WO2019221280A1 - 免疫チェックポイント阻害剤 - Google Patents

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WO2019221280A1
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antibody
cancer
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克明 佐藤
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国立大学法人宮崎大学
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Definitions

  • the present invention relates to an immune checkpoint inhibitor.
  • Non-patent Document 1 An immunotherapy using an inhibitory antibody against these “immune checkpoint molecules” has been attempted (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 An immunotherapy using an inhibitory antibody against these “immune checkpoint molecules” has been attempted (Non-patent Document 1).
  • CTLA-4 / PD-1 system expressed on T cells results in adverse events such as autoimmune-like pathologies that occur due to the activation of immune responses against self as well as cancer.
  • immune checkpoint inhibitors are also required to overcome cancer unresponsiveness and reduce immune-related adverse events (irAEs) resulting from the failure of autoimmune tolerance.
  • Dendritic cells are dendritic cell-negative and major histocompatibility complex class II antigen-presenting cells, which have the same characteristics as conventional dendritic cells (conventional cells and cDCs). It consists of subpopulations that are roughly divided into cell-like dendritic cells (plasmacytoid DCs; spDCs).
  • Dendritic cells activate the immune system through induction of antigen-specific effector T cells as the most powerful antigen-presenting cells linking innate and adaptive immunity in the inflammatory state, and removal of antigen-specific clones and unresponsiveness in the steady state It plays an important role in maintaining immunological homeostasis as a regulatory cell that induces immune tolerance through the generation and amplification of regulatory T (regulatoryulatorT; Treg) cells that have sex induction and immunosuppressive ability.
  • regulatory T regulatory T
  • Non-patent Documents 2 and 3 have succeeded in producing immunosuppressive dendritic cells having a remarkable T cell control function even in an inflammatory state under specific culture conditions in humans and mice.
  • Non-Patent Document 4 It has also been found that in Clec4A4-deficient mice, autoimmune diseases are accelerated by excessive amplification and activation of self-reactive T cells, and the autoimmune pathology worsens.
  • An object of the present invention is to provide an immune checkpoint inhibitor based on a new mechanism.
  • CLEC4A protein is expressed on antigen-presenting cells such as dendritic cells and functions as an immune checkpoint molecule, and a CLEC4A function inhibitor was found to bring about immune checkpoint inhibition against antigen-presenting cells, and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following.
  • An immune checkpoint inhibitor comprising a CLEC4A function inhibitor.
  • the CLEC4A function inhibitor is a CLEC4A function inhibitory antibody or a CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody is an antibody that binds to the extracellular region of the CLEC4A protein.
  • the immune checkpoint inhibitor according to [2] or [3] above, wherein the CLEC4A function-inhibiting antibody binds to a region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or a partial sequence thereof.
  • Antigen-presenting cells that express the CLEC4A protein on the cell surface are treated with a test substance in vitro, the amount of cytokine production from the antigen-presenting cells is measured, and from antigen-presenting cells that are not treated with the test substance Screening for a substance having an immune checkpoint inhibitory action, comprising determining that the test substance has an immune checkpoint inhibitory action when an increase in the amount of inflammatory cytokine production is shown in comparison with the cytokine production quantity Method.
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells can cause immune checkpoint inhibition, and can activate an antitumor immune response that is reduced by the action of the immune checkpoint molecule CLEC4A.
  • FIG. 1 shows OVA-specific T cells (CD44 high OVA-MHC class I pentamer-binding CD8 in WT mice and cancer-inoculated WT mice and Clec4A4-deficient mice (non-cancer-bearing and cancer-bearing mice). (+ T cell) induction is shown by flow cytometry analysis results.
  • a dot plot displays the OVA-MHC class I pentamer CD44, X axis to the Y axis, B denotes the percentage (%) of CD44 high OVA-MHC class I pentamer binding CD8 + T cells in CD8 + T cells .
  • FIG. 2 shows OVA-specific T cells (OVA-specific IFN- ⁇ producing CD8 + T) in WT mice and cancer-vaccinated WT mice and Clec4A4-deficient mice (non-cancer-bearing and cancer-bearing mice). The analysis result by the flow cytometry method about the induction of (cell) is shown.
  • A represents CD8a
  • dot plot displays the IFN-gamma in the X axis
  • B is the percentage of OVA specific IFN-gamma-producing CD8 + T cells in CD8 + T cells (%) in the Y-axis.
  • * P ⁇ 0.01 (comparison with WT mice or comparison between non-cancer-bearing group and cancer-bearing group in WT mice and Clec4A4-deficient mice).
  • FIG. 3 shows the evaluation results of cancer progression in cancer-bearing WT mice and Clec4A4-deficient mice with or without cancer vaccine.
  • A shows a photograph of a tumor-bearing mouse 18 days after cancer cell transplantation and a tumor volume value (mm 3 ).
  • FIG. 4 shows the control function of Clec4A4 on immune cell dynamics. Immune cell dynamics in spleen (A) and cancer tissue (B) of non-cancer-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 - / - ) The eyes were evaluated.
  • the ratio of each immune cell in spleen cells was analyzed by flow cytometry (A).
  • the ratio of each immune cell in the tumor infiltrating leukocytes was analyzed by flow cytometry (B).
  • the expression of each cell surface molecule is shown as a dot plot.
  • the leftmost column is CD11c (X axis) and SiglecH (Y axis)
  • the second column from the left is B220 (X axis) and Gr-1 (Y axis)
  • the center column is F4 / 80 (X Axis) and CD11b (Y axis)
  • the second column from the right shows the expression of NK1.1 (X axis) and CD3 (Y axis)
  • the rightmost column shows the expression of CD8 (X axis) and CD4 (Y axis) Yes.
  • FIG. 5 shows the regulatory function of Clec4A4 on lymphoid tissue T cell activation.
  • T cell dynamics in the spleen of non-cancer-bearing or tumor-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 ⁇ / ⁇ ) were evaluated 20 days after cancer cell transplantation.
  • Expression of each cell surface molecule of splenic CD4 + T cells (A) and splenic CD8 + T cells (B) was analyzed by flow cytometry. The expression of each cell surface molecule is shown as a histogram. In A and B, the left column shows the expression of CD44, and the right column shows the expression of CD62L.
  • FIG. 6 shows the regulatory function of Clec4A4 on tumor infiltrating T cell activation.
  • T cell dynamics in cancer tissues of tumor-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 ⁇ / ⁇ ) were evaluated on the 20th day after cancer cell transplantation.
  • Expression of each cell surface molecule of tumor infiltrating CD4 + T cells (A) and tumor infiltrating CD8 + T cells (B) was analyzed by flow cytometry. The expression of each cell surface molecule is shown as a histogram. In A and B, the left column shows the expression of CD44, and the right column shows the expression of CD62L.
  • FIG. 7 shows the regulatory function of Clec4A4 on splenic dendritic cell activation.
  • Dendritic cell dynamics in the spleen of non-cancer-bearing or tumor-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 ⁇ / ⁇ ) were evaluated on the 20th day after cancer cell transplantation.
  • Expression of each cell surface molecule of spleen dendritic cells was analyzed by flow cytometry. The expression of each cell surface molecule is shown as a histogram. In A, the leftmost column shows the expression of MHC-I, the second column from the left is MHC-II, the middle column is CD40, the second column from the right is CD80, and the rightmost column shows the expression of CD86.
  • FIG. 8 shows the regulatory function of Clec4A4 on tumor infiltrating dendritic cell activation.
  • Dendritic cell dynamics in cancer tissues of tumor-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 ⁇ / ⁇ ) were evaluated on the 20th day after cancer cell transplantation. Expression of each cell surface molecule of tumor infiltrating dendritic cells was analyzed by flow cytometry.
  • each cell surface molecule is shown as a histogram.
  • the leftmost column shows the expression of MHC-I
  • the second column from the left is MHC-II
  • the middle column is CD40
  • the second column from the right is CD80
  • the rightmost column shows the expression of CD86.
  • the leftmost column shows CD11c
  • the second column from the left is Clec4A4
  • the middle column is B7-H1
  • the second column from the right is B7-H2
  • the rightmost column shows the expression of B7-DC.
  • FIG. 9 is a diagram showing the expression state of CLEC4A in healthy human peripheral blood-derived immune cells.
  • A shows the expression of cell surface molecule CLEC4A in CD3 + T cells, CD19 + B cells, CD11c + dendritic cells, CD14 + monocytes and CD56 + NK cells in the peripheral blood mononuclear cell fraction as a histogram.
  • B shows the expression of cell surface molecules CD141, CD1c, CD303, CD11c, HLA-DR, and CLEC4A in the peripheral blood mononuclear cell fraction as a histogram.
  • C shows the expression of cell surface molecules CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR, and CLEC4A in peripheral blood monocytes, peripheral blood monocyte-derived dendritic cells, and peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells. Shown in histogram.
  • FIG. 10 is a dot plot showing the expression of GFP and CLEC4A in the transgenic cell line.
  • A is a mouse dendritic cell line DC2.4 (DC2.4 in the figure), a control retrovirus-infected cell line (mock-GFP in the figure), and a CLEC4A-expressing cell line (CLEC4A-GFP in the figure).
  • the expression of GFP (X axis) and CLEC4A (Y axis) is shown.
  • FIG. 11 shows the cytokine-producing ability in the transgenic cell line.
  • A shows the amount of IL-6 production in the culture supernatant in LPS-stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • B shows the amount of TNF- ⁇ produced in the culture supernatant in LPS-stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • C shows the amount of IL-6 production in the culture supernatant in CECG-B ODN 1668 stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • D shows the amount of TNF- ⁇ produced in the culture supernatant in CECG-B ODN 1668 stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • FIG. 12 shows the reactivity of the culture supernatant of the hybridoma clone to the CLEC4A-expressing cell line.
  • A is a dot plot showing an example of expression of GFP (X axis) and CLEC4A (Y axis) in cells that showed reactivity with a control mouse IgG antibody or anti-CLEC4A antibody (clone 9E8).
  • FIG. 13 shows the control function of the CLEC4A function-inhibiting antibody to the CLEC4A function.
  • A shows stimulation of peripheral blood monocyte-derived dendritic cells with LPS in the presence or absence of control mouse IgG antibody (cont. Ig) or anti-CLEC4A antibody, and then measured IL-6 production by ELISA. Results are shown. “None” in the figure indicates a sample that was not stimulated with LPS in the absence of control mouse IgG antibody and anti-CLEC4A antibody. “LPS” in the figure indicates a sample stimulated with LPS in the absence of control mouse IgG antibody and anti-CLEC4A antibody. “Cont. Ig” in the figure indicates a sample stimulated with LPS in the presence of a control mouse IgG antibody. LPS stimulation was performed in the presence of anti-CLEC4A antibody.
  • the black horizontal line in the figure shows the IL-6 production value when stimulated with LPS in the presence of a control mouse IgG antibody (cont. Ig).
  • B is a soluble type after reacting a CLEC4A-expressing dendritic cell line DC2.4 with a soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule in the presence or absence of a control mouse IgG antibody or mouse anti-CLEC4A antibody.
  • the results of analyzing the binding inhibition rate by flow cytometry using the binding of CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule to CLEC4A-expressing mouse dendritic cell line DC2.4 as an index are shown.
  • the black horizontal line in the figure indicates 80% binding inhibition.
  • A shows NFAT-GFP reporter mouse T cell line derived from 2B4 strain (control T cell line) and CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing NFAT-GFP reporter mouse T cell line in the absence of control mouse IgG antibody and mouse anti-human CLEC4A antibody.
  • the result of having analyzed the expression of CLEC4A and GFP in a flow cytometry method is shown.
  • the expression of CLEC4A (Y axis) and GFP (X axis) is shown as a dot plot.
  • FIG. 15 shows a control function for cancer progression of a CLEC4A function-inhibiting antibody. After culturing human peripheral blood mononuclear cells (HLA-A2 positive) with MART-1 peptide in the presence or absence of control mouse IgG antibody (cont.
  • FIG. 16 shows the regulatory function of CLEC4A function-inhibiting antibody on cancer progression.
  • FIG. 17 shows human peripheral blood mononuclear cells, control mouse IgG antibody (cont.
  • Non-treated indicates non-cancer-bearing NOJ mice.
  • the present invention is based on the function of CLEC4A as an immune checkpoint molecule. More specifically, the present invention relates to an immune checkpoint inhibitor comprising a CLEC4A function inhibitor. The present invention also relates to a pharmaceutical composition for activation of an anti-tumor immune response based on immune checkpoint inhibition comprising such an immune checkpoint inhibitor.
  • CLEC4A is a protein referred to as C type (calcium-dependent) lectin domain family 4 member A (C-type Lectin Domain Family 4 Member A).
  • CLEC4A is an immune checkpoint molecule expressed in antigen-presenting cells such as dendritic cells, and controls the function of antigen-presenting cells.
  • the “CLEC4A function inhibitor” is any substance having an action (antagonism) of inhibiting the function of the CLEC4A protein or the CLEC4A gene.
  • the CLEC4A function inhibitory substance may be, for example, a CLEC4A function inhibitory antibody, a CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid, or the like, but is not limited thereto.
  • the “CLEC4A function-inhibiting antibody” refers to an anti-CLEC4A antibody having an action (antagonism) that inhibits the function of the CLEC4A protein.
  • “CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid” refers to a nucleic acid containing an expression-inhibiting sequence for the CLEC4A gene and capable of suppressing the expression of the CLEC4A gene.
  • the CLEC4A function inhibitor inhibits the function of CLEC4A as an immune checkpoint molecule.
  • the CLEC4A function inhibitor binds to CLEC4A protein or CLEC4A nucleic acid (CLEC4A gene on the genome, mRNA of CLEC4A gene, etc.), preferably specifically binds to inhibit its function.
  • a CLEC4A function inhibitor can bind to and inhibit the function of an endogenous CLEC4A protein of a target organism to which it is administered.
  • a CLEC4A function inhibitor can bind to and inhibit the expression of an endogenous CLEC4A gene mRNA of a subject organism to which it is administered.
  • a CLEC4A function inhibitor such as a CLEC4A function inhibitory antibody
  • a CLEC4A function inhibitory antibody was expressed on the cell surface of antigen presenting cells such as dendritic cells, B cells (CD19 + B cells), monocytes (CD14 + monocytes), etc. It can bind to CLEC4A protein and inhibit the function of CLEC4A protein as an immune checkpoint molecule.
  • the CLEC4A function inhibitor for example, a CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid is an antigen-presenting cell such as a dendritic cell, B cell (CD19 + B cell), monocyte (CD14 + monocyte) or a precursor thereof. In cells, it can bind to CLEC4A gene on the genome or mRNA of CLEC4A gene to suppress the expression of CLEC4A gene.
  • CLEC4A that is a target of CLEC4A function inhibitory substance is preferably derived from mammals, for example, primates such as humans, chimpanzees, gorillas, rodents such as mice, rats, guinea pigs, cows, horses, pigs, sheep May be derived from mammals such as goats, llamas, camels, dogs, cats and rabbits.
  • CLEC4A that is a target of a CLEC4A function inhibitor may be a human CLEC4A, or a homologue (eg, orthologue) such as a mouse homologue (eg, orthologue Clec4A4).
  • the CLEC4A targeted for the CLEC4A function inhibitor is human CLEC4A.
  • the CLEC4A function inhibitor (eg, CLEC4A function inhibitory antibody) may specifically bind to the extracellular region of the CLEC4A protein.
  • the CLEC4A function inhibitor is a sequence comprising a carbohydrate-recognition domain (CRD) in the extracellular region of the CLEC4A protein (eg, 6 amino acids or longer, typically 6-20 amino acids).
  • CCD carbohydrate-recognition domain
  • the CLEC4A protein may be a human CLEC4A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functional variant thereof, or a homologue (preferably an ortholog) thereof.
  • the CLEC4A protein is 70% or more, preferably 80% or more, for example 90% or more, 93% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence.
  • it may comprise an amino acid sequence having a sequence identity of 99.5% or more, and preferably retains an immune checkpoint function (function as an immune checkpoint molecule on antigen-presenting cells such as dendritic cells). .
  • the extracellular region of CLEC4A protein refers to a region from position 69 to position 237 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 12), or a region aligned with that region in the amino acid sequences of other CLEC4A proteins.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may bind to the amino acid sequence (extracellular region) represented by SEQ ID NO: 12 or a partial sequence thereof, for example, a region consisting of a partial sequence of 6 amino acids or more in the CLEC4A protein.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody comprises 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 41-50, 42-50, 51 of SEQ ID NO: 12 in the CLEC4A protein.
  • CLEC4A function inhibitors may also bind to such regions in the CLEC4A protein.
  • the sugar chain recognition domain (CRD) in the extracellular region of CLEC4A protein is the region from position 195 to position 197 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (human CLEC4A), or the region in the amino acid sequence of other CLEC4A protein Refers to the area to be aligned.
  • the ITIM sequence in the intracellular region of the CLEC4A protein refers to the region from the 5th position to the 10th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the region aligned with that region in the amino acid sequence of other CLEC4A proteins.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be any class of immunoglobulin molecule, such as IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, or IgY, and any subclass such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc. It may be.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be in any antibody form, for example, multispecific antibody (such as bispecific antibody), humanized antibody, chimeric antibody, single chain antibody, minibody, diabody, triabody Etc.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be a whole antibody or an antigen-binding fragment of an antibody, such as Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv, sdFv and the like.
  • a CLEC4A function inhibitory substance for example, a CLEC4A function inhibitory antibody, may be subjected to any modification such as glycosylation, acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, or PEGylation.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may be any form of nucleic acid containing an expression-suppressing sequence for the CLEC4A gene, and may be a single-stranded nucleic acid molecule or a double-stranded nucleic acid molecule.
  • the expression suppression sequence for the CLEC4A gene is typically an antisense sequence of a target region of the CLEC4A gene (for example, a target region in the mRNA of the CLEC4A gene), or an antisense sequence and a sense sequence.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may be RNA, DNA, peptide nucleic acid (PNA; Peptide Nucleic Acid), locked nucleic acid (LNA; Locked Nucleic Acid), morpholino nucleic acid, or the like.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may be siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), hpRNA (hairpin RNA), or a longer nucleic acid comprising the same.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid is an siRNA that targets the CLEC4A gene.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may be a precursor nucleic acid that generates siRNA targeting the CLEC4A gene in the body.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may have a modified base. Such modifications include, but are not limited to, fluorescent dye labels, methylation, halogenation, deamination, thiolation, dihydrolation, amination, pseudouridine formation, and the like.
  • the suppression of CLEC4A gene expression by the nucleic acid that suppresses CLEC4A gene expression in the present invention may be due to RNA interference, but is not limited thereto.
  • RNA interference is typically a short double stranded RNA (dsRNA), typically as short as 21-23 base pairs (bp), with an overhang at the 3 'end due to intracellular Dicer.
  • dsRNA double stranded RNA
  • bp base pairs
  • Cleavage into RNA (siRNA) one single-stranded RNA binds to the target mRNA and causes degradation of the target mRNA, thereby suppressing the translation of the target mRNA, thereby suppressing the expression of the target gene from which the target mRNA is derived It is a phenomenon.
  • the expression suppression sequence is 19-30 bases in length, for example, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 bases in length. .
  • the sense strand and the antisense strand are 21 to 34 bases long, 21 to 25 bases long, or 21 to 23 bases long, for example 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, or 34 bases in length.
  • the sense strand and the antisense strand of siRNA may be the same length or different lengths.
  • siRNA usually has an overhang of about 1 to 5 bases (typically 2 bases) at the 3 ′ end.
  • the CLEC4A function inhibitor can be prepared by a conventional method.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can be produced based on a known antibody production method. For example, first, an antigen containing a sequence to be bound by an antibody (target sequence in CLEC4A) or an antigen comprising the sequence (for example, a partial sequence containing the target sequence of CLEC4A, and another protein such as an immunoglobulin Fc molecule)
  • the fusion protein) or cells expressing the antigen thereof on the cell surface are administered to the animal subcutaneously, toe, intraperitoneally, etc. for immunization.
  • the antigen is preferably administered with any adjuvant.
  • the administration of the antigen may be performed once, but is preferably performed a plurality of times (for example, 2 to 5 times).
  • immune cells for example, lymph node cells or spleen cells
  • known parental cells for example, myeloma cells
  • the parent cell of the fusion partner is preferably derived from the same species as the immune cell. Examples of mouse-derived myeloma cells used as parent cells for fusion include P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653), P3x63Ag8U.1, NS-1, and MPC-11. Not.
  • Cell fusion between immune cells and parent cells can be performed according to, for example, the method of Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Specifically, such cell fusion is performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG) (for example, PEG 4000) having an average molecular weight of about 1000 to 6000, Sendai virus (HVJ), or the like can be used.
  • An auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be further used to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of use of immune cells and parent cells can be arbitrarily set.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can be prepared by recovering the antibody from the culture supernatant obtained by culturing the hybridoma.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody is a polyclonal antibody
  • it can be obtained by collecting serum from the immunized animal as described above.
  • a human antibody-producing animal can be used as the animal to be immunized.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can also be produced as a recombinant antibody by cloning an antibody gene, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique. .
  • the variable region (V region) cDNA of an antibody is linked to the DNA encoding the antibody constant region (C region) and incorporated under the control of an expression control region of an expression vector, such as an enhancer or promoter
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can be produced as a recombinant antibody by introducing an expression vector into a host cell, transforming it, and producing the antibody by the host cell.
  • CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid can be prepared based on a known nucleic acid synthesis method. For example, nucleic acid synthesis can be performed from the 3 ′ side to the 5 ′ side of the sequence designed using an automatic nucleic acid synthesizer by the phosphoramidite method.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may also be prepared by dividing and synthesizing a plurality of short nucleic acid fragments and ligating them by annealing or ligation.
  • the CLEC4A gene expression-suppressing nucleic acid may be synthesized using a PCR method using the CLEC4A gene as a template.
  • the antibodies, nucleic acids and the like obtained as described above can be isolated and purified by a known purification method and recovered.
  • Purification methods include affinity purification methods, reversed-phase chromatography, reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), chromatography methods such as ion exchange chromatography, gel filtration, column purification, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) Etc., or any combination thereof, but is not limited thereto.
  • the CLEC4A function inhibitor described above can cause immune checkpoint inhibition.
  • CLEC4A function inhibitors cause immune checkpoint inhibition in antigen-presenting cells by inhibiting CLEC4A function, release the suppression of anti-tumor immune response (cancer immune response) contributed by immune checkpoint molecules, and activate anti-tumor immune response And can enhance an effective anti-tumor immune response (cancer immune response).
  • the antigen-presenting cells that cause immune checkpoint inhibition are antigen-presenting cells that express the CLEC4A protein on the cell surface. Examples of such antigen-presenting cells include dendritic cells, B cells (for example, CD19). + B cells), monocytes (eg, CD14 + monocytes) and the like, but are not limited thereto.
  • the antigen-presenting cell is a cell that activates T cells by presenting the antigen on the cell surface. Therefore, the CLEC4A function inhibitor according to the present invention is an immune checkpoint inhibitor, preferably for antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (for example, CD19 + B cells), monocytes (for example, CD14 + monocytes). It can be used as an immune checkpoint inhibitor.
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (for example, CD19 + B cells), monocytes (for example, CD14 + monocytes). It can be used as an immune checkpoint inhibitor.
  • the cancer targeted for activation of the anti-tumor immune response based on immune checkpoint inhibition may be any type of cancer.
  • the immune checkpoint inhibitor according to the present invention may contain a CLEC4A function inhibitory substance as an active ingredient.
  • the immune checkpoint inhibitor according to the present invention can contain a therapeutically effective amount of a CLEC4A function inhibitor.
  • the immunological checkpoint inhibitory activity (immunological checkpoint inhibitory activity) and the antitumor immune response activating ability of the CLEC4A function inhibitory substance in the present invention are the antigen-presenting cells treated with the CLEC4A functional inhibitory substance, such as dendritic cells. Increased production of inflammatory cytokines (eg, IL-6, TNF- ⁇ , IL-12p40, etc.) (preferably statistically significantly increased) compared to when not treated with a function inhibitor. Can be evaluated using as an index.
  • inflammatory cytokines eg, IL-6, TNF- ⁇ , IL-12p40, etc.
  • the immune checkpoint inhibitory action of a CLEC4A function inhibitory substance and the evaluation of the ability to activate an anti-tumor immune response are performed by evaluating antigen-presenting cells, preferably dendritic cells, TLR ligands such as TLR4 ligand and TLR9 ligand, For example, in the presence of LPS or CpG-B ODN 1668, etc., by adding a CLEC4A function inhibitor and culturing, measuring the amount of cytokine in the culture, and comparing with a control not treated with the CLEC4A function inhibitor It can be carried out.
  • antigen-presenting cells preferably dendritic cells, TLR ligands such as TLR4 ligand and TLR9 ligand
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing a CLEC4A function inhibitor or an immune checkpoint inhibitor comprising the same.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for activation of an anti-tumor immune response (or induction of an anti-tumor immune response) based on immune checkpoint inhibition, comprising a CLEC4A function inhibitor or an immune checkpoint inhibitor comprising the same ( Or pharmaceutical).
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition (or medicament) for treatment or prevention of cancer (for example, prevention of recurrence of cancer) containing a CLEC4A function inhibitor or an immune checkpoint inhibitor containing the same.
  • These pharmaceutical compositions (or pharmaceuticals) are used to treat or prevent cancer based on immune checkpoint inhibition against antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (CD19 + B cells), and monocytes (CD14 + monocytes). Useful for.
  • Cancers or tumors to be treated or prevented in the present invention are not limited to the following, but include malignant melanoma, lung cancer, renal cell cancer, head and neck cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, liver Cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, colon cancer, urothelial cancer, glioblastoma, multiple myeloma, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, breast cancer, malignant pleural mesothelioma Tumor, soft tissue sarcoma, lymphoma (Hodgkin lymphoma, central nervous system primary lymphoma, testicular primary lymphoma, etc.), virus positive or negative solid cancer, Merkel cell carcinoma and the like.
  • malignant melanoma lung cancer, renal cell cancer, head and neck cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, liver Cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, colon cancer, urothelial cancer, glioblastom
  • the immune checkpoint inhibitor according to the present invention or a pharmaceutical composition (or drug) containing the immune checkpoint inhibitor may contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • additives include, but are not limited to, carriers, suspending agents, binders, excipients, lubricants, disintegrants, wetting agents, stabilizers, buffers, preservatives, colorants, pH. Examples include regulators.
  • the additives can be used singly or in combination of two or more, and can be appropriately used depending on the dosage form of the preparation.
  • the CLEC4A function inhibitor, immune checkpoint inhibitor, or pharmaceutical composition containing the same according to the present invention can be administered by any route such as parenteral or oral administration. Administration can be intravenous, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, transdermal, nasal, transpulmonary, or intratumor.
  • Administration can be intravenous, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, transdermal, nasal, transpulmonary, or intratumor.
  • the CLEC4A function inhibitor, immune checkpoint inhibitor, or pharmaceutical composition containing the same according to the present invention may be administered systemically or locally.
  • the present invention also provides an immune checkpoint inhibition method comprising administering the above-mentioned CLEC4A function inhibitor, immune checkpoint inhibitor, or a pharmaceutical composition comprising the same to a subject (patient).
  • the present invention also provides an activity of an anti-tumor immune response based on immune checkpoint inhibition, comprising administering the above-mentioned CLEC4A function inhibitor, immune checkpoint inhibitor, or a pharmaceutical composition comprising the same to a subject (patient)
  • Also provided is a method of activating (or inducing an anti-tumor immune response).
  • the present invention also provides a method for treating or preventing cancer based on immune checkpoint inhibition, comprising administering to the subject the above-mentioned CLEC4A function inhibitor, immune checkpoint inhibitor, or a pharmaceutical composition containing the same.
  • the cancer prevention method may be a cancer recurrence prevention method.
  • immune checkpoint inhibition is preferably directed against antigen presenting cells expressing the CLEC4A protein on the cell surface, such as dendritic cells, B cells (eg, CD19 + B cells), It is preferable for monocytes (for example, CD14 + monocytes).
  • the subject of administration is preferably a mammal, for example, primates such as humans, chimpanzees, gorillas, rodents such as mice, rats, guinea pigs, cows, horses, pigs, sheep, goats, llamas, camels, dogs , Cats, rabbits and other mammals.
  • the subject may be a subject that has or is suspected of having immunosuppression caused by an immune checkpoint molecule.
  • the subject may typically be a subject who has cancer or is suspected of having cancer.
  • the subject may be a subject that is refractory to cancer immunotherapy or has decreased responsiveness to cancer immunotherapy.
  • Such refractory or responsiveness to cancer immunotherapy is an immune checkpoint, especially dendritic cells, B cells (eg CD19 + B cells), monocytes (eg CD14 + monocytes) And so on caused by immune checkpoints in antigen presenting cells.
  • the subject may also be a patient suffering from a cancer that is refractory or resistant to inhibitors against immune checkpoint molecules (CTLA-4, PD-1, PD-L1, etc.) expressed on T cells.
  • CTL-4, PD-1, PD-L1, etc. immune checkpoint molecules
  • the administration method can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the age, weight, sex, symptoms, etc. of the subject (patient).
  • the dose of the CLEC4A function inhibitor for example, the dose can be set in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight and / or in the range of 0.001 mg to 100,000 mg per subject. It is not limited to the range.
  • the CLEC4A function-inhibiting substance, immune checkpoint inhibitor, or pharmaceutical composition comprising the same of the present invention comprises (i) induction of bone marrow-derived suppressor cells and / or in lymphoid tissue and / or cancer tissue.
  • the CLEC4A function-inhibiting substance, immune checkpoint inhibitor, or pharmaceutical composition comprising the same of the present invention is used for immune-related adverse events (for example, autoimmune pathologies such as autoimmune diseases or disorders, weight loss, etc.), particularly T cells High anti-tumor effects can be achieved while reducing the risk of immune related adverse events resulting from inhibition of immune checkpoint molecules expressed in
  • a method for activating an anti-tumor immune response comprising administration of the above-mentioned CLEC4A function inhibitor, immune checkpoint inhibitor, or a pharmaceutical composition containing the same, It may be used in combination with vaccine therapy.
  • cancer vaccine therapy used in combination include a combination of a cancer antigen (eg, ovalbumin) and an agonist TLR ligand, or a combination of a cancer antigen (eg, ovalbumin), an agonist TLR ligand and an agonist anti-CD40 antibody.
  • the method of administering to a patient is mentioned.
  • Agonist TLR ligands include agonist ligands such as TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and / or 13 Examples thereof include agonist TLR9 ligands that are unmethylated CpG dinucleotide motif-containing oligonucleotides such as CpG ODN 2006 and CpG-B ODN 1668.
  • Agonist TLR ligands suitable for administration to a human subject can be agonist ligands for human TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the present invention relates to the above-mentioned CLEC4A function inhibitor or immune checkpoint inhibitor using antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (for example, CD19 + B cells), monocytes (for example, CD14 + monocytes).
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (for example, CD19 + B cells), monocytes (for example, CD14 + monocytes).
  • B cells for example, CD19 + B cells
  • monocytes for example, CD14 + monocytes.
  • the present invention also relates to a screening method for a substance having an immune checkpoint inhibitory action utilizing the function of CLEC4A as an immune checkpoint molecule.
  • the present invention has an immune checkpoint inhibitory action including, for example, treating an antigen-presenting cell expressing CLEC4A protein on the cell surface in vitro with a test substance and evaluating the amount of cytokine production from the antigen-presenting cell.
  • the present invention relates to a screening method for substances. Specifically, in the present invention, for example, antigen-presenting cells that express the CLEC4A protein on the cell surface are treated with a test substance in vitro, the amount of cytokine production from the antigen-presenting cells is measured, and the test substance is treated.
  • Comparison with cytokine production from non-antigen presenting cells (antigen presenting cells of the same type as those treated with the test substance and expressing CLEC4A protein on the cell surface; control), preferably inflammatory
  • a screening method for a substance having an immune checkpoint inhibitory action comprising determining that the test substance has an immune checkpoint inhibitory action when an increase in cytokine production is indicated.
  • This screening method can be basically performed in the same manner as the evaluation method of the immune checkpoint inhibitory action of the above-mentioned CLEC4A function inhibitory substance.
  • antigen presenting cells that express the CLEC4A protein on the cell surface such as dendritic cells (eg, peripheral blood monocyte-derived dendritic cells, and dendritic cell line DC2.4), B cells (eg, CD19 + B cells), monocytes (eg CD14 + monocytes), etc.
  • dendritic cells eg, peripheral blood monocyte-derived dendritic cells, and dendritic cell line DC2.4
  • B cells eg, CD19 + B cells
  • monocytes eg CD14 + monocytes
  • TLR ligands such as TLR4 ligand and TLR9 ligand, eg LPS or CpG-B ODN 1668
  • Culture medium measure the amount of cytokine (preferably inflammatory cytokine) in the culture medium, and measure the control antigen-presenting cells cultured in the same manner except that they are not treated with the test substance (for example, culture medium) It may be compared with the amount of cytokine in the supernatant.
  • Inflammatory cytokines include IL-6, TNF- ⁇ , IL-12p40 and the like. Cytokine amounts can be measured by a conventional method, for example, using an ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method, a CBA (Cytometric Bead Array) method, or the like.
  • the increase in inflammatory cytokine production compared to the control is preferably a statistically significant increase.
  • the test substance to be subjected to this screening method may be any substance, for example, a protein (such as an antibody) or a nucleic acid (such as siRNA).
  • the test substance may target CLEC4A protein or CLEC4A gene.
  • “Targeting a CLEC4A protein or CLEC4A gene” means binding to a CLEC4A protein, or binding to, or expected to bind to, CLEC4A gene or CLEC4A gene mRNA on the genome.
  • Antigen presenting cells used for screening may be, for example, antigen presenting cells (dendritic cells, B cells, monocytes, etc.) derived from a peripheral blood mononuclear cell fraction.
  • An example of a dendritic cell is the mouse DC2.4 strain.
  • the antigen-presenting cell that expresses the CLEC4A protein on the cell surface may be a transgenic cell produced by introducing the CLEC4A gene into the antigen-presenting cell.
  • CLEC4A gene into antigen-presenting cells can be performed by a conventional method, for example, using a recombinant expression vector (for example, a viral vector such as a retrovirus vector) that expresses the CLEC4A gene.
  • a recombinant expression vector for example, a viral vector such as a retrovirus vector
  • Cell culture in this screening method can be carried out using a known culture method for antigen-presenting cells.
  • the test substance selected by this screening method may be a candidate drug used for causing immune checkpoint inhibition to antigen-presenting cells, and can be preferably used as an immune checkpoint inhibitor.
  • the above screening method using the cytokine production amount as an index may further include a screening step based on the binding between the antigen-presenting cell and the test substance.
  • a screening step based on the binding property between antigen-presenting cells and a test substance
  • antigen-presenting cells for example, dendritic cells
  • test substances for example, antibodies
  • in vitro treatment may be performed, and subsequently, the binding property (reactivity) between the antigen-presenting cell (specifically, the CLEC4A protein on the antigen-presenting cell) and the test substance may be detected.
  • a test substance for example, an antibody that binds to the CLEC4A protein can be screened.
  • an antigen-presenting cell in which a CLEC4A protein is expressed on the cell surface for example, a transgenic produced by introducing a CLEC4A gene into the antigen-presenting cell) Cells
  • antigen-presenting cells that do not express CLEC4A protein on the cell surface for example, antigen-presenting cells that are the parent lines of the transgenic cells
  • a mixed cell system prepared with a mixing ratio of about 1: 1 cell number may be treated with the test substance, thereby making it possible to combine the screening reaction system into one, and to make the screening process more efficient. can do.
  • the test substance selected by screening based on the binding property between the antigen-presenting cell and the test substance targets the CLEC4A protein, and can be judged to have a high possibility of having an immune checkpoint inhibitory effect.
  • ⁇ Flow cytometry method> The following fluorescently labeled monoclonal antibodies were used for cell staining in flow cytometry analysis.
  • Anti-mouse CD3 ⁇ antibody (clone 145-2C11; BD Biosciences), anti-mouse CD4 antibody (clone RM4-5; BD Biosciences), anti-mouse CD8 ⁇ antibody (clone 53.6.7; BD Biosciences), anti-mouse CD11b antibody (clone M1 / 70; Biolegend), anti-mouse CD11c antibody (clone HL3; BD Biosciences), anti-mouse CD40 antibody (clone 3/23; BD Biosciences), anti-mouse CD44 antibody (clone IM7; BD Biosciences), anti-mouse CD80 antibody (clone 16 -10A1; BD Biosciences), anti-mouse CD86 antibody (clone GL1; BD Biosciences), anti-mouse CD62L antibody (clone
  • Anti-human CD3 antibody (clone UCHT1; TOMBO), CD8 ⁇ (clone SK1; BD Biosciences), anti-human CD11c antibody (clone 3.9; TOMBO), anti-human CD14 antibody (clone 61D3; TOMBO), anti-human CD19 antibody (clone HIB19; TOMBO), anti-human CD56 antibody (clone MY31; TOMBO), anti-human CD1c antibody (clone L161; Biolegend), anti-human CD40 antibody (clone 5C3; BD Biosciences), anti-human CD80 antibody (clone L307.4; BD Biosciences) Anti-human CD86 antibody (clone IT2.2; BD Biosciences), anti-human CD141 antibody (clone M80; Biolegend), anti-human CD303 antibody (clone 201A; Biolegend), anti-human HLA-DR antibody (clone L243; Biolegend), Anti-human CLEC4A antibody (clon
  • cells (1-5 ⁇ 10 5 cells) were stained by incubating with fluorescently labeled monoclonal antibody at 4 ° C. for 30 minutes.
  • MHC-peptide complexes were used for cell staining instead of fluorescently labeled monoclonal antibodies: mouse H-2Kb OVA peptide pentamer, and human HLA- A * 02: 01 Mart-1 peptide tetramer (MBL).
  • OVA 257-264 peptide amino acid sequence SIINFEKL (SEQ ID NO: 14); 10 ⁇ M
  • protein transport inhibitor GolgiPlug TM protein transport inhibitor GolgiPlug TM
  • Fluorescence staining analysis was performed using a FACSVerse TM flow cytometer (BD Biosciences) and FlowJo software (Tree star).
  • mice C57BL / 6 mice (Japan Clea) were used as wild type (WT) mice.
  • Clec4A4-deficient mice Clec4a4 ⁇ / ⁇ mice
  • Clec4A4-deficient mice strain name B6.Cg-Clec4a4 ⁇ tm1.1Ksat>
  • RIKEN BRC RIKEN BioResource Center
  • OVA ovalbumin
  • TLR cancer vaccine Body
  • CpG-B ODN 1668 50 ⁇ g / animal; Hokkaido System Science
  • agonist anti-CD40 antibody 10 ⁇ g / animal; clone 1C10; Biolegend
  • OVA-specific cytotoxic T cells CD44 high OVA-MHC class I pentamer-binding CD8 + T cells
  • OVA-specific IFN- ⁇ producing CD8 + T cells in the spleen
  • CTL OVA-specific cytotoxic T cells
  • IFN- ⁇ producing CD8 + T cells OVA-specific IFN- ⁇ producing CD8 + T cells
  • cancer vaccine WT mice and tumor-bearing Clec4A4-deficient mice were immunized by intraperitoneal administration of a cancer vaccine.
  • the induction of CD44 high OVA-MHC class I pentamer-binding CD8 + T cells and OVA-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells, which are OVA-specific CTLs was performed according to the above flow site. The analysis was performed by the measurement method.
  • Tumor-bearing WT mice and tumor-bearing Clec4A4-deficient mice produce antigen-specific CTL and antigen-specific IFN- ⁇ in the cancer vaccine immunity group compared to non-tumor-bearing WT mice and Clec4A4-deficient mice CD8 + T cell induction was enhanced (FIGS. 1 and 2). Furthermore, in the cancer vaccine immunity group of tumor-bearing Clec4A4-deficient mice, the induction of antigen-specific CTL and antigen-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells compared to the cancer vaccine immunity group of tumor-bearing WT mice was significantly enhanced (FIGS. 1 and 2).
  • cancer-bearing Clec4A4-deficient mice showed no occurrence of immune-related adverse events, but The development was significantly suppressed (FIGS. 3A to 3C).
  • cancer vaccine immunization group of tumor-bearing WT mice cancer regression was clearly observed after 15 days after cancer cell transplantation.
  • cancer vaccine immunized group of cancer-bearing Clec4A4-deficient mice cancer progression of the cancer vaccine was suppressed on the 23rd day after cancer cell transplantation compared to the cancer vaccine immunized group of tumor-bearing WT mice. Increased effect was observed (FIG. 3).
  • mouse Clec4A4 is an immune checkpoint molecule expressed on dendritic cells and acts to brake the anti-tumor immune response. Also
  • non-cancer-bearing mice and spleen mononuclear cells of tumor-bearing mice were prepared by using spleen cells using erythrocyte lysis buffer (Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max TM ; Sigma-Aldrich) (Non-patent Document 4).
  • Preparation of spleen mononuclear cells and cancer tissue of tumor-bearing mice was carried out 20 days after cancer cell transplantation.
  • non-tumor bearing WT mice and non-tumor bearing Clec4A4-deficient mice were similarly analyzed by flow cytometry. The analysis results are shown in FIGS.
  • tumor-bearing Clec4A4-deficient mice Compared with tumor-bearing WT mice, tumor-bearing Clec4A4-deficient mice have Gr1-1 + CD11b + F4 / 80 + bone marrow-derived suppressor cells (myeloid-derived) in the spleen (FIG. 4A) and cancer tissue (FIG. 4B). Suppressor cells (MDSCs) were suppressed.
  • MSCs bone marrow-derived suppressor cells
  • tumor-bearing Clec4A4-deficient mice Compared with tumor-bearing WT mice, tumor-bearing Clec4A4-deficient mice have CD11c + Siglec-H - cDCs (normal dendritic cells) and CD11c low Siglec-H + pDCs (plasma cell-like trees) in cancer tissues. (Cell-like cells) was increased (FIG. 4B).
  • TILs tumor-infiltrating lymphocytes
  • NK1.1 tumor-infiltrating CD4 + / CD8 + lymphocytes (T cells) in cancer tissues + Increased accumulation of NK cells was observed (FIG. 4B).
  • tumor-bearing WT mice In the tumor-bearing WT mice, expression of MHC I, CD40, CD80, B7-H1, and B7-H2 was decreased in cDCs in the spleen compared to non-cancer-bearing WT mice (FIG. 7).
  • tumor-bearing Clec4A4-deficient mice showed enhanced expression of MHC I, CD80, CD86, B7-H1, and B7-H2 in cDCs in the spleen compared to non-carrying Clec4A4-deficient mice ( FIG. 7).
  • tumor-bearing Clec4A4-deficient mice showed enhanced expression of MHC class I (MHC I), CD80, CD86, B7-H1, and B7-H2 in splenic cDCs ( FIG. 7).
  • tumor-bearing Clec4A4-deficient mice showed enhanced expression of MHC I, MHC class II (MHC II), CD80, CD86, and B7-H1 in tumor-infiltrating cDCs, and B7-H2 and Decreased expression of B7-DC was observed (FIG. 8).
  • the inhibition of dendritic cell function by Clec4A4 is the promotion of the induction and accumulation of bone marrow-derived suppressor cells in lymphoid and cancer tissues, as well as effector T cells, tumor infiltrating T cells, and activated dendritic cells It has been shown that cancer progression is promoted by inducing immunotolerogenicity in the cancer microenvironment based on the induction and accumulation suppression and suppressing the antitumor immune response (FIGS. 4 to 8). ).
  • the above analysis results indicate that inhibition of Clec4A4 function leads to activation of anti-tumor immune response and cancer suppression.
  • Clec4A4 deficiency enhances the cancer immune response and suppresses cancer progression in mice, so Clec4A4 is expressed in dendritic cells and regulates the cancer immune (autoimmune) response. ”Proved.
  • Peripheral blood mononuclear cells were separated from human peripheral blood (peripheral blood of healthy persons) by specific gravity centrifugation using Ficoll-Paque TM PLUS (GE Healthcare Life Sciences). Peripheral blood monocytes were purified from the isolated peripheral blood mononuclear cell fraction using Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) and cell separator autoMACS (R) Pro Separator (Miltenyi Biotec) .
  • the obtained human peripheral blood monocytes were transformed into human recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (50 ng / ml, Wako) and human recombinant IL-4 (100 ng / ml, Wako) was cultured for 1 week to prepare dendritic cells derived from human peripheral blood monocytes.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 100 ng / ml, Wako
  • the obtained human peripheral blood monocytes were transformed into human recombinant GM-CSF (50 ng / ml, Wako), human recombinant IL-4 (100 ng / ml, Wako), Human peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive activity by culturing for 1 week in the presence of human recombinant IL-10 (50 ng / ml, Wako) and human recombinant TGF- ⁇ 1 (50 ng / ml, Wako) Dendritic cells were produced. It is known that peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells are generated in a cancer environment.
  • CLEC4A expression was not observed in CD3 + T cells or CD56 + NK cells in the peripheral blood mononuclear cell fraction, but was observed in CD19 + B cells, CD14 + monocytes, and CD11c + dendritic cells (FIG. 9A). Furthermore, CD14 + monocytes and CD11c + dendritic cells showed higher expression for CLEC4A compared to CD19 + B cells (FIG. 9A).
  • CD141 + cDC1 cells, CD1c + cDC2 cells, and CD303 + pDC cells in peripheral blood mononuclear cell fractions obtained from healthy individuals using the flow cytometry method described above did.
  • the expression of each cell surface molecule (CD141, CD1c, CD303, CD11c, HLA-DR, and CLEC4A) is shown as a histogram in FIG. 9B.
  • the CD1c + peripheral blood mononuclear cells obtained by flow cytometry analysis were designated as cDC2, CD141 + peripheral blood mononuclear cells as cDC1, and CD303 + peripheral blood mononuclear cells as pDC.
  • peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals, prepared peripheral blood monocyte-derived dendritic cells (in the figure, monocyte-derived DC), and peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells (in the figure, The expression of CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR and CLEC4A in monocyte-derived DCreq) was analyzed by the flow cytometry method described above. The expression of each cell surface molecule is shown as a histogram in FIG. 9C.
  • Peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells showed lower expression for CD11c, CD86, and HLA-DR compared to peripheral blood monocyte-derived dendritic cells, but equally high expression for CLEC4A. Shown (FIG. 9C).
  • Clec4A4 expression is limited to CD1c + peripheral blood mononuclear cells (cDC2) in mice (Non-patent Document 4).
  • cDC2 is CD141 + peripheral blood mononuclear cells (cDC1) and CD303 + peripheral blood mononuclear cells.
  • CLEC4A expression was higher than that of nuclear cells (pDC), and CLEC4A expression was also observed in monocytes and B cells.
  • CLEC4A is also expressed in immunosuppressive dendritic cells generated in a cancer environment (Non-patent Document 3 and Nagayama H., et al., Melanoma Res., (2003) 13, pp. 521-530). Was recognized.
  • BamHI recognition sequence (5'-ggatcc-3) at the 5 'end of the base sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the full length of CLEC4A protein (SEQ ID NO: 2; NCBI accession number NP_057268.1; M1-L237; 237 amino acids long) '
  • a cDNA (SEQ ID NO: 11) having an XhoI recognition sequence (5'-ctcgag-3') added to the 3 'end was synthesized by GeneArt (R) (Life Technologies).
  • CLEC4A ITIM Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif sequence deletion mutant (SEQ ID NO: 4; ⁇ I5-V10; 231 amino acids long), CLEC4A extracellular region deletion mutant ( SEQ ID NO: 6; ⁇ F69-L237; 68 amino acids long), CLEC4A sugar chain recognition domain (carbohydrate-recognition domain; CRD) deletion mutant (SEQ ID NO: 8; ⁇ E195-S197; 234 amino acids long), and CLEC4A sugar chain modification A BamHI recognition sequence at the 5 ′ end of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, respectively) encoding the site substitution mutant (SEQ ID NO: 10; N185Q; 237 amino acids long), 3 ′ A cDNA having an XhoI recognition sequence added to the end in the same manner as described above was synthesized by GeneArt (R) (Life Technologies).
  • these cDNAs were treated with restriction enzymes BamHI and XhoI, and introduced into the BamHI-XhoI site in the multicloning site of the pMX-IRES-GFP retroviral vector to prepare CLEC4A or a mutant expression retroviral vector.
  • these retroviral vectors or control retroviral vectors are infected with retroviral packaging cells (Phoenix) using LipofectAMINE Plus Reagent (Life Technologies) for 24 hours. Later, retrovirus was collected from the culture supernatant and concentrated by centrifugation (8,000 g, 16 hours, 4 ° C.).
  • the obtained retrovirus was used for the DOTAP liposomal transfection reagent (DOTAP) against the mouse dendritic cell line DC2.4 (Shen Z, et al., J. Immunol., (1997) 158: p.2723-2730). Liposomal Transfection Reagent; Roche) for 2 days. From the obtained cells, a transgenic cell line was purified and isolated using a FACSAria TM II cell sorter (BD Biosciences) using GFP expression as an index.
  • DOTAP DOTAP liposomal transfection reagent
  • DC2.4 mouse dendritic cell line
  • Liposomal Transfection Reagent Roche
  • Mouse dendritic cell line DC2.4, control retrovirus-infected cell line, CLEC4A expression cell line, sugar chain modification site substitution mutant expression cell line, CRD deletion mutant expression cell line, extracellular region deletion mutant expression cell line, And ITIM sequence-deficient mutant-expressing cell lines were seeded in 48-well culture plates (BD Bioscience), respectively, and TLR4 ligand lipopolysaccharide (LPS; 0.1 ⁇ g / ml; Sigma-Aldrich) or TLR9 ligand CpG-B After adding ODN6681668 (0.1 ⁇ M) for stimulation and culturing for 16 hours, the amount of IL-6 (interferon-6; eBioscience) and TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ; eBioscience) in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • TLR4 ligand lipopolysaccharide LPS; 0.1 ⁇ g / ml; Sigma-Aldrich
  • IL-6 and TNF- were stimulated by LPS or CpG-B ODN 1668. ⁇ production was significantly attenuated (FIG. 11).
  • CLEC4A-expressing cell line CLEC4A-GFP in the figure
  • CRD-deficient mutant-expressing cell line CLEC4A ⁇ E195-S197 -GFP in the figure
  • extracellular region-deficient mutant-expressing cell line CLEC4A in the figure
  • ITIM sequence-deficient mutant cell lines (CLEC4A ⁇ I5-V10- GFP in the figure) stimulated by LPS or CpG-B ODN 1668, IL-6 and TNF- ⁇ production
  • the amount of production was almost the same as that of the control retrovirus-infected cell line (mock-GFP in the figure) (FIG. 11).
  • CLEC4A mutants introduced into these cell lines were shown not to retain CLEC4A activity.
  • CLEC4A is a molecule that regulates the function of antigen-presenting cells, and the molecular basis for CLEC4A's functional regulation in antigen-presenting cells such as dendritic cells is modified by the sugar domain recognition domain (CRD) in the extracellular region and modification.
  • CRD sugar domain recognition domain
  • ITIM-dependent inhibitory signal pathways based on self-molecule (internal / internal) binding via association with sugar chains, and induction of such pathways suppresses cytokine production and T cell activation It has been shown. In other words, it was shown that the extracellular region, CRD, and ITIM sequences are important for the functional control activity of CLEC4A.
  • Example 4 1) Preparation of soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule Base sequence encoding CLEC4A extracellular region (SEQ ID NO: 12; F69-L237; 169 amino acids long) (corresponding to base sequences 205 to 711 of SEQ ID NO: 1) A cDNA with BamHI recognition sequence (5'-ggatcc-3 ') at the 5' end and EcoRV recognition sequence (5'-gatatc-3 ') at the 3' end was synthesized by GeneArt (R) (Life Technologies). did.
  • the obtained cDNA is treated with restriction enzymes BamHI and XhoI, and introduced into the BamHI-EcoRV site in the multiple cloning site of the mouse IgFc chimeric molecule expression vector (pFUSEN-mG2A-Fc vector; InvivoGen).
  • a soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule expression vector was prepared. Soluble CLEC4A- mouse IgFc chimeric molecule expression vector, 293fectin TM Transfection Reagent; was transfected into FreeStyle TM 293-F cells (Life Technologies) using (293fectin TM Transfection Reagent Life Technologies) . Subsequently, the transfected cells were cultured, and the soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule was purified from the culture supernatant using HiTrap TM Protein G HP (GE Healthcare Life Sciences).
  • mice lymph nodes were collected, and the resulting lymph node cells were fused with the P3U1 myeloma cell line using polyethylene glycol 4000 (Wako) to prepare a hybridoma. 480 clones of hybridoma were obtained.
  • the culture supernatant of the prepared hybridoma was added to a mixed cell (mixing ratio 1: 1) of the mouse dendritic cell line DC2.4 and the CLEC4A-expressing cell line (CLEC4A-GFP) prepared in Example 3. Then, the reactivity between the antibody and the cells was examined by the flow cytometry method. By using a mixed cell system, it becomes possible to analyze the reactivity of the mouse dendritic cell line DC2.4 (parent cell line) and the CLEC4A-expressing cell line at a time.
  • FIG. 12B shows an example of reactivity of an antibody clone against a CLEC4A-expressing cell line by a dot plot of expression levels of GFP and CLEC4A.
  • control mouse IgG antibody or anti-CLEC4A antibody (clone 9E8) was mixed with mouse dendritic cell line DC2.4 and CLEC4A-expressing cell line (CLEC4A-GFP) prepared in Example 3 (mixing ratio 1: 1). And the reactivity of the antibody with the cells was examined by the flow cytometry method.
  • FIG. 12A is a dot plot showing the expression levels of GFP and CLEC4A.
  • Mouse anti-CLEC4A antibody was purified from the culture supernatant of the hybridoma selected as a highly reactive clone using HiTrap TM Protein G HP. The obtained anti-CLEC4A antibody was tested for CLEC4A function inhibitory action and immune checkpoint inhibitory action on dendritic cells.
  • Peripheral blood monocyte-derived dendritic cells (1 ⁇ 10 5 cells) obtained in Example 2 were seeded in a 96-well culture plate, and control mouse IgG antibody (cont. Ig) (10 ⁇ g / ml; Sigma-Aldrich) or After stimulation with LPS (0.1 ng / ml) in the presence or absence of mouse anti-human CLEC4A antibody (10 ⁇ g / ml) and culturing for 16 hours, the amount of IL-6 in the culture supernatant was determined by ELISA. It was measured. An example of the result is shown in FIG. 13A. The black horizontal line in the figure shows the IL-6 production value when stimulated with LPS in the presence of a control mouse IgG antibody (cont. Ig).
  • the human CLEC4A-expressing mouse dendritic cell line DC2.4 (4 ⁇ 10 5 cells) was used in the presence or absence of control mouse IgG antibody (100 ⁇ g / ml) or mouse anti-human CLEC4A antibody (100 ⁇ g / ml). After incubation for 60 minutes, soluble human CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule (10 ⁇ g / ml) was added and reacted.
  • the reactivity (binding) of the soluble human CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule to the CLEC4A-expressing mouse dendritic cell line DC2.4 is used as an index, and R-phycoerythrin labeled F (ab ') 2 as a secondary antibody.
  • the binding inhibition rate was analyzed by flow cytometry using fragmented goat anti-mouse IgG (H + L). An example of the result is shown in FIG. 13B.
  • the black horizontal line in the figure indicates 80% binding inhibition.
  • the binding of the soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule to the CLEC4A-expressing mouse dendritic cell line DC2.4 was inhibited by anti-CLEC4A antibodies (clone B-71, A-77, and B-23). % Inhibited. These anti-CLEC4A antibodies were thought to have caused binding inhibition between CLEC4A expressed on the cell surface of dendritic cell line DC2.4 and soluble CLEC4A, and were shown to act as CLEC4A function-inhibiting antibodies. Antibodies B-71, A-77, and B-23 all specifically bind to the extracellular region of human CLEC4A protein (SEQ ID NO: 12).
  • CLEC4A recognition by the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody suppresses the ITIM-dependent inhibitory signal pathway by inhibiting its molecular (internal / inter) binding, that is, controls the immune checkpoint function of CLEC4A. This proved to induce the activation function conversion of dendritic cells.
  • the DNA sequence encoding CLEC4A-CD3 ⁇ has an initiation codon (ATG) added to the DNA sequence encoding the mouse CD3 ⁇ intracellular region (NCBI: NP_001106862.1; R52-R164; 113 amino acids long) and a stop codon (TAA ) Is a DNA sequence that encodes the extracellular region of human CLEC4A and the transmembrane region (L46-L237; 192 amino acids long) on the 5 'end of the deleted sequence (M1-R114; 114 amino acids long) is there.
  • ATG initiation codon
  • TAA stop codon
  • the synthesized cDNA was introduced into the EcoRI-XhoI site in the multicloning site of the pMX-IRES-CD8 ⁇ retroviral vector (Non-patent Document 4) to prepare a CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing retroviral vector.
  • This CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing retrovirus vector or control retrovirus vector (pMX-IRES-CD8 ⁇ ) was used as a retrovirus packaging cell Phoenix (Kitamura T., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, (1995) Vol. 92, pp.
  • Non-Patent Document 4 9146-9150 and Non-Patent Document 4 were infected with LipofectAMINE Plus TM Reagent (Thermo Fisher Scientific), and CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing retrovirus was recovered from the culture supernatant after 24 hours, and centrifuged ( 8,000 g, 16 hours, 4 ° C.).
  • NFAT-GFP reporter mouse T cell line (Ohtsuka M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (2004) 101: produced by introducing the NFAT-GFP construct into the mouse T cell line 2B4: 8126-8131) was infected with the obtained CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing retrovirus for 2 days using DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche).
  • the above NFAT-GFP construct fuses a DNA sequence containing three tandem NFAT (nuclear factor of activated T cells) binding sites to the 5 ′ side of an enhanced GFP (green fluorescent protein) -encoding cDNA. It was produced by this.
  • CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing NFAT-GFP reporter mouse T cell line was purified and separated using a FACSAria TM II cell sorter (BD Biosciences) using CLEC4A expression as an index (Non-patent Document 4).
  • the obtained CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing NFAT-GFP reporter mouse T cell line (1 ⁇ 10 5 cells) or the above NFAT-GFP reporter mouse T cell line (control T cell line) is used as a control mouse IgG antibody (10 ⁇ g / ml) or After culturing for 24 hours in the presence or absence of a mouse anti-human CLEC4A antibody (10 ⁇ g / ml), the expression of GFP and the expression on the cell surface of CLEC4A were measured using GFP fluorescence or mouse anti-human CLEC4A antibody (clone 9E8 ; Analysis by flow cytometry using Biolegend).
  • NFAT is a substrate for calcineurin, a serine threonine phosphatase, and is a transcription factor that is dephosphorylated (activated) by calcineurin and then translocated into the nucleus to activate the gene. NFAT is used as an indicator of lymphocyte activation because it induces cytokine production and activates lymphocytes.
  • the CLEC4A-CD3 ⁇ -expressing NFAT-GFP reporter T cell line was also shown to be useful as an in-vitro evaluation system for immune checkpoint inhibitors (FIG. 14).
  • Example 7 1) MART-1-specific CTL-inducing human peripheral blood mononuclear cells (HLA-A2-positive; 10 7 cells), control mouse IgG antibody (cont Ig;. 10 ⁇ g / ml) or mouse anti-human CLEC4A antibody (clone B -71, 10 ⁇ g / ml) LPS (0.1 ⁇ g / ml), MART-1 peptide (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 17); 10 ⁇ g / ml, MBL), IL-2 (50 U / ml; WAKO) and IL-7 (10 ng / ml; WAKO) were added and cultured on a 35 mm dish (Ultimate low cell binding surface, Thermo Scientific) for 1 week.
  • HLA-A2-positive; 10 7 cells control mouse IgG antibody (cont Ig;. 10 ⁇ g / ml) or mouse anti-human CLEC4A antibody (clone B -71, 10 ⁇ g
  • MART-1-specific CTL MART-1-MHC class I tetramer-binding CD8 + T cells
  • B-71 antibody specifically binds to the extracellular region of human CLEC4A protein (SEQ ID NO: 12).
  • human malignant melanoma cell lines (MEL-624, HLA-A2 positive and MART-1 positive; Kawakami Y., et al., J. Immunol., (1992) 148, pp.638- 643) was implanted subcutaneously on the back of mice (1 ⁇ 10 6 cells / mouse). Evaluation of cancer progression in this cancer-bearing immune system humanized mouse was performed by measuring the tumor volume with a digital caliper on a daily basis until the 30th day after cancer transplantation.
  • Clec4A4 deficient mice do not spontaneously develop autoimmune-like pathological conditions, and CLEC4A function in cancer-bearing immune system humanized mice Since inhibitory antibodies do not induce immune-related adverse events, immune-related adverse events that occur due to functional inhibition of T cell-expressed immune checkpoint molecules are significantly reduced by functional inhibition of dendritic cell-expressed immune checkpoint molecule CLEC4A It has been shown. Therefore, the CLEC4A function inhibitor has the advantage of higher safety in administration.
  • CLEC4A inhibits the function of antigen-presenting cells such as dendritic cells to suppress cancer-specific T cell responses and promote cancer progression.
  • CLEC4A was expressed on antigen-presenting cells such as dendritic cells, and was found to be an “immune checkpoint molecule” that negatively regulates cancer immunity (autoimmunity) response.
  • CLEC4A4 function enhances cancer-specific T cell responses without the occurrence of immune-related adverse events, and suppresses induction of bone marrow-derived suppressor cells in lymphoid and cancer tissues, effector T cells, and tumor invasion Inhibition of immune tolerance in the cancer microenvironment based on the promotion of accumulation of T cells and activated dendritic cells, and suppression of cancer progression by establishing an effective cancer immune response It was. Therefore, CLEC4A function-inhibiting substances such as CLEC4A function-inhibiting antibodies can be advantageously used for cancer immunotherapy.
  • the present invention is a novel method capable of effectively inducing immune checkpoint inhibition against antigen-presenting cells such as dendritic cells through functional inhibition of CLEC4A, which is an immune checkpoint molecule, and activating an anti-tumor immune response. It can be used as a cancer treatment means.
  • SEQ ID NO: 1 Full length CLEC4A coding sequence
  • SEQ ID NO: 2 Full length CLEC4A protein
  • SEQ ID NO: 3 ITIM (I5-V10) deficient mutant coding sequence
  • SEQ ID NO: 4 ITIM (I5-V10) deficient mutant
  • SEQ ID NO: 5 Extracellular region (F69-L237) deletion mutant coding sequence
  • SEQ ID NO: 6 extracellular region (F69-L237) deletion mutant
  • SEQ ID NO: 7 CRD (E195-S197) deletion mutant coding sequence
  • SEQ ID NO: 8 CRD (E195-S197) Deletion mutant
  • SEQ ID NO: 10 N185Q mutant

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Abstract

本発明は、CLEC4A機能阻害抗体等のCLEC4A機能阻害物質を含む、免疫チェックポイント阻害剤、及びその用途に関する。

Description

免疫チェックポイント阻害剤
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に関する。
　がん抗原の発見以来、がん免疫療法開発に向けて様々な研究が進行している。従来のがん免疫療法では、様々なアジュバント、がん抗原タンパク質やがん抗原ペプチドが、抗腫瘍免疫応答の誘導のために使用されている。しかし、がん抗原の多くが正常自己抗原であるため免疫原性が弱く、加えて自己抗原に対する免疫応答（自己免疫）を抑制する免疫制御機構が、がん抗原に対する免疫応答をも抑制していることが明らかになりつつある。このような免疫制御機構は「免疫チェックポイント分子」と呼ばれる分子により担われている。免疫チェックポイント分子は、抗腫瘍免疫応答及び自己免疫応答を負に制御しており、例としてT細胞に発現するCTLA-4やPD-1が挙げられる（非特許文献１）。これら「免疫チェックポイント分子」に対する阻害抗体を用いた免疫治療法が試みられている（非特許文献１）。しかしながら、そのような免疫治療法では一定の臨床効果が認められてはいるものの、多くのがん種では依然として不応答性であることが指摘されており、未だ満足すべき結果が得られているとはいえない。さらにT細胞に発現する免疫チェックポイント分子「CTLA-4・PD-1系」の阻害では、がんのみならず自己に対する免疫応答の活性化により発生する、自己免疫様病態等の有害事象が生じる可能性がある。このように免疫チェックポイント阻害剤では、がん不応答性の克服、及び自己免疫寛容の破綻に起因する免疫関連有害事象（immune-related adverse events: irAEs）の軽減も求められている。
　樹状細胞（dendritic cells; DCs）は樹状突起を有する、系統マーカー陰性、かつ主要組織適合遺伝子複合体クラスII陽性の抗原提示細胞であり、通常型樹状細胞（conventional DCs; cDCs）と形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DCs; pDCs）に大別される亜集団から構成される。樹状細胞は炎症状態では自然免疫と適応免疫を繋ぐ最も強力な抗原提示細胞として抗原特異的エフェクターT細胞の誘導を介して免疫系を賦活し、定常状態では抗原特異的クローンの除去、不応答性の誘導や免疫抑制能を有する制御性T（regulatory T; Treg）細胞の生成・増幅を介した免疫寛容を誘導する制御細胞として、免疫学的恒常性の維持に重要な役割を果たしている。一方、がん環境下での樹状細胞の機能阻害によるがん免疫応答の低下が推察されているが、その作用機序には不明な点が多く残されている。
　本発明者らは、ヒトとマウスにおいて特定の培養条件で炎症状態においても顕著なT細胞制御機能を有する免疫抑制性樹状細胞の作製に成功している（非特許文献２、３）。
　また本発明者らは、Cタイプレクチンレセプターファミリーに属する「Clec4A4 (DCIR2)」を同定し、Clec4A4が細胞内シグナル伝達を介して樹状細胞の機能を制御し、炎症及びT細胞免疫を減弱することを示した（非特許文献４）。Clec4A4欠損マウスでは自己反応性T細胞の過剰な増幅・活性化により自己免疫疾患の発症が早まり、自己免疫病態が増悪することも見出された（非特許文献４）。
Topalian S.L., et al., Cancer Cell. (2015) 27:450-461 Sato K., et al., Immunity. (2003) 18:367-379 Sato K., et al., Blood. (2003) 101:3581-3589 Uto T., et al., Nat. Commun., (2016) 7:11273
　本発明は、新たな機序に基づく免疫チェックポイント阻害剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、CLEC4Aタンパク質が樹状細胞等の抗原提示細胞上で発現して免疫チェックポイント分子として機能すること、また、CLEC4A機能阻害物質が、抗原提示細胞に対して免疫チェックポイント阻害をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] CLEC4A機能阻害物質を含む、免疫チェックポイント阻害剤。
[2] CLEC4A機能阻害物質が、CLEC4A機能阻害抗体、又はCLEC4A遺伝子発現抑制核酸である、上記[1]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[3] CLEC4A機能阻害抗体が、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域に結合する抗体である、上記[2]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[4] CLEC4A機能阻害抗体が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列又はその部分配列からなる領域に結合する、上記[2]又は[3]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[5] CLEC4A遺伝子発現抑制核酸が、CLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAである、上記[2]に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[6] CLEC4AがヒトCLEC4Aである、上記[1]～[5]のいずれかに記載の免疫チェックポイント阻害剤。
[7] 上記[1]～[6]のいずれかに記載の免疫チェックポイント阻害剤を含む、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化のための医薬組成物。
[8] CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を測定し、被験物質で処理していない抗原提示細胞からのサイトカイン産生量と比較して、炎症性サイトカイン産生量の増加が示された場合にその被験物質は免疫チェックポイント阻害作用を有するものと判断することを含む、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-095752号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、樹状細胞などの抗原提示細胞に対し、免疫チェックポイント阻害を引き起こし、免疫チェックポイント分子CLEC4Aの働きにより低下した抗腫瘍免疫応答を活性化することができる。
図１は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（非担がん及び担がんマウス）における、OVA特異的T細胞（CD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞）の誘導についての、フローサイトメトリー法による解析結果を示す。ＡはY軸にCD44、X軸にOVA-MHCクラスIペンタマーを表示したドットプロット、ＢはCD8+ T細胞中のCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞のパーセンテージ（％）を示す。*P <0.01（WTマウスと比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。 図２は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（非担がん及び担がんマウス）における、OVA特異的T細胞（OVA特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞）の誘導についての、フローサイトメトリー法による解析結果を示す。ＡはY軸にCD8α、X軸にIFN-γを表示したドットプロット、ＢはCD8+ T細胞中のOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞のパーセンテージ（％）を示す。*P <0.01（WTマウスと比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。 図３は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種の担がん状態のWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおけるがん進展の評価結果を示す。Ａはがん細胞移植後18日目の担がんマウスの写真と腫瘍体積値（mm3）を示す。Ｂは、がん細胞移植後23日間の腫瘍体積値の変化を示す。Ｃはがん細胞移植後23日目の腫瘍体積値を示す。*P <0.01（WTマウスのワクチン接種群又はワクチン非接種群との比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。 図４は、Clec4A4の免疫細胞動態に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓（Ａ）とがん組織（Ｂ）における免疫細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。脾臓細胞中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した（Ａ）。腫瘍浸潤白血球中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した（Ｂ）。各細胞表面分子の発現をドットプロットで示す。Ａ、Ｂにおいて、最左列はCD11c（X軸）及びSiglecH（Y軸）、左から２番目の列はB220（X軸）及びGr-1（Y軸）、中央列はF4/80（X軸）及びCD11b（Y軸）、右から２番目の列はNK1.1（X軸）及びCD3（Y軸）、最右列はCD8（X軸）及びCD4（Y軸）の発現を示している。 図５は、Clec4A4のリンパ組織T細胞活性化に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓におけるT細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。脾臓CD4+ T細胞（Ａ）と脾臓CD8+ T細胞（Ｂ）の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａ、Ｂにおいて、左列はCD44、右列はCD62Lの発現を示している。 図６は、Clec4A4の腫瘍浸潤T細胞活性化に対する制御機能を示す。担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）のがん組織におけるT細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。腫瘍浸潤CD4+ T細胞（Ａ）と腫瘍浸潤CD8+ T細胞（Ｂ）の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａ、Ｂにおいて、左列はCD44、右列はCD62Lの発現を示している。 図７は、Clec4A4の脾臓樹状細胞活性化に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓における樹状細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。脾臓樹状細胞の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａにおいて、最左列はMHC-I、左から２番目の列はMHC-II、中央列はCD40、右から２番目の列はCD80、最右列はCD86の発現を示している。Ｂにおいて、最左列はCD11c、左から２番目の列はClec4A4、中央列はB7-H1、右から２番目の列はB7-H2、最右列はB7-DCの発現を示している。 図８は、Clec4A4の腫瘍浸潤樹状細胞活性化に対する制御機能を示す。担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）のがん組織における樹状細胞動態をがん細胞移植後20日目に評価した。腫瘍浸潤樹状細胞の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａにおいて、最左列はMHC-I、左から２番目の列はMHC-II、中央列はCD40、右から２番目の列はCD80、最右列はCD86の発現を示している。Ｂにおいて、最左列はCD11c、左から２番目の列はClec4A4、中央列はB7-H1、右から２番目の列はB7-H2、最右列はB7-DCの発現を示している。 図９は、健常人末梢血由来免疫細胞でのCLEC4Aの発現状態を示す図である。Ａは、末梢血単核球画分中のCD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD11c+樹状細胞、CD14+単球、CD56+ NK細胞における細胞表面分子CLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｂは、末梢血単核球画分における細胞表面分子CD141、CD1c、CD303、CD11c、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｃは、末梢血単球、末梢血単球由来樹状細胞、及び末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞における細胞表面分子CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。 図１０は、トランスジェニック細胞株におけるGFP及びCLEC4Aの発現を示すドットプロットである。Ａは、マウス樹状細胞株DC2.4（図中、DC2.4）、対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）、及びCLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）における、GFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現を示す。Ｂは、マウス樹状細胞株DC2.4、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）、CRD欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM（Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif）配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を示す。 図１１は、トランスジェニック細胞株におけるサイトカイン産生能を示す。Ａは、LPS刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のIL-6産生量を示す。Ｂは、LPS刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のTNF-α産生量を示す。Ｃは、CpG-B ODN 1668刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のIL-6産生量を示す。Ｄは、CpG-B ODN 1668刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のTNF-α産生量を示す。*P <0.01（対照レトロウイルス感染細胞株と比較、又はCLEC4A発現細胞株と糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株間の比較）。 図１２は、ハイブリドーマクローンの培養上清の、CLEC4A発現細胞株に対する反応性を示す。Ａは、対照マウスIgG抗体又は抗CLEC4A抗体（クローン9E8）との反応性を示した細胞におけるGFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現の例をドットプロットで示す。Ｂは、作製したハイブリドーマクローンの培養上清との反応性を示した細胞におけるGFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現をドットプロットで示す。なおクローンA-2、A-77、B-23、B-54、C-47、C-90、D-4、D-87、E-11、及びE-88は、旧クローン名suna2、suna77、sunb23、sunb54、sunc47、sunc90、sund4、sund87、sune11、及びsune88に対応する。 図１３は、CLEC4A機能阻害抗体のCLEC4A機能に対する制御機能を示す。Ａは、末梢血単球由来樹状細胞を対照マウスIgG抗体（cont. Ig）若しくは抗CLEC4A抗体の存在下又は非存在下にてLPSで刺激後、IL-6の産生をELISA法により測定した結果を示す。図中の「無刺激（None）」は、対照マウスIgG抗体及び抗CLEC4A抗体の非存在下かつLPSで刺激していない試料を示す。図中の「LPS」は、対照マウスIgG抗体及び抗CLEC4A抗体の非存在下でLPSで刺激した試料を示す。図中の「cont. Ig」は、対照マウスIgG抗体の存在下でLPSで刺激した試料を示す。抗CLEC4A抗体の存在下ではLPS刺激が実施された。図中の黒の水平線は対照マウスIgG抗体（cont. Ig）存在下でLPSで刺激した場合のIL-6産生値を示す。Ｂは、CLEC4A発現樹状細胞株DC2.4を、対照マウスIgG抗体若しくはマウス抗CLEC4A抗体の存在下又は非存在下にて可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子と反応させた後、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する結合を指標にフローサイトメトリー法により結合阻害率を解析した結果を示す。図中の黒の水平線は80％結合阻害を示す。 図１４は、CLEC4A機能阻害抗体のCLEC4A介在性シグナル伝達に対する制御機能を示す。Ａは、対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下の、2B4株由来のNFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（対照T細胞株）及びCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株におけるCLEC4AとGFPの発現をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。CLEC4A（Y軸）及びGFP（X軸）の発現をドットプロットで示す。Ｂは、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（GFP発現陽性率23.8%）を抗CLEC4A抗体若しくは対照マウスIgG抗体の存在下又は非存在下にて培養後、CLEC4AとGFPの発現をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。CLEC4A（Y軸）及びGFP（X軸）の発現をドットプロットで示す。 図１５は、CLEC4A機能阻害抗体のがん進展に対する制御機能を示す。ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性）を対照マウスIgG抗体（cont. Ig）若しくは抗CLEC4A抗体（クローンB-71）の存在下又は非存在下にてMART-1ペプチドと培養した後、MART-1特異的CTL（MART-1-MHCクラスIテトラマー結合CD8+ T細胞）の誘導をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。CD8+ T細胞中のMART-1特異的CTLの誘導をドットプロットで示す（X軸: MART-1-MHCクラスIテトラマー、Y軸: CD8α）。 図１６は、CLEC4A機能阻害抗体のがん進展に対する制御機能を示す。ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性）と、対照マウスIgG抗体（cont. Ig）又は抗CLEC4A抗体（クローンB-71）とを、ヒト悪性黒色腫細胞株（MEL-624, HLA-A2陽性）とともに移植したNOJマウスにおいて、がん進展をがん細胞移植後30日間評価した。Ａは、がん細胞移植後30日間の腫瘍体積（mm3）の経日変化を示す。Ｂは、がん細胞移植後30日目のがん細胞を移植したNOJマウスの移植部位の外観写真を示す。*P < 0.01; 対照マウスIgG処理群と比較。 図１７は、ヒト末梢血単核球と、対照マウスIgG抗体（cont.Ig）又は抗CLEC4A抗体（クローンB-71）とを、ヒト悪性黒色腫細胞株（MEL-624, HLA-A2陽性）とともに移植したNOJマウスにおける、がん移植後30日目の体重を示す。「未処置」は非担がんNOJマウスを示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能に基づくものである。より具体的には、本発明は、CLEC4A機能阻害物質を含む、免疫チェックポイント阻害剤に関する。本発明はまた、そのような免疫チェックポイント阻害剤を含む、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化のための医薬組成物に関する。
　本発明において、CLEC4Aとは、Cタイプ（カルシウム依存性）レクチンドメインファミリー4メンバーA（C-type Lectin Domain Family 4 Member A）と称されるタンパク質である。CLEC4Aは樹状細胞などの抗原提示細胞で発現する免疫チェックポイント分子であり、抗原提示細胞の機能を制御する。
　本発明において、「CLEC4A機能阻害物質」とは、CLEC4Aタンパク質又はCLEC4A遺伝子の機能を阻害する作用（アンタゴニスト作用）を有する任意の物質である。CLEC4A機能阻害物質は、例えば、CLEC4A機能阻害抗体、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸などであり得るが、これらに限定されない。本発明において、「CLEC4A機能阻害抗体」とは、CLEC4Aタンパク質の機能を阻害する作用（アンタゴニスト作用）を有する抗CLEC4A抗体を指す。「CLEC4A遺伝子発現抑制核酸」は、CLEC4A遺伝子に対する発現抑制配列を含み、CLEC4A遺伝子の発現を抑制することができる核酸を指す。
　CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能を阻害する。一実施形態では、CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4Aタンパク質、又はCLEC4A核酸（ゲノム上のCLEC4A遺伝子、CLEC4A遺伝子のmRNAなど）に結合、好ましくは特異的に結合してその機能を阻害する。CLEC4A機能阻害物質は、それが投与される対象生物の内因性CLEC4Aタンパク質に結合し、その機能を阻害することができる。別の実施形態では、CLEC4A機能阻害物質は、それが投与される対象生物の内因性CLEC4A遺伝子のmRNAに結合し、その発現を阻害することができる。好ましい実施形態では、CLEC4A機能阻害物質、例えばCLEC4A機能阻害抗体は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）などの抗原提示細胞の細胞表面上に発現したCLEC4Aタンパク質に結合し、そのCLEC4Aタンパク質の免疫チェックポイント分子としての機能を阻害することができる。好ましい別の実施形態では、CLEC4A機能阻害物質、例えば、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）などの抗原提示細胞又はその前駆細胞中で、ゲノム上のCLEC4A遺伝子又はCLEC4A遺伝子のmRNAに結合し、CLEC4A遺伝子の発現を抑制することができる。
　CLEC4A機能阻害物質の標的となるCLEC4Aは、哺乳動物由来であることが好ましく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳動物由来であってよい。CLEC4A機能阻害物質の標的となるCLEC4AはヒトCLEC4A、又はそのマウスホモログ（例えば、オルソログであるClec4A4）等のホモログ（例えば、オルソログ）であってよい。特に好ましい実施形態では、CLEC4A機能阻害物質の標的となるCLEC4Aは、ヒトCLEC4Aである。
　一実施形態では、CLEC4A機能阻害物質（例えば、CLEC4A機能阻害抗体）は、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合するものであってよい。一実施形態では、CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain; CRD）を含む配列（例えば、6アミノ酸長以上、典型的には6～20アミノ酸長、6～9アミノ酸長、又は7～10アミノ酸長、例えば6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長の配列）に結合するものであってよい。
　ヒトCLEC4Aタンパク質の全長アミノ酸配列の例を配列番号２に、それをコードする塩基配列の例を配列番号１に示す。CLEC4Aタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLEC4Aタンパク質、その機能的変異体、又はそのホモログ（好ましくはオルソログ）であってよい。CLEC4Aタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、例えば90％以上、93％以上、95％以上、98％以上、99％以上、若しくは99.5％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってよく、免疫チェックポイント機能（樹状細胞などの抗原提示細胞上での免疫チェックポイント分子としての機能）を保持することが好ましい。
　CLEC4Aタンパク質の細胞外領域は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69位から237位までの領域（配列番号１２）、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4Aタンパク質において、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（細胞外領域）又はその部分配列、例えば６アミノ酸長以上の部分配列からなる領域に結合するものであってよい。一実施形態では、CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4Aタンパク質中、配列番号１２の1～10位、11～20位、21～30位、31～40位、41～50位、42～50位、51～60位、61～70位、71～80位、81～90位、91～100位、101～110位、111～120位、121～130位、131～140位、141～150位、151～160位、若しくは161～169位のアミノ酸配列、又は６アミノ酸長以上若しくは７アミノ酸長以上、例えば6～20、6～9、若しくは7～10アミノ酸長であるその部分配列を含む領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域に結合するものであってよい。他のCLEC4A機能阻害物質も、CLEC4Aタンパク質中のこのような領域に結合するものであってよい。
　CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメイン（CRD）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ヒトCLEC4A）の195位から197位までの領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。CLEC4Aタンパク質の細胞内領域内のITIM配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の5位から10位までの領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。
　CLEC4A機能阻害抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD、又はIgYであってよく、さらに任意のサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等であってよい。
　CLEC4A機能阻害抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。CLEC4A機能阻害抗体は、任意の抗体形態であってよく、例えば、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ等であってよい。CLEC4A機能阻害抗体はまた、全抗体であっても、抗体の抗原結合性フラグメント、例えばFab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv、sdFv等であってもよい。
　CLEC4A機能阻害物質、例えばCLEC4A機能阻害抗体は、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（PEG）化等の任意の修飾がされていてもよい。
　CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、CLEC4A遺伝子に対する発現抑制配列を含む任意の形態の核酸であってよく、一本鎖核酸分子であっても二本鎖核酸分子であってもよい。CLEC4A遺伝子に対する発現抑制配列は、典型的には、CLEC4A遺伝子の標的領域（例えば、CLEC4A遺伝子のmRNA中の標的領域）のアンチセンス配列、又はアンチセンス配列及びセンス配列である。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、RNA、DNA、ペプチド核酸（PNA; Peptide Nucleic Acid）、ロックド核酸（LNA; Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等であってもよい。一実施形態では、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、hpRNA（hairpin RNA）、又はそれを含むより長い核酸であってもよい。一実施形態では、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、CLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAである。あるいは、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、体内でCLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAを生成する前駆体核酸であってもよい。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、修飾塩基を有していてもよい。その修飾としては、蛍光色素標識、メチル化、ハロゲン化、脱アミノ化、チオ化、ジヒドロ化、アミノ化、シュードウリジン化などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるCLEC4A遺伝子発現抑制核酸によるCLEC4A遺伝子の発現抑制は、RNA干渉によるものであってよいが、それに限定されない。RNA干渉は、典型的には、二本鎖RNA（dsRNA）が、細胞内のDicerにより、3'末端にオーバーハングを有する典型的には21～23塩基対（bp）程度の短い二本鎖RNA（siRNA）に切断され、一方の一本鎖RNAが標的mRNAに結合して標的mRNAの分解を引き起こすことにより標的mRNAの翻訳を抑制し、それにより標的mRNAが由来する標的遺伝子の発現を抑制する現象である。一実施形態では、発現抑制配列は、19～30塩基長であり、例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30塩基長であってよい。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ21～34塩基長、21～25塩基長、又は21～23塩基長、例えば21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、又は34塩基長であるsiRNAであってもよい。siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さであっても異なる長さであってもよい。siRNAは通常、3'末端に1～5塩基程度（典型的には、2塩基）のオーバーハングを有する。
　CLEC4A機能阻害物質は、常法により作製することができる。CLEC4A機能阻害抗体は、公知の抗体作製法に基づいて作製することができる。例えば、まず、抗体の結合対象の配列（CLEC4A中の標的配列）を含む抗原若しくはその配列からなる抗原（例えば、CLEC4Aの標的配列を含む部分配列と、免疫グロブリンFc分子のような他のタンパク質との、融合タンパク質）、又はその抗原を細胞表面に発現する細胞等を、動物の皮下、足蹠、腹腔内等に投与して免疫する。抗原は、任意のアジュバントと共に投与することが好ましい。抗原の投与は１回でもよいが、複数回（例えば、２回～５回）行うことが好ましい。免疫後、免疫細胞（例えば、リンパ節細胞、又は脾臓細胞）を通常の細胞融合法によって公知の親細胞（例えば、ミエローマ細胞）と融合させ、融合細胞を得る。融合相手の親細胞は、免疫細胞と同じ生物種に由来することが好ましい。融合相手の親細胞として用いられるマウス由来のミエローマ細胞としては、P3U1（P3-X63Ag8U1）、P3（P3x63Ag8.653）、P3x63Ag8U.1、NS-1、MPC-11等が挙げられるが、これらに限定されない。
　免疫細胞と親細胞との細胞融合は、例えば、ケーラーとミルステインの方法（Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981)73, 3-46）等に準じて行うことができる。具体的には、そのような細胞融合は、細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で実施される。細胞融合促進剤としては、例えば平均分子量1000～6000程度のポリエチレングリコール（PEG）（例えば、PEG4000）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤をさらに使用することもできる。免疫細胞と親細胞（ミエローマ細胞等）との使用割合は任意に設定することができる。
　得られた融合細胞を、目的の抗体の産生能についてスクリーニングし、クローン化することにより、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得することができる。そのハイブリドーマを培養して得られる培養上清から抗体を回収することによってCLEC4A機能阻害抗体を作製することができる。
　CLEC4A機能阻害抗体がポリクローナル抗体の場合には、上記のとおり免疫した動物から血清を採取することにより取得することができる。この場合、免疫する動物として、ヒト抗体産生動物を用いることができる。
　CLEC4A機能阻害抗体は、さらに、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させることにより、組換え抗体としても製造することができる。具体的には、抗体の可変領域（V領域）のcDNAを抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、発現ベクターの発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御下へ組み込み、その発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、宿主細胞により抗体を産生させることにより、CLEC4A機能阻害抗体を組換え抗体として作製することができる。
　一方、CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、公知の核酸合成法に基づいて作製することができる。例えば、ホスホロアミダイト法により、自動核酸合成機を使用して設計した配列の3'側から5'側に向かって核酸合成を行うことができる。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸はまた、短い複数の核酸断片に分けて合成し、それをアニーリングやライゲーション等により連結することによって作製してもよい。CLEC4A遺伝子発現抑制核酸は、CLEC4A遺伝子を鋳型としたPCR法を用いて合成してもよい。
　以上のようにして得られた抗体や核酸等は、公知の精製法により単離精製し、回収することができる。精製法としては、アフィニティ精製法、逆相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ゲル濾過、カラム精製、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）等、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記のCLEC4A機能阻害物質は、免疫チェックポイント阻害を引き起こすことができる。CLEC4A機能阻害物質は、CLEC4A機能阻害により、抗原提示細胞において免疫チェックポイント阻害を引き起こし、免疫チェックポイント分子が寄与する抗腫瘍免疫応答（がん免疫応答）抑制を解除し、抗腫瘍免疫応答を活性化し、有効な抗腫瘍免疫応答（がん免疫応答）を増強することができる。ここで免疫チェックポイント阻害が引き起こされる抗原提示細胞は、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現している抗原提示細胞であり、そのような抗原提示細胞としては、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお抗原提示細胞は、抗原を細胞表面上に提示してT細胞を活性化する細胞である。したがって本発明に係るCLEC4A機能阻害物質は、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害剤として用いることができる。
　本発明において免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化の標的となるがんは、任意のタイプのがんであってよい。
　本発明に係る免疫チェックポイント阻害剤は、CLEC4A機能阻害物質を有効成分として含むものであってよい。本発明に係る免疫チェックポイント阻害剤は、CLEC4A機能阻害物質を治療上有効量で含むことができる。
　本発明におけるCLEC4A機能阻害物質の免疫チェックポイント阻害作用（免疫チェックポイント阻害活性）や抗腫瘍免疫応答の活性化能は、CLEC4A機能阻害物質で処理した抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、当該CLEC4A機能阻害物質で処理しない場合と比較して、炎症性サイトカイン（例えば、IL-6、TNF-α、IL-12p40等）の産生量が増加する（好ましくは統計学的に有意に増加する）ことを指標として、評価することができる。より具体的には、CLEC4A機能阻害物質の免疫チェックポイント阻害作用や抗腫瘍免疫応答の活性化能の評価は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を、TLR4リガンドやTLR9リガンド等のTLRリガンド、例えば、LPS又はCpG-B ODN 1668等の存在下で、CLEC4A機能阻害物質を添加して培養し、培養液中のサイトカイン量を測定し、当該CLEC4A機能阻害物質で処理しない対照と比較することによって行うことができる。
　本発明はまた、CLEC4A機能阻害物質又はそれを含む免疫チェックポイント阻害剤を含有する、医薬組成物も提供する。本発明は、CLEC4A機能阻害物質又はそれを含む免疫チェックポイント阻害剤を含有する、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化（又は抗腫瘍免疫応答の誘導）のための医薬組成物（又は医薬）を提供する。本発明はまた、CLEC4A機能阻害物質又はそれを含む免疫チェックポイント阻害剤を含有する、がんの治療又は予防（例えば、がんの再発予防）のための医薬組成物（又は医薬）を提供する。これらの医薬組成物（又は医薬）は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害に基づくがんの治療又は予防のために有用である。
　本発明で治療又は予防の対象になるがん又は腫瘍としては、以下に限定されないが、悪性黒色腫、肺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、膀胱がん、膵がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、胆道がん、大腸がん、尿路上皮がん、膠芽腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、乳がん、悪性胸膜中皮腫、軟部肉腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、精巣原発リンパ腫等）、ウイルス陽性又は陰性固形がん、メルケル細胞がん等が挙げられる。
　本発明に係る免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物（又は医薬）は、製薬上許容される添加剤を含んでもよい。そのような添加剤としては、以下に限定されないが、担体、懸濁剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、pH調整剤等が挙げられる。添加剤は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、製剤の剤形に応じて適宜用いることができる。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、非経口又は経口投与などの任意の投与経路で投与することができるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、経鼻、経肺、又は腫瘍内に投与することができる。本発明に係るCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、全身投与又は局所投与してもよい。
　本発明は、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物を対象（患者）に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害方法も提供する。本発明はまた、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物を対象（患者）に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害に基づく、抗腫瘍免疫応答の活性化方法（又は抗腫瘍免疫応答の誘導方法）も提供する。本発明はまた、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害に基づくがんの治療又は予防方法も提供する。がんの予防方法は、がんの再発予防方法であってもよい。これらの方法において、免疫チェックポイント阻害は、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現している抗原提示細胞に対するものであることが好ましく、例えば、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等に対するものであることが好ましい。
　投与の対象は、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳動物由来であってよい。対象は、免疫チェックポイント分子による免疫抑制が生じているか又は生じている疑いのある対象であってよい。対象は、典型的には、がんを有するか又はがんを有する疑いのある対象であってよい。対象は、がん免疫治療法に不応性となっているか又はがん免疫治療法への応答性が低下している対象であってよい。そのようながん免疫治療法への不応性又は応答性の低下は、免疫チェックポイント、特に、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等の抗原提示細胞における免疫チェックポイントによって引き起こされるものであり得る。対象はまた、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子（CTLA-4、PD-1、PD-L1等）に対する阻害剤に対する不応性又は耐性を有するがんに罹患した患者であってもよい。
　投与方法は、対象（患者）の年齢、体重、性別、症状などにより、当業者が適宜選択することができる。CLEC4A機能阻害物質の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mg～1000mgの範囲で、及び／又は対象当たり0.001mg～100000mgの範囲で、投与量を設定することができるが、これらの範囲に限定されない。
　上記CLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物の対象への投与により、抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、炎症性サイトカインの産生が増強され、それがT細胞や他の免疫細胞の機能を活性化／増強し、抗腫瘍免疫応答を活性化（惹起）し、結果的に対象におけるがんの進展抑制や退縮がもたらされる。好ましい実施形態では、本発明のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、（i）リンパ組織及び／又はがん組織における、骨髄由来抑制細胞の誘導及び／又は集積の抑制、（ii）エフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、及び活性化樹状細胞の誘導及び／又は集積の促進、（iii）がん微小環境での免疫寛容の抑制、並びに（iv）抗腫瘍免疫応答の活性化の少なくとも１つをもたらすことができる。本発明のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物は、免疫関連有害事象（例えば、自己免疫疾患又は障害などの自己免疫病態、体重減少等）、特に、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子の阻害に起因する免疫関連有害事象を生じるリスクを低減しながら高い抗腫瘍効果をもたらすことができる。
　本発明では、上記のCLEC4A機能阻害物質、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれを含む医薬組成物の投与を含む、抗腫瘍免疫応答の活性化方法、又はがんの治療若しくは予防方法を、がんワクチン療法と併用してもよい。併用するがんワクチン療法の例としては、がん抗原（例えば、卵白アルブミン）とアゴニストTLRリガンドの組み合わせ、又はがん抗原（例えば、卵白アルブミン）とアゴニストTLRリガンドとアゴニスト抗CD40抗体との組み合わせを患者に投与する方法が挙げられる。アゴニストTLRリガンド（アゴニスト作用性TLRリガンド又はTLRアゴニストとも呼ばれる）としては、TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、及び／又は13等のアゴニストリガンド、例えば、CpG ODN 2006やCpG-B ODN 1668等の非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフ含有オリゴヌクレオチドであるアゴニストTLR9リガンドなどが挙げられる。ヒト対象への投与に好適なアゴニストTLRリガンドは、ヒトTLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10に対するアゴニストリガンドであり得る。
　さらに本発明は、上記のCLEC4A機能阻害物質、又は免疫チェックポイント阻害剤を、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+単球）等の抗原提示細胞を含む免疫細胞とがん細胞とを含む組織又は細胞集団に適用することを含む、in vitroでの免疫チェックポイントの阻害方法も提供する。
　本発明はまた、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能を利用した、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。本発明は、例えば、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を評価することを含む免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。具体的には、本発明は、例えば、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を測定し、被験物質で処理していない抗原提示細胞（被験物質で処理したものと同じ種類の、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞；対照）からのサイトカイン産生量と比較することを含み、好ましくは、炎症性サイトカイン産生量の増加が示された場合にその被験物質は免疫チェックポイント阻害作用を有するものと判断することを含む、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、基本的には、上述のCLEC4A機能阻害物質の免疫チェックポイント阻害作用の評価方法と同様に行うことができる。一実施形態では、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞、例えば、樹状細胞（例えば、末梢血単球由来樹状細胞、及び樹状細胞株DC2.4）、B細胞（例えば、CD19+B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等を、TLR4リガンドやTLR9リガンド等のTLRリガンド、例えば、LPS又はCpG-B ODN 1668等の存在下で、被験物質を添加して培養し、培養液中のサイトカイン（好ましくは、炎症性サイトカイン）量を測定し、その被験物質で処理していないこと以外は同様に培養した対照の抗原提示細胞について測定した培養液（例えば、培養上清）中のサイトカイン量と比較すればよい。炎症性サイトカインとしてはIL-6、TNF-α、IL-12p40等が挙げられる。サイトカイン量の測定は、常法により行うことができ、例えば、ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法、CBA（Cytometric Bead Array）法等を用いて行うことができる。対照と比較した炎症性サイトカイン産生量の増加は、好ましくは、統計学的に有意な増加である。このスクリーニング方法に供する被験物質は、任意の物質であってよく、例えば、タンパク質（抗体など）、核酸（siRNAなど）等であってよい。被験物質は、CLEC4Aタンパク質又はCLEC4A遺伝子を標的とするものであってもよい。「CLEC4Aタンパク質又はCLEC4A遺伝子を標的とする」とは、CLEC4Aタンパク質に結合するか、又はゲノム上のCLEC4A遺伝子若しくはCLEC4A遺伝子のmRNAに結合する、あるいは結合することが予測されることを意味する。スクリーニングに利用する抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球画分由来の抗原提示細胞（樹状細胞、B細胞、単球等）であってよい。樹状細胞の例としてマウスDC2.4株が挙げられる。CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞は、CLEC4A遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって作製されるトランスジェニック細胞であってもよい。CLEC4A遺伝子の抗原提示細胞への導入は、常法により行うことができ、例えば、CLEC4A遺伝子を発現する組換え発現ベクター（例えば、レトロウイルスベクター等のウイルスベクター）を用いて行うことができる。本スクリーニング方法における細胞培養は、抗原提示細胞の公知の培養方法を用いて実施することができる。本スクリーニング方法で選抜された被験物質は、抗原提示細胞に対して免疫チェックポイント阻害を引き起こすために用いる候補薬剤であってよく、好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤に利用することができる。
　一実施形態では、サイトカイン産生量を指標とする上記のスクリーニング方法は、抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニングの工程を、さらに含んでもよい。そのような、抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニングにおいては、例えば、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を、被験物質（例えば、抗体）によりin vitroで処理し、続いて、当該抗原提示細胞（具体的には、当該抗原提示細胞上のCLEC4Aタンパク質）と被験物質との結合性（反応性）を検出してもよい。検出された結合性に基づき、CLEC4Aタンパク質に結合する被験物質（例えば、抗体）を、スクリーニングすることができる。この抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニング方法においては、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現させた抗原提示細胞（例えば、CLEC4A遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって作製されるトランスジェニック細胞）と、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現していない抗原提示細胞（例えば、上記トランスジェニック細胞の親株である抗原提示細胞）との混合細胞（典型的には、1.1:1～1:1.1、例えば、約1:1の細胞数の混合比で調製した混合細胞系）を、被験物質で処理してもよく、それによりスクリーニング反応系を１つにまとめることができ、スクリーニング工程を効率化することができる。抗原提示細胞と被験物質との結合性に基づくスクリーニングによって選抜された被験物質は、CLEC4Aタンパク質を標的とするものであり、免疫チェックポイント阻害作用を有する可能性が高いと判断することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、下記実施例ではフローサイトメトリー法を以下のとおり実施した。
＜フローサイトメトリー法＞
　フローサイトメトリー解析における細胞の染色には、以下の蛍光標識モノクローナル抗体を用いた。
　抗マウスCD3ε抗体（クローン145-2C11; BD Biosciences）、抗マウスCD4抗体（クローンRM4-5; BD Biosciences）、抗マウスCD8α抗体（クローン53.6.7; BD Biosciences）、抗マウスCD11b抗体（クローンM1/70; Biolegend）、抗マウスCD11c抗体（クローンHL3; BD Biosciences）、抗マウスCD40抗体（クローン3/23; BD Biosciences）、抗マウスCD44抗体（クローンIM7; BD Biosciences)、抗マウスCD80抗体（クローン16-10A1; BD Biosciences）、抗マウスCD86抗体（クローンGL1; BD Biosciences）、抗マウスCD62L抗体（クローンMEL-14; Biolegend）、抗マウスB220（抗体クローンRA3-6B2; BD Biosciences）、抗マウスF4/80抗体（クローンBM8; Biolegend）、抗マウスNK1.1抗体（クローンPK136; BD Biosciences）、抗マウスMHCクラスI抗体（クローンAF6-88.5; BD Biosciences）、抗マウスMHCクラスII抗体（クローンM5/114.15.2; BD Biosciences）、抗マウスB7-H1抗体（クローンMIH5; eBioscience）、抗マウスB7-DC抗体（クローンTY25; eBioscience）、抗マウスB7-H2抗体（クローンHK5.3; eBioscience）、抗マウスSiglecH抗体（クローン551; Biolegend）、抗マウスGr-1抗体（クローンRB6-8C5; Biolegend）、抗マウスClec4A4抗体(クローン33D1; Biolegend)、抗マウスIFN-γ抗体（クローンXMG1.2; BD Biosciences）、又は対照ラットIgG抗体（BD Biosciences）。
　抗ヒトCD3抗体（クローンUCHT1; TOMBO）、CD8α（クローンSK1; BD Biosciences）、抗ヒトCD11c抗体（クローン3.9; TOMBO）、抗ヒトCD14抗体（クローン61D3; TOMBO）、抗ヒトCD19抗体（クローンHIB19; TOMBO）、抗ヒトCD56抗体（クローンMY31; TOMBO）、抗ヒトCD1c抗体（クローンL161; Biolegend）、抗ヒトCD40抗体（クローン5C3; BD Biosciences）、抗ヒトCD80抗体（クローンL307.4; BD Biosciences）、抗ヒトCD86抗体（クローンIT2.2; BD Biosciences）、抗ヒトCD141抗体（クローンM80; Biolegend）、抗ヒトCD303抗体（クローン201A; Biolegend）、抗ヒトHLA-DR抗体（クローンL243; Biolegend）、抗ヒトCLEC4A抗体（クローン9E8; Biolegend）、又は対照マウスIgG抗体（BD Biosciences）。
　細胞表面分子の染色は、細胞（1～5 x 105個）を、蛍光標識モノクローナル抗体と共に4℃で30分インキュベートすることにより染色した。
　なお一部のフローサイトメトリー解析では、細胞の染色に、蛍光標識モノクローナル抗体の代わりに、以下の蛍光標識したMHC-ペプチド複合体を用いた：マウスH-2Kb OVAペプチドペンタマー、及びヒトHLA-A*02:01 Mart-1ペプチドテトラマー（MBL）。
　細胞内染色は、上述の細胞表面分子の染色後、OVA257-264ペプチド（アミノ酸配列SIINFEKL（配列番号１４）; 10μM）とタンパク質輸送インヒビターGolgiPlugTM（BD Biosciences）を添加して37℃で２時間刺激し、固定透過化液（Fixation-Permeabilization solution）（BD Cytofix/Cytoperm kit; BD Biosciences）を用いて4℃で20分間、固定及び透過処理した後、蛍光標識モノクローナル抗体を添加して4℃で30分インキュベートすることにより染色した。
　蛍光染色解析はFACSVerseTMフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowJoソフトウェア（Tree star）を用いて行った。
　また、下記実施例で得られたデータについて、統計学的解析は以下のとおり行った。
＜統計学的解析＞
　データの統計学的有意差の解析は分散分析（analysis of variance: ANOVA）を用いた。P値が0.01未満のものを有意とした。図中のデータは平均値（±標準偏差）で示した。
［実施例１］
１）マウス
　本実施例では、野生型（WT）マウスとして、C57BL/6マウス（Japan Clea）を用いた。非特許文献４の記載に従い、C57BL/6マウスを用いて、Clec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-マウス）を作製した。Clec4A4欠損マウス（系統名B6.Cg-Clec4a4<tm1.1Ksat>）は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター（RIKEN BRC; 日本）にアクセッション番号RBRC09657の下で寄託され、入手可能である。なおClec4A4は、CLEC4Aのマウスオルソログである。
２）非担がんマウスモデルのがんワクチン接種後の免疫応答
　WTマウス、及びClec4A4欠損マウスに、がんワクチンとして卵白アルブミン（OVA）（500 μg/1匹; Sigma-Aldrich）、Toll様受容体（Toll-like receptor; TLR）9リガンドであるCpG-B ODN 1668（50 μg/1匹; Hokkaido System Science）、及びアゴニスト抗CD40抗体（10 μg/匹; クローン1C10; Biolegend）を腹腔内投与して免疫した。免疫後6日目に、脾臓におけるOVA特異的細胞傷害性T細胞（CTL）（CD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞）及びOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。対照として、ワクチン接種していないWTマウス及びClec4A4欠損マウスの脾臓についても同様の細胞解析を行った。
　WTマウスでは、ワクチン非接種群と比較して、がんワクチン（OVA、CpG-B ODN 1668、アゴニスト抗CD40抗体）免疫群において抗原特異的CTLであるCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞（図１Ａ及びＢ）と抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞（図２Ａ及びＢ）の誘導が増強されていることが示された。一方、Clec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、抗原特異的CTLと抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞が誘導されただけでなく、WTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、抗原特異的CTLと抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞の誘導が著しく増強された（図１、図２）。
３）担がんマウスモデルのがん進展評価及びがんワクチン接種後の免疫応答
　WTマウス、及びClec4A4欠損マウスの背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞/1匹）することにより、担がんマウスを作製した。がんの進展は、担がんマウスの腫瘍体積をがん移植後23日目まで毎日、デジタルキャリパー（Digimatic Caliper, Mitutoyo）を用いて測定し、それを指標として評価した。
　担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスに対し、がん細胞移植後7日目に、がんワクチンを腹腔内投与して免疫した。がん細胞移植後13日目に、OVA特異的CTLであるCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞、及びOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。
　担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスでは、非担がん状態のWTマウス及びClec4A4欠損マウスと比較して、がんワクチン免疫群での抗原特異的CTL及び抗原特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導が増強された（図１、図２）。さらに、担がんClec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、抗原特異的CTL及び抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞の誘導が著しく増強された（図１、図２）。
　がん細胞移植後15日目以降、担がんWTマウス（ワクチン非接種）と比較して、担がんClec4A4欠損マウス（ワクチン非接種）では、免疫関連有害事象の発生を示さずに、がん進展が著しく抑制された（図３Ａ～Ｃ）。一方、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群では、がん細胞移植後15日目以降、がん退縮が明らかに認められた。さらに、担がんClec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、がん細胞移植後23日目にはがんワクチンのがん進展抑制効果の亢進が認められた（図３）。
　以上の結果から、マウスClec4A4は樹状細胞上に発現する、免疫チェックポイント分子であり、抗腫瘍免疫応答にブレーキをかける働きをしていることが示された。また
４）担がんマウスモデルにおける免疫応答
　WTマウス、及びClec4A4欠損マウスの背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞/1匹）することにより、担がんマウスを作製した。がん細胞移植後20日目に、担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスの脾臓及びがん組織における各種免疫細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。なお、非担がんマウス及び担がんマウスの脾臓単核球は脾臓細胞を赤血球溶解バッファー（Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxTM; Sigma-Aldrich）を用いて調製した（非特許文献４）。担がんマウスの脾臓単核球及びがん組織の調製はがん細胞移植後20日目に行った。対照として、非担がんWTマウス及び非担がんClec4A4欠損マウスにおいても同様にフローサイトメトリー法による解析を行った。解析の結果を図４～８に示す。
　担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、脾臓（図４Ａ）とがん組織（図４Ｂ）におけるGr1-1+CD11b+F4/80+骨髄由来抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells; MDSCs）の増加の抑制が認められた。
　また担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、がん組織におけるCD11c+Siglec-H-cDCs（通常型樹状細胞）とCD11clowSiglec-H+pDCs（形質細胞様樹状細胞）の集積亢進が認められた（図４Ｂ）。
　さらに、担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、がん組織における腫瘍浸潤CD4+/CD8+リンパ球（T細胞）（tumor-infiltrating lymphocytes; TILs）や、NK1.1+NK細胞の集積亢進が認められた（図４Ｂ）。
　担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のGr1-1+CD11b+F4/80+MDSCsの増加が認められるとともに（図４Ａ）、がん組織での顕著な集積が認められた（図４Ｂ）。
　担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のCD44+CD62L-エフェクターCD4+T細胞の増加が認められた（図５Ａ）が、CD8+ T細胞のその増加は認められなかった（図５Ｂ）。一方、担がんClec4A4欠損マウスでは、担がんWTマウスと比較して、脾臓（図５）とがん組織（図６）におけるCD44+CD62L-エフェクターCD4+T細胞/CD8+ T細胞の増加が認められた（Ａ: CD4+ T細胞、Ｂ: CD8+ T細胞）。
　担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のcDCsにおけるMHC I、CD40、CD80、B7-H1、及びB7-H2の発現低下が認められた（図７）。一方、担がんClec4A4欠損マウスでは、非担がんClec4A4欠損マウスと比較して、脾臓中のcDCsにおけるMHC I、CD80、CD86、B7-H1、及びB7-H2の発現増強が認められた（図７）。
　さらに、担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは脾臓cDCsにおけるMHCクラスI（MHC I）、CD80、CD86、B7-H1、及びB7-H2の発現増強が認められた（図７）。
　また担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは腫瘍浸潤cDCsにおけるMHC I、MHCクラスII（MHC II）、CD80、CD86、及びB7-H1の発現増強と、B7-H2及びB7-DCの発現低下が認められた（図８）。
　担がんClec4A4欠損マウスでは、担がんWTマウスと比較して、がん組織におけるcDCsのMHC I、MHC II、CD80、CD86、及びB7-H1の発現増強と、B7-H2及びB7-DCの発現低下が認められた（図８）。
　以上の解析結果から、Clec4A4による樹状細胞機能阻害は、リンパ組織とがん組織における、骨髄由来抑制細胞の誘導と集積の促進、並びにエフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、及び活性化樹状細胞の誘導と集積の抑制に基づいてがん微小環境での免疫寛容原性を誘発し、抗腫瘍免疫応答を抑制することにより、がん進展を促進することが示された（図４～図８）。上記解析結果は、Clec4A4機能の阻害が、抗腫瘍免疫応答の活性化、及びがん抑制につながることを示している。
　さらに、マウスにおいてClec4A4欠損によりがん免疫応答が増強し、がん進展が抑制されることから、Clec4A4は樹状細胞に発現し、がん免疫（自己免疫）応答を制御する「免疫チェックポイント分子」であることが証明された。
［実施例２］
　ヒト末梢血（健常人末梢血）から、末梢血単核球を、Ficoll-PaqueTM PLUS（GE Healthcare Life Sciences）を用いた比重遠心法により分離した。分離した末梢血単核球画分から、末梢血単球を、単球単離キットII（Monocyte Isolation Kit II; Miltenyi Biotec）及び細胞分離装置autoMACS(R) Pro Separator（Miltenyi Biotec）を用いて精製した。
　非特許文献３に記載の方法に従い、取得したヒト末梢血単球をヒト組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（50 ng/ml、Wako）とヒト組換えIL-4（100 ng/ml、Wako）の存在下で1週間培養することにより、ヒト末梢血単球由来樹状細胞を作製した。また、非特許文献３に記載の方法に従い、取得したヒト末梢血単球をヒト組換えGM-CSF（50 ng/ml、Wako）、ヒト組換えIL-4（100 ng/ml、Wako）、ヒト組換えIL-10（50 ng/ml、Wako）、及びヒト組換えTGF-β1（50 ng/ml、Wako）の存在下で1週間培養することにより、ヒト末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞を作製した。末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞はがん環境で生成することが知られている。
　健常人から得られた末梢血単核球画分中の、CD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD14+単球、CD11c+樹状細胞、CD56+ナチュラルキラー（NK）細胞におけるCLEC4Aの発現を上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞における細胞表面分子（CLEC4A）の発現を図９Ａにヒストグラムで示す。
　末梢血単核球画分においてCLEC4Aの発現はCD3+ T細胞やCD56+ NK細胞では認められず、CD19+B細胞、CD14+単球、CD11c+樹状細胞では認められた（図９Ａ）。さらに、CD14+単球とCD11c+樹状細胞は、CD19+ B細胞と比較してCLEC4Aについてより高い発現を示した（図９Ａ）。
　健常人から得られた末梢血単核球画分中の、CD141+cDC1細胞、CD1c+cDC2細胞、CD303+pDC細胞におけるCD11c、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現を上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子（CD141、CD1c、CD303、CD11c、HLA-DR、及びCLEC4A）の発現を図９Ｂにヒストグラムで示す。
　健常人由来の末梢血単核球画分中の末梢血樹状細胞亜集団において、CD1c+CD11c+HLA-DR+cDC2細胞は、CD141+CD11c+HLA-DR+cDC1細胞、及びCD303+CD11c-HLA-DR+pDC細胞と比較して、CLEC4Aについてより高い発現を示した（図９Ｂ）。なお、フローサイトメトリー解析で得られた、CD1c+末梢血単核球をcDC2、CD141+末梢血単核球をcDC1、CD303+末梢血単核球をpDCとした。
　さらに、健常人から得られた末梢血単球、作製された末梢血単球由来樹状細胞（図中、単球由来DC）、及び末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞（図中、単球由来DCreq）におけるCD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現を図９Ｃにヒストグラムで示す。
　末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞は、末梢血単球由来樹状細胞と比較して、CD11c、CD86、HLA-DRについてより低い発現を示したが、CLEC4Aについては同等に高い発現を示した（図９Ｃ）。
　マウスにおいてClec4A4の発現はCD1c+末梢血単核球（cDC2）にのみ限定されるが（非特許文献４）、ヒトにおいてはcDC2がCD141+末梢血単核球（cDC1）やCD303+末梢血単核球（pDC）よりも高いCLEC4A発現を示すとともに、単球やB細胞でもCLEC4A発現が認められた。また、がん環境で生成される免疫抑制性樹状細胞（非特許文献３、及びNagayama H., et al., Melanoma Res., (2003) 13, pp.521-530）においてもCLEC4Aの発現が認められた。これらの結果からヒトにおいてCLEC4Aは抗原提示細胞に発現する機能制御分子であると考えられた。
［実施例３］
　CLEC4Aタンパク質の全長（配列番号２; NCBIアクセッション番号NP_057268.1; M1-L237; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１）の5'末端にBamHI認識配列（5'-ggatcc-3'）、3'末端にXhoI認識配列（5'-ctcgag-3'）を付加したcDNA（配列番号１１）を、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。
　同様に、CLEC4AのITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif））配列欠損変異体（配列番号４; ΔI5-V10; 231アミノ酸長）、CLEC4Aの細胞外領域欠損変異体（配列番号６; ΔF69-L237; 68アミノ酸長）、CLEC4Aの糖鎖認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain; CRD）欠損変異体（配列番号８; ΔE195-S197; 234アミノ酸長）、及びCLEC4Aの糖鎖修飾部位置換変異体（配列番号１０; N185Q; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（それぞれ、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９）の5'末端にBamHI認識配列、3'末端にXhoI認識配列を上記と同様に付加したcDNAを、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。
　次にこれらcDNAを、制限酵素BamHI及びXhoIで処理して、pMX-IRES-GFPレトロウイルスベクターのマルチクローニングサイト中のBamHI-XhoI部位に導入し、CLEC4A又は変異体発現レトロウイルスベクターを作製した。さらに、これらのレトロウイルスベクター、又は対照レトロウイルスベクター（CLEC4A又は変異体コード配列を含まない）を、レトロウイルスパッケージング細胞（Phoenix）にLipofectAMINE Plus Reagent（Life Technologies）を用いて感染させ、24時間後に培養上清からレトロウイルスを採取し、遠心法（8,000 g、16時間、4℃）により濃縮した。
　得られたレトロウイルスを、マウス樹状細胞株DC2.4（Shen Z, et al., J. Immunol., (1997) 158:p.2723-2730）に対し、DOTAPリポソーム性トランスフェクション試薬（DOTAP Liposomal Transfection Reagent; Roche）の2日間処理により感染させた。得られた細胞から、GFP発現を指標として、FACSAriaTMIIセルソーター（BD Biosciences）を用いてトランスジェニック細胞株を精製分離した。
　分離したトランスジェニック細胞株（CLEC4A発現細胞株又はCLEC4A変異体発現細胞株、対照レトロウイルス感染細胞株）、及びマウス樹状細胞株DC2.4における、GFP及びCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。
　マウス樹状細胞株DC2.4（図中、DC2.4）、対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）、及びCLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を、図１０Ａにドットプロットで示す。
　糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）、CRD欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を、図１０Ｂにドットプロットで示す。
　マウス樹状細胞株DC2.4、対照レトロウイルス感染細胞株、CLEC4A発現細胞株、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株、CRD欠損変異体発現細胞株、細胞外領域欠損変異体発現細胞株、及びITIM配列欠損変異体発現細胞株を、48ウェル培養プレート（BD Bioscience）にそれぞれ播種し、TLR4リガンドであるリポ多糖（LPS; 0.1 μg/ml; Sigma-Aldrich）又はTLR9リガンドであるCpG-B ODN 1668（0.1 μM）を刺激のために添加して16時間培養した後、培養上清中のIL-6（インターフェロン-6; eBioscience）とTNF-α（腫瘍壊死因子-α; eBioscience）の量をELISA法により測定した。対照として、同じ細胞株を、リポ多糖もCpG-B ODN 1668も添加せず無刺激で16時間培養後、同様に培養上清中のIL-6及びTNF-αの量をELISA法により測定した。その結果を図１１に示す。
　対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）と比較して、CLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）では、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生が著しく減弱した（図１１）。
　CLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）と比較して、CRD欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）では、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生が著しく亢進し、これらの産生量は対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）とほぼ同等であった（図１１）。これらの細胞株に導入されたCLEC4A変異体はCLEC4A活性を保持しないことが示された。
　一方、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）では、CLEC4A発現細胞株と比較して、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生の部分的な増強が認められた（図１１）。この糖鎖修飾部位置換変異体は、CLEC4A活性を部分的に保持していると考えられた。樹状細胞機能の抑制をもたらすClec4A4の自己分子（内/間）結合には、CRD内の185位（N-186）におけるN-結合型糖鎖が必要とされている。
　以上の結果から、CLEC4Aは抗原提示細胞の機能制御分子であり、樹状細胞などの抗原提示細胞におけるCLEC4Aの機能制御の分子基盤には、その細胞外領域の糖鎖認識ドメイン（CRD）と修飾糖鎖との会合を介した自己分子（内/間）結合に基づくITIM依存性抑制性シグナル経路が関与しており、当該経路の誘導によりサイトカイン産生能及びT細胞活性化能が抑制されることが示された。すなわちCLEC4Aの機能制御活性には、細胞外領域、CRD、及びITIM配列が重要であることが示された。
［実施例４］
１）可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子の作製
　CLEC4A細胞外領域（配列番号１２; F69-L237; 169アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１の205～711位の塩基配列に相当）の5'末端にBamHI認識配列（5'-ggatcc-3'）、3'末端にEcoRV認識配列（5'-gatatc-3'）を付加したcDNAを、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。次に、得られたcDNAを、制限酵素BamHI及びXhoIで処理して、マウスIgFcキメラ分子発現ベクター（pFUSEN-mG2A-Fcベクター; InvivoGen）のマルチクローニングサイト中のBamHI-EcoRV部位に導入し、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子発現ベクターを作製した。可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子発現ベクターを、293fectinTMトランスフェクション試薬（293fectinTM Transfection Reagent; Life Technologies）を用いてFreeStyleTM 293-F細胞（Life Technologies）に遺伝子導入した。続いて遺伝子導入細胞を培養し、培養上清より、HiTrapTMProtein G HP（GE Healthcare Life Sciences）を用いて可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子を精製した。
２）抗CLEC4A抗体の作製
　上記で作製した可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（12.5 μg/１匹）及びTiterMax(R) Gold Adjuvant（27.5 μl/1匹; Sigma-Aldrich）を用いて、マウスの足蹠に対し2週間隔で2回免疫した。さらに、初回免疫後31日目にマウスの尾静脈内へ可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（25 μg/１匹）を投与した。初回免疫後34日目にマウスのリンパ節を採取し、得られたリンパ節細胞と、P3U1ミエローマ細胞株を、ポリエチレングリコール4000（Wako）を用いて融合し、ハイブリドーマを作製した。480クローンのハイブリドーマを得た。
３）抗体のスクリーニング
　作製したハイブリドーマの培養上清について、CLEC4A発現細胞株に対する反応性を指標とし、二次抗体であるR-フィコエリスリン標識F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、上記フローサイトメトリー法により、抗体クローンのスクリーニングを行った。
　具体的には、作製したハイブリドーマの培養上清を、マウス樹状細胞株DC2.4と実施例３で作製したCLEC4A発現細胞株（CLEC4A-GFP）の混合細胞（混合比１：１）に添加し、抗体と細胞の反応性を上記フローサイトメトリー法により調べた。なお混合細胞系を使用することにより、マウス樹状細胞株DC2.4（親株）とCLEC4A発現細胞株のそれぞれに対する反応性を一度に解析することが可能になる。図１２Ｂに、CLEC4A発現細胞株に対する抗体クローンの反応性の例を、GFP及びCLEC4Aの発現量のドットプロットで示す。
　同様に、対照マウスIgG抗体又は抗CLEC4A抗体（クローン9E8）を、マウス樹状細胞株DC2.4と実施例３で作製したCLEC4A発現細胞株（CLEC4A-GFP）の混合細胞（混合比１：１）に添加し、抗体と細胞の反応性を上記フローサイトメトリー法により調べた。図１２Ａに、GFP及びCLEC4Aの発現量のドットプロットで示す。
　このようにして、CLEC4A発現細胞株に特異的な反応を高レベルで示した４０個のクローンを樹立した。高反応性クローンとして選択されたハイブリドーマの培養上清から、HiTrapTM Protein G HPを用いて、マウス抗CLEC4A抗体を精製した。得られた抗CLEC4A抗体を、CLEC4A機能阻害作用、及び樹状細胞に対する免疫チェックポイント阻害作用について試験した。
［実施例５］
　本実施例ではCLEC4A機能阻害抗体のCLEC4A機能制御活性及びCLEC4A結合阻害活性を試験した。
　実施例２で得られた末梢血単球由来樹状細胞（1x105細胞）を、96ウェル培養プレートに播種し、対照マウスIgG抗体（cont. Ig）（10 μg/ml; Sigma-Aldrich）若しくはマウス抗ヒトCLEC4A抗体（10 μg/ml）の存在下又は非存在下にてLPS（0.1 ng/ml）で刺激して16時間培養した後、培養上清中のIL-6量をELISA法により測定した。結果の例を図１３Ａに示す。図中の黒の水平線は対照マウスIgG抗体（cont. Ig）の存在下でLPSで刺激した場合のIL-6産生値を示す。
　図１３Ａに示されるように、末梢血単球由来樹状細胞のLPSの刺激による炎症性サイトカインIL-6の産生は、抗CLEC4A抗体の非存在下（図中、LPS）及び対照マウスIgG抗体（図中、cont. Ig）の存在下と比較して、抗CLEC4A抗体（クローンB-71、A-77、及びB-23）の存在下では約1.5倍の増強が認められた。抗CLEC4A抗体B-71、A-77、及びB-23がCLEC4A機能阻害抗体として作用し、樹状細胞におけるCLEC4Aのサイトカイン産生誘導機能を制御（阻害）したと考えられた。なお抗体B-71、A-77、及びB-23はいずれも、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する。
　また、ヒトCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4（4x105細胞）を、対照マウスIgG抗体（100 μg/ml）若しくはマウス抗ヒトCLEC4A抗体（100 μg/ml）の存在下又は非存在下にて60分間培養した後、可溶型ヒトCLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（10 μg/ml）を添加して反応させた。その後、可溶型ヒトCLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する反応性（結合）を指標に、二次抗体であるR-フィコエリスリン標識F(ab')2断片ヤギ抗マウスIgG(H+L)を用いたフローサイトメトリー法により結合阻害率を解析した。結果の例を図１３Ｂに示す。図中の黒の水平線は80％結合阻害を示す。
　図１３Ｂに示されるとおり、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する結合が抗CLEC4A抗体（クローンB-71、A-77、及びB-23）により80％以上阻害された。それらの抗CLEC4A抗体は、樹状細胞株DC2.4の細胞表面上に発現したCLEC4Aと可溶型CLEC4Aとの結合阻害を引き起こしたと考えられ、CLEC4A機能阻害抗体として作用したことが示された。なお抗体B-71、A-77、及びB-23はいずれも、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する。
　以上の結果から、上記CLEC4A機能阻害抗体によるCLEC4Aの認識はその分子（内/間）結合を阻害することによりITIM依存性抑制性シグナル経路を抑制し、すなわちCLEC4Aの免疫チェックポイント機能を制御することにより、樹状細胞の活性化機能変換を誘導することが証明された。
［実施例６］
　融合タンパク質CLEC4A-CD3ζ（配列番号１６）をコードするDNA配列の5'末端にEcoRI認識配列、3'末端にXhoI認識配列を付加したcDNA（配列番号１５）はGeneArt(R)（Thermo Fisher Scientific）により合成した。CLEC4A-CD3ζをコードするDNA配列は、マウスCD3ζ細胞内領域（NCBI: NP_001106862.1; R52-R164; 113アミノ酸長）をコードするDNA配列に開始コドン（ATG）を付加し、かつ終止コドン（TAA）を削除した配列（M1-R114; 114アミノ酸長）の5'末端側に、ヒトCLEC4Aの細胞外領域と細胞膜貫通領域（L46-L237; 192アミノ酸長）をコードするDNA配列を連結したものである。
　合成したcDNAをpMX-IRES-CD8αレトロウイルスベクター（非特許文献４）のマルチクローニングサイト中のEcoRI-XhoIサイトに導入し、CLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスベクターを作製した。このCLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスベクター又は対照レトロウイルスベクター（pMX-IRES-CD8α）をレトロウイルスパッケージング細胞Phoenix（Kitamura T., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA,(1995) Vol.92, pp. 9146-9150、及び非特許文献４）へLipofectAMINE PlusTM Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて感染させ、24時間後に培養上清からCLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスを回収し、遠心法（8,000 g、16時間、4℃）により濃縮した。
　マウスT細胞株2B4にNFAT-GFPコンストラクトを導入することにより作製されたNFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（Ohtsuka M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., (2004) 101:8126-8131）に、得られたCLEC4A-CD3ζ発現レトロウイルスをDOTAP Liposomal Transfection Reagent（Roche）を用いて2日間感染させた。上記のNFAT-GFPコンストラクトは、３つのタンデムNFAT（nuclear factor of activated T cells; 活性化T細胞核因子）結合部位を含むDNA配列を、増強GFP（緑色蛍光タンパク質）コードcDNAの5'側に融合させることにより作製したものである。感染後、CLEC4A発現を指標にCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株をFACSAriaTM IIセルソーター（BD Biosciences）を用いて精製分離した（非特許文献４）。
　得られたCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（1x105細胞）又は上記のNFAT-GFPレポーターマウスT細胞株（対照T細胞株）を、対照マウスIgG抗体（10 μg/ml）若しくはマウス抗ヒトCLEC4A抗体（10 μg/ml）の存在下又は非存在下にて24時間培養した後、GFPの発現とCLEC4Aの細胞表面上の発現を、GFP蛍光又はマウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローン9E8; Biolegend）を用いたフローサイトメトリー法により解析した。
　その結果を図１４に示す。対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下で、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株では、GFPの恒常的な発現が認められたが、対照T細胞株ではGFPの発現は認められなかった（図１４Ａ）。NFATは、セリンスレオニンホスファターゼであるカルシニューリンの基質であり、カルシニューリンにより脱リン酸化（活性化）された後、核内に移行して遺伝子を活性化する転写因子である。NFATは、サイトカインの産生を誘導し、リンパ球を活性化することから、リンパ球活性化の指標として用いられている。CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株では、細胞表面上のCLEC4Aが結合相手と結合すると、CD3ζ介在性下流シグナルが惹起されることにより最終的にシグナル標的であるNFATが活性化され、活性化NFATがGFPの発現を誘導すると考えられる。図１４Ａに示されるように、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株では、対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下でも恒常的なGFPの発現が認められたことから、CLEC4Aは恒常的な自己分子（内/間）結合によりITIM依存性抑制性シグナル経路を惹起することが証明された（図１４Ａ）。
　一方、図１４Ｂに示されるように、対照マウスIgG抗体及びマウス抗ヒトCLEC4A抗体の非存在下（無処理）（GFP発現陽性率23.8％）又は対照マウスIgG抗体の存在下（図中、cont. Ig; GFP発現陽性率24.0％）のCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターマウスT細胞株と比較して、マウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71、A-77、及びB-23; いずれもヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する）の存在下のCLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターT細胞株では恒常的なGFPの発現が低減した。したがって抗ヒトCLEC4A抗体B-71、A-77、及びB-23は、CLEC4A機能阻害抗体として作用し、CLEC4A介在性のITIM依存性抑制性シグナル経路を抑制することが示された。なお、CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターT細胞株における抗体9E8を用いたフローサイトメトリーによるCLEC4Aの検出量が抗体A-77、及びB-23の存在下で低減したことから、これらの抗体が認識するエピトープ配列は同一又は近似していることが示された（図１４Ｂ）。
　CLEC4A-CD3ζ発現NFAT-GFPレポーターT細胞株は、免疫チェックポイント阻害剤のin vitro評価系として有用であることも示された（図１４）。
［実施例７］
１）MART-1特異的CTL誘導
　ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性; 107細胞）を、対照マウスIgG抗体（cont. Ig; 10 μg/ml）又はマウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71、10μg/ml）の存在下又は非存在下にてLPS（0.1μg/ml）、MART-1ペプチド（ELAGIGILTV（配列番号１７）; 10 μg/ml, MBL）、IL-2（50 U/ml; WAKO）、及びIL-7（10 ng/ml; WAKO）を添加し、35 mmディッシュ（Ultimate low cell binding surface, Thermo Scientific）上で1週間培養した。培養後、ヒト末梢血単核球中のMART-1特異的CTL（MART-1-MHCクラスIテトラマー結合CD8+ T細胞）の誘導を、フローサイトメトリー法により解析した。なおB-71抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域（配列番号１２）に特異的に結合する。
　MART-1ペプチドを添加したヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性）の培養では、対照抗体（cont. Ig）の処理と比較して、マウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71）の処理ではMART-1特異的CTL誘導の増強が認められた（図１５）。上記の抗CLEC4A抗体は、CLEC4A機能阻害抗体として作用し、がん抗原MART-1特異的CTLの誘導を増強することが示された。
２）担がん免疫系ヒト化マウスを用いたがん進展評価
　高度免疫不全ヒト化マウスであるNOJ（NOD/Scid/Jak3null）マウス（Okada S,, et al., Int. J. Hematol., (2008) 88, pp.476-482）へ、ヒト末梢血単核球（HLA-A2陽性; 107細胞）を対照マウスIgG抗体（cont. Ig; 100 μg）又はマウス抗ヒトCLEC4A抗体（クローンB-71、100 μg）とともに静脈内移植した。
　さらに、移植と同日に、ヒト悪性黒色腫細胞株（MEL-624, HLA-A2陽性及びMART-1陽性; Kawakami Y., et al., J. Immunol., (1992) 148, pp.638-643）をマウスの背部に皮下移植した（1x106細胞/1匹）。この担がん免疫系ヒト化マウスにおけるがん進展の評価は、がん移植後30日目まで経日的に腫瘍体積をデジタルキャリパーを用いて測定することにより行った。また、免疫関連有害事象の指標として、担がん免疫系ヒト化マウスの体重変化、飲水摂餌不良の有無、及び外見上変化（不動化、立毛等）をがん移植後30日目まで観察した。
　その結果、担がん免疫系ヒト化マウスにおいて、対照抗体（cont. Ig）と比較して、マウス抗ヒトCLEC4A抗体を投与した場合に顕著な腫瘍退縮効果が認められた（図１６Ａ及びＢ）。さらに、マウス抗ヒトCLEC4A抗体投与群では体重減少、飲水摂餌不良、及び外見上変化（不動化、立毛等）のような免疫関連有害事象の発生を認めなかった（図１６Ｂ、図１７）。抗CLEC4A抗体の投与により、免疫関連有害事象を誘発することなく、がん抗原特異的CTLの誘導を増強し、がん進展を抑制することが示された。したがって、CLEC4A機能阻害抗体は免疫関連有害事象を伴わない免疫チェックポイント阻害剤として有用であることが証明された。
　上述の実施例で示したとおり、CTLA-4欠損マウスやPD-1欠損マウスとは異なり、Clec4A4欠損マウスでは自己免疫様病態を自然発症しないこと、及び担がん免疫系ヒト化マウスにおいてCLEC4A機能阻害抗体は免疫関連有害事象を誘発しないことから、T細胞発現免疫チェックポイント分子に対する機能阻害で発生する免疫関連有害事象が、樹状細胞発現免疫チェックポイント分子CLEC4Aに対する機能阻害では著しく軽減されることが示された。したがってCLEC4A機能阻害物質は、投与する上で、安全性がより高いという利点を有する。
　以上の実施例の結果から、CLEC4Aは樹状細胞等の抗原提示細胞の機能を阻害することによりがん特異的T細胞応答を抑制し、がん進展を促進すると考えられた。また、CLEC4Aは樹状細胞等の抗原提示細胞に発現し、がん免疫（自己免疫）応答を負に制御する「免疫チェックポイント分子」であることが明らかになった。CLEC4A4の機能阻害は、免疫関連有害事象の発生を伴わずにがん特異的T細胞応答を増強するとともに、リンパ組織やがん組織での骨髄由来抑制細胞の誘導抑制とエフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、活性化樹状細胞の集積促進等に基づいてがん微小環境での免疫寛容の誘導を抑制し、有効ながん免疫応答を成立させることによりがん進展を抑制することが示された。したがって、CLEC4A機能阻害抗体等のCLEC4A機能阻害物質は、がん免疫療法に有利に利用できる。
　本発明は、免疫チェックポイント分子であるCLEC4Aの機能阻害を介して樹状細胞等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害を効果的に誘導し、抗腫瘍免疫応答を活性化することができる新たながん治療手段として用いることができる。
　配列番号１：全長CLEC4Aコード配列
　配列番号２：全長CLEC4Aタンパク質
　配列番号３：ITIM(I5-V10)欠損変異体コード配列
　配列番号４：ITIM(I5-V10)欠損変異体
　配列番号５：細胞外領域(F69-L237)欠損変異体コード配列
　配列番号６：細胞外領域(F69-L237)欠損変異体
　配列番号７：CRD(E195-S197)欠損変異体コード配列
　配列番号８：CRD(E195-S197)欠損変異体
　配列番号９：N185Q変異体コード配列
　配列番号１０：N185Q変異体
　配列番号１１：BamHI及びXhoI部位付加断片
　配列番号１２：CLEC4A細胞外領域(F69-L237)
　配列番号１３：CLEC4A ITIM配列(I5-V10)
　配列番号１４：OVA257-264ペプチド
　配列番号１５：CLEC4A-CD3ζコード配列
　配列番号１６：CLEC4A-CD3ζ
　配列番号１７：MART-1ペプチド
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (8)

  1. 　CLEC4A機能阻害物質を含む、免疫チェックポイント阻害剤。
  2. 　CLEC4A機能阻害物質が、CLEC4A機能阻害抗体、又はCLEC4A遺伝子発現抑制核酸である、請求項１に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  3. 　CLEC4A機能阻害抗体が、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域に結合する抗体である、請求項２に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  4. 　CLEC4A機能阻害抗体が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列又はその部分配列からなる領域に結合する、請求項２又は３に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  5. 　CLEC4A遺伝子発現抑制核酸が、CLEC4A遺伝子を標的とするsiRNAである、請求項２に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  6. 　CLEC4AがヒトCLEC4Aである、請求項１～５のいずれか１項に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫チェックポイント阻害剤を含む、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化のための医薬組成物。
  8. 　CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現する抗原提示細胞を被験物質によりin vitroで処理し、その抗原提示細胞からのサイトカイン産生量を測定し、被験物質で処理していない抗原提示細胞からのサイトカイン産生量と比較して、炎症性サイトカイン産生量の増加が示された場合にその被験物質は免疫チェックポイント阻害作用を有するものと判断することを含む、免疫チェックポイント阻害作用を有する物質のスクリーニング方法。
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