocaute do gene de biossíntese de manose Manosidase Alfa Classe 2A Membro 1 (MAN2ZA1).
[00383] A modificação com glicano pode ser a desglicosilação ou desialilação da célula produtora ou dos EVs isolados ou purificados, por exemplo, exossomos. Os EVs, por exemplo, exossomos, podem ser modificados com glicano antes do encapsulamento do agonista de STING ou após o encapsulamento do agonista de STING. A célula produtora ou EV, por exemplo, exossomo, pode ser modificada com glicano (por exemplo, desglicosilada ou dessialilada) cerca ou mais de 99%, 95%, 290%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% em relação a uma célu- la produtora não modificada ou EV, por exemplo, exossomo. A célula produtora ou EV, por exemplo, exossomo, pode ser modificado com glicano entre 95-100%, 90-95%, 85-95%, 80-85%, 75-80%, 70-75%, 65-70%, 60-65%, 55-60%, 50-55%, 45-50%, 40-45%, 35-40%, 30- 35%, 25-30%, 20-25%, 15-20%, 10-15%, ou 5-10% em relação a uma célula produtora não modificada ou EV, por exemplo, exossomo.
[00384] A célula produtora ou EV, por exemplo, exossomo, pode ser modificada com glicano por meio de técnicas de edição química, enzimática ou genética. A modificação com glicano pode incluir o tra- tamento de células produtoras com produtos químicos, pequenas mo- léculas ou enzimas que alteram ou inibem glicosiltransferases, galac- tosiltransferases, sialiltransferases ou enzimas citidilitransferase na célula produtora, resultando em EVs, por exemplo, exossomos, deri- vados da célula produtora que são modificadas com glicano. A modifi-
cação com glicano também pode incluir o tratamento de EVs, por exemplo, exossomos, com produtos químicos ou enzimas que alteram os glicanos na superfície de EV, como inibidores de moléculas peque- nas ou hidrolases de glicosídeo, como enzimas sialidase ou neurami- nidase, bem como qualquer outro tratamento químico ou de enzima por modificação com glicano.
[00385] Em algumas modalidades, a célula produtora ou EVs, por exemplo, exossomos, é modificada com glicano por meio de tratamen- to com kifunensina. A kifunensina é um inibidor da manosidase | que inibe a manosidase | de remover resíduos de manose das glicoproteí- nas precursoras. O tratamento de células com kifunensina resulta em glicoproteínas com resíduos de manose terminal. Outro inibidor da manosidase | que pode ser usado é a 1-desoximanojirimicina. Outras pequenas moléculas que inibem a alfa-manosidase | ou |l ou as enzi- mas beta-manosidase também podem ser utilizadas, como a swainso- nina.
[00386] Algumas modalidades também podem incluir o tratamento de células produtoras ou EVs, por exemplo, exossomos, com glicosí- deos hidrolases, como sialidases, neuraminidases ou manosidases. Qualquer glicosídeo hidrolase conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, mas não se limitando a, exo-a-sialidases, endo-a-sialidases, N-acetilneuraminidase, sialidase 1, sialidase 2, sialidase, 3 ou sialida- se 4, qualquer outro apropriado sialidase, a-manosidases, B-manosi- dases ou qualquer combinação destas.
[00387] Além disso, a modificação com glicano pode incluir alterar geneticamente a célula produtora por meio de uma técnica de edição de genoma apropriada para ter a expressão da enzima glicano altera- da, tal como nocaute ou knock down de glicosiltransferases, galactosil- transferases, sialiltransferase ou enzimas citidililtransferase na célula produtora. Qualquer técnica de edição de genoma conhecida na técni-
ca pode ser usada, incluindo, mas não se limitando a, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cfp1, CRISPR/C2c1, C2c2 ou C2c3, CRISPR/CasY ou CasX, nuclease efetora de TAL ou TALEN, ou sistemas de nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou qualquer combinação destes.
[00388] Genes exemplificativos que podem ser alterados incluem Citidina Monofosfato N-Acetilneuramínico Sintetase (CMAS), e os ge- nes de biossíntese de manose Manosidase Alfa Classe 1h Membro 1 (MANT1A1) e Manosidase Alfa Classe 2A Membro 1 (MAN?ZA1).
[00389] Os EVs modificados com glicano, por exemplo, exossomos, também podem ser derivados de uma linhagem de células produtoras com superexpressão de PTGFRN que também possui ben glicano modificado. Em tal exemplo, a linhagem celular produtora pode ser transformada, transfectada, transduzida ou de outra forma genetica- mente modificada para expressar o gene PTGFRN e o produto do ge- ne e para ter a expressão da enzima glicano transferase alterada. Em uma modalidade, a célula produtora é alterada para superexpressar o gene PTGFRN e o produto do gene e knockdown ou knock out do ge- ne da citidililtransferase CMAS. Alternativamente, a linhagem celular produtora pode ser geneticamente modificada para expressar o gene PTGFRN e o produto do gene e tratada com kifunensina ou outra ma- nosidase, glicosiltransferase, galactosiltransferase, sialiltransferase ou inibidores da citidilitransferase conhecidos na técnica, ou qualquer combinação destes, resultando assim em uma célula produtora que ambos superexpressam o gene PTGFRN e o produto do gene, e alte- ram a expressão de glicano. 11l. Método de produção de EVs com agonistas STING IL.A. Métodos para encapsular agonistas STING em EVs
[00390] Os agonistas de STING podem ser encapsulados em EVs, por exemplo, exossomos, por meio de qualquer técnica apropriada co- nhecida na técnica. É contemplado que todas as formas conhecidas de carregamento de biomoléculas em EVs, por exemplo, exossomos, são consideradas adequadas para uso neste documento. Essas técni- cas incluem difusão passiva, eletroporação, transfecção química ou polimérica, transdução viral, ruptura mecânica da membrana ou cisa- lhamento mecânico ou qualquer combinação destas. O agonista de STING e um EV, por exemplo, exossomo, podem se incubado em um tampão apropriado durante o encapsulamento.
[00391] Em uma modalidade, um agonista de STING é encapsulado por um EV, por exemplo, exossomo, por difusão passiva. O agonista de STING e o EV, por exemplo, exossomo, podem ser misturados e incubados por um período de tempo suficiente para o agonista STING se difundir através da bicamada lipídica da vesícula, tornando-se en- capsulado no EV, por exemplo, exossomo. O agonista de STING e o EV, por exemplo, exossomo, podem ser incubados juntos por cerca de 1 a 30 horas, 2 a 24 horas, 4 a 18 horas, 6 a 16 horas, 8 a 14 horas, a 12 horas, 6 a 12 horas, 12 a 20 horas, 14 a 18 horas ou 20 a 30 horas. O agonista de STING e o EV, por exemplo, exossomo, podem ser incubados juntos por cerca de 2 horas, 4 horas, 6, horas, 8, horas, 10, horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 26 horas ou 30 horas.
[00392] As condições tampão da solução de EVs, por exemplo, exossomos, também podem ser alteradas para otimizar o encapsula- mento do agonista de STING. Em uma modalidade, o tampão pode ser uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) com sacarose. O PBS é um tampão bem conhecido dos versados na técnica. Modifica- ções de tampão adicionais também podem ser usadas, tais como pro- tetores de cisalhamento, modificadores de viscosidade e/ou solutos que afetam as propriedades estruturais da vesícula. Excipientes tam- bém podem ser adicionados para melhorar a eficiência do encapsula- mento do agonista de STING, como materiais de amolecimento da membrana e agentes de aglomeração molecular. Outras modificações no tampão podem incluir faixas específicas de pH e/ou concentrações de sais, solventes orgânicos, pequenas moléculas, detergentes, zwitte- ríons, aminoácidos, polímeros e/ou qualquer combinação dos acima, incluindo múltiplas concentrações.
[00393] A temperatura da solução de EVs, por exemplo, exossomos e agonistas de STING durante a incubação pode ser alterada para otimizar o encapsulamento do agonista de STING. A temperatura pode ser a temperatura ambiente. A temperatura pode estar entre cerca de 15º C a 90º C, 15-30º C, 30-50º C, 50-90º C. A temperatura pode estar em cerca de 15º C, 20º C, 35º C, 30º C, 35º C, 37º C, 40º C, 45º C, 50º C, 55º C, 60º C, 65º C, 70º C, 75º C, 80º C, 85º C ou 90º C.
[00394] A concentração do agonista de STING durante a incubação do agonista com os EVs, por exemplo, exossomos, também pode ser alterada para otimizar o encapsulamento do agonista de STING. À concentração do agonista pode estar entre pelo menos 0,01 mM e 100 mM de agonista de STING. A concentração do agonista pode ser de pelo menos 0,01-1 mM, 1-10 mM, 10-50 mM ou 50-100 mM. A concen- tração do agonista pode ser de pelo menos 0,01 mM, 0,02 mM, 0,03 MM, 0,04 mM, 0,05 mM, 0,06 mM, 0,07 mM, 0,08 mM, 0,09 mM, 0,1 MM, 0,2 MM, 0,3 MM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 MM, 1 MM, 2 MM, 3 mM, 4mM, 5 MM, 6 MM, 7 mM, 8 MM, 9 mM, 10 MM, 15 MM, 20 mM 30 mM, 35 mM, 40 MM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM ou 100 mM.
[00395] O número de partículas extracelulares incubadas com o agonista de STING também pode ser alterado para otimizar o encap- sulamento do agonista de STING. O número de partículas de EV puri- ficadas, por exemplo, exossomo, pode estar entre pelo menos cerca de 10º a pelo menos cerca de 10º partículas totais de vesículas purifi-
cadas. O número de partículas purificadas pode estar entre cerca de 108 a 108, 10*º a 10º6, 10º a 10%, ou 10*º a 10º? de partículas totais de vesículas purificadas. O número de partículas purificadas pode ser pe- lo menos de cerca de 106, 108, 10º, 1012, 1074, 106, 10º8, or 10º de partículas totais de vesículas purificadas.
[00396] Em algumas modalidades, as uma ou mais frações podem ser introduzidas em células produtoras adequadas usando macromo- léculas sintéticas, como lipídios e polímeros catiônicos (Papapetrou et al., Gene Therapy 12: S118-S8130 (2005)). Em algumas modalidades, os lipídios catiônicos formam complexos com uma ou mais porções por meio de interações de carga. Em algumas dessas modalidades, os complexos carregados positivamente se ligam à superfície celular car- regada negativamente e são absorvidos pela célula por endocitose. Em algumas outras modalidades, um polímero catiônico pode ser usa- do para transfectar células produtoras. Em algumas dessas modalida- des, o polímero catiônico é polietilenimina (PEI). Em certas modalida- des, produtos químicos como fosfato de cálcio, ciclodextrina ou poli- breno, podem ser usados para introduzir uma ou mais frações nas cé- lulas produtoras. A uma ou mais frações também podem ser introduzi- das em uma célula produtora usando um método físico, como trans- fecção mediada por partículas, "arma de genes", biolística ou tecnolo- gia de bombardeio de partículas (Papapetrou et al., Gene Therapy 12: S118-S8130 (2005)) Um gene repórter como, por exemplo, beta- galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase, luciferase ou proteína verde fluorescente pode ser usado para avaliar a eficiência da trans- fecção da célula produtora.
[00397] Em algumas modalidades, uma ou mais frações são intro- duzidas na célula produtora por transdução viral. Vários vírus podem ser usados como veículos de transferência de genes, incluindo o vírus da leucemia murina moloney (MMLV), adenovírus, vírus adenoassociado
(AAV), vírus do herpes simplex (HSV), lentivírus e espumavírus. Os veí- culos de transferência de genes mediados por vírus compreendem veto- res baseados em vírus de DNA, como adenovírus, vírus adenoassociado e vírus do herpes, bem como vetores baseados em retrovirais.
[00398] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por eletroporação viral. A eletroporação cria poros transitórios na membrana celular, permitindo a introdução de várias moléculas na célula. Em algumas modalidades, o DNA e o RNA, bem como os agentes terapêuticos polipeptídicos e não polipep- tídicos, podem ser introduzidos na célula produtora por eletroporação.
[00399] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por microinjeção. Em algumas modali- dades, uma micropipeta de vidro pode ser usada para injetar a uma ou mais frações na célula produtora no nível microscópico.
[00400] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por extrusão.
[00401] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por sonicação. Em algumas modalida- des, a célula produtora é exposta a ondas sonoras de alta intensidade, causando ruptura transitória da membrana celular, permitindo o carre- gamento da uma ou mais frações.
[00402] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por fusão celular. Em algumas modali- dades, a uma ou mais frações são introduzidas por fusão celular elétri- ca. Em outras modalidades, o polietileno glicol (PEG) é usado para fundir as células produtoras. Em modalidades adicionais, o vírus sen- dai é usado para fundir as células produtoras.
[00403] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por lise hipotônica. Em tais modalida- des, a célula produtora pode ser exposta a um tampão de baixa força iônica, fazendo com que estourem, permitindo o carregamento de uma ou mais frações. Em outras modalidades alternativas, a diálise contro- lada contra uma solução hipotônica pode ser usada para aumentar a célula produtora e criar poros na membrana celular produtora. A célula produtora é subsequentemente exposta a condições que permitem ve- dar novamente a membrana.
[00404] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por tratamento com detergente. Em cer- tas modalidades, a célula produtora é tratada com um detergente neu- tro que transitoriamente compromete a membrana da célula produtora criando poros que permitem o carregamento da uma ou mais frações. Depois que as células produtoras são carregadas, o detergente é la- vado, vedando a membrana novamente.
[00405] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações introdu- zidas na célula produtora por endocitose mediada por receptor. Em certas modalidades, as células produtoras têm um receptor de superfí- cie que, após a ligação de uma ou mais frações, induz a internalização do receptor e das frações associadas.
[00406] Em algumas modalidades, a uma ou mais frações são in- troduzidas na célula produtora por filtração. Em certas modalidades, as células produtoras e a uma ou mais frações podem ser forçados atra- vés de um filtro de tamanho de poro menor que a célula produtora, causando interrupção transitória da membrana celular produtora e permitindo que a uma ou mais frações entrem na célula produtora.
[00407] Em algumas modalidades, a célula produtora é submetida a vários ciclos de congelamento e descongelamento, resultando na rup- tura da membrana celular, permitindo o carregamento de uma ou mais frações. IV. Purificação EV
[00408] Os EVs, por exemplo, exossomos, preparados para a pre-
sente descrição podem ser isolados das células produtoras. É con- templado que todas as formas conhecidas de isolamento de EVs, por exemplo, exossomos, são consideradas adequadas para uso neste documento. Por exemplo, as propriedades físicas de EVs, por exem- plo, exossomos, podem ser empregadas para separá-los de um meio ou outro material de origem, incluindo a separação com base na carga elétrica (por exemplo, separação eletroforética), tamanho (por exem- plo, filtração, peneiramento molecular, etc.), densidade (por exemplo, centrifugação regular ou gradiente), constante de Svedberg (por exemplo, sedimentação com ou sem força externa, et.c). Alternativa ou adicionalmente, o isolamento pode ser baseado numa ou mais propri- edades biológicas e incluir métodos que podem empregar marcadores de superfície (por exemplo, para precipitação, ligação reversível à fase sólida, separação FACS, ligação a ligante específico, ligação a ligante não específico, etc.). Em ainda outros métodos contemplados, os EVs, por exemplo, os exossomos também podem ser fundidos usando mé- todos químicos e/ou físicos, incluindo fusão induzida por PEG e/ou fu- são ultrassônica.
[00409] Os EVWVs, por exemplo, exossomos, também podem ser puri- ficados após incubação com o agonista de STING para remover o agonista de STING não encapsulado da composição. Todas as formas de métodos anteriormente divulgados também são consideradas ade- quadas para uso neste documento, incluindo a separação com base nas propriedades físicas ou biológicas de EVs, por exemplo, exosso- mos.
[00410] O isolamento, purificação e o enriquecimento podem ser feitos de maneira geral e não seletiva (tipicamente incluindo centrifu- gação em série). Alternativamente, o isolamento, a purificação e o en- riquecimento podem ser feitos de uma maneira mais específica e sele- tiva (por exemplo, usando marcadores de superfície específicos para células produtoras). Por exemplo, marcadores de superfície específi- cos podem ser usados em imunoprecipitação, classificação FACS, pu- rificação por afinidade, ligantes ligados a grânulos para separação magnética, etc.
[00411] Em algumas modalidades, a cromatografia de exclusão de tamanho pode ser utilizada para isolar ou purificar os EVs, por exem- plo, exossomos. As técnicas de cromatografia de exclusão de tamanho são conhecidas na técnica. Técnicas exemplificativas e não limitantes são fornecidas neste documento. Em algumas modalidades, uma fra- ção de volume vazio é isolada e compreende os EVs, por exemplo, exossomos, de interesse. Em algumas modalidades, por exemplo, a centrifugação de gradiente de densidade pode ser utilizada para isolar ainda mais os EVs, por exemplo, exossomos. Além disso, em algumas modalidades, pode ser desejável separar ainda mais os EVs derivados de células produtoras, por exemplo, exossomos, de EVs de outra ori- gem. Por exemplo, os EVs derivados de células produtoras, por exem- plo, exossomos, podem ser separados de EVs derivados de células não produtoras, por exemplo, exossomos, por captura imunossorvente usando um anticorpo antígeno específico para a célula produtora.
[00412] Em algumas modalidades, o isolamento de EVs, por exem- plo, exossomos, pode envolver cromatografia de exclusão de tamanho ou cromatografia de íons, como troca aniônica, troca catiônica ou cro- matografia de modo misto. Em algumas modalidades, o isolamento de EVs, por exemplo, exossomos, pode envolver dessalinização, diálise, filtração de fluxo tangencial, ultrafiltração ou diafiltração, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o isolamento de EVs, por exemplo, exossomos, pode envolver combinações de métodos que incluem, mas não estão limitados a, centrifugação diferencial, filtração por membrana baseada em tamanho, concentração e/ou centrifugação zonal de taxa. Em algumas modalidades, o isolamento de EVs, por exemplo, exossomos, pode envolver uma ou mais etapas de centrifu- gação. A centrifugação pode ser realizada em cerca de 50.000 a
150.000 x g. A centrifugação pode ser realizada a cerca de 50.000 x 9,
75.000 x g, 100.000 x g, 125.000 x g, ou 150.000 x g. V. Administração Terapêutica V.A. Modulação imunológica e dosagem
[00413] São fornecidos neste documento métodos para induzir e/ou modular uma resposta imunológica ou inflamatória em um sujeito pela administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING.
[00414] As células dendríticas (DCs) são uma população de células presentes no antígeno derivadas de uma linhagem de células hemato- poiéticas que ligam os sistemas imunológico inato e adaptativo. As DCs compartilham um precursor mieloide comum com monócitos e macrófagos e são geralmente separadas em dois grupos principais: DCs plasmocitoides (pDCs) e DCs mieloides (mMDCs), que também são conhecidas como DCs convencionais (cDCs). Os mDCs são ainda classificados com base no seu desenvolvimento a partir de precurso- res mieloides ou linfoides e nos níveis de expressão de CD8a, CD4 e C11b. Uma terceira população de DCs são DCs derivadas de monóci- tos (moDCs) que surgem de um precursor de monócitos, não de um progenitor de DC como pDCs e cDCs. As moDCs se desenvolvem após receber sinais inflamatórios. DCs imaturas residem no tecido pe- riférico antes da maturação. Várias vias de sinalização levam à matu- ração de DC, incluindo as cascatas de sinalização induzidas por re- ceptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Cada subconjunto de DCs imaturas varia nos padrões de expressão de proteínas de PRRs, o que permite que as populações de DCs imaturas respondam de ma- neira diferente após a ativação do mesmo PRR. Isso resulta na modu- lação da resposta imunológica mediada por DCs. Os PRRs presentes nas DCs incluem receptores tipo Toll (TLRs), receptores de lectina do tipo C, receptores do tipo gene indutível por ácido retinoico (RIG)-lI (RLRs), receptores do tipo NOD (NLRs) e STING.
[00415] Avia STING é a via de detecção de DNA dominante tanto em mDCs quanto em pDCs. A ativação da via STING em DCs resulta em IFN Tipo | e produção de citocinas pró-inflamatórias via TBK1, IRF3 e sinalização de NF-KB. A ligação do IFN aos seus receptores nas células resulta na ativação de elementos de resposta estimulados por IFN e na transcrição de genes sensíveis a IFN que resultam na resposta imunológica e inflamatória. A sinalização de IFN também ini- cia DCs de forma cruzada para promover a persistência do antígeno, altera o repertório de antígeno disponível para apresentação de MHCI, potencializa a apresentação de MHCI de antígenos e aumenta a ex- pressão de superfície geral de MHCI, MHCII e moléculas coestimulató- rias CD40, CD80 e CD86. Essas ações resultam no aumento do pri- ming de células T CD8 + específicas do tumor e na iniciação da res- posta imunológica adaptativa.
[00416] Em algumas modalidades, o método de administração de um EV, por exemplo, exossomo, encapsulando um agonista de STING e/ou expressando um agonista de STING na superfície para um sujeito em necessidade deste ativa ou induz células dendríticas, induzindo ou modulando uma resposta imunológica ou inflamatória no sujeito. Em algumas modalidades, as células dendríticas ativadas são células dendríticas mieloides. Em algumas modalidades, as células dendríti- cas são células dendríticas plasmocitoides.
[00417] Em algumas modalidades, o método induz a produção de interferon (IFN)-B. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em indução de IFN-B entre 2 e 10.000 vezes maior em comparação com a admi-
nistração de um agonista de STING sozinho. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície) pode resultar em cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 ve- zes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 ve- zes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 dobrar, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800- 900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 ve- zes, 7000-8000 vezes, 8000-9000 vezes ou 9000-10.000 vezes maior indução de IFN-B em comparação com a administração de um agonis- ta de STING sozinho. A administração de EVs, por exemplo, exosso- mos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsu- lado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em mais do que cerca de 2 vezes, > 5 vezes, > 10 vezes, > 20 vezes, > 30 vezes, > 40 vezes, > 50 vezes, > 60 vezes, > 70 vezes, > 80 vezes, > 90 vezes, > 100 vezes, > 200 vezes, > 300 vezes, > 400 vezes, > 500 vezes, > 600 vezes, > 700 vezes, > 800 vezes, > 900 vezes, > 1000 vezes, > 2.000 vezes, > 3.000 vezes, > 4000 vezes, > 5.000 vezes, >
6.000 vezes, > 7.000 vezes, > 8.000 vezes, > 9.000 vezes ou > 10.000 vezes a indução de IFN-B em comparação com a administração de um agonista de STING sozinho. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, en- capsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em indução de IFN-B entre 2 e 10.000 vezes maior em comparação com a produção de IFN-B de linha de base do sujeito. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar entre cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200- 300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 dobrar, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800-900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000- 6000 vezes, 6000-7000 vezes, 7000-8000 vezes, 8000-9000 vezes ou 9000-10.000 vezes maior indução de IFN-B em comparação com a produção de IFN-B de linha de base do sujeito. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING pode resultar em mais do que cerca de 2 vezes, > 5 vezes, > vezes, > 20 vezes, > 30 vezes, > 40 vezes, > 50 vezes, > 60 vezes, > 70 vezes, > 80 vezes, > 90 vezes, > 100 vezes, > 200 vezes, > 300 vezes, > 400 vezes, > 500 vezes, > 600 vezes, > 700 vezes, > 800 ve- zes, > 900 vezes, > 1000 vezes, > 2.000 vezes, > 3.000 vezes, > 4.000 vezes, > 5.000 vezes, > 6.000 vezes, > 7.000 vezes, > 8.000 vezes, >
9.000 vezes ou > 10.000 vezes a indução de IFN-B em comparação com a produção de IFN-B de linha de base do sujeito.
[00418] Em algumas modalidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, divulgado neste documento a um sujeito também pode regular os níveis de outros moduladores imunológicos (por exemplo, citocinas ou quimiocinas). Em certas modalidades, o método divulgado neste documento pode aumentar o nível de IFN-y, CXCL9 e/ou CXCL10. Em algumas modalidades, a administração de EVs, por exemplo, exossomos, descrita neste documento (pode resultar em cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 ve- zes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 ve- zes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800- 900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 ve- zes, Quantidade 7000-8000 vezes, 8000-9000 vezes ou 9000-10000 vezes maior de IFN-y, CXCL9 e/ou CXCL10 em comparação com um agonista de STING livre.
[00419] Em algumas modalidades, o método induz a ativação de células dendríticas mieloides (mMDC). A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em ativação de mDC entre 2 e 50.000 vezes maior em comparação com a administração de um agonista de STING sozinho. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na su- perfície luminal ou exterior) pode resultar em cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800-900 vezes, 900-1000 vezes, 1000- 2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 vezes, 7000-8000 vezes, 8.000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-15.000 vezes, 15.000-20.000 ve- zes, 20.000-25.000 vezes, 25.000-30.000 vezes, 30.000-35.000 vezes,
35.000-40.000 vezes, 40.000-45.000 vezes, ou 45.000-50.000 vezes maior ativação de MDC em comparação com a administração de um agonista de STING sozinho. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, en- capsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em mais do que cerca de 2 vezes, > 5 vezes, > 10 vezes, > 20 vezes, > 30 vezes, > 40 vezes, > 50 vezes, > 60 vezes, > 70 vezes, > 80 ve- zes, > 90 vezes, > 100 vezes, > 200 vezes, > 300 vezes, > 400 vezes, > 500 vezes, > 600 vezes, > 700 vezes, > 800 vezes, > 900 vezes, > 1000 vezes, > 2.000 vezes, > 3.000 vezes, > 4000 vezes, > 5.000 ve- zes, > 6.000 vezes, > 7.000 vezes, > 8.000 vezes, > 9.000 vezes ou >
10.000 vezes, > 15.000 vezes, > 20.000 vezes, > 25.000 vezes, >
30.000 vezes, > 35.000 vezes, > 40.000 vezes, > 45.000 vezes ou >
50.000 vezes a ativação de mMDC em comparação com a administra- ção de um agonista de STING sozinho.
[00420] A administração de EVs, por exemplo, exossomos, com- preendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou ex- presso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em ativação de mDC entre 2 e 10.000 vezes maior em comparação com a ativação de mDC de linha de base do sujeito. A administração de EVs, por exem- plo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resul- tar em cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30- 40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800- 900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 ve- zes, 7000-8000 vezes, 8.000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-
15.000 vezes, 15.000-20.000 vezes, 20.000-25.000 vezes, 25.000-
30.000 vezes, 30.000-35.000 vezes, 35.000-40.000 vezes, 40.000-
45.000 vezes, ou 45.000-50.000 vezes maior ativação de mDC em comparação com a ativação de mDC de linha de base do sujeito de um agonista de STING sozinho. A administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, en- capsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) pode resultar em mais do que cerca de 2 vezes, > 5 vezes, > 10 vezes, > 20 vezes, > 30 vezes, > 40 vezes, > 50 vezes, > 60 vezes, > 70 vezes, > 80 ve- zes, > 90 vezes, > 100 vezes, > 200 vezes, > 300 vezes, > 400 vezes, > 500 vezes, > 600 vezes, > 700 vezes, > 800 vezes, > 900 vezes, > 1000 vezes, > 2.000 vezes, > 3.000 vezes, > 4000 vezes, > 5.000 ve-
zes, > 6.000 vezes, > 7.000 vezes, > 8.000 vezes, > 9.000 vezes ou >
10.000 vezes, > 15.000 vezes, > 20.000 vezes, > 25.000 vezes, >
30.000 vezes, > 35.000 vezes, > 40.000 vezes, > 45.000 vezes ou >
50.000 vezes a ativação de MDC em comparação com a ativação de mDC de linha de base do sujeito.
[00421] Em algumas modalidades, o método de administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) não induz a ativação de monócitos em comparação com a ativação de monócitos de linha de base do sujeito. Em algumas moda- lidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, compre- endendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou ex- presso na superfície luminal ou exterior) resulta em menos do que cer- ca de <2 vezes, <5 vezes, <10 vezes, <20 vezes, <30 vezes, <40 ve- zes, <50 vezes, <60 vezes, <70 vezes, <80 vezes, <90 vezes, <100 vezes, <200 vezes, <300 vezes, <400 vezes, <500 vezes, <600 vezes, <700 vezes, <800 vezes, <900 vezes, <1000 vezes, <2000 vezes, <3000 vezes, <4000 vezes, <5000 vezes, <6000 vezes, <7000 vezes, <8000 vezes, <9.000 vezes, <10.000 vezes, <15.000 vezes, <20.000 vezes, <25.000 vezes, <30.000 vezes, <35.000 vezes, <40.000 vezes, <45.000 vezes, <50.000 vezes, <55.000 vezes, <60.000 vezes, <65.000 vezes, <70.000 vezes, <75.000 vezes, <80.000 vezes, <85.000 vezes, <90.000 vezes, <95.000 vezes, <100.000 vezes, <200.000 vezes, <300.000 vezes, <400.000 vezes, <500.000 vezes, <600.000 vezes, <700.000 vezes, <800.000 vezes, <900.000 vezes ou <1.000.000 vezes de indução da ativação de monócitos em relação à ativação de monócitos de linha de base do sujeito. Em algumas moda- lidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, compre- endendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou ex- presso na superfície luminal ou exterior) a um sujeito resulta em me-
nos de cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10 -20 vezes, 20-30 vezes, 30- 40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200 -300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800- 900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000 -4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 vezes, 7000-8000 vezes, 8.000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-
15.000 vezes, 15.000-20.000 vezes, 20.000-25.000 vezes, 25.000 -
30.000 vezes, 30.000-35.000 vezes, 35.000-40.000 vezes, 40.000-
45.000 vezes, 45.000-50.000 vezes, 55.000-60.000 vezes, 60.000-
65.000 vezes, 65.000-70.000 vezes, 70.000-75.000 vezes, 75.000-
80.000 vezes, 80.000 -85.000 vezes, 85.000-90.000 vezes, 90.000-
95.000 vezes, 95.000-100.000 vezes, 100.000-200.000 vezes,
200.000-300.000 vezes, 300.000-400.000 vezes, 400.000-500.000 ve- zes, 500.000-600.000 vezes, 600.000-700.000 vezes, 700.000-
800.000 vezes, 800.000-900.000 vezes, ou 900.000-1.000.000 vezes indução de ativação de monócitos em relação à ativação de monócitos de linha de base do sujeito.
[00422] Em algumas modalidades, o método de administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) a um sujeito não induz a ativação de monócitos em com- paração com a administração do agonista de STING sozinho. Em al- gumas modalidades, a administração de um EV, por exemplo, exos- somo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsu- lado ou expresso na superfície luminal ou exterior) resulta em menos do que cerca de <2 vezes, <5 vezes, <10 vezes, <20 vezes, <30 ve- zes, <40 vezes, <50 vezes, <60 vezes, <70 vezes, <80 vezes, <90 ve- zes, <100 vezes, <200 vezes, <300 vezes, <400 vezes, <500 vezes, <600 vezes, <700 vezes, <800 vezes, <900 vezes, <1000 vezes,
<2000 vezes, <3000 vezes, <4000 vezes, <5000 vezes, <6000 vezes, <7000 vezes, <8000 vezes, <9000 vezes, <10.000 vezes, <15.000 ve- zes, <20.000 vezes, <25.000 vezes, <30.000 vezes, <35.000 vezes, <40.000 vezes, <45.000 vezes ou <50.000 vezes indução de ativação de monócitos em relação à quantidade de ativação de monócitos após administração do agonista de STING livre. Em algumas modalidades, a administração de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na su- perfície luminal ou exterior) a um sujeito em menos do que cerca de 2- vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800-900 vezes, 900- 1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 vezes, 7000-8000 ve- zes, 8.000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-15.000 vezes,
15.000-20.000 vezes, 20.000-25.000 vezes, 25.000-30.000 vezes,
30.000-35.000 vezes, 35.000-40.000 vezes, 40.000-45.000 vezes, ou
45.000-50.000 vezes a indução de ativação de monócitos em relação à quantidade de ativação de monócitos após administração de um agonista de STING sozinho. A ativação de monócitos pode ser medida pela expressão de superfície de CD86 no monócito, ou por qualquer outro marcador de ativação de monócitos apropriado conhecido na técnica.
[00423] Devido aos efeitos terapêuticos melhorados associados a EVs, por exemplo, exossomos, descritos neste documento, em algu- mas modalidades, as dosagens mais baixas do EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, en- capsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) podem ser distribuídos em comparação com o agonista de STING livre. Além dis-
so, a distribuição não seletiva de altas doses de agonistas de STING pode atenuar as respostas imunoestimulatórias desejáveis. Conse- quentemente, porque os EVs, por exemplo, exossomos, descritos nes- te documento podem ser administrados em doses mais baixas, em al- gumas modalidades, eles podem operar em uma janela terapêutica mais ampla e reduzir as responsabilidades (por exemplo, toxicidade sistêmica, morte de células imunológicas, falta de seletividade celular) observado com agonistas de STING livres.
[00424] As composições descritas neste documento podem ser administradas em uma dosagem suficiente para melhorar a doença, distúrbio, condição ou sintoma do sujeito em necessidade destas. Em algumas modalidades, a dosagem do EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING administrado a um sujeito em necessidade está entre cerca de 0,01 a 0,1 uM, 0,1 a 1 uM, 1a 10 UM, a 100 UM ou 100 a 1000 UM. Em certas modalidades, a dosagem do EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING administrado a um sujeito em necessidade é de cerca de 0,01 UM, 0,05 UM, 0,1 UM, 0,2 UM, 0,3 UM, 0,4 UM, 0,5 UM, 0,6 UM, 0,7 UM, 0,8 uM, 0,9 uM, 1 uM, 2 uM, 3 uM, 4 uM, 5 uM, 6 uM, 7 uM, 8 UM, 9 UM, 10 UM, 11 UM, 12 UM, 13 UM, 14 UM, 15 UM, 16 UM, 17 UM, 18 UM, 19 UM, 20 UM, 25 uM, 30 uM, 35 uM, 40 UM, 45 UM, 40 UM, 55 UM, 60 UM, 65 UM, 70 UM, 75 UM, 80 uM, 85 uM, 90 uM, 95 uM, 100 UM, 150 UM, 200 UM, 250 UM, 300 UM, 350 UM, 400 UM, 450 UM, 500 UM, 550 UM, 600 UM, 650 UM, 700 UM, 750 UM, 800 uM, 850 uM, 900 UM, 950 uM ou 1000 UM.
[00425] Em algumas modalidades, a quantidade de EV, por exem- plo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) adminis- trado a um sujeito em necessidade é inferior a 2 vezes, < 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes,
80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes, 3000 vezes, 4000 vezes, 5000 vezes, 6000 vezes, 7000 vezes, 8000- vezes, 9.000 vezes, 10.000 vezes, 15.000 vezes, 20.000 vezes,
25.000 vezes, 30.000 vezes, 35.000 vezes, 40.000 vezes, 45.000 ve- zes ou 50.000 vezes em relação à quantidade de um agonista de STING livre necessário para efetuar os mesmos resultados de melho- ria em um sujeito em necessidade. Em algumas modalidades, a quan- tidade do EV, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície lumi- nal ou exterior) a um sujeito em necessidade está entre menos do que cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 ve- zes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 ve- zes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800- 900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 ve- zes, 7000-8000 vezes, 8.000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-
15.000 vezes, 15.000-20.000 vezes, 20.000-25.000 vezes, 25.000-
30.000 vezes, 30.000-35.000 vezes, 35.000-40.000 vezes, 40.000-
45.000 vezes, ou 45.000-50.000 vezes menos em relação à quantida- de de um agonista de STING livre para o efeito dos mesmos resulta- dos de melhora em um sujeito em necessidade.
[00426] Em algumas modalidades, o método de administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING não induz inflamação sistêmica em comparação com a infla- mação sistêmica de linha de base do sujeito. Em algumas modalida- des, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreen- dendo um agonista de STING resulta em menos do que cerca de 2 vezes, <5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 dobrado,
60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1.000 vezes, 2.000 vezes, 3.000 vezes, 4.000 vezes, 5.000 ve- zes, 6.000 vezes, 7.000 vezes, 8.000 vezes, 9.000 vezes, 10.000 ve- zes, 15.000 vezes, 20.000 indução de inflamação sistêmica dobrada,
25.000 vezes, 30.000 vezes, 35.000 vezes, 40.000 vezes, 45.000 ve- zes ou 50.000 vezes em relação à inflamação em relação à inflamação sistêmica de linha de base do sujeito. Em algumas modalidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING a um sujeito resulta em menos de cerca de 2-5 ve- zes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500- 600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800-900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000- 5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 vezes, 7000-8000 vezes, 8000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-15.000 vezes, 15.000-
20.000 vezes, 20.000-25.000 vezes, 25.000-30.000 vezes, 30.000-
35.000 vezes, 35.000-40.000 vezes, 40.000-45.000 vezes, ou 45.000-
50.000 vezes a indução de inflamação sistêmica em relação à inflama- ção sistêmica de linha de base do sujeito.
[00427] Em algumas modalidades, o método de administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) a um sujeito não induz a inflamação sistêmica em compa- ração com a administração do agonista de STING sozinho. Em algu- mas modalidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) resulta em menos do que cerca de 2 vezes, <5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes,
50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 ve- zes, 300 vezes, 400 vezes, 500- dobrado, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes, 3000 vezes, 4000 vezes, 5000 vezes, 6000 vezes, 7000 vezes, 8000 vezes, 9000 vezes, 10.000 vezes, 15.000 vezes, 20.000 vezes, 25.000 vezes, 30.000 vezes,
35.000 vezes, 40.000 vezes, 45.000 vezes ou 50.000 vezes indução de inflamação sistêmica em relação à quantidade de inflamação sis- têmica após administração do agonista de STING livre. Em algumas modalidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) a um sujeito em menos do que cerca de 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-20 vezes, 20-30 vezes, 30-40 vezes, 40-50 vezes, 50-60 vezes, 60-70 vezes, 70-80 vezes, 80-90 vezes, 90-100 vezes, 100-200 vezes, 200-300 vezes, 300-400 vezes, 400-500 vezes, 500-600 vezes, 600-700 vezes, 700-800 vezes, 800- 900 vezes, 900-1000 vezes, 1000-2000 vezes, 2000-3000 vezes, 3000-4000 vezes, 4000-5000 vezes, 5000-6000 vezes, 6000-7000 ve- zes, 7000-8000 vezes, 8.000-9000 vezes, 9.000-10.000 vezes, 10.000-
15.000 vezes, 15.000-20.000 vezes, 20.000-25.000 vezes, 25.000-
30.000 vezes, 30.000-35.000 vezes, 35.000-40.000 vezes, 40.000-
45.000 vezes, ou 45.000-50.000 vezes a indução de inflamação sistê- mica em relação à quantidade de inflamação sistêmica após adminis- tração de um agonista de STING sozinho. A inflamação sistêmica po- de ser quantificada ou medida por qualquer método apropriado conhe- cido na técnica.
[00428] Em algumas modalidades, o método de administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) a um sujeito compreende adicionalmente a administração de um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agen-
te terapêutico adicional é um agente imunomodulador. Em algumas modalidades, o componente imunomodulador é um inibidor para um regulador de ponto de verificação negativo ou um inibidor para um parceiro de ligação de um regulador de ponto de verificação negativo. Em algumas dessas modalidades, o regulador de ponto de verificação negativo é selecionado do grupo que consiste em: proteína 4 associa- da a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína de morte celular pro- gramada 1 (PD-1), gene 3 ativado por linfócitos (LAG -3), proteína 3 contendo mucina de imunoglobulina de células T (TIM-3), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunorreceptor de células T com domínios Ig e ITIM (TIGIT), supressor de lg de domínio V de ativação de células T (VISTA), receptor de adenosina A2a (A2aR), receptor semelhante a imunoglobulina de célula assassina (KIR), indoleamina 2,3-dioxige- nase (IDO), CD20, CD39 e CD73. Em várias modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno deste. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste é um ou mais anticorpos inteiros, anticorpos policlonais, monoclonais e recombinantes, fragmentos destes e inclui ainda anticorpos de cadeia única, anticorpos humanizados, anticorpos murinos, quiméricos, camundongo-humano, camundongo -primata, anticorpos monoclonais primata-humano, anticorpos anti-idiotipo, fra- gmentos de anticorpos, tais como, por exemplo, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' e F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb e fragmentos Fd, diacorpos e polipep- tídeos relacionados a anticorpos. O termo anticorpo inclui anticorpos biespecíficos e anticorpos multiespecíficos, desde que exibam a ativi- dade ou função biológica desejada. Em algumas modalidades, o agen- te terapêutico adicional é um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno deste que é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
[00429] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente que previne ou trata a exaustão de células T. Tais agentes podem aumentar, diminuir ou modular a expressão de genes associa- dos à exaustão de células T, incluindg Prdm1, Bhlhe40, Irf4, lkzf2, Zeb2, Lass6, Egr2, Tox, Eomes, Nfatc1, Nfatc2, Zbtb32, Rbpj, Hifla, Lag3, Tnfrsf9, Ptger2, Havcr2, Alcam, Tigit, Ctla4, Ptger4, Tnfrsfib, Ccl4, CD109, CD200, Tnfsf9, Nrp1, Semad4c, Ptprj, 1121, Tspan2, Rgs16, Sh2d2a, Nucb1, Plscr1, Ptpn11, Prkca, Plscr4, Casp3, Gpd2, Gas2, Sh3rf1, Nhedc2, Plek, Tnfaip2 e Ctsb, ou qualquer combinação destes. Os agentes terapêuticos também podem aumentar, diminuir ou modular uma proteína associada à exaustão de células T, incluindo NFAT-1 ou NFAT-2. V.B. Método de Tratamento de Câncer
[00430] São fornecidos neste documento métodos de tratamento de câncer em um sujeito. O método compreende a administração ao su- jeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições di- vulgadas neste documento, em que a composição é capaz de suprar- regular uma resposta imunológica mediada por STING no sujeito, au- mentando assim o direcionamento do tumor do sistema imunológico do sujeito. Em algumas modalidades, a composição é administrada intratumoralmente ao sujeito. Em algumas modalidades, a composição é administrada por via parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, in- traperitoneal ou por qualquer outra via de administração apropriada.
[00431] “Também são fornecidos neste documento métodos de pre- venção de metástases de câncer em um sujeito. O método compreen- de a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições divulgadas neste documento, em que a com- posição é capaz de evitar que um ou mais tumores em um local no su- jeito promovam o crescimento de um ou mais tumores em outro local no sujeito. Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intratumoral em um primeiro tumor em um local, e a composi-
ção administrada no primeiro tumor previne a metástase de um ou mais tumores em um segundo local.
[00432] Em algumas modalidades, a administração de um EV, por exemplo, exossomo, divulgado neste documento inibe e/ou reduz o crescimento do tumor em um sujeito. Em algumas modalidades, o crescimento do tumor (por exemplo, volume ou peso do tumor) é redu- zido em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo me- nos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo me- nos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em comparação com uma referência (por exemplo, o volume do tumor em um sujeito correspondente após a administração de agonista de STING livre ou um EV, por exemplo, exossomo, sem o agonista de STING).
[00433] Em algumas modalidades, o câncer sendo tratado é carac- terizado pela infiltração de leucócitos (células T, células B, macrófa- gos, células dendríticas, monócitos) no microambiente do tumor ou os chamados "tumores quentes" ou "tumores inflamatórios". Em algumas modalidades, o câncer sendo tratado é caracterizado por baixos níveis ou níveis indetectáveis de infiltração de leucócitos no microambiente tumoral, ou os chamados "tumores frios" ou "tumores não inflamató- rios". Em algumas modalidades, um EV, por exemplo, exossomo, é administrado em uma quantidade e por um tempo suficiente para con- verter um "tumor frio" em um "tumor quente", ou seja, a referida admi- nistração resulta na infiltração de leucócitos (como células T) no mi- croambiente do tumor. Em certas modalidades, o câncer compreende câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de células renais, câncer testicular, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço e câncer de ovário, linfoma, câncer de fígado, glioblastoma, melanoma, mieloma, leucemia, cânceres de pâncreas ou combinações destes. O termo "tumor distal" ou "tumor distante" tal conforme usa- do neste documento, refere-se a um tumor que se espalhou do tumor original (ou primário) para órgãos distantes ou tecidos distantes, por exemplo, nódulos linfáticos. Em algumas modalidades, os EVs, por exemplo, exossomos, da descrição tratam um tumor após a propaga- ção metastática.
[00434] “Exemplos não limitativos de cânceres (ou tumores) que po- dem ser tratados com métodos divulgados neste documento incluem carcinoma de células escamosas, câncer de pulmão de célula peque- nas (SCLC), câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas escamosas (NSCLC), NSCLC não escamoso, câncer gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carci- noma de células claras), câncer de ovário, câncer de fígado (por exemplo, carcinoma hepatocelular), câncer colorretal, câncer endome- trial, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata de hor- mônio refratário), câncer de tiroide, câncer pancreático, câncer cervi- cal, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de ma- ma, carcinoma de cólon e câncer de cabeça e pescoço (ou carcino- ma), câncer gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediátri- co, naturais assassinas, sinonasal, melanoma (por exemplo, melano- ma metastático maligno, como melanoma maligno cutâneo ou intrao- cular), câncer de osso, câncer de pele, câncer uterino, câncer da regi- ão anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de falópio, carcino- ma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago (por exemplo, câncer da jun- ção gastroesofágica), câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adre- nal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer do pênis, tu- mores sólidos da infância, câncer de ureter, carcinoma da pelve renal,
angiogênese tumoral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cân- ceres ambientalmente induzidos incluindo os induzidos por amianto, cânceres relacionados a vírus de origem viral (por exemplo, vírus do papiloma humano (tumores relacionados ou originados do HPV)), e malignidades hematológicas derivadas de qualquer uma das duas maiores linhagens de células do sangue, ou seja, a linhagem de célu- las mieloides (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, macró- fagos e mastócitos) ou linhagem de células linfoides (que produz célu- las B, T, NK e plasmáticas), como todos os tipos de leucemias, linfo- mas e mielomas, por exemplo, leucemias agudas, crônicas, linfocíticas e/ou mielogênicas, como leucemia aguda (ALL), leucemia mielogênica aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mielogêni- ca crônica (CML), AML não diferenciada (MO), leucemia mieloblástica (MI), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou variante de M3 [M3V]), leucemia mielomonociti- ca (M4 ou variante de M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemiamegacarioblástica (M7), sarcoma isolado granulocítico e cloroma; limfomas, como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Hodgkin (NHL), malignidade hematológica de células B, por exemplo, linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma monocitoide de células B, linfome de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma de células grandes ana- plásico (por exemplo, Ki1*+), linfoma/leucemia de células T adultas, lin- foma de células do manto, linfoma angioimunoblástico de células T, linfoma angiocêntrico, linfoma intestinal de células T, linfoma mediasti- nal primário de células B, linfoma precursos T linfoblástico, T linfoblás- tico; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periféri- cas, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoprolifertativo pós transplantar, linfoma histiocítico verdadeiro, linfoma de efusão primário, linfoma de células B, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoieticos de |i- nhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de célu- las B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imunoblástico de células grandes, linfoma B lin- foblástico precursor, linfoma cutâneo de células T (CTLC) (também chamado de micose fungoide ou síndrome de Sezary), e linfoma linfo- plasmacitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielo- mas, como o mieloma de IgG, mieloma da cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também chamado de mielome indolente), plasmocitoma solitário e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crôni- ca (CLL), linfoma de células pilosas; tumores hematopoieticos de |i- nhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibros- sarcoma e rabdomiossarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentosum, queratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoi- de e teratocarcinoma, tumores hematopoieticos de origem linfoide, por exemplo tumores de células T e de células B, incluindo, mas não limi- tados a distúrbios de células T como leucemia T prolinfocítica (T-PLL), incluindo de células tipo pequena e cerebriforme; leucemia de linfóci- tos granulares grandes (LGL) das células tipo T; linfoma hepatosplêni- co a/d T-NHL; linfoma periférico/pós tímico de células T (subtipos ple- omórficos e imunoblásticos); linfoma angiocêntrico (nasal) de células T; câncer da cabeça e do pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, e quaisquer combinações destes.
[00435] Em algumas modalidades, um câncer (ou tumor) que pode ser tratado compreende um câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer uterino, câncer cerebral, câncer de pele, câncer renal, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de fí-
gado, câncer de bexiga, câncer renal, câncer peritoneal, câncer de pâncreas, câncer de tireoide, câncer de esôfago, câncer de olho, cân- cer de estômago (gástrico), câncer gastrointestinal, carcinoma, sarco- ma, leucemia, linfoma, mieloma ou uma combinação destes. Em cer- tas modalidades, um câncer que pode ser tratado com a presente des- crição é um câncer pancreático e/ou um câncer peritoneal.
[00436] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do- cumento também podem ser usados para o tratamento de cânceres metastáticos, não ressecáveis, cânceres refratários (por exemplo, cân- ceres refratários à terapia anterior contra o câncer) e/ou cânceres re- correntes.
[00437] Em algumas modalidades, EVs, por exemplo, exossomos, divulgados neste documento podem ser usados em combinação com um ou mais agentes anticâncer e/ou imunomoduladores adicionais. Tais agentes podem incluir, por exemplo, drogas quimioterápicas, dro- gas de pequenas moléculas ou anticorpos que estimulam a resposta imunológica a um dado câncer. Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento são usados em combinação com um tra- tamento padrão (por exemplo, cirurgia, radiação e quimioterapia).
[00438] Em algumas modalidades, um método para tratar um cân- cer divulgado neste documento pode compreender a administração de um EV, por exemplo, exossomo, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, encapsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) com um ou mais agentes imuno-oncológicos, de modo que vários elementos da via imunológica podem ser direcionados. Não limi- tantes de tais combinações incluem: uma terapia que aumenta a apre- sentação do antígeno tumoral (por exemplo, vacina de células dendrí- ticas, vacinas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleotídeos CpG, imiquimod); uma terapia que inibe a regulação imunológica ne- gativa, por exemplo, pela inibição da via CTLA-4 e/ou PD1/PD-L1/PD-
L2 e/ou depleção ou bloqueio de Tregs ou outras células imunossu- pressoras (por exemplo, células supressoras derivadas de mieloide); uma terapia que estimula a regulação imunológica positiva, por exem- plo, com agonistas que estimulam a via CD-137, OX-40 e/ou CD40 ou GITR e/ou estimulam a função efetora das células T; uma terapia que aumenta sistemicamente a frequência de células T antitumorais; uma terapia que esgota ou inibe Tregs, como Tregs no tumor, por exemplo, usando um antagonista de CD25 (por exemplo, daclizumabe) ou por depleção de grânulos de anti-CD25 ex vivo; uma terapia que impacta a função das células mieloides supressoras no tumor; uma terapia que aumenta a imunogenicidade das células tumorais (por exemplo, antra- ciclinas); transferência de células T adotivas ou células NK incluindo células geneticamente modificadas, por exemplo, células modificadas por receptores de antígenos quiméricos (terapia CAR-T); uma terapia que inibe uma enzima metabólica, como indoleamina dioxigenase (IDO), dioxigenase, arginase ou óxido nítrico sintetase; uma terapia que reverte/previne a anergia ou exaustão das células T; uma terapia que desencadeia uma ativação imunológica inata e/ou inflamação no sítio do tumor; administração de citocinas imunoestimulantes; ou blo- queio de citocinas imunorrepressivas.
[00439] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico que pode ser usado em combinação com EVs, por exemplo, exosso- mos, divulgados neste documento compreende um inibidor de ponto de verificação imunológico (ou seja, bloqueia a sinalização através da via de ponto de verificação imunológico particular). Exemplos não limi- tativos de inibidores de ponto de verificação imunológico que podem ser usados nos presentes métodos compreendem um antagonista de CTLA-4 (por exemplo, anticorpo anti-CTLA-4), antagonista PD-1 (por exemplo, anticorpo anti-PD-1, anti-PD -L1), antagonista de TIM-3 (por exemplo, anticorpo anti-TIM-3) ou combinações destes.
[00440] Em algumas modalidades, um agente imuno-oncológico compreende um ativador de ponto de verificação imunológico (ou seja, promove a sinalização através da via de ponto de verificação imunoló- gico particular). Em certas modalidades, o ativador de ponto de verifi- cação imunológico compreende agonista OX40 (por exemplo, anticor- po anti-OX40), agonista LAG-3 (por exemplo anticorpo anti-LAG-3), agonista 4-1BB (CD137) (por exemplo, anticorpo anti-CD137), GITR agonista (por exemplo, anticorpo anti-GITR) ou qualquer combinação destes.
[00441] Em algumas modalidades, uma combinação de um EV, por exemplo, exossomo, divulgado neste documento e um segundo agen- te discutido neste documento (por exemplo, inibidor de ponto de verifi- cação imunológico) pode ser administrado simultaneamente como uma única composição em um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, uma combinação de um EV, por exemplo, exossomo, e um segundo agente discutido neste documento (por exemplo, inibidor de ponto de verificação imunológico) pode ser admi- nistrada simultaneamente como composições separadas. Em outras modalidades, uma combinação de um EV, por exemplo, exossomo, e um segundo agente discutido neste documento (por exemplo, inibidor de ponto de verificação imunológico) pode ser administrada sequenci- almente. Em algumas modalidades, um EV, por exemplo, exossomo, é administrado antes da administração de um segundo agente (por exemplo, inibidor do ponto de verificação imunológico). V.C. Composições Farmacêuticas
[00442] São fornecidas neste documento composições farmacêuti- cas compreendendo EVs, por exemplo, exossomos, que são adequa- dos para administração a um sujeito. As composições farmacêuticas geralmente compreendem uma pluralidade de EVs, por exemplo, exossomos, compreendendo um agonista de STING (por exemplo, en-
capsulado ou expresso na superfície luminal ou exterior) e um excipi- ente ou carreador farmaceuticamente aceitável em uma forma ade- quada para administração a um sujeito. Os excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela com- posição particular a ser administrada, bem como pelo método particu- lar utilizado para administrar a composição. Consequentemente, existe uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas compreendendo uma pluralidade de EVs, por exemplo, exossomos. (Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18º ed. (1990)). As composições farmacêuticas são geralmente formuladas estéreis e em total confor- midade com todos os regulamentos de Boas Práticas de Fabricação (GMP) da Food and Drug Administration dos EUA.
[00443] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais agonistas de STING e os EVs, por exemplo, exossomos, descritos neste documento.
[00444] —Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem excipien- tes que são geralmente seguros (GRAS), não tóxicos e desejáveis, incluindo excipientes aceitáveis para uso veterinário, bem como para uso farmacêutico humano.
[00445] Exemplos de carreadores ou diluentes incluem, mas não se limitam a, água, solução salina, soluções de ringer, solução de dextro- se e albumina de soro humano a 5%. O uso de tais meios e compos- tos para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou composto con- vencional seja incompatível com os EVs, por exemplo, exossomos, descritos neste documento, o uso dos mesmos nas composições é contemplado. Agentes terapêuticos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Tipicamente, uma composição farma- cêutica é formulada para ser compatível com a sua via de administra-
ção pretendida. Os EVs, por exemplo, exossomos, podem ser adminis- trados por via intratumoral, parenteral, tópica, intravenosa, oral, subcu- tânea, intra-arterial, intradérmica, transdérmica, retal, intracraniana, intraperitoneal, intranasal; via intramuscular ou como inalantes. Em uma modalidade, a composição farmacêutica que compreende EVs, por exemplo, exossomos, é administrada por via intravenosa, por exemplo por injeção. Os EVs, por exemplo, exossomos, podem ser opcionalmente administrados em combinação com outros agentes te- rapêuticos que são pelo menos parcialmente eficazes no tratamento da doença, distúrbio ou condição para a qual os EVs, por exemplo, exossomos, se destinam.
[00446] As soluções ou suspensões podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água, solução salina, óleos fixos, polietileno glicois, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; compostos antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; compostos quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracé- tico (EDTA); tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e compostos para o ajuste de tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico.
[00447] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetá- vel incluem soluções aquosas estéreis (se solúveis em água) ou dis- persões e pós estéreis. Para administração intravenosa, carreadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTY (TM) (BASF, Parsippany, NJ) ou tampão salino fosfato (PBS). À composição é geralmente estéril e fluida na medida em que existe fácil seringabilidade. O carreador pode ser solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, pro- pilenoglico!l e polietilenoglicol líquido e semelhantes), e misturas apro- priadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário em caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser ga- rantida por diversos compostos antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Se desejado, compostos isotônicos, por exemplo, açúca- res, poliálcoois, como manitol, sorbitol e cloreto de sódio, podem ser adicionados à composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida incluindo na composição um composto que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelati- na.
[00448] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas in- corporando os EVs, por exemplo, exossomos, em uma quantidade efi- caz e em um solvente apropriado com um ou uma combinação de in- gredientes enumerados neste documento, conforme desejado. Geral- mente, as dispersões são preparadas incorporando os EVs, por exem- plo, exossomos, em um veículo estéril que contém um meio de disper- são básico e quaisquer outros ingredientes desejados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos para preparação são secagem a vácuo e de liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução deste previamente filtrada esterilizada deste. Os EVs, por exemplo, exossomos, podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que pode ser for- mulada de modo a permitir uma liberação sustentada ou pulsátil dos EVs, por exemplo, exossomos.
[00449] A administração sistêmica de composições compreendendo
EVs, por exemplo, exossomos, também pode ser por meios transmu- cosais ou transdérmicos. Para a administração transmucosal ou trans- dérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. Administração transmucosa pode ser realizada com o uso de pulverizações nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os EVs modificados, por exemplo, exossomos, são formulados em pomadas, pomadas, géis ou cremes como geralmente conhecido na técnica.
[00450] Este pedido PCT reivindica o benefício prioritário dos Pedi- dos Provisórios US. Nº 62/647.491, depositado em 23 de março de 2018; 62/680.501, depositado em 4 de junho de 2018; 62/688.600, de- positado em 22 de junho de 2018; e 62/756.247, depositado em 6 de novembro de 2018, cada um dos quais é incorporado neste documen- to por referência em sua totalidade.
EXEMPLOS
[00451] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas para fins ilus- trativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo ou conteúdo da invenção de forma alguma. A prática da invenção atual empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais da proteína da química, bioquímica, técnicas de recombinação de DNA e farmacológica, dentro do âmbito da técnica. Tais técnicas são explica- das por completo na literatura. Ver, por exemplo, TE Creighton, Pro- teins: Structures and Molecular Properties (WH Freeman and Compa- ny, 1993); Green & Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4º Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Colowick & Kaplan, Methods In Enzymology (Academic Press); Re- mington: The Science and Practice of Pharmacy, 22º edição (Pharma- ceutical Press, 2012); Sundberg & Carey, Advanced Organic Chemis-
try: Parts A and B, 5º Edição (Springer, 2007). Métodos Purificação de Exossomos
[00452] As células HEK293SF foram cultivadas até alta densidade em meio quimicamente definido durante 7 dias. O meio de cultura de células condicionado foi coletado e centrifugado a 300-800 xg durante minutos em temperatura ambiente para remover células e resíduos grandes. O sobrenadante do meio foi então suplementado com 1000 U/L de BENZONASEPGO e incubado a 37ºC durante 1 hora em banho- maria. O sobrenadante foi recolhido e centrifugado a 16.000 xg duran- te 30 minutos a 4ºC para remover resíduos celulares residuais e outros contaminantes grandes. O sobrenadante foi então ultracentrifugado a
133.900 xg durante 3 horas a 4ºC para sedimentar os exossomos. O sobrenadante foi descartado e qualquer meio residual foi aspirado do fundo do tubo. O sedimento foi ressuspenso em 200-1000 uL de PBS (-Ca -Mg).
[00453] Para enriquecer ainda mais as populações de exossomos, o pellet foi processado por meio de purificação de gradiente de densi- dade (sacarose ou OPTIPREPTY). Para purificação de gradiente de sacarose, o pellet de exossomo foi colocado em camadas no topo de um gradiente de sacarose conforme definido na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: PORCENTAGEM DE 65% VOL. ESTOQUE (ML) MILLI-Q VOL. (ML) TRABALHO (%) 50 3,85 115 40 3,08 1,92 25 1,92 3,08 0,46 2,54
[00454] O gradiente foi centrifugado a 200.000 xg durante 16 horas a 4ºC em um tubo Ultra-Clear de 12 mL (344059) colocado em um ro- tor SW 41 Ti para separar a fração de exossomo.
[00455] A camada de exossomo foi removida com cuidado da ca- mada superior e diluída em — 32,5 mL de PBS em um tubo Ultra-Clear de 38,5 mL (344058) e ultracentrifugada novamente a 133.900 xg du- rante 3 horas a 4ºC para sedimentar os exossomos purificados. O se- dimento resultante foi ressuspenso em um volume mínimo de PBS (- 200 yuL) e armazenado a 4ºC.
[00456] Para o gradiente OPTIPREPTY, um gradiente estéril de 3 camadas é preparado com volumes iguais de 10%, 30% e 45% de OPTIPREP'TY em um tubo Ultra-Clear de 12 mL (344059) para um ro- tor SW 41 Ti. O pellet foi adicionado ao gradiente OPTIPREP'Y e ul- tracentrifugado a 200.000 xg durante 16 horas a 4ºC para separar a fração de exossomo. A camada do exossomo foi então coletada sua- vemente do topo — 3 mL do tubo.
[00457] A fração de exossomo foi diluída em — 32 mL de PBS em um tubo Ultra-Clear de 38,5 mL (344058) e ultracentrifugada a 133.900 xg durante 3 horas a 4ºC para sedimentar os exossomos purificados. Os exossomos sedimentados foram então ressuspensos em um volu- me mínimo de PBS (- 200 uL) e armazenados a 4ºC. Estudos de microinjeção intratumoral in vivo com CIVOO Cultura Celular de Tumor
[00458] As células A20 (ATCC Lote nº 70006082) foram cultivadas em RPMI 1640 com L-Glutamina (ThermoFisher), soro fetal bovino a 10% (Thermofisher) e BME 50 nanomolar a 37 graus Celsius, CO? a 5%. O teste IMPACT Ill (IDEXX Bioresearch) foi realizado para con- firmar o status livre de micoplasma e patógeno. As células foram ex- pandidas e criopreservadas após 2-3 passagens após a obtenção do vendedor. Após o descongelamento, as células foram mantidas por um máximo de 8 semanas por subcultura 3 vezes por semana e reabaste- cidas a partir de um estoque fresco congelado depois disso.
Estudos in vivo
[00459] “Todos os experimentos em camundongos foram aprovados pelo Conselho de Presage Biosciences da IACUC, Seattle, WA (proto- colo número PR-001) e foram realizados no Presage de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes. Todos os procedimentos rele- vantes foram realizados sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e o sofrimento. Camundongos BALB/cAnNHsd fêmeas (Envigo) com um peso médio de 18 gm foram usados para ex- periências com 5-7 semanas de idade. Para gerar aloenxertos A20, os camundongos foram inoculados com 1 milhão de células A20 em um volume de inoculação de 100 ul. Microinjeções intratumorais CIVOO
[00460] Microinjeções intratumorais de CIVO foram realizadas con- forme descrito em Klinghoffer et al. (2016) Science Translational Medi- cine. Resumidamente, os camundongos (n = 6 por ponto de tempo, 4 e 24 horas) foram inscritos em estudos de microinjeção quando os tumo- res implantados atingiram as seguintes dimensões aproximadas: 14 mm (comprimento), 10 mm (largura) e 7 mm (profundidade). O disposi- tivo CIVO foi configurado com 6 agulhas de injeção de calibre trinta com um volume total de distribuição de 2,0 ul. O marcador de rastrea- mento fluorescente Presage (FTM, 5% por volume) foi adicionado ao conteúdo da injeção para orientação espacial. Os agentes microinjeta- dos foram os seguintes: exossomos de controle PTGFRN ++ GFP, exossomos de PTGFRN ++ GFP carregados de ML RR-S2 CDA, exossomos de PTGFRN ++ GFP dessialilados de ML RR-S2 CDA, exossomos de ML RR-S2 CDA carregados com 10 ng/ul de ML RR- S2 CDA de forma que o valor total distribuído foi de 20 ng. O CDA ML RR-S2 livre foi microinjetado a 20 ng e 2 ug. Às 4 e 24 horas após as microinjeções de CIVO, os camundongos foram sacrificados usando inalação de CO» para análises de biomarcadores.
Histologia, imuno-histoquímica e hibridização in situ
[00461] Os tumores ressecados foram cortados em seções de 2 mm de espessura perpendiculares às colunas de injeção, fixados em formalina tamponada a 10% durante 48 horas. A imagem UV foi usada para confirmar as microinjeções CIVO com base no sinal do FTM inje- tado em cada sítio de CIVO. Cortes de tecido com 2 mm de espessura foram então processados para inclusão em parafina padrão. Secções de 4 um de espessura foram usadas para todos os ensaios histológi- cos conforme descrito abaixo. A coloração com hematoxilina-eosina (H&E) foi realizada usando métodos padrão. Imuno-histoquímica
[00462] Os tumores fixados em formalina e embebidos em parafina foram cortados em lâminas com uma espessura de 4 um.As lâminas foram cozidas durante 1 hora a 60ºC, desparafinizadas em xileno e reidratadas através de álcoois graduados.
[00463] As lâminas foram submetidas a uma incubação de solução de recuperação alvo de 20 minutos a 100ºC, seguida por um resfria- mento de 20 minutos até a temperatura ambiente.O bloco de soro (so- ro de cabra normal em TBST a 5%) foi realizado durante 1 hora à tem- peratura ambiente. A coloração do anticorpo primário foi realizada com o anticorpo primário apropriado em diluente NGS TBS a 5% durante a noite a temperatura ambiente. Os controles de isotipos corresponden- tes foram incluídos em cada lote. A coloração do anticorpo secundário foi realizada com o anticorpo secundário apropriado em diluente NGS TBS a 5% durante a noite àa temperatura ambiente. As lâminas foram contrastadas com DAPI durante 10 minutos e cobertas com um meio de montagem Prolong Gold (Invitrogen).As lâminas coradas foram fo- tografadas usando um scanner digital, automatizado de alta resolução.
[00464] A hibridização in situ foi concluída usando o kit de reagente fluorescente multiplex RNAscope v2 (Advanced Cell Diagnostics). Os tumores fixados em formalina e embebidos em parafina foram corta- dos em lâminas com uma espessura de 4 um.As lâminas foram cozi- das durante 1 hora a 60ºC, desparafinizadas em xileno e reidratadas através de álcoois graduados. Foi adicionado peróxido de hidrogênio durante 10 minutos para suprimir a atividade da peroxidase endógena. As lâminas foram submetidas a uma incubação de solução de recupe- ração alvo de 15 minutos a 100ºC, seguida por uma digestão com pro- tease de 15 minutos a 40ºC. O ensaio ISH RNAscope foi completado com uma sonda Ifnb1 de camundongo (Advanced Cell Diagnostics) e detecção de TSA Plus Cyanine 5 (Perkin Elmer).As lâminas foram con- trastadas com DAPI durante 10 minutos e cobertas com um meio de montagem Prolong Gold (Invitrogen).As lâminas coradas foram foto- grafadas usando um scanner digital, automatizado de alta resolução. Digitalização de lâminas inteiras e análise de imagens
[00465] “Imagens de cada célula de cada seção de tecido corada foram capturadas por varredura digital, automatizada e de alta resolu- ção de todo o tecido (3D Histech Panoramic 250 Flash). As respostas do tumor foram quantificadas a partir de arquivos de imagem de cada seção de tecido usando a plataforma de análise de imagem CIVO Analyzer personalizada da Presage. As imagens da secção de todo o tecido capturadas pelos scanners de lâmina foram processadas auto- maticamente pelo Analisador CIVO. Cada célula de cada secção de tecido foi segmentada com base no sinal nuclear (DAPI) e classificada como biomarcador negativo ou positivo usando Cell Profiler (Broad Institute). Após a segmentação e classificação celular, as regiões cir- culares de interesse (ROI) foram localizadas em torno de cada sítio de microinjeção em cada imagem ao redor do FTM em cada posição, com a maior ROI não superior a 2000 um de raio. A fim de mitigar a in- fluência da necrose pré-existente nas medições de biomarcadores, os sítios de injeção que se enquadram em regiões de tumor amplamente acelulares são excluídos antes da análise quantitativa. Exemplo 1: Agonistas de STING encapsulados em exossomo Encapsulamento de agonista de STING
[00466] O agonista de STING 1 mM incluindo o sal de amônio ML RR-S2 CDA (MedChem Express, Cat. Nº HY-12885B) e (3-3 cAIMP- dFSH; InvivoGen, Cat. Nº tlrl-nacairs) foi incubado com exossomos purificados (1E12 partículas totais) em 300ul de PBS a 37ºC durante a noite. A mistura foi então lavada duas vezes em PBS e purificada por ultra-centrifugação a 100.000 xg (FIG. 1). Quantificação do agonista de STING de dinucleotídeo cíclico Preparação de amostras para análise LC-MS
[00467] Todas as amostras foram recebidas em tampão de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou PBS e sacarose a 5%. Antes da análise, a concentração de partículas (P/mL) foi medida por Nano- particle Tracking Analysis (NTA) no NanoSight NS300. Todos os pa- drões e amostras foram preparados de forma que cada injeção conti- vesse um número virtualmente idêntico de partículas. Isso foi obtido por meio de uma combinação de diluição de amostras e adição de exossomos em padrões para atingir uma concentração final de 1,0- 4,0E + 11 P/mL, dependendo das concentrações iniciais de partículas das amostras.
[00468] As curvas padrão foram preparadas adicionando uma con- centração conhecida de agonista de STING em tampão PBS e, em seguida, preparando padrões adicionais por meio de diluição em série. Padrões separados foram tipicamente preparados de modo que as concentrações finais (após todas as etapas de preparação da amostra) fossem 25, 50, 250, 500, 1250, 2500 e 5000 nM de agonista de STING. Primeiro, 75,0 ul de cada amostra adequadamente diluída e cada padrão de matriz compatível foram preparados em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL separado. Em seguida, 25,0 ul de tampão de lise de exossomo (Tris 60 mM, GdmCIl 400 mM, EDTA 100 mM, TCEP 20 mM, Triton X-100 a 1,0%) foram adicionados a cada tubo, em seguida, todos os tubos foram agitados em vórtex para misturar e brevemente centrifugados para assentar. Finalmente, 1,0 ul de solu- ção concentrada de enzima Proteinase K (Dako, referência S3004) foi adicionado a cada tubo, e novamente todos os tubos foram agitados em vórtice e então brevemente centrifugados, seguido de incubação a 55ºC durante 60 minutos. Antes da injeção no LC-MS, as amostras foram deixadas arrefecer até a temperatura ambiente e foram transfe- ridas para frascos de HPLC.
Análise LC-MS
[00469] 20,0 ul de padrões e amostras foram injetados puros em um sistema de cromatografia de baixo fluxo UltiMate 3000 RSCLnano (Thermo Fisher Scientific) sem limpeza. A separação dos analitos foi realizada usando uma coluna analítica núcleo-casca Phenomenex Ki- netex EVO C18 (50 x 2,1 mm, tamanho de partícula de 2,6 um, tama- nho de poro de 100 À) e as bombas de carregamento distribuindo um gradiente de fase móvel A (MPA: água, ácido fórmico a 0,1%) e fase móvel B (MPB: acetonitrila, ácido fórmico a 0,1%) a uma taxa de fluxo de 500 ulL/min. O gradiente começou em MPB a 2%, que foi mantido durante 2 minutos para carregar e dessalinizar o analito agonista de STING. A porcentagem de MPB então aumentou de 2-30% ao longo de 3 minutos para eluir o analito agonista de STING. A porcentagem de MPB então aumentou de 30-95% ao longo de 1 minuto, mantida em 95% durante 3 minutos, diminuiu de 95-2% ao longo de 1 minuto e, em seguida, mantida a 2% por mais 3 minutos para reequilibrar a coluna. O tempo total de execução para o método foi de 13 minutos, e o fluxo de LC foi direcionado para o MS apenas entre 2,5-4,5 minutos. O transporte típico foi inferior a 0,05% da área do pico da injeção anteri- or, portanto, as injeções em branco não foram realizadas entre as inje-
ções analíticas.
[00470] As análises de massa foram realizadas com um espectrô- metro de massa Q Exactive Basic (Thermo Fisher Scientific) com a fonte lon Max e uma sonda HESI-Il operando em modo de íon negati- vo, e Os espectros de massa foram coletados usando Full MS - SIM varredura em modo de 500-800 Da com um alvo AGC de 1E + 6 íons, um tempo máximo de injeção de 200 ms e uma resolução de 35.000. A quantificação do agonista de STING foi realizada usando o pico do agonista de STING monoisotópico -1 extraindo seletivamente todos os íons dentro da faixa de m/z de 688,97-689,13 Da e, em seguida, inte- grando o pico resultante em um tempo de retenção entre 3,80-3,90 minutos. A concentração de agonista de STING em uma determinada amostra foi determinada comparando a área do pico do agonista de STING nessa amostra com as áreas de pico do agonista de STING geradas por padrões, que é típico de quantificação relativa.
Exemplo 2: Aumento da potência do agonista de STING carregado em exossomos
[00471] O agonista de STING encapsulado em exossomo e o ago- nista de STING livre foram testados quanto à atividade em células mo- nonucleares de sangue periférico humano (PBMCs). PBMCs foram isolados de sangue humano fresco por centrifugação sobre uma ca- mada de Lymphoprep a 1000 xg durante 15 minutos. A camada leuco- citária resultante foi lavada em PBS e contada. PBMCs foram semea- dos em placas de fundo U de 96 poços. As titulações do exossomo encapsulado (agonista Exo-STING) ou do agonista de STING livre fo- ram preparadas em uma placa separada com fundo em U para realizar estudos de dose-resposta. O agonista de STING encapsulado em exossomo ou livre foi adicionado às PBMCs e incubado a 37ºC duran- te a noite. A ativação geral de PBMCs pelo agonista de STING foi de- tectada medindo a quantidade de IFNB no sobrenadante. Como mos-
trado na FIG. 2, tanto o agonista de STING livre quanto o agonista de Exo-STING induziram IFNB máximo em uma extensão semelhante.
Curiosamente, o ECs5o do agonista de Exo-STING foi -65 vezes menor do que para o agonista de STING livre, sugerindo que os exossomos podem aumentar a potência da atividade agonista de STING.
Para en- tender quais tipos de células em PBMCs são afetados diferencialmen- te pelo agonista de Exo-STING, a ativação de monócitos e células dendríticas foi medida.
Como mostrado na FIG. 3, a ativação máxima de monócitos foi atenuada em células tratadas com agonista de Exo- STING, enquanto o ECso foi melhorado em comparação com o agonis- ta de STING livre.
Em contraste, a ativação máxima de células dendrí- ticas mieloides (mMDCs) foi maior, embora também experimentando uma potência melhorada de ECs5o (FIG. 4). mMDC e ativação de monóci- tos foram medidos em PBMCs de 13 doadores após o tratamento com agonista de STING livre ou agonista de Exo-STING, e ativação máxi- ma de mDC foi significativamente maior, enquanto a ativação máxima de monócitos foi significativamente atenuada com agonista de Exo- STING em comparação com agonista de STING livre (FIG. 5). Esses resultados demonstram que, no contexto de PBMCs, apenas uma fra- ção das células dendríticas mieloides foi ativada.
Este resultado é sa- turável e exemplifica as limitações do agonista de STING sozinho, pois a adição de composto adicional não aumenta a quantidade de ativa- ção.
Em contraste, o agonista de STING encapsulado em exossomo ativou uma proporção significativamente maior de células dendríticas mieloides.
Os monócitos foram ativados de forma robusta pelo agonis- ta de STING sozinho com mais de 90% se tornando ativados em con- centrações micromolares do agonista.
No entanto, o agonista de STING encapsulado em exossomo resultou na ativação de uma pro- porção significativamente menor de monócitos.
Dado que os monóci- tos são muito mais abundantes do que as células dendríticas mieloides na circulação, o perfil de ativação mais baixo dos monócitos por ago- nistas de STING encapsulados em exossomo pode resultar em infla- mação sistêmica reduzida em comparação com uma quantidade igual do composto livre. Além disso, o início de respostas imunológicas adaptativas contra tumores é amplamente dependente da ativação de células dendríticas; portanto, os agonistas de STING encapsulados em exossomo provavelmente levarão a respostas imunológicas antitumo- rais aumentadas com toxicidade reduzida em comparação com o composto sozinho.
[00472] Para compreender até que ponto diferentes tipos de células imunológicas são ativados por agonistas de STING, a ativação especí- fica de células T, células B e células NK foi avaliada medindo a quanti- dade de CD69 na superfície celular por citometria de fluxo. A ativação de células apresentadoras de antígeno (APCs), incluindo monócitos, células dendríticas mieloides, células dendríticas plasmocitoides e cé- lulas B foi avaliada pela medição da quantidade de CD80, CD86, HLA- DR ou CD83 na superfície celular por citometria de fluxo. Conforme mostrado na FIG. 6, monócitos agonistas de STING livres prontamente ativados, células NK, células B e células T CD8 de dois doadores dife- rentes. Em contraste, o agonista de Exo-STING reduziu a ativação de células B e células T, enquanto retinha a ativação de células apresen- tadoras de antígeno (FIGURAS 7A e 7B). Esses resultados sugerem que as células apresentadoras de antígeno podem ser ativadas espe- cificamente por exossomos carregados com agonista de STING, en- quanto reduzem a ativação de células T e B, o que pode limitar a toxi- cidade sistêmica. Exemplo 3: Potencialização da atividade de STING exossomo por superexpressão de PTGFRN e modificação com glicano do exos- somo
[00473] Os resultados nos Exemplos 1 e 2 sugerem que as molécu-
las de superfície do exossomo podem mediar o aumento da potência do agonista de Exo-STING em comparação com o agonista de STING livre.
Resultados anteriores demonstraram que o regulador negativo do receptor de prostaglandina F2 (PTGFRN) é uma glicoproteína abun- dante na superfície luminal ou exterior dos exossomos.
Quando o PTGFRN é superexpresso em uma célula produtora, o PIGFRN é a glicoproteína predominante na superfície luminal ou exterior dos exos- somos.
Para determinar se o PTGFRN desempenhou um papel na mediação da ativação do agonista de Exo-STING de células imunoló- gicas, os exossomos com perfis de glicano modificados ou manipula- dos para expressar níveis mais elevados de PTGFRN foram compara- dos com o agonista de STING livre.
Semelhante aos resultados na FIG. 2, o agonista de Exo-STING foi mais potente na indução da pro- dução de IFNB do que o agonista de STING livre sem alterar o nível máximo de produção de IFNB em PBMCs.
STING carregado em exos- somos que foram primeiro desglicosilados por PNGase F potencializou ainda mais essa mudança de potência, enquanto a distribuição do agonista de STING em exossomos que foram primeiro dessialilados com sialidase resultou em uma potencialização adicional de potência e nível máximo mais alto de produção de IFNB, indicando que a modifi- cação de glicano de exossomos podem alterar a distribuição de molé- culas agonistas de STING às células do sistema imunológico.
Surpre- endentemente, os exossomos com superexpressão de PTGFRN e car- regados com agonista de STING potencializaram ainda mais a potên- cia e a produção máxima de IFNB em comparação com os exossomos não modificados ou manipulados com glicano contendo níveis endó- genos de PTGFRN.
A deglicosilação ou dessialilação das amostras de Exo-STING de PTGFRN potencializou ainda mais a potência além do efeito dos exossomos que superexpressam PTGFRN sozinho (FIGU- RAS 8A e 8B em dois doadores). A quantificação do nível de IFNB como resultado da distribuição do agonista de STING demonstra que OS exossomos com superexpressão de PTGFRN modificado com glicano podem potencializar a potência de um agonista de STING mais de 1000 vezes sobre o agonista de STING livre e -50 vezes sobre o agonista de STING carregado em exossomos não modificados (FIG. 9).
[00474] Os resultados na FIG. 9 demonstram que uma combinação de manipulação de glicano e superexpressão de PTGFRN em exos- somos poderia aumentar a distribuição de uma molécula agonista de STING às células imunológicas. Para entender o impacto que essas modificações têm na ativação de tipos específicos de células em PBMCs, as preparações de exossomos carregadas com agonista de STING mostradas na Figura 9 foram testadas em sua ativação de mo- nócitos e células dendríticas. A Figura 10 demonstrou que a modifica- ção com glicano e/ou superexpressão de PTGFRN de exossomos car- regados com agonista de STING resulta em potência aumentada de ativação de monócitos medida por ECso mas um nível reduzido ou inal- terado de ativação máxima em dois doadores (FIG. 10). A alteração na ECs5o da ativação de monócitos foi de até 54.000 vezes para exosso- mos com superexpressão de PTGFRN dessialilado em comparação com o agonista de STING livre (FIG. 11). Em contraste, MDCs agonis- tas de STING livres pobremente ativados em dois doadores, enquanto o glicano manipulado e/ou exossomos com superexpressão de PTG- FRN aumentaram dramaticamente o ECsº e a ativação máxima de mDCs (FIG. 12). O deslocamento em EC5o para mDCs foi >16.000 ve- zes (FIG. 13), enquanto a ativação máxima foi — 4-10 vezes maior para exossomos agonistas de STING com superexpressão de PTGFRN dessialilados. É importante ressaltar que os efeitos observados nesses experimentos não foram devido à eficiência de carregamento aprimo- rada para os exossomos de superexpressão de PTGFRN ou de glica- no manipulado, porque a quantificação do agonista de STING confor-
me determinado pelo LC-MS descrito acima permitiu a normalização do agonista de STING através das preparações de exossomo. De fato, os exossomos de superexpressão de PTGFRN e/ou de glicano mani- pulado são carregados de forma menos eficiente em uma base por partícula do que os exossomos não modificados (FIG. 14). Juntos, es- ses resultados demonstram que modificações específicas de glicano e/ou superexpressão de uma única proteína de superfície de exosso- mo podem aumentar dramaticamente a potência de exossomos carre- gados com agonista de STING e aumentar a seletividade de distribui- ção de carga para células dendríticas.
Pré-tratamento com kifunensina para modular a ativação de STING
[00475] Para determinar se qualquer perturbação dos glicanos de superfície exossômica pode alterar a absorção de células imunológi- cas, as linhagens de células produtoras foram tratadas com o agente alcaloide kifunensina, que impede o corte de resíduos de açúcar de alta manose durante a glicosilação de proteínas e impede a glicosila- ção completa. Os exossomos resultantes das células tratadas com ki- funensina alteraram o status de glicosilação e são enriquecidos em alta manose. Os exossomos tratados com kifunensina foram carrega- dos com agonista de STING e administrados a PBMCs de dois doado- res. Isso resultou em uma atenuação parcial da atividade agonista de STING em comparação com exossomos de tipo selvagem. Especifi- camente, a ativação de monócitos e MDC permaneceram praticamen- te inalterados (FIGURAS 16 e 17, respectivamente), enquanto a pro- dução de IFNB foi dramaticamente reduzida (FIG. 15). Estes resulta- dos sugerem que os padrões de glicosilação específicos medeiam, pelo menos parcialmente, a absorção de exossomos em células imu- nológicas, e que nem todas as modificações das glicoproteínas de su- perfície podem aumentar a ativação de células imunológicas durante a distribuição mediada por exossomo de moléculas de agonista de
STING. Exemplo 4: Otimizando o carregamento de exossomos com o agonista de STING
[00476] Nos exemplos anteriores, os exossomos foram carregados com o agonista de STING por incubação a 37ºC durante a noite. Para determinar a cinética de carregamento do agonista de STING, os exossomos foram incubados com agonista de STING 1 mM durante 2 horas, 6 horas ou durante a noite, e adicionados a PBMCs para medir a produção de IFNB. Conforme mostrado nas FIGURAS 18A e 18B, os exossomos não carregados não conseguiram induzir a produção de IFNB, enquanto os exossomos incubados em agonista de STING du- rante 2 horas não conseguiram induzir a produção de IFNB ou resulta- ram em níveis relativamente baixos. As amostras carregadas durante 6 horas resultaram na produção de IFNB intermediário, enquanto o carregamento durante a noite resultou nos níveis mais altos de produ- ção de IFNB em dois doadores. Estes resultados indicam que a carga do agonista de STING nos exossomos pode ser aumentada aumen- tando o tempo de incubação. Exemplo 5: Potência comparativa de diferentes dinucleotídeos cíclicos agonistas de STING encapsulados em exossomo
[00477] As células HEK293SF de superexpressão de PTGFRN fo- ram cultivadas em frascos de agitação e os exossomos resultantes foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de densidade Optiprep "Y“, conforme descrito nos Métodos. Os exossomos purifica- dos foram carregados com qualquer um dos agonistas de STING ML RR-S2 CDA (MedChem Express, Cat. No. HY-12885B) ou 3-3 cAIMP- dFSH (InvivoGen, Cat. Nº tlrl-nacairs) de acordo com os métodos no Exemplo 1. O carregamento foi quantificado conforme descrito no Exemplo 1. Os agonistas de STING encapsulados em exossomo ou livres foram adicionados a PBMCs humanos e incubados a 37ºC du-
rante a noite. A ativação de PBMCs pelo agonista de STING foi detec- tada medindo a quantidade de IFNB no sobrenadante. Conforme mos- trado na FIG. 19, ambos os agonistas de STING livres induziram IFNB em uma extensão semelhante, enquanto ambos os agonistas de STING encapsulados em exossomo resultaram em uma mudança de potência, conforme mostrado no Exemplo 2. cAIMPAFSH 3-3 encapsu- lado em exossomo foi mais potente do que ML RR-S2 CDA encapsu- lado em exossomo, no entanto, sugerindo que os agonistas de STING fluorados podem fornecer uma vantagem de potência quando adminis- trados em uma formulação de exossomo.
Exemplo 6: Potência in vivo e efeitos sistêmicos de agonistas de STING livres em comparação com agonistas de STING encapsu- lados em exossomo em camundongos portadores de tumor
[00478] “Quatro grupos de camundongos C57BL/6 (3-4 camundon- gos por grupo) foram inoculados subcutaneamente com 5x10º células tumorais B16F10. Oito dias após a inoculação, os camundongos foram injetados com uma única dose intratumoral de PBS, 20 ug de ML RR- S2 CDA livre, 0,2 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug de ML RR-S2 CDA carregado em exossomos de superexpressão de PTGFN (exo ML RR-S2 CDA). Quatro horas após a injeção, os tumores, linfonodos de drenagem, baços e soro foram coletados e os níveis de citocinas foram medidos. Os níveis de expressão do gene IFNB no tumor foram comparáveis nos grupos de agonista de STING de 20 ug livre e ago- nista de STING exossomo 0,2 ug, que eram ambos maiores do que os grupos de agonista de STING livre de 0,2 ug e PBS (FIG. 20A). Além disso, os níveis de IFNy e os quimioatraentes de células T CXCL9 e CXCL10 foram todos mais elevados no grupo de agonista de STING exossomo (FIGURAS 20B, 20C, e 20D). Estes dados demonstram que 100 vezes menos agonista de STING pode induzir uma indução com- parável de uma assinatura de expressão do gene IFN em um tumor quando o agonista de STING é encapsulado em exossomos.
[00479] Os agonistas de STING são moléculas pró-inflamatórias muito potentes e um risco clínico potencial desses compostos é a in- dução de toxicidade sistêmica devido ao composto livre escapar do sítio da injeção do tumor e se difundir na circulação. Os gânglios linfá- ticos de drenagem dos camundongos portadores de tumor tratados com agonista de STING exossomo mostraram expressão do gene comparável ou ligeiramente elevado de IFNB (FIG. 21A), CXCL9 (FIG. 21B), CXCL10 (FIG. 21C) em comparação com a concentração cor- respondente do grupo de agonista de STING, mas reduziu drastica- mente os níveis de expressão em comparação com o grupo de trata- mento com agonista de STING livre 100 vezes maior. Estes resultados foram mais dramáticos no baço (FIGURAS 22A, 22B, e 22C) e no soro (FIGURAS 23A-23E), com o soro mostrando diminuições marcadas nas citocinas pró-inflamatórias IFNB (FIG. 23A), TNF-a (FIG.23B), e IL-6 (FIG.23C) no grupo de agonista de STING exossomo em compa- ração com qualquer um dos grupos de agonista de STING livre.
[00480] Para confirmar que os efeitos observados nas FIGURAS 20-23 foram aplicáveis a outros agonistas de STING, camundongos com tumor subcutâneo B16F10 foram injetados com 20 ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre, 0,2 ug de 3-3 cAIMPAdFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 CAIMPdAFSH carregado em exossomos com superexpressão de PTG- FRN (exo 3-3 cAIMPAFSH). Os níveis de citocinas no tumor (FIGURAS 24A-24D), drenagem do linfonodo (FIGURAS 25A-25D), baço (FIGURAS 26A-26D) e soro (FIGURAS 27 A-27D) foram medidos e mostraram um padrão de expressão semelhantes aos resultados mostrados nas FIGURAS 20-23 para ML RR-S2 CDA. Juntos, esses resultados demonstram que os agonistas de STING encapsulados em exossomo podem induzir uma assinatura de expressão de gene IFN potente comparável a um agonista de STING livre 100 vezes maior após uma injeção intratumoral in vivo, e que esse padrão de expres- são de gene comparável é amplamente limitado ao microambiente tu- moral e não resulta em sinais inflamatórios sistêmicos como é obser- vado com o agonista de STING livre. Além disso, esses efeitos foram observados com dois agonistas de STING diferentes, demonstrando a ampla aplicabilidade do uso de exossomos para distribuir agonistas de STING a um tumor.
Exemplo 7: Ativação local e sistêmica comparativa da via STING após administração intratumoral e intraperitoneal de agonista de STING livre e agonista de STING encapsulado em exossomo em camundongos portadores de tumor
[00481] Cinco grupos de camundongos C57BL/6 (n = 4 camundon- gos por grupo) foram inoculados subcutaneamente com 5x105* células de melanoma murino B16F10. Oito dias após a inoculação, os camun- dongos foram injetados intraperitonealmente (IP) com uma dose única de PBS, 20 ug ML RR-S2, 0,2 ug ML RR-S2, 0,2 ug ML RR-S2 carre- gado em exossomos com superexpressão de PTGFRN (Exo STING IP), ou intratumoralmente (IT) com uma dose única de 0,2 ug ML RR- S2 carregada em exossomos com superexpressão de PTGFRN (Exo STING IT). As formulações de agonista de STING encapsuladas em exossomo foram carregadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 1. O agonista de STING livre de alta dose injetou expressão de IFNB induzida por IP no tumor, pâncreas e baço acima do grupo tratado com PBS. Exo STING IP, em uma dose 100 vezes menor, le- vou a uma expressão superior de IFNB no pâncreas (FIG. 29A) e no baço (FIG. 30A) e reduziu a expressão de IFNB no tumor (FIGURAS 28A) em comparação com a expressão de STING livre de alta dose. À expressão de CXCL9 e CXCL10 foi semelhante no tumor (FIGURAS 28B-C) e no baço (FIGURAS30B-C) entre esses dois grupos, mas aumentada no pâncreas (FIGURAS 29B-C) no grupo Exo STING |P.
Exo STING IT mostrou ativação da via STING muito maior no tumor em comparação com outros grupos, mas não levou a mudanças de expressão robustas no baço em comparação com os grupos de ago- nistas de STING |P ou de STING livre de alta dose e expressão seme- lhante no pâncreas em comparação a agonista de STING livre de altas doses. No pâncreas e no baço, a ativação da via STING foi consisten- temente aumentada por Exo STING |P em comparação com o agonis- ta de STING livre de dose baixa de concentração correspondente, con- firmando um aumento na potência do agonista de STING encapsulado em exossomo. É importante ressaltar que o Exo STING IP levou a uma potência comparável ou, em alguns casos, aumentada em com- paração com uma dose 100 vezes maior de agonista de STING livre no pâncreas e no baço. Estes resultados sugerem que a administração IP regional de exossomos carregados com agonista de STING em uma dose baixa pode induzir uma resposta imunológica potente em tecidos, incluindo o pâncreas, apresentando uma oportunidade para a administração regional para tratar câncer pancreático e outros cânce- res peritoneais.
Exemplo 8: Sinalização diferencial da via STING em camundongos naive in vivo com agonistas de STING encapsulados em exosso- mo e agonistas de STING livres
[00482] “Camundongos C57BL/6 puros foram injetados intraperito- nealmente (IP) com uma dose única de PBS, 20 ug ML RR-S2, 0,2 ug ML RR-S2 ou 0,2 ug ML RR-S2 carregados em exossomos com supe- rexpressão de PTGFRN (Exo STING), que foram formulados e quanti- ficados conforme descrito no Exemplo 1 (n = 5 camundongos por gru- po). Pulmão, baço, pâncreas e soro foram isolados quatro horas após a injeção e analisados quanto à expressão gênica e produção de cito- cinas. A expressão de IFNEB, CXCL9 e CXCL10 foi dramaticamente maior nos pulmões (FIGURAS 31A-C) e baços (FIGURAS 32A-C) de camundongos tratados com Exo STING em comparação com camun- dongos que receberam uma dose 100 vezes maior de agonista de STING livre, enquanto os perfis de expressão do gene pancreático fo- ram semelhantes entre estes dois grupos (FIGURAS 33A-C). Da mesma forma, os níveis de citocinas séricas em camundongos trata- dos com Exo STING foram maiores ou iguais aos camundongos trata- dos com uma dose 100 vezes maior de agonista de STING livre (FIGURAS 34A-G). Juntos, esses resultados demonstram que os exossomos carregados com um agonista de STING são ativadores significativamente mais potentes da via STING in vivo em comparação com quantidades iguais de agonistas de STING livres e que os agonis- tas de STING carregados com exossomo podem, portanto, fornecer uma aplicação terapêutica diferenciada, especialmente no contexto de redução da toxicidade sistêmica de altas doses de agonistas de STING livres e aumento da expressão de quimioatracantes de células T.
[00483] “Um segundo experimento semelhante ao estudo anterior foi realizado com administração IP de dose única e estendido para 24 ho- ras. Células peritoneais e esplenócitos foram isolados de camundon- gos tratados, e a ativação celular foi medida por detecção de CD86. Altas doses de agonista de STING livre resultaram na ativação de cé- lulas B peritoneais, macrófagos, monócitos e células dendríticas con- vencionais (cDCs), enquanto Exo STING em uma dose 100 vezes me- nor induziu maior ativação de macrófagos, ativação semelhante de cDCs e ativação atenuada de Células B e monócitos (FIG. 35). No ba- ço, o agonista de STING de alta dose induziu níveis moderados de ati- vação de células imunológicas, enquanto Exo STING em uma dose 100 vezes menor induziu maior ativação de macrófagos e células T e ativação de cDC dramaticamente maior, sugerindo uma preferência de absorção/distribuição de tipo celular para exossomos em cDCs e ma-
crófagos in vivo (FIG. 36). Estes resultados demonstram que os exos- somos carregados com um agonista de STING podem induzir uma resposta celular específica in vivo em células apresentadoras de antí- geno, que são os mediadores primários das respostas antitumorais e antipatogênicas induzidas pela via STING.
Exemplo 9: Eficácia comparativa in vivo de exossomos carrega- dos com agonista de STING e agonista de STING livre em um mo- delo murino de melanoma
[00484] Os resultados dos Exemplos anteriores sugerem que Exo STING pode ser uma formulação antitumoral mais potente do que quantidades iguais ou maiores de agonista de STING solúvel. Para testar esta hipótese, camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea com 5x10º células de melanoma murino B16F10 (n= 5 camundongos por grupo). Cinco, oito e onze dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intratumoralmente com PBS, 20 ug ML RR-S2, 0,2 ug ML RR-S2, ou 0,2 ug ML RR-S2 carregado em exossomos com superexpressão de PTGFRN. Os volumes de tumor foram medidos diariamente até dia 39, e os animais foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 2000 mm?. Em comparação com o grupo de controle de PBS, o crescimento do tumor foi moderadamente potenciado após o tratamento com 0,2 ug de agonista de STING livre e quase completamente eliminado após o tratamento com 20 ug de ago- nista de STING livre no dia 25. Surpreendentemente, o tratamento com 0,2 ug de Exo STING resultou em uma regressão do tumor dra- maticamente melhorada em comparação com o grupo de agonista de STING livre de concentração correspondente e em uma extensão se- melhante ao grupo de agonista de STING livre de alta dose no dia 25. Notavelmente, o tratamento com Exo STING e agonista de STING livre de alta dose levou a uma resposta completa (definida como tumores indetectáveis no sítio da inoculação; CR) em três de cinco animais em cada grupo (FIGURAS 37A-E). FIG. 37A mostra o crescimento médio do tumor nos grupos de animais e as FIGURAS 37B-D mostra o cres- cimento do tumor em camundongos individuais em cada grupo de tra- tamento.
[00485] A ativação da via STING leva ao recrutamento de células T de memória e, em última instância, a uma resposta imunológica adap- tativa durável. Para determinar se os efeitos antitumorais neste estudo levaram a uma resposta imunológica, os cinco animais nos grupos de agonista de STING de alta dose e Exo STING foram re-expostos no dia 21 por transplante de 5x10º células B16F10 no flanco oposto. Cin- co camundongos naive adicionais foram inoculados com a mesma preparação de células tumorais e tratados diariamente com PBS para garantir a viabilidade celular e a cinética de crescimento. No dia 39 (18 dias após o desafio), todos os camundongos do grupo PBS foram sa- crificados. Os tumores em animais do grupo agonista de STING livre de alta dose não cresceram em quatro de 5 animais, enquanto que, notavelmente, o crescimento do tumor foi indetectável em todos os cinco camundongos no grupo STING Exo (FIGURAS 38A-D). FIG. 38A mostra o crescimento médio do tumor nos grupos de animais e a FIG. 38B mostra o crescimento do tumor em camundongos individuais. FIG. 38C mostra a taxa de sobrevivência de cada grupo de tratamento. Notavelmente, embora dois animais no grupo Exo STING fossem re- fratários ao tratamento nos tumores primários, esses animais não exi- biram crescimento de tumor nos sítios de re-exposição, demonstrando a robustez da resposta imunológica mediada por agonistas de STING carregados em exossomos (FIGURAS 37A-E e 38A-C). Exemplo 10: Resposta Antitumoral Dependente de Dose de Exos- somos Carregados com Agonista de STING em um Modelo Murino de Melanoma
[00486] Os resultados no Exemplo 9 demonstram que Exo STING pode induzir um efeito antitumoral in vivo em uma extensão semelhan- te a uma dose 100 vezes maior de agonista de STING livre.
Para de- terminar a relação entre a dose injetada de Exo STING e o crescimen- to do tumor, um experimento de titulação de dose in vivo foi realizado.
Camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea com 5x10º células de melanoma murino B16F10 (n = 5 camundongos por grupo). Seis, nove e doze dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intratumoralmente com PBS e 200ng, 40ng ou 8ng de ML RR-S2 carregado em exossomos com superexpressão de PTG- FRN). Os volumes do tumor foram medidos diariamente até o dia 18, e os animais foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 2000 mm?. Quatro de cinco camundongos no grupo de controle de PBS fo- ram sacrificados no dia 18, enquanto nenhum dos camundongos trata- dos com Exo STING em qualquer grupo foi sacrificado durante o curso do estudo.
Houve duas respostas completas no grupo 200ng Exo STING e uma resposta completa no grupo 40ng Exo STING.
Surpre- endentemente, houve uma redução substancial no crescimento do tu- mor no grupo 8ng Exo STING em comparação com o grupo PBS, de- monstrando que uma dose muito baixa de Exo STING pode ter um im- pacto farmacológico mensurável em um modelo de tumor agressivo (FIGURAS 39 e 40A-D). FIG. 39 mostra o crescimento médio do tumor nos grupos de animais e as FIGURAS 40A-D mostra o crescimento do tumor em camundongos individuais em cada grupo de tratamento.
É improvável que uma dose baixa de nanograma de agonista de STING induza toxicidade sistêmica prejudicial que é observada com doses mais altas (10-100 microgramas) e, portanto, pode ser uma oportuni- dade atraente para terapias combinadas com outros agentes oncológi- cos ou imuno-oncológicos (por exemplo, anticorpos terapêuticos con- tra PD-1, PD-L1 e/ou CTLA-4). Notavelmente, as curvas de crescimen- to do tumor para grupos de 200ng e 40ng Exo STING foram compará-
veis, sugerindo que uma dose intermediária pode ser suficiente para induzir uma resposta imunológica durável, e que Exo STING pode apresentar uma oportunidade terapêutica para reduzir a dose de ago- nista STING em 100- 1.000 vezes para injeções intratumorais. Exemplo 11: Indução de uma resposta de célula T específica do antígeno por agonista de STING livre e exossomos carregados com agonista de STING
[00487] O agonismo da via STING em células dendríticas aumenta a apresentação do antígeno, a produção de IFNB e recruta as células T de memória CD8 + para eliciar uma resposta imunológica adaptativa durável. Para determinar se Exo STING poderia induzir uma resposta de célula T de memória a um antígeno definido, um estudo de respos- ta de célula T específico de antígeno foi realizado usando ovalbumina purificada (OVA). Um diagrama da visão geral experimental é mostra- do na FIG. 41A. Camundongos C57BL/6 foram injetados intraperitone- almente com 200 ug de OVA misturado com PBS, 20 ug ML RR-S2, 0,2 ug ML RR-S2 ou 0,2 ug ML RR-S2 carregados em exossomos com superexpressão de PTGFRN (n = 4-10 camundongos por grupo). Seis dias após a injeção, baços e nódulos linfáticos mesentéricos foram co- letados, homogeneizados em uma suspensão de célula única e os lin- fócitos vivos foram enriquecidos por centrifugação de densidade. Os linfócitos isolados foram analisados por citometria de fluxo medindo a ligação ao MHC tetramérico de classe | imobilizado ligado ao peptídeo OVA SIINFEKL e ficoeritrina (PE) (iITAg Tetramer/PE - H-2 OVA; MBLO, Código nº TO3000). Células T de memória reativas com OVA foram quantificadas por controle de positividade para PE, CD44 e CD8. Uma proporção maior de células T reativas a OVA no baço (FIG. 41B) e nódulos linfáticos mesentéricos (FIG. 41C) foram detectados nos grupos agonista de STING livre de alta dose e STING Exo em comparação com o PBS, livre de dose baixa de STING e exossomo nativo. O agonista de STING de baixa dose, que foi compatível com a concentração de Exo STING, não mostrou atividade no baço e apenas uma resposta modesta nos linfonodos mesentéricos, demonstrando um claro aumento na potência para agonistas de STING carregados em exossomos. Os camundongos tratados com exossomos não modi- ficados não exibiram uma resposta imunológica, demonstrando que os exossomos sozinhos não são imunogênicos ao longo do tempo do ex- perimento.
[00488] “Como um método ortogonal para medir a imunidade espe- cífica do antígeno, a expressão de IFNy foi medida por ELISpot de acordo com os protocolos padrão (ImmunoSpot6; Cellular Technology Limited). Os esplenócitos foram homogeneizados em uma suspensão de célula única e plaqueados (200.000 células/poço) em uma placa revestida com um anticorpo anti-|IFNy. O peptídeo OVA SIINFEKL foi adicionado às células durante 18 horas para induzir a produção de IFNy, as células foram lavadas da placa e IFNy ligado à placa foi de- tectado usando um anticorpo ortogonal (FIG. 41D). O número total de pontos reativos por placa foi contado e comparado entre os grupos usando o software ImmunoSpotO (Cellular Technology Limited). PBS, exossomo sozinho (EVs) e grupos de agonistas de STING de baixa dose exibiram níveis muito baixos de reatividade OVA. Ambos os gru- pos de agonista de STING de alta dose e Exo STING foram altamente reativos, com maior reatividade no grupo Exo STING, apesar de uma dose 100 vezes menor de agonista de STING neste grupo (FIG. 41E). Estes resultados demonstram que Exo STING pode ser uma oportuni- dade terapêutica diferenciada em desencadear uma resposta imunoló- gica para aplicações em oncologia e doenças infecciosas. Exemplo 12: Eficácia antitumoral e resposta imunológica especií- fica ao antígeno em um modelo de linfoma de células T murino
[00489] Os resultados de eficácia in vivo mostrados nos Exemplos 9 e 10 ea indução da resposta imunológica mostrada no Exemplo 11 sugerem que Exo STING pode ser suficiente para induzir uma respos- ta de eliminação de tumor específica do antígeno e subsequente res- posta imune in vivo.
Para testar esta hipótese, camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea com 1x10º células E.G7-OVA (ATCCG; CRL-2113 TY), uma linhagem de células de linfoma de célu- las T murinas manipulada para expressar estavelmente OVA e permitir a modelagem específica para antígenos Respostas de células T em camundongos (n = 5 camundongos por grupo). Dez, 13 e 16 dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intratumoralmente com PBS, 20 ug ML RR-S2, 0,2 ug ML RR-S2 ou 0,2 ug ML RR-S2 carre- gado em exossomos com superexpressão de PTGFRN). Semelhante aos efeitos observados no modelo B16F10 (FIGURAS 37-38, Exemplo 9), o agonista de STING livre de baixa dose moderadamente atenuou o crescimento do tumor, enquanto o agonista de STING livre de alta dose e Exo STING preveniu drasticamente o crescimento do tumor em comparação com o grupo PBS (FIGURAS 42 e 43A-D). FIG. 42 mos- tra o crescimento médio do tumor nos grupos de animais e as FIGU- RAS 43A-D mostra o crescimento do tumor em camundongos indivi- duais em cada grupo de tratamento.
As células T esplênicas de todos os grupos foram isoladas e medidas quanto à reatividade específica de OVA, conforme descrito no Exemplo 11. O agonista de STING livre de dose baixa induziu uma resposta de células T de memória modesta, enquanto o agonista de STING livre de dose alta e Exo STING induzi- ram uma resposta de célula T de memória potente (FIG. 43E). Estes dados demonstram que um agonista de STING carregado em exos- somos pode induzir simultaneamente respostas antitumorigênicas e de memória de células T in vivo em comparação com composto livre 100 vezes maior.
Exemplo 13: Exossomos de superexpressão de PTGFRN aumen- tam a estabilidade do agonista de STING em comparação com exossomos nativos
[00490] Os exossomos de células HEK293SF (exo STING nativa) e de células HEK293SF de superexpressão de PTGFRN-GFP (PTGFRN exo STING) foram carregados com ML RR-S2, purificados e quantifi- cados conforme descrito no Exemplo 1. Amostras frescas de exo STING nativa e PTGFRN exo STING induziram níveis semelhantes de IFNB em PBMCs de um único doador e ambos forneceram um aumen- to de potência sobre o agonista de STING livre (FIG. 44A). Alíquotas das formulações de agonista de STING exossomo foram congeladas a -80C por sete dias, descongeladas e adicionadas a PBMCs. PTGFRN exo STING induziu um perfil de produção de IFNB semelhante à pre- paração fresca, enquanto exo STING nativo induziu um perfil de ex- pressão de IFNB embotado, com uma Cmax dramaticamente reduzida em comparação com o agonista de STING livre ou exo STING PTG- FRN (FIG. 44B). A perda de potência para PTGFRN exo STING foi moderada em comparação com a perda de potência para exo STING nativa (FIG. 44C).
[00491] “Preparações frescas e congeladas de PTGFRN exo STING foram incubadas com PBMCs, e os perfis de captação celular para DCs, células NK e monócitos foram medidos por marcadores de su- perfície específicos de células e positividade de GFP. Não houve dife- rença no perfil de absorção entre PTGFRN exo STING fresco (FIGURAS 45A-45B) e congelado (FIGURAS 45C-45D), indicando que um ciclo de congelamento-descongelamento não interrompe a ab- sorção de exossomo. Estes resultados demonstram que a superex- pressão de PTGFRN pode ser mais adequada para armazenamento de longo prazo e formulação de exossomos terapêuticos carregados com agonistas de STING.
Exemplo 14: Indução de imunidade protetora e redução de metás- tase por administração intratumoral de exossomos carregados com agonista de STING
[00492] A ativação da via STING promove a apresentação do antí- geno e induz uma resposta de células T durável, conforme mostrado nos Exemplos 11 e 12. Assim, a resposta de memória imunológica in- duzida por EXOSTING '“ pode ser suficiente para prevenir metásta- ses tumorais após uma administração local em um tumor primário. Pa- ra testar esta hipótese, exossomos purificados a partir de células HEK293SF que superexpressam PTGFRN foram carregados com o dinucleotídeo cíclico 3-3 cCAIMPAdFSH conforme descrito no Exemplo 1. Camundongos C57BL/6 foram inoculados subcutaneamente com 1x10º células de melanoma B16F10 no dia zero e desafiados com uma veia da cauda adicional injeção de 1x105 células de melanoma B16F10 para semear metástases pulmonares (n = 8 camundongos por grupo). Cinco, oito e onze dias após a inoculação, os camundongos foram in- jetados intratumoralmente no tumor subcutâneo com PBS, 20 ug 3-3 CAIMPAFSH, 120ng 3-3 cAIMPAFSH, ou 120ng, 12ng ou 1,2 ng 3-3 CAIMPAdFSH carregado em exossomos de superexpressão de PTG- FRN (Agonista Exo STING). No dia 17, os tumores primários nos gru- pos de 20 ug de agonista de STING e de agonista de Exo de 120 ng de STING não cresceram. Houve uma relação dose-resposta nos gru- pos de Agonista de Exo STING de 12 ng e 1,2 ng, mas nenhuma re- gressão do tumor observada nos grupos de PBS ou de Agonista de STING de 120 ng (FIG. 46A). Os pulmões de todos os camundongos foram colhidos, fotografados e contados para metástases. Em compa- ração com o grupo injetado com PBS, as metástases pulmonares fo- ram drasticamente reduzidas nos grupos de Agonista STING Exo de 120 ng e 12ng e no grupo de Agonista STING de 20 ug. Tão pouco quanto 12 ng de Agonista de Exo STING preveniu a metástase pulmo-
nar na mesma extensão que 20 ug de Agonista de STING (FIGURAS 46B e 47). Curiosamente, os grupos tratados com Agonista de STING de 20 ug tiveram uma quantidade significativa de lesões pulmonares dentro do pulmão quando avaliados por histologia, enquanto os grupos Agonista de STING Exo 120ng e 12ng tiveram 4 respostas completas cada (FIG. 48). Esses dados demonstram que os agonistas de STING encapsulados em exossomo podem induzir imunidade protetora de tumor em uma dose muito mais baixa (-1.000 vezes) em comparação com agonistas de STING livres.
Exemplo 15: Distribuição mediada por exossomo de agonistas de STING sinergiza com imunoterapia de bloqueio de ponto de verifi- cação imunológico e depende da morte de tumor mediada por cé- lulas T
[00493] A ativação da via STING induz a regulação positiva dos pontos de verificação da via imunológica, que subsequentemente re- duzem a morte de células mediada por células T e, assim, moderam os efeitos do agonismo da via STING como uma justificativa terapêuti- ca (Cell Rep. 2015 19 de maio; 11 (7): 1018-30). Portanto, pode ser benéfico combinar inibidores da regulação de verificação imunológico para melhorar ainda mais a depuração mediada por imunidade das células tumorais. Para testar esta hipótese, exossomos purificados de células HEK293SF de superexpressão de PTGFRN foram carregados com o dinucleotídeo cíclico ML RR-S2 CDA, conforme descrito no Exemplo 1. Camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutâ- nea com 1x10º células de melanoma B16F10 (n = 6 camundongos por grupo). Cinco, oito e onze dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com um anticorpo de controle (a- IgG; 10 mg/kg; BioLegend, Catálogo nº 400559, Clone RTK3758) ou um anticorpo antagonista contra PD-1 (a PD-1; 10mg/kg; BioLegend, Catálogo nº 114111, Clone RMPI-14) com ou sem uma injeção intra-
tumoral de 30ng ML RR-S2 CDA carregado em exossomos de supe- rexpressão de PTGFRN (EXOSTING TY). Os tumores B16F10 são mal infiltrados por células imunológicas e refratários ao bloqueio de ponto de verificação. A dose subótima de 30 ng de EXOSTING 'Y levou à redução parcial do tumor, que foi amplificada pelo tratamento com a PD-1, mas não com a IgG (FIG. 49A).
[00494] Em um estudo separado, camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea com 1x10º células de melanoma B16F10 (n = 6 camundongos por grupo). Cinco, oito, 11 e 14 dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com IgG (10 mg/kg) ou anticorpo anti-CD8 (10 mg/kg). Seis, nove e 12 dias após a administração IP dos anticorpos, os camundongos foram tratados intratumoralmente com Exossomos ou ExoSTING (3-3 cCAIMPdFSH, 100 ng).
[00495] Os camundongos foram tratados com um anticorpo a CD8 de depleção de células T (10 mg/kg; BioLegend, Catálogo nº 100769, Clone 53-6.7) antes da administração intratumoral de EXOSTING'TY (3- 3 cAIMPAdFSH) de acordo com o esquema mostrado na FIG. 49B. A depleção sistêmica de células T anulou completamente os efeitos de EXOSTINGTY, demonstrando o papel crítico das células T CD8* na mediação dos efeitos antitumorais de EXOSTING'Y induzidos por agonista de STING (FIG. 49B).
[00496] Em um estudo separado, grupos (n = 5 para cada ponto de tempo) de camundongos C57BL/6 foram tratados intratumoralmente com PBS (apenas dia 8), 0,2 ug ML RR-S2 CDA (dias 5 e 8), 20 ug ML RR-S2 CDA (dias 5 e 8) e 0,2 ug de exoSTING (dias 5 e 8). 48 horas após a injeção no dia 8, tumores e baços foram isolados e dissociados em suspensões de células únicas utilizando kits de digestão de ca- mundongos Miltenyi (CAT nº 130-096-730 e 130-095-926, respectiva- mente) seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante em um gentle-
MACS instrumento. As células foram filtradas, lavadas duas vezes e, em seguida, submetidas a análise de citometria de fluxo ou cultura pa- ra ELISPOT para detectar reatividade específica contra antígenos das células tumorais B16F10. O ELISPOT foi realizado usando o Mabtech Mouse IFNy ELISpot PLUS (HRP) de acordo com o protocolo do fabri- cante. Resumidamente, 5x10º esplenócitos foram incubados com 10 vpo/ml de três peptídeos B16F10, a saber GP100 aminoácidos 25-33 (AnaSpec, Catálogo nº AS-62589), Tirosinase aminoácidos 368-376 (AnaSpec, Catálogo nº AS-61456) e TRP2 aminoácidos 180-188 (AnaSpec, Catálogo nº AS-61058). Conforme mostrado na FIG. 49C, EXOSTINGTY a 200 ng induziu significativamente mais pontos positi- vos para IFNy contra os peptídeos B16F10 em comparação com o agonista de STING livre de dose alta ou baixa. Juntos, esses dados demonstram que as células T são mediadores críticos da imunidade antitumoral induzida por agonistas de STING e que EXOSTING 7Y for- nece atividade superior como um agente único ou em combinação com bloqueio de ponto de verificação do que agonistas de STING li- vres.
Exemplo 16: Os níveis de PTGFRN exossômico se correlacionam com a potência de exossomos carregados com agonistas de STING
[00497] Os resultados nos Exemplos 3 e 13 sugerem que a supe- rexpressão de PTGFRN aumenta a atividade de exossomos carrega- dos com Agonista de STING. Para determinar se os níveis de PTG- FRN se correlacionam com a atividade EXOSTING'Y, as células HEK293SF foram geneticamente modificadas por CRISPR/Cas9 para excluir os loci PTGFRN endógenos (conforme descrito no Pedido de Patente Internacional Nº POT/US2018/048026). Os exossomos foram purificados a partir de células WT HEK293SF (WT Exo), células HEK293SF com superexpressão de PTGFRN (PTGFRN O/E Exo) e células nocaute de PTGFRN (PTGFRN KO Exo) e carregadas com 3-3
CAIMPAFSH conforme descrito acima. Em comparação com cAIMP- dFSH 3-3 solúvel, todas as formulações EXOSTING'Y foram ativado- res mais potentes da produção de IFNB em culturas de PBMC (n = 2 repetições). Curiosamente, PTGFRN O/E EXOSTINGY foi o ativador mais potente do IFNB e resultou na maior Cmax das formulações EXOSTINGTY, WT EXOSTING'Y foi atenuado em comparação com PTGFRN O/E EXOSTING'Y e PTGFRN KO EXOSTINGY resultou na resposta de IFNB mais suave (FIG. 50A). O sinal máximo de IFNB também se correlacionou com os níveis de PTGFRN (FIG. 50B). Para determinar se esta diferença de potência era consistente em um cená- rio de tumor in vivo , tumores subcutâneos B16F10 foram injetados com PBS ou 20 ng de WT EXOSTINGTY“, PTGFRN O/E EXOSTING Tv ou PTGFRN KO EXOSTINGY (injetado nos dias 6, 9 e 12). O grau em que os tratamentos EXOSTING 'Y atenuaram o crescimento do tumor também se correlacionou com os níveis de expressão de PTGFRN, indicando que níveis aumentados de PTGFRN podem induzir uma resposta imunológica antitumoral mais favorável e, portanto, as formu- lações terapêuticas EXOSTING T“ podem ser otimizadas aumentando a expressão de PTGFRN na superfície do exossomo (FIG. 50C).
Exemplo 17: Exossomos carregados com agonistas de STING são engolfados por células que apresentam antígeno e não são tóxi- cos para células efetoras imunológicas residentes em tumor
[00498] A ativação constitutiva da via STING resulta em sinalização pró-inflamatória robusta e pode ser tóxica para células e tecidos (N Engl J Med. 2014 Ago 7; 371 (6): 507-518). A distribuição não seletiva de agonistas de STING em um microambiente tumoral pode resultar em uma resposta IFNB robusta, mas se a resposta for muito forte ou se originar em populações de células indesejadas, células efetoras, como células T CD8* , podem ser mortas ou atenuadas de outra for- ma. Tumores de melanoma B16F10 foram injetados com exossomos de superexpressão de PTGFRN marcados com Alexa Fluor'"Y 488 e removidos uma hora após a injeção.
Linfócitos infiltrantes de tumor fo- ram purificados e medidos quanto à fluorescência a 488 nm para ras- trear a captação do exossomo.
Apenas —-20% das células T engolfa- ram exossomos, enquanto -90% e —-70% dos macrófagos e células dendríticas, respectivamente, engolfaram exossomos (FIG. 51A). Es- ses dados sugerem que as células apresentadoras de antígenos no microambiente tumoral são células-alvo naturais dos exossomos hu- manos.
Para determinar se a absorção celular específica de exosso- mos resultou na ativação da via STING diferencial para EXOSTINGTY versus agonistas de STING livres, os tumores de melanoma B16F10 acima foram injetados uma segunda vez com PBS, 20 ug de ML RR- S2 CDA livre, 0,2 ug de ML livre RR-S2 CDA, ou 200ng ML RR-S2 CDA carregado em exossomos com superexpressão de PTGFRN. 24 horas após a injeção, os tumores foram isolados, homogeneizados e as populações de células CD45* vivas foram contadas.
No grupo de 20 vg ML RR-S2 CDA, as células T CD8* , macrófagos e células dendriíti- cas foram dramaticamente reduzidos em comparação com os outros grupos (FIGURAS 51B-D). Estes dados indicam que altas doses de agonistas de STING livres podem ser tóxicas para as células apresen- tadoras de antígeno e células T no microambiente tumoral, as próprias células necessárias para a apresentação de antígeno e morte de célu- las tumorais.
A distribuição não seletiva de altas doses de agonistas de STING, portanto, pode atenuar as respostas imunoestimulatórias desejáveis.
EXOSTINGTY, devido à menor dose necessária para res- posta terapêutica comparável, portanto, opera em uma janela terapêu- tica mais ampla e reduz os riscos (por exemplo, toxicidade sistêmica, morte de células imunológicas, falta de seletividade celular) observa- dos com agonistas de STING livres.
Exemplo 18: Imagem de alta resolução de exossomos carregados com agonista de STING administrados por via intratumoral de- monstra aumento da potência e toxicidade reduzida em compara- ção com o agonista de STING livre
[00499] As medições da atividade de EXOSTINGTY mostradas nos exemplos anteriores demonstram que os exossomos, particularmente OS exossomos com superexpressão de PTGFRN, podem aumentar a atividade das moléculas agonistas de STING. As medições em massa, de tecidos homogeneizados ou soro isolado, fornecem dados significa- tivos sobre a potência e seletividade de EXOSTINGTY em várias apli- cações, mas não permitem a comparação direta entre as amostras no mesmo tumor ou para os efeitos locais no sítio da injeção. Para res- ponder a esta pergunta, um estudo de injeção intratumoral de micro- dosagem foi concluído usando um aparelho multi-injetor (CIVOG; Pre- sage Biosciences, Seattle, WA). Conforme descrito nos Métodos aci- ma, células de linfoma A20 foram implantadas subcutaneamente em camundongos e injetadas simultaneamente com até seis agentes dife- rentes. As injeções de dose única foram feitas com 2ug de ML RR-S2 CDA livre, 200ng de ML RR-S2 CDA, exossomos com superexpressão de PTGFRN, exossomos de tipo selvagem contendo 20ng de ML RR- S2 CDA ou exossomos de superexpressão de PTGFRN contendo 20ng de ML RR-S2 CDA. Os tumores foram coletados quatro horas e 24 horas após a injeção, processados e corados para a presença de mMRNA de IFNB (por hibridização in situ) e proteína caspase 3 clivada (Jackson Immunoresearch, anticorpo nº 111-605-144). Quatro horas após a injeção, os níveis de IFNB eram comparáveis entre o agonista de STING de alta dose e os grupos PTGFRN O/E EXOSTING"Y, e muito mais elevados do que os grupos agonista de STING livre de do- se baixa ou exossomo vazio (FIG. 52A). O sinal de IFNB voltou à linha de base 24 horas após o tratamento. A caspase 3 clivada (CC3), um marcador de apoptose, aumentou dramaticamente em quatro e 24 ho- ras para o agonista de STING livre de alta dose em comparação com todos os outros grupos, e modesta para os grupos EXOSTING'"Y e agonista de STING livre de dose baixa, indicando que doses altas de agonista de STING livre levou a uma maior apoptose sem benefício aprimorado para a produção de IFNB em comparação com EXOS- TINGTY (FIG. 52B). Estes dados, combinados com a absorção seletiva do tipo de célula descrita no Exemplo 17, sugerem que EXOSTINGTY tem como alvo seletivo as células imunológicas, levando a uma secre- ção aumentada de IFNB sem morte celular não seletiva observada com o agonista de STING livre.
[00500] Em outro estudo, as injeções de dose única foram feitas com 2ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, 20ng de 3-3 cAIMPdFSH livre, 0,4 ng, 2,2 ng, 6,6 ng ou 20 ng de 3-3 cCAIMPdAdFSH carregado em exosso- mos com superexpressão de PTGFN em tumores A20. Os tumores foram coletados quatro horas após a injeção, processados, corados para a presença de IFNB ou CXCL10 mRNA (por hibridização in situ ) e a análise de resposta radial foi conduzida. A expressão de mMRNA de IFNB (FIG. 52C) ou CXCL10 (FIG. 52D) foi maior onde as amostras foram injetadas e diminuiu gradualmente conforme a distância radial era aumentada. Exemplo 19: Potência comparativa de diferentes dinucleotídeos cíclicos encapsulados em exossomo ou dinucleotídeos não cícli- cos de Agonista de STING
[00501] As células HEK293SF de superexpressão de PTGFRN fo- ram cultivadas em frascos de agitação e os exossomos resultantes foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de densidade Optiprep "Y“, conforme descrito nos Métodos. Os exossomos purifica- dos foram carregados com agonistas de STING incluindo ML RR-S2 CDA, 2-3 cGAMP, 3-3 cAIMPAdFSH, 3-3 cAIM (PS) 2, cCAIMPmFSH,
CAIMPdF, cAIMP, CP214, CP201 e CP204 de acordo com os métodos no Exemplo 1. O 3-3 cAIMPdFSH, 3-3 cAIM (PS) 2, cAIMPdF, cAIMP correspondem ao composto 53, 13, 52 e 51 de um artigo (J Med Chem. 2016 Nov 23; 59 (22): 10253-10267), respectivamente. O CP214 é 2-3 cCAMPmFSH. O CP201 e o CP204 são análogos dos compostos das patentes WO2017/175156 e WO2017/175147, respec- tivamente. O carregamento foi quantificado conforme descrito no Exemplo 1. Os agonistas de STING encapsulados ou livres de exos- somo foram adicionados a PBMCs humanos e incubados a 37ºC du- rante a noite. A ativação de PBMCs pelo agonista de STING foi detec- tada medindo a quantidade de IFNB no sobrenadante. Conforme mos- trado na FIG. 53A-G, todos os agonistas de STING encapsulados em exossomo resultaram em uma mudança de potência em comparação com agonistas de STING livres, conforme mostrado no Exemplo 2. Exemplo 20: Potência in vivo de agonistas de STING livres em comparação com agonistas de STING encapsulados em exosso- mos em camundongos portadores de tumor (C57BL/6) e camun- dongos nocaute de STING (C57BL/6-Tmem173º')
[00502] Três grupos de camundongos C57BL/6 e C57BL/6- Tmem4173º' ( 4-5 camundongos por grupo) foram inoculados por via subcutânea com 1x108º células tumorais B16F10. Oito dias após a ino- culação, os camundongos foram injetados com uma única dose intra- tumoral de PBS, 20 ug de 3-3 cAIMPAFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 CAIMPAFSH carregado em exossomos com superexpressão de PTGFN (exeSTING). Quatro horas após a injeção, os tumores, linfo- nodos de drenagem, baços e soro foram coletados e os níveis de cito- cinas foram medidos. Os níveis de expressão do gene IFNB nos tumo- res (FIG. 54A), drenagem do linfonodo (FIG. 54B) e baço (FIG. 54C) de camundongos C57BL/6 (barras preenchidas) foram comparáveis em 20 ug de agonista de STING livre e 0,1 ug de grupos de agonistas de STING exossomo, enquanto os níveis de expressão do gene IFNB nos tumores (FIG. 54A), drenagem do linfonodo (FIG. 54B) e baço (FIG. 54C) de camundongos C57BL/6-Tmem173º' (barras vazias) eram semelhantes ao grupo de controle. Além disso, os níveis de IFNy e os quimioatraentes de células T CXCL9 e CXCL10 foram todos mais elevados no grupo de agonista de STING exossomo de camundongos C57BL/6 (barras preenchidas), mas não foram induzidos no grupo de agonista de STING exossomo de camundongos C57BL /6-Tmem173*% (barras vazias) (FIGURAS 55, 56, e 57). Além da expressão gênica, os perfis de citocinas séricas estão mostrando a mesma tendência (FIG. 58).
[00503] Para confirmar que os efeitos observados nas FIGURAS 54-58 foram traduzidos para atividade antitumoral, camundongos C57BL/6 e camundongos C57BL/6-Tmem173º foram inoculados por via subcutânea com células de melanoma murino 1x10º BI6F10 (n= 5 camundongos por grupo). Sete, dez e treze dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intratumoralmente com PBS, exosso- mos, 20 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 cAIMPdAdaFSH car- regado em exossomos de superexpressão de PTGFRN. Os volumes do tumor foram medidos diariamente até o dia 19, e os animais foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 2000 mm?. Como espe- rado, o tratamento com 0,1 ug de EXOSTING 'Y“ e 20 ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre resultou em regressão tumoral dramaticamente me- lhorada em camundongos C57BL/6 (FIG. 59). No entanto, nenhuma regressão do tumor foi observada em camundongos C57BL/ 6- Tmem173º*' de qualquer tratamento (FIG. 59). Coletivamente, esses dados demonstram que a atividade do agonista de STING exossomo é mediada pela via STING.
Exemplo 21: Eficácia comparativa in vivo de exossomos carrega- dos com agonista de STING e agonista de STING livre em um mo- delo murino avançado de melanoma
[00504] “Dados anteriores (FIGURAS 37, 40, 47, 49, 50 e 60) com tumor B16F10 mostraram atividade antitumoral aumentada de exos- somos carregados com agonista de STING. O tratamento foi iniciado quando o volume do tumor atingiu -5SO0Omm:º. Para testar a atividade em tumor avançado, camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea com 1x10º células de melanoma murino B16F10 (n= 5 camundongos por grupo) e esperaram até que o volume do tumor atingisse -100mmº?. Dez, treze e dezesseis dias pós-inoculação, os camundongos foram injetados intratumoralmente com exossomos, 30 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre, 0,3 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, 0,1 ug de 3-3 cAIMPdFSH carregado em exossomos de superexpressão de PTGFRN, ou 0,3 ug de 3-3 cAIMPAdFSH carregado em exossomos com superexpressão de PTGFRN. Os volumes do tumor foram medi- dos diariamente até o dia 28, e os animais foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 2000 mmº?. Em comparação com o grupo de controle de exossomos, o crescimento do tumor não foi afetado após o tratamento com 0,3 ug de agonista de STING livre, mas grande redu- ção da carga tumoral após o tratamento com 30 ug de agonista de STING livre. Surpreendentemente, o tratamento com 0,1 ug de EXOS- TING 7Y resultou em crescimento do tumor moderadamente potencia- do e com 0,3 ug de EXOSTINGTY melhorou dramaticamente a regres- são do tumor em comparação com o grupo de agonista de STING livre de concentração correspondente e em uma extensão semelhante ao grupo de agonista de STING livre de alta dose. FIG. 60 mostra o cres- cimento médio do tumor nos grupos de animais e as FIGURAS 61A- 61E mostra o crescimento do tumor em camundongos individuais em cada grupo de tratamento.
Exemplo 22: Eficácia anti-tumoral em um modelo murino de cân- cer colorretal
[00505] Para testar e expandir a eficácia in vivo para outros tipos de tumores, camundongos BALB/c foram inoculados por via subcutânea com 5x10* células CT26.CL25 (ATCCG6; CRL-2639 "Y), uma linhagem de células de câncer colorretal murino manipulada para expressar es- tavelmente beta-galactosidase, ou 5x10º células CT26.WT (ATCCÔO; CRL-2638 TY) (n =5 — 7 camundongos por grupo). Treze, dezesseis e dezenove dias pós-inoculação, os camundongos foram injetados intra- tumoralmente no tumor CT26.CL25 com exossomos, 0,012 ug de 3-3 CAIMPdAFSH livre ou 0,012 ug -3 cAIMPdAaFSH carregado em exosso- mos com superexpressão de PTGFRN e em tumor CT26.WT com PBS, exossomos, 100 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug -3 cAIMP- dFSH carregado em exossomos de superexpressão de PTGFRN. Se- melhante aos efeitos observados no modelo B16F10 (FIGURAS 37, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50 e 59), o agonista de STING livre de baixa dose moderadamente atenuou o crescimento do tumor, EXOSTINGTY evitou dramaticamente o crescimento do tumor de ambos os tumores CT26.CL25 (FIG. 62) e CT26.WT (FIG. 63) em comparação com o grupo de controle. Exemplo 23: Eficácia comparativa in vivo de exossomos carrega- dos com agonista de STING e agonista de STING livre em um mo- delo murino de melanoma de flanco duplo
[00506] A ativação da via STING leva a induzir respostas de células T específicas do tumor sistêmico, o que resultou em atividade antitu- moral abscopal (Cell Rep. 2018 Dez 11; 25 (11): 3074-3085). Além disso, a ativação da via STING induz a regulação positiva dos pontos de verificação da via imunológica, que subsequentemente reduzem a morte de células mediada por células T e, assim, moderam os efeitos do agonismo da via STING como uma justificativa terapêutica (Cell
Rep. 2015 19 de maio; 11 (7): 1018-30). Para testar ambas as hipóte- ses, camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea com células de melanoma murino 1x10º e 5x105 B16F10 no flanco direito e esquerdo de camundongos, respectivamente (n = 5 camundongos por grupo). Sete, dez e treze dias pós-inoculação, o tumor no flanco direito foi injetado intratumoralmente com exossomos, 20 ug de 3-3 cAIMP- dFSH livre, 0,1 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre ou 0,1 ug 3-3 cAIMPAFSH carregado em exossomos de superexpressão de PTGFRN, com um anticorpo de controle (a-lgG; 10mg/kg; BioLegend, Catálogo nº 400559, Clone RTK3758) ou um anticorpo antagonista contra PD-1 (a PD-1; 10mg/kg; BioLegend, Catálogo nº 114111, Clone RMPI-14). Os anticorpos foram injetados intraperitonealmente.
Os volumes do tumor foram medidos diariamente até o dia 21, e os animais foram sacrifica- dos quando o volume do tumor atingiu 2000 mm?. No tumor injetado, em comparação com o grupo de controle de exossomos (ambos com IgG ou Anti-PD1), o crescimento do tumor foi moderadamente potenci- ado após o tratamento com 0,1 ug de agonista de STING livre + IgG e 0,1 ug de agonista de STING livre + Anti-PD1. Quase completamente eliminado após o tratamento com 20 ug de agonista de STING livre e 0,1 ug de EXOSTING 'Y foi observado independentemente de anti- PD1 (FIG. 64). Surpreendentemente, foi observada redução significati- va do tumor em tumores contralaterais, que não eram tumores injeta- dos, após tratamento com 20 ug de agonista de STING livre e 0,1 ug de EXOSTINGTY., Além disso, esta redução do tumor foi mais fortale- cida com a combinação anti-PD1 (FIG. 65). Estes dados demonstra- ram a indução de respostas de células T específicas de tumor sistêmi- co por EXOSTINGTY,
Exemplo 24: Análise farmacocinética de tumor de exossomos car- regados com agonista de STING e agonista de STING livre em um modelo murino de melanoma
[00507] Para examinar a farmacocinética do tumor do agonista de STING, camundongos C57BL/6 foram inoculados por via subcutânea- com 1x106 células de melanoma murino B16F10 (n = 3 camundongos por grupo e tempo). Oito dias após a inoculação, os tumores foram in- jetados intratumoralmente com 30 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre, 0,3 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre ou 0,3 ug de 3-3 cAIMPAFSH carregado em exossomos de superexpressão de PTGFRN. Cinco minutos, trinta mi- nutos, duas horas, 6 horas, 24 horas e 48 horas após a injeção, os tu- mores foram excisados e lisados com 6 volumes de plasma. A concen- tração de 3-3 cAIMPdAaFSH foi medida por LC-MS/MS, conforme des- crito no Exemplo 1. 3-3 cAIMPdFSH livre em 30 ug e 0,3 ug desapare- ceu rapidamente do tumor, tendo meia-vida de cerca de 10 minutos. Surpreendentemente, a meia-vida de 3-3 cAIMPAFSH foi bastante aumentada (-120 minutos) quando administrada por exossomos (FIG. 66). Estes dados sugerem que após a injeção intratumoral de alta do- se de agonista de STING livre, o agonista de STING vazou para a cir- culação sistêmica rapidamente e finalmente conduziu as respostas sis- têmicas, incluindo aumento de citocinas séricas, conforme descrito no exemplo 6. No entanto, EXOSTINGTY tinha farmacologia retida pelo tumor e ativada as respostas no local, não sistêmicas, o que eventu- almente reduz a toxicidade do agonista de STING.
Exemplo 25: Análise farmacocinética de exossomos carregados com agonista de STING e agonista de STING livre em plasma de camundongo
[00508] Para examinar a farmacocinética do agonista de STING no plasma de camundongo, camundongos C57BL/6 naive foram injetados por via intravenosa com 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre, ou 0,1 ug, 0,3 vg, 0,6 ug 3-3 cAIMPAFSH carregado em exossomos com superex- pressão de PTGFRN. Injeção de um, cinco, dez e trinta minutos, o sangue foi coletado e o plasma foi preparado. A concentração de 3-3
CAIMPdAFSH foi medida por LC-MS/MS, conforme descrito no Exemplo
1. 3-3 cCAIMPdFSH livre desapareceu rapidamente da circulação, tendo meia-vida de 1,2 minutos (FIG. 67).0,1 ug e 0,3 ug 3-3 cAIMPAFSH exossomos carregados com meia-vida semelhante (1,2 e 1,8 minutos, respectivamente) como 3-3 cAIMPdFSH livre, mas 0,6 ug 3-3 cAIMP- dFSH exossomos carregados com meia-vida aumentada (8,5 minutos) (FIG. 68).
Exemplo 26: Atividade in vivo comparativa de exossomos carre- gados com agonista de STING e agonista de STING livre em ca- mundongo após injeção intravenosa
[00509] Para comparar a atividade in vivo de agonista de STING livre e exossomos carregados com agonista de STING além da dosa- gem intratumoral, camundongos C57BL/6 naive foram injetados por via intravenosa com 20 ug de 3-3 cAIMPdFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 CAIMPAFSH carregados em exossomos de superexpressão de PTG- FRN. Trinta minutos, duas horas, seis horas e vinte e quatro horas após a injeção, fígados, baços e soro foram coletados e os níveis de citocinas foram medidos. Surpreendentemente, todos os níveis de ex- pressão de genes de citocinas que foram testados neste documento, incluindo IFNB, CXCL9, CXCL10, IFNy foram significativamente maio- res em 0,2 ug EXOSTINGTY, em comparação com 20 ug de agonista de STING livre, no fígado (FIGURAS 69A-D), baço (FIGURAS 70A-D) e soro (FIGURAS 71A-E), em todos os pontos de tempo, embora a quantidade injetada de -3 cCAIMPdFSH fosse 100 vezes menor no gru- po EXOSTINGY. Isso pode ser devido ao mecanismo de captação seletiva de exossomos para o fígado e baço (J Extracell Vesicles. 2015 abr 20; 4: 26316), que permite a distribuição de agonista de STING a esses órgãos. Estes dados demonstram que 100 vezes menos agonis- ta de STING pode induzir uma indução significativamente maior da ex- pressão de um gene IFN após injeção intravenosa por exossomos de-
vido à alteração da farmacocinética e farmacodinâmica do agonista de STING. Exemplo 27: Atividade in vivo comparativa de exossomos carre- gados com agonista de STING e agonista de STING livre em ca- mundongo após injeção subcutânea
[00510] Para comparar a atividade in vivo de agonista de STING livre e exossomos carregados com agonista de STING além da dosa- gem intratumoral, camundongos C57BL/6 naive foram injetados por via subcutânea com PBS, exossomos, 20 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,2 ug de 3-3 cAIMPAFSH carregados em exossomos de superex- pressão de PTGFRN. Quatro horas após a injeção, linfonodos, baços, fígados e soro foram coletados e os níveis de citocinas foram medidos. Os níveis de expressão do gene IFNB nos linfonodos (FIG. 72A), ba- ços (FIG. 72B) e fígados (FIG. 72C) foram significativamente elevados após 20 ug de tratamento com agonista de STING livre, mas os níveis de expressão do gene IFNB foram dramaticamente reduzidos após EXOSTINGTY, em comparação com o grupo de tratamento com maior agonista de STING livre. Além disso, os níveis de IFNy e os quimioa- trativos de células T CXCL9 e CXCL10 mostraram tendência seme- lhante ao IFNB (FIGURAS 73, 74 e 75). Estes resultados foram mais dramáticos em citocinas séricas mostrando diminuições marcadas nas citocinas pró-inflamatórias IFNB (FIG. 76A), TNF-a (FIG. 76B), IL-6 (FIG. 76C), IFNy (FIG. 76D) e MCP-1 (FIG. 76E) no grupo de agonista de STING exossomo em comparação com grupos de agonista de STING livre. Exemplo 28: Potência in vivo e efeitos sistêmicos de agonistas de STING livres em comparação com agonistas de STING encapsu- lados em exossomo em camundongos portadores de tumor
[00511] — Quatro grupos de camundongos C57BL/6 (5 camundongos por grupo) foram inoculados subcutaneamente com 1x10º células tu-
morais B16F10. Oito dias após a inoculação, os camundongos foram injetados intratumoralmente com uma dose de exossomos, 20 ug de 3- 3 cAIMPdAFSH livre, 0,1 ug de 3-3 cAIMPdAFSH livre ou 0,1 ug de 3-3 CAIMPdAFSH carregado em exossomos de superexpressão de PTGFN (EXOSTINGTY). Metade dos camundongos foram injetados novamente por via intratumoral no dia 11 após a inoculação.
Quatro ou 24 horas após a injeção de cada injeção, os tumores foram coletados, os níveis de citocinas foram medidos por hibridização in situ e as células CD8 ou F4/80 positivas foram contadas por imuno-histoquímica.
A área do tumor e a área do estroma foram identificadas histologicamente.
Os níveis de expressão do gene IFNB na área do tumor (FIG. 77A) e do estroma (FIG. 77B) foram aumentados nos grupos de 20 ug de agonis- ta de STING livre e 0,1 ug EXOSTINGTY 4h após a dose única.
Sur- preendentemente, o nível de IFNB na área do tumor e do estroma di- minuiu significativamente no grupo de agonista de STING de 20 ug livre 4h após as segundas doses, enquanto o nível de IFNB na área do tumor e do estroma foi mantido no grupo EXOSTING'Y de 0,1 ug.
Além disso, as células T CD8 positivas aumentaram significativamente no grupo de EXOSTINGTY de 0,1 ug às 4 e 24 h após as segundas doses, mas não aumentaram no grupo de agonista de STING livre de ug (FIG. 78A). As células F4/80 positivas foram diminuídas em 20 ug de grupo de agonista de STING livre, mas as células foram recupe- radas em 0,1 ug de grupo EXOSTINGTY (FIG. 78B). Esses dados de- monstram que o agonista de STING livre de alta dose pode destruir as células imunológicas que têm a capacidade de induzir respostas de IFN após dose única, o que as torna incapazes de induzir níveis seme- lhantes de respostas de IFN após segundas doses e incapazes de re- crutar as células T para o tumor.
Porém, o exoSTING não destroi as células imunológicas, mas induz respostas de IFN mesmo após múlti- plos tratamentos, o que leva a um aumento da infiltração de células T.
Exemplo 29: Eficácia comparativa in vivo de exossomos carrega- dos com agonista de STING e agonista de STING livre em um mo- delo murino de melanoma para mostrar respostas de células T duráveis
[00512] Os resultados do Exemplo 9 anterior sugerem que EXOS- TINGTY que carregado com ML RR-S2 CDA exibiu as respostas de células T duráveis que bloqueiam o crescimento de tumor re-exposto. Aqui, para determinar se EXOSTING'Y carregado com 3-3 cAIMP- dFSH exibe as mesmas respostas, camundongos C57BL/6 foram ino- culados por via subcutânea com 1x10º células de melanoma murino B16F10 (n = 5-10 camundongos por grupo). Seis, nove e doze dias após a inoculação, os tumores foram injetados intratumoralmente com PBS, exossomos, 100 ug de ML RR-S2 CDA livre ou 0,2 ug 3-3 CAIMPdAFSH carregado em exossomos com superexpressão de PTG- FRN. FIG. 79A mostra o crescimento médio do tumor nos grupos de animais e as FIGURAS 79B-E mostram o crescimento do tumor em camundongos individuais. Os dez animais nos 100 ug de ML RR-S2 CDA livre e quatro animais do grupo EXOSTING '“ que mostraram resposta completa foram re-expostos no dia 20 por transplante de 1x10º células B16F10 no flanco oposto. Cinco camundongos naive adicionais foram inoculados com a mesma preparação de células tu- morais e tratados diariamente com PBS para garantir a viabilidade ce- lular e a cinética de crescimento. No dia 37 (17 dias após o desafio), todos os camundongos do grupo PBS foram sacrificados. Os tumores em animais de 100 ug de ML RR-S2 CDA livre falharam em inibir o crescimento do tumor em 10 de 10 animais, embora notavelmente, o crescimento do tumor foi indetectável em todos os quatro camundon- gos no grupo EXOSTING'TY (FIGURAS 80A-D). FIG. 80A mostra o crescimento médio do tumor nos grupos de animais e as FIGURAS 80B-D mostram o crescimento do tumor em camundongos individuais.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00513] Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes e/ou outros documentos citados neste documento são incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma medida que se cada publicação individual, patente, pedido de patente e/ou ou- tro documento fosse individualmente indicado para ser incorporado a título de referência para todos os fins.
EQUIVALENTES
[00514] A presente descrição fornece, inter alia, composições de exossomos que encapsulam agonistas de STING para uso como tera- pêutica. A presente descrição também fornece métodos de produção de exossomos que encapsulam agonistas de STING e métodos de administração de tais exossomos como terapêuticos. Embora várias modalidades específicas tenham sido ilustradas e descritas, o relatório descritivo acima não é restritivo. Será apreciado que várias alterações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da(s) inven- ção(ões). Muitas variações da invenção tornar-se-ão aparentes àque- les versados na técnica mediante revisão deste relatório descritivo.

Claims (64)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma vesícula extracelular e um estimulador de agonista da proteína dos genes interferon (STING).
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que a vesícula extracelular é um exossomo, uma nanovesícula, um corpo apoptótico, uma microvesícula, um lisossomo, um endossomo, um lipossomo, uma nanopartícula lipídica, uma mice- la, uma estrutura multilamelar, uma vesícula revesiculada ou uma célu- la extrudada.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zada pelo fato de que a vesícula extracelular é um exossomo.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o agonista de STING es- tá associado à vesícula extracelular.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizada pelo fato de que o agonista de STING é encapsulado dentro da vesícula extracelular.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizada pelo fato de que o agonista de STING está ligado a uma bica- mada lipídica da vesícula extracelular, opcionalmente por um ligante.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular superexpressa uma proteína PTGFRN.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizada pelo fato de que o agonista de STING está ligado à proteína PTGFRN, opcionalmente por um ligante.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular é produzida por uma célula que superexpressa uma proteína PTGFRN.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular é modificada com glicano.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular é dessialilada.
12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular é desglicosilada.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular compreende ainda uma proteína que se liga ou reage enzimaticamen- te com o agonista de STING.
14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular compreende ainda um ligante, uma citocina ou um anticorpo.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que o ligante compreende CD40L, OX40L e/ou CD27L.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que a citocina compreende IL-7, IL-12 e/ou IL-15.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que o anticorpo compreende um anticorpo anta- gonista e/ou um anticorpo agonista.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o agonista de STING é um dinucleotídeo cíclico.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o agonista de STING é um dinucleotídeo não cíclico.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1| a 19, caracterizada pelo fato de que o agonista de STING compreende um marcador de ligação a lipídios.
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o agonista de STING é fisicamente e/ou quimicamente modificado.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, carac- terizada pelo fato de que o agonista de STING modificado tem uma polaridade e/ou uma carga diferente do agonista de STING não modi- ficado correspondente.
23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 22, caracterizada pelo fato de que a concentração do agonista de STING associado à vesícula extracelular é de cerca de 0,01 uM a 100 UM.
24. Composição de acordo com a reivindicação 23, carac- terizada pelo fato de que a concentração do agonista de STING asso- ciado à vesícula extracelular é de cerca de 0,01 uM a 0,1 UM, 0,1 UM à 1 UM, 1 UM a 10 UM, 10 uM a 50 uM ou 50 UM a 100 uM.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, carac- terizada pelo fato de que a concentração do agonista de STING asso- ciado à vesícula extracelular é de cerca de 1 uM a 10 uM.
26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que o agonista de STING compreende: Fórmula 1 Fórmula 2 Fórmula 3 2-bo r alo Y sd. Y % o a * o TJ * o To At, " [tis fat, B, õ 8, Z ou B, z em que:
X é H, OH ou F; X2> é H, OH, ou F; Z é OH, OR, SH ou SR, em que: i) R1 é Na ou NH, ou ii) R1 é um grupo lábil a enzima que fornece OH ou SH in vivo, tal como pivaloiloximetil; Bi e B2 são bases escolhidas a partir de: NH oH o 2 N - N N
TT Adenina, Hipoxantina ou OH o
NEN OS a E? asa nn ) YW T+ e Guanina, Com a condição de que: - na Fórmula (1): X1 e X2 não são OH, - na Fórmula (11): quando X; e X> são OH, B: não é Adenina e B2 não é Guanina, e - na Fórmula (III): quando X; e X>são OH, B: não é Adeni- na, Bz não é Guanina e Z não é OH, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, carac- terizada pelo fato de que o agonista de STING é selecionado do grupo que consiste em:
NH NH on ES nos AI e " NJ nt ER ELE, ERR SS Ts EIA CE o OS o CL606 ? cen CcL602 (3'2)c-AIMP (227c-AMP (21,3)c-AIMP.
nos Nºo nºo 2 LO e. OO 2. O E N tor, N nob-or
FTD ES EE goto e fotos os obo, L» Ô NA > õ LIL» o mi Z n nº CO o " o ' CL6ss CL604 CcL609 c-AMP(S) ; C<dAMP-AIMP) ' e<dAMP-2'FAINP) D ne E A E EO 9 he ? HA ee; Hob-om o NON HsPoq o NS eo de > eo > eo > A NTE pano ii AA " form S&S nt O Dobro nl o obs Po Ombro ANN, ANSN M Tl» o Ex Lx E Ú o CcLeta CL656 CcL647 cC-(2'FAAMP-2'FdIMP) c-2'FdAMP(S)-2'FdIMP(S)] (20,3) c(AMP-2'FdIMP) nº o o O o CT 2 OS e EE voto PTN " N PT " NÔ NH E o KV > — e ô à a lo rotor “o o Lobos Meio S o for ) õ > o o o Hi DA . 1 CL626 CL629 CcL603 c-dif(2'FdiMP) ' c-di(2'FAGMP) ' c-(2FAGMP-2'FdAMP) ; nº Nºo o ESA X. EO o EO ) br o AI d Lo, o a Hsbrom NON ção > “ Fo E e 6 EX E SA Pt AS For tt Nom ops o HANNA O o-P-sn HNSANSON, ops PT> Ô XX b É XE? 6 Yo ANSA o Y DE õ CcL632 CcL633 CcL659 cA2'FAGMP(S)-2'FdAMP(S)] c-[2'FAGMP(S)-2'FAdAMP(S))(POM)> c-[2'FAdAMP(S)-2'FAdIMP(S))(POM): e um sal farmaceuticamente aceitável deste.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, carac- terizada pelo fato de que o agonista de STING está no lúmen da vesí- cula extracelular e não está ligado a uma fração de suporte.
29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular associada ao agonista de STING exibe uma ou mais das seguintes características: (i) ativa células dendríticas, por exemplo, células dendrí-
ticas mieloides; (ii) ativa as células de monócitos em um grau menor do que o agonista de STING sozinho ("agonista de STING livre"); (iii) não ativa células de monócitos; (iv) tem um índice terapêutico mais amplo em compara- ção com o agonista de STING livre; (v) tem menos toxicidade sistêmica do que o agonista de STING livre; (vi) tem menos morte de células imunológicas do que o agonista de STING livre; (vii) tem maior seletividade celular do que o agonista de STING livre; (viii) fornece imunidade protetora do tumor em uma do- se mais baixa do que o agonista de STING livre; (ix) induzir uma resposta celular específica in vivo em células apresentadoras de antígeno, por exemplo, células dendríticas; (x) é capaz de induzir uma resposta imunológica em uma região distal após uma administração local; e (xi) é capaz de ser dosado em um nível inferior ao do agonista de STING livre.
30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular associada ao agonista de STING, quando administrada a um mamífe- ro, não esgota as células T e/ou macrófagos no mamífero.
31. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que a vesícula extracelular associada ao agonista de STING, quando administrada a um mamífe- ro, esgota as células T e/ou macrófagos no mamífero em um grau me- nor do que o agonista de STING livre.
32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de
71H que compreende a composição, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 31, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
33. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a com- posição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 32 e as instruções de uso.
34. Método de produção de um EV, por exemplo, caracteri- zado pelo fato de que compreende um agonista de STING, o método compreendendo: a. Obtenção de um EV, por exemplo, exossomo; b. Mistura do EV, por exemplo, exossomo com um agonista de STING em uma solução; Cc. Incubação da mistura do EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING em uma solução compreendendo um tampão sob condições adequadas; e d. Purificação do EV, por exemplo, exossomo compreen- dendo o agonista de STING.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracteri- zado pelo fato de que as condições adequadas compreendem a incu- bação do EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING por cer- ca de 2-24 horas.
36. Método, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, carac- terizado pelo fato de que as condições adequadas compreendem a incubação do EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING a cerca de 15-90ºC.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteri- zado pelo fato de que as condições adequadas compreendem a incu- bação do EV, por exemplo, exossomo e o agonista de STING a cerca de 37ºC.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 37, caracterizado pelo fato de que a quantidade do agonis-
ta de STING na etapa de mistura compreende pelo menos 0,01 mM a 100 mM.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 38, caracterizado pelo fato de que a quantidade do agonis- ta de STING na etapa de mistura compreende pelo menos 1 mM a 10 mM.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 39, caracterizado pelo fato de que a quantidade do exos- somo na etapa de mistura compreende pelo menos cerca de 10º a pe- lo menos cerca de 10º partículas no total.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 40, caracterizado pelo fato de que a quantidade de EV, por exemplo, exossomo na etapa de mistura compreende pelo menos cer- ca de 10º? partículas no total.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 41, caracterizado pelo fato de que o tampão compreende solução salina tamponada com fosfato (PBS).
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 34 a 42, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação compreende uma ou mais etapas de centrifugação.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteri- zado pelo fato de que uma ou mais etapas de centrifugação são de cerca de 100.000 x g.
45. Método para induzir ou modular uma resposta imunoló- gica e/ou uma resposta inflamatória em um sujeito em deste, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujei- to de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 32.
46. Método de tratamento de um tumor em um sujeito em necessidade deste, o método caracterizado pelo fato de que compre- ende a administração ao sujeito da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 32.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, carac- terizado pelo fato de que a administração induz ou modula a resposta imunológica e/ou a resposta inflamatória no sujeito.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a administração ativa células dendríticas.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 48, caracterizado pelo fato de que a administração ativa células dendríticas mieloides.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 49, caracterizado pelo fato de que a administração resulta em ativação de células de monócitos reduzida em comparação com o agonista de STING livre.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 50, caracterizado pelo fato de que a administração não in- duz a ativação de células de monócitos.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 51, caracterizado pelo fato de que a administração induz a produção de interferon-B (IFN-B).
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 52, caracterizado pelo fato de que a administração resulta em inflamação sistêmica reduzida em comparação com o agonista de STING livre.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 53, caracterizado pelo fato de que a administração resulta em quantidades insubstanciais de inflamação sistêmica.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 54, caracterizado pelo fato de que a administração é parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal ou atra- vés de qualquer outra via de administração apropriada.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 55, caracterizado pelo fato de que a administração é intra- venosa.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 56, caracterizado pelo fato de que a resposta imunonológi- ca é uma resposta antitumoral.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 57, caracterizado pelo fato de que a composição está em uma quantidade suficiente para induzir IFN-B e/ou para ativar células dendríticas.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 58, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada intratumoralmente em um primeiro tumor em um local, e em que a composição administrada no primeiro tumor previne de metástases de um ou mais tumores em um segundo local.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 59, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional.
61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente imu- nomodulador.
62. Método de acordo com a reivindicação 60 ou 61, carac- terizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticor- po ou fragmento de ligação ao antígeno deste.
63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 ou LAG3.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 63, caracterizado pelo fato de que a administração evita a metástase do tumor no sujeito.
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