CN113474371A - 与人cd137结合的抗体的制剂及其用途 - Google Patents

与人cd137结合的抗体的制剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及包含与人CD137结合的抗体或其抗原结合片段的稳定制剂，以及所述制剂在治疗或改善适合用CD137抗体治疗的各种疾病和病症(包括癌症)的方法中的用途，以及其他。

Description

与人CD137结合的抗体的制剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求在2019年1月16日提交的美国临时专利申请序列号62/793,342和在2020年1月13日提交的美国临时专利申请序列号62/960,501的权益，其各自内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术
近年来，越来越多的证据表明免疫系统作为肿瘤形成和发展的重要屏障而运转。癌症患者中存在具有抗肿瘤潜力或活性的天然存在的T细胞这一认知合理解释了免疫疗法在肿瘤学中的发展。免疫细胞，例如T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，能表现出抗肿瘤活性，并有效控制恶性肿瘤的发生和生长。肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原能诱导免疫细胞识别和消除恶性肿瘤(Chen&Mellman,(2013)Immunity 39(1):1-10)。尽管存在肿瘤特异性免疫应答，但恶性肿瘤往往通过多种免疫调节机制逃避或避免免疫攻击，导致无法控制肿瘤的发生和发展(Motz&Coukos,(2013)Immunity39(1):61-730)。事实上，癌症的一个新兴方向是开发这些免疫调节机制并使导致肿瘤逃避和逃逸免疫杀伤的抗肿瘤免疫应答失效(Hanahan and Weinberg(2011)Cell 144(5):646-674)。
癌症免疫治疗的新方法包括抵制这些免疫逃避和逃逸机制，并诱导内在免疫系统对抗肿瘤。CD137(也称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员9”(TNFRSF9)、4-1BB和“由淋巴细胞激活诱导”(ILA))是一种跨膜共刺激受体蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族。CD137是一种TCR激活时诱导的T细胞共刺激受体(Nam et al.,(2005)Curr Cancer Drug Targets 5:357-363；Watts et al.,(2005)Annu Rev Immunol 23:23-68)。除了在活化的CD4+和CD8+T细胞上表达外，CD137还在CD4+CD25+调节性T细胞、活化的自然杀伤(NK)和NK-T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞上表达。
在生理条件下，CD137与CD137配体(CD137L)连接，后者是一种存在于抗原呈递细胞(包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)上的激动剂膜分子(Watts et al.,(2005)Annu Rev Immunol 23:23-68)。在与其配体相互作用时，CD137导致增加的TCR诱导的T细胞增殖、细胞因子产生、功能性成熟(functional maturation)和延长的CD8+T细胞存活。使用多种激动剂(例如激动性抗体、重组CD137L蛋白和CD137特异性适体)的CD137共刺激使免疫系统能够攻击肿瘤的潜力已在许多模型中有记录(Dharmadhikari et al.,(2016)Oncoimmunology 5(4):e1113367及其中参考资料)。对激动性CD137抗体的临床评估的一份近期报告(乌瑞芦单抗(Urelumab)，BMS-663513；Bristol-Myers Squibb)记录了在人受试者中观察到的与治疗有关的不良事件，包括与抗体剂量相关的严重肝毒性症状(转氨酶升高(transaminitis))(Segal et al.,(2016)Clin Cancer Res 23(8):1929-1936)。相比之下，一种不同的激动性CD137抗体(乌托鲁单抗(Utomilumab)，PF-05082566；Pfizer)与抗PD-1抗体(派姆单抗(pembrolizumab))组合测试，虽未导致任意剂量限制性毒性，但显示出与单独的抗PD-1抗体疗法相当的结果(Tolcher,A.et al.,(2017)Clin Cancer Res 23(18):5349-5357)。
开发治疗性抗体的挑战之一是蛋白稳定性。抗体具有三维结构，称为三级结构，其对氨基酸官能团与外部环境之间的分子内和分子间相互作用的平衡敏感。非共价相互作用对于维持抗体的天然折叠结构至关重要。此外，折叠的抗体结构处于动态平衡状态，且任意改变相互作用平衡的因素都能导致结构发生变化。这造成了不稳定的大分子。例如，当天然抗体结构解折叠至中间状态或变性状态时，蛋白变体易于聚集(Awwad et al.,Pharmaceutics,2018,10,83；doi:10.3390/pharmaceutics10030083)。
许多因素能导致蛋白聚集，这包括温度、机械、物理和冷冻/解冻应激。因此，抗体开发的障碍之一是稳定抗体制剂的开发。已使用赋形剂，通过减少蛋白动力和运动、增加抗体的构象稳定性和抑制聚集，增加抗体制剂的稳定性。然而，由于抗体序列的差异，用于一种抗体制剂中的赋形剂可能不适合用于另一种抗体(Awwad et al.)。因此，对于稳定抗体制剂，包括包含与人CD137结合的新型激动性抗体的稳定制剂的开发仍然存在未满足的需求。
发明内容
本公开至少部分基于在动物中表现出保护性抗肿瘤免疫的新型激动剂抗CD137抗体及其制剂的发现。值得注意的是，本文所述的抗体对多种肿瘤类型且在很宽的剂量范围内均有效。此外，如工作实施例中举例说明的，本文所述的抗体对非常大的肿瘤具有治疗效果。例如，用本文所述的激动剂抗CD137抗体治疗荷瘤小鼠导致了大至1,800mm3的肿瘤完全消退。如图15所示，对此类小鼠的治疗还产生了保护性免疫。且与观察到的功效相符合的是肿瘤微环境中的阳性免疫表型变化，例如增加的免疫细胞浸润以及调节性T细胞和耗竭的T细胞群体的伴随性减少(参见，例如，图22A-22D)。
如上所述，CD137的激动与某些不良事件相关联，包括人类中与肝毒性有关的死亡(参见，例如，Segal et al.(2017)Clin Cancer Res 23(8):1929-1935)。在动物模型中也已观察到由激动剂抗CD137抗体(例如3H3抗体)治疗产生的类似毒性(参见，例如，Bartkowiak et al.(2018)Clin Cancer Res 24(5):1138-1151)。然而，本文所述的激动剂抗CD137抗体对肝的影响很小，这由例如肝酶(例如丙氨酸转氨酶(ALT))的血浆水平和免疫细胞浸润所确定。例如，没有证据表明用抗体治疗的小鼠的肝内或脾内免疫细胞浸润增加。因此，本文所述的抗体不仅高度有效，还避免了与CD137激动相关的某些毒性。
尽管本公开不受任意特定理论或作用机制的约束，但认为本文所述抗体优秀的治疗性质和毒性适度的性质部分源自其亲和力和其所结合的新表位的一者或两者。即，本文所述的抗体共具一个与其他激动剂抗-CD137抗体的表位不同的共同的新表位。并且，如工作例中举例说明的，相比于与CD137的不同表位结合的激动剂抗体，本文所述抗体与这个表位的结合产生了分化的体外活性，例如对调节性T细胞增殖、CD8+T细胞和巨噬细胞产生的细胞因子以及细胞内信号传导的作用。此外，已经证明抗体的亲和力范围(“甜点(sweetspot))对于抗肿瘤活性最佳。例如，与具有较高或较低亲和力的抗体相比，中等亲和力的抗体显示对大的肿瘤更有效。
本公开至少部分涉及稳定的抗CD137抗体制剂。值得注意的是，本公开的抗CD137抗体制剂保持了抗体或其抗原结合片段的稳定性，使抗体聚集物(高分子量物质)和微粒(particulate)的形成最小化，降低了电荷变体的百分比，并保持了抗体的结构完整性。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和包含组氨酸的缓冲液。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含组氨酸的缓冲液，和二糖。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH值为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约50mM至200mM的NaCl，其中制剂的pH值为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH值为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约50mM至200mM的NaCl，其中制剂的pH值为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，包含约20mM组氨酸的缓冲液，约10％(重量/体积(w/v))的蔗糖，约0.03％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约100mM的NaCl，其中制剂的pH值为约6.0。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗CD137抗体包含DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ IDNO:127)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在本公开的任意前述或相关方面中，抗CD137抗体包含DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQ ID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在本公开的任意前述或相关方面中，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂的抗-CD137抗体包含SEQ IDNO:68的重链CDR3。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗CD137抗体包含SEQ ID NO:48的重链CDR1、SEQ ID NO:56的重链CDR2和SEQ ID NO:68的重链CDR3，以及SEQ ID NO:69的轻链CDR1、SEQID NO:78的轻链CDR2和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗CD137抗体包含SEQ ID NO:51的重链CDR1、SEQ ID NO:108的重链CDR2和SEQ ID NO:68的重链CDR3，以及SEQ ID NO:69的轻链CDR1、SEQ ID NO:78的轻链CDR2和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:4和6具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链和轻链序列。在一些方面，抗CD137抗体包含分别具有如SEQ ID NO:4和6所示的氨基酸序列的重链和轻链序列。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:101和6具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链和轻链序列。在一些方面，抗CD137抗体包含分别具有如SEQ ID NO:101和6所示的氨基酸序列的重链和轻链序列。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗体包含IgGl重链恒定区。在一些方面，IgGl重链恒定区是野生型人IgGl重链恒定区。在一些方面，IgGl重链恒定区包含相对于野生型人IgGl重链恒定区的氨基酸取代。
在本公开的任意前述或相关方面中，抗体包含IgG4重链恒定区。在一些方面，IgG4重链恒定区是野生型人IgG4重链恒定区。在一些方面，IgG4重链恒定区包含相对于野生型人IgG4重链恒定区的氨基酸取代。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，和包含组氨酸的缓冲液。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，和包含组氨酸的缓冲液。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，和包含组氨酸的缓冲液。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，和二糖。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，和二糖。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，和二糖。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
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在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含约20mM组氨酸的缓冲液，约10％(重量/体积(w/v))的蔗糖，约0.03％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约100mM的NaCl，其中制剂的pH值为约6.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，包含约20mM组氨酸的缓冲液，约10％(重量/体积(w/v))的蔗糖，约0.03％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约100mM的NaCl，其中制剂的pH值为约6.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，和包含组氨酸的缓冲液。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含组氨酸的缓冲液，和二糖。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约50mM至200mM的NaCl，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.4的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约50mM至200mM的NaCl，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:4和6所示的重链和轻链可变序列，包含约20mM组氨酸的缓冲液，约10％(重量/体积(w/v))的蔗糖，约0.03％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约100mM的NaCl，其中制剂的pH为约6.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含分别如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，和包含组氨酸的缓冲液。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含组氨酸的缓冲液，和二糖。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约50mM至200mM的NaCl，其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，和包含组氨酸的缓冲液，其中制剂具有约5.0-7.4的pH。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含组氨酸的缓冲液，二糖，非离子表面活性剂，和盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的二糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和约50mM至200mM的盐，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约50mM至200mM的NaCl，其中制剂的pH为约5.0至约7.4。
在一些方面，本公开提供了包含以下的制剂：浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:129和133所示的重链和轻链氨基酸序列，包含约20mM组氨酸的缓冲液，约10％(重量/体积(w/v))的蔗糖，约0.03％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和约100mM的NaCl，其中制剂的pH为约6.0。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂包含组氨酸。在一些方面，本公开的制剂包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些方面，制剂包含约20mM组氨酸。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂包含二糖。在一些实施方案中，二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。在一些实施方案中，二糖是蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约5％至约15％(重量/体积)的二糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约10％(重量/体积)的二糖。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂包含盐。在一些方面，盐是NaCl。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约50mM至200mM的盐。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约100mM的盐。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂具有约5.0-7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0的pH。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂具有约5.0-8.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0-7.4的pH。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂包含非离子表面活性剂。在一些方面，非离子表面活性剂是聚山梨酯。在一些方面，聚山梨酯是聚山梨酯-80。在一些方面，本公开的制剂包含约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂。在一些方面，本公开的制剂包含约0.03％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂。
在本公开的任意前述或相关方面中，本公开的制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约5mg/ml至约15mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约15mg/ml至约30mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约30mg/ml至约45mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约45mg/ml至约60mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约60mg/ml至约75mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约75mg/ml至约90mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约85mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约5mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约10mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约15mg/ml的抗CD137抗体。在一些方面，本公开的制剂包含浓度为约20mg/ml的抗CD137抗体。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的二聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的多聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中的T细胞激活的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。在一些方面，T细胞激活发生在肿瘤微环境中。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中的细胞毒性T细胞应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。在一些方面，细胞毒性T细胞应答发生在肿瘤微环境中。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中免疫细胞的细胞因子产生的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2、TNFα、IL-13、IFN-γ或其组合。在一些方面，细胞因子产生发生在肿瘤微环境中。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中的T细胞增殖的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。在一些方面，T细胞增殖发生在肿瘤微环境中。
在一些方面，本公开提供了一种减少或抑制肿瘤生长的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。
在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者中由人CD137介导的病症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。
在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。
在任一前述方面中，在施用制剂后，免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润增加。在一些方面，免疫细胞表达CD45。
在任一前述方面中，在施用制剂后，肿瘤微环境中调节性T(Treg)细胞的数量减少。在一些方面，Treg细胞表达CD4、FOXP-3和CD25。
在任一前述方面中，在施用分离的单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中巨噬细胞的数量减少。在一些方面，巨噬细胞表达CD45和CD11b。
在任一前述方面中，在施用分离的单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中的T细胞耗竭(Tcell exhaustion)减少。在一些方面，T细胞耗竭的减少包括TIGIT、PD-1、LAG-3或其组合的表达减少。
在任一前述方面中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、血液癌症和头颈癌。在一些方面，血液癌症是B细胞淋巴瘤。
在一些方面，本公开提供了一种诱导抗肿瘤记忆免疫应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本公开的制剂。
在任一前述方面中，抗CD137抗体与Fcγ受体结合。
在任一前述方面中，CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞或其组合的消减(depletion)降低了制剂的功效。
在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含含有本公开的制剂的容器和含有施用制剂的说明的包装插页，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含含有本公开的制剂的容器，和含有单独施用制剂或将其与另一种药剂组合施用的说明的包装插页，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
在一些方面，本公开提供了本公开的制剂在制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物中的用途。
在一些方面，本公开提供了本公开的制剂，用于制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物的用途。
在一些方面，本公开提供了本公开的制剂，用作药物。
鉴于上述，在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约40nM至约100nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些方面，本公开提供了与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约110nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些方面，抗CD137抗体对人CD137的亲和力比mAb10对小鼠CD137的亲和力高至少两倍(例如，至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍)。在一些方面，抗CD137抗体的亲和力不高于500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、250nM、200nM、175nM、150nM、125nM、110nM或100nM。在一些方面，抗CD137抗体对人CD137的亲和力比mAb10对小鼠CD137的亲和力高至少两倍(例如，至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍)，但不高于500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、250nM、200nM、175nM、150nM、125nM、110nM或100nM。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分与人CD137上的表位结合，所述表位包含SEQ IDNO:3的氨基酸111-132中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或全部25个)。在一些方面，本公开提供了与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分与SEQ ID NO:3的氨基酸111-132内的表位结合。在一些方面，本公开提供了与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分与SEQ ID NO:3的氨基酸111-132的全部或部分结合。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的K114。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113和K114。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126和I132。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114和P135。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135。在一些方面，抗体或其抗原结合部分以约30nM至约100nM之间(例如，约30nM至约110nM之间)的亲和力与人CD137结合。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约40-100nM(例如，约40nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，并与人CD137上的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:3的K114。在一些方面，本公开提供了与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，并与人CD137上的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:3的K114。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113和K114。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126和I132。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114和P135。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，并与人CD137上的表位结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列。在一些方面，表位包含对应于SEQID NO:3的氨基酸位置111至135的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，并与人CD137上的表位结合，所述表位位于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-135内。在一些方面，表位是至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。在一些方面，表位少于25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，并与人CD137上的表位结合，所述表位包含ELTK(对应于SEQ IDNO:3的氨基酸残基111-114)。在一些方面，表位进一步包含SEQ ID NO:3的残基N126、I132和P135的一个或多个。
在任一前述方面中，表位是非线性表位。在任一前述方面中，SEQ ID NO:3的残基K114的突变消除了抗体或其抗原结合部分与人CD137的结合。
在任一前述方面中，本文所述的抗体或抗原结合部分以约30-100nM、30-95nM、45-95nM、50-90nM、55-85nM、60-80nM、65-75nM、55-75nM、40-70nM、50-80nM或60-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些方面，抗体或抗原结合部分与人CD137的细胞外结构域的非配体结合区结合。在一些方面，抗体或抗原结合部分不抑制CD137和CD137L之间的相互作用。在一些方面，非配体结合区跨越富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)III和CRDIV。在任一前述方面中，抗体或抗原结合部分不抑制CD137:CD137L单体的三聚体的形成。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分：
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与人CD137的细胞外结构域的非配体结合区结合；和
(iii)与人CD137上的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:3的K114。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分：
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)不抑制人CD137和人CD137配体之间的相互作用；和
(iii)与人CD137上的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:3的K114。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分：(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，和(ii)不抑制CD137:CD137L单体的三聚体(即，CD137:CD137L三聚体:三聚体复合物)的形成。在一些方面，本公开的特点在于以下：与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分：(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，和(ii)与人CD137的细胞外结构域的非配体结合区结合。在一些方面，本公开的特点在于与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或抗原结合部分：(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，和(ii)不抑制人CD137和CD137配体之间的相互作用。
在任一前述方面中，抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在一些方面，抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在任一前述方面中，重链CDR3的残基D95、L100、Y100E、Y100G、Y100H或其组合突变为丙氨酸导致丧失与人CD137的结合。在任一前述方面中，残基P97、F98、D100A、Y100D、Y100F或其组合突变为丙氨酸导致与人CD137的结合降低。在任一前述方面中，抗体或抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；和
(ii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在一些实施方案中，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在另一个方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；和
(ii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQ IDNO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；和
(ii)抗体或其抗原结合部分与人CD137上的表位特异性结合，所述表位包含SEQID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与人CD137上的表位特异性结合，所述表位包含SEQID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个；
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与人CD137上的表位特异性结合，所述表位包含SEQID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个；
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与人CD137上的表位特异性结合，所述表位包含SEQID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个；和
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与人CD137上的表位特异性结合，所述表位包含SEQID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个；和
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在任一前述方面中，表位包含K114。在任一前述方面中，表位包含E111、T113和K114。在任一前述方面中，表位包含E11、T113、K114、N126和I132。在任一前述方面中，表位包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；和
(ii)抗体或其抗原结合部分与表位特异性结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与表位特异性结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列；
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与表位特异性结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列；
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在另一个方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与表位特异性结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列；和
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在另一个方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与表位特异性结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列；和
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在任一前述方面中，表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力与人CD137结合；和
(ii)抗体或其抗原结合部分与表位特异性结合，所述表位包含ELTK(对应于SEQID NO:3的氨基酸残基111-114)。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位特异性结合；
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位特异性结合；
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在一些方面，本公开提供了与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位特异性结合；和
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中
(i)抗体或抗原结合部分以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)抗体或其抗原结合部分与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位特异性结合；和
(iii)抗体或抗原结合部分包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQID NO:128)的重链CDR3，X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在一些方面，X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
在任一前述方面中，表位包含SEQ ID NO:3的残基ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)。在一些方面，表位包含SEQ ID NO:3的ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)和SEQ ID NO:3的残基N126、I132和P135。
在任一前述方面中，表位是非线性表位。在一些方面，人CD137(SEQ ID NO:3)的残基K114的突变消除了抗体或其抗原结合部分与人CD137的结合。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含含有氨基酸序列DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:128)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。在一些方面，本文所述的抗体或抗原结合部分的重链CDR3的残基D95、L100、Y100E、Y100G、Y100H或其组合的突变导致丧失与人CD137的结合。在一些方面，本文所述的抗体或抗原结合部分的重链CDR3的残基P97、F98、D100A、Y100D、Y100F或其组合突变为丙氨酸导致与人CD137的结合降低。在其他方面，本文所述的抗体或抗原结合部分的重链CDR3的残基P97、F98、D100A、Y100D、Y100F或其组合突变为除丙氨酸之外的任意残基导致与人CD137的结合增加。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分以约45-95nM、50-90nM、55-85nM、60-80nM、65-75nM、55-75nM、40-70nM、50-80nM或60-90nM的KD与人CD137结合。在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分以约45nM至约95nM、约50至约90nM、约55至约85nM、约60至约80nM、约65至约75nM、约55至约75nM、约40至约70nM、约50至约80nM或约60至约90nM的KD与人CD137结合。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(b)分别如SEQ ID NO:51、108和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，激动性的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(b)分别如SEQ ID NO:137、141和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，激动性的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(b)分别如SEQ ID NO:51、156和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4和101组成的组的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含SEQID NO:6的氨基酸序列。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；和
(b)分别为SEQ ID NO:101和6。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:4和101组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在任一前述方面中，抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；和
(b)分别为SEQ ID NO:101和6。
在任一前述方面中，抗体或抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链和轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:129和133；和
(b)分别为SEQ ID NO:131和133。
在任一前述方面中，本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分是人CD137活性的激动剂。
在任一前述方面中，本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与mAb1或mAb1的抗原结合片段竞争结合人CD137的表位。
在一些方面，本文所述的制剂包含与CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:70、79和90所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:71、80和91所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:72、81和92所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:73、82和91所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(f)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:74、83和93所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(g)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:75、84和91所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(h)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:74、85和94所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(i)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:76、86和95所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(j)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:77、87和93所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(k)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、88和90所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(l)分别如SEQ ID NO:49、57和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(m)分别如SEQ ID NO:49、58和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(n)分别如SEQ ID NO:49、59和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(o)分别如SEQ ID NO:49、60和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(p)分别如SEQ ID NO:50、61和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(q)分别如SEQ ID NO:50、58和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(r)分别如SEQ ID NO:51、62和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(s)分别如SEQ ID NO:52、63和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(t)分别如SEQ ID NO:50、64和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(u)分别如SEQ ID NO:50、65和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(v)分别如SEQ ID NO:51、108和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(w)分别如SEQ ID NO:107、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(x)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:109、110和92所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、101和103组成的组的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:6、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和105组成的组的氨基酸序列。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；和
(b)分别为SEQ ID NO:102和7。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；
(b)分别为SEQ ID NO:5和29；
(c)分别为SEQ ID NO:5和31；
(d)分别为SEQ ID NO:5和33；
(e)分别为SEQ ID NO:5和35；
(f)分别为SEQ ID NO:5和37；
(g)分别为SEQ ID NO:5和39；
(h)分别为SEQ ID NO:5和41；
(i)分别为SEQ ID NO:5和43；
(j)分别为SEQ ID NO:5和45；
(k)分别为SEQ ID NO:5和47；
(l)分别为SEQ ID NO:9和7；
(m)分别为SEQ ID NO:11和7；
(n)分别为SEQ ID NO:13和7；
(o)分别为SEQ ID NO:15和7；
(p)分别为SEQ ID NO:17和7；
(q)分别为SEQ ID NO:19和7；
(r)分别为SEQ ID NO:21和7；
(s)分别为SEQ ID NO:23和7；
(t)分别为SEQ ID NO:25和7；
(u)分别为SEQ ID NO:27和7；
(v)分别为SEQ ID NO:102和7；
(w)分别为SEQ ID NO:104和7；和
(x)分别为SEQ ID NO:5和106。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)，其中X是任意氨基酸。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含氨基酸序列DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)，其中X是任意氨基酸。在一些方面，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)，其中X是任意氨基酸，并且其中残基D95、L100、Y100E、Y100G、Y100H或以上组合的突变导致丧失与人CD137的结合。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含氨基酸序列DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)，其中X是任意氨基酸，并且其中残基P97、F98、D100A、Y100D、Y100F或以上组合突变为丙氨酸导致与人CD137的结合降低。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含氨基酸序列DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)，其中X是任意氨基酸，并且其中残基P97、F98、D100A、Y100D、Y100F或以上组合突变为除丙氨酸之外的任意残基导致与人CD137的结合增加。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQ ID NO:128)，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在一些方面，其中X2是脯氨酸，其中X3是苯丙氨酸或色氨酸，其中X5是天冬氨酸或谷氨酸，其中X8是酪氨酸，且其中X9是酪氨酸。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；
(b)分别为SEQ ID NO:4和28；
(c)分别为SEQ ID NO:4和30；
(d)分别为SEQ ID NO:4和32；
(e)分别为SEQ ID NO:4和34；
(f)分别为SEQ ID NO:4和36；
(g)分别为SEQ ID NO:4和38；
(h)分别为SEQ ID NO:4和40；
(i)分别为SEQ ID NO:4和42；
(j)分别为SEQ ID NO:4和44；
(k)分别为SEQ ID NO:4和46；
(l)分别为SEQ ID NO:8和6；
(m)分别为SEQ ID NO:10和6；
(n)分别为SEQ ID NO:12和6；
(o)分别为SEQ ID NO:14和6；
(p)分别为SEQ ID NO:16和6；
(q)分别为SEQ ID NO:18和6；
(r)分别为SEQ ID NO:20和6；
(s)分别为SEQ ID NO:22和6；
(t)分别为SEQ ID NO:24和6；
(u)分别为SEQ ID NO:26和6；
(v)分别为SEQ ID NO:101和6；
(w)分别为SEQ ID NO:103和6；和
(x)分别为SEQ ID NO:4和105。
在其他方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、101和103组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:6、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和105组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；
(b)分别为SEQ ID NO:4和28；
(c)分别为SEQ ID NO:4和30；
(d)分别为SEQ ID NO:4和32；
(e)分别为SEQ ID NO:4和34；
(f)分别为SEQ ID NO:4和36；
(g)分别为SEQ ID NO:4和38；
(h)分别为SEQ ID NO:4和40；
(i)分别为SEQ ID NO:4和42；
(j)分别为SEQ ID NO:4和44；
(k)分别为SEQ ID NO:4和46；
(l)分别为SEQ ID NO:8和6；
(m)分别为SEQ ID NO:10和6；
(n)分别为SEQ ID NO:12和6；
(o)分别为SEQ ID NO:14和6；
(p)分别为SEQ ID NO:16和6；
(q)分别为SEQ ID NO:18和6；
(r)分别为SEQ ID NO:20和6；
(s)分别为SEQ ID NO:22和6；
(t)分别为SEQ ID NO:24和6；
(u)分别为SEQ ID NO:26和6；
(v)分别为SEQ ID NO:101和6；
(w)分别为SEQ ID NO:103和6；和
(x)分别为SEQ ID NO:4和105。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链序列，所述重链和轻链序列包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:129和133；和
(b)分别为SEQ ID NO:131和133。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链序列，所述重链和轻链序列分别具有如SEQ ID NO:129和133所示的氨基酸序列。
在一些方面，本文所述的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链序列，所述重链和轻链序列分别具有如SEQ ID NO:131和133所示的氨基酸序列。
在任一前述方面中，抗体或抗原结合部分与人CD137特异性结合并将其激动。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分表现出选自由以下组成的组的特性的至少一个或多个：
(a)诱导或增强CD137三聚体的二聚化；
(b)诱导或增强CD137三聚体的多聚化；
(c)诱导或增强T细胞激活；
(d)诱导或增强细胞毒性T细胞应答；
(e)诱导或增强T细胞增殖；
(f)诱导或增强细胞因子产生；和
(g)特性(a)-(f)的任意组合。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，相对于与人CD137结合的参考抗体，表现出选自由以下组成的组的特性的至少一个或多个：
(a)不诱导或增强肝内T细胞激活；
(b)不诱导或增强肝内T细胞增殖；
(c)不诱导或增强脾内T细胞激活；
(d)不诱导或增强脾内T细胞增殖；
(e)不诱导或增强巨噬细胞激活；
(f)不诱导或增强巨噬细胞分化；
(g)不诱导或增强丙氨酸转氨酶(ALT)活性；和
(h)特性(a)-(g)的任意组合。在一些方面，参考抗体是乌瑞芦单抗(urelumab)。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导或增强人CD137介导的T细胞激活，但在脾和/或肝中不显著诱导或增强人CD137介导的T细胞激活。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导或增强T细胞激活，但在脾和/或肝中不显著诱导或增强T细胞激活。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导或增强人CD137介导的细胞毒性T细胞应答，但在脾和/或肝中不显著诱导或增强人CD137介导的细胞毒性T细胞应答。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导或增强细胞毒性T细胞应答，但在脾和/或肝中不显著诱导或增强T细胞应答。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导人CD137介导的T细胞增殖，但在脾和/或肝中不显著诱导人CD137介导的T细胞增殖。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导T细胞增殖，但在脾和/或肝中不显著诱导T细胞增殖。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导人CD137介导的T细胞浸润，但在脾和/或肝中不显著诱导人CD137介导的T细胞浸润。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在肿瘤微环境中诱导T细胞浸润，但在脾和/或肝中不显著诱导T细胞浸润。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段在肿瘤微环境中诱导或增强人CD137介导的细胞因子产生，但在脾和/或肝中不显著诱导或增强人CD137介导的细胞因子产生。
在任一前述方面中，本文所述的抗体或抗原结合部分的特性不是Fcγ受体结合依赖性的。在一些方面，本文所述的抗体或抗原结合部分的特性通过Fcγ受体结合而增强。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)交叉竞争(cross compete)。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)、mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)或mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)交叉竞争。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)交叉竞争。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)交叉竞争。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含至少mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)的功能特性。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含至少mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)、mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)或mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)的功能特性。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含至少mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)的功能特性。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含至少mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)的功能特性。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分具有至少相当于mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)的KD值。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分具有至少相当于mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)、mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)或mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)的KD值。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分具有至少相当于mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)的KD值。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分具有至少相当于mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)的KD值。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与食蟹猴(cynomolgus)CD137和/或小鼠CD137交叉反应。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分选自由以下组成的组：IgGl、IgG2、和IgG3、IgG4、和IgM、和IgAl、和IgA2、和IgD、和IgE抗体。在一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分是IgG1抗体或IgG4抗体。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体包含野生型IgGl或野生型IgG4重链恒定区。在一些方面，分离的单克隆抗体包含突变的IgGl重链恒定区。在一些方面，分离的单克隆抗体包含突变的IgG4重链恒定区。在一些方面，突变的IgG4重链恒定区包含在Ser228处的取代。在一些方面，突变的IgG4重链恒定区包含取代S228P。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与CD137的表位结合，其中包含被抗体结合的表位的氨基酸残基位于包含mAb1抗体的互补位(paratope)的氨基酸残基的4埃以内，如本文所述。
在任一前述方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与CD137的表位结合，其中被抗体结合的表位的突变抑制、降低或阻断与所述抗体和抗体mAb1两者的结合。
在任一前述方面中，分离的抗体或其抗原结合部分是完全人的或人源化的(即完全人的或人源化的抗体或其抗原结合部分)。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，包含本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。
在其他方面，本公开提供了核酸，其包含编码分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链、重链或轻链和重链两者的核苷酸序列，如本文所述。在一些方面，核酸包含SEQID NO:5和7。在一些方面，核酸包含SEQ ID NO:102和7。在一些方面，本公开提供了包含本文所述的核酸的表达载体。在其他方面，本公开提供了转化有本文所述的表达载体的细胞。
在另一个方面，本公开提供了一种产生与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括将本文所述的细胞维持在允许单克隆抗体或其抗原结合部分表达的条件下。在一些方面，产生与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的方法进一步包括获得单克隆抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的二聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。
在另一个方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的多聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。
在其他方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中由人CD137介导的T细胞激活的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。在一些方面，T细胞激活发生在肿瘤微环境中。在其他方面，T细胞激活不显著发生在受试者的脾和/或肝中。
在另一个方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中由人CD137介导的细胞毒性T细胞应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。在一些方面，细胞毒性T细胞应答发生在肿瘤微环境中。在其他方面，细胞毒性T细胞应答不显著发生在受试者的脾和/或肝中。
在一些方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中由人CD137介导的细胞因子产生的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2、TNFα、IL-13、IFN-γ或其组合。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，产生的细胞因子是TNFα。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2和TNFα。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2和IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是TNFα和IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是TNFα和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-13和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2、TNFα和IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2、TNFα和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IFN-γ、TNFα和IL-13。在其他实施方案中，细胞因子产生发生在肿瘤微环境中。在其他实施方案中，细胞因子产生不显著发生在受试者的脾和/或肝中。
在另一个方面，本公开提供了一种诱导或增强受试者中由人CD137介导的T细胞增殖的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，T细胞增殖发生在肿瘤微环境中。在其他实施方案中，T细胞增殖不显著发生在受试者的脾和/或肝中。
在另一个方面，本公开提供了一种减少或抑制肿瘤生长的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗受试者中由人CD137介导的病症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者中癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、血液癌症和头颈癌。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞淋巴瘤。
在一些方面，本公开提供了一种诱导抗肿瘤记忆免疫应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，或本文所述的药物组合物。
在任一前述方面中，在施用抗体或抗原结合部分后，免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润增加。在一些方面，免疫细胞表达CD45。
在任一前述方面中，在施用抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中调节性T(Treg)细胞的数量减少。在一些方面，Treg细胞表达CD4、FOXP-3和CD24。
在任一前述方面中，在施用单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中巨噬细胞的数量减少。在一些方面，巨噬细胞表达CD45和CD11b。
在任一前述方面中，在施用抗体或抗原结合部分后，T细胞耗竭减少。在一些方面，T细胞耗竭减少包括TIGIT、PD-1、LAG-3或其组合的表达减少。在一些方面，T细胞耗竭减少包括TIGIT和PD-1的表达减少。
在任一前述方面中，CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞或其组合的消减会降低抗体或其抗原结合部分的功效。
在另一个方面，本发明提供了一种检测生物样品中人CD137的存在或不存在的方法，包括：
(a)使生物样品与本文所述的抗体或抗原结合部分接触，其中抗体或抗原结合部分用可检测物质标记；和
(b)检测与人CD137结合的抗体或抗原结合部分，从而检测生物样品中人CD137的存在或不存在。
在另一个方面，本公开提供了一种试剂盒，包含含有本文所述的抗体或抗原结合部分和任选的药学上可接受的载体或本文所述的药物组合物的容器，和含有施用抗体或药物组合物的说明的包装插页，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
在另一个方面，本公开提供了一种试剂盒，包含含有本文所述的抗体或抗原结合部分和任选的药学上可接受的载体或本文所述的药物组合物的容器，和含有单独施用抗体或药物组合物或将其与另一种药剂组合施用的说明的包装插页，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分诱导或增强受试者中由人CD137介导的T细胞激活的用途。在其他方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分诱导或增强受试者中人CD137三聚体的多聚化的用途。在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分诱导或增强受试者中由人CD137介导的细胞毒性T细胞应答的用途。在其他方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分诱导或增强受试者中由人CD137介导的细胞因子产生的用途。在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分诱导或增强受试者中由人CD137介导的T细胞增殖的用途。
在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的用途。在其他方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分治疗有此需要的受试者中由人CD137介导的病症的用途。在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分治疗有此需要的受试者中癌症的用途。
在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物中的用途。在其他方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物。在另一个方面，本公开提供了本文所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，用作药物。
附图简要说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在提出要求并支付必要费用后由专利局提供。
图1描绘了亲本抗CD137抗体mAb1的亲和力成熟克隆的结合亲和力的分布。
图2的示意图显示了mAb1CDRH3丙氨酸扫描的结果，通过对人或小鼠CD137的结合亲和力(KD)测量。
图3A显示了人CD137的氨基酸序列，其中包含被mAb1、mAb4或mAb5结合的表位的残基以粗体表示。
图3B描绘了mAb1对小鼠和大鼠CD137的细胞外结构域的动力学结合数据，通过表面等离子体共振测定。
图3C提供了人CD137与CD137L(以灰色显示)结合的X射线晶体学图像，且残基E111、T113、K114和P135以球体显示。
图3D提供了人CD137与CD137L(以灰色显示)结合的三聚体形式的的X射线晶体学图像，且残基E111、T113、K114和P135以球体显示。
图4A提供了流式细胞术数据的散点图，其描绘了CD44+T细胞上TIGIT(上)或PD-1(下)的表达响应于抗CD137抗体而增加。
图4B描绘了用抗CD137抗体处理后，小鼠脾中表达TIGIT(上)或PD-1(下)的CD8+CD44+T细胞的定量。
图4C描绘了用抗CD137抗体处理后，小鼠脾中CD8+T细胞的定量，以CD45+细胞百分比(左)或每个脾的细胞数(右)表示。
图5A显示了用所示剂量的抗CD137抗体处理后，小鼠中的个体CT26肿瘤体积。
图5B显示了图5A中提供的平均肿瘤体积。
图5C的Kaplan-Meier图显示了用抗CD137抗体治疗后，具有肿瘤的小鼠的总体存活率。
图5D显示了用致瘤CT26细胞再攻击(re-challenged)的小鼠中的肿瘤体积。
图6A显示了用亲本和亲和力成熟的抗CD137抗体处理后，小鼠中的个体CT26肿瘤体积。
图6B提供了图6A中提供的平均肿瘤体积。
图7描绘了用所示剂量的抗CD137抗体处理后，来自脾T细胞(上)和肿瘤浸润白细胞(下)的CD8+或CD4+T细胞的百分比。
图8显示了当用mAb1且有或没有淋巴细胞消减抗体处理小鼠时的个体肿瘤体积。CD4+T细胞用GK1.5消减(中图)，CD8+T细胞用YTS169.4消减(右二图)，NK细胞用抗去唾液酸-GM1(anti-asialo-GM1)抗体消减(最右图)。
图9显示了患有CT26肿瘤(结肠癌)、EMT-6肿瘤(乳腺癌)、A20肿瘤(B细胞淋巴瘤)或MC38肿瘤(结肠癌)并用mAb8或同种型对照抗体治疗的小鼠的个体肿瘤体积。
图10A-10C显示了以150μg/小鼠施用的抗CD137抗体的体内抗肿瘤功效。个体肿瘤体积显示在10A中，平均肿瘤体积显示在10B中，存活百分比显示在10C中。
图11A-11C显示了以20μg/小鼠施用的抗CD137抗体的体内抗肿瘤功效。个体肿瘤体积显示在11A中，平均肿瘤体积显示在11B中，存活百分比显示在11C中。
图12显示了具有CT26肿瘤并用不同剂量的mAb1(即12.5、25、50、100或200μg)或同种型对照治疗的小鼠中的个体肿瘤体积。
图13A和13B显示了mAb1抗肿瘤功效中Fc结合的作用。图13A显示了mAb1作为IgG4同种型或IgG4去糖基化同种型(aglycosylated isotype)。平均肿瘤体积显示在上方，个体肿瘤体积显示在下方。图13B显示了mAb1作为IgG4同种型或IgGl去糖基化同种型。平均肿瘤体积显示在上方，个体肿瘤体积显示在下方。
图14A-14D显示了在接受治疗之前，抗CD137抗体在具有大的已建立肿瘤(即，500mm3)的小鼠中的体内抗肿瘤功效。个体肿瘤体积显示在14A和14D中，平均肿瘤体积显示在14B中，存活百分比显示在14C中。
图15的Kaplan-Meier存活图显示了先前用来自图14A-14C的mAb1、mAb8或同种型对照处理并认为已被治愈的在对侧用CT26细胞再攻击的小鼠中的保护性抗肿瘤免疫。
图16A提供流式细胞术数据的散点图，显示了用所示剂量的抗CD137抗体处理后，CD45+肝内T细胞的扩增。
图16B描绘了用所示剂量的抗CD137抗体处理后，肝内CD8+T细胞(左)和CD4+T细胞(右)的定量。
图17A描绘了用亲和力成熟的抗CD137抗体处理小鼠后，来自脾T细胞的CD3+、CD4+或CD8+T细胞的百分比。
图17B描绘了用亲和力成熟的抗CD137抗体处理小鼠后，来自肝T细胞的CD3+、CD4+或CD8+T细胞的百分比。
图18A描绘了用亲和力成熟的抗CD137抗体处理小鼠后，表达TIGIT、PD-1或LAG3的脾CD8+CD44+T细胞的百分比。
图18B描绘了用亲和力成熟的抗CD137抗体处理小鼠后，表达TIGIT、PD-1或LAG3的肝CD8+CD44+T细胞的百分比。
图19A描绘了用亲和力成熟的抗CD137抗体处理小鼠后，表达TIGIT、PD-1或LAG3的脾CD4+CD44+T细胞的百分比。
图19B描绘了用亲和力成熟的抗CD137抗体处理小鼠后，表达TIGIT、PD-1或LAG3的肝CD4+CD44+T细胞的百分比。
图20A-20C提供了由多次施用不同剂量的抗CD137抗体mAb1、mAb8或3H3引起的体内毒性指标。图20A显示了施用抗CD137抗体后，肝中CD8+T细胞的百分比。图20B显示了施用抗CD137抗体的小鼠血浆中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性。图20C显示了施用抗CD137抗体的小鼠血浆中的TNFα水平。
图21提供了来自用图20A-20C中所述的mAb1、mAb8、3H3或同种型对照处理的小鼠的肝脏切片以苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin，H&E)染色的代表性图。箭头表示免疫细胞的浸润。
图22A-22D提供了显示肿瘤微环境中免疫细胞重编程的代表性FACS图。对具有CT26肿瘤的小鼠施用多剂量的mAb8或同种型对照(第0、3、6和9天)。图22A显示了基于CD45表达的整体免疫细胞浸润。图22B显示了Treg细胞的减少，通过FOXP-3和CD25表达测量。图22C显示了T细胞耗竭的减少，通过PD-1和TIGIT表达测量。图22D显示了肿瘤相关巨噬细胞的减少，通过F4/80和CD11b表达测量。
图23显示了对来自具有CT26肿瘤并用抗CD137抗体mAb1和3H3或同种型对照处理的小鼠的脾的免疫表型分析。
图24显示了当用所示抗CD137抗体刺激时，在OVA刺激测定中由鼠T细胞产生的IL-2的浓度(pg/ml)。随同阿特朱单抗(Atezolizumab，抗PD-L1抗体)，鼠抗PD-1(RMP1-14)用作比较物(comparator)。
图25A和25B显示了在OVA刺激测定中当用所示抗CD137抗体刺激时，表达CD25(25A)或TIGIT(25B)的鼠CD8+T细胞的百分比。随同阿特朱单抗(Atezolizumab，抗PD-L1抗体)，鼠抗PD-1(RMP1-14)和鼠抗CD137(3H3)用作比较物。
图26的条形图描绘了CD3+T细胞在与平板结合的抗CD137抗体一同孵育后产生的细胞因子(IL-2、TNFα、IL-13和IFN-γ)的定量。细胞因子水平显示为抗CD3抗体相对于基线激活的倍数增加。
图27A-27C描绘了用抗CD137抗体处理后，混合淋巴细胞反应中IFN-γ产生的剂量响应。抗PD1抗体(Keytruda；Merck)用作对照。
图28显示了在抗CD137抗体mAb1、mAb8、mAb4或mAb5或同种型对照存在下，与经工程化以表达CD32的CHO细胞(CHO-CD32细胞)共培养的人T细胞的IFN-γ产生。
图29显示了当在抗CD137抗体mAb1、mAb8、mAb4或mAb5、同种型对照存在或不存在下与经工程化以表达CD32的CHO细胞(CHO-CD32细胞)共培养时，Treg细胞的增殖。
图30显示了在不同浓度的mAb1、mAB8、mAb4或mAb5存在下，用NFκβ或SRF的荧光素酶报告子转导的CCL-119细胞中的NFκβ和SRF信号传导。
图31显示了在抗CD137抗体mAb1、3H3或LOB12.3或同种型对照存在下，用TLR9激动剂CpG刺激的骨髓来源的小鼠巨噬细胞对IL-6、TNFα或IL-27的诱导。
图32显示了在抗CD137抗体mAb1、mAb4或mAb5或同种型对照存在下，用LPS刺激的人单核细胞衍生的巨噬细胞对TNFα的诱导。
图33显示了抗CD137抗体对巨噬细胞分化的影响，通过在抗CD137抗体mAb1、mAb4或mAb5或同种型对照存在下用PMA培养的THP1单核细胞的CD64表达测定。
图34A-34C显示了接受人PBMC和抗CD137抗体mAb1、mAb4或mAb5或同种型对照的免疫活性小鼠的hCD45+、hCD8+或hCD4+百分比。
图35图示了对在不同pH值的三个缓冲液中的并储存在4℃或25℃温度下长达4周的高浓度(100mg/mL)mAb1的cIEF电荷变体分析。
图36图示了对在40℃下于不同pH值的三种缓冲液中长达4周的5mg/mL的mAb1的cIEF电荷变体分析。
图37描绘了10倍稀释于5％、0.5％或0.1％右旋糖溶液、0.9％盐水或纯水中并在室温下孵育三天后，mAb1的尺寸排阻色谱图谱。术语右旋糖与术语葡萄糖可互换使用。
图38图示了10倍稀释于5％、0.5％或0.1％右旋糖溶液、0.9％盐水或纯水中并在室温下孵育三天后，mAb1的动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)结果。
图39图示了对2-80mm的亚可见颗粒的微流成像分析。所述分析是使用经历了三个循环的-30℃/室温的冻融和三次通过带有内置5μm过滤器的针或带有内置5μm过滤器的排气针(vented needle)的含10mg/mL的mAb1的本公开制剂进行的。
具体实施方式
本公开提供了与人CD137特异性结合并激动人CD137的抗CD137抗体或其抗原结合片段的各种制剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包括(i)抗CD137抗体或其抗原结合片段，(ii)缓冲液(例如组氨酸)，(iii)二糖(例如蔗糖)；(iv)非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80)；(v)盐(例如NaCl)。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.4的pH。本公开还提供治疗患者中癌症或减少或抑制患者中肿瘤生长的方法，包括向患者施用本公开的制剂。本公开还提供了诱导或增强患者中的T细胞激活的方法，包括向患者施用本公开的制剂。
本公开至少部分基于以下发现：本公开的制剂是稳定的并且使抗体聚集物和微粒的形成最小化。特别地，显示本公开的制剂提供抗CD137激动剂抗体mAb1，其具有优秀的稳定性、无显著的单体抗体损失以及无显著量的降解。特别地，令人惊讶地发现，当在pH5.8的组氨酸缓冲液中配制时，抗CD137抗体在高浓度和强制降解条件(forced degradationconditions)(例如，温度升高)下是稳定的。同样地，发现当在pH6.0和pH6.5的缓冲液中配制抗CD137抗体时，酸性/碱性物质减少。还发现，本公开的抗CD137制剂具有优秀的稳定性而无显著的单体抗体损失。此外，发现向本公开的抗CD137制剂添加蔗糖导致了在温度升高时改善的抗体稳定性。
因此，在一些实施方案中，本公开提供稳定的抗CD137抗体制剂。在一些实施方案中，本公开提供稳定的抗CD137抗体制剂，包含(i)含有约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，(ii)约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，(iii)约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，以及(iv)约50mM-200mM的NaCl，其中制剂的pH值为约5.0至约7.0。在一些实施方案中，制剂的pH为约5.0至约7.4。在一些实施方案中，制剂的pH为约5.0至约8.0。
已显示使用激动剂抗CD137抗体进行癌症治疗在小鼠中诱导免疫介导的肿瘤排斥，且目前正在癌症患者中测试此类的类似药剂。先前的报告已表明，施用抗CD137抗体能诱导肝中T淋巴细胞的多克隆浸润的显著积聚(Dubrot et al.,(2010)CancerImmunology,Immunotherapy59(8):1223-1233)，提示肝炎症和药物引起的肝毒性的可能性。最近的一份关于激动性抗CD137抗体(乌瑞芦单抗(Urelumab)，BMS-663513；Bristol-Myers Squibb)的临床评估报告记录了在人类受试者中观察到的与治疗相关的不良事件，包括与抗体剂量相关的严重肝毒性(转氨酶升高(transaminitis))的迹象(Segal et al.,(2016)Clin Cancer Res 23(8):1929-1936)。
本公开提供了与人CD137的表位特异性结合并激动人CD137的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，及其制剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与mAb1竞争结合人CD137的表位。在一些方面，与抗小鼠CD1373H3抗体(Melero et al.(1997)NatureMedicine 3(6):682-685；Uno et al.(2006)Nature Medicine 12(6):693-696)和至少两种临床开发中的抗人CD137抗体(BMS-663513/乌瑞芦单抗(Urelumab)，Bristol-MeyersSquibb，和PF-05082566/乌托鲁单抗(Utomilumab)，Pfizer)相比，本公开的抗CD137激动剂抗体在肿瘤微环境中诱导细胞因子产生和CD8+T细胞扩增，以及体内保护性抗肿瘤免疫，伴随毒性相关事件的可能性的降低。
定义
除非另有说明，否则权利要求书和说明书中使用的术语定义如下。
必须注意的是，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
如本文所用，“约”将被普通技术人员理解并且将根据使用其的上下文在一定程度上变化。如果普通技术人员根据使用术语的上下文对该术语的使用不清楚，则“约”将意指特定值的至多正负10％。
如本文所用，术语“激动剂”是指部分或完全促进、诱导、增加和/或激活本文公开的天然多肽(例如，CD137)的生物活性的任意分子。合适的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。在一些实施方案中，观察到激动剂存在下的激活是剂量依赖性的。在一些实施方案中，所测量的信号(例如，生物活性)比在相当条件下阴性对照测得的信号高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。本文还公开了鉴定适用于本公开的方法中的激动剂的方法。例如，这些方法包括但不限于结合测定法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、
Figure BDA0003224144880000531
系统和放射免疫测定法(RIA)。这些测定法测定激动剂结合目标多肽(例如受体或配体，例如CD137)的能力，并因此显示激动剂促进、增加或激活多肽活性的能力。激动剂的功效也可以使用功能测定法来确定，例如激动剂激活或促进多肽功能的能力。例如，功能测定法可以包括使多肽与候选激动剂分子接触，并测量通常与多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。激动剂的效力通常由其EC50值(激活50％的激动剂应答所需的浓度)定义。EC50值越低，激动剂的效力越大，激活最大生物应答所需的浓度越低。
如本文所用，术语“丙氨酸扫描(alanine scanning)”是指用于测定一个特定野生型残基对给定蛋白或多肽的稳定性或功能(例如，结合亲和力)的贡献的技术。所述技术包括用丙氨酸残基取代多肽中的野生型残基，然后评估丙氨酸取代的衍生物或突变多肽的稳定性或功能(例如，结合亲和力)，并与野生型多肽比较。用丙氨酸取代多肽中的野生型残基的技术是本领域已知的。
术语“改善”是指在疾病状态例如癌症的治疗中的任何在治疗上的有益结果，包括其预防、减轻严重性或发展、缓解或治愈。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及那些随后被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamate)和O-磷酸丝氨酸(O-phosphoserine)。氨基酸类似物是指该化合物具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即碳与氢、羧基、氨基和R基团结合，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫基甲硫氨酸(methionine methylsulfonium)。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
氨基酸在本文中可以通过公知的它们的三个字母的符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母的符号来指代。同样，核苷酸可以通过普遍接受的它们的单字母编码来表示。如本文所用，“极性氨基酸”是指包含更倾向于在水性环境中的侧链的氨基酸。在一些实施方案中，极性氨基酸选自由以下组成的组：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。极性氨基酸可以带正电荷、带负电荷或带中性电荷。如本文所用，“非极性氨基酸”是指选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。
如本文所用，“氨基酸取代”是指预定的氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基被另一个不同的“置换”氨基酸残基置换。“氨基酸插入”是指将至少一个额外的氨基酸并入预定的氨基酸序列中。虽然插入通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但也可以创建更大的“肽插入”，例如，约三个至约五个，或甚至多达约十个、十五个或二十个氨基酸残基的插入。如上文所公开，插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列中移除至少一个氨基酸残基。
如本文所用，术语“量”或“水平”是指物质(例如，蛋白)的可检测的量、水平或丰度。当指多肽，例如本文所述的那些时，术语“表达水平”或“表达的水平”通常可互换使用，并且通常是指生物样品中(例如，细胞表面上)多肽的可检测的量。
如本文所用，术语“抗CD137激动剂抗体”(与术语“抗CD137抗体”可互换使用)是指与CD137特异性结合并部分或完全地促进、诱导、增加和/或激活CD137的生物活性、应答和/或CD137信号传导介导的下游通路或其他CD137介导的功能的抗体。在一些实施方案中，抗CD137激动剂抗体与CD137结合并允许CD137L的结合。在一些实施方案中，抗CD137激动剂抗体与CD137结合并诱导CD137的多聚化。在一些实施方案中，抗CD137激动剂抗体与CD137结合并诱导CD137三聚体的二聚化。在一些实施方案中，抗CD137激动剂抗体与CD137结合并诱导CD137三聚体的多聚化。本文提供了抗CD137激动剂抗体的实例。检测三聚体:三聚体复合物形成的方法是本领域技术人员已知的。例如，已显示电子显微镜可检测此类复合物，参见，例如，Won,E.The Journal of Biological Chemistry,Vol.285(12):9202-9210(2010)。
如本文所用，术语“抗-CD137 mAb1”(与“mAb1”可互换使用)所指的示例性抗CD137激动剂抗体包含如下可变重链(VH)氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)，
和可变轻链(VL)氨基酸序列：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHLFPITFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:6)。
如本文所用，术语“抗CD137mAb8”(与“mAb8”可互换使用)所指的示例性抗CD137激动剂抗体包含可变重链(VH)氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:101)；
和可变轻链(VL)氨基酸序列：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHLFPITFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:6)。
如本文所用，术语“抗-CD137mAb10”(与“mAb10”可互换使用)所指的示例性抗-CD137激动剂抗体包含如下可变重链(VH)氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQAPGKGLEWVAAISGSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:26)；
和如下可变轻链(VL)氨基酸序列：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHLFPITFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:6)。
如本文所用，术语“抗体”是指包含两条轻链多肽和两条重链多肽的完整抗体。完整抗体包括不同的抗体同种型，包括IgM、IgG、IgA、IgD和IgE抗体。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合化的(chimerized)或嵌合的(chimeric)抗体、人源化抗体、灵长类化抗体(primatized antibody)、去免疫化抗体(deimmunized antibody)和完全人抗体(fully human antibody)。抗体可以从多种物种中的任一种中制备或衍生，所述物种例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如猩猩(orangutan)、狒狒(baboon)或黑猩猩(chimpanzee))、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。抗体可以是纯化抗体或重组抗体。
如本文所用，术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗原结合部分”或类似术语是指保留与靶抗原(例如，CD137)结合并抑制靶抗原的活性的抗体片段。此类片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。scFv片段是包含scFv由此衍生的抗体的重链和轻链可变区的单条多肽链。此外，胞内抗体(intrabody)、微抗体(minibody)、三抗体(triabody)和双抗体(diabody)也包括在抗体的定义中，并且适用于本文所述的方法中。参见，例如，Todorovska et al.,(2001)J.Immunol.Methods 248(1):47-66；Hudson and Kortt,(1999)J.Immunol.Methods 231(1):177-189；Poljak,(1994)Structure 2(12):1121-1123；Rondon and Marasco,(1997)Annu.Rev.Microbiol.51:257-283，以上每个的公开内容均通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“抗体片段”还包括例如单域抗体，例如骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)。参见，例如，Muyldermans et al.,(2001)TrendsBiochem.Sci.26:230-235；Nuttall et al.,(2000)Curr.Pharm.Biotech.1:253-263；Reichmann et al.,(1999)J.Immunol.Meth.231:25-38；PCT申请公开号WO 94/04678和WO94/25591；和美国专利号6,005,079，以上所有均通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，本公开提供了包含具有使单域抗体形成的修饰的两个VH结构域的单域抗体。
在一些实施方案中，抗原结合片段包含重链多肽的可变区和轻链多肽的可变区。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合片段包含抗体的轻链和重链多肽的CDR。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面呈现与MHC复合的外源抗原的细胞。T细胞使用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞(例如THP-1)、B淋巴母细胞(B lymphoblastoid cell)(例如C1R.A2、1518B-LCL)和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。一些APC通过吞噬作用或受体介导的内吞作用来内化抗原。
术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原并使它们能够被T细胞识别的过程，例如，作为MHC-I和/或MHC-II接合物(conjugate)的组分。
如本文所用，术语“细胞凋亡”是指发生在多细胞生物(例如人类)中的程序性细胞死亡过程。导致细胞凋亡的高度调控的生化和分子事件可导致细胞发生可观察到的和表征性的形态变化，包括细胞膜起泡(membrane blebbing)、细胞体积收缩、染色体DNA凝聚和断裂以及mRNA衰变。识别正在经历凋亡的细胞(包括T细胞)的常用方法是使细胞暴露于荧光团偶联的蛋白(膜联蛋白V(Annexin V))。膜联蛋白V通常通过其结合质膜外层上的磷脂酰丝氨酸(其是细胞正在经历凋亡过程的早期指标)的能力用于检测凋亡细胞。
如本文所用，术语“与固定的CD137结合”是指本公开的人抗体与CD137(例如表达在细胞表面上的CD137或结合在固体支持物上的CD137)结合的能力。
如本文所用，术语“双特异性”或“双功能抗体”是指具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmann,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny et al.,(1992)J.Immunol.148:1547-1553。
传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链/轻链对具有不同的特异性(Milstein and Cuello,(1983)Nature 305:537-539)。具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域可以与免疫球蛋白恒定域序列融合。重链可变区的融合优选是与免疫球蛋白重链恒定区，包括至少部分铰链区、CH2区和CH3区。对于示例性的产生双特异性抗体的当前已知方法的进一步细节，参见，例如，Suresh et al.,(1986)Methods Enzymol.121:210；PCT公开号WO96/27011；Brennan etal.,(1985)Science 229:81；Shalaby et al.,J.Exp.Med.(1992)175:217-225；Kostelnyet al.,(1992)J.Immunol.148(5):1547-1553；Hollinger et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Gruber et al.,(1994)J.Immunol.152:5368；和Tutt et al.,(1991)J.Immunol.147:60。双特异性抗体还包括交联或异源结合抗体(heteroconjugate antibody)。可以使用任意方便的交联方法制备异源结合抗体。合适的交联剂是本领域公知的，并且与一些交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
还描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链(leucine zipper)生产双特异性抗体。参见，例如，Kostelny et al.(1992)J Immunol 148(5):1547-1553。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽可以通过基因融合连接至两种不同抗体的Fab’部分。抗体同二聚体可在铰链区还原以形成单体，然后经再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生产抗体同二聚体。由Hollinger et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448描述的“双抗体(diabody)”技术提供了一种制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过接头与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)，所述接头太短以致不能在同一条链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报告了另一种通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的策略。参见，例如，Gruber et al.(1994)J Immunol 152:5368。或者，抗体可以是例如Zapata et al.(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062所述的“线性抗体(linear antibody)”。简言之，这些抗体包含形成一对抗原结合区的一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
具有多于两个价的抗体(例如，三特异性抗体)在例如Tutt et al.(1991)JImmunol 147:60中涉及和描述。
本公开还涵盖多特异性抗体的变体形式，例如Wu et al.(2007)Nat Biotechnol25(11):1290-1297中描述的双可变域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子。将DVD-Ig分子设计为使得来自两种不同的亲本抗体的两个不同的轻链可变域(VL)通过重组DNA技术直接或通过短接头串联连接，随后是轻链恒定域。类似地，重链包含串联连接的两个不同的重链可变域(VH)，然后是恒定域CH1和Fc区。从两种亲本抗体制备DVD-Ig分子的方法进一步描述在例如PCT公开号WO 08/024188和WO 07/024715中。在一些实施方案中，双特异性抗体是Fab串联(Fabs-in-Tandem)免疫球蛋白，其中具有第二特异性的轻链可变区与完整抗体的重链可变区融合。此类抗体描述在例如国际专利申请公开号WO 2015/103072中。
如本文所用，“癌抗原”或“肿瘤抗原”是指(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞，(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞，(v)肿瘤上的胚胎抗原，(vi)自体肿瘤细胞，(vii)肿瘤特异性膜抗原，(viii)肿瘤相关膜抗原，(ix)生长因子受体，(x)生长因子配体，(xi)与癌症相关的任何其他类型的抗原或抗原呈递细胞或物质。
术语“癌”是本领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。本文所述的抗CD137抗体可用于治疗患有、怀疑患有或可能处于发展任意类型的癌症(包括肾癌或黑色素瘤)的高风险中的患者。示例性癌包括从子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈、结肠和卵巢组织形成的癌。此术语还包括癌肉瘤(carcinosarcoma)，其包括由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺样结构的癌。
如本文所用，术语“竞争”，当用于竞争结合相同表位的抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体或其抗原结合片段)的情况下，是指抗原结合蛋白之间的相互作用，通过测定法(例如，竞争性结合测定法；交叉阻断测定法(cross-blocking assay))确定，其中测试抗原结合蛋白(例如，测试抗体)抑制(例如，减少或阻断)参考抗原结合蛋白(例如参考抗体，例如mAb1)与共同抗原(common antigen)(例如CD137或其片段)特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体与mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)、mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)或mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)交叉竞争。
多肽或氨基酸序列“衍生自”指定多肽或蛋白是指所述多肽的来源。优选地，衍生自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与此序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10至20个氨基酸组成，优选至少20至30个氨基酸，更优选至少30至50个氨基酸，或其可由本领域普通技术人员识别为在序列上具有其起源。衍生自另一肽的多肽可具有相对于起始多肽的一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸残基已被另一氨基酸残基取代，或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。
多肽可包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必然与起始分子具有小于100％的序列同一性或相似性。在某些实施方案中，变体将具有以下的氨基酸序列：与起始多肽的氨基酸序列具有约75％至小于100％，更优选约80％至小于100％，更优选约85％至小于100％，更优选约90％至小于100％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)，且最优选约95％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性，例如在变体分子的长度上。
在某些实施方案中，起始多肽序列与衍生自其的序列之间存在一个氨基酸的差异。关于这个序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并引入缺口(如需要)以达到最大序列同一性百分比后，候选序列中与起始氨基酸残基相同(即，相同残基)的氨基酸残基的百分比。在某些实施方案中，多肽由以下组成、基本上由以下组成、或包含以下：选自如表22-27中任一个所示的序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与选自如表22-27中任一个所示的序列的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与选自如表22-27中任一个所示的序列的连续氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的连续氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含具有选自如表22-27中任一个所示的序列的氨基酸序列的至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个或500个(或这些数字内的任意整数)连续氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗体由核苷酸序列编码。本发明的核苷酸序列可用于多种应用，包括：克隆、基因治疗、蛋白表达和纯化、突变引入、对有此需要的宿主进行DNA疫苗接种、用于例如被动免疫的抗体产生、PCR、引物和探针生成等。在某些实施方案中，本发明的核苷酸序列包含选自如表22-27中任一个所示的序列的核苷酸序列或由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与选自如表22-27中任一个所示的序列的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与选自如表22-27中任一个所示的序列的连续核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的连续核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列包含具有选自如表22-27中任一个所示的序列的核苷酸序列的至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个或500个(或这些数字内的任意整数)连续核苷酸的氨基酸序列。
本领域普通技术人员还将理解，可以将适用于本文公开的方法中的抗体进行改变使得它们在序列上与它们衍生自的天然存在的或天然序列不同，而同时保留所需的天然序列的活性。例如，可以进行导致“非必需”(non-essential)氨基酸残基的保守性取代或改变的核苷酸或氨基酸置换。可以通过标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。
适用于本文公开的方法的抗体可以包含在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处的保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，结合性多肽中的非必需氨基酸残基优选由来自相同侧链家族的另一氨基酸残基置换。在某些实施方案中，氨基酸片段(string)可由结构相似而在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的片段置换。或者，在某些实施方案中，可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以将所得突变体并入本发明的结合多肽中并筛选它们与目标靶标结合的能力。
如本文所用，术语抗原“交叉呈递”是指外源蛋白抗原通过APC上的MHCI类和II类分子呈递至T细胞。
如本文所用，术语“交叉反应”是指本公开的抗体与来自不同物种的CD137结合的能力。例如，本公开的与人CD137结合的抗体也可以与另一物种的CD137结合。如本文所用，交叉反应性是通过检测结合测定(例如SPR、ELISA)中与纯化抗原的特异反应性或与生理上表达CD137的细胞结合或在功能上相互作用来测定的。测定交叉反应性的方法包括本文所述的标准结合测定法，例如，通过使用BIACORETM2000 SPR仪器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)进行BIACORETM表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞技术。
如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
如本文所用，术语“二聚化”是指由两个通常非共价结合的大分子例如蛋白或蛋白的多聚体形成大分子复合物。同二聚化是指当大分子(例如蛋白)在性质上相同时的二聚化过程。异二聚化是指当大分子(例如蛋白)在性质上不同时的二聚化过程。确定二聚化的方法是本领域技术人员已知的。例如，此类方法包括但不限于酵母双杂交测定法、荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、蛋白质质谱、倏逝波方法(evanescent wavemethod)、尺寸排阻色谱、分析超速离心、散射技术、NMR光谱、等温滴定量热法、荧光各向异性(fluorescence anisotropy)、荧光相关光谱(FCS)、光漂白后的荧光恢复(FRAP)、临近成像(proximity imaging，PRIM)和双分子荧光互补(BiFC)(参见，例如，Gell D.A.,GrantR.P.,Mackay J.P.(2012)The Detection and Quantitation of ProteinOligomerization.In:Matthews J.M.(eds)Protein Dimerization and Oligomerizationin Biology.Advances in Experimental Medicine and Biology,vol 747.Springer,NewYork,NY；和Xie,Q.et al.Methods Mol Biol,2011；680:3-28)。
如本文所用，术语“CD137的二聚化”是指两个CD137三聚体的二聚化。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强CD137的二聚化。在一些实施方案中，相对于抗CD137激动剂抗体不存在时二聚化的量，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强CD137的二聚化。在一些实施方案中，相对于参考抗CD137激动剂抗体存在时二聚化的量，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强CD137的二聚化。在一些实施方案中，二聚化增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所用，术语“EC50”是指在体外或体内测定中诱导的应答是最大应答的50％，即介于最大应答和基线之间的中位(halfway)的应答时，抗体或其抗原结合部分的浓度。
如本文所用，术语“有效剂量(effective dose)”或“有效用量(effectivedosage)”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效剂量(therapeutically effective dose)”定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者中的疾病及其并发症的量。用于此用途的有效量将取决于所治疗病症的严重性和患者自身免疫系统的一般状态。
如本文所用，术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原(例如，CD137)上由抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段)特异性结合的决定簇或位点。蛋白抗原的表位可分为“线性表位”和“构象表位”。如本文所用，术语“线性表位”是指由连接的氨基酸的连续线性序列形成的表位。蛋白抗原的线性表位通常在暴露于化学变性剂(例如酸、碱、溶剂、交联剂、离液剂(chaotropic agent)、二硫键还原剂)或物理变性剂(例如热、放射性或机械剪切或应力)时得以保留。在一些实施方案中，表位是非线性的，也称为中断表位(interrupted epitope)。如本文所用，术语“构象表位”或“非线性表位”是指由通过多肽的三级折叠并置的非连续氨基酸形成的表位。构象表位在用变性剂处理后通常丧失。表位通常包含处于独特空间构象的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。在一些实施方案中，表位包含处于独特空间构象的少于25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸。通常，对特定靶分子特异的抗体或其抗原结合片段将优先识别并结合蛋白和/或大分子的复杂混合物内的靶分子上的特定表位。在一些实施方案中，表位不包含人CD137的胞外域的所有氨基酸。
本公开还涵盖与CD137上的表位结合的抗体，所述表位包含由本文所述的特定抗体识别的表位的全部或部分(例如，相同或重叠区域，或者区域之间或跨越区域的区域)。
如本文所用，术语“表位定位(epitope mapping)”是指鉴定抗体或其抗原结合片段在其靶蛋白抗原上的结合位点或表位的过程或方法。本文提供了表位定位方法和技术。
如本文所用，术语“CD137”是指跨膜蛋白的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的特定成员。本领域中CD137的替代名称和首字母缩写包括“肿瘤坏死因子受体超家族成员9”(TNFRSF9)、4-1BB和“由淋巴细胞激活诱导”(ILA)(Alderson et al.,(1994)Eur JImmunol 24(9):2219-2227；Schwarz et al.,(1993)Gene 134(2):295-298)。全长人CD137(包含前导、跨膜和细胞质结构域的示例性氨基酸序列)如表23(SEQ ID NO:3)和此处所示：
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
如本文所用，术语“CD137L”或“CD137配体”是指跨膜蛋白的肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员。本领域中CD137L的替代名称和首字母缩写包括“肿瘤坏死因子超家族成员9”(TNFSF9)和4-1BB配体(4-1BBL)(Alderson et al.,(1994)EurJImmunol24(9):2219-2227)。全长CD137L的示例性氨基酸序列如表23(SEQ ID NO:97)所示。
如本文所用，术语“Fc介导的效应子功能”或“Fc效应子功能”是指除抗体的主要功能和目的之外的抗体的生物活性。例如，治疗性激动性抗体的效应子功能是除激活靶蛋白或通路之外的生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；表达Fc受体的血小板的激活的缺乏；和B细胞激活。许多效应子功能始于Fc与Fcγ受体的结合。
如本文所用，术语“Fc受体”是指在免疫效应细胞表面发现的多肽，其被抗体的Fc区结合。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。Fcγ受体分为三个亚类，FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FγcRIII(CD16)。所有四种IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)均结合并激活Fc受体FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。FcγRIIB是抑制性受体，且因此与此受体结合的抗体不会激活补体和细胞应答。FcγRI是以单体形式与IgG结合的高亲和力受体，而FcγRIIA和FcγRIIA是仅以多聚体形式与IgG结合且亲和力略低的低亲和力受体。抗体与Fc受体和/或Clq的结合受Fc区内的特定残基或结构域控制。结合还依赖于位于铰链区内和抗体CH2部分内的残基。在一些实施方案中，本文所述抗体的激动和/或治疗活性依赖于Fc区与Fc受体(例如，FcγR)的结合。在一些实施方案中，本文所述抗体的激动和/或治疗活性通过Fc区与Fc受体(例如，FcγR)的结合而增强。
如本文所用，术语“糖基化谱图”定义为共价连接至蛋白，更具体地连接至免疫球蛋白的碳水化合物单元的谱图。当本领域普通技术人员将异源抗体的糖基化谱图识别为相比于转基因的CH基因衍生自的物种而更类似于非人转基因动物物种中的糖基化模式时，异源抗体的糖基化图谱可以表征为基本相似于天然存在于由非人转基因动物物种产生的抗体上的糖基化谱图。
如本文所用，术语“血液癌症”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾和淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤(B细胞血液癌症)和T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和大多数非霍奇金淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、纵隔大B细胞淋巴瘤(mediastinal large B cell lymphoma)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(nodal marginal zoneB cell lymphoma)、脾边缘区淋巴瘤(splenic marginal zone lymphoma)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿。T细胞淋巴瘤的非限制性实例包括结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T cell lymphoma)。血液恶性肿瘤还包括白血病，例如但不限于继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病。血液恶性肿瘤进一步包括骨髓瘤，例如但不限于多发性骨髓瘤和冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)。其他血液癌症和/或B细胞或T细胞相关癌症涵盖在术语血液恶性肿瘤中。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(若存在)的抗体。本公开的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)(参见，例如，Lonberg et al.,(1994)Nature368(6474):856-859)；Lonberg,(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg&Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93和Harding&Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。然而，术语“人抗体”不包括其中衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体(即人源化抗体)。
如本文所用，术语“异源抗体”是根据产生此类抗体的转基因非人生物体来定义的。此术语是指具有与在不是由转基因非人动物组成的生物体中发现的氨基酸序列或编码核酸序列相对应的氨基酸序列或编码核酸序列，且通常来自非转基因非人动物的物种的抗体。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并且是指刺激对特定抗原的免疫应答(即，被动的或适应性的)。对于诱导CDC或ADCC而使用的术语“诱导”是指刺激特定的直接细胞杀伤机制。
如本文所用，“需要预防”、“需要治疗”或“有此需要”的受试者是指根据合适的医疗工作者(例如，面向人的医生、护士或执业护士；面向非人哺乳动物的兽医)，将合理地受益于给定治疗(例如用包含抗CD137抗体的组合物进行治疗)的受试者。
术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。
如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与人CD137特异性结合的分离的抗体基本上不含与除CD137之外的其他抗原特异性结合的抗体)。然而，与表位特异性结合的分离的抗体可能对来自不同物种的其他CD137蛋白具有交叉反应性。然而，在本文所述的特定结合测定中，抗体继续表现出与人CD137的特异性结合。此外，分离的抗体通常基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。在一些实施方案中，将具有不同CD137特异性的“分离的”抗体的组合在明确定义的组合物中组合。
如本文所用，术语“分离的核酸分子”是指编码与CD137结合的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸，旨在指这样的核酸分子，所述核酸分子中的编码所述抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与除CD137之外的抗原结合的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，并且在人基因组DNA中所述其他序列可以天然位于所述核酸的侧翼。例如，选自如表22-27中任一个所示序列的序列对应于包含本文所述的抗CD137抗体单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸序列。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgGl)。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgGl同种型的。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG1同种型的，并且包含突变。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG2同种型的。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG3同种型的。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG4同种型的。在一些实施方案中，本公开的人单克隆抗体是IgG4同种型的，并且包含突变。在一些实施方案中，突变是Ser228处的取代。在一些实施方案中，Ser228处的取代是S228P。
如本文所用，术语“同种型转换(isotype switching)”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变为另一种其他Ig类别的现象。
如本文所用，术语“KD”或“KD”是指抗体与抗原之间结合反应的平衡解离常数。KD的值是抗体解离速率常数(kd)与抗体结合速率常数(ka)比率的数字表示。KD的值与抗体对抗原的结合亲和力呈反相关。KD值越小，抗体对其抗原的亲和力就越大。亲和力是单个分子对其配体的结合强度，且通常由平衡解离常数(KD)测量和报告，所述平衡解离常数用于对双分子相互作用的强度进行评估和排序。
如本文所用，术语“kd”或“kd”(或者“koff”或“koff”)旨在指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。kd的值是每秒衰变或解离的复合物部分的数字表示，并以单位sec-1表示。
如本文所用，术语“ka”或“ka”(或者“kon”或“kon”)旨在指抗体与抗原结合的结合速率常数。ka的值是在抗体和抗原的1摩尔(1M)溶液中每秒形成的抗体/抗原复合物数量的数字表示，并以单位M-1sec-1表示。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括化学偶联或重组手段在内的任何手段将两个或以上的元件或组分或结构域连接在一起。化学偶联的方法(例如，使用异双功能交联剂)是本领域已知的。
如本文所用，“局部施用”或“局部递送”是指不依赖于组合物或药剂经由血管系统运输至其目标靶组织或部位的递送。例如，组合物可以通过注射或植入组合物或药剂或通过注射或植入含有组合物或药剂的装置来递送。在靶组织或部位附近局部施用后，组合物或药剂或其一种或多种组分可扩散至目标靶组织或部位。
如本文所用，“MHC分子”是指两种类型的分子，MHC I类和MHC II类。MHC I类分子将抗原呈递至特定CD8+T细胞，且MHC II类分子将抗原呈递至特定CD4+T细胞。外源性递送至APC的抗原经过加工主要是为了与MHC II类结合。相比之下，内源性传递至APC的抗原经过加工主要是为了与MHC I类结合。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性并且具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选恒定区的抗体。在一些实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，其包括从转基因非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞(具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组)，其与永生化细胞(immortalized cell)融合。
如本文所用，术语“多聚化”是指包含通常通过非共价相互作用结合的多于两个大分子(例如蛋白)的大分子复合物的形成。测定多聚化的方法是本领域技术人员已知的，并且在上文中针对二聚化进行了描述。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强CD137的多聚化。在一些实施方案中，相对于抗CD137激动剂抗体不存在下的多聚化的量，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强CD137的多聚化。在一些实施方案中，相对于参考抗CD137激动剂抗体存在下的多聚化的量，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强CD137的多聚化。在一些实施方案中，多聚化增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所用，应用于物体时术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从自然界的来源中分离出来并且没有在实验室中被人类有意地修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用，术语“非转换的同种型(nonswitched isotype)”是指当未发生同种型转换时产生的重链同种型类别；编码非转换同种型的CH基因通常是紧接功能重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换已被分类为经典(classical)或非经典(non-classical)同种型转换。经典同种型转换通过涉及转基因中至少一个转换序列区域的重组事件而发生。非经典同种型转换可以通过例如人σμ和人∑μ(δ相关缺失)之间的同源重组而发生。其他的非经典转换机制，例如转基因间和/或染色体间重组等，可能会发生并实现同种型转换。
如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，否则此术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，否则具体的核酸序列也隐含涵盖了其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka et al.,Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Cassol et al,1992；Rossolini et al,Mol.Cell.Probes8:91-98,1994)。对于精氨酸和亮氨酸，第二碱基处的修饰也可以是保守的。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
本文使用的多核苷酸可以包含任意聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以包含单链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA以及单链和双链混合的RNA、包含可以是单链的或更典型是双链的或单链和双链区域混合的DNA和RNA的杂合分子。此外，多核苷酸可包含含有RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。多核苷酸还可以含有一个或多个修饰的碱基或因稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化(tritylated)的碱基和不常见的碱基例如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢修饰的形式。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“有效连接的(operablylinked)”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与所述序列有效连接。关于转录调控序列，有效连接意指被连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区时，是连续的并且在阅读框中。对于转换序列，有效连接表示序列能够实现转换重组。
如本文所用，术语“互补位(paratope)”，也称为“抗原结合位点”是指抗体或其抗原结合片段的一部分，其识别并结合抗原上的表位，包含位于可变重链和轻链内的一组互补决定区(CDR)。
如本文所用，“肠胃外施用”、“肠胃外施用的”和其他语法上等效的短语是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，且包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、脑内、颅内、颈内和胸骨内注射和输注。
如本文所用，术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人类和其他哺乳动物受试者。
在关于两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“同一性百分比”是指当进行最大对应性(correspondence)的比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，使用下述序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查来测定。取决于应用，“同一性百分比”可以存在于被比较序列的一个区域上，例如功能域上，或者存在于要比较的两个序列的全长上。对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。序列比较算法随后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以进行序列的最佳比对以进行比较，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过对这些算法的计算机化实施(Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group,575ScienceDr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(通常参见Ausubel et al.，见上文)。
适用于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，描述在Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心网站公开获得。
如本文中通常使用的，“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合与人类和动物的组织、器官和/或体液接触使用而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的收益/风险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的载体”是指并包括在生理学上相容的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。组合物可包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如，Berge et al.(1977)J Pharm Sci66:1-19)。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。此术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“预防”当与病况相关使用时是指，相对于未接受组合物的受试者，施用组合物，其降低了受试者中医学病况的症状的频率或延缓其发作。
如本文所用，应用于本文所述的任意蛋白(抗体或片段)的术语“纯化的”或“分离的”是指已从自然伴随其的组分(例如蛋白或其他天然存在的生物分子或有机分子)例如表达蛋白的原核生物中的其他蛋白、脂质和核酸中分离或纯化的多肽。通常，当多肽占样品中总蛋白重量的至少60(例如，至少65、70、75、80、85、90、92、95、97或99)％时，其是纯化的。
如本文所用，术语“重排的(rearranged)”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的配置，其中V区段以分别编码基本上完整的VH或VL结构域的构造紧邻D-J或J区段。可以通过与种系DNA比较来鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
如本文所用，术语“受体聚类(receptor clustering)”是指导致一组受体在特定细胞位置集聚或局部积聚，通常以诱导或放大信号传导应答的细胞过程。许多蛋白受体结合同源配体并在结合它们的同源配体后聚类，即形成二聚体、三聚体、寡聚体或多聚体。例如，PDGF受体和TNF受体超家族成员在配体结合后分别形成二聚体和三聚体。同源配体诱导的聚类(例如二聚化、多聚化)通过受体诱导信号转导。因此，本公开的抗体或其抗原结合片段能够通过与一种以上的受体结合来激活受体，并在有或没有同源配体结合的情况下诱导或稳定二聚化、三聚化和/或多聚化。
TNFR信号传导需要受体聚类和多聚化(Wajant(2015)Cell Death Differ22(11):1727-1741)，且尤其是TNFRSF激活。4-1BB(CD137)、CD40、GITR、CD27、DR3、DR5和Fas是已知需要聚类以触发下游信号传导的一些TNFSF受体。4-1BB受体必须与信号交联的实验证据来自Rabu et al。这些作者报告，人4-1BBL的1-三聚体形式对人T细胞没有激活作用，而将蛋白交联成2-或更多三聚体导致了强激活蛋白(Rabu et al.,(2005)JBiol Chem 280:41472-41481)。因此，在一些实施方案中，抗CD137激动剂抗体诱导CD137的2个或更多个三聚体的多聚化。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已引入重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语旨在不仅指具体的受试细胞，而且指这样的细胞的后代。由于某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，因此此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞中，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段来制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，其利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括例如在抗体成熟期间发生的后续重排和突变。如本领域已知的(参见，例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，其由重排以形成对外来抗原特异的抗体的多种基因编码。除了重排之外，可变区可通过多个单一氨基酸变化(称为体细胞突变或超突变)进行进一步修饰，以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将进一步响应抗原而变化(即，同种型转换)。因此，响应抗原而编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排且体细胞上突变的核酸分子可能与原始核酸分子不具有序列同一性，但将是基本上相同或相似的(即，具有至少80％的同一性)。
如本文所用，术语“参考抗体”(与“参考mAb”可互换使用)或“参考抗原结合蛋白”是指与人CD137上的特定表位结合的抗体或其抗原结合片段，并且用于建立自身与一种或多种不同抗体之间的关系。在一些实施方案中，所述关系是参考抗体和一种或多种不同抗体与CD137上相同表位的结合。如本文所用，此术语意味着，作为竞争者可用于测试或测定例如本文所述的那些(例如，竞争性结合测定)中的抗CD137抗体，其中所述测定可用于发现、鉴定或开发一种或多种结合相同表位的不同抗体。示例性参考抗体(mAb1)的可变重链(VH)和轻链(VL)氨基酸序列在表23中提供(VH1，SEQ ID NO.4；VH2，SEQ ID NO.6)。在一些实施方案中，此术语意味着可作为比较物(comparator)用在测试或测定中的抗CD137抗体，其中此测定可用于辨别抗体的特征(例如，肝毒性、抗肿瘤功效)。在一些实施方案中，参考抗体是乌瑞芦单抗。在一些实施方案中，参考抗体是乌托鲁单抗。
如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性与……结合”和“特异性与……结合”是指抗体结合预定抗原上的表位。通常，当通过以下方法测定时，抗体以约小于10-6M，例如约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，所述方法通过BIACORE2000仪器中的表面等离子体共振(SPR)技术，使用重组人CD137作为分析物，且所述抗体作为配体且与预定抗原结合的亲和力比其结合除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高至少两倍。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
如本文所用，术语“转换序列(switch sequence)”是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体(switch donor)”序列，通常是μ转换区域，将位于在转换重组期间要删除的构建区域的5’(即上游)。“转换受体(switch acceptor)”区域将位于要删除的构建区域和置换恒定区之间(例如γ、ε等)。由于不存在总是发生重组的特定位点，最终的基因序列通常无法从构建体预测。
如本文所用，术语“受试者”包括任意人类或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有免疫病症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
对于核酸，术语“基本同源性”表示在进行最佳比对和比较时，两个核酸或其指定序列相同，在至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％，且更优选至少约98％至99.5％的核苷酸中具有恰当的核苷酸插入或缺失。或者，当片段在选择性杂交条件下与链的互补物杂交时，存在基本同源性。
两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数量的函数(即，同源性％＝相同位置数/总位置数x100)，同时考虑进行两个序列的最佳比对需要引入的缺口数和每个缺口的长度。序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性实例中所述。
可以使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重，来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残差表，缺口长度罚分为12，且缺口罚分为4，来确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已并入GCG软件包中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法(可从http://www.gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，且缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本公开的核酸和蛋白序列可进一步用作“查询序列(query sequence)”以相对于公共数据库进行搜索以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以使用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用如Altschul etal.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的缺口BLAST(gapped BLAST)。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl分带(CsCl banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法)从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白)中纯化出核酸时，则核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见F.Ausubel,et al.,ed.CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987)。
来自cDNA、基因组或其混合物的本公开的核酸组合物虽然通常在天然序列中(除了经修饰的限制性位点等)，但也可以使用标准技术进行突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可根据需要影响氨基酸序列。具体地，涵盖了与天然V、D、J、恒定、转换和本文所述的其他此类序列基本上同源或衍生自其的DNA序列(其中“衍生”表示序列与另一序列相同或从其修饰而来)。
如本文所用，术语“肿瘤微环境”(或者“癌症微环境”；缩写为TME)是指肿瘤或瘤存在的细胞环境或环境，包括周围血管以及非癌细胞，包括但不仅限于免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎症细胞和淋巴细胞。信号传导分子和细胞外基质也包含TME。肿瘤与周围微环境密切相关并持续地相互作用。肿瘤可以通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响微环境，而微环境中的免疫细胞能影响肿瘤细胞的生长和进化。
术语“T细胞”是指可以通过细胞表面上T细胞受体的存在与其他白细胞区分开的白细胞类型。T细胞有多个亚群，包括但不限于T辅助细胞(又称TH细胞或CD4+T细胞)和亚型，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9和TFH细胞，细胞毒性T细胞(即TC细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T杀伤细胞、杀伤T细胞)，记忆T细胞和亚型，包括中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM和TEMRA细胞)以及常驻记忆T细胞(TRM细胞)，调节性T细胞(又称Treg细胞或抑制性T细胞)和亚型，包括CD4+FOXP3+Treg细胞、CD4+FOXP3-Treg细胞、Tr1细胞、Th3细胞和Treg17细胞，自然杀伤T细胞(又称NKT细胞)，粘膜相关不变T细胞(mucosal associated invariantT cell，MAIT)和gamma delta T细胞(γδT细胞)，包括Vγ9/Vδ2 T细胞。任意一种或多种上述或未提及的T细胞都可以是本发明应用的方法的靶细胞类型。
如本文所用，术语“T细胞激活”或“T细胞的激活”是指这样的细胞过程，在该过程中在其表面表达抗原特异性T细胞受体的成熟T细胞识别其同源抗原，并通过进入细胞周期、分泌细胞因子或裂解酶并开始或变得有能力执行基于细胞的效应子功能来响应。T细胞激活需要至少两个信号来完全激活。第一个发生在T细胞抗原特异性受体(TCR)接合抗原-主要组织相容性复合物(MHC)之后，且第二个在随后的共刺激分子(例如CD28)接合。这些信号被传送至细胞核，并导致T细胞的克隆扩增、细胞表面激活标志物的上调、分化为效应细胞、细胞毒性或细胞因子分泌的诱导、细胞凋亡的诱导或以上组合。
如本文所用，术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞，包括但不限于效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)介导的任意应答。T细胞介导的应答包括，例如，T细胞的细胞毒性和增殖。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或本文使用的类似术语旨在意指将引发所需生物学或医学应答(例如，癌症的一种或多种症状的改善)的药剂(抗CD137抗体或其抗原结合片段)的量。
如本文所用，术语“治疗”和“疗法”是指本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法采用向需要此类治疗的受试者施用本公开的人抗体，例如，需要针对特定抗原增强免疫应答的受试者，或最终可能患上此类病症的受试者，以对病症或复发病症进行预防、治愈、延缓、降低其严重性或改善一种或多种症状，或以延长受试者的存活期超过不存在此类治疗下的预期。
如本文所用，术语“非重排的(unrearranged)”或“种系配置(germlineconfiguration)”是指其中V区段未经重组以紧邻D或J区段的构型。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般来说，可用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括表达载体的此类其他形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其具有同等功能。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述的那些相似或等价的方法和材料也可以用于本公开的方法和组合物的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其全文并入。
抗CD137制剂
本公开提供了包含与人CD137结合的抗体或其抗原结合片段[下文称为“抗CD137抗体”或“抗人CD137抗体”]的制剂。本公开的抗CD137抗体制剂将抗体或其抗原结合片段保持在稳定条件下，使抗体聚集物(高分子量物质)和微粒的形成最小化，降低电荷变体的百分比，并保持抗体的结构完整性。
一方面，本公开至少部分地提供了抗CD137抗体或其抗原结合片段的多种制剂。在一些实施方案中，包含抗CD137或其抗原结合片段的本公开的制剂还包括：(i)缓冲液(例如，组氨酸)，(ii)二糖(例如，蔗糖)，(iii)非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80)，和/或(iv)盐(例如，NaCl)。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.4的pH。在一些实施方案中，制剂的pH为约5.0至约8.0。在一些实施方案中，本公开的制剂进一步含有一种或多种增溶剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、盐、亲脂性溶剂、氨基酸、螯合剂或防腐剂。
(i)缓冲剂
在一些实施方案中，抗体制剂中包含缓冲剂以提高稳定性和/或控制制剂的pH。如本文所述的工作实施例中所举例说明的，当在组氨酸缓冲液中配制时，抗CD137抗体在高浓度和强制降解条件下是稳定的。
在一些实施方案中，可用于本文所述的制剂中的缓冲剂包括例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐。在一些实施方案中，缓冲液是基于Tris的缓冲液或磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，本文所述的制剂包含可提供缓冲能力等的一种或多种氨基酸。用于本公开的制剂中的合适的氨基酸包括例如组氨酸、甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，本公开的制剂不包含游离氨基酸作为缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含一种游离氨基酸(例如，组氨酸)作为缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含两种或更多种(例如两种、三种、四种、五种、六种或七种或更多种)不同的氨基酸作为缓冲剂，例如丝氨酸和组氨酸。
缓冲剂通常以约10mM至100mM之间的浓度使用，部分取决于所需的缓冲能力。在一些实施方案中，本文所述的制剂包含浓度小于或约100mM(例如，小于或约90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM或10mM)的缓冲剂。在一些实施方案中，本文所述的制剂包含浓度为至少10mM(例如，至少15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM或更高)的缓冲剂。在一些实施方案中，本文所述的制剂包含浓度为约10mM至20mM、15mM至20mM、10mM至25mM、15mM至25mM、20mM至25mM、10mM至30mM、15mM至30mM、20mM至30mM、25mM至30mM、10mM至40mM、15mM至40mM、20mM至40mM、25mM至40mM、30mM至40mM、10mM至50mM、15mM至50mM、20mM至50mM、25mM至50mM、30mM至50mM、40mM至50mM、10mM至100mM、15mM至100mM、20mM至100mM、25mM至100mM、30mM至100mM、40mM至100mM或50至100mM之间的缓冲剂。应当理解，在本公开的制剂包含两种或更多种(例如，至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种)不同缓冲剂的实施方案中，两种或更多缓冲剂中的每种可以独立存在，例如以上述浓度之一。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约20-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约25-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约30-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约40-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约50-100mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10-50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15-50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约20-50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约25-50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约30-50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约40-50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10-40mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15-40mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约20-40mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约25-40mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约30-40mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10-30mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15-30mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约20-30mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约25-30mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10-25mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15-25mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约20-25mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10-20mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15-20mM的组氨酸的缓冲液。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约10mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约11mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约12mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约13mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约14mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约15mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约16mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约17mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约18mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约19mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约20mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约21mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约22mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约23mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约24mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约25mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约26mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约27mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约28mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约29mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约30mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约35mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约40mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约45mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约50mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约55mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约60mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约65mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约70mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约75mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约80mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约85mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约90mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约95mM的组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有浓度为约100mM的组氨酸的缓冲液。
(ii)碳水化合物赋形剂
在一些实施方案中，将碳水化合物赋形剂添加至本公开的抗体制剂以提高稳定性。如工作实施例中提供的，发现向本公开的抗CD137制剂添加蔗糖导致了在升高的温度下的稳定性提高。
在一些实施方案中，本文所述的制剂均含有碳水化合物赋形剂。合适的碳水化合物赋形剂描述在例如Katakam and Banga(1995)J Pharm Pharmacol 47(2):103-107；Andya et al.(2003)AAPS PharmSci 5(2):Article10；和Shire(2009)“Current Trendsin Monoclonal Antibody Development and Manufacturing,”Volume 11,Springer,354pages中。适用于本文所述制剂的碳水化合物赋形剂包括但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖和山梨糖；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖和纤维二糖；多糖，例如麦芽糖糊精、右旋糖和淀粉；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和山梨糖醇。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是二糖(disaccharide或disaccharide sugar)。在一些实施方案中，二糖是蔗糖。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以浓度为至少或约5％(例如，至少或约5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、13.0％、13.5％、14.0％、14.5％、15.0％或更高)重量/体积(w/v)存在于本公开的制剂中。在本公开的制剂含有两种或更多种(例如，至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种)不同的碳水化合物赋形剂(例如，山梨糖醇和甘露糖醇)的实施方案中，每一种赋形剂可以以任意上述浓度独立存在。在本公开的一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约5-15％(w/v)(5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约6％至约15％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约8％至约15％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约10％至约15％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约12％至约15％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约14％至约15％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约5％至约12％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约6％至约12％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约8％至约12％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约10％至约12％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约5％至约10％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约6％至约10％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约8％至约10％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是二糖。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是蔗糖。
在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约5％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约6％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约7％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约8％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约9％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约10％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约11％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约12％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约13％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约14％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂以约15％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是二糖。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是蔗糖。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是海藻糖。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含二糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含蔗糖。在一些实施方案中，碳水化合物赋形剂是海藻糖。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含约5％至约15％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约6％至约15％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约8％至约15％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约10％至约15％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约12％至约15％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约14％至约15％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约5％至约12％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约6％至约12％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约8％至约12％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约10％至约12％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约5％至约10％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约6％至约10％(w/v)的量的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约8％至约10％(w/v)的量的蔗糖。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含约5％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约6％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约7％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约8％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约9％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约10％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约11％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约12％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约13％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约14％(w/v)的蔗糖。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约15％(w/v)的蔗糖。
(iii)表面活性剂
在一些实施方案中，本公开的抗体制剂包含表面活性剂。如本文所用，表面活性剂是在本质上呈两亲性的表面活性剂。在一些实施方案中，将表面活性剂添加到本文的制剂中以提供稳定性、减少和/或防止聚集，或防止和/或抑制加工条件例如纯化、过滤、冷冻干燥、运输、储存和递送期间的蛋白损伤。在本公开的一些实施方案中，表面活性剂可用于为活性成分提供稳定性。
在一些实施方案中，本公开的制剂含有表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(聚山梨酯，以商品名
Figure BDA0003224144880000841
出售)，包括聚山梨酯-20(聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯)、聚山梨酯-40(聚氧乙烯山梨醇单棕榈酸酯)、聚山梨酯-60(聚氧乙烯山梨醇单硬脂酸酯)和聚山梨酯-80(聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)；聚氧乙烯烷基醚，例如
Figure BDA0003224144880000842
58和
Figure BDA0003224144880000843
35；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；
Figure BDA0003224144880000844
X-100和
Figure BDA0003224144880000845
X-114；NP40；Span20、Span40、Span60、Span65、Span80和Span85；乙烯和丙二醇的共聚物(例如，
Figure BDA0003224144880000846
系列的非离子表面活性剂，例如
Figure BDA0003224144880000847
F68、
Figure BDA0003224144880000848
10R5、
Figure BDA0003224144880000849
F108、
Figure BDA00032241448800008410
F127、
Figure BDA00032241448800008411
F38、
Figure BDA00032241448800008412
L44、
Figure BDA00032241448800008413
L62；和十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。
包含在本发明的制剂中的表面活性剂的量是足以进行所需功能的量，即使制剂中的活性药物成分(即，抗CD137抗体或其抗原结合片段)稳定所需的最小量。有关表面活性剂的所有百分比均以w/v％列出。
在一些实施方案中，本文所述的制剂含有浓度为至少或约0.01(例如，至少或约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1或更高)w/v％的表面活性剂(例如，本文所述的或本领域已知的任意药学上可接受的表面活性剂)。在一些实施方案中，本公开的制剂含有不超过0.1(例如，不超过0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01)w/v％的药学上可接受的表面活性剂。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约0.01％至约0.1％w/v的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下量的表面活性剂：约0.01％至约0.09％w/v；约0.01％至约0.08％w/v；约0.01％至约0.07％w/v；约0.01％至约0.06％w/v；约0.01％至约0.05％w/v；约0.01％至约0.04％w/v；约0.01％至约0.03％w/v，或约0.01％至约0.02％w/v。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.025％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.035％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.04％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.05％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.06％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.07％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.08％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.09％w/v的量的表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.1％w/v的量的表面活性剂。
在一些实施方案中，本公开的制剂中的表面活性剂是聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.1％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.09％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.08％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.07％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.06％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.05％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.04％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.03％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％至约0.02％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.1％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.09％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.08％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.07％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.06％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.05％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.04％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.035％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％至约0.03％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.025％至约0.05％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.025％至约0.04％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.025％至约0.035％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.025％至约0.03％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.1％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.09％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.08％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.07％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.06％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.05％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％至约0.04％w/v的量的聚山梨酯80。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.01％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.015％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.02％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.025％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.03％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.035％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.04％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.045％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.05％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.055％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.06％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.065％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.07％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.075％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.08％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.085％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.09％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.095％w/v的量的聚山梨酯80。在一些实施方案中，本公开的制剂包含约0.1％w/v的量的聚山梨酯80。
(iv)盐
在一些实施方案中，盐可包含在本文所述的抗体制剂中，为制剂提供稳定性。在一些实施方案中，本文所述的制剂含有盐，例如氯化钠、氯化钾或氯化镁。在一些实施方案中，本文所述的制剂含有浓度为至少50(例如，至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200或更高)mM的盐。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为小于或约200(例如，小于或约195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50)mM的盐。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约50mM至100mM、60mM至100mM、70mM至100mM、80mM至100mM、90mM至100mM、50mM至120mM、60mM至120mM、70mM至120mM、80mM至120mM、90mM至120mM、100mM至120mM、110mM至120mM、50mM至150mM、60mM至150mM、70mM至150mM、80mM至150mM、90mM至150mM、100mM至150mM、110mM至150mM、120mM至150mM、130mM至150mM、140mM至150mM、50mM至200mM、60mM至200mM、70mM至200mM、80mM至200mM、90mM至200mM、100mM至200mM、110mM至200mM、120mM至200mM、130mM至200mM、140mM至200mM、150mM至200mM、160mM至200mM、170mM至200mM、180mM至200mM或190mM至200mM之间的盐。
应当理解，在本公开的制剂含有两种或更多种(例如，至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种)不同的盐的实施方案中，所述两种或更多种盐中的每一种可以以例如上述浓度之一独立地存在。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约50-100mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约60-100mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约70-100mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约80-100mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约90-100mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约90-110mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约95-105mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约50-120mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约80-120mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约100-120mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约50-150mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约80-150mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约100-150mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约120-150mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约50-200mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约80-200mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约100-200mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约120-200mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约150-200mM的NaCl。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约50mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约60mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约70mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约75mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约80mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约85mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约90mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约95mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约100mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约105mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约110mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约115mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约120mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约125mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约130mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约140mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约150mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约160mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约170mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约180mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约190mM的NaCl。在一些实施方案中，本公开的制剂包含浓度为约200mM的NaCl。
(v)pH
已发现本公开的抗CD137抗体制剂的pH影响制剂的稳定性。如工作实施例中所提供的，与包含pH4.5的谷氨酸或pH7.5的Tris的制剂相比，当抗CD137抗体配制于pH5.8的组氨酸缓冲液中时，观察到稳定性提高。
在一些实施方案中，本文所述的制剂包含缓冲剂或pH调节剂。在一些实施方案中，本文所述的任意制剂均具有或可被调节为具有生理学上可接受的pH。如本文所用，“生理学上可接受的pH”是介于pH5和pH7之间并包含pH5和pH7的pH，并且在本文所述的制剂的一些实施方案中，是介于pH5和pH8之间并包含pH5和pH8的pH。因此，如本文所用，生理学上可接受的pH包含特定的pH值，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0。在一些实施方案中，生理学上可接受的pH是至少pH5(例如，至少pH5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8或5.9)，但小于pH7(例如，小于pH6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2或6.1)。即，在一些实施方案中，生理学上可接受的pH是例如至少pH5.0，但小于pH7.0。在一些实施方案中，生理学上可接受的pH介于pH5.0和pH7.0之间。在一些实施方案中，生理学上可接受的pH介于pH5.5和pH6.5之间。在一些实施方案中，生理学上可接受的pH是例如pH6。在一些实施方案中，本文所述的抗体制剂的pH介于约5.0和7.0之间，包含端值(例如，约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0)。在一些实施方案中，生理上可接受的pH是至少pH5(例如，至少pH5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8或5.9)，但小于pH8(例如，小于pH7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、7.2或7.1)。即，在一些实施方案中，生理学上可接受的pH是例如至少pH5.0，但小于pH8.0。在一些实施方案中，生理学上可接受的pH介于pH5.0和pH8.0之间。在一些实施方案中，生理上可接受的pH介于pH5.5和pH7.5之间。在一些实施方案中，生理上可接受的pH是例如pH6。在一些实施方案中，生理上可接受的pH是例如pH7.4。在一些实施方案中，本文所述的抗体制剂的pH介于约5.0和8.0之间，包含端值(例如，约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0)。
在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5至约6.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约6.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5至约6.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约5.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.8至约6.2的pH。
在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.1的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.2的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.3的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.4的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.6的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.7的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.8的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.9的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.1的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.2的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.3的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.4的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.6的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.7的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.8的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.9的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.0的pH。
在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约8.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.5至约8.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0至约8.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.5至约8.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5至约7.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.8至约6.2的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.8至约7.4的pH。
在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.1的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.2的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.3的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.4的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.6的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.7的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.8的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约5.9的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.1的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.2的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.3的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.4的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.6的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.7的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.8的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.9的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.0的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.1的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.2的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.3的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.4的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.5的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.6的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.7的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.8的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约7.9的pH。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约8.0的pH。
(vi)抗CD137抗体的浓度
在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约1mg/ml至约100mg/ml的浓度存在于本公开的制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约5mg/ml至约15mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约15mg/ml至约30mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约30mg/ml至约45mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约45mg/ml至约60mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约60mg/ml至约75mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约75mg/ml至约90mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约85mg/ml至约100mg/ml的浓度存在于制剂中。
在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约1mg/ml的浓度存在于本公开的制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约2mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约3mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约4mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约5mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约6mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约7mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约8mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约9mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约10mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约11mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约12mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约13mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约14mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约15mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约16mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约17mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约18mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约19mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约20mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约21mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约22mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约23mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约24mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约25mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约30mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约35mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约40mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约45mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约50mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约55mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约60mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约65mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约70mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约75mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约80mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约85mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约90mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约95mg/ml的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，抗CD137抗体或其抗原结合片段以约100mg/ml的浓度存在于制剂中。
(vii)示例性制剂
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含组氨酸的缓冲液和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含组氨酸的缓冲液、二糖和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些实施方案中，二糖是蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约5-15％(w/v)的二糖。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含组氨酸的缓冲液和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂具有约5.0至7.0的pH。在一些实施方案中，制剂包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含组氨酸的缓冲液、二糖、非离子表面活性剂、盐和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂具有约5.0至7.0的pH。在一些实施方案中，制剂包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些实施方案中，制剂的二糖是蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约5-15％(w/v)的二糖。在一些实施方案中，制剂的非离子表面活性剂是聚山梨酯。在一些实施方案中，聚山梨酯是聚山梨酯80。在一些实施方案中，制剂包含约0.01％至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，制剂的盐是NaCl。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约50mM至约200mM的盐。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含组氨酸的缓冲液、约5％至约15％(w/v)的二糖、约0.01％至约0.1％w/v的非离子表面活性剂、约50mM至约200mM的盐和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂具有约5.0至7.0的pH。在一些实施方案中，制剂包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。在一些实施方案中，制剂的二糖是蔗糖。在一些实施方案中，制剂的二糖是乳糖。在一些实施方案中，制剂的二糖是麦芽糖。在一些实施方案中，制剂的二糖是海藻糖。在一些实施方案中，制剂的非离子表面活性剂是聚山梨酯。在一些实施方案中，聚山梨酯是聚山梨酯80。在一些实施方案中，制剂的盐是NaCl。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液、约5％至约15％(w/v)的蔗糖、约0.01％至约0.1％w/v的聚山梨酯80、约50mM至约200mM的NaCl和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂具有约5.0至7.0的pH。在一些实施方案中，制剂具有约5.0至7.4的pH。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以下：包含约20mM组氨酸的缓冲液、约10％(w/v)的蔗糖、约0.03％w/v的聚山梨酯80、约100mM的NaCl和抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂具有约6.0的pH。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约5mg/ml至约15mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约15mg/ml至约30mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约30mg/ml至约45mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约45mg/ml至约60mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约60mg/ml至约75mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约75mg/ml至约90mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约85mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约5mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约10mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约15mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，制剂包含浓度为约20mg/ml的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
如本文所述的本公开的制剂提供具有显著稳定性的抗CD137抗体或其抗原结合片段，使抗体聚集物(高分子量物质)和微粒的形成最小化，使电荷变体最小化，并保持抗体的结构完整性。
(viii)抗CD137制剂的稳定性
在一些实施方案中，本文所述的制剂能够在溶液中长时间保持抗CD137抗体或其抗原结合片段的结构完整性。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约2℃至40℃(例如，储存在例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃)下至少4周(例如，至少五周、六周、七周、八周、九周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周，或至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或更长时间)后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约2℃至9℃下至少4周后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约10℃至19℃下至少4周后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约20℃至29℃下至少4周后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约30℃至40℃下至少4周后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约4℃下至少4周后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约25℃下至少4周后仍保持稳定。在一些实施方案中，本公开的制剂中的抗CD137抗体储存在约40℃下至少4周后仍保持稳定。
如本文所述的工作实施例中所举例说明的，本发明人提供了适合于将约10mg/mL抗CD137抗体或其抗原结合片段保持以主要为单体的形式在4℃下至少24周、在25℃下至少12周、和在40℃下至少4周的制剂。如本文所用，如果溶液中存在的抗体为至少95(例如，至少95.1、95.2、95.3、95.4、95.5、95.6、95.7、95.8、95.9、96、96.1、96.2、96.3、96.4、96.5、96.6、96.7、96.8、96.9、97、97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.9、98、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9或更高)％单体(例如使用尺寸排阻色谱法(SEC)确定)，则本公开的制剂中的抗CD137抗体或其抗原结合片段是“主要为单体的”，或“主要为单体形式”。即：溶液中小于5(例如，小于4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)％的抗体是寡聚的、聚集的和/或片段化的。如本文所用，抗体片段化是指完整抗体的不恰当组装的组分或降解产物，其分子量低于完整抗体。此类片段化形式包括但不限于游离的单体重链多肽、二聚重链多肽(例如，二硫键连接的重链多肽)、与一个轻链多肽结合的二聚重链多肽、与一个轻链多肽结合的单体重链多肽或轻链或重链多肽的进一步降解产物或片段。在一些实施方案中，小于2(例如，小于1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)％的抗体储存在2℃至8℃下至少4周(例如，至少五周、六周、七周、八周、九周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周，或至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或更长时间)后聚集。确定存在于溶液中的抗CD137抗体或其抗原结合片段的单体抗体的量以及寡聚、聚集或片段化形式的量的方法在本文中描述，并在工作实施例中举例说明。例如，技术人员可以使用例如以下来确定存在于给定溶液中的完整的、片段化、未折叠中间体和/或聚集抗体物质的百分比：尺寸排阻色谱(SEC)、尺寸排阻色谱高效液相色谱(SEC-HPLC)、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、尿素诱导的蛋白解折叠技术、内源色氨酸荧光、非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和差示扫描量热法(DSC)。
抗CD137抗体及其抗原结合片段
本公开提供了包含与CD137特异性结合并将其激动的抗体及其抗原结合片段的制剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含任意本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了可用于治疗癌症的包含抗CD137激动剂抗体及其抗原结合片段的制剂。在一些实施方案中，本公开的制剂包含诱导细胞因子产生的抗CD137激动剂抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，本公开的制剂包含增加肿瘤微环境中CD8+T细胞数量的抗CD137激动剂抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含诱导保护性抗肿瘤免疫的抗CD137激动剂抗体及其抗原结合片段。本公开还提供了在体内施用时基本上不增加脾内或肝内CD4+和/或CD8+T细胞群体的包含抗CD137激动剂抗体及其抗原结合片段的制剂。
人CD137是255个氨基酸的跨膜多肽(SEQ ID NO:3；登录号NM_001561；NP_001552)，并且是系统发育保守的肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。CD137(或者4-1BB、TNFR超家族9)及其配体(CD137L)参与调控广泛的免疫活性。CD137配体与在活化T细胞上表达的其受体CD137交联，并共刺激T细胞活性。CD137是激活诱导的共刺激分子。最近的研究已表明，CD137介导的抗癌作用主要基于其激活T细胞的能力，尤其是其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，并诱导细胞因子产生，尤其是大量IFN-γ的能力(Ye et al.,(2014)Clin Cancer Res20(1):44-55)。CD137配体是细胞表面上的跨膜蛋白，且其将信号传递至之上有其表达的细胞中，这种现象称为“反向信号传导(reverse signaling)”或“回向信号传导(back signaling)”。CD137配体表达发现在大多数类型的白细胞和一些非免疫细胞上。在单核细胞(单核细胞、巨噬细胞和DC)中，CD137配体信号传导诱导激活、迁移、存活和分化。
因此，在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与CD137结合并将其激动，并且允许或促进CD137L结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与CD137结合并将其激动。在一些实施方案中，本公开提供的抗CD137抗体与CD137结合并将其激动，并且共刺激T细胞的激活。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段，其具有一种或多种以下特性或特征：
a)与人CD137特异性结合；
b)与人和食蟹猴CD137结合；和
c)与人和小鼠CD137结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与CD137结合并共刺激T细胞活性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与CD137结合并诱导或增强T细胞激活、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、T细胞增殖、细胞因子产生或以上组合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与CD137结合并诱导或增强肿瘤微环境中的T细胞激活、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、T细胞增殖、细胞因子产生或以上组合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段不显著诱导或增强肝内和/或脾内T细胞激活和/或T细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与CD137结合并诱导IFN-γ的产生。在一些实施方案中，本公开提供的抗体与CD137结合并诱导IL-2、TNF-α、IL-13或其组合的产生。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含本文所述的抗CD137抗体，其与CD137特异性结合并将其激动。在一些实施方案中，通过确定免疫细胞产生的细胞因子的浓度来测定CD137的激动。分析细胞因子产生的方法是本领域已知的，并且用于实施例中。在一些实施方案中，免疫细胞产生的细胞因子增加表明了CD137的激动。在一些实施方案中，通过分析T细胞增殖来测定CD137的激动。在一些实施方案中，T细胞增殖增加表明了CD137的激动。在一些实施方案中，通过相关分子的磷酸化或相关启动子后基因报告子的表达的定量测定细胞信号传导水平，以测定CD137的激动。在一些实施方案中，细胞信号传导增加表明了CD137的激动。在一些实施方案中，通过测定肿瘤体积来测定CD137的激动。在一些实施方案中，肿瘤体积减少表明了CD137的激动。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含本文所述的抗CD137抗体，其诱导、增加或稳定CD137的寡聚化、多聚化或其他更高阶的聚类(clustering)。在一些实施方案中，通过荧光显微术观察细胞表面上的CD137聚类。
本文提供了包含与CD137结合并将其激动的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段的制剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段，(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；(ii)与本文所述的人CD137上的表位结合；和/或(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3。
对CD137的亲和力
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间或约40nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合的本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗CD137抗体对人CD137的亲和力比mAb10对小鼠CD137的亲和力高至少两倍(例如，至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或10倍)。在一些实施方案中，抗CD137抗体的亲和力不大于500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、250nM、200nM、175nM、150nM、125nM、110nM或100nM。在一些实施方案中，抗CD137抗体对人CD137的亲和力比mAb10对小鼠CD137的亲和力高至少两倍(例如，至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或10倍)，但不大于500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、250nM、200nM、175nM、150nM、125nM、110nM或100nM。抗体的亲和力是与单个CD137多肽的结合强度。在一些实施方案中，亲和力由平衡解离常数(KD)表示。KD的值与抗体对抗原的结合亲和力成反比。因此，KD的值越小，抗体对其抗原的亲和力越大。
确定抗体对其抗原的亲和力的方法是本领域已知的。确定结合亲和力的示例性方法采用表面等离子体共振。表面等离子体共振是一种光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。有关进一步描述，参见Jonsson,U.,et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnsson,B.,et al.(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约40-100nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约30-40nM、40-50nM、50-60nM、60-70nM、70-80nM、80-90nM、90-100nM、45-55nM、55-65nM、75-85nM、85-95nM、45-95nM、50-90nM、55-85nM、60-80nM、65-75nM、55-75nM、40-70nM、50-80nM或60-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约60-80nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约60-75nM的亲和力(KD)与人CD137结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约60-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约50-80nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约40-70nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约55-75nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约65-75nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约60-80nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约55-85nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约50-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约45-95nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约85-95nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约75-85nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约75-85nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约55-65nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约45-55nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约80-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约70-80nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约60-70nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约50-60nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约40-50nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以约30-40nM的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以以下的亲和力(KD)与人CD137结合：约30nM、约31nM、约32nM、约33nM、约34nM、约35nM、约36nM、约37nM、约38nM、约39nM、约40nM、约41nM、约42nM、约43nM、约44nM、约45nM、约46nM、约47nM、约48nM、约49nM、约50nM、约51nM、约52nM、约53nM、约54nM、约55nM、约56nM、约57nM、约58nM、约59nM、约60nM、约61nM、约62nM、约63nM、约64nM、约65nM、约66nM、约67nM、约68nM、约69nM、约70nM、约71nM、约72nM、约73nM、约74nM、约75nM、约76nM、约77nM、约78nM、约79nM、约80nM、约81nM、约82nM、约83nM、约84nM、约85nM、约86nM、约87nM、约88nM、约89nM、约90nM、约91nM、约92nM、约93nM、约94nM、约95nM、约96nM、约97nM、约98nM、约99nM、约100nM、约101nM、约102nM、约103nM、约104nM、约105nM、约106nM、约107nM、约108nM、约109nM或约110nM。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以以下亲和力(KD)与人CD137结合：至少30nM但小于约110nM、至少31nM但小于约109nM、至少32nM但小于约108nM，至少33nM但小于约107nM，至少34nM但小于约106nM，至少35nM但小于约105nM，至少36nM但小于约104nM，至少37nM但小于约103nM、至少38nM但小于约102nM，至少39nM但小于约101nM，至少40nM但小于约100nM；至少41nM但小于约99nM；至少42nM但小于约98nM；至少43nM但小于约97nM；至少44nM但小于约96nM；至少45nM但小于约95nM；至少46nM但小于约94nM；至少47nM但小于约93nM；至少48nM但小于约92nM；至少49nM但小于约91nM；至少50nM但小于约90nM；至少51nM但小于约89nM；至少52nM但小于约88nM；至少53nM但小于约87nM；至少54nM但小于约86nM；至少55nM但小于约85nM；至少56nM但小于约84nM；至少57nM但小于约83nM；至少58nM但小于约82nM；至少59nM但小于约81nM；至少60nM但小于约80nM；至少61nM但小于约79nM；至少62nM但小于约78nM；至少63nM但小于约77nM；至少64nM但小于约76nM；或至少65nM但小于约75nM。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以至少40nM但小于约100nM的亲和力(KD)与人CD137结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与来自一种以上物种的CD137多肽交叉反应。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体结合食蟹猴CD137和人CD137。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体结合小鼠CD137和人CD137。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体结合人CD137、小鼠CD137和食蟹猴CD137。
CD137表位结合
在一些实施方案中，本公开的制剂包含与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，本公开的制剂包含与人CD137上的表位结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与人CD137上的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:3的氨基酸111-132的一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、9九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或全部25个)。在一些实施方案中，与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与SEQ ID NO:3的氨基酸111-132内的表位结合。在一些方面，本公开提供的与人CD137特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与SEQ ID NO:3的氨基酸111-132的全部或部分结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:3的残基K114的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113和K114的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126和I132的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与包含SEQ IDNO:3的E111、T113、K114、N126、I132和P135的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:3的E111、T113、K114、N126、I132和P135残基的一个或多个的人CD137的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与人CD137的表位结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置100至135、101至135、102至135、103至135、104至135、105至135、106至135、107至135、108至135、109至135、110至135或111至135的一个或多个氨基酸残基的序列。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与人CD137的表位结合，所述表位包含对应于SEQ IDNO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列。在一些实施方案中，表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:3的氨基酸位置100至135、101至135、102至135、103至135、104至135、105至135、106至135、107至135、108至135、109至135、110至135或111至135内的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与在SEQID NO:3的氨基酸位置111至135内的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的人CD137的表位结合。在一些实施方案中，氨基酸残基L112可以是另一氨基酸残基。
在一些实施方案中，表位是非线性表位。在一些实施方案中，氨基酸残基K114的突变消除了本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与人CD137的结合。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与人CD137的表位结合，所述表位包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列，其中所述表位包含至少氨基酸K114，并且其中抗体或其抗原结合部分结合小鼠CD137而不结合大鼠CD137。在一些实施方案中，表位是非线性表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分结合小鼠CD137和食蟹猴CD137而不结合大鼠CD137。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与人、小鼠、大鼠和食蟹猴CD137的结合是通过表面等离子体共振(SPR)测定的。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分以比抗体对大鼠CD137的亲和力高至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍或1000倍的亲和力与小鼠、食蟹猴或人CD137结合。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分以比抗体对与SEQ ID NO:3的人CD137相比不包含在位置114的赖氨酸的CD137多肽的亲和力高至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍或1000倍的亲和力与小鼠、食蟹猴或人CD137结合。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与人CD137的表位结合，并与mAb1竞争结合人CD137的表位。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段与CD137结合并将其激动。在一些实施方案中，本公开提供的抗CD137抗体与CD137结合并将其激动，并且共刺激T细胞的激活。
本公开提供了包含竞争结合CD137上的表位的抗体的制剂，所述表位包含被本文所述的一种或多种特定参考抗体(例如，mAb1)所识别的表位的全部或部分。在一些实施方案中，抗CD137抗体与人CD137的表位结合，并与参考抗体(例如mAb1)竞争结合人CD137的表位，并且其中抗体或其抗原结合片段以1x10-6或更小的平衡解离常数KD与人CD137结合。在一些实施方案中，抗CD137抗体与CD137上的表位结合，其中表位的一个或多个突变抑制、降低或阻断与抗体和参考抗体(例如，mAb1)两者的结合。在一些实施方案中，参考抗体是本文所述的mAb1抗体。在一些实施方案中，参考抗体是表22-27中任一项所提供的任意一种抗体。
因此，本公开提供的抗CD137抗体可以通过对包含与CD137结合的抗体或其片段或部分的晶体结构进行X射线晶体学分析来评估。在一些方面，通过确定人CD137抗原上处于或位于抗体互补位残基例如mAb1的4埃
Figure BDA0003224144880001061
内的残基来鉴定与本公开提供的抗体结合的表位。
在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少3个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少4个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少5个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少6个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少7个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少8个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少9个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少10个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少12个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少3个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少13个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少14个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位是至少15个氨基酸残基。
在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于25个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于24个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于23个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于22个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于21个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于20个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于19个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于18个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于17个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于16个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于15个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于14个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于13个氨基酸残基。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于12个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于11个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于10个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于9个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于8个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于7个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于6个氨基酸残基。在一些实施方案中，与本文所述的抗CD137抗体结合的表位少于5个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与少于25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸的表位结合，且包含SEQ ID NO:3的氨基酸残基K114。
可变区
在一些实施方案中，本文提供了包含分离的单克隆抗体或其抗原结合片段的制剂，所述抗体包含如表22-27中任一项所示的重链和轻链可变序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:70、79和90所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:71、80和91所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:72、81和92所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:73、82和91所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(f)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:74、83和93所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(g)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:75、84和91所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(h)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:74、85和94所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(i)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:76、86和95所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(j)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:77、87和93所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(k)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、88和90所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(l)分别如SEQ ID NO:49、57和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(m)分别如SEQ ID NO:49、58和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(n)分别如SEQ ID NO:49、59和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(o)分别如SEQ ID NO:49、60和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(p)分别如SEQ ID NO:50、61和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(q)分别如SEQ ID NO:50、58和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(r)分别如SEQ ID NO:51、62和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(s)分别如SEQ ID NO:52、63和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(t)分别如SEQ ID NO:50、64和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(u)分别如SEQ ID NO:50、65和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(v)分别如SEQ ID NO:51、108和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(w)分别如SEQ ID NO:107、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(x)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:109、110和92所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(y)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(z)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(aa)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(bb)分别如SEQ ID NO:136、140和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(cc)分别如SEQ ID NO:136、140和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(dd)分别如SEQ ID NO:136、140和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ee)分别如SEQ ID NO:137、141和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ff)分别如SEQ ID NO:137、141和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(gg)分别如SEQ ID NO:137、141和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(hh)分别如SEQ ID NO:138、142和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ii)分别如SEQ ID NO:138、142和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(jj)分别如SEQ ID NO:138、142和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(kk)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ll)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(mm)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(nn)分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(oo)分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(pp)分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(qq)分别如SEQ ID NO:49、155和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(rr)分别如SEQ ID NO:49、155和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ss)分别如SEQ ID NO:49、155和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(tt)分别如SEQ ID NO:51、156和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(uu)分别如SEQ ID NO:51、156和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(vv)分别如SEQ ID NO:51、156和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(ww)分别如SEQ ID NO:50、158和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(xx)分别如SEQ ID NO:50、158和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(yy)分别如SEQ ID NO:50、158和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(zz)分别如SEQ ID NO:153、157和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(aaa)分别如SEQ ID NO:153、157和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:145、148和151所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(bbb)分别如SEQ ID NO:153、157和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:146、149和152所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、101和103组成的组的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:6、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和105组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链CDR，其中重链CDR3包含如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链可变区，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；
(b)分别为SEQ ID NO:4和28；
(c)分别为SEQ ID NO:4和30；
(d)分别为SEQ ID NO:4和32；
(e)分别为SEQ ID NO:4和34；
(f)分别为SEQ ID NO:4和36；
(g)分别为SEQ ID NO:4和38；
(h)分别为SEQ ID NO:4和40；
(i)分别为SEQ ID NO:4和42；
(j)分别为SEQ ID NO:4和44；
(k)分别为SEQ ID NO:4和46；
(l)分别为SEQ ID NO:8和6；
(m)分别为SEQ ID NO:10和6；
(n)分别为SEQ ID NO:12和6；
(o)分别为SEQ ID NO:14和6；
(p)分别为SEQ ID NO:16和6；
(q)分别为SEQ ID NO:18和6；
(r)分别为SEQ ID NO:20和6；
(s)分别为SEQ ID NO:22和6；
(t)分别为SEQ ID NO:24和6；
(u)分别为SEQ ID NO:26和6；
(v)分别为SEQ ID NO:101和6；
(w)分别为SEQ ID NO:103和6；和
(x)分别为SEQ ID NO:4和105。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、101和103组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:6、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和105组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链可变区，其包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；
(b)分别为SEQ ID NO:4和28；
(c)分别为SEQ ID NO:4和30；
(d)分别为SEQ ID NO:4和32；
(e)分别为SEQ ID NO:4和34；
(f)分别为SEQ ID NO:4和36；
(g)分别为SEQ ID NO:4和38；
(h)分别为SEQ ID NO:4和40；
(i)分别为SEQ ID NO:4和42；
(j)分别为SEQ ID NO:4和44；
(k)分别为SEQ ID NO:4和46；
(l)分别为SEQ ID NO:8和6；
(m)分别为SEQ ID NO:10和6；
(n)分别为SEQ ID NO:12和6；
(o)分别为SEQ ID NO:14和6；
(p)分别为SEQ ID NO:16和6；
(q)分别为SEQ ID NO:18和6；
(r)分别为SEQ ID NO:20和6；
(s)分别为SEQ ID NO:22和6；
(t)分别为SEQ ID NO:24和6；
(u)分别为SEQ ID NO:26和6；
(v)分别为SEQ ID NO:101和6；
(w)分别为SEQ ID NO:103和6；和
(x)分别为SEQ ID NO:4和105。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD137特异性结合的抗体，其包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；
(b)分别为SEQ ID NO:5和29；
(c)分别为SEQ ID NO:5和31；
(d)分别为SEQ ID NO:5和33；
(e)分别为SEQ ID NO:5和35；
(f)分别为SEQ ID NO:5和37；
(g)分别为SEQ ID NO:5和39；
(h)分别为SEQ ID NO:5和41；
(i)分别为SEQ ID NO:5和43；
(j)分别为SEQ ID NO:5和45；
(k)分别为SEQ ID NO:5和47；
(l)分别为SEQ ID NO:9和7；
(m)分别为SEQ ID NO:11和7；
(n)分别为SEQ ID NO:13和7；
(o)分别为SEQ ID NO:15和7；
(p)分别为SEQ ID NO:17和7；
(q)分别为SEQ ID NO:19和7；
(r)分别为SEQ ID NO:21和7；
(s)分别为SEQ ID NO:23和7；
(t)分别为SEQ ID NO:25和7；
(u)分别为SEQ ID NO:27和7；
(v)分别为SEQ ID NO:102和7；
(w)分别为SEQ ID NO:104和7；和
(x)分别为SEQ ID NO:5和106。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD137特异性结合的抗体，其包含由与选自由以下组成的组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；
(b)分别为SEQ ID NO:5和29；
(c)分别为SEQ ID NO:5和31；
(d)分别为SEQ ID NO:5和33；
(e)分别为SEQ ID NO:5和35；
(f)分别为SEQ ID NO:5和37；
(g)分别为SEQ ID NO:5和39；
(h)分别为SEQ ID NO:5和41；
(i)分别为SEQ ID NO:5和43；
(j)分别为SEQ ID NO:5和45；
(k)分别为SEQ ID NO:5和47；
(l)分别为SEQ ID NO:9和7；
(m)分别为SEQ ID NO:11和7；
(n)分别为SEQ ID NO:13和7；
(o)分别为SEQ ID NO:15和7；
(p)分别为SEQ ID NO:17和7；
(q)分别为SEQ ID NO:19和7；
(r)分别为SEQ ID NO:21和7；
(s)分别为SEQ ID NO:23和7；
(t)分别为SEQ ID NO:25和7；
(u)分别为SEQ ID NO:27和7；
(v)分别为SEQ ID NO:102和7；
(w)分别为SEQ ID NO:104和7；和
(x)分别为SEQ ID NO:5和106。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区由选自由SEQ ID NO:5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、102和104组成的组的核苷酸序列编码；并且其中轻链可变区由选自由SEQ ID NO:7、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和106组成的组的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区由与选自由SEQ ID NO:5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、102和104组成的组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码；并且其中轻链可变区由与选自由SEQ IDNO:7、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和106组成的组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD137特异性结合并包含具有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3的抗CD137抗体，其中X是任意氨基酸。在一些实施方案中，X是除丙氨酸之外的任意氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:126的残基D95、L100、Y100E、Y100G和/或Y100H的突变导致丧失与人CD137的结合。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD137特异性结合并包含具有氨基酸序列DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)的重链CDR3的抗CD137抗体，其中X是任意氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:126的残基F98、D100A、Y100D和/或Y100F和/或Y100H突变为丙氨酸导致丧失与人CD137的结合。在一些实施方案中，SEQ ID NO:126的残基F98、D100A、Y100D和/或Y100F和/或Y100H突变为除丙氨酸之外的任意残基导致与人CD137的结合增加。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD137特异性结合并包含具有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQ ID NO:128)的重链CDR3的抗CD137抗体，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。在一些实施方案中，X2是脯氨酸，其中X3是苯丙氨酸或色氨酸，其中X5是天冬氨酸或谷氨酸，其中X8是酪氨酸，且其中X9是酪氨酸。
抗体或其抗原结合部分的重链CDR3内的氨基酸残基在与特定靶标(例如，CD137)结合中的作用可以通过本领域技术人员已知的方法确定。在一些实施方案中，完成使用丙氨酸扫描的初始分析以确定抗原结合的关键残基。如本文所述，丙氨酸扫描是用于确定特定野生型残基对给定蛋白或多肽的稳定性或功能(例如，结合亲和力)的贡献的技术。此技术包括用丙氨酸残基取代多肽中的野生型残基，然后评估丙氨酸取代的衍生物或突变多肽的稳定性或功能(例如，结合亲和力)，并与野生型多肽相比较。在一些实施方案中，对被鉴定为不关键的残基进行进一步评估以调节抗体与抗原的结合(例如，增加或减少结合)。此类分析的一个非限制性实例是深度突变扫描(deep mutational scanning)。这种方法允许对大量突变进行评估。在一些实施方案中，将重链CDR3内的每个氨基酸残基突变为每个氨基酸残基(除丙氨酸之外)，并对结合进行评估。用于分析氨基酸残基突变的作用的其他方法是本领域已知的。在一些实施方案中，这些方法用于评估所有重链和轻链CDR中的残基在与人CD137的结合中的作用。
示例性CD137结合抗体
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以约40-100nM(例如，约40nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含与上文所述的人CD137上的表位(例如，包含K114)结合的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有含氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并与上文所述的人CD137上的表位(例如，包含K114)结合的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ IDNO:126)的重链CDR3的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含与上文所述的人CD137上的表位(例如，包含K114)结合并包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合，与上文所述的人CD137上的表位(例如，包含K114)结合，并包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX(SEQ ID NO:126)的重链CDR3的本文所述的抗CD137抗体。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；且
(ii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；且
(ii)与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个的人CD137上的表位结合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个的人CD137上的表位结合；
(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX的重链CDR3，其中X是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个的人CD137上的表位结合；
(iii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个的人CD137上的表位特异性结合；且
(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含SEQ ID NO:3的残基E111、T113、K114、N126、I132和P135的一个或多个的人CD137上的表位结合；和
(iii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；且
(ii)与包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列的表位结合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列的表位结合；
(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX的重链CDR3，其中X是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列的表位结合；
(iii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列的表位结合；且
(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置111至135的一个或多个氨基酸残基的序列的表位结合；且
(iii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力与人CD137结合；且
(ii)与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位结合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位结合；
(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX的重链CDR3，其中X是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位结合；
(iii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸；或
(iv)以上的组合。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位结合；且
(iii)包含含有氨基酸序列DXXXXLXXXXYXYYX的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗CD137抗体
(i)以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合；
(ii)与包含ELTK(对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-114)的表位结合；且
(iii)包含含有氨基酸序列DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。
在一些实施方案中，上文所述的抗CD137抗体包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(b)分别如SEQ ID NO:51、108和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，上文所述的抗CD137抗体包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(b)分别如SEQ ID NO:137、141和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，上文所述的抗CD137抗体包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和
(b)分别如SEQ ID NO:51、156和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有重链和轻链可变区的抗CD137抗体，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:4和101组成的组的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；和
(b)分别为SEQ ID NO:101和6。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；和
(b)分别为SEQ ID NO:101和6；和
(c)分别为SEQ ID NO:26和6。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；和
(b)分别为SEQ ID NO:102和7。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；
(b)分别为SEQ ID NO:102和7；和
(c)分别为SEQ ID NO:27和7。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有重链和轻链可变区的抗CD137抗体，其中重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:4和101组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有重链和轻链可变区的抗CD137抗体，其中重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:4、26和101组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；并且其中轻链可变区包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有重链和轻链可变区的抗CD137抗体，其中重链可变区由与选自由SEQ ID NO:5和102组成的组的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码；并且其中轻链可变区由与SEQ ID NO:7的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含含有重链和轻链可变区的抗CD137抗体，其中重链可变区由与选自由SEQ ID NO:5、27和102组成的组的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码；并且其中轻链可变区由与SEQ ID NO:7的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含含有与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；和
(b)分别为SEQ ID NO:101和6。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含含有与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:4和6；
(b)分别为SEQ ID NO:101和6；和
(c)分别为SEQ ID NO:26和6。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含由与选自由以下组成的组的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；和
(b)分别为SEQ ID NO:102和7。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含由与选自由以下组成的组的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区：
(a)分别为SEQ ID NO:5和7；
(b)分别为SEQ ID NO:102和7；和
(c)分别为SEQ ID NO:27和7。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体具有至少以下：mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)、mab8(即，包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)或mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)的功能特性。在一些实施方案中，本文所述的抗体的功能特性包括但不限于：诱导或增强CD137的二聚化；诱导或增强CD137的多聚化；诱导或增强CD137介导的T细胞激活；诱导或增强CD137介导的细胞毒性T细胞应答；诱导或增强CD137介导的T细胞增殖；诱导或增强CD137介导的细胞因子产生；缺乏对肝内和/或脾内T细胞激活和/或T细胞增殖的诱导或增强；以及减少或抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以至少等价(equivalent)于mAb1(即，包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗体)、mab8(即，包含分别为SEQID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗体)或mAb10(即，包含分别为SEQ ID NO:26和6的重链和轻链可变序列的抗体)的平衡解离常数KD与人CD137结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含人IgG1重链恒定区或人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含人野生型IgG1重链恒定区或人野生型IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含如SEQ ID NO:1所示的人野生型IgGl重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含突变的IgGl重链恒定区或突变的IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含突变的IgG4重链恒定区，其中所述突变的IgG4重链恒定区包含在残基Ser228处的氨基酸取代。在一些实施方案中，残基Ser228处的氨基酸取代是S228P。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含IgG4重链恒定区，其中去除了c端赖氨酸残基。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含IgG4重链恒定区，其中去除了c端赖氨酸残基，并包含S228P氨基酸取代。在一些实施方案中，本文所述的抗-CD137抗体包含如SEQ ID NO:2所示的IgG4重链恒定区。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有如SEQ ID NO:129和133所示的氨基酸序列的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有如SEQ ID NO:130和133所示的氨基酸序列的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有如SEQ ID NO:131和133所示的氨基酸序列的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有如SEQ ID NO:132和133所示的氨基酸序列的重链和轻链。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:129和133具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:130和133具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:131和133具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的重链和轻链。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:132和133具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的重链和轻链。
CDR编号系统
由Kabat描述的系统，也称为“根据Kabat编号”、“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”，提供了适用于抗体的任意可变域的明确残基编号系统，并提供了定义每条链的三个CDR的精确残基边界。(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991)，其内容通过引用以其全文并入。这些CDR称为Kabat CDR并且包含轻链可变域中的约残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)，和重链可变域中的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。当根据Kabat定义CDR时，轻链FR残基位于约残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)，且重链FR残基约位于重链残基中的残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1EU抗体的残基编号。
本领域还使用其他CDR编号系统(参见，例如，表A)。Chothia及同事发现Kabat CDR中的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有巨大的多样性。(Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；和Chothia et al.(1989)Nature342:877-883)。这些子部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些CDR可称为“Chothia CDR”、“Chothia编号”或“根据Chothia编号”，并且包含轻链可变域中的约残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)，和重链可变域中的26-32(CDR1)、50-56或52-56(CDR2)和95-102(CDR3)。Mol.Biol.196:901-917(1987)。
由MacCallum描述的系统，也称为“根据MacCallum编号”或“MacCallum编号”，包含轻链可变域中的约残基30-36(CDR1)、46-55(CDR2)和89-96(CDR3)，和重链可变域中的30-35(CDR1)、47-58(CDR2)和93-101(CDR3)。MacCallum et al.((1996)J.Mol.Biol.262(5):732-745)。
由AbM描述的系统，也称为“根据AbM编号”或“AbM编号”，包含轻链可变域中的约残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)，和重链可变域中的26-35(CDR1)、50-58(CDR2)和95-102(CDR3)。
也可以使用可变区的IMGT(国际免疫遗传学信息系统，INTERNATIONALIMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM)编号，其是根据IMGT的方法对免疫球蛋白可变重链或轻链中的残基进行编号，所述方法描述于Lefranc,M.-P.,"The IMGT unique numberingfor immunoglobulins,T cell Receptors and Ig-like domains",The Immunologist,7,132-136(1999)中，并通过引用以其全文明确并入本文。如本文所用，“IMGT序列编号”或“根据IMTG编号”是指根据IMGT对编码可变区的序列进行编号。对于重链可变区，当根据IMGT编号时，CDR1的高度可变区范围为氨基酸位置27至38，CDR2的高度可变区范围为氨基酸位置56至65，且CDR3的高度可变区范围为氨基酸位置105至117。对于轻链可变域，当根据IMGT编号时，CDR1的高度可变区范围为氨基酸位置27至38，CDR2的高度可变区范围为氨基酸位置56至65，且CDR3的高度可变区范围为氨基酸位置105至117。
在本文所述的抗CD137抗体的一些实施方案中，当根据Chothia编号进行编号时，本文所述的CDR包含轻链可变域中的约残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)，和重链可变域中的27-35(CDR1)、49-60(CDR2)和93-102(CDR3)。在一些实施方案中，当根据Chothia编号进行编号时，轻链可变域中的CDR2可包含氨基酸49-56。
表A：CDR定义
Figure BDA0003224144880001301
在本文所述的抗CD137抗体的一些方面和实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有与SEQ ID NO:4至少90％同一(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)的氨基酸序列的重链可变区，和/或含有与SEQ ID NO:6至少90％同一(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些这样的实施方案中，重链可变区包含与SEQ ID NO:4不同在15个氨基酸或更少、14个氨基酸或更少、13个氨基酸或更少、12个氨基酸或更少、11个氨基酸或更少、10个氨基酸或更少、9个氨基酸或更少、8个氨基酸或更少、7个氨基酸酸或更少、6个氨基酸或更少、5个氨基酸或更少、4个氨基酸或更少、3个氨基酸或更少、2个氨基酸或更少、或1个氨基酸的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，轻链可变区包含与SEQ ID NO:6不同在15个氨基酸或更少、14个氨基酸或更少、13个氨基酸或更少、12个氨基酸或更少、11个氨基酸或更少、10个氨基酸或更少、9个氨基酸或更少、8个氨基酸或更少、7个氨基酸酸或更少、6个氨基酸或更少、5个氨基酸或更少、4个氨基酸或更少、3个氨基酸或更少、2个氨基酸或更少、或1个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当根据Chothia编号进行编号时，抗体或其抗原结合部分的CDR包含SEQ ID NO:6的轻链可变域中的约残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)，和SEQ ID NO:4的重链可变结构域中的27-35(CDR1)、49-60(CDR2)和93-102(CDR3)。在一些实施方案中，当根据Chothia编号进行编号时，SEQ ID NO:6的轻链可变域中的CDR2可包含氨基酸49-56。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含以下的抗体或其抗原结合部分：SEQ IDNO:4的重链可变区的重链CDR，和SEQ ID NO:6的轻链可变区的轻链CDR，其中重链和轻链CDR残基根据Kabat编号。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含以下的抗体或其抗原结合部分：SEQ IDNO:4的重链可变区的重链CDR，和SEQ ID NO:6的轻链可变区的轻链CDR，其中重链和轻链CDR残基根据Chothia编号。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含以下的抗体或其抗原结合部分：SEQ IDNO:4的重链可变区的重链CDR，和SEQ ID NO:6的轻链可变区的轻链CDR，其中重链和轻链CDR残基根据MacCallum编号。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含以下的抗体或其抗原结合部分：SEQ IDNO:4的重链可变区的重链CDR，和SEQ ID NO:6的轻链可变区的轻链CDR，其中重链和轻链CDR残基根据AbM编号。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含以下的抗体或其抗原结合部分：SEQ IDNO:4的重链可变区的重链CDR，和SEQ ID NO:6的轻链可变区的轻链CDR，其中重链和轻链CDR残基根据IMGT编号。
CD137结合抗体的表征和功能
I.亲和力
在一些实施方案中，本公开的制剂包含以由抗原结合测定确定的约40-100nM(例如，约40nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以由抗原结合测定确定的约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合的本文所述的抗CD137抗体。在一些实施方案中，本公开的制剂包含以由抗原结合测定确定的约45-95nM、50-90nM、55-85nM、60-80nM、65-75nM、55-75nM、40-70nM、50-80nM或60-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合的本文所述的抗CD137抗体。
在一些实施方案中，抗原结合测定确定了抗CD137抗体对CD137多肽的结合亲和力。在一些实施方案中，抗原结合测定是表面等离子体共振。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以使用表面等离子体共振确定的约40-100nM(例如，约40nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以使用表面等离子体共振确定的约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以使用表面等离子体共振确定的约45-95nM、50-90nM、55-85nM、60-80nM、65-75nM、55-75nM、40-70nM、50-80nM或60-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。
短语“表面等离子体共振”包括允许通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)。有关进一步描述，参见
Figure BDA0003224144880001321
U.,et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；
Figure BDA0003224144880001322
U.,et al.(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,et al.(1991)Anal.Biochem.198:268-277。在一些实施方案中，抗原结合测定是生物膜层干涉(biolayer interferometry，BLI)。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以使用生物膜层干涉确定的约40-100nM(例如，约40nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以由抗原结合测定确定的约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体以由抗原结合测定确定的约45-95nM、50-90nM、55-85nM、60-80nM、65-75nM、55-75nM、40-70nM、50-80nM或60-90nM的亲和力(KD)与人CD137结合。
短语“生物膜层干涉”或“BLI”包括允许测量其光学层检测表面厚度的亚纳米级变化的光学现象。在一些实施方案中，生物分子在传感器表面结合并改变光学层厚度。光学层厚度变化的幅度与结合分子的质量或分子量成正比。在一些实施方案中，将CD137固定到传感器表面以测量抗体的结合，其中结合产生分子量的变化以产生光学层厚度的相应变化。在一些实施方案中，BLI使用OCTET系统
Figure BDA0003224144880001331
进行。
II.免疫细胞效应
在一些实施方案中，本公开的制剂包含本文所述的抗CD137抗体，其诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生，通过细胞因子测定确定。在一些实施方案中，细胞因子测定确定了从与抗CD137抗体接触的免疫细胞分泌的至少一种细胞因子的量，其中至少一种细胞因子的量的增加表明抗CD137抗体诱导或增强细胞因子产生。在一些实施方案中，细胞因子产生的增加比对照抗体(例如，不与CD137结合且不诱导细胞因子产生的抗体)至少多1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生，通过细胞因子测定确定，其中细胞因子测定包括以下步骤：
(i)使免疫细胞与抗CD137抗体接触；和
(ii)确定免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量，
其中至少一种细胞因子的量的增加表明抗CD137抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生，通过细胞因子测定确定，其中细胞因子测定包括以下步骤：
(i)使免疫细胞与抗CD137抗体接触；和
(ii)确定免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量，和
(iii)将免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量与参考免疫细胞分泌的量进行比较，
其中参考免疫细胞与对照抗体接触，并且其中免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量相对于参考免疫细胞的增加表明人CD137介导的细胞因子产生的诱导或增强。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生，通过细胞因子测定确定，其中细胞因子测定包括以下步骤：
(i)使免疫细胞与抗CD137抗体接触；
(ii)确定免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量，和
(iii)将免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量与参考免疫细胞分泌的量或水平进行比较，
其中参考免疫细胞不与抗CD137抗体接触，并且其中免疫细胞产生的至少一种细胞因子的量相对于参考免疫细胞的增加表明免疫细胞的人CD137介导的细胞因子产生的诱导或增强。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子选自由IL-2、IFN-γ、TNFα、IL-13及其组合组成的组。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，细胞因子是TNFα。在一些实施方案中，细胞因子是IL-13。在一些实施方案中，抗CD137抗体诱导或增强IL-2产生。在一些实施方案中，抗CD137抗体诱导或增强TNFα产生。在一些实施方案中，抗CD137抗体诱导或增强IL-13产生。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2。在一些方面，产生的细胞因子是TNFα。在一些方面，产生的细胞因子是IL-13。在某些方面，产生的细胞因子是IFN-γ。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2和TNFα。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2和IL-13。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2和IFN-γ。在一些方面，产生的细胞因子是TNFα和IL-13。在一些方面，产生的细胞因子是TNFα和IFN-γ。在一些方面，产生的细胞因子是IL-13和IFN-γ。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2、TNFα和IL-13。在一些方面，产生的细胞因子是IL-2、TNFα和IFN-γ。在一些方面，产生的细胞因子是IFN-γ、TNFα和IL-13。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，参考免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，细胞因子测定是细胞因子珠阵列测定(cytokine bead arrayassay)。细胞因子珠阵列测定是可对样品中的多种细胞因子进行多分析物流式细胞测定的基于珠子的免疫测定。使用不同大小或颜色的微球是细胞因子珠阵列测定的基础，其中每个微球(或“珠子”)都包被有与抗原(例如，细胞因子)特异性结合的抗体。然后将抗体包被的珠子与检测抗体(detector antibody)一起引入样品中。然后通过流式细胞术分析珠子:抗原:检测抗体复合物。可商购的细胞因子珠阵列测定包括但不限于BDTMCytometric BeadArray Systems(BD Biosciences)和
Figure BDA0003224144880001351
Assays(R&DSystems)。在一些实施方案中，人CD137介导的细胞因子产生的诱导或增强是通过细胞因子珠阵列测定确定的。在一些实施方案中，人CD137介导的细胞因子产生的诱导或增强通过
Figure BDA0003224144880001352
测定确定。
在一些实施方案中，细胞因子测定是Meso Scale Discovery(MSD)测定(MesoScale Diagnostics；Rockville,MD)。MSD测定是基于对与目标抗原(例如细胞因子)特异性结合的电化学发光标记抗体的检测的可商购的测定。MSD测定包含微孔板孔底部的高结合碳电极，其允许生物试剂的结合(例如，捕获对细胞因子特异的抗体)。MSD测定使用与检测抗体结合的电化学发光标记。将样品添加到微孔板孔中，并通过MSD仪器向平板电极通电，导致电化学发光标记物发光。测量光强度以对样品中的分析物(例如，细胞因子)进行定量。在一些实施方案中，人CD137介导的细胞因子产生的诱导或增强通过Meso ScaleDiscovery(MSD)测定确定。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定。在一些实施方案中，T细胞激活测定确定了从与本文所述的抗CD137抗体接触的T细胞分泌的至少一种细胞因子的量，其中至少一种细胞因子的量的增加表明T细胞激活的诱导或增强。在一些实施方案中，细胞因子产生的增加比对照抗体(例如，不与CD137结合且不诱导细胞因子产生的抗体)多至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)从受试者中分离T细胞；
(ii)使T细胞与抗CD137抗体接触；和
(iii)确定(ii)之后T细胞分泌的至少一种细胞因子的量，
其中至少一种细胞因子的水平的增加表明抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)从受试者中分离T细胞；
(ii)使T细胞与抗CD137抗体接触；
(iii)确定T细胞分泌的至少一种细胞因子的量；和
(iv)将T细胞产生的至少一种细胞因子的量与参考T细胞分泌的量或水平进行比较，
其中参考T细胞不与抗CD137抗体接触，并且其中T细胞产生的至少一种细胞因子的量相对于参考T细胞的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)从受试者中分离T细胞；
(ii)使T细胞与抗CD137抗体接触；
(iii)确定T细胞分泌的至少一种细胞因子的量；和
(iv)将T细胞产生的至少一种细胞因子的量与参考T细胞分泌的量进行比较，
其中参考T细胞与对照抗体接触，并且其中T细胞产生的至少一种细胞因子的量相对于参考T细胞的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，T细胞激活测定包括确定与本文所述的抗CD137抗体接触后T细胞分泌的至少一种细胞因子的水平，其中至少一种细胞因子选自由IL-2、IFN-γ、TNFα和IL-13组成的组。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，细胞因子是TNFα。在一些实施方案中，细胞因子是IL-13。在一些实施方案中，T细胞激活测定包括细胞因子测定，例如本文所述的那些，以确定至少一种细胞因子的量。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，产生的细胞因子是TNFα。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2和TNFα。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2和IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是TNFα和IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是TNFα和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-13和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2、TNFα和IL-13。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IL-2、TNFα和IFN-γ。在一些实施方案中，产生的细胞因子是IFN-γ、TNFα和IL-13。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括对T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行检测，并且其中至少一种激活标志物的表达水平的增加表明T细胞激活的诱导或增强。在一些实施方案中，“表面表达增加”是指与对照抗体存在或抗体不存在下的表面表达相比，表面表达增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过体外T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)从受试者中分离T细胞；
(ii)使T细胞与抗CD137抗体接触；和
(iii)检测T细胞上至少一种激活标志物的表面表达，
其中至少一种激活标志物的表面表达的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)从受试者中分离T细胞；
(ii)使T细胞与抗CD137抗体接触；
(iii)确定T细胞上至少一种激活标志物的表面表达；和
(iv)将T细胞上至少一种激活标志物的表面表达与参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行比较，
其中参考T细胞不与抗CD137抗体接触，并且其中T细胞上至少一种激活标志物的表面表达相对于参考T细胞的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)从受试者中分离T细胞；
(ii)使T细胞与抗CD137抗体接触；
(iii)确定T细胞上至少一种激活标志物的表面表达，
(iv)将T细胞上至少一种激活标志物的表面表达与参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行比较，
其中参考T细胞与对照抗体接触，并且其中T细胞上至少一种激活标志物的表面表达相对于参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过体内T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)向受试者施用抗CD137抗体；
(ii)从受试者中分离T细胞；和
(iii)检测T细胞上至少一种激活标志物的表面表达，
其中至少一种激活标志物的表面表达的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了CD137介导的T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)向受试者施用抗CD137抗体；
(ii)从受试者中分离T细胞；
(iii)确定T细胞上至少一种激活标志物的表面表达；和
(iv)将T细胞上至少一种激活标志物的表面表达与参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行比较，
其中参考T细胞是从未被施用抗CD137抗体的受试者中分离的，并且其中，T细胞上至少一种激活标志物的表面表达相对于参考T细胞的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强T细胞激活，通过T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)向受试者施用抗CD137抗体；
(ii)从受试者中分离T细胞；
(iii)确定T细胞上至少一种激活标志物的表面表达；和
(iv)将T细胞上至少一种激活标志物的表面表达与参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行比较，
其中参考T细胞是从与对照抗体接触的受试者中分离的，并且其中T细胞上至少一种激活标志物的表面表达相对于参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达的增加表明抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体不诱导或增强肝内T细胞激活，通过体内T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)向受试者施用抗CD137；
(ii)从受试者的肝中分离T细胞；
(iii)检测T细胞上至少一种激活标志物的表面表达；和
(iv)将T细胞上至少一种激活标志物的表面表达与参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行比较，
其中参考T细胞是从未被施用抗CD137抗体的受试者分离的，任选地，其中参考T细胞是从施用对照抗体的受试者分离的，并且其中T细胞上至少一种激活标志物的表面表达相对于参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达不存在增加表明，抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体不诱导或增强脾内T细胞激活，通过体内T细胞激活测定确定，其中T细胞激活测定包括以下步骤：
(i)向受试者施用抗CD137；
(ii)从受试者的脾中分离T细胞；
(iii)检测T细胞上至少一种激活标志物的表面表达；和
(iv)将T细胞上至少一种激活标志物的表面表达与参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达进行比较，
其中参考T细胞是从未被施用抗CD137抗体的受试者分离的，任选地，其中参考T细胞是从施用对照抗体的受试者分离的，并且其中T细胞上至少一种激活标志物的表面表达相对于参考T细胞上至少一种激活标志物的表面表达不存在增加表明，抗CD137抗体诱导或增强了T细胞激活。
在一些实施方案中，“不诱导或增强”旨在指不存在活性(例如，T细胞激活)或活性相对于参考抗体的增加没有增加。
在一些实施方案中，T细胞激活标志物的表面表达等同于抗体不存在时的表面表达。在一些实施方案中，与抗体不存在下的表面表达相比，T细胞激活标志物的表面表达比诱导或增强表面表达的参考抗体存在下的表面表达低至少1倍、5倍、10倍、50倍或100倍多。
在一些实施方案中，至少一种激活标志物选自由CD25、CD69和CD40L组成的组。在一些实施方案中，一种或多种激活标志物是CD25。
在一些实施方案中，T细胞是从患有肿瘤的受试者中分离的。在一些实施方案中，T细胞是从肿瘤中分离的。在一些实施方案中，对照抗体是同种型对照抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体诱导或增强一种或多种免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体减少一种或多种免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定。
在一些实施方案中，免疫细胞浸润测定确定了肿瘤中表达一种或多种免疫细胞标志物的免疫细胞的数量。在一些实施方案中，一种或多种免疫细胞标志物用抗体标记。在一些实施方案中，一种或多种免疫细胞标志物选自由CD45、CD25、FOXP3、CD4、CD8、F4/80、CD11b、TIGIT和PD-1组成的组。在一些实施方案中，肿瘤中表达一种或多种免疫细胞标志物的免疫细胞的数量通过流式细胞术确定。通过流式细胞术对表达一种或多种免疫细胞标志物的免疫细胞进行定量的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，抗CD137抗体相对于参考抗体诱导或增强一种或多种免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体相同的同种型并且不与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体相同的同种型并且与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体不同的同种型并且不与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体不同的同种型并且与CD137特异性结合的抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体增加表达CD45的免疫细胞向受试者中的肿瘤微环境的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定，其中测定包括以下步骤：
(i)向患有肿瘤的受试者施用抗CD137抗体；
(ii)获取肿瘤样品；
(iii)使样品与特异性结合CD45的荧光标记的检测抗体接触，其中检测抗体荧光标记表达CD45的免疫细胞；和
(iv)通过流式细胞术确定表达CD45的荧光标记的免疫细胞的数量，
其中肿瘤中表达CD45的荧光免疫细胞的数量增加表明抗CD137抗体诱导或增强了免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，表达CD45的免疫细胞的数量的增加是肿瘤微环境中总细胞的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体减少或抑制一种或多种免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定。在一些实施方案中，抗CD137抗体相对于参照抗体减少一种或多种免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体相同的同种型并且不与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体相同的同种型并且与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体不同的同种型并且不与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是包含与抗CD137抗体不同的同种型并且与CD137特异性结合的抗体。在一些实施方案中，免疫细胞的减少是肿瘤微环境中总细胞的小于40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体减少肿瘤相关巨噬细胞向受试者中肿瘤微环境的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定，其中测定包括以下步骤：
(i)获取肿瘤样品；
(ii)使样品与标记肿瘤相关巨噬细胞的一种或多种抗体接触，其中一种或多种抗体与选自由F4/80、CD11b、CD45及其组合组成的组的免疫细胞标志物特异性结合；和
(iii)通过流式细胞术确定标记的肿瘤相关巨噬细胞的数量。在一些实施方案中，肿瘤相关巨噬细胞少于肿瘤微环境中免疫细胞的40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些实施方案中，肿瘤相关巨噬细胞表达F4/80、CD11b和CD45。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体减少调节性T细胞(Treg)向受试者中肿瘤微环境的浸润，通过免疫细胞浸润测定确定，其中测定包括以下步骤：
(i)获取肿瘤样品；
(ii)使样品与标记肿瘤相关巨噬细胞的一种或多种抗体接触，其中一种或多种抗体与选自由CD25、FOXP-3、CD4及其组合组成的组的免疫细胞标志物特异性结合；和
(iii)通过流式细胞术确定标记的Treg细胞的数量。在一些实施方案中，Treg细胞少于肿瘤微环境中CD4+T细胞的35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些实施方案中，Treg细胞表达CD4、FOXP-3和CD25。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体保护T细胞免遭T细胞耗竭和/或逆转T细胞耗竭，通过T细胞耗竭测定确定。基于其背后的分子机制，可以将耗竭的T细胞与其他T细胞功能障碍例如无反应性(anergy)和衰老(senescence)区分开(Crespo et al.,(2013)Curr Opin Immunol 25(2):241-221)。无反应性由于缺乏共刺激信号而在初免(priming)期间发生，衰老是在广泛增殖后的生长停滞，而耗竭的T细胞则产生自这样的T细胞，该T细胞最初获得并提供T细胞效应子功能，但由于来自持续性抗原(persistent antigen)和炎症介质(inflammatory mediator)(两者皆通常发生在肿瘤中)的持续T细胞受体(TCR)刺激而显示T细胞效应子功能逐渐退化(Wherry&Kurachi(2015)Nat Rev Immunol15(8):486-99)。T细胞耗竭的标志包括但不限于体内和/或离体T细胞功能的持续退化、多种抑制性受体(IR)(例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CD244、CD160、TIGIT)的表达增加、效应细胞因子分泌(例如IL-2、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNFα))的逐渐丧失或减少、CC趋化因子(β-趋化因子)产生的丧失或减少、对IL-7和IL-15的弱反应性、增殖能力的丧失或降低、体内和/或离体细胞溶解活性的丧失或降低、细胞代谢改变以及与未耗竭的T细胞不同的转录谱。严重耗竭的T细胞可以发生缺失(Yi et al.,(2010)Immunology 129(4):474-481)。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体保护T细胞免遭T细胞耗竭和/或逆转T细胞耗竭，通过T细胞耗竭测定确定，其中T细胞耗竭测定确定了用本文所述的抗CD137抗体处理的T细胞分泌的一种或多种效应细胞因子的量或水平，其中一种或多种效应细胞因子的量或水平表明保护免遭T细胞耗竭或将其逆转。在一些实施方案中，T细胞耗竭测定包括以下步骤：
(i)从受试者(例如人类受试者)中分离T细胞；
(ii)使T细胞与诱导T细胞耗竭的抗原接触；
(iii)使T细胞与抗CD137抗体接触；
(iv)确定T细胞分泌的一种或多种效应细胞因子的量；和
(v)将T细胞分泌的一种或多种效应细胞因子的量或水平与参考T细胞分泌的量或水平进行比较，
其中参考T细胞不与诱导T细胞耗竭的抗原接触，并且其中T细胞和参考T细胞分泌的一种或多种效应细胞因子的量或水平的不同表明保护免遭T细胞耗竭或将其逆转。
在一些实施方案中，一种或多种效应细胞因子选自IL-2、IFN-γ和TNFα。在一些实施方案中，一种或多种效应细胞因子的量或水平通过ELISA确定。适用于确定一种或多种效应细胞因子的量或水平的ELISA是本领域已知的。在一些实施方案中，一种或多种效应细胞因子的量或水平由Meso Scale Discovery确定。在一些实施方案中，一种或多种效应细胞因子的量或水平通过本文所述的细胞因子产生测定的任一种来确定。
耗竭的T细胞的逐渐功能障碍伴随着IR的表达，其在与靶细胞上配体的相互作用下将抑制性信号传递至细胞核。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体保护T细胞免遭T细胞耗竭和/或逆转T细胞耗竭，通过T细胞耗竭测定确定，其中T细胞耗竭测定确定了用本文所述的抗CD137抗体处理的T细胞上的一种或多种抑制性受体的表达水平，其中一种或多种抑制性受体的表达水平表明保护免遭T细胞耗竭或将其逆转。在一些实施方案中，T细胞耗竭测定包括以下步骤：
(i)从受试者(例如人类受试者)中分离T细胞；
(ii)使T细胞与诱导T细胞耗竭的抗原接触；
(iii)使T细胞与抗CD137抗体接触；
(iv)确定T细胞上一种或多种抑制性受体的表达水平；和
(v)将T细胞上一种或多种抑制性受体的表达水平与参考T细胞分泌的量或水平进行比较，其中参考T细胞不与诱导T细胞耗竭的抗原接触，并且其中T细胞和参考T细胞上一种或多种抑制性受体表达水平的不同表明保护免遭T细胞耗竭或将其逆转。
在一些实施方案中，一种或多种抑制性受体选自TIGIT和PD-1。在一些实施方案中，一种或多种抑制性受体的表达水平通过流式细胞术测定。通过流式细胞术确定免疫细胞(例如T细胞)上抑制性受体的表达水平的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，耗竭的T细胞的数量是肿瘤微环境中总CD8+或CD4+T细胞的小于20％、15％、10％或5％。
当本文所述的测定是指“从受试者中分离T细胞”时，应当理解，测定可以合适地在先前从受试者分离的T细胞上进行。
其中本文所述的测定是指(i)向受试者施用抗CD137抗体和(ii)从受试者中分离T细胞；应当理解，测定可以合适地在先前从已施用抗CD137抗体的受试者分离的T细胞上进行。
当本文所述的测定是指“获得肿瘤样品”时，应当理解，测定可以合适地在先前从受试者分离的肿瘤样品上进行。
当本文所述的测定是指(i)向患有肿瘤的受试者施用抗CD137抗体和(ii)获得肿瘤样品，应当理解，测定可以合适地在先前从已施用抗CD137抗体的受试者分离的肿瘤样品上进行。
III.非配体结合
在一些实施方案中，本公开的制剂包含与CD137的非配体结合区结合的本文所述的抗CD137抗体，通过配体结合测定确定。配体结合测定(LBA)是一种测定或分析程序，其提供了对两种反应物分子(例如受体和配体多肽)之间发生的相互作用的测量。合适地，LBA提供了对两种反应物分子(例如受体和配体多肽)之间的亲和力程度的测量。例如，在一些实施方案中，配体结合测定用于确定配体分子(例如，CD137L)与受体(例如，CD137)结合的存在、速率、程度或其组合。在一些实施方案中，为了确定配体与受体结合的存在、速率和/或程度，配体结合测定包括检测配体:受体复合物的形成。在一些实施方案中，为了确定配体与受体结合的存在、速率和/或程度，配体结合测定包括确定配体:受体复合物的解离。
在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测与受体复合的荧光标记的配体来确定。在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与配体复合的荧光标记的受体的量来确定。在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与配体:受体复合物特异性结合的荧光标记的抗体的量来确定。检测和定量荧光的方法是本领域已知的，并且包括但不限于荧光偏振(fluorescence polarization，FP)和荧光各向异性(fluorescence anisotropy，FA)。
在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与受体复合的放射性标记的配体的量来确定。在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与配体复合的放射性标记的受体的量来确定。在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与配体:受体复合物特异性结合的放射性标记的抗体的量来确定。检测和定量放射性的方法是本领域已知的，并且包括但不限于定量放射自显影(quantitative autoradiography)和闪烁计数(scintillationcounting)。
在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与受体复合的生物发光标记的配体的量来确定。在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与配体复合的生物发光标记的受体的量来确定。在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过检测和/或定量与配体:受体复合物特异性结合的生物发光标记的抗体的量来确定。检测和定量生物发光的方法是本领域已知的，并且包括但不限于发光测定(luminometry)。
在一些实施方案中，配体:受体复合物的形成和/或解离通过上文所述的表面等离子体共振(SPR)来确定。
在一些实施方案中，配体结合测定通过确定抗体存在下配体与受体结合的存在、速率和/或程度来确定与受体特异性结合的抗体(例如，抗CD137抗体)是否影响配体:受体复合物的形成。在一些实施方案中，与受体(例如，CD137)特异性结合并减少、破坏或阻断配体:受体复合物(例如，CD137:CD137L复合物)形成的抗体(例如，抗CD137抗体)称为“配体阻断抗体”。在一些实施方案中，相比于配体阻断抗体不存在下发生的配体:受体复合物(例如，CD137:CD137L复合物)的形成，“配体阻断抗体”可将配体:受体复合物(例如，CD137:CD137L复合物)的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在一些实施方案中，与受体(例如，CD137)特异性结合并不减少、破坏或阻断配体:受体复合物(例如，CD137:CD137L复合物)形成的抗体(例如，抗CD137抗体)称为“非配体阻断抗体”。在一些实施方案中，相比于非配体阻断抗体不存在下发生的配体:受体复合物(例如，CD137:CD137L复合物)的形成，“非配体阻断抗体”可将配体:受体复合物(例如，CD137:CD137L复合物)的形成减少小于10％、小于5％、小于2％或小于1％。因此，在一些实施方案中，配体结合测定将与受体结合的抗体表征为“配体阻断抗体(ligand blocking antibody)”或“非配体阻断抗体(non-ligand blocking antibody)”。
在一些实施方案中，配体结合测定表征与受体特异性结合并促进配体:受体复合物形成的抗体。在一些实施方案中，配体结合测定表征与受体特异性结合并稳定配体:受体复合物的形成的抗体。在一些实施方案中，抗体对配体:受体复合物形成的诱导和/或稳定有助于抗体的激动作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体将CD137激动，通过配体结合测定确定。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含本文所述的分离的抗CD137抗体或其抗原结合片段，其与CD137结合并诱导CD137L结合，通过配体结合测定(LBA)确定。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137抗体或其抗原结合片段与CD137结合并诱导CD137L结合，通过配体结合测定确定，其中配体结合测定包括以下步骤：
(i)将抗CD137抗体与不同浓度的CD137和CD137L组合，其中CD137和CD137L形成CD137:CD137L复合物，和
(ii)在抗CD137抗体存在下随时间检测CD137:CD137L复合物，
其中抗CD137抗体存在下CD137:CD137L复合物的增加表明抗CD137抗体诱导CD137L与CD137结合。抗CD137抗体存在下CD137:CD137L复合物的增加可以比抗CD137抗体不存在下CD137:CD137L复合物的量高至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗CD137抗体或其抗原结合片段与CD137的非配体结合区结合，通过配体结合测定确定，其中配体结合测定包括以下步骤：
(i)将抗CD137抗体与不同浓度的CD137和CD137L组合，其中CD137和CD137L形成CD137:CD137L复合物，和
(ii)在抗CD137抗体存在下随时间检测CD137:CD137L复合物，
其中抗CD137抗体存在下CD137:CD137L复合物无变化表明抗CD137抗体与CD137的非配体结合区结合。在一些实施方案中，CD137:CD137L复合物小于2％的变化表明抗CD137抗体与CD137的非配体结合区结合。在一些实施方案中，CD137:CD137L复合物小于5％的变化表明抗CD137抗体与CD137的非配体结合区结合。在一些实施方案中，CD137:CD137L复合物小于10％的变化表明抗CD137抗体与CD137的非配体结合区结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与CD137的非配体结合区结合，通过生物膜层干涉(biolayer interferometry)确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与CD137的非配体结合区结合，通过表面等离子体共振成像(SPRi)确定。在一些实施方案中，将CD137和CD137L顺序应用到预加载有抗CD137抗体的传感器(即，抗体被捕获在传感器上)。在一些实施方案中，抗CD137抗体与非配体结合区的结合通过暴露于CD137L后应答的增加来指示。
IV.CD137结合抗体的功能
在一些实施方案中，本公开的制剂包含与人CD137结合的本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并抑制或减少T细胞耗竭。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并诱导或增强T细胞激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并诱导或增强T细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并表现出抗肿瘤功效。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体以约30-100nM(例如，约30nM至约100nM之间)的亲和力(KD)与人CD137结合并与包含SEQ ID:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并诱导或增强T细胞激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并诱导或增强T细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并表现出抗肿瘤功效。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少T细胞耗竭并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并诱导或增强T细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并表现出抗肿瘤功效。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞激活并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并诱导或增强T细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并表现出抗肿瘤功效。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞的细胞因子产生并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并表现出抗肿瘤功效。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强T细胞增殖并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体表现出抗肿瘤功效并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活并诱导或增强NFκβ信号传导。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体抑制或减少巨噬细胞分化和/或激活并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强NFκβ信号传导并诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强NFκβ信号传导并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强NFκβ信号传导并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强NFκβ信号传导并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强NFκβ信号传导并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润并且不诱导肝毒性。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体诱导或增强免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体不诱导肝毒性并与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体不诱导肝毒性并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体不诱导肝毒性并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合并且不抑制CD137和CD137L的相互作用。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体与细胞外CD137上的非配体结合结构域结合并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137激动剂抗体不抑制CD137和CD137L的相互作用并与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合。
表位定位(epitope mapping)
本公开提供了包含抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂，其与人CD137的表位特异性结合并与参考mAb(例如，mAb1)竞争结合人CD137的表位。表征、定位或以其他方式阐明抗CD137抗体的表位的方法可分为结构、功能或计算方法。确定抗体和与之结合的相应抗原之间的相互作用的精确分子结构的尤其合适的结构方法是X射线晶体学(或者“X射线共晶体学”)。结合的抗体-抗原对的晶体结构使能够非常准确地确定来自抗原表位和抗体互补位中的侧链和主链原子两者的单个氨基酸之间的关键相互作用。通常认为彼此在4埃
Figure BDA0003224144880001531
以内的氨基酸是接触残基(contacting residue)。此方法通常涉及抗体和抗原的纯化、复合物的形成和纯化，然后是连续几轮的结晶筛选和优化以获得衍射质量的晶体。在通常位于同步加速器源处的X射线晶体学后获得结构解析。用于表位定位的其他结构方法包括但不限于氢-氘交换耦合质谱(hydrogen-deuterium exchange coupled to massspectrometry)、交联耦合质谱(crosslinking-coupled mass spectrometry)和核磁共振(NMR)(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)；Abbott et al.,(2014)Immunology 142(4):526-535)。
用于表位定位的功能方法是本领域公知的，并且通常涉及抗体与完整蛋白、蛋白片段或肽结合的评估或定量。用于表位定位的功能方法可用于例如鉴定线性或构象表位和/或可用于推断两种或更多种不同的抗体何时与相同或相似的表位结合。用于表位定位的功能方法包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中检测来自CD137的重叠或连续肽对抗CD137抗体(例如，mAb1)的反应性。用于表位定位的其他功能方法包括基于阵列的寡肽扫描(也称为“重叠肽扫描”或“肽扫描(pepscan)分析”)、定点诱变(例如，丙氨酸扫描诱变)和高通量诱变定位(例如，鸟枪诱变定位(shotgun mutagenesis mapping))。
许多类型的竞争性结合测定都是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli et al.,Methods inEnzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland et al.,J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlowand Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel et al.,Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung et al.,Virology 176:546(1990))；和直接标记RIA(Moldenhauer et al.,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。通常，此类测定涉及使用结合至固体表面或细胞的纯化抗原，以及以下其一：1)未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白，或2)标记的测试抗原结合蛋白和未标记的参考抗原结合蛋白。通过确定在测试抗原结合蛋白的存在下结合至固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白(competing antigen-binding protein))包括与参考抗原结合蛋白(例如，mAb1)结合相同表位的抗原结合蛋白，以及与足够接近由参考抗原结合蛋白(例如，mAb1)结合的表位的相邻表位结合以发生空间位阻的抗原结合蛋白。本文实施例中提供了关于用于确定竞争性结合的方法的额外细节。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量(例如，约1倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或约100倍过量)存在时，其将抑制(例如，减少或阻断)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合至少约40-45％、约45-50％、约50-55％、约55-60％、约60-65％、约65-70％、约70-75％或约75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少约80-85％、约85-90％、约90-95％、约95-97％或约97％或更多。
定点诱变方法涉及靶向定点诱变，其中通过系统地将沿蛋白序列引入取代然后确定每个取代对抗体结合的影响，以鉴定关键氨基酸。这可以通过“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham and Wells(1989)Science 244:1081-085)或一些其他形式的CD137中氨基酸残基的点诱变来完成。不受理论的束缚，如果抗原中降低或消除第一抗体结合的基本上所有的氨基酸突变都降低或消除第二或更多抗体的结合，则两种或更多种抗体(例如测试抗体和参考抗体，例如mAb1)具有相同表位。
鸟枪诱变定位使用了针对靶基因的全面的质粒突变文库，其中文库中的每个克隆都带有一个独特的氨基酸突变，并且整个文库覆盖了靶蛋白中的每个氨基酸。构成突变文库的克隆单独排列在微孔板中，在活的哺乳动物细胞内表达，并测试其与目标抗体的免疫反应性。对抗体表位至关重要的氨基酸通过丧失反应性来鉴定，然后定位到蛋白结构上，以显现表位。哺乳动物细胞内靶蛋白抗原的表达通常提供了靶蛋白抗原的天然结构，这允许将线性和构象表位结构均定位到复合物蛋白上。(Paes et al.,J.Am.Chem.Soc.131(20):6952-6954(2009)；Banik and Doranz,Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2):25-28(2010))。
由抗CD137抗体结合的表位也可以使用肽扫描方法确定。在肽扫描中，测试来自靶蛋白CD137的重叠片段的短肽序列的文库结合目标抗体的能力。合成肽并进行结合的筛选，例如使用ELISA或BIACORE，或在芯片上，通过多种固相筛选方法(Reineke et al,Curr.Opin.Biotechnol.12:59-64,2001)中的任一种，如“肽扫描(pepscan)”方法(WO 84/03564；WO 93/09872)中的。
可以使用最近开发的称为CLIPS(chemical linkage of peptides ontoscaffolds，将肽化学连接至支架上)的技术来定位构象表位。将肽的松散末端固定在合成支架上，由此支架肽可能能够采用与完整蛋白中的相应序列相同的空间结构。CLIPS技术用于将线性肽固定为环状结构(“单环”类型)，并将蛋白结合位点的不同部分置于一起(“双环”、“三环”等类型)，从而产生可以测定抗体结合的构象表位。(美国专利号7,972,993)。
本公开提供的由抗体结合的表位还可以使用计算方法进行定位。在这些方法中，例如，肽片段的文库展示在噬菌体或细胞的表面。然后通过使用选择性结合测定筛选针对这些片段的抗体来定位表位。已经开发了许多计算工具，其允许基于使用噬菌体展示获得的线性亲和力选择的肽来预测构象表位(Mayrose et al.,(2007)Bioinformatics 23:3244-3246)。通过噬菌体展示检测构象表位的方法也是可用的。还可以使用微生物展示系统以在细胞表面表达正确折叠的抗原片段以鉴定构象表位(Cochran et al.,J.Immunol.Meth.287:147-158,2004；Rockberg et al.,Nature Methods 5:1039-1045,2008)。
还可以使用涉及蛋白水解和质谱的方法以确定抗体表位(Baerga-Ortiz et al.,Protein Sci.2002 June；11(6):1300-1308)。在有限的蛋白水解中，抗原在抗体存在和不存在下被不同的蛋白酶切割，并通过质谱法鉴定片段。表位是在与抗体结合后被保护免遭蛋白水解的抗原区域(Suckau et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9848-9852,1990)。其他的基于蛋白水解的方法包括，例如，选择性化学修饰(Fiedler et al.,BioconjugateChemistry 1998,9(2):236-234,1998)、表位切除(epitope excision)(Van de Water etal.,Clin.Immunol.Immunopathol.1997,85(3):229-235,1997)以及最近开发的氢-氘(H/D)交换方法(Flanagan,N.,Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2):25-28,2010)。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与位于SEQ ID NO:3的氨基酸残基111-135内的表位结合，通过诱变和哺乳动物展示确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与包含SEQ ID NO:3的K114的表位结合，通过诱变和哺乳动物展示确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与包含SEQ ID NO:3的E111、T113和K114的表位结合，通过诱变和哺乳动物展示确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与包含SEQ IDNO:3的E111、T113、K114和P135的表位结合，通过诱变和哺乳动物展示确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体与包含SEQ ID NO:3的E111、T113、K114、N126、I132和P135的表位结合，通过诱变和哺乳动物展示确定。
生产抗CD137抗体及其抗原结合片段的方法
本公开还表征了生产任意本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的方法。在一些实施方案中，制备本文所述的抗体的方法可包括用合适的免疫原免疫受试者(例如，非人哺乳动物)。用于产生任意本文所述的抗体的合适的免疫原在本文中有阐述。例如，为了产生与CD137结合的抗体，技术人员可以使用全长CD137多肽例如包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列的全长人CD137多肽，来免疫合适的受试者(例如，非人哺乳动物，例如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、狗、猫、猪、山羊、马或非人灵长类动物)。
可以用合适的抗原以及随后的加强免疫对合适的受试者(例如，非人哺乳动物)进行足够多次数的免疫以引发哺乳动物产生抗体。可以将免疫原与佐剂一同施用给受试者(例如，非人哺乳动物)。可用于在受试者中产生抗体的佐剂包括但不限于蛋白佐剂；细菌佐剂，例如全细菌(BCG、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)或明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota))和细菌组分，包括细胞壁骨架、海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰脂A、结核杆菌(tubercle bacillus)的甲醇可提取残余物(methanol extractable residue，MER)、完全或不完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)；病毒佐剂；化学佐剂，例如氢氧化铝和碘乙酸盐以及胆固醇琥珀酸单酯(cholesteryl hemisuccinate)。可用于诱导免疫应答的方法中的其他佐剂包括例如霍乱毒素和副痘病毒蛋白。另参见Bieg et al.(1999)Autoimmunity 31(1):15-24。另参见，例如，Lodmell et al.(2000)Vaccine 18:1059-1066；Johnson et al.(1999)J Med Chem 42:4640-4649；Baldridge et al.(1999)Methods19:103-107；和Gupta et al.(1995)Vaccine 13(14):1263-1276。
在一些实施方案中，所述方法包括制备分泌与免疫原结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。例如，使用如上所述的CD137多肽对合适的哺乳动物例如实验室小鼠进行免疫。在进行至少一次免疫原的加强免疫后2至4天，可以分离经免疫的哺乳动物的抗体产生细胞(例如，脾的B细胞)，然后在与合适的骨髓瘤细胞系的细胞融合之前在培养中短暂生长。细胞可以在融合促进剂如痘苗病毒或聚乙二醇存在下融合。克隆从融合中获得的杂交细胞，并选择分泌所需抗体的细胞克隆。例如，可以将用合适的免疫原免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞融合。融合后，细胞在合适的培养基中扩增，对其定期补充选择培养基，例如HAT培养基，以防止正常骨髓瘤细胞过度生长所需杂交瘤细胞。然后筛选分泌所需抗体，例如与CD137结合的抗体的所得杂交瘤细胞。
在一些实施方案中，技术人员可以从非免疫偏性文库(non-immune biasedlibrary)中鉴定抗CD137抗体，如例如美国专利号6,300,064(Knappik et al.；MorphosysAG)和Schoonbroodt et al.(2005)Nucleic Acids Res 33(9):e81中所述。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以包括以下或与以下结合使用：例如，噬菌体展示技术、细菌展示、酵母表面展示、真核病毒展示、哺乳动物细胞展示和无细胞(例如，核糖体展示)抗体筛选技术(参见，例如，Etz et al.(2001)J Bacteriol 183:6924-6935；Cornelis(2000)Curr Opin Biotechnol 11:450-454；Klemm et al.(2000)Microbiology146/3025-3032；Kieke et al.(1997)Protein Eng 10:1303-1310；Yeung et al.(2002)Biotechnol Prog 18:212-220；Boder et al.(2000)Methods Enzymology 328:430-444；Grabherr et al.(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192；Michael etal.(1995)Gene Ther 2:660-668；Pereboev et al.(2001)J Virol75:7107-7113；Schaffitzel et al.(1999)J Immunol Methods 231:119-135；和Hanes et al.(2000)NatBiotechnol 18:1287-1292)。
使用各种噬菌体展示方法鉴定抗体的方法是本领域已知的。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。此类噬菌体可用于展示由池或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗体的抗原结合结构域，例如Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体片段。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，例如fd和M13。抗原结合结构域表达为与任意噬菌体外壳蛋白pIII、pVIII或pIX的重组融合蛋白。参见，例如，Shi et al.(2010)JMB397:385-396。可用于制备本文所述的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括以下公开的那些：Brinkman et al.(1995)J ImmunolMethods 182:41-50；Ames et al.(1995)J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough et al.(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic et al.(1997)Gene187:9-18；Burton et al.(1994)Advances in Immunology 57:191-280；和PCT公开号WO90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982和WO 95/20401。合适的方法还描述在例如美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中。
在一些实施方案中，噬菌体展示抗体文库可以使用从经免疫的哺乳动物的B细胞收集的mRNA产生。例如，可以从使用如上所述的CD137多肽免疫的小鼠中分离包含B细胞的脾细胞样品。可以从细胞中分离mRNA，并使用标准分子生物学技术将其转化为cDNA。参见，例如，Sambrook et al.(1989)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEdition,”Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Harlow and Lane(1988),见上文；Benny K.C.Lo(2004),见上文；和Borrebaek(1995),见上文。使用编码免疫球蛋白的重链和轻链多肽的可变区的cDNA构建噬菌体展示文库。生成此类文库的方法描述在例如Merz et al.(1995)J Neurosci Methods 62(1-2):213-9；Di Niro et al.(2005)Biochem J 388(Pt3):889-894；和Engberg et al.(1995)Methods Mol Biol 51:355-376中。
在一些实施方案中，可以采用选择和筛选的组合来从例如杂交瘤衍生的抗体的群体或噬菌体展示抗体文库中鉴定目标抗体。合适的方法是本领域已知的，并描述在例如Hoogenboom(1997)Trends in Biotechnology 15:62-70；Brinkman et al.(1995),见上文；Ames et al.(1995),见上文；Kettleborough et al.(1994),见上文；Persic et al.(1997),见上文；和Burton et al.(1994),见上文。例如，使用标准分子生物学技术产生多个噬菌粒载体，每个噬菌粒载体编码噬菌体外壳蛋白(例如，M13噬菌体的pIII、pVIII或pIX)和不同抗原结合区的融合蛋白，并然后将其引入细菌群体(例如，大肠杆菌(E.coli))。在一些实施方案中，细菌中的噬菌体表达可能需要使用辅助噬菌体(helper phage)。在一些实施方案中，不需要辅助噬菌体(参见，例如，Chasteen et al.,(2006)Nucleic AcidsRes 34(21):e145)。回收由细菌产生的噬菌体，然后使其与例如结合至固体支持物(固定的)的靶抗原接触。也可以使噬菌体与溶液中的抗原接触，并随后使复合物结合至固体支持物。
可以使用本领域已知的任意基于免疫学或生物化学的方法来表征使用上述方法筛选的抗体亚群对特定抗原(例如，人CD137)的特异性和结合亲和力。例如，如上所述，抗体与CD137的特异性结合可以例如使用基于免疫学或生物化学的方法来确定，例如但不限于ELISA测定、SPR测定、免疫沉淀测定、亲和层析和平衡渗析。可用于分析抗体的免疫特异性结合和交叉反应性的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，使用技术例如蛋白质印迹、RIA、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。此类测定是常规的并且是本领域公知的。
应当理解，上述方法还可用于确定例如抗CD137抗体是否不与全长人CD137和/或CD137蛋白结合。
在所选CDR氨基酸序列是短序列(例如，长度少于10-15个氨基酸)的实施方案中，编码CDR的核酸可以被化学合成，如描述在例如Shiraishi et al.(2007)Nucleic AcidsSymposium Series 51(1):129-130和美国专利号6,995,259。对于编码受体抗体的给定核酸序列，可以使用标准分子生物学技术将编码CDR的核酸序列区域替换为化学合成的核酸。可以将化学合成的核酸的5’和3’末端合成为包含粘性末端限制性酶位点，用于将核酸克隆至编码供体抗体可变区的核酸中。或者，可以使用本领域已知的DNA组装技术(例如，Gibson组装)，将在一起能够编码抗体的化学合成的核酸的片段连接在一起。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体包含改变的重链恒定区，其相对于其相应的未改变的恒定区具有降低的(或不具有)效应子功能。可以通过改变恒定区或Fc区的性质来调节涉及抗CD137抗体恒定区的效应子功能。改变的效应子功能包括，例如，对以下活性的一种或多种的调节：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、细胞凋亡、与一种或多种Fc受体的结合以及促炎症反应。调节是指，含有改变的恒定区的受试抗体表现出的效应子功能活性与未改变形式的恒定区的活性相比的增加、减少或消除。在具体的实施方案中，调节包括活性被废除或完全不存在的情况。
具有改变的FcR结合亲和力和/或ADCC活性和/或改变的CDC活性的改变的恒定区是与未改变形式的恒定区相比具有增强或减弱的FcR结合活性和/或ADCC活性和/或CDC活性的多肽。显示与FcR结合增加的改变的恒定区以比未改变的多肽更高的亲和力与至少一种FcR结合。显示与FcR结合降低的改变的恒定区以比未改变形式的恒定区更低的亲和力与至少一种FcR结合。显示与FcR结合降低的此类变体可与FcR的结合很少或没有明显结合，例如与天然序列免疫球蛋白恒定区或Fc区与FcR的结合水平相比，与FcR的结合的0％至50％(例如，小于50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。类似地，与未改变的恒定区相比，显示调节的ADCC和/或CDC活性的改变的恒定区可表现出增加或减少的ADCC和/或CDC活性。例如，在一些实施方案中，包含改变的恒定区的抗CD137抗体可表现出未改变形式的恒定区的ADCC和/或CDC活性的约0％至50％(例如，小于50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。包含显示降低的ADCC和/或CDC的改变的恒定区的本文所述的抗CD137抗体可表现出降低的或没有ADCC和/或CDC活性。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD137抗体表现出降低的或没有效应子功能。在一些实施方案中，抗CD137抗体包含杂合恒定区或其部分，例如G2/G4杂合恒定区(参见例如，Burton et al.(1992)Adv Immun 51:1-18；Canfield et al.(1991)J Exp Med 173:1483-1491；和Mueller et al.(1997)Mol Immunol 34(6):441-452)。见上文。
在一些实施方案中，抗CD137抗体可含有表现出增强的或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变的恒定区。可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代、插入或缺失来实现调节的CDC活性。参见，例如，美国专利号6,194,551。或者或另外，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在此区中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚抗体可具有增强的或降低的内化能力和/或增加的或降低的补体介导的细胞杀伤。参见，例如，Caron etal.(1992)J Exp Med 176:1191-1195和Shopes(1992)Immunol148:2918-2922；PCT公开号WO 99/51642和WO 94/29351；Duncan and Winter(1988)Nature 322:738-40；和美国专利号5,648,260和5,624,821。
重组抗体表达和纯化
用于本公开的任意制剂中的本文所述的抗体或其抗原结合片段可以使用分子生物学和蛋白化学领域中已知的多种技术来生产。例如，可以将编码抗体的重链和轻链多肽之一或两者的核酸插入含有转录和翻译调控序列的表达载体中，包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、转录终止信号、多聚腺苷酸化信号和增强子或激活子序列。调控序列包括启动子以及转录起始和终止序列。此外，表达载体可以包括多于一个的复制系统，以便其可以维持在两种不同的生物体例如哺乳动物或昆虫细胞中用于表达，和在原核宿主中用于克隆和扩增。
多种可能的载体系统可用于在哺乳动物细胞中由核酸表达克隆的重链和轻链多肽。一类载体依赖于将所需基因序列整合到宿主细胞基因组中。可以通过同时引入耐药基因例如大肠杆菌gpt(E.coli gpt)(Mulligan and Berg(1981)Proc Natl Acad Sci USA78:2072)或Tn5 neo(Southern and Berg(1982)Mol Appl Genet 1:327)来选择具有稳定整合的DNA的细胞。选择性标志物基因可以与要表达的DNA基因序列连接，或通过共转染将其引入相同细胞中(Wigler et al.(1979)Cell 16:77)。第二类载体使用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。这些载体可以衍生自动物病毒，例如牛乳头瘤病毒(Sarver etal.(1982)Proc Natl Acad Sci USA,79:7147)、巨细胞病毒、多瘤病毒(Deans et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:1292)或SV40病毒(Lusky and Botchan(1981)Nature293:79)。
表达载体可以以适合于随后核酸表达的方式引入细胞。引入方法主要取决于靶向细胞类型，如下所述。示例性方法包括CaPO4沉淀、脂质体融合、阳离子脂质体、电穿孔、病毒感染、右旋糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合和直接显微注射。
用于表达抗体或其抗原结合片段的合适宿主细胞包括酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞。尤其感兴趣的是细菌例如大肠杆菌、真菌例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)、昆虫细胞例如SF9、哺乳动物细胞系(例如人细胞系)以及原代细胞系。
在一些实施方案中，抗体或其片段可以在转基因动物(例如，转基因哺乳动物)中表达和从其纯化。例如，抗体可以在转基因非人哺乳动物(例如，啮齿动物)中产生，并且从奶中分离，如描述在例如Houdebine(2002)Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629；vanKuik-Romeijn et al.(2000)Transgenic Res 9(2):155-159；和Pollock et al.(1999)JImmunol Methods 231(1-2):147-157中。
可以通过在足以允许蛋白表达的条件和时间量下培养用含有编码抗体或片段的核酸的表达载体转化的宿主细胞，来从细胞产生抗体及其片段。这样的蛋白表达条件将随着表达载体和宿主细胞的选择而变化，并且容易由本领域技术人员通过常规实验确定。例如，在大肠杆菌中表达的抗体可以从包涵体(inclusion body)中重新折叠(参见，例如，Houet al.(1998)Cytokine10:319-30)。细菌表达系统及其使用方法是本领域公知的(参见Current Protocols in Molecular Biology,Wiley&Sons，和Molecular Cloning--ALaboratory Manual--3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001))。密码子、合适的表达载体以及合适的宿主细胞的选择将根据多种因素而变化，并且可以根据需要容易地优化。本文所述的抗体(或其片段)可以在哺乳动物细胞或在其他表达系统中表达，包括但不限于酵母、杆状病毒和体外表达系统(参见，例如，Kaszubska etal.(2000)Protein Expression and Purification 18:213-220)。
表达后，可以分离抗体及其片段。抗体或其片段可以根据样品中存在的其他组分以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化。标准纯化方法包括电泳、分子、免疫和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和和反相HPLC色谱。例如，可以使用标准抗抗体柱(例如，蛋白A或蛋白G柱)纯化抗体。超滤(ultrafiltration)和渗滤(diafiltration)技术，结合蛋白浓缩，也是有用的。参见，例如，Scopes(1994)“Protein Purification,3rdedition,”Springer-Verlag,New York City,New York。所需的纯化程度将取决于目标用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化表达的抗体或其片段。
确定纯化抗体或其片段的产量或纯度的方法是本领域已知的，并且包括例如布拉德福德测定(Bradford assay)、UV光谱、双缩脲蛋白测定(Biuret protein assay)、洛瑞蛋白测定(Lowry protein assay)、酰胺黑蛋白测定(amido black protein assay)、高压液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和凝胶电泳方法(例如，使用蛋白染色剂，如考马斯蓝或胶体银染色剂)。
抗体或其抗原结合片段的修饰
用于本公开的任意制剂中的抗体或其抗原结合片段可以在它们的表达和纯化之后进行修饰。修饰可以是共价或非共价修饰。可通过例如使多肽的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，将此类修饰引入抗体或片段中。修饰的合适位点可以使用多种标准中的任一种来选择，包括例如抗体或片段的结构分析或氨基酸序列分析。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以与异源部分结合。异源部分可以是例如异源多肽、治疗剂(例如，毒素或药物)或可检测标记，例如但不限于放射性标记、酶标记、荧光标记、重金属标记、发光标记或亲和标记如生物素或链霉亲和素。合适的异源多肽包括，例如，抗原标签(例如，FLAG(DYKDDDDK；SEQ ID NO:98)、多组氨酸(polyhistidine)(6-His；HHHHHH；SEQ ID NO:99)、血凝素(HA；YPYDVPDYA；SEQ ID NO:100)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))用于纯化抗体或片段。异源多肽还包括用作诊断或可检测标志物的多肽(例如酶)，例如萤光素酶、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。合适的放射性标记包括例如32P、33P、14C、125I、131I、35S和3H。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白(GFP)、DYLIGHTTM488、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、PerCP、PE-ALEXA
Figure BDA0003224144880001641
700、Cy5、别藻蓝蛋白和Cy7。发光标记包括例如多种发光镧系元素(例如铕或铽)螯合物中的任一种。例如，合适的铕螯合物包括二乙烯三胺五乙酸(diethylene triamine pentaacetic acid，DTPA)或四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)的铕螯合物。酶标记包括例如碱性磷酸酶、CAT、萤光素酶和辣根过氧化物酶。
可以使用多种已知化学交联剂中的任一种使两种蛋白(例如，抗体和异源部分)交联。此类交联剂的实例是通过包括“受阻”二硫键的连接来连接两个氨基酸残基的那些。在这些连接中，交联单元内的二硫键被保护(通过二硫键任一侧的阻碍基团)免遭例如还原型谷胱甘肽或二硫键还原酶作用的还原。一种合适的试剂，4-琥珀酰亚胺基氧代羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯(4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α(2-pyridyldithio)toluene，SMPT)，利用一种蛋白的末端赖氨酸和另一种蛋白的末端半胱氨酸在两种蛋白之间形成此类连接。也可以使用通过每种蛋白上的不同偶联部分交联的异双功能试剂。其他有用的交联剂包括但不限于连接以下的试剂：两个氨基(例如N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酸琥珀酰亚胺(N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide))、两个巯基(例如1,4-双-马来酰亚胺基丁烷(1,4-bis-maleimidobutane))、一个氨基和一个巯基(例如，间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester))、氨基和羧基(例如，4-[对叠氮基水杨酰胺基]丁胺(4-[p-azidosalicylamido]butylamine))以及氨基和存在于精氨酸侧链中的胍基(例如，对叠氮苯基乙二醛一水合物(p-azidophenyl glyoxal monohydrate))。
在一些实施方案中，放射性标记可以直接连接到抗体的氨基酸骨架上。或者，放射性标记可作为较大分子的一部分(例如，间-[125I]碘苯基-N-羟基琥珀酰亚胺(meta-[125I]iodophenyl-N-hydroxysuccinimide)([125I]mIPNHS)中的125I)而纳入，其与游离氨基结合以形成转而与蛋白骨架结合的相关蛋白(参见，例如，Rogers et al.(1997)J Nucl Med38:1221-1229)或螯合物(例如，对DOTA或DTPA)的间碘苯基(meta-iodophenyl，mIP)衍生物。将放射性标记或包含它们的较大分子/螯合物与本文所述的抗体或抗原结合片段连接的方法是本领域已知的。此类方法包括在促进放射性标记或螯合物与蛋白结合的条件(例如，pH、盐浓度和/或温度)下将蛋白与放射性标记一同孵育(参见，例如，美国专利号6,001,329)。
将荧光标记(有时称为“荧光团”)与蛋白(例如，抗体)连接的方法是蛋白化学领域已知的。例如，可以使用与荧光团连接的琥珀酰亚胺(NHS)酯或四氟苯基(TFP)酯部分，将荧光团与蛋白的游离氨基(例如，赖氨酸的)或巯基(例如，半胱氨酸)连接。在一些实施方案中，荧光团可以与异双功能交联剂部分例如磺基-SMCC连接。合适的连接方法包括在促进荧光团与蛋白结合的条件下将抗体蛋白或其片段与荧光团一同孵育。参见，例如，Welch andRedvanly(2003)“Handbook of Radiopharmaceuticals:Radiochemistry andApplications,”John Wiley and Sons(ISBN 0471495603)。
在一些实施方案中，可以对抗体或片段进行修饰，例如，使用改善抗体在循环中，例如血液、血清或其他组织中稳定性和/或保持性的部分。例如，抗体或片段可以进行聚乙二醇化，如描述在例如Lee et al.(1999)Bioconjug Chem 10(6):973-8；Kinstler et al.(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews54:477-485；和Roberts et al.(2002)Advanced Drug Delivery Reviews54:459-476中，或进行轻乙基化(HESylated)(Fresenius Kabi,Germany；参见，例如，
Figure BDA0003224144880001651
et al.(2010)Int J Pharm 387(1-2):110-119)。稳定化部分可以将抗体(或片段)的稳定性或保持性提高至少1.5倍(例如，至少2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍或50倍或更多倍)。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以进行糖基化。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可进行酶促或化学处理，或从细胞产生，使得抗体或片段具有降低的或不存在的糖基化。产生具有降低的糖基化的抗体的方法是本领域已知的，并且描述在例如美国专利号6,933,368；Wright et al.(1991)EMBO J 10(10):2717-2723；和Co et al.(1993)Mol Immunol 30:1361中。
应用
本文所述的制剂可用于诊断和治疗应用。例如，可检测标记的抗原结合分子可用于测定中以检测样品(例如，生物样品)中靶抗原的存在或量。所述组合物可用于研究靶抗原功能(例如，CD137介导的细胞信号传导或应答)的抑制的体外测定。在一些实施方案中，例如，其中组合物结合并激活靶抗原(例如，蛋白或多肽)，组合物可在设计用以鉴定也诱导靶蛋白或多肽的活性的其他新化合物的测定中用作阳性对照，和/或另可用于治疗与靶蛋白或多肽相关的病症。例如，CD137激活性组合物可在鉴定诱导、增加或刺激CD137功能的其他化合物(例如，小分子、适体或抗体)的测定中用作阳性对照。所述组合物还可用于以下详述的治疗方法中。
试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了包含任意本文所述的制剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括包含本文所公开的抗CD137抗体的制剂以及使用说明。试剂盒可以在合适的容器中包含抗CD137抗体、一种或多种对照、以及各种缓冲液、试剂、酶和本领域公知的其他标准成分。
容器可包括至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置(means)，任意本公开的制剂可置于其中，并且在一些情况下，进行适当地等分(aliquoted)。当提供额外组分时，试剂盒可含有可放置此组分的额外容器。试剂盒还可以包括用于容纳包含抗CD137抗体的制剂的装置(means)和任意其他封闭限制的的试剂容器，用于商业销售。此类容器可以包括注射或吹塑塑料容器，其中容纳了所需的小瓶。容器和/或试剂盒可以包括带有使用和/或警告说明的标签。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有抗CD137抗体和缓冲液的制剂，或含有抗CD137抗体的制剂，以及用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的说明。在一些实施方案中，试剂盒包含含有抗CD137抗体和缓冲液的制剂，或含有抗CD137抗体的制剂，以及用于将抗CD137抗体单独施用或与另一药剂组合施用给有此需要的受试者的说明，用于治疗或延缓受试者中的癌症发展，或减少或抑制受试者中的肿瘤生长。
使用方法
本发明的制剂具有多种体外和体内效用，包括对CD137的检测和/或定量和/或对CD137功能的激动。
上述制剂可用于治疗或预防受试者中的多种癌症的方法等。可以使用多种方法将制剂施用给受试者，例如人类受试者，这部分取决于施用途径。途径可以是例如静脉注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)注射、肌内注射(IM)或鞘内注射(IT)。注射可以是推注(bolus)或连续输注。
施用可以通过例如局部输注、注射或通过植入物(implant)的方式来实现。植入物可以是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。可以将植入物配置为持续或周期性地向受试者释放组合物。参见，例如，美国专利申请公开号20080241223；美国专利号5,501,856；4,863,457；和3,710,795；EP488401；和EP430539，以上每一个的公开均通过引用以其全文并入本文。可以基于例如扩散、可侵蚀(erodible)或对流系统(例如，渗透泵、可生物降解植入物、电扩散系统、电渗系统、蒸汽压泵、电解泵、泡腾泵、压电泵、基于侵蚀的系统或机电系统)通过可植入装置的方式将组合物递送至受试者。
在一些实施方案中，通过局部施用的方式将包含抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂治疗性递送至受试者。
能够治疗或预防受试者中癌症的本文所述制剂的合适剂量可取决于多种因素，包括例如待治疗受试者的年龄、性别和体重以及所使用的特定抑制剂化合物。例如，与治疗患有癌症的受试者所需的包含结合CD137的Fab’抗体片段的制剂的剂量相比，治疗相同受试者所需的包含完整抗CD137抗体的制剂的剂量可能不同。影响施用给受试者的剂量的其他因素包括例如癌症的类型或严重性。例如，与患有胶质母细胞瘤的受试者相比，患有转移性黑色素瘤的受试者可能需要施用不同剂量的包含抗CD137抗体的制剂。其他因素可以包括，例如，同时或先前影响受试者的其他医学病症、受试者的整体健康状况、受试者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄率、药物组合以及任何其他施用给受试者的额外治疗剂。还应当理解，对任意特定受试者的具体剂量和治疗方案也将取决于治疗医师(例如，医生或护士)的判断。合适的剂量在本文中描述。在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体的制剂在高剂量和低剂量下均有效。
药物制剂可包含治疗有效量的本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段。这样的有效量可由本领域普通技术人员容易地确定，部分基于所施用抗体的效果，或抗体与一种或多种额外活性剂的组合效果(如果使用一种以上的药剂)。本文所述的抗体或其片段的治疗有效量也可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体(和一种或多种额外活性剂)在个体中引起所需应答例(如肿瘤生长减少)的能力的因素而变化。例如，治疗有效量的抗CD137抗体能够抑制(减轻其严重性或消除其发生)和/或预防特定病症和/或本领域已知的或本文所述的特定病症的任一种症状。治疗有效量也是其中治疗有益作用超过制剂的任意毒性或有害作用的量。
可以在例如I期剂量递增研究中进一步评估任意本文所述的抗体或其片段的合适人类剂量。参见，例如，van Gurp et al.(2008)Am J Transplantation 8(8):1711-1718；Hanouska et al.(2007)Clin Cancer Res13(2,part 1):523-531；和Hetherington etal.(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10):3499-3500。
在一些实施方案中，制剂含有任意本文所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种或11种或更多种)额外治疗剂，使得制剂作为一个整体在治疗上有效。例如，制剂可以含有本文所述的抗CD137抗体和烷化剂，其中抗体和药剂各自的浓度在组合时对于治疗或预防受试者中癌症(例如，黑色素瘤)在治疗上有效。
此类制剂的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物(例如，本文所述的任意癌症的动物模型)中的已知药物程序来确定。这些程序可用于例如确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体在治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(therapeutic index)，且它可以表示为LD50/ED50比率。表现出高治疗指数的抗体或其抗原结合片段是优选的。虽然可以使用表现出毒副作用的制剂，但应注意设计将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，并使对正常细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类抗体或其抗原结合片段的剂量通常在抗体或片段的毒性很小或无毒性的包括ED50在内的循环浓度范围内。剂量可在这个范围内变化，取决于所采用的剂型和所使用的施用途径。对于包含本文所述的抗CD137抗体的制剂，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中配制剂量以获得包括在细胞培养中确定的EC50(即，实现对症状的半数最大抑制的抗体浓度)在内的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测定血浆中的水平。在一些实施方案中，例如，当需要局部施用(例如，向眼或关节)时，可以使用细胞培养或动物模型来确定在局部部位内达到治疗有效浓度所需的剂量。
用于体内施用的包含本文所述的制剂的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可以通过用无菌过滤膜过滤来完成。在某些实施方案中，当将组合物冻干时，可以在冻干和重构(reconstitution)之前或之后使用这个方法灭菌。在某些实施方案中，用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或在溶液中储存。在某些实施方案中，通常将肠胃外组合物放置在具有无菌进入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在某些实施方案中，一旦配制了药物组合物，则可以将其以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或以脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。在某些实施方案中，可以将此类制剂以即用形式或以在施用前根据本文所述的制剂重构的形式(例如，冻干的)储存。
在某些实施方案中，提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可包含具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，包括了包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringe)的试剂盒。
在某些实施方案中，在治疗上采用的包含抗CD137抗体的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将领会，根据某些实施方案，治疗的合适剂量水平将因此部分取决于所递送的分子、使用抗CD137抗体针对的病症、施用途径以及患者的体型(体重、体表或器官尺寸)和/或状况(年龄和整体健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可以滴定剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效果。
在某些实施方案中，给药频率将考虑所用制剂中抗CD137抗体的药代动力学参数。在某些实施方案中，临床医师将施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。在某些实施方案中，组合物因此可以以单剂量或以两个或更多个剂量(其可以含有或可以不含有相同量的所需分子)随时间施用，或者经由植入装置或导管以连续输注施用。合适剂量的进一步完善由本领域普通技术人员常规地进行并且在他们常规执行的任务范围内。在某些实施方案中，可以通过使用合适的剂量反应数据来确定合适的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物的施用途径与已知方法一致，例如，经口，通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病变内途径注射，通过缓释系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过推注或通过连续输注或通过植入装置施用。在某些实施方案中，组合疗法的各成分可以通过不同途径施用。
在一些实施方案中，所述方法可以与其他癌症疗法结合进行。例如，可以在放疗、手术、靶向或细胞毒性化疗、放化疗、激素疗法、免疫疗法、基因疗法、细胞移植疗法、精准医疗、基因组编辑疗法或其他药物疗法的同时、之前或之后向受试者施用制剂。
如上所述，本文所述的制剂(例如，包含抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂)可用于治疗多种癌症，例如但不限于：卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞早幼粒细胞单核细胞单核细胞红细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)和边缘区B细胞淋巴瘤、真性红细胞增多淋巴瘤(Polycythemia vera Lymphoma)、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金病(non-Hodgkin's disease)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病(heavychain disease)、实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤、软骨肉瘤(chrondrosarcoma)、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤(seminoma)、胚胎癌、威尔姆氏瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、menangioma、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食道癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌症、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤(intraepithelial neoplasm)、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、黑色素瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌；呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌症。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂可以以单一疗法施用给受试者。或者，如上所述，可以将包含抗体或其片段的制剂以与另一疗法例如另一癌症疗法的组合疗法施用给受试者。例如，组合疗法可以包括向受试者(例如，人类患者)施用一种或多种为患有癌症或处于发展癌症的风险中的受试者提供治疗益处的额外药剂。适合与本发明的组合物共同施用的化学治疗剂包括，例如：紫杉醇、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthrancindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、宝丹酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同系物(homolog)。其他药剂包括例如抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thioTEPA)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C、顺式二氯二胺铂(cis-dichlordiamine platinum)(II)(DDP)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、奈达铂(nedaplatin)、沙铂(satraplatin)或四硝酸三铂(triplatintetranitrate))、蒽环霉素(例如柔红霉素(daunorubicin，以前称daunomycin)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素(dactinomcin，以前称actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和蒽霉素(anthramycin，AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)和替莫唑胺(temozolomide)。在一些实施方案中，同时施用包含抗CD137抗体的制剂和一种或多种额外活性剂。在其他实施方案中，首先适时施用包含抗CD137抗体的制剂，并然后适时施用一种或多种额外活性剂。在一些实施方案中，首先适时施用一种或多种额外活性剂，然后适时施用包含抗CD137抗体的制剂。
包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂能够替代或增强先前或当前施用的治疗剂。例如，在用包含抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂治疗后，一种或多种额外活性剂的施用可以停止或减少，例如以较低的水平或剂量施用。在一些实施方案中，可以维持先前治疗剂的施用。在一些实施方案中，将维持先前的治疗剂直至抗CD137抗体的水平达到足以提供治疗效果的水平。这两种治疗剂可以组合施用。
如本文所定义，监测受试者(例如，人类患者)的癌症改善意指，评估受试者的疾病参数的变化，例如肿瘤生长的减少。在一些实施方案中，在施用后至少一(1)小时，例如至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时或48小时，或至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更多天，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更多周后，进行评估。可以在一个或多个以下时期对受试者进行评估：治疗开始之前；治疗期间；或在施用了治疗的一个或多个成分之后。评估可包括评估进一步治疗的需要，例如评估是否应该改变剂量、施用频率或治疗持续时间。它还可以包括评估增加或减少所选治疗形式(therapeutic modality)的需要，例如增加或减少本文所述的任意癌症的治疗。
在一些实施方案中，施用包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂，以调节患者的T细胞应答，例如通过增加T细胞激活和/或增殖。CD137的交联大幅增强了T细胞增殖、IFN-γ的产生和分泌以及T细胞的细胞溶解活性。因此，在一些实施方案中，施用包含本公开的抗CD137激动剂抗体或其抗原结合片段的制剂给有此需要的患者，以诱导或增加T细胞激活、增强T细胞增殖、诱导IFN-γ的产生和/或分泌，和/或诱导细胞溶解性T细胞应答。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂可用于将患者中的T细胞群体从TH2/TregT细胞群体调节或转变为TH1/TH17T细胞群体，从而改善或增强患者的抗肿瘤应答。研究已表明，尽管CD137在T细胞亚群Th1和Th2 T细胞中均表达，但CD137在CD8+T细胞上的表达水平高于在CD4+T细胞上的表达水平。因此，CD137主要共同刺激CD8+T细胞。因此，施用包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂给患者以增强抗肿瘤应答，例如通过将患者中的T细胞应答和/或T细胞群体从TH2/TregT细胞应答和/或T细胞群体调节或转变为患者中的TH1/TH17 T细胞应答和/或T细胞群体。
在一些癌症(例如黑色素瘤和卵巢癌)中，可以通过优化的细胞培养方法将天然肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)富集，并提供可用于过继免疫疗法的肿瘤反应性淋巴细胞的来源。过继性TIL疗法能导致一些类型癌症的持久性肿瘤消退，这保证了基于TIL的癌症方法的开发和优化。目前，归因于抗原特异性CD8+T细胞的低水平和/或稀有性，对天然肿瘤反应性TIL的鉴定和扩增仍然具有挑战性。T细胞的CD137表达是依赖于激活的，这提供了从循环或从肿瘤样品中捕获表达CD137的活化T细胞的机会。因此，包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂可用于活化的抗原特异性T细胞的选择性富集。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体的制剂的功效取决于有能力(competent)的免疫系统。特别地，在一些实施方案中，CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或自然杀伤细胞的消减降低了抗CD137抗体的功效。在一些实施方案中，CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或自然杀伤细胞的消减降低了本文所述的抗CD137抗体对肿瘤生长的抑制或减少。在一些实施方案中，CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或自然杀伤细胞的消减降低了本文所述的抗CD137抗体对肿瘤生长的抑制或减少。在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体的制剂的功效取决于免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。在一些实施方案中，免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润与向脾和/或肝的浸润的缺乏相结合。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体的制剂诱导保护性抗肿瘤记忆免疫应答。记忆T细胞是抗原特异性T细胞的亚群，其在遇到并响应其同源抗原后会长期存留。此类细胞在重新暴露于其同源抗原后会迅速扩增为大量效应细胞。因此，在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体的制剂刺激针对癌抗原的记忆T细胞的产生。在一些实施方案中，已接受包含本文所述的抗CD137抗体的制剂以治疗或治愈癌症的受试者产生对癌症特异的记忆T细胞。在一些实施方案中，已接受包含本文所述的抗CD137抗体的制剂以治疗或治愈癌症的受试者在再次暴露于癌症时产生抗肿瘤记忆免疫应答。在一些实施方案中，抗肿瘤记忆免疫应答包括刺激记忆T细胞成为效应细胞。在一些实施方案中，已接受包含本文所述的抗CD137抗体的制剂以治疗或治愈癌症的受试者产生针对癌抗原的抗肿瘤记忆免疫应答。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体的制剂诱导肿瘤微环境的免疫重编程。特别地，在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂诱导免疫浸润；减少、抑制或防止Treg增殖；减少、抑制或防止肿瘤相关巨噬细胞的增殖；和保护免遭T细胞耗竭或将其逆转。
在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂诱导免疫细胞向相关肿瘤微环境的浸润。在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂使免疫细胞的浸润增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％或至少150％。在一些实施方案中，免疫细胞的浸润通过测定从肿瘤微环境分离的细胞上的CD45表达水平来确定。测定蛋白表达的方法是本领域技术人员已知的，并且在本文中描述。
在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂防止或抑制肿瘤微环境中Treg细胞的增加。在一些实施方案中，预防或抑制是相对于抗CD137抗体不存在下肿瘤微环境中Treg细胞的数量。在一些实施方案中，Treg细胞增加的预防或抑制是相对于参考抗体的。在一些实施方案中，通过在从肿瘤微环境分离的CD4+T细胞上的CD25和FOX-3P表达来检测Treg细胞。测定蛋白表达的方法是本领域技术人员已知的，并且在本文中描述。
在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂预防或抑制肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的增加。在一些实施方案中，预防或抑制是相对于抗CD137抗体不存在下肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的数量。在一些实施方案中，肿瘤相关巨噬细胞增加的预防或抑制是相对于参考抗体的。在一些实施方案中，通过从肿瘤微环境分离的CD45+免疫细胞上的CD11b和F4/80表达来检测肿瘤相关巨噬细胞。测定蛋白表达的方法是本领域技术人员已知的，并且在本文中描述。
在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂在肿瘤微环境中保护T细胞免遭T细胞耗竭。在一些实施方案中，包含抗CD137抗体的制剂逆转肿瘤微环境中的T细胞耗竭。在一些实施方案中，相对于抗CD137抗体不存在下的肿瘤微环境，在包含本文所述的抗CD137抗体的制剂存在下的肿瘤微环境中T细胞耗竭减少。在一些实施方案中，T细胞耗竭通过分析CD8+T细胞或CD4+T细胞的共抑制性受体(例如PD-1、TIGIT或LAG-3)表达来确定。在一些实施方案中，T细胞耗竭通过从肿瘤微环境分离的CD4+或CD8+T细胞上的PD-1和TIGIT表达来检测。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂可用于检测和/或定量生物样品中的人CD137的方法中。因此，包含本文所述的抗CD137抗体或其抗原结合片段的制剂用于诊断、预测和/或确定患者中疾病(例如，癌症)的发展。
其他实施方案
本公开涉及以下实施方案。在本节中，术语实施方案缩写为“E”，后接序数。例如，E1等同于实施方案1。
E1.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和
(b)包含组氨酸的缓冲液。
E2.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液；和
(c)二糖。
E3.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和
(b)包含组氨酸的缓冲液；
其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
E4.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液，
(c)二糖，
(d)非离子表面活性剂，和
(e)盐，
其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
E5.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液，
(c)约5％至约15％(重量/体积)的二糖，
(d)约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的非离子表面活性剂，和
(e)约50mM-200mM的盐，
其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
E6.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，
(c)约5％至约15％(重量/体积)的蔗糖，
(d)约0.01％至约0.1％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和
(e)约50mM-200mM的NaCl，
其中制剂的pH为约5.0至约7.0。
E7.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含约20mM组氨酸的缓冲液，
(c)约10％(重量/体积(w/v))的蔗糖，
(d)约0.03％(重量/体积(w/v))的聚山梨酯-80，和
(e)约100mM的NaCl，
其中制剂的pH为约6.0。
E8.如实施方案1至7中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。
E9.如实施方案1至7中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQ ID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。
E10.如实施方案9所述的制剂，其中X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
E11.如实施方案1至10中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:68的重链CDR3。
E12.如实施方案1至11中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:48的重链CDR1、SEQ ID NO:56的重链CDR2和SEQ ID NO:68的重链CDR3，以及SEQ ID NO:69的轻链CDR1、SEQ ID NO:78的轻链CDR2和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。
E13.如实施方案1至11中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含SEQ ID NO:51的重链CDR1、SEQ ID NO:108的重链CDR2和SEQ ID NO:68的重链CDR3，以及SEQ ID NO:69的轻链CDR1、SEQ ID NO:78的轻链CDR2和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。
E14.如实施方案1至12中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:4和6具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链和轻链序列。
E15.如实施方案14所述的制剂，其中抗CD137抗体包含分别具有如SEQ ID NO:4和6所示的氨基酸序列的重链和轻链序列。
E16.如实施方案1至11和13中任一项所述的制剂，其中抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:101和6具有至少90％的同一性的氨基酸序列的重链和轻链序列。
E17.如实施方案16所述的制剂，其中抗CD137抗体包含分别具有如SEQ ID NO:101和6所示的氨基酸序列的重链和轻链序列。
E18.如实施方案1至15中任一项所述的制剂，其中抗体包含IgGl重链恒定区。
E19.如实施方案18所述的制剂，其中IgGl重链恒定区是野生型人IgGl重链恒定区。
E20.如实施方案18所述的制剂，其中IgGl重链恒定区包含相对于野生型人IgGl重链恒定区的氨基酸取代。
E21.如实施方案1至15中任一项所述的制剂，其中抗体包含IgG4重链恒定区。
E22.如实施方案21所述的制剂，其中IgG4重链恒定区是野生型人IgG4重链恒定区。
E23.如实施方案21所述的制剂，其中IgG4重链恒定区相对于野生型人IgG4重链恒定区包含氨基酸取代。
E24.如实施方案1至23中任一项所述的制剂，包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。
E25.如实施方案1至24中任一项所述的制剂，包含约20mM组氨酸。
E26.如实施方案1、3、6和8至24中任一项所述的制剂，进一步包含二糖。
E27.如实施方案2、4、5和26中任一项所述的制剂，其中二糖选自蔗糖、乳糖和麦芽糖。
E28.如实施方案27所述的制剂，其中二糖是蔗糖。
E29.如实施方案2、4和26至28中任一项所述的制剂，其中二糖的重量/体积为约5％至约15％。
E30.如实施方案2、4、5和26至28中任一项所述的制剂，其中二糖的重量/体积为约10％。
E31.如实施方案1至3和8至24中任一项所述的制剂，进一步包含盐。
E32.如实施方案4、5和31中任一项所述的制剂，其中盐是NaCl。
E33.如实施方案4和31至32中任一项所述的制剂，其中盐的浓度为约50mM-200mM。
E34.如实施方案4至6和31至32中任一项所述的制剂，其中盐的浓度为约100mM。
E35.如实施方案1、2和8至24中任一项所述的制剂，其中制剂具有约5.0-7.0的pH。
E36.如实施方案3、5、6和35中任一项所述的制剂，其中pH为约6.0。
E37.如实施方案1至3和8至36中任一项所述的制剂，进一步包含非离子表面活性剂。
E38.如实施方案4、5和37中任一项所述的制剂，其中非离子表面活性剂是聚山梨酯。
E39.如实施方案38所述的制剂，其中聚山梨酯是聚山梨酯-80。
E40.如实施方案4和37至38中任一项所述的制剂，其中非离子表面活性剂的重量/体积(w/v)为约0.01％至约0.1％。
E41.如实施方案4、5和37至38中任一项所述的制剂，其中非离子表面活性剂的重量/体积(w/v)为约0.03％。
E42.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约5mg/ml至约15mg/ml的抗CD137抗体。
E43.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约15mg/ml至约30mg/ml的抗CD137抗体。
E44.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约30mg/ml至约45mg/ml的抗CD137抗体。
E45.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约45mg/ml至约60mg/ml的抗CD137抗体。
E46.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约60mg/ml至约75mg/ml的抗CD137抗体。
E47.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约75mg/ml至约90mg/ml的抗CD137抗体。
E48.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约85mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体。
E49.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约5mg/ml的抗CD137抗体。
E50.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约10mg/ml的抗CD137抗体。
E51.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约15mg/ml的抗CD137抗体。
E52.如实施方案1至41中任一项所述的制剂，包含浓度为约20mg/ml的抗CD137抗体。
E53.一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的二聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E54.一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的多聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E55.一种诱导或增强受试者中的T细胞激活的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E56.如实施方案55所述的方法，其中T细胞激活发生在肿瘤微环境中。
E57.一种诱导或增强受试者中的细胞毒性T细胞应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E58.如实施方案57所述的方法，其中细胞毒性T细胞应答发生在肿瘤微环境中。
E59.一种诱导或增强受试者中免疫细胞的细胞因子产生的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E60.如实施方案59所述的方法，其中产生的细胞因子是IL-2、TNFα、IL-13、IFN-γ或以上的组合。
E61.如实施方案59或实施方案60所述的方法，其中细胞因子产生发生在肿瘤微环境中。
E62.一种诱导或增强受试者中的T细胞增殖的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E63.如实施方案62所述的方法，其中T细胞增殖发生在肿瘤微环境中。
E64.一种减少或抑制肿瘤生长的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E65.一种治疗受试者中由人CD137介导的病症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E66.一种治疗受试者中癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52中任一项所述的制剂。
E67.如实施方案64至66中任一项所述的方法，其中在施用制剂后，免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润增加。
E68.如实施方案67所述的方法，其中免疫细胞表达CD45。
E69.如实施方案64至68中任一项所述的方法，其中在施用制剂后，肿瘤微环境中调节性T(Treg)细胞的数量减少。
E70.如实施方案69所述的方法，其中Treg细胞表达CD4、FOXP-3和CD25。
E71.如实施方案64至70中任一项所述的方法，其中在施用分离的单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中巨噬细胞的数量减少。
E72.如实施方案71所述的方法，其中巨噬细胞表达CD45和CD11b。
E73.如实施方案64至72中任一项所述的方法，其中在施用分离的单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中的T细胞耗竭减少，任选地，其中T细胞耗竭的减少包括TIGIT、PD-1、LAG-3或其组合的表达减少。
E74.如实施方案66至73中任一项所述的方法，其中癌症选自由黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、血液癌症和头颈癌组成的组。
E75.如实施方案74所述的方法，其中血液癌症是B细胞淋巴瘤。
E76.一种诱导抗肿瘤记忆免疫应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的实施方案1至52所述的制剂。
E77.如实施方案53至76中任一项的方法，其中抗CD137抗体结合Fcγ受体。
E78.如实施方案53至77中任一项所述的方法，其中CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞或以上组合的消减降低了制剂的功效。
E79.一种包含含有实施方案1至52中任一项所述制剂的容器和含有施用制剂的说明的包装插页的试剂盒，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
E80.一种包含含有实施方案1至52中任一项所述制剂的容器和含有单独施用制剂或将其与另一种药剂组合施用的说明的包装插页的试剂盒，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
E81.如实施方案1至52中任一项所述的制剂在制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物中的用途。
E82.如实施方案1至52中任一项所述的制剂，用于制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物。
E83.如实施方案1至52中任一项所述的制剂，用作药物。
实施例
尽管已经根据本公开的具体实施方案描述了本公开，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变并且可以替换等价物。此外，可以进行许多修改以使具体情况、材料、物质组成、方法、方法步骤或步骤适应本公开的目的、精神和范围。所有此类修改均旨在处于本公开的范围内。
实施例1：在酵母中产生的合成人单克隆抗体表现出与重组人CD137的结合
使用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation试剂盒(Thermo Scientific)将纯化的CD137蛋白抗原生物素化。将CD137抗原浓缩至～1mg/mL，并缓冲液交换至PBS中，然后添加1:7.5摩尔比的生物素化试剂(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation试剂盒，ThermoScientific，目录号21425)。将混合物在4℃下保持过夜，然后进行另一缓冲液交换以去除溶液中的游离生物素。通过
Figure BDA0003224144880001831
上链霉亲和素传感器(Streptavidin sensor)与标记的蛋白的结合来确认生物素化。根据制造商的指南，通过与安装在FORTEBIOOCTETTMRed384干涉仪(Pall ForteBio,Menlo Park,CA)上的连接有链霉亲和素的生物传感器的可检测的结合，证实了CD137蛋白抗原的成功生物素化(数据未显示)。
如前所述地设计、生成和增殖每个具有～109多样性的八个合成的基于酵母的人初始抗体文库(参见，例如，WO2009036379；WO2010105256；WO2012009568；Xu et al.,Protein Eng Des Sel.2013 Oct；26(10):663-70)。使用八个初始文库针对生物素化人CD137-Fc融合进行八次平行选择。
对于前两轮选择，使用Miltenyi MACS系统进行磁珠分选技术，基本上如所述(Siegel et al.,J Immunol Methods.2004 Mar；286(1-2):141-53)。简言之，将酵母细胞(～1010个细胞/文库)与10mL的10nM生物素化人CD137-Fc融合抗原在室温下在含0.1％BSA的FACS洗涤缓冲液PBS中孵育15分钟。用50mL冰冷的洗涤缓冲液洗涤一次后，将细胞沉淀重悬于40mL洗涤缓冲液中，并将500μl链霉亲和素微珠(Streptavidin MicroBeads)(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany。目录号130-048-101)加入酵母中并在4℃下孵育15分钟。接下来，将酵母沉淀，重悬于5mL洗涤缓冲液中，并上样至MACS LS柱(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany。目录号130-042-401)。上样5mL后，用3mLFACS洗涤缓冲液洗涤柱3次。然后将柱从磁场中移出，并用5mL生长培养基洗脱酵母，然后生长过夜。
在两轮MACS之后，使用流式细胞术(FACS)进行三轮分选，其描述在以下三段中。
采用8次利用Fc抗原的平行选择的选择策略
将MACS选择的八个文库进行三轮FACS选择。将每个文库约1×108个酵母沉淀，用洗涤缓冲液洗涤3次，并分别与10nM生物素化人CD137-Fc融合物和10nM生物素化鼠CD137-Fc融合抗原在室温下孵育10分钟。然后将酵母洗涤两次并用1:100稀释的山羊抗人F(ab’)2kappa-FITC(Southern Biotech，Birmingham，Alabama，目录号2062-02)和1:500稀释的链霉亲和素-Alexa Fluor 633(Life Technologies，Grand Island，NY，目录号S21375)，或1:50稀释的Extravidin-phycoerthyrin(Sigma-Aldrich，St Louis，目录号E4011)二级试剂在4℃下染色15分钟。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤两次后，将细胞沉淀重悬于0.4mL洗涤缓冲液中，并转移至过滤器封盖的分选管(strainer-capped sort tube)中。使用FACS ARIA分选器(BD Biosciences)进行分选，并确定分选门(sort gate)以仅选择CD137结合。来自第一轮FACS的鼠和人选择的群体进入下一轮。
上述所选群体的第二轮和第三轮FACS包括人和/或鼠CD137试剂的结合物(binder)的正向分选；或反向分选以减少多特异性试剂结合物(Xu et al.,PEDS.2013Oct；26(10):663-70)。根据特定选择输出的多特异性结合或靶向结合的量，正向分选之后是反向分选，或与之相反，以富集具有有限量的多特异性结合的完整结合群体。还使用文献中的对照mAb进行了竞争选择。对于竞争选择，将mAb4(乌瑞芦单抗；Bristol-MyersSquibb；CAS号：934823-49-1)和mAb5(乌托鲁单抗；Pfizer；CAS号：1417318-27-4)预先复合至生物素化的人CD137-Fc融合物。在FACS上选择在对照mAb存在下结合和不结合的抗体。将这些轮的输出接种到板上，并挑选分离物以进行测序和表征。
在初始选择
Figure BDA0003224144880001851
中鉴定的克隆的亲和力成熟
使用来自针对生物素化人CD137Fc融合输出的第一轮FACS分选的重链，制备用于四轮额外选择的轻链多样化文库。这些轮选择中的第一轮使用与10nM生物素化人CD137-Fc融合物(作为抗原)结合的Miltenyi MAC珠子。
在MAC珠子选择之后，进行了三轮FACS分选。这些轮中的第一轮使用10nM的生物素化人CD137-Fc融合物。上述第二轮FACS包括对小鼠CD137试剂的结合物的正向分选、与前述对照mAb的竞争分选或减少上述多特异性试剂结合物的反向分选。第三轮即最后一轮FACS选择是使用10nM的生物素化鼠CD137Fc融合物或50nM的生物素化人单体CD137完成的。挑选来自上述每一轮FACS选择的单独集落以用于测序表征。
IgG和Fab的生产和纯化
使酵母克隆生长至饱和，并然后在30℃下振荡诱导48小时。诱导后，将酵母细胞沉淀并收集上清液以进行纯化。使用蛋白A柱纯化IgG，并用pH2.0的乙酸洗脱。通过木瓜蛋白酶消化产生Fab片段，并通过CaptureSelect IgG-CH1亲和基质(LifeTechnologies，目录号1943200250)进行纯化。
实施例2：人抗CD137抗体对重组CD137的表位分析(epitope binning)和亲和力确定
在Forte Bio Octet Red384系统(Pall Forte Bio Corporation,Menlo Park,CA)上使用标准夹心格式分析测定(sandwich format binning assay)对实施例1中分离的抗体进行表位分析。将CD137对照抗体IgG上样至AHQ传感器，并将传感器上未占据的Fc结合位点用不相关的人IgG1抗体封闭。然后将传感器暴露于100nM靶抗原，随后暴露于如实施例1中所述鉴定的分离抗体。使用ForteBio的数据分析软件7.0处理数据。抗原结合后第二抗体的额外结合表明未被占据的表位(非竞争者(non-competitor))，而无结合表明表位封闭(竞争者(competitor))(数据未显示)。
CD137抗体的亲和力通过在ForteBio Octet上测量其动力学常数(ka、kd、KD)来确定。ForteBio亲和力测量基本如先前所述地进行(Estep et al.,MAbs.2013 5(2):270-8)。简言之，ForteBio亲和力测量通过将抗体(IgG)在线(on-line)上样至AHQ传感器来进行。将传感器在测定缓冲液中离线(off-line)平衡30分钟，并然后在线监测其60秒以建立基线。对于紧急的结合测量，将上样有IgG的传感器暴露于100nM抗原(人、食蟹猴或鼠CD137)3分钟，然后将它们转移至测定缓冲液中3分钟以进行解离率(off-rate)测量。通过将人CD137-Fc融合物上样至AHQ传感器，然后暴露于200nM抗体Fab的溶液，来获得单价结合测量。使用ForteBio提供的数据分析软件中的1:1结合模型来拟合动力学数据(数据未显示)。
还确定了抗体是否是配体阻断的。具体地，配体阻断实验在Octet HTX(ForteBio)和无标记MX96 SPRi(Caterra)上进行。在Octet传感器或MX96芯片传感器上捕获mAb1。将CD137和CD137L依次应用于预上样有mAb1的传感器。暴露于CD137L后的应答增加表明mAb1和CD137L之间在与CD137结合上不存在竞争。另一方面，信号没有变化表明存在竞争，对照抗体mAb5就是这种情况。mAb1不抑制CD137L与CD137的结合(数据未显示)，并因此认为其是非配体阻断抗体(non-ligand blocking antibody)。
实施例3：亲和力成熟的抗CD137抗体的结合亲和力分布
使用2个突变文库来产生亲和力成熟的抗CD137抗体。第一个文库含有重链中的突变，第二个文库含有轻链中的突变，其中创建了轻链CDR1、CDR2和CDR3中的供体多样性。突变文库经历了3轮噬菌体淘选(phage panning)，旨在提高亲和力并保持与小鼠CD137的交叉反应性。在每一轮中，在与生物素化抗原初始结合(即，在37℃下与过量未标记的抗原或亲本IgG孵育1小时)后，采用解离率竞争步骤。
将来自不同轮选择的所得抗CD137抗体标绘在kd/ka双对数图上。在0.01％PBS-T的运行缓冲液中在SPRi读取器(MX96，Carterra)上测定表观结合和解离动力学速率常数(ka和kd值)。将抗人CD137抗体共价印刷在CFM(Carterra)上的羧甲基葡聚糖水凝胶50L芯片(Xantec bioanalytics)上。使用新鲜混合的激活试剂(含150ml的0.4M EDC和150ml的0.1Msulfo-NHS的H2O)激活SPR基板表面7分钟。使用含10mg/ml抗体的pH4.5乙酸缓冲液进行印刷15分钟。然后将印刷的芯片在SPRi读取器(MX96，Carterra)上用1M乙醇胺淬灭15分钟。对于动力学分析，依次注射纯化的重组his标记的人CD137(0nM、2.05nM、5.12nM、12.8nM、32nM、80nM、200nM、500nM)。对于每个浓度，进行5分钟的结合，然后10分钟的解离。在SPR Inspection Tool和Scrubber软件中处理和分析数据。动力学数据参考间隙参考点(interstitial reference spot)并双重参考(double-referenced)缓冲循环，然后整体拟合至1:1结合模型以确定它们的表观结合和解离动力学速率常数(ka和kd值)。使用kd/ka比率得出每个抗原/mAb相互作用的KD值，即KD＝kd/ka。
KD(kd/ka)在10-20nM之间的抗体显示为正三角形，而KD低于10nM的抗体显示为倒三角形(图1)。仅重链(上小图)或仅轻链(下小图)的亲和力成熟均导致分离出具有比亲本抗体(mAb1)更高的结合亲和力的抗CD137抗体(图1)。mAb1的重链和轻链可变区分别如SEQID NO:4和6所示。
实施例4：鉴定包含抗CD137抗体的重链CDR3(CDRH3)的关键结合残基
为了确定CDRH3中的哪些氨基酸残基对mAb1与小鼠和人CD137多肽的结合至关重要，进行了丙氨酸扫描。产生了一组编码mAb1开放阅读框衍生物的多核苷酸，其中每个衍生物含有在包含CDRH3的野生型氨基酸残基位置处的单丙氨酸残基取代。通过用丙氨酸密码子GCC替换野生型密码子，将SEQ ID NO:4的D95至M100I位置各自突变为丙氨酸。每个mAb1丙氨酸取代衍生物的每个CDRH3的氨基酸序列如SEQ ID NO:111-125所示。通过GibsonAssembly将编码15个mAb1丙氨酸取代衍生物中每个的多核苷酸单独克隆到表达载体(aglyco-IgG1，DID-2600)中。使用本领域已知的标准技术表达和纯化每个mAb1丙氨酸取代衍生物。每个mAb1丙氨酸取代衍生物对人和小鼠CD137的结合亲和力通过对人CD137(huCD137)的Wasatch SPR动力学测量或对小鼠CD137(mCD137)的平衡细胞结合测定来确定。
表1提供了对每个突变体计算的解离常数(KD)。当表中注明“弱”时，存在高于背景的可测量的结合，但曲线拟合的置信度不足以分配准确的KD值。在表1中，“NB”表示在确定结合亲和力期间未观察到结合，并表明了CDRH3中哪些丙氨酸取代导致了抗体不与CD137结合。
表1：人和小鼠CD137的丙氨酸扫描克隆的结合亲和力(KD)
取代 huCD137 mCD137 取代 huCD137 mCD137
D95A NB NB Y(100C)A 1nM 25nM
S96A 1.8nM 40nM Y(100D)A 弱 170nM
P97A 弱 弱 Y(100E)A NB NB
F98A 弱 弱 Y(100F)A 弱 弱
L99A 2.7nM 33nM Y(100G)A NB NB
L100A NB NB Y(100H)A NB NB
D(100A)A 弱 弱 M(100I)A 1.8nM 21nM
D(100B)A 1.3nM 54nM WTK<sub>D</sub> 1nM 11nM
由突变为丙氨酸导致的结合亲和力的保留、减弱或丧失确定了哪些残基是CD137结合所需的，以及哪些残基对突变耐受。图2总结了CDRH3的丙氨酸扫描的结合数据，其中在每个位置指示了野生型氨基酸同一性。如所示，CDRH3位置基于将位置突变为丙氨酸的效果进行颜色编码。这个分析产生了以下共有序列：DXPFXLDXXYYYYYX。当共有序列中的粗体残基突变为丙氨酸时，结合完全丧失，因此这些残基是mAb1与CD137结合所必需的。当共有序列中的斜体残基突变为丙氨酸时，抗体仍然能够结合CD137，但亲和力较弱，表明这些残基在结合中发挥了部分作用，但不是绝对必需的。当共有序列中用X表示的残基位置突变为丙氨酸时，结合亲和力几乎没有变化。因此，这些残基对突变耐受并且对结合相互作用不是关键的。
实施例5：通过扫描饱和诱变和同源物比较进行表位定位
通过扫描饱和诱变文库和同源性比较对CD137表位进行功能定位，以鉴定对抗体与CD137结合重要的残基。生成了CD137突变体的组合文库，其具有在所有残基位置的单点突变至除半胱氨酸外的每个可能氨基酸的取代，并测试它们与mAb1、mAb4和mAb5结合的能力。从商业供应商合成由编码每个CD137点突变体的基因组成的文库，并将其克隆至哺乳动物展示表达载体中。哺乳动物展示用于展现变体人CD137细胞外结构域的文库，其中每个变体相对于野生型人CD137具有至少一个点突变。
将展示CD137变体的细胞文库用非重叠抗体(i)mAb4和mAb1或(ii)mAb4和mAb5染色。通过FACS富集与一种抗体结合减少而不与另一种抗体结合减少的细胞群体。通过Illumina测序对每个群体进行测序，以鉴定在特异性破坏与每种抗体的结合但不影响CD137的正确折叠或与非重叠抗体的结合的位置处的突变。
对于mAb1，K114被鉴定为是对结合CD137最重要的残基，观察到的所有突变中有34％发生在此位置，并且观察了所有氨基酸取代。E111、T113和P135对结合也很重要，在这些位置的每个观察到10％的突变。此外，在对mAb1的结合部分降低的群体中观察到N126和I132。图3A显示了包含针对mAb1、mAb4和mAb5的表位的残基。mAb4和mAb5具有不同于mAb1的结合表位。对于mAb4，N42是最重要的残基，观察到所有突变中有50％在此位置，其次是R41和D38。对于mAb5，I132是最重要的，32％的突变发生在此位置，其次是N126、G96、K114和L95。
从文库筛选中分离的点突变体表达为可溶性蛋白，并测试其与mAb1的结合。在K114(处测试的所有4种突变R、E、N、T)均消除了与mAb1的结合。T113和P135处的突变也破坏了结合。E111处的1/2点突变体、N126处的1/3突变体和I132处的1/4突变体显示没有结合。同样地，N42处的3/3突变体不与mAb4结合，I132处的3/4突变体不与mAb5结合。
此外，还测试了CD137同源物与mAb1的结合。mAb1能够与小鼠CD137结合，但不与大鼠CD137结合，如图3B所示。为了确定小鼠CD137和大鼠CD137之间包含针对mAb1的表位的残基是否存在差异，比对来自人、食蟹猴、大鼠和小鼠的CD137同源物的氨基酸序列以进行比较。所有包含mAb1表位的氨基酸残基均存在于人、食蟹猴和小鼠中，但不存在于大鼠中。人CD137序列的赖氨酸114(K114)，以及食蟹猴和小鼠CD137序列中的对应赖氨酸，在大鼠CD137序列中为谷氨酸(E)，进一步说明了人CD137序列的K114至少是对于mAb1的关键结合残基之一。
图3C和3D显示了与CD137L结合的人CD137的晶体结构(Bitra A et al.,J BiolChem 2018,293(26):9958-9969)，其中残基E111、T113、K114和P135显示为球体。可以看出，这些残基远离以灰色显示的CD137配体(CD137L)结合结构域。
实施例6：抗CD137抗体对小鼠中免疫调节子和CD8+T细胞的影响
进一步分析了实施例1中产生的三种抗CD137抗体mAb1、mAb2和mAb3的功效。这些抗体具有小鼠交叉反应性，并且包含含有S228P突变的人IgG4同种型的恒定区，以防止Fab改组(shuffling)。3H3单克隆抗体，已知可在体内刺激小鼠CD137信号传导并引发抗肿瘤免疫(Melero et al.(1997)Nature Medicine 3(6):682-685；Uno et al.(2006)NatureMedicine12(6):693-696)，用作比较物(BioXcell目录号BE0239；批号5926/1115)。值得注意的是，抗体3H3与乌瑞芦单抗(Bristol-Myers Squibb；CAS号：934823-49-1)(一种靶向CD137的细胞外结构域的全人IgG4-S228P激动性抗体)具有相似的特性，但不阻断配体结合。此外，使用抗大鼠IgG4作为同种型对照(BioXcell目录号BE0089；批号5533/5679-316J1)。在PBS中进行稀释，以在100μL注射体积中达到每只小鼠所需的剂量，如所示。
在第0、3、6天将抗体(100μg)腹膜内施用给非荷瘤雌性Balb/c小鼠，并在第9天收获脾。通过流式细胞术测量CD8+CD44+T细胞上的PD-1和TIGIT表达水平。具体地，通过机械破碎并通过40μm细胞过滤器获得来自脾的单细胞悬液。使用ACK缓冲液裂解红细胞。细胞悬液用以下抗体染色：CD45(克隆30-F11，eBioscience)、CD8(克隆53-6.7，BD Biosciences)、CD4(克隆RM-45，BD Biosciences)、CD44(克隆IM7，eBioscience)、PD-1(RMP1-30，eBioscience)和TIGIT(GIGD7，eBioscience)。在MACSQuant Analyzer流式细胞仪(Miltenyi)上进行数据采集，并使用FlowJo软件(版本10)分析数据。
抗体3H3引起PD-1和TIGIT两者表达的显著增加，而与mAb2和mAb3相比，仅抗体mAb1使表达增加(图4A和4B)。此外，通过分析每个脾的脾CD45+细胞百分比或CD8+T细胞数量来评估CD8+T细胞的扩增。类似地，抗体3H3导致了CD8+T细胞的最大扩增，其中mAb1相对于mAb2和mAb3导致了最大水平的CD8+T细胞扩增(图4C)。因此，选择mAb1进行进一步测试。
实施例7：抗CD137抗体在荷瘤小鼠中的功效
鉴于mAb1增强CD8+T细胞扩增的能力，如实施例6中所示，使用同基因结肠癌(syngeneic colon cancer)的皮下模型进一步分析mAb1的抗肿瘤活性。具体地，将CT26肿瘤细胞(第3次传代)在无菌条件下保持在含有以下的DMEM培养基(Gibco目录号11965-092)中：10％56℃热灭活FBS(Gibco 10438-034)、1mM丙酮酸钠(Gibco目录号11360-070)、1XNEAA(Gibco目录号11140-050)和1X MEM维生素溶液(Gibco目录号11120-052)。将细胞保持在37℃和5％CO2下。在达到50-70％汇合后，在体内植入之前将细胞以1:10的比例传代，总共传代两次。收获细胞并使用血细胞计数器(Hausser Scientific Bright-Line#1492)计数。
Balb/c雌性小鼠购自Charles River Laboratories，且在研究开始时为9周龄。将CT26肿瘤细胞(每只小鼠1x105个细胞，于0.1mLPBS中)皮下注射到每只小鼠的右侧，并使用游标卡尺每周计算两次肿瘤体积(长度*(宽度^2)/2)。在肿瘤接种后第7天，将动物分成八组，并开始治疗。在研究期间每周记录三次体重。
以三种不同的剂量(100、50或25μg/小鼠)施用mAb1，以两种不同的剂量(50或10μg/小鼠)施用3H3，以50μg/小鼠的剂量施用同种型对照抗体。在第0、3、6和9天对所有小鼠进行腹膜内给药。
对于mAb1和3H3抗体，在体内均证实了肿瘤中CD8+T细胞的扩增(数据未显示)。单个肿瘤体积显示在图5A中，且平均肿瘤体积显示在图5B中。在全部三种剂量下，mAb1治疗与对照组相比均导致肿瘤生长受抑制。此外，用mAb1治疗导致了以下小鼠中的完全消退(complete regression)：25μg剂量水平下8只小鼠中的6只、50μg剂量水平下8只小鼠中的5只以及100μg剂量水平下8只小鼠中的3只。
每个治疗组的总生存期显示在图5C中。mAb1针对CT26肿瘤的强抗肿瘤活性反映为延长的总生存期。在25μg剂量水平下80％的小鼠中、50μg剂量水平下62％的小鼠中和100μg剂量水平下38％的小鼠中观察到长期存活(>60天)。
将在第70天没有可触摸到的肿瘤的小鼠视为被治愈，并在对侧通过皮下注射CT26细胞对其进行再攻击(re-challenge)。具体地，向肿瘤被根除的小鼠的左侧再次注射1×105个CT26细胞，并使用游标卡尺每周计算两次肿瘤体积(长度*(宽度^2)/2)。以与对照相同的方式分别对五只未免疫的(幼稚)小鼠进行注射。再攻击实验的结果显示在图5D中。在皮下注射CT26细胞后22天，经过再攻击的小鼠均未形成肿瘤。相比之下，所有注射了相同细胞的幼稚小鼠均形成肿瘤。因此，所有认为治愈的小鼠均抵御了CT26肿瘤，表明mAb1能够诱导长期保护性记忆。
实施例8：亲和成熟的抗CD137抗体在荷瘤小鼠中的功效
使用基本上与实施例7中所述相同的同基因结肠癌(CT26)皮下模型分析实施例4中产生的亲和力成熟的单克隆抗体的抗肿瘤活性。具体地，产生了6个含IgG4恒定区的亲和力成熟的克隆(mAb7-mAb12)并相应地进行测试。下表提供了重链和轻链可变区的序列，以及它们对小鼠CD137(由ForteBio Octet测定，描述在实施例2中)和人CD137(由Carterra测定，描述在实施例4中)的KD值。
表A
Figure BDA0003224144880001921
使用亲本mAb1、3H3抗体(数据未显示)和IgG4同种型抗体作为对照。在第0、3、7和10天对所有小鼠进行50μgmAb/小鼠的腹膜内给药。在治疗开始后第13天收获脾和肝。
单个肿瘤体积显示在图6A中，平均肿瘤体积显示在图6B中。与实施例7的结果一致，用亲本mAb1治疗导致肿瘤体积减小。此外，与用同种型对照抗体处理的小鼠相比，将衍生自mAb1的所有亲和力成熟的克隆(mAb7-mAb12)施用给荷瘤小鼠导致肿瘤生长的抑制。
实施例9：抗CD137抗体对荷瘤小鼠中T细胞的影响
为了确定抗CD137抗体(即，3H3和mAb1)对荷瘤小鼠中T细胞水平的影响，如实施例7中所述，在第0天和第3天向具有CT26肿瘤的Balb/c小鼠腹膜内注射抗体，并在第7天收获组织。以三种不同的剂量(100、50或25μg/小鼠)施用mAb1，以两种不同的剂量(50或10μg/小鼠)施用3H3，并以50μg/小鼠的剂量施用同种型对照抗体。
如实施例6中所述地获得来自脾的单细胞悬液，并且使用肿瘤解离试剂盒(Miltenyi目录号130-096-730)通过酶促和机械消化获得肿瘤细胞悬液。用完全培养基处理细胞悬液以使酶失活，并然后通过40μm细胞过滤器。使用ACK缓冲液裂解红细胞。用针对CD45、CD8和CD4的抗体将细胞染色，并如实施例6中所述进行分析。
图7显示了在脾和肿瘤中发现的CD4+和CD8+T细胞的数量，以CD45+细胞的百分比表示。这些结果表明，与脾CD8+T细胞相比，mAb1选择性扩增了肿瘤浸润性CD8+T细胞。
实施例10：体内CD4+、CD8+或NK淋巴细胞消减对抗CD137抗体的抗肿瘤功效的影响
为了评估抗CD137抗体的作用机制，如实施例7中所述，向具有CT26肿瘤的Balb/c小鼠腹膜内注射单独的mAb1或其与抗CD4(GK1.5)、抗CD8(YTS169.4)或抗去唾液酸-GM1(靶向NK细胞)抗体的组合，以消减动物中这些特定的淋巴细胞亚群。在第6、9、12、19和26天向仅用mAb1抗体处理的小鼠施用150μg抗体。用150μg mAb1与500μg抗CD4、抗CD8或50μL抗去唾液酸-GM1抗体的组合治疗的小鼠在第-1、0、5、10、15和20天施用。通过FACS分析确认有效消减(数据未显示)。
单个肿瘤体积显示在图8中。与实施例7的结果一致，用亲本mAb1治疗导致肿瘤体积减小。此外，mAb1与消减淋巴细胞的抗CD4、抗CD8或抗去唾液酸-GM1抗体的组合施用降低了mAb1抗体的抗肿瘤活性。这些结果表明，对于本文所述的抗CD137抗体的抗肿瘤功效的先天免疫和适应性免疫之间的协作。
实施例11：抗CD137抗体在多种肿瘤模型中的抗肿瘤功效
为了确定抗CD137抗体在不同的肿瘤模型中是否具有抗肿瘤功效，将mAb8施用给患有CT26肿瘤(结肠癌；如上所述)、EMT-6肿瘤(乳腺癌)、A20肿瘤(B细胞淋巴瘤)或MC38肿瘤(结肠癌)之一的小鼠。
对于所有肿瘤模型，雌性小鼠购自Charles River Laboratories，并且在研究开始时为7-9周龄。对于每种肿瘤类型，使用合适的同基因小鼠品系(对于CT26、EMT-6和A20使用Balb/c；对于MC38使用C57BL/6)。将EMT6肿瘤细胞(每只小鼠5x104个细胞，在0.05mLPBS中)注射到每只小鼠的右侧乳腺脂肪垫中。将CT26肿瘤细胞(每只小鼠1x105个细胞)、A20肿瘤细胞(每只小鼠5x106个细胞)和MC38肿瘤细胞(每只小鼠5x105个细胞)皮下注射到每只小鼠的右侧，并且使用游标卡尺每周计算两次肿瘤体积(长度*(宽度^2)/2)。在肿瘤达到50-100mm3大小后，小鼠随机接受mAb8或同种型对照(第0天)。具有正视(orthoptic)EMT6肿瘤的小鼠在第0、3、6和9天接受12.5μg。具有A20(200μg/小鼠)和MC38(12.5μg/小鼠)肿瘤的小鼠每周接受5次剂量。所有小鼠均腹膜内给药。
如图9所示，mAb8在测试的全部四种肿瘤模型中均有效，显示对不同癌症类型的广泛功效。用mAb8治疗导致携带8/8CT26、3/8EMT6、5/8A20肿瘤的小鼠中的肿瘤消退，并导致大多数剩余的携带EMT6、A20和MC38的小鼠中的生长延迟。
实施例12：抗CD137抗体剂量的影响
为了进一步表征抗CD137抗体的抗肿瘤功效，使用基本上与实施例7中所述相同的同基因结肠癌(CT26)皮下模型进行剂量研究。具体地，在第0、3、6和9天以每只小鼠150μg(高剂量)或20μg(低剂量)的剂量腹膜内施用亲本mAb1和亲和力成熟的抗体mAb8和mAb10，每个治疗组8只小鼠。向一组小鼠(n＝8)施用150μg剂量的IgG4同种型对照。
以150μg治疗的小鼠的个体肿瘤体积、平均肿瘤体积和存活百分比分别显示在图10A、图10B和图10C中。以20μg治疗的小鼠的个体肿瘤体积、平均肿瘤体积和存活百分比分别显示在图11A、图11B和图11C中。这些结果表明，使用亲本mAb1和亲和力成熟的mAb8和mAb10抗体的治疗在高剂量和低剂量下均导致肿瘤体积减少和小鼠存活增加。
在使用CT26肿瘤模型的单独剂量研究中，测试了亲本mAb1的其他剂量。具体地，以下列剂量腹膜内施用mAb1：12.5μg、25μg、50μg、100μg和200μg。图12显示了剂量研究的结果，表明在宽剂量范围内的功效。用mAb1治疗导致了在每个剂量水平下至少3/8只小鼠中的肿瘤消退，其中最佳剂量范围(50-100μg/小鼠)导致7/8只小鼠的肿瘤根除。
实施例13：Fc-受体结合对抗CD137抗体抗肿瘤功效的影响
为了确定Fc-受体结合对抗CD137抗体的抗肿瘤活性的贡献，生成了mAb1的去糖基化IgG1和IgG4版本。如实施例7中所述地在小鼠中建立CT26肿瘤。小鼠接受150μg的以下其一：(a)同种型对照；(b)作为IgG4的mAb1；(c)作为IgG4的去糖基化mAb1；或(d)作为IgG1的去糖基化mAb1。
如图13A和13B所示，与mAb1相比，亲本mAb1抗体的去糖基化IgG4和IgG1同种型对肿瘤体积的影响降低。然而，功效未完全消除。因此，这些结果表明，mAb1的抗肿瘤功效并不完全依赖于Fc，其通过Fc受体结合而增强。
实施例14：抗CD137抗体的跨物种亲和力
进一步测试了抗CD137抗体与来自多个物种的CD137的结合。具体地，分析了mAb1、mAb8和mAb10与人、小鼠、食蟹猴和犬CD137的结合。在OctetHTX(ForteBio)上，在动力学缓冲液(1xPBS，pH 7.4，0.1mg/ml BSA和0.002％Tween 20)中进行动力学实验。分别将Fc、小鼠IgG2a或His标记的CD137(人、小鼠、食蟹猴或犬)上样到预先水合(pre-hydrated)的生物传感器AHC、AMC或NTA上5分钟。然后将传感器浸入Fab(0nM、5.12nM、12.8nM、32nM、80nM、200nM和500nM)中结合5分钟，然后解离15分钟。使用ForteBio Data Analysis 9.0分析结果，并整体拟合至1:1结合模型以确定表观KD。人和小鼠CD137结合的KD通过使用来自不同来源(ACRO Biosystems、Sino Biological和内部)的抗原进行确认。结果显示在下表2中。
表2：跨物种亲和力
CD137的物种 mAb1 mAb8 mAb10
人 50-70nM 3-5nM 0.9nM
小鼠 300-500nM 50-90nM 10-30nM
食蟹猴 30-100nM 3-7nM 1.8nM
犬 拟合差 拟合差 拟合差
实施例15：肿瘤大小对抗CD137抗体抗肿瘤功效的影响
为了进一步表征抗CD137抗体的抗肿瘤功效，评估了针对大肿瘤的抗肿瘤功效。允许CT26肿瘤在治疗前生长至约500mm3。在肿瘤建立后第0、3、6和9天以150μg/小鼠(n＝6只小鼠/治疗组)施用亲本mAb1以及亲和力成熟的mAb8和mAb10抗体。使用IgG4同种型对照抗体作为比较物。
如图14A-14C所示，相对于同种型对照，亲本mAb1以及亲和力成熟的mAb8和mAb10减少了肿瘤体积(图14A-14B)并增加了小鼠存活(图14C)。与mAb1和mAb10相比，mAb8产生了显著更大的抗肿瘤功效。使用相同的研究设计进行了单独的研究来比较mAb8和3H3对大肿瘤的功效，不同之处是在第0、7和14天施用25μg抗体。图14D提供了结果，显示3H3对大肿瘤没有功效，而mAb8诱导了肿瘤消退。
如实施例14中所述，mAb8对小鼠CD137的亲和力与mAb1对人CD137的亲和力相当。尽管本公开不受任何特定理论或作用机制的约束，但认为具有中等亲和力的激动剂抗CD137抗体可能甚至对治疗癌症更有用。
在第70天没有可触摸到的肿瘤(palpable tumor)的小鼠被视为被治愈，并在对侧通过皮下注射CT26细胞对其进行再攻击。具体地，向肿瘤被根除的小鼠左侧再次注射1x105个CT26细胞，并使用游标卡尺每周计算两次肿瘤体积(长度*(宽度^2)/2)。以与对照相同的方式分别注射五只未免疫的(幼稚)小鼠。再攻击实验的结果显示在图15中。皮下注射CT26细胞后80天，经再攻击的小鼠均未形成肿瘤。相比之下，所有注射了相同细胞的幼稚小鼠均形成了肿瘤。因此，所有认为被治愈的小鼠均抵御了CT26肿瘤，表明mAb1能够诱导长期保护性记忆免疫。
实施例16：抗CD137抗体在荷瘤小鼠中的毒性
为了确定抗CD137抗体(即，3H3和mAb1)对荷瘤小鼠中肝内T细胞水平的影响，分析了来自实施例7的小鼠。收集肝淋巴细胞并通过流式细胞术进行分析。具体地，使用肝分离试剂盒(liver dissociation kit，Miltenyi目录号130-105-807)和温和的MACSDissociator(Miltenyi)获得来自肝的单细胞悬液。用完全培养基处理细胞悬液以使酶失活，并然后通过40μm细胞过滤器。使用ACK缓冲液裂解红细胞。用针对CD45、CD8和CD4的抗体将细胞染色，并如实施例3中所述地进行分析。
图16A和16B显示了在所治疗小鼠的肝中发现的CD4+和CD8+T细胞的数量，以CD45+细胞的百分比表示。结果表明，mAb1没有诱导肝内T细胞的浸润，显示了其相对于抗体3H3的毒性较低。
实施例17：亲和力成熟的抗CD137抗体在荷瘤小鼠中的毒性
为了评估由抗CD137抗体(即，3H3、mAb1和mAb7-mAb12)介导的毒性相关作用，在施用抗体后分析了来自实施例8的荷瘤小鼠的脾和肝的细胞组成。
收集来自实施例8的荷瘤小鼠中的肝内(肝)和脾内(脾)T细胞，并通过流式细胞术进行分析。如所示，在施用抗CD137抗体或同种型对照抗体后，评估来自肝和脾的CD45+细胞的CD3+、CD4+或CD8+表达。结果显示在图17A(脾)和17B(肝)中。结果表明，相对于施用同种型对照抗体，施用亲本mAb1以及亲和力成熟的抗体(mAb7-mAb12)对肝内或脾内T细胞百分比几乎没有影响。相比之下，相对于同种型对照抗体，施用3H3抗体导致了脾和肝中的T细胞均升高，尤其是CD3+T细胞和CD8+T细胞。
此外，在施用抗CD137抗体或同种型对照抗体后，评估了来自所治疗小鼠的肝和脾的CD45+CD8+T细胞和CD45+CD4+T细胞的TIGIT、PD-1或LAG-3共抑制性受体的表达，作为T细胞激活或耗竭的指标。如在前实施例中所述，通过流式细胞术测量CD8+T细胞和CD4+T细胞上的TIGIT、PD-1和LAG-3表达水平。图18A-18B和19A-19B显示，施用3H3抗体导致这些共抑制性受体在CD8+T细胞和CD4+T细胞中的表达均显著增加，而施用亲本mAb1或亲和力成熟的mAb7-mAb12抗体导致TIGIT、PD-1或LAG-3的表达程度与施用同种型对照抗体后所见程度相似。这些结果表明，亲和力成熟的抗体不诱导全身性CD8+T细胞或CD4+T细胞激活。
总之，这些结果表明，与3H3比较物抗体相比，亲本mAb1和亲和力成熟的mAb7-mAb12抗体表现出较低的体内毒性潜力。在用mAb1和亲和力成熟的mAb7-mAb12抗体治疗后，全身性T细胞激活和扩增的不存在(尤其在肝中)可能会转化为患者中较低可能性的肝毒性(转氨酶升高(transaminitis))。
实施例18：多剂量的抗CD137抗体在荷瘤小鼠中的毒性
为了证实mAb1没有诱导毒性，进行了重复剂量毒性研究。具体地，每周向小鼠施用抗CD137抗体mAb1、mAb8或3H3，持续4周。mAb1和mAb8以10、20、40或80mg/kg施用，而3H3以10或80mg/kg施用。在第35天，根据制造商的说明，使用荧光活性测定法(Sigma，目录号MAK052)测定血浆中的丙氨酸转氨酶(ALT)水平，使用流式细胞术测定肝中的CD8+T细胞(如上所述)，并使用电化学发光测定法(Meso Scale Discovery，定制试剂盒)测定血浆中的TNFα浓度。
图20A显示了在所有4个剂量下施用了mAb1和mAb8的小鼠肝中的CD8+T细胞水平低，而3H3在低(10mg/kg)和高(80mg/kg)剂量下均诱导了高水平的CD8+T细胞。图20B显示了在所有4个剂量下施用了mAb1和mAb8的小鼠血浆中的ALT活性水平低，而3H3在80mg/kg剂量下诱导了高水平的ALT。图20C显示了在低(10mg/kg)和高(80mg/kg)剂量下施用了mAb1mAb8的小鼠血浆中的TNFα水平低，而3H3在低(10mg/kg)和高(80mg/kg)剂量下均诱导了高水平的TNFα。
此外，将来自接受了80mg/kg的抗CD137激动性抗体的所治疗小鼠的肝切片并用H&E染色。对于每只动物，其一半肝叶包埋在OCT中并在液氮中新鲜冷冻。切片和H&E染色由组织病理学实验室(Mass Histology Service,Inc)根据标准程序进行。图21提供的结果显示，接受了3H3(见箭头)的小鼠中的炎症小叶中心病灶，但未见于接受mAb1或亲和力成熟的mAb1的小鼠。
实施例19：用抗CD137抗体进行免疫重编程
为了确定抗CD137抗体对肿瘤微环境中的免疫细胞的作用，使用了CT26肿瘤模型。具体地，如实施例7中所述地建立CT26肿瘤。在第0、3、6和9天以25μg的剂量向小鼠施用mAb8。如实施例16中所述地在第11天分析肿瘤。
通过测量CD45+活细胞的数量来确定免疫细胞向肿瘤微环境的总体浸润。如图22A所示，mAb8显著增加了免疫细胞向肿瘤微环境的浸润。
通过测量CD25+FOXP-3+CD4+肿瘤浸润淋巴细胞的数量来确定肿瘤微环境中的Treg细胞水平。如图22B所示，mAb8显著降低了肿瘤微环境中的Treg水平。
通过测量CD8+或CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的PD-1+TIGIT+表达水平来确定mAb8对T细胞耗竭的作用。图22C显示了CD8+TIL的结果，其中当施用mAb8时，肿瘤微环境中的PD-1+TIGIT+细胞减少。对于CD4+TIL观察到类似的结果(数据未显示)。这些结果表明mAb8保护免遭和/或逆转T细胞耗竭。
此外，分析了mAb8对肿瘤相关巨噬细胞的作用。具体地，测量了F4/80+CD11b+CD45+细胞，并且在用mAb8治疗下观察到肿瘤相关巨噬细胞减少。
在单独的研究中，评估了抗CD137抗体(即，mAb1和3H3)对外周免疫细胞的作用。具体地，在第7天进行分析来自在第0天和第3天以150μg的剂量用mAb1或3H3治疗的CT26荷瘤小鼠的脾。如图23所示，抗CD137抗体3H3诱导了CD8+和CD4+T细胞上的TIGIT和PD-1表达，并增加了CD8+CD25+和CD4+Foxp3+细胞。此外，3H3诱导了CD8+和CD4+效应记忆细胞。相比之下，抗CD137抗体mAb1不显著诱导CD8+TIGIT+PD-1+、CD8+CD25+和CD4+Foxp3+T细胞。此外，mAb1不诱导CD8+或CD4+效应记忆细胞。
总体而言，这些结果表明，抗CD137抗体mAb1和mAb8诱导肿瘤微环境中的显著的免疫重编程，并且对外周免疫细胞的作用较小(如果有的话)。
实施例20：抗CD137抗体对鼠T细胞激活的增强
通过在鼠卵白蛋白刺激测定中评估IL-2产生的刺激，进一步分析抗CD137抗体的激动性活性。在96孔板中，以104个细胞/孔接种JAWS-II树突细胞样细胞，并在鼠IFN-γ(10ng/mL)存在下孵育过夜。将细胞与2μg/mL OVA/A2肽一起孵育，并在37℃下孵育2小时，然后与105个从OT-I小鼠脾中分离的表达OVA的CD8+T细胞一起孵育。同时添加抗体。使用阿特朱单抗(抗PD-L1抗体)和小鼠抗PD-1抗体(RMP1-14)，以及IgG4同种型对照作为比较物。IL-2浓度通过Meso Scale Discovery(MSD)确定。
如图24所示，mAb8和mAb10显著增强了IL-2的产生。
除了测量IL-2的产生，使用相同的鼠卵白蛋白刺激测定分析CD25+CD8+T细胞和TIGIT+CD8+T细胞的百分比。纳入抗体3H3作为比较物。图25A和25B显示mAb8和mAb10增强了CD25(激活标志物)的表达，并避免了TIGIT(耗竭标志物)的诱导。相比之下，3H3增强了TIGIT的表达。
实施例21：抗CD137抗体对细胞因子诱导的作用
为了确定抗CD137抗体对T细胞细胞因子诱导的作用，使用了板结合抗体。使用三种抗体作为比较物：mAb4，对应于乌瑞芦单抗(Bristol-Myers Squibb；CAS号：934823-49-1)，一种全人IgG4-S228P激动性抗体，其靶向CD137的细胞外结构域但不阻断配体结合；mAb5，对应于乌托鲁单抗(Pfizer；CAS号：1417318-27-4)，一种全人IgG2-S228P激动性抗体，其靶向CD137的细胞外结构域并阻断配体结合；和mAb6，一种全人IgG4-S228P激动性抗体，其选自与mAb1相同的文库并靶向CD137的细胞外结构域。mAb6抗体不阻断配体结合。
通过反向选择分离人CD3+T细胞，并将其添加到结合有抗CD137抗体和1μg/ml抗CD3的平板中。添加1nM、10nM、50nM或100nM的抗CD137抗体。将抗体在4℃下包被过夜。
添加T细胞后72小时，根据制造商的说明，通过Luminex试剂盒(LuminexCorporation，Austin，TX)来评估IL-2、IFN-γ、TNFα和IL-13的水平。使用可溶性抗CD28(2μg/mL)作为T细胞激活对照，并使用结合抗CD3的板来设置激活基线。图26显示了每个细胞因子水平的倍数变化，其与激活基线有关。mAb4(乌瑞芦单抗)显示对每种细胞因子的诱导水平最高，而mAb1显示诱导水平较低，但相对于mAb5(乌托鲁单抗)和mAb6较高。这些结果表明，在相同浓度下，mAb1对CD137的激动比mAb4(乌瑞芦单抗)小。
实施例22：抗CD137抗体对干扰素-γ(IFN-γ)的诱导
为了进一步评估抗CD137抗体的激动性活性，在混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction，MLR)中分析了IFN-γ的产生。使用以下作为比较物：mAb2、mAb4(乌瑞芦单抗)、mAb5(乌托鲁单抗)和Keytruda，一种阻断PD-1的人源化抗体(Merck)并已知其诱导IFN-γ产生。
从衍生自三个单独人供体(D985、D7603和D5004)的leukopak(HemaCare，VanNuys，CA)中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用免疫磁性细胞分离(EasySepTM；StemcellTechnologies，VancouverBC)的反向选择，从PBMC富集总T细胞。使用免疫磁性细胞分离(EasySepTM；Stemcell Technologies，Vancouver BC)从PBMC中分离单核细胞。分别将T细胞以1x106个细胞/ml的浓度重悬于完全RPMI中，并将单核细胞调整为5x105个细胞/ml。在96孔板中，以1x105个细胞/孔的密度接种100μl含有T细胞的培养基，然后加入100μl单核细胞悬液(E:T比例为2:1)。接下来，加入50μl含有不同稀释度的CD137抗体的培养基。将平板在37℃下于CO2孵育箱中孵育5天。在孵育期结束时，收集培养上清液并通过MSD测定(Mesoscale Diagnostics,Rockville,MD)分析IFN-γ水平。图27A-27C显示了在所测试的抗体的最终浓度下以pg/mL表示的IFN-γ浓度，如所示。这些结果表明，在相同浓度下，mAb1对CD137的激动比mAb4(乌瑞芦单抗)小，但与mAb5(乌托鲁单抗)程度相似。
在单独的研究中，通过利用工程化以表达CD32(FCyRIIb)的CHO细胞(CHO-CD32细胞)来测量IFN-γ诱导。具体地，在可溶性抗CD3和抗CD137抗体mAb1、mAb8、mAb4和mAb5存在下，将CHO-CD32细胞与人T细胞共培养。
将冷冻的PBMC解冻并在T细胞培养基(TCM)中在37℃5％CO2加湿孵育箱中静置过夜。第二天，将CD3+T细胞用未触的(untouched)CD3T细胞分离试剂盒(Stemcell#17951)分离，然后与经转导以表达人CD32的CHO细胞(Gibco#A29127)(CHO-CD32)、250ng/ml抗-CD3(克隆OKT3)和抗CD137或对照抗体混合。将100,000个T细胞与50,000个CHO-CD32细胞混合在一起。在37℃下孵育3天后，收集上清液用于通过MesoScale Discovery(MSD)分析所分泌的干扰素-γ(IFN-γ)。
图28提供的结果显示了mAb4以低剂量诱导IFN-γ至最高水平。相比之下，mAb5几乎不诱导IFN-γ产物。值得注意的是，mAb1和mAb8提供了剂量依赖性应答，并在mAb4和mAb5诱导的水平之间诱导IFN-γ产生。总体而言，这些结果表明，mAb4具有超级激动剂(superagonist)活性，mAb5的活性较弱，mAb1和mAb8与mAb4和mAb5相比具有中等活性。
实施例23：抗CD137抗体对Treg细胞的作用
为了进一步表征抗CD137抗体的作用机制，确定了所述抗体对Treg细胞的作用。使用EasySepTMHuman CD4+CD127lowCD25+Regulatory T Cell Isolation Kit(StemcellTechnologies,Cat#18063)分离人Treg，并通过immunocult抗CD3/28(Stemcell#10971)将其在含10％FBS的完整T细胞培养基中扩增13天。具体地，在可溶性抗CD3(克隆OKT3)以及抗CD137抗体mAb1、mAb8、mAb4、mAb5和同种型对照存在下，将实施例21中描述的CHO-CD32细胞与扩增的人Treg细胞共培养，所述的人Treg细胞用Cell-trace violet染料(ThermoFisher，Cat#C34557)标记。在第4天测定Treg细胞的增殖。
图29提供的结果显示了即使在低浓度下，mAb4仍强烈诱导了Treg增殖。相比之下，mAb5对Treg增殖的作用非常微弱。值得注意的是，mAb1和mAb8显示出使Treg增殖中等增加。总体而言，这些结果证实了mAb4具有超级激动剂活性，mAb5具有弱活性，mAb1和mAb8具有中等活性。
实施例24：抗CD137抗体对细胞内信号传导的作用
为了进一步评估抗CD137激动性抗体之间的差异，在体外评估了细胞内信号传导。具体地，使用250ng/mL结合板的抗CD3(克隆OKT3)以及不同浓度的结合板的mAb1、mAb8、mAb4、mAb5和同种型对照来刺激用NFkβ(Qiagen；Cat#CLS-013L-1)或SRF(Qiagen；Cat#CLS-010L-1)慢病毒转染(lentifected)的CCL-119T细胞(ATCC；Cat#ATCC CCL-119)。在不含添加剂的RPMI培养基中刺激16小时后，将细胞在荧光素酶缓冲液(Promega；Cat#E263B)中裂解，并在BioTek Synergy H1酶标仪(Cat#11-120-533)上获得相对光单位(RLU)。然后将原始RLU数据导出至Microsoft Excel，并通过将受刺激条件下的RLU与未受刺激的对照相除来计算诱导倍数。
图30提供的结果显示了mAb4和mAb5相对于mAb1及其亲和力成熟的变体mAb8的最小NFkβ和SRF活性。总体而言，这些结果表明mAb1对细胞内信号传导的诱导与mAb4和mAb5不同。
实施例25：抗CD137抗体对巨噬细胞激活和分化的作用
先前已显示，由抗mCD137激动性抗体3H3诱导的肝毒性与肝中巨噬细胞和CD8+T细胞的扩增以及血清中细胞因子水平和ALT活性的增加有关。此外，抗体3H3已被表征为具有与乌瑞芦单抗相似的特性。如本文所述，mAb1不诱导肝毒性。因此，在体外分析了抗CD137激动性抗体对巨噬细胞激活的影响。
具体地，从10周龄的雌性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories)建立小鼠骨髓来源的小鼠巨噬细胞。从小鼠的肌肉组织(musculature)中提取股骨和胫骨，并将骨髓用PBS冲洗至冰上的15mL锥形管中。将细胞以1500rpm离心5分钟，并弃掉上清液。将细胞沉淀破碎并添加培养基(RPMI、20％FBS、50μg/mLM-CSF(Shenandoah Biotechnology,Inc.；Cat#200-08-100)和pen/strep)。将细胞在40微米筛网过滤器上过滤并接种到非组织培养处理的培养皿中。3天后，将10mL培养基添加到每个培养皿中。在培养的第7天，去除培养基并用PBS(10mL)洗涤细胞两次。添加MACS缓冲液(PBS、2μMEDTA和0.5％FBS)加入每个培养皿中，并在37℃下孵育10分钟。从培养皿中收集细胞并以1500rpm离心5分钟。然后在50nm的抗CD137抗体mAb1、3H3或LOB12.3(小鼠特异性CD137激动剂抗体)存在下，用TLR9激动剂CpG刺激这些骨髓来源的巨噬细胞。根据制造商的说明，使用电化学发光测定法(Meso ScaleDiscovery，定制试剂盒)在48小时后从培养上清液中评估鼠骨髓来源的巨噬细胞的IL-6、TNFα和IL-27产生。图31提供的结果表明了mAb1没有诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子，而抗体3H3和LOB12.3则相反。
人类单核细胞衍生的巨噬细胞是通过使用抗CD14微珠(Miltenyi Biotech，Cat#130-050-201)磁性分离CD14+细胞并在50ng/mL m-CSF存在下成熟7天而产生的。然后在5nm的抗CD137抗体mAb1、mAb4或mAb5存在下，用10ng/mL LPS刺激人单核细胞衍生的巨噬细胞。根据制造商的说明，使用电化学发光测定(Meso Scale Discovery，定制试剂盒)在48小时后评估TNFα的产生。图32提供的结果表明，mAb4和mAb5诱导的巨噬细胞激活显著高于mAb1。
此外，使用2μM佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(phorbol 12-myristate13-acetate)(PMA；Sigma；P1585)过夜将THP1单核细胞分化为巨噬细胞。然后在50nm的抗CD137抗体mAb1、mAb4或mAb5存在下培养巨噬细胞，并在48小时后使用流式细胞术(APC抗人CD64抗体克隆10.1；BioLegend；Cat#305013)测量CD64表达。图33提供的结果表明，mAb4和mAb5诱导的巨噬细胞分化显著高于mAb1。
尽管本公开不受任何特定理论或作用机制的约束，但总体而言，这些结果表明mAb1由于降低的巨噬细胞激活潜力而避免了肝毒性。
实施例26：通过抗CD137激动性抗体在体内扩增人CD8+T细胞
为了测试在体内CD137激动性抗体对人细胞的作用，将人PBMC(7x106)静脉注射至免疫功能低下(immunocompromised)的NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ；JacksonLaboratory；Cat#005557)。将小鼠随机分成8组，并在第0、7和14天接受CD137抗体(200μg/小鼠)或媒介物对照。在第10、20和29天收集来自每只小鼠的外周血用于使用流式细胞术测定人CD45+(FITC抗人CD45克隆HI30；BioLegend；Cat#304038)、CD8+(Alexa
Figure BDA0003224144880002041
647抗人CD8a克隆HIT8a；BioLegend；Cat#300918)和CD4+(APC-Cy7抗人CD4克隆RPA-T4；Bd；Cat#557871)移植。
图34A-34C显示了以人CD4+T细胞为代价在接受mAb4的小鼠中hCD45+细胞数量的总体增加和人CD8+T细胞的全身性过度扩增(hyper expansion)。值得注意的是，mAb1没有诱导人T细胞的过度激活。mAb1在外周激活人T细胞的潜力降低可有助于降低毒性可能性。
实施例27：制剂材料和方法
尺寸排阻色谱
在Agilent 1200系列HPLC仪器上使用YMC Diol-200 8x300mm柱(目录号DL20S05-3008WT)进行尺寸排阻色谱(SEC)。运行缓冲液为20mM磷酸钠、400mM NaCl pH 7.0，流速为1mL/min，且每个样品运行时间为15分钟。
毛细管等电聚焦
毛细管等电聚焦(cIEF)在MauriceC.仪器(ProteinSimple)上使用Maurice cIEFCartridge(目录号PS-MC02-C)进行。最终测定组合物由0.5mg/mL抗体、4％Pharmalyte3-10和0.35％甲基纤维素组成。使用了PI标记5.85和8.4。聚焦条件为：1500V1分钟，然后3000V4分钟。用垂线法(dropline method)使用3秒曝光时间的天然荧光信号进行峰积分(peakintegration)。
毛细管电泳十二烷基硫酸钠
毛细管电泳十二烷基硫酸钠(capillary electrophoresis sodium dodecylsulfate，CE-SDS)在LapChip GX II仪器上使用HT Protein Express Chip(PerkinElmer，#760528)和Protein Express Assay Reagent Kit(Perkin Elmer，#CLS960008)进行。根据制造商的说明，制备了试剂和芯片。样品在测定前立即用PBS稀释至0.5mg/mL。对于非还原条件，将2μL稀释样品与7μL含25mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich#A3221-10VL)的样品缓冲液混合在96孔板中；对于还原条件，将2μL稀释样品与7μL含25mMDTT的样品缓冲液混合。在热循环仪(Eppendorf Mastercycler pro)上在75℃下变性10分钟后，将35μL的水添加到每个孔中，并通过移液器混合。然后将平板以2,000g离心1分钟以去除气泡，然后置于LapChipGXII仪器中进行分析。微流成像(micro-flow imaging，MFI)
微流成像(MFI)在FlowCamPV-100仪器(Fluid Imaging Technologies)上进行。样品以0.15mL/min的速率流过，总体积为200～300μL。每个样品运行两次，并且分别对2-10μm、10-25μm和>25μm范围内的颗粒计数进行平均。
实施例28：高浓度的强制降解下抗CD137抗体在不同pH值的缓冲液中的稳定性
在具有不同pH值的三种缓冲液中评估了抗CD137抗体mAb1在高浓度和两种不同温度下的稳定性。mAb1是包含分别为SEQ ID NO:4和6的重链和轻链可变序列的抗CD137抗体。
具体地，将100mg/mL mAb1的缓冲液更换为每种以下缓冲液：(1)20mM Tris，8.5％蔗糖，pH7.5；(2)20mM组氨酸，8.5％蔗糖，0.005％EDTA，pH5.8；和(3)20mM谷氨酸，8.5％海藻糖，pH4.5。每个样品的一半在4℃下储存，另一半在25℃下储存。在第0、1、2、4和6周通过SEC、CE-SDS和cIEF分析制剂(1)-(3)各自的稳定性。
cIEF的结果表明，在高浓度下，pH5.8的组氨酸缓冲液为mAB1提供了最高的稳定性。如表3和图35所示，在25℃和pH4.5时酸性物质逐渐增加；而在pH7.5和25℃时碱性物质的增加更显著，伴随主峰的降低。当通过SEC和CE-SDS分析样品时，没有明显变化。
表3：在4℃或25℃下储存后，三种不同缓冲液中高浓度mAb1的cIEF电荷变体分析。
Figure BDA0003224144880002061
Figure BDA0003224144880002071
还在强制降解条件下在不同pH值的三种制剂中评估了mAb1的稳定性。具体地，在以下三种缓冲液中分别制备5mg/mL mAb1：(1)20mM Tris，pH7.5(2)20mM组氨酸，pH5.8(3)20mM谷氨酸，pH4.5。样品在40℃下储存长达4周，并在第0、2和4周通过SEC、CE-SDS和cIEF评估稳定性。
当mAb1经受强制降解条件时，通过cIEF分析观察到类似但更大的变化。在强制降解条件下提供最高稳定性的缓冲液是20mM组氨酸缓冲液，pH5.8。如表4和图36所示，当mAb1在20mM谷氨酸，pH4.5中孵育4周时，酸性物质增加了约30％；当mAb1在20mMTris，pH7.5中培养4周时，碱性物质增加了约30％，伴随主要峰(mainpeak)的降低。
表4：在40℃下储存后，在强制降解条件下在三种不同缓冲液中对mAB1的cIEF电荷变体分析。
Figure BDA0003224144880002072
Figure BDA0003224144880002081
实施例29：确定缓冲液pH、盐浓度、洗涤剂(detergent)和赋形剂对抗CD137抗体稳定性的影响的制剂前研究
进行了制剂前研究以评估不同缓冲液pH、盐浓度、洗涤剂和赋形剂对抗CD137抗体稳定性的影响。研究是使用亲和力成熟版本的mAb1、mAb8进行的，mAb8是用于体内研究的小鼠替代分子，因为其与小鼠CD137的亲和力和mAb1与人CD137的亲和力相似。具体地，mAb8是一种包含分别为SEQ ID NO:101和6的重链和轻链可变序列的抗CD137抗体。
分析了48种不同的mAb8制剂。每个制剂含有选自以下组的盐、缓冲剂、洗涤剂和赋形剂：
(1)盐：50mMNaCl或125mMNaCl，
(2)缓冲液：20mM乙酸盐pH5.5、20mM组氨酸pH6.0、20mM组氨酸pH6.5或20mM磷酸盐pH7.0
(3)洗涤剂：0.1％聚山梨酯80或0.1％泊洛沙姆P188
(4)赋形剂：10％蔗糖、5％山梨糖醇或7％海藻糖
将mAb8进行缓冲液交换并在100或250mMNaCl中浓缩至50mg/mL。将250μL抗体原液与50μL10x缓冲溶液、50μL10x洗涤剂溶液、125μL4x缓冲糖溶液和25μL水混合，得到总共48种制剂(2x4x2x3＝48)，每种含有0.5mL的25mg/mLmAb8，装于带橡胶塞的2mL玻璃小瓶中。
将小瓶在40℃和75％湿度的孵育箱中孵育，并在第0、3、6、10和14天取样(40μL)，用于通过SEC、CE-SDS和cIEF进行分析。
表5显示了48种不同制剂中各自的缩写命名和制剂组分的最终浓度。阅读表格的关键如下所示。例如，制剂A1(S1B1D1E1)包含(S1)50mM氯化钠，(B1)20mM乙酸盐pH5.5，(D1)0.1％聚山梨酯80和(E1)10％蔗糖。
表5：包含mAb8的制剂
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1B1D1E1 S1B1D1E2 S1B1D1E3 S1B1D2E1 S1B1D2E2 S1B1D2E3 S2B1D1E1 S2B1D1E2 S2B1D1E3 S2B1D2E1 S2B1D2E2 S2B1D2E3
B S1B2D1E1 S1B2D1E2 S1B2D1E3 S1B2D2E1 S1B2D2E2 S1B2D2E3 S2B2D1E1 S2B2D1E2 S2B2D1E3 S2B2D2E1 S2B2D2E2 S2B2D2E3
C S1B3D1E1 S1B3D1E2 S1B3D1E3 S1B3D2E1 S1B3D2E2 S1B3D2E3 S2B3D1E1 S2B3D1E2 S2B3D1E3 S2B3D2E1 S2B3D2E2 S2B3D2E3
D S1B4D1E1 S1B4D1E2 S1B4D1E3 S1B4D2E1 S1B4D2E2 S1B4D2E3 S2B4D1E1 S2B4D1E2 S2B4D1E3 S2B4D2E1 S2B4D2E2 S2B4D2E3
制剂各组分的最终浓度如下：
盐(S)
S1 50mM氯化钠
S2 125mM氯化钠
缓冲液(B)
B1 20mM乙酸盐pH 5.5
B2 20mM组氨酸pH 6.0
B3 20mM组氨酸pH 6.5
B4 20mM磷酸盐pH 7.0
洗涤剂(D)
D1 0.1％聚山梨酯80
D2 0.1％泊洛沙姆P188
赋形剂(E)
E1 10％蔗糖
E2 5％山梨糖醇
E3 7％海藻糖
48种制剂中每一种的cIEF分析结果显示在表6中。具体地，表6提供了48种制剂各自的主峰中mAb8随时间的百分比，其按第14天的主峰％从高到低排序。这些数据表明，总的来说，缓冲液2和3(组氨酸pH 6.0和6.5)中的mAB8具有最高的主峰百分比，其次是缓冲液1(乙酸盐缓冲液pH 5.5)，且最后是缓冲液4(Tris pH 7.5)。
表6：通过cIEF分析确定的48种制剂中每一种的主峰％。
Figure BDA0003224144880002101
Figure BDA0003224144880002111
还通过CE-SDS和SEC分析了48种制剂中的每一种。如表7所示，如通过CE-SDS测量，测试的任何制剂中均未观察到显著的聚集或降解。当通过SEC分析时，在不同制剂之间没有观察到显著变化(数据未显示)。
表7：通过CE-SDS分析确定48种制剂中每一种的纯度
Figure BDA0003224144880002112
Figure BDA0003224144880002121
Figure BDA0003224144880002131
总之，缓冲液的pH值对加速条件(40℃)下观察到的电荷变体的百分比影响最大。在pH6.0和pH6.5的组氨酸缓冲液中包含mAb8的制剂具有最低百分比的酸性/碱性物质。
实施例30：赋形剂对不同温度下抗CD137抗体制剂稳定性的影响
在4℃、25℃或40℃下，在100mMNaCl，0.03％聚山梨酯80，20mM组氨酸pH6.0(不含赋形剂)，10％蔗糖或5％山梨糖醇中评估mAB1的稳定性。
将mAb1(21.8mg/mL于20mM组氨酸10mM NaCl，10％蔗糖pH6.0中)从-80℃的原液中解冻。将70mL抗体溶液在三个Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(Thermo Scientific#66830，MWCO＝10kDa，15-30mL)中针对1.5L的20mM组氨酸，100mM NaCl，0.03％聚山梨酯80，pH6.0在4℃下进行渗析4小时，然后针对2.5L的新鲜缓冲液渗析过夜。第二天早上，合并渗析液，通过0.22um过滤器过滤，并添加20％聚山梨酯80原液以达到0.03％的最终浓度。
不包含赋形剂、包含10％蔗糖或5％山梨糖醇的制剂制备如下：(1)22mL抗体溶液针对1L 20mM组氨酸，100mM NaCl，0.03％聚山梨酯80，pH 6.0进行渗析；(2)将5mL 50％蔗糖添加到20mL抗体溶液中，并针对1L的20mM组氨酸，100mM NaCl，0.03％聚山梨酯80，10％蔗糖，pH6.0进行渗析；和(3)将1.79mL的70％山梨糖醇添加至23mL抗体溶液，针对1L的20mM组氨酸，100mM NaCl，0.03％聚山梨酯80，5％山梨糖醇pH 6.0进行渗析。
渗析后，通过NanoDrop2000上的A280测量抗体浓度，并使用相应的缓冲液将其调节至～10mg/mL。所有样品均通过生物安全柜中的0.22μm过滤器(EMD Millipore,#SLGV033RS；BD Luer-Lock 20mL注射器#302830)进行灭菌。将1mL过滤后的抗体溶液转移到2mL玻璃小瓶中，并用塞子和封条密封。
对于每种制剂，将4个小瓶储存在4℃(冰箱)下，并在第1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、20和24周取样；将8个小瓶储存在25℃和60％湿度下，并在第1、2、3、4、6、8、10和12周取样；将12个小瓶储存在40℃和75％湿度下，并在第1、2、3和4周取样。在每个时间点，每种制剂取一小瓶用于通过SEC、cIEF、CE-SDS和微流成像的分析。
表8：包含100mM NaCl，0.03％聚山梨酯80，20mM组氨酸，pH6.0以及不包含赋形剂、包含10％蔗糖或5％山梨糖醇的mAb1制剂的基质，并在4℃、25℃或40℃下分析。
Figure BDA0003224144880002141
如表9-11所示，糖赋形剂的类型和存在对不同储存温度下的电荷变体没有显示出显著影响。
表9：cIEF分析-酸性物质
Figure BDA0003224144880002151
表10：cIEF分析-主要物质
Figure BDA0003224144880002152
Figure BDA0003224144880002161
表11：cIEF分析-碱性物质
Figure BDA0003224144880002162
如表12所示，在全部三种mAb1制剂(无糖、10％蔗糖、5％山梨糖醇)中，在研究期间聚集未显著增加，通过尺寸排阻色谱确定。
表12：通过尺寸排阻色谱确定的单体百分比
Figure BDA0003224144880002171
使用微流成像分析以评估每种制剂中亚可见颗粒的数量。如表13-15所示，亚可见颗粒的数量随时间增加。含有10％蔗糖的mAB1制剂显示颗粒数量增加最少，尤其是在升高的条件(40℃)下。含有5％山梨糖醇的mAb1制剂显示颗粒数量增加更多。然而，5％山梨糖醇制剂比不含糖的制剂具有的颗粒少。
表13：微流成像分析-不含糖的mAb1制剂
Figure BDA0003224144880002172
Figure BDA0003224144880002181
表14：微流成像分析-含10％蔗糖的mAb1制剂
Figure BDA0003224144880002182
表15：微流成像分析-含有5％山梨糖醇的mAb1制剂
Figure BDA0003224144880002183
Figure BDA0003224144880002191
总言之，mAb1在所有三种制剂中均表现出色的稳定性。单体抗体没有显著损失或降解。在三种mAb1制剂(无赋形剂、10％蔗糖或5％山梨糖醇)每者之间，增加伴随主要电荷物质的减少的酸性和碱性物质的增加是相当的。
值得注意的是，在升高的温度(25℃和40℃)下，不含糖的mAb1制剂显示出显著高于其他两种制剂的亚可见颗粒水平。证明了在升高的温度下，包含10％蔗糖的制剂优于包含5％山梨糖醇的制剂。
实施例31：冻-融应力对抗CD137抗体制剂稳定性的影响
评估冻-融应力后mAb1的聚集，并通过尺寸排阻色谱(SEC)对其进行表征。具体地，将在100mMNaCl，0.03％聚山梨酯80、20mM组氨酸pH6.0以及不含赋形剂、含10％蔗糖或5％山梨糖醇中的mAb1在-80℃和室温之间进行多达5个循环的冻-融。然后对样品进行SEC。如表16所示，在全部三种制剂中，高分子量(HMW)％物质的增加为<0.2％。包含10％蔗糖的制剂的HMW物质增加最少，其次是5％山梨糖醇和无糖。
表16：不包含糖、包含10％蔗糖或5％山梨糖醇的mAb1制剂的SEC分析
Figure BDA0003224144880002192
Figure BDA0003224144880002201
mAb1制剂的冻-融分析也在-30℃和室温之间的温度循环下进行。具体地，将包含100mMNaCl，0.03％聚山梨酯80、20mM组氨酸pH6.0且不含赋形剂或包含10％蔗糖的mAb1制剂在-30℃和室温之间进行三个循环的冻-融。通过SEC和cIEF分析样品。
在至多三个冻-融循环后，在任一制剂中均未观察到单体百分比的显著变化(表17)。与包含10％蔗糖的制剂相比，不含糖的制剂中的mAb1在冻-融后具有的酸性物质略多(表18)。
表17：通过SEC分析对不含糖或包含10％蔗糖的mAb1制剂观察到的单体百分比
无糖 10％蔗糖
0 99.04 99.14
1 X FT 99.04 99.12
3 X FT 99.01 99.15
表18：对不含糖或包含10％蔗糖的mAb1制剂的cIEF分析
Figure BDA0003224144880002202
因此，-80℃和室温之间或-30℃和室温之间的冻-融循环没有导致mAb1制剂中聚集或电荷变体的显著增加。
实施例32：稀释对抗CD137抗体制剂稳定性的影响
许多治疗性抗体通过静脉输注施用。典型的输注液包括5％右旋糖和0.9％盐水。稀释到输注液中的抗体的稳定性不同。例如，赫赛汀(Herceptin)在稀释至5％右旋糖溶液中后即发生快速聚集(Luo et al.MAbs.2015；7(6):1094-103)。
研究了mAb1在稀释至5％右旋糖和0.9％NaCl溶液中后的稳定性。使用右旋糖(D-Glucose,Sigma-Aldrich,#G7021-1KG)在水中制备5％右旋糖溶液(w/v)，并通过0.22μm过滤器进行过滤以灭菌。通过将5％的原液稀释至水中来制备0.5％和0.1％的右旋糖溶液。使用氯化钠(JT.Baker#3627-01)在水中制备0.9％(w/v)盐溶液，并通过0.22μm过滤器进行过滤以灭菌。
将mAb1(Lot0536-07，20mM组氨酸，100mMNaCl，0.03％聚山梨酯80，pH6.0，14.5mg/mL)稀释10倍至5％、0.5％或0.1％右旋糖溶液、0.9％生理盐水或纯水中，并在测定前在室温(18-25℃)下保存3天。对于对照，在分析测定之前将抗体原液稀释10倍至20mM磷酸钠、150mM NaCl pH7.0中。
使用YMC Diol-200 8x300mm柱(目录号DL20S05-3008WT)在Agilent1200系列HPLC仪器上对每个样品进行尺寸排阻色谱(SEC)。运行缓冲液为20mM磷酸钠、400mM NaClpH7.0，流速为1mL/min，且每个样品运行时间为15分钟。如图37所示，通过SEC未检测到聚集的增加，即使在稀释至相应溶液中并培养3天后(术语右旋糖与术语葡萄糖可互换使用)。
动态光散射(dynamic light scattering，DLS)在25℃下在384孔透明底板(Corning#3540)中在Wyatt Dynapro PlateReader-II仪器上进行，样品体积为30μL。每个样品以5秒采集时间测量10次。如图38所示，通过DLS未检测到聚集的增加，除了稀释至纯水中以外。
这些数据证明，mAb1在稀释至两种常用输注液：5％右旋糖和0.9％盐水中后是稳定的。
实施例33：冻-融对抗CD137抗体制剂的亚可见颗粒形成的影响
在制造、储存、运输和施用过程中，蛋白治疗剂可能经历多个冻-融循环。这个过程可能会导致聚集物的形成，其与抗药反应和副作用有关。
研究了冻-融对新型抗CD137激动剂抗体mAb1的生物物理特性的影响。具体地，评估了亚可见颗粒的形成以及通过使溶液通过带有内置过滤器的针头来去除颗粒的有效性。
将mAb1在-30℃和室温(25±3℃)之间进行3次冻-融循环。每个循环后，通过尺寸排阻色谱、动态光散射或微流成像对样品进行表征。
分析方法
对于多次冻-融测试，将八小瓶mAb1在室温下解冻(1xFT)。一个小瓶用于SEC、DLS和微流成像分析。剩余七个小瓶在-30℃下重新冷冻过夜。在第2天，将七个小瓶在室温下解冻，一个小瓶用于SEC、DLS和MFI(2xFT)。剩余六个小瓶在-30℃下重新冷冻过夜。在第3天，将六个小瓶在室温下解冻并合并。一份用于SEC、DLS和MFI(3xFT)。将剩余的抗体溶液分成两半。将一半抗体溶液吸入5mL注射器(BD#309646)中，其中针头含有内置5μm过滤器(BD#305211)。然后，取下针头，将溶液分配到新的小瓶中(S1)。保存约750μL的此溶液用于测定，而其余的则如上所述地进行另外两次过滤(S2和S3)，每次使用新的注射器/针头。另一半抗体溶液通过相同的方法过滤，除了使用含有内置5μm过滤器的排气针(BD#305201)。所得部分标记为Sv1、Sv2和Sv3。在生物安全柜中进行过滤。所有得到的部分均通过SEC、DLS和MFI进行分析。
在Agilent 1200系列HPLC仪器上使用YMC Diol-200 8x300mm柱(目录号DL20S05-3008WT)进行尺寸排阻色谱(SEC)。运行缓冲液为20mM磷酸钠、400mM NaCl pH 7.0，流速为1mL/min，且每个样品运行时间为15分钟。
在MauriceC.仪器(ProteinSimple)上使用Maurice cIEF Cartridge(Cat.No#PS-MC02-C)进行毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing，cIEF)。最终测定组合物由0.5mg/mL抗体、4％Pharmalyte 3-10和0.35％甲基纤维素组成。使用了PI标记5.85和8.4。聚焦条件为：1500 V1分钟，然后3000V4分钟。使用垂线法用3秒曝光时间的天然荧光信号进行峰积分。
在LapChip GX II仪器上使用HT Protein Express Chip(Perkin Elmer，#760528)和Protein Express Assay Reagent Kit(Perkin Elmer，#CLS960008)进行毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)。根据制造商的说明，制备试剂和芯片。在测定前立即将样品用PBS稀释至0.5mg/mL。对于非还原条件，将2μL稀释样品与7μL含25mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich#A3221-10VL)的样品缓冲液在96孔板中混合；对于还原条件，将2μL稀释样品与7μL含25mM DTT的样品缓冲液混合。在热循环仪(Eppendorf Mastercycler pro)上在75℃下变性10分钟后，添加35μL水至每个孔中，并通过移液混合。然后将平板以2,000g离心1分钟以去除气泡，然后置于LapChipGXII仪器中进行分析。
在FlowCam PV-100仪器(Fluid Imaging Technologies)上进行微流成像(MFI)。样品以0.15mL/min的速率流动，总体积为200～300μL。每个样品运行两次，并分别对2-10μm、10-25μm和>25μm范围内的颗粒计数进行平均。
结果
经过3次冻-融循环并通过带有内置过滤器的针头后，抗体溶液中的高分子量物质百分比(HMW％)或单体百分比没有显著变化，利用SEC测量且显示在表19中。
表19：通过SEC测量的曲线下面积和单体百分比
Figure BDA0003224144880002231
Figure BDA0003224144880002241
*CV％代表一式两份注射之间主要峰面积的变化
在检测流体动力学半径为1-1000nm的少量聚集物时，DLS比SEC更灵敏。在本研究中，冻-融和通针过(needlepassage)样品通过DLS一式两份地测量。根据实施例32中描述的方法进行DLS。在大多数样品中未检测到聚集，除了两个样品可能含有亚可见颗粒，其超出了DLS的可测量范围(表20)。
表20：DLS分析
读数1(nm) 读数2(nm)
1XFT 6.7 7.4
2XFT 6.2* 5.9
3XFT 6.5 7.3
S1 7 6.6
S2 6.6 6.4
S3 6.9 6.9
Sv1 6.5 6.6
Sv2 6.5 6.4**
Sv3 6 6.9
*在读数1中发现了半径为9233nm的物质(质量百分比<10％)，但未在读数2中发现
**在读数2中发现了半径为6228nm的物质(质量百分比<5％)，但未在读数1中发现
如图39和表21所示，微流成像检测到2-80μm之间的亚可见颗粒，这是SEC和DLS难以检测到的。冻-融后，2-10μm范围内的颗粒数量增加了～10倍；较大尺寸的颗粒增加的程度较小。额外冻-融后，2-25μm颗粒数减少，而>25μm颗粒数增加。不受理论的束缚或限制，较小的颗粒有可能聚集形成较大的颗粒。
通过带有内置5μm过滤器的针头一次有效去除了大部分颗粒，尤其是>5μm的颗粒。两种类型的注射器在去除颗粒方面的性能相当。
表21：通过微流成像检测的亚可见颗粒
Figure BDA0003224144880002251
总言之，显示冻融会诱导包含mAb1的抗体溶液中亚可见颗粒数量的增加。然而，使用带有内置5μm过滤器的针头或带有内置5μm过滤器的排气针可以有效去除大部分颗粒。
表22：抗体组合表I
Figure BDA0003224144880002252
Figure BDA0003224144880002261
Figure BDA0003224144880002271
Figure BDA0003224144880002281
Figure BDA0003224144880002291
Figure BDA0003224144880002301
Figure BDA0003224144880002311
表23：抗体组合表II
Figure BDA0003224144880002321
表24：抗体组合表III
Figure BDA0003224144880002322
Figure BDA0003224144880002331
表25：序列表
Figure BDA0003224144880002332
Figure BDA0003224144880002341
Figure BDA0003224144880002351
Figure BDA0003224144880002361
Figure BDA0003224144880002371
Figure BDA0003224144880002381
Figure BDA0003224144880002391
Figure BDA0003224144880002401
Figure BDA0003224144880002411
Figure BDA0003224144880002421
Figure BDA0003224144880002431
Figure BDA0003224144880002441
Figure BDA0003224144880002451
Figure BDA0003224144880002461
Figure BDA0003224144880002471
Figure BDA0003224144880002481
Figure BDA0003224144880002491
Figure BDA0003224144880002501
Figure BDA0003224144880002511
Figure BDA0003224144880002521
Figure BDA0003224144880002531
表26：序列表II
Figure BDA0003224144880002532
Figure BDA0003224144880002541
表27：序列表III
Figure BDA0003224144880002542
Figure BDA0003224144880002551

Claims (88)

1.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和
(b)包含组氨酸的缓冲液。
2.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液；和
(c)二糖。
3.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和
(b)包含组氨酸的缓冲液；
其中所述制剂具有约5.0-7.0的pH。
4.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，和
(b)包含组氨酸的缓冲液；
其中所述制剂具有约5.0-7.4的pH。
5.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液，
(c)二糖，
(d)非离子表面活性剂，和
(e)盐，
其中所述制剂的pH为约5.0至约7.0。
6.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液，
(c)二糖，
(d)非离子表面活性剂，和
(e)盐，
其中所述制剂的pH为约5.0至约7.4。
7.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液，
(c)重量/体积为约5％至约15％的二糖，
(d)重量/体积(w/v)为约0.01％至约0.1％的非离子表面活性剂，和
(e)约50mM至200mM的盐，
其中所述制剂的pH为约5.0至约7.0。
8.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含组氨酸的缓冲液，
(c)重量/体积为约5％至约15％的二糖，
(d)重量/体积(w/v)为约0.01％至约0.1％的非离子表面活性剂，和
(e)约50mM至200mM的盐，
其中所述制剂的pH为约5.0至约7.4。
9.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，
(c)重量/体积为约5％至约15％的蔗糖，
(d)重量/体积(w/v)为约0.01％至约0.1％的聚山梨酯-80，和
(e)约50mM至200mM的NaCl，
其中所述制剂的pH为约5.0至约7.0。
10.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含约10mM至约100mM组氨酸的缓冲液，
(c)重量/体积为约5％至约15％的蔗糖，
(d)重量/体积(w/v)为约0.01％至约0.1％的聚山梨酯-80，和
(e)约50mM至200mM的NaCl，
其中所述制剂的pH为约5.0至约7.4。
11.一种制剂，包含：
(a)浓度为约1mg/ml至约100mg/ml的抗CD137抗体，其中所述抗CD137抗体包含SEQ IDNO:126的重链CDR3，其中X是任意氨基酸，
(b)包含约20mM组氨酸的缓冲液，
(c)重量/体积(w/v)为约10％的蔗糖，
(d)重量/体积(w/v)为约0.03％的聚山梨酯-80，和
(e)约100mM的NaCl，
其中所述制剂的pH为约6.0。
12.如权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含DXPFXLDXXYYYYYX(SEQ ID NO:127)的重链CDR3，其中X是任意氨基酸。
13.如权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9YYX10(SEQ ID NO:128)的重链CDR3，其中X1是任意氨基酸，其中X2是非极性氨基酸，其中X3是非极性氨基酸，其中X4是任意氨基酸，其中X5是极性氨基酸，其中X6是任意氨基酸，其中X7是任意氨基酸，其中X8是极性氨基酸，其中X9是极性氨基酸，且其中X10是任意氨基酸。
14.如权利要求13所述的制剂，其中X2是脯氨酸，X3是苯丙氨酸或色氨酸，X5是天冬氨酸或谷氨酸，X8是酪氨酸，且X9是酪氨酸。
15.如权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含SEQ ID NO:68的重链CDR3。
16.如权利要求1至15中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含SEQ ID NO:48的重链CDR1、SEQ ID NO:56的重链CDR2和SEQ ID NO:68的重链CDR3，以及SEQ ID NO:69的轻链CDR1、SEQ ID NO:78的轻链CDR2和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。
17.如权利要求1至15中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR：
(a)分别如SEQ ID NO:48、56和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)分别如SEQ ID NO:51、108和68所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQID NO:69、78和89所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)分别如SEQ ID NO:135、139和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)分别如SEQ ID NO:137、141和143所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)分别如SEQ ID NO:48、154和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(f)分别如SEQ ID NO:51、156和159所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别如SEQID NO:144、147和150所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
18.如权利要求1至16中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含分别含有与SEQID NO:4和6具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链和轻链序列。
19.如权利要求18所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含分别具有如SEQ ID NO:4和6所示的氨基酸序列的重链和轻链序列。
20.如权利要求1至15和17中任一项所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含分别含有与SEQ ID NO:101和6具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链和轻链序列。
21.如权利要求20所述的制剂，其中所述抗CD137抗体包含分别具有如SEQ ID NO:101和6所示的氨基酸序列的重链和轻链序列。
22.如权利要求1至19中任一项所述的制剂，其中所述抗体包含IgG1重链恒定区。
23.如权利要求22所述的制剂，其中所述IgGl重链恒定区是野生型人IgGl重链恒定区。
24.如权利要求22所述的制剂，其中所述IgG1重链恒定区相对于野生型人IgG1重链恒定区包含氨基酸取代。
25.如权利要求1至19中任一项所述的制剂，其中所述抗体包含IgG4重链恒定区。
26.如权利要求25所述的制剂，其中所述IgG4重链恒定区是野生型人IgG4重链恒定区。
27.如权利要求25所述的制剂，其中所述IgG4重链恒定区相对于野生型人IgG4重链恒定区包含氨基酸取代。
28.如权利要求1至27中任一项所述的制剂，包含约10mM组氨酸至约100mM组氨酸。
29.如权利要求1至28中任一项所述的制剂，包含约20mM组氨酸。
30.如权利要求1、3至4、9至10和12至28中任一项所述的制剂，进一步包含二糖。
31.如权利要求2、5至8和30中任一项所述的制剂，其中所述二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。
32.如权利要求31所述的制剂，其中所述二糖是蔗糖。
33.如权利要求2、5至6和30至32中任一项所述的制剂，其中所述二糖的重量/体积为约5％至约15％。
34.如权利要求2、5至8和30至32中任一项所述的制剂，其中所述二糖的重量/体积为约10％。
35.如权利要求1至4和12至28中任一项所述的制剂，进一步包含盐。
36.如权利要求5至8和35中任一项所述的制剂，其中所述盐是NaCl。
37.如权利要求5和35至36中任一项所述的制剂，其中所述盐的浓度为约50mM至200mM。
38.如权利要求5至10和35至36中任一项所述的制剂，其中所述盐的浓度为约100mM。
39.如权利要求1、2和12至28中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有约5.0-7.0的pH。
40.如权利要求1、2和12至28中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有约5.0-7.4的pH。
41.如权利要求3至4、7至10和39至40中任一项所述的制剂，其中所述pH为约6.0。
42.如权利要求1至4和12至41中任一项所述的制剂，进一步包含非离子表面活性剂。
43.如权利要求5至8和42中任一项所述的制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨酯。
44.如权利要求43所述的制剂，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯-80。
45.如权利要求5至6和42至43中任一项所述的制剂，其中所述非离子表面活性剂的重量/体积(w/v)为约0.01％至约0.1％。
46.如权利要求5至8和42至43中任一项所述的制剂，其中所述非离子表面活性剂的重量/体积(w/v)为约0.03％。
47.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约5mg/ml至约15mg/ml的所述抗CD137抗体。
48.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约15mg/ml至约30mg/ml的所述抗CD137抗体。
49.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约30mg/ml至约45mg/ml的所述抗CD137抗体。
50.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约45mg/ml至约60mg/ml的所述抗CD137抗体。
51.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约60mg/ml至约75mg/ml的所述抗CD137抗体。
52.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约75mg/ml至约90mg/ml的所述抗CD137抗体。
53.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约85mg/ml至约100mg/ml的所述抗CD137抗体。
54.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约5mg/ml的所述抗CD137抗体。
55.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约10mg/ml的所述抗CD137抗体。
56.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约15mg/ml的所述抗CD137抗体。
57.如权利要求1至46中任一项所述的制剂，包含浓度为约20mg/ml的所述抗CD137抗体。
58.一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的二聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
59.一种诱导或增强受试者中人CD137三聚体的多聚化的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
60.一种诱导或增强受试者中的T细胞激活的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述T细胞激活发生在肿瘤微环境中。
62.一种诱导或增强受试者中的细胞毒性T细胞应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞应答发生在肿瘤微环境中。
64.一种诱导或增强受试者中免疫细胞的细胞因子产生的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述产生的细胞因子是IL-2、TNFα、IL-13、IFN-γ或其组合。
66.如权利要求64或权利要求65所述的方法，其中所述细胞因子产生发生在肿瘤微环境中。
67.一种诱导或增强受试者中的T细胞增殖的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述T细胞增殖发生在肿瘤微环境中。
69.一种减少或抑制肿瘤生长的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
70.一种治疗受试者中由人CD137介导的病症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
71.一种治疗受试者中癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57中任一项所述的制剂。
72.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中在施用所述制剂后，免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润增加。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述免疫细胞表达CD45。
74.如权利要求69至73中任一项所述的方法，其中在施用所述制剂后，肿瘤微环境中调节性T(Treg)细胞的数量减少。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述Treg细胞表达CD4、FOXP-3和CD25。
76.如权利要求69至75中任一项所述的方法，其中在施用所述分离的单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中巨噬细胞的数量减少。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述巨噬细胞表达CD45和CD11b。
78.如权利要求69至77中任一项所述的方法，其中在施用所述分离的单克隆抗体或抗原结合部分后，肿瘤微环境中的T细胞耗竭减少，任选地，其中T细胞耗竭减少包括TIGIT、PD-1、LAG-3或其组合的表达降低。
79.如权利要求71至78中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、血液癌症和头颈癌。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述血液癌症是B细胞淋巴瘤。
81.一种诱导抗肿瘤记忆免疫应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至57所述的制剂。
82.如权利要求58至81中任一项所述的方法，其中所述抗CD137抗体结合Fcγ受体。
83.如权利要求58至82中任一项所述的方法，其中CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞或其组合的消减降低了所述制剂的功效。
84.一种包含含有权利要求1至57中任一项所述制剂的容器和含有施用所述制剂的说明的包装插页的试剂盒，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
85.一种包含含有权利要求1至57中任一项所述制剂的容器和含有单独施用所述制剂或将其与另一种药剂组合施用的说明的包装插页的试剂盒，用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或用于减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长。
86.如权利要求1至57中任一项所述的制剂在制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物中的用途。
87.如权利要求1至57中任一项所述的制剂，用于制备用于治疗或延缓有此需要的受试者中的癌症发展，或减少或抑制有此需要的受试者中的肿瘤生长的药物。
88.如权利要求1至57中任一项所述的制剂，用作药物。
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