KR20200055729A - 신규한 이중특이적 폴리펩티드 복합체 - Google Patents

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KR20200055729A
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Abstract

본 발명은 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후, 또는 치료를 위해 제공되는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 제공한다.

Description

신규한 이중특이적 폴리펩티드 복합체
본 출원은 2017 년 9 월 22 일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2017/103030을 우선권으로 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 TCR 불변 영역에 융합된 항체 가변 영역을 포함하는 가용성 폴리펩티드 복합체 및 이를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다.
이중특이적 항체는 새로운 카테고리의 치료용 항체로 성장하고 있다. 이들은 표적 상에 2개의 상이한 표적 또는 에피토프에 결합하여, 개별 항체의 효과보다 우수한 부가 또는 상승 효과를 나타낼 수 있다. DVD-Ig, CrossMab, BiTE 등과 같은 새로운 이중특이적 포맷을 설계하기 위해 많은 항체 공학적 노력이 이루어졌다 (Spiess et al., Molecular Immunology, 67 (2), pp.95-106 (2015)). 그러나, 이들 형태는 잠재적으로 안정성, 용해성, 짧은 반감기 및 면역원성에 대한 다양한 제한을 가질 수 있다.
이들 이중특이적 항체 포맷 중, IgG-유사 이중특이적 항체는 공통 포맷이다: 하나는 표적 A에 결합하고 다른 하나는 표적 B에 결합한다. 구조적으로, 이는 항체 A의 절반 및 항체 B의 절반으로부터 이루어지며, 천연 IgG와 비슷한 크기와 모양을 갖는다. 다운스트림 개발을 용이하게하기 위해, 이러한 이중특이적 분자는 높은 발현 수준 및 정확하게 조립된 형태를 갖는 단일 숙주 세포로부터 정상 IgG와 같이 쉽게 생성될 수 있는 것이 바람직하다. 하지만, 동족 경쇄의 쌍 및 2개의 상이한 반 항체 (half antibodies)의 페어링은 자동으로 제어될 수 없다. 임의로 발생한 모든 종류의 미스페어링은 항체의 이질성을 크게 높일 수 있다.
"놉-인투-홀 (knobs-into-holes)" (Ridgway et al., Protein Engineering, 9(7), pp.617-21(1996); Merchant et al., Nature Biotechnology, 16(7), pp.677-681(1998)), 정전기 (Gunasekaran et al., Journal of Biological Chemistry, 285(25), pp.19637-19646 (2010)) 또는 음성 상태 디자인 (Negative sate designs)(Kreudenstein et al., mAbs, 5(5), pp.646-654 (2013); Leaver-Fay et al., Structure, 24(4), pp.641-651 (2016))과 같이 Fc 영역에 돌연변이를 도입함으로써, 2개의 상이한 중쇄의 바람직한 이종 이량체 어셈블리가 달성되었다. 그러나, 각 개별 항체의 경쇄-중쇄 선택적 페어링은 여전히 어려운 일이다. 경쇄-중쇄 사이의 인터페이스는 가변 도메인 (VH-VL) 및 불변 도메인 (CH1-CL)을 포함한다. 동족 페어링을 용이하게 하기 위하여 직교 인터페이스를 설계하는데 몇 가지 전략이 적용되었다. 로슈 (Roche)는 CH1과 CL의 도메인을 교체하고 CrossMab 플랫폼을 만들었고 (Schaefer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(27), pp.11187-11192 (2011)), 메드이뮨 (MedImmune)은 대안적으로 이황화 결합을 도입하였으며 (Mazor et al., mAbs, 7 (2), pp.377-389 (2015)), 암젠 (Amgen)은 CH1-CL 영역에서 추가 정전기를 일으켰고 (Liu et al., Journal of Biological Chemistry, 290). (12), pp.7535-7562 (2015)), Lilly (Lewis 등, Nature Biotechnology, 32 (2), pp.191-198 (2014)), 진테크 (Genentech) (Dillon et al., mAbs, 9(2), pp.213-230 (2017))는 가변 도메인과 불변 도메인 모두에서 돌연변이를 도입하였다.
이와 같이, 바람직한 발현 수준 및 항원에 대한 친화성을 갖는 이중특이적 분자를 설계할 필요성이 매우 크다.
일 측면에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드, C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합 (interchain bond)을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 갖는 폴리펩티드 복합체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 제2 항원-결합 모이어티 (moiety)와 연계된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다: 제1 항원-결합 모이어티는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 N-말단에서 C-말단까지, 제 2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 가지며, 제2 항원-결합 모이어티는 제1 항원 특이성과 상이한 제2 항원 특이성을 가지며, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 미스페어링되는 경향이 훨씬 적다.
일 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다: 제1 항원 특이성을 갖는 본 발명에 따라 제공된 폴리펩티드 복합체를 포함하는 제1 항원-결합 모이어티는, 제1 항원 특이성과 상이한 제2 항원 특이성을 갖는 제2 항원-결합 모이어티와 연계되고, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 미스페어링되는 경향이 훨씬 적다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 이중특이적 단편을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체, 또는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 모이어티에 접합된 접합체 (conjugate)를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체, 또는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 제공된 단리된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체, 또는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법으로서, 폴리펩티드 복합체, 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에서 상기 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 제공된 폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법을 제공한다: a) N-말단에서 C-말단까지, 제 1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 단계에 있어서, C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 가진다; b) 숙주 세포가 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법을 제공한다: a) N-말단에서 C-말단까지, 제 1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 제2 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 제3 폴리펩티드를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제2 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제4 폴리펩티드를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 단계, C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 가지고 제2 항체는 제2 항원 특이성을 가진다; b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법은 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계를 더 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 상태는 제1 항원 및 제2 항원이 둘 다 조절될 때 완화, 제거, 치료 또는 예방될 수 있다.
특정 실시예에서, 비-천연 쇄간 결합은 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기와 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 형성된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 돌연변이 잔기 중 적어도 하나가 시스테인 잔기이다.
특정 실시예에서, 비-천연 쇄간 결합은 이황화 결합이다.
특정 실시예에서, 제1 돌연변이 잔기는 C1의 접촉 계면 내에 포함되고, 및/또는 제2 돌연변이 잔기는 C2의 접촉 계면 내에 포함된다.
특정 실시예에서, 적어도 하나의 천연 시스테인 잔기는 C1 및/또는 C2에 부재 또는 존재한다. 특정 실시예에서, 조작된 CBeta의 위치 C74에 천연 시스테인 잔기가 부재 또는 존재한다. 특정 실시예에서, 천연 C74는 CBeta에 부재한다.
특정 실시예에서, 천연 N-글리코실화 부위는 C1 및/또는 C2에 부재 또는 존재한다. 특정 실시예에서, 천연 N-글리코실화 부위는 C1 및/또는 C2에 부재한다.
특정 실시예에서, 이량체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 비-천연 쇄간 결합을 포함한다. 특정 실시예에서, 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합은 이황화 결합이다. 특정 실시예에서, 이량체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함한다.
특정 실시예에서, a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며; b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며; c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며; d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며; e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는 f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다.
특정 실시예에서, 제1 VH는 제1 접합 도메인의 C1에 작동 가능하게 연결되고, 및 제1 VL은 제2 접합 도메인의 C2에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시예에서, 제1 VH는 연결기 (connector)를 통해 제1 접합 도메인에서 C1에 연결되고, 제1 VL은 연결기를 통해 제2 연결 도메인에서 C2에 연결된다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 접합 도메인은 항체 V/C 접합의 C 말단 단편의 적절한 길이(즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기) 및 TCR V/C 접합의 N 말단 단편의 적절한 길이(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기)를 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 아미노산 잔기 9-35, 52-66, 71-86 및 122-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CAlpha는 아미노산 잔기 6-29, 37-67 및 86-95로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 S56C, S16C, F13C, V12C, E14C, L62C, D58C, S76C 및 R78C 로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CAlpha는 T49C, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, T46C, L51C 및 S62C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta 및 조작된 CAlpha는 CBeta의 S16C 및 Calpha의 Y11C, CBeta의 F13C 및 Calpha의 L13C, CBeta의 S16C 및 Calpha의 L13C, CBeta의 V12C 및 Calpha의 S16C, CBeta의 E14C 및 Calpha의 S16C, CBeta의 F13C 및 Calpha의 V23C, CBeta의 L62C 및 Calpha의 Y44C, CBeta의 D58C 및 Calpha의 T46C, CBeta의 S76C 및 Calpha의 T46C, CBeta의 S56C 및 Calpha의 T49C, CBeta의 S56C 및 Calpha의 L51C, CBeta의 S56C 및 Calpha의 S62C, 및 CBeta의 R78C 및 Calpha의 S62C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기의 쌍을 포함하고, 상기 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
특정 실시예에서, 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CBeta 및/또는 조작된 CAlpha에 부재 또는 존재한다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta의 천연 글리코실화 부위는 N69, 및/또는 조작된 CAlpha의 천연 글리코실화 부위(들)는 N34, N68, N79 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 101-117을 포괄하는 FG 루프 및/또는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 66-71을 포괄하는 DE 루프가 결여 또는 유지되는 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CAlpha는 서열 번호 43-48을 포함, 및/또는 조작된 CBeta는 서열번호 33-41 및 306을 포함하는 것이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함, 및 C2은 조작된 CAlpha를 포함하고; 및 제1 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함 또는 이와 같고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 51 또는 52를 포함 또는 이와 같은 것이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CAlpha를 포함, 및 C2는 조작된 CBeta를 포함하고; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 129 또는 130을 포함 또는 이와 같고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함 또는 이와 같은 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 아미노산 잔기 9-35, 52-66, 71-86 및 122-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CPre-Alpha는 아미노산 잔기 7-19, 26-34, 56-75 및 103-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 S16C, A18C, E19C, F13C, A11C, S56C 및 S76C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CPre-Alpha는 S11C, A13C, I16C, S62C, T65C 및 Y59로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta 및 조작된 CPre-Alpha는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 잔기를 대체하는 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다: CBeta의 S16C 및 CPre-alpha의 S11C, CBeta의 A18C 및 CPre-alpha의 S11C, CBeta의 E19C 및 CPre-alpha의 S11C, CBeta의 F13C 및 CPre-alpha의 A13C, CBeta의 S16C 및 CPre-alpha의 A13C, CBeta의 A11C 및 CPre-alpha의 I16C, CBeta의 S56C 및 CPre-alpha의 S62C, CBeta의 S56C 및 CPre-alpha의 T65C, 및CBeta의 S76C 및 CPre-alpha의 Y59C, 및 상기 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
특정 실시예에서, 적어도 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CBeta 및/또는 조작된 CPre-Alpha에 부재한다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta에 부재 또는 존재하는 글리코실화 부위는 N69이고, 및/또는 조작된 CPre-Alpha에 존재하지 않는 글리코실화 부위는 N50이다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 101-107을 포함하는 FG 루프 및/또는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 66-71을 포함하는 DE 루프가 결여 또는 유지된 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CPre-Alpha는 서열번호 82-83, 311-318 중 어느 하나를 포함하고; 및/또는 조작된 CBeta는 서열번호 84, 33-41, 319-324 중 어느 하나를 포함하는 것이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2은 조작된 CPre-Alpha를 포함하며; 및 제1 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 81 또는 131을 포함한다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2은 조작된 CBeta를 포함하며; 및 제1 접합 도메인은 서열번호 132 또는 133을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 CDelta는 아미노산 잔기 8-26, 43-64 및 84-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CGamma는 아미노산 잔기 11-35 및 55-76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 CGamma는 S17C, E20C, F14C, T12C, M62C, Q57C 및 A19C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CDelta는 F12C, M14C, N16C, D46C, V50C, F87C 및 E88C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 CGamma 및 조작된 CDelta는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 잔기를 대체하는 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다: CGamma의 S17C 및 CDelta의 F12C, CGamma의 E20C 및 CDelta의 F12C, CGamma의 F14C 및 CDelta의 M14C, CGamma의 T12C 및 CDelta의 N16C, CGamma의 M62C 및 CDelta의 D46C, CGamma의 Q57C 및 CDelta의 V50C, CGamma의 A19C 및 CDelta의 F87C, CGamma의 A19C 및 CDelta의 E88C, 및 도입된 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
특정 실시예에서, 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CGamma 및/또는 조작된 CDelta에 부재 또는 존재하는 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CGamma의 천연 글리코실화 부위는 N65, 및/또는 조작된 CDelta의 고유 글리코실화 부위(들)은 N16 및 N79 중 하나 또는 둘 다인 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CGamma는 서열번호 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 또는 340를 포함하고; 및/또는 조작된 CDelta는 서열 번호 115, 116, 310, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 또는 332를 포함한다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2은 조작된 CDelta를 포함하며; 및 제1 접합 도메인은 서열번호 117 또는 118을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 119 또는 120을 포함한다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2가 조작된 CGamma를 포함하며; 및 제1 접합 도메인은 서열번호 123 또는 124를 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 125 또는 126을 포함한다.
특정 실시예에서, 제1 폴리펩티드는 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인을 더 포함한다.
특정 실시예에서, 제1 항원 특이성 및 제2 항원 특이성은 2개의 상이한 항원, 또는 1개의 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 CD3에 결합한다. 특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 CD19에 결합한다. 특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 CD19에 결합한다. 특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 CD3에 결합한다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 CTLA-4에 결합한다. 특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 PD-1에 결합한다. 특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 PD-1에 결합한다. 특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 CTLA-4에 결합한다.
특정 실시예에서, 연결은 연결기, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것이다.
특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 항원 특이성을 갖는 제2 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 Fab를 포함한다.
특정 실시예에서, 제1 항원 특이성 및 제2 항원 특이성은 2개의 상이한 항원, 또는 1개의 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 항원 특이성 중 하나는 T-세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해 세포 (NK 세포) 특이적 수용체 분자에 관한 것이고, 다른 하나는 종양 연계 항원에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 항원 특이성 중 하나는 CD3에 관한 것이고, 다른 하나는 종양 연계 항원에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 항원 특이성 중 하나는 CD3에 관한 것이고, 다른 하나는 CD19에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 제1 이량체화 도메인을 더 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 이량체화 도메인을 더 포함하며, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 연계된 것이다.
특정 실시예에서, 연결은 연결기, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것이다.
제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함하고, IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 선택적으로 유래된 것이다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 이량체화 도메인을 더 포함한다. 특정 실시예에서, 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역, 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다.
특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제3 접합 도메인의 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시예에서, a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, 제3 접합 도메인은 서열번호 53 또는 54을 포함하며; b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, 및 제3 접합 도메인은 서열번호 134, 135, 140 또는 141을 포함하며; c) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, 및 제3 접합 도메인은 서열번호 134, 135, 140 또는 141을 포함하며; d) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, 및 제3 접합 도메인은 서열번호 121 또는 122을 포함하며; 또는 e) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, 및 제3 접합 도메인은 서열번호 127 또는 128을 포함한다.
특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-결합 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고 동종이량체화를 방해 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연계된다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀 (knobs-into-holes), 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용, 또는 증가된 유연성을 통해 이종이량체로 연결될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH를 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 키메라 불변 영역 및 C2는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 서열을 포함한다: 서열번호 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/215, 213/151, 214/212, 214/151, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 및 238/237.
특정 실시예에서, 제1 항원성은 CD3에 관한 것이고, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 서열을 포함한다: 서열번호 2/1, 4/3, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 및 138/139.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 서열 조합을 포함한다: 서열번호 22/12/24/23, 25/12/26/23 및 25/12/27/23로 하고, 상기 제1 항원-결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 제2 항원-결합 모이어티는 CD19에 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체는 Fab, (Fab)2, 바이보디 (Bibody), 트리보디 (Tribody), 탠덤 연결 Fabs (Tandem linked Fabs), Fab-Fv, 탠덤 연결 V 도메인 (Tandem linked V domain), 탠덤 연결 scFvs (Tandem linked scFvs), 및 다른 포맷으로 제조될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후, 또는 치료를 위해 제공되는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 전술한 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면을 참조하여 진행하는 몇 가지 실시예에 대한 다음의 상세한 설명에 따라 보다 명백해질 것이다.
본 발명은 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후, 또는 치료를 위해 제공되는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 연구된 항체 포맷의 개략도를 제시한다. 항-CD3 항체 T3 및 항-CD19 항체 U4 가 설계되었다. T3의 불변 영역 (CL 및 CH1)을 TCR의 불변 도메인으로 대체하여 규칙 항체에 직교하는 독특한 경-중쇄 인터페이스를 설계하였다. Fc 도메인에서 " 놉-인투-홀(knobs-into-holes)" 돌연변이와 함께 TCR-변형 T3 및 천연 U4를 사용하여 이중특이적 항체 포맷 E17 및 F16을 설계하였다.
도 2a 내지 2d는 항체 Fv 모델 및 TCR 구조의 중첩적인 포즈를 제시하여 항체 Fv와 TCR 불변 영역의 퓨징에 대한 방향을 보여준다. 도 2a는 자체 개발한 항체 Fv 구조 모델을 항-CD3 항체 T3의 서열에 기초하여 구축한 것이다. 도 2b는 PDB 4L4T의 TCR 구조를 보여준다. 도 2c는 상이한 배향으로 TCR 가변 영역에 중첩된 항체 Fv 구조 모델을 제시한다. 표면이 고르지 않은 키메라 단백질은 도 2d에 도시된 바와 같이 중첩적인 포즈에서의 TCR 가변 도메인을 제거함으로써 생성되었다. 접합 구역에서 중첩된 잔기들은 접합 영역을 설계하는데 도움이 되었다. 항체의 VL 쇄 및 TCR 알파 쇄는 백색으로 채색되었다. VH 및 베타 쇄는 흑색으로 채색되었다.
도 3a 내지 3b는 TCR 불변 영역 및 항체 Fab 불변 영역을 비교한다. 도 3a는 PDB 4L4T의 TCR 결정 구조를 보여준다. 도 3b는 T3 모델의 Fv 도메인 및 PDB 5DK3의 항체 불변 도메인에 의해 만들어진 항체 Fab 구조 모델을 보여준다. TCR의 불변 도메인과 항체 Fab의 불변 도메인 사이에서 FG 및 DE 루프의 명백한 차이는 모든 잔기 측쇄를 표시함으로써 두드러진다.
도 4는 CAlpha 및 CBeta 쇄를 사용한 TCR-항체 키메라 항체의 디글리코실화 돌연변이의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 샘플은 모두 Expi293 발현의 생성물로부터 얻은 상청액이었다. 레인 1, 3, 5, 7 및 9는 각각 Design_2-QQQQ, Design_2-AAAA, Design_2-QSKE, Design_2-ASKE 및 Design_2-QQQQQ의 비환원된 페이지들이다. 레인 2, 4, 6, 8 및10은 각각 환원된 페이지들이다.
도 5는 CD3-발현된 Jurkat 세포에 결합된 모든 디글리코실화 돌연변이의 용량-의존적 FACS 결합을 보여준다. 모든 표본은 Expi293에서 발현된 디글리코실화 돌연변이의 상청액에서 얻었다. 야생형 항-CD3 항체(T3-IgG1)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 6a 내지 6b는 IgG1 (도 6A) 및 IgG4 (도 6B) 이소타입(isotype)에서의 항체 T3 및 U4의 쇄 미스페어링 시험의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 레인1 및2는 각각 T3_light-U4_heavy 및 T3_heavy-U4_light의 쌍이다. 레인 3 및 4는 레인1 및 2와 동일한 쌍 순서지만, TCR 불변 영역을 이용하여 변형된 T3와 함께이다. 두 도면의 레인1 내지4는 비-환원된 샘플이고, 레인 5 내지 8은 환원된 샘플이다.
도 7a 내지 7b는 IgG1(도 7A) 및 IgG4(도 7B) 에서 정제된 이중특이적 항체인, E17-Design_2-QQQQ의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. IgG1 이소타입(isotype)을 다음의 3단계로 정제하였다: 단백질 A 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 (IEC) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC). 다음의2단계 정제 후 IgG4를 수득하였다: 단백질 A 크로마토그래피 및 SEC. 도 7C-7D는 샘플의 순도를 결정하기 위해 정제된 IgG1 (도 7C) 및 IgG4 (도 7D)의 SEC-HPLC 데이터이다.
도 8은 Ni SepharoseTM 엑셀크로마토그래피에 의해 정제된 6xHis-태그를 갖는 키메라 T3의 Fab 단편의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 레인1및 3은 T3-Fab-Design_2.his1의 밴드이고 레인 2및 4는 T3-Fab-Design_2.his2의 밴드이다.
도 9는 TCR-변형 키메라 T3의 Fab 단편의 용량-의존적 FACS 결합을 예시한다. 야생형 T3 항체의1가 형태 (T3-Fab-IgG4)를 양성 대조군으로 사용하였다. 규칙 인간 IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 10a 내지 10b는 설계된 이중특이적 항체인 E17-Design_2-QQQQ의 CD3+ Jurkat 세포에 대한 용량-의존적 FACS 결합을 나타낸다. 야생형 항체 T3 및 U4 및 그의1가 형태는 양성 대조군 (도 10a) 및 CD19+ Ramos 세포 (도 10b)로서 사용되었다. IgG1 및 IgG4 이소타입 모두를 시험하였다. 무관한 인간 IgG1 또는 IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 11a 내지 11b는 Jurkat 세포상의 CD3 (도 11a) 및 Ramos 세포상의 CD19(도 11b)에 대하여 설계된 이중특이적 항체인, E17-Design_2-QQQQ 및 F16-Design_2-QQQQ의 FACS 결합의 비교를 나타낸다. IgG1 및 IgG4 이소타입 둘 모두에 이중특이적 항체를 시험하였다. 규칙 인간 IgG1 또는 IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 12는 IgG1 및 IgG4 둘 모두에서 이중특이적 항체인 E17-Design_2-QQQQ에 의해 매개된 T-세포 관여 악성 B 세포 사멸에 대한 세포 독성 분석을 보여준다. 부모의 단일특이적 항-CD3 (T3-IgG4), 항-CD19 (U4-IgG) 항체 및 무관한 인간 IgG1 항체가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 13은 T-세포 관여 악성 B 세포 사멸을 매개하는데 있어서 2개의 설계된 이중특이적 항체, E17-Design_2-QQQQ 및 F16-Design_2-QQQQ의 활성을 비교한다. 음성 대조군으로서 무관한 인간 IgG 항체를 사용하였다.
도 14a 내지 14b는 비환원 (도 14a) 및 환원 (도 14b) 조건에서 이중특이적 항체 E17-Design_2-QQQQ의 여러 피크로 나눠진 질량 스펙트럼을 보여준다. 도14a의148180.53에서의 피크는 온전한 우시보디 (WuXiBody)의 정확한 분자량이다. 22877 Da의 피크는 도 14b의 환원된 질량 스펙트럼에서 발견된 경쇄를 나타낸다. 도14a의149128.45 Da에서의 작은 피크는 도14b에 도시된 바와 같이 경쇄상에 위치한 O-글리코실화(약 947.92 Da 이상)로 추정된다.
도 15a 내지 15b는 SDS-PAGE로 특성화된 알파/베타 인터페이스에서의 항체 발현에서 쇄간 이황화 결합의 역할을 보여준다. 도 15a는 CAlpha와 CBeta 사이의 쇄간 이황화 결합을 포함하는 항체를 보여준다. 도 15b는 CAlpha와 CBeta 사이에 쇄간 이황화 결합이 없는 항체를 보여준다. 레인1 및 3은 각각 도입된 이황화 결합이 유무에 따른 Design_2-QQQQ-IgG4의 비환원 PAGE 결과이다. 레인 2 및 4는 각각 도입된 이황화 결합의 유무에 따른 Design_2-QQQQ-IgG4의 환원된 PAGE 결과이다.
도 16은 pre-알파/베타 인터페이스에서 설계된 이황화 결합의 SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인1 및 2는 각각 "Design_5_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys13"및 "Design_6_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys14"이며 비환원 조건으로 처리된다. 레인 4 및 5는 각각 "Design_5_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys13"및 "Design_6_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys14"이며 환원 조건으로 처리된다.
도 17a 내지 17b는 델타/감마 인터페이스에서 설계된 이황화 결합의 SDS-PAGE를 보여준다. 레인 6 및 8은 각각 "Design_2_Cys5_no_Glyco"및 "Design_2_hypeCys2_no_Glyco"이다. 도17a는 비환원된 SDS-PAGE이다. 도 17b는 환원된 SDS-PAGE이다.
도 18a는 돌연변이된 시스테인 잔기를 갖는 천연 TCR 알파 쇄의 서열 및 대응하는 서열을 도시한다. TRAC_Human은 알파 쇄 불변 영역의 자연 서열이다. 4L4T_Alpha_Crystal은 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있는 S55C 돌연변이를 갖는 결정 구조 (PDB 코드 4L4T)의 서열이다. 회색 영역은 본 발명에서 키메라 단백질의 골격으로서 사용되는 불변 영역이다.
도 18b는 천연 TCR 베타 쇄의 서열 및 돌연변이된 시스테인 잔기에 대응하는 서열을 보여준다. TRBC1_Human 및 TRBC2_Human은 베타 불변 영역의 자연 서열이다.
도 18c는 천연 TCR Pre-알파 쇄의 서열을 보여준다. PTCRA_Human은 Pre-알파 쇄 불변 영역의 자연 서열이다 (Pre-알파 쇄에만 가변 도메인이 없음). 3OF6_PreAlpha_Crystal은 결정 구조의 서열이다 (PDB 코드 3OF6). 회색 도메인은 넘버링을 위해 사용되는 불변 영역이다.
도 18d는 천연 TCR 델타 쇄의 서열을 보여준다. TRA@_Human은 델타 영역의 자연 서열이다. 4LFH_Delta_Crystal은 결정 구조 (PDB 코드 4LFH)의 델타 쇄 서열의 불변 영역이다. 회색 영역은 넘버링을 위해 사용되는 불변 영역이다.
도 18e는 천연 TCR 감마 쇄의 서열을 나타낸다. TRGC1_Human 및 TRGC2_Human은 감마 불변 영역의 자연 서열이다. 4LFH_Gamma_Crystal은 결정 구조 (PDB 코드 4LFH)의 감마 쇄 서열의 불변 영역이다. 회색 도메인은 넘버링을 위해 사용되는 불변 영역이다.
도 19a 내지 19e는 TCR 불변 영역의 서열 및 넘버링을 나타낸다. 도 19a는 TCR 알파 불변 영역의 서열 및 넘버링을 나타낸다. 도 19b는 TCR 베타 불변 영역의 서열 및 넘버링을 보여준다. 도 19c는 TCR Pre-Alpha 불변 영역의 서열 및 넘버링을 보여준다. 도 19d는 TCR 델타 불변 영역의 서열 및 넘버링을 나타낸다. 도 19e는 TCR 감마 불변 영역의 서열 및 넘버링을 도시한다.
도 20a 내지 20d는 IgG1 및 IgG4 놉-인투-홀의 서열 및 넘버링을 나타낸다. 도 20a는 IgG1 "knob" 돌연변이의 서열 및 넘버링을 보여준다. 도 20b는 IgG4 "knob" 돌연변이의 서열 및 넘버링을 보여준다. 도 20c는 IgG1 "hole" 돌연변이의 서열 및 넘버링을 보여준다. 도 20d는 IgG4 "hole" 돌연변이의 서열 및 넘버링을 보여준다.
도 21a 내지 21b는 ELISA를 이용하여, 인간 C1Q에 대한 IgG4 (도 21a) 및 야생형 IgG1 (도 21b) 포맷에 대한 E17-Design_2-QQQQ의 결합을 나타낸다. 인간 IgG1 항체는 대조군으로 사용되었다.
도 22는 4개의 대칭 우시보디 (WuXiBody) 포맷 G19, G19R, G25 및 G25R의 개략적인 설명을 나타낸다. 포맷 G19 및 G25에 대하여, 2개의 TCR-함유 키메라 Fab-유사 도메인을 정상 항체의 C-말단 및 N-말단에 각각 이식하였다. 직사각형은 TCR 불변 도메인을 나타내고, 타원은 항체의 가변 및 불변 도메인을 나타낸다. G19 및 G19R 또는 G25 및 G25R 포맷의 차이점은 일반 Fab 및 키메라 Fab의 전환 위치이다. 이들 포맷은 상이한 항체 쌍으로부터 상이한 가변 도메인을 수용할 수 있고 일반적으로 약 240 내지 250 kD의 분자량을 갖는다.
도 23a 내지 23b는 G19 포맷의 2개의 정제된 이중특이적 항체의 SDS-PAGE (도 23a) 및 SEC-HPLC (도 23b) 특성을 나타낸다. SDS-PAGE의 레인 번호는 SEC-HPLC 도시의 라벨 번호와 일치한다. 레인1 및 2는 각각 T1U6 및 U6T1 항체 쌍이다. T1U6에서 T1 (anti-CTLA-4)은 N-말단에 있는 반면, U6T1에서 U6 (anti-PD-1)는 N-말단에 있다. 두 이중특이적 분자 모두 단백질 A 크로마토그래피에 의해 약 90%까지 정제되었다.
도 24a 내지 24b는 인간 PD-1 (도 24a) 및 CTLA-4 (도 24b) 조작된 세포에 대한 G19 포맷의 정제된 U6T1 및 T1U6 항체의 용량-의존적 FACS 결합을 나타낸다. IgG4 항체는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 25a 내지 25b는 상이한 대칭 포맷의 단백질 A로 정제된 이중특이적 항체의 SDS-PAGE (도 25a) 및 SEC-HPLC (도 25b) 특성을 나타낸다. 레인1 내지3은 각각 G19R, G25 및 G25R 포맷의 U6T1 항체 쌍이다. PC는 250 kD 분자량을 갖는 것으로 알려진 대조군 단백질이다. 3종의 이중특이적 분자 모두 90 % 이상의 순도를 가졌다. SDS-PAGE의 레인 번호는 SEC-HPLC 수치의 라벨 번호와 일치한다.
도 26a 내지 26b는 인간 PD-1 (도 26a) 및 CTLA-4 (도 26b) 조작된 세포에 대한 G19R, G25 및 G25R 포맷의 정제된 U6T1 이중특이적 항체의 용량-의존적 FACS 결합을 나타낸다. 벤치마크 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 27a 내지 27b는 각각, PD-1에 대한 인간 PD-L1 결합 (도 27a) 및 CTLA-4에 대한 CD80 결합 (도 27b)을 차단하기 위하여 G19R, G25 및 G25R 포맷으로 설계된 이중특이적 항체의 FACS 경쟁 분석을 나타낸다. 벤치마크 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 28a 내지 28b는 상이한 대칭 포맷의 단백질 A-정제된 이중특이적 항체의 SDS-PAGE (도 28a) 및 SEC-HPLC (도 28b) 특성화를 나타낸다. 레인 1 내지 4는 각각 G19, G19R, G25, 및 G25R 포맷의 U6T5 항체 쌍이다. PC는 250kD 분자량의 대조군 단백질이다. 3가지 이중특이적 분자 모두 90% 이상의 순도를 가졌다. SDS-PAGE의 레인 번호는 SEC-HPLC 수치의 라벨 번호와 일치한다.
도 29a 내지 29b는 인간 PD-1 (도 29a) 및 CTLA-4 (도 29b) 조작된 세포에 대한 G19, G19R, G25 및 G25R 포맷의 정제된 이중특이적 항체의 용량-의존적 FACS 결합을 나타낸다. 기준 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 30은 2 개의 분자 U6T5.G25 및 U6T1.G25R의 ELISA 이중 결합 분석을 나타낸다. 벤치마크 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 31a 내지 31b는 각각, PD-1에 대한 인간 PD-L1 결합 (도 31a) 및 CTLA-4에 대한 CD80 결합 (도 31b)을 차단하기 위해 설계된 이중특이적 항체 U6T5.G25 및 U6T1.G25R의 FACS 경쟁 분석을 나타낸다. 벤치마크 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 32는 경-중 변환 키메라 Fab-유사 도메인을 갖는 3개의 대칭 포맷 G26, G27 및 G26R의 개략도이다.
도 33a 내지 33b는 G27 및 G26R 포맷의 단백질 A-정제된 이중특이적 항체의 SDS-PAGE (도 33a) 및 SEC-HPLC (도 33b) 특성을 나타낸다. 레인1 및 2는 각각 G27 및 G26R 포맷의 T4U6 항체 쌍이다. G26R 포맷의 정제만이 정제 후 90% 순도를 달성했다. SDS-PAGE의 레인 번호는 SEC-HPLC 수치의 라벨 번호와 일치한다.
도 34a 내지 34b는 인간 PD-1 (도 34a) 및 CTLA-4 (도 34b) 조작된 세포에 대한 G26R 포맷의 정제된 이중특이적 T4U6 항체 쌍의 용량-의존적 FACS 결합을 나타낸다. 벤치마크 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 35a 내지 35b는 G26 포맷의 단백질 A-정제된 이중특이적 U6T4 항체 쌍의 SDS-PAGE (도 35a) 및 SEC-HPLC (도 35b) 특성을 나타낸다. 정제 후 순도 90 %를 달성하였다.
도 36a 내지 36d는 인간 PD-1 (도 36a) 및 CTLA-4 (도 36b) 조작된 세포에 대한 G26 포맷의 정제된 이중특이적 U6T4 항체 쌍의 용량-의존적 ELISA 결합뿐만 아니라 인간 PD-1 (도 36c) 및 CTLA-4 (도 36d) 조작된 세포에 대한 G26 포맷의 정제된 이중특이적 U6T4 항체 쌍의 용량-의존적 FACS 결합을 나타낸다. 벤치마크 이중특이적 항-CTAL-4 x PD-1 항체 (BMK1.IgG1)를 대조군으로 사용하였고, 무관한 IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 37은 cynomolgus-CD19로 형질감염된 세포주 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 및 CHO-K1 모 세포주의 유세포 분석 히스토그램을 나타낸다.
도 38은 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 SDS-PAGE를 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, 비환원; 레인 3: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, 환원.
도 39는 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4의 SEC-HPLC를 나타낸다.
도 40은 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 SDS-PAGE를 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, 비환원; 레인 2: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, 환원.
도 41은 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 SEC-HPLC를 나타낸다.
도 42a 내지 42b는 FACS에 의한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 Ramos 세포 (도 42a) 및 Juskat 세포 (도 42b)에 대한 결합을 나타낸다.
도 43a 내지 43b는 FACS에 의한 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 Ramos 세포 (도 43a) 및 Jurkat 세포 (도 43b)에 대한 결합을 나타낸다.
도 44는 FACS에 의하여, cynomolgus-CD19 발현 세포에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 나타낸다.
도 45는 ELISA에 의하여, cynomolgus-CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 나타낸다.
도 46a 내지 46b는 Ramos (도 46a) 및 Jurkat (도 46b) 세포에의 결합에 의해 측정된 바와 같이 인간 CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 친화도를 나타낸다.
도 47a 내지 47b는 CD19+세포에 결합하는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP-매개 CD3+세포를 나타낸다 (도 47a). 무관한 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다 (그림 47b).
도 48a 내지 48b는 Raji 세포에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP가 매개하는 T세포의 세포 독성 활성 (도 48a) 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP가 매개하는 T세포의 세포 독성 활성을 나타낸다(도 48b).
도 49a 내지 49d는 CD19+표적 세포의 존재 또는 부재에 따른 T 세포에서의 CD69 및 CD25 발현을 나타낸다. CD4+T세포 부분집합에서의 CD69+ 발현 T 세포의 백분율 (도 49a); CD8+T 세포 부분집합에서의CD69 발현 T 세포의 백분율 (도 49b); CD4+T 세포 부분집합에서의 CD25 발현 T 세포의 백분율 (도 49c); CD8+T 세포 부분집합에서의 CD25 발현 T 세포의 백분율 (도 49d).
도 50a 내지 50d는 CD19+표적 세포의 존재 또는 부재에 따른 T 세포의 IFN-γ 및 TNF-α 사이토카인 방출을 나타낸다. CD4+T 세포 부분집합에서의 IFN-γ의 방출 (도 50a); CD4+T 세포 부분집합에서의 TNF-α의 방출 (도 50b); CD8+T 세포 부분집합에서의 IFN-γ의 방출 (도 50c); CD8+T 세포 부분집합에서의 TNF-α의 방출 (도 50d).
도 51a 내지 51b는 인간 혈청에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 안정성을 나타낸다. 표지된 날에 혈청에서 인큐베이션된 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 샘플의 결합 (도 51a); 표지된 날에 혈청에서 인큐베이션된 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 샘플의 Jurkat 결합 (도 51b).
도 52는 ELISA에 의하여, W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 C1Q 에 대한 결합을 나타낸다. IgG1 항체는 대조군으로 사용되었다.
도 53은 상이한 용량으로 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP를 Raji 이종이식편 종양을 갖는 혼합된 PBMC 인간화 마우스에 투여한 후의 종양 부피 추적을 나타낸다. 데이터는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. IgG4 항체는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 54는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 약동학을 나타낸다. 두 원숭이의 혈청 샘플을 ELISA로 검출하였다.
도 55a 내지 55b는 W3438-T3U-1.uIgG4.SP. 의 투여 전 및 투여 후 모두를 포함하여 원숭이 #1 (도 55a) 및 원숭이 #2 (도 55b)로부터의 혈청 샘플에서 항-약물 항체 (ELISA에 의해 검출된 ADA)를 나타낸다.
도 56a 내지 56b는 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 SDS-PAGE 특성을 나타낸다. M: 단백질 마커. PC: 약 250 kDa에서 이중특이적 항체의 양성 대조군 (도 56a) 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP의 SEC-HPLC 특성화 (도 56b).
도 57은 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP, W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체 WBP324-BMK1 uIgG1.KDL. 의 용융 온도를 나타낸다.
도 58은 인간 PD-1 조작 세포에 대한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 결합을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL, W324-BMK2.uIgG4 및 W324-BMK3.uIgG4는 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체의 상이한 버전이다. WBP305-BMK1.IgG4는 항-PD-1 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 59는 cynomolgus PD-1 조작 세포에 대한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 결합을 나타낸다. WBP3055_1.153.7.hAb 및 WBP305-BMK1.IgG4는 항-PD-1 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 60은 인간 CTLA-4 조작 세포에 대한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 결합을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL, W324-BMK2.uIgG4 및 W324-BMK3.uIgG4는 상이한 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체이다. WBP316-BMK1.IgG4는 항-CTLA-4-1 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 61은 cynomolgus CTLA-4 조작 세포에 대한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 결합을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL은 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체이다. W3162_1.154.8-z35-IgG1K 및 WBP316-BMK1.IgG4는 항-CTLA-4 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 62는 SPR에 의해 측정된 바와 같이 CTLA-4 및 PD-1에 대한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 결합 친화도를 요약한다. WBP316-BMK1.IgG4는 항-CTLA-4-1 항체이다. 항-PD-1의 모 항체를 대조군으로 사용하였다.
도 63은 PD-1가 조작된 세포에 대한 인간 PD-L1 단백질 결합을 차단하기 위한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 경쟁 분석을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL은 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체이다. WBP3055_1.153.7.hAb 및 WBP305-BMK1.IgG4는 항-PD-1 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 64는 CD80가 조작된 세포에 대한 인간 CTLA-4 단백질 결합을 차단하기 위한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 경쟁 분석을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL은 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체이다. W3162_1.154.8-z35-IgG1K 및 WBP316-BMK1.IgG4는 항-CTLA-4 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 65는 CD80 조작 세포에 cynomolgus CTLA-4 단백질 결합을 차단하기 위한 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 경쟁 분석을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL은 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체이다. W3162_1.154.8-z35-IgG1K 및 WBP316-BMK1.IgG4는 항-CTLA-4 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 66은 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 ELISA 이중 결합 분석을 나타낸다. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL은 벤치마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체이다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 67은 CTLA-4 및 PD-1에 대한 W3248-U6T5.G25R-1.uIgG4.SP 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 FACS 이중 결합을 나타낸다. 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하였다.
도 68a 내지 68b는 인간 CTLA-4 및 PD-1에 대한 ELISA 이중 결합에 의해 측정 된 바와 같이 14일 동안 혈청에서 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP의 안정성을 보여주며(도 68a), 인간 CTLA-4 및 PD-1에 대한 ELISA 이중 결합에 의해 측정된 바와 같이 14일 동안 혈청에서 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 안정성을 나타낸다(도 68b).
본 개시에 대한 설명은 단지 본 개시의 다양한 실시예들을 예시하기 위한 것이다. 이와 같이 논의된 특정 변경사항은 개시범위에 대한 제한사항으로 해석해서는 안 된다. 다양한 등가물, 변경 및 변형이 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 등가물의 실시예가 본 명세서에 포함되는 것으로 이해된다. 공보, 특허 및 특허 출원을 포함하여 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
정의
본 명세서의 "a", "an" 및 "the"는 본문의 문법적 목적어 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 가리키기 위하여 사용된다. 예를 들어, "폴리펩티드 복합체"는 하나의 폴리펩티드 복합체 또는 둘 이상의 폴리펩티드 복합체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 수량, 무게 또는 길이가 30, 25, 20, 10, 9, 8, 6, 4, 3, 2 또는1%만큼 변화하는 것을 말한다. 특히 숫자 값 앞에 있을 때 "주변" 또는 "대략"이라는 용어는 값이 플러스 또는 마이너스15%, 10%, 5% 또는 1%의 범위를 나타낸다.
본 개시 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, "포함하다", "포함하는" 이라는 단어는 언급된 단계나 요소 또는 단계 또는 요소 그룹을 포함하지만, 다른 단계나 요소 또는 요소 그룹을 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "구성되는"은 "구성되는"이라는 문구를 포함하는 것을 의미하며, 이에 한정되는 것을 의미한다. 따라서, "-로 구성되는"이라는 문구는 열거된 요소들이 필수적이거나 필요한 것이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 구성되는"은 구 뒤에 열거된 요소를 포함하는 것을 의미하며, 열거된 요소에 대해 명세서에 명시된 활동이나 행동에 간섭하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서 "본질적으로 구성되는"이라는 문구는 열거된 요소들이 필수이거나 필요한 것이지만, 다른 요소는 선택적이며, 열거된 요소들의 활동이나 행동에 영향을 미치는지에 따라 존재할 수도 있고 없을 수도 있음을 나타낸다.
본 개시 전반에 걸쳐 "일 실시예", "실시예", "특별한 실시예", "관련 실시예", "특정 실시예", "첨가된 실시예" 또는 "추가된 실시예" 또는 조합에 대한 참조는 실시예와 관련하여 설명된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 개시의 적어도 하나의 실시예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 여러 곳에서 전술한 문구의 출현이 반드시 모두 동일한 실시예를 언급하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
본 명세서에서 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 폴리머 또는 여러 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭할 때 서로 바꾸어 사용한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 해당 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. "아미노산"이라는 용어는 자연 발생과 합성 아미노산을 말하며, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체와 아미노산 모방체를 말한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전학적 코드에 의해 암호화된 아미노산뿐 아니라 나중에 수정된 아미노산, 가령, 하이드록시프로라인, 감마-카르복시글루탐산, O-포스포세린을 포함한다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기초 화학 구조를 가진 화합물, 즉 수소에 묶여 있는 알파-탄소, 카복실 그룹, 아미노 그룹, R 그룹, 가령, 호모세린, 노르레우신, 황산화메티오닌, 황화메틸메틸을 말한다. 그러한 유사체는 R군(가령, 노르루신)이나 펩티드 골격을 변형시켰지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지하고 있다. 알파-탄소는 카보닐과 같은 기능 그룹에 부착되는 최초의 탄소 원자를 말한다. 베타-탄소는 알파-탄소와 결합된 두 번째 탄소 원자를 가리키며, 계속해서 카본의 이름을 그리스 문자로 알파벳 순서로 명명한다. 아미노산 유사체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다른 구조를 가지고 있지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 말한다. "단백질"이라는 용어는 일반적으로 큰 폴리펩티드를 가리킨다. "펩티드"라는 용어는 일반적으로 짧은 폴리펩티드를 가리킨다. 폴리펩티드 서열은 보통 폴리펩티드 서열의 왼쪽 끝은 아미노 말단(N-말단)이며, 폴리펩티드 서열의 오른쪽 끝은 카르복실 말단(C-말단)이다. 본 명세서에 사용된 "폴리펩티드 복합체"는 특정 기능을 수행하기 위해 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 복합체를 의미한다. 어떤 실시예에서는 폴리펩티드가 면역과 관련이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 특정 항원에 결합하는 임의의 면역글로불린, 단일 클론 항체, 폴리 클로날 항체, 다중 특이적 항체 또는 이중특이적 (2가) 항체를 포함한다. 본래의 온전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 도메인 ( "HCVR") 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성되는 반면, 각각의 경쇄는 가변 도메인 ("LCVR") 및 불변 영역 (CL). 포유류 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 분류되며 포유류 경쇄는
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
로 분류된다. 항체는 "Y"형상을 가지며, Y의 줄기는 이황화 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 구성된다. Y의 각각의 팔은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 항원 결합을 담당한다. 두 쇄의 가변 도메인은 일반적으로 상보성 결정 도메인 (CDRs) (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한 경쇄 (L) CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한 중쇄 (H) CDR)이라고 불리는 3개의 매우 가변적인 루프를 포함한다. 항체의 CDR 경계는 Kabat, Chothia 또는 Al-Lazikani에 의해 정의되거나 식별될 수 있다(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, AM, J. Mol. Biol., 273 (4) 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol. Biol. Dec 5;186 (3): 651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, AM, J.Mol. Biol.,196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28; 342 (6252): 877-83 (1989); Kabat EA et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 3개의 CDRs은 프레임 워크 영역 (FRs)으로 알려진 플랭킹 스트레치 (flanking stretch) 사이에 개재되며, 이는 CDRs보다 더욱 보존되고 초가변 루프를 지지하는 스캐폴드를 형성한다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 4 개의 FRs을 포함하고, CDRs 및 FRs은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관여하지 않지만 다양한 효과 작용을 한다. 항체는 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 클래스에 할당된다. 항체의 5가지 주요 부류 또는 아이소타입 (isoptype)은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 하는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. 주요 항체 종류로는 IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄), IgA2 (α2 중쇄) 등의 하위 분류가 있다.
본 명세서에서 사용된 항체와 관련하여 용어 "가변 도메인"은 하나 이상의 CDRs을 포함하는 항체 가변 도메인 또는 이의 단편을 지칭한다. 가변 도메인은 온전한 가변 도메인 (예를 들어 HCVR 또는 LCVR)을 포함할 수 있으며, 온전한 가변 도메인은 여전히 항원에 결합하거나 항원-결합 부위를 형성하는 능력을 유지하는 것도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원-결합 모이어티"는 하나 이상의 CDRs을 포함하는 항체의 일부 또는 항원에 결합하지만, 온전한 고유의 항체를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편으로부터 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 모이어티의 예로는 가변 도메인, 가변 영역, 디아보디, Fab, Fab ', F (ab')2, Fv 단편, 이황화 안정화 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv '), 이황화 안정화 디아보디 (ds diabody), 다중 특이적 항체, 카멜라이즈된(camelized) 단일 도메인 항체, 나노보디 (Nanobody), 도메인 항체 및 2가 도메인 항체가 있다. 항원-결합 모이어티는 모 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 항원-결합 모이어티는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 프레임 워크 영역으로 이식된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDRs을 포함할 수 있다. 항원-결합 모이어티의 보다 상세한 형태는 상기Spiess et al, 2015 및 Brinkman et al., mAbs, 9 (2), pp.182-212 (2017)에 기술되어 있으며, 이들은 본 명세서에 포함된다.
항체와 관련하여 "Fab"은 이황화 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역에 관련된 단일 경쇄 (가변 및 불변 영역 둘 다)로 구성된 항체의 부분을 지칭한다. 특정 실시예에서, 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역은 TCR 불변 영역으로 대체된다.
"Fab'"은 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F (ab')2"는 Fab의 이량체를 지칭한다.
"바이보디 (Bibody)"는 scFv를 경쇄 (Fab-L-scFv) 또는 Fd (Fab-H-scFv)의 C-말단에 융합시켜 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
"트리보디 (Tribody)"는 scFv를 경쇄 및 중쇄 (Fab-(scFv)2) 둘 다에 융합시켜 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
"우시보디 (WuXiBody)"는 가변 도메인의 항체 및 TCR의 불변 영역을 갖는 가용성 키메라 단백질을 포함하는 이중특이적 항체이며, 상기 TCR 불변 영역의 서브 유닛 (알파 및 베타 도메인)은 조작된 이황화 결합에 의해 결합된다.
항체와 관련하여 "단편화(Fd)"는 경쇄와 결합하여 Fab를 형성할 수 있는 중쇄 단편의 아미노-말단 절반을 지칭한다.
항체와 관련하여 "Fc"는 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역에 이황화 결합을 통해 결합된 제1 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 불변 영역으로 이루어진 항체의 부분을 지칭한다. 항체의 Fc 부분은 ADCC 및 CDC와 같은 다양한 이펙터 기능을 담당하지만 항원 결합에서는 기능하지 않는다.
항체와 관련하여 "힌지 도메인"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 도메인은 대략 25개의 아미노산 잔기를 포함하고 유연하여, 2개의 N-말단 항원 접합 도메인이 독립적으로 이동할 수 있게 한다.
본 명세서에서 사용된 "CH2 도메인"은 예를 들어, 통상적인 넘버링 방식 (아미노산 244 내지 360, 카바트 (Kabat) 넘버링 시스템; 및 아미노산 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat, E., 등, 미국 보건 복지부 (1983) 참조) 을 사용하여 IgG 항체의 아미노산 약 244 내지 360으로 연장되는 중쇄 분자의 일부를 포함한다.
"CH3 도메인"은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단으로 연장되며 대략108 개의 아미노산을 포함한다. 특정 면역글로불린 부류, 예를 들어 IgM은 CH4 도메인을 추가로 포함한다.
항체와 관련하여 "Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 보유하는 항체의 가장 작은 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 도메인에 결합된 단일 경쇄의 가변 도메인으로 구성된다. dsFvs를 포함하여 다수의 Fv 디자인이 제공되었으며, 상기 두 도메인 사이의 연관성은 도입된 이황화 결합에 의해 향상되고; 및 scFvs는 펩티드 링커를 사용하여 형성되어 2개의 도메인을 단일 폴리펩티드로서 함께 결합시킬 수 있다. 상응하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 및 불변 영역과 관련된 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린의 가변 도메인을 함유하는 Fvs 구조도 생성되었다. Fvs는 또한 디아보디 및 트리보디를 형성하기 위해 다량화되었다 (Maynard et al., Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000)).
"ScFab"은 폴리펩티드 링커를 통해 경쇄에 결합된 Fd를 갖는 융합 폴리펩티드를 말하며, 단일 쇄 Fab 단편 (scFab)을 형성한다.
"TriFabs"는 Fab-기능성을 갖는 3개의 단위로 구성된 가, 이중특이적 융합 단백질을 지칭한다. TriFab은 비대칭 Fab 유사 모이어티에 융합된 개의 정규의 Fab를 보유한다.
"Fab-Fab"은 제1 Fab 암의 Fd 쇄를 제2 Fab 암의 Fd 쇄의 N-말단에 융합시켜 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
"Fab-Fv"는 HCVR을 Fd 쇄의 C-말단에, LCVR을 경쇄의 C-말단에 융합시켜 형성된 융합 단백질을 지칭한다. "Fab-dsFv"분자는 HCVR 도메인과 LCVR 도메인 사이에 이황화 결합을 도입함으로써 형성될 수 있다.
"MAb-Fv"또는 "IgG-Fv"는 HCVR 도메인을 하나의 Fc쇄의 C-말단에의 융합 및 LCVR 도메인의 개별적으로 발현되거나 또는 이의 C-말단에 융합된 것에 의해 형성된 융합 단백질을 지칭한다. 다른 하나는 도메인 간 이황화 결합에 의해 안정화 된 Fv와 함께 이중특이적, 3가 IgG-Fv (mAb-Fv) 융합 단백질을 지칭한다.
"ScFab-Fc-scFv2"및 "ScFab-Fc-scFv"는 단일 쇄 Fab와 Fc 및 이황화-안정화 된 Fv 도메인의 융합에 의해 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
"어펜디드(Appended) IgG"는 이중특이적 (Fab)2-Fc의 포맷을 형성하기 위해 IgG에 융합된 Fab 암을 갖는 융합 단백질을 지칭한다. 이는 커넥터의 유무와 무관하게, IgG 분자의 C-말단 또는 N-말단에 Fab가 융합된 "IgG-Fab"또는 "Fab-IgG"를 형성할 수 있다. 특정 실시예에서, 어펜디드(appended) IgG는 IgG-Fab4의 포맷으로 더욱 변형될 수 있다 (상기 Brinkman et al., 2017, 참조).
"DVD-Ig" IgG 중쇄 및 경쇄에 대한 제2 특이성의 추가 HCVR 도메인 및 LCVR 도메인을 융합시켜 형성되는 이중 가변 도메인 항체를 지칭한다. "CODV-Ig"는 2개의 HCVR 및 2개의 LCVR 도메인이 가변 HCVR-LCVR 도메인의 크로스 오버 페어링을 허용하는 방식으로 결합된 관련 포맷을 지칭하며, 이는 HCVRA-HCVRB 및 LCVRB-LCVRA, HCVRB-HCVRA 및 LCVRA-LCVRB의 순서이다.
"CrossMab"은 비-변형 경쇄와 상응하는 비-변형 중쇄와 쌍을 이루고 변형된 경쇄와 상응하는 변형된 중쇄와 쌍을 이루어 경쇄에서 미스페어링이 감소된 항체를 생성하는 기술을 지칭한다.
"BiTE"는 HCVR-LCVR 배향에서 제2 특이성을 갖는 제2 scFv에 결합된 LCVR-HCVR 배향에서 제1 항원 특이성을 갖는 제1 scFv를 포함하는 이중특이적 T-세포 참여 분자이다.
아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 "백분율 (%) 서열 동일성"이란 서열을 정렬 한 후, 필요에 따라 갭을 도입 한 후, 기준 서열에서 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 (또는 핵산) 잔기의 백분율로서 최대를 달성하기 위해 동일한 아미노산 (또는 핵산)의 수로 정의된다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로 간주되거나 고려되지 않을 수 있다. 퍼센트 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLASTN, BLASTp (미국 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI)의 웹 사이트에서 이용 가능)와 같은 공개 도구를 사용하여 달성될 수 있다. (Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997), ClustalW2 (웹 사이트에서 이용 가능, European Bioinformatics Institute, 함께 보기 Higgins DG et al., Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996); Larkin MA et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23 (21): 2947-8 (2007) 참조) 및 ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어). 당업자는 툴에 의해 제공된 디폴트 파라미터를 사용할 수 있거나, 예를 들어 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬에 적합한 파라미터를 자체적으로 변경할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 조성물을 포함하여 세포 배양물 또는 동물에서 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수있는 화합물, 조성물, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 물질(예를 들어, 하이브리도마와 같은), 또는 세포 배양에 첨가되거나 동물에 주사 또는 흡수되는 (예를 들어, 암-특이적 단백질을 포함하는)것을 지칭한다. 항원은 이종 항원에 의해 유도된 것을 포함하여 특이적 체액성 또는 세포성 면역 (예: 항체)의 산물과 반응한다.
"에피토프 (epitope)" 또는 "항원 결정 인자"는 결합제 (예컨대 항체)가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프 (epitope)는 인접 아미노산 (선형 또는 순차적 에피토프 (epitope)라고도 함) 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비-연속 아미노산 (구성 또는 형태적 에피토프 (epitope)라고도 함)으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (epitope)는 전형적으로 단백질상의1차 아미노산 잔기를 따라 선형으로 배열되고, 인접 아미노산의 작은 세그먼트는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자와의 항원 결합으로부터 분해되거나 변성 용매에 노출시 유지될 수 있다. 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (epitope)는 전형적인 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프 (epitope)는 전형적으로 독특한 공간 형태로 3개 이상, 더욱 일반적으로 5개 이상, 약 7개 또는 약 8-10개 이상의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적 결합"또는 "특이적으로 결합하다"는 2개의 분자, 예를 들어 항체와 항원 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 ≤10-6M (예를 들어, ≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤10-7)의 결합 친화도 (KD)로 항원에 특이적으로 결합한다 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 2x10-9 M, ≤10-9 M 또는 ≤10-10 M). 본 명세서에 사용된 "KD"는 해리 속도 대 결합 속도 (koff/kon)의 비를 지칭하고, 예를 들어 Biacore와 같은기구를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 결합" 또는 "작동 가능하게 결합되는"은 스페이서 또는 링커를 갖거나 갖지 않는 2개 이상의 생물학적 관심 서열이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 방식으로 병치된 것을 의미한다. 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 폴리펩티드 서열은 결합된 생성물이 의도된 생물학적 기능을 갖도록 하는 방식으로 결합되는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체 가변 영역은 항원-결합 활성을 갖는 안정한 생성물을 제공하기 위해 불변 영역에 결합될 수 있다. 이 용어는 또한 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 조절 서열 (가령, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동 가능하게 결합될 때, 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드의 조절된 발현을 허용하는 방식으로 결합되는 것을 의미한다.
아미노산 서열 (가령, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)과 관련하여 사용될 때 용어 "융합" 또는 "융합된"은, 예를 들어 화학적 결합 또는 재조합 수단에 의해 2개 이상의 자연적으로 존재하지 않는 단일 아미노산 서열의 조합을 의미한다. 융합 아미노산 서열은 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 유전자 재조합에 의해 생성될 수 있고, 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구조물을 숙주 세포 내로 도입하는 방법에 의해 발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "스페이서"는1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기 또는 5 내지15, 20, 30, 50 이상의 아미노산 잔기의 길이로, 펩티드 결합에 의해 결합되고 하나 이상의 폴리펩티드를 결합하는데 사용되는 인공 아미노산 서열을 지칭한다. 스페이서는 이차 구조를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 스페이서 서열은 당 업계에 공지되어 있으며 (예를 들어 Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al. structure 2:1121-1123 (1994)), 당 업계에 공지된 임의의 적합한 스페이서가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 유용한 스페이서는 글리신 및 프롤린 잔기가 풍부할 수 있다. 예로는 TGGGG (서열번호 266), GGGGS (서열번호 267) 또는 SGGGG (서열번호 268)와 같은 트레오닌/세린 및 글리신으로 구성된 단일 또는 반복 서열을 갖는 스페이서 또는 그의 탠덤 반복 (가령 2, 3, 4회 또는 그 이상 반복)이 있다. 대안적으로, 스페이서는 GAPGGGGGAAAAAGGGGG (서열번호 269)의 아미노산 서열의 하나 이상의 순차적 또는 탠덤 반복을 함유하는 긴 펩티드 쇄일 수 있다. 특정 실시예에서, 스페이서는 서열번호 269의1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 순차적 또는 탠덤 반복을 포함한다.
용어 "항원 특이성"은 항원-결합 분자에 의해 선택적으로 인식되는 특정 항원 또는 이의 에피토프 (epitope)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 아미노산 잔기와 관련하여 용어 "치환"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 하나 이상의 아미노산을 다른 것으로 자연 발생 또는 유도된 교체 또는 대체를 지칭한다. 폴리펩티드의 치환은 폴리펩티드의 기능을 감소, 향상 또는 제거시킬 수 있다.
치환은 또한 아미노산 서열과 관련하여 "보존적 치환"일 수 있다. 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하거나 아미노산의 폴리펩티드의 활성에 치명적이지 않은 아미노산의 치환을 지칭한다. 예를 들어, 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (가령, Met, Ala, Val, Leu 및 Ile, Pro, Phe, Trp), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 잔기 (가령, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly 및 Gln), 산성 측쇄를 갖는 잔기 (가령, Asp, Glu), 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, His, Lys 및 Arg), 베타 잔기 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, Thr, Val 및 Ile), 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (가령, Cys 및 Met), 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (가령, Trp, Tyr, His 및 Phe) 중에서 보존적 치환이 일어날 수 있다. 특정 실시예에서, 치환, 결실 또는 첨가는 또한 "보존적 치환"으로 고려될 수 있다. 삽입 또는 결실된 아미노산의 수는 약1 내지 5의 범위에 있을 수 있다. 보존적 치환은 일반적으로 단백질 형태 구조에서 상당한 변화를 일으키지 않으므로, 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 아미노산 잔기와 관련하여 용어 "돌연변이" 또는 "돌연변이된"은 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 첨가를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "상동체 서열" 및 "상동성 서열"은 상호 교환적으로 사용되며, 적어도 80% (예를 들어 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 이상, 임의로 정렬될 때 다른 서열에 대한 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 (또는 이의 상보적 가닥) 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "T 세포"는 헬퍼 T 세포 (가령 CD4+ T 세포, T 헬퍼1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T, T 헬퍼 3형 T 세포, T 헬퍼17형 T 세포), 세포 독성 T 세포 (가령 CD8+ T 세포), 기억 T 세포 (가령 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포 및 TEMRA 세포) 및 CD8+ 또는 CD4+인 상주 기억 T 세포 (TRM)), 자연 살해 T (NKT) 세포 및 억제성 T 세포를 포함하며 세포 매개 면역에 중요한 역할을 하는 림프구의 유형을 지칭한다.
천연 "T 세포 수용체" 또는 천연 "TCR"은 신호 전달을 매개할 수 있는 복합체를 형성하기 위해 불변 CD3 쇄와 연계된 이종이량체성 T 세포 표면 단백질이다. TCR은 면역글로불린 수퍼 패밀리에 속하며, 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 갖는 반 항체(half antibody)와 유사하다. 천연 TCR은 세포 외 부분, 막 통과 부분 및 세포 내 부분을 갖는다. TCR의 세포 외 도메인은 막-근위 불변 영역 및 막-말단 가변 영역을 갖는다.
본 명세서에 사용 된 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 진단, 예후, 개선, 질병 또는 장애의 치료 및 예방이 필요한 포유동물 또는 영장류를 포함하는 인간 또는 인간이 아닌 동물을 지칭한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장용 동물, 동물원용, 스포츠용, 또는 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 쥐, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰 등과 같은 애완용 동물을 포함한다.
A. 폴리펩티드 복합체
본 명세서에는 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 항체 중쇄 가변 도메인, 및 제2 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 신규한 폴리펩티드 복합체가 제공되며, 상기 제1 TCR 불변 영역 및 제2 TCR 불변 영역은 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합을 통해 연계된다. 폴리펩티드 복합체는 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이들 각각은 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 TCR로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 폴리펩티드 복합체의 2개의 폴리펩티드 쇄는 한 쌍의 TCR 불변 영역에 각각 작동 가능하게 결합된 한 쌍의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 예로 TCR 불변 영역 쌍은, 예를 들어, 알파/베타, Pre-알파/베타, 및 감마/델타 TCR 불변 영역을 포함한다. 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 TCR 불변 영역은 전장 또는 단편일 수 있으며, 한 쌍의 TCR 불변 영역이 서로 연계하여 이량체를 형성할 수 있는 한 조작될 수 있다.
놀랍게도, 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합 (특히 비-천연 이황화 결합)을 갖는 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 재조합으로 발현되어 원하는 형태로 조립될 수 있으며, 이는 항체 가변 영역의 우수한 항원-결합 활성을 제공하면서 TCR 불변 영역 이량체를 안정화시킨다. 또한, 폴리펩티드 복합체는 일상적인 항체 공학, 예를 들어, 글리코실화 부위의 변형, 및 일부 자연 서열의 제거를 잘 견디는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 제공된 폴리펩티드 복합체는 폴리펩티드 복합체에서 TCR 불변 영역의 존재로 인해 항원 결합 서열의 최소 또는 실질적인 미스페어링 없이 용이하게 발현되고 조립될 수 있는 이중특이적 포맷으로 통합될 수 있다. 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 구조물의 추가적인 장점은 하기 개시에서 더욱 명백해질 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역(C1)에 작동 가능하게 결합된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 결합된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 제공하고, 상기: C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 갖는다.
i. TCR 불변 영역
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 TCR로부터 유래된 불변 영역을 포함한다.
천연 TCR은 2개의 폴리펩티드 쇄로 구성되고, 일반적으로 2개 유형을 갖는다: 하나는 알파 및 베타 쇄 (즉, 알파/베타 TCR)로 구성되고, 다른 하나는 감마 및 델타 쇄 (즉, 감마/델타 TCR)로 구성된다. 이 두 유형은 구조적으로 유사하지만 위치와 기능이 다르다. 약 95%의 인간 T 세포는 알파/베타 TCR을 갖는 반면, 나머지 5%는 감마/델타 TCR을 갖는다. 알파 쇄의 전구체가 또한 발견되고 Pre-알파 쇄로 명명된다. 2개의 TCR 폴리펩티드 쇄 각각은 면역글로불린 영역 및 막 근위 영역을 포함한다. 면역글로불린 도메인은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하고, 면역글로불린형 접힘을 특징으로 한다. 각각의 TCR 폴리펩티드 쇄는 시스테인 잔기 (가령 불변 도메인의 C 말단 또는 막-근위 영역의 N-말단)를 가지며, 이는 함께 2개의 TCR 쇄를 함께 묶는 이황화 결합을 형성할 수 있다.
도18a-18e는 TCR 알파, Pre-알파, 베타, 감마 및 델타 쇄의 천연 TCR 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한 것이다. 명확성 및 일관성을 위해, 이들 서열에서 각각의 아미노산 잔기는 도19a 내지19e에 넘버링되고, 이러한 넘버링은 본 개시 전체에 걸쳐 특정 TCR 불변 영역상의 특정 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용된다.
인간 TCR 알파 쇄 불변 영역은 NCBI 수탁 번호 P01848, 또는 서열번호 254와 함께, TRAC으로 알려져 있다.
인간 TCR 베타 쇄 불변 영역은 TRBC1 및 TRBC2 (IMGT 명명법)로 공지된 2개의 상이한 변이체를 가지며, 상응하는 서열을 각각 서열번호 256 및 서열번호 257에 제시한다(Toyonaga B, et al., PNAs, Vol. 82, pp.8624-8628, Immunology (1985)). 이들 2개의 베타 불변 도메인은 엑손1의 4번째, 5번째 및 37번째 아미노산 잔기에서 상이하다. 구체적으로, TRBC1은 엑손1에서 4N, 5K 및 37F를 갖고, TRBC2는 엑손1에서 4K, 5N 및 37Y를 갖는다.
구체적으로, 천연 TCR 베타 쇄는 74 위치에 천연 시스테인 잔기를 함유하고 (도19b 참조), 이는 비결합되어 천연 알파/베타 TCR에서 이황화 결합을 형성하지 않는다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 이 천연 시스테인 잔기는 존재하지 않거나 다른 잔기로 돌연변이된다. 이것은 잘못된 쇄내 또는 쇄간 페어링을 피하는 데 유용할 수 있다. 특정 실시예에서, 천연 시스테인 잔기는 다른 잔기, 예를 들어 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 특정 실시예에서, 치환은 in vitro에서 TCR 리폴딩 효율을 개선시킬 수 있다.
인간 TCR 감마 쇄 불변 영역은 NCBI 수탁 번호 A26659 및 P03986을 갖는 TRGC1 및 TRGC2 (Lefranc et al., Eur. J. Immunol.19: 989-994 (1989) 참조)로 알려진 2개의 변이체 또는 각각 서열번호 263 및 서열번호 265의 아미노산 서열을 갖는다.
인간 TCR 델타 쇄 불변 영역은 NCBI 수탁 번호가 A35591이거나, 서열번호 261의 아미노산 서열을 갖는 TRDC로 알려져 있다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서 TCR의 불변 영역은 또한 Pre-T-세포 항원 수용체 (Pre-TCR)로부터 유래될 수 있다. Pre-TCR은 초기 T-세포 발달에 중추적인 역할을 하는 미성숙 흉선 세포에 의해 발현된다. Pre-TCR은 규칙적인 베타 쇄를 가지고 있지만, 불변 알파 쇄와는 다른 서열과 구조를 가진 불변 영역만을 가진 특별한 Pre-알파 쇄를 가지고 있다 (참조: Harald von Boehmer, Nat Rev Immunol, Jul; 5 (7): 571-7 (2005)). 인간 Pre-알파 쇄 불변 영역 (PTCRA)의 서열은 NCBI 수탁 번호 AAF89556.1, 또는 아미노산 서열 서열번호 259를 갖는다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제1 및 제2 TCR 불변 영역은 TCR 불변 영역 사이에서 이량체를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "이량체"는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 2개의 분자에 의해 형성되어 연계된 구조를 지칭한다. 동종이량체 또는 동종이량체화는 2개의 동일한 분자에 의해 형성되고, 이종이량체 또는 이종이량체화는 2개의 상이한 분자에 의해 형성된다. 제1 및 제2 TCR 불변 영역에 의해 형성된 이량체는 이종이량체다.
하나의 TCR 불변 영역상의 하나의 아미노산 잔기와 다른 TCR 불변 영역상의 다른 아미노산 잔기 사이에 쇄간 결합이 형성된다. 특정 실시예에서, 비-천연 쇄간 결합은 2개의 TCR 불변 영역을 이량체로 결합시킬 수있는 임의의 결합 또는 상호작용일 수 있다. 적합한 비-천연 쇄간 결합의 예에는 이황화 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 염다리, 소수성-친수성 상호작용, 놉-인투-홀 또는 이들의 조합이 포함된다.
"이황화 결합"은 R-S-S-R' 구조의 공유 결합을 지칭한다. 아미노산 시스테인은 예를 들어 다른 시스테인 잔기로부터 제2 티올기와 이황화 결합을 형성할 수있는 티올기를 포함한다. 이황화 결합은 2개의 폴리펩티드 쇄 상에 각각 존재하는 2개의 시스테인 잔기의 티올기 사이에 형성될 수 있어, 쇄간 가교 또는 쇄간 결합을 형성할 수 있다.
정전기적 상호작용은 비-공유 상호작용이며, 단백질 폴딩, 안정성, 유연성 및 이온성 상호작용, 수소 결합 및 할로겐 결합을 포함하는 기능성에서 중요하다. 정전기적 상호작용은 폴리펩티드에서, 예를 들어 Lys와 Asp 사이, Lys와 Glu 사이, Glu와 Arg 사이, 또는 제1 사슬의 Glu, Trp와 제2 사슬의 Arg, Val 또는 Thr 사이에서 형성될 수 있다.
염다리는 주로 Asp 또는 Glu의 음이온성 카르복실레이트 및 Lys의 양이온 성 암모늄 또는 Arg의 구아니디늄으로부터 발생하는 근거리의 정전기적 상호작용이며, 이는 천연 단백질 구조에서 공간적으로 인접하는 반대로 하전된 잔기 쌍이다. 대부분 소수성 계면에서 하전된 극성 잔기는 결합을 위한 핫스팟으로서 작용할 수 있다. 그 중에서도 His, Tyr 및 Ser과 같은 이온화 가능한 측쇄를 갖는 잔기도 염다리 형성에 참여할 수 있다.
소수성 상호작용은 제1 쇄상의 하나 이상의 Val, Tyr 및 Ala와 제2 쇄상의 하나 이상의 Val, Leu 및 Trp, 또는 제1 쇄상의 His 및 Ala 및 두 번째 사슬 Thr 및 Phe 사이에서 형성될 수 있다 (Brinkmann, et al., 2017, 참조).
수소 결합은 수소 원자가 질소, 산소 또는 불소와 같은 전기 음성도가 높은 원자에 공유적으로 결합될 때 두 극성 그룹 사이의 정전기적 인력에 의해 형성된다. 수소 결합은 각각 Asn의 질소기 및 His의 산소기, 또는 Asn의 산소기 또는 Lys의 질소기와 같은 2개의 잔기의 골격 산소 (예를 들어 칼코겐기)와 아미드 수소 (질소기) 사이의 폴리펩티드에서 형성될 수 있다. 수소 결합은 반 데르 발스 상호작용보다 강하지만 공유 또는 이온 결합보다 약하며 2차 구조 및 3차 구조를 유지하는데 중요합니다. 예를 들어, 알파 나선은 아미노산 잔기의 간격이 위치 i와 i+4 사이에서 규칙적으로 발생할 때 형성된 것이고, 베타 시트는 2개의 펩티드가 2개 또는 3개의 백본 수소 결합하여 길게 형성된 펩티드 사슬 3 내지10개의 아미노산이 펼쳐지고 꼬여서 주름 시트를 형성한 것이다.
본 명세서에 사용된 "놉-인투-홀"은 2개의 폴리펩티드 사이의 상호작용을 말하며, 상기 하나의 폴리펩티드는 부피가 큰 측쇄 (가령 티로신 또는 트립토판)를 갖는 아미노산 잔기의 존재로 인해 돌기 (즉, "놉")를 갖고, 다른 폴리펩티드는 작은 측쇄 아미노산 잔기가 존재하는 캐비티 (즉, "홀")을 가지며 (가령 알라닌 또는 트레오닌), 돌기는 공동에 위치하여 두 폴리펩티드의 상호작용을 촉진하여 이종이량체 또는 복합체를 형성하게 한다. 놉-인투-홀을 사용하여 폴리펩티드를 생성하는 방법은, 가령, 미국 특허 제5,731,168 호에 기재된 바와 같이 당 업계에 공지되어 있다.
특정 실시예에서, TCR 불변 영역 이량체는1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는10개의 비-천연 쇄간 결합을 포함한다. 임의로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는10개의 비-천연 쇄간 결합 중 하나 이상은 이황화 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다.
본 명세서에 사용된 "비-천연" 쇄간 결합은 천연의 대응하는 TCR 불변 영역의 천연 연계에서 발견되지 않는 쇄간 결합을 지칭한다. 예를 들어, 비-천연 쇄간 결합은 각각의 TCR 불변 영역에 존재하는 돌연변이된 아미노산 잔기 및 천연 아미노산 잔기 사이; 또는 대안적으로 TCR 불변 영역에 각각 존재하는 2개의 돌연변이된 아미노산 잔기 사이에서 형성될 수 있다. 특정 실시예에서, 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합은 제1 TCR 불변 영역에 포함된 제1 돌연변이 잔기와 폴리펩티드 복합체의 제2 TCR 불변 영역에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 형성된다.
"돌연변이된" 아미노산 잔기는 상응하는 천연 TCR 불변 영역에서 치환, 삽입 또는 첨가가 발생하여, 그의 천연 대응 잔기와 상이한 것을 의미한다. 예를 들어, 야생형 TCR 불변 영역에서 특정 위치의 아미노산 잔기가 "천연" 잔기로 지칭되는 경우, 그의 돌연변이된 대응물은 TCR 불변 영역에서의 천연 잔기와 다르지만, 동일한 위치에 존재하는 임의의 잔기를 지칭한다. 돌연변이된 잔기는 동일한 위치에서 천연 잔기를 대체하거나 천연 잔기 앞에 삽입되어 원래 위치를 차지하는 상이한 잔기일 수 있다.
특정 실시예에서, 돌연변이된 잔기는 천연-발생 아미노산 잔기일 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 비-천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 돌연변이된 시스테인 잔기이다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합은 이황화 결합이다. 특정 실시예에서, 비-천연 이황화 결합은 각각 제1 및 제2 TCR 불변 영역에 포함된 2개의 돌연변이된 시스테인 잔기 사이에 형성될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 돌연변이 잔기 중 하나 이상은 비-천연 아미노산 잔기이다. 비-천연 발생 아미노산 잔기는 인간 단백질에서 자연적으로 발견되지 않지만, 암호화 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있는 핵산 코돈을 통해 발현될 수 있는 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, L-3,4-디하이드록시 페닐알라닌 (L-DOPA)과 같은 비-천연 아미노산은 주기적으로 유도된 산화에 의해 시스테인, 히스티딘 및 리신과 같은 천연 아미노산과 반응 및 가교될 수 있다. L-DOPA를 항체에 포함시킴으로써, 비-천연 아미노산은 항원의 잔기에 효과적으로 가교 결합하여 공유 결합된 항체-항원 복합체를 생성할 수 있음을 보여 주었다 (Xu, J. et al., 2014, 항체-항원 복합체를 공유적으로 가교시키는 구조 기반 비-정규 아미노산 디자인. Journal of Structural Biology,185 (2), pp.215-222.). 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역에서 돌연변이된 아미노산 잔기는 비 천연 쇄간 공유 결합을 형성하기 위해 천연 아미노산 잔기 (또는 대안적으로 비-천연 아미노산 잔기)와 가교할 수있는 L-DOPA와 같은 비-천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시예에서, 돌연변이된 시스테인 잔기와 천연 시스테인 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 이황화 결합이 형성된다. 특정 실시예에서, 비-천연 이황화 결합은 2개의 돌연변이된 시스테인 잔기 사이에 형성된다. 특정 실시예에서, 비-천연 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 중 적어도 하나는 돌연변이된 시스테인 잔기이다. 특정 실시예에서, 비-천연 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기 둘 모두는 각각 제1 및 제2 TCR 불변 영역 상의 돌연변이된 시스테인 잔기이다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역은 비-천연 쇄간 결합을 형성하는 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하도록 조작될 수 있다. 이러한 돌연변이 된 잔기를 TCR 불변 영역에 도입하기 위하여, 예를 들어, TCR 영역의 암호화 서열을 조작하여 돌연변이 잔기를 코딩하는 코돈을 천연 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체하거나 돌연변이 된 잔기를 인코딩하는 코돈을 천연 잔기의 코돈 전에 삽입할 수 있다. 하나 이상의 원하는 돌연변이 된 아미노산 잔기가 TCR 불변 영역, 예를 들어, 이황화 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기 (가령 시스테인 잔기)는, 두 TCR 불변 영역 사이의 정전기적 상호작용으로 이어질 수 있고, TCR 불변 영역의 유연성을 증가시킬 수 있고, TCR 불변 도메인으로부터 아미노산을 형성하는 공유 결합 중 하나 이상을 위치시킬 수 있고, 염다리 형성에 기여할 수 있는 수소 결합과 같은; 소수성 상호작용을 야기 할 수있는 소수성 아미노산 잔기; 및 친수성 상호작용을 야기할 수 있는 친수성 아미노산 잔기 등, 하나 이상의 원하는 돌연변이가 된 아미노산 잔기가 TCR 불변 영역에 도입될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역은 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 비-시스테인 잔기는 시스테인 잔기로 대체될 수 있거나, 시스테인 잔기는 원래 인접한 2개의 천연 비-시스테인 잔기 사이에 삽입될 수 있다. 시스테인 잔기로의 교체 후, 비-천연 쇄간 이황화 결합이 2개의 TCR 불변 영역 사이에 형성될 수 있도록 치환 위치를 결정할 수 있다. 이를 위해, 예를 들어, 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 충분히 근접할 수 있고, 적합한 알파-베타 결합 배향을 가질 수있는 것을 포함하는 다수의 인자가 고려될 수 있다. 시스테인 잔기의 티올기는 서로 마주 보도록 배향될 수 있고, 대체될 잔기는 시스테인과 화학적 성질이 비교적 유사한 측쇄를 가질 수 있고, 및/또는 치환은 TCR 불변 영역 또는 폴리펩티드 복합체 자체의 3차 구조를 실질적으로 교란시키지 않을 것이다.
당업자는 예를 들어, 광 검출에 의한 거리 맵, 컴퓨터 모델링, NMR 분광법 또는 X-선 결정학에 의한 거리 맵을 제한없이, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 사용하여 대체될 2개의 아미노산 잔기 사이의 거리 및 각도를 결정할 수 있다. 예로서, 관심있는 폴리펩티드 (예를 들어, TCR 불변 영역)의 경우, 그의 단백질 결정 구조는 PDB 데이터베이스와 같은 공개 데이터베이스로부터 수득될 수 있거나, 대안적으로 X-선 결정학과 같은 방법을 사용하여 설명될 수 있다. 단백질 결정 구조 데이터에 기초하여 아미노산 잔기 사이의 거리 및 각도를 결정하기 위해 적합한 컴퓨터 소프트웨어가 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는, 이황화 결합이 각각의 베타 탄소가 예를 들어, 복합체가 올바르게 접힐 때 8 옹스트롬, 7 옹스트롬, 6 옹스트롬, 5 옹스트롬, 4 옹스트롬, 3 옹스트롬, 2 옹스트롬,1 옹스트롬 이하의 거리만큼 충분히 가깝게 돌연변이된 시스테인 잔기 사이에 형성될 수 있다.
제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역으로의 조작을 위한 적합한 위치는 TCR 알파와 베타 (Boulter, JM et al., Protein engineering,16 (9), pp.707-711 (2003)), 감마 및 델타 (Allison, TJ et al., Nature, 411 (6839), pp.820-824 (2001); Uldrich, AP et al., Nature Immunology,14 (11), pp.1137-1145 (2013)) 사이의 복합체에 공개된 결정 구조 데이터로부터 얻을 수 있다. 교체될 잔류물이 결정되면, 당업자는 (예를 들어 ClustalW (European Bioinformatics Institute 웹 사이트 (www.ebi.ac.uk/index.html))와 같은 기존 소프트웨어를 사용한 서열 정렬을 통해 변형될 관심있는 코돈을 쉽게 식별할 수 있다. 그 후 PCR 돌연변이 유발과 같은 당 업계에 공지된 방법에 의해 시스테인 코돈으로 돌연변이 시킨다.
쇄간 이황화 결합의 형성은 당 업계에 공지된 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 발현된 단백질 생성물은 각각 환원 및 비-환원 SDS-PAGE를 수행할 수 있고, 이어서 생성된 밴드를 비교하여 쇄간 이황화 결합의 존재를 나타내는 잠재적인 차이를 식별할 수 있다.
비-천연 쇄간 결합은 폴리펩티드 복합체를 안정화시킬 수 있다. 이러한 안정화 효과는 다양한 방식으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 아미노산 잔기 또는 비-천연 쇄간 결합의 존재는 폴리펩티드 복합체가 안정적으로 발현될 수 있도록 하고, 및/또는 높은 수준으로 발현하기 위해 및/또는 원하는 생물학적 활성(예를 들어, 항원 결합 활성)을 갖는 안정한 복합체로 결합하고, 및/또는 원하는 생물학적 활성을 갖는 높은 수준의 원하는 안정한 복합체로 발현 및 조립될 수 있다. 제1 및 제2 TCR 불변 영역을 안정화시키는 쇄간 결합의 능력은 SDS-PAGE 상에 표시된 분자량, 또는 시차 주사 열량 측정 (DSC) 또는 주사 형광 측정법 (DSF)에 의해 측정된 열 안정성 등의 당 업계에 공지된 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예로서, 생성물이 제1 및 제2 폴리펩티드의 조합된 분자량에 필적하는 분자량을 나타내는 경우, 본 명세서에 제공된 안정한 폴리펩티드 복합체의 형성은 SDS-PAGE에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 그의 열 안정성이 천연 Fab의 열 안정성의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이라는 점에서 안정적이다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 그의 열 안정성이 천연 Fab의 열 안정성과 유사하다는 점에서 안정적이다.
임의의 이론에 구속 되고자하는 것은 아니지만, 폴리펩티드 복합체에서 제1 및 제2 TCR 불변 영역 사이에 형성된 비-천연 쇄간 결합 (이황화 결합과 같은)은 이종 이합체를 안정화시킬 수있는 것으로 여겨진다. TCR 불변 영역에 의해, 정확한 폴딩 수준, 구조 안정성 및/또는 이종이량체 및 폴리펩티드 복합체의 발현 수준을 향상시킨다. T 세포 표면의 막에 고정된 천연 TCR과 달리, 천연 TCR 세포 외 도메인의 이종이량체는 3D 구조에서 항체 Fab와의 유사성에도 불구하고 훨씬 덜 안정한 것으로 밝혀졌다. 실제로, 용해성 조건에서 천연 TCR의 불안정성은 결정 구조의 해명을 막는 중요한 장애물이 되어 왔다 (Wang, Protein Cell, 5 (9), pp.649-652 (2014) 참조). TCR 불변 영역에 한 쌍의 시스테인 (Cys) 돌연변이를 도입함으로써 쇄간 비-천연 이황화 결합의 형성을 가능하게 함으로써, 폴리펩티드 가변체는 안정적으로 발현될 수있는 한편, 항체 가변 영역의 항원-결합 능력이 유지된다.
돌연변이된 잔기를 포함하는 TCR 불변 영역은 본 명세서에서 "조작된" TCR 불변 영역으로도 지칭된다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 복합체의 제1 TCR 불변 영역 (C1)은 조작된 TCR 알파 쇄 (CAlpha)를 포함하고, 제2 TCR 불변 영역 (C2)은 조작된 TCR 베타 쇄 (CBeta)를 포함한다. 특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함한다. 특정 실시예에서, C1은 조작된 TCR Pre-알파 쇄 (CPre-Alpha)를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함한다. 특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함한다. 특정 실시예에서, C1은 조작된 TCR 감마 사슬 (CGamma)을 포함하고, C2는 조작된 TCR 델타 쇄 (CDelta)를 포함한다. 특정 실시예에서, C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다.
특정 실시예에서, 조작된 TCR 불변 영역은 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 돌연변이된 잔기는 제1 및/또는 제2 조작된 TCR 불변 영역의 접촉 계면 내에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "접촉 계면"은 폴리펩티드가 서로 상호작용/연관되는 폴리펩티드상의 특정 영역(들)을 지칭한다. 접촉 인터페이스는 상호작용이 발생할 때 접촉하거나 회합되는, 상응하는 아미노산 잔기(들)와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 접촉 계면에서의 아미노산 잔기는 연속적인 서열일 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, 계면이 3차원인 경우, 계면 내의 아미노산 잔기는 선형 서열상의 상이한 위치에서 분리될 수 있다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 아미노산 잔기 9 내지 35, 52 내지 66, 71 내지 86 및122 내지127로 이루어진 군으로부터 선택된 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 실시예에서, 조작된 CAlpha는 아미노산 잔기 6 내지 29, 37 내지 67 및 86 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택된 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다. 특정되지 않는 한, 본 개시 내용의 TCR 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 도19a-19e에 제시된 바와 같다.
특정 실시예에서, 조작된 CAlpha와 조작된 CBeta 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. CBeta에서의 돌연변이된 시스테인 잔기는 S56C, S16C, F13C, V12C, E14C, F13C, L62C, D58C, S76C 및 R78C로 이루어진 군으로부터 선택된 치환일 수 있고 및/또는 CAlpha에서의 돌연변이된 시스테인 잔기는 T49C, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, T46C, L51C 및 S62C로 이루어진 군으로부터 선택된 치환일 수 있다. 특정 실시예에서, 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 CBeta의 S16C 및 CA11의 Y11C, CBeta의 F13C 및 C13의 L13C, CAlpha의 S16C, CBeta의 S16C 및 CAlpha의 L13C, CBeta의 V12C로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 치환일 수 있다. CAlpha의 S16C, CBeta의 E14C 및 CAlpha의 S16C, CBeta의 F13C 및 CAlpha의 V13C, CABpha의 L62C, CBeta의 Y62C 및 CAlpha의 D58C, CBeta의 D58C, CBeta의 T58C, CAlpha의 S76C, CBeta의 S76C, Cleta의 T46C 및 Cleta의 T46C CAlpha에서, CBeta에서 S56C 및 CAlpha에서 L51C, CBeta에서 S56C 및 CAlpha에서 S62C, 및 CAlpha에서 C78A 및 R78C, 시스테인 잔기 쌍은 비-천연 쇄간 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 본 명세서에서 사용된 바와 같이, TCR 불변 영역과 관련하여 "XnY"는 TCR 불변 영역상의 n번째 아미노산 잔기 X를 의미하는 것으로 의도된다 (본 명세서에 제공된 바와 같이 도19a-19e의 넘버링에 기초함). X 및 Y는 각각 특정 아미노산 잔기의1 문자 약어이다. 숫자 n은 도19a 내지19e에 제공된 숫자에 기초한 것이며 실제 위치와는 다르게 보일 수 있음에 유의해야 한다. 예시하기 위해, 서열번호 34로 나타낸 CBeta (S56C) (N69Q)의 서열이 예로서 사용된다. S에서 C로의 치환은 서열번호 34의 48번째 잔기에서 발생하지만, 바로 그 잔기는 도19a-19e의 넘버링 시스템에 기초하여 56번째 잔기로 지정되고, 그러므로 S에서 C로의 치환은 S56C로 지정되지만 S48C로 지정되지는 않는다. N에서 Q로의 대체는 또한 도19a 내지19e의 넘버링 시스템에 기초하여 N69Q로 지정된다. 아미노산 잔기 치환의 이러한 지정 규칙은 달리 명시되지 않는 한 본 개시 내용의 모든 TCR 불변 영역에 적용된다. 이처럼, Fc 영역과 관련하여 사용될 때 "XnY"는 Fc 불변 영역상의 n 번째 아미노산 잔기 X (본 명세서에 제공된 도 20a-20d의 넘버링에 기초)가 아미노산 잔기 Y로 대체됨을 의미하는 것이다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 서열번호 33 내지 41 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다. 그리고 조작된 CAlpha는 서열번호 43 내지 48 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 비-천연 이황화 결합이 CPre-Alpha와 CBeta 사이의 접촉 계면 내에 형성될 수 있다. 특정 실시예에서, CPre-Alpha의 접촉 계면은 아미노산 잔기 7 내지19, 26 내지 34, 56 내지 75 및103 내지106의 위치에서의 치환으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, CBeta상의 접촉 계면은 아미노산 잔기 9 내지 35, 52 내지 66, 71 내지 86 및122내지127의 위치에서의 치환으로부터 선택된다.
특정 실시예에서, 조작된 Pre-TCR 알파 불변 영역 (CPre-Alpha)과 베타 사슬 불변 영역 (CBeta) 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. CBeta에서 돌연변이된 시스테인 잔기는 S16C, A18C, E19C, F13C, A11C, S56C 및 S76C로 이루어진 군으로부터 선택된 치환일 수 있으며, 및/또는 CPre-Alpha의 돌연변이된 시스테인 잔기는 S11C, A13C, I16C, S62C, T65C 및 Y59로 이루어진 군으로부터 선택된 치환일 수 있다. 특정 실시예에서, 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 치환일 수 있다: CBeta의 S16C 및 CPre-Alpha의 S11C, CBeta의 A18C 및 CPre-Alpha의 S11C, CBeta의 E19C 및 CPre-Alpha의 E11C, CPre-Alpha의 F13C, CBeta의 F13C 및 CPre-Alpha의 S13C, CBeta의 S16C, CPre-Alpha의 A13C, CBeta의 A11C 및 CPre-Alpha의 I16C, CBeta의 S56C 및 CPre-Alpha의 S62C, CBeta의 S56C 및 CPre-Alpha의 S65C, CBeta의 S76C, CBeta의 S76C, CPre-Alpha의 Y59C, 및 상기 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
특정 실시예에서, 조작된 CBeta는 서열번호 33-41 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다. 그리고 조작된 CPre-Alpha는 서열번호 82 및 83 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 비-천연 이황화 결합이 CGamma와 CDelta 사이의 접촉 계면 내에 형성될 수 있다. 특정 실시예에서, CGamma상의 접촉 계면은 위치 아미노산 잔기11-35 및 55-76에서의 치환으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, CDelta의 접촉 계면은 아미노산 잔기의 8-26, 43-64 및 84-88위치에서의 치환으로부터 선택된다.
특정 실시예에서, 조작된 CGamma와 CDelta 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. CGamma에서 돌연변이된 시스테인 잔기는 다음으로 구성된 군에서 선택된 치환일 수 있다: S17C, E20C, F14C, T12C, M62C, Q57C 및 A19C 및/또는 CDelta의 돌연변이된 시스테인 잔기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환일 수 있다: F12C, M14C, N16C, D46C, V50C, F87C 및 E88C. 특정 실시예에서, 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 치환일 수 있다: CGamma의 S17C 및 CDelta의 F12C, CGamma의 E20C 및 CDelta의 F12C, CDGata의 F14C, CDelta의 F14C, CGamma의 T12C, CGamma의 N12C 및 CDelta의 N16C, CGamma의 M62C 및 CDelta의 D46C, CDelta의 Q57C, CDelta의 V57C CDelta에서 CGamma 및 F87C, CDelta에서 CGamma 및 E88C에서 A19C, 상기 도입된 시스테인 잔기쌍은 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
특정 실시예에서, 조작된 CGamma는 서열번호113 및114 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다. 그리고 조작된 CDelta는 서열번호115 및116 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다.
비-천연 아미노산 잔기 이외에, 특정 실시예에서 조작된 TCR 불변 영역은 야생형 TCR 불변 영역 서열에서 하나 이상의 천연 잔기에 대한 추가적인 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 변형의 예에는 천연 시스테인 잔기에 대한 변형, 천연 글리코실화 부위에 대한 변형 및/또는 천연 루프에 대한 변형이 포함된다.
특정 천연 TCR 불변 영역 (CBeta와 같은)은 본 개시의 일부 구체적예에서 변형 (가령 제거)될 수 있거나 대안적으로 일부 다른 구체적예에서 유지될 수 있는 천연 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 실시예에서, TRAC와 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 사이의 알파/베타 이종이량체성 TCR상의 천연 이황화 결합, 즉 IMGT TCR 명명법에 따라 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 천연 이황화 결합은 존재 또는 부재할 수 있다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 천연 시스테인 잔기는 조작된 CBeta에 존재 또는 부재한다. 예를 들어, CBeta의 위치 C74에서 천연 시스테인 잔기는 조작된 CBeta에 존재 또는 부재할 수 있다. 특정 실시예에서, 천연 시스테인 잔기 C74가 존재하지 않는 조작된 CBeta는 서열번호 32-41 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다.
임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 CBeta상의 천연 시스테인 잔기의 존재 또는 부재 모두를 허용한다는 점에서 유리한 것으로 여겨진다. 가용성 TCR 이종이량체상에 고유 시스테인 잔기의 존재가 TCR의 리간드 결합 능력에 해롭다는 것이 제안되었지만 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,666,604 참조), 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 그의 항원-결합 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 천연 시스테인 잔기의 존재를 견딜 수 있다. 또한, 높은 수준으로 발현된 천연 시스테인 잔기가 없는 상태에서 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는, Wu et al. mAbs, 7 (2), pp.364-376 (2005)TCR의 반대 가르침에도 불구하고, 이종이량체에서 천연 이황화 결합은 TCR 이종이량체를 안정화시키기에 좋다.
특정 실시예에서, 천연 TCR 불변 영역에 존재하는 하나 이상의 천연 글리코 실화 부위는, 본 발명에 제공된 폴리펩티드 복합체에서 변형 (가령 제거)되거나 유지될 수 있다. 폴리펩티드 서열과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "글리코실화 부위"는 탄수화물 모이어티 (가령 올리고당 구조)가 부착될 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체와 같은 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기, 예를 들어 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌과 같은 트리펩티드 서열의 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 부착을 말하며, 상기 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. O-결합 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로스 중 하나가 히드록시 아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착된 것을 의미한다. 천연 글리코실화 부위의 제거는 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열 (N-결합된 글리코실화 부위) 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기 (O-결합된 글리코실화 부위) 가 치환되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 하나 이상의 고유 글리코실화 부위는 조작된 TCR 불변 영역, 예를 들어 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역에 부재 또는 존재한다. 임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 N-결합 글리코실화의 존재에 관한 CAlpha (즉, N34, N68 및 N79) 및 CBeta (즉, N69)와 같은 TCR 불변 영역의 부위는 단백질 발현 및 안정성에 필요하다 (Wu et al., Mabs, 7: 2, 364-376, 2015 참조) 는 기존의 교시와 달리, 단백질 발현 및 안정성에 영향을 주지 않으면서 글리코실화 부위의 전부 또는 일부의 제거를 견딜 수 있다고 생각된다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 CApha의 N-글리코실화 부위 중 하나 이상, 가령 N34, N68, N79 및 N61은 부재 또는 존재한다. 특정 실시예에서, 글리코실화 부위가 없는 조작된 CAlpha 서열은 서열번호 44 내지 48을 포함하거나, 이에 해당한다. 특정 실시예에서, 조작된 CBeta의 N-글리코실화 부위 중 하나 이상, 가령 N69가 부재 또는 존재한다. 글리코실화 부위가 없는 조작된 CBeta 서열 (TRBC1)은 서열번호 34 내지 36 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다. 글리코실화 부위가 없는 조작된 CBeta 서열 (TRBC2)은 서열번호 38 내지 40을 포함하거나, 이에 해당한다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 CPre-Alpha의 N-글리코실화 부위 중 하나 이상, 예를 들어 N50이 부재 또는 존재한다. 글리코 실화 부위가 없는 조작된 CPre-Alpha 서열은 서열번호 83을 포함하거나, 이에 해당한다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 CGamma의 N-글리코실화 부위 중 하나 이상, 예를 들어 N65가 부재 또는 존재한다. 특정 구체적예에서, 글리코실화 부위가 없는 조작된 CGamma 서열은 서열번호114를 포함하거나, 이에 해당한다. 특정 실시예에서, 조작된 CDelta의 N-글리코실화 부위 중 하나 이상, 예를 들어, N16 및 N79가 부재 또는 존재한다. 글리코실화 부위가 없는 조작된 CDelta 서열은 서열번호 116을 포함하거나, 이에 해당한다.
특정 실시예에서, 고유 TCR 불변 영역에 존재하는 하나 이상의 고유 이차 구조는 본 개시에 제공된 폴리펩티드 복합체에서 변형 (예를 들어, 제거)되거나 유지될 수 있다. 특정 실시예에서, 천연 루프 (예를 들어, 천연 CBeta의 FG 루프 및/또는 DE 루프)는 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서 변형 (예를 들어, 제거)되거나 유지된다. "FG 루프" 및 "DE 루프" 라는 용어는 주로 TCR 베타 사슬 불변 도메인에서 발견되는 구조이다. FG 루프는 천연 CBeta의 아미노산 잔기101-117을 포함하고 CD3에 대한 알파/베타 TCR 공동의 한 성분을 형성하는 비정상적으로 길쭉한 용매 노출 구조적 요소이다. DE 루프는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 66-71을 포함한다. 면역글로불린 CH1 불변 영역의 서열과 TCR 베타 쇄 불변 영역의 서열의 정렬은 TCR 베타 쇄 불변 영역의 FG 루프가 상당히 더 길다는 것을 밝혀냈다. 도 3은 T 세포 베타 쇄와 항체 중쇄 사이의 불변 영역의 차이를 보여준다. 특정 실시예에서, FG 루프에서의 서열 (YGLSENDEWTQDRAKPVT, 서열번호 79)은 부재하거나 및/또는 YPSN (서열번호: 80)으로 대체된다. 특정 실시예에서, 고유 DE 루프에서의 서열 (QPALNDSR, 서열번호: 88)은 부재하거나 및/또는 QSGR (서열번호: 87)로 대체된다. 특정 실시예에서, 천연 FG 루프가 없는 CBeta 서열은 서열번호 37 내지 40 중 어느 하나를 포함하거나, 이에 해당한다. 특정 실시예에서, 천연 FG 루프 및 천연 DE 루프 둘 다 없는 CBeta 서열은 서열 41을 포함하거나, 이에 해당한다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, TCR로부터 유래된 불변 영역은 항체로부터 유래된 가변 영역에 작동 가능하게 결합된다. 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 스페이서가 있거나 없는 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 결합될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 항체 가변 도메인 (VH)은 제1 접합 도메인에서 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 융합되고, 제1 항체 가변 도메인 (VL)은 제2 접합 도메인에서 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 융합된다.
본 명세서에 사용된 "접합 도메인" 은 2개의 아미노산 서열이 융합되거나 조합된 경계 또는 경계 영역을 지칭한다. 특정 실시예에서, 접합 도메인은 사이의 스페이서 유무에 관계없이, 제1 융합 파트너로부터의 C-말단 단편의 적어도 일부를 포함하고, 제2 융합 파트너로부터의 N-말단 단편의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 실시예에서, 접합 도메인은 융합 파트너 둘 모두의 단편을 포함하고, 융합 지점은 2개의 단편이 서로 직접적으로 또는 스페이서를 통해 서로 결합되는 지점에 존재한다. 다른 특정 실시예에서, 접합 도메인은 하나의 융합 파트너의 단편으로 구성된다. 이러한 실시예에서, 융합 지점은 접합 도메인의 어느 한 쪽 끝에 있을 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 접합 도메인은 항체 V/C 결합의 C-말단 단편의 적어도 일부, 및 TCR V/C 결합의 N-말단 단편의 적어도 일부를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체 V/C 결합"은 항체 가변 도메인 및 불변 도메인의 경계, 예를 들어, 중쇄 가변 도메인과 CH1 도메인 사이, 또는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 도메인 사이의 경계를 지칭한다. 마찬가지로 "TCR V/C 결합"이라는 용어는 TCR 가변 도메인과 불변 도메인의 경계, 예를 들어, TCR 알파 가변 도메인과 불변 도메인 사이 또는 TCR 베타 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 경계를 나타낸다.
면역글로불린의 Fv 영역이 TCR 면역글로불린-유사 도메인과 정렬되면, 항체 V/C 결합 및 TCR V/C 결합도 정렬될 것이다. 하기 표 1에 주어진 예와 같이, 항체 중쇄 V/C 결합 (서열번호 270)이 TCR 베타 V/C 결합 (서열번호 271)에 정렬되는 경우, 항체 경쇄 V/C 결합 (서열번호 272)은 TCR 베타 V/C 결합 (서열번호 273)에 정렬된다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제1 및/또는 제2 접합 도메인은 항체 V/C 결합체의 C-말단 단편의 적절한 길이 (가령, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는10개의 아미노산 잔기) 및 TCR V/C 결합체의 N-말단 단편의 적절한 길이 (가령, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는10개의 아미노산 잔기)를 포함하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같이, 접합 도메인은 TCR V/C 결합으로부터 모든 서열을 갖도록 또는 TCR V/C 결합으로부터의 대부분의 서열 (가령, 서열번호147), 또는 일부 서열 (가령, 서열번호146 참조)을 갖도록 선택될 수 있다 (가령, 서열번호 145). 여전히 표 1을 예로서 사용하면, 접합 도메인은 항체 V/C 결합보다 TCR V/C 결합으로부터 더 많은 잔기를 포함할 수 있고 (가령, 서열번호 147), 또는 그 반대일 수 있다 (가령, 서열번호146).
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제1 및/또는 제2 접합 도메인은 항체 V/C 결합 또는 TCR V/C 결합의 길이와 유사한 전장을 갖는다.
적절한 접합 도메인은 구조적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 TCR의 3차원 구조는 중첩될 수 있으며, 중첩된 구조상의 항체 V/C 결합 및 TCR V/C 결합의 중첩은 항체 또는 TCR V/C 결합으로부터 서열의 길이 또는 비율을 결정할 때 고려될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 접합 도메인은 항체 V/C 결합 및 TCR V/C 결합의 단편 사이에 스페이서를 포함한다. 폴리펩티드 복합체의 항원 결합 또는 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 임의의 적합한 서열 또는 스페이서 서열이 사용될 수 있다.
항체 가변/불변 도메인 경계, 및 TCR 가변/불변 도메인 경계, 및 항체 가변/TCR 불변 영역 경계의 예시적인 서열은 하기 표 1 내지 6에 제공된다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고 C2는 조작된 CAlpha를 포함한다. 설명하기 위해, 표1은 TCR CBeta에 융합된 항체 VH 또는 TCR CA1에 융합된 항체 VL에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 설계를 보여준다. 항체 VH/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CBeta 경계에 정렬되고, 항체 VL/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CAlpha 경계에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태 (가령, 서열번호144, 145, 146 또는147 참조)로 제공되며, 제1 또는 제2 접합 도메인은 밑줄로 표시된다. 이러한 실시예에서, 제1 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함하거나, 서열번호 49 또는 50의 서열에 해당한다. 이러한 실시예에서, 제2 접합 도메인은 서열번호 51 또는 52를 포함하거나, 또는 이에 해당한다.
VH-CBeta/VL-CAlpha의 제1 및 제2 접합 도메인 설계
접합
(중쇄)		 접합
(경쇄)
가변 불변 가변 불변
Antibody_VH
서열번호 270		 ……LVTVSS AS--TKGPS…… Antibody_VL
서열번호 272		 ……KVEIK RTVAAPSVF……
TCR_beta
서열번호 271		 ……RLTVLE DLKNVFPPE…… TCR_alpha
서열번호 273		 ……KLIIK PDIQNPDPA……
H_Conjunction_1서열번호 144 ……LVTVSS AS KNVFPPE …… L_Conjunction_1
서열번호 146		 ……KVEIK RTVAA PDPA ……
H_Conjunction_2서열번호 145 ……LVTV LE DLKNVFPPE …… L_Conjunction_2
서열번호 147		 ……KVEIK PDIQNPDPA ……
특정 실시예에서, C1은 조작된 CAlpha를 포함하고 C2는 조작된 CBeta를 포함한다. 표 2는 TCR CAlpha에 융합된 항체 VH 또는 TCR CBeta에 융합된 항체 VL에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 설계를 보여준다. 항체 VH/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CAlpha 경계에 정렬되고, 항체 VL/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CBeta 경계에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태로 제공되며 (가령, 서열번호148, 149 또는150), 제1 또는 제2 접합 도메인은 밑줄로 도시되어 있다. 이러한 실시예에서, 제1 접합 도메인은 서열번호129 또는130을 포함하거나, 이에 해당한다. 이러한 실시예에서, 제2 접합 도메인은 VH-CBeta/VL-CAlpha에 대한 도메인 디자인을 포함하거나, 이에 해당한다.
VH-CAlpha/VL-CBeta의 제1 및 제2 접합 도메인 설계
접합
(중쇄)		 접합
(경쇄)
가변 불변 가변 불변
Antibody_H
서열번호 274		 ……LVTVSS --ASTKGPS…… Antibody_L
서열번호 276		 ……KVEIK-- RT---VAAPSVF……
TCR_alpha
서열번호 275		 ……KLIIK-- PDIQNPDPA…… TCR_beta
서열번호 277		 ……RLTVLE -DLKNVFPPE……
H_Conjunction_3
서열번호 148		 ……LVTVSS AS IQNPDPA …… L_Conjunction_3
서열번호 150		 ……KVEIK LE
- DLKNVFPPE ……
H_Conjunction_4서열번호 149 ……LVTVSS PDIQNPDPA …… L_Conjunction_4
서열번호 150		 ……KVEIK LE
- DLKNVFPPE ……
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고 C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함한다. 표 3은 TCR CBeta에 융합된 항체 VH 또는 TCR CPre-Alpha에 융합된 항체 VL에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 설계를 보여준다. 항체 VH/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CBeta 경계에 정렬되고, 항체 VL/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CPre-Alpha 경계에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한, 정렬 형태 (가령, 서열번호170, 171, 169 또는156)로 제공되며, 제1 또는 제2 접합 도메인은 밑줄로 도시되어 있다. 이러한 실시예에서, 제1 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함하거나, 또는 이에 해당한다. 이러한 실시예에서, 제2 접합 도메인은 서열번호 81 또는 131을 포함하거나, 또는 이에 해당한다.
VH-CBeta/VL-CPre-Alpha의 제1 및 제2 접합 도메인 설계
Figure pct00003
특정 실시예에서, C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고 C2는 조작된 CBeta를 포함한다. 표 4는 TCR CPre-Alpha에 융합된 항체 VH 또는 TCR CBeta에 융합된 항체 VL에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 설계를 보여준다. 항체 VH/일정한 도메인 경계는 TCR 가변/CPre-Alpha 경계에 정렬되고, 항체 VL/일정한 도메인 경계는 TCR 가변/CBeta 경계에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태 (가령, 서열번호172, 173, 174 또는 175)로 제공되며, 제1 또는 제2 접합 도메인은 밑줄로 표시된다. 이러한 실시예에서, 제1 연결 도메인은 서열번호 81, 131, 132 또는133을 포함하거나, 또는이에 해당한다. 이러한 실시예에서, 제2 연결 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함하거나, 또는 이에 해당한다.
VH-CPre-Alpha/VL-CBeta의 제1 및 제2 접합 도메인 설계
Figure pct00004
특정 실시예에서, C1은 조작된 CGamma를 포함하고 C2는 조작된 CDelta를 포함한다. 표 5는 TCR CGamma에 융합된 항체 VH 또는 TCR CDelta에 융합된 항체 VL에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 디자인을 보여준다. 항체 VH/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CGamma 경계에 정렬되고, 항체 VL/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CDelta 경계에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태 (가령, 서열번호157, 158, 159 또는160)로 제공되며, 제1 또는 제2 연결 도메인은 밑줄로 표시된다. 이러한 실시예에서, 제1 접합 도메인은 서열번호117 또는118을 포함하거나, 또는 이에 해당한다. 이러한 실시예에서, 제2 접합 도메인은 서열번호119 또는120을 포함하거나, 또는 이에 해당한다.
VH-CGamma/VL-CDelta의 제1 및 제2 접합 도메인 설계
Figure pct00005
특정 실시예에서, C1은 조작된 CDelta를 포함하고 C2는 조작된 CGamma를 포함한다. 표 6은 TCR CDelta에 융합된 항체 VH 또는 TCR CGamma에 융합된 항체 VL에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 디자인을 보여준다. 항체 VH/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CDelta 경계에 정렬되고, 항체 VL/불변 도메인 경계는 TCR 가변/CGamma 경계에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태 (가령, 서열번호161, 162, 163 또는164)로 제공되며, 제1 또는 제2 연결 도메인은 밑줄로 표시된다. 이러한 실시예에서, 제1 접합 도메인은 서열번호123 또는124를 포함하거나, 또는 이에 해당한다. 이러한 실시예에서, 제2 접합 도메인은 서열번호125 또는126을 포함하거나, 또는 이에 해당한다.
VH-CDelta/VL-CGamma의 제1 및 제2 접합 도메인 설계
Figure pct00006
특정 실시예에서, 제1 폴리펩티드는 화학식 I에서와 같이 작동 가능하게 결합된 도메인을 포함하는 서열: VH-HCJ-C1을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 화학식 II에서와 같이 작동 가능하게 결합된 도메인을 포함하는 서열: VL-LCJ-C2을 포함하고, 상기:
VH는 항체의 중쇄 가변 도메인이고;
HCJ는 상기 정의된 바와 같이 제1 접합 도메인이고;
C1은 상기 정의된 바와 같이 제1 TCR 불변 도메인이고;
VL은 항체의 경쇄 가변 도메인이고;
LCJ는 상기 정의된 바와 같이 제2 접합 도메인이고;
C2는 상기 정의된 바와 같이 제2 TCR 불변 도메인이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CAlpha이며, 이는 서열번호 42 내지 48 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이고, C2는 조작된 CBeta이고, 이는 서열번호 32 내지 41로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이며, HCJ는 서열번호 49 및 50 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이고; LCJ는 서열번호 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta이고, 이는 서열번호 32 내지 41로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. C2는 조작된 CAlpha이고 서열번호 42 내지 48 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. HCJ는 서열번호129 및130 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. LCJ는 서열번호 49 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta이며, 이는 서열번호 32 내지 41, 84, 319, 320, 321, 322, 323 및 324로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 이에 해당하는 서열이고, C2는 조작된 CPre-Alpha이고, 이는 서열번호 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 및 318로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 이에 해당하는 서열이다. HCJ는 서열 식별 번호 49 및 50 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. LCJ는 서열번호 81 및131로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CPre-Alpha이며, 서열번호 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 및 318 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. C2는 조작된 CBeta이고, 이는 서열번호 32 내지 41 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. HCJ는 서열 식별 번호 81,131,132 및133 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. LCJ는 서열번호 49 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CGamma이며, 이는 서열번호113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 및 340으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. C2는 조작 된 CDelta이고, 서열번호 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 및 332으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. HCJ는 서열번호117 및118으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다. LCJ는 서열번호119 및120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 이에 해당하는 서열이다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CDelta이며, 서열번호 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 및 332 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이에 해당하는 서열이다. C2는 조작된 CGamma이고, 이는 서열번호113,114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 및 340 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이에 해당하는 서열이다. HCJ는 서열번호123 및124 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이에 해당하는 서열이다. LCJ는 서열번호125 및126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이에 해당하는 서열이다.
미국 특허 제 9,683,052 호는 TCR 불변 영역 사이의 접촉 계면 내의 특정 잔기가 2개의 중쇄의 이종이량체 쌍을 용이하게 하기 위해 Fc 영역으로 조작될 수 있음을 개시하고 있다. 본 명세서에 개시된 TCR 불변 영역 사이의 접촉 계면 내의 이러한 잔기 및/또는 상응하는 잔기는 또한 경쇄와 중쇄 사이의 페어링을 용이하게 하기 위해 Fab 영역, 예를 들어 CH1 및 CL 도메인으로 강화될 수 있다.
ii. 항체 가변 영역
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 통상적인 천연 항체에서 가변 영역은 플랭킹 프레임 워크 (FR) 영역에 의해 게재된, 예를 들어, 하기 화학식을 포함한다: N-말단에서 C-말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 와 같이, 3개의 CDR 영역. 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체는 이러한 통상적인 항체 가변 영역을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 가변 도메인이 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 가변 도메인은 3개 또는 3개 미만의 CDR을 포함할 수 있고, 항체 중쇄 또는 경쇄의 4 개 또는 4 개 미만의 FR 모두를 포함할 수 있다.
제1 항체는 제1 항원 특이성을 갖는다. 다시 말해, VH 및 VL은 항원 또는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 형성한다. 항원 특이성은 임의의 적합한 항원 또는 에피토프 (epitope), 예를 들어, 외인성 항원, 내인성 항원, 자가 항원, 신생 항원, 바이러스 항원 또는 종양 항원인 것일 수 있다. 외인성 항원은 흡입, 섭취 또는 주사에 의해 체내로 유입되고, 세포 내 이입 또는 식균 작용에 의해 항원-제시 세포 (APC)에 의해 제시될 수 있고 MHC II 복합체를 형성할 수 있다. 내인성 항원은 MHC I 복합체를 형성할 수 있는 세포 대사, 세포 내 바이러스 또는 박테리아 감염의 결과로서 정상 세포 내에서 생성된다. 자가 항원 (가령 펩티드, DNA 또는 RNA 등)은 자가 면역 질환을 앓고 있는 환자의 면역계에 의해 인식되는 반면, 정상 상태에서는 이 항원이 면역계의 표적이 되지 않는다. 신생 항원은 정상적인 신체에는 전혀 없으며 종양이나 암과 같은 특정 질병으로 인해 생성된다. 특정 실시예에서, 항원은 특정 질환 (가령, 종양 또는 암, 자가 면역 질환, 감염성 및 기생충 질환, 심혈관 질환, 신경 병증, 신경 정신병적 상태, 부상, 염증, 응고 장애) 과 관련된다. 특정 실시예에서, 항원은 면역계 (예를 들어, B 세포, T 세포, NK 세포, 대식세포 등과 같은 면역학적 세포)와 관련된다.
특정 실시예에서, 제1 항원 특이성은 면역 관련 항원 또는 이의 에피토프 (epitope)에 관한 것이다. 면역-관련 항원의 예는 T-세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해 세포 (NK 세포) 특이적 수용체 분자를 포함한다.
T-세포 특이적 수용체 분자는 T-세포에 추가 신호가 존재하는 경우, 항원-제시 세포 또는 APC 라 불리는 다른 세포에 의해 제시된 에피토프 (epitope)/항원에 결합하고 이에 반응하여 활성화 될 수 있게 한다. T-세포 특이적 수용체 분자는 TCR, CD3, CD28, CD134 (OX40으로도 지칭 됨), 4-1 BB, CD5 및 CD95 (Fas 수용체로도 알려짐) 일 수 있다.
NK 세포 특이적 수용체 분자의 예는 다음을 포함한다: CD16, 저친화성 Fc 수용체 및 NKG2D 및 CD2.
특정 실시예에서, 제1 항원 특이성은 종양 관련 항원 또는 이의 에피토프 (epitope)에 관한 것이다. 용어 "종양 관련 항원" 은 종양 세포 표면상에 존재하거나, 종양 세포상에 존재하거나, 그 내에 존재하는 항원을 지칭한다. 일부 실시예에서, 종양 관련 항원은 종양 세포에 의해서만 제시될 수 있고 정상 세포, 즉 비-종양 세포에 의해서만 제시될 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 종양 관련 항원은 종양 세포상에서 독점적으로 발현될 수 있거나 비-종양 세포와 비교하여 종양 특이적 돌연변이를 나타낼 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 종양 관련 항원은 종양 세포 및 비-종양 세포 둘 다에서 발견된 수 있지만, 비-종양 세포와 비교할 때 종양 세포에서 과발현되거나, 덜 컴팩트한 구조로 인해 종양 세포에 항체 결합 접근이 가능하다. 일부 실시예에서, 종양 관련 항원은 종양의 혈관계에 위치한다.
종양 연계 표면 항원의 예로는 CD10, CD19, CD20, CD22, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, Fms-유사 티로신 키나제3 (FLT-3, CD135), 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4, 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, IL3R, 섬유 아세포 활성화 단백질 (FAP), CDCP1, Derlin1, Tenascin, frizzled1-10, 혈관 항원 VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-알파 (CD140a), PDGFR-베타 (CD140b) Endoglin, CLEC14, Tem1-8 및 Tie2이 있다. 추가 예는 A33, CAMPATH-1 (CDw52), Carcinoembryonic antigen (CEA), Carboanhydrase IX (MN/CA IX), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, Folate-binding protein, G250, Fms-유사 티로신 키나제3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, IL-2 수용체, IL3R, MCSP (흑색종 관련 세포 표면 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), Muc-1, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이 항원 (PSA) 및 TAG-72가 있다.
특정 실시예에서, 제1 항원 특이성은 CD3, 4.1BB (CD137), OX40 (CD134), CD16, CD47, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD123, CD133, CEA, cdH3, EpCAM, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), EGFRvIII (돌연변이 형태의 EGFR), HER2, HER3, dLL3, BCMA, Sialyl-Lea, 5T4, ROR1, 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 메조 텔린, 엽산 수용체1, VEGF 수용체, EpCAM, HER2/neu, HER3/neu, G250, CEA, MAGE, 프로테오글리칸, VEGF, FGFR, alphaVbeta3-integrin, HLA, HLA-DR, ASC, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD21, CD23, CD24, CD28, CD30, CD37, CD40, CD41, CD44, CD52, CD64, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, 강글리오시드 GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4 Trp2, gp100, 티로시나제, Muc-1, 텔로머라제, 서바이빈, G250, p53, CA125 MUC, Wue 항원, 루이스 Y 항원, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, E pHA2 및 세포 표면을 표적으로 하는 GC182, GT468 또는 GT512로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 또는 이의 에피토프 (epitope)에 관한 것이다.
항체 가변 도메인은 모 항체로부터 유래될 수 있다. 모 항체는 예를 들어 완전 인간 항체, 인간화 항체 또는 동물 항체 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개 등)를 포함하는 임의의 유형의 항체일 수 있다. 모 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.
특정 실시예에서, 모 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 당 업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 방법, 파지 디스플레이, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있다.
하이브리도마 기술은 항체 발현 B 세포를 불멸의 B 세포주와 융합시켜 높은 생산 수준의 항체 생산과 같은 바람직한 특성에 대해 추가로 스크리닝되며, 하이브리 도마세포의 양호한 성장 및 항체의 강한 결합 또는 우수한 생물학적 활성 하이브리도마를 생산하는 단계를 포함한다(예를 들어, Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed.) 참조).
재조합 방법은 모 항체를 생성하는 다른 방법이다. 간단히, 관심 항체를 분비하는 림프구와 같은 세포가 확인되고 단일 세포가 분리되고, 이어서 역전사 효소 PCR에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 생성한다. 가변 영역의 이들 cDNA 서열은 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 암호화 서열을 구축하는데 사용될 수 있으며, 그리고 나서 적절한 숙주 세포에서 발현된다 (검토를 위해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,627,052; PCT 공개 번호 WO 92/02551; 및 Babcock et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci 미국 93: 7843-7848 참조).
항체 라이브러리는 여전히 모 항체를 수득하기 위한 대안이다. 간략하게, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체를 식별하기 위해 항체 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 재조합 항체 라이브러리의 이러한 스크리닝 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 No. 5,223,409; PCT 공개 번호 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; 및 WO 97/29131; 퓨츠 (Fuchs) 등 (1991) 바이오/테크놀로지 9:1370-1372; Hay 등 (1992) Hum. Antibod. 하이브리도마 3: 81-85; 휴즈 (Huse) 등 (1989) Sci. 246:1275-1281; McCafferty 등 (1990) Nature 348: 552-554; 그리피스 등 (1993) EMBO J.12: 725-734; Hawkins 등, (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature352: 624-628; Gram 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad 등 (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acid Res.19: 4133-4137; 및 Barbas 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20030186374 가 있다.
모 항체를 얻는 다른 예시적인 방법은 파지 디스플레이이다 (예를 들어, Brinkman et al., (1995) J. Immunol. Methods182: 41-50; Ames et al., (1995) J. Immunol. Methods184:177-186; Kettleborough et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al., (1997) Gene187 9-18; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108가 있다). 항체 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 파지 입자에 도입하여 다양한 기능성 항체 도메인을 나타내는 파지 입자의 라이브러리를 생성한다. Fd 및 M13은 일반적으로 사용되는 파지이고, 파지 입자상에 디스플레이된 기능적 항체 도메인은 예를 들어 Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인일 수 있으며, 이는 유전자 III 또는 유전자 VIII에 의해 코딩된 파지 단백질에 재조합적으로 융합된다. 파지 라이브러리는 관심 항원, 예를 들어 선택적으로 표지되거나 결합되거나 고체 기질 (예를 들어, 비드)에 포획되어 스크리닝될 수 있다. 선택된 파지의 경우, 항체 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 수득되어 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 구축에 사용된다. 마찬가지로, 항체 도메인을 효모 세포벽에 테더링함으로써 항체 가변 도메인을 표시하는 효모 라이브러리를 생성할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,699,658 호 참조), 이어서 결합된 항원으로 스크리닝하여 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 구축에 유용한 모 항체를 수득한다.
또한, 모 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 OmniRat, OmniMouse에 관심 항원을 주사함으로써 생성될 수 있다. OmniMouse (예를 들어 Osborn M. 등, Journal of Immunology, 2013,190:1481-90; Ma B. 등, Journal of Immunological Methods 400-401 (2013) 78-86; Geurts A. et. al., Science, 2009, 325: 433; 미국 특허 8,907,157; EP 특허 2152880B1; EP 특허 2336329B1 참조), HuMab 마우스 (상세한 내용은 Lonberg, N. et al., Nature 368 (6474): 856 859 (1994) 참조), Xeno-Mouse (Mendez et al., Nat Genet.,1997,15:146-156 참조), TransChromo Mouse (Ishida et al., Cloning Stem Cells, 2002, 4: 91-102 참조), 및 VelocImmune Mouse (Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014,111: 5153-5158 참조), Kymouse (Lee et al., Nat Biotechnol, 2014, 32: 356-363 참조) 및 트랜스제닉 토끼 (Flisikowska et al., PLoS One , 2011, 6: e21045 참조).
본 명세서에 기재된 모 항체는 추가로 변형될 수 있으며, 예를 들어, CDR 서열을 다른 골격 또는 스캐폴드에 이식하기 위해, 하나 이상의 프레임 워크 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 것, 친화도 성숙을 위해 하나 이상의 CDR 영역에서 하나 이상의 잔기를 대체하는 것 등일 수 있다. 이들은 통상의 기술을 사용하여 당업자에 의해 달성될 수 있다.
모 항체는 또한 당 업계에 공지된 치료용 항체일 수 있으며, 예를 들어, 치료 또는 진단 용도로 FDA에 의해 승인된 것, 또는 상태를 치료하기 위하여 임상 시험중인 것, 또는 연구 및 개발중인 것일 수 있다. 알려진 항체의 가변 영역에 대한 폴리뉴클레오티드 서열 및 단백질 서열은 다음과 같은 공개 데이터베이스로부터 얻을 수 있다 (예를 들어, www.ncbi.nlm nih gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html 참조).
치료용 항체의 예는 이에 제한되지 않지만, 리툭시맙 (rituximab)(Rituxan, IDEC/진엔테크 (Genentech)/Roche) (예를 들어 미국 특허 번호 5,736,137 참조), 비-호지킨 림프종을 치료하도록 승인된 키메라 항-CD20 항체; 현재 젠맙 (genmab)에서 개발중인 항-CD20 인 HuMax-CD20,U.S. Pat.에 기술된 항-CD20 항체; 5,500,362 호, AME-133 (응용 분자 진화), hA20 (이뮤노메딕스 (Immunomedics), Inc.), HumaLYM (Intracel), 및 PRO70769 (PCT 출원 번호 PCT/US2003/040426), 트라스투주맙 (trastuzumab) (Herceptin, 진엔테크 (Genentech)) (예를 들어 미국 특허 번호 5,677,171 참조), 유방암 치료를 위해 승인된 인간화 항-Her2/neu 항체; 현재 진엔테크에 의해 개발되고있는 퍼투주맙 (pertuzumab) (rhuMab-2C4, Omnitarg); U.S. Pat. 4,753,894; 세툭시맙 (cetuximab)(Erbitux, 아임클론 (Imclone)) (미국 특허 번호 4,943,533; PCT 공개 번호 WO 96/40210), 다양한 암에 대한 임상 시험에서 키메라 항-EGFR 항체; 현재 Abgenix-Immunex-Amgen에 의해 개발되고 있는 ABX-EGF (미국 특허 번호 6,235,883); 현재 젠맙에 의해 개발되고 있는 HuMax-EGFr (미국 특허 번호 7,247,301); 425, EMD55900, EMD62000 및 EMD72000 (Merck KGaA) (미국 특허 번호 5,558,864; Murthy et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252 (2): 549-60; Rodeck et al., (1987) J. Cell. Biochem. 35 (4): 315-20; Kettleborough et al., (1991) Protein Eng. 4 (7): 773-83); ICR62 (암 연구소) (PCT 공개 번호 WO 95/20045; Modjtahedi 등, (1993) J. Cell Biophys. 22 (1-3):129-46; Modjtahedi 등, (1993) Br J. Cancer 67 (2): 247-53; Modjtahed 등 (1996) Br. J. Cancer 73 (2): 228-35; Modjtahed 등 (2003) Int. J. Cancer105 (2): 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada 및 Cuba, Centro de Immunologia Molecular) (미국 특허 번호 5,891,996; 미국 특허 번호 6,506,883; Mateo et al., (1997) Immunotechnol. 3 (1): 71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA100 (2): 639-44); KSB-102 (KS 바이오 메딕스); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT 공개 번호 WO 0162931); 및 SC100 (스캔 셀) (PCT WO 01/88138); 알렘투주맙 (alemtuzumab)(Campath, Millenium), B-세포 만성 림프구성 백혈병의 치료를 위해 현재 승인된 인간화 mAb; muromonab-CD3 (오르토클론 OKT3), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의해 개발된 항-CD3 항체, 이브리투모마브 (ibritumomab)툭세탄 (제블린), IDEC/Schering AG에 의해 개발된 항-CD20 항체, 젬투주맙 오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg), Celltech/Wyeth에 의해 개발된 항-CD33 (p67 단백질) 항체, 알레파셉트 (alefacept) (Amevive), Biogen에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합), Centocor/Lilly가 개발한 에이빅시맙 (abciximab) (ReoPro), Novartis가 개발한 바실릭시맙(basiliximab) (Simulect), 메디이뮨 (Medimmune)에서 개발한 팔리비주맙(palivizumab) (Synagis), Centocor가 개발한 항-TNF 알파 항체인 인플릭시맙 (infliximab) (Remicade), 아보트 (Abbott)에 의해 개발된 항-TNF 알파 항체인 아달리무맙 (adalimumab) (Humira), Celltech에서 개발한 항-TNF 알파 항체인 Humicade는Centocor가 개발한 인간 TNF 항체인 골리무맙 (golimumab) (CNTO-148), Immunex/Amgen에 의해 개발된 p75 TNF 수용체 Fc 융합인 에타너셉트 (etanercept) (Enbrel), 로쉐 (Roche)가 개발한 p55TNF 수용체 Fc 융합, 에브제닉스 (Abgenix)에 의해 개발된 항-CD147 항체 인 ABX-CBL, 에브제닉스에 의해 개발된 항-IL8 항체 인 ABX-IL8, 에브제닉스 에 의해 개발된 항-MUC18 항체인 ABX-MA1, 항종에 의해 발생하는 항-MUC1인 펨토마맙 (Pemtumamab) (R1549, 90Y-muHMFG1), 안티소마(Antisoma)에 의해 개발된 항-MUC1 항체인 Therex (R1550), 안티소마가 개발한 안지오맵 (AngioMab) (AS1405), 안티소마에 의해 개발된 HuBC-1, 티오플라틴 (AS1407), 바이오젠에 의해 개발된 항-알파-4-베타-1 (VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체인 안테그렌 (나탈리주맙, natalizumab), 바이오젠에 의해 개발된 항-VLA-1 인테그린 항체인 VLA-1 mAb,Biogen에 의해 개발된 LTBR (anti-lymphotoxin beta receptor) 항체인 LTBR mAb, CAT-152, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발된 항-TGF-
Figure pct00007
2 항체, Abbott에 의해 개발된 항-IL-12 p40 항체인 ABT 874 (J695),CAT-192, 캠브리지 항체 연구소 (Cambridge Antibody Technology) 및 젠자임 (Genzyme)에 의해 개발된 항-TGF.beta.1 항체, CAT-213, 캠브리지 항체 연구소 (Cambridge Antibody Technology)에 의해 개발된 항-Eotaxinl항체, LymphoStat-B는 캠브리지 항체 연구소 (Cambridge Antibody Technology) 와 인간 게놈 과학(Human Genome Sciences Inc.)에서 개발한 항-Blys 항체이고, 캠브리지 항체 연구소 (Cambridge Antibody Technology) 와 인간 게놈 과학(Human Genome Sciences Inc.)에 의해 개발된 항-TRAIL-R1 항체인 TRAIL-RlmAb, 진엔테크 (Genentech)에 의해 개발된 항-VEGF 항체인 어베스틴 베바시주맙 (Avastin bevacizumab), rhuMAb-VEGF), 진엔테크에 의해 개발된 항-HER 수용체 패밀리 항체, 항-조직 인자 (ATF), 진엔테크에 의해 개발된 항-조직 인자 항체, 진엔테크에 의해 개발된 항-IgE 항체인 Xolair (Omalizumab), 진엔테크와 소마 (Xoma)가 개발한 항 CD11a 항체인 랩티바(Raptiva) (에팔리주맙, Efalizumab), MLN-02 항체 (이전의 LDP-02), 진엔테크 및 밀레니엄 제약 (Millenium Pharmaceuticals)에서 개발 중인 HuMax CD4, 젠맙에 의해 개발된 항-CD4 항체, HuMax-IL15, 젠맙 과 암젠 (Amgen)에 의해 개발된 항-IL15 항체, HuMax-Inflam은 젠맙과 메다렉스 (Medarex)에 의해 개발되었다. 젠맙 및 메다렉스와 옥스포드 GcoSciences가 개발한 항 헤파라나제 I 항체인 HuMax-Cancer, HuMax-Lymphoma은 젠맙과 암젠이 개발 중이고, 젠맙에 의해 개발된 HuMax-TAC,IDEC-131, 및 IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD40L 항체, IDEC 제약에 의해 개발된 항-CD4 항체인 IDEC-151 (Clenoliximab), IDEC 제약에 의해 개발된 항-CD80 항체인 IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD23 인 IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에서 개발중인 대식세포 이동 인자 (MIF) 항체, 아임클론 (Imclone)에 의해 개발된 항-이디오타입 항체인 BEC2, 아임클론에 의해 개발된 항-KDR 항체인 IMC-1C11, 아임클론에 의해 개발된 항-flk-1 항체인 DC101, 아임클론에 의해 개발된 항-VE cadherin 항체, 이뮤노메딕스 (Immunomedics)가 개발하고 있는 항암성 배아 항원 (CEA) 항체인 CEA-Cide (레바투주맙, labetuzumab), 이뮤노메딕스가 개발한 항-CD22 항체인 LymphoCide (에프라투주맙, Epratuzumab), 이뮤노메딕스가 개발한 AFP-Cide, 이뮤노메딕스가 개발한 MyelomaCide, 이뮤노메딕스가 개발한 LkoCide, 이뮤노메딕스가 개발한 ProstaCide, 메다렉스 (Medarex)에 의해 개발된 항-CTLA4 항체인 MDX-010, 메다렉스에 의해 개발된 항-CD30 항체인 MDX-060, MDX-070은 메다렉스에 의해 개발되고, MDX-018은 메다렉스에 의해 개발되고, Osidem (IDM-1) 및 메다렉스와 Immuno-Designed Molecules에 의해 개발된 항-Her2 항체, 메다렉스 와 젠맙에 의해 개발된 항-CD4 항체인 HuMax-CD4, 메다렉스와 젠맙에 의해 개발된 항-IL15 항체인 HuMax-IL15, 항-TNFα 인 CNTO148, 메다렉스와 Centocor/J & J에 의해 개발된 항체인 CNTO1275, Centocor/J & J에 의해 개발된 항-사이토카인 항체, MorphoSys에 의해 개발되고 있는 MOR101 및 MOR102, 항 세포간 접착 분자-1 (ICAM-1) (CD54) 항체, MorphoSys가 개발한 항 섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR-3) 항체 MOR201, Protein Design Labs에서 개발중인 항-CD3 항체인 Nuvion (비실리주맙, visilizumab), Protein Design Labs에서 개발중인 항 감마 인터페론 항체인 HuZAF, 안티-알파. 5. Beta.1 Integrin, Protein Design Labs에서 개발, anti-IL-12, Protein Design Labs에서 개발, 소마 (Xoma) 에 의해 개발된 항-Ep-CAM 항체인 ING-1, 제넨테크 (Xenentech) 및 노바티스 (Novartis)가 개발한 Xolair (오말리주맙,Omalizumab) 인간화 항-IgE 항체 및 소마에 의해 개발된 항-베타 2 인테그린 항체 MLN01이 있다. 다른 실시예에서, 치료제는 KRN330 (키린, Kirin)을 포함하고; huA33 항체 (A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95 (알파 V 인테그린, Centocor); MEDI-522 (알파 V.3 인테그린, 메디이뮨); 볼록시시맙(volociximab) (알파 V.1 인테그린, 바이오젠/PDL); 인간 mAb 216 (B 세포 당화 에피토프 (epitope), NCI); BiTE MT103 (이중특이적 CD19 CD3, Medimmune); 4G7 H22 (이중특이적 Bcell.FcgammaR1, Medarex/Merck KGa); rM28 (이중특이적 CD28 x MAPG, EP 특허 번호 EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (Bispecific CD64 EGFR, Medarex); 카투악소맙(Catumaxomab) (레모바브, removab) (Bispecific EpCAM anti-CD3, Trion/Fres); 에투막소맙(Ertumaxomab) (이중특이적 HER2/CD3, Fresenius Biotech); 오레고보맙(oregovomab) (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex (WX G250) (탄산 무수물 IX, Wilex);CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (엔도글린), 트라콘); BMS-663513 (CD137 작용제, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); 시필리주맙(Siplizumab) (MEDI-507) (CD2, Medimmune); 오후투무맙(Ofatumumab) (Humax-CD20) (CD20, 젠맙); 리툭시맙 (rituximab)(Rituxan) (CD20, 진엔테크 (Genentech)); 벨투주맙(veltuzumab) (hA20) (CD20, 면역의학); 에프라투주맙(Epratuzumab) (CD22, 암젠); 루밀리시맙(lumiliximab) (IDEC152) (CD23, 바이오젠); muromonab-CD3 (CD3, 오르토);HuM291 (CD3 fc 수용체, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, 시애틀 제네틱스); SGN-33 (린투주맙, Lintuzumab) (CD33, 시애틀 제네틱스); 자놀리무맙(Zanolimumab) (HuMax-CD4) (CD4, 젠맙); HCD122 (CD40, 노바티스); SGN-40 (CD40, 시애틀 제네틱스); Campathlh (알렘투주맙, Alemtuzumab) (CD52, 젠자임(Genzyme)); MDX-1411 (CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (CD74.38, 면역의학); 갈릭시맙(Galiximab) (IDEC-144) (CD80, 바이오젠); MT293 (TRC093/D93) (절단 콜라겐, 트라콘); HuLuc63 (CS1, PDL 파마); 이필리무맙(ipilimumab) (MDX-010) (CTLA4, 브리스톨 마이어스 스퀴브); 트레멜리무맙(Tremelimumab) (티실리무맙 (Ticilimumab), CP-675,2) (CTLA4, 화이자); HGS-ETR1 (마파투무맙, Mapatumumab) (DR4 TRAIL-R1 작용제, 인간 게놈 과학/Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, 암젠); 아포맙(Apomab) (DR5, 진엔테크 (Genentech)); CS-1008 (DR5, 다이이치산쿄); HGS-ETR2 (렉사투무맙, lexatumumab) (DR5 TRAIL-R2 작용제, HGS); 세툭시맙 (cetuximab) (Erbitux) (EGFR, 아임클론 (Imclone)); IMC-11F8 (EGFR, 아임클론 (Imclone)); 니모투주맙(Nimotuzumab) (EGFR, YM Bio); 파니투무맙(Panitumumab) (Vectabix) (EGFR, 암젠); 잘루투무맙(Zalutumumab) (HuMaxEGFr) (EGFR, 젠맙 (genmab)); CDX-110 (EGFRvIII, AVANT 면역 치료제); 아데카투무맙(adecatumumab) (MT201) (Epcam, Merck); 에드레콜로맙(edrecolomab) (Panorex,17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (엽산 수용체 a, Morphotech); KW-2871 (갱글리오시드 GD3, 쿄와); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, 셀덱스); 트라스투주맙 (trastuzumab) (허셉틴, Herceptin) (HER2, 셀덱스); 페르투주맙(Pertuzumab) (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), 진엔테크 (Genentech)); 아폴리주맙(apolizumab) (HLA-DR 베타 쇄, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, 암젠); 항-IGF-1R R1507 (IGF1-R, 로슈); CP 751871 (IGF-R, 화이자); IMC-A12 (IGF1-R, 임클론); BIIB022 (IGF-1R, 바이오젠); Mik-베타-1 (IL-2Rb (CD122), 호프만라로쉬); CNTO 328 (IL6, Centocor); 항-KIR (1-7F9) (Killer 세포 Ig-유사 수용체 (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11 (LTBR, 바이오젠); HuHMFG1 (MUC1, /NCI); RAV12 (N-연결 탄수화물 에피토프 (epitope), 레이븐); CAL (캘리포니아 대학교 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTH-rP)); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, 아임클론); 바비툭시맙(bavituximab) (포스파티딜세린(phosphatidylserine), 페레그린(Peregrine)); huJ591 (PSMA, 코넬 리서치 재단); muJ591 (PSMA, 코넬 리서치 재단); GC1008 (TGFb (팬) 억제제 (IgG4), 젠 임); 인플릭시맙(Infliximab) (Remicade) (TNFα, Centocor); A27.15 (트랜스페린 수용체, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (트랜스페린 수용체, Salk Institute); 베바시주맙(Bevacizumab) (아바스틴, Avastin) (VEGF, 진엔테크 (Genentech)); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab) PCT 공개 번호 WO/2000/034337, University of Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, 아임클론); IMC-1121 (VEGFR2, 아임클론).
a) 항-CD3 결합 모이어티
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티 또는 제2 항원-결합 모이어티는 서열번호 342 내지 344 및/또는 서열번호 345 내지 347로부터 선택된1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열을 함유하는 항-CD3 항체로부터 유도된 항-CD3 결합 모이어티이다.
이들 CDR 서열은 하기 표 7에 나타낸 항-CD3 항체로부터 유래된다. WBP3311_2.306.4 항체의 CDR 서열은 다음과 같다.
항체명 CDR1 CDR2 CDR3
WBP3311_2.306.4 VH 서열번호 342 서열번호 343 서열번호 344
GFAFTDYYIH WISPGNVNTKYNENFKG DGYSLYYFDY
WBP3311_2.306.4 VL 서열번호 345 서열번호 346 서열번호 347
KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRQS TQSHTLRT
WBP3311_2.306.4 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.
WBP3311_2.306.4-VH
아미노산 서열 (서열번호 348):
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWISPGNVNTKYNENFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQGTTLTVSS
핵산 서열 (서열번호 349):
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCCGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAATGTTAATACTAAATACAATGAAAACTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACTGCAGACCTATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGATATTCCCTGTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.306.4-VL
아미노산 서열(서열번호 350):
DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGGGTKLEIK
핵산 서열 (서열번호 351):
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
CDR은 항원 결합능이 있는 것으로 알려져 있지만, 6개의 CDR 모두가 필수 불가결하거나 변경불가능한 것은 아님이 밝혀졌다. 다시 말해서, WBP3311_2.306.4로부터 유래된 항-CD3 결합 부분에서 하나 이상의 CDR을 대체 또는 변경 또는 변형시킬 수 있지만, CD3에 대한 특이적 결합 친화도를 실질적으로 유지할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 항-CD3 결합 부분은 항-CD3 항체 WBP3311_2.306.4 중 하나의 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 항-CD3 결합 부분은 서열번호 344를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 중쇄 CDR3 영역은 항원 결합 부위의 중심에 위치하고, 그러므로 항원과 가장 많이 접촉하고 항체와 항원의 친화력에 가장 많은 자유 에너지를 제공하는 것으로 여겨진다. 중쇄 CDR3은 길이, 아미노산 조성 및 다수의 다양화 메카니즘에 의한 입체 형태 측면에서 항원 결합 부위의 가장 다양한 CDR인 것으로 여겨진다 (Tonegawa S., Nature. 302: 575-81 (1983)). 중쇄 CDR3의 다양성은 대부분의 항체 특이성 (Xu JL, Davis MM., Immunity.13: 37-45 (2000)) 뿐만 아니라 항원-결합 친화도 (Schier R, et al., J Mol Biol. 263: 551-67 (1996)) 를 생성하기에 충분하다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 항-CD3 결합 부분이 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 적합한 골격 영역 (FR) 서열을 포함한다. 표 7에 제공된 CDR 서열은 마우스 항체, 그러나 이들은 마우스, 인간, 래트, 토끼와 같은 임의의 적합한 종의 임의의 적합한 FR 서열에 재조합 기술과 같은 당 업계에 공지된 적합한 방법을 사용하는 방법으로 이식될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 항-CD3 결합 부분은 인간화된다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 인간화 항원 결합 모이어티는 비-인간 CDR 서열을 제외하고 실질적으로 모든 인간 서열로 구성된다. 일부 실시예에서, 가변 영역 FR 및 만약 불변 영역이 존재한다면, 불변 영역은 전체적으로 또는 실질적으로 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 FR 서열 및 인간 불변 영역 서열은 상이한 인간 면역글로불린 유전자, 예를 들어 하나의 인간 항체로부터 유래된 FR 서열 및 다른 인간 항체로부터 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체적예에서, 인간화 항원 결합 모이어티는 인간 FR1-4를 포함한다.
항-CD3 인간화 항체 WBP3311_2.306.4-z1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.
WBP3311_2.306.4-z1-VH
아미노산 서열 (서열번호 352):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
핵산 서열 (서열번호 353):
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
WBP3311_2.306.4-z1-VL
아미노산 서열 (서열번호 354):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
핵산 서열 (서열번호 355):
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
b) 항-CD19 항체
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티 또는 제2 항원-결합 모이어티는 서열번호 356 내지 359로 이루어진 군에서 선택되고, 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함하는, 및/또는 서열번호 360 내지 362로 이루어진 군으로부터 선택되고, 1, 2 또는 3개의 카파 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항-CD19 결합 모이어티이다.
이들 CDR 서열은 하기 표 8에 나타낸 항체로부터 유래된다. 이들 항-CD19 항체의 CDR 서열은 하기에 제공된다.
　 CDR1 CDR2 CDR3
WBP7011_4.155.8 VH 서열번호 356 서열번호 357 서열번호 358
GYAFTSYNMY YIDPYNGDTTYNQKFKG TAYAMDY
W7011-4.155.8-z1-P15 VH 서열번호 356 서열번호 359 서열번호 358
GYAFTSYNMY YIDPYNADTTYNQKFKG TAYAMDY
WBP7011_4.155.8 VL 서열번호 360 서열번호 361 서열번호 362
SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT
W7011-4.155.8-z1-P15 VL 서열번호 360 서열번호 361 서열번호 362
SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT
WBP7011_4.155.8 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열은 하기에 제공된다.
WBP7011-4.155.8-VH
아미노산 서열 (서열번호 363):
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTTAYAMDYWGQGTSVTVSS
핵산 서열(서열번호 364):
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTACAATGGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCACTACGGCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
WBP7011-4.155.8-VL
아미노산 서열 (서열번호 365):
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSTVNYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK
핵산 서열 (서열번호 366):
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGAAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
특정 실시예에서, 본 명세서에 개시된 항-CD19 결합 부분은 항-CD19 항체 WBP7011_4.155.8 또는 W7011-4.155.8-z1-P15의 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 항-CD19 결합 부분은 서열번호 358을 포함하는 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 중쇄 CDR3 영역은 항원 결합 부위의 중심에 위치하고, 그러므로 항원과 가장 많이 접촉하고 항체와 항원의 친화력에 가장 많은 자유 에너지를 제공하는 것으로 여겨진다. 또한, 중쇄 CDR3은 길이, 아미노산 조성 및 다수의 다양화 메커니즘에 의한 형태 측면에서 항원 결합 부위의 가장 다양한 CDR인 것으로 여겨진다(Tonegawa S., Nature. 302: 575-81 (1983)). 중쇄 CDR3의 다양성은 대부분의 항체 특이성 (Xu JL, Davis MM. Immunity.13: 37-45 (2000)) 뿐만 아니라, 바람직한 항원 결합 친화성을 갖기에 충분하다(Schier R 등, J Mol Biol. 263: 551-67 (1996)).
특정 실시예에서, 본 명세서에 개시된 항-CD19 항체는 인간화된다. 항-CD19 인간화 항체 W7011-4.155.8-z1-P15에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 하기에 제공된다.
W7011-4.155.8-z1-P15-VH
아미노산 서열 (서열번호 367):
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
핵산 서열 (서열번호 368):
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
W7011-4.155.8-z1-P15-VL
아미노산 서열 (서열번호 369):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
핵산 서열 (서열번호 370):
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
이중특이적 폴리펩티드 복합체
일 측면에서, 본 개시 내용은 본 명세서에서 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "이중특이적"은 2개의 항원-결합 모이어티가 존재하고, 이들 각각은 동일한 항원상의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 중쇄 가변 도메인 및 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티, 상기 C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 하나 이상의 비-천연 및 안정화 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있다. 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 제2 항원-결합 부위를 포함하지만 TCR 불변 영역으로부터 유래된 서열을 함유하지 않는 제2 항원-결합 모이어티를 추가로 포함한다.
특정 실시예에서, 본 개시 내용은 제2 항원-결합 모이어티와 관련된 제1항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공하고, 상기:
하기를 포함하는 제1항원-결합 모이어티:
N-말단에서 C-말단까지, 제1 T세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동가능하게 연결된 제1항체의 제1중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1폴리펩티드, 및
N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR불변 영역 (C2)에 작동가능하게 연결된 제1항체의 제1경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2폴리펩티드,
상기:
C1 및 C2는 C1에 포함된 제1돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2돌연변이 잔기 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고,
제1항체는 제1항원 특이성을 가지며,
제2항원-결합 모이어티는 제1항원 특이성과 상이한 제2항원 특이성을 가지며,
제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 미스페어링되는 경향이 훨씬 적다.
본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 미스페어링된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 경향이 훨씬 적다. 임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 제1 항원-결합 모이어티에서 안정화된 TCR 불변 영역은 구체적으로 서로 연결할 수 있는 것으로 믿어진다. 따라서 의도된 VH1과 VL1의 매우 특정한 페어링에 기여하고, 의도된 항원-결합 부위를 제공하지 않는 다른 가변 영역과 VH1 또는 VL1의 원치 않는 미스페어링을 감소시킨다.
우시보디 (WuXiBody) 형식의 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 생체 내 반감기가 길고, 다른 형식의 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 비교할 때, 제조하기가 상대적으로 더 쉽다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제2 항원-결합 모이어티는 제2 항체의 제2 중쇄 가변 도메인 (VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인 (VL2)을 포함한다. 특정 실시예에서, VH2 및 VL2 중 적어도 하나는 항체 불변 영역에 작동 가능하게 연결되거나, VH2 및 VL2 둘 다 각각 항체 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시예에서, 제2 항원 결합 모이어티는 VH2에 작동 가능하게 연결된 항체 불변 CH1 도메인 및 VL2에 작동 가능하게 연결된 항체 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 제2 항원-결합 모이어티는 Fab를 포함한다.
제1, 제2, 제3 및 제4 가변 도메인 (가령, VH1, VH2, VL1 및 VL2)이 하나의 세포에서 발현되는 경우, VH1은 VL1과 특이적으로 쌍을 이루고, VH2는 VL2와 특이적으로 쌍을 이루는 것이 바람직하다. 생성된 이중특이적 단백질 생성물은 정확한 항원-결합 특이성을 가질 것이다. 그러나, 하이브리드-하이브리도마 (또는 쿼드로마)와 같은 기존 기술에서는, VH1, VH2, VL1 및 VL2의 무작위 쌍이 발생하여 결과적으로 최대10개의 상이한 종이 생성되고, 그 중 하나만이 기능성 이중특이적 항원-결합 분자이다. 이는 생산 수율을 감소시킬 뿐만 아니라 목표 생성물의 정제를 복잡하게 한다.
본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 가변 도메인이 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 자연 Fab의 대응물인 경우와 달리, 미스페어링하는 경향이 훨씬 적다는 점에서 예외적이다. 예로서, 제1 항원-접합 도메인은 VL1-C2와 쌍을 이루는 VH1-C1을 포함하고, 제2 항원-접합 도메인은 VL2-CL과 쌍을 이루는 VH2-CH1을 포함한다. 놀랍게도 C1과 C2는 우선적으로 서로 연관되고, CL 또는 CH1과 연관되기 어려워 C1-CH, C1-CL, C2-CH 및 C2-CL과 같은 원치 않는 쌍의 형성은 크게 줄었다. C1-C2의 특이적 결합의 결과로서, VH1은 VL1과 특이적으로 쌍을 이루어 제1 항원 결합 부위를 제공하고, CH1은 CL과 특이적으로 쌍을 형성함으로써, 제2 항원 결합 부위를 제공하는 VH2-VL2의 특이적 쌍을 가능하게 한다. 따라서, 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티는 불일치하는 경향이 감소하고, 예를 들어 VH1-VL2, VH2-VL1, VH1-VH2, VL1-VL2 사이의 부정합은 현저하게 감소될 수 있다. 만약 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 자연 Fab의 대응물이 아니라면, 예를 들어 VH1-CH1, VL1-CL, VH2-CH1 및 VL2-CL의 형태가 되었을 것이다.
특정 실시예에서, 세포로부터 발현될 때 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 유의미한 결합 불량품을 가질 것이고 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 잘못 결합된 생성물), 및/또는 비교 가능한 조건 하에서 발현된 기준 분자보다 상당히 높은 생산 수율 (예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상 더 높은 수율)을 가지고, 상기 기준 분자는 달리 C1 대신에 천연 CH1 및 C2 대신에 고유 CL을 갖는 것을 제외하고는 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 동일하다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 2가, 3가, 4 가와 같은 다가이다. 본 명세서에 사용된 용어 "가(valent)"는 주어진 분자에서 특정 수의 항원 결합 부위의 존재를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가"및 "6가"는 항원-결합 분자에서 각각 2개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위 및 6 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 2개의 결합 부위가 모두 동일한 항원 또는 동일한 에피토프의 특이적 결합에 대한 경우 2가 분자는 단일 특이적일 수 있다. 유사하게, 3가 분자는 예를 들어 2개의 결합 부위가 제1 항원 (또는 에피토프)에 대해 단일 특이적이고 제3 결합 부위가 제2 항원 (또는 에피토프)에 대해 특이적인 경우 이중특이적일 수 있다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제1 및/또는 제2 항원-결합 모이어티는 2가, 3가 또는 4 가일 수 있으며, 동일한 항원 또는 에피토프에 특이적인 2개 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 이는 특정 실시예에서, 1가 대응물보다 항원 또는 에피토프에 더 강한 결합을 제공한다. 특정 실시예에서, 2가 항원-결합 모이어티에서, 제1가의 결합 부위 및 제2가의 결합 부위는 구조적으로 동일하거나 (즉, 동일한 서열을 가진다.), 구조적으로 상이하다 (즉, 동일한 특이성을 갖더라도 상이한 서열을 가진다).
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2항원 결합 모이어티는 다가이며 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 하나 이상의 Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab')2, Fd, Fv 및 scFv 단편 및 상기 기재된 다른 단편(Spiess et al., 2015, sand Brinkmann et al., 2017, 참조) 또는 이들의 조합을 포함하고, 중쇄 및/또는 경쇄에서 스페이서와 함께 또는 없이 연결되고, 적어도 하나는 제2 항체에 결합할 수 있는 형태를 포함한다.
특정 실시예에서, 제2 항원 결합 모이어티는 2개 이상의 Fab의 제2 항체를 포함한다. 2개의 Fab은 서로 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 예를 들어 제1 Fab은 사이에 스페이서가 있거나, 없는 중쇄를 통해 제2 Fab에 공유적으로 부착될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 제1 이량체화 도메인을 추가로 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 이량체화 도메인을 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "이량체화 도메인"은 서로 결합하여 이량체를 형성할 수 있거나, 일부 예에서, 2개의 펩티드의 자발적 이량체화를 가능하게하는 펩티드 도메인을 지칭한다.
특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제2 이량체화 도메인과 연계될 수 있다. 결합은 임의의 적합한 상호작용 또는 연결 또는 결합, 예를 들어, 연결기, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 염다리 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것일 수 있다. 예시적인 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역, 항체 CH2 도메인, 항체 CH3 도메인, 및 서로 이량체화 및 결합할 수 있는 다른 적합한 단백질 단량체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인은 임의의 항체 이소타입 (isoptype), 예컨대 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 유래될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 힌지-Fc 영역의 적어도 일부, 즉 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제1 TCR 불변 영역의 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-결합 모이어티의 항체 CH1 불변 영역의 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제3 접합 도메인에서 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결되어 있거나 (사이에 스페이서가 있거나 없는) 사이에 있다.
만약 면역글로불린의 Fv 영역이 TCR 면역글로불린-유사 도메인과 정렬되면, 항체 힌지 N-말단 및 TCR 힌지 N-말단도 정렬될 것이다. 항체 힌지 N-말단 (서열번호 278 또는 279)이 TCR 베타 힌지 N-말단 (서열번호 280)에 정렬되는 예가 하기 표 9에 제공된다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제3 접합 도메인은 TCR 힌지 N-말단의 적절한 길이 (예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는10 개의 아미노산 잔기) 및 항체 힌지 N-말단의 아미노산 잔기 적절한 길이 (예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는10) 를 포함하도록 선택될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "힌지 N-말단" 은 힌지 영역의 가장 N-말단 쪽 부분의 단편을 지칭한다. 예를 들어, 접합 도메인은 항체 힌지 N-말단 또는 TCR 힌지 N-말단으로부터의 전부 또는 대부분 또는 일부 서열을 갖도록 선택될 수 있거나, 또는 TCR 힌지 N-말단보다 항체 힌지 N-말단으로부터 더 많은 잔기를 포함할 수 있고, 혹은 그 반대로도 가능하다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제3 접합 도메인은 항체 힌지 N-말단 또는 TCR 힌지 N-말단의 길이와 유사한 전장을 갖는다.
유사하게, 적절한 제3 접합 도메인은 구조적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 TCR의 3차원 구조는 중첩될 수 있으며, 중첩된 구조상의 항체 힌지 N-말단 및 TCR 힌지 N-말단의 중첩이 결정될 수 있고, 항체 또는 TCR 힌지 N-말단으로부터 서열의 길이 또는 비율을 결정할 때 고려될 수 있다.
특정 실시예에서, 제3 접합 도메인은 항체 힌지 N-말단 및 TCR 힌지 N-말단의 단편 사이에 스페이서를 포함한다. 폴리펩티드 복합체의 항원 결합 또는 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 임의의 적합한 서열 또는 스페이서 서열의 길이가 사용될 수 있다.
항체 힌지 N-말단, TCR 힌지 N-말단 및 제3 접합 도메인의 예시적인 서열은 하기 표 9, 10, 11 및 12에 제공된다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고 제1 이량체화 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 힌지 및 Fc를 포함한다. 표 9는은 항체 힌지에 융합된 TCR CBeta에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 디자인을 보여준다. 항체 힌지 N-말단은 TCR 베타 힌지 N-말단에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태로 제공된다 (예를 들어, 서열번호152 또는153 참조). 이러한 실시예에서, 제3 접합 도메인은 서열번호 53 또는 54 (제3 접합 도메인 및 힌지 C-말단을 포함)에 포함된다.
VH-CBeta-Hinge의 세 번째 접합 도메인 설계
힌지 서열번호
IgG1_Antibody_H EPKS-CDKTHTC…… 278
IgG4_Antibody_H ESK----YGPPC…… 279
TCR_beta WGRADCGFTSVS…… 280
Conjunction'_1 (IgG1)
Conjunction'_1 (IgG4)		 WGRA-SDKTHTC……
WGR----YGPPC……		 152
153
특정 실시예에서, C1은 조작된 CAlpha 또는 CPre-Alpha를 포함하고 제1 이량체화 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 힌지 및 Fc를 포함한다. 표 10은 항체 힌지에 융합된 TCR CA1pha 또는 CPre-Alpha에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 디자인을 보여준다. 항체 힌지 N-말단은 TCR 알파 또는 CPre-알파 힌지 N-말단에 정렬된다. 이러한 실시예에서, 제3 접합 도메인은 서열번호 134, 135, 140 또는 141 (제3 접합 도메인 및 힌지 C-말단을 포함)에 포함된다.
VH-CAlpha-Hinge의 세 번째 접합 도메인 설계
힌지 서열번호
IgG1_Antibody_H EPKS-CDKTHTC…… 281
IgG4_Antibody_H ESK----YGPPC…… 282
TCR_alpha or TCR_pre-alpha ------------
Conjunction'_2 (IgG1)
Conjunction'_2 (IgG4)		 -----SDKTHTC……
-------YGPPC……		 154
155
특정 실시예에서, C1은 조작된 CGamma를 포함하고 제1 이량체화 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 힌지 및 Fc를 포함한다. 표 11은 항체 힌지에 융합된 TCR CGamma에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 디자인을 보여준다. 항체 힌지 N-말단은 TCR 감마 힌지 N-말단에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태로 제공된다 (예를 들어, 서열번호 165 또는 166 참조). 이러한 실시예에서, 제3 접합 도메인은 서열번호 121 또는 122 (제3 접합 도메인 및 힌지 C-말단을 포함)에 포함된다.
VH-CGamma-Hinge의 세 번째 접합 도메인 설계
힌지 서열번호
IgG1_Antibody_H EPKSCDKTHTC…… 60
IgG4_Antibody_H ESK---YGPPC…… 61
TCR_gamma PPIKTDVITMD…… 62
Conjunction'_3 (IgG1)
Conjunction'_3 (IgG4)		 PPIKSDKTHTC……
PPI---YGPPC……		 165
166
특정 실시예에서, C1은 조작된 CDelta를 포함하고 제1 이량체화 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 힌지 및 Fc를 포함한다. 표 12는 항체 힌지에 융합된 TCR CDelta에 유용한 접합 도메인에 대한 예시적인 디자인을 보여준다. 항체 힌지 N-말단은 TCR 델타 힌지 N-말단에 정렬된다. 접합 도메인의 예시적인 디자인은 또한 정렬 형태로 제공된다. 이러한 실시예에서, 제3 접합 도메인은 서열번호 127 또는 128 (제3 접합 도메인 및 힌지 C-말단을 포함)에 포함된다.
VH-CDelta-Hinge-Fc에 대한 세 번째 접합 도메인 디자인
힌지와 Fc 서열번호
IgG1_Antibody_H EPKSCDKTHTC…… 63
IgG4_Antibody_H ESK---YGPPC…… 103
TCR_delta FEVKTDSTDHV…… 104
Conjunction'_4 (IgG1)
Conjunction'_4 (IgG4)		 EPKSSDKTHTC……
ESK---YGPPC……		 167
168
특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 조작된 TCR 불변 영역의 C-말단에 작동 가능하게 연결되고 함께 키메라 불변 영역을 형성한다. 다시 말해, 키메라 불변 영역은 조작된 TCR 불변 영역과 작동 가능하게 연결된 제1 이량체화 도메인을 포함한다.특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 제1 힌지-Fc 영역에 부착된, 조작된 CBeta를 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 표 13, 14, 15 및 16에 제공된다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유도된 제1 힌지에 부착된, 조작된 CAlpha를 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 표 13, 14 및 15에 제공되어 있다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 서열번호 134, 135, 140 또는 141을 포함하거나 이의 제3 접합 도메인에서 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 제1 힌지에 부착된, 조작된 CPre-Alpha를 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 표 17 및 18에 제공된다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 제1 힌지에 부착된, 조작된 CGamma를 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 표 19, 20에 제공된다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 제1 힌지에 부착된, 조작된 CDelta를 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 표 19 및 20에 제공된다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 제1 항체 CH2 도메인 및/또는 제1 항체 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 키메라 불변 영역은 제3 접합 도메인의 C-말단에 부착된 제1 항체 CH2-CH3 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 표 21에 제공된다.
특정 실시예에서, 제1 키메라 불변 영역 및 제2 TCR 불변 도메인은 표 21에 표시된대로, 서열번호 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199 , 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/151, 214/212, 214/151, 234/233, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 및 238/237 으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 서열을 포함한다.
이들 키메라 불변 영역 및 제2 TCR 불변 도메인 쌍은 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 제공하기 위해, 원하는 항체 가변 영역으로 융합되도록 조작될 수 있다는 점에서 유용하다. 예를 들어, 항체 중쇄 가변 영역을 키메라 불변 영역 (C1을 포함)에 융합시켜 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제1 폴리펩티드 사슬을 만들 수 있고; 유사하게, 항체 경쇄 가변 영역은 제2 TCR 불변 도메인 (C2를 포함 함)에 융합 될 수 있고, 이에 의해 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제2 폴리펩티드 사슬을 제공할 수 있다.
이들 키메라 불변 영역 및 제2 TCR 불변 도메인 쌍은 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제1 항원-결합 모이어티를 생성하기 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 항체의 가변 영역은 플랫폼 서열의 N-말단에서 융합 될 수 있다 (예를 들어, VH를 각각 키메라 불변 도메인에 융합시키고 VL을 각각 TCR 불변 도메인에 융합시키는 것). 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 생성하기 위해, 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 결합되도록 제2 항원-결합 모이어티를 설계하고 생산할 수 있다.
특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 항체, 예컨대 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 임의로 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인, 예를 들어 힌지-Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다. 힌지 영역은 제2 항원 결합 부위 (예를 들어 Fab)의 항체 중쇄에 부착될 수 있다.
이중특이적 폴리펩티드 복합체에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체로 결합될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고, 동종이량체화를 방해하고 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 결합된다. 예를 들어, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이들이 동일하지 않고, 그 자체 내에 동종이량체를 형성하기 보다는 서로간에 이종이량체를 우선적으로 형성하도록 선택될 수 있다. 특정 구체적예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용 또는 증가된 유연성의 형성을 통해 이종이량체로 결합될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀을 형성할 수 있도록 각각 돌연변이된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 작은 아미노산 잔기를 제1 CH2/CH3 폴리펩티드에서 더 큰 것으로 치환함으로써 놉을 얻을 수 있고, 큰 잔기를 더 작은 것으로 교체함으로써 홀을 얻을 수 있다. 손잡이가 구멍에 들어가는 돌연변이 부위에 대한 자세한 내용은 상기 Ridgway 등 (1996), Spiess 등 (2015), Brinkmann (2017), 등을 참조한다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은S139C 및 T151W 치환을 함유하는 IgG1 이소 타입의 첫 번째 CH3 도메인 (서열번호 295, 놉) 및 Y134C, T151S, L153A 및 Y192V 치환을 함유하는 IgG1 이소 타입의 제2 CH3 도메인 (서열 296, 홀)을 포함한다. 다른 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 S136C 및 T148W 치환을 함유하는 IgG4 이소 타입의 제1 CH3 도메인 (서열번호 298, 놉) 및 Y131C, T148S, L150A및 Y189V 치환 (서열번호 299, 홀) 을 함유하는 IgG4 이소 타입의 제2 CH3 도메인을 포함한다. 야생형 Fc IgG1 (서열번호 294) 및 Fc IgG4 (서열번호 297)의 서열 및 번호는 도 20a 내지 20d에 도시되어 있다. 전술한 바와 같이, Fc 영역 (예를 들어, Fc 영역의 CH3 도메인)을 언급 할 때는, XnY는 아미노산 잔기의 넘버링이 도 20a 내지 20d에 도시된 넘버링에 기초한다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 제1 힌지 영역 및 제2 힌지 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 전하 쌍의 치환은 이종이량체화를 촉진하기 위해 IgG1 및 IgG2의 힌지 영역으로 도입될 수 있다. 자세한 내용은 상기 Brinkmann et al., 2017을 참조한다.
이중특이적 포맷
본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 이중특이적 형식일 수 있다. 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 벤치마크 이중특이적 항체 포맷을 기초로 한다. 이중특이적 형식과 관련하여 본 명세서에 사용된 "기초하는"은 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 동일한 이중특이적 형식의 참조 이중특이적 항체를 취한다는 것을 의미하고, 항원-결합 모이어티 중 하나가 C1에 작동 가능하게 연결된 VH, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 VL을 포함하도록 변형된 것을 제외하고, 상기 C1 및 C2는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합과 관련된다. 관련 기술 분야에 공지된 참조 이중특이적 항체 포맷의 예는 (i) 대칭 Fc를 갖는 이중특이적 항체, (ii) 비대칭 Fc를 갖는 이중특이적 항체, (iii) 추가 항원-결합 모이어티가 부가된 정규 항체, (iv) 이중특이적 항체 단편, (v) 정규 항체 단편 추가의 항원-결합 모이어티가 부가되고, (vi) 인간 알부민 또는 인간 알부민-결합 펩티드가 부가된 이중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
BsIgG는 각각의 항원에 대해1가이며 단일 숙주 세포에서 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄의 공발현에 의해 생성될 수 있다. 첨가 IgG는 경쇄 또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 추가적인 항원-결합 단위를 첨가함으로써 이중특이적 IgG를 형성하도록 조작된다. 추가의 항원-결합 단위는 단일 도메인 항체 (비-페어링된 VL 또는 VH), 예컨대 DVD-Ig, 페어링된 항체 가변 도메인 (예를 들어, Fv 또는 scFv) 또는 조작된 단백질 스캐폴드일 수 있다. BsIgG의 항원 결합 단위, 특히 쌍을 이룬 VH-CH1/VL-CL은 본 명세서에 개시된 바와 같이 CH1을 C1로 대체하고 CL을 C2로 대체하여 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공하도록 변형될 수 있다.
이중특이적 항체 단편은 항체로부터 유래되지만 항체 불변 도메인의 일부 또는 전부가 없는 항원-결합 단편이다. 이러한 이중특이적 항체 단편의 예는 예를 들어 단일 도메인 항체, Fv, Fab 및 diabody 등을 포함한다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 항원 결합 부위 (예를 들어, 특정 쌍을 이룬 VH-CH1/VL-이중특이적 항체 단편에서 CL)은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 (예를 들어 VH-C1/CL-C2)를 포함하도록 변형될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 "전체" 항체의 포맷, 예컨대 전체 IgG 또는 IgG-유사 분자 및 작은 재조합 포맷을 기초로 하고, 탠덤 단일 사슬 가변 단편 분자 (taFvs), 디아보디 (Dbs), 단일 쇄 디아보디 (scDbs) 및 이들의 다양한 다른 유도체 (참조: Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632). 이중특이적 항체의 예는 쿼드로마, 화학적으로 결합된 Fab (단편 항원 결합) 및 BiTE (이중특이적 T 세포 결합자)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포맷을 기초로 한다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 다음으로부터 선택된 이중특이적 형식에 기초한다. 트리오맙; 하이브리드 하이브리도마 (quadroma); 다중 특이적 안티칼린 플랫폼 (Pieris); 디아보디 (Diabody); 단일 쇄 디아보디 (Diabody); 직렬 단일 사슬 Fv 단편; TandAbs, 삼중특이적 Ab (Affimed); 다트 (Dart) (이중 친화성 재 타겟팅; Macrogenics); 이중특이적 Xmab (Xencor); 이중특이적 T 세포 참여자 (Bites; Amgen; 55 kDa); 트리플보디 (Triplebody); 트리보디 (Tribody) (Fab-scFv) 융합 단백질 (CreativeBiolabs) 다기능 재조합 항체 유래물; 듀오보디 플랫폼 (젠맙 (genmab)); 도크 및 잠금 플랫폼; 손잡이 구멍 (KIH) 플랫폼; 인간화 이중특이적 IgG 항체 (REGN1979) (Regeneron); Mab2 이중특이적 항체 (F-Star); DVD-Ig (이중 가변 도메인 면역글로불린) (Abbvie); 카파람다체; TBTI (4가 이중특이적 탠덤 Ig); 및 CrossMab.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 하기를 포함하는 이중특이적 IgG-유사 항체 (BsIgG) 로부터 선택된 이중특이적 포맷을 기초로 한다. CrossMab; DAF (two-in-one); DAF (four-in-one); 두타마브; DT-IgG; 놉-인-홀 공통적인 LC; 놉-인투-홀 어셈블리; 하전 쌍; Fab-Arm 교환; 씨드보디; 트리오맙; LUZ-Y; Fcab; 카파람다체; 및 직교-Fab. 이중특이적 항체 포맷에 대한 자세한 설명은 Spiess C., Zhai Q. 및 Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, 에 있고, 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 이중특이적 형식을 기초로 하고, DVD-IgG; IgG (H)-scFv; scFv-(H) IgG; IgG (L)-scFv; scFV-(L) IgG; IgG (L, H)-Fv; IgG (H)-V; V (H)-IgG; IgG (L)-V; V (L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; Zybody; 및 DVI-IgG (four-in-one)를 포함하는 추가의 항원-결합 모이어티를 갖는 IgG-부착 항체로부터 선택된다(Id. 참조).
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 Nanobody; Nanobody-HAS; BiTE; Diabody; DART; TandAb; scDiabody; sc-Diabody-CH3; Diabody-CH3; Triple Body; Mini항체; Minibody; TriBi minibody; scFv-CH3 KIH; Fab-scFv; scFv-CH-CL-scFv; F(ab')2; F(ab')2-scFv2; scFv-KIH; Fab-scFv-Fc; Tetravalent HCAb; scDiabody-Fc; Diabody-Fc; Tandem scFv-Fc; 및 Intrabody (Id. 참조)를 포함하는 이중특이적 항체 단편을 기초로 한다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 Dock and Lock; ImmTAC; HSAbody; scDiabody-HAS; 및 탠덤 scFv-독소 (Id. 참조)과 같은 이중특이적 형식을 기초로 한다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 IgG-IgG; Cov-X-보디; 및 scFv1-PEG-scFv2 (Id. 참조) 를 포함하는 이중특이적 항체 접합체를 기초로 한다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티는 Ig-유사 구조와 연관될 수 있다. Ig-유사 구조는 항원-결합을 위한 2개의 아암 및 회합 및 안정화를 위한1개의 줄기를 갖는 Y형 구조물을 갖는 자연 항체와 유사하다. 자연 항체와의 유사성은 우수한 생체 내 약동학, 원하는 면역학적 반응 및 안정성 등과 같은 다양한 이점을 제공할 수 있다. 본 명세서에서 제공된 제2 항원-결합 부분과 관련된 제1 항원-결합 부분을 포함하는 Ig-유사 구조가 밝혀졌다. 본 명세서에 제공된 모이어티는 Ig (가령 IgG)의 그것과 필적하는 열 안정성을 갖는다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 Ig-유사 구조는 최소한 자연 IgG의 구조의 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%이다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4 개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다: i) VH1-C1-Hinge-CH2-CH3; ii) VL1-C2; iii) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3 및 iv) VL2-CL (상기 C1 및 C2는 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합, 및 2개의 힌지 영역 및/또는 2개를 포함하는 이량체를 형성할 수 있음). CH3 도메인은 이량체화를 촉진할 수 있는, 하나 이상의 쇄간 결합을 형성할 수 있다.
이중특이적 복합체의 항원성 특이성
본 명세서에 제공된 이중특이적 복합체는 2개의 항원 특이성을 갖는다. 제1 및 제2 항원-결합 모이어티는 각각 제1 및 제2 항원 특이성에 관한 것이다.
제1 및 제2 항원 특이성은 동일할 수 있는데, 즉, 제1 및 제2 항원-결합 모이어티는 동일한 항원 분자 또는 동일한 항원 분자의 동일한 에피토프에 결합한다.
대안적으로, 제1 및 제2 항원 특이성은 구별될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 항원-결합 모이어티는 상이한 항원에 결합할 수 있다. 이러한 이중특이적 폴리펩티드 복합체는, 예를 들어 2개의 상이한 항원을 근접하게 하여 그들의 상호작용을 촉진 시키는데 유용할 수 있다(예를 들어, 면역 세포를 종양 항원 또는 병원체 항원에 근접하여 면역 시스템에 의한 그러한 항원의 인식 또는 제거를 촉진시키는 것). 다른 예에서, 제1 및 제2 항원-결합 모이어티는 하나의 항원의 상이한 (및 선택적으로 겹치지 않는) 에피토프에 결합할 수 있다. 이는 표적 항원, 특히 돌연변이에 민감한 항원 (예: 바이러스 항원)의 인식 또는 결합을 향상시키는 데 도움이 될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 이중특이적 복합체의 항원 특이성 중 하나는 T-세포 특이적 수용체 분자, 및/또는 자연 살해 세포 (NK 세포) 특이적 수용체 분자에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 항원-결합 모이어티 중 하나는 CD3, TCR, CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 또는 CD95에 특이적으로 결합할 수 있고, 다른 하나는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 이중특이적 복합체의 항원 특이성 중 하나는 CD3에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제1 항원-결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제2 항원-결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, 이중특이적 복합체의 항원-결합 모이어티는 항-CD3 항체로부터 유래된 VH1 및 VL1을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 다음의 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 서열을 포함한다: 2/1, 3/4 /, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 28/3, 29/3, 30/12, 31/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71 , 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92 /, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 및 138/139, 및 항-CD3 항체 (T3)의 가변 영역은 표20에 나타낸 바와 같이 TCR 불변 영역에 융합된다.
어떤 실시예에서, 본 명세서에 제공된 이중특이적 복합체의 항원 특이성 중 하나는 T-세포 특이적 수용체 분자, 및/또는 자연 살해 세포 (NK 세포) 특이적 수용체 분자에 관한 것이고, 다른 항원 특이성은 종양 관련 표면 항원에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제1 항원-결합 모이어티는 T-세포 특이적 수용체 분자, 및/또는 자연 살해 세포 (NK 세포) 특이적 수용체 분자 (예: CD3)를 포함하고, 제2 항원-결합 부분은 종양 관련 항원 (예: CD19)에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 그 반대 일 수 있다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 서열번호 22/12/24/23 (E17, IgG1), 25/12/26/23 (E17, IgG4) 및 25/12/27/23 (F16)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4-서열 조합을 포함한다. 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합하고, 제2 항원 결합 모이어티는 CD19에 결합한다. E17의 디자인은 이중특이적 2가 항체이고, F16의 디자인은 2회 반복의 항-CD19 항체 Fb를 갖는 이중특이적 및 3가 항원-결합 복합체이다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 CTLA-4에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티 및 PD-1에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티, 또는 그 반대를 포함한다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 다음을 포함하는 4 개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다: i) 제1 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH1; ii) 제2 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VL1; iii) 통상적인 항체 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH2, 및 iv) 통상적인 항체 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VL2. 특정 실시예에서, 제1 키메라 불변 영역은 각각 상기 정의된 바와 같은 C1-힌지-CH2-CH3을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 키메라 불변 영역은, 상기 정의된 바와 같이 C2를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 통상적인 항체 중쇄 불변 영역은 각각 상기 정의된 바와 같은 CH1-힌지-CH2-CH3을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 통상적인 항체 경쇄 불변 영역은 상기 정의된 바와 같이 CL을 포함할 수 있다.
다음의 구조물 이름은 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다: E17-Design_2-QQQQ 및 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP; F16-Design-2-QQQQ 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP; U6T5.G25.IgG4 및 W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP; 및 U6T1.G25R.IgG4 및 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP.
제조방법
본 개시 내용은 폴리펩티드 복합체를 암호화하는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 및 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다.
본 명세서에 사용 된 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 달리 지칭되지 않는 한, 특정 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환), 대립 유전자, 오르쏘로그, SNPs 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 변성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-기재 및/또는 데옥시 이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술을 사용하여 구축될 수 있다. 이를 위해, 모 항체의 항원-결합 모이어티 (CDR 또는 가변 영역)를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 단리 및 서열 분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 마찬가지로, TCR 불변 영역을 코딩하는 DNA가 또한 수득될 수 있다. 예로서, 가변 도메인 (VH)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 제1 TCR 불변 영역 (C1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 수득되고 작동 가능하게 연결되어 숙주 세포에서의 전사 및 발현이 제1 폴리펩티드를 생성할 수 있게 한다. 유사하게, VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 제2 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해 C1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 필요한 경우, 하나 이상의 스페이서에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 것은 또한 원하는 생성물의 발현을 허용하기 위해 다른 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다.
인코딩 폴리 뉴클레오타이드 서열은 임의로 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 서열에 추가로 작동 가능하게 연결되어 제1 및 제2 폴리펩티드의 발현 또는 생성이 가능하고 적절한 제어하에 있을 수 있다.
인코딩 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 당 업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 다른 구체적예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 당 업계에 공지된 상동 재조합에 의해 생성될 수 있다. 많은 벡터를 사용할 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 (예: SV40, CMV, EF-1α) 및 전사 종결 서열.
본 명세서에 사용 된 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 그 단백질의 발현을 야기하도록 작동 가능하게 삽입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 전형적으로, 구조물은 또한 적절한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자는 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 부위 지향적 변형 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'-플랭킹 영역에 위치한 조절 서열을 포함할 수 있고, 숙주 세포에서 원하는 전사체/유전자를 발현 할 수 있는 방식으로 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어있다. 벡터는 숙주 세포 내에서 운반하는 유전자 요소가 발현되도록 숙주 세포를 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체를 포함한다. 예를 들어, 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체 (PAC), 람다 파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지 및 동물 바이러스가 있다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 범주에는 레트로 바이러스 (렌티 바이러스 포함), 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 (가령 단순 포진 바이러스), 폭스 바이러스, 바큘로 바이러스, 유두종 바이러스 및 파포바 바이러스 (가령 SV40)가 포함된다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 가능한 요소 및 리포터 유전자를 포함하여, 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포좀 또는 단백질 코팅을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포로의 진입을 돕는 물질을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 벡터 시스템은 포유류, 박테리아, 효모 시스템 등을 포함한다. 그리고 하기와 같은 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. PALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABA, pWPXL p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 등 기타 실험 실적 및 상업적으로 이용 가능한 벡터. 적합한 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다 (가령, 복제 결함 레트로 바이러스, 아데노 바이러스 및 아데노 관련 바이러스).
본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 명세서에 사용된 어구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
본 명세서의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 생물 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵 생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 진균, 예를 들어, 대장균 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia)와 같은 장내 세균, 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 쉬겔라 (Shigella), 고초균 (B. subtilis) 및 바실러스 리체니포미스 (B. licheniformis)와 같은 바실리 (Bacilli), 슈도모나스 에루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)이 있다.
원핵 생물에 더하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 생물 미생물은 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 제빵 효모는 저등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 본 명세서에서 다수의 다른 속, 종 및 균주를 일반적으로 이용 가능하고 유용하다. 키조사카로마이세스 폼베(chizosaccharomyces pombe)와 같은; 클루베로마이세스 (Kluyveromyces) 호스트, 예를 들어, 클루베로마이세스 락티스 (K. lactis), 클루베로마이세스 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC12,424), 클루베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC16,045), 클루베로마이세스 위커라미 (K. wickeramii )(ATCC 24,178), 클루베로마이세스 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 클루베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루베로마이세스 써모톨러런스(K. thermotolerans) 및 클루베로마이세스 야로위아 (K. marxianus; yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP183,070); 칸디다 (Candida); 트리코더마 리시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크레사 (Neurospora crassa); 슈바니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈바니오마이세스 (Schwanniomyces); 및 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스퍼질러스 니둘란스 (A. nidulans)및 아스퍼질러스 니거 (A. niger)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주.
글리코실화된 폴리펩티드 복합체의 발현에 적합한 숙주 세포, 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 이와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda, 애벌레), 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)가 확인되었습니다. 형질 감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 Autographa californica NPV의 L-1 변이체 및 Bombyx mori NPV의 Bm-5 균주가 공지되어 있고, 이러한 바이러스는 본 발명에 따른 바이러스, 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질 감염을 위한 바이러스로서 사용될 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 이용될 수 있다.
그러나, 척추 동물 세포에 대한 관심이 가장 높았으며, 배양 (조직 배양)에서 척추 동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주의 예는 다음에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통이다. SV40 (COS-7, ATCC CRL1651); Expi293과 같은 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양에서 성장을 위해 서브 클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL10); 중국 햄스터 난소 세포 /-DHFR (CHO, Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포 주 (Hep G2).
숙주 세포는 상기 기재된 발현으로 형질 전환되고, 클로닝 벡터는 프로모터를 유도하거나, 형질 전환체를 선택하거나, 클로닝 벡터를 증폭시키기에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제조를 위해, 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 미디어로는 Ham 's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM), (Sigma)가 숙주세포 배양에 적합하다. 또한, Ham et al., Meth. Enz 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102: 255 (1980), U.S. Pat. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는. US Pat. Re. 30,985가 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이러한 미디어는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 버퍼 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: 겐타마이신TM 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위에서 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 포도당 또는 동등한 에너지원이 보충될 수 있다. 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이고, 당업자에게 명백할 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건하에 본 명세서에 제공된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제조 방법을 제공한다. a) 숙주 세포에 도입하는 단계: 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 N-말단에서 C-말단으로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 및 N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리 뉴클레오타이드 C1 및 C2 사이의 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 C1 및 C2의 이량체를 안정화시킬 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 가지며; b) 숙주 세포가 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
특정 실시예에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제조 방법을 제공한다. a) 숙주 세포에 도입하는 단계: 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 N-말단에서 C-말단으로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 및 N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기와 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있으며, 비-천연 쇄간 결합은 C1 및 C2의 이량체를 안정화시킬 수 있으며, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 항원-결합 모이어티가 천연 Fab 대응물인 경우와 달리 미스페어링을 감소시키고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 갖고, 제2 항체는 제2 항원 특이성을 가지며, b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
특정 실시예에서, 제조 방법은 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
재조합 기술을 사용할 때, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 세포 내에서 생산될 수 있고, 주변 세포질 공간에서, 또는 배지로 직접 분비된다. 제품이 첫 번째 단계로 세포 내에서 생산되는 경우, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편은 예를 들어, 원심 분리 또는 초여과에 의해 제거된다. 카터 Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 대장균의 주변 세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 기술하고 있다. 간단히 말해서, 세포 페이스트를 약 30 분에 걸쳐 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에서 해동시킨다. 세포 파편은 원심 분리로 제거할 수 있다. 생성물이 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 극한 여과 장치 같은 일반적으로 시판되는 단백질 농도 필터를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 단백질 분해 효소 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위한 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염 물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토 그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전, 염석 및 친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 경우, 단백질 A는 폴리펩티드 복합체에 존재하는 Fc 도메인의 종 및 이소 타입에 따라 친화성 리간드로서 사용될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 폴리펩티드 복합체의 정제에 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만 다른 매트릭스도 이용 가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리 (스티렌디비닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것 보다 빠른 유속과 짧은 처리 시간을 가능하게 한다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커 본드 ABX 수지 (J. T. Baker, N.J. 필립스 버그)는 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼의 분류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 크로마토 그래피, 음이온의 헤파린 SEPHAROSETM 크로마토그래피 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리 아스파르트산 컬럼), 크로마토 포커싱, 회수할 항체에 따라 SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전도 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계 (들) 후에, 관심있는 폴리펩티드 복합체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5 내지 4.5의 pH에서, 바람직하게는 낮은 염 농도 (가령, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행되는 용리 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토 그래피에 적용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 통상적인 방법을 사용하여 고수율로 용이하게 정제될 수 있다. 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 장점 중 하나는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 사이의 유의미하게 감소된 부정합이다. 이는 원치 않는 부산물의 생성을 감소시키고 비교적 간단한 정제 공정을 사용하여 고수율로 고순도 생성물을 얻을 수 있게 한다.
유도체
특정 실시예에서, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 원하는 접합체와의 접합 염기로서 사용될 수 있다.
다양한 접합체가 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 연결될 수 있는 것으로 고려된다. (예를 들어, "접합 백신", 미생물학 및 면역학에 대한 기여한, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989) 참조). 이들 접합체는 다른 방법 중에서도 공유 결합, 친화성 결합, 층간 삽입, 좌표 결합, 복합화, 회합, 배합 또는 첨가에 의해 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 연결될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 하나 이상의 접합체에 결합하기 위해 사용될 수있는 에피토프 결합 부분 외부의 특정 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함하여 접합체에 대한 공유 결합을 촉진할 수 있다.
특정 실시예에서, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 예를 들어 다른 접합체 또는 링커를 통해 간접적으로 또는 간접적으로 접합체에 연결될 수 있다.
예를 들어, 시스테인과 같은 반응성 잔기를 갖는 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 반응 그룹은 예를 들어, 말레이미드, 요오도 아세트아미드, 피리딜 디설파이드 또는 다른 티올-반응성 결합 파트너인 티올-반응제에 연결될 수 있다. (Haugland, 2003, Fluorescent Probes and Research Chemicals의 Molecular Probes Handbook of Molecular Probes, Inc .; Brinkley,1992, Bioconjugate Chem. 3: 2; Garman,1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem.1: 2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).
다른 예에서, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 비오틴에 접합된 후 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 접합체에 추가로 연결되는 링커에 연결될 수 있다. 링커의 예에는 이작용성 커플링제 (bifunctional coupling agents), 예컨대 N-숙신 이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신 이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노 티올란 (IT), 이미도 에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 설레이트), 알데히드 (예: 글루타르 알데히드), 비스-아지도 화합물 (비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (비스-(p-디아조늄 벤조일)-에틸렌 디아민 등), 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 그의 활성 불소 화합물 (예:1,5-디플루오로-2,4-디 니트로벤젠). 특히 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오 네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J.173: 723-737 (1978)) 및 이황화 결합을 제공하기 위한 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
결합은 검출 가능한 표지, 약동학적 변형 모이어티, 정제 모이어티 또는 세포 독성 모이어티일 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 형광 표지 (예: 플루오레세인, 로다 민, 단실, 피코에리 트린 또는 텍사스레드), 효소-기재 표지 (예: 양고추냉이 퍼옥시 다제, 알칼리 포스파타제, 글루코 페라제, 글루코 아밀라제, 리소자임, 당 산화 효소 또는
Figure pct00008
-D-갈락토시다제를 포함할 수 있음), 방사성 동위 원소 (예: 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi 및 32P, 기타 란타나이드, 발광 표지), 크로모포릭 모이어티, 디곡시제닌, 비오틴/아비딘, DNA 분자 또는 검출 용 금을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 접합체는 항체의 반감기를 증가시키는 것을 돕는 PEG와 같은 약동학적 변형 부분일 수 있다. 다른 적합한 중합체로는 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리 비닐 알코올, 폴리 비닐 피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체 등이 포함된다. 특정 실시예에서, 접합체는 자기 비드와 같은 정제 모이어티일 수 있다. "세포 독성 모이어티"는 세포에 유해하거나 세포를 손상시키거나 사멸시킬 수있는 임의의 제제일 수 있다. 세포 독성 모이어티의 예는 탁솔, 시토칼라신 B, 그램시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈 크리스틴, 빈 블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미톡산트론, 미트로마이신, 악티노마이신 D,1-데코카이코스테론 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로 마이신 및 그의 유사체, 항 대사 물질 (가령, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제 (가령, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모마니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로 디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라 사이클린 (가령, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (가령, 닥티노마이신포머) , 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC), 및 유사 분열제 (가령, 빈 크리스틴 및 빈 블라스틴)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
항체, 면역글로불린 또는 이의 단편과 같은 단백질에 대한 접합체의 접합 방법이 발견되며, 예를 들어, 미국 특허 5,208,020; 미국 특허 6,441,163; WO2005037992; WO2005081711; 및 WO2006/034488의 전체 내용을 참조하여 본 명세서에 포함된다.
약제학적 조성물
본 개시는 또한 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제, 및/또는 염은 일반적으로 제제를 포함하는 다른 성분과 화학적, 및/또는 물리적으로 양립 가능하고, 그의 수용자와 생리적으로 양립할 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 약제학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 생체 활성이 허용되고 대상체에게 비독성이다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물에 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체는, 예를 들어, 제약상 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비 수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충제, 산화 방지제, 마취제, 현탁/용해제, 격리 또는 킬레이트제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 비-독성 보조 물질, 당 업계에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함한다.
적합한 성분은 예를 들어 산화 방지제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향료, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 시클로 덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 산화 방지제는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 히드록시 아니솔, 부틸화 히드록시 톨루엔 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 산화 방지제를 포함시키면 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 산화가 감소된다. 이러한 산화 감소는 결합 친화력의 손실을 방지 또는 감소시켜 단백질 안정성을 개선하고 저장 수명을 최대화한다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물이 제공된다.
추가로 예시하기 위해, 제약상 허용되는 담체는 예를 들어, 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 덱스트로스 주사제, 멸균수 주사제, 또는 덱스트로스 및 수유성 링거 주사제와 같은 수성 비히클, 식물성 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩유와 같은 비수성 비히클, 정균 또는 진균성 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장화제, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액과 같은 완충액, 중 황산나트륨과 같은 항산화제, 프로카인 염산염과 같은 국소 마취제카르복시메틸 셀룰로오스나트륨, 히드록시 프로필 메틸셀룰로오스 또는 폴리 비닐피롤리돈과 같은 현탁화제 및 분산제, 폴리소르베이트 80 (TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA (에틸렌디아민 테트라아세트산) 또는 EGTA (에틸렌글리콜 테트라아세트산), 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화 나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산과 같은 격리 또는 킬레이트제를 포함할 수 있다. 담체로서 사용되는 항균제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로 부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시 벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다중 용량 용기의 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 비독성 보조 물질은 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정 화제, 용해성 증강제, 또는 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올 아민올레에이트 또는 시클로 덱스트린과 같은 제제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제제 또는 분말일 수있다. 경구 제제는 표준 등급의 담체, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 폴리비닐피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등을 포함 할 수있다.
특정 실시예에서, 약제학적 조성물은 주 사용 조성물로 제제화된다. 주 사용 약제학적 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주 사용 제제에는 주 사용 멸균 및/또는 비발열성 용액, 동결 건조된 분말과 같은 멸균 건조 용해성 제품, 사용 직전에 용매와 결합될 준비가 된 피하 정제, 주 사용 멸균 현탁액, 멸균 사용 직전에 비히클과 조합 될 수있는 건조 불용성 제품, 및 멸균 및/또는 비발열성 에멀젼을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비-수성일 수 있다.
특정 실시예에서, 단위 용량 비경구 제제는 바늘이 있는 앰풀, 바이알 또는 주사기에 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당 업계에 공지되고 실용되는 바와 같이, 멸균되어야 하고 비발열성이어야 한다.
특정 실시예에서, 멸균 동결 건조된 분말은 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 분말로부터 제조된 분말 또는 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 성분을 개선시키는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 물, 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 포도당, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 용매는 완충액, 예를 들어 시트 레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 일 구현예에서 약중성 pH에서 당업자에게 공지된 다른 완충액을 함유할 수 있다. 후속 멸균 용액 여과 후 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서 동결 건조하여 바람직한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 생성된 용액은 동결 건조를 위해 바이알로 분류될 것이다. 각각의 바이알은 단일 용량 또는 다중 용량의 폴리펩티드 복합체, 본 명세서에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 또는 그의 조성물을 함유할 수 있다. 용량 또는 용량 세트 (가령, 약10%)에 필요한 것보다 소량의 바이알을 과도하게 채우는 것은 정확한 샘플 회수 및 정확한 투여를 용이하게 하기 위해 허용된다. 동결 건조된 분말은 약 4 ℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건하에 저장될 수 있다.
동결 건조된 분말을 물로 재구성한 것은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비-열수 또는 다른 액체에 적합한 담체가 동결 건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 선택된 용법에 따라 달라지며 경험적으로 결정될 수 있다.
처치 방법
치료적 유효량의 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 상태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 치료방법이 제공된다. 특정 실시예에서, 대상체는 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 반응하기 쉬운 장애 또는 상태를 갖는 것으로 확인되었다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 상태의 "치료하는" 또는 "치료"는 상태를 예방 또는 완화시키고, 상태의 발병 또는 발병 속도를 늦추고, 상태가 발전할 위험을 감소시키고, 상태와 관련된 증상의 예방 또는 지연, 상태와 관련된 증상 감소, 또는 종료 조건의 전체 또는 부분의 회귀, 조건을 치료하는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량은, 예를 들어 체중, 연령, 과거 병력, 현재 약물, 대상체의 건강 상태 및 교차 반응, 알레르기, 민감성 및 부작용의 가능성, 뿐만 아니라 질병 발생 경로 및 투여 경로와 같이 당 업계에 공지된 다양한 인자에 의존할 것이다. 복용량은 이들 및 다른 환경 또는 요구 사항에 의해 지시된 바와 같이 당업자 (가령, 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 약 0.01 mg/kg 내지 약100 mg/kg 예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약1 mg/kg의 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약10 mg/kg, 약15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg 또는 약100mg/kg). 이들 중 특정 구체적예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되며, 이러한 구체적예에서 특정 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 실시예에서, 투여량은 치료 과정에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시예에서 초기 투여량은 후속 투여량보다 높을 수 있다. 특정 실시예에서, 투여량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정에 따라 달라질 수 있다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응 (가령, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 또는 몇 개의 분할 용량이 시간에 따라 투여될 수 있다.
본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는, 예를 들어 비경구 (예를 들어, 피하, 복강 내, 정맥 내, 정맥 내 주입, 근육 내 또는 피내 주사 포함) 또는 비경구 (예를 들어, 경구, 비강 내, 안내, 설하, 직장 또는 국소) 경로와 같은 당 업계에 공지된 임의의 경로로 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 의해 치료되는 병태 또는 장애는 암 또는 암성 질환, 자가 면역 질환, 감염성 및 기생충 질환, 심혈관 질환, 신경 병증, 신경 정신병적 상태, 부상, 염증 또는 응고 장애이다.
본 명세서에 사용 된 "암" 또는 "암성 상태"는 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이에 의해 매개되는 임의의 의학적 상태를 말하며, 고형암 및 비고형암, 예컨대 백혈병을 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 "종양"은 고형 덩어리의 종양 및/또는 악성 세포를 지칭한다.
암과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 신생물 또는 악성 세포 성장의 억제 또는 둔화를 지칭할 수 있고, 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이의 발달을 예방 또는 지연시키는 증식 또는 전이, 또는 이들의 일부 조합을 지칭하는 것일 수 있다. 종양과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 종양의 전부 또는 일부를 근절하고, 종양 성장을 억제 또는 둔화 및 전이, 종양의 발달을 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합을 지칭하는 것일 수 있다.
예를 들어, 암을 치료하기 위해 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 용도와 관련하여, 치료 유효량은 종양 성장 억제 또는 둔화암성 상태를 매개하는 세포의 성장 또는 증식 억제, 종양 세포 전이 억제, 종양 또는 암성 질환과 관련된 증상 또는 마커 개선종양 또는 암성 질환의 발병 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합으로서 종양의 전부 또는 일부를 근절할 수 있는 폴리펩티드 복합체의 투여량 또는 농도이다.
특정 실시예에서, 병태 및 장애는 종양 및 암, 예를 들어, 비소 세포 폐암, 소세포 폐암, 신장 세포암, 결장 직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교 모세포종, 자궁 경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 진균 곰팡이, 메르켈세포암 및 기타 혈액 악성 종양, 예컨대 고전적 호지킨 림프종 (CHL), 원발 종격동성 큰 B 세포 림프종, T-세포/조직이 풍부한 B-세포 림프종, EBV-양성 및 음성 PTLD 및 EBV 관련 확산된 대형 B-세포 림프종 (DLBCL), 형질 모세포 림프종, 림프절 외 NK/T-세포 림프종, 비-인두암종 및 HHV8-관련 원발 삼출 림프종, 호지킨 림프종, 원발 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경 교종과 같은 중추 신경계 (CNS)의 신생물을 포함한다.
특정 실시예에서, 병태 및 장애는 CD19 관련 질환 또는 병태, 예컨대 B 세포 림프종, 임의로 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종을 포함하며, 상기 비-호지킨 림프종은 확산성 큰 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 한계 영역 B 세포 림프종 (MZL), 점막 관련 림프 조직 림프종 (MALT), 작은 림프구 림프종 (만성 림프구 백혈병, CLL), 맨틀 세포 림프구 (MCL), 급성 림포블라스틱 백혈병 (ALL) 또는 발덴스트롬 마크로 글로불린 혈증 (WM)을 포함한다.
특정 실시예에서, 질환 및 장애는 CTLA-4 및/또는 PD-1에 의한 면역 반응의 조절을 통해 치료될 수 있는 과증식성 질환 또는 감염성 질환을 포함한다. 과증식성 질환의 예는 고형 종양, 혈액암, 연조직 종양 및 전이성 병변을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료 수단 또는 제제와 함께 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 암이나 종양 또는 진행성 질병 치료에 사용될 때, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 화학 요법, 방사선 요법, 암 치료를 위한 수술 (예를 들어, 종양 절제술), 하나 이상의 항 진통제 또는 화학 요법으로 인한 합병증을 위한 다른 치료법과 함께 투여될 수 있으며, 또는 암 또는 관련된 의학적 장애의 치료에 사용하기 위한 임의의 다른 치료제가 제공될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "조합 투여"는 동일한 약제학적 조성물의 일부로서 동시에, 개별 조성물로서 동시에 또는 별도의 조성물로서 상이한 시점에 투여하는 것을 포함한다. 다른 제제 이전 또는 이후에 투여된 조성물은, 문구가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 조성물 및 제2 작용제가 상이한 경로를 통해 투여되더라도, 해당 제제와 "조합하여" 투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 함께 추가 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 일정에 따라, 또는 Physicians' Desk Reference (Physicians' Desk Reference, 70th Ed (2016)) 또는 당 업계에 잘 알려진 프로토콜에 따라, 추가의 치료제가 투여된다.
특정 실시예에서, 치료제는 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 백신을 사용하여 특정 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인 요법은 또한 면역계에 대한 종양 항원 제시를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 사이토카인 요법의 예는 인터페론-α,-β 및 -γ와 같은 인터페론, 대식세포-CSF, 과립구 대식세포 CSF 및 과립구-CSF와 같은 콜로니 자극 인자, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 및 IL-12와 같은 인터루킨, 종양 괴사 인자 TNF-α 및 TNF-β 를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 면역 억제 표적을 불활성화하는 작용제, 예를 들어 TGF-베타 억제제, IL-10 억제제 및 Fas 리간드 억제제가 또한 사용될 수 있다. 다른 약제 그룹에는 종양 또는 암세포에 대한 면역 반응을 활성화시키는 약제, 예를 들어, 이들은 T 세포 활성화 (가령, CTLA-4, ICOS 및 OX-40과 같은 T 세포 공동 자극 분자의 작용제)를 향상시키고, 이들은 수지상 세포 기능 및 항원 제시능을 향상시킨다.
키트
본 개시 내용은 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시예에서, 키트는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 관심의 표적의 존재 또는 수준을 검출하거나, 또는 포획 또는 농축하는데 유용하다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 키트는 검출 가능한 표지와 접합된 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 키트는 본 명세서에 제공된 비-표지된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하고, 본 명세서에 제공된 비-표지된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 2차 표지된 항체를 추가로 포함한다. 키트는 사용 설명서, 및 키트의 각 성분을 분리하는 패키지를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 명세서에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 기질 또는 장치와 관련된다. 유용한 기판 또는 장치는 예를 들어 자성 비드, 마이크로타이터 플레이트 또는 테스트 스트립일 수 있다. 이는 생물학적 시료에서 표적 분자를 포획 또는 농축하는 면역학적 결합 분석 (예: ELISA), 유용할 수 있다.
하기 실시예는 청구된 발명을 보다 잘 설명하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이하에 기술된 모든 특정 조성물, 재료 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위 내에 속한다. 이들 특정 조성물, 재료 및 방법은 본 발명을 제한하려는 것이 아니라, 단지 본 발명의 범주 내에 속하는 특정 실시예를 예시하기 위한 것이다. 당업자는 본 발명의 능력을 발휘하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 조성물, 재료 및 방법을 개발할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위 내에 여전히 남아있는 동안, 본 명세서에 기술된 절차에서 많은 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명자들의 의도는 그러한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것이다.
키메라 불변 영역의 설계 및 이름 (CBeta/CAlpha)
표18에 따른 템플릿 디자인 서열번호:
(중쇄 (HC)/경쇄 (LC))-IgG1
Design_1 177/176
Design_2 179/178
Design_3 184/183
Design_4 185/183
Design_5 180/176
Design_6 181/178
Design_6a 182/178
Design_7 184/186
Design_8 185/186
키메라 불변 영역 (CBeta/CAlpha)의 도메인 및 서열번호
키메라 불변 영역 이름 및 쇄 서열번호: N-말단에서 C-말단까지의 도메인 및 이들의 서열번호
제1 또는 제2 접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 또는 C2) 제3 접합 도메인+힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
Design_1 HC HCJ1 Cbeta(S56C) CJ'1G1 FcG1
서열번호177 서열번호49 서열번호33 서열번호53 서열번호302
Design_1 LC LCJ1 CAlpha(T49C)
서열번호176 서열번호51 서열번호43
Design_2 HC HCJ2 Cbeta(S56C) CJ'1G1 FcG1
서열번호179 서열번호50 서열번호33 서열번호53 서열번호302
Design_2 LC LCJ2 CAlpha(T49C)
서열번호178 서열번호52 서열번호43
Design_3 HC HCJ3 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호184 서열번호129 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_3 LC LCJ3 Cbeta(S56C)
서열번호183 서열번호308 서열번호33+306
Design_4 HC HCJ4 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호185 서열번호130 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_4 LC LCJ3 Cbeta(S56C)
서열번호183 서열번호308 서열번호33+306
Design_5 HC HCJ1 Cbeta(S56C) (FG-) CJ'1G1 FcG1
서열번호180 서열번호49 서열번호37 서열번호53 서열번호302
Design_5 LC LCJ1 CAlpha(T49C)
서열번호176 서열번호51 서열번호43
Design_6 HC HCJ1 CBeta(S56C)(FG-) CJ'1G1 FcG1
서열번호181 서열번호50 서열번호37 서열번호53 서열번호302
Design_6 LC LCJ2 CAlpha(T49C)
서열번호178 서열번호52 서열번호43
Design_6a HC HCJ2 CBeta(S56C)(DE-FG-) CJ'1G1 FcG1
서열번호182 서열번호50 서열번호41 서열번호53 서열번호302
Design_6a LC LCJ2 CAlpha(T49C)
서열번호178 서열번호52 서열번호43
Design_7 HC HCJ3 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호184 서열번호129 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_7 LC LCJ3 CBeta(S56C)(FG-)
서열번호186 서열번호308 서열번호37+306
Design_8 HC HCJ4 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호185 서열번호130 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_8 LC LCJ3 CBeta(S56C)(FG-)
서열번호186 서열번호308 서열번호37+306
글리코실화 부위가 없는 Design_2 (CBeta/CAlpha)의 설계 및 명칭
Sample 서열번호 (HC-CBeta/LC-CAlpha)
HC/LC
Design_2-QQQQ 188/187 (IgG1)
196/187 (IgG4)
Design_2-AAAA 190/189 (IgG1)
Design_2-QSKE 192/191 (IgG1)
Design_2-ASKE 192/193 (IgG1)
Design_2-QQQQQ 195/194 (IgG1)
글리코실화 부위가 없는 Design_2 (CBeta/CAlpha)의 도메인 및 서열번호
복합체명 및 쇄 서열번호 : N-말단에서 C-말단까지의 도메인 및 이들의 서열번호
제1 또는 제2 접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 또는 C2) 제3 접합 도메인+힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
Design_2-QQQQ (IgG1) HC HCJ2 CBeta(S56C) (N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호188 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_2-QQQQ (IgG1) LC LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q)
서열번호187 서열번호52 서열번호44
Design_2-QQQQ (IgG4) HC HCJ2 CBeta(S56C) (N69Q) CJ'1G4 FcG4
서열번호196 서열번호50 서열번호34 서열번호54 서열번호303
Design_2-QQQQ (IgG4) LC LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+N79Q)
서열번호187 서열번호52 서열번호44
Design_2-AAAA (IgG1) HC HCJ2 CBeta(S56C) (N69A) CJ'1G1 FcG1
서열번호190 서열번호50 서열번호35 서열번호53 서열번호302
Design_2-AAAA (IgG1) LC LCJ2 CAlpha(T49C) (N34A+N68A+N79A)
서열번호189 서열번호52 서열번호45
Design_2-QSKE (IgG1) HC HCJ2 CBeta(S56C) (N69E) CJ'1G1 FcG1
서열번호192 서열번호50 서열번호36 서열번호53 서열번호302
Design_2-QSKE (IgG1) LC LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68S+N79K)
서열번호191 서열번호52 서열번호46
Design_2-ASKE (IgG1) HC HCJ2 CBeta(S56C) (N69E) CJ'1G1 FcG1
서열번호192 서열번호50 서열번호36 서열번호53 서열번호302
Design_2-ASKE (IgG1) LC LCJ2 CAlpha(T49C) (N34A+N68S+N79K)
서열번호191 서열번호52 서열번호47
Design_2-QQQQQ (IgG1) HC HCJ2 CBeta(S56C) (N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호195 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_2-QQQQQ (IgG1) LC LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+N79Q+N61Q)
서열번호194 서열번호52 서열번호 48
키메라 불변 영역의 설계 및 이름 (CBeta/Cpre-Alpha)
표18 (IgG1) 기반 템플릿 서열 파일 서열번호:


PreTCR_Design_B 		Design_1_Pre_TCR_ Conjunction'1
Design_2_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys10
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys11
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys12
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys13
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys14
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys15
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys1_4L4T_1
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys2_4L4T_2
Design_10_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys4		 198/197
200/199
202/201
203/201
203/204
205/204
206/204
208/207
208/209
211/210
PreTCR_Design_C PreTCR_Design_5_crossed_1PreTCR_Design_6_crossed_1 213/212
213/215
PreTCR_Design_D PreTCR_Design_5_crossed_2PreTCR_Design_6_crossed_2 214/212
214/215
키메라 불변 영역의 설계 및 이름 (CBeta/Cpre-Alpha)
복합체명 및 쇄 서열번호: N-말단에서 C-말단까지의 도메인 및 이들의 서열번호
제1 또는 제2접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 또는 C2) 제3 접합 도메인+힌지 (CJ') 이량체화 영역(D)
Design_1_Pre_TCR_ Conjunction'1 HC HCJB CBeta(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호198 서열번호50 서열번호84 서열번호53 서열번호302
Design_1_Pre_TCR_ Conjunction'1 LC LCJB CPreAlpha(N50Q)
서열번호197 서열번호309 서열번호83
Design_2_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys10 HC HCJB Cbeta(S76C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 200 서열번호50 서열번호319 서열번호53 서열번호302
Design_2_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys10 LC LCJB CPreAlpha (Y59C)(N50Q)
서열번호199 서열번호309 서열번호311
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys11 HC HCJB Cbeta(F13C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 202 서열번호50 서열번호320 서열번호53 서열번호302
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys11 LC LCJB CPreAlpha (A13C)(N50Q)
서열번호 201 서열번호309 서열번호312
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys12 HC HCJB Cbeta(S16C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 203 서열번호50 서열번호321 서열번호53 서열번호302
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys12 LC LCJB CPreAlpha (A13C)(N50Q)
서열번호 201 서열번호309 서열번호312
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys13 HC HCJB Cbeta(S16C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 203 서열번호50 서열번호321 서열번호53 서열번호302
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys13 LC LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q)
서열번호 204 서열번호309 서열번호313
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys14 HC HCJB Cbeta(A18C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 205 서열번호50 서열번호322 서열번호53 서열번호302
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys14 LC LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q)
서열번호 204 서열번호309 서열번호313
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys15 HC HCJB Cbeta(E19C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 206 서열번호50 서열번호323 서열번호53 서열번호302
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys15 LC LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q)
서열번호 204 서열번호309 서열번호313
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys1_4L4T_1 HC HCJB Cbeta(S56C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 208 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys1_4L4T_1 LC LCJB CPreAlpha (S62C)(N50Q)
서열번호 207 서열번호309 서열번호314
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys2_4L4T_2 HC HCJB Cbeta(S56C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 207 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys2_4L4T_2 LC LCJB CPreAlpha (T65C)(N50Q)
서열번호 209 서열번호309 서열번호315
Design_10_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys4 HC HCJB Cbeta(A11C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 211 서열번호50 서열번호324 서열번호53 서열번호302
Design_10_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys4 LC LCJB CPreAlpha (I16C)(N50Q)
서열번호 210 서열번호309 서열번호316
PreTCR_Design_5_crossed_1 HC
서열번호 213 HCJC CPreAlpha
(S11C)(N50Q) 		CJ'2G1 FcG1
PreTCR_Design_5_crossed_1 LC 서열번호132 서열번호313 서열번호134 서열번호302
서열번호 212 LCJC Cbeta (N69Q, S16C)
PreTCR_Design_6_crossed_1 HC 서열번호50 서열번호321+306
서열번호 213
PreTCR_Design_6_crossed_1 LC HCJC CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G4 FcG4
서열번호215 서열번호132 서열번호313 서열번호134 서열번호303
PreTCR_Design_5_crossed_2 HC LCJC Cbeta(N69Q, A18C)
서열번호 214 서열번호50 서열번호322+306
PreTCR_Design_5_crossed_2 LC
서열번호 212 　HCJD CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1
PreTCR_Design_6_crossed_2 HC 서열번호133 서열번호313 서열번호134 서열번호302
서열번호 214 LCJC Cbeta (N69Q, S16C)
PreTCR_Design_6_crossed_2 LC 서열번호50 서열번호 321+306
서열번호 215 　HCJD CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1
키메라 불변 영역의 디자인 및 이름 (Gamma/Delta)
표15 (IgG1) 기반 템플릿 디자인의 구성 HC/LC에서의 서열번호
dg_Design_1 dg_Design_1 234/233


dg_Design_2 		dg_Design_2
dg_Design_2_no_Glyco
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco		 232/231
216/215
218/217
220/219
222/221
224/223
226/225
227/223
229/228
229/230
dg_Design_3 dg_crossed_Design_1 236/235
dg_Design_4 dg_crossed_Deisng_2 238/237
키메라 불변 영역의 도메인 및 서열번호 (CGamma/CDelta)
복합체명 및 쇄 서열번호: N-말단에서 C-말단까지의 도메인 및 이들의 서열번호
제1 또는 제2접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 또는 C2) 제3 접합 도메인+ 힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
dg_Design_1 HC HCJ4 CGamma CJ'3G1 FcG1
서열번호 234 서열번호117 서열번호113 서열번호121 서열번호302
dg_Design_1 LC LCJ4 CDelta
서열번호 233 서열번호119 서열번호310
dg_Design_2 HC HCJ5 CGamma CJ'3G1 FcG1
서열번호 232 서열번호118 서열번호113 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2 LC LCJ5 CDelta
서열번호 231 서열번호120 서열번호115
dg_Design_2_no_Glyco HC HCJ5 CGamma (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호216 서열번호118 서열번호114 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_no_Glyco LC LCJ5 CDelta(N16Q+N79Q)
서열번호 215 서열번호120 서열번호116
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco HC HCJ5 CGamma(T12C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 218 서열번호118 서열번호333 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco LC LCJ5 CDelta (N16C) (N79Q)
서열번호217 서열번호120 서열번호325
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco HC HCJ5 CGamma (Q57C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 220 서열번호118 서열번호334 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco LC LCJ5 CDelta (V50C) (N16Q+ N79Q)
서열번호 219 서열번호120 서열번호326
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco HC HCJ5 CGamma　 (M62C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호222 서열번호118 서열번호335 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco LC LCJ5 CDelta　 (D46C) (N16Q+ N79Q)
서열번호221 서열번호120 서열번호327
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco HC HCJ5 CGamma(S17C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호224 서열번호118 서열번호336 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco LC LCJ5 CDelta　 (F12C) (N16Q+ N79Q)
서열번호 223 서열번호120 서열번호328
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco HC HCJ5 CGamma(F14C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호226 서열번호118 서열번호337 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco LC LCJ5 CDelta(M14C) (N16Q+ N79Q)
서열번호 225 서열번호120 서열번호329
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco HC HCJ5 CGamma (E20C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 227 서열번호118 서열번호338 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco LC LCJ5 CDelta　 (F12C) (N16Q+ N79Q)
서열번호 223 서열번호120 서열번호328
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco HC HCJ5 CGamma (A19C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 229 서열번호118 서열번호339 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco LC LCJ5 CDelta(F87C) (N16Q+ N79Q)
서열번호 228 서열번호120 서열번호330
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco HC HCJ5 CGamma (A19C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 229 서열번호118 서열번호339 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco LC LCJ5 CDelta (E88C) (N16Q+ N79Q)
서열번호 230 서열번호120 서열번호331
dg_crossed_Design_1 HC HCJ6 CDelta CJ'4G1 FcG1
서열번호 236 서열번호123 서열번호 332 서열번호127 서열번호302
dg_crossed_Design_1 LC LCJ6 CGamma
서열번호 235 서열번호125 서열번호340
dg_crossed_Design_2 HC HCJ7 CDelta CJ'4G1 FcG1
서열번호 238 서열번호124 서열번호332 서열번호127 서열번호302
dg_crossed_Design_2 LC LCJ7 CGamma
서열번호 237 서열번호126 서열번호340
예시적인 키메라 불변 영역에 대한 서열
템플릿 디자인
CAlpha/CBeta 쇄의
유형 		서열번호 서열
Design_1 (IgG1)
normal 		LC 176 LCJ1-CAlpha(T49C) KRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 177 HCJ1-CBeta(S56C)-CJ'1G1-Fc(G1) SSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_2 (IgG1)
normal 		LC 178 LCJ2-CAlpha(T49C) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 179 HCJ2-CBeta(S56C)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_5 (IgG1)
normal 		LC 176 LCJ1-CAlpha(T49C) KRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 180 HCJ1-CBeta(S56C)(FG-DE+)-CJ'1G1-Fc(G1) SSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_6 (IgG1)
normal 		LC 178 LCJ2-CAlpha(T49C) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 181 HCJ2-CBeta(S56C)(FG-DE+)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_6a (IgG1)
normal 		LC 178 LCJ2-CAlpha(T49C) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 182 HCJ2-CBeta(S56C)(FG-DE+)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQSGRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_3 (IgG1)
crossed 		LC 183 LCJ3-CBeta(S56C) KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
HC 184 HCJ2-CBeta(S56C)(FG-DE-)-CJ'1G1-Fc(G1) SSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_4 (IgG1)
crossed 		LC 183 LCJ4-CBeta(S56C) KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
HC 185 HCJ4-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) SSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_7 (IgG1)
crossed 		LC 186 LCJ3-CBeta(S56C)(FG-DE+) KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
HC 184 HCJ3-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) SSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_8 (IgG1)
crossed 		LC 186 LCJ4-CBeta(S56C)(FG-DE+) KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
HC 185 HCJ4-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) SSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_2-QQQQ (IgG1) 		LC 187 LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 188 HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_2-AAAA (IgG1) 		LC 189 LCJ2-CAlpha(T49C) (N34A+N68A+ N79A) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSAKSDFACANAFANSIIPEDTFFPSPESS
HC 190 HCJ2-CBeta(S56C) (N69A)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_2-QSKE (IgG1) 		LC 191 LCJ2-CAlpha(T49C) ( N34Q+N68S+ N79K) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS
HC 192 HCJ2-CBeta(S56C) (N69E)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_2-ASKE (IgG1) 		LC 193 LCJ2-CAlpha(T49C) ( N34A+N68S+ N79K) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS
HC 192 HCJ2-CBeta(S56C)(N69E)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_2-QQQQQ (IgG1) 		LC 194 LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q+ N61Q) KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSQSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 195 HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_2-QQQQ (IgG4) 		LC 187 KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 196 HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G4-Fc(G4) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Pre알파-베타 디자인 쇄의
이름 		서열
번호 		서열
Design_1_Pre_TCR_Conjunction'1 LC 197 LCJB-CPreAlpha(N50Q) KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 198 HCJB-CBeta(N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_2_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys10 LC 199 LCJB-CPreAlpha (Y59C) (N50Q) KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTCGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 200 HCJB-CBeta(S76C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALCSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys11 LC 201 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (A13C) (N50Q) KPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 202 HCJB-CBeta(F13C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVCEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys12 LC 201 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (A13C) (N50Q) KPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 203 HCJB-CBeta(S16C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys13 LC 204 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S11C) (N50Q) KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 203 HCJB-CBeta(S16C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys14 LC 204 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S11C) (N50Q) KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 205 HCJB-CBeta(A18C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys15 LC 204 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S11C) (N50Q) KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 206 HCJB-CBeta(E19C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEACISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys1_4L4T_1 LC 207 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S62C) (N50Q) KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPCPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 208 HCJB-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys2_4L4T_2 LC 209 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (T65C) (N50Q) KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPACDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 208 HCJB-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Design_10_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys4 		LC 210 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (I16C) (N50Q) KPTGVGGTPFPSLAPPCMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 211 HCJB-CBeta(A11C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) LEDLKNVFPPEVCVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PreTCR_Design5_crossed_1 Light 212 VL(CD3)-HCJB-CBeta (N69Q, S16C)-CJ'1G KLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
Heavy (Conjunction more antibody) 213 HCJC-CPreAlpha (S11C, N50Q)-CJ'2G1-Fc SSASGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PreTCR_Design_5_crossed_2 Light 212 VL(CD3)-HCJB-CBeta (N69Q, S16C)-CJ'1G KLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
Heavy (Conjunction more TCR) 214 HCJD-CPreAlpha (S11)-CJ'2G1-Fc SSPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PreTCR_Design_6_crossed_1 Light 215 VL(CD3)-LCJC-CBeta (A18C, N69Q) KLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
Heavy (Conjunction more antibody) 213
PreTCR_Design_6_crossed_2 Light 215 KLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
Heavy (Conjunction more TCR) 214
델타-감마 디자인 쇄
이름 		서열번호 서열
dg_Design_2_no_Glyco LC 215 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (N16Q+N79Q) EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 216 HCJ5-CGamma-CJ'3G1-Fc(G1) (N65Q) TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco LC 217 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (N16C) (N79Q) EPRSQPHTKPSVFVMKCGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 218 HCJ5-CGamma (T12C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPCIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco LC 219 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (V50C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 220 HCJ5-CGamma (Q57C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco LC 221 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (D46C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFCPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 222 HCJ5-CGamma (M62C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTCKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

dg_Design_2_Cys2_no_Glyco 		LC 223 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (F12C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 224 HCJ5-CGamma (S17C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPCIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco LC 225 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (M14C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVFVCKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 226 HCJ5-CGamma (F14C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTICLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

dg_Design_2_Cys3_no_Glyco 		LC 223 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (F12C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 227 HCJ5-CGamma (E20C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPSIACTKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco LC 228 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (F87C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDCE
HC 229 HCJ5-CGamma (A19C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco LC 230 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (E88C) (N16Q+ N79Q) EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFC
HC 229 HCJ5-CGamma (A19C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

dg_Design_2 		LC 231 VL(CD3)-LCJ5-CDelta EPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
HC 232 HCJ5-CGamma-CJ'3G1-Fc(G1) TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_Design_1 LC 233 VL(CD3)-LCJ4-CDelta KPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
HC 234 HCJ4-CGamma-CJ'3G1-Fc(G1) SSASLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_crossed_Design_1 LC 235 VL(CD3)-LCJ6-CGamma KDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
HC 236 HCJ6-CDelta-CJ'4G1-Fc(G1) SSRSQPHTKPSVFVMK Q GTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAI C ISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHD Q KTVHSTDEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
dg_crossed_Design_2 LC 237 VL(CD3)-LCJ7-CGamma KDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
HC 238 HCJ7-CDelta-CJ'4G1-Fc(G1) EPRSQPHTKPSVFVMK Q GTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAI C ISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHD Q KTVHSTDEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
예시적인 폴리펩티드 복합체에 대한 서열
알파-베타 디자인 쇄
이름 		서열번호 서열
T3-Design_1 (IgG1)
normal 		LC 1 VL(CD3)-LCJ1-CAlpha(T49C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 2 VH(CD3)-HCJ1-CBeta(S56C)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
T3-Design_2 (IgG1)
normal 		LC 3 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 4 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_5 (IgG1)
normal 		LC 1 VL(CD3)-LCJ1-CAlpha(T49C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 5 VH(CD3)-HCJ1-CBeta(S56C)(FG-DE+)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_6 (IgG1)
normal 		LC 3 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 6 VH(CD3) - HCJ2-CBeta(S56C)(FG-DE+)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_6a (IgG1)
normal 		LC 3 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 7 VH(CD3) - HCJ2-CBeta(S56C)(FG-DE-)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQ--SG--RYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_3 (IgG1)
crossed 		LC 8 VL(CD3)-LCJ3-CBeta(S56C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
HC 9 VH(CD3)-HCJ3-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_4 (IgG1)
crossed 		LC 8 VL(CD3)-LCJ4-CBeta(S56C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
HC 10 VH(CD3) -HCJ4-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_7 (IgG1)
crossed 		LC 11 VL(CD3)-LCJ3-CBeta(S56C)(FG-DE+) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
HC 9 VH(CD3) -HCJ3-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK


T3-Design_8 (IgG1)
crossed 		LC 11 VL(CD3)-LCJ4-CBeta(S56C)(FG-DE+) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
HC 10 VH(CD3) -HCJ4-CAlpha(T49C)-CJ'2G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_2-QQQQ (IgG1) 		LC 12 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 13 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_2-AAAA (IgG1) 		LC 14 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) (N34A+N68A+ N79A) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSAKSDFACANAFANSIIPEDTFFPSPESS
HC 15 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69A)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_2-QSKE (IgG1) 		LC 16 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) ( N34Q+N68S+ N79K) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS
HC 17 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69E)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_2-ASKE (IgG1) 		LC 18 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) ( N34A+N68S+ N79K) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS
HC 17 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C)(N69E)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_2-QQQQQ (IgG1) 		LC 19 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q+ N61Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSQSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 20 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

T3-Design_2-QQQQ (IgG4) 		LC 12 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 21 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G4-Fc(G4) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

E17-Design_2-QQQQ (IgG1) 		T3-LC 12 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC 22 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1)(Knob) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
U4-LC 23 VL(CD19)-CL DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC 24 VH(CD19)-CH1-Fc(G1) (Hole) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

E17-Design_2-QQQQ (IgG4) 		T3-LC 12 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC 25 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G4-Fc(G4) (Knob) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC 23 VL(CD19)-CL DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC 26 VH(CD19)-CH1-Fc(G4)(Hole) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

F16-Design_2-QQQQ (IgG4) 		T3-LC 12 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC 25 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC 23 VL(CD19)-CL DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC 27 VH(CD19)-CH1-Spacer-VH(CD19)-CH1-Fc(G4) (Hole) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Fc-IgG1 (knob) 304 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc-IgG4 (knob) 305 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

T3-Fab-Design_2.his1 		LC 3 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 28 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C)Conjunction' QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR

T3-Fab-Design_2.his2 		LC 3 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
HC 29 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C)Conjunction' QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD

T3-Fab-Design_2-QQQQ.his1 		LC 12 VL(CD3)-LCJ2-CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 30 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-His1 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR

T3-Fab-Design_2-QQQQ.his2 		LC 12 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC 31 VH(CD3)-HCJ2-CBeta(S56C) (N69Q)-His2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD








CBeta 		CBeta_1_noCys 32 CBeta (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
CBeta_1 33 CBeta(S56C) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
CBeta_1-Q 34 CBeta(S56C) (N69Q) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
CBeta_1-A 35 CBeta(S56C) (N69A) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
CBeta_1-E 36 CBeta(S56C) (N69E) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
CBeta_2 37 CBeta(S56C)(FG-) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSN--------------QIVSAEA
CBeta_2-Q 38 CBeta(S56C) (N69Q) (FG-) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSN--------------QIVSAEA
CBeta_2-A 39 CBeta(S56C) (N69A) (FG-) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSN--------------QIVSAEA
CBeta_2-E 40 CBeta(S56C) (N69E) (FG-) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSN--------------QIVSAEA
CBeta_3 41 CBeta(S56C)(FG-DE-) (C74A) EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQ---S-GRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYPSN--------------QIVSAEA






CAlpha 		CAlpha_1_noCys 42 CAlpha AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
CAlpha_1 43 CAlpha(T49C) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
CAlpha_1-QQQ 44 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
CAlpha_1-AAA 45 CAlpha(T49C) (N34A+N68A+ N79A) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSAKSDFACANAFANSIIPEDTFFPSPESS
CAlpha_1-QSK 46 CAlpha(T49C) (N34Q+N68S+ N79K) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS
CAlpha_1-ASK 47 CAlpha(T49C) (N34A+N68S+ N79K) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFFPSPESS
CAlpha_1-QQQQ 48 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q+N61Q) AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSQSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
ConjunctionX H_Conjunction_1 49 VH-CBetaCJ1 SSASKNVFPP
H_Conjunction_2 50 VH-CBetaCJ2 LEDLKNVFPP
ConjunctionZ L_Conjunction_1 51 VL-CAlphaCJ1 KRTVAAPDP
L_Conjunction_2 52 VL-CAlphaCJ2 KPDIQNPDP
Conjunction'Y Conjunction'_IgG1 53 CBeta-Conjunction'(IgG1)CJ1 WGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGP
Conjunction'_1gG4 54 CBeta-Conjunction'(IgG4)CJ1 WGR---YGPPCPPCPAPEFLGGP
307 FE
308 VH-CBetaCJ2 KLEDLKNVFPP
309 VL-Cpre-AlphaCJB KPTGVGGTP
306 Cter (crossed light chain cter) WGRA
프리 알파-베타 디자인 쇄 이름 서열번호 서열




Design_1_Pre_TCR_Conjunction'1 		LC 64 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha(N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFP S LAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 65 VH(CD3)-HCJB-CBeta(N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_2_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys10 		LC 66 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (Y59C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTCGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 67 VH(CD3)-HCJB-CBeta(S76C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALCSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_3_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys11 		LC 68 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (A13C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 69 VH(CD3)-HCJB-CBeta(F13C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVCEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_4_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys12 		LC 68 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (A13C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 70 VH(CD3)-HCJB-CBeta(S16C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_5_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys13 		LC 71 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S11C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFP CLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 70 VH(CD3)-HCJB-CBeta(S16C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_6_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys14 		LC 71 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S11C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFP CLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 72 VH(CD3)-HCJB-CBeta(A18C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_7_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys15 		LC 71 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S11C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFP CLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 73 VH(CD3)-HCJB-CBeta(E19C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEACISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_8_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys1_4L4T_1 		LC 74 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (S62C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPCPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 75 VH(CD3)-HCJB-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_9_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys2_4L4T_2 		LC 76 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (T65C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPACDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 75 VH(CD3)-HCJB-CBeta(S56C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_10_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys4 		LC 77 VL(CD3)-LCJB-CPreAlpha (I16C) (N50Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLAPPCMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
HC 78 VH(CD3)-HCJB-CBeta(A11C) (N69Q)-CJ'1G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVCVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_11_Pre_TCR_Conjunction'2_CTerminal 		LC 58 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGG
HC 79 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




Design_12_Pre_TCR_Conjunction'3_C 		LC 63 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTC
HC 80 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ConjunctionW L_Conjunction_3 81 VL-Cpre-AlphaCJB PTGVGGTP



















CPreAlpha 		CPreAlpha 82 FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco
(Design1)		 83 (N50Q)
 FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design2) 311 (N50Q, Y59C) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTCGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design3) 312 (N50Q, A13C) FPSLCPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design4) 312 (N50Q, A13C)
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design5) 313 (N50Q, S11C) FPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design6) 313 (N50Q, S11C)
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design7) 313 (N50Q, S11C)
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design8) 314 (N50Q, S62C) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPCPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design9) 315 (N50Q, T65C) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPACDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco-Cys (Design10) 316 (N50Q, I16C) FPSLAPPCMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
CPreAlpha-noGlyco(Design11) 317 (N50Q, ter_residues) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGG
CPreAlpha-noGlyco (Design12) 318 (N50Q, Cter_only) FPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTC






Cbeta_for_CpreAlpha 		CBeta_for PreAlpha 84 N69Q EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_1 84 N69Q
Design_2 319 N69Q, S76C EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALCSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_3 320 N69Q, F13C EVAVCEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_4 321 N69Q, S16C EVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_5 321 N69Q, S16C
Design_6 322 N69Q, A18C EVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_7 323 N69Q, E19C EVAVFEPSEACISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_8 34 N69Q, S56C
Design_9 34 N69Q, S56C
Design_10 324 N69Q, A11C EVCVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
Design_11 84 N69Q
Design_12 84 N69Q
델타-감마 디자인 쇄 이름 서열번호 서열




dg_Design_2_no_Glyco 		LC 85 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (N16Q+N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 86 VH(CD3)-HCJ5-CGamma-CJ'3G1-Fc(G1) (N65Q) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco 		LC 89 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (N16C) (N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKCGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 90 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (T12C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPCIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco 		LC 91 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (V50C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 92 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (Q57C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco 		LC 93 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (D46C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFCPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 94 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (M62C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTCKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_Cys2_no_Glyco 		LC 95 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (F12C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 96 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (S17C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPCIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_Cys1_no_Glyco 		LC 97 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (M14C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVCKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 98 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (F14C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTICLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_Cys3_no_Glyco 		LC 95 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (F12C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
HC 99 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (E20C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSIACTKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_Cys4_no_Glyco 		LC 100 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (F87C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDCE
HC 101 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (A19C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2_Cys5_no_Glyco 		LC 102 VL(CD3)-LCJ5-CDelta (E88C) (N16Q+ N79Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFC
HC 101 VH(CD3)-HCJ5-CGamma (A19C) (N65Q)-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_2 		LC 105 VL(CD3)-LCJ5-CDelta DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
HC 106 VH(CD3)-HCJ5-CGamma-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVTDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_Design_1 		LC 107 VL(CD3)-LCJ4-CDelta DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
HC 108 VH(CD3)-HCJ4-CGamma-CJ'3G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSASLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_crossed_Design_1 		LC 109 VL(CD3)-LCJ6-CGamma DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
HC 110 VH(CD3)-HCJ6-CDelta-CJ'4G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSRSQPHTKPSVFVMK Q GTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAI C ISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHD Q KTVHSTDEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK




dg_crossed_Design_2 		LC 111 VL(CD3)-LCJ7-CGamma DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
HC 112 VH(CD3)-HCJ7-CDelta-CJ'4G1-Fc(G1) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVEPRSQPHTKPSVFVMK Q GTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAI C ISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHD Q KTVHSTDEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CGamma CGamma_1 113 CGamma KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
CGamma_1_no_Glyco 114 CGamma (N65Q) KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_1 113 No mutations
dg_Design_2 113 No mutations
dg_Design_2_no_Glyco 114 N65Q
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco 333 N65Q, T12C KPCIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco 334 N65Q, Q57C KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco 335 N65Q, M62C KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTCKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco 336 N65Q, S17C KPTIFLPCIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLD-KEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco 337 N65Q, F14C KPTICLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco 338 N65Q, E20C KPTIFLPSIACTKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco 339 N65Q, A19C KPTIFLPSICETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco 339 N65Q, A19C
dg_crossed_Design_1 340 KPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGNTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
dg_crossed_Design_2 340
CDelta CDelta_1 115 CDelta SVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
CDelta_1_no_Glyco 116 CDelta(N16Q+ N79Q) SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
310 CDelta KSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
dg_Design_1 115 No Mutations
dg_Design_2 115 No Mutations
dg_Design_2_no_Glyco 116 N16Q, N79Q
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco 325 N16C, N79Q SVFVMKCGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco 326 N16Q, N79Q,V50C SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco 327 N16Q, N79Q,D46C SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFCPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco 328 N16Q, N79Q,F12C SVCVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco 329 N16Q, N79Q,M14C SVFVCKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco 328 N16Q, N79Q,F12C
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco 330 N16Q, N79Q,F87C SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDCE
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco 331 N16Q, N79Q,E88C SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFC
dg_crossed_Design_1 (the delta on heavy chain) 332 N16Q, N79Q,V50C SVFVMKQGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTD--
dg_crossed_Design_2 (the delta on heavy chain) 332
ConjunctionR H_Conjunction_4 117 HCJ4 SSASLDADVSP
H_Conjunction_5 118 HCJ5 TDKQLDADVSP
ConjunctionT L_Conjunction_4 119 LCJ4 PRSQPHTKP
L_Conjunction_5 120 LCJ5 EPRSQPHTKP
Conjunction'S Conjunction'3_IgG1 121 CJ'3G1 PPIKSDKTHTCPPCPAPEAAGGP
Conjunction'3_1gG4 122 CJ'3G4 PPI---YGPPCPPCPAPEFLGGP
ConjunctionH H_Conjunction_6 123 HCJ6 SSRSQPHTKP
H_Conjunction_7 124 HCJ7 EPRSQPHTKP
ConjunctionJ L_Conjunction_6 125 LCJ6 KDKLDADVSP
L_Conjunction_7 126 LCJ7 TDKLDADVSP
Conjunction'I Conjunction'4_IgG1 127 CJ'4G1 EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGP
Conjunction'4_1gG4 128 CJ'4G4 ESK---YGPPCPPCPAPEFLGGP
Conjunction
(Alpha-Beta, crossed, more antibody) 		H_Conjunction_3 129 HCJ3 SSASIQNPDP
L_Conjunction_3 50 LCJ3
Conjunction (Alpha-Beta, crossed, more TCR) H_Conjunction_4 130 HCJ4 SSPDIQNPDP
L_Conjunction_3 50 LCJ3
Conjunction (PreAlpha-Beta, normal, more antibody) Light chain Conjunction 131 LCJA RTVAAGTP
Conjunction (PreAlpha-Beta, crossed, more antibody) Light chain Conjunction 50 LCJC
Heavy chain Conjunction 132 HCJC SSASGVGGTP
Conjunction (PreAlpha-Beta, crossed, more TCR ) Light chain Conjunction 50 LCJD
Heavy chain Conjunction 133 HCJD SSPTGVGGTP
Conjunction' (Alpha-Beta, PreAlpha-Beta, crossed) Conjunction' 134 CJ'2G1
 SDKTHTCPPCPAPEAAGGP
Conjunction' 135 CJ'2G4
 --YGPPCPPCPAPEFLGGP
PreTCR_Design5_crossed_1 Light 136 VL(CD3)-HCJB-CBeta (N69Q, S16C)-CJ'1G DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
Heavy (Conjunction more antibody) 137 VH(CD3)-HCJC-CPreAlpha (S11C, N50Q)-CJ'2G1-Fc QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSASGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PreTCR_Design_5_crossed_2 Light 136 VL(CD3)-HCJB-CBeta (N69Q, S16C)-CJ'1G
Heavy (Conjunction more TCR) 138 VH(CD3)-HCJD-CPreAlpha (S11)-CJ'2G1-Fc Conjunction QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSSPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PreTCR_Design_6_crossed_1 Light 139 VL(CD3)-LCJC-CBeta (A18C, N69Q) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRA
Heavy (Conjunction more antibody) 137
PreTCR_Design_6_crossed_2 Light 139
Heavy (Conjunction more TCR) 138
Conjunction' (alpha-beta, crossed, IgG1) IgG1 140 CJ'2G1
 SDKTHTCPPCPAPEAAGGP
Conjunction' (alpha-beta, crossed, IgG4) IgG4 141 CJ'2G4 YGPPCPPCPAPEFLGGP
Anti-CD3 Antibody VH 300 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV
Anti-CD3 Antibody VL 301 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEI
Fc(G1) 302 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc(G4) 303 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
실시예 1: 항체 및 TCR 키메라 단백질의 설계 및 엔지니어링
TCR 서열
TCR 은 두 개의 쇄로 구성된 이종이량체 단백질이다. 약 95% 인간의 T세포에는 알파 및 베타 쇄로 구성된 TCR이 있으며, 나머지 5%는 감마와 델타 쇄로 구성된 TCR을 가지고 있다. 인간 알파 쇄의 불변 영역은 단 하나의 유전자 TRAC을 가지고 있다. 인간의 베타 쇄의 불변 영역은 두 개의 서브 클래스를 갖는다: 유전자 TRBC1 및 TRBC2. Protein Data Bank (PDB)에서 TRBC1의 결정 구조의 수는 TRBC2의 결정 구조의 수보다 상대적으로 많으므로, TRBC1 서열을 상기 폴리펩티드 복합체를 설계하기 위한 주요한 중추적 요소로 선택하였다("WuXiBody"). TRBC1의 전형적인 아미노산 서열은 PDB 구조 4L4T에서 찾을 수 있다.
TCR의 쇄간 이황화 결합
WuXiBody 설계를 안내하기 위하여 TCR 결정 구조가 사용되었다. T 세포 표면의 막에 고정된 천연 TCR과 달리, 가용성 TCR 분자는 3D 구조가 항체 Fab와 매우 유사하나 덜 안정적이다. 사실, 용해성 조건에서 TCR의 불안정성은 결정 구조에 대한 설명을 막는 큰 장애물이다(Wang 2014, supra). 본 발명자들은 TCR 불변 영역에 한 쌍의 Cys 돌연변이를 도입하는 전략을 채택하였고, 그것은 쇄 조합을 상당히 개선하고 발현을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
항체 발현에 대한 쇄간 이황화 결합의 효과
이황화 결합이 WuXiBody 구조를 유지하는 역할을 하는지의 여부를 확인하기 위하여, 키메라 항체의 TCR 불변 영역에서 이황화 결합을 갖는 및/또는 갖지 않는 구조를 발현하였다. 발현된 WuXiBody의 SDS-PAGE 결과를 도 15 내지 17에 나타내었다. 발현된 모든 WuXiBody는 2개의 동일한 암을 갖는 전체 IgG-유사 구조였다. CBeta의 S56 및 CAlpha의 T49 사이의 시스테인 돌연변이가 있거나 없는 구조의 발현은, CBeta의 S16 또는 A18 및 CPre-Alpha의 S11사이, CGamma의 Q57과 CDelta의 V50 사이, 및 CGamma의 A19와 CDelta의 E88 사이 시스테인 돌연변이가 있는 구조의 발현을 실험하였다.
CBeta/CAlpha (서열번호 32/42)에 이황화 결합 부재를 갖는 구조의 발현 결과는 이황화 결합 부재 구조가 항체 구조를 유지할 수 없음을 나타낸다(도 15B 참조). CBeta/CPre-Alpha 및 CGamma/CDelta에 존재하지 않는 이황화 결합을 갖는 구조의 발현을 또한 실험하였고 비슷한 결과를 나타내었다. 대조적으로, 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 구조는 Ig-유사 구조를 유지할 수 있는 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있었다(도 15A 참조).
WuXibody의 키메라 도메인 설계
TCR 불변 영역에서 시스테인 쌍 돌연변이(도 19A 내지 19E의 서열을 참조하여 넘버링)를 TCR 키메라 항체에 대한 상이한 구조의 설계에 포함시켰고, 이를 표 23에 나타내었다.
쇄간 이황화 결합을 도입하기 위한 한 쌍의 Cys 돌연변이
Alpha-Beta PreAlpha-Beta Delta-Gamma
Cys 쌍 돌연변이 Cys 쌍 돌연변이 HC/LC에서의 서열번호 해당 단백질명 Cys 쌍 돌연변이 HC/LC에서의 서열번호 해당 단백질명
Y11-S16 S11-S16 Design_5_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys13
서열번호 70/71 		F12-S17 Design_2_Cys2_no_Glyco
서열번호 96/95
L13-F13 S11-A18 Design_6_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys14
서열번호 72/71 		F12-E20 Design_2_Cys3_no_Glyco
서열번호 99/95
L13-S16 S11-E19 Design_7_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys15
서열번호 73/71		 M14-F14 Design_2_Cys1_no_Glyco
서열번호 98/97
S16-V12 A13-F13 Design_3_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys11
서열번호 69/68		 N16-T12 Design_2_hypeCys1_no_Glyco
서열번호 90/89
S16-E14 A13-S16 Design_4_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys12서열번호 70/68 D46-M62 Design_2_hypeCys3_no_Glyco
서열번호 94/93
V23-F13 I16-A11 Design_10_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys4
서열번호 78/77		 V50-Q57
Design_2_hypeCys2_no_Glyco
서열번호 92/91
Y44-L62 S62-S56 Design_8_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys1_4L4T_1
서열번호 75/74		 F87-A19 Design_2_Cys4_no_Glyco
서열번호101/100
T46-D58 T65-S56 Design_9_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys2_4L4T_2 서열번호 75/76 E88-A19
Design_2_Cys5_no_Glyco
서열번호 101/102
T46-S76 Y59-S76 Design_2_Pre_TCR_Conjunction'1_Cys10
서열번호 67/66
T49-S56
L51-S56
S62-S56
S62-R78
TCR 알파-베타 불변 영역에서 쌍을 이룬 Cys 돌연변이의 경우, 모든 설계에 T49C-S56C 이황화 결합을 사용하였다.
항체 가변 및 TCR 불변 도메인, 이들의 상대 융합 방향 및 Fc-연결 접합까지 연결하는 접합은 모두 안정적이며 기능적인 WuXiBody를 만들기 위하여 세심하게 조정하였다. TCR 구조는 항체 Fab와 매우 유사하기 때문에, TCR 가변 영역에 항체 Fv 상동성 모델을 중첩시켰다(PDB 4L4T, 도 2B). 중첩된 구조는 항체 Fv가 TCR 불변 도메인과 구조적으로 호환 가능함을 나타낸다. 이러한 구조적 정렬 및 상응하는 서열에 기초하여, 모든 관련 엔지니어링 파라미터가 하기 예시된 바와 같이 설계되었다.
도메인 방향
VH-CBeta/VL-CAlpha 및 교차된 VH-CAlpha/VL-CBeta의 융합 방향이 키메라 단백질을 정확하게 조합할 수 있었으므로, 본 발명자들은 양쪽 방향을 설계하고 실험하였다. VH-VL의 서열 상동성은 TCR VBeta-VAlpha에 더 가깝다. 본 발명자들은 VH-CBeta/VL-CAlpha 공식을 "정상 방향"으로, VH-CAlpha/VL-CBeta를 "교차 방향"으로 명명하였다.
첫 번째 및 두 번째 접합 도메인
본 발명자들은 구조 정렬에 기초하여 항체 및 TCR의 서열을 정렬시켰으며, 생식선 서열에 정의된 접합이 항상 구조에 표시되는 것과 일치하지는 않음을 발견하였다. 예를 들어, 서열 정의로부터, VH 및 CH1을 연결하는 접합은 VH영역에서 마지막 두 잔기 "SS" 바로 다음에서 시작해야 한다. 그러나, 구조적으로, 이 두 잔기는 이미 접합의 일부이다. 본 발명자들은 서열보다는 구조를 기반으로 접합을 정의하였다.
본 개시의 표 1 및 표 2는 연구된 두 방향에 대한 구조-기반 서열 정렬을 나타낸다. 어느 도메인이 어느 접합 도메인과 호환되는지를 예측하는 것이 어려웠으므로, 본 발명자들은 항체와 TCR 접합이 중첩된 구조에서 어떻게 겹쳐지는지를 확인하였고, 하나를 이용해서 다른 하나를 대체할 수 있음을 추정하였다. 접합 도메인의 설계는 표 1 및 표 2에 나타내었다.
제3 접합 도메인
상기에서 언급한 것과 같은 유사한 전략을 사용하여 인간 IgG1 및 IgG4 힌지를 TCR막 근위 영역(즉, TCR 힌지)와 정렬시키고, 구조적 수준에서의 겹침을 또한 확인하였다.
FG 루프 및 DE 루프
TCR 불변 영역의 구조를 항체의 것과 정렬시켜 TCR 베타 쇄의 FG 및 DE 루프가 항체 CH1에 상응하는 영역보다 길다는 것을 밝혔다. 도 3A 및 3B는 T 세포 베타 쇄와 항체 중쇄 사이의 불변 영역의 차이를 나타낸다. CH1이 TCR 베타로 대체된 경우, 이 두 루프가 어떻게 구조를 교란시킬 수 있는지 테스트하기 위하여 두 루프의 있고 없음에 따른 구조를 설계하였다.
상기 언급된 고려 사항으로, 표 24 및 표 25에 나타낸 바와 같이 이들 파라미터를 조합하여 총 9개의 구조를 설계하였다.
WuXiBody의 키메라 단백질 (CBeta/CAlpha)의 설계
서열번호
(Heavy Chain (HC)/Light Chain (LC))-IgG1		 방향 접합 접합' FG 루프 DE 루프
Design_1
서열번호 2/1 		정상 Conjunction_1 Conjunction'_1 (IgG1, IgG4) 천연 천연
Design_2서열번호 4/3 정상 Conjunction_2 Conjunction'_1 (IgG1, IgG4) 천연 천연
Design_3서열번호 9/8 교차 Conjunction_3 Conjunction'_2 (IgG1, IgG4) 천연 천연
Design_4서열번호 10/8 교차 Conjunction_4 Conjunction'_2 (IgG1, IgG4) 천연 천연
Design_5서열번호 5/1 정상 Conjunction_1 Conjunction'_1 (IgG1, IgG4) 대체 천연
Design_6서열번호 6/3 정상 Conjunction_2 Conjunction'_1 (IgG1, IgG4) 대체 천연
Design_6a
서열번호 7/3 		정상 Conjunction_2 Conjunction'_1 (IgG1, IgG4) 대체 대체
Design_7
서열번호 9/11 		교차 Conjunction_3 Conjunction'_2 (IgG1, IgG4) 대체 천연
Design_8서열번호 10/11 교차 Conjunction_4 Conjunction'_2 (IgG1, IgG4) 대체 천연
WuXiBody의 키메라 단백질 (CBeta/CAlpha)의 성분 및 서열
구조체명 및 쇄 서열번호 N-말단에서 C-말단까지의 도메인 및 이의 서열번호
항체 중쇄 가변도메인 (VH or VL) 제1 또는 제2 접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 or C2) 제3 접합도메인+힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
Design_1 HC VH(CD3) HCJ1 Cbeta(S56C) CJ'1G1 FcG1
서열번호 2 서열번호 300 서열번호49 서열번호33 서열번호53 서열번호302
Design_1 LC VL(CD3) LCJ1 CAlpha(T49C)
서열번호 1 서열번호 301 서열번호51 서열번호43
Design_2 HC VH(CD3) HCJ2 Cbeta(S56C) CJ'1G1 FcG1
서열번호 4 서열번호 300 서열번호50 서열번호33 서열번호53 서열번호302
Design_2 LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C)
서열번호 3 서열번호 301 서열번호52 서열번호43
Design_3 HC VH(CD3) HCJ3 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호 9 서열번호 300 서열번호129 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_3 LC VL(CD3) LCJ3 Cbeta(S56C)
서열번호 8 서열번호 301 서열번호308 서열번호33 + 306
Design_4 HC VH(CD3) HCJ4 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호 10 서열번호 300 서열번호130 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_4 LC VL(CD3) LCJ3 Cbeta(S56C)
서열번호 8 서열번호 301 서열번호308 서열번호33 + 306
Design_5 HC VH(CD3) HCJ1 Cbeta(S56C) (FG-) CJ'1G1 FcG1
서열번호 5 서열번호 300 서열번호49 서열번호37 서열번호53 서열번호302
Design_5 LC VL(CD3) LCJ1 CAlpha(T49C)
서열번호 1 서열번호 301 서열번호51 서열번호43
Design_6 HC VH(CD3) HCJ1 CBeta(S56C)(FG-) CJ'1G1 FcG1
서열번호 6 서열번호 300 서열번호50 서열번호37 서열번호53 서열번호302
Design_6 LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C)
서열번호 3 서열번호 301 서열번호52 서열번호43
Design_6a HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C)(DE-FG-) CJ'1G1 FcG1
서열번호 7 서열번호 300 서열번호50 서열번호41 서열번호53 서열번호302
Design_6a LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C)
서열번호 3 서열번호 301 서열번호52 서열번호43
Design_7 HC VH(CD3) HCJ3 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호 9 서열번호 300 서열번호129 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_7 LC VL(CD3) LCJ3 CBeta(S56C)(FG-)
서열번호 11 서열번호 301 서열번호308 서열번호37 + 306
Design_8 HC VH(CD3) HCJ4 CAlpha(T49C) CJ'2G1 FcG1
서열번호 10 서열번호 300 서열번호130 서열번호43 서열번호134 서열번호302
Design_8 LC VL(CD3) LCJ3 CBeta(S56C)(FG-)
서열번호 11 서열번호 301 서열번호308 서열번호37 + 306
실시예 2. 단일특이적 TCR/항체 키메라의 생성 및 특성
TCR 불변 도메인을 이중특이적 항체 구조에 융합시키기 전에, 이를 규칙 단일특이적 IgG에 도입하는 타당성을 먼저 평가하였다. 이 Proof-of-Concept 연구를 수행하기 위하여 자체 개발한 T3이라고 명명한 항-CD3 항체를 선택하였다. T3 IgG의 불변 도메인 CH1 및 CL은 상응하는 TCR 불변 영역 (CAlpha 및 CBeta)으로 대체되었다. 표 24에 열거된 9종의 상이한 전략 (상기 참조)이 모두 적용되었으며, 모든 구조는 Expi293 시스템으로 표현되었다.
표 26은 Q-ELISA에 의해 정량화되어 수확된 상청액에서 설계된 단백질의 발현 수준을 열거하였다. 일반적으로, 대부분의 "정상 방향" 설계는 "교차 방향" 포맷보다 더 나은 발현을 보였으며, 대부분의 "TCR 접합"은 "항체 접합"보다 우수하였다. "정상 방향"의 2개 구조인 Design_5 및 Design-6은 Design_2와 유사한 발현을 가졌다. "교차 방향"의 2개 구조에 대하여, Design_7, 8은 Design_3, 4보다 더 나은 발현을 가졌다. TCR CBeta에서 매우 긴 FG 루프의 낮은 발현이 관찰되었는데, 이는 이 FG 루프가 융합된 항체 VL 도메인과 유의한 입체 충돌을 일으킬 수 있음을 시사한다.
상청액의 모든 설계 발현 수준 및 CD3 결합
샘플 (IgG1) 상청액 내 발현 수준 (ug/mL) FACS 내 농도 (nM)
5.0 0.4 0.032
MFI
T3 N/A 5101 2937 408
Design_1 72.04 5441 2190 292
Design_2 204.42 5833 2616 380
Design_3 15.35 5089 982 137
Design_4 26.11 5438 1213 168
Design_5 113.68 5388 1865 249
Design_6 178.56 5789 3914 613
Design_6a 173.60 5794 2822 405
Design_7 75.69 6322 1929 259
Design_8 98.63 6412 1831 243
이러한 결과는 Wu et al.와 이들의 유사 항체-TCR 키메라 설계에서 관찰된 것과 완전히 달랐다 (Wu et al. 2015, supra): 그들의 "교차 방향" 설계는 낮은 발현을 가졌다. 그들의“정상 방향"설계는 발현조차 하지 못하였다.
발현된 단백질이 정확한 폴딩을 가졌고 원래의 기능을 유지하는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 CD3 양성 Jurkat 세포에서 이들의 결합을 시험하였다. 모든 샘플의 FACS 결합은 3종의 상이한 농도에서 수행되었다: 5.0, 0.4 및 0.032 nm. 기원의 야생형 항체 T3을 양성 대조군으로 사용하였다. 용량-의존적 CD3 결합 데이터는 표 26의 3-5 컬럼에 기재하였다. Design_2, Design_6 및 Design_6a는 천연 항체 T3과 비교할 때 최상의 결합 능력을 나타내었다. 이 3종의 구조가 모두 포유류 세포에서 가장 잘 발현된 3종의 포맷이라는 것은 흥미롭다. 이러한 강한 상관 관계는 발현 또는 결합 수준이 동일한 분자 기원, 즉 항체 가변 도메인 및 TCR 불변 도메인 사이의 적합성에 기인할 수 있으며, 이는 접합 도메인 및 쇄간 이황화 결합 등과 같은 성분의 신중한 설계를 필요로 함을 시사한다.
발현 수준 및 결합 활성에 기초하여, Design_2를 진행할 최종 포맷으로 선택하였다.
실시예3. 디글리코실화
항체상의 N-글리코실화 부위와 같은 번역 후 조작 (PTM)은 단백질의 이질성을 유발하여 개발 단계에 어려움이 될 수 있다. 따라서, TCR 불변 영역에서 N-글리코실화 부위를 제거하려는 시도가 수행되었다. TCR 불변 영역에서 총 4개의 N-글리코실화 부위가 발견되었다. 하나는 CBeta(N69, 서열번호 244 참조)에 있고, 다른 3개는 CAlpha(N34, N68 및 N79, 서열번호 241 참조)에 있다. 본 개시의 발현 데이터는 이들 부위, 특히 CAlpha 상의 부위에 있어서, 분자가 포유 동물 세포에서 발현될 때 실제로 상당히 글리코실화 되었음을 시사하였다.
Design_2상의 모든 글리코실화 부위를 4개의 Asn 잔기를 Gln 또는 Ala로 치환함으로써 제거하였다(Design_2-QQQQ 또는 -AAAA 참조, 표 27 참조). 이 전략은 단백질 공학에서 매우 일반적이지만, Gln/Ala 돌연변이는 TCR/항체 키메라 단백질의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다 (Wu et al., 2015, 참조). 이 위험을 완화하기 위하여, 상응하는 위치 (Design_2-QSKE 및 -ASKE 참조)에서 Pre-TCR (CAlpha의 N68S) 및 macaca TCR (CAlpha의 N79, CBeta의 N69E)의 잔기를 사용하였다. 또한, CAlpha (N61)에 비정형 글리코실화 부위가 존재할 수 있다고 보고되었다(Wollscheid et al., Nature Biotechnology, 27(4), pp.378-386 (2009). "N-연계 세포 표면 당단백질의 질량-분광 분석 및 상대 정량" Wollscheid B., Bausch-Fluck D., Henderson C., O'Brien R., Bibel M., Schiess R., Aebersold R., Watts J.D., Nat. 바이오테크 놀. 27: 378-386 (2009) [PubMed] [유럽 PMC]). 따라서, 이 잔기도 Gln으로 돌연변이되었다 (Design_2-QQQQQ 참조, 표 27 참조). 추가의 시험을 위하여 모든 돌연변이체를 Expi293에서 발현시켰다.
상청액에서의 모든 디글리코실화 설계의 발현 수준
샘플 상청액에서의 발현 수준 (ug/mL) 서열번호
(HC-CBeta/LC-CAlpha)
Design_2-QQQQ 334.39 13/12 (IgG1) 21/12(IgG4)
Design_2-AAAA 414.58 15/14 (IgG1)
Design_2-QSKE 311.48 17/16 (IgG1)
Design_2-ASKE 107.89 17/18 (IgG1)
Design_2-QQQQQ 213.31 20/19 (IgG1)
디글리코실화 설계의 성분
구조체명 및 쇄 서열번호 N-말단에서 C-말단으로의 도메인 및 이의 서열번호
항체 중쇄 가변 도메인(VH or VL) 제1 또는 제2 접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 or C2) 제3 접합 도메인 + 힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
Design_2-QQQQ (IgG1) HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C) (N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 13 서열번호 300 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_2-QQQQ (IgG1) LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q)
서열번호 12 서열번호 301 서열번호52 서열번호44
Design_2-QQQQ (IgG4) HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C) (N69Q) CJ'1G4 FcG4
서열번호 21 서열번호 300 서열번호50 서열번호34 서열번호54 서열번호303
Design_2-QQQQ (IgG4) LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q)
서열번호 12 서열번호 301 서열번호52 서열번호44
Design_2-AAAA (IgG1) HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C) (N69A) CJ'1G1 FcG1
서열번호 15 서열번호 300 서열번호50 서열번호35 서열번호53 서열번호302
Design_2-AAAA (IgG1) LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C) (N34A+N68A+ N79A)
서열번호 14 서열번호 301 서열번호52 서열번호45
Design_2-QSKE (IgG1) HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C) (N69E) CJ'1G1 FcG1
서열번호 17 서열번호 300 서열번호50 서열번호36 서열번호53 서열번호302
Design_2-QSKE (IgG1) LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68S+ N79K)
서열번호 16 서열번호 301 서열번호52 서열번호46
Design_2-ASKE (IgG1) HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C) (N69E) CJ'1G1 FcG1
서열번호 17 서열번호 300 서열번호50 서열번호36 서열번호53 서열번호302
Design_2-ASKE (IgG1) LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C) (N34A+N68S+ N79K)
서열번호 18 서열번호 301 서열번호52 서열번호47
Design_2-QQQQQ (IgG1) HC VH(CD3) HCJ2 CBeta(S56C) (N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 20 서열번호 300 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_2-QQQQQ (IgG1) LC VL(CD3) LCJ2 CAlpha(T49C) (N34Q+N68Q+ N79Q+N61Q)
서열번호 19 서열번호 301 서열번호52 서열번호 48
상청액에서의 발현량은 표 27에 나타낸 Q-ELISA에 의해 추정되었다. 흥미롭게도, 디글리코실화 설계 중 하나만이 발현 수준을 약간 감소시켰다. Gln 또는 Ala에 의한 단순 돌연변이는 비-환원 겔에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않았으며 (도 4), 150 kd 밴드를 관찰하였다. 환원된 겔 (도 4)에서, 25 kd 밴드를 관찰하였다. 둘 다 경쇄 및 중쇄에서 글리코실화의 성공적인 제거를 나타낸다. TCR 불변 영역에서 N-글리칸을 제거한 돌연변이를 CD3-결합에서 시험하였다. 도 5는 CD3 + Jurkat 세포에서 상이한 돌연변이 결합을 보여주었다. 돌연변이 곡선은 야생형 항체 T3과 비교하여 단지 오른쪽으로 약간 이동하였는데, 이는 검출 항체가 키메라보다 인간 IgG에 더 민감하기 때문일 수 있다. 최대 결합은 변경되지 않았다. 전반적으로, 대부분의 디글리코실화 설계는 발현 또는 결합에서 명백한 차이를 나타내지 않았다. 추가 연구를 위한 설계로 Design_2-QQQQ가 선택되었다.
Wu 등 (Wu et al. 2015, 참조)에 의해 수행된 유사한 연구에서, 그들은 "정상 방향"포맷이 발현되지 않았기 때문에 그들의 "교차 방향"포맷에 대해 디글리코실화 돌연변이를 수행하였다.
실시예 4. TCR 프리 알파/베타 기반 WuXiBody의 설계
미성숙 흉선 세포에 의해 발현된 Pre-T-세포 항원 수용체(pre-TCR)는 초기 T-세포 발달에서 중추적인 역할을 한다. Pre-TCR에는 규칙 베타 쇄가 있지만, 불변 영역만 사용할 수 있는 특정한 사전 알파 쇄가 있으며, 서열 및 구조는 규칙 알파 쇄와 매우 다르다. 규칙 TCR의 불변 영역은 항체 가변 영역과 호환 가능하기 때문에, Pre-TCR (PDB 3OF6, 서열번호 246 참조)은 키메라 단백질의 설계에도 도움이 될 것으로 예상되었다. 항체 설계는 표 29에 나타내었다.
WuXiBody에 대한 TCR pre- 알파/베타 기반 키메라의 설계
Figure pct00009
표 30에 나타낸 바와 같이, 이들 파라미터를 조합하여 총 10종의 키메라 구조를 설계하였다.
IgG1 형태의 키메라 Pre-TCR- 항체 키메라 설계의 관련성
표 29의 설계 서열 파일 서열번호 (HC/LC)
PreTCR_Design_B Design_1_Pre_TCR_ Conjunction'1 Design_2_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys10
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys11
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys12
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys13
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys14
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys15
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys1_4L4T_1
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys2_4L4T_2
Design_10_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys4		 65/64
67/66
69/68
70/68
70/71
72/71
73/71
75/74
75/76
78/77
PreTCR_Design_C PreTCR_Design_5_crossed_1PreTCR_Design_6_crossed_1 137/136
137/139
PreTCR_Design_D PreTCR_Design_5_crossed_2PreTCR_Design_6_crossed_2 138/136
138/139
IgG1 형태의 키메라 Pre-TCR- 항체 키메라 설계의 구성 요소
구조체명 및 쇄 서열번호 N-말단에서 C-말단으로의 도메인 및 이의 서열번호
항체 중쇄 가변 도메인 (VH or VL) 제1 또는 데2 접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 or C2) 제3 접합 도메인 + 힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
Design_1_Pre_TCR_ Conjunction'1 HC VH(CD3) HCJB CBeta(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 65 서열번호 300 서열번호50 서열번호84 서열번호53 서열번호302
Design_1_Pre_TCR_ Conjunction'1 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha(N50Q)
서열번호 64 서열번호 301 서열번호309 서열번호83
Design_2_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys10 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(S76C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 67 서열번호 300 서열번호50 서열번호319 서열번호53 서열번호302
Design_2_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys10 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (Y59C)(N50Q)
서열번호 66 서열번호 301 서열번호309 서열번호311
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys11 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(F13C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 69 서열번호 300 서열번호50 서열번호320 서열번호53 서열번호302
Design_3_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys11 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (A13C)(N50Q)
서열번호 68 서열번호 301 서열번호309 서열번호312
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys12 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(S16C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 70 서열번호 300 서열번호50 서열번호321 서열번호53 서열번호302
Design_4_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys12 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (A13C)(N50Q)
서열번호 68 서열번호 301 서열번호309 서열번호312
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys13 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(S16C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 70 서열번호 300 서열번호50 서열번호321 서열번호53 서열번호302
Design_5_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys13 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q)
서열번호 71 서열번호 301 서열번호309 서열번호313
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys14 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(A18C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 72 서열번호 300 서열번호50 서열번호322 서열번호53 서열번호302
Design_6_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys14 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q)
서열번호 71 서열번호 301 서열번호309 서열번호313
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys15 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(E19C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 73 서열번호 300 서열번호50 서열번호323 서열번호53 서열번호302
Design_7_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys15 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (S11C)(N50Q)
서열번호 71 서열번호 301 서열번호309 서열번호313
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys1_4L4T_1 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(S56C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 75 서열번호 300 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_8_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys1_4L4T_1 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (S62C)(N50Q)
서열번호 74 서열번호 301 서열번호309 서열번호314
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys2_4L4T_2 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(S56C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 75 서열번호 300 서열번호50 서열번호34 서열번호53 서열번호302
Design_9_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys2_4L4T_2 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (T65C)(N50Q)
서열번호 76 서열번호 301 서열번호309 서열번호315
Design_10_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys4 HC VH(CD3) HCJB Cbeta(A11C)(N69Q) CJ'1G1 FcG1
서열번호 78 서열번호 300 서열번호50 서열번호324 서열번호53 서열번호302
Design_10_Pre_TCR_Conjunction'_1_Cys4 LC VL(CD3) LCJB CPreAlpha (I16C)(N50Q)
서열번호 77 서열번호 301 서열번호309 서열번호316
PreTCR_Design_5_crossed_1 HC VH(CD3) HCJC CPreAlpha
(S11C)(N50Q) 		CJ'2G1 FcG1
서열번호 137 서열번호300 서열번호132 서열번호313 서열번호 134 서열번호302
PreTCR_Design_5_crossed_1 LC VL(CD3) LCJC Cbeta (N69Q, S16C)
서열번호 136 서열번호 301 서열번호50 서열번호321+ 306
PreTCR_Design_6_crossed_1 HC VH(CD3) HCJC CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G4 FcG4
서열번호 137 서열번호300 서열번호132 서열번호313 서열번호 134 서열번호303
PreTCR_Design_6_crossed_1 LC VL(CD3) LCJC Cbeta(N69Q, A18C)
서열번호 139 서열번호 301 서열번호50 서열번호322+ 306
PreTCR_Design_5_crossed_2 HC VH(CD3) HCJD CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1
서열번호 138 서열번호300 서열번호133 서열번호313 서열번호 134 서열번호302
PreTCR_Design_5_crossed_2 LC VL(CD3) LCJC Cbeta (N69Q, S16C)
서열번호 136 서열번호 301 서열번호50 서열번호 321+ 306
PreTCR_Design_6_crossed_2 HC VH(CD3) HCJD CPreAlpha (S11C)(N50Q) CJ'2G1 FcG1
서열번호 138 서열번호300 서열번호133 서열번호313 서열번호 134 서열번호302
PreTCR_Design_6_crossed_2 LC VL(CD3) LCJC Cbeta(N69Q, A18C)
서열번호 139 서열번호 301 서열번호50 서열번호322+306
실시예 1 내지 3에서 배운 경험은 "정상 방향"및 더 많은 TCR 잔기와의 접합 도메인이 우수한 키메라 단백질을 생성하는데 더 적합하다는 것을 시사하였다. 따라서, 동일한 전략이 채택되었고 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같은 경쇄 및 중쇄 접합 도메인을 설계하였다. 규칙적인 알파 쇄와는 달리, TCR pre-알파 쇄에는 단 하나의 글리코실화 부위 (N50)가 있으며, 이는 Gln 잔기로 돌연변이되었다 (서열번호 247 참조). 베타 불변 영역을 갖는 전체 중쇄는 N-글리코실화 부위 (N69)가 Gln 잔기로 치환된 표 24의 Design_2와 동일하였다 (서열번호 244 참조).
정상 방향의 제3 접합 도메인은 표 9에서와 동일하게 설계하였고, 교차 방향의 제3 접합 도메인은 표 10과 동일하게 설계하였다 (TCR 알파/베타 기반 키메라 항체).
Pre-TCR은 제3 접합 도메인 위에 천연 쇄간 이황화 결합을 갖지 않는다. 일반 TCR에서 수행된 엔지니어링 작업과 유사하게, 키메라 단백질의 안정성을 향상시키기 위하여 불변 영역에서 베타 및 Pre-알파 계면에서의 이황화 결합을 합리적으로 도입하였다(표 13 참조). TCR Pre 결정 구조 (PDB 3OF6)의 모든 계면 잔기을 검사하고 CAlpha 및 CBeta 탄소 원자가 각각 7
Figure pct00010
및 5
Figure pct00011
내에 있는 쇄간 쌍의 목록을 얻었다 (표 13 참조). 이어서 각각의 확인된 쌍을 Cys 잔기로 치환하고 돌연변이를 Expi293 세포에서 발현시켰다.
실시예 5. TCR 감마/델타 기반 키메라 항체의 설계
감마 및 델타 쇄로 구성된 TCR은 덜 일반적이지만 단백질의 이종이량체 특성은 새로운 키메라 포맷을 설계하는데 도움이 될 수 있다. 실시예 1에서 검증된 동일한 전략 및 절차에 따라서, 본 발명자들은 -마 TCR의 불변 영역을 사용하여 항체의 상응하는 영역을 대체하는 새로운 키메라 설계를 수행하였다. 델타-감마 TCR (PDB 4LFH, 서열번호 249 및 252 참조)의 구조는 항체 및 TCR 사이의 구조-유도 서열 정렬을 용이하게 하기 위하여 사용되었다.
표 5 및 표 6에는 각각 "정상 방향" 및 "교차 방향"에 대한 접합 도메인이 나열되어 있다. 상이한 방향에 상응하는 IgG1 및 IgG4 접합 도메인을 표 11 및 표 12에 나타내었다. 델타-감마 TCR의 구조는 알파-베타 TCR의 구조보다는 항체와 더 유사하다. 추가적인 FG 및 DE 루프 설계는 수행되지 않았다. N-글리코실화 부위(N65 on gamma, and N16 and N79 on delta, 서열번호 250 참조)는 Gln (Q) 치환에 의해 모두 제거되었다. 접촉 계면 이황화 결합은 실시예 4에 도입된 동일한 전략에 기초하여 설계되었다.
키메라 TCR/항체의 설계
방향 제1 또는 제2 접합 도메인 제3 접합 도메인 FG 루프 DE 루프
dg_Design_1 정상 Conjunction_4 Conjunction'_3 (IgG1, IgG4) 천연 천연
dg_Design_2 정상 Conjunction_5 Conjunction'_3 (IgG1, IgG4) 천연 천연
dg_Design_3 교차 Conjunction_6 Conjunction'_4 (IgG1, IgG4) 천연 천연
dg_Design_4 교차 Conjunction_7 Conjunction'_4 (IgG1, IgG4) 천연 천연
표 33에 나타낸 바와 같이 이들 파라미터를 조합하여 총 13종의 키메라 구조를 설계하였다.
CGamma/CDelta에 대한 키메라 TCR/항체 설계의 대응
표 32에서의 IgG1의 설계 설계의 구조 HC/LC의 서열번호
dg_Design_1 dg_Design_1 108/107


dg_Design_2 		dg_Design_2
dg_Design_2_no_Glyco
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco		 106/105
86/85
90/89
92/91
94/93
96/95
98/97
99/95
101/100
101/102
dg_Design_3 dg_crossed_Design_1 110/109
dg_Design_4 dg_crossed_Deisgn_2 112/111
CGamma/CDelta를 위한 키메라 TCR/항체 설계의 구성 요소
구조체명 및 쇄 서열번호 N-말단에서 C-말단으로의 도메인 및 이의 서열번호
항체 중쇄 가변 도메인 (VH or VL) 제1 또는 제2 접합 도메인 (CJ) TCR 불변 도메인 (C1 or C2) 제3 접합 도메인 + 힌지 (CJ') 이량체화 도메인 (D)
dg_Design_1 HC VH(CD3) HCJ4 CGamma CJ'3G1 FcG1
서열번호 108 서열번호 300 서열번호117 서열번호113 서열번호121 서열번호302
dg_Design_1 LC VL(CD3) LCJ4 CDelta
서열번호 107 서열번호 301 서열번호119 서열번호310
dg_Design_2 HC VH(CD3) HCJ5 CGamma CJ'3G1 FcG1
서열번호 106 서열번호 300 서열번호118 서열번호113 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2 LC VL(CD3) LCJ5 CDelta
서열번호 105 서열번호 301 서열번호120 서열번호115
dg_Design_2_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 86 서열번호 300 서열번호118 서열번호114 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta(N16Q+N79Q)
서열번호 85 서열번호 301 서열번호120 서열번호116
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma(T12C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 90 서열번호 300 서열번호118 서열번호333 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_hypeCys1_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta (N16C) (N79Q)
서열번호 89 서열번호 301 서열번호120 서열번호325
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma (Q57C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 92 서열번호 300 서열번호118 서열번호334 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_hypeCys2_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta (V50C) (N16Q + N79Q)
서열번호 91 서열번호 301 서열번호120 서열번호326
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma　 (M62C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 94 서열번호 300 서열번호118 서열번호335 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_hypeCys3_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta　 (D46C) (N16Q + N79Q)
서열번호 93 서열번호 301 서열번호120 서열번호327
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma(S17C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 96 서열번호 300 서열번호118 서열번호336 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys2_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta　 (F12C) (N16Q + N79Q)
서열번호 95 서열번호 301 서열번호120 서열번호328
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma(F14C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 98 서열번호 300 서열번호118 서열번호337 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys1_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta(M14C) (N16Q + N79Q)
서열번호 97 서열번호 301 서열번호120 서열번호329
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma (E20C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 99 서열번호 300 서열번호118 서열번호338 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys3_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta　 (F12C) (N16Q + N79Q)
서열번호 95 서열번호 301 서열번호120 서열번호328
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma (A19C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 101 서열번호 300 서열번호118 서열번호339 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys4_no_Glyco LC VL(CD3) LCJ5 CDelta(F87C) (N16Q + N79Q)
서열번호 100 서열번호 301 서열번호120 서열번호330
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco HC VH(CD3) HCJ5 CGamma (A19C) (N65Q) CJ'3G1 FcG1
서열번호 101 서열번호 300 서열번호118 서열번호339 서열번호121 서열번호302
dg_Design_2_Cys5_no_Glyco LC LCJ5 CDelta (E88C) (N16Q + N79Q)
서열번호 102 서열번호120 서열번호331
dg_crossed_Design_1 HC VH(CD3) HCJ6 CDelta CJ'4G1 FcG1
서열번호 110 서열번호 300 서열번호123 서열번호 332 서열번호127 서열번호302
dg_crossed_Design_1 LC VL(CD3) LCJ6 CGamma
서열번호 109 서열번호 301 서열번호125 서열번호340
dg_crossed_Design_2 HC VH(CD3) HCJ7 CDelta CJ'4G1 FcG1
서열번호 112 서열번호 300 서열번호124 서열번호332 서열번호127 서열번호302
dg_crossed_Design_2 LC VL(CD3) LCJ7 CGamma
서열번호 111 서열번호 301 서열번호126 서열번호340
실시예 6. 항체 중경쇄 미스페어링 실험
IgG-유사 포맷으로 이중특이적 항체를 생성하는데 있어서의 문제점 중 하나는 경쇄 및 중쇄가 조절되지 않은 미스페어링된 것이다. CH1 및 CL 도메인을 대체한 TCR 베타 및 알파가 단일 숙주 세포에서 공동 발현될 때 IgG 중쇄 및 경쇄로 조합될 수 있는지 여부를 평가하였다.
항-CD3 항체 T3 외에, 본 발명자들은 또한 B-림프구 항원 CD19를 표적으로 하는 모노클로날 항체 U4를 개발하였다. 2종의 천연 항체의 경쇄 및 중쇄가 어떻게 잘못 짝지어질 수 있는지를 확인하기 위하여, T3 및 U4의 경쇄-중쇄 쌍은 의도적으로 전환되고 (T3_light-U4_heavy, T3_heavy-U4_light) Expi293 세포에서 공동 발현되었다. TCR-변형 T3을 사용한 동일한 연구도 나란히 비교하였다. 도 6A 및 6B는 IgG1 및 IgG4 둘 다에서 단백질의 SDS-PAGE 데이터를 나타냈다. 천연 항체를 사용하는 교환된 쌍에 대해, 비-환원 PAGE에서 150 kd 밴드, 및 감소된 PAGE에서 50 kd, 23 kd 밴드로 미스페어링된 IgG 단백질의 조합을 분명히 확인하였다. 그러나, T3이 변형된 TCR을 도입한 후, 150 kd 밴드가 겔로부터 더 이상 관찰되지 않았으므로, 비-유사 쌍중 어느 것도 항체-유사 분자로 조합될 수 없음을 나타낸다. 이러한 데이터는 본 발명의 설계된 TCR-변형 Fab이 비-유사 체인의 미스페어링을 효과적으로 방지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. Fab-TCR 키메라의 생산 및 특성화
TCR-변형된 항체 Fab를 사용하여 이중특이적 항체를 설계할 수 있도록 하기 위하여, 두 위치에서 절단된 Fab 단편이 구축되었다. 도 8은 N-글리칸이 제거 된 TCR-변형 T3 Fab가 성공적으로 발현되고 정제된 것과 (T3-Fab-Design_2.his1 (서열번호 30/12))T3-Fab-Design_2.his2 (서열번호 31/12))을 나타낸다. CD3에 대한 이들의 결합 능력은 CD3 + Jurkat 세포에서 평가되었고, 야생형 T3의 1가 형태와 비교되었다. 도 9는 키메라 Fab 및 1가 T3이 질적으로 유사한 결합 행동을 가지고 있음을 보여주었다. His 및 Fc 태그가 있는 단백질에 대한 검출 방법의 차이로 인해 편차가 발생할 수 있다.
실시예 8. TCR-기반 놉-인투-홀 이중특이적 항체의 생성 및 특성화
TCR 불변 도메인을 단일특이적 항체 T3에 성공적으로 융합시키고, 새로운 포맷이 항체 U4와의 쇄 미스페어링을 효과적으로 예방할 수 있음을 확인한 후, 본 발명자들은 이중특이적 포맷을 구축하는 과정을 진행하였다.
Fc CH3 도메인에 사용된 "놉-인투-홀" 돌연변이를 갖는 TCR-변형 T3 및 야생형 U4를 Expi293 세포로부터 공동-발현시켰다. “놉-인투-홀"에 대한 돌연변이는 S139C, T3의 CH3 도메인 (서열번호 295, 놉)에서 T151W, Y134C, T151S, L153A 및 IgG1 이소타입에서 U4의 CH3 도메인 (서열번호 296, 홀)의 Y192V에서 이루어졌다. 대안적으로, 상기 놉-인투-홀 돌연변이는 S136C, T3의 CH3 도메인 (서열번호 298, 놉)에서의 T148W, Y131C, T148S, L150A 및 IgG4 이소타입에서 U4의 CH3 도메인 (서열번호 299, 홀)의 Y189V에서 이루어졌다. 도 7A 내지 7B는 정제 후 생산된 단백질의 IgG1 및 IgG4의 SDS-PAGE 데이터를 나타낸다. 도 7A 내지 7B는 정제 후 생산된 단백질의 IgG1 및 IgG4의 SDS-PAGE 데이터를 보여준다. 정확한 분자량, 즉 비-환원 겔에서 약 150 kd의 밴드 및 환원 겔에서 약 50 및 25 kd의 밴드가 모두 명확하게 관찰되었다. 정제된 샘플을 SEC-HPLC에서 추가로 검사하였다. IgG1 및 IgG4의 순도는 98.63% 및 100%를 달성하였다. 이 데이터는 IgG1과 IgG4 모두 IgG와 같은 분자가 잘 발현되고 조합되었음을 나타낸다. 이러한 TCR 관련 새로운 이중특이적 포맷을 'E17-Design_2-QQQQ'(IgG1의 경우 서열번호 22/12/24/23 및 IgG4의 경우 서열번호 25/12/26/23)로 지칭하였다.
설계된 이중특이적 항체에 대해 예상되는 분자량이 관찰되었지만, 각각의 암이 그들의 개별적으로 관련이 있는 항원에 대하여 그들의 본래의 결합 능력을 유지했는지 여부를 검사할 필요가 있었다. 각 타겟에 대하여, E17-Design_2는 1가 바인더이므로, 또한 본 발명자들은 나란히 비교하기 위하여 1가 버전의 천연 T3 및 천연 U4를 구축하였다. 도 10A 및 도 10B는 각각 CD3 + Jurkat 세포 및 CD19 + Ramos 세포에 대해 설계된 이중특이적 항체의 FACS 결합 결과를 보여준다. TCR-변형된 T3의 암은 야생형 T3에 비해 중간 정도의 결합 손실을 나타내지만, IgG4는 IgG1보다 우수하고 천연 단백질에 가깝다. 이웃하게 설계되어진 T3 암에 의하여 U4 암의 결합은 감소되지 않았다. 그것은 1가 형태로 기원의 U4 항체와 유사한 결합을 가졌다. 그러나 흥미롭게도, 이번에는 IgG1이 IgG4보다 성능이 우수하였다. 1가 결합을 유지하는데 이소타입이 중요한 이유는 확실하지 않다. TCR 불변 영역의 안정성, 제3 접합 도메인 설계의 선택 또는 두 Fab 암 사이의 상호작용과 같은 요인이 관찰된 현상을 초래할 수 있다.
CD3 및 CD19에 대한 TCR-변형된 이중특이적 포맷의 1가 결합은 이들의 2가 모 항체와 비교하여 감소하였다. CD3 결합을 통한 T 세포 활성화는 매우 민감한 것으로 알려져 있다. T 세포에 대한 강한 자극은 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서, 비교적 약한 CD3-결합은 아마도 허용 가능하고 심지어는 안전상의 이유로 바람직하였다. 그러나, 약한 CD19-결합은 이중특이적 항체 지향 B 세포 사멸에서의 능력에 직접 영향을 미쳐서, 약물 효능을 감소시킬 수 있다. CD19 결합의 중요성을 확인하고, 키메라 설계의 보편성을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 IgG4에 "F16-Design_2-QQQQ"라고 이름 붙여진 또 다른 이중특이적 구조를 구축하였고, 이렇게 설계한 T3 암은 여전히 1가이지만, U4 암은 2가였다.
새로운 구조는 발현되고 정제되며, 결합 실험을 직접 수행하였다. 도 11A 내지 11B는 이전에 설계된 E17과 2종의 모 항체 T3 및 U4와 비교하여 이의 FACS 결합 데이터를 나타내었다. F16-Design_2-QQQQ가 CD3- 및 CD19-결합(HC/LC (anti-CD3) /HC/LC(anti-CD19)순서로 서열번호 25/12/27/23)을 증가시킬 수 있다는 것은 흥미롭다. 그것의 CD19-결합 (서열번호 27/23)은 야생형 항체 U4와 필적한다. 상기 데이터는 우리의 T3의 키메라 설계가 다른 이중특이적 포맷에 적용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 이중특이적 항체-지향 종양 세포 사멸의 시험관 내 분석
시험관 내 기능성 분석은 악성 B세포를 사멸하는 것을 수반하는 T세포에서 설계된 이중특이적 포맷의 활성을 확인하기 위하여 수행되었다. E17 구조를 먼저 실험하였다. 모 단일특이적 항체 T3 및 U4를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 12는 이러한 이중특이적 포맷인 E17의 용량 의존적 세포 사멸 기능을 나타낸다. E17-IgG4 (EC50 = 57 pM)는 E17-IgG1 (EC50 = 624 pM)보다 더 강력하였다. 세포 사멸의 활성을 개선하기 위하여, 2개의 CD19-결합 부위를 갖는 F16 포맷 또한 E17과 비교되었다. 도 13에 나타난 바와 같이, E17 (EC50 = 17.7 pM)과 비교하여, F16의 효능 (EC50 = 5.5 pM)은 3배 개선되었다. 상기 데이터로 CD19의 결합이 세포 사멸 효과에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 관련되지 않은 인간 IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예 10. 질량 분석 특성화
생산된 이중특이적 항체가 올바른 어셈블리를 가지고 있는지 확인하기 위하여, 질량 분석에서 분자 E17-Design_2-QQQQ를 특성화하였다. 2종의 중쇄 및 2종의 경쇄 사이의 이론적 분자량의 차이는 각각 약 4000 Da 및 500 Da이다. 도 14a는 비-환원 상태에서 단백질의 스펙트럼을 나타낸다. 148180 Da에서의 피크는 올바르게 조합된 이중특이적 항체의 예상 분자량이었다. 다른 피크가 관찰되지 않았다는 것은 Fc 영역에서의 "놉-인투-홀"돌연변이 및 TCR-대체된 CH1/CL 영역이 원하는 4종의 쇄를 쌍으로 만드는 데 적절하게 작용하였다는 것을 나타낸다. 비-환원 질량 스펙트럼은 정확한 조합된 이중특이적 항체를 두 개의 경쇄가 미스페어링된 IgG와 구별하는 것을 도울 수 없다는 점에 주목할 만하다. 그러나, 실시예 4는 미스페어링된 중쇄 및 경쇄가 발현 또는 조합되지 않을 것이며, 이는 중쇄 및 경쇄의 쌍이 미스페어링 될 가능성을 제거함을 보여준다.
비-환원 조건에서 (도 14a 참조), 149128 Da에서 피크가 나타났으며, 이는 계산된 분자량보다 약 947 Da 더 높다. 단백질을 감소된 상태로 사용하여 질량 분석을 수행하였다. 도 14b는 실제로 VL-CAlpha 키메라 경쇄로부터 피크 948 Da가 떨어져서, 경쇄 상의 O-글리칸 변형(GlcNAc + Hex + 2 * NeuAc)을 나타냄을 보여주었다.
실시예 11. 열 안정성 실험
본 발명자들은 추가로 Differential Scanning Fluorimetry (DSF)을 사용하여 단백질 용융 온도 Tm을 측정함으로써 IgG1 및 IgG4 모두에서 설계된 이중특이적 항체의 열 안정성을 실험하고 비교하였다. 천연 단일특이적 T3 및 TCR-변형된 T3 (Design_2 및 Design_2-QQQQ)을 대조군으로 제공하였다.
표 35는 새로운 구조의 측정된 Ton, Tm 값을 열거하였다. 전반적으로, 모든 분자는 타당한 열 안정성을 나타내었다. IgG1-유사 분자는 IgG4-유사 분자보다 더 안정적이었다. 천연 T3 항체의 Tm 값은 74 ℃였다. TCR 항체 키메라 단백질은 약 60 ℃의 비교적 낮은 Tm을 가졌으며, TCR CBeta-CAlpha는 정상 항체의 CH1-CL에 비해 상승된 온도에 대해 내성이 적을 수 있음을 시사한다. 이것은 Wu의 연구 (Wu et al. 2015, 상기)에서 보고된 것과 일치하며, CAlpha 도메인은 CBeta(Toughiri et al. mAbs, 862(July), pp.1276-1285(2016))보다 덜 안정적인 것으로 제시되었다.
TCR 불변 영역에서 N-글리코실화를 제거하는 돌연변이는 키메라 단백질의 열 안정성에 영향을 미치지 않았다. 우리의 이중특이적 항체 E17-Design_2-QQQQ는 Design_2-QQQQ의 Tm과 유사한 Tm을 갖고, 천연 T3보다 낮은 Tm을 가졌다.
Differential Scanning Fluorimetry(DSF)에 의해 측정된 설계된 키메라 및 이중특이적 항체의 열 안정성
Figure pct00012
실시예 12. 재료 및 방법
항체 T3 Fv 상동성 모델링
항체 Fv 구조 모델은 소프트웨어 디스커버리 스튜디오 (BIOVIA)를 사용하여 Fv 아미노산 서열에 기초하여 구축되었다. 경쇄 및 중쇄 서열 모두는 먼저 3개의 CDR 및 각 쇄의 프레임워크를 확인하기 위하여 카바트 넘버링에서 주석을 달았다. 이어서, 각 세그먼트 (CDR 또는 프레임워크)를 PDB의 모든 항체 구조로부터의 서열로 항체 데이터베이스에서 BLAST-검색을 수행하였다. 가장 일치하는 서열의 구조에 있어서, 분해능이 높고 B 계수가 낮으면, 상동성 모델을 작성하는 데 사용되었다. 그런 다음 모든 모델링된 세그먼트를 조합하여 경쇄 및 중쇄 구조 모델을 구성하였다. 가장 유사한 전체 서열을 갖는 항체 구조의 각도를 취함으로써 2개의 모델링된 쇄 사이의 상대 방향을 예측하였다. 모든 분자 시각화 및 분석 작업은 PyMOL 소프트웨어 (Schrφdinger)를 사용하여 수행되었다.
벡터 구축
VL, VH, Ck, CH1 유전자는 기존의 내부의 DNA 주형으로부터 PCR에 의해 증폭되었다. CAlpha 및 CBeta 유전자는 Genewiz Inc.에 의해 합성되었다. 천연 또는 키메라 경쇄 유전자를 CMV 프로모터 및 카파 신호 펩티드를 함유하는 선형화 된 벡터에 삽입하였다. VH-CH1 또는 VH-CBeta의 DNA 단편은 인간 IgG4/IgG1 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 벡터는 CMV 프로모터 및 인간 항체 중쇄 신호 펩티드를 함유한다. 플라스미드 결찰, 형질전환, DNA 제조는 표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 부위 지향적 돌연변이 유발은 돌연변이 유발 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 이어서 주형 DNA의 DpnI 분해에 의해 수행되었다.
단백질 발현
구축된 중쇄 및 경쇄의 벡터를 Expi293 세포 (Thermofisher Scientific)에 공동 감염시켰다. 공동 감염에 대한 상이한 벡터의 비율은 항체의 예상 구조 및 SDS-PAGE에 나타난 초기 발현 결과에 따라 조정되었다. 간략하게, 40 ug 플라스미드 및 108 ul의 익스피펙타민을 사용하여 40 ml 부피의 1.2 x 108 세포를 형질 감염시켰다. 감염 20시간 후에 인핸서 1 및 인핸서 2를 첨가하였다. 감염된 세포를 오비탈 쉐이커에서 120 rpm으로 회전시키면서 8% CO2로 37 ℃에서 배양하였다. 감염 5일 후, 상청액을 원심 분리로 수확하고 세포 단편을 0.22 um 여과로 제거하였다.
SDS-PAGE에 의한 발현 검출
5일째에 수거된 상청액을 NuPAGE LDS 샘플 완충제 (4x), NuPAGE 샘플 환원제 (10x) 및 H2O와 혼합하였다. 환원된 샘플을 겔에 로딩하기 전에 75 ℃에서 가열하였다. 겔을 일정한 200V를 사용하여 35분 동안 작동시켰다. 이어서 겔을 SimplyBlue ? SafeStain (Invitrogen, LC6065)으로 염색하고 5분 동안 마이크로 웨이브처리를 하였다. 변색과정은 물과 함께 배양한 후 7분 동안 마이크로파를 처리하여 수행하였다. 겔 이미지는 Universal HoodIII (Bio-Rad)를 사용하여 촬영하였다.
정제
단백질 A 크로마토그래피 정제
MabSelect ? SuRe ? (MSS) 단백질 A 수지는 GE Healthcare에서 구입하여 유리 컬럼 (BioRad)에 포장하였다. 단백질 A 크로마토그래피에 의한 정제는 0.2 ml/분의 유속에서 전력으로서 연동 펌프를 사용하여 실온에서 수행하였다. 샘플을 로딩한 후, 10 컬럼 부피의 100 mM 글리신, pH 3.5를 용출에 사용하고, 상이한 분획을 수집하였다. 상이한 분획에서의 단백질 농도는 NanoDrop ? 2000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 측정하였다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의하여 검출하였다.
이온-교환 크로마토그래피 (IEC)
IEC 크로마토그래피 실험은
Figure pct00013
KTA Pure 시스템 (GE Healthcare)과 GE Healthcare 생명 과학의 Hi trap SP HP 1 ml 컬럼을 사용하여 수행하였다. 프로그래밍된 분석법 설정은: 세척 완충액 A (10 mM NaH2PO4, pH 6.0)로 컬럼 10 CV를 세척하고; 시료 주입구를 사용하여 시료를 붓고; 세척 완충액 A (10 mM NaH2PO4, pH 6.0)로 컬럼 10 CV를 평형화하고; 세척 완충액 A 및 세척 완충액 B (10 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 6.0)로 칼럼을 용출하였다. 농도구배 용출 조건은 30% 세척 완충제 B와 함께 50 CV에 대한 라이너(liner) 단계, 100% 세척 완충액 B를 사용하여 5 CV에 대한 라이너 스텝, 및 100% 세척 완충액 B로 10 CV를 충전하는 단계를 적용하였다. UV 흡광도 값에 따라 분획을 튜브 당 0.5 ml로 수집하였다 (수집 임계 값은 5 mAU로 설정).
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
GE Healthcare Life Sciences의 SuperdexTM 200 증가 10/300 GL 컬럼 및
Figure pct00014
KTA 시스템을 사용하여 크로마토그래피 실험을 수행하였다. PBS (137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4, 10 Mm Na2HPO4, pH 7.0)를 0.5 ml/분으로 사용하여 실험을 수행하였다. 0.5 ml의 각 분획으로 자동 수집 프로그램 (수집 값을 5 mAU의 UV 흡광도로 설정)을 사용하여 분획을 수집하였다.
Ni 세파로스 TM 엑셀 크로마토그래피 정제
Ni 세파로스TM 엑셀 크로마토그래피를 이용한 6xHis- 태그 된 단백질의 정제 Ni 세파로스TM 엑셀 수지는 GE 헬스케어로부터 구입하였다. 수지를 유리 컬럼 (BioRad)에 패킹 하였다. 10 컬럼 부피 (CV) ddH2O로 컬럼을 세척하여 수지 저장 버퍼를 제거한 후, 6xHis 태그 단백질의 정제에 사용하였다. 간단히 말해서, 연동 펌프를 사용하여 0.2 ml/분의 유속으로 Ni 컬럼에 의한 정제를 실온에서 수행하였다. 샘플 로딩 후, 10 CV PBS (50 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.0)를 세척에 사용한 후, 약하게 결합된 단백질을 제거하기 위하여 5 CV 용출 완충액 1 (50 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.0)을 이어서 수행하였다. 10 CV 용리 완충제 2 (50 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.0)를 사용하여 결합 단백질을 용리시켰다. 용출 후, NanoDrop ? 2000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수집된 단백질을 측정하였다. 용출된 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의해 검출되었다. 위생을 위하여 10 CV ddH2O, 10 CV 스트리핑 완충액 (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4), 10 CV 6 M 구아니딘 히드로 클로라이드, pH 7.4 및 10 CV 0.1 M 니켈 설페이트를 사용하여 컬럼을 재생시켰다. 재생된 컬럼을 20% 에탄올로 채우고 4 ℃에서 저장하였다.
크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC)
샘플의 순도는 Tosoh Bioscience의 TSK-GEL G3000SWXL 컬럼 (7.8 mm Х 300 mm) 및 Agilent 1200 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)을 사용하여 분석하였다. 칼럼을 인산 완충액 (50 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.0)으로 1.0 ml/분의 유속으로 평형화시켰다. 50 ul의 단백질 샘플을 여과 및 주입한 후, 280 nm에서의 UV 흡광도를 모니터링 하였다. 크로마토그램을 통합하여 순도를 추정하였다.
ELISA에 의한 항체 농도의 측정
ELISA 플레이트를 코팅 완충액 (200 mM Na2CO3/NaHCO3, pH 9.2)에서 200 ng/ml (Fab)2 형태의 염소 항-인간 IgG-Fc로 코하였다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 한 후, 플레이트를 깊은 웰 와셔 기계 (Biotek ELx405)를 사용하여 PBS 완충액으로 1회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 완충액 중 2% BSA로 차단하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 양성 대조군 항체 및 희석된 샘플을 첨가하였다. 2시간 인큐베이션 후, 플레이트를 300 ul 세척 완충액으로 6회 세척하고, 비오티닐화된 염소 항-인간 Ig-Fc (Bethyl, 100 ul/웰, 2% BSA에서 1:5000 희석)를 검출 항체로서 첨가하였다. 배양 및 세척 단계 후, SA-HRP (Invitrogen, 2% BSA에서 1:8000 희석)를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 추가 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 300 ul/웰 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 기질 TMB가 추가되고 10분 동안 진행하였다. 정지 용액 (2 M HCl, 100 ul/웰)을 추가로 발색을 중지시키고 플레이트 리더 (Molecular Device SpectraMax®M5e)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
표적-결합 분석
설계된 분자의 결합능은 각각 CD3 + Jurkat 및 CD19 + Ramos 세포주를 사용하여 평가하였다. 두 세포주는 모두 American Type Culture Collection (ATCC)에서 얻었으며, RPMI 1640 배지 (Invitrogen, Cat. No. 22400105) 에서 유지하였고, 10% 소 태아 혈청 (FBS, Corning, Cat. No. 35-076-CV) 을 보충하였다.
웰당 105 개의 세포 분취액을 수집하고 1% 소 혈청 알부민 (BSA, BovoGen-BSAS)으로 세척하고, 이어서, 4웰에서 1시간 동안 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Corning, Cat. No. 3799) 에서 연속 희석된 연구 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1% BSA로 2 회 세척한 후, 플레이트를 PE-접합된 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, Cat. No 109-115-098)와 함께 4 ℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 플레이트를 다시 2회 세척한 후, FACSCanto II 세포계 (BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석법으로 세포를 분석하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 관련 형광 강도를 정량화하였다. 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc)에서 EC50 값을 얻기 위하여 4-파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하였다.
이중특이적 항체-지향성 종양 세포 사멸
인간 T 세포를 수득하기 위하여, 건강한 공여자로부터 얻은 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 헤파린 정맥혈로부터 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17-1440-03) 밀도 원심 분리에 의해 새로 분리하였다. 6일 동안 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토 마이신 용액 (ScienCell, Cat. No.:0503), 인간 IL-2 리간드의 단백질 mL 당 50개 및 10 ng/mL OKT3 항체 ((EBioscience, Cat. No.: 16-0037-85) 가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양한 후, PBMC를 CD8+ T 세포의 농축을 위하여 EasySep (Stemcell, Cat. No.: 19053) 컬럼을 통과시켰다. 음성 선별 컬럼으로부터의 CD8+ T 세포를 효과기 세포로 사용하였다.
세포 독성 분석 방법으로, 표적 세포로서 CD19+ Raji 세포를 37 ℃에서 30분 동안 20 nM CellTrace Far Red (Invitrogen, Cat. No. C34564) 로 사전-표지를 하였다. 이어서, 세포 펠릿을 10% FBS가 보충된 페놀-프리 RPMI 1640 배지 (Invitrogen, Cat. No. 11835030) 로 2 회 세척하였다. 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Corning, Cat. No. 3799)에서, 근적색광으로 염색된 Raji B 세포 (20,000 cells/well)는 분리 된 CD8+ T 세포 (표적 : 이펙터 세포 비율 1:5) 및 연속으로 희석 된 이중특이적 항체와 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, 3 uM 프로피디움 요오드화합물 (PI, Invitrogen, Cat. No. P3566)을 첨가하고 완전히 혼합하여 죽은 세포를 확인하였다. 15분 후, 세포를 FACSCanto II 세포 측정기를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 이중특이적 항체-매개 세포독성은 근적생광의 양성 표적 세포에서 PI 양성 표적 세포의 백분율로 정의될 수 있다. T 세포 결합 세포 독성의 EC50을 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 측정하였다.
질량 분석 특성화
단백질을 0.4 mg/mL로 희석하고, 적어도 4시간 이상 37 ℃에서 100 uL의 20 mM Tris완충액(pH 8.0)에서 1uL의 PNGase F(Glyko, GKE-5006D) (단백질 대 효소 비율 40:1)와 함께 배양하여 글리코실화하였다. 디글리코실화된 이중특이적 항체의 부분표본(aliquot)를 실온에서 15분 동안 20 mM의 최종 농도로 2 uL 1 M DTT를 첨가하여 부분적으로 감소시켰다. 2 ug의 각 샘플을 0.4 mL/분으로 Acquity UPLC BEH300 C4 컬럼 (2.1 x 100 mm, 1.7 um)에 주입하였다. 이동상 A는 HPLC 등급의 물에서 0.1% 포름산 (FA)이었다. 이동상 B는 아세토니트릴에서 0.1% FA였다. 비-환원 및 환원된 조건 모두에 대하여, 3.0 부터 15.0분까지 24% B에서 34% B의 효율적인 용출 농도 구배가 사용되었다. RP UPLC에 의한 분리 후, 비-환원 및 환원된 조건에서 이중특이적 단백질의 질량을 Waters Xevo G2 Q-TOF에 의해 검출하였다. MS 신호는 BiophamaLynx 1.3 소프트웨어를 사용하여 분리하였다. 경쇄 및 중쇄 성분의 이론적 질량-평균 분자량은 GPMaw 프로그램 (v. 6.00)을 사용하여 결정하였다.
DSF에 의한 열 안정성 시험
7500 고속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 DSF 분석을 수행하였다. 간략하게, 19 uL의 항체 용액을 1 uL의 62.5 X SYPRO 오렌지 용액 (Invitrogen)과 혼합하고 96 웰 플레이트 (Biosystems)에 첨가하였다. 플레이트를 2 ℃분의 속도로 26 ℃에서 95 ℃로 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집하였다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음성 유도체를 계산하고, 최대 값을 용융 온도 Th로 정의하였다. 단백질에 다중 전개 전환이 있는 경우, 처음 두 개의 Th는 Th1 및 Th2로 명명하였다. Th1 은 항상 상이한 단백질들간의 비교를 용이하게하기 위하여 공식적인 용융 온도 Tm으로 해석한다. 데이터 수집 및 Th 계산은 운영 소프트웨어에 의해 자동으로 수행되었다. 소프트웨어가 다른 온도의 음성의 파생물 플롯(plot)을 보고하면, 전환 전 기준선에서 곡선이 감소하기 시작하는 지점의 플롯의 지점을 대략 시작 온도 Ton으로 추정할 수 있다.
실시예 13. O-글리칸 식별
이전의 질량 분석 데이터는 TCR-변형된 T3 경쇄에서 O-글리칸을 발견하였다. N-글리코실화 부위와 달리, 아미노산 서열 패턴에 기초하여 위치될 수 있는 O-글리코실화 부위는 서열로부터 예측하기 어렵다. 이 T3 TCR-키메라 경쇄는 T3 알파 항체의 불변 영역뿐만 아니라 T3 모 항체의 V 영역으로 구성되었다. 두 지역 모두 잠재적으로 O-글리코실화 부위를 가질 수 있다. 최초의 T3 모노클로날 항체에 대해 질량 분석을 다시 수행하였고 이 모 항체에는 O-글리칸이 없으며 이는 O-글리칸이 TCR 알파 불변영역에 위치함을 나타냈다.
O-글리코실화는 대부분 Ser 또는 Thr 잔기에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, TCR 알파 불변 영역의 서열에는 21개의 Ser/Thr 잔기가 존재하는 것으로 알려져있다 (아래 서열에서 굵게 표시됨). O-글리코실화 부위의 정확한 위치를 찾기 위하여, Ala 스캐닝을 수행하여 각각의 개별 Ser/Thr을 Ala로 대체하고, 21 개의 TCR-변형된 단일특이적 T3 분자가 구축되었다. 각각의 돌연변이체 상의 잠재적인 O-글리칸을 단백질로부터 방출하고, 2-아미노벤조산으로 표지하고 형광 검출기와 결합된 HPLC로 정량화하였다. O-글리칸 신호의 손실은 O-글리코실화 부위의 위치를 안내할 수 있다.
1 11 21 31 41
PDIQNPDPAV YQLRDSKSSD KSVCLFTDFD SQTQVSQSKD SDVYITDKCV
51 61 71 81 91
LDMRSMDFKS NSAVAWSQKS DFACANAFQN SIIPEDTFFP SPESS
(서열번호 411)
O-글리칸의 양을 확인하고 정량화하기 위하여, 산성 가수 분해 및 HPLC 기반 방법이 개발되었다. 샘플을 2M TFA (트리플루오로아세트산)에 의해 가수 분해하고 O-글리칸의 단당류를 방출시켰다. O-글리칸의 GalNAc (N-아세틸-D-갈락토사민)에서 방출된 GalN (갈락토사민) 및 Gal(갈락토스)는 2-아미노 벤조산으로 표지하고 FLD (Fluorescence Detector) 검출기와 결합된 HPLC로 분석하고 외부 보정 곡선에 의해 정량화하였다. 방출된 GalN 함량은 O-글리칸에 대한 특정 단당이기 때문에 O-글리칸의 양과 직접적으로 관련되었다. 몰 단백질 당 몰 GalN의 양 하나의 mol 단백질을 나타내며 mol O-글리칸의 양을 함유한다는 결과를 보고하였다.
표 34는 모든 돌연변이체에서 정량화 된 O-글리칸 수준을 보여준다. 이중특이적 분자 E17-Design_2-QQQQ를 대조군 단백질로 사용하였다. 데이터는 E17-Design_2-QQQQ 단백질의 각 몰에 0.24 mol O-글리칸이 있음을 보여주었다. 이것은 하나의 TCR 변형 T3 경쇄만을 갖는 이중특이적 항체이기 때문에, 2개의 쇄의 총 O-글리칸 수준은 약 0.48 mol/mol로 두 배가 되어야 한다. 모든 21개의 돌연변이 중에서, 그들 대부분은 예상되는 O-글리칸 양을 유지하였다. 샘플 # 3, # 8, # 10 및 # 20은 약간 신호가 감소하였다. 샘플 # 19는 명백한 O-글리칸 손실을 나타냈다. 신호는 대조 단백질의 신호보다 훨씬 낮았다. 따라서, 위치 S91을 주요 O-글리코실화 부위로 확인하였다. S19, S36, S41 및 S94를 가능한 O-글리코실화 부위로 확인하였다.
다양한 단일 Ala 돌연변이체 상의 정량화된 O-글리칸 (잔기 넘버링은 도 19a에 나열됨)
프로젝트 번호 WBP3438 Analytical NO. AS1803474
시험 아이템 단당류 분석 SOP NO. PD-PAS-LAB-090-02
샘플 No. 샘플 ID 시험 결과(mol/mol protein)
갈락토사민
196388 E17-Design_2-QQQQ 0.24 (x2)
1 T3.uIgG4.SP(S16A) 0.41
2 T3.uIgG4.SP(S18A) 0.43
3 T3.uIgG4.SP(S19A) 0.38
4 T3.uIgG4.SP(S22A) 0.45
5 T3.uIgG4.SP(T27A) 0.57
6 T3.uIgG4.SP(S31A) 0.44
7 T3.uIgG4.SP(T33A) 0.42
8 T3.uIgG4.SP(S36A) 0.36
9 T3.uIgG4.SP(S38A) 0.47
10 T3.uIgG4.SP(S41A) 0.37
11 T3.uIgG4.SP(T46A) 0.50
12 T3.uIgG4.SP(S55A) 0.43
13 T3.uIgG4.SP(S60A) 0.53
14 T3.uIgG4.SP(S62A) 0.56
15 T3.uIgG4.SP(S67A) 0.57
16 T3.uIgG4.SP(S70A) 0.52
17 T3.uIgG4.SP(S81A) 0.53
18 T3.uIgG4.SP(T87A) 0.55
19 T3.uIgG4.SP(S91A) 0.12
20 T3.uIgG4.SP(S94A) 0.32
21 T3.uIgG4.SP(S95A) 0.61
실시예 14. Fcγ 수용체, C1q 및 FcRn에 결합
방법
SPR에 의한 Fcγ 수용체 결합 친화력
FcγR에 대한 항체 결합 친화성을 Biacore T200 (또는 Biacore 8K)을 사용하여 검출하였다. 각각의 수용체는 항-his 항체 고정화 CM5 센서 칩 (GE)에 포획되었다. 상이한 농도의 항체를 60초의 결합 상 동안 30 uL/분의 유속으로 센서 칩 상에 주입하였고, 60초간 해리하였다. 이어서, 각각의 결합 사이클 후 칩을 10 mM 글리신 (pH 1.5)으로 재생시켰다.
블랭크 표면 및 버퍼 채널의 센서그램을 테스트 센서그램에서 뺀다. 실험 데이터는 Langmiur 분석 (FcγRI의 경우) 또는 정상 상태 모델 (다른 수용체의 경우)을 사용하여 1:1 모델로 적합화되었다. 150 KDa의 분자량을 사용하여 항체의 몰 농도를 계산하였다.
C1q binding by ELISA
ELISA 플레이트 (Nunc)를 4 ℃에서 밤새 3 ug/mL로 항체 샘플로 코팅 하였다. 블로킹 및 세척 후, C1q를 600 ug/mL로부터 출발하여 농도 구배로 희석하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 양 항-인간 C1q Ab-HRP와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 2 M HCl에 의해 상호작용을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Device)를 사용하여 판독하였다.
SPR에 의한 FcRn 결합 친화력
FcRn에 대한 항체 결합 친화도는 Biacore T200 (또는 Biacore 8K)을 사용하여 검출하였다. 각 항체를 CM5 센서 칩 (GE)에 고정시켰다. 주행 완충액 (50 mM Na2HPO4/Na2HPO4, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20, pH 6.0)에서 상이한 농도의 FcRn을 60초의 결합 상 동안 30 uL/분의 유속으로 센서 칩 상에 주입한 후 60초 동안 해리시켰다. 이어서, 각 결합 사이클 후 1XPBS (pH 7.4)에 의해 칩을 재생시켰다.
블랭크 표면 및 버퍼 채널의 센서그램을 테스트 센서그램에서 빼내었다. 실험 데이터는 정상 상태 모델에 의해 맞춰졌다. 45 KDa의 분자량을 사용하여 FcRn의 몰 농도를 계산하였다.
결과
상기 언급된 모든 IgG1이 LALA 돌연변이를 갖는 IgG1이므로, FcγRI, FcγRIIa (H167), FcγRIIa (R167), FcγRIIb, FcγRIIIa (F176), FcγRIIIa (V176) 및 FcγRIIIb에 대한 IgG4 및 야생형 IgG1(T3U4.E17-2.(2).uIgG1 (홀에 구멍이있는 야생형 IgG1)) 둘 모두에서 E17-Design_2-QQQQ의 결합 활성이 SPR에 의해 조사되었다.
T3U4의 관련 시퀀스E17-2.(2)uIgG1 구조는 하기에 제공되어 있다.
T3U4.E17-2.(2).uIgG1 U4-LC
(서열번호 371)		 diqltqspsflsasvgdrvtitcsasstvnymhwyqqkpgkapklliystsnlasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyychqwssypytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
U4-HC
(서열번호 372)		 qmqlvqsgpevkkpgtsvkvsckasgyaftsynmywvrqargqrlewigyidpyngdttynqkfkgrvtitrdmststaymelsslrsedtavyyclttayamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
T3-LC
(서열번호 373)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC
(서열번호 374)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
친화도를 표 38 (IgG4) 및 표 39 (야생형 IgG1)에 요약하였다. 두 분자는 모든 Fcγ 수용체에 대한 전형적인 인간 IgG4 및 야생형 IgG1 결합 친화도를 나타냈다.
SPR에 의한 Fc 수용체에 대한 IgG4 친화성
Fc 수용체 KD (M)
FcγRI 9.79E-09
FcγRIIa (H167) 2.05E-05
FcγRIIa (R167) 1.58E-05
FcγRIIb 2.41E-05
FcγRIIIa (F176) 2.93E-05
FcγRIIIa (V176) 1.40E-05
FcγRIIIb >4.10E-05
SPR에 의한 Fc 수용체에 대한 야생형 IgG1 친화성
Fc 수용체 KD (M)
FcγRI 1.30E-09
FcγRIIa (H167) 3.58E-06
FcγRIIa (R167) 4.83E-06
FcγRIIb 8.07E-06
FcγRIIIa (F176) 2.08E-06
FcγRIIIa (V176) 6.44E-07
FcγRIIIb 5.16E-06
C1Q에 대한 항체의 결합 활성을 ELISA로 시험하였다. (도 21a-21b). IgG4의 E17-Design_2-QQQQ는 ELISA에서 결합 신호를 나타내지 않았지만 (도 21a), 반면에 야생형 IgG1 및 대조군인 인간 IgG1 항체에서는 E17-Design_2-QQQQ는 정상적인 결합 신호를 나타냈다(도 21b).
실시예 15. 대칭 포맷 G19, G19R, G25, G25R
CD3 x CD19와 같은 항체 치료제 표적은 안전성 문제로 인해 1가 CD3 결합을 갖는 이중특이적 항체로부터 이익을 얻는다. 이를 염두에 두고 WuXiBody Fab와 놉-인투-홀 기술을 통합하여 대칭 이중특이적 포맷 E17 및 F16을 설계하고 성공적으로 생성하였다. 그러나 CTLA-4 x PD-1과 같은 일부 이중특이적 표적은 대칭 포맷의 이점을 얻으며, 이는 원하는 시너지 효과를 얻기 위하여 원래의 균형 (즉, 총 4가)을 유지하면서 두 개의 서로 다른 항체를 조합할 수 있다. WuXiBody의 핵심 요소는 키메라 Fab이며, 이는 대칭 및 대칭 포맷으로 쉽게 통합되어 동족 경쇄-중쇄의 올바른 페어링을 보장한다. G19, G19R, G25 및 G25R이라는 네 가지 WuXiBody 기반 대칭 포맷을 설계하였다.
도 22는 네 개의 대칭 포맷의 개략적인 설명을 제공한다. G19 및 G25에서, 2개의 WuXiBody 키메라 Fab가 각각 정상 항체의 c-말단 및 n-말단에 접목되었다. G19와 G19R 또는 G25와 G25R의 차이는 각각의 개별 포맷에서 정상 및 키메라 Fab의 반전된 위치이다. IgG-Fc뿐만 아니라 2개의 Fab의 무거운 부분은 하나의 쇄에 통합되었고, 반면에 두 경쇄는 자유롭게 접히고 독립적으로 조합되었다. 3개의 벡터가 숙주 세포 내로 공동-형질 감염된 경우, 발현 과정 동안 정상 항체와 같이 중-중 결합이 일어날 것으로 예상되는 반면, 각각의 경쇄는 중쇄상의 자신의 동족 파트너에 자가-조합될 것으로 예상되었다.
대칭의 WuXiBody 포맷의 이중특이적 CTLA-4 x PD-1 항체가 설계되었다. 새로운 포맷을 플러그인하기 위하여 신규한 항-PD-1 항체 W3055_1.153.7 (U6으로 명명됨) 및 상업적 항-CTLA-4 항체 이필리무맙 (T1로 명명됨)을 채택하였다. 분자에 대한 ADCC 및 CDC 효과의 감소를 보장하기 위하여 IgG4 이소타입을 선택하였다. U6과 T1을 모두 포맷의 상단 또는 하단 (각각 U6T1 및 T1U6으로 명명)에 넣을 수 있기 때문에 단일 포맷 G19가 먼저 두 경우를 발명하는 데 사용되었다.
테스트된 WuXiBody의 관련 서열은 다음과 같다.
Samples Plasmid No Sequences
T1U6.G19.IgG4 T1-LC
(서열번호 375)		 eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
T1-U6-HC
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T4-LC
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U6T1 및 T1U6 구조 모두 Expi293 시스템에서 정상적으로 발현되었고, 발현된 단백질은 단백질 A 크로마토그래피의 1단계 정제 후 약 90% 순도를 달성하였다. 도 23a-23b는 정제된 단백질의 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 특성을 보여주었다. 이들의 결합능을 검사하기 위하여, 이후에 PD-1 및 CTLA-4 표적 모두에 대한 세포-기반 결합 분석을 수행하였다. 도 24a-24b는 U6 및 T1 모두 포맷의 하단에 위치할 경우 결합이 감소되었음을 보여주었다. PD-1의 기능이 CTLA-4의 기능보다 상대적으로 중요하다는 것을 고려하면 (CTLA-4 항체는 더 심각한 부작용이 있는 것으로 알려져 있음), PD-1 결합면을 U6 결합 (즉, T1U6이 아닌 U6T1)을 최대화하고 하부에 위치한 CTLA-4 결합을 최적화하는 방법을 시험하기 위하여 상부에 놓았다.
다른 3개의 WuXiBody 포맷 G19R, G25 및 G25R (도 22에 표시)을 추가로 조사하였다. 또한, 임상 시험에 사용된 PD-1/CTLA-4 이중특이적 항체인 벤치 마크 항체 AK-104 (Akeso Biopharma, Inc)를 얻고 직접 비교를 위한 대조군으로서 사용하였다.
PD-1 기능의 중요성으로 인해, U6은 PD-1 결합을 최대화하기 위하여 모든 포맷의 상단에 유지하였고, T1은 적절한 CTLA-4 결합을 실현하기 위하여 바닥상태를 유지하였다. 모든 구축된 분자는 Expi293에서 잘 발현되었고, 단백질 A 크로마토그래피의 1 단계 정제 후> 90% 순도를 쉽게 달성하였다. 도 25a-25b는 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC를 특징으로 하는 정제된 단백질을 나타낸다.
이어서 PD-1 및 CTLA-4 둘 다에 대한 세포-기반 결합 분석을 수행하여 모든 새로운 구축된 분자의 결합 능력을 확인하였다. 도 26a-26b는 설계된 구조물과 벤치 마크 항체 사이의 결합 곡선 비교를 보여주었다. 데이터는 모든 단백질이 벤치 마크 항체에 매우 유사한 PD-1 결합을 가짐을 보여주었다. 또한, CTLA-4 결합은 G25 및 G25R 포맷에서 유의미하게 개선되었고 벤치 마크 항체와 비교할 만한 성능을 달성하였다 (<= 2 배). 그러나 G19R 포맷은 여전히 잘 작동하지 않았다. G19와 G19R은 T1의 효과적인 바인딩을 방해하는 동일한 문제를 공유했을 가능성이 있다.
분자의 기능은 PD-L1 및 CD80의 두 표적의 각각의 리간드에 대한 그들의 경쟁 능력을 검사함으로써 더욱 특징화 되었다. 도 27a-27b는 이들 분자가 PD-L1과 경쟁할 때 벤치 마크와 유사한 성능을 갖는다는 것을 확인하였다. CTLA-4 측의 경우, G25R 포맷은 CD80과 경쟁할 때 벤치 마크와 유사한 기능을 나타냈다. 다른 두 포맷은 상대적으로 나쁜 결과를 나타냈다. G25와 G25R의 차이점은 TCR 불변 영역의 위치이다. T1이 여전히 U6 아래에 있지만 T1을 WuXiBody 포맷으로 변환하면 T1의 활동이 촉진된 것으로 보인다. 이는 제한된 수의 WuXiBody 파생 포맷을 스캔하여 기능 리드를 효과적으로 차단할 수 있음을 보여주는 좋은 예이다.
따라서, 벤치 마크 항체와 유사한 기능성 PD-1/CTLA-4 이중특이적 항체가 수득되었다. WuXiBody 포맷은 매우 보편적이고, 모든 새로운 항체는 이러한 포맷에 적합하게 기능을 수행할 수 있다. 우수한 모 항체가 이용 가능하다면, 이는 벤치 마크 항체보다 우수한 분자를 생성하는데 사용할 수 있다.
이 개념을 증명하기 위하여, 이필리무맙보다 훨씬 더 강한 친화성을 갖는 또 다른 항-CTLA-4 항체 W3162_1.154.8-z35 (T5로 명명됨)가 개발되어 도 22에 표시된 4가지 포맷 G19, G19R, G25 및 G25R로 모두 구현되었다. 다시, 모든 새로운 구조물은 Expi293 세포에서 잘 발현되었고, 1단계 단백질 A 크로마토그래피로 쉽게 정제되었다. 단백질의 순도는도 28a-28b에 나타내었다.
모든 U6T5 분자, 이전에 확인된 U6T1.G25R 분자 및 벤치 마크 항체의 결합을 모두 수행하고 비교하였다. 결과는 도 29a-29b에 나타내었다. PD-1 항체는 어떠한 형태로도 대체된 PD-1 항체가 없기 때문에, 이전에 관찰된 바와 같이 원래의 결합 거동을 유지하였다. 그러나, CTLA-4측의 경우, 모든 U6T5 구조물 (G19 및 G19R 포맷조차도)U6T1.G25R 및 벤치 마크 분자보다 명백한 우수한 결합을 나타냈다. U6T5.G25는 모든 새로운 단백질 중에서 가장 강한 단백질로, 벤치 마크 항체에 비해 EC50이 1.6배 개선되고 최고 값이> 3 x 개선되었다. 이 분자는 ELISA 이중 결합 분석 및 FACS 경쟁 분석에서 추가로 특성화되었다. 도 30은 두 표적에 동시에 분자의 효과적인 이중 결합을 입증하였다. 도 31a-31b의 데이터는 U6T5.G25가 CD80 대 CTLA-4와의 경쟁 능력이 상당히 개선되었음을 확인하였다. 이것은 WuXiBody 포맷이 다른 모항체를 처리하기에 충분히 유연하다는 것을 증명하였다. 모 항체의 우수한 부분은 분자가 WuXiBody 포맷에 연결될 때 잘 보존되고 반영될 수 있다.
네 가지 대칭 포맷을 모두 포함하는 분자의 열 안정성이 특징적이었다. 대부분의 분자는 60 ℃ 부근의 용융 온도를 보여주었으며 (표 41 참조), 이는 위에서 보여준 비대칭 포맷과 일치한다.
WuXiBody 포맷의 대표적인 항체의 녹는 온도
단백질명 이소타입 pI 버퍼 농도
(mg/ml) 		T h 1
( ℃ ) 		T h 2
( ℃ )
T1U6.G19.IgG4 IgG4,kappa,lamda 5.92 PBS 1.3 60.8 69.9
U6T1.G19.IgG4 IgG4,kappa,lamda 5.92 PBS 0.9 59.1 72.8
U6T1.G25R.IgG4 IgG4,kappa,lamda 6.06 PBS 1.385 60.8 73.9
U6T5.G19.IgG4 IgG4,kappa,lamda 5.93 PBS 0.6 56.2 74.1
U6T5.G19R.IgG4 IgG4,kappa,lamda 5.87 PBS 1.2 63.4 ―
U6T5.G25.IgG4 IgG4,kappa,lamda 5.93 PBS 0.7 63.4 ―
U6T5.G25R.uIgG4 IgG4,kappa,lamda 5.99 PBS 0.5 57.2 74.1
실시예 16. 경-중 스위치 키메라 Fab
총 111 개의 잠재적인 WuXiBody 기반 포맷을 성공적으로 설계하였다. 위에 표시된 E17, F16, G19, G19R, G25 및 G25R 외에도, 교차 TCR- 키메라 Fab이 있는 몇 가지 포맷을 설계하였다. 이들은 G26, G26R 및 G27로 명명되었으며, 도 32에 나타내었다. 이번에는 항체 쌍 U6 및 T4가 사용되었고, 여기서 T4는 항-CTLA-4 항체 WBP3162-1.146.19-z12였다. T4U6 쌍은 포맷 G27 및 G26R에서 개발되었다. 도 33a-33b는 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC를 특징으로 하는 정제된 단백질을 나타내었다. 두 단백질이 모두 발현되었지만, T4U6.G27.IgG4는 순도가 낮지만 T4U6.G26R는 아니었다. IgG4는 정확한 분자량 및 고순도를 가졌다. 후자의 분자의 결합 능력은 FACS 결합을 특징으로 하였다. 도 34a-34b는 PD-1 결합이 하단에 위치하기 때문에 영향을 받는 반면, CTLA 결합 측은 포맷의 상단에 놓았을 때 완전한 회복을 보여주었다.
발현 및 정제 단계는 도 35a 내지 35b에 나타낸 바와 같이 잘 작동하였다. ELISA 및 FACS 결합을 모두 수행하였고 데이터를 도 36a 내지 36d에 나타내었다. 이러한 데이터는 경량의 교차 키메라 Fab이 여전히 잘 작동할 수 있음을 증명하였다. 이 분자의 용융 온도는 표 42에 나타낸 바와 같이 약 63.4이다.
U6T4.G26.IgG4의 녹는 온도
단백질명 이소타입 pI 버퍼 농도
(mg/ml) 		T h 1
( ℃ ) 		T h 2
( ℃ )
U6T4.G26.IgG4 IgG4,kappa,lamda 5.93 PBS 0.8 63.4 -
실시예 17: 이중특이적 항-CD13 x CD19 WuXiBody
배경
표적 생물학
인간 CD19는 면역 글로불린 슈퍼 패밀리에 속하는 타입 I의 막 관통 단백질이다 (Carter et al., Curr Dir Autoimmun, 2004, 7 : 4-32). 대부분의 B 세포에서 발현되지만 형질 세포, 줄기 세포 또는 정상적인 골수 계통에서는 검출되지 않는다(Tedder, Nat Rev Rheumatol, 2009, 5 (10) : 572-577). CD19는 B 세포 수용체 (BCR)-의존 모두를 조절함으로써 고유 B 세포 신호 전달 역치 설정 및 독립적인 신호에 결정적으로 관여한다(Wang et al., Experimental Hematology & Oncology, 2012, 1:36). CD19는 CD20보다 더 넓은 발현을 갖는다. CD19 발현의 패턴은 B-세포 림프종의 모든 서브 타입을 포함하는 B-세포 악성 종양에서 유지되며, B 세포 만성 림프구 백혈병뿐만 아니라 무분별한 것부터 공격적인 형태, 비-T 급성 림프 모구 백혈병, 및 리툭시맙에 의해 표적화 될 수 없는 급성 림프 모 구성 백혈병 (ALL)과 같은 초기 B 세포의 종양 표시의 표적화를 허용한다. 림프종 치료를 위한 몇몇 CD19 단일 클론 항체가 연구되고 있다(미국 특허 출원 공개 번호 20140072587 A1, 미국 특허 번호 8,242,252 B2 및 미국 특허 번호 8,097,703 B2).
CD3 T-세포 공-수용체는 4개의 별개의 쇄, CD3 감마 쇄, CD3 델타 쇄 및 2 개의 CD3 엡실론 쇄로 구성된 단백질 복합체이다. 4개의 쇄는 T-세포 수용체 (TCR)로 알려진 분자 및 제타-쇄와 결합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR, 제타 체인 및 CD3 분자는 TCR 복합체를 구성하는데, 여기서 서브 유닛으로서 TCR은 항원을 인식하고 항원에 결합하고, 서브 유닛으로서 CD3는 항원 자극을 신호 전달 경로로 전달하고 전달하여 궁극적으로 T-세포 활성을 조절한다. CD3 단백질은 사실상 모든 T 세포에 존재한다. CD3-TCR 복합체는 선천적 및 적응 면역 반응뿐만 아니라 세포성 및 체액성 면역 기능 모두에서 T 세포 기능을 조절한다. 여기에는 병원성 유기체 제거 및 광범위한 세포 독성 효과에 의한 종양 성장 제어가 포함된다. 인간 CD3에 특이적인 마우스 모노클로날 항체, 예컨대 OKT3 (Kung et al., Science, 1979, 206 : 347-9)은 치료를 위하여 개발된 1 세대 CD3 항체였다. OKT3는 강력한 면역 억제 효능을 갖지만, 면역 원성 및 유사 분열 잠재력과 관련된 심각한 부작용으로 인해 임상에서의 사용이 방해받았다 (Chatenoud, Nature Reviews, 2003, 3 : 123-132). OKT3는 항-글로불린 반응을 유도하여, 그 자체의 신속한 제거 및 중화를 촉진시켰다 (Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 1982, 137 : 830-8). 또한, OKT3는 시험 관내에서 T-세포 증식 및 생성을 유도하고, 생체 내에서 사이토카인의 대규모 방출을 초래 하였다 (Hirsch et al., J. Immunol, 1989, 142 : 737-43). 이러한 심각한 부작용은 이식에서 OKT3의 더 광범위한 사용뿐만 아니라 자가 면역 (Id.)과 같은 다른 임상 분야로의 사용의 확장을 제한하였다.
CD3 및 CD19를 표적화하는 이중특이적 항체는 T 세포 및 B 세포에 동시에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체가 CD3-양성 T 세포 및 CD19-양성 B 세포에 결합하면, 세포 용해성 시냅스가 형성된다. 세포 독성은 세포 독성 T 세포에서 과립으로부터 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzymes)의 방출에 의해 유도되고, 그랜자임은 악성 B 세포의 세포자연사 및 용해를 유도한다.
블리나투모맙(blinatumomab)의 활성은 클래스 I MHC 및 TCR 인식에 의한 항원 제시와 무관한 것으로 입증되었다. 따라서, 항원 제시기구의 손상 및 종양 미세 환경에서 음성 동시 자극 신호의 활성화와 같은 다양한 종양 매개 면역 탈출 메커니즘을 우회할 수 있다.
충족되지 않은 의학적 요구
성인에서 급성 림프 모구 백혈병 (ALL)의 치료는 여전히 어려운 과제이며 새로운 치료법이 필요하다. 현재의 요법에서, 반응률은 초기 완화, 기간 및 세포 유전학의 지속 기간에 따라 30 내지 50%의 범위이다. 비-호지킨 림프종 (NHL)의 부분 집합에 대한 전체 반응률은 이제 1세대 항-CD20 항체를 사용하는 요법하에서 90% 이상이다. 그러나, 몇몇 NHL 아형은 이들 요법에 반응하지 않고, 반응성 NHL을 갖는 대부분의 환자는 표준 조합된 면역 요법/화학 요법 후에 결국 재발한다. 따라서 이러한 충족되지 않은 요구에는 새로운 1차 요법과 새로운 구제 요법이 필요하다.
재료 및 방법
시노몰구스 원숭이 CD19 발현 세포주 생성
인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD19의 유전자 전체를 pcDNA3.3 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 각각의 발현 벡터를 리포펙타민 2000을 사용하여 각각 CHO-K1 세포로 형질 감염시켰다. 세포를 10% FBS와 함께 F12-K에서 배양하였다. 형질 감염 후 블라스티시딘을 24-48시간동안 첨가하였다. 2 내지 3회 계대후에, 세포는 PE 접합된 항-CD19 항체 및 항-PE 마이크로 비드 (Miltenyi-013-048-801)에 의해 농축되었다. 제한 희석으로 안정한 단일 세포 클론을 분리하고 항-CD19 항체를 사용한 FACS에 의해 스크리닝하였다.
표적-발현 종양 라인
Raji 및 Jurkat 세포는 ATCC로부터 유래되었다. 라모스 세포는 ECACC에서 유래하였다. 모든 종양 세포를 RPMI1640/10% FBS에서 배양하였다.
WuXiBody W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 구성
VL, VH, Ck, CH1 유전자는 기존의 존재하는 DNA 주형으로부터 PCR에 의해 증폭하였다. CAlpha 및 CBeta 유전자는 Genewiz Inc.에 의해 합성하였다. 안티 CD19 네이티브 또는 안티 CD3 키메라 경쇄 유전자를 CMV 프로모터 및 카파 신호 펩티드를 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. VH-CBeta의 DNA 단편을 놉(knob) 돌연변이로 인간 IgG4S228P 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 항 CD3 항 CD19 VH-CH1의 DNA 단편을 홀 돌연변이로 인간 IgG4S228P 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화 된 벡터에 삽입하였다. 벡터는 CMV 프로모터 및 인간 항체 중쇄 신호 펩티드를 함유한다.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 발현 및 정제
중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 Expi293 발현 시스템 키트 (ThermoFisher-A14635)를 사용하여 Expi293 세포로 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염 5일 후, 상청액을 수집하고 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare-17543802) 및 추가 사이즈의 배제 컬럼 (GE Healthcare-17104301)을 사용하여 단백질을 정제하였다. 항체 농도는 Nano Drop으로 측정되었다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC에 의해 평가하였다.
FACS에 의한 표적 결합
CD3- 및 CD19-발현 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합은 각각 Jurkat 및 Ramos를 사용하여 평가하였다. 비관련 항체를 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 세포를 105 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 (Corning-3799)에 펼치고 PBS/1% BSA로 세척하였다. 항체를 연속 희석하고 4 ℃에서 1시간동안 세포와 함께 배양하였다. PE-접합된 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (Jackson-109-115-098)를 검출에 사용하였다. 세척 및 재현탁 후, 세포를 유세포 분석 (Canto II, BD Biosciences)에 의해 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 프리즘 그래프 패드 소프트웨어를 사용하여 EC50 값을 계산하기 위하여 4- 파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하였다.
시노몰구스 CD3에 대한 결합
시노몰구스 CD3에 대한 CD3xCD19 이중특이적 항체의 결합을 단백질 결합 ELISA로 시험하였다. 96 웰 고단백 결합 ELISA 플레이트 (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher, Thermo-442404)를 탄산염-중탄산염 완충액 (20mM Na2CO3, 180mM NaHCO3, PH9.2안의 100 ul의 1 ug/ml Cynomolgus CD3 입실론 단백질(Acro, # CDE-C5226)로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 웰을 PBS/0.5 ? 트윈 -20 (v/v)의 웰당 300 uL로 1회 세척하였다. 이어서, 웰을 PBS/2% BSA(BOVOGEN, #BSAS)의 웰당 200uL로 1 시간 동안 실온에서 차단하고, PBS/0.5 ? 트윈-20(v/v)의 웰당 300uL로 3회 세척하였다. 1차 항체결합을 위하여, PBS/2% BSA에 연속 희석된 CD3xCD19 이중특이적 항체를 관련 웰에 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 100 ul의 100 ng/ml 이차 항체 염소-항-인간 IgG Fc-HRP (Bethyl, # A80-304P)를 첨가하기 전에 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 한 후, 상기 언급한 바와 같이 6회 세척하였다. 결합 검출을 위하여, 100ul 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기질 용액 (Sigma-860336)을 100 ul 2M HCl과의 반응을 정지시키기 전에 암실에서 10 분 동안 실온에서 모든 웰에 첨가하였다. 시노몰구스 CD3에 대한 이중특이적 항체 결합 정도는 SpectraMax® M5e 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 OD450 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 적절한 경우, GraphPad Prism5 소프트웨어를 사용하는 4- 파라미터 비선형 회귀 분석에 의해 결합 EC50 값을 얻었다.
시노노글러스 CD19에 대한 결합
CHOK1 세포상에서 발현된 시노모글러스 CD19 표적 단백질에 대한 CD3xCD19 이중특이적 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 결정하였다. 요약하면, 시노노글러스 CD19 과발현된 안정한 세포주 (WBP701.CHOK1.cPro1.C9, WuXi Biologics)를 트립신으로 수확하고 1% BSA / 1XPBS에서 1x106 세포 / ml로 희석하였다. 1 x 105 세포/웰 (100 ul)을 96- 웰 U- 플레이트 (Corning, # 3799)의 각 웰에 첨가하고, 상청액을 제거하기 전에 1500rpm (Eppendorf, # 5810R)에서 5 분 동안 원심 분리하였다. 1% BSA/1XPBS에 연속 희석된 항체를 펠렛 세포에 100ul/well로 첨가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 비관련 hIgG4 항체를 이소타입 대조군으로 사용하였다. 세포를 4 ℃에서 5 분 동안 1500rpm에서 원심 분리하여 180ul / 웰의 1% BSA / 1XPBS로 2 회 세척하였다. 펠렛 세포를 1:150으로 희석된 100ul /well 형광-표지된 항-인간 IgG Fc 항체(잭슨, #109-115-098)에 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 1% BSA / 1XPBS으로 재현탁하였다. 이어서, 세포를 상기 기재된 바와 같이 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 세포를 80ul 1% BSA / 1X PBS에 재현탁시키고 FACS Canto II 세포 계측기 (BD Biosciences)로 형광값을 측정하였다. 평균 형광 (MFI)을 측정함으로써 세포 표면에 결합된 항-CD19 & CD3 이중특이적 항체의 양을 평가하였다. FlowJo 소프트웨어로 FACS 미가공 데이터 분석되었고, 어떤 항체 또는 이차 항체도 포함하지 않은 웰을 배경 형광을 설정하는데 사용하였다. 결합 EC50 값은 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하는 4- 파라미터 비선형 회귀 분석에 의해 얻어졌다.
FACS에 의한 친화성
CD3 및 CD19에 대한 결합 친화도는 각각 Jurkat 및 Ramos 세포를 사용하는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 세포를 5-104 세포/웰의 밀도로 96- 웰 U- 바닥 플레이트(BD)로 옮겼다. 시험 될 항체는 1% 1XPBS/1% BSA에서 1 : 2배 연속 희석되고 4 ℃에서 1 시간동안 세포와 함께 배양되었다. 이어서, 플레이트를 1500 rpm에서 4 분 동안 원심 분리하고 상청액을 버렸다. 이차 항체인 Alexa647 접합 염소 항 인간 IgG Fc (Jackson, Cat # 109-605-098) 또는
FITC 공액 염소 항-His (Bethyl, Cat # A190-113F)는 재현탁 된 세포에 첨가하고 30 분 동안 어두운 곳에서 4 ℃에서 인큐베이션 하였다. 세포를 1 회 세척하고 100 uL 1XPBS / 1% BSA에 재현탁시켰다. 유세포 분석법 (BD Canto II)에 의해 형광 강도를 측정하고 FlowJo에 의해 분석하였다. 형광 강도는 정량 비드 (QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories)를 기반으로 결합된 분자/세포로 전환되었다. KD는 Graphpad Prism5에 의해 계산되었다.
표적 세포상의 이중 결합
FACS에 의해 CD3 T 세포 및 CD19 B 세포를 가교시키는 이중특이적 항체의 능력을 시험하였다. 1 * 106 세포/ml의 밀도로 37 ℃에서 30분 동안 Jurkat 세포 및 Raji 세포를 20 nM CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564) 및 50 nM Calcein-AM (Invitrogen-C3099)으로 별도로 사전 라벨링하였다. 사전 표지 된 세포 펠렛을 PBS/1% BSA로 2 회 세척 한 다음, 1:1의 최종 밀도로 1 * 106 세포 / ml로 혼합하였다. 세포 혼합물을 원심 분리하고 10nM 항체로 재현탁한 후에 1시간동안 배양하였다. 인큐베이션 직후에 유세포 분석법에 의해 세포 혼합물을 분석하였다. 브리징 백분율은 Far-Red 및 Calcein으로 동시에 레이블이 지정된 이벤트의 백분율로 계산되었다.
세포 독성 분석
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17-1440-03) 밀도 원심 분리를 이용하여 헤파린 정맥혈에서 새로 분리하였다. 이어서, 수득된 PBMC를 CD8 + T 세포의 농축을 위하여 EasySep (Stemcell-19053) 컬럼을 통과시켰으며, 이를 이펙터 세포로서 사용하였다. CD8 + T 세포에 의한 종양 세포 용해를 매개하는 항체의 효능을 유세포 분석에 의하여 결정하였다. 세포 독성 분석에서, 표적 세포로서의 Raji CD19 B 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 20 nM CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564)로 사전 표지한 다음 이어서 1% FBS가 보충된 페놀-프리 RPMI 1640 (Invitrogen-11835030)으로 세포 펠렛을 2회 세척하였다. 근적색광으로 염색된 Raji (웰당 20000 세포)를 분리된 CD8 + T 세포 (이펙터 / 표적 세포 비율 5 : 1) 및 37 ℃에서 연속 희석된 항체와 함께 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Corning-3799)에서 배양 하였다. 배양 후, 죽은 세포를 식별하기 위하여 3 uM 프로피디움 아이오다이드 (PI, Invitrogen-P3566)를 철저히 혼합하였다. 15 분 후, 세포를 FACSCanto II 세포 측정기를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. Ab- 매개 세포 독성은 Far Red- 양성 표적 세포에서 PI- 양성 표적 세포 백분율로 정의할 수 있다. 세포 독성의 EC50을 프리즘을 사용하여 측정하였다.
T 세포 활성화 분석
분비된 시토카인 TNFα 및 IFN
T 세포의 활성화 여부는 상청액에 분비된 TNFα 및 IFN IF의 양에 의해 반영되었다. CD4 및 CD8 양성 T 세포의 분리 절차는 "T 세포 활성화 (세포 내 시토카인 염색)"섹션에 기술되어있다. Raji 인간 B 세포 (2 * 104 세포 / 웰), CD4 또는 CD8 T 세포 (1 * 105 세포 / 웰) 및 항체의 혼합물을 37 ℃에서 24 시간 동안 공동 배양하였다. 상청액을 수집한 후, 반응 혼합물을 1500 rpm에서 5 분 동안 원심분리 하였다. 상청액 중의 TNFα 및 IFN의 양은 인간 TNF ELISA 세트 (R & D-DY210) 및 인간 IFN ELISA 세트(캡처 Ab : Thermo Fisher-M700A, 검출 Ab : Thermo Fisher-M701B, 표준 물질 : PEROTECH- 300-02)에 의해 각각 결정되었다.
샌드위치 ELISA법의 절차는 다음과 같다. 96 웰 고단백 결합 ELISA 플레이트 (ThermoFisher-442404)를 탄산염-중탄산염 완충액 중 50 ul / 웰 포획 항체(20mM Na2CO3, 180mM NaHCO3, pH 9.2)으로 키트 사양에 따라 4 ℃또는 실온에서 밤새 코팅하였다. 모든 웰을 PBS / 0.5% 트윈 -20 (v / v)의 웰당 300 ul로 3 회 세척하고 분석에서 모든 후속 세척 단계를 동일하게 수행하였다. 이어서, 웰을 TNFα의 경우 PBS / 2% BSA (BovoGen 의 경우 100% 카제인 (Pierce-37528)으로 1시간 동안 차단한 다음, 3회 세척하고, 이어서 수집 된 상청액 또는 표준 물질 (50 ul / 웰)을 실온에서 1시간 동안 결합시킨 후 3회 세척하였다. 검출 항체 결합을 위하여, TNFα의 경우 PBS / 2% BSA 및 IFN의 경우 50% 카제인으로 희석 된 해당 항체를 관련 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 2차 항체 SA-HRP 50ul를 첨가하기 전에 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 앞서 설명한 바와 같이 6회 세척하였다. 결합 검출을 위하여, 50 ul 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기판 용액 (Sigma-860336)을 50 ul의 2M HCl로 반응을 정지시키기 전에 10분 동안 모든 웰에 첨가하였다. TNFα 및 IFN의 양은 SpectraMax® M5e 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 OD450 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
T 세포 활성화 분석-표면 마커 CD25 및 CD69 발현
T 세포의 활성화 여부는 표면 수용체 CD25 및 CD69의 염색 신호에 의해 반영되었다. CD4 및 CD8 양성 T 세포의 분리 절차는 "T 세포 활성화 (세포 내 시토카인 TNFα & IFN 염색)"섹션에 기술되어있다. Raji 인간 B 세포 (2 * 104 세포 / 웰), CD4 또는 CD8 T 세포 (1 * 105 세포 / 웰) 및 항체의 혼합물을 37 ℃에서 24 시간 동안 공동 배양 하였다. 1% BSA로 1회 세척한 후, 세포 펠렛을 FITC 마우스 항-인간 CD4 (BD-550628) 또는 PerCpCy5.5 마우스 항-인간 CD8 (BD-560662)을 함유하는 염색 완충액으로 재현탁시키고, PE 마우스 항-인간 CD69 (BD-560968) 및 APC 마우스 항-인간 CD25 (BD-555434)을 이어서 4 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2 회 세척한 후, FITC 또는 PerCpCy5.5 양성 세포에서 PE 및 APC 양성 세포의 백분율을 유세포 분석법에 의하여 결정하였다.
열 안정성 (DSF)
QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 항체의 용융 온도 (Tm)를 조사하였다. 19 ul의 항체 용액을 1 ul의 62.5 X SYPRO 오렌지 용액 (Invitrogen)과 혼합하고 96 웰 플레이트 (Biosystems)로 옮겼다. 플레이트를 0.9 ℃/분의 속도로 26 ℃에서 95 ℃로 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집하였다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음성 유도체가 계산되었고, 최대 값은 용융 온도 Tm으로 정의되었다. 단백질에 여러 개의 전개 전이가 있는 경우 Tm1 및 Tm2로 명명된 처음 두 Tm이 보고되었다. 데이터 수집 및 Tm 계산은 운영 소프트웨어에 의해 자동으로 수행하였다.
혈청 안정성
선택된 공여자로부터 인간 혈액을 항응고제 없이 폴리스틸렌 튜브에 새롭게 수집하였다. 실온에서 30 분 동안 방치한 후, 인간 혈액을 4000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 혈청층을 수집하였다. 혈청이 깨끗하게 보일 때까지 원심 분리 단계를 반복하였다. 수집 된 혈청으로 1 : 9의 비율로 항체를 검출하에 혼합하고, 표시된 시간 동안 37 ℃에서 분취량을 추출 하였다 : 0 일, 1 일, 4 일, 7 일 및 14 일. 액체 질소에서 서로 다른 시점에서 샘플을 급속 냉동하고 사용할 때까지 -80 ℃에 보관하였다. 혈청 처리없이 상응하는 항체와 비교하여 Jurkat CD3 T 세포 및 Ramos CD19 B 세포에 대한 결합 능력을 평가하기 위하여 샘플을 FACS로 분석하였다.
SPR에 의한 Fcγ 수용체 결합 친화력
FcγR에 대한 항체 결합 친화성을 Biacore T200 (또는 Biacore 8K)을 사용하여 검출하였다. 각각의 수용체는 항-his 항체 고정화 CM5 센서 칩 (GE)에 포획되었다. 상이한 농도의 항체를 60 초의 연결 단계에 동안 30uL / 분의 유속으로 센서 칩 상에 주입 한 후 60 초간 해리시켰다. 이어서, 각각의 결합 사이클 후 칩을 10 mM 글리신 (pH 1.5)으로 재생시켰다.
블랭크 표면 및 버퍼 채널의 센서그램을 테스트 센서그램에서 뺐다. 실험 데이터는 Langmiur 분석 (FcγRI의 경우) 또는 정상 상태 모델 (다른 수용체의 경우)을 사용하여 1 : 1 모델로 맞추었다. 150 KDa의 분자량을 사용하여 항체의 몰 농도를 계산하였다.
ELISA에 의한 C1q 결합
ELISA 플레이트 (Nunc)를 4 ℃에서 밤새 3ug / mL로 항체 샘플로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, C1q를 600 ug / mL로부터 시작하여 농도 구배 희석을 하고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 이어서 양 항-인간 C1q Ab-HRP와 함께 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 2M HCl에 의해 상호작용을 중단시켰다. 450nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Device)를 사용하여 판독하였다.
SPR에 의한 FcRn 결합 친화력
FcRn에 대한 항체 결합 친화도는 Biacore T200 (또는 Biacore 8K)을 사용하여 검출하였다. 각 항체를 CM5 센서 칩 (GE)에 고정시켰다. 러닝 버퍼에서 다른 농도의 FcRn (50 mM Na2HPO4 / NaH2PO4, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20, pH 6.0)을 60 초의 결합상 동안 30 uL / 분의 유속으로 센서 칩 상에 주입 한 후 60 초의 동안 해리를 하였다. 이어서, 각각의 결합 주기 후 1XPBS (pH 7.4)에 의해 칩을 재생시켰다.
블랭크 표면 및 버퍼 채널의 센서그램을 테스트 센서그램에서 뺀다. 실험 데이터는 정상 상태 모델에 의해 맞춰졌다. 45 KDa의 분자량을 사용하여 FcRn의 몰 농도를 계산하였다.
쥐과에서 Raji/PBMC 모델의 효능 연구
Raji 종양 세포 (ATCC® CCL-86 ?)는 공기 중 5% CO2 분위기에서 37 ℃에서 10% 태아 소 혈청, 100 U / ml 페니실린 및 100 ug / ml 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 단층 배양물로서 시험관 내에서 유지되었다. 종양 세포는 일주일에 두 번 일상적으로 계대 배양되었다. 지수 성장 단계 (an exponential growth phase)에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위하여 계수 하였다.
당업자의 지시에 따라 피콜-파크 플러스를 사용하여 인간 PBMC를 헤파린 전혈로부터 분리하였다.
각 마우스에게 오른쪽 측면에서 Majigel과 혼합된 Raji 종양 세포 및 D0상의 0.2 ml의 PBS 중 신선한 PBMC을 피하로 공동 접종하였다. 항체 주사는 D3 (i.v. BIW x 4 회)으로부터 수행되었다.
시험 물품 준비
Figure pct00015
종양 측정 및 종점
주요 종점은 종양 성장이 지연될 수 있는지 또는 마우스가 치료될 수 있는지 확인하는 것이었다. 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 2 차원으로 매주 2 회 측정하였고, 부피는 다음 식을 사용하여 mm3으로 표현하였다: V = 0.5 a x b2, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 단 및 장 직경이다. T / C 값 (백분율)은 항 종양 효과의 지표이다.
TGI는 다음 식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산하였다: TGI (%) = [1- (Ti-T0) / (Vi-V0)] Х 100; Ti는 주어진 날에 치료군의 평균 종양량이고, Vi는 Ti와 동일한 날에 비히클(vehicle) 대조군의 평균 종양 부피이고, V0는 치료 시작일에 비히클(vehicle )군의 평균 종양 부피이다.
시노몰구스 원숭이 PK, 독성 및 면역 원성
사이노몰구스 원숭이 수컷 1마리 및 암컷 1마리에게 정맥 내 일시 투여에 의해 1 mg / kg으로 WBP3438을 1 회 투여 하였다. 제제를 20mM NaAc-HAc, 7.0% (w / w) 수크로스, 0.02% (w/v) PS80, pH5.0으로 제제화하였다. PK 혈액 샘플을 투여 전 (-1 일), 0.25 시간, 0.5 시간, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 3 일, 7 일, 14 일, 21 일 및 28 일에 수집하였다. 항 약물 항체 (ADA) 샘플은 3 일, 14 일 (312 시간) 및 28 일 (480 시간)에 수집하였다.
혈청 샘플에서 WBP3438 및 ADA의 혈청 농도는 ELISA에 의하여 결정하였다. 원숭이에서 WBP3438의 혈청 농도는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어 (버전 6.3, Pharsight, Mountain View, CA)를 사용하여 비 획 약동학적 분석을 실시하였다. 선형 / 로그 사다리꼴 규칙을 PK 파라미터를 획득하는데 적용하였다.
일반적인 건강 및 외모, 특히 피부 자극에 대한 케이지 측 관측이 관찰되었다. 혈액학 (CBC)에 대한 전혈 샘플 분석 및 화학 검출에 대한 혈청 분석은 각각 혈액학 분석기 (ADVIA2120) 및 화학 (HITACHI 7180)에 의해 결정하였다.
결과
시노몰구스 CD19 발현 세포주 생성
시노몰구스 CD19 발현 세포주 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9의 발현은 유세포 분석에 의해 항-CD19 항체를 사용하여 검출하였다. WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9는 원숭이 CD19의 높은 발현을 보여주었다 (도 37).
WuXiBody 생성 및 최적화
도 1은 연구된 항체 및 포맷의 개략도를 제시한다. 항-CD3 항체 T3 및 항-CD19 항체 U4 둘 모두를 개발하였다. T3의 불변 영역 (CL 및 CH1)을 TCR의 불변 도메인으로 대체하여 규칙적인 항체에 직교하는 독특한 경쇄 계면을 설계하였다. Fc 도메인에서 "놉-인투-홀"돌연변이와 함께 TCR-변형 T3 및 천연 U4를 사용하여 이중특이적 항체 포맷 E17 및 F16을 설계하였다.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 항-CD3 및 항-CD19의 가변 중쇄 및 경쇄 서열 결합 모이어티는 하기에 제공된다:
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP& W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP anti-CD3 antibody
VH		 DNA sequence
(서열번호 353)		 CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
Amino acid sequence
(서열번호 352)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
anti-CD3 antibody
VL
DNA sequence
(서열번호 355)		 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
Amino acid sequence
(서열번호 354)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
anti-CD19 antibody
VH		 DNA sequence
(서열번호 368)		 CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
Amino acid sequence
(서열번호 367)		 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
anti-CD19 antibody
VL		 DNA sequence
(서열번호 370)		 GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
Amino acid sequence
(서열번호 369)		 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP 의 유전자 전체 서열은 하기에 제공된다 :
Antibody Chain Sequences
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP T3-LC
(서열번호 12)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC
(서열번호 25)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC(서열번호 23) DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC(서열번호 26) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Antibody Chain Sequences
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP T3-LC
(서열번호 12)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC
(서열번호 25)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC(서열번호 23) DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC(서열번호 27) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 생산
항체 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 발현 역가는 일시적 발현을 통해 90mg / L보다 높다. 2 단계 정제 후 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 순도는 97.5%에 이른다 (SEC-HPLC, 도 39). W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP는 환원 조건하에 SDS-PAGE상에서 겉보기 분자 질량 75 kDa, 55 kDa 및 25 kDa로 이동하며, 이는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄에 상응한다. 2 개의 경쇄는 유사한 분자량으로 인해 중첩될 수 있다. 항체는 손상되지 않은 이중특이적 분자를 나타내는 비 환원 조건하에서 200 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 38).
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 생산
항체 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 발현 역가는 일시적 발현을 통해 100mg / L보다 높다. 2 단계 정제 후 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 순도는 95%에 이른다 (SEC-HPLC, 도 41). W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄에 상응하는 환원 조건하에 SDS-PAGE상에서 54 kDa, 56 kDa 및 25 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다. 2 개의 경쇄는 유사한 분자량으로 인해 중첩 될 수 있다. 항체는 손상되지 않은 이중특이적 분자를 나타내는 비 환원 조건에서 150 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 40).
표적 결합
CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 유세포 분석법에 의해 Ramos 및 Jurkat 세포에서 시험하였다 (도 42A-42B). 항체 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 각각 15.6 nM 및 47 nM의 EC50으로 Ramos 및 Jurkat 세포에 대한 강한 결합 활성을 나타냈다.
CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 결합을 유세포 분석법에 의해 Ramos 및 Jurkat 세포에서 시험하였다 (도 43A-43B). 항체 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP는 각각 1.8 nM 및 19.3 nM의 EC50 값을 갖는 Ramos 및 Jurkat 세포에 대한 강한 결합 활성을 나타냈다.
교차 종 결합
시노몰구스 CD19에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 유세포 분석에 의해 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 세포 (CD19- 발현 세포)에서 시험하였다 (도 44).결합 EC50은 26 nM이었다. 시노몰구스 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합은 ELISA에 의해 W331-cynoPro1.ECD.His (시노몰구스 CD3 입실론 단백질)를 사용하여 시험하였다 (도 45). 결합 EC50은 0.04 nM이었다.
표적 세포에 대한 친화성
인간 CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합 친화도는 유동 세포 측정법에 의해 Ramos 및 Jurkat 세포상에서 시험하였다. 결합된 IgG / 유리 IgG 대 결합 된 IgG를도 46A 및 46B에 플롯팅하였다. CD19 및 CD3에 대한 결합의 적합 KD 값은 각각 23 nM 및 9.0 nM이었다.
표적 세포에서의 이중 결합
CD3 T 세포 및 CD19 B 세포를 브릿지하기위한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 활성을 유세포 분석법에 의해 미리-표지 된 Jurkat 및 Raji 세포를 사용하여 시험였다 (도 47A-47B). Q2는 가교 Jurkat 및 Raji 세포의 집단을 보여준다. 음성 대조군과 비교하여, 대략 18%의 세포를 이중특이적 항체 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP를 통해 연결하였다.
세포 독성 분석
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 세포 독성 활성은 CD8 + T 세포 및 라지 세포를 사용하여 평가하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 15 nM의 EC50 값으로 4 시간 배양 (도 48A) 후 빠르고 효과적인 세포 용해를 유도하였다. 최대 세포 사멸 백분율은 90%였다.
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 세포 독성 활성은 CD8 + T 세포 및 raji 세포를 사용하여 평가하였다. W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP는 4 시간 인큐베이션 후 EC50 값이 3.2 nM 인 신속하고 효과적인 세포 용해를 유도하였다 (도 48B). 최대 세포 사멸 백분율은 90%였다.
표적 특이적 T 세포 활성화
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 CD19 + 표적 세포의 존재 또는 부재에서 활성화 마커 CD69 및 CD25를 통한 T 세포 활성화를 나타내는 분석에 의하여 조사하였다. 결과는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP가 CD19 + 표적 세포의 존재하에서만 용량 의존적 방식으로 T 세포 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현을 유도한다는 것을 입증하였다 (도 49A-49D). B 세포가 없는 경우, CD4 + 및 CD8 + T 세포 서브 세트 둘 다에서 CD25 및 CD69의 발현이 관찰되지 않았다.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 또한 CD19 + 표적 세포의 존재 또는 부재에서 사이토카인 방출의 T 세포 활성화 분석에 의하여 조사하였다. 결과는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP가 CD19 + 표적 세포의 존재 하에서만 용량 의존적 방식으로 IFN-γ 및 TNF-α 방출을 유도한다는 것을 입증하였다 (도 50A-50D). B 세포가 없으면, CD4 + 및 CD8 + T 세포 서브 세트 둘 다에서 IFN-γ 및 TNF-α가 검출되지 않았다.
열 안정성
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 열 안정성을 실시간 PCR을 사용하여 조사하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 Tm1 및 Tm2는 60.2 ℃ 및 72.7 ℃이다.
혈청 안정성
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP를 37 ℃에서 14일 동안 혈청 중에서 항온 처리하였다. 0, 1, 4, 7 및 14일 동안 배양된 항체의 결합 활성을 유세포 분석법에 의해 검출하였다. 결과는 CD3 및 CD19 세포 둘 다에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합 활성이 14일 동안 인간 혈청에서 인큐베이션 한 후에 변하지 않았음을 보여 주었다 (도 51A-51B).
Fcγ 수용체 결합
FcγRI, FcγRIIa (H167), FcγRIIa (R167), FcγRIIb, FcγRIIIa (F176), FcγRIIIa (V176) 및 FcγRIIIb에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합 활성을 SPR에 의하여 조사하였다. 친화도는 표 47에 요약하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 모든 Fcγ 수용체에 대한 전형적인 인간 IgG4 결합 친화도를 나타냈다.
SPR에 의한 Fc 수용체에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 친화력
Fc receptor KD (M)
FcγRI 9.79E-09
FcγRIIa (H167) 2.05E-05
FcγRIIa (R167) 1.58E-05
FcγRIIb 2.41E-05
FcγRIIIa (F176) 2.93E-05
FcγRIIIa (V176) 1.40E-05
FcγRIIIb >4.10E-05
C1Q에 대한 항체의 결합 활성을 ELISA으로 시험하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 ELISA에서 결합 신호를 보이지 않았으며 (도 52), 대조군 인간 IgG1 항체는 정상 결합 신호를 나타냈다.
FcRn 결합
FcRn에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합은 pH 6.0에서 SPR에 의해 테스트하였다. 친화도는 인간 IgG4의 FcRn에 대한 전형적인 친화도인 2.58 uM로 장착하였다.
PBMC / Raji 이종 이식편 모델의 효능 연구
이 연구에서, NOG 마우스에서 Raji 세포를 함유하는 혼합된 PBMC 인간화 모델에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 항종양 효능을 조사하였다. 종양 성장 곡선은 도 53에 나타내었다.
D14에서, 이소타입 대조군 처리 그룹의 평균 종양 크기는 342 mm3에 도달하였다. 1.5 mg / kg 및 0.5 mg / kg의 W3438-T3U4.E17-1.uIG4.SP를 사용한 처리는 상당한 항종양 활성을 생성하였다. 평균 종양 크기는 각각 78 mm3 (T / C = 23.0%, TGI = 93.9%, p = 0.016) 및 75 mm3 (T / C = 22.0%, TGI = 95.3%, p = 0.014)이고, 고용량 수준 그룹에서 한 동물의 종양이 박멸되었다. 매우 낮은 용량 (0.06 mg / kg)에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 항 종양 활성을 나타내지 않았다.
시노몰구스 원숭이에서 WuXiBody의 약동학
시노몰구스 혈청에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 농도를 ELISA로 시험 하였다 (도 54). 계산 된 PK 파라미터는 표 48에 열거되어있다. 1mg / kg의 1 회 IV 주사에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 반감기는 152 시간이었다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 blinatumomab보다 원숭이에서 반감기가 훨씬 길었으며 침팬지에서 반감기 (1.5-2.6) 시간이 매우 짧았다 (유럽 의약품 청 평가 보고서 EMA / CHMP / 469312 / 2015).
W3438-T3U4의 시노몰구스 PK. E17-1.uIgG4.SP
PK parameter W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP
C0 (ug/mL) 60.4
T1/2 (h) 152
Vdss (L/kg) 0.0513
Cl (mL/min/kg) 0.00462
AUC0-last (h*ug/mL) 3552
AUC0-inf (h*ug/mL) 3708
MRT0-last (h) 157
MRT0-inf (h) 187
독성
모든 원숭이는 연구의 전체 과정 동안 약물을 잘 견뎌냈다. 연구의 생애기 동안 부작용은 관찰되지 않았다. 음식 소비와 체중에는 뚜렷한 변화가 없었다. AST, ALT, WBC, HGB 및 HCT를 포함한 혈액학 및 임상 화학에 대한 파라미터는 일반적으로 기준 범위 내에 있었다.
면역 원성
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 면역 원성 시험 결과를 도 55A-55B에 나타내었다. 투여 후 3, 14 및 28 일의 원숭이 혈청에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP에 대한 항-약물 항체 (ADA)의 역가는 투여 전과 유의 한 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 1 mg / kg의 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 단일 IV 주사는 원숭이에서 면역 원성이 아닌 것으로 나타났다.
실시예 18. 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 WuXiBody
배경
암 면역 요법은 암 치료를 위한 뜨거운 연구 분야가 되었다. 세포 독성 T- 림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4)는 면역 체크 포인트의 검증된 표적 중 하나이다. T 세포 활성화 후, CTLA-4는 이러한 T 세포상에서, 일반적으로 TCR과의 항원 결합 1 시간 이내에 신속하게 발현한다. CTLA-4는 CD28과의 경쟁을 통해 T 세포 신호 전달을 억제할 수 있으며, 이는 잘 특성화된 T 세포 공동 자극 신호를 매개한다. 항원 제시 세포상의 이의 리간드 CD80 (B7-1) 및 CD86 (B7-2)에 대한 CD28 결합은 인터루킨-2 및 항-아폽토시스 인자의 생성을 유도함으로써 T 세포 증식을 초래한다. CTLA-4의 CD28보다 CD80 및 CD86에 대한 훨씬 높은 친화력 결합으로 인하여, CTLA-4는 CD80 및 CD86에서 CD28 결합과 경쟁하여 T 세포 활성화를 억제할 수 있다. 활성화된 T 세포에서 유도된 발현 외에, CTLA-4는 조절 T 세포 (Treg)의 표면에서 본질적으로 발현되며, CTLA-4는 접촉-매개 억제 및 면역 억제성 변형 성장 인자 베타 및 iterleukin-10 과 같은 사이토카인의 Treg 생산과 관련될 수 있음을 시사한다.
CTLA-4 봉쇄는 다수의 전임상 및 임상 연구에서 입증된 바와 같이 종양 퇴행을 유도할 수 있다. CTLA-4에 대한 두 가지 항체가 임상 개발 중에 있다. IgG1-카파이소타입의 완전 인간 항-CTLA-4 단일 클론 항체인 이필리무맙 (MDX-010, BMS-734016)은, 진행성 흑색 종의 치료를 위한 단일 요법으로 승인된 면역 조절제이다. 이필리무맙에 대한 제안된 작용 메커니즘은 CTLA-4의 상호작용에서의 간섭이며, 이는 전문 항원 제시 세포에서 CD80 / CD86 분자와 함께 활성화된 T 세포의 서브 세트에서 발현된다. 이것은 CTLA-4 및 CD80 / CD86 상호작용에 의해 촉진 된 T-세포 활성화의 억제 조절의 봉쇄로 인한 T-세포 강화를 초래한다. 결과적인 T-세포 활성화, 증식 및 종양으로의 림프구 침윤은 종양 세포 사멸을 초래한다. 상업적 투여 형태는 주입용 용액을 위한 5 mg / ml 농축 물이다. 또한 이필리무맙을 전립선 암 및 폐암을 포함한 다른 종양 유형에 대하여 임상 조사를 하고 있다. 임상 개발에서 두 번째 항-CTLA-4 항체 인 트레멜리무맙 (Tremelimumab)은 흑색 종 및 악성 중피종에서 단일 요법으로 평가되었다.
프로그램된 데스 -1 (PD-1, CD279)은 활성화된 T 세포 및 다른 면역 세포에서 발현된 CD28 패밀리의 구성요소이다. PD-1의 관여는 이들 면역 세포에서 기능을 억제한다. PD-1은 2 개의 공지된 리간드, PD-L1 (B7-H1, CD274) 및 PD-L2 (B7-DC, CD273)를 가지며, 둘 다 B7 패밀리에 속한다. PD-L1 발현은 림프계 및 말초 조직의 다양한 세포 유형에서 유도될 수 있는 반면, PD-L2는 수지상 세포를 포함하는 골수성 세포로 더욱 제한된다. PD-1 경로의 주요 역할은 조직 및 기관에서 염증성 면역 반응을 감소시키는 것이다.
CTLA-4 (이필리무맙, Ipilimumab) 및 PD-1 (니볼루맙, Nivolumab)을 차단하는 단일 클론 항체 (mAbs)의 조합에 의한 면역 요법은 mAb 단독으로 관찰된 것 이상의 임상적 이점을 보여주었다. 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 WuXiBody는 양쪽 체크 포인트 분자의 동시 차단을 통해 항 종양 면역을 유도하기 위하여 개발되었다.
재료 및 방법
일반 재료
일반적인 연구 자료 및 그 출처는 아래 표에 나타내었다.
Materials Vendor Cat.
Expi293F? Cells Thermo Fisher Cat. A14527
ExpiFectamine293 transfection kit Thermo Fisher Cat. A14524
Expi293F? expression medium Thermo Fisher Cat. A1435101
Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Cat. 11668019
FreeStyle? 293-F Cells Thermo Fisher Cat. R79007
FreeStyle? 293 Expression Medium Thermo Fisher Cat. 12338002
CHO-S Cells Thermo Fisher Cat. A1155701
FreeStyle? CHO Expression Medium GIBCO Cat. 12651014
Fetal bovine serum (FBS) Corning Cat. 35-076-CV
Opti-MEM Thermo Fisher Cat. 31985070
Ni column GE healthcare Cat. 17-5247-01
Protein A column GE healthcare Cat. 17-5438-02
Superdex200 prep grade GE Healthcare Cat. 17-1043-01
HPLC-SEC TOSOH Cat. 0008541
NuPAGE4%-12% Bis-Tris Gel Thermo Fisher Cat. NP0322BOX
Human CTLA-4: W316-hPro1.ECD.His Sino Biological Cat. 11159-H08H
Cynomolgus CTLA-4: W316-cpro1.ECD.his Sino Biological Cat. 90213-C08H
Human PD-1: W305-hPro1.ECD.His In house
Cynomolgus PD-1: W305-cynoPro1.ECD.His R&D Cat.R&D-8509-PD-050
Coating 96-well plates for ELISA Nunc MaxiSorp, ThermoFisher
U-bottom 96-well plates for FACS Corning-COSTAR 3799
Human PD-1+ cell line : W305-CHO-S.hPro1.C6 In house
Cynomolgus PD-1+ cells: W305-293F.cPro1.FL.Pool In house
Human CTLA-4+ cell line: W316-293F.hPro1.FL In house
Cynomolgus CTLA-4+ cell line W316-293F.cPro1.FL.Pool In house
Human CD80+ cell line : W316-CHO-K1.hPro1L1.B9B11 In house
Human CD86+ cell line W316-CHO-K1.hPro1L2.A4A7 In house
Human PD-1: W305-hPro1.ECD.mFc In house
Human PD-1: W305-hPro1.ECD.hFc In house
Human PD-1: W305-hPro1.ECD.His In house
Cynomolgus PD-1: W305-cPro1.ECD.His In house
CynoPD-1.hFc protein SinoBiological 90311C02H
Human CTLA-4: W316-hPro1.ECD.mFc In house
Human CTLA-4: W316-hPro1.ECD.hFc In house
Human CTLA-4: W316-hPro1.ECD.His In house
Cynomolgus CTLA-4: W316-cPro1.ECD.His In house
Human PDL1: W315-hPro1.ECD.mFc In house
CynoPD-L1.hFc-Biotin In house
Biotin-labeled W316.hPro1.ECD.hFc In house
Human CD80: W316-hPro1L1.ECD.His In house
WBP316-BMK1 (Ipilimumab) In house
WBP305 BMK1 (nivolumab) In house
WBP324-BMK1.IgG1.KDL In house
Isotye control: WBP332-1.80.12.xAb.hIgG4 In house
HRP-labeled goat anti-human IgG Fc Bethyl Laboratories A80-304P
HRP-labeled mouse anti-Human IgG Fc (CH2) Thermo MA5-16859
HRP-labeled goat anti-mouse IgG Fc Bethyl Laboratories A90-231P
HRP-labeled Streptavidin Lifetechnologies SNN1004
Biotin-labeled anti-His mAb GenScript A00613
FITC-labeled goat anti-human IgG Jackson 109-095-008
PE-labeled goat anti-human IgG Jackson 109-115-098
FITC-labeled goat anti-Mouse IgG Abcam 98716
PE-labeled Streptavidin BD 554061
Human Ficoll-Paque Stemcell 07861
Monocyte enrichment kit Miltenyi Biotec-130-050-201
CD4+ T cell enrichment kit Stemcell 19052
CD4+CD25+ T cell enrichment kit Miltenyi 130-093-631
Recombinant human GM-CSF R&D 215-GM
Recombinant human IL-2 SL PHARM
Recombinant human IL-4; anti-IL-2 Ab R&D AG1815401; MAB602
Recombinant human IFN-γ standard Peprotech 300-02
Anti-IFN-γ antibodies life technology M700A;M7001B
H3-thymidine and MicroScint Perkin Elmer NET027001MC
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10100147
RPMI 1640 medium GIBCO 22400089
DPBS Corning 21-031-CVR
DELFIA® EuTDA Cytotoxicity Reagents PerkinElmer AD0116
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit Promega G7573
Calcein-AM Corning-354216 354216
Far red Invitrogen C34572
가용성 항원의 생성
인간 PD-1의 세포 외 도메인 서열을 코딩하는 DNA 서열 (유니 포트 번호 : Q15116)는 상온 바이오 테크 (상하이, 중국)에서 합성 된 후, C- 말단에서 6xhis를 갖는 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터로 서브클로닝 하였다. 인간, 시노몰구스 및 마우스 CTLA-4의 단백질 및 마우스 및 시노몰구스 PD-1은 Sino Biological에서 구입하였다.
Expi293 세포 (Invitrogen-A14527)를 정제된 발현 벡터 pcDNA3.3으로 형질 감염시켰다. 세포를 5일 동안 배양하고, Ni-NTA 컬럼 (GE Healthcare, 175248)을 사용하여 단백질 정제를 위하여 상청액을 수집하였다. 수득된 인간 PD-1은 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 QC한 후 -80℃에 저장하였다.
참조 항체의 생성
항-CTLA-4 항체 (WBP316-BMK1)의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열인, 항-PD-1 항체 (WBP305-BMK1)는 상온 바이오 테크 (Shangon Biothech) (중국 상하이)에서 합성하였고, 이어서, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 불변 영역을 갖는 변형된 pcDNA3.4 발현 벡터로 서브 클로닝 되었다(S228P). 쥐를 인간 PD-1 및 마우스 PD-1로 면역 한 후 항-PD-1 WBP3055-1.153.7.uIgG4k 및 WBP3055-1.103.11.uIgG4k 항체가 생성되었고, 그것을 IgG4 (S228P) 포맷으로 변환하였다. 벤치 마크 이중특이적 항-CTLA-4 x PD-1 항체 (WBP324-BMK1.IgG1.KDL)를 암호화하는 DNA 서열을 합성하였다.
VH 및 VL 유전자를 함유하는 플라스미드를 Expi293 세포에 공동 형질 감염시켰다. 세포를 5 일 동안 배양하고 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare, 175438) 또는 Protein G 컬럼 (GE Healthcare, 170618)을 사용하여 단백질 정제를 위하여 상청액을 수집하였다. 수득 된 항체를 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 시험한 후, -80 ℃에서 저장하였다.
표적-발현 세포주의 생성
Lipofectamine 2000을 사용하여, CHO-S 또는 293F 세포를 인간 PD-1 또는 마우스 PD-1을 암호화하는 유전자 전체를 함유하는 발현 벡터로 형질 감염시켰다. 세포를 적절한 선별 마커를 함유하는 배지에서 배양하였다. 희석을 제한함으로써 인간 PD-1 고발현 안정 세포주 (WBP305.CHO-S.hPro1.C6) 및 마우스 PD-1 고 발현 안정 세포주 (WBP305.293F.mPro1.B4)를 수득 하였다.
이중특이적 항-CTLA-4 / PD-1 이중특이적 항체의 생성
W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 구성 : 항-PD-1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열, 불변 영역 1, 5 '말단에서 3'말단으로 연결된 항-CTLA-4 중쇄 가변 영역, TCR 베타 불변 영역 및 IgG4 (S228P) 불변 영역 2 및 3 을 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝하였다. 5 '의 TCR 알파 불변 영역상의 항-CTLA-4 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 다른 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-PD-1 경쇄를 제3변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝하였다.
W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP의 구축 : 항-PD-1 중쇄 가변 영역, TCR 베타 쇄의 불변 영역, 항-CTLA-4 중쇄 가변 영역 및 IgG4를 암호화하는 DNA 서열 (S228P ) 5 '말단에서 3'말단으로 연결된 불변 영역을 변형 된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝하였다. 5 '의 TCR 알파 불변 영역상의 항-PD-1 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 다른 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-CTLA-4 경쇄를 제3 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝하였다.
W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 관련 서열은 다음과 같다 :
LC1 Amino acid sequence
(서열번호 412)		 SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
LC2
 Amino acid sequence
(서열번호 413)		 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
HC Amino acid sequence(서열번호 414) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP의 관련 서열은 하기에 제공된다 :
LC1 Amino acid sequence
(서열번호 415)		 SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
LC2
 Amino acid sequence
(서열번호 416)		 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HC Amino acid sequence(서열번호 417) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
이중특이적 항체 둘 다에 대해, 당업자의 지시에 따라 하나의 중쇄 발현 벡터 및 두 개의 경쇄 발현 벡터를 Expi293 세포 (ThermoFisher-A14527)에 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염 5일 후, 상청액을 수거하고 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare-17543802) 및 추가 크기 배제 크로마토그래피 (GE Healthcare-17104301)를 사용하여 정제하였다. 항체 농도는 Nano Drop로 측정되었다. 내독소 검출 키트 (GenScript-L00350)를 사용하여 낮은 내독소 수준을 확인하였고, 2개의 이중특이적 항체의 내독소 수준은 10 EU / mg 미만이었다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC에 의해 평가되었다.
시험 관내 특성화
시차 주사 형광 측정법 (DSF)
7500 고속 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 DSF 분석을 수행하였다. 간단히, 19 uL의 이중특이적 항체 용액을 1 uL의 62.5x SYPRO 오렌지 용액 (TheromFisher-S6650)과 혼합하고 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 2 ℃/분의 속도로 26 ℃에서 95 ℃로 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집 하였다. 데이터는 작동 소프트웨어에 의해 자동으로 분석되었고, 온도에 대해 생성된 형광 데이터의 음성 유도체의 최대 값을 취하여 Th가 계산되었다. 톤은 전이 전 기준선에서 감소하기 시작하는 음의 파생물 플롯의 온도로 대략 결정될 수 있다.
FACS에 의한 인간 PD-1- 결합
조작된 인간 PD-1 발현 세포 W305-CHO-S.hPro1.C6을 U- 바닥 96- 웰 플레이트 (COSTAR 3799)에 1x105 세포 / 웰로 시딩 하였다. 200 nM 내지 0.002 nM의 1% BSA DPBS 중 3.163.16-fold titration을 갖는 항체를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 100 uL 1:125 희석 된 PE- 표지된 염소 항-인간 항체 (Jackson 109-115-098)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포에 대한 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 시험하고 평균 형광 강도 (MFI)를 FlowJo에 의해 분석하였다.
FACS에 의한 시노몰구스 PD-1- 결합
조작된 시노몰구스 PD-1 발현 세포 W305-293F.cynoPro1.FL.pool을 U- 바닥 96- 웰 플레이트 (COSTAR 3799)에 1x105 세포/웰로 시딩하였다. 40 ug/ml 내지 0.0001526 ug/ml의 1% BSA DPBS를 갖는 4.0 배 적정 Ab를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 100 uL 1:150 희석된 PE- 표지된 염소 항-인간 항체 (Jackson 109-115-098)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포에 대한 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 시험하고 평균 형광 강도 (MFI)를 FlowJo에 의해 분석하였다.
FACS에 의한 인간 CTLA-4- 결합
조작된 인간 CTLA-4 발현 세포 W316-293F.hPro1.FL을 U- 바닥 96- 웰 플레이트 (COSTAR 3799)에 1x105 세포/웰로 시딩하였다. 200 nM 내지 0.002 nM의 1% BSA DPBS를 갖는 3.16-fold titrated Ab를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 100 uL 1:150 희석된 PE- 표지 된 염소 항-인간 항체 (Jackson 109-115-098)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포에 대한 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 시험하고 평균 형광 강도 (MFI)를 FlowJo에 의해 분석하였다.
FACS에 의한 시노몰구스 CTLA-4- 결합
조작된 인간 CTLA-4 발현 세포 W316-293F.cynoPro1.F1.Pool 을 U- 바닥 96- 웰 플레이트 (COSTAR 3799)에 1x105 세포 / 웰로 시딩하였다.40 ug / ml 내지 0.00004 ug / ml의 1% BSA DPBS를 갖는 4 배 적정 Ab를 세포에 첨가 하였다. 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 100 uL 1:150 희석 된 PE- 표지 된 염소 항-인간 항체 (Jackson 109-115-098)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포에 대한 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 시험하고 평균 형광 강도 (MFI)를 FlowJo에 의해 분석하였다.
ELISA에 의한 hPD-1 및 hCTLA-4 이중 결합
이중특이적 항체가 hPD-1 및 hCTLA-4 둘 다에 결합할 수 있는지를 시험하기 위하여, ELISA 분석법을 다음과 같이 개발하였다. 96-웰 ELISA 플레이트 (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)를 카보네이트-바이 카보네이트 완충액 중 0.5 ug/ml 항원 -1 (hPD-1-ECD, W305-hPro1.ECD.mFc)로 4 ℃에서 밤새 코팅 하였다. PBS에 용해된 2% (w/v) 소 혈청 알부민 (Pierce)으로 1 시간 차단 단계 후, 2% BSA PBS를 함유하는 PBS에서 상이한 PD-1xCTLA-4 이중특이적 항체의 연속 희석 물을 플레이트에서 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 배양 후, 0.5% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS의 웰당 300 uL로 플레이트를 3 회 세척하였다. 0.5 ug/ml 항원 -2 (hCTLA-4-ECD, W316-hPro1.ECD.hFc. 비오틴)를 플레이트에 첨가하고 혼합물을 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 3 회 세척한 후, 스트렙타비딘 -HRP (Lifetechnologies, # SNN1004) (1:20000 희석)를 첨가하고 플레이트에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 0.5% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS의 웰당 300 uL로 6 회 세척한 후, 웰당 검출을 위하여 100 uL 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질을 첨가하였다. 2M HCl의 웰당 100 uL를 첨가하여 약 5 분 후에 반응을 정지시켰다. 웰의 흡광도는 다중 벽 플레이트 판독기 (SpectraMax® M5e)로 450 nm에서 측정하였다.
FACS에 의한 hPD-1 및 hCTLA-4 이중 결합
이중특이적 항체가 hPD-1 및 hCTLA-4 둘 다에 결합할 수 있는지를 시험하기 위하여, FACS 분석법을 다음과 같이 개발하였다. 조작된 인간 PD-1 및 CTLA-4 발현 세포 W305-CHO-S.hPro1.C6 및 W316-293F.hPro1.F1는
37 ℃에서 20 분 동안 20 nM에서 각각 50 nM에서 Calcein -AM (Corning-354216) 및 근적색광 (Invitrogen-C34572)으로 염색하였다. PBS에 1% (w/v) 소 혈청 알부민 (Pierce)으로 2 회 세척한 후, 혼합된 hPD-1 (5E4) 및 hCTLA-4 (5E4) 세포를 U- 바닥 96-웰 플레이트 (COSTAR 3799)에 1x105 세포/웰로 시딩하였다. 상청액을 제거한 후, 7.5 nM 내지 0.83 nM의 1% BSA DPBS를 갖는 3 x 연속 희석된 항체를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 유세포 분석법으로 시험하고 이중 양성 세포의 백분율을 FlowJo로 분석하였다.
인간 PD-1- 경쟁적 FACS
이중특이적 항체가 hPD-1 단백질에 대한 hPD-L1 결합을 차단할 수 있는지 시험하기 위하여, 경쟁적인 FACS를 수행하였다. 간략하게, 조작 된 인간 PD-1 발현 세포 W305-CHO-S.hPro1.C6 (집내)를 U- 바닥 96- 웰 플레이트 (COSTAR 3799), 200 nM 내지 0.002 nM 인간에 1x105 세포 / 웰로 시딩하였다. 5 ug/ml 인간 PD-L1 단백질 W315-hPro1.ECD.mFc와 결합된 PD-L1을 세포에 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포 발현 성 인간 PD-1에 대한 W315-hPro1.ECD.mFc의 결합은 FITC- 표지된 염소 항-마우스 항체 (abcam 98716 1:125)에 의해 검출되었다. 세포에 대한 항체의 경쟁적 결합을 유세포 분석법으로 시험하고 평균 형광 강도 (MFI)를 FlowJo에 의해 분석하였다.
인간 CD80에 대한 인간/시노몰구스 CTLA-4 결합의 차단
ELISA를 사용하여 이중특이적 항체가 hCD80 단백질에 대한 hCTLA-4 결합을 차단할 수 있는지 여부를 시험하였다. 간단히 말해서, 평평한 바닥 96 웰 플레이트 (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)을 4 ℃에서 밤새 0.5 ug/ml W316-hPro1.ECD.hFc로 미리 코팅 하였다. 2% BSA 차단 후, 0.5 ug/ml 인간 CD80 단백질 W316-hPro1L1.ECD와 결합된 400nM에서 0.04nM Ab까지 100uL 3.16-fold titrated Abs를각 웰에 피펫 팅하고 주위 온도에서 1 시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, 0.5% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS의 웰당 300 uL로 플레이트를 3 회 세척하였다. 100 ul 0.5 ug/ml 비오틴-표지 된 항-His mAb (GenScript-A00613)를 플레이트 웰에 첨가하고 1 시간 동안 배양하였다. 6 회 세척 후, W315-hPro1L1.ECD.His와 WBP316-hPro1.ECD.hFc의 결합은 스트렙 타비 딘 -HRP (Lifetechnologies, # SNN1004) (1:20000 희석)에 의해 검출하였다. 100 uL의 TMB 기질을 분배함으로써 색상을 현상한 다음, 100 uL의 2N HCl에 의해 정지시켰다. 마이크로 플레이트 분광 광도계 (SpectraMax® M5e)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
항체가 세포 표면에서 hCD80에 대한 인간 또는 시노몰구스 CTLA-4 결합을 차단할 수 있는지를 시험하기 위하여 경쟁적 FACS를 사용하였다. 간단히, 인간 CD80- 발현 CHO-K1 세포를 웰당 1 x 105로 96- 웰 플레이트 (COSTAR 3799)의 각 웰에 첨가하고 상청액을 제거하기 전에 4℃에서 4 분 동안 1500 rpm으로 원심분리하였다. 시험 항체의 연속 희석 후, 양성 및 음성 대조군을 비오티닐화 된 인간 CTLA-4.ECD.hFc와 혼합하였다. 세포 표면에서 상이한 밀도의 리간드로 인해, 0.066-0.037 ug/mL의 hCTLA-4.ECD.hFc- 비오틴을 인간 CD80-발현 세포에 사용하였다. 이어서, 항체 및 CTLA-4의 혼합물을 세포에 첨가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200 ul FACS 세척 완충액 (1% BSA를 함유하는 DPBS)으로 2 회 세척하였다. FACS 완충액에 희석된 스트렙타비 딘 PE (BD Pharmingen-554061) 1 내지 600을 세포에 첨가하고 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200 uL FACS 세척 완충액으로 추가 세척 단계를 2회 수행한 다음, 4 ℃에서 4 분 동안 1500 rpm으로 원심 분리하였다. 마지막으로, 세포를 100 uL FACS 세척 완충액에 재현탁시키고, 유세포 분석법에 의해 형광 값을 측정하고 FlowJo에 의해 분석하였다.
CTLA-4 및 PD-1에 대한 친화성
CTLA-4 또는 PD-1의 ECD에 대한 항체의 속도 상수 (ka) 및 속도 상수 (kd)를 측정하기 위하여 SPR 기술을 사용하였다. 결과적으로 친화력 상수 (KD)가 결정되었다.
Biacore T200, 시리즈 S 센서 칩 CM5, 아민 커플링 키트 및 10x HBS-EP는 GE Healthcare로부터 구입하였다. 염소 항-인간 IgG Fc 항체는 Jackson ImmunoResearch Lab (카탈로그 번호 109-005-098)로부터 구입하였다. 고정화 단계에서, 주사 직전에 400 mM EDC 및 100 mM NHS를 혼합하여 활성화 완충액을 제조하였다. CM5 센서 칩은 활성화 버퍼로 420 초 동안 활성화되었다. 이어서 10 mM NaAc (pH 4.5) 중 30 ug/mL의 염소 항 인간 IgG Fcγ 항체를 5 uL/분의 유속으로 200 초 동안 Fc1-Fc4 채널에 주입하였다. 상기 칩은 1M 에탄올 아민 -HCl (GE)에 의해 비활성화되었다. 그런 다음 항체가 칩에 포착되었다. 간단히, 런닝 버퍼 (HBS-EP +) 중 4 ug/mL 항체를 10 ul/분의 유속으로 30 초 동안 Fc3 채널에 개별적으로 주사하였다. CTLA-4 또는 PD-1의 분석 물질 ECD의 8 가지 농도 (20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.15625 nM) 및 블랭크 러닝 버퍼 완충액을 120 초의 결합 단계에 대해 30 uL/분의 유속으로 Fc1-Fc4 채널에 순차적으로 주입되고, 이어서 2400 초 동안 분리 단계를 거쳤다. 모든 해리 단계 후 재생 완충액 (10 mM 글리신 pH 1.5)을 30 초 동안 10 uL/분으로 주입하였다.
인간 혈청 안정성
항체를 37 ℃에서 새로 분리된 인간 혈청에서 인큐베이션 하였다. 지시된 시점에, 혈청 처리된 샘플의 분취액을 인큐베이터에서 제거하고 액체 질소에서 스냅 냉동한 다음 이중 결합 ELISA 시험을위한 준비가 될 때까지 80 ℃에서 저장하였다. 동결된 샘플은 안정성 시험 직전에 빠르게 해동되었다. 간략하게, 플레이트를 4 ℃에서 밤새 0.5 ug/mL의 hCTLA4.ECD.hFc (사내)로 미리 코팅 하였다. 1시간 차단 후, 시험 항체를 다양한 농도로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 주위 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 0.5% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 웰당 300 uL씩 3회 세척하였다. 이어서 0.1 ug/ml hPD-1-ECD. 비오틴을 플레이트에 첨가하고 혼합물을 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 세 번 세척한 후 Streptavidin-HRP (Lifetechnologies, # SNN1004) (1:20000 희석)을 첨가하고 플레이트를 한 시간동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 0.5% (v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS 웰당 300 uL로 6 회 세척 한 후, 웰당 검출을 위하여 100 uL 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기질을 첨가하였다. 2M HCl의 웰당 100 uL를 첨가하여 약 5 분 후에 반응을 정지시켰다. 웰의 흡광도를 다중벽 플레이트 판독기 (SpectraMax® M5e)로 450 nm에서 측정하였다.
결과
이중특이적 항체의 발현 및 정제
이중특이적 항체의 순도는 90% 이상이며, SDS-PAGE (도 56A) 및 SEC-HPLC (도 56B) 두 가지로 분석하였다.
WuXiBody의 DSF
DSF를 사용하여 WuXiBody의 Tm을 측정하였다. 도 57에 도시 된 바와 같이, W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4. SP는 각각 60.8 및 63.4℃에서 Th1을 갖는다.
인간 및 시노몰구스 PD-1에 대한 결합
이중특이적 항체는 인간 PD-1 (도 58) 및 시노몰구스 PD-1 (도 59)에 결합할 수 있다. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP의 인간 PD-1- 결합 활성은 FACS에서 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP보다 약간 우수하였다. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP는 각각 1.24 nM 및 1.32 nM에서 인간 PD-1에 친화성을 갖는다 (도 62).
인간 및 시노몰구스 CTLA-4에 대한 결합
FACS에서 시험된 바와 같이, 정제된 이중특이적 항체는 인간 CTLA-4에 결합하였다 (도 60). 2개의 이중특이적 항체는 또한 시노몰구스 CTLA-4에 결합하였다 (도 61). W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP는 각각 0.0356 nM 및 0.357 nM에서 인간 CTLA-4에 친화성을 갖는다 (그림 62).
CTLA-4 및 PD-1에 대한 동시 결합
이중특이적 항체가 양쪽 표적에 결합할 수 있는지를 시험하기 위하여, ELISA 및 FACS가 사용되었다. ELISA에서, 인간 PD-1이 플레이트 상에 코팅되었다. 이중특이적 항체를 첨가한 후, 비오티닐화된 CTLA-4를 사용하여 결합된 이중특이적 항체를 검출하였다. 도 66에 나타낸 것처럼 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP은 이중특이적 참조 항체 WBP324 BMK1(EC50 = 0.0599 nM)과 비교하여 0.1072 내지 0.0710 nM에서 EC50을 사용한 PD-1 및 CTLA-4 둘 다에 결합 할 수 있다. FACS에서 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP는 동시에 PD-1 + 및 CTLA-4 + 세포에 결합 할 수 있다 (도 67).
CD80 결합에 대한 인간 또는 시노몰구스 CTLA-4 결합 차단
경쟁 FACS를 사용하여 리간드 CD80에 의한 이중특이적 항체의 CTLA-4 차단을 시험하였다. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP는 4.300 및 0.7581 nM의 IC50으로 CD80에 대한 CTLA-4 결합을 차단하였다 (도 64). 유사하게, 이중특이적 항체는 또한 인간 CD80 + 세포에 대한 시노몰구스 CTLA-4 결합을 차단할 수 있다 (도 65).
리간드에 대한 PD-1 결합 차단
경쟁 FACS를 사용하여 리간드 PD-L1에 의한 PD-1의 이중특이적 항체 차단을 시험하였다. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP는 1.670nM 및 1.917nM의 IC50으로 PD-L1에 PD-1 결합을 차단하였다 (도 63).
혈청 안정성
2 개의 이중특이적 항체를 37 ℃ 인간 혈청에서 14 일 동안 인큐베이션하고, 인간 CTLA-4 및 PD-1에 대한 이들의 이중 결합을 ELISA로 측정하였다. 도 68a 및 도 68b에 나타낸 바와 같이, 표적에 대한 W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP 및 WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP 이중 결합은 시간이 지나도 변하지 않고, 이들 2 개의 이중특이적 항체는 적어도 14일 동안 37℃의 인간 혈청에서 안정함을 나타낸다.
본 발명의 개시는 특정 실시예를 참조하여 특별히 도시되고 설명되었지만, 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 개시의 이론 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
<110> WuXi Biologics (Shanghai) CO., LTD. WUXI BIOLOGICS (CAYMAN) INC. <120> NOVEL BISPECIFIC POLYPEPTIDE COMPLEXES <130> PI200006CN <150> PCT/CN 2018/106766 <151> 2018-09-20 <160> 411 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln 85 90 95 Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 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Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu 145 150 155 160 Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr 165 170 175 Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr 180 185 190 Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro 195 200 205 Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn 210 215 220 Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser 225 230 235 240 Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro 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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 625 630 635 640 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 645 650 655 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 660 665 670 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 675 680 685 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 690 695 <210> 404 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 404 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His 35 40 45 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Pro Asp Ile Gln Asn Pro 100 105 110 Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser 115 120 125 Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln Ser 130 135 140 Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg 145 150 155 160 Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys Ser 165 170 175 Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp 180 185 190 Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 <210> 405 <211> 667 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 405 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 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Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala 530 535 540 Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ile 545 550 555 560 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Pro Asp Ile Gln 565 570 575 Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp 580 585 590 Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser 595 600 605 Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp 610 615 620 Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln 625 630 635 640 Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro 645 650 655 Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 660 665 <210> 406 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 406 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu 115 120 125 Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu 145 150 155 160 Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr 165 170 175 Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr 180 185 190 Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro 195 200 205 Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn 210 215 220 Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser 225 230 235 240 Ala Glu Ala Trp Gly Arg 245 <210> 407 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 407 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr 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Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val 225 230 235 240 Ala Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly 245 250 255 Asn Lys Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val 260 265 270 Leu Val Ile Tyr Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Gly 275 280 285 Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg 290 295 300 Ala Gln Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser 305 310 315 320 Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Pro Asp Ile 325 330 335 Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser 340 345 350 Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val 355 360 365 Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu 370 375 380 Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser 385 390 395 400 Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile 405 410 415 Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 420 425 <210> 409 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 409 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu 115 120 125 Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu 145 150 155 160 Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr 165 170 175 Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr 180 185 190 Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro 195 200 205 Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn 210 215 220 Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser 225 230 235 240 Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 340 345 350 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 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Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 411 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 411 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 85 90 95

Claims (92)

  1. 하기를 포함하는 폴리펩티드 복합체:
    N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
    N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드,
    상기:
    C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합 (interchain bond)을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고,
    비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고,
    제1 항체는 제1 항원 특이성을 갖는다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비-천연 쇄간 결합은 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 형성된 것인, 폴리펩티드 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 돌연변이 잔기들 중 적어도 하나가 시스테인 잔기인 것인, 폴리펩티드 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-천연 쇄간 결합은 이황화 결합인 것인, 폴리펩티드 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 돌연변이 잔기는 C1의 접촉 계면 내에 포함되고, 및/또는 제2 돌연변이 잔기는 C2의 접촉 계면 내에 포함되는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연 시스테인 잔기는 C1 및/또는 C2에 부재 또는 존재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연 N-글리코실화 부위는 C1 및/또는 C2에 부재 또는 존재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비-천연 쇄간 결합들을 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합들은 이황화 결합인 것인, 폴리펩티드 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 폴리펩티드 복합체:
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 폴리펩티드 복합체:
    제1 VH는 제1 접합 도메인의 C1에 작동 가능하게 연결되고, 및
    제1 VL은 제2 접합 도메인의 C2에 작동 가능하게 연결된다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 접합 도메인은 항체 V/C 접합의 C 말단 단편의 적절한 길이(즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기) 및 TCR V/C 접합의 N 말단 단편의 적절한 길이(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기)를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  12. 제9항에 있어서, 다음의 폴리펩티드 복합체:
    조작된 CBeta는 아미노산 잔기 9-35, 52-66, 71-86 및 122-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는
    조작된 CAlpha는 아미노산 잔기 6-29, 37-67, 및 86-95로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
  13. 제9항에 있어서, 상기 조작된 CBeta는 S56C, S16C, F13C, V12C, E14C, F13C, L62C, D58C, S76C, 및 R78C로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고, 및/또는 조작된 CAlpha는 T49C, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, T46C, L51C, 및 S62C로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조작된 CBeta 및 조작된 CAlpha는 CBeta의 S56C 및 Calpha의 T49C, CBeta의 S16C 및 Calpha의 Y11C, CBeta의 F13C 및 Calpha의 L13C, CBeta의 S16C 및 Calpha의 L13C, CBeta의 V12C 및 Calpha의 S16C, CBeta의 E14C 및 Calpha의 S16C, CBeta의 F13C 및 Calpha의 V23C, CBeta의 L62C 및 Calpha의 Y44C, CBeta의 D58C 및 Calpha의 T46C, CBeta의 S76C 및 Calpha의 T46C, CBeta의 S56C 및 Calpha의 L51C, CBeta의 S56C 및 Calpha의 S62C, 및 CBeta의 R78C 및 Calpha의 S62C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기들의 쌍을 포함하고, 상기 시스테인 잔기의 쌍은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CBeta의 위치 C74에 천연 시스테인 잔기는 부재 또는 존재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CBeta 및/또는 조작된 CAlpha에 부재 또는 존재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조작된 CBeta의 천연 글리코실화 부위는 N69, 및/또는 조작된 CAlpha의 천연 글리코실화 부위(들)는 N34, N68, N79, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CBeta는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 101-117을 포괄하는 FG 루프 및/또는 천연 CBeta의 아미노산 잔기 66-71을 포괄하는 DE 루프가 결여 또는 유지되는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CAlpha는 서열번호 43-48을 포함하고, 및/또는 조작된 CBeta는 서열번호 33-41을 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2은 조작된 CAlpha를 포함하고; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함 또는 이와 같고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 51 또는 52를 포함 또는 이와 같은 것인, 폴리펩티드 복합체.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1은 조작된 CAlpha를 포함, 및 C2는 조작된 CBeta를 포함하고; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 129 또는 130을 포함 또는 이와 같고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함 또는 이와 같은 것인, 폴리펩티드 복합체.
  22. 제9항에 있어서, 다음의 폴리펩티드 복합체:
    조작된 CBeta는 아미노산 잔기 9-35, 52-66, 71-86 및 122-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는
    조작된 CPre-Alpha는 아미노산 잔기 7-19, 26-34, 56-75 및 103-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
  23. 제9항에 있어서, 상기 조작된 CBeta는 S16C, A18C, E19C, F13C, A11C, S56C, 및 S76C로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는 조작된 CPre-Alpha는 S11C, A13C, I16C, S62C, T65C 및 Y59로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조작된 CBeta 및 조작된 CPre-Alpha는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 잔기들을 대체하는 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기들을 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체: CBeta의 S16C 및 CPre-alpha의 S11C, CBeta의 A18C 및 CPre-alpha의 S11C, CBeta의 E19C 및 CPre-alpha의 S11C, CBeta의 F13C 및 CPre-alpha의 A13C, CBeta의 S16C 및 CPre-alpha의 A13C, CBeta의 A11C 및 CPre-alpha의 I16C, CBeta의 S56C 및 CPre-alpha의 S62C, CBeta의 S56C 및 CPre-alpha의 T65C, 및CBeta의 S76C 및 CPre-alpha의 Y59C, 및 상기 돌연변이된 시스테인 잔기들 쌍은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CBeta 및/또는 조작된 CPre-Alpha에 부재 또는 존재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조작된 CBeta에 부재 또는 존재하는 글리코실화 부위는 N69이고, 및/또는 조작된 CPre-Alpha에 부재하는 글리코실화 부위가 N50인 것인, 폴리펩티드 복합체.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CBeta는 천연 CBeta의 아미노산 잔기들 101-107을 포괄하는 FG 루프 및/또는 천연 CBeta의 아미노산 잔기들 66-71을 포괄하는 DE 루프가 결여 또는 유지된 것인, 폴리펩티드 복합체.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CPre-Alpha는 서열번호 82-83, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 또는 318을 포함하고, 및/또는 조작된 CBeta는 서열번호 84, 33-41, 319, 320, 321, 322, 323, 또는 324를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  29. 제10항 내지 제11항 및 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1은 조작된 CBeta를 포함하고, 및 C2은 조작된 CPre-Alpha를 포함하며; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 81 또는 131을 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  30. 제10항 내지 제11항 및 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, 및 C2는 조작된 CBeta를 포함하며; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 132 또는 133을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 49 또는 50을 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  31. 제9항에 있어서, 다음의 폴리펩티드 복합체:
    조작된 CDelta는 아미노산 잔기 8-26, 43-64, 및 84-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고; 및/또는
    조작된 CGamma는 아미노산 잔기 11-35 및 55-76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
  32. 제9항에 있어서, 상기 조작된 CGamma는 S17C, E20C, F14C, T12C, M62C, Q57C, 및 A19C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고, 및/또는 조작된 CDelta는 F12C, M14C, N16C, D46C, V50C, F87C 및 E88C로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 조작된 CGamma 및 조작된 CDelta는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 잔기를 대체하는 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체: CGamma의 Q57C 및 CDelta의 V50C, CGamma의 A19C 및 CDelta의 E88C, CGamma의 S17C 및 CDelta의 F12C, CGamma의 E20C 및 CDelta의 F12C, CGamma의 F14C 및 CDelta의 M14C, CGamma의 T12C 및 CDelta의 N16C, CGamma의 M62C 및 CDelta의 D46C, 및 CGamma의 A19C 및 CDelta의 F87C, 및 상기 도입된 시스테인 잔기 쌍은 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CGamma 및/또는 조작된 CDelta에 부재 또는 존재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 조작된 CGamma의 천연 글리코실화 부위는 N65, 및/또는 조작된 CDelta의 천연 글리코실화 부위(들)은 N16 및 N79 중 하나 또는 둘 다인 것인, 폴리펩티드 복합체.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CGamma는 서열번호 113, 또는 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 또는 340을 포함하고, 및/또는 조작된 CDelta는 서열번호 115, 116, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 또는 332를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  37. 제10항 내지 제11항 및 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1은 조작된 CGamma를 포함하고, 및 C2은 조작된 CDelta를 포함하며; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 117 또는 118을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 119 또는 120을 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  38. 제10항 내지 제11항 및 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1은 조작된 CDelta를 포함하고, 및 C2은 조작된 CGamma를 포함하며; 및 상기 제1 접합 도메인은 서열번호 123 또는 124를 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인은 서열번호 125 또는 126을 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 특이성은 외인성 항원, 내인성 항원, 자가 항원, 신생 항원, 바이러스 항원 또는 종양 항원에 관한 것인, 폴리펩티드 복합체.
  40. 제2 항원-결합 모이어티와 연계된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체:
    상기 제1 항원-결합 모이어티는 다음을 포함하고:
    N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
    N-말단에서 C-말단까지, 제 2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드,
    상기:
    C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고, 및
    제1 항체는 제1 항원 특이성을 가지며,
    제2 항원-결합 모이어티는 제1 항원 특이성과 상이한 제2 항원 특이성을 가지며, 및
    제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 미스페어링되는 경향이 훨씬 적다.
  41. 다음을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체:
    제1 항원 특이성을 갖는 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체를 포함하는 제1 항원-결합 모이어티는,
    제1 항원 특이성과 상이한 제2 항원 특이성을 갖는 제2 항원-결합 모이어티와 연계되고, 및
    제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 미스페어링되는 경향이 훨씬 적다.
  42. 제40항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 모이어티는 제2 항원 특이성을 갖는 제2 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 모이어티는 Fab를 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  44. 제40항 또는 제43항에 있어서, 상기 제1 항원 특이성 및 제2 항원 특이성은 2개의 상이한 항원, 또는 1개의 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 관한 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 특이성 중 하나는 T-세포 특이적 수용체 분자 및/또는 자연 살해 세포 (NK 세포) 특이적 수용체 분자에 관한 것이고, 다른 하나는 종양 연계 항원에 관한 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 특이성 중 하나는 CD3에 관한 것이고, 다른 하나는 종양 연계 항원에 관한 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 특이성 중 하나는 CD3에 관한 것이고, 다른 하나는 CD19에 관한 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 모이어티는 제1 이량체화 도메인을 추가로 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 이량체화 도메인을 추가로 포함하며, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 연계된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  49. 제48항에 있어서, 상기 연계는 연결기, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  50. 제48항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함하고, IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 선택적으로 유래된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인을 더 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  52. 제48항에 있어서, 상기 제1 이량체화 도메인은 제3 접합 도메인의 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  53. 제52항에 있어서, 다음의 이중특이적 폴리펩티드 복합체:
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, 제3 접합 도메인은 서열번호 53 또는 54을 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, 제3 접합 도메인은 서열번호 134, 135, 140 또는 141을 포함하며;
    c) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, 제3 접합 도메인은 서열번호 134, 135, 140 또는 141을 포함하며;
    d) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, 제3 접합 도메인은 서열번호 121 또는 122을 포함하며; 또는
    e) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, 및 제3 접합 도메인은 서열번호 127 또는 128을 포함한다.
  54. 제49항에 있어서, 상기 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-결합 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인들은 상이하고 동종이량체화를 방해 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연계되는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인들은 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용, 또는 증가된 유연성을 통해 이종이량체로 연계될 수 있는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH를 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 키메라 불변 영역 및 C2는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/151, 214/212, 214/151, 234/233, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 및 238/237.
  58. 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원성은 CD3을 향하고, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 2/1, 4/3, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 및 138/139.
  59. 제40항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 제2 항원-결합 모이어티는 CD19에 결합할 수 있고, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 폴리펩티드 서열 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 22/12/24/23, 25/12/26/23, 및 25/12/27/23.
  60. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체, 또는 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 모이어티에 접합된 접합체.
  61. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체, 또는 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  62. 제61항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터.
  63. 제61항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제62항의 단리된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  64. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체, 또는 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법으로서, 폴리펩티드 복합체, 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에서 제63항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  65. 다음 단계를 포함하는 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법:
    a) 다음을 숙주 세포에 도입하는 단계:
    N-말단에서 C-말단까지, 제 1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및
    N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드
    상기:
    C1 및 C2는 C1 및 C2 사이의 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있고,
    제1 항체는 제1 항원 특이성을 가지고, 및
    b) 숙주 세포가 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
  66. 제65항에 있어서, 다음을 더 포함하는 것인, 방법:
    a) 숙주 세포에 도입하는 단계에서
    제2 항원-결합 모이어티를 암호화하는 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하고,
    상기 제2 항원-결합 모이어티는 상기 제1 항원 특이성과 상이한 제2 항원 특이성을 가지며,
    b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  68. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물.
  69. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  70. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체, 또는 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 상태를 치료하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 상태는 제1 항원 및 제2 항원이 둘 다 조절될 때 완화, 제거, 치료, 또는 예방될 수 있는 것인, 방법.
  72. 다음을 포함하는 폴리펩티드 복합체:
    1) 다음을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티:
    제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH); 및
    제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다; 및
    2) 다음을 포함하는 제2 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 불변 (CL) 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VL,
    상기 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 미스페어링되는 경향이 훨씬 적다.
  73. 제72항에 있어서, 상기 제3 항원-결합 모이어티는 항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VH, 및 항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VL을 더 포함하고, 상기 제3 항원-결합 모이어티의 CH1은 제2 항원-결합 모이어티의 VH에 작동 가능하게 연결된 것인, 폴리펩티드 복합체.
  74. 다음을 포함하는 폴리펩티드 복합체:
    1) 다음을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티:
    제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH); 및
    제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다; 및
    2) 다음을 포함하는 제2 항원-결합 모이어티:
    C1에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VH, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VL에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다;
    3) 다음을 포함하는 제3 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VL;
    4) 다음을 포함하는 제4 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VL;
    폴리펩티드 복합체는 제1 및 제2 항체 CH2 도메인 및 제1 및 제2 항체 CH3 도메인을 더 포함하고,
    상기 제1 항원-결합 모이어티로부터의 VH 및 제2 항원-결합 모이어티로부터의 VH는 제1 및 제2 항체 CH3 도메인에 작동 가능하게 연결되고,
    제3 항원-결합 모이어티로부터의 CH1 및 제4 항원-결합 모이어티로부터의 CH1은 각각 제1 및 제2 항체 CH2 도메인에 작동 가능하게 연결되고,
    제3 항원-결합 모이어티 및 제 4 항원-결합 모이어티는 각각 이량체를 형성할 수 있다.
  75. 다음을 포함하는 폴리펩티드 복합체:
    1) 다음을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티:
    제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH), 및
    제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다; 및
    2) 다음을 포함하는 제2 항원-결합 모이어티:
    C1에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VH, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VL에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다;
    3) 다음을 포함하는 제3 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VL;
    4) 다음을 포함하는 제4 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VH; 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VL;
    폴리펩티드 복합체는 제1 및 제2 항체 CH2 도메인 및 제1 및 제2 항체 CH3 도메인을 추가로 포함하고,
    상기 제1 항원-결합 모이어티로부터의 C1 및 제 2 항원-결합 모이어티로부터의 C1은 제1 및 제2 항체 CH2 도메인에 작동 가능하게 연결되고,
    제3 항원-결합 모이어티로부터의 VH 및 제4 항원-결합 모이어티로부터의 VH는 각각 제1 및 제2 항체 CH3 도메인에 작동 가능하게 연결되고;
    제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 각각 이량체를 형성할 수 있다.
  76. 다음을 포함하는 폴리펩티드 복합체:
    1) 다음을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티:
    제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH), 및
    제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다; 및
    2) 다음을 포함하는 제2 항원-결합 모이어티:
    C1에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VH, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VL에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다;
    3) 다음을 포함하는 제3 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VL;
    4) 다음을 포함하는 제4 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VL;
    폴리펩티드 복합체는 제1 및 제2 항체 CH2 도메인 및 제1 및 제2 항체 CH3 도메인을 추가로 포함하고,
    상기 제3 항원-결합 모이어티로부터의 CH1 및 제4 항원-결합 모이어티로부터의 CH1은 제1 및 제2 항체 CH2 도메인에 작동 가능하게 연결되고, 각각, 제1 항원-결합 모이어티로부터의 C1은 각각 제1 항원-결합 모이어티로부터의 VH에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원-결합 모이어티로부터의 C1은 제2 항원-결합 모이어티로부터의 VH에 작동 가능하게 연결되고, 제3 항원-결합 모이어티 및 제4 항원-결합 모이어티는 이량체를 형성할 수 있다.
  77. 다음을 포함하는 폴리펩티드 복합체:
    1) 다음을 포함하는 제1 항원-결합 모이어티:
    제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH), 및
    제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, 및 C2는 조작된 CGamma를 포함한다; 및
    2) 다음을 포함하는 제 2 항원-결합 모이어티:
    C1에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VH, 및 C2에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 VL에 있어서, 상기 C1 및 C2는 C1에 포함된 제1 돌연변이 잔기 및 C2에 포함된 제2 돌연변이 잔기 사이에 적어도 하나의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
    상기
    a) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함하며;
    b) C1은 조작된 CAlpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    c) C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CPre-Alpha를 포함하며;
    d) C1은 조작된 CPre-Alpha를 포함하고, C2는 조작된 CBeta를 포함하며;
    e) C1은 조작된 CGamma를 포함하고, C2는 조작된 CDelta를 포함하며; 또는
    f) C1은 조작된 CDelta를 포함하고, C2는 조작된 CGamma를 포함한다;
    3) 다음을 포함하는 제3 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제3 항체의 VL;
    4) 다음을 포함하는 제4 항원-결합 모이어티:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VH, 및
    항체 경쇄 CL 도메인에 작동 가능하게 연결된 제4 항체의 VL;
    폴리펩티드 복합체는 제1 및 제2 항체 CH2 도메인을 더 포함하며, 선택적으로 제1 및 제2 항체 CH3 도메인을 추가로 포함하고,
    상기 제1 항원-결합 모이어티로부터의 C1 및 제2 항원-결합 모이어티로부터의 C1은 제1 및 제2 항체 CH2 도메인에 작동 가능하게 연결되고, 각각, 제3 항원-결합 모이어티로부터의 CH1은 제1 항원-결합 모이어티로부터의 VH에 작동 가능하게 연결되고, 제4 항원-결합 모이어티로부터의 CH1은 제2 항원-결합 모이어티로부터의 VH에 작동 가능하게 연결되며, 제1 항원-결합 모이어티 및 제 2 항원-결합 모이어티는 이량체를 형성할 수 있다.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 폴리펩티드 복합체:
    상기 조작된 CBeta는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하고: 아미노산 잔기 9-35, 52-66, 71-86 및 122-127; 및/또는
    상기 조작된 CAlpha는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접촉 계면 내에 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다: 아미노산 잔기 6-29, 37-67, 및 86-95.
  79. 제78항에 있어서, 상기 조작된 CBeta 및 조작된 CAlpha가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 아미노산 잔기를 대체하는 한 쌍의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체: CBeta의 S56C 및 CAlpha의 T49C, CBeta의 S16C 및 CAlpha의 Y11C, CBeta의 F13C 및 CAlpha의 L13C, CBeta의 S16C 및 CAlpha의 L13C, CBeta의 V12C 및 CAlpha의 S16C, CBeta의 E14C 및 CAlpha의 S16C, CBeta의 F13C 및 CAlpha의 V23C, CBeta의 L62C 및 CAlpha의 Y44C, CBeta의 D58C 및 CAlpha의 T46C, CBeta의 S76C 및 CAlpha의 T46C, CBeta의 S56C 및 CAlpha의 L51C, CBeta의 S56C 및 CAlpha의 S62C, 및 CBeta의 R78C 및 CAlpha의 S62C, 및 상기 한 쌍의 시스테인 잔기는 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
  80. 제79항에 있어서, 상기 조작된 CBeta는 S56C를 포함하고, 조작된 CAlpha는 T49C를 포함하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  81. 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CBeta의 위치 C74에 천연 시스테인 잔기가 부재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  82. 제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 CBeta 및/또는 조작된 CAlpha에 부재하는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  83. 제82항에 있어서, 상기 조작된 CBeta의 천연 글리코실화 부위는 N69, 및/또는 조작된 CAlpha의 천연 글리코실화 부위(들)는 N34, N68, N79 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  84. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  85. 제84항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터.
  86. 제84항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제85항의 단리된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  87. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물.
  88. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  89. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 상태를 치료하는 방법.
  90. 제9항 내지 제21항 및 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 CAlpha의 적어도 하나의 천연 Ser 잔기는 돌연변이되어 O-글리코실화를 감소시키는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  91. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1 또는 C2는 조작된 CAlpha를 포함하고, 조작된 CAlpha의 적어도 하나의 천연 Ser 잔기가 돌연변이되어 O-글리코실화를 감소시키는 것인, 폴리펩티드 복합체.
  92. 제90항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기는 S19, S36, S41, S91 및 S94로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 복합체.
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