ES2886189T3

ES2886189T3 - Receptores de antígeno y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2886189T3
Application number: ES18710059T
Authority: ES
Inventors: Ralf Holger VOSS; Ugur Sahin; Petra Simon; Matthias Birtel; Janina Caspar
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech Cell and Gene Therapies GmbH
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech Cell and Gene Therapies GmbH
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2021-12-16
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: MX2019010941A; US11702631B2; JP7073417B2; CN110621693A; EP3596113B1; AU2018234068B2; CA3054253A1; BR112019018705A2; JP2020509783A; EP3596113A1; IL269213B2; AU2018234068A1; SG11201907715YA; KR102396925B1; RU2019125594A; KR20190128683A; WO2018167151A1; ZA201905441B; CN110621693B; WO2018166589A1

Abstract

Un receptor de antígeno, cuyo receptor comprende una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica, en donde la primera cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; la segunda cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; en donde el primer dominio de la primera cadena peptídica forma junto con uno de los dominios de la segunda cadena peptídica un primer sitio de unión al antígeno, y en donde el segundo dominio de la primera cadena peptídica forma junto con el otro dominio de la segunda cadena peptídica un segundo sitio de unión al antígeno, en donde (i) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T y una región constante de una cadena beta del receptor de células T, o (ii) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T y una región constante de una cadena beta del receptor de células T y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno y usos de los mismos

Campo técnico

La presente invención se relaciona con receptores de antígeno recombinantes y usos de los mismos. Las células T modificadas genéticamente para expresar tales receptores de antígeno son útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la expresión de uno o más antígenos unidos mediante los receptores de antígeno.

Antecedentes de la invención

Las células T juegan un papel central en la inmunidad mediada por células en humanos y animales. El reconocimiento y la unión de un antígeno particular está mediado por los receptores de células T (t Cr , por sus siglas en inglés) expresados en la superficie de las células T. El TCR de una célula T puede interactuar con los péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) y presentados en la superficie de las células diana. La unión específica del TCR desencadena una cascada de señales dentro de la célula T que conducen a la proliferación y diferenciación en una célula T efectora madura.

El TCR es parte de una maquinaria de señalización compleja, que incluye el complejo heterodimérico de las cadenas a y p del t Cr , el correceptor CD4 o CD8 y el módulo de transducción de la señales CD3. El heterodímero a/p del TCR es responsable del reconocimiento de antígenos y de transmitir la señal de activación a través de la membrana celular en conjunto con CD3, mientras que las propias cadenas de CD3 transfieren la señal entrante a las proteínas adaptadoras dentro de la célula. Por tanto, la transferencia de las cadenas a/p del TCR ofrece la oportunidad de redirigir las células T hacia cualquier antígeno de interés.

La inmunoterapia basada en la transferencia de células adoptivas (ACT, por sus siglas en inglés) puede definirse ampliamente como una forma de inmunización pasiva con células T previamente sensibilizadas que se transfieren a destinatarios no inmunes o al huésped autólogo después de la expansión ex vivo a partir de bajas frecuencias de precursores hasta números de células clínicamente relevantes. Los tipos de células que se han usado para los experimentos de ACT incluyen las células asesinas activadas por linfocinas (LAK, por sus siglas en inglés) (Mule, J.J. y otros (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. y otros (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (Rosenberg, S.A. y otros (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), los linfocitos donantes después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT, por sus siglas en inglés), así como también líneas o clones de células T específicas de tumores (Dudley, ME y otros (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. y otros (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S .A 99, 16168-16173). Se demostró que la transferencia de células T adoptivas tiene actividad terapéutica contra infecciones virales humanas tal como el CMV. Para la inmunoterapia adoptiva del melanoma, Rosenberg y colaboradores establecieron un enfoque de ACT que se basa en la infusión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos expandidos in vitro aislados a partir de tumores extirpados en combinación con una quimioterapia linfodepletora no mieloablativa y dosis altas de IL2. Un estudio clínico resultó en una velocidad de respuesta objetiva de -50 % de los pacientes tratados que padecen melanoma metastásico (Dudley, ME y otros (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).

Un enfoque alternativo es la transferencia adoptiva de células T autólogas reprogramadas para expresar un inmunorreceptor reactivo al tumor de especificidad definida durante un tiempo corto de cultivo ex vivo seguido por la reinfusión en el paciente (Kershaw M.H. y otros (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). Esta estrategia hace que la ACT sea aplicable a una variedad de neoplasias malignas comunes, incluso si las células T reactivas al tumor están ausentes en el paciente. Dado que la especificidad antigénica de las células T se basa completamente en el complejo heterodimérico de las cadenas a y p del TCR, la transferencia de genes del TCR clonados en las células T ofrece el potencial de redirigirlas hacia cualquier antígeno de interés. Por lo tanto, la terapia génica con TCR proporciona una estrategia atractiva para desarrollar inmunoterapia antígeno-específica con linfocitos autólogos como opción de tratamiento. Las principales ventajas de la transferencia de genes del TCR son la creación de cantidades terapéuticas de células T antígeno-específicas dentro de unos pocos días y la posibilidad de introducir especificidades que no están presentes en el repertorio del TCR endógeno del paciente. Varios grupos demostraron, que la transferencia del gen del TCR es una estrategia atractiva para redirigir la especificidad al antígeno de las células T primarias (Morgan, R.A. y otros (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. y otros (2000) J. Virol. 74, 8207 8212; Fujio, K. y otros (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. y otros (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. y otros (1986) Nature 320, 232-238). Rosenberg y su grupo demostraron la viabilidad de la terapia génica con TCR en humanos en ensayos clínicos para el tratamiento del melanoma maligno. La transferencia adoptiva de linfocitos autólogos transducidos retroviralmente con TCR antígeno-específicas de melanoma/melanocito dio como resultado la regresión del cáncer en hasta el 30 % de los pacientes con melanoma tratados (Morgan, RA y otros (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. y otros (2009) Blood 114, 535-546). Mientras tanto las pruebas clínicas de la terapia génica con TCR se extendieron también a cánceres distintos del melanoma dirigidos a muchos antígenos tumorales diferentes (Park, TS y otros (2011) Trends Biotechnol. 29, 550-557).

El uso de enfoques de ingeniería genética para insertar receptores dirigidos a antígenos de especificidad definida en las células T ha ampliado enormemente las capacidades potenciales de la ACT. Los receptores de antígeno quiméricos (CAR, por sus siglas en inglés) son un tipo de receptor dirigido a antígenos compuesto de dominios intracelulares de señalización de células T fusionados a dominios extracelulares de unión a antígenos, más comúnmente fragmentos variables de cadena única (scFv) a partir de anticuerpos monoclonales. Los CAR reconocen directamente los antígenos de la superficie celular, independientemente de la presentación mediada por MHC, lo que permite el uso de una construcción de receptor único específico para cualquier antígeno dado en todos los pacientes. Los CAR iniciales fusionaron dominios de reconocimiento de antígenos a la cadena de activación CD3Z del complejo del receptor de células T (TCR). Las iteraciones posteriores de los CAR han incluido señales coestimuladoras secundarias en conjunto con CD3Z, mediante la inclusión de dominios intracelulares a partir de CD28 o una variedad de moléculas de la familia de los receptores de TNF tales como 4-1BB (CD137) y OX40 (CD134). Además, los receptores de tercera generación incluyen dos señales coestimuladoras además de CD3Z, más comúnmente a partir de CD28 y 4-1BB. Los CAR de segunda y tercera generación mejoraron drásticamente la eficacia antitumoral in vitro e in vivo (Zhao y otros, (2009) J. Immunol., (183) 5563-5574), en algunos casos induciendo remisiones completas en pacientes con cáncer avanzado (Porter y otros, (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733).

Un CAR clásico consiste de un fragmento de anticuerpo de cadena única antígeno-específico (scFv), fusionado a un dominio transmembrana y de señalización tal como CD3Z. Tras su introducción en las células T se expresa como una proteína unida a la membrana e induce respuestas inmunitarias tras unirse a su antígeno afín (Eshhary otros, (1993) PNAS, (90) 720-724). La respuesta inmunitaria antígeno-específica inducida resulta en la activación de células T CD8 citotóxicas que a su vez conduce a la erradicación de células que expresan el antígeno específico, tales como células tumorales o células infectadas por virus que expresan el antígeno específico. Sin embargo, estas construcciones clásicas de CAR no activan/estimulan las células T a través de su complejo CD3 endógeno, que es normalmente esencial para la activación de las células T. Debido a la fusión del dominio de unión al antígeno a CD3Z, la activación de las células T se induce a través de un "cortocircuito" bioquímico (Aggen y otros, (2012) Gene Therapy, (19) 365 374). Esta activación no fisiológica de las células T plantea un riesgo para el paciente que se trata de esta manera ya que la sobreactivación de las células T puede conducir a efectos secundarios no deseados. Por ejemplo, se ha observado una activación basal a largo plazo de las células T recombinantes debido a la expresión de CAR in vitro ("señalización tónica"), lo que resultó en un aumento de la acumulación de moléculas inhibidoras, tales como LAG-3, TIM-3 y PD-1, en la superficie de las células T que expresan CAR recombinantes, lo que a su vez resultó en un agotamiento prematuro de células T que posteriormente conduce a un fuerte impacto negativo en la respuesta contra las células tumorales in vivo (Longyotros, (2015) Nat. Med., (21)581-590). Esta reacción adversa se ha asociado con un conglomerado irregular de los fragmentos scFv a través de residuos de la estructura de este anticuerpo. Adicionalmente, aunque las construcciones clásicas de CAR de este tipo se han evaluado con éxito contra diferentes neoplasias, tales como la leucemia (Porter y otros, (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733), también han resultado en enfermedades autoinmunes fatales debido a la expresión basal del antígeno dirigido (antígeno tumoral dirigido) en tejidos normales (reacción dentro de la diana/fuera del tumor; Morgan y otros, (2010) Mol Ther., (18) 843-51).

Un enfoque alternativo, en el que la activación de la célula T ocurre a través de un mecanismo más fisiológico, fue la provisión de un fragmento análogo del TCR de cadena única (scTv) fusionado al dominio constante Cp derivado a partir del receptor de célula T (TCR) y su coexpresión con un dominio constante Ca derivado del TCR (Voss y otros, (2010) Blood, (115) 5154-5163), el último que recluta el homodímero CD3Z endógeno esencial (Call y otros, (2002) Cell, (111) 967-79.). Sin embargo, para que estas construcciones funcionaran como activadores del sistema inmunológico, fue esencial que sus dominios constantes se originaran a partir de TCR murinos o necesitaran murinizarse (Cohen y otros, (2006) Cancer Res., (66) 8878-86; Bialery otros, (2010) J. Immunol., (184) 6232-41) para lograr el apareamiento de cadenas entre el scTCR y el Ca. El hecho de que estas construcciones deban tener secuencias xenogénicas para la funcionalidad aumenta el riesgo de que el sistema inmunológico reaccione contra ellas cuando se administren y deteriore o destruya su eficacia terapéutica.

Documento de la técnica anterior Gross y otros. 1992 (FASEBJ 6: 3370-3378) describe un receptor de antígeno de cadena única que comprende el dominio constante de una cadena del receptor de células T combinado con los dominios variables de una inmunoglobulina. EP 2 502 934A1 describe una variante de cadena única del receptor de células T en donde el dominio variable de una cadena del TCR está unido por un enlazador al dominio variable de otra cadena del TCR. WO2017/059900A1 describe un receptor de antígeno con dos sitios de unión al antígeno que se ensamblan a partir de dos subdominios localizados en diferentes cadenas peptídicas.

Existe la necesidad de la provisión de receptores de antígeno recombinantes alternativos, en los que, por ejemplo, el receptor, tras la unión del antígeno, es suficientemente capaz de activar la célula T en la que se expresa de una manera fisiológica normal a través del complejo CD3 endógeno y, opcionalmente, sin requisito de la presencia de ninguna secuencia de aminoácidos que no sea de origen humano, al menos en el dominio de transmisión de señales del receptor de antígeno, que podría inducir una respuesta inmunitaria no deseada contra el propio receptor de antígeno recombinante.

Descripción

Resumen

La presente invención se relaciona con receptores de antígeno recombinantes que tienen al menos dos sitios de unión al antígeno. Los receptores de antígeno comprenden dos cadenas peptídicas. Las cadenas peptídicas comprenden cada una al menos dos dominios, además de una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor, en el que cada uno de los dos dominios de una cadena peptídica forma un sitio de unión al antígeno con uno de los dominios de la otra cadena peptídica. En una modalidad, el receptor de antígeno de la invención tiene la estructura de un receptor de células T en donde cada una las cadenas del mismo comprende dichos al menos dos dominios que forman los sitios de unión al antígeno, preferentemente en el extremo N de las cadenas del receptor de células T.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un receptor de antígeno, cuyo receptor comprende una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica, en donde la primera cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; la segunda cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; en donde el primer dominio de la primera cadena peptídica forma junto con uno de los dominios de la segunda cadena peptídica un primer sitio de unión al antígeno, y en donde el segundo dominio de la primera cadena peptídica forma junto con el otro dominio de la segunda cadena peptídica un segundo sitio de unión al antígeno. En el receptor de antígeno de este aspecto, los dominios que forman los respectivos sitios de unión al antígeno se localizan preferentemente en diferentes cadenas peptídicas. En consecuencia, los sitios de unión al antígeno se forman mediante la interacción intermolecular de los dominios.

En una modalidad, cada uno de los dominios primero y/o segundo comprende una región variable de una cadena de inmunoglobulina o una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la región variable.

En una modalidad, uno de los dominios que forma el primer sitio de unión al antígeno comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina con una especificidad para un antígeno o una porción del mismo y el otro dominio que forma el primer sitio de unión al antígeno comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina con una especificidad para el antígeno o una porción del mismo. En una modalidad, uno de los dominios que forma el segundo sitio de unión al antígeno comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina con una especificidad para un antígeno o una porción del mismo y el otro dominio que forma el segundo sitio de unión al antígeno comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina con una especificidad para el antígeno o una porción del mismo.

En una modalidad, el primer dominio de la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina con una especificidad para un antígeno o una porción del mismo y el dominio de la segunda cadena peptídica forma un sitio de unión al antígeno con el primer dominio de la primera cadena peptídica que comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina con una especificidad para el antígeno o una porción del mismo. En una modalidad, el segundo dominio de la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina con una especificidad para un antígeno o una porción del mismo y el dominio de la segunda cadena peptídica forma un sitio de unión al antígeno con el segundo dominio de la primera cadena peptídica que comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina con una especificidad para el antígeno o una porción del mismo.

En una modalidad, el primer y el segundo dominios de la primera cadena peptídica comprenden cada uno una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina o una porción de la misma; y el primer y el segundo dominios de la segunda cadena peptídica comprenden cada uno una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina o una porción de la misma.

En una modalidad, el dominio del extremo N-terminal de la primera cadena peptídica forma junto con el dominio del extremo N-terminal de la segunda cadena peptídica un sitio de unión al antígeno; y el dominio del extremo C-terminal de la primera cadena peptídica forma junto con el dominio del extremo C-terminal de la segunda cadena peptídica un sitio de unión al antígeno.

En una modalidad, el dominio del extremo N-terminal de la primera cadena peptídica forma junto con el dominio del extremo C-terminal de la segunda cadena peptídica un sitio de unión al antígeno; y el dominio del extremo C-terminal de la primera cadena peptídica forma junto con el dominio del extremo N-terminal de la segunda cadena peptídica un sitio de unión al antígeno.

En una modalidad de los receptores de antígeno de la invención, el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor comprende una región constante o invariante de una cadena del receptor de células T o una región constante o invariante de una cadena del receptor Fc de células inmunitarias o una porción de la región constante o invariante. En una modalidad de los receptores de antígeno de la invención, (i) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma, o (ii) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, la región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma corresponde o esencialmente corresponde a la cadena alfa de un receptor de células T, y la región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma corresponde o esencialmente corresponde a la cadena beta de un receptor de células T, preferentemente el mismo receptor de células T del cual se deriva la cadena alfa de un receptor de células T. Los dominios que forman los sitios de unión al antígeno se fusionan preferentemente en el extremo N de las cadenas, opcionalmente separados mediante un enlazador.

En una modalidad de los receptores de antígeno de la invención, la región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y/o el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptortal como la región constante de un receptor de células T o una porción del mismo es de origen. Por tanto, la cadena de un receptor de células T a la que la región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma pueden corresponder o corresponder esencialmente puede ser de origen humano.

En una modalidad, un receptor de antígeno de la invención comprende (a) enlazador(es) que conectan los dominios del receptor de antígeno. En una modalidad, un receptor de antígeno de la invención comprende uno o más enlazadores entre los dominios que forman los sitios de unión al antígeno y/o entre los dominios que forman los sitios de unión al antígeno y las regiones variables de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma. El enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos arbitraria de cualquier longitud siempre que no interfiera con las funciones del receptor de antígeno, tal como la capacidad del receptor de antígeno para unir el antígeno o para asociarse con el complejo CD3 endógeno, o que interfiera con la capacidad del receptor de antígeno para inducir una respuesta inmunitaria tras la unión del antígeno.

En una modalidad de los receptores de antígeno de la invención, el primer y segundo sitios de unión al antígeno se unen al mismo antígeno o diferentes antígenos. En una modalidad de los receptores de antígeno de la invención, el primer y segundo sitios de unión al antígeno se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno. En consecuencia, mientras que los dominios que forman el primer sitio de unión al antígeno se derivan preferentemente a partir de la misma inmunoglobulina y los dominios que forman el segundo sitio de unión al antígeno se derivan preferentemente a partir de la misma inmunoglobulina, los dominios que forman el primer sitio de unión al antígeno y los dominios que forman el segundo sitio de unión al antígeno se derivan a partir de las mismas o diferentes inmunoglobulinas, dichas diferentes inmunoglobulinas se unen a los mismos o diferentes antígenos.

En una modalidad, el antígeno es un antígeno específico de enfermedad, preferentemente un antígeno tumoral. En una modalidad, el antígeno se expresa en la superficie de una célula.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con una cadena peptídica de los receptores de antígeno de la invención. En una modalidad, la presente invención se relaciona con una cadena peptídica que comprende un primer y un segundo dominio cada uno de los cuales comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina o una porción de la misma o cada uno comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina o una porción de la misma y en donde la cadena peptídica comprende además una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptortal como una región constante de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma. Modalidades adicionales de las cadenas peptídicas de la invención son como se describen en la presente descripción para los receptores de antígeno de la invención.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con una célula, en particular una célula efectora inmunitaria tal como una célula T, modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno de la invención. En un aspecto, la presente invención se relaciona con una célula recombinante, en particular una célula efectora inmunitaria tal como una célula T, que expresa la primera cadena peptídica, la segunda cadena peptídica o tanto la primera y segunda cadenas peptídicas de un receptor de antígeno de la invención o que expresa una cadena peptídica de la invención. Modalidades adicionales de la célula o célula recombinante de la invención son como se describen en la presente descripción para los receptores de antígeno de la invención o las cadenas peptídicas de la invención.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para producir una célula que expresa un receptor de antígeno de la invención, el método comprende: (a) proporcionar una célula; (b) proporcionar una primera construcción genética que codifica la primera cadena peptídica de un receptor de antígeno de la invención; (c) proporcionar una segunda construcción genética que codifica la segunda cadena peptídica de un receptor de antígeno de la invención; (d) introducir la primera y la segunda construcciones genéticas en la célula; y (e) permitir que las construcciones se expresen en la célula. En una modalidad, la presente invención se relaciona con un método para producir una célula que expresa un receptor de antígeno cuyo receptor comprende una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica, el método comprende: (a) proporcionar una célula; (b) proporcionar una primera construcción genética que codifica la primera cadena peptídica que comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; (c) proporcionar una segunda construcción genética que codifica la segunda cadena peptídica que comprende al menos un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; (d) introducir la primera y la segunda construcciones genéticas en la célula; y (e) permitir que las construcciones se expresen en la célula; en donde el primer dominio de la primera cadena peptídica puede formar junto con uno de los dominios de la segunda cadena peptídica un primer sitio de unión al antígeno, y en donde el segundo dominio de la primera cadena peptídica puede formar junto con el otro dominio de la segunda cadena peptídica un segundo sitio de unión al antígeno. En una modalidad de los métodos de la invención, la expresión del receptor de antígeno es en la superficie celular. En una modalidad de los métodos de la invención, la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica proporcionar en una única construcción genética. En una modalidad de los métodos de la invención, la célula es una célula humana. En una modalidad de los métodos de la invención, la célula es una célula efectora inmunitaria tal como una célula T. En una modalidad de los métodos de la invención, las construcciones genéticas comprenden ADN y/o ARN. Modalidades adicionales de los métodos de la invención son como se describen en la presente descripción para los receptores de antígeno de la invención.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con una célula recombinante, en particular una célula efectora inmunitaria tal como una célula T, producida mediante los métodos de la invención para producir una célula que expresa un receptor de antígeno. Modalidades adicionales de la célula recombinante de la invención son como se describen en la presente descripción para los receptores de antígeno de la invención o los métodos de la invención para producir una célula que expresa un receptor de antígeno.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un ácido nucleico tal como ADN o ARN que codifica la primera cadena peptídica, la segunda cadena peptídica o tanto la primera y como la segunda cadenas peptídicas de un receptor de antígeno de la invención o que codifica una cadena peptídica de la invención. Modalidades adicionales del ácido nucleico de la invención son como se describen en la presente descripción para los receptores de antígeno de la invención o las cadenas peptídicas de la invención.

La presente invención abarca generalmente el tratamiento de enfermedades dirigiéndose a las células que expresan uno o más antígenos en la superficie celular tales como células enfermas que expresan uno o más antígenos específicos de enfermedad en la superficie celular, en particular células cancerosas que expresan uno o más antígenos tumorales en la superficie celular mediante el uso de receptores de antígeno de la invención. Los métodos proporcionan la erradicación selectiva de células que expresan en su superficie uno o más antígenos, lo que minimiza de esta manera los efectos adversos a las células normales que no expresan el(los) antígeno(s). En una modalidad, se administran células T genéticamente modificadas para expresar un receptor de antígeno de la invención dirigido a las células a través de la unión a los antígenos. Las células T pueden reconocer las células enfermas que expresan el(los) antígeno(s) en la superficie celular, lo que resulta en la erradicación de las células enfermas. En una modalidad, la población de células diana o el tejido diana son células tumorales o tejido tumoral.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el receptor de antígeno de la invención, la célula recombinante de la invención, o el ácido nucleico de la invención; y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica de la invención puede usarse como un medicamento, en particular en el tratamiento de una enfermedad tal como el cáncer caracterizada por la expresión de uno o más antígenos que están unidos mediante el receptor de antígeno de la invención tal como uno o más antígenos tumorales.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método de tratamiento de una enfermedad tal como el cáncer que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención, en donde la enfermedad se caracteriza por la expresión de al menos un antígeno tal como un antígeno tumoral que se une al receptor de antígeno.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociado con la expresión o expresión elevada de al menos un antígeno, el método comprende administrar al sujeto las células T genéticamente modificadas para expresar un receptor de antígeno de la invención dirigido al menos a un antígeno. En una modalidad, la enfermedad, trastorno o afección es cáncer. En una modalidad, las células T pueden ser autólogas, alogénicas o singénicas para el sujeto.

En una modalidad de la invención, el receptor de antígeno se une solo a un antígeno (por ejemplo, por ser monoespecífico y reconocer el mismo epítopo o por ser biespecífico o multiespecífico y reconocer diferentes epítopos en el mismo antígeno) o se une a diferentes antígenos, en particular a dos diferentes antígenos.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, el método de tratamiento comprende además obtener una muestra de células a partir de un sujeto, la muestra que comprende células T o progenitores de células T, y transfectar las células con un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno de la invención para proporcionar las células T genéticamente modificadas para expresar el receptor de antígeno. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, las células T genéticamente modificadas para expresar el receptor de antígeno se transfectan de forma estable o transitoria con ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno. Por tanto, el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno está integrado o no integrado en el genoma de las células T. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, las células T y/o la muestra de células son del sujeto al que se administran las células T genéticamente modificadas para expresar el receptor de antígeno.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, las células T y/o la muestra de células son de un mamífero que es diferente del mamífero al que se administran las células T genéticamente modificadas para expresar el receptor de antígeno.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, las células T genéticamente modificadas para expresar el receptor de antígeno se inactivan para la expresión de un receptor de células T endógeno y/o HLA endógeno.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, un antígeno se expresa en una célula enferma tal como una célula cancerosa. En una modalidad, se expresa un antígeno en la superficie de una célula enferma tal como una célula cancerosa. En una modalidad, un receptor de antígeno se une a un dominio extracelular o a un epítopo en un dominio extracelular de un antígeno. En una modalidad, un receptor de antígeno se une a epítopos nativos de un antígeno presente en la superficie de las células vivas. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, el antígeno es un antígeno tumoral. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, el antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste en claudinas, tales como la claudina 6 y la claudina 18,2, CD19, CD20, CD22, CD33, c D123, mesotelina, CEA, c-Met, PSMA, GD-2 y NY-ESO-1. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, el antígeno es un antígeno patógeno. El patógeno puede ser un patógeno fúngico, viral o bacteriano. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, el antígeno se expresa en la superficie celular. En una modalidad, un antígeno es una claudina, en particular la claudina 6 o la claudina 18,2, y dicho receptor de antígeno se une al primer lazo extracelular de dicha claudina. En una modalidad, la unión de dicho receptor de antígeno cuando se expresa mediante las células T y/o presenta en las células T a un antígeno presente en las células resulta en funciones efectoras inmunitarias de dichas células T tales como la liberación de citocinas. En una modalidad, la unión de dicho receptor de antígeno cuando se expresa mediante las células T y/o presenta en células T a un antígeno presente en las células tales como células presentadoras de antígenos resulta en la estimulación, cebado y/o expansión de dichas células T. En una modalidad, la unión de dicho receptor de antígeno cuando se expresa mediante las células T y/o presenta en células T a un antígeno presente en células enfermas tales como células cancerosas resulta en la citólisis y/o apoptosis de las células enfermas, en donde dichas células T liberan preferentemente factores citotóxicos, por ejemplo, perforinas y granzimas.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, los dominios de un receptor de antígeno que forman los sitios de unión a antígeno están compuestos mediante un ectodominio del receptor de antígeno. En una modalidad de todos los aspectos de la invención, un receptor de antígeno de la invención comprende un dominio transmembrana. En una modalidad, el dominio transmembrana es una alfa hélice hidrófoba que atraviesa la membrana.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, un receptor de antígeno de la invención comprende un péptido señal que dirige la proteína naciente en el retículo endoplásmico. En una modalidad, el péptido señal precede a los dominios que forman los sitios de unión al antígeno.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, un receptor de antígeno de la invención es preferentemente específico para el antígeno al que está dirigido, en particular cuando está presente en la superficie de una célula tal como una célula enferma o una célula presentadora de antígeno.

En una modalidad de todos los aspectos de la invención, un receptor de antígeno de la invención puede expresarse y/o presentarse en la superficie de una célula inmunorreactiva, tal como una célula T, preferentemente una célula T citotóxica. En una modalidad, la célula T es reactiva con el(los) antígeno(s) a los que está dirigido un receptor de antígeno de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona los agentes y composiciones descritos en la presente descripción para usar en los métodos descritos en la presente descripción.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción detallada

Aunque la presente invención se describe en detalle más abajo, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente descripción, ya que pueden variar. Debe entenderse también, que la terminología usada en la presente descripción es para el propósito de describir solo modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención la cual solo se limitará por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con modalidades específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los ejemplos descritos de diversas maneras y las modalidades preferidas no deben interpretarse para limitar la presente invención solo a las modalidades descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción sustenta y abarca modalidades que combinan las modalidades descritas explícitamente con cualquier cantidad de elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse descritas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera.

Preferentemente, los términos que se usan en la presente descripción se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura del campo (consultar, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, J. Sambrook y otros eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas aunque en algunas modalidades dicho otro miembro entero, o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el tema consiste en la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referentes similares usados en el contexto para describir la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra forma en la presente descripción, o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de los intervalos de valores en la presente descripción pretende servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique de otra forma en la presente descripción, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se enumerara individualmente en la presente descripción.

Todos los métodos que se describen en la presente descripción pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra forma en la presente descripción o que de cualquier otra manera el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o de lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en la presente descripción, sólo tiene la intención de aclarar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se declare de cualquier otra manera. De ninguna manera el lenguaje en la descripción debe interpretarse como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

El término "respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno y preferentemente se refiere a una respuesta inmunitaria celular o una celular así como también una respuesta inmunitaria humoral. La respuesta inmunitaria puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica.

"Proporcionar una respuesta inmunitaria" puede significar que no hubo una respuesta inmunitaria contra un antígeno diana particular, una célula diana y/o un tejido diana antes de proporcionar una respuesta inmunitaria, pero también puede significar que hubo un determinado nivel de respuesta inmunitaria contra un antígeno diana particular, célula diana y/o tejido diana antes de proporcionar una respuesta inmunitaria y después de proporcionar una respuesta inmunitaria dicha respuesta inmunitaria se potencia. Por tanto, "proporcionar una respuesta inmunitaria" incluye "inducir una respuesta inmunitaria" y "potenciar una respuesta inmunitaria". Preferentemente, después de proporcionar una respuesta inmunitaria en un sujeto, dicho sujeto está protegido del desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o el estado de la enfermedad se mejora al proporcionar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, una respuesta inmunitaria contra un antígeno tumoral puede proporcionarse en un paciente que tiene una enfermedad cancerosa o en un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Proporcionar una respuesta inmunitaria en este caso puede significar que el estado de la enfermedad del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis, o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.

"La inmunidad mediada por células" o "la inmunidad celular", o términos similares se destinan a incluir una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la expresión de un antígeno, en particular caracterizada por la presentación de un antígeno con el MHC de clase I o clase II. La respuesta celular se relaciona con células llamadas células T o linfocitos T que actúan como "cooperadoras" o "asesinas". Las células T cooperadoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central mediante la regulación de la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) destruyen las células enfermas, tales como las células cancerosas, para prevenir la producción de más células enfermas.

El término "antígeno" se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el que se genera y/o se direcciona una respuesta inmunitaria. Preferentemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmunitaria, que preferentemente es específica para el antígeno o las células que expresan el antígeno, preferentemente en la superficie celular. El término "antígeno" incluye en particular proteínas y péptidos. Un antígeno es preferentemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Tales antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivarse a partir de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno puede ser también un antígeno tumoral. De acuerdo con la presente invención, un antígeno puede corresponder a un producto de origen natural, por ejemplo, una proteína viral, o una parte de la misma.

El término "patógeno" se relaciona con microorganismos patogénicos y comprende virus, bacterias, hongos, organismos unicelulares, y parásitos. Ejemplos para virus patogénicos son el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el citomegalovirus (CMV), el virus del herpes (HSV, por sus siglas en inglés), el virus de la hepatitis A (VHA), el VHB, el VHC, el virus del papiloma y el virus linfotrófico T humano (HTLV, por sus siglas en inglés). Los organismos unicelulares comprenden los plasmodios, los tripanosomas, las amebas, etc.

En una modalidad preferida, un antígeno es un antígeno específico de la enfermedad o un antígeno asociado a la enfermedad. El término "antígeno específico de la enfermedad" o "antígeno asociado a la enfermedad" se refiere a todos los antígenos que son de importancia patológica. Particularmente en una modalidad preferida, el antígeno está presente en las células, órganos y/o tejidos enfermos mientras que no está presente o está presente en una cantidad reducida en células, órganos y/o tejidos sanos y, por tanto, puede usarse para dirigirse a las células, órganos y/o tejidos enfermos, por ejemplo mediante las células T que llevan un receptor de antígeno dirigido al antígeno. En una modalidad, un antígeno específico de la enfermedad o un antígeno asociado a la enfermedad está presente en la superficie de una célula enferma.

En una modalidad preferida, un antígeno es un antígeno tumoral o antígeno asociado a tumores, es decir, un constituyente de células cancerosas que pueden derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferentemente en gran cantidad, como los antígenos de superficie en células cancerosas.

En el contexto de la presente invención, el término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a tumores" se relaciona con proteínas que bajo condiciones normales se expresan específicamente en un número limitado de órganos y/o tejidos o en etapas específicas del desarrollo, por ejemplo, el antígeno tumoral puede expresarse específicamente bajo condiciones normales en tejido estomacal, preferentemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en tejido trofoblástico, por ejemplo, en placenta, o en células de la línea germinal, y se expresan o se expresan de manera aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa, preferentemente, no más de 3, con mayor preferencia no más de 2. Los antígenos asociados a tumores en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferentemente antígenos de diferenciación de tipo celular específico, es decir, proteínas que bajo condiciones normales se expresan específicamente en un determinado tipo de célula, en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículos, es decir, proteínas que bajo condiciones normales se expresan específicamente en testículos y algunas veces en la placenta, y antígenos específicos de línea germinal. En el contexto de la presente invención, el antígeno tumoral se asocia preferentemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferentemente no se expresa o solo se expresa rara vez en tejidos normales. Preferentemente, el antígeno tumoral o la expresión aberrante del antígeno tumoral identifica las células cancerosas. En el contexto de la presente invención, el antígeno tumoral que se expresa por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece de una enfermedad cancerosa, es preferentemente una proteína propia en dicho sujeto. En modalidades preferidas, el antígeno tumoral en el contexto de la presente invención se expresa bajo condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando se dañan por el sistema inmunitario no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o solo son difícilmente accesibles por el sistema inmunitario. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral es idéntica entre el antígeno tumoral que se expresa en tejidos normales y el antígeno tumoral que se expresa en tejidos cancerosos.

Ejemplos para antígenos tumorales que pueden ser útiles en la presente invención son p53, ART-4, BAGE, betacatenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, Ca Sp -8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas, como CLAUDIN-6, CLAUDIN-18,2 y CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferentemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT. Los antígenos tumorales que se prefieren particularmente incluyen la CLAUDIN-18,2 (CLDN18.2) y la CLAUDIN-6 (CLDN6).

El término "CLDN" o simplemente "Cl" como se usa en la presente descripción significa claudina e incluye CLDN6 y CLDN18.2. Preferentemente, una claudina es una claudina humana. Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde ellas establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembranas que se extienden por la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, ambos localizados en el citoplasma. El primer lazo extracelular, denominado EC1 o ECL1, consiste en promedio de 53 aminoácidos, y el segundo lazo extracelular, denominado EC2 o ECL2, consiste aproximadamente de 24 aminoácidos. Las proteínas de la superficie celular de la familia de la claudina se expresan en tumores de diversos orígenes, y son particularmente adecuados como estructuras diana en relación con la inmunoterapia dirigida al cáncer debido a su expresión selectiva (sin expresión en un tejido normal de toxicidad relevante) y localización en la membrana plasmática.

Se identificó que las CLDN6 y CLDN18.2 se expresan diferencialmente en tejidos tumorales, que el tejido que expresa de forma normal la CLDN18.2 es solo el estómago (las células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica) y que el único tejido que expresa de forma normal la CLDN6 es la placenta.

CLDN18.2 se expresa en cánceres de diversos orígenes tales como el carcinoma pancreático, el carcinoma esofágico, el carcinoma gástrico, el carcinoma bronquial, el carcinoma de mama y los tumores ENT. CLDN18.2 es una diana valiosa para la prevención y/o tratamiento de tumores primarios, tales como cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cánceres de la vesícula biliar, y sus metástasis, en particular, metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos. Los receptores de antígeno que se dirigen al menos a la CLDN18.2 son útiles en el tratamiento de tales enfermedades cancerosas.

CLDN6 se ha encontrado que se expresa, por ejemplo, en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, melanomas, cáncer de cabeza y cuello, sarcomas, cáncer de vías biliares, cáncer de células renales y cáncer de vejiga urinaria. CLDN6 es una diana particularmente preferida para la prevención y/o tratamiento del cáncer de ovario, en particular el adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de las vías biliares, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, cáncer de teratoma testicular y testicular embrionario, cáncer uterino, tumor de células germinales tales como un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, en particular un tumor de células germinales de los testículos y sus formas metastásicas. Los receptores de antígeno que se dirigen al menos a CLDN6 son útiles en el tratamiento de tales enfermedades cancerosas.

En el contexto de las modalidades de la presente invención, un antígeno está presente preferentemente en la superficie de una célula, preferentemente una célula presentadora de antígeno o una célula enferma. De acuerdo con la invención, si un antígeno se une mediante un receptor de antígeno preferentemente puede inducir, opcionalmente en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, estimulación, cebado y/o expansión de la célula T que lleva el receptor de antígeno que se une al antígeno. El reconocimiento de un antígeno en la superficie de una célula enferma puede dar como resultado una reacción inmunitaria contra el antígeno (o la célula que expresa el antígeno).

De acuerdo con los diversos aspectos de la invención, el objetivo es preferentemente proporcionar una respuesta inmunitaria contra las células enfermas que expresan un antígeno tal como las células cancerosas que expresan un antígeno tal como un antígeno tumoral, en particular CLDN6 o CLDN18.2, y tratar una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa que involucra células que expresan un antígeno tal como un antígeno tumoral. Preferentemente la invención involucra la administración de células efectoras inmunitarias con el receptor de antígeno modificado genéticamente tales como células T dirigidas contra células enfermas que expresan un antígeno. Las células que expresan un antígeno en la superficie pueden marcarse mediante células efectoras inmunitarias que llevan un receptor de antígeno dirigido al antígeno.

"Superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica, y por tanto incluye el exterior de la célula que es accesible a la unión mediante proteínas y otras moléculas. Un antígeno se expresa en la superficie de las células si se localiza en la superficie de dichas células y es accesible a la unión mediante moléculas de unión al antígeno tales como receptores de antígeno o anticuerpos antígeno-específicos que se añaden a las células. En una modalidad, un antígeno expresado en la superficie de las células es una proteína integral de membrana que tiene una porción extracelular reconocida mediante un receptor de antígeno. Un receptor de antígeno se expresa en la superficie de las células si se localiza en la superficie de dichas células y es accesible a la unión mediante, por ejemplo, antígeno al que se añade específicamente el receptor de antígeno a las células. En una modalidad, un receptor de antígeno expresado en la superficie de las células es una proteína integral de membrana que tiene una porción extracelular que reconoce el antígeno.

El término "porción extracelular" o "ectodominio" en el contexto de la presente invención se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que está orientada al espacio extracelular de una célula y preferentemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, mediante moléculas de unión tales como anticuerpos que se localizan en el exterior de la célula. Preferentemente, el término se refiere a uno o más lazos extracelulares o dominios o un fragmento de estos.

Los términos "porción" o "parte" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un elemento continuo o discontinuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. El término "fragmento" se refiere a un elemento continuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. Una porción o parte de una secuencia proteica comprende preferentemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50, o al menos 100 aminoácidos consecutivos y/o no consecutivos de la secuencia proteica. Un fragmento de una secuencia proteica comprende preferentemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50, o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia proteica. Una porción, parte o fragmento de una estructura comprende preferentemente una o más propiedades funcionales, por ejemplo propiedades antigénicas, inmunológicas y/o de unión, de dicha estructura. Por ejemplo, una porción de una región variable de una cadena del receptor de células T puede formar preferentemente un sitio de reconocimiento del antígeno y unirse al antígeno. Por tanto, si la región variable de una cadena del receptor de células T es V alfa, una porción de la misma todavía puede interactuar preferentemente con la V beta correspondiente o una porción de la misma para formar un sitio de reconocimiento del antígeno funcional. Si la región variable de una cadena del receptor de células T es V beta, una porción de la misma todavía puede interactuar preferentemente con la V alfa correspondiente o una porción de la misma para formar un sitio de reconocimiento del antígeno funcional. De manera similar, una porción de una región constante de una cadena del receptor de células T puede preferentemente realizar su función de transmisión de la señal.

De acuerdo con la invención, un antígeno no se expresa (sustancialmente) en una célula si el nivel de expresión está más abajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión mediante los anticuerpos antígeno-específicos que se añaden a la célula. De acuerdo con la invención, un antígeno se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es suficientemente alto para permitir la unión mediante los anticuerpos antígeno-específicos que se añaden a la célula. Preferentemente, un antígeno expresado en una célula se expresa o expone, es decir, está presente, en la superficie de dicha célula y, por tanto, disponible para unirse mediante moléculas antígeno-específicas tales como anticuerpos o receptores de antígeno que se añaden a la célula.

"Célula diana" significará una célula que es una diana para una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular. La células dianas incluyen cualquier célula no deseada tal como una célula cancerosa. En modalidades preferidas, la célula diana es una célula que expresa un antígeno diana, en particular un antígeno específico de la enfermedad, que preferentemente está presente en la superficie celular.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que se reconoce, es decir se une, mediante el sistema inmunitario, por ejemplo, que se reconoce mediante un anticuerpo o receptor de antígeno. Por ejemplo, los epítopos son los sitios discretos, tridimensionales en un antígeno, que se reconocen por el sistema inmunitario. Los epítopos usualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen usualmente características específicas de estructura tridimensional, así como también características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Preferentemente un epítopo puede provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno o una célula que expresa el antígeno. Preferentemente, los términos se relacionan con una porción inmunogénica de un antígeno. Un epítopo de una proteína tal como un antígeno tumoral comprende preferentemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferentemente entre 5 y 100, preferentemente entre 5 y 50, con mayor preferencia entre 8 y 30, con la máxima preferencia entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferentemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 aminoácidos de longitud.

"Procesamiento del antígeno" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesamiento, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas de MHC para presentación mediante células, preferentemente células presentadoras de antígenos a células T específicas.

Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo mediante el uso de su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígenos procesan los antígenos y los presentan a las células T. De acuerdo con la invención, el término "célula presentadora de antígeno" incluye células presentadoras de antígenos profesionales y células presentadoras de antígenos no profesionales.

Las células presentadoras de antígenos profesionales son muy eficientes para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula de MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas de MHC de clase II de antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, lo que lleva a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales. Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen el intervalo de presentación de antígeno más amplio, y son probablemente las células presentadoras de antígenos más importantes, los macrófagos, las células B, y determinadas células epiteliales activadas.

Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II requeridas para la interacción con las células T vírgenes; estos se expresan solo tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citocinas tales como el IFNy.

Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de las vías de presentación de antígenos del MHC clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunitarias y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral. Las células dendríticas y las progenitoras pueden obtenerse a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo mediante la adición de una combinación de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNFa a cultivos de monocitos recolectados de sangre periférica. Alternativamente, las células CD34 positivas recolectadas de sangre periférica, sangre del cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas al añadir al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otros compuestos que inducen la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas. Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que pueden usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una baja expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de las células T tales como MHC de clase I y II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB). La maduración de la célula dendrítica se refiere como el estado de activación de la célula dendrítica en el que tales células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por las células dendríticas inmaduras resulta en la tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de la célula dendrítica por CD40L y sustancias liberadas de las células que sufren una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden derivar al cultivar células de la médula ósea in vitro con citocinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

El término "inmunogenicidad" se refiere a la eficiencia relativa de un antígeno para inducir una reacción inmunitaria.

El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente invención incluye cualquier función mediada por los componentes del sistema inmunitario que resulta, por ejemplo, en la destrucción de células enfermas tales como las células tumorales, o en la inhibición del crecimiento tumoral y/o inhibición del desarrollo tumoral, que incluye la inhibición de la diseminación tumoral y la metástasis. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T cooperadora (célula T CD4+) la liberación de citocinas tales como la Interleucina-2 y/o la activación de los linfocitos CD8+ (CTL) y/o las células B, y en el caso de las CTL la eliminación de células, es decir, células caracterizadas por la expresión de un antígeno, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforinas, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, y la destrucción citolítica específica de células diana que expresan el antígeno.

El término "célula inmunorreactiva" o "célula efectora inmunitaria" en el contexto de la presente invención se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una "célula inmunorreactiva" puede preferentemente unirse a un antígeno tal como un antígeno que se expresa en la superficie de una célula y mediar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, destruyen microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas, y opcionalmente eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T cooperadoras, células T infiltrantes de tumor), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, "células inmunorreactivas" son células T, preferentemente células T CD4+ y/o CD8+. De acuerdo con la invención, el término "célula inmunorreactiva" también incluye una célula que puede madurar hasta una célula inmunitaria (tal como una célula T, en particular una célula T cooperadora, o célula T citolítica) con la estimulación adecuada. Las células inmunorreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34+, células T inmaduras y maduras y células B inmaduras y maduras. La diferenciación de los precursores de una célula T en una célula T citolítica, cuando se expone a un antígeno, es similar a la selección clonal del sistema inmunitario.

Preferentemente, una "célula inmunorreactiva" o "célula efectora inmunitaria" reconoce un antígeno con cierto grado de especificidad, en particular si está presente en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas. Preferentemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T cooperadora (célula T CD4+) tal sensibilidad o reactividad puede involucrar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, tal sensibilidad o reactividad puede involucrar la eliminación de células, es decir, células caracterizadas por la expresión de un antígeno, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforinas. De acuerdo con la invención, la capacidad de respuesta de CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, regulación positiva de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de CTL también puede determinarse mediante el uso de un indicador artificial que indica con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Tales CTL que reconocen un antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan "CTL sensibles al antígeno" en la presente descripción.

Una "célula linfoide" es una célula que, opcionalmente después de una modificación adecuada, por ejemplo después de la transferencia de un receptor de células T o receptor de antígeno, puede producir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular, o una célula precursora de tal célula, e incluye linfocitos, preferentemente linfocitos T, linfoblastos, y células plasmáticas. Una célula linfoide puede ser una célula inmunorreactiva o una célula efectora inmunitaria como se describe en la presente descripción. Una célula linfoide preferida es una célula T que puede modificarse para expresar un receptor de células T o un receptor de antígeno en la superficie celular. En una modalidad, la célula linfoide carece de la expresión endógena de un receptor de células T.

Los términos "célula T" y "linfocito T" se usan de forma intercambiable en la presente descripción e incluyen células T cooperadoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+), que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptores de células T (TCR). El timo es el órgano principal responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T cooperadoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, que incluyen la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T cooperadoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas de MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa.

Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+ ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a- y p-TCR. Las células T y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en sus superficies. Sin embargo, en las células T y§, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2 % del total de células T) que las células T ap.

Cada cadena de un receptor de células T está compuesta de dos dominios extracelulares: la región variable (V) y una región constante (C). La región constante está próxima a la membrana celular, seguida por una región transmembrana y una cola citoplasmática corta, mientras que la región variable se une al complejo péptido/MHC. Para el propósito de la presente invención, el término "región constante de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma" también incluye modalidades en donde la región constante de una cadena del receptor de células T es (desde el terminal N al terminal C) seguida por una región transmembrana y una cola citoplasmática, tal como una región transmembrana y una cola citoplasmática que están naturalmente unidas a la región constante de una cadena del receptor de células T.

Todas las células T se originan a partir de células madre hematopoyéticas en la médula ósea. Los progenitores hematopoyéticos derivados de células madre hematopoyéticas pueblan el timo y se expanden por división celular para generar una gran población de timocitos inmaduros. Los primeros timocitos no expresan ni CD4 ni CD8 y, por lo tanto, se clasifican como células dobles negativas (CD4-CD8-). A medida que avanzan en su desarrollo, se convierten en timocitos dobles positivos (CD4+CD8+) y finalmente maduran a timocitos simples positivos (CD4+CD8- o CD4-CD8+) que luego se liberan del timo a los tejidos periféricos.

Las células T pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, mediante el uso de procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T pueden aislarse a partir de la médula ósea, sangre periférica o una fracción de la médula ósea o sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, mediante el uso de un sistema de separación de células disponible comercialmente. Alternativamente, las células T pueden derivarse de seres humanos emparentados o no emparentados, mamíferos no humanos, líneas o cultivos celulares. Una muestra que comprende células T puede ser, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Las células T que se utilizarán de acuerdo con la invención pueden expresar un receptor de células T endógeno o pueden carecer de la expresión de un receptor de células T endógeno.

Los ácidos nucleicos tales como el ARN que codifica un receptor de antígeno pueden introducirse en las células T u otras células con potencial lítico, en particular las células linfoides.

El término "receptor de antígeno dirigido a un antígeno" o términos similares se refieren a un receptor de antígeno que cuando está presente en una célula efectora inmunitaria tal como una célula T reconoce el antígeno tal como en la superficie de las células presentadoras de antígenos o células enfermas tal como células cancerosas, de manera que la célula efectora inmunitaria se estimula, ceba y/o expande o ejerce funciones efectoras de las células efectoras inmunitarias como se describió anteriormente.

El término "célula T antígeno-específica" o términos similares se refiere a una célula T que, en particular cuando se le proporciona un receptor de antígeno, reconoce el antígeno al que se dirige el receptor de antígeno tales como en la superficie de las células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas y preferentemente ejerce funciones efectoras de las células T como se describió anteriormente. Se considera que las células T y otras células linfoides son específicas para el antígeno si las células destruyen las células diana que expresan un antígeno. La especificidad de las células T puede evaluarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas estándar, por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación. Alternativamente, se puede medir la síntesis de linfocinas (tales como el interferón-y).

El término "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas de MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que se encuentra en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas de MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en donde las proteínas o moléculas de MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto antígenos propios (fragmento peptídicos de la propia célula) como antígenos ajenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.

De acuerdo con la invención el término "receptor de antígeno" incluye receptores modificados genéticamente, que confieren una especificidad arbitraria tal como la especificidad de un anticuerpo monoclonal en una célula efectora inmunitaria tal como una célula T. De esta forma, puede generarse un gran número de células T antígeno-específicas de cáncer para la transferencia adoptiva de células. Por tanto, un receptor de antígeno de acuerdo con la invención puede estar presente en células T, por ejemplo en lugar de o además del propio receptor de células T de las células T. Tales células T no requieren necesariamente el procesamiento y la presentación de un antígeno para el reconocimiento de la célula diana si no que pueden reconocer preferentemente con especificidad cualquier antígeno presente en una célula diana. Preferentemente, dicho receptor de antígeno se expresa en la superficie de las células. Para el propósito de la presente invención las células T que comprenden un receptor de antígeno están comprendidas por el término "célula T" como se usa en la presente descripción. Específicamente, de acuerdo con la invención, el término "receptor de antígeno" incluye receptores artificiales que comprenden una sola molécula o un complejo de moléculas que reconocen, es decir se unen a, una estructura diana (por ejemplo, un antígeno) en una célula diana tal como una célula cancerosa (por ejemplo, mediante la unión de un sitio de unión al antígeno o dominio de unión al antígeno a un antígeno que se expresa en la superficie de la célula diana) y puede conferir especificidad a una célula efectora inmunitaria tal como una célula T que expresa dicho receptor de antígeno en la superficie celular. Preferentemente, el reconocimiento de la estructura diana mediante un receptor de antígeno resulta en la activación de una célula efectora inmunitaria que expresa dicho receptor de antígeno. Un receptor de antígeno puede comprender una o más unidades proteicas, dichas unidades proteicas comprenden uno o más dominios como se describe en la presente descripción. El término "receptor de antígeno" no incluye preferentemente receptores de células T. De acuerdo con la invención el término "receptor de antígeno" es preferentemente sinónimo con el término "receptor de antígeno quimérico (CAR)", "receptor de célula T quimérico" y "receptor de células T artificial".

De acuerdo con la invención, el antígeno se puede reconocer mediante un receptor de antígeno a través de cualquier dominio de reconocimiento de antígeno (en la presente descripción también se denomina simplemente como "dominios") puede formar un sitio de unión al antígeno tal como a través de las porciones de unión al antígeno de anticuerpos y receptores de células T que pueden residir en diferentes cadenas peptídicas. En una modalidad, los dos dominios que forman un sitio de unión al antígeno se derivan a partir de una inmunoglobulina. En otra modalidad, los dos dominios que forman un sitio de unión al antígeno se derivan a partir de un receptor de células T. Particularmente se prefieren los dominios variables de anticuerpos, tales como los fragmentos variables de cadena única (scFv) que se derivan a partir de anticuerpos monoclonales y dominios variables del receptor de células T, en particular las cadenas únicas alfa y beta del TCR. De hecho, casi cualquier cosa que se una a una diana determinada con alta afinidad puede usarse como un dominio de reconocimiento de antígenos. En una modalidad, un receptor de antígeno de la invención que comprende al menos cuatro dominios variables de inmunoglobulina que forman al menos dos sitios de unión, en donde los dos sitios de unión pueden unirse al mismo o diferentes epítopos, epítopos que pueden localizarse en el mismo o en diferentes antígenos. En una modalidad el receptor de antígeno comprende un dominio variable (o región) de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una especificidad para un primer epítopo (VH(1)), un dominio variable (o región) de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con especificidad para un primer epítopo (VL(1)), un dominio variable (o región) de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con especificidad para un segundo epítopo (VH(2)), y un dominio variable (o región) de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con especificidad para un segundo epítopo (VL(2)), cuyo primer y segundo epítopos pueden el mismo o diferentes y pueden localizarse en el mismo o en diferentes antígenos. En una modalidad, VH(1) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1) y VH(2) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2), mientras que VH(1) no puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2) y VH(2) no puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1). Sin embargo, en otra modalidad, VH(1) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1), así como también VL(2) y VH(2) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2) así como también VL(1). En la última modalidad, VH(1) y VH(2) pueden ser idénticos o al menos derivarse a partir de la misma inmunoglobulina y VL(1) y VL(2) pueden ser idénticos o al menos derivarse a partir de la misma inmunoglobulina.

En un aspecto, la invención se relaciona con un receptor de antígeno, también denominado receptor de antígeno combinatorio en la presente descripción, cuyo receptor comprende una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica, en donde la primera cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; la segunda cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor; en donde el primer dominio a partir de la primera cadena peptídica forma junto con uno de los dominios de la segunda cadena peptídica un primer sitio de unión al antígeno, y en donde el segundo dominio a partir de la primera cadena peptídica forma junto con el otro dominio de la segunda cadena peptídica un segundo sitio de unión al antígeno.

En una modalidad, el receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada que se conecta a un dominio variable de cadena ligera en cada una de ambas cadenas peptídicas en donde la formación de dos sitios de unión al antígeno tiene lugar a través de la interacción entre un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en diferentes cadenas peptídicas. En una modalidad, el receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende dos cadenas peptídicas, en donde una cadena peptídica comprende VL(1) y VH(2) y la otra cadena polipeptídica comprende VH(1) y VL(2). En otra modalidad, el receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada que se conecta a un dominio variable de cadena pesada en una cadena peptídica y un dominio variable de cadena ligera que se conecta a un dominio variable de cadena ligera en la otra cadena peptídica en donde la formación de dos Los sitios de unión al antígeno tiene lugar a través de la interacción entre un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en diferentes cadenas peptídicas. En una modalidad, el receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende dos cadenas peptídicas, en donde una cadena peptídica comprende VH(1) y VH(2) y la otra cadena peptídica comprende VL(1) y VL(2).

En una modalidad, el receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende una primera cadena peptídica en donde la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) están preferentemente dispuestas, desde el terminal N al terminal C, en el orden VH(1)-VL(2) y una segunda cadena peptídica en donde la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) están preferentemente dispuestas, desde el extremo N al extremo C, en el orden VL(1)-VH(2). La región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor se localizan preferentemente en el extremo C del arreglo de las regiones variables. La región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor comprende preferentemente una región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma que se localiza en una de las cadenas peptídicas, y una región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena beta del receptor de células T que se localiza en la otra de las cadenas peptídicas. En una modalidad, la región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma comprende la cadena alfa de un receptor de células T. En una modalidad, la región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma comprende la cadena beta de un receptor de células T. La cadena alfa de un receptor de células T y la cadena beta de un receptor de células T son preferentemente del mismo receptor de células T.

En una modalidad, el receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende una primera cadena peptídica en donde la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) están preferentemente dispuestas, desde el extremo N al extremo C, en el orden VH(1)-VH(2) y una segunda cadena peptídica en donde la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) están preferentemente dispuestas, desde el extremo N al extremo C, en el orden VL(1)-VL(2). La región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor se localizan preferentemente en el extremo C del arreglo de las regiones variables. La región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor comprende preferentemente una región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma que se localiza en una de las cadenas peptídicas, y una región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y una región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma que se localiza en la otra de las cadenas peptídicas. En una modalidad, la región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma comprende la cadena alfa de un receptor de células T. En una modalidad, la región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y la región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma comprende la cadena beta de un receptor de células T. La cadena alfa de un receptor de células T y la cadena beta de un receptor de células T son preferentemente del mismo receptor de células T.

Los receptores de antígeno de la invención tienen al menos dos sitios de unión al antígeno y por tanto, son al menos bivalentes. Como indicó anteriormente, los sitios de unión de los receptores de antígeno de la invención pueden unirse al mismo o a epítopos diferentes, epítopos que pueden localizarse en el mismo o en diferentes antígenos. Si los sitios de unión se unen a los mismos epítopos, en particular al mismo antígeno, los dos sitios de unión pueden ser idénticos o esencialmente idénticos y/o pueden formarse mediante dominios idénticos o esencialmente idénticos, en donde tales dominios idénticos o esencialmente idénticos pueden derivarse, por ejemplo, de la misma inmunoglobulina. Si los sitios de unión se unen a diferentes epítopos, ya sea en el mismo o en diferentes antígenos, los dos sitios de unión son diferentes y se forman mediante dominios diferentes, en donde tales dominios diferentes pueden derivarse de diferentes inmunoglobulinas. En el caso de tales dominios diferentes se prefiere que los dominios que tienen diferentes especificidades de epítopo no interactúen o no interactúen sustancialmente entre sí, es decir, VH(1) no puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2) y VH(2) no puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1). En consecuencia, VH(1) interactúa y forma un sitio de unión al antígeno con VL(1) y VH(2) interactúa y forma un sitio de unión al antígeno con VL(2). Si un receptor de antígeno combinatorio de la invención comprende dos cadenas peptídicas, en donde una cadena peptídica comprende VH(1) y VL(2) y la otra cadena peptídica comprende VH(2) y VL(1), esto resulta en que las cadenas peptídicas no pueden formar sitios de unión al antígeno a través de la interacción intramolecular de los dominios.

Los dos dominios de un receptor de antígeno de la invención que forman un sitio de unión al antígeno también pueden derivarse a partir de un receptor de células T y pueden ser fragmentos o porciones del mismo que mantienen la unión antígeno-específica, en particular la unión al complejo péptido-MHC, tales como las regiones variables de un receptor de células T.

De acuerdo con la invención, el término "región variable de un receptor de células T" se relaciona con los dominios variables de las cadenas del TCR. La región variable tanto de la cadena a como de la cadena p del TCR tiene tres regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR), mientras que la región variable de la cadena p tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no contacta con el antígeno y por lo tanto no se considera un CDR. La CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena a interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena p interactúa con la parte C-terminal del péptido. Se cree que CDR2 reconoce el MHC. No se cree que la CDR4 de la cadena p participe en el reconocimiento del antígeno, pero se ha demostrado que interactúa con superantígenos.

La descripción anterior con relación a los dominios variables de inmunoglobulina se aplica de manera correspondiente a los dominios variables del receptor de células T. Un receptor de antígeno de la invención en lugar de un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una especificidad para un primer epítopo (VH(1)) y un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con un una especificidad por un primer epítopo (VL(1)) puede comprender un dominio variable de una cadena a del TCR de un TCR con una especificidad para un primer epítopo y un dominio variable de una cadena p del TCR de un TCR con una especificidad para un primer epítopo. Alternativamente o adicionalmente, un receptor de antígeno de la invención en lugar de un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una especificidad para un segundo epítopo (VH(2)), y un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con una especificidad para un segundo epítopo (VL(2)) puede comprender un dominio variable de una cadena a del TCR de un TCR con una especificidad para un segundo epítopo y un dominio variable de una cadena p del TCR de un TCR con una especificidad para un segundo epítopo.

Ya que cada sitio de unión al antígeno se forma a partir de dos dominios, cada dominio puede comprender una porción o un fragmento de una inmunoglobulina o un receptor de células T, respectivamente. La porción o fragmento individual por sí solo no puede unirse al antígeno pero cuando las dos porciones o fragmentos individuales se asocian juntas forman o recrean la estructura de unión al antígeno de la inmunoglobulina original o el receptor de células T y, por tanto, pueden unirse al mismo antígeno, preferentemente con la misma afinidad.

Seguido del reconocimiento del antígeno, los receptores preferentemente se conglomeran y se transmite una señal a la célula. En este sentido, un "dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor" o "dominio de señalización de células T" es un dominio que se involucra en la transmisión de una señal de activación a la célula T después de unirse el antígeno. Tal transmisión de la señal puede habilitarse mediante los receptores de antígeno de la invención que comprenden una región constante o invariante de una cadena de receptor de células T o una región constante o invariante de una cadena del receptor Fc de células inmunitarias o una porción de la región constante o invariante, tal como una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma, en una cadena peptídica y que comprende la región constante o invariante correspondiente de una cadena del receptor de células T o la región constante o invariante correspondiente de una cadena del receptor Fc de células inmunitarias o una porción de la región constante o invariante, tal como una región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma, en la otra cadena peptídica. En este sentido, el complejo CD3 indica un antígeno que se expresa en las células T humanas maduras, timocitos y en un subconjunto de las células asesinas naturales como parte del complejo del receptor de célula T (TCR) multimolecular. El correceptor de células T es un complejo proteico y se compone de cuatro cadenas distintas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena c D38, y dos cadenas CD3e. Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en los linfocitos T. El TCR, la cadena Z, y las moléculas CD3 juntas comprenden el complejo TCR. El CD3 es responsable de la transducción de señales del TCR. Como se describió por Lin y Weiss, Journal de Cell Science 114, 243-244 (2001), la activación del complejo TCR mediante la unión de epítopos de antígenos específicos presentados por el MHC resulta en la fosforilación de los motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor (ITAMs, por sus siglas en inglés) por la familia de la quinasa Src, lo que desencadena el reclutamiento de quinasas adicionales que resulta en la activación de la célula T que incluye la liberación de Ca2+. La agrupación de CD3 en las células T, por ejemplo mediante anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, conduce a la activación de la célula T de manera similar al acoplamiento del receptor de célula T, pero independiente de su especificidad típica de clon.

El dominio de transmisión de señales del receptor de antígeno sirve preferentemente como mínimo para interactuar con el complejo de transducción de señales celular nativo, por ejemplo, el complejo CD3, que es responsable de transmitir la señal de la unión del antígeno a un receptor de antígeno en la célula, lo que resulta en la activación de la célula inmunitaria. La identidad del dominio de transmisión de señales está limitada únicamente en que tiene la capacidad de interactuar con el complejo de transducción de señales nativo para inducir la activación de la célula inmunitaria tras la unión del antígeno al receptor del antígeno.

Preferentemente, el dominio de transmisión de señales en una cadena peptídica formará un dímero con el dominio de transmisión de señales en la segunda cadena, por ejemplo, a través de puentes disulfuro. Los dominios de transmisión de señales que se prefieren pueden comprender una región constante o invariante de una cadena del receptor de células T o una región constante o invariante de una cadena del receptor Fc de células inmunitarias o una porción de la región constante o invariante. Los dominios de transmisión de señales que se prefieren pueden comprender la región constante de las cadenas alfa, beta, gamma o delta de un receptor de células T o una porción de las mismas, así como también las regiones invariantes D2 o D3 del dominio constante de un receptor Fc de células inmunitarias o una porción del mismo. En una modalidad preferida, la primera cadena peptídica comprende una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, la primera cadena peptídica comprende preferentemente una región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma, en donde las regiones variables se localizan en el extremo N de las regiones constantes. Alternativamente, la primera cadena peptídica comprende una región constante de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región constante de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, la primera cadena peptídica comprende preferentemente una región variable de una cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma, en donde las regiones variables se localizan en el extremo N de las regiones constantes. En otra modalidad, la primera cadena peptídica comprende una región constante de una cadena gamma del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región constante de una cadena delta del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, la primera cadena peptídica comprende preferentemente una región variable de una cadena gamma del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena delta del receptor de células T o una porción de la misma, en donde las regiones variables se localizan en el extremo N de las regiones constantes. Alternativamente, la primera cadena peptídica comprende una región constante de una cadena delta del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región constante de una cadena gamma del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, la primera cadena peptídica comprende preferentemente una región variable de una cadena delta del receptor de células T o una porción de la misma y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena gamma del receptor de células T o una porción de la misma, en donde las regiones variables se localizan en el extremo N de las regiones constantes. Opcionalmente, los dominios de transmisión de señales, o la región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma pueden modificarse de manera que se creen enlaces disulfuro adicionales entre las cadenas, lo que conduce a una formación de dímero más efectiva y a una mayor estabilidad del dímero.

Mientras que sin querer limitarse a un mecanismo de acción particular, se cree que las dos cadenas peptídicas del receptor de antígeno de la invención, cuando se expresan en la superficie de una célula inmunitaria, forman un dímero debido a interacciones (por ejemplo, enlace disulfuro) al menos entre los dominios de transmisión de señales del inmunorreceptor individuales en las dos cadenas, así como también forman un complejo con el complejo CD3 endógeno que se involucra en la transducción fisiológica de señales del receptor de células T. Sin embargo, la invención también puede incluir la fusión directa a CD3Z o cualquier otro dominio de señalización de células inmunitarias (CD3, subunidad FcyR del CD3) en lugar de los dominios Ca y Cp del TCR. Tras la unión del antígeno, se cree que se transmite una señal al interior de la célula que conduce a la activación de la célula inmunitaria y a la generación de una respuesta inmunitaria antígeno-específica. Además, se cree que la unión intercatenaria del antígeno proporciona un módulo de transducción de señales CD3 endógeno del receptor antígeno-antígeno más estable, cuya mayor estabilidad a su vez permite una estimulación más efectiva de una respuesta inmunitaria antígenoespecífica, en comparación con los receptores monovalentes y receptores bivalentes que solo pueden la unión intracatenaria del antígeno. También se cree que esta mayor estabilidad permite la opción mediante el uso solo de dominios de transmisión de señales de inmunorreceptores de origen humano (por ejemplo, sustitución mínima o nula de una secuencia de aminoácidos derivada de humanos con una secuencia de aminoácidos derivada a partir de otra especie, tal como el ratón). Por tanto, puede evitarse cualquier respuesta inmunitaria potencial no deseada contra el receptor de antígeno en sí.

Los receptores de antígeno de acuerdo con la invención o las cadenas peptídicas de los mismos pueden además de los dominios que forman los sitios de unión al antígeno, las regiones variables de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, y dominios de transmisión de señales de inmunorreceptores que incluyen el CD3Z o cualquier otro dominio de señalización de células inmunitarias comprenden además uno o más dominios de coestimulación. Los dominios de coestimulación sirven para potenciar la proliferación y sobrevivencia de las células T tales como las células T citotóxicas tras la unión del receptor de antígeno a un resto diana. La identidad de los dominios de coestimulación está limitada solo en que tienen la capacidad para potenciar la proliferación celular y la sobrevivencia tras la unión del resto diana mediante el receptor de antígeno. Los dominios de coestimulación adecuados incluyen CD28, CD137 (4-1BB), un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), CD134 (Ox 4o), un miembro de la superfamilia de receptores R y CD278 (ICOS), una molécula coestimuladora de la superfamilia de CD28 expresada en células T activadas. El experto entenderá que las variantes de secuencia de estos dominios de coestimulación indicados pueden usarse sin impactar de forma adversa la invención, donde las variantes tienen la misma actividad o similar que el dominio sobre el que se modelan. Tales variantes tendrán al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio del que se derivan. En algunas modalidades de la invención, las construcciones del receptor de antígeno o las cadenas peptídicas de las mismas comprenden dos dominios de coestimulación. Si bien las combinaciones particulares incluyen todas las variaciones posibles de los cuatro dominios indicados, los ejemplos específicos incluyen CD28+CD137 (4-1BB) y CD28+CD134 (OX40).

Los receptores de antígeno de la presente invención o las cadenas peptídicas de los mismos pueden comprender uno o más dominios de coestimulación, y dominios de transmisión de señales de inmunorreceptores, unidos en una dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal. Sin embargo, los receptores de antígeno de la presente invención o las cadenas peptídicas de los mismos no se limitan a este arreglo y otros arreglos son aceptables e incluyen dominios de transmisión de señales de inmunorreceptores, y uno o más dominios de coestimulación.

Se debe entender que debido a que los dominios que forman el sitio de unión al antígeno deben estar libres para unir el antígeno, la colocación de estos dominios en la proteína de fusión será generalmente de manera que se logre la visualización de la región en el exterior de la célula. De la misma manera, debido a que los dominios de coestimulación, y los dominios de transmisión de señales de inmunorreceptores sirven para inducir la actividad y proliferación de las células T, la proteína de fusión generalmente visualizará estos dominios en el interior de la célula. Los receptores de antígeno pueden incluir elementos adicionales, tales como un péptido señal para garantizar la exportación apropiada de la proteína de fusión a la superficie de las células, un dominio transmembrana para garantizar que la proteína de fusión se mantenga como una proteína integral de membrana, y un dominio bisagra (o región espaciadora) que imparte flexibilidad al dominio que forma el sitio de unión al antígeno y permite una unión fuerte al antígeno.

Opcionalmente, los receptores de antígeno de la invención pueden comprender además un enlazador, cuyo enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos arbitraria u otro compuesto químico útil como un espaciador entre las secuencias de aminoácidos. El enlazador generalmente se diseña para proporcionar flexibilidad y resistencia a proteasas. Por ejemplo, el enlazador puede estar entre el primer y segundo dominios en la primera cadena peptídica y/o entre el primer y segundo dominios en la segunda cadena peptídica de un receptor de antígeno combinatorio de la invención. Opcionalmente, el enlazador puede presentarse entre los dominios que forman los sitios de unión al antígeno y la región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma. La invención abarca cualquier tipo de enlazador conocido en la técnica que permita que los dominios formen un sitio de unión al antígeno o que no interfiera con la unión al antígeno. En modalidades específicas, el enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos arbitraria y puede ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o al menos de 100 residuos de aminoácidos de longitud. Un enlazador de aminoácidos es típicamente rico en glicina para la flexibilidad, así como también en serina y treonina para la solubilidad. En una modalidad, el enlazador es una o más (1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 o 9) repeticiones de cuatro residuos de glicina seguidos por un residuo de serina (Gly4Ser). En determinadas modalidades, el enlazador puede ser una región de bisagra de un anticuerpo o un fragmento del mismo.

El receptor de antígeno de la invención puede comprender además otro dominio que ancla el receptor de antígeno en la membrana, tal como un dominio transmembrana clásico. Preferentemente, el dominio transmembrana se incorpora o es una parte del dominio de transmisión de señales.

En otras modalidades, los receptores de antígeno o las cadenas peptídicas de los receptores de antígeno de la invención pueden comprender además otros dominios, tales como dominios adicionales que se involucran en la unión de antígenos o que la potencian, secuencias señal para la expresión unidas a la membrana o para la secreción, dominios que proporcionan una dimerización mejorada, y un dominio transmembrana, cuando aún no forma parte del dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor. En determinadas modalidades, el dominio transmembrana puede ser una alfa hélice hidrófoba que atraviesa la membrana.

Preferentemente, una secuencia señal o péptido señal es una secuencia o péptido que permite el paso suficiente a través de la trayectoria secretora y la expresión en la superficie celular de manera que un receptor de antígeno, por ejemplo, puede unirse a un antígeno presente en el ambiente extracelular. Preferentemente, la secuencia señal o péptido señal se escinde y se elimina de las cadenas peptídicas maduras. La secuencia señal o péptido señal se elige preferentemente con respecto a la célula u organismo en donde se producen las cadenas peptídicas.

En una modalidad particular, una cadena peptídica de un receptor de antígeno combinatorio de la invención puede comprender la estructura: Dominio del primer péptido señal NH2 que se involucra en la unión opcional al antígeno del dominio del segundo enlazador que se involucra en la unión opcional al antígeno de la región variable enlazadora de una cadena del receptor de células T o una porción del mismo dominio -COOH de transmisión de señales de inmunorreceptores.

Los receptores de antígeno ilustrativos de la invención, incluyen pero no se limitan a aquellos formados por la primera y segunda cadenas peptídicas que tienen las estructuras enumeradas en la Tabla I más abajo (VH la región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina o una porción de la misma; VL la región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina o parte de la misma; V1 y V2 las regiones variables de una cadena del receptor de células T o una parte de la misma que formarán un dímero entre sí, C1 y C2 los dominios de transmisión de señales del inmunorreceptor que formarán un dímero entre sí, por ejemplo, la región constante o invariante de una cadena del receptor Fc de células inmunitarias, o la región constante o invariante de una cadena del receptor de células T, o una porción de la región constante o invariante). Si C1 y C2 son cada uno regiones constantes de una cadena del receptor de células T, V1 y C1 son preferentemente de la misma cadena del receptor de células T y V2 y C2 son preferentemente de la misma cadena del receptor de células T, las cadenas del receptor de células T preferentemente del mismo receptor de células T. En particular, V1-C1 en una modalidad corresponde en esencia a la secuencia de una cadena del receptor de células T (TCR alfa o TCR beta) y V2-C2 corresponde esencialmente a la secuencia de la cadena del receptor de células T complementario (TCR beta si V1-C1 es el TCR alfa o el TCR alfa si V1-C1 es el TCR beta).

Tabla I

Como se definió anteriormente, el receptor de antígeno comprende un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una especificidad para un primer epítopo (VH(1)), un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con un especificidad para un primer epítopo (VL(1)), un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una especificidad para un segundo epítopo (VH(2)) y un dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con una especificidad para un segundo epítopo (VL(2)), cuyo primer y segundo epítopos pueden ser iguales o diferentes y pueden localizarse en el mismo o en diferentes antígenos. En una modalidad, VH(1) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1) y VH(2) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2), mientras que VH(1) no puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2) y VH(2) no puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1). Sin embargo, en otra modalidad, VH(1) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(1), así como también VL(2) y VH(2) puede interactuar y formar un sitio de unión al antígeno con VL(2) así como también VL(1). En la última modalidad, VH(1) y VH(2) pueden ser idénticos o al menos derivarse a partir de la misma inmunoglobulina y VL(1) y VL(2) pueden ser idénticos o al menos derivarse a partir de la misma inmunoglobulina.

En modalidades específicas, los dominios V1 y V2 de la primera y segunda cadenas peptídicas enumeradas en la Tabla 1 son las regiones variables de las cadenas alfa y beta del receptor de células T, respectivamente, o una porción de las mismas. En modalidades específicas, los dominios C1 y C2 de la primera y segunda cadenas peptídicas enumeradas en la Tabla 1 son las regiones constantes de las cadenas alfa y beta del receptor de células T, respectivamente, o una porción de las mismas.

En una modalidad, los dominios V1 y C1 de la primera cadena peptídica enumerada en la Tabla 1 son las regiones variable y constante de la cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, los dominios V2 y C2 de la segunda cadena peptídica enumerada en la Tabla 1 son preferentemente las regiones variable y constante de la cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma.

En una modalidad, los dominios V1 y C1 de la primera cadena peptídica enumerada en la Tabla 1 son las regiones variable y constante de la cadena beta del receptor de células T o una porción de la misma. En esta modalidad, los dominios V2 y C2 de la segunda cadena peptídica enumerada en la Tabla 1 son preferentemente las regiones variable y constante de la cadena alfa del receptor de células T o una porción de la misma.

En una modalidad preferida, cuando los dos dominios de una cadena peptídica son ambos una región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina o una porción de la misma y los dos dominios de la otra cadena son una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina o una porción de la misma, un enlazador está presente entre el primer y segundo dominios en ambas cadenas peptídicas. El enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos arbitraria entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia 15 aminoácidos de longitud. En una modalidad específica, el enlazador es 3 repeticiones de la secuencia de aminoácidos 5 mer (Gly4Ser).

En determinadas modalidades de la invención, las secuencias de aminoácidos de la primera y segunda cadenas peptídicas, como aquellas que comprenden uno o más de los dominios que forman los sitios de unión al antígeno, la región variable de una cadena del receptor de células T o una porción de la misma, o el dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor, son de origen mamífero, preferentemente de ratón, y con mayor preferencia de origen humano. En una modalidad, las secuencias de aminoácidos son de origen humano pero se han murinizado mediante la sustitución de uno o más aminoácidos en la secuencia humana con el aminoácido que se encuentra en la posición correspondiente en la secuencia de ratón. Tal sustitución puede proporcionar una mayor dimerización o estabilidad o capacidad para transmitir una señal al interior de la célula tras la unión del antígeno. En otra modalidad más, las secuencias de aminoácidos son de origen de ratón y se han humanizado.

De acuerdo con la invención, un receptor de antígeno puede reemplazar la función de un receptor de células T como se describió anteriormente y, en particular, puede conferir reactividad tal como actividad citolítica a una célula tal como una célula T como se describió anteriormente. Sin embargo, por el contrario a la unión del receptor de células T a un antígeno del complejo péptido-MHC como se describió anteriormente, un receptor de antígeno en determinadas modalidades puede unirse a un antígeno, en particular si se expresa en la superficie celular.

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas peptídicas pueden modificarse, que incluye cualquiera de los dominios 0 enlazadores. Por ejemplo, y como se aprecia por los expertos en la técnica, las secuencias de las regiones variables de los anticuerpos y receptores de células T pueden modificarse sin la pérdida de la capacidad de unirse a una diana y en consecuencia la secuencia de aminoácidos de los sitios de unión al antígeno puede modificarse de manera similar sin la pérdida de la capacidad de unir una diana. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un dominio que forma un sitio de unión al antígeno puede ser idéntica o altamente homóloga a la región variable del anticuerpo a partir del se deriva. Por "altamente homóloga" se contempla que pueden hacerse de 1 a 5, preferentemente de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones en las CDR. En una modalidad, una cadena peptídica puede incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. En otra modalidad, una cadena peptídica simplemente incluye aminoácidos naturales. El término "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que tiene una estructura diferente de aquella de las 20 especies de aminoácidos naturales. Dado que los aminoácidos no naturales tienen estructuras similares a las de los aminoácidos naturales, los aminoácidos no naturales pueden clasificarse como derivados o análogos de determinados aminoácidos naturales.

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de una o más de las regiones variables de los receptores de células T o porciones de las mismas, en particular aquellas que no forman los sitios de unión al antígeno, puede modificarse con el fin de eliminar la unión (residual) a su antígeno. En particular, tal modificación de "silenciamiento" puede efectuarse introduciendo una o más mutaciones en la CDR3 de la región variable del TCR alfa y/o el TCR beta.

La presente invención también abarca derivados de los receptores de antígeno y las cadenas peptídicas descritos en la presente descripción. De acuerdo con la invención, los "derivados" son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones únicas o múltiples, de cualquiera de las moléculas asociadas con el receptor de antígeno o la cadena peptídica, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una modalidad, los "derivados" de proteínas o péptidos incluyen aquellos análogos modificados que resultan a partir de la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un antígeno. El término "derivado" se extiende también a todos los equivalentes químicos funcionales de dichos receptores de antígeno y cadenas peptídicas. Preferentemente, un receptor de antígeno modificado o una cadena peptídica del mismo tiene una capacidad de unión o dimerización aumentada y/o la capacidad de activación inmunitaria aumentada.

Las células usadas en relación con el sistema del receptor de antígeno de la presente invención son preferentemente las células T, en particular los linfocitos citotóxicos, preferentemente seleccionados a partir de células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). Tras la activación, cada uno de estos linfocitos citotóxicos desencadena la destrucción de las células diana. Por ejemplo, las células T citotóxicas desencadenan la destrucción de las células diana por uno o ambos de los siguientes medios. Primero, tras la activación, las células T liberan citotoxinas tales como perforina, granzimas y granulisina. La perforina y la granulisina crean poros en la célula diana y las granzimas entran en la célula y desencadenan una cascada de caspasas en el citoplasma que induce a la apoptosis (muerte celular programada) de la célula. Segundo, la apoptosis puede inducirse mediante la interacción de Fas-FAS ligando entre las células T y las células diana. Los linfocitos citotóxicos serán preferentemente células autólogas, aunque pueden usarse células heterólogas o células alogénicas.

El término "inmunoglobulina" se relaciona con proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas, preferentemente a receptores de antígeno tales como anticuerpos o el receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un pliegue de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca las inmunoglobulinas unidas a membrana así como también las inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membrana también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente forman parte del BCR. Las inmunoglobulinas solubles generalmente se denominan anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, típicamente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas se componen principalmente de dominios de inmunoglobulinas, tales como el dominio Vl (cadena ligera variable), dominio Cl (cadena ligera constante) y los dominios Ch (cadena pesada constante) Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos, es decir, a, 8, £, y y M que explican las diferentes clases de anticuerpos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Como opuesto a las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto en su extremo carboxi-terminal. En los mamíferos hay dos tipos de cadenas ligeras, es decir, lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulinas comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, en donde la parte variable es muy diversa y explica el reconocimiento del antígeno.

El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente descripción como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente descripción como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y al primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión y afinidad únicas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que se fusiona a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente descripción, incluye todos los anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma que se prepara a partir de estos, (b) anticuerpos que se aíslan de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos que se aíslan de una biblioteca recombinante, combinatoria, de anticuerpos y (d) anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el empalme de secuencias génicas de la inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.

El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura remanente de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender tanto dominios variables completos fusionados a dominios constantes como solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en las regiones de estructura apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase particular, mientras que el segmento remanente de la cadena es homólogo a secuencias correspondientes en otro. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada mimetiza las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas mediante el uso de células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con las regiones constantes que se derivan de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de ser fácil de preparar y que la fuente no afecta a la especificidad, la región constante que es humana, es menos probable que genere una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que si la región constante fuera de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

Los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, que incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, conejo, cobayo y humano.

Los anticuerpos que se describen en la presente descripción incluyen IgA tal como anticuerpos IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, e IgD. En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un IgG1, isotipo kappa o IgG1 isotipo lambda (es decir, IgG1, k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo IgG2a, k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo IgG3, k, a) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo IgG4, k, A).

Los receptores de antígeno descritos en la presente descripción pueden comprender porciones de unión a antígenos de uno o más anticuerpos. Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") o términos similares se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones aisladas determinantes de la complementariedad (CDR), y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, ellos pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite hacerlos como una proteína de cadena única en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena única se abarquen dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona a un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de la cadena pesada o una región variable de la cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen además en los documentos núms. US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica, y se seleccionan los fragmentos para la utilidad de la misma manera que a los anticuerpos intactos.

Un fragmento variable de cadena única (scFv) es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de inmunoglobulinas, conectadas con un péptido enlazador. El enlazador puede conectar ya sea el N-terminal de la VH con el C-terminal de la VL, o viceversa. Los fragmentos variables de cadena sencilla divalentes (o bivalentes) (di-scFvs, bi-scFvs) pueden modificarse genéticamente para unir dos scFvs. Esto puede hacerse mediante la producción de una cadena sencilla de péptidos con dos regiones VH y dos VL, lo que produce los scFvs en tándem.

El término "dominio de unión" o simplemente "dominio" caracteriza en relación con la presente invención una estructura, por ejemplo de un anticuerpo, que se une a/interactúa con una estructura/antígeno/epítopo diana dado, opcionalmente cuando interactúa con otro dominio. Por tanto, estos dominios de acuerdo con la invención designan un "sitio de unión al antígeno".

Los anticuerpos y derivados de anticuerpos son útiles para proporcionar dominios de unión tales como fragmentos de anticuerpos, en particular para proporcionar regiones Vl y Vh .

Los dominios de unión para un antígeno que pueden estar presentes dentro de un receptor de antígeno tienen la capacidad de unirse (dirigirse) a un antígeno, es decir, la capacidad de unirse (dirigirse) a un epítopo presente en un antígeno, preferentemente un epítopo que se localiza dentro del dominio extracelular de un antígeno. Preferentemente, los dominios de unión para un antígeno son específicos para el antígeno. Preferentemente, los dominios de unión para un antígeno se unen al antígeno expresado en la superficie celular. En modalidades preferidas particulares, los dominios de unión para un antígeno se unen a los epítopos nativos de un antígeno presente en la superficie de las células vivas.

Todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos tales como fragmentos de anticuerpos como se describe en la presente descripción, para los fines de la invención, se abarcan por el término "anticuerpo".

Los anticuerpos pueden producirse mediante una variedad de técnicas, que incluyen la metodología convencional del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B o técnicas de presentación en fagos mediante el uso de bibliotecas de genes de anticuerpos.

El sistema animal que prefiere para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.

Otros sistemas de animales que se prefieren para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y el de conejo (por ejemplo, se describen en Spieker-Polet y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 92:9348 (1995), véase también Rossi y otros, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).

Para generar los anticuerpos, los ratones pueden inmunizarse con portadores de péptidos conjugados derivados de la secuencia del antígeno, es decir, la secuencia contra la cual los anticuerpos deben dirigirse, una preparación enriquecida de antígeno expresado de manera recombinante o fragmentos de este y/o células que expresan el antígeno, como se describió. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el antígeno o fragmentos de este. En el caso de que las inmunizaciones usen una preparación purificada o enriquecida del antígeno no resulten en anticuerpos, los ratones pueden también inmunizarse con células que expresan el antígeno, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.

La respuesta inmunitaria puede monitorearse en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen por la vena de la cola o sangrados retroorbitales. Los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse de manera intraperitoneal o intravenosa con el antígeno que expresan las células 3 días antes del sacrificio y la eliminación del bazo para aumentar la velocidad de hibridomas que secretan anticuerpos específicos.

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales, pueden aislarse los esplenocitos y las células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden luego tamizarse para la producción de anticuerpos antígeno-específicos. Los pocillos individuales pueden luego tamizarse mediante ELISA para hibridomas que secretan anticuerpos. Por análisis de Inmunofluorescencia y FACS mediante el uso de las células que expresan el antígeno, pueden identificarse los anticuerpos con especificidad para el antígeno. Los hibridomas que secretan el anticuerpo pueden replaquearse, tamizarse de nuevo, y si todavía son positivos para los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse por dilución limitante. Los subclones estables entonces pueden cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo de tejidos para la caracterización.

La capacidad de los anticuerpos y otros agentes de unión para unirse a un antígeno puede determinarse mediante el uso de ensayos de unión estándar (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).

El término "unión" de acuerdo con la invención se refiere, preferentemente, a una unión específica.

De acuerdo con la presente invención, un agente tal como un receptor de antígeno puede unirse (dirigirse) a una diana predeterminada si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación en equilibrio (Kd). Preferentemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un objetivo predeterminado con una constante de disociación (Kd) de 10-5 M o inferior, 10-6 M o inferior, 10-7 M o inferior, 10-8 M o inferior, 10-9M o inferior, 10-10 M o inferior, 10-11 M o inferior, o 10-12 M o inferior.

Un agente no es (esencialmente) capaz de unirse (dirigirse) a una diana si no tiene una afinidad significativa por dicha diana y no se une significativamente, en particular no se une de manera detectable, a dicha diana en ensayos estándar. Preferentemente, el agente no se une de manera detectable a dicha diana si se presenta en una concentración de hasta 2, preferentemente 10, con mayor preferencia 20, en particular, 50 o 100 pg/mL o superior. Preferentemente, un agente no tiene afinidad significativa por una diana si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces superior que la Kd de unión a la diana predeterminada a la que el agente puede unirse. Por ejemplo, si la Kd para la unión de un agente a la diana, a la cual el agente puede unirse es 10-7 M, la Kd para la unión a una diana por la cual el agente no tiene afinidad significativa será, al menos, 10-6M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M o 10-1 M.

Un agente es específico para una diana predeterminada si puede unirse a dicha diana predeterminada mientras no puede unirse (sustancialmente) a otras dianas, es decir no tiene afinidad significativa por otras dianas y no se une significativamente a otras dianas en ensayos estándar. Preferentemente, un agente es específico para una diana predeterminada si la afinidad y la unión a tales otras dianas no excede significativamente la afinidad o unión a proteínas que no están relacionadas con una diana predeterminada tal como la albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), la caseína o albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés). Preferentemente, un agente es específico para una diana predeterminada si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces menor que la Kd de unión a una diana para el que no es específico. Por ejemplo, si la Kd de unión de un agente a la diana para el que es específico es 10-7M, la Kd de unión a una diana para el que no es específico pudiera ser de al menos 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, o 10-1 M.

La unión de un agente a una diana puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos descritos en la presente descripción. Las afinidades pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, tales como la diálisis de equilibrio; mediante el uso del instrumento BIAcore 2000, mediante el uso de procedimientos generales delineados por el fabricante; por radioinmunoensayo mediante el uso del antígeno diana radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la materia. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard y otros, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). La afinidad que se mide a una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, Kd, IC50, se llevan a cabo preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.

La invención puede involucrar la introducción, es decir, la transfección, de ácidos nucleicos que codifican los receptores de antígeno en células tales como las células T in vitro o in vivo.

Para los propósitos de la presente invención, el término "transfección" incluye la introducción de un ácido nucleico en una célula o la captación de un ácido nucleico por una célula, en donde la célula puede estar presente en un sujeto, por ejemplo, un paciente. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, una célula para la transfección de un ácido nucleico descrito en la presente descripción puede estar presente in vitro o in vivo, por ejemplo la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo de un paciente. De acuerdo con la invención, la transfección puede ser transitoria o estable. Para algunas aplicaciones de la transfección, es suficiente si el material genético transfectado se expresa solo transitoriamente. Como el ácido nucleico que se introduce en el proceso de transfección no se integra usualmente en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá a través de la mitosis o se degradará. Las células que permiten la amplificación episomal de ácidos nucleicos reducen grandemente la velocidad de la dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe ocurrir una transfección estable. El ARN puede transfectarse en las células para expresar transitoriamente su proteína codificada.

De acuerdo con la presente invención, puede usarse cualquier técnica útil para introducir, es decir, transferir o transfectar, ácidos nucleicos en las células. Preferentemente, el ácido nucleico tal como ARN se transfecta en las células mediante técnicas estándar. Estas técnicas incluyen electroporación, lipofección y microinyección. En una modalidad preferida particularmente de la presente invención, el ARN se introduce en las células mediante electroporación. La electroporación o electropermeabilización se relaciona con un aumento significativo en la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causada por un campo eléctrico aplicado externamente. Suele usarse en biología molecular como una forma de introducir alguna sustancia en una célula. De acuerdo con la invención, se prefiere que la introducción del ácido nucleico que codifica una proteína o péptido en las células resulte en la expresión de dicha proteína o péptido.

Puede usarse una variedad de métodos para introducir las construcciones de los receptores de antígeno en células T que incluye la transfección de ADN no basada en virus, sistemas basados en transposones y sistemas basados en virus. La transfección de ADN no basada en virus tiene un riesgo bajo de mutagénesis de inserción. Los sistemas basados en transposones pueden integrar transgenes de manera más eficiente que los plásmidos que no contienen un elemento integrador.

Los sistemas basados en virus incluyen el uso de Y-retrovirus y vectores lentivirales. Los Y-retrovirus son relativamente fáciles de producir, transducen de manera eficiente y permanente las células T, y se ha probado preliminarmente que son seguros desde el punto de vista de la integración en las células T primarias humanas. Los vectores lentivirales también transducen de manera eficiente y permanente las células T, pero su fabricación es más cara. También son potencialmente más seguros que los sistemas basados en retrovirus.

Para la transfección de células in vivo puede usarse una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno. Un vehículo de administración que dirige el ácido nucleico a una célula específica tal como una célula T puede administrarse a un paciente, lo que resulta en la transfección que ocurre in vivo.

De acuerdo con la invención, se prefiere administrar el ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno en forma desnuda o en un portador. Los portadores tales como los portadores lipídicos contemplados para su uso en la presente invención incluyen cualquier sustancia o vehículo con el que se pueda asociar un ácido nucleico tal como el ARN, por ejemplo mediante la formación de complejos con el ácido nucleico o mediante la formación de vesículas en las que el ácido nucleico está encerrado o encapsulado. Esto puede dar como resultado una mayor estabilidad del ácido nucleico en comparación con el ácido nucleico desnudo. En particular, puede aumentarse la estabilidad del ácido nucleico en sangre. Por ejemplo, pueden usarse formulaciones de ARN nanoparticulado con tamaño de partícula definido, tales como lipoplejos a partir de ARN y liposomas, por ejemplo lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE o DOTMA y colesterol.

Como se usa en la presente, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tiene un diámetro que hace a la partícula adecuada para la administración sistémica, en particular parenteral, de, en particular, ácidos nucleicos, típicamente con un diámetro de menos de 1000 nanómetros (nm). En algunas modalidades, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 600 nm. En algunas modalidades, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 400 nm.

Como se usa en la presente descripción, el término "formulación de nanopartículas" o términos similares se refieren a cualquier sustancia que contenga al menos una nanopartícula. En algunas modalidades, una composición de nanopartículas es una colección uniforme de nanopartículas. En algunas modalidades, las composiciones de nanopartículas son dispersiones o emulsiones. En general, se forma una dispersión o emulsión cuando se combinan al menos dos materiales inmiscibles.

El término "lipoplejo" o "lipoplejo de ácido nucleico", en particular "lipoplejo de ARN", se refiere aun complejo de lípidos y ácidos nucleicos, en particular ARN. Los lipoplejos se forman espontáneamente cuando los liposomas catiónicos, que a menudo también incluyen un lípido "cooperador" neutro, se mezclan con los ácidos nucleicos.

Los lípidos catiónicos, los polímeros catiónicos y otras sustancias con cargas positivas pueden formar complejos con los ácidos nucleicos cargados negativamente. Estas moléculas catiónicas pueden usarse para ácidos nucleicos complejos, que forman de esta manera por ejemplo los denominados lipoplejos o poliplejos, respectivamente, y se ha mostrado que estos complejos suministran ácidos nucleicos en las células.

Las preparaciones de ácido nucleico nanoparticulado para su uso en la presente invención pueden obtenerse mediante diversos protocolos y a partir de diversos compuestos formadores de complejos de ácido nucleico. Los lípidos, polímeros, oligómeros o anfífilos son agentes formadores de complejos típicos. En una modalidad, el compuesto acomplejante comprende al menos un agente seleccionado a partir del grupo que consiste en protamina, polietilenimina, una poli-L-lisina, una poli-L-arginina o una histona.

De acuerdo con la invención, la protamina es útil como agente portador catiónico. El término "protamina" se refiere a cualquiera de las diversas proteínas fuertemente básicas de peso molecular relativamente bajo que son ricas en arginina y se encuentran asociadas especialmente con ADN en su lugar de histonas somáticas en los espermatozoides de diversos animales (como el pez). En particular, el término "protamina" se refiere a proteínas que se encuentran en el esperma del pez que son fuertemente básicas, son solubles en agua, no se coagulan por el calor, y producen principalmente arginina tras la hidrólisis. En forma purificada, se usan en una formulación de insulina de acción prolongada y para neutralizar los efectos anticoagulantes de la heparina.

De acuerdo con la invención, el término "protamina" como se usa en la presente descripción pretende comprender cualquier secuencia de aminoácidos de protamina que se obtiene o se deriva a partir de fuentes nativas o biológicas que incluyen fragmentos de la misma y formas multiméricas de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma. Además, el término abarca polipéptidos (sintetizados) que son artificiales y están diseñados específicamente para propósitos específicos y no pueden aislarse a partir de fuentes nativas o biológicas.

La protamina usada de acuerdo con la presente invención puede ser protamina sulfatada o hidrocloruro de protamina. En una modalidad preferida, la fuente de protamina usada para la producción de las nanopartículas descritas en la presente descripción es protamina 5000 que contiene protamina a más de 10 mg/ml (5000 unidades neutralizadoras de heparina por ml) en una solución salina isotónica.

Los liposomas son vesículas lipídicas microscópicas que a menudo tienen una o más bicapas de un lípido formador de vesículas, tal como un fosfolípido, y pueden encapsular un fármaco. Pueden emplearse diferentes tipos de liposomas en el contexto de la presente invención, que incluyen, sin limitarse a ello, vesículas multilaminares (MLV, por sus siglas en inglés), vesículas unilaminares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés), vesículas unilaminares grandes (LUV, por sus siglas en inglés), liposomas estabilizados estéricamente (SSL, por sus siglas en inglés), vesículas multivesiculares (MV, por sus siglas en inglés) y vesículas multivesiculares grandes (LMV, por sus siglas en inglés) así como también otras formas de bicapa conocidas en la técnica. El tamaño y la lamelaridad del liposoma dependerán de la forma de preparación y la selección del tipo de vesículas a usarse dependerá del modo de administración que se prefiere. Hay varias otras formas de organización supramolecular en las que los lípidos pueden estar presentes en un medio acuoso, que comprenden fases laminares, fases hexagonales y hexagonales inversas, fases cúbicas, micelas, micelas inversas compuestas de monocapas. Estas fases también pueden obtenerse en la combinación con ADN o ARN, y la interacción con ARN y ADN puede afectar sustancialmente el estado de la fase. Las fases descritas pueden estar presentes en las formulaciones de ácidos nucleicos en nanopartículas de la presente invención.

Para la formación de lipoplejos de ácido nucleico a partir de ácido nucleico y liposomas, puede usarse cualquier método adecuado para formar liposomas siempre que proporcione los lipoplejos de ácido nucleico previstos. Los liposomas pueden formarse mediante el uso de métodos estándar tales como el método de evaporación inversa (REV, por sus siglas en inglés), el método de inyección de etanol, el método de deshidratación-rehidratación (DRV, por sus siglas en inglés), sonicación u otros métodos adecuados.

Después de la formación del liposoma, los liposomas pueden dimensionarse para obtener una población de liposomas que tienen un intervalo de tamaño sustancialmente homogéneo.

Los lípidos formadores de bicapas tienen típicamente dos cadenas hidrocarbonadas, particularmente cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o apolar. Los lípidos formadores de bicapas están compuestos ya sea de lípidos de origen natural o de origen sintético, que incluyen los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, y esfingomielina, donde las dos cadenas hidrocarbonadas tienen típicamente entre aproximadamente 14-22 átomos de carbono de longitud, y tienen grados variables de insaturación. Otros lípidos adecuados para su uso en la composición de la presente invención incluyen glicolípidos y esteroles tales como colesterol y sus diversos análogos que también pueden usarse en los liposomas.

Los lípidos catiónicos tienen típicamente un resto lipófilo, tal como un esterol, una cadena de acilo o diacilo, y tienen una carga neta global positiva. El grupo de cabeza del lípido típicamente lleva la carga positiva. El lípido catiónico tiene preferentemente una carga positiva de 1 a 10 valencias, con mayor preferencia una carga positiva de 1 a 3 valencias, y con mayor preferencia una carga positiva de 1 valencia. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA); dimetildioctadecilamonio (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP); propanos de 1,2-diaciloxi-3-dimetilamonio; propanos de 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamonio; cloruro de dioctadecil dimetil amonio (DODAC), 1,2-dimiristoiloxipropil 1,3-dimetilhidroxietil amonio (DMRIE) y 2,3-dioleoiloxi-N-[2 (espermina carboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanamio trifluoroacetato (DOSPA). Se prefieren DOTMA, DOTAP, DODAC y DOSPA. El de mayor preferencia es DOTMA.

Además, las nanopartículas descritas en la presente descripción incluyen preferentemente además un lípido neutro en vista de la estabilidad estructural y similares. El lípido neutro puede seleccionarse apropiadamente en vista de la eficiencia de administración del complejo de ácido nucleico-lípido. Los ejemplos de lípidos neutros incluyen, pero no se limitan a, 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC ), diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidil etanolamina, ceramida, esfingoemielina, cefalina, esterol y cerebrósido. Se prefiere DOPE y/o DOPC. El de mayor preferencia es DOPE. En el caso donde un liposoma catiónico incluya tanto un lípido catiónico como un lípido neutro, la relación molar del lípido catiónico al lípido neutro puede determinarse de forma apropiada en vista de la estabilidad del liposoma y similares.

De acuerdo con una modalidad, las nanopartículas descritas en la presente descripción pueden comprender fosfolípidos. Los fosfolípidos pueden ser glicerofosfolípido. Los ejemplos de glicerofosfolípidos incluyen, sin limitarse a ellos, tres tipos de lípidos: (i) fosfolípidos de ion híbrido, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina de yema de huevo, PC derivada de soja en forma natural, forma parcialmente hidrogenada o totalmente hidrogenada, dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) esfingomielina (SM); (ii) fosfolípidos cargados negativamente: que incluyen, por ejemplo, fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG) dipalmipoil Pg , dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); derivados sintéticos en los que el conjugado produce un fosfolípido de ion híbrido cargado negativamente, tal es el caso del metoxi-polietileno, glicol-diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE); y (iii) fosfolípidos catiónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina o esfingomielina de los cuales el fosfomonoéster fue O-metilado para formar los lípidos catiónicos.

La asociación del ácido nucleico con el lípido portador puede ocurrir, por ejemplo, mediante el ácido nucleico que rellena los espacios intersticiales del portador, de manera que el portador atrapa físicamente al ácido nucleico, o mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, o por medio de la adsorción mediante enlaces no específicos. Cualquiera que sea el modo de asociación, el ácido nucleico debe retener sus propiedades terapéuticas, es decir, codificantes.

De acuerdo con la invención, el ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno en una modalidad es el ARN, preferentemente ARNm. El ARN se obtiene preferentemente mediante transcripción in-vitro.

El término "ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, pretende incluir ADN y ARN tal como moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm, producidas de manera recombinante y sintetizadas de manera química. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. El ARN incluye transcritos de ARN in vitro (IVT a Rn , por sus siglas en inglés) o ARN sintético. De acuerdo con la invención, un ácido nucleico es preferentemente un ácido nucleico aislado.

Los ácidos nucleicos pueden comprenderse en un vector. EL término "vector" como se usa en la presente descripción incluye cualquiera de los vectores conocidos por el experto que incluyen vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos tales como el fago lambda, vectores virales tales como vectores de adenovirus o baculovirus, o vectores cromosómicos artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés), cromosomas artificiales de levadura (YAC, por sus siglas en inglés) o cromosomas artificiales P1 (PAC, por sus siglas en inglés). Dichos vectores incluyen vectores de expresión así como también de clonación. Los vectores de expresión comprenden los plásmidos así como también vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se usan generalmente para modificar genéticamente y amplificar un determinado fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.

En el contexto de la presente invención, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y preferentemente está compuesta totalmente o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se relaciona con un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosil. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tales como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante, así como también ARN modificado que difiere del ARN presente de manera natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo, a uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden comprender también nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos que no son de origen natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden referirse como análogos o análogos de ARN de origen natural.

De acuerdo con la presente invención, el término "ARN" incluye y preferentemente se relaciona con "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se relaciona con un "transcrito" que puede producirse mediante el uso de ADN como molde y codifica un péptido o proteína. El ARNm típicamente comprende una región no traducida 5' (5'-UTR), una región que codifica una proteína o péptido y una región no traducida 3' (3'-UTR). El ARNm tiene un tiempo medio limitado en las células e in vitro. Preferentemente, el ARNm se produce mediante transcripción in vitro mediante el uso de un molde de ADN. En una modalidad de la invención, el ARN se obtiene mediante la transcripción in vitro o síntesis química. La metodología de la transcripción in vitro se conoce por el experto. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.

En una modalidad de la presente invención, el ARN es ARN autorreplicante, tal como ARN autorreplicante monocatenario. En una modalidad, el ARN autorreplicante es ARN monocatenario de sentido positivo. En una modalidad, el ARN autorreplicante es ARN viral o ARN derivado de ARN viral. En una modalidad, el ARN autorreplicante es un ARN genómico alfaviral o se deriva de un ARN genómico alfaviral. En una modalidad, el ARN autorreplicante es un vector de expresión de genes virales. En una modalidad, el virus es el virus del bosque Semliki. En una modalidad, el ARN autorreplicante contiene uno o más transgenes, al menos uno de dichos transgenes codifica los agentes descritos en la presente descripción. En una modalidad, si el ARN es ARN viral o derivado de ARN viral, los transgenes pueden reemplazar parcialmente o completamente las secuencias virales tal como las secuencias virales que codifican proteínas estructurales. En una modalidad, el ARN autorreplicante es ARN transcrito in vitro.

Con el fin de aumentar la expresión y/o la estabilidad del ARN usado de acuerdo con la presente invención, este puede modificarse, preferentemente, sin alteración de la secuencia del péptido o la proteína expresados.

El término "modificación", en el contexto del ARN, como se usa de acuerdo con la presente invención, incluye cualquier modificación del ARN que no se presenta naturalmente en dicho ARN.

En una modalidad de la invención, el ARN utilizado de acuerdo con la invención no tiene 5'-trifosfatos sin caperuza. La eliminación de tales 5'-trifosfatos sin caperuza puede lograrse al tratar el ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con la invención puede tener ribonucleótidos modificados de origen natural o sintéticos con el fin de aumentar su estabilidad y/o disminuir su citotoxicidad. Por ejemplo, en una modalidad, en el ARN usado de acuerdo con la invención se sustituye parcialmente o completamente, preferentemente, completamente, la 5-metilcitidina por citidina. Alternativamente o adicionalmente, en una modalidad, en el ARN usado de acuerdo con la invención se sustituye parcialmente o completamente, preferentemente, completamente, la pseudouridina por uridina.

En una modalidad, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una caperuza 5' o un análogo de la caperuza 5'. El término "5'-cap'" se refiere a una estructura de caperuza que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y consiste, generalmente, en un nucleótido de guanosina que se conecta al ARNm a través de un enlace inusual 5' a 5' trifosfato. En una modalidad, esta guanosina se metila en la posición 7. El término "5'-cap convencional" se refiere a una 5'-cap de ARN de origen natural, preferentemente, a la caperuza 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente invención, el término "5'-cap" incluye un análogo de la 5'-cap que se asemeja a la estructura de la caperuza de ARN y se modifica para que posea la capacidad de estabilizar el ARN si se une a este, preferentemente, in vivo y/o en una célula.

Proporcionar un ARN con una 5'-cap o análogo de la 5'-cap puede lograrse mediante la transcripción in vitro de un molde de ADN en presencia de dicha 5'-cap o análogo de la 5'-cap, en donde dicha 5'-cap se incorpora cotranscripcionalmente a la hebra de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante la transcripción in vitro, y la 5'-cap puede unirse al ARN postranscripcionalmente mediante el uso de enzimas que añaden la caperuza, por ejemplo, las enzimas que añaden la caperuza del virus vaccinia.

El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN usado en la presente invención puede ser una extensión o acortamiento de la cola de poli(A) presente de manera natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' tal como la introducción de una UTR que no se relaciona con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, la inserción de una o más, preferentemente dos copias de una UTR 3' derivada de un gen de globina, tal como alfa2 globina, alfa1 globina, betaglobina, preferentemente betaglobina, con mayor preferencia betaglobina humana.

Por lo tanto, con el fin de aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con la presente invención, puede modificarse para que esté presente junto con una secuencia poli A, que tiene preferentemente una longitud de 10 a 500, con mayor preferencia de 30 a 300, aún con mayor preferencia de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una modalidad preferida especialmente la secuencia de poli A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Además, la incorporación de dos o más regiones no traducidas (UTR) 3' en la región no traducida 3' de una molécula de ARN puede resultar en una potenciación de la eficiencia de la traducción. En una modalidad particular la UTR 3' se deriva del gen de la p-globina humana.

El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. "Vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad, o número de moléculas. En el contexto de la presente invención, la vida media de un ARN indica la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influenciar la "duración de la expresión" del ARN. Puede esperarse que el ARN que tiene una vida media larga se expresará por un período de tiempo prolongado.

En el contexto de la presente invención, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en donde el código genético en una secuencia de ADN se transcribe a ARN. Subsecuentemente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente invención, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en donde el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en donde el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferentemente, mediante el uso de extractos celulares apropiados. Preferentemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcriptos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y son abarcados, de acuerdo con la presente invención, por el término "vector".

El término "traducción", de acuerdo con la descripción, se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el que una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o proteína.

Los ácidos nucleicos pueden, de acuerdo con la descripción, presentarse solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En modalidades preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término "homólogo" significa que los ácidos nucleicos también se unen funcionalmente de forma natural y el término "heterólogo" significa que los ácidos nucleicos no están unidos funcionalmente de forma natural.

Un ácido nucleico y una secuencia de control de la expresión se unen "funcionalmente" entre sí, si se enlazan covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o la transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. Si el ácido nucleico debe traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de la expresión funcionalmente unida a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de la expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco en la secuencia codificante o que dicha secuencia codificante no sea capaz de traducirse en la proteína o péptido deseado.

El término "secuencia de control de la expresión" o "elemento de control de la expresión" comprende, de acuerdo con la descripción promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En modalidades particulares de la descripción, pueden regularse las secuencias de control de la expresión. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o el tipo celular, pero generalmente comprende las secuencias 5'-sin transcribir y 5'- y 3'-sin traducir que están involucradas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de caperuza, secuencia CAAT y similares. Más específicamente, las secuencias de control de expresión 5'-sin transcribir comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de la expresión pueden comprender, además, las secuencias potenciadoras o secuencias activadoras corriente arriba.

El término "expresión" se usa, de acuerdo con la descripción, en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o proteínas, por ejemplo, por transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. Comprende además la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable. De acuerdo con la descripción, el término expresión incluye, además, una "expresión aberrante" o "expresión anormal".

"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa de acuerdo con la descripción que la expresión se altera, preferentemente, se aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una cierta proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de la expresión se refiere aun aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 % o al menos 100 %, o más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.

El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa primariamente en la mucosa gástrica, y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en un grado significativo en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en las células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, tal como el testículo, se expresa específicamente en las células de la mucosa gástrica. En algunas modalidades, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente bajo condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejidos u órganos, pero preferentemente en no más de 3 tipos diferentes de tejidos u órganos. En este caso, el antígeno tumoral se expresa entonces específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa bajo condiciones normales, preferentemente, en un grado aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.

De acuerdo con la descripción, el término "ácido nucleico codificante" significa que el ácido nucleico, si se presenta en el ambiente apropiado, preferentemente, dentro de una célula, puede expresarse para producir una proteína o péptido que codifica.

El término "péptido" de acuerdo con la descripción, comprende oligopéptidos y polipéptidos y se refiere a las sustancias que comprenden dos o más, preferentemente 3 o más, preferentemente 4 o más, preferentemente 6 o más, preferentemente 8 o más, preferentemente 9 o más, preferentemente 10 o más, preferentemente 13 o más, preferentemente 16 o más, preferentemente 21 o más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente, a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos", "cadena peptídica" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en la presente descripción.

Como se mencionó anteriormente, las secuencias de aminoácidos de las cadenas peptídicas y los receptores de antígeno descritos en la presente descripción pueden modificarse para así obtener variantes de dichas secuencias de aminoácidos. En consecuencia, la presente descripción incluye variantes de las secuencias de péptidos y proteínas descritas en la presente descripción e incluye variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de dichas secuencias. Las propiedades importantes son retener la unión de un receptor de antígeno a su diana o la transducción de la señal de unión al antígeno a una célula tal como una célula T. En una modalidad, una secuencia o molécula variante es inmunológicamente equivalente a su secuencia o molécula parental.

El término "variante" de acuerdo con la descripción se refiere, en particular, a mutantes, variantes de corte y empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de manera natural. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya relevancia frecuentemente no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico con especies de diferente origen de una secuencia determinada de un ácido nucleico o aminoácido. El término "variante" abarcará cualquiera de las variantes modificadas postraduccionalmente y variantes conformacionales.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico. En el contexto de la presente invención, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferentemente con respecto a los efectos o propiedades de los receptores de antígeno que se usan para terapia.

Los expertos en la técnica apreciarán que en particular las secuencias de las secuencias de CDR, regiones hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a una diana. Por ejemplo, las regiones CDR pueden ser idénticas o altamente homólogas a las regiones de los anticuerpos parenterales. Por "altamente homóloga" se contempla que de 1 a 5, preferentemente, de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones pueden hacerse en las CDR.

Para los propósitos de la presente descripción, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína se denominan también variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque es posible también una inserción aleatoria con el cribado apropiado del producto resultante.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones aminoterminales y/o carboxiterminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos.

Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tales como por la eliminación de 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos. Las deleciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. La preferencia está dada a las modificaciones que están en las posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o péptidos homólogos y/o al reemplazo de aminoácidos con otros que tienen propiedades similares. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteína son cambios conservadores de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio conservador de aminoácidos involucra la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). En ocasiones la fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente de identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de la secuencia de aminoácidos dada será de al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de similitud o de identidad está dado, preferentemente para una región del aminoácido que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consiste en 200 aminoácidos, el grado de similitud o de identidad se da, preferentemente, para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, o aproximadamente 200 aminoácidos, preferentemente, aminoácidos continuos. En modalidades preferidas, el grado de similitud o identidad está dado por la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. El alineamiento para determinar la similitud de secuencia, preferentemente, la identidad de secuencia, puede realizarse con herramientas conocidas en la técnica, preferentemente, mediante el uso del mejor alineamiento de secuencia, por ejemplo, mediante el uso de Align, mediante el uso de configuraciones estándar, preferentemente, EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. "Identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "porcentaje de identidad" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, se obtiene después del mejor alineamiento, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen en forma aleatoria y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente mediante la comparación de estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" con el fin de identificar y comparar las regiones locales con similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede producirse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 85, 2444, o por medio de programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TfAs TA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula mediante la determinación del número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, se divide este número entre el número de posiciones comparadas, y se multiplica el resultado obtenido por 100 de forma que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Las secuencias de aminoácidos homólogas exhiben, de acuerdo con la descripción, al menos un 40 %, en particular al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % y, preferentemente al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de los residuos de aminoácidos.

De acuerdo con la descripción, una variante, fragmento, parte, porción o derivado de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene preferentemente una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado, es decir, que es funcionalmente equivalente.

En una modalidad, una variante, fragmento, parte, porción o derivado de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es funcionalmente equivalente tal como inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado. En una modalidad, la propiedad funcional es la propiedad de unirse al antígeno o transducir la señal de unión dentro de una célula.

El término "derivado" significa de acuerdo con la descripción que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

El término "célula" o "célula huésped" se refiere, preferentemente, a una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no libera sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, organelos, o material genético. Una célula intacta, preferentemente, es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferentemente, dicho término se refiere, de acuerdo con la descripción, a cualquier célula que puede transfectarse con un ácido nucleico exógeno. Preferentemente, la célula cuando se transfecta con un ácido nucleico exógeno y se transfiere a un receptor puede expresar el ácido nucleico en el receptor. El término "célula" incluye células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células de hongos o células de mamíferos. Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gramnegativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas, y cepas bacterianas grampositivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizo saccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris y Pichia methanolicd) y Hansenula. Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, 293 HEK y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibios, células de insectos, células vegetales y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas como tal. Se prefieren particularmente células de mamífero para la transferencia adoptiva, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares tales como células del sistema inmunitario, en particular células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas y células T, células madre tales como células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimales y otros tipos de células. Las células particularmente preferidas para su uso de acuerdo con la descripción son células efectoras inmunitarias o inmunorreactivas, en particular células T.

Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferentemente el péptido o proteína codificada por el ácido nucleico.

El término "expansión clonal" o "expansión" se refiere a un proceso en donde se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente descripción, el término se usa preferentemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferentemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos. El término "cebado" se refiere a un proceso en donde una célula T tiene su primer contacto con su antígeno específico y causa la diferenciación en células T efectoras.

Las moléculas tales como ácidos nucleicos, cadenas peptídicas o receptores de antígeno, o células descritas en la presente descripción pueden ser recombinantes y/o aisladas.

El término "aislado" como se usa en la presente descripción, pretende referirse a una entidad que está sustancialmente libre de otras moléculas tal como otro material celular. El término "aislado" significa preferentemente que la entidad aislada se ha separado de su ambiente natural. Una entidad aislada pueden estar en un estado purificado esencialmente. El término "purificado esencialmente" significa preferentemente que la entidad está esencialmente libre de otras sustancias con las que se asocia en la naturaleza o in vivo.

El término "recombinante", en el contexto de la presente descripción, significa "producido mediante ingeniería genética". Preferentemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante en el contexto de la presente descripción, no es de origen natural.

El término "de origen natural", como se usa en la presente, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, es de origen natural un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (lo que incluye los virus) y que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio.

El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de cualquier otra manera resulta en el rechazo.

El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa endogámica, o sus tejidos.

El término "heterólogo" se usa para describir algo que consiste de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta al sujeto.

Como se usa en la presente descripción "reducir" o "inhibir" significan la capacidad de causar una disminución global, preferentemente de 5 % o mayor, 10 % o mayor, 20 % o mayor, con mayor preferencia de 50 % o mayor, y con la máxima preferencia de 75 % o mayor en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Los términos tales como "aumentar" o "potenciar", preferentemente se refieren a un aumento o potenciación de aproximadamente al menos 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con mayor preferencia al menos 40 %, con mayor preferencia al menos 50 %, aún con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 100 %.

Dado que un receptor de antígeno de la presente descripción puede modificarse genéticamente para dirigirse virtualmente a cualquier antígeno, incluidos los antígenos específicos de la enfermedad, un receptor de antígeno de la presente descripción tiene un amplio uso terapéutico. En consecuencia, la presente descripción está dirigida al uso de un receptor de antígeno de la descripción, sus cadenas peptídicas, los ácidos nucleicos que lo codifican, y otras moléculas relacionadas en métodos terapéuticos y profilácticos. Uno de tales usos es en la producción de células inmunitarias antígeno-específicas, que pueden administrarse a un paciente para prevenir o tratar una enfermedad, enfermedad que se caracteriza por la expresión de uno o más antígenos que pueden unirse a un receptor de antígeno de la descripción. expresado en las células inmunitarias. Preferentemente, la enfermedad es cáncer. Además, un receptor de antígeno de la descripción y las moléculas relacionadas también pueden usarse para la erradicación selectiva de células que expresan un antígeno predeterminado, así como también para la inmunización o vacunación contra una enfermedad en donde se expresa un antígeno predeterminado, cuyo antígeno puede unirse por al menos un sitio de unión al antígeno de un receptor de antígeno de la descripción.

En una modalidad, un método de tratamiento o prevención de una enfermedad comprende la administración a un paciente de una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno de la descripción, en el que al menos un sitio de unión al antígeno del receptor de antígeno puede unirse a un antígeno que está asociado con la enfermedad (por ejemplo, un antígeno viral o tumoral) que se va a tratar o prevenir. En otra modalidad, un método para tratar o prevenir una enfermedad comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de una célula efectora inmunitaria recombinante o una población expandida de dichas células efectoras inmunitarias, cuya célula efectora inmunitaria o población de células expresa de forma recombinante un receptor de antígeno de la descripción, en la que al menos un sitio de unión a antígeno del receptor de antígeno puede unirse a un antígeno que está asociado con la enfermedad que se va a tratar o prevenir. En modalidades preferidas, la enfermedad es cáncer y el antígeno es un antígeno asociado al tumor.

En otra modalidad, la presente descripción proporciona un método para la inmunización o vacunación contra una enfermedad asociada con un antígeno específico o contra un organismo causante de la enfermedad que expresa un antígeno específico, método que comprende la administración a un paciente una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno de la descripción, en el que al menos un sitio de unión al antígeno del receptor de antígeno puede unirse al antígeno específico. En otra modalidad, la presente descripción proporciona un método de inmunización o vacunación contra una enfermedad asociada con un antígeno específico o contra un organismo causante de la enfermedad que expresa un antígeno específico, método que comprende la administración a un paciente de una cantidad efectiva de una célula efectora inmunitaria recombinante o una población expandida de dichas células efectoras inmunitarias, cuya célula efectora inmunitaria o población de células expresan de manera recombinante un receptor de antígeno de la descripción, en el que al menos un sitio de unión al antígeno del receptor de antígeno puede unirse al antígeno específico.

En determinadas modalidades, la población de células efectoras inmunitarias puede ser una población expandida clonalmente. Las células efectoras inmunitarias recombinantes o poblaciones de las mismas proporcionan una función efectora inmunitaria terapéutica o profiláctica de una manera antígeno-específica. Preferentemente, un receptor de antígeno de la descripción se expresa en la superficie celular de la célula efectora inmunitaria.

Las células usadas en relación con los métodos terapéuticos y profilácticos de la presente descripción son preferentemente células efectoras inmunitarias y las células efectoras inmunitarias son preferentemente las células T. En particular, las células usadas en la presente descripción son linfocitos citotóxicos, preferentemente seleccionadas de células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). Tras la activación/estimulación, cada uno de estos linfocitos citotóxicos desencadena la destrucción de las células diana. Por ejemplo, las células T citotóxicas desencadenan la destrucción de las células diana por uno o ambos de los siguientes medios. Primero, tras la activación, las células T liberan citotoxinas tales como perforina, granzimas, y granulisina. La perforina y la granulisina crean poros en la célula diana y las granzimas entran en la célula y desencadenan una cascada de caspasas en el citoplasma que induce a la apoptosis (muerte celular programada) de la célula. Segundo, la apoptosis puede inducirse mediante la interacción de Fas-Fas ligando entre las células T y las células tumorales diana. Los células T y otros linfocitos citotóxicos serán preferentemente células autólogas, aunque pueden usarse células heterólogas o células alogénicas.

En consecuencia, los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas.

Los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse, además, para la inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en la presente descripción.

El término "enfermedad" se refiere a un estado anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una afección médica asociada con signos y síntomas específicos. Una enfermedad puede causarse por factores originalmente de una fuente externa, tal como enfermedad infecciosa, o puede causarse por disfunciones internas, tales como enfermedades autoinmune. En humanos, "enfermedad" se usa a menudo más ampliamente para referirse a cualquier afección que causa dolor, disfunción, sufrimiento, problemas sociales, o la muerte al individuo afectado, o problemas similares para aquellos en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, algunas veces incluye heridas, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, comportamientos anormales, y variaciones atípicas de la estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros propósitos estas pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades usualmente afectan a los individuos no solo físicamente, si no también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de uno de la vida y la personalidad de uno. De acuerdo con la invención, el término "enfermedad" enfermedades infecciosas y enfermedades cancerosa, en particular aquellas formas de cáncer descritas en la presente descripción. Cualquier referencia en la presente descripción a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye la metástasis del cáncer de estas.

Una enfermedad que se va a tratar de acuerdo con la descripción es preferentemente una enfermedad que involucra un antígeno. "Enfermedad que involucra un antígeno", "enfermedad asociada con la expresión o expresión elevada de un antígeno" o expresiones similares significa de acuerdo con la descripción que el antígeno se expresa en células de un tejido u órgano enfermo. La expresión en células de un tejido u órgano enfermo puede aumentarse en comparación al estado en un tejido u órgano sano. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que no se encuentra la expresión en un tejido sano, por ejemplo está reprimida. De acuerdo con la descripción, las enfermedades que involucran un antígeno incluyen las enfermedades infecciosas y las enfermedades cancerosas, en donde el antígeno asociado a la enfermedad es preferentemente un antígeno del agente infeccioso y un antígeno tumoral, respectivamente. Preferentemente una enfermedad que involucra un antígeno preferentemente es una enfermedad que involucra células que expresan un antígeno, preferentemente en la superficie celular.

El término "sano" o "normal" se refiere a estados no patológicos, y preferentemente significa no infectado o no canceroso.

Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren a o describen el estado fisiológico en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer óseo, cáncer sanguíneo, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer uterino, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la vejiga, cáncer de los riñones, carcinoma celular renal, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma pituitario. El término "cáncer" de acuerdo con la descripción comprende además las metástasis del cáncer. Preferentemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por células que expresan un antígeno tumoral y una célula cancerosa que expresa un antígeno tumoral.

En una modalidad, una enfermedad cancerosa es una enfermedad maligna que se caracteriza por las propiedades de anaplasia, invasividad y metástasis. Un tumor maligno puede contrastarse con un tumor benigno no canceroso en que una malignidad no es autolimitada en su crecimiento, puede invadir los tejidos adyacentes y puede ser capaz de diseminarse a tejidos distantes (metastatizar), mientras que un tumor benigno no tiene ninguna de esas propiedades.

De acuerdo con la descripción, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una inflamación o lesión que se forma por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida y descontrolada y continúa su crecimiento después de que cesa el estímulo que inició el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una pérdida parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser ya sea benigna, premaligna o maligna.

De acuerdo con la descripción, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluidas las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.

"Adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido es parte, además, de una categoría de tejido más grande conocido como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y los órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente a partir de ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, las células no necesitan necesariamente formar parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, que incluye los seres humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los pobremente diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, siempre que exista una función exocrina para la célula, se considera glandular y su forma maligna se denomina, por lo tanto, adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, frecuentemente, con tiempo suficiente hacen metástasis. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrial.

El linfoma y la leucemia son neoplasias derivadas de células hematopoyéticas (formadoras de sangre).

El tumor blástico o blastoma es un tumor (generalmente maligno) que se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en los niños.

Por "metástasis" se entiende la propagación de las células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales del endotelio para entrar en la cavidad y en los vasos del cuerpo, y después, tras haberse transportado por la sangre, la infiltración en los órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio diana depende de la angiogénesis. A menudo la metástasis del tumor ocurre incluso después de la remoción del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la descripción se relaciona con "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que está remoto del tumor primario y del sistema de nódulos linfáticos regional. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la descripción se relaciona con la metástasis en ganglios linfáticos.

Una recaída o recurrencia se produce cuando una persona se ve afectada nuevamente por una afección que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y desarrolla nuevamente dicha enfermedad, dicha enfermedad recientemente desarrollada puede considerarse una recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la descripción, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede, pero no necesariamente, producirse en el sitio de la enfermedad tumoral original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor incluye, además, situaciones en donde un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como también en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse mediante la presente invención son causadas por agentes infecciosos que incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, protozoos, helmintos y parásitos.

Los virus infecciosos tanto de vertebrados humanos como no humanos, incluyen retrovirus, virus de ARN y virus de ADN. Los ejemplos de virus que se han encontrado en los humanos incluyen pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1 (también denominados como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-III; y otros aislados, tales como VIH-LP; Picornaviridae (porejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humano, rinovirus, echovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio); Ortomixoviridae (por ejemplo, virus de la influenza); Bunyaviridae (por ejemplo, Virus Hanta, virus bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbiviurses y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple 1 y 2 (HSV, por sus siglas en inglés), virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxyiridae (virus variólico, virus vaccinia, virus de la viruela); y Iridoviridae (por ejemplo, virus de la peste porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (se cree que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A, no B (clase 1=transmisión interna; clase 2=transmisión parenteral (es decir, Hepatitis C); Norwalk y virus relacionados y astrovirus).

Los retrovirus que se contemplan incluyen tanto retrovirus simples como retrovirus complejos. Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de los lentivirus, virus de leucemia de células T y los virus espumosos. Los lentivirus incluyen VIH-1, pero también incluyen VIH-2, VIS, virus Visna, virus de inmunodeficiencia felina (VIF), y virus de la anemia infecciosa equina (VAIE). Los virus de leucemia de células T incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de leucemia de células T de simio (STLV, por sus siglas en inglés) y virus de leucemia bovina (BLV, por sus siglas en inglés). Los virus espumosos incluyen el virus espumoso humano (HFV, por sus siglas en inglés), el virus espumoso de simio (SFV, por sus siglas en inglés) y el virus espumoso bovino (BFV, por sus siglas en inglés).

Las infecciones o enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse por la presente descripción son causadas por bacterias que incluyen, pero no se limitan a, bacterias que tienen una etapa intracelular en su ciclo de vida, tales como micobacterias (por ejemplo, Mycobacteria tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. leprae, o M. africanum), rickettsia, micoplasma, clamidia y legionella. Otros ejemplos de infecciones bacterianas contempladas incluyen pero no se limitan a infecciones causadas por bacilos Gram positivos (por ejemplo, Listeria, Bacillus tales como Bacillus anthracis, especies de Erysipelothrix), bacilo Gram negativos (por ejemplo, especies de Bartonella, Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Hemophilus, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Vibrio, y Yersinia), bacterias espiroquetas (por ejemplo, especies de Borrelia incluyendo Borrelia burgdorferi que causa la enfermedad de Lyme), bacterias anaeróbicas (por ejemplo, especies de Actinomyces y Clostridium), bacterias cocales Gram positivas y negativas, especies de Enterococcus, especies de Estreptococo, especies de Neumococo, especies de Estafilococo, especies de Neisseria. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen pero no se limitan a: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptococo del grupo A), Streptococcus agalactiae (Estreptococo del grupo B), Streptococcus viridans, Streptococcus aecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneunmoniae, Pasteurella multocida, Fusobacterium nucleatuin, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia y Actinoyyces israelli.

Las enfermedades fúngicas que pueden tratarse o prevenirse mediante la presente descripción incluyen pero no se limitan a aspergilosis, criptococosis, esporotricosis, coccidioidomicosis, paracoccidioidomicosis, histoplasmosis, blastomicosis, cigomicosis, y candidiasis.

Las enfermedades parasitarias que pueden tratarse o prevenirse mediante la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, amebiasis, malaria, leishmania, coccidia, giardiasis, criptosporidiosis, toxoplasmosis y tripanosomiasis. También abarca las infecciones por diversos gusanos, tales como, pero sin limitarse a, ascariasis, anquilostomiasis, tricuriasis, estrongiloidiasis, toxocariasis, triquinosis, oncocercosis, filaria, y dirofilariasis. También abarca las infecciones por diversos trematodos, tales como pero sin limitarse a, esquistosomiasis, paragonimiasis, y clonorquiasis.

El término "tratamiento" o "tratamiento terapéutico" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la esperanza de vida de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o enlentecer el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o enlentecer el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo, y/o disminuir la recurrencia en un individuo quien actualmente tiene o quien previamente tuvo una enfermedad.

Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refieren a cualquier tratamiento que pretende prevenir la aparición de una enfermedad en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se usan en la presente descripción indistintamente.

Los términos "individuo" y "sujeto" se usan indistintamente en la presente descripción. Se refieren a seres humanos, primates no humanos u otros mamíferos (por ejemplo ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, porcino, oveja, caballo o primate) que pueden afectarse con o son susceptibles a una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) pero pueden o no pueden tener la enfermedad o el trastorno. En muchas modalidades, el individuo es un ser humano. A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos "individuo" y "sujeto" no indican una edad particular, y por tanto abarcan adultos, ancianos, niños, y recién nacidos. En modalidades preferidas de la presente descripción, el "individuo" o "sujeto" es un "paciente". El término "paciente" significa de acuerdo con la descripción un sujeto para el tratamiento, en particular un sujeto enfermo.

Por "que está en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica que tiene una posibilidad mayor de la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen o han tenido un cáncertienen, además, un riesgo aumentado de metástasis de cáncer.

El término "inmunoterapia" se relaciona con un tratamiento que involucra una reacción o respuesta inmunitaria específica.

En el contexto de la presente descripción, términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención o al tratamiento, o ambos, de la aparición y/o propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, para minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o para retardar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor.

Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de un agente o composición de la descripción, preferentemente, protege al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de un agente o composición de la descripción, puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción de la progresión de la enfermedad, que conduce, preferentemente, a la eliminación de la enfermedad.

La inmunoterapia puede realizarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes proporcionados en la presente descripción funcionan preferentemente para eliminar las células que expresan el antígeno de un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado de potenciar o inducir una respuesta inmunitaria en un paciente específica para el antígeno o una célula que expresa el antígeno.

El término "inmunización" o "vacunación" describe el proceso para tratar a un sujeto con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria por razones terapéuticas o profilácticas.

El término "in vivo" se relaciona con la situación en un sujeto.

Los receptores de antígeno, cadenas peptídicas, ácidos nucleicos, células recombinantes, células efectoras inmunitarias, preferentemente células T, de la descripción, así como también otros compuestos y agentes descritos en la presente descripción, pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción son, preferentemente, estériles y contienen una cantidad efectiva de los agentes descritos en la presente descripción y opcionalmente de agentes adicionales como se analiza en la presente descripción para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas se proporcionan usualmente en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse en una forma conocida per se. Una composición farmacéutica puede estar por ejemplo en la forma de una solución o una suspensión.

Una composición farmacéutica puede comprender sales, sustancias tamponantes, conservantes, portadores, diluyentes y/o excipientes todos los cuales son preferentemente farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las sales que no son farmacéuticamente aceptables pueden usarse para preparar sales farmacéuticamente aceptables y se incluyen en la descripción. Las sales farmacéuticamente aceptables de este tipo comprenden de manera no limitante, aquellas preparadas a partir de los ácidos siguientes: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse también como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Las sustancias tampón adecuadas para usar en una composición farmacéutica incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Los conservantes adecuados para usar en una composición farmacéutica incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.

Una formulación inyectable puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como lactato de Ringer.

El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de una naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina con el fin de facilitar, potenciar o habilitar la aplicación. De acuerdo con la descripción, el término "portador" incluye, además, uno o más agentes de relleno sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias de encapsulación, que son adecuadas para la administración a un paciente.

Las sustancias portadoras posibles para la administración parenteral son por ejemplo agua estéril, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro de sodio estéril, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros biocompatibles de lactida, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.

El término "excipiente" cuando se usa en la presente descripción pretende indicar todas las sustancias que pueden estar presentes en una composición farmacéutica y que no son ingredientes activos tales como, por ejemplo, portadores, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes activos de superficie, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse por cualquier vía convencional, tal como por administración parenteral que incluye por inyección o infusión. La administración es preferentemente parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden usualmente una preparación acuosa o no acuosa estéril del componente activo, que es, preferentemente, isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, se usan aceites fijados, usualmente estériles, como solución o medio de suspensión.

Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción se administran en cantidades efectivas. Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se relaciona, preferentemente, con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección puede ser también un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha afección.

Una cantidad efectiva de un agente o composición descrito en la presente descripción dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, que incluyen la edad, el estado fisiológico, la talla y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si se presenta), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis administradas de los agentes descritos en la presente descripción pueden depender de varios de tales parámetros. En el caso que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial pueden usarse dosis más altas (o dosis efectivamente más altas alcanzadas por una vía de administración diferente, más localizada).

Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse a los pacientes, por ejemplo, in vivo, para tratar o prevenir una variedad de trastornos tales como aquellos descritos en la presente descripción. Los pacientes que se prefieren incluyen pacientes humanos que tienen trastornos que pueden corregirse o mejorarse mediante la administración de los agentes y composiciones descritas en la presente descripción. Esto incluye trastornos que involucran las células caracterizadas por la expresión de un antígeno.

Por ejemplo, en una modalidad, los agentes descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar un paciente con una enfermedad cancerosa, por ejemplo, una enfermedad cancerosa tal como se describe en la presente descripción caracterizada por la presencia de células cancerosas que expresan un antígeno.

Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos de acuerdo con la descripción pueden usarse también para la inmunización o la vacunación para prevenir una enfermedad descrita en la presente descripción.

La composición farmacéutica de la descripción puede administrarse junto con sustancias suplementarias que potencian la inmunidad tales como uno o más adyuvantes y pueden comprender uno o más sustancias que potencian la inmunidad para aumentar además su efectividad, preferentemente para lograr un efecto sinérgico de inmunoestimulación. El término "adyuvante" se refiere a los compuestos que prolongan o potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. Con respecto a esto, son posibles diversos mecanismos, en dependencia de los diversos tipos de adyuvantes. Por ejemplo, los compuestos que permiten la maduración del DC, por ejemplo lipopolisacáridos o ligando CD40, forman una primera clase de adyuvantes adecuados. Generalmente, cualquier agente que influya en el sistema inmunitario del tipo de una "señal de peligro" (LPS, GP96, ARNdc, etc.) o citocinas, tales como GM-CSF, pueden usarse como un adyuvante que activa una respuesta inmunitaria para intensificarla y/o influenciarla de una manera controlada. Los oligodesoxinucleótidos CpG pueden además usarse opcionalmente en este contexto, aunque deben considerarse sus efecto secundarios que se presentan bajo ciertas circunstancias, como se explicó antes. Particularmente los adyuvantes que se prefieren son las citocinas, tal como monocinas, limfocinas, interleucinas o quimocinas, por ejemplo IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFa, INF-y, GM-CSF, LT-a, o factores de crecimiento, por ejemplo hGH. Otros adyuvantes conocidos son hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o aceite tal como Montanide®, de mayor preferencia Montanide® ISA51. Los lipopéptidos, tales como Pam3Cys, también son adecuados para usar como adyuvantes en la composición farmacéutica de la presente descripción.

La composición farmacéutica puede administrarse localmente o sistémicamente, preferentemente sistémicamente.

El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente de manera que el agente se distribuya ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolle un efecto deseado. Por ejemplo, el agente puede desarrollar su efecto deseado en la sangre y/o alcanza su sitio de acción deseado a través del sistema vascular. Las rutas de administración sistémicas típicas incluyen la administración mediante la introducción del agente directamente en el sistema vascular o la administración oral, pulmonar, o intramuscular en donde el agente se adsorbe, entra al sistema vascular, y se transporta a uno o más sitio(s) de acción deseado(s) a través de la sangre.

De acuerdo con la presente descripción, se prefiere que la administración sistémica sea mediante la administración parenteral. El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente de manera que el agente no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a estas.

La administración también puede llevarse a cabo, por ejemplo, por vía oral, intraperitoneal o intramuscular.

Los agentes y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

La presente descripción se describe en detalle mediante las figuras y los ejemplos más abajo, que se usan solo para propósitos ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, las modalidades adicionales que se incluyen igualmente en la descripción son accesibles para el trabajador experto.

Figuras

La Figura 1 comprende una presentación esquemática de todas las construcciones del receptor de células T (TCR) y del receptor de antígeno quimérico (CAR) usadas en los experimentos. A) y B) Un TCR está compuesto por una proteína de membrana heterodimérica de clase I, cada cadena comprende un dominio C invariante y un dominio V variable, este último reconoce específicamente el péptido procesado de una manera restringida por MHC. La homología de secuencia y estructura de un TCR murino (Mu, A) y humano (Hu, B) es bastante alta. El TCR murino reconoce un antígeno tumoral humano que se origina a partir de la proteína de unión estrecha Claudina 6, mientras que el TCR humano reconoce un antígeno tumoral derivado a partir del antígeno de diferenciación de melanocitos gp100. C) Un CAR monovalente de cadena única comprende un fragmento Fv de cadena única (sc) enganchado aun dominio Cp murino y un dominio Ca del TCR autónomo, precedido por un péptido señal para su exportación a la membrana celular. Opcionalmente, puede aprovecharse con un enlace disulfuro artificial entre los dominios C del TCR para mejorar la expresión en la superficie celular y la función de este CAR. Los fragmentos scFv en este y todas las construcciones ilustrativas siguientes están dirigidos contra la Claudina 6. D) Un scCAR C16 clásico comprende un homodímero cada uno de los cuales se alinea con un fragmento scFv, una región de bisagra del anticuerpo, los dominios CH2CH3 como región espaciadora, la membrana celular y los dominios de señalización intracelular de la molécula coestimuladora CD28 y CD3Z, respectivamente. La homodimerización conduce a un reconocimiento bivalente del antígeno, cada cadena se une a un solo antígeno (es decir, intracatenaria). E) Un prototipo del CAR combinatorio lleva dominios V relacionados con el alelo conectados en serie (es decir VH-VH o VL-VL) y enganchados ya sea a Ca o Cp del TCR, respectivamente. El reconocimiento requiere la unión del antígeno a través de ambas cadenas de modo combinatorio (es decir, intercatenaria) y bivalente. F) Un TCR-CAR C16 heterodimérico que lleva fragmentos scFv ya sea en TCRa gp100 o TCRp de longitud completa que reconoce el antígeno afín de una manera bivalente, pero no combinatoria. G) Con el fin de eliminar el reconocimiento residual del péptido afín gp100 (280-288) por el resto de TCR gp100 del TCR-CAR C16 (F) no combinatorio, se introduce una mutación puntual de 'silenciamiento' (sil) S109Q (de acuerdo con la nomenclatura IMGT) en el lazo CDR3 del TCRa (silCDR3a). H) Se genera un TCR-CAR C16 combinatorio mediante la conexión de los dominios V relacionados con el alelo en serie ya sea en una cadena TCRa gp100 de longitud completa o una cadena TCRp de longitud completa, respectivamente, como se describe en E). Un TCR de longitud completa usado aquí como compañero de fusión puede proporcionar una mejor señalización fisiológica de células T que un TCR truncado que comprende simplemente los dominios C del TCR en su lugar (E). I) Con el fin de eliminar el reconocimiento residual del péptido afín gp100 (280-288) mediante el resto TCR gp100 del TCR-CAR C16 (H) combinatorio, se introduce una mutación puntual de 'silenciamiento' (sil) S109Q (en consecuencia con la nomenclatura IMGT) en el lazo CDR3 del TCRa (silCDR3a) como en G).

La Figura 2A/B muestra la expresión de Claudina 6 en APC y diferentes CAR en células T humanas, respectivamente, antes de la configuración de un cocultivo. A) Las células dendríticas inmaduras (iDC) se sometieron a electroporación con cantidades crecientes del antígeno de longitud completa afín a la Claudina 6, o una única dosis alta del antígeno irrelevante gp100. En este caso, se pudo observar en la citometría de flujo un cambio masivo de la expresión de Cl6 dependiente de la dosis, lo que indica que las iDC de este donante son altamente permisivas para la captación de ARN celular, la traducción de proteínas y la exportación a la superficie celular. La alta expresión de CD86 indica una fuerte diferenciación de monocitos en iDC presentadoras de antígenos favorablemente. B) Las células T CD8 preactivadas se sometieron a electroporación con diferentes ARN que codifican CAR y se evaluó la expresión de CAR en citometría de flujo. Todos los CAR excepto el monovalente y el scCAR clásico, se recuperaron moderadamente en la tinción antiidiotípica. El CAR monovalente fue el que menos se expresó mientras que el scCAR clásico fue el mejor. La Figura 2C muestra la eficiencia de las células T humanas reprogramadas con CAR Cl6 en el reconocimiento de las iDC que expresan Claudina 6 después de la configuración del cocultivo de APC/células T en un ELISA de IFNy. Las células T electroporadas con CAR se cocultivaron durante la noche con APC electroporadas con Cl6 como se explica en 2A/B en una relación E:T (relación de células efectoras a diana) de 10:1. En todo el intervalo de titulación de C16 todos los CAR obtuvieron un valor óptimo a dosis más bajas de C16 (0,02 ug). A una alta expresión de Claudina 6, el scCAR C16 clásico demostró la mejor secreción de IFNy en relación con todos los otros CAR mientras que a la dosis más baja de C16 los CAR combinatorios tendieron a ser algo mejores que el scCAR clásico. En conclusión, los CAR combinatorios alcanzaron al CAR clásico en sus eficiencias funcionales de alta a baja expresión de antígeno: Produjeron cantidades muy altas de IFNy hasta 20-30 000 pg/ml de IFNy para los CAR combinatorios y scCAR C16, respectivamente, yterminaron con 12-15000 pg/ml de IFNy para todas las construcciones a la dosis más baja de C16. A esta dosis, el c A r Ca/Cp intercombinatorio resultó ser la más eficiente.

La Figura 3A/B muestra la expresión de Claudina 6 en APC y diferentes CAR en células T humanas, respectivamente, antes de la configuración de un cocultivo. A) Las células dendríticas inmaduras (iDC) se sometieron a electroporación con cantidades crecientes del antígeno de longitud completa afín a la Claudina 6. Aquí, solo se pudo observar en la citometría de flujo un cambio fraccional dependiente de la dosis de la expresión de Cl6, lo que indica que las iDC de este donante son mucho menos permisivas para la captación de ARN celular, la traducción de proteínas y la exportación a la superficie celular. La alta expresión de CD86 indica una fuerte diferenciación de monocitos en iDC presentadoras de antígenos favorablemente. B) Las células T CD8 preactivadas se sometieron a electroporación con diferentes ARN que codifican CAR y se evaluó la expresión de CAR en citometría de flujo. Todos los CAR excepto el monovalente y el scCAR clásico, solo se recuperaron algo en la tinción antiidiotipo, lo que indica nuevamente que las células de este donante son menos permisivas para la captación y procesamiento de ARN. Sin embargo, las iDC con escasa presentación de antígeno pueden representar una situación de APC mínimamente positivas para antígenos tumorales, ya que esto puede imitar la situación de las variantes de escape tumorales clonales tempranos o la presentación mínima de antígenos tumorales. La Figura 3C muestra la eficiencia de las células T humanas reprogramadas con CAR Cl6 en el reconocimiento de las iDC que expresan Claudina 6 después de la configuración del cocultivo de APC/células T en un ELISA de IFNy. Las células T electroporadas con CAR se cocultivaron durante la noche con APC electroporadas con Cl6 como se explica en 3A/B en una relación E:T de 10:1. En todo el intervalo de titulación de C16 todos los CAR obtuvieron un valor óptimo a dosis más bajas de C16 (0,2 ug). Debido a la expresión absoluta mínima de Claudina 6 como se explicó anteriormente, los CAR C l6 combinatorios demostraron la mejor secreción de IFNy en relación con el scCAR C16 clásico para todas las dosis, una tendencia que fue aún más pronunciada con la dosis más baja de C16 electroporado. En conclusión, para pequeñas cantidades de antígeno los CAR combinatorios fueron incluso mejores que el scCAR Cl6 clásico con respecto a la secreción de IFNy. Las cantidades totales de IFNy secretado cayeron por debajo de 1000 pg/ml para todo el intervalo de titulación debido a una expresión muy baja de antígeno, y también a los c A r .

La Figura 4 representa la eficiencia de las células T humanas reprogramadas con TCR gp100-CAR Cl6 para reconocer las iDC que expresan Claudina 6 o las iDC cargadas con péptido gp100 después de la configuración de HLA-A2,1 del cocultivo de APC/células T en un ELISA de IFNy. Las células T electroporadas con CAR se cocultivaron durante la noche con APC electroporadas con Cl6 o iDC cargadas con péptido gpl00(280-288) en una relación E:T de 5:1. El objetivo final de este experimento fue verificar si en primer lugar (A) los TCR-CAR combinatorios bivalentes eran más eficientes en la secreción de IFNy que los TCR-CAR no combinatorios bivalentes y en segundo lugar (B), hasta qué punto aún reconocen el péptido gp100 de la cadena principal del TCR gp100 usado aquí. Se intentó eliminar la unión del antígeno residual mediante una mutación de "silenciamiento" S109Q en la CDR3 del TCRa gp100. TCR C16 y TCR gp100 sirvieron como controles positivos para el reconocimiento de antígenos afines. A) Los TCR-CAR combinatorios, independientemente de que estuvieran silenciados en CDR3a o no, resultaron ser más funcionales que los CAR no combinatorios, particularmente a la dosis más baja de antígeno. B) El TCR-CAR C16 no combinatorio no silenciado todavía reconocía el gp100 en 10'6 M de péptido. La introducción de la mutación S109Q abolió la secreción de IFNy en absoluto. Para los TCR-CAR C16 combinatorios no se observó secreción de citocina en absoluto, independientemente de estar funcionalmente silenciados o no. Es muy probable, que la unión intercatenaria de los dominios VH-VH y VL-VL conectados en serie en cualquier cadena previene estéricamente la unión del péptido gp100, presentado de una manera restringida por HLA-A2,1 en las APC.

La Figura 5 ilustra la capacidad de proliferación de diferentes CAR Cl6 tras el encuentro del antígeno con las iDC que expresan Cl6 después de la configuración de un cocultivo de APC/células T. Las células T electroporadas con CAR se cocultivaron durante 5 días con APC electroporadas con Cl6 y tituladas en una relación E:T de 10:1. Las células T se tiñeron previamente con éster carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) para cuantificar la dilución de CFSE mediante divisiones celulares y por lo tanto, el número y la frecuencia de las poblaciones hijas resultantes se indican en la derecha de cada gráfico de densidad en la citometría de flujo. A) Los CAR de unión a antígeno de forma monovalente exhibieron la proliferación más débil mientras que los TCR-CAR combinatorios y los CAR clásicos mostraron un patrón de proliferación muy similar. B) El Gráfico de barras para las frecuencias de las poblaciones de células T que se muestran en A). Una alta frecuencia de células T equipadas con el CAR monovalente no proliferaron (40-60 %) mientras que la frecuencia de células T en no proliferación para los TCR-CAR combinatorios y el CAR clásico estuvo aproximadamente en el intervalo de 10-20 %. La proliferación de células T que llevan el CAR C16 clásico fue la más alta en dosis altas (C160,2 |jg) de antígeno (90 % frente al 80 % para los TCR-CAR combinatorios), mientras que en la dosis más baja (0,002 jg ) los TCR-CAR combinatorios fueron al menos tan potentes como el CAR clásico (casi el 80 %). En conclusión, los TCR-CAR combinatorios alcanzaron nuevamente al CAR clásico en sus eficiencias funcionales, aquí en términos de proliferación de células T, desde dosis altas a muy bajas de antígeno. Existe una tendencia hacia ser incluso más efectivo que el CAR clásico.

La Figura 6 provoca la regulación positiva del biomarcador coestimulador CD27 en células T hijas electroporadas con los TCR-CAR Cl6 combinatorios después de la configuración de un cocultivo de APC/células T. Las células T electroporadas con CAR se cocultivaron durante 6 días con iDC electroporadas con Cl6 en una relación E:T de 3:1. Las células T se tiñeron previamente con CPD-450 para cuantificar la dilución de este fluoróforo por divisiones celulares y por lo tanto, el número y la frecuencia de las poblaciones hijas resultantes se indican en la izquierda de los histogramas en la citometría de flujo. Las células T se tiñeron con un anticuerpo específico de CD8 para ejemplificar la regulación positiva moderada e igual de este marcador de correceptor para los CAR combinatorios y clásico. Paralelamente, se tiñeron con un anticuerpo específico para la molécula coestimuladora CD27 para estimar su regulación en poblaciones parentales/hijas de G0-G6 para todos los CAR. Aunque ambos marcadores se regularon positivamente aproximadamente 2 veces y adicionalmente, la expresión media de CD8 fue la misma para todos los CAR, la expresión media de CD27 fue mucho más alta para los c A r combinatorios, y en particular para los TCR-CAR C16 intercombinatorios, que el CAR clásico. El CD27, un biomarcador de la persistencia a largo plazo de las células T in vivo, alcanzó una meseta mucho más alta para las células T con proliferación débil (G2-G4) antes de que los niveles de expresión cayeran a niveles basales en G6.

EJEMPLOS

Las técnicas y métodos usados en la presente descripción se llevan a cabo de la forma conocida per se y como se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Todos los métodos, incluido el uso de estuches y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante a menos que se indique específicamente.

Ejemplo 1: Análisis de expresión de Claudina 6 en las iDC y receptores de antígeno en células T mediante citometría de flujo.

El ARN para las diferentes construcciones se preparó a partir de la transcripción in vitro (ivt-ARN) de marcos abiertos de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) clonados en el vector de ARN pST1 que lleva un promotor T7 en su secuencia principal 5' y una cola poliA optimizada en su cola 3'. La expresión de Claudina 6 en células dendríticas inmaduras humanas se evaluó un día después de la electroporación de ARN (2-0,002 |jg, 300 V, 12 ms, 1 pulso) en monocitos CD14+ tratados con GM-CSF/IL-4 a partir de una capa leucocitaria mediante el uso de un anticuerpo específico a Claudina 6 marcado con el fluoróforo Dylight-650. La expresión de diversas construcciones de receptores de antígeno en células T humanas autólogas se evaluó un día después de la electroporación de ARN (en total 10-30 jg para ambas cadenas, 495 V, 9 ms, 1 pulso) en células T CD8+ preactivadas con OKT3 (anticuerpo monoclonal murino anti CD3e) mediante el uso de un anticuerpo específico de idiotipo scFv C16 marcado con el fluoróforo Dylight-649. La descripción detallada para la preparación de iDC y células T humanas se da en el ejemplo 2. Las construcciones de CAR sometidas a prueba para la expresión fueron (i) el TCR C16 del receptor de células T murino; (ii) TCR gp100 humano; (iii) CAR C16 monovalente no combinatorio; (iv) scCAR clásico) (bivalente); (v) CAR C16 inter-combinatorio fusionado a los dominios Ca/p del TCR humano (bivalentes); (vi) CAR C16 no combinatorio fusionado a TCR gp100 de longitud completa (280-288) (bivalente); (vii) un CAR C16 no combinatorio correspondiente silenciado adicionalmente en la CDR3 del TCRa gp100 para eliminar el reconocimiento de péptidos (bivalente); (viii) CAR C16 inter-combinatorio fusionado a TCR gp100 de longitud completa (280-288) (bivalente) y (ix) un CAR C16 combinatorio correspondiente silenciado adicionalmente en la CDR3 del TCRa gp100 para eliminar el reconocimiento de péptidos (bivalente). Las diferentes construcciones de receptores de antígeno se ilustran esquemáticamente en las Figuras 1A-I. La tinción de las células se realizó de forma rutinaria durante 0,2x106 células en tampón de citometría de flujo durante 20 min a 4 °C, lavadas y fijadas con tampón de citometría de flujo que contiene paraformaldehído al 1 %. Los datos en la Figura 2A muestran la expresión titulada de Claudina 6. Aquí, las iDC de este donante fueron altamente permisivas para el ARN C16 y demostraron un cambio masivo de la expresión de Claudina 6 con cantidades crecientes del ARN electroporado. La expresión de CD86 indicó la diferenciación satisfactoria de los monocitos en iDC presentadoras de antígenos potentes. La figura 2B muestra la expresión de los diferentes CAR usados en este experimento en células T humanas seleccionadas positivamente para CD8 humanas. El scCAR C16 clásico demostró la expresión más alta, debido presumiblemente a su expresión independiente de CD3 endógena en la superficie de las células T. Los CAR combinatorios revelaron una expresión ligeramente mejor que el CAR monovalente, este último que sirvió como un "control débil" debido a su modo de acción de unión al antígeno solo monovalente.

Los datos en la Figura 3A muestran la expresión titulada de Claudina 6 en un experimento independiente. Aquí, las iDC de este donante eran poco permisivas para el ARN de C16 y demostraron un solo cambio fraccional de la expresión de Claudina 6 con cantidades crecientes del ARN electroporado. Pero la expresión de CD86 indicó la diferenciación exitosa de los monocitos en iDC presentadoras de antígenos potentes. La figura 3B muestra la expresión de los diferentes CAR usados en este experimento en células T humanas seleccionadas positivamente para CD8 humanas. Dado que las células T humanas se derivaron a partir del mismo donante que los monocitos diferenciados en un entorno autólogo, las células T también resultaron ser poco permisivas para el ARN electroporado y produjeron solo una expresión más débil para los CAR que en el experimento que se muestra en la Figura 2b . Sin embargo, el scCAR C16 clásico demostró de nuevo la expresión más alta por la misma razón que se describió anteriormente. En línea con las observaciones anteriores, los CAR combinatorios revelaron una expresión ligeramente mejor que el CAR monovalente. Dado que el orden de expresión de CAR se conserva en comparación con el experimento descrito en la Figura 2A/B, este experimento es adecuado para estudiar la potencia de diferentes CAR en el caso de solo cantidades mínimas de expresión de C16 en células presentadoras de antígenos (APC).

Ejemplo 2: Ensayo de secreción de IFN-y titulado con antígeno

El día 1 del experimento, se aislaron células mononucleares de sangre periférica frescas ("PBMC") a partir de una capa leucocitaria de un donante sano. A partir de % de PBMC, se aislaron células CD14+ mediante el uso de clasificación de MACS. El flujo a través de las MACS y las PBMC residuales se clasificaron luego con MACS para las células T CD8+. Las células CD14+ se diferenciaron hacia células dendríticas inmaduras ("iDC") mediante la administración de IL-4 y GM-CSF (1000 U/ml) los días 1,3, 6. Las células T CD8+ se transfirieron a placas de 6 pocillos revestidas con OKT3. El día 3, las células T se transfirieron a nuevas placas de 6 pocillos. El día 7, las iDC se sometieron a electroporación con ARN-ivt C16 e irrelevante dependiente de la dosis en el intervalo de 2 - 0,002 jg de ARN. Las células T activadas con OKT3 se sometieron a electroporación el mismo día con los controles, o las construcciones de receptores de antígeno como se indica en las figuras individuales y como se describe en el Ejemplo 1. Para garantizar la calidad, la expresión de C16 en las iDC y la expresión de la superficie del receptor de antígeno en las células T se analizó el día 8 con anticuerpos específicos marcados con fluorescencia como se explicó antes. Las células T electroporadas y las iDC electroporadas con antígeno se cocultivaron posteriormente en una placa de 96 pocillos durante 20h en una relación E:T de 3:1 -10:1 por duplicado. Rutinariamente, 2,5x104 de iDC se sembraron y cocultivaron con 7,5x104 - 2,5x105 de células T electroporadas con CAR en un volumen de 200 pl de medio de células T. El día 9, se tomaron diferentes cantidades de sobrenadantes de cultivo (10-50 pl) y se analizaron para determinar la cantidad de IFNy secretado en un ELISA tipo sándwich mediante el uso del kit IFN-y Ready Set Go! de eBioscience (#88-7316-88). La absorbancia se detectó mediante el uso de un lector de ELISA Tecan Sunrise.

La Figura 2C ilustra las cantidades de IFNy secretado por las iDC y las células T del mismo donante que fueron altamente permisivas para la electroporación del ARN y en consecuencia, condujeron a una expresión masiva dependiente de la dosis de Cl6 en las iDC y una alta expresión de CAR en las células T ( Figura 2A/B). Todas los CAR de las células T exhibieron su máximo en la secreción de IFNy a 0,02 pg de ARN C16 electroporado lo que resultó en hasta 30 000 pg/ml de IFNy para el scCAR clásico y 20000 pg/ml para los CAR combinatorios ya sea fusionados con el TCR Ca/p o completos con el TCR gp100 de longitud completa. Como se estimó, las células T modificadas con CAR monovalentes resultaron ser las células efectoras más débiles. Curiosamente, a un nivel alto de electroporación de C16 los CAR combinatorios mostraron solo aproximadamente el 50 % de reactividad de la del scCAR C16 clásico, que aumentó al 70 % a la dosis óptima de 0,02 pg de C16 electroporado. Es importante destacar que, a la dosis más baja de C16 evaluada aquí, 0,002 pg de ARN, los CAR combinatorios fueron tan eficientes como el scCAR C16 clásico, o en el caso del CAR combinatorio fusionado al TCR Ca/p, incluso mejor. A este nivel muy bajo de presencia masiva de C16, los CAR combinatorios todavía eran capaces de secretar altas cantidades de IFNy en el intervalo de 10000 pg/ml.

La Figura 3C ejemplifica las cantidades de IFNy secretado para las iDC y las células T del mismo donante que fueron poco permisivas para la electroporación del ARN y, en consecuencia condujeron a solo una expresión fraccional dependiente de la dosis de C16 en las iDC y también una menor expresión de CAR en las células T (Figura 3A/B). Esto puede constituir una situación de encontrar incluso menos C16 en las iDC que la situación para niveles bajos de expresión de C16 en las iDC altamente permisivas tituladas con antígeno (Figura 3A/B frente a 2A/B). Aquí, para todas las pequeñas cantidades tituladas de C16, los CAR combinatorios demostraron ser más eficientes en la secreción de IFNy que el scCAR clásico. Esta tendencia se vuelve incluso más pronunciada para cantidades decrecientes de Cl6 en la superficie celular de las iDC. La cantidad de IFNy secretado es baja (<1000 pg/ml), pero en primer lugar puede mejorarse mediante una mejor expresión de CAR y en segundo lugar puede resultar beneficioso para los pacientes en la clínica que tienen variantes de escape tumoral que expresan muy poco antígeno (temprano) o para abordar la enfermedad residual mínima.

La Figura 4A compara la eficiencia en la secreción de IFNy para los TCR-CAR (bivalentes) no combinatorios frente a los combinatorios contra el antígeno C16 al que son específicos los CAR. Todos los CAR combinatorios fueron más eficientes en el reconocimiento de antígenos en un intervalo amplio de antígenos titulados. Para dosis más altas de antígeno los CAR bivalentes fueron casi iguales en función efectora excepto el TCR-CAR no combinatorio "silenciado". Se conoce que la mutación puntual S109Q en CDR3a deteriora un poco la unión del antígeno gp 100(280-288) (Knies y otros, Oncotarget 2016). La unión intercatenaria de los dominios V y la unión del propio antígeno por el TCR-CAR combinatorio "silenciado" aparentemente compensan la pérdida de función causada por esta mutación. Es importante destacar que, a un nivel bajo de expresión de Cl6 (0,02 pg) los TCR-CAR combinatorios, ya sea funcionalmente silenciados o no, se volvieron superiores a los TCR-CAR no combinatorios hacia la secreción de citocinas.

La Figura 4B ilustra el reconocimiento residual del antígeno gp100(280-288) en la secreción de IFNy titulada con péptidos. Aquí, TCRap gp100 sirvió como control positivo mientras que TCRap C16 como un control de especificidad para estimar la secreción de fondo de citocinas. El TCR-CAR no combinatorio todavía puede reconocer el antígeno restringido por A2-1 con una carga de péptidos alta. La introducción de la mutación de silenciamiento S109Q abolió el reconocimiento en absoluto. Es importante destacar que, el arreglo combinatorio intercatenario de los dominios V conectados en un orden en tándem (VH-VH-, VL-VL-) pareció evitar el reconocimiento del antígeno afín por el resto del TCR gp100 por completo. Por lo tanto la introducción de la mutación de silenciamiento puede servir solo como salvaguardia para garantizar la falta de respuesta funcional del resto del TCR en estos c A r y para centrarse en explotar su cadena principal como un andamio estabilizador del apareamiento de cadenas y como una molécula adaptadora de longitud completa para la señalización fisiológica de células T.

Ejemplo 3: Ensayo de proliferación titulado por antígeno combinado con fenotipado de biomarcadores

El día 1 del experimento, se aislaron PBMC frescas de una capa leucocitaria de un donante sano. A partir de % de las PBMC, se aislaron células CD14+ mediante el uso de clasificación de MACS, y se congelaron las PBMC residuales. Las células CD14+ se diferenciaron a iDC mediante la administración de IL-4 y GM-CSF (1000 U/ml) los días 1, 3, 6. El día 7 las iDC se sometieron a electroporación con ARN-IVT de C16 e irrelevante dependiente de la dosis en el intervalo de 2 - 0,002 pg de ARN. Las PBMC congeladas se descongelaron el mismo día y las MACS se clasificaron para células CD8+. Sin ninguna activación previa (OKT3), células T vírgenes, aprox. 7x106 células, se sometieron a electroporación posteriormente con TCR-CAR clásicos, monovalentes e intercombinatorios como se indicó en la Figura 1.

Para garantizar la calidad, las células T modificadas genéticamente con CAR se analizaron mediante tinción con citometría de flujo el día 8. Las células T se marcaron posteriormente con el marcador de proliferación fluorescente intracelular CFSE (0,8 pM) o CPD-450 (10 pM). Las células T electroporadas y las iDC se cocultivaron posteriormente en una placa de 96 pocilios durante 5 días en una relación E:T de 10:1 (o 3:1 para el fenotipado de biomarcadores) por duplicado. Rutinariamente, 2,5x104 iDC se cultivaron conjuntamente con 2,5x105 células T electroporadas con CAR en un volumen de 200 j l de medio de células T en una placa de 96 pocillos. El día 5, las células cultivadas se tiñeron en las placas de 96 pocillos con anticuerpos para CD4 o CD8 marcados con APC-Cy7. La proliferación de células T se detectó mediante citometría de flujo mediante el cambio de desplazamiento hacia la izquierda de la señal del fluoróforo debido a la dilución en células hijas en proliferación. Las frecuencias de la población parental no proliferante GO y las poblaciones hijas G1-G7 se evaluaron mediante el uso de la herramienta de proliferación en el paquete del software de citometría de flujo FlowJo v7.6.5. Las frecuencias para todas las células T hijas se calcularon a partir de la suma de todas las poblaciones en proliferación G1-G7. Se evaluó la proliferación de fondo de células T para células cultivadas con iDC electroporadas con gp100 de longitud completa irrelevante o células T sembradas sin APC. Las células en proliferación se tiñeron para CD8 para identificarlas inequívocamente como células T. Alternativamente, las células T en proliferación se tiñeron con biomarcadores tales como CD27, CD28, PD-1, CD95, CD45RA, y CCR7 para cuantificar el estado de diferenciación de las células T en no proliferación originalmente vírgenes en GO y las poblaciones hijas en evolución G1-G7, respectivamente, después de 5 o 6 días de cocultivo con APC. Los anticuerpos y los controles de isotipo correspondientes se titularon para estimar la relación señal-ruido óptima. El ensayo se cuantificó en un sistema FACS-Canto II-HTS (BD) en un formato de 96 pocillos.

La Figura 5A representa las gráficas de densidad de células T en proliferación modificadas genéticamente con CAR C16 monovalente como un "control débil", los TCR-CAR combinatorios sin y con la mutación de silenciamiento S109Q en TCR CDR3a, y el scCAR C16 clásico como CAR de referencia. Casi no se pudo observar proliferación inespecífica contra las iDC cargadas con el antígeno irrelevante gp100. La proliferación contra las APC cargadas con el antígeno afín dio como resultado hasta 6 poblaciones hijas distintas, cuyas frecuencias se pudieron discernir fácilmente (enumeradas a la derecha de cada gráfico). Todos los CAR excepto el CAR C16 monovalente, mostraron velocidades de proliferación altas incluso a bajas densidades de antígeno. Las frecuencias máximas estuvieron en G3 en casi todos los casos.

La Figura 5B resume los porcentajes de células T parentales restantes GO y de células T en proliferación G1-G7 en un gráfico de barras. Con una carga alta de antígeno, la barra grande para GO (40 %) y la barra más pequeña para G1-G7 (60 %) en comparación con los otros CAR indica claramente la débil propensión a proliferar de las células T modificadas genéticamente con CAR monovalentes. Las células T modificadas genéticamente con scCAR clásicos demostraron ser algo mejores (90 %) que las modificadas genéticamente con los CAR combinatorios (80%) en línea con los resultados de los ensayos de secreción de IFNy. En consecuencia, cuando disminuye la cantidad de antígeno, las células T modificadas con CAR combinatorios se volvieron al menos tan eficientes como las modificadas con scCAR clásicos (casi el 80 %). A partir de esta tendencia se puede especular que incluso para densidades de antígeno más bajas, los CAR combinatorios pueden llegar a ser incluso más superiores al scCAR clásico en términos de potencia de proliferación.

La Figura 6 describe a la izquierda la frecuencia de células T en proliferación aprovechadas con ya sea el scCAR clásico (arriba), el CAR C16 Ca/p combinatorio (centro), o el TCR-CAR C16 combinatorio silCDR3a (parte inferior). A la derecha se muestra la intensidad media de menos unión inespecífica (es decir, la unión del isotipo) para el correceptor CD8 y el receptor coestimulador CD27 entre todas las poblaciones parentales e hijas. Las células T se tiñeron con un anticuerpo específico para CD8 para visualizar la regulación ascendente moderada y casi igual de este marcador correceptor para los CAR combinatorios y clásicos. Por lo tanto, la tinción de CD8 puede funcionar como un marcador de normalización para enfatizar la regulación igual de esta molécula "inerte" entre todos los CAR examinados aquí. En paralelo, se tiñeron con un anticuerpo específico para la molécula coestimuladora CD27 en un canal de fluorescencia diferente para estimar su regulación en poblaciones parentales/hijas G0-G6 para todos los CAR. Aunque ambos marcadores se regularon positivamente aproximadamente 2 veces y adicionalmente, la expresión media de CD8 fue la misma paras todos los CAR, la expresión media de CD27 fue mucho más alta para los c A r combinatorios, y en particular el TCR-CAR C16 intercombinatorio, que el CAR clásico. CD27, un biomarcador de la persistencia a largo plazo de las células T in vivo, adquirió una meseta mucho más alta para las células T con proliferación débil (G2-G4) antes de que los niveles de expresión cayeran a niveles basales en G6. A partir de esto se puede plantear la hipótesis de que las células T modificadas genéticamente con CAR combinatorios pueden tener menos de un fenotipo terminalmente diferenciado y agotado (es decir, regulación negativa de moléculas coestimuladoras) en poblaciones que proliferación débil y por lo tanto, pueden persistir más tiempo in vivo. El tamaño (dispersión directa) y la granulación (dispersión lateral) de las células T electroporadas con CAR combinatorios cocultivadas fue incluso menor que para el CAR clásico (datos no mostrados). Por lo tanto, una mayor regulación positiva de CD27 no es causada por un aumento de la superficie celular y, por lo tanto, por más CD27 en una superficie más grande.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un receptor de antígeno, cuyo receptor comprende una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica,

en donde

la primera cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor;

la segunda cadena peptídica comprende un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T, y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor;

en donde el primer dominio de la primera cadena peptídica forma junto con uno de los dominios de la segunda cadena peptídica un primer sitio de unión al antígeno, y

en donde el segundo dominio de la primera cadena peptídica forma junto con el otro dominio de la segunda cadena peptídica un segundo sitio de unión al antígeno, en donde

(i) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T y una región constante de una cadena beta del receptor de células T, o

(ii) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T y una región constante de una cadena beta del receptor de células T y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T.
2. El receptor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera y/o la segunda cadenas peptídicas comprenden además un enlazador entre el primer y segundo dominios y/o entre el primer y segundo dominios y la región variable de una cadena del receptor de células T, en donde el enlazador es preferentemente una secuencia de aminoácidos arbitraria.
3. El receptor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el primer y/o el segundo dominio comprenden cada uno una región variable de una cadena de inmunoglobulina o una región variable de una cadena del receptor de células T.
4. El receptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primer dominio de la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina con una especificidad para un antígeno y el dominio de la segunda cadena peptídica forma un sitio de unión al antígeno con el primer dominio de la primera cadena peptídica que comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina con una especificidad para el antígeno.
5. El receptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el segundo dominio de la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina con una especificidad para un antígeno y el dominio de la segunda cadena peptídica forma un sitio de unión al antígeno con el segundo dominio de la primera cadena peptídica que comprende una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina con una especificidad para el antígeno.
6. El receptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

el primer y el segundo dominios de la primera cadena peptídica comprenden cada uno una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina; y

el primer y el segundo dominios de la segunda cadena peptídica comprenden cada uno una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina.
7. El receptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde

el dominio del extremo N-terminal de la primera cadena peptídica forma junto con el dominio del extremo N-terminal de la segunda cadena peptídica un sitio de unión al antígeno; y

el dominio del extremo C-terminal de la primera cadena peptídica forma junto con el dominio del extremo C-terminal de la segunda cadena peptídica un sitio de unión al antígeno.
8. Una célula recombinante que expresa la primera cadena peptídica, la segunda cadena peptídica o tanto la primera como la segunda cadenas peptídicas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un método para producir una célula que expresa un receptor de antígeno cuyo receptor comprende una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica, el método comprende:

(a) proporcionar una célula;

(b) proporcionar una primera construcción genética que codifica la primera cadena peptídica que comprende al menos un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor;

(c) proporcionar una segunda construcción genética que codifica la segunda cadena peptídica que comprende al menos un primer dominio, un segundo dominio, una región variable de una cadena del receptor de células T y un dominio de transmisión de señales del inmunorreceptor;

(d) introducir la primera y la segunda construcciones genéticas en la célula; y

(e) permitir que las construcciones se expresen en la célula;

en donde el primer dominio de la primera cadena peptídica puede formar junto con uno de los dominios de la segunda cadena peptídica un primer sitio de unión al antígeno, y

en donde el segundo dominio de la primera cadena peptídica puede formar junto con el otro dominio de la segunda cadena peptídica un segundo sitio de unión al antígeno;

en donde

(i) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T y una región constante de una cadena beta del receptor de células T, o

(ii) la primera cadena peptídica comprende una región variable de una cadena beta del receptor de células T y una región constante de una cadena beta del receptor de células T y la segunda cadena peptídica comprende una región variable de una cadena alfa del receptor de células T y una región constante de una cadena alfa del receptor de células T.
10. El método de la reivindicación 9, en donde la primera cadena peptídica y la segunda cadena peptídica se proporcionan en una única construcción genética.
11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde la célula es una célula humana, preferentemente una célula T.
12. Una célula recombinante que se produce por el método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicha célula es preferentemente una célula humana.
13. Un ácido nucleico que codifica la primera cadena peptídica, la segunda cadena peptídica o tanto la primera como la segunda cadenas peptídicas que se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es preferentemente ADN o ARN.
14. Una composición farmacéutica que comprende el receptor de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 o 12, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13; y un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente para su uso como un medicamento.
15. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso en el tratamiento de una enfermedad que se caracteriza por la expresión de al menos un antígeno que se une al receptor de antígeno, en donde el antígeno es preferentemente un antígeno tumoral.
16. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la enfermedad es cáncer.
17. Receptor de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 o 12, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad, en donde la enfermedad se caracteriza por la expresión de al menos un antígeno que se une al receptor de antígeno y en donde la enfermedad es preferentemente cáncer.