CN114340681A - 巨噬细胞特异性接合器组合物及其使用方法 - Google Patents

巨噬细胞特异性接合器组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于制备和使用包括髓样细胞特异性接合器的治疗剂的组合物和方法，所述治疗剂用于癌症或感染的免疫疗法。

Description

巨噬细胞特异性接合器组合物及其使用方法
交叉引用
本申请要求于2019年6月11日提交的美国临时申请号62/860,055和于2019年10月1日提交的美国临时申请号62/908,978的权益，每个所述临时申请通过引用以其整体并入本文。
背景技术
细胞免疫疗法是一种有希望的新技术，用于解决治疗疾病，诸如癌症、持续性感染和对其他形式的治疗是难治性的疾病的困难。巨噬细胞代表肿瘤或感染位点中存在的优势细胞类型并且具有若干种策略优势，使得它们可以潜在地最有效用于治疗疾病。作为免疫系统的天然哨兵，这些细胞可以感测并消除包括癌细胞的异常和非健康细胞类型。然而，巨噬细胞用于免疫疗法的潜在用途尚未得到充分探索。寻求使用这些细胞类型开发改进治疗剂(包括但不限于针对T细胞恶性肿瘤)的更新途径。
发明内容
本公开涉及通过吞噬作用引发靶细胞破坏途径的新组合物和方法。本申请基于以下意外发现：当除了与经典配体的结合之外用至少第二并发或后续激活信号触发吞噬受体时，所述第二或另外的信号可以导致吞噬作用对靶细胞的高效破坏。本文呈现了嵌合受体，和被设计用于增强细胞(诸如髓样细胞或单核细胞或巨噬细胞)的吞噬作用的嵌合受体结合细胞外元件。至少第二并发或后续信号的仔细设计和/或操纵可用于成功激活嵌合吞噬受体(诸如本文所述的那些)，使得此后有效地破坏靶细胞。例如，第一信号(信号1)可以经由吞噬作用/拴系受体介导，并且第二信号(信号2)可以通过危险信号(诸如病原体相关分子模式(DAMP))或触发核因子-κB(NF-κB)介导的炎症基因上调的细胞因子介导。如以下章节中所述，在利用单核细胞或巨噬细胞杀伤癌细胞的吞噬能力的背景下，单独触发吞噬作用可能不足以激活单核细胞或巨噬细胞，并且驱动有效的抗肿瘤应答。
在此描述的本发明的具体优点之一在于，本文公开的用于有效细胞免疫疗法的组合物是有成本效益且高效的。
在一些方面，本文提供了新的嵌合细胞表面结合元件或“接合器(engager)”，其与嵌合吞噬受体的细胞外部分结合，并且另外与靶细胞(诸如癌细胞)上的至少一种细胞表面组分结合。
在一个实施方案中，新的嵌合接合器可以与嵌合吞噬受体的细胞外部分结合，并且另外与一种或多种细胞表面组分(其中至少一种是在靶癌细胞上)结合。因此，接合器可以是双特异性单核细胞或巨噬细胞接合器(BiME)并且具有两个结合部分，其中一个结合部分与嵌合吞噬受体的细胞外部分结合，并且另一个结合部分与靶细胞上的细胞表面组分结合。同样地，接合器可以是三特异性单核细胞或巨噬细胞接合器(TriME)并且具有三个结合部分，其中一个结合部分与嵌合吞噬受体的细胞外部分结合，另一个结合部分与靶细胞上的细胞表面组分结合并且第三结合部分与吞噬细胞上的细胞表面组分结合。
在一个方面，所述接合器是合成蛋白质或肽、缀合蛋白质或缀合肽。本文提供了组合物，其包含：第一治疗剂，其中所述治疗剂包含：(a)第一结合结构域，其中所述第一结合结构域是与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段，和(b)第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段；其中，(i)所述第一治疗剂与第一组分偶联，其中所述第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域，或(ii)所述组合物包含另外的治疗剂。
在一个方面，本文提供了组合物，其包含：治疗剂，其中所述治疗剂是接合器，所述接合器包含：(a)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一结合结构域；(b)与髓样细胞特异性相互作用的第二结合结构域；以及(c)与所述髓样细胞特异性相互作用的第三结合结构域。
在一个方面，本文提供了组合物，其包含：治疗剂，其中所述治疗剂是接合器，所述接合器包含：(a)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一结合结构域；(b)第二结合结构域，其中所述第二结合结构域：(i)与髓样细胞(例如，单核细胞或巨噬细胞、或树突细胞)特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的吞噬作用活性，或(ii)与髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的炎症信号传导，或(iii)与髓样细胞或粘附分子特异性相互作用并且促进所述髓样细胞对所述靶细胞的粘附性；以及(c)第三结合结构域，其中所述第三结合结构域(i)与所述髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的吞噬活性，或(ii)与所述髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的炎症信号传导，或(iii)与所述髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞对所述靶细胞的粘附性，或(iv)与所述髓样细胞特异性相互作用并且抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗吞噬活性，或(v)与所述髓样细胞特异性相互作用并且抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗炎活性。
在一些实施方案中，所述髓样细胞是单核细胞或巨噬细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，与髓样细胞特异性相互作用的所述第二结合结构域与所述髓样细胞或单核细胞或巨噬细胞的吞噬或拴系受体相互作用。
在一些实施方案中，与髓样细胞特异性相互作用的所述第三结合结构域与所述髓样细胞或单核细胞或巨噬细胞的第一吞噬或拴系受体的细胞外区域相互作用。
在一些实施方案中，所述组合物中所述治疗剂的任一个结合结构域包括抗体的所述结合结构域、抗体的功能性片段、其可变结构域、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、单链可变片段(scFv)、Fab、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、双特异性抗体、双抗体、或它们的功能性片段或组合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白或超过一种重组蛋白。
在一些实施方案中，所述治疗剂包括含有一种或多种融合蛋白的重组蛋白。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含抗体、抗体的功能性片段、其可变结构域、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、单链可变片段(scFv)、Fab、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、双特异性抗体、双抗体、或它们的功能性片段或组合。在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白或超过一种重组蛋白，每种重组蛋白包含多个结合片段，每个结合片段构成抗体的功能性片段、其可变结构域、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、单链可变片段(scFv)、Fab、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、双特异性抗体、双抗体、或它们的功能性片段或组合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白(所述接合器)，其包含各自具有单独的结合特异性的多个结合结构域，所述多个结合结构各自通过彼此表现出互补结合的接头(例如，肽接头)连接在一起。例如，所述重组蛋白的一个结合结构域与一对接头肽中的第一者融合，并且另一个结合结构域与所述一对接头肽中的第二者融合，其中所述一对接头肽彼此表现出互补结合，其中所述一对接头肽包括：(a)彼此表现出互补结合的亮氨酸拉链(zipper)结构域，例如呈天然存在的蛋白质-蛋白质相互作用的亮氨酸拉链，诸如c-Fos和c-Jun蛋白的结合区域内的拉链序列；(b)合成肽，其被设计为经由设计的亲和部分，诸如合成扣紧物(clasp)彼此特异性结合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含多个结合片段，所述多个结合片段被构造为通过在所述重组蛋白中包含的亮氨酸拉链肽对促进彼此的加速缔合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含多个结合片段，所述多个结合片段被构造为通过在所述重组蛋白内包含的所述肽对中的c-Fos/c-Jun结合结构域促进彼此的加速缔合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含多个结合片段，所述多个结合片段被构造为通过合成扣紧物促进彼此的加速缔合。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是所述靶细胞上的癌症抗原或病原性抗原或者自身免疫性抗原。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是病毒抗原。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是T-淋巴细胞抗原。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是细胞外抗原。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是细胞内抗原。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原选自由以下组成的组：胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、卵泡刺激激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤组2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整联蛋白受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFR-β、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1及其组合。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45、CD56。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是整联蛋白受体。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域与整联蛋白受体结合。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域与选自由以下组成的组中的整联蛋白受体结合：α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。
在一些实施方案中，所述治疗剂与包含吞噬作用激活结构域的吞噬或拴系受体结合。
在一些实施方案中，所述治疗剂与选自由以下组成的组中的受体或蛋白质结合：表2A和表2B中列出的受体或其片段。
在一些实施方案中，所述治疗剂与选自由以下组成的组中的吞噬受体结合：凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169。
在一些实施方案中，所述治疗剂与包含细胞内信号传导结构域的受体结合，所述细胞内信号传导结构域包括促炎信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述第一治疗剂包括长度少于1000个氨基酸或1000nm或为1000nm的多肽。
在一些实施方案中，所述第一治疗剂包括长度少于500个氨基酸或500nm的多肽。
在一些实施方案中，所述第一治疗剂包括长度为200-1000个氨基酸或200-1000nm的多肽。
在一些实施方案中，所述第一治疗剂的所述结合结构域的接合使所述癌细胞与所述髓样细胞接触。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的吞噬作用活性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的炎症信号传导。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域与髓样细胞或粘附分子特异性相互作用并且促进所述髓样细胞对所述靶细胞的粘附性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗吞噬活性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗炎症活性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域促进所述髓样细胞的吞噬活性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域促进所述髓样细胞的炎症信号传导。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域与髓样细胞或粘附分子特异性相互作用并且促进所述髓样细胞对所述靶细胞的粘附性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗吞噬活性。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗炎症活性。
在一些实施方案中，所述治疗剂包括治疗性多肽。
在一些实施方案中，所述治疗剂包括编码所述治疗性多肽的重组核酸。
在一些实施方案中，所述第三结合结构域或所述另外的治疗剂包括CD47拮抗剂、CD47阻断剂、抗体、嵌合CD47受体、唾液酸酶、细胞因子、促炎基因、半胱天冬酶原或抗癌剂。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和所述第三结合结构域与不同的非相同靶抗原结合。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域、所述第二结合结构域或和所述第三结合结构域是配体结合结构域。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域、所述第二结合结构域或所述第三结合结构域通过一个或多个接头可操作地连接。
在一些实施方案中，所述接头是多肽。在一些实施方案中，所述接头是功能性肽。在一些实施方案中，所述接头是针对受体的配体。在一些实施方案中，所述接头是针对单核细胞或巨噬细胞受体的配体。在一些实施方案中，所述接头激活所述受体。在一些实施方案中，所述接头抑制所述受体。在一些实施方案中，所述接头是针对M2单核细胞或巨噬细胞的配体。在一些实施方案中，所述接头是针对TLR受体的配体。在一些实施方案中，所述接头激活所述TLR受体。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域与结合至所述结合结构域的掩蔽物缔合。
在一些实施方案中，所述掩蔽物是抑制剂，所述抑制剂在所述掩蔽物保持与对应的结合结构域缔合时抑制结合结构域与其靶标的相互作用。
在一些实施方案中，所述掩蔽物经由肽接头与所述结合结构域缔合。
在一些实施方案中，所述肽接头包含可裂解部分。
在一些实施方案中，所述可裂解部分由在所述癌症或肿瘤位点中选择性地丰富的蛋白质或酶裂解。
在一些实施方案中，与所述单核细胞或巨噬细胞的第二受体的细胞外区域特异性相互作用的所述第三结合结构域激活所述单核细胞或巨噬细胞。
在一些实施方案中，如通过颗粒摄取测定测量的，与未由所述治疗剂结合的髓样细胞相比，在所述治疗剂与所述髓样细胞结合后，所述髓样细胞的杀伤或吞噬作用活性增加至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％或90％或100％。
在一些实施方案中，第一治疗剂的所述结合结构域的接合触发所述髓样细胞对所述癌细胞的吞噬作用。
在一些实施方案中，所述第二治疗剂的接合加强或增加所述髓样细胞对所述癌细胞的吞噬杀伤。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域与IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcRn、TRIM21、FcRL5的细胞外结构域结合。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括M2结构域。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括LIGHT结构域或HVEM结合结构域。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括HVEM结合结构域。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括GITR结合结构域。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含具有与选自由SEQ ID NO:27、28、111、112、113、115、143和144组成的组中的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含具有与选自由SEQ ID NO:141和142组成的组中的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，所述第一组分包含氨基酸序列GGQEINSSYGG(SEQ ID NO:105)或QEINSSY(SEQ ID NO:129)。
在一些实施方案中，所述第一组分包含氨基酸序列GGAPPHALSGG(SEQ ID NO:109)或APPHALS(SEQ ID NO:137)。
在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGQEINSSYGG(SEQ ID NO:105)或QEINSSY(SEQ ID NO:129)或GGAPPHALSGG(SEQ ID NO:109)或APPHALS(SEQ ID NO:137)。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性或三特异性接合器，其包含具有与SEQID NO:151具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性或三特异性接合器，其包含具有与SEQID NO:152具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
本文提供了一种药物组合物，其包含：第一治疗剂，其中所述治疗剂包含一种或多种多肽或编码所述一种或多种多肽的重组核酸，其中所述一种或多种多肽包含第一结合结构域，其中所述第一结合结构域是与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段；和第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段；其中，(i)所述第一治疗剂与第一组分偶联，其中所述第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域，或(ii)所述组合物包含另外的治疗剂；以及药学上可接受的盐或赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物的所述第一治疗剂包括单一多肽。在一些实施方案中，所述药物组合物的所述第一治疗剂包括多种多肽。在一些实施方案中，所述药物组合物的所述第一治疗剂是编码所述一种或多种多肽的重组核酸。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含第二治疗剂。
本文提供了一种治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：第一治疗剂，其中所述治疗剂包含一种或多种多肽或编码所述一种或多种多肽的重组核酸，其中所述一种或多种多肽包含第一结合结构域，其中所述第一结合结构域是与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段；和第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段；其中，(i)所述第一治疗剂与第一组分偶联，其中所述第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域，或(ii)所述组合物包含另外的治疗剂；以及药学上可接受的盐或赋形剂。
在一些实施方案中，所述治疗方法进一步包括施用第二治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗方法还包括施用所述药物组合物，包括静脉内施用所述药物组合物。
在一些实施方案中，所述治疗方法还包括施用所述药物组合物，包括皮下施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述治疗方法还包括施用所述药物组合物，包括注射所述药物组合物。
在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是作为淋巴细胞的癌细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是作为卵巢癌细胞的癌细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是作为卵巢胰腺细胞的癌细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是作为胶质母细胞瘤细胞的癌细胞。
在一些实施方案中，所述重组核酸是DNA。
在一些实施方案中，所述重组核酸是RNA。
在一些实施方案中，所述重组核酸是mRNA。
在一些实施方案中，所述重组核酸是circRNA。
在一些实施方案中，所述重组核酸是tRNA。
在一些实施方案中，所述重组核酸是微RNA。
本文提供了载体，其包含上文所述的组合物。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，所述载体还包含与编码一种或多种多肽的至少一种核酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述载体是多顺反子性的。在一些实施方案中，所述至少一种核酸序列中的每一种与单独的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述载体还包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，所述载体还包含侧接编码一种或多种多肽的所述至少一种核酸序列的5’UTR和/或3’UTR。在一些实施方案中，所述载体还包含一个或多个调控区。
本文提供了多肽，其由以上所述的组合物的所述重组核酸编码。
根据以下具体实施方式，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员将容易地变得显而易见，其中在以下具体实施方式中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将会理解的，本公开能够有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不背离本公开。相应地，附图和说明书应当被看作是说明性质的，而不是限制性的。
援引并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同明确且单独地指示每个单独出版物、专利或专利申请通过引用并入一般。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开相抵触的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种相抵触的材料。
附图说明
本发明的新颖特征具体地在所附权利要求中阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图(在本文中也称为“图”)获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述附图中：
图1A是产生髓样细胞的双信号即信号1和信号2的示例性细胞外刺激物、受体和途径的图形表示。
图1B是具有结合物A、内衬物L和第二结合物B的简化接合器构建体的图形表示。在该简化图中，结合物A与靶细胞上的细胞表面生物分子结合；结合物B与髓样细胞上的细胞表面生物分子结合。
图2A是作为抗原结合结构域的具有蛋白酶可裂解掩蔽型位点的双特异性scFv接合器的图形表示。
图2B是具有蛋白酶可裂解掩蔽型抗原结合结构域的双特异性VHH接合器的图形表示。
图3A是具有蛋白酶可裂解掩蔽型位点的示例性双特异性scFv接合器和连接作为抗原结合结构域的两个scFv接合器的肽接头的图形表示；在这种情况下，肽接头是另外治疗剂或第三结合结构域，具体地为TLR4配体肽。
图3B是具有蛋白酶可裂解掩蔽型抗原结合结构域的示例性双特异性VHH接合器和连接两个蛋白酶可裂解掩蔽型抗原结合结构域的肽接头的图形表示；在这种情况下，肽接头是另外治疗剂或第三结合结构域，具体地为TLR4配体肽。
图3C是具有蛋白酶可裂解掩蔽型位点的示例性双特异性scFv接合器和连接作为抗原结合结构域的两个scFv接合器的肽接头的图形表示；在这种情况下，肽接头是另外治疗剂或第三结合结构域，具体地为M2靶向肽。
图3D是具有蛋白酶可裂解掩蔽型抗原结合结构域的示例性双特异性VHH接合器和连接两个蛋白酶可裂解掩蔽型抗原结合结构域的肽接头的图形表示；在这种情况下，肽接头是另外治疗剂或第三结合结构域，具体地为M2靶向肽。
图3E描绘了指示出在每种指示TLR肽的存在下培养过夜的单核细胞的细胞因子产生的数据。
图3F示出了双特异性结合物构建体CD5-RS01-CD16的蛋白质结构的图形说明，所述构建体具有分别对CD5和CD16具有特异性的两个scFv结合物和TLR4合成肽接头(RS01)。
图3G示出了图3F中展示的CD5-RS01-CD16的表达数据。泳道M1和M2分别为来自宝公司(TaKaRa)(目录号3452)和金斯瑞公司(Genscript)(目录号M00521)的可商购获得的蛋白质分子量标记物。泳道1和2分别是如所指示分别在还原和非还原条件下的SDS PAGE结果或蛋白质印迹结果。泳道P，阳性对照(多标签，金斯瑞公司(Gene Script)，目录号M0101)。用于蛋白质印迹的一抗：小鼠抗His mAb(金斯瑞公司，目录号A00186)。
图3H示出了双特异性结合物构建体CD5-RS09-CD16的蛋白质结构的图形说明，所述构建体具有分别对CD5和CD16具有特异性的两个scFv结合物和TLR4合成肽接头(RS09)。
图3I描绘了图3H中展示的CD5-RS09-CD16的表达数据。泳道注释和索引如针对图3G的描述中指示的。
图4A是示例性三特异性scFv接合器的图形表示。
图4B是示例性三特异性VHH接合器的图形表示。
图4C是三特异性接合器的示例性作用模式的图形表示。
图5Ai描绘了重组双特异性scFv接合器的结构构型的图形表示，其中每个结合结构域由药剂(掩蔽物)掩蔽，所述药剂防止结合结构域与其同源底物的相互作用。通过可裂解接头(在该实例中为金属蛋白酶(MMP2)底物)将掩蔽物与每条轻链的末端区段附接。箭头指向重组双特异性scFv接合器的结构组分，其如下所述：1，掩蔽物；2，MMP2底物接头；3，ABD1(抗原结合结构域1)-轻链；3’，ABD2(抗原结合结构域2)-轻链；4，连接结合结构域轻链和结合结构域重链的接头；5，ABD1(抗原结合结构域1)重链；5’，ABD2(抗原结合结构域2)重链。
图5Aii描绘了重组双特异性双抗体接合器的结构构型的图形表示，其中每个结合结构域由药剂(掩蔽物)掩蔽，所述药剂防止结合结构域与其同源底物的相互作用。通过可裂解接头(在该实例中为金属蛋白酶(MMP2)底物)将掩蔽物与每条轻链的末端区段附接。箭头指向重组双特异性双抗体接合器的结构组分，其如下所述：1，掩蔽物；2，MMP2底物接头；3，ABD1(抗原结合结构域1)-轻链；3’，ABD2(抗原结合结构域2)-轻链；4，连接ABD1轻链和ABD1重链的接头；4’，连接ABD2轻链和ABD2重链的接头；5，ABD2重链；5’，ABD1重链。
图5B描绘了针对双特异性scFv的单链的线性构建体的图形表示。将对应于图5Ai或图5Aii的部分从N末端至C末端描绘在线性化图内。
图6描绘了包含两个或三个结合结构域以用作双特异性和三特异性接合器的示例性模块化构建体。
图7A上分图是MD2介导的TLR4受体二聚化的图形表示，所述二聚化导致TLR激活。图7A下分图是单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的示例性设计，其中一个结合结构域可以与肿瘤细胞相关分子(肿瘤抗原)结合，另一个结合结构域可以与单核细胞或巨噬细胞受体(在这种情况下为FcR)结合。第三结构域是MD2结构域，其可以结合至TLR4受体并二聚化TLR4受体以激活它们。
图7B是示出了图7A的单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的作用模式的图形表示。
图8A是单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的示例性设计，其中一个结合结构域可以与肿瘤细胞相关分子(肿瘤抗原)结合，第二结合结构域可以与单核细胞或巨噬细胞受体(在这种情况下为FcR)结合。第三结构域是LIGHT结构域，其可以与单核细胞或巨噬细胞HVEM接合并且激活单核细胞或巨噬细胞中的炎症信号。
图8B是示出了图8A的单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的作用模式的图形表示。
图9A是单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的示例性设计，其中一个结合结构域可以与肿瘤细胞相关分子(肿瘤抗原)结合，并且第二结合结构域可以与单核细胞或巨噬细胞受体(在这种情况下为FcR)结合。第三结构域是GIRT配体(GIRTL)结构域或者可替代地抗GITR抗体的抗原结合结构域，其可以激活单核细胞或巨噬细胞受体GITR，并且可以诱导单核细胞或巨噬细胞中的炎症信号。
图9B是示出了图9A的单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的作用模式的图形表示。
图10A示出了示例性的基于异二聚体抗体的接合器分子设计，其包含具有亮氨酸拉链结构域的肽。L1、L2指示配体。
图10B示出了示例性的基于异多聚体抗体的接合器分子设计，其包含具有亮氨酸拉链结构域的肽。L1-L4指示配体。
图10C示出了示例性的基于异二聚体抗体的接合器分子设计，其包含具有合成锚定设计的肽。L1、L2指示配体，并且‘m’和‘n’指示合成结合设计。
具体实施方式
所有术语都旨在被理解为它们将被本领域技术人员理解。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
尽管本公开的各种特征可以在单一实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。反过来，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本公开，但本公开也可以在单一实施方案中实施。
如本说明书和权利要求中所用，词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式诸如“包含有(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式诸如“包括有(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未陈述的元素或方法步骤。预期本说明书中讨论的任何实施方案可以关于本公开的任何方法或组合物来实施，并且反之亦然。此外，本公开的组合物可以用于实现本公开的方法。
当涉及可测量的值(诸如参数、量、持续时间等)使用时，如本文所用的术语“约”或“大约”意指涵盖偏离指定值+/-20％或更少、+/-10％或更少、+/-5％或更少或+/-1％或更少的变化，在该范围内的此类变化合适于进行本公开。应当理解还具体公开了修饰词“约”或“大约”所涉及的值本身。
“药剂”可以包括任何类型的分子，并且包括但不限于抗体、肽、蛋白质、多核苷酸(例如，寡核苷酸、RNA或DNA)、小分子、其衍生物及其类似物。
“生物样品”是来源于生物体的任何组织、细胞、流体或其他物质。如本文所用，术语“样品”包括生物样品，诸如来源于生物体的任何组织、细胞、流体或其他物质。
“特异性结合”是指其中化合物(例如，肽)识别并结合至分子(例如，肽或多肽)，但是基本上不识别并结合至样品(例如，生物样品)中的其他分子的情况，即化合物表现出与分子的选择性结合的情况。如本文所述的“结合物”包括但不限于表现出与同源分子的特异性结合的蛋白质、多肽或其片段。结合物可以是指抗原结合结构域，诸如双特异性或三特异性接合器的第一结合结构域或双特异性或三特异性接合器的第二抗原结合结构域，等等。在一些情况下，结合物可以是可以与细胞上的受体特异性结合且因此表现出示例性接合器的一部分的特异性结合的任何生物分子或其片段，诸如肽或缀合肽或配体。
术语“免疫应答”包括受T细胞共刺激的调节影响的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞激活影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答细胞(例如，单核细胞或巨噬细胞)的激活。
天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列多肽共同的定性生物特性的化合物。“功能性衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，前提是其具有与相应的天然序列多肽共同的生物活性。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰物两者。
术语“吞噬作用细胞”和“吞噬细胞”在本文中可互换地用于指能够有吞噬作用的细胞。有三种主要类别的吞噬细胞：巨噬细胞；单核细胞(mononuclear cell)(组织细胞和单核细胞(monocyte))；多形核白细胞(嗜中性粒细胞)和树突细胞。
术语“生物样品”涵盖从生物体获得并且可以用于诊断或监测测定的多种样品类型。所述术语涵盖生物起源的血液和其他液体样品、固体组织样品诸如活检样本或源自其的组织培养物或细胞及其子代。所述术语涵盖在其取得之后已以任何方式，诸如通过用试剂处理、增溶或针对某些组分富集来操作的样品。所述术语涵盖临床样品，并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
如本文所用，术语“抗原呈递细胞(antigen-presenting cell)”或“抗原呈递细胞(antigen-presenting cells)”或其缩写“APC”或“APCs”是指能够内吞吸附、加工和呈递抗原的一种或多种细胞。所述术语包括专职性抗原呈递细胞，例如B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞(DC)和朗格汉斯细胞；以及其他抗原呈递细胞诸如角质形成细胞、内皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞。术语“抗原呈递”意指在细胞表面上作为与MHC分子结合的肽片段展示抗原。许多不同种类的细胞可以充当APC，包括例如单核细胞或巨噬细胞、B细胞、滤泡树突细胞和树突细胞。APC也可以通过加工外源抗原并在I类MHC分子上呈递加工的抗原来交叉呈递肽抗原。产生与I类MHC分子缔合而被识别的蛋白质的抗原通常是在细胞内产生的蛋白质，并且这些抗原被加工并且与I类MHC分子缔合。
“表位”是指抗原或其他大分子的能够与抗体或TCR的可变区结合囊形成结合相互作用的部分。所述术语包括能够与如本文所定义的抗体、抗体肽和/或抗体样分子(包括但不限于T细胞受体)特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇典型地由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
在一些实施方案中，吞噬受体融合蛋白(PFP)包含与吞噬受体融合、对靶细胞的抗原具有特异性的细胞外抗原结合结构域。靶细胞是例如癌细胞。在一些实施方案中，吞噬细胞在吞噬癌细胞之后可以将癌症抗原呈递在其细胞表面上以激活T细胞。
如本文所用，术语“抗原”是能够刺激免疫应答的任何有机或无机分子。如本文所用，术语“抗原”扩展至能够刺激免疫应答的任何分子，诸如但不限于肽、多肽、蛋白质、核酸分子、碳水化合物分子、有机或无机分子。
在一些实施方案中，吞噬受体融合蛋白可以包含细胞外结构域，其包括可以与癌细胞上的癌症抗原或细胞表面分子结合的抗体结构域或其抗原结合部分。术语“抗体”或“抗体部分”包括但不限于识别表位的任何含多肽链的分子结构。在本发明中利用的抗体可以是多克隆抗体，但是优选单克隆抗体，因为它们可以通过细胞培养物或重组再现，并且可以被修饰以降低其抗原性。所述术语包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgY，并且意指包括全抗体(包括单链全抗体)及其抗原结合(Fab)片段。抗原结合抗体片段包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd(由VH和CH1组成)、单链可变片段(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的可变片段(dsFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包括单独的或与以下中的全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。还包括可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。抗体可以是例如特异性结合HLA相关多肽或HLA-肽复合物的单克隆、多克隆、嵌合、人源化和人单克隆和多克隆抗体。本领域技术人员将认识到，多种免疫亲和性技术适合于富集可溶性蛋白质，诸如可溶性HLA-肽复合物或膜结合HLA相关多肽，例如，所述可溶性蛋白质已经被从膜上蛋白水解裂解。这些包括如下技术：其中(1)将能够与可溶性蛋白特异性结合的一种或多种抗体固定至固定的或可移动的基材(例如，塑料孔或树脂、胶乳或顺磁珠)，以及(2)将含有来自生物样品的可溶性蛋白的溶液在抗体包被的基材上通过，从而允许可溶性蛋白与抗体结合。将具有抗体和结合可溶性蛋白的基材与溶液分离，并且任选地将抗体和可溶性蛋白例如通过改变浸浴抗体的溶液的pH和/或离子强度和/或离子组成来解离。可替代地，可以使用其中组合抗体和可溶性蛋白并且使其形成大分子聚集体的免疫沉淀技术。可以通过尺寸排阻技术或通过离心将大分子聚集体从溶液分离。
自适应免疫系统对侵入生物体的分子结构(称为抗原)作出反应。与先天免疫系统不同，自适应免疫系统对病原体具有高度特异性。自适应免疫也可以提供持久的保护；例如，从麻疹中恢复的人现在终身受到保护免受麻疹。有两种类型的自适应免疫反应，其包括体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免疫反应中，由B细胞分泌至体液中的抗体与病原体来源的抗原结合，从而导致通过多种机制(例如，补体介导的裂解)消除病原体。在细胞介导的免疫反应中，激活能够破坏其他细胞的T细胞。例如，如果与疾病相关的蛋白质存在于细胞中，则将它们在细胞内蛋白质水解片段化成肽。然后，特定细胞蛋白质使它们自身附接至以这种方式形成的抗原或肽并将其转运至细胞的表面，在这里它们被呈递至身体的T细胞中的分子防御机制。细胞毒性T细胞识别这些抗原并且杀伤具有抗原的细胞。
术语“主要组织相容性复合物(MHC)”、“MHC分子”或“MHC蛋白质”是指能够结合抗原性肽的蛋白质，所述抗原性肽由吞噬细胞或抗原呈递细胞内对蛋白质抗原的蛋白水解裂解产生并且出于呈递至T淋巴细胞并将其激活的目的。此类抗原性肽代表T细胞表位。人MHC也称为HLA复合物。因此，术语“人白细胞抗原(HLA)系统”、“HLA分子”或“HLA蛋白”是指编码人中MHC蛋白的基因复合物。术语MHC在小鼠物种中称为“H-2”复合物。本领域普通技术人员将认识到，术语“主要组织相容性复合物(MHC)”、“MHC分子”、“MHC蛋白”和“人白细胞抗原(HLA)系统”、“HLA分子”、“HLA蛋白”在本文中可互换使用。
HLA蛋白通常分类为称为I类HLA和II类HLA的两种类型。两个HLA种类的蛋白质的结构非常相似；然而，它们可以具有不同的功能。I类HLA蛋白存在于身体的几乎所有细胞(包括大多数肿瘤细胞)的表面上。I类HLA蛋白负载有通常来自内源蛋白或来自细胞内存在的病原体的抗原，并且然后被呈递至幼稚或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。II类HLA蛋白存在于抗原呈递细胞(APC)上，所述抗原呈递细胞包括但不限于树突细胞、B细胞和单核细胞或巨噬细胞。它们主要将从例如在细胞外的外部抗原来源加工的肽呈递至辅助T细胞。由I类HLA蛋白结合的大多数肽源自生物体自身的健康宿主细胞中产生的细胞质蛋白，并且通常不刺激免疫反应。
在II类HLA系统中，吞噬细胞(诸如单核细胞或巨噬细胞)和未成熟的树突细胞通过吞噬作用将实体摄取为吞噬体-但B细胞表现出更普遍的成为内体的内吞作用，所述吞噬体和内体与溶酶体融合，溶酶体的酸性酶将摄取的蛋白质裂解成许多不同肽。自体吞噬是II类HLA肽的来源。经由与在宿主基因组中编码的、由宿主携带的II类HLA变体的分子相互作用的物理化学动力学，特定肽表现出免疫显性并负载至II类HLA分子上。这些被运输至细胞表面并且在其上外化。最受研究的II亚类HLA基因是：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。
通过II类HLA分子将肽呈递至CD4+辅助T细胞是为外来抗原的免疫应答所需的。一旦被激活，CD4+T细胞促进B细胞分化和抗体产生，以及CD8+T细胞(CTL)应答。CD4+T细胞还分泌激活和诱导其他免疫细胞的分化的细胞因子和趋化因子。II类HLA分子是α-和β-链的异二聚体，所述链相互作用以形成比I类肽结合槽更开放的肽结合槽。据信与II类HLA分子结合的肽具有9-氨基酸结合核心，其中在N或C末端侧上具有从槽突出的侧接残基。这些肽的长度通常为12-16个氨基酸，并且常常在结合记录(binding register)的位置P1、P4、P6/7和P9处含有3-4个锚定残基(Rossjohn等人,2015)。
HLA等位基因以共显性的方式表示，这意味着从双方父母遗传的等位基因(变体)同样表达。例如，每个人携带3个I类基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)中每一个的2个等位基因，并且因此可以表达六种不同类型的II类HLA。在II类HLA基因座中，每个人遗传一对HLA-DP基因(DPA1和DPB1，其编码α和β链)、HLA-DQ(DQA1和DQB1，针对α和β链)、一个基因HLA-DRα(DRA1)和一个或多个基因HLA-DRβ(DRB1和DRB3，-4或-5)。例如，HLA-DRB1具有超过几乎400个已知等位基因。这意味着一名杂合个体可以遗传六个或八个功能性II类HLA等位基因：来自每位父母的三个或更多个。因此，HLA基因是高度多态性的；在群体内的不同个体中存在许多不同的等位基因。编码HLA蛋白的基因具有许多可能的变型，从而使每个人的免疫系统对广泛范围的外来侵入物作出反应。一些HLA基因具有数百个鉴定形式(等位基因)，对每个所述鉴定形式给出特定编号。在一些实施方案中，I类HLA等位基因是HLA-A*02:01、HLA-B*14:02、HLA-A*23:01、HLA-E*01:01(非经典的)。在一些实施方案中，II类HLA等位基因是HLA-DRB*01:01、HLA-DRB*01:02、HLA-DRB*11:01、HLA-DRB*15:01和HLA-DRB*07:01。
在一些实施方案中，将吞噬细胞施用至患者或受试者。施用至人受试者的细胞必须与受试者免疫相容，所述受试者具有在受试者中天然表达的匹配HLA亚型。受试者的受试者特异性HLA等位基因或HLA基因型可以通过本领域已知的任何方法来确定。在示例性实施方案中，所述方法包括确定多态性基因类型，所述确定可以包括生成从测序数据集中提取的读段与包含多态性基因的等位基团变体的基因参考集的比对，确定比对中每个等位基因变体的第一后验概率或后验概率推导得分，将具有最大第一后验概率或后验概率推导得分的等位基因变体鉴定为第一等位基因变体，鉴定与第一等位基因变体和一个或多个其他等位基因变体对齐的一个或多个重叠读段，使用加权因子确定针对一个或多个其他等位基因变体的第二后验概率或后验概率推导得分，通过选择具有最大第二后验概率或后验概率推导得分的等位基因变体来鉴定第二等位基因变体，第一等位基因变体和第二等位基因变体定义了多态性基因的基因类型，并且提供了第一等位基因变体和第二等位基因变体的输出。如本文所用，表达“氨基酸”旨在包括天然氨基酸和合成氨基酸两者，以及D氨基酸和L氨基酸两者。合成氨基酸还涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、和氨基酸衍生物诸如酰胺。存在于本发明多肽内的氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他化学基团的取代来修饰，所述修饰可以改变循环半衰期而不对其生物活性产生不利影响。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于描述一系列由肽键或修饰的肽键(诸如同电子排列体)共价连接的至少两个氨基酸。对于可以构成肽或蛋白质的最大氨基酸数目没有设限。术语“寡聚物”和“寡肽”还旨在意指如本文所述的肽。此外，术语多肽扩展至肽的片段、类似物和衍生物，其中所述片段、类似物或衍生物保留与片段、衍生物或类似物所来源于的肽相同的生物功能活性。
如本文所用，多肽可以是“蛋白质”，包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、细胞蛋白或膜蛋白。多肽可以包括蛋白质的一种或多种亚基。多肽可以由重组核酸编码。在一些实施方案中，多肽可以在单一氨基酸链中包含多于一种肽，所述多于一种肽可以通过间隔子、接头或肽裂解序列分开。多肽可以是融合多肽。多肽或蛋白质可以包含一个或多个结构域。结构域是蛋白质的具有限定功能的结构部分，多肽或蛋白质可以包含一个或多个模块。模块是结构域或结构域的一部分或具有特定功能的蛋白质部分。模块可以是蛋白质的结构模块，其根据其结构实施方案来命名。部分是多肽、蛋白质或核酸的具有特定结构或进行特定功能的一部分。例如，信号传导部分是在多肽或蛋白质或重组核酸的较大结构内的特定单元，所述特定单元(或在核酸的情况下由其编码的蛋白质部分)参与信号转导过程，例如磷酸化。除非在文本中另外定义了特定结构或功能性取向，否则模块、结构域和部分可以互换使用。基序是生物分子中的结构实体。例如，蛋白质或多肽中的信号传导基序是指蛋白质或多肽上的氨基酸链段，所述氨基酸链段含有可以磷酸化、去磷酸化或可以充当另一种信号传导分子的结合位点的氨基酸。类似地，在核酸的情况下，例如，TNF mRNA在3'UTR中具有保守基序UUAUUUAUU，mRNA去稳定化酶诸如锌指结合蛋白36家族成员与所述保守基序结合。
如本文所用，术语“前抗体(pro-antibody)”可以是指包含非活性抗原结合结构域的抗体、scFv、VHH、单结构域抗体或蛋白质或多肽；其中抗原结合能力被设计为例如通过结合可裂解抗原结构域结合多肽而被阻断或为非活性的，直到进行活性步骤以将前抗体转化为其活性形式。在一些实施方案中，活性步骤涉及对阻断抗原结合结构域的实体的蛋白酶裂解。
如本文所用，术语“重组核酸分子”是指重组DNA分子或重组RNA分子。重组核酸分子是含有来自不同原始来源并且并非天然附接在一起的连接核酸分子的任何核酸分子。可以在实验室中合成重组核酸。可以通过使用DNA的酶促修饰，诸如酶限制消化、连接和DNA克隆而通过使用重组DNA技术来制备重组核酸。如本文所用的重组核酸可以是DNA或RNA。可以在体外转录重组DNA以产生信使RNA(mRNA)，可以分离、纯化重组mRNA并且将其用于转染细胞。重组核酸可以编码蛋白质或多肽。可以将重组核酸在合适的条件下掺入至活细胞中，并且可以在活细胞内表达。如本文所用，核酸的“表达”通常是指核酸的转录和/或翻译。核酸表达的产物通常是蛋白质，但也可以是mRNA。在已经掺入重组核酸的细胞中检测到由重组核酸编码的mRNA被认为是核酸在细胞中“表达”的阳性证据。
将核酸插入或掺入至细胞中的过程可以经由转化、转染或转导进行。转化是细菌细胞摄取外来核酸的过程。该方法适于增殖质粒DNA、蛋白质产生和其他应用。转化将重组质粒DNA引入至从环境中摄取细胞外DNA的感受态细菌细胞中。一些细菌物种在某些环境条件下天然是感受态的，但在实验室环境中人工诱导感染态。转染是将小分子诸如DNA、RNA或抗体强迫引入至真核细胞中。只是为了产生生物混淆，“转染”也是指将噬菌体引入至细菌细胞中。‘转导’主要用于描述将重组病毒载体颗粒引入至靶细胞中，而‘感染’是指用野生型病毒对人或动物的自然感染。
如本文所用，术语“载体”意指能够在细胞之间传递核酸的任何基因构建体，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等。载体可以能够实现复制、表达、重组、插入或整合中的一种或多种，但不必具有这些能力中的每一种。质粒是由术语“载体”涵盖的属的种类。载体典型地是指含有复制起点和在宿主细胞中复制和/或维持所需的其他实体的核酸序列。能够指导它们可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达的载体在本文中称为“表达载体”。一般来讲，具有效用的表达载体常常呈“质粒”的形式，其是指圆形双链DNA分子，所述分子在其载体形式中不与染色体结合，并且典型地包含用于稳定或瞬时表达的实体或编码的DNA。可用于本文公开的方法中的其他表达载体包括但不限于质粒、附加体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，并且此类载体可以整合至宿主的基因组中或在细胞中自主复制。载体可以是DNA或RNA载体。也可以使用本领域技术人员已知的起等同功能的其他形式的表达载体，例如，自我复制型染色体外载体或能够整合至宿主基因组中的载体。示例性载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。
如关于融合蛋白所用的术语“间隔子”或“接头”是指连接构成融合蛋白的蛋白质的肽。在一些实施方案中，可以选择间隔子的组成氨基酸以影响分子的一些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。适用于本公开的实施方案的合适接头是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。使用接头来将两种抗原性肽分开足以确保在一些实施方案中每种抗原性肽适当折叠的距离。示例性肽接头序列采用柔性延伸构象，并且未表现出发展有序二级结构的倾向。柔性蛋白质区域中的典型氨基酸包括Gly、Asn和Ser。预期含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的几乎任何排列满足接头序列的以上标准。其他近中性氨基酸(诸如Thr和Ala)也可用于接头序列中。
在一些实施方案中，肽接头具有多于一种功能特性，诸如本文所述的功能特性。例如，肽接头连接两个或更多个功能性结构域，诸如结合结构域。另外，当肽接头接触细胞的细胞外部分(诸如受体或配体结合蛋白)时，所述接头可以是特定的信号诱导物。
术语“免疫纯化(IP)”(或免疫亲和纯化或免疫沉淀)是本领域熟知的工艺，并且广泛用于从样品中分离所需抗原。一般来讲，所述工艺涉及使含有所需抗原的样品与亲和基质接触，所述亲和基质包含共价附接至固相的针对抗原的抗体。样品中的抗原通过免疫化学键与亲和基质结合。然后洗涤亲和基质以除去任何未结合的物质。通过改变与亲和基质接触的溶液的化学组成来从亲和基质中除去抗原。免疫纯化可以在含有亲和基质的柱上进行，在这种情况下，溶液是洗脱液。可替代地，免疫纯化可以是处于间歇工艺中，在这种情况下，将亲和基质保持为溶液中的悬浮物。所述工艺中的一个重要步骤是从基质中除去抗原。此举通常通过增加与亲和基质接触的溶液的离子强度(例如，通过添加无机盐)来实现。对pH的改变也可以有效地解离抗原与亲和基质之间的免疫化学键。
如本文所用，术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”、“检测”及其语法等同物是指定量确定和定性确定两者，并且因此术语“确定”与“测定”、“测量”等在本文中可互换使用。当预期定量确定时，使用短语“确定分析物的量”等。当预期定性和/或定量确定时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。
“片段”是蛋白质或核酸的一部分，所述部分与参考蛋白质或核酸基本相同。在一些实施方案中，所述部分保留了本文所述的参考蛋白质或核酸的生物活性的至少50％、75％或80％、或90％、95％、或甚至99％。
术语“分离的”、“纯化的”、“生物学纯的”及其语法等同物是指在不同程度上不含如在其天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。“分离”表示与初始来源或周围环境的分开程度。“纯化”表示高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质充分不含其他物质，使得任何杂质不实质上影响蛋白质的生物特性或引起其他不利后果。即，如果当本公开的核酸或肽通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当用化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学品，则所述核酸或肽是纯化的。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以经受修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离蛋白质，所述分离蛋白质可以单独纯化。
术语“瘤形成”和“癌症”是指由不适当高水平的细胞分裂、不适当低水平的细胞凋亡或两者引起或导致所述不适当高水平的细胞分裂或不适当低水平的细胞凋亡的任何疾病。胶质母细胞瘤是瘤形成或癌症的一个非限制性实例。术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖性障碍”是指存在具有致癌细胞的典型特征的细胞，所述典型特征诸如不受控的增殖、永生化、转移潜能、快速的生长和增殖速率以及某些特征性形态学特征。癌细胞常常呈肿瘤的形式，但是此类细胞可以单独存在于动物内，或者可以是非致瘤癌细胞，诸如白血病细胞。
术语“疫苗”应理解为意指用于产生免疫力以便预防和/或治疗疾病(例如，瘤形成/肿瘤/感染原/自身免疫性疾病)的组合物。因此，如本文所用的疫苗是包含重组核酸或包含并表达重组核酸的细胞的药物，并且旨在用于人或动物中以便通过疫苗接种产生特异性防御和保护性物质。“疫苗组合物”可以包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。本公开的方面涉及所述技术在制备基于吞噬细胞的疫苗中的用途。
术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府监管机构批准或可批准或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出以用于动物(包括人)的。“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与药剂一起施用至受试者并且在以足以递送治疗量的药剂的剂量施用时不破坏其药理学活性且无毒的赋形剂、载体或稀释剂。如本文所记载的池化(pooled)疾病特异性抗原的“药学上可接受的盐”可以是通常在本领域中被认为适合与人类或动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激、变应性应答或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。此类盐包括碱性残基(诸如胺)的矿物盐和有机酸盐以及酸性残基(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐。具体的药用盐包括但不限于诸如以下的酸的盐：盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、链烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域的普通技术人员应从本公开和本领域知识认识到本文提供的池化疾病特异性抗原的另外的药学上可接受的盐包括由Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿的药物科学],第17版,Mack Publishing Company[马克出版公司],伊斯顿,宾夕法尼亚州,第1418页(1985)列出的那些。
可用于本公开的方法中的核酸分子包括编码本公开的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不必与内源核酸序列100％相同，但是将典型地表现出基本同一性。相对于内源序列具有基本同一性的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在不同的严格度条件下核酸分子配对以在互补的多核苷酸序列或其部分之间形成双链分子的情况。例如，严格的盐浓度通常可以小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠、小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠、或小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在不存在有机溶剂(例如，甲酰胺)下可以获得低严格度杂交，而在至少约35％甲酰胺、或至少约50％甲酰胺存在下可以获得高严格度杂交。严格的温度条件通常可以包括至少约30℃、至少约37℃、或至少约42℃的温度。不同的另外的参数(诸如杂交时间、洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度以及载体DNA的包含或排除)对本领域的普通技术人员来说是熟知的。根据需要通过组合这些不同的条件来实现不同的严格度水平。在一个示例性实施方案中，杂交可以在30℃下，在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在另一个示例性实施方案中，杂交可以在37℃下，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在另一个示例性实施方案中，杂交可以在42℃下，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的有用变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将可以在严格度方面不同。可以通过盐浓度和温度限定洗涤严格度条件。如上，可以通过降低盐浓度或通过增加温度来增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度可以小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠、或小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件可以包括至少约25℃、至少约42℃、或至少约68℃的温度。在示例性实施方案中，洗涤步骤可以在25℃下，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在其他示例性实施方案中，洗涤步骤可以在42℃下，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在另一种示例性实施方案中，洗涤步骤可以在68℃下，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的另外变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。杂交技术对于本领域的技术人员来说是熟知的并且描述于例如以下文献中：Benton和Davis(Science[科学]196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA[美国国家科学院院刊]72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验手册],Wiley Interscience[威利国际科学],纽约,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques[分子克隆技术指南],1987,Academic Press[学术出版社],纽约)；以及Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆实验指南],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约。
“基本上相同的”是指相对于参考氨基酸序列(例如，本文所述的任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一种核酸序列)表现出至少50％同一性的多肽或核酸分子。这种序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸上可以是至少60％、80％或85％、90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更多相同的。典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传计算组(the Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin Biotechnology Center)(大学大道1710，麦迪逊，威斯康星州53705)的序列分析软件包、BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。这种软件通过对不同的取代、缺失和/或其他修饰分配同源性程度而将相同或相似的序列进行匹配。保守取代典型地包括在以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e-3与e-m°之间的概率得分指示密切相关的序列。“参考”是比较标准。
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅通过举例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、鼠类、牛类、马类、犬类、绵羊或猫类。
术语“治疗(treat/treated/treating/treatment等)”意指减少、预防或改善病症(例如，瘤形成或肿瘤或感染原或自身免疫性疾病)和/或与其相关的症状。“治疗”可以是指在疾病(例如，癌症或感染原感染或自身免疫性疾病)发作或疑似发作之后向受试者施用疗法。“治疗”包括“减轻”的概念，其是指减少与疾病相关的任何症状或其他不良作用和/或与疗法相关的副作用的发生或复发频率或严重程度。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，其是指降低患者中疾病或病症的严重程度，例如延长患有疾病的患者的寿命或延长所述患者的生存能力；或延迟其复发，例如延长已经罹患疾病的患者的缓解期。应理解，尽管没有排除，但治疗病症或病况并不需要完全消除病症、病况或与其相关的症状。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”及其语法等同物意指在施用药剂或化合物开始时尚未发展与疾病或病况相关的症状的受试者中避免或延迟此类症状的发作。
术语“治疗效果”是指在一定程度上减轻病症(例如，瘤形成、肿瘤或感染原感染或自身免疫性疾病)或其相关病变的一种或多种症状。如本文所用的“治疗有效量”是指在单剂量或多剂量施用至细胞或受试者时，在延长患有这种病症的患者的生存能力、减少病症的一种或多种体征或症状、预防或延迟以及超过不存在这种治疗下预期的情况等方面有效的药剂的量。“治疗有效量”旨在限定实现治疗效果所需的量。具有本领域中普通技术的医师或兽医能够容易地确定并开具所需药物组合物的“治疗有效量(例如，ED50)”。
如本文所用，术语“亲和分子”是指以化学特异性与亲和受体肽结合的分子或配体。化学特异性是蛋白质结合位点结合特定配体的能力。蛋白质可以结合的配体越少，其特异性越高。特异性描述了给定蛋白质与配体之间的结合强度。这种关系可以通过对细胞表面组分具有特异性的第一scFv在解离常数(KD)上描述，所述解离常数表征蛋白质-配体系统的结合状态与未结合状态之间的平衡。
在说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特征、结构或特性包括在本公开的至少一些实施方案中，但不必包括在本公开的所有实施方案中。
术语“髓样细胞”是指在血液、骨髓、身体的其他造血或其他非造血隔室中发现的正常或赘生性细胞。特别地，术语“髓样细胞”在本文中用于意指源自骨髓的细胞谱系，所述细胞谱系包括多形核嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞，以及单核细胞/巨噬细胞谱系和不同的树突细胞谱系。髓样细胞不能分化为淋巴细胞(例如，NK-、B-和T-淋巴细胞)。所述术语是指髓样谱系在其所有分化阶段中的细胞，且因此包括造血原始细胞，即定型为髓样细胞谱系，但是在早期分化阶段中的造血细胞。当用适当的生长因子刺激时，造血原始细胞分裂以产生大量比原始分化阶段分化程度更高的细胞。实例尤其是原粒细胞。尽管在整个说明书中举例说明了单核细胞或巨噬细胞，但在此所述的组合物和方法适用于髓样细胞谱系的细胞，诸如树突细胞。如本领域技术人员已知的，在细胞至细胞基础上设想微小的优化和变化，并且将其预期在本发明的范围内。
比原始细胞分化程度更高但尚未完全分化的细胞附加有前缀“前(Pro)”，并且还旨在落入“髓样细胞”的定义下。实例是前髓细胞。
术语“髓样细胞”还包括例如在骨髓中的髓样祖细胞，即细胞谱系，其能够分化为诸如髓单核祖细胞、前成红细胞或未成熟的原巨核细胞的细胞。髓样祖细胞不能产生淋巴细胞。
术语“髓样细胞”不包括淋巴造血干细胞。淋巴造血干细胞被定义为能够进行自我更新和分化为两种原理前体组分即髓样系和淋巴样系的那些细胞。此类干细胞被称为是全能性的。不太全面但仍然可以分化为若干种系的干细胞称为多能性的。
术语“单核细胞或巨噬细胞特异性接合器”不仅适用于单核细胞或巨噬细胞，而是适用于所有髓样细胞，且因此单核细胞或巨噬细胞特异性接合器类似于“髓样细胞特异性接合器”。
吞噬细胞是免疫系统的天然哨兵，并且在体内形成第一防御线。它们吞噬病原体、病原体感染的细胞、外来体或癌细胞并且将其从体内除去。大多数潜在病原体在它们可能引起例如显著感染之前被该系统迅速中和。这可能涉及通过网格蛋白包被小窝系统进行的受体介导的摄取、作为膜边缘波动的结果的胞饮作用(特别是巨胞饮作用)和吞噬作用。因此，吞噬细胞可以由多种非自身(和自身)元件来激活，并且在识别其“靶标”方面表现出可塑性水平。大多数吞噬细胞在其表面上表达作为模式识别分子的清道夫受体，并且可以与广泛范围的外来颗粒以及体内的死细胞、碎屑和不需要的颗粒结合。
髓样细胞(诸如单核细胞和巨噬细胞)也是感染、炎症位点中或肿瘤中最丰富的细胞类型之一。因此，单核细胞或巨噬细胞可以是有吸引力的细胞疗法媒介物。本文提供了修饰单核细胞或巨噬细胞或吞噬细胞以增强吞噬杀伤患病细胞(诸如肿瘤或感染细胞)的机制。
尽管在本公开中详细描述了单核细胞/巨噬细胞，但所述组合物和方法可以适用于任何吞噬细胞类型，或者适用于髓样细胞类型(包括且不限于嗜中性粒细胞和树突细胞)，其中如本领域技术人员已知的那样进行微小的优化(如果适用)。同样，尽管作为本公开中髓样细胞疗法的适应症详细描述了癌症，但可以使得所述组合物和方法适用于感染和自身免疫性病况，其中进行如由本领域技术人员认为需要的微小修改。
吞噬作用(定义为在质膜包膜内对微粒(>0.5μm)的细胞吸收)与流体相巨胞饮和受体途径的可溶性配体的内吞作用密切相关并且与所述内吞作用部分重叠。变体与凋亡细胞的摄取(也称为胞葬作用)，以及由感染和炎症引起的坏死细胞的摄取(坏死性凋亡和细胞焦亡)相关。外源颗粒的摄取(异体吞噬)具有与自体吞噬(螯合和溶酶体处理受损的细胞内细胞器的内源过程)共同的特征。摄取机制根据颗粒尺寸、多种受体-配体相互作用和细胞骨架的累及而变化。一旦内化，吞噬体液泡可以与初级溶酶体或内质网(ER)和高尔基氏复合体的产物选择性融合，以形成二级吞噬溶酶体。该途径是动态的，因为它经历了与内吞的和分泌的囊泡、巨噬细胞、DC、破骨细胞和嗜酸性粒细胞的融合和裂体。抗微生物吞噬作用清除并降解致病微生物，通过细胞因子和趋化因子分泌诱导促炎信号传导，并且募集免疫细胞以组织有效的炎症应答。这种类型的吞噬作用常常被称为“炎症吞噬作用”(或“免疫原性吞噬作用”)。然而，在一些情况下，诸如在某种持续性感染的情况下，抗炎应答可遵循微生物摄取。抗微生物吞噬作用通常由髓样谱系的专职性吞噬细胞(诸如未成熟的树突细胞(DC)和单核细胞或巨噬细胞)并且由组织驻留免疫细胞进行。相比之下，受损的自身来源的凋亡细胞或细胞碎片的吞噬作用(例如，胞葬作用)典型地是非炎症(也称为“非免疫原性”)过程。每天数十亿个受损、死亡和不需要的细胞经历细胞凋亡。不需要的细胞包括例如在发育期间产生的过量细胞、衰老细胞、感染细胞(细胞内细菌或病毒)、转化或恶性细胞以及被细胞毒剂不可逆转地损害的细胞。
骨髓是循环嗜中性粒细胞和单核细胞的来源，所述循环嗜中性粒细胞和单核细胞将替代选择性组织驻留单核细胞或巨噬细胞并且在炎症和感染期间扩增组织髓样群体。在吞噬作用后，新募集的单核细胞和组织巨噬细胞通过从质膜中预先存在的磷脂和花生四烯酸酯产生其产物并且通过释放由激活呼吸爆发或诱导诱导型一氧化氮合成产生的自由基来分泌所述产物；除了通过合成如上产生的低分子量产物(花生四烯酸酯代谢物、超氧化物阴离子和一氧化氮)来实现，由单核细胞或巨噬细胞的吞噬作用诱导的分泌主要通过新的RNA合成和导致进行性酸化的pH变化来实现。高度吞噬巨噬细胞似乎是MARCO+SignR1+，并且发现于外边缘区中，迅速清除有荚膜细菌。类似的CD169+F4/80_巨噬细胞内衬于淋巴结中的被膜下淋巴窦，并且已经与病毒感染有牵连。应指出，内皮巨噬细胞(包括肝脏中的枯氏细胞)从血液和淋巴结中清除微生物和抗原性配体，以提供与粘膜免疫相当但不同的窦内免疫功能。并非所有组织巨噬细胞都是组成型吞噬的，即使它们仍然表达典型的巨噬细胞标记物。在啮齿动物脾脏的边缘区中，缺乏F4/80的嗜金属巨噬细胞强烈表达CD169即唾液酸结合免疫球蛋白(Ig)样凝集素1(SIGLEC1[唾液酸粘附素])，但吞噬作用差。非专职性吞噬细胞包括上皮细胞和成纤维细胞。成纤维细胞是“工人阶级吞噬细胞”，通过经由粘附分子ICAM和玻连蛋白受体使用除CD11b-CD18以外的整联蛋白来清除凋亡碎片。也据报道，星形胶质细胞吞噬(即使没有高效降解)凋亡尸体。与吞噬作用相关的质膜受体可以是主要针对IgG抗体的保守结构域的调理素FcR(激活或抑制)；和补体受体，诸如针对通过补体激活的经典途径(IgM或IgG)或替代凝集素途径沉积的iC3b的CR3。CR3还可以在不存在调理素下或许通过沉积巨噬细胞来源的补体来介导识别。抗微生物吞噬作用通常由髓样谱系的专职性吞噬细胞(诸如未成熟的树突细胞(DC)和巨噬细胞)并且由组织驻留免疫细胞进行。
在癌症中，由多种因子(包括CCL2、ATP等)吸引的单核细胞迁移至肿瘤微环境中。然而，这些单核细胞中的大部分然后可以分化为肿瘤相关单核细胞或巨噬细胞和/或髓样抑制细胞。为了产生有效地杀伤肿瘤细胞的单核细胞或巨噬细胞和髓样细胞，而不是髓样抑制细胞和肿瘤相关单核细胞或巨噬细胞，本发明的组合物提供了用于通过驻留单核细胞或巨噬细胞增强对肿瘤细胞的吞噬作用的手段，并且还组织了成功且稳定的免疫应答。
在肿瘤环境中对单核细胞或巨噬细胞功能的研究表明，激活单核细胞或巨噬细胞需要至少两种信号。第一信号(信号1)经由吞噬作用/拴系受体介导，并且第二信号(信号2)通过危险信号(诸如病原体相关分子模式(DAMP))或触发核因子-κB(NF-κB)介导的炎症基因上调的细胞因子介导(图1A)。在利用巨噬细胞杀伤癌症的背景下，单独触发吞噬作用可能不足以激活单核细胞或巨噬细胞，因为用由与癌细胞的结合产生的单独吞噬作用触发信号不足以驱动抗肿瘤应答。
虽然在此将癌细胞或肿瘤细胞反复称为靶细胞，但在此所述的概念适用于任何类型的靶细胞，诸如感染细胞或需要通过吞噬作用消除的特定疾病细胞类型，只要将癌细胞的细胞表面组分的结合结构域合适地由对靶细胞具有特异性的细胞表面组分的结合结构域替代。
本公开基于解决了触发髓样细胞以组织针对靶细胞(例如，癌细胞或肿瘤细胞)的强烈应答，使得髓样细胞在接触时破坏靶标，并且触发激活其他免疫细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞)的免疫应答的有效方式的许多努力。努力的一个方面是在患者中原位产生治疗上有效的髓样细胞。在另一个方面，离体产生治疗性髓样细胞，并且将其引入至有需要的患者中。
在一个方面，本公开提供了能够结合至并激活髓样细胞以触发针对靶细胞(诸如肿瘤细胞)的吞噬杀伤和免疫应答的一种或多种合成或重组生物分子，诸如蛋白质或多肽。在一些实施方案中，合成或重组生物分子可以(a)一方面结合髓样细胞上的细胞表面分子(即和抗原)并且(b)另一方面结合靶细胞上的细胞表面分子(即和抗原)，从而至少有效地使两种细胞(效应子和靶标)靶细胞亲密接近，使得任一细胞上的其他细胞受体和膜组分可以相互作用，并且效应髓样细胞从而可以触发对靶细胞的吞噬。简化图形表示描绘于图1B中。在结构上，这种分子将具有两个臂(各自对每种细胞表面分子具有特异性的两个臂)，例如通过接头(例如L)连接的第一结合结构域(例如，A)和第二结合结构域(例如，B)(图1B)。此类合成或重组生物分子可以称为双特异性接合器、或双特异性髓样细胞接合器或BiME。在一个或多个实施方案中，双特异性接合器包括两个抗原结合结构域(“结合物”)。两种结合物中的一种被设计为与效应髓样细胞表面上的抗原结合；另一种被设计为与靶细胞上的抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体或其片段。在一些实施方案中，结合物可以是配体，其与细胞表面上的受体，诸如髓样细胞上或靶细胞上的受体结合。
在一个方面，本公开提供了治疗性组合物，其包含能够结合至并激活髓样细胞以触发针对靶细胞(诸如癌细胞)的吞噬杀伤和免疫应答的一种或多种合成或重组生物分子，诸如蛋白质或多肽，并且所述合成或重组生物分子包含超过两种结合物。因此，在一些实施方案中，本文提供了第一治疗剂，其中所述治疗剂包含：第一结合结构域(或第一结合物)，其中第一结合结构域可以是与靶细胞上的抗原或表面分子特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段；和第二结合结构域(或第二结合物)，其中第二结合结构域可以是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段。在一个或多个实施方案中，第一治疗剂与第一组分偶联，所述第一组分诸如是可以提供第三结合结构域的接头或另一种生物活性肽；或激活因子分子、或另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述组合物包含另外的治疗剂。
在一个方面，本公开提供了能够结合至并激活髓样细胞以触发针对靶细胞(诸如癌细胞)的吞噬杀伤和免疫应答的一种或多种合成或重组生物分子，诸如蛋白质或多肽，并且所述合成或重组生物分子包含超过两种结合物。在一个实施方案中，重组生物分子包含三种结合物，其中每一种表现出与表面分子的特异性结合，且因此重组生物分子可以表现出与两种或更多种细胞上的三个元件的结合。在一个实施方案中，具有三种结合物的重组生物分子能够与髓样细胞上或靶细胞上的多于一种抗原结合。将如在此所述的具有三种结合物的重组生物分子称为三特异性髓样细胞接合器(TriME)。在一些实施方案中，TriME可以结合至或接合三种不同的细胞，例如髓样细胞、靶细胞(诸如癌细胞)和第三细胞或靶标。在一些实施方案中，BiME或TriME可以接合髓样细胞上或癌细胞上的多于一种抗原或表面分子，从而激活髓样细胞或抑制癌细胞的功能，诸如与髓样细胞接合并在其上诱导耐受性或免疫抑制。在一些实施方案中，双特异性、三特异性或多特异性接合器可以包含第二触发器，即第二信号，其不仅诱导髓样细胞对靶细胞的吞噬作用，而且还引发激活其他免疫细胞以便实现长期应答和产生免疫记忆的免疫应答或炎症应答。在一些实施方案中，双特异性、三特异性或多特异性接合器是嵌合分子。因此，本文提供了一种组合物，其包含治疗剂，其中所述治疗剂包含：(a)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一结合结构域；(b)与髓样细胞特异性相互作用的第二结合结构域；以及(c)与所述髓样细胞特异性相互作用的第三结合结构域。在一些实施方案中，所述组合物包含另外的治疗剂。在一些实施方案中，结合物也可以是受体诸如清道夫受体或TLR受体的激活因子。在一些实施方案中，结合物可以是病原性靶标上的有毒性剂，或者病原体细胞或肿瘤细胞上的免疫抑制分子的抑制剂或阻断剂。在一些实施方案中，接合器的结合结构域或结合物或可以进行如上所述的功能的任何部分可以是结合物的治疗性元件。在一些实施方案中，接合器可以包含一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗性组合物可以包含一种或多种接合器，和一种或多种治疗剂，诸如单独的重组蛋白或编码其的核酸、药物产品或小分子。
在如本文所述的一些方面，可能需要第二治疗剂。第二治疗剂可以是第二重组蛋白。在一些实施方案中，第二治疗剂可以抑制肿瘤介导的免疫抑制剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是规避髓样细胞抑制功能或髓样细胞上的致耐受性应答所必需的。在一些实施方案中，第二治疗性是规避肿瘤细胞向吞噬细胞发出的抗吞噬的“不要吃我”信号所必需的。例如，第二治疗剂可以包括CD47拮抗剂、CD47阻断剂、抗体、嵌合CD47受体、唾液酸酶、细胞因子、促炎基因、半胱天冬酶原或抗癌剂。在一些实施方案中，第二治疗剂可以提供用于吞噬细胞介导的免疫应答的第二信号。
使用本文所述的方法和组合物，无论肿瘤微环境中的效应如何，都可以指导髓样细胞激活免疫应答循环。可以指导吞噬细胞吞噬并杀伤靶细胞，并激活免疫应答后发症，其产生针对靶标的成功且持续的适应性免疫应答和免疫记忆。
在以下章节中，描述了包含治疗剂的组合物。
第一治疗剂
在一个方面，描述了第一治疗剂，其中第一治疗剂包含：(i)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域；和(ii)与髓样细胞(诸如单核细胞或巨噬细胞)的受体的细胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域。第一治疗剂是重组嵌合蛋白，其可以至少与靶细胞(诸如肿瘤细胞)和单核细胞或巨噬细胞结合，并且附接两种细胞类型以促进单核细胞或巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，第一治疗剂是嵌合双异性接合器或三特异性接合器。在一些实施方案中，第一治疗剂与第一组分偶联，其中第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域。另外的治疗剂可以是肽、蛋白质、缀合蛋白质、抗体、抗体的功能性衍生物(诸如scFv)、配体、针对配体的受体或其功能性片段、或小分子。在前面叙述中的若干个实例中，第一治疗剂与第一组分偶联，其中第一组分是可以与靶细胞或者单核细胞或巨噬细胞的细胞表面组分缔合的结合元件。
在一些实施方案中，第一治疗剂包括另外的治疗剂。如本文所述的另外的治疗剂可以是小分子。在一些实施方案中，另外的治疗剂是肽结合结构域。在一些实施方案中，另外的治疗剂是细胞表面结合结构域。在一些实施方案中，另外的治疗剂是靶细胞结合结构域。在一些实施方案中，另外的治疗剂可以是抗体、抗体的功能性衍生物(诸如scFv)。在一些实施方案中，另外的治疗剂是配体、肽。在一些实施方案中，另外的治疗剂是蛋白质、缀合蛋白质、针对配体的受体或其功能性片段。在一些实施方案中，另外的治疗剂是由靶细胞介导的髓样细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的抑制剂。
在一些实施方案中，治疗剂是重组蛋白。如本文所述的治疗剂是重组蛋白，其不仅结合肿瘤或癌细胞而且结合单核细胞或巨噬细胞，从而提供用于触发单核细胞或巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的第一信号(信号1)，而且还提供第二信号(信号2)以增强单核细胞或巨噬细胞的吞噬杀伤。
在一个实施方案中，第一治疗剂是细胞外蛋白。
在一些实施方案中，第一治疗剂是分泌蛋白。
在一些实施方案中，第一治疗剂由编码一种或多种核酸序列的重组核酸编码，所述一种或多种核酸序列编码与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域，和(ii)与单核细胞或巨噬细胞的受体的细胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第一治疗剂由表达重组核酸的载体编码，所述重组核酸编码一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包含与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域，和(ii)与髓样细胞的受体的细胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，结合物基于其对其靶标或同源元件的结合特异性来选择。结合结构域可以来源于作为抗体或其功能性片段、与靶抗原或同源分子结合的蛋白质。结合结构域是对其靶标具有高特异性、高结合亲和力或两者的结合结构域。
在一些实施方案中，与其靶标或同源分子的结合亲和力是10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小或10-11M或更小、10-12M或更小。在一些实施方案中，可以进一步修饰结合结构域以增加其结合特异性或结合亲和力或两者。本领域技术人员可以使用现有技术来增强结合物区域的结合特性，并且将此类修改预期在本公开的范围内。
双特异性和三特异性单核细胞或巨噬细胞接合器
A.结合靶细胞和效应细胞
本文提供了重组双特异性和三特异性接合器，其被设计为用效应细胞锚定靶细胞，使得效应细胞攻击靶细胞，并且杀伤特定靶细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞是髓样细胞。在一些实施方案中，所述髓样细胞是单核细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。
虽然癌症是在本公开中专门详细描述的一个示例性实施方案，但是预期本文所述的方法和技术可用于靶向体内的感染细胞或以其他方式患病的细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了用于癌症免疫疗法的组合物和方法。本文提供的方法有助于设计工具，所述工具可以诱导驻留人单核细胞或巨噬细胞变为靶向癌细胞并通过高效的吞噬作用消除它们的高效杀伤细胞。在一些实施方案中，单核细胞或巨噬细胞提供针对癌细胞的持续免疫应答。本文描述了各种实施方案。
本文提供了特异性构建体，并且公开了用于此类嵌合蛋白(称为嵌合“接合器”)的设计。
在一些实施方案中，嵌合接合器包含两种或更多种融合抗体，每种融合抗体具有在靶细胞(诸如癌细胞)上或者单核细胞或巨噬细胞上的特异性结合区域。在某些实施方案中，两种或更多种融合抗体或免疫融合体包含靶标结合结构域，所述靶标结合结构域由免疫球蛋白恒定区的铰链-CH2-CH3结构域或铰链-CH3结构域可操作地连接至特异性结合单核细胞或巨噬细胞的细胞表面组分的效应结合结构域。
在一个方面，嵌合蛋白是双特异性单核细胞或巨噬细胞接合器。
在一些实施方案中，双特异性接合器包含第一治疗剂，其中第一治疗剂包含：(i)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域；和(ii)与单核细胞或巨噬细胞的受体的细胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域。在一个实施方案中，治疗剂是双特异性接合器。在一个实施方案中，双特异性单核细胞或巨噬细胞接合器仅包含具有柔性接头的两个抗体单链可变区(scFv)(不包括Fc氨基酸区段)，一个scFv结合靶细胞的细胞表面组分并且另一个结合单核细胞或巨噬细胞表面上的受体。在IgG的完全未修饰形式中，可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)是单独的多肽链，即分别位于轻链和重链中。形成了抗体轻链和抗体重链的相互作用，特别是抗体的表位结合位点之一VL和VH结构域的相互作用。相比之下，在scFv构建体中，而是抗体的VL和VH结构域包括在单一多肽链中。两个结构域由柔性接头分开，所述柔性接头足够长以允许VL和VH结构域自组装为功能性表位结合位点。
在一些实施方案中，双特异性单核细胞或巨噬细胞接合器包含：(a)与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌症抗原)结合的单链可变片段(scFv)，(b)与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的细胞表面组分结合的单链可变片段(scFv)，(c)可操作地连接(a)和(b)的短接头。在一些实施方案中，scFv在其C末端处融合。每个scFv包含由肽接头可操作地连接的轻链可变结构域和重链可变结构域。在某些实施方案中，scFv是人源化的。人源化scFv包含存在于与互补决定区域(CDR)所来源于的亲本免疫球蛋白相比不同的物种的免疫球蛋白的框架上的“CDR”。例如，可以将鼠类CDR移植至人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。包含两个scFv的示例性双特异性接合器的设计可以由以下简化式表示：
NH2-[靶细胞结合scFv]-COOH-[接头]-COOH-[效应细胞结合scFv]-NH2[I]
在一些实施方案中，双特异性接合器是双抗体。将双特异性双抗体构建为在单一多肽链上具有对不同(非相同)表位具有结合特异性的VL和VH结构域。另外，连接VL和VH的接头的长度短于12个氨基酸，所述长度不足以重新组装为功能性表位。一般来讲，一种多肽链构建体包含对第一抗原具有结合特异性的VL和对第二抗原具有结合特异性的VH，并且另一种多肽链构建体包含对第二抗原具有结合特异性的VL和对第一抗原具有结合特异性的VH；允许两条多肽链自组装为双特异性双抗体。在一些实施方案中，可以将半胱氨酸残基引入在构建体的C末端处，从而可以允许两条链之间的二硫键形成而不干扰其结合特性。
在一些实施方案中，双特异性接合器是串联双scFv。
在一些实施方案中，可以制备编码双特异性scFv接合器的重组核酸构建体。用于表达双特异性scFv接合器的重组核酸构建体编码一种或多种多肽，所述构建体包括(a)编码靶细胞结合scFv轻链的可变结构域、接头、靶细胞结合scFv重链的可变结构域的核酸序列；(b)编码接头的核苷酸序列；(c)编码效应细胞(单核细胞或巨噬细胞)结合scFv轻链的可变结构域、接头、效应细胞(单核细胞或巨噬细胞)结合scFv重链的可变结构域的核酸序列。在一些实施方案中，用于表达双特异性scFv接合器的核酸构建体包含N末端信号肽序列以用于分泌双特异性scFv接合器。
在一些实施方案中，双特异性接合器包含与柔性接头可操作地连接的两个单一结构域抗体(VHH)，一个VHH结合靶细胞的细胞表面组分，并且另一个VHH结合单核细胞或巨噬细胞表面上的受体。在一些实施方案中，嵌合双特异性单核细胞或巨噬细胞接合器包含：(a)与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌症抗原)结合的VHH结构域，(b)与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的细胞表面组分结合的VHH结构域，(c)可操作地连接(a)和(b)的短接头。在一些实施方案中，包含两个单结构域抗体的接合器是纳米抗体。包含两个VHH结构域的示例性双特异性接合器的设计可以由以下简化式表示：
NH2-[靶细胞结合单结构域]-COOH-[接头]-COOH-[效应细胞结合单结构域]-NH2 [II]
在一些实施方案中，可操作地连接(a)和(b)的短接头可以进一步具有另外的功能。在一些实施方案中，肽可以与特定细胞表面受体(例如像TLR受体)结合，并且可以激活单核细胞或巨噬细胞中受体介导的细胞信号传导途径。在一些实施方案中，接头被设计为能够结合单核细胞或巨噬细胞并激活其中的至少炎症途径，或者加强单核细胞或巨噬细胞介导的对靶细胞的吞噬作用和杀伤。在一些实施方案中，接头肽可以具有阻断或抑制靶细胞介导的单核细胞或巨噬细胞功能下调的功能。
在一些实施方案中，可以产生用于双特异性VHH接合器的核酸构建体，其包含：(a)核酸序列，所述核酸序列编码(a)与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌症抗原)结合的VHH结构域，(b)与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的细胞表面组分结合的VHH结构域，(c)可操作地连接(a)和(b)的短接头。在一些实施方案中，用于表达双特异性scFv接合器的核酸构建体包含N末端信号肽序列以用于分泌双特异性scFv接合器。
如本领域技术人员已知的，可以将编码包含VHH或scFv结合结构域的多肽的核酸序列插入在合适的表达载体中，处于编码多肽的序列的5'端处的一个或多个启动子(例如CMV)和3'端处的聚腺苷酸化信号之下。
在一些实施方案中，构建体可以包含内部核糖体进入位点(IRES)，例如，编码一种或多种多肽的核酸序列可以在IRES之后。
在一些实施方案中，编码多肽之一的核酸序列可以放置在单独的启动子控制而不是表达序列的剩余部分之下。
在一些实施方案中，双特异性接合器还可以包含与靶细胞的细胞表面组分结合的抗体或其片段、和与效应细胞的细胞表面组分结合的抗体或其片段。
本文提供了接合器的另外变型，三特异性接合器。三特异性接合器包含第一治疗剂，其中第一治疗剂包含：与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域；与单核细胞或巨噬细胞的第一受体的细胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域；以及与单核细胞或巨噬细胞的第二受体的细胞外区域特异性地相互作用的第三抗原结合结构域。
在一些实施方案中，三特异性接合器是三个scFv的融合构建体，所述三个scFv包括对靶癌细胞上的细胞表面组分具有特异性的第一scFv、对单核细胞或巨噬细胞上的细胞表面组分(例如，嵌合吞噬受体)具有特异性的第二scFv以及对单核细胞或巨噬细胞上的另一个细胞表面组分具有特异性的第三scFv。在一些实施方案中，三特异性接合器被设计为使得第三scFv可以结合的单核细胞或巨噬细胞上的细胞表面组分提供用于单核细胞或巨噬细胞的另外的激活信号，以触发对靶细胞的吞噬作用和杀伤。在一些实施方案中，第三scFv与单核细胞或巨噬细胞上的另一种吞噬受体结合。在一些实施方案中，第三scFv与危险相关的单核细胞或巨噬细胞信号传导途径(DAMP)结合。在一些实施方案中，第三scFv与TLR受体结合。在一些实施方案中，第三scFv与细胞因子受体结合，从而激活受体并且触发单核细胞或巨噬细胞细胞内信号传导。在一些实施方案中，第三scFv与已知产生吞噬作用抑制信号的单核细胞或巨噬细胞受体结合，并且第三scFv与该受体的结合阻断受体，使得能够增强吞噬作用。在一些实施方案中，第三scFv与跟一个或多个跨膜结构域接合并增强吞噬信号传导的受体结合。本文已经预期了三特异性接合器的各种设计，其中包含两个scFv的示例性三特异性接合器可以由以下简化式表示：
Figure BDA0003502291170000441
或者(ii)NH2-[靶细胞结合scFv]-COOH-[接头]-COOH-[效应细胞结合第一scFv]-NH2-[接头]-COOH-[效应细胞结合第二scFv]-NH2。 [IV]
在一些实施方案中，三特异性接合器的三个结合结构域中的每一个包含抗体的抗原结合结构域、抗体的功能性片段、其可变结构域、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、单链可变片段(scFv)、Fab、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、双特异性抗体、双抗体、或它们的功能性片段或组合。
在一些实施方案中，三特异性接合器的结合结构域通过一个或多个接头可操作地连接。在一些实施方案中，一个或多个肽接头可以是功能性肽，其可以与特定细胞表面受体(例如像TLR受体)结合，并且可以激活单核细胞或巨噬细胞中受体介导的细胞信号传导途径。在一些实施方案中，接头被设计为能够结合单核细胞或巨噬细胞并激活其中的至少炎症途径，或者加强单核细胞或巨噬细胞介导的对靶细胞的吞噬作用和杀伤。在一些实施方案中，接头肽可以具有阻断或抑制靶细胞介导的单核细胞或巨噬细胞功能下调的功能。
在一些实施方案中，编码三特异性接合器的核酸构建体包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码(a)包含与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌症抗原)结合的scFv结构域的多肽，(b)包含与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的第一细胞表面组分结合的scFv结构域的多肽，(c)包含与单核细胞或巨噬细胞的第二细胞表面组分(例如构成第二治疗剂的嵌合构建体；或天然单核细胞或巨噬细胞表面受体)结合的scFv结构域的多肽，其中多肽中的每一种彼此可操作地连接。在一些实施方案中，编码三特异性接合器的核酸构建体包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码(a)包含与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌症抗原)结合的VHH结构域的多肽，(b)包含与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的第一细胞表面组分结合的VHH结构域的多肽，(c)包含与单核细胞或巨噬细胞的第二细胞表面组分结合的VHH结构域的多肽。在一些实施方案中，用于表达双特异性scFv接合器的核酸构建体包含N末端信号肽序列以用于分泌双特异性scFv接合器。如本文所预期的，技术人员可以用编码任何合适的靶区域结合元件的短肽的核酸序列交换scFv或VHH结合序列。在一些实施方案中，将多肽构建体编码成单顺反子构建体。在一些实施方案中，将多肽构建体编码成多顺反子构建体。在一些实施方案中，将编码短接头多肽的一种或多种核酸序列插入在编码两种多肽的序列之间。在一些实施方案中，编码每种多肽的核酸序列的表达由单独的启动子驱动。在一些实施方案中，编码每种多肽的核酸序列由单一启动子驱动。在一些实施方案中，将一种或多种IRES序列引入至构建体中。
在一些实施方案中，一种或多种多肽可以在细胞内单独表达，并且可以翻译后组装。
在一些实施方案中，多肽可以被设计为在细胞外分泌后在特殊的肽支架上组装。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与癌细胞上的抗原结合，所述抗原选自由以下组成的组：胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、卵泡刺激激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤组2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整联蛋白受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFR-β、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1及其组合。在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌症抗原可以是以下突变/癌症抗原中的一种或多种：MUC16、CCAT2、CTAG1A、CTAG1B、MAGE A1、MAGEA2、MAGEA3、MAGE A4、MAGEA6、PRAME、PCA3、MAGE C1、MAGEC2、MAGED2、AFP、MAGEA8、MAGE9、MAGEA11、MAGEA12、IL13RA2、PLAC1、SDCCAG8、LSP1、CT45A1、CT45A2、CT45A3、CT45A5、CT45A6、CT45A8、CT45A10、CT47A1、CT47A2、CT47A3、CT47A4、CT47A5、CT47A6、CT47A8、CT47A9、CT47A10、CT47A11、CT47A12、CT47B1、SAGE1和CT55。
在一些实施方案中，靶细胞上的抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45、CD56。
在一些实施方案中，抗原是卵巢癌抗原或T淋巴细胞抗原。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌症抗原可以是以下突变/癌症抗原中的一种或多种：IDH1、ATRX、PRL3或ETBR，其中癌症是胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌症抗原可以是以下突变/癌症抗原中的一种或多种：CA125、β-hCG、尿促性腺激素片段、AFP、CEA、SCC、抑制素或雌二醇(extradiol)，其中癌症是卵巢癌。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌症抗原可以是CD5。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌症抗原可以是HER2。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌症抗原可以是EGFR变体III。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌症抗原可以是CD19。
在一些实施方案中，抗原是整联蛋白受体。
在一些实施方案中，抗原是选自由以下组成的组中的整联蛋白受体：α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与来自整联蛋白β2亚家族αMβ2(CD11b/CD18、Mac-1、CR3、Mo-1)、αLβ2(CD11a/CD18、LFA-1)、αXβ2(CD11c/CD18)和αDβ2(CD11d/CD18)的成员的单核细胞或巨噬细胞受体的细胞外结构域结合。
本文提供了可以与癌细胞上的细胞表面分子(诸如细胞表面抗原)特异性结合的示例性靶细胞结合物(例如，接合器)。在一些实施方案中，结合物是对抗原具有特异性的抗体或其片段。在一些实施方案中，结合物包括与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的scFv或其片段。在一些实施方案中，肿瘤细胞上的抗原是CD5。结合物包含重链(HC)序列和轻链(LC)序列。对CD5具有特异性的scFv(抗CD5 scFv)包含对应于可变重链(VH)结构域的氨基酸序列和对应于(VL)的氨基酸序列。在一些实施方案中，作为CD5结合物的第一结合结构域可以是scFv，其包含通过接头肽连接的SEQ ID NO:27的序列和SEQ ID NO:28的序列。本文在表1A中提供了示例性抗CD5 HC和LC可变结构域。
表1A.示例性CD5结合物结构域
Figure BDA0003502291170000481
在一个实施方案中，靶细胞结合物是结合CD5的单一结构域抗体。在一些实施方案中，靶细胞结合物是CD5结合VHH。在一些实施方案中，靶细胞结合物或第一结合结构域可以是包含SEQ ID NO:27的序列的CD5结合VHH。
在一些实施方案中，示例性靶细胞结合物(例如，接合器)是HER2接合器，其可以与在HER2阳性癌细胞上的细胞表面抗原HER2特异性结合。在一些实施方案中，结合物是对抗原具有特异性的抗体或其片段。在一些实施方案中，结合物包括与HER2特异性结合的scFv或其片段。结合物包含重链(HC)序列和轻链(LC)序列。对HER2具有特异性的scFv(抗HER2scFv)包含对应于可变重链(VH)结构域的氨基酸序列和对应于(VL)的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一结合结构域可以是具有HER2结合物的scFv，其包含通过接头肽连接的SEQID NO:29的序列和SEQ ID NO:30的序列。在一些实施方案中，靶细胞结合物或第一结合结构域可以是包含SEQ ID NO:29的序列的HER2结合VHH。
本文在表1B中提供了示例性抗HER2 HC和LC可变结构域。
表1B.示例性HER2结合物结构域
Figure BDA0003502291170000491
在一些实施方案中，肿瘤相关巨噬细胞的特征可以主要为具有M2表型。人M2巨噬细胞可以鉴定为接近细胞表面标记物CD14+CD163+CD206+CD80-表型。因此，与髓样细胞(例如，与肿瘤相关的单核细胞或巨噬细胞)特异性结合的双特异性或三特异性接合器可以包含可以与以下中的一种或多种结合的一个或多个结合结构域：CD14、CD163和CD206细胞表面分子。
典型地，M2样肿瘤相关巨噬细胞(TAM)群体缺乏反应性氮中间体的表达、不太高效地呈递抗原、显示出很小的杀肿瘤活性并且产生血管生成因子、金属蛋白酶和组织蛋白酶。基质金属蛋白酶(例如，MMP2)在TAM中容易表达。巨噬细胞的经典激活上调MMP-1、-3、-7、-10、-12、-14和-25并且降低TIMP-3(金属蛋白酶-3的组织抑制剂)水平。除了对MMP-25和TIMP-3的效应，发现细菌脂多糖、IL-1和TNFα比IFN-γ更有效。相比之下，替代激活降低MMP-2、-8和-19，但增加MMP-11、-12、-25和TIMP-3稳态mRNA水平。在经典激活期间MMP的上调取决于丝裂原激活蛋白激酶、磷酸肌醇-3-激酶和κB激酶-2抑制剂。因此，根据靶单核细胞或巨噬细胞群体，接合器可以被设计为使得金属蛋白酶可以是单核细胞或巨噬细胞接合器的结合部分。MMP2是容易表达的TAM标记物之一，肿瘤特异性髓样细胞接合器包含MMP2结合结构域。
缺氧或继发于缺氧产生的细胞因子吸引巨噬细胞，巨噬细胞随后上调缺氧诱导型因子2-α(HIF-2α)。因此，在与肿瘤相关巨噬细胞特异性结合的双特异性或三特异性接合器上的结合结构域可以与在这些细胞中上调的HIF-2α结合。
单核细胞/巨噬细胞表面标记物包括LPS共受体(CD14)、HLA-DR(II类MHC)、CD312、CD115、FCγ-受体FcγRIII(CD16)。子组特异性标记物包括CD163和CD204(由M2巨噬细胞表达的两种清道夫受体)、CD301(由M2巨噬细胞表达的半乳糖型C型凝集素)。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与吞噬受体的细胞外结构域结合，所述细胞外结构域选自表2A中的任何一种蛋白质的细胞外结构域。
表2A.吞噬细胞上的示例性受体
Figure BDA0003502291170000501
Figure BDA0003502291170000511
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与PFP的细胞外结构域结合，所述细胞外结构域选自表2B中的任何一种蛋白质的细胞外结构域。
表2B提供了单核细胞、巨噬细胞和DC的示例性表面标记物和表型特征。
表2B.
Figure BDA0003502291170000512
Figure BDA0003502291170000521
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与髓样细胞受体(例如，单核细胞受体、巨噬细胞受体)的细胞外结构域结合，例如，选自细胞外结构域的受体包含Ig结合结构域。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与巨噬细胞受体的细胞外结构域，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA(CD16)、FcγRIIIB、FcRn、FcRL5结合结构域结合。本文所提及的CD16受体可以是CD16A受体或CD16B受体。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与FcR细胞外结构域的细胞外结构域结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与巨噬细胞受体的细胞外结构域结合，所述细胞外结构域选自FcR-α、FcR-β、FcR-ε或FcR-γ的细胞外结构域。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与FcαR(FCAR)的细胞外结构域结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与FcR-β的细胞外结构域结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与FcεR(FCER1A)的细胞外结构域结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与FcγR(FDGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B)受体的细胞外结构域结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与单核细胞或巨噬细胞吞噬受体的细胞外结构域结合，所述单核细胞或巨噬细胞吞噬受体选自凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与TREM蛋白的细胞外结构域结合。在一些实施方案中，TREM蛋白的细胞外结构域是TREM 1蛋白细胞外结构域。在一些实施方案中，TREM蛋白的细胞外结构域是TREM 2蛋白细胞外结构域。在一些实施方案中，TREM蛋白的细胞外结构域是TREM 3蛋白细胞外结构域。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与单核细胞或巨噬细胞受体的细胞外结构域结合，所述单核细胞或巨噬细胞受体选自由以下组成的组：凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体。
可以理解，在一些实施方案中，接合器的结合物或任何部分可以是除抗体或其片段之外的分子。例如，结合物与细胞(诸如靶细胞或效应髓样细胞)的表面分子结合，并且可以是针对受体的配体，其中细胞表面分子是对配体具有特异性的受体。在一些实施方案中，配体可以是嵌合蛋白质或融合蛋白、或受体的天然存在的配体。在一些实施方案中，接合器重组蛋白中的一种结合物可以是配体，并且另一种可以是抗体或其片段。
在一些实施方案中，接合器分子可以包含一个或多个接头或间隔子。接头或间隔子可以由2-50个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头是3-30个氨基酸间隔子。在一些实施方案中，接头是4-20或5-10个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，间隔子可以由非反应性氨基酸部分(例如，一系列甘氨酸或丝氨酸或丙氨酸残基)组成。示例性接头可以包含氨基酸序列GSGS、或SGGG、或SGGGGSG。示例性接头可以包含氨基酸序列SSGGGGSGGGGSGGGGS。接头可以连接scFv的VH和VL结构域。接头可以连接双特异性或三特异性接合器的结合物结构域。接头通常充当连接有效结合物位点的结构元件。在一些实施方案中，接头可以是柔性的。在一些实施方案中，接头可以是刚性的。根据设计的需要和将结合物在相对端处隔开的最佳或所需的长度来调整接头的长度。在一些实施方案中，接头可以包括除了连接两个结构域之外具有独特功能的肽。下文讨论的示例性肽可以是双特异性或三特异性或多特异性接合器的设计的一部分，并且可以是或者可以不是接头的一部分。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含特异性靶向肿瘤相关巨噬细胞(例如像M2巨噬细胞)的肽。在一些实施方案中，M2特异性肽是M2-pep，其具有氨基酸序列YEQDPWGVKWWY。(SEQ ID NO:116)。
在一些实施方案中，M2特异性肽可以包含序列HLSWLPDVVYAW(在下文中为HLSpep)(SEQ ID NO:117)。
诸如上文所述的M2-pep或HLS pep的肽可以形成双特异性接合器或三特异性接合器的一部分，诸如两个结合结构域之间的接头或接头的一部分。在一些实施方案中，接合器的第一结合结构域和第二结合结构域与M2-pep或HLS pep偶联，而M2-pep或HLS pep进一步使接合器靶向肿瘤相关巨噬细胞，并且有助于将接合器拴系至肿瘤相关巨噬细胞。
在一些实施方案中，示例性接合器可以包含通过接头连接的CD5结合结构域和CD16结合结构域。在一些实施方案中，示例性接合器包含TLR激活肽，诸如TLR4肽。
B.具有掩蔽型抗原结合结构域的接合器
本文提供了用于治疗剂的组合物，其包含含有一种或多种前抗体的双特异性或三特异性接合器。在一些实施方案中，前抗体是抗体或其片段或变体的无活性形式，其抗原结合结构域被阻断或“掩蔽”免于与抗原相互作用。在一些实施方案中，前抗体包含底物肽或缀合物，其通过蛋白酶可裂解接头肽与抗原结合结构域保持缔合并且“掩蔽”抗原结合结构域免于与其同源抗原结合。在合适的条件下，裂解底物肽以释放掩蔽物，并且促进在抗原结合结构域处的抗原结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性抗体包含作为前抗体的一种或多种scfv，即，scFv的抗原结合结构域用可裂解的阻断剂掩蔽。在一些实施方案中，阻断剂包含底物肽和蛋白酶可裂解接头。在一些实施方案中，双特异性或三特异性抗体包括VHH前抗体，其中，VHH抗体的VL结构域或VH结构域或两者用可裂解的阻断剂掩蔽。在一些实施方案中，双特异性或三特异性抗体包括纳米抗体，其中一个或多个抗原结合结构域通过与底物肽或缀合物缔合来掩蔽，所述底物肽或缀合物通过可裂解接头连接至抗体。
在一些实施方案中，可裂解接头被设计为使得其在治疗剂达到它作用的靶位点时被裂解。例如，癌症治疗剂的前抗体可以被设计为含有蛋白酶可裂解接头，其中裂解蛋白酶可裂解接头的蛋白酶在肿瘤微环境中是丰富的并且在非肿瘤组织中相对缺乏或可忽略不计，并且当治疗剂在全身性施用时到达肿瘤微环境时治疗剂由蛋白酶激活。在一些实施方案中，开发了治疗剂，其包含蛋白酶激活的前抗体以仅将抗体作用指导至疾病位点。
在一些实施方案中，可裂解接头是基质金属蛋白酶-2(MMP2)可裂解肽，其具有氨基酸序列GPLGVR(SEQ ID NO:118)。
在一些实施方案中，可裂解接头是M2特异性肽，其具有氨基酸序列YEQDPWGVKWWY(SEQ ID NO:116)、或氨基酸序列HLSWLPDVVYAW(SEQ ID NO:117)。
在一些实施方案中，可裂解接头包括缺氧诱导型蛋白介导的裂解位点。
在一些实施方案中，可裂解接头是非天然存在的合成肽，并且包含蛋白酶可裂解位点。在一些实施方案中，裂解位点可以由外源施用的蛋白酶裂解。在一些实施方案中，裂解位点可以由与癌症靶向药物缔合的蛋白酶裂解。
在一些实施方案中，可裂解接头是突变型肽，其中突变型肽含有蛋白酶可裂解位点，其不出现在相应的非突变型肽中。
在一些实施方案中，本文公开的本发明程序的目的是产生用于在免疫疗法中使用的治疗性产品。
C.具有促进髓样细胞的增强吞噬活性和免疫应答的结构域的接合器
肿瘤微环境(TME)构成免疫抑制环境。IL-10、糖皮质激素、凋亡细胞和免疫复合物的影响可能干扰先天免疫细胞功能。免疫细胞(包括吞噬细胞)固定为致耐受性表型。在巨噬细胞中，这种表型(通常称为M2表型)不同于M1表型，其中巨噬细胞有效且能够杀伤病原体。例如，暴露于LPS或IFN-γ的巨噬细胞可以朝向M1表型极化，而暴露于IL-4或IL-13的巨噬细胞将朝向M2表型极化。LPS或IFN-γ可以与巨噬细胞表面上的Toll样受体4(TLR4)相互作用，从而诱导Trif和MyD88途径、诱导转录因子IRF3、AP-1和NFKB的激活且因此激活在促炎M1巨噬细胞应答中是必需的TNF-α基因、干扰素基因、CXCL10、NOS2、IL-12等。类似地，IL-4和IL-13与IL-4R结合，激活Jak/Stat6途径，从而调节作为与抗炎应答(M2应答)相关的基因的CCL17、ARG1、IRF4、IL-10、SOCS3等的表达。CD14、CD80、D206的表达和CD163的低表达是朝向M1表型的巨噬细胞极化的指示物。
在一些实施方案中，接合器包含可以与受体(诸如吞噬受体)的细胞外结构域结合的结合结构域。与单核细胞或巨噬细胞吞噬受体例如在特定位点处的接合可以通过以下方式激活受体：增强由受体的细胞内结构域介导的细胞内信号传导。在一些实施方案中，接合器的结合结构域包含针对吞噬受体的配体。在一些实施方案中，结合结构域与配体结合，然后与吞噬受体结合。
一些吞噬受体在激活吞噬作用方面比其他受体更有效，并且可以诱导对靶细胞的快速吞噬作用。有必要鉴定有效的吞噬受体。大多数巨噬细胞清道夫具有广泛的结合特异性，其可以在对外来物质的非特异性抗体独立性识别中用于区分自我和非自我。I型和II类A清道夫受体(SR-AI1和SR-AII)是三聚体膜糖蛋白，其具有小NH2末端细胞内结构域，以及含有短间隔子结构域、α螺旋卷曲螺旋结构域和三螺旋胶原结构域的细胞外部分。I型受体另外含有富含半胱氨酸的COOH末端(SRCR)结构域。这些受体存在于整个身体的不同组织中的巨噬细胞中，并且表现出异常广泛的配体结合特异性。它们结合广泛多种的聚阴离子，包括化学修饰蛋白质(诸如修饰LDL)，并且它们已经与动脉粥样化形成期间的胆固醇沉积有牵连。它们也可以在巨噬细胞相关宿主防御和炎症病况中的细胞粘附过程中起作用。
表2A和表2B举例说明了与不同髓样细胞相关的受体或表面抗原的非广泛列表，其中细胞具有范围从高度吞噬作用至致耐受性的一系列特征。即使在巨噬细胞内，一些受体与主动吞噬M1表型相关，而其他受体与减弱了吞噬应答的抗炎M2表型相关。通过与M1受体接合对M1相关受体的激活可以产生巨噬细胞类型从M2至M1表型的特征偏移。
激活吞噬作用的巨噬细胞受体包含细胞内吞噬作用信号传导结构域，其包括具有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)基序的结构域。ITAM是存在于免疫系统的若干种受体的细胞质尾区中的保守序列，所述若干种受体诸如T细胞受体、免疫球蛋白(Ig)和FcR。它们具有由通过定义间隔分开的成对的YXXL/I基序(Y＝酪氨酸，L＝赖氨酸并且I＝异亮氨酸)(YXXL/I-X6-8-YXXL/I)组成的保守氨基酸序列基序。此外，大多数ITAM在相对于第一ITAM酪氨酸的+2位置中含有带负电荷的氨基酸(D/E)。ITAM内残基的磷酸化募集若干种激活吞噬作用的信号传导分子。ITAM基序也存在于细胞内衔接蛋白即12kDa的DNAX激活蛋白(DAP12)中。
在一些实施方案中，细胞内区域中的吞噬信号传导结构域可以包括PI3激酶(PI3K)募集结构域(也称为PI3K结合结构域)。CD19、CD28、CSFR或PDGFR受体包含到结合结构域的PI3激酶募集。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器与受体，诸如CD19、CD28、CSFR或PDGFR受体中的任何一种或多种结合。与此类受体接合导致Akt介导的信号传导级联和吞噬作用的激活。PI3K-Akt信号传导途径在吞噬作用、调节炎症应答和其他活动(包括囊泡运输和细胞骨架重组)中是重要的。PI3激酶募集结构域是质膜蛋白中的细胞内结构域，所述细胞内结构域具有可以磷酸化的酪氨酸残基，并且所述磷酸化的酪氨酸残基进而可以通过PI3Kp85的Src同源结构域(SH2)结构域识别。p85的SH2结构域识别受体的胞质结构域上的磷酸化酪氨酸。这导致变构激活p110和产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，其通过酶Akt和组成型活性的3'-磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)经由其plekstrin同源结构域来识别。Akt与PIP3的相互作用导致Akt构象的变化和PDK1和rictor-mTOR复合物分别对残基Thr308和Ser473的磷酸化。这两个残基的磷酸化导致Akt的激活，这进而尤其磷酸化底物之中的酶糖原合成酶激酶-3(GSK-3)。GSK-3具有两种同种型GSK-3α和GSK-3β，这两者都是组成型活性的。同种型在结构上相关但在功能上非冗余。当GSK-3α中的残基Ser21或GSK-3β中的Ser9(位于其调节N末端结构域)由Akt和其他激酶磷酸化时，观察到GSK-3的失活。通过磷酸化对GSK-3的抑制对于调节炎症和在吞噬作用过程中是重要的。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含结合结构域，其与可以通过引起DAP12激活来激活促吞噬信号传导的受体或其部分结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含结合结构域，其与促进一组受体在单核细胞或巨噬细胞或吞噬细胞上的聚簇，并且加强吞噬作用的受体或其部分结合。在一些实施方案中，受体的聚簇激活细胞内信号传导途径。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含针对FcαR1(CD89)的结合结构域。FcαR1受体接合或交联激活抗原介导的细胞毒性，并且激活单核细胞或巨噬细胞上的吞噬作用。FcαR1在巨噬细胞以及一些其他细胞诸如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中组成型表达。在三特异性接合器中尤其有利的是接合器包含与靶细胞(诸如肿瘤细胞)上抗原结合的结合结构域、对单核细胞或巨噬细胞受体诸如CD206具有特异性的结合结构域和针对CD89的结合结构域的时候。鉴于接合器分子的长度和设计灵活性，CD206和FcαR1(CD89)结合结构域可以通过与多于一种吞噬作用特异性受体交联并与靶细胞交联来引发和提供多种激活信号。Fc□R1激活将单核细胞或巨噬细胞从M2表型重定向至杀伤M1表型，且因此可以在双特异性或三特异性接合器中具有Fc□R1结合结构域可以是将肿瘤相关巨噬细胞再用于肿瘤细胞毒性的强有力工具。
在一些实施方案中，双特异性和三特异性接合器包含与单核细胞或巨噬细胞清道夫受体结合的结合结构域。目前有八类清道夫受体(A-H类)。在一些情况下，已经将多个名称分配至相同受体(例如，MSR1、SR-AI、CD204和SCARA1)。此外，存在已经基于其他标准命名并且尚未包括在一般清道夫受体名称中的表现出清道夫受体活性的蛋白质。一些实例包括RAGE(SR-E1)、LRP1、LRP2、ASGP、CD163、SR-PSOX和CXCL16。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含与清道夫受体结合的结合结构域，所述清道夫受体选自凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体。结合结构域以10-5至10-12M或更小、或10-7至10-12M或更小、或10-8至10-12M的解离常数(KD)(即以105至1012M或更大、或107至1012M或更大或108至1012M的缔合常数)与其对应配体结合。
在一些实施方案中，接合器的与清道夫受体SRA1结合的示例性结合结构域包括具有以下氨基酸序列或其部分、或与所述序列具有至少95％序列同一性的序列的可变区：EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRAVSTYAMGWFRQAPGKEREFVAAMISSLSSKSYADTVKGRFTISRDYAKNTVYXQMNSLKPEDTADYYCAADLLPYSSSRSLPMGYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)。
接合器的与清道夫受体SRA1结合的示例性结合结构域可以包括具有SEQ ID NO2-7中任一个的氨基酸序列或其部分、或与所述序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列的结合结构域：
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRAVSTYAMGWFRQAPGKEREFVAAMISSLSSKSYADSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAADLLPYSSTRSLPMGYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:2)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSFSLYDMGWFSQAPGKEREFVAAINWSGGSTAYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAKPAKYHFGSGYRDFAEYPYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:3)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAMAWFRHAPGKDREFVAAVSQSGLLTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCAAXSRFPLVVPVAYENWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)；其中X可以是任何天然存在的氨基酸。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAMAWFRHAPGKDREFVAAVSQSGLLTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCAADSRFPLVVPVAYENWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)。
EVQLVESGGGLVQVGGSLRLSCAASGISIRTHAMGWYRQAPGKQRELVATITSVTSGGSLNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKLLGFDYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:6)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIGRFVAMGWYRQAPGKQRELVATITSITSGGRTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVVPYVNDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，接合器的与清道夫受体RAGE结合的示例性结合结构域可以包括具有SEQ ID NO 8-15中任一个的氨基酸序列或其部分、或与所述序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列的结合结构域。
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCIASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYCCATENLASSGSAYSDDRYNACGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:8)。
EVQLVESGGEVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDRAIGWFRQAPGKEREGVACSANNDNRAFYEDSVKGRFAVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATRCAAGRVNLYYGMDYWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGNYAIGWFRQAPGKEREGVSCVDRDGGSTYYLDSVTGRFTTSRDDAENTVYLQMNSLIPDDTAVYYCATRLYGCSGYGRDYADWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRTFSTDAFGWFRQAPGKEREFVSAMRWNGSSSYYADLVKGRFTISRDNAKNTVYLLMNSLKPEDTAVYYCTAGKRYGYYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYSMGWFRQAPGKEREFVATISWSGALTHYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASDSDYGNKYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:12)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTVSDMTMGWFRQAPGKERVFVAAISNSGLSTYYQDSVKGRFTISRDTANNTVALQMNSLKPEDTAVYFCAARSGWSGQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAGISWSGDSTLYADSVKGRFTTSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTANYYCAEKQGADWAPYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:14)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASELTFSLYRMGWFRQAPGKEREFVSAMSTSGAGTYYADSVKGRFTISRDNPKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGVRFGVYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，接合器的与清道夫受体Lox-1结合的示例性结合结构域可以包括具有SEQ ID NO 16-26中任一个的氨基酸序列或其部分、或与所述序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列的结合结构域。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSCISRTDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGRTYYSGSYYFGLGSDEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:16)。
接合器的与清道夫受体Lox-1结合的另外示例性结合结构域的序列包括具有下文给出的氨基酸序列的可变区：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFTINAMAWYRQAPGKQRELVAHLTNSGRTGYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNRLGLHWSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:17)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASIGTFSAYHMGWFRQAPGKERELVAAISWSVSSTYYADSVKGRFTISRDNAKRTVSLQMDSLKPEDTAVYYCAARSGERYDYYKAQYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:18)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAYGSFFSIGTMGWYRQPPGNQRELVAVTYGLGSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCYAEIDTDPRSGEWDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:19)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLPSTSTSSLRTVGWYRQGPGKQRDLVAIMSAGTTRYADSVKGRFTISLDDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYICNGRPVFSNVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:20)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRQAPGKEREGVSCVSRDGGSTYYLDSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDAAVYYCAASRYDCSKYLIDYNYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:21)。
EVQLVKSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRRFSTSGMGWFRQAPGREREFVXGIXWNSRXTYYAESVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATNYYGSXWSVNSDDYDYWXQGXQVTVSS(SEQ ID NO:22)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAQRGRYYYLDRNVEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:23)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYGIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCAAGRTYYSGSYYFGLGSDEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:24)。
EVQLVESGGNLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSVEGSTYYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGTWLDCSGYGSYDMDYWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)。
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSEGSTYYAESVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASTWLDFVHGNEYDYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:26)。
在一些实施方案中，示例性SRA-1结合CDR1序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：TYAMG(SEQ ID NO:31)、YDMG(SEQ ID NO:32)、RYAMA(SEQ ID NO:33)、THAMG(SEQ IDNO:34)、FVAMG(SEQ ID NO:35)。
在一些实施方案中，示例性SRA-1结合CDR2序列可以是以下氨基酸序列中的任一种；
AMISSLSSKSYADTVKG(SEQ ID NO:36)。
AMISSLSSKSYADSVKG(SEQ ID NO:37)。
AINWSGGSTAYADSVKG(SEQ ID NO:38)。
AVSQSGLLTFYADSVKG(SEQ ID NO:39)。
AVSQSGLLTFYADSVKG(SEQ ID NO:40)。
TITSVTSGGSLNYADSVKG(SEQ ID NO:41)。
TITSITSGGRTNYADSVKG(SEQ ID NO:42)。
在一些实施方案中，示例性SRA-1结合CDR3序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：
DLLPYSSSRSLPMGYD(SEQ ID NO:43)。
DLLPYSSTRSLPMGYDY(SEQ ID NO:44)。
KPAKYHFGSGYRDFAE(SEQ ID NO:45)。
XSRFPLVVPVAYEN(SEQ ID NO:46)。
DSRFPLVVPVAYEN(SEQ ID NO:47)。
LGFDY(SEQ ID NO:48)。
VPYVNDY(SEQ ID NO:49)。
其中，X是天然存在的氨基酸。
在一些实施方案中，示例性RAGE结合CDR1序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：DRAIG(SEQ ID NO:50)、NYAIG(SEQ ID NO:51)、TDAFG(SEQ ID NO:52)、NYSMG(SEQ IDNO:53)、DMTMG(SEQ ID NO:54)、NYAMG(SEQ ID NO:55)或LYRMG(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方案中，示例性RAGE结合CDR2序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：
AISWSGGRTYYADSVKG(SEQ ID NO:57)。
CSANNDNRAFYEDSVKG(SEQ ID NO:58)。
CVDRDGGSTYYLDSVTG(SEQ ID NO:59)。
AMRWNGSSSYYADLVKG(SEQ ID NO:60)。
TISWSGALTHYTDSVKG(SEQ ID NO:61)。
AISNSGLSTYYQDSVKG(SEQ ID NO:62)。
GISWSGDSTLYADSVKG(SEQ ID NO:63)。
AMSTSGAGTYYADSVKG(SEQ ID NO:64)。
CISRTDGSTDYADSVKG(SEQ ID NO:65)。
在一些实施方案中，示例性RAGE结合CDR3序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：
ENLASSGSAYSDDRYN(SEQ ID NO:66)
RCAAGRVNLYYGMDY(SEQ ID NO:67)。
RLYGCSGYGRDYAD(SEQ ID NO:68)。
GKRYGYYDY(SEQ ID NO:69)。
SDSDYGNKYDY(SEQ ID NO:70)。
RSGWSGQYDY(SEQ ID NO:71)。
KQGADWAPYDY(SEQ ID NO:72)。
GVRFGVYDY(SEQ ID NO:73)。
在一些实施方案中，Lox-1结合CDR1序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：DYAIG(SEQ ID NO:74)、INAMA(SEQ ID NO:75)、AYHMG(SEQ ID NO:76)、IGTMG(SEQ ID NO:77)、LRTVG(SEQ ID NO:78)、DYAIG(SEQ ID NO:79)、TSGMG(SEQ ID NO:80)、NYAMG(SEQ IDNO:81)、DYGIG(SEQ ID NO:82)、DYVIG(SEQ ID NO:83)。
在一些实施方案中，Lox-1结合CDR2序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：
HLTNSGRTGYADSVKG(SEQ ID NO:84)
AISWSVSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:85)
VTYGLGSTNYAESVKG(SEQ ID NO:86)
IMSAGTTRYADSVKG(SEQ ID NO:87)
CVSRDGGSTYYLDSVKG(SEQ ID NO:88)
GIXWNSRXTYYAESVKG(SEQ ID NO:89)
AITWSGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:90)
CISSSDGSTDYADSVKG(SEQ ID NO:91)
CISSVEGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:92)
CISSSEGSTYYAESVKG(SEQ ID NO:93)
其中，X是天然存在的氨基酸。
在一些实施方案中，Lox-1结合CDR3序列可以是以下氨基酸序列中的任一种：
GRTYYSGSYYFGLGSD(SEQ ID NO:94)
LGLHWS(SEQ ID NO:95)
RSGERYDYYKAQYEY(SEQ ID NO:96)
EIDTDPRSGEWDY(SEQ ID NO:97)
RPVFSNVDY(SEQ ID NO:98)
SRYDCSKYLIDYNY(SEQ ID NO:99)
NYYGSXWSVNSDDYDY(SEQ ID NO:100)
AQRGRYYYLDRNVEYD(SEQ ID NO:101)
GRTYYSGSYYFGLGSDEYDY(SEQ ID NO:102)
GTWLDCSGYGSYDMDY(SEQ ID NO:103)
STWLDFVHGNEYDY(SEQ ID NO:104)
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含结合结构域，其与可以例如经由激活以下中的任一种产生吞噬作用激活信号或促炎信号的蛋白质结合：MRC1、ItgB5、MERTK、ELMO、BAIL Tyro3、Axl、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、PI3K、FcγR1、FcyR2A、FcyR2B2、FcyR2C、FcyR3A、FcER1、FcαRl、BAFF-R、DAP12、NFAM1和CD79b。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含与TREM蛋白的细胞外结构域结合的结合结构域。TREM 1、2、3.各TREM共享共同结构特性，包括V型单一细胞外免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和短细胞质尾区的存在。特别地，TREM跨膜结构域(TM)具有带负电残基，其与12kDa的DNAX激活蛋白(DAP12)(含有基于免疫受体络氨酸的激活基序(ITAM)的跨膜衔接子)的带正电荷残基相互作用。
D.具有促进髓样细胞的炎症活性的结构域的接合器
单核细胞或巨噬细胞的激活可以导致炎症活性的增加。激活的M1单核细胞或巨噬细胞的特征在于IFN-γ产生，以及促炎细胞因子IL-1b、IL-6、CSF、GMCSF和TNF(仅举几个例子)的产生。在一些实施方案中，单核细胞或巨噬细胞M1表型与跟IL-1信号传导级联和炎症体激活相关的有效促炎应答相关。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器可以包含产生触发炎症体和促炎信号所必需的信号的结构域。已知Toll样受体TLR诱导炎症体激活。TLR引起保守的炎症途径，最终激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)。TLR配体包括高迁移率族B1(HMGB1)、热休克蛋白(HSP60、HSP70)、内毒素和细胞外基质组分。TLR2和TLR4例如包含由配体结合激活的细胞外结构域，并且所述配体结合进而激活与炎症体激活相关的促炎级联。细胞内信号传导途径由募集促炎半胱天冬酶并诱导其裂解和激活的信号传导蛋白，例如Nod样受体(NLR)介导。这导致直接激活ROS，并且常常导致称为细胞焦亡的剧烈细胞死亡。有四种炎性体复合物，即NLRP1m、NLRP3、IPAF和AIM2。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器可以包含产生触发炎症体和促炎信号所必需的信号、与TLR(诸如TLR4)结合的结合结构域。TLR4在单核细胞或巨噬细胞中表达，并且由LPS和其他配体诱导。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器可以与TLR配体结合，所述TLR配体然后与TLR结合。
E.具有促进髓样细胞的细胞粘附和炎症活性的结构域的接合器
细胞-细胞和细胞-基质粘附由整联蛋白细胞外结构域与不同的蛋白质配体的结合介导；然而，对这些粘附相互作用的细胞控制及所述粘附相互作用向动态细胞应答(诸如细胞扩散或迁移)的转化需要整联蛋白细胞质尾区。这些短尾与使受体连接至信号传导途径和细胞骨架网络的细胞内配体结合。整联蛋白是通过α和β亚基的非共价缔合形成的异二聚体粘附受体。每个亚基是I型跨膜糖蛋白，其具有相对大的细胞外结构域和(除β4亚基外)短细胞质尾区。单独的整联蛋白家族成员具有识别多种配体的能力。整联蛋白可以与大量的细胞外基质蛋白(骨基质蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白和血管性血友病因子)结合，这反映了整联蛋白在细胞粘附至细胞外基质中的主要功能。许多“反受体”是配体，这反映了整联蛋白在介导细胞-细胞相互作用中的作用。整联蛋白经历构象变化以增加配体亲和力。
整联蛋白β2亚家族由四种不同的整联蛋白受体，即αMβ2(CD11b/CD18、Mac-1、CR3、Mo-1)、αLβ2(CD11a/CD18、LFA-1)、αXβ2(CD11c/CD18)和αDβ2(CD11d/CD18)组成。这些白细胞整联蛋白几乎参与白细胞功能的各个方面，包括免疫应答、粘附至内皮并通过内皮移行、对病原体的吞噬作用和白细胞激活。
所有β2整联蛋白的α亚基含有约200个氨基酸的插入区域(称为I或A结构域)。高度保守的I结构域发现于其他若干种整联蛋白α亚基和其他蛋白质(诸如某些凝结和补体蛋白质)中。I结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，并且在整联蛋白中，它们整体参与蛋白质配体的结合。虽然I结构域主导了其整联蛋白的配体结合功能，但是α亚基的其他区域确实影响配体识别。作为实例，在αMβ2中，识别在I结构域外但在αM亚基中的表位的mAb(OKM1)抑制配体结合；并且αLβ2和α2β1(在其α亚基中具有I结构域的整联蛋白)中的EF手区域有助于配体识别。αM亚基以及或许其他α亚基含有凝集素样结构域，其参与非蛋白质配体的接合，并且占位性可以调节I结构域的功能。
在整联蛋白缺乏酶活性时，信号传导反而由信号传导复合物在质膜的细胞质面上的组装诱导。这些复合物的形成以两种方式实现；第一，通过受体聚簇，其增加了分子相互作用的亲合力，从而增加了效应分子的结合缔合速率，以及第二，通过诱导产生或暴露效应结合位点的受体的构象变化。在ECM内，整联蛋白具有结合纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、腱生蛋白、玻连蛋白和血小板反应蛋白的能力。整联蛋白/ECM相互作用的聚簇形成焦点粘附，从而将细胞骨架组分和信号传导分子在细胞内浓缩。整联蛋白的细胞质尾区充当α-辅肌动蛋白和踝蛋白的结合位点，然后它们募集纽蛋白(一种参与将F-肌动蛋白锚定至膜的蛋白质)。踝蛋白由激酶诸如蛋白激酶C(PKCα)激活。
整联蛋白由选择素激活。白细胞表达L-选择素，激活的血小板表达P-选择素，并且激活的内皮细胞表达E-选择素和P-选择素。P-选择素介导的粘附性能够实现趋化因子或血小板激活因子触发的β2整联蛋白激活，所述激活稳定化粘附。它还有利于从粘附型白细胞中释放趋化因子。P-选择素糖蛋白配体1的细胞质结构域与Nef相关因子1形成组成型复合物。在P-选择素的结合后，Src激酶磷酸化Nef相关因子1，从而募集磷酸肌醇-3-OH激酶p85-p110δ异二聚体并导致白细胞整联蛋白的激活。E-选择素配体转导也影响β2整联蛋白功能的信号。选择素触发Src家族激酶的激活。由选择素接合激活的SFK磷酸化DAP12和FcRγ的细胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些方面，CD44足以从E-选择素转导信号。CD44触发整联蛋白的由内而外的信号传导。整联蛋白激活中的最终常见步骤是踝蛋白与β亚基的细胞质尾区的结合。另一组细胞质衔接子kindlin与整联蛋白β尾区的不同区域结合。kindlin增加踝蛋白激活的整联蛋白的聚簇。kindlin响应于选择素信号传导，然而，kindlin主要发现于造血细胞，诸如嗜中性粒细胞中。选择素信号传导以及在通过趋化因子组分进行整联蛋白激活时的信号传导具有共享组分，包括SFK、Syk和SLP-76。
在一些实施方案中，接合器包含可以与粘附分子诸如整联蛋白或选择素(例如，P-选择素、L-选择素或E-选择素)的细胞外结构域结合的结合结构域。
F.具有抑制髓样细胞的抗吞噬和抗炎活性的结合结构域的接合器
在一个方面，双特异性或三特异性接合器可以包含抑制CD47介导单核细胞或巨噬细胞吞噬作用下调的另外的功能结构域。肿瘤细胞典型地表达“不要吃我”的信号CD47，其与单核细胞或巨噬细胞受体SIRP-α结合，并且抑制吞噬作用。因此，对CD47的抑制抵抗了肿瘤细胞介导的抗吞噬作用活性。双特异性或三特异性接合器的一个臂可以包含CD47阻断剂。与接合器相关的CD47阻断剂可以是SIRP-α的细胞外CD47结合结构域，从而充当诱骗受体或中和受体。
在一个方面，本文公开了组合物，其可以抑制在免疫细胞上表达的膜蛋白的Siglec家族成员的吞噬作用调节信号转导。所述家族的各种成员在与膜蛋白上的唾液酸化聚糖接触时转导检查点信号。在一些成员中，Siglec蛋白的细胞内结构域包含多个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。ITIM在其细胞质尾区中共享共有氨基酸序列，即(I/V/L/S)-X-Y-X-X-(L/V)，其中X表示任何氨基酸，I＝异亮氨酸，V＝缬氨酸，L＝赖氨酸，S＝丝氨酸，Y＝酪氨酸。ITIM基序的酪氨酸残基的磷酸化募集两种含SH2结构域的负调节因子中的任一种：肌醇磷酸酶SHIP(含Src同源性2的肌醇多磷酸5-磷酸酶)或酪氨酸磷酸酶SHP-1(含Src同源性2的蛋白酪氨酸磷酸酶-1)。在(Y+2)位置中的亮氨酸有利于与SHIP的结合，而在(Y-2)位置中的异亮氨酸有利于SHP-1结合。ITIM也可以与另一种酪氨酸磷酸酶SHP-2结合，但SHP-2在ITIM介导的抑制中起功能作用的证据与其他介体相比不太明显。因此，通过与唾液酸残基(例如，在唾液酸化膜聚糖蛋白中)结合在细胞外配体结合结构域处激活Siglec膜蛋白，ITIM接受被磷酸化的细胞内信号，并且引发SHP介导的针对免疫调节(包括吞噬潜力的降低)的信号传导。
Siglec家族受体包括膜蛋白siglec 1(CD169)、siglec 2(CD22)、siglec 3(CD33)、siglec 4(MAG)、siglec 5、siglec 6、siglec 7、siglec 8、siglec 9、siglec 10、siglec 11、siglec 12、siglec 13、siglec 14、siglec 15、siglec 16。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可以包含针对Siglec受体(SgR)的结合结构域，使得阻断SgR受体，并且抑制SgR诱导的免疫调节性细胞内信号传导。
用于接合器的特异性多聚化结构域
在双特异性和三特异性接合器的分子设计中也设想了有助于接合器与多种靶标模块化且同时接合的能力的另外的结构和辅助者。这些设计包括诸如在双特异性或三特异性抗体、三抗体或三体形式中用于由接头分开的两个或更多个结合结构域的另外的锚定或扣紧元件。这些高阶多特异性结合结构域常常需要包含多聚化结构域以改善结合相同和不同细胞上的多个结构域的稳定性和灵活性。另外的锚定或扣紧元件以同源对出现，使得锚定或扣紧模态的同源对中的一者与接合器的结合结构域之一附接，并且并且所述对中的另一者与同源对中的另一者附接。
在一些实施方案中，接合器是重组蛋白，其包含如整个说明书中所述的多个结合结构域，所述多个结合结构域各自具有单独结合特异性、各自通过具有彼此表现出互补结合的同源肽锚定或扣紧元件的接头连接在一起。例如，重组蛋白的一个结合结构域与一对同源肽中的第一者融合，并且另一个结合结构域与该一对肽中的第二者融合，其中所述一对肽彼此表现出互补结合，其中所述一对同源肽包括：(a)彼此表现出互补结合的亮氨酸拉链结构域，例如呈天然存在的蛋白质-蛋白质相互作用的亮氨酸拉链，诸如c-Fos和c-Jun蛋白的结合区域内的拉链序列；(b)合成肽，其被设计为经由合成扣紧物彼此特异性结合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含多个结合片段，所述多个结合片段被构造为通过在所述重组蛋白中包含的亮氨酸拉链肽对促进彼此的加速缔合。亮氨酸拉链序列常常包含七个亮氨酸重复并且在两种肽具有亮氨酸拉链结构时构成粘附肽对。在天然存在的亮氨酸拉链中，c-Fos和c-June对是最广泛已知的。它们表现出具有KD：5.4×10-8M的强结合亲和力。它们形成平行螺旋。在一些实施方案中，亮氨酸拉链螺旋是c-Fos:c-Jun对的螺旋。在一些实施方案中，示例性同源对锚定或扣紧元件包括酸-p1(LZA)和碱-p1(LZB)对；由于氨基酸侧链中电荷之间的静电排斥，可以防止其同二聚化。防止同二聚化在许多实施方案中可以是有益的。
示例性c-Fos亮氨酸拉链结构域包含如下氨基酸序列：IARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH(SEQ ID NO:119)。
示例性c-Jun亮氨酸拉链结构域包含如下氨基酸序列：TDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH(SEQ ID NO:120)。
示例性LZA亮氨酸拉链结构域包含如下氨基酸序列：AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQK(SEQ ID NO:121)。
示例性LZB亮氨酸拉链结构域包含如下氨基酸序列：AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQK(SEQ ID NO:122)。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含多个结合片段，所述多个结合片段被构造为通过在所述重组蛋白内包含的所述肽对中的c-Fos/c-Jun结合结构域促进彼此的加速缔合。
在一些实施方案中，锚定或扣紧元件表现出特异性异二聚化能力，并且未表现出同二聚化。
在一些实施方案中，所述治疗剂是重组蛋白，其包含多个结合片段，所述多个结合片段被构造为通过合成扣紧物促进彼此的加速缔合。在一些实施方案中，合成锚定或扣紧元件被设计为异二聚化并且防止同二聚化。
在一些实施方案中，接头的合成扣紧物是非肽交联剂。
在一些实施方案中，同源肽彼此的互补结合可以经由化学结合，诸如交联进行。化学交联剂可用于在体外激活交联。存在可商购获得的同和异双功能蛋白交联剂。实例包括BS2G交联剂(BS2G；双[磺基琥珀酰亚胺基]戊二酸酯)(其是胺反应性、水溶性的同双功能蛋白交联剂(间隔子臂的相对端处的两个结合单元具有相同反应性基团))或其膜可渗透形式、DSG(双琥珀酰亚胺基戊二酸酯、双(N-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯)、BS3交联剂(双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯、磺基-DSS、BSSS)或DST交联剂(双琥珀酰亚胺基酒石酸酯)，尤其是针对肽的同双功能性交联剂；而BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯)、MBS交联剂(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、PDPH交联剂(3-[2-吡啶基二硫代]丙酰基酰肼)提供了一些异双功能性交联剂的实例。
在一些实施方案中，在多特异性接合器内串联布置的可变轻链(VL)亚基和可变重链(VH)区域可以经由具有具有同源肽锚定或扣紧元件的两个接头连接。接头的长度可以限制或促进特异性VL-VH缔合。例如，将接头肽长度限制为少于10个氨基酸限制了两个相邻的VL和VH结构域之间的缔合。
在一些实施方案中，锚定或扣紧元件表现出具有以下KD的亲和力：小于5×10-6M、或小于10-6M、小于5×10-7M、或小于4×10-7M、或小于3×10-7M、或小于2×10-7M、或小于10- 7M、或小于9×10-8M、或小于8×10-8M、或小于7×10-8M、或小于6×10-8M、或小于5×10-8M、或小于4×10-8M、或小于3×10-8M、或小于2×10-8M、或小于10-8M、或小于10-8M、或小于10-10M、或更高亲和力。
另外，在由异二聚体或异多聚体单元的组装形成的这些高阶多特异性接合器(例如，具有多个结合结构域的接合器)中包含另外的锚定或异多聚化结构域有助于多特异性接合器的产生、折叠、稳定性和组织可用性。
炎症基因的共表达
在一个方面，重组核酸包含促炎基因的编码序列，其在工程化细胞中表达。在一些实施方案中，促炎基因是细胞因子。实例包括但不限于TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、CSF、GMCSF或IL-12或干扰素。在一些实施方案中，编码促炎基因的编码序列的重组核酸是治疗剂，诸如伴随至少第一治疗剂的另外的治疗剂。
肽接头
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域、scFv或结合结构域通过接头彼此连接。在一些实施方案中，当细胞外抗原结合结构域处存在多于一个scFv时，所述多于一个scFv通过接头彼此连接。
在一些实施方案中，接头是柔性的。在一些实施方案中，接头包含铰链区。接头通常是短肽序列。在一些实施方案中，接头是甘氨酸和一个或多个丝氨酸残基的链段。对于肽接头优选的其他氨基酸包括但不限于苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、和丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)。在这些之中，Pro、Thr和Gln是天然接头的经常使用的氨基酸。Pro是独特的氨基酸，其具有导致非常受限的构象的环状侧链。富含Pro的序列用作结构域内接头，包括丙酮酸脱氢酶中硫辛酰基与E3结合结构域之间的接头(GA2PA3PAKQEA3PAPA2KAEAPA3PA2KA)。出于本公开的目的，经验性接头可以是柔性接头、刚性接头和可裂解接头。诸如(G4S)x(其中x是部分的多个拷贝，指定为1、2、3、4等)的序列包含柔性接头序列。本文所用的其他柔性序列包括若干个甘氨酸重复，例如(Gly)6或(Gly)8。另一方面，可以使用刚性接头，例如接头(EAAAK)x(其中x是整数1、2、3、4等)产生刚性接头。
接头肽的长度在多特异性接合器的设计中可能是至关重要的。例如，将接头肽长度限制为少于10个氨基酸限制了两个相邻结构域之间的缔合。在一些实施方案中，接头可以包含锚定或扣紧功能，并且可以包含交联部分。交联部分可以是肽或化学交联部分，其中的若干种在先前章节中进行了描述。
在文件中的别处已经讨论了具有特定功能的特异性肽。在一些实施方案中，肽接头还可以充当髓样细胞中的激活因子或信号。例如，可以将TLR4激活肽掺入至接合器的两个结合结构域之间的接头内，并且TLR4激活肽与TLR4信号结合并且激活单核细胞或巨噬细胞中的TLR4信号。
在一些实施方案中，肽接头还可以充当条件性可裂解接头。关于条件性可裂解，应当理解，当裂解肽的药剂可获得时，所述肽被裂解。例如，本文描述了MMP2可裂解肽，其仅当肽在富含MMP2的区域中时才容易地裂解。示例性MMP2可裂解肽是GPLGVR。
在一些实施方案中，肽接头还可以充当靶向肽。例如，描述了M2肽，其可以与作为主要的肿瘤相关单核细胞或巨噬细胞表型的M2单核细胞或巨噬细胞结合。示例性肽是YEQDPWGVKWWY。
任何一个或多个肽接头可以包含特化功能，诸如它们可以二聚化、三聚化或多聚化。在一些实施方案中，一个或多个接头可以包含亮氨酸拉链序列。
在一些实施方案中，肽接头的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头或具有锚定物或扣紧物的两个接头肽一起跨越50个氨基酸或更少、45个氨基酸或更少、40个氨基酸或更少、35个氨基酸或更少、30个氨基酸或更少、25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、10个氨基酸或更少、或5个氨基酸或更少的长度。在一些实施方案中，肽接头或具有锚定物或扣紧物的两个接头肽一起跨越25个氨基酸或更少、24个氨基酸或更少、23个氨基酸或更少、22个氨基酸或更少、21个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、19个氨基酸或更少、19个氨基酸或更少、18个氨基酸或更少、17个氨基酸或更少、16个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、14个氨基酸或更少、13个氨基酸或更少、12个氨基酸或更少、11个氨基酸或更少、10个氨基酸或更少、9个氨基酸或更少、8个氨基酸或更少、7个氨基酸或更少、6个氨基酸或更少、或5个氨基酸或更少的长度。
用于制备单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的方法
将本文所述的接合器产生为重组蛋白。一般来讲，制备编码重组蛋白的构建多核苷酸序列并且将其以适当的取向和正确的阅读框插入至表达载体(诸如质粒)中用于表达，如有必要，可以将DNA与由所需宿主(例如，细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，但是此类控制通常可在表达载体中获得。然后将载体引入至宿主细菌中以使用标准技术进行克隆(参见例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A LaboratoryManual[分子克隆实验指南],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],ColdSpring Harbor[冷泉港],纽约)。
通过使用本领域技术人员熟知的分子克隆技术将编码例如第一结合结构域、接头和第二结合结构域的DNA连接在相同的开放阅读框中来合成重组多核苷酸。在一些实施方案中，将一个或多个多核苷酸序列布置在相同的启动子和调节元件下以产生单一多肽。在一些实施方案中，可以在编码两种多肽的两个相邻多核苷酸之间插入短间隔子，其中间隔子可以编码翻译后裂解位点。两种多肽可以在翻译之后通过在特定裂解位点处诱导裂解而分离。在一些实施方案中，构建体可以是单顺反子或多顺反子的。在一些实施方案中，产生多于一种多肽，其然后在翻译后重新组装。例如，可以通过从两个独立的多核苷酸序列翻译产生抗体的轻链和重链结构域或其部分，允许其在翻译后彼此自由组装。可替代地，将彼此结合的含有LC和HC可变结构域的多个多肽链从单一多核苷酸转录并翻译，所述单一多核苷酸在翻译后裂解为对应肽链，所述对应肽链然后可以重新组装。具有前导序列的多肽是前蛋白并且可以具有由宿主细胞裂解的前导序列以便形成多肽的成熟形式。
在一些实施方案中，多核苷酸构建体编码在多肽下游的N末端信号序列以用于分泌多肽。在一些实施方案中，N末端信号序列包括分泌序列。所得的具有用于分泌的N末端信号序列的翻译蛋白质产物将由细胞分泌。
在一些实施方案中，通过已知的转染方法，诸如使用lipofectamine或磷酸钙，或经由诸如电穿孔或核转染的物理手段将质粒载体引入或掺入在细胞中。在一些实施方案中，通过感染(一种通常称为病毒转导的过程)将质粒载体引入或掺入在细胞中。
在一些实施方案中，将重组核酸整合或掺入在表达载体中。载体包含一种或多种启动子，以及其他调节组分，包括增强子结合序列、起始密码子和终止密码子、5'UTR、3'UTR(包含转录物稳定元件)、任选的保守调节蛋白结合序列等。
在一些实施方案中，将本申请中使用的载体针对表达进行特异性增强。在整个过程中使用的其他示例性载体包括噬菌体、粘粒或人工染色体。
应当理解，可以将第一结合物结构域(与靶细胞诸如癌细胞或患病细胞或病原体结合的结构域)中的任一个和与髓样细胞结合的第二结合物结构域或本说明书中别处所述的第三结合结构域组合设计。
病毒载体：在一些实施方案中，用于表达重组蛋白的载体是病毒来源的，即慢病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方案中，编码重组核酸的核酸由慢病毒载体编码。在一些实施方案中，将慢病毒载体在内部制备并且出于所述目进行大规模生产。在一些实施方案中，如本领域技术人员所知的，利用可商购获得的慢病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
脂质纳米颗粒介导的递送：脂质纳米颗粒(LNP)可以包含极性和/或非极性脂质。在一些实施方案中，在LNP中存在胆固醇以用于高效递送。LNP直径为100-300nm，提供了向各种细胞类型(包括单核细胞或巨噬细胞)递送mRNA的高效手段。在一些实施方案中，可以使用LNP将重组核酸引入至体外细胞培养物中的细胞中。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中核酸是裸DNA分子。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中核酸是mRNA分子。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中核酸插入在载体，诸如质粒载体中。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中核酸是circRNA分子。
在一些实施方案中，使用LNP来将核酸递送至受试者中。可以使用LNP来将核酸全身性地递送在受试者中。它可以通过注射递送。在一些实施方案中，通过静脉内途径注射包含核酸的LNP。在一些实施方案中，皮下注射LNP。
微泡介导的递送：在一些实施方案中，可以使用微泡来将包含例如核酸的组合物递送到受试者中。全氟化碳填充的微泡作为血池剂在脉管系统中循环是稳定的，它们充当这些药剂的载体直到达到目的位点。然后可以利用在皮肤表面上应用的超声使该位点处的微泡破裂，从而导致药物的局部释放。各种其他形式的微泡包括Sonazoid Optison、气体填充的白蛋白微泡和PESDA。相对于递送的治疗剂的组成以及预期的递送位点来优化微泡的组成是必要的。
在一些实施方案中，重组蛋白(例如接合器)、或共表达的炎症蛋白、或被设计为在髓样细胞中表达的任何相关蛋白可以由重组核酸编码，其中重组核酸是RNA。在一些实施方案中，重组核酸是mRNA。在一些实施方案中，mRNA包含用于增强表达和稳定性的一种或多种修饰。在一些实施方案中，mRNA可以是环化的。在一些实施方案中，修饰可以包括但不限于：用碱基类似物或修饰的核苷酸替换核碱基；在mRNA内插入一个或多个基序；以及在5'和3'UTR中引入修饰。在一些实施方案中，可以将重组核酸直接施用在有需要的受试者中。
药物组合物
本文提供了药物组合物，其包含至少第一治疗剂，所述至少第一治疗剂包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器。组合物中的单核细胞或巨噬细胞特异性接合器可以呈肽或多肽或多种肽的复合物的形式。单核细胞或巨噬细胞特异性接合器可以作为纯化重组蛋白提供在组合物中。单核细胞或巨噬细胞特异性接合器可以作为缀合重组蛋白、VHH复合物、scFv复合物或纳米抗体提供在组合物中。单核细胞或巨噬细胞特异性接合器可以呈编码重组单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的多核苷酸的形式。在一些实施方案中，编码单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的多核苷酸可以包括DNA、mRNA或circRNA或这些中任一种的脂质体组合物。脂质体是LNP。
除活性成分之外，药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应该是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂是在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒的那些，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如
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或聚乙二醇(PEG)。
可接受的载体对施用患者是生理学上可接受的，并且保留与其一起施用或在其中施用的化合物的治疗特性。可接受的载体及其配制品大体描述于例如Remington’pharmaceutical Sciences[雷明顿的药学科学](第18版A.Gennaro,Mack Publishing Co.[马克出版有限公司],伊斯顿,宾夕法尼亚州1990)中。载体的一种实例是生理盐水。药学上可接受的载体是在将主题化合物自身体的一个器官或部分的施用位点携带或转运至身体的另一器官或部分中，或在体外测定系统中涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。可接受的载体与配制品的其他成分相容，并且对所述配制品所施用的受试者没有害。可接受的载体也不应改变新抗原的特异性活性。
在一个方面，本文提供了药学上可接受的或生理学上可接受的组合物，其包含与药物施用相容的溶剂(水性或非水性)、溶液、乳液、分散介质、包衣、等渗和吸收促进或延迟剂。因此，药物组合物或药物配制品是指适用于受试者中的药物用途的组合物。可以配制组合物以与特定的施用途径(即，全身性或局部)相容。因此，组合物包含适用于通过各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，组合物还可以包含可接受的添加剂，以便改善免疫细胞在组合物中的稳定性。可接受的添加剂可以不改变免疫细胞的特异性活性。可接受的添加剂的实例包括但不限于诸如以下的糖：甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受的添加剂可以与可接受的载体和/或赋形剂(诸如右旋糖)组合。可替代地，可接受的添加剂的实例包括但不限于表面活性剂(诸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)，以增加肽的稳定性并减少溶液的胶凝。可以将表面活性剂以溶液的0.01％至5％的量添加至组合物中。添加此类可接受的添加剂增加了组合物在储存中的稳定性和半衰期。
可以例如通过注射施用药物组合物。用于注射的组合物包括水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过以下方式维持流动性：通过使用包衣(诸如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。抗菌和抗真菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。在组合物中可以包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)和氯化钠。所得溶液可以按原样包装使用，或者是冻干的，冻干制剂可以后来在施用之前与无菌溶液组合。对于静脉内注射、或在患病位点处的注射，活性成分将呈肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述肠胃外可接受的水性溶液是无热原的并具有适合的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员使用例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液完全能够制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。可以通过以下方式来制备无菌可注射溶液：将活性成分以所需量掺入根据需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。一般来讲，通过以下方式制备分散体：将活性成分掺入无菌媒介物中，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
可以常规地静脉内施用组合物，诸如通过注射例如单位剂量。对于注射，活性成分可以呈肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述水性溶液是基本上无热原的并具有适合的pH、等渗性和稳定性。可以使用例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。另外，可以经由气溶胶化施用组合物。
当考虑组合物用于在本文提供的药物或任何方法中使用，预期组合物可以基本上不含热原，使得组合物在施用至人患者时不会引起炎症反应或不安全的过敏反应。测试组合物的热原和制备基本上不含热原的组合物是本领域普通技术人员充分了解的，并且可以使用可商购获得的试剂盒来完成。
可接受的载体可以含有稳定、增加或延迟吸收、或者增加或延迟清除的化合物。此类化合物包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；低分子量蛋白；减少肽的清除或水解的组分；或者赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。延迟吸收的药剂包括例如单硬脂酸铝和明胶。洗涤剂也可用于稳定或者增加或减少药物组合物(包括脂质体载体)的吸收。为了保护免于消化，可以将化合物与使得其对酸和酶促水解有抗性的组分复合，或者可以将化合物复合于有适当抗性的载体(诸如脂质体)中。保护化合物免于消化的手段是本领域已知的(例如，Fix(1996)Pharm Res.[药学研究]13:1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.[药学和药理学杂志]48:119 135；以及美国专利号5,391,377)。
可以以与剂量配制品相容的方式，并且以治疗有效量施用组合物。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力以及所需的结合能力程度。施用所需的活性成分的精确量取决于医师的判断并且为每一个体所特有。用于初始施用和加强注射的合适方案也是可变的，但以初始施用之后是以一个或多个小时间隔由随后注射或其他施用进行的重复剂量为典型。可替代地，预期了足以维持血液中浓度的连续静脉内输注。
治疗方法
本公开包括用于治疗疾病(诸如癌症和感染)的方法，其中髓样细胞的增强吞噬作用对于去除患病细胞或感染细胞可以是有益的。
癌症包括但不限于T细胞淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、B细胞癌(例如，多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、重链疾病(例如像，α链疾病、γ链疾病和μ链疾病)、良性单克隆丙种球蛋白病、和免疫细胞淀粉样变性、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌(例如，转移性、激素难治性前列腺癌)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、尿膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌症等。适用于由本公开所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方案中，癌症是上皮癌，诸如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈部癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在又一些其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以各种其他方式表征，所述各种其他方式包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞或未分化性。在一些实施方案中，本公开用于淋巴瘤或其亚型(包括但不限于套细胞淋巴瘤)的治疗、诊断和/或预后。淋巴增殖性病症也被认为是增殖性疾病。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物按施用剂量施用。在一些实施方案中，将包含第一治疗剂的组合物与第二疗法或第三疗法组合施用。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物施用一次。在一些实施方案中，将包含至少第一治疗剂的组合物施用多于一次。在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物在疗法的跨度上重复施用多次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物在包括数月、一年或更长时间的时间跨度上向受试者施用两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次或更多次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物每周施用一次。在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物每周施用两次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物每两周施用一次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物每三周施用一次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物每月施用一次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物在每2个月内施用一次、在每3个月内施用一次、在每4个月内施用一次、在每5个月内施用一次或在每6个月内施用一次。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物通过注射施用。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物通过输注施用。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物通过静脉内输注施用。
在一些实施方案中，将包含包括单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的至少第一治疗剂的组合物通过皮下输注施用。
在一些实施方案中，与没有使用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗增加了吞噬能力和单核细胞或巨噬细胞介导的靶细胞杀伤。在用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗之后从肿瘤位点收回的单核细胞或巨噬细胞可以展现出大于10％、或大于20％、或大于30％、或大于40％、或大于50％、或大于60％、或大于70％、或大于80％、或大于90％、或大于100％、或大于150％、或大于200％、或大于250％、或大于300％、或大于350％、或大于400％、或大于450％、或大于500％、或大于600％、或大于700％、或大于800％、或大于900％、或大于1000％的吞噬作用增加。
在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗增加了可以从肿瘤位点收回的相关单核细胞或巨噬细胞中的ROS产生。与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，在用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗之后从肿瘤位点收回的单核细胞或巨噬细胞可以展现出大于2倍、或大于3倍、或大于4倍、或大于5倍、或大于6倍、或大于7倍、或大于8倍、或大于9倍、或大于10倍、或大于20倍、或大于30倍、或大于40倍、或大于50倍、或大于60倍、或大于70倍、或大于80倍、或大于90倍、或大于100倍、或大于200倍、或大于300倍、或大于400倍、或大于500倍、或大于700倍、或大于800倍、或大于900倍、或大于1000倍的ROS增加。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗增加了可以从肿瘤位点收回的相关单核细胞或巨噬细胞中的iNOS产生。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗增加了可以从肿瘤位点收回的相关单核细胞或巨噬细胞中的呼吸爆发。
在一些实施方案中，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中的CD80表达。在一些实施方案中，与没有治疗相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中CD86的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中TRAIL/TNF家族死亡受体的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中LIGHT的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中HVEM的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中CD40的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中TL1A的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中OX40L的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中GITR的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中SLAM的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中CD58的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中CD155的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加相关单核细胞或巨噬细胞中CD112的表达。在一些实施方案中，与没有单核细胞或巨噬细胞特异性接合器治疗的情况相比，用单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的治疗可以增加肿瘤相关髓样细胞中B7-DC的表达。
实施例
实施例1.材料与方法：
杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium)、胰蛋白酶-EDTA、渥曼青霉素(W)、LY294002(LY)、布拉德福(Bradford)试剂和溶葡球菌酶购自西格玛-奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich,Inc.)(密苏里州圣路易斯)。还原血清Opti-MEM I培养基购自吉布科BRL公司(Gibco-BRL)(马里兰州盖瑟斯堡)。SH-5获取自恩佐生命科学公司(Enzo Life Sciences)(宾夕法尼亚州普利茅斯)，并且OSU-03012(OSU)购自西达兰实验室(Cedarlane Labs)(北卡罗来纳州伯灵顿)。FuGENE转染试剂和50×无EDTA蛋白酶抑制剂混合物购自罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)(德国曼海姆)。将细胞在24孔板中生长至60％至70％汇合，并且将培养基更换为DMEM 10％FCS。然后，为了具有类似蛋白质表达，根据制造商的说明，将在1.2μl FuGENE转染试剂中的5ng pCMV5-Akt-CA或200ngpCMV5-Akt-DN(比率为4:1[FuGENE-质粒])添加至在还原血清Opti-MEM I培养基中的BEC。
出于测试和筛选目的，在细菌表达系统中，诸如在大肠杆菌系统中进行BiME、TriME和多特异性接合器的克隆和表征。简而言之，在筛选用于掺入接合器设计中的结合结构域后，将编码特异性可变轻链和/或可变重链结构域的多核苷酸序列通过PCR从对应的抗体表达克隆物单独扩增。在结合结构域包含整个Fab区的情况下，通过PCR从对应的抗体表达克隆物扩增对应区域。典型地将接头酶促连接至编码Fab或可变结构域的C末端。可替代地，通过顺序克隆将编码结合结构域的多核苷酸和接头序列掺入至质粒中。在又另一种替代性方法中，通过重叠PCR彼此连接编码结合结构域(Fab或可变区)的特定序列，并且将包含Fab-接头-Fab设计的较大插入物克隆至表达载体中以表达包含接合器的嵌合蛋白。
将表达蛋白质通过通常已知的技术纯化并浓缩，并且在实验动物中测试产物的肿瘤靶向和毒性。
在一些实例中，使用包含嵌合蛋白的慢病毒构建体来在单核细胞或巨噬细胞中转导嵌合构建体。
实施例2.双特异性接合器(BiME)平台的构建
在该实施例中，设计了具有蛋白酶掩蔽位点的单核细胞或巨噬细胞和肿瘤靶标。双特异性接合器包含单核细胞或巨噬细胞结合结构域，其是清道夫受体(SRA1)结合结构域。靶细胞结合结构域是肿瘤识别结构域(例如，TROP2)。scFv构建体多肽设计标示于图2A中。VHH构建体多肽设计标示于图2B中。在另一种示例性设计中，用蛋白酶可裂解掩蔽元件占据抗原结合结构域。另外，通过TLR4合成肽连接两个结合结构域。scFv构建体多肽设计标示于图3A中。VHH构建体多肽设计标示于图3B中。合成肽结合至两个scFv(图3A)或在两个单结构域之间(图3B)。特异性TLR4合成肽接头激活单核细胞或巨噬细胞上的TLR4受体，并且提供加强单核细胞或巨噬细胞吞噬和促炎活性的第二激活信号，即信号2。在另一种示例性设计中，单核细胞或巨噬细胞特异性接合器的两个结合结构域包含M2靶向肽。M2靶向肽具有YEQDPWGVKWWY(SEQ ID NO:116)(M2-pep)或HLSWLPDVVYAW(HLS pep)(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列，其特异性靶向并且结合至作为肿瘤相关单核细胞或巨噬细胞的主要表型的M2单核细胞或巨噬细胞。因此，除了特异性结合结构域的结合和激活之外，在该设计中，可以进一步采用双特异性接合器来将接合器靶向至特定细胞，在这种情况下为M2单核细胞或巨噬细胞(图3C和图3D)。
实施例3.双特异性接合器的构建和表达。
该实施例描述了在接头内具有激活因子肽序列的BiME的构建，表达和测试。首先，针对培养物中的单核细胞上的免疫激活测试来源于不同TLR激活因子的肽序列。所测试的示例性TLR肽序列在下面列出：
表3.图3A和图3B中举例说明的用作接头序列的一部分以产生双特异性接合器构建体的TLR激活因子肽序列示出于表3中。
表3.
Figure BDA0003502291170000891
为了测试每种肽的免疫应答，将2×10^6个单核细胞与1微克/ml来自表3的肽一起温育过夜，并且使用利用Luminex 200的荧光检测测量IL6和TNF-α释放。如图3E中所示，RS01和RS09肽诱导更高的IL6释放。接下来从以上池中选择这两种肽序列并且将其用于产生双特异性接合器。类似地，对更多种被测试物进行测试。
可以通过分子克隆构建双特异性或三特异性接合器。在产生成功克隆物后，可以对每种克隆物测序并且验证序列。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合器包含(i)能够与CD5+肿瘤细胞结合的抗CD5scFv，和(ii)能够与单核细胞或巨噬细胞上的CD16表面分子结合的抗CD16 scFv。
示例性抗CD5结合物包含含有以下序列的重链：MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV(SEQ ID NO:111)或MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:144)。
另一种示例性抗CD5结合物包含含有以下序列的重链：EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV(SEQ ID NO:112)或EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:143)。
示例性抗CD5结合物可以包含含有以下氨基酸序列的轻链：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:113)。
示例性双特异性或三特异性接合器，诸如含有抗CD5 scFv的双特异性或三特异性接合器可以包含连接示例性重链和示例性轻链的短肽接头，其具有以下序列：SSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:114)或SGGGGS(SEQ ID NO:145)或GGGGS(SEQ ID NO:146)或GGGG(SEQ ID NO:147)。
示例性抗CD5 scFv包含以下氨基酸序列：MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQID NO:115)。
示例性抗CD16 scFv可以包含含有以下氨基酸序列的重链可变序列：QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:141)。
示例性抗CD16 scFv可以包含含有以下氨基酸序列的轻链可变序列：SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:142)。
两个scFv可以通过合成肽接头连接，所述合成肽接头包含TLR激活肽序列(诸如表3中所述的那些)之一。此后将构建体命名为结合物1-接头-结合物2，诸如CD5-RS01-CD16(在接头中具有RS01 TLR激活肽序列)；或CD5-RS09-CD16(在接头中具有RS09 TLR激活肽序列)，分别如图3F或图3H中所示。然后在合适的细胞中表达序列验证的克隆物，并且使用合适的阳性对照，通过凝胶迁移使用分子标记物和蛋白质印迹来检测蛋白质。
示例性双特异性或三特异性接合器可以包含以下序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:148)或任何其他有用的前导序列。
示例性双特异性或三特异性接合器可以包含以下序列：HHHHHH(SEQ ID NO:149)或任何其他有用的亲核标签。
示例性双特异性或三特异性接合器可以包含以下序列：ENLYFQG(SEQ ID NO:150)或任何其他有用的蛋白酶裂解序列。
示例性双特异性或三特异性接合器可以包含第一scFv，其包含经由第一接头连接至可变轻链的可变重链，所述第一scFv可以经由第二接头连接至第二scFv，其中第二scFv包含经由第三接头连接至可变轻链的可变重链。在一些实施方案中，第二接头包含TLR激活肽序列，诸如表3中所述的那些。在一些实施方案中，第一接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，第三接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个氨基酸。
示例性双特异性或三特异性接合器可以包含以下序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTGHHHHHHENLYFQGEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSsggggsSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLggggQEINSSYggggsQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:151)。
示例性双特异性或三特异性接合器可以包含以下序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTGHHHHHHENLYFQGEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSsggggsSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLggggAPPHALSggggsQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:152)。
CD5-RS01-CD16 BiME的表达在如所指示的还原和非还原凝胶电泳下由图3G(左侧)中的SDS PAGE和图3G(右侧)中的蛋白质印迹示出。CD5-RS09-CD16 BiME的表达在如所指示的还原和非还原凝胶电泳下由图3I(左侧)中的SDS PAGE和图3I(右侧)中的蛋白质印迹示出。这些数据展示了含有TLR激活序列的双特异性接合器的成功产生和表达。在体外测试上文所述的接合器。使用基于微粒的吞噬作用测定来检查吞噬作用的变化。简而言之，将链霉亲和素偶联的荧光聚苯乙烯微粒(6μm直径)与生物素化的重组表达和纯化的癌症配体(在这种情况下为CD5)缀合。将在珠子和接合器蛋白质的存在下培养的髓样细胞与配体包衣的微粒一起温育1-4h，并且使用流式细胞术分析和定量吞噬作用的量。
实施例4.三特异性接合器(TriME)设计
在该实施例中，如下阐述三特异性抗原结合蛋白的设计。三特异性抗原结合蛋白包含(a)与人清道夫/吞噬受体特异性结合的第一结构域(A)；(b)与危险信号受体结合的第二结合结构域(B)；以及(c)与靶抗原特异性结合的第三结构域(C)，其中将所述结构域通过接头L1和L2按顺序H2N-(A)-(B)-(C)-COOH、H2N-(A)-(C)-(B)-COOH、H2N-(B)-(A)-(C)-COOH、H2N-(B)-(C)-(A)-COOH、H2N-(C)-(B)-(A)-COOH或H2N-(C)-(A)-(B)-COOH连接(图4A)。将抗原结合结构域用蛋白酶可裂解掩蔽元件占据，所述蛋白酶可裂解掩蔽元件通过可获得性且与蛋白酶接触而被激活。示例性纳米抗体设计示出于图4B中。图4C提供了三特异性接合器的图形视图和在靶肿瘤细胞和单核细胞或巨噬细胞上的功能的示例性性质。三特异性接合器结构上包含肿瘤识别或肿瘤结合结构域、单核细胞或巨噬细胞受体1结合结构域以及单核细胞或巨噬细胞受体2结合结构域(在图4C的右上角的插图上示出)。作为预期的功能模式，肿瘤结合结构域与肿瘤细胞的靶表面分子(肿瘤抗原)结合，而两种单核细胞或巨噬细胞受体B和A分别由三特异性接合器的单核细胞或巨噬细胞受体1结合结构域和单核细胞或巨噬细胞受体2结合结构域结合。如图中所示，还通过肿瘤识别结构域与肿瘤抗原可操作地连接的三特异性接合器对受体A和B的接合，向单核细胞或巨噬细胞提供信号1和信号2。双重信号(信号1+信号2)激活单核细胞或巨噬细胞，从而增强吞噬作用并且激活该示例性图中的炎症级联，这导致对靶细胞的吞噬杀伤。
实施例5.抗原结合结构域掩蔽设计
在该实施例中，进一步详细描述了具有掩蔽抗原结合结构域的接合器的一般化示例性设计。图5Ai是具有两种scFV结合物即scFv1和scFv2的双特异性接合器的图形表示。SdAb或双抗体接合器也可以同样被构建有必要的结构修饰，具有两种结合物的示例性双抗体构建体表示于图5Aii中。抗原结合结构域通过肽掩蔽物(1)来掩蔽，所述肽掩蔽物保持结合至双抗体的抗原结合部分ABD1和ABD2，通过肽接头(2)连接在第一链的ABD1的轻链可变结构域(3)或第二链的ABD2的轻链可变区的N末端部分处。将掩蔽物与轻链可变结构域连接的肽接头是用于基质金属蛋白酶2(MMP2)的底物，其具有氨基酸序列GPLGVR。所述设计允许掩蔽的双抗体接合器通过循环而不与任何底物结合，直到可获得MMP2来裂解连接肽。应当理解，癌症微环境富含MMP2。因此，双抗体接合器在癌症微环境中被激活以在肿瘤环境中分别用ABD1和ABD2结合其靶癌细胞和单核细胞或巨噬细胞。图5B举例说明了双体抗体的单链的核酸构建体。核酸构建体从5’-3’端包含编码掩蔽肽的核酸序列；MMP2接头；编码ABD1轻链(ABD1-LC)的序列，其与编码肽接头的核酸序列连接，所述肽接头与ABD1-LC和ABD2-HC连接；之后是编码ABD2 HC的核酸序列。
实施例6.模块化抗原结合接合器设计
在该实施例中，通过布置在抗体样多肽结构上的轻链重链结构域表示结合结构域的若干种模块化设计，如图6中所示。在一种设计中，使用普通的轻链来与IgG样结构中的两个非相同重链配对，从而提供可以在双特异性或三特异性接合器设计中使用的双特异性结合结构域。在本文所描绘的另一种模型中，嵌合双特异性或三特异性接合器使用与通常抗体轻链和重链组合中的一个臂连接的scFv的组合。在一种设计中，两个scFv替代重链-轻链配对区域，同时通过重链的恒定区连接scFv。在如本文所描绘的其他设计中，可以将一个或多个scFv与Fc区缀合。在又一些其他设计中，可以将一个或多个scFv与恒定区缀合以作为IgG样多肽的侧链。
实施例7.在接合器中使用单核细胞或巨噬细胞特异性激活因子以用于激活单核 细胞或巨噬细胞中的炎症信号并加强吞噬作用
MD2可以响应于LPS结合至并激活TLR4，如图7A上分图中的图形表示中所示的。在示例性设计中，将MD2构建至单核细胞或巨噬细胞特异性接合器中，其中除了肿瘤特异性结合结构域和单核细胞或巨噬细胞特异性结合结构域，MD2与TLR4受体缔合，并且有助于单核细胞或巨噬细胞上TLR4受体的二聚化，从而发送单核细胞或巨噬细胞激活信号(信号2)，其进一步加强单核细胞或巨噬细胞的炎症激活和对靶细胞的吞噬杀伤(图7B)。
在另一个实例中，将疱疹病毒进入介体(HVEM)及其与肿瘤坏死因子(TNF)相关2(LIGHT)的缔合利用在设计加强单核细胞或巨噬细胞效应子功能的示例性单核细胞或巨噬细胞特异性接合器中。HVEM是TNFR超家族的成员，并且具有两种配体：HSV表面包膜gD和LTα。它在T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和DC上表达。LIGHT-HVEM相互作用增加了单核细胞和嗜中性粒细胞中吞噬作用、白介素(IL)-8、TNF-α、一氧化物(NO)和反应性氧物质(ROS)的水平。在示例性设计中，单核细胞或巨噬细胞特异性接合器包含可以与HVEM结合的LIGHT结构域。在设计的变型中，与HVEM结合的轻结构域可以由与HVEM结合的抗原结合结构域的激动剂抗体替代，如图8A中所示。接合器的相应功能模式图形描绘于图8B中，其中LIGHT结构域与单核细胞或巨噬细胞相关HVEM的结合激活单核细胞或巨噬细胞中的炎症信号(信号2)，其加强作为吞噬细胞的效应子功能。
在另一个实例中，将GIRT相关激活信号利用在图9A中所示的示例性单核细胞或巨噬细胞特定接合器中。GIRT在单核细胞或巨噬细胞上表达，并且当由其配体GIRTL结合时，它产生单核细胞或巨噬细胞中的炎症信号，如图9B中所图形描绘。
实施例8.在接合器内使用具有促进加速缔合的序列的接头
在该实施例中，单核细胞或巨噬细胞特异性接合器被设计为具有在多特异性结合结构域之间的具有彼此互补的接头。图10A-图10C展示了包括亮氨酸拉链结构域(图10A和图10B)或包含互补结合结构域的合理设计合成序列(图10C)的示例性设计。使用了本说明书中公开的示例性接头序列。在特定构建体中，利用二聚化或三聚化的接头结构域，从而使有用的结构域更紧密接近。在这些图中示出的是亮氨酸拉链结构域和偶联蛋白质结构域在使异聚体结合物结构域更紧密结合在一起中的示例性使用。
实施例9.用于选择髓样细胞结合物结构域的筛选
在该实施例中，进行筛选以选择可用于设计用于本文所述的接合器的结合结构域的髓样细胞上的细胞表面分子或其功能性片段。结合结构域可以是吞噬受体接合器或激活因子。如现在理解的，并非吞噬细胞上的所有吞噬细胞表面受体都具有相同的被诱导或激活以产生促炎信号传导或以任何方式加强单核细胞或巨噬细胞效应子功能的能力。因此，为了利用单核细胞或巨噬细胞和其他髓样细胞杀伤癌症，在髓样细胞上产生一系列信号1和信号2靶标。通过筛选与炎症以及免疫耐受性相关的物质来鉴定这些靶标。
这使用独特工具来完成，所述独特工具使用表达载体的专有阵列-编码超过5,500种全长人质膜，并且将分泌蛋白质拴系-点样在载玻片上。将人细胞在顶部上生长，变为逆转染的，导致在不同载玻片位置处的每种对应蛋白质的细胞表面表达。然后施加测试配制品并且使用适当的检测系统分析并确认特异性结合。然后询问这些命中并且将其作为单核细胞或巨噬细胞结合和调节的潜在靶标进行检查。
然后，将从筛选中鉴定的特异性有用结合剂或结构域逆转录，并且克隆至慢病毒表达载体中以产生第二结合结构域或接合器BiME或TriME构建体。可以使用来自从筛选产生的高度吞噬菌受体结合结构域的一个或多个结构域产生编码BiME或TriME的重组核酸。

Claims (81)

1.一种组合物，其包含：第一治疗剂，其中所述治疗剂包含：
(a)第一结合结构域，其中所述第一结合结构域是与靶细胞上的抗原特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段，以及
(b)第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段；
其中，
(i)所述第一治疗剂与第一组分偶联，其中所述第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域，或者
(ii)所述组合物包含另外的治疗剂。
2.一种组合物，其包含：治疗剂，其中所述治疗剂包含：(a)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一结合结构域；(b)与髓样细胞特异性相互作用的第二结合结构域；以及(c)与所述髓样细胞特异性相互作用的第三结合结构域。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述髓样细胞是单核细胞或巨噬细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中与髓样细胞特异性相互作用的所述第二结合结构域与所述髓样细胞的吞噬或拴系受体相互作用。
5.如权利要求2所述的组合物，其中与髓样细胞特异性相互作用的所述第三结合结构域与所述髓样细胞的第一吞噬或拴系受体的细胞外区域相互作用。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂的任一个结合结构域包括抗体的所述结合结构域、抗体的功能性片段、其可变结构域、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、单链可变片段(scFv)、Fab、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、双特异性抗体、双抗体、或它们的功能性片段或组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是所述靶细胞上的癌症抗原或病原性抗原或者自身免疫性抗原。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是病毒抗原。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是T淋巴细胞抗原。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是细胞外抗原。
11.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是细胞内抗原。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原选自由以下组成的组：胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、卵泡刺激激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤组2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整联蛋白受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFR-β、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1及其组合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45和CD56。
14.如权利要求12或13中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是卵巢癌抗原或T淋巴细胞抗原。
15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域所结合的所述靶细胞上的所述抗原是整联蛋白受体。
16.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域与整联蛋白受体结合。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域与选自由以下组成的组中的整联蛋白受体结合：α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂与包含吞噬作用激活结构域的吞噬或拴系受体结合。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述治疗剂与选自由以下组成的组中的受体或蛋白质结合：表2A和表2B中列出的受体或其片段。
20.如权利要求18所述的组合物，其中所述治疗剂与选自由以下组成的组中的吞噬受体结合：凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169。
21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂与包含细胞内信号传导结构域的受体结合，所述细胞内信号传导结构域包括促炎信号传导结构域。
22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述第一治疗剂包括长度少于1000个氨基酸或1000nm的多肽。
23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述第一治疗剂包括长度少于500个氨基酸或500nm的多肽。
24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述第一治疗剂包括长度为200-1000个氨基酸或200-1000nm的多肽。
25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述第一治疗剂的所述结合结构域的接合使所述癌细胞与所述髓样细胞接触。
26.如权利要求1所述的组合物，其中所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的吞噬作用活性。
27.如权利要求1所述的组合物，其中所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且促进所述髓样细胞的炎症信号传导。
28.如权利要求1所述的组合物，其中所述第二结合结构域与髓样细胞或粘附分子特异性相互作用并且促进所述髓样细胞对所述靶细胞的粘附性。
29.如权利要求1所述的组合物，其中所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗吞噬活性。
30.如权利要求1所述的组合物，其中所述第二结合结构域与髓样细胞特异性相互作用并且抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗炎症活性。
31.如权利要求2所述的组合物，其中所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域促进所述髓样细胞的吞噬活性。
32.如权利要求2所述的组合物，其中所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域促进所述髓样细胞的炎症信号传导。
33.如权利要求2所述的组合物，其中所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域与髓样细胞或粘附分子特异性相互作用并且促进所述髓样细胞对所述靶细胞的粘附性。
34.如权利要求2所述的组合物，其中所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗吞噬活性。
35.如权利要求2所述的组合物，其中所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域抑制由所述靶细胞介导的所述髓样细胞的抗炎症活性。
36.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂包括治疗性多肽。
37.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂包括编码所述治疗性多肽的重组核酸。
38.如权利要求1所述的组合物，其中所述第三结合结构域或所述另外的治疗剂包括CD47拮抗剂、CD47阻断剂、抗体、嵌合CD47受体、唾液酸酶、细胞因子、促炎基因、半胱天冬酶原或抗癌剂。
39.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和所述第三结合结构域与不同的非相同靶抗原结合。
40.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域或所述第三结合结构域是配体结合结构域。
41.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域或所述第三结合结构域通过一个或多个接头可操作地连接。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述接头是多肽。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述接头是功能性肽。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述接头是针对受体的配体。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述接头是针对单核细胞或巨噬细胞受体的配体。
46.如权利要求43或44所述的组合物，其中所述接头激活所述受体。
47.如权利要求43或44所述的组合物，其中所述接头抑制所述受体。
48.如权利要求44所述的组合物，其中所述接头是针对M2巨噬细胞受体的配体。
49.如权利要求43或44所述的组合物，其中所述接头是针对TLR受体诸如TLR4的配体。
50.如权利要求43、44、45、46、48或49中任一项所述的组合物，其中所述接头激活TLR受体。
51.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和/或所述第三结合结构域与结合至所述结合结构域的掩蔽物缔合。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述掩蔽物是抑制剂，所述抑制剂在所述掩蔽物保持与对应的结合结构域缔合时抑制结合结构域与其靶标的相互作用。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述掩蔽物经由肽接头与所述结合结构域缔合。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所述肽接头包含可裂解部分。
55.如权利要求53所述的组合物，其中所述可裂解部分由在所述癌症或肿瘤位点中选择性地丰富的蛋白质或酶裂解。
56.如权利要求1-55中任一项所述的组合物，其中与所述巨噬细胞的第二受体的细胞外区域特异性相互作用的所述第三结合结构域激活所述巨噬细胞。
57.如权利要求1-56中任一项所述的组合物，其中如通过颗粒摄取测定测量的，与未由所述治疗剂结合的髓样细胞相比，在所述治疗剂与所述髓样细胞结合后，所述髓样细胞的杀伤或吞噬作用活性增加至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％或90％或100％。
58.如权利要求1-57中任一项所述的组合物，其中第一治疗剂的所述结合结构域的接合触发所述髓样细胞对所述癌细胞的吞噬作用。
59.如权利要求1-58中任一项所述的组合物，其中所述另外的治疗剂的接合加强或增加所述髓样细胞对所述癌细胞的吞噬杀伤。
60.如权利要求1-59中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域与IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcRn、TRIM21、FcRL5的细胞外结构域结合。
61.如权利要求1-60中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括M2结构域。
62.如权利要求1-61中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括LIGHT结构域。
63.如权利要求1-62中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括HVEM结构域。
64.如权利要求1-63中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域或所述第三结合结构域包括GITR结构域。
65.一种药物组合物，其包含：
第一治疗剂，其中所述治疗剂包含一种或多种多肽或编码所述一种或多种多肽的重组核酸，其中所述一种或多种多肽包含：
(a)第一结合结构域，其中所述第一结合结构域是与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段，以及
(b)第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段；
其中，
(i)所述第一治疗剂与第一组分偶联，其中所述第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域，或
(ii)所述组合物包含另外的治疗剂；以及
药学上可接受的盐或赋形剂。
66.如权利要求65所述的药物组合物，其中所述第一治疗剂包括单一多肽。
67.如权利要求65所述的药物组合物，其中所述第一治疗剂包括多种多肽。
68.如权利要求65所述的药物组合物，其中所述第一治疗剂是编码所述一种或多种多肽的重组核酸。
69.如权利要求65所述的药物组合物，其还包含第二治疗剂。
70.一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括：
向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：
第一治疗剂，其中所述治疗剂包含一种或多种多肽或编码所述一种或多种多肽的重组核酸，其中所述一种或多种多肽包含：
(a)第一结合结构域，其中所述第一结合结构域是与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗体或其功能性片段，以及
(b)第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是与髓样细胞特异性相互作用的第二抗体或其功能性片段；
其中，
(i)所述第一治疗剂与第一组分偶联，其中所述第一组分是另外的治疗剂或第三结合结构域，或
(ii)所述组合物包含另外的治疗剂；以及
药学上可接受的盐或赋形剂。
71.如权利要求70所述的方法，其还包括施用第二治疗剂。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述施用所述药物组合物包括静脉内施用所述药物组合物。
73.如权利要求70所述的方法，其中所述施用所述药物组合物包括皮下施用所述药物组合物。
74.如权利要求70所述的方法，其中所述施用所述药物组合物包括注射所述药物组合物。
75.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述第一结合结构域包含具有与选自由SEQID NO:27、28、111、112、113、115、143和144组成的组中的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
76.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述第二结合结构域包含具有与选自由SEQID NO:141和142组成的组中的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
77.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一组分包含氨基酸序列GGQEINSSYGG(SEQID NO:105)或QEINSSY(SEQ ID NO:129)。
78.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一组分包含氨基酸序列GGAPPHALSGG(SEQID NO:109)或APPHALS(SEQ ID NO:137)。
79.如权利要求49或50所述的组合物，其中所述接头包含氨基酸序列GGQEINSSYGG(SEQID NO:105)或QEINSSY(SEQ ID NO:129)或GGAPPHALSGG(SEQ ID NO:109)或APPHALS(SEQID NO:137)。
80.一种双特异性或三特异性接合器，其包含具有与SEQ ID NO:151具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
81.一种双特异性或三特异性接合器，其包含具有与SEQ ID NO:152具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的序列。
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