CN110621693A - 抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及通过靶向在细胞表面上表达抗原的细胞治疗疾病。特别地，本发明涉及重组抗原受体及其用途。工程化以表达这类抗原受体的T细胞可用于治疗疾病，所述疾病的特征在于表达一种或多种抗原，所述抗原被所述抗原受体结合。

Description

抗原受体及其用途
技术领域
本发明涉及重组抗原受体及其用途。工程化以表达这类抗原受体的T细胞可用于治疗疾病，所述疾病的特征在于表达抗原受体结合的一种或多种抗原。
背景技术
在人和动物中，T细胞在细胞介导的免疫中起中心作用。特定抗原的识别和结合由T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)介导。T细胞的TCR能够与结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子并呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致其增殖并分化为成熟的效应T细胞。
TCR是复杂的信号传导体系的一部分，所述信号传导体系包括TCRα-和β-链的异源二聚体复合物、辅助受体CD4或CD8以及CD3信号转导模块。TCRα/β异源二聚体负责抗原识别和与CD3协作转送激活信号通过细胞膜，而CD3链本身将传入的信号传递至细胞内的接头蛋白。因此，TCRα/β链的转移使T细胞有机会重新定向至任何目的抗原。
基于过继细胞转移(ACT)的免疫疗法可以宽泛地定义为一种被动免疫形式，用预先致敏的T细胞的从低前体频率离体扩大至临床相关细胞数量之后将其转移至非免疫受体或自体宿主。已用于ACT实验的细胞类型包括淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞(Mule,J.J.etal.(1984)Science 225,1487-1489；Rosenberg,S.A.et al.(1985)N.Engl.J.Med.313,1485-1492)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)(Rosenberg,S.A.et al.(1994)J.Natl.CancerInst.86,1159-1166)、造血干细胞移植(HSCT)之后的供体淋巴细胞以及肿瘤特异性T细胞系或克隆(Dudley,M.E.et al.(2001)J.Immunother.24,363-373；Yee,C.et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99,16168-16173)。过继T细胞转移显示出对人病毒感染如CMV具有治疗活性。对于黑色素瘤的过继免疫疗法，Rosenberg和同事建立了ACT方法，依靠分离自切除肿瘤经体外扩大的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的输注与非清髓性淋巴清除性化疗和高剂量IL2联合。一项临床研究结果显示经治疗的患有转移性黑色素瘤的患者～50％的客观应答率(Dudley,M.E.et al.(2005)J.Clin.Oncol.23:2346-2357)。
一种替代方法是在短期离体培养期间重新编程以表达具有特定特异性的肿瘤反应性免疫受体然后重新输注入患者体内的自体T细胞的过继转移(Kershaw M.H.et al.(2013)Nature Reviews Cancer 13(8):525-41)。这种策略使得ACT可应用于各种常见的恶性肿瘤，即便患者体内不存在肿瘤反应性T细胞。因为T细胞的抗原特异性完全依赖于TCRα-和β-链的异源二聚体复合物，克隆的TCR基因转移至T细胞中有可能将它们重新定向至任何目的抗原。因此，TCR基因疗法为开发以自体淋巴细胞作为治疗选择的抗原特异性免疫疗法提供有吸引力的策略。TCR基因转移的主要优点是在几天内产生治疗量的抗原特异性T细胞以及引入患者内源TCR库中不存在的特异性的可能性。几个组证实TCR基因转移是使原代T细胞的抗原特异性重新定向的有吸引力的策略(Morgan,R.A.et al.(2003)J.Immunol.171,3287-3295；Cooper,L.J.et al.(2000)J.Virol.74,8207-8212；Fujio,K.et al.(2000)J.Immunol.165,528-532；Kessels,H.W.et al.(2001)Nat.Immunol.2,957-961；Dembic,Z.et al.(1986)Nature 320,232-238)。在人体内使用TCR基因疗法的可行性最初由Rosenberg和他的组在治疗恶性黑色素瘤的临床试验中证实。经由逆转录病毒转导了黑色素瘤/黑素细胞抗原特异性TCR的自体淋巴细胞的过继转移在多达30％的经治疗的黑色素瘤患者中使癌症消退(Morgan,R.A.et al.(2006)Science 314,126-129；Johnson,L.A.et al.(2009)Blood 114,535-546)。与此同时，TCR基因疗法的临床试验还延伸至黑色素瘤以外的癌症，靶向许多不同的肿瘤抗原(Park,T.S.et al.,(2011)TrendsBiotechnol.29,550-557)。
使用基因工程方法将具有特定特异性的抗原靶向受体插入T细胞已极大地扩展了ACT的潜在能力。嵌合抗原受体(CAR)是一种类型的抗原靶向受体，其由融合至胞外抗原结合结构域(最常见的是来自单克隆抗体的单链可变区片段(scFv))的胞内T细胞信号传导结构域组成。CAR直接识别细胞表面抗原，独立于MHC介导的呈递，允许在所有患者中使用对任何给定抗原具有特异性的单一受体构建体。最初的CAR将抗原识别结构域融合至T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ激活链。随后的CAR迭代包括与CD3ζ串联的第二共刺激信号，包括来自CD28或各种TNF受体家族分子如4-1BB(CD137)和OX40(CD134)的胞内结构域。此外，第三代受体包括除CD3ζ以外的两个共刺激信号，最常见的是来自CD28和4-1BB。第二和第三代CAR在体外和体内显著提高抗肿瘤效力(Zhao et al.,(2009)J.Immunol.,(183)5563-5574)，在某些情况下在晚期癌症患者中诱导完全缓解(Porter et al.,(2011)N.Engl.J.Med.,(365)725-733)。
经典的CAR由抗原特异的单链抗体(scFv)片段组成，融合至跨膜和信号传导结构域，例如CD3ζ。引入T细胞后，其表达为膜结合蛋白并在结合至其同源抗原时诱导免疫应答(Eshhar et al.,(1993)PNAS,(90)720-724)。诱导的抗原特异的免疫应答造成细胞毒性CD8+ T细胞的活化，其转而导致表达特异性抗原的细胞的根除，如表达特异性抗原的肿瘤细胞或病毒感染的细胞。但是，这些经典的CAR构建体不通过它们的内源CD3复合物激活/刺激T细胞，这通常对T细胞活化是必要的。由于抗原结合结构域与CD3ζ的融合，通过生物化学“短路”诱导T细胞活化(Aggen et al.,(2012)Gene Therapy,(19)365-374)。T细胞的这种非生理性活化给通过这种方式治疗的患者带来风险，因为T细胞的过度活化可能导致不良副作用。例如，在体外已观察到由于CAR表达而引起的重组T细胞的长期基础活化(“强直信号传导”)，这导致在表达CAR的重组T细胞表面上抑制分子的积累增加，如LAG-3、TIM-3和PD-1，其转而导致过早耗尽的T-细胞，随后导致对体内抗肿瘤细胞反应的强烈负面影响(Long et al.,(2015)Nat.Med.,(21)581-590)。这种不良反应与scFv片段通过该抗体的框架残基不规则聚集有关。此外，虽然这种类型的经典CAR构建体已成功地针对不同瘤进行测试，如白血病(Porter et al.,(2011)N.Engl.J.Med.,(365)725-733)，但是由于正常组织中靶向抗原(靶向肿瘤抗原)的基础表达，它们还导致致命的自身免疫性疾病(脱靶效应(on-target/off-tumor-reaction)；Morgan et al.,(2010)Mol Ther.,(18)843-51)。
一种替代方法，其中通过更生理的机制来激活T细胞(Voss et al.,(2010)Blood,(115)5154-5163)，是提供类似单链TCR(scTv)片段与源自T细胞受体(TCR)的Cβ恒定结构域融合，并且其与TCR衍生的Cα恒定结构域共表达，后者招募重要的内源性CD3ζ同源二聚体(Call et al.,(2002)Cell,(111)967-79.)。但是，为了使这些构建体起到免疫系统激活剂的作用，它们的恒定结构域源自小鼠TCR或将它们的恒定区小鼠化是必要的(Cohen etal.,(2006)Cancer Res.,(66)8878-86；Bialer et al.,(2010)J.Immunol.,(184)
6232-41)，以便实现scTCR和Cα之间的链配对。这些构建体必须具有异基因序列才能发挥功能的事实增加了在给药时免疫系统会对它们产生反应的风险，并且损害或破坏它们的治疗效果。
因此，需要提供替代的重组抗原受体，其中，例如，抗原结合后，受体足以激活T细胞，其中所述受体以正常的生理方式通过内源CD3复合物表达，并且任选地，至少在抗原受体的信号传输结构域中不需要存在任何非人源氨基酸序列，其可以诱导针对重组抗原受体本身的不良免疫反应。
发明内容
本发明涉及具有至少两个抗原结合位点的重组抗原受体。所述抗原受体包含两条肽链。所述肽链每条包含至少两个结构域，除了T细胞受体链的可变区或其部分，以及免疫受体信号传输结构域，其中一条肽链上的两个结构域中的每个都与另一条肽链上的结构域之一形成抗原结合位点。在一实施方案中，本发明的抗原受体具有T细胞受体的结构，其中其链各自包含形成抗原结合位点的所述至少两个结构域，优选在T细胞受体链的N末端。
在一方面，本发明涉及抗原受体，所述受体包含第一肽链和第二肽链，其中所述第一肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域；第二肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域；其中来自所述第一肽链的第一结构域连同来自所述第二肽链的结构域中的一个形成第一抗原结合位点，并且其中来自所述第一肽链的第二结构域连同来自所述第二肽链的结构域中的另一个形成第二抗原结合位点。在这个方面的抗原受体中，形成各抗原结合位点的结构域优选位于不同肽链上。结果，抗原结合位点由结构域的分子间相互作用形成。
在一实施方案中，所述第一和/或第二结构域各自包含免疫球蛋白链的可变区或T细胞受体链的可变区或可变区的一部分。
在一实施方案中，形成第一抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，并且形成第一抗原结合位点的另一结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分。在一实施方案中，形成第二抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，并且形成第二抗原结合位点的另一结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分。
在一实施方案中，来自第一肽链的第一结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，并且来自第二肽链的结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分，所述来自第二肽链的结构域与来自第一肽链的第一结构域形成抗原结合位点。在一实施方案中，来自第一肽链的第二结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，并且来自第二肽链的结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分，所述来自第二肽链的结构域与来自第一肽链的第二结构域形成抗原结合位点。
在一实施方案中，来自第一肽链的第一和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链的可变区或其部分；并且来自第二肽链的第一和第二结构域各自包含免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分。
在一实施方案中，来自第一肽链的N末端结构域连同来自第二肽链的N末端结构域形成抗原结合位点；并且来自第一肽链的C末端结构域连同来自第二肽链的C末端结构域形成抗原结合位点。
在一实施方案中，来自第一肽链的N末端结构域连同来自第二肽链的C末端结构域形成抗原结合位点；并且来自第一肽链的C末端结构域连同来自第二肽链的N末端结构域形成抗原结合位点。
在本发明的抗原受体的一实施方案中，所述免疫受体信号传输结构域包含T细胞受体链的恒定或不变区，或者免疫细胞Fc受体链的恒定或不变区，或者所述恒定或不变区的部分。在本发明的抗原受体的一实施方案中，(i)第一肽链包含T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分，或者(ii)第一肽链包含T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分。在这个实施方案中，T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分对应或基本上对应T细胞受体的α链，并且T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分对应或基本上对应T细胞受体的β链，优选与T细胞受体的α链来源相同T细胞受体。形成抗原结合位点的结构域优选融合在链的N末端，可任选地以连接子分隔。
在本发明的抗原受体的一实施方案中，T细胞受体链的可变区或其部分和/或免疫受体信号传输结构域，例如T细胞受体的恒定区或其部分，是人源的。因此，T细胞受体链的可变区或其部分以及T细胞受体链的恒定区或其部分可能对应或基本上对应的T细胞受体链可以是人源的。
在一实施方案中，本发明的抗原受体包含连接抗原受体结构域的连接子。在一实施方案中，本发明的抗原受体在形成抗原结合位点的结构域之间，和/或形成抗原结合位点的结构域与T细胞受体链的可变区或其部分之间，包含一个或多个连接子。所述连接子可以为任何长度的任意氨基酸序列，只要其不干扰抗原受体的功能，如抗原受体结合抗原或与内源CD3复合物相结合的能力，或者干扰抗原受体在抗原结合时诱导免疫应答的能力。
在本发明的抗原受体的一实施方案中，第一和第二抗原结合位点结合相同抗原或不同抗原。在本发明的抗原受体的一实施方案中，第一和第二抗原结合位点结合相同抗原上的不同表位。因此，虽然形成第一抗原结合位点的结构域优选源自相同免疫球蛋白并且形成第二抗原结合位点的结构域优选源自相同免疫球蛋白，但是形成第一抗原结合位点的结构域和形成第二抗原结合位点的结构域源自相同或不同免疫球蛋白，所述不同免疫球蛋白结合相同或不同抗原。
在一实施方案中，所述抗原是疾病特异性抗原，优选肿瘤抗原。在一实施方案中，所述抗原在细胞表面上表达。
在一方面，本发明涉及本发明的抗原受体的肽链。在一实施方案中，本发明涉及包含第一和第二结构域的肽链，所述第一和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，或者各自包含免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分，并且其中所述肽链进一步包含T细胞受体链的可变区或其部分，以及免疫受体信号传输结构域，如T细胞受体链的恒定区或其部分。本发明的肽链的其他实施方案如本文对本发明的抗原受体所述。
在一方面，本发明涉及一种细胞，特别是一种免疫效应细胞，如T细胞，其经基因改造以表达本发明的抗原受体。在一方面，本发明涉及一种重组细胞，特别是免疫效应细胞，如T细胞，表达本发明的抗原受体的第一肽链、第二肽链或者第一和第二肽链，或者表达本发明的肽链。本发明的细胞或重组细胞的其他实施方案如本文对本发明的抗原受体或本发明的肽链所述。
在一方面，本发明涉及一种制备表达本发明的抗原受体的细胞的方法，所述方法包括：(a)提供细胞；(b)提供第一基因构建体，其编码本发明的抗原受体的第一肽链；(c)提供第二基因构建体，其编码本发明的抗原受体的第二肽链；(d)将第一和第二基因构建体引入细胞；以及(e)使构建体在细胞中表达。在一实施方案中，本发明涉及一种制备表达抗原受体的细胞的方法，所述受体包含第一肽链和第二肽链，所述方法包括：(a)提供细胞；(b)提供第一基因构建体，其编码第一肽链，所述第一肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域；(c)提供第二基因构建体，其编码第二肽链，所述第二肽链至少包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域；(d)将所述第一和第二基因构建体引入细胞；以及(e)使构建体在细胞中表达；其中来自第一肽链的第一结构域能够连同来自第二肽链的结构域中的一个形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的第二结构域能够连同来自第二肽链的结构域中的另一个形成第二抗原结合位点。在本发明的方法的一实施方案中，所述抗原受体在细胞表面表达。在本发明的方法的一实施方案中，所述第一肽链和第二肽链以单一基因构建体提供。在本发明的方法的一实施方案中，所述细胞是人细胞。在本发明的方法的一实施方案中，所述细胞是免疫效应细胞，如T细胞。在本发明的方法的一实施方案中，所述基因构建体包含DNA和/或RNA。本发明的方法的其他实施方案如本文对本发明的抗原受体所述。
在一方面，本发明涉及一种重组细胞，特别是一种免疫效应细胞，如T细胞，通过本发明用于制备表达抗原受体的细胞的方法制备。本发明的重组细胞的其他实施方案如本文对本发明的抗原受体或本发明用于制备表达抗原受体的细胞的方法所述。
在一方面，本发明涉及一种核酸如DNA或RNA，其编码本发明的抗原受体的第一肽链、第二肽链或者第一和第二肽链或者编码本发明的肽链。本发明的核酸的其他实施方案如本文对本发明的抗原受体或本发明的肽链所述。
本发明一般涵盖利用本发明的抗原受体通过靶向其表面表达一种或多种抗原的细胞，如其细胞表面表达一种或多种疾病特异性抗原的病变细胞，特别是其细胞表面表达一种或多种肿瘤抗原的癌细胞，来治疗疾病。所述方法提供选择性根除其表面表达一种或多种抗原的细胞，从而将对不表达所述抗原的正常细胞的不良影响降至最低。在一实施方案中，对经基因改造表达本发明的抗原受体的T细胞进行给药，其通过结合所述抗原靶向细胞。T细胞能够识别其表面表达所述抗原的病变细胞，达到病变细胞的根除。在一实施方案中，靶细胞群或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织。
在一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗原受体、本发明的重组细胞或本发明的核酸，以及药学可接受的载体。本发明的药物组合物可以用作药物，特别是治疗疾病，如癌症，其特征在于表达本发明的抗原受体结合的一种或多种抗原，如一种或多种肿瘤抗原。
在一方面，本发明涉及一种治疗疾病如癌症的方法，所述方法包括向个体给予治疗有效量的本发明的药物组合物，其中所述疾病的特征在于表达所述抗原受体结合的至少一种抗原，如肿瘤抗原。
在一方面，本发明涉及一种治疗个体的方法，所述个体患有与至少一种抗原的表达或高表达相关的疾病、病症或疾病状况，所述方法包括向所述个体给药经基因改造以表达本发明的抗原受体的T细胞，其靶向所述至少一种抗原。在一实施方案中，所述疾病、病症或疾病状况是癌症。在一实施方案中，所述T细胞对于个体可以是自体的、同种异体的或同源(syngeneic)的。
在本发明的一实施方案中，所述抗原受体仅结合一种抗原(例如通过单特异性并识别相同表位，或者通过双特异性或多特异性并识别相同抗原上的不同表位)或者结合不同抗原，特别是两种不同抗原。
在本发明的所有方面的一实施方案中，所述治疗方法进一步包括从个体获得细胞样品，所述样品包含T细胞或T细胞前体，以及用编码本发明的抗原受体的核酸转染所述细胞，以提供经基因改造来表达所述抗原受体的T细胞。在本发明的所有方面的一实施方案中，经基因改造以表达所述抗原受体的T细胞是用编码所述抗原受体的核酸稳定或瞬时转染的。因此，编码所述抗原受体的核酸整合或不整合入T细胞的基因组。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述T细胞和/或细胞样品来自给药了经基因改造以表达所述抗原受体的T细胞的个体。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述T细胞和/或细胞样品来自与给药了经基因改造以表达所述抗原受体的T细胞的哺乳动物不同的哺乳动物。
在本发明的所有方面的一实施方案中，使经基因改造以表达所述抗原受体的T细胞的内源T细胞受体和/或内源HLA的表达失活。
在本发明的所有方面的一实施方案中，抗原在病变细胞如癌细胞中表达。在一实施方案中，抗原在病变细胞如癌细胞的表面上表达。在一实施方案中，抗原受体结合抗原的胞外结构域或胞外结构域的表位。在一实施方案中，抗原受体结合活细胞表面上的抗原的天然表位。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述抗原选自紧密连接蛋白(claudin)，如紧密连接蛋白6和紧密连接蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、间皮素(mesothelin)、CEA、c-Met、PSMA、GD-2以及NY-ESO-1。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述抗原是病原体抗原。所述病原体可以是真菌、病毒或细菌病原体。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述抗原的表达在细胞表面。在一实施方案中，抗原是紧密连接蛋白，特别是紧密连接蛋白6或紧密连接蛋白18.2，并且所述抗原受体结合所述紧密连接蛋白的第一胞外环。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述抗原受体结合细胞上存在的抗原导致所述T细胞的免疫效应功能，如释放细胞因子。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述抗原受体结合细胞如抗原呈递细胞上存在的抗原，导致所述T细胞的刺激、启动(priming)和/或扩增。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述抗原受体结合病变细胞如癌细胞上存在的抗原，导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔蛋白和颗粒酶。
在本发明的所有方面的一实施方案中，形成抗原结合位点的抗原受体结构域由抗原受体的胞外域组成。在本发明的所有方面的一实施方案中，本发明的抗原受体包含跨膜结构域。在一实施方案中，所述跨膜结构域是跨膜的疏水性α螺旋。
在本发明的所有方面的一实施方案中，本发明的抗原受体包含信号肽，其指导新生蛋白进入内质网。在一实施方案中，所述信号肽位于形成抗原结合位点的结构域之前。
在本发明的所有方面的一实施方案中，本发明的抗原受体优选是其靶向的抗原特异性的，特别是当存在于细胞例如病变细胞或抗原呈递细胞表面上时。
在本发明的所有方面的一实施方案中，本发明的抗原受体可以由免疫应答细胞表达和/或存在于其表面上，如T细胞，优选细胞毒性T细胞。在一实施方案中，所述T细胞与本发明的抗原受体靶向的抗原反应。
在另一方面，本发明提供本文所述药剂和组合物用于本文所述方法。
根据下文的详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将更清楚。
具体实施方式
虽然下文详细描述本发明，但是应当理解本发明并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中会描述本发明的要素。这些要素用具体实施方案列出，但是，应当理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生额外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应当理解为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖组合实施方案，其是由明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选的元素组合得到的。此外，除非上下文另有说明，应当认为本申请中所有描述的元素的任何排列和组合被本申请的说明书公开。
优选地，本文使用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Eds.,(1995)Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland所示定义。
除非另有说明，本发明的实施会采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法，在所述领域的文献中对其进行了解释(参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及其变化如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，虽然在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的陈述仅用于充当分别引用落在该范围内每个单独值的简捷方法。除非本文另有说明，每个单独值如其在本文中单独引用地引入本说明书。
除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“例如”)的使用仅为了更好地说明本发明，并不对本发明的范围构成限制。本说明书中任何语言都不应当解释为表示任何未声明的元素对实施本发明是必要的。
在本说明书的整个正文中引用了几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指引等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无法凭借享有在先申请的优先权而早于此类公开。
术语“免疫应答”是指对抗原的综合身体反应，并且优选指细胞免疫应答或者细胞以及体液免疫应答。免疫应答可以是保护性/防护性/预防性和/或治疗性的。
“提供免疫应答”可以表示在提供免疫应答之前没有对特定靶抗原、靶细胞和/或靶组织的免疫应答，但是其还可以表示在提供免疫应答之前对特定靶抗原、靶细胞和/或靶组织有一定水平的免疫应答，并且在提供免疫应答之后所述免疫应答增强。因此，“提供免疫应答”包括“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”。优选地，在个体中提供免疫应答之后，保护所述个体免于疾病发展，所述疾病例如癌症，或者其疾病状况通过提供免疫应答达到改善。例如，可以在癌症患者或有发展癌症的风险的个体中提供对肿瘤抗原的免疫应答。在这种情况下提供免疫应答可以表示个体的疾病状况得到改善，个体免于癌症转移的发展，或者有发展癌症的风险的个体免于癌症发展。
“细胞介导的免疫”或“细胞免疫”或者相似术语表示包括细胞反应，其针对特征是表达抗原的细胞，特别是特征是用I类或II类MHC呈递抗原的细胞。所述细胞反应涉及被称作T细胞或T-淋巴细胞的细胞，其为“辅助性”或“杀伤性”。辅助性T细胞(也称作CD4+ T细胞)通过调节免疫应答发挥中心作用，而杀伤性细胞(也称作细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+ T细胞或CTL)杀死病变细胞如癌细胞，防止产生更多病变细胞。
术语“抗原”涉及包含表位的物质，针对所述表位产生和/或指导免疫应答。优选地，本发明的上下文中的抗原是一种分子，任选在加工之后，诱导免疫反应，优选是抗原或表达抗原的细胞特异性的，优选在细胞表面上。术语“抗原”特别包括蛋白和肽。抗原优选是对应于或源自天然存在的抗原的产物。这类天然存在的抗原可以包括或者可以源自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他传染物和病原体，或者抗原还可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可以对应于天然存在的产物，例如，病毒蛋白或其部分。
术语“病原体”涉及病原微生物，并且包含病毒、细菌、真菌、单细胞生物和寄生虫。病原性病毒的实例是人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒(HSV)、甲型肝炎病毒(HAV)、HBV、HCV、乳头瘤病毒和人类嗜T细胞病毒(HTLV)。单细胞生物包含疟原虫、锥虫、变形虫等。
在一优选实施方案中，抗原是疾病特异性抗原或疾病相关抗原。术语“疾病特异性抗原”或“疾病相关抗原”是指所有具有病理显著性的抗原。在一特别优选的实施方案中，所述抗原存在于病变细胞、组织和/或器官中，同时其不存在或少量存在于健康细胞、组织和/或器官中，因此，可以用于靶向病变细胞、组织和/或器官，例如通过携带靶向所述抗原的抗原受体的T细胞。在一实施方案中，疾病特异性抗原或疾病相关抗原存在于病变细胞的表面上。
在一优选实施方案中，抗原是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，即，可能源自细胞质、细胞表面和细胞核的癌细胞成分，特别是作为癌细胞上的表面抗原产生的，优选大量产生的那些抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”涉及在正常情况下在有限数量的组织和/或器官中或者在特定发育阶段特异性地表达的蛋白，例如，肿瘤抗原可以在正常条件下在胃组织中，优选在胃粘膜中，在生殖器官中，例如，在睾丸中，在滋养层组织中，例如，在胎盘中，或者在生殖系细胞中特异性地表达，并且在一种或多种肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在这个上下文中，“有限数量”优选表示不超过3个，更优选不超过2个。本发明的上下文中的肿瘤抗原包括：例如，分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即，在正常情况下在某个分化阶段在某种细胞类型中特异性地表达的蛋白；癌症/睾丸抗原，即，在正常情况下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性地表达的蛋白，以及生殖系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤抗原优选与癌细胞的细胞表面相关，并且优选在正常组织中不表达或表达很少。优选地，可根据肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴别癌细胞。在本发明的上下文中，个体如癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原，优选是所述个体的自体蛋白。在优选实施方案中，本发明的上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需的组织或器官中特异性地表达，即，当被免疫系统损伤时不导致个体死亡的组织或器官，或者在免疫系统无法到达或几乎无法到达的身体器官或结构中特异性地表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤抗原和癌组织中表达的肿瘤抗原的氨基酸序列相同。
可以用于本发明的肿瘤抗原的实例有p53，ART-4，BAGE，β-catenin/m，Bcr-abLCAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，claudin家族的细胞表面蛋白，如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白(Myosin)/m，MUC1，MUM-1、-2、-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，p190minor BCR-abL，Pm1/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，SURVIVIN，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE以及WT。特别优选的肿瘤抗原包括CLAUDIN-18.2(CLDN18.2)和CLAUDIN-6(CLDN6)。
如本文所用的术语“CLDN”或简单的“Cl”表示紧密连接蛋白(claudin)，并且包括CLDN6和CLDN18.2。优选地，紧密连接蛋白是人紧密连接蛋白。紧密连接蛋白是一个蛋白家族，其是紧密连接的最重要组分，在这里它们建立细胞旁屏障来控制上皮细胞之间的细胞间隙中的分子流动。紧密连接蛋白是跨越膜4次的跨膜蛋白，N-末端和C-末端均位于细胞质中。称作EC1或ECL1的第一胞外环平均由53个氨基酸组成，而称作EC2或ECL2的第二胞外环由大约24个氨基酸组成。紧密连接蛋白家族的细胞表面蛋白在各种起源的肿瘤中表达，并且特别适合作为与靶向癌症免疫疗法相关的靶结构，这是由于它们的选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)并且定位在质膜。
CLDN6和CLDN18.2已被鉴定为在肿瘤组织中差异表达，唯一表达CLDN18.2的正常组织是胃(胃粘膜的分化的上皮细胞)，而唯一表达CLDN6的正常组织是胎盘。
CLDN18.2在各种起源的癌症中表达，如胰腺癌、食管癌、胃癌、支气管癌、乳腺癌和ENT肿瘤。CLDN18.2是预防和/或治疗原发肿瘤的有价值的靶标，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，以及它们的转移癌，特别是胃癌转移如Krukenberg肿瘤、腹膜转移和淋巴结转移。至少靶向CLDN18.2的抗原受体可用于治疗这类癌症。
已发现CLDN6在例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌中表达。CLDN6是用于预防和/或治疗卵巢癌特别优选的靶标，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌，肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌，胃癌，乳腺癌，肝癌，胰腺癌，皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌，恶性黑色素瘤，头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤，肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤，胆管癌，膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌，肾癌，特别是肾细胞癌，包括肾透明细胞癌和乳头状肾细胞癌，结肠癌，小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌，睾丸胚胎性癌，胎盘绒毛膜癌，宫颈癌，睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎性睾丸癌，子宫癌，生殖细胞肿瘤如畸胎癌或胚胎性癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及它们的转移形式。至少靶向CLDN6的抗原受体可用于治疗这类癌症。
在本发明的实施方案的上下文中，抗原优选存在于细胞表面上，优选抗原呈递细胞或病变细胞。根据本发明，抗原在与抗原受体结合后，任选地在适当的共刺激信号的存在下，优选能够诱导携带结合抗原的抗原受体的T细胞的刺激、启动和/或扩增。病变细胞表面上抗原的识别可以导致针对所述抗原(或表达所述抗原的细胞)的免疫反应。
根据本发明的各方面，目标优选是提供针对表达抗原的病变细胞的免疫应答和治疗疾病，所述病变细胞如表达抗原的癌细胞，所述抗原如肿瘤抗原，特别是CLDN6和CLDN18.2，所述疾病例如涉及表达抗原(如肿瘤抗原)的细胞的癌症。优选地，本发明包括给药抗原受体工程化的免疫效应细胞，如靶向表达抗原的病变细胞的T细胞。可以通过携带靶向抗原的抗原受体的免疫效应细胞靶向表面上表达抗原的细胞。
“细胞表面”按照其在本领域中的正常含义使用，因此包括蛋白和其他分子可结合的细胞外部。如果抗原位于细胞表面并且可被添加至细胞的抗原结合分子结合，则抗原在细胞表面上表达，所述抗原结合分子如抗原受体或抗原特异性抗体。在一实施方案中，细胞表面上表达的抗原是整合膜蛋白，其具有可为抗原受体识别的胞外部分。如果抗原受体位于细胞表面并且可被添加至细胞的抗原结合，则抗原受体在细胞表面上表达，所述抗原如抗原受体特异的抗原。在一实施方案中，细胞表面上表达的抗原受体是整合膜蛋白，其具有可识别抗原的胞外部分。
本发明的上下文中的术语“胞外部分”或“胞外域”是指分子例如蛋白的一部分，其面向细胞的胞外空间并且优选是可以从所述细胞外可及的，例如对于位于细胞外的结合分子例如抗体。优选地，该术语是指一个或多个胞外环或结构域或其片段。
术语“部分(portion)”或“部分(part)”在本文中可交换使用，是指结构例如氨基酸序列的连续或不连续元件，术语“片段”是指结构的连续元件，所述结构如氨基酸序列。蛋白序列的一部分优选包含蛋白序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续和/或不连续氨基酸。蛋白序列的片段优选包含蛋白序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。结构的一部分或片段优选包含所述结构的一个或多个功能特性，例如抗原、免疫和/或结合特性。例如，T细胞受体链的可变区的一部分优选能够形成抗原识别位点和结合抗原。因此，如果T细胞受体链的可变区是Vα，其一部分优选仍能与相应的Vβ或其一部分相互作用以形成功能性抗原识别位点。如果T细胞受体链的可变区是Vβ，其一部分优选仍能与相应的Vα或其一部分相互作用以形成功能性抗原识别位点。相似地，T细胞受体链的恒定区的一部分优选能够执行其信号传输功能。
根据本发明，如果抗原的表达水平低于检测极限和/或其表达水平太低以至于不能被添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则抗原(基本上)不在细胞中表达。根据本发明，如果抗原表达水平高于检测极限和/或其表达水平高到能够允许被添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则抗原在细胞中表达。优选地，细胞中表达的抗原表达或暴露在所述细胞表面上，即存在，因此可通过添加至细胞的抗原特异性分子如抗体或抗原受体结合。
“靶细胞”应当表示作为免疫应答如细胞免疫应答的靶标的细胞。靶细胞包括任何不良细胞，如癌细胞。在优选实施方案中，靶细胞是表达靶抗原的细胞，特别是疾病特异性抗原，其优选存在于细胞表面上。
术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即，免疫系统识别(即结合)的分子的一部分或片段，例如，抗体或抗原受体识别的分子的一部分或片段。例如，表位是免疫系统识别的抗原上的离散的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，所述分子如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于前者的结合在变性溶剂的存在下丧失，而后者不会。优选地，表位能够引发针对抗原或表达抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。蛋白如肿瘤抗原的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分，并且优选长度为5-100、优选5-50、更优选8-30、最优选10-25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白降解为肽)，并且这些片段中的一个或多个与MHC分子相互作用(例如，通过结合)以供细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递给特定T细胞。
抗原呈递细胞(APC)是在主要组织相容性复合物(MHC)的存在下在其表面展示抗原的细胞。T细胞可以利用它们的T细胞受体(TCR)识别这种复合物。抗原呈递细胞加工抗原并将它们呈递至T细胞。根据本发明，术语“抗原呈递细胞”包括专业抗原呈递细胞和非专业抗原呈递细胞。
专业抗原呈递细胞在内化抗原方面非常有效，通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用，然后在它们的膜上展示结合至MHC II类分子的抗原片段。T细胞识别并与抗原呈递细胞膜上的抗原-MHC II类分子相互作用。然后抗原呈递细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专业抗原呈递细胞的定义性特征。专业抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞、巨噬细胞、B-细胞和某些活化的上皮细胞，树突细胞抗原呈递泛围最广，并且可能是最重要的抗原呈递细胞。
非专业抗原呈递细胞不组成型表达与初始T细胞相互作用所需要的MHC II类蛋白；这些仅在非专业抗原呈递细胞被某些细胞因子如IFNγ刺激时表达。
树突细胞(DC)是白细胞群，其通过MHC II和I类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递至T细胞。众所周知，树突细胞是免疫应答的有力诱导物，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞和前体可以获得自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、瘤周组织浸润细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其他合适的组织或流体。例如，通过添加细胞因子的组合至收获自外周血的单核细胞培养物可以离体分化树突细胞，所述细胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFa。或者，通过添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或诱导树突细胞的分化、成熟和增殖的其他化合物的组合至培养基，收获自外周血、脐带血或骨髓的CD34阳性细胞可以分化为树突细胞。树突细胞可方便地归类为“未成熟”和“成熟”细胞，这可以用作区分两种特征明确的表型的简单方式。但是，这种命名不应当理解为排除所有可能的分化中间阶段。未成熟的树突细胞可表征为具有较高的抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常特征在于这些标志物的表达较低，但是负责T细胞激活的细胞表面分子表达较高，如I类和II类MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)。树突细胞成熟涉及树突细胞活化的状态，在此状态下这类抗原呈递树突细胞导致T细胞启动，而通过未成熟的树突细胞的呈递导致耐受性。树突细胞成熟主要由生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、树突细胞表面上的CD40配合至CD40L以及经历应激性细胞死亡的细胞释放的物质引起，所述生物分子具有可被先天受体(innatereceptor)检测到的微生物特征。树突细胞可以通过在体外用细胞因子培养骨髓细胞获得，所述细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α。
术语“免疫原性”涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。
本发明的上下文中的术语“免疫效应功能”包括免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀死病变细胞如肿瘤细胞，或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤传播和转移。优选地，本发明的上下文中的免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。在辅助T细胞(CD4+ T细胞)的情况下，这类功能包括释放细胞因子如白介素-2和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B-细胞，在CTL的情况下，这类功能包括消除细胞(即，特征是表达抗原的细胞)，例如通过凋亡或穿孔蛋白介导的细胞裂解、产生细胞因子如IFN-γ和TNF-α，以及通过对于表达抗原的靶细胞的特异性的细胞溶解杀伤。
在本发明的上下文中术语“免疫反应细胞”或“免疫效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。“免疫反应细胞”优选能够结合抗原并介导免疫应答，所述抗原如细胞表面上表达的抗原。例如，这类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子、杀死微生物、分泌抗体、识别被感染的细胞或癌细胞，并且任选地消除这类细胞。例如，免疫反应细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫反应细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+ T细胞。根据本发明，，术语“免疫反应细胞”还包括用合适的刺激可以成熟为免疫细胞(如T细胞，特别是T辅助细胞，或溶细胞性T细胞)的细胞。免疫反应细胞包含CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞以及未成熟和成熟的B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为溶细胞性T细胞与免疫系统的克隆选择相似。
优选地，“免疫反应细胞”或“免疫效应细胞”以一定程度的特异性识别抗原，特别是当其存在于抗原呈递细胞或病变细胞如癌细胞的表面上。优选地，所述识别使得识别抗原的细胞能够响应或反应。如果所述细胞是辅助T细胞(CD4+ T细胞)，则这样的响应性或反应性可以包括释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B-细胞。如果所述细胞是CTL，则这样的响应性或反应性可以包括消除细胞(即，特征是表达抗原的细胞)，例如，通过凋亡或穿孔蛋白介导的细胞裂解。根据本发明，CTL响应性可以包括持续的钙通量、细胞分裂、产生细胞因子如IFN-γ和TNF-α、上调活化标志物(activation marker)如CD44和CD69以及特异性的溶解杀伤表达抗原的靶细胞。还可以通过准确指示CTL响应性的人工报告物(artificial reporter)确定CTL响应性。这样的识别抗原并响应或反应的CTL在本文中也称作“抗原响应性CTL”。
“淋巴样细胞”是这样的细胞，其任选地在合适的修饰之后，例如在T细胞受体或抗原受体转移之后，能够产生免疫应答如细胞免疫应答，或者这样的细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞，优选T淋巴细胞、淋巴母细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文所述的免疫反应细胞或免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是T细胞，可以将其修饰以在细胞表面上表达T细胞受体或抗原受体。在一实施方案中，淋巴样细胞缺少T细胞受体的内源性表达。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可交换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+ T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+ T细胞)，其包含溶胞性T细胞。
T细胞属于称作淋巴细胞的一组白细胞，并且在细胞介导的免疫中起中心作用。通过其细胞表面上存在的叫做T细胞受体(TCR)的特殊受体，它们可以与其他淋巴细胞类型如B细胞和自然杀伤细胞区分。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已发现T细胞的几个不同亚群，其各自具有不同功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括使B细胞成熟为浆细胞以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞等。这些细胞也称作CD4+ T细胞，因为它们在表面上表达CD4蛋白。当抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子向其呈递肽抗原时，辅助T细胞活化。一旦活化，它们快速分裂并分泌称作细胞因子的小蛋白，所述细胞因子调节或辅助主动免疫应答。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称作CD8+ T细胞，因为它们在表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类相互作用的抗原识别它们的靶标，MHC I类存在于身体的几乎每个细胞表面上。
大部分T细胞具有作为几个蛋白的复合物存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条不同的肽链组成，其产生自独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因并称作α-和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表在其表面上具有不同T细胞受体(TCR)的一小部分T细胞。但是，在γδT细胞中，TCR由一条γ-链和一条δ-链组成。这组T细胞比αβT细胞少见(总T细胞的2％)。
T细胞受体的每条链由两个胞外结构域组成：可变(V)区和恒定(C)区。所述恒定区靠近细胞膜，然后是跨膜区和短胞质尾区，而可变区结合肽/MHC复合物。为了本发明的目的，术语“T细胞受体链的恒定区或其部分”还包括实施方案，其中T细胞受体链的恒定区(从N末端至C末端)之后是跨膜区和胞质尾区，如天然连接至T细胞受体链的恒定区的跨膜区和胞质尾区。
所有T细胞均源自骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞迁移至胸腺并通过细胞分裂扩大以产生大量未成熟的胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着发育，它们发展成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。
T细胞一般可以利用标准方法体外或离体制备。例如，T细胞可以分离自哺乳动物如患者的骨髓、外周血或者一部分骨髓或外周血，利用可商购的细胞分离系统。或者，T细胞可以源自相关或无关(related or unrelated)的人、非人动物、细胞系或培养物。例如，包含T细胞的样品可以是外周血单核细胞(PBMC)。
根据本发明使用的T细胞可以表达内源T细胞受体或缺少内源T细胞受体的表达。
可以将编码抗原受体的核酸如RNA引入T细胞或其他具有溶解潜力的细胞，特别是淋巴样细胞。
术语“靶向抗原的抗原受体”或相似术语涉及抗原受体，当存在于免疫效应细胞如T细胞上时，其识别抗原，如抗原呈递细胞或病变细胞如癌细胞表面上的抗原，从而如上文所述免疫效应细胞受到刺激、启动和/或扩增或者发挥免疫效应细胞的效应功能。
术语“抗原特异性T细胞”或相似术语涉及T细胞，特别是提供抗原受体时，其识别抗原受体靶向的抗原，如抗原呈递细胞或病变细胞如癌细胞表面上的抗原，并且优选如上文所述发挥T细胞的效应功能。如果细胞杀死表达抗原的靶细胞，则认为T细胞和其他淋巴样细胞是抗原特异性的。T细胞的特异性可以通过各种标准技术中的任一种来评价，例如，铬释放测定或增殖测定，或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。
术语“主要组织相容性复合物”或缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及所有脊椎动物中均存在的基因复合物。在免疫反应中，MHC蛋白或分子对于淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导很重要，其中MHC蛋白或分子结合并呈递肽以便T细胞受体的识别。MHC编码的蛋白在细胞表面上表达，并且展示T细胞的自身抗原(来自细胞自身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。
根据本发明，术语“抗原受体”包括工程化的受体，其赋予免疫效应细胞如T细胞任意特异性，如单克隆抗体的特异性。以此方式，可以产生大量抗原特异性T细胞用于过继细胞转移。因此，本发明的抗原受体可以存在于T细胞上，例如代替T细胞自身的T细胞受体或与其一起存在。这类T细胞不一定需要抗原的加工和呈递用于靶细胞识别，而是可以优选特异性地识别靶细胞上存在的任何抗原。优选地，所述抗原受体在细胞表面上表达。为了本发明的目的，如本文所用的术语“T细胞”包括包含抗原受体的T细胞。特别地，根据本发明，术语“抗原受体”包括人工受体，其包含单分子或分子复合物，其识别即结合靶细胞如癌细胞上例如抗原的靶结构(例如通过抗原结合位点或抗原结合结构域结合至靶细胞表面上表达的抗原)，并且可以赋予在细胞表面上表达所述抗原受体的免疫效应细胞特异性，所述免疫效应细胞例如T细胞。优选地，通过抗原受体识别靶结构导致表达所述抗原受体的免疫效应细胞的活化。抗原受体可以包含一个或多个蛋白单位，所述蛋白单位包含如本文所述的一个或多个结构域。术语“抗原受体”优选不包括T细胞受体。根据本发明，术语“抗原受体”优选与术语“嵌合抗原受体(CAR)”、“嵌合T细胞受体”和“人工T细胞受体”同义。
根据本发明，抗原受体可以通过能够形成抗原结合位点的任何抗原识别结构域(在本文中还简单地称作“结构域”)识别抗原，如通过可以位于不同肽链上的抗体和T细胞受体的抗原结合部分。在一实施方案中，形成抗原结合位点的两个结构域源自免疫球蛋白。在另一实施方案中，形成抗原结合位点的两个结构域源自T细胞受体。特别优选抗体可变结构域，如源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，以及T细胞受体的可变结构域，特别是TCRα和β单链。实际上，几乎任何以高亲和力结合给定靶标的东西均可以用作抗原识别结构域。
在一实施方案中，本发明的抗原受体包含至少4个免疫球蛋白可变结构域形成至少两个结合位点，其中所述两个结合位点可以结合相同或不同表位，所述表位可以位于相同或不同抗原上。在一实施方案中，抗原受体包含对第一表位具有特异性的免疫球蛋白重链的可变结构域(或区)(VH)(VH(1))，对第一表位具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变结构域(或区)(VL)(VL(1))，对第二表位具有特异性的免疫球蛋白重链的可变结构域(或区)(VH)(VH(2))，以及对第二表位具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变结构域(或区)(VL)(VL(2))，所述第一和第二表位可以相同或不同，并且可以位于相同或不同抗原上。在一实施方案中，VH(1)能够与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，但是VH(1)不能与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)不能与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。但是，在另一实施方案中，VH(1)能够与VL(1)以及VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)以及VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。在后一实施方案中，VH(1)和VH(2)可以相同或至少源自相同免疫球蛋白，并且VL(1)和VL(2)可以相同或至少源自相同免疫球蛋白。
在一方面，本发明涉及抗原受体，在本文中也称作组合抗原受体，所述受体包含第一肽链和第二肽链，其中所述第一肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分，以及免疫受体信号传输结构域；第二肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分，以及免疫受体信号传输结构域；其中来自所述第一肽链的第一结构域连同来自所述第二肽链的结构域中的一个形成第一抗原结合位点，并且其中来自所述第一肽链的第二结构域连同来自所述第二肽链的结构域中的另一个形成第二抗原结合位点。
在一实施方案中，本发明的组合抗原受体的两条肽链各自包含连接至轻链可变结构域的重链可变结构域，其中通过不同肽链上的重链可变结构域与轻链可变结构域之间的相互作用形成两个抗原结合位点。在一实施方案中，本发明的组合抗原受体包含两条肽链，其中一条肽链包含VL(1)和VH(2)，并且另一条多肽链包含VH(1)和VL(2)。在另一实施方案中，本发明的组合抗原受体在一条肽链上包含连接至重链可变结构域的重链可变结构域，并且在另一条肽链上包含连接至轻链可变结构域的轻链可变结构域，其中通过不同肽链上的重链可变结构域与轻链可变结构域之间的相互作用形成两个抗原结合位点的。在一实施方案中，本发明的组合抗原受体包含两条肽链，其中一条肽链包含VH(1)和VH(2)，并且另一条肽链包含VL(1)和VL(2)。
在一实施方案中，本发明的组合抗原受体包含第一肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)从N末端至C末端优选以顺序VH(1)-VL(2)排列，以及第二肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)从N末端至C末端优选以顺序VL(1)-VH(2)排列。T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域优选位于可变区排列的C末端。T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域，优选包含位于肽链之一上的T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分，以及位于另一条肽链上的T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区。在一实施方案中，T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分包含T细胞受体的α链。在一实施方案中，T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分包含T细胞受体的β链。T细胞受体的α链和T细胞受体的β链优选来自相同T细胞受体。
在一实施方案中，本发明的组合抗原受体包含第一肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)从N末端至C末端优选以顺序VH(1)-VH(2)排列，以及第二肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)从N末端至C末端优选以顺序VL(1)-VL(2)排列。T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域优选位于可变区排列的C末端。T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域优选包含位于肽链之一上的T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分，，以及位于另一条肽链上的T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分。在一实施方案中，T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分包含T细胞受体的α链。在一实施方案中，T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分包含T细胞受体的β链。T细胞受体的α链和T细胞受体的β链优选来自相同T细胞受体。
本发明的抗原受体具有至少两个抗原结合位点，因此至少是二价的。如上所述，本发明的抗原受体的结合位点可以结合相同或不同表位，所述表位可以位于相同或不同抗原上。如果结合位点结合相同表位，特别是在相同抗原上，两个结合位点可以相同或基本上相同和/或可以由相同或基本上相同的结构域形成，其中这类相同或基本上相同的结构域可以源自例如相同免疫球蛋白。如果结合位点结合不同表位，无论在相同或不同抗原上，则两个结合位点不同且由不同结构域形成，其中这类不同结构域可以源自不同免疫球蛋白。在这类不同结构域的情况下，优选的具有不同表位特异性的结构域，即VH(1)不能与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)不能与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。结果，VH(1)与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点。如果本发明的组合抗原受体包含两条肽链，其中一条肽链包含VH(1)和VL(2)并且另一条肽链包含VH(2)和VL(1)，这导致不能通过结构域的分子内相互作用形成抗原结合位点的肽链。
形成抗原结合位点的本发明的抗原受体的两个结构域，还可以源自T细胞受体，并且可以是其保持抗原特异性结合的片段或部分，特别是结合至肽-MHC复合物，如T细胞受体的可变区。
根据本发明，术语“T细胞受体的可变区”涉及TCR链的可变结构域。TCRα-链和β-链的可变区均具有3个高变或互补性决定区(CDR)，而β-链的可变区具有额外的高变区(HV4)，其通常不接触抗原，因此不认为是CDR。CDR3是负责识别加工后的抗原的主要CDR，虽然α-链的CDR1显示与抗原肽的N末端部分相互作用，而β-链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。据认为CDR2识别MHC。不认为β-链的CDR4参与抗原识别，但是其显示与超抗原相互作用。
涉及免疫球蛋白可变结构域的上述公开以相应方式应用于T细胞受体可变结构域。代替对第一表位具有特异性的免疫球蛋白重链的可变结构域(VH)(VH(1))和对第一表位具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变结构域(VL)(VL(1))，本发明的抗原受体可以包含对第一表位具有特异性的TCR的TCRα-链的可变结构域和对第一表位具有特异性的TCR的TCRβ-链的可变结构域。可选的或额外地，代替对第二表位具有特异性的免疫球蛋白重链的可变结构域(VH)(VH(2))和对第二表位具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变结构域(VL)(VL(2))，本发明的抗原受体可以包含对第二表位具有特异性的TCR的TCRα-链的可变结构域和对第二表位具有特异性的TCR的TCRβ-链的可变结构域。
因为每个抗原结合位点由两个结构域形成，每个结构域分别可以包含免疫球蛋白或T细胞受体的一部分或片段。单独的所述部分或片段可能不能结合抗原，但是当两个单独部分或片段相互作用时，它们一起形成或重新产生原型(original)免疫球蛋白或T细胞受体的抗原结合结构，因此，能够结合相同抗原，优选具有相同亲和力。
抗原识别之后，受体优选聚集并且将信号传输至细胞。在这方面，“免疫受体信号传输结构域”或“T细胞信号传导结构域”是在结合抗原之后参与向T细胞传输激活信号的结构域。可以通过本发明的抗原受体使这样的信号传输成为可能，所述本发明的抗原受体在一条肽链上包含T细胞受体链的恒定或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定或不变区或者恒定或不变区的一部分，如T细胞受体α链的恒定区或其部分，并且在另一条肽链上包含T细胞受体链的相应恒定或不变区或者免疫细胞Fc受体链的相应恒定或不变区或者恒定或不变区的一部分，如T细胞受体β链的恒定区或其部分。在这方面，CD3复合物表示成熟人T细胞、胸腺细胞和自然杀伤细胞的一个子集上表达的的抗原，其作为多分子T细胞受体(TCR)复合物的一部分。T细胞辅助受体是一种蛋白复合物，并且由4条不同链组成。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链相互作用在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起包含(comprise)TCR复合物。CD3负责TCR的信号转导。如Lin and Weiss,Journal of Cell Science 114,243-244(2001)所述，通过结合MHC呈递的特异性抗原表位激活TCR复合物导致Src家族激酶磷酸化免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，触发其他激酶的募集，这导致T细胞激活，包括Ca2+释放。T细胞上CD3的聚集，例如通过固定化抗CD3抗体，导致与T细胞受体的参与相似的T细胞激活，但是与其克隆典型特异性无关。
抗原受体信号传输结构域优选至少用来与天然细胞信号转导复合物相互作用，例如，CD3复合物，其负责将与抗原受体结合的抗原信号传输入细胞，导致免疫细胞激活。信号传输结构域的特征仅限于其具有与天然信号转导复合物相互作用的能力，以便在抗原结合至抗原受体时诱导免疫细胞的激活。
优选地，一条肽链上的信号传输结构域会与第二条链上的信号传输结构域形成二聚体，例如，通过二硫键。优选的信号传输结构域可以包含T细胞受体链的恒定或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定或不变区或者恒定或不变区的一部分。优选的信号传输结构域可以包含T细胞受体的α、β、γ或δ链的恒定区或者其部分，以及免疫细胞Fc受体的恒定结构域的D2或D3不变区或者其部分。在一优选实施方案中，第一肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其部分。在这个实施方案中，第一肽链优选包含T细胞受体α链的可变区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体β链的可变区或其部分，其中可变区位于恒定区的N末端。或者，第一肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其部分。在这个实施方案中，第一肽链优选包含T细胞受体β链的可变区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体α链的可变区或其部分，其中可变区位于恒定区的N末端。在另一实施方案中，第一肽链包含T细胞受体γ链的恒定区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体δ链的恒定区或其部分。在这个实施方案中，第一肽链优选包含T细胞受体γ链的可变区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体δ链的可变区或其部分，其中可变区位于恒定区的N末端。或者，第一肽链包含T细胞受体δ链的恒定区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体γ链的恒定区或其部分。在这个实施方案中，第一肽链优选包含T细胞受体δ链的可变区或其部分，并且第二肽链包含T细胞受体γ链的可变区或其部分，其中可变区位于恒定区的N末端。任选地，可以修饰信号传输结构域或T细胞受体链的可变区或其部分，从而在链之间产生额外的二硫键，导致更高效的二聚体形成和二聚体更大的稳定性。
虽然不希望局限于某一特定作用机制，但是目前认为当在免疫细胞表面上表达时，本发明的抗原受体的两条肽链至少由于两条链上的单个免疫受体信号传输结构域之间的相互作用(例如，二硫键)形成二聚体，以及与参与生理性T细胞受体信号转导的内源CD3复合物形成复合物。但是，本发明还可以包括直接融合至CD3ζ或任何其他免疫细胞的信号传导结构域(CD3、CD3亚基FcγR)代替TCR Cα和Cβ结构域。目前认为当抗原结合时，信号传输入细胞，导致激活免疫细胞和产生抗原特异性免疫应答。此外，目前认为与单价受体和仅能进行链内抗原结合的二价受体相比，链间抗原结合提供更稳定的抗原-抗原受体-内源CD3信号转导模块，其更高的稳定性转而可以更有效地刺激抗原特异性免疫应答。目前认为这种更高的稳定性还可以选择仅使用人源性免疫受体信号传输结构域(例如，用源自另一物种如小鼠的氨基酸序列最低限度的取代或不取代人源氨基酸序列)。因此，可以避免任何潜在的针对抗原受体本身的不需要的免疫应答。
除了形成抗原结合位点的结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及包括CD3ζ的免疫受体信号传输结构域或任何其他免疫细胞信号传导结构域，本发明的抗原受体或其肽链还可以包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以在抗原受体结合至靶向部分时，促进T细胞如细胞毒性T细胞的增殖和存活。共刺激结构域的特征仅限于它们能够在抗原受体结合靶向部分时促进细胞增殖。合适的共刺激结构域包括CD28、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员CD137(4-1BB)、TNFR受体超家族的成员CD134(OX40)、和CD278(ICOS)，活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激分子。技术人员会理解可以使用这些提到的共刺激结构域的序列变体而不会对本发明产生不利影响，其中变体具有与其模型结构域相同或相似的活性。这类变体与其源结构域的氨基酸序列具有至少约80％序列相同性。在本发明的一些实施方案中，抗原受体构建体或其肽链包含两个共刺激结构域。虽然特定组合包括4种提到的结构域的所有可能的变化，具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。
本发明的抗原受体或其肽链可以包含一个或多个共刺激结构域，以及免疫受体信号传输结构域，以N-末端至C-末端方向连接。但是，本发明的抗原受体或其肽链不限于这种排列，其他排列是可接受的，包括免疫受体信号传输结构域以及一个或多个共刺激结构域。
应当理解因为形成抗原结合位点的结构域必须自由结合抗原，这些结构域在融合蛋白中的位置通常应该使该区域在细胞外部得以展示。以相同方式，因为共刺激结构域和免疫受体信号传输结构域用于诱导T细胞的活性和增殖，融合蛋白通常细胞内部展示这些结构域。抗原受体可以包括额外元件，如信号肽以确保正确输出融合蛋白至细胞表面，跨膜结构域以确保融合蛋白保持为完整的膜蛋白，以及铰链结构域(或间隔子)，其赋予形成抗原结合位点的结构域柔性并使其与抗原牢固结合。
任选地，本发明的抗原受体可以进一步包含连接子，所述连接子可以是可用作氨基酸序列之间的间隔子的任意氨基酸序列或其他化合物。连接子的设计通常旨在提供柔性和蛋白酶抗性。例如，连接子可以在本发明的组合抗原受体的第一肽链上的第一与第二结构域之间和/或第二肽链的第一与第二结构域之间。任选地，连接子可以存在于形成抗原结合位点的结构域与T细胞受体链的可变区或其部分之间。本发明涵盖本领域已知的允许结构域形成抗原结合位点或不干扰抗原结合的任何类型的连接子。在具体实施方案中，连接子可以是任意氨基酸序列，并且长度可以为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少100个氨基酸残基。氨基酸连接子通常富含甘氨酸以具有柔性，以及丝氨酸和苏氨酸以具有溶解性。在一实施方案中，连接子是一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8或9个)4个甘氨酸残基然后1个丝氨酸残基(Gly4Ser)的重复。在某些实施方案中，连接子可以是抗体或其片段的铰链区。
本发明的抗原受体可以进一步包含将抗原受体锚定在膜上的另一结构域，如经典的跨膜结构域。优选地，将跨膜结构域纳入信号传输结构域或跨膜结构域为信号传输结构域的一部分。
在其他实施方案中，本发明的抗原受体或抗原受体的肽链可以进一步包含其他结构域(当其他结构域不是免疫受体信号传输结构域的一部分时)，如参与或增强抗原结合的额外结构域，用于膜结合表达或分泌的信号序列，提供更好的二聚化的结构域，以及跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域可以是跨越膜的输水α螺旋。
优选地，信号序列或信号肽是这样的序列或肽，其允许通过分泌途径的充分传递并在细胞表面上表达，从而使例如抗原受体可以结合胞外环境中存在的抗原。优选地，信号序列或信号肽可切割并从成熟肽链去除。信号序列或信号肽优选根据产生肽链的细胞或生物体选择。
在一特定实施方案中，本发明的组合抗原受体的肽链可以包含结构：NH2-信号肽-参与抗原结合的第一结构域-任选存在的连接子-参与抗原结合的第二结构域-任选存在的连接子-T细胞受体链的可变区或其部分-免疫受体信号传输结构域-COOH。
本发明的示例性抗原受体包括但不限于具有下文表I中列出的结构的第一和第二肽链形成的那些(VH是免疫球蛋白的重链的可变区或其部分；VL是免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分；V1和V2是会互相形成二聚体的T细胞受体链的可变区或其部分；C1和C2是会互相形成二聚体的免疫受体信号传输结构域，例如，免疫细胞Fc受体链的恒定或不变区，或者T细胞受体链的恒定或不变区，或者恒定或不变区的一部分)。如果C1和C2是T细胞受体链的恒定区，V1和C1优选来自相同T细胞受体链，并且V2和C2优选来自相同T细胞受体链，T细胞受体链优选来自相同T细胞受体。特别地，在一实施方案中V1-C1本质上对应于T细胞受体链(TCRα或TCRβ)的序列，并且V2-C2本质上对应于互补T细胞受体链的序列(当V1-C1是TCRα时，V2-C2是TCRβ，或者当V1-C1是TCRβ时，V2-C2是TCRα)。
表I
第一肽链 第二肽链
VH(1)-VL(2)-V1-C1 VL(1)-VH(2)-V2-C2
VH(1)-VH(2)-V1-C1 VL(1)-VL(2)-V2-C2
VH(1)-VH(2)-V1-C1 VL(2)-VL(1)-V2-C2
VH(1)-VL(2)-V1-C1 VH(2)-VL(1)-V2-C2
如上文定义的，抗原受体包含对第一表位具有特异性的免疫球蛋白重链的可变结构域(VH)(VH(1))，对第一表位具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变结构域(VL)(VL(1))，对第二表位具有特异性的免疫球蛋白重链的可变结构域(VH)(VH(2))，以及对第二表位具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变结构域(VL)(VL(2))，所述第一和第二表位可以相同或不同，并且可以位于相同或不同抗原上。在一实施方案中，VH(1)能够与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，但是VH(1)不能与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)不能与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。但是，在另一实施方案中，VH(1)能够与VL(1)以及VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)以及VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。在后一实施方案中，VH(1)和VH(2)可以相同或至少源自相同免疫球蛋白，并且VL(1)和VL(2)可以相同或至少源自相同免疫球蛋白。
在特定实施方案中，表1中列出的第一和第二肽链的V1和V2结构域分别是T细胞受体α和β链的可变区，或其部分。在特定实施方案中，表1中列出的第一和第二肽链的C1和C2结构域分别是T细胞受体α和β链的恒定区，或其部分。
在一实施方案中，表1中列出的第一肽链的V1和C1结构域是T细胞受体α链的可变和恒定区或者其部分。在这个实施方案中，表1中列出的第二肽链的V2和C2结构域优选是T细胞受体β链的可变和恒定区或者其部分。
在一实施方案中，表1中列出的第一肽链的V1和C1结构域是T细胞受体β链的可变和恒定区或者其部分。在这个实施方案中，表1中列出的第二肽链的V2和C2结构域优选是T细胞受体α链的可变和恒定区或者其部分。
在一优选实施方案中，当一条肽链上的两个结构域均为免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，且另一条链上的两个结构域均为免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分时，在两条肽链上的第一与第二结构域之间均存在连接子。连接子可以是长度为10-25个氨基酸的任意氨基酸序列，更优选长度为15个氨基酸。在一具体实施方案中，连接子是3个重复的5聚体氨基酸序列(Gly4Ser)。
在本发明的某些实施方案中，第一和第二肽链的氨基酸序列是哺乳动物来源的，优选小鼠来源的，并且更优选人源的，所述氨基酸序列如包含形成抗原结合位点的一个或多个结构域、T细胞受体链的可变区或其部分、或者免疫受体信号传输结构域。在一实施方案中，所述氨基酸序列是人源的，但是已进行小鼠化，如用小鼠序列中相应位置发现的氨基酸取代人序列中的一个或多个氨基酸。这样的取代可以提供更强的二聚化或稳定性或在抗原结合时将信号传输入细胞的能力。在另一实施方案中，所述氨基酸序列是小鼠来源的，并且已人源化。
根据本发明，抗原受体可以如上文所述代替T细胞受体的功能，并且特别地，可以如上文所述赋予细胞(如T细胞)反应性(如细胞毒性活性)。但是，与如上文所述的T细胞受体结合至抗原肽-MHC复合物相反，在某些实施方案中抗原受体可以结合至抗原，特别是当在细胞表面上表达时。
可以修饰肽链的氨基酸序列，包括任何结构域或连接子。例如，并且如本领域技术人员理解的，可以修饰抗体和T细胞受体的可变区的序列而不使其失去结合靶标的能力，结果可以相似地修饰抗原结合位点的氨基酸序列而不使其失去结合靶标的能力。例如，形成抗原结合位点的结构域的氨基酸序列可以与其来源的抗体的可变区相同或高度同源。关于“高度同源”，考虑可以产生1-5，优选1-4，如1-3或1或2个取代。在一实施方案中，肽链可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸。在另一实施方案中，肽链仅包括天然氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指与20个天然氨基酸种类的结构不同的氨基酸。因为非天然氨基酸具有与天然氨基酸相似的结构，非天然氨基酸可以被归为给定天然氨基酸的衍生物或类似物。
在一实施方案中，可以修饰T细胞受体的一个或多个可变区或者其部分的氨基酸序列，特别是不形成抗原结合位点的那些，以便消除与其抗原的(残留的)结合。特别地，这样的“沉默”修饰可以通过将一个或多个突变引入TCRα和/或TCR β的可变区的CDR3来实现。
本发明还涵盖本文所述抗原受体和肽链的衍生物。根据本发明，“衍生物”是蛋白和肽的修饰形式。这类修饰包括任何化学修饰，并且包含与抗原受体或肽链相关的任何分子的单个或多个取代、删除和/或添加，所述认识分子如碳水化合物、脂质和/或蛋白或肽。在一实施方案中，蛋白或肽的“衍生物”包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白酶切割或结合至抗原所致的那些修饰的类似物。术语“衍生物”还延伸至所述抗原受体和肽链的所有功能性化学等同物。优选地，修饰的抗原受体或其肽链的结合或二聚化能力增强和/或免疫激活能力增强。
与本发明的抗原受体系统组合使用的细胞优选是T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。当活化时，这些细胞毒性淋巴细胞中各自触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的一种或两种触发靶细胞的破坏。第一，一旦活化，T细胞释放细胞毒素如穿孔蛋白、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔蛋白和颗粒溶素使靶细胞产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。第二，可以通过T细胞与靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导凋亡。细胞毒性淋巴细胞优选是自体细胞，虽然也可以使用异源细胞或同种异体细胞。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白，优选涉及抗原受体如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于结构域，即，具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的免疫球蛋白结构域。该术语涵盖膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称作表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其一般是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白一般称作抗体。免疫球蛋白一般包含几条链，通常是通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域组成，如VL(可变轻链)结构域、CL(恒定轻链)结构域以及CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。有5种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即，α、δ、ε、γ和μ，其对应不同类别的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在它们的羧基末端包含跨膜结构域和短的胞内结构域。在哺乳动物中有两种类型的轻链，即，λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的各同种型内基本上是保守的，其中可变部分高度不同并负责抗原识别。
术语“抗体”是指一种糖蛋白，其至少包含通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其穿插于被称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体显示单一结合特异性和亲和力。在一实施方案中，通过杂交瘤制备单克隆抗体，所述杂交瘤包括获得自非人动物如小鼠的B细胞，其融合至永生化细胞。
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，如(a)分离自动物(例如，小鼠)的抗体，相对于免疫球蛋白基因或由其制备的杂交瘤，所述动物是转基因或转染色体(transchromosomal)的，(b)分离自宿主细胞的抗体，转化所述宿主细胞以表达抗体，例如，分离自转染瘤，(c)分离自重组、组合抗体文库的抗体，以及(d)通过任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体，涉及剪接免疫球蛋白基因序列为其他DNA序列。
如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上非人源的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的剩余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可以包含融合至恒定结构域的完整可变结构域，也可以仅包含移植至可变结构域中的适当框架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型也可以是通过一个或多个氨基酸取代修饰的，例如修饰以更接近人免疫球蛋白。一些形式的人源化抗体保留所有CDR序列(例如包含来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式有一个或多个CDR相对于原始抗体发生变异。
术语“嵌合抗体”是指那些抗体，其中重链和轻链各自的氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余部分与另一抗体中的相应序列同源。通常轻链和重链的可变区模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定区与源自另一种哺乳动物的抗体序列同源。这类嵌合形式的一个明显优势是可变区可以方便地源自目前已知的来源，利用来自非人宿主生物的现成B细胞或杂交瘤，与源自例如人细胞制品的恒定区组合。可变区具有易于制备和特异性不受来源影响的优点，同时恒定区是人源的，当注射抗体时，与来自非人源的恒定区相比，不易引发来自人个体的免疫应答。但是定义并不限于这个特定实例。
抗体可以源自不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
本文描述的抗体包括IgA如IgA1或IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM以及IgD。在各种实施方案中，所述抗体是IgG1抗体，更特别是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1,κ,λ)，IgG2a抗体(例如IgG2a,κ,λ)，IgG2b抗体(例如IgG2b,κ,λ)，IgG3抗体(例如IgG3,κ,λ)或IgG4抗体(例如IgG4,κ,λ)。
本文描述的抗原受体可以包含一种或多种抗体的抗原结合部分。术语抗体的“抗原结合部分”(或简单的“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简单的“结合片段”)或相似术语是指保留特异性地结合抗原能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)可以任选地通过合成连接子连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但是可以利用重组方法通过合成连接子将它们连接，使得它们能够成为单一蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird etal.(1988)Science 242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合片段”内。进一步的实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合至免疫球蛋白铰链区多肽的结合结构域多肽，(ii)融合至铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)融合至CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。US 2003/0118592和US 2003/0133939中进一步公开了结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。可通过本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式对这些片段的应用性进行筛选。
单链可变片段(scFv)是用连接子肽连接的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。连接子可以连接VH的N末端与VL的C末端，或者反之亦然。通过连接两个scFv可以工程化二价(或双价)单链可变片段(二scFv、双scFv)。这可以通过制备具有两个VH和两个VL区的单肽链完成，产生串联scFv。
与本发明相关的术语“结合结构域”或简单的“结构域”的表征例如抗体的结构，当任选地与另一结构域相互作用时，其与给定靶结构/抗原/表位结合/相互作用。因此，本发明的这些结构域命名为“抗原结合位点”。
抗体或抗体的衍生物可用于提供结合结构域，如抗体片段，特别是提供VL和VH区。
可能存在于抗原受体内的抗原的结合结构域具有结合(靶向)抗原的能力，即结合(靶向)抗原中表位的能力，优选位于抗原的胞外结构域内的表位。优选地，抗原的结合结构域是抗原特异性的。优选地，抗原的结合结构域结合细胞表面上表达的抗原。在特别优选的实施方案中，抗原的结合结构域结合活细胞表面上存在的抗原的天然表位。
为了本发明的目的，术语“抗体”涵盖所有抗体和抗体的衍生物，如本文描述的抗体片段。
抗体可以通过各种技术制备，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler andMilstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交方法，原则上，也可以采用制备单克隆抗体的其他技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化或者利用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是小鼠系统。小鼠中的杂交瘤制备是非常成熟的方法。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他优选动物系统是大鼠和兔系统(例如Spieker-Polet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9348(1995)中描述的，还参见Rossi et al.,Am.J.Clin.Pathol.124:295(2005))。
为了产生抗体，如同描述的那样，可以用与载体缀合的肽、重组表达的抗原或其片段的富集制备物和/或表达抗原的细胞免疫小鼠，所述与载体缀合的肽源自抗原序列，即抗体针对的序列。。或者，可以用编码抗原或其片段的DNA免疫小鼠。在利用纯化的抗原或抗原的富集制备物免疫不产生抗体的情况下，还可以用表达抗原的细胞免疫小鼠，例如，细胞系，以便促进免疫应答。
在免疫方案的过程中，可通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品监测免疫应答。具有足够效价的免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。在处死和取脾前3天，可以用表达抗原的细胞腹腔内或静脉内对小鼠加强免疫以增加分泌特异性抗体的杂交瘤的比率。
为了制备产生单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和淋巴结细胞并融合至适当的永生化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞系。然后可以筛选所得的杂交瘤用于制备抗原特异性抗体。然后可以通过ELISA筛选单个孔中分泌抗体的杂交瘤。用表达抗原的细胞进行免疫荧光和FACS分析，可以鉴定对抗原具有特异性的抗体。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且如果仍是单克隆抗体阳性的，可以通过有限稀释亚克隆。然后可以体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生抗体用于表征。
可以利用标准结合测定法(例如，ELISA、蛋白印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)测定抗体和其他结合物质结合抗原的能力。
本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
根据本发明，如果物质如抗原受体对预定靶标具有显著亲和力并在标准测定中结合预定靶标，则其能够结合(靶向)预定靶标。“亲和力”或“结合亲和力”常通过平衡解离常数(KD)测量。优选地，术语“显著亲和力”是指以10-5M或更低、10-6M或更低、10-7M或更低、10- 8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低或者10-12M或更低的解离常数(KD)结合预定靶标。
如果物质对靶标没有显著亲和力且在标准测定中不显著结合靶标，特别是对靶标的结合不可检测，则其(基本上)不能结合(靶向)靶标。优选地，如果在高达2，优选10，更优选20，特别是50或100μg/ml或更高的浓度下，则物质对所述靶标的结合不可检测。优选地，与其能够结合的预定靶标相比，如果物质以高至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍的KD结合靶标，则其对所述靶标没有显著亲和力。例如，如果物质结合至其能够结合的靶标的KD是10-7M，则其结合至没有显著亲和力的靶标的KD是至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
如果物质能够结合预定靶标同时其(基本上)不能结合其他靶标，即对其他靶标没有显著亲和力且在标准测定中不显著结合其他靶标，则所述物质是预定靶标特异性的。优选地，如果对这类其他靶标的亲和力和结合不显著超过对与预定靶标无关的蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或人血清白蛋白(HSA)的亲和力或结合，则物质是预定靶标特异性的。优选地，与其非特异性靶标相比，如果物质以低至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍的KD结合靶标，则其是预定靶标特异性的。例如，如果物质结合其特异性靶标的KD是10- 7M，则结合其非特异性靶标的KD是至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
可以利用任何合适的方法实验测定物质对靶标的结合；参见，例如，Berzofsky etal.,"Antibody-Antigen Interactions"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and CompanyNew York,N Y(1992)，以及本文描述的方法。亲和力可以利用常规技术容易地测定，例如通过平衡透析；通过按照制造商概述的常规程序使用BIAcore 2000仪器；通过利用放射性标记的靶抗原进行放射免疫测定；或者通过技术人员已知的其他方法。可以通过例如Scatchard et al.,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析亲和力数据。如果在不同条件下测量，例如，盐浓度、pH，测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数如KD、IC50的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液进行。
本发明可以包括在体外或体内将编码抗原受体的核酸引入细胞如T细胞，即转染。
为了本发明的目的，术语“转染”包括将核酸引入细胞或细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于个体中，例如，患者。因此，根据本发明，用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如所述细胞可以形成患者器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时或稳定的。对于转染的某些应用，转染的遗传物质仅瞬时表达就足够。由于转染过程中引入的核酸通常不整合入核基因组，外源核酸会通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸的游离扩增的细胞大大降低稀释率。如果期望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，必须进行稳定转染。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。
根据本发明，可以使用可用于将核酸引入，即转移或转染入细胞的任何技术。优选地，通过标准技术将核酸如RNA转染入细胞。这类技术包括电穿孔、脂质体转染和显微注射。在本发明的一特别优选的实施方案中，通过电穿孔将RNA引入细胞。电穿孔或电通透(electropermeabilization)涉及由外加电场引起的细胞质膜的电导率和通透性的显著增加。其在分子生物学中通常用作将一些物质引入细胞的一种方式。根据本发明，优选将编码蛋白或肽的核酸引入细胞，导致所述蛋白或肽的表达。
各种方法可以用来将抗原受体构建体引入T细胞，包括基于非病毒的DNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染的插入诱变的风险低。与不含整合元件的质粒相比，基于转座子的系统可以更高效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易制备，高效并永久地转导T细胞，并且从整合角度已初步证实在原代人T细胞中是安全的。慢病毒载体也高效并永久地转导T细胞，但是制造成本更高。它们还可能比基于逆转录病毒的系统更安全。
对于体内细胞转染，可以使用包含编码抗原受体的核酸的药物组合物。可以向患者给药将核酸靶向至特定细胞如T细胞的递送媒介物，导致体内发生的转染。
根据本发明，优选以裸露形式或在载体中给药编码抗原受体的核酸。考虑用于本发明的载体如脂质载体包括任何物质或媒介物，核酸如RNA可以与其相互作用，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包裹或封装核酸的小泡。与裸露的核酸相比，这可以导致核酸的稳定性增加。特别地，可以增加核酸在血液中的稳定性。例如，可以使用具有规定粒径的纳米颗粒RNA制剂，如来自RNA和脂质体的lipoplex，例如包含DOTMA和DOPE或者DOTMA和胆固醇的lipoplex。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有使得颗粒适合全身，特别是肠胃外给药的直径的任何颗粒，特别是核酸颗粒，通常是少于1000纳米(nm)的直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有少于600nm的直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有少于400nm的直径。
如本文所用，术语“纳米颗粒制剂”或相似术语是指包含至少一个纳米颗粒的任何物质。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是纳米颗粒的均匀集合。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是分散剂或乳剂。一般来说，当合并至少两种不互溶的物质时形成分散剂或乳剂。
术语“lipoplex”或“核酸lipoplex”，特别是“RNA lipoplex”是指脂质和核酸(特别是RNA)的复合物。当阳离子脂质体，其通常还包括中性“辅助”脂质，与核酸混合时自发形成lipoplex。
阳离子脂质、阳离子聚合物和其他带正电荷的物质可以与带负电荷的核酸形成复合物。这些阳离子分子可以用来络合核酸，从而分别形成例如所谓的lipoplex或polyplex，并且这些复合物已被证明可以将核酸递送入细胞。
可以由各种核酸络合化合物通过各种方案获得用于本发明的纳米颗粒核酸制品。脂质、聚合物、寡聚体或两亲分子是典型的络合剂。在一实施方案中，络合化合物包含选自鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸或组蛋白的至少一种物质。
根据本发明，鱼精蛋白可用作阳离子载体物质。术语“鱼精蛋白”是指任何分子量相对较低的强碱性蛋白，其富含精氨酸并发现在各种动物(如鱼)的精细胞中代替体细胞组蛋白特别与DNA相互作用。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精子中发现的蛋白，其是强碱性的，在水中可溶，加热不会凝结，并且在水解时主要产生精氨酸。以纯化的形式，它们用于胰岛素的长效制剂以及中和肝素的抗凝作用。
根据本发明，如本文所用的术语“鱼精蛋白”旨在包含获得自或衍生自天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段以及所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。此外，该术语涵盖(合成的)多肽，所述多肽是人工的且专为特定目的而设计，并且不可以分离自天然或生物来源。
根据本发明使用的鱼精蛋白可以是硫酸鱼精蛋白或盐酸鱼精蛋白。在一优选实施方案中，用于制备本文所述纳米颗粒的鱼精蛋白来源是鱼精蛋白5000，其在等渗盐溶液中包含超过10mg/ml的鱼精蛋白(5000肝素-中和单位/ml)。
脂质体是微小的脂泡，其通常具有一个或多个形成囊泡的脂质双层，如磷脂，并且能够包裹药物。在本发明的上下文中可以采用不同类型的脂质体，包括但不限于多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)、空间稳定脂质体(SSL)、多泡囊泡(MV)和大多泡囊泡(LMV)以及本领域已知的其他双层形式。脂质体的大小和片层结构(lamellarity)取决于制备方式，并且待用的囊泡类型的选择取决于给药的优选模式。有几种其他形式的超分子组织，其中脂质可以存在于水性介质中，包含层状相、六角形和倒六角形相、立方相、胶束、由单层组成的反胶束。这些相还可以与DNA或RNA组合获得，并且与RNA和DNA的相互作用可能实质上影响相状态。所述相可以存在于本发明的纳米颗粒核酸制剂中。
对于从核酸和脂质体形成核酸lipoplex，可以使用任何合适的形成脂质体的方法，只要可以提供设想的核酸lipoplex。可以利用标准方法形成脂质体，如逆相蒸发法(REV)、乙醇注入法、脱水-复水法(DRV)、超声或其他合适的方法。
脂质体形成之后，可以改变脂质体的大小以获得具有基本上均匀大小范围的脂质体群体。
形成双层的脂质通常具有两条烃链，特别是酰基链，以及头部基团，其可以是极性或非极性。形成双层的脂质由天然存在的或合成的脂质构成，包括磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中所述两条烃链通常长度为约14-22个碳原子，并且具有不同程度的不饱和度。用于本发明的组合物的其他合适的脂质包括糖脂和固醇如胆固醇及其可以用于脂质体的各种类似物。
阳离子脂质通常具有亲脂部分，如固醇，酰基或二酰基链，并且具有总的净正电荷。脂质的头部基团通常携带正电荷。阳离子脂质优选具有1-10价的正电荷，更优选1-3价的正电荷，并且更优选1价的正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)；二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；二(十八烷基)二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二豆蔻酰基丙基-1,3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)以及2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺(propanamium)三氟乙酸盐(DOSPA)。优选DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选DOTMA。
此外，为了结构稳定性等，本文所述纳米颗粒优选进一步包括中性脂质。可以根据核酸-脂质复合物的递送效率适当选择中性脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基(octadecenoyl))-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂(sphingoemyelin)、脑磷脂、固醇和脑苷脂。优选DOPE和/或DOPC。最优选DOPE。在阳离子脂质体同时包含阳离子脂质和中性脂质的情况下，阳离子脂质比中性脂质的摩尔比可以根据脂质体的稳定性等适当确定。
根据一实施方案，本文所述纳米颗粒可以包含磷脂。磷脂可以是甘油磷脂。甘油磷脂的实例包括但不限于3种类型的脂质：(i)两性离子磷脂，其包括例如磷脂酰胆碱(PC)，卵黄磷脂酰胆碱，天然的大豆来源的PC，部分氢化或完全氢化的形式，二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)鞘磷脂(SM)；(ii)负电荷的磷脂：其包括例如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、二棕榈酰(dipalmipoyl)PG、二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)；合成衍生物，其中缀合使两性离子磷脂带负电荷，例如甲氧基-聚乙烯,乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)的情况就是这样；以及(iii)阳离子磷脂，其包括例如磷脂酰胆碱或鞘磷脂，将其磷酸单酯O-甲基化以形成阳离子脂质。
核酸与脂质载体可以通过例如使核酸填充载体的间隙结合，从而载体物理地捕获核酸，或者通过共价键、离子键或氢键，或者通过非特异性键吸附。无论以哪种方式结合，核酸必须保留其治疗，即编码特性。
根据本发明，在一实施方案中编码抗原受体的核酸是RNA，优选mRNA。所述RNA优选通过体外转录获得。
如本文所用，术语“核酸”意图包括DNA和RNA，如基因组DNA、cDNA、mRNA，重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，核酸优选是分离的核酸。
核酸可以包含在载体中。如本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体如λ噬菌体，病毒载体如腺病毒或杆状病毒载体，或者人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体，并且一般包含所需的编码序列以及在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当DNA序列。克隆载体一般用来工程化和扩增某个所需的DNA片段，并且可以缺少表达所需DNA片段所需要的功能序列。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及不同于天然存在的RNA的修饰的RNA，通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸的。这类改变可以包括添加非核苷酸物质，如添加在RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸上。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物或天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”，其表示“信使RNA”并涉及“转录物”，转录物可以利用DNA作为模板产生并编码肽或蛋白。mRNA通常包含5'非翻译区(5'-UTR)、蛋白或肽编码区以及3'非翻译区(3'-UTR)。mRNA在细胞中和体内具有有限的半衰期。优选地，利用DNA模板通过体外转录产生mRNA。在本发明的一实施方案中，通过体外转录或化学合成获得RNA。体外转录方法是技术人员已知的。例如，有各种体外转录试剂盒可商购。
在本发明的一实施方案中，RNA是自我复制的RNA，如单链自我复制的RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是正义的单链RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是病毒RNA或源自病毒RNA的RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是甲病毒(alphaviral)基因组RNA或源自甲病毒基因组RNA。在一实施方案中，自我复制的RNA是病毒基因表达载体。在一实施方案中，病毒是塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)。在一实施方案中，自我复制的RNA包含一个或多个转基因，至少一个所述转基因编码本文描述的物质。在一实施方案中，如果RNA是病毒RNA或源自病毒RNA，转基因可以部分或完全代替病毒序列如编码结构蛋白的病毒序列。在一实施方案中，自我复制的RNA是体外转录的RNA。
为了增加根据本发明使用的RNA的表达和/或稳定性，可以将其修饰，优选不改变表达的肽或蛋白的序列。
根据本发明使用的RNA的上下文中的术语“修饰”包括在所述RNA中非天然存在的RNA的任何修饰。
在本发明的一实施方案中，根据本发明使用的RNA没有无帽的5'-三磷酸。可以通过用磷酸酶处理RNA去除这类无帽的5'-三磷酸。
本发明的RNA可以具有修饰的天然存在或合成的核糖核苷酸以增加其稳定性和/或减少细胞毒性。例如，在一实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷部分地或完全地，优选完全地取代胞苷。可选地或额外地，在一实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷部分地或完全地，优选完全地取代尿苷。
在一实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’帽或5’帽类似物的RNA。术语“5’帽”是指在mRNA分子的5'末端上发现的帽结构，并且一般由通过不寻常的5'至5'三磷酸键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一实施方案中，这个鸟苷在7位置甲基化。术语“常规5’帽”是指天然存在的RNA5’帽，优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’帽”包括5’帽类似物，其类似RNA帽结构并且经修饰可以在粘附于RNA时稳定RNA，优选在体内和/或细胞中。
可以通过在所述5’帽或5’帽类似物的存在下体外转录DNA模板提供具有5’帽或5’帽类似物的RNA，其中所述5’帽共转录地掺入产生的RNA链，或者可以例如通过体外转录产生RNA，并且可以利用加帽酶，例如痘苗病毒的加帽酶，将5’帽转录后连接至RNA。
RNA可以包含进一步的修饰。例如，本发明中使用的RNA的进一步修饰可以是天然存在的poly(A)尾的延长或截短，或者5'或3'非翻译区(UTR)的改变，如引入与所述RNA的编码区无关的UTR，例如，插入一个或多个，优选两个拷贝的源自珠蛋白基因的3'UTR，如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。
因此，为了增加根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可以将其修饰以便与polyA序列一起出现，优选具有10-500，更优选30-300，甚至更优选65-200，特别是100-150个腺苷残基的长度。在一特别优选的实施方案中，polyA序列具有约120个腺苷残基的长度。此外，将两个或更多个3'非翻译区(UTR)纳入RNA分子的3'非翻译区可以导致翻译效率增强。在一特别实施方案中，3’-UTR源自人β-珠蛋白基因。
RNA的术语“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数量所需要的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA稳定性。RNA的半衰期可以影响RNA的“表达持续时间”。可以预期具有长半衰期的RNA会表达延长的时间。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及一个过程，其中DNA序列中的遗传密码转录为RNA。随后，RNA可以翻译为蛋白。根据本发明，术语“转录”包含“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及一个过程，其中RNA，特别是mRNA，在不含细胞的系统中体外合成，优选利用适当的细胞提取物。优选地，克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体一般指定为转录载体，并且根据本发明涵盖在术语“载体”内。
本发明的术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程信使RNA链指导氨基酸序列组装以产生肽或蛋白。
根据本发明，核酸可以单独存在或与其他核酸组合存在，所述其他核酸可以是同源或异源的。在优选的实施方案中，将核酸功能性连接至表达控制序列，所述表达控制序列可以与所述核酸同源或异源。术语“同源”表示核酸也天然地功能性连接，而术语“异源”表示核酸不是天然地功能性连接。
如果核酸和表达控制序列彼此共价连接的方式是使得所述核酸的表达或转录在所述表达控制序列的控制或影响下，则它们互相“功能性”连接。如果核酸翻译为功能性蛋白，则有了功能性连接至编码序列的表达控制序列，诱导所述表达控制序列导致所述核酸的转录，不会引起编码序列中的移码或所述编码序列不能翻译为期望的蛋白或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“表达控制元件”包含启动子、核糖体结合位点、增强子以及调节基因的转录或mRNA的翻译的其他控制元件。在本发明的特定实施方案中，可以调节表达控制序列。表达控制序列的精确结构可以根据物种或细胞类型变化，但是一般包含5’-非转录以及5’-和3’-非翻译序列，其分别参与转录和翻译的起始，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5’-非转录表达控制序列包含启动子区，其包括启动子序列，所述启动子序列用于功能性连接的核酸的转录控制。表达控制序列还可以包含增强子序列或上游激活序列。
术语“表达”根据本发明以其最普遍的含义使用，包括产生RNA和/或肽或蛋白，例如通过转录和/或翻译。至于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及产生肽或蛋白,其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。
根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”表示与参考相比，例如个体未患有与某种蛋白(例如，肿瘤抗原)的异常或不正常表达相关的疾病的状态，表达改变，优选增加。表达增加是指增加至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％，或者更多。在一实施方案中，仅在病变组织中发现表达，而健康组织中的表达受到抑制。
术语“特异性地表达”表示蛋白基本上仅在特定的组织或器官中表达。例如，在胃粘膜中特异性表达的肿瘤抗原表示所述蛋白主要在胃粘膜中表达，并且不在其他组织中表达，或者在其他组织或器官类型中表达不显著。因此，仅在胃粘膜细胞中表达且在任何其他组织如睾丸中的表达显著较少的蛋白在胃粘膜细胞中特异性地表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原还可以在正常条件下在一种以上细胞类型或器官中特异性地表达，如在2或3种组织类型或器官中，但是优选在不超过3种不同组织或器官类型中表达。在这种情况下，则肿瘤抗原在这些器官中特异性地表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下在肺和胃中优选表达程度大致相等，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性地表达。
根据本发明，术语“核酸编码”表示如果存在于适当环境中，优选在细胞内，核酸可以表达以产生其编码的蛋白或肽。
本发明的术语“肽”包含寡肽和多肽，是指包含通过肽键共价连接的2个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选9个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个并且优选多达8、10、20、30、40或50个，特别是100个氨基酸的物质。术语“蛋白”是指大肽，优选具有超过100个氨基酸残基的肽，但是一般术语“肽”、“肽链”和“蛋白”是同义的，并且在本文中可交换使用。
如上文提到的，可以修饰本文描述的肽链和抗原受体的氨基酸序列以获得所述氨基酸序列的变体。因此，本发明包括本文描述的肽和蛋白序列的变体，并且包括天然存在的氨基酸序列的变体，其导致在功能上等同于所述序列的序列，例如表现出与所述序列相同或相似特性的氨基酸序列。重要特性是保留抗原受体对其靶标的结合或者将抗原结合信号转导至细胞，如T细胞。在一实施方案中，变体分子或序列与其亲本分子或序列在免疫学上是等同的。
本发明的术语“变体”特别指突变体、剪接变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体或物种同源物(species homolog)，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列中的改变，其意义通常不清楚。完整基因测序通常可鉴定出给定基因的许多等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应当涵盖任何翻译后修饰的变体和构象变体。
术语“在免疫学上等同”表示在免疫学上等同的分子，如在免疫学上等同的氨基酸序列，表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应，例如，在免疫学效应的类型方面。在本发明的上下文中，术语“在免疫学上等同”的使用优选关于用于治疗的抗原受体的免疫学效应或特性。
本领域技术人员会理解，特别是，可以修饰CDR序列、高变和可变区的序列而不失去结合靶标的能力。例如，CDR区可以与亲本抗体的区域相同或高度同源。“高度同源”可以认为在CDR中可以产生1-5，优选1-4，如1-3或1或2个取代。
为了本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。在蛋白的N末端和/或C末端包含缺失的氨基酸缺失变体还称作N末端和/或C末端截短变体。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列中的特定位点，虽然随机插入并恰当筛选所得产物也是可行的。
氨基酸添加变体包含在氨基末端和/或羧基末端融合一个或多个氨基酸，如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列去除一个或多个氨基酸，如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白的任何位置。
氨基酸取代变体的特征在于去除序列中的至少一个残基并在其位置插入另一残基。优先考虑修饰氨基酸序列中在同源蛋白或肽之间非保守的位置和/或用具有相似特性的其他氨基酸代替氨基酸。优选地，蛋白变体中的氨基酸改变是保守性氨基酸改变，即，带电荷相似或不带电荷的氨基酸的取代。保守性氨基酸改变涉及取代侧链相关的氨基酸家族的成员之一。天然存在的氨基酸一般分为4个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)，碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性，优选相同性的程度是至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选对参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，优选对至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸给出相似性或相同性程度，优选连续的氨基酸。在优选的实施方案中，对参考氨基酸序列的全长给出相似性或相同性程度。可以利用本领域已知的工具确定序列相似性，优选序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle,Matrix:Blosum62,Gap Open 10.0,Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表示相同的或代表保守性氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“相同性百分比(percentage identity)”意图表示经最佳比对之后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，这个百分比纯粹是统计的，并且两个序列之间的差异是随机分布的，并且分布在它们的全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较通常通过在将其序列最佳对齐之后比较这些序列进行，所述比较通过分段或通过“比较窗口”进行以鉴定并比较局部区域的序列相似性。除了手动，用于比较的序列的最佳比对可以这样进行，通过Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法，通过Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，通过Pearson andLipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性检索方法，或者通过使用这些算法的计算机程序(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup)，威斯康星州麦迪逊市575科学大道)。
相同性百分比这样计算，通过确定待比较的两个序列之间相同位置的数量，将这个数量除以比较的位置数量，并将获得的结果乘以100以获得这两个序列之间的相同性百分比。
根据本发明，同源氨基酸序列表现出至少40％、特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％且优选至少95％、至少98或至少99％的氨基酸残基的相同性。
根据本发明，氨基酸序列、肽或蛋白的变体、片段、部分(part)、部分(portion)或衍生物优选分别具有其起源的氨基酸序列、肽或蛋白的功能特性，即其是功能等同的。在一实施方案中，氨基酸序列、肽或蛋白的变体、片段、部件、部分或衍生物分别与其起源的氨基酸序列、肽或蛋白是功能等同的，如在免疫学上等同的。在一实施方案中，功能特性是结合抗原或在细胞内转导结合信号的特性。
根据本发明，术语“起源”表示特定实体，特别是特定序列，存在于其起源的物体中，特别是生物体或分子。在氨基酸序列的情况下，特别是特定序列区域，“起源”特别表示相关氨基酸序列源自其存在的氨基酸序列。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选涉及完整细胞，即具有完整膜的尚未释放其正常胞内组分如酶、细胞器或遗传物质的细胞。完整细胞优选是活细胞，即能够进行其正常代谢功能的活细胞。根据本发明，优选所述术语涉及可以用外源核酸转染的任何细胞。优选地，当用外源核酸转染并转移至受体时，所述细胞可以在受体中表达核酸。术语“细胞”包括细菌细胞；其他可用的细胞是酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括来自革兰氏阴性细菌菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌(Proteus)和假单胞菌(Pseudomonas)的菌株以及革兰氏阳性细菌菌株如芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、葡萄球菌(staphylococcus)和乳球菌(Lactococcus)的菌株的细胞。合适的真菌细胞包括来自木霉(Trichoderma)、脉孢菌(Neurospora)和曲霉(Aspergillus)的物种的细胞。合适的酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolicd))和汉逊酵母属(Hansenula)的物种的细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293HEK等。但是，也可以使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。哺乳动物细胞特别优选用于过继转移，如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类的细胞。细胞可以源自大量组织类型，并且包括原代细胞和细胞系，如免疫系统的细胞，特别是抗原呈递细胞如树突细胞和T细胞，干细胞如造血干细胞和间充质干细胞以及其他细胞类型。根据本发明使用的特别优选的细胞是免疫反应或免疫效应细胞，特别是T细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达所述核酸编码的肽或蛋白。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指特定实体增加的过程。在本发明的上下文中，该术语优选用于免疫应答的背景下，其中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特定淋巴细胞扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。术语“启动”是指这样的过程，其中T细胞第一次与其特异性抗原接触并导致分化为效应T细胞。
分子如核酸、肽链或抗原受体，或者本文描述的细胞可以是重组和/或分离的。
如本文所用的术语“分离的”是指基本上不含其它分子如其它细胞物质的实体。术语“分离的”优选表示分离的实体已脱离其自然环境。分离的实体可以处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”优选表示实体基本上不含其在自然中或体内相关的其他物质。
在本发明的上下文中，术语“重组”表示“通过遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物体”如重组细胞不是天然存在的。
如本文所用的术语“天然存在”是指物体可以在自然中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可以分离自自然来源并且尚未被人在实验室中有意改造的肽或核酸是天然存在的。
术语“自体”用来描述源自相同个体的任何事物。例如，“自体移植”是指源自相同个体的组织或器官的移植。这类方法是有利的，因为它们克服了导致排斥的免疫屏障。
术语“同种异体”用来描述源自相同物种的不同个体的任何事物。如果两个或多个个体的基因在一个或多个基因座处不同，则其是同种异体的。
术语“同基因”用来描述源自具有相同基因型的个体或组织的任何事物，即，同卵双胞胎或同种繁殖的动物，或者它们的组织。
术语“异源”用来描述由多种不同元素组成的事物。例如，将一个个体的骨髓转移入不同个体构成异源移植。异源基因是源自个体以外来源的基因。
如本文所用的“减少”或“抑制”表示引起水平总体减少的能力，优选5％或更大，10％或更大，20％或更大，更优选50％或最大，并且最优选75％或更大。术语“抑制”或相似短语包括完全或基本上完全抑制，即减少至0或基本上至0。
术语如“增加”或“增强”优选涉及增加或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％。
因为本发明的抗原受体可以工程化以靶向几乎任何抗原，包括疾病特异性抗原，所以本发明的抗原受体具有广泛的治疗用途。因此，本发明涉及本发明的抗原受体、其肽链、编码其的核酸以及其他相关分子在治疗和预防方法中的用途。一个这样的用途是产生抗原特异性免疫细胞，可以将其给药至患者用于预防或治疗疾病，所述疾病的特征在于表达一种或多种抗原，所述抗原可被在免疫细胞中表达的本发明的抗原受体结合。优选地，所述疾病是癌症。此外，本发明的抗原受体和相关分子还可以用于选择性根除表达预定抗原的细胞，以及针对其中表达预定抗原的疾病的免疫或疫苗接种，本发明的抗原受体的至少一个抗原结合位点可以结合所述抗原。
在一实施方案中，治疗或预防疾病的方法包括向患者给药有效量的编码本发明的抗原受体的核酸，其中所述抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合与待治疗或预防的疾病相关的抗原(例如，病毒或肿瘤抗原)。在另一实施方案中，治疗或预防疾病的方法包括向患者给药有效量的重组免疫效应细胞或所述免疫效应细胞的扩增群体，所述免疫效应细胞或细胞群体重组表达本发明的抗原受体，其中所述抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合与待治疗或预防的疾病相关的抗原。在优选的实施方案中，所述疾病是癌症，并且所述抗原是肿瘤相关抗原。
在另一实施方案中，本发明提供一种针对与特定抗原相关的疾病或针对表达特定抗原的致病生物免疫或疫苗接种的方法，所述方法包括向患者给药有效量的编码本发明的抗原受体的核酸，其中所述抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合所述特定抗原。在另一实施方案中，本发明提供一种针对与特定抗原相关的疾病或针对表达特定抗原的致病生物免疫或疫苗接种的方法，所述方法包括向患者给药有效量的重组免疫效应细胞或所述免疫效应细胞的扩增群体，所述免疫效应细胞或细胞群体重组表达本发明的抗原受体，其中所述抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合所述特定抗原。
在某些实施方案中，免疫效应细胞的群体可以是克隆扩增的群体。重组免疫效应细胞或其群体以抗原特异性方式提供治疗或预防性免疫效应功能。优选地，本发明的抗原受体在免疫效应细胞的细胞表面上表达。
与本发明的治疗和预防方法结合使用的细胞优选是免疫效应细胞，并且免疫效应细胞优选是T细胞。特别地，本文使用的细胞是细胞毒性淋巴细胞，优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。当活化/刺激时，这些细胞毒性淋巴细胞中的每种都触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的一种或两种触发靶细胞的破坏。第一，一旦活化，T细胞释放细胞毒素如穿孔蛋白(perforin)、颗粒酶(granzyme)和颗粒溶素(granulysin)。穿孔蛋白和颗粒溶素在靶细胞中打孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶(caspase)级联，诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。第二，可以通过T细胞与靶肿瘤细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导凋亡。T细胞和其他细胞毒性淋巴细胞优选是自体细胞，虽然可以使用异源细胞或同种异体细胞。
因此，本文描述的物质、组合物和方法可以用来治疗患有疾病的个体，例如，特征在于存在表达抗原的病变细胞的疾病。特别优选的疾病是癌症。
本文描述的物质、组合物和方法还可以用来免疫或疫苗接种以预防本文描述的疾病。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常理解为与特定症状或体征有关的医学状况。疾病可以由源自外部的因素引起，如传染病，或者其可以由内部功能失调引起，如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用来指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡，或者与所述个体接触的人的相似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，其有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、分离的症状、偏差行为以及结构和功能的非典型变化，但是在其他上下文中和为了其他目的，这些可认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上，而且还在情感上影响个体，因为感染并患有多种疾病可以改变一个人的人生观和一个人的性格。根据本发明，术语“疾病”包括传染病和癌症，特别是本文所述的那些形式的癌症。本文中对癌症或特定形式的癌症的任何提及还包括其癌症转移。
根据本发明治疗的疾病优选是涉及抗原的疾病。根据本发明“涉及抗原的疾病”、“与抗原的表达或表达升高相关的疾病”或相似表述表示，根据本发明，抗原在病变组织或器官的细胞中表达。病变组织或器官的细胞中的表达与健康组织或器官中的状态相比可能增加。在一实施方案中，仅在病变组织中发现表达，而在健康组织中未发现表达，例如表达受到抑制。根据本发明，涉及抗原的疾病包括传染病和癌症，其中疾病相关抗原优选分别是传染源的抗原或肿瘤抗原。优选地，涉及抗原的疾病优选是涉及表达抗原的细胞的疾病，优选在细胞表面上表达抗原。
术语“健康”或“正常”是指非病理状态，并且优选表示未感染的或非癌性的。
术语“癌症疾病(cancer disease)”和“癌症”是指或描述个体中的生理状况，通常其特征在于无节制的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这类癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈的癌症、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛部癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性和生殖器官癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌、脊髓轴肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤以及垂体腺瘤。本发明的术语“癌症”还包含癌症转移。优选地，“癌症疾病”的特征在于表达肿瘤抗原的细胞，并且癌细胞表达肿瘤抗原。
在一实施方案中，癌症疾病是恶性疾病，其特征在于其间变、侵袭和转移的特性。恶性肿瘤可以与非癌性良性肿瘤形成对比，其中恶性肿瘤在其生长中不受自我限制，能够侵入相邻组织，并且可能能够扩散至远处的组织(转移)，而良性肿瘤没有这些特性。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(称作瘤细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病变(lesion)。“肿瘤细胞”表示异常细胞，其通过快速、不受控制的细胞增殖生长，并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长。肿瘤表现出部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调，并且通常形成可能是良性、前恶性或恶性的明显的组织块。
根据本发明，“癌”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。这组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”是起源于腺组织的癌症。这种组织还是称作上皮组织的较大组织类别的一部分。上皮组织包括皮肤、腺以及衬在身体的空腔和器官的各种其他组织。上皮在胚胎学上源自外胚层、内胚层和中胚层。要被归类为腺癌，细胞不必是腺体的一部分，只要具有分泌特性即可。这种形式的癌可以在一些高等哺乳动物中发生，包括人。分化良好的腺癌倾向于类似它们起源的腺组织，而分化不良的可能不会。通过给来自活检的细胞染色，病理学家确定肿瘤是腺癌或一些其他类型的癌症。由于腺体在体内无处不在，腺癌可以出现在身体的许多组织中。虽然每种腺体可能不分泌相同物质，但是只要细胞有外分泌功能，则认为是腺体，并且其恶性形式因此命名为腺癌。恶性腺癌侵袭其他组织，并且如果有足够的时间通常会转移。卵巢腺癌是卵巢癌的最常见类型，其包括浆液性和粘液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
淋巴瘤和白血病是源自造血(血液形成(blood-forming))细胞的恶性肿瘤。
胚期肿瘤或胚细胞瘤是类似于未成熟或胚胎组织的肿瘤(通常是恶性的)。许多这些肿瘤在儿童中最常见。
“转移”表示癌细胞从其原始部位扩散至身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离，侵袭胞外基质，穿透内皮基底膜以进入体腔和血管，然后，通过血液运送之后，浸润靶器官。最后，在靶位点处新肿瘤的生长取决于血管发生。因为肿瘤细胞或组分可以保留并发展转移潜能，肿瘤转移甚至在切除原发性肿瘤后也经常发生。在一实施方案中，本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域淋巴结系统的转移。在一实施方案中，本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。
当人再次受到过去影响他们的疾病状况影响时，会发生旧病复发(relapse)或复发(recurrence)。例如，如果患者已患有肿瘤疾病，已接受所述疾病的成功治疗并再次发展所述疾病，所述新发展的疾病可以认为是旧病复发或复发。但是，根据本发明，肿瘤疾病的旧病复发或复发可以但不必发生在原始肿瘤疾病的部位。因此，例如，如果患者已患有卵巢肿瘤并已接受成功治疗，旧病复发或复发可以是卵巢肿瘤的发生或在不同于卵巢的部位的肿瘤的发生。肿瘤的旧病复发或复发还包括这样的情况，其中肿瘤发生在不同于原始肿瘤部位的部位以及在原始肿瘤的部位。优选地，患者已接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，在不同于原始肿瘤部位的部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
可以通过本发明治疗或预防的传染病是由传染原引起，所述传染原包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫和寄生虫。
人和非人脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。已在人中发现的病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称作HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或者HIV-III；以及其他分离株，如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒、)；杯状病毒科(Caliciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚bunya病毒、白蛉病毒和内罗毕病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多泡病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)、以及虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、δ肝炎的病原体(认为是乙肝病毒的缺陷卫星)，非甲型肝炎、非乙型肝炎的病原体(类别1＝内部传输；类别2＝肠外传输(即，丙型肝炎)；诺瓦克(Norwalk)和相关病毒，以及星状病毒)。
考虑的逆转录病毒包括简单的逆转录病毒和复杂的逆转录病毒。复杂的逆转录病毒包括慢病毒、T细胞白血病病毒和泡沫病毒的亚组。慢病毒包括HIV-1，但也包括HIV-2、SIV、维斯纳(Visna)病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿猴T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
可以通过本发明治疗或预防的细菌感染或疾病是由细菌引起的，包括但不限于在其生命周期中具有胞内阶段的细菌，如分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鸟型分枝杆菌(M.avium)、麻风分枝杆菌(Mleprae)或非洲分枝杆菌(M.africanum))、立克次氏体、支原体、衣原体和军团菌。考虑的细菌感染的其他实例包括但不限于由革兰氏阳性杆菌(例如，李斯特菌(Listeria)、芽孢杆菌(Bacillus)如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、丹毒杆菌属(Erysipelothrix)物种)，革兰氏阴性杆菌(例如，巴尔通氏体属(Bartonella)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲菌属(Campylobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、克雷伯菌属(Klebsiella)、摩根菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、Providencia、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、弧菌(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)物种)，螺旋体细菌(例如，包柔氏螺旋体属(Borrelia)物种，包括引起莱姆病的伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi))，厌氧细菌(例如，放线菌(Actinomyces)和梭菌(Clostridium)物种)，革兰氏阳性和阴性球菌，肠球菌(Enterococcus)物种，链球菌(Streptococcus)物种，肺炎球菌(Pneumococcus)物种，葡萄球菌(Staphylococcus)物种，奈瑟氏菌属(Neisseria)物种。传染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、结核分枝杆菌、鸟型分枝杆菌、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringes)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、核梭菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、雅司螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)以及以色列放线菌(Actinomyces israelii)。
可以通过本发明治疗或预防的真菌疾病包括但不限于曲霉病(aspergillosis)、隐球菌病(cryptococcosis)、孢子丝菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、接合菌病和念珠菌病。
可以通过本发明治疗或预防的寄生虫病包括但不限于阿米巴病、疟疾、利什曼病、球虫病、贾第虫病、隐孢子虫病、弓形虫病和锥虫病。还涵盖各种蠕虫感染，例如但不限于蛔虫病、钩虫病、鞭虫病、类圆线虫病、弓蛔虫病、旋毛虫病、盘尾丝虫病、丝虫病和恶丝虫病。还涵盖各种吸虫感染，例如但不限于血吸虫病、肺吸虫病和华支睾吸虫病。
术语“治疗”或“治疗性治疗”涉及改善个体健康状况和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体疾病，阻止或减缓个体疾病的发展，抑制或减缓个体疾病的发展，减少个体症状的频率或严重程度，和/或减少目前患有或以前患有疾病的个体的复发。
术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及意图防止个体发生疾病在的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可交换使用。
术语“个体”和“主体”在本文中可互换使用。它们是指可以患有或易患疾病或病症(例如，癌症)但是可能患有或未患有这种疾病或病症的人、非人灵长类或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，术语“个体”和“主体”不表示特定年龄，因此涵盖成年、老年、幼年和新生儿。在本发明的优选实施方案中，“个体”或“主体”是“患者”。根据本发明术语“患者”表示治疗对象，特别是患病个体。
“有风险”表示个体，即患者，其与一般群体相比，被鉴定为发展疾病(特别是癌症)的机会比正常更高，。此外，曾经患有或目前患有疾病(特别是癌症)的个体是发展疾病的风险增加的个体，因为这样的个体可能继续发展疾病。目前患有或以前患有癌症的个体的癌症转移的风险也增加。
术语“免疫疗法”涉及包括特异性免疫反应或应答的治疗。
在本发明的上下文中，术语如“保护”、“防止”、“预防”、“保护性”或“预防性”涉及个体中疾病的发生和/或传播的预防或治疗或两者，特别是最小化个体发展疾病的机会或延缓疾病的发展。例如，如上文所述，有肿瘤风险的人将成为预防肿瘤疗法的候选人。
免疫疗法的预防性给药，例如，本发明的物质或组合物的预防性给药，优选保护受体免于发展疾病。免疫疗法的治疗性给药，例如，本发明的物质或组合物的治疗性给药，可以抑制疾病的进展/发展。这包括减慢疾病的进展/发展，特别是破坏疾病的进展，这优选导致消除疾病。
免疫疗法可以利用任何技术进行，其中本文提供的试剂优选地起从患者中去除抗原表达细胞的作用。这种去除可能是因为增强或诱导患者体内对抗原或表达抗原的细胞特异性的免疫应答。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述治疗个体的过程，目的是出于治疗或预防原因诱导免疫应答。
术语“体内”涉及个体中的环境。
本发明的抗原受体、肽链、核酸、重组细胞、免疫效应细胞(优选T细胞)，以及本文描述其他化合物和试剂可以以任何合适的药物组合物的形式给药。
本发明的药物组合物优选是无菌的，并且包含有效量的本文描述的试剂和任选存在的如本文讨论的其他试剂以产生期望的反应或期望的效应。
药物组合物通常以统一的剂型提供，并且可以以本身(per se)已知的方式制备。药物组合物可以例如为溶液或悬浮液形式。
药物组合物可以包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，全部优选是药学可接受的。术语“药学可接受的”是指物质的无毒性，其不与药物组合物的活性组分的作用相互作用。
非药学可接受的盐可以用于制备药学可接受的盐，并且包括在本发明中。这类药学可接受的盐包括但不限于由以下的酸制备的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学可接受的盐还可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。
用于药物组合物的合适的缓冲物质包括盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。
用于药物组合物的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
可注射制剂可以包含药学可接受的赋形剂，如乳酸林格氏液(Ringer lactate)。
术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中将活性组分组合以促进、增强或使得能够应用。根据本发明，术语“载体”还包括一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包裹物质，其适合给药至患者。
可能的用于肠胃外给药的载体物质是例如无菌水、林格氏液(Ringer)、乳酸林格氏液(Ringer lactate)、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘以及尤其是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。
当在本文中使用时，术语“赋形剂”意图表示可能存在于药物组合物中并且不是活性成分的所有物质，例如，载体、粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、增香剂或着色剂。
本文描述的药剂和组合物可以通过任何常规途径给药，如通过肠胃外给药，包括通过注射或输注。给药优选是肠胃外地，例如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌肉内。
适合肠胃外给药的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制品，其优选与受体的血液是等渗的。相容性载体和溶剂的实例是林格氏液和等渗氯化钠溶液。此外，通常无菌的、不挥发性油用作溶液或悬浮液介质。
本文描述的药剂或组合物以有效量给药。“有效量”是指单独或与进一步的剂量一起达到期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定疾病状况的情况下，期望反应优选涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展，特别是，中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或疾病状况中的期望反应还可以是延迟或者防止所述疾病或所述疾病的发作。
本文描述的药剂或组合物的有效量取决于待治疗的疾病状况，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、尺寸和体重，治疗的持续时间，伴随疗法的类型(如果存在)，具体给药途径以及类似因素。因此，本文描述的药剂的给药剂量可以取决于各种这样的参数。在患者对初始剂量的反应不足的情况下，可以使用更高剂量(或者通过不同的、更局部化的给药途径达到有效更高剂量)。
本文描述的药剂或组合物可以例如体内给药至患者以治疗或预防各种病症，如本文描述的那些。优选的患者包括人类患者，其患有的疾病可以通过给药本文描述的药剂或组合物来纠正或改善。这包括涉及细胞的特征在于表达抗原的病症。
例如，在一实施方案中，本文描述的药剂可以用来治疗患有癌症疾病的患者，例如本文描述的特征在于存在表达抗原的癌细胞的癌症疾病。
根据本发明描述的药物组合物和治疗方法还可以用于免疫或疫苗接种以预防本文描述的疾病。
本发明的药物组合物可以与补充免疫增强物质如一种或多种佐剂一起给药，并且可以包含一种或多种免疫增强物质以进一步增加其效果，优选达到免疫刺激的协同效应。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。在这方面，取决于各种类型的佐剂，各种机制都是可能的。例如，允许DC成熟的化合物，例如脂多糖或CD40配体，形成第一类合适的佐剂。一般来说，影响免疫系统的“危险信号”(LPS、GP96、dsRNA等)或细胞因子(如GM-CSF)类型的任何物质均可以用作佐剂，其使得能够以受控方式强化和/或影响免疫应答。CpG寡脱氧核苷酸也可以任选地用于此背景，尽管如上文所述，要考虑它们在某些情况下的副作用。特别优选的佐剂是细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-α，或者生长因子，例如hGH。其他已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如最优选ISA51。脂肽如Pam3Cys也适合用作本发明的药物组合物中的佐剂。
药物组合物可以局部或全身给药，优选全身。
术语“全身给药”是指物质的给药，从而物质以显著的量广泛分布于个体体内并发挥期望效应。例如，物质可以在血液中发挥期望效应和/或通过血管系统到达其期望的作用部位。典型的全身给药途径包括通过将物质直接引入血管系统给药或者口服、肺部或肌肉内给药，其中物质被吸收，进入血管系统，并且通过血液携带至一个或多个期望的作用部位。
根据本发明，优选全身给药是通过肠胃外给药。术语“肠胃外给药”是指药剂的给药，以使所述药剂不通过肠。术语“肠胃外给药”包括静脉内给药、皮下给药、皮内给药或动脉内给药，但不限于此。
给药还可以通过例如口服、腹腔内或肌肉内进行。
本文提供的物质或组合物可以单独使用或与常规治疗方案如手术、辐照、化疗和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关联的(unrelated))组合使用。
通过下文的附图和实施例详细描述本发明，其仅用于说明目的而不是表示限制。由于说明书和实例，技术人员容易得到同样包括在本发明内的其他实施方案。
附图说明
图1包含实验中使用的所有T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)构建体的示意图。A)和B)TCR由异源二聚体I类膜蛋白组成，每条链包含不变的C结构域和可变的V结构域，后者以MHC限制性的方式特异性地识别加工的肽。小鼠(Mu,A)和人(Hu,B)TCR的序列和结构同源性非常高。小鼠TCR识别源自紧密连接蛋白Claudin 6的人肿瘤抗原，而人TCR识别源自黑色素细胞分化抗原gp100的肿瘤抗原。C)单价单链CAR包含连接至小鼠Cβ结构域和自主TCR Cα-结构域的单链(sc)Fv片段，前面有信号肽用于输出至细胞膜。任选地，其可以利用TCR C结构域之间的人工二硫键来改善这种CAR的细胞表面表达和功能。这个和所有以下示例性构建体中的scFv片段均针对Claudin 6。D)经典scCAR Cl6包含一个同源二聚体，其中每个均分别由scFv片段、抗体铰链区、作为间隔区的CH2CH3结构域、共刺激分子CD28和CD3的细胞膜和胞内信号传导结构域排列而成。同源二聚化导致抗原的二价识别，每条链结合单个抗原(即链内)。E)原型组合CAR携带串联连接的等位基因相关的V结构域(即VH-VH或VL-VL)，并且分别钩至TCR Cα或Cβ。识别使得必须以组合(即链间)和二价的方式在两条链上抗原结合。F)在全长TCRαgp100或TCRβ上携带scFv片段的异源二聚体TCR-CAR Cl6以二价但非组合的方式识别同源抗原。G)为了消除非组合TCR-CAR Cl6(F)的TCR gp100部分对同源肽gp100(280-288)的残余识别，将“沉默”(sil)点突变S109Q(根据IMGT命名法)引入TCRα的CDR3环(silCDR3α)。H)如E)概括(outlined)的，通过分别在全长TCRαgp100链或全长TCRβ链上串联等位基因相关的V结构域来产生组合TCR-CAR Cl6。与仅包含TCR C结构域的截短的TCR(E)相比，这里用作融合伴侣的全长TCR可以提供更好的生理T-细胞信号传导。I)为了消除组合TCR-CAR Cl6(H)的TCR gp100部分对同源肽gp100(280-288)的残余识别，如G)中所述，将“沉默”(sil)点突变S109Q(根据IMGT命名法)引入TCRα的CDR3环(silCDR3α)。
图2A/B示出在建立共培养之前，Claudin 6在APC上和不同CAR在人T细胞上的表达。A)将未成熟的树突细胞(iDC)用增加量的同源全长抗原Claudin 6或单一高剂量的无关抗原gp100电穿孔。这里，在流式细胞术中可以观察到Cl6表达的剂量依赖性的主体位移，表明这个供体的iDC高度允许细胞RNA摄取、蛋白翻译和输出至细胞表面。高CD86表达表明单核细胞强烈分化为有利的抗原呈递iDC。B)将预活化的CD8+ T细胞用不同编码CAR的RNA电穿孔并在流式细胞术中评估CAR的表达。在抗独特型染色中，除单价和经典scCAR以外的所有CAR均有中等程度的恢复。单价CAR表达最少，而经典scCAR表达最佳。图2C示出在IFNγ-ELISA中在建立APC/T细胞共培养后，CAR Cl6重新编程的人T细胞识别表达Claudin 6的iDC的效率。如2A/B中解释的将CAR-电穿孔的T-细胞与Cl6-电穿孔的APC以10:1的E:T-比例(效应子比靶细胞比例)共培养过夜。在Cl6滴定的整个范围中，所有CAR均在较低的Cl6剂量(0.02μg)下结果最佳。在高Claudin 6下，经典scCAR Cl6与所有其他CAR相比表现出最佳的IFNγ-分泌，而在最低Cl6剂量下，组合CAR倾向于比经典scCAR好一些。总之，从高至低抗原表达，组合CAR在它们的功能效率上均赶上了经典CAR：组合CAR和scCAR Cl6分别产生非常大量的IFNγ，多达20-30.000pg/ml IFNγ，并且在最低剂量的Cl6下，所有构建体均最终产生12-15.000pg/ml IFNγ。在这个剂量下，互相组合(inter-combinationary)Cα/Cβ-CAR显示是最高效的一种。
图3A/B示出在建立共培养之前，Claudin 6在APC上和不同CAR在人T细胞上分别的表达。A)将未成熟的树突细胞(iDC)用增加量的同源全长抗原Claudin 6电穿孔。这里，在流式细胞术中仅可以观察到Cl6表达的剂量依赖性级分位移，表明这个供体的iDC对细胞RNA摄取、蛋白翻译和输出至细胞表面的容许性(permissive)低得多。高CD86表达表明单核细胞强烈分化为有利的抗原呈递iDC。B)将预先激活的CD8+ T细胞用不同的编码CAR的RNA电穿孔并用流式细胞术评估CAR的表达。除了单价和经典scCAR，所有CAR在抗独特型染色中仅稍微恢复一些，再次表明具有此供体的细胞对RNA摄取和加工的容许性较低。但是，抗原呈递不良的iDC可能代表最低肿瘤抗原阳性APC的情况，因为这可能模仿早期克隆肿瘤逃逸变体或最低的肿瘤抗原呈递的情况。图3C示出在IFNγ-ELISA中在建立APC/T细胞共培养之后，CAR Cl6重新编程的人T细胞识别表达Claudin6的iDC的效率。将如3A/B中解释的经CAR电穿孔的T细胞与经Cl6电穿孔的APC以10:1的E:T比例共培养过夜。在Cl6滴定的整个范围中，所有CAR均在较低的Cl6剂量(0.2μg)下结果最佳。如之前解释的，由于Claudin6最低量的表达，与经典scCAR相比，组合CAR Cl6在所有剂量下均表现出最佳的IFNγ分泌，此趋势在最低电穿孔的Cl6剂量下更明显。总之，对于少量的抗原，在IFNγ的分泌方面，组合CAR甚至比经典scCAR Cl6更好。由于非常低的抗原表达，对于所有滴定范围和CAR来说，分泌的IFNγ的总量均降至低于1.000pg/ml，。
图4示出在IFNγ-ELISA中在建立HLA-A2.1+ APC/T细胞共培养之后，TCR gp100-CAR Cl6重新编程的人T细胞识别表达Claudin6的iDC或装载gp100肽的iDC的效率。将经CAR电穿孔的T细胞与经Cl6电穿孔的APC或装载gp100(280-288)肽的iDC以5:1的E:T比例共培养过夜。这个实验的最终目标是验证首先(A)二价组合TCR-CAR是否在分泌IFNγ方面比二价非组合TCR-CAR更高效，然后(B)，到何种程度它们仍识别此处使用的TCR gp100骨架的gp100肽。尝试通过TCRαgp100的CDR3中的“沉默”突变S109Q消除残余抗原结合。TCR Cl6和TCR gp100用作同源抗原识别的阳性对照。A)组合TCR-CAR，不论在CDR3中是否沉默，证明比非组合CAR功能更强，特别是在最低剂量的抗原下。B)未沉默的非组合TCR-CAR Cl6在10-6M的肽下仍识别gp100。突变S109Q的引入完全消除了IFNγ的分泌。不论是否功能性沉默，完全未观察到组合TCR-CARCl6中细胞因子的分泌。很有可能任一链上串联的VH-VH和VL-VL结构域的链间结合在空间上阻碍gp100肽的结合，在APC上以HLA-A2.1限制性的方式存在。
图5说明建立APC/T细胞共培养之后，当抗原遇到表达Cl6的iDC时不同CAR的增殖能力。将经CAR电穿孔的T细胞与经Cl6电穿孔并滴定的APC以10:1的E:T比例共培养5天。将T细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)染色以定量CFSE被细胞分裂的稀释程度，由此定量流式细胞术中每个密度图右边显示的所得子代群体的数量和频率。A)单价抗原结合的CAR表现出最弱的增殖，而组合TCR-CAR和经典CAR表现出非常相似的增殖模式。B)在A)中示出的T细胞群体频率的条形图。高频率(40-60％)的具有单价CAR的T细胞没有增殖，而具有组合TCR-CAR和经典CAR的没有增殖的T细胞的频率大约在10-20％的范围中。携带经典CAR Cl6的T细胞的增殖在高剂量(0.2μg Cl6)抗原下最高(90％对组合TCR-CAR的80％)，而在最低剂量(0.002μg)下，组合TCR-CAR至少和经典CAR一样有效(差不多80％)。最终，就T细胞增殖而言，从高至非常低剂量的抗原下，组合TCR-CAR在它们的功能效率中再次赶上经典CAR此处。趋势是比经典CAR甚至更有效。
图6在建立APC/T细胞共培养之后，在经组合TCR-CAR Cl6电穿孔的子代T细胞上引发共刺激生物标志物CD27的上调。将经CAR电穿孔的T细胞与经Cl6电穿孔的iDC以3:1的E:T比例共培养6天。将T细胞用CPD-450染色以定量这种荧光团被细胞分裂的稀释程度，因此定量流式细胞术中直方图左边显示的所得子代群体的数量和频率。将T细胞用CD8特异性抗体染色，以示例组合和经典CAR的这种共同受体的中度和等量程度的上调。平行地，将它们用共刺激分子CD27特异性抗体染色，以估计其在所有CAR的亲代/子代群体G0-G6中的调节。虽然两种标志物均上调至大约2倍，此外，对于所有CAR，CD8的平均表达相同，对于组合CAR来说，特别是链间组合(inter-combinationary)的TCR-CAR Cl6，CD27的平均表达比经典CAR高很多。T细胞在体内长期存活的生物标志物CD27，对于微弱增殖的T细胞(G2-G4)达到更高的平台，之后表达水平在G6中降至基础水平。
实施例
本文使用的技术和方法在本文中描述或以本身已知的方式进行,并且例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.所述。除非特别说明，包括使用试剂盒和试剂在内的所有方法均依照制造商的信息进行。
实施例1：利用流式细胞术的iDC中的Claudin6和T细胞中的抗原受体的表达分析
不同构建体的RNA制备自克隆入RNA载体pST1的开放阅读框(ORF)的体外翻译(ivt-RNA)，RNA载体pST1在其5’前导序列携带T7启动子，并且在其3’尾携带优化的polyA尾。在将RNA(2-0.002μg,300V,12ms,1脉冲)电穿孔入来自血沉棕黄层的经GM-CSF/IL-4处理的CD14+单核细胞之后一天，利用荧光团Dylight-650标记的Claudin6特异性抗体评估人未成熟的树突细胞中Claudin6的表达。在将RNA(两条链总计10-30μg,495V,9ms,1脉冲)电穿孔入经OKT3(抗CD3ε小鼠单克隆抗体)预激活的CD8+ T细胞之后一天，利用荧光团Dylight-649标记的Cl6scFv独特型特异性抗体评估自体人T细胞中各种抗原受体的表达。制备人iDC和T细胞的详细描述在实施例2中给出。测试表达的CAR-构建体是(i)小鼠T细胞受体TCRCl6；(ii)人TCR gp100；(iii)单价非组合CAR Cl6；(iv)经典scCAR)(二价)；(v)融合至人TCR Cα/β结构域的互相组合的CAR Cl6(二价)；(vi)融合至全长TCR gp100(280-288)的非组合CAR Cl6(二价)；(vii)相应的非组合CAR Cl6(二价)，其在TCRαgp100的CDR3中额外沉默以消除肽识别的相应的非组合CAR Cl6(二价)；(viii)融合至全长TCR gp100(280-288)的互相组合的CAR Cl6(二价)以及(ix)相应的组合CAR Cl6(二价)，其在TCRαgp100的CDR3额外沉默以消除肽识别。不同的抗原受体构建体在图1A-I中示意性说明。在4℃下于流式细胞术缓冲液中对0.2x106个细胞按常规进行细胞染色20min，洗涤并用包含1％多聚甲醛的流式细胞术缓冲液固定。图2A中的数据示出滴定的Claudin6的表达。这里，来自此供体的iDC对Cl6RNA的容许性高，并且显示随电穿孔的RNA的量增加Claudin6表达的主体位移。CD86表达表明单核细胞成功分化为有力的抗原呈递iDC。图2B示出这个实验中使用的不同CAR在经人CD8-阳性选择的人T细胞中的表达。经典scCAR Cl6显示了最高的表达，很可能是由于其在T-细胞表面上不依赖于内源CD3的表达。组合CAR显示比单价CAR略好的表达，由于其唯一的单价抗原结合作用模式，后者用作“弱对照”。
图3A中的数据示出独立实验中滴定的Claudin6表达。这里，来自此供体的iDC对Cl6RNA的容许性很低，并且随电穿孔的RNA量的增加，显示出仅Claudin6的级分位移，具有增加量的电穿孔的RNA。但是CD86表达表明单核细胞成功分化为有力的抗原呈递iDC。图3B示出这个实验中使用的不同CAR在人CD8-阳性选择的人T-细胞中的表达。因为人T-细胞源自相同供体而不是自体环境中分化的单核细胞，结果T-细胞也对电穿孔的RNA容许性很低，并且仅产生比图2B中示出的实验更弱的CAR表达。但是，与上文列出的原因相同，经典scCARCl6再次显示出最高的表达。与以前的观察一致，组合CAR显示比单价CAR略好的表达。这个实验与图2A/B列出的实验相比，都有CAR表达的指令，因此适合研究在抗原呈递细胞(APC)上仅有少量Cl6表达的情况下不同CAR的效力。
实施例2：抗原滴定的IFN-γ分泌测定
在实验的第1天，从一个健康供体的血沉棕黄层分离新鲜的外周血单核细胞("PBMC")。从1/4的PBMC，利用MACS分选分离CD14+细胞。然后将MACS流穿液(flow through)和剩余的PBMC进行MACS分选CD8+ T细胞。通过在第1、3、6天给予IL-4&GM-CSF(1000U/ml)，CD14+细胞分化为未成熟的树突细胞(“iDC”)。将CD8+ T细胞转移至OKT3包被的6孔板上。在第3天，将T细胞转移至新的6孔板。在第7天，将iDC用无关的和Cl6ivt-RNA在2-0.002μg RNA的范围内进行剂量依赖性的电穿孔。在同一天将OKT3激活的T细胞用对照或者如单独图中所示和如实施例1所述的抗原受体构建体电穿孔。为了质量保证，在第8天如上文解释的用特异性荧光标记的抗体分析iDC上的Cl6的表达和T细胞上的抗原受体的表面表达。随后将电穿孔的T细胞和经抗原电穿孔的iDC以3:1-10:1的E:T比例在96孔板中共培养20小时，一式两份。常规地，接种2.5x104个iDC并与7.5x104-2.5x105个经CAR电穿孔的T细胞在200μl T细胞培养基的体积中共培养。在第9天，采集不同量的培养上清液(10-50μl)并利用来自eBioscience的IFN-γReady Set Go！试剂盒(#88-7316-88)在夹心ELISA中分析分泌的IFNγ质量。利用Tecan Sunrise ELISA酶标仪检测吸光度。
图2C说明相同供体的iDC和T细胞的分泌的IFNγ的量，所述供体对RNA电穿孔高度宽容，结果导致iDC中Cl6的剂量依赖性的大量表达和T细胞中CAR的高表达(图2A/B)。所有CAR T细胞在经0.02μg Cl6RNA电穿孔时表现出其最大的IFNγ分泌，对于经典scCAR导致多达30.000pg/mlIFNγ，并且对于融合至TCR Cα/β或全长TCR gp100的组合CAR导致20.000pg/ml。与预计一样，结果单价CAR修饰的T细胞是最弱的效应细胞。有趣的是，在高Cl6电穿孔水平下，组合CAR仅表现出经典scCAR Cl6的大约50％的反应性，这在0.02μg Cl6电穿孔的最佳剂量下增加至70％。重要的是，在这里测试的最低剂量的Cl6下，即0.002μgRNA，组合CAR与经典scCAR Cl6一样有效，或者在融合至TCR Cα/β的组合CAR的情况下，甚至更好。在这个非常低水平的大量存在的Cl6下，组合CAR仍能够分泌大量的IFNγ，在10.000pg/ml的范围中。
图3C示例相同供体的iDC和T细胞分泌的IFNγ的量，所述供体对RNA电穿孔的容许性很低，结果导致iDC中仅Cl6的剂量依赖性的部分表达还有T细胞中CAR的较低表达(图3A/B)。这可能构成与高度宽容的抗原滴定的iDC中低Cl6表达水平的情况相比，在iDC上发现甚至更少Cl6的情况(图3A/B对2A/B)。这里，对所有滴定的少量Cl6，证实组合CAR在IFNγ分泌中比经典scCAR更有效。对于iDC的细胞表面上减少量的Cl6，这种趋势甚至变得更明显。分泌的IFNγ的量低(<1000pg/ml)，但是首先可以通过更好的CAR表达提高，其次对于携带非常低的抗原表达(早期)肿瘤逃逸变体的临床患者或者对于处理微小残留病灶(minimalresidue disease)可能变得有益。
图4A比较针对CAR特异性抗原Cl6，(二价)非组合对组合TCR-CAR在IFNγ分泌中的效率。在宽范围的滴定抗原中，所有组合CAR在抗原识别中都更有效率。对于较高剂量的抗原，二价CAR的效应功能几乎相等，除了“沉默的”非组合TCR-CAR。已知CDR3α中的S109Q点突变有点损害gp100(280-288)-抗原结合(Knies et al.,Oncotarget 2016)。V结构域的链间结合以及“沉默的”组合TCR-CAR与抗原本身的结合显然补偿这个突变引起的功能丧失。重要的是，在低水平的Cl6表达(0.02μg)下，组合TCR-CAR无论功能性沉默与否，对于细胞因子分泌都变得优于非组合TCR-CAR。
图4B说明肽滴定的IFNγ分泌中，对gp100(280-288)抗原的残余识别。这里，TCRαβgp100用作阳性对照，而TCRαβCl6用作特异性对照以估计细胞因子的背景分泌。非组合TCR-CAR仍能在高肽负荷下识别A2-1限制性抗原。引入沉默突变S109Q完全消除识别。重要的是，串联的V结构域(VH-VH、VL-VL)的链间组合排列看来完全防止TCR gp100部分的同源抗原识别。因此引入沉默突变可能仅用作保障，以保证这些CAR中的TCR部分的功能无反应性以及集中在利用其骨架作为链配对稳定支架和作为全长接头分子用于生理T细胞信号转导。
实施例3：与生物标志物表型分型组合的抗原滴定的增殖测定
在实验的第1天，从健康供体的血沉棕黄层分离新鲜的PBMC。从1/4的PBMC，利用MACS分选分离CD14+细胞，并且将剩余的PBMC冷冻。通过在第1、3、6天给予IL-4&GM-CSF(1000U/ml)，CD14+细胞分化为iDC。在第7天，将iDC用无关的和Cl6IVT-RNA电穿孔，在2-0.002μg RNA的范围内进行剂量依赖性电穿孔。在同一天将冷冻的PBMC解冻并MACS分选CD8+细胞。随后将没有任何预激活(OKT3)的约7x106个细胞的初始T细胞用如图1所示的用经典、单价和互相组合的TCR-CAR电穿孔。
为了质量保证，在第8天通过流式细胞术染色分析CAR工程化的T细胞。随后用胞内荧光增殖标记CFSE(0.8μM)或CPD-450(10μM)标记T细胞。随后将电穿孔的T细胞和iDC以10:1的E:T比例(或者3:1用于生物标志物表型分型)在96孔板中共培养5天，一式两份。常规地，将2.5x104个iDC与2.5x105个经CAR电穿孔的T细胞在200μl T细胞培养基的体积中于96孔板中共培养。在第5天，将培养的细胞在96孔板中用APC-Cy7标记的CD4或CD8抗体染色。应用流式细胞术检测T细胞的增殖，通过由于增殖子细胞中荧光团信号的稀释造成的荧光团信号的左移。利用流式细胞术软件包FlowJo v7.6.5中的增殖工具评估非增殖的亲代群体G0和子代群体G1-G7的频率。所有子代T细胞的频率由所有增殖群体G1-G7的总和计算。对用无关全长gp100电穿孔的iDC培养的细胞或没有APC接种的T细胞进行T细胞的背景增殖评估。将增殖细胞染色CD8以明确鉴定它们为T细胞。或者，在与APC共培养5或6天之后，将增殖T细胞用生物标志物如CD27、CD28、PD-1、CD95、CD45RA和CCR7染色以分别定量G0的原始初始非增殖T细胞和进化的子代群体G1-G7的分化状态。将抗体和相应的同种型对照滴定以估计最佳信噪比。在FACS-Canto II-HTS系统(BD)上以96孔形式定量测定。
图5A示出用单价CAR Cl6(作为“弱对照”)、在TCR CDR3α中没有或有沉默突变S109Q的组合TCR-CAR以及经典scCAR Cl6(作为参考CAR)工程化的增殖T细胞的密度图。针对装载无关抗原gp100的iDC几乎没有观察到非特异性增殖。针对装载同源抗原的APC的增殖导致多达6个不同的子代群体，其频率可以容易地辨认(于每个图的右侧列出)。除单价CARCl6以外的所有CAR即使在低抗原密度下表现出高增殖率。在几乎所有情况下最大频率都在G3。
图5B在条形图中总结了剩余亲代T细胞G0和增殖T细胞G1-G7的百分比。在高抗原负荷下，与其他CAR相比，G0(40％)的大条形和G1-G7(60％)的较小的条形清楚表明单价CAR工程化的T细胞较弱的增殖倾向。经典scCAR修饰的T细胞(90％)证实比组合CAR(80％)略好，与来自IFNγ分泌测定的结果一致。结果，当减少抗原的量时，经组合CAR改造的T细胞变得至少与经典scCAR一样有效(将近80％)。从这个趋势，可以推测对于甚至更低的抗原密度，组合CAR在增殖效力方面可能变得甚至更优于经典scCAR。
图6左边描述利用经典scCAR(上)、组合Cα/β-CAR Cl6(中)或组合TCR-CARCl6silCDR3α(下)的增殖T细胞的频率。右边示出所有亲代和子代群体中共同受体CD8和共刺激受体CD27的平均强度减去非特异性结合(即同种型结合)。将T细胞用CD8特异性抗体染色，以使组合和经典CAR的这种共同受体标志物的中度和几乎等量的上调可视化。因此，CD8染色可以用作归一化标记以强调这里审核的所有CAR中这种“惰性”分子的等量上调。平行地，将它们在不同荧光通道中用共刺激分子CD27特异性抗体染色，以估计其在所有CAR的亲代/子代群体G0-G6中的调节。虽然两种标志物均上调大约2倍，此外，对于所有CAR，CD8的平均表达几乎相同，对于组合CAR，CD27的平均表达比经典CAR高很多，特别是互相组合的TCR-CAR Cl6。T细胞在体内长期存活的生物标志物CD27，对于微弱增殖的T细胞(G2-G4)达到更高的平台，之后表达水平在G6中降至基础水平。由此可以假设，组合CAR工程化的T细胞可能在微弱增殖的群体具有较少的终末分化和耗尽的表型(即共刺激分子的下调)，因此，在体内可能存留更长时间。共培养的经组合CAR电穿孔的T细胞的大小(正向散射)和造粒(侧向散射)甚至比经典CAR更低(数据未示出)。因此，CD27的较高上调不是由细胞表面增加引起的，因此，是由较大表面上的较多CD27引起的。

Claims (33)

1.一种抗原受体，所述受体包含第一肽链和第二肽链，其中
所述第一肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域；
所述第二肽链包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域；
其中来自所述第一肽链的第一结构域与来自所述第二肽链的结构域中的一个一起形成第一抗原结合位点，并且
其中来自所述第一肽链的第二结构域与来自所述第二肽链的结构域中的另一个起形成第二抗原结合位点。
2.权利要求1的受体，其中
所述免疫受体信号传输结构域包含T细胞受体链的恒定或不变区，或者免疫细胞Fc受体链的恒定或不变区，或者恒定或不变区的部分。
3.权利要求1或2的受体，其中
所述第一和/或第二肽链在所述第一与第二结构域之间和/或在所述第一和第二结构域与T细胞受体链的可变区或其部分之间进一步包含连接子。
4.权利要求3的受体，其中所述连接子是任意氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的受体，其中所述第一和/或第二结构域各自包含免疫球蛋白链的可变区或T细胞受体链的可变区或可变区的一部分。
6.权利要求1-5中任一项的受体，其中
(i)所述第一肽链包含T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分，并且所述第二肽链包含T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分，或者
(ii)所述第一肽链包含T细胞受体β链的可变区或其部分以及T细胞受体β链的恒定区或其部分，并且所述第二肽链包含T细胞受体α链的可变区或其部分以及T细胞受体α链的恒定区或其部分。
7.权利要求1-6中任一项的受体，其中所述免疫受体信号传输结构域是人源的。
8.权利要求1-7中任一项的受体，其中
来自所述第一肽链的第一结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，并且来自所述第二肽链的结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分，所述来自所述第二肽链的结构域与来自所述第一肽链的第一结构域形成抗原结合位点。
9.权利要求1-8中任一项的受体，其中
来自所述第一肽链的第二结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，并且来自所述第二肽链的结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分，所述来自所述第二肽链的结构域与来自所述第一肽链的第二结构域形成抗原结合位点。
10.权利要求1-9中任一项的受体，其中所述第一和第二抗原结合位点结合相同抗原或不同抗原。
11.权利要求1-10中任一项的受体，其中所述第一和第二抗原结合位点结合相同抗原上的不同表位。
12.权利要求1-11中任一项的受体，其中所述抗原是疾病特异性抗原，优选肿瘤抗原。
13.权利要求12的受体，其中所述抗原在细胞表面上表达。
14.权利要求1-13中任一项的受体，其中
来自所述第一肽链的第一和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链的可变区或其部分；并且
来自所述第二肽链的第一和第二结构域各自包含免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分。
15.权利要求1-14中任一项的受体，其中
来自所述第一肽链的N末端结构域与来自所述第二肽链的N末端结构域一起形成抗原结合位点；并且
来自所述第一肽链的C末端结构域与来自所述第二肽链的C末端结构域一起形成抗原结合位点。
16.一种肽链，其包含第一和第二结构域，所述第一和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链的可变区或其部分，或者各自包含免疫球蛋白的轻链的可变区或其部分，并且其中所述肽链进一步包含T细胞受体链的可变区或其部分以及免疫受体信号传输结构域。
17.一种重组细胞，其表达权利要求1-15中任一项中定义的第一肽链、第二肽链或者第一和第二肽链，或者表达权利要求16的肽链。
18.一种制备表达抗原受体的细胞的方法，所述受体包含第一肽链和第二肽链，所述方法包括：
(a)提供细胞；
(b)提供第一基因构建体，其编码第一肽链，所述第一肽链至少包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分，以及免疫受体信号传输结构域；
(c)提供第二基因构建体，其编码第二肽链，所述第二肽链至少包含第一结构域、第二结构域、T细胞受体链的可变区或其部分，以及免疫受体信号传输结构域；
(d)将所述第一和第二基因构建体引入细胞；以及
(e)使所述构建体在所述细胞中表达；
其中来自所述第一肽链的第一结构域能够与来自所述第二肽链的结构域中的一个一起形成第一抗原结合位点，并且
其中来自所述第一肽链的第二结构域能够与来自所述第二肽链的结构域中的另一个一起形成第二抗原结合位点。
19.权利要求18的方法，其中所述抗原受体表达在细胞表面。
20.权利要求18或19的方法，其中在单一基因构建体上提供所述第一肽链和所述第二肽链。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。
22.权利要求18-21中任一项的方法，其中所述细胞是T细胞。
23.一种重组细胞，其通过权利要求18-22中任一项的方法制备。
24.一种核酸，其编码权利要求1-15中任一项中定义的第一肽链、第二肽链或者第一和第二肽链，或者编码权利要求16的肽链。
25.权利要求24的核酸，其中所述核酸是DNA或RNA。
26.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的抗原受体、权利要求17或23的重组细胞、或者权利要求24或25的核酸；以及药学可接受的载体。
27.权利要求26的药物组合物作为药物的用途。
28.权利要求26的药物组合物，用于治疗疾病，所述疾病的特征在于表达至少一种与所述抗原受体结合的抗原。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
30.权利要求28或29的药物组合物，其中所述疾病是癌症。
31.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向个体给药治疗有效量的权利要求26的药物组合物，其中所述疾病的特征在于表达至少一种与所述抗原受体结合的抗原。
32.权利要求31的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
33.权利要求31或32的方法，其中所述疾病是癌症。
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