BR112020005676A2 - novos complexos polipeptídicos biespecíficos - Google Patents

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Zhuozhi Wang
Jing Li
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Abstract

A presente divulgação proporciona um complexo polipeptídico compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo, respectivamente, fundidas às regiões constantes do TCR. São proporcionados aqui também um complexo polipeptídico biespecífico de ligação ao antígeno que contém uma primeira porção de ligação ao antígeno do complexo polipeptídico e uma segunda porção de ligação ao antígeno, métodos para a produção do complexo polipeptídico ou do complexo polipeptídico biespecífico de ligação ao antígeno, métodos para o tratamento de doenças ou distúrbio com o uso do complexo polipeptídico ou do complexo polipeptídico biespecífico de ligação ao antígeno, polipeptídeos que codificam o complexo polipeptídico e/ou o complexo polipeptídico biespecífico de ligação ao antígeno, vetores e células hospedeiras contendo os polipeptídeos, composições e composições farmacêuticas compreendendo o complexo polipeptídico e/ou o complexo polipeptídico biespecífico de ligação ao antígeno.

Description

“NOVOS COMPLEXOS POLIPEPTÍDICOS BIESPECÍFICOS” REFERÊNCIA CRUZADA
[001] Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido de Patente Internacional No. PCT/CN2017/103.030, depositado em 22 de setembro de 2017, cujo conteúdo é incorporado neste documento em sua totalidade por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente divulgação refere-se, em geral, a complexos polipeptídicos solúveis compreendendo regiões variáveis de anticorpo fundidas às regiões constantes do TCR e complexos polipeptídicos biespecíficos compreendendo os mesmos.
FUNDAMENTOS
[003] Os anticorpos biespecíficos estão se tornando a nova categoria de anticorpos terapêuticos. Eles podem ligar dois alvos diferentes ou dois epítopos diferentes em um alvo, criando um efeito aditivo ou sinérgico superior ao efeito dos anticorpos individuais. Muitos esforços de construção de anticorpos foram dedicados ao desenvolvimento de novos formatos biespecíficos, como DVD-Ig, CrossMab, BiTE etc. (Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp. 95-106 (2015)). No entanto, esses formatos podem apresentar várias limitações quanto à estabilidade, solubilidade, meia-vida curta e imunogenicidade.
[004] Entre esses formatos de anticorpos biespecíficos, um anticorpo biespecífico tipo IgG apresenta um formato comum: um braço se liga ao alvo A e outro braço se liga ao alvo B. Estruturalmente, ele é feito a partir da metade do anticorpo A e da metade do anticorpo B, com tamanho e forma semelhantes aos da IgG natural.
A fim de facilitar o desenvolvimento a jusante, é desejável que tais moléculas biespecíficas possam ser facilmente produzidas como uma IgG normal a partir de uma única célula hospedeira com alto nível de expressão e forma montada correta.
Infelizmente, o pareamento de cadeias leves-pesadas cognatas, bem como a montagem de dois meios-anticorpos diferentes, não pode ser controlado automaticamente. Todos os tipos de pareamentos incorretos de forma aleatória podem resultar na heterogeneidade significativa do produto.
[005] Ao introduzir mutações na região Fc, como “knobs-into-holes” (Ridgway et al., Protein Engineering, 9(7), pp.617-21 (1996); Merchant et al., Nature Biotechnology, 16(7), pp. 67-681 (1998)), eletrostática (Gunasekaran et al., Journal of Biological Chemistry, 285(25), pp.19637-19646 (2010)) ou projetos de estado negativo (Kreudenstein et al., mAbs, 5(5), pp.646-654 (2013); Leaver-Fay et al., Structure, 24(4), pp.641-651 (2016)), a montagem heterodimérica preferencial de duas cadeias pesadas diferentes foi realizada. No entanto, o pareamento seletivo das cadeias pesada-leve de cada anticorpo individual continua sendo um desafio. A interface entre as cadeias leve-pesada inclui o domínio variável (VH-VL) e o domínio constante (CH1- CL). Várias estratégias foram aplicadas no desenvolvimento de interfaces ortogonais para facilitar o pareamento cognato. A Roche trocou os domínios de CH1 e CL e criou a plataforma CrossMab (Schaefer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(27), pp.11187–11192 (2011)), a MedImmune introduziu, como alternativa, a ligação dissulfeto (Mazor et al., mAbs, 7(2), pp. 37-389 (2015)), a Amgen produziu mais eletrostática na região CH1-CL (Liu et al., Journal of Biological Chemistry, 290(12), pp.7535-7562 (2015)) e Lilly (Lewis et al., Nature Biotechnology, 32(2), pp.191-198 (2014)) e Genentech (Dillon et al., mAbs, 9 (2), pp.213-230 (2017)) introduziram mutações nos domínios variável e constante.
[006] Por conseguinte, há uma grande necessidade em desenvolver moléculas biespecíficas com desejável nível de expressão e afinidade aos antígenos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona um complexo polipeptídico compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada
(VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de células T (TCR), e um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre C1 e C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica.
[008] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona um complexo polipeptídico biespecífico compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno associada a uma segunda porção de ligação ao antígeno, em que a primeira porção de ligação ao antígeno compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de células T (TCR) e um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica, uma segunda porção de ligação ao antígeno apresenta uma segunda especificidade antigênica que é diferente da primeira especificidade antigênica, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao pareamento incorreto do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural.
[009] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um complexo polipeptídico biespecífico compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno que compreende o complexo polipeptídico proporcionado aqui com uma primeira especificidade antigênica, associada a uma segunda porção de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade antigênica que é diferente da primeira especificidade antigênica, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao pareamento incorreto do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural.
[010] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona um fragmento biespecífico do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
[011] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um conjugado compreendendo o complexo polipeptídico proporcionado aqui, ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui conjugado a uma porção.
[012] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um polinucleotídeo isolado que codifica o complexo polipeptídico proporcionado aqui, ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
[013] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um vetor isolado compreendendo o polinucleotídeo proporcionado aqui.
[014] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo isolado proporcionado aqui ou o vetor isolado proporcionado aqui.
[015] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um método para expressar o complexo polipeptídico proporcionado aqui, ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui, compreendendo cultivar a célula hospedeira proporcionada aqui sob a condição na qual o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico é expresso.
[016] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um método para produzir o complexo polipeptídico proporcionado aqui, compreendendo a) introduzir em uma célula hospedeira um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a um primeiro domínio constante (C1) do TCR, e um segundo polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a um segundo domínio constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero de C1 e C2, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica; b) permitir que a célula hospedeira expresse o complexo polipeptídico.
[017] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um método para a produção do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui, compreendendo a) introduzir em uma célula hospedeira um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do TCR, um segundo polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, um terceiro polinucleotídeo que codifica um terceiro polipeptídeo compreendendo VH de um segundo anticorpo e um quarto polinucleotídeo que codifica um quarto polipeptídeo compreendendo VL do segundo anticorpo, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica e o segundo anticorpo apresenta uma segunda especificidade antigênica; b) permitir que a célula hospedeira expresse o complexo polipeptídico biespecífico.
[018] Em certas formas de realização, o método para a produção do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui compreende ainda isolar o complexo polipeptídico.
[019] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona uma composição compreendendo o complexo polipeptídico proporcionado aqui, ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
[020] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui uma composição farmacêutica compreendendo o complexo polipeptídico proporcionado aqui, ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[021] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um método para o tratamento de uma condição em um indivíduo que precisa do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo polipeptídico proporcionado aqui, ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui. Em certas formas de realização, a condição pode ser aliviada, eliminada, tratada ou prevenida quando o primeiro antígeno e o segundo antígeno são ambos modulados.
[022] Em certas formas de realização, a ligação intercadeia não nativa é formada entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2. Em certas formas de realização, pelo menos um dos primeiro e segundo resíduos mutados é um resíduo de cisteína.
[023] Em certas formas de realização, a ligação intercadeia não nativa é uma ligação dissulfeto.
[024] Em certas formas de realização, o primeiro resíduo mutado está compreendido dentro de uma interface de contato de C1, e/ou o segundo resíduo mutado está compreendido dentro de uma interface de contato de C2.
[025] Em certas formas de realização, pelo menos um resíduo de cisteína nativo está ausente ou presente em C1 e/ou C2. Em certas formas de realização, o resíduo de cisteína nativo na posição C74 da CBeta modificada está ausente ou presente. Em certas formas de realização, o C74 nativo está ausente em CBeta.
[026] Em certas formas de realização, pelo menos um sítio de N-glicosilação nativo está ausente ou presente em C1 e/ou C2. Em certas formas de realização, os sítios de N-glicosilação nativos estão ausentes em C1 e/ou C2.
[027] Em certas formas de realização, o dímero compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais ligações intercadeias não nativas. Em certas formas de realização, pelo menos uma das ligações intercadeias não nativas é a ligação dissulfeto. Em certas formas de realização, o dímero compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais ligações dissulfeto.
[028] Em certas formas de realização, a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada; b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada; d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada.
[029] Em certas formas de realização, o primeiro VH está operacionalmente ligado a C1 em um primeiro domínio de junção (conjunction) e o primeiro VL está operacionalmente ligado a C2 em um segundo domínio de junção. Em certas formas de realização, o primeiro VH se associa a C1 em um primeiro domínio de junção por meio de um conector, o primeiro VL se associa a C2 em um segundo domínio de junção por meio de um conector.
[030] Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de junção compreendem um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do fragmento C-terminal da junção V/C do anticorpo e um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do fragmento N-terminal da junção V/C do TCR.
[031] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste nos resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86, e 122-127; e/ou a CAlfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste nos resíduos de aminoácidos 6-29, 37- 67 e 86-95.
[032] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: S56C, S16C, F13C, V12C, E14C, L62C, D58C, S76C e R78C e/ou a CAlfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: T49C, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, T46C, L51C e S62C.
[033] Em certas formas de realização, a CBeta modificada e a CAlfa modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: S56C em CBeta e T49C em CAlfa, S16C em CBeta e Y11C em CAlfa, F13C em CBeta e L13C em CAlfa, S16C em CBeta e L13C em CAlfa, V12C em CBeta e S16C em CAlfa, E14C em CBeta e S16C em CAlfa, F13C em CBeta e V23C em CAlfa, L62C em CBeta e Y44C em CAlfa, D58C em CBeta e T46C em CAlfa, S76C em CBeta e T46C em CAlfa,
S56C em CBeta e L51C em CAlfa, S56C em CBeta e S62C em CAlfa, e R78C em CBeta e S62C em CAlfa, e em que o par de resíduos de cisteína é capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
[034] Em certas formas de realização, pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente ou presente na CBeta modificada e/ou na CAlfa modificada.
[035] Em certas formas de realização, o sítio de glicosilação nativo na CBeta modificada é N69 e/ou o(s) sítio(s) de glicosilação nativo(s) na CAlfa modificada é/são selecionado(s) dentre N34, N68, N79 e qualquer combinação dos mesmos.
[036] Em certas formas de realização, a CBeta modificada não possui ou mantém uma alça FG que engloba os resíduos de aminoácidos 101-117 da CBeta nativa e/ou uma alça DE que engloba os resíduos de aminoácidos 66-71 da CBeta nativa.
[037] Em certas formas de realização, a CAlfa modificada compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-48 e/ou a CBeta modificada compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-41 e 306.
[038] Em certas formas de realização, a C1 compreende a CBeta modificada e C2 compreende a CAlfa modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50, e/ou o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 51 ou 52.
[039] Em certas formas de realização, a C1 compreende a CAlfa modificada e a C2 compreende a CBeta modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 129 ou 130, e/ou o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50.
[040] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86 e 122-127; e/ou a CPré- Alfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 7-19, 26-34, 56-75 e 103-106.
[041] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: S16C, A18C, E19C, F13C, A11C, S56C e S76C e/ou a CPré-Alfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre S11C, A13C, I16C, S62C, T65C e Y59C.
[042] Em certas formas de realização, a CBeta modificada e a CPré-Alfa modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: S16C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, A18C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, E19C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, F13C em CBeta e A13C em CPré-Alfa, S16C em CBeta e A13C em CPré-Alfa, A11C em CBeta e I16C em CPré-Alfa, S56C em CBeta e S62C em CPré-Alfa, S56C em CBeta e T65C em CPré-Alfa, e S76C em CBeta, e Y59C em CPré-Alfa, e em que o par de resíduos de cisteína mutados são capazes de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
[043] Em certas formas de realização, pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente na CBeta modificada e/ou na CPré-Alfa modificada.
[044] Em certas formas de realização, o sítio de glicosilação ausente ou presente na CBeta modificada é N69, e/ou o sítio de glicosilação ausente na CPré- Alfa modificada é N50.
[045] Em certas formas de realização, a CBeta modificada não possui ou mantém uma alça FG que engloba os resíduos de aminoácidos 101-107 da CBeta nativa e/ou uma alça DE na posição que engloba os resíduos de aminoácidos 66-71 da CBeta nativa.
[046] Em certas formas de realização, a CPré-Alfa modificada compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 82, 83 e 311 -318; e/ou a CBeta modificada compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 84, 33-41, e 319-324.
[047] Em certas formas de realização, a C1 compreende a CBeta modificada e a C2 compreende a CPré-Alfa modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 49 ou 50 e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 81 ou 131.
[048] Em certas formas de realização, a C1 compreende a CPré-Alfa modificada e a C2 compreende a CBeta modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 132 ou 133 e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 49 ou 50.
[049] Em certas formas de realização, a CDelta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 8-26, 43-64 e 84-88; e/ou a CGama modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 11-35 e 55-76.
[050] Em certas formas de realização, a CGama modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: S17C, E20C, F14C, T12C, M62C, Q57C e A19C e/ou a CDelta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: F12C, M14C, N16C, D46C, V50C, F87C e E88C.
[051] Em certas formas de realização, a CGama modificada e a CDelta modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: S17C em CGama e F12C em CDelta, E20C em CGama e F12C em CDelta, F14C em CGama e M14C em CDelta, T12C em CGama e N16C em CDelta, M62C em CGama e D46C em CDelta, Q57C em CGama e V50C em CDelta, A19C em CGama e F87C em CDelta, e A19C em CGama e E88C em CDelta, e em que o par de resíduos de cisteína introduzido é capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeia.
[052] Em certas formas de realização, pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente ou presente na CGama modificada e/ou na CDelta modificada.
[053] Em certas formas de realização, o sítio de glicosilação nativo na CGama modificada é N65 e/ou o(s) sítio(s) de glicosilação nativo(s) na CDelta modificada é/são um ou ambos de N16 e N79.
[054] Em certas formas de realização, a CGama modificada compreende SEQ ID NO: 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 ou 340, e/ou a CDelta modificada compreende SEQ ID NO: 115, 116, 310, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 ou 332.
[055] Em certas formas de realização, C1 compreende a CGama modificada e C2 compreende a CDelta modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 117 ou 118 e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 119 ou 120.
[056] Em certas formas de realização, C1 compreende a CDelta modificada e C2 compreende a CGama modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 123 ou 124, e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 125 ou 126.
[057] Em certas formas de realização, o primeiro polipeptídeo compreende ainda um domínio CH2 de anticorpo e/ou um domínio CH3 de anticorpo.
[058] Em certas formas de realização, a primeira especificidade antigênica e a segunda especificidade antigênica são dirigidas a dois antígenos diferentes ou são dirigidas a dois epítopos diferentes em um antígeno.
[059] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno se liga a CD3. Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a CD19. Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno se liga a CD19. Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a CD3.
[060] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno se liga ao CTLA-4. Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a PD-1. Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno se liga a PD-1. Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno se liga ao CTLA-4.
[061] Em certas formas de realização, a associação é por meio de um conector, uma ligação dissulfeto, uma ligação de hidrogênio, interação eletrostática, uma ponte de sal ou interação hidrofóbica-hidrofílica, ou a combinação dos mesmos.
[062] Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve de um segundo anticorpo com a segunda especificidade antigênica.
[063] Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende um Fab.
[064] Em certas formas de realização, a primeira especificidade antigênica e a segunda especificidade antigênica são dirigidas a dois antígenos diferentes ou são dirigidas a dois epítopos diferentes em um antígeno.
[065] Em certas formas de realização, uma das primeira e segunda especificidades antigênicas é dirigida a uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK) e a outra é dirigida a um antígeno associado a tumor.
[066] Em certas formas de realização, uma das primeira e segunda especificidades antigênicas é dirigida a CD3 e a outra é dirigida a um antígeno associado a tumor.
[067] Em certas formas de realização, uma das primeira e segunda especificidades antigênicas é dirigida a CD3 e a outra é dirigida a CD19.
[068] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende ainda um primeiro domínio de dimerização e a segunda porção de ligação ao antígeno compreende ainda um segundo domínio de dimerização, em que o primeiro e o segundo domínios de dimerização estão associados.
[069] Em certas formas de realização, a associação é por meio de um conector, uma ligação dissulfeto, uma ligação de hidrogênio, interação eletrostática, uma ponte de sal ou interação hidrofóbica-hidrofílica, ou a combinação dos mesmos.
[070] Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização compreendem pelo menos uma porção de uma região de dobradiça de anticorpo, opcionalmente derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4.
[071] Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização compreendem ainda um domínio de dimerização. Em certas formas de realização, o domínio de dimerização compreende pelo menos uma porção de uma região de dobradiça de anticorpo, um domínio CH2 de anticorpo e/ou um domínio CH3 de anticorpo.
[072] Em certas formas de realização, o primeiro domínio de dimerização está operacionalmente ligado à primeira região constante (C1) do TCR em um terceiro domínio de junção.
[073] Em certas formas de realização, a) C1 compreende uma CBeta modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 53 ou 54; b) C1 compreende uma CAlfa modificada, e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 134, 135, 140, ou 141; c) C1 compreende uma CPré- Allfa modificada, e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 134, 135, 140, ou 141; d) C1 compreende uma CGama modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 121 ou 122; ou e) C1 compreende uma
CDelta modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 127 ou 128.
[074] Em certas formas de realização, o segundo domínio de dimerização está operacionalmente ligado ao domínio variável de cadeia pesada da segunda porção de ligação ao antígeno.
[075] Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização são diferentes e se associam de uma maneira que desencoraja a homodimerização e/ou favorece a heterodimerização.
[076] Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização são capazes de se associar a heterodímeros por meio de knobs-into- holes, interação hidrofóbica, interação eletrostática, interação hidrofílica ou maior flexibilidade.
[077] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende o primeiro polipeptídeo contendo VH operacionalmente ligado a uma região constante quimérica, e o segundo polipeptídeo compreende VL operacionalmente ligado a C2, em que a região constante quimérica e C2 compreendem um par de sequências selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/151, 214/212, 214/151, 234/233, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 e 238/237.
[078] Em certas formas de realização, a primeira antigenicidade é dirigida a CD3, e o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreendem um par de sequências selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/1, 3/4/, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92/, 94/93,
96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 e 138/139.
[079] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno compreendem uma combinação de quatro sequências selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 22/12/24/23, 25/12/26/23 e 25/12/27/23, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a CD3 e a segunda porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a CD19.
[080] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico proporcionado aqui pode ser feito em um Fab, um (Fab)2, um diacorpo, um triacorpo, um triFabs, Fabs ligados em tandem, um Fab-Fv, domínios V ligados em tandem, scFvs ligados em tandem e entre outros formatos.
[081] Em outro aspecto, a presente divulgação proporciona um kit compreendendo o complexo polipeptídico proporcionado aqui para detecção, diagnóstico, prognóstico ou tratamento de uma doença ou condição.
[082] As características anteriores e outras características e vantagens da invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada abaixo das várias formas de realização que prosseguem com referência às Figuras anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DE FIGURAS
[083] Figura 1 apresenta as representações químicas dos formatos dos anticorpos estudados. O anticorpo T3 anti-CD3 e o anticorpo U4 anti-CD19 foram desenvolvidos. A região constante (CL e CH1) de T3 foi substituída pelos domínios constantes do TCR para desenvolver uma interface de cadeia leve-pesada única que é ortogonal ao anticorpo regular. O T3 modificado com TCR e o U4 nativo em conjunto com as mutações “knobs-into-holes” no domínio Fc foram utilizados para desenvolver os formatos de anticorpos biespecíficos E17 e F16.
[084] Figuras 2A-2D apresentam representações sobrepostas de modelo de Fv do anticorpo e estrutura de TCR que proporcionam orientação para a fusão do Fv do anticorpo e a região constante TCR. A Figura 2A apresenta um modelo estrutural de Fv do anticorpo que foi construído com base na sequência de um anticorpo T3 anti- CD3 desenvolvido internamente. A Figura 2B apresenta a estrutura do TCR do PDB 4L4T. A Figura 2C apresenta um modelo estrutural de Fv do anticorpo sobreposto à região variável do TCR em diferentes orientações. Proteínas quiméricas brutas foram criadas pela remoção do domínio variável do TCR nas representações sobrepostas, como mostrado na Figura 2D. Os resíduos sobrepostos na área de junção ajudaram a desenvolver a região de junção. A cadeia VL do anticorpo e a cadeia alfa do TCR foram coloridas em branco. As cadeias VH e beta foram coloridas em preto.
[085] Figuras 3A-3B ilustram uma comparação entre a região constante do TCR e região constante do Fab do anticorpo. A Figura 3A ilustra uma estrutura cristalina do TCR a partir de PDB 4L4T. a Figura 3B ilustra um modelo estrutural do Fab do anticorpo produzido pelo domínio Fv do modelo T3 e o domínio constante do anticorpo a partir de APO 5DK3. As diferenças óbvias nas alças FG e DE entre os domínios constantes do TCR e domínios constantes do Fab do anticorpo foram marcados pela apresentação de todas as cadeias laterais dos resíduos.
[086] Figura 4 ilustra os resultados de SDS-PAGE dos mutantes de deglicosilação dos anticorpos quiméricos anticorpo-TCR com as cadeias CAlfa e CBeta. Os sobrenadantes de todas as amostras da produção das expressões em Expi293 foram coletados. As pistas 1, 3, 5, 7 e 9 são as PAGEs não redutoras do Design_2-QQQQ, Design_2-AAAA, Design_2-QSKE, Design_2-ASKE e Design_2- QQQQQ, respectivamente. As pistas 2, 4, 6, 8 e 10 são as PAGEs redutoras correspondentes.
[087] A Figura 5 ilustra as ligações dose-dependentes por FACS de toda ligação de todos os mutantes deglicosilados às células Jurkat que expressam CD3.
Os sobrenadantes de todas amostras dos mutantes de glicosilação expressos em Expi293 foram coletados. O anticorpo anti-CD3 do tipo selvagem (T3-IgG1) foi usado como controle positivo.
[088] Figuras 6A-6B ilustram os resultados de SDS-PAGE dos testes de mispairing (pareamento incorreto) da cadeia do anticorpo T3 e U4 no isotipo IgG1 (Figura 6A) e IgG4 (Figura 6B). As pistas 1-2 são os pares de T3_leve-U4_pesada e T3_pesada-U4_leve, respectivamente. As pistas 3-4 são a mesma ordem de par das pistas 1-2, mas com o T3 modificado usando a região constante do TCR. As pistas 1- 4 em ambas as imagens são as amostras não reduzidas, e as pistas 5-8 são as amostras reduzidas correspondentes.
[089] Figuras 7A-7B ilustram os resultados de SDS-PAGE do anticorpo biespecífico purificado, E17-Design_2-QQQQ em IgG1 (Figura 7A) e IgG4 (Figura 7B).
O isotipo IgG1 foi purificado por três etapas de purificação: cromatografia em proteína A, cromatografia de troca iônica (IEC) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).
A IgG4 foi obtida após duas etapas de purificação: cromatografia em proteína A e SEC.
As Figuras 7C-7D ilustram os dados da SEC-HPLC para as amostras purificadas de IgG1 (Figura 7C) e IgG4 (Figura 7D), para determinar os graus de pureza das amostras.
[090] Figura 8 ilustra os resultados de SDS-PAGE dos fragmentos Fab de T3 quimérico com um tag de 6xHis, purificado por cromatografia em Ni SepharoseTM excel.
As pistas 1 e 3 são bandas para T3-Fab-Design_2.his1, e as pistas 2 e 4 são bandas para T3-Fab-Design_2.his2.
[091] Figura 9 ilustra ligações dose-dependentes por FACS do fragmento Fab do T3 quimérico modificado com TCR. A forma monovalente do anticorpo T3 do tipo selvagem (T3-Fab-IgG4) foi usada como controle positivo. Um anticorpo IgG4 humano regular foi usado como controle negativo.
[092] Figuras 10A-10 B ilustram ligações dose-dependentes por FACS do anticorpo biespecífico desenvolvido, E17-Design_2-QQQQ, às células Jurkat CD3 +. O anticorpo do tipo selvagem T3 e U4, bem como suas formas monovalentes, foram utilizados como controles positivos (Figura 10A) e células CD19 + Ramos (Figura 10B).
Os isotipos IgG1 e IgG4 foram testados. Um anticorpo IgG1 ou IgG4 humano irrelevante foi usado como controle negativo.
[093] Figuras 11A-11B ilustram a comparação das ligações por FACS de dois anticorpos biespecíficos desenvolvidos, E17-Design_2-QQQQ e F16-Design_2- QQQQ, ao CD3 em células Jurkat (Figura 11A) e CD19 expresso em células Ramos (Figura 11B). Os anticorpos biespecíficos em ambos os isotipos IgG1 e IgG4 foram testados. Um anticorpo IgG1 ou IgG4 humano regular foi usado como controle negativo.
[094] Figura 12 ilustra o ensaio citotóxico de morte de células B malignas dirigida por célula T mediada por anticorpos biespecíficos desenvolvidos E17- Design_2-QQQQ em ambos IgG1 e IgG4. O anticorpo monoespecífico parental anti- CD3 (T3-IgG4), anti-CD19 (U4-IgG) e um anticorpo IgG1 humano irrelevante foi usado como controle negativo.
[095] Figura 13 compara a atividade de dois anticorpos biespecíficos desenvolvidos, E17-Design_2-QQQQ e F16-Design_2-QQQQ, na mediação da morte de células B malignas com envolvimento de células T. Um anticorpo IgG humano irrelevante foi usado como controle negativo.
[096] Figuras 14A-14B ilustram espectros de massa deconvoluídos do anticorpo biespecífico E17-Design_2-QQQQ em condições não reduzidas (Figura 14A) e reduzidas (Figura 14B). O pico em 148180,53 na Figura 14A é o peso molecular correto do WuXiBody intacto. O pico em 22877 Da indica a cadeia leve encontrada nos espectros de massa reduzidos na Figura 14B. O pequeno pico em 149128,45 Da na Figura 14A foi deduzido como sendo a O-glicosilação (aproximadamente (947,92 Da mais) localizada na cadeia leve, como mostrado na Figura 14B.
[097] Figuras 15A-15B ilustram o papel da ligação dissulfeto intercadeia na expressão de anticorpo na interface alfa/beta caracterizada por SDS-PAGE. A Figura 15A ilustra o anticorpo contendo ligação dissulfeto intercadeia entre CAlfa e CBeta; a Figura 15B ilustra o anticorpo sem ligação dissulfeto intercadeia entre CAlfa e CBeta; as pistas 1 e 3 são os resultados da PAGE não redutora do Design_2-QQQQ-IgG4 com e sem ligação dissulfeto introduzida, respectivamente. As pistas 2 e 4 são os resultados de PAGE redutora de Design_2-QQQQ-IgG4 com e sem ligação dissulfeto introduzida, respectivamente.
[098] Figura 16 ilustra a SDS-PAGE da ligação dissulfeto desenvolvida na interface pré-alfa/beta. A pista 1 e a pista 2 são “Design_5_Pre_TCR_ Conjunction’1_Cys13” e “Design_6_Pre_TCR_Conjunction’1_Cys14”, respectivamente, tratadas em condições não redutoras. A pista 4 e a pista 5 são “Design_5_Pre_TCR_Conjunction’1_Cys13” e “Design_6_Pre_TCR_Conjunction’1_Cys14", respectivamente, tratadas em condições redutoras.
[099] Figuras 17A-17B ilustram SDS-PAGE da ligação dissulfeto desenvolvida na interface delta/gama. A pista 6 e a pista 8 são “Design_2_Cys5_no_Glyco” e “Design_2_hypeCys2_no_Glyco”, respectivamente. A Figura 17A é a SDS-PAGE não redutora. A Figura 17B é SDS-PAGE redutora.
[0100] Figura 18A ilustra a sequência da cadeia alfa de TCR nativo e sua sequência equivalente com resíduos de cisteína mutados. TRAC_Human é uma sequência natural da região constante da cadeia alfa. 4L4T_Alpha_Crystal é a sequência de uma estrutura cristalina (PDB código 4L4T) com mutações S55C que podem formar uma ligação dissulfeto intercadeia. A região cinzenta é a região constante usada como arcabouço da proteína quimérica nesta invenção.
[0101] Figura 18B ilustra a sequência da cadeia beta do TCR nativo e sua sequência equivalente com resíduos de cisteína mutados. TRBC1_Human e TRBC2_Human são sequências naturais da região constante beta.
[0102] Figura 18C ilustra as sequências da cadeia pré-alfa de TCR nativo.
PTCRA_Human é uma sequência natural da região constante da cadeia pré-alfa (a cadeia pré-alfa não possui apenas região variável). 3OF6_PreAlpha_Crystal é a sequência de uma estrutura cristalina (PDB código 3OF6). A região cinzenta é a região constante usada acima para definir a numeração.
[0103] Figura 18D ilustra as sequências da cadeia delta de TCR nativo.
TRA@_Human é a sequência natural da região constante delta. 4LFH_Delta_Crystal é a região constante de uma sequência de cadeia delta de uma estrutura cristalina (PDB código 4LFH). A região cinzenta é a região constante usada acima para definir a numeração.
[0104] Figura 18E ilustra as sequências da cadeia gama de TCR nativo.
TRGC1_Human e TRGC2_Human são sequências naturais da região constante gama.
4LFH_Gamma_Crystal é a região constante de uma sequência de cadeia gama de uma estrutura cristalina (PDB código 4LFH). A região cinza é a região constante usada acima para definir a numeração.
[0105] Figuras 19A-19E ilustram as sequências e a numeração das regiões constantes de TCR. A Figura 19A ilustra as sequências e a numeração da região constante de TCR Alfa. A Figura 19B ilustra as sequências e a numeração da região constante de TCR Beta. A Figura 19C ilustra as sequências e a numeração da região constante de TCR Pré-Alfa. A Figura 19D ilustra as sequências e a numeração da região constante de TCR Delta. A Figura 19E ilustra as sequências e a numeração da região constante de TCR Gama.
[0106] Figuras 20A-20D ilustram as sequências e a numeração dos knobs- into-holes de IgG1 e IgG4. A Figura 20A ilustra as sequências e a numeração das mutações “knob” de IgG1. A Figura 20B ilustra as sequências e a numeração das mutações “knob” de IgG4. A Figura 20C ilustra as sequências e a numeração das mutações “hole” de IgG1. A Figura 20D ilustra as sequências e a numeração das mutações “hole” de IgG4.
[0107] Figuras 21A-21 B ilustram as ligações de E17-Design_2-QQQQ em ambos formatos IgG4 (Figura 21A) e IgG1 de tipo selvagem (Figura 21B) para C1Q humano por ELISA. Um anticorpo IgG1 humano foi usado como controle.
[0108] Figura 22 ilustra uma descrição esquemática de quatro formatos simétricos de WuXiBody, G19, G19R, G25 e G25R. Para o formato G19 e G25, dois domínios tipo Fab quimérico contendo TCR foram enxertados na extremidade C- terminal e N-terminal de um anticorpo normal, respectivamente. Os retângulos indicam os domínios constantes do TCR e os ovais indicam os domínios variáveis e constantes de um anticorpo. A diferença entre os formatos G19 e G19R ou G25 e G25R é a posição trocada do Fab normal e Fab quimérico. Estes formatos podem acomodar diferentes regiões variáveis de diferentes pares de anticorpos e geralmente apresentam um peso molecular em torno de 240-250 kDa.
[0109] Figuras 23A-23B ilustram as caracterizações de SDS-PAGE (Figura 23A) e SEC-HPLC (Figura 23B) de dois anticorpos biespecíficos purificados em formato G19. Os números das pistas no SDS-PAGE são consistentes com os números de identificação na Figura SEC-HPLC. As pistas 1 e 2 são o par de anticorpo T1U6 e U6T1, respectivamente. Em T1U6, T1 (anti-CTLA-4) estava na extremidade N- terminal do formato, enquanto em U6T1, U6 (anti-PD-1) estava na extremidade N- terminal do formato. Ambas as moléculas biespecíficas foram purificadas por cromatografia em proteína A, e obteve-se uma pureza em torno de 90%.
[0110] Figuras 24A-24B ilustram ligações dose-dependentes por FACS dos anticorpos U6T1 e T1U6 purificados em formato G19 às células humanas PD-1 (Figura
24A) e CTLA-4 (Figura 24B) modificadas. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0111] Figuras 25A-25 B ilustram as caracterizações de SDS-PAGE (Figura 25A) e SEC-HPLC (Figura 25B) dos anticorpos biespecíficos purificados em proteína A em diferentes formatos simétricos. As pistas 1-3 são o par de anticorpos U6T1 nos formatos G19R, G25, e G25R, respectivamente. PC é uma proteína controle conhecida por ter um peso molecular de 250 kD. Todos as três moléculas biespecíficas apresentaram pureza superior a 90%. Os números das pistas no SDS- PAGE são consistentes com os números de identificação nas Figuras de SEC-HPLC.
[0112] Figuras 26A-26 B ilustram ligações dose-dependentes por FACS de anticorpos biespecíficos U6T1 purificados nos formatos G19R, G25, e G25R às células humanas PD-1 (Figura 26A) e CTLA-4 (Figura 26B) modificadas. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA-4 x PD-1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0113] Figuras 27A-27B ilustram ensaios de competição por FACS dos anticorpos biespecíficos desenvolvidos nos formatos G19R, G25 e G25R para bloquear a ligação de PD-L1 humano a PD-1 (Figura 27A) e ligação de CD80 a CTLA- 4 (Figura 27B), respectivamente. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA- 4 x PD-1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0114] Figuras 28A-28B ilustram as caracterizações de SDS-PAGE (Figura 28A) e SEC-HPLC (Figura 28B) dos anticorpos biespecíficos purificados em proteína A em diferentes formatos simétricos. As pistas 1-4 são o par de anticorpos U6T5 nos formatos G19, G19R, G25 e G25R, respectivamente. PC é uma proteína controle com peso molecular de 250 kD. Todos as três moléculas biespecíficas apresentaram pureza superior a 90%. Os números das pistas no SDS-PAGE são consistentes com os números de identificação nas Figuras de SEC-HPLC.
[0115] Figuras 29A-29B ilustram ligações dose-dependentes por FACS de anticorpos biespecíficos purificados nos formatos G19, G19R, G25, e G25R às células PD-1 (Figura 29A) e CTLA-4 (Figura 29B) humano modificadas. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA-4 x PD-1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0116] Figura 30 ilustra o ensaio ELISA de ligação dupla de duas moléculas U6T5.G25 e U6T1.G25R. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA-4 x PD- 1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0117] Figuras 31A-31B ilustram ensaios de competição por FACS dos anticorpos biespecíficos U6T5.G25 e U6T1.G25R para bloquear a ligação de PD-L1 humano a PD-1 (Figura 31A) e ligação de CD80 a CTLA-4 (Figura 31B), respectivamente. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA-4 x PD-1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0118] Figura 32 ilustra a descrição esquemática dos três formatos simétricos G26, G27 e G26R com domínios tipo Fab quimérico com leve-pesada trocada.
[0119] Figuras 33A-33B ilustram as caracterizações de SDS-PAGE (Figura 33A) e SEC-HPLC (Figura 33B) dos anticorpos biespecíficos purificados em proteína A nos formatos G27 e G26R. As pistas 1-2 são o par de anticorpos T4U6 nos formatos G27 e G26R, respectivamente. Somente o formato G26R alcançou 90% de pureza após a purificação. Os números das pistas no SDS-PAGE são consistentes com os números de identificação nas Figuras SEC-HPLC.
[0120] Figuras 34A-34B ilustram ligações dose-dependentes por FACS do par de anticorpos T4U6 biespecíficos purificados no formato G26R às células PD-1 (Figura 34A) e CTLA-4 (Figura 34B) humano modificadas. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA-4 x PD-1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0121] Figuras 35A-35B ilustram as caracterizações de SDS-PAGE (Figura 35A) e SEC-HPLC (Figura 35B) do par de anticorpos U6T4 biespecíficos purificados em proteína A no formato G26. Obteve-se 90% de pureza após a purificação.
[0122] Figuras 36A-36D ilustram ligações dose-dependentes por ELISA do par de anticorpos U6T4 biespecíficos purificados em formato G26 às células PD-1 (Figura 36A) e CTLA-4 (Figura 36B) humano modificadas, bem como ligações dose- dependentes por FACS do par de anticorpos U6T4 biespecíficos purificados em formato G26 às células PD-1 (Figura 36C) e CTLA-4 (Figura 36D) humano modificadas. Um anticorpo biespecífico de referência anti-CTLA-4 x PD-1 (BMK1.IgG1) foi usado como controle e um anticorpo IgG4 irrelevante foi usado como controle negativo.
[0123] Figura 37 ilustra histogramas de citometria de fluxo da linhagem de células transfectadas com CD19 de cinomolgo WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 e linhagem de células parentais CHO-K1.
[0124] Figura 38 ilustra a SDS-PAGE de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP. M: marcador de proteína; Pista 1: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, não reduzida; Pista 3: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, reduzida.
[0125] Figura 39 ilustra a SEC-HPLC de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.
[0126] Figura 40 ilustra a SDS-PAGE de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP. M: marcador de proteína; Pista 1: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, não reduzida; Pista 2: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, reduzida.
[0127] Figura 41 ilustra a SEC-HPLC de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP.
[0128] Figuras 42A-42B ilustra a ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP às células Ramos (Figura 42A) e células Jurkat (Figura 42B) por FACS.
[0129] Figuras 43A-43B ilustram a ligação de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP às células Ramos (A Figura 43A) e células Jurkat (Figura 43B) por FACS.
[0130] Figura 44 ilustra a ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a uma célula que expressa CD19 de cinomolgo por FACS.
[0131] Figura 45 ilustra a ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a CD3 de cinomolgo por ELISA.
[0132] Figuras 46A-46B ilustram a afinidade de W3438-T3U4.E17-
1.uIgG4.SP ao CD19 e CD3 humanos pela medição da ligação às células Ramos (Figura 46A) e Jurkat (Figura 46B).
[0133] Figuras 47A-47B ilustram a ligação de células CD3+ mediada por W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP às células CD19+ (Figura 47A). Uma IgG irrelevante foi usada como controle negativo (Figura 47B).
[0134] Figuras 48A-48B ilustram a atividade citotóxica de morte das células Raji pelas células T mediada por W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP (Figura 48A) e atividade citotóxica de morte das células Raji pelas células T mediada por W3438- T3U4.F16-1.uIgG4.SP (Figura 48B).
[0135] Figuras 49A-49D ilustram a expressão de CD69 e CD25 em células T na presença ou na ausência de células-alvo CD19 +. Percentagem de expressão de CD69+ em células T no subconjunto de células T CD4+ (Figura 49A); Percentagem de expressão de CD69+ em células T no subconjunto de células T CD8+ (Figura 49B); Percentagem de expressão de CD25+ em células T no subconjunto de células T CD4+ (Figura 49C); Porcentagem de expressão de CD25+ em células T no subconjunto de células T CD8+ (Figura 49D).
[0136] Figuras 50A-50D ilustram a liberação de citocinas IFN-γ e TNFα de células T na presença ou ausência de células-alvo CD19 +. Liberação de IFNγ no subconjunto de células T CD4+ (Figura 50A); Liberação de TNFα no subconjunto de células T CD4+ (Figura 50B); Liberação de IFNγ no subconjunto de células T CD8 + (Figura 50C); Liberação de TNFα no subconjunto de células T CD8+ (Figura 50D).
[0137] Figuras 51A-51B ilustram a estabilidade de W3438-T3U4.E17-
1.uIgG4.SP em soro humano. Ligação de amostras W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP incubadas em soro às células Ramos nos dias indicados (Figura 51A); ligação de amostras W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP incubadas em soro de às células Jurkat nos dias indicados (Figura 51B).
[0138] Figura 52 ilustra a ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a C1Q por ELISA. Um anticorpo IgG1 foi usado como controle.
[0139] Figura 53 ilustra o traço de volume tumoral após a administração de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP em doses diferentes em camundongos humanizados com PBMC misturadas contendo tumores de xenoenxerto de células Raji. Os pontos de dados representam a média do grupo e as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Um anticorpo IgG4 foi utilizado como controle negativo.
[0140] Figura 54 ilustra a farmacocinética de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP em macacos cinomolgo. As amostras de soro de dois macacos foram detectadas por ELISA.
[0141] Figuras 55A-55B ilustram o anticorpo anti-droga (ADA detectado por ELISA) em amostras de soro do macaco #1 (Figura 55A) e macaco #2 (Figura 55B), incluindo tanto a pré-dose quanto a pós-dose de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP.
[0142] Figuras 56A-56B ilustram as caracterizações de SDS-PAGE de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP. M: marcador de proteína. PC: controle positivo de um anticorpo biespecífico em torno de 250 kDa (Figura 56A) e caracterizações de SEC-HPLC de W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP (Figura 56B).
[0143] Figura 57 ilustra as temperaturas de fusão de W3248-U6T1.G25R-
1.uIgG4.SP, W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP e um anticorpo de referência anti-CTLA- 4 x PD-1 biespecífico WBP324-BMK1.uIgG1.KDL.
[0144] Figura 58 ilustra ligações por FACS de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP às células PD-1 humano modificadas. WBP324- BMK1.uIgG1.KDL, W324-BMK2.uIgG4, e W324-BMK 3.uIgG4 são diferentes versões dos anticorpos de referência biespecíficos anti-CTLA-4 x PD-1. WBP305-BMK1.IgG4 é um anticorpo anti-PD-1. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0145] Figura 59 ilustra ligações por FACS de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP às células PD-1 de cinomolgo modificadas.
WBP3055_1.153.7.hAb e WBP305-BMK1.IgG4 são anticorpos anti-PD-1. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0146] Figura 60 ilustra ligações por FACS de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP às células CTLA-4 humano modificadas. WBP324- BMK1.uIgG1.KDL, W324-BMK2.uIgG4, e W324-BMK 3.uIgG4 são anticorpos de referência biespecíficos anti-CTLA-4 x PD-1 diferentes. WBP316-BMK1.IgG4 é um anticorpo anti-CTLA-4-1. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0147] Figura 61 ilustra ligações por FACS de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP às células CTLA-4 de cinomolgo modificadas.
WBP324-BMK1.uIgG1.KDL é um anticorpo de referência biespecífico anti-CTLA-4 x PD-1. W3162_1.154.8-z35-IgG1K e WBP316-BMK1.IgG4 são anticorpos anti-CTLA-
4. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0148] Figura 62 resume as afinidades de ligação de W3248-U6T5.G25-
1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP a CTLA-4 e PD-1, conforme medido por SPR. WBP316-BMK1.IgG4 é um anticorpo anti-CTLA-4-1. Um anticorpo parental de anti-PD-1 foi usado como controle.
[0149] Figura 63 ilustra os ensaios de competição por FACS de W3248- U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP para bloquear a ligação da proteína PD-L1 humana às células PD-1 modificadas. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL é um anticorpo de referência biespecífico anti-CTLA-4 x PD-1. WBP3055_1.153.7.hAb e WBP305-BMK1.IgG4 são anticorpos anti-PD-1. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0150] Figura 64 ilustra os ensaios de competição por FACS de W3248- U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP para bloquear a ligação da proteína CTLA-4 humana às células CD80 modificadas. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL é um anticorpo de referência biespecífico anti-CTLA-4 x PD-1. W3162_1.154.8-z35- IgG1K e WBP316-BMK1.IgG4 são anticorpos anti-CTLA-4. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0151] Figura 65 ilustra ensaios de competição por FACS de W3248- U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP para bloquear a ligação da proteína CTLA-4 de cinomolgo às células CD80 modificadas. WBP324- BMK1.uIgG1.KDL é um anticorpo de referência biespecífico anti-CTLA-4 x PD-1.
W3162_1.154.8-z35-IgG1K e WBP316-BMK1.IgG4 são anticorpos anti-CTLA-4. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0152] Figura 66 ilustra o ensaio ELISA de ligação dupla de W3248- U6T5.G25-1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP. WBP324- BMK1.uIgG1.KDL é um anticorpo de referência biespecífico anti-CTLA-4 x PD-1. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0153] Figura 67 ilustra a ligação dupla por FACS de W3248-U6T5.G25-
1.uIgG4.SP e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP a CTLA-4 e PD-1. Um anticorpo IgG4 foi usado como controle negativo.
[0154] Figuras 68A-68B ilustram a estabilidade de W3248-U6T5.G25-
1.uIgG4.SP no soro durante 14 dias, conforme medido pelo ELISA de ligação dupla,
a CTLA-4 e PD-1 (Figura 68A) e estabilidade de W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP no soro por 14 dias, conforme medido pelo ELISA de ligação dupla, a CTLA-4 e PD-1 humano (Figura 68B).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0155] A descrição da divulgação abaixo é meramente uma ilustração das várias formas de realização da divulgação. Como tal, as modificações específicas discutidas não devem ser interpretadas como limitações ao escopo da divulgação.
Será evidente para um técnico no assunto que vários equivalentes, alterações e modificações podem ser realizados sem se afastar do escopo da divulgação, e entende-se que tais formas de realização equivalentes devem ser incluídas neste documento. Todas as referências citadas aqui, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.
[0156] Definições
[0157] Os artigos “uma”, “um” e “a/o(s)” são utilizados aqui para se referirem a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) objeto gramatical do artigo. A título de exemplo “um complexo polipeptídico” significa um complexo polipeptídico ou mais de um complexo polipeptídico.
[0158] Conforme usado neste documento, o termo “cerca de” ou ”aproximadamente” refere-se a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentual, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia em até 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% em relação a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentual, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência. Em determinadas formas de realização, os termos “cerca de” ou “aproximadamente” ao preceder um valor numérico indicam o valor mais ou menos uma faixa de 15%, 10%, 5% ou 1%.
[0159] Ao longo desta divulgação, a menos que o contexto exija de outra forma, entende-se que as palavras “compreendem”, “compreende” e “compreendendo”
implicam a inclusão de uma etapa ou elemento declarado ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Entende-se por “consiste em” a inclusão, e limitando-se a, de qualquer coisa que segue a frase “consiste em”. Assim, a frase “consiste em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. Entende-se por “consiste essencialmente em” a inclusão de quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na divulgação para os elementos listados. Assim, a frase “consiste essencialmente em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes, dependendo se eles afetam ou não a atividade ou ação dos elementos listados.
[0160] A referência ao longo desta divulgação a “1(uma) forma de realização”, “uma forma de realização”, “uma determinada forma de realização”, “uma forma de realização relacionada”, “uma certa forma de realização”, “uma forma de realização adicional” ou ”uma outra forma de realização” ou combinações das mesmas significa que uma propriedade, estrutura ou característica específica descrita em conexão com a forma de realização está incluída em pelo menos uma forma de realização da presente divulgação. Assim, os aparecimentos das frases anteriores em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não estão necessariamente todos se referindo à mesma forma de realização. Além disso, as propriedades, estruturas ou características particulares podem ser combinadas de qualquer maneira adequada em uma ou mais formas de realização.
[0161] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são utilizados alternadamente aqui para referir a um polímero de resíduos de aminoácidos, ou um conjunto de vários polímeros de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos é um mimético químico artificial de um aminoácido natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos naturais e a um polímero de aminoácidos não naturais.
O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos naturais.
Os aminoácidos naturais são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo,
hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O-fosfoserina.
Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica de um aminoácido natural, ou seja, um carbono alfa ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina,
sulfóxido de metionina, metionina metilsulfônio.
Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou arcabouços peptídicos modificados, mas mantêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural.
Um carbono alfa refere-se ao primeiro átomo de carbono que se liga a um grupo funcional, como uma carbonila.
Um carbono beta refere-se ao segundo átomo de carbono ligado ao carbono alfa, e o sistema continua nomeando os carbonos em ordem alfabética com letras gregas.
Os miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido natural.
O termo “proteína”
normalmente se refere a grandes polipeptídeos.
O termo “peptídeo” normalmente se refere a polipeptídeos curtos.
As sequências polipeptídicas são geralmente descritas como: a extremidade esquerda de uma sequência polipeptídica é o terminal amino (N-
terminal) e a extremidade direita de uma sequência polipeptídica é o terminal carboxila
(C-terminal). “Complexo polipeptídico”, conforme utilizado neste documento, refere-se a um complexo compreendendo um ou mais polipeptídeos que estão associados para executar determinadas funções.
Em certas formas de realização, os polipeptídeos estão relacionados ao sistema imune.
[0162] O termo “anticorpo”, conforme utilizado neste documento, abrange qualquer imunoglobulina, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo multiespecífico ou anticorpo biespecífico (bivalente) que se liga a um antígeno específico. Um anticorpo intacto nativo compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada consiste em uma região variável (“HCVR”) e uma primeira, segunda e terceira região constante (CH1, CH2 e CH3), enquanto cada cadeia leve consiste em uma região variável (“LCVR”) e uma região constante (CL).
As cadeias pesadas de mamíferos são classificadas como α, δ, ε, γ e μ, e as cadeias leves de mamíferos são classificadas como λ ou κ. O anticorpo tem uma forma de “Y”, com a haste do Y consistindo na segunda e terceira regiões constantes de duas cadeias pesadas ligadas entre si por meio da ligação dissulfeto. Cada braço do Y inclui a região variável e a primeira região constante de uma única cadeia pesada ligada às regiões variáveis e constantes de uma única cadeia leve. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada são responsáveis pela ligação ao antígeno. As regiões variáveis em ambas as cadeias geralmente contêm três alças altamente variáveis chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (CDRs de cadeia leve (L) incluem LCDR1, LCDR2 e LCDR3, CDRs de cadeia pesada (H) incluem HCDR1, HCDR2, HCDR3). Os limites de CDR para anticorpos podem ser definidos ou identificados pelas convenções de Kabat, Chothia ou Al-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, AM, J. Mol. Biol., 273 (4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J. Mol. Biol.
5 de dezembro; 186(3): 651-63 (1985); Chothia, C. e Lesk, AM, J. Mol. Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dezembro 21-28; 342(6252): 877-83 (1989); Kabat E. A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). As três CDRs são interpostas entre trechos flanqueadores conhecidos como regiões de estrutura ou framework (FRs), que são mais altamente conservadas que as CDRs e formam uma estrutura para suportar as alças hipervariáveis. Cada HCVR e LCVR compreende quatro FRs, e as CDRs e FRs estão dispostas do terminal amino ao terminal carboxila na ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões constantes das cadeias pesada e leve não estão envolvidas na ligação ao antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Os anticorpos são classificados em classes com base na sequência de aminoácidos da região constante da sua cadeia pesada. As cinco principais classes ou isotipos de anticorpos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, caracterizadas pela presença das cadeias pesadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente.
Várias das principais classes de anticorpos são divididas em subclasses como IgG1 (cadeia pesada γ1), IgG2 (cadeia pesada γ2), IgG3 (cadeia pesada γ3), IgG4 (cadeia pesada γ4), IgA1 (cadeia pesada α1) ou IgA2 (cadeia pesada α2).
[0163] O termo “domínio variável” em relação a um anticorpo, conforme utilizado neste documento, refere-se a uma região variável de anticorpo ou um fragmento da mesma compreendendo uma ou mais CDRs. Embora um domínio variável possa compreender uma região variável intacta (tal como HCVR ou LCVR), é possível compreender também menos do que uma região variável intacta e mesmo assim manter a capacidade de ligação a um antígeno ou formação de um sítio de ligação ao antígeno.
[0164] O termo “porção de ligação ao antígeno”, conforme utilizado neste documento, refere-se a um fragmento de anticorpo formado a partir de uma porção de um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se ligue a um antígeno, mas não compreende uma estrutura de anticorpo nativa intacta. Exemplos de porção de ligação ao antígeno incluem, sem limitação, um domínio variável, uma região variável, diacorpo, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um fragmento Fv, fragmento Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), um (dsFv)2, um dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), diacorpo estabilizado por dissulfeto (ds diacorpo), um anticorpo multiespecífico, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, e um anticorpo de domínio bivalente. Uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo parental se liga. Em certas formas de realização, uma porção de ligação ao antígeno pode compreender uma ou mais CDRs de um anticorpo humano particular enxertado em uma região estrutural a partir de um ou mais anticorpos humanos diferentes. Mais formatos detalhados da porção de ligação ao antígeno encontram-se descritos em Spiess et al., 2015 (Supra) e Brinkman et al., MAbs, 9(2), pp.182-212 (2017), que são incorporados aqui na sua totalidade.
[0165] “Fab”, no que se refere a um anticorpo, refere-se àquela porção do anticorpo que consiste em uma única cadeia leve (ambas regiões variável e constante) que se associam a região variável e a primeira região constante de uma única cadeia pesada por uma ligação dissulfeto. Em certas formas de realização, as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada são substituídas pelas regiões constantes do TCR.
[0166] “Fab” refere-se a um fragmento Fab que inclui uma porção da região de dobradiça.
[0167] “F(ab')2” refere-se a um dímero de Fab'.
[0168] “Diacorpo” refere-se a uma proteína de fusão formada pela fusão de um scFv à extremidade C-terminal da cadeia leve (Fab-L-scFv) ou Fd (Fab-H-scFv).
[0169] “Triacorpo” refere-se a uma proteína de fusão formada pela fusão de um scFv à cadeia leve e à cadeia pesada (Fab-(scFv)2).
[0170] Um “WuXiBody” é um anticorpo biespecífico compreendendo proteína quimérica solúvel com domínios variáveis de um anticorpo e os domínios constantes do TCR, em que as subunidades (como domínios alfa e beta) dos domínios constantes do TCR são ligadas por ligação dissulfeto modificada.
[0171] Um “fragmento difficult (Fd)”, em relação a um anticorpo, refere-se à metade amino terminal do fragmento da cadeia pesada que pode ser combinada com a cadeia leve para formar o Fab.
[0172] “Fc”, em relação a um anticorpo, refere-se à porção do anticorpo que consiste na segunda (CH2) e na terceira (CH3) regiões constantes de uma primeira cadeia pesada ligada à segunda e terceira regiões constantes de uma segunda cadeia pesada via ligação dissulfeto. A porção Fc do anticorpo é responsável por várias funções efetoras, como ADCC e CDC, mas não funciona na ligação ao antígeno.
[0173] “Região de dobradiça”, em termos de um anticorpo, inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões de ligação ao antígeno N-terminais se movam independentemente.
[0174] “Domínio CH2”, conforme utilizado neste documento, inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, do aminoácido 244 ao aminoácido 360 de um anticorpo IgG usando esquemas de numeração convencionais (aminoácidos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat e aminoácidos 231-340, sistema de numeração da UE; vide Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983).
[0175] O “domínio CH3” se estende do domínio CH2 à extremidade C-terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 aminoácidos. Certas classes de imunoglobulinas, por exemplo, IgM, incluem ainda uma região CH4.
[0176] “Fv”, em relação a um anticorpo, refere-se ao menor fragmento do anticorpo que comporta o sítio completo de ligação ao antígeno. Um fragmento Fv consiste no domínio variável de uma única cadeia leve ligada ao domínio variável de uma única cadeia pesada. Vários desenhos de Fv foram apresentados, incluindo dsFvs, nos quais a associação entre os dois domínios é aprimorada por uma ligação dissulfeto introduzida; e os scFvs podem ser formados usando um ligante peptídico para ligar os dois domínios juntos como um único polipeptídeo. Construções de Fvs contendo um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina associada ao domínio variável e constante da cadeia pesada ou leve da imunoglobulina correspondente também foram produzidas. Fvs também foram multimerizados para formar diacorpos e triacorpos (Maynard et al., Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000)).
[0177] “ScFab” refere-se a um polipeptídeo de fusão com um Fd ligado a uma cadeia leve por meio de um ligante polipeptídico, resultando na formação de um fragmento Fab de cadeia única (scFab).
[0178] “TriFabs” refere-se a uma proteína de fusão biespecífica e trivalente composta por três unidades com funcionalidades de Fab. A TriFabs abriga dois Fabs regulares fundidos a uma porção assimétrica do tipo Fab.
[0179] “Fab-Fab” refere-se a uma proteína de fusão formada pela fusão da cadeia Fd de um primeiro braço Fab à extremidade N-terminal da cadeia Fd de um segundo braço Fab.
[0180] “Fab-Fv” refere-se a uma proteína de fusão formada pela fusão de um HCVR à extremidade C-terminal de uma cadeia Fd e uma LCVR à extremidade C- terminal de uma cadeia leve. Uma molécula “Fab-dsFv” pode ser formada pela introdução de uma ligação dissulfeto interdomínio entre o domínio da HCVR e o domínio da LCVR.
[0181] “MAb-Fv” ou “IgG-Fv” refere-se a uma proteína de fusão formada pela fusão do domínio da HCVR à extremidade C-terminal de uma cadeia Fc e ao domínio da LCVR, expresso separadamente ou fundido à extremidade C-terminal do outro, resultou em uma proteína de fusão IgG-Fv biespecífica e trivalente (mAb-Fv), com o Fv estabilizado por uma ligação dissulfeto interdomínio.
[0182] “ScFab-Fc-scFv2” e “ScFab-Fc-scFv” referem-se a uma proteína de fusão formada pela fusão de um Fab de cadeia única com Fc e domínios Fv estabilizados por dissulfeto.
[0183] “IgG anexada” refere-se a uma proteína de fusão com um braço Fab fundido a uma IgG para formar o formato de (Fab)2-Fc biespecífico. Pode formar um “IgG-Fab” ou um “Fab-IgG”, com um Fab fundido à extremidade C-terminal ou N- terminal de uma molécula de IgG com ou sem um conector. Em certas formas de realização, a IgG anexada pode ser modificada ainda a um formato de IgG-Fab4 (vide Brinkman et al., 2017, Supra).
[0184] “DVD-Ig” refere-se a um anticorpo de domínio variável duplo que é formado pela fusão de um domínio HCVR adicional e domínio LCVR de uma segunda especificidade a uma cadeia pesada e leve de IgG. “CODV-Ig” refere-se a um formato relacionado, no qual os dois domínios HCVR e dois LCVR são ligados de uma maneira que permite o pareamento cruzado dos domínios variáveis de HCVR-LCVR, que são organizados (da extremidade N-terminal à C-terminal) na ordem HCVRA-HCVRB e LCVRB-LCVRA, ou na ordem HCVRB-HCVRA e LCVRA-LCVRB.
[0185] Um “CrossMab” refere-se a uma tecnologia de pareamento da cadeia leve não modificada com a cadeia pesada não modificada correspondente e pareamento da cadeia leve modificada com a cadeia pesada modificada correspondente, resultando assim em um anticorpo com redução de pareamento incorreto na cadeia leve.
[0186] Um “BiTE” é uma molécula acopladora de células T bipespecífica, compreendendo um primeiro scFv com uma primeira especificidade a antígeno na orientação LCVR-HCVR ligada a um segundo scFv com uma segunda especificidade na orientação HCVR-LCVR.
[0187] “Percentual (%) de identidade de sequência”, em relação à sequência de aminoácidos (ou sequência de ácido nucleico), é definida como os percentuais de resíduos de aminoácidos (ou ácido nucleico) em uma sequência candidata que são idênticos aos do aminoácido (ou ácido nucleico) em uma sequência de referência após o alinhamento das sequências e, se necessário, com a introdução de lacunas para atingir o número máximo de aminoácidos (ou ácidos nucleicos) idênticos. A substituição conservativa dos resíduos de aminoácidos pode ou não ser considerada como resíduos idênticos. O alinhamento para fins de determinação do percentual de identidade de sequência de aminoácidos (ou ácido nucleico) pode ser alcançado, por exemplo, utilizando-se ferramentas disponíveis ao público, como BLASTN, BLASTp (disponível no endereço eletrônico do U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI), consulte também, Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-4040 (1997)), ClustalW2 (disponível no endereço eletrônico do European Bioinformatics Institute, vide também Higgins DG et al., Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996); Larkin MA et al., Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), 23(21): 2947-8 (2007)) e os softwares ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnica no assunto podem usar os parâmetros padrão fornecidos pela ferramenta ou podem personalizar os parâmetros, conforme a necessidade, para o alinhamento, como por exemplo, selecionando um algoritmo adequado.
[0188] Um “antígeno” ou “Ag”, conforme utilizado neste documento, refere-se a um composto, composição, peptídeo, polipeptídeo, proteína ou substância que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T na cultura de células ou em um animal, incluindo composições (como aquela que inclui uma proteína específica para o câncer) que são adicionadas a uma cultura de células (como um hibridoma) ou injetadas ou absorvidas em um animal. Um antígeno reage com os produtos da imunidade humoral ou celular específica (como um anticorpo), incluindo aqueles induzidos por antígenos heterólogos.
[0189] Um “epítopo” ou “determinante antigênico” refere-se à região de um antígeno ao qual um agente de ligação (como um anticorpo) se liga. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos (também chamados epítopos lineares ou sequenciais) quanto de aminoácidos não contíguos justapostos pelo dobramento terciário de uma proteína (também chamada epítopo configuracional ou conformacional). Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente dispostos linearmente ao longo dos resíduos de aminoácidos primários na proteína e os pequenos segmentos dos aminoácidos contíguos podem ser digeridos a partir de uma ligação ao antígeno com moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ou retidos em exposição aos solventes desnaturantes, enquanto que epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos durante o tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3 e, mais usualmente, pelo menos 5, cerca de 7 ou cerca de 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única.
[0190] O termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente”, conforme utilizado neste documento, refere-se a uma reação de ligação não aleatória entre duas moléculas, como, por exemplo, entre um anticorpo e um antígeno. Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico e o complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui se ligam especificamente a um antígeno com uma afinidade de ligação (KD) de ≤ 10-6 M (e.g., ≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤ 10-7 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤ 10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 2x10-9 M, ≤ 10-9 M ou ≤ 10-10 M). KD, conforme utilizado neste documento, refere-se à razão entre a taxa de dissociação e a taxa de associação (koff/kon), e pode ser determinada utilizando-se de métodos de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, utilizando um instrumento como o Biacore.
[0191] O termo “ligar operacionalmente” ou “operacionalmente ligado” refere- se a uma justaposição, com ou sem espaçador ou ligante, de duas ou mais sequências biológicas de interesse, de modo que elas estejam em um relacionamento que lhes permitam funcionar na maneira pretendida. Quando utilizado em relação aos polipeptídeos, significa que as sequências polipeptídicas devem estar ligadas de maneira a permitir que o produto ligado tenha a função biológica pretendida. Por exemplo, uma região variável de anticorpo pode estar operacionalmente ligada a uma região constante, de modo a proporcionar um produto estável com atividade de ligação ao antígeno. O termo também pode ser usado em relação aos polinucleotídeos.
Por um lado, quando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora (por exemplo, promotor, intensificador, sequência silenciadora, etc.) significa que as sequências polinucleotídicas devem estar ligadas de maneira a permitir a regulação da expressão do polipeptídeo a partir do polinucleotídeo.
[0192] O termo “fusão” ou “fundido”, quando usado em relação a sequências de aminoácidos (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo ou proteína), refere-se à combinação de duas ou mais sequências de aminoácidos, por exemplo, por ligação química ou meios recombinantes, em uma única sequência de aminoácidos que não existe naturalmente. Uma sequência de aminoácidos de fusão pode ser produzida por recombinação genética de duas sequências polinucleotídicas codificantes e pode ser expressa por um método de introdução de uma construção contendo os polinucleotídeos recombinantes em uma célula hospedeira.
[0193] O termo “espaçador”, conforme utilizado neste documento, refere-se a uma sequência de aminoácidos artificial contendo 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos, ou um comprimento entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais resíduos de aminoácidos, unidos por ligações peptídicas e são usados para ligar um ou mais polipeptídeos. Um espaçador pode ou não ter uma estrutura secundária. As sequências de espaçadores são conhecidas no estado da arte, vide, por exemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al. Structure 2: 1121-1123 (1994). Qualquer espaçador adequado conhecido no estado da arte pode ser usado. Por exemplo, um espaçador útil na presente divulgação pode ser rico em resíduos de glicina e prolina. Os exemplos incluem espaçadores com sequências únicas ou repetidas compostas de treonina/serina e glicina, como TGGGG (SEQ ID NO: 266), GGGGS (SEQ ID NO: 267) ou SGGGG (SEQ ID NO: 268) ou suas repetições em tandem (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais repetições). Alternativamente, um espaçador pode ser uma cadeia peptídica longa contendo uma ou mais repetições sequenciais ou em tandem da sequência de aminoácidos de GAPGGGGGAAAAAGGGGG (SEQ ID NO: 269). Em certa forma de realização, o espaçador compreende 1, 2, 3, 4 ou mais repetições sequenciais ou em tandem da SEQ ID NO: 269.
[0194] O termo “especificidade antigênica” refere-se a um antígeno específico ou a um epítopo do mesmo que é reconhecido seletivamente por uma molécula de ligação ao antígeno.
[0195] O termo “substituição”, em relação ao resíduo de aminoácido, conforme utilizado neste documento, refere-se à substituição natural ou induzida de um ou mais aminoácidos por outro em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. A substituição em um polipeptídeo pode resultar na diminuição, aumento ou eliminação da função do polipeptídeo.
[0196] A substituição pode ser também “substituição conservativa”, em relação à sequência de aminoácidos, refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente com uma cadeia lateral com propriedades físico-químicas semelhantes ou substituição dos aminoácidos que não são críticos para a atividade do polipeptídeo. Por exemplo, as substituições conservativas podem ser realizadas entre os resíduos de aminoácidos com cadeias laterais não polares (por exemplo., Met, Ala, Val, Leu, e Ile, Pro, Phe, Trp), entre os resíduos com cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly e Gln), entre os resíduos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, Asp, Glu), entre os amino ácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, His, Lys e Arg), entre os aminoácidos com cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, Thr, Val e Ile), entre os aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre (por exemplo, Cys e Met), ou entre os resíduos com cadeias laterais aromáticas (por exemplo., Trp, Tyr,
His e Phe). Em certas formas de realização, substituições, deleções ou adições podem ser consideradas também como “substituição conservativa”. O número de aminoácidos que são inseridos ou excluídos pode estar na faixa de cerca de 1 a 5. A substituição conservativa geralmente não causa alterações significativas na estrutura conformacional da proteína e, portanto, a atividade biológica de uma proteína pode ser mantida.
[0197] O termo “mutação” ou “mutado” em relação ao resíduo de aminoácido, conforme utilizado neste documento, refere-se à substituição, inserção ou adição de um resíduo de aminoácido.
[0198] Conforme utilizado neste documento, uma “sequência homóloga” e “sequência com homologia” são utilizados alternadamente e referem-se a sequências polinucleotídicas (ou a sua cadeia complementar) ou sequências de aminoácidos que apresentam identidade de sequência de pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos, 85 %, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) com outras sequências quando opcionalmente alinhadas.
[0199] “Célula T”, conforme usado neste documento, refere-se a um tipo de linfócito que desempenha um papel crítico na imunidade mediada por células, incluindo células T helper ou auxiliares (por exemplo, células T CD4+, células T do tipo T helper 1, células T do tipo T helper 2, células T do tipo T helper 3, células T do tipo T helper 17), células T citotóxicas (por exemplo, células T CD8+), células T de memória (por exemplo, células T de memória central (células TCM), células T de memória efetiva (células TEM e células TEMRA) e células T de memória residente (TRM) que são CD8+ ou CD4+), células T natural killer (NKT) e células T inibidoras.
[0200] Um “receptor de células T” nativo ou um “TCR” nativo é uma proteína de superfície heterodimérica de célula T que está associada com cadeias CD3 invariantes para formar um complexo capaz de mediar a transdução de sinal. O TCR pertence à superfamília da imunoglobulina e é semelhante a um meio anticorpo com uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve. O TCR nativo possui uma porção extracelular, uma porção transmembrana e uma porção intracelular. O domínio extracelular de um TCR possui uma região constante proximal à membrana e uma região variável distal à membrana.
[0201] O termo “sujeito” ou “indivíduo” ou “animais” ou “paciente”, conforme utilizado neste documento, refere-se ao humano ou animal não humano, incluindo um mamífero ou um primata, que necessita de diagnóstico, prognóstico, melhora, prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio. Os mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de criação e de zoológico, esporte ou animais de estimação, como cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, suínos, vacas, ursos e assim por diante.
A. Complexo polipeptídico
[0202] São proporcionados neste documento novos complexos polipeptídicos que compreendem um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante do receptor de célula T (TCR) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante do TCR, em que a primeiro região constante do TCR e a segunda região constante do TCR são associadas por pelo menos uma ligação intercadeia não nativa. O complexo polipeptídico compreende pelo menos duas cadeias polipeptídicas, cada uma das quais compreendendo um domínio variável derivado de um anticorpo e uma região constante derivada de um TCR. As duas cadeias polipeptídicas dos complexos polipeptídicos compreendem um par de domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, os quais estão operacionalmente ligados a um par de regiões constantes do TCR, respectivamente. Exemplos de pares de regiões constantes de TCR incluem, por exemplo, regiões constantes de TCR alfa/beta, pré-alfa/beta e gama/delta. As regiões constantes do TCR nos complexos polipeptídicos proporcionadas aqui podem ser completas ou em um fragmento, e podem ser modificadas, desde que o par de regiões constantes do TCR seja capaz de se associar entre si para formar um dímero.
[0203] Verificou-se, surpreendentemente, que os complexos polipeptídicos proporcionados aqui com pelo menos uma ligação intercadeia não nativa (em particular, um ligação dissulfeto não nativa) podem ser expressos recombinantemente e montados na conformação desejada, o que estabiliza a dímero de região constante do TCR, proporcionando uma boa atividade de ligação ao antígeno das regiões variáveis do anticorpo. Além disso, verificou-se que os complexos polipeptídicos toleram bem a construção rotineira de anticorpos, por exemplo, modificação dos sítios de glicosilação e remoção de algumas sequências naturais. Além disso, os complexos polipeptídicos proporcionados aqui podem ser incorporados em um formato biespecífico que pode ser rapidamente expresso e montado com um pareamento incorreto mínimo ou substancialmente inexistente das sequências de ligação ao antígeno devido à presença das regiões constantes do TCR nos complexos polipeptídicos. Vantagens adicionais dos complexos e construções dos polipeptídeos proporcionados aqui ficarão mais claras na descrição abaixo.
[0204] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona complexos polipeptídicos compreendendo um primeiro polipeptídeo que compreende, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de célula T (TCR), e um segundo polipeptídeo que compreende, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo ligado operacionalmente a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre C1 e C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica.
i. Região constante do TCR
[0205] Os complexos polipeptídicos proporcionados aqui compreendem regiões constantes derivadas de um TCR.
[0206] O TCR nativo consiste em duas cadeias polipeptídicas e geralmente possui dois tipos: um consiste em cadeias alfa e beta (isto é, TCR alfa/beta), e o outro consiste em cadeias gama e delta (isto é, TCR gama/delta). Esses dois tipos são estruturalmente semelhantes, mas têm localizações e funções distintas. Cerca de 95% das células T humanas têm TCR alfa/beta, enquanto os 5% restantes possuem TCR gama/delta. Um precursor da cadeia alfa também é encontrado e denominado como cadeia pré-alfa. Cada uma das duas cadeias polipeptídicas de TCR compreende um domínio de imunoglobulina e uma região proximal à membrana. A região de imunoglobulina compreende uma região variável e uma região constante e é caracterizada pela presença de uma dobra do tipo imunoglobulina. Cada cadeia polipeptídica do TCR possui um resíduo de cisteína (por exemplo, na extremidade C- terminal do domínio constante ou na extremidade N-terminal da região proximal à membrana) que juntos podem formar uma ligação dissulfeto que liga as duas cadeias de TCR juntas.
[0207] As Figuras 18A-18E apresentam as sequências de aminoácidos das regiões constantes de TCR nativo das cadeias de TCR alfa, pré-alfa, beta, gama e delta. Para clareza e consistência, cada um dos resíduos de aminoácidos nestas sequências é numerado nas Figuras 19A-19E, e tal numeração é usada ao longo do presente relatório descritivo para se referir a um determinado resíduo de aminoácido de uma região constante de TCR específica.
[0208] A região constante da cadeia alfa de TCR humano é conhecida como TRAC, com o número de acesso NCBI de P01848, ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254.
[0209] A região constante da cadeia beta de TCR humano tem duas variantes diferentes conhecidas como TRBC1 e TRBC2 (nomenclatura IMGT), com as sequências correspondentes apresentadas na SEQ ID NO: 256 e SEQ ID NO: 257, respectivamente (vide também Toyonaga B, et al., PNAs, Vol. 82, pp. 8624-8628, Immunology (1985)). Estes dois domínios constantes beta são diferentes no 4º, 5º e 37º resíduos de aminoácidos do éxon 1. Especificamente, TRBC1 possui 4N, 5K e 37F no éxon 1 e TRBC2 tem 4K, 5N e 37Y no éxon 1.
[0210] Especificamente, a cadeia beta de TCR nativo contém um resíduo de cisteína nativo na posição 74 (vide Figura 1 9B), que não é pareado e, por conseguinte, não forma uma ligação dissulfeto em um TCR alfa/beta nativo. Em certas formas de realização, nos complexos polipeptídicos proporcionados aqui, este resíduo de cisteína nativo está ausente ou mutado a outro resíduo. Isso pode ser útil para evitar o pareamento intercadeias ou intracadeias incorreto. Em certas formas de realização, o resíduo nativo de cisteína é substituído por outro resíduo, por exemplo, serina ou alanina. Em certas formas de realização, a substituição em certas formas de realização pode melhorar as eficiências de redobramento do TCR in vitro.
[0211] As regiões constantes da cadeia gama de TCR humano têm duas variantes, conhecidas como TRGC1 e TRGC2 (vide Lefranc et al., Eur. J. Immunol.
19: 989-994 (1989)), com o número de acesso NCBI de A26659 e P03986, respectivamente, ou as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 263 e SEQ ID NO: 265, respectivamente.
[0212] A região constante da cadeia delta de TCR humano é conhecida como TRDC, com o número de acesso NCBI de A35591, ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 261.
[0213] A região constante de TCR nos complexos polipeptídicos proporcionados aqui também pode ser derivada do receptor de antígeno das células pré-T (pré-TCR). O pré-TCR é expresso por timócitos imaturos, que têm um papel central no desenvolvimento inicial das células T. O pré-TCR possui uma cadeia beta regular, mas uma cadeia pré-alfa especial com apenas a região constante disponível, com sequência e estrutura distintas das da cadeia alfa regular (vide Harald von Boehmer, Nat Rev Immunol, 5 de julho; 7(7): 571-7 (2005)). A sequência da região constante da cadeia pré-alfa humana (PTCRA) tem o número de acesso NCBI de AAF89556.1, ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 259.
[0214] Na presente descrição, as primeira e segunda regiões constantes do TCR dos complexos polipeptídicos proporcionados aqui são capazes de formar um dímero que compreende, entre as regiões constantes do TCR, pelo menos uma ligação intercadeia não nativa que é capaz de estabilizar o dímero.
[0215] O termo “dímero”, conforme utilizado neste documento, refere-se a uma estrutura associada formada por duas moléculas, como polipeptídeos ou proteínas, por meio de interações covalentes ou não covalentes. Um homodímero ou homodimerização é formado por duas moléculas idênticas e um heterodímero ou heterodimerização é formado por duas moléculas diferentes. O dímero formado pela primeira e segunda regiões constantes do TCR é um heterodímero.
[0216] Uma ligação intercadeia é formada entre um resíduo de aminoácido em uma região constante do TCR e um outro resíduo de aminoácido em outra região constante do TCR. Em certas formas de realização, a ligação intercadeia não nativa pode ser qualquer ligação ou interação que seja capaz de associar duas regiões constantes do TCR em um dímero. Exemplos de ligação intercadeia não nativa adequada incluem uma ligação dissulfeto, uma ligação de hidrogênio, interação eletrostática, uma ponte de sal ou interação hidrofóbica-hidrofílica, um knob-into-holes ou a combinação dos mesmos.
[0217] Uma “ligação dissulfeto” refere-se a uma ligação covalente com a estrutura R-S-S-R'. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação dissulfeto com um segundo grupo tiol, por exemplo, de outro resíduo de cisteína. A ligação dissulfeto pode ser formada entre os grupos tiol de dois resíduos de cisteína que residem respectivamente nas duas cadeias polipeptídicas, formando, assim, uma ponte intercadeia ou uma ligação intercadeia.
[0218] A interação eletrostática é uma interação não covalente e é importante no dobramento, estabilidade, flexibilidade e função das proteínas, incluindo interações iônicas, ligação de hidrogênio e ligação de halogênio. As interações eletrostáticas podem ser formadas em um polipeptídeo, por exemplo, entre Lys e Asp, entre Lys e Glu, entre Glu e Arg, ou entre Glu, Trp na primeira cadeia e Arg, Val ou Thr na segunda cadeia.
[0219] Uma ponte de sal são interações eletrostáticas de curto alcance que surgem principalmente do carboxilato aniônico da Asp ou Glu e do amônio catiônico da Lys ou da guanidina da Arg, que são pares espacialmente proximais dos resíduos de carga oposta em estruturas proteicas nativas. Os resíduos carregados e polares em interfaces amplamente hidrofóbicas podem atuar como hot spots para ligação.
Entre outros, os resíduos com cadeias laterais ionizáveis, tais como Seu, Tyr e Ser, podem participar também na formação de uma ponte de sal.
[0220] Uma interação hidrofóbica pode ser formada entre uma ou mais Val, Tyr e Ala na primeira cadeia e um ou mais Val, Leu e Trp na segunda cadeia, ou His e Ala na primeira cadeia e Thr e Phe na a segunda cadeia (vide Brinkmann, et al., 2017, Supra).
[0221] Uma ligação de hidrogênio é formada pela atração eletrostática entre dois grupos polares quando um átomo de hidrogênio se liga covalentemente a um átomo altamente eletronegativo, como nitrogênio, oxigênio ou flúor. Uma ligação de hidrogênio pode ser formada em um polipeptídeo entre os oxigênios (por exemplo, grupos de calcogênio) e hidrogênio de amida (grupo de nitrogênio) estruturais de dois resíduos, respectivamente, como um grupo de nitrogênio em Asn e um grupo de oxigênio em His ou um grupo de oxigênio em Asn e um grupo de nitrogênio em Lys.
Uma ligação de hidrogênio é mais forte que uma interação de Van der Waals, no entanto, é mais fraca que as ligações covalentes ou iônicas e é fundamental para manter a estrutura secundária e a estrutura terciária. Por exemplo, uma hélice alfa é formada quando o espaçamento dos resíduos de aminoácidos ocorre regularmente entre as posições i e i+4, e uma folha beta é um trecho da cadeia peptídica de 3 a 10 aminoácidos formada quando dois peptídeos se unem por pelo menos duas ou três ligações de hidrogênio estruturais, formando uma folha pregueada e torcida.
[0222] “Knobs-into-holes”, conforme utilizado neste documento, refere-se a uma interação entre dois polipeptídeos, em que um polipeptídeo tem uma protuberância (isto é, um “knob”) devido à presença de um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral volumosa (por exemplo, tirosina ou triptofano) e o outro polipeptídeo possui uma cavidade (isto é, “hole”) onde reside um pequeno resíduo de aminoácido da cadeia lateral (por exemplo, alanina ou treonina), e a protuberância é posicionável na cavidade para promover a interação dos dois polipeptídeos de modo a formar um heterodímero ou um complexo. Os métodos de geração de polipeptídeos com knobs-into-holes são conhecidos no estado da arte, por exemplo, como descrito na Patente US 5,731,168.
[0223] Em certas formas de realização, o dímero da região constante do TCR compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações intercadeias não nativas.
Opcionalmente, pelo menos uma das 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações intercadeias não nativas são ligações dissulfeto, ligações de hidrogênio, interação eletrostática, ponte de sal ou interação hidrofóbica-hidrofílica, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0224] Uma ligação intercadeia “não nativa”, conforme utilizada neste documento, refere-se a uma ligação intercadeia que não é encontrada em uma associação nativa das regiões constantes do TCR do equivalente nativo. Por exemplo, uma ligação intercadeia não nativa pode ser formada entre um resíduo de aminoácido mutado e um resíduo de aminoácido nativo, cada um residindo em uma respectiva região constante do TCR; ou, como alternativa, entre dois resíduos de aminoácidos mutados que residem respectivamente nas regiões constantes do TCR. Em certas formas de realização, a pelo menos uma ligação intercadeia não nativa é formada entre um primeiro resíduo mutado compreendido na primeira região constante do TCR e um segundo resíduo mutado compreendido na segunda região constante do TCR do complexo polipeptídico.
[0225] Um resíduo de aminoácido “mutado” refere-se a um que é substituído, inserido ou adicionado e é diferente do seu resíduo equivalente nativo em uma região constante correspondente do TCR nativo. Por exemplo, se um resíduo de aminoácido em uma determinada posição na região constante de TCR de tipo selvagem é referido como o “nativo”, então, o seu mutante equivalente é qualquer resíduo que é diferente do resíduo nativo, mas que reside na mesma posição na região constante do TCR.
Um resíduo mutado pode ser um resíduo diferente que substitui o resíduo nativo na mesma posição ou que é inserido antes do resíduo nativo e, portanto, assume sua posição original.
[0226] Em certas formas de realização, o resíduo mutado pode ser um resíduo de aminoácido natural. Em certas formas de realização, pelo menos um dos primeiro e segundo resíduos de aminoácidos não nativos é um resíduo de cisteína mutado. Em certas formas de realização, uma ou mais das ligações intercadeias não nativas é uma ligação dissulfeto. Em certas formas de realização, a ligação dissulfeto não nativa pode ser formada entre duas resíduos de cisteína mutados compreendidos na primeira e segunda regiões constantes do TCR, respectivamente.
[0227] Em certas formas de realização, pelo menos um dos primeiro e segundo resíduos mutados é um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural.
Um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural refere-se a um resíduo de aminoácido que não é encontrado naturalmente nas proteínas humanas, mas pode ser expresso por meio de um códon de ácido nucleico que pode ser incorporado no polinucleotídeo codificante. Por exemplo, aminoácidos não naturais, como L-3,4-di- hidroxifenilalanina (L-DOPA) pode reagir e formar ligações cruzadas com os aminoácidos naturais, tais como cisteína, histidina e lisina, por meio da oxidação induzida com periodato. Tem sido demonstrado que incorporando L-DOPA a um anticorpo, o aminoácido de ocorrência não natural era capaz de fazer ligação cruzada eficaz com os resíduos no antígeno, resultando em um complexo antígeno-anticorpo ligado covalentemente (Xu, J. et al., 2014, Structure-based non-canonical amino acid Design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology, 185 (2), pp.215-222). Considera-se neste documento que o resíduo de aminoácido mutado na primeira e/ou na segunda regiões constantes do TCR pode compreender um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural, como L-DOPA, que pode fazer ligação cruzada com um resíduo de aminoácido natural (ou, como alternativa, um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural) para formar uma ligação covalente intercadeia não nativa.
[0228] Em certas formas de realização, pelo menos uma ligação dissulfeto não nativa é formada entre um resíduo de cisteína mutado e um resíduo de cisteína nativo. Em certas formas de realização, as ligações dissulfeto não nativas são formadas entre dois resíduos de cisteína mutados. Em certas formas de realização, pelo menos um dos resíduos de cisteína que formam a ligação dissulfeto não nativa é um resíduo de cisteína mutado. Em certas formas de realização, ambos os resíduos de cisteína que formam a ligação dissulfeto não nativa são resíduos de cisteína mutados na primeira e segunda regiões constantes do TCR, respectivamente.
[0229] Em certas formas de realização, a primeira e/ou segunda regiões constantes do TCR podem ser modificadas para compreender um ou mais resíduos de aminoácidos mutados que são responsáveis pela formação da ligação intercadeia não nativa. Para introduzir tal resíduo mutado à região constante de TCR, uma sequência codificante de uma região do TCR pode ser modificada para, por exemplo,
substituir um códon que codifica um resíduo nativo pelo códon que codifica o resíduo mutado, ou para inserir um códon que codifica o resíduo mutado antes do códon do resíduo nativo. Um ou mais resíduos de aminoácidos mutados desejados podem ser introduzidos na região constante do TCR, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, resíduo de cisteína) capazes de formar uma ligação dissulfeto, que pode levar a interações eletrostáticas entre as duas regiões constantes do TCR, que podem aumentar a flexibilidade das regiões constantes do TCR, que posicionam pelo menos um dos aminoácidos formadores de ligação covalente longe do domínio constante do TCR, como uma ligação de hidrogênio, que pode contribuir para a formação de uma ponte de sal; resíduos de aminoácidos hidrofóbicos capazes de levar a interações hidrofóbicas; e resíduos de aminoácidos hidrofílicos capazes de levar a interações hidrofílicas, e assim por diante.
[0230] Em certas formas de realização, a primeira e/ou segunda regiões constantes do TCR podem ser modificadas para compreender um ou mais resíduos de cisteína mutados. Por exemplo, um resíduo não cisteína pode ser substituído por um resíduo cisteína ou um resíduo cisteína pode ser inserido entre dois resíduos não cisteína nativos originalmente adjacentes. As posições de substituição podem ser determinadas de tal modo que, após a substituição dos resíduos de cisteína, uma ligação intercadeia não nativa dissulfeto poderia ser formada entre as duas regiões constantes do TCR. Para este fim, vários fatores podem ser considerados, incluindo, por exemplo, os resíduos de cisteína que formam a ligação dissulfeto podem estar suficientemente próximos, podem ter orientação de ligação alfa-beta adequada, os grupos tiol dos resíduos de cisteína podem ser orientados de modo a ficarem voltados um para o outro, o resíduo a ser substituído pode ter uma cadeia lateral com propriedade química relativamente semelhante à da cisteína e/ou a substituição não perturbaria substancialmente a estrutura terciária da região constante do TCR ou o próprio complexo polipeptídico.
[0231] Um técnico no assunto pode determinar a distância e o ângulo entre dois resíduos de aminoácido a serem substituídos utilizando-se métodos adequados conhecidos no estado da arte, por exemplo, sem limitação, mapas de distância por fotodetecção, modelagem computacional, espectroscopia por RMN ou cristalografia de raios-X. Em um exemplo ilustrativo, para um polipeptídeo de interesse (como uma região constante de TCR), sua estrutura proteica cristalina pode ser obtida de bancos de dados públicos, como banco de dados PDB, ou como alternativa ser elucidada utilizando-se métodos como a cristalografia de raios-X. Softwares adequados podem ser utilizados para determinar as distâncias e os ângulos entre os resíduos de aminoácidos com base nos dados da estrutura proteica cristalina. Em certas formas de realização, no complexo polipeptídico proporcionado aqui, uma ligação dissulfeto pode ser formada entre resíduos de cisteína mutados com os respectivos carbonos beta suficientemente próximos, por exemplo, a uma distância inferior a 8 angstroms, 7 angstroms, 6 angstroms, 5 angstroms, 4 angstroms, 3 angstroms, 2 angstroms, 1 angstrom ou menos quando o complexo é dobrado corretamente.
[0232] Posições adicionais adequadas para o desenvolvimento da primeira e/ou segunda regiões constantes do TCR podem ser obtidas a partir dos dados da estrutura cristalina publicados sobre o complexo entre o TCR alfa e beta (Boulter, JM et al., Protein engineering, 16(9), pp.707-711 (2003)), ou gama e delta (Allison, TJ et al., Nature, 411(6839), pp.820-824. (2001); Uldrich, AP et al., Nature Immunology, 14(11), pp. 137-1145 (2013)). Uma vez que o resíduo a ser substituído é determinado, um técnico no assunto pode facilmente identificar o códon de interesse a ser mutado (por exemplo, através do alinhamento de sequências utilizando softwares existentes, tais como ClustalW (endereço eletrônico do European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk/index.html)), e, em seguida, mutá-lo para o códon de cisteína por métodos conhecidos no estado da arte, tais como a mutagênese por PCR.
[0233] A formação da ligação dissulfeto intercadeia pode ser determinada por métodos adequados conhecidos no estado da arte. Por exemplo, o produto de proteína expressa pode ser submetido à SDS-PAGE redutora e não redutora, respectivamente, seguido por comparação das bandas resultantes para identificar a diferença de potencial que indica a presença de ligação dissulfeto intercadeia.
[0234] A ligação intercadeias não nativa é capaz de estabilizar a complexo polipeptídico. Tais efeitos sobre a estabilização podem ser concretizados de várias maneiras. Por exemplo, a presença do resíduo de aminoácido mutado ou da ligação intercadeia não nativa pode permitir que o complexo polipeptídico se expresse de forma estável e/ou se expresse em um nível alto e/ou se associe em um complexo estável com a atividade biológica desejada (por exemplo, atividade de ligação ao antígeno) e/ou se expresse e organize em um alto nível de complexo estável desejado com a atividade biológica desejada. A capacidade da ligação intercadeia de estabilizar as primeira e segunda regiões constantes do TCR pode ser avaliada utilizando-se métodos adequados conhecidos no estado da arte, tais como o peso molecular apresentado em SDS-PAGE, ou termoestabilidade medida por calorimetria diferencial de varredura (DSC) ou fluorimetria diferencial de varredura (DSF). Em um exemplo ilustrativo, a formação de um complexo polipeptídico estável proporcionado aqui pode ser confirmada por SDS-PAGE, se um produto ilustra um peso molecular comparável ao peso molecular combinado do primeiro e do segundo polipeptídeos. Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico proporcionado aqui é estável, pois sua estabilidade térmica não é inferior a 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da de um Fab natural. Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico proporcionado aqui é estável, pois sua estabilidade térmica é comparável à de um Fab natural.
[0235] Sem estar limitado por qualquer teoria, acredita-se que a ligação intercadeia não nativa (tal como uma ligação dissulfeto) formada entre a primeira e segunda regiões constantes do TCR nos complexos polipeptídicos são capazes de estabilizar o heterodímero das regiões constantes de TCR, aumentando, assim, o nível de dobramento correto, a estabilidade estrutural e/ou o nível de expressão do heterodímero e dos complexos polipeptídicos. Ao contrário do TCR nativo ancorado na membrana de superfície da célula T, verificou-se que os heterodímeros de domínios extracelulares de TCR nativos são muito menos estáveis, apesar da sua semelhança ao Fab de anticorpo quanto à estrutura tridimensional. De fato, a instabilidade do TCR nativo em condição solúvel costumava ser um obstáculo significativo que impedia a elucidação de sua estrutura cristalina (vide Wang, Protein Cell, 5(9), pp.649-652 (2014)). Ao introduzir um par de mutações de cisteína (Cys) nas regiões constantes do TCR e, permitindo, dessa forma, a formação de ligação dissulfeto intercadeia não nativa, os complexos polipeptídicos podem ser expressos de forma estável, enquanto, ao mesmo tempo, a capacidade de ligação ao antígeno da região variável do anticorpo é mantida.
[0236] A região constante do TCR que compreende um resíduo mutado é referido aqui também como uma região constante do TCR “modificada”. Em certas formas de realização, a primeira região constante do TCR (C1) do complexo polipeptídico compreende uma cadeia alfa de TCR modificada (CAlfa) e a segunda região constante (C2) do TCR compreende uma cadeia beta de TCR modificada (CBeta). Em certas formas de realização, C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada. Em certas formas de realização, C1 compreende uma cadeia Pré-alfa de TCR modificada (CPré-Alfa), e C2 compreende uma CBeta modificada. Em certas formas de realização, C1 compreende uma CBeta modificada, e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada. Em certas formas de realização, C1 compreende uma cadeia gama de TCR modificada (CGama) e C2 compreende uma cadeia delta de TCR modificada (CDelta). Em certas formas de realização, C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada.
[0237] Em certas formas de realização, a região constante de TCR modificada compreende um ou mais resíduos de cisteína mutados. Em certas formas de realização, o um ou mais resíduos mutados estão compreendidos dentro de uma interface de contato da primeira e/ou segunda regiões constantes de TCR modificadas.
[0238] O termo “interface de contato”, conforme utilizado neste documento, refere-se à(s) região(ões) específica(s) nos polipeptídeos onde os polipeptídeos interagem/se associam. Uma interface de contato compreende um ou mais resíduos de um aminoácido que são capazes de interagir com o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) correspondentes que entram em contato ou em associação quando a interação ocorre.
Os resíduos de aminoácidos em uma interface de contato podem estar ou não em uma sequência consecutiva. Por exemplo, quando a interface é tridimensional, os resíduos de aminoácidos dentro da interface podem ser separados em diferentes posições na sequência linear.
[0239] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86, e 122-127. Em certas formas de realização, a CAlfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 6-29, 37-67 e 86-95. A menos que especificado, a numeração doa resíduos de aminoácidos na região constante do TCR na presente divulgação é tal como definida adiante nas Figuras 19A-19E.
[0240] Em certas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto podem ser formadas entre a CAlfa modificada e a CBeta modificada. O resíduo de cisteína mutado em CBeta pode ser uma substituição selecionada grupo que consiste em: S56C, S16C, F13C, V12C, E14C, F13C, L62C, D58C, S76C, e R78C, e/ou os resíduos de cisteína mutados em CAlfa podem ser uma substituição selecionada do grupo que consiste em: T49C, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, T46C, L51C e S62C.
Em certas formas de realização, o par de resíduos de cisteína mutados pode ser um par de substituições selecionadas do grupo que consiste em: S16C em CBeta e Y11C em CAlfa, F13C em CBeta e L13C em CAlfa, S16C em CBeta e L13C em CAlfa, V12C em CBeta e S16C em CAlfa, E14C em CBeta e S16C em CAlfa, F13C em CBeta e V23C em CAlfa, L62C em CBeta e Y44C em CAlfa, D58C em CBeta e T46C em CAlfa, S76C em CBeta e T46C em CAlfa, S56C em CBeta e T49C em CAlfa, S56C em CBeta e L51C em CAlfa, S56C em CBeta e S62C em CAlfa, e R78C em CBeta e S62C em CAlfa e em que o par de resíduos de cisteína é capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
[0241] Conforme utilizado ao longo do pedido, “XnY” no que diz respeito a uma região constante do TCR significa que o nº resíduo de aminoácido X na região constante do TCR (com base na numeração nas Figuras 19A-19E, conforme apresentada aqui) é substituído pelo resíduo de aminoácido Y, em que X e Y são respectivamente a abreviação de uma letra de um resíduo de aminoácido específico.
Observa-se que o número n é baseado unicamente na numeração fornecida nas Figuras 19A-19E, e pode ter um aspecto diferente da sua posição real. Para ilustrar, a sequência de CBeta (S56C)(N69Q) mostrada na SEQ ID NO: 34 é usada como exemplo. Enquanto a substituição de S para C ocorre no 48° resíduo em SEQ ID NO: 34, o mesmo resíduo é designado como o 56° resíduo com base no sistema de numeração apresentado nas Figuras 19A-19E, e, por conseguinte, essa substituição de S para C é designada como S56C, mas não S48C. Da mesma forma, a substituição de N para Q é também designada como N69Q com base no sistema de numeração apresentado nas Figuras 19A-19E. Esta regra de designação de substituição de resíduos de aminoácidos se aplica a toda a região constante do TCR na presente divulgação, salvo especificação em contrário. Da mesma forma, “XnY”, quando utilizado com relação a uma região Fc, significa que o n° resíduo de aminoácido X na região constante de Fc (com base na numeração nas Figuras 20A-20D, conforme apresentada aqui) é substituído pelo resíduo de aminoácido Y.
[0242] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende ou é qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-41, e a CAlfa modificada compreende ou é qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-48.
[0243] Em certas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto não nativas podem ser formadas dentro das interfaces de contato entre CPré-Alfa e CBeta.
Em certas formas de realização, a interface de contato em CPré-Alfa é selecionada das substituições na posição de resíduos de aminoácidos 7-19, 26-34, 56-75 e 103-
106. Em certas formas de realização, a interface de contato em CBeta é selecionada das substituições na posição de resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86 e 122-
127.
[0244] Em certas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto podem ser formadas entre a região constante Pré-Alfa de TCR modificada (CPré-Alfa) e a região constante da cadeia beta (CBeta). Os resíduos de cisteína mutados em CBeta podem ser uma substituição selecionada do grupo que consiste em: S16C, A18C, E19C, F13C, A11C, S56C e S76C e/ou os resíduos de cisteína mutados em CPré-Alfa podem ser uma substituição selecionada do grupo que consiste em: S11C, A13C, I16C, S62C, T65C e Y59. Em certas formas de realização, o par de resíduos de cisteína mutados pode ser um par de substituições selecionadas do grupo que consiste em: S16C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, A18C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, E19C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, F13C em CBeta e A13C em CPré- Alfa, S16C em CBeta e A13C em CPré-Alfa, A11C em CBeta e I16C em CPré-Alfa, S56C em CBeta e S62C em CPré-Alfa, S56C em CBeta e T65C em CPré-Alfa, e S76C em CBeta, e Y59C em CPré-Alfa, e em que o par de resíduos de cisteína mutados são capazes de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
[0245] Em certas formas de realização, a CBeta modificada compreende ou é qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-41, e a CPré-Alfa modificada compreende ou é qualquer uma das SEQ ID NOs: 82 e 83.
[0246] Em certas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto não nativas podem ser formadas dentro das interfaces de contato entre CGama e CDelta.
Em certas formas de realização, a interface de contato em CGama é selecionada das substituições na posição de resíduos de aminoácidos 11-35 e 55-76. Em certas formas de realização, a interface de contato em CDelta é selecionada das substituições na posição de resíduos de aminoácidos 8-26, 43-64 e 84-88.
[0247] Em certas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto podem ser formadas entre a CGama e a CDelta modificada. O resíduo de cisteína mutado em CGama pode ser uma substituição selecionada do grupo que consiste em: S17C, E20C, F14C, T12C, M62C, Q57C, e A19C, e/ou os resíduos de cisteína mutados em CDelta pode ser uma substituição selecionada do grupo que consiste em: F12C, M14C, N16C, D46C, V50C, F87C e E88C. Em certas formas de realização, o par de resíduos de cisteína mutados pode ser um par de substituições selecionadas do grupo que consiste em: S17C em CGama e F12C em CDelta, E20C em CGama e F12C em CDelta, F14C em CGama e M14C em CDelta, T12C em CGama e N16C em CDelta, M62C em CGama e D46C em CDelta, Q57C em CGama e V50C em CDelta, A19C em CGama e F87C em CDelta, e A19C em CGama e E88C em CDelta, e em que o par de resíduos de cisteína introduzido é capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeia.
[0248] Em certas formas de realização, a CGama modificada compreende ou é qualquer um das SEQ ID NOs: 113 e 114, e a CDelta modificada compreende ou é qualquer um das SEQ ID NOs: 115 e 116.
[0249] Além do resíduo de aminoácido não nativo, a região constante de TCR modificada, em certas formas de realização, pode compreender ainda uma modificação adicional de um ou mais resíduos nativos na sequência da região constante de TCR do tipo selvagem. Exemplos de tais modificações adicionais incluem, como modificação de um resíduo de cisteína nativo, a modificação de um sítio de glicosilação nativo e/ou modificação de uma alça nativo.
[0250] Certas regiões constantes de TCR nativo (como CBeta) compreendem um resíduo de cisteína nativo que, em algumas formas de realização da presente divulgação, pode ser modificado (por exemplo, removido) ou, como alternativa, pode ser mantido em algumas outras formas de realização. Em certas formas de realização, uma ligação dissulfeto nativa no TCR heterodimérico alfa/beta entre o domínio constante TRAC e TRBC1 ou TRBC2, ou seja, entre Cys4 do éxon 2 de TRAC e Cys2 do éxon 2 de TRBC1 ou TRBC2, de acordo com a nomenclatura IMGT de TCR, pode estar presente ou ausente.
[0251] Em certas formas de realização, pelo menos um resíduo de cisteína nativo está ausente ou presente na CBeta modificada. Por exemplo, o resíduo de cisteína nativo na posição C74 de CBeta pode estar presente ou ausente na CBeta modificada. Em certas formas de realização, a CBeta modificada, na qual o resíduo de cisteína nativo C74 está ausente, compreende ou é qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-41.
[0252] Sem estar ligado a qualquer teoria, acredita-se que o complexo polipeptídico proporcionado aqui é vantajoso, pois tolera a presença e a ausência do resíduo de cisteína nativo em CBeta. Apesar de ter sido sugerido (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7,666,604) que a presença de resíduos de cisteína nativos em heterodímeros de TCR solúveis é prejudicial para a capacidade do TCR de ligação ao ligante, o complexo polipeptídico proporcionado aqui pode tolerar a presença desse resíduo de cisteína nativo sem afetar negativamente sua atividade de ligação ao antígeno. Além disso, o complexo polipeptídico proporcionado aqui, na ausência do resíduo de cisteína nativo, expressou em altos níveis, apesar dos ensinamentos contrários de Wu et al. mAb, 7 (2), pp.364-376 (2005) de que a ligação dissulfeto nativa no heterodímero de TCR é bom para estabilizar o heterodímero de TCR.
[0253] Em certas formas de realização, um ou mais sítios de glicosilação nativos presentes nas regiões constantes do TCR nativo podem ser modificados (por exemplo, removidos) ou mantidos no complexo polipeptídico apresentado na presente divulgação. O termo “sítio de glicosilação”, conforme utilizado neste documento, com relação a uma sequência polipeptídica, refere-se a um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral à qual uma porção de carboidrato (por exemplo, uma estrutura de oligossacarídeo) pode ser ligada. A glicosilação de polipeptídeos como anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. A ligada a N refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina, por exemplo, um resíduo de asparagina em uma sequência de tripeptídeo, como asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente a serina ou treonina. A remoção dos sítios de glicosilação nativos pode ser convenientemente realizada alterando-se a sequência de aminoácidos de modo que uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para os sítios de glicosilação ligada a N) ou um ou mais resíduos de serina ou treonina (para os sítios de glicosilação ligadas a O) sejam substituídas.
[0254] Em certas formas de realização, no complexo polipeptídico proporcionado aqui, pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente ou presente nas regiões constantes do TCR modificadas, por exemplo, na primeira e/ou na segunda regiões constantes do TCR. Sem estar ligado a qualquer teoria, acredita- se que o complexo polipeptídico proporcionado aqui possa tolerar a remoção de todo ou parte dos sítios de glicosilação sem afetar a expressão e a estabilidade da proteína, ao contrário dos ensinamentos existentes que mostram que a presença de sítios de glicosilação ligada a N na região constante do TCR, como CAlfa (por exemplo, N34, N68 e N79) e CBeta (por exemplo, N69), é necessária para a expressão e estabilidade da proteína (vide Wu et al., Mabs, 7: 2, 364-376, 2015).
[0255] Em certas formas de realização, no complexo polipeptídico proporcionado aqui, pelo menos um dos sítios de N-glicosilação nas CAlfa modificadas, por exemplo, N34, N68, N79 e N61, estão ausentes ou presentes. Em certas formas de realização, as sequências de CAlfa modificadas ausentes de um sítio de glicosilação compreendem ou são qualquer uma das SEQ ID NOs: 44-48. Em certas formas de realização, pelo menos um dos sítios de N-glicosilação na CBeta modificada, por exemplo, N69, está ausente ou presente. As sequências CBeta modificadas (TRBC1) ausentes do sítio de glicosilação compreendem ou são qualquer uma das SEQ ID NOs: 34-36. As sequências de CBeta modificadas (TRBC2) ausentes de um sítio de glicosilação compreendem ou são qualquer uma das SEQ ID NOs: 38-
40.
[0256] Em certas formas de realização, no complexo polipeptídico proporcionado aqui, pelo menos um dos sítios de N-glicosilação na CPré-Alfa modificada, por exemplo, N50, está ausente ou presente. A sequência de CPré-Alfa modificada ausente de um sítio de glicosilação compreende ou é a SEQ ID NO: 83.
[0257] Em certas formas de realização, no complexo polipeptídico proporcionado aqui, pelo menos um dos sítios de N-glicosilação na CGama modificada, por exemplo, N65, está ausente ou presente. Em certas formas de realização, a sequência de CGama modificada ausente de um sítio de glicosilação compreende ou é a SEQ ID NO: 114. Em certas formas de realização, pelo menos um dos sítios de N-glicosilação na CDelta modificada, por exemplo, N16 e N79, está ausente ou presente. A sequência CDelta modificada ausente do sítio de glicosilação compreende ou é a SEQ ID NO: 116.
[0258] Em certas formas de realização, uma ou mais estruturas secundárias nativas presentes nas regiões constantes do TCR nativo podem ser modificadas (por exemplo, removidas) ou mantidas no complexo polipeptídico apresentado na presente divulgação. Em certas formas de realização, uma alça nativa (como a alça FG e/ou a alça DE da CBeta nativa) é modificada (por exemplo, removida) ou mantida no complexo polipeptídico proporcionado aqui. O termo “alça FG” e “alça DE” são estruturas encontradas principalmente no domínio constante da cadeia beta do TCR.
A alça FG engloba os resíduos de aminoácidos 101-117 da CBeta nativa e é um elemento estrutural exposto a solvente incomumente alongado que forma um componente de uma cavidade de TCR alfa/beta contra CD3. A alça DE abrange os resíduos de aminoácidos 66-71 da CBeta nativa. Um alinhamento da sequência da região constante da cadeia beta do TCR com a região constante da imunoglobulina CH1 revelou que a alça FG da região constante da cadeia beta do TCR é significativamente mais longa. A Figura 3 ilustra as diferenças das regiões constantes entre a cadeia beta de células T e a cadeia pesada de anticorpos. Em certas formas de realização, a sequência na alça FG (YGLSENDEWTQDRAKPVT, SEQ ID NO: 79) está ausente e/ou é substituída por YPSN (SEQ ID NO: 80). Em certas formas de realização, a sequência na alça DE nativo (QPALNDSR, SEQ ID NO: 88) está ausente e/ou é substituída por QSGR (SEQ ID NO: 87). Em certas formas de realização, as sequências CBeta ausentes da alça FG nativa compreendem ou são qualquer uma das SEQ ID NOs: 37-40. Em certas formas de realização, a sequência de CBeta ausente da alça FG nativa e alça DE nativa compreende ou é a SEQ ID NO: 41.
[0259] No complexo polipeptídico proporcionado aqui, as regiões constantes derivadas de um TCR estão operacionalmente ligadas às regiões variáveis derivadas de um anticorpo. A região variável da cadeia pesada ou da cadeia leve de um anticorpo pode ser operacionalmente ligada a uma região constante do TCR, com ou sem um espaçador.
[0260] Em certas formas de realização, o primeiro domínio variável de anticorpo (VH) é fundido com a primeira região constante (C1) do TCR em um primeiro domínio de junção, o primeiro domínio variável de anticorpo (VL) é fundido com a segunda região constante (C2) do TCR em um segundo domínio de junção.
[0261] “Domínio de junção”, conforme utilizado neste documento, refere-se a uma região de fronteira ou limite em que duas sequências de aminoácidos são fundidas ou combinadas. Em certas formas de realização, o domínio de junção compreende pelo menos uma porção do fragmento C-terminal de um primeiro parceiro de fusão fundida a pelo menos uma porção do fragmento N-terminal de um segundo parceiro de fusão, com ou sem um espaçador entre eles. Em tais formas de realização, o domínio de junção compreende fragmentos de ambos os parceiros de fusão e o ponto de fusão reside no ponto em que os dois fragmentos se ligam entre si, por exemplo, diretamente ou através de um espaçador. Em certas outras formas de realização, o domínio de junção consiste em um fragmento de um parceiro de fusão.
Em tais formas de realização, o ponto de fusão pode estar em qualquer extremidade do domínio de junção.
[0262] Em certas formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende pelo menos uma porção do fragmento C-terminal de uma junção V/C do anticorpo, e pelo menos uma porção do fragmento N-terminal de uma junção V/C do TCR.
[0263] O termo “junção V/C do anticorpo", conforme utilizado neste documento, refere-se ao limite do domínio variável e do domínio constante do anticorpo, por exemplo, o limite entre o domínio variável da cadeia pesada e o domínio CH1, ou entre o domínio variável da cadeia leve e o domínio constante da cadeia leve.
Da mesma forma, o termo “junção V/C do TCR” refere-se ao limite do domínio variável e do domínio constante do TCR, por exemplo, o limite entre o domínio variável e o domínio constante do TCR Alfa, ou entre o domínio variável e o domínio constante do TCR Beta.
[0264] Se a região Fv de uma imunoglobulina estiver alinhada com um domínio de TCR do tipo imunoglobulina, a junção V/C do anticorpo e a junção V/C do TCR também estarão alinhadas. Um exemplo é apresentado na Tabela 1 abaixo, onde a junção V/C da cadeia pesada do anticorpo (SEQ ID NO: 270) está alinhada à junção V/C do TCR Beta (SEQ ID NO: 271) e a junção V/C da cadeia leve do anticorpo (SEQ ID NO: 272) está alinhada à junção V/C do TCR Beta (SEQ ID NO: 273).
[0265] O primeiro e/ou segundo domínios de junção do complexo polipeptídico, como proporcionados aqui, podem ser selecionados de tal modo que ele compreenda um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do fragmento C-terminal da junção V/C do anticorpo e um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do fragmento N-terminal da junção V/C do TCR. Por exemplo, como mostrado na Tabela 1, o domínio de junção pode ser selecionado de forma a possuir toda a sequência da junção V/C do TCR (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 145) ou a maior parte da sequência (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 147) ou alguma sequência (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 146) da junção V/C do TCR. Ainda usando a Tabela 1 como exemplo, o domínio de junção pode compreender mais resíduos da junção V/C do TCR do que da junção V/C do anticorpo (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 147) ou vice- versa (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 146)
[0266] Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de junção do complexo polipeptídico, conforme proporcionado aqui, têm um comprimento total comparável ao da junção V/C do anticorpo ou à junção V/C do TCR.
[0267] Um domínio de junção apropriado pode ser determinado em uma base estrutural. Por exemplo, as estruturas tridimensionais do anticorpo e do TCR podem ser sobrepostas, e sobreposições da junção V/C do anticorpo e da junção V/C do TCR na estrutura sobreposta podem ser determinadas e consideradas quando se determina o comprimento ou a proporção de sequências a partir da junção V/C do anticorpo ou do TCR.
[0268] Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de junção compreendem um espaçador entre os fragmentos da junção V/C do anticorpo e V/C do TCR. Podem ser utilizadas quaisquer sequências adequadas ou comprimento de sequências espaçadoras, desde que não afete negativamente a ligação ao antígeno ou a estabilidade do complexo polipeptídico.
[0269] Exemplos de sequências de limite de domínio variável/constante de anticorpo e limite de domínio variável/constante de TCR e limite de região variável de anticorpo/constante de TCR são fornecidos nas Tabelas 1-6 abaixo.
[0270] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada. Para ilustrar, a Tabela 1 ilustra exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para o VH de anticorpo fundido a CBeta de TCR, ou para o VL de anticorpo fundido a CAlfa de TCR. O limite do domínio constante/VH de anticorpo está alinhado ao limite de CBeta/variável de TCR, e o limite de domínio constante/VL de anticorpo está alinhado ao limite de CAlfa/variável de TCR. Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 144, 145, 146, ou 147), em que o primeiro ou o segundo domínio de junção está representado na forma sublinhada. Em tais formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50. Em tais formas de realização, o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 51 ou 52.
TABELA 1. Desenhos do primeiro e segundo domínios de junção para VH- CBeta/VL-CAlfa Junção Junção (cadeia pesada) (cadeia leve) Variável Constante Variável Constante Antibody_VH ……LVTVSS AS--TKGPS…… Antibody_VL ……KVEIK RTVAAPSVF…… SEQ ID NO:270 SEQ ID NO:272
TCR_beta ……RLTVLE DLKNVFPPE…… TCR_alpha ……KLIIK PDIQNPDPA…… SEQ ID NO:271 SEQ ID NO:273 H_Conjunction_1 ……LVTVSS ASKNVFPPE…… L_Conjunction_1 ……KVEIK RTVAAPDPA…… SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO:146 H_Conjunction_2 ……LVTVLE DLKNVFPPE…… L_Conjunction_2 ……KVEIK PDIQNPDPA…… SEQ ID NO: 145 SEQ ID NO: 147
[0271] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada. A Tabela 2 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para o VH de anticorpo fundido a CAlfa de TCR, ou para o VL de anticorpo fundido a CBeta de TCR. O limite do domínio constante/VH de anticorpo está alinhado ao limite de CAlfa /variável de TCR e o limite de domínio constante /VL de anticorpo está alinhado ao limite de CBeta/variável de TCR.
Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 148, 149 ou 150), em que o primeiro ou o segundo domínio de junção está representado na forma sublinhada. Em tais formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 129 ou 130. Em tais formas de realização, o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50.
TABELA 2. Desenhos do primeiro e segundo domínios de junção para VH- CAlfa/VL-CBeta Junção Junção (cadeia pesada) (cadeia leve) Variável Constante Variável Constante Antibody_H ……LVTVSS --ASTKGPS…… Antibody_L ……KVEIK-- RT---VAAPSVF…… SEQ ID NO:274 SEQ ID NO:276 TCR_alpha ……KLIIK-- PDIQNPDPA…… TCR_beta ……RLTVLE -DLKNVFPPE…… SEQ ID NO:275 SEQ ID NO:277 H_Conjunction_3 L_Conjunction_3 ……KVEIKLE ……LVTVSS ASIQNPDPA…… -DLKNVFPPE…… SEQ ID NO:148 SEQ ID NO:150 H_Conjunction_4 L_Conjunction_4 ……KVEIKLE ……LVTVSS PDIQNPDPA…… -DLKNVFPPE…… SEQ ID NO:149 SEQ ID NO:150
[0272] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada. A Tabela 3 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para o VH de anticorpo fundido a CBeta de TCR, ou para o VL de anticorpo fundido a CPré-Alfa de TCR. O limite do domínio constante/VH de anticorpo está alinhado ao limite de CBeta/variável de TCR, e o limite do domínio constante/VL de anticorpo está alinhado ao limite de
CPré-Alfa/variável de TCR. Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 170, 171, 169 ou 156), em que o primeiro ou o segundo domínio de junção está representado na forma sublinhada. Em tais formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50. Em tais formas de realização, o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 81 ou 131.
TABELA 3. Desenhos do primeiro e segundo domínios de junção para VH- CBeta/VL-CPré-Alfa Junção Junção (cadeia pesada) (cadeia leve) Variável Constante Variável Constante Antibody_H ……LVTVSS AS--TKGPS…… Antibody_L ……KVEIK RTVAAPSVF…… SEQ ID NO:283 SEQ ID NO:285 TCR_beta ……RLTVLE DLKNVFPPE…… TCR_alfa ……KLIIK PDIQNPDPA…… SEQ ID NO:284 SEQ ID NO:286 Pre-TCR_alfa ……GCPAL PTGVGGTPF…… SEQ ID NO:287 H_Conjunction_A ……LVTVSS ASKNVFPPE…… L_Conjunction_A ……KVEIK RTVAAGTPF…… SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 169 H_Conjunction_B ……LVTVLE DLKNVFPPE…… L_Conjunction_B ……KVEIK PTGVGGTPF…… SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 156
[0273] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada. A Tabela 4 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para o VH de anticorpo fundido a CPré- Alfa de TCR, ou para o VL de anticorpo fundido a CBeta de TCR. O limite do domínio constante/VH de anticorpo está alinhado ao limite de CPré-Alfa/variável de TCR e o limite do domínio constante/VL de anticorpo está alinhado ao limite de CBeta/variável de TCR. Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 172, 173, 174 ou 175), em que o primeiro ou o segundo domínio de junção está representado na forma sublinhada. Em tais formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 81, 131, 132 ou 133. Em tais formas de realização, o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50.
TABELA 4. Desenhos do primeiro e segundo domínios de junção para VH- CPré-Alfa/VL-CBeta Junção Junção (cadeia pesada) (cadeia leve)
Variável Constante Variável Constante Antibody_H ……LVTVSS --ASTKGPS…… Antibody_L ……KVEIK-- RTVAAPSVF…… SEQ ID NO:288 SEQ ID NO:291 TCR-alpha ……KLIIK-- PDIQNPDPA…… TCR_beta ……RLTVLE -DLKNVFPPE…… SEQ ID NO:289 SEQ ID NO:292 Pre-TCR_alpha ……GCPAL-- PTGVGGTPF…… SEQ ID NO:290 H_Conjunction_C ……LVTVSS ASGVGGTPF…… L_Conjunction_C ……KVEIKLE -DLKNVFPPE…… SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 174 H_Conjunction_D ……LVTVSS PTGVGGTPF…… L_Conjunction_D ……KVEIKLE -DLKNVFPPE…… SEQ ID NO: 173 SEQ ID NO: 175
[0274] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada. A Tabela 5 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para o VH de anticorpo fundido a CGama de TCR, ou para o VL de anticorpo fundido a CDelta de TCR. O limite do domínio constante/VH de anticorpo está alinhado com a limite de CGama/variável de TCR e o limite do domínio constante/VL de anticorpo está alinhado com o limite de CDelta/variável de TCR. Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 157, 158, 159 ou 160), em que o primeiro ou o segundo domínio de junção está representado na forma sublinhada. Em tais formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 117 ou 118. Em tais formas de realização, o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 119 ou 120.
TABELA 5. Desenhos do primeiro e segundo domínios de junção para para VH-CGama/VL-CDelta Junção Junção (cadeia pesada) (cadeia leve) Variável Constante Variável Constante Antibody_H ……LVTVSS AS--TK-GPS…… Antibody_L ……KVEIK ---RTVAAPSVF…… SEQ ID NO:293 SEQ ID NO:143 TCR_gamma ……TLVVTD KQLDADVSPK…… TCR_delta ……RVTVE PRSQPHTKPSVF…… SEQ ID NO:142 SEQ ID NO:55 H_Conjunction_4 ……LVTVSS ASLDADVSPK…… L_Conjunction_4 ……KVEIK PRSQPHTKPSVF…… SEQ ID NO:157 SEQ ID NO: 159 H_ Conjunction _5 ……LVTVTD KQLDADVSPK…… L_ Conjunction _5 ……KVEIE PRSQPHTKPSVF…… SEQ ID NO:158 SEQ ID NO:160
[0275] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada. A Tabela 6 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para o VH de anticorpo fundido a CDelta de TCR, ou para o VL de anticorpo fundido a CGama de TCR. O limite do domínio constante/VH de anticorpo está alinhado ao limite de CDelta/variável de TCR e o limite do domínio constante/VL de anticorpo está alinhado ao limite de CGama/variável de TCR. Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 161, 162, 163 ou 164), em que o primeiro ou o segundo domínio de junção está representado na forma sublinhada. Em tais formas de realização, o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 123 ou 124. Em tais formas de realização, o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 125 ou 126.
TABELA 6. Desenhos do primeiro e segundo domínios de junção para para VH-CDelta/VL-CGama Junção Junção (cadeia pesada) (cadeia leve) Variável Constante Variável Constante Antibody_H ……LVTVSS --ASTKGPS…… Antibody_L ……KVEIK- RTV---AAPSVF…… SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:58 TCR_delta ……RVTVEP RSQPHTKPS…… TCR_gamma ……TLVVTD KQLDADVSPKPT…… SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:59 H_Conjunction_6 ……LVTVSS RSQPHTKPS…… L_Conjunction_6 ……KVEIKD KQLDADVSPKPT…… SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:163 H_Conjunction_7 ……LVTVEP RSQPHTKPS…… L_Conjunction_7 ……KVEITD KQLDADVSPKPT…… SEQ ID NO:162 SEQ ID NO:164
[0276] Em certas formas de realização, o primeiro polipeptídeo compreende uma sequência compreendendo domínios operacionalmente ligados como na fórmula (I): VH-HCJ-C1, e o segundo polipeptídeo compreende uma sequência compreendendo domínios operacionalmente ligados como na fórmula (II): VL-LCJ-C2, em que: VH é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo; HCJ é um primeiro domínio de junção como definido acima; C1 é um primeiro domínio constante de TCR como definido acima; VL é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo; LCJ é um segundo domínio de junção como definido acima; C2 é um segundo domínio constante de TCR como definido acima.
[0277] Em certas formas de realização, C1 é uma CAlfa modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID
NOs: 42-48, e C2 é uma CBeta modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 32-41, o HCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 49 e 50; LCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 51 e 52.
[0278] Em certas formas de realização, C1 é uma CBeta modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 32-41 e C2 é uma CAlfa modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 42-48, o HCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 129 e 130; LCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 49 e 50.
[0279] Em certas formas de realização, C1 é uma CBeta modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 32-41, 84, 319, 320, 321, 322, 323 e 324 e C2 é uma CPré-Alfa modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 e 318, o HCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 49 e 50; LCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 81 e
131.
[0280] Em certas formas de realização, C1 é uma CPré-Alfa modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 e 318 e C2 é uma CBeta modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 32-41, o HCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 81, 131, 132 e 133; LCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 49 e 50.
[0281] Em certas formas de realização, C1 é uma CGama modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 e 340, e C2 é uma Cdelta modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 e 332, o HCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 117 e 118; LCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 119 e 120.
[0282] Em certas formas de realização, C1 é uma CDelta modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 e 332, e C2 é uma CGama modificada que compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 e 340, o HCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 123 e 124; LCJ compreende ou é uma sequência selecionada de um grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 125 e 126.
[0283] A patente U.S. 9,683,052 divulga que certos resíduos na interface de contato entre as regiões constantes do TCR podem ser modificados em uma região Fc para facilitar o pareamento heterodimérico de duas cadeias pesadas. Tais resíduos e/ou resíduos correspondentes dentro da interface de contato entre as regiões constantes do TCR divulgadas aqui podem ser incorporados também em uma região Fab, por exemplo, os domínios CH1 e CL, para facilitar o pareamento entre uma cadeia leve e uma cadeia pesada.
[0284] ii. Região variável do anticorpo
[0285] O complexo polipeptídico proporcionado aqui compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) e um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo. Em um anticorpo nativo convencional, uma região variável compreende três regiões CDR interpostas por regiões estruturais (FR) flanqueadoras, por exemplo, conforme estabelecido na seguinte fórmula: FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4, da extremidade N-terminal à C-terminal. O complexo polipeptídico proporcionado aqui pode compreender, mas não está limitado a uma região variável de anticorpo convencional. Por exemplo, o domínio variável pode compreender todas as três ou menos que três das CDRs, com todas as quatro ou menos que quatro das FRs da cadeia pesada ou leve do anticorpo, desde que o domínio variável seja capaz de se ligar especificamente a um antígeno.
[0286] O primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica.
Em outras palavras, VH e VL formam um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a um antígeno ou a um epítopo. A especificidade antigênica pode ser dirigida a qualquer antígeno ou epítopo adequado, por exemplo, um que seja antígeno exógeno, antígeno endógeno, autoantígeno, neoantígeno, antígeno viral ou antígeno tumoral. Um antígeno exógeno entra no corpo por inalação, ingestão ou injeção e pode ser apresentado pelas células apresentadoras de antígeno (APCs) por endocitose ou fagocitose e formar o complexo MHC II. Um antígeno endógeno é gerado no interior das células normais como um resultado do metabolismo celular, infecção viral ou bacteriana intracelular, que pode formar complexo MHC I. Um autoantígeno (por exemplo, peptídeos, DNA ou RNA, etc.) é reconhecido pelo sistema imune de um paciente que sofre de doenças autoimunes, ao passo que, sob condições normais, este antígeno não deve ser o alvo do sistema imune. O neoantígeno está completamente ausente de um corpo normal e é gerado devido a uma determinada doença, tais como tumores ou câncer. Em certas formas de realização, o antígeno está associado a uma determinada doença (por exemplo, tumor ou câncer, doenças autoimunes, doenças infecciosas e parasitárias, doenças cardiovasculares, neuropatias, condições neuropsiquiátricas, lesões, inflamações, distúrbio de coagulação). Em certas formas de realização, o antígeno está associado ao sistema imune (por exemplo, células imunológicas como células B, células T, células NK, macrófagos, etc.).
[0287] Em certas formas de realização, a primeira especificidade antigênica é dirigida a um antígeno relacionado ao sistema imune ou a um epítopo do mesmo.
Exemplos de um antígeno relacionado ao sistema imune incluem uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK).
[0288] A molécula receptora específica de célula T permite que uma célula T se ligue e, se houver sinais adicionais, seja ativada e responda a um epítopo/antígeno apresentado por outra célula chamada de célula apresentadora de antígeno ou APC.
A molécula receptora específica de célula T pode ser o TCR, CD3, CD28, CD134 (também denominado OX 0), 4-1BB, CD5 e CD95 (também conhecido como receptor Fas).
[0289] Exemplos de uma molécula de receptor específico de células NK incluem o CD16, um receptor de Fc de afinidade baixa e NKG2D e CD2.
[0290] Em certas formas de realização, a primeira especificidade antigênica é dirigida a um antígeno associado a um tumor ou a um epítopo do mesmo. O termo “antígeno associado ao tumor” refere-se a um antígeno que é ou pode ser apresentado na superfície celular de um tumor e que está localizado nas ou dentro das células tumorais. Em algumas formas de realização, os antígenos associados a tumor podem ser apresentados apenas por células tumorais e não por células normais, isto é, não tumorais. Em algumas outras formas de realização, os antígenos associados a tumor podem ser expressos exclusivamente em células tumorais ou podem apresentar uma mutação tumoral específica em comparação com as células não tumorais. Em algumas outras formas de realização, os antígenos associados ao tumor podem ser encontrados tanto em células tumorais quanto em células não tumorais, mas são superexpressos em células tumorais quando comparados com as células não tumorais ou são acessíveis para ligação de anticorpos em células tumorais devido à estrutura menos compacta do tecido tumoral em comparação com o tecido não tumoral. Em algumas formas de realização, o antígeno associado ao tumor está localizado na vasculatura de um tumor.
[0291] Os exemplos ilustrativos de um antígeno de superfície associado a tumor são CD10, CD19, CD20, CD22, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, tirosina quinase 3 tipo Fms (FLT-3, CD135), proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4, proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, IL3R, proteína Ativadora de fibroblastos (FAP), CDCP1, Derlin1, Tenascin, frizzled 1-10, os antígenos vasculares VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-alfa (CD140a), PDGFR-beta (CD140b) Endoglina, CLEC14, Tem1-8 e Tie2.
Outros exemplos podem incluir A33, CAMPATH-1 (CDw52), antígeno carcinoembrionário (CEA), Carboanidrase IX (MN/CA IX), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, proteína de ligação ao folato, G250, tirosina quinase 3 tipo Fms (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, receptor de IL-2, IL3R, MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina de superfície celular associado ao melanoma), Muc-1, antígeno de membrana específico para a próstata (PSMA), antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno específico da próstata (PSA) e TAG-72.
[0292] Em certas formas de realização, a primeira especificidade antigênica é dirigida a um antígeno ou um epítopo do mesmo, selecionado do grupo que consiste em: CD3, 4.1BB (CD137), OX40 (CD134), CD16, CD47, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD123, CD133, CEA, CDH3, EpCAM, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), EGFRvIII (uma forma mutante do EGFR), HER2, HER3, dLL3, BCMA, Sialyl-Lea 5T4, ROR1, proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma, mesotelina, receptor de folato 1, receptor VEGF, EpCAM, HER2/neu,
HER3/neu, G250, CEA, MAGE, proteoglicanos, VEGF, FGFR, integrina alfaVbeta3, HLA, HLA-DR, ASC, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD21, CD23, CD24, CD28, CD30, CD37, CD40, CD41, CD44, CD52, CD64, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, gangliosídeo GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4 Trp2, gp100, tirosinase, Muc-1, telomerase, survivina, G250, p53, CA125 MUC, antígeno Wue, antígeno Lewis Y, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EpHA2 e os alvos de superfície celular GC182, GT468 ou GT512.
[0293] Os domínios variáveis de anticorpo podem ser derivados de um anticorpo parental. Um anticorpo parental pode ser qualquer tipo de anticorpo, incluindo, por exemplo, um anticorpo totalmente humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo animal (por exemplo, camundongo, rato, coelho, ovelha, vaca, cachorro, etc.). O anticorpo parental pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
[0294] Em certas formas de realização, o anticorpo parental é um anticorpo monoclonal. Um anticorpo monoclonal pode ser produzido por vários métodos conhecidos no estado da arte, por exemplo, tecnologia de hibridoma, método recombinante, phage display ou qualquer combinação dos mesmos.
[0295] A tecnologia de hibridoma envolve a fusão de células B que expressam anticorpos com uma linhagem de células B imortal para produzir hibridomas, os quais são rastreados quanto às características desejáveis, tais como alto nível de produção de anticorpos, bom crescimento das células de hibridoma e forte ligação ou boa atividade biológica do anticorpo (vide, por exemplo, Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed.).
[0296] O método recombinante é outra maneira de produzir um anticorpo parental. Resumidamente, as células, tais como linfócitos que secretam os anticorpos de interesse, são obtidas e identificadas e células individuais são isoladas, seguido de
PCR com transcriptase reversa para produzir cDNAs da região variável de cadeia pesada e leve. Estas sequências de cDNA das regiões variáveis podem ser utilizadas para construir a sequência codificante do complexo polipeptídico proporcionado aqui, e, em seguida, expressas em uma célula hospedeira adequada (para revisar, vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5,627,052; Publicação PCT WO 92/02551 e Babcock et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848).
[0297] As bibliotecas de anticorpos ainda são uma alternativa para a obtenção de um anticorpo parental. Resumidamente, pode-se rastrear uma biblioteca de anticorpos para identificar um anticorpo com a especificidade de ligação desejada. Os métodos para esse rastreamento de bibliotecas de anticorpos recombinantes são bem conhecidos no estado da arte, e incluem os métodos descritos, por exemplo, na U.S.
Pat. No. 5,223,409; Publicação PCT Nos. WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 97/29131; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod.
Hibridomas 3: 81-85; Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554; Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nucl. Acid Res. 19: 4133- 4137; e Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; e Publicação do Pedido de Patente US No. 20030186374.
[0298] Um outro método ilustrativo para se obter um anticorpo parental é o phage display ou exibição em fagos (vide, por exemplo, Brinkman et al., (1995) J.
Immunol. Methods 182: 41-50.; Ames et al., (1995) J. Immunol. Methods 184: 177- 186; Kettleborough et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al., (1997) Gene 187 9-18; e Patentes US Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225;
5,658,727; 5,733,743; e 5,969,108). As sequências polinucleotídicas que codificam os domínios de anticorpo são introduzidas nas partículas do fago para gerar uma biblioteca de partículas do fago que exibem uma variedade de domínios de anticorpo funcionais. Fd e M13 são fagos filamentosos comumente usados, e os domínios de anticorpos funcionais exibidos nas partículas de fago podem ser, por exemplo, domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizado por dissulfeto, que são fundidos de forma recombinante a uma proteína de fago codificada pelo gene III ou gene VIII. A biblioteca de fagos pode ser pesquisada utilizando-se um antígeno de interesse, por exemplo, que é opcionalmente marcado e ligado ou capturado em um substrato sólido (por exemplo, uma esfera). Para um fago selecionado, suas sequências polinucleotídicas que codificam os domínios variáveis de anticorpo são obtidas e utilizados na construção do complexo polipeptídico proporcionado aqui. Da mesma forma, uma biblioteca de levedura que exibe domínios variáveis de anticorpo fixando os domínios de anticorpo à parede celular de levedura (vide, por exemplo, Patente US No. 6,699,658) pode ser gerada, e depois rastreada com um antígeno ligado para obter um anticorpo parental útil para a construção do complexo polipeptídico proporcionado aqui.
[0299] Além disso, um anticorpo parental pode ser produzido também pela injeção de um antígeno de interesse em um animal não humano transgênico que compreende parte ou todo o locus da imunoglobulina humana, por exemplo, OmniRat, OmniMouse (vide, por exemplo, Osborn M. et al., Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-1490; Ma B. et al., Journal of Immunological Methods 400 - 401 (2013) 78-86; Geurts A. et al., Science, 2009, 325: 433; Patente US 8,907,157; Patente EP 2152880B1; Patente EP 2336329B1), camundongos HuMab (vide, para detalhes, Lonberg, N. et al., Nature 368 (6474): 856 859 (1994)), Xeno-Mouse (Mendez et al., Nat Genet., 1997, 15: 146-156), TransChromo Mouse (Ishida et al., Cloning Stem Cells, 2002, 4: 91-102) e VelocImmune Mouse (Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014,
111: 5153-5158), Kymouse (Lee et al., Nat. Biotechnol, 2014, 32: 356–363) e coelho transgênico (Flisikowska et al., PLoS One, 2011, 6: e21045).
[0300] Os anticorpos parentais descritos aqui podem ser modificados ainda mais, por exemplo, para enxertar as sequências de CDR em uma estrutura ou suporte diferente, para substituir um ou mais resíduos de aminoácidos em uma ou mais regiões estruturais, para substituir um ou mais resíduos em uma ou mais regiões CDR para maturação por afinidade e assim por diante. Estes podem ser realizados por um técnico no assunto com o uso de técnicas convencionais.
[0301] O anticorpo parental pode ser também um anticorpo terapêutico conhecido no estado da arte como, por exemplo, os aprovados pela FDA para a terapêutica ou diagnóstico, ou aqueles em ensaio clínico para o tratamento de uma condição, ou aqueles em investigação e desenvolvimento. As sequências polinucleotídicas e de proteínas para as regiões variáveis dos anticorpos conhecidos podem ser obtidas em bancos de dados públicos, como, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html.
[0302] Exemplos de anticorpos terapêuticos incluem, mas não estão limitados a rituximab (Rituxan, IDEC/Genentech/Roche) (vide, por exemplo, a Patente U.S. No.
5.736.137), um anticorpo anti-CD20 quimérico aprovado para tratar linfoma Não Hodgkin; HuMax-CD20, um anti-CD20 atualmente em desenvolvimento pela Genmab, um anticorpo anti-CD20 descrito na Pat. U.S. 5,500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) e PRO70769 (Pedido PCT No. PCT/US2003/040426), trastuzumab (Herceptin, Genentech) (vide, por exemplo, Pat. U.S. 5,667,171), um anticorpo anti-Her2/neu humanizado aprovado para tratar câncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg), atualmente em desenvolvimento pela Genentech; um anticorpo anti-Her2 descrito na Patente U.S. No.
4,753,894; cetuximab (Erbitux, Imclone) (Patente US No. 4,943,533; Publicação PCT
No. WO 96/40210), um anticorpo anti-EGFR quimérico em ensaios clínicos para uma variedade de cânceres; ABX-EGF (Patente US No. 6,235,883), atualmente em desenvolvimento pela Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax-EGFr (Pat. US 7,247,301), atualmente em desenvolvimento pela Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 e EMD72000 (Merck KGaA) (Patente US 5,558,864; Murthy et al., (1987) Arch. Biochem.
Biophys. 252 (2): 549-60; Rodeck et al., (1987) J. Cell. Biochem. 35 (4): 315-20; Kettleborough et al., (1991) Protein Eng. 4 (7): 773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (Publicação PCT No. WO 95/20045; Modjtahedi et al., (1993) J. Cell Biophys. 22 (1-3): 129-46; Modjtahedi et al., (1993) Br J. Cancer 67 (2): 247-53; Modjtahedi et al., (1996) Br. J. Cancer 73 (2): 228-35; Modjtahedi et al., (2003) Int. J.
Cancer 105 (2): 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá e Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Patente U.S. No. 5,891,996; Patente U.S. No.
6,506,883; Mateo et al., (1997) Immunotechnol. 3 (1): 71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al., (2003) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 100 (2): 639-44); KSB-102 (KSBiomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (publicação PCT No. WO 0162931); e SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (Campath, Millenium), um mAb humanizado atualmente aprovado para tratamento de leucemia linfocítica crônica de células B; muromonab- CD3 (Orthoclone OKT3), um anticorpo anti-CD3 desenvolvido por OrthoBiotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin), um anticorpo anti- CD20 desenvolvido pela IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg), um anticorpo anti-CD33 (proteína p67) desenvolvido por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive), uma fusão anti-LFA-3 Fc desenvolvida por Biogen), abciximab (ReoPro), desenvolvido por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect), desenvolvido pela Novartis, palivizumab (Synagis), desenvolvido pela Medimmune, infliximab (Remicade), um anticorpo anti-TNF alfa desenvolvido pelo Centocor, adalimumab (Humira), um anticorpo anti-TNF alfa desenvolvido pela Abbott, Humicade, um anticorpo anti-TNF alfa desenvolvido por Celltech, golimumab (CNTO-148), um anticorpo TNF totalmente humano desenvolvido por Centocor, etanercept (Enbrel), uma fusão do receptor Fc p75 TNF desenvolvida por Immunex/Amgen, lenercept, uma fusão receptor Fc p55TNF anteriormente desenvolvida pela Roche, ABX-CBL, um anticorpo anti-CD147 em desenvolvimento pela Abgenix, ABX-IL8, um anticorpo anti-IL8 em desenvolvimento pela Abgenix, ABX-MA1, um anticorpo anti-MUC18 em desenvolvimento pela Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), um anti-
MUC1 em desenvolvimento por Antisoma, Therex (R1550), um anticorpo anti-MUC1 em desenvolvimento por Antisoma, AngioMab (AS1405), em desenvolvimento por
Antisoma, HuBC-1, em desenvolvimento por Antisoma, Thioplatin (AS1407) em desenvolvimento pela Antisoma, Antegren (natalizumab), um anticorpo anti-alfa-4-
beta-1 (VLA-4) e alfa-4-beta-7 em desenvolvimento pela Biogen, VLA-1 mAb, um anticorpo anti-integrina VLA-1 em desenvolvimento pela Biogen, LTBR mAb, um anticorpo anti-receptor de linfotoxina beta (LTBR) em desenvolvimento pela Biogen,
CAT-152, um anticorpo anti-TGF-beta 2 em desenvolvimento pela Cambridge
Antibody Technology, ABT 874 (J695), um anticorpo anti-IL-12 p40 em desenvolvimento pela Abbott, CAT-192, um anticorpo anti-TGF beta1 em desenvolvimento pela Cambridge Antibody Technology and Genzyme, CAT-213, um anticorpo anti-Eotaxinl em desenvolvimento pela Cambridge Antibody Technology,
LymphoStat-B, um anticorpo anti-Blys em desenvolvimento pela Cambridge Antibody
Technology e Human Genome Sciences Inc., TRAIL-RlmAb, um anticorpo anti-TRAIL-
R1 em desenvolvimento pela Cambridge Antibody Technology e Human Genome
Sciences, Inc., Avastin bevacizumab, rhuMAb-VEGF), um anticorpo anti-VEGF em desenvolvimento pela Genentech, um anticorpo da família de receptores anti-HER em desenvolvimento pela Genentech, um Fator Anti-Tecidual (ATF), um anticorpo anti-
Fator Tecidual em desenvolvimento pela Genentech, Xolair (Omalizumab), um anticorpo anti-IgE em desenvolvimento pela Genentech, Raptiva (Efalizumab), um anticorpo anti-CD11a em desenvolvimento pela Genentech e Xoma, Anticorpo MLN-
02 (anteriormente LDP-02), em desenvolvimento pela Genentech e Millenium
Pharmaceuticals, HuMax CD4, um anticorpo anti-CD4 em desenvolvimento pela
Genmab, HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 em desenvolvimento pela Genmab e
Amgen, HuMax-Inflam, em desenvolvimento pela Genmab e Medarex, HuMax-Cancer,
um anticorpo anti-Heparanase I em desenvolvimento pela Genmab e Medarex e
Oxford GcoSciences, HuMax-Linfoma, em desenvolvimento pela Genmab e Amgen,
HuMax-TAC, em desenvolvimento pela Genmab, IDEC-131 e anticorpo anti-CD40L em desenvolvimento pela IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), um anticorpo anti-CD4 em desenvolvimento pela IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, um anticorpo anti-CD80 em desenvolvimento pela IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, um anti-CD23 em desenvolvimento pela IDEC Pharmaceuticals, anticorpos anti-fator de migração de macrófagos (MIF) em desenvolvimento pela IDEC Pharmaceuticals,
BEC2, um anticorpo anti-idiotípico em desenvolvimento pela Imclone, IMC-1C11, um anticorpo anti-KDR em desenvolvimento pela Imclone, DC101, um anticorpo anti-flk-1 em desenvolvimento pela Imclone, anticorpos anti-VE caderina em desenvolvimento pela Imclone, CEA-Cide (labetuzumab), um anticorpo para antígeno anti-
carcinoembrionário (CEA) em desenvolvimento pela Immunomedics, LymphoCide
(Epratuzumab), um anticorpo anti-CD22 em desenvolvimento pela Immunomedics,
AFP-Cide, em desenvolvimento pela Immunomedics, MyelomaCide, em desenvolvimento pela Immunomedics, LkoCide, em desenvolvimento pela
Immunomedics, ProstaCide, em desenvolvimento pela Immunomedics, MDX-010, um anticorpo anti-CTLA4 em desenvolvimento pela Medarex, MDX-060, um anticorpo anti-CD30 em desenvolvimento pela Medarex, MDX-070 em desenvolvimento pela
Medarex, MDX-018 em desenvolvimento pela Medarex, Osidem (IDM-1) e anticorpo anti-Her2 em desenvolvimento pela Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax-
CD4, um anticorpo anti-CD4 em desenvolvimento pela Medarex e Genmab, HuMax-
IL15, um anticorpo anti-IL15 em desenvolvimento pela Medarex e Genmab, CNTO
148, um anticorpo anti-TNF alfa. em desenvolvimento pela Medarex e Centocor/J & J,
CNTO 1275, um anticorpo anti-citocina em desenvolvimento pela Centocor/J & J,
MOR101 e MOR102, anticorpos anti-molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1)
(CD54) em desenvolvimento pela MorphoSys, MOR201, um anticorpo anti-receptor 3 do fator de crescimento fibroblástico (FGFR-3) em desenvolvimento pela MorphoSys,
Nuvion (visilizumab), um anticorpo anti-CD3 em desenvolvimento pela Protein Design
Labs, HuZAF, um anticorpo anti-interferon gama em desenvolvimento pela Protein
Design Labs, Anti-integrina alfa5-beta1, em desenvolvimento pela Protein Design
Labs, anti-IL-12, em desenvolvimento pela Protein Design Labs, ING-1, um anticorpo anti-Ep-CAM em desenvolvimento pela Xoma, Xolair (Omalizumab), um anticorpo humanizado anti-IgE desenvolvido por Genentech e Novartis e MLN01, um anticorpo anti-integrina beta2 em desenvolvimento pela Xoma.
Em outra forma de realização, a terapêutica inclui KRN330 (Kirin); anticorpo huA33 (A33, Ludwig Institute for Cancer
Research); CNTO 95 (integrinas alfa V, Centocor); MEDI-522 (integrina alfaV.beta.3,
Medimmune); volociximab (integrina alfaV.beta1, Biogen/PDL); mAb 216 humano
(epítopo glicosilado de células B, NCI); BiTE MT103 (CD19 x CD3 biespecífico,
Medimmune); 4G7 x H22 (Bcell.times.FcgammaR1 biespecífico, Medarex/Merck KGa);
rM28 (CD28.times.MAPG biespecífico, Patente EP No.
EP 1 444 268); MDX447 (EMD
82633) (CD64 ˣ EGFR biespecífico, Medarex); Catumaxomab (Removab) (EpCAM ˣ anti-CD3 biespecífico, Trion/Fres); Ertumaxomab (HER2/CD3 biespecífico, Fresenius
Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex (WX G250) (anidrase carbônica IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglina),
Tracon);BMS-663513 (agonista de CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19,
Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20)
(CD20, Genmab); Rituximab (rituxano) (CD20, Genentech); veltuzumab (hA20) (CD20,
Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEC 152)
(CD23,Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (receptor CD3 fc, PDL
Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30,
Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genetics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle
Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis);
SGN-40 (CD40, Seattle Genetics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme);
MDX-1411 (CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab
(IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (colágeno clivado, Tracon);
HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb);
Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab)
(agonista de DR4 TRAIL-R1, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655
(DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-
ETR2 (lexatumumab) (agonista de TRAIL-R2, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR,
Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YMBio); Panitumumab
(Vetabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110
(EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab (MT201) (Epcam, Merck);
edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (receptor de folato a, Morphotech); KW-2871 (gangliosídeo GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9,
Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin)
(HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab
(cadeia beta de HLA-DR, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); anti-IGF-1R
R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone);
BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO
328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (Receptor de células Killer tipo Ig (KIR), Novo);
Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11 (LTBR,
Biogen); HuHMFG1 (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (epítopo de carboidrato ligado a
N, Raven); CAL (proteína relacionada ao hormônio da paratireoide (PTH-rP),
Universidade da Califórnia); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1,
Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidilserina, Peregrine); hJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (inibidor de TGFb (pan) (IgG4), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNF alfa, Centocor); A27.15 (receptor de transferrina, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (receptor de transferrina, Salk Institute); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab) Publicação PCT No. WO/2000/034337, Universidade do Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).
a) Porção de ligação anti-CD3
[0303] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno ou a segunda porção de ligação ao antígeno é uma porção de ligação d anti- CD3 derivada de um anticorpo anti-CD3 compreendendo 1, 2 ou 3 sequências de CDR de cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 342-344 e/ou 1, 2, ou 3 sequências de CDR de cadeia leve selecionadas das SEQ ID NOs: 345-347.
[0304] Estas sequências de CDR são derivadas do anticorpo anti-CD3 mostrado na Tabela A abaixo. As sequências de CDR do anticorpo WBP3311_2.306.4 são fornecidas abaixo.
Tabela A ID do Anticorpo: CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 343 SEQ ID NO: 344
VH WISPGNVNTKYNENF WBP3311_2.306.4 GFAFTDYYIH DGYSLYYFDY
KG SEQ ID NO: 345 SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 347
VL KSSQSLLNSRTRKN WBP3311_2.306.4 WASTRQS TQSHTLRT
YLA
[0305] As sequências da região variável da cadeia leve kappa e pesada do anticorpo WBP3311_2.306.4 são fornecidas abaixo.
WBP3311_2.306.4-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 348):
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWISPGNVNTKYNE
NFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 349):
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCCGTGAGGATATC CTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG GACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAATGTTAATACTAAATACAATGAA AACTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACTGCAGACCTATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCT CAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGATATTCCCTGT
ATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA WBP3311_2.306.4-V L Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 350):
DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQS
GVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGGGTKLEIK Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 351):
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTAT GAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGT ACCAGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCT GGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGG TGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCG GTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
[0306] As CDRs são conhecidas por serem responsáveis pela ligação ao antígeno, no entanto, verificou-se que nem todas as 6 CDRs são indispensáveis ou imutáveis. Em outras palavras, é possível substituir ou alterar ou modificar uma ou mais CDRs na porção de ligação do anti-CD3 derivada de WBP3311_2.306.4, mantendo ainda substancialmente a afinidade de ligação específica a CD3.
[0307] Em certas formas de realização, a porção de ligação do anti-CD3 proporcionada aqui compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada de um dos anticorpos anti-CD3 WBP3311_2.306.4. Em certas formas de realização, a porção de ligação do anti-CD3 proporcionada aqui compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO. 344. As regiões de CDR3 de cadeia pesada estão localizadas no centro do sítio de ligação ao antígeno e, portanto, acredita-se que ele faça o maior contato com o antígeno e forneça energia mais livre à afinidade do anticorpo ao antígeno. Acredita-se também que a CDR3 de cadeia pesada é de longe a CDR mais diversa do sítio de ligação ao antígeno em termos de comprimento, composição de aminoácidos e conformação por múltiplos mecanismos de diversificação (Tonegawa S., Nature. 302: 575-81 (1983)). A diversidade na CDR3 da cadeia pesada é suficiente para produzir a maioria das especificidades dos anticorpos (Xu JL, Davis MM., Immunity. 13: 37-45 (2000)), bem como a afinidade desejável de ligação ao antígeno (Schier R, et al., J Mol Biol. 263: 551-67 (1996)).
[0308] Em certas formas de realização, a porção de ligação do anti-CD3 proporcionada aqui compreende as sequências da região estrutural adequada (FR), desde que a porção de ligação a anti-CD3 possa se ligar especificamente ao CD3. As sequências de CDR fornecidas na Tabela A são obtidas a partir de anticorpos de camundongo, mas podem ser enxertadas em quaisquer sequências FR adequadas de qualquer espécie adequada, como camundongo, humano, rato, coelho, entre outras, usando métodos adequados conhecidos no estado da arte, como as técnicas recombinantes.
[0309] Em certas formas de realização, a porção de ligação do anti-CD3 proporcionada aqui é humanizada.
[0310] Em certas formas de realização, a porção de ligação ao antígeno humanizado proporcionada aqui é composta substancialmente por todas as sequências humanas, exceto pelas sequências CDR que não são humanas. Em algumas formas de realização, a região variável FRs e regiões constantes, se presentes, são derivadas total ou substancialmente das sequências de imunoglobulina humana. As sequências FR humanas e as sequências da região constante humana podem ser derivadas de diferentes genes de imunoglobulina humana, por exemplo, sequências FR derivadas de um anticorpo humano e região constante de outro anticorpo humano. Em algumas formas de realização, a porção de ligação ao antígeno humanizado compreende a FR1-4 humana.
[0311] As sequências da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo humanizado anti-CD3, WBP3311_2.306.4-z1, são fornecidas abaixo.
WBP3311_2.306.4-z1-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 352):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNE
NFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 353):
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTC ATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCG GACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAG AACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCT GTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGT
ATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC WBP3311_2.306.4-z1-VL Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 354):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQS
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 355):
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCAT CAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGT ATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCT GGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTC ACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCG
GCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG 1b) Anticorpo anti-CD19
[0312] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno ou a segunda porção de ligação ao antígeno é uma porção de ligação anti- CD19 derivada de um anticorpo anti-CD19 compreendendo 1, 2 ou 3 sequências de CDR de cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 356- 359 e/ou sequências de CDR da cadeia leve kappa de 1, 2 ou 3 selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 360-362.
[0313] Estas sequências de CDR são derivadas dos anticorpos apresentados na Tabela B abaixo. As sequências de CDR dos anticorpos anti-CD19 são fornecidas abaixo.
Tabela B CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 357 SEQ ID NO: 358 WBP7011_4.155.8 VH YIDPYNGDTTYNQKF
GYAFTSYNMY TAYAMDY KG
SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 359 SEQ ID NO: 358 W7011-4.155.8-z1-
VH YIDPYNADTTYNQKF P15 GYAFTSYNMY TAYAMDY
KG SEQ ID NO: 360 SEQ ID NO: 361 SEQ ID NO: 362 WBP7011_4.155.8 VL
SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT W7011-4.155.8-z1- SEQ ID NO: 360 SEQ ID NO: 361 SEQ ID NO: 362
VL P15 SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT
[0314] As sequências da região variável da cadeia leve kappa e pesada do anticorpo WBP7011_4.155.8 são fornecidas abaixo.
WBP7011-4.155.8-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 363):
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQ
KFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTTAYAMDYWGQGTSVTVSS Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 364):
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTATC CTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGAGCCATG GAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTACAATGGTGATACTACCTACAACCAG AAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCT CAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCACTACGGCCTATGCTATGG
ACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA WBP7011-4.155.8-VL Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 365):
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSTVNYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFS
GSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 366):
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCT AACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTT CTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGAAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGC CGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGG AAATAAAA
[0315] Em certas formas de realização, a porção de ligação do anticorpo anti- CD19 descrita aqui compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti-CD19, WBP7011_4.155.8 ou W7011-4.155.8-Z1-P15. Em certas formas de realização, a porção de ligação do anticorpo anti-CD19 proporcionada aqui compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 358. As regiões CDR3 da cadeia pesada estão localizadas no centro do sítio de ligação ao antígeno e, portanto, acredita-se que ele faça o maior contato com o antígeno e forneça energia mais livre à afinidade do anticorpo ao antígeno. Acredita- se também que a CDR3 de cadeia pesada é de longe a CDR mais diversa do sítio de ligação ao antígeno em termos de comprimento, composição de aminoácidos e conformação por múltiplos mecanismos de diversificação (Tonegawa S., Nature. 302: 575-81 (1983)). A diversidade na CDR3 da cadeia pesada é suficiente para produzir a maioria das especificidades dos anticorpos (Xu JL, Davis MM., Immunity. 13: 37-45 (2000)), bem como a afinidade desejável de ligação ao antígeno (Schier R, et al., J Mol Biol. 263: 551-67 (1996)).
[0316] Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 divulgados aqui são humanizados. A sequências da região variável da cadeia leve e cadeia pesada para o anticorpo anti-CD19 humanizado, W7011-4.155.8-Z1-P15, são fornecidas abaixo.
W7011-4.155.8-z1-P15-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 367):
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQ
KFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 368):
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTC ATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAG GACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAG AAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCT GAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGG
ACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT W7011-4.155.8-z1-P15-VL Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 369):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFS
GSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 370):
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTAT CACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAG CCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGC GGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGC CACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGG
AGATTAAG Complexos polipeptídicos biespecíficos
[0317] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona aqui um complexo polipeptídico biespecífico. O termo “biespecífico”, conforme utilizado neste documento, significa que existem duas porções de ligação ao antígeno, cada uma das quais é capaz de se ligar especificamente a um antígeno diferente ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. O complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui compreende uma primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo um primeiro domínio variável de cadeia pesada operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do TCR e um primeiro domínio variável de cadeia leve operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa e estabilizadora entre C1 e C2. O complexo polipeptídeo biespecífico proporcionado aqui compreende ainda uma segunda porção de ligação ao antígeno compreendendo um segundo sítio de ligação ao antígeno, mas não contém uma sequência derivada de uma região constante de TCR.
[0318] Em certas formas de realização, a presente divulgação proporciona um complexo polipeptídico biespecífico, compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno associada a uma segunda porção de ligação ao antígeno, em que: a primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo: um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C- terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de células T (TCR), e um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C- terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR,
em que: C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica, uma segunda porção de ligação ao antígeno apresenta uma segunda especificidade antigênica que é diferente da primeira especificidade antigênica, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao pareamento incorreto do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural.
[0319] O complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui é significativamente menos propenso a ter domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve com pareamento incorreto. Sem estar ligado a qualquer teoria, acredita- se que as regiões constantes do TCR estabilizadas na primeira porção de ligação ao antígeno possam se associar especificamente e, portanto, contribuir para o pareamento altamente específico dos VH1 e VL1 pretendidos, desencorajando pareamentos incorretos indesejados de VH1 ou VL1 com outras regiões variáveis que não apresentam os sítios de ligação ao antígeno pretendidos.
[0320] Os complexos polipeptídicos biespecíficos nos formatos WuXiBody têm meia-vida in vivo mais longa e são relativamente mais fáceis de fabricar quando comprados com os complexos polipeptídicos biespecíficos em outros formatos.
[0321] Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui compreende um segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) de um segundo anticorpo. Em certas formas de realização, pelo menos um de VH2 e VL2 está operacionalmente ligado a uma região constante de anticorpo, ou ambos VH2 e VL2 estão operacionalmente ligados a regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo, respectivamente. Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio constante CH1 do anticorpo operacionalmente ligado a VH2, e um domínio constante de cadeia leve do anticorpo operacionalmente ligado a VL2. Por exemplo, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende um Fab.
[0322] Onde um primeiro, segundo, terceiro e quarto domínios variáveis (por exemplo, VH1, VH2, VL1 e VL2) são expressos em uma célula, é altamente desejável que VH1 pareie especificamente com VL1 e VH2 pareie especificamente com VL2, de tal modo que o produto proteico biespecífico resultante tenha as especificidades de ligação ao antígeno corretas. No entanto, nas tecnologias existentes, tais como hibridoma híbrido (ou quadroma), o pareamento aleatório de VH1, VH2, VL1 e VL2 ocorre e, por conseguinte, resulta na geração de até dez espécies diferentes, das quais apenas uma é a molécula de ligação ao antígeno funcional biespecífica. Isso não apenas reduz o rendimento da produção, mas também complica a purificação do produto alvo.
[0323] Os complexos polipeptídicos biespecíficos proporcionados aqui são excepcionais, na medida em que os domínios variáveis são menos propensos a pareamentos incorretos do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural. Em um exemplo ilustrativo, o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende VH1-C1 pareado com VL1-C2, e o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende VH2-CH1 pareado com VL2-CL. Surpreendentemente, verificou-se que C1 e C2 se associam preferencialmente entre si e são menos propensos a se associar a CL ou CH1, desse modo, a formação de pares indesejados como C1-CH, C1-CL, C2-CH e C2-CL é desencorajada e significativamente reduzida. Como resultado da associação específica de C1-C2, o VH1 pareia especificamente com o VL1, produzindo, assim, o primeiro sítio de ligação ao antígeno, e o CH1 pareia especificamente com o CL, permitindo, desse modo, o pareamento específico de VH2-VL2 que proporciona o segundo sítio de ligação ao antígeno. Por conseguinte, a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao mismatch, e os pareamentos incorretos entre, por exemplo, VH1-VL2, VH2-VL1, VH1- VH2, VL1-VL2 seriam significativamente reduzidos, do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural, por exemplo, na forma de VH1-CH1, VL1-CL, VH2-CH1 e VL2-CL.
[0324] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui, quando expresso por uma célula, teria significativamente menos produtos com pareamentos incorretos (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou mais produtos com pareamentos incorretos) e/ou significativamente maior rendimento de produção (por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou rendimento bem superior) do que uma molécula de referência expressa em condições comparáveis, em que a molécula de referência é de alguma forma idêntica ao complexo polipeptídico biespecífico, exceto pelo fato de ter um CH1 nativo no lugar de C1 e um CL nativo no lugar de C2.
[0325] Em certas formas de realização, a primeira e/ou a segunda porção de ligação ao antígeno é multivalente, como bivalente, trivalente, tetravalente. O termo “valente”, conforme utilizado neste documento, refere-se à presença de um número específico de sítios de ligação ao antígeno em uma dada molécula. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. Uma molécula bivalente pode ser monoespecífica se os dois sítios de ligação são ambos para ligação específica do mesmo antígeno ou do mesmo epítopo. Da mesma forma, uma molécula trivalente pode ser biespecífica,
por exemplo, quando dois sítios de ligação são monoespecíficos para um primeiro antígeno (ou epítopo) e o terceiro sítio de ligação é específico para um segundo antígeno (ou epítopo). Em certas formas de realização, a primeira e/ou a segunda porção de ligação ao antígeno no complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser bivalente, trivalente ou tetravalente, com pelo menos dois sítios de ligação específicos para o mesmo antígeno ou epítopo. Isso, em certas formas de realização, proporciona uma ligação mais forte ao antígeno ou ao epítopo do que uma equivalente monovalente. Em certas formas de realização, em uma porção de ligação ao antígeno bivalente, a primeira valência do sítio de ligação e a segunda valência do sítio de ligação são estruturalmente idênticas (ou seja, tendo as mesmas sequências) ou estruturalmente diferentes (ou seja, tendo sequências diferentes, embora com a mesma especificidade).
[0326] Em certas formas de realização, a primeira e/ou a segunda porção de ligação ao antígeno é multivalente e compreende dois ou mais sítios de ligação ao antígeno operacionalmente ligados entre si, com ou sem um espaçador.
[0327] Em certas formas de realização, a primeira e/ou a segunda porção de ligação ao antígeno compreende um ou mais fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd, Fv e scFv e outros fragmentos descritos em Spiess et al., 2015, supra e Brinkmann et al., 2017, supra, ou a combinação dos mesmos, que estão ligados com ou sem um espaçador na cadeia pesada e/ou na cadeia leve e forma pelo menos uma capaz de ligação a um segundo anticorpo.
[0328] Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende dois ou mais Fabs do segundo anticorpo. Os dois Fabs podem ser operacionalmente ligados um ao outro, por exemplo, o primeiro Fab pode ser covalentemente ligado ao segundo Fab via cadeia pesada, com ou sem um espaçador entre eles.
[0329] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende ainda um primeiro domínio de dimerização e a segunda porção de ligação ao antígeno compreende ainda um segundo domínio de dimerização. O termo “domínio de dimerização”, conforme utilizado neste documento, refere-se ao domínio peptídico que é capaz de se associar para formar um dímero, ou em alguns exemplos, permite a dimerização espontânea de dois peptídeos.
[0330] Em certas formas de realização, o primeiro domínio de dimerização pode ser associado ao segundo domínio de dimerização. A associação pode ser através de qualquer interação ou ligação ou conexão adequada, por exemplo, por meio de um conector, uma ligação dissulfeto, uma ligação de hidrogênio, interação eletrostática, uma ponte de sal ou interação hidrofóbica-hidrofílica, ou a combinação dos mesmos. Exemplos de domínios de dimerização incluem, sem limitação, a região de dobradiça do anticorpo, um domínio CH2 de anticorpo, um domínio CH3 de anticorpo, e outros monômeros de proteína adequados capazes de dimerização e de se associarem um ao outro. A região de dobradiça, o domínio CH2 e/ou CH3 pode ser derivado de qualquer isotipo de anticorpo, como IgG1, IgG2 e IgG4.
[0331] Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização compreendem pelo menos uma porção de uma região de dobradiça de anticorpo. Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização podem compreender ainda um domínio CH2 de anticorpo e/ou um domínio CH3 de anticorpo. Em certas formas de realização, o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização compreendem pelo menos uma porção da região de dobradiça-Fc, isto é, domínio dobradiça-CH2-CH3. Em certas formas de realização, o primeiro domínio de dimerização pode ser operacionalmente ligado à extremidade C- terminal da primeira região constante do TCR. Em certas formas de realização, o segundo domínio de dimerização pode ser operacionalmente ligado à extremidade C-
terminal da região constante CH1 de anticorpo da segunda porção de ligação ao antígeno.
[0332] Em certas formas de realização, o primeiro domínio de dimerização está operacionalmente ligado a (com ou sem um espaçador entre) primeira região constante (C1) do TCR em um terceiro domínio de junção.
[0333] Se a região Fv de uma imunoglobulina está alinhada com um domínio de TCR do tipo imunoglobulina, o N-terminal da dobradiça do anticorpo e o N-terminal da dobradiça do TCR também seriam alinhados. Um exemplo é dado na Tabela 7 abaixo, onde o N-terminal da dobradiça do anticorpo (SEQ ID NO: 278 ou 279) está alinhado ao N-terminal da dobradiça do TCR Beta (SEQ ID NO: 280).
[0334] O terceiro domínio de junção do complexo polipeptídico biespecífico, proporcionado aqui, pode ser selecionado de tal modo que ele compreenda um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 resíduos de aminoácidos) do N-terminal da dobradiça do anticorpo e um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do N-terminal da dobradiça do TCR. O termo “N-terminal da dobradiça", conforme utilizado neste documento, refere-se ao fragmento mais N terminal da região da dobradiça. Por exemplo, o domínio de junção pode ser selecionado para ter todas, ou a maioria, ou algumas sequências do N-terminal da dobradiça do anticorpo ou do N-terminal da dobradiça do TCR, ou pode compreender mais resíduos do N-terminal da dobradiça do anticorpo do que do N-terminal da dobradiça do TCR, ou vice-versa.
[0335] Em certas formas de realização, os terceiros domínios de junção do complexo polipeptídico, proporcionado aqui, tem um comprimento total comparável ao do N-terminal da dobradiça do anticorpo ou do N-terminal da dobradiça do TCR.
[0336] Da mesma forma, um terceiro domínio de junção adequado pode ser determinado em uma base estrutural. Por exemplo, as estruturas tridimensionais do anticorpo e do TCR podem ser sobrepostas e as sobreposições do N-terminal da dobradiça do anticorpo e do N-terminal da dobradiça do TCR na estrutura sobreposta podem ser determinadas e consideradas ao se determinar o comprimento ou a proporção das sequências do N-terminal da dobradiça do anticorpo ou do TCR.
[0337] Em certas formas de realização, o terceiro domínio de junção compreende um espaçador entre os fragmentos do N-terminal da dobradiça do anticorpo e do N-terminal da dobradiça do TCR. Podem ser utilizadas quaisquer sequências adequadas ou o comprimento das sequências espaçadoras, desde que não afete negativamente a ligação ao antígeno ou a estabilidade do complexo polipeptídico.
[0338] Exemplos de sequências do N-terminal da dobradiça do anticorpo, do N-terminal da dobradiça do TCR e do terceiro domínio de junção são fornecidos nas Tabelas 7, 8, 9 e 10 abaixo.
[0339] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CBeta modificada e o primeiro domínio de dimerização compreende a dobradiça e Fc de IgG1 ou IgG4. A Tabela 7 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para a CBeta de TCR fundida à dobradiça do anticorpo. O N-terminal da dobradiça do anticorpo está alinhado ao N-terminal da dobradiça do TCR Beta.
Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 152 ou 153). Em tais formas de realização, o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 53 ou 54 (que abrange o terceiro domínio de junção e o C-terminal da dobradiça).
TABELA 7. Desenhos do terceiro domínio de junção para VH-CBeta- Dobradiça Dobradiça SEQ ID NO IgG1_Antibody_H EPKS-CDKTHTC…… 278 IgG4_Antibody_H ESK----YGPPC…… 279 TCR_beta WGRADCGFTSVS…… 280 Conjunction’_1 (IgG1) WGRA-SDKTHTC…… 152 Conjunction’_1 (IgG4) WGR----YGPPC…… 153
[0340] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CAlfa ou CPré- Alfa modificada e o primeiro domínio de dimerização compreende dobradiça e Fc de IgG1 ou IgG4. A Tabela 8 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para CAlfa ou CPré-Alfa de TCR fundidas à dobradiça do anticorpo. O N-terminal da dobradiça do anticorpo está alinhado ao N-terminal da dobradiça da Alfa ou CPré- Alfa do TCR. Em tais formas de realização, o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 134, 135, 140 ou 141 (que abrange o terceiro domínio de junção e o C-terminal da dobradiça).
TABELA 8. Desenhos do terceiro domínio de junção para VH-CAlfa- Dobradiça Dobradiça SEQ ID NO IgG1_Antibody_H EPKS-CDKTHTC…… 281 IgG4_Antibody_H ESK----YGPPC…… 282 TCR_alpha ou TCR_pre-alpha ------------ Conjunction’_2 (IgG1) -----SDKTHTC…… 154 Conjunction’_2 (IgG4) -------YGPPC…… 155
[0341] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CGama modificada e o primeiro domínio de dimerização compreende dobradiça e Fc de IgG1 ou IgG4. A Tabela 9 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para a CGama de TCR fundida à dobradiça do anticorpo. O N-terminal da dobradiça do anticorpo está alinhado ao N-terminal da dobradiça do TCR Gama.
Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 165 ou 166). Em tais formas de realização, o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 121 ou 122 (que abrange o terceiro domínio de junção e o C-terminal da dobradiça).
TABELA 9. Desenhos do terceiro domínio de junção para VH-CGama- Dobradiça Dobradiça SEQ ID NO IgG1_Antibody_H EPKSCDKTHTC…… 60 IgG4_Antibody_H ESK---YGPPC…… 61 TCR_gamma PPIKTDVITMD…… 62
Conjunction’_3 (IgG1) PPIKSDKTHTC…… 165 Conjunction’_3 (IgG4) PPI---YGPPC…… 166
[0342] Em certas formas de realização, C1 compreende uma CDelta modificada e o primeiro domínio de dimerização compreende dobradiça e Fc de IgG1 ou IgG4. A Tabela 10 ilustra os exemplos de desenhos para os domínios de junção úteis para a CDelta de TCR fundida à dobradiça do anticorpo. O N-terminal da dobradiça do anticorpo está alinhado ao N-terminal da dobradiça do TCR Delta.
Exemplos de desenhos dos domínios de junção também são apresentados em forma de alinhamento. Em tais formas de realização, o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 127 ou 128 (que abrange o terceiro domínio de junção e o C-terminal da dobradiça).
TABELA 10. Desenhos do terceiro domínio de junção para VH-CDelta- dobradiça-Fc Dobradiça e Fc SEQ ID NO IgG1_Antibody_H EPKSCDKTHTC…… 63 IgG4_Antibody_H ESK---YGPPC…… 103 TCR_delta FEVKTDSTDHV…… 104 Conjunction’_4 (IgG1) EPKSSDKTHTC…… 167 Conjunction’_4 (IgG4) ESK---YGPPC…… 168
[0343] Em certas formas de realização, o primeiro domínio de dimerização está operacionalmente ligado à extremidade C-terminal de uma região constante de TCR modificada e, em conjunto, forma uma região constante quimérica. Em outras palavras, a região constante quimérica compreende o primeiro domínio de dimerização operacionalmente ligado à região constante de TCR modificada.
[0344] Em certas formas de realização, a região constante quimérica compreende uma CBeta modificada ligada à primeira região de dobradiça-Fc derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4. Exemplos de sequências de tal região constante quimérica são fornecidos nas Tabelas 11, 12, 13 e 14.
[0345] Em certas formas de realização, a região constante quimérica compreende uma CAlfa modificada ligada à primeira dobradiça derivada de IgG1,
IgG2 ou IgG4. Exemplos de sequências de tal região constante quimérica são fornecidos nas Tabelas 11, 12 e 13.
[0346] Em certas formas de realização, a região constante quimérica compreende uma CPré-Alfa modificada ligada à primeira dobradiça derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4, no terceiro domínio de junção que compreende ou é a SEQ ID NO: 134, 135, 140 ou 141. Exemplos de sequências de tal região constante quimérica são fornecidos nas Tabelas 15 e 16.
[0347] Em certas formas de realização, a região constante quimérica compreende uma CGama modificada ligada à primeira dobradiça derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4. Exemplos de sequências de tal região constante quimérica são fornecidos nas Tabelas 17 e 18.
[0348] Em certas formas de realização, a região constante quimérica compreende uma CDelta modificada ligado à primeira dobradiça derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4. Exemplos de sequências de tal região constante quimérico são fornecidos nas Tabelas 17 e 18.
[0349] Em certas formas de realização, a região constante quimérica compreende ainda um primeiro domínio CH2 de anticorpo, e/ou um primeiro domínio CH3 de anticorpo. Por exemplo, a região constante quimérica compreende ainda um primeiro domínio CH2-CH3 de anticorpo ligado à extremidade C-terminal do terceiro domínio de junção. Exemplos de sequências de tal região constante quimérica são fornecidos na Tabela 19.
[0350] Em certas formas de realização, a primeira região constante quimérica e o segundo domínio constante do TCR compreendem um par de sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/151, 214/212, 214/151, 234/233,
232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 e 238/237, conforme mostrado na Tabela 19.
[0351] Estes pares de regiões constantes quiméricas e segundos domínios constantes de TCR são úteis na medida em que podem ser modificados para fundir a uma região variável de anticorpo desejada, de modo a proporcionar o complexo polipeptídico, como aqui revelado. Por exemplo, uma região variável da cadeia pesada do anticorpo pode ser fundida à região constante quimérica (compreendendo C1), produzindo, assim, a primeira cadeia polipeptídica do complexo polipeptídico proporcionado aqui; e de forma similar, uma região variável de cadeia leve do anticorpo pode ser fundida ao segundo domínio constante do TCR (compreendendo C2), produzindo, assim, a segunda cadeia polipeptídica do complexo polipeptídico proporcionado aqui.
[0352] Estes pares de regiões constantes quiméricas e segundos domínios constantes de TCR podem ser usados como uma plataforma para gerar a primeira porção de ligação ao antígeno dos complexos polipeptídicos biespecíficos proporcionados aqui. Por exemplo, as regiões variáveis de um primeiro anticorpo podem ser fundidas na extremidade N-terminal das sequências da plataforma (por exemplo, fundindo o VH ao domínio constante quimérico e o VL ao domínio constante do TCR, respectivamente). Para produzir o complexo polipeptídico biespecífico, a segunda porção de ligação ao antígeno pode ser modificada e produzida, de modo a associar-se ao complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
[0353] Em certas formas de realização, o segundo domínio de dimerização compreende uma região de dobradiça. A região de dobradiça pode ser derivada de um anticorpo, como IgG1, IgG2 ou IgG4. Em certas formas de realização, o segundo domínio de dimerização pode compreender opcionalmente ainda um domínio CH2 de anticorpo e/ou um domínio CH3 de anticorpo, por exemplo, como uma região Fc de dobradiça. A região de dobradiça pode ser ligada à cadeia pesada do anticorpo do segundo sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, Fab).
[0354] No complexo polipeptídico biespecífico, o primeiro e o segundo domínios de dimerização são capazes de se associarem a um dímero. Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização são diferentes e se associam de uma forma que desencoraja a homodimerização e/ou favorece heterodimerização. Por exemplo, o primeiro e o segundo domínios de dimerização podem ser selecionados para que não sejam idênticos e que eles formem preferencialmente heterodímeros entre si, em vez de formar homodímeros em si. Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização são capazes de se associar a heterodímeros por meio da formação de knob-into-holes, interação hidrofóbica, interação eletrostática, interação hidrofílica ou maior flexibilidade.
[0355] Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização compreendem domínios CH2 e/ou CH3 que são respectivamente mutados para serem capazes de formar um knob-into-holes. Um knob pode ser obtido pela substituição de um pequeno resíduo de aminoácido por um maior no primeiro polipeptídeo CH2/CH3, e um hole pode ser obtido pela substituição de um resíduo grande por um menor. Para detalhes dos sítios de mutação para knob-into-holes, consulte Ridgway et al., 1996, supra, Spiess et al., 2015, supra e Brinkmann et al., 2017, supra.
[0356] Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização compreendem um primeiro domínio CH3 do isotipo IgG1 contendo as substituições S139C e T151W (SEQ ID NO: 295, knob) e um segundo domínio CH3 do isotipo IgG1 contendo as substituições Y134C, T151S, L153A e Y192V (SEQ ID NO: 296, hole). Em outras formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização compreendem um primeiro domínio CH3 do isotipo IgG4 contendo as substituições S136C e T148W (SEQ ID NO: 298, knob) e um segundo domínio CH3 do isotipo IgG4 contendo as substituições Y131C, T148S, L150A e Y189V (SEQ ID NO: 299, hole). As sequências e as numerações de Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 294) e Fc de IgG4 (SEQ ID NO: 297) de tipo selvagem são mostrados nas Figuras 20A-20D.
Conforme observado acima, XnY ao se referir à região Fc (por exemplo, domínio CH3 da região Fc), a numeração do resíduo de aminoácido baseia-se na numeração mostrada nas Figuras 20A-20D.
[0357] Em certas formas de realização, o primeiro e o segundo domínios de dimerização compreendem ainda uma primeira região de dobradiça e uma segunda região de dobradiça. Por exemplo, pares de carga de substituição podem ser introduzidos na região de dobradiça de IgG1 e IgG2 para promover a heterodimerização. Para detalhes, consulte Brinkmann et al., 2017, supra.
Formato biespecífico
[0358] O complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser em qualquer formato biespecífico adequado conhecido no estado da arte. Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico é baseado em um formato de anticorpo biespecífico de referência. “Baseado em”, conforme utilizado neste documento em relação a um formato biespecífico, significa que o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui assume o mesmo formato biespecífico de um anticorpo biespecífico de referência, exceto que uma das porções de ligação ao antígeno foi modificada para compreender um VH operacionalmente ligado a C1 e um VL operacionalmente ligado a C2, em que C1 e C2 estão associados a pelo menos uma ligação intercadeia não nativa, como definido acima. Exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos de referência conhecidos no estado da arte, incluem, sem limitação, (i) um anticorpo biespecífico com Fc simétrico, (ii) um anticorpo biespecífico com Fc assimétrico, (iii) um anticorpo regular anexado a uma porção de ligação ao antígeno adicional, (iv) um fragmento de anticorpo biespecífico, (v) um fragmento de anticorpo regular anexado com uma porção de ligação ao antígeno adicional, (vi) um anticorpo biespecífico anexado a albumina humana ou peptídeo de ligação a albumina humana.
[0359] O BsIgG é monovalente para cada antígeno e pode ser produzido por coexpressão de duas cadeias leves e duas pesadas em uma única célula hospedeira.
Uma IgG anexa é modificada para formar uma IgG biespecífica pela anexação das extremidades amino ou carboxila terminais das cadeias leves ou pesadas com unidades adicionais de ligação ao antígeno. As unidades adicionais de ligação ao antígeno podem ser anticorpos de domínio único (VL ou VH não pareados), como DVD-Ig, domínios variáveis de anticorpos pareados (por exemplo, Fv ou scFv) ou estruturas de proteínas modificadas. Qualquer uma das unidades de ligação ao antígeno em BsIgG, em particular, VH-CH1/VL-CL pareado, pode ser modificada para substituir o CH1 por C1 e CL por C2, conforme divulgado aqui, para produzir o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui.
[0360] Fragmentos de anticorpo não biespecíficos são fragmentos de ligação ao antígeno que são derivados de um anticorpo, mas não possuem alguns ou todos os domínios constantes de anticorpos. Exemplos desse fragmento de anticorpo biespecífico incluem, por exemplo, anticorpo de domínio único, Fv, Fab e diacorpo etc.
Para produzir o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, um sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, VH-CH1/VL-CL) em um fragmento de anticorpo biespecífico, pode ser modificado para compreender o complexo polipeptídico, como divulgado aqui (por exemplo, VH-C1/CL-C2).
[0361] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, é baseado no formato de um anticorpo “completo”, tal como as moléculas completas de IgG ou do tipo IgG, e pequenos formatos recombinantes, tais como moléculas de fragmento variável de cadeia única em tandem (taFvs), diacorpos (Dbs), diacorpos de cadeia única (scDbs) e vários outros derivados destes (conforme os formatos dos anticorpos biespecíficos, tal como descrito por Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621 -632. Os exemplos de anticorpo biespecífico são baseados em um formato que inclui, mas não se limita ao quadroma, Fab acoplados quimicamente (fragmento de ligação ao antígeno), eBiTE (Bispecific T cell engager).
[0362] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, é baseado em um formato biespecífico selecionado a partir de Triomabs; hibridoma híbrido (quadroma); plataforma multiespecífica anticalin (Pieris); Diacorpo; Diacorpo de cadeia única; Fragmentos Fv de cadeia simples em tandem; TandAbs, Abs triespecíficos (Affimed); Darts (redirecionamento de dupla afinidade; Macrogenics); Xmabs biespecíficos (Xencor); Acopladores de células T biespecíficos (Bites; Amgen; 55 kDa); Triplebodies; Derivados de anticorpos recombinantes multifuncionais de Proteína de Fusão (CreativeBiolabs) Tricorpo (Fab- scFv); Plataforma Duobody (Genmab); Plataforma Dock and lock; plataforma Knob into hole (KIH); Anticorpo IgG biespecífico humanizado (REGN1979) (Regeneron); Anticorpos biespecíficos Mab2 (F-Star); DVD-Ig (imunoglobulina de domínio variável duplo) (Abbvie); corpos kappa-lambda; TBTI (Ig biespecífica tetravalente em tandem); e CrossMab.
[0363] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, é baseado em um formato biespecífico selecionado a partir de anticorpos biespecíficos do tipo IgG (BsIgG) compreendendo CrossMab; DAF (dois em um); DAF (quatro em um); DutaMab; DT-IgG; Knobs-into-holes LC comum; Montagem de Knobs-into-holes; Par de carga; Troca de braço Fab; SEEDbody; Triomab; LUZ-Y; Fcab; corpo kappa-lambda; e Fab ortogonal. Para uma descrição detalhada dos formatos de anticorpos biespecíficos, consulte Spiess C., Zhai Q. e Carter PJ (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
[0364] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, é baseado em um formato biespecífico selecionado a partir de anticorpos anexados a IgG com uma porção de ligação ao antígeno adicional compreendendo DVD-IgG; IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)-scFv; scFV-(L)IgG; IgG(L,H)-Fv; IgG(H)-V; V(H)-IgG; IgG(L)-V; V(L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG- 2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; e DVI-IgG (quatro em um) (vide Id.).
[0365] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, é baseado em um formato selecionado a partir de fragmentos de anticorpos biespecíficos compreendendo Nanocorpo; Nanocorpo-HAS; BiTE; Diacorpo; DART; TandAb; scDiacorpo; sc-Diacorpo-CH3; Diacorpo-CH3; Triple Body; Minianticorpo; Minicorpo; Minicorpo TriBi; scFv-CH3 KIH; Fab-scFv; scFv-CH- CL-scFv; F(ab')2; F (ab')2-scFv2; scFv-KIH; Fab-scFv-Fc; HCAb Tetravalente; scDiacorpo-Fc; Diacorpo-Fc; ScFv-Fc em tandem; e Intracorpo (vide Id.).
[0366] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico conforme proporcionado aqui é baseado em um formato biespecífico, como Dock and Lock; ImmTAC; HSAcorpo; scDiacorpo-HAS; e scFv-Toxina em tandem (vide Id.).
[0367] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico, conforme proporcionado aqui, é baseado em um formato selecionado a partir de conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo IgG-IgG; Cov-X-Corpo; e scFv1-PEG-scFv2 (vide Id.).
[0368] Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação podem ser associadas a uma estrutura semelhante a Ig. Uma estrutura semelhante a Ig é como um anticorpo natural com uma construção em forma de Y, com dois braços para ligação ao antígeno e um tronco para associação e estabilização. A semelhança com o anticorpo natural pode proporcionar várias vantagens, tais como boa farmacocinética in vivo, resposta imunológica e estabilidade desejadas etc. Verificou-se que a estrutura semelhante a
Ig compreendendo a primeira porção de ligação ao antígeno proporcionada aqui associada à segunda porção de ligação ao antígeno proporcionada aqui apresenta estabilidade térmica que é comparável à de uma Ig (por exemplo, uma IgG). Em certas formas de realização, a estrutura semelhante a Ig proporcionada aqui é pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% daquela de uma IgG natural.
[0369] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico compreende quatro cadeias polipeptídicas: i) VH1-C1-Dobradiça-CH2-CH3; ii) VL1- C2; iii) VH2-CH1-Dobradiça-CH2-CH3, e iv) VL2-CL, em que a C1 e C2 são capazes de formar um dímero que compreende pelo menos um ligação intercadeia não nativa, e as duas regiões de dobradiça e/ou os dois domínios CH3 são capazes de formar uma ou mais ligações intercadeias que podem facilitar a dimerização.
Especificidades antigênicas do complexo biespecífico
[0370] O complexo biespecífico proporcionado aqui tem duas especificidades antigênicas. A primeira e a segunda porções de ligação ao antígeno são dirigidas para a primeira e a segunda especificidades antigênicas, respectivamente.
[0371] A primeira e a segunda especificidades antigênicas podem ser idênticas, em outras palavras, a primeira e a segunda porções de ligação ao antígeno se ligam à mesma molécula de antígeno ou ao mesmo epítopo da mesma molécula de antígeno.
[0372] Alternativamente, a primeira e a segunda especificidades antigênicas podem ser distintas. Por exemplo, a primeira e a segunda porções de ligação ao antígeno podem se ligar a diferentes antígenos. Tal complexo polipeptídico biespecífico poderia ser útil em, por exemplo, trazendo os dois antígenos diferentes para bem próximo e promovendo assim as suas interações (por exemplo, trazer células imunológicas bem próximas para um antígeno tumoral ou um antígeno patogênico e, portanto, promover o reconhecimento ou eliminação de tal antígeno pelo sistema imune). Para outro exemplo, a primeira e a segunda porções de ligação ao antígeno podem se ligar a diferentes epítopos (e opcionalmente não sobrepostos) de um antígeno. Isso pode ser útil para melhorar o reconhecimento ou a ligação a um antígeno alvo, em particular aquele que é suscetível a mutação (por exemplo, um antígeno viral).
[0373] Em algumas formas de realização, uma das especificidades antigênicas do complexo biespecífico proporcionado aqui é dirigida a uma molécula receptora específica de célula T e/ou a uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK). Em algumas formas de realização, uma das primeira e segunda porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a CD3, TCR, CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 ou CD95 e a outra é capaz de se ligar especificamente a um antígeno associado a um tumor.
[0374] Em certas formas de realização, uma das especificidades antigênicas do complexo biespecífico proporcionado aqui é dirigida para CD3. Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno do complexo biespecífico é capaz de se ligar especificamente a CD3. Em certas formas de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno do complexo biespecífico é capaz de se ligar especificamente a CD3.
[0375] Em certas formas de realização, a porção de ligação ao antígeno dos complexos biespecíficos compreende um VH1 e VL1 derivados de um anticorpo anti- CD3. Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeos compreendem um par de sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2/1, 3/4/, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 28/3, 29/3, 30/12, 31/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92/, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136,
137/139 e 138/139, em que as regiões variáveis do anticorpo anti-CD3 (T3) são fundidas à região constante do TCR, conforme mostrado na Tabela 20.
[0376] Em algumas formas de realização, uma das especificidades antigênicas do complexo biespecífico proporcionado aqui é dirigida a uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK) e a outra especificidade antigênica é dirigida a um antígeno de superfície associado ao tumor. Em certas formas de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno do complexo biespecífico é capaz de se ligar especificamente à molécula receptora específica de célula T e/ou a uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK) (como CD3) e ao segundo antígeno a porção de ligação é capaz de se ligar especificamente a um antígeno associado a um tumor (como CD19) ou vice-versa.
[0377] Em certas formas de realização, os complexos polipeptídicos biespecíficos compreendem uma combinação de quatro sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 22/12/24/23 (E17, IgG1), 25/12/26/23 (E17, IgG4) e 25/12/27/23 (F16), como mostrado no Exemplo 8 e Tabela 20, em que a primeira porção de ligação ao antígeno se liga a CD3 e a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a CD19. O desenho de E17 é um anticorpo biespecífico e bivalente, e o desenho de F16 é um complexo de ligação ao antígeno biespecífico e trivalente, com duas repetições de Fab do anticorpo anti-CD19.
[0378] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico compreende uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a CTLA-4, e uma segunda porção de ligação de antígeno que se liga a PD-1, ou vice-versa.
[0379] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico compreende quatro cadeias polipeptídicas compreendendo: i) VH1 operacionalmente ligado a uma primeira região constante quimérica; ii) VL1 operacionalmente ligado a uma segunda região constante quimérica; iii) VH2 operacionalmente ligado à região constante da cadeia pesada de anticorpo convencional e iv) VL2 operacionalmente ligado à região constante da cadeia leve de anticorpo convencional. Em certas formas de realização, a primeira região constante quimérica pode compreender C1- dobradiça-CH2-CH3, tal como definido acima. Em certas formas de realização, a segunda região constante quimérica pode compreender C2, tal como definido acima.
Em certas formas de realização, a região constante da cadeia pesada de anticorpo convencional pode compreender CH1-dobradiça-CH2-CH3, tal como definido acima.
Em certas formas de realização, a região constante da cadeia leve do anticorpo convencional pode compreender CL, tal como definido acima.
[0380] Os seguintes nomes de construção são usados indiferentemente nesta divulgação: E17-Design_2-QQQQ e W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP; F16-Design-2- QQQQ e W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP; U6T5.G25.IgG4 e W3248-U6T5.G25-
1.uIgG4.SP; e U6T1.G25R.IgG4 e W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP.
Método de preparação
[0381] A presente divulgação proporciona ácidos nucleicos ou polinucleotídeos isolados que codificam o complexo polipeptídico, e o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
[0382] O termo “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo”, conforme utilizado neste documento, refere-se a ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e seus polímeros na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange polinucleotídeos contendo análogos de nucleotídeos naturais conhecidos que possuem propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência polinucleotídica específica também inclui implicitamente variantes modificadas de forma conservativa (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser alcançadas pela geração de sequências, em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxinosina (vide Batzer et al., Nucleic Acid Res 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J.
Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
[0383] Os ácidos nucleicos ou polinucleotídeos que codificam o complexo polipeptídico e o complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui podem ser construídos utilizando-se técnicas recombinantes. Para esse fim, o DNA que codifica uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo parental (como CDR ou região variável) pode ser isolado e sequenciado pelo uso de procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Da mesma forma, o DNA que codifica uma região constante de TCR também pode ser obtido. Como um exemplo, a sequência polinucleotídica que codifica o domínio variável (VH) e a sequência polinucleotídica que codifica a primeira região constante (C1) do TCR são obtidas e ligadas operacionalmente de modo a permitir a transcrição e expressão em uma célula hospedeira para a produção do primeiro polipeptídeo. Do mesmo modo, a sequência polinucleotídica que codifica VL está operacionalmente ligada à sequência polinucleotídica que codifica C1, de modo a permitir a expressão do segundo polipeptídeo na célula hospedeira. Se necessário, as sequências polinucleotídicas que codificam um ou mais espaçadores também estão operacionalmente ligadas às outras sequências codificantes de modo a permitir a expressão do produto desejado.
[0384] As sequências polinucleotídicas codificantes podem ser ainda ligadas operacionalmente a uma ou mais sequências reguladoras, opcionalmente em um vetor de expressão, de tal modo que a expressão ou a produção dos primeiro e segundo polipeptídeos seja viável e sob um controle adequado.
[0385] A(s) sequência(s) polinucleotídica(s) codificante(s) pode(m) ser inserida(s) em um vetor para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão, utilizando-se técnicas recombinantes conhecidas no estado da arte. Em outra forma de realização, o complexo polipeptídico e o complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui podem ser produzidos por recombinação homóloga conhecida no estado da arte. Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor (por exemplo, SV40, CMV, EF-1α) e uma sequência de finalização da transcrição.
[0386] O termo “vetor”, conforme utilizado neste documento, refere-se a um veículo no qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína pode ser operacionalmente inserido, de modo a provocar a expressão dessa proteína.
Normalmente, a construção também inclui sequências reguladoras apropriadas. Por exemplo, a molécula polinucleotídica pode incluir sequências reguladoras localizadas na região flanqueadora 5' da sequência nucleotídica que codifica o RNA guia e/ou a sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo modificador sítio-dirigido, ligado operacionalmente às sequências codificadoras de uma maneira capaz de expressar o transcrito/gene desejado em uma célula hospedeira. Um vetor pode ser usado para transformar, transduzir ou transfectar uma célula hospedeira, de modo a provocar a expressão do elemento genético que ela carrega dentro da célula hospedeira.
Exemplos de vetores incluem plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais, como o cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos, como fago lambda ou fago M13 e vírus de animais. As categorias de vírus animais usados como vetores incluem retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociado, herpesvírus (por exemplo, vírus do herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (por exemplo, SV40). Um vetor pode conter uma variedade de elementos para controlar a expressão, incluindo sequências promotoras, sequências de iniciação de transcrição, sequências intensificadoras, elementos selecionáveis e genes repórteres. Além disso, o vetor pode conter uma origem de replicação. Um vetor pode incluir também materiais para auxiliar a sua entrada na célula, incluindo, mas não se limitando a uma partícula viral, um lipossomo ou um revestimento de proteína.
[0387] Em algumas formas de realização, o sistema vetorial inclui sistemas de levedura, de mamíferos, bacterianos, etc. e compreende plasmídeos como, mas não limitado a pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO,pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 etc., e outros vetores laboratoriais e comercialmente disponíveis. Os vetores adequados podem incluir, plasmídeo, ou vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados de replicação defeituosa).
[0388] Os vetores compreendendo a(s) sequência(s) polinucleotídica(s) proporcionados aqui podem ser introduzidos em uma célula hospedeira para clonagem ou expressão de genes. A frase “célula hospedeira”, conforme aqui utilizada, refere-se a uma célula na qual um polinucleotídeo exógeno e/ou um vetor foi introduzido.
[0389] As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o DNA nos vetores citados aqui são as células procarióticas, leveduras ou eucarióticas superiores descritas acima. Procariotos adequados para esse fim incluem as eubactérias, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como os bacilos, tais como B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, e Streptomyces.
[0390] Além dos procariotos, micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vetores que codificam o complexo polipeptídico e o complexo polipeptídico biespecífico. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de panificação comum, é a mais comumente usada entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis aqui, como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces, como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K.
wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, e K. marxianus; Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, hospedeiros Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, como A. nidulans e A. niger.
[0391] Células hospedeiras adequadas para a expressão do complexo polipeptídico glicosilado, o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui é derivado de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Numerosas cepas e variantes baculovirais e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de frutas) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção está disponível publicamente, por exemplo, a variante L-1 do Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 do Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser utilizadas também como hospedeiros.
[0392] No entanto, o interesse tem sido maior em células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), como Expi293; células renais de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol Reprod 23: 243- 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de figado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); Células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); Células MRC 5; Células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[0393] As células hospedeiras são transformadas com a expressão descrita acima ou os vetores de clonagem podem ser cultivados em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os vetores de clonagem.
[0394] Para produção do complexo polipeptídico e do complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui, as células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis, como Ham’s F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.
102: 255 (1980), US Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ou 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou U.S. Pat. Re. 30.985 pode ser usado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como o medicamento GENTAMYCINTM), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas usadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para o técnico no assunto.
[0395] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona um método de expressão do complexo polipeptídico e do complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui, o qual compreende realizar a cultura da célula hospedeira proporcionada aqui sob a condição em que o complexo polipeptídico, ou o complexo polipeptídico biespecífico seja expresso.
[0396] Em certas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de produção do complexo polipeptídico proporcionado aqui, o qual compreende a) introduzir em uma célula hospedeira: um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-
terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do TCR e um segundo polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que: C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre C1 e C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica; b) permitir que a célula hospedeira expresse o complexo polipeptídico.
[0397] Em certas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de produção do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui, o qual compreende a) introduzir em uma célula hospedeira: um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do TCR, um segundo polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, e um ou mais polinucleotídeos adicionais que codificam uma segunda porção de ligação ao antígeno, em que: C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero de C1 e C2, a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno reduziram o pareamento incorreto do que seria de outro modo se a primeira porção de ligação ao antígeno fosse equivalente ao Fab natural, e o primeiro anticorpo tivesse uma primeira especificidade antigênica e o segundo anticorpo tivesse uma segunda especificidade antigênica, b) permitindo que a célula hospedeira expresse o complexo polipeptídico biespecífico.
[0398] Em certas formas de realização, o método compreende ainda isolar o complexo polipeptídico.
[0399] Ao usar técnicas recombinantes, o complexo polipeptídico, o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou secretado diretamente no meio. Se o produto é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os detritos particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) durante cerca de 30 min. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o produto é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são, em geral, primeiramente concentrados utilizando-se um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, como o PMSF, pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para impedir o crescimento de contaminantes estranhos.
[0400] O complexo polipeptídico e o complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui provenientes das células podem ser purificados usando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose, precipitação com sulfato de amônio, salting out e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferencial.
[0401] Onde o complexo polipeptídico ou do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui compreende domínio Fc de imunoglobulina, em seguida, a proteína A pode ser usada como um ligante de afinidade, dependendo da espécie e do isotipo do domínio Fc que está presente no complexo polipeptídico. A proteína A pode ser utilizada para a purificação de complexos polipeptídicos com base nas cadeias pesadas γ1, γ2, ou y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol Meth 62: 1- 13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567 1575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade está ligado é mais frequentemente a agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, como vidro de poro controlado ou poli (estirenodivinil) benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que os obtidos com a agarose.
[0402] Onde o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas, como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação por etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSETM, cromatografia em resina de troca aniônica ou catiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[0403] Após qual(is)quer etapa(s) preliminar(es) de purificação, a mistura compreendendo o complexo polipeptídico de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH usando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência, realizada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0-0,25 M de sal).
[0404] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser facilmente purificado com altos rendimentos utilizando- se métodos convencionais. Uma das vantagens do complexo polipeptídico biespecífico é o pareamento incorreto significativamente reduzido entre as sequências de domínio variável de cadeia pesada e de cadeia leve. Isso reduz a produção de subprodutos indesejados e torna possível obter produtos de alta pureza com altos rendimentos por meio do uso de processos de purificação relativamente simples.
Derivados
[0405] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico pode ser usado como a base de conjugação com os conjugados desejados.
[0406] Compreende-se que uma variedade de conjugados possa estar ligada ao complexo polipeptídico ou ao complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui (vide, por exemplo, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse e R.E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, Nova Iorque, (1989)).
Estes conjugados podem ser ligados ao complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico por ligação covalente, ligação por afinidade, intercalação, ligação coordenada, complexação, associação, mistura ou adição, entre outros métodos.
[0407] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser modificado de modo a conter sítios específicos fora da porção de ligação ao epítopo que podem ser utilizados para a ligação a um ou mais conjugados. Por exemplo, esse sítio pode incluir um ou mais resíduos de aminoácidos reativos, como por exemplo, resíduos de cisteína ou histidina, para facilitar a ligação covalente a um conjugado.
[0408] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico pode ser ligado a um conjugado indiretamente, ou indiretamente, por exemplo, através de outro conjugado ou através de um ligante.
[0409] Por exemplo, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico com um resíduo reativo, como a cisteína, pode ser ligado a um agente reativo ao tiol no qual o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um piridil dissulfeto, ou outro parceiro de conjugação tiol-reativo (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3: 2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).
[0410] Para outro exemplo, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico pode ser conjugado com biotina, depois indiretamente conjugado com um segundo conjugado que é conjugado à avidina. Ainda em outro exemplo, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico podem ser ligados a um ligante que se liga ainda ao conjugado. Exemplos de ligantes incluem agentes de acoplamento bifuncionais, como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (como dissuccinimidil suherato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazônio (como bis (p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6- diisocianato de tolueno) e compostos de flúor his-ativos (como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferenciais incluem N- succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-
737 (1978)) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)) pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação dissulfeto.
[0411] O conjugado pode ser um marcador detectável, uma porção de modificação farmacocinética, uma porção de purificação ou uma porção citotóxica.
Exemplos de marcadores detectáveis podem incluir marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, rodamina, dansilo, ficoeritrina, ou Texas Red), marcadores de enzimas-substrato (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, luceriferases, glucoamilase, lisozima, sacarídeo-oxidases ou β-D-galactosidase), radioisótopos (por exemplo, 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, e 32P, outros lantanídeos, marcadores luminescentes), porção cromofórica, digoxigenina, biotina/avidina, molécula de DNA ou ouro para detecção. Em certas formas de realização, o conjugado pode ser uma porção de modificação farmacocinética, como o PEG, que ajuda a aumentar a meia- vida do anticorpo. Outros polímeros adequados incluem, tais como carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol e similares. Em certas formas de realização, o conjugado pode ser uma porção de purificação, como uma esfera magnética. Uma “porção citotóxica” pode ser qualquer agente prejudicial para as células ou que pode danificar ou matar células. Exemplos de porção citotóxica incluem, sem limitação, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di- hidroxi-antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dihidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina e análogos dos mesmos, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclothosfamida, bussulfano, dibromomannitol,
estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antitimóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
[0412] Métodos para a conjugação de conjugados a proteínas como anticorpos, imunoglobulinas ou seus fragmentos são encontrados, por exemplo, na Patente U.S. No. 5,208,020; Pat. U.S. No. 6,441,163; WO2005037992; WO2005081711; e WO2006/034488, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade.
Composição farmacêutica
[0413] A presente divulgação também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0414] O termo “farmaceuticamente aceitável” indica que o carreador, veículo, diluente, excipiente(s) e/ou sal designado é, em geral, compatível química e/ou fisicamente com os outros ingredientes que compreendem a formulação e compatível fisiologicamente com o receptor do mesmo.
[0415] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não seja um ingrediente ativo, que tenha bioatividade aceitável e não seja tóxico para um indivíduo. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para uso nas composições farmacêuticas divulgadas aqui podem incluir, por exemplo, carreadores líquidos, gel ou sólidos, veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos, agentes de suspensão/dispersão, agentes sequestrantes ou quelantes, diluentes, adjuvantes, excipientes ou substâncias auxiliares não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, outros componentes conhecidos no estado da arte, ou várias combinações dos mesmos.
[0416] Os componentes adequados podem incluir, por exemplo, antioxidantes, cargas, aglutinantes, desintegrantes, tampões, conservantes, lubrificantes, aromatizantes, espessantes, corantes, emulsificantes ou estabilizadores, como açúcares e ciclodextrinas. Antioxidantes adequados podem incluir, por exemplo, metionina, ácido ascórbico, EDTA, tiossulfato de sódio, platina, catalase, ácido cítrico, cisteína, tioglicerol, ácido tioglicólico, tiosorbitol, hidroxanisol butilado, hidroxitolueno butilado e/ou galato de propila. Como divulgado neste documento, a inclusão de um ou mais antioxidantes como a metionina em uma composição farmacêutica proporcionada aqui diminui a oxidação do complexo polipeptídico ou do complexo polipeptídico biespecífico. Essa redução na oxidação evita ou reduz a perda de afinidade de ligação, melhorando a estabilidade das proteínas e maximizando a vida útil. Portanto, em certas formas de realização, são fornecidas composições que compreendem o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico divulgado aqui e um ou mais antioxidantes, como a metionina.
[0417] Para ilustrar ainda mais, carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, veículos aquosos, como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção isotônica de dextrose, injeção de água estéril ou injeção de Ringer com dextrose e lactato, veículos não aquosos, como óleos fixos de origem vegetal, óleo de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim ou óleo de amendoim, agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, agentes isotônicos, como cloreto de sódio ou dextrose, tampões, como tampões fosfato ou citrato, antioxidantes, como bissulfato de sódio, anestésicos locais, como cloridrato de procaína, agentes de suspensão e dispersão, tais como carboximetilcelulose sódica, hidroxipropilmetilcelulose, ou a polivinilpirrolidona, agentes emulsificantes, tais como Polissorbato 80 (TWEEN-80), agentes sequestrantes ou agentes quelantes, tais como
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou EGTA (etilenolicol ácido tetra-acético), álcool etílico, polietilenoglicol, propilenoglicol, hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático. Agentes antimicrobianos utilizados como carreadores podem ser adicionados a composições farmacêuticas em recipientes de doses múltiplas que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, metil e propil ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Excipientes adequados podem incluir, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Substâncias auxiliares não tóxicas adequadas podem incluir, por exemplo, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, estabilizantes, intensificadores de solubilidade ou agentes como acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina ou ciclodextrina.
[0418] As composições farmacêuticas podem ser uma solução líquida, suspensão, emulsão, pílula, cápsula, comprimido, formulação de liberação prolongada ou pó. As formulações orais podem incluir carreadores padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinil pirrolidona, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.
[0419] Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas são formuladas em uma composição injetável. As composições farmacêuticas injetáveis podem ser preparadas em qualquer forma convencional, como, por exemplo, solução líquida, suspensão, emulsão ou formas sólidas adequadas para gerar a solução, suspensão ou emulsão líquida. As preparações para injeção podem incluir soluções estéreis e/ou não piréticas prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, estéreis produtos insolúveis secos prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes do uso e emulsões estéreis e/ou não piréticas. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.
[0420] Em certas formas de realização, as preparações parentéricas em dose única são embaladas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha.
Todas as preparações para administração parentérica devem ser estéreis e antipiréticas, tal como é conhecido e praticado no estado da arte.
[0421] Em certas formas de realização, um pó esterilizado e liofilizado é preparado dissolvendo-se o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico, conforme divulgado aqui, em um solvente adequado. O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outros componentes farmacológicos do pó ou solução reconstituída preparada a partir do pó. Os excipientes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a água, dextrose, sorbital, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outro agente adequado. O solvente pode conter um tampão, tal como citrato, fosfato de sódio ou potássio ou outro tampão conhecido pelos técnicos no assunto, em uma forma de realização, aproximadamente em pH neutro. A filtração estéril subsequente da solução seguida de liofilização sob condições padrão conhecidas pelos técnicos no assunto gera uma formulação desejável. Em uma forma de realização, a solução resultante será distribuída em frascos para liofilização. Cada frasco pode conter uma dosagem única ou múltiplas dosagens do complexo polipeptídico, do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui ou da sua composição. O enchimento excessivo dos frascos com uma pequena quantidade acima da necessária para uma dose ou conjunto de doses (por exemplo, cerca de 10%) é aceitável, de modo a facilitar a retirada precisa da amostra e a dosagem precisa. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tais como cerca de 4°C até a temperatura ambiente.
[0422] A reconstituição de um pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso em administração parenteral. Em uma forma de realização, para reconstituição, a água estéril e/ou não pirética ou outro carreador líquido adequado é adicionado ao pó liofilizado. A quantidade precisa depende da terapia selecionada e pode ser determinada empiricamente.
Método de tratamento
[0423] Os métodos terapêuticos também são proporcionados, os quais compreendem: administrar uma quantidade eficaz do complexo polipeptídico ou do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui a um indivíduo que precisa do mesmo, tratando ou prevenindo uma condição ou distúrbio. Em certas formas de realização, o indivíduo foi identificado como portando um distúrbio ou condição passível de responder ao complexo polipeptídico ou do complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
[0424] “Tratar” ou “tratamento” de uma condição, tal como utilizada aqui, inclui prevenir ou aliviar uma condição, retardar o início ou a taxa de desenvolvimento de uma condição, reduzir o risco de desenvolver uma condição, impedir ou atrasar o desenvolvimento de sintomas associados a uma condição, reduzir ou eliminar os sintomas associados a uma condição, gerar uma regressão completa ou parcial de uma condição, curar uma condição ou alguma combinação das mesmas.
[0425] A quantidade terapeuticamente eficaz do complexo polipeptídico e do complexo polipeptídico biespecífico proporcionados aqui dependerá de vários fatores conhecidos no estado da arte, tais como, por exemplo, peso corporal, idade, histórico médico passado, medicamentos atuais, estado de saúde do paciente e potencial para reação cruzada, alergias, sensibilidades e efeitos colaterais adversos, bem como a via de administração e extensão do desenvolvimento da doença. As dosagens podem ser proporcionalmente reduzidas ou aumentadas por um técnico no assunto (por exemplo, médico ou veterinário), conforme indicado por estas e outras circunstâncias ou requisitos.
[0426] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser administrado em uma dosagem terapeuticamente eficaz de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg ou cerca de 100 mg/kg). Em algumas dessas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui é administrado em uma dosagem de cerca de 50 mg/kg ou menos, e em algumas dessas formas de realização a dosagem é de 10 mg/kg ou menos, 5 mg/kg ou menos, 1 mg/kg ou menos, 0,5 mg/kg ou menos, ou 0,1 mg/kg ou menos. Em certas formas de realização, a dosagem de administração pode mudar ao longo do curso do tratamento. Por exemplo, em certas formas de realização, a dosagem de administração inicial pode ser maior que as dosagens de administração subsequentes. Em certas formas de realização, a dosagem de administração pode variar ao longo do curso do tratamento, dependendo da reação do indivíduo.
[0427] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma dose única pode ser administrada ou várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo.
[0428] O complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser administrado por qualquer via conhecida no estado da arte, como, por exemplo, a parenteral (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal,
intravenosa, incluindo infusão intravenosa, injeção intramuscular ou intradérmica) ou não parenteral (por exemplo, orais, intranasais, intraoculares, sublinguais, retais ou tópicos).
[0429] Em certas formas de realização, a condição ou distúrbio tratado pelo complexo polipeptídico ou pelo complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui é o câncer ou condição cancerosa, doenças autoimunes, doenças infecciosas e parasitárias, doenças cardiovasculares, neuropatias, condições neuropsiquiátricas, lesões, inflamações, ou distúrbio de coagulação.
[0430] “Câncer” ou “condição cancerosa”, conforme usado neste documento, refere-se a qualquer condição médica mediada pelo crescimento, proliferação ou metástase de células neoplásicas ou malignas, e inclui cânceres sólidos e cânceres não sólidos, como a leucemia. “Tumor”, conforme utilizado neste documento, refere- se a uma massa sólida de células neoplásicas e/ou malignas.
[0431] Com relação ao câncer, “tratar” ou “tratamento” pode se referir à inibição ou lentificação do crescimento, proliferação ou metástase de células neoplásicas ou malignas, impedindo ou atrasando o desenvolvimento de crescimento, proliferação ou metástase de células neoplásicas ou malignas, ou alguma combinação dos mesmos. No que diz respeito a um tumor, “tratar” ou “tratamento” inclui a erradicação de todo ou parte de um tumor, inibindo ou retardando o crescimento e as metástases do tumor, impedindo ou atrasando o desenvolvimento de um tumor, ou alguma combinação dos mesmos.
[0432] Por exemplo, com relação ao uso do complexo polipeptídico ou complexo polipeptídico biespecífico divulgado aqui para tratar o câncer, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a dosagem ou concentração do complexo polipeptídico capaz de erradicar todo ou parte de um tumor, inibindo ou desacelerando o crescimento do tumor, inibindo o crescimento ou a proliferação de células mediando uma condição cancerosa, inibindo a metástase de células tumorais, melhorando qualquer sintoma ou marcador associado a um tumor ou condição cancerosa, impedindo ou atrasando o desenvolvimento de um tumor ou condição cancerosa ou alguma combinação dos mesmos.
[0433] Em certas formas de realização, as condições e distúrbios incluem tumores e cânceres, por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de células renais, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pâncreas, carcinoma gástrico, câncer de bexiga, câncer de esôfago, mesotelioma, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, sarcoma, câncer de próstata, glioblastoma, câncer de colo do útero, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micoses fungoides, câncer de células de Merkel e outras doenças hematológicas malignas, tais como linfoma de Hodgkin clássico (CHL), linfoma primário de grandes células mediastinais, linfoma de células B/rico em histiócitos/células T, PTLD positivo e negativo para EBV e linfoma difuso de grandes células B associado a EBV (DLBCL), linfoma plasmablástico, linfoma extranodal de células NK/T, carcinoma nasofaríngeo e linfoma de derrame primário associado ao HHV8, linfoma de Hodgkin, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), como linfoma primário do SNC, tumor no eixo espinhal, glioma do tronco cerebral.
[0434] Em certas formas de realização, as condições e distúrbios incluem uma doença ou condição relacionada ao CD19, como linfoma de células B, opcionalmente linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin, em que o linfoma não Hodgkin compreende: Linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular, linfoma de células B da zona marginal (MZL), linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico pequeno (leucemia linfocítica crônica, LLC) ou linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) ou Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM).
[0435] Em certas formas de realização, as condições e distúrbios incluem as condições hiperproliferativas ou doenças infecciosas que podem ser tratadas através da regulação da resposta imune por CTLA-4 e/ou PD-1. Exemplos de condições hiperproliferativas incluem, mas não estão limitados aos tumores sólidos, cânceres hematológicos, tumores de tecidos moles e lesões metastáticas.
[0436] O complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico podem ser administrados isoladamente ou em combinação com um ou mais meios ou agentes terapêuticos adicionais.
[0437] Em certas formas de realização, quando utilizado para tratamento de câncer ou tumor ou doença proliferativa, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui pode ser administrado em combinação com a quimioterapia, radioterapia, cirurgia para o tratamento de câncer (por exemplo, tumorectomia), um ou mais antieméticos ou outros tratamentos para complicações decorrentes da quimioterapia ou qualquer outro agente terapêutico para uso no tratamento do câncer ou qualquer distúrbio médico relacionado. “Administrado em combinação”, conforme utilizado neste documento, inclui administrar simultaneamente como parte da mesma composição farmacêutica, ao mesmo tempo como composições separadas, ou em diferentes momentos como composições separadas. Uma composição que é administrada antes ou depois de outro agente é considerada administrada “em combinação” com esse agente, conforme a frase utilizada neste documento, mesmo que a composição e o segundo agente sejam administrados por diferentes vias. Quando possível, agentes terapêuticos adicionais administrados em combinação com o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui são administrados de acordo com o esquema listado na folha de informações do produto do agente terapêutico adicional, ou de acordo com a Physicians' Desk Reference, 70ª Edição (2016) ou protocolos bem conhecidos no estado da arte.
[0438] Em certas formas de realização, os agentes terapêuticos podem induzir ou aumentar a resposta imune contra o câncer. Por exemplo, uma vacina contra tumores pode ser usada para induzir a resposta imune a certos tumores ou câncer. A terapia com citocinas pode ser usada também para melhorar a apresentação dos antígenos tumorais ao sistema imune. Exemplos de terapia com citocinas incluem, sem limitação, interferons, como o interferon-α, -β e -γ, fatores estimuladores de colônias, como CSF de macrófagos, CSF de macrófagos e granulócitos, CSF de granulócitos, interleucinas como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-12, fatores de necrose tumoral, como como TNF-α e TNF-β. Os agentes que inativam alvos imunossupressores também podem ser utilizados como, por exemplo, os inibidores de TGF-beta, inibidores de IL-10 e inibidores de Fas ligante.
Outro grupo de agentes inclui aqueles que ativam a resposta imune contra células tumorais ou cancerosas, por exemplo, aumentando a ativação de células T (por exemplo, agonista de moléculas coestimulatórias de células T, como CTLA-4, ICOS e OX-40), e aumentando a função da célula dendrítica e a apresentação de antígenos.
Kits
[0439] A presente divulgação proporciona ainda kits compreendendo o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui.
Em algumas formas de realização, os kits são úteis para detectar a presença ou nível de, ou capturar ou enriquecer um ou mais alvos de interesse em uma amostra biológica. A amostra biológica pode compreender uma célula ou um tecido.
[0440] Em alguns exemplos, o kit compreende o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui, o qual é conjugado com um marcador detectável. Em certas outras formas de realização, o kit compreende um complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico não marcado proporcionado aqui e compreende ainda um anticorpo secundário marcado que é capaz de se ligar ao complexo polipeptídico ou ao complexo polipeptídico biespecífico não marcado proporcionado aqui. O kit pode compreender ainda uma instrução de uso e uma embalagem que separa cada um dos componentes no kit.
[0441] Em certas formas de realização, o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico proporcionado aqui está associado a um substrato ou dispositivo. Substrato ou dispositivo útil pode ser, por exemplo, esferas magnéticas, placas de microtitulação, ou tira de teste. Estes podem ser uteis para um ensaio de ligação (como ELISA), um ensaio imunográfico, captura ou enriquecimento de uma molécula alvo em uma amostra biológica.
[0442] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar melhor a invenção reivindicada e não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.
Todas as composições, materiais e métodos específicos descritos abaixo, no todo ou em parte, se enquadram no escopo da presente invenção. Essas composições, materiais e métodos específicos não tem a intenção de limitar a invenção, mas apenas a de ilustrar as formas de realização específicas que se enquadram no escopo da invenção. Um técnico no assunto pode desenvolver composições, materiais e métodos equivalentes sem o exercício da capacidade inventiva e sem se afastar do escopo da invenção. Deve-se entender que muitas variações podem ser feitas nos procedimentos descritos aqui enquanto permanecem ainda dentro dos limites da presente invenção. É intenção dos inventores que tais variações estejam incluídas dentro do escopo da invenção.
TABELA 11. Desenhos e nomes das regiões constantes quiméricas (CBeta/CAlfa) SEQ ID NOs: Desenhos modelos baseados na Tabela (Cadeia Pesada (HC)/Cadeia Leve (LC))- 16 IgG1 Design_1 177/176 Design_2 179/178 Design_3 184/183 Design_4 185/183 Design_5 180/176
SEQ ID NOs: Desenhos modelos baseados na Tabela (Cadeia Pesada (HC)/Cadeia Leve (LC))- 16 IgG1
Design_6 181/178
Design_6a 182/178
Design_7 184/186
Design_8 185/186
TABELA 12. Domínios e SEQ ID NOs. das regiões constantes quiméricas
(CBeta/CAlfa) Nome da região Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. constante Primeiro ou Terceiro domínio de quimérica e SEQ Domínio constante do Domínio de segundo domínio junção + dobradiça ID NOs. da TCR (C1 ou C2) Dimerização (D) de junção (CJ) (CJ') cadeia Design_1 HC HCJ1 CBeta (S56C) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 177 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_1 LC LCJ1 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:43 Design_2 HC HCJ2 CBeta (S56C) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 179 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_2 LC LCJ2 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:43 Design_3 HC HCJ3 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 Design_3 LC LCJ3 CBeta (S56C) SEQ ID NO:33 + SEQ ID NO: 183 SEQ ID NO:308 NO:306 Design_4 HC HCJ4 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: 185 SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 Design_4 LC LCJ3 CBeta (S56C) SEQ ID NO:33 + SEQ ID NO: 183 SEQ ID NO:308 NO:306 Design_5 HC HCJ1 CBeta (S56C) (FG-) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_5 LC LCJ1 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:43 Design_6 HC HCJ1 CBeta (S56C)(FG-) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 181 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_6 LC LCJ2 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:43 Design_6a HC HCJ2 CBeta (S56C) (DE-FG-) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_6a LC LCJ2 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:43 Design_7 HC HCJ3 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 Design_7 LC LCJ3 CBeta (S56C)(FG-) SEQ ID NO:37 + SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO:308 NO:306 Design_8 HC HCJ4 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: 185 SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302
Nome da região Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. constante Primeiro ou Terceiro domínio de quimérica e SEQ Domínio constante do Domínio de segundo domínio junção + dobradiça ID NOs. da TCR (C1 ou C2) Dimerização (D) de junção (CJ) (CJ') cadeia Design_8 LC LCJ3 CBeta (S56C)(FG-) SEQ ID NO:37 + SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO:308 NO:306
TABELA 13. Desenhos e nomes do Design_2 (CBeta/CAlfa) sem sítios de glicosilação SEQ ID NO: (HC-CBeta/LC-CAlfa) Amostra HC/LC 188/187 (IgG1) Design_2-QQQQ 196/187 (IgG4)
Design_2-AAAA 190/189 (IgG1)
Design_2-QSKE 192/191 (IgG1)
Design_2-ASKE 192/193 (IgG1)
Design_2-QQQQQ 195/194 (IgG1)
TABELA 14. Domínios e SEQ ID NOs. do Design_2 (CBeta/CAlfa) sem sítios de glicosilação Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e Primeiro ou Terceiro domínio SEQ ID Domínio constante do Domínio de segundo domínio de junção + NOs. da TCR (C1 ou C2) Dimerização (D) de junção (CJ) dobradiça (CJ') cadeia: Design_2- QQQQ HCJ2 CBeta (S56C) (N69Q) CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC SEQ ID NO: SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 188 Design_2- CAlpha (T49C) QQQQ LCJ2 (N34Q+N68Q+ N79Q) (IgG1) LC SEQ ID NO: SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:44 187 Design_2- QQQQ HCJ2 CBeta (S56C) (N69Q) CJ'1G4 FcG4 (IgG4) HC SEQ ID NO: SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:303 196 Design_2- CAlpha (T49C) QQQQ LCJ2 (N34Q+N68Q+ N79Q) (IgG4) LC SEQ ID NO: SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:44 187
Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e Primeiro ou Terceiro domínio SEQ ID Domínio constante do Domínio de segundo domínio de junção + NOs. da TCR (C1 ou C2) Dimerização (D) de junção (CJ) dobradiça (CJ') cadeia: Design_2- AAAA HCJ2 CBeta (S56C) (N69A) CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC SEQ ID NO: SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 190 Design_2- CAlpha (T49C) AAAA LCJ2 (N34A+N68A+ N79A) (IgG1) LC SEQ ID NO: SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:45 189 Design_2- QSKE HCJ2 CBeta (S56C) (N69E) CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC SEQ ID NO: SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 192 Design_2- CAlpha (T49C) QSKE LCJ2 (N34Q+N68S+ N79K) (IgG1) LC SEQ ID NO: SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:46 191 Design_2- ASKE HCJ2 CBeta (S56C) (N69E) CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC SEQ ID NO: SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 192 Design_2- CAlpha (T49C) ASKE LCJ2 (N34A+N68S+ N79K) (IgG1) LC SEQ ID NO: SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:47 191 Design_2- QQQQQ HCJ2 CBeta (S56C) (N69Q) CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC SEQ ID NO: SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 195 Design_2- CAlpha (T49C) QQQQQ LCJ2 (N34Q+N68Q+ (IgG1) LC N79Q+N61Q) SEQ ID NO: SEQ ID NO:52 SEQ ID NO: 48 194
TABELA 15. Desenhos e nomes das regiões constantes quiméricas
(CBeta/CPré-Alfa) Modelos baseados Arquivo da sequência SEQ ID NOs: na Tabela 16 (IgG1) Design_1_Pre_TCR_ Conjunction’1 198/197 Design_2_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys10 200/199 Design_3_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys11 202/201 Design_4_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys12 203/201 Pre-TCR_Design_B Design_5_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys13 203/204 Design_6_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys14 205/204 Design_7_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys15 206/204 Design_8_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys1_4L4T_1 208/207
Design_9_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys2_4L4T_2 208/209 Design_10_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys4 211/210 Pre-TCR_Design_5_crossed_1 213/212 Pre-TCR_Design_C Pre-TCR_Design_6_crossed_1 213/215 Pre-TCR_Design_5_crossed_2 214/212 Pre-TCR_Design_D Pre-TCR_Design_6_crossed_2 214/215 TABELA 16. Domínios e SEQ ID NOs. das regiões constantes quiméricas (CBeta/CPré-Alfa) Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e SEQ Primeiro ou Terceiro domínio Domínio de Domínio constante do TCR ID NOs. da segundo domínio de junção + Dimerização (C1 ou C2) cadeia: de junção (CJ) dobradiça (CJ') (D) Design_1_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (N69Q) CJ'1G1 FcG1 1 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 198 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:84 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_1_Pre_T CR_ LCJB CPreAlpha (N50Q) Conjunction’1 LC SEQ ID NO: 197 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:83 Design_2_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (S76C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys10 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:319 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_2_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (Y59C)(N50Q) _1_Cys10 LC SEQ ID NO: 199 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:311 Design_3_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (F13C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys11 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:320 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_3_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (A13C)(N50Q) _1_Cys11 LC SEQ ID NO: 201 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:312 Design_4_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (S16C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys12 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 203 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:321 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_4_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (A13C)(N50Q) _1_Cys12 LC SEQ ID NO: 201 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:312 Design_5_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (S16C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys13 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 203 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:321 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_5_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q) _1_Cys13 LC SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:313
Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e SEQ Primeiro ou Terceiro domínio Domínio de Domínio constante do TCR ID NOs. da segundo domínio de junção + Dimerização (C1 ou C2) cadeia: de junção (CJ) dobradiça (CJ') (D) Design_6_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (A18C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys14 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:322 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_6_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q) _1_Cys14 LC SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:313 Design_7_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (E19C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys15 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 206 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:323 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_7_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q) _1_Cys15 LC SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:313 Design_8_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (S56C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys1_4L4T_1
HC
SEQ ID SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_8_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (S62C)(N50Q) _1_Cys1_4L4T_1
LC SEQ ID NO: 207 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:314 Design_9_Pre_T CR_Conjunction’ HCJB CBeta (S56C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 _1_Cys2_4L4T_2
HC
SEQ ID SEQ ID NO: 207 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_9_Pre_T CR_Conjunction’ LCJB CPreAlpha (T65C)(N50Q) _1_Cys2_4L4T_2
LC SEQ ID NO: 209 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:315 Design_10_Pre_ TCR_Conjunction HCJB CBeta (A11C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1 ’_1_Cys4 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 211 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:324 SEQ ID NO:53 NO:302 Design_10_Pre_ TCR_Conjunction LCJB CPreAlpha (I16C)(N50Q) ’_1_Cys4 LC SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO:309 SEQ ID NO:316 Pre- TCR_Design_5_c rossed_1 HC SEQ ID NO: 213 HCJC CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1 Pre-
SEQ ID TCR_Design_5_c SEQ ID NO:132 SEQ ID NO:313 SEQ ID NO: 134 NO:302 rossed_1 LC SEQ ID NO: 212 LCJC Cbeta (N69Q, S16C)
Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e SEQ Primeiro ou Terceiro domínio Domínio de Domínio constante do TCR ID NOs. da segundo domínio de junção + Dimerização (C1 ou C2) cadeia: de junção (CJ) dobradiça (CJ') (D) Pre- TCR_Design_6_c SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:321+ 306 rossed_1 HC SEQ ID NO: 213 Pre- TCR_Design_6_c HCJC CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G4 FcG4 rossed_1 LC
SEQ ID SEQ ID NO:215 SEQ ID NO:132 SEQ ID NO:313 SEQ ID NO: 134 NO:303 Pre- TCR_Design_5_c LCJC CBeta (N69Q, A18C) rossed_2 HC SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:322+ 306 Pre- TCR_Design_5_c rossed_2 LC SEQ ID NO: 212 HCJD CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1 Pre-
SEQ ID TCR_Design_6_c SEQ ID NO:133 SEQ ID NO:313 SEQ ID NO: 134 NO:302 rossed_2 HC SEQ ID NO: 214 LCJC Cbeta (N69Q, S16C) Pre- TCR_Design_6_c SEQ ID NO:50 SEQ ID NO: NO:321+ 306 rossed_2 LC SEQ ID NO: 215 HCJD CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1 TABELA 17. Desenhos e nomes das regiões constantes quiméricas (CGama/CDelta) Modelos baseados Construção de Desenho SEQ ID NOs nas HC/LC na Tabela 13 (IgG1) dg_Design_1 dg_Design_1 234/233 dg_Design_2 232/231 dg_Design_2_no_Glyco 216/215 dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco 218/217 dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco 220/219 dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco 222/221 dg_Design_2 dg_Design_2_Cys2_no_Glyco 224/223 dg_Design_2_Cys1_no_Glyco 226/225 dg_Design_2_Cys3_no_Glyco 227/223 dg_Design_2_Cys4_no_Glyco 229/228 dg_Design_2_Cys5_no_Glyco 229/230 dg_Design_3 dg_crossed_Design_1 236/235 dg_Design_4 dg_crossed_Deisng_2 238/237 TABELA 18. Domínios e SEQ ID NOs. das regiões constantes quiméricas (CGama/CDelta)
Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e SEQ Primeiro ou segundo Terceiro domínio de Domínio de Domínio constante do ID NOs. da domínio de junção junção + dobradiça Dimerização TCR (C1 ou C2) cadeia: (CJ) (CJ') (D) dg_Design_1 HC HCJ4 CGamma CJ'3G1 FcG1
SEQ ID SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:113 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_1 LC LCJ4 CDelta SEQ ID NO: 233 SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:310 dg_Design_2 HC HCJ5 CGamma CJ'3G1 FcG1
SEQ ID SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:113 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2 LC LCJ5 CDelta SEQ ID NO: 231 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:115 dg_Design_2_no HCJ5 CGamma (N65Q) CJ'3G1 FcG1 _Glyco HC
SEQ ID SEQ ID NO:216 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:114 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_no LCJ5 CDelta (N16Q+N79Q) _Glyco LC SEQ ID NO: 215 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:116 dg_Design_2_hy CGamma (T12C) peCys1_no_Glyc HCJ5 CJ'3G1 FcG1 (N65Q) o HC
SEQ ID SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:333 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_hy peCys1_no_Glyc LCJ5 CDelta (N16C) (N79Q) o LC SEQ ID NO:217 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:325 dg_Design_2_hy CGamma (Q57C) peCys2_no_Glyc HCJ5 CJ'3G1 FcG1 (N65Q) o HC
SEQ ID SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:334 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_hy CDelta (V50C) (N16Q peCys2_no_Glyc LCJ5 + N79Q) o LC SEQ ID NO: 219 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:326 dg_Design_2_hy CGamma (M62C) peCys3_no_Glyc HCJ5 CJ'3G1 FcG1 (N65Q) o HC
SEQ ID SEQ ID NO:222 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:335 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_hy CDelta (D46C) (N16Q peCys3_no_Glyc LCJ5 + N79Q) o LC SEQ ID NO:221 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:327 dg_Design_2_Cy CGamma (S17C) HCJ5 CJ'3G1 FcG1 s2_no_Glyco HC (N65Q)
SEQ ID SEQ ID NO:224 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:336 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_Cy CDelta (F12C) (N16Q + LCJ5 s2_no_Glyco LC N79Q) SEQ ID NO: 223 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:328 dg_Design_2_Cy CGamma (F14C) HCJ5 CJ'3G1 FcG1 s1_no_Glyco HC (N65Q)
SEQ ID SEQ ID NO:226 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:337 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_Cy CDelta (M14C) (N16Q LCJ5 s1_no_Glyco LC + N79Q)
Nome do Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. complexo e SEQ Primeiro ou segundo Terceiro domínio de Domínio de Domínio constante do ID NOs. da domínio de junção junção + dobradiça Dimerização TCR (C1 ou C2) cadeia: (CJ) (CJ') (D) SEQ ID NO: 225 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:329 dg_Design_2_Cy CGamma (E20C) HCJ5 CJ'3G1 FcG1 s3_no_Glyco HC (N65Q)
SEQ ID SEQ ID NO: 227 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:338 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_Cy CDelta (F12C) (N16Q + LCJ5 s3_no_Glyco LC N79Q) SEQ ID NO: 223 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:328 dg_Design_2_Cy CGamma (A19C) HCJ5 CJ'3G1 FcG1 s4_no_Glyco HC (N65Q)
SEQ ID SEQ ID NO: 229 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:339 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_Cy CDelta (F87C) (N16Q + LCJ5 s4_no_Glyco LC N79Q) SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:330 dg_Design_2_Cy CGamma (A19C) HCJ5 CJ'3G1 FcG1 s5_no_Glyco HC (N65Q)
SEQ ID SEQ ID NO: 229 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:339 SEQ ID NO:121 NO:302 dg_Design_2_Cy CDelta (E88C) (N16Q LCJ5 s5_no_Glyco LC + N79Q) SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:331 dg_crossed_Desi HCJ6 CDelta CJ'4G1 FcG1 gn_1 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO:123 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO:127 NO:302 dg_crossed_Desi LCJ6 CGamma gn_1 LC SEQ ID NO: 235 SEQ ID NO:125 SEQ ID NO:340 dg_crossed_Desi HCJ7 CDelta CJ'4G1 FcG1 gn_2 HC
SEQ ID SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO:124 SEQ ID NO:332 SEQ ID NO:127 NO:302 dg_crossed_Desi LCJ7 CGamma gn_2 LC SEQ ID NO: 237 SEQ ID NO:126 SEQ ID NO:340 TABELA 19. Sequências para os exemplos de regiões constantes quiméricas Desenhos Modelos Tipo de SEQ ID Sequências CAlfa/CBeta Cadeia NO
KRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF LCJ1- DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 176 CAlpha (T49C) SNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF
PSPESS Design_1 SSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL (IgG1) HCJ1- VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD normal CBeta PQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQN HC 177 (S56C)- PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ CJ’1G1- IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS Fc(G1) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF LCJ2- DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 178 CAlpha (T49C) SNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF
PSPESS LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_2 PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ (IgG1) HCJ2- IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS normal CBeta VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE HC 179 (S56C)- CJ’1G1- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Fc(G1) YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
KRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF LCJ1- DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 176 CAlpha (T49C) SNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF
PSPESS SSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_5 PRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKT (IgG1) HCJ1- normal CBeta HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI (S56C)(FG- SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE HC 180 DE+)- VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW CJ’1G1- LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Fc(G1)
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF LCJ2- DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 178 CAlpha (T49C) SNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF
PSPESS LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_6 PRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKT (IgG1) HCJ2- normal CBeta HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI (S56C)(FG- SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE HC 181 DE+)- VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW CJ’1G1- LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP Fc(G1)
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF LCJ2- DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 178 CAlpha (T49C) SNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF
PSPESS LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQSGRYALSSRLRVSATFWQNPRNH Design_6a FRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCP (IgG1) HCJ2- normal CBeta PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP (S56C)(FG- EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA HC 182 DE+)- KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK CJ’1G1- EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ Fc(G1)
VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKAT LCJ3- LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT LC 183 CBeta DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ (S56C) NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT
QIVSAEAWGRA SSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD
FDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF Design_3 KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF (IgG1) crossed HCJ2- FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CBeta FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE (S56C)(FG- HC 184 DE-)-
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CJ’1G1- VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI Fc(G1) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKAT LCJ4- LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT LC 183 CBeta DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ (S56C) NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT
QIVSAEAWGRA SSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD
FDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF Design_4 KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF (IgG1) crossed HCJ4-
FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CAlpha FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE HC 185 (T49C)- VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CJ’2G1- VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI Fc(G1) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ3- KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKAT Design_7 LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT CBeta (IgG1) LC 186 crossed (S56C)(FG- DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ DE+) NPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
SSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD FDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF
KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF HCJ3-
FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CAlpha FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE HC 184 (T49C)- VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CJ’2G1- VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI Fc(G1) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ4- KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKAT CBeta LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT LC 186 (S56C)(FG- DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ DE+) NPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
SSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD
FDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF Design_8 KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF (IgG1) HCJ4-
FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL crossed CAlpha FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE HC 185 (T49C)- VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV CJ’2G1- VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI Fc(G1) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ2- KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF CAlpha DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 187 (T49C) (N34Q+N68
SNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFF Q+ N79Q) PSPESS
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_2- PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJ2- QQQQ (IgG1) IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta (S56C) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE HC 188 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ2- KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF CAlpha DSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 189 (T49C) (N34A+N68
SNSAVAWSAKSDFACANAFANSIIPEDTFF A+ N79A) PSPESS
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL Design_2- AAAA (IgG1) HCJ2- VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD CBeta PQPLKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQN (S56C) HC 190 (N69A)-
PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ CJ’1G1- IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS Fc(G1) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ2- KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF CAlpha DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 191 (T49C) (N34Q+N68
SNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFF S+ N79K) PSPESS
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_2- PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJ2- QSKE (IgG1) IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta (S56C) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE HC 192 (N69E)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ2- KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF CAlpha DSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 193 (T49C) ( N34A+N68
SNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFF S+ N79K) PSPESS
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_2- PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ ASKE (IgG1) HCJ2- IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE HC 192 (S56C)(N69 E)-CJ’1G1- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Fc(G1) YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJ2- KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF CAlpha DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK (T49C) LC 194 SQSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFF (N34Q+N68 Q+ N79Q+ PSPESS N61Q)
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL Design_2- VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
QQQQQ PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN HCJ2- (IgG1) PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ CBeta (S56C) IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS HC 195 (N69Q)- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE CJ’1G1- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Fc(G1)
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF
DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFK LC 187
SNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFF PSPESS LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD
PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_2- PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJ2- QQQQ (IgG4) CBeta IVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (S56C) FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE HC 196 (N69Q)- VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV CJ’1G4- VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI Fc(G4)
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Desenhos de Nome da SEQ ID Pré-Alfa- Beta Cadeia NO Sequências
KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 197 CPreAlpha (N50Q) GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV
CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD
PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN Design_1_Pr PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ e_TCR_Conj HCJB- unction’1 IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE HC 198 (N69Q)- CJ’1G1- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Fc(G1) YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LCJB- KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVV CPreAlpha CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTC LC 199 (Y59C) GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD Design_2_Pr PQPLKEQPALQDSRYALCSRLRVSATFWQN e_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys CBeta IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS 10 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (S76C) HC 200 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
VL(CD3)- KPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 201 CPreAlpha (A13C)
GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVAVCEPSEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD Design_3_Pr PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN e_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta 11 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (F13C) HC 202 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 201 CPreAlpha (A13C)
GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD Design_4_Pr PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN e_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta 12 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (S16C) HC 203 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 204 CPreAlpha (S11C)
GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD Design_5_Pr PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN e_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta 13 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (S16C) HC 203 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Design_6_Pr VL(CD3)- KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY e_TCR_Conj LC 204 CPreAlpha unction’1_Cys (S11C)
GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV 14 CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART (N50Q)
LEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN HCJB-
PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ CBeta IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS (A18C) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE HC 205 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 204 CPreAlpha (S11C)
GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEACISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD Design_7_Pr PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN e_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta 15 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (E19C) HC 206 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 207 CPreAlpha (S62C)
GPCPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD Design_8_Pr PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN e_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta 1_4L4T_1 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (S56C) HC 208 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 209 CPreAlpha (T65C)
GPSPACDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV Design_9_Pr CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART (N50Q) e_TCR_Conj unction’1_Cys HCJB- LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL CBeta VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTD 2_4L4T_2 (S56C) HC 208 (N69Q)-
PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN CJ’1G1- PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ Fc(G1) IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KPTGVGGTPFPSLAPPCMLLVDGKQQMVVV LCJB- CLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTY LC 210 CPreAlpha (I16C)
GPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLV (N50Q) CHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
LEDLKNVFPPEVCVFEPSEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD Design_10_P PQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQN re_TCR_Conj PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQ HCJB- unction’1_Cys IVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPS CBeta 4 VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (A11C) HC 211 (N69Q)- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CJ’1G1- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Fc(G1)
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKAT HCJB- LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST CBeta Leve 212 (N69Q,
DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ S16C)- NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT CJ’1G QIVSAEAWGRA
SSASGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT
YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL Pre- TCR_Design_
VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTS 5_crossed_1 HCJC- DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT Pesada CPreAlpha LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD (Junção mais 213 (S11C, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH anticorpo) N50Q) - QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CJ’2G1- Fc
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- KLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKAT HCJB- LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST CBeta Leve 212 DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ (N69Q, S16C)- NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT CJ’1G QIVSAEAWGRA Pre- SSPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVV TCR_Design_ 5_crossed_2 VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT HCJD- YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL Pesada CPreAlpha (Junção mais 214 VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTS (S11) - Pré-TCR) DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT CJ’2G1- Fc
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)-
KLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKAT LCJC- LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST Leve 215 CBeta DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ Pre- (A18C, NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT TCR_Design_ N69Q) QIVSAEAWGRA 6_crossed_1 Pesada (Junção mais 213 anticorpo)
KLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKAT
LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST Leve 215 DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ Pre- TCR_Design_ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT 6_crossed_2 QIVSAEAWGRA Pesada (Junção mais 214 TCR) Desenhos Nome da SEQ ID Delta- Gama Cadeia NO Sequências VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA LC 215 CDelta (N16Q+N79
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE Q) TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE
GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI dg_Design_2 VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC _no_Glyco HCJ5- PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma- TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 216 CJ’3G1- Fc(G1) KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY (N65Q) KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKCGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA LC 217 CDelta
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE (N16C) (N79Q)
TDKQLDADVSPKPCIFLPSIAETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 _hypeCys1_n
GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI HCJ5- o_Glyco CGamma VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC (T12C) PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV HC 218 (N65Q)- TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT CJ’3G1- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY Fc(G1)
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNA CDelta LC 219 (V50C)
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCE dg_Design_2 GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _hypeCys2_n VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- o_Glyco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (Q57C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 220 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFCPAIVISPSGKYNA CDelta LC 221 (D46C)
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 GNTCKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _hypeCys3_n VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- o_Glyco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (M62C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 222 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta LC 223 (F12C)
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTIFLPCIAETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _Cys2_no_Gl VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- yco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (S17C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 224 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVCKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta LC 225 (M14C)
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTICLPSIAETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _Cys1_no_Gl VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- yco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (F14C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 226 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta LC 223 (F12C)
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTIFLPSIACTKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _Cys3_no_Gl VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- yco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (E20C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 227 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta LC 228 VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDCE (F87C) (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _Cys4_no_Gl VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- yco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (A19C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 229 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta LC 230 (E88C)
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFC (N16Q + N79Q)
TDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGT
YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE dg_Design_2 GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI _Cys5_no_Gl VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC HCJ5- yco PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma (A19C) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 229 (N65Q)- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CJ’3G1- KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY Fc(G1)
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- EPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYP LC 231 LCJ5- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta VKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE GNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI
VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC dg_Design_2 HCJ5- PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma- TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 232 CJ’3G1- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY Fc(G1) KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK VL(CD3)- KPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYP LC 233 LCJ4- KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNA CDelta VKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
SSASLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQE GNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI
VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPC dg_Design_1 HCJ4- PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CGamma- TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT HC 234 CJ’3G1- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY Fc(G1) KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
KDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT VL(CD3)- YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCE LC 235 LCJ6- dg_crossed_ CGamma
GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI Design_1 VRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD HCJ6-
SSRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP HC 236 KDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNA CDelta-
CJ’4G1- VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDEPK Fc(G1) SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK
DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
KDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT VL(CD3)- YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCE LC 237 LCJ7- CGamma GNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI
VRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYP KDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNA
VKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDEPK dg_crossed_ Design_2
SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK HCJ7- DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY CDelta- HC 238 VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV CJ’4G1- Fc(G1) LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSPGK TABELA 20. Sequências para os exemplos de complexos peptídicos Desenhos Nome da SEQ ID Sequências Alfa-Beta Cadeia No
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ1- LC 1 CAlpha
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKRTVAAPDP (T49C) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS
KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY
NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED T3-Design_1 TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSA (IgG1) SKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL normal ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP VH(CD3)- LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HCJ1- HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 2 CBeta(S56 C)-CJ’1G1- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL Fc(G1) FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK T3-Design_2 VL(CD3)- DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL LC 3 (IgG1) LCJ2- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR normal CAlpha QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA (T49C) VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL
ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP VH(CD3)- LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HCJ2- HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 4 CBeta(S56 C)-CJ’1G1- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL Fc(G1) FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ1- LC 1 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKRTVAAPDP CAlpha (T49C) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS
KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSA T3-Design_5 (IgG1)
SKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL normal VH(CD3) - ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP HCJ1- LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTC HC 5 C)(FG- DE+)- PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT CJ’1G1- PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN Fc(G1) AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ2- LC 3 CAlpha
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP T3-Design_6 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS (T49C) (IgG1) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN normal
KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS VH(CD3) – QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT HC 6 HCJ2- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY CBeta(S56
C)(FG- NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED DE+)- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED CJ’1G1- Fc(G1)
LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ2- LC 3 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP CAlpha (T49C) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS
KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED T3-Design_6a LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL (IgG1) ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP normal VH(CD3) – LKEQ--SG-- HCJ2- RYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYP CBeta(S56 HC 7 SNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAG C)(FG-DE-)- CJ’1G1- GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV Fc(G1) SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VL(CD3)- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVF LCJ3- LC 8 CBeta(S56
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY C) PDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP
ALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ T3-Design_3 VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG (IgG1) crossed RA
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT VH(CD3) - HCJ3- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY CAlpha NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED HC 9 (T49C)- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSA CJ’2G1- SIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDS Fc(G1)
QTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSN SAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPS PESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VL(CD3)- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVF LCJ4- LC 8 PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY CBeta(S56 C) PDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP
ALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG RA QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT
DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY T3-Design_4 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED (IgG1) TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSP crossed DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDS VH(CD3) – QTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSN HCJ4- SAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPS CAlpha HC 10 PESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP (T49C)- CJ’2G1- KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF Fc(G1) NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ3- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVF LC 11 CBeta(S56 PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY C)(FG-DE+) PDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP
ALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYPSNQIVSAEAWGRA
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT T3-Design_7 DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY (IgG1) NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED crossed TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSA VH(CD3) – HCJ3- SIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDS CAlpha QTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSN HC 9 (T49C)- SAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPS CJ’2G1- PESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP Fc(G1)
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ4- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVF LC 11 CBeta(S56 PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY C)(FG-DE+) PDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP
ALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYPSNQIVSAEAWGRA QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY
NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED T3-Design_8 TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSP (IgG1) DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDS crossed VH(CD3) – QTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSN HCJ4- SAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPS CAlpha HC 10 PESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP (T49C)- CJ’2G1- KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF Fc(G1) NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ2- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CAlpha LC 12 (T49C)
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP (N34Q+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS Q+ N79Q) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED T3-Design_2- LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL QQQQ (IgG1) ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP VH(CD3)- HCJ2- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 13 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL LCJ2- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR T3-Design_2- LC 14 AAAA (IgG1) CAlpha QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA (T49C) VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP
(N34A+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQS A+ N79A) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSA
KSDFACANAFANSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL
ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP VH(CD3)- HCJ2- LKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 15 C) (N69A)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ2- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CAlpha LC 16 (T49C) (
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP N34Q+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS S+ N79K) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSS
KSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED T3-Design_2- LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL QSKE (IgG1) ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP VH(CD3)- HCJ2- LKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 17 C) (N69E)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ2- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CAlpha LC 18 (T49C) (
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP N34A+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQS T3-Design_2- S+ N79K) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSS ASKE (IgG1) KSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS VH(CD3)- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT HCJ2- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY HC 17 CBeta(S56 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED C)(N69E)- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED
CJ’1G1- LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL Fc(G1) ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP
LKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- LCJ2-
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR CAlpha QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 19 (T49C) VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP (N34Q+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS Q+ N79Q+ KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSQSAVAWSQ N61Q)
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED T3-Design_2-
QQQQQ
LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL (IgG1) ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP VH(CD3)- HCJ2- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 20 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 12 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT
DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY T3-Design_2- QQQQ (IgG4) NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED VH(CD3)- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED HCJ2- LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL CBeta(S56 HC 21 C) (N69Q)-
ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP CJ’1G4- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN Fc(G4) HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS
AEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ2- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CAlpha T3-LC 12 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP (T49C) (N34Q+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS Q+ N79Q) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED
LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL VH(CD3)- ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP HCJ2- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS T3-HC 22 C) (N69Q)- CJ’1G1- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL Fc(G1)(Kno FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE b) VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV E17- FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Design_2- DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVN QQQQ (IgG1) YMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSR
FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQW VL(CD19)- SSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS U4-LC 23
CL DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFT SYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTY NQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP
EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS VH(CD19)- LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV U4-HC 24 CH1-Fc(G1) DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF (Hole) LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL T3-LC 12 LCJ2- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR CAlpha
E17- (T49C) QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA Design_2- (N34Q+N68 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP QQQQ (IgG4) Q+ N79Q)
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED
LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL VH(CD3)- ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP HCJ2- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS T3-HC 25 C) (N69Q)- CJ’1G4- AEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP Fc(G4) KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF (Knob) NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVN YMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSR
FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQW VL(CD19)- SSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS U4-LC 23
CL DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFT SYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTY NQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP
EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS VH(CD19)- LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV CH1- U4-HC 26 DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP Fc(G4)(Hole ) PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA T3-LC 12 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP F16- AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS Design_2- QQQQ (IgG4) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT T3-HC 25
DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVN YMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSR
FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQW VL(CD19)- SSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS U4-LC 23
CL DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFT SYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTY NQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVGGGGSGGGGSQMQLVQSGPEVKKPGT
SVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLE VH(CD19)- CH1-
WIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMST Spacer- STAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYW U4-HC 27 VH(CD19)- GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSE CH1- STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV Fc(G4) HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT (Hole)
YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCT LPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL Fc-IgG1 (knob) 304 PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEM
TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL Fc-IgG4 (knob) 305 PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEM
TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJ2- LC 3 CAlpha
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP (T49C) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS
KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN
KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS T3-Fab- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT Design_2.his DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY 1 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED VH(CD3)- HCJ2- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED HC 28 CBeta(S56 LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL C)Conjuncti ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP on’ LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN
HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGR DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 3 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN
KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS T3-Fab- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT Design_2.his DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY 2 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED VH(CD3)- HCJ2- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED HC 29 CBeta(S56 LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL C)Conjuncti ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP on’ LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN
HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGRAD
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ2- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CAlpha LC 12 (T49C)
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP (N34Q+N68 AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS Q+ N79Q) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ T3-Fab- KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS Design_2- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT QQQQ.his1 DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY VH(CD3)- HCJ2- NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED HC 30 CBeta(S56 TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED C) (N69Q)- LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL His1 ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP
LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGR DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 12 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDP
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS T3-Fab- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT Design_2- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY QQQQ.his2 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED VH(CD3)- HCJ2- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED HC 31 CBeta(S56 LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL C) (N69Q)- ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP His2 LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN
HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGRAD
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta_1_noC CBeta HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL 32 ys (C74A) NDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta(S56 HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_1 33 C) (C74A) NDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta(S56 HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_1-Q 34 C) (N69Q) (C74A)
QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta(S56 HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_1-A 35 C) (N69A) (C74A) ADSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta(S56 HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_1-E 36 C) (N69E) (C74A) EDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta CBeta(S56 HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_2 37 C)(FG-) (C74A) NDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYPSN--------------QIVSAEA CBeta(S56 EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD C) (N69Q) HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_2-Q 38 (FG-) QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ (C74A) FYPSN--------------QIVSAEA CBeta(S56 EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD C) (N69A) HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_2-A 39 (FG-) ADSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ (C74A) FYPSN--------------QIVSAEA CBeta(S56 EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD C) (N69E) HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL CBeta_2-E 40 (FG-) (C74A)
EDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYPSN--------------QIVSAEA
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta(S56 HVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQ--- CBeta_3 41 C)(FG-DE-) S- (C74A) GRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY PSN--------------QIVSAEA
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS CAlpha_1_no Cys 42 CAlpha KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSN
KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS CAlpha CAlpha_1 43 (T49C)
KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN
KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS CAlpha AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS CAlpha_1- (T49C) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQ 44 QQQ (N34Q+N68 Q+ N79Q)
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS CAlpha AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQS CAlpha_1- (T49C) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSA 45 AAA (N34A+N68 A+ N79A)
KSDFACANAFANSIIPEDTFFPSPESS CAlpha AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS CAlpha_1- (T49C) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSS CAlpha 46 QSK (N34Q+N68 S+ N79K)
KSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS CAlpha AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQS CAlpha_1- (T49C) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSS 47 ASK (N34A+N68 S+ N79K)
KSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS CAlpha AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS (T49C) KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSQSAVAWSQ CAlpha_1- (N34Q+N68
QQQQ 48 Q+
KSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS N79Q+N61 Q) H_Conjunctio 49 VH- SSASKNVFPP n_1 CBetaCJ1 ConjunctionX H_Conjunctio 50 VH- LEDLKNVFPP n_2 CBetaCJ2 L_Conjunctio 51 VL- KRTVAAPDP n_1 CAlphaCJ1 ConjunctionZ L_Conjunctio 52 VL- KPDIQNPDP n_2 CAlphaCJ2 Conjunction’_I CBeta- WGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGP 53 Conjunction’ gG1 (IgG1)CJ1 Conjunction’Y Conjunction’_ CBeta- WGR---YGPPCPPCPAPEFLGGP 54 Conjunction’ 1gG4 (IgG4)CJ1 307 FE 308 VH- KLEDLKNVFPP CBetaCJ2 309 VL-Cpre- KPTGVGGTP AlphaCJB Cter (cadeia WGRA leve 306 cruzada cter) Desenhos Nome da SEQ ID Sequências Pré-Alfa-Beta Cadeia No
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 64 CPreAlpha FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_1_Pr LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL e_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP unction’1 VH(CD3)- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HCJB- HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 65 CBeta(N69 Q)-CJ’1G1- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL Fc(G1) FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 66 CPreAlpha (Y59C) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTCGPSPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_2_Pr LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL e_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP unction’1_Cys VH(CD3)- 10 HCJB- LKEQPALQDSRYALCSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S76 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 67 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)-
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL LCJB- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LC 68 CPreAlpha QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA (A13C) VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP Design_3_Pr (N50Q) FPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP e_TCR_Conj unction’1_Cys GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT 11 WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED LKNVFPPEVAVCEPSEAEISHTQKATLVCL
ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP VH(CD3)- HCJB- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(F13 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 69 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 68 CPreAlpha (A13C) FPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_4_Pr LKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCL e_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP unction’1_Cys VH(CD3)- 12 HCJB- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S16 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 70 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 71 CPreAlpha (S11C) FPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP Design_5_Pr (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT e_TCR_Conj WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG unction’1_Cys HSRSTQPMHLSGEASTART 13 VH(CD3)- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT HC 70 HCJB- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY CBeta(S16
C) (N69Q)- NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED CJ’1G1- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Fc(G1)
LKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCL ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 71 CPreAlpha (S11C)
FPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_6_Pr LKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCL e_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP unction’1_Cys VH(CD3)- 14 HCJB- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(A18 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 72 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 71 CPreAlpha (S11C) FPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART Design_7_Pr e_TCR_Conj QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT unction’1_Cys VH(CD3)- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY 15 HCJB- NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED CBeta(E19 HC 73 C) (N69Q)-
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED CJ’1G1- LKNVFPPEVAVFEPSEACISHTQKATLVCL Fc(G1) ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP
LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 74 CPreAlpha (S62C) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPCPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_8_Pr LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL e_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP unction’1_Cys VH(CD3)- 1_4L4T_1 HCJB- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(S56 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 75 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 76 CPreAlpha (T65C) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPACDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT
DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY Design_9_Pr NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED e_TCR_Conj TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED unction’1_Cys VH(CD3)- 2_4L4T_2 HCJB- LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL CBeta(S56 ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP HC 75 C) (N69Q)- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CJ’1G1- HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS Fc(G1)
AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 77 CPreAlpha (I16C) FPSLAPPCMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP (N50Q) GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_10_P LKNVFPPEVCVFEPSEAEISHTQKATLVCL re_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP unction’1_Cys VH(CD3)- 4 HCJB- LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN CBeta(A11 HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 78 C) (N69Q)- AEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL CJ’1G1- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc(G1)
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 58 FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP
GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPG G QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY
NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED Design_11_P
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED re_TCR_Conj LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL unction’2_CT ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP erminal LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN
HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 79
AEAWGRADCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTP LC 63
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTARTC QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLED Design_12_P LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL re_TCR_Conj ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQP unction’3_C LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN
HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVS HC 80
AEAWGRADCGFTSVCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ConjunctionW L_Conjunctio 81 VL-Cpre- PTGVGGTP n_3 AlphaCJB
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP
GLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGT CPreAlpha 82
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT (N50Q) noGlyco 83 (Design1)
WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTCGPSPATDGT (N50Q, noGlyco-Cys 311 (Design2) Y59C) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART
FPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT (N50Q, noGlyco-Cys 312 (Design3) A13C) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART CPreAlpha- (N50Q, noGlyco-Cys 312 A13C) (Design4)
FPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT (N50Q, noGlyco-Cys 313 (Design5) S11C) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG CPreAlpha
HSRSTQPMHLSGEASTART CPreAlpha- (N50Q, noGlyco-Cys 313 S11C) (Design6) CPreAlpha- (N50Q, noGlyco-Cys 313 S11C) (Design7)
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPCPATDGT (N50Q, noGlyco-Cys 314 (Design8) S62C) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPACDGT (N50Q, noGlyco-Cys 315 (Design9) T65C) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART
FPSLAPPCMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT (N50Q, noGlyco-Cys 316 (Design10) I16C) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTART
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- (N50Q, GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT noGlyco 317 ter_residues WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG (Design11) ) HSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPG
G
FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPP CPreAlpha- (N50Q, GLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGT noGlyco 318 Cter_somen (Design12) te) WTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEG
HSRSTQPMHLSGEASTARTC
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD CBeta_for HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL 84 N69Q PreAlpha QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA Design_1 84 N69Q
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD N69Q, HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL Design_2 319 S76C QDSRYALCSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVCEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD N69Q, HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL Design_3 320 F13C QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPD N69Q, HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL Design_4 321 S16C QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ Cbeta_for_Cp FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA reAlpha N69Q, Design_5 321 S16C
EVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPD N69Q, HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL Design_6 322 A18C QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
EVAVFEPSEACISHTQKATLVCLATGFYPD N69Q, HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL Design_7 323 E19C QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA N69Q, Design_8 34 S56C
N69Q, Design_9 34 S56C
EVCVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD N69Q, HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL Design_10 324 A11C QDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ
FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA Design_11 84 N69Q Design_12 84 N69Q Desenhos Nome da SEQ ID Sequências Delta-Gama Cadeia NO
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 85 CDelta VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (N16Q+N79 PSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS Q) SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK
QLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLC dg_Design_2 LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT VH(CD3)- _no_Glyco HCJ5- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH CGamma- ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 86 CJ’3G1- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV Fc(G1) VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR (N65Q)
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)-
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 89 CDelta VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (N16C) PSVFVMKCGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS (N79Q) SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT
DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY dg_Design_2 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED VH(CD3)- _hypeCys1_n HCJ5- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK o_Glyco CGamma QLDADVSPKPCIFLPSIAETKLQKAGTYLC HC 90 (T12C) LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT (N65Q)- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH CJ’3G1- ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP Fc(G1)
EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CDelta LC 91 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (V50C) (N16Q + PSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS N79Q) SKKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK
QLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLC dg_Design_2 VH(CD3)- LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNT _hypeCys2_n HCJ5- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH o_Glyco CGamma ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 92 (Q57C) (N65Q)- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV CJ’3G1- VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR Fc(G1) EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CDelta LC 93 (D46C)
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (N16Q + PSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS N79Q) SKKITEFCPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK
QLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLC dg_Design_2 VH(CD3)- LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT _hypeCys3_n HCJ5- CKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH o_Glyco CGamma ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 94 (M62C) (N65Q)- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV CJ’3G1- VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR Fc(G1) EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK VL(CD3)- DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL LC 95 LCJ5- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR CDelta
(F12C) QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA dg_Design_2 (N16Q + VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK _Cys2_no_Gl N79Q) yco
PSVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK
QLDADVSPKPTIFLPCIAETKLQKAGTYLC VH(CD3)- LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT HCJ5- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH CGamma ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 96 (S17C) (N65Q)- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV CJ’3G1- VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR Fc(G1) EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CDelta LC 97 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (M14C) (N16Q + PSVFVCKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS N79Q) SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK
QLDADVSPKPTICLPSIAETKLQKAGTYLC dg_Design_2 VH(CD3)- LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT _Cys1_no_Gl HCJ5- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH yco CGamma ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 98 (F14C) (N65Q)- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV CJ’3G1- VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR Fc(G1) EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CDelta LC 95 (F12C)
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (N16Q + PSVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS dg_Design_2 N79Q) SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS _Cys3_no_Gl NSVTCSVQHDQKTVHSTDFE yco VH(CD3)- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT HC 99 HCJ5- DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY CGamma
(E20C) NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED (N65Q)- TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK CJ’3G1- Fc(G1)
QLDADVSPKPTIFLPSIACTKLQKAGTYLC LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CDelta LC 100 VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (F87C) (N16Q + PSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS N79Q) SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDCE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK
QLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTYLC dg_Design_2 VH(CD3)- LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT _Cys4_no_Gl HCJ5- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH yco CGamma ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 101 (A19C) (N65Q)- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV CJ’3G1- VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR Fc(G1) EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL(CD3)- NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR LCJ5- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA CDelta LC 102 (E88C)
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK (N16Q + PSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS N79Q) SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDQKTVHSTDFC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT dg_Design_2 DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY VH(CD3)- _Cys5_no_Gl HCJ5-
NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED yco CGamma TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK HC 101 (A19C) QLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTYLC (N65Q)- LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT CJ’3G1- MKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH Fc(G1)
ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 105 LCJ5- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTK CDelta PSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS
SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS NSVTCSVQHDNKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDK QLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLC
LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT dg_Design_2 VH(CD3)- MKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH HCJ5- ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 106 CGamma- CJ’3G1- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV Fc(G1) VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LC 107 LCJ4- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPRSQPHTK CDelta PSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS
SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS NSVTCSVQHDNKTVHSTDFE QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSA SLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLC
LLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNT dg_Design_1 VH(CD3)- MKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRH HCJ4- ENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP HC 108 CGamma- CJ’3G1- EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV Fc(G1) VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VL(CD3)- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKDKQLDADV LC 109 LCJ6- CGamma SPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFF
PDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDT YMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNG VDQEIIFPPIKTDVITMD QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSR dg_crossed_ SQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDI Design_1 VH(CD3)-
RINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAVKL HCJ6- GKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDEPKSCD HC 110 CDelta- KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL CJ’4G1- MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG Fc(G1) VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VL(CD3)- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKDKQLDADV LC 111 LCJ7- CGamma SPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFF
PDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDT YMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNG VDQEIIFPPIKTDVITMD QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVEPR dg_crossed_ SQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDI Design_2 VH(CD3)-
RINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAVKL HCJ7- GKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDEPKSCD HC 112 CDelta- KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL CJ’4G1- MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG Fc(G1) VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD
VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYM CGamma_1 113 CGamma
KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD CGamma
QEIIF CGamma_1_ CGamma KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD 114 no_Glyco (N65Q) VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYM
KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF dg_Design_1 Sem 113 mutações Sem dg_Design_2 113 mutações dg_Design_2 114 N65Q _no_Glyco
KPCIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYM N65Q, _hypeCys1_n 333 o_Glyco T12C KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF
KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYM N65Q, _hypeCys2_n 334 o_Glyco Q57C KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF
KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTCKTQDTYM N65Q, _hypeCys3_n 335 o_Glyco M62C KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF
KPTIFLPCIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYM N65Q, _Cys2_no_Gl 336 yco S17C KFSWLTVPEESLD-
KEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
KPTICLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYM N65Q, _Cys1_no_Gl 337 yco F14C KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF
KPTIFLPSIACTKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYM N65Q, _Cys3_no_Gl 338 yco E20C KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF
KPTIFLPSICETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_Design_2 VIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYM N65Q, _Cys4_no_Gl 339 yco A19C KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIF dg_Design_2 N65Q, _Cys5_no_Gl 339 A19C yco
KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPD dg_crossed_ VIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYM 340 Design_1 KFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVD
QEIIFPPIKTDVITMD dg_crossed_ 340 Design_2
SVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS CDelta_1 115 CDelta KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN
SVTCSVQHDNKTVHSTDFE
SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS CDelta_1_no CDelta(N16 CDelta _Glyco 116 Q + N79Q)
KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN SVTCSVQHDQKTVHSTDFE
KSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVS 310 CDelta SKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDS
NSVTCSVQHDNKTVHSTDFE dg_Design_1 Sem 115 mutações Sem dg_Design_2 115 mutações dg_Design_2 N16Q, 116 _no_Glyco N79Q dg_Design_2 SVFVMKCGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS N16C, _hypeCys1_n 325 KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN N79Q o_Glyco SVTCSVQHDQKTVHSTDFE dg_Design_2 N16Q, SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS _hypeCys2_n 326 N79Q, KKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDSN o_Glyco V50C SVTCSVQHDQKTVHSTDFE dg_Design_2 N16Q, SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS _hypeCys3_n 327 N79Q, KKITEFCPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN o_Glyco D46C SVTCSVQHDQKTVHSTDFE dg_Design_2 N16Q, SVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS _Cys2_no_Gl 328 N79Q, KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN yco F12C SVTCSVQHDQKTVHSTDFE dg_Design_2 N16Q, SVFVCKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS _Cys1_no_Gl 329 N79Q, KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN yco M14C SVTCSVQHDQKTVHSTDFE dg_Design_2 N16Q, _Cys3_no_Gl 328 N79Q, yco F12C dg_Design_2 N16Q, SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS _Cys4_no_Gl 330 N79Q, KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN yco F87C SVTCSVQHDQKTVHSTDCE dg_Design_2 N16Q, SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS _Cys5_no_Gl 331 N79Q, KKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSN yco E88C SVTCSVQHDQKTVHSTDFC dg_crossed_ SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSS Design_1 N16Q, KKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDSN (delta na 332 N79Q, cadeia V50C SVTCSVQHDQKTVHSTD-- pesada) dg_crossed_ Design_2 (delta na 332 cadeia pesada) H_Conjunctio 117 HCJ4
SSASLDADVSP n_4 ConjunctionR H_Conjunctio 118 HCJ5 TDKQLDADVSP n_5 L_Conjunctio 119 LCJ4 PRSQPHTKP n_4 ConjunctionT L_Conjunctio 120 LCJ5
EPRSQPHTKP n_5 Conjunction’3 121 CJ’3G1 PPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGP _IgG1 Conjunction’S Conjunction’3 122 CJ’3G4 PPI---YGPPCPPCPAPEFLGGP _1gG4 H_Conjunctio 123 HCJ6 SSRSQPHTKP n_6 ConjunctionH H_Conjunctio 124 HCJ7 EPRSQPHTKP n_7 ConjunctionJ L_Conjunctio 125 LCJ6 KDKLDADVSP n_6
L_Conjunctio 126 LCJ7 TDKLDADVSP n_7 Conjunction’4 127 CJ’4G1 EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGP _IgG1 Conjunction’I Conjunction’4 128 CJ’4G4 ESK---YGPPCPPCPAPEFLGGP _1gG4 Conjunction H_Conjunctio 129 HCJ3 SSASIQNPDP (Alfa-Beta, n_3 cruzada, mais L_Conjunctio 50 LCJ3 anticorpo) n_3 Conjunction H_Conjunctio 130 HCJ4 SSPDIQNPDP (Alfa-Beta, n_4 cruzada, mais L_Conjunctio 50 LCJ3 TCR) n_3 Conjunction RTVAAGTP (Pré-Alfa- Junção de Beta, normal, 131 LCJA cadeia leve mais anticorpo) Conjunction Junção de 50 LCJC (Pré-Alfa- cadeia leve Beta, cruzada, mais Junção de SSASGVGGTP cadeia 132 HCJC anticorpo) pesada Conjunction Junção de 50 LCJD (Pré-Alfa- cadeia leve Beta, cruzada, mais Junção de SSPTGVGGTP cadeia 133 HCJD TCR) pesada CJ’2G1 SDKTHTCPPCPAPEAAGGP Conjunction’ Conjunction’ 134 (Alfa-Beta, Pré-Alfa-Beta, CJ’2G4 --YGPPCPPCPAPEFLGGP cruzada) Conjunction’ 135
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)- QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA HCJB- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVF CBeta Leve 136 PPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFY (N69Q, S16C)- PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQP CJ’1G ALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ
VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG RA
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT PreTCR_Desi DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY gn5_crossed_ 1 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSA VH(CD3)- SGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCL HCJC- VLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGP Pesada CPreAlpha (Junção mais 137 (S11C,
SPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCH anticorpo) TGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTSDKT N50Q) - CJ’2G1- Fc HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK VL(CD3)- HCJB- CBeta Leve 136 (N69Q, S16C)- CJ’1G
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSP PreTCR_Desi TGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCL gn_5_crossed VH(CD3)-
VLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGP _2 SPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCH HCJD- Pesada TGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTSDKT CPreAlpha (Junção mais 138 Pré-TCR) (S11) - HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI CJ’2G1- Fc SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE Conjunction
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL
NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR VL(CD3)-
QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA LCJC- VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVF Leve 139 CBeta PPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFY PreTCR_Desi (A18C, PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQP gn_6_crossed N69Q) ALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ _1
VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG
RA Pesada (Junção mais 137 anticorpo) Leve 139 PreTCR_Desi gn_6_crossed Pesada _2 (Junção mais 138 TCR) Conjunction’ SDKTHTCPPCPAPEAAGGP (alfa-beta, CJ’2G1 IgG1 140 cruzada, IgG1) Conjunction’ YGPPCPPCPAPEFLGGP (alfa-beta, CJ’2G4 IgG4 141 cruzada, IgG4)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFT VH de DYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKY Anticorpo 300 NENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED Anti-CD3
TAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL VL de NSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR Anticorpo 301 QSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA Anti-CD3
VYYCTQSHTLRTFGGGTKVEI SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM Fc(G1) 302
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM Fc(G4) 303
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Desenho e construção de proteínas quiméricas de anticorpos e
TCR
[0443] Sequências de TCR
[0444] Os TCRs são proteínas heterodiméricas compostas de duas cadeias.
Cerca de 95% das células T humanas têm TCRs constituídos por cadeias alfa e beta, enquanto as 5% restantes possuem TCRs compostos por cadeias gama e delta. A região constante da cadeia alfa humana possui apenas um gene TRAC. A região constante da cadeia beta humana possui duas subclasses: gene TRBC1 e TRBC2.
No Banco de Dados de Proteínas (PDB), o número de estruturas cristalinas do TRBC1 é relativamente maior que o do TRBC2; portanto, as sequências do TRBC1 foram escolhidas como o principal esqueleto para projetar o complexo polipeptídico divulgado aqui (“WuXiBody”). Uma sequência típica de aminoácidos de TRBC1 pode ser encontrada na estrutura PDL 4L4T.
[0445] Ligação dissulfeto intercadeia de TCR
[0446] As estruturas cristalinas do TCR foram usadas para guiar a construção do WuXiBody. Ao contrário do TCR nativo ancorado na membrana da superfície das células T, as moléculas solúveis de TCR são menos estáveis, embora sua estrutura 3D seja muito semelhante ao Fab do anticorpo. De fato, a instabilidade do TCR em condições solúveis costumava ser um grande obstáculo que impede a elucidação de sua estrutura cristalina (Wang 2014, supra). Uma estratégia de introdução de um par de mutações Cys na região constante de TCR foi adotada e descobriu-se que se pode melhorar significativamente a montagem da cadeia e melhorar a expressão.
[0447] Efeitos da ligação dissulfeto intercadeia na expressão de anticorpos
[0448] Para determinar se as ligações dissulfeto desempenham um papel na manutenção das estruturas WuXiBody, construções com e/ou sem ligações dissulfeto na região constante do TCR dos anticorpos quiméricos foram expressas. Os resultados de SDS-PAGE do WuXiBody expresso foram mostrados nas Figuras 15-
17. Todos os WuXiBody expressos eram construções do tipo IgG completo com dois braços idênticos. Expressão das construções com e sem mutações de cisteína entre S56 em CBeta e T49 em CAlfa, expressão de construções com mutações de cisteína entre S16 ou A18 em CBeta e S11 em CPré-Alfa, entre Q57 em CGama e V50 em CDelta e entre A19 no CGama e E88 no CDelta foi testada.
[0449] O resultado da expressão das construções com a ligação dissulfeto ausente em CBeta/CAlfa (SEQ ID NOs: 32/42) indica que as construções sem ligações dissulfeto não foram capazes de manter a estrutura do anticorpo (vide Figura 15B). A expressão das construções com ligação dissulfeto ausente em CBeta/CPré- Alfa e CGama/CDelta também foi testada e mostrou resultados semelhantes. Em contrapartida, as construções contendo resíduos de cisteína mutados foram capazes de formar ligações dissulfeto intercadeia, que foram capazes de manter as estruturas do tipo Ig (vide Figura 15A).
Desenho de domínios quiméricos de WuXiBody
[0450] As mutações de par de cisteína (numeração de referência das sequências nas Figuras 19A-19E) nas regiões constantes de TCR foram incorporadas em diferentes desenhos de construção, para os anticorpos quiméricos com TCR, que foram apresentados na Tabela 21.
TABELA 21. Mutações Cys pareadas para introduzir ligação dissulfeto intercadeia Alfa-Beta Pré-Alfa-Beta Delta-Gama Nome da Proteína Nome da Proteína Mutações de Mutações de Mutações de Correspondente Correspondente par de Cys par de Cys par de Cys SEQ ID NOs. na HC/LC SEQ ID NOs. na HC/LC Design_5_Pre_TCR_Conjun S11-S16 Design_2_Cys2_no_Glyco Y11-S16 ction’1_Cys13 F12-S17 SEQ ID NOs: 96/95 SEQ ID NOs: 70/71 Design_6_Pre_TCR_Conjun Design_2_Cys3_no_Glyco L13-F13 S11-A18 ction’1_Cys14 F12-E20 SEQ ID NOs: 99/95 SEQ ID NOs: 72/71 Design_7_Pre_TCR_Conjun Design_2_Cys1_no_Glyco L13-S16 S11-E19 ction’1_Cys15 M14-F14 SEQ ID NOs: 98/97 SEQ ID NOs: 73/71 Design_3_Pre_TCR_Conjun Design_2_hypeCys1_no_Gl S16-V12 A13-F13 ction’1_Cys11 N16-T12 yco SEQ ID NOs: 69/68 SEQ ID NOs: 90/89 Design_4_Pre_TCR_Conjun Design_2_hypeCys3_no_Gl S16-E14 A13-S16 ction’1_Cys12 D46-M62 yco SEQ ID NOs: 70/68 SEQ ID NOs: 94/93 Design_10_Pre_TCR_Conju Design_2_hypeCys2_no_Gl V50-Q57 V23-F13 I16-A11 nction’1_Cys4 yco SEQ ID NOs: 78/77 SEQ ID NOs: 92/91 Design_8_Pre_TCR_Conjun Design_2_Cys4_no_Glyco Y44-L62 S62-S56 ction’1_Cys1_4L4T_1 F87-A19 SEQ ID NOs:101/100 SEQ ID NOs: 75/74 Design_9_Pre_TCR_Conjun E88-A19 Design_2_Cys5_no_Glyco T46-D58 T65-S56 ction’1_Cys2_4L4T_2 SEQ SEQ ID NOs: 101/102 ID NOs: 75/76 Design_2_Pre_TCR_Conjun T46-S76 Y59-S76 ction’1_Cys10 SEQ ID NOs: 67/66 T49-S56
Alfa-Beta Pré-Alfa-Beta Delta-Gama Nome da Proteína Nome da Proteína Mutações de Mutações de Mutações de Correspondente Correspondente par de Cys par de Cys par de Cys SEQ ID NOs. na HC/LC SEQ ID NOs. na HC/LC L51-S56 S62-S56 S62-R78
[0451] Para mutações Cys pareadas nas regiões constantes do TCR Alfa- Beta, a ligação dissulfeto T49C-S56C foi usada para todos os desenhos.
[0452] As junções que conectam os domínios variável do anticorpo e constante do TCR, suas orientações relativas de fusão, bem como as junções de conexão de Fc foram cuidadosamente giradas para criar um WuXiBody estável e funcional. Como a estrutura do TCR é muito semelhante ao Fab de anticorpo, sobrepusemos o modelo de homologia do Fv do anticorpo na região variável do TCR (PDB 4L4T, Figura 2B). A estrutura sobreposta indica que o Fv do anticorpo é estruturalmente compatível com o domínio constante do TCR. Com base nesse alinhamento estrutural e nas sequências correspondentes, todos os parâmetros de construção/modificação relevantes foram desenvolvidos, conforme ilustrado abaixo.
Orientação de domínio
[0453] Como as orientações de fusão da VH-CBeta/VL-CAlfa e da VH- CAlfa/VL-CBeta cruzada poderiam montar corretamente a proteína quimérica, construímos e testamos as duas orientações. A homologia de sequência do VH-VL está mais próxima do TCR VBeta-VAlfa. Chamamos as fórmulas VH CBeta/VL-CAlfa como “orientação normal”, e a VH-CAlfa/VL-CBeta como “orientação cruzada”.
Primeiro e segundo domínios de junção
[0454] As sequências de anticorpo e TCR foram alinhadas com base no alinhamento da estrutura e descobrimos que as junções definidas na sequência da linhagem germinativa nem sempre são consistentes com o que é exibido na estrutura.
Por exemplo, a partir da definição de sequência, as junções que conectam VH e CH1 devem começar logo após os dois últimos resíduos “SS” na região VH. No entanto,
estruturalmente, esses dois resíduos já fazem parte da junção. Definimos nossas junções com base na estrutura, e não na sequência.
[0455] A Tabela 1 e a Tabela 2 na presente divulgação mostraram o alinhamento de sequência baseado em estrutura para duas orientações estudadas.
Como era um desafio prever qual domínio seria compatível com qual domínio de junção, verificamos como as junções de anticorpo e TCR se sobrepunham nas estruturas sobrepostas e estimamos a possível substituição usando uma e outra. Os desenhos dos domínios de junção foram listados na Tabela 1 e na Tabela 2.
Terceiros domínios de junção
[0456] Estratégia semelhante à descrita acima foi usada para alinhar a dobradiça de IgG1 e IgG4 humana com a região proximal de membrana do TCR (isto é, dobradiça do TCR), e sua sobreposição no nível estrutural também foi verificada. A Tabela 7 e a Tabela 8 na presente divulgação listam os desenhos dos terceiros domínios de junção.
Alça FG e alça DE
[0457] O alinhamento das estruturas da região constante do TCR com a do anticorpo revelou que as alças FG e DE da cadeia beta do TCR são mais longas que a região correspondente no CH1 do anticorpo. As Figuras 3A-3B mostram as diferenças das regiões constantes da cadeia beta de células T e da cadeia pesada do anticorpo. Para testar como essas duas alças poderiam perturbar a estrutura se o CH1 fosse substituído pelo TCR beta, construções com e sem essas duas alças foram desenvolvidas.
[0458] Tendo em vista as considerações mencionadas acima, um total de nove construções foram desenvolvidas combinando-se esses parâmetros, conforme listado na Tabela 22 e Tabela 23.
TABELA 22. Desenho das proteínas quiméricas (CBeta/CAlfa) do WuXiBody
SEQ ID NOs: (Cadeia Pesada Orientação Conjunction Conjunction’ Alça FG Alça DE (HC)/Cadeia Leve (LC))-IgG1 Design_1 Conjunction’_1 Normal Conjunction_1 Nativa Nativa SEQ ID NO: 2/1 (IgG1, IgG4) Design_2 Conjunction’_1 Normal Conjunction_2 Nativa Nativa SEQ ID NO: 4/3 (IgG1, IgG4) Design_3 Conjunction’_2 Cross Conjunction_3 Nativa Nativa SEQ ID NO: 9/8 (IgG1, IgG4) Design_4 Conjunction’_2 Cross Conjunction_4 Nativa Nativa SEQ ID NO: 10/8 (IgG1, IgG4) Design_5 Conjunction’_1 Normal Conjunction_1 Substituída Nativa SEQ ID NO: 5/1 (IgG1, IgG4) Design_6 Conjunction’_1 Normal Conjunction_2 Substituída Nativa SEQ ID NO: 6/3 (IgG1, IgG4) Design_6a Conjunction’_1 Normal Conjunction_2 Substituída Substituída SEQ ID NO: 7/3 (IgG1, IgG4) Design_7 Conjunction’_2 Cruzada Conjunction_3 Substituída Nativa SEQ ID NO: 9/11 (IgG1, IgG4) Design_8 Conjunction’_2 Cruzada Conjunction_4 Substituída Nativa SEQ ID NO: 10/11 (IgG1, IgG4)
TABELA 23. Componentes e sequências de proteínas quiméricas
(CBeta/CAlfa) do WuXiBody Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs.
Nome do Domínio Primeiro ou Terceiro complexo e variável de Domínio Domínio de segundo domínio de SEQ ID NOs. cadeia pesada constante do Dimerização domínio de junção + da cadeia: do anticorpo TCR (C1 ou C2) (D) junção (CJ) dobradiça (CJ') (VH ou VL) Design_1 HC VH(CD3) HCJ1 CBeta (S56C) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_1 LC VL(CD3) LCJ1 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:43 Design_2 HC VH(CD3) HCJ2 CBeta (S56C) CJ'1G1 FcG1 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_2 LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:43 Design_3 HC VH(CD3) HCJ3 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 Design_3 LC VL(CD3) LCJ3 CBeta (S56C) SEQ ID NO:33 + SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:308 NO:306 Design_4 HC VH(CD3) HCJ4 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 10 Design_4 LC VL(CD3) LCJ3 CBeta (S56C) SEQ ID NO:33 + SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:308 NO:306 CBeta (S56C) Design_5 HC VH(CD3) HCJ1 CJ'1G1 FcG1 (FG-) SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_5 LC VL(CD3) LCJ1 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:43
Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. Nome do Domínio Primeiro ou Terceiro complexo e variável de Domínio Domínio de segundo domínio de SEQ ID NOs. cadeia pesada constante do Dimerização domínio de junção + da cadeia: do anticorpo TCR (C1 ou C2) (D) junção (CJ) dobradiça (CJ') (VH ou VL) CBeta Design_6 HC VH(CD3) HCJ1 CJ'1G1 FcG1 (S56C)(FG-) SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_6 LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:43 CBeta Design_6a HC VH(CD3) HCJ2 CJ'1G1 FcG1 (S56C)(DE-FG-) SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_6a LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha (T49C) SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:43 Design_7 HC VH(CD3) HCJ3 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 CBeta Design_7 LC VL(CD3) LCJ3 (S56C)(FG-) SEQ ID NO: SEQ ID NO:37 + SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:308 11 NO:306 Design_8 HC VH(CD3) HCJ4 CAlpha (T49C) CJ'2G1 FcG1 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:134 SEQ ID NO:302 10 CBeta Design_8 LC VL(CD3) LCJ3 (S56C)(FG-) SEQ ID NO: SEQ ID NO:37 + SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:308 11 NO:306 EXEMPLO 2: Geração e caracterização das quimeras de TCR/anticorpo monoespecífico
[0459] Antes de fundir os domínios constantes do TCR em construções de anticorpos biespecíficos, a viabilidade de introduzi-los em uma IgG monoespecífica regular foi avaliada em primeiro lugar. Um anticorpo anti-CD3 desenvolvido internamente, chamado T3, foi selecionado para conduzir este estudo de Validação do Conceito. Os domínios constantes CH1 e CL de T3 IgG foram substituídos pela região constante do TCR correspondente (CAlfa e CBeta). Todas as nove estratégias diferentes listadas na Tabela 22 (vide acima) foram aplicadas e todas as construções foram expressas no sistema Expi293.
[0460] A Tabela 24 listou o nível de expressão das proteínas modificadas nos sobrenadantes coletados e quantificados por Q-ELISA. Em geral, a maior parte dos desenhos “de orientação normal” tiveram expressão melhor do que os formatos de “orientação cruzada”, e a maior parte das “junções de TCR” são melhores do que as “junções de anticorpo”. Duas construções de “orientação normal”, Design_5 e Design-6 tiveram expressão comparável à do Design_2). Quanto às duas construções de “orientação cruzada”, o Design_7, 8 apresentou melhor expressão que o Design_3,
4. A baixa expressão da alça FG extra-longa no TCR CBeta foi observada, sugerindo que essa alça FG pode provocar confrontos estéricos significativos com o domínio VL do anticorpo fundido.
TABELA 24. Os níveis de expressão e ligação a CD3 de todos os desenhos no sobrenadante Nível de Expressão Concentração (nM) em FACS Amostras (IgG1) no Sobrenadante 5,0 0,4 0,032 (µg/mL) MFI T3 N/A 5101 2937 408 Design_1 72,04 5441 2190 292 Design_2 204,42 5833 2616 380 Design_3 15,35 5089 982 137 Design_4 26,11 5438 1213 168 Design_5 113,68 5388 1865 249 Design_6 178,56 5789 3914 613 Design_6a 173,60 5794 2822 405 Design_7 75,69 6322 1929 259 Design_8 98,63 6412 1831 243
[0461] Estes resultados foram completamente diferentes do que Wu et al.
observaram no desenho de quimeras anticorpo-TCR semelhante (Wu et al. 2015, supra): Seus desenhos de “orientação cruzada” apresentaram baixa expressão. Seus desenhos de “orientação normal” nem sequer expressaram.
[0462] Para confirmar se as proteínas expressas tiveram dobramento correto e mantiveram a função original, testamos sua ligação em células Jurkat CD3 positivas.
As ligações por FACS de todas as amostras foram realizadas em três concentrações diferentes: 5,0, 0,4 e 0,032 nm. O anticorpo T3 original do tipo selvagem foi usado como controle positivo. Os dados de ligação a CD3 dose-dependentes foram listados na coluna 3-5 na Tabela 24. Design_2, Design_6 e Design_6a apresentaram melhor capacidade de ligação, comparável ao anticorpo T3 nativo. É interessante que todas essas três construções tenham sido os três melhores formatos expressos em células de mamíferos. Essa forte correlação sugeriu que o nível de expressão ou ligação pode resultar da mesma origem molecular, ou seja, a compatibilidade entre o domínio variável do anticorpo e os domínios constantes do TCR, o que exigiu desenhos cuidadosos dos componentes, como os domínios de junção e ligação dissulfeto intercadeia etc.
[0463] Com base no nível de expressão e na atividade de ligação, o Design_2 foi selecionado como o formato final para prosseguir.
EXEMPLO 3: Desglicosilação
[0464] Modificações pós-traducionais (PTM), como sítios de N-glicosilação em um anticorpo, podem causar heterogeneidade das proteínas, tornando-se um desafio nos estágios de desenvolvimento. Portanto, foi realizada uma tentativa de remover os sítios de N-glicosilação na região constante do TCR. Existem no total quatro sítios de N-glicosilação encontrados na região constante do TCR. Um está na CBeta (N69, vide SEQ ID NO: 244) e os outros três estão na CAlfa (N34, N68 e N79, vide SEQ ID NO: 241). Os dados de expressão da presente divulgação sugeriram que esses sítios, especialmente os sítios em CAlfa, eram de fato fortemente glicosilados quando a molécula foi expressa na célula de mamífero.
[0465] Todos os sítios de glicosilação no Design_2 foram removidos substituindo-se os quatro resíduos de Asn por Gln ou Ala (consulte Design_2-QQQQ ou –AAAA, vide a Tabela 25). Embora essa estratégia seja muito geral em modificação de proteínas, foi relatado que as mutações de Gln/Ala podem afetar o nível de expressão de proteínas quiméricas de TCR/anticorpo (Wu et al., 2015, supra). Para mitigar esse risco, também foram utilizados resíduos do pré-TCR (N68S em CAlfa) e de TCR de macaca (N79 em CAlfa, N69E em CBeta) nas posições correspondentes
(consulte Design_2-QSKE e -ASKE) (vide a Tabela 25). Além disso, foi relatado que pode existir um sítio de glicosilação atípico em CAlfa (N 6 1) (Wollscheid et al., Nature Biotechnology, 27 (4), pp. 378-386 (2009) "Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins." WollscheidB., Bausch- Fluck D., Henderson C., O'Brien R., Bibel M., Schiess R., Aebersold R., Watts JD, Nat.
Biotechnol. 27: 378-386 (2009) [PubMed] [Europe PMC]). Portanto, esse resíduo também foi alterado para Gln (consulte Design_2-QQQQQ, consulte a Tabela 25).
Todos os mutantes foram expressos em Expi293 para testes adicionais.
TABELA 25. Os níveis de expressão no sobrenadante de todos os desenhos de deglicosilação Nível de expressão no sobrenadante SEQ ID NO: Amostra (µg/mL)) (HC-CBeta/LC-CAlfa) 13/12 (IgG1) Design_2-QQQQ 334,39 21/12(IgG4) Design_2-AAAA 414,58 15/14 (IgG1) Design_2-QSKE 311,48 17/16 (IgG1) Design_2-ASKE 107,89 17/18 (IgG1) Design_2-QQQQQ 213,31 20/19 (IgG1) TABELA 26 Componentes dos desenhos de deglicosilação Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. Nome do Terceiro complexo e SEQ Domínio variável Primeiro ou Domínio domínio de Domínio de ID NOs. da de cadeia pesada segundo constante do junção + Dimerização cadeia: do anticorpo (VH domínio de TCR (C1 ou dobradiça (D) ou VL) junção (CJ) C2) (CJ') Design_2-QQQQ CBeta (S56C) VH(CD3) HCJ2 CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC (N69Q) SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 CAlpha (T49C) Design_2-QQQQ VL(CD3) LCJ2 (N34Q+N68Q+ (IgG1) LC N79Q) SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:44 Design_2-QQQQ CBeta (S56C) VH(CD3) HCJ2 CJ'1G4 FcG4 (IgG4) HC (N69Q) SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:303 CAlpha (T49C) Design_2-QQQQ VL(CD3) LCJ2 (N34Q+N68Q+ (IgG4) LC N79Q) SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:44
Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. Nome do Terceiro complexo e SEQ Domínio variável Primeiro ou Domínio domínio de Domínio de ID NOs. da de cadeia pesada segundo constante do junção + Dimerização cadeia: do anticorpo (VH domínio de TCR (C1 ou dobradiça (D) ou VL) junção (CJ) C2) (CJ') Design_2-AAAA CBeta (S56C) VH(CD3) HCJ2 CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC (N69A) SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 CAlpha (T49C) Design_2-AAAA VL(CD3) LCJ2 (N34A+N68A+ (IgG1) LC N79A) SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:45 Design_2-QSKE CBeta (S56C) VH(CD3) HCJ2 CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC (N69E) SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 CAlpha (T49C) Design_2-QSKE VL(CD3) LCJ2 (N34Q+N68S+ (IgG1) LC N79K) SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:46 Design_2-ASKE CBeta (S56C) VH(CD3) HCJ2 CJ'1G1 FcG1 (IgG1) HC (N69E) SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 CAlpha (T49C) Design_2-ASKE VL(CD3) LCJ2 (N34A+N68S+ (IgG1) LC N79K) SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:47 Design_2- CBeta (S56C) QQQQQ (IgG1) VH(CD3) HCJ2 CJ'1G1 FcG1 (N69Q)
HC SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:302 Design_2- CAlpha (T49C) QQQQQ (IgG1) VL(CD3) LCJ2 (N34Q+N68Q+ LC N79Q+N61Q) SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO: 48
[0466] As quantidades de expressão nos sobrenadantes foram estimadas por Q-ELISA e mostradas na Tabela 25. Curiosamente, apenas um de nossos desenhos de deglicosilação diminuiu ligeiramente o nível de expressão. Mutações simples por Gln ou Ala não tiveram efeitos negativos no gel não reduzido (Figura 4), e observou- se uma banda de 150 kd. No gel redutor (Figura 4), a banda de 25 kd foi observada.
Ambos indicam a remoção bem sucedida da glicosilação na cadeia leve e na cadeia pesada. As muteínas com a remoção de N-glicanos na região constante do TCR foram testadas na ligação a CD3. A Figura 5 ilustra as diferentes muteínas que se ligam às células Jurkat CD3+. As curvas das muteínas apenas se deslocaram ligeiramente para a direita em comparação com o anticorpo T3 do tipo selvagem, que pode ser devido à detecção de anticorpos ser mais sensíveis à IgG humana do que à quimera. A ligação máxima não foi alterada. No geral, a maioria dos desenhos de deglicosilação não exibiu diferenças óbvias na expressão ou na ligação. O Design_2-QQQQ foi escolhido como o desenho para estudos adicionais.
[0467] No estudo semelhante realizado por Wu et al., (Wu et al. 2015, supra), realizaram mutações de deglicosilação nos seus formatos de “orientação cruzada”, uma vez que seus formatos de “orientação normal” não expressam.
EXEMPLO 4: Desenho de WuXiBody baseado em TCR pré-alfa/beta
[0468] O receptor de antígeno de pré-célula T (pré-TCR), expresso por timócitos imaturos, tem um papel central no desenvolvimento precoce das células T.
O pré-TCR possui uma cadeia beta regular, mas uma cadeia pré-alfa especial, com apenas região constante disponível, cuja sequência e estrutura são bem distintas daquelas da cadeia alfa regular. Como a região constante do TCR regular é compatível com a região variável do anticorpo, esperava-se que o Pré-TCR (vide PDB 3OF6, SEQ ID NO: 246) também ajudasse no desenvolvimento das proteínas quiméricas. Os desenhos de anticorpos foram mostrados na Tabela 27.
TABELA 27. Desenho de quimeras baseadas em TCR pré-alfa/beta para WuXiBody Alça Alça Orientação Conjunction Conjunction’
FG DE Pre- Conjunction’_1 Normal Conjunction_A Nativa Nativa TCR_Design_A (IgG1, IgG4) Pre- Conjunction’_1 Normal Conjunction_B Nativa Nativa TCR_Design_B (IgG1, IgG4) Pre- Conjunction’_2 Cruzada Conjunction_C Nativa Nativa TCR_Design_C (IgG1, IgG4) Pre- Conjunction’_2 Cruzada Conjunction_D Nativa Nativa TCR_Design_D (IgG1, IgG4)
[0469] No total, dez construções quiméricas foram desenvolvidas combinando-se esses parâmetros, conforme listado na Tabela 28.
TABELA 28. Correspondência do desenho do anticorpo quimérico pré-TCR quimérico na forma de IgG1
Desenhos na Tabela SEQ ID NOs: Arquivo de Sequência 27 (HC/LC) Design_1_Pre_TCR_ Conjunction’1 65/64 Design_2_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys10 67/66 Design_3_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys11 69/68 Design_4_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys12 70/68 Design_5_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys13 70/71 Pre-TCR_Design_B Design_6_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys14 72/71 Design_7_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys15 73/71 Design_8_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys1_4L4T_1 75/74 Design_9_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys2_4L4T_2 75/76 Design_10_Pre_TCR_Conjunction’_1_Cys4 78/77 Pre-TCR_Design_5_crossed_1 137/136 Pre-TCR_Design_C Pre-TCR_Design_6_crossed_1 137/139 Pre-TCR_Design_5_crossed_2 138/136 Pre-TCR_Design_D Pre-TCR_Design_6_crossed_2 138/139
TABELA 29. Componentes do projeto do anticorpo quimérico pré-TCR quimérico na forma de IgG1 Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs.
Domínio Terceiro Nome do complexo e Primeiro ou Domínio variável de domínio de Domínio de SEQ ID NOs. da segundo constante do cadeia pesada junção + Dimerização cadeia: domínio de TCR (C1 ou do anticorpo dobradiça (D) junção (CJ) C2) (VH ou VL) (CJ') Design_1_Pre_TCR_ VH(CD3) HCJB CBeta (N69Q) CJ'1G1 FcG1 Conjunction’1 HC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:84 NO:53 Design_1_Pre_TCR_ CPreAlpha VL(CD3) LCJB Conjunction’1 LC (N50Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 64 301 NO:309 NO:83 Design_2_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys10 VH(CD3) HCJB (S76C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:319 NO:53 Design_2_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys10 VL(CD3) LCJB (Y59C)(N50Q LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 66 301 NO:309 NO:311 Design_3_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys11 VH(CD3) HCJB (F13C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:320 NO:53 Design_3_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys11 VL(CD3) LCJB (A13C)(N50Q LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 68 301 NO:309 NO:312 Design_4_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys12 VH(CD3) HCJB (S16C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:321 NO:53
Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs.
Domínio Terceiro Nome do complexo e Primeiro ou Domínio variável de domínio de Domínio de SEQ ID NOs. da segundo constante do cadeia pesada junção + Dimerização cadeia: domínio de TCR (C1 ou do anticorpo dobradiça (D) junção (CJ) C2) (VH ou VL) (CJ') Design_4_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys12 VL(CD3) LCJB (A13C)(N50Q LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 68 301 NO:309 NO:312 Design_5_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys13 VH(CD3) HCJB (S16C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:321 NO:53 Design_5_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys13 VL(CD3) LCJB (S11C)(N50Q LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 71 301 NO:309 NO:313 Design_6_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys14 VH(CD3) HCJB (A18C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:322 NO:53 Design_6_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys14 VL(CD3) LCJB (S11C)(N50Q LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 71 301 NO:309 NO:313 Design_7_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys15 VH(CD3) HCJB (E19C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:323 NO:53 Design_7_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys15 VL(CD3) LCJB (S11C)(N50Q LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 71 301 NO:309 NO:313 Design_8_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys1_4L VH(CD3) HCJB (S56C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 4T_1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:34 NO:53 Design_8_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys1_4L VL(CD3) LCJB (S62C)(N50Q 4T_1 LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 74 301 NO:309 NO:314 Design_9_Pre_TCR_C Cbeta onjunction’_1_Cys2_4L VH(CD3) HCJB (S56C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 4T_2 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:34 NO:53 Design_9_Pre_TCR_C CPreAlpha onjunction’_1_Cys2_4L VL(CD3) LCJB (T65C)(N50Q 4T_2 LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 76 301 NO:309 NO:315
Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. Domínio Terceiro Nome do complexo e Primeiro ou Domínio variável de domínio de Domínio de SEQ ID NOs. da segundo constante do cadeia pesada junção + Dimerização cadeia: domínio de TCR (C1 ou do anticorpo dobradiça (D) junção (CJ) C2) (VH ou VL) (CJ') Design_10_Pre_TCR_ Cbeta Conjunction’_1_Cys4 VH(CD3) HCJB (A11C)(N69Q CJ'1G1 FcG1 HC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO:302 300 NO:50 NO:324 NO:53 Design_10_Pre_TCR_ CPreAlpha Conjunction’_1_Cys4 VL(CD3) LCJB (I16C)(N50Q)
LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 77 301 NO:309 NO:316 Pre- CPre-Alfa TCR_Design_5_crosse VH(CD3) HCJC (S11C)(N50Q CJ'2G1 FcG1 d_1 HC ) SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO:300 SEQ ID NO:302 NO:132 NO:313 134 Pre- Cbeta (N69Q, TCR_Design_5_crosse VL(CD3) LCJC S16C) d_1 LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 136 301 NO:50 NO:321+ 306 Pre- CPreAlpha TCR_Design_6_crosse VH(CD3) HCJC (S11C)(N50Q CJ'2G4 FcG4 d_1 HC ) SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO:300 SEQ ID NO:303 NO:132 NO:313 134 Pre- Cbeta (N69Q, TCR_Design_6_crosse VL(CD3) LCJC A18C) d_1 LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 139 301 NO:50 NO:322+ 306 Pre- CPreAlpha TCR_Design_5_crosse VH(CD3) HCJD (S11C)(N50Q CJ'2G1 FcG1 d_2 HC ) SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO:300 SEQ ID NO:302 NO:133 NO:313 134 Pre- Cbeta (N69Q, TCR_Design_5_crosse VL(CD3) LCJC S16C) d_2 LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 136 301 NO:50 NO:321+ 306 Pre- CPreAlpha TCR_Design_6_crosse VH(CD3) HCJD (S11C)(N50Q CJ'2G1 FcG1 d_2 HC ) SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO:300 SEQ ID NO:302 NO:133 NO:313 134 Pre- Cbeta (N69Q, TCR_Design_6_crosse VL(CD3) LCJC A18C) d_2 LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 139 301 NO:50 NO:322+306
[0470] A experiência aprendida nos Exemplos 1-3 sugeriu que a “orientação normal” e o domínio de junção com mais resíduos de TCR eram mais adequados na produção de boas proteínas quiméricas. Assim, a mesma estratégia foi adoptada e os domínios de junção de cadeia leve e de cadeia pesada, conforme mostrados na Tabela 3 e Tabela 4, foram desenvolvidos. Diferente da cadeia alfa regular, existe apenas um sítio de glicosilação (N50) na cadeia pré-alfa do TCR, que foi mutada para o resíduo de Gln (vide SEQ ID NO: 247). Toda a cadeia pesada com a região constante beta foi igual à do Design_2 na Tabela 22, com o sítio de N-glicosilação (N69) substituído pelo resíduo de Gln (vide SEQ ID NO: 244).
[0471] Os terceiros domínios de junção em orientação normal foram desenvolvidos de forma idêntica àquela presente na Tabela 7, e os terceiros domínios de junção em orientação cruzada foram desenvolvidos de forma idêntica àquela presente na Tabela 8 (anticorpos quiméricos baseados em TCR alfa/beta.
[0472] O pré-TCR não possui ligação dissulfeto intercadeia nativa acima do terceiro domínio de junção. Semelhante ao trabalho de construção realizado no TCR regular, introduzimos racionalmente a ligação dissulfeto na interface beta e pré-alfa na região constante para melhorar a estabilidade da proteína quimérica (vide a Tabela 11). Todos os resíduos de interface na estrutura cristalina do pré-TCR (APO 3OF6) foram examinados e a lista de pares intercadeia foi obtida, cujos átomos de carbono de CAlfa e CBeta estavam dentro de 7 Å e 5 Å, respectivamente (vide Tabela 11).
Cada par identificado foi então substituído pelos resíduos de Cys e a muteína foi expressa nas células Expi293.
EXEMPLO 5: Desenhos de anticorpos quiméricos baseados em TCR gama/delta
[0473] Os TCRs compostos de cadeia gama e delta são menos comuns, mas a natureza heterodimérica da proteína também pode ajudar a desenvolver um novo formato quimérico. Seguindo a mesma estratégia e procedimento que foram validados no Exemplo 1, realizamos novos projetos quiméricos que usavam a região constante do TCR delta-gama para substituir a região correspondente do anticorpo. A estrutura do TCR delta-gama (PDB 4LFH, vide SEQ ID NO: 249 e 252) foi usada para facilitar o alinhamento da sequência guiada pela estrutura entre o anticorpo e o TCR.
[0474] A Tabela 5 e a Tabela 6 listaram domínios de junção desenvolvidos para “orientação normal” e “orientação cruzada”, respectivamente. Os domínios de junção IgG1 e IgG4 correspondentes de diferentes orientações foram mostrados na Tabela 9 e na Tabela 10. A estrutura do TCR delta-gama é mais semelhante ao anticorpo do que a estrutura do TCR alfa-beta. Nenhum desenho adicional de alça FG e DE foi realizado. Os sítios de N-glicosilação (N65 na gama, e N16 e N79 na Delta, vide SEQ ID NO: 250) foram todas removidas pelas substituições de Gln (Q). A ligação dissulfeto da interface de contato foi modificada com base na mesma estratégia introduzida no Exemplo 4.
TABELA 30. Desenho de TCR/anticorpo quimérico Primeiro e segundo Terceiro domínio Orientação Alça FG Alça DE domínios de de junção junção Conjunction’_3 dg_Design_1 Normal Conjunction_4 Nativa Nativa (IgG1, IgG4) Conjunction’_3 dg_Design_2 Normal Conjunction_5 Nativa Nativa (IgG1, IgG4) Conjunction’_4 dg_Design_3 Cruzada Conjunction_6 Nativa Nativa (IgG1, IgG4) Conjunction’_4 dg_Design_4 Cruzada Conjunction_7 Nativa Nativa (IgG1, IgG4)
[0475] Um total de treze construções quiméricas foram desenvolvidas combinando-se esses parâmetros, conforme listado na Tabela 31.
TABELA 31. Correspondência do desenho de TCR/anticorpo quimérico para CGama/CDelta Desenhos na Tabela Construção do Desenho SEQ ID NOs. em HC/LC 30 de IgG1 dg_Design_1 dg_Design_1 108/107 dg_Design_2 106/105 dg_Design_2_no_Glyco 86/85 dg_Design_2 dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco 90/89 dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco 92/91 dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco 94/93 dg_Design_2_Cys2_no_Glyco 96/95 dg_Design_2_Cys1_no_Glyco 98/97 dg_Design_2_Cys3_no_Glyco 99/95 dg_Design_2_Cys4_no_Glyco 101/100 dg_Design_2_Cys5_no_Glyco 101/102 dg_Design_3 dg_crossed_Design_1 110/109 dg_Design_4 dg_crossed_Deisgn_2 112/111 TABELA 32. Componentes do desenho de TCR/anticorpo quimérico para CGama/CDelta Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. Domínio Terceiro Primeiro ou Domínio Nome do complexo e variável de domínio de Domínio de segundo constante do SEQ ID NOs. da cadeia: cadeia pesada junção + Dimerização domínio de TCR (C1 ou do anticorpo dobradiça (D) junção (CJ) C2) (VH ou VL) (CJ') dg_Design_1 HC VH(CD3) HCJ4 CGamma CJ'3G1 FcG1 SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 108 300 NO:117 NO:113 NO:121 NO:302 dg_Design_1 LC VL(CD3) LCJ4 CDelta SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 107 301 NO:119 NO:310 dg_Design_2 HC VH(CD3) HCJ5 CGamma CJ'3G1 FcG1 SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 106 300 NO:118 NO:113 NO:121 NO:302 dg_Design_2 LC VL(CD3) LCJ5 CDelta SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 105 301 NO:120 NO:115 dg_Design_2_no_Glyco CGamma VH(CD3) HCJ5 CJ'3G1 FcG1 HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 86 300 NO:118 NO:114 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_no_Glyco VL(CD3) LCJ5 (N16Q+N79Q
LC ) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 85 301 NO:120 NO:116 CGamma dg_Design_2_hypeCys1 VH(CD3) HCJ5 (T12C) CJ'3G1 FcG1 _no_Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 90 300 NO:118 NO:333 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_hypeCys1 VL(CD3) LCJ5 (N16C) _no_Glyco LC (N79Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 89 301 NO:120 NO:325 CGamma dg_Design_2_hypeCys2 VH(CD3) HCJ5 (Q57C) CJ'3G1 FcG1 _no_Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 92 300 NO:118 NO:334 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_hypeCys2 (V50C) VL(CD3) LCJ5 _no_Glyco LC (N16Q + N79Q)
Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs.
Domínio Terceiro Primeiro ou Domínio Nome do complexo e variável de domínio de Domínio de segundo constante do SEQ ID NOs. da cadeia: cadeia pesada junção + Dimerização domínio de TCR (C1 ou do anticorpo dobradiça (D) junção (CJ) C2) (VH ou VL) (CJ') SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 91 301 NO:120 NO:326 CGamma dg_Design_2_hypeCys3 VH(CD3) HCJ5 (M62C) CJ'3G1 FcG1 _no_Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 94 300 NO:118 NO:335 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_hypeCys3 (D46C) VL(CD3) LCJ5 _no_Glyco LC (N16Q + N79Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 93 301 NO:120 NO:327 CGamma dg_Design_2_Cys2_no_ VH(CD3) HCJ5 (S17C) CJ'3G1 FcG1 Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 96 300 NO:118 NO:336 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_Cys2_no_ VL(CD3) LCJ5 (F12C) (N16Q Glyco LC + N79Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 95 301 NO:120 NO:328 CGamma dg_Design_2_Cys1_no_ VH(CD3) HCJ5 (F14C) CJ'3G1 FcG1 Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 98 300 NO:118 NO:337 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_Cys1_no_ (M14C) VL(CD3) LCJ5 Glyco LC (N16Q + N79Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 97 301 NO:120 NO:329 CGamma dg_Design_2_Cys3_no_ VH(CD3) HCJ5 (E20C) CJ'3G1 FcG1 Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 99 300 NO:118 NO:338 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_Cys3_no_ VL(CD3) LCJ5 (F12C) (N16Q Glyco LC + N79Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 95 301 NO:120 NO:328 CGamma dg_Design_2_Cys4_no_ VH(CD3) HCJ5 (A19C) CJ'3G1 FcG1 Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 101 300 NO:118 NO:339 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_Cys4_no_ VL(CD3) LCJ5 (F87C) (N16Q Glyco LC + N79Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 100 301 NO:120 NO:330
Domínios da extremidade N-terminal à C-terminal e suas SEQ ID NOs. Domínio Terceiro Primeiro ou Domínio Nome do complexo e variável de domínio de Domínio de segundo constante do SEQ ID NOs. da cadeia: cadeia pesada junção + Dimerização domínio de TCR (C1 ou do anticorpo dobradiça (D) junção (CJ) C2) (VH ou VL) (CJ') CGamma dg_Design_2_Cys5_no_ VH(CD3) HCJ5 (A19C) CJ'3G1 FcG1 Glyco HC (N65Q) SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 101 300 NO:118 NO:339 NO:121 NO:302 CDelta dg_Design_2_Cys5_no_ (E88C) LCJ5 Glyco LC (N16Q + N79Q)
SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 102 NO:120 NO:331 dg_crossed_Design_1 VH(CD3) HCJ6 CDelta CJ'4G1 FcG1
HC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 110 300 NO:123 332 NO:127 NO:302 dg_crossed_Design_1 VL(CD3) LCJ6 CGamma
LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 109 301 NO:125 NO:340 dg_crossed_Design_2 VH(CD3) HCJ7 CDelta CJ'4G1 FcG1
HC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 112 300 NO:124 NO:332 NO:127 NO:302 dg_crossed_Design_2 VL(CD3) LCJ7 CGamma
LC SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 111 301 NO:126 NO:340 EXEMPLO 6: Testes de pareamento incorreto de cadeia pesada de anticorpo
[0476] Um dos desafios na produção do anticorpo biespecífico em formato tipo IgG é o pareamento incorreto descontrolado de cadeias leves e pesadas. Avaliamos se os domínios CH1 e CL substituídos por TCR beta e alfa podem se reunir com a cadeia pesada e a cadeia leve de IgG normal quando foram c-expressos em uma única célula hospedeira.
[0477] Além do anticorpo T3 anti-CD3, também desenvolvemos um anticorpo monoclonal U4 que tem como alvo o antígeno de linfócitos B, o CD19. Para verificar a probabilidade de as cadeias leves e pesadas dos dois anticorpos nativos poderem serem pareadas incorretamente, os pares leve-pesada de T3 e U4 foram trocados de propósito (T3_leve-U4_pesada, T3_pesada-U4_leve) e coexpressos em células Expi293. O mesmo estudo utilizando o T3 modificado com TCR também foi realizado como comparação lado a lado. As Figuras 6A-6B apresentaram os dados de SDS-
PAGE das proteínas em ambas IgG1 e IgG4. Para os pares trocados que utilizam anticorpos nativos, a banda de 150 kd na PAGE não redutora e as bandas de 50 kd e 23 kd na PAGE redutora confirmaram claramente a montagem da proteína IgG pareada incorretamente. No entanto, após a introdução do T3 modificado com TCR, as bandas de 150 kd não foram mais observadas no gel, indicando que nenhum dos pares não cognatos pode se reunir na molécula tipo anticorpo. Esses dados confirmaram que nosso Fab modificado com TCR desenvolvido pode efetivamente impedir o pareamento incorreto de cadeias não cognitivas.
EXEMPLO 7: Produção e caracterização da quimera Fab-TCR
[0478] Para garantir que o anticorpo Fab modificado com TCR possa ser usado para desenvolver o anticorpo biespecífico, foram construídos fragmentos Fab truncados em duas posições. A Figura 8 ilustra que os Fabs de T3 modificados com TCR com N-glicano removido foram expressos e purificados com sucesso (T3-Fab- Design_2.his1 (SEQ ID NO: 30/12) e T3-Fab-Design_2.his2 (SEQ ID NO: 31/12)). Sua capacidade de ligação a CD3 também foi avaliada em células Jurkat CD3 + e comparada à forma monovalente do tipo selvagem T3. A Figura 9 mostrou que o Fab quimérico e o T3 monovalente tinham comportamentos de ligação qualitativamente semelhantes. Os desvios podem resultar da diferença nos métodos de detecção de proteínas com os marcadores His e Fc.
EXEMPLO 8: Geração e caracterização do anticorpo biespecífico com knob- into-holes baseado em TCR
[0479] Após a fusão bem-sucedida do domínio constante do TCR no anticorpo monoespecífico T3 e a confirmação de que o novo formato pode efetivamente impedir o pareamento incorreto da cadeia com o anticorpo U4, passamos a construir formatos biespecíficos.
[0480] T3 modificado com TCR e U4 do tipo selvagem, com mutações “knob- into-holes” utilizadas no domínio CH3 Fc, foram coexpressos a partir de células
Expi293. As mutações para “knob-into-holes” foram feitas em S139C e T151W no domínio CH3 (SEQ ID NO: 295, knob) de T3 e Y134C, T151S, L153A e Y192V no domínio CH3 (SEQ ID NO: 296, hole) de U4 no isotipo IgG1. Alternativamente, as mutações “knob-into-holes” foram feitas em S136C e T148W no domínio CH3 (SEQ ID NO: 298, knob) de T3 e Y131C, T148S, L150A e Y189V no domínio CH3 (SEQ ID NO: 299, hole) de U4 no isotipo IgG4. As Figuras 7A-7B mostram os dados de SDS- PAGE das proteínas produzidas em IgG1 e IgG4, após as purificações. O rendimento após a primeira etapa de purificação em proteína A alcançou 125 mg/L e 173,7 mg/L, para a IgG1 e IgG4, respectivamente. O peso molecular correto, isto é, as bandas em torno de 150 kd em gel não reduzido, bem como as bandas em torno de 50 e 25 kd em gel redutor, foram todas claramente observadas. As amostras purificadas foram posteriormente inspecionadas em SEC-HPLC. A pureza de IgG1 e IgG4 atingiu 98,63% e 100%. Os dados indicaram que as moléculas do tipo IgG, tanto IgG1 como IgG4, foram bem expressas e montadas. Estes novos formatos biespecíficos envolvidos com TCR foram referidos como 'E17-Design_2-QQQQ' (SEQ ID NO: 22/12/24/23 para IgG1 e SEQ ID NO: 25/12/26/23 para IgG4).
[0481] Embora o peso molecular esperado tenha sido observado para o anticorpo biespecífico desenvolvido, era necessário verificar se cada braço mantinha sua capacidade de ligação original ao antígeno cognato individual. Como para cada alvo, o E17-Design_2 foi um ligante monovalente, também construímos a versão monovalente do T3 nativo e do U4 nativo para fazer as comparações lado a lado. A Figura 10A e a Figura 10B mostram os resultados da ligação por FACS do anticorpo biespecífico desenvolvido para células Jurkat CD3+ e células Ramos CD19+, respectivamente. O braço do T3 modificado com TCR apresentou perda de ligação moderada em comparação com o T3 do tipo selvagem, mas o IgG4 foi melhor que o IgG1 e próximo à proteína nativa. A ligação do braço U4 não foi reduzida pelo braço T3 modificado adjacente. Apresentou ligação semelhante ao anticorpo U4 original na forma monovalente. Mas, curiosamente, desta vez a IgG1 teve um desempenho melhor que a IgG4. Não está claro por que o isotipo é importante na manutenção da ligação monovalente. Fatores como estabilidade da região constante do TCR, seleção dos desenhos de terceiro domínio de junção ou interações entre os dois braços Fab podem resultar nos fenômenos observados.
[0482] As ligações monovalentes do formato biespecífico modificado com TCR para CD3 e CD19 foram ambas reduzidas em comparação com seus anticorpos parentais bivalentes. Sabe-se que a ativação de células T através da ligação a CD3 é bastante sensível. Fortes estímulos para as células T podem causar efeitos colaterais.
Portanto, a ligação relativamente fraca a CD3 foi provavelmente aceitável e até desejada por razões de segurança. No entanto, a fraca ligação ao CD19 pode afetar diretamente sua capacidade de matar células B dirigidas por anticorpos biespecíficos e, assim, reduzir a eficácia do medicamento. Para confirmar a importância da ligação ao CD19 e testar a universalidade de nossos desenhos quiméricos, construímos outras construções biespecíficas denominadas “F16-Design_2-QQQQ” em IgG4, nas quais o braço T3 desenvolvido continuava ainda monovalente, mas o braço U4 era bivalente.
[0483] A nova construção foi expressa e purificada, e o experimento de ligação foi realizado diretamente. As Figuras 11A-11B mostrou seus dados de ligação por FACS em relação ao E17 anteriormente desenvolvido e dois anticorpos parentais T3 e U4. É interessante que o F16-Design_2-QQQQ melhorou a ligação a CD3 e CD19 (SEQ ID NO: 25/12/27/23 na ordem HC/LC (anti-CD3)/HC/LC (anti-CD19)). A sua ligação a CD19 (SEQ ID NO: 27/23) foi comparável ao do anticorpo U4 do tipo selvagem. Os dados confirmaram que nosso desenho quimérico em T3 pode ser aplicado a diferentes formatos biespecíficos.
EXEMPLO 9: Ensaio de morte de células tumorais in vitro dirigida por anticorpos biespecíficos
[0484] O ensaio funcional in vitro foi realizado para verificar a atividade do formato biespecífico desenvolvido na morte de células B malignas com envolvimento de células T. A construção E17 foi testada primeiramente. Os anticorpos monoespecíficos parentais T3 e U4 foram utilizados como controle negativo. A Figura 12 ilustra a função de morte celular dose-dependente deste formato biespecífico E17.
E17-IgG4 (EC50 = 57 pM) foi mais potente que E17-IgG1 (EC50 = 624 pM). A fim de melhorar a atividade de morte celular, o formato F16, que tinha dois sítios de ligação a CD19, também foi comparado ao E17. Conforme mostrado na Figura 13, em comparação com E17 (EC50 = 17,7 pM), a potência de F16 (EC50 = 5,5 pM) foi 3 vezes melhorada. Os dados confirmaram que a ligação do CD19 afetou o efeito de morte celular. Um anticorpo IgG4 humano irrelevante foi usado como controle negativo.
EXEMPLO 10: Caracterização por espectrometria de massa
[0485] Para confirmar que o anticorpo biespecífico produzido apresentava a montagem correta, caracterizamos a molécula E17-Design_2-QQQQ por espectrometria de massa. As diferenças de peso molecular teórico entre as duas cadeias pesadas e as duas cadeias leves são de aproximadamente 4000 Da e 500 Da, respectivamente. A Figura 14A ilustra os espectros da proteína em condição não redutora. O pico em 148180 Da foi o peso esperado da molécula do anticorpo biespecífico montado corretamente. Nenhum outro pico observado indica que as mutações “knob-into-holes” na região Fc, bem como nossa região CH1/CL substituído por TCR trabalharam adequadamente no pareamento das quatro cadeias desejadas.
Ressalta-se que os espectros de massa não reduzidos não podem ajudar a distinguir o anticorpo biespecífico montado correto da IgG que possui ambas as cadeias leves pareadas incorretamente. No entanto, o Exemplo 4 indica que as cadeias pesada e leve pareadas incorretamente não expressam ou montam, o que eliminou a possibilidade de erros de pareamento incorreto de dois pares de cadeias pesadas e leves.
[0486] Em condições não redutoras (vide Figura 14A), houve um pico em 149128 Da, que é cerca de 947 Da a mais do que o peso calculado da molécula. Uma análise por espectrometria de massa também foi realizada usando a proteína em condição reduzida. A Figura 14B mostrou que realmente havia um pico de 948 Da distante da cadeia leve quimérica VL-CAlfa, indicando modificações de O-glicano (GlcNAc+Hex+2*NeuAc) na cadeia leve.
EXEMPLO 11: Testes de estabilidade térmica
[0487] Nós ainda testamos e comparamos a estabilidade térmica dos anticorpos biespecíficos desenvolvidos em ambas IgG1 e IgG4 através da medição da temperatura de fusão Tm da proteína utilizando-se fluorimetria diferencial de varredura (DSF). O T3 monoespecífico nativo e o T3 modificado com TCR (Design_2 e Design_2-QQQQ) foram utilizados como controle.
[0488] A Tabela 33 listou os valores medidos de Ton e Tm das novas construções. No geral, todas as moléculas apresentaram estabilidade térmica razoável. As moléculas do tipo IgG1 eram mais estáveis do que as moléculas do tipo IgG4. O valor de Tm do anticorpo T3 nativo foi de 74°C. As proteínas quiméricas de anticorpos e TCR tinham uma Tm relativamente baixa de cerca de 60°C, sugerindo que CBeta-CAlfa de TCR pode ser menos resistente às temperaturas elevadas, em comparação com a CH1-CL do anticorpo normal. Isto é consistente com o que foi relatado a partir do estudo de Wu (Wu et al. 2015, supra), e sugeriu-se que o domínio CAlfa seja menos estável do que CBeta (Toughiri et al. MAbs, 862 (Julho), pp. 1276- 1285 (2016)).
[0489] As mutações que removeram a N-glicosilação na região constante do TCR não afetaram a estabilidade térmica da proteína quimérica. O nosso anticorpo biespecífico E17-Design_2-QQQQ apresentou Tm semelhante ao do Design_2-QQQQ, e menor Tm do que o T3 nativo.
TABELA 33. Termoestabilidade do anticorpo quimérico e biespecífico desenvolvido, medida por fluorimetria diferencial de varredura (DSF) Nome da Proteína Concentração Ton Th 1 (Tm) Th 2 HC/LC (anti-CD3)/HC/LC Isotipo pI Pureza (mg/ml) (℃) (℃) (℃ ) (anti-CD19) T3 IgG1 2,7 57 74,2 na 8,31 99,41% Design_2 (SEQ ID NO: IgG1 1,6 46 59,3 na 6,07 93,09% 4/3/4/3) Design_2-QQQQ IgG1 1,1 45 59,1 na 6,07 99,03 % (SEQ ID NO: 13/12/13/12) E17-Design_2-QQQQ (SEQ IgG1 0,3 49 61,9 76,2 7,29 98,63% ID NO: 22/12/24/23) T3 IgG4 1,4 53 65 73,2 8,24 96,06% Design_2-QQQQ IgG4 0,9 45 58,4 na 5,7 96,05% (SEQ ID NO: 21/12/21/12) E17-Design_2-QQQQ (SEQ IgG4 0,8 47 60,2 72,7 6,4 100% ID NO: 25/12/26/23) EXEMPLO 12: Materiais e Métodos Modelagem de Homologia de Fv do Anticorpo T3
[0490] O modelo estrutural do Fv do anticorpo foi construído com base em suas sequências de aminoácidos do Fv utilizando-se o software Discovery Studio (BIOVIA). As sequências de cadeia leve e pesada foram anotadas primeiramente na numeração de Kabat para identificar três CDRs, bem como a estrutura de cada cadeia.
Cada segmento (CDR ou estrutura) foi então pesquisado no banco de dados de anticorpos BLAST com sequências de todas as estruturas de anticorpos no PDB. A estrutura da sequência mais correspondente, se tiver alta resolução e baixo fator B, foi usada para construir o modelo de homologia. Todos os segmentos modelados foram montados para construir o modelo estrutural de cadeia leve e pesada. A orientação relativa entre duas cadeias modeladas foi prevista tomando o ângulo da estrutura do anticorpo que tinha a sequência completa mais semelhante. Todo o trabalho de visualização e análise molecular foi realizado utilizando-se o software PyMOL (Schrödinger).
Construções vetoriais
[0491] Os genes VL, VH, Ck, CH1 foram amplificados por PCR a partir de modelos internos de DNA existentes. Os genes CAlfa e CBeta foram sintetizados pela
Genewiz Inc. Genes da cadeia leve nativos ou quiméricos foram inseridos em um vetor linearizado contendo um promotor de CMV e um peptídeo sinal kappa. Os fragmentos de DNA de VH-CH1 ou VH-CBeta foram inseridos em um vetor linearizado contendo a região constante CH2-CH3 de IgG4/IgG1 humana. O vetor contém um promotor de CMV e um peptídeo sinal de cadeia pesada de anticorpo humano. As ligações plasmidiais, transformações, preparações de DNA foram realizadas utilizando-se protocolos padrão de biologia molecular. A mutagênese sítio-dirigida foi conduzida pela amplificação por PCR utilizando-se iniciadores mutagênicos e seguida por digestão com DpnI do molde de DNA.
Expressão Proteica
[0492] Os vetores construídos de cadeia pesada e cadeia leve foram cotransfectados em células Expi293 (Thermofisher Scientific). A proporção de diferentes vetores para a cotransfecção foi ajustada de acordo com a estrutura esperada dos anticorpos e o resultado da expressão inicial foi mostrado em SDS- PAGE. Resumidamente, 40 µg de plasmídeo e 108 µL de expifectamina foram usados para transfectar um volume de 40 mL de 1,2 x 108 células. Intensificador 1 e Intensificador 2 foram adicionados 20 horas após a transfecção. As células transfectadas foram cultivadas a 37°C com 8% de CO2 em um agitador orbital, com rotação de 120 rpm. Cinco dias após a transfecção, os sobrenadantes foram coletados por centrifugação e os fragmentos celulares foram removidos por filtração em 0,22 µm.
Detecção de expressão por SDS-PAGE
[0493] O sobrenadante coletado no dia 5 foi misturado com Tampão de amostra NuPAGE LDS (4x), Agente Redutor de Amostra NuPAGE (10x) e H 2O. As amostras reduzidas foram aquecidas a 75°C antes do carregamento no gel. Os géis foram corridos usando 200V constantes por 35 minutos. Em seguida, os géis foram corados com SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, LC6065) e submetidos a micro-onda por 5 minutos. Descoloração foi realizada por meio da incubação com água e micro-
ondas durante 7 minutos. As imagens dos géis foram obtidas utilizando-se Universal HoodIII (Bio-Rad).
Purificação Purificação por cromatografia em proteína A
[0494] Resinas de proteína A MabSelect™ SURE™ (MSS) foram obtidas da GE Healthcare e acondicionadas em colunas de vidro (BioRad). A purificação por cromatografia em proteína A foi realizada à temperatura ambiente utilizando-se bomba peristáltica como energia a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. Após o carregamento das amostras, um volume de 10 colunas de glicina a 100 mM, pH3,5 foi utilizado para eluição, e diferentes frações foram coletadas. A concentração de proteína em diferentes frações foi medida utilizando-se um NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific). A pureza da proteína foi detectada por SDS-PAGE e SEC-HPLC.
Cromatografia de troca iônica (IEC)
[0495] Os experimentos cromatográficos IEC foram realizados utilizando-se uma coluna Hi trap SP HP de 1 ml das ciências da vida da GE Healthcare com um sistema ÄKTA Pure (GE Healthcare). As configurações do método foram programadas: lavar a coluna 10 CV com tampão de lavagem A (10 mM de NaH2PO4, pH 6,0); aplicar a amostra usando a entrada da amostra; equilibrar a coluna com 10 CV de tampão de lavagem A (10 mM de NaH2PO4, pH 6,0); eluir a coluna com tampão de lavagem A e tampão de lavagem B (10 mM de NaH2PO4, 1 M de NaCl, pH 6,0). Uma condição de eluição com gradiente foi aplicada como etapa de revestimento para 50 CV com 30% de tampão de lavagem B, etapa de revestimento para 5 CV com 100% de tampão de lavagem B e uma etapa com preenchimento para 10 CV com 100% de tampão de lavagem B. As frações foram coletadas como 0,5 mL por tubo de acordo com o valor de absorbância de UV (o limiar de coleta foi definido como 5 mAU).
Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)
[0496] Os experimentos cromatográficos foram realizados utilizando-se uma coluna Superdex™ 10/300 GL 200 de aumento e um sistema ÄKTA da GE Healthcare.
O experimento foi realizado utilizando-se PBS (137 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 1,76 mM de KH2PO4, 10 mM de NaH2PO4, pH 7,0) a 0,5 mL/min. As frações foram coletadas utilizando-se o programa de coleta automatizada (o valor de coleta foi definido como 5 mAU de absorbância de UV) com 0,5 mL de cada porção.
Purificação por cromatografia Ni Sepharose™ Excel
[0497] A purificação da proteína marcada com 6xHis utilizando-se resinas excel Ni SepharoseTM Excel Chromatography Ni SepharoseTM adquiridas da GE Healthcare. A resina foi acondicionada em colunas de vidro (BioRad). Depois que a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna (CV) de ddH2O para a remoção do tampão de armazenamento de resina, ela foi usada para a purificação das proteínas marcadas com 6xHis. Resumidamente, a purificação por coluna Ni foi realizada à temperatura ambiente utilizando-se bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. Após o carregamento da amostra, 10 CV de PBS (50 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, pH 7,0) foram usados para lavagem, seguidos por 5 CV de tampão de eluição 1 (50 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 7,0) para remover proteínas fracamente ligadas. Utilizou-se 10 CV de tampão de eluição 2 (50 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, 500 mM de imidazol, pH 7,0) para eluir a proteína ligada.
Após a eluição, a proteína coletada foi medida utilizando-se um NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific). A pureza da proteína eluída foi detectada por SDS-PAGE e SEC-HPLC. A coluna foi regenerada utilizando-se 10 CV de ddH2O, 10 CV de tampão de extração (50 mM de Tris, 500 mM de NaCl, 50 mM de EDTA, pH 7,4) para o limpeza, 10 CV de cloridrato de guanidina a 6 M, pH 7,4 e 10 CV de sulfato de níquel a 0,1 M. A coluna regenerada foi preenchida com etanol a 20% e armazenada a 4°C.
Cromatografia líquida de alta eficiência - Exclusão por tamanho (SEC-HPLC)
[0498] A pureza das amostras foi analisada utilizando-se uma coluna TSK- GEL G3000SWXL (7,8 mm × 300 mm) da Tosoh Bioscience e um sistema Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies). A coluna foi equilibrada a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min com tampão fosfato (50 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 7,0).
Após a amostra de proteína de 50 µL ter sido filtrada e injetada, a absorbância de UV a 280 nm foi monitorada. A pureza foi estimada através da integração dos cromatogramas.
Medição da concentração de anticorpos por ELISA
[0499] Placas de ELISA foram revestidas com 200 ng/mL de forma (Fab)2 de anti-IgG-Fc humano de cabra no tampão de revestimento (200 mM de Na2CO3/NaHCO3, pH 9,2). Após incubação durante a noite a 4°C, as placas foram lavadas uma vez com tampão PBS utilizando uma lavadora de poço profundo (Biotek ELx405). Em seguida, as placas foram bloqueadas com BSA a 2% em tampão PBS e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, e o anticorpo de controle positivo e as amostras diluídas foram adicionadas. Após 2 horas de incubação, as placas foram lavadas 6 vezes com 300 µL de tampão de lavagem e anti-Ig-Fc humano de cabra biotinilado (Bethyl, 100 µL/poço, diluição 1: 5000 em BSA a 2%) foi adicionado como anticorpo de detecção.
Após as etapas de incubação e lavagem, foi adicionado SA-HRP (Invitrogen, diluição 1: 8000 em BSA a 2%). Em seguida, as placas foram incubadas à temperatura ambiente por mais 1 hora. As placas foram lavadas 6 vezes com 300 µL de tampão de lavagem/poço. O substrato TMB foi adicionado e desenvolvido por 10 minutos. Foi adicionada solução de parada (HCl a 2 M, 100 µL/poço) para interromper o desenvolvimento da cor e a absorbância foi lida a 450 nm utilizando-se um leitor de placas (Molecular Device SpectraMax® M5e).
Ensaios de ligação ao alvo
[0500] A capacidade de ligação de moléculas desenvolvidas foi avaliada utilizando-se as linhagens celulares CD3+ Jurkat e CD19+ Ramos, respectivamente.
Ambas as linhagens celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Cat. No. 22400105), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SFB, Corning, Cat. No. 35-076 -CV).
[0501] As alíquotas de 105 células por poço foram coletadas e lavadas com 1% de albumina de soro bovino (BSA, BovoGen-BSAS), seguido pela incubação com anticorpos estudados diluídos em série em placa de 96 poços de fundo redondo (Corning, Cat No. 3799) a 4°C por 1 hora. Depois de lavadas duas vezes com 1% de BSA, as placas foram incubadas ainda com anticorpos anti-IgG Fc humano de cabra conjugados com PE (Jackson Immuno Research Laboratories, Cat. No. 109-115-098) a 4°C por 30 minutos. Após as placas terem sido lavadas duas vezes novamente, as células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando-se um citômetro FACSCanto II (BDBiosciences) e a intensidade de fluorescência associada foi quantificada utilizando-se o software FlowJo. A análise de regressão não linear de quatro parâmetros foi usada para se obter os valores de EC50 no software Prism (GraphPad Software, Inc).
Morte de células tumorais dirigidas por anticorpos biespecíficos
[0502] Para se obter células T humanas, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis foram isoladas em seguida por centrifugação de densidade com Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17-1440-03) a partir de sangue venoso heparinizado. Depois de cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB, 1% de solução de penicilina/estreptomicina (ScienCell, Cat. No. 0503), 50 unidades por mL de proteína IL-2 ligante humana e 10 ng/mL de anticorpo OKT3 (EBioscience, Cat. No. 16-0037-85) por 6 dias, as PBMCs foram passadas através das colunas EasySep (Stemcell, Cat. No. 19053) para o enriquecimento de células T CD8+. As células T CD8+ provenientes das colunas de seleção negativa foram usadas como células efetoras.
[0503] No ensaio de citotoxicidade, as células CD19+ Raji, usadas como células-alvo, foram pré-marcadas com 20 nM de CellTrace Far Red (Invitrogen, Cat.
No. C34564) a 37°C por 30 minutos. Os sedimentos celulares foram então lavados duas vezes com meio RPMI 1640 isento de fenol (Invitrogen, Cat. No. 11835030) suplementado com 10% de SFB. Na placa de fundo redondo de 96 poços (Corning, Cat. No. 3799), as células B Raji marcadas com Far Red (20.000 células/poço) foram incubadas com as células T CD8+ isoladas (proporção de células-alvo: efetoras de 1:5) e os anticorpos biespecíficos diluídos em série a 37°C por 4 horas. Após a incubação, 3 μM de iodeto de propídio (PI, Invitrogen, Cat. No. P3566) foi adicionado e misturado completamente para identificação das células mortas. Após 15 minutos, as células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando-se um citômetro FACSCanto II. A citotoxicidade mediada por anticorpo biespecífico pode ser definida como o percentual de células-alvo positivas para PI em células-alvo positivas para Far Red. A EC 50 da citotoxicidade com envolvimento de células T foi determinada utilizando-se o software Prism (GraphPad Software, Inc.).
Caracterização por espectrometria de massa
[0504] A proteína foi diluída para 0,4 mg/mL e deglicosilada por incubação com 1μL de PNGase F (Glyko, GKE-5006D) (proporção proteína/enzima de 40: 1) em 100 μL de tampão Tris a 20 mM (pH 8,0) a 37°C por pelo menos 4 horas. Uma alíquota de anticorpos biespecíficos deglicosilados foi parcialmente reduzida pela adição de 2 μL de DTT a 1M a uma concentração final de 20 mM à temperatura ambiente por 15 minutos. Cada amostra a 2 µg foi injetada em uma coluna C4 Acquity UPLCBEH300 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) a 0,4 mL/min. A fase móvel A foi constituída por 0,1% de ácido fórmico (FA) em água de grau para HPLC. A fase móvel B foi constituída por 0,1% de FA em acetonitrila. Para condições não reduzidas e reduzidas, foi utilizado um gradiente de eluição eficiente de 24% de B a 34% de B de 3,0 a 15,0 minutos. Após separação por RP UPLC, a massa da proteína biespecífica em condições não redutoras e redutoras foi detectada pelo Waters Xevo G2 Q-TOF. Os sinais de MS foram desconvoluídos utilizando-se o software BiophamaLynx 1.3. Os pesos moleculares teóricos médios da massa da cadeia leve e da cadeia pesada foram determinados utilizando-se o programa GPMaw (v. 6.00).
Teste de termoestabilidade por DSF
[0505] Um teste DSF foi realizado utilizando-se o sistema de PCR em tempo real 7500 Fast (Applied Biosystems). Resumidamente, 19 µL da solução de anticorpo foram misturados com 1 µL da solução de SYPRO Orange 62,5x (Invitrogen) e adicionados a uma placa de 96 poços (Biosystems). A placa foi aquecida de 26°C a 95°C a uma taxa de 2°C/min, e os dados de fluorescência resultantes foram coletados.
Os derivados negativos das mudanças de fluorescência em relação a diferentes temperaturas foram calculados e o valor máximo foi definido como temperatura de fusão Th. Se uma proteína tiver várias transições de desdobramento, os dois primeiros Th foram relatados, denominados Th1 e Th2. Th1 é sempre interpretada como a temperatura de fusão formal Tm para facilitar as comparações entre as diferentes proteínas. A coleta de dados e o cálculo do Th foram realizados automaticamente pelo software de operação. Uma vez que o gráfico de derivadas negativas das diferentes temperaturas foi gerado pelo software, o ponto no gráfico em que a curva começa a diminuir a partir de uma linhagem de base de pré-transição pode ser estimado aproximadamente como a temperatura inicial Ton.
EXEMPLO 13: Identificação do O-glicano
[0506] Os dados anteriores da espectrometria de massa descobriram O- glicanos na cadeia leve de T3 modificado com TCR. Ao contrário dos sítios de N- glicosilação, que podem ser localizados com base nos padrões de sequência de aminoácidos, os sítios de O-glicosilação são difíceis de prever a partir da sequência.
Esta cadeia leve TCR-quimérica de T3 foi composta pela região V do anticorpo parental T3, bem como pela região constante da cadeia alfa de TCR. Ambas as regiões podem potencialmente ter sítios de O-glicosilação. A análise de espectrometria de massa foi conduzida novamente no anticorpo monoclonal T3 original e verificou-se que este anticorpo parental estava isento de O-glicanos, o que indicou que os O-glicanos estavam localizados na região constante alfa do TCR.
[0507] Sabe-se que a O-glicosilação ocorre principalmente nos resíduos Ser ou Thr, e existem 21 resíduos de Ser/Thr na sequência da região constante alfa do TCR (mostrada em negrito na sequência abaixo). Para localizar a posição exata dos sítios de O-glicosilação, o rastreamento de Ala foi efetuado para substituir cada Ser/Thr individual por Ala, e 21 moléculas de T3 monoespecíficas modificadas por TCR foram construídas. Os O-glicanos potenciais em cada mutante foram liberados da proteína, marcados com ácido 2-aminobenzoico e quantificados por HPLC juntamente com o Detector de Fluorescência. A perda do sinal de O-glicano pode nos guiar a localização do sítio de O-glicosilação. 1 11 21 31 41
PDIQNPDPAV YQLRDSKSSD KSVCLFTDFD SQTQVSQSKD SDVYITDKCV 51 61 71 81 91
LDMRSMDFKS NSAVAWSQKS DFACANAFQN SIIPEDTFFP SPESS (SEQ ID NO: 411)
[0508] A fim de identificar e quantificar a quantidade de O-glicano, um método baseado em hidrólise ácida e baseado em HPLC foi desenvolvido. A amostra foi hidrolisada com TFA a 2M (ácido trifluoroacético) e o monossacarídeo dos O-glicanos foi liberado. A GalN liberada (galactosamina) da GalNAc (N-acetil-D-galactosamina) do O-glicano e Gal (galactose) foi marcado com ácido 2-aminobenzoico e analisado por HPLC acoplado com detector FLD (Detector de Fluorescência) e quantificado por uma curva de calibração externa. O conteúdo de GalN liberado foi diretamente correlacionado com a quantidade de O-glicano, pois é o monossacarídeo específico dos O-glicanos. Os resultados relataram que a quantidade de GalN por mol de proteína, o que significa um mol de proteína, contém a quantidade de mol de O-glicano.
[0509] A Tabela 34 ilustra os níveis de O-glicano quantificados em todos os mutantes. A molécula biespecífica E17-Design_2-QQQQ foi usada como uma proteína de controle. Os dados mostraram que havia 0,24 mol de O-glicanos disponíveis em cada mol da proteína E17-Design_2-QQQQ. Como este é um anticorpo biespecífico que possui apenas uma cadeia leve de T3 modificada por TCR, o nível total de O-glicano das duas cadeias deve ser dobrado, isto é, em torno de 0,48 mol/mol. Entre todos os 21 mutantes, a maioria deles manteve a quantidade esperada de O-glicano. As amostras #3, #8, #10 e #20 tiveram uma ligeira diminuição do sinal.
A amostra #19 exibiu perda óbvia de O-glicano. O sinal foi ainda mais baixo que o da proteína de controle. Portanto, a posição S91 foi identificada como o principal sítio de O-glicosilação. S19, S36, S41 e S94 foram identificados como possíveis sítios de O- glicosilação.
TABELA 34. O-glicanos quantificados em vários mutantes Ala únicos (a numeração de resíduos foi listada na Figura 19A) NO. do Desenho WBP3438 NO. Analítico AS1803474 Análise do Item de Teste SOP NO. PD-PAS-LAB-090-02 Monossacarídeo No. da Resultado do Teste (mol/mol proteína) ID da Amostra Amostra Galactosamina 196388 E17-Design_2-QQQQ 0,24 (x2) 1 T3.uIgG4.SP(S16A) 0,41 2 T3.uIgG4.SP(S18A) 0,43 3 T3.uIgG4.SP(S19A) 0,38 4 T3.uIgG4.SP(S22A) 0,45 5 T3.uIgG4.SP(T27A) 0,57 6 T3.uIgG4.SP(S31A) 0,44 7 T3.uIgG4.SP(T33A) 0,42 8 T3.uIgG4.SP(S36A) 0,36 9 T3.uIgG4.SP(S38A) 0,47 10 T3.uIgG4.SP(S41A) 0,37 11 T3.uIgG4.SP(T46A) 0,50 12 T3.uIgG4.SP(S55A) 0,43 13 T3.uIgG4.SP(S60A) 0,53 14 T3.uIgG4.SP(S62A) 0,56 15 T3.uIgG4.SP(S67A) 0,57 16 T3.uIgG4.SP(S70A) 0,52 17 T3.uIgG4.SP(S81A) 0,53 18 T3.uIgG4.SP(T87A) 0,55 19 T3.uIgG4.SP(S91A) 0,12
NO. do Desenho WBP3438 NO. Analítico AS1803474 Análise do Item de Teste SOP NO. PD-PAS-LAB-090-02 Monossacarídeo No. da Resultado do Teste (mol/mol proteína) ID da Amostra Amostra Galactosamina 20 T3.uIgG4.SP(S94A) 0,32 21 T3.uIgG4.SP(S95A) 0,61 EXEMPLO 14: Ligação ao receptor Fcγ, C1q e FcRn Métodos Afinidade de ligação ao receptor Fcγ por SPR
[0510] A afinidade de ligação do anticorpo a FcγRs foi detectada utilizando-se Biacore T200 (ou Biacore 8K). Cada receptor foi capturado em um chip sensor CM5 (GE) imobilizado com anticorpo anti-his. Os anticorpos em diferentes concentrações foram injetados sobre o chip sensor a uma taxa de fluxo de 30 µL/min para uma fase de associação de 60 s, seguida por dissociação de 60 s. O chip foi então regenerado por glicina a 10 mM (pH 1,5) após cada ciclo de ligação.
[0511] Os sensogramas do canal de tampão e superfície de referência (blank) foram subtraídos dos sensogramas testes. Os dados experimentais foram ajustados pelo modelo 1: 1 utilizando-se a análise de Langmiur (para FcγRI) ou modelo de estado estacionário (para outros receptores). O peso molecular de 150 KDa foi utilizado para calcular a concentração molar dos anticorpos.
Ligação a C1q por ELISA
[0512] As placas de ELISA (Nunc) foram revestidas com amostras de anticorpos a 3μg/mL durante a noite a 4°C. Após o bloqueio e a lavagem, o C1q foi gradualmente diluído a partir de 600 μg/mL e incubado à temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram então lavadas e subsequentemente incubadas com Ab anti- C1q-HRP humano de ovelha durante 1 hora. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a interação foi interrompida por HCl a 2 M. A absorbância a 450 nm foi lida utilizando-se um leitor de microplacas (Molecular Device).
Afinidade de ligação ao FcRn por SPR
[0513] A afinidade de ligação do anticorpo ao FcRn foi detectada utilizando- se o Biacore T200 (ou Biacore 8K). Cada anticorpo foi imobilizado no chip sensor CM5 (GE). O FcRn em diferentes concentrações no tampão de corrida (50 mM de Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween20, pH 6,0) foi injetado sobre o chip sensor a uma taxa de fluxo de 30 µL/min para uma fase de associação de 60 s, seguida por dissociação de 60 s. O chip foi então regenerado por PBS 1X (pH 7,4) após cada ciclo de ligação.
[0514] Os sensogramas do canal de tampão e superfície de referência foram subtraídos dos sensogramas testes. Os dados experimentais foram ajustados pelo modelo de estado estacionário. Um peso molecular de 45 KDa foi usado para calcular a concentração molar de FcRn.
Resultados
[0515] Como todas as IgG1s mencionadas acima eram IgG1 com mutação LALA, a atividade de ligação do E17-Design_2-QQQQ em ambas IgG4 e IgG1 do tipo selvagem (T3U4.E17-2.(2).uIgG1 (IgG1 de tipo selvagem com knob-into-holes)) a FcγRI, FcγRIIa (H167), FcγRIIa (R167), FcγRIIb, FcγRIIIa (F176), FcγRIIIa (V176) e FcγRIIIb foram investigados por SPR.
[0516] As sequências relevantes da construção T3U4.E17-2.(2).uIgG1 são fornecidas abaixo.
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTS U4-LC NLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTK (SEQ ID LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL NO: 371) QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV
TKSFNRGEC QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYI DPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYA
MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV T3U4.E17- TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK U4-HC
2.(2).uIgG1 PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT (SEQ ID NO: 372) PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT
VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEM TKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK T3-LC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPK (SEQ ID LLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRT NO: 373) FGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDS
DVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSP ESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWI SPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYS LYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATG
FYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATF T3-HC
WQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCP (SEQ ID PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY NO: 374) VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
[0517] As afinidades foram resumidas na Tabela 35 (IgG4) e na Tabela 36 (IgG1 do tipo selvagem). Ambas as moléculas mostraram uma afinidade típica de ligação à IgG4 humana e à IgG1 do tipo selvagem para todos os receptores Fcγ.
TABELA 35. Afinidade de IgG4 ao receptor Fc por SPR Receptor Fc KD (M) FcγRI 9,79E-09 FcγRIIa (H167) 2,05E-05 FcγRIIa (R167) 1,58E-05 FcγRIIb 2,41E-05 FcγRIIIa (F176) 2,93E-05 FcγRIIIa (V176) 1,40E-05 FcγRIIIb >4,10E-05 TABELA 36, Afinidade de IgG1 do tipo selvagem ao receptor Fc por SPR Receptor Fc KD (M) FcγRI 1,30E-09 FcγRIIa (H167) 3,58E-06 FcγRIIa (R167) 4,83E-06 FcγRIIb 8,07E-06 FcγRIIIa (F176) 2,08E-06 FcγRIIIa (V176) 6,44E-07 FcγRIIIb 5,16E-06
[0518] A atividade de ligação dos anticorpos ao C1Q foi testada por ELISA (Figuras 21A-21B). O E17-Design_2-QQQQ em IgG4 não mostrou sinal de ligação no ELISA (Figura 21A), enquanto o E17-Design_2-QQQQ em IgG1 do tipo selvagem e o anticorpo IgG1 humano de controle mostrou sinal de ligação normal (Figura 21B).
EXEMPLO 15: Formatos simétricos G19, G19R, G25, G25R
[0519] Os alvos do anticorpo terapêutico, como CD3 x CD19, se beneficiam de um anticorpo biespecífico com ligação a CD3 monovalente, por questões de segurança. Com isso em mente, foram desenvolvidos e gerados com sucesso os formatos biespecíficos assimétricos E17 e F16, através da integração do WuXiBody Fab, bem como as técnicas de “knob-into-holes”. Alguns alvos biespecíficos como CTLA-4 x PD-1, no entanto, se beneficiam de um formato simétrico, que pode montar dois anticorpos diferentes enquanto mantém suas valências originais (ou seja, tetravalentes no total) para alcançar os efeitos sinérgicos desejados. A unidade principal do WuXiBody é um Fab quimérico, que pode ser facilmente incorporado em formatos assimétricos e simétricos para garantir o pareamento correto das cadeias leves-pesadas cognatas. Os quatro formatos simétricos baseados no WuXiBody, denominados G19, G19R, G25 e G25R, foram desenvolvidos.
[0520] A Figura 22 fornece uma descrição esquemática de quatro formatos simétricos. No G19 e G25, dois Fabs quiméricos de WuXiBody foram enxertados na extremidade C-terminal e N-terminal de um anticorpo normal, respectivamente. A diferença entre G19 e G19R, ou entre G25 e G25R, são as localizações invertidas do Fab normal e quimérico em cada formato individual. As partes pesadas de dois Fabs, bem como o IgG-Fc, foram integradas em uma cadeia, enquanto as duas cadeias leves estavam livres para dobrar e montar de forma independente. Quando três vetores foram cotransfectados nas células hospedeiras, esperava-se que a associação pesada-pesada ocorresse como anticorpos normais durante o processo de expressão, enquanto se esperava que cada cadeia leve se autorreunisse em seu próprio parceiro cognato na cadeia pesada.
[0521] Os anticorpos biespecíficos CTLA-4 x PD-1 em formato WuXiBody simétrico foram desenvolvidos. Um novo anticorpo anti-PD-1 W3055_1.153.7 (nomeado como U6) e um anticorpo comercial anti-CTLA-4 ipilimumab (nomeado como T1) foram adotados para integrar os novos formatos. O isotipo IgG4 foi escolhido para garantir a depleção do efeito ADCC e CDC na molécula. Como o U6 e o T1 podiam ser colocados no lado superior ou inferior do formato (nomeados como U6T1 e T1U6, respectivamente), o formato único G19 foi usado primeiramente para investigar os dois casos.
[0522] Sequências relevantes do WuXiBody testado são fornecidas abaixo: No. do Amostras Sequências Plasmídeo
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLI T1-LC YGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWT (SEQ ID NO: FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV 375) QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVT FISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCAR TGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF T1-U6-HC NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE T1U6.G19.I PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT (SEQ ID NO: gG4 PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL 376)
SLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNV FPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSG VCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLS ENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD 377) VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPS
PESS
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW 378) KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTH
EGSTVEKTVAPTECS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
NRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL U6T1.G19.I VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG gG4 TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPK U6-T1-HC PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ (SEQ ID NO: FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR 379) EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVLEDLKNV FPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSG
No. do Amostras Sequências Plasmídeo
VCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLS ENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLI T1-LC YGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWT (SEQ ID NO: FGQGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSK 380) DSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTF
FPSPESS
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD 381) VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPS
PESS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK NRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSS RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG
RYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE U6-T1-HC DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE U6T1.G19R. YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC (SEQ ID NO: IgG4 LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR 382)
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWV TFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCA RTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLI T1-LC YGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWT (SEQ ID NO: FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV 383) QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD 384) VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPS
PESS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
NRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL U6T1.G25.I
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSS gG4
RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG U6-T1-HC RGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVR (SEQ ID NO: QAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR 385) AEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST
SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK
No. do Amostras Sequências Plasmídeo
TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLI T1-LC YGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWT (SEQ ID NO: FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV 386) QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW 387) KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTH
EGSTVEKTVAPTECS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK NRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSL
RLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGR U6-T1-HC FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTV U6T1.G25R. LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVN (SEQ ID NO: IgG4 GKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ 388)
VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGK
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLI T1-LC YGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWT (SEQ ID NO: FGQGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSK 389) DSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTF
FPSPESS
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD 390) VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPS
PESS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS
TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK U6T4.G26.I
NRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL gG4 VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSS U6-HC-T4-LC
RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG (SEQ ID NO: RGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLNSDGNTYL 391) YWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLGSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED
VGVYYCVQGTHDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
No. do Amostras Sequências Plasmídeo
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGYDWTWIRKPPGKGMEWI GYISYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCAS MMVPHYYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL T4-HC GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP (SEQ ID NO: KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE 392) QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW 393) KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTH
EGSTVEKTVAPTECS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK NRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ U6-T5-HC FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR U6T5.G19.I EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT (SEQ ID NO: gG4 TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS 394)
LSLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADK STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLVTVLEDLKN VFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHS GVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSPKLWVHG T5-LC TSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFG (SEQ ID NO: GGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDS 395) DVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFP
SPESS
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD 396) VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPS
PESS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK NRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL
VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSS U6T5.G19R. RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG IgG4 RYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE U6-T5-HC DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE (SEQ ID NO: YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC 397) LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWM GRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA RRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
No. do Amostras Sequências Plasmídeo
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSPKLWVHG T5-LC TSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFG (SEQ ID NO: GGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW 398) KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD 399) VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPS
PESS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK NRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSS RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG
RGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYFMNWVR U6-T5-HC QAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADKSTSTAYMELSSLR U6T5.G25.I SEDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS (SEQ ID NO: gG4 TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS 400)
SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSPKLWVHG T5-LC TSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFG (SEQ ID NO: GGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW 401) KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYR U6-LC DSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGG (SEQ ID NO: GTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW 402) KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTH
EGSTVEKTVAPTECS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS TITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK NRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSV
KVSCKASGYTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKFKKR U6-T5-HC VTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLVT U6T5.G25R. VLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWV (SEQ ID NO: IgG4 NGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRC 403)
QVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSLGK
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSPKLWVHG T5-LC TSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFG (SEQ ID NO: GGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDS 404) DVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFP
SPESS
No. do Amostras Sequências Plasmídeo
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGYDWTWIRKPPGKGMEWI GYISYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCAS MMVPHYYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE T4-HC-U6-LC
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[0523] Ambas as construções U6T1 e T1U6 foram expressas normalmente no sistema Expi293, e a proteína expressa alcançou cerca de 90% de pureza após a purificação em uma etapa da cromatografia em proteína A. As Figuras 23A-23B mostraram as caracterizações por SDS-PAGE e SEC-HPLC das proteínas purificadas.
Para inspecionar sua capacidade de ligação, ensaios de ligação baseados em células para os alvos PD-1 e CTLA-4 foram conduzidos posteriormente. As Figuras 24A-24B mostraram que tanto U6 quanto T1 tinham ligação reduzida, se localizados no lado inferior do formato. Considerando que a função do PD-1 tem importância relativamente maior do que a do CTLA-4 (sabe-se que os anticorpos contra CTLA-4 têm efeito colateral mais grave), o lado de ligação ao PD-1 foi colocado no lado superior para maximizar a ligação ao U6 (ou seja, U6T1, em vez de T1U6), e para testar como otimizar a ligação ao CTLA-4 localizada no lado inferior.
[0524] Os outros três formatos de WuXiBody G19R, G25 e G25R (mostrados na Figura 22) foram investigados também. Além disso, um anticorpo de referência AK- 104 (Akeso Biopharma, Inc.), que é um anticorpo biespecífico PD-1/CTLA-4 utilizado no ensaio clínico, foi obtido e utilizado como um controle para comparação direta.
[0525] Devido à importância da função de PD-1, U6 foi mantido no lado superior de todos os formatos para maximizar a ligação a PD-1, enquanto T1 foi mantido na parte inferior para realizar a ligação adequada a CTLA-4. Todas as moléculas construídas foram bem expressas em Expi293 e alcançaram facilmente > 90% de pureza após purificação em uma etapa da cromatografia em proteína A. As Figuras 25A-25B mostraram as proteínas purificadas caracterizadas por SDS-PAGE, bem como por SEC-HPLC.
[0526] Os ensaios de ligação a PD-1 e CTLA-4 baseados em células foram então realizados para verificar a capacidade de ligação de todas as moléculas recém- construídas. As Figuras 26A-26B mostraram as comparações das curvas de ligação entre as construções desenvolvidas e o anticorpo de referência. Os dados mostraram que todas as proteínas tinham uma ligação a PD-1 muito semelhante ao anticorpo de referência. Além disso, a ligação ao CTLA-4 melhorou significativamente no formato G25 e G25R e alcançou um desempenho comparável ao anticorpo de referência (<=
2 vezes). O formato G19R, no entanto, ainda não funcionou bem. É provável que G19 e G19R tenham compartilhado o mesmo problema que impediu a ligação efetiva de T1.
[0527] As funções das moléculas foram ainda caracterizadas pela inspeção de suas capacidades de competição para cada ligante de dois alvos, PD-L1 e CD80.
As Figuras 27A-27B confirmaram que estas moléculas têm um desempenho comparável ao valor de referência para competir com PD-L1. Para o lado do CTLA-4, o formato G25R apresentou capacidade semelhante àquela da referência ao competir com o CD80. Os outros dois formatos tiveram resultados relativamente piores. A diferença entre G25 e G25R é a localização da região constante do TCR. Parece que a conversão de T1 no formato WuXiBody facilitou a atividade de T1, embora T1 ainda estivesse abaixo de U6. Isso proporcionou um bom exemplo de demonstração de que os líderes funcionais poderiam ser efetivamente triados por varredura em relação ao número limitado de formatos derivados do WuXiBody.
[0528] Consequentemente, foi obtido um anticorpo biespecífico PD-1/CTLA-4 funcional semelhante ao anticorpo de referência. Os formatos de WuXiBody são muito universais, ou seja, qualquer novo anticorpo pode se encaixar nesses formatos e desempenhar sua função. Se um bom anticorpo parental estiver disponível, ele poderá ser usado para criar uma molécula superior ao anticorpo de referência.
[0529] Para provar o conceito, um outro anticorpo anti-CTLA-4 W3162_1.154.8-z35 (chamado T5), que tem afinidade muito mais forte do que Ipilimumab, foi desenvolvido e implementado em todos os quatro formatos G19, G19R, G25 e G25R mostrados na Figura 22. Novamente, todas as novas construções foram bem expressas nas células Expi293 e facilmente purificadas por cromatografia em proteína A em uma etapa. Os graus de pureza das proteínas foram mostrados nas Figuras 28A-28B.
[0530] As ligações de todas as moléculas U6T5, da molécula U6T1.G25R previamente identificada, bem como do anticorpo de referência foram todas conduzidas e comparadas. Os resultados foram listados nas Figuras 29A-29B. O lado de PD-1 manteve os comportamentos de ligação originais como observado anteriormente, porque nenhum anticorpo PD-1 foi substituído em nenhum dos formatos. No entanto, para o lado de CTLA-4, todas as construções de U6T5 (mesmo os formatos G19 e G19R) exibiram ligações superiores óbvias em relação ao U6T1.G25R, bem como à molécula de referência. O U6T5.G25 foi a mais forte entre todas as novas proteínas, que tiveram EC50 melhorado em 1,6x e valores superiores melhorados > 3x em relação ao anticorpo de referência. Esta molécula foi ainda caracterizada no ensaio ELISA de ligação dupla e nos ensaios de competição por FACS. A Figura 30 provou as ligações duplas eficazes das moléculas para ambos os alvos simultaneamente. Os dados nas Figuras 31A-31B confirmaram que U6T5.G25 teve significativamente melhor capacidade de competição com o CD80 para CTLA-4.
Isso provou que os formatos de WuXiBody foram suficientemente flexíveis para lidar com diferentes anticorpos parentais. A parte superior de um anticorpo parental pode ser bem conservada e refletida quando a molécula é conectada aos formatos de WuXiBody.
[0531] A estabilidade térmica das moléculas que abrangeram todos os quatro formatos simétricos foi caracterizada. A maioria das moléculas mostrou a temperatura de fusão em torno de 60°C (mostrada na Tabela 37), o que é consistente com o formato assimétrico mostrado acima.
TABELA 37: Temperaturas de anticorpos representativos nos formatos de WuXiBody Concentração Th1 Th2 Nome de Proteína Isotipo pI Tampão (mg/ml) (℃) (℃) T1U6.G19.IgG4 IgG4,kappa,lambda 5,92 PBS 1,3 60,8 69,9 U6T1.G19.IgG4 IgG4,kappa,lambda 5,92 PBS 0,9 59,1 72,8 U6T1.G25R.IgG4 IgG4,kappa,lambda 6,06 PBS 1,385 60,8 73,9
U6T5.G19.IgG4 IgG4,kappa,lambda 5,93 PBS 0,6 56,2 74,1 U6T5.G19R.IgG4 IgG4,kappa,lambda 5,87 PBS 1,2 63,4 — U6T5.G25.IgG4 IgG4,kappa,lambda 5,93 PBS 0,7 63,4 — U6T5.G25R.uIgG4 IgG4,kappa,lambda 5,99 PBS 0,5 57,2 74,1 EXEMPLO 16: Fab quimérico com troca de leve-pesada
[0532] No total, 111 formatos potenciais baseados em WuXiBody foram desenvolvidos com sucesso. Além dos E17, F16, G19, G19R, G25 e G25R mostrados acima, também foram desenvolvidos alguns formatos com Fab quimérico com TCR com leve-pesada cruzada. Estes foram nomeados G26, G26R e G27, mostrados na Figura 32. Desta vez, o par de anticorpos U6 e T4 foi usado, onde T4 era um anticorpo anti-CTLA-4, WBP3162-1.146.19-z12. O par T4U6 foi desenvolvido no formato G27 e G26R. As Figuras 33A-33B mostraram a proteína purificada caracterizada por SDS- PAGE e SEC-HPLC. Embora ambas as proteínas tenham sido expressas, T4U6.G27.IgG4 apresentou baixo grau de pureza, mas T4U6.G26R.IgG4 tinha peso molecular correto e alta pureza. A capacidade de ligação da última molécula foi caracterizada na ligação em FACS. As Figuras 34A-34B mostraram que a ligação a PD-1, uma vez localizado no lado inferior, foi afetada, enquanto o lado de ligação do CTLA mostrou recuperação completa, pois foi colocado no lado superior do formato.
[0533] O par de U6T4 foi testado no formato G26. Ambos as etapas de expressão e purificação funcionaram bem, tal como mostrado nas Figuras 35A-35B.
As ligações evidenciadas por ELISA e FACS foram conduzidas e os dados foram apresentados nas Figuras 36A-36D. Esses dados provaram que o Fab quimérico com leve-pesada cruzada ainda pode funcionar bem. A temperatura de fusão desta molécula é de cerca de 63,4, conforme mostrado na Tabela 38.
TABELA 38. Temperatura de fusão de U6T4.G26.IgG4 Concentração Th1 Th 2 Nome de Proteína Isotipo pI Tampão (mg/ml) (℃) (℃) U6T4.G26.IgG4 IgG4,kappa,lambda 5,93 PBS 0,8 63,4 - EXEMPLO 17: Anti-CD13 x CD19 WuXiBody Biespecífico
Fundamentos Biologia alvo
[0534] O CD19 humano é uma proteína transmembrana do tipo I pertencente à superfamília de imunoglobulina (Carter et al., Curr Dir Autoimmun, 2004, 7: 4-32). É expresso na maioria das células B, mas não é detectado nas células plasmáticas, células-tronco ou na linhagem mieloide normal (Tedder, Nat Rev Rheumatol, 2009, 5 (10): 572-577). O CD19 está criticamente envolvido no estabelecimento de limiares de sinalização de células B intrínsecos através da modulação da sinalização dependente e independente do receptor de células B (BCR) (Wang et al., Experimental Hematology & Oncology, 2012, 1:36). O CD19 tem expressão mais ampla que CD20. O padrão de expressão de CD19 é mantido nas neoplasias de células B, cobrindo todos os subtipos de linfoma de células B, das formas indolentes às agressivas, bem como a leucemia linfocítica crônica de células B e leucemia linfoblástica aguda não-T e permite o direcionamento de indicações tumorais de células B precoces, como uma leucemia linfoblástica aguda (LLA), que não podem ser afetadas pelo Rituximab. Vários anticorpos CD19 monoclonais têm sido explorados para a terapia do linfoma (Publicação do Pedido Patente U.S. No. 20140072587 A1, Patente U.S. No. 8,242,252 B2, e Patente U.S. No. 8,097,703 B2).
[0535] O correceptor de células T CD3 é um complexo de proteínas composto por quatro cadeias distintas, uma cadeia CD3Gama, uma cadeia CD3delta e duas cadeias CD3epsilon. As quatro cadeias se associam a uma molécula conhecida como receptor de células T (TCR) e a cadeia zeta para gerar sinal de ativação nos linfócitos T. Os TCRs, a cadeia zeta, e as moléculas de CD3 compõe o complexo TCR, em que o TCR, como uma subunidade, reconhece e se liga ao antígeno, e CD3, como uma subunidade, transfere e transporta a estimulação antigênica para a via de sinalização, e, finalmente, regula o atividade das células T. A proteína CD3 está presente em praticamente todas as células T. O complexo CD3-TCR modula as funções das células
T, tanto na resposta imune inata quanto na adaptativa, assim como as funções imunes celulares e humorais. Essas incluem a eliminação de organismos patogênicos e o controle do crescimento tumoral por uma ampla variedade de efeitos citotóxicos.
Anticorpos monoclonais de camundongo específicos para CD3 humano, como OKT3 (Kung et al., Science, 1979, 206: 347-9), foram os anticorpos CD3 de primeira geração desenvolvidos para tratamento. Embora o OKT3 tenha uma forte potência imunossupressora, seu uso clínico foi dificultado devido aos sérios efeitos colaterais ligados a seus potenciais imunogênicos e mitogênicos (Chatenoud, Nature Reviews, 2003, 3: 123-132). O OKT3 induziu uma resposta antiglobulina, promovendo sua própria rápida depuração e neutralização (Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 1982, 137: 830-8). Além disso, OKT3 induziu a proliferação de células T e a produção de citocinas in vitro, e levou a uma liberação em larga escala de citocinas in vivo (Hirsch et al., J. Immunol, 1989, 142: 737-43). Tais efeitos colaterais graves limitaram o uso mais difundido de OKT3 no transplante, bem como a extensão de seu uso em outros campos clínicos, como autoimunidade (Id.).
[0536] Um anticorpo biespecífico direcionado a CD3 e CD19 podem se ligar às células T e às células B simultaneamente. Uma vez que o anticorpo biespecífico se liga a uma célula T CD3 positiva e a uma célula B CD19 positiva, é formada uma sinapse citolítica. A citotoxicidade é então induzida pela liberação de perforina e granzimas a partir de grânulos na célula T citotóxica, estes últimos induzindo apoptose e a lise da célula B maligna.
[0537] A atividade do blinatumomab foi provada como independente da apresentação do antígeno pelo reconhecimento de MHC de classe I e TCR. Portanto, ele pode contornar uma variedade de mecanismos de escape imune mediados por tumores, como comprometimento das máquinas de apresentação de antígenos e ativação de sinais coestimuladores negativos no microambiente tumoral.
Necessidade médicas não atendidas
[0538] O tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em adultos permanece desafiador e são necessárias novas terapias. Com as terapias atuais, as taxas de resposta variam de 30 a 50%, dependendo da duração da remissão inicial, idade e citogenética. As taxas gerais de resposta para um subconjunto de linfoma não Hodgkin (NHL) agora são maiores que 90% em regimes que empregam a primeira geração de anticorpos anti-CD20. No entanto, vários subtipos de NHL não são tão responsivos a essas terapias, e a maioria dos pacientes com NHL responsivo acaba por apresentar recidivas após o regime padrão combinado de imunoterapia/quimioterapia. Assim, são necessárias novas terapias de primeira linha e novos regimes de resgate para essas necessidades não atendidas.
Materiais e métodos Geração de linhagem celular de macaco cinomolgo que expressa CD19
[0539] O gene completo do CD19 de humano ou macaco cinomolgo foi clonado no vetor pcDNA3.3. Cada vetor de expressão foi então transfectado para as células CHO-K1, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000. As células foram cultivadas em F12-K com 10% de SFB. Blasticidina foi adicionada 24-48 horas após a transfecção. Após duas a três passagens da seleção, as células foram enriquecidas por anticorpo anti-CD19 conjugado com PE e microesferas anti-PE (Miltenyi - 013- 048-801). Os clones de célula única estáveis foram isolados por diluição limitante e rastreados por FACS utilizando-se anticorpo anti-CD19.
Linhagens tumorais que expressam alvo
[0540] As células Raji e Jurkat foram provenientes da ATCC. A célula Ramos foi proveniente da ECACC. Todas as células tumorais foram cultivadas em RPMI1640/10% de SFB.
Construção do WuXiBody W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP e W3438- T3U4.F16-1.uIgG4.SP
[0541] Os genes VL, VH, Ck, CH1 foram amplificados por PCR a partir de modelos internos de DNA existentes. Os genes CAlfa e CBeta foram sintetizados por Genewiz Inc. Os genes da cadeia leve quimérica de Anti CD3 ou nativa de Anti CD19 foram inseridos em um vetor linearizado contendo um promotor de CMV e um peptídeo sinal kappa. Os fragmentos de DNA de Anti CD3 VH-CBeta foram inseridos em um vetor linearizado contendo a região constante CH2-CH3 de IgG4S228P humana com uma mutação knob. Os fragmentos de DNA de Anti CD 19 VH-CH1 foram inseridos em um vetor linearizado contendo a região constante CH2-CH3 de IgG4S228P humana com uma mutação hole. O vetor contém um promotor de CMV e um peptídeo sinal de cadeia pesada de anticorpo humano.
Expressão e purificação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP e W3438- T3U4.F16-1.uIgG4.SP
[0542] Os plasmídeos de expressão de cadeia pesada e cadeia leve foram cotransfectados para células Expi293 utilizando-se o kit do sistema de expressão Expi293 (ThermoFisher-A14635) de acordo com as instruções do fabricante. Cinco dias após a transfecção, os sobrenadantes foram coletados e a proteína foi purificada utilizando-se a coluna de proteína A (GE Healthcare-17543802) e coluna adicional para exclusão por tamanho (GE Healthcare-17104301). A concentração de anticorpos foi medida por Nano Drop. A pureza das proteínas foi avaliada por SDS-PAGE e HPLC-SEC.
Ligação ao alvo por FACS
[0543] A ligação de anticorpos biespecíficos a células que expressam CD3 e CD19 foi avaliada utilizando-se Jurkat e Ramos, respectivamente. Um anticorpo não relevante foi utilizado como controle de isotipo. As células foram difundidas em placas de 96 poços (Corning-3799) a uma densidade de 105 células/poço e lavadas com PBS/1% de BSA. Os anticorpos foram diluídos em série e incubados com as células a 4°C por 1 hora. O anticorpo de cabra anti-IgG Fc humano conjugado com PE
(Jackson-109-115-098) foi utilizado para a detecção. Após lavagem e ressuspensão, as células foram analisadas por citometria de fluxo (Canto II, BD Biosciences). Os dados foram analisados no software FlowJo. A análise de regressão não linear de quatro parâmetros foi usada para calcular os valores de EC50 utilizando-se o software GraphPad Prism.
Ligação ao CD3 de cinomolgo
[0544] A ligação do anticorpo biespecífico CD3 × CD19 ao CD3 de cinomolgo foi testada por ELISA de ligação a proteínas. Placas ELISA de 96 poços de alta ligação às proteínas (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher, Thermo-442404) foram revestidas durante a noite a 4°C com 100 µL de 1 μg/mL de proteína epsilon de CD3 de cinomolgo (Acro, #CDE-C5226) em tampão de carbonato-bicarbonato (20 mM de Na 2CO3, 180 mM de NaHCO3, pH 9.2). Todos os poços foram lavados uma vez com 300 μL de PBS/0,5% de Tween-20 (v/v) por poço. Os poços foram então bloqueados por uma hora à temperatura ambiente com 200 μL de PBS/2% de BSA (BOVOGEN, #BSAS) por poço e lavados três vezes com 300 μL por poço de PBS/0,5% de Tween-20 (v/v) Para a ligação do anticorpo primário, o anticorpo biespecífico CD3 × CD19 diluído em série em PBS/2% de BSA foi transferido para os poços relevantes e incubado à temperatura ambiente por duas horas. As placas foram lavadas três vezes da mesma forma anterior antes da adição de 100 µL de anticorpo secundário de 100 ng/mL de anti-IgG Fc humano-HRP de cabra (Bethyl, #A80-304P). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora, seguido de seis lavagens como descrito acima. Para a detecção da ligação, 100 µL de solução de substrato tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-860336) foram adicionados a todos os poços durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro antes de parar a reação com 100 µL de HCl a 2M. A extensão da ligação do anticorpo biespecífico ao CD3 de cinomolgo foi determinada medindo-se a absorbância a OD450 utilizando-se o leitor de microplacas SpectraMax® M5e. Sempre que apropriado, os valores de EC 50 de ligação foram obtidos pela análise de regressão não linear de quatro parâmetros, utilizando-se o software GraphPad Prism 5.
Ligação ao CD19 de cinomolgo
[0545] A ligação do anticorpo biespecífico CD3 × CD19 à proteína-alvo CD19 de cinomolgo expressa em células CHOK1 foi determinada pela análise de citometria de fluxo. Resumidamente, a linhagem celular estável que superexpressa o CD19 de cinomolgo (WBP701.CHOK1.cPro1.C9, WuXiBiologics) foi coletada com tripsina e diluída para 1 x 106 células/mL em 1% de BSA/PBS 1X. 1 x 105 células/poço (100 µL) foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo U (Corning, #3799) e centrifugadas a 1500 rpm (Eppendorf, #5810R) durante 5 minutos antes da remoção do sobrenadante. Os anticorpos diluídos em série em 1% de BSA/PBS 1X foram adicionados a 100 µL/poço às células sedimentadas e incubados a 4°C durante 1 hora.
Um anticorpo hIgG4 não relacionado foi usado como controle de isotipo. As células foram lavadas duas vezes com 180 µL/poço de 1% de BSA/PBS 1X por centrifugação a 1500rpm por 5 minutos a 4°C. As células sedimentadas foram ressuspensas em 100 µL/poço de anticorpo anti-IgG Fc humano marcado com fluorescência (Jackson, #109- 115-098) diluído a 1:150 em 1% de BSA/PBS 1X por 30 minutos a 4°C no escuro. As células foram então lavadas duas vezes como descrito acima. Após a lavagem final, as células foram ressuspensas em 80 µL de 1% de BSA/PBS 1X e os valores de fluorescência foram medidos com um citômetro FACS Canto II (BDBiosciences). A quantidade de anticorpo biespecífico anti-CD19 e CD3 ligado à superfície celular foi avaliada medindo-se a fluorescência média (MFI). Os dados brutos do FACS foram analisados pelo software FlowJo; poços contendo nenhum anticorpo ou anticorpo secundário foram usados apenas para estabelecer a fluorescência de fundo. Os valores de EC50 de ligação foram obtidos pela análise de regressão não linear de quatro parâmetros utilizando-se o software GraphPad Prism 5.
Afinidade por FACS
[0546] A afinidade de ligação a CD3 e CD19 foi determinada por citometria de fluxo utilizando-se células Jurkat e Ramos, respectivamente. As células foram transferidas para placas de 96 poços de fundo em U (BD) a uma densidade de 5x10 4 células/poço. Os anticorpos a serem testados foram diluídos em série de 1:2 vezes em 1% de PBS 1X/1% de BSA e incubados com as células a 4°C por 1 hora. Em seguida, as placas foram centrifugadas a 1500 rpm durante 4 minutos e o sobrenadante descartado. O anticorpo secundário, anti-IgG Fc humano de cabra conjugado com Alexa 647 (Jackson, Cat #109-605-098) ou anti-His de cabra conjugado com FITC (Bethyl, Cat #A190-113F) foi adicionado às células ressuspensas e incubado em 4°C no escuro por 30 min. As células foram lavadas uma vez e ressuspensas em 100 mL de PBS 1X/1% de BSA. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
A intensidade da fluorescência foi convertida em moléculas/célula ligadas com base nas esferas quantitativas (QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories). K D foi calculado por Graphpad Prism 5.
Ligação dupla às células-alvo
[0547] A capacidade de os anticorpos biespecíficos em ligar células T CD3 e células B CD19 foi testada por FACS. Células Jurkat e Raji foram pré-marcadas separadamente com 20 nM de CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564) e 50 nM de calceína-AM (Invitrogen-C3099) a 37°C durante 30 min, a uma densidade de 1 x 10 6 células/mL. As células pré-marcadas sedimentadas foram lavadas duas vezes com PBS/1% de BSA, em seguida, misturadas 1:1 até uma densidade final de 1 x 10 6 células/mL. A mistura de células foi centrifugada e ressuspensa com 10 nM de anticorpo seguido por 1 hora de incubação. A mistura celular foi analisada por citometria de fluxo imediatamente após a incubação. O percentual de ligação (bridging) foi calculado como o percentual de eventos marcados simultaneamente com Far-Red e calceína.
Ensaio de citotoxicidade
[0548] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) fresco foram isoladas por centrifugação de densidade por Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17- 1440-03) a partir de sangue venoso heparinizado. As PBMCs obtidas foram passadas através das colunas EasySep (Stemcell-19053) para o enriquecimento de células T CD8+, que foram usadas como células efetoras. A eficácia dos anticorpos para mediar a lise das células tumorais pelas células T CD8 + foi determinada por citometria de fluxo. No ensaio de citotoxicidade, as células B Raji CD19 como células-alvo foram pré-marcadas com 20 nM de CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564) a 37°C por 30 min, seguido pela lavagem dos sedimentos celulares duas vezes com RPMI 1640 sem fenol (Invitrogen-11835030) suplementado com 1% de SFB. Incubou-se as Raji marcadas com Far Red (20.000 células por poço) em placa de fundo redondo de 96 poços (Corning-3799) com as células T CD8+ isoladas (proporção de células efetoras/alvo a 5:1) e anticorpos diluídos em série a 37°C por 4 h. Após a incubação, 3 µM de iodeto de propídio (PI, Invitrogen-P3566) foram muito bem misturados para a identificação de células mortas. Após 15 minutos, as células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando-se um citômetro FACSCanto II. A citotoxicidade mediada por Ab pode ser definida como o percentual de células-alvo positivas para PI em células-alvo positivas para Far Red. EC50 da citotoxicidade foi determinada pelo Prism.
Ensaio de ativação de células T Citocinas TNFα e IFNγ secretadas
[0549] A ativação das células T foi refletida pela quantidade de TNFα e IFNγ secretada para o sobrenadante. O procedimento de isolamento de células T positivas para CD4 e CD8 foi descrito na Seção “Ativação de células T (marcação intracelular de citocinas TNFα e IFNγ)”. A mistura de células B Raji humanas (2 x 10 4 células/poço), células T CD4 ou CD8 (1 x 105 células/poço) e anticorpos foi coincubada a 37°C durante 24 h. O sobrenadante foi coletado seguido por centrifugação da mistura reacional a 1500 rpm por 5 min. A quantidade de TNFα e IFNγ no sobrenadante foi determinada por ELISA de TNF humano (R&D-DY210) e ELISA de IFNγ humano (Ab de Captura: Thermo Fisher - M700A, Ab de Detecção: Thermo Fisher - M701B, Substância Padrão: PEROTECH - 300-02), respectivamente.
[0550] O procedimento de ELISA sanduíche foi o seguinte. Placas de ELISA de 96 poços de alta ligação à proteína (ThermoFisher - 442404) foram revestidas durante a noite a 4°C ou à temperatura ambiente com 50 μL/poço de anticorpo de captura em tampão carbonato-bicarbonato (20 mM de Na2CO3, 180 mM de NaHCO3, pH 9.2) de acordo com as especificações do kit. Todos os poços foram lavados três vezes com 300 μL de PBS/0,5% de Tween-20 (v/v) por poço e todas as etapas de lavagem seguintes do ensaio foram realizadas igualmente. Os poços foram então bloqueados por uma hora com PBS/2% de BSA (BovoGen Biologicals-BSAS) para TNFα e 100% de caseína (Pierce-37528) para IFNγ e depois lavados três vezes, seguido pela ligação do sobrenadante coletado acima ou substância padrão (50 μL/poço) por 1 hora em temperatura ambiente e três lavagens em seguida. Para a ligação do anticorpo de detecção, os anticorpos correspondentes diluídos em PBS/2% de BSA para TNFα e 50% de caseína para IFNγ foram adicionados aos poços relevantes e incubados à temperatura ambiente por duas horas. As placas foram lavadas três vezes antes da adição de 50 μL de anticorpo secundário SA-HRP. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora, seguido de seis lavagens como descrito acima. Para a detecção da ligação, 50 μL de solução de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-860336) foram adicionados a todos os poços por 10 minutos antes de interromper a reação com 50 mL de HCl a 2M. A quantidade de TNFα e IFNγ foi determinada medindo-se a absorbância a OD450 utilizando-se o leitor de microplacas SpectraMax® M5e.
Ensaio de ativação de células T - expressão do marcador de superfície CD25 e CD69
[0551] A ativação das células T foi refletida pelos sinais de marcação dos receptores de superfície CD25 e CD69. O procedimento de isolamento de células T positivas para CD4 e CD8 foi descrito na Seção “Ativação de células T (marcação intracelular de citocinas TNFα e IFNγ)”. A mistura de células B Raji humanas (2 x 10 4 células/poço), células T CD4 ou CD8 (1 x 105 células/poço) e anticorpos foi coincubada a 37°C durante 24 h. Após lavagem uma vez com 1% de BSA, os sedimentos celulares foram ressuspensos com tampão de marcação contendo anti- CD4 humano de camundongo marcado com FITC (BD-550628) ou anti-CD8 humano de camundongo marcado com PerCPCy5.5 (BD-560662), anti-CD69 humano de camundongo marcado com PE (BD-560968) e anti-CD25 humano de camundongo marcado com APC (BD-555434), seguido por uma incubação de 30 minutos a 4°C.
Após duas lavagens das células, o percentual de células positivas para PE e APC em células positivas para FITC ou PerCPCy5.5 foi determinado por citometria de fluxo.
Estabilidade térmica (DSF)
[0552] A temperatura de fusão (Tm) dos anticorpos foi investigada utilizando- se sistema de PCR em tempo real QuantStudio 7 Flex (Applied Biosystems). 19 µL da solução de anticorpo foram misturados com 1 µL da solução de SYPRO Orange (Invitrogen) 62,5x e transferidos para uma placa de 96 poços (Biosystems). A placa foi aquecida de 26°C a 95°C a uma taxa de 0,9°C/min, e os dados de fluorescência resultantes foram coletados. As derivadas negativas das mudanças de fluorescência em relação às diferentes temperaturas foram calculadas e o valor máximo foi definido como a temperatura de fusão Tm. Se uma proteína continha múltiplas transições de desdobramento, as duas primeiras Tm eram identificadas e nomeadas como Tm1 e Tm2. A coleta de dados e o cálculo da Tm foram realizados automaticamente pelo software de operação.
Estabilidade sérica
[0553] Sangue humano fresco foi coletado de doadores selecionados e transferidos para tubos de poliestireno sem anticoagulante. Após 30 min de repouso à temperatura ambiente, o sangue humano foi centrifugado a 4000 rpm durante 10 minutos para a coleta da camada de soro. A etapa de centrifugação foi repetida até o soro clarificar. Os anticorpos foram misturados sob detecção com o soro coletado na proporção de 1:9, e as alíquotas foram coletadas a 37°C nos tempos indicados: 0 dia, 1 dia, 4 dias, 7 dias e 14 dias. As amostras foram congeladas rapidamente em diferentes pontos de tempo em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C até a sua utilização. As amostras foram analisadas por FACS para avaliar a capacidade de ligação em células T CD3 Jurkat e células B CD19 Ramos em comparação com a dos anticorpos correspondentes sem tratamento sérico.
Afinidade de ligação ao receptor Fcγ por SPR
[0554] A afinidade de ligação do anticorpo aos FcγRs foi detectada utilizando- se o Biacore T200 (ou Biacore 8K). Cada receptor foi capturado em um chip sensor CM5 (GE) imobilizado com anticorpo anti-his. Os anticorpos em diferentes concentrações foram injetados sobre o chip sensor a uma taxa de fluxo de 30 µL/min para uma fase de associação de 60 s, seguida por dissociação de 60 s. O chip foi então regenerado por glicina a 10 mM (pH 1,5) após cada ciclo de ligação.
[0555] Os sensogramas do canal de tampão e superfície de referência (blank) foram subtraídos dos sensogramas testes. Os dados experimentais foram ajustados pelo modelo 1: 1 utilizando-se a análise de Langmiur (para FcγRI) ou modelo de estado estacionário (para outros receptores). O peso molecular de 150 KDa foi utilizado para calcular a concentração molar dos anticorpos.
Ligação a C1q por ELISA
[0556] As placas ELISA (Nunc) foram revestidas com amostras de anticorpos a 3μg/mL durante a noite a 4°C. Após o bloqueio e a lavagem, o C1q foi gradualmente diluído a partir de 600 μg/mL e incubado à temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram então lavadas e subsequentemente incubadas com anti-C1q Ab-HRP humano de ovelha por 1 hora. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a interação foi interrompida por HCl a 2 M. A absorbância a 450 nm foi lida utilizando- se um leitor de microplacas (Molecular Device).
Afinidade de ligação ao FcRn por SPR
[0557] A afinidade de ligação do anticorpo ao FcRn foi detectada utilizando- se o Biacore T200 (ou Biacore 8K). Cada anticorpo foi imobilizado no chip sensor CM5 (GE). FcRn em diferentes concentrações em tampão de corrida (50 mM de Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) foram injetados sobre o chip sensor a uma taxa de fluxo de 30 µL/min para uma fase de associação de 60 s, seguidos por 60 s de dissociação. O chip foi então regenerado por PBS 1X (pH 7,4) após cada ciclo de ligação.
[0558] Os sensogramas do canal de tampão e superfície de referência foram subtraídos dos sensogramas testes. Os dados experimentais foram ajustados pelo modelo de estado estacionário. Um peso molecular de 45 KDa foi usado para calcular a concentração molar de FcRn.
Estudo de eficácia no modelo de Raji murino /PBMC
[0559] As células tumorais Raji (ATCC® CCL-86™) foram mantidas in vitro como uma cultura em monocamada em RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram coletadas e contadas para inoculação de tumores.
[0560] As PBMC humanas foram isoladas a partir de sangue total heparinizado utilizando-se Ficoll-Paque Plus de acordo com as instruções do fabricante.
[0561] Cada camundongo foi coinoculado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais Raji misturadas com Matrigel e PBMC fresco em 0,2 mL de PBS em D0. A injeção de anticorpos foi realizada a partir de D3 (i.v. duas vezes por semana x 4 vezes).
Preparação do artigo de teste Conc. Compostos Dosagem Preparação mg/ml Controle Isotipo 0,031 mL de solução + 9,38 mg/mL 1,5 1,908 mL de PBS W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP B: 0,138 mL de solução + 1,5 2,254 mL de PBS W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP B1: 0,450 mL de B + 1,800 2,6 mg/mL 0,3 mL de PBS W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP B2: 0,450 mL de B1 + 0,06 1,800 mL de PBS Desfechos e Medições dos tumores
[0562] O principal desfecho foi avaliar se o crescimento tumoral poderia ser retardado ou se os camundongos puderam ser curados. O tamanho tumoral foi medido duas vezes por semana em duas dimensões por meio de um paquímetro, e o volume foi expresso em mm3 através da fórmula: V = 0,5 a x b2, em que a e b são os diâmetros longos e curtos do tumor, respectivamente. O valor T/C (em percentual) é uma indicação da eficácia antitumoral.
[0563] O TGI foi calculado para cada grupo utilizando-se a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100; Ti é o volume tumoral médio de um grupo de tratamento em um determinado dia, T0 é o volume tumoral médio do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi é o volume tumoral médio do grupo controle de veículo no mesmo dia com Ti, e V0 é o volume tumoral médio do grupo veículo no dia do início do tratamento.
Farmacocinética (PK), toxicidade e imunogenicidade em macaco cinomolgo
[0564] 1 mg/kg de WBP3438 uma vez por administração intravenosa em bolus foi administrado em um macaco cinomolgo macho e um macaco cinomolgo fêmea. As formulações foram formuladas em 20 mM de NaAc-HAc, 7,0% (p/p) de Sacarose, 0,02%
(p/v) de PS80, pH 5,0. Amostras de sangue PK foram coletadas na pré-dose (Dia-1), 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, Dia 3, Dia 7, Dia 14, Dia 21 e Dia 28. As amostras de anticorpo antidrogas (ADA) foram coletadas em 3d, 14 d (312 h) e 28 d (480 h).
[0565] As concentrações séricas de WBP3438 e ADA em amostras de soro foram determinadas por ELISA. A concentração sérica de WBP3438 em macacos foi submetido a uma análise farmacocinética não-compartimental utilizando-se o software Phoenix WinNonlin (versão 6.3, Pharsight, Mountain View, CA). A regra trapezoidal linear/log foi aplicada para a obtenção dos parâmetros de PK.
[0566] Observações laboratoriais (cage-side) quanto à saúde e aparência geral, especialmente irritação da pele foram observadas. A análise da amostra de sangue total para hematologia (CBC) e a análise sérica para detecção química foram determinadas pelo analisador hematológico (ADVIA2120) e químico (HITACHI 7180), respectivamente.
Resultados Geração de linhagem celular de cinomolgo que expressa CD19
[0567] A expressão da linhagem celular de cinomolgo que expressa CD19, WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9, foi detectada utilizando-se anticorpo anti-CD19 por citometria de fluxo. WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 mostrou alta expressão de CD19 de macaco (Figura 37).
Geração e otimização do WuXiBody
[0568] A Figura 1 apresenta representações esquemáticas dos anticorpos e formatos estudados. O anticorpo T3 anti-CD3 e o anticorpo U4 anti-CD19 foram desenvolvidos. A região constante (CL e CH1) de T3 foi substituída pelo domínio constante de TCR para desenvolver uma interface de cadeia leve-pesada única que é ortogonal ao anticorpo regular. O T3 modificado com TCR e o U4 nativo em conjunto com as mutações “knobs-into-holes” no domínio Fc foram usados para desenvolver o formato de anticorpo biespecífico E17 e F16.
[0569] Sequências da cadeia leve e cadeia pesada variável das porções de ligação de anti-CD3 e anti-CD19 de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP e W3438- T3U4.F16-1.uIgG4.SP são fornecidas abaixo:
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAA GAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGG CTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCAC TGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTG
GATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAA Sequência de DNA AGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATT (SEQ ID NO: 353) ACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGA VH do anticorpo GCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCT anti-CD3 ACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTAC
TTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGT GAGCTCC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIH Sequência de WVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTI aminoácidos (SEQ TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYY ID NO: 352) FDYWGQGTLVTVSS
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGC TGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCA AGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGG
AAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGG Sequência de DNA CCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCA (SEQ ID NO: 355) CCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGA VL do anticorpo TCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAG anti-CD3 CTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACT W3438- GTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGA T3U4.E17- GGGACTAAAGTGGAGATTAAG
1.uIgG4.SP DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTR & W3438- Sequência de KNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSG T3U4.F16- aminoácidos (SEQ SGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGG
1.uIgG4.SP ID NO: 354) GTKVEIK
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAA GAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGG CTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTAC
TGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTG Sequência de DNA GATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTA (SEQ ID NO: 368) CCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATT VH do anticorpo ACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGA anti-CD19 GCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGT
ACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTAT TGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMY Sequência de WVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTI aminoácidos (SEQ TRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDY ID NO: 367) WGQGTLVTVSS
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTC CGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCT
CAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTAC VL do Sequência de DNA CAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGAT anticorpo CTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAA (SEQ ID NO: 370) anti-CD19 GCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTC
ACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTT TGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACC CCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATT AAG
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWY Sequência de
QQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEF aminoácidos (SEQ TLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEI ID NO: 369) K
[0570] As sequências completas de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP e W3438- T3U4.F16-1.uIgG4.SP são fornecidas abaixo: Anticorpo Cadeia Sequências
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQ
QKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQA T3-LC (SEQ ID EDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSK NO: 12) SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKS
NSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQ GLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEV AVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHS
GVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ T3-HC (SEQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPE ID NO: 25) FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQ
VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF W3438- LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK T3U4.E17- DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAP
1.uIgG4.SP KLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYY U4-LC (SEQ ID NO: CHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA 23) SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQ RLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP
CSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV U4-HC LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE (SEQ ID NO: SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV 26) VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN
HYTQKSLSLSLGK Anticorpo Cadeia Sequências
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQ
QKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQA T3-LC (SEQ EDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSK ID NO: 12) SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKS
NSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS W3438-
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQ T3U4.F16- GLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSL
1.uIgG4.SP RSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEV T3-HC (SEQ AVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHS ID NO: 25) GVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ
VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN
Anticorpo Cadeia Sequências
WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAP
KLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYY U4-LC (SEQ CHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA ID NO: 23) SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQ RLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVG GGGSGGGGSQMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNM
YWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTS U4-HC (SEQ TAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTK ID NO: 27) GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[0571] Produção de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP
[0572] O título da expressão do anticorpo W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP é superior a 90 mg/L através da expressão transitória. Após purificação em duas etapas, a pureza de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP atinge 97,5% (SEC-HPLC, Figura 39).
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP migra com a massa molecular aparente de 75 kDa, 55 kDa e 25 kDa em SDS-PAGE em condições redutoras, o que corresponde às duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As duas cadeias leves podem se sobrepor devido aos pesos moleculares semelhantes. O anticorpo migra com a massa molecular aparente de 200 kDa sob condição não redutora, indicando a molécula biespecífica inicial (Figura 38).
Produção de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP
[0573] O título da expressão do anticorpo W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP é superior a 100 mg/L através da expressão transitória. Após purificação em duas etapas, a pureza de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP atinge 95% (SEC-HPLC, Figura 41). W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP migra com a massa molecular aparente de 54 kDa,
56 kDa e 25 kDa em SDS-PAGE sob condições redutoras, o que corresponde às duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As duas cadeias leves podem se sobrepor devido aos pesos moleculares semelhantes. O anticorpo migra com a massa molecular aparente de 150 kDa sob condição não redutora, indicando a molécula biespecífica intacta (Figura 40).
Ligação ao alvo
[0574] A ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a CD19 e CD3 foi testada em células Ramos e Jurkat por citometria de fluxo (Figuras 42A-42B). O anticorpo W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP mostrou forte atividade de ligação às células Ramos e Jurkat, com valores de EC50 de 15,6 nM e 47 nM, respectivamente.
[0575] A ligação de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP a CD19 e CD3 foi testada em células Ramos e Jurkat por citometria de fluxo (Figuras 43A-43B). O anticorpo W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP mostrou forte atividade de ligação às células Ramos e Jurkat, com valores de EC50 de 1,8 nM e 19,3 nM, respectivamente.
Ligação cruzada entre espécies
[0576] A ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP ao CD19 de cinomolgo foi testada na célula WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 (célula que expressa CD19) por citometria de fluxo (Figura 44). A ligação de EC50 foi de 26 nM. A ligação de W3438- T3U4.E17-1.uIgG4.SP ao CD3 de cinomolgo foi testada utilizando-se W331- cynoPro1.ECD.His (proteína epsilon de CD3 de cinomolgo) por ELISA (Figura 45). A ligação EC50 foi de 0,04 nM.
Afinidade às células alvo
[0577] A afinidade de ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a CD19 e CD3 humanos foi testada em células Ramos e Jurkat por citometria de fluxo. A IgG livre /IgG ligada contra IgG ligada foi representada graficamente nas Figuras 46A e 46B.
Os valores de KD ajustados de ligação a CD19 e CD3 foram 23 nM e 9,0 nM, respectivamente.
Ligação dupla às células alvo
[0578] A atividade de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP para ligar célula T CD3 e célula B CD19 foi testada utilizando células Jurkat Raji pré-marcadas por citometria de fluxo (Figuras 47A-47B). O Q2 ilustra a população de células Jurkat e Raji em ponte ou ligadas. Em comparação com o controle negativo, aproximadamente 18% das células foram ligadas através do anticorpo biespecífico W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP.
Ensaio de citotoxicidade
[0579] A atividade citotóxica de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP foi avaliada utilizando-se células T CD8+ e células Raji. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP induziu lise celular rápida e eficaz ao fim de 4 horas de incubação (Figura 48A) com um valor de EC50 de 15 nM. O percentual máximo de morte celular foi de 90%.
[0580] A atividade citotóxica de W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP foi avaliada utilizando-se células T CD8+ e células Raji. W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP induziu lise celular rápida e eficaz após 4 horas de incubação (Figura 48B) com um valor de EC 50 de 3,2 nM. O percentual máximo de morte celular foi de 90%.
Ativação de célula T alvo-específica
[0581] W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP foi investigado em ensaios que indicaram a ativação de células T através dos marcadores de ativação CD69 e CD25 na presença ou ausência de células alvo CD19+. Os resultados demonstram que W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP induz a expressão dos marcadores de ativação CD25 e CD69 de células T de uma maneira dose-dependente apenas na presença das células-alvo CD19+ (Figuras 49A-49D). Quando a célula B está ausente, não foi observada expressão de CD25 e CD69 nos subconjuntos de células T CD4 + e CD8+.
[0582] O W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP também foi investigado em ensaios de ativação de células T quanto à liberação de citocinas na presença ou ausência de células-alvo CD19+. Os resultados demonstraram que W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP induz a liberação de IFNγ e TNFα de maneira dose-dependente apenas na presença de células-alvo CD19+ (Figuras 50A-50D). Quando a célula B está ausente, nenhum IFNγ e TNFα foi detectado nos subconjuntos de células T CD4 + e CD8+.
Estabilidade térmica
[0583] A estabilidade térmica de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP foi investigada utilizando-se PCR em tempo real. Tm1 e Tm2 de W3438-T3U4.E17-
1.uIgG4.SP são 60,2°C e 72,7°C.
Estabilidade sérica
[0584] W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP foi incubado em soro a 37°C por 14 dias.
A atividade de ligação do anticorpo incubado por 0, 1, 4, 7 e 14 dias foi detectada por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a atividade de ligação de W3438- T3U4.E17-1.uIgG4.SP a ambas as células CD3 e CD19 foi inalterada após incubação em soro humano durante 14 dias (Figuras 51A-51B).
Ligação ao receptor Fcγ
[0585] A atividade de ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a FcγRI, FcγRIIa (H167), FcγRIIa (R167), FcγRIIb, FcγRIIIa (F176),FcγRIIIa (V176) e FcγRIIIb foram investigados por SPR. As afinidades foram resumidas na Tabela 39. W3438- T3U4.E17-1.uIgG4.SP mostrou uma afinidade típica de ligação a IgG4 humana a todos os receptores Fcγ.
TABELA 39. Afinidade do W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP ao receptor Fc por
SPR Receptor Fc KD (M) FcγRI 9,79E-09 FcγRIIa (H167) 2,05E-05 FcγRIIa (R167) 1,58E-05 FcγRIIb 2,41E-05 FcγRIIIa (F176) 2,93E-05 FcγRIIIa (V176) 1,40E-05 FcγRIIIb >4,10E-05
[0586] A atividade de ligação de anticorpos ao C1Q foi testada por ELISA.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP não mostrou sinal de ligação no ELISA (Figura 52), e o anticorpo IgG1 humano de controle mostrou sinal de ligação normal.
Ligação a FcRn
[0587] A ligação de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP ao FcRn foi testada por SPR em pH 6,0. A afinidade foi ajustada como 2,58 µM, que é uma afinidade típica de IgG4 humana para FcRn.
Estudo de eficácia no modelo de xenoenxerto PBMC/Raji
[0588] Neste estudo, a eficácia antitumoral de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP no modelo humanizado de PBMC misturada contendo célula Raji em camundongos NOG foi investigada. A curva de crescimento tumoral é mostrada na Figura 53.
[0589] No D14, o tamanho tumoral médio do grupo de tratamento com controle de isotipo atingiu 342 mm3. O tratamento com 1,5 mg/kg e 0,5 mg/kg de W3438-T3U4.E17-1.uIG4.SP produziu uma atividade antitumoral significativa. O tamanho tumoral médio foi, respectivamente, de 78 mm3 (T/C = 23,0%, TGI = 93,9%, p = 0,016) e 75 mm3 (T/C = 22,0%, TGI = 95,3%, p = 0,014) e o tumor de um animal no grupo de alto nível de dosagem foi erradicado. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP em dose muito baixa (0,06 mg/kg) não mostrou atividade antitumoral.
Farmacocinética (PK) de WuXiBody em macaco cinomolgo
[0590] A concentração de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP no soro de cinomolgo foi testada por ELISA (Figura 54). Os parâmetros de PK calculados foram listados na Tabela 40. A meia-vida de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP para uma única injeção IV a 1 mg/kg foi de 152 horas. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP mostrou meia- vida muito mais longa em macacos do que o blinatumomab, que tem uma meia-vida (1,5-2,6) em horas muito curta em chimpanzés (relatório de avaliação da Agência Europeia de Medicamentos EMA/CHMP/469312/2015).
TABELA 40. PK em cinomolgo de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP
Parâmetro de PK W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP C0 (μg/mL) 60,4 T1/2 (h) 152 Vdss (L/kg) 0,0513 Cl (mL/min/kg) 0,00462 AUC0-últ. (h*μg/mL) 3552 AUC0-inf (h*μg/mL) 3708 MRT0-últ. (h) 157 MRT0-inf (h) 187 Toxicidade
[0591] Todos os macacos toleraram a droga durante todo o curso do estudo.
Não foram observados efeitos adversos durante a fase de vida do estudo. Não houve mudança evidente no consumo de alimentos e no peso. Os parâmetros para Hematologia e Química Clínica, incluindo AST, ALT, WBC, HGB e HCT estavam, em geral, dentro do intervalo de referência.
Imunogenicidade
[0592] Os resultados dos testes de imunogenicidade W3438-T3U4.E17-
1.uIgG4.SP são mostrados nas Figuras 55A-55B. Os títulos de anticorpo antidrogas (ADA) contra W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP no soro de macaco de 3, 14 e 28 dias após a dose não mostraram diferença significativa em relação à pré-dose. Portanto, a injeção IV única de W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP a 1 mg/kg parecia não ser imunogênica em macacos.
EXEMPLO 18: WuXiBody Anti-CTLA-4 x PD-1 Biespecífico Fundamentos
[0593] A imunoterapia contra o câncer tornou-se uma área de pesquisa para o tratamento de câncer. A proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) é um dos alvos validados do check point imunológico. Após a ativação das células T, o CTLA-4 se expressa rapidamente nessas células T, geralmente dentro de uma hora do envolvimento do antígeno com o TCR. O CTLA-4 pode inibir a sinalização das células T através da competição com CD28, que medeia um sinal coestimulador de células T bem caracterizado. A ligação do CD28 aos seus ligantes CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) nas células apresentadoras de antígeno leva à proliferação de células T, induzindo a produção de interleucina-2 e fatores antiapoptóticos. Devido à afinidade de ligação do CTLA-4 a CD80 e CD86 ser muito maior do que a do CD28, o CTLA-4 pode competir com o CD28 pela ligação ao CD80 e CD86, levando à supressão da ativação das células T. Além da expressão induzida em células T ativadas, o CTLA-4 é expresso constitutivamente na superfície das células T reguladoras (Treg), sugerindo que o CTLA-4 pode ser necessário para a supressão mediada por contato e estar associado à produção de citocinas imunossupressoras pelas Tregs, como como o fator de crescimento transformador beta e a interleucina-10.
[0594] O bloqueio de CTLA-4 pode induzir regressão tumoral, como demonstrado em vários estudos clínicos e pré-clínicos. Dois anticorpos contra o CTLA-4 estão em desenvolvimento clínico. O ipilimumab (MDX-010, BMS-734016), um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 totalmente humano do isotipo IgG1-kappa, é um agente imunomodulador que foi aprovado como monoterapia para o tratamento de melanoma avançado. O mecanismo de ação proposto para o ipilimumab é a interferência na interação do CTLA-4, que é expresso em um subconjunto de células T ativadas, com as moléculas CD80/CD86 em células apresentadoras de antígenos profissionais. Isso resulta na potenciação das células T devido ao bloqueio da modulação inibidora da ativação de células T promovida pela interação CTLA-4 e CD80/CD86. A ativação das células T resultante, proliferação e infiltração de linfócitos nos tumores, leva à morte das células tumorais. A forma de dosagem comercial é uma taxa de concentração de 5 mg/mL para solução para perfusão. O ipilimumab também está sob investigação clínica para outros tipos de tumores, incluindo câncer de próstata e pulmão. O segundo anticorpo anti-CTLA-4 em desenvolvimento clínico, Tremelimumab, foi avaliado como monoterapia em melanoma e mesotelioma maligno.
[0595] O Programmed Death-1 (PD-1, CD279) é um membro da família CD28 expressa em células T ativadas e outras células imunes. O envolvimento de PD-1 inibe a função nessas células imunológicas. PD-1 tem dois ligantes conhecidos, PD-L1 (B7- H1, CD274) e PD-L2 (B7-DC, CD273), ambos pertencentes à família B7. A expressão de PD-L1 é induzível em uma variedade de tipos de células nos tecidos linfóides e periféricos, enquanto o PD-L2 é mais restrito a células mielóides, incluindo as células dendríticas. O principal papel da via de PD-1 é reduzir a resposta imune inflamatória em tecidos e órgãos.
[0596] A imunoterapia com a combinação de anticorpos monoclonais (mAb) que bloqueiam CTLA-4 (Ipilimumab) e PD-1 (Nivolumab) tem demonstrado benefício clínico para além do observado com ambos os mAb isoladamente. O WuXiBody anti- CTLA-4 x PD-1 biespecífico foi desenvolvido para induzir imunidade antitumoral através do bloqueio simultâneo de ambas as moléculas de check point.
Materiais e métodos Materiais gerais
[0597] Os materiais gerais de pesquisa e suas fontes estão listados na tabela abaixo. Materiais Fornecedor Cat. Células Expi293F™ Thermo Fisher Cat. A14527 Kit de transfecção ExpiFectamine293 Thermo Fisher Cat. A14524 Expi293F™ meio de expressão Thermo Fisher Cat. A1435101 Reagente de Transfecção Lipofectamine™ Thermo Fisher Cat. 11668019 2000 Células FreeStyle™ 293-F Thermo Fisher Cat. R79007 Meio de expressão FreeStyle™ 293 Thermo Fisher Cat. 12338002 Células CHO-S Thermo Fisher Cat. A1155701 Meio de expressão FreeStyle™ CHO GIBCO Cat. 12651014 Soro Fetal Bovino (SFB) Corning Cat. 35-076-CV Opti-MEM Thermo Fisher Cat. 31985070 Coluna Ni GE healthcare Cat. 17-5247-01 Coluna de proteína A GE healthcare Cat. 17-5438-02 Superdex200 prep grau GE Healthcare Cat. 17-1043-01 HPLC-SEC TOSOH Cat. 0008541
Materiais Fornecedor Cat. NuPAGE4%-12% Bis-Tris Gel Thermo Fisher Cat. NP0322BOX CTLA-4 Humano: W316-hPro1.ECD.His Sino Biological Cat. 11159-H08H CTLA-4: W316-cpro1.ECD.his de Sino Biological Cat. 90213-C08H Cinomolgo PD-1 Humano: W305-hPro1.ECD.His Próprio Cinomolgo PD-1: W305-cynoPro1.ECD.His R&D Cat.R&D-8509-PD- 050 Placas de revestimento de 96 poços para Nunc MaxiSorp, ELISA ThermoFisher Placas de 96 poços de fundo em U para Corning-COSTAR 3799
FACS Linhagem celular PD-1+ Humano: W305- Próprio CHO-S.hPro1.C6 Células PD-1+ de Cinomolgo: W305- Próprio 293F.cPro1.FL.Pool Linhagem celular CTLA-4+ Humano: Próprio W316-293F.hPro1.FL Linhagem celular CTLA-4+ de Cinomolgo: Próprio W316-293F.cPro1.FL.Pool Linhagem celular CD80+ Humano: W316- Próprio CHO-K1.hPro1L1.B9B11 Linhagem celular CD86+ Humano: W316- Próprio CHO-K1.hPro1L2.A4A7 PD-1 Humano: W305-hPro1.ECD.mFc Próprio PD-1 Humano: W305-hPro1.ECD.hFc Próprio PD-1 Humano: W305-hPro1.ECD.His Próprio PD-1 de Cinomolgo: W305-cPro1.ECD.His Próprio Proteína CynoPD-1.hFc Sino Biological 90311C02H CTLA-4 Humano: W316-hPro1.ECD.mFc Próprio CTLA-4 Humano: W316-hPro1.ECD.hFc Próprio CTLA-4 Humano: W316-hPro1.ECD.His Próprio CTLA-4 de Cinomolgo: W316- Próprio cPro1.ECD.His PDL1 de Humano: W315-hPro1.ECD.mFc Próprio CynoPD-L1.hFc-Biotina Próprio W316.hPro1.ECD.hFc marcado com Próprio Biotina CD80 Humano: W316-hPro1L1.ECD.His Próprio WBP316-BMK1 (Ipilimumab) Próprio WBP305 BMK1 (nivolumab) Próprio WBP324-BMK1.IgG1.KDL Próprio Controle de Isotipo: WBP332- Próprio
1.80.12.xAb.hIgG4 anti-IgG Fc Humano de cabra marcado Bethyl Laboratories A80-304P com HRP
Materiais Fornecedor Cat. anti-IgG Fc Humano de camundongo Thermo MA5-16859 marcado com HRP (CH2) anti-IgG Fc de camundongo de cabra Bethyl Laboratories A90-231P marcado com HRP Estreptavidina marcada com HRP Life technologies SNN1004 mAb anti-His marcado com biotina GenScript A00613 anti-IgG humano de cabra marcado com Jackson 109-095-008
FITC anti-IgG humano de cabra marcado com Jackson 109-115-098
PE anti-IgG de camundongo de cabra marcado Abcam 98716 com FITC Estreptavidina marcada com PE BD 554061 Ficoll-Paque Humano Stemcell 07861 Kit de enriquecimento de monócitos Miltenyi Biotec-130-050-201 Kit de enriquecimento de células T CD4+ Stemcell 19052 Kit de enriquecimento de células T Miltenyi 130-093-631 CD4+CD25+ GM-CSF recombinante humano R&D 215-GM IL-2 recombinante humano SL PHARM IL-4; anti-IL-2 Ab recombinante humano R&D AG1815401; MAB602 Padrão de IFN-γ recombinante humano Peprotech 300-02 Anticorpos anti-IFN-γ Life technology M700A;M7001B H3-timidina e MicroScint Perkin Elmer NET027001MC Soro Fetal Bovino (SFB) GIBCO 10100147 Meio RPMI 1640 GIBCO 22400089 DPBS Corning 21-031-CVR Reagentes de Citotoxicidade DELFIA® Perkin Elmer AD0116 EuTDA Kit para ensaio de viabilidade celular Promega G7573 luminescente CellTiter-Glo Calceína-AM Corning-354216 354216 Far red Invitrogen C34572 Geração de Antígenos Solúveis
[0598] As sequências de DNA que codificam a sequência do domínio extracelular do PD-1 humano (Uniport No.: Q15116) foram sintetizadas pela Sangon Biotech (Shanghai, China) e subclonadas em vetores de expressão de pcDNA3.3 modificados com 6xhis na extremidade C-terminal. Proteínas de CTLA-4 humano, de cinomolgo e camundongo e PD-1 de camundongo e de cinomolgo foram adquiridas da Sino Biological.
[0599] As células Expi293 (Invitrogen-A14527) foram transfectadas com o vetor de expressão purificado pcDNA3.3. As células foram cultivadas por 5 dias e o sobrenadante foi coletado para purificação de proteínas utilizando-se a coluna Ni-NTA (GE Healthcare, 175248). O PD-1 humano obtido foi quantificado (QC'ed) por SDS- PAGE e SEC, e, em seguida, armazenado a -80°C.
Geração de anticorpos de referência
[0600] A sequência de DNA que codifica a região variável do anticorpo anti- CTLA-4 (WBP316-BMK1), anticorpo anti-PD-1 (WBP305-BMK1) foi sintetizada pela Sangon Biothech (Shanghai, China) e subclonada em vetores de expressão modificados pcDNA3.4 com região constante de IgG1 humana ou IgG4 humana (S228P). Os anticorpos anti-PD-1 WBP3055-1.153.7.uIgG4k e WBP3055-
1.103.11.uIgG4k foram gerados após a imunização de ratos com PD-1 humano e PD- 1 de camundongo, e foram convertidos para o formato IgG4 (S228P). A sequência de DNA que codifica um anticorpo anti-CTLA-4 x PD-1 biespecífico de referência (WBP324-BMK1.IgG1.KDL) foi sintetizada.
[0601] Os plasmídeos contendo os genes VH e VL foram cotransfectados em células Expi293. As células foram cultivadas por 5 dias e o sobrenadante foi coletado para purificação de proteínas utilizando-se a coluna de proteína A (GE Healthcare, 175438) ou a coluna de proteína G (GE Healthcare, 170618). Os anticorpos obtidos foram testados por SDS-PAGE e SEC e armazenados a -80°C.
Geração de linhagens celulares que expressam alvos
[0602] Utilizando lipofectamina 2000, células CHO-S ou 293F foram transfectadas com o vetor de expressão contendo os genes que codificam PD-1 humano ou PD-1 de camundongo completo. As células foram cultivadas em meio contendo marcadores de seleção adequados. A linhagem celular estável de alta expressão de PD-1 humano (WBP305.CHO-S.hPro1.C6) e a linhagem celular estável de alta expressão de PD-1 de camundongo (WBP305.293F.mPro1.B4) foram obtidas por diluição limitante.
Geração de anticorpos biespecíficos anti-CTLA-4/PD-1
[0603] A construção de W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP: sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de anti-PD-1, região constante 1, região variável da cadeia pesada de anti-CTLA-4, região constante beta do TCR e as regiões constantes 2 e 3 de IgG4 (S228P), ligadas da extremidade 5' para a extremidade 3', foram clonadas em um vetor de expressão pcDNA3.3 modificado. A sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo anti- CTLA-4 na extremidade 5' da região constante alfa do TCR foi clonada em outro vetor de expressão pcDNA3.3 modificado. A cadeia leve de anti-PD-1 foi clonada no terceiro vetor de expressão pcDNA3.3 modificado.
[0604] A construção de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP: sequência de DNA que codifica região variável de cadeia pesada de anti-PD-1, região constante da cadeia beta do TCR, região variável de cadeia pesada de anti-CTLA-4 e região constante de IgG4 (S228P), ligada da extremidade 5' à extremidade 3', foram clonadas em um vetor de expressão pcDNA3.3 modificado. A sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 na extremidade 5' da região constante alfa do TCR foi clonada em outro vetor de expressão pcDNA3.3 modificado.
A cadeia leve de anti-CTLA-4 foi clonada no terceiro vetor de expressão pcDNA3.3 modificado.
[0605] Sequências relevantes de W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP são fornecidas abaixo:
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAP Sequência de
VLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYY aminoácidos LC1 CQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKA (SEQ ID NO: TLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYA 412) ASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQ Sequência de
APRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV aminoácidos LC2 YYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDK (SEQ ID NO: SVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAV 413) AWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGK GLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDK RVGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSS
YTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDN Sequência de
SKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVL aminoácidos
HC EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVEL (SEQ ID NO: SWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATF 414) WQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRY
GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLG
[0606] Sequências relevantes de W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP são fornecidas abaixo:
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAP Sequência de VLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYY LC1 aminoácidos CQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVC (SEQ ID NO: 415) LFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWS
QKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSP Sequência de KLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYY LC2 aminoácidos CHHWSNTQWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA (SEQ ID NO: 416) SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGK GLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEV AVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHS GVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRGGGGSGGGGSQV
QLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYFMNWVRQAPGQGL Sequência de EWMGRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADKSTSTAYMELSSLRS HC aminoácidos EDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA (SEQ ID NO: 417) PCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG
[0607] Para ambos os anticorpos biespecíficos, um vetor de expressão de cadeia pesada e dois vetores de expressão de cadeia leve foram cotransfectados em células Expi293 (ThermoFisher-A14527) de acordo com as instruções do fabricante.
Cinco dias após a transfecção, os sobrenadantes foram coletados e purificados utilizando-se a coluna de proteína A (GE Healthcare-17543802) e cromatografia de exclusão por tamanho adicional (GE Healthcare-17104301). A concentração de anticorpos foi medida por Nano Drop. O baixo nível de endotoxina foi confirmado utilizando-se o kit de detecção de endotoxina (GenScript-L00350), e o nível de endotoxina dos dois anticorpos biespecíficos foi inferior a 10 EU/mg. A pureza das proteínas foi avaliada por SDS-PAGE e HPLC-SEC.
Caracterização In Vitro Fluorimetria diferencial de varredura (DSF)
[0608] Um ensaio de DSF foi realizado utilizando-se o sistema de PCR em tempo real 7500 Fast (Applied Biosystems). Resumidamente, 19 µL de solução de anticorpo biespecífico foram misturados com 1 µL de solução SYPRO Orange 62,5x (TheromFisher-S6650) e adicionados a uma placa de 96 poços. A placa foi aquecida de 26°C a 95°C a uma taxa de 2°C/min e os dados de fluorescência resultantes foram coletados. Os dados foram analisados automaticamente pelo seu software de operação e o Th foi calculado considerando o valor máximo da derivada negativa dos dados de fluorescência resultantes em relação à temperatura. A Ton pode ser determinada aproximadamente como a temperatura do gráfico de derivada negativa que começa a diminuir a partir de uma linha de base pré-transição.
Ligação a PD-1 humano por FACS
[0609] Células modificadas que expressam PD-1 humano, W305-CHO- S.hPro1.C6, foram plaqueadas a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U (Costar 3799). Anticorpos com titulação de 3,16 vezes em DPBS com 1% de BSA de 200 nM a 0,002 nM foram adicionados às células. As placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, 100 µL de anticorpo anti-humano de cabra marcado com PE diluído a 1: 125 (Jackson 109-115-098) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. A ligação dos anticorpos às células foi testada por citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência (MFI) foi analisada por FlowJo.
Ligação ao PD-1 de cinomolgo por FACS
[0610] Células modificadas que expressam PD-1 de cinomolgo, W305- 293F.cynoPro1.FL.pool, foram plaqueadas a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U (Costar 3799). Anticorpos com titulação de 4 vezes em DPBS com 1% de BSA de 40 µg/ml a 0,0001526 µg/ml foram adicionados às células. As placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, 100 µL de anticorpo anti- humano de cabra marcado com PE diluído a 1:150 (Jackson 109-115-098) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. A ligação dos anticorpos às células foi testada por citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência (MFI) foi analisada por FlowJo.
Ligação ao CTLA-4 humano por FACS
[0611] Células modificadas que expressam CTLA-4 humano, W316- 293F.hPro1.FL, foram plaqueadas a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U (Costar 3799). Anticorpos com titulação de 3,16 vezes em DPBS com 1% de BSA de 200 nM a 0,002 nM foram adicionados às células. As placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, 100 µL de anticorpo anti-humano de cabra marcado com PE diluído a 1: 125 (Jackson 109-115-098) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. A ligação dos anticorpos às células foi testada por citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência (MFI) foi analisada por FlowJo.
Ligação ao CTLA-4 de cinomolgo por FACS
[0612] Células modificadas que expressam CTLA-4 humano, W316- 293F.cynoPro1.F1.pool, foram plaqueadas a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U (Costar 3799). Anticorpos com titulação de 4 vezes em DPBS com 1% de BSA de 40 µg/ml a 0.00004 µg/mL foram adicionados às células. As placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, 100 µL de anticorpo anti-humano de cabra marcado com PE diluído a 1:150 (Jackson 109-115-098) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. A ligação dos anticorpos às células foi testada por citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência (MFI) foi analisada por FlowJo.
Ligação dupla de hPD-1 e hCTLA-4 por ELISA
[0613] A fim de testar se os anticorpos biespecíficos poderiam se ligar a hPD- 1 e hCTLA-4, um ensaio ELISA foi desenvolvido como abaixo. Uma placa de ELISA de 96 poços (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher) foi revestida durante a noite a 4°C com 0,5 µg/mL de antígeno-1 (hPD-1-ECD, W305-hPro1.ECD.mFc) em tampão de carbonato-bicarbonato. Após uma etapa de bloqueio de 1 hora com 2% (p/v) de albumina de soro bovino (Pierce) dissolvida em PBS, diluições seriadas dos diferentes anticorpos biespecíficos PD-1 × CTLA-4 em PBS contendo 2% de BSA foram incubadas nas placas por 1 hora em temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas três vezes com 300 μL por poço de PBS contendo 0,5% (v/v) de Tween 20. 0,5 μg/mL de antígeno-2 (hCTLA-4-ECD, W316-hPro1.ECD.hFc.Biotina) foi adicionado às placas e a mistura foi incubada por 1 hora. Após três lavagens das placas, Estreptavidina-HRP (Life Technologies, #SNN1004) (1: 20000 diluída) foi adicionada e incubada nas placas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após seis lavagens com 300 µL por poço de PBS contendo 0,5% (v/v) de Tween 20, 100 µL do substrato tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionado para a detecção por poço. A reação foi interrompida após aproximadamente 5 minutos, através da adição de 100 µL por poço de HCl a 2 M. A absorbância dos poços foi medida a 450 nm com um leitor de placas de paredes múltiplas (SpectraMax® M5e).
Ligação dupla a hPD-1 e hCTLA-4 por FACS
[0614] Para testar se os anticorpos biespecíficos poderiam se ligar a ambos hPD-1 e hCTLA-4, um ensaio FACS foi desenvolvido como abaixo. Células modificadas que expressam PD-1 e CTLA-4 humanos, W305-CHO-S.hPro1.C6 e W316-293F.hPro1.F1, foram coradas com 50 nM de calceína-AM (Corning-354216) e 20 nM de Far Red (Invitrogen-C34572), respectivamente, por 20 minutos a 37°C. Após duas lavagens com 1% (p/v) de albumina de soro bovino (Pierce) dissolvida em PBS, células hPD-1 (5E4) e hCTLA-4 (5E4) misturadas foram plaqueadas a 1 x 10 5 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U (Costar 3799). Após a remoção do sobrenadante, anticorpos diluídos em série 3 x com DPBS e 1% de BSA de 7,5 nM a 0,83 nM foram adicionados às células. As placas foram incubadas a 4°C por 1,5 hora. As células foram testadas por citometria de fluxo e o percentual de células positivas duplas foi analisado por FlowJo.
FACS competitiva para PD-1 humano
[0615] Para testar se os anticorpos biespecíficos poderiam bloquear a ligação de hPD-L1 à proteína hPD-1, foi realizado um FACS competitivo. Resumidamente, células modificada que expressam PD-1 humano, W305-CHO-S.hPro1.C6 (próprio), foram plaqueadas a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U, 200 nM a 0,002 nM de PD-L1 humano acoplados a 5 µg/mL de proteína PD-L1 humana W315-hPro1.ECD.mFc foram adicionados às células. As placas foram incubadas a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, a ligação de W315-hPro1.ECD.mFc ao PD-1 humano expresso pela célula foi detectada pelo anticorpo anti-camundongo de cabra marcado com FITC (abcam 98716 1: 125). A ligação de competição dos anticorpos às células foi testada por citometria de fluxo e a intensidade média de fluorescência (MFI) foi analisada por FlowJo.
Bloqueio da ligação de CTLA-4 humano/cinomolgo ao CD80 humano
[0616] O ELISA foi utilizado para testar se os anticorpos biespecíficos poderiam bloquear a ligação do hCTLA-4 à proteína hCD80. Resumidamente, placas de 96 poços de fundo plano (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher) foram pré-revestidas com 0,5 μg/mL de W316-hPro1.ECD.hFc durante a noite a 4°C. Após o bloqueio com 2% de BSA, 100 μL de anticorpos com titulação de 3,16 vezes de 400 nM a 0,04 nM de Abs, acoplado a 0,5 μg/mL de proteína CD80 humana W316-hPro1L1.ECD, foram pipetados em cada poço e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas são lavadas 3 vezes com 300 μL por poço de PBS contendo 0,5% (v/v) de Tween 20. 100 µL de 0,5 μg/mL de mAb anti-His marcado com biotina (GenScript-A00613) foram adicionados à placa por poço e incubação por 1 hora. Após 6 lavagens, a ligação de W315-hPro1L1.ECD.His a WBP316-hPro1.ECD.hFc foi detectada por Estreptavidina-HRP (Lifetechnologies, #SNN1004) (diluída 1:20000). A cor foi desenvolvida disponibilizando 100 μL de substrato TMB e depois interrompida por 100 μL de HCl a 2N. A absorbância foi lida a 450 nm utilizando-se um espectrofotômetro de microplacas (SpectraMax® M5e).
[0617] FACS competitiva foi usada para testar se os anticorpos poderiam bloquear a ligação de CTLA-4 humano ou de cinomolgo ao hCD80 na superfície celular. Resumidamente, as células CHO-K1 que expressam CD80 humano foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços (Costar 3799) a 1 x 10 5 por poço e centrifugadas a 1500 rpm durante 4 minutos a 4°C antes da remoção do sobrenadante. Diluições em série de anticorpos de teste, controles positivos e negativos foram misturados com CTLA-4.ECD.hFc humano biotinilado. Devido à diferente densidade de ligantes na superfície celular, 0,066-0,037 µg/ml de hCTLA-
4.ECD.hFc-Biotina foi utilizado para células que expressam CD80 humano. Em seguida, as misturas de anticorpo e CTLA-4 foram adicionadas às células e incubadas por 1 hora a 4°C. As células foram lavadas duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem FACS (DPBS contendo 1% de BSA). A estreptavidina PE (BD Pharmingen- 554061) diluída 1 para 600 em tampão FACS foi adicionada às células e incubada a 4°C por 1 hora. Etapas de lavagem adicionais foram realizadas duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem FACS, seguido de centrifugação a 1500 rpm por 4 minutos a 4°C. Finalmente, as células foram ressuspensas em 100 μL de tampão de lavagem FACS e os valores de fluorescência foram medidos por citometria de fluxo e analisados por FlowJo.
Afinidade a CTLA-4 e PD-1
[0618] A tecnologia SPR foi usada para medir a constante on-rate (ka) e constante off-rate (kd) dos anticorpos para ECD de CTLA-4 ou PD-1. A constante de afinidade (KD) foi consequentemente determinada.
[0619] Biacore T200, chip sensor CM5 da série S, kit de acoplamento de amina e 10x HBS-EP foram adquiridos da GE Healthcare. O anticorpo anti-IgG Fc humano de cabra foi adquirido no Jackson ImmunoResearch Lab (número de catálogo 109-005-098). Na etapa de imobilização, o tampão de ativação foi preparado misturando 400 mM de EDC e 100 mM de NHS imediatamente antes da injeção. O chip sensor CM5 foi ativado por 420 s com o tampão de ativação. 30 µg/mL de anticorpo anti-IgG Fcγ humano de cabra em 10 mM de NaAc (pH 4,5) foi então injetado nos canais Fc1-Fc4 por 200s a uma taxa de fluxo de 5 µL/min. O chip foi desativado com 1 M de etanolamina-HCl (GE). Em seguida, os anticorpos foram capturados no chip. Resumidamente, 4 μg/mL de anticorpos em tampão de corrida (HBS-EP+) foram injetados individualmente no canal Fc3 por 30 s a uma taxa de fluxo de 10 μL/min.
Oito concentrações diferentes (20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 e 0,15625 nM) do analito ECD de CTLA-4 ou PD-1 e tampão de corrida de referência (blank) foram injetados em ordem nos canais Fc1-Fc4 a uma taxa de fluxo de 30 μL/min para uma fase de associação de 120 s, seguida pela fase de dissociação de 2400 s. O tampão de regeneração (10 mM de glicina, pH 1,5) foi injetado a 10 µL/min por 30 s após cada fase de dissociação.
Estabilidade em soro humano
[0620] Os anticorpos foram incubados em soro humano fresco a 37°C. Nos pontos de tempo indicados, uma alíquota de amostra tratada com soro foi removida da incubadora e congelada rapidamente em nitrogênio líquido, e depois armazenada a -80°C até estar pronto para um ensaio de dupla ligação por ELISA. As amostras congeladas foram rapidamente descongeladas imediatamente antes do teste de estabilidade. Resumidamente, as placas foram pré-revestidas com 0,5 μg/mL de hCTLA4.ECD.hFc (internamente) a 4°C durante a noite. Após 1 hora de bloqueio, os anticorpos de teste foram adicionados às placas em várias concentrações. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a incubação, as placas foram lavadas três vezes com 300 μL por poço de PBS contendo 0,5% (v/v) de Tween
20. Em seguida, 0,1 μg/mL de hPD-1-ECD.biotina foi adicionado às placas e a mistura foi incubada por 1 hora. Após três lavagens das placas, Estreptavidina-HRP (Life Technologies, #SNN1004) (1: 20000 diluída) foi adicionada e incubada nas placas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após seis lavagens com 300 µL por poço de PBS contendo 0,5% (v/v) de Tween 20, 100 µL do substrato tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionado para a detecção por poço. A reação foi interrompida após aproximadamente 5 minutos, através da adição de 100 µL por poço de HCl a 2 M. A absorbância dos poços foi medida a 450 nm com um leitor de placas de paredes múltiplas (SpectraMax® M5e).
Resultados Expressão e purificação de anticorpos biespecíficos
[0621] A pureza dos anticorpos biespecíficos foi superior a 90%, analisada por ambos SDS-PAGE (Figura 56 A) e SEC-HPLC (Figura 56B).
DSF do WuXiBody
[0622] O DSF foi usado para medir Tm do WuXiBody. Como mostrado na Figura 57, W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP tem Th1 a 60,8 e 63,4°C, respectivamente.
Ligação ao PD-1 humano e de cinomolgo
[0623] Os anticorpos biespecíficos podem se ligar ao PD-1 humano (Figura 58) e ao PD-1 de cinomolgo (Figura 59). A atividade de ligação ao PD-1 humano de W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP foi ligeiramente melhor que WBP3248-U6T5.G25-1- uIgG4.SP por FACS. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1- uIgG4.SP têm afinidade ao PD-1 humano a 1,24 nM e 1,32 nM, respectivamente (Figura 62).
Ligação ao CTLA-4 humano e de cinomolgo
[0624] Os anticorpos biespecíficos purificados se ligaram ao CTLA-4 humano, como testado por FACS (Figura 60). Os dois anticorpos biespecíficos também se ligaram ao CTLA-4 de cinomolgo (Figura 61). W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP têm afinidade ao CTLA-4 humano a 0,0356 nM e 0,357 nM, respectivamente (Figura 62).
Ligação simultânea ao CTLA-4 e PD-1
[0625] Para testar se os anticorpos biespecíficos podem se ligar a ambos os alvos, ELISA e FACS foram usados. No ELISA, o PD-1 humano foi revestido na placa.
Após adição de anticorpos biespecíficos, o CTLA-4 biotinilado foi utilizado para detectar anticorpos biespecíficos ligados. Conforme mostrado na Figura 66, W3248- U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP podem se ligar ao PD-1 e ao CTLA-4 com EC50 de 0,1072 a 0,0710 nM, comparável ao um anticorpo de referência biespecífico WBP324BMK1 (EC50 = 0,0599 nM). No FACS, tanto o W3248- U6T1.G25R-1.uIgG4.SP quanto o WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP podem se ligar simultaneamente às células PD-1+ e CTLA-4+ (Figura 67).
Bloqueio da ligação de CTLA-4 humano ou de cinomolgo à ligação de CD80
[0626] FACS competitivo foi usado para testar o bloqueio de CTLA-4 dos anticorpos biespecíficos com o seu ligante CD80. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP bloquearam a ligação de CTLA-4 a CD80 com IC 50 de 4,300 e 0,7581 nM (Figura 64). Da mesma forma, os anticorpos biespecíficos também podem bloquear a ligação de CTLA-4 de cinomolgo às células humanas CD80+ (Figura 65).
Bloqueio da ligação de PD-1 ao seu ligante
[0627] Um FACS competitivo foi usado para testar o bloqueio dos anticorpos biespecíficos de PD-1 com seu ligante, PD-L1. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP bloquearam a ligação de PD-1 a PD-L1 com IC50 de 1,670 nM e 1,917 nM (Figura 63).
Estabilidade sérica
[0628] Os dois anticorpos biespecíficos foram incubados em soro humano a 37°C durante 14 dias, e a sua ligação dupla a CTLA-4 e PD-1 humanos foi medida por ELISA. Como mostrado nas Figuras 68A e 68B, a ligação dupla de W3248- U6T1.G25R-1.uIgG4.SP e WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP aos alvos não se alterou ao longo do tempo, indicando que estes dois anticorpos biespecíficos apresentaram estabilidade em soro humano a 37°C durante pelo menos 14 dias.
[0629] Embora a divulgação tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência às formas de realização específicas, deve ser entendido pelos técnicos no assunto que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser realizadas nas mesmas sem se afastar do espírito e do escopo da presente divulgação, conforme divulgado neste documento.

Claims (92)

REIVINDICAÇÕES
1. Complexo polipeptídico CARACTERIZADO por compreender: um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C- terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de células T (TCR), e um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C- terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que: C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre C1 e C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica.
2. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a ligação intercadeia não nativa é formada entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2.
3. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um dos primeiro e segundo resíduos mutados é um resíduo de cisteína.
4. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a ligação intercadeia não nativa é uma ligação dissulfeto.
5. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro resíduo mutado está compreendido dentro de uma interface de contato de C1 e/ou o segundo resíduo mutado está compreendido dentro de uma interface de contato de C2.
6. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um resíduo de cisteína nativo está ausente ou presente em C1 e/ou C2.
7. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um sítio nativo de N- glicosilação está ausente ou presente em C1 e/ou C2.
8. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o dímero compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações intercadeias não nativas, opcionalmente, pelo menos uma das ligações intercadeias não nativas é uma ligação dissulfeto.
9. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada; b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada; d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada.
10. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que: o primeiro VH está operacionalmente ligado a C1 em um primeiro domínio de junção e o primeiro VL está operacionalmente ligado a C2 em um segundo domínio de junção.
11. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo domínios de junção compreendem um comprimento adequado (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do fragmento C-terminal da junção V/C do anticorpo e um comprimento adequado (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos) do fragmento N-terminal da junção V/C do TCR.
12. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86 e 122-127; e/ou a CAlfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 6-29, 37-67 e 86-95.
13. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: S56C, S16C, F13C, V12C, E14C, F13C, L62C, D58C, S76C e R78C, e/ou a CAlfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada entre: T49C, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, T46C, L51C e S62C.
14. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada e a CAlfa modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: S56C em CBeta e T49C em CAlfa, S16C em CBeta e Y11C em CAlfa, F13C em CBeta e L13C em CAlfa, S16C em CBeta e L13C em CAlfa, V12C em CBeta e S16C em CAlfa, E14C em CBeta e S16C em CAlfa, F13C em CBeta e V23C em CAlfa, L62C em CBeta e Y44C em CAlfa, D58C em CBeta e T46C em CAlfa, S76C em CBeta e T46C em CAlfa, S56C em CBeta e L51C em CAlfa, S56C em CBeta e S62C em CAlfa, e R78C em CBeta e S62C em CAlfa e em que o par de resíduos de cisteína são capazes de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
15. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de cisteína nativo na posição C74 da CBeta modificada está ausente ou presente.
16. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente ou presente na CBeta modificada e/ou na CAlfa modificada.
17. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de glicosilação nativo na CBeta modificada é N69 e/ou o(s) sítio(s) de glicosilação nativo(s) na CAlfa modificada é/são selecionado(s) dentre N34, N68, N79 e qualquer combinação dos mesmos.
18. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada não possui ou mantém uma alça FG que engloba os resíduos de aminoácidos 101-117 da CBeta nativa e/ou uma alça DE que engloba os resíduos de aminoácidos 66-71 da CBeta nativa.
19. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a CAlfa modificada compreende a SEQ ID NO: 43-48 e/ou a CBeta modificada compreende a SEQ ID NO: 33-41.
20. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que C1 compreende a CBeta modificada e C2 compreende a CAlfa modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50, e/ou o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 51 ou 52.
21. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a C1 compreende a CAlfa modificada e a C2 compreende a CBeta modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 129 ou 130, e/ou o segundo domínio de junção compreende ou é a SEQ ID NO: 49 ou 50.
22. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86 e 122-127; e/ou a CPré-Alfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 7-19, 26-34, 56-75 e 103-106.
23. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: S16C, A18C, E19C, F13C, A11C, S56C e S76C e/ou a CPré-Alfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre S11C, A13C, I16C, S62C, T65C e Y59.
24. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada e a CPré-Alfa modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: S16C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, A18C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, E19C em CBeta e S11C em CPré-Alfa, F13C em CBeta e A13C em CPré-Alfa, S16C em CBeta e A13C em CPré-Alfa, A11C em CBeta e I16C em CPré-Alfa, S56C em CBeta e S62C em CPré- Alfa, S56C em CBeta e T65C em CPré-Alfa, e S76C em CBeta, e Y59C em CPré-Alfa, e em que o par de resíduos de cisteína mutados é capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
25. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente ou presente na CBeta modificada e/ou na CPré-Alfa modificada.
26. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de glicosilação ausente ou presente na CBeta modificada é N69 e/ou o sítio de glicosilação ausente na CPré-Alfa modificada é N50.
27. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada não possui ou mantém uma alça FG que engloba os resíduos de aminoácidos 101-107 da CBeta nativa e/ou uma alça DE na posição que engloba os resíduos de aminoácidos 66-71 da CBeta nativa.
28. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a CPré-Alfa modificada compreende SEQ ID NO: 82-83, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 ou 318 e/ou a CBeta modificada compreende SEQ ID NO: 84, 33-41, 319, 320, 321, 322, 323 ou 324.
29. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11 e 22-28, CARACTERIZADO pelo fato de que C1 compreende a CBeta modificada e C2 compreende a CPré-Alfa modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 49 ou 50 e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 81 ou 131.
30. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11 e 22-28, CARACTERIZADO pelo fato de que C1 compreende a CPré-Alfa modificada e C2 compreende a CBeta modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 132 ou 133 e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 49 ou 50.
31. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: a CDelta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 8-26, 43-64 e 84-88; e/ou a CGama modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 11-35 e 55-76.
32. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a CGama modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: S17C, E20C, F14C, T12C, M62C, Q57C e A19C e/ou a CDelta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado que substitui um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada dentre: F12C, M14C, N16C, D46C, V50C, F87C e E88C.
33. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a CGama modificada e a CDelta modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: Q57C em CGama e V50C em CDelta, A19C em CGama e E88C em CDelta, S17C em CGama e F12C em CDelta, E20C em CGama e F12C em CDelta, F14C em CGama e M14C em CDelta, T12C em CGama e N16C em CDelta, M62C em CGama e D46C em CDelta, e A19C em CGama e F87C em CDelta, e em que o par de resíduos de cisteína introduzido é capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeia.
34. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente ou presente na CGama modificada e/ou na CDelta modificada.
35. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de glicosilação nativo na CGama modificada é N65 e/ou o(s) sítio(s) de glicosilação nativo(s) na CDelta modificada é/são um ou ambos de N16 e N79.
36. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a CGama modificada compreende SEQ ID NO: 113, ou 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 ou 340, e/ou a CDelta modificada compreende SEQ ID NO: 115, 116, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 ou
332.
37. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11 e 31-36, CARACTERIZADO pelo fato de que C1 compreende a CGama modificada e C2 compreende a CDelta modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 117 ou 118 e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 119 ou 120.
38. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-11 e 31-36, CARACTERIZADO pelo fato de que C1 compreende a CDelta modificada e C2 compreende a CGama modificada; e em que o primeiro domínio de junção compreende SEQ ID NO: 123 ou 124, e/ou o segundo domínio de junção compreende SEQ ID NO: 125 ou 126.
39. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira especificidade antigênica é dirigida a um antígeno exógeno, um antígeno endógeno, um autoantígeno, um neoantígeno, um antígeno viral ou um antígeno tumoral.
40. Complexo polipeptídico biespecífico, CARACTERIZADO por compreender uma primeira porção de ligação ao antígeno associada a uma segunda porção de ligação ao antígeno, em que: a primeira porção de ligação ao antígeno compreende: um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C- terminal, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de células T (TCR), e um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C- terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que: C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica, uma segunda porção de ligação ao antígeno apresenta uma segunda especificidade antigênica que é diferente da primeira especificidade antigênica, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao pareamento incorreto do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural.
41. Complexo polipeptídico biespecífico, CARACTERIZADO por compreender: uma primeira porção de ligação ao antígeno, compreendendo o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 1-39, com uma primeira especificidade antigênica, associada a uma segunda porção de ligação ao antígeno com uma segunda especificidade antigênica que é diferente da primeira especificidade antigênica, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao pareamento incorreto do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural.
42. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda porção de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve de um segundo anticorpo com a segunda especificidade antigênica.
43. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda porção de ligação ao antígeno compreende um Fab.
44. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 ou 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira especificidade antigênica e a segunda especificidade antigênica são dirigidas a dois antígenos diferentes ou são dirigidas a dois epítopos diferentes em um antígeno.
45. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que uma das primeira e segunda especificidades antigênicas é dirigida a uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK) e a outra é dirigida a um antígeno associado a tumor.
46. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que uma das primeira e segunda especificidades antigênicas é dirigida a CD3 e a outra é dirigida a um antígeno associado a tumor.
47. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que uma das primeira e segunda especificidades antigênicas é dirigida a CD3 e a outra é dirigida a CD19.
48. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira porção de ligação ao antígeno compreende ainda um primeiro domínio de dimerização e a segunda porção de ligação ao antígeno compreende ainda um segundo domínio de dimerização, em que o primeiro e o segundo domínios de dimerização estão associados.
49. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a associação é por meio de um conector, uma ligação dissulfeto, uma ligação de hidrogênio, interação eletrostática, uma ponte salina ou interação hidrofóbica-hidrofílica, ou a combinação dos mesmos.
50. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização compreendem pelo menos uma porção de uma região de dobradiça de anticorpo, opcionalmente derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4.
51. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo domínios de dimerização compreende ainda um domínio CH2 de anticorpo e/ou um domínio CH3 de anticorpo.
52. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro domínio de dimerização está operacionalmente ligado à primeira região constante (C1) do TCR em um terceiro domínio de junção.
53. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de que: a) C1 compreende uma CBeta modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 53 ou 54; b) C1 compreende uma CAlfa modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 134, 135, 140 ou 141; c) C1 compreende um uma CPré-Alfa modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 134, 135, 140 ou 141; d) C1 compreende uma CGama modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 121 ou 122; ou e) C1 compreende uma CDelta modificada e o terceiro domínio de junção está compreendido na SEQ ID NO: 127 ou 128.
54. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo domínio de dimerização está operacionalmente ligado ao domínio variável de cadeia pesada da segunda porção de ligação ao antígeno.
55. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e o segundo domínios de dimerização são diferentes e se associam de uma maneira que desencoraja a homodimerização e/ou favorece a heterodimerização.
56. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e o segundo domínios de dimerização são capazes de se associar em heterodímeros por meio de knob-into-holes, interação hidrofóbica, interação eletrostática, interação hidrofílica ou maior flexibilidade.
57. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-56, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo o primeiro polipeptídeo contendo VH operacionalmente ligado a uma região constante quimérica, e o segundo polipeptídeo compreende VL operacionalmente ligado a C2, em que a região constante quimérica e C2 compreendem um par de sequências selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/151, 214/212, 214/151, 234/233, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 e 238/237.
58. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-57, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira antigenicidade é dirigida a CD3 e o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreendem um par de sequências selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/1, 4/3, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 e 138/139.
59. Complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-58, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a CD3, e a segunda porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a CD19, e o complexo polipeptídico biespecífico compreende uma combinação de quatro sequências polipeptídicas selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 22/12/24/23, 25/12/26/23 e 25/12/27/23.
60. Conjugado CARACTERIZADO por compreender o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 40-59, conjugado a uma porção.
61. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO por codificar o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 40-59.
62. Vetor isolado CARACTERIZADO por compreender o polinucleotídeo definido na reivindicação 61.
63. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender o polinucleotídeo isolado definido na reivindicação 61 ou o vetor isolado definido na reivindicação 62.
64. Método para expressar o complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-59, CARACTERIZADO por compreender cultivar a célula hospedeira definida na reivindicação 63 sob a condição na qual o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico é expresso.
65. Método para produzir o complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico, CARACTERIZADO por compreender: a) introduzir em uma célula hospedeira: um primeiro polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, uma primeira região variável da cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligada a uma primeira região constante (C1) do TCR, e um segundo polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo compreendendo, da extremidade N-terminal à C-terminal, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que: C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre C1 e C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e o primeiro anticorpo apresenta uma primeira especificidade antigênica, b) permitir que a célula hospedeira expresse o complexo polipeptídico.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO por compreender ainda: a) introduzir em uma célula hospedeira um ou mais polinucleotídeos adicionais que codificam uma segunda porção de ligação ao antígeno, em que a segunda porção de ligação ao antígeno tem uma segunda especificidade antigênica diferente da primeira especificidade antigênica, b) permitir que a célula hospedeira expresse o complexo polipeptídico biespecífico.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64-66, CARACTERIZADO por compreender ainda isolar o complexo polipeptídico ou o complexo polipeptídico biespecífico.
68. Composição CARACTERIZADA por compreender o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 40-59.
69. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 40- 59 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
70. Método para o tratamento de uma condição em um indivíduo que precisa do mesmo CARACTERIZADO por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 1-39, ou o complexo polipeptídico biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 40-59.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, CARACTERIZADO pelo fato de que a condição pode ser aliviada, eliminada, tratada ou prevenida quando o primeiro antígeno e o segundo antígeno são modulados.
72. Complexo polipeptídico CARACTERIZADO por compreender: 1) uma primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de célula T (TCR), e um domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, um em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada; b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada; e 2) uma segunda porção de ligação ao antígeno compreendendo: um VH de um segundo anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do segundo anticorpo operacionalmente ligado a um domínio constante da cadeia leve (CL) do anticorpo, e em que a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são menos propensas ao pareamento incorreto do que seria de outro modo se ambas as primeira e segunda porções de ligação ao antígeno fossem equivalentes ao Fab natural.
73. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO por compreender ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno compreendendo um VH de um terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio de cadeia pesada CH1 do anticorpo, e um VL do terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio de cadeia leve CL do anticorpo, em que o CH1 da terceira porção de ligação ao antígeno está operacionalmente ligado ao VH da segunda porção de ligação ao antígeno.
74. Complexo polipeptídico CARACTERIZADO por compreender: 1) uma primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de célula T (TCR), e um domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e
C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada; e
2) uma segunda porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um segundo anticorpo operacionalmente ligado a C1 e um VL do segundo anticorpo operacionalmente ligado a C2, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada;
3) uma terceira porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo;
4) uma quarta porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um quarto anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do quarto anticorpo operacionalmente ligada a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo;
o complexo polipeptídico compreendendo ainda um primeiro e segundo domínio CH2 de anticorpo e um primeiro e segundo domínios CH3 de anticorpo,
em que o VH da primeira porção de ligação ao antígeno e o VH da segunda porção de ligação ao antígeno são operacionalmente ligados ao primeiro e segundo domínios CH3 de anticorpo, respectivamente, o CH1 da terceira porção de ligação ao antígeno e o CH1 da quarta porção de ligação de antígeno estão ligados operacionalmente aos primeiro e segundo domínios CH2 de anticorpo, respectivamente, e a terceira porção de ligação ao antígeno e a quarta porção de ligação ao antígeno são capazes de formar um dímero.
75. Complexo polipeptídico CARACTERIZADO por compreender: 1) uma primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de célula T (TCR), e um domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada; b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada; d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada; e
2) uma segunda porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um segundo anticorpo operacionalmente ligado a C1 e um VL do segundo anticorpo operacionalmente ligado a C2, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada;
3) uma terceira porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo;
4) uma quarta porção de ligação ao antígeno compreendendo: um VH de um quarto anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do quarto anticorpo operacionalmente ligada a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo; o complexo polipeptídico compreendendo ainda um primeiro e segundo domínio CH2 de anticorpo e um primeiro e segundo domínios CH3 de anticorpo, em que a C1 da primeira porção de ligação ao antígeno e a C1 da segunda porção de ligação de antígeno estão ligadas operacionalmente aos primeiro e segundo domínios CH2 de anticorpo, respectivamente, o VH da terceira porção de ligação ao antígeno e o VH da quarta porção de ligação de antígeno estão ligados operacionalmente aos primeiro e segundo domínios CH3 de anticorpo, respectivamente, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são capazes de formar um dímero.
76. Complexo polipeptídico CARACTERIZADO por compreender: 1) uma primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de célula T (TCR), e um domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada; e
2) uma segunda porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um segundo anticorpo operacionalmente ligado a C1 e um VL do segundo anticorpo operacionalmente ligado a C2, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada; e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada; 3) uma terceira porção de ligação ao antígeno compreendendo: um VH de um terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do terceiro anticorpo operacionalmente ligada a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo; 4) uma quarta porção de ligação ao antígeno compreendendo: um VH de um quarto anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do quarto anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo; o complexo polipeptídico compreendendo ainda um primeiro e segundo domínio CH2 de anticorpo e um primeiro e segundo domínio CH3 de anticorpo, em que o CH1 da terceira porção de ligação ao antígeno e o CH1 da quarta porção de ligação de antígeno estão ligados operacionalmente aos primeiro e segundo domínios CH2 de anticorpo, respectivamente, a C1 da primeira porção de ligação ao antígeno está operacionalmente ligada ao VH da primeira porção de ligação ao antígeno, a C1 da segunda porção de ligação ao antígeno está operacionalmente ligada ao VH da segunda porção de ligação ao antígeno, e a terceira porção de ligação ao antígeno e a quarta porção de ligação ao antígeno são capazes de formar um dímero.
77. Complexo polipeptídico CARACTERIZADO por compreender:
1) uma primeira porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma primeira região constante (C1) do receptor de célula
T (TCR), e um domínio variável de cadeia leve (VL) do primeiro anticorpo operacionalmente ligado a uma segunda região constante (C2) do TCR, em que C1 e
C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada; e
2) uma segunda porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um segundo anticorpo operacionalmente ligado a C1 e um VL do segundo anticorpo operacionalmente ligado a C2, em que C1 e C2 são capazes de formar um dímero compreendendo pelo menos uma ligação intercadeia não nativa entre um primeiro resíduo mutado compreendido em C1 e um segundo resíduo mutado compreendido em C2, e a ligação intercadeia não nativa é capaz de estabilizar o dímero, e em que a) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CAlfa modificada;
b) C1 compreende uma CAlfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
c) C1 compreende uma CBeta modificada e C2 compreende uma CPré-Alfa modificada;
d) C1 compreende uma CPré-Alfa modificada e C2 compreende uma CBeta modificada;
e) C1 compreende uma CGama modificada e C2 compreende uma CDelta modificada; ou f) C1 compreende uma CDelta modificada e C2 compreende uma CGama modificada;
3) uma terceira porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do terceiro anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo;
4) uma quarta porção de ligação ao antígeno compreendendo:
um VH de um quarto anticorpo operacionalmente ligado a um domínio CH1 de cadeia pesada de anticorpo, e um VL do quarto anticorpo operacionalmente ligada a um domínio CL de cadeia leve de anticorpo;
o complexo polipeptídico compreendendo ainda um primeiro e segundo domínio CH2 de anticorpo e, opcionalmente, um primeiro e segundo domínio CH3 de anticorpo, em que a C1 da primeira porção de ligação ao antígeno e a C1 da segunda porção de ligação de antígeno estão ligadas operacionalmente aos primeiro e segundo domínios CH2 de anticorpo, respectivamente, o CH1 da terceira porção de ligação ao antígeno está operacionalmente ligado ao VH do primeira porção de ligação ao antígeno, o CH1 da quarta porção de ligação ao antígeno está ligado operacionalmente ao VH da segunda porção de ligação ao antígeno, e a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno são capazes de formar um dímero.
78. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 77, CARACTERIZADO pelo fato de que: a CBeta modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 9-35, 52-66, 71-86 e 122-127; e/ou a CAlfa modificada compreende um resíduo de cisteína mutado dentro de uma interface de contato selecionada de um grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 6-29, 37-67 e 86-95.
79. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada e a CAlfa modificada compreendem um par de resíduos de cisteína mutados que substituem um par de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: S56C em CBeta e T49C em CAlfa, S16C em CBeta e Y11C em CAlfa, F13C em CBeta e L13C em CAlfa, S16C em CBeta e L13C em CAlfa, V12C em CBeta e S16C em CAlfa, E14C em CBeta e S16C em CAlfa, F13C em CBeta e V23C em CAlfa, L62C em CBeta e Y44C em CAlfa, D58C em CBeta e T46C em CAlfa, S76C em CBeta e T46C em CAlfa, S56C em CBeta e L51C em CAlfa, S56C em CBeta e S62C em CAlfa, e R78C em CBeta e S62C em CAlfa, e em que o par de resíduos de cisteína são capazes de formar uma ligação dissulfeto intercadeia não nativa.
80. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 79, CARACTERIZADO pelo fato de que a CBeta modificada compreende S56C e a CAlfa modificada compreende T49C.
81. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-80, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de cisteína nativo na posição C74 da CBeta modificada está ausente.
82. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72-81, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um sítio de glicosilação nativo está ausente na CBeta modificada e/ou na CAlfa modificada.
83. Complexo polipeptídico, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de glicosilação nativo na CBeta modificada é N69 e/ou o(s) sítio(s) de glicosilação nativo(s) na CAlfa modificada é/são selecionado(s) dentre N34, N68, N79 e qualquer combinação dos mesmos.
84. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO por codificar o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 72-83.
85. Vetor isolado CARACTERIZADO por compreender o polinucleotídeo definido na reivindicação 84.
86. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender o polinucleotídeo isolado definido na reivindicação 84 ou o vetor isolado definido na reivindicação 85.
87. Composição CARACTERIZADA por compreender o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 72-83.
88. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender o complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 72-83 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
89. Método para o tratamento de uma condição em um indivíduo que precisa do mesmo CARACTERIZADO por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo polipeptídico definido em qualquer uma das reivindicações 72-83.
90. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 21 e 72 a 83, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um resíduo de Ser nativo na CAlfa modificada é mutado para reduzir a O-glicosilação.
91. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que C1 ou C2 compreende uma CAlfa modificada e em que pelo menos um resíduo de Ser nativo na CAlfa modificada é mutado para reduzir a O-glicosilação.
92. Complexo polipeptídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-91, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de aminoácido mutado é selecionado dentre S19, S36, S41, S91 e S94.
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