KR102084173B1

KR102084173B1 - 항원 수용체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102084173B1
Application number: KR1020187010044A
Authority: KR
Inventors: 랄프 홀거 보스; 우거 사인; 마티아스 테오발트; 페트라 시몬; 마티아스 비르텔
Original assignee: 비온테크 쎌 & 제네 테라피스 게엠베하; 트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하
Priority date: 2015-10-07
Filing date: 2016-10-05
Publication date: 2020-03-03
Also published as: AU2016335217A8; RU2018112327A; PL3359563T3; WO2017059900A1; EP3359563B1; HUE046749T2; PT3359563T; DK3359563T3; IL258079A; IL258079B; CN108137673A; US20180282390A1; CN115536752A; EP3359563B8; RU2018112327A3; AU2016335217B2; CA2998450A1; CN108137673B; ZA201801607B; HK1255312A1

Abstract

본 발명은 일반적으로 세포 표면에서 항원을 발현하는 세포를 표적화하여 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 특히 본 발명은 재조합 항원 수용체 및 그의 용도에 관한 것이다. 이러한 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포는 항원 수용체에 의해 결합한 하나 이상의 항원의 발현이 특징인 질병의 치료에 유용하다.

Description

항원 수용체 및 그의 용도

본 발명은 재조합 항원 수용체 및 그의 용도에 관한 것이다. 이러한 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포는 항원 수용체에 결합한 하나 이상의 항원의 발현이 특징인 질병의 치료에 유용하다.

T 세포는 인간과 동물의 세포 매개 면역에 있어 중심적인 역할을 한다. 특정 항원의 인식 및 결합은 T 세포의 표면에 발현된 T 세포 수용체 (T cell receptors, TCRs)에 의해 매개된다. T 세포의 TCR은 주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC) 분자에 결합하고 표적 세포 (target cells)의 표면에 제시된 면역성 펩티드 (에피토프, epitopes)와 상호 작용할 수 있다. TCR의 특이적 결합은 T 세포 내의 신호 캐스캐이드를 유발하여 성숙한 이펙터 T 세포로의 증식 및 분화를 유도한다.

TCR은 TCR α- 및 β-사슬의 헤테로다이머 복합체, 공 수용체 CD4 또는 CD8 및 CD3 신호 전달 모듈을 포함하는 복합적 신호 전달 시스템의 일부이다 (도 1). 상기 TCR α/β 헤테로다이머는 항원 인식 및 CD3와 협력하여 세포막을 통한 활성화 신호의 전달을 담당하는 한편, CD3 사슬 자체는 들어오는 신호를 세포 내의 어댑터 단백질로 전달한다. 따라서, 상기 TCR α/β 사슬의 전달은 관심 있는 모든 항원을 향해 T 세포의 방향을 전환시키는 기회를 제공한다.

입양 세포 전송 (adoptive cell transfer, ACT) 기반의 면역 요법은 비면역 수용자 또는 낮은 전구체 빈도에서 임상적으로 관련된 세포 수로 체외 (ex vivo) 확장 이후 자가 숙주로 전달되는, 사전에 감작된 T 세포와 함께 수동 면역의 형태로 크게 정의될 수 있다. ACT 실험에 사용된 세포 유형에는 종양 특이적 T 세포주 또는 클론 (Dudley, M.E. 등 (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173) 뿐만 아니라 림포카인 활성 킬러 (lymphokine-activated killer, LAK) 세포 (Mule, J.J. 등 (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. 등 (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), 종양 침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) (Rosenberg, S.A. 등 (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), 조혈 줄기세포 이식 (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 후의 기증자 림프구가 포함된다. 입양 T 세포 전달은 CMV 등의 인간 바이러스 감염에 대해 치료 활성이 있는 것으로 나타났다. 흑색종의 입양 면역 요법에 대해 로젠버그와 그의 동료들은, 비 골수 절제식 림프 파괴 화학 요법 (non-myeloablative lymphodepleting chemotherapy) 및 고선량 IL2와 함께 절제된 종양으로부터 단리된 시험관 내 (in vitro) 확장된 자가 종양침윤 림프구 (TILs)의 주입에 의존하는 ACT 접근법을 확립했다. 임상 시험 결과 전이성 흑색종으로 고통받는 환자의 목적 반응 비율이 ~50%에 이르렀다 (Dudley, M.E. 등 (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).

또 다른 접근법은 단시간의 생체 외 (ex vivo) 배양 중 한정된 특이성을 가지는 종양 반응성 면역 수용체를 발현하도록 재프로그램된 자가 T 세포를 입양 전달 후 환자에게 재주입시키는 것이다 (Kershaw M.H. 등 (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). 이 전략은 종양 반응성 T 세포가 환자에게 없는 경우에도 ACT를 다양한 일반 악성 종양에 적용할 수 있게 한다. T 세포의 항원 특이성이 전적으로 TCR α- 및 β-사슬의 헤테로다이머 복합체에 있기 때문에, T 세포로 복제된 TCR 유전자의 전달은 관심 있는 모든 항원을 향해 그들의 방향을 전환시키는 가능성을 제공한다. 따라서, TCR 유전자 치료는 치료 옵션으로서 자가 림프구를 가진 항원 특이적 면역 요법을 개발하는데 매력적인 전략을 제공한다. TCR 유전자 전달의 주요 이점은 며칠 내에 항원 특이적 T 세포의 치료량을 생성하고 환자의 내인성 TCR 레퍼토리에 존재하지 않는 특이성을 도입할 수 있다는 것이다. 몇몇 그룹은 TCR 유전자 전달이 일차 T 세포의 항원 특이성을 전환시키는 매력적인 전략임을 입증했다 (Morgan, R.A. 등 (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. 등 (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. 등 (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. 등 (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. 등 (1986) Nature 320, 232-238). 인간에서의 TCR 유전자 치료의 가능성은 초기에 로젠버그와 그의 그룹에 의한 악성 흑색종의 치료를 위한 임상 시험에서 입증되었다. 흑색종 (melanoma)/멜라닌 세포 (melanocyte) 항원 특이적 TCR로 레트로바이러스 변환된 자가 림프구의 입양 전달은 치료를 받은 흑색종 환자의 30%까지 암 퇴행 를 일으켰다 (Morgan, R.A. 등 (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. 등 (2009) Blood 114, 535-546). 한편 TCR 유전자 치료의 임상 시험은 흑색종 외에도 많은 다양한 종양 항원을 표적으로 하는 암으로까지 확대되었다 (Park, T.S. 등, (2011) Trends Biotechnol. 29, 550-557).

특정 특이성의 항원 표적 수용체를 T 세포에 삽입하기 위한 유전 공학 접근법의 사용은 ACT의 잠재 능력을 크게 확장시켰다. 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptors, CARs)는 세포 외 항원-결합 도메인에 융합된 세포 내 T 세포 신호 전달 도메인, 가장 일반적으로는 단일 클론 항체로부터의 단일 사슬 가변 단편 (single-chain variable fragments, scFv's)으로 구성된 유형의 항원 표적 수용체이다. CARs는 MHC 매개의 제시와 독립적인 세포 표면 항원을 직접 인식하여, 모든 환자의 주어진 임의의 항원에 특이적인 단일 수용체 구조의 사용을 허용한다. 최초의 CARs는 항원 인식 도메인을 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 CD3ζ 활성화 사슬에 융합시켰다 (도 2). 그 이후의 CARs 반복은 CD28로부터의 세포 내 도메인 또는 4-1BB(CD137) 및 OX40(CD134) 등의 다양한 TNF 수용체 계열의 분자를 포함하는 CD3ζ와 더불어 이차적 공동 자극 신호를 포함한다. 또한, 3세대 수용체는 주로 CD28과 4-1BB로부터 유래한 CD3ζ 외에도 2가지 공동 자극 신호를 포함한다. 2 및 3세대 CARs은 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 항종양 효능을 현저히 향상시켰으며 (Zhao 등, (2009) J. Immunol., (183) 5563-5574), 일부 경우에는 진행된 암 환자의 완전완화를 유도했다 (Porter 등, (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733).

고전 CAR은 항원 특이적 단일 사슬 항체 (scFv) 단편으로 구성되어 있으며, 막 (transmembrane) 및 CD3ζ 등의 신호 전달 도메인에 융합되어 있다. T 세포로 도입시 이것은 막 결합 단백질로 발현되며 동족 항원에 결합시 면역 반응을 유도한다 (Eshhar 등, (1993) PNAS, (90) 720-724). 상기 유도된 항원 특이적 면역 반응은 종양 세포와 같이 특정 항원을 발현하는 세포 또는 특정 항원을 발현하는 바이러스 감염 세포의 박멸을 차례차례 유도하는 세포 독성 CD8+ T 세포의 활성화를 유도한다. 그러나 이러한 고전 CAR 구조는 T 세포 활성화에 일반적으로 필수적인 내인성 CD3 복합체를 통해 T 세포를 활성화/자극하지 않는다. CD3ζ과 항원 결합 도메인의 융합으로 인해, T 세포 활성화는 생화학적 "단락 (short circuit)"을 통해 유도된다 (Aggen 등, (2012) Gene Therapy, (19) 365-374). T 세포의 과다 활성화는 원치 않는 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 이러한 생화학적 단락을 통한 T 세포의 비생리적 활성화는 본 방식으로 치료받는 환자에게 위험하다. 예를 들어, CAR 발현으로 인한 재조합 T 세포의 장기 기초 활성화는 시험관 내에서 관찰되어 ("강장 신호 (tonic signaling)"), 재조합 CAR-발현 T 세포의 표면에 저해 분자, 예컨대 LAG-3, TIM-3 및 PD-1의 축적을 증가시켰으며, 결과적으로 생체 내 종양 세포에 대한 반응에 부정적인 영향을 강하게 유도하는 T 세포의 조기 소진을 차례차례 초래하였다 (Long 등, (2015) Nat. Med., (21) 581-590). 이러한 역반응은 이 항체의 뼈대 잔기를 통한 scFv-단편의 불규칙적인 클러스터링과 관련된다. 또한, 이러한 유형의 고전 CAR 구조는 백혈병 등의 다른 종양 형성에 대해 성공적으로 테스트 되었지만 (Porter 등, (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733), 정상 조직에서 표적이 된 항원 (표적이 된 종양 항원)의 기초 발현으로 인한 치명적인 자가 면역 질병 역시 초래하였다 (on-target/off-tumor-reaction; Morgan 등, (2010) Mol Ther., (18) 843-51).

보다 생리적인 기전을 통해 T 세포의 활성화가 일어나는 또 다른 접근법은 T 세포 수용체 (TCR)로부터 유래한 Cβ 불변 도메인에 융합된 유사 단일 사슬-TCR(scTv)-단편 및 TCR-유래의 Cα 불변 도메인과의 동시 발현이었으며 (Voss 등, (2010) Blood, (115) 5154-5163), 후자는 본질적인 내인성 CD3ζ 호모다이머를 모집한다 (Call 등, (2002) Cell, (111) 967-79.). 그러나 이러한 구조물이 면역 시스템 활성화제로서 기능하기 위해서는, TCR로부터 유래한 불변 도메인이 마우스 TCRs로부터 유래한 것이거나 scTCR 및 Cα 사이의 사슬 짝지음 (chain pairing)을 달성하기 위해 쥐화 (murinized; Cohen 등, (2006) Cancer Res., (66) 8878-86) 되는 것이 필수적이었다. 이러한 구조가 기능성을 위해 외인성 (exogenic) 서열을 가져야만 한다는 사실은 이들이 주입될 때 면역계가 반응할 위험을 증가시키고, 치료 효능을 감소시키거나 파괴한다.

따라서, 대체 재조합 항원 수용체, 예컨대 항원 결합시 내인성 CD3 복합체를 통해 보통의 생리적 방식으로 발현되는 T 세포를 충분히 활성화시킬 수 있는 수용체를 제공할 필요가 있으며, 선택적으로, 적어도 항원 수용체의 신호 전달 도메인에서 재조합 항원 수용체 자체에 대한 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있는 인간 기원이 것이 아닌 임의의 아미노산 서열의 존재에 대한 필요가 없다.

본 발명은 적어도 2개의 항원 결합 부위를 가지는 재조합 항원 수용체에 관한 것이다. 상기 항원 수용체는 2개의 펩티드 사슬을 포함한다. 한 측면에서, 상기 펩티드 사슬은 각각 면역 수용체 신호 전달 도메인 외에도 2개 이상의 도메인을 포함하며, 하나의 펩티드 사슬에 있는 2개의 도메인 각각은 다른 펩티드 사슬에 있는 도메인 중 하나와 항원 결합 부위를 형성한다. 또 다른 측면에서, 펩티드 사슬 중 하나는 면역 수용체 신호 전달 도메인에 외에도 4개 이상의 도메인을 가지며, 4개의 도메인 중 2개는 동일한 펩티드 사슬에 있는 나머지 2개의 도메인과 2개의 항원 결합 부위를 형성한다.

한 측면에서, 본 발명은 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체에 관한 것이고, 상기 제1 펩티드 사슬은 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하고, 상기 제2 펩티드 사슬은 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 제2 펩티드 사슬의 도메인 중 하나와 함께 제1 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 제2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 측면의 항원 수용체에서, 각각의 항원 결합 부위를 형성하는 상기 도메인은 서로 다른 펩티드 사슬에 위치하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 항원 결합 부위는 도메인의 분자 간 상호 작용에 의해 형성된다

한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 도메인은 각각 면역 글로불린 사슬의 가변 영역, 또는 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역, 또는 상기 가변 영역의 일부를 포함한다.

한 구체예에서, 제1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 중 하나는 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중(重)사슬의 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 부위를 형성하는 다른 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경(輕)사슬의 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 제2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 중 하나는 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 부위를 형성하는 다른 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 제2 펩티드 사슬의 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 경사슬의 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 제2 펩티드 사슬의 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 경사슬의 가변 영역을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬의 제1 및 제2 도메인은 각각 면역 글로불린 또는 그의 일부의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 제2 펩티드 사슬의 제1 및 제2 도메인은 각각 면역 글로불린 또는 그의 일부의 경사슬의 가변 영역을 포함한다.

한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬의 N-말단 도메인은 제2 펩티드 사슬의 N-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하고, 제1 펩티드 사슬의 C-말단 도메인은 제2 펩티드 사슬의 C-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.

한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬의 N-말단 도메인은 제2 펩티드 사슬의 C-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하고, 제1 펩티드 사슬의 C-말단 도메인은 제2 펩티드 사슬의 N-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.

한 측면에서, 본 발명은 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체에 관한 것으로, 상기 제1 펩티드 사슬은 적어도 4개의 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하고, 상기 제2 펩티드 사슬은 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 제1 펩티드 사슬의 2개의 도메인은 제1 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 다른 2개의 도메인은 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 측면의 항원 수용체에서, 각각의 항원 결합 부위를 형성하는 상기 도메인은 동일한 펩티드 사슬에 위치하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 항원 결합 부위는 도메인의 분자 내 상호 작용에 의해 형성된다.

한 구체예에서, 4개의 도메인은 각각 면역 글로불린 사슬의 가변 영역, 또는 T 세포 수용체 사슬의 가변 영역, 또는 상기 가변 영역의 일부를 포함한다.

한 구체예에서, 제1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 중 하나는 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 부위를 형성하는 다른 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 제2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 중 하나는 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 부위를 형성하는 다른 도메인은 항원 또는 그의 일부에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역을 포함한다.

한 구체예에서, 4개의 도메인의 2개의 N-말단 도메인은 함께 항원 결합 부위를 형성하고, 4개의 도메인의 2개의 C-말단 도메인은 함께 항원 결합 부위를 형성한다.

한 구체예에서, 4개의 도메인의 2개의 N-말단 도메인 중 하나는 면역 글로불린 또는 그의 일부의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 4개의 도메인의 2개의 N-말단 도메인 중 다른 하나는 면역 글로불린 또는 그의 일부의 경사슬의 가변 영역을 포함하며, 4개의 도메인의 2개의 C-말단 도메인 중 하나는 면역 글로불린 또는 그의 일부의 중사슬의 가변 영역을 포함하고, 4개의 도메인의 2개의 C-말단 도메인 중 다른 하나는 면역 글로불린 또는 그의 일부의 경사슬의 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 항원 수용체의 한 구체예에서, 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은 T 세포 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 상기 불변 또는 고정 영역의 일부을 포함한다. 본 발명의 항원 수용체의 한 구체예에서, (i) 제1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하고 제2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 제1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하고 제2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함한다.

본 발명의 항원 수용체의 한 구체예에서, 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은 인간 기원의 것이다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 항원 수용체의 도메인을 연결하는 링커(들)을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 사이 및/또는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인 사이에 하나 이상의 링커를 포함한다. 상기 링커는 항원 수용체의 기능, 예컨대 항원 수용체가 항원에 결합하거나 내인성 CD3 복합체와 결합하는 능력을 방해하지 않거나, 또는 항원 수용체가 항원 결합시 면역 반응을 유도하는 능력을 방해하지 않을 정도로 긴 임의의 길이의 임의의 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명의 항원 수용체의 한 구체예에서, 제1 및 제2 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 항원에 결합한다. 본 발명의 항원 수용체의 한 구체예에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 부위는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다. 결과적으로, 제1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 동일한 면역 글로불린으로부터 유래하는 것이 바람직하고 제2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 동일한 면역 글로불린으로부터 유래하는 것이 바람직하지만, 제1 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 및 제2 항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 동일하거나 상이한 면역 글로불린으로부터 유래하며, 상기 상이한 면역 글로불린은 동일하거나 상이한 항원에 결합한다.

한 구체예에서, 상기 항원은 질병 특이적 항원, 바람직하게는 종양 항원이다. 한 구체예에서, 상기 항원은 세포의 표면에서 발현된다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 항원 수용체의 펩티드 사슬에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명은 각각 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하거나 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 제1 및 제2 도메인을 포함하고, 면역 수용체 신호 전달 도메인을 추가로 포함하는 펩티드 사슬에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명은 적어도 4개의 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 펩티드 사슬에 관한 것이며, 상기 펩티드 사슬의 2개의 도메인은 제1 항원 결합 부위를 형성하고, 펩티드 사슬의 다른 2개의 도메인은 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 본 발명의 펩티드 사슬의 다른 구체예는 본 발명의 항원 수용체에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 세포, 특히 T 세포 등의 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체의 제1 펩티드 사슬, 제2 펩티드 사슬 또는 제1 및 제2 펩티드 사슬 모두를 발현하거나, 또는 본 발명의 펩티드 사슬을 발현하는 재조합 세포, 특히 T 세포 등의 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포 또는 재조합 세포의 다른 구체예는 본 발명의 항원 수용체 또는 본 발명의 펩티드 사슬에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 세포를 제공하는 단계, (b) 본 발명의 항원 수용체의 제1 펩티드 사슬을 코딩하는 제1 유전자 구조물을 제공하는 단계, (c) 본 발명의 항원 수용체의 제2 펩티드 사슬을 코딩하는 제2 유전자 구조물을 제공하는 단계, (d) 상기 세포에 제1 및 제2 유전자 구조물을 도입하는 단계 및 (e) 상기 구조물이 세포 내에서 발현되도록 허용하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 세포를 제공하는 단계, (b) 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제1 펩티드 사슬을 코딩하는 제1 유전자 구조물을 제공하는 단계, (c) 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제2 펩티드 사슬을 코딩하는 제2 유전자 구조물을 제공하는 단계 (d) 상기 세포에 제1 및 제2 유전자 구조물을 도입하는 단계 및 (e) 상기 구조물이 세포 내에서 발현되도록 허용하는 단계를 포함하며, 상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 제2 펩티드 사슬의 도메인 중 하나와 함께 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 제2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 세포를 제공하는 단계, (b) 적어도 4개의 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제1 펩티드 사슬을 코딩하는 제1 유전자 구조물을 제공하는 단계, (c) 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제2 펩티드 사슬을 코딩하는 제2 유전자 구조물을 제공하는 단계, (d) 상기 세포에 제1 및 제2 유전자 구조물을 도입하는 단계 및 (e) 상기 구조물이 세포 내에서 발현되도록 허용하는 단계를 포함하며, 상기 제1 펩티드 사슬의 2개의 도메인은 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, 상기 제1 펩티드 사슬의 다른 2개의 도메인은 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 항원 수용체의 발현은 세포 표면에서 일어난다. 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬은 단일 유전자 구조물상에 제공된다. 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 상기 세포는 T 세포 등의 면역 이펙터 세포이다. 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 상기 유전자 구조물은 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 본 발명의 방법의 다른 구체예는 본 발명의 항원 수용체에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같다.

한 측면에서, 본 발명은 항원 수용체를 발현하는 세포의 생산을 위한 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 세포, 특히 T 세포 등의 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 세포의 다른 구체예는 본 발명의 항원 수용체 또는 항원 수용체를 발현하는 세포의 생산을 위한 본 발명의 방법에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체의 제1 펩티드 사슬, 제2 펩티드 사슬 또는 제1 및 제2 펩티드 사슬 모두를 코딩하거나 본 발명의 펩티드 사슬을 코딩하는 DNA 또는 RNA 등의 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 핵산의 다른 구체예는 본 발명의 항원 수용체 또는 본 발명의 펩티드 사슬에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같다.

본 발명은 일반적으로 본 발명의 항원 수용체를 이용하여 세포 표면에 하나 이상의 항원을 발현하는 세포, 예컨대 세포 표면에 하나 이상의 질병 특이적 항원을 발현하는 질병 세포, 특히 세포 표면에 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암세포를 표적화하는 질병의 치료를 포함한다. 상기 방법은 표면에 하나 이상의 항원을 발현하는 세포의 선택적 박멸을 제공함으로써, 항원(들)을 발현하지 않는 정상 세포에 대한 역효과를 최소화한다. 한 구체예에서, 항원(들)에 대한 결합을 통해 세포를 표적화하는 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포가 투여된다. T 세포는 세포 표면에 항원(들)을 발현하는 질병 세포를 인식할 수 있어, 질병 세포의 박멸을 초래한다. 한 구체예에서, 상기 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직이다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체, 본 발명의 재조합 세포, 또는 본 발명의 핵산과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 본 발명의 약학 조성물은 의약으로서, 본 발명의 항원 수용체에 의해 결합하는 하나 이상의 항원, 특히 종양 항원의 발현이 특징인 암 등의 질병의 치료에 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물의 치료상 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원 수용체에 의해 결합하는 하나 이상의 항원, 예컨대 종양 항원의 발현이 특징인 암 등의 질병의 치료 방법에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 항원의 발현 또는 상승된 발현과 관련된 질병, 장애 또는 증상이 있는 대상의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 적어도 하나의 항원을 표적으로 하는 본 발명의 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 암이다. 한 구체예에서, 상기 T 세포는 대상에게 자가 (autologous), 동종 (allogeneic) 또는 동계 (syngeneic)일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 항원 수용체는 오직 하나의 항원에 결합하거나 (예를 들어, 단일 특이성이면서 동일한 에피토프를 인식하거나, 또는 이중 특이성 또는 다중 특이성이면서 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식함으로써), 또는 상이한 항원, 특히 2개의 다른 항원에 결합한다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 치료 방법은 대상으로부터 T 세포 또는 T 세포 전구세포를 포함하는 세포 샘플을 수득하는 단계 및 상기 세포를 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포를 제공하기 위해 본 발명의 항원 수용체를 코딩하는 핵산으로 트랜스펙션시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 상기 T 세포는 안정적으로 또는 일시적으로 항원 수용체를 코딩하는 핵산으로 트랜스펙션된다. 따라서, 상기 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 T 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않는다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 T 세포 및/또는 세포 샘플은 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포가 주입된 대상으로부터 유래한 것이다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 T 세포 및/또는 상기 세포 샘플은 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포가 주입된 포유류와 다른 포유류로부터 유래한 것이다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위해 불활성화된다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 항원은 암세포 등의 질병 세포에서 발현된다. 한 구체예에서, 항원은 암세포 등의 질병 세포의 표면에서 발현된다. 한 구체예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인 또는 항원의 세포외 도메인에 있는 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 항원 수용체는 살아있는 세포의 표면에 존재하는 항원의 천연 에피토프에 결합한다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 항원은 종양 항원이다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 항원은 클라우딘6 및 클라우딘18.2 등의 클라우딘, CD19, CD20, CD22, CD33, CD123, 메소틸렌 (mesothelin), CEA, c-Met, PSMA, GD-2, 및 NY-ESO-1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 항원은 병원균 항원이다. 상기 병원균는 진균성 (fungal), 바이러스성 (viral), 또는 박테리아성 (bacterial) 병원균일 수 있다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 상기 항원의 발현은 상기 세포 표면에서 일어난다. 한 구체예에서 항원은 클라우딘, 특히 클라우딘6 또는 클라우딘18.2이고, 상기 항원 수용체는 상기 클라우딘의 제1 세포 외 루프에 결합한다. 한 구체예에서, T 세포에 의해 발현되는 경우 및/또는 T 세포상에 존재하는 경우 상기 항원 수용체의 세포상 존재하는 항원에 대한 결합은 사이토카인의 방출 등 상기 T 세포의 면역 이펙터 기능을 초래한다. 한 구체예에서, T 세포에 의해 발현되는 경우 및/또는 T 세포상에 존재하는 경우 상기 항원 수용체의, 항원 제시 세포 등 세포상 존재하는 항원에 대한 결합은 상기 T 세포의 자극, 프라이밍 및/또는 팽창을 초래한다. 한 구체예에서, T 세포에 의해 발현되는 경우 및/또는 T 세포상에 존재하는 경우 상기 항원 수용체의, 암세포 등의 질병 세포상 존재하는 항원에 대한 결합은 질병 세포의 세포 용해 및/또는 세포 자멸사를 초래하고, 상기 T 세포는 예컨대 퍼포린 (perforins) 및 그랜자임 (granzymes) 등의 세포독성 인자를 방출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 상기 항원 수용체의 도메인은 항원 수용체의 엑소도메인에 포함된다. 본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 막 횡단 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 막 횡단 도메인은 막을 가로지르는 소수성 알파 나선이다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 초기 단백질을 소포체 (endoplasmic reticulum)로 향하게 하는 신호 펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 신호 펩티드는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인에 선행한다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 바람직하게는 특히 질병 세포 또는 항원 제시 세포의 표면에 존재하는 경우 표적화되는 항원에 특이적이다.

본 발명의 모든 측면의 한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 T 세포, 바람직하게는 세포 독성 T 세포에 의해 발현 및/또는 T 세포 표면에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 T 세포는 본 발명의 항원 수용체가 표적화되는 항원(들)에 대해 반응성을 가진다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 물질 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명과 청구범위로부터 명백해질 것이다.

하기에 상세히 기술되지만, 본 발명은 다양할 수 있으므로, 본 발명이 본 명세서에서 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 오로지 특정 구체예를 설명하기 위한 것으로, 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.

다음에서, 본 발명의 구성 요소에 대해 기술할 것이다. 이들 요소는 특정 구체예와 함께 열거되지만, 추가적인 구체예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해하여야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 바람직한 구체예는 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예들로 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 설명은 명시적으로 기술된 구체예와 임의의 수로 개시된 및/또는 바람직한 요소를 결합하는 구체예를 지지하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 본 출원에서 기술된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 고려되어야 한다.

바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Kφlbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland에서 설명한대로 정의된다.

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 본 기술 분야의 문헌에서 설명되는 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook 등 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참조).

후속하는 본 명세서와 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다"란 단어 및 "포함한다"와 "포함하는" 등의 변형은 명시된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하고, 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계를 배제하지 않지만, 몇몇 구체예에서는 상기 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹이 배제될 수 있다는 뜻으로 이해될 것이며, 즉 주어가 명시된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹의 포함으로 구성된다는 것을 의미한다. 본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용된 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 참조는 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위의 설명은 단지 범위 내에 속하는 각 분리된 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법의 역할을 하기 위한 것이다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 각 개별적인 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용한 것처럼 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예시, 또는 예시적 언어 (예를 들어, "등의")의 사용은, 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이고, 달리 청구된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인, 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 여러 문헌이 인용되었다. 본 명세서에서 인용된 각각의 문헌은 (모든 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체 사양, 지침, 등), 상기 또는 하기에 무관하게, 그 전체가 참조로서 포함된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

"면역 반응"이란 용어는 항원에 대한 통합적인 신체 반응을 의미하며 바람직하게는 세포성 면역 반응 또는 세포성 뿐만 아니라 체액성 면역 반응도 뜻한다. 상기 면역 반응은 보호적/방지적/예방적/ 및/또는 치료적일 수 있다.

"면역 반응 제공"은 면역 반응을 제공하기 전 특정 표적 항원, 표적 세포 및/또는 표적 조직에 대한 면역 반응이 없었음을 의미할 수도 있지만, 면역 반응을 제공하기 전 특정 표적 항원, 표적 세포 및/또는 표적 조직에 대한 특정 수준의 면역 반응이 있었고 면역 반응의 제공 후 상기 면역 반응이 강화되었음을 의미할 수도 있다. 따라서, "면역 반응 제공"은 "면역 반응 유도" 및 "면역 반응 강화"를 포함한다. 바람직하게는, 대상에 면역 반응을 제공한 후에, 상기 대상은 암 질환 등의 질병의 발병으로부터 보호되거나, 면역 반응을 제공함으로써 질병의 상태가 완화된다. 예를 들어, 종양 항원에 대한 면역 반응은 암 질환을 앓고 있는 대상 또는 암 질환이 발병할 위험에 처한 대상에 제공될 수 있다. 이 경우 면역 반응의 제공은 대상의 질병 상태가 완화되고, 전이를 일으키지 않거나, 또는 암 질환이 발병할 위험이 있는 대상에게 암 질환이 발병하지 않을 수 있음을 의미할 수 있다.

"세포 매개 면역" 또는 "세포성 면역", 또는 유사한 용어는 항원의 발현이 특징인, 특히 class I 또는 class II MHC로 항원을 제시하는 것이 특징인 세포에 대한 세포성 반응을 포함하는 의미이다. 상기 세포성 반응은 "헬퍼" 또는 "킬러"의 역할을 하는 T 세포 또는 T 림프구로 불리는 세포와 관련된다. 상기 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 하고, 상기 킬러 T 세포 (세포 독성 T 세포, 세포 용해성 T 세포, CD8⁺ T 세포 또는 CTLs라고도 함)는 암세포 등의 질병 세포를 죽여 더 많은 질병 세포의 생성을 막는다.

"항원"이란 용어는 면역 반응이 발생 및/또는 유도되는 에피토프를 포함하는 물질과 관련된다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 항원은, 가공 후 임의로, 항원 또는 항원을 발현하는 세포, 바람직하게는 세포의 표면에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. "항원"이란 용어는 특히 단백질과 펩티드를 포함한다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 상응하거나 이로부터 유래한 생성물이다. 이러한 자연 발생 항원은 알레르겐, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 기타 감염 인자와 병원균를 포함하거나 이로부터 유래할 수 있고, 또는 항원은 종양 항원일 수도 있다. 본 발명에 따르면, 항원은 자연 발생 생성물, 예를 들어 바이러스성 단백질, 또는 그의 일부에 상응할 수 있다.

"병원균"이란 용어는 병원성 미생물과 관련이 있으며 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 단세포 생물 및 기생충을 포함한다. 병원성 바이러스의 예시로는 인간 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV), 거대 세포 바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 헤르페스 바이러스 (herpes virus, HSV), A형 간염 바이러스 (hepatitis A-virus, HAV), HBV, HCV, 유두종 바이러스 (papilloma virus) 및 인간 T-백혈병 바이러스 (human T-lymphotrophic virus, HTLV)를 포함한다. 단세포 생물은 말라리아원충 (plasmodia), 트리파노소마 (trypanosomes), 아메바 (amoeba) 등을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 항원은 질병 특이적 항원 또는 질병 관련 항원이다. "질병 특이적 항원" 또는 "질병 관련 항원"이란 용어는 병리학적으로 중요한 모든 항원을 의미한다. 한 특히 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 건강한 세포, 조직 및/또는 기관에 감소된 양으로 존재하거나 존재하지 않지만, 질병 세포, 조직 및/또는 기관에 존재하며, 따라서, 예컨대 항원에 표적화된 항원 수용체가 있는 T 세포에 의해 질병 세포, 조직 및/또는 기관을 표적화하는데 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 항원은 종양 항원 또는 종양 관련 항원이며, 즉, 세포질, 세포 표면 및 세포핵으로부터 유래할 수 있는 암세포의 구성 요소이고, 특히 상기 항원은 암세포 상의 표면 항원과 같이, 많은 양으로 생성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 문맥상, "종양 항원" 또는 "종양 관련 항원"이란 용어는 제한된 수의 조직 및/또는 기관 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질과 관련되며, 예를 들어, 상기 종양 항원은 위 조직, 바람직하게는 위 점막에서, 고환 등의 생식 기관에서, 태반 등의 영양 융모 조직에서 또는 생식 세포에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있을 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현될 수 있다. 이러한 문맥상, "제한된 수"는 바람직하게는 3개 이하, 더 바람직하게는 2개 이하를 의미한다. 본 발명의 문맥상 상기 종양 항원은 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질인 세포 유형 특이적 분화 항원, 고환 및 때때로 태반에서 특이적으로 발현되는 정상 조건 하에 있는 단백질인 암/고환 항원, 및 생식선 특이적 항원을 포함한다. 본 발명의 문맥상, 상기 종양 항원은 바람직하게는 암세포의 세포 표면과 관련되며 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 미약하게 발현된다. 바람직하게는, 상기 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적인 발현은 암세포를 확인하게 한다. 본 발명의 문맥상, 대상, 예컨대 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암세포에 의해 발현되는 상기 종양 항원은 상기 대상에서의 자가 단백질인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 문맥상 상기 종양 항원은 정상 조건 하에서, 특히 비필수 조직 또는 기관, 즉 면역계에 의해 손상되었을 때 대상의 죽음을 초래하지 않는 조직 또는 기관에서 발현되거나, 또는 면역계에 의해 전혀 접근할 수 없거나 거의 접근할 수 없는 신체의 장기 또는 구조물에서 발현된다. 바람직하게는, 정상 조직에서 발현되는 종양 항원과 암 조직에서 발현되는 종양 항원 사이에서 아미노산 서열은 동일하다.

본 발명에서 유용할 수 있는 종양 항원의 예시는 p53, ART-4, BAGE, beta-catenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질, 예컨대 클라우딘-6, 클라우딘-18.2 및 클라우딘-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너 BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT이다. 특히 바람직한 종양 항원은 클라우딘-18.2 (CLDN18.2)과 클라우딘-6 (CLDN6)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바과 같이 "CLDN" 또는 간단히 "Cl"이란 용어는 클라우딘을 의미하고 CLDN6과 CLDN18.2를 포함한다. 바람직하게는, 클라우딘은 인간 클라우딘이다. 클라우딘은 상피 세포의 사이의 세포 간 공간에서 분자의 흐름을 조절하는 세포 간 장벽을 만드는, 타이트정션의 가장 중요한 구성 요소인 단백질 계열에 속한다. 클라우딘은 N-말단과 C-말단의 끝이 모두 세포질에 위치하는 막을 4번 가로지르는 막 횡단 단백질이다. EC1 또는 ECL1으로 명명된 첫 번째 세포 외 루프는 평균 53개의 아미노산으로 구성되고, EC2 또는 ECL2로 명명된 두 번째 세포 외 루프는 약 24개의 아미노산으로 구성된다. 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질은 다양한 기원의 종양에서 발현되고, 그 선택적 발현 (독성 관련 정상 조직에서는 발현되지 않음) 및 원형질막에 국한된 특성 때문에 표적 암 면역 요법과 관련하여 표적 구조로서 특히 적합하다.

CLDN6과 CLDN18.2는 종양 조직에서 상이하게 발현되는 것으로 확인되었는데, CLDN18.2를 발현하는 유일한 정상 조직은 위이고 (위 점막의 분화된 상피 세포) CLDN6을 발현하는 유일한 정상 조직은 태반이다.

CLDN18.2는 췌장암, 식도암, 위암, 기관지암, 유방암 및 ENT 종양 등 다양한 기원의 암에서 발현된다. CLDN18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 비소세포폐 (NSCLC) 등의 폐암, 난소암, 대장암, 간암, 두경부암 및 담낭암 등의 원발성 종양 및 이들의 전이, 특히 크루켄베르그 종양 (Krukenberg tumors) 등의 위암 전이, 복막 전이 및 림프절 전이의 예방 및/또는 치료를 위한 중요한 표적이다. 적어도 CLDN18.2를 표적으로 하는 항원 수용체는 이러한 암 질환의 치료에 유용하다.

CLDN6은 예를 들어, 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 신장 세포 암 및 방광암에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. CLDN6은 난소암, 특히 난소 선암과 난소 기형암, 소세포폐암 (SCLC)과 비소세포폐암 (NSCLC) 등의 폐암, 특히 편평상피성 폐암과 폐선암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저 세포암과 편평 세포암, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형성 선종, 육종, 특히 윤활막육종과 암육종, 담관암, 방광암, 특히 이행 세포암과 유두암, 신장암, 특히 투명 세포 신장 세포 암과 유두상 신장 세포암 등의 신장 세포암, 대장암, 회장암 등의 소장암, 특히 소장 선암과 회장 선암, 고환 배아암, 태반 융모암, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형종과 배아 고환암, 자궁암, 기형암종 또는 태생성 암종 등의 생식 세포종, 특히 고환의 생식 세포종 및 이들의 전이 형태의 예방 및/또는 치료에 특히 바람직한 표적이다. 적어도 CLDN6을 표적으로 하는 항원 수용체는 이러한 암 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 구체예의 문맥상, 항원은 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포 또는 질병 세포의 표면에 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 항원 수용체에 의해 결합하는 경우 항원은 바람직하게는 항원에 결합하는 항원 수용체가 있는 T 세포의 자극, 프라이밍 및/또는 팽창을 적절한 공동 자극 신호의 존재 하 임의로 유도할 수 있다. 질병 세포 표면의 항원의 인식은 항원 (또는 항원을 발현하는 세포)에 대한 면역 반응을 초래할 수 있다.

본 발명의 다양한 측면에 따르면, 본 발명은 종양 항원 등의 항원을 발현하는 질병 세포, 특히 CLDN6 또는 CLDN18.2 등의 항원을 발현하는 암세포에 대한 면역 반응을 제공하고, 종양 항원 등의 항원을 발현하는 세포를 포함하는 암 질환 등의 질병을 치료하는 것에 그 목적이 있다. 바람직하게는 본 발명은 항원을 발현하는 질병 세포를 표적으로 하는 T 세포 등의 항원 수용체-조작된 면역 이펙터 세포의 투여를 포함한다. 표면에 항원을 발현하는 세포는 항원을 표적으로 하는 항원 수용체가 있는 면역 이펙터 세포에 의해 표적화될 수 있다.

"세포 표면"은 본 기술 분야의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자에 의한 결합이 가능한 세포의 바깥 부분을 포함한다. 항원은 상기 세포의 표면에 위치하고, 세포에 첨가된 항원 수용체 또는 항원 특이적 항체 등의 항원 결합 분자에 의한 결합이 가능한 경우 세포의 표면에서 발현된다. 한 구체예에서, 세포의 표면에서 발현된 항원은 항원 수용체에 의해 인식되는 세포 외 부분이 있는 내재막 단백질이다. 항원 수용체는 상기 세포의 표면에 위치하고, 예컨대 항원 수용체 특이적인 세포에 첨가된 항원에 의한 결합이 가능한 경우 세포의 표면에서 발현된다. 한 구체예에서, 세포의 표면에서 발현된 항원 수용체는 항원을 인식하는 세포 외 부분이 있는 내재막 단백질이다.

본 발명의 문맥상 "세포 외 부분" 또는 "엑소도메인"이란 용어는 세포의 세포 외 공간을 마주하고, 바람직하게는 예컨대, 세포 외부에 위치한 항체 등의 분자와 결합하는 등 상기 세포의 외부로부터 접근 가능한 단백질 등의 분자의 일부를 의미한다. 바람직하게는, 상기 용어는 하나 이상의 세포 외 루프 또는 도메인 또는 그 단편을 의미한다.

"부분" 또는 "일부"란 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고 아미노산 서열과 같은 구조의 연속적 또는 불연속적 요소를 의미한다. "단편"이란 용어는 아미노산 서열과 같은 구조의 연속적 요소를 의미한다. 구조의 부분, 일부 또는 단편은 바람직하게는 상기 구조의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 항원성, 면역성 및/또는 결합하는 특성을 포함한다. 단백질 서열의 부분 또는 일부는 바람직하게는 6개 이상, 특히 8개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 단백질 서열의 연속 아미노산을 포함한다.

본 발명에 따르면, 항원은 발현 수준이 검출 한계에 미치지 못하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 항원 특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 너무 낮은 경우 세포에서 (실질적으로) 발현되지 않는다. 본 발명에 따르면, 항원은 발현 수준이 검출 한계를 넘어서는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 항원 특이적 항체에 의한 결합을 허용할 정도로 충분히 높은 경우 세포에서 발현된다. 바람직하게는, 세포에서 발현된 항원은 상기 세포의 표면에서 발현되거나 노출, 즉 존재하며, 따라서 세포에 첨가된 항체 또는 항원 수용체와 같은 항원 특이적 분자에 의한 결합이 가능하다.

"표적 세포"는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응의 표적이 되는 세포를 의미한다. 표적 세포는 암세포 등 임의의 바람직하지 않은 세포를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 표적 세포는 표적 항원, 특히 바람직하게는 세포 표면에 존재하는 질병 특이적 항원인 표적 항원을 발현하는 세포이다.

"에피토프"란 용어는 항원과 같은 분자, 즉 면역계에 의해 인식된, 즉 결합한, 예컨대 항체 또는 항원 수용체에 의해 인식되는 분자의 일부 또는 단편 내의 항원결정기를 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 면역계에 의해 인식되는 항원의 분리된 3차원적 부위이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 설탕 곁사슬과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되어 있으며 일반적으로 특정 3차원적 구조의 특성 뿐만 아니라 특정 전하의 특성도 가진다. 구조적 및 비구조적 에피토프는 변성 용매의 존재 하 후자와 달리 전자에 대한 결합을 잃는다는 점에서 구별된다. 바람직하게는 에피토프는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 상기 용어는 항원의 면역성 부분과 관련된다. 종양 항원과 같은 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하고 바람직하게는 5개 내지 100개 사이, 바람직하게는 5개 내지 50개 사이, 더욱 바람직하게는 8개 내지 30개 사이, 더더욱 바람직하게는 10개 내지 25개 사이 길이의 아미노산이고, 예를 들어 상기 에피토프는 바람직하게는 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 길이의 아미노산일 수 있다.

"항원 처리"는 항원의 그 단편인 가공 생성물로의 분해 (예를 들어, 단백질의 펩티드로의 분해)를 의미하고, 세포의 제시, 바람직하게는 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포의 제시를 위한 이들 단편 중 하나 이상과 MHC 분자와의 연관 (예를 들어, 결합을 통해)을 의미한다.

항원 제시 세포 (APC)는 표면에 주조직 적합성 복합체 (MHC)와 관련하여 항원을 나타내는 세포이다. T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이 복합체를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포는 항원을 처리하고 T 세포에게 이를 제시한다. 본 발명에 따르면, "항원 제시 세포"란 용어는 전문적 항원 제시 세포 및 비전문적 항원 제시 세포를 포함한다.

전문적 항원 제시 세포는 식균 작용 또는 수용체 매개 세포 내 섭취에 의해 항원을 내재화하고, 이들의 막 상에서 class Ⅱ MHC 분자에 결합한 항원의 단편을 나타내는데 매우 효율적이다. 상기 T 세포는 항원 제시 세포막 상의 항원-class Ⅱ MHC 분자 복합체를 인식하고 상호 작용한다. 항원 제시 세포에 의해 추가적인 공동 자극 신호가 생성되고, T 세포의 활성화가 초래된다. 공동 자극 분자의 발현은 전문적 항원 제시 세포의 특징이다. 전문적 항원 제시 세포의 주요 유형은 가장 넓은 범위로 항원을 제시하는 수지상 세포이고, 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포는 대식세포, B 세포, 및 특정 활성화된 상피 세포이다.

비전문적 항원 제시 세포는 천연 T 세포와 상호 작용을 위해 요구되는 MHC class Ⅱ 단백질을 실질적으로 발현하지 않으며, 이들은 IFNγ 등의 특정 사이토카인에 의한 비전문적 항원 제시 세포의 자극시에만 발현된다.

수지상 세포 (DCs)는 MHC class Ⅱ 및 I 항원 제시 경로 모두를 통해 말초 조직에서 T 세포로 포획된 항원을 나타내는 백혈구 집단이다. 수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도제이며 이들 세포의 활성화가 항종양 면역의 유도에 중요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포 및 전구 세포는 말초 혈액, 골수, 종양 침윤 세포, 종양 부근 조직 침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 임의의 다른 적합한 조직 또는 유체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFa 등의 사이토카인의 조합을 말초 혈액으로부터 채취한 단핵 백혈구의 배양 조직에 첨가함으로써 생체 외에서 분화될 수 있다. 대안적으로, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 채취한 CD34 양성 세포는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 다른 조성물(들)의 조합을 배양 배지에 첨가함으로써 분화될 수 있다. 수지상 세포는 "미숙" 및 "성숙" 세포로 간편하게 분류되며, 이는 두 가지의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나 이 명명법은 가능한 모든 분화의 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미숙 수지상 세포는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 관련된, 항원 섭취 및 처리에 대한 높은 능력이 있는 항원 제시 세포로 특징지어진다. 상기 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커의 낮은 발현, 그러나 class I 및 class II MHC, 접합분자 (예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공동 자극 분자 (예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB) 등의 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현을 특징으로 한다. 수지상 세포 성숙은 항원 제시 수지상 세포가 T 세포 프라이밍을 유도하는 한편, 미숙 수지상 세포에 의한 제시가 내성을 초래하는 수지상 세포 활성화 상태로 지칭된다. 수지상 세포 성숙은 선천적 수용체 (박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 전 염증성 사이토카인 (TNF, IL-1, IFNs), CD40L에 의한 수지상 세포 표면의 CD40의 결합 및 스트레스성 세포사를 겪는 세포로부터 방출된 물질에 의해 검출되는 미생물적 특징을 가지는 생체 분자에 의해 주로 야기된다. 상기 수지상 세포는 시험관 내에서 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파 등의 사이토카인으로 골수를 배양함으로써 유도될 수 있다.

"면역원성"이란 용어는 면역 반응을 유도하기 위한 항원의 상대적인 효율성과 관련된다.

본 발명의 문맥상 "면역 이펙터 기능"이란 용어는, 예를 들어 종양 세포 등의 질병 세포의 제거, 또는 종양 성장의 억제, 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 포함하는 종양 발달의 억제를 초래하는 면역계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 상기 면역 이펙터 기능은 T 세포 매개 이펙터 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 (CD4⁺T 세포)의 경우 인터류킨-2 등의 사이토카인의 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTLs) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우 세포, 즉 항원의 발현이 특징인, 예를 들어, 세포 자멸사 또는 퍼포린 매개 세포 용해를 통한 세포의 제거, IFN-γ 및 TNF-α 등의 사이토카인의 생산, 및 표적 세포를 발현하는 항원의 특정 세포 용해성 제거를 포함한다.

본 발명의 문맥상 "면역 반응성 세포" 또는 "면역 이펙터 세포"란 용어는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포와 관련된다. "면역 반응성 세포"는 바람직하게는 세포의 표면에서 발현되는 항원 등의 항원을 결합시킬 수 있고 면역 반응을 매개할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 미생물을 죽이고, 항체를 분비하고, 감염되거나 암에 걸린 세포를 인식하고, 선택적으로 이러한 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역 반응성 세포는 T 세포 (세포 독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 킬러 세포, 호중구, 대식 세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상, "면역 반응성 세포"는 T 세포, 바람직하게는 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포이다. 본 발명에 따르면, "면역 반응성 세포"란 용어는 또한 적절한 자극으로 면역 세포 (예컨대 T 세포, 특히 T 헬퍼 세포, 또는 세포 용해성 T 세포)로 성숙될 수 있는 세포를 포함한다. 면역 반응성 세포는 CD34⁺ 조혈 줄기세포, 미숙 및 성숙 T 세포, 및 미숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. 항원에 노출되었을 때, T 세포 전구체가 세포 용해성 T 세포로 분화되는 것은 면역계의 클론 선택과 유사하다.

바람직하게는, "면역 반응성 세포" 또는 "면역 이펙터 세포"가 특히 항원 제시 세포 또는 암세포 등의 질병 세포의 표면에 존재하는 경우, 어느 정도의 특이성으로 항원을 인식한다. 바람직하게는, 상기 인식은 항원을 인식하는 상기 세포로 하여금 반응성 (responsive 또는 reactive)이 되도록 한다. 상기 세포가 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포)인 경우 이러한 반응성은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTLs) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함할 수 있다. 상기 세포가 CTL인 경우 이러한 반응성은 세포, 즉 항원의 발현이 특징인 세포, 예를 들어 세포 자멸사 또는 퍼포린-매개 세포 용해를 통한 세포의 제거를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, CTL 반응성은 지속적인 칼슘 플럭스, 세포 분열, IFN-γ 및 TNF-α 등의 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69 등의 활성화 마커의 상향조절, 및 표적 세포를 발현하는 항원의 특이적 세포 용해성 제거를 포함할 수 있다. CTL 반응성은 또한 CTL 반응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 측정될 수 있다. 항원을 인식하고 반응성이 있는 이러한 CTL은 본 명세서에서 "항원 반응성 CTL"이라고도 명명된다.

"림프계 세포 (lymphoid cell)"는 임의의 적합한 변형 후, 예를 들어 T 세포 수용체 또는 항원 수용체의 전달 후에 세포성 면역 반응 등의 면역 반응 또는 이러한 세포의 전구 세포의 생성이 가능하고, 림프구, 바람직하게는 T 림프구, 림프아세포 및 형질 세포를 포함한다. 림프계 세포는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 면역 반응성 세포 또는 면역 이펙터 세포일 수 있다. 바람직한 림프계 세포는 세포 표면에 T 세포 수용체 또는 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있는 T 세포이다. 한 구체예에서, 상기 림프계 세포는 T 세포 수용체의 내인성 발현이 결여되어 있다.

"T 세포" 및 "T 림프구"란 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포 (CD4⁺ T 세포) 및 세포 용해성 T 세포를 포함하는 세포 독성 T 세포 (CLLs, CD8⁺ T 세포)를 포함한다.

T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 군에 속하며, 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 한다. 이들은 T 세포 수용체 (TCR)로 불리는 세포 표면의 특별한 수용체의 존재를 통해 B 세포 및 자연 킬러 세포 등의 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 주요 기관이다. T 세포의 몇몇 상이한 서브 세트가 발견되었고, 각각은 구별되는 기능을 가진다.

T 헬퍼 세포는 여러가지 기능 중에서도, B 세포의 형질 세포로의 성숙 및 세포 독성 T 세포와 대식 세포의 활성화를 비롯한 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는다. 이들 세포는 표면에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 알려져있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APCs)의 표면에서 발현된 MHC class Ⅱ 분자에 의해 펩티드 항원으로 제시되었을 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들은 빠르게 분열하고 활성 면역 반응을 조절하거나 돕는 사이토카인으로 불리는 작은 단백질을 분비한다.

세포 독성 T 세포는 바이러스 감염 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 이식 거부 반응에도 영향을 미친다. 이들 세포는 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포 표면에 존재하는 MHC class Ⅰ과 관련된 항원에 결합함으로써 표적을 인식한다.

다수의 T 세포에는 여러 단백질의 복합체로 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)가 존재한다. 상기 실제 T 세포 수용체는 독립 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생산되고 α- 및 β-TCR 사슬로 불리는 2개의 분리된 펩티드 사슬로 구성되어 있다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 표면에 뚜렷한 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있는 T 세포의 작은 부분을 나타낸다. 그러나 γδ T 세포에서, 상기 TCR은 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다. 이들 T 세포의 군은 αβ T 세포보다 훨씬 드물다 (총 T 세포의 2%).

모든 T 세포는 골수의 조혈 줄기세포로부터 기원한다. 조혈 줄기세포로부터 유래한 조혈 전구 세포는 흉선에 거주하며, 미숙 흉선 세포의 많은 개체군을 생성하기 위한 세포분열에 의해 팽창한다. 가장 초기의 흉선 세포는 CD4 와 CD8를 모두 발현하지 않으며, 따라서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 이들은 발달 단계를 거치면서 이중-양성 흉선 세포 (CD4+CD8+)가 되고, 최종적으로 흉선에서 말초 조직으로 방출되는 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선 세포로 성숙한다.

T 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관 내 또는 생체 외에서 제조될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 상업적으로 이용 가능한 세포 분리 시스템을 사용하여 환자 등의 포유류의 골수, 말초 혈액 또는 골수, 말초 혈액의 일부로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 관련되거나 관련이 없는 인간, 비인간 동물, 세포주 또는 배지로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, T 세포를 포함하는 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체를 발현할 수 있거나 내인성 T 세포 수용체의 발현이 결여될 수 있다.

항원 수용체를 코딩하는 RNA 등의 핵산은 T 세포 또는 용혈성 잠재능 (lytic potential) 을 가지는 다른 세포, 특히 림프계 세포로 도입될 수 있다.

"항원을 표적으로 하는 항원 수용체"란 용어 또는 이와 유사한 용어는 항원 수용체가 T 세포 등의 면역 이펙터 세포상에 존재할 때, 항원 제시 세포 또는 암세포 등의 질병 세포의 표면 항원을 인식하는 항원 수용체과 관련이 있으며, 면역 이펙터 세포는 전술한 바와 같이 자극, 프라임 및/또는 팽창되거나 면역 이펙터 세포의 이펙터 기능을 발휘한다.

"항원-특이적 T 세포"란 용어 또는 이와 유사한 용어는 특히 T 세포가 항원 수용체와 제공될 때, 항원 수용체가 표적화하는 항원, 예컨대 항원 제시 세포 또는 암세포 등의 질병 세포의 표면 항원을 인식하는 T 세포, 바람직하게는 전술한 바와 같이 T 세포의 이펙터 기능을 발휘하는 T 세포와 관련된다. T 세포 및 다른 림프계 세포는 항원을 발현하는 표적 세포를 제거하는 경우 항원에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 예를 들어, 크롬 방출 분석 또는 증식 분석 등의 임의의 다양한 표준 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 림포카인 (예컨대 인터페론-γ)의 합성이 측정될 수 있다.

"주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex)" 및 그 약어 "MHC"란 용어는 MHC class I 및 MHC class II 분자를 포함하고 모든 척추동물에서 발생하는 유전자의 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병 세포 사이의 신호 전달에 중요하며, 여기서 상기 MHC 단백질 또는 분자는 펩티드를 결합시키고 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이를 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질은 세포 표면에서 발현되며, T 세포에 자체 항원 (세포 자체의 펩티드 단편)과 비자체 항원 (예를 들어, 침입 미생물의 단편)을 모두 나타낸다.

본 발명에 따르면, "항원 수용체"란 용어는 단일 클론 항체의 T 세포 등의 면역 이펙터 세포에 대한 특이성 등의 임의의 특이성을 부여하는 조작된 수용체를 포함한다. 이러한 방식으로, 다수의 항원 특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 수용체는, 예를 들어 T 세포 자신의 T 세포 수용체 대신 또는 이에 더하여 T 세포상에 존재할 수 있다. 이러한 T 세포는 표적 세포의 인식을 위한 항원의 프로세싱 및 제시를 필수적으로 요하지 않고, 오히려 바람직하게는 표적 세포상에 존재하는 임의의 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 수용체는 세포 표면에서 발현된다. 본 발명의 목적상, 항원 수용체를 포함하는 T 세포는 본 명세서에서 사용되는 "T 세포"라는 용어에 포함된다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, "항원 수용체"라는 용어는 암세포 등의 표적 세포상의 표적 구조 (예를 들어, 항원)를 인식, 즉 결합하고 (예를 들어, 항원 결합 부위 또는 항원 결합 도메인을 표적 세포의 표면에서 발현된 항원에 결합시킴으로써), 세포 표면의 상기 항원 수용체를 발현하는 T 세포 등의 면역 이펙터 세포상에 대한 특이성을 부여할 수 있는 단일 분자 또는 분자의 복합체를 포함하는 인공 수용체를 포함한다. 바람직하게는, 항원 수용체에 의한 표적 구조의 인식은 상기 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포의 활성화를 초래한다. 항원 수용체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 도메인을 포함하는 상기 단백질 단위를 하나 이상 포함할 수 있다. "항원 수용체"란 용어는 바람직하게는 T 세포 수용체를 포함하지 않는다. 본 발명에 따르면, "항원 수용체"란 용어는 바람직하게는 "키메라 항원 수용체 (CAR)", "키메라 T 세포 수용체" 및 "인공 T 세포 수용체"란 용어와 동의어이다.

본 발명에 따라, 항원은 항체의 항원-결합 부분 및 동일하거나 상이한 펩티드 사슬에 있을 수 있는 T 세포 수용체를 통해 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 임의의 항원 인식 도메인 (본 명세서에서 간단히 "도메인"으로도 지칭됨)을 통해 항원 수용체에 의해 인식될 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 도메인은 면역 글로불린으로부터 유래한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 도메인은 T 세포 수용체로부터 유래한다. 단일 클론 항체 및 T 세포 수용체 가변 도메인, 특히 TCR 알파 및 베타 단일 사슬로부터 유래한 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 등의 항체 가변 도메인이 특히 바람직하다. 실제로, 높은 친화도로 주어진 표적을 결합시키는 거의 모든 것이 항원 인식 도메인으로 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체는 2개 이상의 결합 부위를 형성하는 4개 이상의 면역 글로불린 가변 도메인을 포함하며, 상기 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이 에피토프는 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항원 수용체는 제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬 (VH)의 가변 도메인 (또는 영역) (VH(1)), 제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬 (VL)의 가변 도메인 (또는 영역) (VL(1)), 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬 (VH)의 가변 도메인 (또는 영역) (VH(2)), 및 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬 (VL)의 가변 도메인 (또는 영역) (VL(2))을 포함하고, 상기 제1 및 제2 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있으며 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 한 구체예에서, VH(1)은 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있으며 VH(2)는 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 반면, VH(1)은 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없으며 VH(2)는 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없다. 그러나 또 다른 구체예에서, VH(1)은 VL(1)뿐만 아니라 VL(2)와도 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있으며 VH(2)는 VL(2)뿐만 아니라 VL(1)과도 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 후자의 구체예에서, VH(1) 및 VH(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역 글로불린으로부터 유래할 수 있고 VL(1) 및 VL(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역 글로불린으로부터 유래할 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는, 본 명세서에서 결합적 항원 수용체로도 지칭되는 항원 수용체에 관한 것으로, 상기 제1 펩티드 사슬은 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하고, 상기 제2 펩티드 사슬은 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 도메인 중 하나와 함께 제1 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.

한 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체는 두 펩티드 사슬 각각의 경사슬 가변 도메인에 연결된 중사슬 가변 도메인을 포함하며, 여기에서 상이한 펩티드 사슬의 중사슬 가변 도메인과 경사슬 가변 도메인 사이의 상호 작용을 통해 2개의 항원 결합 부위의 형성이 일어난다. 한 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체는 한 펩티드드 사슬이 VL(1) 및 VH(2)를 포함하고 다른 폴리펩티드 사슬이 VH(1) 및 VL(2)를 포함하는 2개의 펩티드 사슬을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체는 한 펩티드 사슬의 중사슬 가변 도메인에 연결된 중사슬 가변 도메인 및 다른 펩티드 사슬의 경사슬 가변 도메인에 연결된 경사슬 가변 도메인을 포함하고, 여기에서 상이한 펩티드 사슬의 중사슬 가변 도메인과 경사슬 가변 도메인 사이의 상호 작용을 통해 2개의 항원 결합 부위의 형성이 일어난다. 한 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체는 한 펩티드 사슬이 VH(1) 및 VH(2)를 포함하고 다른 펩티드 사슬이 VL(1) 및 VL(2)를 포함하는 2개의 펩티드 사슬을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체는 중사슬 가변 영역 (VH) 및 사슬 가변 영역 (VL)이 N-말단에서 C-말단으로, VH(1)-VL(2)의 순서로 바람직하게 배열된 제1 펩티드 사슬 및 중사슬 가변 영역 (VH) 및 사슬 가변 영역 (VL)이 N-말단에서 C-말단으로, VL(1)-VH(2)의 순서로 바람직하게 배열된 제2 펩티드 사슬을 포함한다. 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은 바람직하게는 가변 영역의 배열에 대해 C-말단에 위치하고 바람직하게는 펩티드 사슬 중 하나에 위치한 T 세포 수용체 알파 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역 및 다른 펩티드 사슬에 위치한 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체는 중사슬 가변 영역 (VH) 및 사슬 가변 영역 (VL)이 N-말단에서 C-말단으로, VH(1)-VH(2)의 순서로 바람직하게 배열된 제1 펩티드 사슬 및 중사슬 가변 영역 (VH) 및 사슬 가변 영역 (VL)이 N-말단에서 C-말단으로, VL(1)-VL(2)의 순서로 바람직하게 배열된 제2 펩티드 사슬을 포함한다. 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은 바람직하게는 가변 영역의 배열에 대해 C-말단에 위치하고 바람직하게는 펩티드 사슬 중 하나에 위치한 T 세포 수용체 알파 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역 및 다른 펩티드 사슬에 위치한 T 세포 수용체 베타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는, 본 명세서에서 탠덤 항원 수용체로도 명명된 항원 수용체에 관한 것으로, 상기 제1 펩티드 사슬은 적어도 4개의 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하고, 상기 제2 펩티드 사슬은 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 제1 펩티드 사슬의 2개의 도메인은 제1 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 다른 2개의 도메인은 제2 항원 결합 부위를 형성한다.

한 구체예에서, 본 발명의 탠덤 항원 수용체는 제1 펩티드 사슬의 경사슬 가변 도메인에 연결된 추가의 중사슬 가변 도메인에 연결된 경사슬 가변 도메인에 연결된 중사슬 가변 도메인을 포함하며, 여기에서 동일한 펩티드 사슬의 중사슬 가변 도메인과 경사슬 가변 도메인 사이의 상호 작용을 통해 2개의 항원 결합 부위의 형성이 일어난다. 따라서, 제1 펩티드 사슬은 동일한 펩티드 사슬에 VH(1) 및 VL(1)뿐만 아니라 VH(2) 및 VL(2)도 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 탠덤 항원 수용체는 제1 펩티드 사슬에 링커 펩티드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 탠덤 항원 수용체는 중사슬 가변 영역 (VH) 및 경사슬 가변 영역 (VL)이 N-말단에서 C-말단으로, VH(1)-VL(1)-VH(2)-VL(2), VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2), VH(1)-VL(1)-VL(2)-VH(2), 또는 VL(1)-VH(1)-VL(2)-VH(2)의 순서로 바람직하게 배열된 제1 펩티드 사슬을 포함한다. 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은 바람직하게는 가변 영역의 배열에 대해 C-말단에 위치하고 바람직하게는 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부, 또는 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 제2 펩티드 사슬에 위치한 면역 수용체 신호 전달 도메인은 바람직하게는 제1 펩티드 사슬이 T 세포 베타 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 경우 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부, 또는 제1 펩티드 사슬이 T 세포 알파 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 경우 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함한다.

본 발명의 항원 수용체는 2개 이상의 항원 결합 부위를 가지고, 따라서 적어도 2가이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 항원 수용체의 결합 부위는 동일하거나 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이 에피토프는 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 상기 결합 부위가 특히 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 경우, 2개의 결합 부위는 동일하거나 실질적으로 동일 및/또는 동일하거나 실질적으로 동일한 도메인에 의해 형성될 수 있으며, 상기 동일하거나 실질적으로 동일한 도메인은 예를 들어, 동일한 면역 글로불린으로부터 유래할 수 있다. 상기 결합 부위가 동일하거나 상이한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 한 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 2개의 결합 부위는 상이하고 상이한 도메인에 의해 형성되며, 상기 상이한 도메인은 상이한 면역 글로불린으로부터 유래할 수 있다. 이러한 상이한 도메인의 경우에서, 상이한 에피토프에 대한 특이성이 있는 도메인은 서로 상호 작용하지 않거나 또는 실질적으로 상호 작용하지 않는 것이 바람직하며, 즉 VH(1)은 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없고, VH(2)는 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없다. 결과적으로, VH(1)은 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성하며 VH(2)는 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성한다. 본 발명의 결합적 항원 수용체가 한 펩티드 사슬이 VH(1) 및 VL(2)를 포함하고 다른 펩티드 사슬이 VH(2) 및 VL(1)을 포함하는 2개의 펩티드 사슬을 포함하는 경우, 이는 펩티드 사슬이 도메인의 분자 내 상호 작용을 통해 항원 결합 부위를 형성할 수 없게 한다.

항원 결합 부위를 형성하는 본 발명의 항원 수용체의 2개의 도메인은 또한 T 세포 수용체로부터 유래할 수 있으며, 항원 특이적 결합, 특히 펩티드-MHC 복합체, 예컨대 T 세포 수용체의 가변 영역에 대한 결합을 유지하는 단편 또는 그의 일부일 수 있다.

본 발명에 따르면, "T 세포 수용체의 가변 영역"이란 용어는 TCR 사슬의 가변 도메인에 관한 것이다. TCR α-사슬 및 β-사슬 모두의 가변 영역은 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions, CDRs)을 가지는 반면, β-사슬의 가변 영역은 항원과 정상적으로 접촉하지 않는 추가적인 초가변 영역 (HV4)을 가지며, 따라서 CDR로 간주되지 않는다. CDR3은 처리된 항원을 인식하는 주요 CDR이지만, α-사슬의 CDR1은 항원 펩티드의 N-말단 부분과 상호 작용하는 것으로 나타난 반면, β-사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호 작용한다. 펩티드. CDR2는 MHC를 인식하는 것으로 생각된다. β-사슬의 CDR4는 항원 인식에 관여하는 것으로 생각되지 않지만, 초항원과 상호 작용하는 것으로 나타났다.

면역 글로불린 가변 도메인에 관한 상기 개시는 T 세포 수용체 가변 도메인에 상응하는 방식으로 적용된다.

제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬 (VH)의 가변 도메인 (VH(1)) 및 제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬 (VL)의 가변 도메인 (VL(1)) 대신에 본 발명의 항원 수용체는 제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 TCR의 TCR α-사슬의 가변 도메인 및 제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 TCR의 TCR β-사슬의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬 (VH)의 가변 도메인 (VH(2)) 및 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬 (VL) 의 가변 도메인 (VL(2)) 대신에 본 발명의 항원 수용체는 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 TCR의 TCR α-사슬의 가변 도메인 및 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 TCR의 TCR β-사슬의 가변 도메인을 포함할 수 있다.

각각의 항원 결합 부위가 2개의 도메인으로부터 형성되기 때문에, 각각의 도메인은 면역 글로불린 또는 T 세포 수용체의 부분 또는 단편을 개별적으로 포함할 수 있다. 개별 부분 또는 단편만으로는 항원에 결합할 수 없지만 2개의 개별 부분 또는 단편이 결합하여 이들이 원래의 면역 글로불린 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 구조를 형성하거나 재현할 때, 따라서 이들은 동일한 항원에, 바람직하게는 동일한 친화도로 결합할 수 있다.

항원 인식 후, 수용체들은 바람직하게는 모이고 신호는 세포로 전달된다. 이와 관련하여, "면역 수용체 신호 전달 도메인" 또는 "T 세포 신호 도메인"은 항원이 결합한 후에 T 세포에 활성화 신호를 전달하는 데 관여하는 도메인이다. 이러한 신호 전달은 하나의 펩티드 사슬의 T 세포 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 등의 불변 또는 고정 영역 또는 그의 일부를 포함하고, 다른 펩티드 사슬의 상응하는 T 세포 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 상응하는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 등의 불변 또는 고정 영역 또는 그의 일부를 포함하는 본 발명의 항원 수용체에 의해 가능해질 수 있다. 이와 관련하여, CD3 복합체는 다중 분자 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 일부로서 성숙 인간 T 세포, 흉선 세포 및 자연 살해 세포의 서브 세트에서 발현되는 항원을 나타낸다. 상기 T 세포 보조 수용체는 단백질 복합체이며 4개의 뚜렷한 사슬로 구성된다. 포유류에서, 상기 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 포함한다. 이러한 사슬은 T 세포 수용체 (TCR) 및 ζ-사슬과 결합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. 상기 TCR, ζ-사슬 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 구성한다. CD3는 상기 TCR의 신호 전달을 담당한다. Lin 및 Weiss, Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001)에 기술된 바와 같이, MHC-제시된 특이적 항원 에피토프의 결합에 의한 TCR 복합체의 활성화는 Src 계 키나아제에 의한 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs)의 인산화를 초래하여, Ca² ⁺ 방출을 포함한 T 세포 활성화를 초래하는 추가적 키나아제의 모집을 유발한다. CD3의, 예를 들어 항-CD3-항체에 의한 고정화에 의한 T 세포에서의 모임은 T 세포 수용체의 결합과 유사하지만, 클론의 전형적인 특이성으로부터 독립적인 T 세포 활성화를 야기한다.

바람직하게는 항원 수용체 신호 전달 도메인은 적어도 천연 세포 신호 전달 복합체, 예를 들어 항원 수용체에 결합하는 항원의 신호를 세포 내로 전달하는 역할을 하는 CD3 복합체와 상호 작용하여 면역 세포 활성화를 초래한다. 신호 전달 도메인의 정체는 항원 수용체에 대한 항원의 결합시 면역 세포의 활성화를 유도하기 위해 천연 신호 전달 복합체와 상호 작용하는 능력을 가진다는 점에서만 한정된다.

바람직하게는, 하나의 펩티드 사슬의 신호 전달 도메인은 예를 들어, 이황화 결합을 통해 제2 사슬의 신호 전달 도메인과 다이머를 형성할 것이다. 바람직한 신호 전달 도메인은 T 세포 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 상기 불변 또는 고정 영역의 일부를 포함할 수 있다. 바람직한 신호 전달 도메인은 T 세포 수용체 또는 그의 일부의 알파, 베타, 감마 또는 델타 사슬의 불변 영역뿐만 아니라, 면역 세포 Fc 수용체 또는 그의 일부의 불변 도메인의 D2 또는 D3 고정부를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제1 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 알파 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하고 제2 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 베타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하거나, 또는 제1 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 베타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하고 제2 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 알파 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제1 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 감마 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하고 제2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 델타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하거나, 제1 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 델타 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함하고 제2 펩티드 사슬이 T 세포 수용체 감마 사슬 또는 그의 일부의 불변 영역을 포함한다. 선택적으로, 상기 신호 전달 도메인은 사슬 간의 추가적인 이황화 결합이 생성되어 보다 효과적인 다이머 형성 및 다이머의 보다 큰 안정도을 유도하도록 변형될 수 있다.

특정 작용 메커니즘에 한정되기를 원하지 않더라도, 면역 세포의 표면에서 발현될 때, 본 발명의 항원 수용체의 2개의 펩티드 사슬은 적어도 2개의 사슬의 개별 면역 수용체 신호 전달 도메인 사이에서 상호 작용 (예를 들어, 이황화 결합)에 의한 다이머를 형성할 뿐만 아니라 생리적 T 세포 수용체 신호 전달에 관여하는 내인성 CD3 복합체와 복합체를 형성한다. 그러나 본 발명은 또한 TCR Cα 및 Cβ-도메인 대신에 CD3ξ 또는 임의의 다른 면역 세포 신호 전달 도메인 (CD3, CD3 서브유닛 FcγR)에 대한 직접 융합을 포함할 수 있다. 항원 결합시 면역 세포의 활성화 및 항원-특이적 면역 반응의 생성을 유도하며 신호가 세포 내로 전달되는 것으로 여겨진다. 또한, 사슬 간 항원 결합은 보다 안정한 항원-항원 수용체-내인성 CD3 신호 전달 모듈을 제공하며, 안정성이 더 높아질 경우, 사슬 내 항원 결합만이 가능한 1가 수용체 및 2가 수용체와 비교하여 항원-특이적 면역 반응의 보다 효과적인 자극이 가능해진다. 이러한 더 큰 안정성은 또한 인간 유래 면역 수용체 신호 전달 도메인 (예를 들어, 마우스 등의 다른 종으로부터 유래한 아미노산 서열을 가지는 인간 유래 아미노산 서열의 최소한의 치환 또는 치환되지 않은)만을 사용할 수 있는 선택을 가능하게 한다고 믿어진다. 따라서, 항원 수용체 자체에 대한 임의의 잠재적인 원치 않는 면역 반응을 피할 수 있다.

본 발명에 따른 항원 수용체 또는 그의 펩티드 사슬은 항원 결합 부위를 형성하는 도메인 및 CD3ξ 또는 임의의 다른 면역 세포 신호 전달 도메인을 포함하는 면역 수용체 신호 전달 도메인은 하나 이상의 공동 자극 도메인 또한 포함할 수 있다. 상기 공동 자극 도메인은 표적화된 부분에 대한 항원 수용체의 결합시 세포 독성 T 세포 등의 T 세포의 증식 및 생존을 향상시키는 역할을 한다. 공동 자극 도메인의 정체는 항원 수용체에 의한 표적화된 부분의 결합시 세포 증식 및 생존을 향상시키는 능력이 있다는 점에서만 제한된다. 적절한 공동 자극 도메인은 CD28, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 과의 구성원인 CD137(4-1BB), 수용체의 TNFR-상과 (superfamily)의 구성원인 CD134(OX40), 및 활성화된 T 세포상에 발현되는 CD28-상과 공동 자극 분자인 CD278(ICOS)를 포함한다. 당업자는 이들 언급된 공동 자극 도메인의 서열 변이체가 본 발명에 악영향을 미치지 않고 사용될 수 있음을 이해할 것이며, 상기 변이체는 모델링된 도메인과 동일하거나 유사한 활성을 가진다. 이러한 변이체는 이들이 유래한 도메인의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상일 것이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 항원 수용체 구조물 또는 그의 펩티드 사슬은 2개의 공동 자극 도메인을 포함한다. 특정 조합이 4개의 언급된 도메인의 모든 가능한 변형을 포함하는 한편, 구체적인 예시는 CD28+CD137 (4-1BB) 및 CD28+CD134 (OX40)를 포함한다.

본 발명의 항원 수용체 또는 그의 펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된 하나 이상의 공동 자극 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 그러나 본 발명의 항원 수용체 또는 그의 펩티드 사슬은 이러한 배열에 제한되지 않고 다른 배열도 허용 가능하며, 면역 수용체 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공동 자극 도메인을 포함한다.

항원 결합 부위를 형성하는 도메인은 항원에 자유롭게 결합해야 하기 때문에, 융합 단백질에 이들 도메인을 배치하는 것은 일반적으로 세포 외부의 영역 표시가 달성될 것이라는 사실이 이해될 것이다. 동일한 방식으로, 공동 자극 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인이 T 세포의 활성 및 증식을 유도하는 역할을 하기 때문에, 상기 융합 단백질은 일반적으로 세포의 내부에 이들 도메인을 표시할 것이다. 상기 항원 수용체는 세포 표면에 융합 단백질의 적절한 수출을 보장하기 위한 신호 펩티드, 융합 단백질이 필수적인 막 단백질로서 유지되도록 하는 막 횡단 도메인, 및 항원 결합 부위를 형성하는 도메인에 유연성을 부여하고 항원에 강한 결합을 허용하는 힌지 도메인 (또는 스페이서 영역) 등의 추가적인 요소를 포함할 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 항원 수용체는 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 링커는 아미노산 서열 사이의 스페이서로서 유용한 임의의 아미노산 서열 또는 다른 화학적 화합물일 수 있다. 상기 링커는 일반적으로 유연성 및 프로테아제 내성을 제공하도록 설계된다. 예를 들어, 상기 링커는 본 발명의 결합적 항원 수용체의 제1 펩티드 사슬의 제1 및 제2 도메인 사이 및/또는 제2 펩티드 사슬의 제1 및 제2 도메인 사이에 존재할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 링커는 본 발명의 탠덤 항원 수용체의 제1 펩티드 사슬의 4개 이상의 도메인 중 임의의 2개 사이, 즉 제1 및 제2 도메인 사이 및/또는 제2 및 제3 도메인 사이 및/또는 제3 및 제4 도메인 사이에 존재할 수 있다. 선택적으로, 상기 링커는 항원 결합 부위를 형성하는 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인 사이에 존재할 수 있다. 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 허용하거나 항원 결합을 방해하지 않는 본 기술 분야에 공지된 임의의 유형의 링커가 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 상기 링커는 임의의 아미노산 서열일 수 있고, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 적어도 100개 이상 길이의 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 링커는 전형적으로 유연성을 위한 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 용해성을 위한 세린 및 트레오닌도 풍부하다. 한 구체예에서, 상기 링커는 세린 잔기 (Gly4Ser)가 뒤따르는 4개의 글리신 잔기의 하나 이상 (1,2,3,4,5,6,7,8 또는 9)의 반복이다. 특정 구체예에서, 상기 링커는 항체의 힌지 영역 또는 그의 단편일 수 있다.

본 발명의 항원 수용체는 고전 막 횡단 도메인 등 막 상에 항원 수용체를 고정하는 다른 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 막 횡단 도메인은 신호 전달 도메인에 통합되거나 그의 일부이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항원 수용체 또는 항원 수용체의 펩티드 사슬은, 면역 수용체 신호 전달 도메인의 일부인 경우가 아니라면, 항원 결합, 막 결합 발현 또는 분비를 위한 신호 서열에 관여하거나 향상시키는 추가적인 도메인, 개선된 다이머화를 제공하는 도메인 및 막 횡단 도메인 등의 다른 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 막 횡단 도메인은 막을 가로지르는 소수성 알파 나선 일 수 있다.

바람직하게는, 신호 서열 또는 신호 펩티드는 항원 수용체가, 예를 들어 세포 외 환경에 존재하는 항원에 결합할 수 있는 세포 표면에서의 분비 경로 및 발현을 통해 충분한 통과를 허용하는 서열 또는 펩티드이다. 바람직하게는, 상기 신호 서열 또는 신호 펩티드는 절단 가능하고 성숙한 펩티드 사슬로부터 제거된다. 상기 신호 서열 또는 신호 펩티드는 바람직하게는 펩티드 사슬이 생성되는 세포 또는 유기체에 관하여 선택된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 결합적 항원 수용체의 펩티드 사슬은 NH2-신호 펩티드-항원 결합에 관여하는 제1 도메인-선택적 링커-항원 결합에 관여하는 제2 도메인-선택적 링커-면역 수용체 신호 전달 도메인-COOH의 구조를 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 탠덤 항원 수용체의 제1 펩티드 사슬은 NH2-신호 펩티드-항원 결합에 관여하는 제1 도메인-선택적 링커-항원 결합에 관여하는 제2 도메인-선택적 링커-항원 결합에 관여하는 제3 도메인-선택적 링커-항원 결합에 관여하는 제4 도메인-선택적 링커-면역 수용체 신호 전달 도메인-COOH의 구조를 포함할 수 있다.

본 발명의 탠덤 항원 수용체와 관련하여, 본 명세서에서 제1 펩티드 사슬의 항원 결합 부위의 형성과 관련된 제1 및 제2 (N-말단으로부터 C-말단으로의) 도메인은 또한 "N-말단 도메인"으로 지칭되며, 제1 펩티드 사슬의 항원 결합 부위의 형성과 관련된 제3 및 제4 (N-말단으로부터 C-말단으로의) 도메인은 또한 "C-말단 도메인"으로 지칭된다.

본 발명의 예시적인 항원 수용체는 하기 표 1에 열거된 구조를 가지는 제1 및 제2 펩티드 사슬에 의해 형성된 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 (VH는 면역 글로불린 또는 그의 일부의 중사슬 가변 영역, VL은 면역 글로불린 또는 그의 일부의 경사슬의 가변 영역, C1 및 C2는 서로 다이머를 형성할 면역 수용체 신호 전달 도메인, 예를 들어 면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 T 세포 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는 불면 또는 고정 영역의 일부이다):

제1 펩티드 사슬	제2 펩티드 사슬
VH(1)-VL(2)-C1	VL(1)-VH(2)-C2
VH(1)-VH(2)-C1	VL(1)-VL(2)-C2
VH(1)-VH(2)-C1	VL(2)-VL(1)-C2
VH(1)-VL(2)-C1	VH(2)-VL(1)-C2
VH(1)-VL(1)-VH(2)-VL(2)-C1	C2
VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2)-C1	C2
VH(1)-VL(1)-VL(2)-VH(2)-C1	C2
VL(1)-VH(1)-VL(2)-VH(2)-C1	C2

상기에서 정의된 바와 같이, 항원 수용체는 제1 에피토프에 대한 특이성이 있 면역 글로불린의 중사슬 (VH)의 가변 도메인 (VH(1)), 제1 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬 (VL)의 가변 도메인 (VL(1)), 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬 (VH)의 가변 도메인 (VH(2)), 및 제2 에피토프에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬 (VL)의 가변 도메인 (VL(2))을 포함하며, 상기 제1 및 제2 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있고 동일하거나 상이한 항원에 위치할 수 있다. 한 구체예에서, VH(1)은 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, VH(2)는 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 반면, VH(1)은 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없고, VH(2)는 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 없다. 그러나 또 다른 구체예에서, VH(1)은 VL(1) 뿐만 아니라 VL(2)와 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, VH(2)는 VL(2) 뿐만 아니라 VL(1)과 상호 작용하고 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 후자의 구체예에서, VH(1) 및 VH(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역 글로불린으로부터 유래한 것일 수 있고 VL(1) 및 VL(2)는 동일하거나 적어도 동일한 면역 글로불린으로부터 유래한 것일 수 있다.

구체적인 실시예에서, 표 1에 열거된 제1 및 제2 펩티드 사슬의 C1 및 C2 도메인은 각각 T 세포 수용체 알파 및 베타 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부이다.

바람직한 구체예에서, 한 펩티드 사슬의 2개의 도메인이 모두 면역 글로불린 중사슬 가변 영역 또는 그의 일부이고 다른 사슬의 2개의 도메인이 모두 면역 글로불린 경사슬 가변 영역 또는 그의 일부인 경우, 링커는 두 펩티드 사슬 모두의 제1 및 제2 도메인 사이에 존재한다. 상기 링커는 10개 내지 25개 길이의 아미노산, 더욱 바람직하게는 15개 길이의 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 구체적인 구체예에서, 상기 링커는 5-mer 아미노산 서열 (Gly4Ser)의 3 번 반복이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 예컨대 항원 결합 부위를 형성하는 하나 이상의 도메인 또는 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제1 및 제2 펩티드 사슬의 상기 아미노산 서열은 포유류 기원, 바람직하게는 마우스 기원, 보다 바람직하게는 인간 기원의 것이다. 한 구체예에서, 상기 아미노산 서열은 인간 기원의 것이지만, 인간 서열의 하나 이상의 아미노산을 마우스 서열의 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산으로 치환함으로써 쥐화 (murinized)되어왔다. 이러한 치환은 보다 큰 다이머화 또는 안정성 또는 항원 결합시 신호를 세포 내로 전달하는 능력을 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 아미노산 서열은 마우스 기원의 것이고 인간화 되어왔다.

본 발명에 따르면, 항원 수용체는 상기 전술한 바와 같이 T 세포 수용체의 기능을 대체할 수 있고, 특히 상기 전술한 바와 같이 세포 용해 활성과 같은 반응성을 T 세포 등의 세포에 부여할 수 있다. 그러나 상기 전술한 바와 같은 항원 펩티드-MHC 복합체에 대한 T 세포 수용체의 결합과 대조적으로, 항원 수용체는 특정 구체예에서, 특히 세포 표면에서 발현될 때 항원에 결합할 수 있다.

임의의 도메인 또는 링커를 비롯한 펩티드 사슬의 아미노산 서열은 변형될 수 있다. 예를 들어, 그리고 본 기술분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항체 및 T 세포 수용체의 가변 영역의 서열은 표적에 결합하는 능력을 잃지 않고 변형될 수 있고 결과적으로 항원 결합 부위의 아미노산 서열은 표적에 결합하는 능력을 잃지 않고 유사하게 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원 결합 부위를 형성하는 도메인의 아미노산 서열은 유래한 항체의 가변 영역과 동일하거나 상동성이 매우 높을 수 있다. "상동성이 매우 높음"으로써, 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 예컨대 1 내지 3 또는 1 또는 2 치환이 이루어질 수 있음이 고려된다. 한 구체예에서, 펩티드 사슬은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 펩티드 사슬은 단지 천연 아미노산만을 포함한다. "비천연 아미노산"이란 용어는 20개의 천연 아미노산 종과 상이한 구조를 가지는 아미노산을 의미한다. 비천연 아미노산은 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지므로, 비천연 아미노산은 특정 천연 아미노산의 유도체 또는 유사체로 분류될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 항원 수용체 및 펩티드 사슬의 유도체를 포함한다. 본 발명에 따르면, "유도체"는 단백질 및 펩티드의 변형된 형태이다. 그러한 변형은 임의의 화학적 변형을 포함하고, 항원 수용체 또는 펩티드 사슬과 관련된 임의의 분자, 예컨대 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩티드의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다. 한 구체 예에서, 단백질 또는 펩티드의 "유도체"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미데이션, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화, 지질화, 알킬화, 유도체화, 보호/차단기의 도입, 단백질 분해 또는 항원과의 결합으로부터 생성된 변형된 유사체를 포함한다. 상기 "유도체"란 용어는 또한 상기 항원 수용체 및 펩티드 사슬의 모든 기능적 화학적 등가물까지 확장된다. 바람직하게는, 변형된 항원 수용체 또는 그의 펩티드 사슬은 결합 또는 다이머화 능력이 증가 및/또는 면역 활성화 능력이 증가된 것이 바람직하다.

본 발명의 항원 수용체 시스템과 관련하여 사용되는 상기 세포는 바람직하게는 T 세포, 특히 세포 독성 림프구이고, 바람직하게는 세포 독성 T 세포, 자연 킬러 세포 (NK) 및 림포카인-활성화 킬러 (LAK) 세포 중에서 선택된다. 활성화시, 이들 각각의 세포 독성 림프구는 표적 세포의 파괴를 유발한다. 예를 들어, 세포 독성 T 세포는 다음과 같은 방법 중 하나 또는 모두에 의해 표적 세포의 파괴를 유발한다. 첫째, 활성화시 T 세포는 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신 등의 세포 독소를 방출한다. 퍼포린 및 그래뉼리신은 표적 세포에서 공극을 만들고 그랜자임은 세포로 들어가 세포의 세포 자멸사 (프로그램된 세포사)를 유발하는 세포질에서 카스파제 캐스캐이드를 유발한다. 둘째, T 세포와 표적 세포 사이의 Fas-Fas 리간드 상호 작용을 통해 세포 자멸이 유도될 수 있다. 상기 세포 독성 림프구는 이종 세포 또는 동종 세포가 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직하게는 자가 세포일 것이다.

"면역 글로불린"이란 용어는 면역 글로불린 상과의 단백질, 바람직하게는 항체 또는 B 세포 수용체 (BCR) 등의 항원 수용체와 관련된다. 면역 글로불린은 구조적 도메인, 즉 면역 글로불린 (Ig) 폴드를 가지는 면역 글로불린 도메인이 특징이다. 상기 용어는 가용성 면역 글로불린 뿐만 아니라 막 결합 면역 글로불린도 포함한다. 막 결합 면역 글로불린은 표면 면역 글로불린 또는 막 면역 글로불린으로도 지칭되며, 일반적으로 BCR의 일부이다. 가용성 면역 글로불린은 일반적으로 항체라고 지칭된다. 면역 글로불린은 일반적으로 여러 사슬, 전형적으로 이황화 결합을 통해 연결되는 2개의 동일한 중사슬 및 2개의 동일한 경사슬을 포함한다. 이들 사슬은 주로 VL (가변 경사슬) 도메인, CL (불변 경사슬) 도메인 및 CH (불변 중사슬) 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4 등의 면역 글로불린 도메인으로 구성된다. 포유류 면역 글로불린 중사슬의 5 가지 유형, 즉 α, d, ε, g 및 μ 가 있으며, 이들은 상이한 종류의 항체, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 설명한다. 가용성 면역 글로불린의 중사슬과는 대조적으로, 상기 막 또는 표면 면역 글로불린의 중사슬은 막 횡단 도메인 및 그들의 카복시-말단에 짧은 세포질 도메인을 포함한다. 포유류에는 2 가지 유형의 경사슬, 즉 람다 및 카파가 있다. 상기 면역 글로불린 사슬은 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 영역은 면역 글로불린의 상이한 이소 형태 내에서 필수적으로 보존되는데, 가변 영역은 매우 다양하며 항원 인식을 설명한다.

"항체"란 용어는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개 이상의 중사슬 (H) 사슬 및 2개 이상의 경사슬 (L)을 포함하는 당단백질을 지칭한다. "항체"란 용어는 단일 클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 각각의 중사슬은 중사슬 가변 영역 (본 명세서에서는 VH로 약칭됨) 및 중사슬 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경사슬은 경사슬 가변 영역 (본 명세서에서는 VL로 약칭됨) 및 경사슬 불변 영역으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은, 더욱 보전되고 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 영역으로 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 다음의 순서, 즉 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중사슬 및 경사슬의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전보체계의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "단일 클론 항체"란 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조를 의미한다. 단일 클론 항체는 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 한 구체예에서, 상기 단일 클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된 비인간 동물, 예컨대 마우스로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

본 명세서에서 사용된 "재조합 항체"란 용어는, 예컨대 (a) 면역 글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자 변형된 또는 트랜스염색체를 가진 동물 (예를 들어, 마우스)으로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질 전환 된 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 면역 글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에 스플라이싱 (splicing)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 등 재조합 수단들에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "인간 항체"란 용어는 인간 생식계 면역 글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 인간 생식계 면역 글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 혹은 생체 내의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

"인간화된 항체"란 용어는 비인간 종으로부터의 면역 글로불린으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합 부위를 가지는 분자를 말하며, 상기 분자의 나머지 면역 글로불린 구조는 인간 면역 글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반한다. 상기 항원 결합 부위는 불변 도메인상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형일 수 있거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형, 예컨대 인간 면역글로블린과 더 비슷하게 변형될 수 있다. 인간화된 항체 (예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화된 마우스 항체)의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다. 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR을 가진다.

"키메라 항체"란 용어는 중사슬 및 경사슬의 아미노산 서열 각각의 한 부분이 특정 종으로부터 유래한 항체에서 상응하는 서열과 상동성이거나 특정 부류에 속하는 한편, 사슬의 남은 부분은 다른 항체의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 의미한다. 전형적으로, 경사슬 및 중사슬의 가변 영역은 포유류의 한 종에서 유래한 항체의 가변 영역을 모방하는 한편, 불변 부분은 다른 종에서 유래한 항체의 서열과 상동성이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 분명한 이점은 가변 영역이 예컨대 인간 세포 제제로부터 유래한 불변 영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터의 용이하게 이용 가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유래할 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제제의 용이성이 있다는 이점을 가지며 그 특이성이 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 인간인 불변 영역은 항체가 주입되는 경우 비인간 근원의 불변 영역으로부터보다 인간 대상으로부터의 면역 반응을 이끌어 낼 확률이 낮다. 그러나 상기 정의는 이 특정 예시에 한정되지 않는다.

항체는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 및 인간을 포함 하나 이에 한정되지 않는 상이한 종으로부터 유래할 수 있다.

본 명세서에 기술된 항체는 IgA1 또는 IgA2 등의 IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 항체는 IgG1 항체, 보다 구체적으로 IgG1, 카파 또는 IgG1, 람다 이소타입 (즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체 (예를 들어, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체 (예를 들어, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체 (예를 들어, IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체 (예를 들어, IgG4, κ, λ)이다.

본 명세서에 기재된 항원 수용체는 하나 이상의 항체의 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 (또는 단순히 "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편" (또는 간단히 "결합 단편") 또는 유사한 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 상기 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예시로 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편, (iii) VH 및 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward 등, (1989) Nature 341 : 544-546), (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 및 (vii) 선택적으로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩됨에도 불구하고, 이들은 VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 짝을 짓는 단일 단백질 사슬 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려짐, 예컨대 Bird 등 (1988) Science 242 : 423-426 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85 : 5879-5883] 참조)로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또 다른 예시는 (i) 면역 글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역 글로불린 중사슬 CH2 불변 영역 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역 글로불린 중사슬 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역 글로불린 융합 단백질이다. 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중사슬 가변 영역 또는 경사슬 가변 영역일 수 있다. 상기 결합-도메인 면역 글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편을 손상되지 않은 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위한 스크리닝한다.

단일 사슬 가변 단편 (scFv)은 링커 펩티드와 연결된 면역 글로불린의 중사슬 (VH) 및 경사슬 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 상기 링커는 VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 또는 그 역으로 연결할 수 있다. 2가 (divalent 또는 bivalent) 단일 사슬 가변 단편 (di-scFvs, bi-scFvs)은 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있다. 이것은 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 가지는 단일 펩티드 사슬을 생성함으로써 수행될 수 있으며, 탠덤 scFv를 생성한다.

본 발명과 관련하여 "결합 도메인" 또는 간단히 "도메인"이란 용어는, 예를 들어, 다른 도메인과 상호 작용할 때 선택적으로, 주어진 표적 구조/항원/에피토프와 결합/상호 작용하는 항체의 구조를 특징짓는다. 따라서, 본 발명에 따른 이들 도메인은 "항원 결합 부위"를 나타낸다.

항체 및 항체의 유도체는 항체 단편 등의 결합 도메인을 제공, 특히 VL 및 VH 영역을 제공하는데 유용하다.

항원 수용체 내에 존재할 수 있는 항원에 대한 결합 도메인은 항원에 결합하는 (표적화하는) 능력, 즉 항원에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 항원의 세포 외 도메인 내에 위치한 에피토프에 결합하는 (표적화하는) 능력을 가진다. 바람직하게는, 항원에 대한 결합 도메인은 그 항원에 특이적이다. 바람직하게는, 항원에 대한 결합 도메인은 세포 표면에서 발현되는 항원에 결합한다. 특히 바람직한 구체 예에서, 항원에 대한 결합 도메인은 살아있는 세포의 표면에 존재하는 항원의 천연 에피토프에 결합한다.

본 발명의 목적을 위해 본 명세서에 기술된 모든 항체 및 항체 단편 등의 항체 유도체는 "항체"란 용어에 포함된다.

항체는 통상적인 단일 항체 방법론, 예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature 256 : 495 (1975)의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 원칙적으로 바람직하지만, 단일 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예컨대, B-림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질 전환 또는 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.

단일 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 쥣과의 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생성은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장 세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 본 기술분야에 알려져 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 쥣과의 골수종 세포) 및 융합 절차 역시 알려져 있다.

단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 바람직한 동물 시스템은 래트 및 토끼 시스템이다 (예를 들어 Spieker-Polet 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995) 및 Rossi 등, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005) 참조).

항체를 생성하기 위해, 마우스는 설명된 바와 같이 항원 서열, 즉 항체가 유도되는 서열, 재조합적으로 발현된 항원 또는 그의 단편 및/또는 항원을 발현하는 세포의 농축된 제제로부터 유래한 담체-결합한 펩티드로 면역화될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 항원 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 정제되거나 농축된 항원 제제를 사용하는 면역화가 항체를 초래하지 않는 경우, 마우스는 항원을 발현하는 세포, 예를 들어, 세포주로 면역화될 수 있다. .

상기 면역 반응은 혈장 및 혈청 샘플을 꼬리 정맥 또는 눈뒤 출혈로부터 수득하는 면역 프로토콜 과정에서 모니터될 수 있습니다. 면역 글로불린의 충분한 역가를 가지는 마우스는 융합에 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장이 제거되기 3 일 전에 특정 항체 분비 하이브리도마의 비율을 증가시키기 위해 항원 발현 세포로 복강 내 또는 정맥 내로 부스트될 수 있다.

단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포 및 림프절 세포가 단리되고, 마우스 골수종 세포주 등의 적절한 불멸화 세포주에 융합될 수 있다. 생성된 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝될 수 있다. 그 후 개별 웰은 항체 분비 하이브리도마를 위해 ELISA로 스크리닝될 수 있다. 항원 발현 세포를 이용한 면역형광검사 (immunofluorescence) 및 FACS 분석을 통해 항원 특이성이 있는 항체를 동정할 수 있다. 상기 항체 분비 하이브리도마는 다시 옮겨 질 수 있고, 다시 스크리닝될 수 있으며, 여전히 단일 클론 항체에 대해 양성이면 한계 희석에 의해 서브 클로닝될 수 있다. 상기 안정한 서브 클론은 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성하도록 시험관 내에서 배양될 수 있다.

항원 및 다른 결합제가 항원에 결합하는 능력은 표준 결합 분석 (예를 들어, ELISA, 웨스턴블롯, 면역형광검사 및 유동세포측정 분석)을 사용하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 "결합"이란 용어는 바람직하게는 특이적 결합과 관련된다.

본 발명에 따르면, 항원 수용체 등의 제제는 소정의 표적에 대해 유의한 친화도를 가지는 경우 상기 소정의 표적에 결합 (표적화) 될 수 있으며, 표준 분석에서 상기 소정의 표적에 결합한다. "친화도" 또는 "결합 친화도"란 용어는 종종 평형 해리 상수 (K_D)로 측정된다. 바람직하게는, "유의한 친화도"란 용어는 10^-5M 이하, 10^-6M 이하, 10^-7M 이하, 10^-8M 이하, 10^-9M 이하, 10^-10M 이하, 10^-11M 이하 또는 10^-12M 이하의 해리 상수 (K_D)를 가지는 소정의 표적에 대한 결합을 의미한다.

제제는 상기 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않는 경우 표적에 대해 (실질적으로) 결합 (표적화) 할 수 없으며, 표준 분석에서 유의하게 결합하지 않으며, 특히 검출 가능할 정도로 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제는 2 까지, 바람직하게는 10, 더욱 바람직하게는 20, 특히 50 또는 100 ㎍/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하는 경우 상기 표적에 검출 가능할 정도로 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제는 제제가 결합할 수 있는 소정의 표적에 결합하기 위한 K_D 보다 적어도 10 배, 100 배, 10³ 배, 10⁴ 배, 10⁵ 배 또는 10⁶ 배 이상의 K_D로 상기 표적에 결합하는 경우 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않는다. 예를 들어, 제제가 결합할 수 있는 표적에 대한 제제의 결합에 대한 K_D가 10^- ⁷M인 경우, 제제가 유의한 친화도를 가지지 않는 표적에 대한 결합에 대한 K_D는 적어도 10^-6 M, 10^-5M, 10^-4M, 10^-3M, 10^-2M 또는 10^-1M이다.

제제가 소정의 표적에 결합할 수 있는 한편 다른 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없는 경우, 즉 다른 표적에 대해 유의한 친화도를 가지지 않고 표준 분석에서 다른 표적에 유의적으로 결합하지 않는 경우, 제제는 상기 소정의 표적에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 제제가 그러한 다른 표적에 결합하기 대한 친화도 및 결합이 소 혈청 알부민 (BSA), 카세인 또는 인간 혈청 알부민 (HSA) 등의 소정의 표적과 무관한 단백질에 대한 친화도 또는 결합을 초과하여 유의하지 않은 경우, 제제는 소정의 표적에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 제제가 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 K_D보다 적어도 10 배, 100 배, 10³ 배, 10⁴ 배, 10⁵ 배 또는 10⁶ 배 이하의 K_D로 상기 표적에 결합하는 경우, 제제는 소정의 표적에 대해 특이적이다. 예를 들어, 특이적인 표적에 제제가 결합하기 위한 K_D가 10^- ⁷M인 경우, 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 K_D는 적어도 10^-6M, 10^-5 M, 10^-4M, 10^-3M, 10^-2M 또는 10^-1M이다.

제제의 표적에 대한 결합은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, Berzofsky 등, "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), 및 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 친화도는 통상적인 기술, 예컨대 평형 투석을 통해, BIAcore 2000 기기를 사용하여, 제조자가 설명한 일반적인 절차를 사용하여, 방사선 표지된 표적 항원을 사용하는 방사면역검정법을 사용하여, 또는 숙련된 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 상기 친화도 데이터는, 예를 들어 Scatchard 등, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있다. 상기 측정된 특정 항체-항원 상호 작용의 친화도는 상이한 조건, 예를 들어 염 농도, pH 하에서 측정되는 경우 변할 수 있다. 따라서, 친화도의 측정 및 K_D, IC₅₀와 같은 다른 항원-결합 매개 변수는 바람직하게는 항체 및 항원의 표준 용액 및 표준화된 완충액으로 만들어진다.

본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 T 세포 등의 세포 내로 항원 수용체를 코딩하는 핵산의 도입, 즉 트랜스펙션을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, "트랜스펙션"이란 용어는 핵산의 세포 내로의 도입 또는 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 상기 세포는 대상, 예컨대 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본 명세서에 기술된 핵산의 트랜스펙션을 위한 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 존재할 수 있으며, 예를 들어 상기 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 트랜스펙션은 일시적 또는 안정적일 수 있다. 트랜스펙션의 몇몇 적용의 경우, 트랜스펙션된 유전 물질이 일시적으로만 발현되는 것으로 충분하다. 트랜스펙션 과정에서 도입된 핵산은 대개 핵 게놈에 통합되지 않기 때문에, 상기 외래 핵산은 체세포 분열을 통해 희석되거나 분해된다. 핵산의 에피솜 증폭을 허용하는 세포는 희석 속도를 크게 감소시킨다. 트랜스펙션된 핵산이 실제로 세포 및 그의 딸세포의 게놈에 남아있는 것이 바람직한 경우, 안정적인 트랜스펙션이 일어나야 한다. RNA는 코딩된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포 내로 핵산을 도입, 즉 전달 또는 트랜스펙션시키는데 유용한 임의의 기술이 사용될 수 있다. 바람직하게는, RNA 등의 핵산은 표준 기술에 의해 세포 내로 트랜스펙션된다. 그러한 기술은 전기천공법 (electroporation), 리포펙션 및 마이크로인젝션을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 한 구체예에서, RNA는 전기천공법에 의해 세포 내로 도입된다. 전기천공법 (electroporation 또는 electropermeabilization)은 외부에서 적용된 전기장에 의해 야기되는 세포 원형질막의 전기 전도도 및 투과도의 현저한 증가와 관련된다. 이는 일반적으로 분자생물학에서 세포 내로 물질을 도입하는 방법으로 사용된다. 본 발명에 따르면, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산의 세포로의 도입이 상기 단백질 또는 펩티드의 발현을 초래하는 것이 바람직하다.

비-바이러스-기반 DNA 트랜스펙션, 트랜스포존-기반 시스템 및 바이러스-기반 시스템을 포함하여 T 세포에 항원 수용체 구조물을 도입하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 비-바이러스-기반 DNA 트랜스펙션은 삽입 돌연변이 유발의 위험이 낮다. 트랜스포존-기반 시스템은 통합 요소를 포함하지 않는 플라스미드보다 이식유전자를 효율적으로 통합시킬 수 있다. 바이러스-기반 시스템은 γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 사용을 포함한다. γ-레트로바이러스는 상대적으로 생산하기 쉽고, 효율적이고 영구적으로 T 세포를 전달하며, 1차적 인간 T 세포의 통합 관점에서 예비적으로 안전성이 입증되었다. 렌티바이러스 벡터는 또한 효율적이고 영구적으로 T 세포를 형질 도입시키지만 제조 비용이 더 비싸다. 이들은 또한 레트로바이러스 기반 시스템보다 어쩌면 더 안전하다.

생체 내에서 세포의 트랜스펙션을 위해, 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물이 사용될 수 있다. 핵산을 T 세포 등의 특정 세포로 표적화하는 운반체는 환자에게 투여되어, 생체 내에서 일어나는 트랜스펙션을 일으킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 나체 형태 또는 담체로 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용이 고려되는 담체, 예컨대 지질 담체는 RNA 등의 핵산이 예를 들어, 핵산과 복합체를 형성하거나 또는 핵산이 봉입되거나 캡슐화된 소포를 형성함으로써 결합될 수 있는 임의의 물질 또는 운반체를 포함한다. 이것은 나체의 핵산에 비해 핵산의 증가된 안정성을 초래할 수 있다. 특히, 혈액 중의 핵산의 안정성이 증가될 수 있다. 예를 들어, RNA 및 리포솜으로부터의 리포플렉스 (lipoplexes) 등의, 정의된 입자 크기를 가지는 나노입자 RNA 제제, 예컨대 DOTMA 및 DOPE 또는 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하는 리포플렉스가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "나노입자"란 용어는 일반적으로 직경이 1000 나노 미터 (nm) 미만인 특히, 핵산의 전신 투여, 특히 비경구 투여에 적합한 입자를 만드는 직경을 가지는 임의의 입자를 의미한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 600 nm 미만의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 나노입자는 400 nm 미만의 직경을 가진다.

본 명세서에서 사용된 "나노입자 제제"란 용어 또는 유사한 용어는 적어도 하나 이상의 나노입자를 함유하는 임의의 물질을 지칭한다. 일부 구체예에서, 나노입자 조성물은 나노입자의 균일한 집합체이다. 일부 구체예에서, 나노입자 조성물은 분산액 또는 유화액이다. 일반적으로, 적어도 2 종 이상의 비혼합성 물질이 혼합될 때 분산액 또는 유화액이 형성된다.

"리포플렉스" 또는 "핵산 리포플렉스", 특히 "RNA 리포플렉스"란 용어는 지질과 핵산, 특히 RNA의 복합체를 지칭한다. 리포플렉스는 종종 중성의 "헬퍼" 지질을 포함하는 양이온성 리포솜이 핵산과 섞일 때 자발적으로 형성된다.

양이온성 지질, 양이온성 중합체 및 양전하를 가지는 다른 물질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 이들 양이온성 분자는 핵산을 착물화시키는데 사용될 수 있으며, 예컨대 이른바 각각 리포플렉스 또는 폴리플렉스로 불리는 것을 형성하고, 이들 복합체는 핵산을 세포 내로 운반하는 것으로 나타났다.

본 발명에서 사용하기 위한 나노입자 핵산 제제는 다양한 프로토콜에 의해, 다양한 핵산 착물 화합물로부터 수득될 수 있다. 지질, 중합체, 올리고머 또는 양친매성 물질은 전형적인 착물 형성 제제이다. 한 구체예에서, 상기 착물 화합물은 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌 또는 히스톤으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함한다.

본 발명에 따르면, 프로타민은 양이온 담체 제제로서 유용하다. "프로타민"이란 용어는 아르기닌이 풍부하고 다양한 동물 (특히 어류)의 정자 세포에서 체성 히스톤 대신에 DNA와 관련된 비교적 작은 분자량의 임의의 다양한 강염기성 단백질을 의미한다. 특히, "프로타민"이란 용어는 강염기성이며, 물에 용해되고, 열에 의해 응고되지 않으며, 가수 분해시 주로 아르기닌을 생성하는 어류의 정자에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 정제된 형태로, 이들은 장시간 작용하는 인슐린의 제조 및 헤파린의 항응고 효과를 중화시키는 데 사용된다.

본 발명에 따르면, 본 명세서에서 사용되는 "프로타민"이란 용어는 공급원의 단편과 아미노산 서열 또는 그의 단편의 다량체 형태를 포함하는 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 수득되거나 유래한 임의의 프로타민 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 이 용어는 인공적이며 특정 목적을 위해 특별히 설계되고 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 없는 (합성된) 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 상기 프로타민은 황산염 프로타민 또는 염산염 프로타민이 될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 나노입자의 제조에 사용되는 프로타민 공급원은 등장성 염 용액에서 프로타민을 10 mg/ml (㎖당 5000 헤파린-중화 단위) 이상 함유하는 프로타민 5000이다.

리포솜은 종종 인지질 등 소포 형성 지질의 하나 이상의 이중층을 가지는 미세한 지질 소포이며 약물을 캡슐화할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 다양한 유형의 리포솜이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 기술분야에 공지된 다른 이중층 형태 뿐만 아니라 다중층 소포 (MLV), 소형 단일층 소포 (SUV), 대형 단일층 소포 (LUV), 입체적으로 안정화된 리포솜 (SSL), 다발성 소포체 소포 (MV) 및 대형 다발성 소포 (LMV)를 포함한다. 리포솜의 크기 및 층상도는 제조 방법에 좌우되며, 사용되는 소포의 유형의 선택은 바람직한 투여 방식에 좌우될 것이다. 지질이 수용성 매질에 존재할 수 있는 층상, 육각형 및 역상육각형상, 입방형상, 미셀, 단층으로 구성된 역 미셀을 포함하는 다른 여러 형태의 초분자 조직이 있다. 이들 상은 DNA 또는 RNA와의 조합에서 또한 수득될 수 있으며, RNA 및 DNA와의 상호 작용은 실질적으로 상의 상태에 영향을 줄 수 있다. 상기 기술된 상은 본 발명의 나노입자 핵산 제제에 존재할 수 있다.

핵산 및 리포솜으로부터 핵산 리포플렉스를 형성하기 위해, 예상되는 핵산 리포플렉스를 제공하는 한, 리포솜을 형성하는 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 리포솜은 역증발법 (REV), 에탄올 주입법, 탈수-재수화법 (DRV), 초음파처리 또는 다른 적절한 방법 등의 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다.

리포솜 형성 후, 실질적으로 균질한 크기 범위를 가지는 리포솜 집단을 수득하도록 리포솜의 크기가 바뀔 수 있다.

이중층-형성 지질은 전형적으로 2개의 탄화수소 사슬, 특히 아실 사슬, 및 극성 또는 비극성의 헤드 그룹을 가진다. 이중층-형성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고미엘린 등의 인지질을 포함하는 자연 발생 지질 또는 합성 기원으로 구성되며, 여기서 2개의 탄화수소 사슬은 전형적으로 약 14개 내지 22개 길이의 탄소 원자를 가지고, 다양한 불포화도를 가진다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 다른 적합한 지질은 리포솜에도 사용될 수 있는 당지질 및 콜레스테롤 및 그의 다양한 유사체 등의 스테롤을 포함한다.

양이온성 지질은 전형적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬 등의 친유성 부분을 가지며, 전반적으로 순 양전하를 가진다. 상기 지질의 헤드 그룹은 전형적으로 양전하를 띠고 있다. 상기 양이온성 지질은 바람직하게는 1 내지 10가의 양전하, 더욱 바람직하게는 1 내지 3가의 양전하, 및 더더욱 바람직하게는 1가의 양전하를 가진다. 양이온성 지질의 예시로는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 (DODAP), 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판, 디옥타데실디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디미리스토일옥시프로필-1,3-디메틸히드록시에틸 암모늄 (DMRIE) 및 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스페린 카복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판 트리플루오르아세테이트 (DOSPA)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. DOTMA가 가장 바람직하다.

또한, 본 명세서에 기재된 나노입자는 구조 안정성 등의 관점에서 중성 지질을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 중성 지질은 핵산-지질 복합체의 전달 효율의 관점에서 적절하게 선택될 수 있다. 상기 중성 지질의 예시로는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디올레오일-Sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 디아실포스파티딜 콜린, 디아실포스파티딜 에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 스테롤 및 세레브로시드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. DOPE 및/또는 DOPC가 바람직하다. DOPE가 가장 바람직하다. 양이온성 리포솜이 양이온성 지질 및 중성 지질을 모두 포함하는 경우, 양이온성 지질과 중성 지질의 몰 비는 리포솜의 안정성 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다.

한 구체예에 따르면, 본 명세서에 기술된 나노입자는 인지질을 포함할 수 있다. 상기 인지질은 글리세로인지질일 수 있다. 글리세로인지질의 예시는 3 유형의 지질, 즉 (i) 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 난황 포스파티딜콜린, 부분적으로 수소화되거나 완전히 수소화 된 형태의 자연계 대두-유래 PC, 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 스핑고미엘린 (SM)을 포함하는 양성이온성 인지질, (ii) 음으로 하전된 인지질, 즉 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜이노시톨 (PI), 포스파티드산 (PA), 포스파티딜글리세롤 (PG) 디팔미포일 PG, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤 (DMPG)을 포함하는 음전하로 하전된 인지질, 접합체가 메톡시-폴리에틸렌,글리콜-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (mPEG-DSPE)의 경우와 같이 음으로 하전된 양성이온성 인지질을 제공하는 합성 유도체, 및 (iii) 예컨대, 양이온성 지질을 형성하기 위해 포스포모노에스터가 O-메틸화된 포스파티딜콜린 또는 스핑고미엘린을 포함하는 양이온성 인지질을 포함하나, 이들에 한정되지는 않는다.

지질 담체에 대한 핵산의 결합은, 예를 들어 담체가 물리적으로 핵산을 포획하도록 담체의 간질 공간을 채우는 핵산에 의해, 또는 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합에 의해, 또는 비-특이적 결합에 의한 흡착에 의해 발생할 수 있다. 결합 형태가 무엇이든, 상기 핵산은 그의 치료학적, 즉 코딩 특성을 유지해야 한다.

본 발명에 따르면, 한 구체예에서 항원 수용체를 코딩하는 상기 핵산은 RNA, 바람직하게는 mRNA이다. 상기 RNA는 바람직하게는 시험관 내 전사에 의해 수득된다.

본 명세서에 사용된 "핵산"이란 용어는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자 등의 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관 내 전사 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA가 포함된다. 본 발명에 따르면, 핵산은 바람직하게는 단리된 핵산이다.

핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지 등의 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 등의 인공 염색체 벡터, 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 P1 인공 염색체 (PAC)를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 클로닝 벡터 뿐만 아니라 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 바이러스 벡터 뿐만 아니라 플라스미드를 포함하고, 일반적으로 특정 숙주 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류) 내에서 또는 시험관 내 발현 시스템 내에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 원하는 코딩 서열 및 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 특정 원하는 DNA 단편을 조작하고 증폭시키는데 사용되며, 원하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능 서열이 결여될 수 있다.

본 발명의ㅏ 문맥상, "RNA"란 용어는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 리보뉴클레오티드 잔기로 완전히 또는 실질적으로 구성된 분자와 관련된다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 그룹의 2'-위치에 하이드록시기를 가지는 뉴클레오티드와 관련된다. 상기 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 정제된 단리된 RNA, 실질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 조작된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드, 예컨대 RNA의 말단 또는 내부적으로, 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 디옥시뉴클레오티드 등의 비-표준 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 이러한 변형된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 지칭될 수 있다.

본 발명에 따르면, "RNA"란 용어는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함 및 바람직하게는 관련이 있고, DNA를 주형으로 사용하여 생산될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있는 "전사체"와 관련된다. mRNA는 전형적으로 5'비 번역 영역 (5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 코딩 영역 및 3'비 번역 영역 (3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포 내 및 시험관 내에서 제한된 하프 타임을 가진다. 바람직하게는, mRNA는 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생성된다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 RNA는 시험관 내 전사 또는 화학적 합성에 의해 수득된다. 상기 시험관 내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 다양한 시험관 내 전사 키트가 존재한다.

본 발명의 한 구체예에서, RNA는 자가-복제 RNA, 예컨대 단일 가닥 자가-복제 RNA이다. 한 구체예에서, 상기 자가-복제 RNA는 양성 센스의 단일 가닥 RNA이다. 한 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 RNA 또는 바이러스 RNA로부터 유래한 RNA이다. 한 구체예에서, 상기 자가-복제 RNA는 알파 바이러스 게놈 RNA이거나 알파 바이러스 게놈 RNA로부터 유래한다. 한 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 유전자 발현 벡터이다. 한 구체예에서, 상기 바이러스는 Semliki forest 바이러스이다. 한 구체예에서, 상기 자가-복제 RNA는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 제제를 코딩하는 상기 형질 도입 유전자를 하나 이상의 형질 도입 유전자를 함유한다. 한 구체예에서, 상기 RNA가 바이러스 RNA이거나 바이러스 RNA로부터 유래한 경우, 상기 형질 도입 유전자는 바이러스 서열, 예컨대 구조 단백질을 코딩하는 바이러스 서열을 부분적으로 또는 완전히 대체할 수 있다. 한 구체예에서, 자가-복제 RNA는 시험관 내 전사된 RNA이다.

본 발명에 따라 사용된 RNA의 발현 및/또는 안정성을 증가시키기 위해, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고 이를 변형시킬 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 RNA의 문맥상 "조작"이란 용어는 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 조작을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 상기 RNA는 캡핑되지 않은 5'-삼인산을 가지지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-삼인산의 제거는 포스파타아제로 RNA를 처리함으로써 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 RNA는 그 안정성을 증가시키고 및/또는 세포 독성을 감소시키기 위해 자연 발생 또는 합성된 리보뉴클레오티드를 조작할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 상기 RNA에서 유사우리딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된다.

한 구체예에서, "조작"이란 용어는 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 가지는 RNA를 제공하는 것과 관련된다. "5'-캡"이란 용어는 mRNA 분자의 5'-말단에 있는 캡 구조를 지칭하며 일반적으로 특이한 5'에서 5' 삼인산 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 한 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. "통상적인 5'-캡"이란 용어는 자연 발생적인 RNA 5'-캡을 의미하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡 (m7G)을 의미한다. 본 발명의 문맥상, "5'-캡"이란 용어는 RNA 캡 구조와 유사한 5'-캡 유사체를 포함하고, 바람직하게는 생체 내 및/또는 세포 내로 부착된 경우 RNA를 안정화시키는 능력을 보유하도록 조작된다.

5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 가지는 RNA의 제공은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재하에 DNA 주형의 시험관 내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공동 전사로 통합되거나 예컨대, 시험관 내 전사를 통해 RNA가 생성될 수 있고, 상기 5'-캡은 캡핑 효소, 예컨대 우두바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다.

상기 RNA는 추가적인 조작을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가적인 조작은 자연 발생 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절단, 또는 상기 RNA의 코딩 영역과 무관한 UTR의 삽입 등의 5'- 또는 3'-비 번역 영역 (UTR)의 변경, 예를 들어, 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더욱 바람직하게는 인간 베타-글로빈 등의 글로빈 유전자로부터 유래한 하나 이상, 바람직하게는 두 복제본의 3'-UTR의 삽입일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 사용된 상기 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위하여, 바람직하게는 길이가 10개 내지 500개, 더욱 바람직하게는 30개 내지 300개, 더더욱 바람직하게는 65개 내지 200개 및 특히 100개 내지 150개 아데노신 잔기를 가지는 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 조작될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 폴리-A 서열은 약 120 아데노신 잔기의 길이를 가진다. 또한, 2개 이상의 3'- 비 번역 영역 (UTR)을 RNA 분자의 3'- 비 번역 영역에 통합하면 번역 효율이 향상될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 상기 3'-UTR은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래한다.

RNA의 "안정성"이란 용어는 RNA의 "반감기"와 관련된다. "반감기"는 분자의 활동, 양 또는 수의 절반을 제거하는데 필요한 시간을 의미한다. 본 발명의 문맥상, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 지속 시간"에 영향을 줄 수 있다. 반감기가 긴 RNA가 장시간 발현될 것으로 기대될 수 있다.

본 발명의 문맥상, "전사"란 용어는 DNA 서열 내의 유전 코드가 RNA로 전사되는 과정과 관련된다. 이어서, 상기 RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, "전사"란 용어는 "시험관 내 전사"를 포함하며, 상기 "시험관 내 전사"란 용어는 RNA, 특히 mRNA가 무-세포계에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관 내에서 합성되는 과정과 관련된다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 지정되며, "벡터"란 용어에 포함되는 본 발명에 따른 것이다.

본 발명에 따른 "번역"이란 용어는 메신저 RNA의 가닥이 펩티드 또는 단백질을 만들기 위해 아미노산 서열의 조립을 지시하는 세포의 리보솜에서의 과정과 관련된다.

본 발명에 따르면, 핵산은 단독으로 또는 상동성 또는 이종성일 수 있는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 핵산에 대해 상동성 또는 이종성일 수 있는 발현 조절 서열과 기능적으로 연결된다. "상동성"이란 용어는 핵산이 또한 자연적으로 기능적으로 연결되어 있음을 의미하며, "이종성"이란 용어는 핵산이 자연적으로 기능적으로 연결되어 있지 않다는 것을 의미한다.

핵산 및 발현 조절 서열은 상기 핵산의 발현 또는 전사가 상기 발현 조절 서열의 조절하에 또는 영향하에 있는 방식으로 서로 공유 결합되어 있는 경우 서로 "기능적으로" 연결된다. 상기 핵산이 기능성 단백질로 번역될 경우, 코딩 서열에 기능적으로 연결된 발현 조절 서열과 함께, 상기 발현 조절 서열의 유도는 코딩 서열에서 프레임 시프트를 야기하지 않고 상기 핵산의 전사를 초래하거나 원하는 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 없는 상기 코딩 서열을 초래한다.

"발현 조절 서열" 또는 "발현 조절 요소"란 용어는 본 발명에 따라 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 다른 조절 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 발현 조절 서열은 조절될 수 있다. 상기 발현 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 변하지만, 일반적으로 각각 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5'-비 전사 및 5'- 및 3'-비 번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비 전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상부 활성 서열을 포함할 수 있다.

"발현"이란 용어는 가장 일반적인 의미로 본 발명에서 사용되며, 예컨대 전사 및/또는 번역에 의한 RNA 및/또는 펩티드 또는 단백질의 생산을 포함한다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이란 용어는 특히 펩티드 또는 단백질의 생산과 관련된다. 이는 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 발현은 또한 "이상 발현" 또는 "비정상적 발현"을 포함한다.

"이상 발현" 또는 "비정상적 발현"은 본 발명에 따라, 발현이 기준, 예컨대 종양 항원 등의 특정 단백질이 이상 또는 비정상적으로 발현되는 질병이 없는 대상의 상태에 비해 바뀌고, 바람직하게는 증가한 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 한 구체예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.

"특이적으로 발현되는"이란 용어는 단백질이 실질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 위 점막에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 위 점막에서 주로 발현되고 다른 조직에서 발현되지 않거나 다른 조직 또는 기관 유형에서 현저히 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 위 점막의 세포에서 독점적으로 발현되고 다른 임의의 조직, 예컨대 고환에서 현저히 적게 발현되는 단백질은 위 점막의 세포에서 특이적으로 발현된다. 몇몇 구체예에서, 종양 항원은 또한 2개 또는 3개의 조직 유형 또는 기관 등 하나 이상의 조직 유형 또는 기관에서 정상 조건하에서 특이적으로 발현될 수 있지만, 3개 이하의 조직 또는 기관 유형에서 특이적으로 발현될 수 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 종양 항원은 이들 기관에서 특이적으로 발현된다. 예를 들어, 바람직하게는 종양 항원이 폐 및 위장에서 거의 동등하게 정상 조건하에서 발현되는 경우, 상기 종양 항원은 폐 및 위장에서 특이적으로 발현된다.

본 발명에 따르면, "핵산 코딩"이란 용어는 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우 핵산이 코딩하는 단백질 또는 펩티드를 생산하도록 발현될 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따른 "펩티드"란 용어는 올리고- 및 폴리펩티드를 포함하고, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 21개 이상 및 바람직하게는 최대 8개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 펩티드 결합에 의해 공유 결합하는 아미노산을 포함하는 물질을 의미한다. "단백질"이란 용어는 큰 펩티드, 바람직하게는 100개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 "펩티드", "펩티드 사슬" 및 "단백질"이란 용어는 동의어이며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 펩티드 사슬 및 항원 수용체의 아미노산 서열은 상기 아미노산 서열의 변이체를 수득하도록 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 펩티드 및 단백질 서열의 변이체를 포함하며, 상기 서열과 기능적으로 동등한 서열을 생성하는 자연 발생 아미노산 서열의 변이체, 예컨대 상기 서열의 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 특성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 중요한 특성은 항원 수용체의 표적에 대한 결합 또는 항원 결합 신호를 T 세포 등의 세포에 전달을 유지하는 것이다. 한 구체예에서, 변이체 분자 또는 서열은 그의 모체 분자 또는 서열과 면역학적으로 동등하다.

본 발명에 따른 "변이체"란 용어는 특히, 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 형태, 이소형태, 대립 형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체를 지칭하며, 특히 이들은 자연적으로 존재한다. 대립 형질 변이체는 유전자의 정상 서열의 변경과 관련이 있으며, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립 형질 변이를 확인한다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 종류의 기원을 가지는 핵산 또는 아미노산 서열이다. "변이체"란 용어는 번역 후 조작된 임의의 변이체 및 형태 변이체를 포함한다.

"면역학적으로 동등한"이란 용어는 면역학적으로 동등한 아미노산 서열이 동일하거나 실질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고 및/또는 동일하거나 실질적으로 동일한 면역학적 효과, 예컨대 면역학적 효과의 유형에 관한 효과를 발휘하는 등 면역학적으로 동등한 분자를 의미한다. 본 발명의 문맥상, "면역학적으로 동등한"이란 용어는 바람직하게는 치료에 사용되는 항원 수용체의 면역학적 효과 또는 특성에 관하여 사용된다.

특히 CDR 서열, 초 가변 및 가변 영역의 서열이 표적에 결합하는 능력을 잃지 않고 조작될 수 있다는 것은 본 기술 분야의 당업자에게 이해될 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 모체 항체 영역과 동일하거나 매우 상동성일 수 있다. "매우 상동성"으로 인해 1개 내지 5개, 바람직하게는 1개 내지 4개, 예컨대 1개 내지 3개 또는 1개 또는 2개의 치환이 CDR에서 이루어질 수 있다고 생각된다.

본 발명의 목적을 위해, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서의 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체로도 불린다.

아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 가지는 아미노산 서열 변이체의 경우, 결과 생성물의 적절한 스크리닝을 통한 무작위 삽입도 가능하지만, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입된다.

아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시- 말단 융합체를 포함한다.

아미노산 결실 변이체는 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 제거에 의해 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 제거되는 것이 특징이다. 상기 결실은 단백질의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.

아미노산 치환 변이체는 서열의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것이 특징이다. 상동성 단백질 또는 펩티드 사이에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 조작을 가하는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측사슬과 관련된 아미노산 계열 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4 계열, 즉 산성 (아스파테이트, 글루타메이트), 염기성 (리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 (알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 하전되지 않은 극성 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다.

바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99% 이상일 것이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 기준 아미노산 서열의 전체 길이의 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 또는 약 100% 이상인 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 약 20개 이상, 약 40개 이상, 약 60개 이상, 약 80개 이상, 약 100개 이상, 약 120개 이상, 약 140개 이상, 약 160개 이상, 약 180개 이상 또는 약 200개의 아미노산, 바람직하게는 연속 아미노산에 대해 주어진다. 바람직한 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어 Align을 사용하여, 표준 정렬, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5 을 사용하여 공지된 도구로 수행될 수 있다.

"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 퍼센트를 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 사이의 동일한 아미노산의 퍼센트를 나타낸다.

"퍼센트 동일성"이란 용어는 최상의 정렬 후에 수득된 비교되는 두 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 퍼센트를 나타내며, 이 퍼센트는 순전히 통계적이며, 두 서열 간의 차이는 무작위적으로 및 그들의 전체 길이 이상으로 분포된다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬시킨 후 이들 서열을 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국부 영역을 동정하고 비교하기 위해 영역별로 또는 "비교의 창"을 통해 수행된다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 Smith 및 Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482 의 국소 상동 알고리즘을 사용하여, Neddleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443 의 국소 상 동성 알고리즘을 사용하여, Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 의 유사성 검색 방법을 사용하여, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 사용하여 수동으로 생성할 수 있다.

퍼센트 동일성은 비교되는 두 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 사이의 퍼센트 동일성을 수득함으로써 계산된다.

상동 아미노산 서열은 본 발명에 따라 40% 이상, 특히 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 바람직하게는 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 잔기의 동일성을 나타낸다.

본 발명에 따르면, 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 변이체, 단편, 부분, 일부 또는 유도체는 바람직하게는 각각 이들이 유래한 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 기능적 특성을 가지며, 즉 기능적으로 동일하다. 한 구체예에서, 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질의 변이체, 단편, 부분, 일부 또는 유도체는 각각 이들이 유래한 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질과 기능적으로 동등, 예컨대 면역학적으로 동등하다. 한 구체예에서, 상기 기능적 특성은 항원에 결합하거나 세포 내에서 결합 신호를 변환시키는 특성이다.

"유래한"이란 용어는 본 발명에 따라 특정 개체, 특히 특정 서열이 유래한 개체, 특히 유기체 또는 분자에 존재하는 것을 의미한다. 아미노산 서열, 특히 특정 서열 영역의 경우, "유래한"은 특히 관련 아미노산 서열이 존재하는 아미노산 서열로부터 관련 아미노산 서열이 유래한 것을 의미한다.

"세포" 또는 "숙주 세포"란 용어는 바람직하게는 손상되지 않은 세포, 즉 효소, 세포 기관 또는 유전 물질 등 정상적인 세포 내 성분을 방출하지 않는 정상 세포막을 가지는 세포와 관련된다. 손상되지 않은 세포는 바람직하게는 생존 가능한 세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 바람직하게는 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 트랜스펙션될 수 있는 임의의 세포와 관련된다. 바람직하게는, 외인성 핵산으로 트랜스펙션 되고 수용자에게 전달될 때, 상기 세포는 수용자에서 핵산을 발현할 수 있다. "세포"란 용어는 박테리아 세포를 포함하고, 다른 유용한 세포로는 효모 세포, 진균 세포 또는 포유류 세포가 있다. 적절한 박테리아 세포는 대장균 (Escherichia coli), 프로테우스 (Proteus) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 등의 그람-음성 박테리아 균주 및 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 포도상구균 (Staphylococcus) 및 락토코커스 (Lactococcus) 등의 그람-양성 박테리아 균주의 세포를 포함한다. 적절한 진균 세포는 트리코더마 (Trichoderma), 뉴로스포라 (Neurospora) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 종의 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces, 예를 들어 스키조 사카로마이세스 품베 (Schizo saccharomyces pombe)), 피치아 (Pichia, 예를 들어 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 및 피치아 메탄올리치 (Pichia methanolicd)), 한세뉼라 (Hansenula) 종의 세포를 포함한다. 적절한 포유류 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, 293 HEK 등을 포함한다. 그러나 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 이종 단백질의 발현을 위해 본 기술 분야에서 사용되는 임의의 다른 세포 역시 사용될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류의 세포 등의 포유류 세포가 입양 전달을 위해 특히 바람직하다. 상기 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래할 수 있으며, 면역계의 세포, 특히 수지상 세포 및 T 세포 등의 항원 제시 세포, 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포 등의 줄기세포 및 기타 세포 유형과 같은 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기에 특히 바람직한 세포는 면역반응성 또는 면역 이펙터 세포, 특히 T 세포이다.

핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질을 발현한다.

"클론 확장" 또는 "확장"이란 용어는 특정 개체가 증식하는 과정을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 이 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되고 증식하여 상기 항원을 인식하는 특이적 림프구가 증폭되는 면역 반응의 문맥에서 사용된다. 바람직하게는, 클론 확장은 림프구의 분화를 유도한다. "프라이밍"이란 용어는 T 세포가 그것의 특정 항원과의 첫 번째 접촉을 가지고 이펙터 T 세포로의 분화를 일으키는 과정을 의미한다.

본 명세서에 기재된 핵산, 펩티드 사슬 또는 항원 수용체, 또는 세포 등의 분자는 재조합 및/또는 단리될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "단리된"이란 용어는 다른 세포 물질 등의 다른 분자가 실질적으로 존재하지 않는 개체를 의미한다. "단리된"이란 용어는 바람직하게는 단리된 개체가 자연환경으로부터 분리되어 있는 것을 의미한다. 단리된 개체는 실질적으로 정제된 상태일 수 있다. "실질적으로 정제된"이란 용어는 개체가 자연 또는 생체 내에서 관련된 다른 물질을 실질적으로 함유하지 않은 것을 의미한다.

본 발명의 문맥상 "재조합"이란 용어는 "유전 공학을 통해 제조된"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 재조합 세포 등의 "재조합 물체"는 자연 발생적이지 않다.

본 명세서에 사용된 "자연 발생적"이란 용어는 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체 (바이러스 포함)에 존재하고 실질적으로 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 조작되지 않은 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적이다.

"자가"란 용어는 동일한 대상에서 유래한 모든 것을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 대상에서 유래한 조직 또는 기관의 이식을 의미한다. 이러한 절차는 그 외의 경우에 거부 반응을 일으키는 면역 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.

"동종 이형"이란 용어는 동일한 종의 상이한 개체에서 유래한 것을 설명하는 데 사용된다. 하나 이상의 유전자 자리의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체는 서로 동종 이형이라고 한다.

"동계"란 용어는 동일한 유전형을 가지는 개체 또는 조직, 즉 동일한 근친 교배 계통의 일란성 쌍둥이 또는 동물, 또는 이들의 조직으로부터 유래한 것을 설명하는데 사용된다.

"이종"이란 용어는 다수의 상이한 요소로 구성된 것을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, 한 개체의 골수를 다른 개체로 이식하는 것은 이종 이식이다. 이종 유전자는 대상 이외의 공급원으로부터 유래한 유전자이다.

본 명세서에서 사용된 "감소" 또는 "억제"은 전반적인 감소를 일으키는 능력, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 수준으로 감소시키는 능력을 의미한다. "억제" 또는 이와 유사한 문구는 완전히 또는 실질적으로 완전한 억제, 즉 0 또는 실질적으로 0으로의 감소를 포함한다.

"증가" 또는 "향상" 등의 용어는 바람직하게는 약 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더더욱 바람직하게는 80% 이상, 및 가장 바람직하게는 100% 이상의 증가 또는 향상과 관련된다.

본 발명의 항원 수용체는 질병-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 실질적으로 표적화하도록 조작될 수 있기 때문에, 본 발명의 항원 수용체는 광범위한 치료적 용도를 가진다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항원 수용체, 그의 펩티드 사슬, 이를 코딩하는 핵산 및 기타 관련 분자의 치료 및 예방 방법에서의 용도에 관한 것이다. 그러한 용도 중 하나는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있는 항원-특이적 면역 세포의 생산에 사용되며, 상기 질병은 본 발명의 면역 세포에서 발현되는 항원 수용체에 의해 결합될 수 있는 하나 이상의 항원의 발현이 특징이다. 바람직하게는, 상기 질병은 암이다. 또한, 본 발명의 항원 수용체 및 관련 분자는 소정의 항원이 발현되는 질병에 대한 면역 또는 예방 접종에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 소정의 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 박멸하는데 사용될 수도 있으며, 상기 항원은 본 발명의 항원 수용체의 적어도 하나의 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있다.

한 구체예에서, 질병을 치료 또는 예방하는 방법은 본 발명의 항원 수용체를 코딩하는 핵산의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 이 단계에서 항원 수용체의 하나 이상의 항원 결합 부위는 치료 또는 예방될 질병 (예를 들어, 바이러스 또는 종양 항원)과 관련된 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 질병을 치료 또는 예방하는 방법은 재조합 면역 이펙터 세포 또는 상기 면역 이펙터 세포의 확장된 집단의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역 이펙터 세포 또는 세포 집단은 본 발명의 항원 수용체를 재조합적으로 발현하고, 이 단계에서 상기 항원 수용체의 하나 이상의 항원 결합 부위는 치료 또는 예방될 질병과 관련된 항원에 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 암이고 항원은 종양 관련 항원이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 특정 항원 또는 특정 항원을 발현하는 질병-유발 유기체와 관련된 질병에 대해 면역화 또는 백신 접종하는 방법을 제공하며, 이 방법은 환자에게 본 발명의 항원 수용체를 코딩하는 핵산의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 이 단계에서 항원 수용체의 하나 이상의 항원 결합 부위는 특정 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 특정 항원 또는 특정 항원을 발현하는 질병-유발 유기체와 관련된 질병에 대해 면역화 또는 백신 접종하는 방법을 제공하며, 이 방법은 재조합 면역 이펙터 세포 또는 상기 면역 이펙터 세포의 확장된 집단의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역 이펙터 세포 또는 세포의 집단은 본 발명의 항원 수용체를 재조합적으로 발현하고, 이 발명에서 상기 항원 수용체의 하나 이상의 항원 결합 부위는 특정 항원에 결합할 수있다.

특정 구체예에서, 상기 면역 이펙터 세포의 집단은 클론 확장된 집단일 수 있다. 상기 재조합 면역 이펙터 세포 또는 그의 집단은 항원-특이적 방식으로 치료적 또는 예방적 면역 이펙터 기능을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항원 수용체는 면역 이펙터 세포의 세포 표면에서 발현된다.

본 발명의 치료 및 예방 방법과 관련하여 사용되는 상기 세포는 바람직하게는 면역 이펙터 세포이고, 상기 면역 이펙터 세포는 바람직하게는 T 세포이다. 특히, 본 발명에서 사용된 세포는 세포 독성 림프구이며, 바람직하게는 세포 독성 T 세포, 자연 킬러 세포 (NK), 및 림포카인-활성화 킬러 (LAK) 세포 중에서 선택된다. 활성화/자극시, 이들 각각의 세포 독성 림프구는 표적 세포의 파괴를 유발한다. 예를 들어, 세포 독성 T 세포는 다음의 방법 중 하나 또는 둘 모두에 의해 표적 세포의 파괴를 유발한다. 첫째, 활성화시, T 세포는 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신 등의 세포 독소를 방출한다. 퍼포린 및 그래뉼리신은 표적 세포에서 공극을 만들고 그랜자임은 세포로 들어가 세포의 세포 자멸사 (프로그램된 세포사)를 유발하는 세포질에서 카스파제 캐스캐이드를 유발한다. 둘째, T 세포와 표적 종양 세포 사이의 Fas-Fas 리간드 상호 작용을 통해 세포 자멸이 유도될 수 있다. 상기 T 세포 및 다른 세포 독성 림프구는 이종 세포 또는 동종 세포가 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직하게는 자가 세포일 것이다.

따라서, 본 명세서에 기술된 작용제, 조성물 및 방법은 질병, 예를 들어 항원을 발현하는 질병 세포의 존재가 특징인 질병이 있는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 질병은 암 질환인 것이 바람직하다.

본 명세서에 기술된 상기 작용제, 조성물 및 방법은 또한 본 명세서에 기술된 질병을 예방하기 위한 면역화 또는 예방 접종에 사용될 수 있다.

"질병"이란 용어는 개인의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 증상을 의미한다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 의료상 문제로 해석된다. 질병은 전염병 등 외부 원인에 기인한 요인에 의해 야기되거나, 또는 자가 면역 질병 등 내부 기능 장애에 의해 야기될 수 있다. 인간의 경우, "질병"은 고통받는 개인에게 통증, 기능 장애, 고통, 사회적 문제, 또는 죽음을 초래하는 모든 문제, 또는 상기 개인과 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 지칭하기 위해 더 광범위하게 사용된다. 이러한 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 장애, 이상, 증후군, 감염, 격리 증상, 비정상적인 행동 및 구조와 기능의 비정형적인 변화를 포함하지만, 다른 맥락에서 및 다른 목적을 위해서 이들은 구별 가능한 카테고리로 고려될 수 있다. 많은 질병에 걸려 생활하는 것은 사람의 삶에 대한 관점, 및 사람의 성격을 바꿀 수 있기 때문에 질병은 대개 신체적으로 뿐만 아니라 정서적으로도 개인에게 영향을 미친다. 본 발명에 따르면, "질병"이란 용어는 전염병 및 암 질환, 특히 본 명세서에 기재된 암의 유형을 포함한다. 암 또는 암의 특정 형태에 대한 본 명세서의 어떠한 언급도 그의 암 전이를 포함한다.

본 발명에 따라 치료되는 질병은 바람직하게는 항원을 포함하는 질병이다. "항원 관련 질병", "항원의 발현 또는 상승된 발현과 관련된 질병" 또는 유사한 표현은 본 발명에 따라 항원이 병든 조직 또는 기관의 세포에서 발현된다는 것을 의미한다. 병든 조직 또는 기관의 세포에서의 발현은 건강한 조직 또는 기관의 상태에 비해 증가할 수 있다. 한 구체예에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 발견되지 않으며, 예컨대 발현이 억제된다. 본 발명에 따르면, 항원 관련 질병은 전염병 및 암 질환을 포함하며, 상기 질병-관련 항원은 바람직하게는 감염 물질의 항원 및 종양 항원이다. 바람직하게는 항원을 포함하는 질병은, 바람직하게는 항원을 발현하는 세포, 바람직하게는 세포 표면에서 발현하는 세포를 포함하는 질병이다.

"건강한" 또는 "정상적인"이란 용어는 병적이 아닌 상태를 말하며, 바람직하게는 감염되지 않은 상태 또는 암에 걸리지 않은 상태를 의미한다.

"암 질환" 또는 "암"이란 용어는 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장이 특징인, 개체에서의 생리적 상태를 말하거나 설명한다. 암의 예시로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 보다 구체적으로는, 이러한 암의 예시는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨병 (Hodgkin's Disease), 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추신경계 (CNS) 종양, 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경아교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함한다. 본 발명에 따른 "암"이란 용어는 암 전이도 포함한다. 바람직하게는, "암 질환"은 종양 항원을 발현하는 세포가 특징이고, 암세포는 종양 항원을 발현한다.

한 구체예에서, 암 질환은 퇴화, 침윤 및 전이의 특성을 가지는 악성 질환이다. 악성 종양은 성장에 자체적으로 제한이 없다는 점에서 비-종양 양성 종양과 대조될 수 있고, 인접한 조직으로 침입할 수 있으며, 먼 조직으로 퍼질 수 있는 (전이) 반면, 양성 종양에는 이러한 특성이 없다.

본 발명에 따르면, "종양" 또는 "종양 질환"이란 용어는 비정상적인 세포 (신생 세포 또는 종양 세포로 불림) 성장에 의해 형성된 팽창 또는 병변을 의미한다. "종양 세포"란 급속히, 통제되지 않은 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과 구조적 조직 및 기능적 협동이 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있으며, 대개 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 조직의 뚜렷한 덩어리를 형성한다.

본 발명에 따르면, "암종"은 상피 세포로부터 유래한 악성 종양이다. 이 그룹은 일반적인 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는 가장 흔한 암을 나타낸다.

"선암종"은 분비선 조직에서 기원하는 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직으로 알려진 보다 큰 조직 카테고리의 일부이다. 상피 조직에는 피부, 땀샘 및 신체의 빈 공간 및 기관를 이어주는 다양한 다른 조직이 포함된다. 상피는 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 발생학적으로 유래한다. 선암종으로 분류되기 위해, 상기 세포는 분비 성질이 있는 한, 반드시 분비선의 일부가 될 필요는 없다. 이 형태의 암종은 인간을 포함한 일부 고등 포유류에서 발생할 수 있다. 잘 분화된 선암종은 그들이 유래한 분비선 조직과 유사한 경향이 있지만, 불완전하게 분화된 것은 그렇지 않을 수 있다. 생체조직검사에서 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암종 또는 다른 유형의 암인지 여부를 결정할 수 있다. 선암종은 신체 내 분비선이 매우 흔하게 존재하기 때문에 신체의 많은 조직에서 발생할 수 있다. 각 분비선은 동일한 물질을 분비하지 않을 수 있지만, 세포에 외분비 기능이 있는 한, 그것은 분비선으로 고려되며 그 악성 형태는 따라서 선암종으로 지칭된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침범하고 충분한 시간이 주어지면 종종 전이된다. 난소 선암은 가장 흔한 유형의 난소 암종이다. 이는 장액성 및 점액성 선암, 선명한 세포 선암 및 자궁내막 모양 선암을 포함한다.

림프종 및 백혈병은 조혈 (혈액을 형성하는) 세포에서 유래한 악성 종양이다.

모세포 종양 또는 모세포종은 미숙 또는 배아 조직과 닮은 종양 (대개 악성 종양)이다. 이들 종양 중 많은 것들이 어린이에게서 가장 흔하다.

"전이"란 암세포가 원래의 위치에서 다른 신체 부위로 퍼지는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발성 종양으로부터 악성 세포의 분리, 세포 외 기질의 침투, 내피 기저막의 체강과 혈관에의 침투, 그 다음, 혈액에 의해 운반된 후, 표적 기관의 침투에 달려있다. 최종적으로, 표적 부위에서의 새로운 종양의 성장은 혈관 형성에 달려있다. 종양 전이는 종종 종양 세포 또는 성분이 전이 능력을 유지할 수 있기 때문에 원발성 종양의 제거 후에도 발생한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"란 용어는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"와 관련된다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"란 용어는 림프절 전이와 관련된다.

악화 또는 재발은 사람이 과거에 영향을 받았던 증상에 의해 다시 영향을 받게된 경우에 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질환을 앓았고, 상기 질환에 대한 성공적인 치료를 받고, 다시 새로 상기 질환이 발병하는 경우, 새로 발병한 질환은 악화 또는 재발로 고려될 수 있다. 그러나 본 발명에 따르면, 종양 질환의 악화 또는 재발은 원래의 종양 질환 부위에서 일어날 수는 있지만 반드시 일어나는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소 종양을 앓았고, 성공적인 치료를 받은 경우, 악화 또는 재발은 난소 종양의 발병 또는 난소와 다른 부위에서의 종양의 발병일 수 있다. 종양의 악화 또는 재발은 또한 원래의 종양의 부위 뿐만 아니라 원래의 종양의 부위와 다른 부위에서도 종양이 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 상기 환자가 치료를 받은 원래 종양은 원발성 종양이고 원래의 종양의 위치와 다른 부위의 종양은 제2차 또는 전이성 종양이다.

본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 전염병은 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 연충 및 기생충을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 감염 인자에 의해 유발된다.

인간과 비-인간 척추동물 모두의 전염성 바이러스에는 레트로바이러스, RNA 바이러스 및 DNA 바이러스가 포함된다. 인간에서 발견된 바이러스의 예시로는 Retroviridae (예컨대, HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV 또는 HIV-III, 및 HIV-LP 등의 다른 분리체로도 지칭됨) 등의 인간 면역결핍 바이러스), Picornaviridae (예컨대, 소아마비 바이러스, A 형 간염 바이러스, 엔테로바이러스, 인간 콕사키 (Coxsackie) 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스), Calciviridae (예컨대, 위장염 유발 균주), Togaviridae (예컨대, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스), Flaviridae (예컨대, 뎅기바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스), Coronaviridae (예컨대, 코로나 바이러스), Rhabdoviridae (예컨대, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스), Filoviridae (예컨대, 에볼라 바이러스), Paramyxoviridae (에컨대 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스), Orthomyxoviridae (예컨대, 인플루엔자 바이러스), Bungaviridae (예컨대, 한타 (Hanta) 바이러스, 분가 바이러스, 펠보 바이러스 및 나이로 (Nairo) 바이러스), Arena viridae (출혈열 바이러스), Reoviridae (예컨대, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스), Birnaviridae, Hepadnaviridae (B형 간염 바이러스), Parvoviridae (파보바이러스), Papovaviridae (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스), Adenoviridae (대부분의 아데노바이러스), Herpesviridae (단순 포진 바이러스 1 및 2, 수두 대상 포진 바이러스, 시토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스), Poxviridae (천연두 바이러스, 우두 바이러스, 수두 바이러스) 및 Iridoviridae (예컨대, 아프리카 돼지 열병 바이러스), 및 분류되지 않은 바이러스 (예컨대, 해면양뇌병의 원인체, 델타 간염의 원인체 (B형 간염 바이러스의 결함 위성으로 생각됨), 비-A, 비-B형 간염의 원인체 (1 기=내부 전염, 2 기=비경구적 전염 (즉, C형 간염), 노르와크 (Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

고려된 레트로바이러스는 단순한 레트로바이러스 및 복잡한 레트로바이러스를 모두 포함한다. 복잡한 레트로바이러스에는 렌티바이러스, T 세포 백혈병 바이러스 및 거품성바이러스의 하위 그룹이 포함된다. 렌티바이러스에는 HIV-1 뿐만 아니라, HIV-2, SIV, 비스나 (Visna)바이러스, 고양잇과 면역결핍 바이러스 (FIV) 및 말과 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 가 포함된다. 상기 T 세포 백혈병 바이러스는 HTLV-1, HTLV-II, 원숭잇과 T 세포 백혈병 바이러스 (STLV) 및 솟과 백혈병 바이러스 (BLV)를 포함한다. 거품성바이러스는 인간 거품성바이러스 (HFV), 원숭잇과 거품성바이러스 (SFV) 및 솟과 거품성바이러스 (BFV)를 포함한다.

본 발명에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 박테리아 감염 또는 질병은 생활 주기에서의 세포 내 단계를 가지는 박테리아, 예를 들어 미코박테리아 (예컨대, 미 코박테리아 튜베르큘로시스 (cobacteria tuberculosis), 미코박테리아 보비스 (M. bovis), 미코박테리아 아비움 (M. avium ), 미코박테리아 레프라 (M leprae ) 또는 미코박테리아 아프리카눔 (M. africanum )), 리케차, 미코플라스마, 클라미디아 및 레지오넬라를 포함하는 박테리아에 의해 유발된다. 고려된 박테리아 감염의 다른 예시로는 그람 양성균 (예컨대, 리스테리아 ( Listeria ), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis ) 등의 바실러스, 에리시펠로트릭스 ( Erysipelothrix ) 종), 그람 음성균 (예컨대, 바르토넬라 ( Bartonella ), 브루셀라 ( Brucella ), 캄필로박터 (Campylobacter), 엔테로박터 ( Enterobacter ), 대장균 (Escherichia ), 프란시셀라 (Francisella), 헤모필루스 ( Hemophilus ), 클레프시엘라 ( Klebsiella ), 모르가넬라 (Morganella), 프로테우스 ( Proteus ), 프로비덴시아 ( Providencia ), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 ( Serratia ), 시겔라 ( Shigella ), 비브릭 ( Vibrio ) 및 예르시니아 ( Yersinia ) 종), 스피로헤타 박테리아 (예컨대, Lyme 병을 유발하는 보렐리아 복도페리 ( Borrelia burgdorferi )를 포함하는 보렐리 아 종), 혐기성 박테리아 (악티노마이세스 ( Actinomyces ) 및 클로스트리디움 (Clostridium) 종), 그람 양성 및 음성 구균 박테리아, 엔테로코커스 (Enterococcus) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 뉴모코커스 (Pneumococcus) 종, 스타피로코커스 (Staphylococcus) 종, 나이세리아 ( Neisseria ) 종에 의해 유발되는 감염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 전염성 박테리아의 구체적인 예시로는 헬리코박터 파일로리 ( Helicobacter pyloris ), 보렐리아 복도페 리 ( Borrelia burgdorferi ), 레지오넬라 뉴모필라 ( Legionella pneumophilia ), 미 코박테리아 튜베르큘로시스 (Mycobacteria tuberculosis), 미코박테리아 아비움 (M. avium ), 미코박테리아 인트라셀룰라레 (M. intracellulare ), 미코박테리아 칸 사이 (M. kansaii ), 미코박테리아 고르도나에 (M. gordonae ), 스타필로코커스 아우 레우스 (Staphylococcus aureus ), 나이세리아 고노르호애 ( Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝지티이스 ( Neisseria meningitidis ), 리스테리아 모 노사이토제니스 ( Listeria monocytogenes ), 스트렙토코커스 피오제니스 (Streptococcus pyogenes , 그룹 A 연쇄상구균), 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae , 그룹 B 연쇄상구균), 스트렙토코커스 비리던스 (Streptococcus viridans ), 스트렙토코커스 아이칼리스 (Streptococcus aecalis ), 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis ), 스트렙토코커스 뉴모니아이 (Streptococcus pneumoniae ), 헤모필루스 인플루엔자 ( Haemophilus influenzae ), 바실러스 안트라시스 (Bacillus antracis ), 코리네박테리아 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae ), 돼지단독균 (Erysipelothrix rhusiopathiae ), 클 로스트리디움 퍼프링거스 (Clostridium perfringers ), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani ), 엔테로박터 에어로게네스 ( Enterobacter aerogenes ), 크렙 시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneunmoniae ), 파스튜렐라 멀토시다 ( Pasturella multocida), 푸소박테리아 뉴클리에튬 ( Fusobacterium nucleatuin ), 스트렙토바실 러스 모닐리포르미 ( Streptobacillus moniliformis ), 트레포네마 팔리디움 (Treponema pallidium ), 트렙토네마 페르테누이 ( Treponema pertenue ), 렙토스피라 (Leptospira), 리케치아 (Rickettsia) 및 악티노마이세스 이스라엘리 ( Actinomyces israelli)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 진균 질병은 아스페르길루스증 (aspergilliosis), 크립토코커스증 (crytococcosis), 스포로트리코시스증 (sporotrichosis), 콕시디오이데스진균증 (coccidioidomycosis), 파라콕시디오이데스진균증 (paracoccidioidomycosis), 히스토플라스마증 (histoplasmosis), 블라스토마이세스증 (blastomycosis), 털곰팡이증 (zygomycosis) 및 칸디다증 (candidiasis)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 기생충 질병은 아메바증 (amebiasis), 말라리아 (malaria), 리슈만 (leishmania), 콕시듐 (coccidia), 지질 다발증 (giardiasis), 크립토스포리드 증 (cryptosporidiosis), 톡소 플라스마 증 (toxoplasmosis) 및 트리 파노 모 니아 증 (trypanosomiasis)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 회충증 (ascariasis), 십이지장충증 (ancylostomiasis), 편충증 (trichuriasis), 간충증 (strongyloidiasis), 톡소카라증 (toxoccariasis), 선모충증 (trichinosis), 사상충증 (onchocerciasis), 필라리아 (filaria) 및 개사상충증 (dirofilariasis) 등 다양한 벌레에 의한 감염이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 주혈흡충증 (schistosomiasis), 폐흡충증 (paragonimiasis) 및 간흡충증 (clonorchiasis) 등 다양한 흡충에 의한 감염이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

"치료" 또는 "치료상 처치"란 용어는 건강 상태를 향상시키고 및/또는 개인의 수명을 연장 (증가)시키는 모든 치료와 관련된다. 상기 치료는 개인의 질병을 퇴치하거나, 개인의 질병의 발달을 멈추거나 느리게 하거나, 개인의 질병의 발달을 억제 또는 지연시키고, 개인의 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고, 및/또는 현재 질병에 걸린 사람 또는 이전에 질병에 걸렸던 개인의 재발을 감소시킬 수 있다.

"예방적 치료" 또는 "예방 치료"란 용어는 개인의 질병의 발생을 예방하기 위한 치료와 관련된다. "예방적 치료" 또는 "예방 치료"란 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

"개인" 및 "대상"이란 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 그들은 질병이나 장애 (예컨대, 암)에 걸리거나 감염될 수 있지만 질병 또는 장애가 있거나 없을 수도 있는 인간, 비-인간 영장류 또는 기타 포유류 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 많은 구체예에서, 상기 개인은 인간이다. 달리 명시되지 않는 한, "개인" 및 "대상"이란 용어는 특정 연령을 나타내지 않으므로, 성인, 연장자, 어린이 및 신생아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, "개인" 또는 "대상"은 "환자"이다. "환자"란 용어는 본 발명에 따라 치료 대상, 특히 질환이 있는 대상을 의미한다.

"위험에 처한"이란 일반인과 비교하여 질병, 특히 암이 발병할 확률이 정상보다 높은 것으로 확인된 대상, 즉 환자를 의미한다. 또한, 질병, 특히 암을 앓았거나 현재 앓고 있는 대상은 질병이 발병할 위험이 높은 대상이며, 대상은 계속해서 질병이 발병할 수 있다. 현재 암에 걸렸거나 걸렸었던 대상은 암 전이 위험이 높다.

"면역 요법"이란 용어는 특정 면역 반응 또는 특정 반응을 포함하는 치료와 관련된다.

본 발명의 문맥상, "보호", "예방", "예방적", "예방의" 또는 "보호적" 등의 용어는 대상에서 질병의 발생 및/또는 증식의 예방 및 치료 또는 둘 모두와 관련이 있으며, 특히, 대상이 질병을 발병할 가능성을 최소화하는 것 또는 질병의 발달을 지연시키는 것과 관련된다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, 종양 위험이 있는 사람은 종양 예방 치료의 후보가 된다.

면역 요법의 예방적 투여, 예를 들어, 본 발명의 제제 또는 조성물의 예방적 투여는 바람직하게는 수혜자를 질병 발달로부터 보호한다. 면역 요법의 치료적 투여, 예를 들어, 본 발명의 제제 또는 조성물의 치료적 투여는 질병의 진행/성장의 억제를 유도할 수 있다. 이는 질병의 진행/성장 속도의 감속, 특히 바람직하게는 질병의 퇴치로 유도하는 질병의 진행의 중단을 포함한다.

면역 요법은 본 명세서에서 제공되는 제제가 바람직하게는 환자로부터 항원-발현 세포를 제거하는 기능을 하는 임의의 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 제거는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 환자에서 면역 반응을 증진시키거나 유도하는 결과로서 일어날 수 있다.

"면역화" 또는 "예방 접종"이란 용어는 치료적 또는 예방적 이유로 면역 반응을 유도하기 위한 대상의 치료 과정을 의미한다.

"생체 내"란 용어는 대상의 상황과 관련된다.

본 명세서의 항원 수용체, 펩티드 사슬, 핵산, 재조합 세포, 면역 이펙터 세포, 바람직하게는 T 세포 뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 다른 화합물 및 제제는 임의의 적합한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 멸균되고 본 명세서에 기술된 바와 같은 유효량을 함유하며, 원하는 반응 또는 원하는 효과를 발생시키기 위해 본 명세서 논의된 바와 같은 선택적인 추가의 제제를 함유한다.

약학 조성물은 대개 균일한 투여 형태로 제공되며, 그 자체가 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약학 조성물은 예를 들어, 용액이나 현탁액의 형태일 수 있다.

약학 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염, 완충 물질, 방부제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. "약학상 허용되는"이란 용어는 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.

약학적으로 허용되지 않는 염은 약학적으로 허용되는 염을 제조하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등의 산으로부터 제조된 것들을 비제한적으로 포함한다. 약학적으로 허용되는 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염 등의 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속 염으로부터 제조될 수 있다.

약학 조성물에 사용하기에 적합한 완충 물질은 염의 아세트산, 염의 시트르산, 염의 붕산 및 염의 인산을 포함한다.

약학 조성물에 사용하기에 적합한 방부제는 염화 벤즈알코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.

주사 가능한 제제는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 링거 락테이트 (Linger Lactate)를 포함할 수 있다.

"담체"란 용어는 자연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 의미하며, 활성 성분이 적용을 촉진, 증진 또는 가능하게 하기 위해 결합되어 있다. 본 발명에 따르면, "담체"란 용어는 또한 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다.

가능한 비경구 투여용 담체 물질은 예를 들어, 멸균수, 링거 (Ringer), 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히, 생체적합성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 공중합체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용된 "부형제"란 용어는 약학 조성물에 존재할 수 있으며 예를 들어 담체, 결합제, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 향료 또는 착색제 등의 활성 성분이 아닌 모든 물질을 의미한다.

본 명세서에 기술된 제제 및 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통해, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 활성 화합물의 멸균수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이는 바람직하게는 수혜자의 혈액과 등장성이다. 적합한 담체 및 용매의 예시로는 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 대개 멸균된, 고정유가 용액 또는 현탁 용매로 사용된다.

본 명세서에 기술된 제제 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 증상 치료의 경우, 바람직한 반응은 바람직하게는 상기 질병의 경과의 억제와 관련된다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 증상의 치료에 바람직한 반응은 상기 질병 또는 상기 증상의 발병의 지연 또는 예방일 수도 있다.

본 명세서에 기술된 제제 또는 조성물의 유효량은 치료될 증상, 질병의 중증도, 환자의 연령을 포함하는 파라미터, 생리적 상태, 크기 및 중량, 치료 기간, 동반하고 있는 치료 (있는 경우), 특정 투여 경로 및 이와 유사한 요소들에 좌우될 것이다. 따라서, 본 명세서에 기술된 제제의 투여량은 이러한 파라미터의 다양성에 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 투여량으로 불충분한 경우, 보다 많은 투여량 (또는 상이하고 보다 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 보다 높은 투여량)이 사용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 제제 및 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위해 환자에게, 예컨대 생체 내 투여될 수 있다. 환자는 본 명세서에 기술된 제제 및 조성물이 투여됨으로써 교정되거나 개선될 수 있는 장애를 가진 인간 환자를 포함하는 것이 바람직하다. 이는 항원의 발현이 특징인 세포를 포함하는 장애를 포함한다.

예를 들어, 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 제제는 암 질환, 예를 들어 항원을 발현하는 암세포의 존재가 특징인 본 명세서에 기술된 바와 같은 암 질환 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 기술된 약학 조성물 및 치료 방법은 또한 본 명세서에 기술된 질병을 예방하기 위한 면역화 또는 예방 접종에 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 보조제 등의 면역-증진 물질을 보충하면서 투여될 수 있으며, 그 효과를 더욱 증가시키기 위해, 바람직하게는 면역자극의 상승 효과를 달성하기 위해 하나 이상의 면역-증진 물질을 포함할 수 있다. "보조제"란 용어는 면역 반응을 연장하거나 강화시키거나 촉진시키는 화합물과 관련된다. 이러한 점에서 다양한 보조제의 유형에 좌우되는 다양한 메커니즘이 가능하다. 예를 들어, DC의 성숙을 가능하게 하는 화합물, 예를 들어, 지질다당류 (lipopolysaccharides) 또는 CD40 리간드는 적합한 보조제 제1 class를 형성한다. 일반적으로, "위험 신호" (LPS, GP96, dsRNA 등) 또는 GM-CSF 등의 사이토카인 유형의 면역 시스템에 영향을 미치는 임의의 제제는 면역 반응을 제어된 방식으로 강화 및/또는 영향을 미치게 하는 보조제로서 사용될 수 있다. CpG 올리고디옥시뉴클레오티드는 임의적으로 본 문맥에서 사용될 수 있지만, 상기 설명한 바와 같이, 특정 상황에서 발생하는 부작용이 고려되어야 한다. 특히 보조제는 모노카인, 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인, 예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-α, 또는 hGH 등의 성장 인자 등의 사이토카인인 것이 바람직하다. 추가로 공지된 보조제는 수산화알루미늄, 프로인트 (Freund's) 보조제 또는 Montanide® 등의 오일, 가장 바람직하게는 Montanide® ISA51이다. 리포펩티드, 예컨대 Pam3Cys는 또한 본 발명의 약학 조성물에서 보조제로 사용하기에 적합하다.

약학 조성물은 국부적으로 또는 전신적으로, 바람직하게는 전신적으로 투여될 수 있다.

"전신 투여"란 용어는 제제가 현저한 양으로 개인의 신체 내에서 광범위하게 분포되어 원하는 효과를 나타내도록 하는 제제의 투여를 의미한다. 예를 들어, 상기 제제는 혈액 내에서 원하는 효과를 나타낼 수 있고 및/또는 혈관계를 통해 원하는 작용 부위에 도달할 수 있다. 전형적인 전신 투여 경로는 제제를 혈관계 또는 구강, 폐 또는 근육 내에 직접 도입하여 투여하는 것을 포함하며, 이때 제제는 흡착되고, 혈관계로 들어가며, 혈액을 통해 하나 이상의 원하는 작용 부위로 운반된다.

본 발명에 따르면, 전신 투여는 비경구 투여인 것이 바람직하다. "비경구 투여"란 용어는 제제가 장을 통과하지 않는 제제의 투여를 의미한다. "비경구 투여"란 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 동맥 내 투여를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

투여는 또한 예를 들어 경구, 복강 내 또는 근육 내에서 수행될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 제제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학 요법 및/또는 골수 이식 (자가, 동계, 동종 또는 무관한) 등의 통상적인 치료 요법과 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 상세히 설명되며, 이는 단지 설명의 목적으로 사용되는 것이고 한정하려는 것은 아니다. 설명 및 실시예들로 인해, 본 발명에 마찬가지로 포함되는 추가 구체예들이 숙련된 기술자에게 접근 가능하다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 TCR -CD3 복합체의 표현을 포함한다. 상기 TCR 및 CD3-서브 유닛은 세포 외 도메인, 줄기 영역, 막 횡단 도메인 및 ITAM을 지니는 세포질 도메인으로 구성된다. CD4 또는 CD8 보조수용체의 발현은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 서브 세트에 대한 기여도를 결정한다. 세포질 내 CD3 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAMs)는 실린더로 표시된다 ("The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001에서 차용).

도 2는 CAR의 차세대 디자인을 나타낸다. 서로 다른 세대의 CAR (1G, 1세대, 2G, 2세대, 3G, 3세대)의 개략도. 1세대는 즉각적인 IFNγ-분비 또는 세포 독성 등의 이펙터 기능을 매개하는 세포 외 scFv 및 세포질 CD3ζ 사슬/ZAP70을 포함하고, 2세대는 증식을 촉진하는 CD28/PI3K를 추가적으로 포함하며, 3세대는 나아가 세포 생존을 유지시키는 4-1BB 또는 OX40/TRAF도 포함한다 (Casucci, M. 등 (2011) 2: 378-382).

도 3은 항원에 대한 T 세포의 방향 전환을 위한 상이한 수용체 포맷의 개략도를 나타낸다. Cα/β는 결합한 항원의 신호를 세포막을 통해 세포질에서 모집된 CD3-복합체의 신호 전달 도메인으로 전달할 때 신호 전달 도메인으로도 작용하는 TCR의 불변 영역이고, VH 및 VL은 각각 면역 글로불린의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역이며, 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 펩티드 사슬의 도메인을 나타낸다.

왼쪽 : 항원-특이적 scFv 단편, IgG1-유래의 스페이서 도메인, CD28 보조자극 및 CD3ζ 신호 전달 도메인 (고전 단일 사슬 CAR)으로 구성된 2 세대 CAR, 중간 : 쥣과 TCRβ 사슬의 불변 도메인과 scFv의 결합 및 쥣과 TCRα 사슬의 불변 도메인의 동시 발현에 기반한 신규 CAR 포맷 (1가 비-결합성 항원 수용체), 오른쪽 : TCRα/β 사슬 (mu, 쥣과(murine))으로 구성된 쥣과 TCR. 상기 헤테로다이머 CD3δε와 호모다이머 CD3ζζ는 Cα-도메인에 의해 모집되는 한편 CD3ηε는 Cβ-도메인에 의해 모집된다.

도 4A 및 B는 본 명세서에 기술된 특정 항원 수용체의 구조를 나타낸다.

도메인의 명명법은 도 3의 설명에 설명되어 있다. 탠덤 항원 수용체 (탠덤 AR)는 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 가변 항체 단편을 포함하는 사슬을 포함한다. 인트라/인터-조합 AR은 항원에 인트라- 및 인터사슬-결합이 가능하다. 인터-조합 AR은 항원 결합을 인터사슬-결합을 통해 독점적으로 허용한다. 1가 비-조합 AR은 내인성 CD3의 모집에 기반한 신규 AR-디자인의 1가 원형을 나타내며, 2가 비-조합 AR은 CAR이고, 이 디자인은 이미 Gross 등, 1992 FASEB J.,(6) 3370-3378에 암시되어 있고 각 항원의 단일 사슬에 결합하는 것을 제한한다. 1가 조합 AR은 CAR-디자인에서 scFv-단편을 통해 더 높은 원자가를 제공함으로써 기능의 이점을 입증하기 위한 기준 AR 또는 음성 대조군 역할을 한다.

도 5는 T 세포 내의 항원 수용체의 상대적인 발현 수준을 나타내는 히스토그램이다. T 세포에 전기천공된 CAR RNA의 발현은 클라우딘6-특이적 항체 IMAB206의 파라토프에 대한 이디오타입 항체를 이용하여 유동 세포 분석법에서 검증되었다. 유동 세포 분석 항체를 Dylight-640으로 직접 표지하고, 발현 수준을 평균 형광 강도 (MFI)로 나타내었다.

도 6A 내지 도 6C는 면역 세포 활성화의 지표인 IFN -γ 생성의 상대적 유도 수준을 나타내는 히스토그램이다. 도 6A : 상이한 항원 수용체 발현 구조물 및 대조군으로 전기천공되고, Cl6 음성 및 양성 미숙 수지상 세포 (iDC)와의 공-배양된 CD8+ T 세포에 대한 ELISA에서 IFN-γ 생성의 검출. 사슬 간 항원 결합이 가능한 2가 항원 수용체는 우수한 IFN-γ 생성을 나타냈다 (인터-조합 AR 2GS, 3GS, 4GS). 가변 도메인 사이의 링커 길이의 변화는 수용체 기능에 유의한 영향을 미치지 않았지만, 3GS 링커는 2- 및 4GS-링커에 비해 다소 양호한 것으로 나타났다. 1가 항원 수용체 (1가 조합 AR)를 수득하기 위해 2가 항원 수용체의 N-말단 가변 도메인이 절단됨으로써 수용체 기능이 현저하게 감소되었고, 우수한 수용체 기능에 대한 2가 항원-결합의 중요성이 입증되었다. 항원 수용체 구조의 쥣과 불변 도메인은 IFN-γ 생성을 약간 향상시킨다 (인터-조합. AR Mu 3GS). 도 6B : 상기 결과의 기증자-독립성을 증명하기 위해 상이한 기증자로부터 수득된 T 세포를 사용하여 유사한 결과를 나타내는 도 6A에 개시된 실험의 반복. 도 6C : 실질적으로 도 6A 및 도 6B에 개시된 실험의 반복. 탠덤 항원 수용체 및 (인트라- 및 인터-사슬 VH/VL-도메인 조합 모두를 통한 항원 인식을 가능하게 하는) 인트라/인터-조합 항원 수용체, 각각은 1가 항원 수용체에 비해 IFN-γ 발현의 보다 높은 유도를 초래하고 (1가 비-조합 AR), 항원 수용체에 비해 단지 인트라-사슬 항원 결합을 가진다 (2가 비-조합 AR).

도 7은 난소암 세포 Sk - ov -3에 대한 CAR C16-조작된 T 세포의 세포 독성 효능을 나타내는 히스토그램이다. 종양 세포는 양이 증가하는 Cl6 RNA로 전기천공되고, CD8+ T 세포는 상이한 항원 수용체 발현 구조물로 전기천공된다. 세포 용해로 측정된 T 세포 이펙터 기능은 Sk-ov-3 세포에서 발현된 Cl6의 양이 감소함에 따라 감소하였다. 2가 항원 수용체 (탠덤 AR 및 인터-조합 AR)를 재조합적으로 발현하는 T 세포의 세포 독성은 1가 비-조합 항원 수용체 및 고전 scCAR에 비해 표적 세포상의 항원 밀도에 덜 좌우되었다.

도 8A 내지 8D는 APC로서 iDC에 대한 세포 증식에 의해 결정되는 면역 세포 활성화의 결과를 나타내는 히스토그램이다. 도 8A 및 8B : 각각 C16 음성 미숙 수지상 세포 (iDC)에 대해 CD4+ (도 8A) 및 CD8+ T 세포 (도 8B)로 표지된 CFSE의 증식. 분자 CD80 및 41BBL의 cis로 공동 자극시 (즉, T- 세포 내로의 전기천공), 고전 단일 사슬 키메라 항원 수용체 (고전 scCAR)는 동족 항원의 부재하에 백그라운드 증식을 나타냈다. 이는 또한 표적 세포 없이 배양된 T 세포에서도 관찰되었으며, 비-특이적 증식이 고전 scCAR를 발현하는 T 세포의 고유한 특성임을 나타냈다 (데이터 표시되지 않음). 이 결과는 Cl6 음성 세포주 Sk-Ov-3에서도 나타났다. 도 8C 및 8D : 각각 Cl6+ iDC에 대해 CD4+ (도 8C) 및 CD8+ T 세포 (도 8D)로 표지된 CFSE의 증식. CD4+ T 세포는 인터-조합 AR을 발현하는 구조물로 전기천공되었을 때 C16 로딩된 iDC에 대해 증식하였다. 고전 scCAR 디자인은 더 적은 증식을 초래했다. CD8+ T 세포의 경우, 고전 scCAR 및 인터-조합 AR은 거의 동일한 우수한 증식을 나타냈다.

도 9A 내지 9B는 APC로서 종양 세포에 대한 세포 증식에 의해 결정되는 면역 세포 활성화의 결과를 나타내는 히스토그램이다. 공동 자극 분자 CD80 및 41BBL로 전기천공된 (trans로 공동 자극) Cl6+ 난소암 세포주 Ov-90에 대해 CD4+ (도 9A) 및 CD8+ (도 9B) T 세포로 표지된 CFSE의 증식. CD4+ T 세포는 iDC^Cl6 ⁺와 유사하게 인터-조합 AR로 전기천공되었을 때 Ov-90^Cl6 ^+CD80+ ^41BBL ⁺에 대해 증식할 수 있었다. 1가 및 2가 항원 수용체 모두 CD8+ T 세포의 증식을 초래했다. 증식의 양은 고전 scCAR에 필적했다. T 세포의 cis로 공동 자극은 T 세포 증식을 더욱 강화시켰다.

도 10은 IFN -γ 생성의 항원 투여량-의존 유도를 나타내는 히스토그램이다. 상이한 항원 수용체 발현 구조물 및 대조군으로 전기천공된 CD8+ T 세포에 대한 ELISA에서의 IFN-γ 생성 검출, 및 0.01㎍ 내지 1㎍의 범위에서 관련된 전체 길이의 Cl6 RNA를 전기천공시킨 미숙 수지상 세포 (iDC)와 1㎍의 무관한 gp100의 공동배양. 2가 항원 수용체는 인터- > 인터/인트라- > 2가 비-조합 AR의 순서로 조합 사슬 짝지음의 가정된 양에 좌우되는 사이토카인 분비에 대해 평가되었다. 높은 항원 밀도 (1μg Cl6)에서 고전 CAR은 가장 많은 양의 IFN-γ-분비를 끌어냈고 그 다음으로 인터- 및 인터/인트라-조합 AR이 뒤따랐다. 2가 비-조합 AR은 1가. 조합 AR과 1가. 비-조합 AR보다 덜 기능적이었다. 2가 비-조합 AR은 인간 C-불변 도메인 사이의 사슬 짝지음에만 의존하는 반면, 1가 조합 AR은 인간 C- 및 마우스 V- 도메인 사이의 보다 양호한 사슬 짝지음을 달성한다. 1가 비-조합 AR은 2가 비-조합 AR보다 더 기능적이며, 이는 인터-사슬 짝지음이 보다 약한 인간의 것 대신에 마우스 C- 도메인에 의해 촉진된다는 사실 때문이다. 이는 본 분석에 적용된 임의의 항원 투여에도 해당되는 사실이다. 특히, 항원 밀도를 낮추었을 때도 (0.1㎍, 0.01㎍의 Cl6 RNA-전기천공된 세포), 인터-조합 AR은 고전 CAR에 비해, 관련 항원을 가지고 RNA로 펄스된 iDC에 대해 점점 더 반응적이 되었다. 이는 Cl6-전기천공된 종양 세포주 Skov-3에 대한 항원 투여량-의존 세포 독성 분석 (도 7)에서 나타난 유사한 경향과 일맥상통한다.

도 11은 IFN -γ 생성의 항원 투여량-의존 유도를 나타내는 히스토그램이다. 도 11A에서, 고전 및 신규 조합 고전 CAR의 포맷의 비교를 나타내었다. 두 CAR 모두 T 세포의 내인성 CD3 복합체와 독립적으로 융합된 CD3ζ-신호 전달 부분을 통한 신호 전달에 의존한다. 도 11B는 모두 CH2-CH3- 항체 도메인 및 CD28을 운반하고 신호 전달 도메인으로 CD3ζ를 운반하는, 클라우딘6-특이적 고전 CAR 및 신규 조합 고전 CAR로 전기천공된 CD8+ T 세포에 대한 ELISA에서 IFN-γ 생성의 검출을 나타낸다. 이들은 0.002㎍ 내지 2㎍의 범위에서 관련된 전체 길이의 C16 RMA를 전기천공시킨 미숙 수지상 세포 (iDC) 및 2㎍의 무관한 gp100와 공동 배양되었다. 보다 높은 항원 밀도 (2μg 내지 0.2μg Cl6)에서 두 CAR 포맷 모두 동일하게 많은 양의 IFNγ-분비를 끌어냈다. 보다 낮은 항원 밀도에서는 상기 고전 CAR은 IFNγ 분비하는데 있어 다소 더 효과적이었다. 중요하게도, 상기 조합 고전 CAR은 고전 CAR과 동일한 적정 항원 범위 내에서 기능적이다.

[실시예]

본 명세서에서 사용된 기술 및 방법은 본 명세서에 설명되어 있거나 또는 예를 들어, 문헌 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y에서 설명된 바와 같이 그 자체가 공지된 방식으로 수행된다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 특별히 명시하지 않는 한, 제조업체의 안내에 따라 수행된다.

실시예 1: T 세포에서의 항원 수용체의 발현

다양한 항원 수용체 구조물의 발현이 Cl6 scFv 이디오타입-특이적 항체를 사용하여 CD8+ T 세포로 전기천공시킨 1 일 후 평가되었다. 발현에 대해 테스트되는 구조물 또는 구조물의 조합은 (i) 쥣과 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 도메인 단독 (mCα), (ii) VH-VL-mCβ 단독 (scFv-mCβ), (iii) VH-VL-CH2-CH3-CD28-CD3ζ (고전 scCAR), (iv) mCα 및 VH-VL-mCβ (1가 비-조합 AR), (v) VH-VL-mCα 및 VH-VL-mCβ (2가 비-조합 AR), (vi) VL-VH-mCα 및 VH-VL-mCβ (인트라/인터-조합 AR), (vii) mCα 및 VH-VL-VH-VL-mCβ (탠덤 AR), (viii) VH-hCα 및 VL-hCβ (1가 조합 AR), (ix) VH-(GGGGS)3-VH-hCα 및 VL-(GGGGS)3-VL-hCβ (인터-조합 AR 3GS) 및 (x) VH-(GGGGS)3-VH-mCα 및 VL-(GGGGS)3-VL-mCβ (인터-조합 AR Mu 3GS)이다 (불변 도메인의 "m" 또는 "Mu"는 쥣과 기원을 나타내며, "h"는 인간 기원을 나타낸다). 이들 상이한 항원 수용체 구조물은 도 4A-4B에 개략적으로 나타내었다. 도 5의 데이터는 2가 비-조합, 인트라/인터-조합 및 1가 조합 항원 수용체에 대한 2개의 개별적인 측정, 탠덤 및 인터-조합 항원 수용체에 대한 5개의 측정과, 고전 scCAR 및 1가 비-조합 항원 수용체에 대한 최대 10개의 측정 결과를 나타낸다. 각 샘플의 MFI 값은 대응하는 음성 대조군 (mCα 또는 scFv-mCβ를 1로 설정)에 대해 표준화되었다.

도 5에서 나타냈듯이, 고전 scCAR 디자인이 가장 우수한 발현을 나타냈다. 인간 (hC) 또는 쥣과 (mC) 불변 도메인을 가진 1가 비-조합, 2가 비-조합, 인트라/인터-조합 및 인터-조합 항원 수용체는 유사한 발현을 나타냈다. 1가 조합 AR은 표면 염색이 감소한 반면, 탠덤 항원 수용체는, 고전 scCAR을 제외하고, 다른 구조물에 비해 표면 염색이 증가하였다.

실시예 2: IFN-γ 분비 분석

실험 1 일째에, 건강한 기증자의 연막에서 신선한 말초 혈액 단핵 세포 ("PBMCs")를 단리했다. PBMC의 3/4에서, CD14+ 세포는 MACS 분류를 사용하여 단리되었다. 이후 MACS 통과액 및 잔류 PBMC는 CD8+ T 세포에 대해 MACS 분류되었다. CD14+ 세포는 1 일, 3 일, 6 일째에 IL-4 및 GM-CSF (1000U/㎖) 투여에 의해 미숙 수지상 세포 ("iDCs")로 분화되었다. CD8+ T 세포는 OKT3 코팅된 6 웰 플레이트로 옮겨졌다. 3 일째에, T 세포를 새로운 6 웰 플레이트로 옮겼다. 7 일째에, iDC는 무관한 및 Cl6 IVT RNA로 전기천공되었다. OKT3 활성화된 T 세포는 그 후에 대조군, 또는 개별적인 도면에서 말하고 실시예 1에 설명된 바와 같은 항원 수용체 구조물로 전기천공되었다. 품질 보증을 위해, T 세포에서의 항원 수용체 표면 발현이 Dylight 650으로 표지된 Cl6 항원 수용체 이디오타입-특이적 항체를 사용하여 8 일째에 분석되었다. 전기천공된 T 세포 및 항원이 전기천공된 iDC는 96 웰 플레이트에서 10:1 의 E:T 비율로 중복하여 20 시간 동안 공동 배양되었다. 9 일째, 배양 상층액을 채취하여 eBioscience (#88-7316-88)의 IFN-γ Ready Set Go! 키트를 사용하여 샌드위치 ELISA에서 분비된 IFN-γ의 양을 분석하였다. 흡광도는 Tecan Sunrise ELISA 판독기를 사용하여 검출되었다.

도 6A에 나타낸 바와 같이, Cl6 양성 또는 음성 iDC로 배양된 mock (mCα)이 전기천공된 T 세포는 비-특이적 IFN-γ 생성을 나타내지 않았다. 항원 수용체 양성 T 세포 중 오직 고전 scCAR 양성 세포만이 C16 음성 표적 세포와 배양될 때 사이토카인의 검출 가능한 백그라운드를 생성하였다. 1가 항원 수용체 양성 세포로부터의 IFN-γ 생성은 Cl6+ iDC와 함께 배양될 때 관찰될 수 있다. 상기 고전 scCAR은 많은 양의 IFN-γ를 생성하였다. 조합 항원 수용체의 오직 하나의 사슬, 이 경우에는 VH-VH-Cα의 음성 대조군으로 전기천공되었을 때, IFN-γ 생성이 관찰되지 않을 수 있다. 이 대조군은 양쪽 사슬이 T 세포의 항원 인식 및 후속 활성화에 필요하다는 것을 증명했다. 대조적으로, 상기 인터-조합 AR (3GS)은 1가 AR (조합 및 비-조합)로 생성된 것에 비해 IFN-γ 생성이 확연히 개선되었다. 상이한 링커 길이, 가변 도메인 사이의 Gly4Ser 링커의 2 또는 4 반복은 3 반복에 비해 기능적으로 큰 영향을 주지 않았다.

중요하게도, 조합 항원 수용체 구조에서의 N-말단 가변 도메인의 절단은 이펙터 기능의 큰 감소를 나타냈다. 이 관찰은 2가 항원-결합이 T 세포 활성화를 지지한다는 것을 분명히 증명했다. 1가 조합 AR과 2가 조합 AR 사이의 기능에 있어서현저한 증가는 또한 인터-사슬 가변 도메인에 의해 매개되는 사슬-짝지음의 개선 외에도, 2개의 사슬을 가로질러 항원 결합 자체의 발생이 더욱 수용체 사슬 짝지음을 안정화시키고, 따라서 내인성 CD3 복합체로의 혼합 및 후속적인 T 세포 활성화/기능을 개선시킨다는 강한 증거이다. 이중 사슬 T 세포 수용체로부터, 사슬의 헤테로다이머화가 CD3 복합체로의 효과적인 혼합을 위한 필수 전제 조건이라는 것은 잘 알려져 있다.

조합 AR 구조로의 쥣과 잔기의 통합은 인간 TCR 상수에 비해 쥣과 TCR 상수 Cα/β-도메인의 알려진 강한 상호 작용에 기인한 것라고 충분히 할 만한 활성화를 더 증가시킬 수 있었다. 따라서, 가변 도메인에 대한 인터-사슬 항원 결합 또는 개별 사슬의 T 세포 수용체 불변 도메인의 다이머화를 통한 항원 수용체의 펩티드 사슬의 헤테로다이머화가 개선되었고, 내인성 CD3 복합체 내로의 항원 수용체의 통합이 개선되었고, 따라서, T 세포 기능이 개선되었다. 이들 결과는 상이한 T 세포 기증자로 고도로 재현가능하였다 (도 6B 참조).

특히, 고전 scCAR은 본 실험에서 Cl6 음성 iDC에 대한 IFN-γ 생성의 비-특이적 백그라운드를 입증했다. 이 결과는 또한 재현 가능하며 고전 scCAR-CD28-CD3ζ 융합 포맷에 의한 강장 신호를 논의하고 있는 Long 등 ((2015) Nat. Med., (21) 581-590)이 반포한 데이터와 일맥상통한다. Long 등은 다양한 항원 특이성이 있는 여러 고전 scCAR에 대해 항원 비-의존적 활성화를 관찰하였다. 고전 scCAR 양성 T 세포의 비-특이적 백그라운드 활성화가 T 세포 기증자 특이적 효과가 아니라고 가정한다.

또한, 도 6C에 묘사된 바와 같이, IFN-γ 생성을 위한 2가 비-조합 및 인트라/인터-조합 항원 수용체를 탠덤 2가 항원 수용체와 함께 테스트하였다. 비교를 위해, 음성 대조군으로 1가 비-조합 AR, 양성 대조군으로 고전 scCAR도 도면에 나타내었다. 탠덤 2가 항원 수용체는 1가 항원 수용체에 비해 개선되었음이 나타났다. 2가 비-조합 항원 수용체 VH-VL-Cα + VH-VL-Cβ는 관련 인트라/인터-조합 항원 수용체 VL-VH-Cα + VH-VL-Cβ에 비해 낮은 IFN-γ 생성을 끌어냈다. 이들 관찰은 V-도메인 짝지음과 상이한 사슬의 가변 도메인에 대한 항원 결합 모두에 의해 부여된 인터-사슬 상호 작용이 헤테로다이머 토폴로지를 안정화시키고 보다 견고한 수용체-의존 T 세포 신호 전달 반응을 제공한다는 가설을 확인했다.

실시예 3: 세포 독성 분석

실험 1 일째에, 두 건강한 기증자의 2개의 연막에서 신선한 PBMC를 단리했다. PBMC는 CD8+ T 세포에 대해 MACS 분류되었다. CD8+ T 세포를 OKT3 코팅된 6 웰 플레이트에 옮겼다. 이들은 50U/ml IL-2를 함유하는 배지에서 배양되었다. 3 일째에, T 세포를 새로운 6 웰 플레이트로 옮기고 배양 배지를 교체하였다. 7 일째에, 난소암 세포주 Sk-Ov-3를 다양한 양의 Cl6 RNA 및 10μg의 루시퍼라제 RNA로 RNA-전기천공하였다. OKT3 활성화 T 세포를 무관한 고전 scCAR, 관련 Cl6-특이적 고전 scCAR, 1가 비-조합 항원 수용체 및 탠덤 항원 수용체 뿐만 아니라 도 7에 나타낸 바와 같은 본 발명의 인터-조합 항원 수용체로 전기천공하였다. 품질 보증을 위해, T 세포상에서의 항원 수용체 표면 발현을 Dylight 650으로 표지된 Cl6 항원 수용체 이디오타입-특이적 항체를 사용하여 8일 째에 분석하였다. 항원 수용체가 전기천공된 T 세포 및 항원이 전기천공된 Sk-Ov-3는 96 웰 플레이트에서 30:1 의 E:T 비율로 3 회 중복하여 3 시간 동안 공동 배양되었다. 배양 3 시간 후, 루시페린을 각 배지에 첨가하였다. 특정 세포 용해는 TECAN 판독기에서 방출된 루시퍼라제에 의한 회전율에 기인한 루시페린-신호의 감소로 검출되었다.

상기 Sk-Ov-3 데이터는 본 발명의 2가 항원 수용체 (인터-조합 AR 및 탠덤 AR)가 고전 scCAR 및 1 가 비-조합 AR에 비해 현저한 개선을 나타냈다는 것을 인상적으로 기록하고 있다. 다른 모든 항원 수용체 구조물에 비해, 고전 scCAR 디자인은 Cl6이 전기천공된 Sk-Ov-3 세포에 대해 약 77%의 최상의 세포 용해를 나타냈다. 그러나 10μg의 항원 RNA는 비생리적 상태이며 생체 내 상황을 정확하게 반영하지 못한다고 언급되어야 한다. 낮은 항원 투여량에서, 1가 비-조합 AR은 만족스러운 방식으로 종양 세포를 용해시킬 수 없었다 (9.2 %). 대조적으로, 인터-조합 AR (3GS)은 고전 scCAR 디자인 (48.1%)에 비해 여전히 우수한 특정 세포 용해를 나타냈고 (41.3%), 결론적으로 실질적인 세포 독성 이펙터 기능에 대한 항원 밀도에 덜 의존적이었다.

실시예 4: 증식 분석

실험 1 일째에, 건강한 기증자의 연막에서 신선한 PBMC를 단리하였다. PBMC의 3/4에서, CD14+ 세포는 MACS 분류 사용하여 단리되었고, 잔류 PBMC는 동결되었다. 1 일, 3 일, 6 일째에 IL-4 및 GM-CSF (1000U/㎖)를 투여하여 CD14+ 세포를 iDC로 분화시켰다. 7 일째에 iDC를 무관한 및 Cl6 IVT-RNA로 전기천공하였다. 동결된 PBMC를 같은 날에 해동시키고 CD4+ 및 CD8+ 세포로 MACS 분류하였다. 임의의 사전 활성화 (OKT3)없이, 실시예 1에 기술된 구조물인 도 8A 내지 8D에 나타낸 바와 같이, 본래의 T 세포, 6 및 7x10⁶ 세포를 대조군, 고전, 1가 및 2가 항원 수용체 구조물로 각각 전기천공하였다. T 세포 반응자의 독립적인 세트에서, 동일한 항원 수용체 구조물은 공동 자극 분자 41BBL 및 CD80과 함께 전기천공되어 자동 공동 자극또는 cis로 공동 자극을 달성하여, 이펙터 기능을 개선시키는 것으로 나타났다.

품질 보증을 위해, 항원 수용체 및 T 세포상의 41BBL + CD80 발현을 FACS 염색으로 8 일째에 분석하였다. T 세포는 이어서 증식 마커 CFSE로 표지되었다. 전기천공된 T 세포와 iDC 뿐만 아니라 난소암 세포주 OV-90은 후속적으로 96 웰 플레이트에서 10:1 의 E:T 비율로 중복해서 5일 동안 공동 배양되었다. 5 일째에, 배양 된 세포를 APC-Cy7로 표지된 CD4 또는 CD8 항체로 96 웰 플레이트에서 염색하였다. T 세포의 증식은 증식하는 딸세포의 희석에 기인한 CFSE-신호의 감소에 따라 FACS를 통해 검출되었다. 사소한 조정을 통해, 딸세포 개체군 크기가 Flowjo에서 구현된 증식 툴을 사용하여 평가되었다. 증식하는 세포의 총합은 딸세포 세대로 나타내었다.

T 세포의 백그라운드 증식은 Cl6 음성 세포주 Sk-Ov-3 또는 Cl6 음성 iDC로 배양된 세포에 대해 평가되었다. 전기천공된 항원 수용체 구조물과 독립적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 Cl6 음성 세포에 대해 모두 증식하지 않았다. cis로 공동 자극시, 고전 scCAR로 조작된 T 세포만 Cl6 음성 iDC 및 Sk-Ov-3 (Sk-Ov-3 데이터표시되지 않음)에 비특이적으로 증식하였다. CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포에 비해 Cl6+ 세포에 대하여 전반적으로 덜 효과적으로 증식했다 (도 8C 내지 8D 참조). 이는 표적 세포로서 Cl6 + Ov-90 종양 세포를 사용할 때 특히 사실이었다 (도 9A 내지 9B).

iDC와 공동 배양된 T 세포에 대한 결과는 인터-조합 항원 수용체의 전반적으로 양호한 기능을 입증했다. cis로 공동 자극이 없는 CD4+ T 세포 중 인터-조합 항원 수용체는 우수한 증식을 나타냈고 심지어 고전 scCAR 디자인보다 우수했다. 이 효과는 CAR 이디오타입 염색법으로 분석한 바와 같이 고전 scCAR의 표면 발현이 감소 되었기 때문이 아니다. CD8+ T 세포의 경우, 인터-조합 항원 수용체 디자인은 Cl6 로딩된 iDC에 대해 현저한 증식을 입증했다 (70 %). T 세포의 cis로 공동 자극은 T 세포 반응을 더욱 강화시킬 수 있다.

흥미롭게도 세포의 증식은 Cl6+ 난소암 세포주 OV-90에 대해 관찰할 수 없었다 (데이터는 표시되지 않음). 이는 종양 세포의 표면에 공동 자극 분자가 결여되었기 때문인 것이라고 할 수 있다. 이러한 공동 자극의 결여를 보충하기 위해, Ov-90 세포를 CD80 및 41BBL RNA로 전기천공하였다. 이 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식이 검출될 수 있다 (도 9A 및 9B 참조). 특히, CD4+ 세포를 위해 이는 오직 인터-조합 AR 디자인의 경우였다 (15 %). CD8+ 세포의 경우, 증식 패턴이 다르게 보였다. 1가 비-조합 AR, 고전 scCAR 및 인터-조합 AR 반응은 60% 증식 세포와 유사했다. cis로 공동 자극시, 특히 CD4+ T 세포의 증식이 개선되었다.

상기 데이터는 2가 항원 수용체 구조물 (인터-조합 AR)이 공동 자극될 때 Cl6+ 종양 세포주에 대해 증식할 수 있음을 명확하게 나타낸다. 일반적으로, 인터-조합 AR은 동종 표적 항원으로 로딩된 iDC에 대해 증식하는 1가 비-조합 AR보다 훨씬 낫다. 고전 scCAR은 Cl6 음성 iDC에 대해 cis로 공동 자극했을 때 비특이적 반응을 하는 경향이 있어, 항원-독립적 T 세포 신호 전달에 대한 높은 감수성을 나타낸다.

실시예 5: 항원-적정 IFNγ-분비 분석

실험 1 일째에, 건강한 기증자의 연막에서 신선한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 단리했다. PBMC의 3/4에서, CD14+ 세포는 MACS 분류를 사용하여 단리되었다. MACS 통과액 및 잔류 PBMC는 이후 CD8+ T 세포로 MACS 분류되었다. CD14+ 세포를 1 일, 3 일, 6 일째에 IL-4 및 GM-CSF (1000U/㎖) 투여에 의해 미숙 수지상 세포 ("iDCs")로 분화시켰다. CD8+ T 세포를 OKT3 코팅된 6 웰 플레이트로 옮겼다. 3 일째에, T 세포를 새로운 6 웰 플레이트로 옮겼다. 7 일째에, iDC는 무관한 및 Cl6 IVT RNA를 투여량-의존적으로 전기천공하였다. OKT3 활성화 T 세포는 그 후에 개별적인 도면에서 말하고 실시예 1에 설명된 바와 같은 대조군 또는 항원 수용체 구조물로 전기천공되었다. 품질 보증을 위해, T 세포에서의 항원 수용체 표면 발현이 Dylight 650으로 표지된 Cl6 항원 수용체 이디오타입-특이적 항체를 사용하여 8 일째에 분석되었다. 전기천공된 T 세포 및 항원이 전기천공된 iDC는 96 웰 플레이트에서 10:1의 E:T 비율로 중복하여 20 시간 동안 공동 배양되었다. 9 일째에, 배양 상층액을 채취하여 eBioscience (# 88-7316-88)의 Ready Set Go! 키트를 사용하여 샌드위치 ELISA에서 분비된 IFN-γ의 양을 분석하였다. 흡광도는 Tecan Sunrise ELISA 판독기를 사용하여 검출되었다. 결과는 도 10에 나타냈다.

2가 항원 수용체는 안정적인 발현 및 이후의 T 세포 신호 전달을 유도하는 결합 방식으로 쌍을 이루는 가정된 성향에 의존하는 사이토카인 분비량에 대해 평가되었다. 즉, 우리는 인터/인트라-조합 AR은 덜 유리한 인트라-사슬 짝지음의 비율로 공존할 수 있는 한편, 인터-조합 AR에 대한 배타적 조합 V-도메인 인터-사슬 짝지음을 관찰할 것으로 추측되었다. 높은 항원 밀도 (1μg Cl6)에서 고전 CAR은 가장 많은 양의 IFNγ-분비를 끌어냈으며, 예상한 바와 같이, 인터- 및 인터/인드라-조합 AR이 그 뒤를 따랐다. 2가 비-조합 AR은 1가 조합 AR 및 1가 비-조합 AR의 기준보다 덜 기능적이었다. 2가 비-조합 AR은 인간 C-불변 도메인 사이의 사슬 짝지음에만 의존하는 반면, 1가 조합 AR은 인간 C- 및 마우스 V- 도메인 사이의 보다 양호한 사슬 짝지음을 달성한다. 예상되는 결과와 일맥상통하게, 1가 비-조합 AR도 2가 비-조합 AR보다 더 기능적이다. 왜냐하면, 여기서 인터-사슬 짝지음이 C- 도메인으로도 제한된다는 사실에도 불구하고, 약한 인간의 것 대신 마우스 C- 도메인에 의해 촉진되기 때문이다. 이는 본 분석에서 적용된 임의의 항원 투여에 대하여도 사실이다.

특히, 항원 밀도를 낮추었을 때도 (0.1㎍, 0.01㎍의 Cl6 RNA-전기천공된 세포), 인터-조합 AR은 고전 CAR에 비해, 관련 RNA로 펄스된 iDC에 대해 점점 더 반응적이 되었다. 이는 Cl6-전기천공된 종양 세포주 Skov-3에 대한 항원 투여량-의존 세포 독성 분석 (도 7)에서 나타난 유사한 경향과 일맥상통한다.

고전 CAR은 또한 항원-적정 IFNγ-분비 분석 (도 11)에서 새로운 조합 고전 AR과 비교되었다. 두 키메라 항원 수용체는 모두 신호 전달 도메인으로서 CH2-CH3-항체 도메인 및 CD28, 및 CD3ξ를 포함한다. 이들은 0.002㎍ 내지 2㎍의 범위에서 관련된 전체 길이의 C16 RNA를 전기천공시킨 미숙 수지상 세포 (iDC) 및 2㎍의 무관한 gp100와 공동 배양되었다. 보다 높은 항원 밀도 (2㎍ 내지 0.2㎍ Cl6)에서 두 CAR 포맷 모두 동일하게 많은 양의 IFNγ-분비를 끌어냈다. 보다 낮은 항원 밀도에서는 상기 고전 CAR은 IFNγ 분비하는데 있어 다소 더 효과적이었다. 중요하게도, 상기 조합 고전 CAR은 내인성으로 발현된 매우 낮은 양의 클라우딘6에 이르기까지 고전 CAR과 동일한 적정 항원의 범위 내에서 기능적이다. 그러나 TCR Cα / Cβ- 아마도 외인성 CD3κ 의존성이지만 내인성 CD3 독립적 인 신호 전달에 기인 한 고전적 CAR보다 T 세포 시그널이 동등하지만 좋지는 않다. 이전의 메커니즘은 TCR 또는 CAR 각각에 대한 내인성 CD3 모집과는 독립적 인 것으로 가정되며, 이는 차례로 T 세포 활성화의 양을 조절할 것이다.

Claims

제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체로서,
상기 제1 펩티드 사슬은 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하고,
상기 제2 펩티드 사슬은 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하며,
상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은 인간 기원의 것이고,
상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 도메인들 중 하나와 함께 제1 항원 결합 부위를 형성하고,
상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 제2 항원 결합 부위를 형성하는, 항원 수용체.
제1항에 있어서, 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인은,
T 세포 수용체 사슬의 불변 또는 고정 (invariant) 영역, 또는
면역 세포 Fc 수용체 사슬의 불변 또는 고정 영역, 또는
상기 불변 또는 고정 영역의 일부
를 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 사슬은,
상기 제1과 제2 도메인 사이의 링커 및/또는
상기 제1 및 제2 도메인과 상기 면역 수용체 신호 전달 도메인 사이의 링커
를 추가로 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 도메인은 각각,
면역 글로불린 사슬의 가변 영역, 또는
T 세포 수용체 사슬의 가변 영역, 또는
상기 가변 영역의 일부
를 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서,
(i) 상기 제1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하고, 상기 제2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하거나, 또는
(ii) 상기 제1 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 베타 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하고, 상기 제2 펩티드 사슬은 T 세포 수용체 알파 사슬의 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 항원에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중(重)사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인과 항원 결합 부위를 형성하는 상기 제2 펩티드 사슬의 도메인은 항원에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경(輕)사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 항원에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하고, 상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인과 항원 결합 부위를 형성하는 상기 제2 펩티드 사슬의 도메인은 항원에 대한 특이성이 있는 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 제1 및 제2 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 항원에 결합하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 제1 펩티드 사슬의 제1 및 제2 도메인은 각각 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하고,
상기 제2 펩티드 사슬의 제1 및 제2 도메인은 각각 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 것인 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 제1 펩티드 사슬의 N-말단 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 N-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하고,
상기 제1 펩티드 사슬의 C-말단 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 C-말단 도메인과 함께 항원 결합 부위를 형성하는 것인 항원 수용체.
제1 및 제2 도메인이 각각 면역 글로불린의 중사슬의 가변 영역을 포함하거나, 또는 제1 및 제2 도메인이 각각 면역 글로불린의 경사슬의 가변 영역을 포함하는 펩티드 사슬로서,
상기 펩티드 사슬은 면역 수용체 신호 전달 도메인을 추가로 포함하는 펩티드 사슬.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에서 정의된 제1 및 제2 펩티드 사슬 양자 모두를 발현하는 재조합 세포.
제11항에서 정의된 제1 및 제2 펩티드 사슬 양자 모두를 발현하는 재조합 세포.
제1 펩티드 사슬 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포의 세포 외 (ex vivo) 생산 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 세포를 제공하는 단계,
(b) 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제1 펩티드 사슬을 코딩하는 제1 유전자 구조물을 제공하는 단계,
(c) 적어도 제1 및 제2 도메인과 면역 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 제2 펩티드 사슬을 코딩하는 제2 유전자 구조물을 제공하는 단계,
(d) 상기 세포 내로 상기 제1 및 제2 유전자 구조물을 도입하는 단계 및
(e) 상기 구조물들이 상기 세포 내에서 발현되도록 허용하는 단계
를 포함하고,
상기 세포는 T 세포이며,
상기 제1 펩티드 사슬의 제1 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 도메인들 중 하나와 함께 제1 항원 결합 부위를 형성할 수 있고,
상기 제1 펩티드 사슬의 제2 도메인은 상기 제2 펩티드 사슬의 다른 도메인과 함께 제2 항원 결합 부위를 형성할 수 있고,
상기 제1 펩티드 사슬 및 상기 제2 펩티드 사슬은 단일 유전자 구조물 상에서 제공되는 것인, 세포 외 생산방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에서 정의된 상기 제1 및 제2 펩티드 사슬 양자 모두를 코딩하는 핵산으로서,
상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 핵산.
제11항에 기재된 펩티드 사슬을 코딩하는 핵산으로서,
상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 핵산.
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 항원 수용체, 또는
(b) 제1 펩티드 사슬을 코딩하는 핵산 및 제2 펩티드 사슬을 코딩하는 핵산으로서, 상기 사슬들은 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에서와 같이 정의되는 것인 핵산; 및
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
상기 항원 수용체에 의해 결합하는 적어도 하나의 항원의 발현이 특징인 질병의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 항원 수용체; 및
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
암 질병의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
제12항에 따른 재조합 세포; 및
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
상기 항원 수용체에 의해 결합하는 적어도 하나의 항원의 발현이 특징인 질병의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
제12항에 따른 재조합 세포; 및
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
암 질병을 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
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