KR20200141047A - Sting-작용제를 포함하는 세포외 소수포 - Google Patents

Sting-작용제를 포함하는 세포외 소수포 Download PDF

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KR20200141047A
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sting
exosomes
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protein
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장수철
창 링 시아
누루딘 디. 르위스
레니 에이. 하리손
레이몬드 제이. 모니즈
스리람 사티야나라야난
더글라스 이. 윌리엄스
키리아코스 에코노미데스
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코디악 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 조성물, 캡슐화된 STING 작용제 및 기재된 상기 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 치료량의 EV, 예를 들어, STING 작용제를 캡슐화하는 엑소좀의 투여를 통해 면역 반응을 조절하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 면역 반응은 IENβ 반응 또는 골수 수지상 세포(mDC)의 활성화일 수 있다. STING 작용제를 캡슐화하는 엑소좀의 투여를 통해 전신 염증을 유도하지 않는 면역 반응을 조절하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.

Description

STING-작용제를 포함하는 세포외 소수포
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2018년 3월 23일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/647,491, 2018년 6월 4일에 출원된 62/680,501; 2018년 6월 22일에 출원된 62/680,600; 2018년 11월 6일에 출원된 62/756,247; 및 2019년 3월 21일에 출원된 62/822,019의 이익 및 이에 대한 우선권을 청구하며; 각각의 내용은 이의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
EFS-WEB을 통해 전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(명칭: 4000_0210000_Seqlisting_ST25.txt; 크기: 238,061바이트; 및 생성일: 2019년 3월 20일)의 전자 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
인터페론 유전자 자극인자(Stimulator of Interferon Genes, STING)는 전형적으로 박테리아에 의해 생산되는 고리형 디뉴클레오타이드의 세포질 센서이다. 활성화 시, I형 인터페론의 생산을 야기하고 면역 반응을 개시한다. STING의 작용성(agonism)은 전임상에서 종양에 대한 면역 반응의 생성을 위한 유망한 접근으로 나타났다. 불행하게도, STING의 광범위한 발현 프로필로 인해, STING 작용제의 전신 전달은 전신 염증을 야기한다. 이는 제공할 수 있는 용량을 제한하며 다시 치료 유효성을 제한한다. 전신 전달에 대한 대안적 접근은 종양 내로 직접 STING 작용제를 주사하는 것이다. 종양-내 주사는 상당히 효과적이다; 그러나, 이들은 바늘이 도달할 수 있는 고형 종양으로 제한되며 조직 손상을 야기한다. 따라서 STING 작용제를 전달하는 개선된 방법이 요구된다.
개시의 요약
필요로 하는 대상체에 투여 시 인간 면역계를 조절할 수 있는 STING 작용제를 캡슐화하거나 이와 연합된 엑소좀을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 조성물은 복수의 질환 또는 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있고 여기서 STING 신호전달 경로의 조절은 유익한 효과를 갖는다. 예를 들어, 인간 대상체에서 종양 또는 암성 병소의 치료. 엑소좀 내부로의 STING 작용제의 캡슐화는 면역 세포의 선택적 활성화를 허용하고 더 좁은 생체분포 프로필을 제공하여, 작용제의 단독 투여와 연관된 독성 없이 전신 전달을 허용한다.
일부 구현예에서, 조성물은 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함한다.
하나의 구현예에서, 조성물은 세포외 소수포 및 STING 작용제를 포함하며, 여기서 세포외 소수포는 엑소좀, 나노소수포, 아폽토시스체, 마이크로소수포, 라이소좀, 엔도좀, 리포좀, 지질 나노입자, 마이셀, 다층판 구조, 재소수포화된 소수포, 또는 압출된 세포이다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 단백질 PTGFRN을 과발현한다. 하나의 구현예에서, 엑소좀은 PTGFRN을 과발현하는 세포에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 IgV 도메인-함유 단백질을 과발현한다. 하나의 구현예에서, 엑소좀은 IgV 도메인-함유 단백질을 과발현하는 세포에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, IgV-함유 단백질은 Basigin, IGSF2, IGSF3, 또는 IGSF8이다. 또 다른 구현예에서, 엑소좀 또는 엑소좀 생산 세포는 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는, 미국 특허 출원 62/656,956에 상세히 기재된 엑소좀 표면 단백질을 과발현한다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 글리칸 변형된다. 하나의 구현예에서, 글리칸 변형은 효소적 또는 화학적 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 엑소좀은 글리칸 변형된 생산체 세포로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 효소적 또는 화학적 변형을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 키푸넨신으로의 처리를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자의 녹아웃을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자의 CRISPR 녹아웃을 포함한다. 하나의 구현예에서, 유전자는 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMAS)이다. 다른 구현예에서, 엑소좀은 탈시알릴화되거나 탈글리코실화된다.
일부 구현예에서, PTGFRN 또는 IgV 도메인-함유 단백질을 과발현하는 엑소좀은 글리칸 변형된 엑소좀이다. 하나의 구현예에서, PTGFRN 또는 IgV 도메인-함유 단백질을 과발현하는 엑소좀은 탈시알릴화된다. 하나의 구현예에서, PTGFRN 또는 IgV 도메인-함유 단백질을 과발현하는 엑소좀은 탈글리코실화된다. 일부 구현예에서, 엑소좀 또는 생산체 세포는 95% 정도 또는 그 초과, 90-95%, 85-90%, 80-85%, 75-80%, 70-75%, 65-70%, 60-65%, 50-60%, 40-50%, 30-40%, 20-30%, 10-20% 또는 0-10%로 탈글리코실화되거나 탈시알릴화된다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 리간드, 사이토카인, 또는 항체를 발현하는 엑소좀을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 리간드는 CD40L, OX40L, 또는 CD27L을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 사이토카인은 IL-7, IL-12, 또는 IL-15를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 길항성 항체 또는 작용성 항체를 포함한다.
하나의 구현예에서, STING 작용제는 지질-결합 태그를 포함하는 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, STING 작용제는 물리적으로 또는 화학적으로 변형된 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함하며, 상기 변형은 작용제 극성 또는 전하의 변경을 포함한다. 또 다른 구현예에서, STING 작용제는 물리적으로 및/또는 화학적으로 변형된 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함한다. 다른 구현예에서, STING 작용제는 변형 전의 STING 작용제(즉, 상응하는 변형되지 않은 STING 작용제)와 상이한 극성 및/또는 전하를 갖는다.
엑소좀과 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01 μM 내지 100 μM일 수 있다. 하나의 구현예에서, 엑소좀과 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01 μM 내지 0.1 μM, 0.1 μM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 10 μM 내지 50 μM, 또는 50 μM 내지 100 μM이다. 또 다른 구현예에서, 엑소좀과 연합된 STING 작용제의 농도는 약 1 μM 내지 10 μM이다.
임의의 상기 청구범위의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트가 또한 본원에서 제공된다.
엑소좀을 수득하는 단계, 엑소좀을 STING 작용제와 용액 중 혼합하는 단계, 엑소좀 및 STING 작용제의 혼합물을 완충액을 포함하는 용액 중 인큐베이션하는 단계, 및 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 정제하는 단계를 포함하는, STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 제조하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 2-24시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 6-12시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 12-20시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 14-18시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 16시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 15-90℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 37℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 15-30℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 30-50℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 약 50-90℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 적어도 0.01 mM 내지 100 mM STING 작용제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 적어도 1 mM 내지 10 mM STING 작용제를 포함한다.
일부 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 적어도 약 108 내지 적어도 약 1016개의 정제된 엑소좀의 총 입자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 적어도 약 1012개의 정제된 엑소좀의 총 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 완충액은 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다.
일부 구현예에서, 정제 단계는 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 크로마토그래피를 포함한다. 하나의 구현예에서, 정제 단계는 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 단계는 탈염, 투석, 접선류 여과, 초여과, 또는 투석여과를 포함한다. 하나의 구현예에서, 정제 단계는 하나 이상의 원심분리 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 정제 단계는 약 100,000 × g에서 하나 이상의 원심분리 단계를 포함한다.
대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 상기 방법은 약학적 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하여 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 수지상 세포를 활성화한다. 하나의 구현예에서, 방법은 골수 수지상 세포를 활성화한다. 일부 구현예에서, 방법은 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 단핵구 세포 활성화를 일으킨다. 하나의 구현예에서, 방법은 단핵구 세포 활성화를 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도한다.
하나의 구현예에서, 방법은 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 전신 염증을 일으킨다. 일부 구현예에서, 방법은 비실질적인 양의 전신 염증을 일으킨다.
일부 구현예에서, 투여는 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통한다. 하나의 구현예에서, 투여는 정맥내이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 항-종양 반응이다.
대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 상기 방법은 IFN-β를 유도하거나 수지상 세포를 활성화하기 충분한 양으로 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하여, 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 방법은 골수 수지상 세포를 활성화한다. 일부 구현예에서, 방법은 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 단핵구 세포 활성화를 일으킨다. 하나의 구현예에서, 방법은 단핵구 세포 활성화를 유도하지 않는다. 하나의 구현예에서, 방법은 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 전신 염증을 일으킨다. 일부 구현예에서, 방법은 비실질적인 양의 전신 염증을 일으킨다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하여, 대상체에서 항-종양 면역 반응을 유도하거나 조절하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 방법은 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도한다.
일부 구현예에서, 투여는 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통한다.
다양한 구현예에서, 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역조절제이다. 하나의 구현예에서, 추가 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 하나의 구현예에서, 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제이다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 암의 전이를 방지하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀은 대상체의 하나의 위치에서의 하나 이상의 종양의 대상체의 또 다른 위치에서의 하나 이상의 종양 성장을 촉진하는 것을 방지할 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도한다.
다양한 구현예에서, 투여는 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통한다.
일부 구현예에서, 조성물은 하나의 위치에서 제1 종양에 종양내 투여되며, 여기서 제1 종양에 투여되는 조성물은 제2 위치에서의 하나 이상의 종양의 전이를 방지한다.
다양한 구현예에서, 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역조절제이다. 하나의 구현예에서, 추가 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 하나의 구현예에서, 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제이다.
세포외 소수포 및 인터페론 유전자 자극인자 단백질(STING) 작용제를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 세포외 소수포는 엑소좀, 나노소수포, 아폽토시스체, 마이크로소수포, 라이소좀, 엔도좀, 리포좀, 지질 나노입자, 마이셀, 다층판 구조, 재소수포화된 소수포, 또는 압출된 세포이다. 특정 구현예에서, 세포외 소수포를 엑소좀이다.
일부 구현예에서, STING 작용제는 세포외 소수포와 연합된다. 일부 구현예에서, STING 작용제는 세포외 소수포 내에 캡슐화된다. 특정 구현예에서, STING 작용제는 선택적으로 링커에 의해, 세포외 소수포의 지질 이중층에 연결된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 세포외 소수포는 PTGFRN 단백질을 과발현한다. 특정 구현예에서, STING 작용제는 선택적으로 링커에 의해, PTGFRN 단백질에 연결된다.
일부 구현예에서, 세포외 소수포는 PTGFRN 단백질을 과발현하는 세포에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 세포외 소수포는 글리칸 변형된다. 특정 구현예에서, 세포외 소수포는 탈시알릴화된다. 추가 구현예에서, 세포외 소수포는 탈글리코실화된다.
일부 구현예에서, 세포외 소수포는 STING 작용제에 결합하거나 이와 효소적으로 반응하는 단백질을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 소수포는 리간드, 사이토카인, 또는 항체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 CD40L, OX40L, 및/또는 CD27L을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-7, IL-12, 및/또는 IL-15를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 길항성 항체 및/또는 작용성 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, STING 작용제는 고리형 디뉴클레오타이드이다. 다른 구현예에서, STING 작용제는 비-고리형 디뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, STING 작용제는 지질-결합 태그를 포함한다. 일부 구현예에서, STING 작용제는 물리적으로 및/또는 화학적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 변형된 STING 작용제는 대응하는 변형되지 않은 STING 작용제와 상이한 극성 및/또는 전하를 갖는다.
일부 구현예에서, 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01 μM 내지 100 μM이다. 특정 구현예에서, 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01 μM 내지 0.1 μM, 0.1 μM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 10 μM 내지 50 μM, 또는 50 μM 내지 100 μM이다. 추가 구현예에서, 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제의 농도는 약 1 μM 내지 10 μM이다.
일부 구현예에서, STING 작용제는 하기, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
식 중,
X1은 H, OH, 또는 F이며;
X2는 H, OH, 또는 F이고;
Z는 OH, OR1, SH 또는 SR1이고, 여기서:
i) R1은 Na 또는 NH4이거나, 또는
ii) R1은 피발로일옥시메틸과 같은 생체내 OH 또는 SH를 제공하는 효소-불안정기이고;
Bi 및 B2는 하기로부터 선택되고:
Figure pct00004
단,
- 화학식 (I)에서: X1 및 X2는 OH가 아니며,
- 화학식 (II)에서: X1 및 X2가 OH인 경우, B1은 아데닌이 아니며, B2는 구아닌이 아니고,
- 화학식 (III)에서: X1 및 X2가 OH인 경우, B1은 아데닌이 아니며, B2는 구아닌이 아니고, Z는 OH가 아니다.
일부 구현예에서, STING 작용제는 하기 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
.
일부 구현예에서, STING 작용제와 연합된 세포외 소수포는 하나 이상의 하기 특징을 나타낸다: (i) 수지상 세포, 예를 들어, 골수 수지상 세포를 활성화함; (ii) STING 작용제 단독("자유 STING 작용제")에 비해 단핵구 세포를 더 적은 정도로 활성화함; (iii) 단핵구 세포를 활성화하지 않음; (iv) 자유 STING 작용제에 비해 더 넓은 치료 지수를 가짐; (v) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 전신 독성을 가짐; (vi) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 면역 세포 사멸을 가짐; (vii) 자유 STING 작용제에 비해 더 높은 세포 선택성을 가짐; (viii) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 용량으로 종양 보호 면역성을 제공함; (ix) 항원-제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포에서 생체내 특이적 세포 반응을 유도함; (x) 국소 투여 후 원부 영역에서 면역 반응을 유도할 수 있음; 및 (xi) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 수준으로 투여될 수 있음.
일부 구현예에서, STING 작용제와 연합된 세포외 소수포는, 포유류에 투여되는 경우, 포유류에서 T 세포 및/또는 대식구를 고갈시키지 않는다. 다른 구현예에서, STING 작용제와 연합된 세포외 소수포는, 포유류에 투여되는 경우, 포유류에서 T 세포 및/또는 대식구를 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 정도로 고갈시킨다.
(예를 들어, 본원에서 기재되는 세포외 소수포를 포함하는) 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 개시된다.
(예를 들어, 본원에서 기재되는 세포외 소수포를 포함하는) 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트가 본원에서 개시된다.
STING 작용제를 포함하는 세포외 소수포(EV)(예를 들어, 엑소좀)를 제조하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 상기 방법은 (a) EV, 예를 들어, 엑소좀을 수득하는 단계; (b) EV, 예를 들어, 엑소좀을 STING 작용제와 용액 중 혼합하는 단계; (c) EV, 예를 들어, 엑소좀 및 STING 작용제의 혼합물을 적합한 조건 하에 완충액을 포함하는 용액 중 인큐베이션하는 단계; 및 (d) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 정제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적합한 조건은 약 2-24시간 동안 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 STING 작용제의 인큐베이션을 포함한다. 특정 구현예에서, 적합한 조건은 약 15-90℃에서 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 STING 작용제의 인큐베이션을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 조건은 약 37℃에서 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 STING 작용제의 인큐베이션을 포함한다.
일부 구현예에서, 혼합 단계에서 STING 작용제의 양은 적어도 0.01 mM 내지 100 mM을 포함한다. 특정 구현예에서, 혼합 단계에서 STING 작용제의 양은 적어도 1 mM 내지 10 mM을 포함한다. 추가 구현예에서, 혼합 단계에서 엑소좀의 양은 적어도 약 108 내지 적어도 약 1016개 총 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 단계에서 EV, 예를 들어, 엑소좀의 양은 적어도 약 1012개 총 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 제조하기 위한 완충액은 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다.
일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀을 정제하는 단계는 하나 이상의 원심분리 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 원심분리 단계는 약 100,000 × g에서 수행된다.
본 개시는 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응 및/또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에서 개시된 약학적 유효량의 조성물 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
이를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 본원에서 개시된 조성물 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 투여하는 단계는 대상체에서 면역 반응 및/또는 염증 반응을 유도하거나 조절한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 수지상 세포를 활성화한다. 일부 구현예에서, 투여하는 단계는 자유 STING 작용제에 비해 감소된 단핵구 세포 활성화를 일으킨다. 추가 구현예에서, 투여하는 단계는 단핵구 세포 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 투여하는 단계는 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도한다. 일부 구현예에서, 투여하는 단계는 자유 STING 작용제에 비해 감소된 전신 염증을 일으킨다. 일부 구현예에서, 투여하는 단계는 비실질적인 양의 전신 염증을 일으킨다.
일부 구현예에서, 투여는 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통한다. 특정 구현예에서, 투여는 정맥내이다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에서 개시되는 조성물 또는 약학 조성물을 투여하여 유도되거나 조절될 수 있는) 면역 반응은 항-종양 면역 반응이다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에서 개시되는) 조성물은 IFN-β를 유도하고/하거나 수지상 세포를 활성화하기 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나의 위치에서 제1 종양에 종양내 투여되며, 여기서 제1 종양에 투여되는 조성물은 제2 위치에서의 하나 이상의 종양의 전이를 방지한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 면역 반응 및/또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법 또는 대상체에서 종양을 치료하는 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 면역조절제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제이다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 조성물 또는 약학 조성물의 투여는 대상체에서 종양의 전이를 방지한다.
구현예
구현예 1. 세포외 소수포 및 인터페론 유전자 자극인자 단백질(STING) 작용제를 포함하는 조성물.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 세포외 소수포가 엑소좀, 나노소수포, 아폽토시스체, 마이크로소수포, 라이소좀, 엔도좀, 리포좀, 지질 나노입자, 마이셀, 다층판 구조, 재소수포화된 소수포, 또는 압출된 세포인 조성물.
구현예 3. 구현예 2에 있어서, 세포외 소수포가 엑소좀인 조성물.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, STING 작용제가 엑소좀과 연합된 조성물.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, STING 작용제가 엑소좀의 지질 이중층과 연합되거나 엑소좀 내에 캡슐화된 조성물.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 단백질 PTGFRN을 과발현하는 조성물.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 PTGFRN을 과발현하는 세포에 의해 생산되는 조성물.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 글리칸 변형된 조성물.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 글리칸 변형이 효소적 또는 화학적 변형을 포함하는 조성물.
구현예 10. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 글리칸 변형된 생산체 세포로부터 유래되는 조성물.
구현예 10에 있어서, 생산체 세포의 글리칸 변형이 효소적 또는 화학적 변형을 포함하는 조성물.
구현예 12. 구현예 10에 있어서, 생산체 세포의 글리칸 변형이 키푸넨신으로의 처리를 포함하는 조성물.
구현예 13. 구현예 10에 있어서, 생산체 세포의 글리칸 변형이 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자의 녹아웃을 포함하는 조성물.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 생산체 세포의 글리칸 변형이 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자의 CRISPR 녹아웃을 포함하는 조성물.
구현예 15. 구현예 13 또는 14에 있어서, 상기 유전자가 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMAS)인 조성물.
구현예 16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 탈시알릴화된 조성물.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 탈글리코실화된 조성물.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, PTGFRN을 과발현하는 엑소좀이 글리칸 변형된 엑소좀인 조성물.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, PTGFRN을 과발현하는 엑소좀이 탈시알릴화된 조성물.
구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, PTGFRN을 과발현하는 엑소좀이 탈글리코실화된 조성물.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀 또는 생산체 세포가 95% 정도 또는 그 초과, 90-95%, 85-90%, 80-85%, 75-80%, 70-75%, 65-70%, 60-65%, 50-60%, 40-50%, 30-40%, 20-30%, 10-20% 또는 0-10%로 탈글리코실화 또는 탈시알릴화된 조성물.
구현예 22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제에 결합하거나 이와 효소적으로 반응하는 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
구현예 23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀이 리간드, 사이토카인, 또는 항체를 발현하는 엑소좀을 추가로 포함하는 조성물.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 리간드가 CD40L, OX40L, 또는 CD27L을 포함하는 조성물.
구현예 25. 구현예 23에 있어서, 사이토카인이 IL-7, IL-12, 또는 IL-15를 포함하는 조성물.
구현예 26. 구현예 23에 있어서, 항체가 길항성 항체 또는 작용성 항체를 포함하는 조성물.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, STING 작용제가 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함하는 조성물.
구현예 28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, STING 작용제가 지질-결합 태그를 포함하는 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함하는 조성물.
구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, STING 작용제가 물리적으로 또는 화학적으로 변형된 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함하며, 상기 변형은 작용제 극성 또는 전하의 변경을 포함하는 조성물.
구현예 30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀과 연합된 STING 작용제의 농도가 약 0.01 μM 내지 100 μM인 조성물.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀과 연합된 STING 작용제의 농도가 약 0.01 μM 내지 0.1 μM, 0.1 μM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 10 μM 내지 50 μM, 또는 50 μM 내지 100 μM인 조성물.
구현예 32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 엑소좀과 연합된 STING 작용제의 농도가 약 1 μM 내지 100 μM인 조성물.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트.
구현예 34. STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 제조하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a. 엑소좀을 수득하는 단계;
b. 상기 엑소좀을 STING 작용제와 용액 중 혼합하는 단계;
c. 엑소좀 및 STING 작용제의 혼합물을 완충액을 포함하는 용액 중 인큐베이션하는 단계; 및
d. STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 정제하는 단계.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 2-24시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 36. 구현예 34에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 6-12시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 37. 구현예 34에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 12-20시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 38. 구현예 34에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 14-18시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 39. 구현예 34에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 16시간 동안 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 40. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계기 약 15-90℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 41. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 37℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 42. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 15-30℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 43. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 30-50℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 44. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 약 50-90℃에서 엑소좀 및 STING 작용제를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 45. 구현예 34 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 적어도 0.01 mM 내지 100 mM STING 작용제를 포함하는 방법.
구현예 46. 구현예 34 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 적어도 1 mM 내지 10 mM STING 작용제를 포함하는 방법.
구현예 47. 구현예 34 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 적어도 약 108 내지 적어도 약 1016개의 정제된 엑소좀의 총 입자를 포함하는 방법.
구현예 48. 구현예 34 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 적어도 약 1012개의 정제된 엑소좀의 총 입자를 포함하는 방법.
구현예 49. 구현예 34 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 완충액이 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함하는 방법.
구현예 50. 구현예 34 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 정제 단계가 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 크로마토그래피를 포함하는 방법.
구현예 51. 구현예 34 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 정제 단계가 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법.
구현예 52. 구현예 34 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 정제 단계가 탈염, 투석, 접선류 여과, 초여과, 또는 투석여과를 포함하는 방법.
구현예 53. 구현예 34 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 정제 단계가 하나 이상의 원심분리 단계를 포함하는 방법.
구현예 54. 구현예 53에 있어서, 정제 단계가 약 100,000 × g에서 하나 이상의 원심분리 단계를 포함하는 방법.
구현예 55. 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법으로서, 약학적 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하여, 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, 방법이 수지상 세포를 활성화하는 방법.
구현예 57. 구현예 55 또는 56에 있어서, 방법이 골수 수지상 세포를 활성화하는 방법.
구현예 58. 구현예 55 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 방법이 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 단핵구 세포 활성화를 일으키는 방법.
구현예 59. 구현예 55 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 방법이 단핵구 세포 활성화를 유도하지 않는 방법.
구현예 60. 구현예 55 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 방법이 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도하는 방법.
구현예 61. 구현예 55 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 방법이 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 전신 염증을 일으키는 방법.
구현예 62. 구현예 55 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 방법이 비실질적인 양의 전신 염증을 일으키는 방법.
구현예 63. 구현예 55 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 투여가 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통하는 방법.
구현예 64. 구현예 55 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 투여가 정맥내인 방법.
구현예 65. 구현예 55 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응이 항-종양 반응인 방법.
구현예 66. 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법으로서, IFN-β를 유도하거나 수지상 세포를 활성화하기 충분한 양으로 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하여, 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 67. 구현예 66에 있어서, 방법이 골수 수지상 세포를 활성화하는 방법.
구현예 68. 구현예 66 또는 67에 있어서, 방법이 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 단핵구 세포 활성화를 일으키는 방법.
구현예 69. 구현예 66 또는 67에 있어서, 방법이 단핵구 세포 활성화를 유도하지 않는 방법.
구현예 70. 구현예 66 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 방법이 유사하거나 동일한 수준의 자유 STING 작용제의 투여에 비해 감소된 전신 염증을 일으키는 방법.
구현예 71. 구현예 66 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 방법이 유의미한 전신 염증을 유도하지 않는 방법.
구현예 72. 구현예 66 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 투여가 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통하는 방법.
구현예 73. 구현예 66 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 투여가 정맥내인 방법.
구현예 74. 구현예 66 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응이 항-종양 반응인 방법.
구현예 75. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하여, 대상체에서 항-종양 면역 반응을 유도하거나 조절하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 76. 구현예 75에 있어서, 방법이 인터페론-β(IFNβ) 생산을 유도하는 방법.
구현예 77. 구현예 75 또는 76에 있어서, 투여가 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통하는 방법.
구현예 78. 구현예 75 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 79. 구현예 75 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제가 면역조절제인 방법.
구현예 80. 구현예 79에 있어서, 추가 치료제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
구현예 81. 구현예 80에 있어서, 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제인 방법.
구현예 82. 대상체에서 암의 전이를 방지하는 방법으로서, 방법이 치료 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 83. 구현예 81에 있어서, 치료 유효량의 STING 작용제를 포함하는 엑소좀이 대상체의 하나의 위치에서의 하나 이상의 종양이 대상체의 또 다른 위치에서의 하나 이상의 종양 성장을 촉진하는 것을 방지할 수 있는 방법.
구현예 84. 구현예 82 또는 83에 있어서, 방법이 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도하는 방법.
구현예 85. 구현예 81 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 투여가 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통하는 방법.
구현예 86. 구현예 81 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 하나의 위치에서 제1 종양에 종양내 투여되며, 제1 종양에 투여되는 조성물이 제2 위치에서의 하나 이상의 종양의 전이를 방지하는 방법.
구현예 87. 구현예 81 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 88. 구현예 87에 있어서, 추가 치료제가 면역조절제인 방법.
구현예 89. 구현예 88에 있어서, 추가 치료제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
구현예 90. 구현예 89에 있어서, 추가 치료제가 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제인 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
도 1은 엑소좀에 STING 작용제를 로딩하는 방법의 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 상대 발광(RLU)에 의해 결정되는, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제로 처리된 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서 IFNβ 반응의 비교를 나타낸다.
도 3은 CD86 평균 형광 세기(MFI)에 의해 결정되는, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제로 처리된 세포에서 단핵구 활성화의 비교를 나타낸다.
도 4는 CD86 평균 형광 세기(MFI)에 의해 결정되는, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제로 처리된 세포에서 mDC 활성화의 비교를 나타낸다.
도 5a는 CD86 염색에 의해 결정되는, 활성화 엑소좀-캡슐화 STING 작용제(Exo-STING) 또는 자유 STING 작용제로 처리된 샘플에서의 mDC를 나타내며, 도 5b는 CD86 염색에 의해 결정되는, 활성화 엑소좀-캡슐화 STING 작용제(Exo-STING) 또는 자유 STING 작용제로 처리된 샘플에서의 단핵구 활성화를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 자유 STING 작용제(STING 작용제)로의 처리 후 상이한 세포 유형의 집단(mDC, pDC, 단핵구, NK 세포, CD8+ T 세포, 및 B 세포)의 활성화 마커 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 7a는 자유 STING 작용제(STING 작용제)로의 처리 후 상이한 세포 유형의 집단(mDC, pDC, 단핵구, NK 세포, CD8+ T 세포, 및 B 세포)의 활성화 마커 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 7b는 엑소좀-캡슐화 STING 작용제(STING 엑소좀)로의 처리 후 상이한 세포 유형의 집단(mDC, pDC, 단핵구, NK 세포, CD8+ T 세포, 및 B 세포)의 활성화 마커 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 자유 STING 작용제, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제(STING Exo), 또는 글리칸 변형된 또는 단백질-과발현 엑소좀이 캡슐화된 STING 작용제(탈글리코실화[Degly], 탈시알릴화[Desialy], PTGFRN-과발현[PTGFRN], 탈글리코실화 및 PTGFRN-과발현[PTGFRN Degly] 또는 탈시알릴화 및 PTGFRN-과발현[PTGFRN Desialy])로의 처리 후 2명의 공여체로부터의 PBMC에서의 용량-의존적 IFN-β 반응을 나타낸다.
도 9는 도 8에서 평가된 자유 STING 작용제 및 엑소좀-캡슐화 STING 작용제에 대한 IFN-β 생산 EC50의 비교를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 자유 STING 작용제, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제(STING Exo), 또는 글리칸 변형된 또는 단백질-과발현 엑소좀이 캡슐화된 STING 작용제로의 처리 후 2명의 공여체로부터의 단핵구에서의 용량-의존적 CD86 발현 반응을 나타낸다.
도 11은 도 10에서 평가된 자유 STING 작용제 및 엑소좀-캡슐화 STING 작용제에 대한 단핵구 활성화 EC50의 비교를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 자유 STING 작용제, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제(STING Exo), 또는 글리칸 변형된 또는 단백질-과발현 엑소좀이 캡슐화된 STING 작용제로의 처리 후 mDC에서의 용량-의존적 CD86 발현 반응을 나타낸다.
도 13은 도 12에서 평가된 자유 STING 작용제 및 엑소좀-캡슐화 STING 작용제에 대한 mDC 활성화 EC50의 비교를 나타낸다.
도 14는 엑소좀에서 STING 작용제의 농도 정량을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 캡슐화된 STING 작용제를 포함하는 또는 포함하지 않는 키푸넨신 처리된(Exo + Kif) 또는 처리되지 않은(Exo) 엑소좀으로의 처리 후 2명의 상이한 공여체 샘플에서의 용량-의존적 IFNβ 반응을 나타낸다.
도 16a 및 16b는 캡슐화된 STING 작용제를 포함하는 또는 포함하지 않는 키푸넨신 처리된(Exo + Kif) 또는 처리되지 않은(Exo) 엑소좀으로의 처리 후 2명의 상이한 공여체 샘플에서의 CD86 신호에 의해 측정되는 단핵구의 용량-의존적 활성화를 나타낸다.
도 17a 및 17b는 캡슐화된 STING 작용제를 포함하는 또는 포함하지 않는 키푸넨신 처리된(Exo + Kif) 또는 처리되지 않은(Exo) 엑소좀으로의 처리 후 2명의 상이한 공여체 샘플에서의 CD86 신호에 의해 측정되는 mDC의 용량-의존적 활성화를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 상이한 양의 시간(2 h, 6 h, 하룻밤(O/N)) 동안 STING 작용제와 인큐베이션된 엑소좀 또는 STING 작용제가 없는 엑소좀(exo)으로의 처리 후 2명의 상이한 공여체 샘플에서의 용량-의존적 IFNβ 반응을 나타낸다.
도 19는 상대 발광(RLU)에 의해 결정되는, 2개의 상이한 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제(ML RR-S2 CDA 및 3-3 cAIMPdFSH)로 처리된 인간 PBMC에서의 용량-의존적 IFNβ 반응을 나타낸다.
도 20a-20d는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 종양에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, CXCL10, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 21a-21c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 배액 림프절에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 22a-22c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 비장에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 23a-23e는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 혈청에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, TNF-α, IL-6, MCP-1, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 24a-24d는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 종양에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, CXCL10, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 25a-25d는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 배액 림프절에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, CXCL10, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 26a-26d는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 비장에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, CXCL10, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 27a-27d는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 혈청에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, TNF-α, IL-6, 및 MCP-1)을 나타낸다.
도 28a-c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 복강내 주사 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 종양에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 29a-c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 복강내 주사 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 췌장에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 30a-30c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 복강내 주사 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 마우스의 비장에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 31a-31c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA, 또는 동일한 수의 엑소좀의 단회 복강내 주사 후 나이브 마우스의 폐에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 32a-32c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA, 또는 동일한 수의 엑소좀의 단회 복강내 주사 후 나이브 마우스의 비장에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 33a-33c는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA, 또는 동일한 수의 엑소좀의 단회 복강내 주사 후 나이브 마우스의 췌장에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10)을 나타낸다.
도 34a-34g는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA, 또는 동일한 수의 엑소좀의 단회 복강내 주사 후 나이브 마우스의 혈청에서의 사이토카인 발현 프로필(각각 IFN-β, IFN-γ, TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-1a, 및 IL-27)을 나타낸다.
도 35는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 복강내 주사 24시간 후 복강에서의 면역 세포 활성화 프로필을 나타낸다.
도 36은 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 단회 복강내 주사 24시간 후 비장에서의 면역 세포 활성화 프로필을 나타낸다.
도 37a는 실시예 9(즉, PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 유효성을 비교하는 종양내 주사 연구)에 기재된 연구 과정에 걸쳐 B16F10 종양-보유 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 37b-37e는 상이한 군(즉, 각각 PBS, STING 작용제(20 ㎍), STING 작용제(0.2 ㎍), 및 Exo STING 작용제(0.2 ㎍))에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 38a는 두 번째 종양 세포 접종으로의 재-유발접종 후 도 37a에 기재된 바와 같이 STING 작용제로 사전 처리된 B16F10 종양-보유 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 38b는 상이한 군에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 38c는 도 37a에 기재된 연구에서의 동물의 생활성을 나타낸다.
도 39는 실시예 10(B16F10 종양-보유 마우스에서 8 ng, 40 ng, 및 200 ng의 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA의 유효성을 비교하는 종양내 주사 용량-적정 연구)에 기재된 연구 과정 동안의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 40a-40d는 도 39에 기재된 상이한 군(즉, 각각 PBS, Exo STING 작용제(8 ng), Exo STING 작용제(40 ng), 및 Exo STING 작용제(200 ng))에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 41a-41e는 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA와 혼합된 200 ㎍ 오발부민이 주사된 나이브 마우스에서 항원으로 오발부민을 사용하는 실험 계획 및 항원-특이적 T-세포 유도 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 오발부민-반응성 T-세포의 백분율 및 IFN-γ 생산 비장세포의 수를 측정하였다.
도 42는 실시예 12에 기재된 연구(즉, PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA로 처리된 E.G7-OVA 종양-보유 마우스에서의 항-종양형성 효과 및 면역 메모리 반응 유도를 비교하는 종양 내 주사 연구) 과정 동안의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 43a-43d는 상이한 군(즉, 각각 PBS, STING 작용제(20 ㎍), STING 작용제(0.2 ㎍), 및 Exo STING 작용제(0.2 ㎍))에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 43e는 각각의 군에서의 동물의 비장으로부터 단리된 오발부민-반응성 메모리 T-세포의 백분율을 나타낸다.
도 44a-44b는 신선 제조된(도 44a) 또는 7일 동안 -80℃에서 냉동된(도 44b) PBMC에서의 원상태 엑소좀 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀 내로 로딩된 STING 작용제의 역가를 나타낸다. 역가는 IFNβ 생산에 의해 측정된다. 도 44c는 신선 제조된 엑소좀 대비 7일 동안 -80℃에서 보관 후 원상태 엑소좀 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀 내로 로딩된 STING의 역가 감소를 나타낸다.
도 45a-45d는 신선 제조된 엑소좀 대비 7일 동안 -80℃에서 보관 후 PTGFRN-과발현 엑소좀에서의 흡수 역학의 유지를 나타낸다. 도 45a 및 45b는 2명의 별도 공여체(각각 공여체 1 및 2)로부터의 신선 제조된 엑소좀에 대한 결과를 나타낸다. 도 45c 및 45d는 2명의 별도 공여체(각각 공여체 5 및 6)로부터의 보관 후 엑소좀에 대한 결과를 나타낸다.
도 46a는 실시예 14에 기재된 연구(즉, PTGFRN-과발현 엑소좀 내로 로딩된 PBS, 고 또는 저 용량의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 3개 용량 중 하나의 3-3 cAIMPdFSH로 처리된 B16F10 종양-보유 마우스에서의 항-종양형성 효과를 비교하는 폐 전이 유발접종이 뒤따르는 종양내 주사 연구) 과정 동안의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 46b는 연구 종료 후 각각의 군에서의 동물로부터의 대표 폐 이미지를 나타낸다.
도 47은 도 46a 및 46b에 나타낸 연구에서 동물의 폐 전이의 미시적 정량이다.
도 48은 도 46a 및 46b에 나타낸 연구에서 동물의 폐 전이의 조직학적 정량이다.
도 49a는 실시예 15에 기재된 체크포인트 차단 연구(즉, PTGFRN-과발현 엑소좀 내로 로딩된 3개 용량의 30 ng ML RR-S2 CDA로 처리된 B16F10 종양-보유 마우스에서 전신 면역 체크포인트 억제(항-CD-1 항체로의 처리)와 조합된 종양내 주사 연구) 과정 동안의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 49b는 실시예 15에 기재된 T-세포 고갈 연구(즉, PTGFRN-과발현 엑소좀 내로 로딩된 3개 용량의 100 ng의 3-3 cAIMPdFSH로 처리된 B16F10 종양-보유 마우스에서 T-세포 고갈(항-PD-8 항체로의 처리)과 조합된 종양내 주사 연구) 과정 동안의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 49c는 실시예 15에 기재된 연구(즉, PTGFRN-과발현 엑소좀 내로 로딩된 고 또는 저 용량 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 저 용량 ML RR-S2 CDA의 3회 주사로 처리된 B16F10 종양-보유 마우스에서 조합된 종양내 주사 연구에 이어 종양 항원에 대한 T-세포 반응성을 측정하기 위한 종양 세포-특이적 ELISPOT)로부터의 ELISPOT 결과를 나타낸다.
도 50a는 상대 발광(RLU)에 의해 결정되는, 야생형 엑소좀, PTGFRN 과발현 엑소좀, 또는 PTGFRN 녹아웃 엑소좀으로부터의 3-3 cAIMPdFSH, 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH로 처리된 PBMC에서의 IFNβ 반응의 비교를 나타낸다. 도 50b는 50a에서 엑소좀으로 처리된 PBMC로부터의 최대 IFNβ 신호의 비교를 나타낸다. 도 50c는 야생형 엑소좀, PTGFRN 과발현 엑소좀, 또는 PTGFRN 녹아웃 엑소좀 내로 로딩된 PBS 또는 20 ng의 3-3 cAIMPdFSH의 3회 종양내 주사(이식 6, 9, 및 12일 후) 후 마우스에서 피하 이식된 B16F10 흑색종 종양의 성장 곡선을 나타낸다.
도 51a는 Alexa Fluor™ 488-표지 엑소좀이 주사된 피하 종양으로부터 단리된 상이한 클래스의 종양-침윤 림프구의 양성 집단-퍼센트를 나타낸다. 도 51b는 PBS, PTGFRN 과발현 엑소좀(ExoSTING™)에 로딩된 200 ng의 ML RR-S2 CDA, 200 ng의 ML RR-S2 CDA, 또는 20 ㎍의 ML RR-S2 CDA가 주사된 피하 종양으로부터 단리된 CD8+ T-세포의 상대 집단을 나타낸다. 도 51c는 PBS, PTGFRN 과발현 엑소좀(ExoSTING™)에 로딩된 200 ng의 ML RR-S2 CDA, 200 ng의 ML RR-S2 CDA, 또는 20 ㎍의 ML RR-S2 CDA가 주사된 피하 종양으로부터 단리된 대식구의 상대 집단을 나타낸다. 도 51d는 PBS, PTGFRN 과발현 엑소좀(ExoSTING™)에 로딩된 200 ng의 ML RR-S2 CDA, 200 ng의 ML RR-S2 CDA, 또는 20 ㎍의 ML RR-S2 CDA가 주사된 피하 종양으로부터 단리된 수지상 세포의 상대 집단을 나타낸다.
도 52a-52d는 마이크로용량의 자유 ML RR-S2 CDA 또는 ML RR-S2 CDA를 포함하는 또는 포함하지 않는, 나타낸 엑소좀이 직접 주사된 쥣과 육종 세포에서의 IFNβ전사체(도 52a) 또는 절단된 카스파제 3 단백질(도 52b)의 정량적 조영 결과를 나타낸다. 도 52c-d는 마이크로용량의 자유 3-3 cAIMPdFSH 또는 3-3 cAIMPdFSH-로딩 엑소좀이 주사된 후 IFNβ(도 52c) 또는 CXCL10(도 52d) 전사체의 방사상 반응 분석을 나타낸다.
도 53a-53g는 상대 발광(RLU)에 의해 결정되는, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제로 처리된 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서의 IFNβ 반응의 비교를 나타낸다. 도 53a는 STING 작용제 ML RR-S2 CDA("ExoML RR-S2") 또는 2-3 cGAMP("Exo2-3 cGAMP")가 로딩된 엑소좀에 대한 결과를 나타낸다. 대응하는 자유 STING 작용제는 각각 "자유 ML RR-S2" 및 "자유 2-3 cGAMP"로 나타낸다. 도 53b는 STING 작용제 3-3 cAIMPdFSH가 로딩된 엑소좀("exo3-3 cAIMPdFSH") 또는 3-3 cAIM(PS)2가 로딩된 엑소좀("exo3-3 cAIM(PS)2")에 대한 결과를 나타낸다. "자유 3-3 cAIMPdFSH" 및 "자유 3-3 cAIM(PS)2"는 각각 대응하는 작용제의 자유 형태를 나타낸다. 도 53c는 3-3 cAIMP가 로딩된 엑소좀("exo3-3 cAIMP") 및 3-3 cAIMPdF가 로딩된 엑소좀("exo3-3 cAIMPdF")에 대한 결과를 나타낸다. 대응하는 자유 STING 작용제는 각각 "자유 3-3 cAIMP" 및 "자유 3-3 cAIMPdF"로 나타낸다. 도 53d는 STING 작용제 3-3 cAIMPmFSH가 로딩된 엑소좀("exo3-3 cAIMPmFSH") 및 자유 STING 작용제 3-3 cAIMPmFSH("자유 3-3 cAIMPmFSH")에 대한 결과를 나타낸다. 도 53e는 STING 작용제 CP214가 로딩된 엑소좀("Exo-CP214"; 흰 다이아몬드) 및 자유 CP214 STING 작용제("CP214"; 검은 다이아몬드)에 대한 결과를 나타낸다. 도 53f는 STING 작용제 CP201이 로딩된 엑소좀("Exo-CP201"; 흰 사각형) 및 자유 형태의 CP201 STING 작용제("CP201"; 검은 사각형)에 대한 결과를 나타낸다. 도 53g는 STING 작용제 CP204가 로딩된 엑소좀("Exo-CP204"; 흰 삼각형) 및 자유 CP204 STING 작용제("CP204"; 검은 삼각형)에 대한 결과를 나타낸다. 3-3 cAIMPdFSH, 3-3 cAIM(PS)2, cAIMPdF, cAIMP는 각각 논문(J Med Chem. 2016 Nov 23;59(22):10253-10267)의 화합물 53, 13, 52, 및 51에 대응한다. CP214는 2-3 cAMPmFSH이다. CP201 및 CP204는 각각 특허 WO2017/175156 및 WO2017/175147로부터의 화합물의 유사체이다.
도 54a-54c는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스(검은 막대) 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 조직(각각 종양, 배액 림프절, 및 비장)에서의 IFNβ 발현 프로필을 나타낸다.
도 55a-55c는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스(검은 막대) 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 조직(각각 종양, 배액 림프절, 및 비장)에서의 CXCL9 발현 프로필을 나타낸다.
도 56a-56c는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스(검은 막대) 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 조직(각각 종양, 배액 림프절, 및 비장)에서의 CXCL10 발현 프로필을 나타낸다.
도 57a-57c는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스(검은 막대) 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 조직(각각 종양, 배액 림프절, 및 비장)에서의 IFN-γ 발현 프로필을 나타낸다.
도 58a-58d는 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 종양내 주사 후 B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스(검은 막대) 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 혈청 사이토카인 발현 프로필(각각 IFN-β, TNF-α, IL-6, 및 MCP-1)을 나타낸다.
도 59는 실시예 20에 기재된 연구(즉, B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스에서 PBS, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 유효성을 비교하는 종양내 주사 연구) 과정에 걸쳐 B16F10 종양-보유 C57BL/6 마우스 또는 C57BL/6-Tmem173gt 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 60은 실시예 21에 기재된 연구 과정에 걸친 B16F10 종양-보유 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 61a-61e는 도 60 및 실시예 21에 나타낸 상이한 군에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 상이한 군에는 엑소좀(도 61a), exoSTING(0.1 ㎍)(도 61b), exoSTING(0.3 ㎍)(도 61c), STING 작용제(30 ㎍)(도 61d), 및 STING 작용제(0.3 ㎍)(도 61e)가 포함된다.
도 62는 실시예 22에 기재된 연구 과정에 걸친 CT26.CT25 종양-보유 BALB/c 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 63은 실시예 22에 기재된 연구 과정에 걸친 CT26.wt 종양-보유 BALB/c 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 64는 실시예 23에 기재된 연구 과정에 걸친 주사된 B16F10 종양의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 65는 실시예 23에 기재된 연구 과정에 걸친, 주사되지 않은 반대쪽 B16F10 종양의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 66은 B16F10 종양에서 30 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 및 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 종양내 주사 후 3-3 cAIMPdFSH의 종양 약동학을 나타낸다. 표는 각 샘플의 반감기를 나타낸다.
도 67은 나이브 C57BL/6 마우스에서 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH의 정맥내 주사 후 3-3 cAIMPdFSH의 혈장 약동학을 나타낸다.
도 68은 나이브 C57BL/6 마우스에서 0.1 ㎍, 0.3 ㎍, 및 0.6 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 정맥내 주사 후 3-3 cAIMPdFSH의 혈장 약동학을 나타낸다. 표는 각 샘플의 반감기를 나타낸다.
도 69a-69d는 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 정맥내 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스의 간에서의 경시적인 사이토카인 발현 프로필(각각 IFN-β, CXCL9, CXCL10, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 70a-70d는 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 정맥내 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스의 비장에서의 경시적인 사이토카인 발현 프로필(각각 IFN-β, CXCL9, CXCL10, 및 IFN-γ)을 나타낸다.
도 71a-71e는 나이브 C57BL/6 마우스에서 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 정맥내 주사 후 경시적인 혈청 사이토카인 발현 프로필(각각 IFN-β, TNF-α, IL-6, IFN-γ 및 MCP-1)을 나타낸다.
도 72a-72c는 PBS, 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 피하 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 조직(각각 림프절, 비장, 및 간)에서의 IFNβ 발현 프로필을 나타낸다.
도 73a-73c는 PBS, 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 피하 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 조직(각각 림프절, 비장, 및 간)에서의 CXCL9 발현 프로필을 나타낸다.
도 74a-74c는 PBS, 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 피하 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 조직(각각 림프절, 비장, 및 간)에서의 CXCL10 발현 프로필을 나타낸다.
도 75a-75c는 PBS, 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 피하 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 조직(각각 림프절, 비장, 및 간)에서의 IFN-γ 발현 프로필을 나타낸다.
도 76a-76e는 PBS, 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.2 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 단회 피하 주사 후 나이브 C57BL/6 마우스에서의 혈청 사이토카인 발현 프로필(각각 IFNβ, TNFα, IL-6, IFN-γ, 및 MCP-1)을 나타낸다.
도 77a 및 77b는 실시예 28에 기재된 바와 같은 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.1 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 종양내 주사 후 B16F10 종양 절편으로부터의 종양(도 77a) 또는 기질 영역(도 77b)에서의 정량적 IFNβ 발현 프로필을 나타낸다.
도 78a 및 78b는 실시예 28에 기재된 바와 같은 엑소좀, 20 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 0.1 ㎍ 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH의 종양내 주사 후 종양 절편에서의 CD8 양성 세포(도 78a) 및 F4/80 양성 세포(도 78b)의 수를 나타낸다.
도 79a는 실시예 29에 기재된 연구 과정에 걸친 B16F10 종양-보유 마우스에서의 원발성 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 79b-79e는 상이한 군(즉, 각각 PBS, 엑소좀, ADUS100, 및 exoCL656)에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 80a는 실시예 29에 기재된 연구 과정에 걸친 B16F10 종양-보유 마우스에서의 재-유발접종 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 80b-80d는 상이한 군(즉, 각각 PBS, ADUS100, 및 exoCL656)에서의 각각의 동물에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다.
본 발명을 더 상세히 설명하기 전에, 기재된 특정 구현예가 당연히 변할 수 있으므로, 본 발명이 이에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용되는 용어가 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 평가에서 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적 방법 및 물질이 이제 기재된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 공보 또는 특허가 참조로 포함됨을 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 같이 본원에서 참조로 포함되며, 인용되는 공보와 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에서 참조로 포함된다.
본 개시의 독서 시 당업자에게 자명할 바와 같이, 본원에서 기재되고 예시되는 각각의 개별 구현예는 각각 본 발명의 범위 또는 정신에서 벗어나지 않고 임의의 다른 몇몇 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 구별되는 성분 및 특징을 갖는다. 모든 열거된 방법은 열거된 이벤트의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
I. 정의
본원에서 그리고 첨부되는 청구범위에서 사용된 바와 같이, 맥락 상 명확히 달리 나타내지 않는 한, 단수 형태("a", "an," 및 "the")에는 복수 참조물이 포함됨이 주지된다. 이와 같이, 용어 하나("a" 또는 "an"), "하나 이상," 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있음이 추가로 주지된다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다. 이와 같이, 상기 언급은 청구범위 요소의 열거, 또는 부정적 제한의 사용에 관해 "단독으로", "만" 등과 같은 이러한 배타적 용어의 사용에 대해 선행 기준으로 작용하려는 것이다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것을 포함하거나 포함하지 않고 2개의 명시된 특징 또는 성분 각각의 구체적 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하려는 것이다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 양태 각각을 포괄하려는 것이다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
양태가 "포함하는"과 같은 언어로 본원에서 기재되는 경우에는 달리 기재되지 않는 한 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 관점에서 기재되는 유사한 양태도 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 관련되는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 개시에서 사용되는 여러 용어의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두어, 및 기호는 이의 국제 시스템 단위(SI)에서 허용된 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 수치 범위가 열거되는 경우, 각각의 개재 정수값, 및 그 범위의 열거된 상한 및 하한 사이의 이의 각각의 분수가 또한 이러한 값 간의 각각의 하위범위와 함께, 구체적으로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있고, 두 경계 중 하나, 0개 또는 둘 다가 포함되는 각각의 범위도 본 개시 내에 포괄된다. 따라서, 본원에서 열거된 범위는 열거된 종결점을 포함하는, 범위 내의 모든 값에 대한 약기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성되는 군으로부터의 임의의 수치, 수치의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
값이 명시적으로 열거되는 경우, 열거된 값과 거의 동일한 수량 또는 양인 값이 또한 본 개시의 범위 내임이 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소의 각각의 하위조합이 또한 구체적으로 개시되며 본 개시의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소의 군이 개별적으로 개시되는 경우, 이의 조합이 또한 개시된다. 본 개시의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 제외되는 개시의 예가 또한 본원에서 개시된다; 본 개시의 하나를 초과하는 요소는 이러한 제외를 가질 수 있고, 이러한 제외를 갖는 요소의 모든 조합이 본원에서 개시된다.
뉴클레오타이드는 이의 일반적으로 허용되는 한글자 코드로 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 뉴클레오타이드 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 배향으로 기재된다. 뉴클레오타이드는 본원에서 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 이의 일반적으로 알려진 한글자 기호로 나타낸다. 따라서, A는 아데닌을 나타내며, C는 시토신을 나타내고, G는 구아닌을 나타내고, T는 티민을 나타내고, U는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카복시 배향으로 기재된다. 아미노산은 이의 일반적으로 알려진 3글자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1근자 기호로 본원에서 나타낸다.
용어 "약" 또는 "대략"은 본원에서 사용되어 대략, 거의, 주위, 또는 그 영역임을 의미한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 나타낸 수치값의 위 및 아래로 경계를 연장하여 그 범위를 수식한다. 본원에서 사용되는 용어는 언급된 양의 5% 이내를 의미하며, 예를 들어, 약 50%는 47.5% 내지 52.5%의 값 범위를 포괄하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 소수포" 또는 "EV"는 내부 공간을 봉입하는 막을 포함하는 세포-유래 소수포를 나타낸다. 세포외 소수포는 이들이 유래되는 세포보다 작은 지름을 갖는 전체 막-결합 소수포(예를 들어, 엑소좀, 나노소수포)를 포함한다. 일반적으로 세포외 소수포는 지름 20 nm 내지 1000 nm의 범위이며, 세포외 소수포의 외부 표면 상에 나타나는 및/또는 막에 걸쳐있는, 내부 공간(즉, 내강) 내에 다양한 거대분자 페이로드를 포함할 수 있다. 상기 페이로드는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 및/또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 소수포는 스캐폴드 모이어티를 포함한다. 예로서 그리고 비제한적으로, 세포외 소수포에는 아폽토시스체, 세포의 단편, 직접적 또는 간접적 조작에 의해(예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리성 용액으로의 처리에 의해) 세포로부터 유래된 소수포, 소수포화된 소기관, 및 살아있는 세포에 의해(예를 들어, 직접적 형질막 발아 또는 후기 엔도좀과 형질막의 융합에 의해) 생산된 소수포가 포함된다. 세포외 소수포는 살아있는 또는 죽은 유기체, 외삽입된 조직 또는 기관, 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 소수포는 하나 이상의 트랜스유전자 산물을 발현하는 세포에 의해 생산된다.
본원에서 사용되는 용어 "엑소좀"은 내부 공간(즉, 내강)을 봉입하며, 직접적 형질막 발아에 의해 또는 후기 엔도좀과 형질막의 융합에 의해 상기 세포로부터 생성되는, 막을 포함하는 세포-유래 소형(20-300 nm 지름, 보다 바람직하게는 40-200 nm 지름) 소수포를 나타낸다. 엑소좀은 일종의 세포외 소수포이다. 엑소좀은 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하며 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 리시버(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA), 당(예를 들어, 단순 당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 스캐폴드 모이어티를 포함한다. 엑소좀은 생산체 세포로부터 유래되고, 그 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이의 조합에 기반하여 생산체 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 엑소좀은 하나 이상의 트랜스유전자 산물을 발현하는 세포에 의해 생산된다.
본원에서 사용되는 용어 "나노소수포"는 내부 공간을 봉입하며 상기 나노소수포가 상기 조작 없이 상기 생산체 세포에 의해 생산되지 않도록 할 직접적 또는 간접적 조작에 의해 상기 세포로부터 생성되는, 막을 포함하는 세포-유래 소형(20-250 nm 지름, 보다 바람직하게는 30-150 nm 지름) 소수포를 나타낸다. 상기 생산체 세포의 적절한 조작에는 비제한적으로 연속 압출, 알칼리성 용액으로의 처리, 초음파 분쇄, 또는 이의 조합이 포함된다. 나노소수포의 생산은, 일부 경우에서, 상기 생산체 세포의 파괴를 일으킬 수 있다. 바람직하게는, 나노소수포 집단에는 형질막으로부터의 직접적 발아 또는 후기 엔도좀과 형질막의 융합에 의해 생산체 세포로부터 유래되는 소수포가 실질적으로 없다. 나노소수포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 리시버(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA), 당(예를 들어, 단순 당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 나노소수포는 스캐폴드 모이어티를 포함한다. 나노소수포는, 일단 상기 조작에 따라 생산체 세포로부터 유래되는 경우, 그 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이의 조합에 기반하여 생산체 세포로부터 단리될 수 있다.
본원에서 기재된 엑소좀의 맥락에서 사용되는 경우, 용어 "변형된"은 변형된 EV가 자연-발생 EV와 상이하도록 하는, EV의 변경 또는 조작을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재되는 변형된 EV는 자연-발생 EV의 막에 비해 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 상이한 막을 포함한다(예를 들어, 막이 더 큰 밀도 또는 수의 천연 EV 단백질을 포함하고/하거나 막이 EV에서 자연적으로 확인되지 않는 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 막에 대한 이러한 변형은 EV의 외부 표면을 변화시킨다. 특정 구현예에서, 막에 대한 이러한 변형은 EV의 내강을 변화시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "스캐폴드 모이어티"는 EV의 내강 표면 또는 외부 표면 상에 본원에서 개시되는 STING 작용제 또는 EV에 대한 임의의 다른 관심 화합물(예를 들어, 페이로드)을 부착하기 위해 사용될 수 있는 분자를 나타낸다. 특정 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 합성 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 비-폴리펩타이드 모이어티를 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 EV에 자연적으로 존재하는 지질, 탄수화물, 또는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 엑소좀에 자연적으로 존재하지 않는 지질, 탄수화물, 또는 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 X이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 Y이다. 추가 구현예에서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 X 및 스캐폴드 Y를 둘 다 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "스캐폴드 X"는 최근에 엑소좀의 표면 상에서 확인된 엑소좀 단백질을 나타낸다. 예를 들어, 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허 번호 10,195,290을 참고한다. 스캐폴드 X 단백질의 비제한적 예에는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성적 조절제("PTGFRN 단백질"); 바시긴("BSG 단백질"); 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 2("IGSF2 단백질"); 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 3("IGSF3 단백질"); 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 8("IGSF8 단백질"); 인테그린 베타-1("ITGB1 단백질); 인테그린 알파-4("ITGA4 단백질"); 4F2 세포-표면 항원 중쇄("SLC3A2 단백질"); 및 ATP 트랜스포터 단백질 클래스("ATP1A1 단백질", "ATP1A2 단백질", "ATP1A3 단백질", "ATP1A4 단백질", "ATP1B3 단백질", "ATP2B1 단백질", "ATP2B2 단백질", "ATP2B3 단백질", "ATP2B 단백질")이 포함된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X 단백질은 전체 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능적 단편, 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면 또는 내강 표면 상에 또 다른 모이어티를 부착할 수 있는 가장 작은 단편)일 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면 또는 내강 표면으로 모이어티(예를 들어, STING 작용제)를 부착할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "스캐폴드 Y"는 엑소좀의 내강 표면 내에서 새로 확인된 엑소좀 단백질을 나타낸다. 예를 들어, 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 국제 출원 번호 PCT/US2018/061679를 참고한다. 스캐폴드 Y 단백질의 비제한적 예에는 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 키나제 C 기질("MARCKS 단백질"); 미리스토일화된 알라닌 풍부 단백질 키나제 C 기질 유사 1("MARCKSL1 단백질"); 및 뇌 산 가용성 단백질 1("BASP1 단백질")이 포함된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 Y 단백질은 전체 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능적 단편, 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 상에 모이어티를 부착할 수 있는 가장 작은 단편)일 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 Y는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에 모이어티(예를 들어, STING 작용제)를 부착할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 단백질(예를 들어, 치료 단백질, 스캐폴드 X, 또는 스캐폴드 Y)의 "단편"은 자연-발생 서열보다 짧은, 자연-발생 단백질에 비해 N- 및/또는 C-말단 결실된 또는 단백질의 임의의 부분이 결실된 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "기능적 단편"은 단백질 기능을 보유하는 단백질 단편을 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, 스캐폴드 X 단백질의 기능적 단편은 EV의 내강 표면 상에 및/또는 외부 표면 상에 모이어티를 부착하는 능력을 보유한다. 유사하게, 특정 구현예에서, 스캐폴드 Y 단백질의 기능적 단편은 EV의 내강 표면 상에 모이어티를 부착하는 능력을 보유한다. 단편이 기능적 단편인지 여부는 웨스턴 블롯, FACS 분석 및 단편과 예로 GFP와 같은 자가형광 단백질의 융합을 포함하는 EV의 단백질 함량을 결정하기 위한 임의의 당분야에 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 스캐폴드 X 단백질의 기능적 단편은 자연 발생 스캐폴드 X 단백질의 능력, 예를 들어, 모이어티를 부착하는 능력의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100%를 보유한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 Y 단백질의 기능적 단편은 자연 발생 스캐폴드 Y 단백질의 능력, 예를 들어, 또 다른 분자를 부착하는 능력의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100%를 보유한다.
본원에서 사용되는 용어 분자(예를 들어, 기능적 분자, 항원, 스캐폴드 X 및/또는 스캐폴드 Y)의 "변이체"는 당분야에 알려진 방법에 의해 비교 시 또 다른 분자와 특정한 구조적 및 기능적 동일성을 공유하는 분자를 나타낸다. 예를 들어, 단백질의 변이체에는 또 다른 단백질에서의 치환, 삽입, 결실, 프레임변화 또는 재배열이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 스캐폴드 X의 변이체는 전장, 성숙 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 트랜스포터 단백질 또는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 트랜스포터 단백질의 단편(예를 들어, 기능적 단편)과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, PTGFRN의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 1에 따른 PTGFRN과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 BSG의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 9에 따른 BSG와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, IGSF2의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 34에 따른 IGSF2와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 IGSF3의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 20에 따른 IGSF3과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 IGSF8의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 14에 따른 IGSF8과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ITGB1의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 21에 따른 ITGB1과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ITGA4의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 22에 따른 ITGA4와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 SLC3A2의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 23에 따른 SLC3A2와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP1A1의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 24에 따른 ATP1A1과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP1A2의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 25에 따른 ATP1A2와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP1A3의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 26에 따른 ATP1A3과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP1A4의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 27에 따른 ATP1A4와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP1B3의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 28에 따른 ATP1B3과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP2B1의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 29에 따른 ATP2B1과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP2B2의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 30에 따른 ATP2B2와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP2B3의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 31에 따른 ATP2B3과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 ATP2B4의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 32에 따른 ATP2B4와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 스캐폴드 X 단백질의 변이체 또는 단편의 변이체는 EV에 특이적으로 표적화되는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X에는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 포함된다.
일부 구현예에서, 스캐폴드 Y의 변이체는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 MARCKS, MARCKSL1, 또는 BASP1의 단편과 적어도 70% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서 MARCKS의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 47에 따른 MARCKS와 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 MARCKSL1의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 48에 따른 MARCKSL1과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서 BASP1의 변이체 또는 단편의 변이체는 서열 번호 49에 따른 BASP1과 또는 이의 기능적 단편과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 Y 단백질의 변이체 또는 단편의 변이체는 EV의 내강에 특이적으로 표적화되는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 Y에는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 포함된다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분기화 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당분야에 정의되었다. 따라서, 폴리펩타이드에서의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 여겨진다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 간의 용어 "서열 동일성 퍼센트" 또는 "동일성 퍼센트"는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 부가 또는 결실(즉, 갭)을 고려하여, 비교 윈도우에 걸쳐 서열에 의해 공유되는 동일하게 매칭된 위치의 수를 나타낸다. 매칭된 위치는 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 표적 및 참조 서열 둘 다에 제시되는 임의의 위치이다. 갭은 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 아니므로, 표적 서열에 제시되는 갭은 계수되지 않는다. 마찬가지로, 표적 서열 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 계수되며, 참조 서열로부터의 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 계수되지 않으므로, 참조 서열에 제시되는 갭은 계수되지 않는다.
서열 동일성 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 두 서열에서 모두 일어나는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 제공하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치의 총 수로 나누고 결과에 100을 곱해 서열 동일성 백분율을 제공하여 계산된다. 두 서열 간 서열 비교 및 서열 동일성 퍼센트의 결정은 온라인 사용을 위해 그리고 다운로드를 위해 모두 쉽게 이용 가능한 소프트웨어를 사용해서 달성될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 원천으로부터, 그리고 단백질 및 뉴클레오타이드 서열 둘 다의 정렬을 위해 이용 가능하다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생물공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용 가능한 프로그램 BLAST suite의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 간 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하기 위해 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하기 위해 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어, 바이오인포마틱스 프로그램 EMBOSS suite의 일부이며, 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 바이오인포마틱스 연구소(EBI)로부터 이용 가능한 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 참조 서열과 정렬되는 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 이들의 고유한 서열 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 서열 동일성 퍼센트값은 가장 가까운 소수점 첫째자리로 반올림됨이 주지된다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 내림되는 반면, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 올림된다. 길이 값은 항상 정수일 것임이 또한 주지된다.
당업자는 서열 동일성 퍼센트의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해 배타적으로 유도되는 이원성 서열-서열 비교에 제한되지 않음을 이해할 것이다. 서열 정렬은 다중 서열 정렬로부터 유도될 수 있다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 www.clustal.org로부터 이용 가능한 ClustalW2이다. 또 다른 적합한 프로그램은 www.drive5.com/muscle/로부터 이용 가능한 MUSCLE이다. ClustalW2 및 MUSCLE은, 예로 EBI로부터, 대안적으로 이용 가능하다.
또한 서열 정렬은 서열 데이터를 구조 데이터(예를 들어, 결정측정 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생학 데이터와 같은 이종성 원천으로부터의 데이터와 통합하여 생성될 수 있음이 이해될 것이다. 이종성 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하기 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용 가능하며, 예를 들어, EBI로부터 대안적으로 이용 가능한 T-Coffee이다. 또한 서열 동일성 퍼센트를 계산하기 위해 사용되는 최종 정렬은 자동으로 또는 수동으로 큐레이션될 수 있음이 이해될 것이다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 다에 변경을 함유할 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 침묵 치환, 부가, 또는 결실을 생성하지만, 인코딩된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성은 변경하지 않는 변경을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 변이체는 유전 코드의 축퇴성으로 인해 침묵 치환에 의해 생산된다. 다른 구현예에서, 5-10, 1-5, 또는 1-2개 아미노산이 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 부가되는 변이체. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어, 특정 숙주에 대해 코돈 발현을 최적화하기 위해(인간 mRNA에서 다른 것, 예로 대장균과 같은 박테리아 숙주로 코돈을 변화시키기 위해), 생산될 수 있다.
자연 발생 변이체는 "대립유전자 변이체"로 불리며 유기체의 염색체 상에서 주어진 유전자위를 점유하는 유전자의 몇몇 대안적 형태 중 하나를 나타낸다(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). 이들 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 수준에서 변할 수 있고 본 개시에 포함된다. 대안적으로, 비-자연 발생 변이체는 돌연변이화 기법에 의해 또는 직접적 합성에 의해 생산될 수 있다.
단백질 조작 및 재조합 DNA 기술의 알려진 방법을 사용하여, 변이체는 폴리펩타이드의 특징을 개선하거나 변경하기 위해 생성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적 손실 없이 분비된 단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)은 3, 8, 또는 27개 아미노-말단 아미노산 잔기의 결실 후에도 헤파린 결합 활성을 갖는 변이체 KGF 단백질을 보고하였다. 유사하게, 인터페론 감마는 상기 단백질의 카복시 말단으로부터 8-10개 아미노산 잔기의 결실 후 최대 10배 더 큰 활성을 나타내었다(본원에서 그 전문이 참조로 포함되는, Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).
또한, 변이체가 종종 자연 발생 단백질과 유사한 생물학적 활성을 보유함을 충분한 증거가 실증한다. 예를 들어, Gayle와 공동 연구자들(그 전문이 본원에서 참조로 포함된 J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993))은 인간 사이토카인 IL-1a의 광범위한 돌연변이 분석을 수행하였다. 이들은 무작위 돌연변이화를 사용하여 분자의 전체 길이에 걸쳐 변이체 당 평균 2.5개의 아미노산 변화를 갖는 3,500개를 초과하는 개별 IL-1a 돌연변이체를 생성하였다. 가능한 모든 아미노산 위치에서 여러 돌연변이가 조사되었다. 연구자들은 "[대]부분의 분자가 [결합 또는 생물학적 활성]에 대해 거의 효과를 갖지 않고 변경될 수 있음"을 확인하였다(초록 참고). 사실 상, 검사된 3,500개를 초과하는 뉴클레오타이드 서열 중 23개의 고유한 아미노산 서열만이 야생형과 유의미하게 활성이 상이한 단백질을 생산하였다.
상기 언급된 바와 같이, 폴리펩타이드 변이체에는, 예를 들어, 변형된 폴리펩타이드가 포함된다. 변형에는, 예를 들어, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 부착 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, peg화(그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 Mei et al., Blood 116:270-79 (2010)), 단백분해 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같이 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가, 및 유비퀴틴화가 포함된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X 및/또는 스캐폴드 Y는 임의의 편리한 위치에서 변형된다.
본원에서 사용되는 용어 "생산체 세포"는 EV를 생성하기 위해 사용되는 세포를 나타낸다. 생산체 세포는 시험관내 배양된 세포, 또는 생체내 세포일 수 있다. 생산체 세포에는 비제한적으로 EV, 예를 들어, 엑소좀을 생성하는 데 효과적인 것으로 알려져 있는 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), BJ 인간 포피 섬유아세포 세포, s9f 세포, fHDF 섬유아세포 세포, AGE.HN® 뉴런 전구체 세포, CAP® 양막세포, 지방 중간엽 줄기 세포, 및 RPTEC/TERT1 세포가 포함된다. 특정 구현예에서, 생산체 세포는 항원-제시 세포이다. 일부 구현예에서, 생산체 세포는 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 생산체 세포는 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 대식구, 호중구, 쿠퍼-브로윅즈(Kupffer-Browicz) 세포, 또는 임의의 이러한 세포로부터 유래되는 세포, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 생산체 세포는 박테리아 세포가 아니다. 다른 구현예에서, 생산체 세포는 항원-제시 세포가 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "와 연합된"은 제1 모이어티, 예를 들어, STING 작용제의 제2 모이어티, 예를 들어, 세포외 소수포 내로의 캡슐화, 또는 제1 모이어티 및 제2 모이어티, 예를 들어, 각각 STING 작용제 및 세포외 소수포 간 형성된 공유 또는 비-공유 결합, 예를 들어, 세포외 소수포 내에서 또는 상에서 발현된 스캐폴드 모이어티 및 STING 작용제, 예를 들어, 각각 세포외 소수포의 내강 표면 상에 또는 그 외부 표면 상에 발현된 스캐폴드 X(예를 들어, PTGFRN 단백질)를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 용어 "와 연합된"은 공유, 비-펩타이드 결합 또는 비-공유 결합을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 시스테인은 제2 시스테인 잔기 상의 티올기와 디설파이드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 공유 결합의 예에는 비제한적으로 펩타이드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 디설파이드 결합, 시그마 결합, 파이 결합, 델파 결합, 글리코시드계 결합, 작용성 결합, 굴곡 결합, 이극성 결합, 파이 역결합, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 접합, 과접합, 방향성, 합텐성, 또는 항결합이 포함된다. 비-공유 결합의 비제한적 예에는 이온성 결합(예를 들어, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들어, 이수소 결합, 이수소 복합체, 저-배리어 수소 결합, 또는 대칭성 수소 결합), 반 데르 발스력, 린던 분산력, 기계적 결합, 할로겐 결합, 친금성, 개재, 적층, 엔트로피력, 또는 화학적 극성이 포함된다. 다른 구현예에서, 용어 "와 연합된"은 제2 모이어티, 예를 들어, STING 작용제의 제1 모이어티, 예를 들어, 세포외 소수포에 의한 캡슐화 상태를 의미한다. 캡슐화 상태에서, 제1 모이어티 및 제2 모이어티는 서로 연결될 수 있다. 다른 구현예에서, 캡슐화는 제1 모이어티 및 제2 모이어티가 서로 물리적으로 및/또는 화학적으로 연결되지 않음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "에 연결된" 또는 "에 접합된"은 상호 교환적으로 사용되며 제1 모이어티 및 제2 모이어티, 예를 들어, 각각 STING 작용제 및 세포외 소수포, 예를 들어, 세포외 소수포 내에 또는 상에 발현된 스캐폴드 모이어티 및 STING 작용제, 예를 들어, 각각 세포외 소수포의 내강 표면 또는 그의 외부 표면 상의 스캐폴드 X(예를 들어, PTGFRN 단백질) 간에 형성된 공유 또는 비-공유 결합을 나타낸다.
용어 "캡슐화된", 또는 용어의 문법적으로 상이한 형태(예를 들어, 캡슐화, 또는 캡슐화하는)는 두 모이어티를 화학적으로 또는 물리적으로 연결하지 않고 제2 모이어티(예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀) 내부로 제1 모이어티(예를 들어, STING 작용제)를 갖는 상태 또는 공정을 나타낸다. 일부 구현예에서, 용어 "캡슐화된"은 "의 내강에"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 제2 모이어티(예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀) 내로의 제1 모이어티(예를 들어, STING 작용제) 캡슐화의 비제한적 예는 본원에서 다른 곳에 개시된다.
본원에서 사용되는 용어 "단리한다", "단리된", 및 "단리하는" 또는 "정제한다", "정제된", 및 "정제하는"뿐만 아니라 "추출된" 및 "추출하는"은 상호 교환적으로 사용되며 하나 이상의 정제 공정, 예를 들어, 요망되는 EV 제조물의 선택 또는 농축을 거친, 요망되는 EV의 제조 상태(예를 들어, 복수의 알려진 또는 알려지지 않은 양 및/또는 농도)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 단리하는 또는 정제하는이란 생산체 세포를 함유하는 샘플로부터 EV를 제거하는, 부분적으로 제거하는(예를 들어, 분별) 공정이다. 일부 구현예에서, 단리된 EV 조성물은 검출 가능한 요망되지 않는 활성을 갖지 않거나, 대안적으로, 요망되지 않는 활성의 수준 또는 양이 허용 가능한 수준 또는 양 이하이다. 다른 구현예에서, 단리된 EV 조성물은 허용 가능한 양 및/또는 농도 이상의 요망되는 EV의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 구현예에서, 단리된 EV 조성물은 조성물이 수득되는 원료(예를 들어, 생산체 세포 제조물)에 비해 농축된다. 상기 농축은 원료에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999%, 또는 99.9999% 초과만큼일 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 EV 제조물에는 잔여 생물학적 산물이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 단리된 EV 제조물에는 임의의 오염성 생물학적 물질이 100% 없거나, 99% 없거나, 98% 없거나, 97% 없거나, 96% 없거나, 95% 없거나, 94% 없거나, 93% 없거나, 92% 없거나, 91% 없거나, 90% 없다. 잔여 생물학적 산물에는 비생물 물질(화학물질 포함) 또는 원치않는 핵산, 단백질, 지질, 또는 대사물질이 포함될 수 있다. 실질적으로 잔여 생물학적 산물이 없는이란 또한 EV 조성물이 검출 가능한 생산체 세포를 함유하지 않으며 EV만 검출 가능함을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작용제"는 수용체에 결합하며 수용체를 활성화하여 생물학적 반응을 생성하는 분자를 나타낸다. 수용체는 내인성 또는 외인성 작용제에 의해 활성화될 수 있다. 내인성 작용제의 비제한적 예에는 호르몬, 신경전달물질, 및 고리형 디뉴클레오타이드가 포함된다. 외인성 작용제의 비제한적 예에는 약물, 소분자, 및 고리형 디뉴클레오타이드가 포함된다. 작용제는 전체, 부분, 또는 역 작용제일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "길항제"는 수용체에 결합 시 생물학적 반응 자체의 유발보다는 작용제 매개 반응을 차단하거나 방해하는 분자를 나타낸다. 여러 길항제가 수용체 상의 구조적으로 정의된 결합 부위에서 내인성 리간드 또는 기질과 경쟁하여 이의 역가를 달성한다. 길항제의 비제한적 예에는 알파 차단제, 베타-차단제, 및 칼슘 채널 차단제가 포함된다. 길항제는 경쟁적, 비-경쟁적, 또는 무경쟁 길항제일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "자유 STING 작용제"는 세포외 소수포와 연합되지 않은, 그러나 그 외에는 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제와 동일한 STING 작용제를 의미한다. 특히 STING 작용제와 연합된 세포외 소수포와 비교되는 경우, 자유 STING 작용제는 세포외 소수포와 연합된 동일한 STING 작용제이다. 일부 구현예에서, 자유 STING 작용제가 그 유효성, 독성, 및/또는 임의의 다른 특징에 있어서 STING 작용제를 포함하는 세포외 소수포와 비교되는 경우, 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제에 비해 자유 STING 작용제의 양은 EV와 연합된 STING 작용제의 양과 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드"는 수용체에 결합하고 수용체를 조절하여 생물학적 반응을 생성하는 분자를 나타낸다. 조절은 수용체에 의해 매개되는 생물학적 반응의 활성화, 탈활성화, 차단, 또는 방해일 수 있다. 수용체는 내인성 또는 외인성 리간드에 의해 조절될 수 있다. 내인성 리간드의 비제한적 예에는 항체 및 펩타이드가 포함된다. 외인성 작용제의 비제한적 예에는 약물, 소분자, 및 고리형 디뉴클레오타이드가 포함된다. 리간드는 전체, 부분, 또는 역 리간드일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 천연이건 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생산되건 면역글로불린, 및 이의 단편을 포괄한다. 상기 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인과 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포괄한다. "항체"에는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 추가로 포함된다. 용어 항체의 사용은 완전 항체, 폴리클로날, 모노클로날 및 재조합 항체, 이의 단편을 포함하려는 것이며, 단일쇄 항체, 인간화 항체, 쥣과 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 모노클로날 항체, 항-개별특이형 항체, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 및 Fd 단편과 같은 항체 단편, 디아바디, 및 항체-관련 폴리펩타이드가 추가로 포함된다. 항체에는 이들이 요망되는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 이를 필요로 하는 대상체 상에서 요망되는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성하기 충분한 시약 또는 약학적 화합물의 양이다. 예방이 치료법으로 간주될 수 있으므로, 치료 유효량은 "예방 유효량"일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학 조성물"은 약학적으로-허용 가능한 담체 및 부형제와 같은, 하나 이상의 다른 화학적 성분과 혼합되거나 섞인, 또는 이 중에 현탁된, 예를 들어, EV와 같은, 본원에서 기재된 하나 이상의 화합물을 나타낸다. 약학 조성물의 하나의 목적은 대상체에 대한 EV 제조물의 투여를 촉진하는 것이다. 용어 "부형제" 또는 "담체"는 화합물의 투여를 추가 촉진하기 위해 약학 조성물에 첨가된 불활성 성분을 나타낸다. 용어 "약학적으로-허용 가능한 담체" 또는 "약학적으로-허용 가능한 부형제" 및 이의 문법적 변형은 미국 연방 정부의 규제 당국에 의해 승인받은 또는 인간을 포함하는 동물에서의 사용을 위해 미국 약전에 기재된 임의의 제제뿐만 아니라 대상체에 대한 조성물의 투여를 금지하는 정도까지 요망되지 않는 생리학적 효과의 생성을 유도하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐지하지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포괄한다. 약학 조성물의 제조에 유용하며 일반적으로 안전하고, 무독성이고, 요망되는 부형제 및 담체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "페이로드"는 EV와 접촉되는 표적(예를 들어, 표적 세포) 상에 작용하는 치료제를 나타낸다. EV 및/또는 생산체 세포 내로 도입될 수 있는 페이로드에는 뉴클레오타이드(예를 들어, 검출 가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 전사를 손상시키는 뉴클레오타이드), 핵산(예를 들어, 효소와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA 분자, 또는 miRNA, dsDNA, lncRNA, 및 siRNA와 같이 조절 기능을 갖는 RNA 분자), 아미노산(예를 들어, 검출 가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 번역을 손상시키는 아미노산), 폴리펩타이드(예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물, 및 소분자(예를 들어, 소분자 약물 및 독소)와 같은 치료제가 포함된다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이의 변이체는 대상체 내로의 EV와 같은 조성물, 또는 제제의 도입을 나타내며, 조성물 또는 제제의 동시적 및 순차적 도입이 포함된다. 대상체 내로의 조성물 또는 제제의 도입은 종양내, 경구, 폐, 비강내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장, 림프내, 척수내, 눈주위 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한다. 투여에는 자가-투여 및 타인에 의한 투여가 포함된다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 제제가 그 의도되는 기능을 수행할 수 있도록 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 대상체의 정맥 내로 조성물 또는 제제를 도입하여 투여된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료한다", "치료", 또는 "치료하는"은, 예를 들어, 질환 또는 상태의 중증도 감소; 질환 과정의 기간 감소; 질환 또는 상태와 연관된 하나 이상의 증상의 완화 또는 제거; 반드시 질환 또는 상태의 근치를 포함하지는 않는, 질환 또는 상태를 갖는 대상체에 대한 유익한 효과의 제공을 나타낸다. 용어에는 또한 질환 또는 상태 또는 그 증상의 예방 또는 방지가 포함된다. 하나의 구현예에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 항원에 대한 대상체에서의 면역 반응 유도를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "방지한다" 또는 "방지하는"은 특정 결과의 발생 또는 중증도 감소 또는 저하를 나타낸다. 일부 구현예에서, 결과의 방지는 예방적 치료를 통해 달성된다.
본원에서 사용되는 용어 "조절한다", "조절하는", "변형한다" 및/또는 "조절인자"는 일반적으로, 예를 들어, 질항제 또는 작용제로서 작용하는 것과 같이, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 거동의 증가 또는 감소에 의해, 예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로 촉진/자극/상향조절하거나 방해/억제/하향조절하여 변경하는 능력을 나타낸다. 일부 경우에서, 조절인자는 대조군 대비, 또는 일반적으로 예상될 평균 활성 수준 대비 또는 대조군 활성 수준 대비 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가시키고/시키거나 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "포유류 대상체"에는 비제한적으로 인간, 가정 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그 등)을 포함하는 모든 포유류가 포함된다.
용어 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 그에 대한 진단, 치료, 또는 치료법이 요망되는 포유류 대상체, 특히 인간을 나타낸다. 본원에서 기재된 방법은 인간 치료법 및 수의학적 적용 모두에 적용 가능하다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이며, 다른 구현예에서 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 없는"이란 EV를 포함하는 샘플이 질량/부피(m/v) 백분율 농도 기준으로 10% 미만의 거대분자를 포함함을 의미한다. 이러한 분율은 0.001% 미만, 0.01% 미만, 0.05% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3 % 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 또는 10%(m/v) 미만의 거대분자를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "거대분자"는 핵산, 외인성 단백질, 지질, 탄수화물, 대사물질, 또는 이의 조합을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "비실질적인", "감소된", 또는 "무시할만한"은 대상체에서의 기준선 염증 반응 대비 또는 자유 STING 작용제의 투여에 대한 대상체 염증 반응에 비해 STING 작용를 캡슐화하는 EV를 포함하는 샘플의 투여 후 대상체에서의 염증 반응의 존재, 수준, 또는 양을 나타낸다. 예를 들어, 무시할만한 또는 비실질적인 존재, 수준 또는 양의 전신 염증은 대상체에서의 기준선 염증 대비 또는 자유 STING 작용제의 투여에 대한 대상체 면역 반응에 비해 0.001% 미만, 0.01% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3 % 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 17% 미만, 20% 미만, 또는 25% 미만의 전신 염증일 수 있다. 전신 염증의 수준 또는 양은 기준선 대비 또는 자유 STING 작용제의 투여에 대한 염증 반응에 비해 0.1배 미만, 0.5배 미만, 0.5배 미만, 1배 미만, 1.5배 미만, 2배 미만일 수 있다.
본원에서 열거된 범위는 열거된 종결점을 포함하여, 범위 내의 모든 값에 대한 약기로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 구성된 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 나타내지 않는 한, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 이의 각각의 입체이성질체, 및 입체이성질체의 모든 조합을 의도한다.
II. STING 작용제를 포함하는 조성물(소수포)
선천성 면역계는 면역 반응을 유도하는 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 병원체 연합 분자 패턴(PAMP)을 인식한다. PRR은 단일 및 이중 가닥 RNA 및 DNA를 포함하는 다양한 병원체 분자를 인식한다. 레티노산-유도성 유전자-I(RIG-I)-유사 수용체(RLR) 및 일부 톨(toll)-유사 수용체(TLR)와 같은 PRRS는 RNA 리간드를 인식한다. DNA 리간드는 고리형 GMP-AMP 합성효소(cGAS), AIM2 및 다른 TLR에 의해 인식된다. TLR, RLR, 및 AIM2는 다른 신호 캐스케이드 어댑터 단백질과 직접 상호작용하여 전사 인자를 활성화하는 반면, cGAS는 인터페론 유전자 자극인자(STING) 수용체를 활성화하는 고리형 디뉴클레오타이드 분자인 cGAMP를 생산한다. STING 및 RLR은 둘 다 전사 인자 IRF3, 및 NF-κB의 활성화를 유도하는 어댑터 키나제 TBK1을 활성화하고, I형 IFN 및 전-염증성 사이토카인의 생산을 일으킨다.
고리형 디뉴클레오타이드(CDN)는 분자 c-디-GMP에서와 같이, 2개의 3', 5' 포스포디에스테르 결합을 특징으로 하는 박테리아 신호전달 분자로 최초 확인되었다. STING은 박테리아 CDN에 의해 활성화될 수 있는 반면, 포유류 세포에서의 선천성 면역 반응은 cGAS에 의해 생산되는 CDN 신호전달 분자 cGAMP에 의해서 또한 매개된다. cGAMP은 혼합된 2', 5' 및 3', 5' 포스포디에스테르 결합을 특징으로 한다. 박테리아 및 포유류 CDN은 모두 STING과 직접 상호작용하여 IFNα 및 IFN-β와 같은 I형 IFN의 생산을 일으키는 전-염증성 신호전달 캐스케이드를 유도한다.
II.A. STING 작용제
본 개시에서 사용되는 STING 작용제는 고리형 디뉴클레오타이드(CDN) 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 작용제일 수 있다. 비제한적으로 cGMP, 고리형 디-GMP(c-디-GMP), cAMP, 고리형 디-AMP(c-디-AMP), 고리형-GMP-AMP(cGAMP), 고리형 디-IMP(c-디-IMP), 고리형 AMP-IMP(cAIMP), 및 이의 임의의 유사체와 같은 고리형 퓨린 디뉴클레오타이드는 환자에서 면역 또는 염증 반응을 자극하거나 증강시키는 것으로 알려져 있다. CDN은 고리형 디뉴클레오타이드를 연결하는 2'2', 2'3', 2'5', 3'3', 또는 3'5' 결합, 또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있다.
고리형 퓨린 디뉴클레오타이드는 표준 유기 화학 기법을 통해 변형되어 퓨린 디뉴클레오타이드 유사체를 생산할 수 있다. 적합한 퓨린 디뉴클레오타이드에는 비제한적으로 아데닌, 구아닌, 이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 이소구아닌, 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 적절한 퓨린 디뉴클레오타이드가 포함된다. 고리형 디뉴클레오타이드는 변형된 유사체일 수 있다. 비제한적으로 포스포로티오에이트, 바이포스포로티오에이트, 플루오리네이트, 및 디플루오리네이트 변형을 포함하는 당분야에 알려진 임의의 적합한 변형이 사용될 수 있다.
5,6-디메틸잔텐온-4-아세트산(DMXAA), 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 비-고리형 디뉴클레오타이드 작용제와 같은 비고리형 디뉴클레오타이드 작용제가 또한 사용될 수 있다.
임의의 STING 작용제가 사용될 수 있음이 고려된다. STING 작용제 중에는 DMXAA, STING 작용제-1, ML RR-S2 CDA, ML RR-S2c-디-GMP, ML-RR-S2 cGAMP, 2'3'-c-디-AM(PS)2, 2'3'-cGAMP, 2'3'-cGAMPdFHS, 3'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMPdFSH, cAIMP, cAIM(PS)2, 3'3'-cAIMP, 3'3'-cAIMPdFSH, 2'2'-cGAMP, 2'3'-cGAM(PS)2, 3'3'-cGAMP, c-디-AMP, 2'3'-c-디-AMP, 2'3'-c-디-AM(PS)2, c-디-GMP, 2'3'-c-디-GMP, c-디-IMP, c-디-UMP 또는 이의 임의의 조합이 있다. 바람직한 구현예에서, STING 작용제는 대안적으로 3-3 cAIMPdFSH로 명명되는, 3'3'-cAIMPdFSH이다. 당분야에 알려진 추가 STING 작용제가 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
[화학식 1]
Figure pct00010
,
[화학식 2]
Figure pct00011
,
[화학식 3]
Figure pct00012
식 중,
X1은 H, OH, 또는 F이며;
X2는 H, OH, 또는 F이고;
Z는 OH, OR1, SH 또는 SR1이고, 여기서:
i) R1은 Na 또는 NH4이거나, 또는
ii) R1은 피발로일옥시메틸과 같은 생체내 OH 또는 SH를 제공하는 효소-불안정기이고;
Bi 및 B2는 하기로부터 선택되고:
Figure pct00013
단,
- 화학식 (I)에서: X1 및 X2는 OH가 아니며,
- 화학식 (II)에서: X1 및 X2가 OH인 경우, B1은 아데닌이 아니며, B2는 구아닌이 아니고,
- 화학식 (III)에서: X1 및 X2가 OH인 경우, B1은 아데닌이 아니며, B2는 구아닌이 아니고, Z는 OH가 아니다. 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함되는 WO 2016/096174를 참고한다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00014
Figure pct00015
.
WO 2016/096174A1을 참고한다.
다른 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물, 또는 이의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00016
,
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00021
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2014/093936에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00022
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2014/189805에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00023
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2015/077354에 정의된다. 또한 Cell reports 11, 1018-1030 (2015)를 참고한다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 이의 전문이 본원에서 참조로 포함되는 WO 2013/185052 및 Sci. Transl. Med. 283,283ra52 (2015)에 기재된 c-디-AMP, c-디-GMP, c-디-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, 및 c-GMP-IMP를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00024
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2014/189806에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00025
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2015/185565에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00026
또는
Figure pct00027
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2014/179760에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00028
Figure pct00029
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2014/179335에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2015/017652에 기재된, 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00030
.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2016/096577에 기재된, 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00031
.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00032
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2016/120305에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00033
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2016/145102에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00034
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2017/027646에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00035
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2017/075477에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00036
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2017/027645에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00037
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2018/100558에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00038
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2017/175147에 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 하기 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00039
또는
Figure pct00040
식 중, 각각의 기호는 그 내용의 전문이 본원에서 참조로 포함하는 WO 2017/175156에 정의된다.
일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL606, CL611, CL602, CL655, CL604, CL609, CL614, CL656, CL647, CL626, CL629, CL603, CL632, CL633, CL659, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL606 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL611 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL602 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL655 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL604 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL609 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL614 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL656 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL647 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL626 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL629 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL603 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL632 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL633 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 본 개시에 유용한 STING 작용제는 CL659 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다.
일부 양태에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제 및/또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제를 포함한다. 일부 양태에서, 몇몇 고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제가 본원에서 개시되는 EV, 예를 들어, 엑소좀 상에 존재하는 경우, 이러한 STING 작용제는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 일부 양태에서, 몇몇 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제가 존재하는 경우, 이러한 STING 작용제는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 일부 양태에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀 조성물은 2개 이상의 EV, 예를 들어, 엑소좀 집단을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 EV, 예를 들어, 엑소좀 집단은 상이한 STING 작용제 또는 이의 조합을 포함한다.
STING 작용제는 또한 세포외 소수포 또는 EV에서(예를 들어, 내강에 결합되지 않고) 작용제의 캡슐화를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, STING 작용제는 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y에 연결된다. 특정 구현예에서, 변형은 EV, 예를 들어, (예를 들어, 본원에서 개시된 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X에 연결된) 엑소좀의 외부 표면 상에서 STING 작용제의 더 우수한 발현을 허용한다. 상기 변형에는 작용제를 화학물질 또는 효소로 처리하여, 또는 STING 작용제의 극성 또는 전하를 물리적으로 또는 화학적으로 변경하여 지질 결합 태그의 부가가 포함될 수 있다. STING 작용제는 단일 처리에 의해, 또는 처리의 조합에 의해, 예로 지질 결합 태그만 부가하여, 또는 지질 결합 태그를 부가하고 극성을 변경하여, 변형될 수 있다. 이전의 예는 비제한적 예시적 경우임을 의미한다. 변형의 임의의 조합이 실시될 수 있음이 고려된다. 변형은 변형되지 않은 작용제의 캡슐화에 비해 2배 내지 10,000배, 10배 내지 1,000배, 또는 100배 내지 500배만큼 EV에서 작용제의 캡슐화를 증가시킬 수 있다. 변형은 변형되지 않은 작용제의 캡슐화에 비해 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 또는 10,000배만큼 EV에서 작용제의 캡슐화를 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, STING 작용제는 변형되어 EV, 예를 들어, 엑소좀(예를 들어, 본원에서 개시된 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X에 연결됨)의 외부 표면 상에서 작용제의 더 우수한 발현을 허용할 수 있다. 상술된 임의의 변형이 사용될 수 있다. 변형은 변형되지 않은 작용제의 캡슐화에 비해, 약 2배 내지 10,000배, 약 10배 내지 1,000배, 또는 약 100배 내지 500배만큼 EV, 예를 들어, 엑소좀에서 작용제의 캡슐화를 증가시킬 수 있다. 변형은 변형되지 않은 작용제의 발현에 비해 적어도 약 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 또는 10,000배만큼 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면 상에서 작용제의 발현을 증가시킬 수 있다.
EV와 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01 μM 내지 1000 μM일 수 있다. 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01-0.05 μM, 0.05-0.1 μM, 0.1-0.5 μM, 0.5-1 μM, 1-5 μM, 5-10 μM, 10-15 μM, 15-20 μM, 20-25 μM, 25-30 μM, 30-35 μM, 35-40 μM, 45-50 μM, 55-60 μM, 65-70 μM, 70-75 μM, 75-80 μM, 80-85 μM, 85-90 μM, 90-95 μM, 95-100 μM, 100-150 μM, 150-200 μM, 200-250 μM, 250-300 μM, 300-350 μM, 250-400 μM, 400-450 μM, 450-500 μM, 500-550 μM, 550-600 μM, 600-650 μM, 650-700 μM, 700-750 μM, 750-800 μM, 800-850 μM, 805-900 μM, 900-950 μM, 또는 950-1000 μM일 수 있다. 연합된 STING 작용제의 농도는 약 0.01 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM, 80 μM, 85 μM, 90 μM, 95 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM, 400 μM, 450 μM, 500 μM, 550 μM, 600 μM, 650 μM, 700 μM, 750 μM, 800 μM, 850 μM, 900 μM, 950 μM, 또는 1000 μM 이상일 수 있다.
II.B. 스캐폴드-X-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀
일부 구현예에서, 본 개시의 EV는 그 조성이 변형된 막을 포함한다. 예를 들어, 이의 막 조성은 막의 단백질, 지질, 또는 글리칸 함량을 변화시켜 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 표면-조작 EV는 PEG-유도 융합 및/또는 초음파 융합과 같은 화학적 및/또는 물리적 방법에 의해 생성된다. 다른 구현예에서, 표면-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀은 유전 조작에 의해 생성된다. 유전적으로 변형된 생산체 세포 또는 유전적으로 변형된 세포의 자손으로부터 생산된 EV는 변형된 막 조성을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 표면-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀은 더 큰 또는 더 적은 밀도로(예를 들어, 더 많은 수로) 스캐폴드 모이어티(예를 들어, 엑소좀 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 X)를 갖거나 스캐폴드 모이어티의 변이체 또는 단편을 포함한다.
예를 들어, 표면-조작 EV(예를 들어, 스캐폴드 X-조작 EV)는 스캐폴드 모이어티(예를 들어, 엑소좀 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 X)를 인코딩하는 외인성 서열 또는 이의 변이체 또는 단편으로 형질전환된 세포(예를 들어, HEK293 세포)로부터 생산될 수 있다. 외인성 서열로부터 발현된 스캐폴드 모이어티를 포함하는 EV에는 변형된 막 조성이 포함될 수 있다.
스캐폴드 모이어티의 다양한 변형 또는 단편이 본 개시의 구현예를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 제제에 대해 증강된 친화도를 갖도록 변형된 스캐폴드 모이어티는 결합 제제를 사용하여 정제될 수 있는 표면-조작 EV를 생성하기 위해 사용될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀, 및/또는 막으로 보다 효과적으로 표적화되도록 변형된 스캐폴드 모이어티가 사용될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀, 막으로의 특이적이고 효과적인 표적화를 위해 요구되는 최소 단편을 포함하도록 변형된 스캐폴드 모이어티가 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 STING 작용제는 융합 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 X에 대한 STING 작용제의 융합 단백질로서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면 상에서 발현된다. 예를 들어, 융합 단백질는 스캐폴드 모이어티(예를 들어, 스캐폴드 X)에 연결된 본원에서 개시된 STING 작용제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 스캐폴드 X는 PTGFRN 단백질, BSG 단백질, IGSF2 단백질, IGSF3 단백질, IGSF8 단백질, ITGB1 단백질, ITGA4 단백질, SLC3A2 단백질, ATP 트랜스포터 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 표면-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀(예를 들어, 스캐폴드 X-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀)은 당분야에 알려진 EV, 예를 들어, 엑소좀에 비해 더 우수한 특징을 실증한다. 예를 들어, 표면(예를 들어, 스캐폴드 X)-조작은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀, 또는 통상적 엑소좀 단백질을 사용하여 생산된 EV, 예를 들어, 엑소좀에 비해 이의 표면 상에 보다 고도 농축된 변형된 단백질을 함유한다. 또한, 본 발명의 표면-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀(예를 들어, 스캐폴드 X-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀)은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀, 또는 통상적인 엑소좀 단백질을 사용하여 생산된 EV, 예를 들어, 엑소좀에 비해 더 크거나, 더 특이적이거나, 더 제어되는 생물학적 활성을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 STING 작용제 및 스캐폴드 X를 함유하며, 여기서 STING 작용제는 스캐폴드 X에 연결된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 STING 작용제 및 스캐폴드 X를 포함하며, 여기서 STING 작용제는 스캐폴드 X에 연결되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 X는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성적 조절제(PTGFRN 폴리펩타이드)를 포함한다. PTGFRN 단백질은 또한 CD9 파트너 1(CD9P-1), Glu-Trp-Ile EWI 모티프-함유 단백질 F(EWI-F), 프로스타글란딘 F2-알파 수용체 조절 단백질, 프로스타글란딘 F2-알파 수용체-연관 단백질, 또는 CD315로 언급될 수 있다. 인간 PTGFRN 단백질의 전장 아미노산 서열(유니프롯 접근 번호 Q9P2B2)을 서열 번호 1로 표 1에 나타낸다. PTGFRN 폴리펩타이드는 신호 펩타이드(서열 번호 1의 아미노산 1 내지 25), 세포외 도메인(서열 번호 1의 아미노산 26 내지 832), 막통과 도메인(서열 번호 1의 아미노산 833 내지 853), 및 세포질 도메인(서열 번호 1의 아미노산 854 내지 879)을 함유한다. 성숙 PTGFRN 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 1, 즉, 서열 번호 1의 아미노산 26 내지 879로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 PTGFRN 폴리펩타이드 단편은 PTGFRN 폴리펩타이드의 막통과 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시에 유용한 PTGFRN 폴리펩타이드 단편은 PTGFRN 폴리펩타이드의 막통과 도메인 및 (i) 막통과 도메인의 N 말단에 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150개 아미노산, (ii) 막통과 도메인의 C 말단에 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 또는 적어도 25개 아미노산, 또는 (i) 및 (ii) 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, PTGFRN 폴리펩타이드의 단편에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 1의 아미노산 26 내지 879와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 33과 적어도 약 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 1개 아미노산 돌연변이, 2개 아미노산 돌연변이, 3개 아미노산 돌연변이, 4개 아미노산 돌연변이, 5개 아미노산 돌연변이, 6개 아미노산 돌연변이, 또는 7개 아미노산 돌연변이를 제외하고, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 33의 아미노산 서열 및 서열 번호 33의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산을 포함한다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 1개 아미노산 돌연변이, 2개 아미노산 돌연변이, 3개 아미노산 돌연변이, 4개 아미노산 돌연변이, 5개 아미노산 돌연변이, 6개 아미노산 돌연변이, 또는 7개 아미노산 돌연변이를 제외하고, 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7의 아미노산 서열 및 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산을 포함한다.
표 1.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 X는 서열 번호 9로 나타낸, Basigin(BSG 단백질)을 포함한다. BSG 단백질은 5F7, 콜라게나제 자극 인자, 세포외 기질 메탈로프로티나제 유도제(EMMPRIN), 백혈구 활성화 항원 M6, OK 혈액 그룹 항원, 종양 세포-유래 콜라게나제 자극 인자(TCSF), 또는 CD147로도 알려져 있다. 인간 BSG 단백질에 대한 유니프롯(Uniprot) 번호는 P35613이다. BSG 단백질의 신호 펩타이드는 서열 번호 9의 아미노산 1 내지 21이다. 서열 번호 9의 아미노산 138-323은 세포외 도메인이며, 아미노산 324 내지 344는 막통과 도메인이고, 서열 번호 9의 아미노산 345 내지 385는 세포질 도메인이다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 9의 아미노산 22 내지 385와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Basigin 폴리펩타이드의 단편에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어, 서열 번호 9의 아미노산 221 내지 315가 없다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 10, 11, 또는 12와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 1개 아미노산 돌연변이, 2개 아미노산 돌연변이, 3개 아미노산 돌연변이, 4개 아미노산 돌연변이, 5개 아미노산 돌연변이, 6개 아미노산 돌연변이, 또는 7개 아미노산 돌연변이를 제외하고, 서열 번호 10, 11, 또는 12의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 10, 11, 또는 12의 아미노산 서열 및 서열 번호 10, 11, 또는 12의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 X는 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 8(IgSF8 또는 IGSF8 단백질)을 포함하며, 이는 CD81 파트너 3, Glu-Trp-Ile EWI 모티프-함유 단백질 2(EWI-2), 각질세포-연관 막통과 단백질 4(KCT-4), LIR-D1, 프로스타글란딘 조절-유사 단백질(PGRL) 또는 CD316으로도 알려져 있다. 전장 인간 IGSF8 단백질은 유니프롯에서 접근 번호 Q969P0이며 본원에서 서열 번호 14로 나타낸다. 인간 IGSF8 단백질은 신호 펩타이드(서열 번호 14의 아미노산 1 내지 27), 세포외 도메인(서열 번호 14의 아미노산 28 내지 579), 막통과 도메인(서열 번호 14의 아미노산 580 내지 600), 및 세포질 도메인(서열 번호 14의 아미노산 601 내지 613)을 갖는다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 14의 아미노산 28 내지 613과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IGSF8 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 15, 16, 17, 또는 18과 적어도 약 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 1개 아미노산 돌연변이, 2개 아미노산 돌연변이, 3개 아미노산 돌연변이, 4개 아미노산 돌연변이, 5개 아미노산 돌연변이, 6개 아미노산 돌연변이, 또는 7개 아미노산 돌연변이를 제외하고, 서열 번호 15, 16, 17, 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 15, 16, 17, 또는 18의 아미노산 서열 및 서열 번호 15, 16, 17, 또는 18의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 STING 작용제와 함께 사용될 수 있는 스캐폴드 X는 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 3(IgSF3 또는 IGSF3 단백질)을 포함하며, 이는 Glu-Trp-Ile EWI 모티프-함유 단백질 3(EWI-3)으로도 알려져 있고, 서열 번호 20의 아미노산 서열로 나타낸다. 인간 IGSF3 단백질은 신호 펩타이드(서열 번호 20의 아미노산 1 내지 19), 세포외 도메인(서열 번호 20의 아미노산 20 내지 1124), 막통과 도메인(서열 번호 20의 아미노산 1125 내지 1145), 및 세포질 도메인(서열 번호 20의 아미노산 1146 내지 1194)을 갖는다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 20의 아미노산 28 내지 613과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IGSF3 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 X는 인테그린 베타-1(ITGB1 단백질)을 포함하며, 이는 파이브로넥틴 수용체 서브유닛 베타, 당단백질 IIa(GPIIA), VLA-4 서브유닛 베타, 또는 CD29로도 알려져 있고, 서열 번호 21의 아미노산 서열로 나타낸다. 인간 ITGB1 단백질은 신호 펩타이드(서열 번호 21의 아미노산 1 내지 20), 세포외 도메인(서열 번호 21의 아미노산 21 내지 728), 막통과 도메인(서열 번호 21의 아미노산 729 내지 751), 및 세포질 도메인(서열 번호 21의 아미노산 752 내지 798)을 갖는다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 21의 아미노산 21 내지 798과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITGB1 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드(서열 번호 22의 아미노산 1 내지 33)가 없는 서열 번호 22와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ITGA4 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ITGA4 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 23과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, SLC3A2 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, SLC3A2 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 24와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP1A1 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP1A1 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 25와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP1A2 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP1A2 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 26과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP1A3 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP1A3 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 27과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP1A4 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP1A4 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 28과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP1A5 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP1A5 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 29와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP2B1 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP2B1 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 30과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP2B2 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP2B2 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 31과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP2B3 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP2B3 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 32와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, ATP2B4 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, ATP2B4 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 34와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, IGSF2 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, IGSF2 단백질에는 IgV와 같은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면으로 STING 작용제를 연결하기 위해 사용될 수 있는 다른 스캐폴드 X 단백의 비제한적 예는 그 전문이 참조로 포함되는, 2019년 2월 5일에 허여된 미국 특허 번호 10,195,290 B1에서 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 X 단백질에는 원상태 단백질의 N-말단으로부터 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X에는 원상태 단백질의 C-말단으로부터 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X에는 원상태 단백질의 N-말단 및 C-말단 모두로부터 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X에는 원상태 단백질의 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 스캐폴드 X는 또한 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 상에 및/또는 외부 표면 상에 동시에 STING 작용제를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, PTGFRN 폴리펩타이드는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에 부가하여 내강 내부에 STING 작용제를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 X는 EV, 예를 들어, 엑소좀(예를 들어, 페이로드)으로 STING 작용제 및 추가 치료제를 연결하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 페이로드). 따라서, 특정 구현예에서, 본원에서 개시된 스캐폴드 X는 이중 목적을 위해 사용될 수 있다.
스캐폴드-Y-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀
일부 구현예에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀과 상이한 내부 공간(즉, 내강)을 포함한다. 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 측 조성이 자연-발생 EV, 예를 들어, 엑소좀의 조성과 상이한 단백질, 지질, 또는 글리칸 함량을 갖도록 변화될 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 스캐폴드 모이어티(예를 들어, 엑소좀 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 Y) 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 측 조성 또는 함량을 변화시키는 스캐폴드 모이어티의 변형 또는 단편을 인코딩하는 외인성 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 측에서 발현될 수 있는 엑소좀 단백질의 다양한 변형 또는 단편은 본 개시의 구현예를 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 STING 작용제는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에 있다(즉, 캡슐화된다). 일부 구현예에서, STING 작용제는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면에 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분자(예를 들어, 항원 또는 아주반트)가 EV, 예를 들어, 엑소좀의 "내강 내에"로 기재되는 경우, 이는 분자가 EV, 예를 들어, 엑소좀 내에 위치하(예를 들어, 연합되)지만, EV의 내강 표면 상의 임의의 분자에 연결되지 않음을 의미한다. 다른 구현예에서, STING 작용제는 융합 분자, 예를 들어, STING 작용제의 스캐폴드 모이어티(예를 들어, 스캐폴드 Y)로의 융합 분자로서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 상에서 발현된다. 특정 구현예에서, 스캐폴드 Y는 MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 STING 작용제 및 스캐폴드 Y를 함유하며, 여기서 STING 작용제는 스캐폴드 Y에 연결된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 STING 작용제 및 스캐폴드 Y를 포함하며, 여기서 STING 작용제는 스캐폴드 Y에 연결되지 않는다.
일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 측을 변화시킬 수 있는 스캐폴드 모이어티(예를 들어, 스캐폴드 Y)에는 비제한적으로 MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이의 임의의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 스캐폴드 Y는 뇌 산 가용성 단백질 1(BASP1 단백질)을 포함한다. BASP1 단백질은 22 kDa 뉴런 조직-농축 산성 단백질 또는 뉴런 축삭 막 단백질 NAP-22로도 알려져 있다. 전장 인간 BASP1 단백질 서열(이성질체 1)을 표 2에 나타낸다. 대안적 스플라이싱에 의해 생산된 이성질체는 서열 번호 XX로부터의 아미노산 88 내지 141이 소실되어 있다(이성질체 1).
표 2.
Figure pct00044
성숙 BASP1 단백질 서열은 서열 번호 49로부터 첫 번째 Met이 소실되어 있고 이에 따라 서열 번호 49의 아미노산 2 내지 227을 함유한다.
다른 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 Y는 서열 번호 49의 아미노산 2 내지 227과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 스캐폴드 X는 서열 번호 50-155와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 Y는 1개 아미노산 돌연변이, 2개 아미노산 돌연변이, 3개 아미노산 돌연변이, 4개 아미노산 돌연변이, 5개 아미노산 돌연변이, 6개 아미노산 돌연변이, 또는 7개 아미노산 돌연변이를 제외하고, 서열 번호 50-155의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 Y는 서열 번호 50-155의 아미노산 서열 및 서열 번호 50-155의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 Y는 MARCKS 단백질이며, 이는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 47과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, MARCKS 단백질에는 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
일부 구현예에서, 스캐폴드 Y는 MARCKSL1 단백질을 포함하며, 이는 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 48과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, MARCKS 단백질에는 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 스캐폴드 Y는 MGXKLSKKK를 갖고, 여기서 X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산인 펩타이드를 포함한다(서열 번호 163). 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 서열 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)를 갖는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 괄호 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, ξ는 (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, Arg)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, (+)는 (Lys, Arg, His)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 위치 5는 (+)가 아니고 위치 6은 (+)도 아니고 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 추가 구현예에서, 본원에서 기재된 EV, 예를 들어, 엑소좀(예를 들어, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀)은 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 괄호 위치는 아미노산을 나타내고, π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고, (+)는 (Lys, Arg, His)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이고; 여기서 위치 5는 (+)가 아니고 위치 6은 (+)도 아니고 (Asp 또는 Glu)도 아니다.
일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 상에서 STING 작용제를 발현하기 위해 사용될 수 있는 스캐폴드 Y는 서열 번호 7-155 중 어느 하나와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 기재된 스캐폴드 Y-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀은 SEQ ID NO: 47-155에 나타낸 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다.
II.C. 링커
본 개시의 EV는 EV에 또는 EV의 외부 표면 상의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X에 STING 작용제를 연결하는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, STING 작용제는 EV에 직접 또는 EV 상의 스캐폴드 모이어티에서 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 당분야에 알려진 임의의 화학적 모이어티일 수 있다.
일부 구현예에서, 용어 "링커"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열) 또는 비-폴리펩타이드를 나타낸다. 일부 양태에서, 2개 이상의 링커가 일렬로 연결될 수 있다. 일반적으로, 링커는 가요성을 제공하거나 입체 장애를 방지한다/완화한다. 링커는 전형적으로 절단되지 않지만; 특정 양태에서, 이러한 절단이 요망될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서 링커는 하나 이상의 프로테아제로 절단 가능한 부위를 포함할 수 있고, 이는 링커의 서열 또는 링커 서열의 어느 한 말단에서 링커에 인접한 서열 내에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개, 적어도 약 50개, 적어도 약 55개, 적어도 약 60개, 적어도 약 65개, 적어도 약 70개, 적어도 약 75개, 적어도 약 80개, 적어도 약 85개, 적어도 약 90개, 적어도 약 95개, 또는 적어도 약 100개 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 합성, 즉, 비-자연 발생이다. 하나의 양태에서, 펩타이드 링커에는 아미노산의 제1 선형 서열을 자연적으로 연결되거나 자연에서 유전적으로 융합되지 않는 아미노산의 제2 선형 서열에 연결하거나 유전적으로 융합시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(또는 폴리펩타이드)(예를 들어, 천연 또는 비-자연 발생 펩타이드)가 포함된다. 예를 들어, 하나의 양태에서 펩타이드 링커는 자연 발생 폴리펩타이드의 변형된 형태인 비-자연 발생 폴리펩타이드(예를 들어, 부가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함함)를 포함할 수 있다.
링커는 절단에 취약하여("절단 가능한 링커") 이에 따라 STING 작용제 또는 다른 페이로드의 방출을 촉진할 수 있다. 일부 양태에서, 링커는 "환원-민감성 링커"이다. 일부 양태에서, 환원-민감성 링커는 디설파이드 결합을 함유한다. 일부 양태에서, 링커는 "산 불안정 링커"이다. 일부 양태에서, 산 불안정 링커는 하이드라존을 함유한다. 적합한 산 불안정 링커에는 또한, 예를 들어, 시스-아코니틴산 링커, 하이드라지드 링커, 티오카바모일 링커, 또는 이의 임의의 조합이 포함된다. 일부 양태에서, 링커는 절단-불가능 링커를 포함한다.
II.D. 생산체 세포 및 변형
EV, 예를 들어, 엑소좀은 시험관내 또는 대상체의 체액에서 성장시킨 세포로부터 생산될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀이 시험관내 세포 배양으로부터 생산되는 경우, 다양한 생산체 세포, 예를 들어, HEK293 세포가 사용될 수 있다. 본원에서 기재된 내강-조작 EV, 예를 들어, 엑소좀의 생산을 위해 사용될 수 있는 추가 세포 유형에는 비제한적으로 중간엽 줄기 세포, T-세포, B-세포, 수지상 세포, 대식구, 및 암 세포주가 포함된다. 추가 예에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), BJ 인간 포피 섬유아세포, fHDF 섬유아세포, AGE.HN® 뉴런 전구체 세포, CAP® 양막세포, 지방 중간엽 줄기 세포, 및 RPTEC/TERT1 세포가 포함된다. 특정 구현예에서, 생산체 세포는 수지상 세포, 대식구, B 세포, 비만 세포, 호중구, 쿠퍼-브로윅즈 세포, 또는 임의의 이들 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 임의의 조합이 아니다.
일부 구현예에는 또한 소수포 표면 상에서 외인성 단백질을 발현하는 변형된 EV를 생산하기 위해 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소좀의 유전적 변형이 포함될 수 있다. 외인성 서열은 EV, 예를 들어, 엑소좀 단백질 또는 EV 단백질의 변형 또는 단편을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀 단백질을 인코딩하는 서열의 추가 카피가 더 고밀도 EV 단백질을 갖는 표면-조작 EV를 생산하기 위해 도입될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀 단백질의 변형 또는 단편을 인코딩하는 외인성 서열이 EV 단백질의 변형 또는 단편을 함유하는 변형된 EV를 생산하기 위해 도입될 수 있다. 친화도 태그를 인코딩하는 외인성 서열이 EV 단백질에 부착된 친화도 태그를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀을 생산하기 위해 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 외인성 서열은 스캐폴드 X(예를 들어, PTGFRN 단백질, BSG 단백질, IGSF2 단백질, IGSF3 단백질, IGSF8 단백질, ITGB1 단백질, ITGA4 단백질, SLC3A2 단백질, ATP 트랜스포터 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 인코딩한다. 일부 구현예에서 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 스캐폴드 X(예를 들어, PTGFRN 단백질, BSG 단백질, IGSF2 단백질, IGSF3 단백질, IGSF8 단백질, ITGB1 단백질, ITGA4 단백질, SLC3A2 단백질, ATP 트랜스포터 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 과발현한다. 다른 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 스캐폴드 X(예를 들어, PTGFRN 단백질, BSG 단백질, IGSF2 단백질, IGSF3 단백질, IGSF8 단백질, ITGB1 단백질, ITGA4 단백질, SLC3A2 단백질, ATP 트랜스포터 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 과발현하는 세포에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 외인성 서열은 스캐폴드 Y(예를 들어, MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 스캐폴드 Y(예를 들어, MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 과발현한다. 다른 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 스캐폴드 Y(예를 들어, MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 과발현하는 세포에 의해 생산된다.
외인성 서열은 전달감염, 형질전환, 형질도입, 전기천공, 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 적절한 유전자 전달 방법 또는 이의 조합을 통해 생산체 세포 또는 세포주에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현될 수 있다. 외인성 서열은 생산체 세포 게놈 내로 통합되거나, 염색체외 유지될 수 있다. 외인성 서열은 플라스미드로 형질전환될 수 있다. 외인성 서열은 표적화된 부위에서 또는 무작위 부위에서, 생산체 세포의 게놈 서열 내로 안정적으로 통합될 수 있다. 외인성 서열은 EV, 예를 들어, 엑소좀 단백질을 인코딩하는 내인성 서열의 상류(5'-말단) 또는 하류(3'-말단) 내에 위치하는, 생산체 세포의 게놈 서열 내로 삽입될 수 있다. 당분야에 알려진 다양한 방법이 생산체 세포 내로 외인성 서열의 도입을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 유전자 편집 방법(예를 들어, 상동성 재조합, 트랜스포존-매개 시스템, loxP-Cre 시스템, CRISPR/Cas9 CRISPR/Cfp1, CRISPR/C2c1, C2c2, 또는 C2c3, CRISPR/CasY 또는 CasX, TAL-효과기 뉴클레아제 또는 TALEN, 또는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템을 사용하는 방법)을 사용하여 변형된 세포는 다양한 구현예의 범위 내이다.
일부 구현예에서, 생산체 세포는 추가적인 외인성 서열을 포함하도록 추가 변형된다. 예를 들어, 추가적인 외인성 서열이 내인성 유전자 발현을 조절하거나, 면역 반응 또는 면역 신호전달을 조절하거나, 페이로드로서 특정 폴리펩타이드 또는 추가적인 표면 발현된 리간드를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 생산하기 위해 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산체 세포는 EV, 예를 들어, 엑소좀에 추가적인 기능성, 예를 들어, 특이적 표적화능, 전달 기능, 효소적 기능, 증가되거나 감소된 생체내 반감기 등을 부여하는 추가적인 외인성 서열을 포함하도록 추가 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산체 세포는 2개의 외인성 서열로서, 엑소좀 단백질 또는 엑소좀 단백질의 변형 또는 단편을 인코딩하는 하나, 및 엑소좀에 추가적인 기능성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 다른 하나를 포함하도록 변형된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 비제한적으로 리간드, 사이토카인, 또는 항체, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 추가적인 외인성 단백질을 인코딩하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 이들 추가적인 외인성 단백질은 STING 작용제와의 조합으로 추가적인 면역 자극 신호의 활성화 또는 조절을 가능하게 할 수 있다. 사용을 위해 고려되는 예시적인 추가적 외인성 단백질에는 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는, 미국 특허 출원 62/611,140에 상세히 기재되는 단백질, 리간드, 및 다른 분자가 포함된다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 CD40L, OX40L, 또는 CD27L을 포함하는 리간드로 추가 변형된다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 IL-7, IL-12, 또는 IL-15를 포함하는 사이토카인으로 추가 변형된다. 본원에서 기재된 임의의 하나 이상의 엑소좀 단백질은 플라스미드, 게놈 내로 삽입된 외인성 서열 또는 합성 메신저 RNA(mRNA)와 같은 다른 외인성 핵산으로부터 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 EV 흡수를 유도하거나, STING 작용제의 조합 효과를 증강시키기 위한 세포 경로를 활성화하거나, 차단하기 위해, EV, 예를 들어, 엑소좀, 표면 상에 길항성 항체 또는 작용성 항체 또는 이의 단편을 나타내도록 추가 변형된다. 일부 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 DEC205, CLEC9A, CLEC6, DCIR, DC-SIGN, LOX-1, 또는 Langerin에 대한 항체이다. 생산체 세포는 길항성 항체 또는 작용성 항체를 인코딩하는 추가적인 외인성 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 길항성 항체 또는 작용성 항체는 당분야에 알려진 임의의 적절한 연결 화학을 통해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 공유 연결되거나 접합될 수 있다. 적절한 연결 화학의 비제한적 예에는 아민-반응기, 카복실-반응기, 설프하이드릴-반응기, 알데하이드-반응기, 광반응기, ClickIT 화학, 바이오틴-스트렙타비딘 또는 다른 아비딘 접합, 또는 이의 임의의 조합이 포함된다.
II.D.1. 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 글리칸 변형
일부 구현예에서 EV, 예를 들어, 엑소좀은 효소적 또는 화학적 처리를 통해 변형된 글리칸이다. 하나의 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 글리칸 변형된 생산체 세포로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 효소적 또는 화학적 변형을 포함한다. 다양한 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 키푸넨신으로의 처리 또는 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자의 녹아웃이다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMAS)의 녹아웃을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 만노스 생합성 유전자 만노시다제 알파 클래스 1A 구성원 1(MAN1A1)의 녹아웃을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포의 글리칸 변형은 만노스 생합성 유전자 만노시다제 알파 클래스 2A 구성원 1(MAN2A1)의 녹아웃을 포함한다.
글리칸 변형은 생산체 세포 또는 단리된 또는 정제된 EV, 예를 들어, 엑소좀의 탈글리코실화 또는 탈시알릴화일 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀은 STING 작용제의 캡슐화 전 또는 STING 작용제의 캡슐화 후 변형된 글리칸일 수 있다. 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀은 변형되지 않은 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀 대비 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 정도 또는 초과 변형된(예로 탈글리코실화된 또는 탈시알릴화된) 글리칸일 수 있다. 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀은 변형되지 않은 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀 대비 95-100%, 90-95%, 85-95%, 80-85%, 75-80%, 70-75%, 65-70%, 60-65%, 55-60%, 50-55%, 45-50%, 40-45%, 35-40%, 30-35%, 25-30%, 20-25%, 15-20%, 10-15%, 또는 5-10% 변형된 글리칸일 수 있다.
생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀은 화학적, 효소적, 또는 유전적 편집 기법을 통해 변형된 글리칸일 수 있다. 글리칸 변형에는 글리칸 변형된 생산체 세포로부터 유래되는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 생산하는, 생산체 세포에서 글리코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 효소를 변경하거나 억제하는 화학물질, 소분자, 또는 효소로의 생산체 세포 처리가 포함될 수 있다. 글리칸 변형에는 또한 EV 표면 상의 글리칸을 변경하는 화학물질 또는 효소, 예컨대 소분자 억제제 또는 시알리다제 또는 뉴라미니다제 효소와 같은 글리코시드 가수분해효소뿐만 아니라 임의의 다른 적절한 화학물질 또는 효소 글리칸 변형 처리로의 EV, 예를 들어, 엑소좀 처리가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀은 키푸넨신으로의 처리를 통해 변형된 글리칸이다. 키푸넨신은 만노시다제 I이 전구체 당단백질로부터 만노스 잔기를 제거하는 것을 억제하는 만노시다제 I 억제제이다. 키푸넨신으로의 세포 처리는 말단 만노스 잔기를 갖는 당단백질을 생성한다. 사용될 수 있는 또 다른 만노시다제 I 억제제는 1-데옥시만노지리마이신이다. 스와인소닌과 같은 알파-만노시다제 I 또는 II 또는 베타-만노시다제 효소를 억제하는 다른 소분자가 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에는 또한 생산체 세포 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 시알리다제, 뉴라미니다제, 또는 만노시다제와 같은 글리코시드 가수분해효소로의 처리가 포함될 수 있다. 비제한적으로 엑소-α-시알리다제, 엔도-α-시알리다제, N-아세틸뉴라미니다제, 시알리다제 1, 시알리다제 2, 시알리다제, 3, 또는 시알리다제 4, 임의의 다른 적절한 시알리다제, α-만노시다제, β-만노시다제, 또는 이의 임의의 조합이 포함되는, 당분야에 알려진 임의의 글리코시드 가수분해효소가 사용될 수 있다.
또한, 글리칸 변형에는 생산체 세포에서 글리코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 효소의 녹아웃 또는 녹 다운과 같이, 변경된 글리칸 효소 발현을 갖기 위한 적절한 게놈 편집 기법을 통한 생산체 세포의 유전적 변경이 포함될 수 있다. 비제한적으로 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cfp1, CRISPR/C2c1, C2c2, 또는 C2c3, CRISPR/CasY 또는 CasX, TAL-효과기 뉴클레아제 또는 TALEN, 또는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 또는 이의 임의의 조합이 포함되는, 당분야에 알려진 임의의 게놈 편집 기법이 사용될 수 있다.
변경될 수 있는 예시적인 유전자에는 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMAS), 및 만노스 생합성 유전자 만노시다제 알파 클래스 1A 구성원 1(MAN1A1) 및 만노시다제 알파 클래스 2A 구성원 1(MAN2A1)이 포함된다.
글리칸 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 또한 글리칸 변형된 PTGFRN 과발현 생산체 세포주로부터 또한 유래될 수 있다. 이러한 예에서, 생산체 세포주는 PTGFRN 유전자 및 유전자 산물을 발현하고 변경된 글리칸 트랜스퍼라제 효소 발현을 갖기 위해 형질전환되거나, 전달감염되거나, 형질도입되거나, 달리 유전적으로 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, 생산체 세포는 PTGFRN 유전자 및 유전자 산물을 과발현하고 시티딜릴트랜스퍼라제 유전자 CMAS를 녹다운하거나 녹아웃하기 위해 변경된다. 대안적으로, 생산체 세포주는 PTGFRN 유전자 및 유전자 산물을 발현하기 위해 유전적으로 변형되고 키푸넨신 또는 당분야에 알려진 다른 만노시다제, 글리코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제 또는 시티딜릴트랜스퍼라제 억제제, 또는 이의 임의의 조합으로 처리되어, PTGFRN 유전자 및 유전자 산물을 과발현하면서도 변경된 글리칸 발현을 갖는 생산체 세포를 생성할 수 있다.
III. STING 작용제를 포함하는 EV를 제조하는 방법
III.A. EV에 STING 작용제를 캡슐화하는 방법
STING 작용제는 당분야에 알려진 임의의 적절한 기법을 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀에 캡슐화될 수 있다. 생체분자의 EV, 예를 들어, 엑소좀 내로의 모든 알려진 로딩 방식이 본원에서 사용하기 적합한 것으로 간주됨이 고려된다. 이러한 기법에는 수동 확산, 전기천공, 화학물질 또는 중합체 전달감염, 바이러스 형질도입, 기계적 막 분쇄 또는 기계적 전단, 또는 이의 임의의 조합이 포함된다. STING 작용제 및 EV, 예를 들어, 엑소좀은 캡슐화 동안 적절한 완충액 중 인큐베이션될 수 있다.
하나의 구현예에서, STING 작용제는 수동 확산에 의해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 의해 캡슐화된다. STING 작용제 및 EV, 예를 들어, 엑소좀은 함께 혼합되고 STING 작용제가 소수포 지질 이중층을 통해 확산하기 충분한 시기 동안 인큐베이션되어 EV, 예를 들어, 엑소좀에 캡슐화될 수 있다. STING 작용제 및 EV, 예를 들어, 엑소좀은 약 1 내지 30시간, 2 내지 24시간, 4 내지 18시간, 6 내지 16시간, 8 내지 14시간, 10 내지 12시간, 6 내지 12시간, 12 내지 20시간, 14 내지 18시간, 또는 20 내지 30시간 동안 함께 인큐베이션될 수 있다. STING 작용제 및 EV, 예를 들어, 엑소좀은 약 2시간, 4시간, 6,시간, 8,시간, 10,시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 또는 30시간 동안 함께 인큐베이션될 수 있다.
EV, 예를 들어, 엑소좀 용액의 완충액 조건은 또한 STING 작용제의 캡슐화를 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충액은 수크로스 함유 인산염 완충 식염수(PBS)일 수 있다. PBS는 당업자에게 널리 알려진 완충액이다. 전단 보호제, 점도 변형제, 및/또는 소수포 구조 특성에 영향을 미치는 용질과 같은 추가적인 완충액 변형이 또한 사용될 수 있다. 부형제는 또한 막 연화 물질 및 분자 밀집화제와 같은 STING 작용제 캡슐화 효율을 개선하기 위해 첨가될 수 있다. 완충액에 대한 다른 변형에는 특정 pH 범위 및/또는 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 쯔비터이온, 아미노산, 중합체의 농도, 및/또는 다중 농도를 포함하는 임의의 상기 조합이 포함될 수 있다.
인큐베이션 동안 EV, 예를 들어, 엑소좀, 및 STING 작용제 용액의 온도는 STING 작용제의 캡슐화를 최적화하기 위해 변화될 수 있다. 온도는 실온일 수 있다. 온도는 약 15℃ 내지 90℃, 15℃-30℃, 30-50℃, 50-90℃일 수 있다. 온도는 약 15℃, 20℃, 35℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃일 수 있다.
작용제와 EV, 예를 들어, 엑소좀의 인큐베이션 동안 STING 작용제의 농도는 또한 STING 작용제의 캡슐화를 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 작용제의 농도는 적어도 0.01 mM 내지 100 mM STING 작용제일 수 있다. 작용제의 농도는 적어도 0.01-1 mM, 1-10 mM, 10-50 mM, 또는 50-100 mM일 수 있다. 작용제의 농도는 적어도 0.01 mM, 0.02 mM, 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 30 mM, 35mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 또는 100 mM일 수 있다.
STING 작용제와 인큐베이션되는 세포외 입자의 수는 또한 STING 작용제의 캡슐화를 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 정제된 EV, 예를 들어, 엑소좀, 입자의 수는 적어도 약 106 내지 적어도 약 1020개의 정제된 소수포의 총 입자일 수 있다. 정제된 입자의 수는 약 108 내지 1018, 1010 내지 1016, 108 내지 1014, 또는 1010 내지 1012개의 정제된 소수포의 총 입자일 수 있다. 정제된 입자의 수는 적어도 약 106, 108, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 또는 1020개의 정제된 소수포의 총 입자일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대분자를 사용하여 적합한 생산체 세포 내로 도입될 수 있다(Papapetrou et al., Gene Therapy 12: S118-S130 (2005)). 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 전하 상호작용을 통해 하나 이상의 모이어티와 복합체를 형성한다. 일부 이들 구현예에서, 양으로 하전된 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하며 세포내섭취에 의해 세포에 의해 섭취된다. 일부 다른 구현예에서, 양이온성 중합체는 생산체 세포를 전달감염시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 이들 구현예에서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다. 특정 구현예에서, 칼슘 포스페이트, 사이클로덱스트린, 또는 폴리브렌과 같은 화학물질이 생산체 세포에 하나 이상의 모이어티를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 모이어티가 또한 입자-매개 전달감염, "유전자 총" 바이오리스틱, 또는 입자 충격 기술과 같은 물리적 방법을 사용하여 생산체 세포 내로 도입될 수 있다(Papapetrou et al., Gene Therapy 12: S118-S130 (2005)). 예를 들어, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 루시퍼라제, 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자가 생산체 세포의 전달감염 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티가 바이러스 형질도입에 의해 생산체 세포에 도입된다. 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 렌티바이러스, 및 스푸마바이러스를 포함하는 여러 바이러스가 유전자 전달 비히클로 사용될 수 있다. 바이러스 매개 유전자 전달 비히클은 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 헤르페스 바이러스와 같은 DNA 바이러스 기반 벡터뿐만 아니라 레트로바이러스 기반 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티가 전기천공에 의해 생산체 세포 내로 도입된다. 전기천공은 세포막에 일시적 포어를 생성하여 다양한 분자의 세포내 도입을 허용한다. 일부 구현예에서, DNA 및 RNA뿐만 아니라 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 치료제가 전기천공에 의해 생산체 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 마이크로주입에 의해 생산체 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 유리 마이크로피펫이 미시적 수준에서 하나 이상의 모이어티를 생산체 세포 내로 주사하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 압출에 의해 생산체 세포에 도입된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 초음파 분쇄에 의해 생산체 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 생산체 세포는 고강도 음파에 노출되어 세포막의 일시적 손상을 유도하고 하나 이상의 모이어티의 로딩을 허용한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 세포 융합에 의해 생산체 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 전기적 세포 융합에 의해 도입된다. 다른 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 생산체 세포를 융합시키기 위해 사용된다. 추가 구현예에서, 센다이 바이러스가 생산체 세포를 융합시키기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 저장성 용해에 의해 생산체 세포에 도입된다. 이러한 구현예에서, 생산체 세포는 저-이온 강도 완충액에 노출되어 이들이 파열되도록 유도하고 하나 이상의 모이어티의 로딩을 허용할 수 있다. 다른 구현예에서, 저장성 용액에 대한 제어되는 투석이 생산체 세포를 팽윤시키고 생산체 세포막에서 포어를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 생산체 세포는 이후 막의 재밀봉을 허용하는 조건으로 노출된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 세제 처리에 의해 생산체 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 생산체 세포는 일시적으로 생산체 세포막을 손상시키는 약한 세제로 처리되고 포어를 생성하여 하나 이상의 모이어티의 로딩을 허용한다. 생산체 세포가 로딩된 후, 세제가 세척 제거되어 막을 재밀봉한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 수용체 매개 세포내섭취에 의해 생산체 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 생산체 세포는 하나 이상의 모이어티의 결합 시 수용체 및 연합된 모이어티의 내재화를 유도하는 표면 수용체를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 모이어티는 여과에 의해 생산체 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 생산체 세포 및 하나 이상의 모이어티는 생산체 세포보다 작은 포어 크기의 필터를 통해 가압되어 생산체 세포막의 일시적 손상을 유도하고 하나 이상의 모이어티가 생산체 세포에 들어가는 것을 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 생산체 세포는 몇몇 냉동 해동 사이클을 거쳐, 세포막 손상을 일으키고 하나 이상의 모이어티의 로딩을 허용한다.
IV. EV 정제
본 개시를 위해 제조된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 생산체 세포로부터 단리될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀의 모든 알려진 단리 방식이 본원에서 사용하기 적합한 것으로 간주됨이 고려된다. 예를 들어, 전기적 전하(예를 들어, 전기영동 분리), 크기(예를 들어, 여과, 분자 체질 등), 밀도(예를 들어, 정규 또는 구배 원심분리), 스베드베리(Svedberg) 상수(예를 들어, 외부력을 이용하거나 이용하지 않는 침강 등)에 기반한 분리를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 물리적 특성이 이들을 배지 또는 다른 원천 물질과 분리하기 위해 채택될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 단리는 하나 이상의 생물학적 특성에 기반할 수 있고, 표면 마커를 채택할 수 있는 방법(예를 들어, 침전, 고상으로의 가역적 결합, FACS 분리, 특이적 리간드 결합, 비-특이적 리간드 결합 등)이 포함된다. 다른 추가 고려되는 방법에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 또한 PEG-유도 융합 및/또는 초음파 융합을 포함하는 화학적 및/또는 물리적 방법을 사용하여 융합될 수 있다.
EV, 예를 들어, 엑소좀은 또한 조성물로부터 캡슐화되지 않은, 자유 STING 작용제를 제거하기 위해 STING 작용제와의 인큐베이션 후 정제될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀의 물리적 또는 생물학적 특성에 기반한 분리를 포함하여, 이전에 개시된 모든 방식이 또한 본원에서 사용하기 적합한 것으로 간주된다.
단리, 정제, 및 농축은 일반적이고 비-선택적 방식으로(전형적으로 일련의 원심분리 포함) 수행될 수 있다. 대안적으로, 단리, 정제, 및 농축은 보다 특이적이고 선택적인 방식으로(예를 들어, 생산체 세포-특이적 표면 마커를 사용하여) 수행될 수 있다. 예를 들어, 특이적 표면 마커가 면역침전, FACS 정렬, 친화도 정제, 자기 분리를 위한 비드-결합된 리간드 등에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피가 EV, 예를 들어, 엑소좀을 단리하거나 정제하기 위해 이용될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 기법은 당분야에 알려져 있다. 예시적인, 비제한적 기법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 공극(void) 부피 분획이 단리되고 관심 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리가 EV, 예를 들어, 엑소좀을 추가 단리하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 일부 구현예에서, 생산체 세포-유래 EV, 예를 들어, 엑소좀을 다른 기원의 EV로부터 추가 분리하는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, 생산체 세포-유래 EV, 예를 들어, 엑소좀은 생산체 세포에 특이적인 항원 항체를 사용하여 면역흡착 포착에 의해 비-생산체 세포-유래 EV, 예를 들어, 엑소좀과 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 단리에는 음이온 교환, 양이온 교환, 또는 혼합 방식 크로마토그래피와 같은 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 크로마토그래피가 관여될 수 있다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 단리에는 탈염, 투석, 접선류 여과, 초여과, 또는 투석여과, 또는 이의 임의의 조합이 관여될 수 있다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 단리에는 비제한적으로 분별 원심분리, 크기-기반 막 여과, 농축 및/또는 속도 구역별 원심분리가 포함되는 방법의 조합이 관여될 수 있다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 단리에는 하나 이상의 원심분리 단계가 관여될 수 있다. 원심분리는 약 50,000 내지 150,000 × g에서 수행될 수 있다. 원심분리는 약 50,000 × g, 75,000 × g, 100,000 × g, 125,000 × g, 또는 150,000 × g에서 수행될 수 있다.
V. 치료 투여
V.A. 면역 조절 및 투여량
STING 작용제를 포함하는 약학적 유효량의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하여 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하고/하거나 조절하는 방법이 본원에서 제공된다.
수지상 세포(DC)는 선천성 및 적응 면역계를 연결하는 조혈 세포 계통에서 유래된 항원 제시 세포 집단이다. DC는 단핵구 및 대식구와 공통 골수 전구체를 공유하며 일반적으로 2개의 주요 그룹: 형질세포양 DC(pDC) 및 통상적 DC(cDC)로도 알려져 있는 골수 DC(mDC)로 구분된다. mDC는 골수 및 림프구 전구체로부터의 이의 발생 및 CD8α, CD4, 및 C11b의 발현 수준에 기반하여 추가 분류된다. 세 번째 DC 집단은 pDCs 및 cDC와 같이 DC 전구세포가 아니라 단핵구 전구체로부터 발생하는 단핵구-유래 DC(moDC)이다. moDC는 염증 신호를 수신한 후 발생한다. 미성숙 DC는 성숙 전 말초 조직에 체류한다. 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 유도되는 신호전달 캐스케이드를 포함하는 몇몇 신호전달 경로가 DC 성숙을 야기한다. 각각의 미성숙 DC의 하위세트는 미성숙 DC 집단이 동일한 PRR의 활성화 시 상이하게 반응할 수 있도록 하는 PRR의 단백질 발현 패턴이 다르다. 이는 DC에 의해 매개되는 면역 반응의 조절을 일으킨다. DC에 존재하는 PRR에는 톨-유사 수용체(TLR), C-유형 렉틴 수용체, 레티노이드-산 유도성 유전자(RIG)-I-유사 수용체(RLR), NOD-유사 수용체(NLR), 및 STING이 포함된다.
STING 경로는 mDC 및 pDC 둘 다에서 우세한 DNA 감지 경로이다. DC에서 STING 경로의 활성화는 TBK1, IRF3, 및 NF-κB 신호전달을 통해 I형 IFN 및 전염증성 사이토카인 생산을 일으킨다. 세포 상 이의 수용체에 대한 IFN의 결합은 면역 및 염증성 반응을 일으키는 IFN-자극 반응 요소의 활성화 및 IFN-민감성 유전자의 전사를 일으킨다. IFN 신호전달은 또한 DCF를 교차-감작하여 항원 유지를 촉진하고, MHCI 제시를 위해 이용 가능한 항원 레파토리를 변경하고, 항원의 MHCI 제시를 증강시키고, MHCI, MHCII, 및 공동-자극 분자 CD40, CD80, 및 CD86의 전반적 표면 발현을 증가시킨다. 이들 작용은 종양 특이적 CD8+ T 세포의 증가된 감작 및 적응 면역 반응의 개시를 일으킨다.
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에 STING 작용제를 캡슐화하고/하거나 STING 작용제를 표면 상에 발현하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 방법은 수지상 세포를 활성화하거나 유도하고, 이에 따라 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 유도하거나 조절한다. 일부 구현예에서, 활성화된 수지상 세포는 골수 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 수지상 세포는 형질세포양 수지상 세포이다.
일부 구현예에서, 방법은 인터페론(IFN)-β 생산을 유도한다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 STING 작용제의 단독 투여에 비해 2배 내지 10,000배 초과의 IFN-β를 유도할 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 STING 작용제의 단독 투여에 비해 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 또는 9000-10,000배 더 큰 IFN-β를 유도할 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 STING 작용제의 단독 투여에 비해 약 2배, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과, 500배 초과, 600배 초과, 700배 초과, 800배 초과, 900배 초과, 1000배 초과, 2000배 초과, 3000배 초과, 4000배 초과, 5000배 초과, 6000배 초과, 7000배 초과, 8000배 초과, 9000배 초과, 또는 10,000배 초과로 더 큰 IFN-β를 유도할 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 IFN-β 생산에 비해 2배 내지 10,000배 더 큰 IFN-β를 유도할 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 IFN-β 생산에 비해 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 또는 9000-10,000배 더 큰 IFN-β를 유도할 수 있다. STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 IFN-β 생산에 비해 약 2배, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과, 500배 초과, 600배 초과, 700배 초과, 800배 초과, 900배 초과, 1000배 초과, 2000배 초과, 3000배 초과, 4000배 초과, 5000배 초과, 6000배 초과, 7000배 초과, 8000배 초과, 9000배 초과, 또는 10,000배 초과로 더 큰 IFN-β를 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀의 대상체에 대한 투여는 또한 다른 면역 조절인자(예를 들어, 사이토카인 또는 케모카인)의 수준을 조절할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 개시된 방법은 IFN-γ, CXCL9, 및/또는 CXCL10의 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 (자유 STING 작용제에 비해 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 또는 9000-10,000배 더 많은 양의 IFN-γ, CXCL9, 및/또는 CXCL10을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 골수 수지상 세포(mDC) 활성화를 유도한다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 STING 작용제의 단독 투여에 비해 2배 내지 50,000배 더 큰 mDC 활성화를 일으킬 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 STING 작용제의 단독 투여에 비해 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 또는 45,000-50,000배 더 큰 mDC 활성화를 일으킬 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 STING 작용제의 단독 투여에 비해 약 2배, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과, 500배 초과, 600배 초과, 700배 초과, 800배 초과, 900배 초과, 1000배 초과, 2000배 초과, 3000배 초과, 4000배 초과, 5000배 초과, 6000배 초과, 7000배 초과, 8000배 초과, 9000배 초과, 10,000배 초과, 15,000배 초과, 20,000배 초과, 25,000배 초과, 30,000배 초과, 35,000배 초과, 40,000배 초과, 45,000배 초과, 또는 50,000배 초과의 더 큰 mDC 활성화를 일으킬 수 있다.
(예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 mDC 활성화에 비해 2배 내지 10,000배 더 큰 mDC 활성화를 일으킬 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 mDC 활성화에 비해 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 또는 45,000-50,000배 더 큰 mDC 활성화를 일으킬 수 있다. (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 mDC 활성화에 비해 약 2배, 5배 초과, 10배 초과, 20배 초과, 30배 초과, 40배 초과, 50배 초과, 60배 초과, 70배 초과, 80배 초과, 90배 초과, 100배 초과, 200배 초과, 300배 초과, 400배 초과, 500배 초과, 600배 초과, 700배 초과, 800배 초과, 900배 초과, 1000배 초과, 2000배 초과, 3000배 초과, 4000배 초과, 5000배 초과, 6000배 초과, 7000배 초과, 8000배 초과, 9000배 초과, 10,000배 초과, 15,000배 초과, 20,000배 초과, 25,000배 초과, 30,000배 초과, 35,000배 초과, 40,000배 초과, 45,000배 초과, 또는 50,000배 초과의 더 큰 mDC 활성화를 일으킬 수 있다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 방법은 대상체의 기준선 단핵구 활성화에 비해 단핵구 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 단핵구 활성화 대비 약 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 30배 미만, 40배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1000배 미만, 2000배 미만, 3000배 미만, 4000배 미만, 5000배 미만, 6000배 미만, 7000배 미만, 8000배 미만, 9000배 미만, 10,000배 미만, 15,000배 미만, 20,000배 미만, 25,000배 미만, 30,000배 미만, 35,000배 미만, 40,000배 미만, 45,000배 미만, 50,000배 미만, 55,000배 미만, 60,000배 미만, 65,000배 미만, 70,000배 미만, 75,000배 미만, 80,000배 미만, 85,000배 미만, 90,000배 미만, 95,000배 미만, 100,000배 미만, 200,000배 미만, 300,000배 미만, 400,000배 미만, 500,000배 미만, 600,000배 미만, 700,000배 미만, 800,000배 미만, 900,000배 미만, 또는 1,000,000배 미만으로 더 적은 단핵구 활성화를 유도한다. 일부 구현예에서, 대상체에 대한 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 단핵구 활성화 대비 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 45,000-50,000배, 55,000-60,000배, 60,000-65,000배, 65,000-70,000배, 70,000-75,000배, 75,000-80,000배, 80,000-85,000배, 85,000-90,000배, 90,000-95,000배, 95,000-100,000배, 100,000-200,000배, 200,000-300,000배, 300,000-400,000배, 400,000-500,000배, 500,000-600,000배, 600,000-700,000배, 700,000-800,000배, 800,000-900,000배, 또는 900,000-1,000,000배 더 적은 단핵구 활성화를 유도한다.
일부 구현예에서, 대상체에 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 방법은 STING 작용제의 단독 투여에 비해 단핵구 활성화를 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 자유 STING 작용제의 투여 후 단핵구 활성화량 대비 약 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 30배 미만, 40배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1000배 미만, 2000배 미만, 3000배 미만, 4000배 미만, 5000배 미만, 6000배 미만, 7000배 미만, 8000배 미만, 9000배 미만, 10,000배 미만, 15,000배 미만, 20,000배 미만, 25,000배 미만, 30,000배 미만, 35,000배 미만, 40,000배 미만, 45,000배, 또는 50,000배 미만으로 더 적은 단핵구 활성화를 유도한다. 일부 구현예에서, 대상체에 대한 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 자유 STING 작용제의 투여 후 단핵구 활성화량 대비 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 또는 45,000-50,000배 더 적은 단핵구 활성화를 유도한다. 단핵구 활성화는 단핵구 상에서 CD86의 표면 발현에 의해, 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 적절한 단핵구 활성화 마커에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 기재된 EV, 예를 들어, 엑소좀과 연관된 개선된 치료 효과로 인해, 일부 구현예에서, 자유 STING 작용제에 비해 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 더 적은 투여량의 EV, 예를 들어, 엑소좀이 전달될 수 있다. 또한, 고용량 STING 작용제의 비-선택적 전달은 요망되는 면역 자극 반응을 약화시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 기재된 EV, 예를 들어, 엑소좀이 더 적은 용량으로 투여될 수 있으므로, 일부 구현예에서, 이들은 더 넓은 치료 윈도우에서 작동하며 자유 STING 작용제로 관찰되는 책임(예를 들어, 전신 독성, 면역 세포 사멸, 세포 선택성의 부재)를 감소시킬 수 있다.
본원에서 기재된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체의 질환, 장애, 상태, 또는 증상을 완화하기 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 필요로 하는 대상체에 투여되는 STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여량은 약 0.01 내지 0.1 μM, 0.1 내지 1 μM, 1 내지 10 μM, 10 내지 100 μM, 또는 100 내지 1000 μM이다. 특정 구현예에서, 필요로 하는 대상체에 투여되는 STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여량은 약 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 40 μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM, 80 μM, 85 μM, 90 μM, 95 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM, 400 μM, 450 μM, 500 μM, 550 μM, 600 μM, 650 μM, 700 μM, 750 μM, 800 μM, 850 μM, 900 μM, 950 μM, 또는 1000 μM이다.
일부 구현예에서, 필요로 하는 대상체에 투여되는 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 양은 필요로 하는 대상체에서 동일한 완화 결과를 일으키기 위해 요구되는 자유 STING 작용제의 양 대비 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 30배 미만, 40배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1000배 미만, 2000배 미만, 3000배 미만, 4000배 미만, 5000배 미만, 6000배 미만, 7000배 미만, 8000배 미만, 9000배 미만, 10,000배 미만, 15,000배 미만, 20,000배 미만, 25,000배 미만, 30,000배 미만, 35,000배 미만, 40,000배 미만, 45,000배 미만, 또는 50,000배 미만이다. 일부 구현예에서, 필요로 하는 대상체에 투여되는 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 양은 필요로 하는 대상체에서 동일한 완화 결과를 일으키기 위해 요구되는 자유 STING 작용제의 양 대비 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 또는 45,000-50,000배 미만으로 더 적다.
일부 구현예에서, STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 방법은 대상체의 기준선 전신 염증에 비해 전신 염증을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 전신 염증 대비 약 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 30배 미만, 40배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1000배 미만, 2000배 미만, 3000배 미만, 4000배 미만, 5000배 미만, 6000배 미만, 7000배 미만, 8000배 미만, 9000배 미만, 10,000배 미만, 15,000배 미만, 20,000배 미만, 25,000배 미만, 30,000배 미만, 35,000배 미만, 40,000배 미만, 45,000배 미만, 또는 50,000배 미만으로 더 적은 전신 염증을 유도한다. 일부 구현예에서, 대상체에 대한 STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체의 기준선 전신 염증 대비 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 또는 45,000-50,000배 더 적은 전신 염증을 유도한다.
일부 구현예에서, 대상체에 (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 방법은 STING 작용제의 단독 투여에 비해 전신 염증을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 자유 STING 작용제의 투여 후 전신 염증의 양 대비 약 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 30배 미만, 40배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1000배 미만, 2000배 미만, 3000배 미만, 4000배 미만, 5000배 미만, 6000배 미만, 7000배 미만, 8000배 미만, 9000배 미만, 10,000배 미만, 15,000배 미만, 20,000배 미만, 25,000배 미만, 30,000배 미만, 35,000배 미만, 40,000배 미만, 45,000배 미만, 또는 50,000배 미만으로 더 적은 전신 염증을 유도한다. 일부 구현예에서, 대상체에 대한 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 자유 STING 작용제의 투여 후 전신 염증의 양 대비 약 2-5배, 5-10배, 10-20배, 20-30배, 30-40배, 40-50배, 50-60배, 60-70배, 70-80배, 80-90배, 90-100배, 100-200배, 200-300배, 300-400배, 400-500배, 500-600배, 600-700배, 700-800배, 800-900배, 900-1000배, 1000-2000배, 2000-3000배, 3000-4000배, 4000-5000배, 5000-6000배, 6000-7000배, 7000-8000배, 8000-9000배, 9000-10,000배, 10,000-15,000배, 15,000-20,000배, 20,000-25,000배, 25,000-30,000배, 30,000-35,000배, 35,000-40,000배, 40,000-45,000배, 또는 45,000-50,000배 더 적은 전신 염증을 유도한다. 전신 염증은 당분야에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 정량되거나 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에 (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역조절제이다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 음성적 체크포인트 조절제에 대한 억제제 또는 음성적 체크포인트 조절제의 결합 파트너에 대한 억제제이다. 일부 이들 구현예에서, 음성적 체크포인트 조절제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다: 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA-4), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감약인자(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 저해인자(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), CD20, CD39, 및 CD73. 다양한 구현예에서, 추가 치료제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 전체 항체, 폴리클로날, 모노클로날 및 재조합 항체, 이의 단편이며, 추가로 단일쇄 항체, 인간화 항체, 쥣과 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 모노클로날 항체, 항-개별특이형 항체, 예를 들어, scFv,(scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 및 Fd 단편과 같은 항체 단편, 디아바디, 및 항체-관련 폴리펩타이드가 포함된다. 용어 항체에는 이들이 요망되는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체가 포함된다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제인 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 추가 치료제는 T 세포 고갈을 방지하거나 치료하는 제제이다. 이러한 제제는 Prdm1, Bhlhe40, Irf4, Ikzf2, Zeb2, Lass6, Egr2, Tox, Eomes, Nfatc1, Nfatc2, Zbtb32, Rbpj, Hif1a, Lag3, Tnfrsf9, Ptger2, Havcr2, Alcam, Tigit, Ctla4, Ptger4, Tnfrsf1b, Ccl4, CD109, CD200, Tnfsf9, Nrp1, Sema4c, Ptprj, Il21, Tspan2, Rgs16, Sh2d2a, Nucb1, Plscr1, Ptpn11, Prkca, Plscr4, Casp3, Gpd2, Gas2, Sh3rf1, Nhedc2, Plek, Tnfaip2, 및 Ctsb, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, T 세포 고갈과 연관된 유전자 발현을 증가시키거나, 감소시키거나, 조절할 수 있다. 치료제는 또한 NFAT-1 또는 NFAT-2를 포함하는, T 세포 고갈과 연관된 단백질을 증가시키거나, 감소시키거나, 조절할 수 있다.
V.B. 암을 치료하는 방법
대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법은 본원에서 개시된 치료 유효량의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 대상체에서 STING-매개 면역 반응을 상향조절하여 대상체 면역계의 종양 표적화를 증강시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체에 종양내 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통해 투여된다.
대상체에서 암의 전이를 방지하는 방법이 본원에서 제공된다. 방법은 본원에서 개시된 치료 유효량의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 대상체의 하나의 위치에서의 하나 이상의 종양이 대상체의 또 다른 위치에서의 하나 이상의 종양 성장을 촉진하는 것을 방지할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나의 위치에서 제1 종양에 종양내 투여되며, 제1 종양에 투여되는 조성물은 제2 위치에서의 하나 이상의 종양의 전이를 방지한다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여는 대상체에서 종양 성장을 억제하고/하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 종양 성장(예를 들어, 종양 부피 또는 중량)은 참조(예를 들어, 자유 STING 작용제 또는 STING 작용제가 없는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 투여 후 대응하는 대상체에서의 종양 부피)에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 암이 치료되고 있다는 것은 종양 미세환경, 또는 소위 "핫(hot) 종양" 또는 "염증성 종양" 내로 백혈구(T-세포, B-세포, 대식구, 수지상 세포, 단핵구)가 침윤하는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 암이 치료되고 있다는 것은 종양 미세환경, 또는 소위 "콜드(cold) 종양" 또는 "비-염증성 종양" 내로 저수준의 또는 검출 불가능한 수준의 백혈구가 침윤되는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 "콜드 종양"을 "핫 종양"으로 전환하기 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 투여된다, 즉 상기 투여는 종양 미세환경 내로 백혈구(예컨대 T-세포)의 침윤을 일으킨다. 특정 구현예에서, 암은 방광암, 자궁경부암, 신세포암, 정소암, 결장직장암, 폐암, 두부경부암, 및 난소암, 림프종, 간암, 교모세포종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 췌장암, 또는 이의 조합을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "원부 종양" 또는 "원위 종양"은 원래(또는 원발성) 종양으로부터 원위 기관 또는 원위 조직, 예를 들어, 림프절로 전파된 종양을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 전이성 전파 후 종양을 치료한다.
본원에서 개시된 방법으로 치료될 수 있는 암(또는 종양)의 비제한적 예에는 편평상피세포 암종, 소세포 폐암(SCLC), 비-소세포 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비편평상피 NSCLC, 위장관암, 신장암(예를 들어, 투명 세포 암종), 난소암, 간암(예를 들어, 간세포 암종), 결장직장암, 자궁내막암, 신장암(예를 들어, 신세포 암종(RCC)), 전립샘암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립샘 샘암종), 갑상샘암, 췌장암, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간암, 유방암, 결장 암종, 및 두부경부암(또는 암종), 위암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 부비강 자연 살해, 흑색종(예를 들어, 피부 또는 안내 악성 흑색종과 같은 전이성 악성 흑색종), 뼈암, 피부암, 자궁암, 항문 영역의 암, 정소암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암(예를 들어, 위식도 접합부 암), 소장암, 내분비계암, 부갑상샘암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 아동 고형 종양, 요관암, 신우 암종, 종양 혈관신생, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양 암, 편평상피세포암, T-세포 림프종, 석면증에 의해 유도된 암을 포함하는 환경-유도 암, 바이러스-관련 암 또는 바이러스 기원 암(예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV-관련 또는 -기원 종양)), 및 2가지 주요 혈액 계통, 즉, 골수 세포주(과립구, 적혈구, 혈소판, 대식구 및 비만 세포를 생성함) 또는 림프구 세포주(B, T, NK 및 형질 세포를 생성함)으로부터 유래된 혈액 종양, 예컨대 모든 유형의 백혈병, 림프종, 및 골수종, 예를 들어, 급성, 만성, 림프구 및/또는 골수성 백혈병, 예컨대 급성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML), 미분화 AML(MO), 골수모구 백혈병(M1), 골수모구 백혈병(M2; 세포 성숙을 포함함), 전골수구 백혈병(M3 또는 M3 변형[M3V]), 골수단핵구 백혈병(M4 또는 호산구증가증을 갖는 M4 변형[M4E]), 단핵구 백혈병(M5), 적백혈병(M6), 거대모구 백혈병(M7), 단리된 과립구 육종, 및 녹색종; 림프종, 예컨대 호지킨 림프종(HL), 비-호지킨 림프종(NHL), B 세포 혈액 종양, 예를 들어, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 림프형질세포양 림프종, 단핵구모양 B-세포 림프종, 점막-연관 림프 조직(MALT) 림프종, 역형성(예를 들어, Ki1+) 큰-세포 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병, 맨틀 세포 림프종, 혈관 면역모구 T-세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 장 T-세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종, 전구체 T-림프모구 림프종, T-림프모구; 및 림프종/백혈병(T-Lbly/T-ALL), 말초 T-세포 림프종, 림프모구 림프종, 이식-후 림프증식성 장애, 진-조직구 림프종, 원발성 삼출 림프종, B 세포 림프종, 림프모구 림프종(LBL), 림프 계통의 혈액 종양, 급성 림프모구 백혈병, 확산성 큰 B-세포 림프종, 버키트 림프종, 소포 림프종, 확산성 조직구 림프종(DHL), 면역모구 큰 세포 림프종, 전구체 B-림프모구 림프종, 피부 T-세포 림프종(CTLC)(균상 식육종 또는 세자리 증후군으로도 불림), 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 갖는 림프형질세포양 림프종(LPL); 골수종, 예컨대 IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비분비 골수종, 무증상 골수종(무통 골수종으로도 불림), 고립 형질세포종, 및 다발성 골수종, 만성 림프구 백혈병(CLL), 털 세포 림프종; 골수 계통의 혈액 종양, 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 고환종, 기형암종, 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 피부건조증, 각질가시세포종, 고환종, 갑상샘 소포암 및 기형암종, 림프 계통의 혈액 종양, 예를 들어 비제한적으로 T-세포 장애, 예컨대 작은 세포 및 대뇌모양 세포 유형을 포함하는 T-전림프구 백혈병(T-PLL); T-세포 유형의 큰 과립 림프구 백혈병(LGL); a/d T-NHL 간비장 림프종; 말초/후-가슴샘 T 세포 림프종(다형태 및 면역모구 서브타입); 혈관중심성(비강) T-세포 림프종을 포함하는 T-세포 및 B-세포 종양; 두부경부암, 신장암, 직장암, 갑상샘암; 급성 골수 림프종, 및 이의 임의의 조합이 포함된다.
일부 구현예에서, 치료받을 수 있는 암(또는 종양)은 유방암, 두부경부암, 자궁암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장직장암, 전립샘암, 간암, 방광암, 신장암, 복강암, 췌장암, 갑상샘암, 식도암, 눈암, 위(위의)암, 위장관암, 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 골수종, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시로 치료받을 수 있는 암은 췌장암 및/또는 복강암이다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법은 또한 전이성 암, 절제 불가능한, 난치성 암(예를 들어, 사전 암 치료법에 불응성인 암), 및/또는 재발성 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 하나 이상의 추가적인 항암제 및/또는 면역조절제와의 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 제제에는, 예를 들어, 화학치료법 약물, 소분자 약물, 또는 주어진 암에 대한 면역 반응을 자극하는 항체가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법은 표준 케어 치료(예를 들어, 수술, 방사선, 및 화학치료법)와의 조합으로 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 암을 치료하는 방법은 면역 경로의 여러 요소가 표적화될 수 있도록, 하나 이상의 면역-종양 제제와 함께 (예를 들어, 캡슐화되거나 또는 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 조합의 비제한적 예에는 종양 항원 제시를 증강시키는 치료법(예를 들어, 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포 백신, CpG 올리고뉴클레오타이드, 이미퀴모드); 예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD1/PD-L1/PD-L2 경로를 억제하고/하거나 Treg 또는 다른 면역 억제 세포(예를 들어, 골수-유래 저해인자 세포)를 고갈시키거나 차단하여, 음성적 면역 조절을 억제하는 치료법; 예를 들어, CD-137, OX-40, 및/또는 CD40 또는 GITR 경로를 자극하고/하거나 T 세포 효과기 기능을 자극하는 작용제로, 양성적 면역 조절을 자극하는 치료법; 항-종양 T 세포의 빈도를 전신 증가시키는 치료법; 예를 들어, CD25 길항제(예를 들어, 다클리주맙)를 사용하여 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의해, Treg, 예컨대 종양에서의 Treg를 고갈시키거나 억제하는 치료법; 종양에서 저해인자 골수 세포의 기능에 영향을 미치는 치료법; 종양 세포의 면역원성을 증강시키는 치료법(예를 들어, 안트라사이클린); 유전적으로 변형된 세포, 예를 들어, 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 세포(CAR-T 치료법)를 포함하는 차용 T 세포 또는 NK 세포 전달; 인돌아민 디옥시게나제(IDO), 디옥시게나제, 아르기나제, 또는 질소 산화물 합성효소와 같은 대사 효소를 억제하는 치료법; T 세포 무반응 또는 고갈을 역전시키는/방지하는 치료법; 종양 부위에서 선천성 면역 활성화 및/또는 염증을 유발하는 치료법; 면역 자극성 사이토카인의 투여; 또는 면역 억제성 사이토카인의 차단이 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀과의 조합으로 사용될 수 있는 면역-종양학 제제는 면역 체크포인트 억제제를 포함한다(즉, 특정 면역 체크포인트 경로를 통한 신호전달을 차단함). 본 발명에서 사용될 수 있는 면역 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 CTLA-4 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체), PD-1 길항제(예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체), TIM-3 길항제(예를 들어, 항-TIM-3 항체), 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역-종양학 제제는 면역 체크포인트 활성화제를 포함한다(즉, 특정 면역 체크포인트 경로를 통한 신호전달을 촉진함). 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 활성화제는 OX40 작용제(예를 들어, 항-OX40 항체), LAG-3 작용제(예로 항-LAG-3 항체), 4-1BB(CD137) 작용제(예를 들어, 항-CD137 항체), GITR 작용제(예를 들어, 항-GITR 항체), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 본원에서 논의된 제2 제제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)의 조합은 약학적으로 허용 가능한 담체 중 하나의 조성물로 동시에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀, 및 본원에서 논의된 제2 제제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)의 조합은 별도 조성물로 동시적으로 투여될 수 있다. 추가 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀, 및 본원에서 논의된 제2 제제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)의 조합은 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 제2 제제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)의 투여 전에 투여된다.
V.C. 약학 조성물
대상체로의 투여에 적합한, EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 약학 조성물은 일반적으로 대상체로의 투여에 적합한 형태로 (예를 들어, 캡슐화되거나 내강 또는 외부 표면 상에 발현된) STING 작용제를 포함하는 복수의 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 약학적으로-허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 약학적으로-허용 가능한 부형제 또는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 복수의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 약학 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990) 참고). 약학 조성물은 일반적으로 멸균으로 제형화되며 미국 식약청의 모든 GMP(우수 의약품 제조) 규제를 모두 준수한다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 STING 작용제 및 본원에서 기재된 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함한다.
약학적으로-허용 가능한 부형제에는 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약학 용도를 위해 허용 가능한 부형제를 포함하여, 일반적으로 안전하고(GRAS), 무독성이고, 요망되는 부형제가 포함된다.
담체 또는 희석제의 예에는 비제한적으로 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함된다. 약학적 활성 성분에 대한 이러한 배지 및 화합물의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 임의의 통상적 배지 또는 화합물이 본원에서 기재된 EV, 예를 들어, 엑소좀과 비상용성인 경우를 제외하고, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 치료제가 또한 조성물 내로 포함될 수 있다. 전형적으로, 약학 조성물은 의도되는 투여 경로와 상용성으로 제형화된다. EV, 예를 들어, 엑소좀은 종양내, 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내; 근육내 경로에 의해 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 정맥내, 예로 주사에 의해 투여된다. EV, 예를 들어, 엑소좀은 선택적으로 EV, 예를 들어, 엑소좀에 대해 의도되는 질환, 장애 또는 상태의 치료에서 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와의 조합으로 투여될 수 있다.
용액 또는 현탁액에는 하기 성분: 물, 식염수 용액, 신전유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균 화합물; 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트화 화합물; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액, 및 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조정용 화합물이 포함될 수 있다. pH는 염산 또는 나트륨 하이드록사이드와 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 제조물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학 조성물에는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체에는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 조성물은 일반적으로 멸균성이고 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도까지 유체이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성이, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균 및 항진균 화합물, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 요망되는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 나트륨 클로라이드가 조성물에 첨가될 수 있다. 주사 가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 화합물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 일으킬 수 있다.
멸균 주사 가능 용액은 요망되는 대로, 본원에 열거된 성분의 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에 유효량으로 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 임의의 요망되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로, EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함시켜 제조된다. 멸균 주사 가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분과 활성 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조이다. EV, 예를 들어, 엑소좀은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 지속된 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데팟 주사 또는 임플란트 제조물 형태로 투여될 수 있다.
EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당분야에 알려져 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 세제, 담즙염, 및 푸시딘산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 당분야에 일반적으로 알려진 바와 같은 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
본 PCT 출원은 2018년 3월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/647,491; 2018년 6월 4일에 출원된 62/680,501; 2018년 6월 22일에 출원된 62/680,600; 2018년 11월 6일에 출원된 62/756,247의 우선권 이익을 청구하며; 각각의 내용은 이의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 범위 내의 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 통상적 방법을 채택할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 전체 설명되어 있다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); Green & Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Colowick & Kaplan, Methods In Enzymology (Academic Press); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition (Pharmaceutical Press, 2012); Sundberg & Carey, Advanced Organic Chemistry: Parts A and B, 5th Edition (Springer, 2007)을 참고한다.
방법
엑소좀 정제
HEK293SF 세포를 7일 동안 화학적으로 정의된 배지에서 고밀도로 성장시켰다. 컨디셔닝된 세포 배양 배지를 수집하고 실온에서 5분 동안 300 - 800 × g에서 원심분리하여 세포 및 큰 파편을 제거하였다. 이어서 배지 상청액에 1000 U/ℓ BENZONASE®를 보충하고 수조에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 4℃에서 30분 동안 16,000 × g에서 원심분리하여 잔여 세포 파편 및 다른 큰 오염물질을 제거하였다. 이어서 상청액을 4℃에서 3시간 동안 133,900 × g에서 초원심분리하여 엑소좀을 펠렛화하였다. 상청액을 폐기하고 임의의 잔여 배지를 튜브 하부로부터 흡인하였다. 펠렛을 200 - 1000 ㎕ PBS(-Ca -Mg) 중에 재현탁하였다.
엑소좀 집단을 추가 농축하기 위해, 펠렛을 밀도 구배 정제(수크로스 또는 OPTIPREP™)를 통해 가공하였다. 수크로스 구배 정제를 위해, 엑소좀 펠렛을 아래의 표 3에 정의된 바와 같이 수크로스 구배 상부에 층으로 형성하였다.
표 3:
Figure pct00045
구배를 SW 41 Ti 로터에 배치된 12 ㎖ Ultra-Clear(344059) 튜브에서 4℃에서 16시간 동안 200,000 × g에서 회전시켜 엑소좀 분획을 분리하였다.
엑소좀층을 상부층으로부터 부드럽게 제거하고 38.5 ㎖ Ultra-Clear(344058) 튜브에서 약 32.5 ㎖ PBS 중에 희석하고 4℃에서 3시간 동안 133,900 × g에서 다시 초원심분리하여 정제된 엑소좀을 펠렛화하였다. 생성 펠렛을 최소 부피의 PBS(약 200 ㎕) 중에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다.
OPTIPREP™ 구배를 위해, 3-티어 멸균 구배를 SW 41 Ti 로터용 12 ㎖ Ultra-Clear(344059) 튜브에서 동일 부피의 10%, 30%, 및 45% OPTIPREP™으로 제조한다. 펠렛을 OPTIPREP™ 구배에 첨가하고 4℃에서 16시간 동안 200,000 × g에서 초원심분리하여 엑소좀 분획을 분리하였다. 이어서 엑소좀층을 튜브의 상부 약 3 ㎖로부터 부드럽게 수집하였다.
엑소좀 분획을 38.5 ㎖ Ultra-Clear(344058) 튜브에서 약 32 ㎖ PBS 중에 희석하고 4℃에서 3시간 동안 133,900 × g에서 초원심분리하여 정제된 엑소좀을 펠렛화하였다. 이어서 펠렛화된 엑소좀을 최소 부피의 PBS(약 200 ㎕) 중에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다.
CIVO®를 이용한 생체내 종양내 마이크로주사 연구
종양 세포 배양
A20 세포(ATCC Lot # 70006082)를 37℃, 5% CO2에서 L-Glutamine(ThermoFisher), 10% 우태 혈청(Thermofisher) 및 50나노몰 농도 BME와 함께 RPMI 1640 중에 배양하였다. IMPACT III 평가(IDEXX Bioresearch)를 수행하여 미코플라즈마-부재 및 병원체-부재 상태를 확인하였다. 세포를 증폭시키고 공급자로부터 수득 후 2-3계대 후 냉동 보존하였다. 해동 후, 1주 3회 하위배양하여 최대 8주 동안 세포를 유지하고 이후 신선 냉동 스톡으로부터 보충하였다.
생체내 연구
마우스에서의 모든 실험은 Presage Biosciences, Seattle, WA(프로토콜 번호 PR-001)의 IACUC 위원회에 의해 승인받았고 관련 가이드라인 및 규제에 따라 Presage에서 수행하였다. 모든 관련 절차는 마취 하에 수행하였고 통증 및 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 평균 체중 18 gm의 암컷 BALB/cAnNHsd 마우스(Envigo)를 5-7주령에 실험을 위해 사용하였다. A20 동종이식편을 생성하기 위해, 마우스에 100 ㎕ 접종 부피 중 백만 개의 A20 세포를 접종하였다.
CIVO® 종양내 마이크로주사
CIVO 종양내 마이크로주사를 Klinghoffer et al. (2016) Science Translational Medicine에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 마우스(시점 4 및 24시간 당, n=6)는 임플란트된 종양이 하기 근사 치수: 14 ㎜(길이), 10 ㎜(폭) 및 7 ㎜(깊이)에 도달했을 때 마이크로주사 연구에 등록시켰다. 총 전달 부피 2.0 ㎕를 갖는 6개의 30-게이지 주사 바늘로 CIVO 장치를 구성하였다. Presage의 형광 추적 마커(FTM, 5부피%)를 공간적 배향을 위해 주사 내용물에 첨가하였다. 마이크로주사된 제제는 하기와 같았다: 대조군 PTGFRN++ GFP 엑소좀, ML RR-S2 CDA 로딩된 PTGFRN++ GFP 엑소좀, ML RR-S2 CDA 로딩된 PTGFRN++ GFP 탈시알릴화 엑소좀, ML RR-S2 CDA 로딩된 원상태 엑소좀으로, 모두 10 ng/㎕ ML RR-S2 CDA는 전달되는 총량이 20 ng이도록 하였다. 자유 ML RR-S2 CDA는 20 ng 및 2 ㎍ 둘 다로 마이크로주사하였다. CIVO 마이크로주사 4 및 24시간 후, 마우스를 바이오마커 분석을 위해 CO2 흡입을 사용하여 안락사시켰다.
조직학, 면역조직화학 및 원 위치 혼성화
재절제된 종양을 주사 칼럼과 수직인 2 ㎜ 두께 절편으로 절단하고, 48시간 동안 10% 완충 포르말린 중에 고정하였다. UV 조영을 사용하여 각각의 CIVO 부위에 주사된 FTM으로부터의 신호에 기반해서 CIVO 마이크로주사를 확인하였다. 이어서 2 ㎜ 두께 조직 절편을 표준 파라핀 포매를 위해 가공하였다. 4 ㎛ 두께 절편을 후술된 바와 같이 모든 조직학적 분석을 위해 사용하였다. 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 표준 방법을 사용하여 수행하였다.
면역조직화학
포르말린-고정, 파라핀 포매된 종양을 4 ㎛ 두께로 슬라이드 상에 절단했다. 슬라이드를 60℃에서 1시간 동안 베이킹하고, 자일렌 중에서 탈파라핀화하고, 등급 알코올을 통해 재수화하였다.
슬라이드로 100℃에서 20분 표적 회수 용액 인큐베이션을 거친 후 20분 동안 실온까지 냉각했다. 혈청 차단(TBST 중 5% 정상 염소 혈청)을 실온에서 1 hr 동안 수행하였다. 일차 항체 염색을 실온에서 하룻밤 동안 5% NGS TBS 희석제 중 적절한 일차 항체로 수행하였다. 대응하는 이소형 대조군이 각각의 배치에 첨가되었다. 이차 항체 염색을 실온에서 하룻밤 동안 5% NGS TBS 희석제 중 적절한 이차 항체로 수행하였다. 슬라이드를 10분 동안 DAPI로 카운터염색하고 Prolong Gold 실장 배지(Invitrogen)와 함께 커버슬립처리하였다. 염색된 슬라이드를 디지털, 자동화, 고해상 스캐너를 사용하여 이미지화하였다.
원 위치 혼성화를 RNAscope 멀티플렉스 형광 시약 키트 kit v2(Advanced Cell Diagnostics)를 사용하여 완료하였다. 포르말린-고정, 파라핀 포매된 종양을 4 ㎛ 두께로 슬라이드 상에 절단했다. 슬라이드를 60℃에서 1시간 동안 베이킹하고, 자일렌 중 탈파라핀화하고, 등급 알코올을 통해 재수화하였다. 과산화수소를 10분 동안 첨가하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭하였다. 슬라이드로 100℃에서 15분 표적 회수 용액 인큐베이션을 거친 후 40℃에서 15분 프로테아제 소화를 거쳤다. RNAscope ISH 검정을 마우스 Ifnb1 탐침(Advanced Cell Diagnostics) 및 TSA Plus Cyanine 5 검출(Perkin Elmer)로 완료하였다.　슬라이드를 10분 동안 DAPI로 카운터염색하고 Prolong Gold 실장 배지(Invitrogen)와 함께 커버슬립처리하였다. 염색된 슬라이드를 디지털, 자동화, 고해상 스캐너를 사용하여 이미지화하였다.
전체-슬라이드 스캐닝 및 이미지 분석
염색된 각각의 조직 절편으로부터의 모든 세포 이미지를 디지털, 자동화, 고해상 전조직 스캐닝(3D Histech Panoramic 250 Flash)에 의해 포착하였다. 종양 반응을 Presage의 맞춤형 CIVO 분석장치 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 각각의 조직 절편으로부터의 이미지 파일로부터 정량하였다. 슬라이드 스캐너에 의해 포착된 전조직 절편 이미지를 CIVO 분석장치에 의해 자동 가공하였다. 각각의 조직 절편으로부터의 각각의 세포를 핵(DAPI) 신호에 기반하여 분할하고 세포 프로필분석장치(Broad Institute)를 사용하여 바이오마커-음성 또는 -양성으로 분류하였다. 세포 분할 및 분류 후, 관심 원형 영역(ROI)을 각 위치에서 FTM 주위의 각각의 이미지에서 각각의 마이크로주사 부위 근처에 배치하였고, 가장 큰 ROI는 반지름 2000 ㎛ 이하였다. 바이오마커 측정에 대한 기존 괴사의 영향을 줄이기 위해, 대부분 무세포 종양 영역 내에 속하는 주사 부위는 정량 분석 전에 제외한다.
실시예 1: 엑소좀-캡슐화 STING 작용제
STING 작용제의 캡슐화
ML RR-S2 CDA 암모늄염(MedChem Express, Cat. No. HY-12885B) 및 (3-3 cAIMPdFSH; InvivoGen, Cat. No. tlrl-nacairs)을 포함하는 1 mM STING 작용제를 하룻밤 동안 37℃에서 300 ㎕의 PBS 중 정제된 엑소좀-(1E12개 총 입자)과 인큐베이션하였다. 이어서 혼합물을 PBS 중에 2회 세척하고 100,000 × g에서 초원심분리에 의해 정제하였다(도 1).
고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제의 정량
LC-MS 분석용 샘플 제조
모든 샘플을 인산염-완충 식염수(PBS) 완충액 또는 PBS 및 5% 수크로스 중에서 받았다. 분석 전에, 입자 농도(P/㎖)를 NanoSight NS300 상에서 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 측정하였다. 모든 표준 및 샘플은 각각의 주사가 실질적으로 동일한 수의 입자를 함유하도록 제조하였다. 이는 샘플의 최초 입자 농도에 따라, 1.0-4.0E+11 P/㎖의 최종 농도에 도달하도록 샘플 희석 및 표준 내로의 엑소좀 스파이크처리의 조합을 통해 달성하였다.
표준 곡선은 알려진 농도의 STING 작용제를 PBS 완충액 내로 스파이크처리한 후 일련의 희석을 통해 추가 표준을 제조함으로써 제조하였다. 별도 표준은 전형적으로 최종 농도(모든 샘플 제조 단계 후)가 25, 50, 250, 500, 1250, 2500, 및 5000 nM STING 작용제이도록 제조하였다. 먼저, 75.0 ㎕의 각각의 적절히 희석된 샘플 및 각각의 매트릭스-매칭 표준을 별도의 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브에서 제조하였다. 다음으로, 25.0 ㎕의 엑소좀 용해 완충액(60 mM 트리스, 400 mM GdmCl, 100 mM EDTA, 20 mM TCEP, 1.0% Triton X-100)을 각각의 튜브로 첨가한 후, 모든 튜브를 볼텍싱해서 혼합하고 짧게 원심분리하여 침강시켰다. 마지막으로, 1.0 ㎕의 농축된 프로티나제 K 효소 용액(Dako, reference S3004)을 각각의 튜브로 첨가하고, 다시 모든 튜브를 볼텍싱한 후 짧게 원심분리하고, 이어서 60분 동안 55℃에서 인큐베이션하였다. LC-MS 상으로의 주입 전에, 샘플이 실온으로 냉각되도록 하고 HPLC 바이알로 옮겼다.
LC-MS 분석
20.0 ㎕의 표준 및 샘플을 클린업 과정 없이 UltiMate 3000 RSCLnano(Thermo Fisher Scientific) 저-플로우 크로마토그래피 시스템 내로 그대로 주입하였다. 분석물질의 분리는 Phenomenex Kinetex EVO C18 코어-셸 분석용 칼럼(50 × 2.1 ㎜, 2.6 ㎛ 입자 크기, 100 Å 포어 크기) 및 500 ㎕/분의 유속으로 이동상 A(MPA: 물, 0.1% 포름산) 및 이동상 B(MPB: 아세토니트릴, 0.1% 포름산)의 구배를 전달하는 로딩 펌프를 사용해서 수행하였다. 구배를 2% MPB로 시작하고, 이를 2분 동안 유지하여 STING 작용제 분석물질을 로딩하고 탈염시켰다. 이어서 MPB 백분율을 3분에 걸쳐 2%에서 30%로 증가시켜 STING 작용제 분석물질을 용출하였다. 이어서 MPB 백분율을 1분에 걸쳐 30%에서 95%로 증가시키고, 3분 동안 95%에서 유지하고, 1분에 걸쳐 95%에서 2%로 감소시킨 후 다시 3분 동안 2%에서 유지하여 칼럼을 재-평형화하였다. 방법을 위한 전체 수행시간은 13분이었고, LC 흐름은 2.5-4.5분 간만 MS 내로 직접 유도하였다. 전형적인 잔존은 이전 주입 피크 면적의 0.05% 미만이었고, 이에 따라 분석 주입 간에 블랭크 주입은 수행하지 않았다.
질량 분석을 Ion Max 소스 및 음이온 모드로 작동하는 HESI-II 탐침을 갖는 Q Exactive Basic(Thermo Fisher Scientific) 질량 분광측정계로 수행하였고, 질량 스펙트럼을 AGC 표적 1E+6 이온, 최대 주입 시간 200 ms, 및 해상도 35,000으로 500-800 Da을 스캐닝하는 전체 MS - SIM 모드로 수집하였다. STING 작용제 정량은 688.97-689.13 Da의 m/z 범위 내의 모든 이온을 선택적으로 추출한 후, 3.80-3.90분의 유지 시간으로 생성 피크를 적분하여 단일동위원소 -1 STING 작용제 피크를 사용해서 수행하였다. 주어진 샘플에서 STING 작용제의 농도는 그 샘플 내 STING 작용제 피크 면적을 표준에 의해 생성된 STING 작용제 피크 면적과 비교하여 결정하였고, 이는 전형적인 상대 정량이다.
실시예 2: 엑소좀에 로딩된 STING 작용제의 증가된 역가
엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제를 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서의 활성에 대해 평가하였다. PBMC를 15분 동안 1000 × g에서 Lymphoprep층 상에서 원심분리에 의해 신선 인간 혈액으로부터 단리하였다. 생성 백혈구연층을 PBS 중에 세척하고 계수하였다. PBMC를 96-웰 U-형 바닥 플레이트에 접종하였다. 엑소좀-캡슐화된(Exo-STING 작용제) 또는 자유 STING 작용제의 적정을 별도의 U-형 바닥 플레이트에 제조하여 용량-반응 연구를 수행하였다. 엑소좀-캡슐화 또는 자유 STING 작용제를 PBMC에 첨가하고 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액 중 IFNβ의 양을 측정하여 STING 작용제에 의한 PBMC의 일반적 활성화를 검출하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 자유 STING 작용제 및 Exo-STING 작용제가 모두 유사한 정도로 최대 IFNβ를 유도하였다. 흥미롭게도, Exo-STING 작용제의 EC50은 자유 STING 작용제에서보다 약 65배 더 낮아, 엑소좀이 STING 작용제 활성의 역가를 증가시킬 수 있음을 제시하였다. PBMC에서 어느 세포 유형이 Exo-STING 작용제에 의해 차별적으로 영향받는지를 이해하기 위해, 단핵구 및 수지상 세포 활성화를 측정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Exo-STING 작용제 처리된 세포에서는 최대 단핵구 활성화가 약화된 반면, EC50은 자유 STING 작용제에 비해 개선되었다. 대조적으로, 골수 수지상 세포(mDC)의 최대 활성화는 더 큰 반면, EC50의 역가 개선을 경험하였다(도 4). mDC 및 단핵구 활성화를 자유 STING 작용제 또는 Exo-STING 작용제로의 처리 후 13명의 공여체로부터의 PBMC에서 측정하였고, 자유 STING 작용제에 비해 최대 mDC 활성화는 유의미하게 더 큰 반면 최대 단핵구 활성화는 Exo-STING 작용제로 유의미하게 약화되었다(도 5). 이들 결과는 PBMC의 맥락에서, 골수 수지상 세포의 일부만 활성화되었음을 실증한다. 추가 화합물의 첨가가 활성화량을 증가시키지 않으므로, 상기 결과는 포화 가능하며 단독 STING 작용제의 한계를 예시한다. 대조적으로, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제는 유의미하게 더 큰 비율의 골수 수지상 세포를 활성화하였다. 단핵구는 STING 작용제 단독에 의해 강력히 활성화되어 90% 초과가 마이크로몰 농도의 작용제로 활성화되었다. 그러나, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제는 유의미하게 더 적은 비율의 단핵구가 활성화되도록 유도하였다. 단핵구가 순환에서 골수 수지상 세포보다 훨씬 더 풍부하므로, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제에 의한 단핵구의 더 낮은 활성화 프로필은 동량의 자유 화합물에 비해 감소된 전신 염증을 일으킬 수 있다. 또한, 종양에 대한 적응 면역 반응의 개시는 대부분 수지상 세포 활성화에 의존한다; 따라서, 엑소좀-캡슐화 STING 작용제는 단독 화합물에 비해 감소된 독성으로 증가된 항-종양 면역 반응을 야기할 수 있을 것이다.
상이한 면역 세포 유형이 STING 작용제에 의해 활성화되는 정도를 이해하기 위해, 유세포측정에 의해 세포 표면 상의 CD69의 양을 측정하여 T 세포, B 세포, 및 NK 세포의 특이적 활성화를 평가하였다. 유세포측정에 의해 세포 표면 상의 CD80, CD86, HLA-DR, 또는 CD83의 양을 측정하여 단핵구, 골수 수지상 세포, 형질세포양 수지상 세포, 및 B 세포를 포함하는 항원-제시 세포(APC)의 활성화를 평가하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 자유 STING 작용제는 2명의 상이한 공여체로부터의 단핵구, NK 세포, B 세포, 및 CD8 T 세포를 쉽게 활성화하였다. 대조적으로, Exo-STING 작용제는 B 세포 및 T 세포의 활성화를 감소시킨 반면, 항원 제시 세포의 활성화는 유지하였다(도 7a 및 7b). 이들 결과는 항원 제시 세포가 T 세포 및 B 세포의 활성화를 감소시키면서 STING 작용제 로딩된 엑소좀에 의해 특이적으로 활성화될 수 있고, 전신 독성을 제한할 수 있음을 제시한다.
실시예 3: PTGFRN 과발현 및 엑소좀 글리칸 변형에 의한 STING 엑소좀 활성의 증강
실시예 1 및 2에서의 결과는 엑소좀 표면 분자가 자유 STING 작용제에 비해 Exo-STING 작용제의 증가된 역가를 매개할 수 있음을 제시한다. 이전 결과는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성적 조절제(PTGFRN)가 엑소좀의 내강 또는 외부 표면 상에 풍부한 당단백질임을 실증하였다. PTGFRN이 생산체 세포에서 과발현되는 경우, PTGFRN은 엑소좀의 내강 또는 외부 표면 상에 우세한 당단백질이다. PTGFRN이 면역 세포의 Exo-STING 작용제 활성화의 매개에서 역할을 담당했는지를 결정하기 위해, 글리칸 프로필이 변형되거나 더 큰 수준의 PTGFRN을 발현하도록 조작된 엑소좀을 자유 STING 작용제와 비교하였다. 도 2에서의 결과와 유사하게, Exo-STING 작용제는 PBMC에서 IFNβ 생산의 최대 수준을 변경하지 않고 자유 STING 작용제에 비해 IFNβ 생산 유도에 있어서 더 강력하였다. PNG아제 F로 먼저 탈글리코실화된 엑소좀 내로 로딩된 STING은 상기 역가 변화를 추가 증강시킨 반면, 시알리다제로 먼저 탈시알릴화된 엑소좀에서의 STING 작용제의 전달은 역가의 추가 증강 및 더 큰 최대 수준의 IFNβ 생산을 유도하여, 엑소좀의 글리칸 변형이 면역 세포에 대한 STING 작용제 분자의 전달을 변경할 수 있음을 시사하였다. 놀랍게도, PTGFRN을 과발현하고 STING 작용제가 로딩된된 엑소좀은 내인성 수준의 PTGFRN을 함유하는 변형되지 않은 또는 글리칸 조작된 엑소좀에 비해 역가 및 IFNβ의 최대 생산을 추가 증강시켰다. PTGFRN Exo-STING 샘플의 탈글리코실화 또는 탈시알릴화는 단독 PTGFRN을 과발현하는 엑소좀의 효과를 넘어서서 역가를 추가 증강시켰다(2명의 공여체에서의 도 8a 및 8b). STING 작용제 전달의 결과로서 IFNβ의 수준 정량은 글리칸 변형된 PTGFRN 과발현 엑소좀이 STING 작용제의 역가를 자유 STING 작용제에 비해 1000배 초과, 그리고 변형되지 않은 엑소좀에 로딩된 STING 작용제에 비해 약 50배 증강시킬 수 있음을 실증한다(도 9).
도 9에서의 결과는 엑소좀 상에서 글리칸 조작 및 PTGFRN 과발현의 조합이 STING 작용제 분자의 면역 세포로의 전달을 증강시킬 수 있음을 실증한다. 이들 변형이 PBMC에서 특정 세포 유형의 활성화에 대해 갖는 영향을 이해하기 위해, 도 9에 나타낸 STING 작용제 로딩된 엑소좀 제조물을 이의 단핵구 및 수지상 세포의 활성화에 대해 평가하였다. 도 10은 STING 작용제 로딩된 엑소좀의 글리칸 변형 및/또는 PTGFRN 과발현이 EC50에 의해 측정된 바와 같이 단핵구 활성화의 증가된 역가를, 그러나 2명의 공여체에서 감소된 또는 변화되지 않은 수준의 최대 활성화를 유도함을 실증하였다(도 10). 단핵구 활성화의 EC50에서의 변화는 자유 STING 작용제에 비해 탈시알릴화 PTGFRN 과발현 엑소좀에 있어서 최대 54,000배였다(도 11). 대조적으로, 자유 STING 작용제는 2명의 공여체에서 mDC를 불량하게 활성화한 반면, 글리칸 조작된 및/또는 PTGFRN 과발현 엑소좀은 mDC의 EC50 및 최대 활성화를 크게 증강시켰다(도 12). 탈시알릴화 PTGFRN 과발현 STING 작용제 엑소좀에 있어서 mDC에 대한 EC50의 변화는 16,000배 초과인 반면(도 13), 최대 활성화는 약 4-10배 더 컸다. 중요하게는, 상술된 LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 STING 작용제 정량이 엑소좀 제조물에 걸쳐 STING 작용제의 정상화를 허용하였으므로, 이들 실험에서 관찰된 효과는 PTGFRN 과발현 또는 글리칸 조작된 엑소좀에 있어서 증강된 로딩 효율로 인한 것이 아니었다. 실제로, PTGFRN 과발현 및/또는 글리칸 조작된 엑소좀은 변형되지 않은 엑소좀보다 입자 당 기준으로 덜 효율적으로 로딩된다(도 14). 종합하면, 이들 결과는 특정 글리칸 변형 및/또는 단일 엑소좀 표면 단백질의 과발현이 STING 작용제 로딩된 엑소좀의 역가를 크게 증강시키고 수지상 세포로의 화물 전달의 선택성을 증강시킬 수 있음을 실증한다.
STING 활성화를 조절하기 위한 키푸넨신 전-처리
엑소좀 표면 글리칸의 임의의 교란이 면역 세포 흡수를 변경할 수 있는지를 결정하기 위해, 생산체 세포주를 알칼로이드 제제 키푸넨신으로 처리하였고, 이는 단백질 글리코실화 동안 고-만노스 당 잔기의 가공을 방지하고, 완전 글리코실화를 방지한다. 키푸넨신-처리 세포로부터 생성된 엑소좀은 변경된 글리코실화 상태를 가지며, 고-만노스가 농축된다. 키푸넨신-처리 엑소좀에 STING 작용제를 로딩하고 2명의 공여체로부터의 PBMC에 투여하였다. 이는 야생형 엑소좀 대비 STING 작용성 활성의 부분적 약화를 일으켰다. 구체적으로, 단핵구 및 mDC 활성화는 대부분 변화되지 않은 반면(각각 도 16 및 17), IFNβ 생산은 크게 감소되었다(도 15). 이들 결과는 특정 글리코실화 패턴이 면역 세포에서의 엑소좀 흡수를 적어도 부분적으로 매개하며, 표면 당단백질의 모든 변형이 STING 작용제 분자의 엑소좀-매개 전달 동안 면역 세포의 활성화를 증강시킬 수는 없음을 제시한다.
실시예 4: STING 작용제로의 엑소좀 로딩 최적화
이전 실시예에서, 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하여 엑소좀에 STING 작용제를 로딩하였다. STING 작용제 로딩의 역학을 결정하기 위해, 엑소좀을 2시간, 6시간, 또는 하룻밤 동안 1 mM STING 작용제와 인큐베이션하고, PBMC에 첨가하여 IFNβ 생산을 측정하였다. 도 18a 및 18b에 나타낸 바와 같이, 로딩되지 않은 엑소좀은 IFNβ 생산을 유도하지 못한 반면, 2시간 동안 STING 작용제 중 인큐베이션된 엑소좀은 IFNβ 생산을 유도하지 못했거나 상대적으로 저수준을 유도하였다. 6시간 동안 로딩된 샘플은 중간 IFNβ 생산을 일으킨 반면, 하룻밤 동안의 로딩은 2명의 공여체에서 가장 큰 수준의 IFNβ 생산을 일으켰다. 이들 결과는 엑소좀 내로의 STING 작용제 로딩이 인큐베이션 시간 증가에 의해 증강될 수 있음을 시사한다.
실시예 5: 상이한 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 고리형 디뉴클레오타이드의 비교 역가
PTGFRN을 과발현하는 HEK293SF 세포를 진탕 플라스크에서 성장시키고 생성 엑소좀을 방법에 기재된 바와 같이 Optiprep™ 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 엑소좀에 실시예 1에서의 방법에 따라 STING 작용제 ML RR-S2 CDA(MedChem Express, Cat. No. HY-12885B) 또는 3-3 cAIMPdFSH(InvivoGen, Cat. No. tlrl-nacairs)를 로딩하였다. 로딩을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정량하였다. 엑소좀-캡슐화 또는 자유 STING 작용제를 인간 PBMC에 첨가하고 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액 중 IFNβ의 양을 측정하여 STING 작용제에 의한 PBMC의 활성화를 검출하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 두 자유 STING 작용제는 모두 유사한 정도로 IFNβ를 유도한 반면, 두 엑소좀-캡슐화 STING 작용제는 모두 실시예 2에 나타낸 바와 같이 역가 변화를 일으켰다. 그러나 엑소좀-캡슐화 3-3 cAIMPdFSH가 엑소좀-캡슐화 ML RR-S2 CDA보다 강력하여, 불소화된 STING 작용제가 엑소좀 제형으로 전달되는 경우 역가 장점을 제공할 수 있음을 제시하였다.
실시예 6: 종양-보유 마우스에서 엑소좀-캡슐화 STING 작용제에 비해 자유 STING 작용제의 생체내 역가 및 전신 효과
4개 군의 C57BL/6 마우스(군 당 3-4 마리 마우스)에 5×105 B16F10 종양 세포를 피하 접종하였다. 접종 8일 후, 마우스에 단회 종양내 용량의 PBS, 20 ㎍의 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍의 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 PTGFN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍의 ML RR-S2 CDA(exo ML RR-S2 CDA)를 주사하였다. 주사 4시간 후, 종양, 배액 림프절, 비장, 및 혈청을 수집하고 사이토카인 수준을 측정하였다. 종양에서의 IFNβ 유전자 발현 수준은 20 ㎍ 자유 STING 작용제 및 0.2 ㎍ 엑소좀-STING 작용제군에서 필적하였고, 이는 둘 다 0.2 ㎍ 자유 STING 작용제 및 PBS군에서보다 높았다(도 20a). 추가적으로, IFNγ 및 T-세포 화학유인인자 CXCL9 및 CXCL10의 수준은 모두 엑소좀-STING 작용제군에서 더 높았다(도 20b, 20c, 및 20d). 이들 데이터는 STING 작용제가 엑소좀에 캡슐화되는 경우, 100배 더 적은 STING 작용제가 필적하는 IFN 유전자 발현 특징부의 유도를 종양에서 유도할 수 있음을 실증한다.
STING 작용제는 매우 강력한 전-염증성 분자이며, 이들 화합물의 하나의 잠재적인 임상적 책임은 종양 주사 부위를 탈출하여 순환 내로 확산되는 자유 화합물로 인한 이의 전신 독성의 유도이다. 엑소좀-STING 작용제-처리 종양 보유 마우스의 배액 림프절은 농도-매칭 자유 STING 작용제군에 비해 필적하거나 약간 상승된 IFNβ(도 21a), CXCL9(도 21b), 및 CXCL10(도 21c) 유전자 발현을, 그러나 100배 더 큰 자유 STING 작용제 처리군에 비해 크게 감소된 발현 수준을 나타내었다. 이들 결과는 비장(도 22a, 22b, 및 22c) 및 혈청(도 23a-23e)에서 더 극적이었으며, 혈청은 어느 하나의 자유 STING 작용제군에 비해 엑소좀-STING 작용제군에서 전염증성 사이토카인 IFNβ(도 23a), TNF-α(도 23b), 및 IL-6(도 23c)에서의 현저한 감소를 나타내었다.
도 20-23에서 관찰된 효과가 다른 STING 작용제에 적용 가능함을 확인하기 위해, B16F10 피하 종양-보유 마우스에 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.2 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH(exo 3-3 cAIMPdFSH)를 주사하였다. 종양(도 24a-24d), 배액 림프절(도 25a-25d), 비장(도 26a-26d), 및 혈청(도 27a-27d)에서의 사이토카인 수준을 측정하고 ML RR-S2 CDA에 있어서 도 20-23에 나타낸 결과와 유사한 발현 패턴을 나타내었다. 종합하면 이들 결과는 엑소좀-캡슐화 STING 작용제가 생체내 종양내 주사 후 100배 더 큰 자유 STING 작용제에 필적하는 강력한 IFN 유전자 발현 특징부를 유도할 수 있고 상기 필적하는 유전자 발현 패턴이 대부분 종양 미세환경에 제한되며 자유 STING 작용제로 관찰된 바와 같은 전신 염증 신호를 일으키지 않음을 실증하였다. 추가적으로, 이들 효과는 2개의 상이한 STING 작용제로 관찰되어, 종양으로 STING 작용제를 전달하기 위해 엑소좀을 사용하는 광범위한 적용 가능성을 실증하였다.
실시예 7: 종양-보유 마우스에서 자유 STING 작용제 및 엑소좀-캡슐화 STING 작용제의 종양내 및 복강내 투여 후 STING 경로의 비교 국소 및 전신 활성화
5개 군의 C57BL/6 마우스(군 당 n=4마리 마우스)에 5×105 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하였다. 접종 8일 후, 마우스에 단회 용량의 PBS, 20 ㎍ ML RR-S2, 0.2 ㎍ ML RR-S2, PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍ ML RR-S2(Exo STING IP)를 복강내(IP), 또는 단회 용량의 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍ ML RR-S2(Exo STING IT)를 종양내(IT) 주사하였다. 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 제형을 실시예 1에 기재된 바와 같이 로딩하고 정량하였다. IP 주사된 고용량 자유 STING 작용제는 PBS-처리군을 초과하여 종양, 췌장, 및 비장에서 IFNβ 발현을 유도하였다. 100배 더 적은 용량의 Exo STING IP는 고용량 자유 STING에 비해 췌장(도 29a) 및 비장(도 30a)에서 더 우수한 IFNβ 발현 및 종양에서 감소된 IFNβ 발현(도 28a)을 야기하였다. CXCL9 및 CXCL10 발현은 이들 두 군 간에 종양(도 28b-c) 및 비장(도 30b-c)에서 유사했으나 Exo STING IP군에서는 췌장에서 증강되었다(도 29b-c). Exo STING IT는 다른 군에 비해 종양에서 훨씬 더 큰 STING 경로 활성화를 나타내었으나, Exo STING IP 또는 고용량 자유 STING 작용제군에 비해 비장에서 강력한 발현 변화를 야기하지 않았고, 고용량 자유 STING 작용제에 비해 췌장에서 유사한 발현을 나타내었다. 췌장 및 비장에서, STING 경로 활성화는 농도-매칭 저용량 자유 STING 작용제에 비해 Exo STING IP에 의해 일관되게 증강되어, 엑소좀 캡슐화된 STING 작용제에 대한 역가 증가를 확인시켜주었다. 중요하게는, Exo STING IP는 췌장 및 비장에서 100배 더 큰 용량의 자유 STING 작용제에 비해 필적하거나, 일부 경우에서는, 증가된 역가를 야기하였다. 이들 결과는 저용량에서 STING 작용제-로딩 엑소좀의 국소 IP 투여가 췌장을 포함하는 조직에서 강력한 면역 반응을 유도할 수 있음을 제시하여, 췌장암 및 다른 복강암을 치료하기 위한 국소 투여에 대한 기회를 제시한다.
실시예 8: 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 및 자유 STING 작용제를 이용한 생체내 나이브 마우스에서의 차별적 STING 경로 신호전달
나이브 C57BL/6 마우스에, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화되고 정량된 단회 용량의 PBS, 20 ㎍ ML RR-S2, 0.2 ㎍ ML RR-S2, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍ ML RR-S2(Exo STING)을 복강내(IP) 주사하였다(군 당 n=5마리 마우스). 폐, 비장, 췌장, 및 혈청을 주사 4시간 후 단리하고 유전자 발현 및 사이토카인 생산에 대해 분석하였다. IFNβ, CXCL9, 및 CXCL10 발현은 100배 더 큰 용량의 자유 STING 작용제를 수여받은 마우스에 비해 Exo STING-처리 마우스의 폐(도 31a-c) 및 비장(도 32a-c)에서 크게 더 큰 반면, 췌장 유전자 발현 프로필은 이들 두 군 간에 유사하였다(도 33a-c). 유사하게, Exo STING-처리 마우스에서의 혈청 사이토카인 수준은 100배 더 큰 용량의 자유 STING 작용제로 처리된 마우스 이상이었다(도 34a-g). 종합하면, 이들 결과는 STING 작용제가 로딩된 엑소좀이 동량의 자유 STING 작용제에 비해 생체내 STING 경로의 유의미하게 더 강력한 활성화제이며, 이에 따라 엑소좀-로딩 STING 작용제가, 특히 고용량의 자유 STING 작용제의 전신 독성 감소 및 T-세포 화학유인인자의 발현 증강의 맥락에서, 차별화된 치료 적용을 제공할 수 있음을 실증한다.
이전 연구와 유사한 두 번째 실험을 단회 용량의 IP 투여로 수행하였고, 24시간까지 연장하였다. 복강 세포 및 비장세포를 처리된 마우스로부터 단리하고, 세포 활성화를 CD86의 검출에 의해 측정하였다. 고용량 자유 STING 작용제는 복강 B 세포, 대식구, 단핵구 및 통상적 수지상 세포(cDC)의 활성화를 일으킨 반면, 100배 더 적은 용량의 Exo STING은 대식구의 더 큰 활성화, cDC의 유사한 활성화, 및 B-세포 및 단핵구의 약화된 활성화를 유도하였다(도 35). 비장에서, 고용량 STING 작용제는 중등도 수준의 면역 세포 활성화를 유도한 반면, 100배 더 적은 용량의 Exo STING은 더 큰 대식구 및 T-세포 활성화, 및 크게 더 큰 cDC 활성화를 유도하여, 생체내 cDC 및 대식구에서의 엑소좀에 대한 세포-유형 흡수/전달 선호를 제시하였다(도 36). 이들 결과는 STING 작용제가 로딩된 엑소좀이 STING 경로-유도 항-종양 및 항-병원체 반응의 일차적 매개체인, 항원 제시 세포에서 생체내 특이적 세포 반응을 유도할 수 있음을 실증한다.
실시예 9: 흑색종의 쥣과 모델에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 비교 생체내 유효성
이전 실시예의 결과는 Exo STING이 동량 이상의 가용성 STING 작용제보다 더 강력한 항-종양 제형일 수 있음을 제시한다. 상기 가설을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에 5×105 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하였다(군 당 n=5마리 마우스). 접종 5, 8, 11일 후, 마우스에 PBS, 20 ㎍ ML RR-S2, 0.2 ㎍ ML RR-S2, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍ ML RR-S2를 종양내 주사하고 종양 부피를 39일까지 매일 측정하고, 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하였을 때 동물을 희생시켰다. PBS 대조군에 비해, 0.2 ㎍ 자유 STING 작용제로의 처리 후 종양 성장이 중등도 강화되었고 25일째에 20 ㎍ 자유 STING 작용제로의 처리 시 거의 완전히 제거되었다. 놀랍게도, 0.2 ㎍의 Exo STING으로의 처리는 25일째에 농도-매칭 자유 STING 작용제군에 비해 크게 개선되고 고용량 자유 STING 작용제군에서와 유사한 정도로 종양 퇴행을 일으켰다. 특히, Exo STING 및 고용량 자유 STING 작용제로의 처리는 각 군에서의 5마리 동물 중 3마리에서 완전 반응(주사 부위에서의 검출 불가능한 종양으로 정의됨; CR)을 야기하였다(도 37a-e). 도 37a는 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며, 도 37b-d는 각각의 처리군에서 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다.
STING 경로 활성화는 메모리 T-세포 모집 및 궁크게 오래 지속되는 적응 면역 반응을 야기한다. 본 연구에서의 항-종양 효과가 면역 반응을 야기했는지를 결정하기 위해, 고용량 STING 작용제 및 Exo STING 군에서의 5마리 동물에 반대쪽 넙다리 상에 5×105 B16F10 세포를 이식하여 21일째에 재유발접종하였다. 5마리의 추가적인 나이브 마우스에 동일한 종양 세포 제조물을 접종하고 매일 PBS로 처리하여 세포 생활성 및 성장 역학을 확인하였다. 39일경(유발접종 18일 후) PBS군의 모든 마우스를 희생시켰다. 고용량 자유 STING 작용제군으로부터의 동물에서의 종양은 5마리 동물 중 4마리에서 성장하지 못했고, 특히 Exo STING군에서의 모든 5마리 마우스에서는 종양 성장이 검출 불가능했다(도 38a-d). 도 38a는 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며 도 38b는 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다. 도 38c는 각각의 처리군에서의 생존율을 나타낸다. 특히, Exo STING군에서의 2마리 동물은 원발성 종양에서 치료에 대해 불응성이었으나, 이들 동물은 재유발접종 부위에서 종양 성장을 나타내지 않아, 엑소좀에 로딩된 STING 작용제에 의해 매개된 면역 반응의 강력함을 실증하였다(도 37a-e 및 38a-c).
실시예 10: 흑색종의 쥣과 모델에서 STING 작용제-로딩 엑소좀의 용량-의존적 항-종양 반응
실시예 9에서의 결과는 Exo STING이 100배 더 큰 용량의 자유 STING 작용제와 유사한 정도로 생체내 항-종양 효과를 유도할 수 있음을 실증한다. 주사된 용량의 Exo STING 및 종양 성장 간 상관간계를 결정하기 위해, 생체내 용량-적정 실험을 수행하였다. C57BL/6 마우스에 5×105 B16F10 쥣과 흑색종 세포(군 당 n=5마리 마우스)를 피하 접종하였다. 접종 6, 9, 및 12일 후, 마우스에 PBS 및 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 200 ng, 40 ng, 또는 8 ng의 ML RR-S2)를 종양내 주사하였다. 종양 부피를 18일까지 매일 측정하고, 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하였을 때 동물을 희생시켰다. 18일경 PBS 대조군에서의 5마리 마우스 중 4마리가 희생된 반면, 연구 과정 동안 어떤 군에서도 Exo STING-처리 마우스는 희생되지 않았다. 200 ng Exo STING군에서 2개의 완전 반응 및 40 ng Exo STING군에서 하나의 완전 반응이 있었다. 놀랍게도, PBS군에 비해 8 ng Exo STING군에서 종양 성장의 실질적 감소가 존재하여, 매우 저용량 Exo STING이 공격적 종양 모델에서 측정 가능한 약리학적 효과를 가질 수 있음을 실증하였다(도 39 및 40a-d). 도 39는 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며 도 40a-d는 각각의 처리군에서 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다. 저 나노그램 용량의 STING 작용제는 더 큰 용량(10-100마이크로그램)으로 관찰되는 해로운 전신 독성을 유도하지 않을 것이므로, 이에 따라 다른 종양학 또는 면역-종양학 제제(예를 들어, PD-1, PD-L1, 및/또는 CTLA-4에 대한 치료 항체)와의 조합 치료법을 위한 매력적인 기회일 수 있다. 특히, 200 ng 및 40 ng Exo STING군에 대한 종양 성장 곡선이 필적하여, 중간 용량이 오래 지속되는 면역 반응을 유도하기 충분할 수 있으며 Exo STING이 종양내 주사를 위해 STING 작용제의 용량을 100-1,000배만큼 감소시키는 치료 기회를 제공할 수 있음을 제시하였다.
실시예 11: 자유 STING 작용제 및 STING 작용제-로딩 엑소좀에 의한 항원-특이적 T-세포 반응의 유도
수지상 세포에서 STING 경로 작용성은 항원 제시, IFNβ 생산을 증강시키며, CD8+ 메모리 T-세포를 모집하여 오래 지속되는 적응 면역 반응을 유발한다. Exo STING이 정의된 항원에 대해 메모리 T-세포 반응을 유도할 수 있는지를 결정하기 위해, 항원-특이적 T-세포 반응 연구를 정제된 오발부민(OVA)을 사용하여 수행하였다. 실험 개요의 다이어그램을 도 41a에 나타낸다. C57BL/6 마우스에 PBS, 20 ㎍ ML RR-S2, 0.2 ㎍ ML RR-S2, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍ ML RR-S2와 혼합된 200 ㎍ OVA를 복강내 주사하였다(군 당 n=4-10마리 마우스). 주사 6일 후, 비장 및 장간막 림프절을 수집하고, 단세포 현탁액으로 균질화하고, 살아있는 림프구를 밀도 원심분리에 의해 농축하였다. OVA 펩타이드 SIINFEKL 및 피코에리트린(PE)에 결합된 고정화된 사량체 MHC 클래스 I(iTAg 사량체/PE - H-2 OVA; MBL® Code # T03000)에 대한 결합을 측정하여 유세포 측정에 의해 단리된 림프구를 분석하였다. OVA-반응성 메모리 T-세포를 PE, CD44, 및 CD8 양성에 대한 관문화에 의해 정량하였다. PBS, 저용량 자유 STING 및 원상태 엑소좀에 비해 고용량 자유 STING 작용제 및 Exo STING군에서 비장(도 41b) 및 장간막 림프절(도 41c)에서 더 큰 비율의 OVA-반응성 T-세포가 검출되었다. Exo STING과 농도-매칭된 저용량 STING 작용제는 비장에서 활성을 나타내지 않았고 장간막 림프절에서 중등도 반응만을 나타내어, 엑소좀에 로딩된 STING 작용제에 있어서 역가의 명확한 증가를 실증하였다. 변형되지 않은 엑소좀이 처리된 마우스는 면역 반응을 나타내지 않아, 실험 과정에 걸쳐 경시적으로 엑소좀만으로는 비-면역원성임을 실증하였다.
항원-특이적 면역성을 측정하기 위한 교차 방법으로서, IFNγ 발현을 표준 프로토콜에 따라 ELISpot에 의해 측정하였다(ImmunoSpot®; Cellular Technology Limited). 비장세포를 단세포 현탁액으로 균질화하고 항-IFNγ 항체가 코팅된 플레이트에 접종하였다(200,000 세포/웰). OVA 펩타이드 SIINFEKL을 18시간 동안 세포에 첨가하여 IFNγ 생산을 유도하고, 세포를 플레이트로부터 세척하고, 플레이트-결합 IFNγ를 교차 항체를 사용하여 검출하였다(도 41d). 플레이트 당 반응성 스팟의 총 수를 계수하고 ImmunoSpot® 소프트웨어(Cellular Technology Limited)를 사용하여 군들에 걸쳐 비교하였다. PBS, 엑소좀 단독(EV), 및 저용량 STING 작용제군은 매우 저수준의 OVA-반응성을 나타내었다. 고용량 STING 작용제 및 Exo STING군은 모두 고반응성으로, 상기 군에서 STING 작용제의 100배 더 적은 용량에도 불구하고 Exo STING군에서 더 큰 반응성을 가졌다(도 41e). 이들 결과는 Exo STING이 종양학 및 감염성 질환에서의 적용을 위해 면역 반응을 유발하는 데 있어서 차별화된 치료 기회일 수 있음을 실증한다.
실시예 12: 쥣과 T-세포 림프종 모델에서의 항-종양 유효성 및 항원-특이적 면역 반응
실시예 9 및 10에 나타낸 생체내 유효성 결과 및 실시예 11에 나타낸 면역 반응 유도는 Exo STING이 생체내 항원-특이적 종양-사멸 반응 및 후속 면역 반응을 유도하기 충분할 수 있음을 제시한다. 상기 가설을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에 OVA를 안정적으로 발현하고 마우스에서 항원-특이적 T-세포 반응을 모델링할 수 있도록 조작된 쥣과 T-세포 림프종 세포주인 1×106 E.G7-OVA 세포(ATCC®; CRL-2113™)를 피하 접종하였다(군 당 n=5마리 마우스). 접종 10, 13, 및 16일 후, 마우스에 PBS, 20 ㎍ ML RR-S2, 0.2 ㎍ ML RR-S2, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍ ML RR-S2)를 종양내 주사하였다. B16F10 모델에서 관찰된 효과와 유사하게(도 37-38, 실시예 9), 저용량 자유 STING 작용제는 종양 성장을 중증도로 약화시킨 반면, 고용량 자유 STING 작용제 및 Exo STING은 PBS군에 비해 종양 성장을 크게 방지하였다(도 42 및 43a-d). 도 42는 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며 도 43a-d는 각각의 처리군에서 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다. 모든 군으로부터 비장 T-세포를 단리하고 실시예 11에 기재된 바와 같이 OVA-특이적 반응성에 대해 측정하였다. 저용량 자유 STING 작용제는 중등도 메모리 T-세포 반응을 유도한 반면, 고용량 자유 STING 작용제 및 Exo STING은 모두 강력한 메모리 T-세포 반응을 유도하였다(도 43e). 이들 데이터는 엑소좀에 로딩된 STING 작용제가 100배 더 큰 자유 화합물에 비해 필적하는 항-종양형성 및 메모리 T-세포 반응을 생체내에서 동시에 유도할 수 있음을 실증한다.
실시예 13: PTGFRN-과발현 엑소좀이 원상태 엑소좀에 비해 STING 작용제의 안정성을 증강시킴
HEK293SF 세포로부터의 엑소좀(원상태 exo STING) 및 PTGFRN-GFP를 과발현하는 HEK293SF 세포로부터의 엑소좀(PTGFRN exo STING)에 ML RR-S2를 로딩하고, 정제하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 정량하였다. 원상태 exo STING 및 PTGFRN exo STING의 신선 샘플은 1명의 공여체로부터의 PBMC에서 유사한 IFNβ 수준을 유도하였고, 둘 다 자유 STING 작용제에 비해 역가 증강을 제공하였다(도 44a). 엑소좀-STING 작용제 제형의 분취물을 7일 동안 -80 C에 냉동하고, 해동하고, PBMC에 첨가하였다. PTGFRN exo STING은 신선 제조물과 유사한 IFNβ 생산 프로필을 유도한 반면, 원상태 exo STING은 둔화된 IFNβ 발현 프로필을 유도하였고, 자유 STING 작용제 또는 PTGFRN exo STING에 비해 크게 감소된 Cmax를 가졌다(도 44b). PTGFRN exo STING에 대한 역가 손실은 원상태 exo STING에 대한 역가 손실에 비해 중등도였다(도 44c).
PTGFRN exo STING의 신선 및 냉동 제조물을 PBMC와 인큐베이션하고, DC, NK 세포, 및 단핵구에 대한 세포 흡수 프로필을 세포-특이적 표면 마커 및 GFP 양성에 의해 측정하였다. 신선(도 45a-45b) 및 냉동(도 45c-45d) PTGFRN exo STING 간 흡수 프로필에는 차이가 없어서, 1사이클의 냉동-해동이 엑소좀 흡수를 손상시키지 않음을 시사하였다. 이들 결과는 PTGFRN 과발현이 장기 보관 및 STING 작용제가 로딩된 치료 엑소좀의 제형화에 더 적합할 수 있음을 실증한다.
실시예 14: STING 작용제-로딩 엑소좀의 종양내 투여에 의한 보호 면역성의 유도 및 전이의 감소
STING 경로의 활성화는 실시예 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 항원 제시를 촉진하고 오래 지속되는 T-세포 반응을 유도한다. 따라서, EXOSTING™에 의해 유도된 면역 메모리 반응은 원발성 종양에서의 국소 투여 후 종양 전이를 방지하기 충분할 수 있다. 상기 가설을 평가하기 위해, PTGFRN을 과발현하는 HEK293SF 세포로부터 정제된 엑소좀에 실시예 1에 기재된 바와 같이 고리형 디뉴클레오타이드 3-3 cAIMPdFSH를 로딩하였다. C57BL/6 마우스에 0일째에 1×106 B16F10 흑색종 세포를 피하 접종하고 1×105 B16F10 흑색종 세포의 추가적인 꼬리 정맥 주사로 유발접종하여 폐 전이의 씨드를 제공하였다(군 당 n=8마리 마우스). 접종 5, 8, 및 11일 후, 마우스에 PBS, 20 ㎍ 3-3 cAIMPdFSH, 120 ng 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 120 ng, 12 ng, 또는 1.2 ng 3-3 cAIMPdFSH(Exo STING 작용제)를 피하 종양에 종양내 주사하였다. 17일경, 20 ㎍ STING 작용제 및 120 ng Exo STING 작용제군에서 원발성 종양은 성장하지 않았다. 12 ng 및 1.2 ng Exo STING 작용제군에서는 용량-반응 상관관계가 존재했으나, PBS 또는 120 ng STING 작용제군에서는 종양 퇴행이 관찰되지 않았다(도 46a). 모든 마우스로부터 폐를 수확하고, 조영하고, 전이에 대해 계수하였다. PBS-주사군에 비해, 120 ng 및 12 ng Exo STING 작용제군 및 20 ㎍ STING 작용제군에서 폐 전이가 크게 감소되었다. 12 ng만큼 적은 양의 Exo STING 작용제가 20 ㎍ STING 작용제와 같은 정도로 폐 전이를 방지하였다(도 46b 및 47). 흥미롭게도, 20 ㎍ STING 작용제 처리군은 조직학에 의해 평가되는 경우 폐 내부에 상당량의 폐 병소를 가진 반면, 120 ng 및 12 ng Exo STING 작용제군은 각각 4개의 완전 반응을 가졌다(도 48). 이들 데이터는 엑소좀-캡슐화 STING 작용제가 자유 STING 작용제에 비해 훨씬 더 적은 용량(약 1,000배)으로 종양-보호 면역성을 유도할 수 있음을 실증한다.
실시예 15: STING 작용제의 엑소좀-매개 전달이 면역 체크포인트 차단 면역치료법과 상승작용하며 T-세포-매개 종양 사멸에 의존함
STING 경로의 활성화는 면역 경로 체크포인트의 상향조절을 유도한 후 T-세포-매개 세포 사멸을 감소시키고, 이에 따라 치료 논리로서 STING 경로 작용성 효과를 완화한다(Cell Rep. 2015 May 19;11(7):1018-30). 따라서, 면역 체크포인트 조절 억제제를 조합하여 종양 세포의 면역-매개 제거를 추가 개선하는 것이 유익할 수 있다. 상기 가설을 평가하기 위해, PTGFRN을 과발현하는 HEK293SF 세포로부터 정제된 엑소좀에 실시예 1에 기재된 바와 같은 고리형 디뉴클레오타이드 ML RR-S2 CDA를 로딩하였다. C57BL/6 마우스에 1×106 B16F10 흑색종 세포를 피하 접종하였다(군 당 n=6마리 마우스). 접종 5, 8, 및 11일 후, 마우스에 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 30 ng ML RR-S2 CDA(EXOSTING™)의 종양내 주사를 포함하고 또는 포함하지 않고, 대조군 항체(α-IgG; 10 ㎎/㎏; BioLegend, 카탈로그 #400559, Clone RTK3758) 또는 PD-1에 대한 길항성 항체(α-PD-1; 10 ㎎/㎏; BioLegend, 카탈로그 #114111, Clone RMPI-14)를 복강내 주사하였다. B16F10 종양은 면역 세포 침윤이 불량하였고 체크포인트 차단에 불응성이었다. 최적미만 용량인 30 ng의 EXOSTING™은 부분적인 종양 감소를 야기하였고, 이는 αIgG가 아닌 αPD-1로의 처리에 의해 증폭되었다(도 49a).
별도 연구에서, C57BL/6 마우스에 1×106 B16F10 흑색종 세포(군 당 n=6마리 마우스)를 피하 접종하였다. 접종 5, 8, 11, 및 14일 후, 마우스에 IgG(10 ㎎/㎏) 또는 항-CD8 항체(10 ㎎/㎏)를 복강내 주사하였다. 항체의 IP 투여 6, 9, 및 12일 후, 마우스를 엑소좀 또는 ExoSTING(3-3 cAIMPdFSH, 100 ng)으로 종양내 처리하였다.
마우스를 T-세포-고갈 αCD8 항체(10 ㎎/㎏; BioLegend, 카탈로그 #100769, Clone 53-6.7)로 처리한 후 도 49b에 나타낸 모식도에 따라 EXOSTING™(3-3 cAIMPdFSH)을 종양내 투여하였다. T-세포의 전신 고갈은 EXOSTING™의 효과를 완전 폐지하여 EXOSTING™의 STING 작용제-유도 항종양 효과의 매개에서 CD8+ T-세포의 중추적 역할을 실증하였다(도 49b).
별도 연구에서, C57BL/6 마우스군(각각의 시점에 있어서 n = 5)을 PBS(8일에만), 0.2 ㎍ ML RR-S2 CDA(5 및 8일), 20 ㎍ ML RR-S2 CDA(5 및 8일), 및 0.2 ㎍ exoSTING(5 및 8일)로 종양내 처리하였다. 8일째에 주사 48시간 후, 종양 및 비장을 단리하고 gentleMACS 기기에 대한 제조업체의 제시 프로토콜에 따라 Miltenyi 마우스 소화 키트(각각 CAT# 130-096-730 및 130-095-926)를 이용하여 단세포 현탁액으로 해리하였다. 세포를 여과하고, 2회 세척한 후 유세포측정 분석을 거치거나 ELISPOT을 위해 배양하여 B16F10 종양 세포로부터의 항원에 대한 특이적 반응성을 검출하였다. ELISPOT을 제조업체의 프로토콜에 따라 Mabtech 마우스 IFNγ ELISpot PLUS(HRP)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 5×105 비장세포를 10 ㎍/㎖의 3가지 B16F10 펩타이드, 즉 GP100 아미노산 25-33(AnaSpec, 카탈로그 # AS-62589), 티로시나제 아미노산 368-376(AnaSpec, 카탈로그 # AS-61456), 및 TRP2 아미노산 180-188(AnaSpec, 카탈로그 # AS-61058)과 인큐베이션하였다. 도 49c에 나타낸 바와 같이, EXOSTING™ 200 ng은 고용량 또는 저용량 자유 STING 작용제에 비해 B16F10 펩타이드에 대해 유의미하게 더 많은 IFNγ 양성 스팟을 유도하였다. 종합하면, 이들 데이터는 T-세포가 STING 작용제에 의해 유도된 항-종양 면역성의 중추적 매개체이며 EXOSTING™이 자유 STING 작용제에 비해 단일 제제로서 또는 체크포인트 차단과의 조합으로 더 우수한 활성을 제공함을 실증한다.
실시예 16: 엑소좀 PTGFRN 수준이 STING 작용제가 로딩된 엑소좀의 역가와 연관됨
실시예 3 및 13에서의 결과는 PTGFRN 과발현이 STING 작용제-로딩 엑소좀의 활성을 증강시킴을 제시한다. PTGFRN 수준이 EXOSTING™ 활성과 연관되는지를 결정하기 위해, HEK293SF 세포를 CRISPR/Cas9에 의해 유전적으로 조작하여 내인성 PTGFRN 유전자위를 결실시켰다(국제 특허 출원 번호 PCT/US2018/048026에 기재됨). 엑소좀을 WT HEK293SF 세포(WT Exo), PTGFRN 과발현 HEK293SF 세포(PTGFRN O/E Exo) 및 PTGFRN 녹아웃 세포(PTGFRN KO Exo)로부터 정제하고 상술된 바와 같이 3-3 cAIMPdFSH를 로딩하였다. 가용성 3-3 cAIMPdFSH에 비해, 모든 EXOSTING™ 제형은 PBMC 배양에서 IFNβ 생산의 보다 강력한 활성화제였다(n=2 반복물). 흥미롭게도, PTGFRN O/E EXOSTING™은 IFNβ의 가장 강력한 활성화제였고 EXOSTING™ 제형의 가장 큰 Cmax를 생성하였다. WT EXOSTING™은 PTGFRN O/E EXOSTING™에 비해 약화되었고 PTGFRN KO EXOSTING™은 가장 약한 IFNβ 반응을 일으켰다(도 50a). 최대 IFNβ 신호도 PTGFRN 수준과 연관되었다(도 50b). 상기 역가 차이가 생체내 종양 환경과 일치하는지를 결정하기 위해, B16F10 피하 종양에 PBS 또는 20 ng의 WT EXOSTING™ PTGFRN O/E EXOSTING™ 또는 PTGFRN KO EXOSTING™을 주사하였다(6, 9, 및 12일에 주사함). EXOSTING™ 처리가 종양 성장을 약화시키는 정도도 PTGFRN 발현 수준과 연관되어, 증가된 PTGFRN 수준이 보다 바람직한 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있고, 이에 따라 EXOSTING™ 처리 제형이 엑소좀 표면 상에서 PTGFRN의 발현을 증가시켜 최적화될 수 있음을 시사하였다(도 50c).
실시예 17: STING 작용제가 로딩된 엑소좀이 항원 제시 세포에 의해 포식되며 종양-잔류 면역 효과기 세포에 독성이 아님
STING 경로의 구성적 활성화는 강력한 전염증성 신호전달을 일으키며 세포 및 조직에 독성일 수 있다(N Engl J Med. 2014 Aug 7; 371(6): 507-518). 종양 미세환경에서 STING 작용제의 비-선택적 전달은 강력한 IFNβ 반응을 일으킬 수 있지만, 반응이 너무 강하거나 요망되지 않는 세포 집단에서 기원하는 경우, CD8+ T-세포와 같은 효과기 세포가 사멸되거나 달리 약화될 수 있다. B16F10 흑색종 종양에 Alexa Fluor™ 488이 표지된 PTGFRN-과발현 엑소좀을 주사하고 주사 1시간 후 제거하였다. 종양-침윤 림프구를 정제하고 488 nm에서의 형광에 대해 측정하여 엑소좀 흡수를 추적하였다. 약 20%의 T-세포만 엑소좀을 포식한 반면, 각각 약 90% 및 약 70%의 대식구 및 수지상 세포가 엑소좀을 포식하였다(도 51a). 이들 데이터는 종양 미세환경에서의 항원 제시 세포가 인간 엑소좀의 천연 표적 세포임을 제시한다. 엑소좀의 세포-특이적 흡수가 EXOSTING™ 대 자유 STING 작용제에 대해 차별적 STING 경로 활성화를 일으키는지를 결정하기 위해, 상기로부터의 B16F10 흑색종 종양에 두 번째로 PBS, 20 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 0.2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 200 ng ML RR-S2 CDA를 주사하였다. 주사 24시간 후, 종양을 단리하고, 균질화하고, 살아있는 CD45+ 세포 집단을 계수하였다. 20 ㎍ ML RR-S2 CDA군에서, CD8+ T-세포, 대식구, 및 수지상 세포가 다른 군에 비해 크게 감소되었다(도 51b-d). 이들 데이터는 고용량의 자유 STING 작용제가 종양 미세환경에서 항원 제시 및 종양 세포 사멸을 위해 요구되는 세포인, 항원 제시 세포 및 T-세포에 독성일 수 있음을 시사한다. 따라서 고용량 STING 작용제의 비-선택적 전달은 요망되는 면역 자극 반응을 약화시킬 수 있다. 이에 따라 EXOSTING™은 필적하는 치료 반응을 위해 더 적은 용량이 요구되므로, 더 넓은 치료 윈도우에서 작동하며 자유 STING 작용제로 관찰되는 책임(예를 들어, 전신 독성, 면역 세포 사멸, 세포 선택성의 부재)을 감소시킨다.
실시예 18: 종양내 투여된 STING 작용제-로딩 엑소좀의 고해상 조영이 자유 STING 작용제에 비해 증가된 역가 및 감소된 독성을 실증함
이전 실시예에 나타난 EXOSTING™ 활성의 측정은 엑소좀, 특히 PTGFRN-과발현 엑소좀이 STING 작용제 분자의 활성을 증강시킬 수 있음을 실증한다. 균질화된 조직 또는 단리된 혈청으로부터의 대규모 측정은 다양한 적용에서 EXOSTING™의 역가 및 선택성에 대해 유의미한 데이터를 제공하지만, 동일한 종양에서의 샘플 간 또는 주사 부위에서의 국소 효과와의 직접적 비교를 허용하지는 않는다. 상기 질문에 답하기 위해, 마이크로투여 종양내 주사 연구를 다중-주사장치 기구(CIVO®; Presage Biosciences, Seattle, WA)를 사용하여 완료하였다. 상기 방법에 기재된 바와 같이, A20 림프종 세포를 마우스에 피하 임플란트하고 최대 6개의 상이한 제제를 동시에 주사하였다. 단회 용량 주사를 2 ㎍ 자유 ML RR-S2 CDA, 200 ng ML RR-S2 CDA, PTGFRN 과발현 엑소좀, 20 ng ML RR-S2 CDA 함유 야생형 엑소좀, 또는 20 ng의 ML RR-S2 CDA 함유 PTGFRN 과발현 엑소좀으로 수행하였다. 종양을 주사 4시간 및 24시간 후 수집하고, 가공하고, IFNβ mRNA(원 위치 혼성화) 및 절단된 카스파제 3 단백질(Jackson Immunoresearch, 항체 #111-605-144)의 존재에 대해 염색하였다. 주사 4시간 후, IFNβ 수준은 고용량 STING 작용제 및 PTGFRN O/E EXOSTING™군 간에 필적하였고, 저용량 자유 STING 작용제 또는 빈 엑소좀군에서보다 훨씬 높았다(도 52a). IFNβ 신호는 처리 후 24시간내로 기준선으로 복귀하였다. 아폽토시스에 대한 마커인 절단된 카스파제 3(CC3)은 모든 다른 군에 비해 고용량 자유 STING 작용제에 있어서 4 및 24시간째에 크게 증가되었고, EXOSTING™ 및 저용량 자유 STING 작용제군에 있어서 중등도로, 고용량의 자유 STING 작용제가 EXOSTING™에 비해 IFNβ 생산에 대해 증강된 이익을 갖지 않고 더 큰 아폽토시스를 야기하였음을 시사한다(도 52b). 실시예 17에 기재된 선택적 세포-유형 흡수와 조합되어, 이들 데이터는 EXOSTING™이 면역 세포를 선택적으로 표적화하여 자유 STING 작용제로 관찰되는 비-선택적 세포 사멸 없이 증강된 IFNβ 분비를 야기함을 제시한다.
또 다른 연구에서, 단회 용량 주사를 A20 종양 내로 2 ㎍ 자유 3-3 cAIMPdFSH, 20 ng 자유 3-3 cAIMPdFSH, PTGFN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.4 ng, 2.2 ng, 6.6 ng, 또는 20 ng의 3-3 cAIMPdFSH로 수행하였다. 종양을 주사 4시간 후 수집하고, 가공하고, IFNβ 또는 CXCL10 mRNA의 존재에 대해 염색하고(원 위치 혼성화에 의해), 방사상 반응 분석을 수행하였다. IFNβ(도 52c) 또는 CXCL10(도 52d) mRNA 발현은 샘플이 주사된 위치에서 가장 높았고 방사상 거리가 증가됨에 따라 점차적으로 감소되었다.
실시예 19: 상이한 엑소좀-캡슐화 고리형 디뉴클레오타이드 또는 비-고리형 디뉴클레오타이드 STING 작용제의 비교 역가
PTGFRN을 과발현하는 HEK293SF 세포를 진탕 플라스크에서 성장시키고 생성 엑소좀을 방법에 기재된 바와 같이 Optiprep™ 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 엑소좀에 실시예 1에서의 방법에 따라 ML RR-S2 CDA, 2-3 cGAMP, 3-3 cAIMPdFSH, 3-3 cAIM(PS)2, cAIMPmFSH, cAIMPdF, cAIMP, CP214, CP201, 및 CP204를 포함하는 STING 작용제를 로딩하였다. 3-3 cAIMPdFSH, 3-3 cAIM(PS)2, cAIMPdF, cAIMP는 각각 논문(J Med Chem. 2016 Nov 23;59(22):10253-10267)으로부터의 화합물 53, 13, 52, 및 51에 대응한다. CP214는 2-3 cAMPmFSH이다. CP201 및 CP204는 각각 특허 WO2017/175156 및 WO2017/175147로부터의 화합물의 유사체이다. 로딩을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정량하였다. 엑소좀-캡슐화 또는 자유 STING 작용제를 인간 PBMC에 첨가하고 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액 중 IFNβ의 양을 측정하여 STING 작용제에 의한 PBMC의 활성화를 검출하였다. 도 53a-g에 나타낸 바와 같이, 모든 엑소좀-캡슐화 STING 작용제는 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 자유 STING 작용제에 비해 역가 변화를 일으켰다.
실시예 20: 종양-보유 마우스(C57BL/6) 및 STING 녹아웃 마우스(C57BL/6-Tmem173 gt )에서 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 대비 자유 STING 작용제의 생체내 역가
3개 군의 C57BL/6 마우스 및 C57BL/6-Tmem173gt 마우스(군 당 4-5마리 마우스)에 1×106 B16F10 종양 세포를 피하 접종하였다. 접종 8일 후, 마우스에 단회 종양내 용량의 PBS, 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.1 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH(exeSTING)를 주사하였다. 주사 4시간 후, 종양, 배액 림프절, 비장, 및 혈청을 수집하고 사이토카인 수준을 측정하였다. C57BL/6 마우스(검은 막대)로부터의 종양(도 54a), 배액 림프절(도 54b), 및 비장(도 54c)에서의 IFNβ 유전자 발현 수준은 20 ㎍ 자유 STING 작용제 및 0.1 ㎍ 엑소좀-STING 작용제군에서 필적한 반면, C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 종양(도 54a), 배액 림프절(도 54b), 및 비장(도 54c)에서 IFNβ 유전자 발현 수준은 대조군과 유사하였다. 추가적으로, IFNγ 및 T-세포 화학유인인자 CXCL9 및 CXCL10의 수준은 C57BL/6 마우스(검은 막대)로부터의 엑소좀-STING 작용제군에서 모두 더 높았으나, C57BL/6-Tmem173gt 마우스(흰 막대)로부터의 엑소좀-STING 작용제군에서는 유도되지 않았다(도 55, 56, 및 57). 유전자 발현에 부가하여, 혈청 사이토카인 프로필은 동일한 경향성을 나타낸다(도 58).
도 54-58에서 관찰된 효과가 항-종양 활성으로 반영되었음을 확인하기 위해, C57BL/6 마우스 및 C57BL/6-Tmem173gt 마우스에 1×106 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하였다(군 당 n=5마리 마우스). 접종 7, 10, 및 13일 후, 마우스에 PBS, 엑소좀, 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.1 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 종양내 주사하였다. 19일까지 종양 부피를 매일 측정하고, 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하였을 때 동물을 희생시켰다. 예상된 바와 같이, 0.1 ㎍의 EXOSTING™ 및 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH로의 처리는 C57BL/6 마우스에서 종양 퇴행을 크게 개선하였다(도 59). 그러나, C57BL/6-Tmem173gt 마우스에서는 어느 처리로부터도 종양 퇴행이 관찰되지 않았다(도 59). 종합적으로, 이들 데이터는 엑소좀-STING 작용제의 활성이 STING 경로에 의해 매개됨을 실증한다.
실시예 21: 흑색종의 진행된 쥣과 모델에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 비교 생체내 유효성
B16F10 종양으로의 이전 데이터(도 37, 40, 47, 49, 50, 및 60)는 STING 작용제-로딩 엑소좀의 증강된 항-종양 활성을 나타내었다. 처리는 종양 부피가 약 50 ㎣에 도달하였을 때 시작하였다. 진행된 종양에서의 활성을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에 1×106 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하고(군 당 n=5마리 마우스) 종양 부피가 약 100 ㎣에 도달할 때까지 기다렸다. 접종 10, 13, 및 16일 후, 마우스에 엑소좀, 30 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.3 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.1 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.3 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 종양내 주사하였다. 종양 부피를 28일까지 매일 측정하고, 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하였을 때 동물을 희생시켰다. 엑소좀 대조군에 비해, 0.3 ㎍의 자유 STING 작용제로의 처리 후 종양 성장은 영향받지 않았으나, 30 ㎍ 자유 STING 작용제로의 처리 시 종양 부담이 크게 감소하였다. 놀랍게도, 0.1 ㎍의 EXOSTING™으로의 처리는 중등도로 강화된 종양 성장을 일으켰고 0.3 ㎍의 EXOSTING™은 농도-매칭 자유 STING 작용제군에 비해 크게 개선된 그리고 고용량 자유 STING 작용제군에 비해 유사한 정도로 종양 퇴행을 일으켰다. 도 60은 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며 도 61a-61e는 각각의 처리군에서 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다.
실시예 22: 쥣과 결장직장암 모델의 모델에서의 항-종양 유효성
다른 유형의 종양에 대한 생체내 유효성을 평가하고 확장하기 위해, 베타-갈락토시다제를 안정적으로 발현하도록 조작된 쥣과 결장직장암 세포주인 5×105 CT26.CL25 세포(ATCC®; CRL-2639™), 또는 5×105 CT26.WT 세포(ATCC®; CRL-2638™)를 BALB/c 마우스에 피하 접종하였다(군 당 n=5-7마리 마우스). 접종 13, 16, 및 19일 후, 마우스에 엑소좀, 0.012 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.012 ㎍의 -3 cAIMPdFSH을 CT26.CL25 종양 내로 및 PBS, 엑소좀, 100 ㎍의 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍의 -3 cAIMPdFSH를 CT26.WT 종양 내로 종양내 주사하였다. B16F10 모델에서 관찰된 효과와 유사하게(도 37, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 및 59), 저용량 자유 STING 작용제는 종양 성장을 중증도로 약화시켰고, EXOSTING™은 대조군에 비해 CT26.CL25(도 62) 및 CT26.WT 종양(도 63) 모두의 종양 성장을 크게 방지하였다.
실시예 23: 흑색종 모델의 이중 넙다리 쥣과 모델에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 비교 생체내 표적-외(abscopal) 유효성
STING 경로 활성화는 전신 종양 특이적 T-세포 반응을 유도하며, 이는 표적-외 항-종양 활성을 일으켰다(Cell Rep. 2018 Dec 11;25(11):3074-3085). 또한, STING 경로의 활성화는 면역 경로 체크포인트의 상향조절을 유도한 후 T-세포-매개 세포 사멸을 감소시키고, 이에 따라 치료 논리로서 STING 경로 작용성의 효과를 완화하였다(Cell Rep. 2015 May 19;11(7):1018-30). 두 가설을 모두 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에 마우스의 우측 및 좌측 넙다리 내로 각각 1×106 및 5×105 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하였다(군 당 n=5마리 마우스). 접종 7, 10, 및 13일 후, 우측 넙다리의 종양에 대조군 항체(α-IgG; 10 ㎎/㎏; BioLegend, 카탈로그 #400559, Clone RTK3758) 또는 PD-1에 대한 길항성 항체(αPD-1; 10 ㎎/㎏; BioLegend, 카탈로그 #114111, Clone RMPI-14)와 함께 엑소좀, 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.1 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.1 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 종양내 주사하였다. 항체를 복강내 주사하였다. 종양 부피를 21일까지 매일 측정하고, 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하였을 때 동물을 희생시켰다. 주사된 종양에서, 엑소좀 대조군(IgG 또는 항-PD1 모두)에 비해, 종양 성장은 0.1 ㎍ 자유 STING 작용제 + IgG 및 0.1 ㎍ 자유 STING 작용제 + 항-PD1 둘 다의 처리 후 중등도로 강화되었다. 항-PD1과 무관하게, 20 ㎍ 자유 STING 작용제 및 0.1 ㎍의 EXOSTING™으로의 처리 시 거의 완전히 제거됨이 관찰되었다(도 64). 놀랍게도, 20 ㎍ 자유 STING 작용제 및 0.1 ㎍의 EXOSTING™으로의 처리 시, 주사된 종양이 아닌 반대쪽 종양에서 유의미한 종양 감소가 관찰되었다. 또한, 상기 종양 감소는 항-PD1 조합으로 더욱 강화되었다(도 65). 이들 데이터는 EXOSTING™에 의한 전신 종양 특이적 T 세포 반응의 유도를 실증하였다.
실시예 24: 흑색종의 쥣과 모델에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 종양 약동학 분석
STING 작용제의 종양 약동학을 조사하기 위해, C57BL/6 마우스에 1×106 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하였다(군 및 시간 당 n=3마리 마우스). 접종 8일 후, 종양에 30 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.3 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.3 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 종양내 주사하였다. 주사 5분, 30분, 2시간, 6시간, 24시간, 및 48시간 후, 종양을 절제하고 6부피의 혈장으로 용해시켰다. 3-3 cAIMPdFSH의 농도를 실시예 1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. 30 ㎍ 및 0.3 ㎍ 모두에서 자유 3-3 cAIMPdFSH는 약 10분의 반감기를 가지며, 종양으로부터 빠르게 소실되었다. 놀랍게도, 3-3 cAIMPdFSH의 반감기는 엑소좀에 의해 전달되는 경우 크게 증강되었다(약 120분)(도 66). 상기 데이터는 고용량 자유 STING 작용제의 종양내 주사 후, STING 작용제가 전신 순환 내로 빠르게 누출되고 최종적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 혈청 사이토카인의 증가를 포함하는 전신 반응을 야기함을 제시한다. 그러나, EXOSTING™은 종양-보유된 약리를 가졌고 전신이 아닌 국소에서 반응을 활성화하여, 궁크게 STING 작용제의 독성을 감소시켰다.
실시예 25: 마우스 혈장에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 약동학 분석
마우스 혈장에서 STING 작용제의 약동학을 조사하기 위해, 나이브 C57BL/6 마우스에 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.1 ㎍, 0.3 ㎍, 0.6 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 정맥내 주사하였다. 주사 1, 5, 10, 및 30분 후, 채혈하고 혈장을 준비하였다. 3-3 cAIMPdFSH의 농도를 실시예 1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. 자유 3-3 cAIMPdFSH는 1.2분의 반감기를 가지며, 순환에서 빠르게 소실되었다(도 67). 0.1 ㎍ 및 0.3 ㎍ 3-3 cAIMPdFSH 로딩된 엑소좀은 자유 3-3 cAIMPdFSH와 유사한 반감기(각각 1.2 및 1.8분)를 가졌으나, 0.6 ㎍ 3-3 cAIMPdFSH 로딩된 엑소좀은 증강된 반감기(8.5분)를 나타내었다(도 68).
실시예 26: 정맥내 주사 후 마우스에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 비교 생체내 활성
종양내 투여를 넘어서 자유 STING 작용제 및 STING 작용제-로딩 엑소좀의 생체내 활성을 비교하기 위해, 나이브 C57BL/6 마우스에 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 정맥내 주사하였다. 주사 30분, 2시간, 6시간, 및 24시간 후, 간, 비장 및 혈청을 수집하고 사이토카인 수준을 측정하였다. 놀랍게도, IFNβ, CXCL9, CXCL10, IFNγ를 포함하여, 여기서 평가된 모든 사이토카인 유전자 발현 수준이 모든 시점에 걸쳐 간(도 69a-d), 비장(도 70a-d) 및 혈청(도 71a-e)에서 20 ㎍ 자유 STING 작용제에 비해 0.2 ㎍ EXOSTING™에서 유의미하게 더 컸으나, -3 cAIMPdFSH의 주사량은 EXOSTING™군에 비해 100배 더 적었다. 이는 아마도 간 및 비장에 대한 엑소좀의 선택적 흡수 기전에 기인할 수 있고(J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316), 이는 이들 기관으로 STING 작용제의 전달을 허용한다. 이들 데이터는 100배 더 적은 STING 작용제가 STING 작용제의 변화된 약동학 및 약력학으로 인해 엑소좀에 의한 정맥내 주사 후 IFN 유전자 발현의 유의미하게 더 큰 유도를 일으킬 수 있음을 실증한다.
실시예 27: 피하 주사 후 마우스에서 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 비교 생체내 활성
종양내 투여를 넘어서 자유 STING 작용제 및 STING 작용제-로딩 엑소좀의 생체내 활성을 비교하기 위해, 나이브 C57BL/6 마우스에 PBS, 엑소좀, 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 피하 주사하였다. 주사 4시간 후, 림프절, 비장, 간, 및 혈청을 수집하고 사이토카인 수준을 측정하였다. 림프절(도 72a), 비장(도 72b), 및 간(도 72c)에서의 IFNβ 유전자 발현 수준은 20 ㎍의 자유 STING 작용제 처리 후 유의미하게 상승되었으나, IFNβ 유전자 발현 수준은 더 큰 자유 STING 작용제 처리군에 비해 EXOSTING™ 후 크게 감소되었다. 추가적으로, IFNγ 및 T-세포 화학유인인자 CXCL9 및 CXCL10의 수준은 IFNβ와 유사한 경향성을 나타내었다(도 73, 74, 및 75). 이들 결과는 혈청 사이토카인에서 보다 극적으로, 자유 STING 작용제군에 비해 엑소좀-STING 작용제군에서 전염증성 사이토카인 IFNβ(도 76a), TNF-α(도 76b), IL-6(도 76c), IFNγ(도 76d), 및 MCP-1(도 76e)의 현저한 감소를 나타내었다.
실시예 28: 종양-보유 마우스에서 엑소좀-캡슐화 STING 작용제 대비 자유 STING 작용제의 생체내 역가 및 전신 효과
4개 군의 C57BL/6 마우스(군 당 5마리 마우스)에 1×106 B16F10 종양 세포를 피하 접종하였다. 접종 8일 후 마우스에 엑소좀, 20 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 0.1 ㎍의 자유 3-3 cAIMPdFSH, 또는 PTGFN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.1 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH(EXOSTING™) 용량을 종양내 주사하였다. 접종 11일 후 마우스의 절반에 다시 종양내 주사하였다. 각각의 주사의 4시간 또는 24시간 주사 후, 종양을 수집하고, 사이토카인 수준을 원 위치 혼성화에 의해 측정하고, CD8 또는 F4/80 양성 세포를 면역조직화학에 의해 계수하였다. 종양 영역 및 간질 영역을 조직학적으로 확인하였다. 종양(도 77a) 및 간질(도 77b) 영역에서의 IFNβ 유전자 발현 수준은 단회 용량 4 h 후 20 ㎍ 자유 STING 작용제 및 0.1 ㎍ EXOSTING™군에서 증가되었다. 놀랍게도, 두 번째 용량 4 h 후 20 ㎍ 자유 STING 작용제군에서 종양 및 간질 영역 모두에서의 IFNβ 수준이 유의미하게 감소된 반면, 0.1 ㎍ EXOSTING™군에서는 종양 및 간질 영역 모두에서의 IFNβ 수준이 유지되었다. 또한, CD8 양성 T 세포는 두 번째 용량 4 및 24 h 후 0.1 ㎍ EXOSTING™군에서 유의미하게 증가되었으나, 20 ㎍ 자유 STING 작용제군에서는 증가되지 않았다(도 78a). F4/80 양성 세포는 20 ㎍ 자유 STING 작용제군에서 감소되었으나, 세포는 0.1 ㎍ EXOSTING™군에서 회복되었다(도 78b). 이들 데이터는 고용량 자유 STING 작용제가 단회 용량 후 IFN 반응을 유도하는 능력을 갖는 면역 세포를 파괴할 수 있고, 이는 이들을 두 번째 용량 후 유사한 수준의 IFN 반응을 유도할 수 없게 그리고 T 세포를 종양 내로 모집할 수 없게 만든다는 것을 실증한다. 그러나, exoSTING은 면역 세포를 파괴하지 않지만, 다회 처리 후에도 IFN 반응을 유도하였고, 이는 T 세포의 침윤 증가를 야기하였다.
실시예 29: 오래 지속되는 T 세포 반응을 나타내기 위한 쥣과 흑색종 모델에서의 STING 작용제-로딩 엑소좀 및 자유 STING 작용제의 비교 생체내 유효성
이전 실시예 9의 결과는 ML RR-S2 CDA이 로딩된 EXOSTING™이 재유발접종된 종양의 성장을 차단하는 오래 지속되는 T 세포 반응을 나타내었음을 제시한다. 여기서는, 3-3 cAIMPdFSH이 로딩된 EXOSTING™이 동일한 반응을 나타내는지를 결정하기 위해, C57BL/6 마우스에 1×106 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 접종하였다(군 당 n=5-10마리 마우스). 접종 6, 9, 및 12일 후, 종양에 PBS, 엑소좀, 100 ㎍의 자유 ML RR-S2 CDA, 또는 PTGFRN-과발현 엑소좀에 로딩된 0.2 ㎍의 3-3 cAIMPdFSH를 종양내 주사하였다. 도 79a는 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며 도 79b-e는 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다. 완전 반응을 나타낸 100 ㎍의 자유 ML RR-S2 CDA에서의 10마리 동물 및 EXOSTING™군에서의 4마리 동물을 20일째에 반대쪽 넙다리 상에 1×106 B16F10 세포의 이식에 의해 재유발접종하였다. 5마리의 추가적인 나이브 마우스에 동일한 종양 세포 제조물을 접종하고 PBS로 매일 처리하여 세포 생활성 및 성장 역학을 확인하였다. 37일경(유발접종 17일 후) PBS군에서 모든 마우스가 희생되었다. 100 ㎍의 자유 ML RR-S2 CDA로부터의 동물에서 종양은 10마리 동물 중 10마리에서 종양 성장을 억제하지 못한 반면, 놀랍게도, EXOSTING™군에서의 모든 4마리 마우스에서는 종양 성장이 검출 불가능하였다(도 80a-d). 도 80a는 동물군에서의 평균 종양 성장을 나타내며 도 80b-d는 개별 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다.
참조에 의한 포함
본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은 각각의 개별 공보, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조로 포함됨을 개별적으로 나타낸 바와 같은 정도로, 본원에 이의 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
균등부
본 개시는 특히, 치료제로 사용하기 위한 STING 작용제를 캡슐화하는 엑소좀 조성물을 제공한다. 본 개시는 또한 STING 작용제를 캡슐화하는 엑소좀을 제조하는 방법 및 이러한 엑소좀을 치료제로 투여하는 방법을 제공한다. 다양한 구체적 구현예가 예시되고 기재되었으나, 상기 명세서는 제한적이 아니다. 다양한 변화가 본 발명(들)의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 여러 변이는 본 명세서의 리뷰 시 당업자에게 자명해질 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CODIAK BIOSCIENCES, INC. <120> EXTRACELLULAR VESICLE COMPRISING STING AGONIST <130> 4000.0210000/C-K/DKC <140> US 62/647,491 <141> 2019-03-23 <160> 204 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 879 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val 20 25 30 Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr 35 40 45 Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly 50 55 60 Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg 85 90 95 Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser 100 105 110 Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val 115 120 125 Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser 130 135 140 Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg 145 150 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Synthetic peptide <400> 123 Met Gly Gly Gln Gln Ala Lys 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 124 Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Met Gly Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Met Gly Ala Lys Phe Ser Lys 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Met Gly Ala Lys Phe Ala Lys 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Met Gly Ala Lys Ser Ser Lys 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Met Gly Ser Gln Gln Ser Lys 1 5 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Met Gly Ser Gln Gln Ala Lys 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 156 Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys 1 5 <210> 157 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 157 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly 50 55 60 Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile 65 70 75 80 Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr 85 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Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile 225 230 235 240 Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu 245 250 255 Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val 260 265 270 Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala 275 280 285 Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr 290 295 <210> 161 <211> 680 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 161 augaagccca ccgagaacaa cgaagacuuc aacaucgugg ccguggccag caacuucgcg 60 accacggauc ucgaugcuga ccgcgggaag uugcccggca agaagcugcc gcuggaggug 120 cucaaagagu uggaagccaa ugcccggaaa gcuggcugca ccaggggcug ucugaucugc 180 cugucccaca ucaagugcac gcccaagaug aagaaguuca ucccaggacg cugccacacc 240 uacgaaggcg acaaagaguc cgcacagggc ggcauaggcg aggcgaucgu cgacauuccu 300 gagauuccug gguucaagga cuuggagccc uuggagcagu ucaucgcaca ggucgaucug 360 uguguggacu gcacaacugg cugccucaaa gggcuugcca acgugcagug uucugaccug 420 cucaagaagu ggcugccgca acgcugugcg accuuugcca gcaagaucca gggccaggug 480 gacaagauca agggggccgg uggugacuaa ggauccaucg auaagcuuca ucgaaacaug 540 aggaucaccc auaucugcag ucgacaucga aacaugagga ucacccaugu cugcagucga 600 caucgaaaca ugaggaucac ccaugucugc agucgacauc gaaacaugag gaucacccau 660 gucugcaguc gacaucgaaa 680 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any Naturally Occuring Amino Acid <400> 162 Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 163 Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys 1 5 <210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Gly, Ala, or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Lys or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu, Phe, Ser, or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Ala, See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 164 Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys 1 5 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 165 tggaggtgct caaagagttg 20 <210> 166 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 ttgggcgtgc acttgat 17 <210> 167 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 167 gggcattggc ttc 13 <210> 168 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 168 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys 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<400> 173 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp 20 25 30 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly 35 40 45 Glu Glu Leu Phe Thr Gly 50 <210> 174 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 174 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 20 25 30 Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu 35 40 45 Phe Thr Gly 50 <210> 175 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 175 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 20 25 30 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 35 40 45 <210> 176 <211> 45 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 179 Met Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys 1 5 10 15 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu 20 25 30 Leu Phe Thr Gly 35 <210> 180 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 180 Met Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 1 5 10 15 Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr 20 25 30 Gly <210> 181 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 181 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Val Ser Lys Gly 50 <210> 182 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 182 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Ala Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Val Ser Lys Gly 35 <210> 183 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 183 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ser Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val 20 25 30 Ser Lys Gly 35 <210> 184 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 184 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30 Lys Gly <210> 185 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 185 Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Ala 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 189 Met Gly Gly Lys Leu Asp Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala 20 25 30 <210> 190 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 190 Met Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala 20 25 30 <210> 191 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 191 Met Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala 20 25 30 <210> 192 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 192 Met Gly Ala Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe 1 5 10 15 Lys Leu Ser Gly Phe Ser 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any integer from 1-100 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X can be any integer from 1-100 <400> 204 Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Gly Ser Xaa 1 5 10

Claims (64)

  1. 세포외 소수포(extracellular vesicle) 및 인터페론 유전자 자극인자 단백질(STING) 작용제를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 엑소좀, 나노소수포, 아폽토시스체, 마이크로소수포, 라이소좀, 엔도좀, 리포좀, 지질 나노입자, 마이셀, 다층판 구조, 재소수포화된 소수포, 또는 압출된 세포인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 엑소좀인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제가 상기 세포외 소수포와 연합된, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 STING 작용제가 상기 세포외 소수포 내에 캡슐화된, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 STING 작용제가 선택적으로 링커에 의해, 상기 세포외 소수포의 지질 이중층에 연결된, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 PTGFRN 단백질을 과발현하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 STING 작용제가 선택적으로 링커에 의해, 상기 PTGFRN 단백질에 연결된, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 PTGFRN을 과발현하는 세포에 의해 생산되는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 글리칸 변형된, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 탈시알릴화된, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 탈글리코실화된, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 상기 STING 작용제에 결합하거나 또는 이와 효소적으로 반응하는 단백질을 추가로 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포가 리간드, 사이토카인, 또는 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 리간드가 CD40L, OX40L, 및/또는 CD27L을 포함하는, 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-7, IL-12, 및/또는 IL-15를 포함하는, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 항체가 길항성 항체 및/또는 작용성 항체를 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제가 고리형 디뉴클레오타이드인, 조성물.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제가 비-고리형 디뉴클레오타이드인, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제가 지질-결합 태그를 포함하는, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제가 물리적으로 및/또는 화학적으로 변형된, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 변형된 STING 작용제가 대응하는 변형되지 않은 STING 작용제와는 상이한 극성 및/또는 전하를 갖는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제의 농도가 약 0.01 μM 내지 100 μM인, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제의 농도가 약 0.01 μM 내지 0.1 μM, 0.1 μM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 10 μM 내지 50 μM, 또는 50 μM 내지 100 μM인, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 세포외 소수포와 연합된 STING 작용제의 농도가 약 1 μM 내지 10 μM인, 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제가 하기, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pct00046
    ,
    [화학식 2]
    Figure pct00047
    , 또는
    [화학식 3]
    Figure pct00048

    식 중,
    X1은 H, OH, 또는 F이며;
    X2는 H, OH, 또는 F이고;
    Z는 OH, OR1, SH 또는 SR1이고, 여기서:
    i) R1은 Na 또는 NH4이거나, 또는
    ii) R1은 피발로일옥시메틸과 같이 생체내 OH 또는 SH를 제공하는 효소-불안정기이고;
    Bi 및 B2는 하기로부터 선택되고:
    Figure pct00049

    단,
    - 화학식 (I)에서: X1 및 X2는 OH가 아니며,
    - 화학식 (II)에서: X1 및 X2가 OH인 경우, B1은 아데닌이 아니고 B2는 구아닌이 아니고, 그리고
    - 화학식 (III)에서: X1 및 X2가 OH인 경우, B1은 아데닌이 아니고 B2는 구아닌이 아니고 Z는 OH가 아니다.
  27. 제26항에 있어서, 상기 STING 작용제가 하기 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물:
    Figure pct00050

    Figure pct00051

    Figure pct00052

    Figure pct00053

    Figure pct00054
    .
  28. 제27항에 있어서, 상기 STING 작용제가 상기 세포외 소수포의 내강 내에 있으며 스캐폴드 모이어티에 연결되어 있지 않은, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제와 연합된 세포외 소수포가 하기 특징 중 하나 이상을 나타내는, 조성물:
    (i) 수지상 세포, 예를 들어, 골수 수지상 세포를 활성화함;
    (ii) STING 작용제 단독("자유 STING 작용제")에 비해 더 적은 정도로 단핵구 세포를 활성화함;
    (iii) 단핵구 세포를 활성화하지 않음;
    (iv) 자유 STING 작용제에 비해 더 넓은 치료 지수를 가짐;
    (v) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 전신 독성을 가짐;
    (vi) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 면역 세포 사멸을 가짐;
    (vii) 자유 STING 작용제에 비해 더 큰 세포 선택성을 가짐;
    (viii) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 용량으로 종양 보호 면역성을 제공함;
    (ix) 항원-제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포에서 생체내 특이적 세포 반응을 유도함;
    (x) 국소 투여 후 원부 영역에서 면역 반응을 유도할 수 있음; 및
    (xi) 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 수준으로 투여될 수 있음.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제와 연합된 세포외 소수포가 포유류에 투여되는 경우에 상기 포유류에서 T 세포 및/또는 대식구를 고갈시키지 않는, 조성물.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제와 연합된 세포외 소수포가 포유류에 투여되는 경우에 상기 포유류에서 자유 STING 작용제에 비해 더 적은 정도로 T 세포 및/또는 대식구를 고갈시키는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트.
  34. STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 제조하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a. EV, 예를 들어, 엑소좀을 수득하는 단계;
    b. EV, 예를 들어, 엑소좀을 STING 작용제와 용액 중에서 혼합하는 단계;
    c. 상기 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 STING 작용제의 혼합물을 적합한 조건 하에 완충액을 포함하는 용액 중에서 인큐베이션하는 단계; 및
    d. 상기 STING 작용제를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 정제하는 단계.
  35. 제34항에 있어서, 상기 적합한 조건이 약 2-24시간 동안 상기 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 상기 STING 작용제의 인큐베이션을 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 적합한 조건이 약 15-90℃에서 상기 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 상기 STING 작용제의 인큐베이션을 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 적합한 조건이 약 37℃에서 상기 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 상기 STING 작용제의 인큐베이션을 포함하는, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 단계에서 상기 STING 작용제의 양이 적어도 0.01 mM 내지 100 mM을 포함하는, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 단계에서 상기 STING 작용제의 양이 적어도 1 mM 내지 10 mM을 포함하는, 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 단계에서 상기 엑소좀의 양이 적어도 약 108 내지 적어도 약 1016개 총 입자를 포함하는, 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 단계에서 EV, 예를 들어, 엑소좀의 양이 적어도 약 1012개 총 입자를 포함하는, 방법.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액이 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함하는, 방법.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제하는 단계가 하나 이상의 원심분리 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 원심분리 단계가 약 100,000 × g에서 수행되는, 방법.
  45. 면역 반응 및/또는 염증 반응의 유도 또는 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응 및/또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는 방법으로서, 약학적 유효량의 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제32항의 약학 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  46. 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제32항의 약학 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 상기 대상체에서 면역 반응 및/또는 염증 반응을 유도하거나 조절하는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 수지상 세포를 활성화하는, 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 골수 수지상 세포를 활성화하는, 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 자유 STING 작용제에 비해 감소된 단핵구 세포 활성화를 초래하는, 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 단핵구 세포 활성화를 유도하지 않는, 방법.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 인터페론-β(IFN-β) 생산을 유도하는, 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 자유 STING 작용제에 비해 감소된 전신 염증을 초래하는, 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 비실질적인(insubstantial) 양의 전신 염증을 초래하는, 방법.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 비경구, 경구, 정맥내, 근육내, 종양내, 복강내, 또는 임의의 다른 적절한 투여 경로를 통하는, 방법.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 정맥내인, 방법.
  57. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응이 항-종양 반응인, 방법.
  58. 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 IFN-β를 유도하고/하거나 수지상 세포를 활성화하기 충분한 양인, 방법.
  59. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나의 위치에서 제1 종양에 종양내 투여되며, 상기 제1 종양에 투여되는 조성물은 제2 위치에서의 하나 이상의 종양의 전이를 방지하는, 방법.
  60. 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 추가 치료제가 면역조절제인, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 추가 치료제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 또는 LAG3의 억제제인, 방법.
  64. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 상기 대상체에서 종양의 전이를 방지하는, 방법.
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