KR20190128683A - 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 세포 표면에서 항원을 발현하는 세포를 표적화하여 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 재조합 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 이러한 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포는 항원 수용체에 의해 결합된 하나 이상의 항원의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용하다.

Description

항원 수용체 및 이의 용도
본 발명은 재조합 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 이러한 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포는 항원 수용체에 의해 결합된 하나 이상의 항원의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용하다.
T 세포는 인간과 동물의 세포-매개성 면역에 있어 중심적인 역할을 한다. 특정 항원의 인식 및 결합은 T 세포의 표면에 발현된 T 세포 수용체(TCR)에 의해 매개된다. T 세포의 TCR은 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 분자에 결합하고 표적 세포의 표면에 제시된 면역원성 펩티드(에피토프)와 상호작용할 수 있다. TCR의 특이적 결합은 T 세포 내부의 신호 캐스캐이드(signal cascade)를 촉발하여 성숙한 이펙터 T 세포로의 증식 및 분화를 유도한다.
TCR은 TCR α- 및 β-사슬의 이종이량체 복합체, 공동수용체 CD4 또는 CD8 및 CD3 신호전달 모듈을 포함하는 복합적 신호전달 시스템의 일부이다. TCR α/β 이종이량체는 항원 인식 및 CD3와 협력하여 세포막을 통한 활성화 신호의 전달을 담당하는 한편, CD3 사슬 자체는 들어오는 신호를 세포 내의 어댑터 단백질로 전달한다. 따라서, TCR α/β 사슬의 전달은 관심대상의 모든 항원을 향해 T 세포의 방향을 전환시키는 기회를 제공한다.
입양 세포 이식(adoptive cell transfer: ACT) 기반의 면역요법은 비면역 수용자 또는 낮은 전구체 빈도로부터 임상적으로 관련된 세포 수로 생체외 확장(expansion) 이후 자가 숙주로 전달되는 사전에 감작된 T 세포로의 수동 면역화의 형태로서 대략적으로 정의될 수 있다. ACT 실험에 사용된 세포 유형에는 림포카인-활성화 살해(lymphokine-activated killer: LAK) 세포(Mule, J.J. 등 (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. 등 (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), 종양-침윤 림프구(TIL)(Rosenberg, S.A. 등 (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), 조혈 줄기세포 이식(HSCT) 후의 기증자 림프구뿐만 아니라 종양 특이적 T 세포주 또는 클론(Dudley, M.E. 등 (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173)이 포함된다. 입양 T 세포 전달은 CMV와 같은 인간 바이러스 감염에 대해 치료 활성이 있는 것으로 나타났다. 흑색종의 입양 면역요법에 대해 로젠버그와 그의 동료들은, 비-골수절제식 림프파괴 화학요법(non-myeloablative lymphodepleting chemotherapy) 및 고용량 IL2와 함께 절제된 종양으로부터 단리된 시험관내 확장된 자가 종양-침윤 림프구(TIL)의 주입에 의존하는 ACT 접근법을 확립하였다. 임상 시험 결과 전이성 흑색종으로 고통받는 환자의 객관적 반응률(objective response rate)이 약 50%에 이르렀다(Dudley, M.E. 등 (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).
또 다른 접근법은 단시간의 생체외 배양 동안 한정된 특이성을 가지는 종양-반응성 면역수용체를 발현하도록 재프로그램된 자가 T 세포를 입양 전달한 후 환자에게 재주입하는 것이다(Kershaw M.H. 등 (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). 이러한 전략은 종양 반응성 T 세포가 환자에 없는 경우에도 ACT를 다양한 일반 악성 종양에 적용할 수 있게 한다. T 세포의 항원 특이성이 전적으로 TCR α- 및 β-사슬의 이종이량체 복합체에 있기 때문에, T 세포로 클로닝된 TCR 유전자의 전달은 관심대상의 모든 항원을 향해 T 세포의 방향을 전환시키는 가능성을 제공한다. 따라서, TCR 유전자 요법은 치료 옵션으로서 자가 림프구를 이용한 항원 특이적 면역요법을 개발하는데 매력적인 전략을 제공한다. TCR 유전자 전달의 주요 이점은 며칠 내에 항원 특이적 T 세포의 치료량을 생성하고 환자의 내인성 TCR 레퍼토리에 존재하지 않는 특이성을 도입할 수 있다는 것이다. 몇몇 그룹은 TCR 유전자 전달이 1차 T 세포의 항원 특이성을 전환시키는 매력적인 전략임을 입증하였다(Morgan, R.A. 등 (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. 등 (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. 등 (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. 등 (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. 등 (1986) Nature 320, 232-238). 인간에서의 TCR 유전자 요법의 가능성은 초기에 로젠버그와 그의 그룹에 의한 악성 흑색종의 치료를 위한 임상 시험에서 입증되었다. 흑색종/멜라닌 세포 항원-특이적 TCR로 레트로바이러스에 의해 형질도입된 자가 림프구의 입양 전달은 치료를 받은 흑색종 환자의 30%까지 암 퇴행을 일으켰다(Morgan, R.A. 등 (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. 등 (2009) Blood 114, 535-546). 한편 TCR 유전자 요법의 임상 시험은 흑색종 외에도 많은 다양한 종양 항원을 표적으로 하는 암으로까지 확대되었다(Park, T.S. 등, (2011) Trends Biotechnol. 29, 550-557).
한정된 특이성의 항원-표적 수용체를 T 세포에 삽입하기 위한 유전공학 접근법의 사용은 ACT의 잠재 능력을 크게 확장시켰다. 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)는 세포외 항원-결합 도메인에 융합된 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 가장 일반적으로는 단클론 항체로부터의 단일-사슬 가변 단편(scFv)으로 구성된 항원 표적 수용체의 한 유형이다. CAR는 MHC 매개의 제시와 독립적으로 세포 표면 항원을 직접 인식하여, 모든 환자의 주어진 임의의 항원에 특이적인 단일 수용체 컨스트럭트의 사용을 허용한다. 최초의 CAR는 항원 인식 도메인을 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3ζ 활성화 사슬에 융합되었다. 그 이후의 CAR 반복은 CD28로부터의 세포내 도메인 또는 4-1BB(CD137) 및 OX40(CD134)와 같은 다양한 TNF 수용체 계열의 분자를 포함하는 CD3ζ와 더불어 이차적 공동자극 신호를 포함한다. 또한, 3세대 수용체는 CD3ζ 외에도 주로 CD28과 4-1BB로부터 유래한 2가지 공동자극 신호를 포함한다. 2세대 및 3세대 CAR은 시험관내 및 생체내에서 항종양 효능을 현저히 향상시켰으며(Zhao 등, (2009) J. Immunol., (183) 5563-5574), 일부 경우에는 진행된 암 환자의 완전 관해를 유도하였다(Porter 등, (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733).
고전적 CAR은 항원 특이적 단일 사슬 항체(scFv) 단편으로 구성되어 있으며, 막횡단(transmembrane) 및 CD3ζ와 같은 신호전달 도메인에 융합되어 있다. T 세포로 도입시 이것은 막 결합형 단백질로서 발현되며 이의 동족 항원에 결합시 면역 반응을 유도한다(Eshhar 등, (1993) PNAS, (90) 720-724). 유도된 항원 특이적 면역 반응은 종양 세포와 같이 특정 항원을 발현하는 세포 또는 특정 항원을 발현하는 바이러스 감염된 세포의 박멸을 유도하는 세포독성 CD8+ T 세포의 활성화를 유도한다. 그러나, 이러한 고전적 CAR 컨스트럭트는 T 세포 활성화에 일반적으로 필수적인 내인성 CD3 복합체를 통해 T 세포를 활성화/자극하지 않는다. CD3ζ에의 항원 결합 도메인의 융합으로 인해, T 세포 활성화는 생화학적 "단락 (short circuit)"을 통해 유도된다(Aggen 등, (2012) Gene Therapy, (19) 365-374). T 세포의 과다활성화는 원치 않는 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 이러한 T 세포의 비생리적 활성화는 이러한 방식으로 치료받는 환자에게 위험하다. 예를 들어, CAR 발현으로 인한 재조합 T 세포의 장기 기초 활성화가 시험관내에서 관찰되었고("강장 신호전달(tonic signaling)"), 재조합 CAR-발현 T 세포의 표면에 저해 분자, 예컨대 LAG-3, TIM-3 및 PD-1의 축적을 증가시켰으며, 이는 결국 조기 고갈된 T 세포(exhausted T-cell)를 생성시키고 후속적으로 생체내 종양 세포에 대항한 반응에 대한 강한 부정적인 영향을 초래하였다(Long 등, (2015) Nat. Med., (21) 581-590). 이러한 역반응은 이 항체의 프레임워크(framework) 잔기를 통한 scFv-단편의 불규칙적인 클러스터화(clustering)와 관련된다. 또한, 이러한 유형의 고전적 CAR 컨스트럭트는 백혈병과 같은 상이한 신생물에 대해 성공적으로 시험되었지만(Porter 등, (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733), 정상 조직에서 표적화된 항원(표적화된 종양 항원)의 기저 발현으로 인한 치명적인 자가면역 질환을 역시 초래하였다(on-target/off-tumor-reaction; Morgan 등, (2010) Mol Ther., (18) 843-51).
더 많은 생리학적 기전을 통해 T 세포의 활성화가 일어나는 또 다른 접근법은 T 세포 수용체(TCR)로부터 유래한 Cβ 불변 도메인에 융합된 유사 단일 사슬-TCR(scTv)-단편 및 TCR-유래의 Cα 불변 도메인과의 공동 발현이었으며 (Voss 등, (2010) Blood, (115) 5154-5163), 후자는 본질적인 내인성 CD3ζ 동종이량체를 모집한다(Call 등, (2002) Cell, (111) 967-79.). 그러나 이러한 컨스트럭트가 면역계 활성화제로서 기능하기 위해서는, 이의 불변 도메인이 뮤린 TCR로부터 기원하거나 scTCR 및 Cα 사이의 사슬 짝지음(chain pairing)을 달성하기 위해 뮤린화(murinized)(Cohen 등, (2006) Cancer Res., (66) 8878-86; Bialer 등, (2010) J. Immunol., (184) 6232-41)되는 것이 필수적이었다. 이러한 컨스트럭트가 기능성을 위해 외인성(xenogenic) 서열을 가져야만 한다는 사실은 투여시 이들에 대해 면역계가 반응할 위험을 증가시키고, 치료 효능을 손상시키거나 파괴한다.
따라서, 대체 재조합 항원 수용체, 예를 들어 항원 결합시 내인성 CD3 복합체를 통해 정상적인 생리학적 방식으로 발현되는 T 세포를 충분히 활성화시킬 수 있는 수용체를 제공하는 것이 요구되며, 임의로, 적어도 항원 수용체의 신호전달 도메인에서 재조합 항원 수용체 자체에 대한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 인간 기원이 것이 아닌 임의의 아미노산 서열이 존재해야 할 필요가 없다.
본 발명은 적어도 2개의 항원 결합 부위를 가지는 재조합 항원 수용체에 관한 것이다. 상기 항원 수용체는 2개의 펩티드 사슬을 포함한다. 상기 펩티드 사슬은 각각, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인 외에도 적어도 2개의 도메인을 포함하며, 하나의 펩티드 사슬상의 2개의 도메인 각각은 다른 펩티드 사슬상의 도메인 중 하나와 항원 결합 부위를 형성한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 이의 각 사슬이 바람직하게는 T 세포 수용체 사슬의 N 말단에 항원 결합 부위를 형성하는 상기 적어도 2개의 도메인을 포함하는 T 세포 수용체의 구조를 갖는다.
일 측면에서, 본 발명은 항원 수용체로서, 상기 수용체는 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬을 포함하고, 상기 제 1 펩티드 사슬은 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하고; 상기 제 2 펩티드 사슬은 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하며; 상기 제 1 펩티드 사슬로부터 제 1 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인 중 하나와 함께 제 1 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터 다른 도메인과 함께 제 2 항원 결합 부위를 형성하는, 항원 수용체에 관한 것이다. 이러한 측면의 항원 수용체에서, 각각의 항원 결합 부위를 형성하는 상기 도메인은 바람직하게는 상이한 펩티드 사슬에 위치한다. 결과적으로, 항원 결합 부위는 도메인의 분자간 상호작용에 의해 형성된다.
일 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 도메인은 각각 면역글로불린 사슬의 가변 영역 또는 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 상기 가변 영역의 일부를 포함한다.
일 구현예에서, 제 1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 중 하나는 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 1 항원 결합 부위를 형성하는 다른 도메인은 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 일 구현예에서, 제 2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 중 하나는 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 항원 결합 부위를 형성하는 다른 도메인은 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
일 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인은 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인은 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 일 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인은 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역을 포함하고, 상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인은 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
일 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인 및 제 2 도메인은 각각 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인 및 제 2 도메인은 각각 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
일 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬로부터의 N-말단 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 N-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하고; 제 1 펩티드 사슬로부터의 C-말단 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 C-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
일 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬로부터의 N-말단 도메인은 제 2 펩티드 사슬의 C-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하고; 제 1 펩티드 사슬로부터의 C-말단 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 N-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 항원 수용체의 일 구현예에서, 면역수용체 신호전달 도메인은 T 세포 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 상기 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역의 일부을 포함한다. 본 발명의 항원 수용체의 일 구현예에서, (i) 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하거나, (ii) 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 구현예에서, T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부는 T 세포 수용체의 알파 사슬에 상응하거나 본질적으로 이에 상응하고, T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부는 T 세포 수용체, 바람직하게는 T 세포 수용체의 알파 사슬이 유래하는 동일한 T 세포 수용체의 베타 사슬에 상응하거나 본질적으로 이에 상응한다. 항원 결합 부위를 형성하는 도메인들은 바람직하게는, 임의로 링커에 의해 분리된 사슬의 N 말단에서 융합된다.
본 발명의 항원 수용체의 일 구현예에서, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및/또는 면역수용체 신호전달 도메인, 예컨대 T 세포 수용체의 불변 영역 또는 이의 일부는 인간 기원의 것이다. 따라서, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부에 상응하거나 본질적으로 이에 상응할 수 있는 T 세포 수용체의 사슬은 인간 기원의 것일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 항원 수용체의 도메인들을 연결하는 (하나의) 링커(들)을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 사이 및/또는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인과 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 사이에 하나 이상의 링커를 포함한다. 링커는 항원 수용체의 기능, 예컨대 항원 수용체가 항원에 결합하거나 내인성 CD3 복합체와 회합하는 능력을 방해하지 않거나 항원 수용체가 항원 결합시 면역 반응을 유도하는 능력을 방해하지 않을 정도로 길다면 어떠한 길이의 임의의 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 항원 수용체의 일 구현예에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부위는 동일한 항원 또는 상이한 항원에 결합한다. 본 발명의 항원 수용체의 일 구현예에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부위는 동일한 항원상의 상이한 에피토프들에 결합한다. 결과적으로, 제 1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 바람직하게는 동일한 면역글로불린으로부터 유래하고 제 2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 바람직하게는 동일한 면역글로불린으로부터 유래하지만, 제 1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 및 제 2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 동일하거나 상이한 면역글로불린으로부터 유래하며, 상기 상이한 면역글로불린들은 동일하거나 상이한 항원에 결합한다.
일 구현예에서, 항원은 질환 특이적 항원, 바람직하게는 종양 항원이다. 일 구현예에서, 항원은 세포의 표면에서 발현된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체의 펩티드 사슬에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 각각 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하거나 각각 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하는 제 1 도메인과 제 2 도메인을 포함하는 펩티드 사슬로서, 상기 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인, 예컨대 T 세포 수용체 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함하는, 펩티드 사슬에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 사슬의 추가 구현예는 본 발명의 항원 수용체에 대해 본 명세서에서 설명한 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포, 특히 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체의 제 1 펩티드 사슬, 제 2 펩티드 사슬 또는 제 1 및 제 2 펩티드 사슬 모두를 발현하거나 본 발명의 펩티드 사슬을 발현하는 재조합 세포, 특히 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포 또는 재조합 세포의 추가의 구현예는 본 발명의 항원 수용체 또는 본 발명의 펩티드 사슬에 대해 본 명세서에서 설명된 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은 (a) 세포를 제공하는 단계, (b) 본 발명의 항원 수용체의 제 1 펩티드 사슬을 암호화(encoding)하는 제 1 유전자 컨스트럭트를 제공하는 단계, (c) 본 발명의 항원 수용체의 제 2 펩티드 사슬을 암호화하는 제 2 유전자 컨스트럭트를 제공하는 단계, (d) 제 1 및 제 2 유전자 컨스트럭트를 상기 세포내로 도입하는 단계 및 (e) 세포내에서 컨스트럭트가 발현되도록 하는 단계;를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은 (a) 세포를 제공하는 단계; (b) 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하는 제 1 펩티드 사슬을 암호화하는 제 1 유전자 컨스트럭트를 제공하는 단계; (c) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하는 제 2 펩티드 사슬을 암호화하는 제 2 유전자 컨스트럭트를 제공하는 단계; (d) 제 1 및 제 2 유전자 컨스트럭트를 상기 세포내로 도입하는 단계; 및 (e) 세포내에서 컨스트럭트가 발현되도록 하는 단계;를 포함하고, 상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인 중 하나와 함께 제 1 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, 상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인은 제 2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 제 2 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 항원 수용체의 발현은 세포 표면에서 일어난다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬은 단일 유전자 컨스트럭트 상에 제공된다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 상기 세포는 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포이다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 유전자 컨스트럭트는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 본 발명의 방법의 추가 구현예는 본 발명의 항원 수용체에 대해 본 명세서에서 설명된 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조를 위한 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 세포, 특히 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 세포의 추가 구현예는 본 발명의 항원 수용체 또는 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조를 위한 본 발명의 방법에 대해 본 명세서에서 설명된 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체의 제 1 펩티드 사슬, 제 2 펩티드 사슬 또는 제 1 및 제 2 펩티드 사슬 모두를 암호화하거나 본 발명의 펩티드 사슬을 암호화하는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 핵산의 추가 구현예는 본 발명의 항원 수용체 또는 본 발명의 펩티드 사슬에 대해 본 명세서에서 설명된 바와 같다.
본 발명은 일반적으로 본 발명의 항원 수용체를 이용하여 세포 표면에 하나 이상의 항원을 발현하는 세포, 예컨대 세포 표면에 하나 이상의 질환 특이적 항원을 발현하는 질환 세포, 특히 세포 표면에 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암세포를 표적화하는 질환의 치료를 포함한다. 상기 방법은 표면에 하나 이상의 항원을 발현하는 세포의 선택적 박멸을 제공함으로써, 항원(들)을 발현하지 않는 정상 세포에 대한 유해 효과를 최소화한다. 일 구현예에서, 항원(들)에 대한 결합을 통해 세포를 표적화하는 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포가 투여된다. T 세포는 세포 표면에 항원(들)을 발현하는 질환 세포를 인식할 수 있어, 질환 세포의 박멸을 초래한다. 일 구현예에서, 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체, 본 발명의 재조합 세포 또는 본 발명의 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 하나 이상의 종양 항원과 같은 본 발명의 항원 수용체에 의해 결합되는 하나 이상의 항원의 발현을 특징으로 하는 암과 같은 질환의 치료에서 의약으로서 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 객체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원 수용체에 의해 결합되는 종양 항원과 같은 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하는 암과 같은 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 항원의 발현 또는 상승된 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 객체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 적어도 하나의 항원을 표적으로 하는 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포를 객체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 암이다. 일 구현예에서, 상기 T 세포는 객체에게 자가(autologous), 동종이계(allogeneic) 또는 동계(syngeneic)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항원 수용체는 오직 하나의 항원에 결합하거나(예를 들어, 단일 특이성이면서 동일한 에피토프를 인식하거나, 이중 특이성 또는 다중 특이성이면서 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식함으로써), 상이한 항원, 특히 2개의 상이한 항원에 결합한다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 치료 방법은 객체로부터 T 세포 또는 T 세포 전구세포를 포함하는 세포 샘플을 수득하는 단계 및 상기 세포를 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포를 제공하기 위해 본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 핵산으로 형질감염(transfection)시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포는 안정적으로 또는 일시적으로 항원 수용체를 암호화하는 핵산으로 형질감염된다. 따라서, 항원 수용체를 암호화하는 핵산은 T 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않는다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, T 세포 및/또는 세포 샘플은 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포가 투여된 객체로부터 유래한 것이다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, T 세포 및/또는 세포 샘플은 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포가 투여되는 포유류와 상이한 포유류로부터 유래한 것이다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위해 불활성화된다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원은 암세포와 같은 질환 세포에서 발현된다. 일 구현예에서, 항원은 암세포와 같은 질환 세포의 표면에서 발현된다. 일 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인 또는 항원의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, 항원 수용체는 살아있는 세포의 표면에 존재하는 항원의 천연 에피토프에 결합한다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 상기 항원은 종양 항원이다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원은 클라우딘 6 및 클라우딘 18.2와 같은 클라우딘, CD19, CD20, CD22, CD33, CD123, 메소틸렌(mesothelin), CEA, c-Met, PSMA, GD-2, 및 NY-ESO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원은 병원체 항원이다. 병원체는 진균성(fungal), 바이러스성(viral), 또는 세균성(bacterial) 병원체일 수 있다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원의 발현은 세포 표면에서 일어난다. 일 구현예에서 항원은 클라우딘, 특히 클라우딘 6 또는 클라우딘 18.2이고, 상기 항원 수용체는 상기 클라우딘의 제 1 세포외 루프에 결합한다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되는 경우 및/또는 T 세포상에 존재하는 경우 상기 항원 수용체의 세포상에 존재하는 항원에 대한 결합은 사이토카인의 방출과 같은 T 세포의 면역 이펙터 기능을 초래한다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되는 경우 및/또는 T 세포상에 존재하는 경우 항원-제시 세포와 같은 세포상에 존재하는 항원에 대한 상기 항원 수용체의 결합은 상기 T 세포의 자극, 초회감작(priming) 및/또는 확장을 초래한다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되는 경우 및/또는 T 세포상에 존재하는 경우 암세포와 같은 질환 세포상에 존재하는 항원에 대한 상기 항원 수용체의 결합은 질환 세포의 세포용해 및/또는 아폽토시스(apoptosis)를 초래하고, 상기 T 세포는 바람직하게는 세포독성 인자, 예를 들어 퍼포린 및 그랜자임을 방출한다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 항원 수용체의 도메인은 항원 수용체의 엑토도메인에 포함된다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 막횡단 도메인은 막을 가로지르는 소수성 알파 나선이다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 초기 단백질을 소포체로 향하게 하는 신호 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인에 선행한다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 바람직하게는 특히 질환 세포 또는 항원 제시 세포와 같은 세포의 표면에 존재하는 경우 이것을 표적화하는 항원에 특이적이다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 T 세포와 같은 면역반응성 세포, 바람직하게는 세포독성 T 세포에 의해 발현될 수 있고/있거나 이의 표면에 존재할 수 있다. 일 구현예에서, T 세포는 본 발명의 항원 수용체가 표적으로 하는 항원(들)에 대해 반응성을 가진다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 물질 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명과 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명이 이하 상세히 설명되지만, 본 명세서에서 설명된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 다양할 수 있으므로 본 발명이 이러한 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 오로지 특정 구현예를 설명하기 위한 것으로, 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
하기에서, 본 발명의 구성 요소에 대해 설명할 것이다. 이들 요소는 특정 구현예와 함께 열거되지만, 추가적인 구현예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해하여야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 구현예는 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구현예들로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이 설명은 명시적으로 기재된 구현예를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 결합시키는 구현예를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 본 출원에서 기재된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 고려되어야 한다.
바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Kφlbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에서 설명한 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 본 기술 분야의 문헌에서 설명되는 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook 등 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조).
후속하는 본 명세서와 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)"란 단어 및 "포함한다(comprises)"와 "포함하는(comprising)"과 같은 변형어는 명시된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하고, 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않지만, 몇몇 구현예에서는 이러한 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹이 배제될 수 있음을 내포하는 것으로 이해될 것이며, 즉 청구대상이 명시된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹의 포함으로 구성된다는 것을 의미한다. 본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용된 단수형(원문의 "a", "an" 및 "the")의 용어 및 유사한 지시대상은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위의 언급은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 독립된 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법의 역할을 하기 위한 것이다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 각 개별적인 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용한 것처럼 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 설명된 모든 방법은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예시, 또는 예시적 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은, 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이고, 달리 청구된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 여러 문헌이 인용되었다. 본 명세서에서 인용된 각각의 문헌은 (모든 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체 사양, 지침서 등), 상기 또는 하기에 어디서든, 그 전체가 참조로서 인용된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
"면역 반응"이란 용어는 항원에 대한 통합적인 신체 반응을 의미하며 바람직하게는 세포성 면역 반응 또는 세포성 뿐만 아니라 체액성 면역 반응도 뜻한다. 면역 반응은 보호적/방지적/예방적 및/또는 치료적일 수 있다.
"면역 반응의 제공"은 면역 반응을 제공하기 전에는 특정 표적 항원, 표적 세포 및/또는 표적 조직에 대한 면역 반응이 없었음을 의미할 수 있지만, 면역 반응을 제공하기 전 특정 표적 항원, 표적 세포 및/또는 표적 조직에 대한 특정 수준의 면역 반응이 있었고 면역 반응의 제공 후에는 상기 면역 반응이 강화되었음을 의미할 수도 있다. 따라서, "면역 반응 제공"은 "면역 반응 유도" 및 "면역 반응 강화"를 포함한다. 바람직하게는, 객체에 면역 반응을 제공한 후에, 상기 객체는 암 질환과 같은 질환의 발병으로부터 보호되거나, 면역 반응을 제공함으로써 질환의 상태가 완화된다. 예를 들어, 종양 항원에 대한 면역 반응은 암 질환을 앓고 있는 객체 또는 암 질환이 발병할 위험에 처한 객체에 제공될 수 있다. 이러한 경우에, 면역 반응의 제공은 객체의 질환 상태가 완화되고, 객체가 전이를 일으키지 않거나 암 질환이 발병할 위험이 있는 객체에서 암 질환이 발병하지 않을 수 있음을 의미할 수 있다.
"세포-매개성 면역" 또는 "세포성 면역", 또는 유사한 용어는 항원의 발현을 특징으로 하는, 특히 클래스 I 또는 클래스 II MHC로 항원을 제시하는 것을 특징으로 하는 세포에 대해 지시된 세포성 반응을 포함하고자 한다. 세포성 반응은 "헬퍼" 또는 "킬러"의 역할을 하는 T 세포 또는 T 림프구로 불리는 세포와 관련된다. 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 하고, 킬러 T 세포(세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL이라고도 함)는 암세포와 같은 질환 세포를 사멸시켜 더 많은 질환 세포의 생성을 방지한다.
"항원"이란 용어는 면역 반응이 발생 및/또는 유도되는 에피토프를 포함하는 물질과 관련된다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 항원은, 프로세싱(processing) 후 임의로, 항원 또는 항원을 발현하는 세포, 바람직하게는 세포의 표면에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. "항원"이란 용어는 특히 단백질과 펩티드를 포함한다. 항원은 바람직하게는 천연 발생 항원에 상응하거나 이로부터 유래한 생성물이다. 이러한 천연 발생 항원은 알레르겐, 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충 및 기타 감염 인자와 병원체를 포함하거나 이로부터 유래할 수 있거나 항원은 종양 항원일 수도 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 천연 발생 생성물, 예를 들어 바이러스성 단백질, 또는 이의 일부에 상응할 수 있다.
"병원체"란 용어는 병원성 미생물과 관련이 있으며 바이러스, 세균, 진균, 단세포 유기체 및 기생충을 포함한다. 병원성 바이러스의 예는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스(HSV), A형 간염 바이러스(HAV), HBV, HCV, 유두종 바이러스 및 인간 T-림프친화 바이러스(HTLV)를 포함한다. 단세포 유기체는 말라리아원충, 트리파노소마(trypanosomes), 아메바 등을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 항원은 질환-특이적 항원 또는 질환-관련 항원이다. "질환 특이적 항원" 또는 "질환 관련 항원"이란 용어는 병리학적으로 중요한 모든 항원을 의미한다. 하나의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 항원은 건강한 세포, 조직 및/또는 기관에는 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재하지만, 질환 세포, 조직 및/또는 기관에는 존재하며, 따라서, 예컨대 항원에 표적화된 항원 수용체를 갖는 T 세포에 의해 질환 세포, 조직 및/또는 기관을 표적화하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항원은 종양 항원 또는 종양 관련 항원이며, 즉, 세포질, 세포 표면 및 세포핵으로부터 유래할 수 있는 암세포의 구성 요소, 특히 암세포 상의 표면 항원과 같이, 바람직하게는 다량으로 생성되는 항원이다.
본 발명의 문맥상, "종양 항원" 또는 "종양 관련 항원"이란 용어는 제한된 수의 조직 및/또는 기관 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질과 관련되며, 예를 들어, 종양 항원은 정상 조건 하에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막에서, 고환과 같은 생식 기관에서, 태반과 같은 영양 융모 조직에서 또는 생식 세포에서 특이적으로 발현될 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현될 수 있다. 이러한 문맥상, "제한된 수"는 바람직하게는 3개 이하, 더 바람직하게는 2개 이하를 의미한다. 본 발명의 문맥상 종양 항원은 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질, 암/고환 항원, 즉 고환 및 때때로 태반에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질 및 생식선 특이적 항원을 포함한다. 본 발명의 문맥상, 종양 항원은 바람직하게는 암세포의 세포 표면과 관련되며 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 미약하게 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적인 발현은 암 세포를 동정해 준다. 본 발명의 문맥상, 객체, 예를 들어 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은 상기 객체에서의 자가 단백질인 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 문맥상 종양 항원은 정상 조건 하에, 특히 비필수 조직 또는 기관, 즉 면역계에 의해 손상되었을 때 객체의 사멸을 초래하지 않는 조직 또는 기관에서 발현되거나, 면역계가 전혀 접근할 수 없거나 거의 접근할 수 없는 신체의 장기 또는 구조에서 발현된다. 바람직하게는, 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 사이에서 아미노산 서열은 동일하다.
본 발명에서 유용할 수 있는 종양 항원의 예는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질, 예컨대 클라우딘-6, 클라우딘-18.2 및 클라우딘-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너 BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT이다. 특히 바람직한 종양 항원은 클라우딘-18.2(CLDN18.2)과 클라우딘-6(CLDN6)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바과 같이 "CLDN" 또는 간단히 "Cl"이란 용어는 클라우딘을 의미하고 CLDN6과 CLDN18.2를 포함한다. 바람직하게는, 클라우딘은 인간 클라우딘이다. 클라우딘은 상피의 세포들 사이의 세포간 공간에서 분자의 흐름을 조절하는 세포간 장벽을 확립하는 밀착연접(tight junction)의 가장 중요한 구성 요소인 단백질 계열에 속한다. 클라우딘은 N-말단과 C-말단의 끝이 모두 세포질에 위치하는, 막을 4번 가로지르는 막횡단 단백질이다. EC1 또는 ECL1으로 명명된 첫 번째 세포외 루프는 평균 53개의 아미노산으로 구성되고, EC2 또는 ECL2로 명명된 두 번째 세포외 루프는 약 24개의 아미노산으로 구성된다. 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질은 다양한 기원의 종양에서 발현되고, 이의 선택적 발현 (독성 관련 정상 조직에서는 발현되지 않음) 및 원형질막으로의 국소화로 인해 표적화 암 면역요법과 관련하여 표적 구조로서 특히 적합하다.
CLDN6과 CLDN18.2는 종양 조직에서 상이하게 발현되는 것으로 확인되었는데, CLDN18.2를 발현하는 유일한 정상 조직은 위이고 (위 점막의 분화된 상피 세포) CLDN6을 발현하는 유일한 정상 조직은 태반이다.
CLDN18.2는 췌장 암종, 식도 암종, 위 암종, 기관지 암종, 유방 암종 및 ENT 종양과 같은 다양한 기원의 암에서 발현된다. CLDN18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 비소세포폐암(NSCLC)와 같은 폐암, 난소암, 대장암, 간암, 두경부암 및 담낭암과 같은 원발성 종양 및 이들의 전이, 특히 크루켄베르그 종양(Krukenberg tumors)과 같은 위암 전이, 복막 전이 및 림프절 전이의 예방 및/또는 치료를 위한 중요한 표적이다. 적어도 CLDN18.2를 표적으로 하는 항원 수용체는 이러한 암 질환의 치료에 유용하다.
CLDN6은 예를 들어, 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 신장 세포 암 및 방광암에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. CLDN6은 난소암, 특히 난소 선암과 난소 기형암, 소세포폐암(SCLC)과 비소세포폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 특히 편평상피성 폐암과 폐선암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저세포 암 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 윤활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광암, 특히 이행세포 암종 및 유두 암종, 신장암, 특히 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장 세포 암종을 포함하는 신장세포 암, 결장암, 회장암과 같은 소장암, 특히 소장 선암과 회장 선암, 고환 배아암, 태반 융모암, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종 및 배아 고환암, 자궁암, 기형암종 또는 태생성 암종과 같은 생식 세포 종, 특히 고환의 생식세포 종양 및 이들의 전이 형태의 예방 및/또는 치료에 특히 바람직한 표적이다. 적어도 CLDN6을 표적으로 하는 항원 수용체는 이러한 암 질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 구현예의 문맥상, 항원은 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포 또는 질환 세포의 표면에 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 항원 수용체에 의해 결합하는 경우 항원은 바람직하게는 항원에 결합하는 항원 수용체를 보유하는 T 세포의 자극, 초회감작 및/또는 확장을 적절한 공동자극 신호의 존재 하에 임의로 유도할 수 있다. 질환 세포의 표면의 항원의 인식은 항원 (또는 항원을 발현하는 세포)에 대한 면역 반응을 초래할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면에 따르면, 본 발명은 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 질환 세포, 특히 CLDN6 또는 CLDN18.2와 같은 항원을 발현하는 암세포에 대한 면역 반응을 제공하고, 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 포함하는 암 질환과 같은 질환을 치료하는 것에 그 목적이 있다. 바람직하게는 본 발명은 항원을 발현하는 질환 세포를 표적으로 하는 T 세포와 같은 항원 수용체-조작된 면역 이펙터 세포의 투여를 포함한다. 표면에 항원을 발현하는 세포는 항원을 표적으로 하는 항원 수용체를 갖는 면역 이펙터 세포에 의해 표적화될 수 있다.
"세포 표면"은 당업계의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자에 의한 결합이 가능한 세포의 바깥 부분을 포함한다. 항원은 세포의 표면에 위치하고, 세포에 첨가된 항원 수용체 또는 항원 특이적 항체와 같은 항원 결합 분자에 의한 결합이 가능한 경우 세포의 표면에서 발현된다. 일 구현예에서, 세포의 표면에서 발현된 항원은 항원 수용체에 의해 인식되는 세포외 부분을 갖는 내재성 막 단백질이다. 항원 수용체는 세포의 표면에 위치하고, 예를 들어 세포에 첨가된 항원 수용체 특이적 항원에 의한 결합이 가능한 경우 세포의 표면에서 발현된다. 일 구현예에서, 세포의 표면에서 발현된 항원 수용체는 항원을 인식하는 세포외 부분을 갖는 내재성 막 단백질이다.
본 발명의 문맥상 "세포외 부분" 또는 "엑토도메인"이란 용어는 세포의 세포외 공간을 접하고 있고, 바람직하게는 예를 들어 세포 외부에 위치한 항체와 같은 분자에 결합함으로써 상기 세포의 외부로부터 접근 가능한 단백질와 같은 분자의 일부를 의미한다. 바람직하게는, 상기 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 의미한다.
"일부" 또는 "부분"이란 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 아미노산 서열과 같은 구조의 연속적 또는 불연속적 요소를 의미한다. "단편"이란 용어는 아미노산 서열과 같은 구조의 연속적 요소를 의미한다. 단백질 서열의 일부 또는 부분은 바람직하게는 단백질 서열의 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속적 및/또는 비연속적 아미노산을 포함한다. 단백질 서열의 단편은 바람직하게는 단백질 서열의 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속적 아미노산을 포함한다. 구조의 일부, 부분 또는 단편은 바람직하게는 상기 구조의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 항원성, 면역원성 및/또는 결합 특성을 포함한다. 예를 들어, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역의 일부는 바람직하게는 항원 인식 부위를 형성하고 항원에 결합할 수 있다. 따라서, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역이 V 알파일 경우, 이의 일부는 바람직하게는 상응하는 V 베타 또는 이의 일부와 여전히 상호작용하여 기능적 항원 인식 부위를 형성할 수 있다. T 세포 수용체 사슬의 가변 영역이 V 베타일 경우, 이의 일부는 바람직하게는 상응하는 V 알파 또는 이의 일부와 여전히 상호작용하여 기능적 항원 인식 부위를 형성할 수 있다. 마찬가지로, T 세포 수용체 사슬의 불변 영역의 일부는 바람직하게는 이의 신호전달 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 항원은 발현 수준이 검출 한계 미만인 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 항원 특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 너무 낮은 경우 세포에서 (실질적으로) 발현되지 않는다. 본 발명에 따르면, 항원은 발현 수준이 검출 한계를 상회하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 항원 특이적 항체에 의한 결합을 허용할 정도로 충분히 높은 경우 세포에서 발현된다. 바람직하게는, 세포에서 발현된 항원은 상기 세포의 표면에서 발현되거나 노출, 즉 존재하며, 따라서 세포에 첨가된 항체 또는 항원 수용체와 같은 항원 특이적 분자에 의한 결합이 가능하다.
"표적 세포"는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응의 표적이 되는 세포를 의미한다. 표적 세포는 암세포와 같은 임의의 바람직하지 않은 세포를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 표적 세포는 표적 항원, 특히 바람직하게는 세포 표면에 존재하는 질환 특이적 항원인 표적 항원을 발현하는 세포이다.
"에피토프"란 용어는 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기, 즉 면역계에 의해 인식되는, 즉 결합되는, 예를 들어 항체 또는 항원 수용체에 의해 인식되는 분자의 일부 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 면역계에 의해 인식되는 항원상의 별개의 3차원적 부위이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며 일반적으로 특정 3차원 구조의 특성 뿐만 아니라 특정 전하 특성도 가진다. 구조적 및 비구조적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 후자와 달리 전자에 대한 결합을 잃는다는 점에서 구별된다. 바람직하게는 에피토프는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 상기 용어는 항원의 면역원성 부분과 관련된다. 종양 항원과 같은 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하고 길이가 바람직하게는 5개 내지 100개, 바람직하게는 5개 내지 50개, 더욱 바람직하게는 8개 내지 30개, 가장 바람직하게는 10개 내지 25개 아미노산이고, 예를 들어 에피토프는 길이가 바람직하게는 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 아미노산일 수 있다.
"항원 프로세싱"은 상기 항원의 단편인 프로세싱 생성물로의 분해(예를 들어, 단백질의 펩티드로의 분해)를 의미하고, 세포에 의한 제시, 바람직하게는 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포에 의한 제시를 위한 이들 단편 중 하나 이상과 MHC 분자와의 회합(예를 들어, 결합을 통해)을 의미한다.
항원 제시 세포(APC)는 표면에 주조직 적합성 복합체(MHC)의 범주에서 항원을 나타내는 세포이다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 사용하여 이 복합체를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포는 항원을 프로세싱하고 T 세포에 이를 제시한다. 본 발명에 따르면, "항원 제시 세포"란 용어는 전문적 항원 제시 세포 및 비전문적 항원 제시 세포를 포함한다.
전문적 항원-제시 세포는 식균작용 또는 수용체-매개 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 항원을 내재화하고, 이어서 이들의 막 상에 클래스 Ⅱ MHC 분자에 결합된 항원의 단편을 나타내는데 매우 효율적이다. T 세포는 항원-제시 세포막 상의 항원-클래스 Ⅱ MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용한다. 항원 제시 세포에 의해 추가적인 공동자극 신호가 생성되고, T 세포의 활성화가 초래된다. 공동자극 분자의 발현은 전문적 항원 제시 세포의 의미를 규정하는 특징이다. 전문적 항원 제시 세포의 주요 유형은 가장 광범위하게 항원을 제시하고 아마도 가장 중요한 항원-제시 세포인 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 및 특정 활성화된 상피 세포이다.
비전문적 항원 제시 세포는 천연 T 세포와의 상호작용을 위해 요구되는 MHC 클래스 Ⅱ 단백질을 구성적으로 발현하지 않으며; 이들은 IFNγ와 같은 특정 사이토카인에 의한 비전문적 항원 제시 세포의 자극시에만 발현된다.
수지상 세포(DC)는 MHC 클래스 Ⅱ 및 I 항원 제시 경로 모두를 통해 말초 조직에서 포획된 항원을 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도제이며 이들 세포의 활성화가 항종양 면역의 유도에 중요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포 및 전구 세포는 말초 혈액, 골수, 종양-침윤 세포, 종양 부근 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 임의의 다른 적합한 조직 또는 유체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFa와 같은 사이토카인의 조합을 말초 혈액으로부터 수거된 단핵구의 배양물에 첨가함으로써 생체외에서 분화될 수 있다. 대안적으로, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 수거된 CD34 양성 세포는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 다른 화합물(들)의 조합을 배양 배지에 첨가함으로써 분화될 수 있다. 수지상 세포는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로서 간편하게 분류되며, 이는 두 가지의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로서 사용될 수 있다. 그러나 이러한 명명법은 가능한 모든 분화의 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 미성숙 수지상 세포는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있는 항원 흡수 및 프로세싱에 대한 높은 능력을 갖는 항원 제시 세포로서 특징지어진다. 상기 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커의 낮은 발현, 그러나 클래스 I 및 클래스 II MHC, 접합분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현을 특징으로 한다. 수지상 세포 성숙은 항원 제시 수지상 세포가 T 세포 초회감작을 유도하는 수지상 세포 활성화 상태로 지칭되는 반면, 미성숙 수지상 세포에 의한 제시는 내성을 초래한다. 수지상 세포 성숙은 선천적 수용체(세균 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 전염증성 사이토카인(TNF, IL-1, IFNs), CD40L에 의한 수지상 세포 표면상의 CD40의 결합 및 스트레스성 세포사멸을 겪는 세포로부터 방출된 물질에 의해 검출되는 미생물적 특징을 가지는 생체 분자에 의해 주로 야기된다. 수지상 세포는 시험관내에서 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파와 같은 사이토카인으로 골수를 배양함으로써 유도될 수 있다.
"면역원성"이란 용어는 면역 반응을 유도하기 위한 항원의 상대적인 효율성과 관련된다.
본 발명의 문맥상 "면역 이펙터 기능"이란 용어는, 예를 들어 종양 세포와 같은 질환 세포의 제거, 또는 종양 성장의 억제, 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 포함하는 종양 발달의 억제를 초래하는 면역계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 면역 이펙터 기능은 T 세포 매개 이펙터 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포)의 경우 인터류킨-2와 같은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구(CTL) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우 세포, 즉 항원의 발현을 특징으로 하는, 예를 들어, 아폽토시스 또는 퍼포린-매개 세포용해를 통한 세포의 제거, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생산, 및 표적 세포를 발현하는 항원의 특정 세포용해성 제거를 포함한다.
본 발명의 문맥상 "면역 반응성 세포" 또는 "면역 이펙터 세포"란 용어는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포와 관련된다. "면역 반응성 세포"는 바람직하게는 세포의 표면에서 발현되는 항원과 같은 항원을 결합시킬 수 있고 면역 반응을 매개할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 미생물을 죽이고, 항체를 분비하고, 감염되거나 암에 걸린 세포를 인식하고, 선택적으로 이러한 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역 반응성 세포는 T 세포(세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식 세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, "면역 반응성 세포"는 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 본 발명에 따르면, "면역 반응성 세포"란 용어는 또한 적절한 자극으로 면역 세포(예컨대 T 세포, 특히 T 헬퍼 세포, 또는 세포용해성 T 세포)로 성숙될 수 있는 세포를 포함한다. 면역 반응성 세포는 CD34+ 조혈 줄기세포, 미숙 및 성숙 T 세포, 및 미숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. 항원에 노출되었을 때, T 세포 전구체가 세포용해성 T 세포로 분화되는 것은 면역계의 클론 선택과 유사하다.
바람직하게는, "면역반응성 세포" 또는 "면역 이펙터 세포"가 특히 항원 제시 세포 또는 암세포와 같은 질환 세포의 표면에 존재하는 경우, 어느 정도의 특이성으로 항원을 인식한다. 바람직하게는, 상기 인식은 항원을 인식하는 상기 세포로 하여금 응답성(responsive) 또는 반응성(reactive)이 되도록 한다. 세포가 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포)인 경우 이러한 반응성은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구(CTL) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함할 수 있다. 세포가 CTL인 경우 이러한 반응성은 세포, 즉 항원의 발현을 특징으로 하는 세포, 예를 들어 아폽토시스 또는 퍼포린-매개 세포용해를 통한 세포의 제거를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, CTL 반응성은 지속적인 칼슘 플럭스, 세포 분열, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향조절, 및 표적 세포를 발현하는 항원의 특이적 세포용해성 제거를 포함할 수 있다. CTL 반응성은 또한 CTL 반응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 측정될 수 있다. 항원을 인식하고 반응성을 갖는 이러한 CTL은 본 명세서에서 "항원 반응성 CTL"이라고도 명명된다.
"림프계 세포(lymphoid cell)"는 임의의 적합한 변형 후, 예를 들어 T 세포 수용체 또는 항원 수용체의 전달 후에 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응 또는 이러한 세포의 전구 세포의 생성이 가능하고, 림프구, 바람직하게는 T 림프구, 림프아세포 및 형질세포를 포함한다. 림프계 세포는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 면역 반응성 세포 또는 면역 이펙터 세포일 수 있다. 바람직한 림프계 세포는 세포 표면에 T 세포 수용체 또는 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있는 T 세포이다. 일 구현예에서, 상기 림프계 세포는 T 세포 수용체의 내인성 발현이 결여되어 있다.
"T 세포" 및 "T 림프구"란 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포(CD4+ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포(CLLs, CD8+ T 세포)를 포함한다.
T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 군에 속하며, 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 한다. 이들은 T 세포 수용체(TCR)로 불리는 세포 표면의 특별한 수용체의 존재를 통해 B 세포 및 자연 살해 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 주요 기관이다. T 세포의 몇몇 상이한 서브세트가 발견되었고, 각각은 구별되는 기능을 가진다.
T 헬퍼 세포는 여러가지 기능 중에서도, B 세포의 형질세포로의 성숙 및 세포독성 T 세포와 대식 세포의 활성화를 비롯한 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는다. 이들 세포는 표면에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 알려져있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 발현된 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 의해 펩티드 항원으로 제시되었을 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들은 빠르게 분열하고 활성 면역 반응을 조절하거나 돕는 사이토카인으로 불리는 작은 단백질을 분비한다.
세포독성 T 세포는 바이러스 감염 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 이식 거부 반응에도 영향을 미친다. 이들 세포는 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 Ⅰ과 관련된 항원에 결합함으로써 표적을 인식한다.
다수의 T 세포에는 여러 단백질의 복합체로서 존재하는 T 세포 수용체(TCR)가 존재한다. 실제 T 세포 수용체는 독립 T 세포 수용체 알파 및 베타(TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생산되고 α- 및 β-TCR 사슬로 불리는 2개의 분리된 펩티드 사슬로 구성되어 있다. γδ T 세포(감마 델타 T 세포)는 표면에 뚜렷한 T 세포 수용체(TCR)를 가지고 있는 T 세포의 작은 부분을 나타낸다. 그러나 γδ T 세포에서, 상기 TCR은 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다. 이들 T 세포의 군은 αβ T 세포보다 훨씬 드물다(총 T 세포의 2%).
T 세포 수용체의 각 사슬은 2개의 세포외 도메인: 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역으로 구성된다. 불변 영역은 세포막에 인접하고 막횡단 영역 및 짧은 세포질 테일이 뒤따르는 반면, 가변 영역은 펩티드/MHC 복합체에 결합한다. 본 발명의 목적상, "T 세포 수용체 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부"란 용어는 T 세포 수용체 사슬의 불변 영역 다음에 (N 말단에서 C 말단으로) T 세포 수용체 사슬의 불변 영역에 천연적으로 연결되어 있는 막횡단 영역 및 세포질 테일과 같은 막횡단 영역 및 세포질 테일이 뒤따르는 구현예를 또한 포함한다.
모든 T 세포는 골수의 조혈 줄기세포로부터 기원한다. 조혈 줄기세포로부터 유래한 조혈 전구 세포는 흉선에 거주하며, 미숙 흉선 세포의 많은 개체군을 생성하기 위한 세포분열에 의해 확장한다. 가장 초기의 흉선 세포는 CD4 와 CD8를 모두 발현하지 않으며, 따라서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 이들은 발달 단계를 거치면서 이중-양성 흉선 세포(CD4+CD8+)가 되고, 최종적으로 흉선에서 말초 조직으로 방출되는 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선 세포로 성숙한다.
T 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체외에서 제조될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 상업적으로 이용 가능한 세포 분리 시스템을 사용하여 환자와 같은 포유류의 골수, 말초 혈액 또는 골수, 말초 혈액의 일부로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 관련되거나 관련이 없는 인간, 비인간 동물, 세포주 또는 배지로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, T 세포를 포함하는 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체를 발현할 수 있거나 내인성 T 세포 수용체의 발현이 결여될 수 있다.
항원 수용체를 암호화하는 RNA와 같은 핵산은 T 세포 또는 용혈성 잠재성을 갖는 다른 세포, 특히 림프계 세포로 도입될 수 있다.
"항원으로 표적화된 항원 수용체"란 용어 또는 이와 유사한 용어는, T 세포와 같은 면역 이펙터 세포상에 존재할 때 항원 제시 세포 또는 암세포와 같은 질환 세포의 표면상의 항원을 인식하여 면역 이펙터 세포가 전술한 바와 같이 자극, 초회감작 및/또는 확장되거나 면역 이펙터 세포의 이펙터 기능을 발휘하도록 하는 항원 수용체와 관련된다.
"항원-특이적 T 세포"란 용어 또는 이와 유사한 용어는 특히 T 세포가 항원 수용체와 제공될 때, 항원 수용체가 표적화하는 항원, 예컨대 항원 제시 세포 또는 암세포와 같은 질환 세포의 표면 항원을 인식하는 T 세포, 바람직하게는 전술한 바와 같이 T 세포의 이펙터 기능을 발휘하는 T 세포와 관련된다. T 세포 및 다른 림프계 세포는 항원을 발현하는 표적 세포를 제거하는 경우 항원에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 예를 들어, 크롬 방출 분석 또는 증식 분석과 같은 임의의 다양한 표준 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 림포카인(예컨대 인터페론-γ)의 합성이 측정될 수 있다.
"주조직 적합성 복합체" 및 약어 "MHC"란 용어는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하고 모든 척추동물에서 발생하는 유전자의 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환 세포 사이의 신호전달에 중요하며, 여기서 상기 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드에 결합하고 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이를 제시한다. MHC에 의해 암호화된 단백질은 세포 표면에서 발현되며, T 세포에 자기 항원(세포 자체로부터의 펩티드 단편)과 비자기 항원(예를 들어, 침입 미생물의 단편)을 모두 나타낸다.
본 발명에 따르면, "항원 수용체"란 용어는 단클론 항체의 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 대한 특이성과 같은 임의의 특이성을 부여하는 조작된 수용체를 포함한다. 이러한 방식으로, 다수의 항원 특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 수용체는, 예를 들어 T 세포 자신의 T 세포 수용체 대신 또는 이에 더하여 T 세포상에 존재할 수 있다. 이러한 T 세포는 표적 세포의 인식을 위한 항원의 프로세싱 및 제시를 필수적으로 요하지 않고, 오히려 바람직하게는 표적 세포상에 존재하는 임의의 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 수용체는 세포 표면에서 발현된다. 본 발명의 목적상, 항원 수용체를 포함하는 T 세포는 본 명세서에서 사용되는 "T 세포"라는 용어에 포함된다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, "항원 수용체"라는 용어는 암세포와 같은 표적 세포상의 표적 구조(예를 들어, 항원)를 인식, 즉 결합하고(예를 들어, 항원 결합 부위 또는 항원 결합 도메인을 표적 세포의 표면에서 발현된 항원에 결합시킴으로써), 세포 표면의 상기 항원 수용체를 발현하는 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포상에 대한 특이성을 부여할 수 있는 단일 분자 또는 분자의 복합체를 포함하는 인공 수용체를 포함한다. 바람직하게는, 항원 수용체에 의한 표적 구조의 인식은 상기 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포의 활성화를 초래한다. 항원 수용체는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 도메인을 포함하는 상기 단백질 단위를 하나 이상 포함할 수 있다. "항원 수용체"란 용어는 바람직하게는 T 세포 수용체를 포함하지 않는다. 본 발명에 따르면, "항원 수용체"란 용어는 바람직하게는 "키메라 항원 수용체(CAR)", "키메라 T 세포 수용체" 및 "인공 T 세포 수용체"란 용어들과 동의어이다.
본 발명에 따르면, 항원은 항체의 항원-결합 부분 및 상이한 펩티드 사슬에 위치할 수 있는 T 세포 수용체를 통해 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 임의의 항원 인식 도메인(본 명세서에서 간단히 "도메인"으로도 지칭됨)을 통해 항원 수용체에 의해 인식될 수 있다. 일 구현예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 도메인은 면역글로불린으로부터 유래한다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 도메인은 T 세포 수용체로부터 유래한다. 단클론 항체 및 T 세포 수용체 가변 도메인, 특히 TCR 알파 및 베타 단일 사슬로부터 유래한 단일 사슬 가변 단편 (scFv)와 같은 항체 가변 도메인이 특히 바람직하다. 실제로, 주어진 표적에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 도메인으로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체는 2개 이상의 결합 부위를 형성하는 4개 이상의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하며, 상기 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이 에피토프는 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항원 수용체는 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 도메인(또는 영역)(VH(1)), 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변 도메인(또는 영역)(VL(1)), 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 도메인(또는 영역)(VH(2)), 및 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변 도메인(또는 영역)(VL(2))을 포함하고, 상기 제 1 및 제 2 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있으며 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 일 구현예에서, VH(1)은 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있으며 VH(2)는 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 반면, VH(1)은 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없으며 VH(2)는 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없다. 그러나, 또 다른 구현예에서, VH(1)은 VL(1)뿐만 아니라 VL(2)와도 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있으며 VH(2)는 VL(2)뿐만 아니라 VL(1)과도 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 후자의 구현예에서, VH(1) 및 VH(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역글로불린으로부터 유래할 수 있고 VL(1) 및 VL(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역글로불린으로부터 유래할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 조합 항원 수용체로도 지칭되는 항원 수용체로서, 상기 수용체는 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬을 포함하고, 상기 제 1 펩티드 사슬은 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하고; 상기 제 2 펩티드 사슬은 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하며; 상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인은 상기 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인 중 하나와 함께 제 1 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 제 1 펩티드 사슬의 제 2 도메인은 상기 제 2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는, 항원 수용체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체는 두 펩티드 사슬 각각의 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상이한 펩티드 사슬상의 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 사이의 상호작용을 통해 2개의 항원 결합 부위의 형성이 일어난다. 일 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체는 한 펩티드 사슬이 VL(1) 및 VH(2)를 포함하고 다른 폴리펩티드 사슬이 VH(1) 및 VL(2)를 포함하는 2개의 펩티드 사슬을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체는 한 펩티드 사슬의 중쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인 및 다른 펩티드 사슬의 경쇄 가변 도메인에 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 상이한 펩티드 사슬의 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 사이의 상호작용을 통해 2개의 항원 결합 부위의 형성이 일어난다. 일 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체는 한 펩티드 사슬이 VH(1) 및 VH(2)를 포함하고 다른 펩티드 사슬이 VL(1) 및 VL(2)를 포함하는 2개의 펩티드 사슬을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 바람직하게는 N-말단에서 C-말단으로 VH(1)-VL(2)의 순서로 배열된 제 1 펩티드 사슬 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 바람직하게는 N-말단에서 C-말단으로 VL(1)-VH(2)의 순서로 배열된 제 2 펩티드 사슬을 포함한다. T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인은 바람직하게는 가변 영역의 배열에 대해 C-말단에 위치한다. T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인은 바람직하게는 펩티드 사슬 중 하나에 위치한 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부, 및 다른 펩티드 사슬에 위치한 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부는 T 세포 수용체의 알파 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부는 T 세포 수용체의 베타 사슬을 포함한다. T 세포 수용체의 알파 사슬 및 T 세포 수용체의 베타 사슬은 바람직하게는 동일한 T 세포 수용체로부터의 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 바람직하게는 N-말단에서 C-말단으로 VH(1)-VH(2)의 순서로 배열된 제 1 펩티드 사슬 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 바람직하게는 N-말단에서 C-말단으로 VL(1)-VL(2)의 순서로 배열된 제 2 펩티드 사슬을 포함한다. T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인은 바람직하게는 가변 영역의 배열에 대해 C-말단에 위치한다. T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인은 바람직하게는 펩티드 사슬 중 하나에 위치한 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부, 및 다른 펩티드 사슬에 위치한 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 일 구현예에서, T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부는 T 세포 수용체의 알파 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역 또는 이의 일부는 T 세포 수용체의 베타 사슬을 포함한다. T 세포 수용체의 알파 사슬 및 T 세포 수용체의 베타 사슬은 바람직하게는 동일한 T 세포 수용체로부터의 것이다.
본 발명의 항원 수용체는 2개 이상의 항원 결합 부위를 가지고, 따라서 적어도 2가이다. 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 항원 수용체의 결합 부위는 동일하거나 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이 에피토프는 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 결합 부위가 특히 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 경우, 2개의 결합 부위는 동일하거나 실질적으로 동일 및/또는 동일하거나 실질적으로 동일한 도메인에 의해 형성될 수 있으며, 상기 동일하거나 실질적으로 동일한 도메인은 예를 들어 동일한 면역글로불린으로부터 유래할 수 있다. 결합 부위가 동일하거나 상이한 항원상의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 2개의 결합 부위는 상이하고 상이한 도메인에 의해 형성되며, 이러한 상이한 도메인은 상이한 면역글로불린으로부터 유래할 수 있다. 이러한 상이한 도메인의 경우에, 상이한 에피토프 특이성을 갖는 도메인은 서로 상호작용하지 않거나 또는 실질적으로 상호작용하지 않는 것이 바람직하며, 즉 VH(1)은 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없고, VH(2)는 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없다. 결과적으로, VH(1)은 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성하며 VH(2)는 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성한다. 본 발명의 조합 항원 수용체가 한 펩티드 사슬이 VH(1) 및 VL(2)를 포함하고 다른 펩티드 사슬이 VH(2) 및 VL(1)을 포함하는 2개의 펩티드 사슬을 포함하는 경우, 이것은 펩티드 사슬이 도메인의 분자내 상호작용을 통해 항원 결합 부위를 형성할 수 없게 한다.
항원 결합 부위를 형성하는 본 발명의 항원 수용체의 2개의 도메인은 또한 T 세포 수용체로부터 유래할 수 있으며, T 세포 수용체의 가변 영역과 같이 항원 특이적 결합, 특히 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합을 유지하는 단편 또는 이의 일부일 수 있다.
본 발명에 따르면, "T 세포 수용체의 가변 영역"이란 용어는 TCR 사슬의 가변 도메인에 관한 것이다. TCR α-사슬 및 β-사슬 모두의 가변 영역은 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 가지는 반면, β-사슬의 가변 영역은 항원과 정상적으로 접촉하지 않는 추가적인 초가변 영역(HV4)을 가지며, 따라서 CDR로 간주되지 않는다. CDR3은 프로세싱된 항원을 인식하는 주요 CDR이지만, α-사슬의 CDR1은 항원 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용하는 것으로 나타난 반면, β-사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용한다. 펩티드. CDR2는 MHC를 인식하는 것으로 생각된다. β-사슬의 CDR4는 항원 인식에 관여하는 것으로 생각되지 않지만, 초항원과 상호작용하는 것으로 나타났다.
면역글로불린 가변 도메인에 관한 상기 개시내용은 T 세포 수용체 가변 도메인에 상응하는 방식으로 적용된다. 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 도메인(VH(1)) 및 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변 도메인(VL(1)) 대신에, 본 발명의 항원 수용체는 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 TCR의 TCR α-사슬의 가변 도메인 및 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 TCR의 TCR β-사슬의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 도메인(VH(2)) 및 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL) 의 가변 도메인(VL(2)) 대신에 본 발명의 항원 수용체는 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 TCR의 TCR α-사슬의 가변 도메인 및 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 TCR의 TCR β-사슬의 가변 도메인을 포함할 수 있다.
각각의 항원 결합 부위가 2개의 도메인으로부터 형성되기 때문에, 각각의 도메인은 각각 면역글로불린 또는 T 세포 수용체의 일부 또는 단편을 포함할 수 있다. 개별적 일부 또는 단편만으로는 항원에 결합할 수 없지만, 2개의 개별적 일부 또는 단편이 회합하여 이들은 함께 원래의 면역글로불린 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 구조를 형성하거나 재현하고, 따라서 바람직하게는 동일한 친화도로 동일한 항원에 결합할 수 있다.
항원 인식 후, 수용체들은 바람직하게는 클러스터화되고 신호는 세포로 전달된다. 이와 관련하여, "면역수용체 신호전달 도메인" 또는 "T 세포 신호 도메인"은 항원이 결합한 후에 T 세포에 활성화 신호를 전달하는 데 관여하는 도메인이다. 이러한 신호전달은 하나의 펩티드 사슬의 T 세포 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부와 같은 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역의 일부를 포함하고, 다른 펩티드 사슬상에 상응하는 T 세포 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 상응하는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부와 같은 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역을 포함하는 본 발명의 항원 수용체에 의해 가능해질 수 있다. 이와 관련하여, CD3 복합체는 다중분자 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 부분로서 성숙한 인간 T 세포, 흉선 세포 및 자연 살해 세포의 서브세트에서 발현되는 항원을 나타낸다. T 세포 공동수용체는 단백질 복합체이며 4개의 별개의 사슬로 구성된다. 포유류에서, 상기 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 포함한다. 이러한 사슬들은 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-사슬과 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. 상기 TCR, ζ-사슬 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 구성한다. CD3는 상기 TCR의 신호전달을 담당한다. 문헌[Lin and Weiss, Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001)에 설명된 바와 같이, MHC-제시된 특이적 항원 에피토프의 결합에 의한 TCR 복합체의 활성화는 Src 계열 키나아제에 의한 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)의 인산화를 초래하여, Ca2+ 방출을 포함한 T 세포 활성화를 초래하는 추가적 키나아제의 모집을 유발한다. 예를 들어 고정된 항-CD3-항체에 의한 T 세포에서의 CD3의 클러스터화는 T 세포 수용체의 맞물림(engagement)과 유사하지만, 클론의 전형적인 특이성과 독립적인 T 세포 활성화를 야기한다.
항원 수용체 신호전달 도메인은 바람직하게는 항원 수용체에 결합하는 항원의 신호를 세포 내로 전달하는 역할을 하는 천연 세포 신호전달 복합체, 예를 들어 CD3 복합체와 상호작용하여 면역 세포 활성화를 초래하는 작용을 최소한 한다. 신호전달 도메인의 정체는 항원 수용체에 대한 항원의 결합시 면역 세포의 활성화를 유도하기 위해 천연 신호전달 복합체와 상호작용하는 능력을 가진다는 점에서만 한정된다.
바람직하게는, 하나의 펩티드 사슬의 신호전달 도메인은 예를 들어, 이황화 결합을 통해 제 2 사슬의 신호전달 도메인과 이량체를 형성할 것이다. 바람직한 신호전달 도메인은 T 세포 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 상기 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역의 일부를 포함할 수 있다. 바람직한 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타, 감마 또는 델타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부뿐만 아니라, 면역 세포 Fc 수용체의 불변 도메인의 D2 또는 D3 불변 영역을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬은 바람직하게는 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 상기 가변 영역은 불변 영역의 N 말단에 위치한다. 대안적으로, 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬은 바람직하게는 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 상기 가변 영역은 불변 영역의 N 말단에 위치한다. 또 다른 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 감마 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 델타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬은 바람직하게는 T 세포 수용체 감마 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 델타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 상기 가변 영역은 불변 영역의 N 말단에 위치한다. 대안적으로, 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 델타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 감마 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 구현예에서, 제 1 펩티드 사슬은 바람직하게는 T 세포 수용체 델타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 감마 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 상기 가변 영역은 불변 영역의 N 말단에 위치한다. 임의로, 신호전달 도메인 또는 T 세포 수용체 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부는 사슬들 간의 추가적인 이황화 결합이 생성되어 보다 효과적인 이량체 형성 및 이량체의 보다 큰 안정성을 유도하도록 변형될 수 있다.
특정 작용 메커니즘에 한정되기를 원하지 않더라도, 면역 세포의 표면에서 발현될 때, 본 발명의 항원 수용체의 2개의 펩티드 사슬은 적어도 2개의 사슬의 개별 면역수용체 신호전달 도메인 간의 상호작용(예를 들어, 이황화 결합)으로 인해 이량체를 형성할 뿐만 아니라 생리학적 T 세포 수용체 신호전달에 관여하는 내인성 CD3 복합체와 복합체를 형성한다. 그러나, 본 발명은 또한 TCR Cα 및 Cβ-도메인 대신에 CD3ξ 또는 임의의 다른 면역 세포 신호전달 도메인(CD3, CD3 서브유닛 FcγR)에 대한 직접적 융합을 포함할 수 있다. 항원 결합시 신호가 세포 내로 전달되어 면역 세포의 활성화 및 항원-특이적 면역 반응의 생성을 유도하는 것으로 믿어진다. 또한, 사슬간 항원 결합은 보다 안정한 항원-항원 수용체-내인성 CD3 신호전달 모듈을 제공하며, 안정성이 더 높아질 경우, 사슬내 항원 결합만이 가능한 1가 수용체 및 2가 수용체와 비교하여 항원-특이적 면역 반응의 보다 효과적인 자극이 가능해진다. 이러한 더 큰 안정성은 또한 인간 기원 면역수용체 신호전달 도메인(예를 들어, 마우스와 같은 다른 종으로부터 유래한 아미노산 서열을 가지는 인간 유래의 아미노산 서열의 최소한의 치환 또는 치환되지 않은)만을 사용할 수 있는 옵션을 가능하게 한다고 믿어진다. 따라서, 항원 수용체 자체에 대한 임의의 잠재적인 원치 않는 면역 반응을 피할 수 있다.
본 발명에 따른 항원 수용체 또는 이의 펩티드 사슬은, 항원 결합 부위를 형성하는 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 CD3ξ 또는 임의의 다른 면역 세포 신호전달 도메인을 포함하는 면역수용체 신호전달 도메인 이외에도 하나 이상의 공동자극 도메인 또한 포함할 수 있다. 상기 공동자극 도메인은 표적화된 부분에 대한 항원 수용체의 결합시 세포독성 T 세포와 같은 T 세포의 증식 및 생존을 향상시키는 역할을 한다. 공동자극 도메인의 정체는 항원 수용체에 의한 표적화된 부분의 결합시 세포 증식 및 생존을 향상시키는 능력이 있다는 점에서만 제한된다. 적절한 공동자극 도메인은 CD28, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 계열의 구성원인 CD137(4-1BB), 수용체의 TNFR-상과(superfamily)의 구성원인 CD134(OX40), 및 활성화된 T 세포상에 발현되는 CD28-상과 공동자극 분자인 CD278(ICOS)를 포함한다. 당업자는 이들 언급된 공동자극 도메인의 서열 변이체가 본 발명에 악영향을 미치지 않고 사용될 수 있음을 이해할 것이며, 상기 변이체는 모델링된 도메인과 동일하거나 유사한 활성을 가진다. 이러한 변이체는 이들이 유래한 도메인의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 약 80%일 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 항원 수용체 컨스트럭트 또는 이의 펩티드 사슬은 2개의 공동자극 도메인을 포함한다. 특정 조합이 언급된 4개의 도메인의 모든 가능한 변형을 포함하지만, 구체적인 예는 CD28+CD137 (4-1BB) 및 CD28+CD134 (OX40)를 포함한다.
본 발명의 항원 수용체 또는 이의 펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된 하나 이상의 공동자극 도메인과 면역수용체 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 그러나 본 발명의 항원 수용체 또는 이의 펩티드 사슬은 이러한 배열로 제한되지 않고 다른 배열도 허용 가능하며, 면역수용체 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다.
항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 항원에 자유롭게 결합해야 하기 때문에, 융합 단백질에 이들 도메인을 배치하는 것은 일반적으로 세포 외부에 있는 영역의 표시가 달성되도록 할 것이라는 사실이 이해될 것이다. 동일한 방식으로, 공동자극 도메인과 면역수용체 신호전달 도메인이 T 세포의 활성 및 증식을 유도하는 역할을 하기 때문에, 상기 융합 단백질은 일반적으로 세포의 내부에 이들 도메인을 표시할 것이다. 항원 수용체는 세포 표면으로의 융합 단백질의 적절한 외수송을 보장하기 위한 신호 펩티드, 융합 단백질이 내재성 막 단백질로서 유지되도록 하는 막횡단 도메인, 및 항원 결합 부위를 형성하는 도메인에 유연성을 부여하고 항원에 강한 결합을 허용하는 힌지 도메인(또는 스페이서 영역)와 같은 추가적인 요소를 포함할 수 있다.
임의로, 본 발명의 항원 수용체는 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 링커는 아미노산 서열 사이의 스페이서로서 유용한 임의의 아미노산 서열 또는 다른 화학적 화합물일 수 있다. 링커는 일반적으로 유연성 및 프로테아제 내성을 제공하도록 설계된다. 예를 들어, 링커는 본 발명의 조합 항원 수용체의 제 1 펩티드 사슬의 제 1 및 제 2 도메인 사이 및/또는 제 2 펩티드 사슬의 제 1 및 제 2 도메인 사이에 존재할 수 있다. 임의로, 상기 링커는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인과 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 사이에 존재할 수 있다. 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 허용하거나 항원 결합을 방해하지 않는 당업계에 공지된 임의의 유형의 링커가 본 발명에 포함된다. 특정 구현예에서, 링커는 임의의 아미노산 서열일 수 있고, 길이가 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 적어도 100개의 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 링커는 전형적으로 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 용해성을 위해 세린 및 트레오닌도 풍부하다. 일 구현예에서, 링커는 세린 잔기 (Gly4Ser)가 뒤따르는 4개의 글리신 잔기의 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)의 반복체이다. 특정 구현예에서, 링커는 항체의 힌지 영역 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명의 항원 수용체는 고전적 막횡단 도메인과 같은 막상의 항원 수용체를 고정하는 다른 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 막횡단 도메인은 신호전달 도메인에 통합되거나 이의 일부이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항원 수용체 또는 항원 수용체의 펩티드 사슬은, 이미 면역수용체 신호전달 도메인의 일부인 경우가 아니라면, 항원 결합, 막 결합 발현 또는 분비를 위한 신호 서열에 관여하는 추가적인 도메인, 개선된 이량체화를 제공하는 도메인 및 막횡단 도메인과 같은 다른 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 막횡단 도메인은 막을 가로지르는 소수성 알파 나선일 수 있다.
바람직하게는, 신호 서열 또는 신호 펩티드는 항원 수용체가, 예를 들어 세포외 환경에 존재하는 항원에 결합할 수 있도록 하는 세포 표면에서의 분비 경로 및 발현을 통한 충분한 통과를 허용하는 서열 또는 펩티드이다. 바람직하게는, 상기 신호 서열 또는 신호 펩티드는 절단 가능하고 성숙한 펩티드 사슬로부터 제거된다. 상기 신호 서열 또는 신호 펩티드는 바람직하게는 펩티드 사슬이 생성되는 세포 또는 유기체와 관련하여 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조합 항원 수용체의 펩티드 사슬은 NH2-신호 펩티드-항원 결합에 관여하는 제 1 도메인-임의적 링커-항원 결합에 관여하는 제 2 도메인-임의적 링커-T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부-면역수용체 신호전달 도메인-COOH의 구조를 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적인 항원 수용체는 하기 표 1에 열거된 구조를 갖는 제 1 및 제 2 펩티드 사슬에 의해 형성된 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다(VH는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부이고; VL은 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부이고; V1 및 V2는 서로 이량체를 형성할 수 있는 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부이고, C1 및 C2는 서로 이량체를 형성할 수 있는 면역수용체 신호전달 도메인, 예를 들어 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 T 세포 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 상기 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역의 일부이다). C1 및 C2가 각각 T 세포 수용체 사슬의 불변 영역일 경우, V1 및 C1은 바람직하게는 동일한 T 세포 수용체 사슬로부터의 것이고 V2 및 C2는 바람직하게는 동일한 T 세포 수용체 사슬로부터의 것이고, T 세포 수용체 사슬은 바람직하게는 동일한 T 세포 수용체로부터의 것이다. 특히, V1-C1은 일 구현예에서 T 세포 수용체 사슬(TCR 알파 또는 TCR 베타)의 서열에 본질적으로 상응하고 V2-C2는 상보적인 T 세포 수용체 사슬(V1-C1이 TCR 알파일 경우 TCR 베타 또는 V1-C1이 TCR 베타일 경우 TCR 알파)의 서열에 본질적으로 상응한다.
제 1 펩티드 사슬 제 2 펩티드 사슬
VH(1)-VL(2)-V1-C1 VL(1)-VH(2)-V2-C2
VH(1)-VH(2)-V1-C1 VL(1)-VL(2)-V2-C2
VH(1)-VH(2)-V1-C1 VL(2)-VL(1)-V2-C2
VH(1)-VL(2)-V1-C1 VH(2)-VL(1)-V2-C2
상기에서 정의된 바와 같이, 항원 수용체는 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 도메인(VH(1)), 제 1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변 도메인(VL(1)), 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 도메인(VH(2)), 및 제 2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변 도메인(VL(2))을 포함하며, 상기 제 1 및 제 2 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있고 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 일 구현예에서, VH(1)은 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, VH(2)는 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 반면, VH(1)은 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없고, VH(2)는 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없다. 그러나, 또 다른 구현예에서, VH(1)은 VL(1)뿐만 아니라 VL(2)와 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, VH(2)는 VL(2) 뿐만 아니라 VL(1)과 상호작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 후자의 구현예에서, VH(1) 및 VH(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역글로불린으로부터 유래한 것일 수 있고 VL(1) 및 VL(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역글로불린으로부터 유래한 것일 수 있다.
구체적인 구현예에서, 표 1에 열거된 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬의 V1 도메인 및 V2 도메인은 각각 T 세포 수용체 알파 및 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부이다. 구체적인 구현예에서, 표 1에 열거된 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬의 C1 도메인 및 C2 도메인은 각각 T 세포 수용체 알파 및 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부이다.
일 구현예에서, 표 1에 열거된 제 1 펩티드 사슬의 V1 도메인 및 C1 도메인은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 및 불변 영역 또는 이의 일부이다. 이러한 구현예에서, 표 1에 열거된 제 2 펩티드 사슬의 V2 도메인 및 C2 도메인은 바람직하게는 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 및 불변 영역 또는 이의 일부이다. 일 구현예에서, 표 1에 열거된 제 1 펩티드 사슬의 V1 도메인 및 C1 도메인은 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 및 불변 영역 또는 또는 이의 일부이다. 이러한 구현예에서, 표 1에 열거된 제 2 펩티드 사슬의 V2 도메인 및 C2 도메인은 바람직하게는 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 및 불변 영역 또는 또는 이의 일부이다.
바람직한 구현예에서, 한 펩티드 사슬상의 2개의 도메인이 모두 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이의 일부이고 다른 사슬상의 2개의 도메인이 모두 면역글로불린 경쇄 가변 영역 또는 이의 일부인 경우, 링커는 두 펩티드 사슬 모두의 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 존재한다. 링커는 길이가 10개 내지 25개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 15개의 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 링커는 5량체 아미노산 서열(Gly4Ser)의 3회 반복이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 하나 이상의 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부, 또는 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하는 것들과 같은 제 1 펩티드 사슬과 제 2 펩티드 사슬의 아미노산 서열은 포유류 기원, 바람직하게는 마우스 기원, 보다 바람직하게는 인간 기원의 것이다. 일 구현예에서, 아미노산 서열은 인간 기원의 것이지만, 인간 서열의 하나 이상의 아미노산을 마우스 서열의 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산으로 치환함으로써 뮤린화(murinized)되었다. 이러한 치환은 보다 큰 이량체화 또는 안정성 또는 항원 결합시 세포 내로 신호를 전달하는 능력을 제공할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 마우스 기원의 것이고 인간화 되었다.
본 발명에 따르면, 항원 수용체는 전술한 바와 같이 T 세포 수용체의 기능을 대체할 수 있고, 특히 전술한 바와 같이 세포용해 활성과 같은 반응성을 T 세포와 같은 세포에 부여할 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같은 항원 펩티드-MHC 복합체에 대한 T 세포 수용체의 결합과 대조적으로, 항원 수용체는 특정의 구현예에서, 특히 세포 표면에서 발현될 때 항원에 결합할 수 있다.
임의의 도메인 또는 링커를 포함하는 펩티드 사슬의 아미노산 서열은 변형될 수 있다. 예를 들어, 그리고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항체 및 T 세포 수용체의 가변 영역의 서열은 표적에 결합하는 능력을 상실하지 않고 변형될 수 있고 결과적으로 항원 결합 부위의 아미노산 서열은 이것이 표적에 결합하는 능력을 상실하지 않고 유사하게 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 부위를 형성하는 도메인의 아미노산 서열은 유래한 항체의 가변 영역과 동일하거나 매우 상동성일 수 있다. "매우 상동성"임으로서, 1 내지 5회, 바람직하게는 1 내지 4회, 예컨대 1 내지 3회 또는 1 또는 2회 치환이 이루어질 수 있음이 고려된다. 일 구현예에서, 펩티드 사슬은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 사슬은 단지 천연 아미노산만을 포함한다. "비천연 아미노산"이란 용어는 20개의 천연 아미노산 종과 상이한 구조를 가지는 아미노산을 의미한다. 비천연 아미노산은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖기 때문에, 비천연 아미노산은 특정 천연 아미노산의 유도체 또는 유사체로서 분류될 수 있다.
일 구현예에서, T 세포 수용체의 가변 영역 또는 이의 일부 중 하나 이상의 아미노산 서열, 특히 항원 결합 부위를 형성하지 않는 것들은 이의 항원에 대한 (잔류) 결합을 제거하기 위해 변형될 수 있다. 특히, 이러한 "침묵(silencing)" 변형은 TCR 알파 및/또는 TCR 베타의 가변 영역의 CDR3 내로 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 실시될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 설명된 항원 수용체 및 펩티드 사슬의 유도체를 포함한다. 본 발명에 따르면, "유도체"는 단백질 및 펩티드의 변형된 형태이다. 이러한 변형은 임의의 화학적 변형을 포함하고, 항원 수용체 또는 펩티드 사슬과 관련된 임의의 분자, 예컨대 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩티드의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 "유도체"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화, 지질화, 알킬화, 유도체화, 보호/차단기의 도입, 단백질 분해 또는 항원과의 결합으로부터 생성된 변형된 유사체를 포함한다. 상기 "유도체"란 용어는 또한 항원 수용체 및 펩티드 사슬의 모든 기능적 화학적 등가물까지 확장된다. 바람직하게는, 변형된 항원 수용체 또는 이의 펩티드 사슬은 증가된 결합 또는 이량체화 능력 및/또는 증가된 면역 활성화 능력을 갖는다.
본 발명의 항원 수용체 시스템과 관련하여 사용되는 세포는 바람직하게는 T 세포, 특히 세포독성 림프구이고, 바람직하게는 세포독성 T 세포, 자연 살해 세포(NK) 및 림포카인-활성화 살해(LAK) 세포로부터 선택된다. 활성화시, 이들 각각의 세포독성 림프구는 표적 세포의 파괴를 유발한다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 다음과 같은 방법 중 하나 또는 모두에 의해 표적 세포의 파괴를 유발한다. 첫째, 활성화시 T 세포는 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신과 같은 세포 독소를 방출한다. 퍼포린 및 그래뉼리신은 표적 세포에서 공극을 만들고 그랜자임은 세포로 들어가 세포의 아폽토시스(프로그램된 세포사멸)를 유도하는 세포질내의 카스파제 캐스캐이드를 촉발한다. 둘째, T 세포와 표적 세포 사이의 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 아폽토시스가 유도될 수 있다. 이종 세포 또는 동종 세포가 사용될 수 있으나, 세포독성 림프구는 바람직하게는 자가 세포일 것이다.
"면역글로불린"이란 용어는 면역글로불린 상과의 단백질, 바람직하게는 항체 또는 B 세포 수용체(BCR)와 같은 항원 수용체와 관련된다. 면역글로불린은 구조적 도메인, 즉 면역글로불린(Ig) 폴드를 가지는 면역글로불린 도메인을 특징으로 한다. 상기 용어는 가용성 면역글로불린 뿐만 아니라 막 결합형 면역글로불린도 포함한다. 막 결합형 면역글로불린은 표면 면역글로불린 또는 막 면역글로불린으로도 지칭되며, 일반적으로 BCR의 일부이다. 가용성 면역글로불린은 일반적으로 항체라고 지칭된다. 면역글로불린은 일반적으로 여러 사슬, 전형적으로 이황화 결합을 통해 연결되는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄을 포함한다. 이들 사슬은 주로 VL (가변 경쇄) 도메인, CL (불변 경쇄) 도메인 및 CH (불변 중쇄) 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4와 같은 면역글로불린 도메인으로 구성된다. 포유류 면역글로불린 중쇄의 5가지 유형, 즉 α, d, ε, g 및 μ 가 있으며, 이들은 상이한 종류의 항체, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 설명한다. 가용성 면역글로불린의 중쇄와는 대조적으로, 상기 막 또는 표면 면역글로불린의 중쇄는 막횡단 도메인 및 그들의 카복시-말단에 짧은 세포질 도메인을 포함한다. 포유류에는 2가지 유형의 경쇄, 즉 람다 및 카파가 있다. 면역글로불린 사슬은 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 영역은 면역글로불린의 상이한 이소형 내에서 필수적으로 보존되고, 가변 영역은 매우 다양하며 항원 인식을 설명한다.
"항체"란 용어는 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개 이상의 중쇄(H) 사슬 및 2개 이상의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. "항체"란 용어는 단클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은, 더욱 보전되고 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 다음의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전 보체계의 제 1 성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "단클론 항체"란 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 의미한다. 단클론 항체는 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 일 구현예에서, 단클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된 비인간 동물, 예를 들어 마우스로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본 명세서에서 사용된 "재조합 항체"란 용어는, (a) 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자 변형된 또는 트랜스염색체를 가진 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질 전환 된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은 재조합 수단들에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "인간 항체"란 용어는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 혹은 생체내의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
"인간화된 항체"란 용어는 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합 부위를 가지는 분자를 지칭하며, 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형일 수 있거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형, 예를 들어 인간 면역글로블린과 더 비슷하도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화된 마우스 항체)의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다. 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR을 가진다.
"키메라 항체"란 용어는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 일부분이 특정 종으로부터 유래하거나 특정 부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 상동성인 한편, 사슬의 나머지 절편은 다른 항체의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 의미한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 포유류의 한 종으로부터 유래한 항체의 가변 영역을 모방하는 한편, 불변 부분은 다른 종으로부터 유래한 항체의 서열과 상동성이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 분명한 이점은 가변 영역이 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래한 불변 영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터의 용이하게 이용가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유도할 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제조의 용이성을 갖고 특이성이 공급원에 의해 영향을 받지 않는다는 이점을 갖지만, 인간인 불변 영역은 항체가 주사되는 경우 비인간 공급원으로부터의 불변 영역보다 인간 객체로부터 면역 반응을 이끌어낼 확률이 낮다. 그러나 그 정의는 이러한 특정 예에 한정되지 않는다.
항체는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 및 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 상이한 종으로부터 유래할 수 있다.
본 명세서에서 설명된 항체는 IgA1 또는 IgA2와 같은 IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 포함한다. 다양일 구현예에서, 항체는 IgG1 항체, 보다 구체적으로 IgG1, 카파 또는 IgG1, 람다 이소타입 (즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체(예를 들어, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체(예를 들어, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체(예를 들어, IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체(예를 들어, IgG4, κ, λ)이다.
본 명세서에 기재된 항원 수용체는 하나 이상의 항체의 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 (또는 단순히 "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편"(또는 간단히 "결합 단편") 또는 유사한 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (iii) VH 및 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward 등, (1989) Nature 341 : 544-546), (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 임의로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv (scFv)로 알려짐, 예컨대 문헌[Bird 등 (1988) Science 242 : 423-426 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85 : 5879-5883] 참조)로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또 다른 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편을 온전한 항체에서와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝한다.
단일 사슬 가변 단편(scFv)은 링커 펩티드와 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 연결시키거나 그 반대로 연결시킬 수 있다. 2가(divalent 또는 bivalent) 단일-사슬 가변 단편(di-scFvs, bi-scFvs)은 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있다. 이것은 2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역을 가지는 단일 펩티드 사슬을 생성함으로써 수행될 수 있으며, 탠덤 scFv를 생성한다.
본 발명과 관련하여 "결합 도메인" 또는 간단히 "도메인"이란 용어는, 예를 들어, 임의로, 다른 도메인과 상호작용할 때 주어진 표적 구조/항원/에피토프와 결합/상호작용하는 항체의 구조를 특징짓는다. 따라서, 본 발명에 따른 이들 도메인은 "항원 결합 부위"를 나타낸다.
항체 및 항체의 유도체는 항체 단편과 같은 결합 도메인을 제공하는데, 특히 VL 및 VH 영역을 제공하는데 유용하다.
항원 수용체 내에 존재할 수 있는 항원에 대한 결합 도메인은 항원에 결합하는(표적화하는) 능력, 즉 항원에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 항원의 세포외 도메인 내에 위치한 에피토프에 결합하는(표적화하는) 능력을 가진다. 바람직하게는, 항원에 대한 결합 도메인은 그 항원에 특이적이다. 바람직하게는, 항원에 대한 결합 도메인은 세포 표면에서 발현되는 항원에 결합한다. 특히 바람직한 구현예에서, 항원에 대한 결합 도메인은 살아있는 세포의 표면에 존재하는 항원의 천연 에피토프에 결합한다.
본 발명의 목적을 위해 본 명세서에서 설명된 모든 항체 및 항체 단편과 같은 항체 유도체는 "항체"란 용어에 포함된다.
항체는 통상적인 단일클론 항체 방법론, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256 : 495 (1975)]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 원칙적으로 바람직하지만, 단일 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B-림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환 또는 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.
단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생성은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 알려져 있다. 융합 파트너(예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 역시 알려져 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 바람직한 동물 시스템은 래트 및 토끼 시스템이다(예를 들어 Spieker-Polet 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995) 및 Rossi 등, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005) 참조).
항체를 생성하기 위해, 마우스는 설명된 바와 같이 항원 서열, 즉 항체가 유도되는 서열, 재조합적으로 발현된 항원 또는 이의 단편 및/또는 항원을 발현하는 세포의 농축된 제제로부터 유래한 담체-접합된 펩티드로 면역화될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 면역화될 수 있다. 정제되거나 농축된 항원 제제를 사용하는 면역화가 항체를 초래하지 않는 경우, 마우스는 항원을 발현하는 세포, 예를 들어, 면역 반응을 촉잰하는 세포주로 면역화될 수 있다.
상기 면역 반응은 혈장 및 혈청 샘플을 꼬리 정맥 또는 안와후 출혈로부터 수득하는 면역 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있습니다. 면역글로불린의 충분한 역가를 가지는 마우스는 융합에 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장이 제거되기 3일 전에 특정 항체 분비 하이브리도마의 비율을 증가시키기 위해 항원 발현 세포로 복강내 또는 정맥내로 부스트(boost)될 수 있다.
단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포 및 림프절 세포가 단리되고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합될 수 있다. 생성된 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝될 수 있다. 그 후 개별 웰은 항체 분비 하이브리도마를 위한 ELISA로 스크리닝될 수 있다. 항원 발현 세포를 이용한 면역형광 및 FACS 분석을 통해 항원 특이성을 갖는 항체를 동정할 수 있다. 상기 항체 분비 하이브리도마는 재플레이팅하고 다시 스크리닝될 수 있으며, 여전히 단클론 항체에 대해 양성이라면 한계 희석에 의해 서브클로닝될 수 있다. 안정한 서브클론은 특성규명을 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성하도록 시험관내에서 배양될 수 있다.
항원 및 다른 결합제가 항원에 결합하는 능력은 표준 결합 분석(예를 들어, ELISA, 웨스턴블롯, 면역형광 및 유세포계측 분석)을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "결합"이란 용어는 바람직하게는 특이적 결합과 관련된다.
본 발명에 따르면, 항원 수용체와 같은 제제는 소정의 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지는 경우 상기 소정의 표적에 결합(표적화)될 수 있으며, 표준 분석에서 상기 소정의 표적에 결합한다. "친화도" 또는 "결합 친화도"란 용어는 종종 평형 해리 상수(KD)로 측정된다. 바람직하게는, "유의적인 친화도"란 용어는 10-5M 이하, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하 또는 10-12M 이하의 해리 상수(KD)를 가지는 소정의 표적에 대한 결합을 의미한다.
제제는 상기 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않는 경우 표적에 대해 (실질적으로) 결합(표적화)할 수 없으며, 표준 분석에서 유의적으로 결합하지 않으며, 특히 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제는 2 ㎍/ml, 바람직하게는 10 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 20 ㎍/ml, 특히 50 또는 100 ㎍/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하는 경우 상기 표적에 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제는 제제가 결합할 수 있는 소정의 표적에 결합하기 위한 KD 보다 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배 또는 106배 이상의 KD로 상기 표적에 결합하는 경우 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않는다. 예를 들어, 제제가 결합할 수 있는 표적에 대한 제제의 결합에 대한 KD가 10-7M인 경우, 제제가 유의한 친화도를 가지지 않는 표적에 대한 결합에 대한 KD는 적어도 10-6 M, 10-5M, 10-4M, 10-3M, 10-2M 또는 10-1M일 수 있다.
제제가 소정의 표적에 결합할 수 있는 한편 다른 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없는 경우, 즉 다른 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않고 표준 분석에서 다른 표적에 유의적으로 결합하지 않는 경우, 제제는 상기 소정의 표적에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 제제가 이러한 다른 표적에 결합하기 대한 친화도 및 결합이 소 혈청 알부민(BSA), 카세인 또는 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 소정의 표적과 무관한 단백질에 대한 친화도 또는 결합을 유의적으로 초과하지 않는 경우, 제제는 소정의 표적에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 제제가 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD보다 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배 또는 106배 이하의 KD로 상기 표적에 결합하는 경우, 제제는 소정의 표적에 대해 특이적이다. 예를 들어, 특이적인 표적에 제제가 결합하기 위한 KD가 10-7M인 경우, 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD는 적어도 10-6M, 10-5 M, 10-4M, 10-3M, 10-2M 또는 10-1M이다.
제제의 표적에 대한 결합은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 문헌[Berzofsky 등, "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)] 및 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 친화도는 통상적인 기술, 예컨대 평형화 투석을 통해; BIAcore 2000 기기를 사용하여; 제조자가 설명한 일반적인 절차를 사용하여; 방사선 표지된 표적 항원을 사용하는 방사면역검정법에 의해; 또는 숙련된 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는, 예를 들어 문헌[Scatchard 등, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)]에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있다. 측정된 특정 항체-항원 상호작용의 친화도는 상이한 조건, 예를 들어 염 농도, pH 하에서 측정되는 경우 변할 수 있다. 따라서, 친화도의 측정 및 KD, IC50와 같은 다른 항원-결합 매개변수는 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 완충액으로 만들어진다.
본 발명은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 T 세포와 같은 세포 내로 항원 수용체를 암호화하는 핵산의 도입, 즉 형질감염을 포함할 수 있다.
본 발명의 목적상, "형질감염(transfection)" 이란 용어는 핵산의 세포 내로의 도입 또는 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 상기 세포는 객체, 예를 들어 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본 명세서에서 설명된 핵산의 형질감염을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있으며, 예를 들어 상기 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 형질감염의 몇몇 적용의 경우, 형질감염된 유전 물질이 일시적으로만 발현되는 것으로 충분하다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 대개 핵 게놈에 통합되지 않기 때문에, 상기 외래 핵산은 체세포 분열을 통해 희석되거나 분해된다. 핵산의 에피솜 증폭을 허용하는 세포는 희석율을 크게 감소시킨다. 형질감염된 핵산이 실제로 세포 및 이의 딸세포의 게놈에 남아있는 것이 바람직한 경우, 안정적인 형질감염이 일어나야 한다. RNA는 암호화된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포 내로 형질감염될 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포 내로 핵산을 도입, 즉 전달 또는 형질감염시키는데 유용한 임의의 기술이 사용될 수 있다. 바람직하게는, RNA와 같은 핵산은 표준 기술에 의해 세포 내로 형질감염된다. 이러한 기술은 전기천공(electroporation), 리포펙션 및 마이크로인젝션을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에서, RNA는 전기천공법에 의해 세포 내로 도입된다. 전기천공(electroporation 또는 electropermeabilization)은 외부에서 인가된 전기장에 의해 야기되는 세포 원형질막의 전기 전도도 및 투과도의 현저한 증가와 관련된다. 이는 일반적으로 분자생물학에서 세포 내로 물질을 도입하는 방법으로 사용된다. 본 발명에 따르면, 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 핵산의 세포로의 도입이 상기 단백질 또는 펩티드의 발현을 초래하는 것이 바람직하다.
비-바이러스-기반 DNA 형질감염, 트랜스포존-기반 시스템 및 바이러스-기반 시스템을 포함하여 T 세포에 항원 수용체 컨스트럭트를 도입하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 비-바이러스-기반 DNA 형질감염은 삽입 돌연변이유발의 위험이 낮다. 트랜스포존-기반 시스템은 통합 요소를 함유하지 않는 플라스미드보다 전이유전자를 효율적으로 통합시킬 수 있다. 바이러스-기반 시스템은 γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 사용을 포함한다. γ-레트로바이러스는 상대적으로 생산하기 쉽고, 효율적이고 영구적으로 T 세포를 형질도입하며, 1차 인간 T 세포의 통합 관점에서 안전성이 이미 입증되었다. 렌티바이러스 벡터는 또한 효율적이고 영구적으로 T 세포를 형질도입시키지만 제조 비용이 더 비싸다. 이들은 또한 레트로바이러스 기반 시스템보다 잠재적으로 더 안전하다.
생체내에서 세포의 형질감염을 위해, 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 약학적 조성물이 사용될 수 있다. 핵산을 T 세포와 같은 특정 세포로 표적화하는 운반체는 환자에게 투여되어, 생체내에서 일어나는 형질감염을 일으킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 나형(naked form) 또는 담체 중에서 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용이 고려되는 지질 담체와 같은 담체는 RNA와 같은 핵산이 예를 들어, 핵산과 복합체를 형성하거나 또는 핵산이 봉입되거나 캡슐화된 소포를 형성함으로써 회합될 수 있는 임의의 물질 또는 운반체를 포함한다. 이것은 나형 핵산에 비해 핵산의 안정성을 증가시킬 수 있다. 특히, 혈중의 핵산의 안정성이 증가될 수 있다. 예를 들어, RNA 및 리포솜으로부터의 리포플렉스(lipoplexes)와 같은 정의된 입자 크기를 가지는 나노입자 RNA 제형, 예를 들어 DOTMA 및 DOPE 또는 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하는 리포플렉스가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "나노입자"란 용어는 일반적으로 직경이 1000 나노 미터 (nm) 미만인, 특히 핵산의 전신 투여, 특히 비경구 투여에 적합한 입자를 만드는 직경을 가지는 임의의 입자를 의미한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 600 nm 미만의 직경을 가진다. 일부 구현예에서, 나노입자는 400 nm 미만의 직경을 가진다.
본 명세서에서 사용된 "나노입자 제제"란 용어 또는 유사한 용어는 적어도 하나의 나노입자를 함유하는 임의의 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 나노입자 조성물은 나노입자의 균일한 집합체이다. 일부 구현예에서, 나노입자 조성물은 분산액 또는 유화액이다. 일반적으로, 적어도 2종의 비혼화성 물질이 혼합될 때 분산액 또는 유화액이 형성된다.
"리포플렉스" 또는 "핵산 리포플렉스", 특히 "RNA 리포플렉스"란 용어는 지질과 핵산, 특히 RNA의 복합체를 지칭한다. 리포플렉스는 종종 중성의 "헬퍼" 지질을 포함하는 양이온성 리포솜이 핵산과 혼합될 때 자발적으로 형성된다.
양이온성 지질, 양이온성 중합체 및 양전하를 가지는 다른 물질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 이들 양이온성 분자는 핵산을 착체화시키는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 이른바 각각 리포플렉스 또는 폴리플렉스로 불리는 것을 형성하고, 이들 복합체는 핵산을 세포 내로 운반하는 것으로 나타났다.
본 발명에서 사용하기 위한 나노입자 핵산 제제는 다양한 프로토콜에 의해 다양한 핵산 착물 화합물로부터 수득될 수 있다. 지질, 중합체, 올리고머 또는 양친매성 물질은 전형적인 착물 형성 제제이다. 일 구현예에서, 상기 착물 화합물은 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌 또는 히스톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함한다.
본 발명에 따르면, 프로타민은 양이온 담체 제제로서 유용하다. "프로타민"이란 용어는 아르기닌이 풍부하고 다양한 동물(특히 어류)의 정자 세포에서 체성 히스톤 대신에 DNA와 회합된 비교적 작은 분자량의 임의의 다양한 강염기성 단백질을 의미한다. 특히, "프로타민"이란 용어는 강염기성이며, 물에 용해되고, 열에 의해 응고되지 않으며, 가수분해시 주로 아르기닌을 생성하는 어류의 정자에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 정제된 형태로, 이들은 인슐린의 지속성 제형에서 및 헤파린의 항응고 효과를 중화시키는 데 사용된다.
본 발명에 따르면, 본 명세서에서 사용되는 "프로타민"이란 용어는 공급원의 단편과 아미노산 서열 또는 이의 단편의 다량체 형태를 포함하는 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 수득되거나 유래한 임의의 프로타민 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 인공적이며 특정 목적을 위해 특별히 설계되고 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 없는 (합성된) 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 프로타민은 황산염 프로타민 또는 염산염 프로타민일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 설명된 나노입자의 제조에 사용되는 프로타민 공급원은 등장성 염 용액 중에서 프로타민을 10 mg/ml (㎖당 5000 헤파린-중화 단위) 이상 함유하는 프로타민 5000이다.
리포솜은 종종 인지질 등 소포 형성 지질의 하나 이상의 이중층을 가지는 미세한 지질 소포이며 약물을 캡슐화할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 다중층 소포(MLV), 소형 단일층 소포(SUV), 대형 단일층 소포(LUV), 입체적으로 안정화된 리포솜 (SSL), 다발성 소포체 소포(MV) 및 대형 다발성 소포(LMV)뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 이중층 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 유형의 리포솜이 사용될 수 있다. 리포솜의 크기 및 층상도는 제조 방법에 좌우되며, 사용되는 소포의 유형의 선택은 바람직한 투여 방식에 좌우될 것이다. 지질이 수용성 매질에 존재할 수 있는 층상, 육각형 및 역상육각형상, 입방형상, 미셀, 단층으로 구성된 역 미셀을 포함하는 다른 여러 형태의 초분자 조직이 있다. 이들 상은 DNA 또는 RNA와의 조합에서 또한 수득될 수 있으며, RNA 및 DNA와의 상호작용은 실질적으로 상의 상태에 영향을 줄 수 있다. 상기 기재된 상은 본 발명의 나노입자 핵산 제제에 존재할 수 있다.
핵산 및 리포솜으로부터 핵산 리포플렉스를 형성하기 위해, 예상되는 핵산 리포플렉스를 제공하는 한, 리포솜을 형성하는 어떠한 적절한 방법이라도 사용될 수 있다. 리포솜은 역증발법(REV), 에탄올 주입법, 탈수-재수화법 (DRV), 초음파처리 또는 다른 적절한 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다.
리포솜 형성 후, 실질적으로 균질한 크기 범위를 가지는 리포솜 집단을 수득하도록 리포솜의 크기 조정될 수 있다.
이중층-형성 지질은 전형적으로 2개의 탄화수소 사슬, 특히 아실 사슬, 및 극성 또는 비극성의 헤드기(head group)를 가진다. 이중층-형성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고미엘린과 같은 인지질을 포함하는 천연 발생 지질 또는 합성 기원으로 구성되며, 여기서 2개의 탄화수소 사슬은 길이가 전형적으로 약 14개 내지 22개의 탄소 원자이고, 다양한 불포화도를 가진다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 다른 적합한 지질은 리포솜에도 사용될 수 있는 당지질 및 콜레스테롤 및 이의 다양한 유사체와 같은 스테롤을 포함한다.
양이온성 지질은 전형적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 부분을 가지며, 전반적으로 순 양전하를 가진다. 상기 지질의 헤드기는 전형적으로 양전하를 띠고 있다. 상기 양이온성 지질은 바람직하게는 1 내지 10가의 양전하, 더욱 바람직하게는 1 내지 3가의 양전하, 및 더욱 바람직하게는 1가의 양전하를 가진다. 양이온성 지질의 예는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA), 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP), 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 디옥타데실디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 1,2-디미리스토일옥시프로필-1,3-디메틸히드록시에틸 암모늄(DMRIE) 및 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스페린 카복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판 트리플루오르아세테이트(DOSPA)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. DOTMA가 가장 바람직하다.
또한, 본 명세서에 기재된 나노입자는 구조 안정성과 같은 관점에서 중성 지질을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 중성 지질은 핵산-지질 복합체의 전달 효율의 관점에서 적절하게 선택될 수 있다. 상기 중성 지질의 예시로는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디올레오일-Sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 디아실포스파티딜 콜린, 디아실포스파티딜 에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 스테롤 및 세레브로시드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. DOPE 및/또는 DOPC가 바람직하다. DOPE가 가장 바람직하다. 양이온성 리포솜이 양이온성 지질 및 중성 지질을 모두 포함하는 경우, 양이온성 지질과 중성 지질의 몰 비는 리포솜의 안정성 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 명세서에서 설명된 나노입자는 인지질을 포함할 수 있다. 상기 인지질은 글리세로인지질일 수 있다. 글리세로인지질의 예는 3가지 유형의 지질, 즉 (i) 예를 들어 포스파티딜콜린 (PC), 난황 포스파티딜콜린, 부분적으로 수소화되거나 완전히 수소화된 형태의 자연계 대두-유래 PC, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 스핑고미엘린(SM)을 포함하는 양성이온성 인지질, (ii) 음으로 하전된 인지질, 즉 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨 (PI), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG) 디팔미포일 PG, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG)을 포함하는 음전하로 하전된 인지질, 접합체가 메톡시-폴리에틸렌,글리콜-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(mPEG-DSPE)의 경우와 같이 음으로 하전된 양성이온성 인지질을 제공하는 합성 유도체 및 (iii) 예를 들어, 포스포모노에스테르가 O-메틸화되어 양이온성 지질을 형성하는 포스파티딜콜린 또는 스핑고미엘린을 포함하는 양이온성 인지질을 포함하나, 이들에 한정되지는 않는다.
지질 담체에 대한 핵산의 회합은, 예를 들어 담체가 물리적으로 핵산을 포획하도록 담체의 간질 공간을 채우는 핵산에 의해, 또는 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합에 의해, 또는 비-특이적 결합에 의한 흡착에 의해 발생할 수 있다. 회합 형태가 무엇이든, 핵산은 이의 치료학적, 즉 암호화 특성을 유지해야 한다.
본 발명에 따르면, 한 구현예에서 항원 수용체를 암호화하는 상기 핵산은 RNA, 바람직하게는 mRNA이다. 상기 RNA는 바람직하게는 시험관내 전사에 의해 수득된다.
본 명세서에 사용된 "핵산"이란 용어는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자와 같은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA가 포함된다. 본 발명에 따르면, 핵산은 바람직하게는 단리된 핵산이다.
핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 세균 인공 염색체(BAC)와 같은 인공 염색체 벡터, 효모 인공 염색체(YAC) 또는 P1 인공 염색체(PAC)를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 클로닝 벡터 뿐만 아니라 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 바이러스 벡터 뿐만 아니라 플라스미드를 포함하고, 일반적으로 특정 숙주 생물(예를 들어, 세균, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류) 내에서 또는 시험관내 발현 시스템 내에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 원하는 암호화 서열 및 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 특정 원하는 DNA 단편을 조작하고 증폭시키는데 사용되며, 원하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능 서열이 결여될 수 있다.
본 발명의 문맥상, "RNA"란 용어는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 리보뉴클레오티드 잔기로 전적으로 또는 실질적으로 구성된 분자와 관련된다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 하이드록시기를 가지는 뉴클레오티드와 관련된다. 상기 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 정제된 단리된 RNA, 실질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 조작된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서 예컨대 RNA의 말단(들) 또는 내부적으로, 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 이러한 변형된 RNA는 유사체 또는 천연 발생 RNA의 유사체라고 지칭될 수 있다.
본 발명에 따르면, "RNA"란 용어는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함하고 바람직하게는 관련이 있고, DNA를 주형으로서 사용하여 생산될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 "전사체"와 관련된다. mRNA는 전형적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 암호화 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포내 및 시험관내에서 제한된 반감기를 가진다. 바람직하게는, mRNA는 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 수득된다. 상기 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 다양한 시험관내 전사 키트가 존재한다.
본 발명의 일 구현예에서, RNA는 자가-복제 RNA, 예컨대 단일 가닥 자가-복제 RNA이다. 일 구현예에서, 상기 자가-복제 RNA는 양성 센스의 단일 가닥 RNA이다. 일 구현예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 RNA 또는 바이러스 RNA로부터 유래한 RNA이다. 일 구현예에서, 상기 자가-복제 RNA는 알파 바이러스 게놈 RNA이거나 알파 바이러스 게놈 RNA로부터 유래한다. 일 구현예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 유전자 발현 벡터이다. 일 구현예에서, 상기 바이러스는 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki forest virus)이다. 일 구현예에서, 자가-복제 RNA는 본 명세서에 기재된 제제를 암호화하는 적어도 하나의 전이유전자 하나 이상의 전이유전자를 함유한다. 일 구현예에서, RNA가 바이러스 RNA이거나 바이러스 RNA로부터 유래한 경우, 전이유전자는 바이러스 서열, 예컨대 구조 단백질을 암호화하는 바이러스 서열을 부분적으로 또는 완전히 대체할 수 있다. 일 구현예에서, 자가-복제 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
본 발명에 따라 사용된 RNA의 발현 및/또는 안정성을 증가시키기 위해, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않으면서 이를 변형시킬 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 RNA의 문맥상 "변형"이란 용어는 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 가지지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 포스파타아제로 RNA를 처리함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 RNA는 이의 안정성을 증가시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 천연 발생 또는 합성된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘을 대체한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 상기 RNA에서 슈도우리딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘을 대체한다.
일 구현예에서, "변형"이란 용어는 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 가지는 RNA를 제공하는 것과 관련된다. "5'-캡"이란 용어는 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며 일반적으로 비통상적 5'에서 5' 삼인산 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 구현예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. "통상적인 5'-캡"이란 용어는 천연 발생 RNA 5'-캡을 의미하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 의미한다. 본 발명의 문맥상, "5'-캡"이란 용어는 RNA 캡 구조와 유사한 5'-캡 유사체를 포함하고, 바람직하게는 생체내 및/또는 세포 내에서 이에 부착된 경우 RNA를 안정화시키는 능력을 보유하도록 변형된다.
5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 가지는 RNA의 제공은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공동전사되어 통합되거나 예를 들어, 시험관내 전사를 통해 RNA가 생성될 수 있고, 상기 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어 우두 바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다.
상기 RNA는 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가적인 변형은 천연 발생 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절두, 또는 상기 RNA의 암호화 영역과 무관한 UTR의 삽입과 같은 5'- 또는 3'-비번역 영역(UTR)의 변경, 예를 들어, 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더욱 바람직하게는 인간 베타-글로빈과 같은 글로빈 유전자로부터 유래한 하나 이상, 바람직하게는 두 복제본의 3'-UTR의 삽입일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 사용된 상기 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위하여, 바람직하게는 길이가 10개 내지 500개, 더욱 바람직하게는 30개 내지 300개, 더욱 바람직하게는 65개 내지 200개 및 특히 100개 내지 150개 아데노신 잔기를 가지는 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 폴리-A 서열은 길이가 약 120개 아데노신 잔기이다. 또한, 2개 이상의 3'-비번역 영역(UTR)을 RNA 분자의 3'-비번역 영역에 통합하면 번역 효율이 향상될 수 있다. 특정한 일 구현예에서, 3'-UTR은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래한다.
RNA의 "안정성"이란 용어는 RNA의 "반감기"와 관련된다. "반감기"는 분자의 활동, 양 또는 수의 절반을 제거하는데 필요한 시간을 의미한다. 본 발명의 문맥상, RNA의 반감기는 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속 시간"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA가 장시간 발현될 것으로 예상될 수 있다.
본 발명의 문맥상, "전사"란 용어는 DNA 서열 내의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정과 관련된다. 이어서, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, "전사"란 용어는 "시험관내 전사"를 포함하며, "시험관내 전사"란 용어는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내에서 합성되는 과정과 관련된다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로서 지정되며, 본 발명에 따 "벡터"란 용어에 포함된다.
본 발명에 따른 "번역"이란 용어는 메신저 RNA의 가닥이 펩티드 또는 단백질을 만들기 위해 아미노산 서열의 조립을 지시하는 세포의 리보솜에서의 과정과 관련된다.
본 발명에 따르면, 핵산은 단독으로 또는 상동성 또는 이종성일 수 있는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 핵산에 대해 상동성 또는 이종성일 수 있는 발현 조절 서열과 기능적으로 연결된다. "상동성"이란 용어는 핵산이 또한 자연적으로 기능적으로 연결되어 있음을 의미하며, "이종성"이란 용어는 핵산이 자연적으로 기능적으로 연결되어 있지 않다는 것을 의미한다.
핵산 및 발현 조절 서열은 상기 핵산의 발현 또는 전사가 상기 발현 조절 서열의 조절하에 또는 영향하에 있는 방식으로 서로 공유 결합되어 있는 경우 서로 "기능적으로" 연결된다. 상기 핵산이 기능성 단백질로 번역될 경우, 암호화 서열에 기능적으로 연결된 발현 조절 서열과 함께, 상기 발현 조절 서열의 유도는 암호화 서열에서의 프레임 시프트를 야기하지 않으면서 상기 핵산의 전사를 초래하거나 상기 암호화 서열은 원하는 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 없다.
"발현 조절 서열" 또는 "발현 조절 요소"란 용어는 본 발명에 따라 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 다른 조절 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 발현 조절 서열은 조절될 수 있다. 상기 발현 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 각각 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비 전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성 서열을 포함할 수 있다.
"발현"이란 용어는 가장 일반적인 의미로 본 발명에서 사용되며, 예를 들어 전사 및/또는 번역에 의한 RNA 및/또는 펩티드 또는 단백질의 생산을 포함한다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이란 용어는 특히 펩티드 또는 단백질의 생산과 관련된다. 이는 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 게다가, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 본 발명에 따르면, 발현이란 용어는 또한 "이상 발현" 또는 "비정상적 발현"을 포함한다.
"이상 발현" 또는 "비정상적 발현"은 본 발명에 따라, 발현이 기준, 예를 들어 종양 항원과 같은 특정 단백질의 이상 또는 비정상적 발현과 관련된 질환이 없는 객체의 상태와 비교해 변경된, 바람직하게는 증가한 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 일 구현예에서, 발현은 질환 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
"특이적으로 발현되는"이란 용어는 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 위 점막에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 위 점막에서 주로 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 다른 조직 또는 기관 유형에서 현저히 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 위 점막의 세포에서 독점적으로 발현되고 다른 임의의 조직, 예컨대 고환에서 현저히 적게 발현되는 단백질은 위 점막의 세포에서 특이적으로 발현된다. 몇몇 구현예에서, 종양 항원은 또한 2가지 또는 3가지 조직 유형 또는 기관과 같은 하나 이상의 조직 유형 또는 기관에서 정상 조건 하에 특이적으로 발현될 수 있지만, 3가지 이하의 조직 또는 기관 유형에서 특이적으로 발현될 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 상기 종양 항원은 이들 기관에서 특이적으로 발현된다. 예를 들어, 바람직하게는 종양 항원이 정상 조건 하에 폐 및 위장에서 거의 동등한 정도로 발현되는 경우, 상기 종양 항원은 폐 및 위장에서 특이적으로 발현된다.
본 발명에 따르면, "핵산 암호화"란 용어는 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우 핵산이 암호화하는 단백질 또는 펩티드를 생산하도록 발현될 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 "펩티드"란 용어는 올리고- 및 폴리펩티드를 포함하고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합되는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 21개 이상 및 바람직하게는 최대 8개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개, 특히 100개의 아미노산을 포함하는 물질을 의미한다. "단백질"이란 용어는 큰 펩티드, 바람직하게는 100개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 "펩티드", "펩티드 사슬" 및 "단백질"이란 용어는 동의어이며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 명세서에서 설명된 펩티드 사슬 및 항원 수용체의 아미노산 서열은 상기 아미노산 서열의 변이체를 수득하도록 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 단백질 서열의 변이체를 포함하며, 상기 서열과 기능적으로 동등한 서열을 생성하는 천연 발생 아미노산 서열의 변이체, 예를 들어 상기 서열의 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 특성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 중요한 특성은 항원 수용체의 표적에 대한 결합 또는 항원 결합 신호의 T 세포와 같은 세포로의 전달을 유지하는 것이다. 일 구현예에서, 변이체 분자 또는 서열은 이의 모체 분자 또는 서열과 면역학적으로 동등하다.
본 발명에 따른 "변이체"란 용어는 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 입체형태 변이체(conformation), 이소형(isoform), 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 천연적으로 존재하는 것들을 지칭한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열의 변경에 관한 것이고, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 소정의 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 동정한다. 종 상동체는 소정의 핵산 또는 아미노산 서열과는 상이한 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. "변이체"란 용어는 임의의 번역 후 변형된 변이체 및 입체형태 변이체를 포함한다.
"면역학적으로 동등한"이란 용어는 면역학적으로 동등한 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 동등한 분자가 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고/내거나 동일하거나 본질적으로 동일한 면역학적 효과, 예를 들어 면역학적 효과의 유형에 관한 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥상, "면역학적으로 동등한"이란 용어는 바람직하게는 요법에 사용되는 항원 수용체의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 사용된다.
특히 CDR 서열, 초가변 및 가변 영역의 서열이 표적에 결합하는 능력을 상실하지 않고 조작될 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 모체 항체 영역과 동일하거나 매우 상동성일 수 있다. "매우 상동성"으로 인해 1개 내지 5회, 바람직하게는 1개 내지 4회, 예컨대 1개 내지 3회 또는 1개 또는 2회의 치환이 CDR에서 이루어질 수 있다고 생각된다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서의 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절두 변이체로도 불린다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 가지는 아미노산 서열 변이체의 경우, 결과 생성물의 적절한 스크리닝을 통한 무작위 삽입도 가능하지만, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열 내의 특정 부위에 삽입된다.
아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시- 말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 제거와 같은 서열로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거를 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것이 특징이다. 상동성 단백질 또는 펩티드 사이에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 변형을 가하는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산 계열 중 하나의 치환을 포함한다. 천연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 계열, 즉 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 비하전된 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 기준 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 부여된다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개의 아미노산, 바람직하게는 연속적 아미노산에 대해 부여된다. 바람직한 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 부여된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계 공지된 도구를 사용하여, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어 Align을 사용하여, 표준 정렬, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하여 실시할 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 퍼센트를 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이의 동일한 아미노산의 퍼센트를 나타낸다.
"퍼센트 동일성"이란 용어는 최상의 정렬 후에 수득된 비교될 두 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 퍼센트를 나타내며, 이 퍼센트는 순전히 통계적이며, 두 서열 간의 차이는 무작위로 그 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬시킨 후 이들 서열을 비교함으로써 실시하며, 상기 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 동정하고 비교하기 위해 영역별로 또는 "비교 윈도우"를 통해 실시한다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 수동에 의한 것 외에도, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소 상동 알고리즘을 사용하여, 문헌[Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소 상동성 알고리즘을 사용하여, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색 방법을 사용하여 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 사용하여 생성할 수 있다.
퍼센트 동일성은 비교될 두 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 사이의 퍼센트 동일성을 수득함으로써 계산된다.
상동 아미노산 서열은 본 발명에 따라 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 잔기의 동일성을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 변이체, 단편, 부분, 일부 또는 유도체는 바람직하게는 각각 이들이 유래한 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 기능적 특성을 가지며, 즉 기능적으로 동일하다. 일 구현예에서, 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 변이체, 단편, 부분, 일부 또는 유도체는 각각 이들이 유래한 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질과 기능적으로 동등하고, 예컨대 면역학적으로 동등하다. 일 구현예에서, 기능적 특성은 항원에 결합하거나 세포 내에서 결합 신호를 전달하는 특성이다.
"유래한"이란 용어는 본 발명에 따라 특정 실체, 특히 특정 서열이 이것이 유래한 대상, 특히 유기체 또는 분자에 존재하는 것을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특정 서열 영역의 경우에, "유래한"은 특히 관련 아미노산 서열이 이것이 존재하는 아미노산 서열로부터 유래한 것을 의미한다.
"세포" 또는 "숙주 세포"란 용어는 바람직하게는 온전한 세포, 즉 효소, 세포 기관 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않는 온전한 막을 가지는 세포와 관련된다. 온전한 세포는 바람직하게는 생존 가능한 세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 바람직하게는 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 형질감염될 수 있는 임의의 세포와 관련된다. 바람직하게는, 외인성 핵산으로 형질감염되고 수용자에게 전달될 때, 상기 세포는 수용자에서 핵산을 발현할 수 있다. "세포"란 용어는 세균 세포를 포함하고; 다른 유용한 세포는 효모 세포, 진균 세포 또는 포유류 세포이다. 적절한 세균 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 그람-음성 세균 균주 및 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 락토코커스(Lactococcus)와 같은 그람-양성 세균 균주의 세포를 포함한다. 적절한 진균 세포는 트리코더마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 종의 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)(예를 들어 스키조 사카로마이세스 품베(Schizo saccharomyces pombe)), 피치아(Pichia)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피치아 메탄올리치(Pichia methanolicd)), 한세뉼라(Hansenula) 종의 세포를 포함한다. 적절한 포유류 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, 293 HEK 등을 포함한다. 그러나 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 이종 단백질의 발현을 위해 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포도 역시 사용될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류의 세포와 같은 포유류 세포가 입양 전달을 위해 특히 바람직하다. 상기 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래할 수 있으며, 면역계의 세포, 특히 수지상 세포 및 T 세포와 같은 항원 제시 세포, 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포 및 기타 세포 유형과 같은 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기에 특히 바람직한 세포는 면역반응성 또는 면역 이펙터 세포, 특히 T 세포이다.
핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 핵산에 의해 암호화되는 펩티드 또는 단백질을 발현한다.
"클론 확장" 또는 "확장"이란 용어는 특정 개체가 증식하는 과정을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 상기 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되고 증식하여 상기 항원을 인식하는 특이적 림프구가 증폭되는 면역 반응의 문맥에서 사용된다. 바람직하게는, 클론 확장은 림프구의 분화를 유도한다. "초회감작"이란 용어는 T 세포가 이의 특이적 항원과의 첫 번째 접촉을 가지고 이펙터 T 세포로의 분화를 일으키는 과정을 의미한다.
본 명세서에 기재된 핵산, 펩티드 사슬 또는 항원 수용체, 또는 세포와 같은 분자는 재조합체이고/이거나 단리될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "단리된"이란 용어는 다른 세포 물질과 같은 다른 분자가 실질적으로 존재하지 않는 실체를 의미한다. "단리된"이란 용어는 바람직하게는 단리된 실체가 자연 환경으로부터 분리되어 있는 것을 의미한다. 단리된 실체는 실질적으로 정제된 상태일 수 있다. "실질적으로 정제된"이란 용어는 실체가 자연에서 또는 생체내에서 관련된 다른 물질을 본질적으로 함유하지 않은 것을 의미한다.
본 발명의 문맥상 "재조합"이란 용어는 "유전공학을 통해 제조된"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 재조합 세포와 같은 "재조합 물체"는 천연 발생적이지 않다.
본 명세서에 사용된 "천연 발생"이란 용어는 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 실질적으로 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩티드 또는 핵산은 천연 발생적이다.
"자가"란 용어는 동일한 객체로부터 유래한 임의의 것을 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 객체로부터 유래한 조직 또는 기관의 이식을 의미한다. 이러한 절차는 그 외의 경우에 거부 반응을 일으키는 면역 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.
"동종이계"란 용어는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래한 임의의 것을 설명하는 데 사용된다. 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체는 서로 동종이계라고 한다.
"동계"란 용어는 동일한 유전형을 갖는 개체 또는 조직, 즉 일란성 쌍생아 또는 동일한 동계교배계의 동물 또는 이들의 조직으로부터 유래한 임의의 것을 설명하는 데 사용된다.
"이종"이란 용어는 다수의 상이한 요소들로 구성된 어떤 것을 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 한 개체의 골수를 다른 개체로 이식하는 것은 이종 이식을 구성한다. 이종 유전자는 객체 이외의 공급원으로부터 유래한 유전자이다.
본 명세서에서 사용된 "감소시키다" 또는 "억제하다"는 전반적인 감소를 일으키는 능력, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 수준으로 감소시키는 능력을 의미한다. "억제" 또는 이와 유사한 문구는 완전한 또는 실질적으로 완전한 억제, 즉 0 또는 실질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가시키다" 또는 "향상시키다"와 같은 용어는 바람직하게는 약 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80% 및 가장 바람직하게는 적어도 100%의 증가 또는 향상과 관련된다.
본 발명의 항원 수용체는 질환-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 실질적으로 표적화하도록 조작될 수 있기 때문에, 본 발명의 항원 수용체는 광범위한 치료학적 용도를 가진다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체, 이의 펩티드 사슬, 이를 암호화하는 핵산 및 기타 관련 분자의 치료 및 예방 방법에서의 용도에 관한 것이다. 이러한 용도 중 하나는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있는 항원-특이적 면역 세포의 생산에 사용되며, 상기 질환은 본 발명의 면역 세포에서 발현되는 항원 수용체에 의해 결합될 수 있는 하나 이상의 항원의 발현을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 질환은 암이다. 또한, 본 발명의 항원 수용체 및 관련 분자는 소정의 항원이 발현되는 질환에 대한 면역화 또는 백신접종에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 소정의 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 박멸하는데 사용될 수도 있으며, 상기 항원은 본 발명의 항원 수용체의 적어도 하나의 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 질환을 치료 또는 예방하는 방법은 본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 핵산의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 이 단계에서 항원 수용체의 적어도 하나의 항원 결합 부위는 치료 또는 예방될 질환(예를 들어, 바이러스 또는 종양 항원)과 관련된 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 질환을 치료 또는 예방하는 방법은 재조합 면역 이펙터 세포 또는 상기 면역 이펙터 세포의 확장된 집단의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역 이펙터 세포 또는 세포 집단은 본 발명의 항원 수용체를 재조합적으로 발현하고, 이 단계에서 상기 항원 수용체의 하나 이상의 항원 결합 부위는 치료 또는 예방될 질환과 관련된 항원에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 질환은 암이고 항원은 종양 관련 항원이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 특이적 항원 또는 특이적 항원을 발현하는 질환-유발 유기체와 관련된 질환에 대해 면역화 또는 백신접종하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에게 본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 핵산의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 항원 수용체의 적어도 하나의 항원 결합 부위는 특이적 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 특이적 항원 또는 특이적 항원을 발현하는 질환-유발 유기체와 관련된 질환에 대해 면역화 또는 백신접종하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 면역 이펙터 세포 또는 상기 면역 이펙터 세포의 확장된 집단의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역 이펙터 세포 또는 세포의 집단은 본 발명의 항원 수용체를 재조합적으로 발현하고, 상기 항원 수용체의 적어도 하나의 항원 결합 부위는 특이적 항원에 결합할 수있다.
특정 구현예에서, 면역 이펙터 세포의 집단은 클론 확장된 집단일 수 있다. 재조합 면역 이펙터 세포 또는 이의 집단은 항원-특이적 방식으로 치료학적 또는 예방학적 면역 이펙터 기능을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항원 수용체는 면역 이펙터 세포의 세포 표면에서 발현된다.
본 발명의 치료 및 예방 방법과 관련하여 사용되는 세포는 바람직하게는 면역 이펙터 세포이고, 면역 이펙터 세포는 바람직하게는 T 세포이다. 특히, 본 발명에서 사용된 세포는 세포독성 림프구이며, 바람직하게는 세포독성 T 세포, 자연 살해 세포(NK), 및 림포카인-활성화 살해(LAK) 세포로부터 선택된다. 활성화/자극시, 이들 각각의 세포독성 림프구는 표적 세포의 파괴를 유발한다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 다음의 방법 중 하나 또는 둘 모두에 의해 표적 세포의 파괴를 유발한다. 첫째, 활성화시, T 세포는 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신과 같은 세포 독소를 방출한다. 퍼포린 및 그래뉼리신은 표적 세포에서 공극을 만들고 그랜자임은 세포로 들어가 세포의 아폽토시스(프로그램된 세포사)를 유발하는 세포질에서 카스파제 캐스캐이드를 유발한다. 둘째, T 세포와 표적 종양 세포 사이의 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 아폽토시스가 유도될 수 있다. 이종 세포 또는 동종 세포가 사용될 수 있으나, T 세포 및 다른 세포독성 림프구는 바람직하게는 자가 세포일 것이다.
따라서, 본 명세서에서 설명된 제제, 조성물 및 방법은 질환, 예를 들어 항원을 발현하는 질환 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 객체를 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 질환은 암 질환인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 설명된 상기 제제, 조성물 및 방법은 또한 본 명세서에서 설명된 질환을 예방하기 위한 면역화 또는 백신접종에 사용될 수 있다.
"질환"이란 용어는 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 의미한다. 질환은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 의학적 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인에 기인한 요인에 의해 야기되거나, 또는 자가면역 질환 등 내부 기능 장애에 의해 야기될 수 있다. 인간의 경우, "질환"은 고통받는 개체에게 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제, 또는 죽음을 초래하는 모든 문제, 또는 개체와 접촉된 것들에 대한 유사한 문제를 지칭하기 위해 더 광의적으로 사용된다. 이러한 광의적 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 격리 증상, 비정상적인 행동 및 구조와 기능의 비정형적인 변화를 포함하지만, 다른 맥락에서 및 다른 목적을 위해서 이들은 구별 가능한 카테고리로 간주될 수 있다. 많은 질환에 걸려서 생활하는 것은 개체의 삶에 대한 관점, 및 개체의 성격을 바꿀 수 있기 때문에 질환은 대개 신체적으로 뿐만 아니라 정서적으로도 개체에게 영향을 미친다. 본 발명에 따르면, "질환"이란 용어는 감염성 질환 및 암 질환, 특히 본 명세서에 기재된 유형의 암을 포함한다. 암 또는 암의 특정 형태에 대한 본 명세서의 어떠한 언급이라도 이의 암 전이를 포함한다.
본 발명에 따라 치료되는 질환은 바람직하게는 항원을 포함하는 질환이다. "항원 관련 질환", "항원의 발현 또는 상승된 발현과 관련된 질환" 또는 유사한 표현은 본 발명에 따라 항원이 이환된 조직 또는 기관의 세포에서 발현된다는 것을 의미한다. 이환된 조직 또는 기관의 세포에서의 발현은 건강한 조직 또는 기관의 상태에 비해 증가할 수 있다. 일 구현예에서, 발현은 질환 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 발견되지 않으며, 예를 들어 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 항원 관련 질환은 감염성 질환 및 암 질환을 포함하며, 질환-관련 항원은 바람직하게는 감염 인자의 항원 및 종양 항원이다. 바람직하게는 항원을 포함하는 질환은, 바람직하게는 항원을 발현하는 세포, 바람직하게는 세포 표면에서 발현하는 세포를 포함하는 질환이다.
"건강한" 또는 "정상적인"이란 용어는 병적이 아닌 상태를 지칭하며, 바람직하게는 감염되지 않은 상태 또는 암에 걸리지 않은 상태를 의미한다.
"암 질환" 또는 "암"이란 용어는 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 개체의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 보다 구체적으로는, 이러한 암의 예시는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 생식 기관의 암종, 호지킨병(Hodgkin's Disease), 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추신경계(CNS) 종양, 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경아교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함한다. 본 발명에 따른 "암"이란 용어는 암 전이를 또한 포함한다. 바람직하게는, "암 질환"은 종양 항원을 발현하는 세포를 특징으로 하고, 암세포는 종양 항원을 발현한다.
일 구현예에서, 암 질환은 퇴화, 침윤 및 전이의 특성을 특징으로 하는 악성 질환이다. 악성 종양은 이의 성장에 자체적으로 제한이 없다는 점에서 비-종양 양성 종양과 대조될 수 있고, 인접한 조직으로 침입할 수 있으며, 먼 조직으로 확산될 수 있는(전이) 반면, 양성 종양에는 이러한 특성이 없다.
본 발명에 따르면, "종양" 또는 "종양 질환"이란 용어는 비정상적인 세포(신생 세포 또는 종양 세포로 불림) 성장에 의해 형성된 확장 또는 병변을 의미한다. "종양 세포"란 통제되지 않은 급속한 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과 구조적 조직 및 기능적 협동이 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있으며, 대개 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 조직의 별개의 덩어리를 형성한다.
본 발명에 따르면, "암종"은 상피 세포로부터 유래한 악성 종양이다. 이 그룹은 일반적인 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는 가장 흔한 암을 나타낸다.
"선암종"은 분비선 조직에서 기원하는 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직으로서 알려진 보다 큰 조직 카테고리의 일부이다. 상피 조직에는 피부, 땀샘 및 신체의 빈 공간 및 기관를 이어주는 다양한 다른 조직이 포함된다. 상피는 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 발생학적으로 유래한다. 선암종으로 분류되기 위해, 세포는 분비 특성을 갖는 한, 반드시 분비선의 일부일 필요는 없다. 이러한 형태의 암종은 인간을 포함한 일부 고등 포유류에서 발생할 수 있다. 잘 분화된 선암종은 그들이 유래한 분비선 조직과 유사한 경향이 있지만, 불완전하게 분화된 것은 그렇지 않을 수 있다. 생검에서 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암종인지 또는 다른 유형의 암인지 여부를 결정할 수 있다. 신체 내 분비선이 매우 흔하게 존재하기 때문에 선암종은 신체의 많은 조직에서 발생할 수 있다. 각 분비선은 동일한 물질을 분비하지 않을 수 있지만, 세포에 외분비 기능을 갖는 한, 그것은 분비선으로 고려되며 따라서 이의 악성 형태는 선암종으로서 지칭된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침범하고 충분한 시간이 주어지면 종종 전이된다. 난소 선암종은 가장 흔한 유형의 난소 암종이다. 이는 장액성 및 점액성 선암종, 선명한 세포 선암종 및 자궁내막 모양 선암종을 포함한다.
림프종 및 백혈병은 조혈(혈액-형성) 세포로부터 유래한 악성 종양이다.
모세포 종양 또는 모세포종은 미숙 또는 배아 조직과 유사한 종양 (대개 악성 종양)이다. 이들 종양 중 많은 것들이 아동에서 가장 흔하다.
"전이"란 암세포가 원래의 위치에서 다른 신체 부위로 퍼지는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발성 종양으로부터 악성 세포의 분리, 세포외 기질의 침투, 내피 기저막의 체강과 혈관에의 침투, 그 다음, 혈액에 의해 운반된 후, 표적 기관의 침투에 의존한다. 최종적으로, 표적 부위에서의 새로운 종양의 성장은 혈관 형성에 의존한다. 종양 전이는 종종 종양 세포 또는 성분이 전이 능력을 유지할 수 있기 때문에 원발성 종양의 제거 후에도 발생한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "전이"란 용어는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 떨어진 전이와 관련된 "원거리 전이"와 관련된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "전이"란 용어는 림프절 전이와 관련된다.
악화 또는 재발은 사람이 과거에 영향을 받았던 병태에 의해 다시 영향을 받게된 경우에 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질환을 앓았고, 상기 질환에 대한 성공적인 치료를 받고, 다시 새로 상기 질환이 발병하는 경우, 새로 발병한 질환은 악화 또는 재발로서 고려될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 종양 질환의 악화 또는 재발은 원래의 종양 질환 부위에서 일어날 수는 있지만 반드시 일어나는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소 종양을 앓았고, 성공적인 치료를 받은 경우, 악화 또는 재발은 난소 종양의 발병 또는 난소와 다른 부위에서의 종양의 발병일 수 있다. 종양의 악화 또는 재발은 또한 원래의 종양의 부위뿐만 아니라 원래의 종양의 부위와 다른 부위에서도 종양이 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 상기 환자가 치료를 받은 원래 종양은 원발성 종양이고 원래의 종양의 위치와 다른 부위의 종양은 제2차 또는 전이성 종양이다.
본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균, 원생동물, 연충 및 기생충을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 감염 인자에 의해 유발된다.
인간과 비-인간 척추동물 모두의 전염성 바이러스는 레트로바이러스, RNA 바이러스 및 DNA 바이러스를 포함한다. 인간에서 발견된 바이러스의 예는 레트로바이러스과(Retroviridae)(예를 들어, HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV 또는 HIV-III, 및 HIV-LP와 같은 다른 분리체로도 지칭됨)와 같은 인간 면역결핍 바이러스), 피코르나바이러스과(Picornaviridae)(예를 들어, 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스, 엔테로바이러스, 인간 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스), 칼시바이러스과(Calciviridae)(예를 들어, 위장염 유발 균주), 토가바이러스과(Togaviridae)(예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스), 플라비바이러스과(Flaviridae)(예를 들어, 뎅기바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스), 코로나바이러스과(Coronaviridae)(예를 들어, 코로나바이러스), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae)(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스), 필로바이러스과(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라 바이러스), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)(에컨대 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 분가비리다에(Bungaviridae)(예를 들어, 한타(Hanta) 바이러스, 분가 바이러스, 펠보바이러스 및 나이로(Nairo) 바이러스), 아레나바이러스과(Arena viridae)(출혈열 바이러스), 레오바이러스과(Reoviridae)(예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스), 버나바이러스과(Birnaviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스), 파르보바이러스과(Parvoviridae)(파보바이러스), 파포바바이러스과(Papovaviridae)(유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스), 아데노바이러스과(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae)(단순 포진 바이러스 1 및 2, 수두 대상 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스과(Poxyiridae)(천연두 바이러스, 우두 바이러스, 수두 바이러스) 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)(예를 들어, 아프리카 돼지 열병 바이러스), 및 분류되지 않은 바이러스(예를 들어, 해면양뇌병의 원인체, 델타 간염의 원인체(B형 간염 바이러스의 결함 위성으로 생각됨), 비-A, 비-B형 간염의 원인체(클래스 1=내부 전염, 클래스 2=비경구적 전염 (즉, C형 간염), 노르와크(Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
고려된 레트로바이러스는 단순한 레트로바이러스 및 복잡한 레트로바이러스를 모두 포함한다. 복잡한 레트로바이러스에는 렌티바이러스, T 세포 백혈병 바이러스 및 거품형성 바이러스(foamy virus)의 하위 그룹이 포함된다. 렌티바이러스에는 HIV-1 뿐만 아니라, HIV-2, SIV, 비스나(Visna) 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)가 포함된다. T 세포 백혈병 바이러스는 HTLV-1, HTLV-II, 원숭이 T 세포 백혈병 바이러스(STLV) 및 소 백혈병 바이러스(BLV)를 포함한다. 거품형성 바이러스는 인간 거품형성 바이러스(HFV), 원숭이 거품형성 바이러스(SFV) 및 소 거품형성 바이러스(BFV)를 포함한다.
본 발명에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 세균 감염 또는 질환은 생활 주기에서 세포내 단계를 갖는 세균, 예컨대 미코박테리아(예를 들어, 미코박테리아 튜베르큘로시스(Mycobacteria tuberculosis), 엠. 보비스(M. bovis), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 레프라(M leprae) 또는 엠. 아프리카눔(M. africanum)), 리케치아, 미코플라스마, 클라미디아 및 레지오넬라를 포함하는 세균에 의해 유발된다. 고려된 세균 감염의 다른 예에는 그람 양성균(예를 들어, 리스테리아(Listeria), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)와 같은 바실러스, 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix) 종), 그람 음성균(예를 들어, 바르토넬라(Bartonella), 브루셀라 (Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 헤모필루스(Hemophilus), 클레프시엘라(Klebsiella), 모르가넬라(Morganella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 비브릭(Vibrio) 및 예르시니아(Yersinia) 종), 스피로헤타 세균(예를 들어, 라임병을 유발하는 보렐리아 복도페리(Borrelia burgdorferi)를 포함하는 보렐리아 종), 혐기성 세균(악티노마이세스(Actinomyces) 및 클로스트리디움(Clostridium) 종), 그람 양성 및 음성 구균 세균, 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 뉴모코커스(Pneumococcus) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 나이세리아(Neisseria) 종에 의해 유발되는 감염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 전염성 세균의 구체적인 예에는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pyloris), 보렐리아 복도페리 (Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophilia), 미코박테리아 튜베르큘로시스(Mycobacteria tuberculosis), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 엠. 칸사이(M. kansaii), 엠. 고르도나에(M. gordonae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝지티이스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오제니스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 연쇄상구균), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae)(그룹 B 연쇄상구균), 스트렙토코커스 비리던스(Streptococcus viridans), 스트렙토코커스 아이칼리스(Streptococcus aecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 뉴모니아이(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리아 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 에리시펠로트릭스 류시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 퍼프링거스(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneunmoniae), 파스튜렐라 멀토시다(Pasturella multocida), 푸소박테리아 뉴클리에튬(Fusobacterium nucleatuin), 스트렙토바실러스 모닐리포르미(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트렙토네마 페르테누이(Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케치아(Rickettsia) 및 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelli)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 진균 질환은 아스페르길루스증(aspergilliosis), 크립토코커스증(crytococcosis), 스포로트리코시스증(sporotrichosis), 콕시디오이데스진균증(coccidioidomycosis), 파라콕시디오이데스진균증(paracoccidioidomycosis), 히스토플라스마증(histoplasmosis), 블라스토마이세스증(blastomycosis), 털곰팡이증(zygomycosis) 및 칸디다증(candidiasis)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 기생충 질환은 아메바증(amebiasis), 말라리아(malaria), 리슈만(leishmania), 콕시듐(coccidia), 지질 다발증(giardiasis), 크립토스포리드 증(cryptosporidiosis), 톡소플라스마증(toxoplasmosis) 및 트리파노모니아증(trypanosomiasis)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 회충증(ascariasis), 십이지장충증(ancylostomiasis), 편충증(trichuriasis), 간충증(strongyloidiasis), 톡소카라증(toxoccariasis), 선모충증(trichinosis), 사상충증(onchocerciasis), 필라리아(filaria) 및 개사상충증(dirofilariasis) 등 다양한 벌레에 의한 감염이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 주혈흡충증(schistosomiasis), 폐흡충증(paragonimiasis) 및 간흡충증(clonorchiasis) 등 다양한 흡충에 의한 감염이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
"치료" 또는 "치료학적 처치"란 용어는 건강 상태를 향상시키고 및/또는 개체의 수명을 연장(증가)시키는 임의의 치료와 관련된다. 상기 치료는 개체의 질환을 퇴치하거나, 개체의 질환의 발달을 멈추거나 느리게 하거나, 개체의 질환의 발달을 억제 또는 지연시키고, 개체의 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고, 및/또는 현재 질환에 걸린 사람 또는 이전에 질환에 걸렸던 개체의 재발을 감소시킬 수 있다.
"예방학적 치료" 또는 "예방학 치료"란 용어는 개체의 질환의 발생을 예방하기 위한 치료와 관련된다. "예방학적 치료" 또는 "예방 치료"란 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"개체" 및 "객체"란 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 그들은 질환 또는 장애(예를 들어, 암)에 걸리거나 감염될 수 있지만 질환 또는 장애를 가질 수 있거나 가질 수 없는 인간, 비-인간 영장류 또는 기타 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 많은 구현예에서, 상기 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않는 한, "개체" 및 "객체"란 용어는 특정 연령을 나타내지 않으므로, 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, "개체" 또는 "객체"는 "환자"이다. "환자"란 용어는 본 발명에 따라 치료 객체, 특히 질환에 걸린 객체를 의미한다.
"위험에 처한"이란 일반 집단과 비교하여 질환, 특히 암이 발병할 확률이 정상보다 높은 것으로 확인된 객체, 즉 환자를 의미한다. 또한, 질환, 특히 암을 앓았거나 현재 앓고 있는 객체는 질환이 발병할 위험이 높은 객체이며, 객체는 계속해서 질환이 발병할 수 있다. 현재 암에 걸렸거나 걸렸었던 객체는 암 전이 위험이 높다.
"면역요법"이란 용어는 특정 면역 반응 또는 응답을 포함하는 치료와 관련된다.
본 발명의 문맥상, "보호", "예방", "예방학적", "예방의" 또는 "보호적"과 같은 용어는 객체에서 질환의 발생 및/또는 증식의 예방 및 치료 또는 둘 모두와 관련이 있으며, 특히, 객체가 질환이 발병할 가능성을 최소화하는 것 또는 질환의 발병을 지연시키는 것과 관련된다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, 종양 위험이 있는 사람은 종양 예방 요법의 후보일 수 있다.
면역요법의 예방학적 실시, 예를 들어, 본 발명의 제제 또는 조성물의 예방학적 투여는 바람직하게는 수용자를 질환 발병으로부터 보호한다. 면역요법의 치료학적 실시, 예를 들어, 본 발명의 제제 또는 조성물의 치료학적 투여는 질환의 진행/성장의 억제를 유도할 수 있다. 이는 질환의 진행/성장 감속, 특히 바람직하게는 질환의 제거를 유도하는 질환의 진행의 중단을 포함한다.
면역요법은 본 명세서에서 제공되는 제제가 바람직하게는 환자로부터 항원-발현 세포를 제거하는 기능을 하는 임의의 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 제거는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 환자에서 면역 반응을 증진시키거나 유도하는 결과로서 일어날 수 있다.
"면역화" 또는 "백신접종"이란 용어는 치료학적 또는 예방학적 이유로 면역 반응을 유도하기 위한 객체의 치료 과정을 의미한다.
"생체내(in vivo)"란 용어는 객체의 상황과 관련된다.
본 명세서의 항원 수용체, 펩티드 사슬, 핵산, 재조합 세포, 면역 이펙터 세포, 바람직하게는 T 세포뿐만 아니라 본 명세서에서 설명된 다른 화합물 및 제제는 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고 본 명세서에서 설명된 바와 같은 유효량을 함유하며, 원하는 반응 또는 원하는 효과를 발생시키기 위해 본 명세서에서 논의된 바와 같은 선택적인 추가의 제제를 함유한다.
약학적 조성물은 대개 균일한 투여 형태로 제공되며, 그 자체가 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 예를 들어, 용액이나 현탁액의 형태일 수 있다.
약학적 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용되는 염, 완충 물질, 방부제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 용어는 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
약학적으로 허용되지 않는 염은 약학적으로 허용되는 염을 제조하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약학적으로 허용되는 염은 비제한적으로 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 석신산과 같은 산으로부터 제조된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속 염으로부터 제조될 수 있다.
약학적 조성물에 사용하기에 적합한 완충 물질은 염의 아세트산, 염의 시트르산, 염의 붕산 및 염의 인산을 포함한다.
약학적 조성물에 사용하기에 적합한 방부제는 염화 벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.
주사 가능한 제제는 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 링거 락테이트(Ringer Lactate)를 포함할 수 있다.
"담체"란 용어는 적용을 촉진, 증진 또는 적용 가능하게 하기 위해 그 안에 활성 성분이 조합되는 천연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 지칭한다. 본 발명에 따르면, "담체"란 용어는 또한 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다.
비경구 투여용으로 가능한 담체 물질은 예를 들어, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히, 생체적합성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 공중합체이다.
본 명세서에서 사용된 "부형제"란 용어는 약학적 조성물에 존재할 수 있고 예를 들어 담체, 결합제, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 향료 또는 착색제와 같은, 활성 성분이 아닌 모든 물질을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 설명된 제제 및 조성물은 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하는 비경구 투여에 의한 것과 같은 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 비경구적으로, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 활성 화합물의 멸균 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성이다. 양립가능한 담체 및 용매의 예는 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 대개 멸균된 고정유가 용액 또는 현탁 매질로서 사용된다.
본 명세서에서 설명된 제제 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 병태를 치료하는 경우에, 목적하는 반응은 바람직하게는 상기 질환의 경과의 억제와 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추고, 특히, 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에서 목적하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 개시의 지연 또는 예방일 수 있다.
본 명세서에서 설명된 제제 또는 조성물의 유효량은 치료될 병태, 질환의 중증도, 연령, 생리적 상태, 신장 및 체중, 치료 기간, 동반 요법의 종류(있는 경우), 특정 투여 경로 및 이와 유사한 인자들을 포함하는 환자의 개별 매개변수에 의해 좌우될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 설명된 제제의 투여량은 이러한 파라미터의 다양성에 의해 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 투여량으로 불충분한 경우에는, 보다 많은 투여량 (또는 상이하고 보다 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 보다 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 제제 및 조성물은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위해 환자에게, 예를 들어 생체내 투여될 수 있다. 바람직한 환자는 본 명세서에서 설명된 제제 및 조성물이 투여됨으로써 교정되거나 개선될 수 있는 장애를 가진 인간 환자를 포함한다. 이는 항원의 발현을 특징으로 하는 세포를 포함하는 장애를 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본 명세서에서 설명된 제제는 암 질환, 예를 들어 항원을 발현하는 암세포의 존재를 특징으로 하는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 암 질환 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 기재된 약학적 조성물 및 치료 방법은 또한 본 명세서에서 설명된 질환을 예방하기 위한 면역화 또는 백신접종에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 보조제와 같은 면역-향상 물질을 보충하면서 투여될 수 있으며, 그 효과를 더욱 증가시키기 위해, 바람직하게는 면역자극의 상승 효과를 달성하기 위해, 하나 이상의 면역-향상 물질을 포함할 수 있다. "보조제"란 용어는 면역 반응을 연장하거나 향상시키거나 가속화시키는 화합물과 관련된다. 이러한 점에서, 다양한 보조제의 유형에 따라, 다양한 메커니즘이 가능하다. 예를 들어, DC의 성숙을 가능하게 하는 화합물, 예를 들어, 지질다당류 또는 CD40 리간드는 적합한 보조제 제 1 부류를 형성한다. 일반적으로, "위험 신호" (LPS, GP96, dsRNA 등) 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인 유형의 면역계에 영향을 미치는 임의의 제제를 제어된 방식으로 면역 반응을 강화시키고/시키거나 영향을 미칠 수 있는 하는 보조제로서 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드가 사용될 수 있지만, 상기 설명한 바와 같이 특정 상황에서 발생하는 부작용이 고려되어야 한다. 특히 바람직한 보조제는 모노카인, 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인과 같은 사이토카인, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-α 또는 성장 인자, 예를 들어 hGH이다. 추가로 공지된 보조제는 수산화알루미늄, 프로인트 (Freund's) 보조제 또는 Montanide®, 가장 바람직하게는 Montanide® ISA51과 같은 오일이다. Pam3Cys와 같은 지질펩티드도 본 발명의 약학적 조성물에서 보조제로서 사용하기에 적합하다.
약학적 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로, 바람직하게는 전신적으로 투여될 수 있다.
"전신 투여"란 용어는 제제가 상당한 양으로 개체의 체내에 광범위하게 분포되어 원하는 효과를 나타내도록 하는 제제의 투여를 의미한다. 예를 들어, 상기 제제는 혈액 내에서 원하는 효과를 나타낼 수 있고/있거나 혈관계를 통해 원하는 작용 부위에 도달할 수 있다. 전형적인 전신 투여 경로는 제제를 혈관계 또는 구강, 폐 또는 근육 내에 직접 도입하여 투여하는 것을 포함하며, 이때 제제는 흡착되고, 혈관계로 들어가며, 혈액을 통해 하나 이상의 원하는 작용 부위로 운반된다.
본 발명에 따르면, 전신 투여는 비경구 투여인 것이 바람직하다. "비경구 투여"란 용어는 제제가 장을 통과하지 않는 제제의 투여를 의미한다. "비경구 투여"란 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 동맥 내 투여를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
투여는 또한 예를 들어 경구, 복강내 또는 근육내에서 수행될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 무관한)과 같은 통상적인 치료 요법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 상세히 설명되며, 이는 단지 설명의 목적으로 사용되는 것이고 한정하려는 것은 아니다. 설명 및 실시예들로 인해, 본 발명에 마찬가지로 포함되는 추가 구현예들은 당업자에게 접근 가능하다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 실험에 사용된 모든 T-세포 수용체(TCR)-컨스트럭트 및 키메라 항원 수용체(CAR)-컨스트럭트의 개략도를 포함한다. A) 및 B) TCR은 이종이량체 클래스 I 막 단백질로 구성되며, 각각의 사슬은 불변 C-도메인 및 가변 V-도메인을 포함하고, 후자는 MHC-제한된 방식으로 프로세싱된 펩티드를 특이적으로 인식한다. 뮤린(Mu, A) 및 인간(Hu, B) TCR의 서열- 및 구조-상동성은 다소 높다. 뮤린 TCR은 밀착연접 단백질 클라우딘 6으로부터 유래한 인간 종양 항원을 인식하는 반면, 인간 TCR은 멜라닌 세포 분화 항원 gp100으로부터 유래한 종양 항원을 인식한다. C) 1가 단일 사슬 CAR은 세포막으로 외수송하기 위한 신호 펩티드가 선행하는 뮤린 Cβ-도메인 및 자율 TCR Cα-도메인에 연결된 단일 사슬(sc) Fv-단편을 포함한다. 임의로, 그것은 세포 표면 발현 및 이러한 CAR의 기능을 향상시키기 위해 TCR C-도메인들 사이에 인공 이황화 결합에 의해 하네스 연결(harness)될 수 있다. 상기 및 모든 다음의 예시적인 컨스트럭트에서의 scFv 단편은 클라우딘 6에 대해 지시된 것이다. D) 고전적 scCAR Cl6은 각각 scFv 단편, 항체 힌지 영역, 스페이서 영역으로서의 CH2CH3-도메인, 각각 공동자극 분자 CD28 및 CD3ζ의 세포막 및 세포내 신호전달 도메인이 정렬되어 있는 이종이량체를 포함한다. 동종이량체화는 각 사슬이 단일 항원에 결합하는(즉, 사슬내) 항원의 2가 인식을 유도한다. E) 프로토타입 조합 CAR은 연속하여 연결되어 있고(즉, VH-VH 또는 VL-VL) 각각 TCR Cα 또는 Cβ에 연결된 대립유전자-관련 V-도메인을 보유한다. 인식은 조합적(즉, 사슬간) 및 2가 방식으로 양쪽 쇄에 걸친 항원 결합을 필요로 한다. F) 전장 TCRα gp100 또는 TCRβ에 scFv 단편을 보유하는 이종이량체 TCR-CAR Cl6은 2가이지만 비-조합적인 방식으로 동족 항원을 인식한다. G) 비-조합 TCR-CAR Cl6(F)의 TCR gp100 모이어티에 의한 동족 펩티드 gp100(280-288)의 잔류 인식을 제거하기 위해, '침묵'(sil) S109Q(IMGT 명명법에 따름) 점 돌연변이가 TCRα의 CDR3 루프에 도입된다(silCDR3α). H) 조합 TCR-CAR Cl6은 각각 E)에 개요된 전장 TCRα gp100 사슬 또는 전장 TCRβ 사슬상에서 대립형질-관련 V 도메인들을 연속하여 연결시킴으로써 생성시킨다. 여기서 융합 파트너로서 이용된 전장 TCR은 (E) 대신에 단지 TCR C-도메인을 포함하는 절두된 TCR보다 더 우수한 생리학적 T-세포 신호전달을 제공할 수 있다. I) 조합 TCR-CAR Cl6(H)의 TCR gp100 모이어티에 의한 동족 펩티드 gp100(280-288)의 잔류 인식을 제거하기 위해, G)에서와 같이 '침묵'(sil) S109Q(IMGT 명명법에 따름) 점 돌연변이가 TCRα의 CDR3 루프에 도입된다(silCDR3α).
도 2a/도 2b는 공동배양을 설정하기 전 각각 APC에서의 클라우딘 6 및 인간 T-세포에서의 상이한 CAR의 발현을 도시한다. A) 미성숙 수지상 세포(iDC)를 증가하는 양의 동족 전장 항원 클라우딘 6 또는 단일 고 용량의 무관한 항원 gp100으로 전기천공시켰다. 여기서, Cl6-발현의 용량 의존적으로 대규모 이동이 유세포계측법에서 관찰될 수 있었는데, 이는 이 공여자의 iDC가 세포성 RNA 흡수, 단백질 번역 및 세포 표면으로의 외수송에 대해 매우 허용적임을 나타낸다. 높은 CD86 발현은 단핵구가 순조롭게 항원-제시 iDC로 강력하게 분화됨을 나타낸다. B) 사전활성화된 CD8+ T-세포를 상이한 CAR-암호화 RNA로 전기천공시키고 유세포계측법으로 CAR-발현에 대해 평가하였다. 1가 및 고전적 scCAR을 제외한 모든 CAR은 항-이디오타입 염색에서 중간 정도로 회수되었다. 1가 CAR은 가장 적게 발현되는 반면, 고전적 scCAR은 가장 높은 것으로 밝혀졌다. 도 2c는 IFNγ-ELISA에서 APC/T-세포 공동배양의 설정 후 클라우딘 6 발현 iDC의 인식에 있어 CAR Cl6 재프로그램된 인간 T-세포의 효율을 도시한다. CAR-전기천공된 T-세포를 10:1의 E:T-비(이펙터 대 표적 세포 비)에서 2a/2b에 설명된 바와 같이 Cl6-전기천공된 APC와 함께 밤새 공동배양하였다. Cl6 적정의 전체 범위에 걸쳐, 모든 CAR은 보다 낮은 Cl6 용량(0.02 μg)에서 최적을 이끌어냈다. 높은 클라우딘 6 발현에서는 고전적 scCAR Cl6이 다른 모든 CAR에 비해서 최상의 IFNγ-분비를 나타낸 반면, 가장 낮은 Cl6 용량에서는 조합 CAR이 고전적 scCAR보다 다소 우수한 경향이 있었다. 결론적으로, 조합 CAR은 높은 항원 발현에서 낮은 항원 발현에 이르기까지 기능적 효율면에서 고전적 CAR을 따라잡았다: 이들은 각각 조합 CAR 및 scCAR Cl6에 대해 최대 20 내지 30.000 pg/ml까지 매우 높은 양의 IFNγ을 산출하였으며 최저 용량의 Cl6에서 모든 컨스트럭트에 대해 12 내지 15.000 pg/ml IFNγ로 종료되었다. 이러한 용량에서, 사슬간-조합 Cα/Cβ-CAR이 가장 효율적인 것으로 밝혀졌다.
도 3a/도 3b는 공동배양을 설정하기 전, 각각 APC에서의 클라우딘 6 및 인간 T-세포에서의 상이한 CAR의 발현을 도시한다. A) 미성숙 수지상 세포(iDC)를 증가하는 양의 동족 전장 항원 클라우딘 6으로 전기천공시켰다. 여기서, 유세포계측법에서 Cl6-발현의 용량-의존적 단편적 이동만이 관찰될 수 있었으며, 이는 이 공여자의 iDC가 세포 RNA 흡수, 단백질 번역 및 세포 표면으로의 외수송에 대해 훨씬 덜 허용적임을 나타낸다. 높은 CD86 발현은 단핵구가 순조롭게 항원-제시 iDC로 강력하게 분화됨을 나타낸다. B) 사전활성화된 CD8+ T-세포를 상이한 CAR-암호화 RNA로 전기천공시키고 유세포계측법으로 CAR-발현에 대해 평가하였다. 1가 및 고전적 scCAR을 제외한 모든 CAR은 항-이디오타입 염색이 단지 약간만 회복되었으며, 이는 이 공여자의 세포가 RNA 흡수 및 프로세싱에 대해 덜 허용적임을 다시 나타낸다. 그러나, 불량한 항원-제시 iDC는 초기 클론성 종양 탈출 변이체(tumor escape variant) 또는 최소 종양 항원 제시의 상황을 모방할 수 있기 때문에 최소의 종양 항원-양성 APC의 상황을 나타낼 수 있다. 도 3c는 IFNν-ELISA에서 APC/T-세포 공동배양을 설정한 후 클라우딘 6 발현 iDC의 인식에 있어 CAR Cl6 재프로그램된 인간 T-세포의 효율을 도시한다. CAR-전기천공된 T-세포를 10:1의 E:T-비에서 도 3a/3b에 설명된 바와 같이 Cl6- 전기천공된 APC와 함께 하룻밤 공동배양하였다. Cl6 적정의 전체 범위에 걸쳐서, 모든 CAR은 보다 낮은 Cl6 용량(0.2 μg)에서 최적을 이끌어냈다. 앞서 설명한 바와 같이, 최소의 클라우딘 6 발현으로 인해, 조합 CAR Cl6은 모든 용량에 대해 고전적 scCAR Cl6에 비해 최상의 IFNν-분비를 나타냈으며 가장 낮은 전기천공된 Cl6 용량에서 더욱 두드러진 경향을 보였다. 결론적으로, 소량의 항원의 경우, 조합 CAR은 IFNν-분비와 관련하여 고전적 scCAR Cl6보다 훨씬 우수하였다. 분비된 IFNν의 총량은 항원 및 또한 CAR의 매우 낮은 발현으로 인해 전체 적정 범위에서 1.000 pg/ml 미만으로 저하되었다.
도 4는 IFNν-ELISA에서 HLA-A2.1 + APC/T-세포 공동배양의 설정 후 클라우딘 6 발현 iDC 또는 gp100 펩티드-부하된 iDC의 인식에 있어 TCR gp100-CAR Cl6 재프로그램된 인간 T-세포의 효율을 도시한다. CAR-전기천공된 T-세포를 5:1의 E:T-비에서 Cl6-전기천공된 APC 또는 gp100(280-288) 펩티드-부하된 iDC와 함께 하룻밤 공동배양하였다. 본 실험의 궁극적인 목표는, 첫째 (A) 2가 비-조합 TCR-CAR보다 2가 조합 TCR-CAR이 IFNν의 분비에 있어 더 효과적이었는지 여부 및 둘째 (B) CAR들이 여기서 사용된 TCR gp100 골격의 gp100 펩티드를 여전히 어느 정도까지 인식하는지를 검증하는 것이었다. 잔류 항원 결합을 TCRα gp100의 CDR3 내의 '침묵' 돌연변이 S109Q에 의해 제거하도록 시도하였다. TCR Cl6 및 TCR gp100은 동족 항원 인식에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. A) 조합 TCR-CAR은 CDR3β에서 침묵되었는지 여부에 관계없이, 특히 가장 낮은 용량의 항원에서 비-조합 CAR보다 더 기능적인 것으로 밝혀졌다. B) 비-침묵된 비-조합 TCR-CAR Cl6은 10-6 M 펩티드에서 gp100을 여전히 인식하였다. 돌연변이 S109Q의 도입은 IFNν- 분비를 어쨋든 소멸시켰다. 조합 TCR-CAR Cl6의 경우, 기능적으로 침묵되었는지 여부에 관계없이 사이토카인의 분비가 전혀 관찰되지 않았다. 어느 한 사슬상의 연속적으로 연결된 VH-VH- 및 VL-VL-도메인의 사슬간 결합은 HLA-A2.1-제한된 방식으로 APC에 제시된 gp100 펩티드의 결합을 입체적으로 방지할 가능성이 높다.
도 5는 APC/T-세포 공동배양의 설정 후 Cl6-발현 iDC와의 항원 접촉시 상이한 CAR Cl6의 증식 능력을 예시한다. CAR-전기천공된 T-세포를 10:1의 E:T-비에서 Cl6-전기천공된 및 -적정된 APC와 함께 5일 동안 공동배양하였다. T-세포를 우선 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 염색하여 세포 분열에 의한 CFSE의 희석을 정량하고, 따라서 결과적인 딸 집단의 수 및 빈도를 유세포계측법에서 각 밀도 플롯의 우측에 나타내었다. A) 1가 항원-결합 CAR은 가장 약한 증식을 나타내는 반면에, 조합 TCR-CAR 및 고전적 CAR은 매우 유사한 증식 패턴을 나타냈다. B) A)에 도시된 T-세포 집단의 빈도에 대한 막대 차트. 1가 CAR이 장착된 높은 빈도의 T 세포는 증식하지 않은 반면에(40 내지 60%), 조합 TCR-CAR 및 고전적 CAR에 대한 비-증식성 T-세포의 빈도는 대략 10 내지 20%의 범위였다. 고전적 CAR Cl6을 보유하는 T-세포의 증식은 고 용량(0.2 ㎍ Cl6)의 항원에서 가장 높은 반면에(조합 TCR-CAR의 경우 90% 대 80%), 가장 낮은 용량(0.002 ㎍)에서 조합 TCR-CAR은 적어도 고전적 CAR(거의 80 %)만큼 강력하였다. 결론적으로, 조합 TCR-CAR은 높은 항원 발현에서 낮은 항원 발현에 이르기까지 기능적 효율면에서 고전적 CAR을 따라잡았다. 고전적 CAR보다 훨씬 더 효과적인 경향이 있다.
도 6은 APC/T-세포 공동배양의 설정 후 조합 TCR-CAR Cl6 전기천공된 딸 T-세포상에서 공동자극 바이오마커 CD27의 상향조절을 유도한다. CAR-전기천공된 T-세포를 3:1의 E:T-비에서 Cl6-전기천공된 iDC와 함께 6일 동안 공동배양하였다. T-세포를 우선 CPD-450으로 염색하여 세포 분열에 의한 이 형광단의 희석을 정량하고, 따라서 결과적인 딸 집단의 수 및 빈도를 유세포계측법에서 히스토그램의 좌측에 나타내었다. T-세포를 CD8-특이적 항체로 염색하여 조합 및 고전적 CAR에 대한 이 공동수용체 마커의 중간 정도 및 동등한 상향조절을 예시하였다. 동시에, 이들을 공동자극 분자 CD27에 특이적인 항체로 염색하여 모든 CAR에 대한 모/딸 집단 G0-G6에서의 이의 조절을 추정하였다. 두 마커 모두 대략 2배 상향조절되었고 추가로 CD8의 평균 발현이 모든 CAR에 대해 거의 동일하지만, CD27의 평균 발현은 고전적 CAR보다 조합 CAR 및 특히 사슬간-조합 TCR-CAR Cl6에서 훨씬 높았다. 생체내 T-세포의 장기간 지속성의 바이오마커인 CD27은 발현 수준이 G6에서의 기저 수준으로 저하되기 전에 약한-증식성 T-세포(G2-G4)에 대해 훨씬 더 높은 플래토(plateau)를 획득하였다.
실시예
본 명세서에서 사용된 기술 및 방법은 본 명세서에 설명되어 있거나 또는 예를 들어, 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y]에서 설명된 바와 같이 그 자체가 공지된 방식으로 수행된다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 특별히 명시하지 않는 한, 제조업체의 정보에 따라 수행된다.
실시예 1: 유세포계측법에 의한 iDC에서의 클라우딘 6 및 T-세포에서의 항원 수용체의 발현 분석
상이한 컨스트럭트들에 대한 RNA를 이의 5'-리딩 서열에 T7 프로모터를 보유하고 이의 3' 테일에 폴리A-테일을 보유하는 RNA-벡터 pST1로 클로닝된 오픈 리딩 프레임(ORF)의 시험관내 전사(ivt-RNA)로부터 제조하였다. 형광단 Dylight-650로 표지된 클라우딘 6-특이적 항체를 이용하여 버피 코트로부터의 GM-CSF/IL-4 처리된 CD14+ 단핵구 내로 RNA(2 내지 0.002 ㎍, 300V, 12 ms, 1 펄스)를 전기천공시킨 후 다음날에 인간 미성숙 수지상세포에서의 클라우딘 6 발현을 평가하였다. OKT3(항 CD3ε 뮤린 단클론 항체)-사전활성화된 CD8+ T 세포로 RNA(두 사슬 모두에 대해 총 10 내지 30 ㎍, 495V, 9 ms, 1 펄스)를 전기천공시킨 후 다음날에 자가 인간 T-세포에서의 다양한 항원 수용체 컨스트럭트의 발현을 평가하였다. 인간 iDC 및 T-세포의 제조에 대한 상세한 설명은 실시예 2에 제공되어 있다. 발현이 시험된 CAR-컨스트럭트는 (i) 뮤린 T 세포 수용체 TCR Cl6; (ii) 인간 TCR gp100; (iii) 1가 비-조합 CAR Cl6; (iv) 고전적 scCAR) (2가); (v) 인간 TCR Cα/β-도메인에 융합된 사슬간-조합 CAR Cl6(2가); (vi) 전장 TCR gp100(280-288)에 융합된 비-조합 CAR Cl6(2가); (vii) 펩티드 인식을 제거하기 위해 TCRα gp100의 CDR3에서 추가로 침묵된 상응하는 비-조합 CAR Cl6 (2가); (viii) 전장 TCR gp100(280-288)에 융합된 사슬간-조합 CAR Cl6(2가) 및 (ix) 펩티드 인식을 제거하기 위해 TCRα gp100의 CDR3에서 추가로 침묵된 상응하는 조합 CAR Cl6(2가)이었다. 상이한 항원 수용체 컨스트럭트는 도 1a 내지 도 1i에 개략적으로 도시되어 있다. 세포의 염색을 4℃에서 20분 동안 유세포계측 완충액 중에서 0.2x106 세포에 대해 일상적으로 수행하고, 세척하고, 1% 파라포름알데히드-함유 유세포계측 완충액으로 고정시켰다. 도 2a의 데이터는 적정된 클라우딘 6의 발현을 도시한다. 여기서, 상기 공여자로부터의 iDC는 Cl6 RNA에 매우 허용적이고, 전기천공된 RNA의 양이 증가함에 따라 클라우딘 6 발현의 대규모 이동을 입증하였다. CD86 발현은 단핵구의 강력한 항원 제시 iDC로의 성공적인 분화를 나타냈다. 도 2b는 인간 CD8-양성 선택된 인간 T-세포에서 본 실험에 사용된 상이한 CAR의 발현을 도시한다. 고전적 scCAR Cl6은 아마도 T-세포 표면에서의 내인성 CD3-독립적 발현으로 인해 가장 높은 발현을 나타냈다. 조합 CAR은 1가 CAR보다 약간 더 우수한 발현을 나타냈고, 후자는 이의 유일한 1가 항원 결합 작용 방식으로 인해 '약한 대조군'으로서 작용하였다.
도 3a의 데이터는 독립적 실험에서 적정된 클라우딘 6 발현을 도시한다. 여기서, 상기 공여자로부터의 iDC는 Cl6 RNA에 대해 불량하게 허용적이었고 전기천공된 RNA의 양이 증가함에 따라 클라우딘 6 발현의 단편적 이동만을 입증하였다. 그러나, CD86 발현은 단핵구의 강력한 항원 제시 iDC로의 성공적 분화를 나타냈다. 도 3b는 인간 CD8-양성 선택된 인간 T-세포에서 본 실험에 사용된 상이한 CAR의 발현을 도시한다. 인간 T-세포가 자가 환경에서 분화된 단핵구와 동일한 공여자로부터 유래되었기 때문에, T-세포는 또한 전기천공된 RNA에 대해 불량하게 허용적인 것으로 드러났고, 도 2b에 도시된 실험에서보다 CAR에 대해 더 약한 발현을 나타냈다. 그러나, 고전적 scCAR Cl6은 이전에 개요된 것과 동일한 이유로 인해 가장 높은 발현을 다시 증명하였다. 이전의 관찰과 일치하여, 조합 CAR은 1가 CAR보다 약간 더 우수한 발현을 나타냈다. CAR-발현의 순서는 도 2a/도 2b에 개요된 실험과 비교하여 보존되기 때문에, 본 실험은 항원 제시 세포(APC)에서의 단지 소량의 Cl6 발현의 경우에 상이한 CAR들의 효능을 연구하기에 적합하다.
실시예 2: 항원-적정된 IFN-γ 분비 분석법
실험 1일차에, 신선한 말초 혈액 단핵 세포("PBMC")를 한 명의 건강한 공여자의 버피 코트로부터 단리하였다. PBMC의 1/4로부터, CD14+ 세포를 MACS 분류를 사용하여 단리하였다. 이어서, MACS 통류물 및 잔류 PBMC를 CD8+ T 세포에 대해 MACS 분류하였다. CD14+ 세포를 1일, 3일, 6일차에 IL-4 & GM-CSF(1000U / ml)의 투여에 의해 미성숙 수지상 세포("iDC")로 분화시켰다. CD8+ T 세포를 OKT3 코팅된 6웰 플레이트상으로 옮겼다. 3일차에, T 세포를 새로운 6웰 플레이트로 옮겼다. 7일차에, iDC를 2 내지 0.002 ㎍ RNA의 범위에서 무관한 및 Cl6 ivt-RNA로 용량 의존적으로 전기천공시켰다. OKT3 활성화된 T 세포를 동일한 날에 대조군 또는 각각의 도면에 제시되어 있고 실시예 1에 설명된 바와 같은 항원 수용체 컨스트럭트로 전기천공시켰다. 품질 보장을 위해, iDC에서의 Cl6 발현 및 T 세포에서의 항원 수용체 표면 발현을 8일차에 이전에 설명한 바와 같이 특이적 형광-표지된 항체를 이용하여 분석하였다. 이어서, 전기천공된 T 세포 및 항원 전기천공된 iDC를 96웰 플레이트에서 3:1 내지 10:1의 E:T 비로 중복하여 20시간 동안 공동배양하였다. 일반적으로, 2.5x104 iDC를 접종(seed)하고, 200㎕ T-세포 배지의 체적에서 7.5x104 내지 2.5x105 CAR-전기천공된 T-세포와 함께 공동배양하였다. 9일차에, 상이한 양의 배양 상청액(10 내지 50 ㎕)을 취하여 eBioscience의 IFN-γ Ready Set Go! 키트(# 88-7316-88)를 사용하여 샌드위치 ELISA에서 분비된 IFNγ의 양에 대해 분석하였다. Tecan Sunrise ELISA 판독기를 사용하여 흡광도를 검출하였다.
도 2c는 RNA 전기천공에 대해 매우 허용적이고 따라서 iDC에서 Cl6의 대규모 용량-의존적 발현 및 T-세포에서의 CAR의 높은 발현(도 2a/도 2b)을 야기한 동일한 공여자의 iDC 및 T-세포에 대한 분비된 IFNγ의 양을 도시한다. 모든 CAR T-세포는 0.02 ㎍의 전기천공된 Cl6 RNA에서 IFNγ-분비에서 최대 값을 나타냈으며, 이는 고전적 scCAR의 경우 최대 30.000 pg/ml IFNγ 및 TCR Cα/β 또는 전장 TCR gp100에 융합된 조합 CAR의 경우 20.000 pg/ml을 초래하였다. 추정된 바와 같이, 1가 CAR-변형된 T-세포는 가장 약한 이펙터 세포인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 높은 Cl6 전기천공 수준에서, 조합 CAR은 고전적 scCAR Cl6의 반응성의 대략 50%만을 나타냈고, 이는 0.02 ㎍ 전기천공된 Cl6의 최적 용량에서 70%로 증가하였다. 중요하게도, 여기서 시험된 가장 낮은 용량의 Cl6, 0.002 ㎍ RNA에서 조합 CAR은 고전적 scCAR Cl6만큼 효율적이거나, TCR Cα/β에 융합된 조합 CAR의 경우에 훨씬 더 효율적이었다. 이러한 매우 낮은 수준의 Cl6의 대규모 존재에서, 조합 CAR은 여전히 10.000 pg/ml의 범위에서 높은 양의 IFNγ을 분비할 수 있었다.
도 3c는 RNA 전기천공에 대해 불량하게 허용적이고 따라서 iDC에서의 Cl6의 오직 단편적 용량-의존적 발현 및 또한 T-세포에서 더 낮은 CAR 발현을 야기한 동일한 공여자의 iDC 및 T-세포에 대한 분비된 IFNν 양을 예시한다(도 3a/도 3b). 이는 고도로 허용적인 항원 적정된 iDC에서 낮은 Cl6 발현 수준에 대한 상황보다 iDC에서 발견되는 Cl6이 훨씬 적은 상황을 구성할 수 있다(도 3a/도 3b 대 도 2a/도 2b). 여기에서, 모든 적정된 아주 적은 양의 C16에 대해, 조합 CAR 들이 고전적 scCAR보다 IFNν-분비에서 더 효율적인 것으로 입증되었다. 이러한 경향은 iDC의 세포 표면에서 Cl6의 양이 감소함에 따라 더욱 두드러진다. 분비된 IFNν의 양은 적지만(<1000 pg/ml), 첫째로 더 우수한 CAR 발현에 의해 개선될 수 있고, 둘째로 매우 낮은 항원 발현(초기) 종양 탈출 변이체를 보유하는 진료소의 환자들에게 또는 미세 잔존 질환을 다루기 위해 유익할 수 있다.
도 4a는 CAR-특이적 항원 Cl6에 대항한 (2가) 비-조합 TCR-CAR 대 조합 TCR-CAR에 대한 IFNν-분비의 효율을 비교한다. 모든 조합 CAR은 광범위한 적정된 항원에 걸쳐 항원 인식이 보다 효율적이었다. 더 높은 용량의 항원의 경우, 2가 CAR은 '침묵된' 비-조합 TCR-CAR을 제외하고는 이펙터 기능이 대부분 동일하였다. CDR3α에서의 S109Q 점 돌연변이가 약간의 gp100(280-288)-항원 결합을 손상시킨다는 것은 공지되어 있다(Knies 등, Oncotarget 2016). '침묵된' 비-조합 TCR-CAR에 의한 V-도메인의 사슬간-결합 및 항원 자체의 결합은 이러한 돌연변이에 의해 야기된 기능 상실을 명백하게 보완한다. 중요하게도, 낮은 수준의 Cl6-발현 (0.02 ㎍)에서, 기능적으로 침묵되었는지 여부에 관계없이 조합 TCR-CAR은 사이토카인 분비에 대해 비-조합 TCR-CAR보다 우수하였다.
도 4b는 펩티드-적정된 IFNν-분비에서 gp100 (280-288) 항원의 잔류 인식을 예시한다. 여기서, TCRαβ gp100은 양성 대조군으로서 작용하는 반면, TCRαβ Cl6은 사이토카인의 배경 분비를 추정하기 위한 특이성 대조군으로서 작용하였다. 비-조합 TCR-CAR은 여전히 높은 펩티드 부하에서 A2-1-제한된 항원을 인식할 수 있다. 침묵 돌연변이 S109Q의 도입은 어쨋든 인식을 소멸시켰다. 중요하게는, 탠덤-순서(VH-VH-, VL-VL-)로 연결된 V-도메인의 사슬간 조합 배열은 전적으로 TCR gp100 모이어티에 의한 동족 항원의 인식을 방해하는 것으로 보였다. 따라서, 침묵 돌연변이의 도입은 이들 CAR에서 TCR 모이어티의 기능적 비반응성을 보장하고 사슬-쌍 안정화 스캐폴드로서 및 생리적 T-세포 신호전달을 위한 전장 어댑터 분자로서 이의 골격을 이용하는 것에 초점을 맞추기 위한 보호수단으로서 작용할 수 있다.
실시예 3: 바이오마커 표현형 결정과 조합된 항원-적정된 증식 분석법
실험 1일차에, 신선한 PBMC를 한 명의 건강한 공여자의 버피 코트로부터 단리하였다. PBMC의 1/4로부터, CD14+ 세포를 MACS 분류를 사용하여 단리하고 잔류 PBMC를 동결시켰다. CD14+ 세포를 1일, 3일, 6일차에 IL-4 & GM-CSF(1000U / ml)의 투여에 의해 iDC로 분화시켰다. 7일차에, iDC를 2 내지 0.002 ㎍ RNA의 범위에서 무관한 및 Cl6 IVT-RNA 용량 의존적으로 전기천공시켰다. 동결된 PBMC를 동일한 날에 해동시키고 MACS를 CD8+ 세포에 대해 분류하였다. 이어서, 임의의 사전 활성화(OKT3) 없이 비접촉(naive) T 세포, 대략 7x106 세포를 도 1에 나타낸 고전적, 1가 및 사슬간-조합 TCR-CAR로 전기천공시켰다. 품질 보장을 위해, CAR-조작된 T 세포를 8일차에 유세포계측 염색에 의해 분석하였다. 이어서, T 세포를 세포내 형광 증식 마커 CFSE(0.8 μM) or CPD-450 (10 μM)로 표지하였다. 이어서, 전기천공된 T 세포 및 iDC를 96웰 플레이트에서 10:1(또는 바이오마커 표현형 결정의 경우 3:1)의 E:T 비로 중복하여 5시간 동안 공동배양하였다. 일반적으로, 2.5x104 iDC를 96웰 플레이트에서 200㎕ T-세포 배지의 부피로 2.5x105 CAR-전기천공된 T-세포와 함께 공동배양하였다. 5일차에, 배양된 세포를 96웰 플레이트에서 APC-Cy7로 표지된 CD4 또는 CD8 항체로 염색하였다. T 세포의 증식은 증식하는 딸 세포의 희석으로 인해 형광단-신호의 좌측방향 이동에 의해 유세포계측법을 통해 검출되었다. 비-증식성 모(母) 집단 G0 및 딸 집단 G1-G7의 빈도를 유세포계측법 소프트웨어 패키지 FlowJo v7.6.5의 증식 도구를 사용하여 평가하였다. 모든 딸 T-세포의 빈도는 모든 증식성 집단 G1-G7의 총합으로부터 계산하였다. TPC의 배경 증식은 무관한 전장 gp100으로 전기천공된 iDC 또는 APC없이 접종된 T-세포와 함께 배양된 세포에 대해 평가하였다. 증식성 세포를 CD8에 대해 염색하여 이들이 T-세포임을 명백하게 밝혀냈다. 대안적으로, 증식성 T-세포를 CD27, CD28, PD-1, CD95, CD45RA 및 CCR7과 같은 바이오마커로 염색하여, 5일 또는 6일간 APC와 공동배양한 후, 각각 G0에서 원래의 비증식성 비접촉 T-세포 및 진화하는 딸 집단 G1-G7의 분화 상태를 정량하였다. 최적의 신호 대 노이즈 비를 추정하기 위해 항체 및 상응하는 이소타입 대조군을 적정하였다. 분석을 FACS-Canto II-HTS 시스템(BD)상에서 96웰 포맷으로 정량하였다.
도 5a는 '약한 대조군'으로서의 1가 CAR Cl6, TCR CDR3α에서의 침묵 돌연변이 S109Q를 갖거나 갖지 않는 조합 TCR-CAR, 및 참조로서의 고전적 scCAR Cl6으로 조작된 증식 T-세포의 밀도 플롯을 도시한다. 무관한 항원 gp100이 부하된 iDC에 대해서는 비특이적 증식이 거의 관찰되지 않았다. 동족 항원이 부하된 APC에 대한 증식은 최대 6종의 별개의 딸 집단을 생성시켰으며, 이들의 빈도는 쉽게 식별될 수 있었다(각 플롯의 우측에 나열됨). 1가 CAR Cl6을 제외한 모든 CAR은 낮은 항원 밀도에서도 높은 증식 속도를 나타냈다. 최대 빈도는 G3에서 거의 모든 경우에 있었다.
도 5b는 막대형 차트에서 잔류 모 T-세포 G0 및 증식성 T-세포 G1-G7의 퍼센트를 요약한 것이다. 높은 항원 부하에서, 다른 CAR과 비교해 G0에 대한 큰 막대(40%) 및 G1-G7에 대한 작은 막대(60%)는 1가 CAR-조작된 T-세포가 증식하는 경향이 약함을 명확하게 나타낸다. 고전적 scCAR-변형된 T-세포는 IFNν-분비 분석의 결과와 일치하여 조합 CAR(80 %)보다 다소 더 우수한(90%) 것으로 입증되었다. 결과적으로, 항원의 양을 감소시킬 때, 조합 CAR-변형된 T-세포는 적어도 고전적 scCAR만큼 효율적이 되었다(거의 80%). 이러한 경향으로부터, 보다 낮은 항원 밀도의 경우 조합 CAR이 증식 효능 측면에서 고전적 scCAR보다 훨씬 우수할 수 있다는 것을 추측할 수 있다.
도 6은 좌측에 고전적 scCAR(상단), 조합 Cα/β-CAR Cl6(중앙) 또는 조합 TCR-CAR Cl6 silCDR3α(하단)를 이용하는 증식성 T-세포의 빈도를 기재하고 있다. 우측에는, 모든 모 집단 및 딸 집단 중에서 공동수용체 CD8 및 공동자극 수용체 CD27에 대한 평균 강도에서 비특이적 결합(즉, 이소타입 결합)을 공제한 것이 도시되어 있다. T-세포를 CD8-특이적 항체로 염색하여, 조합 CAR 및 고전적 CAR에 대한 상기 공동수용체 마커의 중간 정도 및 거의 동일한 상향조절을 시각화하였다. 따라서, CD8-염색은 여기서 조사된 모든 CAR 중에서 이러한 '불활성' 분자의 동등한 조절을 강조하기 위해 표준화 마커로서 작용할 수 있다. 동시에, 이들을 상이한 CAR-형광 채널에서 공동자극 분자 CD27에 특이적인 항체로 염색하여 모든 CAR에 대한 모/딸 집단 G0-G6에서의 이의 조절을 추정하였다. 두 마커 모두 대략 2배 상향조절되고 추가로 CD8의 평균 발현이 모든 CAR에 대해 거의 동일하지만, CD27의 평균 발현은 고전적 CAR보다 조합 CAR 및 특히 사슬간-조합 TCR-CAR Cl6에서 훨씬 높았다. 생체내 T-세포의 장기간 지속성의 바이오마커인 CD27은 발현 수준이 G6에서 기저 수준으로 저하되기 전에 약한-증식성 T-세포(G2-G4)에 대해 훨씬 더 높은 플래토를 획득하였다. 이것으로부터, 조합 CAR-조작된 T-세포는 약한 증식성 집단에서 말기 분화된 고갈된 표현형(exhausted phenotype)(즉, 공동자극 분자의 하향조절)이 적을 수 있고, 따라서 생체내에서 더 오래 지속될 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 공동배양된 조합 CAR-전기천공된 T-세포의 크기(전방향 산란) 및 과립화(측면 산란)는 고전적 CAR(데이터 미도시)의 경우보다 훨씬 낮았다. 따라서, CD27의 더 높은 상향조절은 세포 표면의 증가에 의해 야기되지 않으며, 따라서 더 큰 표면상의 더 많은 CD27에 의해 야기된다.

Claims (33)

  1. 항원 수용체로서,
    상기 수용체는 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬을 포함하고,
    상기 제 1 펩티드 사슬은 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부, 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하고;
    상기 제 2 펩티드 사슬은 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부, 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하고;
    상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인 중 하나와 함께 제 1 항원 결합 부위를 형성하고,
    상기 제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 다른 도메인과 함께 제 2 항원 결합 부위를 형성하는, 항원 수용체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역수용체 신호전달 도메인이 T 세포 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역, 또는 상기 불변(constant) 또는 불변(invariant) 영역의 일부를 포함하는, 수용체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 펩티드 사슬이 제 1 및 제 2 도메인 사이, 및/또는 제 1 및 제 2 도메인 및 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 사이의 링커를 추가로 포함하는, 수용체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 링커가 임의의 아미노산 서열인, 수용체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 도메인이 각각 면역 글로불린 사슬의 가변 영역, 또는 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역, 또는 상기 가변 영역의 일부를 포함하는, 수용체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고,
    (ⅱ) 제 1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하고, 제 2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 수용체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역수용체 신호전달 도메인이 인간 기원인, 수용체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인은 항원 또는 이의 일부에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역을 포함하고,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인은 항원 또는 이의 일부에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역을 포함하는, 수용체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인은 항원 또는 이의 일부에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역을 포함하고,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인은 항원 또는 이의 일부에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역을 포함하는, 수용체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부위가 동일한 항원 또는 상이한 항원에 결합하는, 수용체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부위가 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합하는, 수용체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 질환-특이적 항원, 바람직하게는 종양 항원인, 수용체.
  13. 제 12 항에 있어서, 항원이 세포의 표면상에 발현되는 것인, 수용체.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 및 제 2 도메인은 각각 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고;
    제 2 펩티드 사슬로부터의 제 1 및 제 2 도메인은 각각 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 수용체.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 N-말단 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 N- 말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하고;
    제 1 펩티드 사슬로부터의 C-말단 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 C-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는, 수용체.
  16. 제 1 및 제 2 도메인을 포함하는 펩티드 사슬로서,
    상기 제 1 및 제 2 도메인은 각각 면역글로불린의 중쇄 가변 영역 또는 이의 일부, 또는 면역글로불린의 경쇄 가변 영역 또는 이의 일부를 포함하고,
    펩티드 사슬은 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 펩티드 사슬.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 제 1 펩티드 사슬, 제 2 펩티드 사슬 또는 제 1 및 제 2 펩티드 사슬 모두를 발현하는, 또는 제 16 항의 펩티드 사슬을 발현하는, 재조합 세포.
  18. 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법으로서,
    상기 수용체는 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬을 포함하고,
    상기 방법은
    (a) 세포를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부, 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하는 제 1 펩티드 사슬을 암호화(encoding)하는 제 1 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공하는 단계;
    (c) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인, T 세포 수용체 사슬의 가변 영역 또는 이의 일부 및 면역수용체 신호전달 도메인을 포함하는 제 2 펩티드 사슬을 암호화하는 제 2 유전자 컨스트럭트를 제공하는 단계;
    (d) 제 1 및 제 2 유전자 컨스트럭트를 세포내로 도입하는 단계; 및
    (e) 세포내에서 컨스트럭트가 발현되도록 하는 단계;를 포함하고,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 1 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 도메인 중 하나와 함께 제 1 항원 결합 부위를 형성할 수 있고,
    제 1 펩티드 사슬로부터의 제 2 도메인은 제 2 펩티드 사슬로부터의 다른 도메인과 함께 제 2 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 것인, 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 항원 수용체의 발현은 세포 표면에 있는 것인, 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 제 1 펩티드 사슬 및 제 2 펩티드 사슬은 단일 유전자 컨스트럭트 상에 제공되는 것인, 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것인, 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
  22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포인 것인, 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
  23. 제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는, 재조합 세포.
  24. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 제 1 펩티드 사슬, 제 2 펩티드 사슬, 또는 제 1 및 제 2 펩티드 사슬 모두를 암호화하거나, 제 16 항의 펩티드 사슬을 암호화하는 핵산.
  25. 제 24 항에 있어서, 핵산은 DNA 또는 RNA인 것인, 핵산,
  26. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 수용체, 제 17 항 또는 제 23 항의 재조합 세포, 또는 제 24 항 또는 제 25 항의 핵산; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 조성물은 의약으로서 사용되는 것인, 약학적 조성물.
  28. 제 26 항에 있어서, 항원 수용체에 의해 결합되는 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용되는 것인, 약학적 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 항원은 종양 항원인 것인, 약학적 조성물.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 질환은 암인 것인, 약학적 조성물.
  31. 제 26 항 기재의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 객체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법으로서, 상기 질환은 항원 수용체에 의해 결합되는 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하는 질환인 것인, 치료 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 항원은 종양 항원인 것인, 치료 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 질환은 암인 것인, 치료 방법.
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