KR20220048988A - 대식세포 특이적 인게이저 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

대식세포 특이적 인게이저 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20220048988A
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KR
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binding domain
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bone marrow
receptor
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다니엘 게츠
위시아오 왕
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마이얼로이드 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시 내용은 암 또는 감염의 면역 요법에 사용되는, 골수 세포 특이적 인게이저를 포함하는 치료제를 제조 및 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

대식세포 특이적 인게이저 조성물 및 이의 사용 방법
상호 참조
본 출원은 2019년 6월 11일자로 출원된 미국 가출원 62/860,055 및 2019년 10월 1일자로 출원된 미국 가출원 62/908,978의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다. 2020년 7월 7일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 56371-703_601_SL.txt로 명명되며, 87,312 byte의 크기이다.
세포 면역 요법은 암, 지속적인 감염 및 다른 형태의 치료에 불응성인 질병과 같은 치료하기 어려운 질병과 싸우기 위한 유망한 신기술이다. 대식세포는 종양 또는 감염 부위에 존재하는 우세한 세포 유형을 나타내며, 상기 질병을 가장 효과적으로 치료하는데 잠재적으로 이용될 수 있는 몇 가지 전략적 이점을 갖는다. 면역계의 자연적인 감시자로서, 이러한 세포는 암 세포를 비롯하여 비정상적이고 건강하지 않은 세포 유형을 감지하고 제거할 수 있다. 그러나, 면역 요법을 위한 대식세포의 잠재적 사용은 완전히 탐색되지 않았다. T 세포 악성 종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는 개선된 치료제의 개발에 이러한 세포 유형을 사용하기 위한 새로운 방안이 모색되고 있다.
본 개시 내용은 식세포 작용을 통해 표적 세포 파괴 경로를 개시하는 신규한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 출원은, 식세포 수용체가 고전적 리간드에 결합하는 것에 추가하여 적어도 제2의 동시 또는 후속 활성화 신호로 촉발될 때, 제2 또는 추가의 신호(들)가 식세포 작용에 의해 표적 세포의 효율적인 파괴를 초래할 수 있다는 예상치 못한 발견을 기반으로 한다. 골수 세포, 또는 단핵구 또는 대식세포와 같은, 세포의 식세포 작용을 증진시키기 위해 설계된 키메라 수용체 및 키메라 수용체 결합 세포외 요소가 본 출원에서 제시된다. 상기 적어도 제2의 동시 또는 후속 신호의 신중한 설계 및/또는 조작은 표적 세포가 이후에 효과적으로 파괴되도록 본 출원에서 기재된 것들과 같은 키메라 식세포 수용체의 성공적인 활성화에 유용하다. 예를 들어, 제1 신호(신호 1)는 식세포 작용/테더링 수용체를 통해 매개될 수 있으며, 제2 신호(신호 2)는 염증 유전자의 핵 인자-κB(nuclear factor-κB: NF-κB) 매개성 상향 조절을 촉발하는 사이토카인 또는 병원체 관련 분자 패턴(DAMP)과 같은 매개성 위험 신호에 의해 매개될 수 있다. 다음 섹션에서 기재되는 바와 같이, 식세포 작용만을 촉발하는 것은, 단핵구 또는 대식세포의 식세포 능력을 이용하여 암 세포를 사멸하고 효과적인 항종양 반응을 유도하는 맥락에서, 단핵구 또는 대식세포를 활성화하기에 충분하지 않을 수 있다.
본 출원에서 기재된 본 발명의 특정한 이점들 중 하나는 본 출원에서 개시된 효과적인 세포성 면역 요법을 위한 조성물이 비용 효율적이고 효율적이라는 것이다.
일부 양태에서, 키메라 식세포 수용체의 세포외 부분에 결합하고 암 세포와 같은 표적 세포 상의 적어도 세포 표면 성분에 추가로 결합하는 신규한 키메라 세포 표면 결합 요소 또는 "인게이저(engager)"가 본 출원에서 제공된다.
하나의 실시형태에서, 상기 신규한 키메라 인게이저는 키메라 식세포 수용체의 세포외 부분에 결합할 수 있고, 하나 이상의 세포 표면 성분에 추가로 결합할 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 표적 암 세포 상에 있다. 따라서, 인게이저는 이중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저(bi-specific monocyte or macrophage engager(BiME))일 수 있고 2개의 결합 부분을 가질 수 있으며, 여기서, 하나의 결합 부분은 키메라 식세포 수용체의 세포외 부분에 결합하고, 다른 하나는 표적 세포 상의 세포 표면 성분에 결합한다. 유사하게, 인게이저는 삼중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저(trispecific monocyte or macrophage engager: TriME)일 수 있고 3개의 결합 부분을 가질 수 있으며, 여기서, 하나의 결합 부분은 키메라 식세포 수용체의 세포외 부분에 결합하고, 또 다른 결합 부분은 표적 세포 상의 세포 표면 성분에 결합하고, 제3 결합 부분은 포식 세포의 세포 표면 성분에 결합한다.
하나의 양태에서, 상기 인게이저는 합성 단백질 또는 펩타이드, 컨쥬게이트된 단백질 또는 컨쥬게이트된 펩타이드이다. 제1 치료제를 포함하는 조성물이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는 (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및 (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 제2 결합 도메인을 포함하고; 여기서, (i) 상기 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되고, 여기서, 상기 제1 성분은 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인이거나, (ii) 상기 조성물은 추가의 치료제를 포함한다.
하나의 양태에서, 치료제를 포함하는 조성물이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는 (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 결합 도메인, (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 결합 도메인, 및 (c) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제3 결합 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, 치료제를 포함하는 조성물이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는: (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 결합 도메인, (b) (i) 골수 세포(예를 들어, 단핵구 또는 대식세포, 또는 수지상 세포)와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 식세포 작용 활성을 촉진하거나 (ii) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 염증 신호 전달을 촉진하거나 (iii) 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 대한 상기 골수 세포의 부착을 촉진하는 제2 결합 도메인, 및 (c) (i) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 식세포 작용 활성을 촉진하거나 (ii) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 염증 신호 전달을 촉진하거나 (iii) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 대한 상기 골수 세포의 부착을 촉진하거나 (iv) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제하거나 (v) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증 활성을 억제하는 제3 결합 도메인을 포함하는 인게이저이다.
일부 실시형태에서, 상기 골수 세포는 단핵구 또는 대식세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 상기 제2 결합 도메인은 상기 골수 세포 또는 단핵구 또는 대식세포의 식세포 또는 테더링 수용체와 상호 작용한다.
일부 실시형태에서, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 상기 제3 결합 도메인은 상기 골수 세포 또는 단핵구 또는 대식세포의 제1 식세포 또는 테더링 수용체의 세포외 영역과 상호 작용한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제의 결합 도메인 중 어느 하나는 항체의 결합 도메인, 항체의 기능성 단편, 이의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중 특이적 항체, 디아바디, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 하나의 재조합 단백질 또는 하나 초과의 재조합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 하나 이상의 융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 항체, 항체의 기능성 단편, 이의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중 특이적 항체, 디아바디, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합을 포함하는 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 치료제는 각각 다중 결합 단편을 포함하는 하나의 재조합 단백질 또는 하나 초과의 재조합 단백질이며, 각각의 결합 단편은 항체의 기능성 단편, 이의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중 특이적 항체, 디아바디, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합을 구성한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 서로 상보적 결합을 나타내는 링커(예를 들어, 펩타이드 링커)에 의해 각각 함께 연결되는 개별 결합 특이성을 각각 갖는 다중 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질(인게이저)이다. 예를 들어, 상기 재조합 단백질의 한 결합 도메인은 제1 링커 펩타이드 쌍과 융합되고, 다른 결합 도메인은 제2 링커 펩타이드 쌍과 융합되며, 여기서, 상기 링커 펩타이드 쌍은 서로 상보적 결합을 나타내고, 상기 링커 펩타이드 쌍은 (a) 서로 상보적 결합을 나타내는 류신 지퍼 도메인; 예를 들어, c-Fos 및 c-Jun 단백질의 결합 영역 내의 지퍼 서열과 같은 자연 발생 단백질-단백질 상호 작용의 류신 지퍼, (b) 합성 갈고리(clasp)와 같은 설계된 친화도를 통해 서로 특이적으로 결합하도록 설계된 합성 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 상기 재조합 단백질에 포함된 류신 지퍼 펩타이드 쌍에 의해 서로 가속화된 회합(association)을 용이하게 하도록 구성된 다중 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 상기 재조합 단백질 내에 포함된 상기 펩타이드 쌍 중의 c-Fos/c-Jun 결합 도메인에 의해 서로 가속화된 회합을 용이하게 하도록 구성된 다중 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 합성 갈고리에 의해 서로 가속화된 회합을 용이하게 하도록 구성된 다중 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 암 항원 또는 상기 표적 세포 상의 병원성 항원 또는 자가 면역 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 바이러스 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, T 림프구 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 세포외 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 세포내 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 티미딘 키나아제(TK1), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(HPRT), 수용체 타이로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 뮤신-1, 뮤신-16(MUC16), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 vIII(EGFRvIII), 메소텔린, 사람 상피 세포 성장 인자 수용체 2(HER2), 메소텔린, EBNA-1, LEMD1, 포스파티딜 세린, 암배아 항원(CEA), B 세포 성숙 항원(BCMA), 글리피칸 3(GPC3), 여포 자극 호르몬 수용체, 섬유 아세포 활성화 단백질(FAP), 에리트로포이에틴 생산 간세포 암종 A2(EphA2), EphB2, 자연 살해 군 2D(NKG2D) 리간드, 디시알로강글리오사이드 2(GD2), CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD45, CD56CD79b, CD97, CD117, CD123, CD133, CD138, CD171, CD179a, CD213A2, CD248, CD276, PSCA, CS-1, CLECL1, GD3, PSMA, FLT3, TAG72, EPCAM, IL-1, 인테그린 수용체, PRSS21, VEGFR2, PDGFR-베타, SSEA-4, EGFR, NCAM, 프로스타아제, PAP, ELF2M, GM3, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, IGLL1 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CCR4, CD8, CD30, CD45 및 CD56으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 난소암 항원 또는 T 림프종 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 표적 세포 상의 항원은, 인테그린 수용체이다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인 또는 상기 제3 결합 도메인은 인테그린 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인 또는 상기 제3 결합 도메인은 α1, α2, αIIb, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αV, αX, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7 및 β8로 이루어진 군으로부터 선택된 인테그린 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 식세포 작용 활성화 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 표 2a 및 표 2b에 열거된 수용체들로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 또는 단백질, 또는 이의 단편에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저(scavenger) 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fc-알파 수용체 I, CR1, CD35, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택된 식세포 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 전염증 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 1000개 아미노산 또는 1000 nm 길이 미만 또는 1000 nm인 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 500개 아미노산 또는 500 nm 길이 미만인 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 200~1000개 아미노산 또는 200~1000 nm 길이인 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제의 상기 결합 도메인들의 관여(engagement)는 상기 암 세포를 상기 골수 세포에 접촉시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고, 상기 골수 세포의 식세포 작용 활성을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 염증 신호 전달을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 대한 상기 골수 세포의 부착을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증 활성을 억제한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 골수 세포의 식세포 활성을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 골수 세포의 염증 신호 전달을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 대한 상기 골수 세포의 부착을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항식세포 활성을 억제한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 표적 세포에 의해 매개되는 골수 세포의 항염증 활성을 억제한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 치료학적 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 치료학적 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제3 결합 도메인 또는 추가의 치료제는 CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다아제, 사이토카인, 전염증 유전자, 프로카스파아제 또는 항암제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인, 상기 제2 결합 도메인 및 상기 제3 결합 도메인은 특유의 비동일 표적 항원에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인, 상기 제2 결합 도메인 또는 상기 제3 결합 도메인은 리간드 결합 도메인이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 기능성 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 상기 수용체를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 상기 수용체를 억제한다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 M2 단핵구 또는 대식세포에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 TLR 수용체에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 상기 TLR 수용체를 활성화시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 제1, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 결합 도메인에 결합하는 마스크와 회합된다.
일부 실시형태에서, 상기 마스크는, 상기 마스크가 각각의 결합 도메인과 회합된 채로 유지될 때, 이의 표적에 대한 결합 도메인의 상호 작용을 억제하는 억제제이다.
일부 실시형태에서, 상기 마스크는 펩타이드 링커를 통해 상기 결합 도메인과 회합된다.
일부 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 절단 가능한 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 모이어티는 상기 암 또는 종양의 부위에 선택적으로 풍부한 단백질 또는 효소에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포의 제2 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제3 결합 도메인은 상기 단핵구 또는 대식세포를 활성화한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제의 상기 골수 세포에 대한 결합시, 상기 골수 세포의 사멸 또는 식세포 작용 활성은 입자 흡수 검정(particle uptake assay)에 의해 측정될 때 상기 치료제에 의해 결합되지 않은 골수 세포와 비교하여 적어도 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 90% 또는 100% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제의 상기 결합 도메인들의 관여는 상기 골수 세포에 의한 상기 암 세포의 식세포 작용을 촉발한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 치료제의 관여는 상기 골수 세포에 의한 상기 암 세포의 식세포 사멸을 강화하거나 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcRn, TRIM21, FcRL5의 세포외 영역에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 M2 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 LIGHT 도메인 또는 HVEM 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 HVEM 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 GITR 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 결합 도메인은 서열번호 27, 28, 111, 112, 113, 115, 143 및 144로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 서열번호 141 및 142로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 성분은 아미노산 서열 GGQEINSSYGG(서열번호 105) 또는 QEINSSY(서열번호 129)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 성분은 아미노산 서열 GGAPPHALSGG(서열번호 109) 또는 APPHALS(서열번호 137)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 아미노산 서열 GGQEINSSYGG(서열번호 105) 또는 QEINSSY(서열번호 129) 또는 GGAPPHALSGG(서열번호 109) 또는 APPHALS(서열번호 137)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 151과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저가 본 출원에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 152와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저가 본 출원에서 제공된다.
제1 치료제를 포함하는 약학 조성물이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 폴리펩타이드는 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 제2 결합 도메인을 포함하고; 여기서, (i) 상기 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되고, 여기서, 상기 제1 성분은 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인이거나, (ii) 상기 조성물은 추가의 치료제 및 허용되는 약제학적 염 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 약학 조성물의 상기 제1 치료제는 단일 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 약학 조성물의 상기 제1 치료제는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 약학 조성물의 상기 제1 치료제는 상기 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산이다. 일부 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 제2 치료제를 추가로 포함한다.
제1 치료제를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 폴리펩타이드는 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 제2 결합 도메인을 포함하고; 여기서, (i) 상기 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되고, 여기서, 상기 제1 성분은 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인이거나, (ii) 상기 조성물은 추가의 치료제 및 허용되는 약제학적 염 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료 방법은 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 치료 방법은 상기 약학 조성물을 정맥내로 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료 방법은 상기 약학 조성물을 피하로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 치료 방법은 상기 약학 조성물을 주사하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 림프구인 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 난소암 세포인 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 난소 췌장 세포인 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 교모세포종 세포인 암 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 DNA이다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 RNA이다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 mRNA이다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 circRNA이다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 tRNA이다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 마이크로RNA이다.
상기에서 기재된 조성물을 포함하는 벡터가 본 출원에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 폴리시스트론성이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 핵산 서열의 각각은 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site: IRES)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 플랭킹하는 5'UTR 및/또는 3'UTR을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 하나 이상의 조절 영역을 추가로 포함한다.
상기에서 기재된 조성물의 재조합 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드가 본 출원에서 제공된다.
본 개시 내용의 추가의 양태 및 이점은, 본 개시 내용의 예시적인 실시형태만이 도시되고 기재되는, 하기 상세한 설명으로부터 당해 분야의 통상의 기술자들에게 용이하게 명백해질 것이다. 인식되는 바와 같이, 본 개시 내용은 기타 및 상이한 실시형태가 가능하고, 이의 몇몇 세부 사항은 본 개시 내용을 벗어나지 않고 다양한 명백한 측면에서 변형이 가능할 수 있다. 따라서, 도면과 상세한 설명은 사실상 예시적인 것이지 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
참조문헌 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 명시된 것처럼, 동일한 정도로 참조로 본 출원에 포함된다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 정도까지, 본 명세서는 이러한 임의의 모순되는 자료를 대체 및/또는 우선한다.
본 발명의 신규한 특징들은 첨부된 청구 범위에서 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 보다 나은 이해는, 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시형태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면(본 출원에서는 또한 도라고 함)을 참조하여 수득될 것이다:
도 1a는 예시적인 세포외 자극제, 수용체, 및 골수 세포에 대한 이중 신호, 즉, 신호 1 및 신호 2를 생성하는 경로의 그래픽 표현이다.
도 1b는 바인더 A, 라이너 L 및 제2 바인더 B를 갖는 단순화된 인게이저 작제물의 그래픽 표현이다. 이러한 단순화된 다이어그램에서, 바인더 A는 표적 세포 상의 세포 표면 생체 분자에 결합하며; 바인더 B는 골수 세포 상의 세포 표면 생체 분자에 결합한다.
도 2a는 항원 결합 도메인인 프로테아제 절단 가능한 차폐된 부위를 갖는 이중 특이적 scFv 인게이저의 그래픽 표현이다.
도 2b는 프로테아제 절단 가능한 차폐된 항원 결합 도메인을 갖는 이중 특이wjr VHH 인게이저의 그래픽 표현이다.
도 3a는 프로테아제 절단 가능한 차폐된 부위를 갖는 예시적인 이중 특이적 scFv 인게이저, 및 항원 결합 도메인인 2개의 scFv 인게이저를 연결하는 펩타이드 링커의 그래픽 표현이며; 이 경우, 상기 펩타이드 링커는 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인, 구체적으로는 TLR4 리간드 펩타이드이다.
도 3b는 프로테아제 절단 가능한 차폐된 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 이중 특이적 VHH 인게이저, 및 2개의 프로테아제 절단 가능한 차폐된 항원 결합 도메인을 연결하는 펩타이드 링커의 그래픽 표현이며; 이 경우, 상기 펩타이드 링커는 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인, 구체적으로는 TLR4 리간드 펩타이드이다.
도 3c는 프로테아제 절단 가능한 차폐된 부위를 갖는 예시적인 이중 특이적 scFv 인게이저, 및 항원 결합 도메인인 2개의 scFv 인게이저를 연결하는 펩타이드 링커의 그래픽 표현이며; 이 경우, 상기 펩타이드 링커는 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인, 구체적으로는 M2 표적화 펩타이드이다.
도 3d는 프로테아제 절단 가능한 차폐된 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 이중 특이적 VHH 인게이저, 및 2개의 프로테아제 절단 가능한 차폐된 항원 결합 도메인을 연결하는 펩타이드 링커의 그래픽 표현이며; 이 경우, 상기 펩타이드 링커는 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인, 구체적으로는 M2 표적화 펩타이드이다.
도 3e는 표시된 각 TLR 펩타이드의 존재하에 밤새 배양된 단핵구에 의한 사이토카인 생산을 나타내는 데이터를 도시한 것이다.
도 3f는 각각 CD5 및 CD16에 대해 특이적인 2개의 scFv 바인더, 및 TLR4 합성 펩타이드 링커(RS01)를 갖는 이중 특이적 바인더 작제물 CD5-RS01-CD16의 단백질 구조의 그래픽 삽화를 도시한 것이다.
도 3g는 도 3f에 나타낸 CD5-RS01-CD16의 발현 데이터를 도시한 것이다. 레인 M1 및 M2, 각각 TaKaRa, 카탈로그 번호 3452 및 GenScript, 카탈로그 번호 M00521에서 시판되는 단백질 분자량 마커. 레인 1과 2는, 각각 환원 및 비환원 조건하에, 표시된 SDS PAGE 결과 또는 웨스턴 블롯 결과이다. 레인 P, 양성 대조군(다중 태그, Gene Script, 카탈로그 번호 M0101). 웨스턴 블롯에 사용된 일차 항체: 마우스 항-His mAb(GenScripts, 카탈로그 번호 A00186).
도 3h는 각각 CD5 및 CD16에 대해 특이적인 2개의 scFv 바인더, 및 TLR4 합성 펩타이드 링커(RS09)를 갖는 이중 특이적 바인더 작제물 CD5-RS09-CD16의 단백질 구조의 그래픽 삽화를 도시한 것이다.
도 3i는 도 3h에 나타낸 CD5-RS09-CD16의 발현 데이터를 도시한 것이다. 레인 주석 및 인덱스는 도 3g에 대한 설명에 나타낸 바와 같다.
도 4a는 예시적인 삼중 특이적 scFv 인게이저의 그래픽 표현이다.
도 4b는 예시적인 삼중 특이적 VHH 인게이저의 그래픽 표현이다.
도 4c는 삼중 특이적 인게이저의 예시적인 작용 방식의 그래픽 표현이다.
도 5aa는 각 결합 도메인이 결합 도메인과 이의 동족 기질의 상호 작용을 방지하는 제제(마스크)에 의해 차폐되는 재조합 이중 특이적 scFv 인게이저의 구조적 배열 형태의 그래픽 표현을 도시한 것이다. 상기 마스크는 절단 가능한 링커, 예들 들어, 메탈로프로테이나아제(MMP2) 기질에 의해 각 경쇄의 말단 섹션에 부착된다. 화살표는 다음과 같은 재조합 이중 특이적 scFv 인게이저의 구조적 성분을 가리킨다: 1, 마스크; 2, MMP2 기질 링커; 3, ABD1(항원 결합 도메인 1) 경쇄; 3', ABD2(항원 결합 도메인 2) 경쇄; 4, 결합 도메인 경쇄와 결합 도메인 중쇄를 연결하는 링커; 5, ABD1(항원 결합 도메인 1) 중쇄; 5', ABD2(항원 결합 도메인 2) 중쇄.
도 5ab는 각 결합 도메인이 결합 도메인과 이의 동족 기질의 상호 작용을 방지하는 제제(마스크)에 의해 차폐되는 재조합 이중 특이적 디아바디 인게이저의 구조적 배열 형태의 그래픽 표현을 도시한 것이다. 상기 마스크는 절단 가능한 링커, 예들 들어, 메탈로프로테이나아제(MMP2) 기질에 의해 각 경쇄의 말단 섹션에 부착된다. 화살표는 다음과 같은 재조합 이중 특이적 디아바디 인게이저의 구조적 성분을 가리킨다: 1, 마스크; 2, MMP2 기질 링커; 3, ABD1(항원 결합 도메인 1) 경쇄; 3', ABD2(항원 결합 도메인 2) 경쇄; 4, ABD1 경쇄와 ABD1 중쇄를 연결하는 링커; 4', ABD2 경쇄와 ABD2 중쇄를 연결하는 링커; 5, ABD2 중쇄; 5', ABD1 중쇄.
도 5b는 이중 특이적 scFv의 단일 쇄에 대한 선형 작제물의 그래픽 표현을 도시한 것이다. 5aa 또는 도 5ab에 상응하는 부분들은 N-말단에서 C-말단까지 선형화된 다이어그램 내에서 도시되어 있다.
도 6은 이중 특이적 및 삼중 특이적 인게이저로서 이용하기 위한 2개 또는 3개의 결합 도메인을 포함하는 예시적인 모듈 작제물을 도시한 것이다.
도 7a의 상부 패널은, TLR 활성화를 초래하는, TLR4 수용체의 MD2 매개성 이량체화의 그래픽 표현이다. 도 7a의 하부 패널은 종양 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 예시적인 디자인이며, 여기서, 하나의 결합 도메인은 종양 세포 관련 분자(종양 항원)에 결합할 수 있고, 또 다른 결합 도메인은 단핵구 또는 대식세포 수용체, 이 경우에는 FcR에 결합할 수 있다. 제3 도메인은, TLR4 수용체에 결합하고 이를 이량체화하여 활성화할 수 있는 MD2 도메인이다.
도 7b는 도 7a의 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 작용 방식을 도시하는 그래픽 표현이다.
도 8a는 종양 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 예시적인 디자인이며, 여기서, 하나의 결합 도메인은 종양 세포 관련 분자(종양 항원)에 결합할 수 있고, 제2 결합 도메인은 단핵구 또는 대식세포 수용체, 이 경우에는 FcR에 결합할 수 있다. 제3 도메인은, 단핵구 또는 대식세포 HVEM에 관여하고(engage) 단핵구 또는 대식세포에서 염증 신호를 활성화할 수 있는 LIGHT 도메인이다.
도 8b는 도 8a의 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 작용 방식을 도시하는 그래픽 표현이다.
도 9a는 종양 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 예시적인 디자인이며, 여기서, 하나의 결합 도메인은 종양 세포 관련 분자(종양 항원)에 결합할 수 있고, 제2 결합 도메인은 단핵구 또는 대식세포 수용체, 이 경우에는 FcR에 결합할 수 있다. 제3 도메인은, 단핵구 또는 대식세포 수용체 GITR을 활성화할 수 있고 단핵구 또는 대식세포에서 염증 신호를 유도할 수 있는 항-GITR 항체의 GIRT 리간드(GIRTL) 도메인 또는 대안으로는 항원 결합 도메인이다.
도 9b는 도 9a의 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 작용 방식을 도시하는 그래픽 표현이다.
도 10a는 류신 지퍼 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 예시적인 이종 이량체성 항체 기반 인게이저 분자 디자인을 도시한 것이다. L1, L2는 리간드를 나타낸다.
도 10b는 류신 지퍼 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 예시적인 이종 다량체성 항체 기반 인게이저 분자 디자인을 도시한 것이다. L1~L4는 리간드를 나타낸다.
도 10c는 합성 앵커 디자인을 갖는 펩타이드를 포함하는 예시적인 이종 이량체성 항체 기반 인게이저 분자 디자인을 도시한 것이다. L1, L2는 리간드를 나타내며, 'm'과 'n'은 합성 결합 디자인을 나타낸다.
모든 용어들은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 이해되도록 의도된다. 달리 정의되지 않는다면, 본 출원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 출원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 유기적 구조의 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 한정하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
본 개시 내용의 다양한 특징들이 단일 실시형태의 맥락에서 기재될 수 있지만, 이러한 특징들은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수 있다. 정반대로, 본 개시 내용이 명료함을 위해 개별적인 실시형태의 맥락에서 본 출원에 기재될 수 있지만, 본 개시 내용은 또한 단일 실시형태에서 실시될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 "포함하는 (comprising)"(및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖다" 및 "갖는다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는 (including)"(및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다" 및 "함유한다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)이라는 문구는 포괄적이거나 개방적이며, 인용되지 않은 추가의 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시형태는 본 개시 내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지인 것으로 고려된다. 또한, 본 개시 내용의 조성물은 본 개시 내용의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
파라미터, 양, 시간적 지속 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 출원에서 사용되는 "약" 또는 "대략"이라는 용어는, 명시된 값의 또는 명시된 값으로부터 +/-20% 이하, +/-10% 이하, +/-5% 이하 또는 +/-1% 이하의 변화가 본 개시 내용에서 수행하기에 적절한 한, 이러한 변화를 포괄하는 것으로 여겨진다. "약" 또는 "대략"이라는 수식어가 지칭하는 값 자체는 또한 구체적으로 개시되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
"제제"는 임의의 유형의 분자를 포함할 수 있으며, 항체, 펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, RNA 또는 DNA), 소분자, 이의 유도체 및 이의 유사체를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
"생물학적 샘플"은 유기체로부터 유래된 임의의 조직, 세포, 체액 또는 기타 물질이다. 본 출원에서 사용되는 "샘플"이라는 용어는 유기체로부터 유래된 임의의 조직, 세포, 체액 또는 기타 물질과 같은 생물학적 샘플을 포함한다.
"특이적으로 결합한다"는, 화합물(예를 들어, 펩타이드)이 분자(예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)를 인식하고 이에 결합하지만 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플의 다른 분자를 실질적으로 인식하고 이에 결합하지 않는, 즉, 화합물이 분자에 대한 선택적인 결합을 나타내는 상태를 지칭한다. 본 출원에서 기재된 "바인더"로는 동족 분자에 대한 특이적 결합을 나타내는 단백질, 폴리펩타이드 또는 이의 단편이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바인더는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저의 제1 결합 도메인, 또는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저의 제2 항원 결합 도메인 등과 같은 항원 결합 도메인을 지칭할 수 있다. 일부 경우에서, 바인더는 세포 상의 수용체에 특이적으로 결합할 수 있으므로 예시적인 인게이저의 한 부분의 특이적 결합을 나타내는 펩타이드 또는 컨쥬게이트된 펩타이드 또는 리간드와 같은 임의의 생체 분자 또는 이의 단편일 수 있다.
"면역 반응"이라는 용어는 T 세포 공동 자극의 조절에 의해 영향을 받는 T 세포 매개성 및/또는 B 세포 매개성 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응으로는 T 세포 반응, 예를 들어, 사이토카인 생산 및 세포 세포독성이 포함된다. 또한, 면역 반응이라는 용어는 T 세포 활성화, 예를 들어, 항체 생산(체액성 반응) 및 사이토카인 반응성 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응을 포함한다.
본래 서열 폴리펩타이드의 "기능성 유도체"는 본래 서열 폴리펩타이드와 공통적인 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능성 유도체"는 상응하는 본래 서열 폴리펩타이드와 공통적인 생물학적 활성을 갖는 한 본래 서열의 단편 및 본래 서열 폴리펩타이드의 유도체 및 이의 단편을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다, "유도체"라는 용어는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체 및 이의 공유적 변형을 모두 포괄한다.
"포식 세포" 및 "식세포"라는 용어는 식세포 작용이 가능한 세포를 지칭하기 위해 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다. 식세포에는 다음 3개의 주요 범주가 있다: 대식세포, 단핵 세포(조직구 및 단핵구); 다형핵 백혈구(호중구); 및 수지상 세포.
"생물학적 샘플"이라는 용어는 유기체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포괄하며, 진단 또는 모니터링 검정에 사용될 수 있다. 이러한 용어는 생물학적 기원의 혈액 및 기타 액체 샘플, 고체 조직 샘플, 예를 들어, 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포 및 이의 자손을 포괄한다. 이러한 용어는 특정 성분에 대한 시약 처리, 가용화 또는 농축과 같이 조달 후 어떤 식으로든 조작된 샘플을 포괄한다. 이러한 용어는 임상 샘플을 포괄하며, 또한 세포 배양물 중의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생체액 및 조직 샘플의 세포를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "항원 제시 세포" 또는 "항원 제시 세포들"이라는 용어 또는 이의 약어 "APC" 또는 "APC"는 항원의 세포내 이입 흡착, 처리 및 제시가 가능한 세포 또는 세포들을 지칭한다. 이러한 용어는 전문 항원 제시 세포, 예를 들어, B 림프구, 단핵구, 수지상 세포(dendritic cell: DC) 및 랑게르한스 세포 뿐만 아니라, 기타 항원 제시 세포, 예를 들어, 각질 형성 세포, 내피 세포, 신경 아교 세포, 섬유 아세포 및 희소 돌기 아교 세포를 포함한다. "항원 제시"라는 용어는 MHC 분자에 결합된 펩타이드 단편으로서 항원을 세포 표면 상에서 표시하는 것을 의미한다. 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포, B 세포, 여포성 수지상 세포 및 수지상 세포를 포함하는 많은 상이한 종류의 세포가 APC로서 기능할 수 있다. APC는 또한 외인성 항원을 처리하고 처리된 항원을 클래스 I MHC 분자에 제시함으로써 펩타이드 항원을 교차 제시할 수 있다. 클래스 I MHC 분자와 함께 인식되는 단백질을 생성하는 항원은 일반적으로 세포 내에서 생산되는 단백질이며, 이러한 항원은 클래스 I MHC 분자로 처리되고 이와 회합된다.
"에피토프"는 항체 또는 TCR의 가변 영역 결합 포켓과 결합 상호 작용을 형성할 수 있는 항원 또는 기타 거대 분자의 일부를 지칭한다. 이러한 용어는 본 출원에서 정의된 바와 같은 항체, 항체 펩타이드 및/또는 항체 유사 분자(T 세포 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않음)에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정 인자를 포함한다. 에피토프 결정 인자는 전형적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 군으로 이루어지며, 일반적으로 특정한 3차원 구조적 특성 뿐만아니라 특정한 전하 특성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 식세포 수용체 융합 단백질(phagocytic receptor fusion protein: PFP)은 식세포 수용체에 융합된, 표적 세포의 항원에 대해 특이적인 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 표적 세포는, 예를 들어, 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 포식 세포는 암 세포의 포식 후 T 세포를 활성화하기 위해 이의 세포 표면에 암 항원을 제시할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "항원"이라는 용어는 면역 반응을 자극할 수 있는 임의의 유기 또는 무기 분자이다. 본 출원에서 사용되는 "항원"이라는 용어는 면역 반응을 자극할 수 있는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산 분자, 탄수화물 분자, 유기 또는 무기 분자(이들에 한정되지 않음)와 같은 임의의 분자로 확장된다.
일부 실시형태에서, 상기 식세포 수용체 융합 단백질은 암 항원 또는 암 세포 상의 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 항체 도메인 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. "항체" 또는 "항체 모이어티"라는 용어는 에피토프를 인식하는 임의의 폴리펩타이드 쇄 함유 분자 구조를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 단클론 항체가 세포 배양에 의해 또는 재조합으로 복제될 수 있고 항원성을 감소시키기 위해 변형될 수 있기 때문에 바람직하지만, 본 발명에서 이용되는 항체는 다클론 항체일 수 있다. 이러한 용어는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgM 및 IgY를 포함하며, 온전한 단일 쇄 항체를 비롯한 온전한 항체 및 이의 항원 결합(Fab) 단편을 포함하는 것으로 여겨진다. 항원 결합 항체 단편으로는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd(VH 및 CH1로 이루어짐), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 단일 쇄 항체, 이황화 연결된 가변 단편(dsFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편이 포함된다. 상기 항체는 임의의 동물 기원으로부터 유래할 수 있다. 단일 쇄 항체를 비롯한 항원 결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합이 또한 포함된다. 항체는, 예를 들어, HLA 관련 폴리펩타이드 또는 HLA-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 단클론, 다클론, 키메라, 사람화 및 사람 단클론 및 다클론 항체일 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 다양한 면역 친화성 기법이, 예를 들어, 막으로부터 단백질 가수분해로 절단된 가용성 HLA-펩타이드 복합체 또는 막 결합된 HLA 관련 폴리펩타이드와 같은 가용성 단백질을 농축하는데 적합하다는 것을 인식할 것이다. 이들은 (1) 가용성 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체가 고정 또는 이동성 기질(예를 들어, 플라스틱 웰 또는 수지, 라텍스 또는 상자성 비드)에 고정되고, (2) 생물학적 샘플 유래의 가용성 단백질을 함유하는 용액이 항체 코팅된 기질을 통과하여 가용성 단백질이 항체에 결합하도록 하는 기법을 포함한다. 항체 및 결합된 가용성 단백질을 갖는 기질은 용액으로부터 분리되고, 임의로, 항체 및 가용성 단백질은, 예를 들어, pH 및/또는 이온 강도 및/또는 항체를 침지하는 용액의 이온 조성을 변화시킴으로써 해리된다. 대안으로, 항체와 가용성 단백질을 배합하고 거대 분자 응집체를 형성하도록 하는 면역 침전 기법이 사용될 수 있다. 상기 거대 분자 응집체는 크기 배제 기법 또는 원심 분리에 의해 용액으로부터 분리될 수 있다.
적응 면역계는 항원으로서 지칭되는 침입 유기체의 분자 구조에 반응한다. 선천 면역계와 달리, 적응 면역계는 병원체에 대해 매우 특이적이다. 적응 면역은 또한 오래 지속되는 방어를 제공할 수 있으며; 예를 들어, 홍역으로부터 회복된 사람은 이제 평생 동안 홍역으로부터 방어된다. 체액성 면역 반응과 세포 매개성 면역 반응을 포함하는 2가지 유형의 적응 면역 반응이 있다. 체액성 면역 반응에서, B 세포에 의해 체액으로 분비된 항체는 병원체 유래 항원에 결합하여 다양한 기전, 예를 들어, 보체 매개성 용해를 통해 병원체의 제거를 초래한다. 세포 매개성 면역 반응에서, 다른 세포를 파괴할 수 있는 T 세포가 활성화된다. 예를 들어, 질병과 관련된 단백질이 세포에 존재하는 경우, 이들은 단백질 가수분해에 의해 세포 내의 펩타이드로 단편화된다. 그 다음, 특정 세포 단백질은 자신을 이러한 방식으로 형성된 항원 또는 펩타이드에 부착시키고 자신을 세포의 표면으로 이동시켜 신체의 T 세포에서 분자 방어 기전에 제시된다. 세포독성 T 세포는 이러한 항원을 인식하고 항원을 보유하고 있는 세포를 사멸한다.
"주요 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC)", "MHC 분자" 또는 "MHC 단백질"이라는 용어는 식세포 또는 항원 제시 세포 내부에서 단백질 항원의 단백질 가수분해 절단으로 생성된 항원 펩타이드에 결합할 수 있고 T 림프구에 대한 제시 및 T 림프구 활성화를 위한 단백질을 지칭한다. 이러한 항원성 펩타이드는 T 세포 에피토프를 나타낸다. 사람 MHC는 또한 HLA 복합체로도 호칭된다. 따라서, "사람 백혈구 항원(human leukocyte antigen: HLA) 시스템", "HLA 분자" 또는 "HLA 단백질"이라는 용어는 사람에서 MHC 단백질을 인코딩하는 유전자 복합체를 지칭한다. MHC라는 용어는 쥐과 동물 종에서 "H-2" 복합체로서 지칭된다. 당해 분야의 통상의 기술자들은 "주요 조직 적합성 복합체(MHC)", "MHC 분자", "MHC 단백질" 및 "사람 백혈구 항원(HLA) 시스템", "HLA 분자", "HLA 단백질"이라는 용어가 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다는 것을 인식할 것이다.
HLA 단백질은 전형적으로 HLA 클래스 I과 HLA 클래스 II로서 지칭되는 2가지 유형으로 분류된다. 2개의 HLA 클래스의 단백질 구조는 매우 유사하지만, 상이한 기능을 가질 수 있다. 클래스 I HLA 단백질은 대부분의 종양 세포를 비롯한 신체의 거의 모든 세포의 표면 상에 존재한다. 클래스 I HLA 단백질은 일반적으로 내인성 단백질로부터 또는 세포 내부에 존재하는 병원체로부터 유래하는 항원을 로딩한 다음, 나이브(naive) 또는 세포독성 T 림프구(cytotoxic T-lymphocyte: CTL)에 제시된다. HLA 클래스 II 단백질은 수지상 세포, B 세포, 단핵구 또는 대식세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)에 존재한다. 이들은, 외부 항원 공급원으로부터, 예를 들어, 세포 외부에서 처리되는 펩타이드를 헬퍼 T 세포에 주로 제시한다. HLA 클래스 I 단백질에 결합된 대부분의 펩타이드는 유기체 자체의 건강한 숙주 세포에서 생산된 세포질 단백질로부터 유래하며, 통상적으로 면역 반응을 자극하지 않는다.
HLA 클래스 II 시스템에서, 단핵구 또는 대식세포와 같은 식세포 및 미성숙 수지상 세포는 식세포 작용에 의해 엔터티(entity)를, 산성 효소가 흡수된 단백질을 많은 상이한 펩타이드로 절단하는 리소좀과 융합하는 파고솜 내로 흡수하지만 - B 세포는 엔도솜으로의 보다 일반적인 엔도사이토시스를 나타낸다. 자가 포식 현상은 HLA 클래스 II 펩타이드의 원천이다. 숙주 게놈에 인코딩된 숙주에 의해 전달되는 HLA 클래스 II 변이체와의 분자 상호 작용에서의 물리 화학적 역학을 통해, 특정 펩타이드는 면역 우성을 나타내며 HLA 클래스 II 분자에 로딩된다. 이들은 세포 표면으로 수송되고 외부화된다. 가장 많이 연구된 서브클래스 II HLA 유전자는 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1이다.
HLA 클래스 II 분자에 의한 펩타이드의 CD4+ 헬퍼 T 세포에 대한 제시는 외래 항원에 대한 면역 반응에 필요하다. 일단 활성화되면, CD4+ T 세포는 B 세포 분화 및 항체 생산 뿐만 아니라 CD8+ T 세포(CTL) 반응을 촉진한다. CD4+ T 세포는, 다른 면역 세포의 분화를 활성화하고 유도하는 사이토카인 및 케모카인을 또한 분비한다. HLA 클래스 II 분자는 클래스 I 펩타이드 결합 홈(groove)보다 더 개방된 펩타이드 결합 홈을 형성하기 위해 상호 작용하는 α 쇄와 β 쇄의 이종 이량체이다. HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩타이드는 홈으로부터 돌출된 N 말단 또는 C 말단 측 상에 플랭킹 잔기를 갖는 9개 아미노산 결합 코어를 갖는 것으로 믿어진다. 이러한 펩타이드는 일반적으로 12~16개 아미노산 길이이며, 종종 결합 레지스터(binding register)의 P1, P4, P6/7 및 P9 위치에 3~4개의 앵커 잔기를 함유한다(문헌 [Rossjohn et al., 2015]).
HLA 대립 유전자는 공동 우성 방식으로 발현되는데, 이는 양쪽 부모로부터 유전된 대립 유전자(변이체)가 동등하게 발현된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 각 사람은 3개의 클래스 I 유전자(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C) 각각의 2개의 대립 유전자를 갖고 있으므로 6개의 상이한 유형의 클래스 II HLA를 발현할 수 있다. 클래스 II HLA 유전자좌에서, 각 사람은 한쌍의 HLA-DP 유전자(α 및 β 쇄를 인코딩하는 DPA1 및 DPB1), HLA-DQ(α 및 β 쇄에 대해 DQA1 및 DQB1), 하나의 유전자 HLA-DRα(DRA1) 및 하나 이상의 유전자 HLA-DRβ(DRB1 및 DRB3, DRB4 또는 DRB5)를 물려받는다. 예를 들어, HLA-DRB1은 거의 400개 이상의 공지된 대립 유전자를 갖는다. 이는 한 이형 접합 개체가 6개 또는 8개(각 부모로부터 3개 이상)의 기능성 클래스 II HLA 대립 유전자를 물려받을 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 HLA 유전자는 고도로 다형성이며, 많은 상이한 대립 유전자는 집단 내의 상이한 개체에 존재한다. HLA 단백질을 인코딩하는 유전자는 가능한 많은 변이를 가지고 있어 각 개인의 면역계가 광범위한 외부 침입자에 반응할 수 있도록 한다. 일부 HLA 유전자는 수백 개의 식별된 버전(대립 유전자)을 가지며, 이의 각각은 특정 번호를 부여받는다. 일부 실시형태에서, 상기 클래스 I HLA 대립 유전자는 HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01(비고전적)이다. 일부 실시형태에서, 클래스 II HLA 대립 유전자는 HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 및 HLA-DRB*07:01이다.
일부 실시형태에서, 상기 포식 세포는 환자 또는 대상체에게 투여된다. 사람 대상체에게 투여된 세포는, 대상체에서 자연적으로 발현되는 매칭 HLA 서브타입을 갖는 대상체에게 면역 적격이어야 한다. 대상체 특이적 HLA 대립 유전자 또는 대상체의 HLA 유전자형은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 상기 방법은 다형 유전자의 대립 유전자 변이체를 포함하는 유전자 참조 세트에 대한 서열 분석 데이터 세트로부터 추출된 판독물(read)의 정렬을 생성하는 단계, 상기 정렬에서 각각의 대립 유전자 변이체에 대한 제1 사후 확률 또는 사후 확률 유도된 점수를 결정하는 단계, 제1 대립 유전자 변이체로서 최대 제1 사후 확률 또는 사후 확률 유도된 점수를 갖는 상기 대립 유전자 변이체를 식별하는 단계, 상기 제1 대립 유전자 변이체 및 하나 이상의 다른 대립 유전자 변이체와 정렬된 하나 이상의 중첩 판독물을 식별하는 단계, 가중 인자를 사용하여 상기 하나 이상의 다른 대립 유전자 변이체에 대한 제2 사후 확률 또는 사후 확률 유도된 점수를 결정하는 단계, 최대 제2 사후 확률 또는 사후 확률 유도된 점수를 갖는 상기 대립 유전자 변이체를 선택하여 제2 대립 유전자 변이체를 식별하는 단계, 및 상기 제1 및 제2 대립 유전자 변이체의 산출물을 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 대립 유전자 변이체가 상기 다형 유전자에 대한 유전자 유형을 정의하는, 다형 유전자 유형을 결정하는 것을 포함한다.본 출원에서 사용되는 "아미노산"이라는 표현은 천연 및 합성 아미노산 모두 및 D 및 L 아미노산 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 합성 아미노산은, 염 및 아미노산 유도체, 예를 들어, 아미드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 화학적으로 변형된 아미노산을 또한 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드 내에 존재하는 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 또는 생물학적 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 순환 반감기를 변경할 수 있는 다른 화학기에 의한 치환에 의해 변형될 수 있다.
"펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 본 출원에서 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합, 예를 들어, 동배체에 의해 공유적으로 연결된 일련의 적어도 2개의 아미노산을 기술하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 어떠한 제한도 없다. "올리고머" 및 "올리고펩타이드"라는 용어는 또한 본 출원에서 기재된 바와 같은 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 또한, 폴리펩타이드라는 용어는 펩타이드의 단편, 유사체 및 유도체로 확장되며, 여기서, 상기 단편, 유사체 또는 유도체는 상기 단편, 유도체 또는 유사체가 유래되는 펩타이드와 동일한 생물학적 기능성 활성을 보유한다.
본 출원에서 사용되는 폴리펩타이드는 당 단백질, 지질 단백질, 세포성 단백질 또는 막 단백질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 "단백질"일 수 있다. 폴리펩타이드는 단백질의 하나 이상의 서브유닛을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 재조합 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 스페이서, 링커 또는 펩타이드 절단 서열에 의해 분리될 수 있는 단일 아미노산 쇄에 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드일 수 있다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 도메인은 정의된 기능을 갖는 단백질의 구조적 부분이며, 폴리펩타이드 또는 단백질은 하나 이상의 모듈을 포함할 수 있다. 모듈은 특정 기능을 갖는 도메인 또는 도메인의 일부 또는 단백질의 일부이다. 모듈은 구조적 실시형태에 의해 명명된 단백질의 구조적 모듈일 수 있다. 모이어티는 특정 구조를 가지거나 특정 기능을 수행하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 핵산의 일부이다. 예를 들어, 신호 전달 모이어티는 단일 신호 전달 과정, 예를 들어, 인산화에 관여하는 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 재조합 핵산의 보다 큰 구조 내의 특정 단위(또는 핵산의 경우, 이에 의해 인코딩되는 단백질 부분)이다. 본 출원에서 사용되는 모듈, 도메인 및 모이어티는 특정 구조적 또는 기능적 배향이 본문에서 달리 정의되지 않는다면 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 모티프는 생체 분자의 구조적 엔터티이다. 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드에서의 신호 전달 모티프는 인산화될 수 있거나 탈인산화될 수 있거나 또 다른 신호 전달 분자의 결합 부위의 역할을 할 수 있는 아미노산을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드 상의 아미노산의 스트레치를 의미한다. 유사하게, 핵산의 경우, 예를 들어, TNF mRNA는 아연-핑거 결합 단백질 36 계열 구성원과 같은 mRNA 탈안정화 효소가 결합하는 3'UTR에서 보존적 모티프 UUAUUUAUU를 갖는다.
본 출원에서 사용되는 "프로-항체"라는 용어는 항체, scFv, VHH, 단일 도메인 항체, 또는 불활성 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있으며; 여기서, 항원 결합 능력은, 상기 프로-항체를 이의 활성 형태로 전환시키는 활성 단계가 수행될 때까지, 절단 가능한 항원 도메인 결합 폴리펩타이드에 결합함으로써 차단되거나 불활성화되도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 상기 활성 단계는 항원 결합 도메인을 차단하는 엔터티의 프로테아제 절단을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "재조합 핵산 분자"라는 용어는 재조합 DNA 분자 또는 재조합 RNA 분자를 지칭한다. 재조합 핵산 분자는 자연적으로 함께 부착되지 않고 상이한 원래 공급원 유래의 결합된 핵산 분자를 포함하는 임의의 핵산 분자이다. 재조합 핵산은 실험실에서 합성될 수 있다. 재조합 핵산은 효소적 제한 분해, 연결 및 DNA 클로닝과 같은 DNA의 효소적 변형을 사용함으로써 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 재조합 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 재조합 DNA는 시험관 내에서 전사되어 전령 RNA(mRNA)를 생성할 수 있으며, 재조합 mRNA는 단리되고 정제되어 세포를 형질 감염시키는데 사용될 수 있다. 재조합 핵산은 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 적합한 조건하의 재조합 핵산은 생 세포에 도입될 수 있으며, 생 세포 내부에서 발현될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 핵산의 "발현"은 일반적으로 핵산의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 핵산 발현의 산물은 일반적으로 단백질이지만, 또한 mRNA일 수 있다. 재조합 핵산을 도입한 세포에서 재조합 핵산에 의해 인코딩된 mRNA의 검출은 핵산이 세포에서 "발현"된다는 긍정적인 증거로서 간주된다.
핵산을 세포 내로 삽입 또는 도입하는 과정은 형질 전환, 형질 감염 또는 형질 도입을 통해 이루어질 수 있다. 형질 전환은 세균 세포에 의한 외래 핵산의 흡수 과정이다. 이러한 과정은 플라스미드 DNA의 증식, 단백질 생산 및 기타 적용에 적합하다. 형질 전환은 환경으로부터 세포외 DNA를 흡수하는 적격 세균 세포 내에 재조합 플라스미드 DNA를 도입한다. 일부 세균 종은 특정 환경 조건하에 자연적으로 적격이지만, 적격은 실험실 환경에서 인위적으로 유도된다. 형질 감염은 DNA, RNA 또는 항체와 같은 작은 분자를 진핵 세포 내에 강제로 도입하는 것이다. 생명을 혼란스럽게 하기 위해, '형질 감염'은 또한 박테리오파지를 세균 세포 내에 도입하는 것을 지칭한다. '형질 도입'은 주로 재조합 바이러스 벡터 입자를 표적 세포에 도입하는 것을 기술하는데 사용되며, '감염'은 야생형 바이러스에 의한 사람 또는 동물의 자연 감염을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 세포들 사이에 핵산을 전달할 수 있는 임의의 유전자 작제물, 예를 들어, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 의미한다. 벡터는 복제, 발현, 재조합, 삽입 또는 통합 중 하나 이상을 수행할 수 있지만, 이들 능력을 각각 보유할 필요는 없다. 플라스미드는 "벡터"라는 용어에 포괄되는 속의 종이다. 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 복제 및/또는 유지에 필요한 복제 원점 및 기타 엔터티를 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 작동적으로 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 출원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드"의 형태로 존재하며, 이는 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않은 원형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭하며 전형적으로 안정하거나 일시적인 발현 또는 인코딩된 DNA를 위한 엔터티를 포함한다. 본 출원에서 개시된 바와 같은 방법에 사용될 수 있는 다른 발현 벡터는 플라스미드, 에피솜, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 이러한 벡터는 숙주 게놈 내에 통합되거나 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 동등한 기능을 제공하는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 자기 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈 내에 통합될 수 있는 벡터가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 이들이 연결되는 핵산의 자율 복제 및/또는 발현을 가능하게 하는 것들이다.
융합 단백질과 관련하여 사용되는 "스페이서" 또는 "링커"라는 용어는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 연결하는 펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 스페이서의 구성 아미노산은 분자의 폴딩, 순 전하 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 본 개시 내용의 실시형태에서 사용하기에 적합한 링커는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지 있으며, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커 또는 펩타이드 링커를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 링커는 일부 실시형태에서 각 항원성 펩타이드가 적절하게 폴딩되는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 2개의 항원성 펩타이드를 분리하는데 사용된다. 예시적인 펩타이드 링커 서열은 가요성의 확장된 입체 형태를 채택하며, 질서 정연한 2차 구조를 발달시키는 경향을 나타내지 않는다. 가요성 단백질 영역 내의 일반적인 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. Gly, Asn 및 Ser을 포함하는 아미노산 서열의 거의 모든 순열은 링커 서열에 대한 상기 기준을 충족할 것으로 예상된다. Thr 및 Ala와 같은 다른 거의 중성 아미노산도 또한 링커 서열에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 본 출원에서 기재된 것과 같은 하나 이상의 기능적 특성을 갖는다. 예를 들어, 상기 펩타이드 링커는 결합 도메인과 같은 2개 이상의 기능성 도메인을 연결한다. 추가로, 상기 펩타이드 링커는 상기 링커가 수용체 또는 리간드 결합 단백질과 같은 세포의 세포외 부분과 접촉할 때 특이적 신호 유도 물질일 수 있다.
"면역 정제(immunopurification: IP)"(또는 면역 친화성 정제 또는 면역 침전)라는 용어는 당해 분야에 널리 공지된 공정이며, 샘플로부터 목적하는 항원을 단리하기 위해 널리 사용된다. 일반적으로, 상기 공정은 목적하는 항원을 함유하는 샘플을 고체상에 공유적으로 부착된 항원에 대한 항체를 포함하는 친화성 매트릭스와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 샘플 중의 항원은 면역 화학 결합을 통해 친화성 매트릭스에 결합된다. 그 다음, 상기 친화성 매트릭스는 임의의 미결합 종을 제거하기 위해 세척된다. 상기 항원은 친화성 매트릭스와 접촉하는 용액의 화학적 조성을 변경하여 친화성 매트릭스로부터 제거된다. 상기 면역 정제는 친화성 매트릭스를 함유하는 컬럼 상에서 수행될 수 있으며, 이 경우에는 상기 용액이 용출액이다. 대안으로, 상기 면역 정제는 회분식 공정일 수 있으며, 이 경우에는 상기 친화성 매트릭스가 상기 용액 중에서 현탁액으로서 유지된다. 상기 공정에서 중요한 단계는 매트릭스로부터 항원을 제거하는 것이다. 이는 일반적으로, 예를 들어, 무기 염의 첨가에 의해, 친화성 매트릭스와 접촉하는 용액의 이온 강도를 증가시켜 달성된다. pH의 변경은 또한 항원과 친화성 매트릭스 사이의 면역 화학적 결합을 해리하는데 효과적일 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "결정하는", "평가하는", "검정하는", "측정하는", "검출하는"이라는 용어들 및 이들의 문법적 등가물은 정량적 및 정성적 결정을 모두 지칭하며, 이와 같이, "결정하는"이라는 용어는 본 출원에서 "검정하는", "측정하는" 등과 상호 교환적으로 사용된다. 정량적 측정이 의도되는 경우, 분석물의 "양을 결정하는"이라는 문구가 사용된다. 정성적 및/또는 정량적 측정이 의도되는 경우, 분석물의 "수준을 결정하는" 또는 분석물을 "검출하는"이라는 문구가 사용된다.
"단편"은 참조 단백질 또는 핵산과 실질적으로 동일한 단백질 또는 핵산의 일부이다. 일부 실시형태에서, 상기 일부는 본 출원에서 기재된 기준 단백질 또는 핵산의 생물학적 활성 중 적어도 50%, 75% 또는 80% 또는 90%, 95% 또는 심지어 99%를 유지한다.
"단리된", "정제된", "생물학적으로 순수한"이라는 용어들 및 이들의 문법적 등가물은 본래의 상태에서 발견되는 것과 같이 통상적으로 함께 제공되는 성분이 다양한 정도로 없는 물질을 나타낸다. "단리된"은 원래 공급원 또는 주위와의 분리 정도를 나타낸다. "정제하다"는 단리보다 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은, 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치거나 다른 불리한 결과를 초래하지 않도록 다른 물질이 충분히 없다. 즉, 본 개시 내용의 핵산 또는 펩타이드는, 재조합 DNA 기법으로 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질 및 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학 물질이 실질적으로 없는 경우, 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석적 화학 기법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기 영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성한다는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화를 겪을 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 개별적으로 정제될 수 있는 상이한 분리된 단백질을 생성할 수 있다.
"신생물" 및 "암"이라는 용어들은 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 아폽토시스, 또는 둘 다에 기인하거나 이를 초래하는 임의의 질병을 지칭한다. 교모세포종은 신생물 또는 암의 하나의 비제한적인 예이다. 암", "종양" 또는 "과다 증식성 장애"라는 용어는, 제어되지 않는 증식, 불멸, 전이 잠재성, 급속 성장 및 증식 속도 및 특정한 특징적인 형태학적 특징과 같은 암 유발 세포를 대표하는 특징을 보유하는 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양의 형태로 존재하지만, 이러한 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수도 있거나, 백혈병 세포와 같은 비종양 형성 암 세포일 수 있다.
"백신"이라는 용어는 질병(예를 들어, 신생물/종양/감염체/자가 면역 질환)의 예방 및/또는 치료를 위한 면역을 생성하기 위한 조성물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 출원에서 사용되는 백신은 재조합 핵산 또는 재조합 핵산을 포함하고 이를 발현하는 세포를 포함하는 약제이며, 백신 접종에 의해 특정 방어 및 방어 물질을 생성하기 위해 사람 또는 동물에서 사용되도록 의도된다. "백신 조성물"은 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 양태는 포식 세포 기반 백신을 제조하는데 있어서 기술의 사용에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 사람을 비롯한 동물에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에서 승인되거나 승인될 수 있거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재되는 것을 지칭한다. "약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제"는 제제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 제제의 치료학적 양을 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 무독성인 부형제, 담체 또는 희석제를 지칭한다. 본 출원에서 인용되는 풀링된 질병 특이적 항원의 "약제학적으로 허용되는 염"은 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 사람 또는동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 것으로 당해 분야에서 일반적으로 고려되는 산 또는 염기 염일 수 있다. 이러한 염으로는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 및 유기산 염 뿐만 아니라, 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염이 포함된다. 구체적인 약제학적 염으로는 염산, 인산, 브롬화수소산, 말산, 글리콜산, 푸마르산, 황산, 설팜산, 설파닐산, 포름산, 톨루엔 설폰산, 메탄 설폰산, 벤젠 설폰산, 에탄 디설폰산, 2-하이드록시에틸설폰산, 질산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 스테아르산, 살리실산, 글루탐산, 아스코르브산, 파모산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 프로피온산, 하이드록시말레산, 하이드록시요오드산, 페닐아세트산, 알칸산, 예를 들어, 아세트산, HOOC-(CH2)n-COOH(여기서, n은 0~4임) 등과 같은 산의 염이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 유사하게, 약제학적으로 허용되는 양이온으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418(1985)]에 열거된 것들을 비롯하여, 풀링된 질병 특이적 항원에 대한 추가의 약제학적으로 허용되는 염이 본 출원에서 제공된다는 것을 본 개시 내용 및 당해 분야의 지식으로부터 인식할 것이다.
본 개시 내용의 방법에 유용한 핵산 분자로는 본 개시 내용의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩하는 임의의 핵산 분자가 포함된다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 실질적인 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 하이브리드화할 수 있다. "하이브리드화하다"는 핵산 분자가 다양한 엄격도 조건하에 쌍을 이루어 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열들 또는 이의 일부들 사이에 이중 가닥 분자를 형성할 때를 지칭한다. 예를 들어, 엄격한 염 농도는 일반적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산 삼나트륨 미만, 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산 삼나트륨 미만, 또는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산 삼나트륨 미만일 수 있다. 낮은 엄격도 하이브리드화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재하에 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격도 하이브리드화는 적어도 약 35% 포름아미드 또는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재하에 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 30℃, 적어도 약 37℃ 또는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 수 있다. 하이브리드화 시간, 계면 활성제(detergent), 예를 들어, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 농도 및 담체 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가의 파라미터는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이러한 다양한 조건들을 결합하여 달성된다. 예시적인 실시형태에서, 하이브리드화는 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 삼나트륨 및 1% SDS 중에 30℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 하이브리드화는 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산 삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100μg/ml 변성 연어 정자 DNA(ssDNA) 중에 37℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 하이브리드화는 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산 삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 μg/ml ssDNA 중에 42℃에서 일어날 수 있다. 이러한 조건들에 대한 유용한 변형은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 용이하게 명백할 것이다. 대부분의 적용의 경우, 하이브리드화 이후의 세척 단계도 또한 엄격성이 달라질 수 있다. 세척 엄격도 조건은 염분 농도와 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기한 바와 같이, 세척 엄격도는 염 농도를 감소시키거나 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에 대한 엄격한 세척 농도는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산 삼나트륨 미만, 또는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산 삼나트륨 미만일 수 있다. 세척 단계에 대한 엄격한 온도 조건은 적어도 약 25℃, 적어도 약 42℃ 또는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산 삼나트륨 및 0.1% SDS 중에 25℃에서 일어날 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산 삼나트륨 및 0.1% SDS 중에 42℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산 삼나트륨 및 0.1% SDS 중에 68℃에서 일어날 수 있다. 이러한 조건들에 대한 추가의 변형은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 용이하게 명백할 것이다. 하이브리드화 기술은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Benton and Davis, Science 196:180, 1977]; [Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001]; [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York] 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.
"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본 출원에서 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본 출원에서 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 50%의 동일성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 서열은 비교에 사용된 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 80% 또는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일할 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 유전학 컴퓨터 군의 서열 분석 소프트웨어 패키지, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 기타 변형에 상동성 정도를 할당하여 동일하거나 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 기들 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신. 동일성 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근 방식에서, BLAST 프로그램이 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e-3과 e-m° 사이의 확률 점수와 함께 사용될 수 있다. "참조"는 비교의 표준이다.
"대상체" 또는 "환자"라는 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. 단지 예로서, 대상체로는 사람 또는 비-사람 포유 동물, 예를 들어, 영장류, 쥐과 동물, 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 포유 동물이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"치료하다", "치료된", "치료하는", "치료" 등과 같은 용어는 장애 및/또는 이와 관련된 증상(예를 들어, 신생물 또는 종양 또는 감염체 또는 자가 면역 질환)을 감소, 예방 또는 개선하는 것을 지칭하는 것으로 여겨진다. "치료하는"은 질병(예를 들어, 암 또는 감염체에 의한 감염 또는 자가 면역 질환)의 발병 또는 의심되는 발병 후 대상체에 대한 요법의 투여를 지칭할 수 있다. "치료"는 질병과 관련된 임의의 증상 또는 기타 부작용 및/또는 요법과 관련된 부작용의 발생 또는 재발의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 지칭하는 "경감"의 개념을 포함한다. "치료하는"이라는 용어는 또한 환자에서 질병 또는 장애의 중증도를 감소시키는 것, 예를 들어, 질병에 걸린 환자의 수명을 연장하거나 생존 가능성을 연장하거나 이의 재발을 지연시키는 것, 예를 들어, 질병으로부터 고통을 받은 환자에서 관해의 기간을 연장하는 것을 지칭하는 "관리"의 개념을 포괄한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태의 치료가 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지 않는 것으로 이해된다.
본 출원에서 사용되는 "예방하다", "예방하는", "예방"이라는 용어 및 이들의 문법적 등가물은, 제제 또는 화합물의 투여가 시작될 당시에 이러한 증상을 발병하지 않은 대상체에서 질병 또는 병태와 관련된 증상의 발병을 회피하거나 지연시키는 것을 의미한다.
"치료학적 효과"라는 용어는 장애(예를 들어, 신생물, 종양, 감염체에 의한 감염 또는 자가 면역 질환) 또는 이의 관련 병리의 하나 이상의 증상의 어느 정도 완화를 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 "치료학적 유효량"은, 세포 또는 대상체에 대한 단일 또는 다중 용량 투여시, 이러한 치료의 부재하에 예상되는 것을 넘어 이러한 장애를 갖는 환자의 생존 가능성을 연장하거나, 상기 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소, 예방 또는 지연시키는 등에 있어서 효과적인 제제의 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"은 치료학적 효과를 달성하는데 필요한 양을 정량화하기 위한 것이다. 당해 분야의 통상의 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 약학 조성물의 "치료학적 유효량"(예를 들어, ED50)을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "친화성 분자"라는 용어는 친화성 수용체 펩타이드에 대해 화학적 특이성으로 결합하는 분자 또는 리간드를 지칭한다. 화학적 특이성은 특정 리간드에 결합하는 단백질 결합 부위의 능력이다. 단백질이 결합할 수 있는 리간드가 적을수록, 이의 특이성은 높아진다. 특이성은 주어진 단백질과 리간드 사이의 결합 강도를 기술한다. 이러한 관계는 단백질-리간드 시스템에 대한 결합 상태와 미결합 상태 사이의 균형을 특성화하는, 해리 상수(KD)의 세포 표면 성분에 대해 특이적인 제1 scFv에 의해 기술될 수 있다.
본 명세서에서 "일부 실시형태", "한 실시형태", "하나의 실시형태" 또는 "다른 실시형태"에 대한 언급은, 실시형태와 관련하여 기재된 특징, 구조 또는 특성이 본 개시 내용의 적어도 일부 실시형태에는 포함되지만 반드시 모든 실시형태에 포함되는 것이 아니다는 것을 의미한다.
"골수 세포"라는 용어는 신체의 혈액, 골수, 기타 조혈 또는 기타 비-조혈 구획에서 발견되는 정상 또는 신생물 세포를 지칭한다. 특히, "골수 세포"라는 용어는 본 출원에서 다형핵 호중구, 호산구, 호염구 및 비만 세포 뿐만 아니라 단핵구/대식세포 계통 및 다양한 수지상 세포 계통을 포함하는 골수 유래 세포 계통을 의미하기 위해 사용된다. 골수 세포는 림프구 세포(예를 들어, NK 림프구, B 림프구 및 T 림프구)로 분화할 수 없다. 이러한 용어는 분화의 모든 단계에서 골수 계통의 세포를 지칭하므로, 조혈 모세포, 즉, 골수 세포 계통에 속하지만 분화의 초기 단계에 있는 조혈 세포를 포함한다. 적절한 성장 인자로 자극될 때, 조혈 모세포는 분열하여 모세포 분화 단계보다 더 분화되는 많은 수의 세포를 생성한다. 예는 특히 골수아구이다. 단핵구 또는 대식세포가 본 명세서 전반에 걸쳐 예시되지만, 본 출원에서 기재된 조성물 및 방법은 수지상 세포와 같은 골수 세포 계통의 세포에 적용 가능하다. 경미한 최적화 및 변경이 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 세포 대 세포 기반으로 구상되고 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
모세포 보다 더 분화되었지만 아직 완전히 분화되지 않은 세포는 접두사 "프로"가 추가되며, 또한 "골수 세포"의 정의에 해당하는 것으로 의도된다. 예는 전골수구이다.
"골수 세포"라는 용어는 또한 골수성 선조 세포, 즉, 골수 단구성 선조 세포, 전적아구 또는 미성숙 거핵아구와 같은 세포에서 분화할 수 있는, 예를 들어, 골수에서의 세포 계통을 포함한다. 골수성 선조 세포는 림프계 세포를 생성할 수 없다.
"골수 세포"라는 용어는 림프 조혈 줄기 세포를 포함하지 않는다. 림프 조혈 줄기 세포는 자기 재생과 2개의 주요 전구체 성분인 골수 계열 및 림프구 계열로의 분화 모두가 가능한 세포로 정의된다. 이러한 줄기 세포는 전능성(totipotent)이라고 한다. 덜 일반적이지만 여전히 여러 계통으로 분화할 수 있는 줄기 세포는 만능성이라고 호칭된다.
"단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저"라는 용어는 단핵구 또는 대식세포 뿐만 아니라 모든 골수 세포에 적용되므로, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저는 "골수 세포 특이적 인게이저"와 유사하다.
식세포는 면역계의 자연적인 감시자이며 신체의 제1 방어선을 형성한다. 이는 병원체, 병원체 감염된 세포, 이물질 또는 암성 세포를 포식하여 체내로부터 제거한다. 대부분의 잠재적 병원체는, 예를 들어, 뚜렷한 감염을 일으킬 수 있기 전에 이러한 시스템에 의해 신속하게 중화된다. 이는 클라트린 코팅된 오목 시스템(pit system)을 통한 수용체 매개성 흡수, 음세포 작용, 특히, 막 파동 운동(ruffling) 및 식세포 작용의 결과로서의 거대 음세포 작용을 포함할 수 있다. 그러므로, 식세포는 다양한 비-자기(및 자기) 요소에 의해 활성화될 수 있으며, "표적"의 인식에서 일정 수준의 가소성을 나타낸다. 대부분의 식세포는 패턴 인식 분자인 스캐빈저 수용체를 자신의 표면 상에 나타내며, 광범위한 외래 입자 뿐만 아니라 체내의 사망 세포, 잔해물 및 원치 않는 입자에 결합할 수 있다.
단핵구 및 대식세포와 같은 골수 세포는 또한 감염, 염증 또는 종양의 부위에서 가장 풍부한 세포 유형 중 하나이다. 그러므로, 단핵구 또는 대식세포는 매력적인 세포 요법 비히클이 될 수 있다. 종양 또는 감염 세포와 같은 질병 세포의 식세포 사멸을 증진시키기 위해 단핵구 또는 대식세포 또는 포식 세포를 변형시키는 기전이 본 출원에서 제공된다.
단핵구/대식세포가 본 개시 내용에서 상세하게 기재되어 있지만, 상기 조성물 및 방법은 임의의 식세포 유형에 사용하기 위해 적용 가능하거나, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 적용 가능한 경우, 약간의 최적화로 호중구 및 수지상 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 골수 세포 유형에 적용 가능하다. 마찬가지로, 암이 본 개시 내용에서 골수 세포 요법에 대한 적응증으로서 상세하게 기재되어 있지만, 상기 조성물 및 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 필요하다고 간주되는 약간의 변형으로 감염 및 자가 면역 병태에 적용 가능하게 만들어질 수 있다.
원형질막 외피 내 미립자(>0.5 □m)의 세포 흡수로 정의되는 식세포 작용은 유체상 거대 음세포 및 수용체 경로에 의한 가용성 리간드의 세포내 이입과 밀접하게 관련되며 부분적으로 중복된다. 변이체는 아폽토시스 세포의 흡수(에페로사이토시스(efferocytosis)로서도 또한 공지됨) 및 감염 및 염증으로 인해 발생하는 괴사성 세포의 흡수(네크롭토시스 및 파이롭토시스)와 관련된다. 외인성 입자의 흡수(이형 포식)는 손상된 세포내 소기관의 격리 및 리소좀 처리의 내인성 과정인 자가 포식과 공통점을 갖는다. 흡수 기전은 입자 크기, 수용체-리간드 상호 작용의 다중도 및 세포 골격의 관여에 따라 달라진다. 일단 내재화되면, 파고솜 액포는 1차 리소좀, 또는 소포체(endoplasmic reticulum: ER) 및 골지 복합체의 생성물과 선택적으로 융합하여 2차 포식리소좀을 형성할 수 있다. 이러한 경로는 세포내 이입 및 분비 소포, 대식세포, DC, 파골 세포 및 호산구와의 융합 및 분열을 겪는다는 점에서 역동적이다. 항미생물 식세포 작용은 질병 유발 미생물을 제거 및 분해하고, 사이토카인 및 케모카인 분비를 통해 전염증 신호를 유도하고, 효과적인 염증 반응을 시작하기 위해 면역 세포를 동원한다. 이러한 유형의 식세포 작용은 종종 "염증성 식세포 작용"(또는 "면역원성 식세포 작용")이라고 합니다. 그러나, 특정한 지속적 감염과 같은 일부 경우에서, 항염증 반응이 미생물 흡수에 뒤따를 수 있다. 항미생물 식세포 작용은 일반적으로 미성숙 수지상 세포(DC) 및 단핵구 또는 대식세포와 같은 골수 계통의 전문 식세포 및 조직 상주 면역 세포에 의해 수행된다. 대조적으로, 손상된 자기 유래 아폽토시스 세포 또는 세포 잔해물의 식세포 작용(예를 들어, 에페로사이토시스)은 전형적으로 비염증성("비면역원성"으로도 또한 지칭됨) 과정이다. 수십억 개의 손상되고 죽어가고 원치 않는 세포가 매일 아폽토시스를 겪는다. 원치 않는 세포는, 예를 들어, 발달 동안 생성된 과잉 세포, 노화 세포, 감염 세포(세포내 세균 또는 바이러스), 형질 전환 또는 악성 세포, 및 세포독성제에 의해 비가역적으로 손상된 세포를 포함한다.
골수는 선택된 조직 상주 단핵구 또는 대식세포를 대체하고 염증 및 감염 동안 조직 골수 집단을 증폭시키는 순환 호중구 및 단핵구의 공급원이다. 식세포 작용 후, 새로 동원된 단핵구 및 조직 대식세포는 원형질막에서 기존 인지질 및 아라키도네이트로부터 생성물을 생성하고 호흡 폭발의 활성화 또는 유도성 산화 질소 합성의 유도에 의해 생성된 라디칼을 방출함으로써 생성물을 분비하고; 상기한 바와 같이 생성된 저분자량 생성물(아라키도네이트 대사 산물, 슈퍼옥사이드 음이온, 산화 질소)의 합성에 의해 달성되는 것 이외에도, 단핵구 또는 대식세포에서 식세포 작용에 의해 유도된 분비는 주로 RNA의 새로운 합성과 pH 변화에 의해 달성되어 점진적인 산성화를 초래한다. 높은 식세포성 대식세포는 MARCO+ SignR1+인 것으로 보이며, 외부 변연대에서 발견되며, 캡슐화된 세균를 신속하게 제거한다. 유사한 CD169+ F4/80- 대식세포는 림프절의 피막하동을 형성하며 바이러스 감염과 연루되어 있다. 간의 쿠퍼 세포를 비롯한 내피 대식세포는 혈액 및 림프절로부터 미생물 및 항원 리간드를 제거하여 점막 면역과 비슷하지만 구별되는 시뉴소이드(sinusoidal) 면역 기능을 제공한다는 것에 유의하였다. 모든 조직 대식세포가 여전히 대표적인 대식세포 마커를 발현하지만 항시적으로 식세포인 것은 아니다. 설치류 비장의 변연대에서, F4/80이 결핍된 금속 친화성 대식세포는 CD169, 시알산 결합 면역글로불린(Ig) 유사 렉틴 1(SIGLEC1[시알로어드헤신])을 강력하게 발현하지만, 불충분한 식세포성이다. 비전문 식세포는 상피 세포 및 섬유 아세포를 포함한다. 섬유 아세포는 부착 분자 ICAM 및 비트로넥틴 수용체를 통해 CD11b-CD18 이외의 인테그린을 사용하여 아폽토시스 잔해물을 제거하는 "노동자 계급(working-class) 식세포"이다. 성상 교세포는 또한 효율적으로 분해되지는 않더라도 아폽토시스 사체를 포식하는 것으로 보고되었다. 식세포 작용과 관련된 원형질막 수용체는 옵소닌성, 주로 IgG 항체의 보존적 도메인에 대한 FcR(활성화 또는 억제) 및 보체 수용체, 예를 들어, 보체 활성화의 고전적(IgM 또는 IgG) 또는 대체 렉틴 경로에 의해 침착된 iC3b에 대한 CR3일 수 있다. CR3는, 아마도 대식세포 유래 보체를 침착시킴으로써, 옵소닌의 부재하에 인식을 또한 매개할 수 있다. 항미생물 식세포 작용은 일반적으로 미성숙 수지상 세포(DC) 및 대식세포와 같은 골수 계통의 전문 식세포 및 조직 상주 면역 세포에 의해 수행된다.
암에서, CCL2, ATP 등을 비롯한 수많은 인자들에 의해 이끌린 단핵구는 종양 미세 환경으로 이동한다. 그러나, 이러한 단핵구들의 대부분은 종양 관련 단핵구 또는 대식세포 및/또는 골수 억제 세포로 분화될 수 있다. 골수 억제 세포 및 종양 관련 단핵구 또는 대식세포와는 대조적으로 종양 세포를 사멸시키는데 강력한 단핵구 또는 대식세포 및 골수 세포를 생성하기 위해, 본 발명의 조성물은 상주 단핵구 또는 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포 작용을 증진시키고 또한 성공적이고 안정적인 면역 반응을 시작하기 위한 수단을 제공한다.
종양 환경에서의 단핵구 또는 대식세포 기능에 대한 조사는 적어도 2개의 신호가 단핵구 또는 대식세포의 활성화에 필요하다는 것을 나타냈다. 제1 신호(신호 1)는 식세포 작용/테더링 수용체를 통해 매개되며, 제2 신호(신호 2)는 염증 유전자의 핵 인자-κB(NF-κB) 매개성 상향 조절을 촉발하는 사이토카인 또는 병원체 관련 분자 패턴(DAMP)과 같은 위험 신호에 의해 매개된다(도 1a). 식세포 작용의 촉발 단독으로는 단핵구 또는 대식세포를 활성화하기에 불충분할 수 있으며, 대식세포를 이용하여 암을 사멸시키는 맥락에서, 암 세포에 결합하여 생성된 식세포 작용 촉발 신호 단독으로는 항종양 반응을 유도하는 것이 불충분하기 때문일 수 있다.
암 세포 또는 종양 세포가 본 출원에서 표적 세포로서 반복적으로 언급되는 반면, 본 출원에서 기재된 개념은, 암 세포의 세포 표면 성분에 대한 결합 도메인이 표적 세포에 대해 특이적인 세포 표면 성분에 대한 결합 도메인으로 적합하게 대체되는 한, 감염 세포 또는 식세포 작용에 의해 제거되어야 하는 특정 질병 세포 유형과 같은 임의의 유형의 표적 세포 적합하다.
본 개시 내용은, 골수 세포가 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 또는 종양 세포에 강한 반응을 시작하도록 촉발하여 골수 세포가 접촉시 표적을 파괴할 뿐만 아니라 다른 면역 세포, 예를 들어, T 림프구, B 림프구 및 NK 세포를 활성화하는 면역 반응을 촉발하도록 하는 효과적인 방법을 다루는 많은 노력을 기반으로 한다. 노력 중 하나의 양태는 제자리 환자에서 치료학적으로 효과적인 골수 세포를 생성하는 것이다. 또 다른 양태에서, 치료학적 골수 세포는 생체외에서 생성되고 이를 필요로 하는 환자에게 도입된다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은, 골수 세포에 결합하고 이를 활성화하여 종양 세포와 같은 표적 세포에 대한 식세포 사멸 및 면역 반응을 촉발할 수 있는 하나 이상의 합성 또는 재조합 생체 분자, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 합성 또는 재조합 생체 분자는 (a) 한편으로는 골수 세포 상의 세포 표면 분자(즉, 및 항원)에, (b) 다른 한편으로는 표적 세포 상의 세포 표면 분자(즉, 및 항원)에 결합함으로써, 효과적으로 적어도 상기 2개의 세포(이펙터와 표적)를 아주 근접하게 하여 어느 한 세포 상의 다른 세포 수용체와 막 성분은 상호 작용할 수 있으므로, 상기 이펙터 골수 세포는 상기 표적 세포의 포식을 촉발할 수 있다. 단순화된 그래픽 표현은 도 1b에 도시되어 있다. 구조적으로, 이러한 분자는 2개의 아암(arm), 예를 들어, 링커(예를 들어, L)에 의해 연결된 제1 결합 도메인(예를 들어, A) 및 제2 결합 도메인(예를 들어, B)을 가질 것이며, 이는 각 세포 표면 분자에 대해 특이적이다(도 1b). 이러한 합성 또는 재조합 생체 분자는 이중 특이적 인게이저 또는 이중 특이적 골수 세포 인게이저 또는 BiME로 호칭될 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 상기 이중 특이적 인게이저는 2개의 항원 결합 도메인("바인더")을 포함한다. 상기 2개의 바인더 중 하나는 이펙터 골수 세포 표면 상의 항원에 결합하도록 설계되고, 다른 하나는 표적 세포 상의 항원에 결합하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 상기 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 바인더는 골수 세포 또는 표적 세포 상의 수용체와 같은 세포 표면 상의 수용체에 결합하는 리간드일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은, 골수 세포에 결합하고 이를 활성화하여 암 세포와 같은 표적 세포에 대한 식세포 사멸 및 면역 반응을 촉발할 수 있는 하나 이상의 합성 또는 재조합 생체 분자, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하며, 상기 합성 또는 재조합 생체 분자는 2개 초과의 바인더를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 치료제가 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는 표적 세포 상의 항원 또는 표면 분자와 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편일 수 있는 제1 결합 도메인(또는 제1 바인더), 및 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편일 수 있는 제2 결합 도메인(또는 제2 바인더)을 포함한다. 하나 이상의 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 제3 결합 도메인을 제공할 수 있는 제1 성분, 예를 들어, 링커 또는 또 다른 생체 활성 펩타이드; 또는 활성 인자 분자 또는 추가의 치료제에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 추가의 치료제를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은, 골수 세포에 결합하고 이를 활성화하여 암 세포와 같은 표적 세포에 대한 식세포 사멸 및 면역 반응을 촉발할 수 있는 하나 이상의 합성 또는 재조합 생체 분자, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 합성 또는 재조합 생체 분자는 2개 초과의 바인더를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 재조합 생체 분자는 각각 표면 분자에 대해 특이적 결합을 나타내는 3개의 바인더를 포함하므로, 상기 재조합 생체 분자는 2개 이상의 세포 상의 3개의 요소에 대한 결합을 나타낼 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 3개의 바인더를 갖는 재조합 생체 분자는 골수 세포 또는 표적 세포 상의 1개 초과의 항원에 결합할 수 있다. 본 출원에서 기재된 바와 같은 3개의 바인더를 갖는 재조합 생체 분자는 삼중 특이적 골수 세포 인게이저(TriME)라고 한다. 일부 실시형태에서, TriME는 3개의 상이한 세포, 예를 들어, 골수 세포, 표적 세포, 예를 들어, 암 세포, 및 제3 세포 또는 표적에 결합하거나 관여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 BiME 또는 TriME는 골수 세포, 또는 상기 골수 세포를 활성화하거나 골수 세포 상의 면역 관용 또는 면역 억제에 관여하고 이를 유도하는 것과 같은 암 세포의 기능을 억제하는 암 세포 상의 1개 초과의 항원 또는 표면 분자에 관여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 다중 특이적 인게이저는 제2 트리거(triger), 즉, 골수 세포에 의한 표적 세포의 식세포 작용을 유도할 뿐만 아니라 면역학적 기억의 연장된 반응 및 생성을 위한 다른 면역 세포를 활성화시키는 면역 반응 또는 염증 반응을 개시하는 제2 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 다중 특이적 인게이저는 키메라 분자이다. 따라서, 치료제를 포함하는 조성물이 본 출원에서 제공되며, 여기서, 상기 치료제는 (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 결합 도메인, (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 결합 도메인, 및 (c) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제3 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 추가의 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바인더는 또한 스캐빈저 수용체 또는 TLR 수용체와 같은 수용체의 활성 인자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바인더는 병원성 표적 상의 병독성 물질의 억제제 또는 차단제, 또는 병원체 세포 또는 종양 세포 상의 면역 억제 인자 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기에서 기재된 바와 같은 기능을 수행할 수 있는 결합 도메인 또는 바인더 또는 인게이저의 임의의 부분은 바인더의 치료학적 요소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 인게이저는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 치료학적 조성물은 하나 이상의 인게이저, 및 하나 이상의 치료제, 예를 들어, 별개의 재조합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 약제학적 제품 또는 소분자를 포함할 수 있다.
본 출원에서 기재된 바와 같은 일부 양태에서, 제2 치료제가 필요할 수 있다. 제2 치료제는 제2 재조합 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 치료제는 종양 매개성 면역 억제 인자를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 치료제는 골수 세포 억제 인자 기능 또는 골수 세포 상의 면역 관용 반응을 회피하는데 필요하다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 치료제는 식세포를 향하는 종양 세포에 의한 항식세포성 "나를 먹지 마라" 신호를 회피하는데 필요하다. 예를 들어, 상기 제2 치료제는 CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다아제, 사이토카인, 전염증 유전자, 프로카스파아제 또는 항암제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 치료제는 포식 세포 매개성 면역 반응에 대한 제2 신호를 제공할 수 있다.
본 출원에서 기재된 방법 및 조성물을 사용하여, 골수 세포는 종양 미세 환경에서의 효과와 관계 없이 면역 반응 주기를 활성화하도록 지시를 받을 수 있다. 포식 세포는 표적 세포를 포식하고 사멸하고 표적에 대한 성공적이고 지속적인 적응성 면역 반응 및 면역학적 기억을 생성하는 면역 반응 후유증을 활성화하도록 지시를 받을 수 있다.
다음 섹션에서, 치료제를 포함하는 조성물이 기재된다.
제1 치료제
하나의 양태에서, 제1 치료제가 기재되며, 여기서, 상기 제1 치료제는 (i) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) 단핵구 또는 대식세포와 같은 골수 세포의 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 상기 제1 치료제는, 적어도 종양 세포와 같은 표적 세포 및 단핵구 또는 대식세포에 결합하고 상기 2가지 세포 유형에 부착하여 상기 단핵구 또는 대식세포에 의한 암 세포의 식세포 작용을 용이하게 할 수 있는 재조합 키메라 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 키메라 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저이다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되며, 여기서, 상기 제1 성분은 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인이다. 추가의 치료제는 펩타이드, 단백질, 컨쥬게이트된 단백질, 항체, 항체의 기능성 유도체, 예를 들어, scFv, 리간드, 리간드에 대한 수용체 또는 이의 기능성 단편, 또는 소분자일 수 있다. 이전 문장의 여러 예에서, 상기 제1 치료제는 제1 성분에 커플링되며, 여기서, 상기 제1 성분은 표적 세포 또는 단핵구 또는 대식세포의 세포 표면 성분과 회합할 수 있는 결합 요소이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 추가의 치료제를 포함한다. 본 출원에서 기재된 바와 같은 추가의 치료제는 소분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 펩타이드 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 세포 표면 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 표적 세포 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 항체 또는 항체의 기능성 유도체, 예를 들어, scFv일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 리간드 또는 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 단백질, 컨쥬게이트된 단백질, 리간드에 대한 수용체 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 골수 세포, 예를 들어, 표적 세포에 의해 매개되는 단핵구 또는 대식세포의 억제제이다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 재조합 단백질이다. 본 출원에서 기재된 바와 같은 치료제는 종양 또는 암 세포 및 단핵구 또는 대식세포에 결합하여 상기 단핵구 또는 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포 작용을 촉발하기 위한 제1 신호(신호 1)를 제공할 뿐만 아니라, 상기 단핵구 또는 대식세포에 의한 식세포 사멸을 증진시키기 위한 제2 신호(신호 2)를 제공하는 재조합 단백질이다.
하나의 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 세포외 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 분비 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 (i) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) 단핵구 또는 대식세포의 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제2 항원 결합 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 인코딩하는 재조합 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 (i) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) 골수 세포의 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 발현하는 벡터에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 바인더는 이의 표적 또는 동족체 요소에 대한 이의 결합 특이성에 기초하여 선택된다. 결합 도메인은 표적 항원 또는 동족체 분자에 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편인 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 결합 도메인은 이의 표적에 대해 높은 특이성, 높은 결합 친화도 또는 둘 다를 갖는 도메인이다.
일부 실시형태에서, 이의 표적 또는 동족체 분자에 대한 결합 친화도는 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하 또는 10-12 M 이하이다. 일부 실시형태에서, 상기 결합 도메인은 이의 결합 특이성 또는 결합 친화도 또는 둘 다를 증가시키도록 추가로 변형될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 바인더 영역의 결합 특성을 증진시키기 위해 기존 기술을 사용할 수 있으며, 이러한 변형은 본 개시 내용의 범위 내에서 고려된다.
이중 특이적 및 삼중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저
A. 결합 표적 세포 및 이펙터 세포
표적 세포를 이펙터 세포에 고정시켜 이펙터 세포가 표적 세포를 공격하고 특정 표적 세포를 사멸시키도록 설계된 재조합 이중 특이적 및 삼중 특이적 인게이저가 본 출원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 이펙터 세포는 골수 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 골수 세포는 단핵구 또는 대식세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 세포는 암 세포이다.
암이 본 개시 내용에서 독점적으로 상세하게 기재된 하나의 예시적인 실시형태이지만, 본 출원에서 기재된 방법 및 기술은 신체 내부의 감염 또는 질병 세포를 표적화하는데 유용한 것으로 고려된다.
일부 실시형태에서, 본 개시 내용은 암 면역 요법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 출원에서 제공되는 방법은, 상주하는 사람 단핵구 또는 대식세포가 암 세포를 표적화하고 이를 효율적인 식세포 작용에 의해 제거하는 효율적인 살해 세포로 되도록 유도할 수 있는 도구를 설계하는데 도움을 준다. 일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포는 상기 암 세포에 대해 지속적인 면역학적 반응을 제공한다. 다양한 실시형태가 본 출원에서 기재된다.
키메라 "인게이저"라고 하는 이러한 키메라 단백질에 대한 특정 작제물 및 디자인이 본 출원에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 키메라 인게이저는 2개 이상의 융합된 항체를 포함하며, 각각은 암 세포와 같은 표적 세포 또는 단핵구 또는 대식세포에 대한 특이적 결합 영역을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 2개 이상의 융합된 항체 또는 면역 융합체는 단핵구 또는 대식세포의 세포 표면 성분에 특이적으로 결합하는 이펙터 결합 도메인에 면역글로불린 불변 영역의 힌지-CH2-CH3 도메인 또는 힌지-CH3 도메인에 의해 작동 가능하게 연결된 표적 결합 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 키메라 단백질은 이중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저이다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 인게이저는 제1 치료제를 포함하며, 여기서, 상기 제1 치료제는 (i) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항원 결합 도메인, 및 (ii) 단핵구 또는 대식세포의 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 치료제는 이중 특이적 인게이저이다. 하나의 실시형태에서, 상기 이중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저는 가요성 링커를 갖는 2개의 항체 단일 쇄 가변 영역(scFv)만을 포함하며(Fc 아미노산 분절 불포함), 하나의 scFv는 표적 세포의 세포 표면 성분에 결합하고, 다른 하나는 단핵구 또는 대식세포 표면 상의 수용체에 결합한다. 완전 비변형된 형태의 IgG에서, 가변 경쇄 도메인(VL) 및 가변 중쇄 도메인(VH)은 별개의 폴리펩타이드 쇄이며, 즉, 각각 경쇄 및 중쇄에 위치한다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호 작용, 특히, VL 도메인과 VH 도메인의 상호 작용에 의해, 항체의 에피토프 결합 부위 중 하나가 형성된다. 대조적으로, scFv 작제물에서, 항체의 VL 및 VH 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄에 포함된다. 상기 2개의 도메인은 VL 및 VH 도메인이 기능성 에피토프 결합 부위로 자가 조립될 수 있도록 충분히 긴 가요성 링커에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저는 (a) 표적 세포, 예를 들어, 암 항원의 세포 표면 성분에 결합하는 단일 쇄 가변 단편(scFv), (b) 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 세포 표면 성분에 결합하는 단일 쇄 가변 단편(scFv), (c)(a)와(b)를 작동 가능하게 연결하는 짧은 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 scFv는 이의 C-말단에서 융합된다. 각각의 scFv는 펩타이드 링커에 의해 작동 가능하게 연결된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 scFv는 사람화된다. 사람화 scFv는, CDR이 유래된 모체 면역글로불린의 프레임워크와 비교하여 상이한 종의 면역글로불린의 프레임워크에 존재하는 "상보성 결정 영역"(complementarity determining region: CDR)을 포함한다. 예를 들어, 쥐과 동물 CDR은 "사람화 항체"를 제조하기 위해 사람 항체의 프레임워크 영역에 이식될 수 있다. 2개의 scFv를 포함하는 예시적인 이중 특이적 인게이저의 디자인은 단순화된 하기 식으로 표시될 수 있다:
NH2-[표적 세포 결합 scFv]-COOH - [링커] -COOH- [이펙터 세포 결합 scFv]-NH2 [I]
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 인게이저는 디아바디이다. 상기 이중 특이적 디아바디는 상이한(비동일) 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄 상의 VL 및 VH 도메인으로 작제된다. 또한, VL과 VH를 연결하는 링커는 기능성 에피토프로 재조립하기에 충분하지 않는 12개 아미노산 길이 보다 짧다. 일반적으로, 하나의 폴리펩타이드 쇄 작제물은 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 VL 및 제2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 VH를 포함하고, 또 다른 폴리펩타이드 쇄 작제물은 제2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 VL 및 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 VH를 포함하며; 상기 2개의 폴리펩타이드 쇄는 이중 특이적 디아바디로 자가 조립되도록 허용된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 2개의 쇄들 사이의 결합 특성을 방해하지 않고 이황화 결합 형성을 허용할 수 있는 작제물의 C 말단에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 인게이저는 탠덤-디-scFv이다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 scFv 인게이저를 코딩하는 재조합 핵산 작제물이 제조될 수 있다. 이중 특이적 scFv 인게이저를 발현하기 위한 재조합 핵산 작제물은 (a) 표적 세포 결합 scFv 경쇄의 가변 도메인, 링커, 표적 세포 결합 scFv 중쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열;(b) 링커를 인코딩하는 핵산 서열;(c) 이펙터(단핵구 또는 대식세포) 세포 결합 scFv 경쇄의 가변 도메인, 링커, 이펙터(단핵구 또는 대식세포) 세포 결합 scFv 중쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 인코딩하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적 scFv 인게이저를 발현하기 위한 핵산 작제물은 이중 특이적 scFv 인게이저의 분비를 위한 N-말단 신호 펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 인게이저는 가요성 링커와 작동 가능하게 연결된 2개의 단일 도메인 항체(VHH)를 포함하며, 하나의 VHH는 표적 세포의 세포 표면 성분에 결합하고, 다른 VHH는 단핵구 또는 대식세포 표면 상의 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 키메라 이중 특이적 단핵구 또는 대식세포 인게이저는 (a) 표적 세포, 예를 들어, 암 항원의 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인, (b) 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인, (c)(a)와(b)를 작동 가능하게 연결하는 짧은 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 2개의 단일 도메인 항체를 포함하는 인게이저는 나노바디이다. 2개의 VHH 도메인 포함하는 예시적인 이중 특이적 인게이저의 디자인은 단순화된 하기 식으로 표시될 수 있다:
NH2-[표적 세포 결합 단일 도메인]-COOH - [링커] -COOH- [이펙터 세포 결합 단일 도메인]-NH2 [II]
일부 실시형태에서, 상기(a)와(b)를 작동 가능하게 연결하는 짧은 링커는 추가의 기능을 추가로 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 펩타이드는, 예를 들어, TLR 수용체와 같은 특정 세포 표면 수용체에 결합할 수 있으며, 단핵구 또는 대식세포에서 수용체 매개성 세포 신호 전달 경로를 활성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 단핵구 또는 대식세포에서 적어도 염증 경로에 결합하고 이를 활성화할 수 있거나, 단핵구 또는 대식세포 매개성 식세포 작용 및 표적 세포의 사멸을 강화할 수 있도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 상기 링커 펩타이드는 단핵구 또는 대식세포 기능의 표적 세포 매개성 하향 조절을 차단 또는 억제하는 기능을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, (a) 표적 세포, 예를 들어, 암 항원의 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인, (b) 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인, (c)(a)와(b)를 작동 가능하게 연결하는 짧은 링커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이중 특이적 VHH 인게이저에 대한 핵산 작제물이 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적 scFv 인게이저를 발현하기 위한 핵산 작제물은 이중 특이적 scFv 인게이저의 분비를 위한 N-말단 신호 펩타이드 서열을 포함한다.
당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, VHH 또는 scFv 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 프로모터, 예를 들어, 5' 말단의 CMV, 및 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 하에 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 작제물은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있으며, 예를 들어, IRES는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열에 선행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드들 중 하나를 인코딩하는 핵산 서열은 나머지 발현 서열과는 별개의 프로모터 제어 하에 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 인게이저는 표적 세포의 세포 표면 성분에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 이펙터 세포의 세포 표면 성분에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있다.
삼중 특이적 인게이저인 인게이저의 추가의 변형이 본 출원에서 제공된다. 삼중 특이적 인게이저는 제1 치료제를 포함하며, 여기서, 상기 제1 치료제는 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항원 결합 도메인; 단핵구 또는 대식세포의 제1 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제2 항원 결합 도메인; 및 단핵구 또는 대식세포의 제2 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 제3 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 삼중 특이적 인게이저는 표적 암 세포 상의 세포 표면 성분에 대해 특이적인 제1 scFv, 단핵구 또는 대식세포 상의 세포 표면 성분, 예를 들어, 키메라 식세포 수용체에 대해 특이적인 제2 scFv, 및 단핵구 또는 대식세포 상의 또 다른 세포 표면 성분에 대해 특이적인 제3 scFv를 포함하는 3개의 scFv의 융합 작제물이다. 일부 실시형태에서, 상기 삼중 특이적 인게이저는, 제3 scFv에 결합할 수 있는 단핵구 또는 대식세포 상의 세포 표면 성분이 단핵구 또는 대식세포에 추가의 활성화 신호를 제공하여 식세포 작용 및 표적 세포의 사멸을 촉발하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 scFv는 단핵구 또는 대식세포 상의 또 다른 식세포 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 scFv는 위험 관련 단핵구 또는 대식세포 신호 전달 경로(DAMP)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 scFv는 TLR 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 scFv는, 수용체를 활성화하고 단핵구 또는 대식세포 세포내 신호 전달을 촉발하는 사이토카인 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 scFv는 식세포 작용 억제 신호를 생성하는 것으로 공지된 단핵구 또는 대식세포 수용체에 결합하며, 수용체에 대한 제3 scFv의 결합은 수용체를 차단하여 증진된 식세포 작용을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 scFv는, 하나 이상의 막 관통 도메인과 결합하고 식세포 신호 전달을 증진시키는 수용체에 결합한다. 삼중 특이적 인게이저의 다양한 디자인이 본 출원에서 고려되었으며, 그 중 2개의 scFv를 포함하는 예시적인 삼중 특이적 인게이저는 단순화된 하기 식으로 표시될 수 있다:
Figure pct00001
[III]
또는
Figure pct00002
[IV]
일부 실시형태에서, 상기 삼중 특이적 인게이저의 3개의 결합 도메인 각각은 항체의 항원 결합 도메인, 항체의 기능성 단편, 이의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중 특이적 항체, 디아바디, 또는 이의 기능성 단편 또는 조합을 포함하는 재조합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 상기 삼중 특이적 인게이저의 결합 도메인은 하나 이상의 펩타이드 링커에 의해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 펩타이드 링커는, 예를 들어, TLR 수용체와 같은 특정 세포 표면 수용체에 결합할 수 있으며 단핵구 또는 대식세포에서 수용체 매개성 세포 신호 전달 경로를 활성화할 수 있는 기능성 펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 단핵구 또는 대식세포에서 적어도 염증 경로에 결합하고 이를 활성화할 수 있거나, 단핵구 또는 대식세포 매개성 식세포 작용 및 표적 세포의 사멸을 강화할 수 있도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 상기 링커 펩타이드는 단핵구 또는 대식세포 기능의 표적 세포 매개성 하향 조절을 차단 또는 억제하는 기능을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 삼중 특이적 인게이저를 인코딩하는 핵산 작제물은 (a) 표적 세포, 예를 들어, 암 항원의 세포 표면 성분에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, (b) 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 제1 세포 표면 성분에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, (c) 단핵구 또는 대식세포의 제2 세포 표면 성분, 예를 들어, 제2 치료제를 구성하는 키메라 작제물; 또는 본래의 단핵구 또는 대식세포의 세포 표면 수용체에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 여기서, 각각의 폴리펩타이드는 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 삼중 특이적 인게이저를 인코딩하는 핵산 작제물은 (a) 표적 세포, 예를 들어, 암 항원의 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, (b) 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 대식세포의 제1 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, (c) 단핵구 또는 대식세포의 제2 세포 표면 성분에 결합하는 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적 scFv 인게이저를 발현하기 위한 핵산 작제물은 이중 특이적 scFv 인게이저의 분비를 위한 N-말단 신호 펩타이드 서열을 포함한다. 본 출원에서 고려되는 바와 같이, 당해 분야의 통상의 기술자는 scFv 또는 VHH 결합 서열을 임의의 적합한 표적 영역 결합 요소를 인코딩하는 짧은 펩타이드의 핵산 서열로 교환할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 단시스트론성 작제물에 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 다시스트론성 작제물에 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 짧은 링커 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 2개의 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열 사이에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 각각의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현은 별도의 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시형태에서, 각각의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 단일 프로모터에 의해 구동된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 IRES 서열이 작제물에 도입된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드는 세포 내에서 별도로 발현될 수 있으며, 이는 번역 후 조립될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 세포 외부로 분비될 때 특수 펩타이드 스캐폴드 상에 조립되도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 티미딘 키나아제(TK1), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(HPRT), 수용체 타이로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 뮤신-1, 뮤신-16(MUC16), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 vIII(EGFRvIII), 메소텔린, 사람 상피 세포 성장 인자 수용체 2(HER2), 메소텔린, EBNA-1, LEMD1, 포스파티딜 세린, 암배아 항원(CEA), B 세포 성숙 항원(BCMA), 글리피칸 3(GPC3), 여포 자극 호르몬 수용체, 섬유 아세포 활성화 단백질(FAP), 에리트로포이에틴 생산 간세포 암종 A2(EphA2), EphB2, 자연 살해 군 2D(NKG2D) 리간드, 디시알로강글리오사이드 2(GD2), CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD45, CD56CD79b, CD97, CD117, CD123, CD133, CD138, CD171, CD179a, CD213A2, CD248, CD276, PSCA, CS-1, CLECL1, GD3, PSMA, FLT3, TAG72, EPCAM, IL-1, 인테그린 수용체, PRSS21, VEGFR2, PDGFR-베타, SSEA-4, EGFR, NCAM, 프로스타아제, PAP, ELF2M, GM3, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, IGLL1 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 암 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 다음 돌연변이/암 항원 중 하나 이상일 수 있다: MUC16, CCAT2, CTAG1A, CTAG1B, MAGE A1, MAGEA2, MAGEA3, MAGE A4, MAGEA6, PRAME, PCA3, MAGE C1, MAGEC2, MAGED2, AFP, MAGEA8, MAGE9, MAGEA11, MAGEA12, IL13RA2, PLAC1, SDCCAG8, LSP1, CT45A1, CT45A2, CT45A3, CT45A5, CT45A6, CT45A8, CT45A10, CT47A1, CT47A2, CT47A3, CT47A4, CT47A5, CT47A6, CT47A8, CT47A9, CT47A10, CT47A11, CT47A12, CT47B1, SAGE1 및 CT55.
일부 실시형태에서, 암 세포 상의 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CCR4, CD8, CD30, CD45 및 CD56으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 항원은 난소암 항원 또는 T 림프종 항원이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 다음 돌연변이/암 항원 중 하나 이상일 수 있으며, 여기서, 상기 암은 교모세포종이다: IDH1, ATRX, PRL3 또는 ETBR.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 다음 돌연변이/암 항원 중 하나 이상일 수 있으며, 여기서, 상기 암은 난소암이다: CA125, 베타-hCG, 비뇨 생식선 자극 호르몬 단편, AFP, CEA, SCC, 인히빈 또는 엑스트라디올.
일부 실시형태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 CD5일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 HER2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 EGFR 변이체 III일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 암 세포에 대한 암 항원은 CD19일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 항원은 인테그린 수용체이다.
일부 실시형태에서, 상기 항원은 α1, α2, αIIb, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αV, αX, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7 및 β8로 이루어진 군으로부터 선택된 인테그린 수용체이다. 일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 인테그린 β2 아과 αMβ2(CD11b/CD18, Mac-1, CR3, Mo-1), αLβ2(CD11a/CD18, LFA-1), αXβ2(CD11c/CD18) 및 αDβ2(CD11d/CD18)의 구성원으로부터의 단핵구 또는 대식세포 수용체의 세포외 도메인에 결합한다.
암 세포 상의 세포 표면 분자(예를 들어, 세포 표면 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 표적 세포 바인더(예를 들어, 인게이저)가 본 출원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 바인더는 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 바인더는 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 세포 상의 항원은 CD5이다. 상기 바인더는 중쇄(HC) 서열 및 경쇄(LC) 서열을 포함한다. CD5에 대해 특이적인 scFv(항-CD5 scFv)는 가변 중쇄(VH) 도메인에 상응하는 아미노산 서열 및 가변 경쇄(VL) 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD5 바인더인 제1 결합 도메인은 링커 펩타이드에 의해 연결된 서열번호 27의 서열 및 서열번호 28의 서열을 포함하는 scFv일 수 있다. 예시적인 항-CD5 HC 및 LC 가변 도메인이 본 출원의 표 1a에서 제공된다.
(표 1a)
Figure pct00003
하나의 실시형태에서, 상기 표적 세포 바인더는 CD5에 결합하는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 세포 바인더는 CD5 결합 VHH이다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 세포 바인더 또는 제1 결합 도메인은 서열번호 27의 서열을 포함하는 CD5 결합 VHH일 수 있다.
일부 실시형태에서, 예시적인 표적 세포 바인더(예를 들어, 인게이저)는 HER2 양성 암 세포 상의 세포 표면 항원 HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 HER2 인게이저이다. 일부 실시형태에서, 상기 바인더는 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 바인더는 HER2에 특이적으로 결합하는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 바인더는 중쇄(HC) 서열 및 경쇄(LC) 서열을 포함한다. HER2에 대해 특이적인 scFv(항-HER2 scFv)는 가변 중쇄(VH) 도메인에 상응하는 아미노산 서열 및 가변 경쇄(VL) 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 링커 펩타이드에 의해 연결된 서열번호 29의 서열 및 서열번호 30의 서열을 포함하는 HER2 바인더를 갖는 scFv일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 세포 바인더 또는 제1 결합 도메인은 서열번호 29의 서열을 포함하는 HER2 결합 VHH일 수 있다.
예시적인 항-HER2 HC 및 LC 가변 도메인이 본 출원의 표 1b에서 제공된다.
(표 1b)
Figure pct00004
일부 실시형태에서, 상기 종양 관련 대식세포는 주로 M2 표현형을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 사람 M2 대식세포는 세포 표면 마커 CD14+CD163+CD206+ CD80- 표현형에 근접한 것으로 식별될 수 있다. 따라서, 골수 세포, 예를 들어, 종양과 관련된 단핵구 또는 대식세포에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 CD14, CD163 및 CD206 세포 표면 분자 중 하나 이상에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다.
전형적으로, M2 유사 종양 관련 대식세포(tumor associated macrophage: TAM) 집단은 반응성 질소 중간체의 발현이 결핍되고, 항원을 덜 효율적으로 제시하고, 살종양 활성을 거의 나타내지 않으며, 신생 혈관 유발 인자, 메탈로프로테이나아제 및 카텝신을 생산한다. 매트릭스 메탈로프로테이나아제, 예를 들어, MMP2는 TAM에서 용이하게 발현된다. 대식세포의 고전적 활성화는 MMP-1, -3, -7, -10, -12, -14 및 -25를 상향 조절하며, TIMP-3(메탈로프로테이나아제-3의 조직 억제제) 수준을 감소시킨다. 세균성 지질 다당류, IL-1 및 TNFα는 MMP-25 및 TIMP-3에 대한 효과를 제외하고는 IFN-감마 보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 대체 활성화는 MMP-2, -8 및 -19를 감소시키지만, MMP-11, -12, -25 및 TIMP-3 정상 상태 mRNA 수준을 증가시킨다. 고전적 활성화 동안 MMP의 상향 조절은 미토겐 활성화 단백질 키나아제, 포스포이노시타이드-3-키나아제 및 κB 키나아제-2의 억제제에 의존한다. 그러므로, 상기 표적 단핵구 또는 대식세포 집단에 따라, 인게이저는 메탈로프로테이나제가 상기 단핵구 또는 대식세포 인게이저에 대한 결합 모이어티일 수 있도록 설계될 수 있다. MMP2는 용이하게 발현되는 TAM 마커 중 하나이며, 종양 특이적 골수 세포 인게이저는 MMP2 결합 도메인을 포함한다.
저산소증 또는 저산소증에 이어 생성된 사이토카인은 대식세포를 유인하여 후속적으로 저산소증 유발 인자 2-알파(HIF-2α)를 상향 조절한다. 따라서, 종양 관련 대식세포에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저 상의 결합 도메인은 이러한 세포에서 상향 조절되는 HIF-2α에 결합할 수 있다.
단핵구/대식세포 표면 마커로는 LPS 공동 수용체(CD14), HLA-DR(MHC 클래스 II), CD312, CD115, Fcγ 수용체 FcγRIII(CD16)이 포함된다. 서브세트 특이적 마커로는 M2 대식세포에 의해 발현된 2개의 스캐빈저 수용체인 CD163 및 CD204, M2 대식세포에 의해 발현된 갈락토스형 C형 렉틴인 CD301이 포함된다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 표 2a의 단백질 중 어느 하나의 세포외 도메인으로부터 선택된, 식세포 수용체의 세포외 도메인에 결합한다.
(표 2a)
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 표 2b의 단백질 중 어느 하나의 세포외 도메인으로부터 선택된, PFP의 세포외 도메인에 결합한다.
표 2b는 단핵구, 대식세포 및 DC의 예시적인 표면 마커 및 표현형 특성을 제공한다.
(표 2b)
Figure pct00007
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 골수 세포 수용체, 예를 들어, 단핵구 수용체, 대식세포 수용체의 세포외 도메인에 결합하며, 예를 들어, 상기 세포외 도메인으로부터 선택된 수용체는 Ig 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 대식세포 수용체의 세포외 도메인, 예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA(CD16), FcγRIIIB, FcRn, FcRL5 결합 도메인에 결합한다. 본 출원에서 언급된 CD16 수용체는 CD16A 수용체 또는 CD16B 수용체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 FcR의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 FcR-알파, FcR-베타, FcR-엡실론 또는 FcR-감마의 세포외 도메인으로부터 선택된, 대식세포 수용체의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 FcαR(FCAR)의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 FcR-베타의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 FcεR(FCER1A)의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 FcγR(FDGR1A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A, FCGR3B) 수용체를 포함하는 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 렉틴, 덱틴 1, 만노오스 수용체(CD206), 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L) 및 CD169 수용체로부터 선택된 단핵구 또는 대식세포의 식세포 수용체의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 TREM 단백질의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 TREM 단백질의 세포외 도메인은 TREM 1 단백질 세포외 도메인이다. 일부 실시형태에서, 상기 TREM 단백질의 세포외 도메인은 TREM 2 단백질 세포외 도메인이다. 일부 실시형태에서, 상기 TREM 단백질의 세포외 도메인은 TREM 3 단백질 세포외 도메인이다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 렉틴, 덱틴 1, 만노오스 수용체(CD206), 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L) 및 CD169 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 단핵구 또는 대식세포 수용체의 세포외 도메인에 결합한다.
일부 실시형태에서, 바인더 또는 인게이저의 임의의 부분은 항체 또는 이의 단편 이외의 다른 분자일 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 또는 이펙터 골수 세포와 같은 세포의 표면 분자에 결합하는 바인더는 수용체에 대한 리간드일 수 있으며, 여기서, 상기 세포 표면 분자는 리간드에 대해 특이적인 수용체이다. 일부 실시형태에서, 리간드는 키메라 단백질 또는 융합 단백질, 또는 수용체의 자연 발생 리간드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 인게이저 재조합 단백질 중 하나의 바인더는 리간드일 수 있으며, 또 다른 바인더는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
일부 실시형태에서, 인게이저 분자는 하나 이상의 링커 또는 스페이서를 포함할 수 있다. 링커 또는 스페이서는 2~50개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 3~30개 아미노산 스페이서이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 4~20개 또는 5~10개 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 스페이서는 비반응성 아미노산 모이어티, 예를 들어, 일련의 글리신 또는 세린 또는 알라닌 잔기로 제조될 수 있다. 예시적인 링커는 아미노산 서열 GSGS(서열번호 153) 또는 SGGG(서열번호 154) 또는 SGGGGSG(서열번호 155)를 포함할 수 있다. 예시적인 링커는 아미노산 서열 SSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 114)를 포함할 수 있다. 링커는 scFv의 VH 및 VL 도메인을 연결할 수 있다. 링커는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저의 바인더 도메인들을 연결할 수 있다. 상기 링커는 일반적으로 효과적인 결합 부위를 연결하는 구조 요소의 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 가요성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 강성일 수 있다. 상기 링커의 길이는 디자인의 필요에 따라 그리고 반대쪽 말단에서 바인더를 간격을 두는데 최적이거나 필요한 길이로 조정된다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 2개의 도메인을 연결하는 것 이외에 다른 고유한 기능을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다. 하기에서 논의되는 예시적인 펩타이드는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 또는 다중 특이적 인게이저의 디자인의 일부일 수 있으며, 링커의 일부일 수 있거나 아닐 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는, 예를 들어, M2 대식세포와 같은 종양 관련 대식세포를 특이적으로 표적화하는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 M2 특이적 펩타이드는 아미노산 서열 YEQDPWGVKWWY(서열번호 116)를 갖는 M2-pep이다.
일부 실시형태에서, M2 특이적 펩타이드는 서열 HLSWLPDVVYAW(이하, HLS pep)(서열번호 117)를 포함할 수 있다.
상기에서 기재된 M2-pep 또는 HLS pep와 같은 펩타이드는 이중 특이적 인게이저 또는 삼중 특이적 인게이저의 일부, 예를 들어, 2개의 결합 도메인들 사이의 링커 또는 링커의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인게이저의 제1 및 제2 결합 도메인은 M2-pep 또는 HLS pep에 커플링되는 반면, 상기 M2-pep 또는 HLS pep는 인게이저를 종양 관련 대식세포에 추가로 표적화하고, 인게이저를 종양 관련 대식세포에 테더링하는 것을 돕는다.
일부 실시형태에서, 예시적인 인게이저는 링커에 의해 연결된 CD5 결합 결합 도메인과 CD16 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예시적인 인게이저는 TLR4 펩타이드와 같은 TLR 활성화 펩타이드를 포함한다.
B. 차폐된 항원 결합 도메인을 갖는 인게이저
하나 이상의 프로-항체를 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저를 포함하는 치료제를 위한 조성물이 본 출원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 프로-항체는 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체의 불활성 형태이며, 이의 항원 결합 도메인은 항원과의 상호 작용이 차단되거나 "차폐"되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 프로-항체는, 프로테아제 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 항원 결합 도메인과 회합된 채로 남아 있고 항원 결합 도메인이 이의 동족체 항원에 결합하는 것을 "차폐"하는 기질 펩타이드 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 적절한 조건하에, 상기 기질 펩타이드는 절단되어 마스크를 해제하고 항원 결합 도메인에서 항원 결합을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체는 프로-항체인 하나 이상의 scfv를 포함하며, 즉, 상기 scFv의 항원 결합 도메인은 절단 가능한 차단제로 차폐된다. 일부 실시형태에서, 상기 차단제는 기질 펩타이드 및 프로테아제 절단 가능한 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체는 VHH 프로-항체를 포함하며, 여기서, VHH 항체의 VL 도메인 또는 VH 도메인 또는 둘 다는 절단 가능한 차단제로 차폐된다. 일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체는 하나 이상의 항원 결합 도메인이 절단 가능한 링커에 의해 항체에 연결된 기질 펩타이드 또는 컨쥬게이트와의 회합에 의해 차폐되는 나노바디를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 치료제가 이의 표적 작용 부위에 도달할 때 절단되도록 설계된다. 예를 들어, 암 치료제에 대한 프로-항체는, 프로테아제 절단 가능한 링커를 절단하는 프로테아제가 종양 미세 환경에서 풍부하고 비종양 조직에서 상대적으로 없거나 무시할 수 있는 프로테아제 절단 가능한 링커를 함유하도록 설계될 수 있으며, 치료제는 전신으로 투여되어 치료제가 종양 미세 환경에 도달할 때 프로테아제에 의해 활성화된다. 일부 실시형태에서, 항체 작용을 질병 부위에만 향하도록 하기 위해 프로테아제 활성화된 프로-항체를 포함하는 치료제가 개발된다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 아미노산 서열 GPLGVR(서열번호 118)을 갖는 매트릭스 메탈로프로테아제-2(MMP2) 절단 가능한 펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 아미노산 서열 YEQDPWGVKWWY(서열번호 116) 또는 아미노산 서열 HLSWLPDVVYAW(서열번호 117)를 갖는 M2 특이적 펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 저산소증 유도 단백질 매개성 절단 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 비천연 합성 펩타이드이며, 프로테아제 절단 가능한 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 부위는 외인성으로 투여되는 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 부위는 암 표적화 약물과 회합된 프로테아제에 의해 절단될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 돌연변이된 펩타이드이며, 여기서, 상기 돌연변이된 펩타이드는 상응하는 비-돌연변이된 펩타이드에서 발생하지 않는 프로테아제 절단 가능한 부위를 함유한다.
일부 실시형태에서, 본 출원에서 개시된 본 프로그램의 목적은 면역 요법에 사용하기 위한 치료제를 제조하는 것이다.
C. 골수 세포의 증진된 식세포 활성 및 면역 반응을 촉진하는 도메인을 갖는 인게이저
종양 미세 환경(tumor microenvironment: TME)은 면역 억제 환경을 구성한다. IL-10, 글루코코르티코이드 호르몬, 아폽토시스 세포 및 면역 복합체의 영향은 선천성 면역 세포 기능을 방해할 수 있다. 식세포를 비롯한 면역 세포는 면역 관용 표현형으로 정리된다. 대식세포에서, 일반적으로 M2 표현형으로 공지된 이러한 표현형은, 대식세포가 강력하고 병원체를 사멸시킬 수 있는 M1 표현형과 구별된다. 예를 들어, LPS 또는 IFN-감마에 노출된 대식세포는 M1 표현형으로 분극화될 수 있는 반면, IL-4 또는 IL-13에 노출된 대식세포는 M2 표현형으로 분극화될 것이다. LPS 또는 IFN-감마는 Trif 및 MyD88 경로를 유도하는 대식세포 표면의 톨 유사 수용체 4(Toll-like receptor 4: TLR4)와 상호 작용하여 전사 인자 IRF3, AP-1 및 NFKB의 활성화를 유도하므로, 전염증성 M1 대식세포 반응에 필요한 TNF-□ 유전자, 인터페론 유전자, CXCL10, NOS2, IL-12 등을 활성화시킬 수 있다. 유사하게, IL-4 및 IL-13은 IL-4R에 결합하여 항염증 반응(M2 반응)과 관련된 유전자인 CCL17, ARG1, IRF4, IL-10, SOCS3 등의 발현을 조절하는 Jak/Stat6 경로를 활성화시킨다. CD14, CD80, D206의 발현 및 CD163의 낮은 발현은 M1 표현형에 대한 대식세포 분극화의 지표이다.
일부 실시형태에서, 상기 인게이저는 식세포 수용체와 같은 수용체의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 특정 부위에서 단핵구 또는 대식세포의 식세포 수용체와의 결합은 수용체의 세포내 도메인에 의해 매개되는 세포내 신호 전달을 증진시켜 수용체를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 인게이저의 결합 도메인은 식세포 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 결합 도메인은 리간드에 결합한 다음, 식세포 수용체에 결합한다.
일부 식세포 수용체는 다른 수용체보다 식세포 작용을 활성화하는데 보다 강력하며, 표적 세포의 신속한 식세포 작용을 유도할 수 있다. 강력한 식세포 수용체를 식별하는 것이 필요하다. 대부분의 대식세포 스캐빈저는 이물질의 비특이적 항체 비의존적 인식에서 자기와 비자기를 구별하는데 사용될 수 있는 광범위한 결합 특이성을 갖는다. I 및 II형 클래스 A 스캐빈저 수용체(SR-AI1 및 SR-AII)는 작은 NH2-말단 세포내 도메인, 및 짧은 스페이서 도메인, α-나선 코일형 코일 도메인 및 삼중 나선 콜라겐성 도메인을 함유하는 세포외 부분을 갖는 삼량체 막 당 단백질이다. I형 수용체는 시스테인 풍부한 COOH-말단(SRCR) 도메인을 추가로 함유한다. 이러한 수용체들은 신체 전체에 걸쳐 다양한 조직의 대식세포에 존재하며, 특이하게도 광범위한 리간드 결합 특이성을 나타낸다. 이들은 변형된 LDL과 같은 화학적으로 변형된 단백질을 비롯하여 다양한 다가 음이온에 결합하며, 이들은 죽종 형성 동안 콜레스테롤 침착에 연루되어 있다. 이들은 또한 대식세포 관련 숙주 방어 및 염증 병태에서 세포 부착 과정에 역할을 할 수 있다.
표 2a 및 표 2b는 다양한 골수 세포와 관련된 수용체 또는 표면 항원의 비-광범위한 목록을 예시하며, 여기서, 상기 세포는 고도의 식세포성에서 면역 관용성까지의 범위의 다양한 특성을 갖는다. 대식세포 내에서도, 일부 수용체는 활성 식세포 M1 표현형과 관련되는 반면, 다른 수용체는 식세포 반응을 약화시킨 항염증 M2 표현형과 관련된다. M1 수용체 관여에 의한 M1 관련 수용체의 활성화는 M2에서 M1 표현형으로 대식세포 유형의 특징적인 이동을 생성할 수 있다.
식세포 작용을 활성화하는 대식세포 수용체는 하나 이상의 면역 수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif: ITAM) 모티프들을 갖는 도메인을 포함하는 세포내 식세포 작용 신호 전달 도메인을 포함한다. ITAM은 T 세포 수용체, 면역글로불린(Ig) 및 FcR과 같은 면역계의 여러 수용체의 세포질 꼬리에 존재하는 보존적 서열이다. 이들은 정의된 간격으로 분리된 YXXL/I 모티프(Y= 타이로신, L= 라이신 및 I= 이소류신) 쌍으로 이루어진 보존적 아미노산 서열 모티프(YXXL/I-X6-8-YXXL/I)를 갖는다. 또한, 대부분의 ITAM은 제1 ITAM 타이로신 대비 +2 위치에 음으로 하전된 아미노산(D/E)을 포함한다. ITAM 내 잔기의 인산화는 식세포 작용을 활성화하는 여러 신호 분자를 동원한다. ITAM 모티프는 또한 세포내 어댑터 단백질인 12 kDa의 DNAX 활성화 단백질(DAP12)에 존재한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포내 영역의 식세포 신호 전달 도메인은 PI3 키나아제(PI3K) 동원 도메인(PI3K 결합 도메인으로도 또한 호칭됨)을 포함할 수 있다. CD19, CD28, CSFR 또는 PDGFR 수용체는 결합 도메인에 대한 PI3 키나아제 동원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 CD19, CD28, CSFR 또는 PDGFR 수용체 중 임의의 하나 이상과 같은 수용체에 결합한다. 이러한 수용체 관여는 Akt 매개성 신호 전달 캐스케이드 및 식세포 작용 활성화를 초래한다. PI3K-Akt 신호 전달 경로는 식세포 작용, 염증 반응 조절, 소포 수송 및 세포 골격 재구성을 비롯한 기타 활동에 중요하다. PI3 키나아제 동원 도메인은, 인산화될 수 있는 타이로신 잔기를 갖고 결국 PI3Kp85의 Src 상동성 도메인(SH2 도메인)에 의해 인식될 수 있는 원형질막 단백질의 세포내 도메인이다. p85의 SH2 도메인은 수용체의 세포질 도메인 상의 인산화된 타이로신을 인식한다. 이는 p110의 알로스테릭 활성화 및 플레크스트린 상동성 도메인을 통한 Akt 효소에 의해 인식되는 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트(PIP3)와 항시적 활성 3'-포스포이노시타이드 의존적 키나아제 1(PDK1)의 생성을 유발한다. Akt와 PIP3의 상호 작용은 각각 PDK1 및 릭터(rictor)-mTOR 복합체에 의해 Akt 입체 형태의 변화 및 Thr308 및 Ser473 잔기의 인산화를 유발한다. 이러한 2개의 잔기들의 인산화는 Akt의 활성화를 유발하여 결국 다른 기질 중에서도 글리코겐 신타아제 키나아제-3(glycogen synthase kinase-3: GSK-3) 효소를 인산화한다. GSK-3은 2가지 이소형인 GSK-3α와 GSK-3β를 가지며, 이들 모두는 항시적으로 활성이다. 상기 이소형은 구조적으로 관련되어 있지만 기능적으로 중복되지 않는다. GSK-3의 불활성화는 조절 N-말단 도메인에 위치한 GSK-3α의 Ser21 잔기 또는 GSK-3β의 Ser9 잔기가 Akt 및 다른 키나아제에 의해 인산화될 때 관찰된다. 인산화에 의한 GSK-3의 억제는 염증 조절 및 식세포 작용 과정에 중요하다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 DAP12 활성화에 관여함으로써 프로-식세포 신호 전달을 활성화할 수 있는 수용체 또는 이의 일부에 결합하는 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 단핵구 또는 대식세포 또는 포식 세포 상의 수용체의 기의 클러스터링을 촉진하고 식세포 작용을 강화하는 수용체 또는 이의 일부에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체의 클러스터링은 세포내 신호 전달 경로를 활성화시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 Fc□R1(CD89)에 대한 결합 도메인을 포함한다. Fc□R1 수용체 관여 또는 교차 결합은 항원 매개성 세포독성을 활성화하고 단핵구 또는 대식세포 상의 식세포 작용을 활성화한다. Fc□R1은 대식세포 뿐만 아니라 호중구 및 호산구와 같은 일부 다른 세포에서 항시적으로 발현된다. 이는 인게이저가 종양 세포와 같은 표적 세포, CD206과 같은 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대해 특이적인 결합 도메인, 및 CD89에 대한 결합 도메인 상의 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함할 때, 삼중 특이적 인게이저에서 특히 유리하다. 인게이저 분자 디자인의 길이와 가요성을 고려해 볼 때, 상기 CD206 및 Fc□R1(CD89) 결합 도메인은 하나 이상의 식세포 작용 특이적 수용체와 교차 결합하고 표적 세포와 교차 결합함으로써 복수 활성화 신호에 관여하고 이를 제공할 수 있다. Fc□R1 활성화는 단핵구 또는 대식세포를 M2 표현형에서 살해 M1 표현형으로 재지시하므로, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저에 Fc□R1 결합 도메인을 갖는 것은 종양 세포독성에 대한 종양 관련 대식세포의 용도를 변경하는 강력한 도구가 될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 및 삼중 특이적 인게이저는 단핵구 또는 대식세포의 스캐빈저 수용체에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 현재 8가지 클래스(클래스 A~H)의 스캐빈저 수용체가 있다. 일부 경우에서, 복수의 명칭이 동일한 수용체에 할당되었다(예를 들어, MSR1, SR-AI, CD204 및 SCARA1). 또한, 다른 기준에 따라 명명되었으며 일반적인 스캐빈저 수용체 명명법에는 포함되지 않은 스캐빈저 수용체 활성을 나타내는 단백질이 있다. 일부 예로는 RAGE(SR-E1), LRP1, LRP2, ASGP, CD163, SR-PSOX 및 CXCL16이 포함된다. 일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 렉틴, 덱틴 1, 만노오스 수용체(CD206), 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L) 및 CD169 수용체로부터 선택된, 스캐빈저 수용체에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 결합 도메인들은 상기 결합 도메인은 10-5 내지 10-12 M 이하, 또는 10-7 내지 10-12 M 이하, 또는 10-8 내지 10-12 M의 해리 상수(KD)(즉, 105 내지 1012 M 이상, 또는 107 내지 1012 M 이상, 또는 108 내지 1012 M의 결합 상수(KA))를 갖는 이들의 각각의 리간드에 결합한다.
일부 실시형태에서, 스캐빈저 수용체 SRA1에 결합하는 인게이저의 예시적인 결합 도메인은 하기 아미노산 서열 또는 이의 일부, 또는 하기 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 가변 영역을 포함한다: EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRAVSTYAMGWFRQAPGKEREFVAAMISSLSSKSYADTVKGRFTISRDYAKNTVYXQMNSLKPEDTADYYCAADLLPYSSSRSLPMGYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 1).
스캐빈저 수용체 SRA1에 결합하는 인게이저의 예시적인 결합 도메인은 서열번호 2~7 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 일부, 또는 상기 서열들 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 결합 도메인을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRAVSTYAMGWFRQAPGKEREFVAAMISSLSSKSYADSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAADLLPYSSTRSLPMGYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 2).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSFSLYDMGWFSQAPGKEREFVAAINWSGGSTAYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAKPAKYHFGSGYRDFAEYPYWGQGTQVTVSS(서열번호 3).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAMAWFRHAPGKDREFVAAVSQSGLLTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCAAXSRFPLVVPVAYENWGQGTQVTVSS(서열번호 4); 여기서, X는 임의의 자연 발생 아미노산일 수 있다.
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAMAWFRHAPGKDREFVAAVSQSGLLTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYDCAADSRFPLVVPVAYENWGQGTQVTVSS(서열번호 5).
EVQLVESGGGLVQVGGSLRLSCAASGISIRTHAMGWYRQAPGKQRELVATITSVTSGGSLNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKLLGFDYRGQGTQVTVSS(서열번호 6).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIGRFVAMGWYRQAPGKQRELVATITSITSGGRTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVVPYVNDYWGQGTQVTVSS(서열번호 7).
일부 실시형태에서, 스캐빈저 수용체 RAGE에 결합하는 인게이저의 예시적인 결합 도메인은 서열번호 8~15 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 일부, 또는 상기 서열들 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 결합 도메인을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCIASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYCCATENLASSGSAYSDDRYNACGQGTQVTVSS(서열번호 8).
EVQLVESGGEVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDRAIGWFRQAPGKEREGVACSANNDNRAFYEDSVKGRFAVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATRCAAGRVNLYYGMDYWGKGTLVTVSS(서열번호 9).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGNYAIGWFRQAPGKEREGVSCVDRDGGSTYYLDSVTGRFTTSRDDAENTVYLQMNSLIPDDTAVYYCATRLYGCSGYGRDYADWGQGTQVTVSS(서열번호 10).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRTFSTDAFGWFRQAPGKEREFVSAMRWNGSSSYYADLVKGRFTISRDNAKNTVYLLMNSLKPEDTAVYYCTAGKRYGYYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 11).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYSMGWFRQAPGKEREFVATISWSGALTHYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASDSDYGNKYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 12).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTVSDMTMGWFRQAPGKERVFVAAISNSGLSTYYQDSVKGRFTISRDTANNTVALQMNSLKPEDTAVYFCAARSGWSGQYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 13).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAGISWSGDSTLYADSVKGRFTTSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTANYYCAEKQGADWAPYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 14).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASELTFSLYRMGWFRQAPGKEREFVSAMSTSGAGTYYADSVKGRFTISRDNPKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGVRFGVYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 15).
일부 실시형태에서, 스캐빈저 수용체 Lox-1에 결합하는 인게이저의 예시적인 결합 도메인은 서열번호 16~26 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 일부, 또는 상기 서열들 중 어느 하나와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 결합 도메인을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSCISRTDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGRTYYSGSYYFGLGSDEYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 16).
스캐빈저 수용체 Lox-1에 결합하는 인게이저의 추가의 예시적인 결합 도메인의 서열은 하기에서 제공된 아미노산 서열을 갖는 가변 영역을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFTINAMAWYRQAPGKQRELVAHLTNSGRTGYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNRLGLHWSWGQGTQVTVSS(서열번호 17).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASIGTFSAYHMGWFRQAPGKERELVAAISWSVSSTYYADSVKGRFTISRDNAKRTVSLQMDSLKPEDTAVYYCAARSGERYDYYKAQYEYWGQGTQVTVSS(서열번호 18).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAYGSFFSIGTMGWYRQPPGNQRELVAVTYGLGSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCYAEIDTDPRSGEWDYWGQGTQVTVSS(서열번호 19).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLPSTSTSSLRTVGWYRQGPGKQRDLVAIMSAGTTRYADSVKGRFTISLDDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYICNGRPVFSNVDYWGQGTQVTVSS(서열번호 20).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRQAPGKEREGVSCVSRDGGSTYYLDSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDAAVYYCAASRYDCSKYLIDYNYRGQGTQVTVSS(서열번호 21).
EVQLVKSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRRFSTSGMGWFRQAPGREREFVXGIXWNSRXTYYAESVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATNYYGSXWSVNSDDYDYWXQGXQVTVSS(서열번호 22).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAQRGRYYYLDRNVEYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 23).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYGIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCAAGRTYYSGSYYFGLGSDEYDYWGQGTQVTVSS(서열번호 24).
EVQLVESGGNLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSVEGSTYYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGTWLDCSGYGSYDMDYWGKGTLVTVSS(서열번호 25).
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYVIGWFRQAPGKEREGVSCISSSEGSTYYAESVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASTWLDFVHGNEYDYRGQGTQVTVSS(서열번호 26).
일부 실시형태에서, 예시적인 SRA-1 결합 CDR1 서열은 다음 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다: TYAMG(서열번호 31), YDMG(서열번호 32), RYAMA(서열번호 33), THAMG(서열번호 34), FVAMG(서열번호 35).
일부 실시형태에서, 예시적인 SRA-1 결합 CDR2 서열은 하기 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다:
AMISSLSSKSYADTVKG (서열번호 36).
AMISSLSSKSYADSVKG (서열번호 37).
AINWSGGSTAYADSVKG (서열번호 38).
AVSQSGLLTFYADSVKG (서열번호 39).
AVSQSGLLTFYADSVKG (서열번호 40).
TITSVTSGGSLNYADSVKG (서열번호 41).
TITSITSGGRTNYADSVKG (서열번호 42).
일부 실시형태에서, 예시적인 SRA-1 결합 CDR3 서열은 하기 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다:
DLLPYSSSRSLPMGYD (서열번호 43).
DLLPYSSTRSLPMGYDY (서열번호 44).
KPAKYHFGSGYRDFAE (서열번호 45).
XSRFPLVVPVAYEN (서열번호 46).
DSRFPLVVPVAYEN (서열번호 47).
LGFDY (서열번호 48).
VPYVNDY (서열번호 49).
여기서, X는 자연 발생 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 예시적인 RAGE 결합 CDR1 서열은 다음 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다: DRAIG(서열번호 50), NYAIG(서열번호 51), TDAFG(서열번호 52), NYSMG(서열번호 53), DMTMG(서열번호 54), NYAMG(서열번호 55) 또는 LYRMG(서열번호 56).
일부 실시형태에서, 예시적인 RAGE 결합 CDR2 서열은 하기 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다:
AISWSGGRTYYADSVKG (서열번호 57).
CSANNDNRAFYEDSVKG (서열번호 58).
CVDRDGGSTYYLDSVTG (서열번호 59).
AMRWNGSSSYYADLVKG (서열번호 60).
TISWSGALTHYTDSVKG (서열번호 61).
AISNSGLSTYYQDSVKG (서열번호 62).
GISWSGDSTLYADSVKG (서열번호 63).
AMSTSGAGTYYADSVKG (서열번호 64).
CISRTDGSTDYADSVKG (서열번호 65).
일부 실시형태에서, 예시적인 RAGE 결합 CDR3 서열은 하기 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다:
ENLASSGSAYSDDRYN (서열번호 66)
RCAAGRVNLYYGMDY (서열번호 67).
RLYGCSGYGRDYAD (서열번호 68).
GKRYGYYDY (서열번호 69).
SDSDYGNKYDY (서열번호 70).
RSGWSGQYDY (서열번호 71).
KQGADWAPYDY (서열번호 72).
GVRFGVYDY (서열번호 73).
일부 실시형태에서, Lox-1 결합 CDR1 서열은 다음 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다: DYAIG(서열번호 74), INAMA(서열번호 75), AYHMG(서열번호 76), IGTMG(서열번호 77), LRTVG(서열번호 78), DYAIG(서열번호 79), TSGMG(서열번호 80), NYAMG(서열번호 81), DYGIG(서열번호 82), DYVIG(서열번호 83).
일부 실시형태에서, Lox-1 결합 CDR2 서열은 하기 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다:
HLTNSGRTGYADSVKG (서열번호 84)
AISWSVSSTYYADSVKG (서열번호 85)
VTYGLGSTNYAESVKG (서열번호 86)
IMSAGTTRYADSVKG (서열번호 87)
CVSRDGGSTYYLDSVKG (서열번호 88)
GIXWNSRXTYYAESVKG (서열번호 89)
AITWSGSSTYYADSVKG (서열번호 90)
CISSSDGSTDYADSVKG (서열번호 91)
CISSVEGSTYYADSVKG (서열번호 92)
CISSSEGSTYYAESVKG (서열번호 93)
여기서, X는 자연 발생 아미노산이다.
일부 실시형태에서, Lox-1 결합 CDR3 서열은 하기 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다:
GRTYYSGSYYFGLGSD (서열번호 94)
LGLHWS (서열번호 95)
RSGERYDYYKAQYEY (서열번호 96)
EIDTDPRSGEWDY (서열번호 97)
RPVFSNVDY (서열번호 98)
SRYDCSKYLIDYNY (서열번호 99)
NYYGSXWSVNSDDYDY (서열번호 100)
AQRGRYYYLDRNVEYD (서열번호 101)
GRTYYSGSYYFGLGSDEYDY (서열번호 102)
GTWLDCSGYGSYDMDY (서열번호 103)
STWLDFVHGNEYDY (서열번호 104)
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는, 예를 들어, MRC1, ItgB5, MERTK, ELMO, BAIL Tyro3, Axl, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, PI3K, FcγR1, FcyR2A, FcyR2B2, FcyR2C, FcyR3A, FcER1, FcαRl, BAFF-R, DAP12, NFAM1 및 CD79b 중 어느 하나의 활성화를 통해 식세포 작용 활성화 신호 또는 전염증 신호를 생성할 수 있는 단백질에 결합하는 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 TREM 단백질의 세포외 도메인에 결합하는 결합 도메인을 포함한다: TREM 1, 2, 3. TREM들은 V형의 단일 세포외 면역글로불린 유사 도메인, 막 관통 도메인 및 짧은 세포질 꼬리의 존재를 비롯하여 일반적인 구조적 특성을 공유한다. 특히, TREM 막 관통 도메인(TM)은 면역 수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 막 관통 어댑터인 12 kDa의 DNAX 활성화 단백질(DAP12)의 양으로 하전된 잔기와 상호 작용하는 음으로 하전된 잔기를 보유한다.
D. 골수 세포의 염증 활성을 촉진하는 도메인을 갖는 인게이저
단핵구 또는 대식세포의 활성화는 염증 활성의 증가를 초래할 수 있다. 활성화된 M1 단핵구 또는 대식세포는, 몇 가지 예를 들면, IFN-감마 생산 뿐만 아니라 전염증성 사이토카인, IL-1b, IL-6, CSF, GMCSF 및 TNF의 생산을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 M1 표현형은 IL-1 신호 전달 캐스케이드 및 인플라마좀 활성화와 관련된 강력한 전염증 반응과 관련되어 있다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 인플라마좀 및 전염증 신호를 촉발하는데 필요한 신호를 생성하는 도메인을 포함할 수 있다. 톨 유사 수용체인 TLR은 인플라마좀 활성화를 유도하는 것으로 공지되어 있다. TLR은 보존적 염증 경로를 유도하여 NF-κB의 활성화에서 정점에 달하고 단백질-1(AP-1)을 활성화시킨다. TLR 리간드로는 고 이동성 군 B1(HMGB1), 열 충격 단백질(HSP60, HSP70), 내독소 및 세포외 매트릭스 성분이 포함된다. 예를 들어, TLR2 및 TLR4는, 리간드 결합에 의해 활성화되고 결국 인플라마좀 활성화와 관련된 전염증 캐스케이드를 활성화하는 세포외 도메인을 포함한다. 세포내 신호 전달 경로는 신호 전달 단백질, 예를 들어, 전염증성 카스파아제를 동원하고 이의 절단 및 활성화를 유도하는 Nod 유사 수용체(Nod-like receptor: NLR)에 의해 매개된다. 이는 ROS의 직접적인 활성화를 유발하고, 종종 파이롭토시스로 공지된 격렬한 세포사를 초래한다. 4개의 인플라마좀 복합체, 즉, NLRP1m, NLRP3, IPAF 및 AIM2가 있다.
일부 실시형태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는, 인플라마좀 및 전염증 신호를 촉발하는데 필요한 신호를 생성하고 TLR4와 같은 TLR에 결합하는 결합 도메인을 포함할 수 있다. TLR4는 단핵구 또는 대식세포에서 발현되며, LPS 및 다른 리간드에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 TLR 리간드에 결합한 다음, TLR에 결합할 수 있다.
E. 골수 세포의 염증 활성 및 세포 부착을 촉진하는 도메인을 갖는 인게이저
세포-세포 및 세포-기층(substratum) 부착은 다양한 단백질 리간드에 대한 인테그린 세포외 도메인의 결합에 의해 매개되지만, 이러한 접착 상호 작용의 세포 제어 및 세포 확산 또는 이동과 같은 동적 세포 반응으로의 번역은 인테그린 세포질 꼬리를 필요로 한다. 이러한 짧은 꼬리들은 수용체를 신호 전달 경로와 세포 골격 네트워크에 연결하는 세포내 리간드에 결합한다. 인테그린은 α 및 β 서브유닛의 비공유 결합에 의해 형성된 이종 이량체 부착 수용체이다. 각각의 서브유닛은 비교적 큰 세포외 도메인과, β4 서브유닛을 제외하고는 짧은 세포질 꼬리를 갖는 I형 막 관통 당 단백질이다. 개별 인테그린 계열 구성원은 복수의 리간드를 인식할 수 있다. 인테그린은 많은 수의 세포외 매트릭스 단백질(골 매트릭스 단백질, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴 및 폰 빌레브란트 인자)에 결합할 수 있으며, 이는 세포외 매트릭스에 대한 세포 부착에서 인테그린의 주요 기능을 반영한다. 많은 "반대 수용체(counter-receptor)"는 리간드이며, 이는 세포-세포 상호 작용을 매개하는데 있어서 인테그린의 역할을 반영한다. 인테그린은 리간드 친화도를 증가시키기 위해 구조적 변화를 겪는다.
인테그린 β2 아과는 4개의 상이한 인테그린 수용체, 즉, αMβ2(CD11b/CD18, Mac-1, CR3, Mo-1), αLβ2(CD11a/CD18, LFA-1), αXβ2(CD11c/CD18) 및 αDβ2(CD11d/CD18)로 이루어진다. 이러한 백혈구 인테그린은 면역 반응, 내피에 대한 부착 및 내피를 통한 이동, 병원체의 식세포 작용, 백혈구 활성화를 비롯하여 백혈구 기능의 거의 모든 측면에 관여한다.
모든 β2 인테그린의 α 서브유닛은 I 또는 A 도메인이라고 하는 약 200개 아미노산의 삽입된 영역을 포함한다. 고도의 보존적 I 도메인은 특정 응고 및 보체 단백질과 같은 여러 다른 인테그린 α 서브유닛 및 다른 단백질에서 발견된다. I 도메인은 단백질-단백질 상호 작용을 매개하며, 인테그린에서는 단백질 리간드의 결합에 통합적으로 관여한다. I 도메인이 인테그린의 리간드 결합 기능을 지배하지만, α 서브유닛의 다른 영역은 리간드 인식에 영향을 미친다. 예로서, αMβ2에서, I 도메인 외부지만 αM 서브유닛에서 에피토프를 인식하는 mAb(OKM1)는 리간드 결합을 억제하며; α 서브유닛에서 I 도메인을 갖는 인테그린, 즉, αLβ2 및 α2β1의 EF-핸드 영역(EF-hand region)은 리간드 인식에 기여한다. αM 서브유닛 및 아마도 다른 α 서브유닛은 비단백질 리간드의 관여에 관련되는 렉틴 유사 도메인을 함유하며, 점유는 I 도메인의 기능을 조절할 수 있다.
인테그린은 효소 활성이 부족하기 때문에, 신호 전달은 대신 원형질막의 세포질 면 상의 신호 전달 복합체의 조립에 의해 유도된다. 이러한 복합체의 형성은 2가지 방식, 즉, 첫째, 분자 상호 작용의 결합 활성(avidity)을 증가시켜 이펙터 분자의 결합의 온-속도(on-rate)를 증가시키는 수용체 클러스터링에 의해서와, 둘째, 이펙터 결합 부위를 생성하거나 노출시키는 수용체의 입체 형태 변화의 유도에 의해 달성된다. ECM 내에서, 인테그린은 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 테나신, 비트로넥틴 및 트롬보스폰딘에 결합하는 능력을 갖는다. 인테그린/ECM 상호 작용의 클러스터는 국소 부착을 형성하여 세포 골격 성분 및 세포내 신호 전달 분자를 집중시킨다. 인테그린의 세포질 꼬리는, 이후에 F-액틴을 막에 고정시키는데 관여하는 단백질인 빈쿨린을 동원하는 α-액티닌 및 탈린(talin)에 대한 결합 부위의 역할을 한다. 탈린은 단백질 키나아제 C(PKC□)와 같은 키나아제에 의해 활성화된다.
인테그린은 셀렉틴에 의해 활성화된다. 백혈구는 L-셀렉틴을 발현하고, 활성화된 혈소판은 P-셀렉틴을 발현하고, 활성화된 내피 세포는 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 발현한다. P-셀렉틴 매개성 부착은 β2 인테그린의 케모카인 또는 혈소판 활성화 인자 촉발 활성화를 가능하게 하여 부착을 안정화시킨다. 이는 또한 부착 백혈구로부터 케모카인의 방출을 용이하게 한다. P-셀렉틴 당 단백질 리간드 1의 세포질 도메인은 Nef 관련 인자 1과 구성적 복합체를 형성하였다. P-셀렉틴의 결합 후, Src 키나아제는 Nef 관련 인자 1을 인산화하여 포스포이노시타이드-3-OH 키나아제 p85-p110δ 이종 이량체를 동원하고 백혈구 인테그린의 활성화를 초래한다. E-셀렉틴 리간드는 β2 인테그린 기능에도 또한 영향을 미치는 신호를 전달한다. 셀렉틴은 Src 계열 키나아제의 활성화를 촉발시킨다. 셀렉틴 관여에 의해 활성화된 SFK는 DAP12 및 FcRγ의 세포질 도메인에서 면역 수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 인산화한다. 일부 면에서, CD44는 E-셀렉틴으로부터 신호를 전달하기에 충분하다. CD44는 인테그린의 내부-외부 신호를 촉발시킨다. 인테그린 활성화의 마지막 공통 단계는 β 서브유닛의 세포질 꼬리에 탈린을 결합하는 것이다. 세포질 어댑터의 또 다른 군인 킨들린은 인테그린 β 꼬리의 상이한 영역에 결합한다. 킨들린은 탈린 활성화된 인테그린의 클러스터링을 증가시킨다. 킨들린은 셀렉틴 신호 전달에 빠른 반응을 보이지만, 킨들린은 주로 호중구와 같은 조혈 세포에서 발견된다. 케모카인 성분에 의한 인테그린 활성화시 신호 전달 뿐만 아니라 셀렉틴 신호 전달은 SFK, Syk 및 SLP-76을 비롯한 성분을 공유한다.
일부 실시형태에서, 상기 인게이저는 인테그린 또는 셀렉틴, 예를 들어, P-셀렉틴, L-셀렉틴 또는 E-셀렉틴과 같은 부착 분자의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함한다.
F. 골수 세포의 항식세포 및 항염증 활성을 억제하는 결합 도메인을 갖는 인게이저
하나의 양태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 단핵구 또는 대식세포의 식세포 작용의 CD47 매개성 하향 조절을 억제하는 추가의 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 종양 세포는 전형적으로 단핵구 또는 대식세포 수용체 SIRP-α에 결합하고 식세포 작용을 억제하는 "나를 먹지 마라"라는 신호 CD47을 발현한다. 그러므로, CD47의 억제는 종양 세포 매개성 항식세포 작용을 제거한다. 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저의 하나의 아암은 CD47 차단제를 포함할 수 있다. 상기 인게이저와 회합된 CD47 차단제는 유인(decoy) 수용체 또는 중화 수용체로서 작용하는 SIRP-α의 세포외 CD47 결합 도메인일 수 있다.
하나의 양태에서, 면역 세포 상에서 발현되는 막 단백질의 Siglec 계열 구성원에 의한 식세포 작용 조절 신호 전달을 억제할 수 있는 조성물이 본 출원에서 개시된다. 상기 계열의 다양한 구성원은 막 단백질 상의 시알릴화된 글리칸과 접촉할 때 체크포인트 신호를 전달한다. 일부 구성원에서, Siglec 단백질의 세포내 도메인은 다중 면역 수용체 타이로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 포함한다. ITIM은 세포질 꼬리에서 공통 아미노산 서열, 즉, (I/V/L/S)-XYXX-(L/V)를 공유하며, 여기서, X는 임의의 아미노산을 나타내고, I=이소류신, V=발린, L=라이신, S=세린, Y=타이로신이다. ITIM 모티프에서의 타이로신 잔기의 인산화는 다음 2개의 SH2 도메인 함유 음성 조절제 중 어느 하나를 동원한다: 이노시톨 포스파타아제 SHIP(Src 상동성 2-함유 이노시톨 폴리포스페이트 5-포스파타아제) 또는 타이로신 포스파타아제 SHP-1(Src 상동성 2-함유 단백질 타이로신 포스파타아제-1). (Y+2) 위치의 류신은 SHIP에 대한 결합을 선호하는 반면, (Y-2) 위치의 이소류신은 SHP-1 결합을 선호한다. ITIM은 또한 또 다른 타이로신 포스파타아제인 SHP-2에 결합할 수 있지만, ITIM 매개성 억제에서 기능적 역할을 하는 SHP-2에 대한 증거는 다른 매개체에 대한 것보다 덜 명확하다. 그러므로, 시알산 잔기와의 결합에 의한 세포외 리간드 결합 도메인에서의 Siglec 막 단백질의 활성화, (예를 들어, 시알릴화된 막 글리칸 단백질에서), ITIM은 인산화된 세포내 신호를 수신하고, 식세포 잠재력의 감소를 비롯한 면역 조절을 위한 SHP 매개성 신호 전달을 개시한다.
Siglec 계열 수용체로는 막 단백질, siglec 1(CD169), siglec 2(CD22), siglec 3(CD33), siglec 4(MAG), siglec 5, siglec 6, siglec 7, siglec 8, siglec 9, siglec 10, siglec 11, siglec 12, siglec 13, siglec 14, siglec 15, siglec 16이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 기재된 조성물은, Siglec 수용체(SgR 수용체)가 차단되고 SgR 유도된 면역 조절 세포내 신호 전달이 억제되도록 하는 SgR 수용체에 대한 결합 도메인을 포함할 수 있다.
인게이저를 위한 특정 다량체화 도메인
복수의 표적과 모듈식으로 동시에 관여하는 인게이저의 능력을 보조하는 추가의 구조 및 헬퍼가 이중 특이적 및 삼중 특이적 인게이저의 분자 디자인에서 또한 구상된다. 이러한 디자인은 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체, 트리바디 또는 트리플 바디 형식에서와 같이 링커에 의해 분리된 2개 이상의 결합 도메인에 대한 추가의 앵커 또는 갈고리 요소를 포함한다. 이러한 고차 다중 특이적 결합 도메인은 종종 동일하고 상이한 세포 상의 복수의 도메인을 결합하는데 있어서 안정성 및 가요성을 개선하기 위해 다량체화 도메인의 포함을 필요로 한다. 상기 추가의 앵커 또는 갈고리 요소는 동족체 쌍에서 발생하여, 앵커 또는 갈고리 양상의 동족체 쌍 중 하나는 인게이저의 결합 도메인들 중 하나에 부착되고, 상기 쌍 중 다른 하나는 동족체 쌍의 다른 하나에 부착된다.
일부 실시형태에서, 상기 인게이저는 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 복수의 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질이며, 각각은 서로 상보적 결합을 나타내는 동족체 펩타이드 앵커 또는 갈고리 요소를 갖는 링커에 의해 함께 각각 연결되는 개별 결합 특이성을 갖는다. 예를 들어, 상기 재조합 단백질의 한 결합 도메인은 제1 동족체 펩타이드 쌍과 융합되고, 다른 결합 도메인은 제2 펩타이드 쌍과 융합되며, 여기서, 상기 펩타이드 쌍은 서로 상보적 결합을 나타내고, 상기 동족체 펩타이드 쌍은 (a) 서로 상보적 결합을 나타내는 류신 지퍼 도메인; 예를 들어, c-Fos 및 c-Jun 단백질의 결합 영역 내의 지퍼 서열과 같은 자연 발생 단백질-단백질 상호 작용의 류신 지퍼, (b) 합성 갈고리를 통해 서로 특이적으로 결합하도록 설계된 합성 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 상기 재조합 단백질에 포함된 류신 지퍼 펩타이드 쌍에 의해 서로 가속화된 회합(association)을 용이하게 하도록 구성된 다중 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질이다. 류신 지퍼 서열은 종종 헵타드 류신 반복체를 포함하며, 2개의 펩타이드가 류신 지퍼 구조를 가질 때 부착 펩타이드 쌍을 구성한다. 자연 발생 류신 지퍼들 중에서, c-Fos와 c-June 쌍은 가장 널리 공지되어 있다. 이들은 5.4 x 10-8 M의 KD를 갖는 강력한 결합 친화도를 나타낸다. 이들은 평행 코일을 형성한다. 일부 실시형태에서, 상기 류신 지퍼 코일은 c-Fos:c-Jun 쌍의 코일이다. 일부 실시형태에서, 예시적인 동족체 쌍 앵커 또는 갈고리 요소는 ACID-p1(LZA) 및 BASE-p1(LZB) 쌍을 포함하며; 이는 아미노산 측쇄들 중의 전하들 사이의 정전기적 반발 때문에 동종 이량체화를 방지한다. 동종 이량체화의 방지는 다수의 실시형태에서 유리할 수 있다.
예시적인 c-Fos 류신 지퍼 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다: IARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH(서열번호 119).
예시적인 c-Jun 류신 지퍼 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다: TDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH(서열번호 120).
예시적인 LZA 류신 지퍼 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다: AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQK(서열번호 121).
예시적인 LZB 류신 지퍼 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다: AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQK(서열번호 122).
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 상기 재조합 단백질 내에 포함된 상기 펩타이드 쌍 중의 c-Fos/c-Jun 결합 도메인에 의해 서로 가속화된 회합을 용이하게 하도록 구성된 다중 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 앵커 또는 갈고리 요소는 특정 이종 이량체화 능력을 나타내고, 동종 이량체화를 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 합성 갈고리에 의해 서로 가속화된 회합을 용이하게 하도록 구성된 다중 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 합성 앵커 또는 갈고리 요소는 이종 이량체화를 형성하고 동종 이량체화를 방지하도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 상기 링커의 합성 갈고리는 비-펩타이드 가교제이다.
일부 실시형태에서, 서로 동족체 펩타이드들의 상보적 결합은 교차 결합와 같은 화학적 결합을 통해 이루어질 수 있다. 화학적 가교제는 시험관내 교차 결합을 활성화하는데 유용할 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 동종 이작용성 및 이종 이작용성 단백질 가교제가 있다. 그 예로서, BS2G 가교제(BS2G; 비스[설포석신이미딜]글루타레이트)는 아민 반응성, 수용성, 동종 이작용성 단백질 가교제(스페이서 아암의 반대쪽 말단에 있는 두 결합 단위는 모두 동일한 반응성 기를 가짐) 또는 이의 막 투과성 버전 DSG(디석신이미딜글루타레이트; 디(N-석신이미딜)글루타레이트)이고; BS3 가교제(비스[설포석신이미딜]수베레이트, 설포-DSS, BSSS) 또는 DST 가교제(디석신이미딜 타르트레이트)는 펩타이드를 위한 다른 동종 이작용성 가교제 중 하나인 반면; BMPS(N-(β-말레이미도프로필옥시)석신이미드 에스테르, MBS 가교제(m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르), PDPH 가교제(3-[2-피리딜디티오]프로피오닐 하이드라지드)는 일부 이종 이작용성 가교제의 예를 제공한다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 인게이저 내에서 나란히 배열된 가변 경쇄(VL) 서브유닛 및 가변 중쇄(VH) 영역은 동족체 펩타이드 앵커 또는 갈고리 요소를 갖는 2개의 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커의 길이는 특정 VL-VH 회합을 제한하거나 촉진할 수 있다. 예를 들어, 링커 펩타이드 길이를 10개 미만의 아미노산으로 제한하는 것은 2개의 인접한 VL 및 VH 도메인 사이의 회합을 제한한다.
일부 실시형태에서, 상기 앵커 또는 갈고리 요소는 5 x 10-6 M 미만, 또는 10-6 M 미만, 5 x 10-7 M 미만, 또는 4 x 10-7 M 미만, 또는 3 x 10-7 M 미만, 또는 2 x 10-7 M 미만; 또는 10-7 M 미만, 또는 9 x 10-8 M 미만, 또는 8 x 10-8 M 미만, 또는 7 x 10-8 M 미만, 또는 6 x 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 4 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 10-10 M 미만의 KD를 갖는 친화도 또는 보다 높은 친화도를 나타낸다.
또한, 이종 이량체 또는 이종 다량체 단위의 조립에 의해 형성되는 이러한 고차 다중 특이적 인게이저(예를 들어, 복수 결합 도메인을 갖는 인게이저)에 추가의 앵커 또는 이종 다량체화 도메인의 포함은 다중 특이적 인게이저의 생산, 폴딩, 안정성 및 조직 이용 가능성에 도움을 준다.
염증 유전자의 공동 발현
하나의 양태에서, 상기 재조합 핵산은 조작된 세포에서 발현되는 전염증 유전자에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 전염증 유전자는 사이토카인이다. 예로는 TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, CSF, GMCSF 또는 IL-12 또는 인터페론이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 상기 전염증 유전자의 코딩 서열을 인코딩하는 재조합 핵산은 치료제, 예를 들어, 적어도 제1 치료제를 동반하는 추가의 치료제이다.
펩타이드 링커
일부 실시형태에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인, scFv 또는 결합 도메인은 링커에 의해 서로 연결된다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인에 1개 초과의 scFv가 있는 경우, 보다 많은 scFv가 링커에 의해 서로 연결된다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 가요성이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 힌지 영역을 포함한다. 링커는 일반적으로 짧은 펩타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 글리신 및 하나 이상의 세린 잔기의 스트레치이다. 펩타이드 링커에 바람직한 다른 아미노산으로는 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 프롤린(Pro), 글리신(Gly), 아스파르트산(Asp), 라이신(Lys), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 페닐알라닌(Phe) 및 글루탐산(Glu)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 중에서, Pro, Thr 및 Gln은 천연 링커에 자주 사용되는 아미노산이다. Pro는 매우 제한된 입체 형태를 유발하는 사이클릭 측쇄를 갖는 독특한 아미노산이다. Pro 풍부한 서열은 피루베이트 데데하이드로게나아제에서 리포일과 E3 결합 도메인 사이의 링커(GA2PA3PAKQEA3PAPA2KAEAPA3PA2KA(서열번호 156))를 비롯하여 도메인간 링커로서 사용된다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 경험적 링커는 가요성 링커, 강성 링커 및 절단 가능한 링커일 수 있다. (G4S)x(서열번호 157)(여기서, x는 모이어티의 복수 사본으로, 1, 2, 3, 4 등으로 지정됨)와 같은 서열은 가요성 링커 서열을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 다른 가요성 서열은 글리신의 여러 반복체, 예를 들어, (Gly)6(서열번호 158) 또는 (Gly)8(서열번호 159)을 포함한다. 다른 한편으로, 강성 링커, 예를 들어, 링커(EAAAK)x(서열번호 160)가 사용될 수 있으며, 여기서, x는 정수이고, 1, 2, 3, 4 등이 강성 링커를 생성한다.
링커 펩타이드의 길이는 다중 특이적 인게이저의 디자인에서 중요할 수 있다. 예를 들어, 링커 펩타이드 길이를 10개 미만의 아미노산으로 제한하는 것은 2개의 인접 도메인 사이의 회합을 제한한다. 일부 실시형태에서, 상기 링커는 앵커 또는 갈고리 기능을 포함할 수 있으며, 교차 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 교차 결합 모이어티는 펩타이드 또는 화학적 교차 결합 모이어티일 수 있으며, 이들 중 몇 개는 이전 섹션에 기재되어 있다.
특정 기능을 갖는 특정 펩타이드는 본 문서의 다른 곳에서 논의되었다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 골수 세포에서 활성 인자 또는 신호로서 추가로 기능할 수 있다. 예를 들어, TLR4 활성화 펩타이드는 인게이저의 2개의 결합 도메인들 사이의 링커 내에 도입될 수 있으며, 상기 TLR4 활성화 펩타이드는 단핵구 또는 대식세포에서 TLR4 신호에 결합하여 이를 활성화한다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 조건부로 절단 가능한 링커로서 추가로 기능할 수 있다. 조건부로 절단 가능한이란 펩타이드가 이를 절단하는 제제가 이용 가능할 때 절단되는 것으로 이해된다. 예를 들어, MMP2 절단 가능한 펩타이드는 본 출원에서 기재되어 있으며, 이는 이러한 펩타이드가 MMP2 풍부한 영역에 있을 때에만 용이하게 절단된다. 예시적인 MMP2 절단 가능한 펩타이드는 GPLGVR(서열번호 118)이다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 표적화 펩타이드로서 추가로 기능할 수 있다. 예를 들어, M2 단핵구 또는 대식세포에 결합할 수 있는 M2 펩타이드가 기재되어 있으며, 이는 주요 종양 관련 단핵구 또는 대식세포 표현형이다. 예시적인 펩타이드는 YEQDPWGVKWWY(서열번호 116)이다.
임의의 하나 이상의 펩타이드 링커들은 이들이 이량체화, 삼량체화 또는 다량체화될 수 있는 것과 같은 특수 기능을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 류신 지퍼 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 앵커 또는 갈고리를 함께 갖는 펩타이드 링커 또는 2개의 링커 펩타이드는 50개 아미노산 이하, 45개 아미노산 이하, 40개 아미노산 이하, 35개 아미노산 이하, 30개 아미노산 이하, 25개 아미노산 이하, 20개 아미노산 이하, 15개 아미노산 이하, 10개 아미노산 이하 또는 5개 아미노산 이하의 길이에 걸쳐 있다. 일부 실시형태에서, 앵커 또는 갈고리를 함께 갖는 펩타이드 링커 또는 2개의 링커 펩타이드는 25개 아미노산 이하, 24개 아미노산 이하, 23개 아미노산 이하, 22개 아미노산 이하, 21개 아미노산 이하, 20개 아미노산 이하, 19개 아미노산 이하, 19개 아미노산 이하, 18개 아미노산 이하, 17개 아미노산 이하, 16개 아미노산 이하, 15개 아미노산 이하, 14개 아미노산 이하, 13개 아미노산 이하, 12개 아미노산 이하, 11개 아미노산 이하, 10개 아미노산 이하, 9개 아미노산 이하, 8개 아미노산 이하, 7개 아미노산 이하, 6개 아미노산 이하 또는 5개 아미노산 이하의 길이에 걸쳐 있다.
단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 제조 방법
본 출원에서 기재된 인게이저는 재조합 단백질로서 제조된다. 일반적으로, 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 작제되어 발현을 위한 적절한 배향 및 올바른 판독 프레임으로 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입되며, 필요에 따라, DNA가 목적하는 숙주(예를 들어, 세균)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있지만, 이러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용 가능하다. 그 다음, 상기 벡터는 표준 기법을 사용하여 클로닝을 위해 숙주 세균에 도입된다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 분자 클로닝 기법을 사용하여 동일한 오픈 리딩 프레임에서, 예를 들어, 제1 결합 도메인, 링커 및 제2 결합 도메인을 인코딩하는 DNA를 연결함으로써 합성된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열은 단일 폴리펩타이드의 생성을 위한 동일한 프로모터 및 조절 요소하에 배열된다. 일부 실시형태에서, 짧은 스페이서가 2개의 폴리펩타이드를 인코딩하는 2개의 인접 폴리뉴클레오타이드들 사이에 삽입될 수 있으며, 여기서, 상기 스페이서는 번역후 절단 부위를 인코딩할 수 있다. 상기 2개의 폴리펩타이드는 특정 절단 부위에서 절단의 유도에 의해 번역 후에 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 작제물은 단시스트론성 또는 다시스트론성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개 초과의 폴리펩타이드가 생성된 후 번역 후에 재조립된다. 예를 들어, 항체의 경쇄 및 중쇄 도메인 또는 이의 일부가 2개의 독립적인 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 번역에 의해 생성되어 번역 후 서로 자유롭게 조립될 수 있다. 대안으로, 서로 결합하는 LC 및 HC 가변 도메인을 함유하는 복수의 폴리펩타이드 쇄가 단일 폴리뉴클레오타이드로부터 전사 및 번역되어 번역 후에 각각의 펩타이드 쇄로 절단된 다음 재조립될 수 있다. 선도 서열을 갖는 폴리펩타이드는 프레단백질이며, 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 형성하는 선도 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 작제물은 폴리펩타이드의 분비를 위한 폴리펩타이드의 업스트림에 N-말단 신호 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 상기 N-말단 신호 서열은 분비 서열을 포함한다. 분비를 위한 N-말단 신호 서열을 갖는 생성되는 번역된 단백질 산물은 세포에 의해 분비될 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 플라스미드 벡터는 리포펙타민 또는 칼슘 포스페이트를 사용하는 것과 같은 공지된 형질 감염 방법에 의해 또는 전기 천공 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)과 같은 물리적 수단을 통해 세포에 도입되거나 혼입된다. 일부 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 바이러스 형질 도입으로 일반적으로 공지된 과정인 감염에 의해 세포에 도입되거나 혼입된다.
일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 발현 벡터에 통합되거나 혼입된다. 벡터는 하나 이상의 프로모터와, 인핸서 결합 서열, 개시 및 말단 코돈, 5'UTR, 전사 안정화 요소를 포함하는 3'UTR, 임의의 보존적 조절 단백질 결합 서열 및 기타를 비롯한 다른 조절 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 출원에서 사용되는 벡터는 발현을 위해 특이적으로 증진된다. 과정 전반에 걸쳐 사용되는 다른 예시적인 벡터는 파지, 코스미드 또는 인공 염색체를 포함한다.
제1 바인더 도메인(암 세포 또는 질병 세포 또는 병원체와 같은 표적 세포에 결합하는 도메인) 중 어느 하나는 본 명세서의 어느 곳에서나 기재된 골수 세포 또는 제3 바인더 도메인과 결합하는 제2 바인더 도메인과 조합하여 설계될 수 있는 것으로 이해된다.
바이러스 벡터 : 일부 실시형태에서, 상기 재조합 단백질의 발현을 위한 벡터는 바이러스 기원 벡터, 즉, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산을 인코딩하는 핵산은 렌티바이러스 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 사내에서 제조되고 상기 목적을 위해 대규모로 제조된다. 일부 실시형태에서, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 상업적으로 입수 가능한 렌티바이러스 벡터가 이용된다.
일부 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(Adeno-Associated Virus: AAV) 벡터이다.
지질 나노입자 매개성 전달 : 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)는 극성 및/또는 비극성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 콜레스테롤이 효율적인 전달을 위해 LNP에 존재한다. LNP는 직경이 100~300 nm이며, 단핵구 또는 대식세포를 비롯한 다양한 세포 유형에 mRNA를 효율적으로 전달하는 수단을 제공한다. 일부 실시형태에서, LNP는 시험관내 세포 배양에서 재조합 핵산을 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 LNP는 핵산을 캡슐화하며, 여기서, 상기 핵산은 네이키드(naked) DNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 상기 LNP는 핵산을 캡슐화하며, 여기서, 상기 핵산은 mDNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 상기 LNP는 핵산을 캡슐화하며, 여기서, 상기 핵산은 플라스미드 벡터와 같은 벡터에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 상기 LNP는 핵산을 캡슐화하며, 여기서, 상기 핵산은 circRNA 분자이다.
일부 실시형태에서, 상기 LNP는 핵산을 대상체에 전달하는데 사용된다. LNP는 대상체에서 핵산을 전신으로 전달하는데 사용될 수 있다. 이는 주사로 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산을 포함하는 LNP는 정맥내 경로에 의해 주사된다. 일부 실시형태에서, 상기 LNP는 피하로 주사된다.
미세 기포 매개성 전달: 일부 실시형태에서, 미세 기포는 대상체에서, 예를 들어, 핵산을 포함하는 조성물의 전달을 위해 사용될 수 있다. 과불화탄소 충전된 미세 기포는 혈액 풀 제제로서 혈관계에서 순환하기에 안정하며, 관심 대상 부위에 도달할 때까지 이러한 제제의 담체로서 역할을 한다. 그 다음, 피부 표면에 적용된 초음파는 이러한 부위에서 미세 기포를 폭발시켜 약물의 국부 방출을 초래하는데 사용된다. 다양한 다른 형태의 미세 기포는 Sonazoid Optison, 가스 충전된 알부민 미세 기포 및 PESDA를 포함한다. 의도되는 전달 부위와 함께, 전달되는 치료제의 조성과 관련하여 미세 기포 조성의 최적화가 필요하다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 단백질, 예를 들어, 인게이저, 또는 공동 발현되는 염증성 단백질, 또는 골수 세포에서 발현되도록 설계된 임의의 관련 단백질은 재조합 핵산에 의해 인코딩될 수 있으며, 여기서, 상기 재조합 핵산은 RNA이다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태에서, 상기 mRNA는 증진된 발현 및 안정성을 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 mRNA는 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 변형으로는 염기 유사체 또는 변형된 뉴클레오타이드에 의한 핵염기의 교체, mRNA 내에 하나 이상의 모티프의 삽입, 및 5'UTR 및 3'UTR에 변형의 도입이 포함될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 핵산은 이를 필요로 하는 대상체에게 직접 투여될 수 있다.
약학 조성물
단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 약학 조성물이 본 출원에서 제공된다. 상기 조성물 중의 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 복수의 펩타이드의 복합체 형태일 수 있다. 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저는 정제된 재조합 단백질로서 조성물 중에 제공될 수 있다. 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저는 컨쥬게이트된 재조합 단백질, VHH 복합체, scFv 복합체 또는 나노바디로서 조성물 중에 제공될 수 있다. 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저는 상기 재조합 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA, mRNA 또는 circRNA, 또는 이들 중 어느 하나의 리포좀 조성물을 포함할 수 있다. 상기 리포좀은 LNP이다.
약학 조성물은 활성 성분에 추가하여 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 상기 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 좌우될 것이다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제로는 사용되는 투약량 및 농도에서 수여자에게 무독성인 것들이 있으며, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화 방지제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당류, 예를 들어, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면 활성제, 예를 들어, TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다.
허용되는 담체는 투여된 환자에게 생리학적으로 허용되며, 이것이 투여되는 화합물의 치료학적 특성을 유지한다. 허용되는 담체 및 이의 제형은 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Remington' pharmaceutical Sciences, 18th ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990]에 기재되어 있다. 담체의 한 예는 생리 식염수이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 대상 화합물을 한 장기의 투여 부위 또는 신체의 일부로부터 또 다른 장기 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송하는데 관여하는 또는 시험관내 검정 시스템에서 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이다. 허용되는 담체는 상기 제형의 다른 성분과 상용 가능하며, 이것이 투여되는 대상체에게 손상을 주지 않는다. 또한, 허용되는 담체는 신생 항원의 비활성(specific activity)을 변경하지 않아야 한다.
하나의 양태에서, 약제학적 투여와 상용 가능한, 용매(수성 또는 비수성), 용액, 에멀젼, 분산매, 코팅제, 등장화제 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함하는 약제학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용되는 조성물이 본 출원에서 제공된다. 그러므로, 약학 조성물 또는 약제학적 제형은 대상체에서 약제학적 사용에 적합한 조성물을 지칭한다. 조성물은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 국부)와 상용 가능하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 조성물 중 면역 세포의 안정성을 개선하기 위해 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 첨가제는 면역 세포의 비활성을 변경하지 않을 수 있다. 허용되는 첨가제의 예로는 만니톨, 소르비톨, 글루코오스, 자일리톨, 트레할로오스, 소르보오스, 수크로오스, 갈락토오스, 덱스트란, 덱스트로오스, 프럭토오스, 락토오스 및 이들의 혼합물과 같은 당이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 허용되는 첨가제는 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예를 들어, 덱스트로오스와 조합될 수 있다. 대안으로, 허용되는 첨가제의 예로는 펩타이드의 안정성을 증가시키고 용액의 겔화를 감소시키기 위해 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 계면 활성제가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 계면 활성제는 용액의 0.01% 내지 5%의 양으로 조성물에 첨가될 수 있다. 이러한 허용되는 첨가제의 첨가는 보관시 조성물의 안정성 및 반감기를 증가시킨다.
상기 약학 조성물은, 예를 들어, 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사용 약학 조성물은 수용액(수용성인 경우) 또는 분산물, 및 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체로는 생리 염수, 정균수 또는 포스페이트 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)가 포함된다. 상기 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산물의 경우에서 요구된 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 항균제 및 항진균제로는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살이 포함된다. 등장화제, 예를 들어, 당, 다가 알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 생성된 용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결 건조될 수 있으며, 이러한 동결 건조된 제제는 나중에 투여 전에 멸균 용액과 배합될 수 있다. 정맥내 주사 또는 고통 부위의 주사의 경우, 활성 성분은 발열성 물질이 제거되고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 예를 들어, 염화 나트륨 주사제, 링거 주사제, 락테이트화 링거 주사제와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 완충제, 산화 방지제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 멸균 주사 용액은 요구량의 활성 성분을 필요에 따라 상기에서 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 멸균 여과시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 성분을 기본 분산매와 상기에서 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조일 수 있다.
예를 들어, 조성물은, 예를 들어, 단위 용량의 주사에 의해, 통상적으로 정맥내로 투여될 수 있다. 주사의 경우, 활성 성분은 발열성 물질이 실질적으로 제거되고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 수 있다. 사람들은, 예를 들어, 염화 나트륨 주사제, 링거 주사제, 락테이트화 링거 주사제와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 완충제, 산화 방지제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 추가로, 조성물은 에어로졸화를 통해 투여될 수 있다.
상기 조성물이 약제 또는 본 출원에서 제공된 임의의 방법에 사용하기 위해 고려되는 경우, 상기 조성물은 사람 환자에게 투여될 때 상기 조성물이 염증 반응 또는 불안전한 알러지 반응을 일으키지 않도록 발열 물질이 실질적으로 제거될 수 있는 것으로 고려된다. 발열 물질에 대해 조성물을 테스트하고 발열 물질이 실질적으로 제거된 조성물을 제조하는 것은 통상의 기술자에게 잘 이해되며, 상업적으로 입수 가능한 키트를 사용하여 달성될 수 있다.
허용되는 담체는 흡수를 안정화, 증가 또는 지연시키거나 제거를 증가 또는 지연시키는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물로는, 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물; 저분자량 단백질; 펩타이드의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제가 포함된다. 흡수 지연제로는, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴이 포함된다. 계면 활성제는 또한 리포좀 담체를 포함하는 약학 조성물의 흡수를 안정화, 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 소화로부터 보호하기 위해, 상기 화합물은 산성 및 효소 가수분해에 내성이 되도록 하는 조성물과 복합체를 형성할 수 있거나, 상기 화합물은 리포좀과 같은 적절한 내성 담체 중에서 복합체를 형성할 수 있다. 소화로부터 화합물을 보호하는 수단은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Fix(1996) Pharm Res. 13:1760 1764]; [Samanen(1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135]; 및 미국 특허 US 5,391,377).
상기 조성물은 투약 제형과 상용 가능한 방식으로 및 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 치료되는 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체 면역계의 능력 및 목적하는 결합 능력의 정도에 좌우된다. 투여되는 활성 성분의 정확한 필요량은 진료 의사의 판단에 좌우되며, 각각의 개체에 대해 특유하다. 초기 투여 및 부스터 샷(booster shot)에 적합한 방법이 또한 변수이지만, 초기 투여 후에 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 1 시간 이상의 간격의 반복 투여가 대표적이다. 대안으로, 혈액 중 농도를 유지하기에 충분한 연속적 정맥내 주입이 고려된다.
치료 방법
본 개시 내용은 암 및 감염과 같은 질병의 치료 방법을 포함하며, 여기서, 골수 세포에 의한 증진된 식세포 작용은 질병 세포 또는 감염 세포를 제거하는데 유리할 수 있다.
암으로는 T 세포 림프종, 피부 림프종, B 세포 암(예를 들어, 다발성 골수종, 발덴스트룀 거대 글로불린 혈증), 중쇄 질환(예를 들어, 알파 쇄 질환, 감마 쇄 질환 및 뮤 쇄 질환), 양성 단클론 감마병증 및 면역 세포 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암(전이성, 호르몬 불응성 전립선암), 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌암 또는 중추 신경계암, 말초 신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁암 또는 자궁내막암, 구강암 또는 인두암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장암 또는 충수암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골 육종, 혈액 조직암 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 개시 내용에 포함되는 방법에 적용 가능한 암 유형의 다른 비제한적인 예로는 사람 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골원성 육종, 척삭종, 맥관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두상 선암종, 낭선 암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신 세포 암종, 간 세포 암종, 담관 암종, 간암, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌종양, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경 교종, 성상 세포종, 수모세포종, 두개 인두종, 뇌실막 세포종, 송과체종, 혈관 모세포종, 청신경종, 희소 돌기 아교 세포종, 수막종, 흑색종, 신경 모세포종, 망막 모세포종; 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수 아구성, 전골수구성, 골수 단구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성 적혈구 증가증, 림프종(호지킨 병 및 비호지킨 병), 다발성 골수종, 발덴스트룀 거대 글로불린 혈증 및 중쇄 질환이 포함된다. 일부 실시형태에서, 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인과암, 신암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 피부암을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 상피암이다. 다른 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 폐암 또는 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 상피암은 비소세포 폐암, 비유두성 신 세포 암종, 자궁 경부 암종, 난소 암종(예를 들어, 장액성 난소 암종) 또는 유방 암종이다. 상기 상피암은 장액성, 자궁내막양, 점액성, 투명 세포 또는 미분화를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 다른 방식으로 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시 내용은 림프종, 또는 외투 세포 림프종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 이의 서브타입의 치료, 진단 및/또는 예후에서 사용된다. 림프구 증식성 장애는 또한 증식성 질환으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 투여 용량 당 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 치료제는 제2 또는 제3 요법과 조합하여 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 1회 초과로 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 요법의 기간에 걸쳐 반복적으로 복수회 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 수개월, 1년 또는 그 이상을 포함하는 기간에 걸쳐 대상체에게 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 또는 그 이상 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 주 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 주 2회 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 2주 마다 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 3주 마다 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 월 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 2 개월 마다 1회, 3 개월 마다 1회, 4 개월 마다 1회, 5 개월 마다 1회 또는 6 개월 마다 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 주사에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 주입에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 포함하는 적어도 제1 치료제를 포함하는 조성물은 피하 주입에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저가 사용되지 않은 경우와 비교하여 식세포 능력 및 단핵구 또는 대식세포 매개성 표적 세포 사멸을 증가시킨다. 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료 후 종양 부위로부터 회수된 단핵구 또는 대식세포는 식세포 작용에서 10% 초과 또는 20% 초과 또는 30% 초과 또는 40% 초과 또는 50% 초과 또는 60% 초과 또는 70% 초과 또는 80% 초과 또는 90% 초과 또는 100% 초과 또는 150% 초과 또는 200% 초과 또는 250% 초과 또는 300% 초과 또는 350% 초과 또는 400% 초과 또는 450% 초과 또는 500% 초과 또는 600% 초과 또는 700% 초과 또는 800% 초과 또는 900% 초과 또는 1000% 초과의 증가를 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 종양 부위로부터 회수될 수 있는 관련 단핵구 또는 대식세포에서 ROS 생성을 증가시킨다. 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료 후 종양 부위로부터 회수된 단핵구 또는 대식세포는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 ROS에서 2배 초과 또는 3배 초과 또는 4배 초과 또는 5배 초과 또는 6배 초과 또는 7배 초과 또는 8배 초과 또는 9배 초과 또는 10배 초과 또는 20배 초과 또는 30배 초과 또는 40배 초과 또는 50배 초과 또는 60배 초과 또는 70배 초과 또는 80배 초과 또는 90배 초과 또는 100배 초과 또는 200배 초과 또는 300배 초과 또는 400배 초과 또는 500배 초과 또는 700배 초과 또는 800배 초과 또는 900배 초과 또는 1000배 초과의 증가를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 종양 부위로부터 회수될 수 있는 관련 단핵구 또는 대식세포에서 iNOS 생성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 종양 부위로부터 회수될 수 있는 관련 단핵구 또는 대식세포에서 호흡 폭발을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 관련 단핵구 또는 대식세포에서 CD80의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 비치료와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 CD86의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 TRAIL/TNF 계열 사멸 수용체의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 LIGHT의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 HVEM의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 CD40의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 TL1A의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 OX40L의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 GITR의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 SLAM의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 CD58의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 CD155의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 관련 단핵구 또는 대식세포에서 CD112의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저에 의한 치료는 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 치료가 없는 경우와 비교하여 종양 관련 골수 세포에서 B7-DC의 발현을 증가시킬 수 있다.
실시예
실시예 1. 재료 및 방법:
둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco modified Eagle medium), 트립신-EDTA, 보르트만닌(wortmannin: W), LY294002(LY), 브래드포드(Bradford) 시약 및 리소스타핀을 Sigma-Aldrich, Inc.(St. Louis, MO)로부터 구입한다. 감소된 혈청 Opti-MEM I 배지를 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD)로부터 구입한다. SH-5를 Enzo Life Sciences(Plymouth, PA)로부터 구입하고, OSU-03012(OSU)를 Cedarlane Labs(Burlington, NC)로부터 구입하였다. FuGENE 형질 감염 시약 및 50X EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일을 Roche Applied Science(Manheim, Germany)로부터 구입한다. 세포를 24웰 플레이트에서 60~70%의 밀집도까지 성장시키고, 배양 배지를 DMEM 10% FCS로 교체하였다. 그 다음, 유사한 단백질 발현을 갖기 위해, 제조업체의 설명서에 따라 1.2 μl의 FuGENE 형질 감염 시약(비율, 4:1 [FuGENE-플라스미드]) 중의 5 ng의 pCMV5-Akt-CA 또는 200 ng의 pCMV5-Akt-DN을 감소된 혈청 Opti-MEM I 배지 중의 BEC에 첨가한다.
BiME, TriME 및 다중 특이적 인게이저의 클로닝 및 특성화를 테스트 및 스크리닝 목적을 위한 이. 콜라이(E. coli) 시스템과 같은 세균 발현 시스템에서 수행한다. 간단히 말하자면, 인게이저 디자인에 도입하기 위한 결합 도메인의 스크리닝 후, 특정 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 각각의 항체 발현 클론으로부터 PCR에 의해 개별적으로 증폭시킨다. 결합 도메인이 전체 Fab 영역을 포함하는 경우, 각각의 항체 발현 클론으로부터 PCR에 의해 각각의 영역을 증폭시킨다. 인코딩된 Fab 또는 가변 도메인의 C-말단 말단에 링커를 전형적으로 효소에 의해 연결한다. 대안으로, 결합 도메인 및 링커 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 순차적 클로닝에 의해 플라스미드에 혼입한다. 또 다른 대안적인 방법에서, 결합 도메인(Fab 또는 가변 영역)을 인코딩하는 특정 서열을 PCR 중복에 의해 서로 연결하고, Fab-링커-Fab 디자인을 포함하는 보다 큰 삽입물을 발현 벡터에 클로닝하여 인게이저를 포함하는 키메라 단백질을 발현시킨다.
발현된 단백질을 일반적으로 공지된 기법에 의해 정제 및 농축하고, 생성물을 종양 표적화 및 독성에 대해 실험 동물에서 테스트한다.
일부 예에서, 상기 키메라 단백질을 포함하는 렌티바이러스 작제물은 상기 키메라 작제물을 단핵구 또는 대식세포에 형질 도입하는데 사용된다.
실시예 2. BiME(이중 특이적 인게이저) 플랫폼의 구축
본 실시예에서, 프로테아제 차폐 부위를 갖는 단핵구 또는 대식세포 및 종양 표적을 설계한다. 이중 특이적 인게이저는 스캐빈저 수용체(SRA1) 결합 도메인인 단핵구 또는 대식세포 결합 도메인을 포함한다. 표적 세포 결합 도메인은 종양 인식 도메인(예를 들어, TROP2)이다. scFv 작제물 폴리펩타이드 디자인은 도 2a에 도시되어 있다. VHH 작제물 폴리펩타이드 디자인은 도 2b에 도시되어 있다. 또 다른 예시적인 디자인에서, 상기 항원 결합 도메인은 프로테아제 절단 가능한 차폐 요소로 점유되어 있다. 추가로, 상기 2개의 결합 도메인은 TLR4 합성 펩타이드에 의해 연결된다. scFv 작제물 폴리펩타이드 디자인은 도 3a에 도시되어 있다. VHH 작제물 폴리펩타이드 디자인은 도 3b에 도시되어 있다. 상기 합성 펩타이드는 2개의 scFv에 결합되거나(도 3a), 2개의 단일 도메인에 걸쳐 있다(도 3b). 특정 TLR4 합성 펩타이드 링커는 단핵구 또는 대식세포 상의 TLR4 수용체를 활성화하며, 단핵구 또는 대식세포의 식세포 및 전염증 활성을 강화하는 제2 활성화 신호 - 신호 2를 제공한다. 또 다른 예시적인 디자인에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저의 2개의 결합 도메인은 M2 표적화 펩타이드를 포함한다. 상기 M2 표적화 펩타이드는 YEQDPWGVKWW(서열번호 116)(M2-pep) 또는 HLSWLPDVVYAW(HLS pep)(서열번호 117)의 아미노산 서열을 가지며, 이는 종양 관련 단핵구 또는 대식세포의 우세한 표현형인 M2 단핵구 또는 대식세포를 특이적으로 표적화하고 이에 결합한다. 따라서, 상기 특이적 결합 도메인에 의한 결합 및 활성화에 추가하여, 이러한 디자인에서, 이중 특이적 인게이저는 이러한 인게이저를 특정 세포, 이 경우에는 M2 단핵구 또는 대식세포로 표적화하는데 추가로 사용될 수 있다(도 3c 및 도 3d).
실시예 3. 이중 특이적 인게이저의 작제 및 발현
본 실시예는 링커 내에 활성화 인자 펩타이드 서열을 갖는 BiME의 작제, 발현 및 테스트를 기재한다. 먼저, 상이한 TLR 활성화 인자로부터 유래된 펩타이드 서열을 배양물 중의 단핵구에 대한 면역 활성화에 대해 테스트하였다. 테스트된 예시적인 TLR 펩타이드 서열은 하기 표 3에 나열되어 있다:
도 3a 및 도 3b에 예시된 이중 특이적 인게이저 작제물을 생성하기 위해 링커 서열의 일부로서 사용된 TLR 활성화 인자 펩타이드 서열은 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00008
각 펩타이드의 면역 반응을 테스트하기 위해, 2 x 106개 단핵구를 1 마이크로그램/ml의 표 3의 펩타이드와 함께 밤새 인큐베이션하고, Luminex 200을 사용하는 형광 검출을 사용하여 IL6 및 TNF-알파 방출을 측정하였다. 도 3e에서 도시된 바와 같이, RS01 및 RS09 펩타이드는 보다 높은 IL6 방출을 유도하였다. 다음으로, 이러한 2개의 펩타이드 서열을 상기 풀로부터 선택하고, 이중 특이적 인게이저를 생성하기 위해 이용하였다. 유사하게, 몇 가지를 더 테스트하고 있다.
이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저를 분자 클로닝에 의해 작제할 수 있다. 성공적인 클론이 생성되면, 각 클론을 서열 분석하고 서열을 검증할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 (i) CD5+ 종양 세포에 결합할 수 있는 항-CD5 scFv, 및 (ii) 단핵구 또는 대식세포 상의 CD16 표면 분자에 결합할 수 있는 항-CD16 scFv를 포함한다.
예시적인 항-CD5 바인더는 하기 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV (서열번호 111) 또는MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(서열번호 144).
또 다른 예시적인 항-CD5 바인더는 하기 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다: EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV(서열번호 112) 또는
EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTG EPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(서열번호 143).
예시적인 항-CD5 바인더는 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(서열번호113).
항-CD5 scFv를 함유하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저와 같은 예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 다음 서열을 갖는 예시적인 중쇄와 예시적인 경쇄를 연결하는 짧은 펩타이드 링커를 포함할 수 있다: SSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 114) 또는 SGGGGS(서열번호 145) 또는 GGGGS(서열번호 146) 또는 GGGG(서열번호 147).
예시적인 항-CD5 scFv는 하기 아미노산 서열을 포함한다: MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(서열번호 115).
예시적인 항-CD16 scFv는 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다: QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS(서열번호 141).
예시적인 항-CD16 scFv는 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 서열을 포함할 수 있다: SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(서열번호 142).
상기 2개의 scFv는 표 3에 기재된 것들과 같은 TLR 활성화 펩타이드 서열들 중 하나를 포함하는 합성 펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 그 후, 상기 작제물은 바인더 1-링커-바인더 2, 예를 들어, 각각 도 3f 또는 도 3h에서 도시된 바와 같이, 링커에 RS01 TLR 활성화 펩타이드 서열을 갖는 CD5-RS01-CD16 또는 링커에 RS01 TLR 활성화 펩타이드 서열을 갖는 CD5-RS09-CD16으로서 명명된다. 그 다음, 서열 확인된 클론을 적합한 세포에서 발현하고, 적합한 양성 대조군을 사용하는 분자 마커 및 웨스턴 블롯을 사용하여 겔 이동에 의해 단백질을 검출한다.
예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 서열 METDTLLLWVLLLWVPGSTG(서열번호 148) 또는 임의의 다른 유용한 선도 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 서열 HHHHHH(서열번호 149) 또는 임의의 다른 유용한 친화성 태그를 포함할 수 있다.
예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 서열 ENLYFQG(서열번호 150) 또는 임의의 다른 유용한 프로테아제 절단 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 제1 링커를 통해 가변 경쇄에 연결된 가변 중쇄를 포함하는 제1 scFv를 포함할 수 있고, 상기 제1 scFv는 제2 링커를 통해 제2 scFv에 연결될 수 있으며, 여기서, 상기 제2 scFv는 제3 링커를 통해 가변 경쇄에 연결된 가변 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 링커는 표 3에 기재된 것들과 같은 TLR 활성화 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 제3 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는다.
예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 하기 서열을 포함할 수 있다: METDTLLLWVLLLWVPGSTGHHHHHHENLYFQGEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSsggggsSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLggggQEINSSYggggsQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(서열번호 151).
예시적인 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 하기 서열을 포함할 수 있다: METDTLLLWVLLLWVPGSTGHHHHHHENLYFQGEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSsggggsSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLggggAPPHALSggggsQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(서열번호 152).
CD5-RS01-CD16 BiME의 발현은 표시된 바와 같은 환원 및 비환원 겔 전기 영동하에 도 3g(좌측)에서 SDS PAGE에 의해, 도 3g(우측)에서 웨스턴 블롯에 의해 도시된다. CD5-RS09-CD16 BiME의 발현은 표시된 바와 같은 환원 및 비환원 겔 전기 영동하에 도 3i(좌측)에서 SDS PAGE에 의해, 도 3i(우측)에서 웨스턴 블롯에 의해 도시된다. 이러한 데이터들은 이중 특이적 인게이저를 함유하는 TLR 활성화 서열의 성공적인 생성 및 발현을 입증한다. 상기에서 기재된 인게이저를 시험관 내에서 테스트한다. 마이크로입자 기반 식세포 작용 분석을 사용하여 식세포 작용의 변화를 검사하였다. 간단히 말하자면, 스트렙트아비딘 커플링된 형광 폴리스티렌 미세입자(직경 6 μm)를, 비오틴화된 재조합으로 발현되고 정제된 암 리간드, 이 경우에서는 CD5와 컨쥬게이션한다. 비드 및 인게이저 단백질의 존재하에 배양된 골수 세포를 리간드 코팅된 마이크로입자와 함께 1~4 시간 동안 인큐베이션하고, 유세포 계측법을 사용하여 식세포 작용의 양을 분석 및 정량화하였다.
실시예 4. 삼중 특이적 인게이저(TriME) 설계
본 실시예에서, 삼중 특이적 항원 결합 단백질의 디자인을 다음과 같이 제시한다. 상기 삼중 특이적 항원 결합 단백질은 (a) 사람 스캐빈저/식세포 수용체에 특이적으로 결합하는 제1 도메인(A);(b) 위험 신호 수용체인 제2 도메인(B); 및 (c) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제3 도메인(C)을 포함하며, 여기서, 상기 도메인들은 링커 L1 및 링커 L2에 의해 H2N-(A)-(B)-(C)-COOH, H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C)-COOH, H2N-(B)-(C)-(A)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH 또는r H2N-(C)-(A)-(B)-COOH의 순서로 연결된다(도 4a). 상기 항원 결합 도메인은 이용 가능성 및 프로테아제와의 접촉에 의해 활성화되는 프로테아제 절단 가능한 차폐 요소로 점유된다. 예시적인 나노바디 디자인은 도 4b에 도시되어 있다. 도 4c는 표적 종양 세포 및 단핵구 또는 대식세포에 대한 삼중 특이적 인게이저 및 예시적인 기능 특성의 그래픽 도면을 제공한다. 상기 삼중 특이적 인게이저는 구조적으로 종양 인식 또는 종양 결합 도메인, 단핵구 또는 대식세포의 수용체 1 결합 도메인 및 단핵구 또는 대식세포의 수용체 2 결합 도메인(도 4c의 우측 상단 모서리 상에 삽입물로 도시됨)을 포함한다. 예상되는 기능성 방식로서, 상기 종양 결합 도메인은 종양 세포의 표적 표면 분자(종양 항원)에 결합하는 반면, 상기 2개의 단핵구 또는 대식세포의 수용체인 B 및 A는 각각 단핵구 또는 대식세포의 수용체 1 결합 도메인 및 삼중 특이적 인게이저의 단핵구 또는 대식세포의 수용체 2 결합 도메인에 의해 결합된다. 상기 도면에서 도시된 바와 같이, 종양 인식 도메인에 의해 종양 항원과 또한 작동 가능하게 연결된 삼중 특이적 인게이저에 의한 수용체 A 및 B의 관여는 단핵구 또는 대식세포에 신호 1 및 신호 2를 제공한다. 이중 신호(신호 1 + 신호 2)는 단핵구 또는 대식세포를 활성화하여 이러한 예시적인 도면에서 식세포 작용을 증진시키고 염증 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포의 식세포 사멸을 유발한다.
실시예 5. 항원 결합 도메인 차폐 디자인
본 실시예에서, 차폐된 항원 결합 도메인을 갖는 인게이저에 대한 일반화된 예시적인 디자인을 더욱 상세하게 기재한다. 도 5aa는 2개의 scFV 바인더, 즉, scFv1 및 scFv2를 갖는 이중 특이적 인게이저의 도식적 표현이다. SdAb 또는 디아바디 인게이저를 또한 마찬가지로 필요한 구조적 변형으로 작제할 수 있으며, 2개의 바인더를 갖는 예시적인 디아바디 작제물은 도 5ab에 도시되어 있다. 제1 쇄의 ABD1(3)의 경쇄 가변 도메인의 N-말단 부분 또는 제2쇄의 ABD2의 경쇄 가변 영역에서 펩타이드 링커(2)에 의해 연결된, 디아바디 ABD1 및 ABD2의 항원 결합 부분에 결합된 채로 남아 있는 펩타이드 마스크(1)에 의해 상기 항원 결합 도메인을 차폐한다. 상기 마스크를 경쇄 가변 도메인과 연결하는 펩타이드 링커는 GPLGVR(서열번호 118) 아미노산 서열을 갖는 매트릭스 메탈로프로테이나아제 2(MMP2) 기질에 대한 기질이다. 상기 디자인은 MMP2가 연결 펩타이드를 절단할 수 있을 때까지 어떠한 기질에도 결합하지 않고 순환을 통과하도록 차폐된 디아바디 인게이저의 통과를 가능하게 한다. 암 미세 환경은 MMP2가 풍부한 것으로 이해된다. 그러므로, 디아바디 인게이저는 암 미세 환경에서 활성화되어 종양 환경에서 이의 표적 암 세포 및 단핵구 또는 대식세포를 각각 ABD1 및 ABD2와 결합시킨다. 도 5b는 디아바디의 단일 쇄의 핵산 작제물을 예시한 것이다. 상기 핵산 작제물은 마스크 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, MMP2 링커, ABD1 경쇄(ABD1-LC)를 인코딩하는 서열을 5'-3' 말단으로부터 포함하며, 이는 ABD1-LC 및 ABD2-HC와 연결되는 펩타이드 링커를 인코딩하는 핵산 서열에 이어서 ABD2 HC를 인코딩하는 핵산 서열에 연결된다.
실시예 6. 모듈식 항원 결합 인게이저 디자인
본 실시예에서, 도 6에서 도시된 바와 같이 경쇄 및 중쇄 도메인으로 표시된 결합 도메인의 여러 모듈식 디자인을 항체 유사 폴리펩타이드 구조 상에 배열한다. 하나의 디자인에서, 일반적인 경쇄를 사용하여 IgG 유사 구조에서 2개의 비동일 중쇄와 쌍을 이루게 함으로써, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저 디자인에 사용될 수 있는 이중 특이적 결합 도메인을 제공한다. 본 출원에서 도시된 또 다른 모델에서, 키메라 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저는 일반적인 항체 경쇄 및 중쇄 조합의 한 아암에 연결된 scFv의 조합을 사용한다. 하나의 디자인에서, 2개의 scFv는 중쇄-경쇄 쌍을 이루는 영역을 대체하면서, 상기 scFv는 중쇄의 불변 영역에 의해 연결된다. 본 출원에 도시된 다른 디자인에서, 하나 이상의 scFv를 Fc 영역에 컨쥬게이션할 수 있다. 또 다른 디자인에서, 하나 이상의 scFv를 IgG 유사 폴리펩타이드의 측쇄로서 불변 영역에 컨쥬세이션할 수 있다.
실시예 7. 단핵구 또는 대식세포에서 염증 신호를 활성화하고 식세포 작용을 강화하기 위한 인게이저에서 단핵구 또는 대식세포 특이적 활성 인자의 사용
MD2는 도 7a의 상부 패널에서 도식적 표현으로 도시된 바와 같이 LPS에 대응하여 TLR4에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있다. 예시적인 디자인에서, MD2를 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저로 작제하며, 여기서, 상기 MD2는 종양 특이적 결합 도메인 및 단핵구 또는 대식세포 특이적 결합 도메인에 추가하여 TLR4 수용체와 회합하고 상기 단핵구 또는 대식세포 상의 TLR4 수용체의 이량체화를 보조함으로써, 상기 단핵구 또는 대식세포에 의한 표적 암 세포의 염증 활성화 및 식세포 사멸을 추가로 강화하는 단핵구 또는 대식세포 활성화 신호(신호 2)를 전송한다(도 7b).
또 다른 예에서, 단핵구 또는 대식세포 이펙터 기능을 강화하는 예시적인 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 설계하는데 있어서 헤르페스 바이러스 진입 매개체(Herpes Virus Entry Mediator: HVEM) 및 이의 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 관련 2(LIGHT)와의 회합을 이용한다. HVEM은 TNFR 상과의 구성원이며, 2개 초과의 리간드를 갖는다: HSV 표면 외피 gD 및 LT□. 이를 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 호중구 및 DC에서 발현시킨다. LIGHT-HVEM 상호 작용은 단핵구와 호중구에서 식세포 작용, 인터루킨(IL)-8, TNF-□, 산화 질소(NO) 및 반응성 산소종(reactive oxygen species: ROS)의 수준을 증가시켰다. 예시적인 디자인에서, 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저는 HVEM에 결합할 수 있는 LIGHT 도메인을 포함한다. 디자인의 변형에서, HVEM에 결합하는 LIGHT 도메인은 도 8a에서 도시된 바와 같이 HVEM에 결합하는 항원 결합 도메인의 작용제 항체로 대체될 수 있다. 상응하는 인게이저의 기능 방식은 도 8b에 그래픽으로 도시되어 있으며, LIGHT 도메인과 단핵구 또는 대식세포 관련 HVEM의 결합은 단핵구 또는 대식세포에서 염증 신호(신호 2)를 활성화시켜 포식 세포로서 이의 이펙터 기능을 강화시킨다.
또 다른 예에서, GIRT 관련 활성화 신호를 도 9a에서 도시된 예시적인 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저 디자인에서 이용한다. GIRT는 단핵구 또는 대식세포 상에서 발현되며, 이의 리간드인 GIRTL에 의해 결합될 때, 이는 도 9b에서 그래프로 도시된 바와 같이 단핵구 또는 대식세포에서 염증 신호를 생성한다.
실시예 8. 인게이저와 가속화된 회합을 용이하게 하기 위한 서열을 갖는 링커의 사용
본 실시예에서, 서로 상보성을 갖는 다중 특이적 결합 도메인들 사이에 링커를 갖도록 단핵구 또는 대식세포 특이적 인게이저를 설계한다. 도 10a~도 10c는 류신 지퍼 도메인을 포함하는 예시적인 디자인(도 10a 및 10b) 또는 상보적인 결합 영역을 포함하는 합리적으로 설계된 합성 서열(도 10c)을 나타낸 것이다. 본 명세서에서 개시된 예시적인 링커 서열을 사용한다. 구체적인 작제물에서, 삼량체를 이량체화하는 링커 도메인을 이용하여 유용한 도메인을 아주 근접하게 생성한다. 이종 동의(heteromeric) 바인더 도메인을 더 가깝게 결합하는데 있어서 류신 지퍼 도메인 및 커플링 단백질 도메인의 예시적인 사용을 이들 도면에서 도시한다.
실시예 9. 골수 세포 바인더 도메인을 선택하기 위한 스크리닝
본 실시예에서, 본 출원에서 기재된 인게이저에 대한 결합 도메인을 설계하는데 유용할 수 있는 골수 세포 또는 이의 기능성 단편 상의 세포 표면 분자를 선택하기 위한 스크리닝을 착수한다. 결합 도메인은 식세포 작용 수용체 인게이저 또는 활성 인자일 수 있다. 이제 이해되는 바와 같이, 포식 세포 상의 모든 포식 세포 표면 수용체가 전염증 신호 전달을 생성하거나 어떤 방식으로든 단핵구 또는 대식세포 이펙터 기능을 강화하도록 유도되거나 활성화되는 동등한 능력을 갖는 것은 아니다. 따라서, 단핵구 또는 대식세포 및 다른 골수 세포를 이용하여 암을 사멸시키기 위해, 일련의 신호 1 및 신호 2 표적을 골수 세포 상에서 생성한다. 이러한 표적들을 면역 관용 뿐만 아니라 염증과 관련된 물질의 스크리닝을 통해 확인하였다.
이는 슬라이드에 발견되는 발현 벡터의 독점적 배열 - 5,500개 이상의 전장 사람 원형질막과 테더링된 분비 단백질을 인코딩함 - 을 사용하는 고유한 도구를 사용하여 수행된다. 상단에 걸쳐 성장된 사람 세포는 역 형질 감염되어 특유의 슬라이드 위치에서 각각의 각 단백질의 세포 표면 발현을 초래한다. 그 다음, 테스트 제형을 적용하고, 적절한 검출 시스템을 사용하여 특이적 결합을 분석 및 확인한다. 그 다음, 이러한 히트를 조사하고 단핵구 또는 대식세포 결합 및 조절에 대한 잠재적인 표적으로서 검사하였다.
그 다음, 특정의 유용한 결합제 또는 스크리닝으로부터 식별된 도메인을 역전사하고 렌티바이러스 발현 벡터로 클로닝하여 제2 결합 도메인 또는 인게이저 BiME 또는 TriME 작제물을 생성한다. 스크리닝으로부터 생성된 고도의 식세포 수용체 결합 도메인으로부터 하나 이상의 도메인을 사용하여, BiME 또는 TriME를 인코딩하는 재조합 핵산을 생성할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MYELOID THERAPEUTICS, INC. <120> MACROPHAGE SPECIFIC ENGAGER COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 56371-703.601 <140> PCT/US2020/037312 <141> 2020-06-11 <150> 62/908,978 <151> 2019-10-01 <150> 62/860,055 <151> 2019-06-11 <160> 160 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Any amino acid <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ala Val Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Met Ile Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Xaa Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Ser Arg Ser Leu Pro Met Gly 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ala Val Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Met Ile Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Thr Arg Ser Leu Pro Met Gly 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Phe Ser Leu Tyr Asp 20 25 30 Met Gly Trp Phe Ser Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Lys Pro Ala Lys Tyr His Phe Gly Ser Gly Tyr Arg Asp Phe Ala 100 105 110 Glu Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (99)..(99) <223> Any amino acid <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg His Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Val Ser Gln Ser Gly Leu Leu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys 85 90 95 Ala Ala Xaa Ser Arg Phe Pro Leu Val Val Pro Val Ala Tyr Glu Asn 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg His Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Val Ser Gln Ser Gly Leu Leu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Ser Arg Phe Pro Leu Val Val Pro Val Ala Tyr Glu Asn 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Ile Arg Thr His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Ser Val Thr Ser Gly Gly Ser Leu Asn Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Lys Leu Leu Gly Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Gly Arg Phe Val 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Ser Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asn Val Val Pro Tyr Val Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly 20 25 30 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile 35 40 45 Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 50 55 60 Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 65 70 75 80 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys Ala Thr Glu 85 90 95 Asn Leu Ala Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asp Asp Arg Tyr Asn Ala 100 105 110 Cys Gly Gln Gly Thr Gln Val 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Ser Phe Phe Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Thr Tyr Gly Leu Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr 85 90 95 Ala Glu Ile Asp Thr Asp Pro Arg Ser Gly Glu Trp Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Pro Ser Thr Ser Thr Ser Ser Leu Arg 20 25 30 Thr Val Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Asp 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Synthetic peptide <400> 43 Asp Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Ser Arg Ser Leu Pro Met Gly Tyr Asp 1 5 10 15 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Asp Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Thr Arg Ser Leu Pro Met Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Lys Pro Ala Lys Tyr His Phe Gly Ser Gly Tyr Arg Asp Phe Ala Glu 1 5 10 15 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <400> 46 Xaa Ser Arg Phe Pro Leu Val Val Pro Val Ala Tyr Glu Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Asp Ser Arg Phe Pro Leu Val Val Pro Val Ala Tyr Glu Asn 1 5 10 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 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54 Asp Met Thr Met Gly 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Asn Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Leu Tyr Arg Met Gly 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Cys Ser Ala Asn Asn Asp Asn Arg Ala Phe Tyr Glu Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Cys Val Asp Arg Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Thr 1 5 10 15 Gly <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Glu Ile Asp Thr Asp Pro Arg Ser Gly Glu Trp Asp Tyr 1 5 10 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Arg Pro Val Phe Ser Asn Val Asp Tyr 1 5 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Ser Arg Tyr Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Ile Asp Tyr Asn Tyr 1 5 10 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid <400> 100 Asn Tyr Tyr Gly Ser Xaa Trp Ser Val Asn Ser Asp Asp Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 101 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Ala Gln Arg Gly Arg Tyr Tyr Tyr Leu Asp Arg Asn Val Glu Tyr Asp 1 5 10 15 <210> 102 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Phe Gly Leu Gly Ser Asp 1 5 10 15 Glu Tyr Asp Tyr 20 <210> 103 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Thr Trp Leu Asp Cys Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Asp Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Ser Thr Trp Leu Asp Phe Val His Gly Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Gly Gly Gln Glu Ile Asn Ser Ser Tyr Gly Gly 1 5 10 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Gly Gly Ser Met Pro Asn Pro Met Val Gly Gly 1 5 10 <210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Gly Gly Gly Leu Gln Gln Val Leu Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Gly Gly Tyr Ala Pro Gln Arg Leu Pro Gly Gly 1 5 10 <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Gly Gly Ala Pro Pro His Ala Leu Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Gly Gly Val Val Pro Thr Pro Pro Tyr Gly Gly 1 5 10 <210> 111 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 35 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Synthetic peptide <400> 128 Gly Gly Glu Leu Ala Pro Asp Ser Pro Gly Gly 1 5 10 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Gln Glu Ile Asn Ser Ser Tyr 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Ser His Pro Arg Leu Ser Ala 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Ser Met Pro Asn Pro Met Val 1 5 <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Gly Leu Gln Gln Val Leu Leu 1 5 <210> 133 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 His Glu Leu Ser Val Leu Leu 1 5 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 134 Tyr Ala Pro Gln Arg Leu Pro 1 5 <210> 135 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 135 Thr Pro Arg Thr Leu Pro Thr 1 5 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 136 Ala Pro Val His Ser Ser Ile 1 5 <210> 137 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 137 Ala Pro Pro His Ala Leu Ser 1 5 <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 138 Thr Phe Ser Asn Arg Phe Ile 1 5 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 139 Val Val Pro Thr Pro Pro Tyr 1 5 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 140 Glu Leu 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Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 144 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 144 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 35 40 45 Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Met Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ser 65 70 75 80 Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala 85 90 95 Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 100 105 110 Cys Thr Arg Arg Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 145 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 145 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 146 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 147 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 148 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 148 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 149 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 149 His His His His His His 1 5 <210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 150 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 151 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 151 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val 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of substitutions and preferred embodiments <400> 157 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 158 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 158 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 159 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 159 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 160 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 1-4 'Glu Ala Ala Ala Lys' repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 160 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys 20

Claims (81)

  1. 제1 치료제를 포함하는 조성물로서,
    상기 치료제는,
    (a) 표적 세포 상의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및
    (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 제2 결합 도메인
    을 포함하며; 여기서,
    (i) 상기 제1 치료제가, 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인인 제1 성분에 커플링되거나, 또는
    (ii) 상기 조성물이 추가의 치료제를 포함하는, 조성물.
  2. 치료제를 포함하는 조성물로서, 상기 치료제는, (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 결합 도메인, (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 결합 도메인, 및 (c) 상기 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제3 결합 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 골수 세포는 단핵구 세포 또는 대식세포인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 상기 제2 결합 도메인은 상기 골수 세포의 식세포 또는 테더링 수용체와 상호 작용하는 것인 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 상기 제3 결합 도메인은 상기 골수 세포의 제1 식세포 또는 테더링 수용체의 세포외 영역과 상호 작용하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제의 결합 도메인 중 어느 하나는, 항체의 결합 도메인, 항체의 기능성 단편, 이의 가변 도메인, VH 도메인, VL 도메인, VNAR 도메인, VHH 도메인, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, 이중 특이적 항체, 디아바디, 또는 이들의 기능성 단편 또는 조합을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 암 항원 또는 상기 표적 세포 상의 병원성 항원 또는 자가 면역 항원인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 바이러스 항원인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 T 림프구 항원인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 세포외 항원인 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 세포내 항원인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은, 티미딘 키나아제(TK1), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(HPRT), 수용체 타이로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 뮤신-1, 뮤신-16(MUC16), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 vIII(EGFRvIII), 메소텔린, 사람 상피 세포 성장 인자 수용체 2(HER2), 메소텔린, EBNA-1, LEMD1, 포스파티딜 세린, 암배아 항원(CEA), B 세포 성숙 항원(BCMA), 글리피칸 3(GPC3), 여포 자극 호르몬 수용체, 섬유 아세포 활성화 단백질(FAP), 에리트로포이에틴 생산 간세포 암종 A2(EphA2), EphB2, 자연 살해 군 2D(NKG2D) 리간드, 디시알로강글리오사이드 2(GD2), CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD45, CD56CD79b, CD97, CD117, CD123, CD133, CD138, CD171, CD179a, CD213A2, CD248, CD276, PSCA, CS-1, CLECL1, GD3, PSMA, FLT3, TAG72, EPCAM, IL-1, 인테그린 수용체, PRSS21, VEGFR2, PDGFR-베타, SSEA-4, EGFR, NCAM, 프로스타아제, PAP, ELF2M, GM3, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, IGLL1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CCR4, CD8, CD30, CD45 및 CD56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 난소암 항원 또는 T 림프종 항원인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인이 결합하는 상기 표적 세포 상의 상기 항원은 인테그린 수용체인 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인 또는 상기 제3 결합 도메인은 인테그린 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인 또는 상기 제3 결합 도메인은, α1, α2, αIIb, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, α11, αD, αE, αL, αM, αV, αX, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7 및 β8로 이루어진 군으로부터 선택된 인테그린 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는, 식세포 작용 활성화 도메인을 포함하는 식세포 또는 테더링 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치료제는, 표 2a 및 표 2b에 열거된 상기 수용체들로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 또는 단백질, 또는 이들의 단편에 결합하는 것인 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 치료제는, 렉틴, 덱틴 1, CD206, 스캐빈저 수용체 A1(SRA1), MARCO, CD36, CD163, MSR1, SCARA3, COLEC12, SCARA5, SCARB1, SCARB2, CD68, OLR1, SCARF1, SCARF2, CXCL16, STAB1, STAB2, SRCRB4D, SSC5D, CD205, CD207, CD209, RAGE, CD14, CD64, F4/80, CCR2, CX3CR1, CSF1R, Tie2, HuCRIg(L), CD64, CD32a, CD16a, CD89, Fc-알파 수용체 I, CR1, CD35, CR3, CR4, Tim-1, Tim-4 및 CD169로 이루어진 군으로부터 선택된 식세포 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는, 전염증 신호 전달 도메인(pro-inflammatory signaling domain)을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 치료제는, 1000개 아미노산 또는 1000 nm 길이 미만인 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 치료제는, 500개 아미노산 또는 500 nm 길이 미만인 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 치료제는, 200~1000개의 아미노산 또는 200~1000 nm의 길이인 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 치료제의 상기 결합 도메인들의 관여(engagement)는, 상기 암 세포를 상기 골수 세포에 접촉시키는 것인 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 식세포 작용 활성을 촉진하는 것인 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 골수 세포의 염증 신호 전달을 촉진하는 것인 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은, 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 대한 상기 골수 세포의 부착을 촉진하는 것인 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 의해 매개되는 상기 골수 세포의 항식세포 활성을 억제하는 것인 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은, 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 의해 매개되는 상기 골수 세포의 항염증 활성을 억제하는 것인 조성물.
  31. 제2항에 있어서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 골수 세포의 식세포 활성을 촉진하는 것인 조성물.
  32. 제2항에 있어서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은 상기 골수 세포의 염증 신호 전달을 촉진하는 것인 조성물.
  33. 제2항에 있어서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은, 골수 세포 또는 부착 분자와 특이적으로 상호 작용하고 상기 표적 세포에 대한 상기 골수 세포의 부착을 촉진하는 것인 조성물.
  34. 제2항에 있어서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은, 상기 표적 세포에 의해 매개되는 상기 골수 세포의 항식세포 활성을 억제하는 것인 조성물.
  35. 제2항에 있어서, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은, 상기 표적 세포에 의해 매개되는 상기 골수 세포의 항염증 활성을 억제하는 것인 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 치료학적 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는, 상기 치료학적 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  38. 제1항에 있어서, 상기 제3 결합 도메인 또는 상기 추가의 치료제는, CD47 길항제, CD47 차단제, 항체, 키메라 CD47 수용체, 시알리다아제, 사이토카인, 전염증 유전자, 프로카스파아제 또는 항암제를 포함하는 것인 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인, 상기 제2 결합 도메인 및 상기 제3 결합 도메인은, 특유의 비동일 표적 항원에 결합하는 것인 조성물.
  40. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인, 상기 제2 결합 도메인 또는 상기 제3 결합 도메인은 리간드 결합 도메인인 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 작동 가능하게 연결되는 것인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 링커는 폴리펩타이드인 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 링커는 기능성 펩타이드인 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 링커는 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 링커는 단핵구 또는 대식세포 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 링커는 상기 수용체를 활성화하는 것인 조성물.
  47. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 링커는 상기 수용체를 억제하는 것인 조성물.
  48. 제44항에 있어서, 상기 링커는 M2 대식세포 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  49. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 링커는 TLR4와 같은 TLR 수용체에 대한 리간드인 조성물.
  50. 제43항, 제44항, 제45항, 제46항, 제48항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 TLR 수용체를 활성화하는 것인 조성물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 상기 제2 및/또는 상기 제3 결합 도메인은, 상기 결합 도메인에 결합하는 마스크와 회합되는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 마스크는, 상기 마스크가 상기 결합 도메인의 각각과 회합된 채로 유지될 때, 이의 표적에 대한 결합 도메인의 상호 작용을 억제하는 억제제인 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 마스크는 펩타이드 링커를 통해 상기 결합 도메인과 회합되는 것인 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 절단 가능한 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
  55. 제53항에 있어서, 상기 절단 가능한 모이어티는, 상기 암 또는 종양의 부위에 선택적으로 풍부한 단백질 또는 효소에 의해 절단되는 것인 조성물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대식세포의 제2 수용체의 세포외 영역과 특이적으로 상호 작용하는 상기 제3 결합 도메인은 상기 대식세포를 활성화하는 것인 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 세포에 대한 상기 치료제의 결합시, 상기 골수 세포의 사멸 또는 식세포 작용 활성은, 입자 흡수 검정(particle uptake assay)에 의해 측정될 때, 상기 치료제에 의해 결합되지 않은 골수 세포와 비교하여 적어도 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 90% 또는 100% 만큼 증가되는 것인 조성물.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 치료제의 상기 결합 도메인들의 관여는, 상기 골수 세포에 의한 상기 암 세포의 식세포 작용을 촉발하는 것인 조성물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 치료제의 관여는, 상기 골수 세포에 의한 상기 암 세포의 식세포 사멸을 강화하거나 증가시키는 것인 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcRn, TRIM21, FcRL5의 세포외 영역에 결합하는 것인 조성물.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 M2 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 LIGHT 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 HVEM 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 또는 상기 제3 결합 도메인은 GITR 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  65. 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 상기 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 제1 치료제 및 허용되는 약제학적 염 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 하나 이상의 폴리펩타이드는,
    (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및
    (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 제2 결합 도메인
    을 포함하고;
    (i) 상기 제1 치료제가, 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인인 제1 성분 에 커플링되거나, 또는
    (ii) 상기 조성물이 추가의 치료제를 포함하는 것인 약학 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 제1 치료제는 단일 폴리펩타이드를 포함하는 것인 약학 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 상기 제1 치료제는 복수의 폴리펩타이드를 포함하는 것인 약학 조성물.
  68. 제65항에 있어서, 상기 제1 치료제는, 상기 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산인 약학 조성물.
  69. 제65항에 있어서, 제2 치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  70. 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 대상체의 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    상기 약학 조성물은, 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 상기 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 제1 치료제 및 허용되는 약제학적 염 또는 부형제를 포함하고,
    상기 하나 이상의 폴리펩타이드는,
    (a) 표적 세포의 항원과 특이적으로 상호 작용하는 제1 항체 또는 이의 기능성 단편인 제1 결합 도메인, 및
    (b) 골수 세포와 특이적으로 상호 작용하는 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 제2 결합 도메인
    을 포함하며;
    (i) 상기 제1 치료제가, 추가의 치료제 또는 제3 결합 도메인인 제1 성분 에 커플링되거나, 또는
    (ii) 상기 조성물이 추가의 치료제를 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 약학 조성물을 투여하는 단계는 상기 약학 조성물을 정맥 내로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 약학 조성물을 투여하는 단계는 상기 약학 조성물을 피하로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  74. 제70항에 있어서, 상기 약학 조성물을 투여하는 단계는 상기 약학 조성물을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
  75. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은, 서열번호 27, 28, 111, 112, 113, 115, 143 및 144로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%인 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  76. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은, 서열번호 141 및 142로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%인 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  77. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분이 아미노산 서열 GGQEINSSYGG(서열번호 105) 또는 QEINSSY(서열번호 129)를 포함하는 것인 조성물.
  78. 제1항에 있어서, 상기 제1 성분이 아미노산 서열 GGAPPHALSGG(서열번호 109) 또는 APPHALS(서열번호 137)를 포함하는 것인 조성물.
  79. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 링커가 아미노산 서열 GGQEINSSYGG(서열번호 105) 또는 QEINSSY(서열번호 129) 또는 GGAPPHALSGG(서열번호 109) 또는 APPHALS(서열번호 137)를 포함하는 것인 조성물.
  80. 서열번호 151과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%인 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저.
  81. 서열번호 152와 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%인 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 인게이저.
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