BR112019018705A2

BR112019018705A2 - receptor de antígenos, cadeia de peptídeos, células recombinantes, métodos de produção de células e de tratamento de doenças, ácido nucleico e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112019018705A2
Application number: BR112019018705A
Authority: BR
Inventors: Caspar Janina; Birtel Matthias; Simon Petra; Holger VOSS Ralf; Sahin Ugur
Original assignee: Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh; Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2020-04-07
Also published as: MX2019010941A; US11702631B2; JP7073417B2; CN110621693A; EP3596113B1; AU2018234068B2; CA3054253A1; JP2020509783A; EP3596113A1; IL269213B2; AU2018234068A1; SG11201907715YA; KR102396925B1; RU2019125594A; KR20190128683A; WO2018167151A1; ZA201905441B; CN110621693B; WO2018166589A1; NZ756383A

Abstract

a presente invenção engloba, de forma geral, o tratamento de doenças por meio do direcionamento a células que expressam um antígeno sobre a superfície celular. particularmente, a presente invenção refere-se a receptores de antígenos recombinantes e seus usos. células t elaboradas para expressar esses receptores de antígenos são úteis no tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de um ou mais antígenos ligados pelos receptores de antígenos.

Description

“RECEPTOR DE ANTIGENOS, CADEIA DE PEPTÍDEOS, CÉLULAS RECOMBINANTES, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE CÉLULAS E DE TRATAMENTO DE DOENÇAS, ÁCIDO NUCLEICO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a receptores de antigenos recombinantes e seus usos. Células T elaboradas para expressar esses receptores de antigenos são úteis no tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de um ou mais antigenos ligados pelos receptores de antigenos.

Antecedentes da Invenção [002] As células T desempenham papel central na imunidade mediada por células em seres humanos e animais. O reconhecimento e a ligação de antigenos específicos são mediados pelos receptores de células T (TCRs) expressos sobre a superfície de células T. O TCR de células T é capaz de interagir com peptídeos imunogênicos (epítopos) ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e apresentadas sobre a superfície de células alvo. A ligação específica do TCR aciona uma cascata de sinais no interior da célula T, gerando proliferação e diferenciação em uma célula T efetora amadurecida.

[003] O TCR é uma parte de um mecanismo de sinalização complexo, que inclui o complexo heterodimérico das cadeias α e β de TCR, o correceptor CD4 ou CD8 e o módulo de transdução de sinais CD3. O heterodímero α/β de TCR é responsável pelo reconhecimento de antigenos e pela retransmissão do sinal de ativação através da membrana celular em conjunto com CD3, enquanto as próprias cadeias CD3 transferem o sinal recebido para proteínas adaptadoras no interior da célula. A transferência das cadeias α/β de TCR oferece, portanto, a oportunidade de redirecionar as

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2/131 células T em direção a qualquer antígeno de interesse.

[004] Imunoterapia com base na transferência de células adotivas (ACT) pode ser amplamente definida como uma forma de imunização passiva com células T previamente sensibilizadas que são transferidas para receptores não imunes ou para o hospedeiro autólogo após expansão ex vivo a partir de frequências precursoras baixas para números de células clinicamente relevantes. Tipos de células que foram utilizados para experimentos de ACT incluem células matadoras ativadas por linfocinas (LAK) (Mule, J. J. et al (1984), Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S. A. et al (1985), N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) (Rosenberg, S. A. et al (1994), J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), linfócitos doadores após transplante de células tronco hematopoiéticas (HSCT), bem como linhagens de células T específicas de tumores (Dudley, Μ. E. et al (2001), J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al (2002), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 99, 16168-16173). Demonstrou-se que a transferência de células T adotivas exibe atividade terapêutica contra infecções virais humanas, tais como CMV. Para imunoterapia adotiva de melanoma, Rosenberg e colaboradores estabeleceram abordagem de ACT dependente da infusão de linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) autólogos expandidos in vitro isolados de tumores extirpados em combinação com quimioterapia linfoesgotadora não mieloablativa e IL2 em alta dose. Estudo clínico resultou em taxa de resposta objetiva de cerca de 50% de pacientes tratados que sofrem de melanoma metastático (Dudley, Μ. E. et al (2005), J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).

[005] Uma abordagem alternativa é a transferência adotiva de células T autólogas reprogramadas para expressar um imunorreceptor reativo a tumores com especificidade definida durante cultivo ex vivo de curto período, seguida por reinfusão no paciente (Kershaw, Μ. H. et al (2013), Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Esta estratégia torna ACT aplicável a uma

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3/131 série de malignidades comuns, mesmo se células T reativas para tumores estiverem ausentes no paciente. Como a especificidade antigênica de células T repousa inteiramente no complexo heterodimérico da cadeia α e β de TCR, a transferência de genes de TCR clonados para células T oferece o potencial de redirecioná-las para qualquer antígeno de interesse. Terapia genética com TCR fornece, portanto, estratégia atraente para o desenvolvimento de imunoterapia específica de antígenos com linfócitos autólogos como opção de tratamento. As principais vantagens da transferência genética de TCR são a criação de quantidades terapêuticas de células T específicas de antígenos em poucos dias e a possibilidade de introdução de especificidades que não estão presentes no repertório de TCR endógeno do paciente. Diversos grupos demonstraram que a transferência de genes de TCR é uma estratégia atraente para redirecionar a especificidade de antígenos de células T primárias (Morgan, R. A. et al (2003), J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L. J. et al (2000), J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al (2000), J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H. W. et al (2001), Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al (1986), Nature 320, 232-238). A viabilidade da terapia genética de TCR em seres humanos foi demonstrada inicialmente em testes clínicos para o tratamento de melanoma maligno por Rosenberg e seu grupo. A transferência adotiva de linfócitos autólogos que sofreram transdução retroviral com TCRs específicos de antígenos de melanoma/melanócitos resultou em regressão do câncer de até 30% dos pacientes com melanoma tratados (Morgan, R. A. et al (2006), Science 314, 126-129; Johnson, L. A. et al (2009), Blood 114, 535-546). Enquanto isso, o teste clínico de terapia genética de TCR foi também estendido para cânceres diferentes de melanoma, dirigindo-se a diferentes antígenos de tumores (Park, T. S. et al (2011), Trends Biotechnol. 29, 550-557).

[006] O uso de abordagens de engenharia genética para inserir receptores dirigidos a antígenos com especificidade definida em células T

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4/131 ampliou muito as capacidades potenciais de ACT. Receptores de antígenos quiméricos (CARs) são um tipo de receptor dirigido a antígenos composto de domínios de sinalização de células T intracelulares fundidos a domínios de ligação de antígenos extracelulares, mais comumente fragmentos variáveis de fita simples (scFvs) de anticorpos monoclonais. CARs reconhecem diretamente antígenos da superfície celular, independentes da apresentação mediada por MHC, que permitem o uso de uma única construção receptora específica para qualquer dado antígeno em todos os pacientes. CARs iniciais fundiram domínios de reconhecimento de antígenos à cadeia de ativação CD3ζ do complexo receptor de células T (TCR). Iterações de CAR subsequentes incluíram sinais coestimulantes secundários em conjunto com ΰϋ3ζ, incluindo domínios intracelulares de CD28 ou uma série de moléculas da família de receptores de TNF, tais como 4-1 BB (CD137) e 0X40 (CD134). Além disso, receptores de terceira geração incluem dois sinais coestimulantes além de Οϋ3ζ, mais comumente de CD28 e 4-1 BB. CARs de segunda e terceira geração aumentaram dramaticamente a eficácia antitumores in vitro e in vivo (Zhao et al (2009), J. Immunol. (183) 5563-5574), induzindo, em alguns casos, remissões completas em pacientes com câncer avançado (Porter et al (2011), N. Engl. J. Med. (365) 725-733).

[007] CAR clássico consiste de um fragmento de anticorpo de fita simples (scFv) específico de antígenos, fundido a uma transmembrana e domínio de sinalização, tal como CD3ζ. Mediante introdução em células T, ele é expresso na forma de proteína ligada a membrana e induz reações imunológicas mediante ligação ao seu antígeno cognato (Eshhar et al (1993), PNAS (90), 720-724). A reação imunológica específica de antígenos induzida resulta na ativação de células T CD8+ citotóxicas que, por sua vez, gera erradicação de células que expressam o antígeno específico, tais como células de tumores ou células infectadas por vírus que expressam o antígeno

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5/131 específico. Essas construções de CAR clássicas, entretanto, não ativam/estimulam as células T por meio do seu complexo de CD3 endógeno, o que é normalmente essencial para a ativação de células T. Devido à fusão do domínio de ligação de antígenos a Οϋ3ζ, a ativação de células T é induzida por meio de um “curto circuito” bioquímico (Aggen et al (2012), Gene Therapy (19) 365-374). Essa ativação não fisiológica de células T apresenta risco para o paciente sendo tratado desta forma, pois a ativação excessiva de células T pode gerar efeitos colaterais indesejados. A ativação básica a longo prazo de células T recombinantes devido à expressão de CAR foi observada, por exemplo, in vitro (“sinalização tônica”), o que resultou em aumento do acúmulo de moléculas inibidoras, tais como LAG-3, TIM-3 e PD-1, sobre a superfície de células T que expressam CAR recombinantes, o que, por sua vez, resultou em células T prematuramente esgotadas, gerando em seguida forte impacto negativo sobre a reação contra células de tumores in vivo (Long et al (2015), Nat. Med. (21) 581-590). Esta reação adversa foi associada à formação de conjuntos irregulares de fragmentos de scFv através de resíduos de cadeia principal desse anticorpo. Além disso, embora construções de CAR clássicas deste tipo tenham sido testadas com sucesso contra diferentes neoplasias, tais como leucemia (Porter et al (2011), N. Engl. J. Med. (365) 725-733), elas também resultaram em doenças autoimunes fatais devido à expressão básica do antígeno dirigido (antígeno de tumor dirigido) em tecidos normais (reação no alvo/forado tumor; Morgan et al (2010), Mol. Ther. (18) 843-51).

[008] Uma abordagem alternativa, na qual ocorre ativação da célula T por meio de um mecanismo mais fisiológico, foi o fornecimento de um fragmento de TCR de fita simples (scTv) análogo fundido ao domínio constante C3 derivado do receptor de células T (TCR) e sua coexpressão com um domínio constante Ca derivado de TCR (Voss et al (2010), Blood (115) 51545163), em que este último recruta o homodímero CD3ζ endógeno essencial

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6/131 (Call et al (2002), Cell (111) 967-79). Para que essas construções funcionem como ativadores do sistema imunológico, entretanto, é essencial que seus domínios constantes originem-se de TCRs murinos ou necessitem ser murinizados (Cohen et al (2006), Cancer Res. (66) 8878-86; Bialer et al (2010), J. Immunol. (184) 6232-41) para atingir emparelhamento de cadeias entre scTCR e Ca. O fato de que essas construções devem possuir sequências xenogênicas para funcionalidade eleva o risco de reação do sistema imunológico contra elas quando administradas e prejudica ou destrói a sua eficácia terapêutica.

[009] Existe, portanto, a necessidade de fornecimento de receptores de antígenos recombinantes alternados, nos quais, por exemplo, o receptor, mediante ligação de antígenos, é suficientemente capaz de ativar a célula T na qual é expresso de forma fisiológica normal por meio do complexo de CD3 endógeno e, opcionalmente, sem necessidade da presença de nenhuma sequência de aminoácidos não de origem humana, pelo menos no domínio de transmissão de sinais do receptor de antígenos, que podería induzir reação imunológica indesejada contra o próprio receptor de antígenos recombinante.

Descrição Resumida da Invenção [0010] A presente invenção refere-se a receptores de antígenos recombinantes que contêm pelo menos dois locais de ligação de antígenos. Os receptores de antígenos compreendem duas cadeias de peptídeos. Cada uma das cadeias de peptídeos compreende pelo menos dois domínios, além de uma região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes, e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores, no qual cada um dos dois domínios sobre uma cadeia de peptídeos forma um local de ligação de antígenos com um dos domínios da outra cadeia de peptídeos. Em uma realização, o receptor de antígenos de acordo com a presente invenção

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7/131 possui a estrutura de um receptor de células T, em que cada uma das suas cadeias compreende os mencionados pelo menos dois domínios que formam os locais de ligação de antígenos, preferencialmente no terminal N das cadeias receptoras de células T.

[0011] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um receptor de antígenos, em que o receptor compreende primeira cadeia de peptídeos e segunda cadeia de peptídeos e a primeira cadeia de peptídeos compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; e a segunda cadeia de peptídeos compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; em que o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com um dos domínios da segunda cadeia de peptídeos, primeiro local de ligação de antígenos; e o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o outro domínio da segunda cadeia de peptídeos, segundo local de ligação de antígenos. No receptor de antígenos deste aspecto, os domínios que formam os locais de ligação de antígenos correspondentes estão preferencialmente localizados sobre cadeias de peptídeos diferentes. Consequentemente, são formados locais de ligação de antígenos por meio da interação intermolecular de domínios.

[0012] Em uma realização, cada um dentre os primeiro e/ou segundo domínios compreende uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina, uma região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma parte da região variável.

[0013] Em uma realização, um dos domínios que formam o primeiro local de ligação de antígenos compreende uma região variável de

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8/131 cadeia pesada de imunoglobulina com especificidade para um antígeno ou uma de suas partes e o outro domínio que forma o primeiro local de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com especificidade para o antígeno ou uma de suas partes. Em uma realização, um dos domínios que formam o segundo local de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com especificidade para um antígeno ou uma de suas partes e o outro domínio que forma o segundo local de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com especificidade para o antígeno ou uma de suas partes.

[0014] Em uma realização, o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com especificidade para um antígeno ou uma de suas partes e o domínio da segunda cadeia de peptídeos que forma um local de ligação de antígenos com o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com especificidade para o antígeno ou uma de suas partes. Em uma realização, o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com especificidade para um antígeno ou uma de suas partes e o domínio da segunda cadeia de peptídeos que forma um local de ligação de antígenos com o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com especificidade para o antígeno ou uma de suas partes.

[0015] Em uma realização, cada um dentre os primeiro e segundo domínios da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou uma de suas partes; e cada um dentre os primeiro e segundo domínios da segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina ou uma de suas partes.

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9/131 [0016] Em uma realização, o domínio N-terminal da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o domínio N-terminal da segunda cadeia de peptídeos, um local de ligação de antígenos; e o domínio C-terminal da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o domínio C-terminal da segunda cadeia de peptídeos, um local de ligação de antígenos.

[0017] Em uma realização, o domínio N-terminal da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o domínio C-terminal da segunda cadeia de peptídeos, um local de ligação de antígenos; e o domínio C-terminal da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o domínio N-terminal da segunda cadeia de peptídeos, um local de ligação de antígenos.

[0018] Em uma realização dos receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores compreende uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores de células T, uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores Fc de células imunes ou uma parte da região constante ou invariável. Em uma realização dos receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, (i) a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de uma cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de uma cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de uma cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de uma cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes; ou (ii) a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de uma cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de uma cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de uma cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de uma cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes.

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Nesta realização, a região variável de uma cadeia alfa de receptores de células T ou uma de suas partes e a região constante de uma cadeia alfa de receptores de células T ou uma de suas partes corresponde ou corresponde essencialmente à cadeia alfa de um receptor de células Tea região variável de uma cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e a região constante de uma cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes corresponde ou corresponde essencialmente à cadeia beta de um receptor de células T, preferencialmente o mesmo receptor de células T do qual é derivada a cadeia alfa de um receptor de células T. Os domínios que formam os locais de ligação de antígenos são preferencialmente fundidos ao terminal N das cadeias, opcionalmente separadas por um ligante.

[0019] Em uma realização dos receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, a região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e/ou o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores, tal como a região constante de um receptor de células T ou uma de suas partes, é de origem humana. Desta forma, a cadeia de um receptor de células T ao qual a região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e a região constante de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes correspondentes ou essencialmente correspondentes pode ser de origem humana.

[0020] Em uma realização, um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção compreende um ou mais ligantes que conectam domínios do receptor de antígenos. Em uma realização, um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção compreende um ou mais ligantes entre os domínios que formam os locais de ligação de antígenos e/ou entre os domínios que formam os locais de ligação de antígenos e as regiões variáveis de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes. O ligante pode ser uma sequência de aminoácidos arbitrária com qualquer

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11/131 comprimento, desde que não interfira com as funções do receptor de antígenos, tais como a capacidade do receptor de antígenos de ligar antígeno ou associar-se ao complexo de CD3 endógeno, ou interferir com a capacidade do receptor de antígenos de induzir reação imunológica mediante ligação de antígenos.

[0021] Em uma realização dos receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, os primeiro e segundo locais de antígenos ligam-se ao mesmo antígeno ou a antígenos diferentes. Em uma realização dos receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, os primeiro e segundo locais de ligação de antígenos ligam-se a epítopos diferentes no mesmo antígeno. Consequentemente, embora os domínios que formam o primeiro local de ligação de antígenos sejam preferencialmente derivados da mesma imunoglobulina e os domínios que formam o segundo local de ligação de antígenos sejam preferencialmente derivados da mesma imunoglobulina, os domínios que formam o primeiro local de ligação de antígenos e os domínios que formam o segundo local de ligação de antígenos são derivados de imunoglobulinas idênticas ou diferentes, em que as mencionadas imunoglobulinas diferentes ligam-se a antígenos idênticos ou diferentes.

[0022] Em uma realização, o antígeno é um antígeno específico de doenças, preferencialmente um antígeno de tumores. Em uma realização, o antígeno é expresso sobre a superfície de uma célula.

[0023] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma cadeia de peptídeos dos receptores de antígenos de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a presente invenção refere-se a uma cadeia de peptídeos que compreende primeiro e segundo domínio, em que cada qual compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou uma de suas partes ou cada qual compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina ou uma de suas partes, em que a cadeia de peptídeos

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12/131 compreende adicionalmente uma região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores, tal como região constante de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes. Realizações adicionais das cadeias de peptídeos de acordo com a presente invenção são conforme descrito no presente para os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção.

[0024] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula, particularmente uma célula efetora imune tal como célula T, geneticamente modificada para expressar um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante, particularmente uma célula efetora imune tal como célula T, que expressa a primeira cadeia de peptídeos, a segunda cadeia de peptídeos ou ambas, a primeira e a segunda cadeias de peptídeos de um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção ou que expressa uma cadeia de peptídeos de acordo com a presente invenção. Realizações adicionais da célula ou célula recombinante de acordo com a presente invenção são conforme descrito no presente para os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção ou as cadeias de peptídeos de acordo com a presente invenção.

[0025] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção de células que expressam receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, em que o método compreende: (a) fornecimento de células; (b) fornecimento de primeira construção genética que codifica a primeira cadeia de peptídeos de um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção; (c) fornecimento de segunda construção genética que codifica a segunda cadeia de peptídeos de um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção; (d) introdução das primeira e segunda construções genéticas na célula; e (e) permissão da expressão das

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13/131 construções na célula. Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de células que expressam receptores de antígenos, em que o receptor compreende primeira cadeia de peptídeos e segunda cadeia de peptídeos e o método compreende: (a) fornecimento de células; (b) fornecimento de primeira construção genética que codifica a primeira cadeia de peptídeos que compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; (c) fornecimento de segunda construção genética que codifica a segunda cadeia de peptídeos que compreende pelo menos um primeiro domínio, segundo domínio, região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; (d) introdução das primeira e segunda construções genéticas na célula; e (e) permissão da expressão das construções na célula; em que o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos é capaz de formar, em conjunto com um dos domínios da segunda cadeia de peptídeos, primeiro local de ligação de antígenos e o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos é capaz de formar, em conjunto com o outro domínio da segunda cadeia de peptídeos, segundo local de ligação de antígenos. Em uma realização dos métodos de acordo com a presente invenção, a expressão do receptor de antígenos encontra-se na superfície celular. Em uma realização dos métodos de acordo com a presente invenção, a primeira cadeia de peptídeos e a segunda cadeia de peptídeos são fornecidas em uma única construção genética. Em uma realização dos métodos de acordo com a presente invenção, a célula é uma célula humana. Em uma realização dos métodos de acordo com a presente invenção, a célula é uma célula efetora imune, tal como célula T. Em uma realização dos métodos de acordo com a presente invenção, as construções genéticas compreendem DNA e/ou RNA. Realizações adicionais dos métodos de acordo com a presente invenção são

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14/131 conforme descrito no presente para os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção.

[0026] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante, particularmente uma célula efetora imune tal como célula T, produzida por meio dos métodos de acordo com a presente invenção para produzir células que expressam um receptor de antígenos. Realizações adicionais da célula recombinante de acordo com a presente invenção são conforme descrito no presente para os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção ou os métodos de acordo com a presente invenção para produzir uma célula que expressa um receptor de antígenos.

[0027] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico tal como DNA ou RNA que codifica a primeira cadeia de peptídeos, a segunda cadeia de peptídeos ou ambas, a primeira e a segunda cadeia de peptídeos de um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção ou que codifica uma cadeia de peptídeos de acordo com a presente invenção. Realizações adicionais do ácido nucleico de acordo com a presente invenção são conforme descrito no presente para os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção ou as cadeias de peptídeos de acordo com a presente invenção.

[0028] A presente invenção engloba geralmente o tratamento de doenças por meio do direcionamento de células que expressam um ou mais antígenos sobre a superfície celular, tais como células doentes que expressam, um ou mais antígenos específicos de doenças sobre a superfície celular, particularmente células de câncer que expressam um ou mais antígenos de tumores sobre a superfície celular, utilizando receptores de antígenos de acordo com a presente invenção. Os métodos fornecem erradicação seletiva de células que expressam sobre a sua superfície um ou mais antígenos, de forma a minimizar efeitos adversos para células normais que não expressam

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15/131 o(s) antígeno(s). Em uma realização, são administradas células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção dirigido às células por meio de ligação ao(s) antígeno(s). As células T são capazes de reconhecer células doentes que expressam o(s) antígeno(s) sobre a superfície celular, resultando na erradicação de células doentes. Em uma realização, a população de células alvo ou tecido alvo é de células de tumores ou tecido de tumores.

[0029] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende o receptor de antígenos de acordo com a presente invenção, a célula recombinante de acordo com a presente invenção ou o ácido nucleico de acordo com a presente invenção; e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser utilizada como medicamento, particularmente no tratamento de doenças tais como câncer, caracterizado pela expressão de um ou mais antígenos que são ligados pelo receptor de antígenos de acordo com a presente invenção, tais como um ou mais antígenos de tumores.

[0030] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de doenças tais como câncer, que compreende a administração a pacientes de quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, em que a doença é caracterizada pela expressão de pelo menos um antígeno, tal como um antígeno de tumor, que é ligado pelo receptor de antígenos.

[0031] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de pacientes portadores de doença, distúrbio ou condição associada à expressão ou expressão elevada de pelo menos um antígeno, em que o método compreende a administração ao paciente de células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção dirigido ao pelo menos um antígeno. Em

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16/131 uma realização, a doença, distúrbio ou condição é câncer. Em uma realização, as células T podem ser autólogas, alogeneicas ou singeneicas para o paciente.

[0032] Em uma realização da presente invenção, o receptor de antígenos liga-se a apenas um antígeno (por exemplo, que é monoespecífico e reconhece o mesmo epítopo ou que é biespecífico ou multiespecífico e reconhece epítopos diferentes no mesmo antígeno) ou liga-se a antígenos diferentes, particularmente dois antígenos diferentes.

[0033] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, o método de tratamento compreende adicionalmente a obtenção de uma amostra de células de pacientes, em que a amostra compreende células T ou progenitores de células T, e transfecção das células com um ácido nucleico que codifica o receptor de antígenos de acordo com a presente invenção para fornecer células T geneticamente modificadas para expressar o receptor de antígenos. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, as células T geneticamente modificadas para expressar o receptor de antígenos são transfectadas de forma estável ou transitória com ácido nucleico que codifica o receptor de antígenos. Desta forma, o ácido nucleico que codifica o receptor de antígenos é integrado ou não integrado ao genoma das células T. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, as células T e/ou a amostra de células são do paciente a quem são administradas as células T geneticamente modificadas para expressar o receptor de antígenos. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, as células T e/ou a amostra de células são de um mamífero que é diferente do mamífero ao qual são administradas as células T geneticamente modificadas para expressar o receptor de antígenos.

[0034] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, as células T geneticamente modificadas para expressar o receptor de antígenos são desativadas para expressão de receptores de células T

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17/131 endógenas e/ou HLA endógeno.

[0035] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, um antígeno é expresso em células doentes, tais como células de câncer. Em uma realização, um antígeno é expresso sobre a superfície de células doentes, tais como células de câncer. Em uma realização, um receptor de antígenos liga-se a um domínio extracelular ou a um epítopo em um domínio extracelular de antígeno. Em uma realização, um receptor de antígenos liga-se a epítopos nativos de um antígeno presente sobre a superfície de células vivas. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, o antígeno é um antígeno de tumores. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste de claudinas, tais como claudina 6 e claudina 18.2, CD19, CD20, CD22, CD33, CD123, mesotelina, CEA, c-Met, PSMA, GD-2 e qualquer NY-ESO-1. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, o antígeno é um antígeno de patógenos. O patógeno pode ser patógeno fúngico, viral ou bacteriano. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, a expressão do antígeno encontra-se na superfície celular. Em uma realização, um antígeno é claudina, particularmente claudina 6 ou claudina 18.2, e o mencionado receptor de antígenos liga-se ao primeiro circuito extracelular da mencionada claudina. Em uma realização, a ligação do mencionado receptor de antígenos, quando expresso por células T e/ou presente sobre células T, a um antígeno presente sobre as células resulta em funções efetoras imunes das mencionadas células T, tais como a liberação de citocinas. Em uma realização, a ligação do mencionado receptor de antígenos, quando expresso por células T e/ou presente sobre células T, a um antígeno presente sobre as células tais como células que apresentam antígenos resulta em estímulo, primer e/ou expansão das mencionadas células T. Em uma realização, a ligação do mencionado receptor de antígenos quando expresso

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18/131 por células T e/ou presente sobre células T a um antígeno presente em células doentes, tais como células de câncer, resulta em citólise e/ou apoptose das células doentes, em que as mencionadas células T liberam preferencialmente fatores citotóxicos, tais como perforinas e granzimas.

[0036] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, os domínios de um receptor de antigenos que forma locais de ligação de antigenos são compreendidos por um ectodomínio do receptor de antigenos. Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, um receptor de antigenos de acordo com a presente invenção compreende um domínio transmembrana. Em uma realização, o domínio transmembrana é uma hélice alfa hidrofóbica que cobre a membrana.

[0037] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, um receptor de antigenos de acordo com a presente invenção compreende um peptídeo de sinal que dirige a proteína nascente para o retículo endoplasmático. Em uma realização, o peptídeo de sinal precede os domínios que formam locais de ligação de antigenos.

[0038] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, um receptor de antigenos de acordo com a presente invenção é preferencialmente específico para o antígeno ao qual é dirigido, particularmente quando presente sobre a superfície de uma célula tal como uma célula doente ou uma célula que apresenta antigenos.

[0039] Em uma realização de todos os aspectos da presente invenção, um receptor de antigenos de acordo com a presente invenção pode ser expresso e/ou estar presente sobre a superfície de uma célula imunorreativa, tal como célula T, preferencialmente célula T citotóxica. Em uma realização, a célula T é reativa com o(s) antígeno(s) ao(s) qual(is) o receptor de antigenos de acordo com a presente invenção é dirigido.

[0040] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece os

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19/131 agentes e composições descritos no presente para uso nos métodos descritos no presente.

[0041] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e das reivindicações.

Descrição Detalhada da Invenção [0042] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deve-se compreender que a presente invenção não se limita às metodologias específicas, protocolos e reagentes descritos no presente, pois estes podem variar. Deve-se também compreender que a terminologia utilizada no presente destina-se ao propósito de descrever unicamente realizações específicas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado comumente compreendido pelos técnicos comuns no assunto.

[0043] Os elementos da presente invenção serão descritos a seguir. Estes elementos são relacionados com realizações específicas, mas dever-se-á compreender que eles podem ser combinados de qualquer forma e em qualquer quantidade para criar realizações adicionais. Os diversos exemplos descritos e realizações preferidas não deverão ser interpretados como limitando a presente invenção apenas às realizações explicitamente descritas. O presente relatório descritivo deverá ser compreendido como sustentando e englobando realizações que combinam as realizações explicitamente descritas com qualquer quantidade dos elementos descritos e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutas e combinações de todos os elementos descritos no presente pedido deverão ser consideradas reveladas pelo relatório descritivo do presente pedido, a menos que o contexto indique em contrário.

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20/131 [0044] Preferencialmente, os termos utilizados no presente são definidos conforme descrito em A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations), H. G. W. Leuenberger, B. Nagel e H. Kõlbl, Eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basiléia, Suíça.

[0045] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de bioquímica, biologia celular, imunologia e métodos de DNA recombinante, que são explicados na literatura da técnica (cf., por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, J. Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

[0046] Ao longo de todo o presente relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto indique em contrário, a palavra “compreender” e variações, como “compreende” e “que compreende”, serão compreendidas como indicando a inclusão de um membro, número inteiro ou etapa indicada, ou de um grupo de membros, números inteiros ou etapas, mas sem excluir nenhum outro membro, número inteiro, etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas, embora, em algumas realizações, esse outro membro, número inteiro ou etapa, ou grupo de membros, números inteiros ou etapas, possa ser excluído, ou seja, o objeto consiste na inclusão de um membro, número inteiro ou etapa indicada, ou grupo de membros, números inteiros ou etapas. Os termos “um”, “uma, o/a e referências similares utilizados no contexto de descrição da presente invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados como cobrindo singular e plural, a menos que indicado em contrário no presente ou em clara contradição pelo contexto. A indicação de faixas de valores no presente destina-se apenas a servir de método abreviado de referência individual a cada valor separado que se enquadra dentro da faixa. A menos que indicado em contrário no presente, cada valor individual é incorporado ao relatório descritivo como se

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21/131 fosse individualmente indicado no presente.

[0047] Todos os métodos descritos no presente podem ser realizados em qualquer ordem apropriada, a menos que indicado em contrário no presente ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo ou expressão de exemplo (por exemplo, “tal como”) fornecido no presente destina-se meramente a melhor ilustrar a presente invenção e não impõe limitação sobre o escopo da presente invenção, a menos que reivindicado em contrário. Nenhuma expressão do presente relatório descritivo deverá ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da presente invenção.

[0048] Diversos documentos são mencionados ao longo de todo o texto do presente relatório descritivo. Todos os documentos mencionados no presente (incluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções etc.), seja acima ou abaixo, são integralmente incorporados ao presente como referência. Nenhum ponto do presente deve ser interpretado como admissão de que a presente invenção não se destina a antecipar essa publicação em virtude de invenção anterior.

[0049] A expressão “reação imunológica” designa uma reação corporal integrada a um antígeno e designa preferencialmente uma reação imunológica celular ou reação imunológica humoral, bem como celular. A reação imunológica pode ser protetora/preventiva/profilática e/ou terapêutica.

[0050] “Fornecimento de reação imunológica” pode indicar que não houve reação imunológica contra um antígeno alvo, célula alvo e/ou tecido alvo específico antes de fornecer reação imunológica, mas pode também indicar que houve certo nível de reação imunológica contra um antígeno alvo, célula alvo e/ou tecido alvo específico antes de fornecer reação imunológica e após fornecer reação imunológica, em que a mencionada reação imunológica é mais alta. “Fornecimento de reação imunológica” inclui, portanto, “indução de

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22/131 reação imunológica” e “aumento da reação imunológica”. Preferencialmente, após fornecer reação imunológica em pacientes, o mencionado paciente é protegido contra o desenvolvimento de doenças tais como doença de câncer ou a condição da doença é melhorada pelo fornecimento de reação imunológica. Reação imunológica contra um antígeno de tumor pode ser fornecida, por exemplo, em pacientes portadores de doença de câncer ou em pacientes que se encontram em risco de desenvolver doença de câncer. O fornecimento de reação imunológica, neste caso, pode indicar que a condição de doença do paciente é melhorada, que o paciente não desenvolve metástase ou que o paciente que se encontra em risco de desenvolver doença de câncer não desenvolve doença de câncer.

[0051] “Imunidade mediada por células”, “imunidade celular” ou expressões similares destinam-se a incluir reação celular dirigida a células caracterizada pela expressão de antígenos, particularmente caracterizada pela apresentação de antígeno com MHC classe I ou classe II. A reação celular refere-se a células denominadas células T ou linfócitos T que agem como “auxiliares” ou “matadores”. As células T auxiliares (também denominadas células T CD4⁺) desempenham papel central regulando a reação imunológica e as células matadoras (também denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8⁺ ou CTLs) matam células doentes como células de câncer, evitando a produção de mais células doentes.

[0052] O termo “antígeno” designa um agente que compreende um epítopo contra o qual deve ser gerada e/ou dirigida reação imunológica. Preferencialmente, um antígeno no contexto da presente invenção é uma molécula que, opcionalmente após processamento, induz reação imunológica, que é preferencialmente específica para o antígeno ou células que expressam o antígeno, preferencialmente sobre a superfície celular. O termo “antígeno” inclui particularmente proteínas e peptídeos. Antígeno é preferencialmente um

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23/131 produto que corresponde a um antígeno de ocorrência natural ou dele é derivado. Esses antígenos de ocorrência natural podem incluir ou ser derivados de alérgenos, vírus, bactérias, fungos, parasitas e outros agentes infecciosos e patógenos, ou um antígeno pode também ser um antígeno de tumor. Segundo a presente invenção, um antígeno pode corresponder a um produto de ocorrência natural, tal como uma proteína viral ou uma de suas partes.

[0053] O termo “patógeno” designa micro-organismos patogênicos e compreende vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e parasitas. Exemplos de vírus patogênicos são vírus da imunodeficiência humana (HIV), citomegalovírus (CMV), vírus da herpes (HSV), vírus da hepatite A (HAV), HBV, HCV, vírus papilloma e vírus linfotróficos T humanos (HTLV). Organismos unicelulares compreendem plasmodia, tripanossomos, amebas etc.

[0054] Em realização preferida, um antígeno é um antígeno específico de doença ou antígeno associado a doença. A expressão “antígeno específico de doença” ou “antígeno associado a doença” designa todos os antígenos que possuem significado patológico. Em realização particularmente preferida, o antígeno está presente em células, tecidos e/ou órgãos doentes, embora não esteja presente ou esteja presente em quantidades reduzidas em células, tecidos e/ou órgãos saudáveis e, portanto, pode ser utilizado para dirigir-se a células, tecidos e/ou órgãos doentes, por exemplo, por células T que conduzem um receptor de antígenos dirigido ao antígeno. Em uma realização, antígenos específicos de doenças ou antígenos associados a doenças estão presentes sobre a superfície de células doentes.

[0055] Em realização preferida, antígeno é um antígeno de tumor ou antígeno associado a tumor, ou seja, um componente de células de câncer que podem ser derivadas do citoplasma, da superfície celular e do núcleo celular, particularmente os antígenos que são produzidos, preferencialmente em grandes quantidades, como antígenos da superfície sobre células de

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24/131 câncer.

[0056] No contexto da presente invenção, a expressão “antígeno de tumor” ou “antígeno associado a tumor” designa proteínas que se encontram sob condições normais especificamente expressas em quantidade limitada de tecidos e/ou órgãos ou em estágios de desenvolvimento específicos; o antígeno de tumor pode, por exemplo, encontrar-se em condições normais especificamente expressas em tecido do estômago, preferencialmente na mucosa gástrica, em órgãos reprodutores, por exemplo nos testículos, em tecido trofoblástico, por exemplo na placenta, ou em células de linhagem de germens e são expressas ou expressas de forma aberrante em um ou mais tecidos de câncer ou tumor. Neste contexto, “quantidade limitada” indica preferencialmente não mais de 3, de maior preferência não mais de 2. Os antígenos de tumores, no contexto da presente invenção, incluem, por exemplo, antígenos de diferenciação, preferencialmente antígenos de diferenciação específicos de tipo celular, ou seja, proteínas que se encontram sob condições normais, especificamente expressas em um certo tipo celular em um dado estágio de diferenciação, antígenos de câncer/testículos, ou seja, proteínas que se encontram sob condições normais especificamente expressas nos testículos e às vezes na placenta e antígenos específicos da linhagem de germens. No contexto da presente invenção, o antígeno de tumor é preferencialmente associado à superfície celular de uma célula de câncer e preferencialmente não é ou é apenas raramente expresso em tecidos normais. Preferencialmente, o antígeno de tumor ou a expressão aberrante do antígeno de tumor identifica células de câncer. No contexto da presente invenção, o antígeno de tumor que é expresso por uma célula de câncer em pacientes, tal como um paciente que sofre de doença de câncer, é preferencialmente uma autoproteína no mencionado paciente. Em realizações preferidas, o antígeno de tumor no contexto da presente invenção é expresso sob condições normais

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25/131 especificamente em tecidos ou órgãos que são não essenciais, ou seja, tecidos ou órgãos que, quando danificados pelo sistema imunológico não geram morte do paciente ou em órgãos ou estruturas do corpo que não são ou são apenas dificilmente acessíveis pelo sistema imunológico. Preferencialmente, a sequência de aminoácidos do antígeno de tumor é idêntica entre o antígeno de tumor que é expresso em tecidos normais e o antígeno de tumor que é expresso em tecidos de câncer.

[0057] Exemplos de antígenos de tumores que podem ser úteis na presente invenção são p53, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, as proteínas da superfície celular da família de claudina, tais como CLAUDINA-6, CLAUDINA-18.2 e CLAUDINA12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, GapWO, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ou hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferencialmente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGEA3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGEA10, MAGE-A11 ou MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1 R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, 2, 3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-apL, Pm1/RARa, PRAME, proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ou RU2, SAGE, SART-1 ou SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE e WT. Antígenos de tumor particularmente preferidos incluem CLAUDINA-18.2 (CLDN18.2) e CLAUDINA-6 (CLDN6).

[0058] O termo “CLDN” ou simplesmente “Cl”, da forma utilizada no presente indica claudina e inclui CLDN6 e CLDN18.2. Preferencialmente, claudina é claudina humana. Claudinas são uma família de proteínas que são os componentes mais importantes de junções firmes, nas quais elas estabelecem a barreira paracelular que controla o fluxo de moléculas no espaço intercelular entre células de epitélio. Claudinas são proteínas

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26/131 transmembrana que cobrem a membrana quatro vezes com as extremidades N-terminal e C-terminal, ambas localizadas no citoplasma. O primeiro circuito extracelular, denominado EC1 ou ECL1, consiste, em média, de 53 aminoácidos e o segundo circuito extracelular, denominado EC2 ou ECL2, consiste de cerca de 24 aminoácidos. Proteínas da superfície celular da família de claudina são expressas em tumores de diversas origens e são particularmente apropriadas como estruturas alvo com relação à imunoterapia de câncer dirigida, devido à sua expressão seletiva (sem expressão em tecido normal relevante para a toxicidade) e localização na membrana de plasma.

[0059]CLDN6 e CLDN18.2 foram identificados como expressos de forma diferencial em tecidos de tumores, em que o único tecido normal que expressa CLDN18.2 é do estômago (células epiteliais diferenciadas da mucosa gástrica) e o único tecido normal que expressa CLDN6 é placenta.

[0060] CLDN18.2 é expresso em cânceres de várias origens, tais como carcinoma pancreático, carcinoma do esôfago, carcinoma gástrico, carcinoma brônquico, carcinoma da mama e tumores de ENT. CLDN18.2 é um alvo valioso para a prevenção e/ou tratamento de tumores primários, tais como câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer do pâncreas, câncer do pulmão tal como câncer do pulmão não de células pequenas (NSCLC), câncer do ovário, câncer do cólon, câncer hepático, câncer da cabeça e do pescoço, cânceres da vesícula biliar e suas metástases, particularmente metástase de câncer gástrico, como tumores de Krukenberg, metástase peritoneal e metástase dos nódulos linfáticos. Receptores de antígenos dirigidos a pelo menos CLDN18.2 são úteis no tratamento dessas doenças do câncer.

[0061] Concluiu-se que CLDN6 é expresso, por exemplo, em câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, melanomas, câncer da cabeça e do pescoço, sarcomas, câncer dos dutos biliares, câncer das células renais e

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27/131 câncer da bexiga urinária. CLDN6 é um alvo particularmente preferido para a prevenção e/ou tratamento de câncer do ovário, particularmente adenocarcinoma do ovário e teratocarcinoma do ovário, câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas (SCLC) e câncer do pulmão não de células pequenas (NSCLC), particularmente carcinoma do pulmão de células escamosas e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, particularmente carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, câncer da cabeça e do pescoço, particularmente adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, particularmente sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer dos dutos biliares, câncer da bexiga urinária, particularmente carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer dos rins, particularmente carcinoma das células renais, incluindo carcinoma das células renais de células limpas e carcinoma das células renais papilares, câncer do cólon, câncer do intestino delgado, incluindo câncer do íleo, particularmente adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrional testicular, coriocarcinoma da placenta, câncer do colo do útero, câncer dos testículos, particularmente seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embriônico, câncer do útero, tumores de células germens tais como teratocarcinoma ou carcinoma embrional, particularmente tumores de células germens dos testículos, e suas formas metastáticas. Receptores de antígenos dirigidos a pelo menos CLDN6 são úteis no tratamento dessas doenças do câncer.

[0062] No contexto das realizações da presente invenção, antígenos encontram-se preferencialmente presentes sobre a superfície das células, preferencialmente células que apresentam antígenos ou células doentes. Segundo a presente invenção, antígenos, caso ligados por receptores de antígenos, são preferencialmente capazes de induzir, opcionalmente na

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28/131 presença de sinais coestimulantes apropriados, o estímulo, primer e/ou expansão da célula T que conduz o receptor de antígenos que liga o antígeno. O reconhecimento de antígenos sobre a superfície de células doentes pode resultar em reação imunológica contra o antígeno (ou célula que expressa o antígeno).

[0063] Segundo os diversos aspectos da presente invenção, o objeto é de preferencialmente fornecer reação imunológica contra células doentes que expressam um antígeno tal como células de câncer que expressam um antígeno tal como antígeno de tumor, particularmente CLDN6 ou CLDN18.2, e tratar de doenças tais como doenças de câncer que envolvem células que expressam antígenos tais como antígenos de tumores. Preferencialmente, a presente invenção envolve a administração de células efetoras imunes elaboradas por receptores de antígenos, tais como células T dirigidas a células doentes que expressam antígenos. Células que expressam antígenos sobre a superfície podem ser dirigidas por células efetoras imunes que conduzem receptores de antígenos dirigidos ao antígeno.

[0064] “Superfície celular” é utilizada de acordo com o seu significado normal na técnica e inclui, portanto, o lado externo da célula que é acessível para ligação por proteínas e outras moléculas. Antígenos são expressos sobre a superfície de células caso estejam localizados na superfície das mencionadas células e sejam acessíveis a ligação por moléculas de ligação de antígenos, tais como receptores de antígenos ou anticorpos específicos de antígenos adicionados às células. Em uma realização, antígenos expressos sobre a superfície das células são uma proteína de membrana integral que possui uma parte extracelular reconhecida por um receptor de antígenos. Receptores de antígenos são expressos sobre a superfície de células caso estejam localizados na superfície das mencionadas células e são acessíveis a ligação, por exemplo, por antígenos aos quais o

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29/131 receptor de antígenos é especificamente adicionado às células. Em uma realização, receptores de antígenos expressos sobre a superfície das células são uma proteína de membrana integral que possui um antígeno que reconhece a parte extracelular.

[0065]A expressão “parte extracelular” ou “ectodomínio”, de acordo com a presente invenção, designa uma parte de uma molécula, tal como uma proteína, que é frontal ao espaço extracelular de uma célula e, preferencialmente, é acessível a partir do lado externo da mencionada célula, por exemplo, por moléculas de ligação tais como anticorpos localizados no lado externo da célula. Preferencialmente, a expressão designa um ou mais domínios ou circuitos extracelulares, ou seus fragmentos.

[0066] Os termos “parte” ou “porção” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam um elemento contínuo ou descontínuo de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos. O termo “fragmento” designa um elemento contínuo de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos. Uma parte ou porção de uma sequência de proteínas preferencialmente compreende pelo menos 6, particularmente pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50 ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos e/ou não consecutivos da sequência de proteínas. Um fragmento de uma sequência de proteínas compreende preferencialmente pelo menos 6, particularmente pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50 ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos da sequência de proteínas. Uma parte, porção ou fragmento de uma estrutura compreende preferencialmente uma ou mais propriedades funcionais, tais como propriedades antigênicas, imunológicas e/ou de ligação, da mencionada estrutura. Uma parte de uma região variável de uma cadeia de receptores de células T, por exemplo, é preferencialmente capaz de formar um local de reconhecimento de antígenos e

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30/131 ligar antígenos. Desta forma, caso a região variável de uma cadeia de receptores de células T seja V alfa, uma de suas partes ainda é preferencialmente capaz de interagir com a V beta correspondente ou uma de suas partes, para formar um local de reconhecimento de antígenos funcional. Caso a região variável de uma cadeia de receptores de células T seja V beta, uma de suas partes ainda é preferencialmente capaz de interagir com a V alfa correspondente ou uma de suas partes, para formar um local de reconhecimento de antígenos funcional. De forma similar, uma parte de região constante de uma cadeia de receptores de células T é preferencialmente capaz de desempenhar a sua função de transmissão de sinais.

[0067] Segundo a presente invenção, um antígeno não é (substancialmente) expresso em células caso o nível de expressão esteja abaixo do limite de detecção e/ou se o nível de expressão for baixo demais para permitir a ligação por anticorpos específicos de antígenos adicionados à célula. Segundo a presente invenção, um antígeno é expresso em células caso o nível de expressão esteja acima do limite de detecção e/ou se o nível de expressão for suficientemente alto para permitir a ligação por anticorpos específicos de antígenos adicionados à célula. Preferencialmente, um antígeno expresso em uma célula é expresso ou exposto, ou seja, está presente sobre a superfície da mencionada célula e, portanto, disponível para ligação por moléculas específicas de antígenos, tais como anticorpos ou receptores de antígenos adicionados à célula.

[0068] “Célula alvo” deverá indicar uma célula que é alvo para reação imunológica, tal como reação imunológica celular. Células alvo incluem qualquer célula indesejável, tal como célula de câncer. Em realizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa um antígeno alvo, particularmente um antígeno específico de doença, que se encontra preferencialmente presente sobre a superfície celular.

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31/131 [0069] O termo “epítopo” indica um determinante antigênico em uma molécula tal como um antígeno, ou seja, para uma parte ou fragmento da molécula que é reconhecida, ou seja, ligada pelo sistema imunológico; por exemplo, que é reconhecida por um receptor de antígenos ou anticorpo. Epítopos são, por exemplo, os locais tridimensionais discretos sobre um antígeno, que são reconhecidos pelo sistema imunológico. Epítopos normalmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epítopos de conformação e sem conformação são diferenciados porque a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida na presença de solventes de desnaturação. Preferencialmente, um epítopo é capaz de permitir reação imunológica contra o antígeno ou uma célula que expressa o antígeno. Preferencialmente, o termo designa uma parte imunogênica de um antígeno. Um epítopo de proteína, tal como um antígeno de tumor, compreende preferencialmente uma parte contínua ou descontínua da mencionada proteína e possui preferencialmente de 5 a 100, preferencialmente 5 a 50, de maior preferência de 8 a 30 e, de preferência superior, de 10 a 25 aminoácidos de comprimento; o epítopo pode ter preferencialmente, por exemplo, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21,22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento.

[0070] “Processamento de antígenos” designa a degradação de antígenos em produtos de processamento, que são fragmentos do mencionado antígeno (por exemplo, a degradação de proteínas em peptídeos) e a associação de um ou mais desses fragmentos (por exemplo, por meio de ligação) com moléculas de MHC para apresentação por células, preferencialmente células que apresentam antígenos para células T específicas.

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32/131 [0071] Células que apresentam antígenos (APC) são células que exibem antígenos no contexto de complexo importante de histocompatibilidade (MHC) sobre a sua superfície. Células T podem reconhecer este complexo utilizando o seu receptor de células T (TCR). Células que apresentam antígenos processam antígenos e os apresentam a células T. Segundo a presente invenção, a expressão “célula que apresenta antígenos” inclui células que apresentam antígenos profissionais e células que apresentam antígenos não profissionais.

[0072] Células que apresentam antígenos profissionais são muito eficientes na internalização de antígenos, seja por meio de fagocitose ou de endocitose mediada por receptor, e exibem em seguida um fragmento do antígeno, ligado a uma molécula MHC classe II, sobre a sua membrana. A célula T reconhece e interage com o complexo de moléculas de MHC classe II de antígeno sobre a membrana da célula que apresenta antígenos. Um sinal coestimulante adicional é produzido em seguida pela célula que apresenta antígenos, gerando ativação da célula T. A expressão de moléculas coestimulantes é uma característica determinante de células que apresentam antígenos profissionais. Os principais tipos de células que apresentam antígenos profissionais são células dendríticas, que possuem a faixa mais ampla de apresentação de antígenos e são provavelmente as células que apresentam antígenos mais importantes, macrófagos, células B e certas células epiteliais ativadas.

[0073] Células que apresentam antígenos não profissionais não expressam constitutivamente as proteínas MHC classe II necessárias para interação com células T que nunca receberam tratamento; estas somente são expressas mediante estímulo das células que apresentam antígenos não profissionais por certas citocinas tais como IFNy.

[0074] Células dendríticas (DCs) são populações de leucócitos

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33/131 que apresentam antígenos capturados em tecidos periféricos para células T por meio de processos de apresentação de antígenos MHC classe I e II. Sabe-se bem que células dendríticas são indutores potentes de reações imunológicas e a ativação dessas células é uma etapa fundamental para a indução de imunidade antitumoral. Células dendríticas e progenitores podem ser obtidos a partir de sangue periférico, medula óssea, células que se infiltram em tumores, células que se infiltram em tecidos peritumorais, nódulos linfáticos, baço, pele, sangue de cordão umbilical ou qualquer outro fluido ou tecido apropriado. Células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo, por exemplo, por meio da adição de uma combinação de citocinas tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e/ou TNFa a cultivos de monócitos colhidos de sangue periférico. Alternativamente, células positivas para CD34 colhidas de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas por meio de adição ao meio de cultivo de combinações de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligante CD40, LPS, ligante flt3 e/ou outro(s) composto(s) que induz(em) a diferenciação, maturação e proliferação de células dendríticas. Células dendríticas são convenientemente classificadas como células “maduras” e “imaturas”, que podem ser utilizadas como forma simples de discriminação entre dois fenótipos bem caracterizados. Essa nomenclatura não deverá ser interpretada, entretanto, como excluindo todos os estágios de diferenciação intermediários possíveis. Células dendríticas imaturas são caracterizadas como células que apresentam antígenos com alta capacidade de absorção e processamento de antígenos, correlacionada à alta expressão de receptor de Fcy e receptor de manose. O fenótipo maduro é tipicamente caracterizado por expressão mais baixa desses marcadores, mas pela alta expressão de moléculas da superfície celular responsáveis pela ativação de células T, tais como MHC classe I e classe II, moléculas de adesão (por exemplo, CD54 e CD11) e moléculas coestimulantes (por exemplo, CD40, CD80, CD86 e 4-1

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BB). A maturação de células dendríticas é indicada como a situação da ativação de células dendríticas à qual essas células dendríticas que apresentam antigenos geram primer de células T, enquanto a apresentação por células dendríticas imaturas resulta em tolerância. A maturação de células dendríticas é principalmente causada por biomoléculas com características microbianas detectadas por receptores inatos (DNA bacteriano, DNA viral, endotoxinas etc.), citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-1, IFNs), ligação de CD40 sobre a superfície de células dendríticas por CD40L e substâncias liberadas de células que sofrem morte celular desgastante. As células dendríticas podem ser derivadas por meio do cultivo de células da medula óssea in vitro com citocinas, tais como fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e fator alfa de necrose tumorosa.

[0075] O termo “imunogenicidade” designa a eficiência relativa de antigenos para induzir reação imunológica.

[0076] A expressão “funções efetoras imunes” no contexto da presente invenção inclui quaisquer funções mediadas por componentes do sistema imunológico que resultam, por exemplo, na morte de células doentes tais como células de tumores, ou na inibição do crescimento de tumores e/ou inibição do desenvolvimento de tumores, incluindo a inibição de disseminação de tumores e metástase. Preferencialmente, as funções efetoras imunes no contexto da presente invenção são funções efetoras mediadas por células T. Essas funções compreendem, no caso de célula T auxiliar (célula T CD4⁺), a liberação de citocinas tais como Interleucina 2 e/ou a ativação de linfócitos CD8⁺ (CTLs) e/ou células B e, no caso de CTL, a eliminação de células, ou seja, células caracterizadas pela expressão de um antígeno, por exemplo, por meio da apoptose ou lise celular mediada por perforina, produção de citocinas tais como IFN-γ e TNF-α e morte citolítica específica de células alvo que expressam antigenos.

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35/131 [0077] A expressão “célula imunorreativa” ou “célula efetora imune”, no contexto da presente invenção, designa uma célula que exerce funções efetoras durante uma reação imunológica. “Célula imunorreatora” é preferencialmente capaz de ligar um antígeno tal como um antígeno expresso sobre a superfície de uma célula e mediar reação imunológica. Essas células secretam, por exemplo, citocinas e/ou quemocinas, matam micróbios, secretam anticorpos, reconhecem células cancerosas ou infectadas e opcionalmente eliminam essas células. Células imunorreativas compreendem, por exemplo, células T (células T citotóxicas, células T auxiliares e células T infiltrantes de tumores), células B, células matadoras naturais, neutrófilos, macrófagos e células dendríticas. Preferencialmente, no contexto da presente invenção, “células imunorreativas” são células T, preferencialmente células T CD4⁺ e/ou CD8⁺. Segundo a presente invenção, a expressão “célula imunorreativa” também inclui uma célula que pode amadurecer em uma célula imune (tal como célula T, particularmente célula auxiliar T ou célula T citolítica) com estímulo apropriado. Células imunorreativas compreendem células tronco hematopoiéticas CD34⁺, células T maduras e imaturas e células B maduras e imaturas. A diferenciação de precursores de células T em células T citolíticas, quando expostas a antígenos, é similar à seleção clonal do sistema imunológico.

[0078] Preferencialmente, “célula imunorreativa” ou “célula efetora imune” reconhece um antígeno com algum grau de especificidade, particularmente quando presente sobre a superfície de células que apresentam antígenos ou células doentes, tais como células de câncer. Preferencialmente, o mencionado reconhecimento permite que a célula que reconhece antígeno seja reativa. Caso a célula seja uma célula T auxiliar (célula T CD4⁺), essa capacidade de reação ou reatividade pode envolver a liberação de citocinas e/ou a ativação de linfócitos CD8⁺ (CTLs) e/ou células B. Caso a célula seja

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CTL, essa capacidade de reação ou reatividade pode envolver a eliminação de células, ou seja, células caracterizadas pela expressão de antígenos, por exemplo, por meio de apoptose ou lise celular mediada por perforina. Segundo a presente invenção, a capacidade de reação de CTL pode incluir fluxo de cálcio sustentado, divisão celular, produção de citocinas tais como IFN-γ e TNF-α, regulagem para cima de marcadores de ativação tais como CD44 e CD69 e morte citolítica específica de células alvo que expressam antígenos. A capacidade de reação de CTL pode ser também determinada utilizando um relator artificial que indica com precisão a capacidade de reação de CTL. Esses CTLs que reconhecem antígenos e são reativos são também denominados “CTLs reativos a antígenos” no presente.

[0079] “Célula linfoide” é uma célula que, opcionalmente após modificação apropriada, tal como após a transferência de receptores de células T ou receptores de antígenos, é capaz de produzir reação imunológica, tal como reação imunológica celular, ou uma célula precursora dessa célula e inclui linfócitos, preferencialmente linfócitos T, linfoblastas e células de plasma. Células linfoides podem ser células imunorreativas ou células efetores imunes, conforme descrito no presente. Células linfoides preferidas são células T que podem ser modificadas para expressar receptores de células T ou receptores de antígenos sobre a superfície celular. Em uma realização, a célula linfoide não possui expressão endógena de receptores de células T.

[0080] As expressões “célula T” e “linfócito T” são utilizadas de forma intercambiável no presente e incluem células auxiliares T (células T CD4+) e células T citotóxicas (CTLs, células T CD8+) que compreendem células T citolíticas.

[0081] Células T pertencem a um grupo de glóbulos brancos do sangue conhecidos como linfócitos e desempenham papel central na imunidade mediada por células. Elas podem ser diferenciadas de outros tipos

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37/131 de linfócitos, tais como células B e células matadoras naturais, pela presença de um receptor especial sobre a sua superfície celular denominada receptores de células T (TCR). O timo é o órgão principal responsável pela maturação de células T. Diversos subconjuntos diferentes de células T foram descobertos, cada qual com uma função distinta.

[0082] Células auxiliares T assistem outros glóbulos brancos do sangue em processos imunológicos, incluindo a maturação de células B em células de plasma e a ativação de células T citotóxicas e macrófagos, entre outras funções. Essas células são também conhecidas como células T CD4+ porque expressam a proteína CD4 sobre a sua superfície. Células T auxiliares tornam-se ativadas quando são apresentadas com antígenos de peptídeos por moléculas de MHC classe II que são expressas sobre a superfície de células que apresentam antígenos (APCs). Após a ativação, elas se dividem rapidamente e secretam pequenas proteínas denominadas citocinas que regulam ou assistem a reação imunológica ativa.

[0083] Células T citotóxicas destroem células infectadas por vírus e células de tumores e são também relacionadas à rejeição de transplantes. Essas células são também conhecidas como células T CD8+ porque expressam a glicoproteína CD8 na sua superfície. Essas células reconhecem os seus alvos por meio de ligação a antígeno associado a MHC classe I, que está presente sobre a superfície de quase todas as células do corpo.

[0084] A maior parte das células T possui um receptor de células T (TCR) existente na forma de complexo de diversas proteínas. O receptor de células T real é composto de duas cadeias de peptídeos separadas, que são produzidas a partir dos genes receptores de células T independentes alfa e beta (TCRa and TCR3) e são denominadas cadeias de TCR α e β. Células T γδ (células T gama delta) representam um subconjunto pequeno de células T que possuem um receptor de células T (TCR) distinto sobre a sua superfície.

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Em células T γδ, entretanto, ο TCR é composto de uma cadeia γ e uma cadeia δ. Este grupo de células T é muito menos comum (2% das células T totais) que as células T αβ.

[0085] Cada cadeia de um receptor de células T é composta de dois domínios extracelulares: região variável (V) e região constante (C). A região constante é próxima à membrana celular, seguida por uma região transmembrana e uma extremidade citoplasmática curta, enquanto a região variável liga-se ao complexo de peptídeo/MHC. Para o propósito da presente invenção, a expressão “região constante de cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes” também inclui realizações nas quais a região constante de uma cadeia de receptores de células T é (do terminal N para o terminal C) seguida por uma região transmembranas e uma extremidade citoplasmática, tal como uma região transmembrana e uma extremidade citoplasmática que são ligadas naturalmente à região constante de uma cadeia de receptores de células T.

[0086] Todas as células T originam-se de células tronco hematopoiéticas na medula óssea. Progenitores hematopoiéticos derivados de células tronco hematopoiéticas povoam o timo e expandem-se por meio de divisão celular para gerar grande população de timócitos imaturos. Os primeiros timócitos não expressam CD4 nem CD8 e são, portanto, classificados como células duplas negativas (CD4-CD8-). À medida que eles progridem ao longo do seu desenvolvimento, eles se tornam timócitos duplos positivos (CD4+CD8+) e, por fim, amadurecem em timócitos positivos isolados (CD4+CD8- ou CD4-CD8+), que são liberados em seguida do timo para tecidos periféricos.

[0087] Células T podem ser geralmente preparadas in vitro ou ex vivo, utilizando procedimentos padrão. Células T podem ser isoladas, por exemplo, a partir de medula óssea, sangue periférico ou uma fração de medula

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39/131 óssea ou sangue periférico de mamíferos, tais como pacientes, utilizando um sistema de separação celular disponível comercialmente. Alternativamente, células T podem ser derivadas de seres humanos, animais não humanos, linhagens celulares ou culturas relacionadas ou não relacionadas. Uma amostra que compreende células T pode ser, por exemplo, células mononucleares do sangue periférico (PBMC).

[0088] As células T a serem utilizadas de acordo com a presente invenção podem expressar um receptor de células T endógeno ou podem não possuir expressão de receptor de células T endógeno.

[0089] Ácidos nucleicos, tais como RNA que codifica um receptor de antígenos, podem ser introduzidos em células T ou outras células com potencial lítico, particularmente células linfoides.

[0090] A expressão “receptor de antígenos dirigido a antígeno” ou similar designa um receptor de antígenos que, quando presente em uma célula efetora imune tal como célula T, reconhece o antígeno, por exemplo, sobre a superfície de células que apresentam antígenos ou células doentes, tais como células de câncer, de tal forma que a célula efetora imune seja estimulada, receba primer e/ou seja expandida ou exerça funções efetoras de células efetoras imunes conforme descrito acima.

[0091] A expressão “célula T específica de antígeno” ou expressões similares designam células T que, particularmente quando recebem receptores de antígenos, reconhecem o antígeno ao qual o receptor de antígenos é dirigido, tal como sobre a superfície de células que apresentam antígenos ou células doentes tais como células de câncer, e preferencialmente exercem funções efetoras de células T conforme descrito acima. Células T e outras células linfoides são consideradas específicas para antígenos caso as células matem células alvo que expressam antígenos. A especificidade de células T pode ser avaliada utilizando qualquer um dentre uma série de

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40/131 métodos padrão, por exemplo, dentro de um teste de liberação de cromo ou teste de proliferação. Alternativamente, a síntese de linfocinas (tais como interferona-γ) pode ser medida.

[0092] A expressão “complexo importante de histocompatibilidade” e a abreviação “MHC” incluem moléculas de MHC classe I e MHC classe II e referem-se a um complexo genético que ocorre em todos os vertebrados. Proteínas ou moléculas de MHC são importantes para a sinalização entre linfócitos e células que apresentam antígenos ou células doentes em reações imunológicas, em que as proteínas ou moléculas de MHC ligam peptídeos e os apresentam para reconhecimento por receptores de células T. As proteínas codificadas pelo MHC são expressas sobre a superfície das células e exibem autoantígenos (fragmentos de peptídeos da própria célula) e antígenos que não são próprios (por exemplo, fragmentos de micro-organismos invasores) para uma célula T.

[0093] Segundo a presente invenção, a expressão “receptor de antígenos” inclui receptores elaborados, que conferem especificidade arbitrária, tal como a especificidade de um anticorpo monoclonal para uma célula efetora imune, tal como uma célula T. Desta forma, grande quantidade de células T específicas de antígenos pode ser gerada para transferência celular adotiva. Receptores de antígenos de acordo com a presente invenção podem, portanto, estar presentes sobre células T, por exemplo, no lugar ou adicionalmente ao próprio receptor de células T da célula T. Essas células T não exigem necessariamente processamento e apresentação de antígenos para reconhecimento da célula alvo, mas sim podem reconhecer, preferencialmente com especificidade, qualquer antígeno presente em uma célula alvo. Preferencialmente, o mencionado receptor de antígenos é expresso sobre a superfície das células. Para o propósito da presente invenção, células T que compreendem um receptor de antígenos são compreendidas pela expressão

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41/131 “célula T” conforme utilizado no presente. Especificamente, segundo a presente invenção, a expressão “receptor de antígenos” inclui receptores artificiais que compreendem uma única molécula ou um complexo de moléculas que reconhecem, ou seja, ligam-se a uma estrutura alvo (por exemplo, um antígeno) em uma célula alvo, tal como uma célula de câncer (por exemplo, por meio de ligação de um local de ligação de antígenos ou domínio de ligação de antígenos a um antígeno expresso sobre a superfície da célula alvo) e pode fornecer especificidade para células efetoras imunes, tais como células T que expressam o mencionado receptor de antígenos sobre a superfície celular. Preferencialmente, o reconhecimento da estrutura alvo por um receptor de antígenos resulta na ativação de células efetoras imunes que expressam o mencionado receptor de antígenos. Um receptor de antígenos pode compreender uma ou mais unidades de proteínas, em que as mencionadas unidades de proteínas compreendem um ou mais domínios conforme descrito no presente. A expressão “receptor de antígenos” preferencialmente não inclui receptores de células T. Segundo a presente invenção, a expressão “receptor de antígenos” é preferencialmente sinônimo das expressões “receptor de antígenos quiméricos (CAR)”, “receptor de células T quiméricas” e “receptor de células T artificiais”.

[0094] Segundo a presente invenção, antígenos podem ser reconhecidos por um receptor de antígenos por meio de quaisquer domínios de reconhecimento de antígenos (também denominados no presente simplesmente “domínios”) capazes de formar um local de ligação de antígenos tal como por meio de partes de ligação de antígenos de anticorpos e receptores de células T que podem residir em diferentes cadeias de peptídeos. Em uma realização, os dois domínios que formam um local de ligação de antígenos são derivados de imunoglobulina. Em outra realização, os dois domínios que formam um local de ligação de antígenos são derivados de um receptor de

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42/131 células T. São particularmente preferidos domínios variáveis de anticorpos, tais como fragmentos variáveis de fita simples (scFv) derivados de anticorpos monoclonais e domínios variáveis de receptores de células T, particularmente cadeias isoladas alfa e beta de TCR. De fato, quase tudo o que liga um dado alvo com alta afinidade pode ser utilizado como um domínio de reconhecimento de antígenos.

[0095] Em uma realização, um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção compreende pelo menos quatro domínios variáveis de imunoglobulina que formam pelo menos dois locais de ligação, em que os dois locais de ligação podem ligar-se a epítopos idênticos ou diferentes, em que esses epítopos podem estar localizados sobre antígenos idênticos ou diferentes. Em uma realização, o receptor de antígenos compreende um domínio (ou região) variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) com especificidade para primeiro epítopo (VH(1)), um domínio (ou região) variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) com especificidade para primeiro epítopo (VL(1)), um domínio (ou região) variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) com especificidade para segundo epítopo (VH(2)) e um domínio (ou região) variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) com especificidade para segundo epítopo (VL(2)), em que os primeiro e segundo epítopos podem ser idênticos ou diferentes e podem estar localizados sobre antígenos idênticos ou diferentes. Em uma realização, VH(1) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(1) e VH(2) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(2), enquanto VH(1) não é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(2) e VH(2) não é capaz de formar um local de ligação de antígenos com VL(1). Em outra realização, entretanto, VH(1) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(1) bem como VL(2) e VH(2) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(2), bem como

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VL(1). Nesta última realização, VH(1) e VH(2) podem ser idênticos ou pelo menos derivados da mesma imunoglobulina e VL(1) e VL(2) podem ser idênticos ou pelo menos derivados da mesma imunoglobulina.

[0096] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um receptor de antígenos, também denominado receptor de antígenos combinatório no presente, em que o receptor compreende primeira cadeia de peptídeos e segunda cadeia de peptídeos e a primeira cadeia de peptídeos compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; e a segunda cadeia de peptídeos compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; em que o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com um dos domínios da segunda cadeia de peptídeos, primeiro local de ligação de antígenos; e o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o outro domínio da segunda cadeia de peptídeos, segundo local de ligação de antígenos.

[0097] Em uma realização, o receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada conectado a um domínio variável de cadeia leve sobre cada uma das duas cadeias de peptídeos, em que a formação de dois locais de ligação de antígenos tem lugar por meio de interação entre um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve sobre cadeias de peptídeos diferentes. Em uma realização, o receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreende duas cadeias de peptídeos, em que uma cadeia de peptídeo compreende VL(1) e VH(2) e a outra cadeia de polipeptídeos compreende VH(1) e VL(2). Em outra realização, o receptor

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44/131 de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada conectado a um domínio variável de cadeia pesada sobre uma cadeia de peptídeos e um domínio variável de cadeia leve conectado a um domínio variável de cadeia leve sobre a outra cadeia de peptídeos, em que a formação de dois locais de ligação de antígenos tem lugar por meio de interação entre um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve sobre cadeias de peptídeos diferentes. Em uma realização, o receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreende duas cadeias de peptídeos, em que uma cadeia de peptídeos compreende VH(1) e VH(2) e a outra cadeia de peptídeos compreende VL(1) e VL(2).

[0098] Em uma realização, o receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreende primeira cadeia de peptídeos, em que a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) são preferencialmente dispostas, do terminal N para o terminal C, na ordem VH(1)-VL(2), e uma segunda cadeia de peptídeos, em que a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) são preferencialmente dispostas, do terminal N para o terminal C, na ordem VL(1 )VH(2). A região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores encontramse preferencialmente em localização C-terminal para a disposição de regiões variáveis. A região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores preferencialmente compreende uma região variável de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes localizada em uma das cadeias de peptídeos e uma região variável de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de cadeia beta de receptor de

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45/131 células T localizada sobre a outra das cadeias de peptídeos. Em uma realização, a região variável de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e a região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes compreende a cadeia alfa de um receptor de células T. Em uma realização, a região variável de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e a região constante de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes compreende a cadeia beta de um receptor de células T. A cadeia alfa de um receptor de células Tea cadeia beta de um receptor de células T são preferencialmente do mesmo receptor de células T.

[0099] Em uma realização, o receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreende primeira cadeia de peptídeos, em que a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) são preferencialmente dispostas, do terminal N para o terminal C, na ordem VH(1)-VH(2), e uma segunda cadeia de peptídeos, em que a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) são preferencialmente dispostas, do terminal N para o terminal C, na ordem VL(1 )VL(2). A região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores encontramse preferencialmente em localização C-terminal para a disposição de regiões variáveis. A região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores preferencialmente compreende uma região variável de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes localizada em uma das cadeias de peptídeos e uma região variável de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes localizada sobre a outra das cadeias de peptídeos. Em uma realização, a região variável de cadeia alfa de receptor de

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46/131 células T ou uma de suas partes e a região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes compreende a cadeia alfa de um receptor de células T. Em uma realização, a região variável de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e a região constante de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes compreende a cadeia beta de um receptor de células T. A cadeia alfa de um receptor de células Tea cadeia beta de um receptor de células T são preferencialmente do mesmo receptor de células T.

[00100] Receptores de antigenos de acordo com a presente invenção contêm pelo menos dois locais de ligação de antigenos e, portanto, são pelo menos bivalentes. Conforme indicado acima, os locais de ligação dos receptores de antigenos de acordo com a presente invenção podem ligar-se a epítopos idênticos ou diferentes, em que os epítopos podem estar localizados nos mesmos antigenos ou em antigenos diferentes. Caso os locais de ligação liguem-se aos mesmos epítopos, particularmente sobre o mesmo antígeno, os dois locais de ligação podem ser idênticos ou essencialmente idênticos e/ou podem ser formados por domínios idênticos ou essencialmente idênticos, em que esses domínios idênticos ou essencialmente idênticos podem ser derivados, por exemplo, da mesma imunoglobulina. Caso os locais de ligação liguem-se a epítopos diferentes, em antigenos idênticos ou diferentes, os dois locais de ligação são diferentes e formados por domínios diferentes, em que esses domínios diferentes podem ser derivados de imunoglobulinas diferentes. No caso desses domínios diferentes, prefere-se que os domínios que possuem especificidades de epítopos diferentes não interajam ou não interajam substancialmente entre si, ou seja, VH(1) não é capaz de interagir e formar um local de ligação de antigenos com VL(2) e VH(2) não é capaz de interagir e formar um local de ligação de antigenos com VL(1). Consequentemente, VH(1) interage e forma um local de ligação de antigenos com VL(1) e VH(2) interage

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47/131 e forma um local de ligação de antígenos com VL(2). Caso um receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção compreenda duas cadeias de peptídeos, em que uma cadeia de peptídeos compreende VH(1) e VL(2) e a outra cadeia de peptídeos compreende VH(2) e VL(1), como resultado, as cadeias de peptídeos não são capazes de formar locais de ligação de antígenos por meio da interação intramolecular de domínios.

[00101] Os dois domínios de um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção que formam um local de ligação de antígenos podem também ser derivados de um receptor de células T e podem ser fragmentos ou suas partes que mantêm a ligação específica de antígenos, particularmente a ligação ao complexo de peptídeo e MHC, tais como as regiões variáveis de receptores de células T.

[00102] Segundo a presente invenção, a expressão “região variável de receptores de células T” designa os domínios variáveis das cadeias de TCR. A região variável da cadeia α e cadeia β de TCR possui três regiões de determinação da complementaridade (CDRs) ou hipervariáveis, enquanto a região variável da cadeia β possui uma área adicional de hipervariabilidade (HV4) que normalmente não entra em contato com antígenos e, portanto, não é considerada CDR. CDR3 é a CDR principal, responsável pelo reconhecimento de antígenos processados, embora também se tenha demonstrado que CDR1 da cadeia α interage com a parte N-terminal do peptídeo antigênico, enquanto CDR1 da cadeia β interage com a parte C-terminal do peptídeo. Acredita-se que CDR2 reconheça o MHC. Não se acredita que CDR4 da cadeia β participe do reconhecimento de antígenos, mas demonstrou-se que ele interage com superantígenos.

[00103] A descrição acima referente a domínios variáveis de imunoglobulina aplica-se, de forma correspondente, a domínios variáveis de receptores de células T. Receptores de antígenos de acordo com a presente

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48/131 invenção no lugar de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) com especificidade para primeiro epítopo (VH(1)) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) com especificidade para primeiro epítopo (VL(1)) pode compreender um domínio variável de cadeia α de TCR de um TCR com especificidade para um primeiro epítopo e um domínio variável de cadeia β de TCR de um TCR com especificidade para primeiro epítopo. Alternativa ou adicionalmente, receptores de antígenos de acordo com a presente invenção no lugar de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) com especificidade para segundo epítopo (VH(2)) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) com especificidade para segundo epítopo (VL(2)) pode compreender um domínio variável de cadeia a de TCR de um TCR com especificidade para segundo epítopo e um domínio variável de cadeia β de TCR de um TCR com especificidade para segundo epítopo.

[00104] Como cada local de ligação de antígenos é formado a partir de dois domínios, cada domínio pode compreender uma parte ou fragmento de imunoglobulina ou receptor de células T, respectivamente. A parte individual ou fragmento isolado pode não ser capaz de ligar o antígeno, mas, quando as duas partes ou fragmentos individuais associam-se, juntas elas formam ou recriam a estrutura de ligação de antígenos da imunoglobulina ou receptor de células T original e, portanto, são capazes de ligar o mesmo antígeno, preferencialmente com a mesma afinidade.

[00105] Após o reconhecimento de antígenos, os receptores preferencialmente se reúnem e um sinal é transmitido para a célula. Neste particular, “domínio de transmissão de sinais imunorreceptores” ou “domínio de sinalização de células T” é um domínio envolvido na transmissão de sinais de ativação para a célula T após a ligação do antígeno. Essa transmissão de sinais pode ser capacitada pelos receptores de antígenos de acordo com a

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49/131 presente invenção, que compreendem uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores de células T ou uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores Fc de células imunes ou uma parte da região constante ou invariável, tal como uma região constante de uma cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes, em uma cadeia de peptídeos e que compreende a região constante ou invariável correspondente de uma cadeia de receptores de células T ou região constante ou invariável correspondente de uma cadeia de receptores Fc de células imunes ou uma parte da região constante ou invariável, tal como uma região constante de uma cadeia beta de receptores de células T ou uma de suas partes, sobre a outra cadeia de peptídeos. Neste particular, o complexo de CD3 indica um antígeno que é expresso sobre células T humanas maduras, timócitos e um subconjunto de células matadoras naturais como parte do complexo de receptores de células T (TCR) multimoleculares. O correceptor de células T é um complexo de proteínas e é composto de quatro cadeias distintas. Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3Õ e duas cadeias CD3s. Essas cadeias associam-se ao receptor de células T (TCR) e à cadeia ζ para gerar sinais de ativação em linfócitos T. O TCR, a cadeia ζ e moléculas CD3 juntas compreendem o complexo de TCR. CD3 é responsável pela transdução de sinais do TCR. Conforme descrito por Lin e Weiss, Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001), a ativação do complexo de TCR por meio da ligação de epítopos de antígenos específicos apresentados por MHC resulta na fosforilação de motivos de ativação com base em tirosina imunorreceptores (ITAMs) por quinases da família de Src, que acionam o recrutamento de quinases adicionais, o que resulta na ativação de células T, incluindo a liberação de Ca²⁺. A formação de conjuntos de CD3 em células T, por exemplo, por anticorpos anti-CD3 imobilizados, gera ativação de células T similar à ativação do receptor de células T, mas independente da sua especificidade

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50/131 típica de clone.

[00106] O domínio de transmissão de sinais receptores de antígenos preferencialmente serve pelo menos para interagir com o complexo de transdução de sinais celulares nativos, tais como o complexo de CD3, que é responsável pela transmissão do sinal de ligação de antígenos a um receptor de antígenos na célula, o que resulta na ativação de células imunes. A identidade do domínio de transmissão de sinais é limitada apenas porque possui a capacidade de interagir com o complexo de transdução de sinais nativos para induzir a ativação da célula imune mediante ligação do antígeno ao receptor de antígenos.

[00107] Preferencialmente, o domínio de transmissão de sinais em uma cadeia de peptídeos formará um dímero com o domínio de transmissão de sinais na segunda cadeia, por exemplo, por meio de pontes de dissulfeto. Domínios de transmissão de sinais preferidos podem compreender uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores de células T ou uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores Fc de células imunes ou uma parte da região constante ou invariável. Domínios de transmissão de sinais preferidos podem compreender a região constante das cadeias alfa, beta, gama ou delta de um receptor de células T ou uma de suas partes, bem como as regiões invariáveis D2 ou D3 do domínio constante de um receptor Fc de células imunes ou uma de suas partes. Em realização preferida, a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes. Nesta realização, a primeira cadeia de peptídeos compreende preferencialmente uma região variável de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia beta de receptor de células T ou

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51/131 uma de suas partes, em que as regiões variáveis estão localizadas no terminal N das regiões constantes. Alternativamente, a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes. Nesta realização, a primeira cadeia de peptídeos compreende preferencialmente uma região variável de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes, em que as regiões variáveis estão localizadas no terminal N das regiões constantes. Em outra realização, a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia gama de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia delta de receptor de células T ou uma de suas partes. Nesta realização, a primeira cadeia de peptídeos compreende preferencialmente uma região variável de cadeia gama de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia delta de receptor de células T ou uma de suas partes, em que as regiões variáveis estão localizadas no terminal N das regiões constantes. Alternativamente, a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia delta de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região constante de cadeia gama de receptor de células T ou uma de suas partes. Nesta realização, a primeira cadeia de peptídeos compreende preferencialmente uma região variável de cadeia delta de receptor de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia gama de receptor de células T ou uma de suas partes, em que as regiões variáveis estão localizadas no terminal N das regiões constantes. Opcionalmente, os domínios de

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52/131 transmissão de sinais ou a região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes podem ser modificados de forma a criar ligações de dissulfeto adicionais entre as cadeias, gerando formação de dímeros mais eficaz e maior estabilidade do dímero.

[00108] Embora sem desejar limitações a um mecanismo de ação específico, acredita-se que as duas cadeias de peptídeos do receptor de antígenos de acordo com a presente invenção, quando expressas sobre a superfície de células imunes, formem um dímero devido a interações (por exemplo, ligação de dissulfeto) pelo menos entre os domínios de transmissão de sinais imunorreceptores individuais sobre as duas cadeias e também formem um complexo com o complexo de CD3 endógeno envolvido na transdução de sinais receptores de células T fisiológicos. A presente invenção pode também incluir, entretanto, a fusão direta a Οϋ3ζ ou qualquer outro domínio de sinalização de células imunes (CD3, subunidade FcyR de CD3) no lugar de domínios Ca e Οβ de TCR. Mediante ligação de antígenos, acredita-se que um sinal seja transmitido para a célula, causando a ativação da célula imune e a geração de reação imunológica específica de antígenos. Além disso, acredita-se que a ligação de antígenos intercadeias forneça um módulo de transdução de sinais CD3 endógenos-receptor de antígenos-antígenos mais estável, cuja maior estabilidade permite, por sua vez, estímulo mais eficaz da reação imunológica específica de antígenos, em comparação com receptores monovalentes e receptores bivalentes capazes somente de ligação de antígenos intracadeias. Também se acredita que essa maior estabilidade permita a opção de uso de apenas domínios de transmissão de sinais imunorreceptores de origem humana (por exemplo, substituição mínima ou nenhuma de sequências de aminoácidos derivadas de seres humanos por uma sequência de aminoácidos derivada de outras espécies, tais como camundongos). Desta forma, qualquer potencial reação imunológica indesejada

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53/131 contra o próprio receptor de antígenos pode ser evitada.

[00109] Receptores de antígenos de acordo com a presente invenção ou suas cadeias de peptídeos podem, além dos domínios que formam os locais de ligação de antígenos, regiões variáveis de cadeias de receptores de células T ou uma de suas partes e domínios de transmissão de sinais imunorreceptores, incluindo Οϋ3ζ ou qualquer outro domínio de sinalização de células imunes, também compreender um ou mais domínios de coestímulo. Os domínios de coestímulo servem para aumentar a proliferação e a sobrevivência das células T, tais como células T citotóxicas, mediante ligação do receptor de antígenos a uma porção dirigida. A identidade dos domínios de coestímulo é somente limitada porque eles possuem a capacidade de aumentar a proliferação e a sobrevivência celular mediante ligação da porção dirigida pelo receptor de antígenos. Domínios de coestímulo apropriados incluem CD28, CD137 (4-1 BB), um membro da família de receptores de fator da necrose tumorosa (TNF), CD134 (0X40), um membro da superfamília de TNFR de receptores e CD278 (ICOS), uma molécula coestimulante da superfamília de CD28 expressa sobre células T ativadas. Os técnicos no assunto compreenderão que variantes de sequências desses domínios de coestímulo indicados podem ser utilizadas sem prejudicar a presente invenção, em que as variantes possuem atividade idêntica ou similar ao domínio no qual são modeladas. Essas variantes terão identidade de sequências de pelo menos cerca de 80% com a sequência de aminoácidos do domínio do qual são derivadas. Em algumas realizações da presente invenção, as construções de receptores de antígenos ou suas cadeias de peptídeos compreendem dois domínios de coestímulo. Embora as combinações específicas incluam todas as variações possíveis dos quatro domínios indicados, exemplos específicos incluem CD28+CD137 (4-1 BB) e CD28+CD134 (0X40).

[00110] Os receptores de antígenos de acordo com a

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54/131 presente invenção ou suas cadeias de peptídeos podem compreender um ou mais domínios de coestímulo e domínios de transmissão de sinais imunorreceptores, ligados na direção N-terminal para C-terminal. Os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção ou suas cadeias de peptídeos, entretanto, não são limitados a essa disposição e outras disposições são aceitáveis e incluem domínios de transmissão de sinais imunorreceptores e um ou mais domínios de coestímulo.

[00111] Compreender-se-á que, como os domínios que formam os locais de ligação de antígenos devem ser livres para ligar antígeno, a colocação desses domínios na proteína de fusão geralmente fará com que seja atingida a exibição da região sobre o lado externo da célula. Da mesma forma, como os domínios de coestímulo e os domínios de transmissão de sinais imunorreceptores servem para induzir a atividade e a proliferação das células T, a proteína de fusão geralmente exibirá esses domínios no interior da célula. Os receptores de antígenos podem incluir elementos adicionais, tais como um peptídeo de sinal para garantir a exportação adequada da proteína de fusão para a superfície celular, um domínio transmembrana para garantir que a proteína de fusão seja mantida como proteína de membrana integral e um domínio de articulação (ou região espaçadora) que forneça flexibilidade aos domínios que formam os locais de ligação de antígenos e permita forte ligação ao antígeno.

[00112] Opcionalmente, os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção podem compreender adicionalmente um ligante, em que o ligante pode ser uma sequência de aminoácidos arbitrária ou outro composto químico útil como espaçador entre sequências de aminoácidos. O ligante é geralmente projetado para fornecer flexibilidade e resistência à protease. O ligante pode estar, por exemplo, entre o primeiro e o segundo domínio na primeira cadeia de peptídeos e/ou entre o primeiro e o segundo

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55/131 domínio na segunda cadeia de peptídeos de um receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção. Opcionalmente, o ligante pode estar presente entre os domínios que formam o locais de ligação de antígenos e a região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes. Qualquer tipo de ligante conhecido na técnica que permita que os domínios formem um local de ligação de antígenos ou não interfira com a ligação de antígenos é englobado pela presente invenção. Em realizações específicas, o ligante pode ser qualquer sequência de aminoácidos arbitrária e pode ter pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou pelo menos 100 resíduos de aminoácidos de comprimento. Um ligante de aminoácidos é tipicamente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina e treonina para solubilidade. Em uma realização, o ligante é uma ou mais (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) repetições de quatro resíduos de glicina seguidos por um resíduo de serina (Gly4Ser). Em certas realizações, o ligante pode ser uma região de articulação de um anticorpo ou seu fragmento.

[00113] O receptor de antígenos de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente outro domínio que ancora o receptor de antígenos sobre a membrana, tal como um domínio transmembrana clássico. Preferencialmente, o domínio transmembrana é incorporado ao domínio de transmissão de sinais ou é uma parte dele.

[00114] Em outras realizações, receptores de antígenos ou cadeias de peptídeos de receptores de antígenos de acordo com a presente invenção podem compreender adicionalmente outros domínios, tais como domínios adicionais envolvidos na ligação de antígenos ou que a aumentam, sequências de sinais para expressão ligada por membranas ou para secreção, domínios que fornecem dimerização aprimorada e um domínio transmembrana, quando já não são uma parte do domínio de transmissão de sinais imunorreceptores. Em certas realizações, o domínio transmembrana pode ser

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56/131 uma hélice alfa hidrofóbica que cobre a membrana.

[00115] Preferencialmente, uma sequência de sinais ou peptídeo de sinais é uma sequência ou peptídeo que permite passagem suficiente através do processo de secreção e expressão sobre a superfície celular, de tal forma que um receptor de antígenos, por exemplo, possa ligar um antígeno presente no ambiente extracelular. Preferencialmente, a sequência de sinais ou o peptídeo de sinal é divisível e removido das cadeias de peptídeos maduros. A sequência de sinais ou o peptídeo de sinal é preferencialmente selecionado com relação à célula ou organismo no qual as cadeias de peptídeos são produzidas.

[00116] Em realização específica, uma cadeia de peptídeos de um receptor de antígenos combinatório de acordo com a presente invenção pode compreender a estrutura: NH2-peptídeo de sinal-primeiro domínio envolvido na ligação de antígenos-ligante opcional-segundo domínio envolvido na ligação de antígenos-ligante opcional-região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes-domínio de transmissão de sinais imunorreceptores-COOH.

[00117] Exemplos de receptores de antígenos de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, os formados pelas primeira e segunda cadeias de peptídeos que possuem as estruturas relacionadas na Tabela I abaixo (em que VH é a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou uma de suas partes; VL é a região variável de cadeia leve de imunoglobulina ou uma de suas partes; V1 e V2 são as regiões variáveis de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes que formarão um dímero entre si, C1 e C2 são os domínios de transmissão de sinais imunorreceptores que formarão um dímero entre si, tais como a região constante ou invariável de uma cadeia de receptores Fc de células imunes ou a região constante ou invariável de uma cadeia de receptores de células T ou

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57/131 uma parte da região constante ou invariável). Caso C1 e C2 sejam regiões constantes de uma cadeia de receptores de células T, V1 e C1 são preferencialmente da mesma cadeia de receptores de células T e V2 e C2 são preferencialmente da mesma cadeia de receptores de células T, em que as cadeias de receptores de células T são preferencialmente do mesmo receptor de células T. Particularmente, V1-C1, em uma realização, corresponde essencialmente à sequência de uma cadeia de receptores de células T (TCR alfa ou TCR beta) e V2-C2 corresponde essencialmente à sequência da cadeia de receptores de células T complementar (TCR beta se V1 -C1 for TCR alfa ou TCR alfa se V1 -C1 for TCR beta).

Tabela I

Primeira cadeia de peptídeos	Segunda cadeia de peptídeos
VH(1)-VL(2)-V1-C1	VL(1)-VH(2)-V2-C2
VH(1)-VH(2)-V1-C1	VL(1)-VL(2)-V2-C2
VH(1)-VH(2)-V1-C1	VL(2)-VL(1)-V2-C2
VH(1)-VL(2)-V1-C1	VH(2)-VL(1)-V2-C2

[00118] Conforme definido acima, o receptor de antígenos compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) com especificidade para primeiro epítopo (VH(1)), um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) com especificidade para primeiro epítopo (VL(1)), um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) com especificidade para segundo epítopo (VH(2)) e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) com especificidade para segundo epítopo (VL(2)), em que os primeiro e segundo epítopos podem ser idênticos ou diferentes e podem estar localizados sobre os mesmos antígenos ou diferentes. Em uma realização, VH(1) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(1) e VH(2) é capaz de interagir e formar um local de ligação

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58/131 de antígenos com VL(2), enquanto VH(1) não é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(2) e VH(2) não é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(1). Em outra realização, entretanto, VH(1) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(1) bem como VL(2) e VH(2) é capaz de interagir e formar um local de ligação de antígenos com VL(2), bem como VL(1). Nesta última realização, VH(1) e VH(2) podem ser idênticos ou pelo menos derivados da mesma imunoglobulina e VL(1) e VL(2) podem ser idênticos ou pelo menos derivados da mesma imunoglobulina.

[00119] Em realizações específicas, os domínios V1 e V2 das primeira e segunda cadeias de peptídeos relacionadas na Tabela 1 são as regiões variáveis das cadeias alfa e beta de receptor de células T, respectivamente, ou uma de suas partes. Em realizações específicas, os domínios C1 e C2 das primeira e segunda cadeias de peptídeos relacionadas na Tabela 1 são as regiões constantes das cadeias alfa e beta de receptor de células T, respectivamente, ou uma de suas partes.

[00120] Em uma realização, os domínios V1 e C1 da primeira cadeia de peptídeos relacionada na Tabela 1 são as regiões variáveis e constantes da cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes. Nesta realização, os domínios V2 e C2 da segunda cadeia de peptídeos relacionada na Tabela 1 são preferencialmente as regiões variáveis e constantes da cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes.

[00121] Em uma realização, os domínios V1 e C1 da primeira cadeia de peptídeos relacionada na Tabela 1 são as regiões variáveis e constantes da cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes. Nesta realização, os domínios V2 e C2 da segunda cadeia de peptídeos relacionada na Tabela 1 são preferencialmente as regiões variáveis e constantes da cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes.

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59/131 [00122] Em realização preferida, quando os dois domínios em uma cadeia de peptídeos forem uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou uma de suas partes e os dois domínios na outra cadeia forem ambos uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina ou uma de suas partes, um ligante está presente entre o primeiro e o segundo domínio nas duas cadeias de peptídeos. O ligante pode ser uma sequência de aminoácidos arbitrária com 10 a 25 aminoácidos de comprimento, de maior preferência 15 aminoácidos de comprimento. Em realização específica, o ligante são três repetições da sequência de aminoácidos 5-mer (Gly4Ser).

[00123] Em certas realizações da presente invenção, as sequências de aminoácidos das primeira e segunda cadeias de peptídeos, tais como as que compreendem um ou mais dos domínios que formam os locais de ligação de antígenos, a região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes ou o domínio de transmissão de sinais imunorreceptores têm origem em mamíferos, preferencialmente origem em camundongos e, de maior preferência, origem humana. Em uma realização, as sequências de aminoácidos são de origem humana, mas foram murinizadas pela substituição de um ou mais aminoácidos na sequência humana com o aminoácido encontrado na posição correspondente na sequência de camundongo. Essa substituição pode fornecer maior dimerização, estabilidade ou capacidade de transmitir sinais para a célula mediante ligação de antígenos. Em ainda outra realização, as sequências de aminoácidos têm origem em camundongos e foram humanizadas.

[00124] Segundo a presente invenção, um receptor de antígenos pode substituir a função de um receptor de células T conforme descrito acima e, particularmente, pode conferir reatividade tal como atividade citolítica para uma célula tal como uma célula T conforme descrito acima. Ao contrário da ligação do receptor de células T a um complexo de MHC e

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60/131 peptídeo de antígeno conforme descrito acima, entretanto, um receptor de antígenos pode, em certas realizações, ligar-se a um antígeno, particularmente quando expresso sobre a superfície celular.

[00125] As sequências de aminoácidos das cadeias de peptídeos, incluindo quaisquer dos domínios ou ligantes, podem ser modificadas. Como apreciam os técnicos no assunto, por exemplo, as sequências das regiões variáveis de anticorpos e receptores de células T podem ser modificadas sem perder a capacidade de ligar-se a um alvo e, consequentemente, a sequência de aminoácidos dos locais de ligação de antígenos pode ser modificada de forma similar sem perder a capacidade de ligar um alvo. A sequência de aminoácidos de um domínio que forma um local de ligação de antígenos pode ser idêntica ou altamente homóloga à região variável do anticorpo do qual foi derivado. Por “altamente homólogo”, indica-se que podem ser realizadas de 1 a 5, preferencialmente de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 a 2 substituições. Em uma realização, uma cadeia de peptídeos pode incluir aminoácidos naturais e aminoácidos não naturais. Em outra realização, uma cadeia de peptídeos inclui apenas aminoácidos naturais. A expressão “aminoácido não natural” designa um aminoácido que possui estrutura diferente das 20 espécies de aminoácidos naturais. Como aminoácidos não naturais possuem estruturas similares às de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais podem ser classificados como derivados ou análogos de certos aminoácidos naturais.

[00126] Em uma realização, a sequência de aminoácidos de uma ou mais das regiões variáveis de receptores de células T ou suas partes, particularmente as que não formam os locais de ligação de antígenos, pode ser modificada a fim de eliminar a ligação (residual) ao seu antígeno. Particularmente, essa modificação “silenciosa” pode ser realizada por meio da introdução de uma ou mais mutações em CDR3 da região variável de TCR alfa

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61/131 e/ou TCR beta.

[00127] A presente invenção também engloba derivados dos receptores de antígenos e cadeias de peptídeos descritos no presente. Segundo a presente invenção, “derivados” são formas modificadas de proteínas e peptídeos. Essas modificações incluem quaisquer modificações químicas e compreendem uma ou mais substituições, exclusões e/ou adições de quaisquer moléculas associadas à cadeia de peptídeos ou receptor de antígenos, tais como carboidratos, lipídios e/ou proteínas ou peptídeos. Em uma realização, “derivados” de proteínas ou peptídeos incluem os análogos modificados resultantes da glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, palmitoilação, miristoilação, isoprenilação, lipidação, alquilação, derivação, introdução de grupos protetores/bloqueadores, divisão proteolítica ou ligação a antígenos. O termo “derivado” também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais dos mencionados receptores de antígenos e cadeias de peptídeos. Preferencialmente, um receptor de antígenos modificado ou sua cadeia de peptídeos possui maior capacidade de dimerização ou ligação e/ou maior capacidade de ativação imune.

[00128] As células utilizadas com relação ao sistema de receptor de antígenos de acordo com a presente invenção são preferencialmente células T, particularmente linfócitos citotóxicos, preferencialmente selecionadas a partir de células T citotóxicas, células matadoras naturais (NK) e células matadoras ativadas por linfocinas (LAK). Mediante ativação, cada um desses linfócitos citotóxicos aciona a destruição de células alvo. Células T citotóxicas, por exemplo, acionam a destruição de células alvo por um ou ambos os meios a seguir. Em primeiro lugar, mediante ativação, as células T liberam citotoxinas, tais como perforina, granzimas e granulisina. Perforina e granulisina criam poros na célula alvo e granzimas entram na célula e acionam um processo de caspase no citoplasma que induz

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62/131 a apoptose (morte celular programada) da célula. Em segundo lugar, a apoptose pode ser induzida por meio da interação de ligante Fas-Fas entre as células T e as células alvo. Os linfócitos citotóxicos serão preferencialmente células autólogas, embora células heterólogas ou células alogênicas possam ser utilizadas.

[00129] O termo “imunoglobulina” designa proteínas da superfamília das imunoglobulinas, preferencialmente receptores de antígenos tais como anticorpos ou o receptor de células B (BCR). As imunoglobulinas são caracterizadas por um domínio estrutural, ou seja, o domínio de imunoglobulina, que possui dobra de imunoglobulina (Ig) característica. O termo engloba imunoglobulinas ligadas a membranas, bem como imunoglobulinas solúveis. Imunoglobulinas ligadas a membranas são também denominadas imunoglobulinas da superfície ou imunoglobulinas da membrana, que geralmente são parte do BCR. Imunoglobulinas solúveis são geralmente denominadas anticorpos. Imunoglobulinas geralmente compreendem diversas cadeias, tipicamente duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas que são ligadas por meio de ligações de dissulfeto. Essas cadeias são principalmente compostas de domínios de imunoglobulina, tais como o domínio Vl (cadeia leve variável), Cl (cadeia leve constante) e os domínios Ch (cadeia pesada constante) Ch1, Ch2, Ch3 e Ch4. Existem cinco tipos de cadeias pesadas de imunoglobulina de mamíferos, ou seja, α, δ, ε, γ e μ que representam as diferentes classes de anticorpos, ou seja, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Ao contrário das cadeias pesadas de imunoglobulinas solúveis, as cadeias pesadas de imunoglobulinas da superfície ou membrana compreendem um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático curto no seu terminal carbóxi. Em mamíferos, existem dois tipos de cadeias leves, ou seja, lambda e capa. As cadeias de imunoglobulina compreendem uma região variável e uma região constante. A região constante é essencialmente conservada dentro dos

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63/131 diferentes isótipos das imunoglobulinas, em que a parte variável é altamente diversa e responsável pelo reconhecimento de antígenos.

[00130] O termo “anticorpo” designa uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. O termo “anticorpo” inclui anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos quiméricos. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação da complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de terminal amino para terminal carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo diversas células do sistema imunológico (tais como células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[00131] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa uma preparação de moléculas de anticorpos com composição molecular única. Um anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade. Em uma realização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano, tal como camundongo, fundida a uma célula imortalizada.

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64/131 [00132] A expressão “anticorpo recombinante”, da forma utilizada no presente, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de animais (por exemplo, camundongos) que são transgênicos ou transcromossômicos com relação aos genes de imunoglobulina ou hibridoma preparada a partir deles; (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de transfectoma; (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante; e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a divisão de sequências genéticas de imunoglobulina para outras sequências de DNA.

[00133] A expressão “anticorpo humano”, da forma utilizada no presente, destina-se a incluir anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha de germens humana. Anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem de germens humanas (por exemplos, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou específica de local in vitro ou por meio de mutação somática in vivo).

[00134] A expressão “anticorpo humanizado” designa uma molécula que possui um local de ligação de antigenos que é substancialmente derivado de imunoglobulina de espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula é baseada na estrutura e/ou sequência de imunoglobulinas humanas. O local de ligação de antigenos pode compreender domínios variáveis completos fundidos a domínios constantes ou apenas as regiões de determinação da complementaridade (CDR) enxertadas a regiões de cadeia principal apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação de antigenos podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais

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65/131 substituições de aminoácidos, por exemplo, modificados para relembrar imunoglobulinas humanas com mais precisão. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs do anticorpo de camundongo). Outras formas possuem uma ou mais CDRs que são alteradas com relação ao anticorpo original.

[00135] A expressão “anticorpo quimérico” designa os anticorpos em que uma parte de cada uma das sequências de aminoácidos de cadeias leve e pesada é homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe específica, enquanto o segmento remanescente da cadeia é homólogo a sequências correspondentes em outra. Tipicamente, a região variável de cadeias leve e pesada imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero, enquanto as partes constantes são homólogas a sequências de anticorpos derivados de outra. Uma clara vantagem dessas formas quiméricas é o fato de que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes atualmente conhecidas utilizando células B facilmente disponíveis ou hibridomas de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparações de células humanas. Embora a região variável possua a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não seja afetada pela fonte, em que a região constante é humana, ela é menos propensa a permitir reação imunológica de pacientes humanos quando os anticorpos são injetados que a região constante de uma fonte não humana. A definição, entretanto, não é limitada a este exemplo específico.

[00136] Os anticorpos podem ser derivados de diferentes espécies, incluindo, mas sem limitações, camundongos, ratos, coelhos, cobaias e seres humanos.

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66/131 [00137] Os anticorpos descritos no presente incluem anticorpos IgA, tais como lgA1 ou lgA2, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgE, IgM e IgD. Em várias realizações, o anticorpo é anticorpo lgG1, mais especificamente lgG1, capa ou lgG1, isótipo lambda (ou seja, lgG1, κ, λ), anticorpo lgG2a (por exemplo, lgG2a, κ, λ), anticorpo lgG2b (por exemplo, lgG2b, κ, λ), anticorpo lgG3 (por exemplo, lgG3, κ, λ) ou anticorpo lgG4 (por exemplo, lgG4, κ, λ).

[00138] Os receptores de antígenos descritos no presente podem compreender partes de ligação de antígenos de um ou mais anticorpos. As expressões “parte de ligação de antígenos” de um anticorpo (ou simplesmente “parte de ligação”) ou “fragmento de ligação de antígenos” de um anticorpo (ou, simplesmente, “fragmento de ligação”) ou expressões similares designam um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de ligação específica a antígenos. Demonstrou-se que a função de ligação de antígenos de um anticorpo pode ser realizada por meio de fragmentos de um anticorpo com comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação englobados na expressão “fragmento de ligação de antígenos” de um anticorpo incluem (i) fragmentos de Fab, fragmentos monovalentes que consistem dos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos de F(ab’)2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) fragmentos de Fd que consistem dos domínios VH e CH; (iv) fragmentos que consistem dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) fragmentos de dAb (Ward et al (1989), Nature 341: 544546), que consistem de um domínio VH; (vi) regiões de determinação da complementaridade (CDR) isoladas; e (vii) combinações de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmente unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite a sua elaboração como

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67/131 uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de fita simples (scFv); vide, por exemplo, Bird et al (1988), Science 242: 423-426; e Huston et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 85, 5879-5883). Esses anticorpos de fita simples também se destinam a ser englobados na expressão “fragmento de ligação de antígenos” de um anticorpo. Um exemplo adicional são proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação que compreendem (i) um polipeptídeo de domínio de ligação que é fundido a um polipeptídeo de região de articulação de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de articulação e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região constante CH2. O polipeptídeo de domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação são adicionalmente descritas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando métodos convencionais conhecidos pelos técnicos no assunto e os fragmentos são selecionados para utilidade da mesma forma que anticorpos intactos.

[00139] Fragmento variável de fita simples (scFv) é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de imunoglobulinas, conectadas com um peptídeo ligante. O ligante pode conectar o terminal N do VH com o terminal C do VL ou vice-versa. Fragmentos variáveis de fita simples divalentes (ou bivalentes) (di-scFvs, bi-scFvs) podem ser elaborados por meio da ligação de dois scFvs. Isso pode ser feito produzindo-se uma cadeia de peptídeos simples com duas regiões VH e duas VL, gerando scFvs conjuntos.

[00140] A expressão “domínio de ligação” ou simplesmente “domínio” caracteriza, com relação à presente invenção, uma estrutura, por

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68/131 exemplo, de anticorpo, que liga/interage com uma dada estrutura/antígeno/epítopo alvo, opcionalmente ao interagir com outro domínio. Estes domínios de acordo com a presente invenção designam, portanto, um “local de ligação de antígenos”.

[00141] Anticorpos e derivados de anticorpos são úteis para fornecer domínios de ligação tais como fragmentos de anticorpos, particularmente para fornecer regiões VL e VH.

[00142] Domínios de ligação para antígenos que podem estar presentes em um receptor de antígenos possuem a capacidade de ligação (direcionamento) a antígeno, ou seja, a capacidade de ligação (direcionamento) a um epítopo presente em um antígeno, preferencialmente um epítopo localizado dentro do domínio extracelular de antígenos. Preferencialmente, domínios de ligação de antígenos são específicos para o antígeno. Preferencialmente, domínios de ligação para um antígeno ligam-se ao antígeno expresso sobre a superfície celular. Em realizações particularmente preferidas, domínios de ligação para antígenos ligam-se a epítopos nativos de antígeno presente sobre a superfície de células vivas.

[00143] Todos os anticorpos e derivados de anticorpos, tais como fragmentos de anticorpos conforme descrito no presente para os propósitos da presente invenção, são englobados pelo termo “anticorpo”.

[00144] Anticorpos podem ser produzidos por meio de uma série de métodos, incluindo metodologia de anticorpos monoclonais convencionais, tal como o método de hibridização celular somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora sejam preferidos procedimentos de hibridização celular somática, em princípio, podem ser empregados outros métodos de produção de anticorpos monoclonais, tais como transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou métodos de exibição de fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpos.

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69/131 [00145] O sistema animal preferido para a preparação de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais é o sistema murino. A produção de hibridomas no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Métodos e protocolos de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

[00146] Outros sistemas animais preferidos para a preparação de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais são o sistema de rato e coelho (por exemplo, descrito em Spieker-Polet et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 92: 9348 (1995); vide também Rossi et al, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).

[00147] Para gerar anticorpos, camundongos podem ser imunizados com peptídeos conjugados a veículos derivados da sequência de antígenos, ou seja, a sequência contra a qual os anticorpos devem ser dirigidos, uma preparação enriquecida de antígeno expresso de forma recombinante ou seus fragmentos e/ou células que expressam o antígeno, conforme descrito. Alternativamente, camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica o antígeno ou seus fragmentos. Caso imunizações que utilizam uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno não resultem em anticorpos, camundongos podem ser também imunizados com células que expressam o antígeno, tais como uma linhagem celular, para promover reações imunológicas.

[00148] A reação imunológica pode ser monitorada ao longo do transcurso do protocolo de imunização com amostras de soro e plasma que são obtidas por meio da veia da cauda ou sangramento retro-orbitral. Camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina podem ser utilizados para fusões. Os camundongos podem ser amplificados por via intraperitoneal

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70/131 ou intravenosa com células que expressam antígenos três dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas que secretam anticorpos específicos.

[00149] Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais, esplenócitos e células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem de células imortalizadas apropriada, tal como uma linhagem de células de mieloma de camundongos. Os hibridomas resultantes podem ser selecionados em seguida para determinar a produção de anticorpos específicos de antígenos. Cavidades individuais podem ser selecionadas em seguida por meio de ELISA para hibridomas que secretam anticorpos. Por meio de imunofluorescência e análise de FACS utilizando células que expressam antígenos, podem ser identificados anticorpos com especificidade para o antígeno. Os hibridomas que secretam anticorpos podem ser novamente colocados em placas, novamente selecionados e, se ainda forem positivos para anticorpos monoclonais, podem ser subclonados por meio de limitação da diluição. Os subclones estáveis podem ser cultivados in vitro em seguida para gerar anticorpos em meio de cultivo de tecidos para caracterização.

[00150] A capacidade dos anticorpos e outros agentes de ligação de ligar um antígeno pode ser determinada utilizando-se testes de ligação padrão (por exemplo, ELISA, Western Blot, Imunofluorescência e análise citométrica de fluxo).

[00151] O termo “ligação”, de acordo com a presente invenção, refere-se preferencialmente a uma ligação específica.

[00152] Segundo a presente invenção, um agente tal como um receptor de antígenos é capaz de ligar (dirigir) um alvo previamente determinado caso possua afinidade significativa para o mencionado alvo previamente determinado e ligar-se ao mencionado alvo previamente

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71/131 determinado em testes padrão. “Afinidade” ou “afinidade de ligação” é frequentemente medida por meio de constante de dissociação de equilíbrio (Kd). Preferencialmente, a expressão “afinidade significativa” designa a ligação a um alvo previamente determinado com constante de dissociação (Kd) de 10’⁵M ou menos, 10’⁶ M ou menos, 10’⁷ M ou menos, 10’⁸ M ou menos, 10’⁹ M ou menos, 10’¹⁰ M ou menos, 10’¹¹ M ou menos ou 10’¹² M ou menos.

[00153] Um agente não é (substancialmente) capaz de ligarse (dirigir-se) a um alvo caso não possua afinidade significativa para o mencionado alvo e não se liga significativamente, particularmente não se liga de forma detectável, ao mencionado alvo em testes padrão. Preferencialmente, o agente não se liga de forma detectável ao mencionado alvo quando presente em concentração de até 2, preferencialmente 10, de maior preferência 20, particularmente 50 ou 100 pg/ml ou mais. Preferencialmente, um agente não possui afinidade significativa para um alvo caso se ligue ao mencionado alvo com Kd que é de pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 10³ vezes, 10⁴ vezes, 10⁵vezes ou 10⁶ vezes mais alta que o Kd para ligação ao alvo previamente determinado ao qual o agente é capaz de ligar-se. Caso o Kd para ligação de agente ao alvo ao qual o agente é capaz de ligar-se, por exemplo, é de 10’⁷ M, o Kd para ligação a um alvo para o qual o agente não possui afinidade significativa seria de pelo menos 10’⁶ Μ, 10’⁵ Μ, 10’⁴ Μ, 10’³ Μ, 10’² M ou 10’¹M.

[00154] Um agente é específico para um alvo previamente determinado se for capaz de ligar-se ao mencionado alvo previamente determinado, embora não seja (substancialmente) capaz de ligar-se a outros alvos, ou seja, não possui afinidade significativa para outros alvos e não se liga significativamente a outros alvos em testes padrão. Preferencialmente, um agente é específico para um alvo previamente determinado caso a afinidade e a ligação a esses outros alvos não exceda significativamente a afinidade ou

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72/131 ligação a proteínas que não são relacionadas a um alvo previamente determinado, tal como albumina de soro bovino (BSA), caseína ou albumina de soro humano (HSA). Preferencialmente, um agente é específico para alvo previamente determinado caso se ligue ao mencionado alvo com Kd que é de pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 10³ vezes, 10⁴ vezes, 10⁵ vezes ou 10⁶ vezes mais baixa que o Kd para ligação a um alvo para o qual não é específico. Caso o Kd para ligação de agente ao alvo para o qual é específico seja, por exemplo, de 10-⁷ M, o Kd para ligação a um alvo para o qual não é específico seria de pelo menos 10’⁶ M, W⁵ M, W⁴ M, W³ M, W² M ou W¹ M.

[00155] A ligação de um agente ao alvo pode ser determinada experimentalmente utilizando qualquer método apropriado; vide, por exemplo, Berzofsky et al, Antibody-Antigen Interactions em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press, Nova Iorque NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman & Company, Nova Iorque NY (1992) e métodos descritos no presente. As afinidades podem ser facilmente determinadas utilizando métodos convencionais, tais como diálise de equilíbrio; utilizando o instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimentos gerais descritos pelo fabricante; por meio de radioimunoteste utilizando antígeno alvo radiomarcado; ou por outro método conhecido pelos técnicos no assunto. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, por meio do método de Scatchard et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949). A afinidade medida de interação entre antígeno e anticorpo específica pode variar quando medida sob condições diferentes, tais como concentração de sal e pH. Desta forma, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação de antígenos, tais como Kd e IC50, são preferencialmente realizadas com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno e um tampão padronizado.

[00156] A presente invenção pode envolver a introdução, ou seja, transfecção, de ácidos nucleicos que codificam receptores de antígenos

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73/131 em células, tais como células T in vitro ou in vivo.

[00157] Para os propósitos da presente invenção, o termo “transfecção” inclui a introdução de ácido nucleico em uma célula ou a absorção de um ácido nucleico por uma célula, em que a célula pode estar presente, por exemplo, em pacientes. Desta forma, de acordo com a presente invenção, a célula para transfecção de ácidos nucleicos descritos no presente pode estar presente in vitro ou in vivo; a célula pode, por exemplo, fazer parte de órgão, tecido e/ou organismo de pacientes. Segundo a presente invenção, a transfecção pode ser transitória ou estável. Para algumas aplicações de transfecção, é suficiente que o material genético que sofreu transfecção seja expresso apenas de forma transitória. Como o ácido nucleico introduzido no processo de transfecção normalmente não é integrado ao genoma nuclear, o ácido nucleico externo será diluído por meio de mitose ou degradado. Células que permitem amplificação epissomal de ácidos nucleicos reduzem em grande parte a taxa de diluição. Caso se deseje que o ácido nucleico transfectado realmente permaneça no genoma da célula e suas células descendentes, deve ocorrer transfecção estável. RNA pode ser transfectado em células para expressar de forma transitória a sua proteína codificada.

[00158] Segundo a presente invenção, pode-se utilizar qualquer método útil para introdução, ou seja, transferência ou transfecção de ácidos nucleicos em células. Preferencialmente, ácido nucleico tal como RNA é transfectado em células por meio de métodos padrão. Esses métodos incluem eletroporação, lipofecção e microinjeção. Em realização particularmente preferida da presente invenção, RNA é introduzido em células por meio de eletroporação. Eletroporação ou eletropermeabilização designa aumento significativo da condutividade elétrica e permeabilidade da membrana de plasma celular causado por um campo elétrico aplicado externamente. Ele é normalmente utilizado em biologia molecular como forma de introdução de

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74/131 alguma substância em células. Segundo a presente invenção, prefere-se que a introdução de ácido nucleico codificador de proteínas ou peptídeos em células resulta na expressão da mencionada proteína ou peptídeo.

[00159] Diversos métodos podem ser utilizados para introduzir construções de receptores de antígenos em células T, incluindo transfecção de DNA não com base viral, sistemas com base em transpossons e sistemas com base viral. Transfecção de DNA sem base viral apresenta baixo risco de mutagênese de inserção. Sistemas com base em transpossons podem integrar transgenes com mais eficiência que plasmídeos que não contêm um elemento integrante. Sistemas com base viral incluem o uso de γ-retrovírus e vetores lentivirais. γ-Retrovírus são de produção relativamente fácil, realizam transdução de células T de forma eficiente e permanente e possuem segurança preliminarmente comprovada do ponto de vista de integração em células T humanas primárias. Vetores lentivirais também realizam transdução eficiente e permanente de células T, mas sua fabricação é mais cara. Eles são potencialmente mais seguros que sistemas com base em retrovirus.

[00160] Para transfecção de células in vivo, pode-se utilizar uma composição farmacêutica que compreende ácido nucleico que codifica o receptor de antígenos. Um veículo de fornecimento que dirige o ácido nucleico a uma célula específica, tal como célula T pode ser administrado a pacientes, resultando em transfecção que ocorre in vivo.

[00161] Segundo a presente invenção, prefere-se administrar o ácido nucleico que codifica um receptor de antígenos em forma bruta ou em uma portadora. Os veículos tais como veículos de lipídios contemplados para uso na presente invenção incluem quaisquer substâncias ou veículos com os quais ácido nucleico tal como RNA pode ser associado, por exemplo, por meio da formação de complexos com o ácido nucleico ou formação de bolhas nas quais o ácido nucleico é incluído ou encapsulado. Isso

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75/131 pode resultar em aumento da estabilidade do ácido nucleico em comparação com ácido nucleico bruto. Particularmente, a estabilidade do ácido nucleico no sangue pode aumentar. Podem ser utilizadas, por exemplo, formulações de RNA nanoparticuladas com tamanho de partícula definido tais como lipoplex de RNA e lipossomos, por exemplo, lipoplex que compreende DOTMA e DOPE ou DOTMA e colesterol.

[00162] Da forma utilizada no presente, o termo “nanopartícula” designa qualquer partícula que possui diâmetro que torna a partícula apropriada para administração sistêmica, particularmente parenteral, particularmente de ácidos nucleicos, tipicamente diâmetro de menos de 1000 nanômetros (nm). Em algumas realizações, a nanopartícula possui diâmetro de menos de 600 nm. Em algumas realizações, a nanopartícula possui diâmetro de menos de 400 nm.

[00163] Da forma utilizada no presente, a expressão “formulação nanoparticulada” ou similar designa qualquer substância que contenha pelo menos uma nanopartícula. Em algumas realizações, composição nanoparticulada é uma coleção uniforme de nanopartículas. Em algumas realizações, composições nanoparticuladas são dispersões ou emulsões. Geralmente, dispersões ou emulsões são formadas quando pelo menos dois materiais imiscíveis são combinados.

[00164] A expressão “lipoplex” ou “lipoplex de ácido nucleico”, particularmente “lipoplex de RNA”, designa um complexo de lipídios e ácidos nucleicos, particularmente RNA. Lipoplex é formado espontaneamente quando lipossomos catiônicos, que frequentemente também incluem um lipídio “auxiliar” neutro, são misturados com ácidos nucleicos.

[00165] Lipídios catiônicos, polímeros catiônicos e outras substâncias com cargas positivas podem formar complexos com ácidos nucleicos com carga negativa. Essas moléculas catiônicas podem ser utilizadas

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76/131 para formar ácidos nucleicos complexos, para assim formar, por exemplo, o chamado lipoplex ou poliplex, respectivamente, e demonstrou-se que esses complexos fornecem ácidos nucleicos para células.

[00166] Preparações de ácidos nucleicos nanoparticuladas para uso na presente invenção podem ser obtidas por meio de diversos protocolos e a partir de diversos compostos formadores de complexos de ácidos nucleicos. Lipídios, polímeros, oligômeros ou anfifilos são agentes formadores de complexos típicos. Em uma realização, o composto formador de complexos compreende pelo menos um agente selecionado a partir do grupo que consiste de protamina, polietilenoimina, póli-L-lisina, póli-L-arginina ou histona.

[00167] Segundo a presente invenção, protamina é útil como agente veículo catiônico. O termo “protamina” designa qualquer uma dentre diversas proteínas fortemente básicas com peso molecular relativamente baixo que são ricas em arginina e encontradas associadas especialmente com DNA no lugar de histonas somáticas nas células de esperma de diversos animais (como peixes). Particularmente, o termo “protamina” designa proteínas encontradas em esperma de peixes que são fortemente básicas, solúveis em água, não são coaguladas pelo calor e geram principalmente arginina mediante hidrólise. Em forma purificada, elas são utilizadas em formulação de insulina de longa duração e para neutralizar os efeitos anticoagulantes de heparina.

[00168] Segundo a presente invenção, o termo “protamina”, da forma utilizada no presente, destina-se a compreender qualquer sequência de aminoácidos de protamina obtida ou derivada de fontes naturais ou biológicas, incluindo seus fragmentos e formas multiméricas da mencionada sequência de aminoácidos ou um de seus fragmentos. Além disso, o termo engloba polipeptídeos (sintetizados) que são artificiais, especificamente projetados para fins específicos e não podem ser isolados de fontes nativas ou

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77/131 biológicas.

[00169] A protamina utilizada de acordo com a presente invenção pode ser protamina sulfatada ou protamina de cloridrato. Em realização preferida, a fonte de protamina utilizada para a produção das nanopartículas descritas no presente é protamina 5000, que contém protamina em mais de 10 mg/ml (5000 unidades de neutralização de heparina por ml) em uma solução de sais isotônicos.

[00170] Lipossomos são bolhas lipídicas microscópicas que possuem frequentemente uma ou mais bicamadas de um lipídio formador de bolhas, tal como fosfolipídio, e são capazes de encapsular drogas. Diferentes tipos de lipossomos podem ser empregados no contexto da presente invenção, incluindo, sem limitações, bolhas multilamelares (MLV), bolhas unilamelares pequenas (SUV), bolhas unilamelares grandes (LUV), lipossomos estericamente estabilizados (SSL), bolhas multivesiculares (MV) e bolhas multivesiculares grandes (LMV), bem como outras formas em duas camadas conhecidas na técnica. O tamanho e a lamelaridade do lipossomo dependerão da forma de preparação e a seleção do tipo de bolhas a serem utilizadas dependerá do modo de administração preferido. Existem diversas outras formas de organização supramolecular nas quais lipídios podem estar presentes em meio aquoso, que compreendem fases lamelares, fases hexagonais e hexagonais inversas, fases cúbicas, micelas e micelas reversas compostas de monocamadas. Essas fases podem ser também obtidas em combinação com DNA ou RNA e a interação com RNA e DNA pode afetar substancialmente o estado de fases. As fases descritas podem estar presentes nas formulações de ácidos nucleicos nanoparticuladas de acordo com a presente invenção.

[00171] Para formação de lipoplex de ácido nucleico a partir de ácido nucleico e lipossomos, qualquer método apropriado de formação de

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78/131 lipossomos pode ser utilizado, desde que forneça o lipoplex de ácido nucleico idealizado. Lipossomos podem ser formados utilizando métodos padrão tais como o método de evaporação reversa (REV), o método de injeção de etanol, o método de desidratação-reidratação (DRV), sonicação ou outros métodos apropriados.

[00172] Após a formação de lipossomos, os lipossomos podem ser dimensionados para obter uma população de lipossomos que possui faixa de tamanhos substancialmente homogênea.

[00173] Lipídios formadores de duas camadas possuem tipicamente duas cadeias de hidrocarbonetos, particularmente cadeias acila, e um grupo superior, polar ou não polar. Lipídios formadores de duas camadas são compostos de lipídios de ocorrência natural ou de origem sintética, incluindo os fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol e esfingomielina, em que as duas cadeias de hidrocarbonetos possuem tipicamente cerca de 14 a 22 átomos de carbono de comprimento e graus variáveis de insaturação. Outros lipídios apropriados para uso na composição de acordo com a presente invenção incluem glicolipídios e esteróis tais como colesterol e seus diversos análogos que também podem ser utilizados nos lipossomos.

[00174] Lipídios catiônicos possuem tipicamente uma porção lipofílica, tal como uma cadeia de esterol, acila ou diacila, e possuem carga positiva líquida geral. O grupo superior do lipídio conduz tipicamente a carga positiva. O lipídio catiônico possui preferencialmente carga positiva de 1 a 10 valências, de maior preferência carga positiva de 1 a 3 valências e, de maior preferência, carga positiva de 1 valência. Exemplos de lipídios catiônicos incluem, mas sem limitações, 1,2-di-0-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA); dimetildioctadecilamônio (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP); 1,2

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79/131 diacilóxi-3-dimetilamônio propanos; 1,2-dialquilóxi-3-dimetilamônio propanos; cloreto de dioctadecildimetil amônio (DODAC), 1,2-dimiristoiloxipropil-1,3dimetil-hidroxietil amônio (DMRIE) e trifluoroacetato de 2,3-dioleoilóxi-N-[2(espermino carboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanâmio (DOSPA). São preferidos DOTMA, DOTAP, DODAC e DOSPA. DOTMA é de preferência superior.

[00175] Além disso, as nanopartículas descritas no presente incluem ainda preferencialmente um lipídio neutro em vista da estabilidade estrutural e similares. O lipídio neutro pode ser adequadamente selecionado em vista da eficiência de fornecimento do complexo de lipídio e ácido nucleico. Exemplos de lipídios neutros incluem, mas sem limitações, 1,2-di-(9Zoctadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidil colina, diacilfosfatidil etanol amina, ceramida, esfingoemielina, cefalina, esterol e cerebrosida. É preferido DOPE e/ou DOPC. DOPE é de preferência superior. Caso um lipossomo catiônico inclua um lipídio catiônico e um lipídio neutro, a razão molar entre o lipídio catiônico e o lipídio neutro pode ser adequadamente determinada em vista da estabilidade do lipossomo e similares.

[00176] Segundo uma realização, as nanopartículas descritas no presente podem compreender fosfolipídios. Os fosfolipídios podem ser glicerofosfolipídios. Exemplos de glicerofosfolipídios incluem, sem limitações, três tipos de lipídios: (i) fosfolipídios zwitteriônicos, que incluem, por exemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina de gema de ovo, PC derivada de soja em forma natural, parcialmente hidrogenada ou totalmente hidrogenada, dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) esfingomielina (SM); (ii) fosfolipídios com carga negativa: que incluem, por exemplo, fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG) dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); derivados sintéticos nos quais o conjugado fornece

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80/131 um fosfolipídio zwitteriônico com carga negativa, como no caso de metoxipolietileno, glicol diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE); e (iii) fosfolipídios catiônicos, que incluem, por exemplo, fosfatidilcolina ou esfingomielina, cujo fosfomonoéster foi O-metilado para formar os lipídios catiônicos.

[00177] Pode ocorrer associação de ácido nucleico ao veículo de lipídio, por exemplo, por meio do preenchimento, pelo ácido nucleico, de espaços intersticiais da portadora, de forma que o veículo capture fisicamente o ácido nucleico, ou por meio de ligação covalente, iônica ou de hidrogênio, ou por meio de adsorção por ligações não específicas. Seja qual for o modo de associação, o ácido nucleico deve reter as suas propriedades terapêuticas, ou seja, codificadoras.

[00178] Segundo a presente invenção, o ácido nucleico que codifica um receptor de antígenos em uma realização é RNA, preferencialmente mRNA. O RNA é preferencialmente obtido por meio de transcrição in vitro.

[00179] A expressão “ácido nucleico”, da forma utilizada no presente, destina-se a incluir DNA e RNA, tal como moléculas de DNA genômico, cDNA, mRNA, produzidas de forma recombinante e quimicamente sintetizadas. Ácido nucleico pode ser de fita simples ou fita dupla. RNA inclui RNA transcrito in vitro (RNA IVT) ou RNA sintético. Segundo a presente invenção, ácido nucleico é preferencialmente um ácido nucleico isolado.

[00180] Ácidos nucleicos podem ser compreendidos em um vetor. O termo “vetor”, da forma utilizada no presente, inclui quaisquer vetores conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo vetores de plasmídeos, vetores de cosmídeos, vetores de fagos, tais como fago lambda, vetores virais tais como vetores adenovirais ou bacilovirais, ou vetores de cromossomos artificiais, tais como cromossomos artificiais bacterianos (BAC), cromossomos

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81/131 artificiais de leveduras (YAC) ou cromossomos artificiais P1 (PAC). Os mencionados vetores incluem vetores de expressão e de clonagem. Vetores de expressão compreendem plasmídeos, bem como vetores virais, e contêm geralmente uma sequência de codificação desejada e sequências de DNA apropriadas e necessárias para expressão da sequência de codificação ligada operativamente em organismos hospedeiros específicos (por exemplo, bactérias, leveduras, plantas, insetos ou mamíferos) ou em sistemas de expressão in vitro. Vetores de clonagem são geralmente utilizados para elaborar e amplificar um certo fragmento de DNA desejado e podem não possuir sequências funcionais necessárias para expressão dos fragmentos de DNA desejados.

[00181] No contexto da presente invenção, o termo “RNA” indica uma molécula que compreende resíduos de ribonucleotídeos e é preferencialmente composta total ou substancialmente de resíduos de ribonucleotídeos. “Ribonucleotídeo” designa um nucleotídeo com grupo hidroxila na posição 2’ de um grupo β-D-ribofuranosila. O termo inclui RNA de fita dupla, RNA de fita simples, RNA isolado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido de forma recombinante, bem como RNA modificado que difere de RNA de ocorrência natural por meio da adição, exclusão, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Essas alterações podem incluir a adição de material não de nucleotídeos, tal como até a(s) extremidade(s) de RNA ou internamente, tal como em um ou mais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos em moléculas de RNA podem também compreender nucleotídeos fora do padrão, tais como nucleotídeos não de ocorrência natural ou desoxinucleotídeos ou nucleotídeos quimicamente sintetizados. Esses RNAs alterados podem ser denominados análogos ou análogos de RNA de ocorrência natural.

[00182] Segundo a presente invenção, o termo “RNA” inclui

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82/131 e refere-se preferencialmente a “mRNA”, que indica “RNA mensageiro” e refere-se a um “transcrito” que pode ser produzido utilizando DNA como modelo e codifica um peptídeo ou proteína. mRNA compreende tipicamente uma região não traduzida 5’ (5'-UTR), uma região de codificação de peptídeos ou proteínas e uma região não traduzida 3' (3'-UTR). mRNA possui meia vida limitada em células e in vitro. Preferencialmente, mRNA é produzido por meio de transcrição in vitro utilizando um modelo de DNA. Em uma realização da presente invenção, o RNA é obtido por meio de transcrição in vitro ou síntese química. A metodologia de transcrição in vitro é conhecida pelos técnicos no assunto. Existe, por exemplo, uma série de kits de transcrição in vitro disponíveis comercialmente.

[00183] Em uma realização da presente invenção, RNA é RNA autorreprodutor, tal como RNA autorreprodutor de fita simples. Em uma realização, o RNA autorreprodutor é RNA de fita simples com sentido positivo. Em uma realização, o RNA autorreprodutor é RNA viral ou RNA derivado de RNA viral. Em uma realização, o RNA autorreprodutor é RNA genômico alfaviral ou é derivado de RNA genômico alfaviral. Em uma realização, o RNA autorreprodutor é um vetor de expressão genética viral. Em uma realização, o vírus é vírus florestal Semliki. Em uma realização, o RNA autorreprodutor contém um ou mais transgenes em pelo menos um dos mencionados transgenes que codificam os agentes descritos no presente. Em uma realização, se o RNA for RNA viral ou derivado de RNA viral, os transgenes podem substituir total ou parcialmente sequências virais tais como sequências virais que codificam proteínas estruturais. Em uma realização, o RNA autorreprodutor é RNA transcrito in vitro.

[00184] A fim de aumentar a expressão e/ou a estabilidade do RNA utilizado de acordo com a presente invenção, ele pode ser modificado, preferencialmente sem alterar a sequência da proteína ou do peptídeo

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83/131 expresso.

[00185] O termo “modificação”, no contexto de RNA conforme utilizado de acordo com a presente invenção, inclui qualquer modificação de RNA que não esteja naturalmente presente no mencionado RNA.

[00186] Em uma realização da presente invenção, o RNA utilizado de acordo com a presente invenção não possui 5’-trifosfatos desprotegidos. A remoção desses 5’-trifosfatos desprotegidos pode ser atingida por meio de tratamento de RNA com fosfatase.

[00187] O RNA de acordo com a presente invenção pode possuir ribonucleotídeos sintéticos ou de ocorrência natural modificados, a fim de aumentar sua estabilidade e/ou reduzir a citotoxicidade. Em uma realização, por exemplo, no RNA utilizado de acordo com a presente invenção, 5metilcitidina é substituído total ou parcialmente, de preferência totalmente, por citidina. Alternativa ou adicionalmente, em uma realização, no RNA utilizado de acordo com a presente invenção, pseudouridina é total ou parcialmente substituída, de preferência totalmente, por uridina.

[00188] Em uma realização, o termo “modificação” indica o fornecimento de RNA com cobertura 5’ ou análogo a cobertura 5’. A expressão “cobertura 5”’ designa uma estrutura de cobertura encontrada na extremidade 5’ de uma molécula de mRNA e consiste geralmente de um nucleotídeo de guanosina conectado ao mRNA por meio de uma ligação 5’ a 5’ trifosfato incomum. Em uma realização, essa guanosina é metilada na posição 7. A expressão “cobertura 5’ convencional” designa uma cobertura 5’ de RNA de ocorrência natural, preferencialmente para a cobertura de 7-metilguanosina (m7G). No contexto da presente invenção, a expressão “cobertura 5”’ inclui um análogo de cobertura 5’ que relembra a estrutura de cobertura de RNA e é modificado para que possua a capacidade de estabilizar RNA quando ligado a

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84/131 ela, preferencialmente in vivo e/ou em células.

[00189] Pode-se atingir o fornecimento de RNA com cobertura 5’ ou análogo de cobertura 5’ por meio de transcrição in vitro de um modelo de DNA na presença da mencionada cobertura 5’ ou análogo de cobertura 5’, em que a mencionada cobertura 5’ é incorporada por meio de cotranscrição à fita de RNA gerada ou o RNA pode ser gerado, por exemplo, por meio de transcrição in vitro e a cobertura 5’ pode ser ligada ao RNA após a transcrição, utilizando enzimas de cobertura, tais como enzimas de cobertura de vírus vaccinia.

[00190] O RNA pode compreender modificações adicionais. Uma modificação adicional do RNA utilizado na presente invenção pode ser, por exemplo, uma extensão ou truncagem da cauda póli(A) de ocorrência natural ou uma alteração das regiões não traduzidas (UTR) 5’ ou 3’, tal como a introdução de UTR que não possui relação com a região de codificação do mencionado RNA, por exemplo, a inserção de uma ou mais, preferencialmente duas cópias de 3’-UTR derivada de um gene de globina, tal como alfa2-globina, alfal-globina, beta-globina, preferencialmente beta-globina e, de maior preferência, beta-globina humana.

[00191] A fim de aumentar a estabilidade e/ou a expressão do RNA utilizado de acordo com a presente invenção, ele pode ser modificado de forma a estar presente em conjunto com uma sequência de póli-A, preferencialmente que possui comprimento de 10 a 500, de maior preferência 30 a 300, de preferência ainda maior de 65 a 200 e, especialmente, de 100 a 150 resíduos de adenosina. Em uma realização de preferência especial, a sequência de póli-A possui comprimento de cerca de 120 resíduos de adenosina. Além disso, a incorporação de duas ou mais regiões não traduzidas (UTR) 3’ na região não traduzida 3’ de uma molécula de RNA pode resultar em aumento da eficiência de tradução. Em uma realização específica, a 3’-UTR é

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85/131 derivada do gene de β-globina humana.

[00192] O termo “estabilidade” de RNA designa “meia vida” de RNA. “Meia vida” indica o período de tempo que é necessário para eliminar metade da atividade, quantidade ou número de moléculas. No contexto da presente invenção, a meia vida de RNA é indicativa da estabilidade do mencionado RNA. A meia vida de RNA pode influenciar a “duração de expressão” do RNA. Pode-se esperar que RNA que possui meia vida longa será expresso por um período de tempo mais longo.

[00193] No contexto da presente invenção, o termo “transcrição” designa um processo, no qual o código genético em uma sequência de DNA é transcrito em RNA. O RNA pode ser traduzido em proteína em seguida. Segundo a presente invenção, o termo “transcrição” compreende “transcrição in vitro, em que a expressão “transcrição in vitro designa um processo no qual RNA, particularmente mRNA, é sintetizado in vitro em um sistema livre de células, preferencialmente utilizando extratos celulares apropriados. Preferencialmente, vetores de clonagem são aplicados para geração de transcritos. Esses vetores de clonagem são geralmente denominados vetores de transcrição e são englobados, de acordo com a presente invenção, pelo termo “vetor”.

[00194] O termo “tradução”, de acordo com a presente invenção, refere-se ao processo em ribossomos celulares, por meio do qual uma fita de RNA mensageiro dirige a montagem de uma sequência de aminoácidos para elaborar um peptídeo ou proteína.

[00195] Ácidos nuceicos podem, de acordo com a presente invenção, estar presentes isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucleicos, que podem ser homólogos ou heterólogos. Em realizações preferidas, ácidos nucleicos são ligados funcionalmente a sequências de controle da expressão que podem ser homólogas ou heterólogas com relação

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86/131 ao mencionado ácido nucleico. O termo “homólogo” indica que os ácidos nucleicos também são funcionalmente ligados naturalmente e o termo “heterólogo” indica que os ácidos nucleicos não são funcionalmente ligados naturalmente.

[00196] Ácidos nucleicos e sequências de controle de expressão são “funcionalmente” ligados entre si caso sejam covalentemente ligados entre si de forma que a expressão ou transcrição do mencionado ácido nucleico esteja sob o controle ou sob a influência da mencionada sequência de controle da expressão. Caso o ácido nucleico deva ser traduzido em uma proteína funcional, com uma sequência de controle de expressão funcionalmente ligada a uma sequência de codificação, a indução da mencionada sequência de controle de expressão resulta na transcrição do mencionado ácido nucleico, sem causar alteração de quadros na sequência de codificação ou a mencionada sequência de codificação não é capaz de ser traduzida na proteína ou peptídeo desejado.

[00197] A expressão “sequência de controle de expressão” ou “elemento de controle de expressão” compreende, segundo a presente invenção, promotores, locais de ligação de ribossomos, aprimoradores e outros elementos de controle que regulam a transcrição de um gene ou a tradução de mRNA. Em realizações específicas da presente invenção, as sequências de controle de expressão podem ser reguladas. A estrutura exata de sequências de controle de expressão pode variar em função da espécie ou tipo de células, mas geralmente compreende sequências não transcritas 5’ e não traduzidas 5’ e 3’ que são envolvidas no início de transcrição e tradução, respectivamente, tais como caixa TATA, sequência de cobertura, sequência CAAT e similares. Mais especificamente, sequências de controle de expressão não transcritas 5’ compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controle da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligado. Sequências de

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87/131 controle de expressão podem também compreender sequências aprimoradoras ou sequências ativadoras acima no fluxo.

[00198] O termo “expressão” é utilizado de acordo com a presente invenção no seu significado mais geral e compreende a produção de RNA e/ou peptídeos ou proteínas, por exemplo, por meio de transcrição e/ou tradução. Com relação a RNA, o termo “expressão” ou “tradução” designa particularmente a produção de peptídeos ou proteínas. Ele também compreende expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser estável ou transitória. Segundo a presente invenção, o termo “expressão” também inclui “expressão aberrante” ou “expressão anormal”.

[00199] “Expressão aberrante” ou “expressão anormal” indica, segundo a presente invenção, que a expressão é alterada, preferencialmente aumentada, em comparação com referência, tal como o estado em pacientes que não são portadores de doenças associadas à expressão anormal ou aberrante de uma certa proteína, tal como antígeno de tumor. Aumento da expressão indica aumento de pelo menos 10%, particularmente pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100% ou mais. Em uma realização, a expressão somente é encontrada em tecidos doentes, enquanto a expressão em tecidos saudáveis é reprimida.

[00200] A expressão “especificamente expresso” indica que a proteína é essencialmente expressa apenas em um tecido ou órgão específico. Antígenos de tumores especificamente expressos na muscosa gástrica, por exemplo, indicam que a mencionada proteína é principalmente expressa na mucosa gástrica e não é expressa em outros tecidos, ou não é significativamente expressa em outros tipos de órgãos ou tecidos. Proteínas que são exclusivamente expressas em células da mucosa gástrica e significativamente menos em qualquer outro tecido, tal como testículos, portanto, são especificamente expressas em células da mucosa gástrica. Em

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88/131 algumas realizações, antigenos de tumores podem também ser especificamente expressos sob condições normais em mais de um órgão ou tipo de tecido, tal como em dois ou três órgãos ou tipos de tecidos, mas preferencialmente em não mais de três tipos de órgãos ou tecidos diferentes. Neste caso, o antígeno de tumor é especificamente expresso nesses órgãos em seguida. Caso um antígeno de tumor seja expresso sob condições normais, preferencialmente em extensão aproximadamente igual no pulmão e no estômago, por exemplo, o mencionado antígeno de tumor é especificamente expresso no pulmão e no estômago.

[00201] Segundo a presente invenção, a expressão “codificação de ácidos nucleicos” indica que o ácido nucleico, quando presente no ambiente apropriado, preferencialmente no interior de uma célula, pode ser expresso para produzir uma proteína ou peptídeo que codifica.

[00202] O termo “peptídeo”, de acordo com a presente invenção, compreende oligo e polipeptídeos e designa substâncias que compreendem dois ou mais, preferencialmente 3 ou mais, preferencialmente 4 ou mais, preferencialmente 6 ou mais, preferencialmente 8 ou mais, preferencialmente 9 ou mais, preferencialmente 10 ou mais, preferencialmente 13 ou mais, preferencialmente 16 ou mais, preferencialmente 21 ou mais e até preferencialmente 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, particularmente 100 aminoácidos covalentemente ligados por ligações de peptídeos. O termo “proteína” designa peptídeos grandes, preferencialmente peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos, mas as expressões “peptídeo”, “cadeia de peptídeos” e “proteína” são geralmente sinônimos e utilizadas de forma intercambiável no presente.

[00203] Conforme mencionado acima, as sequências de aminoácidos das cadeias de peptídeos e receptores de antigenos descritas no presente podem ser modificadas de forma a obter variantes das mencionadas sequências de aminoácidos. Consequentemente, a presente invenção inclui

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89/131 variantes das sequências de peptídeos e proteína descritas no presente e inclui variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência natural que resultam em sequências que são funcionalmente equivalentes às mencionadas sequências, tais como sequências de aminoácidos que exibem propriedades idênticas ou similares às das mencionadas sequências. Propriedades importantes são a retenção da ligação de receptores de antígenos ao seu alvo ou transdução do sinal de ligação de antígenos a células, tais como células T. Em uma realização, uma sequência ou molécula variante é imunologicamente equivalente à sua sequência ou molécula parental.

[00204] O termo “variante”, segundo a presente invenção, designa particularmente mutantes, variantes de divisão, conformações, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e homólogos de espécies, particularmente os que são naturalmente presentes. Variantes alélicas designam alterações da sequência normal de genes, cujo significado muitas vezes é incerto. Sequenciamento genético completo frequentemente identifica diversas variantes alélicas para um dado gene. Espécies homólogas são sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos com espécies de origem diferente de uma dada sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos. O termo “variante” deverá englobar quaisquer variantes modificadas após a tradução e variantes de conformação.

[00205] A expressão “imunologicamente equivalente” indica que a molécula imunologicamente equivalente, tal como a sequência de aminoácidos imunologicamente equivalente, exibe propriedades imunológicas idênticas ou essencialmente idênticas e/ou exerce efeitos imunológicos idênticos ou essencialmente idênticos com relação, por exemplo, ao tipo do efeito imunológico. No contexto da presente invenção, a expressão “imunologicamente equivalente” é preferencialmente utilizada com relação às propriedades ou efeitos imunológicos de receptores de antígenos utilizados

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90/131 para terapia.

[00206] Os técnicos no assunto apreciarão que, particularmente, as sequências das sequências de CDR, regiões variáveis e hipervariáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade de ligação a alvos. Regiões de CDR podem ser, por exemplo, idênticas ou altamente homólogas às regiões de anticorpos parentais. Por “altamente homólogo”, indica-se que podem ser realizadas de 1 a 5, preferencialmente de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 a 2 substituições nas CDRs.

[00207] Para os propósitos da presente invenção, “variantes de sequências de aminoácidos compreendem variantes de inserção de aminoácidos, variantes de adição de aminoácidos, variantes de exclusão de aminoácidos e/ou variantes de substituição de aminoácidos. Variantes de exclusão de aminoácidos que compreendem a exclusão na extremidade Nterminal e/ou C-terminal da proteína são também denominadas variantes de truncagem N-terminal e/ou C-terminal.

[00208] Variantes de inserção de aminoácidos compreendem inserções de um, dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos específica. No caso de variantes de sequências de aminoácidos que possuem inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em um local específico em uma sequência de aminoácidos, embora também seja possível inserção aleatória com seleção apropriada do produto resultante.

[00209] Variações de aminoácidos compreendem fusões amino e/ou carbóxi-terminais de um ou mais aminoácidos, tais como 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos.

[00210] Variações de exclusão de aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência, tais como a remoção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos. As

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91/131 exclusões podem estar em qualquer posição da proteína.

[00211] Variantes de substituições de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência que é removido e outro resíduo que é inserido no seu lugar. Dá-se preferência às modificações que se encontram em posições da sequência de aminoácidos que não são conservadas entre peptídeos ou proteínas homólogas e/ou à substituição de aminoácidos por outros que possuem propriedades similares. Preferencialmente, alterações de aminoácidos em variantes de proteínas são alterações de aminoácidos conservadoras, ou seja, substituições de aminoácidos não carregados ou carregados de forma similar. Alterações de aminoácidos conservadoras envolvem a substituição de um dentre uma família de aminoácidos que são relacionados nas suas cadeias laterais. Aminoácidos de ocorrência natural são geralmente divididos em quatro famílias: aminoácidos ácidos (aspartato e glutamato), básicos (lisina, arginina e histidina), não polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano) e polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina). Fenilalanina, triptofano e tirosina às vezes são classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos.

[00212] Preferencialmente, o grau de similaridade, preferencialmente a identidade entre uma dada sequência de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da mencionada sequência de aminoácidos fornecida será de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%>, 98% ou 99%. O grau de similaridade ou identidade é preferencialmente fornecido para uma região de aminoácidos que é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca

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92/131 de 90% ou cerca de 100% de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. Caso a sequência de aminoácidos de referência consista de 200 aminoácidos, por exemplo, o grau de similaridade ou identidade é preferencialmente fornecido para pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180 ou cerca de 200 aminoácidos, preferencialmente aminoácidos contínuos. Em realizações preferidas, o grau de similaridade ou identidade é fornecido para todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. O alinhamento para determinar a similaridade de sequências, preferencialmente identidade de sequências, pode ser realizado com ferramentas conhecidas na técnica, preferencialmente utilizando o melhor alinhamento de sequências, tal como utilizando Align, utilizando configurações padrão, preferencialmente EMBOSS:agulha, Matriz: Blosum62, Abertura de Lacuna 10,0, Extensão de Lacuna 0,5.

[00213] “Similaridade de sequências” indica o percentual de aminoácidos que são idênticos ou representam substituições de aminoácidos conservadoras. “Identidade de sequências” entre duas sequências de aminoácidos indica o percentual de aminoácidos que são idênticos entre as sequências.

[00214] A expressão “percentual de identidade” destina-se a indicar o percentual de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtido após o melhor alinhamento, em que esse percentual é puramente estatístico e as diferenças entre as duas sequências são distribuídas aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. Comparações de sequências entre duas sequências de aminoácidos são convencionalmente conduzidas por meio de comparação dessas sequências após seu alinhamento ideal, em que a mencionada

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93/131 comparação é conduzida pelo segmento ou por “janela de comparação”, a fim de identificar e comparar regiões locais com similaridade de sequências. O alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de similaridades de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 2444, ou por meio de programas de computador que utilizam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[00215] O percentual de identidade é calculado por meio de determinação da quantidade de posições idênticas entre as duas sequências sendo comparadas, dividindo-se este número pelo número de posições comparadas e multiplicando-se o resultado obtido por 100, de forma a obter o percentual de identidade entre essas duas sequências.

[00216] Sequências de aminoácidos homólogas exibem, de acordo com a presente invenção, pelo menos 40%, particularmente pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e, preferencialmente, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade dos resíduos de aminoácidos.

[00217] Segundo a presente invenção, variantes, fragmentos, partes, porções ou derivados de sequências de aminoácidos, peptídeos ou proteínas possuem preferencialmente uma propriedade funcional da sequência de aminoácidos, peptídeo ou proteína, respectivamente, da qual foram derivados, ou seja, são funcionalmente equivalentes. Em uma realização, variantes, fragmentos, partes, porções ou derivados de sequências de aminoácidos, peptídeos ou proteínas são funcionalmente equivalentes, tais

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94/131 como imunologicamente equivalentes à sequência de aminoácidos, peptídeo ou proteína, respectivamente, da qual foram derivados. Em uma realização, a propriedade funcional é a propriedade de ligação a antígenos ou transdução do sinal de ligação no interior de uma célula.

[00218] O termo “derivado” indica, de acordo com a presente invenção, que uma entidade específica, particularmente uma sequência específica, está presente no objeto do qual é derivado, particularmente um organismo ou molécula. No caso de sequências de aminoácidos, especialmente regiões de sequências específicas, “derivado” indica particularmente que a sequência de aminoácidos relevante é derivada de uma sequência de aminoácidos na qual está presente.

[00219] A expressão “célula” ou “célula hospedeira” designa preferencialmente uma célula intacta, ou seja, uma célula com uma membrana intacta que não tenha liberado seus componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelas ou material genético. Células intactas são preferencialmente células viáveis, ou seja, células vivas capazes de realizar suas funções metabólicas normais. Preferencialmente, a mencionada expressão indica, de acordo com a presente invenção, qualquer célula que possa ser transfectada com um ácido nucleico exógeno. Preferencialmente, a célula, quando transfectada com um ácido nucleico exógeno e transferida para pacientes, pode expressar o ácido nucleico no paciente. O termo “célula” indica células bacterianas; outras células úteis são células de leveduras, células fúngicas ou células de mamíferos. Células bacterianas apropriadas incluem células de linhagens bacterianas gram-negativas, tais como linhagens de Escherichia coli, Proteus e Pseudomonas, bem como linhagens bacterianas gram-positivas, tais como linhagens de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus e Lactococcus. Células fúngicas apropriadas incluem células de espécies de Trichoderma, Neurospora e Aspergillus. Células de leveduras apropriadas

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95/131 incluem células de espécies de Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosacharomyces pombe), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris e Pichia methanolicd) e Hansenula. Células de mamíferos apropriadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, 293 HEK e similares. Células de anfíbios, células de insetos, células vegetais e quaisquer outras células utilizadas na técnica para expressão de proteínas heterólogas, entretanto, também podem ser utilizadas. Células de mamíferos são particularmente preferidas para transferência adotiva, tais como células de seres humanos, camundongos, cobaias, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas de uma grande quantidade de tipos de tecidos e incluem células primárias e linhagens celulares, tais como células do sistema imunológico, particularmente células que apresentam antígenos tais como células dendríticas e células T, células tronco tais como células tronco hematopoiéticas, células tronco mesenquimais e outros tipos de células. Células particularmente preferidas para uso de acordo com a presente invenção são células efetoras imunes ou imunorreativas, particularmente células T.

[00220] Células que compreendem moléculas de ácido nucleico expressam preferencialmente o peptídeo ou proteína codificada pelo ácido nucleico.

[00221] A expressão “expansão clonal” ou “expansão” designa um processo no qual uma entidade específica é multiplicada. No contexto da presente invenção, a expressão é preferencialmente utilizada no contexto de reação imunológica na qual os linfócitos são estimulados por antígenos, proliferam-se e o linfócito específico que reconhece o mencionado antígeno é amplificado. Preferencialmente, a expansão clonal gera diferenciação dos linfócitos. O termo “primer” designa um processo no qual uma célula T possui seu primeiro contato com seu antígeno específico e causa

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96/131 diferenciação em células T efetoras.

[00222] As moléculas tais como ácidos nucleicos, cadeias de peptídeos ou receptores de antígenos, ou células descritas no presente, podem ser recombinantes e/ou isoladas.

[00223] O termo “isolado”, da forma utilizada no presente, destina-se a indicar entidades que são substancialmente livres de outras moléculas, tais como outro material celular. O termo “isolado” indica preferencialmente que a entidade isolada foi separada do seu ambiente natural. Entidades isoladas podem encontrar-se em estado essencialmente purificado. A expressão “essencialmente purificado” indica preferencialmente que a entidade é essencialmente livre de outras substâncias às quais é associada na natureza ou in vivo.

[00224] O termo “recombinante”, no contexto da presente invenção, indica “elaborado por meio de engenharia genética”. Preferencialmente, “objeto recombinante”, tal como uma célula recombinante no contexto da presente invenção, não é de ocorrência natural.

[00225] A expressão “de ocorrência natural”, da forma utilizada no presente, indica o fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Peptídeos ou ácidos nucleicos que estão presentes em organismos (incluindo vírus), podem ser isolados de fontes naturais e não foram modificados intencionalmente pelo homem no laboratório, por exemplo, são de ocorrência natural.

[00226] O termo “autólogo” é utilizado para descrever tudo o que for derivado do mesmo paciente. “Transplante autólogo”, por exemplo, designa um transplante de tecido ou órgãos derivados do mesmo paciente. Esses procedimentos são convenientes, pois eles superam a barreira imunológica que, de outra forma, resulta em rejeição.

[00227] O termo “alogeneico” é utilizado para descrever tudo

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97/131 o que for derivado de diferentes indivíduos da mesma espécie. Afirma-se que dois ou mais indivíduos são alogeneicos entre si quando os genes em um ou mais locais não forem idênticos.

[00228] O termo “singeneico” é utilizado para descrever tudo o que for derivado de indivíduos ou tecidos que possuem genótipos idênticos, ou seja, gêmeos idênticos ou animais da mesma linhagem congênita ou seus tecidos.

[00229] O termo “heterólogo” é utilizado para descrever algo que consiste de diversos elementos diferentes. Como exemplo, a transferência da medula óssea de um indivíduo para um indivíduo diferente constitui um transplante heterólogo. Gene heterólogo é um gene derivado de fontes diferentes do paciente.

[00230] “Reduzir” ou “inibir”, da forma utilizada no presente, indica a capacidade de causar redução geral do nível, preferencialmente de 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, de maior preferência de 50% ou mais e, de preferência superior, de 75% ou mais. O termo “inibir” ou similares inclui inibição completa ou essencialmente completa, ou seja, redução a zero ou essencialmente a zero.

[00231] Termos como “aumentar” ou “ampliar” indicam preferencialmente aumento ou ampliação de cerca de pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, preferencialmente pelo menos 30%, de maior preferência pelo menos 40%, de maior preferência pelo menos 50%, de preferência ainda maior pelo menos 80% e, de preferência superior, pelo menos 100%.

[00232] Como receptores de antígenos de acordo com a presente invenção podem ser elaborados para dirigir-se a virtualmente qualquer antígeno, incluindo antígenos específicos de doenças, os receptores de antígenos de acordo com a presente invenção possuem amplo uso

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98/131 terapêutico. Consequentemente, a presente invenção refere-se ao uso de receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, suas cadeias de peptídeos, ácidos nucleicos que os codificam e outras moléculas relacionadas em métodos terapêuticos e profiláticos. Um desses usos encontra-se na produção de células imunes específicas de antígenos, que podem ser administradas a pacientes para prevenir ou tratar de doenças, em que as doenças são caracterizadas pela expressão de um ou mais antígenos que podem ser ligados por um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção expresso nas células imunes. Preferencialmente, a doença é câncer. Além disso, um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção e moléculas relacionadas também podem ser utilizados para erradicação seletiva de células que expressam antígenos previamente determinados, bem como para imunização de vacinação contra doenças nas quais os antígenos previamente determinados são expressos, em que esse antígeno pode ser ligado por pelo menos um local de ligação de antígenos de receptores de antígenos de acordo com a presente invenção.

[00233] Em uma realização, métodos de tratamento ou prevenção de doenças compreendem a administração a pacientes de quantidade eficaz de ácidos nucleicos que codificam receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, em que pelo menos um local de ligação de antígenos do receptor de antígenos é capaz de ligar um antígeno que é associado à doença (por exemplo, antígeno viral ou de tumor) a ser tratada ou evitada. Em outra realização, métodos de tratamento ou prevenção de doenças compreendem a administração a pacientes de quantidade eficaz de células efetoras imunes recombinantes ou uma população expandida das mencionadas células efetoras imunes, em que a célula efetora imune ou a população de células expressam de forma recombinante um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção, em que pelo menos um local de

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99/131 ligação de antígenos do receptor de antígenos é capaz de ligar antígeno que é associado à doença a ser tratada ou evitada. Em realizações preferidas, a doença é câncer e o antígeno é um antígeno associado a tumores.

[00234] Em outra realização, a presente invenção fornece um método de imunização ou vacinação contra doenças associadas a antígenos específicos ou contra organismos causadores de doenças que expressam antígenos específicos, em que o método compreende a administração ao paciente de quantidade eficaz de ácidos nucleicos que codificam receptores de antígenos de acordo com a presente invenção, em que pelo menos um local de ligação de antígenos do receptor de antígenos é capaz de ligar o antígeno específico. Em outra realização, a presente invenção fornece um método de imunização ou vacinação contra doenças associadas a antígenos específicos ou contra organismos causadores de doenças que expressam antígenos específicos, em que o método compreende a administração ao paciente de quantidade eficaz de células efetoras imunes recombinantes ou uma população expandida das mencionadas células efetoras imunes, em que a célula efetora imune ou a população de células expressam de forma recombinante um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção e pelo menos um local de ligação de antígenos do receptor de antígenos é capaz de ligar-se ao antígeno específico.

[00235] Em certas realizações, a população de células efetoras imunes pode ser uma população expandida de forma clonal. As células efetoras imunes recombinantes ou suas populações fornecem função efetora imune terapêutica ou profilática de forma específica de antígenos. Preferencialmente, um receptor de antígenos de acordo com a presente invenção é expresso sobre a superfície celular da célula efetora imune.

[00236] As células utilizadas com relação aos métodos terapêuticos e profiláticos de acordo com a presente invenção são

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100/131 preferencialmente células efetoras imunes e as células efetoras imunes são preferencialmente células T. Particularmente, as células utilizadas no presente são linfócitos citotóxicos, preferencialmente selecionados a partir de células T citotóxicas, células matadoras naturais (NK) e células matadoras ativadas por linfocinas (LAK). Mediante ativação/estímulo, cada um desses linfócitos citotóxicos aciona a destruição de células alvo. Células T citotóxicas, por exemplo, acionam a destruição de células alvo por um ou ambos os meios a seguir. Em primeiro lugar, mediante ativação, as células T liberam citotoxinas, tais como perforina, granzimas e granulisina. Perforina e granulisina criam poros na célula alvo e granzimas entram na célula e acionam um processo de caspase no citoplasma que induz a apoptose (morte celular programada) da célula. Em segundo lugar, a apoptose pode ser induzida por meio da interação de ligante Fas-Fas entre as células T e as células de tumor alvo. As células T e outros linfócitos citotóxicos serão preferencialmente células autólogas, embora células heterólogas ou células alogênicas possam ser utilizadas.

[00237] Consequentemente, os agentes, composições e métodos descritos no presente podem ser utilizados para tratar pacientes com doenças, tais como doenças caracterizadas pela presença de células doentes que expressam antígenos. Doenças particularmente preferidas são doenças de câncer.

[00238] Os agentes, composições e métodos descritos no presente podem ser também utilizados para imunização ou vacinação, a fim de evitar doenças descritas no presente.

[00239] O termo “doença” designa condição anormal que afeta o corpo de um indivíduo. Doença é frequentemente interpretada como condição médica associada a sinais e sintomas específicos. Doenças podem ser causadas por fatores originalmente de fontes externas, tais como doenças infecciosas, ou podem ser causadas por distúrbios internos, tais como doenças

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101/131 autoimunes. Em seres humanos, “doença” é frequentemente utilizada de forma mais ampla para indicar qualquer condição que cause dor, distúrbios, sofrimento, problemas sociais ou morte para o indivíduo afligido ou problemas similares para os que se encontram em contato com o indivíduo. Neste sentido mais amplo, às vezes inclui lesões, incapacidades, distúrbios, síndromes, infecções, sintomas isolados, desvios de comportamento e variações atípicas de função e estrutura, enquanto, em outros contextos e para outros propósitos, estes podem ser considerados categorias diferenciáveis. As doenças normalmente afetam os indivíduos não apenas fisicamente, mas também emocionalmente, pois contrair e viver com muitas doenças pode alterar as perspectivas de vida e a personalidade das pessoas. Segundo a presente invenção, o termo “doença” inclua doenças infecciosas e doenças de câncer, particularmente as formas de câncer descritas no presente. Qualquer referência no presente a câncer ou formas específicas de câncer também inclui metástase de câncer.

[00240] Doenças a serem tratadas de acordo com a presente invenção são preferencialmente doenças que envolvem antígenos. “Doenças que envolvem antígenos”, “doenças associadas à expressão ou expressão elevada de antígenos” ou expressões similares indicam, de acordo com a presente invenção, que o antígeno é expresso em células de órgãos ou tecidos doentes. A expressão em células de tecidos ou órgãos doentes pode aumentar em comparação com o estado em órgãos ou tecidos saudáveis. Em uma realização, a expressão somente é encontrada em tecidos doentes, enquanto a expressão em tecidos saudáveis não é encontrada; a expressão, por exemplo, é reprimida. Segundo a presente invenção, doenças que envolvem antígenos incluem doenças infecciosas e doenças de câncer, em que o antígeno associado a doenças é preferencialmente um antígeno do agente infeccioso e um agente de tumor, respectivamente. Doenças que envolvem

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102/131 antigenos são preferencialmente doenças que envolvem células que expressam antigenos, preferencialmente sobre a superfície celular.

[00241] O termo “saudável” ou “normal” designa condições não patológicas e, preferencialmente, indica não infectado ou não canceroso.

[00242] Os termos “doença de câncer” ou “câncer” designam ou descrevem a condição fisiológica em indivíduos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitações, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Mais especificamente, exemplos desses cânceres incluem câncer dos ossos, câncer do sangue, câncer do pulmão, câncer do fígado, câncer do pâncreas, câncer da pele, câncer da cabeça ou do pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer do útero, câncer do ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer de mama, câncer da próstata, câncer do útero, carcinoma dos órgãos sexuais e reprodutores, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da bexiga, câncer dos rins, carcinoma de células renais, carcinoma da pélvis renal, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), câncer neuroectodermal, tumores da coluna vertebral, glioma, meningioma e adenoma da pituitária. Ο termo “câncer”, segundo a presente invenção, também compreende metástases de câncer. Preferencialmente, “doença de câncer” é caracterizada por células que expressam antigenos de tumores e células de câncer expressam antigenos de tumores.

[00243] Em uma realização, doença de câncer é doença maligna que é caracterizada pelas propriedades de anaplasia, invasividade e metástase. Tumores malignos podem contrastar com tumores benignos não cancerosos porque o crescimento da malignidade não é autolimitado, ela é

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103/131 capaz de invadir tecidos adjacentes e pode ser capaz de difundir-se para tecidos distantes (metástase), enquanto o tumor benigno não possui nenhuma dessas propriedades.

[00244] Segundo a presente invenção, a expressão “tumor” ou “doença de tumor” designa inchaço ou lesão formada pelo crescimento anormal das células (denominadas células neoplásticas ou células de tumores). “Célula de tumor” indica uma célula anormal que cresce por meio de proliferação celular rápida e descontrolada e continua a crescer após cessarem o estímulos que iniciaram o novo crescimento. Tumores exibem falta total ou parcial de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal e normalmente formam uma massa distinta de tecido, que pode ser benigno, pré-maligno ou maligno.

[00245] Segundo a presente invenção, “carcinoma” é um tumor maligno derivado de células epiteliais. Este grupo representa os cânceres mais comuns, incluindo as formas comuns de câncer de mama, próstata, pulmão e cólon.

[00246] “Adenocarcinoma” é câncer que se origina em tecido glandular. Este tecido também é parte de uma categoria de tecidos maior, conhecida como tecido epitelial. Tecido epitelial inclui pele, glândulas e uma série de outros tecidos que alinham as cavidades e órgãos do corpo. Epitélio é derivado embriologicamente de ectoderma, endoderma e mesoderma. Para serem classificadas como adenocarcinoma, as células não precisam ser necessariamente parte de uma glândula, desde que possuam propriedades secretórias. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo seres humanos. Adenocarcinomas bem diferenciados tendem a relembrar o tecido glandular de que são derivados, enquanto os mal diferenciados não o fazem. Manchando as células de biópsia, o patologista determinará se o tumor é adenocarcinoma ou algum outro tipo de câncer.

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Adenocarcinomas podem surgir em muitos tecidos do corpo, devido à natureza onipresente das glândulas no interior do corpo. Embora cada glândula possa não estar secretando a mesma substância, desde que exista função exócrina para a célula, ela é considerada glandular e sua forma maligna é, portanto, denominada adenocarinoma. Adenocarcinomas malignos invadem outros tecidos e frequentemente sofrem metástase após tempo suficiente. Adenocarcinoma do ovário é o tipo mais comum de carcinoma do ovário. Ele inclui os adenocarcinomas serosos e mucinosos, adenocarcinoma de células limpas e adenocarcinoma endometrioide.

[00247] Linfoma e leucemia são malignidades derivadas de células hematopoiéticas (formadoras de sangue).

[00248] Tumor blástico ou blastoma é um tumor (normalmente maligno) que relembra um tecido embriônico ou imaturo. Muitos desses tumores são mais comuns em crianças.

[00249] “Metástase” indica a difusão de células de câncer do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende da separação de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas base endoteliais para que entrem na cavidade corporal e nos vasos e, em seguida, após serem transportadas pelo sangue, infiltração de órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende da angiogênese. Metástase de tumor frequentemente ocorre mesmo após a remoção do tumor primário, pois células ou componentes do tumor podem permanecer e desenvolver potencial metastático. Em uma realização, o termo “metástase” de acordo com a presente invenção refere-se a “metástase distante”, que se refere a metástase que é remota do tumor primário e do sistema de nódulos linfáticos regionais. Em uma realização, o termo “metástase” de acordo com a presente invenção refere-se à metástase dos nódulos linfáticos.

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105/131 [00250] Recorrência ou reincidência ocorre quando a pessoa é novamente afetada por uma condição que a afetou no passado. Caso um paciente tenha sofrido de doença de tumor, por exemplo, recebido tratamento bem sucedido da mencionada doença e novamente desenvolva a mencionada doença, a mencionada doença recém desenvolvida pode ser considerada recorrência ou reincidência. Segundo a presente invenção, entretanto, recorrência ou reincidência de doenças de tumor pode ocorrer, mas não necessariamente ocorre no local da doença de tumor original. Desta forma, por exemplo, caso a paciente tenha sofrido de tumor do ovário e recebido tratamento bem sucedido, a recorrência ou reincidência pode ser a ocorrência de tumor do ovário ou a ocorrência de tumor em local diferente do ovário. A recorrência ou reincidência de tumores também inclui situações nas quais um tumor ocorre em local diferente do local do tumor original, bem como no local do tumor original. Preferencialmente, o tumor original para o qual o paciente recebeu tratamento é um tumor primário e o tumor em um local diferente do local do tumor original é um tumor secundário ou metastático.

[00251] Doenças infecciosas que podem ser tratadas ou evitadas pela presente invenção são causadas por agentes infecciosos, que incluem, mas sem limitações, vírus, bactérias, fungos, protozoários, helmíntios e parasitas.

[00252] Vírus infecciosos de vertebrados humanos e não humanos incluem retrovirus, vírus de RNA e vírus de DNA. Exemplos de vírus que foram encontrados em seres humanos incluem, mas sem limitações: Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana, tais como HIV-1 (também denominado HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV) ou HIV-III; e outros isolados, tais como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, vírus da pólio e vírus da hepatite A; enterovirus, vírus Coxsackie humanos, rinovírus e ecovírus); Calciviridae (por exemplo, linhagens que causam gastroenterite); Togaviridae

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106/131 (por exemplo, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola); Flaviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da parainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus sincitial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza); Bungaviridae (por exemplo, vírus Hanta, vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo); Arena viridae (vírus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus da hepatite B); Parvovirida (parvovirus); Papovaviridae (vírus papilloma, vírus de polioma); Adenoviridae (a maioria dos adenovirus); Herpesviridae (vírus simplex da herpes (HSV) 1 e 2, vírus zóster da varicela, citomegalovírus (CMV), vírus da herpes; Poxyiridae (vírus da varíola, vírus da vaccinia, poxvirus); e Iridoviridae (por exemplo, vírus da febre suína africana); e vírus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicos de encefalopatias espongiformes, agente da hepatite delta (considerado satélite defeituoso do vírus da hepatite B), os agentes da hepatite não A e não B (classe 1 = transmitidos internamente; classe 2 = transmitidos parenteralmente (ou seja, hepatite C)); vírus Norwalk e relacionados e astrovírus).

[00253] Retrovirus contemplados incluem retrovirus simples e retrovirus complexos. Os retrovirus complexos incluem os subgrupos de lentivírus, vírus da leucemia de células T e os vírus espumosos. Lentivírus incluem HIV-1, mas também incluem HIV-2, SIV, vírus Visna, vírus da imunodeficiência felina (FIV) e vírus da anemia infecciosa equina (EIAV). Os vírus da leucemia de células T incluem HTLV-1, HTLV-II, vírus da leucemia de células T de símios (STLV) e vírus da leucemia bovina (BLV). Os vírus espumosos incluem vírus espumoso humano (HFV), vírus espumoso dos símios (SFV) e vírus espumoso bovino (BFV).

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107/131 [00254] Doenças ou infecções bacterianas que podem ser tratadas ou evitadas por meio da presente invenção são causadas por bactérias que incluem, mas sem limitações, bactérias que possuem um estágio intracelular no seu ciclo de vida, tais como micobactérias (por exemplo, Mycobacteria tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. leprae ou M. africanum), rickettsia, micoplasma, clamídia e legionella. Outros exemplos de infecções bacterianas contempladas incluem, mas sem limitações, infecções causadas por bacilos Gram positivos (por exemplo, Listeria, Bacillus tais como Bacillus anthracis e espécies de Erysipelothrix), bacilos Gram negativos (por exemplo, espécies de Bartonella, Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Hemophilus, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Vibrio e Yersinia), bactérias espiroquetes (por exemplo, espécies de Borrelia, incluindo Borrelia burgdorferi que causa doença de Lyme), bactérias anaeróbicas (por exemplo, espécies de Actinomyces e Clostridium), bactérias cocais Gram positivas e negativas, espécies de Enterococcus, espécies de Streptococcus, espécies de Pneumococcus, espécies de Staphylococcus e espécies de Neisseria. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluem, mas sem limitações: Helicobacter pylon's, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus do Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus do Grupo B), Streptococcus viridans, Streptococcus aecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Fusobacterium nucleatuin, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium,

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Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia e Actinoyyces israelii.

[00255] Doenças fúngicas que podem ser tratadas ou evitadas pela presente invenção incluem, mas sem limitações, aspergiliose, critococose, esporotricose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose, histoplasmose, blastomicose, zigomicose e candidíase.

[00256] Doenças parasíticas que podem ser tratadas ou evitadas por meio da presente invenção incluem, mas sem limitações, amebíase, malária, leishmania, coccídia, giardíase, criptosporidiose, toxoplasmose e tripanossomíase. São também englobadas infecções por diversos vermes, tais como, mas sem limitações, ascaríase, ancilostomíase, tricuríase, estrongiloidíase, toxocaríase, triquinose, oncocercíase, filária e dirofilaríase. São também englobadas infecções por diversos vermes, tais como, mas sem limitações, esquistossomíase, paragonimíase e clonorquíase.

[00257] A expressão “tratamento” ou “tratamento terapêutico” indica qualquer tratamento que melhore a situação de saúde e/ou prolongue (aumente) o período de vida do indivíduo. O mencionado tratamento pode eliminar a doença em indivíduos, suspender ou retardar o desenvolvimento de doenças em indivíduos, inibir ou retardar o desenvolvimento de doenças em indivíduos, reduzir a frequência ou a severidade de sintomas em indivíduos e/ou reduzir a reincidência em indivíduos que sejam atualmente portadores ou foram portadores de doença anteriormente.

[00258] As expressões “tratamento profilático” ou “tratamento preventivo” designam qualquer tratamento que se destine a evitar a ocorrência de doenças em indivíduos. As expressões “tratamento profilático” ou “tratamento preventivo” são utilizadas no presente de forma intercambiável.

[00259] Os termos “indivíduo” e “paciente” são utilizados no presente de forma intercambiável. Eles se referem a seres humanos, primatas

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109/131 não humanos ou outros mamíferos (por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, bois, suínos, carneiros, cavalos ou primatas) que podem sofrer ou são susceptíveis a doenças ou distúrbios (por exemplo, câncer), mas podem ou não ser portadores da doença ou distúrbio. Em muitas realizações, o indivíduo é um ser humano. A menos que indicado em contrário, os termos “indivíduo” e “paciente” não indicam idade específica e, portanto, englobam adultos, idosos, crianças e recém-nascidos. Em realizações preferidas da presente invenção, o “indivíduo” é “paciente”. O termo “paciente” indica, segundo a presente invenção, paciente para tratamento, particularmente paciente doente.

[00260] “Encontra-se em risco” indica um paciente que é identificado como possuindo chance maior que a normal de desenvolver doença, particularmente câncer, em comparação com a população em geral. Além disso, pacientes que sofreram ou sofrem atualmente com uma doença, particularmente câncer, são pacientes que apresentam risco mais alto de desenvolvimento da doença, pois esse paciente pode continuar a desenvolver a doença. Pacientes que atualmente são portadores ou foram portadores de câncer também apresentam risco mais alto de metástases de câncer.

[00261] O termo “imunoterapia” indica tratamento que envolve reação ou resposta imunológica específica.

[00262] No contexto da presente invenção, termos como “proteger”, “evitar”, “profilático”, “preventivo” ou “protetor” designam a prevenção e/ou tratamento da ocorrência e/ou propagação de doenças em pacientes e, particularmente, minimizar a possibilidade de desenvolvimento de doenças por pacientes ou retardar o desenvolvimento da doença. Pessoas com risco de tumor, conforme descrito acima, seriam, por exemplo, candidatos para terapia de prevenção de tumores.

[00263] Administração profilática de imunoterapia, tal como

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110/131 administração profilática de agentes ou composições de acordo com a presente invenção, preferencialmente protege o paciente contra o desenvolvimento de doenças. Administração terapêutica de imunoterapia, tal como administração terapêutica de agentes ou composições de acordo com a presente invenção, pode gerar a inibição do progresso/crescimento da doença. Isso compreende a desaceleração do progresso/crescimento da doença, particularmente interrupção da progressão da doença, que preferencialmente gera eliminação da doença.

[00264] Pode-se realizar imunoterapia utilizando-se qualquer um dentre uma série de métodos, nos quais os agentes fornecidos no presente funcionam preferencialmente para remover células que expressam antígenos de pacientes. Essa remoção pode ter lugar como resultado do aumento ou indução de reação imunológica em pacientes específicos para antígenos ou antígenos que expressam células.

[00265] O termo “imunização” ou “vacinação” descreve o processo de tratamento de pacientes com o propósito de induzir reação imunológica por razões terapêuticas ou profiláticas.

[00266] A expressão ‘77? vivo refere-se à situação em pacientes.

[00267] Os receptores de antígenos, cadeias de peptídeos, ácidos nucleicos, células recombinantes, células efetoras imunes, preferencialmente células T, de acordo com a presente invenção, bem como outros compostos e agentes descritos no presente podem ser administrados na forma de qualquer composição farmacêutica apropriada.

[00268] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preferencialmente estéreis e contêm quantidade eficaz dos agentes descritos no presente e, opcionalmente, agentes adicionais discutidos no presente para gerar a reação desejada ou o efeito desejado.

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111/131 [00269] Composições farmacêuticas são normalmente fornecidas em forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de forma intrinsecamente conhecida. Composições farmacêuticas podem apresentar-se, por exemplo, na forma de solução ou suspensão.

[00270] Composições farmacêuticas podem compreender sais, substâncias tampão, conservantes, veículos, diluentes e/ou excipientes, todos os quais preferencialmente são farmaceuticamente aceitáveis. A expressão “farmaceuticamente aceitável” designa não toxicidade de materiais que não interagem com a ação do componente ativo da composição farmacêutica.

[00271] Sais que não são farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis e são incluídos na presente invenção. Sais farmaceuticamente aceitáveis deste tipo compreendem, de forma não limitadora, os preparados a partir dos ácidos a seguir: ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico e similares. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser também preparados na forma de sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.

[00272] Substâncias tampão apropriadas para uso em composições farmacêuticas incluem ácido acético em sais, ácido cítrico em sais, ácido bórico em sais e ácido fosfórico em sais.

[00273] Conservantes apropriados para uso em composições farmacêuticas incluem cloreto de benzalcônio, clorobutanol, paraben e timerosal.

[00274] Formulações injetáveis podem compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como lactato de Ringer.

[00275] O termo “veículo” designa um componente orgânico

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112/131 ou inorgânico, natural ou sintético, no qual o componente ativo é combinado a fim de facilitar, aprimorar ou permitir a aplicação. Segundo a presente invenção, o termo “veículo também inclui uma ou mais cargas, diluentes ou substâncias encapsuladoras líquidas ou sólidas compatíveis, que são apropriadas para administração a pacientes.

[00276] Possíveis substâncias veículo para administração parenteral são, por exemplo, água estéril, Ringer, lactato de Ringer, solução de cloreto de sódio estéril, polialquileno glicóis, naftalenos hidrogenados e, particularmente, polímeros de lactídeos biocompatíveis, copolímeros de lactídeo/glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.

[00277] O termo “excipiente”, quando utilizado no presente, destina-se a indicar todas as substâncias que podem estar presentes em composições farmacêuticas e que não são ingredientes ativos, tais como veículos, aglutinantes, lubrificantes, espessantes, agentes ativos na superfície, conservantes, emulsificantes, tampões, agentes aromatizantes ou corantes.

[00278] Os agentes e composições descritos no presente podem ser administrados por meio de qualquer via convencional, tal como por meio de administração parenteral, incluindo injeção ou infusão. A administração é preferencialmente realizada por via parenteral, tal como intravenosa, intraarterial, subcutânea, intradérmica ou intramuscular.

[00279] Composições apropriadas para administração parenteral normalmente compreendem uma preparação aquosa ou não aquosa estéril do composto ativo, que é preferencialmente isotônica para o sangue do paciente. Exemplos de veículos e solventes compatíveis são solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos, normalmente estéreis, são utilizados como meio de suspensão ou solução.

[00280] Os agentes e composições descritos no presente são administrados em quantidades eficazes. “Quantidade eficaz” designa a

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113/131 quantidade que atinge reação desejada ou efeito desejado isolado ou em conjunto com doses adicionais. No caso de tratamento de doenças específicas ou condições específicas, a reação desejada preferencialmente se refere à inibição do transcurso da doença. Isso compreende a redução da velocidade de progresso da doença e, particularmente, interrupção ou reversão do progresso da doença. A reação desejada no tratamento de doenças ou condições pode também ser atraso do início ou prevenção do início da mencionada doença ou da mencionada condição.

[00281] Quantidade eficaz de agente ou composição descrito no presente dependerá da condição a ser tratada, severidade da doença, parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, tamanho e peso, duração do tratamento, tipo de terapia acompanhante (quando presente), via específica de administração e fatores similares. Consequentemente, as doses administradas dos agentes descritos no presente podem depender de diversos desses parâmetros. Caso a reação em paciente seja insuficiente com dose inicial, podem ser utilizadas doses mais altas (ou doses efetivamente mais altas atingidas por uma via de administração diferente, mais localizada).

[00282] Os agentes e composições descritos no presente podem ser administrados a pacientes, por exemplo, in vivo, para tratar ou evitar uma série de distúrbios como os descritos no presente. Pacientes preferidos incluem pacientes humanos portadores de distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados por meio de administração dos agentes e composições descritos no presente. Isso inclui distúrbios que envolvem células caracterizadas pela expressão de antígenos.

[00283] Em uma realização, por exemplo, os agentes descritos no presente podem ser utilizados para tratar pacientes com doença de câncer, tal como doença de câncer como a descrita no presente,

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114/131 caracterizada pela presença de células de câncer que expressam antígenos.

[00284] As composições farmacêuticas e os métodos de tratamento descritos de acordo com a presente invenção podem ser também utilizados para imunização ou vacinação, a fim de evitar doenças descritas no presente.

[00285] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada em conjunto com a suplementação de substâncias amplificadoras da imunidade, tais como um ou mais adjuvantes, e pode compreender uma ou mais substâncias amplificadoras da imunidade para aumentar ainda mais a sua eficácia, preferencialmente para atingir efeito sinérgico de imunoestímulo. O termo “adjuvante” indica compostos que prolongam, aprimoram ou aceleram a reação imunológica. Diversos mecanismos são possíveis neste particular, dependendo dos vários tipos de adjuvantes. Compostos que permitem a maturação de DC, tais como lipopolissacarídeos ou ligante CD40, por exemplo, formam primeira classe de adjuvantes apropriados. Geralmente, qualquer agente que influencie o sistema imunológico do tipo “sinal de perigo” (LPS, GP96, dsRNA etc.) ou citocinas, tais como GM-CSF, pode ser utilizado como adjuvante que permite a intensificação e/ou influência controlada de reação imunológica. Oligodesoxinucleotídeos CpG podem também ser opcionalmente utilizados neste contexto, embora seus efeitos colaterais que ocorrem sob certas circunstâncias, conforme explicado acima, devam ser considerados. Adjuvantes particularmente preferidos são citocinas, tais como monocinas, linfocinas, interleucinas ou quemocinas, tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNa, IFNy, GM-CSF, LT-a ou fatores de crescimento, tais como hGH. Adjuvantes conhecidos adicionais são hidróxido de alumínio, adjuvante de Freund ou óleo tal como Montanide®, de maior preferência Montanide® ISA51. Lipopeptideos, tais como Pam3Cys, também são apropriados para uso como adjuvantes na

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115/131 composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.

[00286] A composição farmacêutica pode ser administrada de forma local ou sistêmica, preferencialmente sistêmica.

[00287] A expressão “administração sistêmica” designa a administração de agentes de forma que o agente seja amplamente distribuído no corpo do indivíduo em quantidades significativas e desenvolva efeito desejado. O agente pode, por exemplo, desenvolver o seu efeito desejado no sangue e/ou atingir o seu local de ação desejado por meio do sistema vascular. Vias de administração sistêmicas típicas incluem administração por meio de introdução do agente diretamente no sistema vascular ou administração oral, pulmonar ou intramuscular em que o agente é adsorvido, entra no sistema vascular e é conduzido para um ou mais locais de ação desejados por meio do sangue.

[00288] Segundo a presente invenção, prefere-se que a administração sistêmica seja realizada por meio de administração parenteral. A expressão “administração parenteral” designa administração de agentes, de forma que o agente não passe para o intestino. A expressão “administração parenteral” inclui administração intravenosa, administração subcutânea, administração intradérmica ou administração intra-arterial, mas sem limitações.

[00289] A administração pode também ser conduzida, por exemplo, por via oral, intraperitoneal ou intramuscular.

[00290] Os agentes e composições fornecidos no presente podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com reagentes terapêuticos convencionais, tais como cirurgia, irradiação, quimioterapia e/ou transplante de medula óssea (autólogo, singeneico, alogeneico ou não relacionado).

[00291] A presente invenção é descrita em detalhes por meio das figuras e exemplos abaixo, que são utilizados apenas para fins de

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116/131 ilustração e não se destinam a ser limitadores. Devido à descrição e aos exemplos, realizações adicionais que são incluídas de forma similar na presente invenção são acessíveis para os técnicos no assunto.

Breve Descrição das Figuras [00292] A Figura 1 compreende uma apresentação esquemática de todas as construções de receptor de células T (TCR) e receptor de antígenos quiméricos (CAR) utilizadas nos experimentos. (A) e (B) TCR é composto de uma proteína de membrana classe I heterodimérica, em que cada cadeia compreende um domínio C invariável e um domínio V variável e esta última reconhece especificamente o peptídeo processado de forma restrita por MHC. A homologia de estrutura e de sequência de TCR murino (Mu, A) e humano (Hu, B) é muito alta. TCR murino reconhece um antígeno de tumor humano originário da proteína de junção firme Claudina 6, enquanto o TCR humano reconhece um antígeno de tumor derivado do antígeno de diferenciação de melanócitos gp100. (C) CAR de fita simples monovalente compreende um fragmento de Fv de fita simples (sc) enganchado a um domínio Cp murino e um domínio Ca de TCR autônomo, precedido por um peptídeo de sinal para exportação para a membrana celular. Opcionalmente, ele pode ser potencializado com uma ligação de bissulfeto artificial entre os domínios C de TCR para aumentar a função e a expressão na superfície celular desse CAR. O fragmento de scFv neste e em todos os exemplos de construções a seguir é dirigido contra Claudina 6. (D) scCAR clássico CI6 compreende um homodímero, cada qual alinhando um fragmento de scFv, uma região de articulação de anticorpos, os domínios CH2CH3 como região espaçadora, a membrana celular e domínios de sinalização intracelular da molécula coestimulante CD28 e Ωϋ3ζ, respectivamente. Homodimerização gera reconhecimento bivalente do antígeno, em que cada cadeia liga um único antígeno (ou seja, intracadeias). (E) CAR combinatório protótipo conduz

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117/131 domínios V relacionados a alelos conectados em série (ou seja, VH-VH ou VLVL) e enganchados a TCR Ca ou C3, respectivamente. O reconhecimento necessita de ligação de antígenos ao longo das duas cadeias em forma combinatória (ou seja, intercadeias) e bivalente. (F) TCR-CAR CI6 heterodimérico que conduz fragmentos de scFv em TCRa gp1OO com comprimento total ou TCR3 reconhece o antígeno cognato de forma bivalente, mas não combinatória. (G) A fim de eliminar o reconhecimento residual do peptídeo cognato gp1OO (280-288) pela porção TCR gp100 do TCR-CAR CI6 não combinatório (F), introduz-se mutação pontual S109Q de “silenciamento” (sil) (conforme a nomenclatura IMGT) no circuito CDR3 de TCRa (silCDR3a).

(H) TCR-CAR CI6 combinatório é gerado por meio de conexão dos domínios V relativos a alelos em série sobre uma cadeia TCRa gp100 com comprimento total ou uma cadeia TCR3 com comprimento total, respectivamente, conforme descrito em (E). TCR com comprimento total utilizado como parceiro de fusão no presente pode fornecer melhor sinalização de células T fisiológicas que um TCR truncado que compreende apenas os domínios C de TCR em vez de (E).

(I) A fim de eliminar o reconhecimento residual do peptídeo cognato gp100 (280-288) pela porção de TCR gp100 do TCR-CAR CI6 combinatório (H), introduz-se mutação pontual S109Q de “silenciamento” (sil) (conforme a nomenclatura IMGT) no circuito CDR3 de TCRa (silCDR3a) como em (G).

[00293] As Figuras 2A/B exibem a expressão de Claudina 6 em APCs e diferentes CARs sobre células T humanas, respectivamente, antes da configuração de cocultivo. (A) Células dendríticas imaturas (iDCs) sofreram eletroporação com quantidades crescentes do antígeno com comprimento total cognato Claudina 6 ou uma única dose alta do antígeno irrelevante gp100. Neste ponto, alteração de volume dependente de dosagem da expressão de CI6 poderá ser observada em citometria de fluxo, o que indica que iDCs desse doador são altamente permissivas para absorção de RNA celular, tradução de

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118/131 proteínas e exportação para a superfície celular. Alta expressão de CD86 indica forte diferenciação de monócitos em iDCs que apresentam antigenos de forma favorável. (B) Células T CD8+ previamente ativadas sofreram eletroporação com diferentes RNAs codificadores de CAR e foram testadas para determinar a expressão de CAR em citometria de fluxo. Todos os CARs, exceto o scCAR clássico e monovalente, foram moderadamente recuperados em manchas anti-idiotipos. O CAR monovalente foi menos expresso quando o scCAR clássico foi considerado melhor. A Figura 2C exibe a eficiência de células T humanas reprogramadas CAR CI6 no reconhecimento de iDCs que expressam Claudina 6 após a configuração do cocultivo de células T/APC em ELISA IFNy. Células T eletroporadas por CAR foram cocultivadas por uma noite com APCs eletroporadas por CI6 conforme explicado em 2A/B em razão E:T (razão entre células efetoras e alvo) de 10:1. Ao longo de toda a faixa de titulação de CI6, todos os CARS apresentaram desencadeamento ideal em doses de CI6 inferiores (0,02 pg). Sob alta expressão de Claudina 6, scCAR CI6 clássico demonstrou a melhor secreção de IFNy com relação a todos os outros CARs, enquanto, à dose de CI6 mais baixa, CARs combinatórios tenderam a ser um pouco melhores que scCAR clássico. Em conclusão, os CARs combinatórios foram similares ao CAR clássico nas suas eficiências funcionais de expressão de antigenos alta para baixa: eles geraram quantidades muito altas de IFNy de até 20-30.000 pg/ml de IFNy para os CARs combinatórios e o scCAR CI6, respectivamente, e terminaram com 12-15.000 pg/ml de IFNy para todas as construções à dose mais baixa de CI6. Nessa dose, Ca/C3-CAR intercombinatório mostrou-se o mais eficiente.

[00294] As Figuras 3A/B exibem a expressão de Claudina 6 em APCs e diferentes CARs sobre células T humanas, respectivamente, antes da configuração de cocultivo. (A) Células dendríticas imaturas (iDCs) sofreram eletroporação com quantidades crescentes do antígeno com comprimento total

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119/131 cognato Claudina 6. Neste ponto, somente alteração fracional dependente de dosagem da expressão de CI6 poderá ser observada em citometria de fluxo, o que indica que iDCs desse doador são muito menos permissivas para absorção de RNA celular, tradução de proteínas e exportação para a superfície celular. Alta expressão de CD86 indica forte diferenciação de monócitos em IDCs que apresentam antígenos de forma favorável. (B) Células T CD8+ previamente ativadas sofreram eletroporação com diferentes RNAs codificadores de CAR e foram testadas para determinar a expressão de CAR em citometria de fluxo. Todos os CARs, exceto o scCAR clássico e o monovalente, foram apenas um pouco recuperados em manchas anti-idiotípicas, o que indica novamente que as células desse doador são menos permissivas para absorção e processamento de RNA. As iDCs que apresentam poucos antígenos podem, entretanto, representar uma situação de APCs minimamente positivas para antígenos de tumor, pois isso pode imitar a situação de variantes de escape de tumor clonal inicial ou apresentação mínima de antígenos de tumor. A Figura 3C exibe a eficiência de células T humanas reprogramadas CAR CI6 no reconhecimento de iDCs que expressam Claudina 6 após a configuração do cocultivo de células T/APC em ELISA ΙΡΝγ. Células T eletroporadas por CAR foram cocultivadas por uma noite com APCs eletroporadas por CI6 conforme explicado em 3A/B em razão E:T de 10:1. Ao longo de toda a faixa de titulação de CI6, todos os CARs apresentaram desencadeamento ideal em doses de CI6 inferiores (0,2 pg). Devido à expressão mínima de Claudina 6 conforme explicado acima, CARs CI6 combinatórios demonstraram a melhor secreção de IFNy com relação ao scCAR CI6 clássico para todas as doses, uma tendência que foi ainda mais pronunciada à dose de CI6 eletroporada mais baixa. Em conclusão, para quantidades minúsculas de antígeno, os CARs combinatórios foram ainda melhores que o scCAR CI6 clássico com relação à secreção de IFNy. As quantidades totais de IFNy secretado caíram abaixo de 1,000 pg/ml

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120/131 para toda a faixa de titulação devido à expressão muito baixa de antígeno, bem como os CARs.

[00295] A Figura 4 ilustra a eficiência de células T humanas reprogramadas TCR gp100-CAR CI6 no reconhecimento de iDCs que expressam Claudina 6 ou iDCs carregadas com peptídeo gp100 após a configuração do cocultivo de células T/APC HLA-A2.1+ em ELISA ΙΡΝγ. Células T eletroporadas por CAR foram cocultivadas por uma noite com APCs eletroporadas por CI6 ou iDCs carregadas com peptídeo gp100 (280-288) em razão E:T de 5:1. O objetivo final deste experimento foi verificar se, primeiramente, (A) os TCR-CARs combinatórios bivalentes foram mais eficientes na secreção de IFNy que os TCR-CARs não combinatórios bivalentes e, em segundo lugar, (B) até que ponto eles ainda reconhecem o peptídeo gp100 da cadeia principal de TCR gp100 utilizada no presente. Tentou-se eliminar a ligação de antígenos residual por meio de uma mutação “silenciosa” S109Q em CDR3 de TCRa gplOO. TCR CI6 e TCR gp100 serviram de controle positivo para o reconhecimento de antígenos cognatos. (A) Os TCR-CARs combinatórios, independentemente de serem silenciados em CDR3a ou não, mostraram-se mais funcionais que os CARs não combinatórios, particularmente na dose mais baixa de antígeno. (B) TCR-CAR CI6 não combinatório e não silenciado ainda reconheceu gplOO a 10’⁶ M de peptídeo. A introdução da mutação S109Q aboliu completamente a secreção de IFN-γ. Para TCR-CARs CI6 combinatórios, não se observou secreção de citocina, independentemente de serem funcionalmente silenciados ou não. É muito provável que a ligação intercadeias de domínios VH-VH e VL-VL conectados em série em cada cadeia evite estericamente a ligação do peptídeo gplOO, apresentado em forma restrita por HLA-A2.1 em APCs.

[00296] A Figura 5 ilustra a capacidade de proliferação de diferentes CARs CI6 mediante encontro de antígenos com iDCs que expressam

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CI6 após a configuração de um cocultivo de APC/células T. Células T eletroporadas por CAR foram cocultivadas por cinco dias com APCs tituladas e eletroporadas por CI6 em razão E:T de 10:1. Células T foram previamente manchadas com succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) para quantificar a diluição de CFSE por divisões celulares e, com isso, o número e a frequência de populações descendentes resultantes foram indicados à direita de cada plotagem de densidade em citometria de fluxo. (A) CARs de ligação de antígenos monovalente exibiram a proliferação mais fraca, enquanto TCRCARs combinatórios e CARs clássicos exibiram padrão de proliferação muito similar. (B) Gráfico de barras para frequências de populações de células T exibidas em (A). Alta frequência de células T equipadas com o CAR monovalente não se proliferou (40-60%), enquanto a frequência de células T não proliferantes para TCR-CARs combinatórios e CAR clássico encontrava-se na faixa de cerca de 10-20%. A proliferação de células T que conduzem CAR CI6 clássico foi mais alta em alta dose (0,2 pg de CI6) de antígeno (90% contra 80% para TCR-CARs combinatórios), enquanto, à dose mais baixa (0,002 pg), os TCR-CARs combinatórios foram pelo menos tão potentes quanto o CAR clássico (quase 80%). Concluindo, a eficiência funcional dos TCR-CARs combinatórios novamente se igualou ao CAR clássico, neste ponto em termos de proliferação de células T, desde doses altas a muito baixas de antígeno. Existe a tendência para que sejam ainda mais eficazes que CAR clássico.

[00297] A Figura 6 demonstra a regulagem para cima do biomarcador coestimulante CD27 sobre células T descendentes eletroporadas com TCR-CAR CI6 combinatório após configuração de cocultivo de células T e APC. Células T eletroporadas por CAR foram cocultivadas por seis dias com iDCs eletroporadas por CI6 em razão E:T de 3:1. Células T foram previamente manchadas com CPD-450 para quantificar a diluição desse fluoroforo por divisões celulares e, com isso, o número e a frequência de populações

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122/131 descendentes resultantes foram indicados à esquerda dos histogramas em citometria de fluxo. Células T foram manchadas com um anticorpo específico de CD8 para exemplificar a regulagem para cima igual e moderada desse marcador correceptor para CARs clássicos e combinatórios. Paralelamente, elas foram manchadas com um anticorpo específico para a molécula coestimulante CD27, para estimar sua regulagem em populações parentais/descendentes G0-G6 para todos os CARs. Embora os dois marcadores fossem regulados para cima a cada cerca de duas vezes e, adicionalmente, a expressão média de CD8 fosse idêntica para todos os CARs, a expressão média de CD27 foi muito mais alta para os CARs combinatórios e, particularmente, o TCR-CAR CI6 intercombinatório, que o CAR clássico. CD27, biomarcador de persistência a longo prazo de células T in vivo, atingiu nível muito mais alto para as células T em proliferação dim (G2-G4) antes que os níveis de expressão caíssem até os níveis básicos em G6.

Exemplos [00298] Os métodos e técnicas utilizados no presente são descritos no presente ou conduzidos de forma intrinsecamente conhecida e descritos, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY. Todos os métodos, incluindo o uso de kits e reagentes, são conduzidos de acordo com as informações dos fabricantes, a menos que especificamente indicado.

Exemplo 1 [00299] Análise da expressão de Claudina 6 em iDCs e receptores de antígenos em células T por meio de citometria de fluxo:

RNA para as diferentes construções foi preparado a partir da transcrição in vitro (ivt-RNA) de estruturas de leitura aberta (ORF) clonadas no vetor de RNA pST1 que conduz um promotor T7 na sua sequência 5’-líder e

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123/131 uma extremidade póliA otimizada na sua extremidade 3’. A expressão de Claudina 6 em células dendríticas imaturas humanas foi determinada um dia após a eletroporação de RNA (2-0,002 pg, 300 V, 12 ms, 1 pulso) em monócitos CD14+ tratados com GM-CSF/IL-4 de uma camada leucoplaquetária utilizando um anticorpo específico para Claudina 6 marcado com o fluoroforo Dylight 650. A expressão de várias construções de receptores de antígenos em células T humanas autólogas foi determinada um dia após a eletroporação de RNA (ao todo, 10-30 pg para as duas cadeias, 495 V, 9 ms, 1 pulso) em células T CD8+ previamente ativadas por OKT3 (anticorpo monoclonal murino antiCD3s) utilizando um anticorpo específico de idiotipos scFv CI6 marcado com o fluoroforo Dylight 649. A descrição detalhada da preparação de IDCs humanas e células T é fornecida no Exemplo 2. As construções de CAR testadas para determinar a expressão foram (i) receptor de células T murino TCR CI6; (ii) TCR gp100 humano; (iii) CAR CI6 não combinatório monovalente; (iv) scCAR clássico (bivalente); (v) CAR CI6 intercombinatório fundido a domínios Ca/β TCR humanos (bivalente); (vi) CAR CI6 não combinatório fundido a TCR gp100 (280-288) com comprimento total (bivalente); (vii) CAR CI6 não combinatório correspondente adicionalmente silenciado em CDR3 de TCRa gp100 para eliminar o reconhecimento de peptídeos (bivalente); (viii) CAR CI6 intercombinatório fundido a TCR gp100 (280-288) com comprimento total (bivalente); e (ix) CAR CI6 combinatório correspondente adicionalmente silenciado em CDR3 de TCRa gp1OO para eliminar o reconhecimento de peptídeos (bivalente). As construções de receptor de antígenos diferentes são ilustradas esquematicamente nas Figuras 1A-I. Manchas das células foram realizadas rotineiramente para 0,2x10⁶ células em tampão de citometria de fluxo por 20 minutos a 4 °C, lavadas e fixadas com tampão de citometria de fluxo contendo 1% de paraformaldeído. Os dados da Figura 2A exibem a expressão titulada de Claudina 6. Neste ponto, iDCs deste doador foram

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124/131 altamente permissivas para RNA CI6 e demonstraram grande alteração da expressão de Claudina 6 com quantidades crescentes de RNA eletroporado. A expressão de CD86 indicou a diferenciação bem sucedida dos monócitos em iDCs que apresentam antígenos potentes. A Fig. 2B exibe a expressão dos diferentes CARs utilizados neste experimento em células T humanas selecionadas positivas para CD8 humano. scCAR CI6 clássico demonstrou a expressão mais alta, provavelmente devido à sua expressão independente de CD3 endógena sobre a superfície de células T. Os CARs combinatórios revelaram expressão levemente melhor que o CAR monovalente, em que este último serviu de “controle fraco” devido ao seu modo de ação de ligação de antígenos apenas monovalente.

[00300] Os dados da Figura 3A demonstram a expressão titulada de Claudina 6 em um experimento independente. Neste ponto, IDCs deste doador foram pouco permissivas para RNA CI6 e demonstraram alteração apenas fracional da expressão de Claudina 6 com quantidades crescentes de RNA eletroporado. A expressão de CD86 indicou, entretanto, a diferenciação bem sucedida dos monócitos em iDCs que apresentam antígenos potentes. A Fig. 3B exibe a expressão dos diferentes CARs utilizados neste experimento em células T humanas selecionadas positivas para CD8 humano. Como as células T humanas foram derivadas do mesmo doador dos monócitos diferenciados em ambiente autólogo, as células T resultaram ser também pouco permissivas para RNA eletroporado e geraram expressão apenas mais fraca para os CARs que no experimento exibido na Figura 2B. scCAR CI6 clássico demonstrou novamente, entretanto, a expressão mais alta pela mesma razão descrita acima. De forma alinhada com as observações anteriores, os CARs combinatórios revelaram expressão levemente melhor que o CAR monovalente. Como a ordem da expressão de CAR é preservada em comparação com o experimento descrito na Figura

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2A/B, este experimento é apropriado para estudar a potência de CARs diferentes no caso de quantidades apenas pequenas de expressão de CI6 sobre células que apresentam antígenos (APCs).

Exemplo 2 [00301] Teste de secreção de IFN-γ titulado por antígeno:

No dia 1 do experimento, células mononucleares do sangue periférico (“PBMCs”) foram isoladas de uma camada leucoplaquetária de doador saudável. De 1/4 de PBMCs, células CD14+ foram isoladas utilizando seleção de MACS. Fluxo de MACS e PBMCs residuais foram selecionadas por MACS para células T CD8+. Células CD14+ foram diferenciadas para células dendríticas imaturas (“iDCs”) por meio da administração de IL-4 e GM-CSF (1000 U/ml) nos dias 1,3 e 6. Células T CD8+ foram transferidas sobre placas com seis cavidades revestidas com OKT3. No dia 3, células T foram transferidas para placas com seis cavidades novas. No dia 7, iDCs sofreram eletroporação com ivt-RNA C16 e irrelevante de forma dependente da dosagem na faixa de 2-0,002 pg de RNA. Células T ativadas por OKT3 sofreram eletroporação no mesmo dia com controles ou construções de receptores de antígenos conforme descrito nas figuras individuais e conforme descrito no Exemplo 1. Para garantia de qualidade, a expressão de CI6 sobre iDCs e a expressão da superfície de receptores de antígenos sobre células T foram analisadas com anticorpos com marcas fluorescentes específicos conforme explicado acima no dia 8. As células T que sofreram eletroporação e iDCs que sofreram eletroporação de antígenos foram cocultivadas em seguida em uma placa com 96 cavidades por 20 horas em razão E:T de 3:1 - 10:1 em duplicatas. Rotineiramente, 2,5x10⁴ iDCs foram semeadas e cocultivadas com 7,5x10⁴ - 2,5x10⁵ células T com eletroporação de CAR em volume de 200 pl de meio de células T. No dia 9, diferentes quantidades de sobrenadantes de cultivo (10-50 pl) foram tomadas e analisadas para determinar a quantidade de

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IFNy secretada em ELISA de sanduíche utilizando o kit de IFN-γ Ready Set Go! da eBioscience (n° 88-7316-88). A absorção foi detectada utilizando um leitor de ELISA Tecan Sunrise.

[00302] A Figura 2C ilustra as quantidades de IFNy secretada para iDCs e células T do mesmo doador, que foram altamente permissivas para eletroporação de RNA e, consequentemente, geraram expressão dependente de dosagem de volume de CI6 em IDCs e alta expressão de CARs em células T (Figura 2A/B). Todas as células T CAR exibiram seu máximo em secreção de IFNy a 0,02 pg de RNA CI6 eletroporado, resultando em até 30,000 pg/ml de IFNy para scCAR clássico e 20,000 pg/ml para CARs combinatorics fundidos a TCR Ca/β ou TCR gp100 com comprimento total. Conforme estimado, as células T modificadas por CAR monovalentes resultaram ser as células efetoras mais fracas. Curiosamente, em alto nível de eletroporação de CI6, os CARs combinatorics exibiram apenas cerca de 50% de reatividade do scCAR CI6 clássico, que aumentou para 70% à dose ideal de 0,02 pg de CI6 eletroporado. De forma importante, na dose mais baixa de CI6 testada no presente, 0,002 pg de RNA, os CARs combinatorics foram tão eficientes quanto o scCAR CI6 clássico ou, no caso de CAR combinatório fundido a TCR Ca/β, até melhor. Nesse nível muito baixo de presença de volume de CI6, os CARs combinatorics ainda foram capazes de secretar altas quantidades de IFNy na faixa de 10,000 pg/ml.

[00303] A Figura 3C exemplifica as quantidades de IFNy secretada para iDCs e células T do mesmo doador, que foram pouco permissivas para eletroporação de RNA e, consequentemente, geraram expressão dependente de dosagem apenas fracional de CI6 em IDCs e também expressão inferior de CARs em células T (Figura 3A/B). Isso pode constituir uma situação em que ainda menos CI6 é encontrado sobre iDCs que a situação para baixos níveis de expressão de CI6 em iDCs tituladas com

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127/131 antígeno altamente permissivas (Figura 3A/B em comparação com 2A/B). Neste ponto, para todas as quantidades minúsculas de C16 tituladas, os CARs combinatórios comprovaram ser mais eficientes na secreção de IFNy que o scCAR clássico. Esta tendência torna-se ainda mais pronunciada para quantidades decrescentes de CI6 sobre a superfície celular de iDCs. A quantidade de IFNy secretado é baixa (< 1000 pg/ml), mas pode ser primeiramente aprimorada pela melhor expressão de CAR e, em segundo lugar, pode tornar-se benéfica para pacientes em tratamento com variantes de escape de tumor (iniciais) que expressam muito pouco antígeno ou para cuidar de doença residual mínima.

[00304] A Figura 4A compara a eficiência de secreção de IFNy para TCR-CARs não combinatórios (bivalentes) em comparação com combinatórios contra o antígeno específico de CAR CI6. Todos os CARs combinatórios foram mais eficientes no reconhecimento de antígenos ao longo de ampla faixa de antígeno titulado. Para doses mais altas de antígenos, CARs bivalentes apresentaram função efetora quase igual, exceto pelo TCR-CAR não combinatório “silenciado”. Sabe-se que a mutação pontual S109Q em CDR3a prejudica um pouco a ligação de antígeno gp100 (280-288) (Knies et al, Oncotarget 2016). A ligação intercadeias de domínios V e a ligação do próprio antígeno pelo TCR-CAR combinatório “silenciado” aparentemente compensam a perda de função causada por esta mutação. De forma importante, em baixo nível de expressão de CI6 (0,02 pg), os TCR-CARs combinatórios, funcionalmente silenciados ou não, tornaram-se superiores aos TCR-CARs não combinatórios para secreção de citocinas.

[00305] A Figura 4B ilustra o reconhecimento residual do antígeno gp100 (280-288) em secreção de IFNy titulada por peptídeos. Neste ponto, TCRa3 gp100 serviu de controle positivo, enquanto TCRa3 CI6 serviu de controle da especificidade para estimar a secreção de fundo de citocina.

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TCR-CAR não combinatório ainda é capaz de reconhecer o antígeno restrito por A2-1 em alta carga de peptídeos. A introdução da mutação silenciosa S109Q eliminou totalmente o reconhecimento. De forma importante, a disposição combinatória intercadeias dos domínios V conectados em ordem de conjunto (VH-VH, VL-VL) aparentemente evita totalmente o reconhecimento do antígeno cognato pela porção TCR gp1OO. A introdução da mutação silenciosa pode, portanto, servir apenas de salvaguarda para garantir a ausência de reação funcional da porção de TCR nesses CARs e concentrar-se na exploração da sua cadeia principal como estrutura de estabilização do emparelhamento de cadeias e como molécula adaptadora com comprimento total para sinalização de células T fisiológicas.

Exemplo 3 [00306] Teste de proliferação titulado por antígenos combinado com fenotipificação de biomarcadores:

No dia 1 do experimento, PBMCs novas foram isoladas de uma camada leucoplaquetária de doador saudável. De 1/4 de PBMCs, células CD14+ foram isoladas utilizando seleção de MACS e PBMCs residuais foram congeladas. Células CD14+ foram diferenciadas para iDCs por meio da administração de IL-4 e GM-CSF (1000 U/ml) nos dias 1,3 e 6. No dia 7, iDCs sofreram eletroporação com IVT-RNA C16 e irrelevante dependente da dosagem na faixa de 2-0,002 pg de RNA. As PBMCs congeladas foram descongeladas no mesmo dia e selecionadas por MACS para células CD8+. Sem nenhuma ativação anterior (OKT3), células T que nunca receberam tratamento, cerca de 7x10⁶ células, sofreram eletroporação em seguida com TCR-CARs clássicos, monovalentes e intercombinatórios conforme indicado na Figura 1.

[00307] Para determinação da qualidade, células T elaboradas por CAR foram analisadas por meio de manchas de citometria de

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129/131 fluxo no dia 8. Células T foram marcadas em seguida com o marcador da proliferação fluorescente intracelular CFSE (0,8 μΜ) ou CPD-450 (10 μΜ). As células T que sofreram eletroporação e IDCs foram cocultivadas em seguida em uma placa com 96 cavidades por cinco dias em razão E:T de 10:1 (ou 3:1 para fenotipificação de biomarcadores) em duplicatas. Rotineiramente, 2,5x10⁴iDCs foram cocultivadas com 2,5x10⁵ células T com eletroporação de CAR em volume de 200 μΙ de meio de células T em uma placa com 96 cavidades. No dia 5, células cultivadas foram manchadas nas placas com 96 cavidades com anticorpos CD4 ou CD8 marcados com APC-Cy7. A proliferação de células T foi detectada por meio de citometria de fluxo pela alteração à esquerda do sinal de fluoroforo devido à diluição em células descendentes em proliferação. As frequências da população parental não proliferante G0 e das populações descendentes G1-G7 foram determinadas utilizando-se a ferramenta de proliferação no pacote de software de citometria de fluxo FlowJo v7.6.5. As frequências para todas as células T descendentes foram calculadas a partir da soma de todas as populações em proliferação G1-G7. A proliferação de fundo de células T foi determinada para células cultivadas com iDCs que sofreram eletroporação com comprimento total irrelevante gp100 ou células T semeadas sem APCs. Células em proliferação foram manchadas para CD8, a fim de identificá-las inequivocamente como células T. Alternativamente, células T em proliferação foram manchadas com biomarcadores tais como CD27, CD28, PD1, CD95, CD45RA e CCR7 para quantificar a situação de diferenciação das células T sem proliferação originais que nunca receberam tratamento em G0 e as populações descendentes em evolução G1-G7, respectivamente, após cinco ou seis dias de cocultivo com APCs. Anticorpos e controles de isótipos correspondentes foram titulados para estimar a relação sinal-ruído ideal. O teste foi quantificado em um sistema FACS-Canto ll-HTS (BD) em formato de 96 cavidades.

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130/131 [00308] A Figura 5A ilustra as plotagens de densidade de células T em proliferação elaboradas com CAR CI6 monovalente como “controle fraco”, TCR-CARs combinatórios com e sem a mutação silenciosa S109Q em TCR CDR3a e o scCAR CI6 clássico como CAR de referência. Quase nenhuma proliferação não específica pôde ser observada contra iDCs carregadas com o antígeno irrelevante gp100. Proliferação contra APCs carregadas com o antígeno cognato resultou em até seis populações descendentes distintas, cujas frequências puderam ser facilmente diferenciadas (relacionadas à direita de cada plotagem). Todos os CARs, exceto o CAR monovalente CI6, exibiram altas taxas de proliferação, mesmo sob baixas densidades de antígenos. As frequências máximas encontravam-se, em quase todos os casos, em G3.

[00309] A Figura 5B resume os percentuais de células T parentais remanescentes G0 e células T em proliferação G1-G7 em um gráfico de barras. Em alta carga de antígeno, a barra grande para GO (40%) e a barra menor para G1-G7 (60%) em comparação com os outros CARs indica claramente a baixa propensão das células T elaboradas por CAR monovalentes à proliferação. Comprovou-se que as células T modificadas por scCAR clássico são um pouco melhores (90%) que os CARs combinatórios (80%), de forma alinhada com os resultados dos testes de secreção de IFNy. Consequentemente, ao reduzir a quantidade de antígeno, as células T modificadas por CAR combinatório tornaram-se pelo menos tão eficientes quanto o scCAR clássico (quase 80%). A partir desta tendência, pode-se especular que, para densidades de antígenos ainda mais baixas, os CARs combinatórios podem tornar-se ainda mais superiores ao scCAR clássico em termos de potência de proliferação.

[00310] A Figura 6 descreve à esquerda a frequência de células T em proliferação potencializadas com o scCAR clássico (topo), Ca/β

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CAR CI6 combinatório (centro) ou o TCR-CAR CI6 silCDR3a combinatório (abaixo). À direita, são exibidas a intensidade média menos ligação não específica (ou seja, ligação de isótipos) para o correceptor CD8 e o receptor coestimulante CD27 entre todas as populações parentais e descendentes. Células T foram manchadas com um anticorpo específico de CD8 para visualizar a regulagem para cima moderada e quase igual desse marcador correceptor para CARs clássicos e combinatórios. Desta forma, manchas de CD8 podem operar como marcador de normalização para enfatizar a regulagem igual dessa molécula “inerte” entre todos os CARs pesquisados no presente. Paralelamente, elas foram manchadas com um anticorpo específico para a molécula coestimulante CD27 em um canal de fluorescência diferente para estimar sua regulagem em populações parentais/descendentes G0-G6 para todos os CARs. Embora os dois marcadores fossem regulados para cima a cada cerca de duas vezes e, adicionalmente, a expressão média de CD8 fosse quase idêntica para todos os CARs, a expressão média de CD27 foi muito mais alta para os CARs combinatórios e, particularmente, o TCR-CAR CI6 intercombinatório, que o CAR clássico. CD27, biomarcador de persistência a longo prazo de células T in vivo, atingiu nível muito mais alto para as células T em proliferação dim (G2-G4) antes que os níveis de expressão caíssem até os níveis básicos em G6. A partir disso, pode-se formular a hipótese de que as células T elaboradas com CAR combinatório podem possuir um fenótipo exaurido e diferenciado de forma terminal (ou seja, regulagem para baixo de moléculas coestimulantes) em populações proliferantes dim e, portanto, podem persistir por mais tempo in vivo. O tamanho (difusão frontal) e a granulação (difusão lateral) de células T que sofreram eletroporação por CAR combinatório em cocultivo foram ainda inferiores ao CAR clássico (dados não exibidos). Desta forma, regulagem para cima mais alta de CD27 não é causada pelo aumento da superfície celular e, portanto, por mais CD27 sobre uma superfície maior.

Claims

Reivindicações

1. RECEPTOR DE ANTÍGENOS, caracterizado pelo receptor compreender primeira cadeia de peptídeos e segunda cadeia de peptídeos; em que:

a primeira cadeia de peptídeos compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia receptora de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores; e a segunda cadeia de peptídeos compreende primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia receptora de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores;

em que o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com um dos domínios da segunda cadeia de peptídeos, primeiro local de ligação de antígenos; e em que o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o outro domínio da segunda cadeia de peptídeos, segundo local de ligação de antígenos.
2. RECEPTOR de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo domínio de transmissão de sinais imunorreceptores compreender uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores de células T, uma região constante ou invariável de uma cadeia de receptores Fc de células imunes ou uma parte da região constante ou invariável.
3. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelas primeiras e/ou segundas cadeias de peptídeos compreenderem adicionalmente um ligante entre os primeiro e segundo domínios e/ou entre os primeiro e segundo domínios e a região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes.

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4. RECEPTOR de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo ligante ser uma sequência de aminoácidos arbitrária.
5. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por cada um dentre os primeiro e/ou segundo domínios compreender uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina, uma região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma parte da região variável.
6. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela:

i. a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de uma cadeia alfa de receptores de células T ou uma de suas partes e uma região constante de uma cadeia alfa de receptores de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de cadeia beta de receptor de células T ou uma de suas partes; ou ii. a primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de uma cadeia beta de receptores de células T ou uma de suas partes e uma região constante de uma cadeia beta de receptores de células T ou uma de suas partes e a segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes e uma região constante de cadeia alfa de receptor de células T ou uma de suas partes.
7. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo domínio de transmissão de sinais imunorreceptores ser de origem humana.
8. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos

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3/7 compreender uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com especificidade para um antígeno ou uma de suas partes e o domínio da segunda cadeia de peptídeos que forma um local de ligação de antígenos com o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com especificidade para o antígeno ou uma de suas partes.
9. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos compreender uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com especificidade para um antígeno ou uma de suas partes e o domínio da segunda cadeia de peptídeos que forma um local de ligação de antígenos com o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com especificidade para o antígeno ou uma de suas partes.
10. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelos primeiro e segundo locais de ligação de antígenos ligam-se ao mesmo antígeno ou antígenos diferentes.
11. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelos primeiro e segundo locais de ligação de antígenos ligam-se a epítopos diferentes sobre o mesmo antígeno.
12. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo antígeno ser um antígeno específico de doenças, preferencialmente antígeno de tumores.
13. RECEPTOR de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo antígeno ser expresso sobre a superfície de uma célula.
14. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado por:

cada um dentre os primeiro e segundo domínios da

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4/7 primeira cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia pesada de uma imunoglobulina ou uma de suas partes; e cada um dentre os primeiro e segundo domínios da segunda cadeia de peptídeos compreende uma região variável de cadeia leve de uma imunoglobulina ou uma de suas partes.
15. RECEPTOR de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo:

o domínio N-terminal da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o domínio N-terminal da segunda cadeia de peptídeos, um local de ligação de antígenos; e o domínio C-terminal da primeira cadeia de peptídeos forma, em conjunto com o domínio C-terminal da segunda cadeia de peptídeos, um local de ligação de antígenos.
16. CADEIA DE PEPTÍDEOS caracterizado por compreender primeiro e segundo domínios, em que cada qual compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou uma de suas partes ou cada qual compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina ou uma de suas partes, em que a cadeia de peptídeos compreende adicionalmente uma região variável de uma cadeia de receptores de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores.
17. CÉLULA RECOMBINANTE caracterizado por expressar a primeira cadeia de peptídeos, a segunda cadeia de peptídeos ou ambas, primeira e segunda cadeias de peptídeos conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 15 ou que expressam a cadeia de peptídeos conforme definido na reivindicação 16.
18. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CÉLULAS caracterizado por expressar receptores de antígenos, em que o receptor compreende

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5/7 primeira cadeia de peptídeos e segunda cadeia de peptídeos e o método compreende:

a. fornecimento de células;

b. fornecimento de primeira construção genética que codifica a primeira cadeia de peptídeos que compreende pelo menos um primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia receptora de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores;

c. fornecimento de segunda construção genética que codifica a segunda cadeia de peptídeos que compreende pelo menos um primeiro domínio, segundo domínio, uma região variável de cadeia receptora de células T ou uma de suas partes e um domínio de transmissão de sinais imunorreceptores;

d. introdução das primeira e segunda construções genéticas na célula; e

e. permissão da expressão das construções na célula;

em que o primeiro domínio da primeira cadeia de peptídeos é capaz de formar, em conjunto com um dos domínios da segunda cadeia de peptídeos, primeiro local de ligação de antígenos; e em que o segundo domínio da primeira cadeia de peptídeos é capaz de formar, em conjunto com o outro domínio da segunda cadeia de peptídeos, segundo local de ligação de antígenos.
19. MÉTODO de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela expressão do receptor de antígenos encontra-se na superfície celular.
20. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 18 ou 19, caracterizado pela primeira cadeia de peptídeos e a segunda cadeia de peptídeos serem fornecidas sobre uma única construção genética.
21. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 18 a

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20, em que a célula é uma célula humana.
22. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 18 a

21, caracterizado pela célula ser uma célula T.
23. CÉLULA RECOMBINANTE caracterizado por ser produzida por meio do método conforme definido em qualquer das reivindicações 18 a 22.
24. ÁCIDO NUCLEICO caracterizado por codificar a primeira cadeia de peptídeos, a segunda cadeia de peptídeos ou ambas, primeira e segunda cadeias de peptídeos conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 15 ou que codifica a cadeia de peptídeos conforme definido na reivindicação 16.
25. ÁCIDO NUCLEICO de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo ácido nucleico é DNA ou RNA.
26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizado por compreender o receptor de antigenos conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 15, a célula recombinante conforme definido em qualquer das reivindicações 17 ou 23 ou o ácido nucleico conforme definido em qualquer das reivindicações 24 ou 25; e um veículo farmaceuticamente aceitável.
27. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 26 caracterizado pelo uso como medicamento.
28. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 26 para uso no tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de pelo menos um antígeno que é ligado pelo receptor de antigenos.
29. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo antígeno ser um antígeno de tumor.
30. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com qualquer das reivindicações 28 ou 29, caracterizado pela doença ser câncer.
31. MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇAS,

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7/7 caracterizado por compreender a administração ao paciente de quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 26, em que a doença é caracterizada pela expressão de pelo menos um antígeno que é ligado pelo receptor de antígenos.
32. MÉTODO de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo antígeno ser um antígeno de tumor.
33. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 31 ou 32, caracterizado pela doença ser câncer.