CN115466723B - 一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115466723B
CN115466723B CN202211213710.3A CN202211213710A CN115466723B CN 115466723 B CN115466723 B CN 115466723B CN 202211213710 A CN202211213710 A CN 202211213710A CN 115466723 B CN115466723 B CN 115466723B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sting
cells
rab22a
activated
evps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211213710.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115466723A (zh
Inventor
康铁邦
付清玲
高瑛
钱林霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University Cancer Center
Original Assignee
Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University Cancer Center filed Critical Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority to CN202211213710.3A priority Critical patent/CN115466723B/zh
Publication of CN115466723A publication Critical patent/CN115466723A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115466723B publication Critical patent/CN115466723B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明的包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒，是通过诱导细胞分泌包裹有激活型干扰素基因刺激蛋白(STING)的细胞外囊泡(EVs)得到的，包裹有激活型STING的EVs稳定性强，不易降解，直接用于抗肿瘤及免疫调节，不需要在体内注射STING激动剂间接诱导生成激活型STING，进一步避免了个体差异带来的不确定性因素。本发明通过构建增强RAB22A的自噬功能的细胞，从而增强细胞分泌包裹激活型STING的EVs，达到更好的抗肿瘤效果。

Description

一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地，涉及一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING；也被称为MITA、MYPS、ERIS)是一个内质网(endoplasmic reticulum，ER)相关的信号分子，当细胞识别到异常DNA或者循环二核苷酸(cyclic dinucleotides，CDNs)后，激活的STING负责调控多种宿主防御基因的转录，包括I型干扰素(interferon，IFN)和促炎细胞因子。STING信号转导可以保护细胞免受各种病原体的侵袭，甚至通过促进抗肿瘤的免疫反应对癌症的发展起着至关重要的作用。
cGAS-cGAMP-STING信号通路在天然免疫中发挥重要作用。环鸟嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸(cyclic GMP-AMP，cGAMP)合成酶(cGAMP synthase，cGAS)感受细胞质DNA刺激后产生cGAMP，cGAMP作为干扰素基因刺激分子(stimulator of interferon genes，STING)的天然激动剂和STING结合后激活TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)，进而诱导干扰素β(interferonβ，IFNβ)的产生，补充IFNβ在先天性免疫中的功能。同时，IFNβ可以选择性地刺激肿瘤抗原的交叉递呈，动员肿瘤特异性T细胞，从而启动对抗肿瘤的适应性免疫应答。
细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)EVs是一组具有异质性的细胞来源的膜状小体结构，主要包括外泌体(exosomes)和微囊泡(microvesicles，MVs)，外泌体来源于细胞的内膜系统，微囊泡来源于细胞膜出芽。EVs携带有母细胞的多种核酸、蛋白质、脂质、氨基酸和代谢产物等重要信息，在细胞间通讯以及器官体内稳态和疾病中发挥着重要作用，在癌症生物学和免疫学等多个学科中受到广泛关注。
间充质干细胞(MSCs)是多能干细胞，通常从骨髓、脂肪组织和脐带血中分离出来。MSCs通过与T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞或树突状细胞的相互作用，对免疫系统疾病具有强大的免疫调节作用。MSCs发挥其免疫调节特性的主要机制是通过细胞间接触和旁分泌因子，旁分泌因子包括TGF-β1、TNF-α、PGE2、IFN-γ和HGF等，被包裹在细胞外囊泡中到达远处，调节相应宿主细胞。MSCs的免疫原性普遍较低，由于MSCs表达相对较低水平的主要组织相容性复合体I类分子，缺乏主要组织相容性复合体II类和共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)的表达，因此MSCs不容易触发受体免疫应答。然而，使用成人MSCs有几个潜在的局限性，包括其增殖能力有限、不同供体细胞质量的显著差异以及多潜能的快速丧失。诱导多能干细胞(IPSCs)是使用转录因子从体细胞重新编程的细胞。与胚胎干细胞类似，IPSCs已被成功诱导分化为多种功能细胞，如神经元、心肌细胞、胰岛细胞和MSCs。由于IPSCs是非特异性细胞，能在培养皿中无限更新，IPSCs来源的MSCs显示出更高的增殖率。此外，与成人MSCs相比，人IPSC-MSC对IFN-γ诱导的人类白细胞抗原(HLA)-II表达不敏感，移植后具有更低的免疫原性。
以STING为靶标的小分子激动剂在抗肿瘤免疫领域已经取得一定进展，有研究报道显示：在动物体内，小分子的STING激动剂以及各种CDNs可以刺激STING信号通路，促进抗原呈递和T细胞启动，从而抑制肿瘤。然而，CDNs固有的负电荷、对酶降解的敏感性、亲水性以及小体积等特性，使CDNs在组织和细胞中难以维持稳定性、生物利用度、传递和保留性能。cGAMP亲水性强而不易跨越细胞膜，因此在细胞间的转移摄取效率都很低，而且cGAMP在体外很容易被降解。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用。
本发明提出受体细胞摄取包含激活型干扰素基因刺激蛋白(STING)的细胞外囊泡(EVs)后分泌干扰素β(IFNβ)，进而动员T细胞启动杀伤肿瘤的作用。此外，本发明还提出RAB22A在内质网形成自噬体，将激活型STING包裹在自噬体内；RAB22A还诱导早期内体的形成，RAB22A形成的自噬体和RAB22A形成的早期内体互相融合膨大形成自噬MVBs，由此将激活型STING带入自噬多囊泡体(MVBs)。同时，RAB22A诱导RAB蛋白中的RAB7失活导致MVBs不和溶酶体融合，将STING分泌到细胞外。
本发明的第一个目的是提供一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒的制备方法。
本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒。
本发明的第三个目的是提供所述包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒的制备方法，用含有干扰素基因刺激蛋白激动剂的培养基培养细胞，或者在细胞中过表达激活型干扰素基因刺激蛋白的基因，得到活化的细胞，收集所述活化的细胞分泌的细胞外囊泡和颗粒，所述细胞外囊泡和颗粒即为包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒，所述细胞外囊泡和颗粒为extracellular vesicles and particles，EVPs。
优选地，用含有干扰素基因刺激蛋白激动剂的培养基培养细胞，使细胞分泌激活型干扰素基因刺激蛋白，收集所述细胞的培养上清液，离心清除培养上清液中的细胞和细胞碎片，得到包裹激活型干扰素基因刺激蛋白的细胞外囊泡。
优选地，所述包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒为所述活化的细胞分泌的细胞外囊泡。
优选地，所述激活型干扰素基因刺激蛋白为STINGV155M或STINGR281Q，所述STING的在NCBI上的登录号为Gene ID：36016，所述STINGV155M为STING的第155位的氨基酸由V突变为M，所述STINGR281Q为STING的第281位的氨基酸由R突变为Q。
优选地，所述干扰素基因刺激蛋白激动剂为diABZI、cGAMP、MSA-2或SR-717。
更优选地，所述干扰素基因刺激蛋白激动剂为diABZI或cGAMP。
更优选地，用含有5～10μm的diABZI培养基培养细胞。
优选地，所述细胞为增强RAB22A的自噬功能的细胞，所述RAB22A的在NCBI上的登录号为Gene ID：57403。
更优选地，所述增强RAB22A的自噬功能的细胞为过表达RAB22AQ64L蛋白的细胞，所述RAB22AQ64L为RAB22A的第64位的氨基酸由Q突变为L。
更优选地，过表达RAB22AQ64L、STINGV155M或STINGR281Q蛋白的细胞的方法为，用扩增RAB22AQ64L、STINGV155M或STINGR281Q基因的引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物，将PCR扩增产物连接到表达载体上得到重组表达载体，将重组表达载体转入细胞，转入所述重组表达载体的细胞为过表达RAB22AQ64L基因的细胞；
所述扩增RAB22AQ64L基因的正向引物核苷酸序列为AATTCCTAATCTGGGATACAGCTGGATAAGAACGATTTCGTGCCTTAGCAC，所述扩增RAB22AQ64L基因的反向引物核苷酸序列为引物核苷酸序列为TGTATCCCAGATTAGGAATTTATGTAGCTC；
所述扩增STINGV155M基因的正向引物核苷酸序列为TGTGTGAAAAAGGGAATTTCAACATGGCCCATGGGCTGGCAT，所述扩增STINGV155M基因的反向引物核苷酸序列为TTCCCTTTTTCACACACTGCAG；
所述扩增STINGR281Q基因的正向引物核苷酸序列为CACAATACAGTCAAGCTGGCTTTAGCCAG GAGGATAGGCTTGA，所述扩增STINGR281Q基因的反向引物核苷酸序列为GCCAGCTTGACTGTATTGTGACAT。
更优选地，所述PCR反应体系为：待过表达RAB22AQ64L、STINGV155M或STINGR281Q的野生型细胞的cDNA模板1μL、10μM正向引物2μL、10μM反向引物2μL、2×PrimeSTAR Max Premix25μL和ddH2O 20μL；
所述PCR反应条件为：
95℃预变性5min后，下列条件进行35个循环：98℃10s，60℃30s，72℃10s(/kb)。35个循环过后，再进行一步72℃，10min延伸反应。得PCR产物即为RAB22AQ64L基因、STINGV155M基因或STINGR281Q基因。
优选地，所述细胞为动物细胞。
更优选地，所述动物细胞为动物体外细胞。
更优选地，所述细胞为人源间充质干细胞。
所述方法制备得到的包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒。
所述包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤为抑制肿瘤体积和/或重量的生长。
一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物中含有所述包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒。
优选地，所述肿瘤为乳腺癌、鼻咽癌和/或宫颈癌肿瘤。
优选地，所述抗肿瘤为抑制肿瘤体积和/或重量的生长。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明的包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒，是通过诱导细胞分泌包裹有激活型干扰素基因刺激蛋白(STING)的细胞外囊泡(EVs)得到的，包裹有激活型STING的EVs稳定性强，不易降解，直接用于抗肿瘤及免疫调节，不需要在体内注射STING激动剂间接诱导生成激活型STING，进一步避免了个体差异带来的不确定性因素。本发明通过构建增强RAB22A的自噬功能的细胞，从而增强细胞分泌包裹激活型STING的EVs，达到更好的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为不受diABZI刺激的IPSC-MSC和受不同浓度的diABZI刺激的IPSC-MSC，其细胞外囊泡和颗粒(extracellular vesicles and particles，EVPs)和细胞裂解液(WCL)中STING的表达情况。
图2为不受diABZI刺激的IPSC-MSC和受不同浓度的diABZI刺激的IPSC-MSC，其EVPs中STING对THP-1细胞的IFNβ表达的影响。
图3为用或不用doxycycline刺激表达激活型STING的稳定过表达细胞株(IPSC-MSC-PSIN-Teton STINGV155M)，其EVPs和细胞裂解液(WCL)中STING的表达情况。
图4为用或不用doxycycline刺激表达激活型STING的稳定过表达细胞株(IPSC-MSC-PSIN-Teton STINGV155M)，其EVPs中STING对THP-1细胞的IFNβ表达的影响。
图5为用或不用diABZI处理野生型和稳定敲除STING的HeLa(STING-/-HeLa)细胞，其EVPs中STING的表达情况和EVPs中STING对THP-1细胞的IFNβ表达的影响。其中A为EVPs中STING的表达情况；B为STING对THP-1细胞的IFNβ表达的影响。
图6为STINGV155M/WT型HeLa细胞和STINGWT/WT型HeLa细胞中EVPs和细胞裂解液(WCL)中的STINGV155M/WT和STINGWT/WT的表达量。
图7为用或不用diABZI处理HeLa后，收集EVs和NV，检测其中STING的表达情况。其A为不加diABZI处理后收集的EVs和NV(也叫particle，颗粒)，图B为加diABZI处理后收集的EVs和NV。
图8为构建BLAB/C小鼠皮下移植瘤模型，以注射PBS为对照，检测分别注射WT-diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs、STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs的小鼠肿瘤体积。
图9为构建BLAB/C小鼠皮下移植瘤模型，以注射PBS为对照，检测分别注射WT-diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs、STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs的小鼠肿瘤体积折线图。
图10为构建BLAB/C小鼠皮下移植瘤模型，以注射PBS为对照，检测分别注射WT-diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs、STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs的小鼠肿瘤重量。
图11为构建BLAB/C小鼠皮下移植瘤模型，以注射PBS为对照，检测分别注射WT-diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs、STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs的小鼠肿瘤的CD3+和CD8+T细胞数量的流式图。
图12构建BLAB/C小鼠皮下移植瘤模型，以注射PBS为对照，检测分别注射WT-diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs、STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs的小鼠肿瘤的CD3+T数量的散点图。
图13构建BLAB/C小鼠皮下移植瘤模型，以注射PBS为对照，检测分别注射WT-diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs、STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs的小鼠肿瘤的CD8+T数量的散点图。
图14为化疗和/或放疗后的鼻咽癌患者血清的EVPs中STING的表达情况。
图15为评估化疗和/或放疗的鼻咽癌患者血清中STING表达情况与化疗和/或放疗敏感性相关性。
图16为过表达带HA标签的野生型STING和激活型STINGV155M和STINGR281Q的HeLa细胞，再都分别稳定过表达Vector、带Flag标签的RAB22A和RAB22AQ64L，其EVPs和细胞裂解液(lysates)中带HA标签的STING的表达情况。从左至右依次为STING-HA、STINGV155M-HA和STINGR281Q-HA。
图17为过表达STINGV155M-HA的HeLa细胞，再分别过表达Flag-RAB22AWT和Flag-RAB22AQ64L，STING和RAB22AWT或RAB22AQ64L共定位的情况。其中A为免疫荧光图；B为柱形图。
图18为过表达STINGV155M-HA的NCI-H1975细胞，再分别过表达Flag-RAB22AWT和Flag-RAB22AQ64L，STING和RAB22AWT或RAB22AQ64L共定位的情况。其中A为免疫荧光图；B为柱形图。
图19为在NCI-H1975细胞中过表达RAB22A，用或不用diABZI处理的NCI-H1975细胞的免疫荧光图。
图20为敲除HeLa细胞中的RAB22A并用diABZI处理，其EVPs中的STING表达情况。
图21为将过表达RAB22A的4T1细胞接种到BLAB/C小鼠中，以表达Vector的4T1细胞接种到BLAB/C小鼠中做对照，用或不用1.5mg/kg diABZI尾静脉注射小鼠后，小鼠肿瘤大小的图片。
图22为将过表达RAB22A的4T1细胞接种到BLAB/C小鼠中，以表达Vector的4T1细胞接种到BLAB/C小鼠中做对照，用或不用1.5mg/kg diABZI尾静脉注射小鼠后，小鼠肿瘤体积折线图。
图23为将过表达RAB22A的4T1细胞接种到BLAB/C小鼠中，以表达Vector的4T1细胞接种到BLAB/C小鼠中做对照，用或不用1.5mg/kg diABZI尾静脉注射小鼠后，小鼠肿瘤重量图。
图24为过表达带Flag标签的RAB22AWT或RAB22AQ64L的HeLa细胞，其免疫荧光实验结果，MVBs的直径大小和MVBs中含有LC3的MVBs的占比情况。其中A为LC3和RAB22AWT或RAB22AQ64L共定位的免疫荧光图；B为过表达RAB22AWT或RAB22AQ64L的HeLa细胞形成的MVBs的直径大小的柱状图；C为过表达RAB22AWT或RAB22AQ64L的HeLa细胞形成的MVBs样结构中含有LC3的MVBs的占比的柱状图。
图25为HeLa细胞中过表达STINGV155M-HA，再分别过表达带Flag标签的RAB22AWT或RAB22AQ64L，通过亚细胞器提取法得到MVBs，免疫共沉淀检测STINGV155M和LC3-II在RAB22A诱导的MVBs中的表达情况。
图26为使用超分辨率结构照明显微镜(SIM)观察过表达GFP-RAB22AQ64L的HeLa细胞中的MVBs中LC3和RAB22AQ64L的共定位情况。
图27为使用免疫电镜(IEM)观察过表达Flag-RAB22AQ64L的HeLa细胞中LC3在MVBs中的定位情况。
图28为在野生型或敲除ATG5(Atg5-/-)的HeLa细胞中瞬时转染STINGV155M-GFP，再分别过表达Vector和Flag-RAB22AQ64L，做免疫荧光实验，分析含有LC3的MVBs在总MVBs中的占比和含有STINGV155M的MVBs在总MVBs中占比情况。其中A为LC3和STINGV155M-GFP在RAB22AQ64L形成的MVBs中共定位，敲除ATG5后，LC3和STINGV155M-GFP均不存在于RAB22AQ64L形成的MVBs的免疫荧光图；B为含有LC3的MVBs在总MVBs中的占比情况；C为含有STINGV155M的MVBs在总MVBs中占比情况。
图29为在HeLa细胞中都过表达GFP-LC3，分别过表达Vector、Flag-RAB22A、Flag-RAB22AQ64L，用calnexin的内源性抗体对calnexin进行染色，通过免疫荧光实验观察过表达RAB22A时，MVBs中LC3和calnexin的共定位情况。其中A为GFP-LC3、calnexin共定位于RAB22AQ64L形成的MVBs的免疫荧光图；B为LC3和calnexin共定位的MVBs在总MVBs中所占的比例；C为包含calnexin的MVBs在总MVBs中所占的比例。
图30为在HeLa细胞中瞬转GFP-LC3质粒，再过表达带Flag标签的RAB22AWT或RAB22AQ64L，用EEA1的内源性抗体对EEA1进行染色，免疫荧光观察EEA1(早期核内体标记物)和Flag、GFP-LC3的共定位情况。其中A为EEA1和GFP-LC3、Flag共定位的免疫荧光图；B为包含GFP-LC3的MVBs在总MVBs中所占的比例；C为RAB22AWT或RAB22AQ64L与EEA1共定位的MVBs在总MVBs中所占的比例。
图31为在HeLa细胞中稳定过表达带GFP标签的RAB22AQ64L，瞬转calnexin-mCherry质粒，用EEA1的内源性抗体对EEA1进行染色，免疫荧光观察EEA1和GFP-RAB22AQ64L、calnexin-mCherry的共定位情况。
图32为在HeLa细胞中稳定表达GFP-RAB22AQ64L，用calnexin的内源性抗体对calnexin进行染色，利用结构光照明显微镜(SIM)观察RAB22AQ64L和calnexin共定位情况。
图33为在稳定表达GFP-RAB22AQ64L的HeLa细胞中瞬转calnexin-mCherry质粒，用50ng/mLdoxycycline处理细胞，用动态实时荧光成像仪观察MVBs与早期内体融合的时间图像。
图34为在稳定表达GFP-RAB22AQ64L的HeLa细胞中瞬转STINGV155M-Halo质粒，用50ng/mLdoxycycline处理细胞，用动态实时荧光成像仪观察过表达RAB22AQ64L的细胞中STINGV155M表达的时间图像。
图35为在HEK-293T细胞中分别过表达Flag-RAB22AWT和Flag-RAB22AQ64L，再过表达SBP-RILP，然后用Strep-Agarose进行免疫共沉淀。
图36为在HeLa细胞中敲除RAB22A，用GTP-Agarose进行免疫共沉淀。
图37为在多个时间点用或不用cGAMP(STING配体)处理野生型NCI-H1975细胞和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞，用calnexin的内源性抗体对calnexin进行染色，免疫荧光观察STING和calnexin的共定位情况。其中A为免疫荧光图；B为在野生型(WT)和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，STING和calnexin共定位比例随时间变化的柱状图。
图38为在多个时间点用或不用cGAMP(STING配体)处理野生型NCI-H1975细胞和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞，用GM130的内源性抗体对GM130(高尔基体标记物)进行染色，免疫荧光观察STING和GM130的共定位情况。其中A为免疫荧光图；B为在野生型(WT)和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，STING和GM130共定位比例随时间变化的柱状图。
图39为在多个时间点用或不用cGAMP(STING配体)处理野生型NCI-H1975细胞和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞，用CD63的内源性抗体对CD63(外泌体标记物)进行染色，免疫荧光观察STING和CD63的共定位情况。其中A为免疫荧光图；B为在野生型(WT)和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，STING和CD63共定位比例随时间变化的柱状图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。若无特别说明，文中％含量均指体积浓度。
实施例1干扰素基因刺激蛋白(STING)可以分泌到细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)
一、实验方法
1、制备IPSC-MSC细胞
(1)制备人多能干细胞(IPSCs)
招募不同年龄的具有不同疾病遗传背景的人的尿液，建立尿源性细胞系(urine-derived cells(UCs))。构建表达人miR-302-367集群的游离型载体(episomal vector)，命名为pCEP4-miR302-367。
用胰蛋白酶消化尿源性细胞系后传代，用AmaxaTM Basic NucleofectorTM Kit试剂盒，通过电穿孔将pCEP4-miR302-367与pEP4EO2SET2K(含有OCT4、SOX2、SV40LT和KLF4)同时转染到UCs，电穿孔程序为T-020(LONZA)。
将电穿孔后的UCs接种到基质胶包被的6孔板上，传代培养。传代培养过程中的培养基为mTeSR1培养基或E8培养基(培养基成分为：DMEM/F12+2％ITS+Vc(70mg/mL)+bFGF(100ng/mL)+Tgfb1(2ng/mL))，每天更换一次培养基。电穿孔后最初2～5代，用分散酶(1mg/mL在DMEM/F12中)消化IPSCs，往后传代中用0.5mM EDTA消化。电穿孔后20～30天，观察到人类胚胎干细胞样(iPSCs)的菌落。
(2)IPSCs生成间充质干细胞(MSCs)
将步骤(1)EDTA处理后的IPSCs铺板到基质胶包被的6孔板上，进行传代培养。传代后的IPSCs在mTeSR1培养基中培养2天，直至达到60％(细胞密度)的融合度。第3天，将mTeSR1培养基更换为MSC诱导培养基，所述MSC诱导培养基中含有MEM培养基、10％血清、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、50μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸，持续培养2周。然后将MSC诱导培养基培养2周的细胞接种到涂有0.1％明胶的培养器皿中。当细胞长到汇合后，用MSC培养基对其进行传代培养，所述MSC培养基中的成分包含：DMEM培养基，10％胎牛血清、成纤维细胞生长因子(5ng/mL)和表皮生长因子(10ng/mL)。经过3～4传代，这些细胞表型呈现MSC样，即得IPSC-MSC。第10～15次传代的IPSC-MSC用于功能实验。
2、收集IPSC-MSC细胞培养上清液，通过差速离心法提取得到细胞外囊泡和微颗粒(extracellular vesicles and particles，EVPs)，裂解IPSC-MSC得到细胞裂解液(lysates)。
(1)用含10％EVs-free血清的IPSC-MSC细胞培养基培养野生型IPSC-MSC(IPSC-MSCWT)，IPSC-MSC细胞培养基配制成分如表1所示。分别将STING激动剂diABZI添加到IPSC-MSC细胞培养基中，使diABZI浓度分别为5μm和10μm，培养48h，得到5μm diABZI处理的IPSC-MSC细胞和10μm diABZI处理的IPSC-MSC细胞。
(2)提取EVPs：收集diABZI处理IPSC-MSC细胞的培养上清液。清除培养上清液中的细胞和细胞碎片，步骤为：300g×10min离心，取上清；600g×20min离心，取上清；2000g×30min离心，取上清。随后将上清移入新管，100000g×3h离心，取沉淀；加无菌PBS重悬后100000g×3h离心，取沉淀，加入100μL PBS重悬，得到野生型iPSC-MSC细胞分泌的EVPs(WT-diABZI EVPs)和不同浓度diABZI处理的iPSC-MSC细胞分泌的含有激活型STING的EVPs(WT+5μm diABZI EVPs、WT+10μm diABZI EVPs)。
(3)提取细胞裂解液及裂解后蛋白定量：
配制RIPA裂解液(母液，1L)方法：称取8.77g NaCl(150mM)、1.46g Na2EDTA(0.5％)、6.06g Tris base(50mM)、5mL NP-40(0.5％)，加至900mL灭菌双蒸水，充分溶解后调PH至8.0，并定容至1L，4℃保存。使用时按照RIPA裂解液：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂A：磷酸酶抑制剂B＝100：1：1：1的体积比配制RIPA裂解液工作液。
裂解步骤：将待裂解的IPSC-MSCWT细胞、5μm diABZI处理的IPSC-MSCWT细胞和10μmdiABZI处理的IPSC-MSCWT细胞从敷箱取出，弃去培养基，用预冷的PBS将残留的培养基洗净。将细胞置于冰上，往细胞中加入RIPA裂解液工作液，放在冰上裂解20min。用细胞刮刀将细胞刮下来，吸取细胞裂解液至EP管中，12000rpm离心20min。吸取10μL上清，加入到含200μLBCA试剂的96孔板中，用酶标仪于562nm处测定各孔的吸光度值，之后加RIPA裂解液工作液将各蛋白浓度配平，加入5×loading buffer，放在100℃金属浴中煮5min，保存于-20℃。Western Blot检测时将裂解后蛋白从-20℃冰箱拿出来放在100℃金属浴中热2min即可使用。
表1 IPSC-MSC细胞培养基配制成分(总：565.51mL)
名称 体积-浓度
DMEM培养基 450mL
EVs-free胎牛血清 50mL
Human FGF-basic 5μL(母液浓度1μg/mL)
Human EGF蛋白 5μL(母液浓度10μg/mL)
NEAA非必需氨基酸 5mL
L-Glutamine 5mL
β-mercaptoethanol 500μL
青霉素/链霉素溶液 5mL(100X)
所述EVs-free血清的配置方法为：将商品化的血清分装到超离管中，用超高速冷冻离心机100000g，4℃离心16h，随后弃去沉淀，吸取上层血清，用0.22μm的针头式过滤器过滤，-80℃保存。
3、BCA法蛋白定量
用Thermo ScientificTM PierceTM BCA蛋白检测试剂盒(货号：23227)对本实施例步骤2中的EVPs和细胞裂解液进行定量分析。
(1)制备蛋白标准曲线
取2mg/mL的蛋白标准品BSA，梯度稀释(2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL和25μg/mL)。以50：1的比例将BCA蛋白检测试剂盒中的A液B液混合均匀(现配现用)，得到A液B液的混合液。各取10μL不同浓度稀释的标准液装于96孔酶标板中，加入200μL A液B液的混合液(每组设置三个复孔)，用10μL PBS做对照。充分混匀后，37℃孵育30min，用酶标仪于562nm处测定各孔的吸光度值，得蛋白定量标准曲线回归方程。
(2)蛋白浓度测定
取待测EVPs或细胞裂解液样品10μL于96孔酶标板中，同时加入200μL A液B液的混合液，以10μL PBS做对照，37℃孵育30min，用酶标仪于562nm处测定各孔的吸光度值，代入标准曲线回归方程得到样品浓度。之后加PBS将各样品浓度配平，加入5×loading buffer，放在100℃金属浴中煮5min，保存于-20℃。Western Blot检测时将蛋白从-20℃冰箱拿出来放在100℃金属浴中热2min即可使用。
4、对本实施例步骤2中的EVPs和细胞裂解液中的STING进行蛋白免疫印迹(Western Blot)定量分析，使用雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒配制SDS-PAGE，进行SDS-PAGE电泳分析。
二、实验结果
如图1所示，Western Blot检测发现内源过表达的野生型、激活型STING，同时存在于EVPs和细胞裂解液中，并且STING激动剂diABZI促进更多的激活型STING进入EVPs以及促进细胞中STING下游信号通路的激活。
实施例2包含干扰素基因刺激蛋白(STING)的细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)促进THP-1细胞表达干扰素β(IFNβ)
一、实验方法
1、THP-1细胞培养条件为：RPMI-1640培养基(500mL)中加入1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2、收集实施例1中的WT-diABZI EVPs、WT+5μm diABZI EVPs和WT+10μm diABZIEVPs，分别用含有PBS及上述EVPs的培养基培养THP-1细胞，其中EVPs的浓度为8μg/mL，24h后提取受体细胞RNA，做逆转录(RT-PCR)和qPCR(Real-time PCR)，检测不同EVPs刺激THP-1细胞表达IFNβ的RNA水平。
RNA提取使用天根生化科技(北京)有限公司的总RNA提取试剂盒，全部步骤用无RNA酶的枪头。用南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure SMS_1
II Q RT SuperMix for qPCR两步法逆转录试剂盒进行逆转录。用南京诺唯赞生物科技有限公司的ChamQ SYBR qPCRMaster Mix进行qPCR扩增。
二、实验结果
如图2所示，包含激活型STING的EVPs促进THP-1细胞产生IFNβ。其中，WT+10μmdiABZI EVPS组的促进作用明显高于WT+5μm diABZI EVPs组、WT-diABZI EVPS组和PBS组，差异显著。
实施例3构建含干扰素基因刺激蛋白(STING)激活型突变的IPSC-MSC细胞，其分泌的细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)促进THP-1细胞表达干扰素β(IFNβ)
一、实验方法
1、构建PSIN-Tet on STINGV155M(STING激活型突变)质粒。
(1)PCR扩增
针对目的基因(此处为STINGV155M)设计克隆引物(STINGV155M-F引物和STING V155M-R引物)，使用TAKARA的高保真PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行快速扩增反应，以野生型IPSC-MSC细胞的cDNA为模板(在其他细胞中过表达STINGV155M，以对应细胞的cDNA为模板)，进行目的产物的PCR扩增反应，反应体系为：cDNA模板1μL、Forward primer(10μM)2μL、Reverse primer(10μM)2μL、2×PrimeSTAR Max Premix 25μL、ddH2O 20μL，total：50μL。
STINGV155M-F(Forward primer)引物序列：
TGTGTGAAAAAGGGAATTTCAACATGGCCCATGGGCTGGCAT
STING V155M-R(Reverse primer)引物序列：TTCCCTTTTTCACACACTGCAG
将上述反应体系混匀后置于PCR仪器中进行PCR扩增反应，反应条件如下：
95℃预变性5min后，下列条件进行35个循环：98℃10s，60℃30s，72℃10s(/kb)。35个循环过后，再进行一步72℃，10min延伸反应。得PCR产物即为STINGV155M基因，4℃保存或进行下一步琼脂糖凝胶电泳实验。
(2)在步骤(1)的PCR产物中加入10×DNA loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳实验。
(3)胶回收使用天根生化科技(北京)有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒。
(4)载体酶切：在200μL PCR管中进行酶切反应。反应体系为：限制性内切酶2μL、10×Green Buffer 3μL和载体(Tet-on系统对应为带有反式激活因子的Psin载体，其它为一般Psin载体)3μg，加ddH2O至30μL。37℃酶切3h，电泳后进行胶回收，同步骤(2)和(3)。
(5)连接：在室温(25±5℃)进行连接反应，反应体系为：步骤(1)的STINGV155M基因DNA片段0.3pmol、步骤(4)的酶切的载体DNA 0.03pmol和2×syno assembly mix 5μL，加ddH2O至10μL。37℃连接30min。得到连接产物。
(6)转化：将步骤(5)的连接产物全部加入到感受态细胞(DH5α或者Stbl3)中，轻轻混匀，冰浴20min，42℃热激90s，随后冰浴2min，加入800μL无抗生素的LB培养基，于37℃摇床200rpm/min振荡培养30min。2000rpm离心3min，弃去上清，留下100μL的培养基将沉淀吹打均匀，然后将其加至对应抗性(此处为氨苄)的固体LB培养板上涂板，放入37℃细菌培养箱中，培养过夜，第二天挑取单克隆菌落，扩大培养，进行PCR验证，阳性菌落送SANGER测序验证克隆是否成功。成功后用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提中量试剂盒进行质粒提取，得到大量PSIN-Tet on STINGV155M质粒。
2、往实施例1的IPSC-MSC中转染PSIN-Tet on STINGV155M质粒，之后挑单克隆，构建表达激活型STING的稳定过表达细胞株。
将IPSC-MSC用完全培养基铺于6孔板或Confocol小皿中，待第二天细胞汇合度约为50％(细胞密度)时进行转染。将Lipofectamine 3000和Lipofectamine p3000以1：1的体积比进行混合，静置5min得到mix溶液。将质粒、mix溶液和Opti-MEM培养基混合，轻轻弹匀后静置10min，得转染用混合液，将得转染用混合液均匀加入铺有IPSC-MSC的6孔板中，每个孔需要2μg质粒、5μL mix溶液和200μL Opti-MEM培养基，6～8h后用完全培养基换液，加入嘌呤霉素(0.5μg/mL)进行抗性筛选，约1～2周筛选得到稳定过表达的单克隆细胞株，即IPSC-MSC-PSIN-Tet on STINGV155M。
3、用实施例1的含10％EVs-free血清的IPSC-MSC培养基培养本实施例步骤2构建的IPSC-MSC-PSIN-Tet on STINGV155M细胞，将培养基分为不加doxycycline组(所培养的细胞不表达激活型STING)和含有150ng/mL doxycycline组(所培养的细胞表达激活型STING)，培养48h后按实施例1的步骤收集EVPs和细胞裂解液(lysates)，得到不表达激活型STING的-dox EVPs与-dox WCL，表达激活型STING的+dox EVPs与+dox WCL，用实施例1的Western Blot方法检测蛋白表达情况。
分别用PBS、8μg/mL的-dox EVPs和+dox EVPs案照实施例2的方法，刺激实施例2的THP-1细胞24h，收集细胞RNA，做逆转录和qPCR，检测THP-1细胞IFNβ的RNA水平，检测方法与实施例2相同。
二、实验结果
1、细胞裂解液和EVPs的STING的表达情况如图3所示，+dox促进包含外源激活型STING(STINGV155M)的EVPs的形成，同时WCL中STING的下游蛋白p-TBK1表达增加，表明STING信号通路增强。
2、如图4所示，包含激活型STING的EVPs(STINGV155M+dox EVPs)促进THP-1细胞产生IFNβ。
实施例4敲除干扰素基因刺激蛋白(STING)的HeLa细胞的细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)下调THP-1细胞表达干扰素β(IFNβ)，构建STINGV155M/WT HeLa细胞系证明进入EVPs的是STINGV155M/WT而不是STINGWT/WT
一、实验方法
1、为进一步证明实施例2和3中THP-1受体细胞中IFNβmRNA表达水平增高是由细胞外囊泡EVPs中激活型STING所诱导，以HeLa细胞为例，在HeLa细胞中稳定敲除STING(STING-/-)。
(1)构建sgRNA质粒
1)退火：退火反应体系为：Forward primer(10μM)2μL、Reverse primer(10μM)2μL、T4 PNK Buffer 1μL、T4 PNK ligase 0.5μL，用ddH2O定容至10μL。反应程序为：37℃，30min；95℃，5min；然后梯度降温至25℃，得退火产物。
构建STING的SgRNA的引物序列为：STING-F：CACCG TGAAAAAGGGAATTTCAACG；
STING-R：AAAC CGTTGAAATTCCCTTTTTCAC。
2)连接：退火产物(稀释至50μL)1μL、酶切载体1μL、T4 Buffer 1μL、T4 ligase0.5μL，用ddH2O定容至10μL。室温连接过夜，得连接产物。
3)转化：将连接产物全部加入到感受态细胞(DH5α或者Stbl3)中，轻轻混匀，冰浴20min，42℃热激90s，随后冰浴2min，加入800μL无抗生素的LB培养基，于37℃摇床200rpm/min振荡培养30min。2000rpm离心3min，弃去上清，留下100μL的培养基将沉淀吹打均匀，然后将其加至对应抗性的固体LB培养板上涂板，放入37℃细菌培养箱中，培养过夜，第二天挑取单克隆菌落，扩大培养，进行PCR验证，阳性菌落送SANGER测序验证克隆是否成功。成功后按实施例3进行质粒提取，得到大量STING-/-质粒。
(2)包病毒转染：将HEK-293T细胞用完全培养基铺于6孔板中，待第二天细胞汇合度约为90％(细胞密度)时进行转染。使用三质粒慢病毒包装系统，将两个包装质粒psPAX2、PMD2.G和目的基因(STING-/-质粒)分别以3μg：2μg：1μg的量混合，然后然后加入24μL PEI(2mg/mL)，最后加入200μL Opti-MEM培养基，轻轻弹匀后静置10min，然后将混合液均匀加入铺有HEK-293T细胞的6孔板中，6～8h后用完全培养基换液，48h后收集细胞培养上清液，使用0.4μm的滤膜过滤，得到病毒液。
(3)构建STING敲低型HeLa细胞(STING-/-HeLa)
将培养在直径10cm培养瓶的HeLa细胞消化下来，离心取上清后加入3mL完全培养基重悬，得细胞重悬液，每个孔取200μL细胞重悬液置于6孔板中，再加入3mL的病毒液、1mL完全培养基和5μg/mL的polybrene，得感染病毒的HeLa细胞，将感染病毒的HeLa细胞混匀静置后置于37℃离心机中2000rpm，离心1h，然后放于敷箱中正常培养。24h后换成完全培养基，加入嘌呤霉素(0.5μg/mL)进行抗性筛选，约1～2周筛选得到敲除STING的STING-/-HeLa细胞系。
2、用含有10μm STING的激动剂diABZI的培养基培养本实施例步骤1得到的STING-/-HeLa细胞，收集其EVPs，得到未用diABZI刺激的STING-/-细胞分泌的EVPs(STING-/--diABZI EVPs)和用diABZI刺激的STING-/-细胞分泌的EVPs(STING-/-+diABZI EVPs)，按照实施例1的方法，用Western Blot实验检测蛋白表达情况，然后按照实施例2的方法，用EVPs刺激THP-1检测IFNβ的RNA水平。
其中HeLa细胞培养条件为：DMEM培养基(500mL)中加入1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清(完全培养基)，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、构建内源编辑STINGV155M/WT杂合子突变的HeLa细胞系。
内源性杂合子的建立是通过一种基于同源定向修复(HDR)的改进方法完成的。首先将STING内含子3的高效sgRNA(5'-AUCGAAAUGGGCAGAGG-3')克隆到pLenti-CRISPR-V2中。使用包含巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的DsRed表达的供体DNA模板，其两侧为左右同源臂，所需的V155M突变位于左臂。由于供体DNA模板携带独立的表达框，DsRed的表达不影响STING的表达。供体模板经PCR扩增并纯化。然后将sgRNA-Cas9和供体DNA模板共同转染到HeLa细胞中。6天后，通过流式细胞仪对DsRed阳性细胞进行分选，并选择阳性克隆。通过Sanger测序分析这些细胞的cDNA，以鉴定已成功编辑的克隆，得到内源编辑STINGV155M/WT杂合子突变的HeLa细胞系。
用Western Blot检测STINGV155M/WT杂合子突变的HeLa细胞系和野生型HeLa细胞的EVPs和细胞裂解液(WCL)中STING的表达情况。STINGV155M/WT杂合子突变的HeLa细胞系分泌的STING为STINGV155M/WT，野生型HeLa细胞分泌的STING为STINGWT/WT，EVPs和细胞裂解液提取检测方法与实施例1相同。
4、为了证明diABZI刺激激活型STING进入的是EVPs中的EVs，而不是非泡状(NV)颗粒(particles)，用含有或不含有10μm diABZI的培养基培养HeLa细胞，培养条件见本实施例步骤2，48h后收集HeLa细胞的培养上清液，用高分辨率密度梯度分馏法分离来源于的EVPs中的EVs和非泡状(NV)颗粒。
高分辨率(12％～36％)碘克沙醇密度梯度分馏操作步骤：对400mL培养的HeLa细胞上清液样品进行超离，以获得浓缩的细胞外物质。通过碘克沙醇密度梯度分馏分离浓缩的细胞外物质。碘克沙醇(OptiPrep)密度培养基(Sigma Aldrich，D1556)在使用前立即在冰冷的PBS中制备，以产生不连续的(12％～36％)梯度。浓缩的细胞外物质再次悬浮在冰凉的PBS中，并与冰凉的碘克沙醇/PBS混合，形成最终的36％碘克沙醇溶液。将悬浮液添加到离心管的底部，并小心地将PBS中碘克沙醇浓度下降的溶液分层，形成一个完整的梯度。用SW41 TI转子(Beckman Coulter)在4℃下以120000×g的速度对底部加载的12％～36％梯度层进行15h的超速离心。从梯度的顶部到底部收集了12个单独的1mL组分。将每个200μL组分转移到新试管中，添加50μL 5×上样缓冲液，并煮沸10min。每个20μL样品进行Westernblotting实验。
二、实验结果
图5A的Western Blot实验表明diABZI促进野生型HeLa细胞中含激活型STING的EVPs的分泌，diABZI不能促进STING-/-HeLa细胞中含激活型STING的EVPs的分泌；图5B的柱状图表明用上述EVPs刺激THP-1细胞后，只有包含激活型STING的EVPs促进THP-1细胞产生IFNβ。
如图6所示，进入EVPs的是STINGV155M/WT而不是STINGWT/WT(Alix、FLOT2、GAPDH、HSP70作为EVPs的内参)。STINGV155M/WT型HeLa细胞的WCL中，TBK1总量不变的情况下，磷酸化的TBK1增加，即STING下游信号通路中的p-TBK1的表达增强。
图7A表明，不加STING激动剂diABZI，在EVs和NV中都没有激活型STING；图7B表明，加diABZI促进激活型STING进入EVs，颗粒中依然不存在激活型STING，证明EVPs中真正起作用的是含激活型STING的EVs。在图7A和图7B中，CD9、CD81、CD63、Syntenin-1作为EV标记物，只存在于EV而不存在于NV中，证明成功将EV和NV分离；Alix、FLOT2、GAPDH和HSP70作为Western blotting时衡量EV定量准确的内参。
实施例5评估包含激活型干扰素基因刺激蛋白(STING)的细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)对肿瘤生长的影响
一、实验方法
动物护理和实验严格按照《实验动物护理和使用指南》和《脊椎动物使用和护理原则》进行，并经SYSUCC动物研究委员会批准(批准号19120D)。选择6周龄的雌性BLAB/C小鼠，将4T1(小鼠乳腺癌)细胞(5×105)皮下注射到小鼠的右侧腹股沟区。植入后6天，将小鼠随机分为五个组：
即用PBS，实施例2的WT-diABZI EVPs和WT+10μm diABZI EVPs，实施例4的STING-/--diABZI EVPs和STING-/-+diABZI EVPs，分别注射植入乳腺癌的小鼠。每只小鼠尾静脉PBS注射量为200μL，EVPs注射量为5μg，每周注射3次。每2天监测肿瘤体积，计算公式：肿瘤体积＝(短2×长径)/2。皮下接种19天后，处死小鼠，取出肿瘤称量重量，对肿瘤进行流式细胞术分析，并将剩余肿瘤组织制成石蜡切片，做荧光免疫组化分析。
1、流式细胞术：为了分析小鼠肿瘤中的细胞毒性T细胞浸润情况，将小鼠肿瘤在37℃，100rpm条件下，在含有0.4mg/mL胶原酶IV(Sigma-Aldrich)和50U/mL DNase I(Sigma-Aldrish)的消化缓冲液(RPMI 1640培养基)中消化1h。消化的细胞悬浮液用70μm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬浮液，用染色缓冲液(含2％胎牛血清BS的PBS)洗涤两次，PBS洗涤一次。
从外周血淋巴细胞分离物(TBD，LTS1077)中获得淋巴细胞。用死活染料(ZombieAquaTM Fixable Viability Kit(bv510))对PBS中非存活淋巴细胞染色15min，之后，用染色缓冲液洗涤细胞2次，并用APC抗CD45(Biolegend，103111)、FITC抗CD3ε(Biolegend，100203)和PE/cy7抗CD8α(BioLend，100721)抗体在4℃下染色30min。用染色缓冲溶液洗涤细胞2次后进行流式细胞术分析。
2、荧光免疫组化
(1)肿瘤组织用4％多聚甲醛固定12h后，脱水，透明，浸蜡与包埋，制成石蜡切片。(2)对步骤(1)的石蜡切片烤片，65℃烤片2h。通风橱中进行二甲苯脱蜡2次，每次15min；之后用梯度酒精进行水化：无水乙醇，95％，90％，80％，70％，50％乙醇，各2min。将切片于双蒸水中浸泡清洗酒精2次，每次3min。(3)配制3％H2O2，将步骤(2)处理后的切片室温(25±5℃)孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。然后于双蒸水洗3次，每次1min。(4)抗原修复。配制枸橼酸盐缓冲液，先将枸橼酸盐缓冲液用高火加热至沸腾，将步骤(3)处理后的切片正面朝上放入枸橼酸盐缓冲液中，转中低火继续进行25min。自然冷却至室温，冷水(蒸馏水)冲洗15min。PBS缓冲液洗3次，每次1min。(5)取出步骤(4)处理后的切片组织，将水甩干，用免疫组化笔在切片组织周围画完整圆圈，在切片上滴加山羊血清封闭液，室温封闭30min。(6)敷一抗：使用Dako免疫组化抗体稀释液稀释一抗，步骤(5)处理后的切片敷一抗，置于湿盒中4℃过夜或者37℃，2h。PBS洗三遍，每次5min。(7)敷荧光二抗(从此步开始后面都避光)：将荧光二抗稀释于稀释液中，室温孵育步骤(6)处理后的切片组织1h。PBS洗三遍，每次5min。(8)往步骤(7)处理后的切片组织中加入Hoechst 33342，室温孵育5min，用PBS洗三遍，每次5min。(9)往步骤(8)处理后的切片组织加入抗荧光淬灭剂封片，盖上盖玻片。(10)步骤(9)处理后的切片组织使用高分辨激光共聚焦显微镜LSM880进行观察并统计。
二、实验结果
包含激活型STING的EVPs通过激活T细胞的抗肿瘤免疫抑制肿瘤生长。图8为剥出的小鼠肿瘤大小的图片，显示不同组间小鼠肿瘤的体积变化。图9为每两天监测肿瘤体积后得到的折线图，都反映了WT+diABZI组小鼠肿瘤的体积最小，敲除STING再加diABZI(STING-/-+diABZI EVPs)对小鼠肿瘤的抑制作用不明显。图10为剥出的小鼠肿瘤重量，WT+diABZI组小鼠肿瘤平均重量最小。
注射包含激活型STING的EVPs组小鼠肿瘤组织的CD3和CD8阳性细胞比例显著增加。图11免疫荧光图显示WT+diABZI EVPs组小鼠肿瘤细胞中CD3+和CD8+T细胞比例显著大于STING-/-+diABZI EVPs组。图12为显示不同处理组小鼠CD3+T数量的散点图，图13为显示不同处理组小鼠CD8+T数量的散点图，图12和图13表明敲除STING加diABZI并不能增强对肿瘤的抑制能力。以上共同表明包含激活型STING的细胞外囊泡EVPs抑制肿瘤生长是通过调控肿瘤免疫，促进T细胞的浸润从而杀伤肿瘤细胞。
实施例6化疗或放疗后鼻咽癌(NPC)患者的血清细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)中激活型干扰素基因刺激蛋白(STING)的表达水平
一、实验方法
将化疗或放疗后鼻咽癌患者血清添加到0.5％NP40中，在冰上放置1h，以完全溶解囊泡，用ELISA试剂盒(Cloud Clone Corp，HEN011Hu)检测STING水平。首先，将100μL待测血清样本添加到96孔板中，并在37℃下培养1h。然后，除去每个孔中的液体，添加100μL工作液A，并在37℃下培养1h。抽吸去除溶液，并使用350μL 1倍浓度的洗涤液清洗三次。接下来，添加100μL工作液B，并在37℃下培养30min，按照上述清洗过程清洗五次。向每个孔中添加90μL基质液，并在37℃下培养10～20min，直到样品变蓝。然后，添加50μL终止液，并在摇床上轻轻混匀。使用酶标仪在450nm处测量溶液吸光度，根据基于标准溶液的标准曲线分析STING水平。用实施例1的Western blot法检测化疗或放疗后鼻咽癌患者血清的EVPs中STING的表达情况。
二、实验结果
如图14所示，为Western blot法在鼻咽癌患者化疗和/或放疗后的血清EVPs中检测到STING。
如图15所示，ELISA结果显示，在化疗和/或放疗过程中，病情有明显改善(OR)的NPC患者血清中STING水平显著高于疾病稳定无明显改善(SD)的患者。血清中STING水平与NPC患者对放化疗的敏感性呈正相关。
实施例7 RAB22A控制含有激活型STING的多囊泡体(multivesicμlar bodies,MVBs)样结构的形成和细胞外囊泡和颗粒(统称为EVPs)的分泌
一、实验方法
RAB22A在NCBI上的登录号为Gene ID：57403。
1、按实施例3质粒构建方法，构建带HA标签的野生型STING(STINGWT)、带HA标签的激活型STING(STINGV155M、STINGR281Q)、带Flag标签的野生型RAB22A(RAB22AWT)、带Flag标签的激活型RAB22A(RAB22AQ64L)质粒。构建过程中所用的到的引物序列如下：
构建野生型STING(STINGWT)质粒：STING-F：ATGCCCCACTCCAGCCTGCATC；
STING-R：AGAGAAATCCGTGCGGAGAGGGAG。
构建激活型STING(STINGV155M)质粒：
STINGV155M-F：TGTGTGAAAAAGGGAATTTCAACATGGCCCATGGGCTGGCAT；
STINGV155M-R：TTCCCTTTTTCACACACTGCAG。
构建激活型STING(STINGR281Q)质粒：
STINGR281Q-F：CACAATACAGTCAAGCTGGCTTTAGCCAGGAGGATAGGCTTGA；
STINGR281Q-R：GCCAGCTTGACTGTATTGTGACAT。
构建野生型RAB22A(RAB22AWT)质粒：RAB22A-F：ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAG；
RAB22A-R：TCAGCAGCAGCTCCGCTTTGG。
构建激活型RAB22A(RAB22AQ64L)质粒：
RAB22AQ64L-F：AATTCCTAATCTGGGATACAGCTGGATAAGAACGATTTCGTGCCTTAGCAC；
RAB22AQ64L-R：TGTATCCCAGATTAGGAATTTATGTAGCTC。
按照实施例3的方法，往HeLa细胞中分别瞬时转染上述质粒后挑单克隆，得到稳定过表达STINGWT、STINGV155M和STINGR281Q的HeLa细胞，然后这三个细胞再分别稳定过表达空载体(Vector)、Flag-RAB22A和Flag-RAB22AQ64L，检测细胞EVPs中STING的表达情况。
2、按照本实施例步骤1的方法，在HeLa细胞和NCI-H1975(培养条件同实施例4的HeLa细胞)细胞中过表达STINGV155M-HA后，得到稳定过表达的STINGV155M的HeLa细胞和NCI-H1975，再分别过表达空载体(Vector)、Flag-RAB22AWT和Flag-RAB22AQ64L，拍免疫荧光图，计算RAB22AWT和RAB22AQ64L诱导的含STINGV155M MVBs的数量，做柱形图。
免疫荧光步骤为：1)将本实施例步骤1构建的HeLa细胞或NCI-H1975细胞从敷箱取出，弃去培养基，用PBS洗两遍。2)用4％多聚甲醛室温固定细胞15min，用PBS洗3遍。3)用0.5％的Triton对步骤2)处理后的细胞破膜15min，用PBS洗3遍，得到破膜后的细胞。4)用山羊血清室温封闭步骤3)破膜后的细胞30min，得封闭后的细胞。5)弃去步骤4)封闭后的细胞的封闭液，用一抗室温孵育步骤4)封闭后的HeLa细胞2h(或4℃过夜)，用PBS洗3遍，得一抗处理的细胞。6)用荧光二抗室温(25℃±5℃)孵育步骤5)一抗处理的细胞1h，用PBS洗3遍，得二抗处理的细胞。7)用Hoechst 33342室温孵育步骤6)二抗处理的细胞2min，用PBS洗3遍，得Hoechst 33342处理的细胞。8)用抗荧光淬灭剂对步骤7)的Hoechst 33342处理的细胞封片。9)用蔡司LSM 880共聚焦激光扫描显微镜观察步骤8)的细胞。
3、按照实施例1的方法，用含有10μm diABZI的培养基培养野生型的NCI-H1975细胞(培养条件同实施例4的HeLa细胞)，用RAB22A的内源性抗体对RAB22A进行染色，拍免疫荧光图看STING和RAB22A共定位情况。
4、按照实施例4的方法，用RAB22A的SgRNA敲除HeLa细胞中的RAB22A，并按照实施例4的方法，用含有10μm STING激动剂diABZI的培养基培养HeLa细胞，Western Blot实验检测细胞EVPs中STING水平。
SgRNA核苷酸序列为：RAB22A#1：TAGGTAAATCGAGTATTGTG；
RAB22A#2：AGTCATGGAGAGAGATGCAA。
5、动物实验验证
按照实施例3构建目的基因过表达细胞系的方法，利用RAB22A克隆引物，构建过表达RAB22A的4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)和过表达空载体(Vector)的4T1细胞，将过表达RAB22A的4T1细胞和Vector的4T1细胞，分别原位接种到BLAB/C小鼠中6天。小鼠尾静脉注射diABZI，每周注射3次，注射量根据小鼠体积而定，为1.5mg/kg，共注射14天，以注射PBS为对照。每2天测量一次肿瘤。
RAB22A克隆引物的核苷酸序列为：RAB22A-F：ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAG；
RAB22A-R：TCAGCAGCAGCTCCGCTTTGG。
二、实验结果
1、RAB22A促进激活型STING(STINGV155M和STINGR281Q)分泌到EVPs，而对野生型STING的分泌无影响。如图16所示，过表达RAB22A后，对野生型STING的分泌无影响，但显著增加EVPs中的激活型STING，即STINGV155M和STING R281Q表达，并且活化型RAB22AQ64L比野生型RAB22A增加EVPs中的激活型STING作用更强，而不影响细胞内激活型STING的水平，细胞裂解液(lysates)中激活型STING的水平变化不大。
2、如图17A所示，为HeLa细胞的免疫荧光图；如图18A所示，为NCI-H1975细胞的免疫荧光图。如图17B和图18B所示，在HeLa细胞和NCI-H1975细胞中，RAB22AWT和RAB22AQ64L诱导含有STINGV155M-HA的MVBs的形成，并且RAB22AWT形成的MVBs比RAB22AQ64L诱导形成的体积更小。
3、如图19所示，diABZI诱导STING与RAB22A在内源性水平共定位。
4、如图20所示，敲除RAB22A的HeLa细胞的EVPs中激活型STING水平显著降低。
5、如图21所示，为剥出的小鼠肿瘤大小的图片，显示不同组间小鼠肿瘤的体积变化。图22为每两天监测肿瘤体积后得到的折线图，图23显示剥出的小鼠肿瘤重量。结果表明，RAB22A+diABZI(过表达RAB22A，且用diABZI治疗)抑制肿瘤生长的效果显著优于单纯加diABZI(不过表达RAB22A，仅用diABZI治疗)，优于单纯过表达RAB22A(过表达RAB22A，不用diABZI治疗)。
实施例8 RAB22A调控自噬体和早期内体融合形成的多囊泡体(multivesicμlarbodies,MVBs)，其不与溶酶体融合降解，从而分泌包含激活型STING的外泌体。
一、实验方法
1、激活型STING进入RAB22A诱导形成的MVBs与自噬有关。
(1)按照实施例7的步骤在HeLa细胞中分别稳定过表达空载体(Vector)、Flag-RAB22A、Flag-RAB22AQ64L和带GFP标签的LC3(GFP-LC3质粒)，24h后，用实施例7的方法做免疫荧光，观察HeLa细胞中MVBs样结构的形成。
2、激活型STING进入MVBs依赖于RAB22A诱导的自噬。
通过亚细胞器提取法分离得到本实施例步骤1所构建的HeLa细胞的MVBs，进行免疫沉淀。
亚细胞器免疫沉淀步骤：(1)将本实施例步骤1构建的稳定过表达Flag-RAB22A和Flag-RAB22AQ64L的HeLa细胞接种在一个15cm的培养皿上培养24h，培养条件与实施例4中所述HeLa细胞培养条件相同。(2)当步骤(1)的HeLa细胞融合率达到90％(细胞密度)，将细胞清洗并刮下来，放入4℃预冷的含有蛋白酶抑制剂的KPBS缓冲液(136mM KCl和10mM KH2PO4，用KOH调节pH至2.5)中，然后在2000×g，4℃下离心1min，形成颗粒。(3)去除步骤(2)离心后的上清，加200μL KPBS缓冲液重悬颗粒，并取10μL悬液用作对照组(WCL组)。(4)在2mLDounce匀浆器中对剩余颗粒进行40次研磨，得研磨的匀浆。将匀浆在4℃，3000×g条件离心3min。(5)取步骤(4)离心后的上清液，加入含Flag的珠子，4℃下在旋转摇床上共孵育30min，表达RAB22A或RAB22AQ64L的亚细胞器会和珠子结合，随后用KPBS清洗珠子三次，洗去非特异性结合的珠子。将含有KPBS的与亚细胞器结合的珠子放在磁性支架上，除去上清液，然后用1mL KPBS缓冲液洗涤珠子三次，洗去非特异性结合的珠子，得到含有阳性亚细胞器免疫沉淀样品的珠子。(6)将步骤(5)含有阳性亚细胞器免疫沉淀样品的珠子与40μL裂解缓冲液混合，在100°℃条件下煮沸，保存于-20℃或直接进行Western Blot检测。
3、使用超分辨率结构照明显微镜(SIM，实验步骤同实施例7中的免疫荧光)以及免疫电镜(IEM)观察提取到的MVBs样结构。
免疫电镜(IEM)方法：(1)将本实施例步骤1所构建的HeLa细胞在150g转速下造粒8min，得颗粒；在4℃下将所述颗粒固定在含有2％多聚甲醛、0.05％戊二醛和0.1M PBS(pH7.4)的溶液中90min，得固定颗粒。(2)在4℃下用0.1M PBS(pH 7.4)洗涤步骤(1)的固定颗粒三次，每次10min。依次用30％、50％、70％和90％梯度乙醇脱水，除30％乙醇脱水步骤在4℃下进行外，其余均在-20℃下进行，每次脱水持续20min，得脱水后的颗粒。(3)在-20℃下连续用40％、70％和100％LR White/乙醇渗透步骤(2)脱水后的颗粒1h，在-20℃下用100％LR White渗透过夜(16h以上)，得渗透后的颗粒。(4)在PCR管中于-30℃～20℃低温紫外线照射(360nm)72h和室温(25±5℃)下紫外聚合步骤(3)渗透后的颗粒48h，得聚合后的颗粒。(5)用兔抗HA抗体在37℃下对步骤(4)聚合后的颗粒进行免疫标记2h，再与含有10nm胶体金偶联的山羊抗兔二抗在37℃下孵育2h，得待观测样品。(6)在120KV的加速电压下，使用带有AMT XR41数字成像系统的JEOL JEM-1400透射电子显微镜观察待观测样品。
4、按照实施例4的方法，敲除HeLa细胞中自噬必需基因Atg5，得Atg5-/-HeLa细胞。按实施例7的方法，在野生型或Atg5-/-HeLa细胞中转染STINGV155M-GFP，之后，都分别过表达空载体(Vector)和Flag-RAB22AQ64L，做免疫荧光，所述STINGV155M-GFP为将HA标签的STINGV155M中的HA标签替换为GFP标签。
Atg5的SgRNA核苷酸序列为：Atg5#1CCTTAGATGGACAGTGCAGA；
Atg5#2GGCCATCAATCGGAAACTCA。
5、RAB22A介导的自噬体来源于内质网，并与RAB22A形成的早期内体融合，然后转化为MVBs样结构
(1)按照实施例7所述步骤在HeLa细胞中分别过表达空载体(Vector)、带Flag标签的RAB22A或带Flag标签的RAB22AQ64L后，都过表达GFP-LC3，用calnexin的内源性抗体对calnexin(ER标记物)进行染色，进行免疫荧光操作，分别测定GFP-LC3与calnexin(红色)共定位的MVBs和含有calnexin的MVBs在总MVBs中所占的百分比。
(2)免疫荧光观察本实施例步骤1构建的分别过表达空载体(Vector)、Flag-RAB22A、Flag-RAB22AQ64L的HeLa细胞，都过表达GFP-LC3质粒，用EEA1的内源性抗体对EEA1进行染色，观察EEA1(早期核内体标记物)、Flag和GFP-LC3的共定位情况。
(3)按实施例7所述步骤在HeLa细胞中过表达GFP-RAB22AQ64L，calnexin-mCherry，用EEA1的内源性抗体对EEA1进行染色，免疫荧光观察EEA1和GFP-RAB22AQ64L、calnexin-mCherry的共定位情况。所述带GFP标签的RAB22AQ64L为将实施例7带Flag标签的RAB22AQ64L中的Flag标签替换为GFP标签。
(4)按实施例7所述步骤在HeLa细胞中稳定过表达带GFP标签的RAB22AQ64L，使用超分辨率结构光照明显微镜(SIM)观察RAB22AQ64L和calnexin的共定位情况。
(5)按实施例7所述步骤在HeLa细胞中过表达带GFP-RAB22AQ64L，calnexin-mCherry或STINGV155M-Halo质粒，用50ng/mL doxycycline(dox)处理细胞，利用动态实时荧光成像仪分析。所述STINGV155M-Halo质粒为将实施例7带HA标签的STINGV155M中的HA标签替换为Halo标签。
动态实时荧光成像方法：将过表达带GFP标签的RAB22AQ64L的HeLa细胞接种在35mm玻璃底培养皿中培养24h后，用calnexin-mCherry或STINGV155M-Halo转染，再用50ng/mLdoxycycline处理24h。成像前，将瞬时表达STINGV155M-Halo的HeLa细胞与30nM的HaloTag配体在37℃预孵育30min，然后更换培养基。以10～20s为间隔的图像捕捉方式记录图片。
6、RAB22A使RAB7失活，抑制MVBs和溶酶体的融合，影响激活型STING的结局。
已知自噬体与溶酶体的融合依赖于活性RAB7与其效应子RILP的结合。按照实施例7的步骤在HEK-293T细胞中过表达Flag-RAB22A和SBP-RILP，用Strep-Agarose磁珠进行蛋白免疫共沉淀实验。
(1)构建SBP-RILP的质粒为：SBP-RILP-F引物：ATGGAGCCCAGGAGGGCGGC；
SBP-RILP-R引物：TCAGGCCTCTGGGGCGGCT。
(2)蛋白免疫共沉淀实验步骤为：
将细胞从敷箱取出，弃去培养基，用预冷的PBS将残留的培养基洗净。将细胞置于冰上，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解20min。
用细胞刮刀将细胞刮下来，吸取裂解液至EP管中，12000rpm离心20min。吸取上清，留30μL作为WCL组，加入5×loading buffer(终浓度为1×)，100℃煮5min，保存于-20℃。其余的上清加入磁珠，4度垂直摇床10～12rpm翻转孵育6h。将样品取出，4℃，12000rpm离心1min，弃上清，加入RIPA清洗，重复以上步骤4次，加入5×loading buffer，100℃煮10min，保存于-20℃或直接进行Western Blot检测。
7、按照实施例4的方法，用RAB22A的SgRNA敲除HEK-293T细胞中的RAB22A，用GTP-Agarose磁珠进行免疫共沉淀实验。
SgRNA核苷酸序列为：RAB22A#1：TAGGTAAATCGAGTATTGTG；
RAB22A#2：AGTCATGGAGAGAGATGCAA。
GTP结合实验步骤为：将细胞从敷箱取出，弃去培养基，用预冷的PBS将残留的培养基洗净。将细胞置于冰上，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的GTP-binding Buffer，将细胞用刮刀刮下来，吸取至EP管中，使用冻融法裂解细胞。将细胞悬液置于-80℃使其凝固，然后取出置于37℃水浴摇床中使其快速融化，如此反复3次。4℃，12000rpm离心20min，取上清，取30μL作为WCL组，加入5×loading buffer，100℃煮5min。其余上清加100μL GTP-Agarose，4度垂直摇床10～12rpm翻转孵育2h。将样品取出，4℃，12000rpm离心1min，弃上清，加入GTP-binding Buffer清洗，重复以上步骤3次，加入5×loading buffer，100℃煮10min，保存于-20℃。
8、按照实施例4的方法，敲除NCI-H1975细胞中RAB22A，在多个时间点用STING配体(cGAMP)处理敲除RAB22A的NCI-H1975细胞和野生型NCI-H1975细胞，分别观察STING和calnexin(内质网标记物)、GM130(高尔基体标记物)、CD63(外泌体标记物)的共定位情况在野生型NCI-H1975细胞和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中的区别。
二、实验结果
1、如图24A所示，为反映LC3和RAB22AWT或RAB22AQ64L在HeLa细胞中共定位情况的免疫荧光图。图24B为HeLa细胞分别过表达RAB22AWT和RAB22AQ64L后，形成的MVBs的直径大小的柱状图。图24C为HeLa细胞分别过表达RAB22AWT和RAB22AQ64L后，形成的含有LC3的MVBs在总MVBs中占比的柱状图。以上结果表明，过表达RAB22AWT和RAB22AQ64L诱导了HeLa细胞中含有LC3(自噬Maker)的MVBs的形成。
2、如图25所示，蛋白免疫共沉淀结果显示STINGV155M和LC3-II(自噬Maker)富集在RAB22A或RAB22AQ64L诱导形成的MVBs中。
3、图26为SIM的观测图，图27为IEM的观测图。由RAB22AQ64L驱动形成的MVBs样结构中清楚地看到有包含LC3的ILVs(腔内囊泡)。
4、如图28所示，图28A为在WT HeLa和ATG5-/-HeLa细胞中LC3和STINGV155M-GFP、Flag-RAB22AQ64L共定位的免疫荧光图；图28B为MVBs样结构中含有LC3的MVBs的占比情况；图28C为含有STINGV155M的MVBs在总MVBs中占比情况。野生型HeLa细胞中，激活型STING和LC3都被包含在RAB22AQ64L诱导形成的MVBs中；而在Atg5-/-HeLa中，由于自噬被抑制，激活型STING和自噬Maker(LC3蛋白)都不能进入RAB22A形成的MVBs中。表明激活型STING进入MVBs中依赖于自噬。
5、(1)如图29所示，图29A为GFP-LC3、calnexin和Flag共定位的免疫荧光图，可以观察到LC3与内质网(ER)标志物calnexin共定位，并且LC3和calnexin都分布在RAB22A诱导的MVBs的ILVs上；图29B为LC3和calnexin共定位的MVBs在总MVBs中所占的比例；图29C为包含calnexin的MVBs在总MVBs中占的比例。表明RAB22A诱导形成的自噬体来源于内质网，并与RAB22A形成的早期内体融合，然后转化为MVBs样结构。
(2)如图30所示，图30A为EEA1和Flag、GFP-LC3共定位的免疫荧光图，RAB22AWT或RAB22AQ64L与EEA1共同定位在含有LC3的MVBs的表面上。图30B为包含GFP-LC3的MVBs在总MVBs中所占比例的柱状图；图30C为EEA1和RAB22AWT或RAB22AQ64L共定位的MVBs在总MVBs中所占比例的柱状图。图31显示RAB22AQ64L和EEA1共同定位在稳定表达RAB22AQ64L的细胞中的含有calnexin的MVBs表面上。
(3)如图32所示，在MVBs样结构中看到含有calnexin的ILVs，其形成由RAB22AQ64L驱动。
(4)如图33和图34动态实时荧光成像显示，在稳定过表达RAB22AQ64L的细胞中，含有calnexin或STINGV155M的自噬体或MVBs与RAB22A阳性的早期内体融合。
6、如图35所示，过表达RAB22AWT或RAB22AQ64L后，和RILP结合的活性Rab7a明显减少，表明过表达RAB22A下调细胞自噬水平(已知自噬体与溶酶体的融合依赖于活性RAB7与其效应子RILP的结合)。
7、如图36所示，显示敲除RAB22A后，与GTP结合的RAB7增多。
8、如图37所示，图37A为免疫荧光图；图37B为在野生型(WT)和敲除RAB22A的NCI-H1975细胞中，显示STING和calnexin共定位比例随时间变化的柱状图。RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，在cGAMP刺激下，与calnexin共定位的STING逐渐减少，表明STING被激活并从内质网释放。如图38所示，图38A为免疫荧光图；图38B为在野生型(WT)和敲除RAB22A的NCI-H1975细胞中，显示STING和GM130共定位比例随时间变化的柱状图。RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，在cGAMP刺激下，更多活化的STING逐渐与GM130共定位，表明STING被激活释放后，转移到高尔基体。如图39所示，图39A为免疫荧光图；图39B为在野生型(WT)和RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，STING和CD63共定位比例随时间变化的柱状图。RAB22A敲除型NCI-H1975细胞中，在cGAMP刺激下，更多活化的STING逐渐与外泌体共定位，表明STING被激活释放和转移后，进入到外泌体。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，用含有干扰素基因刺激蛋白激动剂diABZI的培养基培养间充质干细胞，收集培养的细胞分泌的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡即为包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒。
2.权利要求1所述方法制备得到的包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒。
3.权利要求2所述包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为乳腺癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤为抑制肿瘤体积和/或重量的生长。
5.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物中含有权利要求2所述包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒。
CN202211213710.3A 2022-09-30 2022-09-30 一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用 Active CN115466723B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211213710.3A CN115466723B (zh) 2022-09-30 2022-09-30 一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211213710.3A CN115466723B (zh) 2022-09-30 2022-09-30 一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115466723A CN115466723A (zh) 2022-12-13
CN115466723B true CN115466723B (zh) 2023-05-30

Family

ID=84335546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211213710.3A Active CN115466723B (zh) 2022-09-30 2022-09-30 一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115466723B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949768A (zh) * 2018-04-28 2018-12-07 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用
AR115013A1 (es) * 2018-03-23 2020-11-18 Codiak Biosciences Inc Vesícula extracelular que comprende agonista de sting
WO2022003152A2 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 Aarhus Universitet Compositions comprising extracellular vesicles and sting stimulatory agents

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019237508A1 (en) * 2018-03-23 2020-10-01 Lonza Sales Ag Extracellular vesicles comprising STING-agonist

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR115013A1 (es) * 2018-03-23 2020-11-18 Codiak Biosciences Inc Vesícula extracelular que comprende agonista de sting
CN108949768A (zh) * 2018-04-28 2018-12-07 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用
WO2022003152A2 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 Aarhus Universitet Compositions comprising extracellular vesicles and sting stimulatory agents

Also Published As

Publication number Publication date
CN115466723A (zh) 2022-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6899333B2 (ja) 汎用キラーｔ細胞
CN105658789B (zh) 干细胞微粒和miRNA
BR112019023323A2 (pt) composições para facilitar a fusão de membrana e usos das mesmas
KR20210131991A (ko) 구획-특이적 카고 전달을 위한 조성물 및 방법
CN103189511B (zh) 利用siRNA导入的新型hiPSC制作法
CN102459576B (zh) 用于调节干细胞的组合物和方法及其应用
Li et al. HIMF deletion ameliorates acute myocardial ischemic injury by promoting macrophage transformation to reparative subtype
Labonte et al. Expression of scavenger receptor‐AI promotes alternative activation of murine macrophages to limit hepatic inflammation and fibrosis
Miserocchi et al. Three-dimensional collagen-based scaffold model to study the microenvironment and drug-resistance mechanisms of oropharyngeal squamous cell carcinomas
WO2018088875A2 (ko) 외래 미토콘드리아를 포함하는 자연살해세포 및 이를 포함하는 약학적 조성물
Zhao et al. Human NT2 neural precursor-derived tumor-infiltrating cells as delivery vehicles for treatment of glioblastoma
CN106754723B (zh) 一种具有抗肿瘤功能的免疫细胞及其应用
Meng et al. Immunization of stromal cell targeting fibroblast activation protein providing immunotherapy to breast cancer mouse model
JP6750782B2 (ja) 移植用幹細胞及びその製造方法
JP2016053036A (ja) アスパラギニル−β−ヒドロキシラーゼ発現腫瘍に対する樹状細胞ワクチン
Rowson-Hodel et al. Neoplastic transformation of porcine mammary epithelial cells in vitro and tumor formation in vivo
US8691568B2 (en) Method for preparing cell populations with anti-tumor immune response activity
CN112138162B (zh) 降低kat7含量或活性的物质在预防衰老和治疗肝纤维化中的应用
CN115466723B (zh) 一种包含激活型干扰素基因刺激蛋白的纳米颗粒及其制备方法和应用
Zeng et al. Engineered extracellular vesicles for delivering functional Cas9/gRNA to eliminate hepatitis B virus cccDNA and integration
ITUB20159750A1 (it) Metodo per la promozione ed il miglioramento delle proprieta? del tessuto adiposo, tessuto e cellule ottenute tramite detto metodo
WO2017193862A1 (zh) Fats作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用
Yu et al. Single-component lipid nanoparticles for engineering SOCS1 gene-silenced dendritic cells to boost tumor immunotherapy
CN110194800B (zh) 一种融合蛋白、细胞外泌体和肿瘤疫苗及其应用
CN114410686B (zh) 一种工程化外泌体原位纳米疫苗及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant