WO2011129379A1 - 新規抗hsp90モノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗HSP90抗体及びその用途に関し、より具体的には、細胞表面HSP90を認識可能な抗HSP90抗体、該抗体を使用するワクチン、該抗体を使用する薬剤、該抗体を含むアジュバント、及び該抗体を使用する細胞表面にHSP90を発現している細胞の検出方法等に関する。
Description
本発明は、抗HSP90モノクローナル抗体及びその用途に関し、より具体的には、細胞表面HSP90を認識可能な抗HSP90モノクローナル抗体、該抗体を使用する細胞表面にHSP90を発現している細胞の検出方法、該抗体を使用するワクチン、該抗体を使用する薬剤、及び該抗体を含むアジュバント等に関する。
ヒートショックタンパク質(HSP)は、その発現レベルが熱等の多種のストレスによって上昇する主要なシャペロン分子であり、新たに合成されるタンパク質のフォールディング、損傷タンパク質の凝集防止、不可逆的に損傷を受けたタンパク質のプロテアソーム依存性分解の促進、クライアントタンパク質及びペプチドのオルガネラ間及び/又はタンパク質間輸送、において中心的な役割を果たす。HSP90は、最も存在量の多いシャペロンタンパク質のひとつであり、細胞内の全タンパク質量の1%近くを占め、主に細胞質中に存在する(非特許文献1及び2)。
しかし近年、癌細胞において、細胞表面にHSP90が存在し、癌細胞の浸潤又は転移においてメディエーターとして関与することが見出されている(非特許文献3及び4)。また、HSP90は神経細胞の表面にも発現しており、発生過程における細胞移動に関与する(非特許文献5)。HSP90αは、TGFα刺激を受けたヒト角化細胞から分泌され、LRP1と相互作用することにより、これらの細胞の運動性に関与する(非特許文献6及び7)。これらの結果は、HSP90が細胞表面に存在するときには、細胞移動及び浸潤につながる新規の経路に関与するという、HSP90の追加的役割を示唆する。
一方、これまで樹状細胞(DC)及びマクロファージ、すなわち抗原提示細胞(APC)上の細胞表面HSP90を検出することのできる適切なモノクローナル抗体が存在しなかったため、細胞表面のHSP90を同定することは困難であった。既存の抗HSP90抗体はいずれも、細胞内のHSP90は良好に認識するものの、細胞膜上のHSP90との反応性が低い。そのため、細胞表面にHSP90を発現している細胞をフローサイトメトリー等の種々の分析方法で検出することは、これまで不可能であった。
DCにおいては、細胞外からの抗原がプロテアソームによって分解され、MHCクラスI分子と結合して細胞表面に提示されること、すなわちクロスプレゼンテーションが起こることが知られている。クロスプレゼンテーションに関しては、HSP90-ペプチド複合体の効果が実証されており、アジュバントを使用せずにCD8+T細胞を刺激することができる(非特許文献8及び9)。しかしCD8+T細胞の刺激には、大量のHSP90-ペプチド複合体が必要であるため、効率良くCD8+T細胞を刺激することのできる手段が求められていた。
Lindquist S. Annu Rev Biochem. 1986;55:1151-1191.
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Kurotaki T, Tamura Y, Ueda G, et al. J Immunol. 2007;179:1803-1813.
本発明の目的は、新規な抗HSP90抗体及びその用途を提供することであり、より具体的には、細胞表面に発現しているHSP90を認識することができるモノクローナル抗体の提供、該抗体を用いた細胞の同定方法、該抗体と抗原からなるワクチン、該抗体を使用する薬剤、さらにはアジュバントとしての用途を提供することにある。
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、細胞表面上に発現したHSP90を高感度で認識可能な新規抗HSP90モノクローナル抗体を得て、さらにHSP90上の重複するアミノ酸配列を有するペプチドからなるライブラリーを使用してエピトープマッピングを行い、該抗体のエピトープを同定することに成功した。
また本発明者らは、該抗体が、細胞表面HSP90発現細胞上(例えば抗原提示細胞等)の細胞表面HSP90に結合することによって、細胞表面HSP90の急速な内部移行が誘導され、同時に該抗体も細胞内に移行することを見出した。さらに、本発明者らは、該抗体に連結させた抗原が、抗原提示細胞内に移行した後、MHCクラスI抗原提示経路へと送達され、その結果CD8+T細胞が活性化されることを見出した。さらに、該抗体が、Fcレセプターを介した抗原提示機構を増強するアジュバント効果を有することを見出した。以上の知見を得て、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
[1]アミノ酸配列VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)、又はアミノ酸配列HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
[2]配列番号1のアミノ酸配列中、X2がE又はDである[1]に記載のモノクローナル抗体。
[3]配列番号1のアミノ酸配列中、X4がE又はDである[1]に記載のモノクローナル抗体。
[4]配列番号2のアミノ酸配列中、X6がI又はVである[1]に記載のモノクローナル抗体。
[5]該エピトープが、
(1)X1がTであり、X2がEであり、X3がMであり、及びX4がDである配列番号1のアミノ酸配列、
(2)X1がPであり、X2がDであり、X3がIであり、及びX4がEである配列番号1のアミノ酸配列、
(3)X5がSであり、及びX6がIである配列番号2のアミノ酸配列、又は
(4)X5がPであり、及びX6がVである配列番号2のアミノ酸配列
を含むエピトープである、[1]に記載のモノクローナル抗体。
[6]細胞が、抗原提示細胞である、[1]~[5]のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
[7]抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト(単核球)である、[6]に記載のモノクローナル抗体。
[8]細胞が、腫瘍細胞である、[1]~[5]のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
[9]腫瘍細胞が、ヒト由来である、[8]に記載のモノクローナル抗体。
[10]受託番号がFERM BP-11222又はFERM BP-11243であるハイブリドーマ。
[11][10]記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
[12][10]に記載のハイブリドーマによって産生される、[1]~[9]のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
[13]重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含む、細胞表面HSP90を認識する抗体。
[14]配列番号10の36~185位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は配列番号12の20~177位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体。
[15]アミノ酸配列VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)、又はアミノ酸配列HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)のいずれかから選択されるアミノ酸配列をエピトープとして含む免疫原ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体の製造方法。
[16]重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含むようにポリペプチドを調製する工程を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体の製造方法。
[17]細胞表面上のHSP90を認識する抗体と標的抗原との複合体を含むワクチン。
[18]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体である、[17]に記載のワクチン。
[19]標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、[17]又は[18]に記載のワクチン。
[20]細胞表面上のHSP90を認識する抗体と標的抗原との複合体を形成させる工程を含む、ワクチンの製造方法。
[21][17]~[19]のいずれかに記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[22][17]~[19]のいずれかに記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
[23]細胞表面上のHSP90を認識する抗体と生物学的活性を有する物質との複合体を含む薬剤。
[24]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体である、[23]に記載の薬剤。
[25]生物学的活性を有する物質が核酸分子である、[23]又は[24]に記載の薬剤。
[26]該核酸分子がsiRNAである、[25]に記載の薬剤。
[27]生物学的活性を有する物質が抗癌剤である、[23]又は[24]に記載の薬剤。
[28][23]~[27]のいずれかに記載の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
[29]細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバント。
[30]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体である、[29]に記載のアジュバント。
[31]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである、[29]に記載のアジュバント。
[32]細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位が、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合部位中の軽鎖可変領域を含んでなる、[29]に記載のアジュバント。
[33]細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを医薬上許容可能な賦形剤又は添加剤と混合する工程を含む、アジュバントの製造方法。
[34]Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンと[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[35]抗原提示細胞が樹状細胞である、[34]記載の免疫誘導方法。
[36]ワクチンが、[17]~[19]のいずれかに記載のワクチンである、[34]に記載の免疫誘導方法。
[37]ワクチンが、標的抗原と抗体との複合体を含む、[34]に記載の免疫誘導方法。
[38]標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、[37]に記載の免疫誘導方法。
[39]Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンの有効量と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
[40]抗腫瘍抗原抗体と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[41]抗腫瘍細胞抗体と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[42]抗癌剤と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[43]抗腫瘍抗原抗体の有効量と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントの有効量とを対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
[44](i)[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体を、透過処理していない細胞に反応させる工程、及び、
(ii)該抗体と細胞膜上に発現しているHSP90との複合体形成の有無を評価する工程、
を含む、細胞表面にHSP90を発現している細胞の検出方法。
[45]複合体形成の有無を評価する工程において、フローサイトメーターを使用することを特徴とする、[44]に記載の方法。
[46]細胞表面にHSP90を発現している細胞が抗原提示細胞である[44]に記載の方法。
[47]抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト(単核球)である、[46]に記載の方法。
[48]細胞表面にHSP90を発現している細胞が、腫瘍細胞である、[44]に記載の方法。
[49]腫瘍細胞が、ヒト由来である、[48]に記載の方法。
[1]アミノ酸配列VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)、又はアミノ酸配列HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
[2]配列番号1のアミノ酸配列中、X2がE又はDである[1]に記載のモノクローナル抗体。
[3]配列番号1のアミノ酸配列中、X4がE又はDである[1]に記載のモノクローナル抗体。
[4]配列番号2のアミノ酸配列中、X6がI又はVである[1]に記載のモノクローナル抗体。
[5]該エピトープが、
(1)X1がTであり、X2がEであり、X3がMであり、及びX4がDである配列番号1のアミノ酸配列、
(2)X1がPであり、X2がDであり、X3がIであり、及びX4がEである配列番号1のアミノ酸配列、
(3)X5がSであり、及びX6がIである配列番号2のアミノ酸配列、又は
(4)X5がPであり、及びX6がVである配列番号2のアミノ酸配列
を含むエピトープである、[1]に記載のモノクローナル抗体。
[6]細胞が、抗原提示細胞である、[1]~[5]のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
[7]抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト(単核球)である、[6]に記載のモノクローナル抗体。
[8]細胞が、腫瘍細胞である、[1]~[5]のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
[9]腫瘍細胞が、ヒト由来である、[8]に記載のモノクローナル抗体。
[10]受託番号がFERM BP-11222又はFERM BP-11243であるハイブリドーマ。
[11][10]記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
[12][10]に記載のハイブリドーマによって産生される、[1]~[9]のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
[13]重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含む、細胞表面HSP90を認識する抗体。
[14]配列番号10の36~185位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は配列番号12の20~177位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体。
[15]アミノ酸配列VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)、又はアミノ酸配列HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)のいずれかから選択されるアミノ酸配列をエピトープとして含む免疫原ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体の製造方法。
[16]重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含むようにポリペプチドを調製する工程を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体の製造方法。
[17]細胞表面上のHSP90を認識する抗体と標的抗原との複合体を含むワクチン。
[18]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体である、[17]に記載のワクチン。
[19]標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、[17]又は[18]に記載のワクチン。
[20]細胞表面上のHSP90を認識する抗体と標的抗原との複合体を形成させる工程を含む、ワクチンの製造方法。
[21][17]~[19]のいずれかに記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[22][17]~[19]のいずれかに記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
[23]細胞表面上のHSP90を認識する抗体と生物学的活性を有する物質との複合体を含む薬剤。
[24]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体である、[23]に記載の薬剤。
[25]生物学的活性を有する物質が核酸分子である、[23]又は[24]に記載の薬剤。
[26]該核酸分子がsiRNAである、[25]に記載の薬剤。
[27]生物学的活性を有する物質が抗癌剤である、[23]又は[24]に記載の薬剤。
[28][23]~[27]のいずれかに記載の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
[29]細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバント。
[30]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体である、[29]に記載のアジュバント。
[31]細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである、[29]に記載のアジュバント。
[32]細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位が、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合部位中の軽鎖可変領域を含んでなる、[29]に記載のアジュバント。
[33]細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを医薬上許容可能な賦形剤又は添加剤と混合する工程を含む、アジュバントの製造方法。
[34]Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンと[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[35]抗原提示細胞が樹状細胞である、[34]記載の免疫誘導方法。
[36]ワクチンが、[17]~[19]のいずれかに記載のワクチンである、[34]に記載の免疫誘導方法。
[37]ワクチンが、標的抗原と抗体との複合体を含む、[34]に記載の免疫誘導方法。
[38]標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、[37]に記載の免疫誘導方法。
[39]Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンの有効量と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
[40]抗腫瘍抗原抗体と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[41]抗腫瘍細胞抗体と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[42]抗癌剤と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
[43]抗腫瘍抗原抗体の有効量と[29]~[32]のいずれかに記載のアジュバントの有効量とを対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
[44](i)[1]~[9]、及び[11]~[14]のいずれかに記載の抗体を、透過処理していない細胞に反応させる工程、及び、
(ii)該抗体と細胞膜上に発現しているHSP90との複合体形成の有無を評価する工程、
を含む、細胞表面にHSP90を発現している細胞の検出方法。
[45]複合体形成の有無を評価する工程において、フローサイトメーターを使用することを特徴とする、[44]に記載の方法。
[46]細胞表面にHSP90を発現している細胞が抗原提示細胞である[44]に記載の方法。
[47]抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト(単核球)である、[46]に記載の方法。
[48]細胞表面にHSP90を発現している細胞が、腫瘍細胞である、[44]に記載の方法。
[49]腫瘍細胞が、ヒト由来である、[48]に記載の方法。
本発明の抗HSP90抗体は、細胞表面HSP90を高感度に認識可能であり、したがって、該抗体はFACS解析において、生細胞の細胞表面HSP90を検出し得る。本発明の抗体は、細胞表面HSP90を高感度かつ特異的に認識することができるため、例えば、本発明のワクチンの調製、生物学的活性を有する物質の送達、及びワクチン、腫瘍抗原抗体、抗腫瘍細胞抗体の機能を増強するアジュバント、細胞表面HSP90発現細胞の特異的な検出方法等において使用することができる。
本発明によって提供される抗HSP90抗体と抗原からなるワクチンは、抗原提示細胞、特に活性化された樹状細胞にのみ抗原を送達することができる。また、少ない抗原量で効率よくT細胞を活性化することができるため、抗原を適切に選択することによって、種々の疾患の治療に用いることが可能である。
本発明によって提供される抗HSP90抗体は細胞表面のHSP90を特異的に認識し、結合後速やかに細胞内に移行するため、生物学的活性を有する物質を細胞表面にHSP90を発現している細胞に効率的に送達することが可能である。
本発明によって提供されるアジュバントは、細胞表面のHSP90およびFcRγからなる複合体への結合を介して、Fcレセプターとの結合により起こる樹状細胞等の抗原提示機構を増強することができる。例えば、ワクチンと併用することにより、当該ワクチンの使用量を減らし、潜在的な副作用のリスクを低減させることができる。
さらに、本発明によれば、従来検出され得なかった細胞表面にHSP90を発現している細胞を生細胞の状態で検出できるため、例えば抗原提示細胞の検出、単離、分析等に用いることができる。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物、特許出願及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
また、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すIUPAC-IUB生化学命名委員会(CBN)で採用された略語を用いて表される。また、特に断りがない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端に向かってN末端からC末端となるように記載される。
Ala又はA:アラニン
Val又はV:バリン
Leu又はL:ロイシン
Ile又はI:イソロイシン
Pro又はP:プロリン
Phe又はF:フェニルアラニン
Trp又はW:トリプトファン
Met又はM:メチオニン
Gly又はG:グリシン
Ser又はS:セリン
Thr又はT:トレオニン
Cys又はC:システイン
Gln又はQ:グルタミン
Asn又はN:アスパラギン
Tyr又はY:チロシン
Lys又はK:リシン
Arg又はR:アルギニン
His又はH:ヒスチジン
Asp又はD:アスパラギン酸
Glu又はE:グルタミン酸
Ala又はA:アラニン
Val又はV:バリン
Leu又はL:ロイシン
Ile又はI:イソロイシン
Pro又はP:プロリン
Phe又はF:フェニルアラニン
Trp又はW:トリプトファン
Met又はM:メチオニン
Gly又はG:グリシン
Ser又はS:セリン
Thr又はT:トレオニン
Cys又はC:システイン
Gln又はQ:グルタミン
Asn又はN:アスパラギン
Tyr又はY:チロシン
Lys又はK:リシン
Arg又はR:アルギニン
His又はH:ヒスチジン
Asp又はD:アスパラギン酸
Glu又はE:グルタミン酸
本発明は、細胞表面HSP90を認識可能な抗HSP90モノクローナル抗体であって、HSP90上の特定の配列を認識するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体と抗原とを結合させた複合体を含むワクチン及びその用途、該抗体に生物学的活性を有する化合物を結合させた複合体を含む薬剤、該抗体を含むアジュバント及びその用途、該抗体を使用する細胞表面HSP90発現細胞の検出方法等を提供する。
本発明において、HSP90とは、熱等の多種のストレスにさらされることによりその発現が上昇し、細胞を保護する分子量90kDaのタンパク質の一群を意味し、分子シャペロンとして機能する。HSP90には、HSP90α及びβのアイソフォームが知られている。したがって、本発明において、HSP90とは、HSP90α及びβのいずれのアイソフォームをも意味する。
哺乳動物において、HSP90α及びβのアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列はともに、その多くが公知となっている。例えば、ヒトHSP90α(NM_005348,NP_005339)、マウスHSP90α(NM_010480,NP_034610)、ヒトHSP90β(NM_007355,NP_031381)、マウスHSP90β(NM_008302,NP_032328)の塩基配列及びアミノ酸配列がそれぞれ公開されている。HSP90α及びβのアミノ酸配列は、異なる哺乳動物種間でもそれぞれ良く保存されており、例えばヒトとマウスにおける配列を比較すると、HSP90αは99.0%、HSP90βは99.6%の配列同一性を示すことが知られている。またHSP90αとβの間の配列相同性は、ヒトにおいては86.1%、マウスにおいては86.2%であることが報告されている。したがって、これらの配列は、異なる種間又はアイソフォーム間の配列であっても、短い領域(例えば数十アミノ酸)においては100%の配列同一性を示し得る。例えば、後述するが、本発明のモノクローナル抗体のエピトープは、マウスとヒトで100%の配列同一性を示す。
本発明において、細胞表面HSP90とは、細胞の細胞膜近傍において発現しているHSP90を意味する。抗原提示細胞(例えば、活性化樹状細胞、マクロファージ、モノサイト(単核球)等)、多分化能間葉系前駆細胞(MPC)(Gronthos S, McCarty R, Mrozik K, et al. Stem Cells Dev. 2009;18:1253-1262)、及びオリゴデンドロサイト前駆細胞(Cid C, Alvarez-Cermeno JC, Camafeita E, Salinas M, Alcazar A. FASEB J. 2004;18:409-411.)等で細胞表面HSP90が報告されている。「抗原提示細胞」とは、異物である抗原を細胞内に取り込み、ペプチドへと分解した後、これをHLA分子に結合して細胞表面に発現することによりT細胞に抗原を提示する働きを有する細胞であり、樹状細胞、マクロファージ、B細胞又はモノサイト(単核球)等が知られている。本発明で対象とする抗原提示細胞としては、好ましくは樹状細胞、マクロファージ及びモノサイト等であり、特に好ましくは活性化樹状細胞(抗原が取り込まれた状態にある細胞)、マクロファージ及びモノサイトである。
また、メラノーマ(Becker B, Multhoff G, Farkas B, et al. Exp Dermatol. 2004;13:27-32.;Stellas D, Karameris A, Patsavoudi E. Clin Cancer Res. 2007;13:1831-1838.)、線維肉腫(Eustace BK, Sakurai T, Stewart JK, et al. Nat Cell Biol. 2004;6:507-514.)、及び神経芽細胞腫(Cid C, Regidor I, Poveda PD, Alcazar A. Cell Stress Chaperones. 2009;14:321-327.)等のヒトの腫瘍細胞において細胞表面HSP90が報告されている。
したがって、本発明において、細胞表面HSP90発現細胞とは、これらの細胞を含む。好ましくは細胞表面HSP90発現細胞は、抗原提示細胞又は腫瘍細胞であり、特に好ましくは活性化樹状細胞及びマクロファージ、並びにヒトの腫瘍細胞である。
細胞表面HSP90は、少なくとも細胞外の抗HSP90抗体と反応し得る様式で細胞膜近傍に存在する。
抗HSP90抗体
本発明のモノクローナル抗体は、下記配列番号1又は2のアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面上のHSP90を特異的に認識する。本発明のモノクローナル抗体はHSP90αおよびHSP90βのいずれか一方を特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体はHSP90αおよびHSP90βの両方を特異的に認識する。
VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)
HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)
本発明のモノクローナル抗体は、下記配列番号1又は2のアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面上のHSP90を特異的に認識する。本発明のモノクローナル抗体はHSP90αおよびHSP90βのいずれか一方を特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体はHSP90αおよびHSP90βの両方を特異的に認識する。
VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)
HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)
配列番号1において、X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示すが、X2は好ましくはE又はDであり、X4はE又はDであることが好ましい。配列番号2において、X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示すが、X6はI又はVであることが好ましい。
該エピトープは、より好ましくは、
(1)X1がTであり、X2がEであり、X3がMであり、及びX4がDである配列番号1のアミノ酸配列(即ち、VTEEMPPLEGDD(配列番号:3))、
(2)X1がPであり、X2がDであり、X3がIであり、及びX4がEである配列番号1のアミノ酸配列(即ち、VPDEIPPLEGDE(配列番号:4))、
(3)X5がSであり、及びX6がIである配列番号2のアミノ酸配列(即ち、HSIIETLRQKAE(配列番号:5))、又は
(4)X5がPであり、及びX6がVである配列番号2のアミノ酸配列(即ち、HPIVETLRQKAE(配列番号:6))
を含む。
(1)X1がTであり、X2がEであり、X3がMであり、及びX4がDである配列番号1のアミノ酸配列(即ち、VTEEMPPLEGDD(配列番号:3))、
(2)X1がPであり、X2がDであり、X3がIであり、及びX4がEである配列番号1のアミノ酸配列(即ち、VPDEIPPLEGDE(配列番号:4))、
(3)X5がSであり、及びX6がIである配列番号2のアミノ酸配列(即ち、HSIIETLRQKAE(配列番号:5))、又は
(4)X5がPであり、及びX6がVである配列番号2のアミノ酸配列(即ち、HPIVETLRQKAE(配列番号:6))
を含む。
該エピトープは、特に好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号4のアミノ酸配列を含む。
配列番号3のアミノ酸配列は、ヒトHSP90α(NP_005339)の712~723領域、あるいはマウスHSP90α(NP_034610)の713~724領域に相当し、配列番号4のアミノ酸配列は、ヒトHSP90β(NP_031381)の704~715領域、あるいはマウスHSP90β(NP_032328)の704~715領域に相当し、配列番号5のアミノ酸配列は、ヒトHSP90αの640~651領域、あるいはマウスHSP90αの641~652領域に相当し、配列番号6のアミノ酸配列は、ヒトHSP90βの632~643領域、あるいはマウスHSP90βの632~643領域に相当する。
本発明の抗体は、上記エピトープと結合し、細胞表面上のHSP90を認識できるものであれば特に制限はなく、天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、Fab発現ライブラリーによって作製された抗体断片、及びこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、例えば、重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含む、細胞表面HSP90を認識する抗体であってもよく、または、配列番号10の36~185位で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は配列番号12の20~177位で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体であってもよい。例えば、非ヒト哺乳動物由来のCDR配列をヒトフレームワーク(FR)配列に移植したヒト化抗体、非ヒト哺乳動物由来の可変領域配列をヒト定常領域配列と組み合わせたヒト型抗体を使用することができる。このような抗体の作製方法は公知であり、例えば、ヒト化抗体は米国特許第5225539号、5585089号、5693761号、5693762号、6180370号などに記載されている。結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、sFv、dsFv(disulphide stabilised Fv)、dAb(single domain antibody)等が挙げられる(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。これらのいずれもが本発明のモノクローナル抗体と同様に使用可能である。以下、主にモノクローナル抗体について記載するが、本明細書においてモノクローナル抗体に言及する場合、それには上記のような抗体およびその断片が含まれる。また、上記抗体およびその断片は例えばポリエチレングリコール(PEG)などで化学的に修飾されていてもよい。
また、本発明のモノクローナル抗体は、上記エピトープと結合し、且つ細胞表面上のHSP90を認識できる限り、そのアミノ酸配列において、1~数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を有するものであってもよい。
抗体のクラスは特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。精製の容易性等を考慮すると好ましくはIgGであり、より好ましくはIgG2aである。
本発明のモノクローナル抗体の製造に用いられる免疫原としては、HSP90タンパク質の全長又はエピトープを含むその一部からなるポリペプチドを用いることができる。具体的には、該免疫原は、配列番号1又は2、より好ましくは配列番号3~6からなる群より選択される1つのアミノ酸配列からなる領域を含むポリペプチドである。
また、上記ポリペプチドを担体に架橋する、精製に利用する等の目的で、1個又は複数個のアミノ酸を付加してもよい。付加されるアミノ酸の数は、特に限られないものの、製造される抗体の特異性を考慮すると、好ましくは1~10個、より好ましくは1~5個、更に好ましくは1~2個、最も好ましくは1個である。
付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドのN末端、C末端のいずれでもよいが、好ましくはN末端である。
さらに、免疫原性が維持されている限り、上記免疫原としてのポリペプチドは、そのアミノ酸配列において1~数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を有するものであってもよい。置換、欠失及び/又は挿入をするアミノ酸の数は、特に限られないものの、好ましくは1~20個、より好ましくは1~10個、更に好ましくは1~5個、最も好ましくは1~2個である。
免疫原ポリペプチドは、例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の抗原産生組織又は細胞から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて単離・精製する方法;ペプチド・シンセサイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的に合成する方法;免疫原ポリペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養する方法;あるいは、免疫原ポリペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写/翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等によって取得することができる。
哺乳動物の組織又は細胞から免疫原を調製する場合、該組織又は細胞をホモジナイズした後、酸、又はアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を自体公知の蛋白質分離技術(例:塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等)に付すことにより単離・精製することができる。得られた抗原ペプチドをそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
化学的に免疫原ポリペプチドを合成する場合、該合成ペプチドとしては、例えば、上述した天然より精製される免疫原ポリペプチドと同一の構造を有するもの、具体的には、該天然免疫原ポリペプチドのアミノ酸配列において、本発明のモノクローナル抗体のエピトープである配列番号1又は2のアミノ酸配列、もしくは配列番号3~6からなる群より選択される1つのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが用いられる。
DNAを含有する形質転換体を用いて免疫原ポリペプチドを製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法[例えば、Molecular Cloning, 2nd ed.; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989) に記載の方法など]に従って作成することができる。
無細胞転写/翻訳系を利用する場合、上記と同様、公知のクローニング方法により調製した免疫原ポリペプチドをコードするDNAを挿入した発現ベクター(例えば、該DNAがT7、SP6プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど)を鋳型とし、該プロモーターに適合するRNAポリメラーゼ及び基質(NTPs)を含む転写反応液を用いてmRNAを合成した後、該mRNAを鋳型として公知の無細胞翻訳系(例:大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液)を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。
免疫原ポリペプチドは、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、必要に応じて適当な担体(キャリア)に結合又は吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物又は共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体は、上記した免疫原を用いて当分野で通常用いられる方法により調製され得る。
(モノクローナル抗体の作製)
具体的には下記のようにして製造することができる。免疫原ポリペプチド(上述)を、マウス、ラットあるいはハムスターなどの動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に1乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約1乃至14日毎に1乃至4回免疫を行って、最終免疫より約1乃至5日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
具体的には下記のようにして製造することができる。免疫原ポリペプチド(上述)を、マウス、ラットあるいはハムスターなどの動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に1乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約1乃至14日毎に1乃至4回免疫を行って、最終免疫より約1乃至5日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞(ミエローマ細胞)からハイブリドーマ(融合細胞)を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ(融合細胞)の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法(Nature, Vol.256, p.495-497, 1975)及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合をさせることにより調製される。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653(653;ATCC No.CRL1580)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/0、Sp2)、PAI、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、例えばRIAやELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、免疫原との親和性に加え、エピトープとの結合性及び細胞表面HSP90を認識する能力を有する必要があることから、得られたハイブリドーマが産生する抗体について、それらの特徴の有無を確認する。具体的には各ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体のエピトープマッピングによって評価することができる。エピトープマッピングは、ペプチドアレイ法、質量分析法、NMRによる構造決定などによって行うことができる。ペプチドアレイ法は免疫原のアミノ酸配列をウィンドウをずらしながら切断したものを配置したペプチドアレイに抗体を結合させ、どの配列断片を認識したかによってエピトープを決める方法であり、質量分析法は抗原抗体複合体の表面水酸基を重水置換した後にマススペクトロメトリーによりマスクされていたエピトープ領域を決める方法である。このどちらの手法も使えない抗原の場合にはNMRによる構造解析により結合部分を決定する。
細胞表面HSP90を認識する能力を評価する方法は、後述の、細胞表面にHSP90を発現している細胞を検出する方法に準じて実施することができる。
かくして、エピトープが、配列番号1又は2、好ましくは配列番号3~6からなる群より選択される1つであり、且つ細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体を得、さらに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、本発明のモノクローナル抗体及び本発明のハイブリドーマとすることができる。
モノクローナル抗体は、単離及び/又は精製されることが好ましい。モノクローナル抗体の単離/精製は、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインAあるいはプロテインG(モノクローナル抗体のクラスによって異なる)などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
本発明のモノクローナル抗体は、検出可能な標識で標識されていてもよい。標識には蛍光標識、低分子化合物による標識、ペプチドによる標識等が挙げられる。
(ハイブリドーマ)
本発明は、細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。該ハイブリドーマは、具体的には上記(モノクローナル抗体の作製)の項で述べたようにして調製されるが、具体的には本発明者らによって新たに分離され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1 中央第6)に寄託され、受託番号としてFERM BP-11222、FERM BP-11243が付されているハイブリドーマ等である(受託日:それぞれ2010年1月13日および2010年3月11日)。
本発明は、細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。該ハイブリドーマは、具体的には上記(モノクローナル抗体の作製)の項で述べたようにして調製されるが、具体的には本発明者らによって新たに分離され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1 中央第6)に寄託され、受託番号としてFERM BP-11222、FERM BP-11243が付されているハイブリドーマ等である(受託日:それぞれ2010年1月13日および2010年3月11日)。
従って本発明の抗体は、受託番号がFERM BP-11222又はFERM BP-11243である上記ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体であり得る。受託番号がFERM BP-11222である上記ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、配列番号10の36~185位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)、及び/又は配列番号12の20~177位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む。これらの配列のいずれかを利用して可変領域以外がヒト由来であるキメラ(ヒト型)抗体を作製することができる。さらに、上記モノクローナル抗体は、重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3として配列番号10の66~70位、85~101位、134~141位、配列番号12の43~58位、74~80位、113~121位で表わされるアミノ酸配列をそれぞれ含む。これらの配列のいずれかを利用してCDR以外がヒト由来であるヒト化抗体を作製することができる。また該抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体も本発明の抗体として好適に用いることができる。
さらに本発明の抗体は、その重鎖及び軽鎖の塩基配列情報に基づいて遺伝子工学的に製造することもできる。例えば、配列番号9及び/又は11の2配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することができる。ここで配列番号9及び/又は11は同一の発現ベクター中に導入されていてもよいし、別個の発現ベクター中に導入されていてもよい。
本発明の抗体を発現すべく構築された発現ベクターを用いて、本発明の抗体又はその機能的断片を発現する細胞を調製することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などを用いることができる。
抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Wardら, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、araBプロモーター(Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1(Pharmacia社製)、「QIAexpress system」(QIAGEN社製)、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
また、哺乳動物由来の発現ベクター(例えば、pcDNA3(Invitrogen社製)や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、pEF、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター(例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL社製)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウィルス由来の発現ベクター(例えば、pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば、「Pichia Expression Kit」(Invitrogen社製)、pNV11、SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター(例えば、pPL608、pKTH50)等を用いることができる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター(Mulliganら, Nature (1979) 277, 108、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、CAGプロモーター(Gene. (1991) 108, 193、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子(例えば、薬剤(ネオマイシン、G418など)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター(例えば、pCHOIなど)を導入し、メトトレキセート(MTX)により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター(pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むことができる。
細胞表面HSP90の検出方法
本発明は、細胞表面にHSP90を発現している細胞を検出する方法を提供する。該方法は、(i)配列番号1又は2、好ましくは配列番号3~6からなる群より選択される1つのアミノ酸配列からなるエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とする本発明の抗体(特にモノクローナル抗体)、又は、受託番号FERM BP-11222又はFERM BP-11243の本発明のハイブリドーマにより産生された本発明のモノクローナル抗体を透過処理していない細胞に反応させる工程、及び、(ii)該抗体と細胞表面HSP90との複合体形成の有無を評価する工程、を含む。
本発明は、細胞表面にHSP90を発現している細胞を検出する方法を提供する。該方法は、(i)配列番号1又は2、好ましくは配列番号3~6からなる群より選択される1つのアミノ酸配列からなるエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とする本発明の抗体(特にモノクローナル抗体)、又は、受託番号FERM BP-11222又はFERM BP-11243の本発明のハイブリドーマにより産生された本発明のモノクローナル抗体を透過処理していない細胞に反応させる工程、及び、(ii)該抗体と細胞表面HSP90との複合体形成の有無を評価する工程、を含む。
「透過処理」とは、抗体等の大きな分子が細胞内に入り込めるように細胞膜に孔をあける処理であり、当分野において周知の方法(例えば界面活性剤を使用する方法、有機溶媒を使用する方法等)を使用して実施される。
本発明においてHSP90の発現を検出する対象となる細胞は、かかる膜透過処理を施していない為、抗体が細胞内に入らず、従って細胞内のHSP90と反応しない。すなわち、本発明の方法は、本発明のモノクローナル抗体が細胞表面のHSP90を認識できるという知見に基づいてなされたものであり、細胞表面HSP90を発現している細胞を検出することを可能にする。細胞質中に発現しているHSP90が哺乳動物の細胞において普遍的に存在するのに対し、細胞表面に発現しているHSP90は上記のように抗原提示細胞や腫瘍細胞等の限られた種類の細胞においてのみ存在する。したがって、本発明の検出方法は、これらの細胞を特異的に検出することを可能にする。また本発明の検出方法は、細胞の膜透過処理を必要としないため、生細胞を対象とすることも可能である。
以下、各工程について説明する。
(i)本発明のモノクローナル抗体を透過処理していない細胞に反応させる工程。
(i)本発明のモノクローナル抗体を透過処理していない細胞に反応させる工程。
本工程で用いるモノクローナル抗体は、上記した本発明のモノクローナル抗体であって、具体的には、配列番号1又は2、好ましくは配列番号3~6からなる群より選択される1つのアミノ酸配列からなるエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識できるモノクローナル抗体である。
本発明のモノクローナル抗体を反応させる対象となる細胞は、細胞表面にHSP90を発現しているか否かを調べることが所望される任意の動物細胞であり得る。
モノクローナル抗体を細胞に反応させる際の反応条件(例、抗体及び細胞の濃度、反応温度、反応時間、使用する緩衝液の組成等)は当業者に公知の条件が使用され、例えば細胞あたり過剰量の抗体を用い、0℃~20℃、好ましくは約4℃で0.5時間~1時間、等張リン酸緩衝液等の緩衝液中で反応させる。
(ii)該抗体と細胞膜上に発現しているHSP90との複合体形成の有無を評価する工程。
該工程は、通常の抗原抗体反応において形成される複合体を検出する方法と同様な方法で実施することができる。例えば、RIA法、表面プラズモン共鳴法、プロテインチップ、フローサイトメトリー等の自体公知の方法を用いることができる。これらの方法においては、検出のために本発明のモノクローナル抗体をあらかじめ標識しておいてもよいし、本発明の抗体を認識可能な、標識された二次抗体も使用することができる。標識には蛍光標識、低分子化合物による標識、ペプチドによる標識等が挙げられる。いずれの方法も当分野で常套的に行われている手法であり、当業者はその目的を考慮して適宜選択し実施することができる。例えば、本発明では膜透過処理を施さない細胞、好ましくは生細胞を用いることから、フローサイトメーターを用いた方法、すなわちフローサイトメトリー(FACS)に好適である。
上述のように、本発明のモノクローナル抗体は細胞表面のHSP90を認識することができる。従って、膜透過処理を施さなかった場合に該抗体とHSP90との複合体形成が観察されるということは、HSP90が細胞表面上に存在していることを意味する。
細胞表面HSP90が検出される細胞としては抗原提示細胞(上述)又は腫瘍細胞が挙げられ、具体的には活性化樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞、又はヒト由来の腫瘍細胞である。従って、本発明の細胞表面にHSP90を発現している細胞を検出・同定する方法は、活性化樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞を検出する方法、あるいはヒト由来の腫瘍細胞を検出・同定する方法に相当する。
モノクローナル抗体以外の本発明の抗HSP90抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記検出方法に用いることができる。
ワクチン
本発明は、細胞表面上のHSP90を認識するモノクローナル抗体と標的抗原との複合体(以下、便宜上、単に本発明の「抗原-抗体複合体」と称する場合もある)を含むワクチンを提供する。好ましくは、該モノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体(上述)である。より好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである。具体的には、例えば、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(6H8D2;便宜上6H8と称する場合もある)の軽鎖及び/又は重鎖可変領域又はそのCDRのいずれかを含む抗原結合部位、またはそれを含む抗体である。ここで、抗原結合部位は、抗体中の、抗原に結合する部位を言い、例えば軽鎖定常領域と軽鎖可変領域を含むFab領域(Fragment, antigen binding)を抗原結合部位を含むポリペプチドとして使用することができる。ここで軽鎖可変領域とは抗原を認識するのに必要な配列を含む軽鎖Fab領域のN末端側の領域を言う。
本発明は、細胞表面上のHSP90を認識するモノクローナル抗体と標的抗原との複合体(以下、便宜上、単に本発明の「抗原-抗体複合体」と称する場合もある)を含むワクチンを提供する。好ましくは、該モノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体(上述)である。より好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである。具体的には、例えば、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(6H8D2;便宜上6H8と称する場合もある)の軽鎖及び/又は重鎖可変領域又はそのCDRのいずれかを含む抗原結合部位、またはそれを含む抗体である。ここで、抗原結合部位は、抗体中の、抗原に結合する部位を言い、例えば軽鎖定常領域と軽鎖可変領域を含むFab領域(Fragment, antigen binding)を抗原結合部位を含むポリペプチドとして使用することができる。ここで軽鎖可変領域とは抗原を認識するのに必要な配列を含む軽鎖Fab領域のN末端側の領域を言う。
実施例にて後述するが、該モノクローナル抗体は、抗原提示細胞上のHSP90に結合すると、抗体-HSP90の複合体を形成し、該複合体は効率よく細胞内へと内部移行する(取り込まれる)。したがって、細胞表面上のHSP90を認識するモノクローナル抗体(好ましくは本発明のモノクローナル抗体)と標的抗原との複合体は、細胞表面上のHSP90に結合し、次いで細胞内部へと取り込まれる。
上記複合体中の標的抗原は、複合体が細胞に取り込まれるのに伴い、内部移行する。その後、該抗原はMHCクラスI抗原提示経路へと送達され、クロスプレゼンテーションが起こり、CD8+T細胞を活性化する。かかる作用機序により、上記複合体は、ワクチンとして機能する。従って、本発明のワクチンを標的抗原に対する免疫誘導方法において使用することができる。
また、本発明によれば、本発明のワクチンの有効量を対象に投与する工程を含む、疾患の治療または予防方法が提供される。標的抗原は、予防又は治療されるべき疾患に基づき、任意の公知の抗原から選択することができる。
例えば、標的抗原は、異常細胞又は病原体(pathogen)に発現している抗原であって、それを標的とする免疫作用により、体内における当該異常細胞又は病原体の消失、あるいは当該異常細胞又は病原体量の減少が期待できるものである限り特に限定されない。例えば、標的抗原としては、腫瘍抗原、病原体抗原が挙げられる。
腫瘍抗原は、上皮性及び非上皮性腫瘍を含む固形腫瘍、造血組織における腫瘍の抗原であり得る。固形腫瘍抗原としては特に限定されないが、例えば、MART-1/Melan-A、Mage-1、Mage-3、gp100、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質2(trp2)、CEA、PSA、CA-125、erb-2、Muc-1、Muc-2、TAG-72、AES、FBP、C-レクチン、NY-ESO-1、galectin-4/NY-CO-27、Pec60、HER-2/erbB-2/neu、テロメラーゼ、G250、Hsp105、点変異ras癌遺伝子、点変異p53癌遺伝子、癌胎児性抗原が挙げられる(例えば、特開2005-139118号公報、特開2004-147649号公報、特開2002-112780号公報、特開2004-222726号公報を参照)。造血組織における腫瘍(例、白血病)の抗原としては特に限定されないが、例えば、proteinase 3、WT-1、hTERT、PRAME、PML/RAR-a、DEK/CAN、シクロフィリンB、TEL-MAL1、BCR-ABL、OFA-iLRP、Survivin、idiotype、Sperm protein 17、SPAN-Xb、CT-27、MUC1が挙げられる。
病原体抗原は、病原性ウイルス抗原、病原性微生物抗原、又は病原性原生動物抗原であり得る。病原性ウイルス抗原としては特に限定されないが、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、肝炎ウイルス(例、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎ウイルス)、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイル熱ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス(例、HTLV-I)等のウイルスの抗原が挙げられる。具体的には、例えば、GP-120、p17、GP-160(以上、HIV)、NP、HA(以上、インフルエンザウイルス)、HBs Ag、HBVエンベロープタンパク質、コアタンパク質、ポリメラーゼタンパク質、NS3、NS5(以上、肝炎ウイルス)、HSVdD(単純ヘルペスウイルス)、EBNA1、2、3A、3B及び3C、LMP1及び2、BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1(以上、EBウイルス)、Tax(HTLV-I)、SARS-CoVスパイクタンパク質(SARSウイルス)、CMV pp5、IE-1(以上、CMV)、E6、E7タンパク質(以上、HPV)が挙げられる(例えば、特開2004-222726号公報参照)。病原性微生物抗原としては、例えば、病原性細菌(例、クラミジア、ミコバクテリア、レジオネラ)、病原性酵母(例、アスペルギルス、カンジダ)に発現している抗原が挙げられる。病原性原生動物抗原としては、例えば、マラリア、住血吸虫に発現している抗原が挙げられる。
本発明の抗原-抗体複合体において、細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体と標的抗原との結合は、共有結合又は非共有結合であってもよく、また直接的であっても間接的であってもよい。両者の結合には、当分野で公知の種々の方法を使用することができる。
共有結合としては、例えば、マレイミド化した抗原を、抗体と反応させることにより複合体を形成させる場合等が挙げられるが、これに限定されない。
非共有結合の場合としては、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用し、抗体又は抗原の一方にビオチンを結合し、他方にストレプトアビジンを結合することによって、抗体と抗原とを間接的に連結させる場合等が挙げられるが、これに限定されない。また抗体と抗原との間接的な結合には、リポソームなどのナノキャリアを利用することもできる。この場合、抗原をナノキャリアの表面に結合させるか又は内部に封入し、抗体をナノキャリアの表面に抗原結合部位を外側に向けて結合させることで、抗原-抗体複合体を調製することができる。ナノキャリアの組成は特に限定されず、当該分野で公知のものから選択することができる。また抗体又は抗原とナノキャリアの結合も当該分野で公知の方法を用いて行なうことができる。
本発明の抗原-抗体複合体は、ワクチンとして機能する有効量で患者に投与され得る。有効量は、当業者であれば、例えば、細胞株を使用するエキソビボ試験又は実験動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を必要とすることなく決定することができる。
本発明のワクチンは腫瘍性疾患又は感染症に有用である。
腫瘍性疾患としては、例えば、固形腫瘍(例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍)、造血組織における腫瘍が挙げられる。より詳細には、固形腫瘍としては、例えば、消化器癌(例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌)、肺癌(例、小細胞癌、非小細胞癌)、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺、脾臓、甲状腺癌、副腎、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌(例、子宮内膜癌、子宮頚癌)、骨癌、皮膚癌、肉腫(例、カポシ肉腫)、黒色腫、芽細胞腫(例、神経芽細胞腫)、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍、ならびにこれらの固形腫瘍の再発及び転移が挙げられる。造血組織における腫瘍としては、白血病(例、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、成人T細胞白血病(ATL)、骨髄異形成症候群(MDS))、リンパ腫(例、Tリンパ腫、Bリンパ腫、ホジキンリンパ腫)、骨髄腫(多発性骨髄腫)、ならびにこれらの腫瘍の再発が挙げられる。感染症としては、例えば、上述の病原体により引き起こされる感染症が挙げられる。
本発明のワクチンは、上記抗原-抗体複合体に加えて、随意に医薬上許容可能な賦形剤、又は添加剤を含んでよい。医薬上許容可能な賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。医薬上許容可能な担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
本発明のワクチンは、経口又は非経口的に投与される。経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤(経皮剤等)、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与することができる。
また本発明のワクチンは、その免疫効果を増強するために、アジュバントと共に投与することができる。一般にアジュバントとは、抗原と共に用いられると、抗原に対する免疫応答を非特異的に高め、抗原に対する細胞性免疫や抗体生産を増強するという役割を果たす物質を指す。アジュバントとしては、例えば、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、細菌や寄生虫由来の物質(Propionibacterium Acnes死菌など)などが挙げられるがこれらに限定されない。またアジュバントとして本発明の抗体を本発明のワクチンと共に投与することができる。「共に投与する」とは、同時投与又は併用投与を意味し、例えば、本発明のワクチンとアジュバントとが1つの組成物中に存在する場合、別個の組成物中に存在しほぼ同じ時間にしかし異なる部位で投与される場合、又は別個の組成物中に存在し異なる時間において投与される場合である。異なる時間において投与される場合、本発明のワクチンとアジュバントのいずれを先に投与してもよいが、アジュバントを先に投与することが好ましい。投与の間隔は、数秒、数分、数時間、又は数日の範囲において、任意に設定することができる。
アジュバントは、本発明のワクチンの免疫効果を増強する有効量で投与される。有効量は、当業者であれば、例えば、実験動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を必要とすることなく決定することができる。
アジュバントは、本発明のワクチンの免疫効果を増強する有効量で投与される。有効量は、当業者であれば、例えば、実験動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を必要とすることなく決定することができる。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与(例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等)に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容可能な担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
モノクローナル抗体以外の本発明の抗HSP90抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記ワクチンに用いることができる。
薬剤
本発明は、細胞表面HSP90を認識可能な抗HSP90モノクローナル抗体に、生物学的活性を有する物質を結合させた複合体を含む薬剤を提供する。
本発明は、細胞表面HSP90を認識可能な抗HSP90モノクローナル抗体に、生物学的活性を有する物質を結合させた複合体を含む薬剤を提供する。
本発明のワクチンと同様、本発明の薬剤においては、抗体と生物学的活性を有する物質との複合体(以下、便宜上「物質-抗体複合体」とも称する)は、細胞内に内部移行し得る。内部移行した物質-抗体複合体から、分解又は他の機構により、物質が遊離し、該物質が有する生物学的活性を示す。したがって、本発明の薬剤においては、生物学的活性を有する物質は、効率良く細胞内へと送達され得る。
抗体、抗体と物質との結合、薬剤の製剤化、投与方法についての説明は、本発明の上記ワクチンについての対応する記載を適用することができる。
生物学的活性を有する物質としては、生物学的活性を有している限り特に限定されず、公知の物質であっても今後開発される新規な物質であってもよい。また、化合物であっても組成物であってもかまわない。化合物としては低分子化合物及び高分子化合物等が挙げられ、低分子化合物とは分子量1000未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物及びその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物及びその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量1000以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、及びこれらを組み合わせたものなどが挙げられる。組成物としては上記化合物を2種以上を含むものや、必要に応じて生物学的活性に悪影響を及ぼさない不活性の担体等を含めることができる。これらの物質は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
抗体に結合させる物質は、好ましくは、細胞表面のHSP90を認識して、抗体とともに細胞内へと移行することから、細胞表面にHSP90を発現している細胞に対して、生物学的活性を示す物質である。例えばヒト腫瘍細胞にHSP90が発現していることから該物質として抗癌剤を用いることができる。抗癌剤としては、シクロフォスファミドやトリエチレンメラミンなどのアルキル化剤、メルカプトプリンや5-フルオロウラシルやメトトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシンやアドリアマイシンなどの抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド類、ホルモン類などが挙げられる。さらに細胞内に移行して機能することから該物質として核酸分子を用いることができる。核酸分子としては、核酸としては、DNA、RNAのいずれでもよい。DNAは、遺伝子を発現可能に含むものが挙げられ、例えばプラスミド、或いはプロモーターに連結された遺伝子を含む遺伝子構築物などが挙げられる。DNAとしては、アンチセンスDNA、酵素阻害剤、細胞毒性ないしアポトーシス誘導作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子、転写因子の阻害物質をコードする遺伝子などが挙げられる。RNAとしては、siRNA、アンチセンスRNA、shRNAなどが挙げられる。特にsiRNAは、遺伝子の発現を制御する周知の機能を有しており、本発明の薬剤における使用に適している。
本発明の薬剤を用いれば、生物学的活性を示す物質により治療又は予防され得る疾患又は状態(例えば腫瘍など)を治療又は予防することができる。従って、本発明は、本発明の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療方法を提供する。
モノクローナル抗体以外の本発明の抗HSP90抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記薬剤に用いることができる。
アジュバント及びその用途
本発明は、細胞表面上のHSP90を認識するモノクローナル抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバントを提供する。該モノクローナル抗体は、好ましくは、上述の本発明のモノクローナル抗体である。より好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである。具体的には、例えば、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(6H8D2;便宜上6H8と称する場合もある)の軽鎖及び/又は重鎖可変領域又はそのCDRのいずれかを含む抗原結合部位、またはそれを含む抗体である。ここで、抗原結合部位は、抗体中の、抗原に結合する部位を言い、例えば軽鎖定常領域と軽鎖可変領域を含むFab領域(Fragment, antigen binding)を抗原結合部位を含むポリペプチドとして使用することができる。ここで軽鎖可変領域とは抗原を認識するのに必要な配列を含む軽鎖Fab領域のN末端側の領域を言う。
本発明は、細胞表面上のHSP90を認識するモノクローナル抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバントを提供する。該モノクローナル抗体は、好ましくは、上述の本発明のモノクローナル抗体である。より好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである。具体的には、例えば、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(6H8D2;便宜上6H8と称する場合もある)の軽鎖及び/又は重鎖可変領域又はそのCDRのいずれかを含む抗原結合部位、またはそれを含む抗体である。ここで、抗原結合部位は、抗体中の、抗原に結合する部位を言い、例えば軽鎖定常領域と軽鎖可変領域を含むFab領域(Fragment, antigen binding)を抗原結合部位を含むポリペプチドとして使用することができる。ここで軽鎖可変領域とは抗原を認識するのに必要な配列を含む軽鎖Fab領域のN末端側の領域を言う。
本発明のアジュバントは、実施例にて後述するように、Fcレセプターへの結合を介した抗原提示機構を増強することができる。その作用機構において、細胞表面のHSP90と複合体を形成しているFcRγが重要な役割を果たしている。このFcRγは免疫の誘導において貪食能の亢進、サイトカイン/ケモカインの産生と分泌、酸化バーストの誘導、antibody dependent cell mediated cytotoxicity(ADCC)誘導といった作用を示す事が知られている。従って、本発明のアジュバントは、このような抗原提示機構の増強に基づいた免疫誘導方法において、使用され得る。
本発明のアジュバントは、Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞(好ましくは樹状細胞)に取り込まれるワクチンとともに対象に投与され得る。ここで用いられるワクチンは、例えば、標的抗原と抗体(好ましくはモノクローナル抗体)との複合体を含む。抗体は、Fc部分を有し、抗原提示細胞(好ましくは樹状細胞)上のFcレセプターと結合できるものであれば特に制限されない。抗体は、好ましくは、Fcγレセプターと結合できるIgGである。また標的抗原としては、例えば、上記本発明のワクチンの説明において列挙した標的抗原が挙げられ、好ましくは、病原体抗原又は腫瘍抗原である。
ワクチンとして、本発明のワクチンを使用することも好ましい。
該複合体において、抗体と標的抗原との結合部位は、該抗体とFcレセプターとの結合を妨げない限り、任意の部位を選択することができる。また両者の結合は、共有結合又は非共有結合であってよく、結合させる反応は、当分野で公知の種々の方法を使用して行なうことができる。
ワクチンとして、本発明のワクチンを使用することも好ましい。
該複合体において、抗体と標的抗原との結合部位は、該抗体とFcレセプターとの結合を妨げない限り、任意の部位を選択することができる。また両者の結合は、共有結合又は非共有結合であってよく、結合させる反応は、当分野で公知の種々の方法を使用して行なうことができる。
本発明のアジュバントは、抗腫瘍抗原抗体とともに投与され得る。ここで、抗腫瘍抗原抗体としては、上記本発明のワクチンの説明のために記載した腫瘍抗原を認識する抗体が挙げられる。
抗腫瘍抗原抗体は腫瘍抗原と複合体を形成し、その複合体がFcレセプターを介して樹状細胞に取り込まれる、腫瘍抗原に対する免疫反応が誘導される。本発明のアジュバントはこのような免疫誘導機構を増強することができる。
抗腫瘍抗原抗体は腫瘍抗原と複合体を形成し、その複合体がFcレセプターを介して樹状細胞に取り込まれる、腫瘍抗原に対する免疫反応が誘導される。本発明のアジュバントはこのような免疫誘導機構を増強することができる。
また、本発明のアジュバントは、抗腫瘍細胞抗体とともに投与され得る。抗腫瘍細胞抗体とは、腫瘍細胞膜表面に結合し、腫瘍細胞を殺傷する効果を有する抗体を意味する。このような抗体は、腫瘍細胞に作用した場合、細胞死(アポトーシス)を引き起こす。アポトーシスでばらばらになった腫瘍細胞等の細胞断片(apoptotic body)がFcレセプターを介して取り込まれ、免疫反応が誘導される。腫瘍細胞(又はその一部)には多くの腫瘍抗原が含まれているので、抗腫瘍細胞抗体で処理した腫瘍細胞は、腫瘍細胞に対する免疫反応を誘導する、多価ワクチンとして機能する。抗腫瘍細胞抗体としては、抗NY-ESO-1抗体、抗MAGE-3抗体、抗サバイビン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアジュバントは、このような樹状細胞内への取り込みを促進することができる。
本発明のアジュバントは、このような樹状細胞内への取り込みを促進することができる。
上記免疫誘導方法における、本発明のアジュバント及びワクチンの対象への投与方法についての説明は、上記本発明のワクチンについての対応する記載を適用することができる。
本発明のアジュバントは、抗癌剤を対象に投与する工程を含む免疫誘導方法においても使用され得る。抗癌剤により攻撃を受け潰れた癌細胞から腫瘍抗原が放出される。かかる腫瘍抗原と、該抗原に対して対象が産生した抗腫瘍抗原抗体とが結合し、得られた抗原抗体複合体が樹状細胞にFcレセプターを介して取り込まれる。本発明のアジュバントはこの取り込みを効果的に促進する。
抗癌剤としては、例えば、上記本発明の薬剤の説明において列挙した抗癌剤が挙げられる。
抗癌剤としては、例えば、上記本発明の薬剤の説明において列挙した抗癌剤が挙げられる。
本発明のアジュバントは、そこに含まれる、細胞表面上のHSP90を認識するモノクローナル抗体、特にその抗原結合部位、好ましくは本発明で提供されるモノクローナル抗体、特にその抗原結合部位が、Fcレセプターを介した抗原提示機構を増強する、即ちアジュバント効果を発揮するのに有効な量で投与される。有効量は、当業者であれば、例えば動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を行なうことなく適宜決定することができる。
モノクローナル抗体以外の本発明の抗HSP90抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記アジュバントに用いることができる。
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
実施例1
本実施例に、抗HSP90モノクローナル抗体及びそれらを産生するハイブリドーマの作製について説明する。
BALB/cマウスを50μgヒトリコンビナントHSP90α(長崎大学歯学部 根本孝幸 教授より提供された大腸菌発現ベクターを使用して調製、参考文献 J.Biol.Chem.272:26179-26187、1997)で2回免疫した。アジュバントにはTiterMax Gold(TiterMax、Georgia、USA)50μlを用いた。最終免疫から3日後に免疫マウスより脾臓細胞を取り出し、ポリエチレングリコール4000により、P3U1ミエローマ細胞と1:1の割合で融合した。融合した細胞は、96穴プレートに5000個/ウェルになるよう撒き、HAT選択培養液(0.1mMヒポキサンチン、0.016mMチミジン、0.4nMアミノプテリンを含む、10%FCS含有RPMI)で10日間培養した。増殖してきた細胞を含むウェルの上清中に存在するHSP90αに対する抗体をELISA法により検出した。HSP90αに対する抗体を分泌しているハイブリドーマを0.2個/ウェルに撒き直し、さらに10日間HT選択培養液(0.1mMヒポキサンチン、0.016mMチミジンを含む、10%FCS含有RPMI)で培養した。増殖してきた細胞上清中の抗体はELISA法とウエスタンブロット法によりHSP90に対する抗体を分泌している事を確かめた。ウェスタンブロット解析の結果を図1Aに示す。DC2.4樹状細胞株抽出物をSDS-PAGE展開の後、得られた抗HSP90抗体(2A6E9(2A6)、6H8D2(6H8)、5H12B7(5H12)、4B6G12(4B6))でブロットした。いずれのモノクローナル抗体も、商業的に入手可能なモノクローナル抗体(レーン5、SPA-840、Stressgen)により検出されるHSP90と対応するサイズの単一のバンドとしてHSP90を検出した。
6H8抗体を産生するハイブリドーマ、及び5H12抗体を産生するハイブリドーマを、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1 中央第6)に寄託した。それぞれ受託番号FERM BP-11222、FERM BP-11243が付されている(受託日:それぞれ2010年1月13日および2010年3月11日)。
実施例1
本実施例に、抗HSP90モノクローナル抗体及びそれらを産生するハイブリドーマの作製について説明する。
BALB/cマウスを50μgヒトリコンビナントHSP90α(長崎大学歯学部 根本孝幸 教授より提供された大腸菌発現ベクターを使用して調製、参考文献 J.Biol.Chem.272:26179-26187、1997)で2回免疫した。アジュバントにはTiterMax Gold(TiterMax、Georgia、USA)50μlを用いた。最終免疫から3日後に免疫マウスより脾臓細胞を取り出し、ポリエチレングリコール4000により、P3U1ミエローマ細胞と1:1の割合で融合した。融合した細胞は、96穴プレートに5000個/ウェルになるよう撒き、HAT選択培養液(0.1mMヒポキサンチン、0.016mMチミジン、0.4nMアミノプテリンを含む、10%FCS含有RPMI)で10日間培養した。増殖してきた細胞を含むウェルの上清中に存在するHSP90αに対する抗体をELISA法により検出した。HSP90αに対する抗体を分泌しているハイブリドーマを0.2個/ウェルに撒き直し、さらに10日間HT選択培養液(0.1mMヒポキサンチン、0.016mMチミジンを含む、10%FCS含有RPMI)で培養した。増殖してきた細胞上清中の抗体はELISA法とウエスタンブロット法によりHSP90に対する抗体を分泌している事を確かめた。ウェスタンブロット解析の結果を図1Aに示す。DC2.4樹状細胞株抽出物をSDS-PAGE展開の後、得られた抗HSP90抗体(2A6E9(2A6)、6H8D2(6H8)、5H12B7(5H12)、4B6G12(4B6))でブロットした。いずれのモノクローナル抗体も、商業的に入手可能なモノクローナル抗体(レーン5、SPA-840、Stressgen)により検出されるHSP90と対応するサイズの単一のバンドとしてHSP90を検出した。
6H8抗体を産生するハイブリドーマ、及び5H12抗体を産生するハイブリドーマを、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1 中央第6)に寄託した。それぞれ受託番号FERM BP-11222、FERM BP-11243が付されている(受託日:それぞれ2010年1月13日および2010年3月11日)。
実施例2
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面HSP90発現細胞上の細胞表面HSP90を認識することを説明する。
本発明者らが作製した複数のハイブリドーマから得られた抗HSP90抗体(2A6、6H8、5H12、4B6)を使用して、GMCSF依存性骨髄由来樹状細胞(GMCSF-BMDC)様の樹状細胞株DC2.4(Dr. Ken Rock、マサチューセッツ工科大学より供与)の細胞膜表面の染色を以下の手順に従って行なった。
(1)ビオチン化試薬EZ-Link(登録商標)Sulfo-NHS-Biotin(21217、タカラバイオ株式会社)1.1mgを純水250μlに溶解した(濃度10mM)。抗体タンパク質(1mg/ml)100μlに対して、溶解したビオチン化試薬2μlを加え、氷冷下で2時間反応させた。反応後、Centricon[5k](ミリポア)を用いて、反応しなかったビオチン試薬を除いた。最終濃度を1mg/mlとし、4℃にて保存した。
(2)膜透過処理を施していないDC2.4(1×106個/0.1ml)を、ビオチン化抗HSP90抗体(1μg/ml)と、4℃にて30分間インキュベートした。陰性対照として、DC2.4を、抗体を含まないPBS中で同様にインキュベートした。
(3)未反応の抗体を除去した後、DC2.4(1×106個/0.1ml)をPE-cy5ストレプトアビジン(eBioscience、15-4317-82、使用濃度0.5μg/ml)と、4℃にて30分間インキュベートした。
(4)未反応のPE-cy5ストレプトアビジンを除去した後、細胞をFACS(Becton Dickinson)により解析した。
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面HSP90発現細胞上の細胞表面HSP90を認識することを説明する。
本発明者らが作製した複数のハイブリドーマから得られた抗HSP90抗体(2A6、6H8、5H12、4B6)を使用して、GMCSF依存性骨髄由来樹状細胞(GMCSF-BMDC)様の樹状細胞株DC2.4(Dr. Ken Rock、マサチューセッツ工科大学より供与)の細胞膜表面の染色を以下の手順に従って行なった。
(1)ビオチン化試薬EZ-Link(登録商標)Sulfo-NHS-Biotin(21217、タカラバイオ株式会社)1.1mgを純水250μlに溶解した(濃度10mM)。抗体タンパク質(1mg/ml)100μlに対して、溶解したビオチン化試薬2μlを加え、氷冷下で2時間反応させた。反応後、Centricon[5k](ミリポア)を用いて、反応しなかったビオチン試薬を除いた。最終濃度を1mg/mlとし、4℃にて保存した。
(2)膜透過処理を施していないDC2.4(1×106個/0.1ml)を、ビオチン化抗HSP90抗体(1μg/ml)と、4℃にて30分間インキュベートした。陰性対照として、DC2.4を、抗体を含まないPBS中で同様にインキュベートした。
(3)未反応の抗体を除去した後、DC2.4(1×106個/0.1ml)をPE-cy5ストレプトアビジン(eBioscience、15-4317-82、使用濃度0.5μg/ml)と、4℃にて30分間インキュベートした。
(4)未反応のPE-cy5ストレプトアビジンを除去した後、細胞をFACS(Becton Dickinson)により解析した。
図1B左パネルに示すように、実験に供した抗体のうち、6H8D2(6H8)及び5H12B7(5H12)モノクローナル抗体が、細胞表面HSP90を高感度で認識した。図1B右パネルには、左パネル中のデータの平均蛍光強度(MFI)についての棒グラフを示す。
6H8モノクローナル抗体を使用して、上記方法に従って、以下の抗原提示細胞の染色を行なった;(i)DC2.4、(ii)マウスBMDC(GM-CSFにより誘導)、(iii)マウスBMDC(Flt3Lにより誘導)、(iv)ヒトPBMC由来未熟DC(ヒト末梢血CD14陽性細胞よりGM-CSF及びIL4により誘導)、(v)ヒトBMDC由来成熟DC(ヒト末梢血CD14陽性細胞よりGM-CSF及びIL4により誘導し、さらにTNFαにて成熟化)、(vi)マウス腹腔マクロファージ(プリステン(和光純薬)0.5mlをマウス腹腔内に投与し5日後に腹腔洗浄液として回収した)、(vii)ヒトマクロファージ細胞株J774(ATCC)。図1C中、灰色部分は、PE-Cy5ストレプトアビジンのみでの染色データを陰性対照として示す。図1Dには、図1CのデータのMFIについての棒グラフを示す。図1C及びDに示すように、6H8抗体は、ヒトPBMC由来未熟DC以外の細胞上の細胞表面HSP90を認識した。
実施例3
本実施例に、抗HSP90モノクローナル抗体のエピトープマッピングについて説明する。
抗HSP90モノクローナル抗体として、実施例1で作製したモノクローナル抗体2A6E9(2A6)、6H8D2(6H8)、5H12B7(5H12)及び4B6G12(4B6)、並びにK41102、K41107、K41331及びK41009(Dr.根本孝幸 長崎大学より供与)を用いた。
エピトープマッピングは、ビオチン化オーバーラッピングペプチドを使用して行なった。ビオチン化オーバーラッピングペプチドは、公知文献(J. Immunological Methods 2002;267:27-35.)に記載の方法に従って作製した。全長12アミノ酸の4アミノ酸の重なりを有する合成ペプチドライブラリーを用いて実施した。
アビジンでコートしたプレートをBSAでブロッキングした後、上記ビオチン化オーバーラッピングペプチド(1.25-3.75mg/ml)を加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした後、PBS/Tween20で洗浄し、未反応のビオチン化オーバーラッピングペプチドを除去した。各抗HSP90モノクローナル抗体(1μg/ml)を加え、室温で2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tween20で洗浄し、未反応の抗体を除去した後、抗マウスIgG-ALP(BD Pharmingen、2000倍希釈にて使用)を加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS/Tween20で洗浄し、未反応の抗マウスIgG-ALPを除去した後、pNPP溶液(KPL、1mg/ml)を加えて室温にて3時間インキュベートし、発色させた。発色後のプレートのOD405nmを測定した。
図2A及びB左パネルにおいて、横軸は、マウスのHSP90αのアミノ酸番号を示し、縦軸はELISAアッセイにより得られたOD405の相対値を示す。各抗HSP90モノクローナル抗体によりマッピングされた領域を、HSP90α上のアミノ酸番号範囲として示す。6H8D2(6H8)によって認識されるエピトープは、HSP90α713-724(HSP90β704-715に対応)にマッピングされ、5H12B7(5H12)によって認識されるエピトープは、HSP90α641-652(HSP90β632-643に対応)にマッピングされた。
本実施例に、抗HSP90モノクローナル抗体のエピトープマッピングについて説明する。
抗HSP90モノクローナル抗体として、実施例1で作製したモノクローナル抗体2A6E9(2A6)、6H8D2(6H8)、5H12B7(5H12)及び4B6G12(4B6)、並びにK41102、K41107、K41331及びK41009(Dr.根本孝幸 長崎大学より供与)を用いた。
エピトープマッピングは、ビオチン化オーバーラッピングペプチドを使用して行なった。ビオチン化オーバーラッピングペプチドは、公知文献(J. Immunological Methods 2002;267:27-35.)に記載の方法に従って作製した。全長12アミノ酸の4アミノ酸の重なりを有する合成ペプチドライブラリーを用いて実施した。
アビジンでコートしたプレートをBSAでブロッキングした後、上記ビオチン化オーバーラッピングペプチド(1.25-3.75mg/ml)を加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした後、PBS/Tween20で洗浄し、未反応のビオチン化オーバーラッピングペプチドを除去した。各抗HSP90モノクローナル抗体(1μg/ml)を加え、室温で2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tween20で洗浄し、未反応の抗体を除去した後、抗マウスIgG-ALP(BD Pharmingen、2000倍希釈にて使用)を加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS/Tween20で洗浄し、未反応の抗マウスIgG-ALPを除去した後、pNPP溶液(KPL、1mg/ml)を加えて室温にて3時間インキュベートし、発色させた。発色後のプレートのOD405nmを測定した。
図2A及びB左パネルにおいて、横軸は、マウスのHSP90αのアミノ酸番号を示し、縦軸はELISAアッセイにより得られたOD405の相対値を示す。各抗HSP90モノクローナル抗体によりマッピングされた領域を、HSP90α上のアミノ酸番号範囲として示す。6H8D2(6H8)によって認識されるエピトープは、HSP90α713-724(HSP90β704-715に対応)にマッピングされ、5H12B7(5H12)によって認識されるエピトープは、HSP90α641-652(HSP90β632-643に対応)にマッピングされた。
図2A及びB右パネルには、実施例2と同様に各モノクローナル抗体で染色したDC2.4細胞についてのFACSデータ(ヒストグラム)を示す。
図2Cには、エピトープマッピングの結果をまとめて図示する。対応するモノクローナル抗体によってDC2.4細胞の細胞表面上で検出された、及び検出されなかった認識部位を、それぞれ斜線ボックス及び灰色ボックスで表す。
本実施例から、6H8抗体によって認識されるエピトープは、マウスHSP90α713-724(HSP90β704-715に対応)に位置することがわかった。かかる領域はヒトHSP90α712-723(HSP90β704-715に対応)に相当する。HSP90α及びβ上のエピトープの相同性は66.7%であり、12アミノ酸のうち8アミノ酸が同一であるに過ぎないが、残り4アミノ酸は同じカテゴリーに分類されるアミノ酸である。HSP90α713-724は、C末端近傍に位置し、この領域は、柔軟性が高すぎるためX線結晶構造解析において結晶化しない。同様にC末端近傍に位置するエピトープを認識する2A6E9抗体及びK41009抗体は、それぞれマウスHSP90α722-733及びマウスHSP90α702-716をエピトープとし、マウスHSP90α713-724と重複する領域を認識するが、細胞表面HSP90を認識しなかった。これらの結果より、これらのエピトープが2A6E9抗体やK41009抗体によって認識されるのを妨げるような、細胞表面においてHSP90と複合体を形成する未知の分子が存在する可能性が示唆される。
実施例4
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面HSP90の2つのアイソフォーム、HSP90α及びβの両方に結合することについて説明する。
まずDC2.4細胞の細胞表面をビオチン化した。ビオチン化は、Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC(Thermo scientific、21338)を使用し、同試薬添付のインストラクションに従って行なった。細胞膜を細胞分画抽出キット(sub-cellular extraction kit)(Calbiochem)により調製し、2A6E9抗体を使用して免疫沈降を実施した。沈殿物をSDS-PAGEに供した後、抗HSP90α及びβの両方を認識する抗体(実施例1で得られた別の抗体である6B1C4)又はアビジン-HRPを使用してブロッティングを行なった(図3A)。
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面HSP90の2つのアイソフォーム、HSP90α及びβの両方に結合することについて説明する。
まずDC2.4細胞の細胞表面をビオチン化した。ビオチン化は、Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC(Thermo scientific、21338)を使用し、同試薬添付のインストラクションに従って行なった。細胞膜を細胞分画抽出キット(sub-cellular extraction kit)(Calbiochem)により調製し、2A6E9抗体を使用して免疫沈降を実施した。沈殿物をSDS-PAGEに供した後、抗HSP90α及びβの両方を認識する抗体(実施例1で得られた別の抗体である6B1C4)又はアビジン-HRPを使用してブロッティングを行なった(図3A)。
図3Aに示すように、2A6E9抗体により免疫沈降され(6Bのレーン)、かつビオチン化された(Avi.のレーン)、HSP90が検出され、DC2.4細胞表面にHSP90が発現していることが示された。
哺乳動物HSP90には、二つのアイソフォーム、HSP90α及びβが存在する。本発明の抗体によってHSP90αのみならず、HSP90βも認識されているか否かを以下の実験により確認した。まず、6H8、2A6、及び陰性対照として正常マウスIgGを使用して、DC2.4生細胞を氷上にて各抗体とインキュベートした。未反応の抗体を除去するために十分に洗浄した後、細胞を溶解し、該溶解物を10,000×gで遠心分離し、得られた上清をプロテインG-セファロースとインキュベートした。結合物をSDS-PAGEに供した後、抗HSP90α抗体(SPS-771、Assay designs)、抗HSP90β抗体(PB-118-P1、Neomarkers)、並びにHSP90α及びβの両方を認識する抗体(実施例1で得られた別の抗体である6B1C4)を使用してブロッティングを行った。
図3Bに示すように、HSP90α及びβの両方が細胞表面に存在し、6H8によって、認識されることが示された(図3B中、6Hのレーン)。一方、図3Aにおいて細胞分画後の膜画分中のHSP90を認識・免疫沈降した2A6E9は、生細胞上では細胞表面HSP90α及びβのいずれも認識しなかった(図3B中、2Aのレーン)。したがって、本発明の抗体は、生細胞の細胞表面HSP90の分析に使用可能である点で、既存の抗体に比べて優れている。
実施例5
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面HSP90の研究においても有用であることを説明する。
上記した実施例から、細胞質シャペロンであるHSP90がAPCの細胞表面に発現する機構が存在することが明らかになった。HSP90は、自身を細胞膜や分泌経路へと標的化するためのシグナル配列を有さないため、細胞表面に移行するためには、非従来型分泌経路を通じて細胞表面に出る未知の分子と結合する必要がある。
そこで、HSP90特異的阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンの、細胞表面HSP90の発現への影響を調べた。DC2.4細胞を、OVA(図4A中、i;1mg/ml)、ラディシコール(図4A中、ii;25μM)又はノボビオシン(図4A中、iii;400μM)の存在下、5%CO2中で37℃にて3時間インキュベートした。次いで、細胞を氷上で冷却し、細胞表面HSP90を検出するために、6H8抗体で染色した後、FACSにより解析した。図4Aに示すように、HSP90特異的阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンは、表面HSP90の発現レベルにほとんど又は全く影響を与えなかった。HSP90阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンによる処理が、表面HSP90の発現に影響を与えなかったことは、細胞表面におけるHSP90と、HSP90を細胞表面へ移行させる分子との結合様式がこれらの阻害剤に抵抗性であることを示しており、したがって、HSP90は通常のクライアントタンパク質ではない分子と結合することによって、細胞表面への移行を指示されている可能性がある。
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面HSP90の研究においても有用であることを説明する。
上記した実施例から、細胞質シャペロンであるHSP90がAPCの細胞表面に発現する機構が存在することが明らかになった。HSP90は、自身を細胞膜や分泌経路へと標的化するためのシグナル配列を有さないため、細胞表面に移行するためには、非従来型分泌経路を通じて細胞表面に出る未知の分子と結合する必要がある。
そこで、HSP90特異的阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンの、細胞表面HSP90の発現への影響を調べた。DC2.4細胞を、OVA(図4A中、i;1mg/ml)、ラディシコール(図4A中、ii;25μM)又はノボビオシン(図4A中、iii;400μM)の存在下、5%CO2中で37℃にて3時間インキュベートした。次いで、細胞を氷上で冷却し、細胞表面HSP90を検出するために、6H8抗体で染色した後、FACSにより解析した。図4Aに示すように、HSP90特異的阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンは、表面HSP90の発現レベルにほとんど又は全く影響を与えなかった。HSP90阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンによる処理が、表面HSP90の発現に影響を与えなかったことは、細胞表面におけるHSP90と、HSP90を細胞表面へ移行させる分子との結合様式がこれらの阻害剤に抵抗性であることを示しており、したがって、HSP90は通常のクライアントタンパク質ではない分子と結合することによって、細胞表面への移行を指示されている可能性がある。
サイトカインが細胞表面HSP90発現の変動因子である可能性を考え、種々のサイトカインの細胞表面HSP90発現への影響を以下のように調べた。DC2.4細胞及びマウスGMCSF依存BMDCを、IFNα(500U/ml)、IFNβ(500U/ml)、若しくはIFNγ(50ng/ml)の存在下(図5A中、太線)又は非存在下(図5A中、細線)、5%CO2中で37℃にて24時間インキュベートし、6H8抗体を用いて染色した細胞表面HSP90をFACSにより解析した。その結果、培養液へのIFNα、β、γの添加により、細胞表面HSP90発現が増加することを確認した(図5A)。なお、灰色部分は、PE-Cy5のみによる染色の結果を陰性対照として示す。
また図5Bには、異なる濃度のIFNα、β、γにより処理した結果を示す。黒色棒は、図5Aにおけるサイトカイン処理した細胞についてのMFIを示し、灰色棒は、低濃度のIFNα(100U/ml)、IFNβ(100U/ml)、又はIFNγ(10ng/ml)存在下でインキュベートした細胞についてのMFIを示す。白色棒は、サイトカイン非存在下でのMFIを陰性対照として示す。
図5Cには、種々のサイトカインにより、上記の実験と同様にBMDCを処理した結果を示す。黒色棒は、高濃度のIFN(図5Bと同様)、又は他のサイトカイン(100ng/ml)存在下でインキュベートしたBMDCについてのMFIを示し、灰色棒は、低濃度のIFN(図5Bと同様)、又は他のサイトカイン(10ng/ml)存在下でインキュベートしたBMDCについてのMFIを示す。白色棒は、サイトカイン非存在下でのBMDCについてのMFIを陰性対照として示す。IL-3、4、5、6、10、12、15、18、23による処理では、陰性対照に対して有意な差は認められなかった。
また図5Bには、異なる濃度のIFNα、β、γにより処理した結果を示す。黒色棒は、図5Aにおけるサイトカイン処理した細胞についてのMFIを示し、灰色棒は、低濃度のIFNα(100U/ml)、IFNβ(100U/ml)、又はIFNγ(10ng/ml)存在下でインキュベートした細胞についてのMFIを示す。白色棒は、サイトカイン非存在下でのMFIを陰性対照として示す。
図5Cには、種々のサイトカインにより、上記の実験と同様にBMDCを処理した結果を示す。黒色棒は、高濃度のIFN(図5Bと同様)、又は他のサイトカイン(100ng/ml)存在下でインキュベートしたBMDCについてのMFIを示し、灰色棒は、低濃度のIFN(図5Bと同様)、又は他のサイトカイン(10ng/ml)存在下でインキュベートしたBMDCについてのMFIを示す。白色棒は、サイトカイン非存在下でのBMDCについてのMFIを陰性対照として示す。IL-3、4、5、6、10、12、15、18、23による処理では、陰性対照に対して有意な差は認められなかった。
実施例6
本実施例に、本発明の抗体による細胞表面HSP90の内部移行について説明する。
以下の方法により、6H8抗体により認識された後の6H8-HSP90複合体の挙動を調べた。まずDC2.4細胞を、ビオチン化6H8(1μg/ml)の存在下、氷上で30分間インキュベートし、洗浄した。次いで、細胞を37℃、5%CO2下で、0、10、20、30、又は60分間インキュベートした。氷上で冷却した後、細胞をPE-Cy5-ストレプトアビジンで染色し、FACSにより解析した。結果を図4B左パネルに示し、右パネルには、各群のMFIについての棒グラフを示す。6H8-HSP90複合体は、非常に短い時間(すなわち10分程度)で、細胞表面から消失すること(細胞内へ移行すること)が見出された。
本実施例に、本発明の抗体による細胞表面HSP90の内部移行について説明する。
以下の方法により、6H8抗体により認識された後の6H8-HSP90複合体の挙動を調べた。まずDC2.4細胞を、ビオチン化6H8(1μg/ml)の存在下、氷上で30分間インキュベートし、洗浄した。次いで、細胞を37℃、5%CO2下で、0、10、20、30、又は60分間インキュベートした。氷上で冷却した後、細胞をPE-Cy5-ストレプトアビジンで染色し、FACSにより解析した。結果を図4B左パネルに示し、右パネルには、各群のMFIについての棒グラフを示す。6H8-HSP90複合体は、非常に短い時間(すなわち10分程度)で、細胞表面から消失すること(細胞内へ移行すること)が見出された。
さらに、免疫染色により、HSP90の挙動を、MHCクラスI分子であるH-2Kb及びMHCクラスII分子であるI-Abの挙動と比較した。まずDC2.4細胞を、ビオチン化6H8抗体、及びFITC標識抗H-2Kb抗体又は抗I-Ab抗体(Pharmingen、100倍希釈した抗体で使用)の存在下、上記方法と同様にインキュベートした。細胞をPE-Cy5-ストレプトアビジンで染色し、室温に移して20分間インキュベートした後、共焦点顕微鏡により観察した。図4CにHSP90及びH-2Kbの結果を、図4DにHSP90及びI-Abの結果をそれぞれ示す。6H8抗体によって細胞表面HSP90が内部移行することが確認された。
実施例7
本実施例に、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原をCD8+T細胞へとクロスプレゼンテーションさせることが可能であることを説明する。
実施例6の結果は、6H8抗体が抗原を効率よく細胞内に導入するアジュバントとして使用できる可能性を示す。そこで、モデル抗原として卵白アルブミン(Ovalbumin:OVA)を使用して、6H8抗体のアジュバント能の検討を行なった。
Imject maleimide-activated OVAは、Thermo scientific(Rockford、USA)から入手した。6H8 mAb(5mg/ml)(50mM phosphate、1mM EDTA)1mlを、10μlのSATA溶液(6.5mgのN-Succinimidyl S-acetylthioacetateを500μlのDMSOに溶解)と室温で30分間反応させた。30,000MW cut-off centrifugal filter(ミリポア)で3回遠心洗浄後、1mlになるよう調整し、100μlの0.5Mヒドロキシルアミンを加えて室温にて2時間反応させた。これをmaleimide-activated OVAと1:1.5の比率で90分間反応させて、10mM(最終濃度)2-MEを加えて反応を止めた。
6H8抗体及びマレイミド化OVAの反応液を、Superose6カラム(GE Healthcare)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーに供し、コンジュゲートを未反応のタンパク質から分離した。サイズ排除クロマトグラフィーはSuperose6カラム、AKTA purifier(GE Healthcare)を用いて行い、移動相にはPBSを使用し、流速は0.5ml/分とした。分取は0.5ml/フラクションで行なった。図6Aに、クロマトグラムを示す。以上の操作により、フラクション1から50を得た。
本実施例に、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原をCD8+T細胞へとクロスプレゼンテーションさせることが可能であることを説明する。
実施例6の結果は、6H8抗体が抗原を効率よく細胞内に導入するアジュバントとして使用できる可能性を示す。そこで、モデル抗原として卵白アルブミン(Ovalbumin:OVA)を使用して、6H8抗体のアジュバント能の検討を行なった。
Imject maleimide-activated OVAは、Thermo scientific(Rockford、USA)から入手した。6H8 mAb(5mg/ml)(50mM phosphate、1mM EDTA)1mlを、10μlのSATA溶液(6.5mgのN-Succinimidyl S-acetylthioacetateを500μlのDMSOに溶解)と室温で30分間反応させた。30,000MW cut-off centrifugal filter(ミリポア)で3回遠心洗浄後、1mlになるよう調整し、100μlの0.5Mヒドロキシルアミンを加えて室温にて2時間反応させた。これをmaleimide-activated OVAと1:1.5の比率で90分間反応させて、10mM(最終濃度)2-MEを加えて反応を止めた。
6H8抗体及びマレイミド化OVAの反応液を、Superose6カラム(GE Healthcare)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーに供し、コンジュゲートを未反応のタンパク質から分離した。サイズ排除クロマトグラフィーはSuperose6カラム、AKTA purifier(GE Healthcare)を用いて行い、移動相にはPBSを使用し、流速は0.5ml/分とした。分取は0.5ml/フラクションで行なった。図6Aに、クロマトグラムを示す。以上の操作により、フラクション1から50を得た。
抗マウスIgG-HRP(6H8抗体を検出)及びビオチン化抗OVAモノクローナル抗体(OVAを検出)を使用してイムノブロッティングを行なうことにより、各フラクションの分子量プロファイルを確認した(図6B)。フラクション15から19には、高分子の6H8-OVAコンジュゲートが含まれていること、フラクション33には、コンジュゲート化されていないOVAが含まれており、6H8抗体は含まれていないことを確認した。
各フラクションを抗原として使用し、クロスプレゼンテーションアッセイを行なった。DC2.4細胞を、5μg/mlの各フラクション(フラクション33のみ30μg/ml)又は1mg/mlの遊離OVAで3時間パルスした。パラホルムアルデヒドを使用して固定した後、DC2.4細胞(1×104個/ウェル)を、96穴丸底プレートにて、OT-I CD8+T細胞(1×105個/ウェル:OT-Iマウスの脾臓細胞を回収し、標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD11b magnetic particles DM(BD Biosciences Pharmingen、558013)を使用してCD11b陽性細胞を除去した。次いで標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD8a particles DM(BD Biosciences Pharmingen、551516)を使用してCD8a陽性細胞を精製した。得られた細胞をOT-I CD8+T細胞として使用した)と共培養した。24~72時間後、培養上清を集め、IFNγ量を測定した。図6Cに示すように、高分子の複合体(すなわち6H8-OVAコンジュゲート)を含むフラクション15~21をパルスしたDC2.4細胞は、効率良くCD8+T細胞のIFNγ産生を誘導した。これらのフラクションのパルスに使用したタンパク質量(6H8抗体とマレイミド化OVAとの合計量)は、いずれも5μg/ml以下であり、陽性対照(OVA)に含まれるOVA量の1/200以下であった。
さらに、細胞表面HSP90を欠くDC2.4L細胞(6H8抗体にて検出され、且つ細胞表面HSP90及びH-2Kbの発現が低下した株;DC2.4の培養途中に得られ、継続培養により樹立された株)を使用して、6H8-OVAの細胞表面HSP90に対する特異性を調べた。DC2.4及びDC2.4L細胞を、6H8-OVAを含むフラクション15~19(混合物)(30μg/ml)とインキュベートし、その後ビオチン化抗OVAモノクローナル抗体及びPE-Cy5ストレプトアビジンにより染色し、FACS解析を行なった。図6Dに示すように、細胞表面HSP90を発現するDC2.4細胞(左上パネル)は、抗OVAモノクローナル抗体に認識された(右上パネル)。予想通り、細胞表面HSP90を欠くDC2.4L細胞(左下パネル)は、OVAモノクローナル抗体に認識されなかった(右下パネル)。この結果は、6H8-OVAが、OVAを結合していてもHSP90特異的抗体として働くことを示している。
次いで、段階的用量の6H8-OVA(フラクション15~19)及び遊離OVA(フラクション33)を、DC2.4細胞にパルスし、OT-I CD8+T細胞及びOT-II CD4+T細胞(OT-IIマウスの脾臓細胞を回収し、標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD11b magnetic particles DM(BD Biosciences Pharmingen、558013)を使用してCD11b陽性細胞を除去した。次いで標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD4 particles DM(BD Biosciences Pharmingen、551539)を使用してCD4陽性細胞を精製した。得られた細胞をOT-II CD4+T細胞として使用した)とインキュベートし、T細胞から分泌されたIFNγ量を測定することにより、6H8-OVAのクロスプレゼンテーション能力を評価した。その結果、6H8-OVAは、OT-I CD8+T細胞に対して遊離OVAよりも少なくとも100倍高い効果を示した(図6E、上パネル)。OT-I CD8+T細胞の活性化とは対照的に、OT-II CD4+T細胞に対する抗原提示は、遊離OVAよりは良好だったものの、弱かった(図6E、下パネル)。
実施例8
本実施例に、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原のクロスプレゼンテーションが、細胞表面HSP90を介して行なわれていることを説明する。
DC2.4細胞(1.5×106個)の細胞ペレットを、20μg/mlの抗体(6H8D2(6H8)、2A6E9(2A6)又は4B6G12(4B6))で37℃、5%CO2中で15分間インキュベートした。その後6H8-OVAを3又は1μg/mlになるよう加え、37℃、5%CO2中で3時間インキュベートした。未反応の抗体及び6H8-OVAを除去するために洗浄を行なった後、細胞を0.5%パラホルムアルデヒドで固定した。この細胞1×104個を、OT-I CD8+T細胞1×105個と、96穴丸底プレート内で37℃、5%CO2中で共培養し、適宜上清を回収し、IFNγを標準的ELISA法で測定した。
図7に示すように、6H8-OVAによるクロスプレゼンテーション効果は、あらかじめ6H8でDC2.4細胞を処理しておくと減弱したが、2A6E9、4B6G12抗体では全く抑制されなかった。この結果は、6H8抗体が細胞表面HSP90に結合したことにより、クロスプレゼンテーションが阻害されたことを示す。すなわち、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原のクロスプレゼンテーションは、細胞表面HSP90を介して行なわれていることを示す。
本実施例に、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原のクロスプレゼンテーションが、細胞表面HSP90を介して行なわれていることを説明する。
DC2.4細胞(1.5×106個)の細胞ペレットを、20μg/mlの抗体(6H8D2(6H8)、2A6E9(2A6)又は4B6G12(4B6))で37℃、5%CO2中で15分間インキュベートした。その後6H8-OVAを3又は1μg/mlになるよう加え、37℃、5%CO2中で3時間インキュベートした。未反応の抗体及び6H8-OVAを除去するために洗浄を行なった後、細胞を0.5%パラホルムアルデヒドで固定した。この細胞1×104個を、OT-I CD8+T細胞1×105個と、96穴丸底プレート内で37℃、5%CO2中で共培養し、適宜上清を回収し、IFNγを標準的ELISA法で測定した。
図7に示すように、6H8-OVAによるクロスプレゼンテーション効果は、あらかじめ6H8でDC2.4細胞を処理しておくと減弱したが、2A6E9、4B6G12抗体では全く抑制されなかった。この結果は、6H8抗体が細胞表面HSP90に結合したことにより、クロスプレゼンテーションが阻害されたことを示す。すなわち、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原のクロスプレゼンテーションは、細胞表面HSP90を介して行なわれていることを示す。
実施例9
本実施例に、6H8-OVAコンジュゲートがインビボにおいてCD8+T細胞活性化能を有することを説明する。
まずCFSE標識OT-I CD8+T細胞を以下のように作製した:DMSOに溶解した10mM CFSEストック溶液をPBSで希釈して10μM CFSE溶液を調製した。15mlチューブ内に調製した脾臓細胞のペレットを、タッピングによりよくほぐした後、ここに10μM CFSE溶液を2ml加え、軽くボルテックスにかけた。室温で5分間静置した後、PBS(5ml)で2回洗浄を行なった。
CFSE標識OT-I CD8+T細胞を、被移植マウスに尾静脈から移植した。被移植マウスとしては野生型B6マウス(WT B6)とTAP1欠損マウス(TAP1 KO(米国、Jackson Laboratoryより購入))を用いた。同時に、3μgのフラクション15~19(混合物)、3μgのフラクション33、又はフラクション33(3μg)と遊離6H8抗体(3μg)との混合物を注射した。3日後、被移植マウスの脾細胞を集め、移植細胞の増殖を調べた。その結果、フラクション15~19(混合物)を投与したマウスにおいて、CD8+T細胞の増殖が確認された(図8A)。一方、TAP1欠損マウスにおいては、フラクション15~19(混合物)はCD8+T細胞の増殖を全く誘導しなかった(図8B)。このことは6H8-OVAのクロスプレゼンテーションがTAP分子に依存性であることを示す。
本実施例に、6H8-OVAコンジュゲートがインビボにおいてCD8+T細胞活性化能を有することを説明する。
まずCFSE標識OT-I CD8+T細胞を以下のように作製した:DMSOに溶解した10mM CFSEストック溶液をPBSで希釈して10μM CFSE溶液を調製した。15mlチューブ内に調製した脾臓細胞のペレットを、タッピングによりよくほぐした後、ここに10μM CFSE溶液を2ml加え、軽くボルテックスにかけた。室温で5分間静置した後、PBS(5ml)で2回洗浄を行なった。
CFSE標識OT-I CD8+T細胞を、被移植マウスに尾静脈から移植した。被移植マウスとしては野生型B6マウス(WT B6)とTAP1欠損マウス(TAP1 KO(米国、Jackson Laboratoryより購入))を用いた。同時に、3μgのフラクション15~19(混合物)、3μgのフラクション33、又はフラクション33(3μg)と遊離6H8抗体(3μg)との混合物を注射した。3日後、被移植マウスの脾細胞を集め、移植細胞の増殖を調べた。その結果、フラクション15~19(混合物)を投与したマウスにおいて、CD8+T細胞の増殖が確認された(図8A)。一方、TAP1欠損マウスにおいては、フラクション15~19(混合物)はCD8+T細胞の増殖を全く誘導しなかった(図8B)。このことは6H8-OVAのクロスプレゼンテーションがTAP分子に依存性であることを示す。
また、6H8-OVAコンジュゲートを含むフラクション15~19の混合物を、被移植マウスに段階的用量で注射し、上記と同様にOT-I CD8+T細胞の増殖を調べた。その結果、より高用量の該混合物は、CD8+T細胞の増殖をより強く促進したが、その効果は0.1μgでも見られた(図8C上パネル)。一方、OT-II CD4+T細胞の分裂の促進には、より高用量の6H8-OVAコンジュゲートが必要であった(図8C下パネル)。以上の結果は、6H8抗体にコンジュゲートしたOVAが、MHCクラスI抗原提示経路に送達され、CD8+T細胞へ提示され、その結果CD8+T細胞が活性化したことを示す。
さらに、OT-I CD8+T細胞の分裂は、インビボでのクロスプライミングを必ずしも意味しないことから、6H8-OVA(マウス当たり3μg)でマウスを免疫することで、OVA257-264主要エピトープに特異的な細胞傷害性T細胞を生じるか否かを調べた。マウスを1週間の間隔で2回免疫し、2回目の免疫の1週間後に、脾臓細胞をOVA257-264ペプチド存在下で5日間培養し、生じた細胞障害性T細胞を、四量体(テトラマー)染色(T-Select H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL-PE(MBL、TS5001-1、使用量1test/tube)で室温にて30分間、T細胞を染色した)及び標準51Cr放出アッセイ(マウス腫瘍細胞E.G7(米国ワシントン大学 Dr.Michael Bevanより供与、参考文献 Cell vol 54:777-785 1988)及びEL4(ATCCより購入)、各2×106個をsodium 51Cr 50マイクロキュリーでラベルし、これを標的細胞とした。5×103個の標的細胞に対し図8Eに示したごとく細胞障害性T細胞を加え、4時間培養後の上清遊離51Crを測定することにより障害活性を算出した。EL4細胞はペプチドOVA257-264をパルスしたものとしないものを準備した)によりモニターした。6H8-OVAによる免疫は、FACS解析の結果から示されるように、四量体陽性細胞を生じ(図8D)、OVA257-264エピトープに対する細胞傷害性も見られた(図8E)。これらの結果から、6H8と抗原との複合体により免疫することで、抗原特異的な細胞障害性T細胞を生じ得ることが示された。
すなわち、本発明のワクチンは、本発明の抗体にコンジュゲートした抗原をCD8+T細胞へとクロスプレゼンテーションさせることが可能である(図23)。また該抗原として腫瘍抗原を選択すれば、本発明のワクチンは腫瘍の転移の抑制に有効であり得る。
実施例10
本実施例に、インビボにおいてOT-I CD8+T細胞の増殖を誘導する6H8-OVAコンジュゲートの活性を、6H8抗体が増強することを説明する。
6H8抗体又はIgG2a(正常マウスIgG2a(nmIgG2a)、20μg)を200μlのPBSで希釈し、尾静脈からB6マウスに投与した。コントロールとしてPBS投与群も作製した。
その後、CFSEラベルしたOT-I CD8+T細胞(1.5×106個)を200μlのRPMIに懸濁し、尾静脈から投与した。同時に200μlのPBSで希釈した6H8-OVA(0.3μg)を尾静脈から投与した。コントロールとしてPBS投与群も作製した。
72時間後、被投与マウスから脾臓細胞を回収し、FACS Calibur(BD Biosciences)にてCFSE強度の減衰を測定し、移入細胞の増殖を確認した。
図9に示すように、6H8抗体をあらかじめ投与した場合、6H8-OVAによるCD8+T細胞の増殖促進効果が増強された。
本実施例に、インビボにおいてOT-I CD8+T細胞の増殖を誘導する6H8-OVAコンジュゲートの活性を、6H8抗体が増強することを説明する。
6H8抗体又はIgG2a(正常マウスIgG2a(nmIgG2a)、20μg)を200μlのPBSで希釈し、尾静脈からB6マウスに投与した。コントロールとしてPBS投与群も作製した。
その後、CFSEラベルしたOT-I CD8+T細胞(1.5×106個)を200μlのRPMIに懸濁し、尾静脈から投与した。同時に200μlのPBSで希釈した6H8-OVA(0.3μg)を尾静脈から投与した。コントロールとしてPBS投与群も作製した。
72時間後、被投与マウスから脾臓細胞を回収し、FACS Calibur(BD Biosciences)にてCFSE強度の減衰を測定し、移入細胞の増殖を確認した。
図9に示すように、6H8抗体をあらかじめ投与した場合、6H8-OVAによるCD8+T細胞の増殖促進効果が増強された。
実施例11-1
本実施例に、マウスに投与したAlexa488標識6H8抗体が、脾臓においてCD11b+モノサイトに集積することを説明する。
まずAlexa488標識6H8抗体を、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit(Invitrogen、Molecular probes、A10235)を用いて標準的プロトコールに従って作製した。
Alexa488標識6H8抗体(20μg)を200μlのPBSで希釈し、尾静脈からB6マウスに投与した。3時間後、被投与マウスから脾臓を回収し、以下のようにCollagenase処理を行なった:Collagenase(400U/ml、Wako、032-10534)、DNase(15μg/ml、Roche、10401600)を含むRPMI(10ml)を6cmディッシュに加え、この中で脾臓を良くほぐした。その後37℃、5%CO2中で10分間インキュベートした。パスツールピペットで撹拌した後、最終濃度が5mMになるようEDTAを加え、37℃、5%CO2中でさらに5分間インキュベートした。その後、RPMI(5ml)で2回洗浄を行った。
Collagenase処理後、赤血球を破砕した。試料を、マウスIgG(SIGMA、I5381、10μg/ml)を用いて氷冷下で30分間ブロッキングした(100μl/106個)。その後、各種抗体(PE-Cy5 conjugate Anti-Mouse CD11b:(eBiosciences、15-0112-81、0.2μg/ml)、PE conjugate Anti-mouse/human CD45(B220):(eBiosciences、12-0452-81、1μg/ml)、PE anti-mouse CD11c(HL3)(Integrin αx chain):(BD Pharmingen、553802、1μg/ml))を用いて氷冷下で30分間染色し(100μl/106個)、FACS Caliburにて解析を行なった。
6H8抗体は、インビボでは活性化樹状細胞、マクロファージなどに結合すると考えられるが、図10Aに示すように、投与したAlexa488標識6H8抗体は、とりわけCD11b+モノサイトに結合した。したがって、6H8抗体結合性モノサイトが抗原提示細胞として直接T細胞を活性化している可能性、あるいはモノサイトから一旦抗原が樹状細胞に受け渡しされ、樹状細胞がT細胞を活性化している可能性などが考えられる。
本実施例に、マウスに投与したAlexa488標識6H8抗体が、脾臓においてCD11b+モノサイトに集積することを説明する。
まずAlexa488標識6H8抗体を、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit(Invitrogen、Molecular probes、A10235)を用いて標準的プロトコールに従って作製した。
Alexa488標識6H8抗体(20μg)を200μlのPBSで希釈し、尾静脈からB6マウスに投与した。3時間後、被投与マウスから脾臓を回収し、以下のようにCollagenase処理を行なった:Collagenase(400U/ml、Wako、032-10534)、DNase(15μg/ml、Roche、10401600)を含むRPMI(10ml)を6cmディッシュに加え、この中で脾臓を良くほぐした。その後37℃、5%CO2中で10分間インキュベートした。パスツールピペットで撹拌した後、最終濃度が5mMになるようEDTAを加え、37℃、5%CO2中でさらに5分間インキュベートした。その後、RPMI(5ml)で2回洗浄を行った。
Collagenase処理後、赤血球を破砕した。試料を、マウスIgG(SIGMA、I5381、10μg/ml)を用いて氷冷下で30分間ブロッキングした(100μl/106個)。その後、各種抗体(PE-Cy5 conjugate Anti-Mouse CD11b:(eBiosciences、15-0112-81、0.2μg/ml)、PE conjugate Anti-mouse/human CD45(B220):(eBiosciences、12-0452-81、1μg/ml)、PE anti-mouse CD11c(HL3)(Integrin αx chain):(BD Pharmingen、553802、1μg/ml))を用いて氷冷下で30分間染色し(100μl/106個)、FACS Caliburにて解析を行なった。
6H8抗体は、インビボでは活性化樹状細胞、マクロファージなどに結合すると考えられるが、図10Aに示すように、投与したAlexa488標識6H8抗体は、とりわけCD11b+モノサイトに結合した。したがって、6H8抗体結合性モノサイトが抗原提示細胞として直接T細胞を活性化している可能性、あるいはモノサイトから一旦抗原が樹状細胞に受け渡しされ、樹状細胞がT細胞を活性化している可能性などが考えられる。
実施例11-2
本実施例に、マウスに投与したAlexa647標識6H8抗体が、脾臓において樹状細胞(CD11c陽性)とりわけCD8α陽性樹状細胞に集積することを説明する。
まずAlexa647標識6H8抗体を、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit(Invitrogen、Molecular probes、A20173)を用いて標準的プロトコールに従って作製した。
Alexa647標識6H8抗体(30μg)を200μlのPBSで希釈し、尾静脈からB6マウスに投与した。1.5時間後(又は3時間後)に、被投与マウスから脾臓を回収し、以下のようにCollagenase処理を行なった:Collagenase(400U/ml、Wako、032-10534)、DNase(15μg/ml、Roche、10401600))を含むRPMI(10ml)を6cmディッシュに加え、この中で脾臓を良くほぐした。その後37℃、5%CO2中で10分間インキュベートした。パスツールピペットで撹拌した後、最終濃度が5mMになるようEDTAを加え、37℃、5%CO2中でさらに5分間インキュベートした。その後、RPMI(5ml)で2回洗浄を行った。
Collagenase処理後、赤血球を破砕した。試料を、マウスIgG(SIGMA、I5381、10μg/ml)を用いて氷冷下で30分間ブロッキングした(100μl/106個)。その後、各種抗体(PE-Cy5 conjugate Anti-Mouse CD11b:(eBiosciences、15-0112-81、0.2μg/ml)、PE conjugate Anti-mouse/human CD45(B220):(eBiosciences、12-0452-81、1μg/ml)、PE anti-mouse CD11c(HL3)(Integrinαx chain):(BD Pharmingen、553802、1μg/ml)、PE anti-mouse CD8α(Ly-2)(Integrinαx chain):(BD Pharmingen、12-0081、1μg/ml)を用いて氷冷下で30分間染色し(100μl/106個)、FACS Cantoにて解析を行なった。
6H8抗体は、インビボでは活性化樹状細胞、マクロファージなどに結合すると考えられるが、図10AのR2領域に相当する領域を詳細に検討した。その結果、図10Bに示すように、投与したAlexa647標識6H8抗体は、樹状細胞(CD11c陽性)に取り込まれた。また、図10Cに示すように、とりわけCD8α陽性樹状細胞に結合した。したがって、CD8α陽性樹状細胞が抗原提示細胞としてT細胞を活性化している可能性が考えられる。
本実施例に、マウスに投与したAlexa647標識6H8抗体が、脾臓において樹状細胞(CD11c陽性)とりわけCD8α陽性樹状細胞に集積することを説明する。
まずAlexa647標識6H8抗体を、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit(Invitrogen、Molecular probes、A20173)を用いて標準的プロトコールに従って作製した。
Alexa647標識6H8抗体(30μg)を200μlのPBSで希釈し、尾静脈からB6マウスに投与した。1.5時間後(又は3時間後)に、被投与マウスから脾臓を回収し、以下のようにCollagenase処理を行なった:Collagenase(400U/ml、Wako、032-10534)、DNase(15μg/ml、Roche、10401600))を含むRPMI(10ml)を6cmディッシュに加え、この中で脾臓を良くほぐした。その後37℃、5%CO2中で10分間インキュベートした。パスツールピペットで撹拌した後、最終濃度が5mMになるようEDTAを加え、37℃、5%CO2中でさらに5分間インキュベートした。その後、RPMI(5ml)で2回洗浄を行った。
Collagenase処理後、赤血球を破砕した。試料を、マウスIgG(SIGMA、I5381、10μg/ml)を用いて氷冷下で30分間ブロッキングした(100μl/106個)。その後、各種抗体(PE-Cy5 conjugate Anti-Mouse CD11b:(eBiosciences、15-0112-81、0.2μg/ml)、PE conjugate Anti-mouse/human CD45(B220):(eBiosciences、12-0452-81、1μg/ml)、PE anti-mouse CD11c(HL3)(Integrinαx chain):(BD Pharmingen、553802、1μg/ml)、PE anti-mouse CD8α(Ly-2)(Integrinαx chain):(BD Pharmingen、12-0081、1μg/ml)を用いて氷冷下で30分間染色し(100μl/106個)、FACS Cantoにて解析を行なった。
6H8抗体は、インビボでは活性化樹状細胞、マクロファージなどに結合すると考えられるが、図10AのR2領域に相当する領域を詳細に検討した。その結果、図10Bに示すように、投与したAlexa647標識6H8抗体は、樹状細胞(CD11c陽性)に取り込まれた。また、図10Cに示すように、とりわけCD8α陽性樹状細胞に結合した。したがって、CD8α陽性樹状細胞が抗原提示細胞としてT細胞を活性化している可能性が考えられる。
実施例12
本実施例に、本発明のモノクローナル抗体が、Fcレセプターを介したクロスプレゼンテーション機構を促進すること、即ち優れたアジュバントとしても有用であることを説明する。
実施例9で説明したインビボにおけるクロスプレゼンテーションアッセイと同様の以下の方法により、フリーの6H8抗体存在下での、CD8+T細胞の増殖を調べた。
(1)CFSEラベルしたOT-I/CD45.1マウスのCD8+T細胞を、被移植マウスに尾静脈より移入し、同時に6H8-OVA(若しくは6H8(F(ab’)2)-OVA、又はOVA、又はIgG2a-OVA)(0.3μg)及びフリーの6H8抗体(若しくは6H8(F(ab’)2)、又はIgG2a)(30μg)を尾静脈より投与した。
(2)72時間後にマウス脾臓を回収し、96穴丸底プレート内で、2×106個の脾臓細胞をPE-CD45.1抗体で30分間染色した(氷冷)。
(3)FACS Canto(BD)を用いて、CD45.1陽性細胞(OT-I CD8+T細胞)のCFSE強度を測定した。
結果を図11に示す。0.3μgの6H8-OVAを投与した場合、養子移入したOT-I CD8+T細胞は軽微の増殖反応を示したが、同時に6H8抗体又は6H8(F(ab’)2)抗体を投与すると、OT-I CD8+T細胞の増殖反応は著しく増強された。それに対して、6H8(F(ab’)2)-OVA又はOVAを投与した場合、6H8抗体によるOT-I CD8+T細胞の増殖反応増強効果は認められなかった。またIgG2a-OVAを投与した場合には、6H8抗体による増強効果が認められた。
以上の結果から、本発明のモノクローナル抗体の樹状細胞への結合は、Fcレセプターを介したクロスプレゼンテーション機構を促進すると結論される。さらに、上記の結果は、本発明のモノクローナル抗体からの刺激がFcレセプターからの刺激と交錯することを示唆しており、例えばFcRγサブユニットを介して、共通のシグナルカスケードが活性化されていることが考えられる(図12A及びB)。
本実施例に、本発明のモノクローナル抗体が、Fcレセプターを介したクロスプレゼンテーション機構を促進すること、即ち優れたアジュバントとしても有用であることを説明する。
実施例9で説明したインビボにおけるクロスプレゼンテーションアッセイと同様の以下の方法により、フリーの6H8抗体存在下での、CD8+T細胞の増殖を調べた。
(1)CFSEラベルしたOT-I/CD45.1マウスのCD8+T細胞を、被移植マウスに尾静脈より移入し、同時に6H8-OVA(若しくは6H8(F(ab’)2)-OVA、又はOVA、又はIgG2a-OVA)(0.3μg)及びフリーの6H8抗体(若しくは6H8(F(ab’)2)、又はIgG2a)(30μg)を尾静脈より投与した。
(2)72時間後にマウス脾臓を回収し、96穴丸底プレート内で、2×106個の脾臓細胞をPE-CD45.1抗体で30分間染色した(氷冷)。
(3)FACS Canto(BD)を用いて、CD45.1陽性細胞(OT-I CD8+T細胞)のCFSE強度を測定した。
結果を図11に示す。0.3μgの6H8-OVAを投与した場合、養子移入したOT-I CD8+T細胞は軽微の増殖反応を示したが、同時に6H8抗体又は6H8(F(ab’)2)抗体を投与すると、OT-I CD8+T細胞の増殖反応は著しく増強された。それに対して、6H8(F(ab’)2)-OVA又はOVAを投与した場合、6H8抗体によるOT-I CD8+T細胞の増殖反応増強効果は認められなかった。またIgG2a-OVAを投与した場合には、6H8抗体による増強効果が認められた。
以上の結果から、本発明のモノクローナル抗体の樹状細胞への結合は、Fcレセプターを介したクロスプレゼンテーション機構を促進すると結論される。さらに、上記の結果は、本発明のモノクローナル抗体からの刺激がFcレセプターからの刺激と交錯することを示唆しており、例えばFcRγサブユニットを介して、共通のシグナルカスケードが活性化されていることが考えられる(図12A及びB)。
実施例13
本実施例に、細胞表面へのHSP90の発現がFcRγに依存性であることを説明する。
図12に提示したモデルを検証するために、GM-CSF依存性BMDCを用いて、以下の実験を行なった。
本実施例に、細胞表面へのHSP90の発現がFcRγに依存性であることを説明する。
図12に提示したモデルを検証するために、GM-CSF依存性BMDCを用いて、以下の実験を行なった。
1.細胞表面HSP90の発現:
(1)正常マウス及びFcRγKOマウス(筑波大学大学院 人間総合科学研究科 生命システム医学専攻 免疫制御医学分野 渋谷彰教授より供与を受けた)から、以下の方法により骨髄由来の樹状細胞(BMDC)を樹立した:マウス大腿骨及び脛骨より骨髄を回収し、各1x106個の細胞を24ウェルプレートで培養した。培養には、リコンビナントマウスGMCSF(R&D)20ng/mlを含むコンプリートRPMIを2ml/ウェルで使用した。培地の半量を、培養3日目に新鮮な培地と交換し、培養5日目にBMDCとして使用した。
(2)GM-CSF依存性に誘導したDay5のBMDCを、ビオチン-6H8(2.5μg/ml)及びストレプトアビジン-APC(0.2μg/ml)で染色し、FACS Canto(BD)を用いて蛍光を測定した。
結果を図13に示す。細胞表面HSP90(図13中、HSP90)は、正常マウス由来樹状細胞(WT B6)では発現が認められたが、KOマウス由来樹状細胞(FcRγKO)では完全に消失していた。
(1)正常マウス及びFcRγKOマウス(筑波大学大学院 人間総合科学研究科 生命システム医学専攻 免疫制御医学分野 渋谷彰教授より供与を受けた)から、以下の方法により骨髄由来の樹状細胞(BMDC)を樹立した:マウス大腿骨及び脛骨より骨髄を回収し、各1x106個の細胞を24ウェルプレートで培養した。培養には、リコンビナントマウスGMCSF(R&D)20ng/mlを含むコンプリートRPMIを2ml/ウェルで使用した。培地の半量を、培養3日目に新鮮な培地と交換し、培養5日目にBMDCとして使用した。
(2)GM-CSF依存性に誘導したDay5のBMDCを、ビオチン-6H8(2.5μg/ml)及びストレプトアビジン-APC(0.2μg/ml)で染色し、FACS Canto(BD)を用いて蛍光を測定した。
結果を図13に示す。細胞表面HSP90(図13中、HSP90)は、正常マウス由来樹状細胞(WT B6)では発現が認められたが、KOマウス由来樹状細胞(FcRγKO)では完全に消失していた。
2.インビトロクロスプレゼンテーションアッセイ:
(1)GM-CSF依存性に誘導したDay5のBMDC 1×106個分の細胞ペレットを、15mlチューブ中に調製した。ここに抗原(6H8-OVA、OVA、又はOVA257-264)400μlを加え、5%CO2中で37℃にて3時間インキュベートした。細胞を0.5%パラホルムアルデヒドで固定した後、0.1Mグリシンで洗浄し、更にRPMIで洗浄した後、1×105個/mlに調整した。
(2)並行して、OT-I CD8+T細胞を精製し、1×106個/mlに調整した。
(3)上記処理を施したBMDC1×104個及びOT-I CD8+T細胞1×105個を96穴丸底プレート内で共培養した。
(4)適宜上清を回収し、IFNγの産生量をELISA法で測定した。
結果を図14に示す。6H8-OVAについてのFcRγKOマウス由来樹状細胞(FcRγKO)のクロスプレゼンテーション能は、正常マウス由来樹状細胞(WT B6)と比較して、有意に低下していることが明らかになった。一方、OVA又はOVA257-264については、KOマウス由来樹状細胞は、正常マウス由来樹状細胞と同等のクロスプレゼンテーション能を示した。
さらにインビボにおいてOT-I CD8陽性細胞の増殖反応も、FcRγKOマウスでは有意に低下した(データ示さず)。
以上の結果から、細胞表面へのHSP90の発現がFcRγに依存性であること、及び本発明のワクチンが機能する上でFcRγが重要な役割を果たすことが示された(図24)。
(1)GM-CSF依存性に誘導したDay5のBMDC 1×106個分の細胞ペレットを、15mlチューブ中に調製した。ここに抗原(6H8-OVA、OVA、又はOVA257-264)400μlを加え、5%CO2中で37℃にて3時間インキュベートした。細胞を0.5%パラホルムアルデヒドで固定した後、0.1Mグリシンで洗浄し、更にRPMIで洗浄した後、1×105個/mlに調整した。
(2)並行して、OT-I CD8+T細胞を精製し、1×106個/mlに調整した。
(3)上記処理を施したBMDC1×104個及びOT-I CD8+T細胞1×105個を96穴丸底プレート内で共培養した。
(4)適宜上清を回収し、IFNγの産生量をELISA法で測定した。
結果を図14に示す。6H8-OVAについてのFcRγKOマウス由来樹状細胞(FcRγKO)のクロスプレゼンテーション能は、正常マウス由来樹状細胞(WT B6)と比較して、有意に低下していることが明らかになった。一方、OVA又はOVA257-264については、KOマウス由来樹状細胞は、正常マウス由来樹状細胞と同等のクロスプレゼンテーション能を示した。
さらにインビボにおいてOT-I CD8陽性細胞の増殖反応も、FcRγKOマウスでは有意に低下した(データ示さず)。
以上の結果から、細胞表面へのHSP90の発現がFcRγに依存性であること、及び本発明のワクチンが機能する上でFcRγが重要な役割を果たすことが示された(図24)。
実施例14
本実施例に、本発明のワクチンの投与により、インビボにおいてメモリーT細胞への分化が誘導されることを説明する。
メモリーT細胞は、免疫記憶に関わるT細胞であり、一度ある抗原に感作された生体内で生じた後、長期間生体内に留まり、同一抗原による再度の刺激に対して速やかに免疫応答を引き起こす。従って、ワクチンの投与によってメモリーT細胞への分化が起こることは、当該ワクチンの効果がより長期間持続することを意味する。
本発明のワクチンの投与によってメモリーT細胞が誘導される可能性を調べるために、以下の方法により実験を行なった。
(1)OT-I/CD45.1マウスのCD8+細胞2×106個を、C57BL/6マウスに尾静脈より移入し、同時に3μgの6H8-OVA又はPBSを尾静脈より投与した。
(2)96時間後にマウス脾臓を回収し、96穴丸底プレート内で2×106個の脾臓細胞を以下の抗体で30分間染色した(氷冷)。
・PE-抗マウス/ヒトCD44(eBioscience: Cat No. 12-0041) 濃度1μg/ml、使用量100μl。
・ビオチン-抗CD45.1(eBioscience: 13-0453) 濃度2.5μg/ml、使用量100μl。
(3)PBSで2回洗浄した後、細胞を以下の抗体で30分間染色した(氷冷)。
・ストレプトアビジン-APC(BioLegend: 405207) 濃度0.2μg/ml、使用量100μl。
(4)Annexin結合バッファーで2回洗浄した後、Annexin V FITC reagentを使用してFITC-Annexin Vで10分間染色した(氷冷)。
・Annexin結合バッファー(HEPES 10mM、NaCl 150mM、KCl 5mM、MgCl2 1mM、CaCl2 1.8mM)
・Annexin V FITC reagent(MBL: BV-1001-5) 濃度原液5倍希釈、使用量500μl
(5)FACS Canto(BD)を用いて蛍光を測定した。
結果を図15に示す。養子移入したOT-I CD8+T細胞は、6H8-OVAの投与によって活性化され、6H8-OVA未投与群に比べてCD44の発現レベルが上昇していた。このことは、6H8-OVAの投与により、メモリーT細胞への移行が引き起こされたことを示す。なお、6H8-OVA投与群及び未投与群のいずれにおいても、一部の細胞は、Annexin V陽性細胞になっていたことから、アポトーシスに陥ったことが示唆される。また図15右パネルは、UV照射によりアポトーシスを誘導したDC2.4細胞を用いて、使用したAnnexin Vの試薬としての機能を確認したコントロール実験の結果である。
以上の結果から、本発明のワクチンによりメモリーT細胞への分化が誘導されることが示された。
本実施例に、本発明のワクチンの投与により、インビボにおいてメモリーT細胞への分化が誘導されることを説明する。
メモリーT細胞は、免疫記憶に関わるT細胞であり、一度ある抗原に感作された生体内で生じた後、長期間生体内に留まり、同一抗原による再度の刺激に対して速やかに免疫応答を引き起こす。従って、ワクチンの投与によってメモリーT細胞への分化が起こることは、当該ワクチンの効果がより長期間持続することを意味する。
本発明のワクチンの投与によってメモリーT細胞が誘導される可能性を調べるために、以下の方法により実験を行なった。
(1)OT-I/CD45.1マウスのCD8+細胞2×106個を、C57BL/6マウスに尾静脈より移入し、同時に3μgの6H8-OVA又はPBSを尾静脈より投与した。
(2)96時間後にマウス脾臓を回収し、96穴丸底プレート内で2×106個の脾臓細胞を以下の抗体で30分間染色した(氷冷)。
・PE-抗マウス/ヒトCD44(eBioscience: Cat No. 12-0041) 濃度1μg/ml、使用量100μl。
・ビオチン-抗CD45.1(eBioscience: 13-0453) 濃度2.5μg/ml、使用量100μl。
(3)PBSで2回洗浄した後、細胞を以下の抗体で30分間染色した(氷冷)。
・ストレプトアビジン-APC(BioLegend: 405207) 濃度0.2μg/ml、使用量100μl。
(4)Annexin結合バッファーで2回洗浄した後、Annexin V FITC reagentを使用してFITC-Annexin Vで10分間染色した(氷冷)。
・Annexin結合バッファー(HEPES 10mM、NaCl 150mM、KCl 5mM、MgCl2 1mM、CaCl2 1.8mM)
・Annexin V FITC reagent(MBL: BV-1001-5) 濃度原液5倍希釈、使用量500μl
(5)FACS Canto(BD)を用いて蛍光を測定した。
結果を図15に示す。養子移入したOT-I CD8+T細胞は、6H8-OVAの投与によって活性化され、6H8-OVA未投与群に比べてCD44の発現レベルが上昇していた。このことは、6H8-OVAの投与により、メモリーT細胞への移行が引き起こされたことを示す。なお、6H8-OVA投与群及び未投与群のいずれにおいても、一部の細胞は、Annexin V陽性細胞になっていたことから、アポトーシスに陥ったことが示唆される。また図15右パネルは、UV照射によりアポトーシスを誘導したDC2.4細胞を用いて、使用したAnnexin Vの試薬としての機能を確認したコントロール実験の結果である。
以上の結果から、本発明のワクチンによりメモリーT細胞への分化が誘導されることが示された。
実施例15
本実施例において、固層化6H8抗体刺激による骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生の誘導について説明する。
6H8抗体が骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生に与える影響を調べるために、以下の方法により実験を行なった。
(1)PBSに希釈した6H8抗体(10mg/ml)を96ウェルフラットプレート(Corning Incoporated, 製品番号3596)に50mlずつ加え、4℃にて一晩処理した。
(2)PBS 200mlで2回プレートを洗浄し、過剰な6H8抗体を除去した。
(3)誘導後5日目のGMCSF依存性骨髄由来樹状細胞を1x105/ウェルずつ(2)のプレートに加え、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。
(4)培養開始12時間後に上清を回収し、上清中のサイトカイン・ケモカイン量を、Bio-Plexサスペンションアレイシステムにて23-Plex Panel(Bio-rad、171-F11241)を用いて標準的プロトコールに従って測定した。
図16の結果より、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、G-CSF、GM-CSF、KC、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTESなどの産生が6H8抗体刺激により誘導された。以上の結果から、本発明のワクチンは樹状細胞を刺激活性化する事ができ、アジュバントとして優れた特性を有することが示された。
本実施例において、固層化6H8抗体刺激による骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生の誘導について説明する。
6H8抗体が骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生に与える影響を調べるために、以下の方法により実験を行なった。
(1)PBSに希釈した6H8抗体(10mg/ml)を96ウェルフラットプレート(Corning Incoporated, 製品番号3596)に50mlずつ加え、4℃にて一晩処理した。
(2)PBS 200mlで2回プレートを洗浄し、過剰な6H8抗体を除去した。
(3)誘導後5日目のGMCSF依存性骨髄由来樹状細胞を1x105/ウェルずつ(2)のプレートに加え、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。
(4)培養開始12時間後に上清を回収し、上清中のサイトカイン・ケモカイン量を、Bio-Plexサスペンションアレイシステムにて23-Plex Panel(Bio-rad、171-F11241)を用いて標準的プロトコールに従って測定した。
図16の結果より、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、G-CSF、GM-CSF、KC、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTESなどの産生が6H8抗体刺激により誘導された。以上の結果から、本発明のワクチンは樹状細胞を刺激活性化する事ができ、アジュバントとして優れた特性を有することが示された。
実施例16
本実施例では、6H8-抗原の特異的CTL誘導能について、低濃度範囲で検討した結果、及び抗原を既存のアジュバントと共に用いた場合の特異的CTL誘導能と比較した結果を示す。
6H8-OVA又はIFA+OVAを1週間間隔で合計2回免疫した。6H8-OVAは、記載した量の6H8-OVAをPBS 200μlに希釈して尾静脈より投与した。IFA+OVAは、記載した量のOVA257-264ペプチドが投与量200μlに含まれるようにエマルジョンを作製して皮下に投与した。エマルジョンは、予めPBSに必要量のOVA257-264ペプチドを混和し、そこに等量のIFA(SIGMA: F5506)を加え、作製した。
最終免疫から7日後に被投与マウスの脾臓を採取し、ピンセットを用いて細かくほぐし、脾臓細胞を回収した。15mlチューブに脾臓細胞ペレットを作製し、ここにOVA257-264ペプチド(最終濃度10-5M)を含むコンプリートRPMI(FCSを含有しない)2mlを加え、チューブの蓋を緩めた状態で、37℃、5%CO2インキュベーターに1時間静置した。その後、培養液RPMI(FCS10%を含む)を加え合計量が20mlになるように調整し、24穴プレートに2mlずつまいた。
5日間培養後細胞を回収し、H-2Kb+OVA257-264特異的テトラマー(MBL: TS-5001-1)及びFITC-anti-mouse CD8a(eBioscience: 11-0081)を用いて染色し、特異的CTLの誘導をFACS Cantoにて確認した。なお、染色方法はH-2Kb+OVA257-264特異的テトラマーのインストラクションに従った。
結果を図17に示す。6H8-OVAはCTL誘導においてIFA+OVAと同等又はそれ以上の効果をもつことが明らかになった。
本実施例では、6H8-抗原の特異的CTL誘導能について、低濃度範囲で検討した結果、及び抗原を既存のアジュバントと共に用いた場合の特異的CTL誘導能と比較した結果を示す。
6H8-OVA又はIFA+OVAを1週間間隔で合計2回免疫した。6H8-OVAは、記載した量の6H8-OVAをPBS 200μlに希釈して尾静脈より投与した。IFA+OVAは、記載した量のOVA257-264ペプチドが投与量200μlに含まれるようにエマルジョンを作製して皮下に投与した。エマルジョンは、予めPBSに必要量のOVA257-264ペプチドを混和し、そこに等量のIFA(SIGMA: F5506)を加え、作製した。
最終免疫から7日後に被投与マウスの脾臓を採取し、ピンセットを用いて細かくほぐし、脾臓細胞を回収した。15mlチューブに脾臓細胞ペレットを作製し、ここにOVA257-264ペプチド(最終濃度10-5M)を含むコンプリートRPMI(FCSを含有しない)2mlを加え、チューブの蓋を緩めた状態で、37℃、5%CO2インキュベーターに1時間静置した。その後、培養液RPMI(FCS10%を含む)を加え合計量が20mlになるように調整し、24穴プレートに2mlずつまいた。
5日間培養後細胞を回収し、H-2Kb+OVA257-264特異的テトラマー(MBL: TS-5001-1)及びFITC-anti-mouse CD8a(eBioscience: 11-0081)を用いて染色し、特異的CTLの誘導をFACS Cantoにて確認した。なお、染色方法はH-2Kb+OVA257-264特異的テトラマーのインストラクションに従った。
結果を図17に示す。6H8-OVAはCTL誘導においてIFA+OVAと同等又はそれ以上の効果をもつことが明らかになった。
実施例17
本実施例において、Propionibacterium Acnes(P. Acnes)死菌投与による炎症が、樹状細胞膜表面のHSP90及びCD64(Fcγレセプター)の発現を誘導することを説明する。
図18に記載した量のP. AcnesをPBS200μlに希釈して、各マウスに尾静脈より投与した。投与から6日後(実験1)又は0~10日後(実験2)に、被投与マウスの脾臓を採取し、下記のコラゲナーゼ処理及びゲイズ溶液処理を行ない脾臓細胞を回収した。
コラゲナーゼ処理の詳細は以下の通りである。
コラゲナーゼ溶液10mlの入った6cmディッシュ内で脾臓1個をピンセットなどを用いて細かくほぐし、37℃インキュベーターの中に15分間静置した。ここに最終濃度が5mMになるようEDTAを加えピペッティングし、更に37℃インキュベーターの中に5分間静置した。メッシュを通し15mlチューブへと移した。
コラゲナーゼ溶液:コラゲナーゼ(Wako, 032-10534)400U/ml、Dnase 15μg/mlをRPMIに溶解したもの。使用直前に作製した。
ゲイズ処理の詳細は以下の通りである。
細胞のペレットを15mlチューブ内に準備し、これをタッピングで良くほぐした。ここにゲイズ溶液を2ml加え氷上にて3-5分間静置した。その後10mlのPBSを加えて手早く遠心を行ない、ゲイズ溶液を除去した。
ゲイズ溶液:以下のA-D液をA20%、B5%、C5%、D70%の比率で混和したもの。
A液:NH4Cl(3.5g)、KCl(0.185g)、Na2HPO4(0.06g)、KH2PO4(0.012g)、D-Glucose(0.5g)、Bromo phenol red(5mg)
B液:MgCl2・6H2O(0.42g)、MgSO4・7H2O(0.14g)、CaCl2(0.34g)
C液:NaHCO3(2.25g)
D液:DW
それぞれをDW 100mlに溶解し、オートクレーブ処理したものを用いた。
その後2x106個の脾臓細胞を96穴ラウンドプレート内で染色し、FACS Cantoを用いて解析した。ブロッキング並びに抗体染色は、抗体量100μl/ウェル、氷上30分静置にて行なった。各染色間にはPBS200μlを用いて洗浄を2回ずつ行なった。用いた抗体は以下の通りである:Mouse IgG(SIGMA: I5381、100μg/ml)(ブロッキング用)、FITC-anti mouse CD8a(eBioscience: 11-0081、5μg/ml)、PE-anti mouse B220(eBioscience: 12-0452、1μg/ml)、PE-anti mouse CD64(BioLegend: 139304、1μg/ml)、PE-anti mouse CD86(BioLegend: 105508、1μg/ml)、PE-Cy5-anti mouse CD11b(eBioscience: 15-0112、0.4μg/ml)、PE-Cy5-anti mouse CD4(eBioscience: 15-0042、0.4μg/ml)、APC-Streptavidin(BioLegend: 405207、0.2μg/ml)、APC-Cy7-anti mouse CD11c(BioLegend: 117324、2μg/ml)、Biotin-6H8(10μg/ml)。また脾腫についても評価した(++++、強度脾腫あり;++、中等度脾腫あり;+、軽度脾腫あり;-、脾腫なし)。
図18に示すように、P. Acnesの投与量及び投与後の時間経過に比例して、HSP90及びCD64(FCγレセプター)の発現は増強した。
本実施例において、Propionibacterium Acnes(P. Acnes)死菌投与による炎症が、樹状細胞膜表面のHSP90及びCD64(Fcγレセプター)の発現を誘導することを説明する。
図18に記載した量のP. AcnesをPBS200μlに希釈して、各マウスに尾静脈より投与した。投与から6日後(実験1)又は0~10日後(実験2)に、被投与マウスの脾臓を採取し、下記のコラゲナーゼ処理及びゲイズ溶液処理を行ない脾臓細胞を回収した。
コラゲナーゼ処理の詳細は以下の通りである。
コラゲナーゼ溶液10mlの入った6cmディッシュ内で脾臓1個をピンセットなどを用いて細かくほぐし、37℃インキュベーターの中に15分間静置した。ここに最終濃度が5mMになるようEDTAを加えピペッティングし、更に37℃インキュベーターの中に5分間静置した。メッシュを通し15mlチューブへと移した。
コラゲナーゼ溶液:コラゲナーゼ(Wako, 032-10534)400U/ml、Dnase 15μg/mlをRPMIに溶解したもの。使用直前に作製した。
ゲイズ処理の詳細は以下の通りである。
細胞のペレットを15mlチューブ内に準備し、これをタッピングで良くほぐした。ここにゲイズ溶液を2ml加え氷上にて3-5分間静置した。その後10mlのPBSを加えて手早く遠心を行ない、ゲイズ溶液を除去した。
ゲイズ溶液:以下のA-D液をA20%、B5%、C5%、D70%の比率で混和したもの。
A液:NH4Cl(3.5g)、KCl(0.185g)、Na2HPO4(0.06g)、KH2PO4(0.012g)、D-Glucose(0.5g)、Bromo phenol red(5mg)
B液:MgCl2・6H2O(0.42g)、MgSO4・7H2O(0.14g)、CaCl2(0.34g)
C液:NaHCO3(2.25g)
D液:DW
それぞれをDW 100mlに溶解し、オートクレーブ処理したものを用いた。
その後2x106個の脾臓細胞を96穴ラウンドプレート内で染色し、FACS Cantoを用いて解析した。ブロッキング並びに抗体染色は、抗体量100μl/ウェル、氷上30分静置にて行なった。各染色間にはPBS200μlを用いて洗浄を2回ずつ行なった。用いた抗体は以下の通りである:Mouse IgG(SIGMA: I5381、100μg/ml)(ブロッキング用)、FITC-anti mouse CD8a(eBioscience: 11-0081、5μg/ml)、PE-anti mouse B220(eBioscience: 12-0452、1μg/ml)、PE-anti mouse CD64(BioLegend: 139304、1μg/ml)、PE-anti mouse CD86(BioLegend: 105508、1μg/ml)、PE-Cy5-anti mouse CD11b(eBioscience: 15-0112、0.4μg/ml)、PE-Cy5-anti mouse CD4(eBioscience: 15-0042、0.4μg/ml)、APC-Streptavidin(BioLegend: 405207、0.2μg/ml)、APC-Cy7-anti mouse CD11c(BioLegend: 117324、2μg/ml)、Biotin-6H8(10μg/ml)。また脾腫についても評価した(++++、強度脾腫あり;++、中等度脾腫あり;+、軽度脾腫あり;-、脾腫なし)。
図18に示すように、P. Acnesの投与量及び投与後の時間経過に比例して、HSP90及びCD64(FCγレセプター)の発現は増強した。
実施例18
本実施例では、P. Acnes投与による脾臓の樹状細胞膜表面HSP90及びCD64の発現変化に必須な因子について説明する。
<実験1>C57BL/6マウス、MyD88/TRIFノックアウト(KO)マウス、IFNγKOマウス及びIFNα/βレセプターKOマウスに、PBS200μlに希釈したP. Acnes500μgを尾静脈より投与した。投与から6日後に被投与マウスの脾臓を採取し、以下実施例17と同様に解析を行った。
<実験2>C57BL/6マウス及びIL-18 KOマウス、Fcレセプターγ鎖(FcRγ)KOマウスを用いて<実験1>と同様の解析を行った。
結果を図19に示す。実験1の結果から、P. Acnes投与による樹状細胞の活性化(HSP90及びCD64発現)は、MyD88依存性であり、かつIFNγにも依存性であることが分かった。一方、IFNα/βには依存しなかった。また実験2の結果から、該活性化は、IL-18には依存しないが、やはりFcRγサブユニットには依存する事が明らかになった。
本実施例では、P. Acnes投与による脾臓の樹状細胞膜表面HSP90及びCD64の発現変化に必須な因子について説明する。
<実験1>C57BL/6マウス、MyD88/TRIFノックアウト(KO)マウス、IFNγKOマウス及びIFNα/βレセプターKOマウスに、PBS200μlに希釈したP. Acnes500μgを尾静脈より投与した。投与から6日後に被投与マウスの脾臓を採取し、以下実施例17と同様に解析を行った。
<実験2>C57BL/6マウス及びIL-18 KOマウス、Fcレセプターγ鎖(FcRγ)KOマウスを用いて<実験1>と同様の解析を行った。
結果を図19に示す。実験1の結果から、P. Acnes投与による樹状細胞の活性化(HSP90及びCD64発現)は、MyD88依存性であり、かつIFNγにも依存性であることが分かった。一方、IFNα/βには依存しなかった。また実験2の結果から、該活性化は、IL-18には依存しないが、やはりFcRγサブユニットには依存する事が明らかになった。
実施例19
本実施例では、C57BL/6マウスの各種細胞集団における、P. Acnes投与による膜表面HSP90及びCD64の発現の違いについて説明する。
PBS200μlに希釈したP. Acnes500μgを、C57BL/6マウスに尾静脈より投与した。投与から6日後に被投与マウスの脾臓を採取し、コラゲナーゼ処理(既出)及びゲイズ溶液処理(既出)を用いて脾臓細胞を回収した。その後96穴ラウンドプレート内で2x106個の脾臓細胞をMouse IgG抗体(100μg/ml)を用いてブロッキング処理をした後、各種抗体で染色した。なおブロッキング及び抗体染色は、抗体量100μl/ウェル、氷上30分静置にて行なった。各染色間にはPBS200μlを用いて2回ずつ洗浄を行なった。染色に用いた抗体は以下の通りである(既出のものについては詳細省略):<樹状細胞/マクロファージ>PE-Cy5-anti mouse CD11b(eBioscience: 15-0112、0.4μg/ml)、APC-Cy7-anti mouse CD11c、PE-anti mouse CD64、Biotin-6H8、APC-Streptavidin;<T細胞>APC-Cy7-anti mouse CD11c、FITC-anti mouse CD8a、PE-Cy5-anti mouse CD4(eBioscience: 15-0042、0.4μg/ml)、PE-anti mouse CD64、Biotin-6H8、 APC-Streptavidin;<B細胞>APC-Cy7-anti mouse CD11c、PE-anti mouse B220(eBioscience: 12-0452、1μg/ml)、Biotin-6H8、APC-Streptavidin。染色後の細胞は、FACS Cantoを用いて解析した。
図20には、それぞれの細胞集団の生細胞におけるHSP90(6H8)/CD64の発現を二次元ドットプロットで示す。CD11chigh/CD11b(-)の集団(D)では、HSP90、CD64ともに発現が見られなかった。一方、樹状細胞の中でもCD11chigh/CD11bmiddle(C)、CD11cmiddle/CD11bhigh(A及びB)ではHSP90、CD64ともに発現が見られた。T細胞、B細胞ではHSP90、CD64ともに発現は見られなかった。以上より、P. Acnes投与により細胞膜表面にHSP90が発現するのは抗原提示細胞に限られることが明らかとなった。
本実施例では、C57BL/6マウスの各種細胞集団における、P. Acnes投与による膜表面HSP90及びCD64の発現の違いについて説明する。
PBS200μlに希釈したP. Acnes500μgを、C57BL/6マウスに尾静脈より投与した。投与から6日後に被投与マウスの脾臓を採取し、コラゲナーゼ処理(既出)及びゲイズ溶液処理(既出)を用いて脾臓細胞を回収した。その後96穴ラウンドプレート内で2x106個の脾臓細胞をMouse IgG抗体(100μg/ml)を用いてブロッキング処理をした後、各種抗体で染色した。なおブロッキング及び抗体染色は、抗体量100μl/ウェル、氷上30分静置にて行なった。各染色間にはPBS200μlを用いて2回ずつ洗浄を行なった。染色に用いた抗体は以下の通りである(既出のものについては詳細省略):<樹状細胞/マクロファージ>PE-Cy5-anti mouse CD11b(eBioscience: 15-0112、0.4μg/ml)、APC-Cy7-anti mouse CD11c、PE-anti mouse CD64、Biotin-6H8、APC-Streptavidin;<T細胞>APC-Cy7-anti mouse CD11c、FITC-anti mouse CD8a、PE-Cy5-anti mouse CD4(eBioscience: 15-0042、0.4μg/ml)、PE-anti mouse CD64、Biotin-6H8、 APC-Streptavidin;<B細胞>APC-Cy7-anti mouse CD11c、PE-anti mouse B220(eBioscience: 12-0452、1μg/ml)、Biotin-6H8、APC-Streptavidin。染色後の細胞は、FACS Cantoを用いて解析した。
図20には、それぞれの細胞集団の生細胞におけるHSP90(6H8)/CD64の発現を二次元ドットプロットで示す。CD11chigh/CD11b(-)の集団(D)では、HSP90、CD64ともに発現が見られなかった。一方、樹状細胞の中でもCD11chigh/CD11bmiddle(C)、CD11cmiddle/CD11bhigh(A及びB)ではHSP90、CD64ともに発現が見られた。T細胞、B細胞ではHSP90、CD64ともに発現は見られなかった。以上より、P. Acnes投与により細胞膜表面にHSP90が発現するのは抗原提示細胞に限られることが明らかとなった。
実施例20
本実施例では、6H8抗体遺伝子解析について説明する。
1.マウス抗体(IgG)配列特異的RT反応
6H8抗体を産生するハイブリドーマ(受託番号FERM BP-11222)から定法に従って調製した全RNAを鋳型として、マウス抗体(IgG)重鎖(H鎖)特異的なプライマー(H-RT1:TCCAKAGTTCCA(配列番号7))を用いてcDNA合成を行った。同様に軽鎖(L鎖)特異的なプライマー(L-RT1:GCTGTCCTGATC(配列番号8))を用いてcDNAを合成した。RT反応は、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Cat.No.634924)の説明書に従い、以下の条件で行なった。
(1)全RNA 0.5μg、H-RT1又はL-RT1(12μM) 1μl、dH2O 3.75μlまでを混合し、70℃、3分間、42℃、2分間の反応を行った。
(2)反応液に、SMARTer II A Oligonucleotide(12μM) 1μl、DTT(20mM)
1μl、dNTP Mix(各10mM) 1μl、5×First-Strand Buffer 2μl、RNase Inhibitor(40U/μl) 0.25μl、SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(100U/μl) 1μlを添加し、42℃、90分間、70℃、10分間の反応を行った。
(3)50μl Tricine-EDTAバッファーを添加して反応を停止させ、-20℃にて保存した。
2.マウス抗体(IgG)配列特異的RACE PCR反応
SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kitを用いて5’RACE PCR解析を行った。
(1)上記1で合成したcDNA(H鎖特異的なプライマーにより合成)を鋳型として、マウス抗体(IgG)H鎖特異的なプライマーをリバースプライマー、キットに含まれるUPM(Universal primer mix)をフォワードプライマーとしてRACE PCR反応を行った。同様にcDNA(L鎖特異的なプライマーにより合成)を鋳型に、L鎖特異的なプライマーを用いてRACE PCR反応を行った。PCR酵素にはPrimeSTAR(タカラバイオ株式会社)を使用した。
PCR反応は上記キットに添付されたプロトコルに従って行なった。
(2)想定の大きさのPCR産物が得られたことを、アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。PCR産物をSYN3025H、SYN3025Lと命名し、ゲル抜き精製後、解析に用いた。
3.クローニング及び塩基配列解析
(1)ゲル抜き精製したPCR産物(SYN3025H、SYN3025L)をクローニングプラスミドpMD20-T(タカラバイオ株式会社)にライゲーションした。
(2)常法により形質転換を行い、PCR産物ごとに48クローンを取得した。
(3)取得したクローンに含まれるインサートの配列を定法に従い解析した。シークエンス反応は、BigDye Terminators v3.1 Cycle Sequencing Kit(ABI社)を使用し、同社プロトコルに従ってABI3730 Sequencer(ABI社)により行った。
(4)H鎖、L鎖、それぞれ48クローンの塩基配列解析結果と、ここからベクター領域及び確度の低い領域を除いた塩基配列を取得した。
4.結果評価
次に、3-(4)で得られた塩基配列を用いて以下の解析を行った。
(1)取得配列の分類とコンセンサス配列の取得
H鎖、L鎖の塩基配列を相同性により分類した。相同性比較はDNA Sequenceアセンブルソフトウエア、SEQUENCHERTM(Gene Codes:Windows(登録商標)版)により行った。この結果、H鎖で1つ、L鎖で3つのコンティグが得られた(コンティグを構成しない配列も見られた。)。得られたコンティグからコンセンサス配列を取得した。
(2)目的遺伝子の候補配列について
コンセンサス配列及び、コンティグを形成しなかった配列から、目的遺伝子の候補と考えられる配列を選別した。ここでは抗体定常域遺伝子のアミノ酸配列上流に、ストップコドンを含まずにメチオニン残基を持つ配列を全て選択した。
(3)アミノ酸配列の推定
候補配列の内、コンティグを形成した配列数及び、取得配列で考えられた遺伝子長から、H鎖、L鎖それぞれのメジャーコンティグが目的配列の可能性が高いと考えられた。そこで、それぞれのメジャーコンティグのコンセンサス配列にコードされるアミノ酸配列をH鎖及びL鎖のアミノ酸配列とした。
以上の方法により取得した6H8抗体H鎖及びL鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図21及び22に示す。H鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。L鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号11及び12に示す。配列番号10において2つ目のメチオニンをコードするコドンが開始コドンであると考えられ、Kabatらの番号付け(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH.)によれば17~35位がリーダー配列、66~70位がCDR1、85~101位がCDR2、134~141位がCDR3に相当する。同様に、配列番号12において、1~19位がリーダー配列、43~58位がCDR1、74~80位がCDR2、113~121位がCDR3に相当する。
本実施例では、6H8抗体遺伝子解析について説明する。
1.マウス抗体(IgG)配列特異的RT反応
6H8抗体を産生するハイブリドーマ(受託番号FERM BP-11222)から定法に従って調製した全RNAを鋳型として、マウス抗体(IgG)重鎖(H鎖)特異的なプライマー(H-RT1:TCCAKAGTTCCA(配列番号7))を用いてcDNA合成を行った。同様に軽鎖(L鎖)特異的なプライマー(L-RT1:GCTGTCCTGATC(配列番号8))を用いてcDNAを合成した。RT反応は、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Cat.No.634924)の説明書に従い、以下の条件で行なった。
(1)全RNA 0.5μg、H-RT1又はL-RT1(12μM) 1μl、dH2O 3.75μlまでを混合し、70℃、3分間、42℃、2分間の反応を行った。
(2)反応液に、SMARTer II A Oligonucleotide(12μM) 1μl、DTT(20mM)
1μl、dNTP Mix(各10mM) 1μl、5×First-Strand Buffer 2μl、RNase Inhibitor(40U/μl) 0.25μl、SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(100U/μl) 1μlを添加し、42℃、90分間、70℃、10分間の反応を行った。
(3)50μl Tricine-EDTAバッファーを添加して反応を停止させ、-20℃にて保存した。
2.マウス抗体(IgG)配列特異的RACE PCR反応
SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kitを用いて5’RACE PCR解析を行った。
(1)上記1で合成したcDNA(H鎖特異的なプライマーにより合成)を鋳型として、マウス抗体(IgG)H鎖特異的なプライマーをリバースプライマー、キットに含まれるUPM(Universal primer mix)をフォワードプライマーとしてRACE PCR反応を行った。同様にcDNA(L鎖特異的なプライマーにより合成)を鋳型に、L鎖特異的なプライマーを用いてRACE PCR反応を行った。PCR酵素にはPrimeSTAR(タカラバイオ株式会社)を使用した。
PCR反応は上記キットに添付されたプロトコルに従って行なった。
(2)想定の大きさのPCR産物が得られたことを、アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。PCR産物をSYN3025H、SYN3025Lと命名し、ゲル抜き精製後、解析に用いた。
3.クローニング及び塩基配列解析
(1)ゲル抜き精製したPCR産物(SYN3025H、SYN3025L)をクローニングプラスミドpMD20-T(タカラバイオ株式会社)にライゲーションした。
(2)常法により形質転換を行い、PCR産物ごとに48クローンを取得した。
(3)取得したクローンに含まれるインサートの配列を定法に従い解析した。シークエンス反応は、BigDye Terminators v3.1 Cycle Sequencing Kit(ABI社)を使用し、同社プロトコルに従ってABI3730 Sequencer(ABI社)により行った。
(4)H鎖、L鎖、それぞれ48クローンの塩基配列解析結果と、ここからベクター領域及び確度の低い領域を除いた塩基配列を取得した。
4.結果評価
次に、3-(4)で得られた塩基配列を用いて以下の解析を行った。
(1)取得配列の分類とコンセンサス配列の取得
H鎖、L鎖の塩基配列を相同性により分類した。相同性比較はDNA Sequenceアセンブルソフトウエア、SEQUENCHERTM(Gene Codes:Windows(登録商標)版)により行った。この結果、H鎖で1つ、L鎖で3つのコンティグが得られた(コンティグを構成しない配列も見られた。)。得られたコンティグからコンセンサス配列を取得した。
(2)目的遺伝子の候補配列について
コンセンサス配列及び、コンティグを形成しなかった配列から、目的遺伝子の候補と考えられる配列を選別した。ここでは抗体定常域遺伝子のアミノ酸配列上流に、ストップコドンを含まずにメチオニン残基を持つ配列を全て選択した。
(3)アミノ酸配列の推定
候補配列の内、コンティグを形成した配列数及び、取得配列で考えられた遺伝子長から、H鎖、L鎖それぞれのメジャーコンティグが目的配列の可能性が高いと考えられた。そこで、それぞれのメジャーコンティグのコンセンサス配列にコードされるアミノ酸配列をH鎖及びL鎖のアミノ酸配列とした。
以上の方法により取得した6H8抗体H鎖及びL鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図21及び22に示す。H鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。L鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号11及び12に示す。配列番号10において2つ目のメチオニンをコードするコドンが開始コドンであると考えられ、Kabatらの番号付け(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH.)によれば17~35位がリーダー配列、66~70位がCDR1、85~101位がCDR2、134~141位がCDR3に相当する。同様に、配列番号12において、1~19位がリーダー配列、43~58位がCDR1、74~80位がCDR2、113~121位がCDR3に相当する。
本発明の抗体は、本発明のワクチンの調製、生物学的活性を有する化合物の送達、及び細胞表面HSP90発現細胞の特異的な検出等において使用することができる。したがって、ワクチンを使用して治療可能な疾患の治療、細胞内に薬剤を送達することによって治療可能な疾患の治療、及び抗原提示細胞等の細胞表面HSP90発現細胞の分析等において有用である。さらに本発明の抗体は、アジュバントとして使用することができ、ワクチン等による免疫誘導の効率を高めることができ、疾患の治療における患者負担の軽減に有用である。
本出願は、米国仮特許出願61/323,578(出願日:2010年4月13日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (43)
- アミノ酸配列VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)、又はアミノ酸配列HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面HSP90を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列中、X2がE又はDである請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列中、X4がE又はDである請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列中、X6がI又はVである請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 該エピトープが、
(1)X1がTであり、X2がEであり、X3がMであり、及びX4がDである配列番号1のアミノ酸配列、
(2)X1がPであり、X2がDであり、X3がIであり、及びX4がEである配列番号1のアミノ酸配列、
(3)X5がSであり、及びX6がIである配列番号2のアミノ酸配列、又は
(4)X5がPであり、及びX6がVである配列番号2のアミノ酸配列
を含むエピトープである、請求項1記載のモノクローナル抗体。 - 細胞が、抗原提示細胞である、請求項1~5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト(単核球)である、請求項6記載のモノクローナル抗体。
- 細胞が、腫瘍細胞である、請求項1~5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 腫瘍細胞が、ヒト由来である、請求項8記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号がFERM BP-11222又はFERM BP-11243であるハイブリドーマ。
- 請求項10記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面Hsp90を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
- 請求項10記載のハイブリドーマによって産生される、請求項1~9のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含む、細胞表面HSP90を認識する抗体。
- 配列番号10の36~185位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び/又は配列番号12の20~177位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体。
- アミノ酸配列VX1X2EX3PPLEGDX4(X1~X4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:1)、又はアミノ酸配列HX5IX6ETLRQKAE(X5~X6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す)(配列番号:2)のいずれかから選択されるアミノ酸配列をエピトープとして含む免疫原ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、細胞表面HSP90を認識するモノクローナル抗体の製造方法。
- 重鎖CDR1(配列番号10の66~70位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号10の85~101位で表わされるアミノ酸配列)、CDR3(配列番号10の134~141位で表わされるアミノ酸配列)、軽鎖CDR1(配列番号12の43~58位で表わされるアミノ酸配列)、CDR2(配列番号12の74~80位で表わされるアミノ酸配列)、及びCDR3(配列番号12の113~121位で表わされるアミノ酸配列)のいずれか1つを少なくとも含むようにポリペプチドを調製する工程を含む、細胞表面HSP90を認識する抗体の製造方法。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体と標的抗原との複合体を含むワクチン。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、請求項1~9、及び11~14のいずれか1項に記載の抗体である、請求項17記載のワクチン。
- 標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、請求項17又は18記載のワクチン。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体と標的抗原との複合体を形成させる工程を含む、ワクチンの製造方法。
- 請求項17~19のいずれか1項に記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
- 請求項17~19のいずれか1項に記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療または予防方法。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体と生物学的活性を有する物質との複合体を含む薬剤。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、請求項1~9、及び11~14のいずれか1項に記載の抗体である、請求項23記載の薬剤。
- 生物学的活性を有する物質が核酸分子である、請求項23又は24記載の薬剤。
- 該核酸分子がsiRNAである、請求項25記載の薬剤。
- 生物学的活性を有する物質が抗癌剤である、請求項23又は24記載の薬剤。
- 請求項23~27のいずれか1項に記載の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバント。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体が請求項1~9、及び11~14のいずれか1項に記載の抗体である、請求項29記載のアジュバント。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体が、配列番号3のアミノ酸配列(VTEEMPPLEGDD)をエピトープとして認識するものである、請求項29に記載のアジュバント。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位が、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合部位中の軽鎖可変領域を含んでなる、請求項29に記載のアジュバント。
- 細胞表面上のHSP90を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを医薬上許容可能な賦形剤又は添加剤と混合する工程を含む、アジュバントの製造方法。
- Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンと請求項29~32のいずれか1項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
- 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項34記載の免疫誘導方法。
- ワクチンが請求項17~19のいずれか1項に記載のワクチンである、請求項34に記載の免疫誘導方法。
- ワクチンが、標的抗原と抗体との複合体を含む、請求項34記載の免疫誘導方法。
- 標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、請求項37記載の免疫誘導方法。
- Fcレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンの有効量と請求項29~32のいずれか1項に記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
- 抗腫瘍抗原抗体と請求項29~32のいずれか1項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
- 抗腫瘍細胞抗体と請求項29~32のいずれか1項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
- 抗癌剤と請求項29~32のいずれか1項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
- 抗腫瘍抗原抗体の有効量と請求項29~32のいずれか1項に記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
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