JP2022536684A - マクロファージ特異的エンゲージャー組成物およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、がんまたは感染症の免疫療法のために使用される骨髄性細胞特異的エンゲージャーを含む治療剤を作成および使用する組成物および方法を提供する。【選択図】図３Ｆ

Description

相互参照
[0001]本出願は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１９年６月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／８６０，０５５号、および２０１９年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／９０８，９７８号の利益を請求する。
[0002]細胞免疫療法は、がん、持続感染、および処置の他の形態に難治性の疾患などの疾患を処置する困難と闘う有望な新しい技術である。マクロファージは、腫瘍または感染部位に存在する優位な細胞型を代表し、それらが最も有効に疾患を処置するために利用され得るようにいくつかの戦略的利点を持つ。免疫系の自然センチネルとして、これらの細胞は、がん細胞を含む異常および非健常細胞型を感知および除去することができる。しかしながら、免疫療法のためのマクロファージの使用可能性は、完全には調査されていない。最新の手段は、限定はされないがＴ細胞悪性腫瘍を含む、改善された治療の開発に向けてこれらの細胞型を使用するために考えられる。
[0003]本開示は、食作用を通して標的細胞破壊経路を開始する新しい組成物および方法に関する。本出願は、食作用受容体がその古典的なリガンドに結合するのに加えて少なくとも第２の同時またはその後の活性化シグナルによって起動される場合、第２またはさらなるシグナル（複数可）が食作用により標的細胞の十分な破壊をもたらし得るという予期しない発見に基づく。本明細書では、骨髄性細胞、または単球もしくはマクロファージなどの細胞の食作用を増強するために設計されたキメラ受容体、およびキメラ受容体結合細胞外エレメントを提供する。少なくとも第２の同時またはその後のシグナルの慎重な設計および／または操作は、その後に標的細胞が効果的に破壊されるように、本明細書に記載のものなどのキメラ食作用受容体の活性化の成功のために有用である。例えば、第１のシグナル（シグナル１）は食作用／係留受容体を介して媒介され、第２のシグナル（シグナル２）は病原体関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、または炎症遺伝子の核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）媒介性上方制御を起動するサイトカインなどの危険シグナルによって媒介され得る。以下の節に記載するように、食作用単独を起動することは、がん細胞を死滅させ、有効な抗腫瘍応答を駆動する単球またはマクロファージの食作用能を利用する文脈で単球またはマクロファージを活性化するのに不十分であり得る。
[0004]本明細書に記載の本発明の特定の利点の１つは、本明細書に開示の有効な細胞免疫療法のための組成物が、コスト効率が良く、有効であることである。
[0005]いくつかの態様では、本明細書は、キメラ食作用受容体の細胞外部分に結合し、さらにがん細胞などの標的細胞の少なくとも細胞表面構成要素に結合する、新しいキメラ細胞表面結合エレメントまたは「エンゲージャー」を提供する。
[0006]一実施形態では、新しいキメラエンゲージャーは、キメラ食作用受容体の細胞外部分に結合し、さらに１つまたは複数の細胞表面構成要素に結合することができ、その少なくとも１つは標的がん細胞上である。したがって、エンゲージャーは二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャー（ＢｉＭＥ）であってもよく、２つの結合部分を有し、１つの結合部分はキメラ食作用受容体の細胞外部分に結合し、その他は標的細胞の細胞表面構成要素に結合する。同様に、エンゲージャーは三重特異性単球またはマクロファージエンゲージャー（ＴｒｉＭＥ）であってもよく、３つの結合部分を有し、１つの結合部分はキメラ食作用受容体の細胞外部分に結合し、別の結合部分は標的細胞の細胞表面構成要素に結合し、第３の結合部分は食細胞の細胞表面構成要素に結合する。
[0007]一態様では、エンゲージャーは合成タンパク質またはペプチド、コンジュゲートタンパク質またはコンジュゲートペプチドである。本明細書では、第１の治療剤を含む組成物であって、治療剤が、（ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片である第１の結合ドメイン、および（ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片である第２の結合ドメインを含み、（ｉ）第１の治療剤がさらなる治療剤または第３の結合ドメインである第１の構成要素と結合し、または（ｉｉ）組成物がさらなる治療剤を含む、組成物を提供する。
[0008]一態様では、本明細書は、治療剤を含む組成物であって、治療剤が、（ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の結合ドメイン、（ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の結合ドメイン、および（ｃ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第３の結合ドメインを含むエンゲージャーである組成物を提供する。
[0009]一態様では、本明細書は、治療剤を含む組成物であって、治療剤が、（ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の結合ドメイン、（ｂ）（ｉ）骨髄性細胞（例えば、単球もしくはマクロファージ、または樹状細胞）と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の食作用活性を促進する、または（ｉｉ）骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の炎症シグナル伝達を促進する、または（ｉｉｉ）骨髄性細胞または接着分子と特異的に相互作用し、標的細胞への骨髄性細胞の接着を促進する第２の結合ドメイン、および（ｃ）（ｉ）骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の食作用活性を促進する、または（ｉｉ）骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の炎症シグナル伝達を促進する、または（ｉｉｉ）骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞への骨髄性細胞の接着を促進する、または（ｉｖ）骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗食作用活性を阻害する、または（ｖ）骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗炎症活性を阻害する第３の結合ドメインを含むエンゲージャーである組成物を提供する。
[0010]いくつかの実施形態では、骨髄性細胞は単球またはマクロファージ細胞である。
[0011]いくつかの実施形態では、標的細胞はがん細胞である。
[0012]いくつかの実施形態では、骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の結合ドメインは、骨髄性細胞または単球またはマクロファージ細胞の食作用または係留受容体と相互作用する。
[0013]いくつかの実施形態では、骨髄性細胞と特異的に相互作用する第３の結合ドメインは、骨髄性細胞または単球またはマクロファージ細胞の第１の食作用または係留受容体の細胞外領域と相互作用する。
[0014]治療剤の結合ドメインのいずれか１つが、抗体、抗体の機能的断片、その可変ドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＮＡＲドメイン、ＶＨＨドメイン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、二重特異性抗体、ディアボディ、またはその機能的断片もしくは組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
[0015]いくつかの実施形態では、治療剤は組換えタンパク質または１つより多くの組換えタンパク質である。
[0016]いくつかの実施形態では、治療剤は１つまたは複数の融合タンパク質を含む組換えタンパク質を含む。
[0017]いくつかの実施形態では、治療剤は、抗体、抗体の機能的断片、その可変ドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＮＡＲドメイン、ＶＨＨドメイン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、二重特異性抗体、ディアボディ、またはその機能的断片もしくは組合せを含む組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、治療剤は、それぞれ複数の結合断片を含み、各結合断片が抗体の機能的断片、その可変ドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＮＡＲドメイン、ＶＨＨドメイン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、二重特異性抗体、ディアボディ、またはその機能的断片もしくは組合せを構成する、組換えタンパク質または１つより多くの組換えタンパク質である。
[0018]いくつかの実施形態では、治療剤は、互いに相補的な結合を示すリンカー（例えば、ペプチドリンカー）によってそれぞれ共に連結される、それぞれ個々の結合特異性を有する、複数の結合ドメインを含む組換えタンパク質（エンゲージャー）である。例えば、組換えタンパク質の１つの結合ドメインが第１の対のリンカーペプチドと融合され、他の結合ドメインが第２の対のリンカーペプチドと融合され、対のリンカーペプチドは互いに相補的な結合を示し、対のリンカーペプチドは、（ａ）互いに相補的な結合を示すロイシンジッパー、例えばｃ－Ｆｏｓおよびｃ－Ｊｕｎタンパク質の結合領域内のジッパー配列などの自然発生のタンパク質－タンパク質相互作用におけるロイシンジッパー、（ｂ）合成留め具などの設計された親和性を介して互いに特異的に結合するように設計された合成ペプチドを含む。
[0019]いくつかの実施形態では、治療剤は、組換えタンパク質に含まれるロイシンジッパーペプチド対により、互いとの加速した会合を促進するように構成された複数の結合断片を含む組換えタンパク質である。
[0020]いくつかの実施形態では、治療剤は、組換えタンパク質内に含まれるペプチド対のｃ－Ｆｏｓ／ｃ－Ｊｕｎ結合ドメインにより、互いとの加速した会合を促進するように構成された複数の結合断片を含む組換えタンパク質である。
[0021]いくつかの実施形態では、治療剤は、合成留め金によって互いとの加速した会合を促進するように構成された複数の結合断片を含む組換えタンパク質である。
[0022]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は、がん抗原または標的細胞の病原性抗原または自己免疫抗原である。
[0023]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原はウイルス抗原である。
[0024]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原はＴリンパ球抗原である。
[0025]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は細胞外抗原である。
[0026]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は細胞内抗原である。
[0027]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は、チミジンキナーゼ（ＴＫ１）、ヒポキサンチン－グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ムチン－１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、上皮増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ＥＢＮＡ－１、ＬＥＭＤ１、ホスファチジルセリン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、卵胞刺激ホルモン受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、エリスロポエチン産生肝細胞癌Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＥｐｈＢ２、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２４８、ＣＤ２７６、ＰＳＣＡ、ＣＳ－１、ＣＬＥＣＬ１、ＧＤ３、ＰＳＭＡ、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＥＰＣＡＭ、ＩＬ－１、インテグリン受容体、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧＭ３、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ＩＧＬＬ１およびこれらの組合せからなる群から選択される。
[0028]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＣＲ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ５６からなる群から選択される。
[0029]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は、卵巣がん抗原またはＴリンパ腫抗原である。
[0030]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原は、インテグリン受容体である。
[0031]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインまたは第３の結合ドメインは、インテグリン受容体に結合する。
[0032]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインまたは第３の結合ドメインは、α１、α２、αＩＩｂ、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、およびβ８からなる群から選択されるインテグリン受容体に結合する。
[0033]いくつかの実施形態では、治療剤は、食作用活性化ドメインを含む食作用または係留受容体に結合する。
[0034]いくつかの実施形態では、治療剤は、表２Ａおよび表２Ｂに列挙した受容体、またはそれらの断片からなる群から選択される受容体またはタンパク質に結合する。
[0035]いくつかの実施形態では、治療剤は、レクチン、デクチン１、ＣＤ２０６、スカベンジャー受容体Ａ１（ＳＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＭＳＲ１、ＳＣＡＲＡ３、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ５、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＡＲＢ２、ＣＤ６８、ＯＬＲ１、ＳＣＡＲＦ１、ＳＣＡＲＦ２、ＣＸＣＬ１６、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＳＲＣＲＢ４Ｄ、ＳＳＣ５Ｄ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＲＡＧＥ、ＣＤ１４、ＣＤ６４、Ｆ４／８０、ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＨｕＣＲＩｇ（Ｌ）、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ８９、Ｆｃ－アルファ受容体Ｉ、ＣＲ１、ＣＤ３５、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｔｉｍ－１、Ｔｉｍ－４およびＣＤ１６９からなる群から選択される食作用受容体に結合する。
[0036]いくつかの実施形態では、治療剤は、炎症促進性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む受容体に結合する。
[0037]いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、１０００アミノ酸または１０００ｎｍ長より小さいポリペプチドを含む。
[0038]いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、５００アミノ酸または５００ｎｍ長より小さいポリペプチドを含む。
[0039]いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、２００～１０００アミノ酸または２００～１０００ｎｍ長であるポリペプチドを含む。
[0040]いくつかの実施形態では、第１の治療剤の結合ドメインの結合は、がん細胞を骨髄性細胞へと接触させる。
[0041]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の食作用活性を促進する。
[0042]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の炎症性シグナル伝達を促進する。
[0043]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは骨髄性細胞または接着分子と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の標的細胞への接着を促進する。
[0044]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗食作用活性を阻害する。
[0045]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗炎症活性を阻害する。
[0046]いくつかの実施形態では、第２および／または第３の結合ドメインは、骨髄性細胞の食作用活性を促進する。
[0047]いくつかの実施形態では、第２および／または第３の結合ドメインは、骨髄性細胞の炎症性シグナル伝達を促進する。
[0048]いくつかの実施形態では、第２および／または第３の結合ドメインは骨髄性細胞または接着分子と特異的に相互作用し、標的細胞への骨髄性細胞の接着を促進する。
[0049]いくつかの実施形態では、第２および／または第３の結合ドメインは、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗食作用活性を阻害する。
[0050]いくつかの実施形態では、第２および／または第３の結合ドメインは、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗炎症活性を阻害する。
[0051]いくつかの実施形態では、治療剤は治療ポリペプチドを含む。
[0052]いくつかの実施形態では、治療剤は治療ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。
[0053]いくつかの実施形態では、第３の結合ドメイン、またはさらなる治療剤は、ＣＤ４７アンタゴニスト、ＣＤ４７ブロッカー、抗体、キメラＣＤ４７受容体、シアリダーゼ、サイトカイン、炎症促進性遺伝子、プロカスパーゼ、または抗がん剤を含む。
[0054]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン、第２の結合ドメインおよび第３の結合ドメインは、異なる非同一の標的抗原に結合する。
[0055]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン、第２の結合ドメインおよび第３の結合ドメインは、リガンド結合ドメインである。
[0056]いくつかの実施形態では、第１、第２または第３の結合ドメインは、１つまたは複数のリンカーによって作動可能に連結されている。
[0057]いくつかの実施形態では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは機能性ペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、リンカーは単球またはマクロファージ受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、リンカーは受容体を活性化する。いくつかの実施形態では、リンカーは受容体を阻害する。いくつかの実施形態では、リンカーはＭ２単球またはマクロファージのリガンドである。いくつかの実施形態では、リンカーはＴＬＲ受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、リンカーはＴＬＲ受容体を活性化する。
[0058]いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の結合ドメインは、結合ドメインに結合するマスクと会合する。
[0059]いくつかの実施形態では、マスクがそれぞれの結合ドメインと会合したままである場合、マスクは、その標的への結合ドメインの相互作用を阻害する阻害剤である。
[0060]いくつかの実施形態では、マスクは、ペプチドリンカーを介して結合ドメインと会合する。
[0061]いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは切断可能な部分を含む。
[0062]いくつかの実施形態では、切断可能な部分は、がんまたは腫瘍の部位に選択的に豊富なタンパク質または酵素によって切断される。
[0063]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージの第２の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第３の結合ドメインは、単球またはマクロファージを活性化する。
[0064]いくつかの実施形態では、治療剤が骨髄性細胞に結合すると、骨髄性細胞の殺作用または食作用活性が、粒子取り込みアッセイによって測定した場合、治療剤によって結合されない骨髄性細胞と比較して少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％または９０％または１００％増加する。
[0065]いくつかの実施形態では、第１の治療剤の結合ドメインの結合が、骨髄性細胞によるがん細胞の食作用を起動する。
[0066]いくつかの実施形態では、第２の治療剤の結合が、骨髄性細胞によるがん細胞の食作用性殺作用を可能にする、または増加する。
[0067]いくつかの実施形態では、第２または第３の結合ドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃＲｎ、ＴＲＩＭ２１、ＦｃＲＬ５の細胞外に結合する。
[0068]いくつかの実施形態では、第２または第３の結合ドメインはＭ２ドメインを含む。
[0069]いくつかの実施形態では、第２または第３の結合ドメインはＬＩＧＨＴドメインまたはＨＶＥＭ結合ドメインを含む。
[0070]いくつかの実施形態では、第２または第３の結合ドメインはＨＶＥＭ結合ドメインを含む。
[0071]いくつかの実施形態では、第２または第３の結合ドメインはＧＩＴＲ結合ドメインを含む。
[0072]いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号２７、２８、１１１、１１２、１１３、１１５、１４３および１４４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む。
[0073]いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、群１４１および１４２から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む。
[0074]いくつかの実施形態では、第１の構成要素は、アミノ酸配列ＧＧＱＥＩＮＳＳＹＧＧ（配列番号１０５）またはＱＥＩＮＳＳＹ（配列番号１２９）を含む。
[0075]いくつかの実施形態では、第１の構成要素は、アミノ酸配列ＧＧＡＰＰＨＡＬＳＧＧ（配列番号１０９）またはＡＰＰＨＡＬＳ（配列番号１３７）を含む。
[0076]いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＱＥＩＮＳＳＹＧＧ（配列番号１０５）、またはＱＥＩＮＳＳＹ（配列番号１２９）またはＧＧＡＰＰＨＡＬＳＧＧ（配列番号１０９）またはＡＰＰＨＡＬＳ（配列番号１３７）を含む。
[0077]いくつかの実施形態では、本明細書は、配列番号１５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む、二重特異性または三重特異性エンゲージャーを提供する。
[0078]いくつかの実施形態では、本明細書は、配列番号１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む、二重特異性または三重特異性エンゲージャーを提供する。
[0079]本明細書では、医薬組成物であって、治療剤が、１つもしくは複数のポリペプチドまたは１つもしくは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸を含み、１つまたは複数のポリペプチドが、標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片である第１の結合ドメイン、および骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片である第２の結合ドメインを含み、（ｉ）第１の治療剤が第１の構成要素に結合され、第１の構成要素がさらなる治療剤または第３の結合ドメインである、または（ｉｉ）組成物がさらなる治療剤を含む第１の治療剤、ならびに薬学的に許容される塩または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
[0080]いくつかの実施形態では、医薬組成物の第１の治療剤は単一のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物の第１の治療剤は、複数のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物の第１の治療剤は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、第２の治療剤をさらに含む。
[0081]本明細書では、処置の方法であって、治療剤が１つもしくは複数のポリペプチドまたは１つもしくは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸を含み、１つまたは複数のポリペプチドが第１の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインが標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片であり、第２の結合ドメインが骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片であり、（ｉ）第１の治療剤が第１の構成要素に結合され、第１の構成要素がさらなる治療剤または第３の結合ドメインである、または（ｉｉ）組成物がさらなる治療剤を含む、第１の治療剤、ならびに薬学的に許容される塩または賦形剤を含む医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
[0082]いくつかの実施形態では、処置の方法は、第２の治療剤を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、処置の方法は、医薬組成物を静脈内に投与するステップを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む。
[0083]いくつかの実施形態では、処置の方法は、医薬組成物を皮下に投与するステップを含む、医薬組成物を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、処置の方法は、医薬組成物を注射するステップを含む、医薬組成物を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。
[0084]いくつかの実施形態では、標的細胞は、リンパ球であるがん細胞である。
[0085]いくつかの実施形態では、標的細胞は、卵巣がん細胞であるがん細胞である。
[0086]いくつかの実施形態では、標的細胞は、卵巣膵臓細胞であるがん細胞である。
[0087]いくつかの実施形態では、標的細胞は、神経膠芽腫細胞であるがん細胞である。
[0088]いくつかの実施形態では、組換え核酸はＤＮＡである。
[0089]いくつかの実施形態では、組換え核酸はＲＮＡである。
[0090]いくつかの実施形態では、組換え核酸はｍＲＮＡである。
[0091]いくつかの実施形態では、組換え核酸はｃｉｒｃＲＮＡである。
[0092]いくつかの実施形態では、組換え核酸はｔＲＮＡである。
[0093]いくつかの実施形態では、組換え核酸はｍｉｃｒｏＲＮＡである。
[0094]本明細書では、上記の組成物を含むベクターを提供する。
[0095]いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターはポリシストロニックである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸配列のそれぞれが別々のプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列に隣接する５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の調節性領域をさらに含む。
[0096]本明細書では、上記の組成物の組換え核酸によってコードされるポリペプチドを提供する。
[0097]本開示のさらなる態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し、記載する以下の詳細な説明に従って当業者には容易に明らかであろう。明確に理解されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態であることができ、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明らかな観点での改変が可能である。したがって、図面および詳細な説明は、天然に例示的とみなされ、限定的ではないと認識されるであろう。
参照による組込み
[0098]本明細書に記載の全ての論文、特許、および特許出願は、各個々の論文、特許、または特許出願が参照により組み込まれると特におよび個々に示されるようにある程度まで参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる論文および特許または特許出願が本明細書に含有される開示と矛盾する範囲で、本明細書は、任意のそのような矛盾する物質にとって代わるおよび／または優先することが意図される。
図面の簡単な説明
[0099]本発明の新規の特徴は添付の特許請求の範囲に特に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面（本明細書では「図」とも記載される）を参照することによって得られるであろう。
[00100]図１Ａは、骨髄性細胞の二重シグナルを生成する例示的な細胞外刺激、受容体および経路の図示である：シグナル１およびシグナル２。 [00101]図１Ｂは、バインダーＡ、ライナーＬおよび第２のバインダーＢを有する単純化したエンゲージャー構築物の図示である。この簡略図では、バインダーＡは標的細胞の細胞表面生体分子に結合し；バインダーＢは骨髄性細胞の細胞表面生体分子に結合する。 [00102]図２Ａは、抗原結合ドメインである、プロテアーゼ切断可能なマスクされた部位を有する二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの図示である。[00103]図２Ｂは、プロテアーゼ切断可能なマスクされた抗原結合ドメインを有する二重特異性ＶＨＨエンゲージャーの図示である。 [00104]図３Ａは、プロテアーゼ切断可能なマスクされた部位、および抗原結合ドメインである２つのｓｃＦｖエンゲージャーを接続するペプチドリンカーを有する例示的な二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの図示であり、この場合、ペプチドリンカーはさらなる治療剤または第３の結合ドメイン、特にＴＬＲ４リガンドペプチドである。 [00105]図３Ｂは、プロテアーゼ切断可能なマスクされた抗原結合ドメイン、および２つのプロテアーゼ切断可能なマスクされた抗原結合ドメインを接続するペプチドリンカーを有する例示的な二重特異性ＶＨＨエンゲージャーの図示であり、この場合、ペプチドリンカーはさらなる治療剤または第３の結合ドメイン、特にＴＬＲ４リガンドペプチドである。 [00106]図３Ｃは、プロテアーゼ切断可能なマスクされた部位、および抗原結合ドメインである２つのｓｃＦｖエンゲージャーを接続するペプチドリンカーを有する例示的な二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの図示であり、この場合、ペプチドリンカーはさらなる治療剤または第３の結合ドメイン、特にＭ２標的化ペプチドである。 [00107]図３Ｄは、プロテアーゼ切断可能なマスクされた抗原結合ドメイン、および２つのプロテアーゼ切断可能なマスクされた抗原結合ドメインを接続するペプチドリンカーを有する例示的な二重特異性ＶＨＨエンゲージャーの図示であり、この場合、ペプチドリンカーはさらなる治療剤または第３の結合ドメイン、特にＭ２標的化ペプチドである。 [00108]図３Ｅは、指定したそれぞれのＴＬＲペプチドの存在下で終夜培養した単球によるサイトカイン産生を示すデータを示す図である。 [00109]図３Ｆは、それぞれＣＤ５およびＣＤ１６に特異的な２つのｓｃＦｖバインダー、およびＴＬＲ４合成ペプチドリンカー（ＲＳ０１）を有する二重特異性バインダー構築物ＣＤ５－ＲＳ０１－ＣＤ１６のタンパク質構造の図示である。 [00110]図３Ｇは、図３Ｆで示したＣＤ５－ＲＳ０１－ＣＤ１６の発現データを示す図である。レーンＭ１およびＭ２、それぞれＴａｋａｒａ、カタログ番号３４５２およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００５２１の市販のタンパク質分子量マーカー。レーン１およびレーン２は、それぞれ還元および非還元条件下での、示したようにＳＤＳ ＰＡＧＥ結果またはウェスタンブロット結果である。レーンＰ、陽性対照（Ｍｕｌｔｉｐｌｅタグ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ０１０１）。ウェスタンブロットで使用した一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００１８６）。 [00111]図３Ｈは、それぞれＣＤ５およびＣＤ１６に特異的な２つのｓｃＦｖバインダー、およびＴＬＲ４合成ペプチドリンカー（ＲＳ０９）を有する二重特異性バインダー構築物ＣＤ５－ＲＳ０９－ＣＤ１６のタンパク質構造の図示である。 [00112]図３Ｉは、図３Ｈで示したＣＤ５－ＲＳ０９－ＣＤ１６の発現データを示す図である。レーンの注釈およびインデックスは、図３Ｇの説明に示した通りである。 [00113]図４Ａは、例示的な三重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの図示である。 [00114]図４Ｂは、例示的な三重特異性ＶＨＨエンゲージャーの図示である。 [00115]図４Ｃは、三重特異性エンゲージャーの作用の例示的な様式の図示である。 [00116]図５Ａｉは、組換え二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの構造形状の図示であり、それぞれの結合ドメインは薬剤（マスク）によってマスクされ、その同族の基質との結合ドメインの相互作用を防止する。マスクは、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２）基質の例では、切断可能なリンカーによって各軽鎖の末端部分と接着される。矢印は、組換え二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの構造の構成要素を指し、以下の通りである：１、マスク；２、ＭＭＰ２基質リンカー；３、ＡＢＤ１（抗原結合ドメイン１）－軽鎖；３’、ＡＢＤ２（抗原結合ドメイン２）－軽鎖；４、結合ドメイン軽鎖と結合ドメイン重鎖を接続するリンカー；５、ＡＢＤ１（抗原結合ドメイン１）重鎖；５’、ＡＢＤ２（抗原結合ドメイン２）重鎖。 [00117]図５Ａｉｉは、組換え二重特異性ディアボディエンゲージャーの構造形状の図示であり、それぞれの結合ドメインは薬剤（マスク）によってマスクされ、その同族の基質との結合ドメインの相互作用を防止する。マスクは、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２）基質の例では、切断可能なリンカーによって各軽鎖の末端部分と接着される。矢印は、組換え二重特異性ディアボディエンゲージャーの構造の構成要素を指し、以下の通りである：１、マスク；２、ＭＭＰ２基質リンカー；３、ＡＢＤ１（抗原結合ドメイン１）－軽鎖；３’、ＡＢＤ２（抗原結合ドメイン２）－軽鎖；４、ＡＢＤ１軽鎖とＡＢＤ１重鎖を接続するリンカー；４’、ＡＢＤ２軽鎖とＡＢＤ２重鎖を接続するリンカー；５、ＡＢＤ２重鎖；５’、ＡＢＤ１重鎖。 [00118]図５Ｂは、二重特異性ｓｃＦｖの一本鎖の線状構築物の図示である。図５Ａｉまたは図５Ａｉｉに相当する部分は、Ｎ末端からＣ末端まで線状化したダイアグラムに示す。 [00119]図６は、二重特異性および三重特異性エンゲージャーとして利用される２つまたは３つの結合ドメインを含む例示的なモジュール構築物を示す図である。 [00120]図７Ａの上のパネルは、ＴＬＲ活性化をもたらすＴＬＲ４受容体のＭＤ２媒介性二量体化の図示である。図７Ａの下のパネルは、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの例示的な設計であり、１つの結合ドメインは腫瘍細胞関連分子（腫瘍抗原）に結合することができ、別の結合ドメインは単球またはマクロファージ受容体に結合することができ、この場合ＦｃＲである。第３のドメインはＭＤ２ドメインであり、ＴＬＲ４受容体に結合して二量体化し、それらを活性化することができる。 [00121]図７Ｂは、図７Ａの単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの作用の様式を示す図である。 [00122]図８Ａは、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの例示的な設計であり、１つの結合ドメインは腫瘍細胞関連分子（腫瘍抗原）に結合することができ、第２の結合ドメインは単球またはマクロファージ受容体に結合することができ、この場合ＦｃＲである。第３のドメインはＬＩＧＨＴドメインであり、単球またはマクロファージＨＶＥＭと結合し、単球またはマクロファージでの炎症性シグナルを活性化することができる。 [00123]図８Ｂは、図８Ａの単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの作用の様式を示す図である。 [00124]図９Ａは、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの例示的な設計であり、１つの結合ドメインは腫瘍細胞関連分子（腫瘍抗原）に結合することができ、第２の結合ドメインは単球またはマクロファージ受容体に結合することができ、この場合ＦｃＲである。第３のドメインはＧＩＲＴリガンド（ＧＩＲＴＬ）ドメインまたは代わりに単球またはマクロファージ受容体ＧＩＴＲを活性化することができ、単球またはマクロファージでの炎症性シグナルを誘導することができる抗ＧＩＴＲ抗体の抗原結合ドメインである。 [00125]図９Ｂは、図９Ａの単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの作用の様式を示す図である。 [00126]図１０Ａは、ロイシンジッパードメインを有するペプチドを含む例示的なヘテロ二量体の抗体ベースのエンゲージャー分子設計を示す図である。Ｌ１、Ｌ２はリガンドを示す。 [00127]図１０Ｂは、ロイシンジッパードメインを有するペプチドを含む例示的なヘテロ二量体の抗体ベースのエンゲージャー分子設計を示す図である。Ｌ１～Ｌ４はリガンドを示す。 [00128]図１０Ｃは、合成の繋留設計を有するペプチドを含む例示的なヘテロ二量体抗体ベースのエンゲージャー分子設計を示す図である。Ｌ１、Ｌ２はリガンドを示し、「ｍ」および「ｎ」は合成結合設計を示す。
[00129]全ての用語は、当業者によって理解されるであろう通りに理解されることを意図する。他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
[00130]本明細書で使用する節の見出しは構成目的のみのためであり、記載した主題を制限すると解釈されない。
[00131]本開示の様々な特徴が単一の実施形態の文脈で記載され得るが、該特徴は別々にまたは任意の好適な組合せでも提供され得る。反対に、明確にするために、本開示は別々の実施形態の文脈で本明細書に記載され得るが、本開示は単一の実施形態でも実行され得る。
[00132]本明細書および請求項（複数可）で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）のいずれかの形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）のいずれかの形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）のいずれかの形態）または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）のいずれかの形態）は、包括的または開放的であり、さらなる、列挙していないエレメントまたは方法ステップを除外しない。本明細書で議論する任意の実施形態が、本開示の任意の方法または組成物に関して実行され得ると考えられ、逆の場合も同じである。さらに、本開示の組成物は本開示の方法を達成するために使用され得る。
[00133]本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、例えばパラメーター、量、一時的な期間等の測定可能な値に言及する場合、そのようなバリエーションが本開示の実施に適切である限りは、特定の値のおよび特定の値からの＋／－２０％またはそれ以下、＋／－１０％またはそれ以下、＋／－５％またはそれ以下、または＋／－１％またはそれ以下のバリエーションを包含することを意味する。修飾語句「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」を付ける値が、それ自体も特に開示されることが理解される。
[00134]「薬剤（ａｇｅｎｔ）」は、任意の型の分子を含むことができ、限定はされないが、抗体、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、小分子、それらの誘導体およびそれらの類似体を含む。
[00135]「生体試料」は、任意の組織、細胞、体液、または他の生物由来の物質である。本明細書で使用される場合、用語「試料」は、任意の組織、細胞、体液、または他の生物由来の物質などの生体試料を含む。
[00136]「特異的に結合する」は、化合物（例えばペプチド）が分子（例えばペプチドまたはポリペプチド）を認識および結合するが、試料、例えば生体試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない、つまり化合物が分子への選択的な結合を示す状態を指す。本明細書に記載の「バインダー」は、限定はされないが、同族の分子に特異的な結合を示すタンパク質、ポリペプチドまたはその断片を含む。バインダーは、抗原結合ドメイン、例えば二重特異性もしくは三重特異性エンゲージャーの第１の結合ドメイン、または二重特異性もしくは三重特異性エンゲージャーの第２の抗原結合ドメインなどを指し得る。いくつかの場合では、バインダーは、任意の生体分子またはその断片、例えば細胞の受容体に特異的に結合することができ、したがって、例示的なエンゲージャーの一部分の特異的結合を示すペプチドまたはコンジュゲートペプチドまたはリガンドであってもよい。
[00137]用語「免疫応答」は、Ｔ細胞共刺激の調節によって影響される、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えばサイトカイン産生、および細胞傷害活性を含む。さらに、用語免疫応答は、Ｔ細胞活性化、例えば抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば単球またはマクロファージの活性化によって間接的に影響される免疫応答を含む。
[00138]天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それらが相当する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有する限り、限定はされないが、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含む。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントとそれらの共有結合修飾の両方を包含する。
[00139]用語「食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」および「食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）」は、本明細書で交換可能に使用され、食作用が可能な細胞を指す。食細胞の３つの主な分類がある：マクロファージ、単核細胞（組織球および単球）；多形核白血球（好中球）および樹状細胞。
[00140]用語「生体試料」は、生物から得られ、診断またはモニタリングアッセイで使用され得る様々な試料型を包含する。用語は、血液および生物起源の他の液体試料、固形組織試料、例えば生検組織または組織培養またはそれに由来する細胞ならびにそれらの子孫を包含する。用語は、試薬での処置、可溶化、または特定の構成要素の濃縮など、それらの獲得後にいずれかの方法で操作された試料を包含する。用語は、臨床試料を包含し、細胞培養の細胞、細胞培養上済、細胞ライセート、血清、血漿、生物体液、および組織試料も含む。
[00141]本明細書で使用される場合、用語「抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」または「抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）」またはその略語「ＡＰＣ」または「ＡＰＣｓ」は、抗原のエンドサイトーシス吸着、プロセシングおよび提示が可能な１つまたは複数の細胞を指す。用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば：Ｂリンパ球、単球、樹状細胞（ＤＣ）およびランゲルハンス細胞、ならびに他の抗原提示細胞、例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイトを含む。用語「抗原提示」は、細胞表面でＭＨＣ分子に結合するペプチド断片として抗原を呈することを意味する。多くの異なる種類の細胞が、例えば単球またはマクロファージ、Ｂ細胞、濾胞性樹状細胞および樹状細胞を含むＡＰＣとして機能し得る。ＡＰＣは、外因性抗原をプロセスし、クラスＩ ＭＨＣ分子上にプロセスされた抗原を提示することによりペプチド抗原を交差提示することもできる。クラスＩ ＭＨＣ分子と会合して認識されるタンパク質を生じる抗原は、一般に細胞内で産生されるタンパク質であり、これらの抗原はプロセスされ、クラスＩ ＭＨＣ分子と会合する。
[00142]「エピトープ」は、抗体またはＴＣＲの可変領域結合ポケットと結合相互作用を形成することが可能な抗原または他の巨大分子の部分を指す。用語は、本明細書で定義されるように、抗体、抗体ペプチド、および／または抗体様分子（限定はされないが、Ｔ細胞受容体を含む）に特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、典型的には、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に特異的な三次元構造特徴ならびに特異的な荷電特徴を有する。
[00143]いくつかの実施形態では、食作用受容体融合タンパク質（ＰＦＰ）は、食作用受容体に融合した、標的細胞の抗原に特異的な細胞外抗原結合ドメインを含む。標的細胞は、例えば、がん細胞である。いくつかの実施形態では、食細胞は、がん細胞の貪食後、その細胞表面にがん抗原を提示し、Ｔ細胞を活性化することができる。
[00144]本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、免疫応答を刺激することが可能な任意の有機または無機分子である。用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、免疫応答を刺激することが可能なペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸分子、炭水化物分子、有機または無機分子などの任意の分子に及ぶ。
[00145]いくつかの実施形態では、食作用受容体融合タンパク質は、がん抗原またはがん細胞の細胞表面分子に結合することができる、抗体ドメインまたはその抗原結合部分を含む、細胞外ドメインを含み得る。用語「抗体」または「抗体部分」は、限定はされないが、エピトープを認識するポリペプチド鎖を含有する分子構造である。本発明で利用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、細胞培養または組換えにより再生産されてもよく、改変してそれらの抗原性を減らすことができるためモノクローナル抗体が好ましい。用語は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＹを含み、一本鎖全長抗体、およびこれらの抗原結合（Ｆａｂ）断片を含む、全長抗体を含むことを意味する。抗原結合抗体断片は、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ（ＶＨおよびＣＨ１からなる）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合した可変断片（ｄｓＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片を含む。抗体は任意の動物起源由来であり得る。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、単独または以下のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは一部と組み合わせた可変領域（複数可）を含み得る。また、可変領域（複数可）と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの任意の組合せも含まれる。抗体は、例えばＨＬＡ－会合ポリペプチドまたはＨＬＡペプチド複合体を特異的に結合するモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、およびヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であり得る。当業者は、様々な免疫親和性技術が、例えば膜からタンパク質分解性に切断された可溶性ＨＬＡペプチド複合体または膜結合ＨＬＡ－会合ポリペプチドなどの可溶性タンパク質を濃縮するのに好適であることを認識するであろう。これらは、（１）可溶性タンパク質に特異的に結合することが可能な１つまたは複数の抗体が、固定された、または可動性の基質（例えばプラスチックウェルまたは樹脂、ラテックスまたは常磁性ビーズ）に固定される、および（２）生体試料由来の可溶性タンパク質を含有する溶液が抗体コートした基質上を通過し、可溶性タンパク質が抗体に結合することを可能にする技術を含む。抗体および結合した可溶性タンパク質を有する基質は、溶液から分離され、場合により、例えば抗体を浸す溶液のｐＨおよび／またはイオン強度および／またはイオン組成を変更することにより、抗体および可溶性タンパク質は解離される。あるいは、抗体および可溶性タンパク質が結合され、巨大分子凝集物を形成することを可能にする免疫沈降技術が使用され得る。巨大分子凝集物は、サイズ排除技術により、または遠心分離により溶液から分離され得る。
[00146]適応免疫系は、侵入する生物の抗原と呼ばれる分子構造に反応する。自然免疫系とは異なり、適応免疫系は病原体に非常に特異的である。適応免疫は、長期持続性の保護も提供することができる：例えば、はしかから回復したヒトは生涯はしかに対して保護される。２つの型の適応免疫反応があり、体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応を含む。体液性免疫反応では、Ｂ細胞によって体液中へと分泌された抗体は、病原体由来の抗原に結合し、様々なメカニズム、例えば補体媒介性溶解を通して病原体の除去をもたらす。細胞媒介性免疫反応では、他の細胞を破壊することが可能なＴ細胞が活性化される。例えば、疾患と関連するタンパク質が細胞に存在する場合、それらは細胞内でペプチドへとタンパク質分解により断片化される。特定の細胞タンパク質は、次いで、それら自身を抗原またはこの方法で形成されたペプチドに接着させ、それらを細胞の表面に輸送し、身体のＴ細胞において分子防御メカニズムに提示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、これらの抗原を認識し、その抗原を持つ細胞を死滅させる。
[00147]用語「主要組織適合抗原（ＭＨＣ）」、「ＭＨＣ分子」、または「ＭＨＣタンパク質」は、食細胞または抗原提示細胞内でのタンパク質抗原のタンパク質分解性切断から生じ、Ｔリンパ球に提示し、Ｔリンパ球を活性化するための抗原ペプチドを結合することが可能なタンパク質を指す。そのような抗原ペプチドは、Ｔ細胞エピトープを示す。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ複合体とも呼ばれる。したがって、用語「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系」、「ＨＬＡ分子」または「ＨＬＡタンパク質」は、ヒトにおいてＭＨＣタンパク質をコードする遺伝子複合体を指す。用語「ＭＨＣ」は、マウス種では「Ｈ－２」複合体と呼ばれる。当業者は、用語「主要組織適合抗原（ＭＨＣ）」、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」および「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系」、「ＨＬＡ分子」、「ＨＬＡタンパク質」が本明細書で交換可能に使用されることを認識するであろう。
[00148]ＨＬＡタンパク質は、典型的には、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩと呼ばれる２つの型に分類される。２つのＨＬＡクラスのタンパク質の構造は非常に類似しているが、それらは異なる機能を有し得る。クラスＩ ＨＬＡタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、身体のほぼ全ての細胞の表面に提示される。クラスＩ ＨＬＡタンパク質は、通常内在性タンパク質または細胞内に存在する病原体から生じる抗原を搭載され、次いで、ナイーブまたは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。ＨＬＡ クラスＩＩタンパク質は、限定はされないが、樹状細胞、Ｂ細胞、および単球またはマクロファージを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示される。それらは主に、例えば細胞の外側など、外部の抗原供給源からプロセスされるペプチドをヘルパーＴ細胞に提示する。ＨＬＡクラスＩタンパク質によって結合されるほとんどのペプチドは、生物自体の健康な宿主細胞で産生された細胞質タンパク質から生じ、通常免疫反応を刺激しない。
[00149]ＨＬＡクラスＩＩ系では、単球またはマクロファージおよび未成熟樹状細胞などの食細胞は、食作用によりファゴソームへと物質を取り込み－Ｂ細胞はより一般的にはエンドソームへのエンドサイトーシスを示すが－リソソームと融合し、その酸性酵素は取り込んだタンパク質を多くの異なるペプチドへと切断する。オートファジー（Ａｕｔｈｏｐｈａｇｙ）は、ＨＬＡクラスＩＩペプチドの供給源である。宿主が保持し、宿主のゲノムにコードされるＨＬＡクラスＩＩバリアントとの分子相互作用における物理化学的な動力学を介して、特定のペプチドが免疫優性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ分子上に搭載される。これらは、細胞表面に輸送され、外面化される。最も研究されたサブクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子は：ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１である。
[00150]ＨＬＡクラスＩＩ分子によるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞へのペプチドの提示は、外来抗原に対する免疫応答に必要とされる。一度活性化されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞分化および抗体産生、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を促進する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、他の免疫細胞の分化を活性化および誘導するサイトカインおよびケモカインも分泌する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、相互作用してクラスＩペプチド結合溝より開いたペプチド結合溝を形成する、αおよびβ鎖のヘテロ二量体である。ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、溝からオーバーハングしているＮまたはＣ末端側のいずれかに隣接する残基と９アミノ酸結合コアを有すると考えられる。これらのペプチドは、通常１２～１６アミノ酸長であり、結合レジスターの位置Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６／７およびＰ９に３～４個の繋留残基を含有することが多い（Ｒｏｓｓｊｏｈｎら、２０１５）。
[00151]ＨＬＡ対立遺伝子は、共優性様式で発現され、両親から受け継いだ対立遺伝子（バリアント）が等しく発現されることを意味する。例えば、各人は３個のクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ）のそれぞれの２つの対立遺伝子を持ち、クラスＩＩ ＨＬＡの６つの異なる型を発現することができる。クラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子座では、各人は、一対のＨＬＡ－ＤＰ遺伝子（αおよびβ鎖をコードするＤＰＡ１およびＤＰＢ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（αおよびβ鎖のＤＱＡ１およびＤＱＢ１）、一遺伝子ＨＬＡ－ＤＲα（ＤＲＡ１）、および１つまたは複数の遺伝子ＨＬＡ－ＤＲβ（ＤＲＢ１およびＤＲＢ３、－４または－５）を受け継ぐ。例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１はほぼ４００個より多くの公知の対立遺伝子を有する。それは、一人のヘテロ接合性の個体が、６または８個の機能するクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子：各親から３個またはそれ以上を受け継ぐことができることを意味する。したがって、ＨＬＡ遺伝子は高度に多型であり；多くの異なる対立遺伝子が集団内の異なる個体に存在する。ＨＬＡタンパク質をコードする遺伝子は、多くの可能なバリエーションを有し、各人の免疫系を広範な外来侵入者に対して反応させる。いくつかのＨＬＡ遺伝子は、数百の同定されたバージョン（対立遺伝子）を有し、その各々は特定の番号が与えられる。いくつかの実施形態では、クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１（非古典的）である。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０１：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊１１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊１５：０１、およびＨＬＡ－ＤＲＢ＊０７：０１である。
[00152]いくつかの実施形態では、食細胞が患者または対象に投与される。ヒト対象に投与される細胞は、対象に免疫適合性でなければならず、対象において天然に発現される適合するＨＬＡ亜型を有する。対象特異的なＨＬＡ対立遺伝子または対象のＨＬＡ遺伝子型は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定され得る。例示的な実施形態では、方法は、多型遺伝子の対立遺伝子バリアントを含む遺伝子参照セットに設定したシークエンシングデータから抽出したリードのアライメントを生成するステップ、アライメントの各対立遺伝子バリアントの第１の事後確率または事後確率由来のスコアを決定するステップ、第１の対立遺伝子バリアントとして最大の第１の事後確率または事後確率由来のスコアを有する対立遺伝子バリアントを同定するステップ、第１の対立遺伝子バリアントおよび１つまたは複数の他の対立遺伝子バリアントとアラインした１つまたは複数のオーバーラップするリードを同定するステップ、重み因子を使用する１つまたは複数の他の対立遺伝子バリアントの第２の事後確率または事後確率由来のスコアを決定するステップ、最大の第２の事後確率または事後確率由来のスコアを有する対立遺伝子バリアント、多型遺伝子の遺伝子型を規定する第１および第２の対立遺伝子バリアントを選択するステップにより第２の対立遺伝子バリアントを同定するステップ、ならびに第１および第２の対立遺伝子バリアントのアウトプットを提供するステップを含み得る、多型遺伝子型を決定するステップを含む。本明細書で使用される場合、表現「アミノ酸」は、天然と合成アミノ酸の両方、およびＤとＬアミノ酸の両方を含むことを意図する。合成アミノ酸は、限定はされないが、塩、およびアミドなどのアミノ酸誘導体を含む化学的に改変されたアミノ酸も包含する。本発明のポリペプチド内に存在するアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、またはそれらの生物学的活性に悪影響を及ぼさずに循環の半減期を変更することができる他の化学基との置換により改変され得る。
[00153]用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で交換可能に使用され、アイソスターなどの、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって共有結合された一連の少なくとも２つのアミノ酸を記載する。ペプチドまたはタンパク質を含み得るアミノ酸の最大数に制限は無い。用語「オリゴマー」および「オリゴペプチド」も、本明細書に記載のペプチドを意味することを意図する。さらに、用語ポリペプチドは、ペプチドの断片、類似体および誘導体に及び、前記断片、類似体または誘導体は、断片、誘導体または類似体が由来するペプチドと同じ生物学的機能活性を維持する。
[00154]本明細書で使用される場合、ポリペプチドは、限定はされないが、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞内タンパク質または膜タンパク質を含む「タンパク質」であってもよい。ポリペプチドは、タンパク質の１つまたは複数のサブユニットを含んでもよい。ポリペプチドは、組換え核酸によってコードされてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、単一のアミノ酸鎖に１つより多くのペプチドを含んでもよく、それはスペーサー、リンカーまたはペプチド切断配列によって分けられてもよい。ポリペプチドは、融合ポリペプチドであってもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数のドメインを含んでもよい。ドメインは、規定した機能を有するタンパク質の構造部分であり、ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数のモジュールを含んでもよい。モジュールは、ドメインまたはドメインの部分または特定の機能を有するタンパク質の部分である。モジュールは、タンパク質の構造モジュールであってもよく、その構造の実施形態によって命名される。部分は、特定の構造を有するまたは特定の機能を実施するポリペプチド、タンパク質または核酸の一部である。例えば、シグナル伝達部分は、ポリペプチドまたはタンパク質または組換え核酸のより大きな構造内の特定のユニットであり、それ（または核酸の場合、それによってコードされるタンパク質部分）は、シグナル伝達プロセス、例えばリン酸化に結合する。モジュール、ドメインおよび部分は、本明細書で使用される場合、特定の構造または機能的な方向が文脈において他に規定されない限り、交換可能に使用することができる。モチーフは、生体分子の構造実体である。タンパク質またはポリペプチドにおけるシグナル伝達モチーフは、例えば、リン酸化、脱リン酸化されてもよい、または別のシグナル伝達分子の結合部位として寄与することができるアミノ酸を含有するタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸の鎖を指す。同様に、核酸の場合、例えば、ＴＮＦ ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ脱安定化酵素、例えばジンクフィンガー結合タンパク質３６ファミリーメンバーが結合する３’ＵＴＲに保存されたモチーフＵＵＡＵＵＵＡＵＵを有する。
[00155]用語「ｐｒｏ－抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体、または不活性な抗原結合ドメインを含むタンパク質もしくはポリペプチドを指してもよく；抗原結合能は、例えば、活性ステップが実施され、ｐｒｏ－抗体をその活性型へと変換するまで、切断可能な抗原ドメイン結合ポリペプチドを結合することによってブロックまたは不活性化されるように設計される。いくつかの実施形態では、活性ステップは、抗原結合ドメインをブロックする実体のプロテアーゼ切断を含む。
[00156]本明細書で使用される場合、用語「組換え核酸分子」は、組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子を指す。組換え核酸分子は、異なる起源由来の接合された核酸分子を含有し、天然では互いに結合しない任意の核酸分子である。組換え核酸は、研究室で合成されてもよい。組換え核酸は、制限酵素消化、ライゲーションおよびＤＮＡクローニングなどのＤＮＡの酵素的改変を使用することによる組換えＤＮＡ技術を使用することによって調製され得る。組換え核酸は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ、またはＲＮＡであり得る。組換えＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成してもよく、組換えｍＲＮＡは単離、精製、および使用して細胞をトランスフェクトしてもよい。組換え核酸は、タンパク質またはポリペプチドをコードしてもよい。組換え核酸は、好適な条件下で、生細胞へと組み込むことができ、生細胞内で発現することができる。本明細書で使用される場合、核酸の「発現」は、通常核酸の転写および／または翻訳を指す。核酸発現の産物は、通常タンパク質だが、ｍＲＮＡでもあり得る。組換え核酸が組み込まれた細胞における組換え核酸によってコードされるｍＲＮＡの検出は、核酸が細胞において「発現された」ことの正の証明と考えられる。
[00157]核酸を細胞に挿入するまたは組み込むプロセスは、トランスフォーメーション、トランスフェクションまたはトランスダクションを介し得る。トランスフォーメーションは、細菌細胞による外来核酸の取り込みのプロセスである。このプロセスは、プラスミドＤＮＡの増殖、タンパク質産生、および他の適用に適応される。トランスフォーメーションは、組換えプラスミドＤＮＡを、環境から細胞外ＤＮＡを取り込むコンピテントな細菌細胞へと導入する。いくつかの細菌種は、特定の環境条件下で自然にコンピテントであるが、コンピテンスは研究室設定で人工的に導入される。トランスフェクションは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または抗体などの小分子の真核細胞への強制導入である。寿命を混乱させるため、「トランスフェクション」は、バクテリオファージの細菌細胞への導入も指す。「トランスダクション」は、多くは組換えウイルスベクター粒子の標的細胞への導入を記載するために使用されるが、「感染」は、野生型ウイルスによるヒトまたは動物の自然感染を指す。
[00158]本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、細胞間で核酸を輸送することが可能な、任意の遺伝子構築物、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を意味する。ベクターは、複製、発現、組換え、挿入またはインテグレーションの１つまたは複数が可能であってもよいが、これらの能力のそれぞれを保持する必要は無い。プラスミドは、用語「ベクター」によって包含される属の種である。ベクターは、典型的には、複製起点および宿主細胞における複製および／または維持に必要な他の実体を含有する核酸配列を指す。遺伝子および／またはそれらが作動可能に連結されている核酸配列の発現を指示することが可能なベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、有用な発現ベクターは、環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す「プラスミド」の形態であることが多く、それらのベクター形態では、染色体に結合されず、典型的には安定または一過的発現のための実体またはコードされたＤＮＡを含む。本明細書で開示する方法で使用され得る他の発現ベクターは、限定はされないが、プラスミド、エピソーム、バクテリア人工染色体、イースト人工染色体、バクテリオファージまたはウイルスベクターを含み、そのようなベクターは宿主のゲノムにインテグレートすることができるか、または細胞において自律的に複製することができる。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。等価な機能を与える当業者に公知の発現ベクターの他の形態、例えば、自己複製の染色体外ベクターまたは宿主ゲノムへとインテグレートすることが可能なベクターも使用され得る。例示的なベクターは、自己複製および／またはそれらが連結した核酸の発現が可能なものである。
[00159]融合タンパク質を参照して使用される場合、用語「スペーサー」または「リンカー」は、融合タンパク質を含むタンパク質を結合するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のフォールディング、正味電荷、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響するように選択され得る。本開示の実施形態での使用のための好適なリンカーは当業者に周知であり、限定はされないが、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含む。リンカーを使用して、いくつかの実施形態では、各抗原ペプチドが正しくフォールドするのを保証するのに十分な距離によって２つの抗原ペプチドを分ける。例示的なペプチドリンカー配列は可動性の伸長した構造を採用し、規則的な二次構造を生じるための特性を示さない。可動性タンパク質領域の典型的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含む。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の事実上いずれの並び替えもリンカー配列の上記の基準を満たすと考えられるであろう。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の近い天然アミノ酸も、リンカー配列に使用され得る。
[00160]いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、本明細書に記載したものなどの１つより多くの機能的特性を有する。例えば、ペプチドリンカーは、結合ドメインなどの２つまたはそれ以上の機能的ドメインを連結する。さらに、ペプチドリンカーは、リンカーが受容体またはリガンド結合タンパク質などの細胞の細胞外部分に接触する場合、特定のシグナル誘導因子であってもよい。
[00161]用語「免疫精製（ＩＰ）」（または免疫親和性精製もしくは免疫沈降）は、当業者に周知のプロセスであり、試料からの所望の抗原の単離に広く使用される。一般に、プロセスは、抗体を含む親和性マトリックスを有する所望の抗原を含有する試料を、固相に共有結合された抗原と接触させるステップを含む。試料中の抗原は、免疫化学結合を通して親和性マトリックスに結合するようになる。次いで、親和性マトリックスルは洗浄され、いずれの未結合の種も除去する。抗原は、親和性マトリックスと接触する溶液の化学組成を変更することにより親和性マトリックスから除去される。免疫精製は、親和性マトリックスを含有するカラムで実行することができ、その場合溶液は溶離液である。あるいは、免疫精製はバッチプロセスであることができ、その場合親和性マトリックスは溶液中の懸濁液として維持される。プロセスの重要なステップは、マトリックスからの抗原の除去である。これは、一般に、例えば無機塩の添加により、親和性マトリックスと接触する溶液のイオン強度を増加することによって達成される。ｐＨの変更は、抗原と親和性マトリックスの間の免疫化学結合の解離にも有効であり得る。
[00162]本明細書で使用される場合、用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｅｉｎｇ）」、「検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」およびこれらの文法的等価物は、質的と量的な決定の両方を指し、用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」は、「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｅｉｎｇ）」等と本明細書で交換可能に使用される。量的な決定が意図される場合、分析物等の語句「量を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎ ａｍｏｕｎｔ）」が使用される。質的および／または量的な決定が意図される場合、分析物の語句「レベルを決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａ ｌｅｖｅｌ）」または分析物を「検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」が使用される。
[00163]「断片」は、参照タンパク質または核酸と実質的に同一である、タンパク質または核酸の部分である。いくつかの実施形態では、部分は、本明細書に記載の参照タンパク質または核酸の生物学的活性の少なくとも５０％、７５％、または８０％、または９０％、９５％、または９９％さえも保持する。
[00164]用語「単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、「生物学的に純粋な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」およびそれらの文法的な等価物は、通常その天然の状態で見出されるように伴う構成要素から程度を自由に変えることができる物質を指す。「単離する（ｉｓｏｌａｔｅ）」は、もともとの起源または周辺物質からの分離の程度を示す。「精製する（ｐｕｒｉｆｙ）」は、単離より高い分離の程度を示す。「精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」または「生物学的に純粋な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」タンパク質は、いずれの不純物もタンパク質の生物学的特性に大きく影響しないかまたは他の有害な結果を引き起こさないように、他の物質を十分に含まない。つまり、本開示の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合には、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地を、または化学合成される場合には、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない場合精製される。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルで基本的に１本のバンドを生じることを示すことができる。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質については、異なる改変は、別々に精製され得る異なる単離タンパク質を生じることができる。
[00165]用語「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」および「がん（ｃａｎｃｅｒ）」は、不適切な高レベルの細胞分裂、不適切な低レベルのアポトーシス、または両方によって引き起こされるまたはそれらを生じる任意の疾患を指す。神経膠芽腫は、新生物またはがんの１つの非限定的な例である。用語「がん（ｃａｎｃｅｒ）」または「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」または「過剰増殖性障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、非制御増殖、不死性、転移能、迅速増殖および増殖速度、ならびに特定の特徴の形態学的特性などの、がんを引き起こす細胞の典型的な特徴を持つ細胞の存在を指す。がん細胞は、腫瘍の形態であることが多いが、そのような細胞は動物内で単独で存在することができ、または白血病細胞などの非腫瘍原生のがん細胞であり得る。
[00166]用語「ワクチン」は、疾患（例えば、新生物／腫瘍／感染因子／自己免疫疾患）の予防および／または処置のための免疫を生じさせるための組成物を意味すると理解される。したがって、本明細書で使用される場合、ワクチンは、組換え核酸、または組換え核酸を含むおよび発現する細胞を含む医薬であり、ワクチン接種により特定の防御および保護物質を生成するためにヒトまたは動物で使用されることを意図する。「ワクチン組成物」は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含み得る。本開示の態様は、食細胞ベースのワクチンの調製での技術の使用に関する。
[00167]用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって認可されるまたは認可可能であること、または米国薬局方もしくはヒトを含む動物での使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されることを指す。「薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤」は、薬剤と一緒に対象に投与することができ、それらの薬理活性を壊さず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である賦形剤、担体または希釈剤を指す。本明細書に列挙したプールした疾患特異的抗原の「薬学的に許容される塩」は、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を起こさずヒトまたは動物の組織と接して使用するのに好適であると一般に当技術分野で考えられる酸または塩基塩であり得る。そのような塩は、ミネラルおよびアミンなどの塩基性残基の有機酸塩、ならびにアルカリまたはカルボン酸などの酸性残基の有機塩を含む。特定の薬学的な塩は、限定はされないが、酸の塩、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸などのアルカン酸、ｎが０～４であるＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ等を含む。同様に、薬学的に許容される陽イオンは、限定はされないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウムおよびアンモニウムを含む。当業者は、本開示および当技術分野の知識から、本明細書で提供するプールした疾患特異的抗原のさらなる薬学的に許容される塩が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）に列挙されるものを含むことを認識するであろう。
[00168]本開示の方法で有用な核酸分子は、本開示のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内在性配列と実質的な同一性を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一本鎖とハイブリダイズすることが可能である。「ハイブリダイズ」は、核酸分子対がストリンジェンシーの様々な条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列、またはその部分間で二本鎖分子を形成することを指す。例えば、ストリンジェント塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウムより低い、約５００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウムより低い、または約２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウムより低くてもよい。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの不在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、または少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェント温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、少なくとも約３７℃、または少なくとも約４２℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの包括または排除などの様々なさらなるパラメーターが当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることにより達成される。例示的な実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳ中、３０℃で生じ得る。別の例示的な実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で生じ得る。別の例示的な実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中、４２℃で生じ得る。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかであろう。ほとんどの適用のため、ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップもストリンジェンシーにおいて変わり得る。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少または温度の上昇により増加され得る。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェント塩濃度は、約３０ｍＭ ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウムより低い、または約１５ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムより低くてもよい。洗浄ステップのためのストリンジェント温度条件は、少なくとも約２５℃、少なくとも約４２℃、または少なくとも約６８℃の温度を含み得る。例示的な実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、２５℃で生じ得る。他の例示的な実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、４２℃で生じ得る。別の例示的な実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、６８℃で生じ得る。これらの条件のさらなるバリエーションは、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者には周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載される。
[00169]「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を指す。そのような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸で、比較のために使用する配列と少なくとも６０％、８０％または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上さえも同一であり得る。配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えばＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ ｐｒｏｇｒａｍｓ）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の改変に相同性の程度を割り当てることによって同一または類似の配列を適合する。保存的置換は、典型的には以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的な手法では、近縁の配列を示すｅ－３とｅ－ｍ°の間の確率スコアにより、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得る。「参照」は、比較の基準である。
[00170]用語「対象」または「患者」は、処置、観察、または実験の対象である動物を指す。例としてのみ、対象は、限定はされないが、ヒトまたは非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどの非ヒト哺乳動物を含む、限定はされないが哺乳動物を含む。
[00171]用語「処置（治療）する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（治療）した（ｔｒｅａｔｅｄ）」、「処置（治療）すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（治療）（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、関連する障害および／または症状（例えば、新生物または腫瘍または感染因子または自己免疫疾患）を減らす、防止する、または改善することを指すことを意味する。「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患（例えば、がんまたは感染因子による感染または自己免疫疾患）の発症、または発症の疑い後の、対象への治療の投与を指すことができる。「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、「緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」の概念を含み、疾患と関連する任意の症状または他の弊害および／または治療と関連する副反応の発生もしくは再発の頻度または重症度を減らすことを指す。用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、「管理する（ｍａｎａｇｉｎｇ）」の概念も包含し、患者の疾患または障害の重症度を減らすこと、例えば寿命を延ばすこと、または疾患を有する患者の生存率を延長すること、またはその再発を遅らせること、例えば疾患を患っている患者の緩解期間を延ばすことを指す。除外されないが、障害または状態を処置することは、関連する障害、状態、または症状が完全に除去されることを必要としないはずである。
[00172]本明細書で使用される場合、用語「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」およびそれらの文法的な等価物は、薬剤または化合物の投与の開始時に、そのような症状を発生していない対象において、疾患または状態と関連する症状の発症を避けるまたは遅らせることを意味する。
[00173]用語「治療効果」は、障害（例えば、新生物、腫瘍、または感染因子による感染または自己免疫疾患）の１つまたは複数の症状またはその関連病理のある程度の軽減を指す。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、細胞または対象に単一または複数用量を投与すると、そのような処置がない場合に予測されるのを超えて、そのような障害を有する患者の生存可能性を延長すること、障害の１つまたは複数の兆候もしくは症状を減らすこと、防止または遅延することなどにおいて有効である薬剤の量を指す。「治療有効量」は、治療効果を達成するのに必要な量を定量することを意図する。当技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の「治療有効量」（例えばＥＤ５０）を容易に決定および処方することができる。
[00174]本明細書で使用される場合、用語「親和性分子」は、親和性アクセプターペプチドに化学的特異性で結合する分子またはリガンドを指す。化学的特異性は、特定のリガンドに結合するタンパク質の結合部位の能力である。タンパク質が結合できるリガンドが少ないほどその特異性は高い。特異性は、所与のタンパク質とリガンド間の結合の強度を記載する。この関係は、タンパク質－リガンド系の結合状態と非結合状態の間のバランスを特徴付ける、解離定数（ＫＤ）での、細胞表面構成要素に特異的な第１のｓｃＦｖによって記載され得る。
[00175]「いくつかの実施形態（ｓｏｍｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」、「一実施形態（ａ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「他の実施形態（ｏｔｈｅｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」への本明細書での言及は、実施形態と関連して記載される特性、構造、または特徴が、本開示の全ての実施形態である必要は無いが、少なくともいくつかの実施形態に含まれることを意味する。
[00176]用語「骨髄性細胞」は、血液、骨髄、身体の他の造血または他の非造血区画に見出される正常または新生細胞を指す。特に、本明細書で使用される用語「骨髄性細胞」は、多形核好中球、好酸球、好塩基球、および脂肪細胞を含む骨髄から生じる細胞系列、ならびに単球／マクロファージ系列および異なる樹状細胞系列を意味する。骨髄性細胞は、リンパ球細胞（例えば、ＮＫ－、Ｂ－およびＴ－リンパ球）へと分化することができない。用語は、それらの分化の全ての段階での骨髄性系列の細胞を指し、したがって造血芽細胞、すなわち骨髄性細胞系列に拘束されるが、分化の初期段階である造血細胞を含む。適切な増殖因子によって刺激された場合、造血芽細胞は分化し、分化の芽球段階よりもより分化される多くの細胞を産生する。例はとりわけ骨髄芽球である。本明細書を通して単球またはマクロファージが例示されるが、本明細書に記載の組成物および方法は、樹状細胞などの骨髄性細胞系列の細胞に適用可能である。小さな最適化および変化が、当業者に公知のように細胞から細胞成分に想定され、本発明の範囲内で考えられる。
[00177]芽球よりもより分化されるが完全には分化されない細胞は、接頭辞「前（ｐｒｏ）」を付けられ、「骨髄性細胞」の定義下にあるとも意図される。例は前骨髄性細胞（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｅｓ）である。
[00178]用語「骨髄性細胞」は、骨髄系前駆細胞、つまり、例えば骨髄において、骨髄単球性前駆細胞、前赤芽球または未成熟巨核芽球などの細胞に分化することが可能な細胞系列も含む。骨髄系前駆細胞は、リンパ球細胞を生じることができない。
[00179]用語「骨髄性細胞」は、リンパ球－造血幹細胞を含まない。リンパ球－造血幹細胞は、自己再生と２つの主な前駆体成分、骨髄性細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ）およびリンパ球株への分化の両方が可能な細胞として定義される。そのような幹細胞は、全能性と呼ばれる。全般的ではないが、いくつかの株へと分化することができる幹細胞は、多能性と呼ばれる。
[00180]用語「単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー」は、単球またはマクロファージ細胞だけでなく、全ての骨髄性細胞に適応し、したがって単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは「骨髄性細胞特異的エンゲージャー」と類似している。
[00181]食細胞は、免疫系の自然センチネルであり、身体の防御の第一線を形成する。それらは、病原体、病原体感染細胞、異物または癌細胞を貪食し、それを身体から除去する。ほとんどの潜在的な病原体は、それらが例えば、重大な感染症を引き起こし得る前に、この系によって迅速に中和される。これは、膜ラフリングおよび食作用の結果として、クラスリン被覆ピット系、ピノサイトーシス、特にマクロピノサイトーシスを介する受容体媒介性取り込みを含み得る。したがって、食細胞は、様々な非自己（および自己）エレメントによって活性化され、それらの「標的」の認識の可塑性のレベルを示すことができる。ほとんどの食細胞は、パターン認識分子であり、広範囲の外来粒子、ならびに死細胞、デブリおよび身体内の望まない粒子に結合することができるその表面のスカベンジャー受容体を発現する。
[00182]骨髄性細胞、例えば単球およびマクロファージは、感染、炎症の部位または腫瘍において最も豊富な細胞型の１つでもある。したがって、単球またはマクロファージは、魅力的な細胞治療ビヒクルであり得る。本明細書では、単球またはマクロファージまたは食細胞を改変し、腫瘍または感染細胞などの疾患細胞の食作用性殺作用を増強するメカニズムを提供する。
[00183]単球／マクロファージは、本開示に詳細に記載されるが、組成物および方法は、任意の食細胞型での使用に適用可能であり、または限定はされないが、適用可能である場合、当業者に公知のようにわずかに最適化した好中球および樹状細胞を含む骨髄性細胞型に対して適用可能であり得る。同様に、がんは本開示の骨髄性細胞治療の適応症として詳細に記載されるが、組成物および方法は、当業者によって必要と認められるわずかな改変により、感染症および自己免疫状態に適用可能にすることができる。
[00184]細胞膜エンベロープ内の粒子（＞０．５□ｍ）の細胞取り込みとして定義される食作用は、液相マクロピノサイトーシスおよび受容体経路による可溶性リガンドのエンドサイトーシスと密に関係し、また部分的に重複する。エフェロサイトーシスとしても公知の、アポトーシス細胞の取り込みと関連するバリアント、およびネクローシス細胞のものは、感染および炎症から生じる（ネクロトーシスおよびピロトーシス）。外因性粒子の取り込み（ヘテロファジー）は、オートファジーと共通する特徴、損傷した細胞内小器官の分離およびリソソーム廃棄の内在性プロセスを有する。粒子サイズ、受容体－リガンド相互作用の多様性、および細胞骨格の関与により、取り込みメカニズムは変わる。一度内部移行すると、食胞は一次リソソームまたは小胞体（ＥＲ）およびゴルジ複合体の産物と選択的に融合し、二次ファゴリソソームを形成することができる。この経路は動的であり、細胞内小胞および分泌小胞、マクロファージ、ＤＣ、破骨細胞および好酸球との融合および分裂を受ける。抗微生物食作用は、疾患を引き起こす微生物を排除および分解し、サイトカインおよびケモカイン分泌を通して炎症促進性シグナル伝達を誘導し、免疫細胞を動員して有効な炎症応答を開始する。この型の食作用は、「炎症性食作用」（または「免疫原性食作用」）と呼ばれることが多い。しかしながら、特定の持続性感染などのいくつかの場合では、抗炎症応答は微生物取り込みに続き得る。抗微生物食作用は、一般に、未成熟樹状細胞（ＤＣ）および単球またはマクロファージなどの骨髄性系統のプロフェッショナル食細胞、ならびに組織常在性免疫細胞によって実施される。損傷した、自己由来のアポトーシス細胞または細胞デブリの食作用（例えば、エフェロサイトーシス）は、反対に、典型的には、非炎症性（「非免疫原性」とも呼ばれる）プロセスである。何十億もの損傷した、瀕死の、および望まない細胞が毎日アポトーシスされる。望まない細胞は、例えば発生の間に生じた過剰な細胞、老化細胞、感染細胞（細胞内細菌またはウイルス）、形質転換または悪性細胞、および細胞傷害性薬剤によって不可逆的に損傷した細胞を含む。
[00185]骨髄は、炎症および感染の間に選択された組織常在性の単球またはマクロファージを置き換え、組織骨髄性集団を増殖させる循環する好中球および単球の供給源である。食作用後、新しく動員された単球および組織マクロファージは、細胞膜の既存のリン脂質およびアラキドン酸からそれらを生成することにより、および呼吸性バーストの活性化または誘導性一酸化窒素合成の誘導によって生成された基を放出することによりそれらの産物を分泌し；上記のように生成した低分子量産物（アラキドン酸代謝物、スーパーオキシドアニオン、および一酸化窒素）の合成によって達成されるのとは別に、単球またはマクロファージの食作用によって誘導される分泌は主にＲＮＡの新しい合成およびｐＨの変化によって達成され、段階的酸性化を生じる。非常に食作用性のマクロファージは、ＭＡＲＣＯ＋ＳｉｇｎＲ１＋であるようであり、外側の辺縁帯に見出され、迅速にカプセル化した細菌を排除する。類似のＣＤ１６９＋ Ｆ４／８０マクロファージ株はリンパ節の被膜下洞にあり、ウイルス感染に関係があるとされている。肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞を含む内皮マクロファージは、血液およびリンパ節から微生物および抗原性リガンドを排除し、粘膜免疫に匹敵するが異なる洞様毛細血管免疫機能を提供することが知られている。典型的なマクロファージマーカーを発現するにもかかわらず、全ての組織マクロファージが構成的に食作用性ではない。げっ歯類の脾臓の辺縁帯では、Ｆ４／８０を欠損する好金属マクロファージは、ＣＤ１６９、シアル酸結合免疫グロブリン（Ｉｇ）様レクチン１（ＳＩＧＬＥＣ１［シアロアドへシン］）を強く発現するが、食作用性は弱い。非プロフェッショナル食細胞は、上皮細胞、および線維芽細胞を含む。線維芽細胞は、「ワーキングクラスの食細胞」であり、接着分子ＩＣＡＭおよびビトロネクチン受容体を通してＣＤ１１ｂ－ＣＤ１８以外のインテグリンを使用することによりアポトーシスデブリを排除する。星状細胞も、効率的にアポトーシス死骸を分解しないとしても、貪食することが報告されている。食作用に関連する細胞膜受容体は、オプソニンの、主にＩｇＧ抗体の保存ドメインのＦｃＲ（活性化または阻害）、および補体活性化の古典経路（ＩｇＭまたはＩｇＧ）または代替のレクチン経路により蓄積したｉＣ３ｂのＣＲ３などの補体受容体であり得る。ＣＲ３は、おそらくマクロファージ由来の補体を蓄積することによって、オプソニンの不在下での認識も媒介することができる。抗微生物食作用は、一般に、未成熟樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージなどの骨髄系統のプロフェッショナル食細胞により、および組織常在性の免疫細胞により実施される。
[00186]がんでは、ＣＣＬ２、ＡＴＰ等を含む多くの因子によって引きつけられた単球は、腫瘍微小環境に移動する。しかしながら、これらの単球のほとんどが、次いで腫瘍関連単球またはマクロファージおよびまたは骨髄性抑制細胞へと分化することができる。骨髄性抑制細胞および腫瘍関連単球またはマクロファージであるのとは対照的に、腫瘍細胞を死滅させる能力のある単球またはマクロファージおよび骨髄性細胞を生成するため、本組成物は常在性の単球またはマクロファージによる腫瘍細胞の食作用を増強し、有効および安定な免疫応答も開始するための手段を提供する。
[00187]腫瘍微小環境における単球またはマクロファージ機能の調査は、単球またはマクロファージの活性化のために少なくとも２つのシグナルが必要とされることを示した。第１のシグナル（シグナル１）は食作用／係留受容体、および病原体関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、または炎症遺伝子の核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）媒介性上方制御を起動するサイトカインなどの危険シグナルによる第２のシグナル（シグナル２）を介して媒介される（図１Ａ）。がん細胞への結合によって生成される食作用起動シグナルのみで抗腫瘍応答を駆動することは不十分であるため、食作用のみを起動することは、単球またはマクロファージを活性化すること、およびがんを死滅させるマクロファージを利用する文脈では不十分であり得る。
[00188]がん細胞または腫瘍細胞は標的細胞として本明細書に繰り返し参照されるが、本明細書に記載の概念は、がん細胞の細胞表面構成要素の結合ドメインが標的細胞に特異的な細胞表面構成要素の結合ドメインによって好適に置き換えられる限り、食作用によって除去される必要がある感染細胞、または特定の疾患細胞型など、任意の型の標的細胞に好適である。
[00189]本開示は、骨髄性細胞が接触すると標的を破壊し、ならびに他の免疫細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球およびＮＫ細胞を活性化する免疫応答を起動するように、骨髄性細胞を起動し、標的細胞、例えばがん細胞または腫瘍細胞への強い応答を開始する有効な方法に取り組む多くの努力に基づく。努力の一態様は、ｉｎ ｓｉｔｕで、患者において治療に有効な骨髄性細胞を生成することである。別の態様では、治療用骨髄性細胞はｅｘ ｖｉｖｏで生成され、それを必要とする患者に導入される。
[00190]一態様では、本開示は、骨髄性細胞に結合し、活性化して腫瘍細胞などの標的細胞に対する食作用性殺作用および免疫応答を起動することが可能なタンパク質またはポリペプチドなどの、１つまたは複数の合成または組換え生体分子を提供する。いくつかの実施形態では、合成または組換え生体分子は、（ａ）一方の手に、骨髄性細胞の細胞表面分子（すなわち抗原）、および他方の手に（ｂ）標的細胞の細胞表面分子（すなわち抗原）を結合することができ、それにより有効に、少なくとも、２つの細胞（エフェクターおよび標的）を近位に運び、いずれかの細胞の他の細胞受容体および膜構成要素が相互作用することができ、エフェクター骨髄性細胞がそれにより標的細胞の貪食を起動することができる。単純化した図示を図１Ｂに示す。構造的に、そのような分子は２つの腕を有し、１つは各細胞表面分子、例えば第１の結合ドメイン（例えばＡ）に特異的であり、第２の結合ドメイン（例えばＢ）はリンカー（例えばＬ）によって接続される（図１Ｂ）。そのような合成または組換え生体分子は、二重特異性エンゲージャー、または二重特異性骨髄性細胞エンゲージャー、またはＢｉＭＥと呼ぶことができる。１つまたは複数の実施形態では、二重特異性エンゲージャーは、２つの抗原結合ドメイン（「バインダー」）を含む。２つのバインダーの１つは、エフェクター骨髄性細胞の表面の抗原に結合するように設計され；もう１つは標的細胞の抗原に結合するように設計される。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、バインダーはリガンドであってもよく、骨髄性細胞または標的細胞の受容体などの細胞表面の受容体に結合する。
[00191]一態様では、本開示は、骨髄性細胞に結合し、活性化して、がん細胞などの標的細胞に対する食作用性殺作用および免疫応答を起動することができるタンパク質またはポリペプチドなどの、１つまたは複数の合成または組換え生体分子、ならびに２つより多くのバインダーを含む合成または組換え生体分子を含む治療用組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書は第１の治療剤を提供し、治療剤は、標的細胞の抗原または表面分子と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片であってもよい第１の結合ドメイン（または第１のバインダー）、および骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片であってもよい第２の結合ドメイン（または第２のバインダー）を含む。１つまたは複数の実施形態では、第１の治療剤は、リンカーまたは第３の結合ドメインを提供し得る別の生体活性ペプチドなどの第１の構成要素、またはアクチベーター分子、またはさらなる治療剤と結合される。いくつかの実施形態では、組成物はさらなる治療剤を含む。
[00192]一態様では、本開示は、骨髄性細胞に結合し、活性化して、がん細胞などの標的細胞に対する食作用性殺作用および免疫応答を起動することができるタンパク質またはポリペプチドなどの、１つまたは複数の合成または組換え生体分子、ならびに２つより多くのバインダーを含む合成または組換え生体分子を提供する。一実施形態では、組換え生体分子は、それぞれ表面分子に特異的な結合を示す３つのバインダーを含み、したがって組換え生体分子は、２つまたはそれ以上の細胞の３つのエレメントへの結合を示すことができる。一実施形態では、３つのバインダーを有する組換え生体分子は、骨髄性細胞または標的細胞の１つより多くの抗原に結合することができる。３つのバインダーを有する本明細書に記載の組換え生体分子は、三重特異的骨髄性細胞エンゲージャー（ＴｒｉＭＥ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＴｒｉＭＥは、３つの異なる細胞、例えば骨髄性細胞、がん細胞などの標的細胞、および第３の細胞、または標的に結合、または誘導し得る。いくつかの実施形態では、ＢｉＭＥまたはＴｒｉＭＥは、骨髄性細胞に結合するおよび骨髄性細胞に寛容または免疫抑制を誘導するなど、骨髄性細胞を活性化するか、またはがん細胞の機能を阻害する、骨髄性細胞かがん細胞の１つより多くの抗原または表面分子を結合し得る。いくつかの実施形態では、二重特異性、三重特異性または多重特異性エンゲージャーは、第２のトリガー、つまり骨髄性細胞による標的細胞の食作用を誘導するだけでなく、反応の延長および免疫記憶の生成のため、他の免疫細胞を活性化する免疫応答または炎症反応も開始する第２のシグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、二重特異性、三重特異性または多重特異性エンゲージャーはキメラ分子である。したがって、本明細書では、治療剤を含む組成物であって、治療剤が、（ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の結合ドメイン、（ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の結合ドメイン、および（ｃ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第３の結合ドメインを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物はさらなる治療剤を含む。いくつかの実施形態では、バインダーは、スカベンジャー受容体、またはＴＬＲ受容体などの受容体のアクチベーターであってもよい。いくつかの実施形態では、バインダーは、病原性標的の有害な因子の阻害剤または遮断剤、または病原性細胞もしくは腫瘍細胞の免疫抑制分子であってもよい。いくつかの実施形態では、上記の機能を実施し得る結合ドメインまたはバインダーまたはエンゲージャーの任意の一部は、バインダーの治療エレメントであってもよい。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは１つまたは複数の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、１つまたは複数のエンゲージャー、および別々の組換えタンパク質、またはそれをコードする核酸、医薬品または小分子などの１つまたは複数の治療剤を含んでもよい。
[00193]本明細書に記載のいくつかの態様では、第２の治療剤が必要とされてもよい。第２の治療剤は第２の組換えタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、腫瘍媒介性免疫抑制因子を抑制することができる。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、骨髄性細胞抑制機能、または骨髄性細胞での免疫寛容誘発応答を避けるために必要とされる。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、食細胞に対する腫瘍細胞による、抗食作用性の「ｄｏｎ‘ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルを避けるために必要である。例えば、第２の治療剤は、ＣＤ４７アンタゴニスト、ＣＤ４７ブロッカー、抗体、キメラＣＤ４７受容体、シアリダーゼ、サイトカイン、炎症促進性遺伝子、プロカスパーゼ、または抗がん剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、食細胞媒介性免疫応答のための第２のシグナルを提供することができる。
[00194]本明細書に記載の方法および組成物を使用して、骨髄性細胞は、腫瘍微小環境における効果と無関係の免疫応答サイクルを活性化させることができる。食細胞は、標的細胞を食作用および死滅させ、有効であり持続する適応免疫応答および標的に対する免疫記憶を生成する免疫応答の後遺症を活性化することができる。
[00195]以下の節では、治療剤を含む組成物を記載する。
第１の治療剤
[00196]一態様では、第１の治療剤が記載され、第１の治療剤が、（ｉ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）単球またはマクロファージ細胞などの骨髄性細胞の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合ドメインを含む。第１の治療剤は、腫瘍細胞などの少なくとも標的細胞、および単球またはマクロファージ細胞に結合し、２つの細胞型を接着させ、単球またはマクロファージによるがん細胞の食作用を促進することができる組換えキメラタンパク質である。いくつかの実施形態では、第１の治療剤はキメラ二重または三重特異性エンゲージャーである。いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、第１の構成要素に結合され、第１の構成要素はさらなる治療剤または第３の結合ドメインである。さらなる治療剤は、ペプチド、タンパク質、コンジュゲートタンパク質、抗体、ｓｃＦｖなどの抗体の機能的誘導体、リガンド、リガンドの受容体もしくはその機能的断片、または小分子であってもよい。前述の文章のいくつかの例では、第１の治療剤は第１の構成要素に結合され、第１の構成要素は標的細胞または単球もしくはマクロファージ細胞の細胞表面構成要素と会合することができる結合エレメントである。
[00197]いくつかの実施形態では、第１の治療剤はさらなる治療剤を含む。本明細書に記載のさらなる治療剤は、小分子であり得る。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤はペプチド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は細胞表面結合ドメインである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は標的細胞結合ドメインである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、抗体、ｓｃＦｖなどの抗体の機能的誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤はリガンド、ペプチドである。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤はタンパク質、コンジュゲートタンパク質、リガンドの受容体またはその機能的断片である。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は、骨髄性細胞、例えば標的細胞によって媒介される単球またはマクロファージ細胞の阻害剤である。
[00198]いくつかの実施形態では、治療剤は組換えタンパク質である。本明細書に記載の治療剤は、腫瘍またはがん細胞および単球またはマクロファージに結合し、それにより単球またはマクロファージによる腫瘍細胞の食作用を起動する第１のシグナル（シグナル１）を提供するだけでなく、第２のシグナル（シグナル２）も提供し、単球またはマクロファージによる食作用性殺作用を増強する組換えタンパク質である。
[00199]一実施形態では、第１の治療剤は細胞外タンパク質である。
[00200]いくつかの実施形態では、第１の治療剤は分泌タンパク質である。
[00201]いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）単球またはマクロファージ細胞の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合ドメインをコードする１つまたは複数の核酸配列をコードする組換え核酸によってコードされる。
[00202]いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）骨髄性細胞の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸を発現するベクターによってコードされる。
[00203]いくつかの実施形態では、バインダーはその標的または同族のエレメントに特異的なその結合に基づいて選択される。結合ドメインは、標的抗原または同族分子に結合する抗体またはその機能的断片であるタンパク質に由来してもよい。結合ドメインは、その標的に対して高い特異性、高い結合親和性または両方を有するものである。
[00204]いくつかの実施形態では、その標的または同族分子への結合親和性は、１０－８Ｍまたはそれ以下、１０－９Ｍまたはそれ以下、１０－１０Ｍまたはそれ以下、または１０－１１Ｍまたはそれ以下、１０－１２Ｍまたはそれ以下である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、その結合特異性または結合親和性または両方を増加するようにさらに改変されてもよい。当業者は、既存の技術を使用して、結合領域の結合特性を増強することができ、そのような改変は本開示の範囲内であると考えられる。
二重および三重特異性単球またはマクロファージエンゲージャー
Ａ．標的細胞とエフェクター細胞の結合
[00205]本明細書では、エフェクター細胞が標的細胞を攻撃し、特定の標的細胞を死滅させるように、標的細胞をエフェクター細胞と繋留するように設計された組換え二重および三重特異的エンゲージャーを提供する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は骨髄性細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄性細胞は単球またはマクロファージ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はがん細胞である。
[00206]がんは、本開示の排他的な詳細に記載される１つの例示的な実施形態であるが、本明細書に記載の方法および技術は、体内の感染またはそうでなければ疾患細胞の標的化に有用であると考えられる。
[00207]いくつかの実施形態では、本開示はがん免疫療法の組成物および方法を提供する。本明細書で提供する方法は、常在性のヒト単球またはマクロファージを誘導して、がん細胞を標的化し、有効な食作用によってそれらを除去する有効なキラー細胞にすることができる手段を設計する一助となる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージは、がん細胞に対する持続する免疫学的応答を提供する。様々な実施形態が本明細書に記載される。
[00208]本明細書では、特定の構築物を提供し、設計はキメラ「エンゲージャー」と呼ばれるそのようなキメラタンパク質を開示する。
[00209]いくつかの実施形態では、キメラエンゲージャーは、がん細胞などの標的細胞または単球もしくはマクロファージにそれぞれ特異的な結合領域を有する２つまたはそれ以上の融合抗体を含む。特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の融合抗体または免疫融合は、単球またはマクロファージの細胞表面構成要素を特異的に結合するエフェクター結合ドメインに免疫グロブリン定常領域のヒンジＣＨ２－ＣＨ３ドメインまたはヒンジＣＨ３ドメインによって作動可能に連結された標的結合ドメインを含む。
[00210]一態様では、キメラタンパク質は二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーである。
[00211]いくつかの実施形態では、二重特異性エンゲージャーは第１の治療剤を含み、第１の治療剤は、（ｉ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）単球またはマクロファージ細胞の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、治療剤は二重特異性エンゲージャーである。一実施形態では、二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーは、可動性リンカーを有する２つの抗体一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）のみ（Ｆｃアミノ酸セグメントは含まない）を含み、１つのｓｃＦｖは標的細胞の細胞表面構成要素に結合し、その他は単球またはマクロファージ細胞表面の受容体に結合する。ＩｇＧの全長非改変形態では、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）は別々のポリペプチド鎖であり、つまりそれぞれ軽鎖および重鎖に位置する。抗体軽鎖と抗体重鎖の相互作用、特にＶＬとＶＨドメインの相互作用では、抗体のエピトープ結合部位の１つが形成される。対照的に、ｓｃＦｖ構築物では、抗体のＶＬおよびＶＨドメインは単一のポリペプチド鎖に含まれる。２つのドメインは、ＶＬおよびＶＨドメインの機能的エピトープ結合部位への自己アセンブリーを可能にするのに十分長い可動性リンカーによって分けられる。
[00212]いくつかの実施形態では、二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーは、（ａ）標的細胞の細胞表面構成要素、例えばがん抗原に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの細胞表面構成要素に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｃ）（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはそれらのＣ末端で融合される。各ｓｃＦｖは、軽鎖可変ドメイン、および重鎖可変ドメインを含み、ペプチドリンカーによって作動可能に連結される。特定の実施形態では、ｓｃＦｖはヒト化される。ヒト化ｓｃＦｖは、ＣＤＲが由来する親の免疫グロブリンのものと比較して、異なる種の免疫グロブリンのフレームワークに存在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含む。例えば、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製してもよい。２つのｓｃＦｖを含む例示的な二重特異性エンゲージャーの設計は略算式によって表すことができる：
Figure 2022536684000002
[00213]いくつかの実施形態では、二重特異性エンゲージャーはディアボディである。二重特異性ディアボディは、異なる（非同一）エピトープに結合特異性を有する、単一のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインで構築される。さらに、ＶＬとＶＨを接続するリンカーは１２アミノ酸長よりも短く、機能的エピトープへの再アセンブリーに不十分である。一般に、１つのポリペプチド鎖構築物は、第１の抗原に結合特異性を有するＶＬおよび第２の抗原に結合特異性を有するＶＨを含み、別のポリペプチド鎖構築物は、第２の抗原に結合特異性を有するＶＬおよび第１の抗原に結合特異性を有するＶＨを含み；２つのポリペプチド鎖は二重特異性ディアボディへの自己アセンブルが可能である。いくつかの実施形態では、システイン残基は構築物のＣ末端に導入され、構築物の結合特性と干渉せずに２つの鎖間でジスルフィド結合形成を可能にすることができる。
[00214]いくつかの実施形態では、二重特異性エンゲージャーは、タンデム－ジ－ｓｃＦｖである。
[00215]いくつかの実施形態では、組換え核酸構築物は、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーをコードして調製され得る。二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現する組換え核酸構築物は、（ａ）標的細胞結合ｓｃＦｖ軽鎖の可変ドメイン、リンカー、標的細胞結合ｓｃＦｖ重鎖の可変ドメインをコードする核酸配列；（ｂ）リンカーをコードする核酸配列；（ｃ）エフェクター（単球またはマクロファージ）細胞結合ｓｃＦｖ軽鎖の可変ドメイン、リンカー、エフェクター（単球またはマクロファージ）細胞結合ｓｃＦｖ重鎖の可変ドメインをコードする核酸配列をコードする１つまたは複数のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現する核酸構築物は、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの分泌のためのＮ末端シグナルペプチド配列を含む。
[00216]いくつかの実施形態では、二重特異性エンゲージャーは、可動性リンカーと作動可能に連結した２つの単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含み、１つのＶＨＨは標的細胞の細胞表面構成要素に結合し、他のＶＨＨは単球またはマクロファージ細胞表面の受容体に結合する。いくつかの実施形態では、キメラ二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーは、（ａ）標的細胞の細胞表面構成要素、例えばがん抗原に結合するＶＨＨドメイン、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの細胞表面構成要素に結合するＶＨＨドメイン、（ｃ）（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーを含む。いくつかの実施形態では、２つの単一ドメイン抗体を含むエンゲージャーはナノボディである。２つのＶＨＨドメインを含む例示的な二重特異性エンゲージャーの設計は、略算式によって表すことができる：
Figure 2022536684000003
[00217]いくつかの実施形態では、（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーは、さらなる機能をさらに有してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えばＴＬＲ受容体などの特定の細胞表面受容体に結合することができ、単球またはマクロファージ細胞における受容体媒介性細胞シグナル伝達経路を活性化することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも単球またはマクロファージ細胞における炎症経路に結合および活性化することができる、または単球もしくはマクロファージ媒介性の標的細胞の食作用または殺作用を増強することができるように設計される。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、単球またはマクロファージ細胞機能の標的細胞媒介性の下方制御を遮断または阻害する機能を有してもよい。
[00218]いくつかの実施形態では、二重特異性ＶＨＨエンゲージャーの核酸構築物を生成することができ、（ａ）標的細胞の細胞表面構成要素、例えばがん抗原に結合するＶＨＨドメイン、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの細胞表面構成要素に結合するＶＨＨドメイン、（ｃ）（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現する核酸構築物は、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの分泌のためのＮ末端シグナルペプチド配列を含む。
[00219]当業者に公知のように、ＶＨＨまたはｓｃＦｖ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列が、１つまたは複数のプロモーター、例えばポリペプチドをコードする配列の５’端のＣＭＶおよび３’端のポリアデニル化シグナル下で好適な発現ベクターに挿入することができる。
[00220]いくつかの実施形態では、構築物は配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよく、例えば１つまたは複数のポリペプチドをコードする核酸配列がＩＲＥＳに先行されてもよい。
[00221]いくつかの実施形態では、ポリペプチドの１つをコードする核酸配列は、発現された配列の残りとは別々のプロモーター制御下に配置されてもよい。
[00222]いくつかの実施形態では、二重特異性エンゲージャーは、標的細胞の細胞表面構成要素に結合する抗体またはその断片、およびエフェクター細胞の細胞表面構成要素に結合する抗体またはその断片をさらに含んでもよい。
[00223]本明細書では、エンゲージャーのさらなるバリエーション、三重特異性エンゲージャーを提供する。三重特異性エンゲージャーは、第１の治療剤を含み、第１の治療剤は：標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合ドメイン；単球またはマクロファージ細胞の第１の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合ドメイン；および単球またはマクロファージ細胞の第２の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第３の抗原結合ドメインを含む。
[00224]いくつかの実施形態では、三重特異性エンゲージャーは、標的がん細胞の細胞表面構成要素に特異的な第１のｓｃＦｖ、単球またはマクロファージの細胞表面構成要素、例えばキメラ食作用受容体に特異的な第２のｓｃＦｖ、および単球またはマクロファージの別の細胞表面構成要素に特異的な第３のｓｃＦｖを含む、３つのｓｃＦｖの融合構築物である。いくつかの実施形態では、三重特異性エンゲージャーは、第３のｓｃＦｖが結合することができる単球またはマクロファージの細胞表面構成要素が、単球またはマクロファージのさらなる活性化シグナルを提供し、標的細胞の食作用および殺作用を起動するように設計される。いくつかの実施形態では、第３のｓｃＦｖは、単球またはマクロファージの別の食作用受容体に結合する。いくつかの実施形態では、第３のｓｃＦｖは、危険因子関連単球またはマクロファージシグナル伝達経路（ＤＡＭＰ）に結合する。いくつかの実施形態では、第３のｓｃＦｖは、ＴＬＲ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、第３のｓｃＦｖは、サイトカイン受容体に結合し、受容体を活性化し、単球またはマクロファージ細胞内シグナル伝達を起動する。いくつかの実施形態では、第３のｓｃＦｖは、食作用阻害シグナルを生成することが公知の単球またはマクロファージ受容体に結合し、受容体への第３のｓｃＦｖの結合が受容体を遮断し、食作用の増強を可能にする。いくつかの実施形態では、第３のｓｃＦｖは、１つまたは複数の膜貫通ドメインと結合する受容体に結合し、食作用シグナル伝達を増強する。三重特異性エンゲージャーの様々な設計が本明細書で検討され、２つのｓｃＦｖを含むその例示的な三重特異性エンゲージャーは、略算式によって表すことができる：
Figure 2022536684000004
[00225]いくつかの実施形態では、三重特異性エンゲージャーの３つの結合ドメインのそれぞれは、抗体、抗体の機能的断片、その可変ドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＮＡＲドメイン、ＶＨＨドメイン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、二重特異性抗体、ディアボディ、またはその機能的断片もしくは組合せの抗原結合ドメインを含む。
[00226]いくつかの実施形態では、三重特異性エンゲージャーの結合ドメインは、１つまたは複数のペプチドリンカーによって作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドリンカーは、例えばＴＬＲ受容体などの特定の細胞表面受容体に結合することができる機能性ペプチドであってもよく、単球またはマクロファージ細胞における受容体媒介性細胞シグナル伝達経路を活性化することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも単球またはマクロファージ細胞における炎症経路に結合および活性化することができる、または単球もしくはマクロファージ媒介性の標的細胞の食作用または殺作用を増強することができるように設計される。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、単球またはマクロファージ細胞機能の標的細胞媒介性の下方制御を遮断または阻害する機能を有してもよい。
[00227]いくつかの実施形態では、三重特異性エンゲージャーをコードする核酸構築物は、（ａ）標的細胞の細胞表面構成要素、例えばがん抗原に結合するｓｃＦｖドメインを含むポリペプチド、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの第１の細胞表面構成要素に結合するｓｃＦｖドメインを含むポリペプチド、（ｃ）単球またはマクロファージの第２の細胞表面構成要素に結合するｓｃＦｖドメインを含むポリペプチド、例えば第２の治療剤を構成するキメラ構築物；または天然の単球もしくはマクロファージ細胞表面受容体をコードする１つまたは複数の核酸を含み、各ポリペプチドが互いに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、三重特異性エンゲージャーをコードする核酸構築物は、（ａ）標的細胞の細胞表面構成要素、例えばがん抗原に結合するＶＨＨドメインを含むポリペプチド、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの第１の細胞表面構成要素に結合するＶＨＨドメインを含むポリペプチド、（ｃ）単球またはマクロファージの第２の細胞表面構成要素に結合するＶＨＨドメインを含むポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現する核酸構築物は、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの分泌のためのＮ末端シグナルペプチド配列を含む。本明細書で検討する場合、当業者は、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ結合配列を、任意の好適な標的領域結合エレメントをコードする短いペプチドの核酸配列と交換することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、モノシストロニックな構築物にコードされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、ポリシストロニックな構築物にコードされる。いくつかの実施形態では、短いリンカーポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列は、２つのポリペプチドをコードする配列の間に挿入される。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、別々のプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドをコードする核酸配列は、単一のプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＩＲＥＳ配列は構築物に導入される。
[00228]いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドは、細胞内で別々に発現されてもよく、翻訳後にアセンブルしてもよい。
[00229]いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞の外側に分泌すると、特定のペプチド足場でアセンブルするように設計されてもよい。
[00230]いくつかの実施形態では、二重または三重特異的エンゲージャーは、
チミジンキナーゼ（ＴＫ１）、ヒポキサンチン－グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ムチン－１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、上皮増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ＥＢＮＡ－１、ＬＥＭＤ１、ホスファチジルセリン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、卵胞刺激ホルモン受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、エリスロポエチン産生肝細胞癌Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＥｐｈＢ２、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２４８、ＣＤ２７６、ＰＳＣＡ、ＣＳ－１、ＣＬＥＣＬ１、ＧＤ３、ＰＳＭＡ、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＥＰＣＡＭ、ＩＬ－１、インテグリン受容体、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロテアーゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧＭ３、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ＩＧＬＬ１およびこれらの組合せからなる群から選択される、がん細胞の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、例えば、標的がん細胞のがん抗原は、１つまたは複数の変異／がん抗原であり得る：ＭＵＣ１６、ＣＣＡＴ２、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＰＣＡ３、ＭＡＧＥ Ｃ１、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥＤ２、ＡＦＰ、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥ９、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＰＬＡＣ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＬＳＰ１、ＣＴ４５Ａ１、ＣＴ４５Ａ２、ＣＴ４５Ａ３、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴ４５Ａ６、ＣＴ４５Ａ８、ＣＴ４５Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１、ＣＴ４７Ａ２、ＣＴ４７Ａ３、ＣＴ４７Ａ４、ＣＴ４７Ａ５、ＣＴ４７Ａ６、ＣＴ４７Ａ８、ＣＴ４７Ａ９、ＣＴ４７Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１１、ＣＴ４７Ａ１２、ＣＴ４７Ｂ１、ＳＡＧＥ１、およびＣＴ５５。
[00231]いくつかの実施形態では、がん細胞の抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＣＲ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ５６からなる群から選択される。
[00232]いくつかの実施形態では、抗原は卵巣がん抗原またはＴリンパ腫抗原である。
[00233]いくつかの実施形態では、例えば標的がん細胞のがん抗原は、１つまたは複数の変異／がん抗原：ＩＤＨ１、ＡＴＲＸ、ＰＲＬ３、またはＥＴＢＲであり得、がんは神経膠芽腫である。
[00234]いくつかの実施形態では、例えば、標的がん細胞のがん抗原は、１つまたは複数の変異／がん抗原：ＣＡ１２５、ベータ－ｈＣＧ、尿中ゴナドトロピン断片、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＳＣＣ、インヒビンまたはエクストラジオールであり、がんは卵巣がんである。
[00235]いくつかの実施形態では、標的がん細胞のがん抗原はＣＤ５であってもよい。
[00236]いくつかの実施形態では、標的がん細胞のがん抗原はＨＥＲ２であってもよい。
[00237]いくつかの実施形態では、標的がん細胞のがん抗原はＥＧＦＲ Ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩであってもよい。
[00238]いくつかの実施形態では、標的がん細胞のがん抗原はＣＤ１９であってもよい。
[00239]いくつかの実施形態では、抗原はインテグリン受容体である。
[00240]いくつかの実施形態では、抗原は、α１、α２、αＩＩｂ、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、およびβ８からなる群から選択されるインテグリン受容体である。いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、インテグリンβ２サブファミリーαＭβ２（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、Ｍａｃ－１、ＣＲ３、Ｍｏ－１）、αＬβ２（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＬＦＡ－１）、αＸβ２（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）、およびαＤβ２（ＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８）のメンバーからの単球またはマクロファージ受容体の細胞外ドメインに結合する。
[00241]本明細書では、がん細胞の細胞表面分子（細胞表面抗原など）に特異的に結合することができる例示的な標的細胞バインダー（例えば、エンゲージャー）を提供する。いくつかの実施形態では、バインダーは、抗原に特異的な抗体、またはその断片である。いくつかの実施形態では、バインダーは、腫瘍細胞の抗原に特異的に結合するｓｃＦＶ、またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の抗原はＣＤ５である。バインダーは、重鎖（ＨＣ）配列および軽鎖（ＬＣ）配列を含む。ＣＤ５に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ５ ｓｃＦｖ）は、可変重鎖（ＶＨ）ドメインに相当するアミノ酸配列および（ＶＬ）に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５バインダーである第１の結合ドメインは、リンカーペプチドによって接合された配列番号２７の配列と配列番号２８の配列を含むｓｃＦｖであり得る。本明細書では、表１Ａに、例示的な抗ＣＤ５ ＨＣおよびＬＣ可変ドメインを提供する。
Figure 2022536684000005
[00242]一実施形態では、標的細胞バインダーは、ＣＤ５を結合する単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、標的細胞バインダーは、ＣＤ５結合ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、標的細胞バインダーまたは第１の結合ドメインは、配列番号２７の配列を含むＣＤ５結合ＶＨＨであり得る。
[00243]いくつかの実施形態では、例示的な標的細胞バインダー（例えば、エンゲージャー）は、ＨＥＲ２陽性がん細胞の細胞表面抗原ＨＥＲ２に特異的に結合することができる、ＨＥＲ２エンゲージャーである。いくつかの実施形態では、バインダーは抗原に特異的な抗体、またはその断片である。いくつかの実施形態では、バインダーは、ＨＥＲ２に特異的に結合するｓｃＦｖ、またはその断片を含む。バインダーは、重鎖（ＨＣ）配列および軽鎖（ＬＣ）配列を含む。ＨＥＲ２に特異的なｓｃＦｖ（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ）は、可変重鎖（ＶＨ）ドメインに相当するアミノ酸配列および（ＶＬ）に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、リンカーペプチドによって接続される配列番号２９の配列と配列番号３０の配列を含むＨＥＲ２バインダーを有するｓｃＦｖであってもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞バインダーまたは第１の結合ドメインは、配列番号２９の配列を含むＨＥＲ２結合ＶＨＨであり得る。
[00244]本明細書では、表１Ｂに、例示的な抗ＨＥＲ２ ＨＣおよびＬＣ可変ドメインを提供する。
Figure 2022536684000006
[00245]いくつかの実施形態では、腫瘍関連マクロファージは、Ｍ２表現型を有すると主に特徴付けられてもよい。ヒトＭ２マクロファージは、細胞表面マーカーＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋ＣＤ８０－表現型に近いと同定され得る。したがって、骨髄性細胞、例えば腫瘍と関連する単球またはマクロファージに特異的に結合する二重または三重特異性エンゲージャーは、１つまたは複数の：ＣＤ１４、ＣＤ１６３、およびＣＤ２０６細胞表面分子に結合することができる１つまたは複数の結合ドメインを含むことができる。
[00246]典型的には、Ｍ２様腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）集団は、反応性窒素中間体の発現を欠如し、抗原提示の効率が悪く、わずかな殺腫瘍活性を示し、血管新生因子、メタロプロテアーゼ、およびカテプシンを産生する。マトリックスメタロプロテアーゼ、例えばＭＭＰ２は、ＴＡＭにおいて容易に発現される。マクロファージの古典的な活性化は、ＭＭＰ－１、－３、－７、－１０、－１２、－１４、および－２５を上方制御し、ＴＩＭＰ－３（メタロプロテアーゼ－３の組織阻害剤）レベルを減少させる。細菌リポポリサッカライド、ＩＬ－１およびＴＮＦαは、ＭＭＰ－２５、およびＴＩＭＰ－３への効果を除き、ＩＦＮ－ガンマよりも有効であることが見出される。対照的に、代替えの活性化はＭＭＰ－２、－８および－１９を減少させるが、ＭＭＰ－１１、－１２、－２５およびＴＩＭＰ－３定常状態ｍＲＮＡレベルを増加させる。古典的な活性化の間のＭＭＰの上方制御は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、ホスホイノシチド－３－キナーゼおよびκＢキナーゼ－２の阻害剤に依存する。したがって、標的単球またはマクロファージ集団により、エンゲージャーは、メタロプロテナーゼが単球またはマクロファージエンゲージャーの結合部分であり得るように設計されてもよい。ＭＭＰ２は容易に発現されるＴＡＭマーカーの１つであり、腫瘍特異的骨髄性細胞エンゲージャーはＭＭＰ２結合ドメインを含む。
[00247]低酸素症、または低酸素症に次いで産生されたサイトカインは、次いで低酸素症誘導因子２－アルファ（ＨＩＦ－２α）を上方制御するマクロファージを引きつける。したがって、腫瘍関連マクロファージに特異的に結合する二重または三重特異性エンゲージャーの結合ドメインは、これらの細胞で上方制御されるＨＩＦ－２αに結合することができる。
[00248]単球／マクロファージ細胞表面マーカーは、ＬＰＳ共受容体（ＣＤ１４）、ＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ３１２、ＣＤ１１５、Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。サブセット特異的マーカーは、ＣＤ１６３およびＣＤ２０４、Ｍ２マクロファージによって発現される両スカベンジャー受容体、ＣＤ３０１、Ｍ２マクロファージによって発現されるガラクトース型Ｃ型レクチンを含む。
[00249]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、表２Ａのいずれか１つのタンパク質の細胞外ドメインから選択される食作用受容体の細胞外ドメインに結合する。
Figure 2022536684000007
[00250]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、表２Ｂのいずれか１つのタンパク質の細胞外ドメインから選択されるＰＦＰの細胞外ドメインに結合する。
[00251]表２Ｂは、単球、マクロファージおよびＤＣの例示的な表面マーカーおよび表現型特徴を提供する。
Figure 2022536684000008
[00252]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、骨髄性細胞受容体、例えば単球受容体、マクロファージ受容体、例えばＩｇ結合ドメインを含む細胞外ドメインから選択される受容体の細胞外ドメインに結合する。
[00253]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、マクロファージ受容体の細胞外ドメイン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃＲｎ、ＦｃＲＬ５結合ドメインに結合する。本明細書で参照するＣＤ１６受容体は、ＣＤ１６Ａ受容体またはＣＤ１６Ｂ受容体であり得る。
[00254]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーはＦｃＲ細胞外ドメインの細胞外ドメインに結合する。
[00255]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＦｃＲ－アルファ、ＦｃＲ－ベータ、ＦｃＲ－イプシロンまたはＦｃＲ－ガンマの細胞外ドメインから選択されるマクロファージ受容体の細胞外ドメインに結合する。
[00256]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＦｃαＲ（ＦＣＡＲ）の細胞外ドメインに結合する。
[00257]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＦｃＲ－ベータの細胞外ドメインに結合する。
[00258]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＦｃεＲ（ＦＣＥＲ１Ａ）の細胞外ドメインに結合する。
[00259]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＦｃγＲ（ＦＤＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ）受容体を含む細胞外ドメインに結合する。
[00260]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、レクチン、デクチン１、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体Ａ１（ＳＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＭＳＲ１、ＳＣＡＲＡ３、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ５、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＡＲＢ２、ＣＤ６８、ＯＬＲ１、ＳＣＡＲＦ１、ＳＣＡＲＦ２、ＣＸＣＬ１６、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＳＲＣＲＢ４Ｄ、ＳＳＣ５Ｄ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＲＡＧＥ、ＣＤ１４、ＣＤ６４、Ｆ４／８０、ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＨｕＣＲＩｇ（Ｌ）、およびＣＤ１６９受容体から選択される単球またはマクロファージ食作用受容体の細胞外ドメインに結合する。
[00261]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＴＲＥＭタンパク質の細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭタンパク質の細胞外ドメインはＴＲＥＭ１タンパク質細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭタンパク質の細胞外ドメインはＴＲＥＭ２タンパク質細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭタンパク質の細胞外ドメインはＴＲＥＭ３タンパク質細胞外ドメインである。
[00262]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、レクチン、デクチン１、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体Ａ１（ＳＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＭＳＲ１、ＳＣＡＲＡ３、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ５、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＡＲＢ２、ＣＤ６８、ＯＬＲ１、ＳＣＡＲＦ１、ＳＣＡＲＦ２、ＣＸＣＬ１６、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＳＲＣＲＢ４Ｄ、ＳＳＣ５Ｄ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＲＡＧＥ、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＨｕＣＲＩｇ（Ｌ）、およびＣＤ１６９受容体からなる群から選択される単球またはマクロファージ食作用受容体の細胞外ドメインに結合する。
[00263]いくつかの実施形態では、バインダーまたはエンゲージャーの任意の部分が抗体またはその断片以外の分子であり得ることは理解され得る。例えば、バインダーは標的細胞またはエフェクター骨髄性細胞などの細胞の表面分子に結合し、受容体のリガンドであってもよく、その場合細胞表面分子はリガンドに特異的な受容体である。いくつかの実施形態では、リガンドはキメラタンパク質もしくは融合タンパク質、または受容体の自然発生のリガンドであってもよい。いくつかの実施形態では、エンゲージャー組み替えタンパク質の１つのバインダーはリガンドであってもよく、別のものは抗体またはその断片であってもよい。
[00264]いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、１つまたは複数のリンカーまたはスペーサーを含んでもよい。リンカーまたはスペーサーは、２～５０アミノ酸からなってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは３～３０アミノ酸スペーサーである。いくつかの実施形態では、リンカーは４～２０または５～１０アミノ酸長のペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、非反応性アミノ酸分子、例えば一連のグリシンまたはセリンまたはアラニン残基から構成されてもよい。例示的なリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳ、またはＳＧＧＧ、またはＳＧＧＧＧＳＧを含んでもよい。例示的なリンカーは、アミノ酸配列ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含んでもよい。リンカーは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインを連結してもよい。リンカーは、二重または三重特異性エンゲージャーのバインダードメインを連結してもよい。リンカーは一般に、有効なバインダー部位を接続する構造エレメントとして寄与する。いくつかの実施形態では、リンカーは可動性であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは固定されてもよい。リンカーの長さは、反対端でバインダーの間隔を開けるのに最適または必要な設計および長さの必要性により調整される。いくつかの実施形態では、リンカーは、２つのドメインを連結する以外のユニークな機能を有するペプチドを含んでもよい。以下に議論する例示的なペプチドは、二重または三重特異性または多重特異性エンゲージャーの設計の一部であってもよく、リンカーの一部であってもなくてもよい。
[00265]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、例えばＭ２マクロファージなどの腫瘍関連マクロファージを特異的に標的化するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ２特異的ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＱＤＰＷＧＶＫＷＷＹ（配列番号１１６）を有するＭ２－ｐｅｐである。
[00266]いくつかの実施形態では、Ｍ２特異的ペプチドは、配列ＨＬＳＷＬＰＤＶＶＹＡＷ（以降、ＨＬＳｐｅｐ）（配列番号１１７）を含んでもよい。
[00267]上記のＭ２－ｐｅｐまたはＨＬＳｐｅｐなどのペプチドは、２つの結合ドメインの間のリンカーまたはリンカーの一部などの二重特異性エンゲージャーまたは三重特異性エンゲージャーの一部を形成することができる。いくつかの実施形態では、エンゲージャーの第１および第２の結合ドメインはＭ２－ｐｅｐまたはＨＬＳｐｅｐに結合されるが、Ｍ２－ｐｅｐまたはＨＬＳｐｅｐはエンゲージャーを腫瘍関連マクロファージにさらに標的化し、エンゲージャーを腫瘍関連マクロファージに係留することを助ける。
[00268]いくつかの実施形態では、例示的なエンゲージャーは、リンカーによって接続されたＣＤ５結合ドメインおよびＣＤ１６結合ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、例示的なエンゲージャーは、ＴＬＲ４ペプチドなどのＴＬＲ活性化ペプチドを含む。
Ｂ．マスクされた抗原結合ドメインを有するエンゲージャー
[00269]本明細書では、１つまたは複数のｐｒｏ－抗体を含む二重特異性または三重特異性エンゲージャーを含む治療剤のための組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｐｒｏ－抗体は、その抗原結合ドメインが抗原との相互作用から遮断または「マスク」される抗体の不活性形態、またはその断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ｐｒｏ－抗体は、プロテアーゼ切断可能リンカーペプチドによって抗原結合ドメインと会合したままであり、その同族の抗原への結合から抗原結合ドメインを「マスク」する基質ペプチドまたはコンジュゲートを含む。好適な条件下で、基質ペプチドは切断されてマスクを放出し、抗原結合ドメインでの抗原結合を促進する。
[00270]いくつかの実施形態では、二重特異性または三重特異性抗体は、ｐｒｏ－抗体である１つまたは複数のｓｃＦｖを含み、つまり、ｓｃＦｖの抗原結合ドメインは切断可能ブロッカーによってマスクされる。いくつかの実施形態では、ブロッカーは基質ペプチドおよびプロテアーゼ切断可能リンカーを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性または三重特異性抗体はＶＨＨｐｒｏ－抗体を含み、ＶＨＨ抗体のＶＬドメインまたはＶＨドメインまたは両方が、切断可能ブロッカーによってマスクされる。いくつかの実施形態では、二重特異性または三重特異性抗体はナノボディを含み、１つまたは複数の抗原結合ドメインは、切断可能リンカーによって抗体に連結された基質ペプチドまたはコンジュゲートと会合することによってマスクされる。
[00271]いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、治療剤がその作用の標的部位に到達すると切断されるように設計される。例えば、がん治療剤のためのｐｒｏ－抗体は、プロテアーゼ切断可能リンカーを含有するように設計することができ、プロテアーゼ切断可能リンカーを切断するプロテアーゼは腫瘍微小環境に豊富であり、非腫瘍組織では相対的に不在であるか無視でき、治療剤は、全身投与された場合に腫瘍微小環境に治療剤が達するとプロテアーゼによって活性化される。いくつかの実施形態では、治療剤は、プロテアーゼ活性化ｐｒｏ－抗体を含み、疾患部位にのみ抗体作用を向けるように開発される。
[00272]いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、アミノ酸配列ＧＰＬＧＶＲ（配列番号１１８）を有するマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ２）切断可能ペプチドである。
[00273]いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、アミノ酸配列ＹＥＱＤＰＷＧＶＫＷＷＹ（配列番号１１６）またはアミノ酸配列ＨＬＳＷＬＰＤＶＶＹＡＷ（配列番号１１７）を有するＭ２特異的ペプチドである。
[00274]いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、低酸素症誘導タンパク質媒介性切断部位を含む。
[00275]いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは非自然発生の合成ペプチドであり、プロテアーゼ切断可能部位を含む。いくつかの実施形態では、切断部位は、外部から投与されるプロテアーゼによって切断することができる。いくつかの実施形態では、切断部位は、がん標的化薬と会合されるプロテアーゼによって切断することができる。
[00276]いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは変異ペプチドであり、変異ペプチドはプロテアーゼ切断可能部位を含有し、相当する非変異ペプチドでは生じない。
[00277]いくつかの実施形態では、本明細書に開示のインスタントプログラムの目的は、免疫療法での使用のための治療薬を生成することである。
Ｃ．骨髄性細胞の食作用活性の増強および免疫応答を促進するドメインを有するエンゲージャー
[00278]腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、免疫抑制環境を構成する。ＩＬ－１０、グルココルチコイドホルモン、アポトーシス細胞、および免疫複合体の影響は、生来の免疫細胞機能と干渉することができる。食細胞を含む免疫細胞は、寛容原性表現型に定着する。マクロファージでは、Ｍ２表現型として公知のこの表現型はＭ１表現型とは異なり、マクロファージは効力があり、病原体を死滅させることができる。ＬＰＳまたはＩＦＮ－ガンマに暴露されたマクロファージは、例えば、Ｍ１表現型に分極することができるが、ＩＬ－４またはＩＬ－１３に暴露されたマクロファージはＭ２表現型に分極するであろう。ＬＰＳまたはＩＦＮ－ガンマは、ＴｒｉｆおよびＭｙＤ８８経路を誘導する、転写因子ＩＲＦ３、ＡＰ－１、およびＮＦＫＢの活性化を誘導する、したがって、炎症促進性Ｍ１マクロファージ応答に必要であるＴＮＦ－□遺伝子、インターフェロン遺伝子、ＣＸＣＬ１０、ＮＯＳ２、ＩＬ－１２等を活性化するマクロファージの表面のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）と相互作用することができる。同様に、ＩＬ－４およびＩＬ－１３はＩＬ－４Ｒに結合し、抗炎症応答（Ｍ２応答）と関連する遺伝子であるＣＣＬ１７、ＡＲＧ１、ＩＲＦ４、ＩＬ－１０、ＳＯＣＳ３等の発現を調節するＪａｋ／Ｓｔａｔ６経路を活性化する。ＣＤ１４、ＣＤ８０、Ｄ２０６の発現、およびＣＤ１６３の低発現は、Ｍ１表現型へのマクロファージ分極の指標である。
[00279]いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、食作用受容体などの受容体の細胞外ドメインに結合することができる結合ドメインを含む。特定の部位での単球またはマクロファージ食作用受容体との結合は、例えば、受容体の細胞内ドメインによって媒介される細胞内シグナル伝達を増強することによって受容体を活性化することができる。いくつかの実施形態では、エンゲージャーの結合ドメインは食作用受容体のリガンドを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、次いで食作用受容体に結合するリガンドに結合する。
[00280]いくつかの食作用受容体は、他よりも食作用の活性化により有効であり、標的細胞の迅速な食作用を誘導することができる。有効な食作用受容体を同定する必要がある。ほとんどのマクロファージスカベンジャーは、外来物質の非特異的抗体非依存的認識における自己と非自己の間を区別するために使用されてもよい広範な結合特異性を有する。ＩおよびＩＩ型クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ－ＡＩ１およびＳＲ－ＡＩＩ）は、小さいＮＨ２末端細胞内ドメイン、および短いスペーサードメイン、ヘリックスコイルドコイルドメイン、および三重ヘリックスコラーゲンドメインを含有する細胞外部分を有する三量体膜糖タンパク質である。Ｉ型受容体は、さらにシステインリッチＣＯＯＨ－末端（ＳＲＣＲ）ドメインを含有する。これらの受容体は、身体中の多様な組織のマクロファージに存在し、通常広範なリガンド結合特異性を示す。それらは、改変ＬＤＬなどの化学的に改変されたタンパク質を含む多種多様なポリアニオンに結合し、それらはアテローム形成中のコレステロール沈着と関係する。それらは、マクロファージ関連宿主防御および炎症状態における細胞接着プロセスにも役割を果たすことができる。
[00281]表２Ａおよび表２Ｂは、異なる骨髄性細胞と関連する受容体または表面抗原の簡単なリストを例示し、細胞は高度に食作用性から寛容原性にわたる範囲の特徴を有する。マクロファージ内でさえも、いくつかの受容体は活発な食作用性のＭ１表現型と関連するが、その他は食作用応答が弱まった抗炎症Ｍ２表現型と関連する。Ｍ１受容体とのエンゲージによるＭ１関連受容体の活性化は、Ｍ２からＭ１表現型へのマクロファージ型の特徴の移行を生じることができる。
[00282]食作用を活性化するマクロファージ受容体は、１つまたは複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）モチーフを有するドメインを含む細胞内食作用シグナル伝達ドメインを含む。ＩＴＡＭは、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＦｃＲｓなどの免疫系のいくつかの受容体の細胞質尾部に存在する保存配列である。それらは、規定した間隔（ＹＸＸＬ／Ｉ－Ｘ６－８－ＹＸＸＬ／Ｉ）によって分けられる、対のＹＸＸＬ／Ｉモチーフ（Ｙ＝チロシン、Ｌ＝リジンおよびＩ＝イソロイシン）からなる保存アミノ酸配列モチーフを有する。さらに、ほとんどのＩＴＡＭは、第１のＩＴＡＭチロシンに対して＋２位に負電荷のアミノ酸（Ｄ／Ｅ）を含有する。ＩＴＡＭ内の残基のリン酸化は、食作用を活性化するいくつかのシグナル伝達分子を動員する。ＩＴＡＭモチーフは、細胞内アダプタータンパク質、１２ｋＤａのＤＮＡＸ活性化タンパク質（ＤＡＰ１２）にも存在する。
[00283]いくつかの実施形態では、細胞内領域の食作用シグナル伝達ドメインは、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）動員ドメイン（ＰＩ３Ｋ結合ドメインとも呼ばれる）を含み得る。ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＳＦＲまたはＰＤＧＦＲ受容体は、結合ドメインへのＰＩ３キナーゼ動員を含む。いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーはＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＳＦＲまたはＰＤＧＦＲ受容体のいずれか１つまたは複数などの受容体に結合する。そのような受容体とのエンゲージは、Ａｋｔ媒介性シグナル伝達カスケードおよび食作用の活性化をもたらす。ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路は、食作用、炎症応答の調節、および小胞輸送および細胞骨格認識を含む他の活動に重要である。ＰＩ３キナーゼ動員ドメインは、細胞膜タンパク質の細胞内ドメインであり、リン酸化され得る、およびＰＩ３Ｋｐ８５のＳｒｃ相同ドメイン（ＳＨ２）ドメインによって認識され得るチロシン残基を有する。ｐ８５のＳＨ２ドメインは、受容体の細胞質ドメインのリン酸化チロシンを認識する。これは、ｐ１１０のアロステリックな活性化および酵素Ａｋｔおよびそれらのプレクストリン相同ドメインを介して構成的に活性な３’－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）によって認識されるホスファチジルイノシトール－３，４，５－三リン酸（ＰＩＰ３）の産生を引き起こす。ＡｋｔのＰＩＰ３との相互作用は、Ａｋｔ構造の変化、およびそれぞれＰＤＫ１およびｒｉｃｔｏｒ－ｍＴＯＲ複合体による残基Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３のリン酸化を引き起こす。これら２つの残基のリン酸化は、Ａｋｔの活性化を引き起こし、次いで他の基質の中で、グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３（ＧＳＫ－３）をリン酸化する。ＧＳＫ－３は２つのアイソフォームを有し、そのＧＳＫ－３αとＧＳＫ－３βの両方は、構成的に活性である。アイソフォームは構造的に関連するが、機能的には重複しない。ＧＳＫ－３の不活性化は、それらの調節性Ｎ末端ドメインに位置するＧＳＫ－３αのＳｅｒ２１残基またはＧＳＫ－３βのＳｅｒ９残基がＡｋｔおよび他のキナーゼによってリン酸化される場合に観察される。リン酸化によるＧＳＫ－３の阻害は、炎症および食作用プロセスの調節に重要である。
[00284]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＤＡＰ１２活性化を誘導することにより食作用促進性シグナル伝達を活性化することができる受容体またはその一部に結合する結合ドメインを含む。
[00285]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、単球またはマクロファージまたは食細胞の受容体の群のクラスタリングを促進し、食作用を増強する受容体またはその一部に結合する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、受容体のクラスタリングは細胞内シグナル伝達経路を活性化する。
[00286]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、Ｆｃ□Ｒ１（ＣＤ８９）の結合ドメインを含む。Ｆｃ□Ｒ１受容体結合または架橋結合は、抗原媒介性の細胞障害性を活性化し、単球またはマクロファージの食作用を活性化する。Ｆｃ□Ｒ１は、マクロファージならびに好中球および好酸球などのいくつかの他の細胞において構成的に発現される。エンゲージャーが、腫瘍細胞などの標的細胞の抗原に結合する結合ドメイン、ＣＤ２０６などの単球またはマクロファージ受容体に特異的な結合ドメイン、およびＣＤ８９の結合ドメインを含む場合、三重特異性エンゲージャーに特に有利である。エンゲージャー分子の設計の長さおよび可動性を考慮すると、ＣＤ２０６およびＦｃ□Ｒ１（ＣＤ８９）結合ドメインは、１つより多くの食作用特異的受容体と架橋結合することにより、および標的細胞と架橋結合することにより複数の活性化シグナルをエンゲージおよび提供することができた。Ｆｃ□Ｒ１活性化は、Ｍ２表現型からキラーＭ１表現型へと単球またはマクロファージを向け直し、したがって二重または三重特異性エンゲージャーにおいてＦｃ□Ｒ１結合ドメインを有することは、腫瘍細胞障害性のため腫瘍関連マクロファージを再利用する強力な手段であり得る。
[00287]いくつかの実施形態では、二重および三重特異性エンゲージャーは、単球またはマクロファージスカベンジャー受容体に結合する結合ドメインを含む。現在、スカベンジャー受容体の８個のクラスがある（クラスＡ－Ｈ）。いくつかの場合では、複数の名前が同じ受容体に割り当てられている（例えば、ＭＳＲ１、ＳＲ－ＡＩ、ＣＤ２０４、およびＳＣＡＲＡ１）。さらに、他の基準に基づいて名付けられ、通常のスカベンジャー受容体の命名法に含まれない、スカベンジャー受容体活性を示すタンパク質がある。いくつかの例は、ＲＡＧＥ（ＳＲ－Ｅ１）、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、ＡＳＧＰ、ＣＤ１６３、ＳＲ－ＰＳＯＸ、およびＣＸＣＬ１６を含む。いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、レクチン、デクチン１、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体Ａ１（ＳＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＭＳＲ１、ＳＣＡＲＡ３、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ５、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＡＲＢ２、ＣＤ６８、ＯＬＲ１、ＳＣＡＲＦ１、ＳＣＡＲＦ２、ＣＸＣＬ１６、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＳＲＣＲＢ４Ｄ、ＳＳＣ５Ｄ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＲＡＧＥ、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＨｕＣＲＩｇ（Ｌ）、およびＣＤ１６９受容体から選択されるスカベンジャー受容体に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインは、１０－５～１０－１２Ｍまたはそれ以下、または１０－７～１０－１２Ｍまたはそれ以下、または１０－８～１０－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する（つまり、１０５～１０１２Ｍまたはそれ以上、または１０７～１０１２Ｍまたはそれ以上、または１０８～１０１２Ｍの会合定数（ＫＡ）を有する）それらのそれぞれのリガンドに結合する。
[00288]いくつかの実施形態では、スカベンジャー受容体ＳＲＡ１に結合するエンゲージャーの例示的な結合ドメインは、アミノ酸配列もしくはその部分、または配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＲＡＶＳＴＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＭＩＳＳＬＳＳＫＳＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＹＡＫＮＴＶＹＸＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＡＤＬＬＰＹＳＳＳＲＳＬＰＭＧＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１）。
と少なくとも９５％配列同一性を有する配列を有する可変領域を含む。
[00289]スカベンジャー受容体ＳＲＡ１に結合するエンゲージャーの例示的な結合ドメインは、配列番号２～７のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその部分、または配列：
[00290]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＲＡＶＳＴＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＭＩＳＳＬＳＳＫＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＹＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＡＤＬＬＰＹＳＳＴＲＳＬＰＭＧＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２）。
[00291]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＦＳＬＹＤＭＧＷＦＳＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＮＷＳＧＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＫＰＡＫＹＨＦＧＳＧＹＲＤＦＡＥＹＰＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３）。
[00292]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＹＡＭＡＷＦＲＨＡＰＧＫＤＲＥＦＶＡＡＶＳＱＳＧＬＬＴＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＤＣＡＡＸＳＲＦＰＬＶＶＰＶＡＹＥＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号４）；［式中、Ｘは自然発生のアミノ酸のいずれかであり得る。］
[00293]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＹＡＭＡＷＦＲＨＡＰＧＫＤＲＥＦＶＡＡＶＳＱＳＧＬＬＴＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＤＣＡＡＤＳＲＦＰＬＶＶＰＶＡＹＥＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号５）。
[00294]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＶＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＳＩＲＴＨＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＴＩＴＳＶＴＳＧＧＳＬＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＬＬＧＦＤＹＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号６）。
[00295]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＧＲＦＶＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＴＩＴＳＩＴＳＧＧＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＶＰＹＶＮＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号７）。
のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する配列を有する結合ドメインを含むことができる。
[00296]いくつかの実施形態では、スカベンジャー受容体ＲＡＧＥに結合するエンゲージャーの例示的な結合ドメインは、配列番号８～１５のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその部分、または配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＩＡＳＧＲＴＦＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＣＣＡＴＥＮＬＡＳＳＧＳＡＹＳＤＤＲＹＮＡＣＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８）。
[00297]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＥＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＲＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＣＳＡＮＮＤＮＲＡＦＹＥＤＳＶＫＧＲＦＡＶＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＲＣＡＡＧＲＶＮＬＹＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）。
[00298]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＧＮＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＶＤＲＤＧＧＳＴＹＹＬＤＳＶＴＧＲＦＴＴＳＲＤＤＡＥＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＩＰＤＤＴＡＶＹＹＣＡＴＲＬＹＧＣＳＧＹＧＲＤＹＡＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１０）。
[00299]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＲＴＦＳＴＤＡＦＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＡＭＲＷＮＧＳＳＳＹＹＡＤＬＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＬＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＡＧＫＲＹＧＹＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１１）。
[00300]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＮＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＳＷＳＧＡＬＴＨＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＳＤＳＤＹＧＮＫＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１２）。
[00301]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＶＳＤＭＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＶＦＶＡＡＩＳＮＳＧＬＳＴＹＹＱＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＡＮＮＴＶＡＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＡＲＳＧＷＳＧＱＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１３）。
[00302]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＮＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＩＳＷＳＧＤＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＴＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＮＹＹＣＡＥＫＱＧＡＤＷＡＰＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１４）。
[00303]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＥＬＴＦＳＬＹＲＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＡＭＳＴＳＧＡＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＶＲＦＧＶＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５）。
のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する配列を有する結合ドメインを含むことができる。
[00304]いくつかの実施形態では、スカベンジャー受容体Ｌｏｘ－１に結合するエンゲージャーの例示的な結合ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその部分、または配列：
[00305]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＤＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＲＴＤＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＲＴＹＹＳＧＳＹＹＦＧＬＧＳＤＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１６）。
のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する配列を有する結合ドメインを含むことができる。
[00306]スカベンジャー受容体Ｌｏｘ－１に結合するエンゲージャーのさらなる例示的な結合ドメインの配列は、以下に示すアミノ酸配列を有する可変領域を含む：
[00307]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＴＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＨＬＴＮＳＧＲＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＳＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＲＬＧＬＨＷＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１７）。
[00308]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＩＧＴＦＳＡＹＨＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＡＩＳＷＳＶＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＳＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＳＧＥＲＹＤＹＹＫＡＱＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１８）。
[00309]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＹＧＳＦＦＳＩＧＴＭＧＷＹＲＱＰＰＧＮＱＲＥＬＶＡＶＴＹＧＬＧＳＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＳＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡＥＩＤＴＤＰＲＳＧＥＷＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１９）。
[00310]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＬＰＳＴＳＴＳＳＬＲＴＶＧＷＹＲＱＧＰＧＫＱＲＤＬＶＡＩＭＳＡＧＴＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＤＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＩＣＮＧＲＰＶＦＳＮＶＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２０）。
[00311]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＶＳＲＤＧＧＳＴＹＹＬＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＳＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＡＡＶＹＹＣＡＡＳＲＹＤＣＳＫＹＬＩＤＹＮＹＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２１）。
[00312]ＥＶＱＬＶＫＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＲＦＳＴＳＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＲＥＲＥＦＶＸＧＩＸＷＮＳＲＸＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＹＹＧＳＸＷＳＶＮＳＤＤＹＤＹＷＸＱＧＸＱＶＴＶＳＳ（配列番号２２）。
[00313]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＱＲＧＲＹＹＹＬＤＲＮＶＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２３）。
[00314]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＤＹＧＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＲＴＹＹＳＧＳＹＹＦＧＬＧＳＤＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２４）。
[00315]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＮＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＶＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＶＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＴＷＬＤＣＳＧＹＧＳＹＤＭＤＹＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）。
[00316]ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＶＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＥＧＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＳＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＳＴＷＬＤＦＶＨＧＮＥＹＤＹＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２６）。
[00317]いくつかの実施形態では、例示的なＳＲＡ－１結合ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列：ＴＹＡＭＧ（配列番号３１）、ＹＤＭＧ（配列番号３２）、ＲＹＡＭＡ（配列番号３３）、ＴＨＡＭＧ（配列番号３４）、ＦＶＡＭＧ（配列番号３５）のいずれか１つであり得る。
[00318]いくつかの実施形態では、例示的なＳＲＡ－１結合ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列；
ＡＭＩＳＳＬＳＳＫＳＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号３６）。
ＡＭＩＳＳＬＳＳＫＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）。
ＡＩＮＷＳＧＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）。
ＡＶＳＱＳＧＬＬＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９）。
ＡＶＳＱＳＧＬＬＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４０）。
ＴＩＴＳＶＴＳＧＧＳＬＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４１）。
ＴＩＴＳＩＴＳＧＧＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４２）。
のいずれか１つであり得る。
[00319]いくつかの実施形態では、例示的なＳＲＡ－１結合ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列：
ＤＬＬＰＹＳＳＳＲＳＬＰＭＧＹＤ（配列番号４３）。
ＤＬＬＰＹＳＳＴＲＳＬＰＭＧＹＤＹ（配列番号４４）。
ＫＰＡＫＹＨＦＧＳＧＹＲＤＦＡＥ（配列番号４５）。
ＸＳＲＦＰＬＶＶＰＶＡＹＥＮ（配列番号４６）。
ＤＳＲＦＰＬＶＶＰＶＡＹＥＮ（配列番号４７）。
ＬＧＦＤＹ（配列番号４８）。
ＶＰＹＶＮＤＹ（配列番号４９）。
［式中、Ｘは自然発生のアミノ酸である］
のいずれか１つであり得る。
[00320]いくつかの実施形態では、例示的なＲＡＧＥ結合ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列：ＤＲＡＩＧ（配列番号５０）、ＮＹＡＩＧ（配列番号５１）、ＴＤＡＦＧ（配列番号５２）、ＮＹＳＭＧ（配列番号５３）、ＤＭＴＭＧ（配列番号５４）、ＮＹＡＭＧ（配列番号５５）、またはＬＹＲＭＧ（配列番号５６）のいずれか１つであり得る。
[00321]いくつかの実施形態では、例示的なＲＡＧＥ結合ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列：
ＡＩＳＷＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７）。
ＣＳＡＮＮＤＮＲＡＦＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号５８）。
ＣＶＤＲＤＧＧＳＴＹＹＬＤＳＶＴＧ（配列番号５９）。
ＡＭＲＷＮＧＳＳＳＹＹＡＤＬＶＫＧ（配列番号６０）。
ＴＩＳＷＳＧＡＬＴＨＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号６１）。
ＡＩＳＮＳＧＬＳＴＹＹＱＤＳＶＫＧ（配列番号６２）。
ＧＩＳＷＳＧＤＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６３）。
ＡＭＳＴＳＧＡＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６４）。
ＣＩＳＲＴＤＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６５）。
のいずれか１つであり得る。
[00322]いくつかの実施形態では、例示的なＲＡＧＥ結合ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列：
ＥＮＬＡＳＳＧＳＡＹＳＤＤＲＹＮ（配列番号６６）
ＲＣＡＡＧＲＶＮＬＹＹＧＭＤＹ（配列番号６７）。
ＲＬＹＧＣＳＧＹＧＲＤＹＡＤ（配列番号６８）。
ＧＫＲＹＧＹＹＤＹ（配列番号６９）。
ＳＤＳＤＹＧＮＫＹＤＹ（配列番号７０）。
ＲＳＧＷＳＧＱＹＤＹ（配列番号７１）。
ＫＱＧＡＤＷＡＰＹＤＹ（配列番号７２）。
ＧＶＲＦＧＶＹＤＹ（配列番号７３）。
のいずれか１つであり得る。
[00323]いくつかの実施形態では、Ｌｏｘ－１結合ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列：ＤＹＡＩＧ（配列番号７４）、ＩＮＡＭＡ（配列番号７５）、ＡＹＨＭＧ（配列番号７６）、ＩＧＴＭＧ（配列番号７７）、ＬＲＴＶＧ（配列番号７８）、ＤＹＡＩＧ（配列番号７９）、ＴＳＧＭＧ（配列番号８０）、ＮＹＡＭＧ（配列番号８１）、ＤＹＧＩＧ（配列番号８２）、ＤＹＶＩＧ（配列番号８３）のいずれか１つであり得る。
[00324]いくつかの実施形態では、Ｌｏｘ－１結合ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列：
ＨＬＴＮＳＧＲＴＧＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８４）
ＡＩＳＷＳＶＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）
ＶＴＹＧＬＧＳＴＮＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号８６）
ＩＭＳＡＧＴＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８７）
ＣＶＳＲＤＧＧＳＴＹＹＬＤＳＶＫＧ（配列番号８８）
ＧＩＸＷＮＳＲＸＴＹＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号８９）
ＡＩＴＷＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９０）
ＣＩＳＳＳＤＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９１）
ＣＩＳＳＶＥＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９２）
ＣＩＳＳＳＥＧＳＴＹＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号９３）
［式中、Ｘは自然発生のアミノ酸である］
のいずれか１つであり得る。
[00325]いくつかの実施形態では、Ｌｏｘ－１結合ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列：
ＧＲＴＹＹＳＧＳＹＹＦＧＬＧＳＤ（配列番号９４）
ＬＧＬＨＷＳ（配列番号９５）
ＲＳＧＥＲＹＤＹＹＫＡＱＹＥＹ（配列番号９６）
ＥＩＤＴＤＰＲＳＧＥＷＤＹ（配列番号９７）
ＲＰＶＦＳＮＶＤＹ（配列番号９８）
ＳＲＹＤＣＳＫＹＬＩＤＹＮＹ（配列番号９９）
ＮＹＹＧＳＸＷＳＶＮＳＤＤＹＤＹ（配列番号１００）
ＡＱＲＧＲＹＹＹＬＤＲＮＶＥＹＤ（配列番号１０１）
ＧＲＴＹＹＳＧＳＹＹＦＧＬＧＳＤＥＹＤＹ（配列番号１０２）
ＧＴＷＬＤＣＳＧＹＧＳＹＤＭＤＹ（配列番号１０３）
ＳＴＷＬＤＦＶＨＧＮＥＹＤＹ（配列番号１０４）
のいずれか１つであり得る。
[00326]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、例えばＭＲＣ１、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＭＯ、ＢＡＩＬ Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＰＩ３Ｋ、ＦｃγＲ１、ＦｃｙＲ２Ａ、ＦｃｙＲ２Ｂ２、ＦｃｙＲ２Ｃ、ＦｃｙＲ３Ａ、ＦｃＥＲ１、ＦｃαＲｌ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１、およびＣＤ７９ｂのいずれか１つの活性化を介して、食作用活性化シグナルまたは炎症促進性シグナルを生成することができるタンパク質に結合する結合ドメインを含む。
[00327]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、ＴＲＥＭタンパク質の細胞外ドメインに結合する結合ドメインを含む。ＴＲＥＭ１、２、３。ＴＲＥＭは、共通の構造特性を共有し、Ｖ型の単一の細胞外免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部の存在を含む。特に、ＴＲＥＭ膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、１２ｋＤａのＤＮＡＸ活性化タンパク質（ＤＡＰ１２）の正電荷残基と相互作用する負電荷残基、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する膜貫通アダプターを持つ。
Ｄ．骨髄性細胞の炎症活性を促進するドメインを有するエンゲージャー
[00328]単球またはマクロファージの活性化は、炎症活性の増加をもたらすことができる。活性化したＭ１単球またはマクロファージは、ＩＦＮ－ガンマ産生、ならびに炎症促進性サイトカイン、数例挙げると、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、およびＴＮＦの産生によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージＭ１表現型は、ＩＬ－１シグナル伝達カスケードと関連する強力な炎症促進性応答およびインフラマソーム活性化と関連する。
[00329]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、インフラマソームおよび炎症促進性シグナルを起動するのに必要なシグナルを生成するドメインを含んでもよい。トール様受容体、ＴＬＲは、インフラマソーム活性化を誘導することが公知である。ＴＬＲは、結果的にＮＦ－κＢおよび活性化タンパク質－１（ＡＰ－１）の活性化になる保存された炎症経路を誘発する。ＴＬＲリガンドは、高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０）、エンドトキシン、および細胞外マトリックス構成要素を含む。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４は、例えばリガンド結合によって活性化され、次いでインフラマソーム活性化と関連する炎症促進性カスパーゼを活性化する細胞外ドメインを含む。細胞内シグナル伝達経路は、シグナル伝達タンパク質、例えば炎症促進性カスケードを動員し、それらの切断および活性化を誘導するＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）によって媒介される。これは、ＲＯＳの直接活性化をもたらし、ピロトーシスとして公知の激しい細胞死を生じることが多い。４つのインフラマソーム複合体、ＮＬＲＰ１ｍ、ＮＬＲＰ３、ＩＰＡＦおよびＡＩＭ２がある。
[00330]いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、インフラマソームおよび炎症促進性シグナルを起動するのに必要なシグナルを生成する結合ドメインを含んでもよく、ＴＬＲ４などのＴＬＲに結合すする。ＴＬＲ４は、単球またはマクロファージで発現され、ＬＰＳおよび他のリガンドによって誘導される。いくつかの実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーはＴＬＲリガンドに結合してもよく、次いでＴＬＲに結合する。
Ｅ．骨髄性細胞の細胞接着および炎症活性を促進するドメインを有するエンゲージャー
[00331]細胞－細胞および細胞－基質接着は、多様なタンパク質リガンドへのインテグリン細胞外ドメインの結合により媒介されるが、これらの接着相互作用および細胞拡散または遊走などの動的細胞応答へのそれらの翻訳の細胞制御は、インテグリン細胞質尾部を必要とする。これらの短い尾部は、受容体をシグナル伝達経路および細胞骨格ネットワークに接続する細胞内リガンドに結合する。インテグリンは、αおよびβサブユニットの非共有結合性会合により形成されるヘテロ二量体接着受容体である。各サブユニットは、β４サブユニット、短い細胞質尾部を除く、比較的大きな細胞外ドメインを有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。個々のインテグリンファミリーメンバーは複数のリガンドを認識する能力を有する。インテグリンは、多くの細胞外マトリックスタンパク質（骨マトリックスタンパク質、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびフォンビルブランド因子）に結合することができ、細胞外マトリックスへの細胞接着におけるインテグリンの主要な機能を表す。多くの「対抗受容体」はリガンドであり、細胞－細胞相互作用の媒介におけるインテグリンの役割を表す。インテグリンは構造変化を受け、リガンド親和性を増加させる。
[00332]インテグリンβ２サブファミリーは、４つの異なるインテグリン受容体、αＭβ２（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、Ｍａｃ－１、ＣＲ３、Ｍｏ－１）、αＬβ２（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＬＦＡ－１）、αｘβ２（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）、およびαＤβ２（ＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８）からなる。これらの白血球インテグリンは、免疫応答、血管内皮への接着および血管内皮を通る輸送、病原体の食作用、および白血球活性化を含む、白血球機能の事実上全ての態様に関与する。
[00333]全てのβ２インテグリンのαサブユニットは、ＩまたはＡドメインと呼ばれる～２００アミノ酸の挿入領域を含有する。高度に保存されたＩドメインは、いくつかの他のインテグリンαサブユニットおよび特定の凝固および補体タンパク質などの他のタンパク質に見出される。Ｉドメインは、タンパク質－タンパク質相互作用を媒介し、インテグリンでは、それらはタンパク質リガンドの結合に一体的に関与する。Ｉドメインは、それらのインテグリンのリガンド結合機能を支配するが、αサブユニットの他の領域はリガンド認識に影響する。例として、αＭβ２では、ｍＡｂ（ＯＫＭ１）はＩドメインの外側のエピトープを認識するが、αＭサブユニットはリガンド結合を阻害し；αＬβ２およびα２β１のＥＦハンド領域、それらのαサブユニットにＩドメインを有するインテグリンは、リガンド認識に貢献する。αＭサブユニット、およびおそらく他のαサブユニットは、非タンパク質リガンドの結合に関与するレクチン様ドメインを含有し、占有はＩドメインの機能を調節し得る。
[00334]インテグリンは酵素活性を欠如するため、シグナル伝達は代わりに細胞膜の細胞質面のシグナル伝達複合体のアセンブリーによって誘導される。これらの複合体の形成は、２つの方法で達成される；１つ目は、それによりエフェクター分子の結合の発生率を増加する分子相互作用の結合活性を増加する受容体クラスタリングにより、２つ目は、エフェクター結合部位を作成または暴露する受容体の構造変化の誘導による。ＥＣＭ内では、インテグリンは、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、テネイシン、ビトロネクチンおよびトロンボスポンジンを結合する能力を有する。インテグリン／ＥＣＭ相互作用のクラスターは接着点を形成し、細胞骨格成分と細胞内のシグナル伝達分子を接続する。インテグリンの細胞質尾部は、α－アクチニンおよびタリンの結合部位として寄与し、次いでビンクリン、Ｆアクチンの膜への繋留に関与するタンパク質を動員する。タリンは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ□）などのキナーゼによって活性化される。
[00335]インテグリンはセレクチンによって活性化される。白血球は、Ｌ－セレクチンを発現し、活性化された血小板はＰ－セレクチンを発現し、活性化された内皮細胞はＥ－およびＰ－セレクチンを発現する。Ｐ－セレクチン媒介性接着は、β２インテグリンのケモカインまたは血小板活性化因子起動活性化を可能にし、接着を安定化する。それは、接着した白血球からのケモカインの放出も促進する。Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド１の細胞質ドメインは、Ｎｅｆ関連因子１と構成的な複合体を形成した。Ｐ－セレクチンの結合後、ＳｒｃキナーゼはＮｅｆ関連因子１をリン酸化し、ホスホイノシチド－３－ＯＨキナーゼｐ８５－ｐ１１０δヘテロ二量体を動員し、白血球インテグリンの活性化を生じる。Ｅ－セレクチンリガンドは、β２インテグリン機能にも影響するシグナルを導入する。セレクチンは、Ｓｒｃファミリーキナーゼの活性化を起動する。セレクチン結合によって活性化されたＳＦＫは、ＤＡＰ１２およびＦｃＲγの細胞質ドメインの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化する。いくつかの点で、ＣＤ４４はＥ－セレクチンからのシグナルを導入するのに十分である。ＣＤ４４は、インテグリンの内側から外側のシグナル伝達を起動する。インテグリン活性化の最終の共通ステップは、βサブユニットの細胞質尾部へのタリンの結合である。細胞質アダプターの別の群であるキンドリンは、インテグリンβ尾部の異なる領域に結合する。キンドリンはタリン活性化インテグリンのクラスタリングを増加する。キンドリンはセレクチンシグナル伝達に応答するが、キンドリンはほとんど好中球などの造血幹細胞に見出される。セレクチンシグナル伝達ならびにケモカイン構成要素によるインテグリン活性化の際のシグナル伝達は、ＳＦＫ、Ｓｙｋ、およびＳＬＰ－７６を含む構成要素を共有する。
[00336]いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、インテグリンまたはセレクチン、例えばＰ－セレクチン、Ｌ－セレクチンまたはＥ－セレクチンなどの接着分子の細胞外ドメインに結合することができる。
Ｆ．骨髄性細胞の抗食作用活性および抗炎症活性を阻害する結合ドメインを有するエンゲージャー
[00337]一態様では、二重または三重特異性エンゲージャーは、単球またはマクロファージ食作用のＣＤ４７媒介性下方制御を阻害するさらなる機能性ドメインを含んでもよい。腫瘍細胞は、典型的には、単球またはマクロファージ受容体ＳＩＲＰ－αに結合し、食作用を阻害する「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルＣＤ４７を発現する。したがって、ＣＤ４７の阻害は、腫瘍細胞媒介性の抗食作用活性を妨害する。二重または三重特異性エンゲージャーの１つのアームは、ＣＤ４７ブロッカーを含んでもよい。エンゲージャーと会合するＣＤ４７遮断剤は、ＳＩＲＰ－αの細胞外ＣＤ４７結合ドメインであってもよく、デコイ受容体または中和受容体として作用する。
[00338]一態様では、本明細書では、免疫細胞で発現される膜タンパク質のＳｉｇｌｅｃファミリーのメンバーによる食作用調節性シグナル伝達を阻害することができる組成物を開示する。ファミリーの様々なメンバーは、膜タンパク質のシアル酸付加グリカンと接触するとチェックポイントシグナルを導入する。いくつかのメンバーでは、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質の細胞内ドメインは、複数の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＩＴＩＭは、それらの細胞質尾部にコンセンサスアミノ酸配列、つまり（Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｓ）－Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｘ－（Ｌ／Ｖ）を共有し、Ｘは任意のアミノ酸、Ｉ＝イソロイシン、Ｖ＝バリン、Ｌ＝リジン、Ｓ＝セリン、Ｙ＝チロシンを示す。ＩＴＩＭモチーフでのチロシン残基のリン酸化は、負の調節性因子を含有する２つのＳＨ２ドメインのいずれかを動員する：イノシトールホスファターゼＳＨＩＰ（イノシトールホスファターゼ５－ホスファターゼを含有するＳｒｃ相同性２）またはチロシンホスファターゼＳＨＰ－１（タンパク質チロシンホスファターゼ－１を含有するＳｒｃ相同性２）。（Ｙ＋２）位のロイシンはＳＨＩＰへの結合を好むが、（Ｙ－２）位のイソロイシンはＳＨＰ－１結合を好む。ＩＴＩＭは、別のチロシンホスファターゼ、ＳＨＰ－２にも結合することができるが、ＳＨＰ－２がＩＴＩＭ媒介性阻害に機能的役割を果たすという証拠は、他の媒介因子よりも明確ではない。したがって、シアル酸残基との結合による細胞外リガンド結合ドメインでのＳｉｇｌｅｃ膜タンパク質の活性化は（例えば、シアル酸付加の膜グリカンタンパク質において）、ＩＴＩＭがリン酸化される細胞内シグナルを受け、食作用能の減少を含む免疫調節のためのＳＨＰ媒介性シグナル伝達を開始する。
[00339]Ｓｉｇｌｅｃファミリー受容体は、膜タンパク質、ｓｉｇｌｅｃ１（ＣＤ１６９）、ｓｉｇｌｅｃ２（ＣＤ２２）、ｓｉｇｌｅｃ３（ＣＤ３３）、ｓｉｇｌｅｃ４（ＭＡＧ）、ｓｉｇｌｅｃ５、ｓｉｇｌｅｃ６、ｓｉｇｌｅｃ７、ｓｉｇｌｅｃ８、ｓｉｇｌｅｃ９、ｓｉｇｌｅｃ１０、ｓｉｇｌｅｃ１１、ｓｉｇｌｅｃ１２、ｓｉｇｌｅｃ１３、ｓｉｇｌｅｃ１４、ｓｉｇｌｅｃ１５、ｓｉｇｌｅｃ１６を含む。
[00340]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＳｇＲ受容体が遮断され、ＳｇＲ誘導免疫調節細胞内シグナル伝達が阻害されるように、Ｓｉｇｌｅｃ受容体（ＳｇＲ）の結合ドメインを含んでもよい。
エンゲージャーの特異的多量体ドメイン
[00341]また、二重および三重特異性エンゲージャーの分子設計で想定されるのは、さらなる構造およびモジュール式に、および付随して複数の標的と結合するエンゲージャーの能力を助けるヘルパーである。これらの設計は、二重または三重特異性抗体、トリボディまたはトリプルボディフォーマットなどの、リンカーによって分けられる２つまたはそれ以上の結合ドメインのさらなる繋留または留め金エレメントを含む。これらの高次多特異性の結合ドメインは、多量体化ドメインの包括を必要とすることが多く、同じおよび異なる細胞での複数のドメイン結合における安定性および可動性を改善する。さらなる繋留または留め金エレメントは同族対で生じ、同族対の繋留または留め金様式の１つがエンゲージャーの結合ドメインの１つに接着され、対の他方は同族対のその他の方に接着される。
[00342]いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、本明細書全体に記載される複数の結合ドメインを含む組換えタンパク質であり、それぞれ個々の結合特異性を有し、それぞれ互いに相補性結合を示す同族ペプチド繋留または留め金エレメントを有するリンカーによって共に連結される。例えば、組換えタンパク質の１つの結合ドメインは第１の対の同族ペプチドと融合し、他の結合ドメインは第２の対のペプチドと融合され、対のペプチドは互いに相補性結合を示し、対の同族ペプチドは：（ａ）互いに相補性結合を示すロイシンジッパードメイン；例えばｃ－Ｆｏｓおよびｃ－Ｊｕｎタンパク質の結合領域内のジッパー配列などの自然発生のタンパク質－タンパク質相互作用におけるロイシンジッパー、（ｂ）合成留め金を介して互いに特異的に結合するように設計された合成ペプチドを含む。
[00343]いくつかの実施形態では、治療剤は、組換えタンパク質に含まれるロイシンジッパーペプチド対により、互いの加速した会合を促進するように形成された複数の結合断片を含む組換えタンパク質である。ロイシンジッパー配列は、７個のロイシンリピートを含み、２つのペプチドがロイシンジッパー構造を持つ場合、接着性のペプチド対を構成することが多い。自然発生のロイシンジッパーの中で、ｃ－Ｆｏｓおよびｃ－Ｊｕｎ対は最も広く知られている。それらは、ＫＤ：５．４×１０－８Ｍの強い結合親和性を示す。それは、平行コイルを形成する。いくつかの実施形態では、ロイシンジッパーコイルはｃ－Ｆｏｓ：ｃ－Ｊｕｎ対のコイルである。いくつかの実施形態では、例示的な同族対の繋留または留め金エレメントは、ＡＣＩＤ－ｐ１（ＬＺＡ）およびＢＡＳＥ－ｐ１（ＬＺＢ）対を含み、アミノ酸側鎖間の電荷の間の静電反発力によりホモ二量体の形成を防止する。ホモ二量体化の防止は、多くの実施形態で有益であり得る。
[00344]例示的なｃ－Ｆｏｓロイシンジッパードメインは、以下：
ＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号１１９）
のアミノ酸配列を含む。
[00345]例示的なｃ－Ｊｕｎロイシンジッパードメインは、以下：
ＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨ（配列番号１２０）
のアミノ酸配列を含む。
[00346]例示的なＬＺＡロイシンジッパードメインは、以下：
ＡＱＬＥＫＥＬＱＡＬＥＫＥＮＡＱＬＥＷＥＬＱＡＬＥＫＥＬＡＱＫ（配列番号１２１）
のアミノ酸配列を含む。
[00347]例示的なＬＺＢロイシンジッパードメインは、以下：
ＡＱＬＫＫＫＬＱＡＬＫＫＫＮＡＱＬＫＷＫＬＱＡＬＫＫＫＬＡＱＫ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を含む。
[00348]いくつかの実施形態では、治療剤は、組換えタンパク質に含まれるペプチド対のｃ－Ｆｏｓ／ｃ－Ｊｕｎ結合ドメインにより互いに加速した会合を促進するように形成された複数の結合断片を含む組換えタンパク質である。
[00349]いくつかの実施形態では、繋留または留め金エレメントは特定のヘテロ二量体化能を示し、ホモ二量体化を示さない。
[00350]いくつかの実施形態では、治療剤は、合成留め金により互いに加速した会合を促進するように形成された複数の結合断片を含む組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、合成繋留または留め金エレメントは、ヘテロ二量体化するように設計され、ホモ二量体化を防止する。
[00351]いくつかの実施形態では、リンカーの合成留め金は非ペプチド架橋剤である。
[00352]いくつかの実施形態では、互いに同族ペプチドの相補性結合は、架橋などの化学結合を介することができる。化学架橋剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの架橋を活性化するために有用であり得る。市販のホモおよびヘテロ二官能性タンパク質架橋剤がある。例はＢＳ２Ｇ架橋剤（ＢＳ２Ｇ、ビス［スルホスクシンイミジル］グルタミン酸）を含み、アミン反応性、水溶性、ホモ二官能性タンパク質架橋剤（同一の反応基を有するスペーサーアームの反対端の両結合ユニット）であり、またはその膜透過性バージョン、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタル酸；Ｄｉ（Ｎ－スクシンイミジル）グルタル酸）；ＢＳ３架橋剤（ビス［スルフォスクリンイミジル］基質；Ｓｕｌｆｏ－ＤＳＳ；ＢＳＳＳ）またはＤＳＴ架橋剤（ジスクシンイミジル酒石酸）はペプチドの他のホモ二官能性架橋剤であるが；ＢＭＰＳ（Ｎ－（β－マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミジルエステル；ＭＢＳ架橋剤（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）；ＰＤＰＨ架橋剤（３－［２－ピリジルジチオ］プロピノイルヒドラジド）は、いくつかのヘテロ二官能性架橋剤の例を提供する。
[00353]いくつかの実施形態では、多重特異性エンゲージャー内で縦に配置された可変軽鎖（ＶＬ）サブユニットおよび可変重鎖（ＶＨ）領域は、同族ペプチド繋留または留め金エレメントを有する２つのリンカーを介して連結されてもよい。リンカーの長さは、特定のＶＬ－ＶＨ会合を限定または促進することができる。例えば、リンカーペプチド長を１０アミノ酸より短く限定することは、２つの隣接するＶＬおよびＶＨドメインの間の会合を制限する。
[00354]いくつかの実施形態では、繋留または留め金エレメントはＫＤ：５×１０－６Ｍより低い、または１０－６Ｍより低い、５×１０－７Ｍより低い、または４×１０－７Ｍより低い、または３×１０－７Ｍより低い、または２×１０－７Ｍより低い；または１０－７Ｍより低い、または９×１０－８Ｍより低い、または８×１０－８Ｍより低い、または７×１０－８Ｍより低い、または６×１０－８Ｍより低い、または５×１０－８Ｍより低い、または４×１０－８Ｍより低い、または３×１０－８Ｍより低い、または２×１０－８Ｍより低い、または１０－８Ｍより低い、または１０－８Ｍより低い、または１０－１０Ｍより低いを有する親和性、または高親和性を示す。
[00355]さらに、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体ユニットのアセンブリーによって形成されるこれらの高次多重特異性エンゲージャー（例えば、複数の結合ドメインを有するエンゲージャー）におけるさらなる繋留またはヘテロ多量体化ドメインの包括は、多重特異性エンゲージャーの産生、フォールディング、安定性および組織利用可能性を助ける。
炎症遺伝子の共発現
[00356]一態様では、組換え核酸は、操作した細胞で発現される炎症促進性遺伝子のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、炎症促進性遺伝子はサイトカインである。例としては、限定はされないが、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、またはＩＬ－１２またはインターフェロンが挙げられる。いくつかの実施形態では、炎症促進性遺伝子のコード配列をコードする組換え核酸は、少なくとも第１の治療剤に伴うさらなる治療剤などの治療剤である。
ペプチドリンカー
[00357]いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメイン、ｓｃＦｖまたは結合ドメインは、リンカーによって互いに連結される。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインに１つより多くのｓｃＦｖがあり、１つより多くのｓｃＦｖはリンカーによって互いに連結される。
[00358]いくつかの実施形態では、リンカーは可動性である。いくつかの実施形態では、リンカーはヒンジ領域を含む。リンカーは通常、短いペプチド配列である。いくつかの実施形態では、リンカーはグリシンおよび１つまたは複数のセリン残基の鎖である。ペプチドリンカーに好まれる他のアミノ酸は、限定はされないが、スレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、リジン（Ｌｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、およびアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）を含む。これらのうちのＰｒｏ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎは、天然のリンカーに頻繁に使用されるアミノ酸である。Ｐｒｏは、非常に制限された構造を引き起こす環状側鎖を有するユニークアミノ酸である。Ｐｒｏリッチ配列は、ドメイン間のリンカーとして使用され、ピルビン酸脱水素酵素（ＧＡ２ＰＡ３ＰＡＫＱＥＡ３ＰＡＰＡ２ＫＡＥＡＰＡ３ＰＡ２ＫＡ）のｌｉｐｏｙｌとＥ３結合ドメインの間のリンカーを含む。本開示の目的のため、経験的なリンカーは、可動性リンカー、堅いリンカー、および切断可能リンカーであってもよい。（Ｇ４Ｓ）ｘ（ｘは、１、２、３、４などとして示される複数コピーの部分である）などの配列は、可動性リンカー配列を含む。本明細書で使用する他の可動性配列は、グリシンのいくつかの反復、例えば（Ｇｌｙ）６または（Ｇｌｙ）８を含む。一方、堅いリンカーは、例えば堅いリンカーを生じるｘが整数１、２、３、４等であるリンカー（ＥＡＡＡＫ）ｘを使用してもよい。
[00359]リンカーペプチドの長さは、多重特異性エンゲージャーの設計に重要であり得る。例えば、リンカーペプチド長を１０アミノ酸以下に限定すると、２つの隣接するドメイン間の会合を制限する。いくつかの実施形態では、リンカーは、繋留または留め金機能を含んでもよく、架橋結合部分を含んでもよい。架橋結合部分はペプチドまたは化学架橋結合部分であってもよく、そのいくつかは先の節に記載される。
[00360]特定の機能を有する特定のペプチドは、本文書の他の部分で議論した。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、骨髄性細胞のアクチベーターまたはシグナルとしてさらに機能してもよい。例えば、ＴＬＲ４活性化ペプチドは、エンゲージャーの２つの結合ドメイン間のリンカー内に組み込まれてもよく、ＴＬＲ４活性化ペプチドは、単球またはマクロファージにおいてＴＬＲ４シグナルに結合し、活性化する。
[00361]いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは条件的に切断可能なリンカーとしてさらに機能してもよい。条件的に切断可能なことにより、ペプチドは、それを切断する薬剤が利用可能である場合に切断されると理解される。例えば、ＭＭＰ２切断可能ペプチドが本明細書に記載され、ペプチドがＭＭＰ２リッチな領域にある場合のみ容易に切断される。例示的なＭＭＰ２切断可能ペプチドはＧＰＬＧＶＲである。
[00362]いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは標的化ペプチドとしてさらに機能してもよい。例えば、Ｍ２ペプチドが記載され、Ｍ２単球またはマクロファージに結合することができ、腫瘍関連単球またはマクロファージ表現型に優勢である。例示的なペプチドはＹＥＱＤＰＷＧＶＫＷＷＹである。
[00363]任意の１つまたは複数のペプチドリンカーは、それらが二量体化、三量体化または多量体化することができるなど、特定の機能を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、ロイシンジッパー配列を含んでもよい。
[00364]いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーまたは繋留もしくは留め金を有する２つのリンカーペプチドは共に、５０アミノ酸またはそれ以下、４５アミノ酸またはそれ以下、４０アミノ酸またはそれ以下、３５アミノ酸またはそれ以下、３０アミノ酸またはそれ以下、２５アミノ酸またはそれ以下、２０アミノ酸またはそれ以下、１５アミノ酸またはそれ以下、１０アミノ酸またはそれ以下、または５アミノ酸またはそれ以下の長さにわたる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーまたは繋留もしくは留め金を有する２つのリンカーペプチドは共に、２５アミノ酸またはそれ以下、２４アミノ酸またはそれ以下、２３アミノ酸またはそれ以下、２２アミノ酸またはそれ以下、２１アミノ酸またはそれ以下、２０アミノ酸またはそれ以下、１９アミノ酸またはそれ以下、１９アミノ酸またはそれ以下、１８アミノ酸またはそれ以下、１７アミノ酸またはそれ以下、１６アミノ酸またはそれ以下、１５アミノ酸またはそれ以下、１４アミノ酸またはそれ以下、１３アミノ酸またはそれ以下、１２アミノ酸またはそれ以下、１１アミノ酸またはそれ以下、１０アミノ酸またはそれ以下、９アミノ酸またはそれ以下、８アミノ酸またはそれ以下、７アミノ酸またはそれ以下、６アミノ酸またはそれ以下、または５アミノ酸またはそれ以下の長さにわたる。
単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを調製する方法
[00365]本明細書に記載のエンゲージャーは、組換えタンパク質として産生される。一般に、ポリヌクレオチド配列は組換えタンパク質をコードするように構築され、発現のために適切な方向および正確なリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに調製および挿入され、必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主（例えば細菌）によって認識される適切な転写および翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、そのような制御は一般に発現ベクターで利用可能である。次いでベクターは、標準的な技術を使用するクローニングのための宿主細菌へと導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。
[00366]組換えポリヌクレオチドは、例えば、当業者に周知の分子クローニング技術を使用して同じオープンリーディングフレームに第１の結合ドメイン、リンカー、および第２の結合ドメインをコードするＤＮＡをライゲートすることによって合成される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチド配列は、単一のポリペプチドの生成のための同じプロモーターおよび調節性エレメント下に配置される。いくつかの実施形態では、短いスペーサーは、スペーサーが翻訳後切断部位をコードしてもよい２つのポリペプチドをコードする２つの隣接するポリヌクレオチドの間に挿入されてもよい。２つのポリペプチドは、特定の切断部位での切断の導入によって翻訳後に分けられ得る。いくつかの実施形態では、構築物はモノシストロニックまたはポリシストロニックであってもよい。いくつかの実施形態では、１つより多くのポリペプチドが生成され、次いで翻訳後に再アセンブルされる。例えば、抗体の軽鎖および重鎖ドメインまたはその一部は、２つの独立したポリヌクレオチド配列からの翻訳によって生成することができ、翻訳後に互いに自由にアセンブルすることが可能である。あるいは、互いに結合するＬＣおよびＨＣ可変ドメインを含有する複数のポリペプチド鎖は、単一のポリヌクレオチドから転写および翻訳され、翻訳後に次いで再アセンブルすることができるそれぞれのペプチド鎖へと切断される。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有し、ポリペプチドの成熟形態を形成することができる。
[00367]いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、ポリペプチドの分泌のためのポリペプチドの上流にＮ末端シグナル配列をコードする。いくつかの実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は分泌配列を含む。分泌のためのＮ末端シグナル配列を有する生じる翻訳されたタンパク質産物は細胞によって分泌されるであろう。
[00368]いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、リポフェクタミン、またはリン酸カルシウムを使用する、または電気穿孔またはヌクレオフェクションなどの物理的な手段を介するなどのトランスフェクションの公知の方法により細胞に導入または組み込まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、感染によって細胞に導入または組み込まれ、ウイルス形質導入として公知のプロセスである。
[00369]いくつかの実施形態では、組換え核酸は発現ベクターにインテグレートまたは組み込まれる。ベクターは、１つまたは複数のプロモーター、およびエンハンサー、結合配列、開始および終止コドン、５’ＵＴＲ、転写安定化エレメントを含む３’ＵＴＲ、場合により保存調節性タンパク質結合配列およびその他を含む他の調節性構成要素を含む。
[00370]いくつかの実施形態では、本明細書で使用のベクターは、発現のために特異的に増強される。プロセスを通して使用する他の例示的なベクターは、ファージ、コスミド、または人工染色体を含む。
[00371]いずれか１つの第１のバインダードメイン（がん細胞または疾患細胞などの標的細胞または病原体に結合するトメイン）は、骨髄性細胞に結合する第２のバインダードメインまたは本明細書のどこかに記載する第３の結合ドメインと組み合わせて設計され得る。
[00372]ウイルスベクター：いくつかの実施形態では、組換えタンパク質の発現のためのベクターは、ウイルスオリジン、主にレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸をコードする核酸はレンチウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、インハウスで調製され、目的のためにラージスケールで製造される。いくつかの実施形態では、当業者に公知のように市販のレンチウイルスベクターが利用される。
[00373]いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
[00374]脂質ナノ粒子媒介性送達：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、極性および／または非極性脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、コレステロールは効率的な送達のためにＬＮＰに存在する。ＬＮＰは、直径１００～３００ｎｍであり、単球またはマクロファージを含む様々な細胞型へのｍＲＮＡ送達の効率的な手段を提供する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養で細胞へと組換え核酸を導入するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは核酸をカプセル化し、核酸は裸のＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは核酸をカプセル化し、核酸はｍＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは核酸をカプセル化し、核酸はプラスミドベクターなどのベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは核酸をカプセル化し、核酸はｃｉｒｃＲＮＡ分子である。
[00375]いくつかの実施形態では、ＬＮＰは核酸を対象へと送達するために使用される。ＬＮＰは、対象において全身的に核酸を送達するために使用され得る。それは注射によって送達され得る。いくつかの実施形態では、核酸を含むＬＮＰは静脈内経路によって注射される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは皮下に注射される。
[00376]微小気泡媒介送達：いくつかの実施形態では、微小気泡は、対象において、例えば核酸を含む組成物の送達のために使用され得る。パーフルオロカーボン充填微小気泡は、血液プール剤として血管での循環に安定であり、それらは、目的の部位に到達するまでこれらの薬剤の担体として作用する。次いで、皮膚表面に適用した超音波は、この部位で微小気泡をバーストするために使用することができ、薬剤の局所放出を起こす。微小気泡の様々な他の形態は、Ｓｏｎａｚｏｉｄ Ｏｐｔｉｓｏｎ、ガス充填アルブミン微小気泡、およびＰＥＳＤＡを含む。意図した送達の部位とともに、送達される治療剤の組成物に関して、微小気泡の組成物の最適化が必要である。
[00377]いくつかの実施形態では、組換えタンパク質、例えばエンゲージャー、または共発現される炎症性タンパク質、または骨髄性細胞で発現されるように設計された任意の会合タンパク質は、組換え核酸によってコードされてもよく、組換え核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、組換え核酸はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、発現および安定性を増強するための１つまたは複数の改変を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、改変は、限定はされないが、塩基類似体、または改変ヌクレオチドとの核酸塩基の置換；ｍＲＮＡ内の１つまたは複数のモチーフの挿入、および５’－および３’ＵＴＲでの改変の導入を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、それを必要とする対象に直接投与されてもよい。
医薬組成物
[00378]本明細書では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む医薬組成物を提供する。組成物の単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは、ペプチドもしくはポリペプチドの形態、または複数のペプチドの複合体であってもよい。単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは、精製した組換えタンパク質として組成物で提供されてもよい。単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは、コンジュゲート組換えタンパク質、ＶＨＨ複合体、ｓｃＦｖ複合体またはナノボディとして組成物で提供されてもよい。単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは、組換え単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーをコードするポリヌクレオチドの形態であってもよい。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはｃｉｒｃＲＮＡまたはこれらのいずれか１つのリポソーム組成物を含んでもよい。リポソームはＬＮＰである。
[00379]医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者に周知の他の物質を含み得る。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の効果と干渉しないべきである。担体または他の物質の正確な性質は、投与の経路によるであろう。
[00380]許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性のものであり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基より小さい）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの円形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質を含む。
[00381]許容される担体は、投与する患者に生理的に許容され、それが投与される化合物の治療特性を保持する。許容される担体およびそれらの製剤は、一般に、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＣＯ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０）に記載される。担体の一例は、生理食塩水である。薬学的に許容される担体は、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化する物質などの薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクルであり、一器官、または身体の部分の投与部位から別の器官または身体の部分へ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系での対象化合物の運搬または送達に関与する。許容される担体は、製剤の他の成分と互換性であり、それが投与される対象に有害ではない。また許容される担体はネオ抗原の特定の活性を変更するべきではない。
[00382]一態様では、本明細書は、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される組成物を提供し、溶剤（水性または非水性）、溶液、乳剤、分散媒、コーティング、等張および吸収促進または遅延剤を含み、投与製剤と互換性である。医薬組成物または医薬製剤は、したがって、対象における薬学的使用に好適な組成物を指す。組成物は、投与の特定の経路（つまり全身または局所）と互換性であるように製剤化され得る。したがって、組成物は、様々な経路による投与に好適な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
[00383]いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の免疫細胞の安定性を改善するために許容される添加剤をさらに含み得る。許容される添加剤は免疫細胞の特定の活性を変更しなくてもよい。許容される添加剤の例としては、限定はされないが、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトースおよびこれらの混合物が挙げられる。許容される添加剤は、許容される担体および／またはデキストロースなどの賦形剤と組み合わせることができる。あるいは、許容される添加剤の例としては、限定はされないが、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などの界面活性剤が挙げられ、ペプチドの安定性を増加させ、溶液のゲル化を減少させる。界面活性剤は、溶液の０．０１％～５％の量で組成物に添加され得る。そのような許容される添加剤の添加は、安定性および保存中の組成物の半減期を増加させる。
[00384]医薬組成物は、例えば注射によって投与され得る。注射用組成物は、水性溶液（水溶性）または分散剤および滅菌注射可能溶液または分散剤の即席調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のため、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびこれらの好適な混合物を含有する溶剤または分散培地であり得る。流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。抗菌剤および抗真菌剤は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールを含む。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムは、組成物に含まれ得る。生じる溶液は、使用のためにパッケージ、または凍結乾燥することができ；凍結乾燥製剤は、後に投与前に滅菌溶液と組み合わせることができる。静脈注射または苦痛部位での注射のため、活性成分は、パイロゲンフリーであり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射などの等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を調製することができる。必要に応じて保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含めることができる。滅菌注射可能溶液は、活性成分を上記に列挙した成分の１つまたは組合せを有する適切な溶剤中に必要な量で組み込むことにより調製することができ、必要であれば、続いて濾過滅菌する。一般に、分散剤は、活性成分を基本の分散培地および上記に列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分プラスそれらの事前滅菌濾過溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる。
[00385]組成物は、例えば、単位用量の注射により、従来法で静脈内投与され得る。注射のため、活性成分は、実質的にパイロゲンフリーであり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射などの等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を調製することができる。必要に応じて保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含めることができる。さらに、組成物は、エアロゾル化を介して投与することができる。
[00386]組成物が、医薬または本明細書で提供する任意の方法での使用を検討される場合、組成物がヒト患者に投与された場合に炎症反応または安全ではないアレルギー反応を引き起こさないように、組成物は実質的にパイロゲンフリーであり得ると考えられる。組成物のパイロゲンを試験し、実質的にパイロゲンフリーの組成物を調製することは、当業者によく理解され、市販のキットを使用して達成することができる。
[00387]許容される担体は、吸収を安定化、増加もしくは遅延する、またはクリアランスを増加または遅延する化合物を含有し得る。そのような化合物は、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物；低分子量のタンパク質；ペプチドのクリアランスまたは加水分解を減少させる組成物；または賦形剤もしくは他の安定剤および／または緩衝剤を含む。吸収を遅延させる薬剤は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む。界面活性剤は、リポソーム担体を含む、医薬組成物の吸収を安定化、または増加、または減少させるために使用することもできる。消化から保護するため、化合物は組成物と複合体化して、酸および酵素加水分解に耐性にすることができ、または化合物はリポソームなどの適切な耐性担体に複合体化することができる。化合物を消化から保護する手段が当技術分野で公知である（例えば、Ｆｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１３：１７６０ １７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９ １３５；および米国特許第５，３９１，３７７号）。
[00388]組成物は、投与製剤と対応する方法、および治療有効量で投与することができる。投与される量は、処置される対象、対象の免疫系の活性成分を利用する能力、および所望の結合能の程度による。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、医師の判断により、各個人に固有である。初回投与およびブースターショットの好適なレジメンも多様であるが、その後の注射または他の投与による、１またはそれ以上の時間間隔での初期投与後の反復投与が典型である。あるいは、血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が検討される。
治療方法
[00389]本開示は、がん、および感染症などの疾患の処置（治療）の方法を含み、骨髄性細胞による食作用の増強は、疾患細胞または感染細胞を除去するのに有益であり得る。
[00390]がんは、限定はされないが、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、Ｂ細胞がん（例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、重鎖疾患（例えば、アルファ鎖疾患、ガンマ鎖疾患、およびミュー鎖疾患など）、良性単クローン性免疫グロブリン血症、および免疫球性アミロイドーシス、メラノーマ、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん（例えば、転移性、ホルモン不応性前立腺がん）、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん等を含む。本開示に包含される方法に適用可能ながんの型の他の非限定的な例は、ヒト肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、血管内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、扁平上皮癌、基底細胞がん、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、肝臓がん、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウイルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；および真性多血症、リンパ腫（ホジキン疾患および非ホジキン疾患）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖疾患を含む。いくつかの実施形態では、がんは、限定はされないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、婦人科がん、腎臓がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、または皮膚がんなどの上皮がんである。他の実施形態では、がんは乳がん、前立腺がん、肺がん、または大腸がんである。さらに他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮がんは、限定はされないが、漿液性の、類内膜の、粘液性の、明細胞または未分化を含む様々な他の方法で特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、本開示は、限定はされないが、外套細胞リンパ腫を含む、リンパ腫またはそのサブタイプの処置、診断、および／または予後で使用される。リンパ増殖性障害も増殖性疾患であると考えられる。
[00391]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む、少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、投与用量あたり投与される。いくつかの実施形態では、第１の治療剤の組成物は、第２または第３の治療と組み合わせて投与される。
[00392]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、１回投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、１回より多く投与される。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異性エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、治療の期間にわたり複数回反復投与される。
[00393]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、数カ月、１年またはそれ以上を含む期間にわたり２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回またはそれ以上対象に投与される。
[00394]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、週に１回投与される。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、週に２回投与される。
[00395]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、２週間ごとに１回投与される。
[00396]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、３週間ごとに１回投与される。
[00397]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、月に１回投与される。
[00398]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、２カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、４カ月ごとに１回、５カ月ごとに１回または６カ月ごとに１回投与される。
[00399]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、注射によって投与される。
[00400]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、注入によって投与される。
[00401]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、静脈内注入によって投与される。
[00402]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーを含む少なくとも第１の治療剤を含む組成物は、皮下注入によって投与される。
[00403]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーが使用されなかった場合と比較して、食作用能および単球またはマクロファージ媒介性標的細胞殺作用を増加する。単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置後、腫瘍部位から回収した単球またはマクロファージは、食作用の１０％より高い、または２０％より高い、または３０％より高い、または４０％より高い、または５０％より高い、または６０％より高い、または７０％より高い、または８０％より高い、または９０％より高い、または１００％より高い、または１５０％より高い、または２００％より高い、または２５０％より高い、または３００％より高い、または３５０％より高い、または４００％より高い、または４５０％より高い、または５００％より高い、または６００％より高い、または７００％より高い、または８００％より高い、または９００％より高い、または１０００％より高い増加を示すことができる。
[00404]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、腫瘍部位から回収され得る関連単球またはマクロファージでのＲＯＳ産生を増加する。単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置後に腫瘍部位から回収した単球またはマクロファージは、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、ＲＯＳの２倍より高い、または３倍より高い、または４倍より高い、または５倍より高い、または６倍より高い、または７倍より高い、または８倍より高い、または９倍より高い、または１０倍より高い、または２０倍より高い、または３０倍より高い、または４０倍より高い、または５０倍より高い、または６０倍より高い、または７０倍より高い、または８０倍より高い、または９０倍より高い、または１００倍より高い、または２００倍より高い、または３００倍より高い、または４００倍より高い、または５００倍より高い、または７００倍より高い、または８００倍より高い、または９００倍より高い、または１０００倍より高い増加を示すことができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、腫瘍部位から回収され得る関連単球またはマクロファージでのｉＮＯＳ産生を増加する。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、腫瘍部位から回収され得る関連単球またはマクロファージでの呼吸性バーストを増加する。
[00405]いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、関連単球またはマクロファージでのＣＤ８０の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、処置しない場合と比較して関連単球またはマクロファージでのＣＤ８６の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＴＲＡＩＬ／ＴＮＦファミリー死受容体の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＬＩＧＨＴの発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＨＶＥＭの発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＣＤ４０の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＴＬ１Ａの発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＯＸ４０Ｌの発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＧＩＴＲの発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＳＬＡＭの発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＣＤ５８の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＣＤ１５５の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、関連単球またはマクロファージでのＣＤ１１２の発現を増加することができる。いくつかの実施形態では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーによる処置は、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー処置しない場合と比較して、腫瘍関連骨髄性細胞でのＢ７－ＤＣの発現を増加することができる。
実施例１．材料および方法：
[00406]ダルベッコ改変イーグル培地、トリプシンＥＤＴＡ、ワートマニン（Ｗ）、ＬＹ２９４００２（ＬＹ）、ブラッドフォード試薬、およびリソスタフィンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｒｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入する。血清低減Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地は、Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。ＳＨ－５はＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＰＡ）から獲得し、ＯＳＵ－０３０１２（ＯＳＵ）はＣｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）から購入した。ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬および５０×ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビターカクテルは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入する。細胞は、２４ウェルプレート中で６０～７０％コンフルエンスに増殖させ、培養培地をＤＭＥＭ １０％ＦＣＳに交換した。次いで、同様のタンパク質発現を示すように、１．２μｌのＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬中５ｎｇのｐＣＭＶ５－Ａｋｔ－ＣＡまたは２００ｎｇのｐＣＭＶ５－Ａｋｔ－ＤＮ（比、４：１［ＦｕＧＥＮＥ－ｐｌａｓｍｉｄ］）を、製造業者の説明書に従って、血清低減Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地中のＢＥＣに添加する。
[00407]ＢｉＭＥ、ＴｒｉＭＥおよび多重特異性エンゲージャーのクローニングおよび特徴付けは、試験およびスクリーニング目的の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系など、細菌発現系で実施する。簡潔に言うと、エンゲージャー設計に組み込む結合ドメインのスクリーニング後、特定の可変軽鎖および／または可変重鎖ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれの抗体発現クローンからＰＣＲによって個々に増幅される。結合ドメインがＦａｂ領域全体を含む場合、それぞれの領域はそれぞれの抗体発現クローンからＰＣＲによって増幅される。リンカーは、典型的にはコードされたＦａｂのＣ末端または可変ドメインに酵素的にライゲートされる。あるいは、結合ドメインおよびリンカー配列をコードするポリヌクレオチドは、配列のクローニングによってプラスミドへと組み込まれる。さらに別の代替えの方法では、結合ドメイン（Ｆａｂまたは可変領域）をコードする特定の配列は、オーバーラップＰＣＲによって互いにライゲートされ、Ｆａｂ－リンカー－Ｆａｂ設計を含む大きなインサートは発現ベクターにクローニングされ、エンゲージャーを含むキメラタンパク質を発現する。
[00408]発現されたタンパク質は、一般に公知の技術により精製および濃縮され、産物は、腫瘍標的化および毒性を実験動物で試験される。
[00409]いくつかの例では、キメラタンパク質を含むレンチウイルス構築物を使用して、単球またはマクロファージにキメラ構築物を形質導入する。
実施例２．二重特異性エンゲージャー（ＢｉＭＥ）プラットフォームの構築
[00410]この例では、単球またはマクロファージおよびプロテアーゼマスク部位を有する腫瘍標的が設計される。二重特異性エンゲージャーは、スカベンジャー受容体（ＳＲＡ１）結合ドメインである、単球またはマクロファージ結合ドメインを含む。標的細胞結合ドメインは腫瘍認識ドメイン（例えばＴＲＯＰ２）である。ｓｃＦｖ構築物ポリペプチド設計は、図２Ａに示す。ＶＨＨ構築物ポリペプチド設計は、図２Ｂに示す。別の例示的な設計では、抗原結合ドメインはプロテアーゼ切断可能マスクエレメントによって占有される。さらに、２つの結合ドメインはＴＬＲ４合成ペプチドによって連結される。ｓｃＦｖ構築物ポリペプチド設計は図３Ａに示す。ＶＨＨ構築物ポリペプチド設計は図３Ｂに示す。合成ペプチドは２つのｓｃＦｖに結合されるか（図３Ａ）、または２つの単一ドメインに渡る（図３Ｂ）。特定のＴＬＲ４合成ペプチドリンカーは、単球またはマクロファージのＴＬＲ４受容体を活性化し、単球またはマクロファージ食作用および炎症促進活性を増強する第２の活性化シグナル－シグナル２を提供する。別の例示的な設計では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの２つの結合ドメインは、Ｍ２標的化ペプチドを含む。Ｍ２標的化ペプチドは、ＹＥＱＤＰＷＧＶＫＷＷＹ（配列番号１１６）（Ｍ２－ｐｅｐ）またはＨＬＳＷＬＰＤＶＶＹＡＷ（ＨＬＳｐｅｐ）（配列番号１１７）のアミノ酸配列を有し、腫瘍関連単球またはマクロファージの優勢な表現型であるＭ２単球またはマクロファージを特異的に標的化および結合する。したがって、特定の結合ドメインによる結合および活性化に加えて、この設計では、二重特異性エンゲージャーをさらに用い、特定の細胞、この場合Ｍ２単球またはマクロファージ細胞にエンゲージャーを標的化することができる（図３Ｃおよび図３Ｄ）。
実施例３．二重特異性エンゲージャーの構築および発現
[00411]この例は、リンカー内のアクチベーターペプチド配列を有するＢｉＭＥの構築、発現および試験を記載する。第１に、異なるＴＬＲアクチベーターに由来するペプチド配列が、培養での単球の免疫活性化を試験された。試験された例示的なＴＬＲペプチド配列は以下に列挙する：
[00412]表３．図３Ａおよび図３Ｂに例示した二重特異性エンゲージャー構築物を生成するリンカー配列の一部として使用したＴＬＲアクチベーターペプチド配列は表３に示す。
Figure 2022536684000009
[00413]各ペプチドの免疫応答を試験するため、２×１０６個の単球は、表３由来の１マイクログラム／ｍｌのペプチドと終夜インキュベートし、ＩＬ６およびＴＮＦ－アルファ放出を、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００を使用する蛍光定量的な検出を使用して測定した。図３Ｅに示すように、ＲＳ０１およびＲＳ０９ペプチドは高いＩＬ６放出を誘導した。これら２つのペプチド配列は、次いで上記のプールから選択され、利用して二重特異性エンゲージャーを生成した。同様に、さらにいくつかが試験される。
[00414]二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、分子クローニングによって構築することができる。有効なクローンが生成すると、各クローンをシークエンスし、配列確認することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、（ｉ）ＣＤ５＋腫瘍細胞に結合することができる抗ＣＤ５ ｓｃＦｖ、および（ｉｉ）単球またはマクロファージ細胞のＣＤ１６表面分子に結合することができる抗ＣＤ１６ｓｃＦｖを含む。
[00415]例示的な抗ＣＤ５バインダーは、配列：
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ（配列番号１１１）またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４４）
を含む重鎖を含む。
[00416]別の例示的な抗ＣＤ５バインダーは、配列：
ＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ
（配列番号１１２）またはＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧ ＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４３）
を含む重鎖を含む。
[00417]例示的な抗ＣＤ５バインダーは、アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１１３）
を含む軽鎖を含み得る。
[00418]抗ＣＤ５ ｓｃＦｖを含有する二重特異性または三重特異性エンゲージャーなどの例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）またはＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４５）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１４６）またはＧＧＧＧ（配列番号１４７）を有する、例示的な重鎖と例示的な軽鎖を接続している短いペプチドリンカーを含んでもよい。
[00419]例示的な抗ＣＤ５ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１１５）
を含む。
[00420]例示的な抗ＣＤ１６ ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４１）
を含む重鎖可変配列を含み得る。
[00421]例示的な抗ＣＤ１６ ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
ＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１４２）
を含む軽鎖可変配列を含み得る。
[00422]２つのｓｃＦｖは、表３に記載のものなど、ＴＬＲ活性化ペプチド配列の１つを含む合成ペプチドリンカーによって連結され得る。構築物は、その後、それぞれ図３Ｆまたは図３Ｈに示すように、リンカーにＲＳ０１ ＴＬＲ活性化ペプチド配列を有するＣＤ５－ＲＳ０１－ＣＤ１６、またはリンカーにＲＳ０１ ＴＬＲ活性化ペプチド配列を有するＣＤ５－ＲＳ０９－ＣＤ１６など、バインダー１－リンカー－バインダー２と名付けられる。配列確認したクローンは、次いで好適な細胞で発現され、タンパク質は、好適な陽性対照を使用して、分子マーカーおよびウェスタンブロットを使用するゲル泳動により検出される。
[00423]例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１４８）または任意の他の有用なリーダー配列を含み得る。
[00424]例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４９）または任意の他の有用な親和性タグを含み得る。
[00425]例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１５０）または任意の他の有用なプロテアーゼ切断配列を含み得る。
[00426]例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、第１のリンカーを介して可変軽鎖に連結した可変重鎖を含む第１のｓｃＦｖを含むことができ、第２のリンカーを介して第２のｓｃＦｖに連結することができ、第２のｓｃＦｖは、第３のリンカーを介して可変軽鎖に連結した可変重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、表３に記載のものなど、ＴＬＲ活性化ペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ以上のアミノ酸長を有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０またはそれ以上のアミノ酸長を有する。いくつかの実施形態では、第３のリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ以上のアミノ酸長を有する。
[00427]例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＧＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳｓｇｇｇｇｓＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬｇｇｇｇＱＥＩＮＳＳＹｇｇｇｇｓＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳｓｇｇｇｇｓＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５１）
を含み得る。
[00428]例示的な二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＧＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳｓｇｇｇｇｓＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬｇｇｇｇＡＰＰＨＡＬＳｇｇｇｇｓＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳｓｇｇｇｇｓＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５２）
を含み得る。
[00429]ＣＤ５－ＲＳ０１－ＣＤ１６ ＢｉＭＥの発現は、示したように、還元および非還元下のゲル電気泳動の、図３Ｇ（左）のＳＤＳ ＰＡＧＥにより、および図３Ｇ（右）のウェスタンブロットにより示す。ＣＤ５－ＲＳ０９－ＣＤ１６ ＢｉＭＥの発現は、示したように、還元および非還元下のゲル電気泳動の、図３Ｉ（左）のＳＤＳ ＰＡＧＥにより、および図３Ｉ（右）のウェスタンブロットにより示す。これらのデータは、二重特異性エンゲージャーを含有するＴＬＲ－活性化配列の生成および発現の成功を実証する。上記のエンゲージャーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験される。微粒子ベースの食作用アッセイを使用して食作用の変化を調べた。簡潔に言うと、ストレプトアビジン結合蛍光ポリスチレン微粒子（直径６μｍ）は、ビオチン化された、組換えにより発現および精製されたがんリガンド、この場合ＣＤ５とコンジュゲートされる。ビーズおよびエンゲージャータンパク質の存在下で培養した骨髄性細胞は、リガンドコートした微粒子と１～４時間インキュベートされ、食作用の量はフローサイトメトリーを使用して解析および定量した。
実施例４．三重特異性エンゲージャー（ＴｒｉＭＥ）設計
[00430]この例では、三重特異性抗原結合タンパク質の設計は、以下に記載される。三重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）ヒトスカベンジャー／食作用受容体に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）危険シグナル受容体である第２のドメイン（Ｂ）；および（ｃ）標的抗原に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ドメインは、リンカーＬ１およびＬ２によりＨ２Ｎ－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ａ）－（Ｃ）－（Ｂ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ｂ）－（Ａ）－（Ｃ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ｂ）－（Ｃ）－（Ａ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ｃ）－（Ｂ）－（Ａ）－ＣＯＯＨ、またはＨ２Ｎ－（Ｃ）－（Ａ）－（Ｂ）－ＣＯＯＨの順で連結されている（図４Ａ）。抗原結合ドメインは、プロテアーゼ切断可能マスクエレメントで占有され、プロテアーゼの利用、およびプロテアーゼとの接触によって活性化される。例示的なナノボディ設計は、図４Ｂに示す。図４Ｃは、三重特異性エンゲージャーならびに標的腫瘍細胞および単球またはマクロファージの機能の例示的な性質の図示を提供する。三重特異性エンゲージャーは、構造的に腫瘍認識または腫瘍結合ドメイン、単球またはマクロファージ受容体１結合ドメイン、および単球またはマクロファージ受容体２結合ドメインを含む（図４Ｃの右上の角に挿入で示す）。予想される機能モードとして、腫瘍結合ドメインは腫瘍細胞の標的表面分子（腫瘍抗原）に結合するが、２つの単球またはマクロファージ受容体、ＢおよびＡはそれぞれ、三重特異性エンゲージャーの単球またはマクロファージ受容体１結合ドメインおよび単球またはマクロファージ受容体２結合ドメインによって結合される。図に示すように、三重特異性エンゲージャーによる受容体ＡおよびＢの結合も、腫瘍認識ドメインにより腫瘍抗原と作動可能に連結され、シグナル１およびシグナル２を単球またはマクロファージに提供する。二重シグナル（シグナル１＋シグナル２）は、単球またはマクロファージを活性化し、それにより食作用を増強し、この例示的な図での炎症カスケードを活性化し、標的細胞の食作用性死滅をもたらす。
実施例５．抗原結合ドメインマスク設計
[00431]この例では、マスクされた抗原結合ドメインを有するエンゲージャーの一般化した例示的な設計をさらに詳細に記載する。図５Ａｉは、２つのｓｃＦｖバインダー、ｓｃＦｖ１、およびｓｃＦｖ２を有する二重特異性エンゲージャーの図示である。ＳｄＡｂまたはディアボディエンゲージャーも、同様に必要な構造改変により構築することができ、２つのバインダーを有する例示的なディアボディ構築物を図５Ａｉｉに示す。抗原結合ドメインは、ペプチドリンカー（２）により、第１の鎖のＡＢＤ１（３）の軽鎖可変ドメインまたは第２の鎖のＡＢＤ２の軽鎖可変領域のＮ末端部分で連結された、ディアボディＡＢＤ１およびＡＢＤ２の抗原結合部分に結合したままであるペプチドマスク（１）によってマスクされる。マスクを軽鎖可変ドメインと接合するペプチドリンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）基質の基質であり、アミノ酸配列ＧＰＬＧＶＲを有する。ＭＭＰ２までいずれの基質にも結合せずに循環を通過するように、マスクされたディアボディエンゲージャーの通過を可能にする設計は、連結しているペプチドを切断するのに利用可能である。がん微小環境はＭＭＰ２が豊富であることが理解される。したがって、ディアボディエンゲージャーはがん微小環境で活性化され、腫瘍環境でそれぞれＡＢＤ１およびＡＢＤ２によりその標的がん細胞および単球またはマクロファージに結合する。図５Ｂは、ディアボディの一本鎖の核酸構築物を例示する。核酸構築物は、５’～３’端に、マスクペプチド、ＭＭＰ２リンカーをコードする核酸配列、ＡＢＤ１－ＬＣおよびＡＢＤ２－ＨＣと接合するペプチドリンカーをコードする核酸配列に連結されているＡＢＤ１軽鎖（ＡＢＤ１－ＬＣ）をコードする配列；次いでＡＢＤ２ ＨＣをコードする核酸配列を含む。
実施例６．モジュール抗原結合エンゲージャー設計
[00432]この例では、結合ドメインのいくつかのモジュール設計は、図６に示すように、抗体様ポリペプチド構造に配置された軽鎖重鎖ドメインによって表される。一設計では、共通の軽鎖が使用され、ＩｇＧ様構造の２つの非同一重鎖と対を形成し、それにより二重特異性または三重特異性エンゲージャー設計で使用することができる二重特異性結合ドメインにする。本明細書で示した別のモデルでは、キメラ二重または三重特異性エンゲージャーは、通常の抗体軽鎖と重鎖の組合せの１つのアームと接合したｓｃＦｖの組合せを使用する。一設計では、２つのｓｃＦｖは、重鎖－軽鎖対合領域を置換するが、ｓｃＦｖは重鎖の定常領域によって接続される。本明細書に示した他の設計では、１つまたは複数のｓｃＦｖがＦｃ領域にコンジュゲートされ得る。さらに他の設計では、１つまたは複数のｓｃＦｖは、ＩｇＧ様ポリペプチドの側鎖として定常領域にコンジュゲートされ得る。
実施例７．単球またはマクロファージにおいて炎症シグナルを活性化し、食作用を増強するためのエンゲージャーの単球またはマクロファージ特異的アクチベーターの使用
[00433]図７Ａの上のパネルに図示したように、ＭＤ２はＬＰＳに応答してＴＬＲ４に結合し、活性化することができる。例示的な設計では、ＭＤ２は単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーへと構築され、ＭＤ２は、腫瘍特異的結合ドメインおよび単球またはマクロファージ特異的結合ドメインに加えて、ＴＬＲ４受容体と会合し、単球またはマクロファージでのＴＬＲ４受容体の二量体化を助け、それにより、単球またはマクロファージによる標的がん細胞の炎症活性化および食作用性死滅をさらに増強する単球またはマクロファージ活性化シグナル（シグナル２）を送る（図７Ｂ）。
[00434]別の例では、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）および腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）－関連２（ＬＩＧＨＴ）とのその会合は、単球またはマクロファージエフェクター機能を増強する例示的な単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーの設計に利用される。ＨＶＥＭはＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、もう２つのリガンドを有する：ＨＳＶ表面エンベロープｇＤおよびＬＴ□。それは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、好中球、およびＤＣで発現される。ＬＩＧＥＴ－ＨＶＥＭ相互作用は、単球または好中球での食作用、インターロイキン（ＩＬ）－８、ＴＮＦ－□、一酸化窒素（ＮＯ）、および活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを増加する。例示的な設計では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは、ＨＶＥＭに結合することができるＬＩＧＨＴドメインを含む。設計のバリエーションでは、ＨＶＥＭに結合するＬＩＧＨＴドメインは、図８Ａに示すように、ＨＶＥＭに結合する抗原結合ドメインのアゴニスト抗体によって置き換えられてもよい。エンゲージャーの機能の相当する様式は図８Ｂに図示し、単球またはマクロファージ関連ＨＶＥＭとのＬＩＧＨＴドメインの結合は、単球またはマクロファージにおける炎症シグナル（シグナル２）を活性化し、食細胞としてのそのエフェクター機能を増強する。
[00435]別の実施例では、ＧＩＲＴ関連活性化シグナルは、図９Ａに示す例示的な単球またはマクロファージ特異的エンゲージャー設計において利用される。ＧＩＲＴは単球またはマクロファージで発現され、そのリガンド、ＧＩＲＴＬによって結合されると、それは、図９Ｂに図示したように単球またはマクロファージにおいて炎症シグナルを生成する。
実施例８．エンゲージャーとの会合の加速を促進する配列を有するリンカーの使用
[00437]この例では、単球またはマクロファージ特異的エンゲージャーは、互いに相補性を有する多重特異性結合ドメインの間にリンカーを持つように設計される。図１０Ａ～図１０Ｃは、ロイシンジッパードメイン（図１０Ａおよび図１０Ｂ）または相補性結合領域を含む合理的に設計された合成配列（図１０Ｃ）を含む例示的な設計を示す。本明細書に開示の例示的なリンカー配列が使用される。特定の構築物では、リンカードメインが利用され、二量体化または三量体化し、有用なドメインを近位に運ぶ。これらの図に示すのは、互いにより近いヘテロマーバインダードメインの結合における、ロイシンジッパードメインおよび結合タンパク質ドメインの例示的な使用である。
実施例９．骨髄性細胞バインダードメインを選択するためのスクリーニング
[00438]この例では、スクリーニングは、本明細書に記載のエンゲージャーの結合ドメインの設計に有用であり得る骨髄性細胞の細胞表面分子またはその機能的断片を選択するために行われる。結合ドメインは、食作用受容体エンゲージャーまたはアクチベーターであり得る。現在理解されるように、食細胞の全ての食細胞表面受容体が、炎症促進性シグナル伝達を生成するか、またはどんな方法でも単球もしくはマクロファージエフェクター機能を増強するために誘導または活性化される等しい能力を有する訳ではない。したがって、がんを死滅させるために単球またはマクロファージおよび他の骨髄性細胞を利用するため、一連のシグナル１およびシグナル２標的は、骨髄性細胞で生成される。これらの標的は、炎症ならびに免疫寛容と関連する物質のスクリーニングを通して同定された。
[00439]これは、スライド上にスポットされた、－５５００を超える全長ヒト細胞膜および係留分泌タンパク質をコードする－発現ベクターの私有のアレイを使用するユニークな技術を使用して行われる。ヒト細胞は上限を超えて増殖させ、逆トランスフェクトされ、正確なスライド位置にそれぞれのタンパク質の細胞表面発現を生じる。次いで、試験製剤を適用し、特異的結合を解析し、適切な検出系を使用して確認する。これらのヒットは、次いで単球またはマクロファージ結合および調節のための潜在的な標的として照合および調べられた。
[0440]特定の有用な結合剤、またはスクリーニングから同定されたドメインは、次いで逆転写され、レンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、第２の結合ドメインまたはエンゲージャーＢｉＭＥまたはＴｒｉＭＥ構築物を生成する。ＢｉＭＥまたはＴｒｉＭＥをコードする組換え核酸は、スクリーニングから生成した高度に食作用性の受容体結合ドメインから１つまたは複数のドメインを使用して生成され得る。

Claims (81)

  1. 第１の治療剤を含む組成物であって、該治療剤が、
    （ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片である第１の結合ドメイン、および
    （ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片である第２の結合ドメイン
    を含み、
    （ｉ）前記第１の治療剤が第１の構成要素と結合しており、該第１の構成要素はさらなる治療剤または第３の結合ドメインである、または
    （ｉｉ）前記組成物がさらなる治療剤を含む、
    組成物。
  2. 治療剤を含む組成物であって、該治療剤が、（ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の結合ドメイン、（ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の結合ドメイン、および（ｃ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第３の結合ドメインを含む、組成物。
  3. 前記骨髄性細胞が、単球細胞またはマクロファージ細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 骨髄性細胞と特異的に相互作用する前記第２の結合ドメインが、前記骨髄性細胞の食作用または係留受容体と相互作用する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 骨髄性細胞と特異的に相互作用する前記第３の結合ドメインが、前記骨髄性細胞の第１の食作用または係留受容体の細胞外領域と相互作用する、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記治療剤の結合ドメインのいずれか１つが、抗体の結合ドメイン、抗体の機能的断片、その可変ドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＮＡＲドメイン、ＶＨＨドメイン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、二重特異性抗体、ディアボディ、またはその機能的断片もしくは組合せを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原が、標的細胞のがん抗原もしくは病原性抗原または自己免疫抗原である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原がウイルス抗原である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原がＴリンパ球抗原である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原が細胞外抗原である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原が細胞内抗原である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原が、チミジンキナーゼ（ＴＫ１）、ヒポキサンチン－グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ムチン－１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、上皮増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ＥＢＮＡ－１、ＬＥＭＤ１、ホスファチジルセリン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、卵胞刺激ホルモン受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、エリスロポエチン産生肝細胞癌Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＥｐｈＢ２、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２４８、ＣＤ２７６、ＰＳＣＡ、ＣＳ－１、ＣＬＥＣＬ１、ＧＤ３、ＰＳＭＡ、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＥＰＣＡＭ、ＩＬ－１、インテグリン受容体、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロテアーゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧＭ３、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ＩＧＬＬ１およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＣＲ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４５、およびＣＤ５６からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原が、卵巣がん抗原またはＴリンパ腫抗原である、請求項１２または１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記第１の結合ドメインが結合する標的細胞の抗原がインテグリン受容体である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記第２の結合ドメインまたは前記第３の結合ドメインがンテグリン受容体に結合する、請求項１または２に記載の組成物。
  17. 前記第２の結合ドメインまたは前記第３の結合ドメインが、α１、α２、αＩＩｂ、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、およびβ８からなる群から選択されるインテグリン受容体に結合する、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記治療剤が、食作用活性化ドメインを含む食作用または係留受容体に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記治療剤が、表２Ａおよび表２Ｂに列挙した受容体、またはそれらの断片からなる群から選択される受容体またはタンパク質に結合する、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記治療剤が、レクチン、デクチン１、ＣＤ２０６、スカベンジャー受容体Ａ１（ＳＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＭＳＲ１、ＳＣＡＲＡ３、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ５、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＡＲＢ２、ＣＤ６８、ＯＬＲ１、ＳＣＡＲＦ１、ＳＣＡＲＦ２、ＣＸＣＬ１６、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＳＲＣＲＢ４Ｄ、ＳＳＣ５Ｄ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＲＡＧＥ、ＣＤ１４、ＣＤ６４、Ｆ４／８０、ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＨｕＣＲＩｇ（Ｌ）、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ８９、Ｆｃ－アルファ受容体Ｉ、ＣＲ１、ＣＤ３５、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｔｉｍ－１、Ｔｉｍ－４およびＣＤ１６９からなる群から選択される食作用受容体に結合する、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記治療剤が、炎症促進性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む受容体に結合する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記第１の治療剤が、１０００アミノ酸または１０００ｎｍ長より小さいポリペプチドを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記第１の治療剤が、５００アミノ酸または５００ｎｍ長より小さいポリペプチドを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記第１の治療剤が、２００～１０００アミノ酸または２００～１０００ｎｍ長であるポリペプチドを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記第１の治療剤の結合ドメインの結合が、がん細胞を骨髄性細胞へと接触させる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記第２の結合ドメインが骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の食作用活性を促進する、請求項１に記載の組成物。
  27. 前記第２の結合ドメインが骨髄性細胞と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の炎症性シグナル伝達を促進する、請求項１に記載の組成物。
  28. 前記第２の結合ドメインが骨髄性細胞または接着分子と特異的に相互作用し、骨髄性細胞の標的細胞への接着を促進する、請求項１に記載の組成物。
  29. 前記第２の結合ドメインが骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗食作用活性を阻害する、請求項１に記載の組成物。
  30. 前記第２の結合ドメインが骨髄性細胞と特異的に相互作用し、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗炎症活性を阻害する、請求項１に記載の組成物。
  31. 前記第２および／または前記第３の結合ドメインが、骨髄性細胞の食作用活性を促進する、請求項２に記載の組成物。
  32. 前記第２および／または前記第３の結合ドメインが、骨髄性細胞の炎症性シグナル伝達を促進する、請求項２に記載の組成物。
  33. 前記第２および／または前記第３の結合ドメインが、骨髄性細胞または接着分子と特異的に相互作用し、標的細胞への骨髄性細胞の接着を促進する、請求項２に記載の組成物。
  34. 前記第２および／または前記第３の結合ドメインが、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗食作用活性を阻害する、請求項２に記載の組成物。
  35. 前記第２および／または前記第３の結合ドメインが、標的細胞によって媒介される骨髄性細胞の抗炎症活性を阻害する、請求項２に記載の組成物。
  36. 前記治療剤が治療ポリペプチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記治療剤が治療ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記第３の結合ドメインまたはさらなる治療剤が、ＣＤ４７アンタゴニスト、ＣＤ４７ブロッカー、抗体、キメラＣＤ４７受容体、シアリダーゼ、サイトカイン、炎症促進性遺伝子、プロカスパーゼ、または抗がん剤を含む、請求項１に記載の組成物。
  39. 前記第１の結合ドメイン、前記第２の結合ドメインおよび前記第３の結合ドメインが、異なる非同一の標的抗原に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記第１の結合ドメイン、前記第２の結合ドメインまたは前記第３の結合ドメインが、リガンド結合ドメインである、請求項１または２に記載の組成物。
  41. 前記第１、前記第２または前記第３の結合ドメインが、１つまたは複数のリンカーによって作動可能に連結されている、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記リンカーがポリペプチドである、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記リンカーが機能性ペプチドである、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記リンカーが受容体のリガンドである、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記リンカーが単球またはマクロファージ受容体のリガンドである、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記リンカーが受容体を活性化する、請求項４３または４４に記載の組成物。
  47. 前記リンカーが受容体を阻害する、請求項４３または４４に記載の組成物。
  48. 前記リンカーがＭ２マクロファージ受容体のリガンドである、請求項４４に記載の組成物。
  49. 前記リンカーが、ＴＬＲ４などのＴＬＲ受容体のリガンドである、請求項４３または４４に記載の組成物。
  50. 前記リンカーがＴＬＲ受容体を活性化する、請求項４３、４４、４５、４６、４８または４９のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記第１、前記第２および／または前記第３の結合ドメインが、結合ドメインに結合するマスクと会合する、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記マスクがそれぞれの結合ドメインと会合したままである場合、前記マスクがその標的への結合ドメインの相互作用を阻害する阻害剤である、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記マスクが、ペプチドリンカーを介して結合ドメインと会合する、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記ペプチドリンカーが切断可能な部分を含む、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記切断可能な部分が、がんまたは腫瘍の部位に選択的に豊富なタンパク質または酵素によって切断される、請求項５３に記載の組成物。
  56. マクロファージの第２の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する前記第３の結合ドメインが、マクロファージを活性化する、請求項１～５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記治療剤が骨髄性細胞に結合すると、骨髄性細胞の殺作用または食作用活性が、粒子取り込みアッセイによって測定した場合、治療剤によって結合されない骨髄性細胞と比較して少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％または９０％または１００％増加する、請求項１～５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 第１の治療剤の結合ドメインの結合が、骨髄性細胞によるがん細胞の食作用を起動する、請求項１～５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. さらなる治療剤の結合が、骨髄性細胞によるがん細胞の食作用性殺作用を増強または増加する、請求項１～５８のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記第２または前記第３の結合ドメインが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃＲｎ、ＴＲＩＭ２１、ＦｃＲＬ５の細胞外に結合する、請求項１～５９のいずれか一項に記載の組成物。
  61. 前記第２または前記第３の結合ドメインがＭ２ドメインを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の組成物。
  62. 前記第２または前記第３の結合ドメインがＬＩＧＨＴドメインを含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 前記第２または前記第３の結合ドメインがＨＶＥＭドメインを含む、請求項１～６２のいずれか一項に記載の組成物。
  64. 前記第２または前記第３の結合ドメインがＧＩＴＲドメインを含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 医薬組成物であって、医薬組成物は第１の治療剤を含み、
    該治療剤が、１つもしくは複数のポリペプチドまたは該１つもしくは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸を含み、
    該１つまたは複数のポリペプチドが、
    （ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片である第１の結合ドメイン、および
    （ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片である第２の結合ドメイン
    を含み、
    （ｉ）前記第１の治療剤が第１の構成要素に結合され、第１の構成要素がさらなる治療剤または第３の結合ドメインである、または
    （ｉｉ）組成物がさらなる治療剤を含む
    ならびに薬学的に許容される塩または賦形剤を含む、医薬組成物。
  66. 前記第１の治療剤が単一のポリペプチドを含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
  67. 前記第１の治療剤が、複数のポリペプチドを含む、請求項６５に記載の組成物。
  68. 前記第１の治療剤が、１つまたは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸である、請求項６５に記載の医薬組成物。
  69. 第２の治療剤をさらに含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
  70. それを必要とする対象において疾患または症状を処置する方法であって、
    治療剤が、１つもしくは複数のポリペプチドまたは１つもしくは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸を含み、１つまたは複数のポリペプチドが、
    （ａ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗体またはその機能的断片である第１の結合ドメイン、および
    （ｂ）骨髄性細胞と特異的に相互作用する第２の抗体またはその機能的断片である第２の結合ドメイン、
    を含み、
    （ｉ）第１の治療剤が第１の構成要素に結合され、第１の構成要素がさらなる治療剤または第３の結合ドメインであるか、または
    （ｉｉ）組成物がさらなる治療剤を含む、
    第１の治療剤、ならびに
    薬学的に許容される塩または賦形剤
    を含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、方法。
  71. 第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 医薬組成物を投与するステップが医薬組成物を静脈内に投与するステップを含む、請求項７０に記載の方法。
  73. 医薬組成物を投与するステップが、医薬組成物を皮下に投与するステップを含む、請求項７０に記載の方法。
  74. 医薬組成物を投与するステップが医薬組成物を注射するステップを含む、請求項７０に記載の方法。
  75. 前記第１の結合ドメインが、配列番号２７、２８、１１１、１１２、１１３、１１５、１４３および１４４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む、請求項１または２に記載の組成物。
  76. 前記第２の結合ドメインが、配列番号１４１および１４２からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む、請求項１または２に記載の組成物。
  77. 前記第１の構成要素が、アミノ酸配列ＧＧＱＥＩＮＳＳＹＧＧ（配列番号１０５）またはＱＥＩＮＳＳＹ（配列番号１２９）を含む、請求項１に記載の組成物。
  78. 前記第１の構成要素が、アミノ酸配列ＧＧＡＰＰＨＡＬＳＧＧ（配列番号１０９）またはＡＰＰＨＡＬＳ（配列番号１３７）を含む、請求項１に記載の組成物。
  79. 前記リンカーが、アミノ酸配列ＧＧＱＥＩＮＳＳＹＧＧ（配列番号１０５）、またはＱＥＩＮＳＳＹ（配列番号１２９）またはＧＧＡＰＰＨＡＬＳＧＧ（配列番号１０９）またはＡＰＰＨＡＬＳ（配列番号１３７）を含む、請求項４９または５０に記載の組成物。
  80. 配列番号１５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む、二重特異性または三重特異性エンゲージャー。
  81. 配列番号１５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する配列を含む、二重特異性または三重特異性エンゲージャー。
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