CN117693522A - 具有改善的稳定性和表达的多肽复合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种多肽复合物，其包含重链和轻链的抗体可变区分别融合到修饰的TCR恒定区，其中修饰的TCR恒定区包含至少一个突变以稳定多肽复合物，使得多肽复合物具有改善的稳定性和/或表达水平。本文还提供了一种双特异性抗原结合多肽复合物，其含有多肽复合物的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，产生多肽复合物或双特异性抗原结合多肽复合物的方法，使用多肽复合物或双特异性抗原结合多肽复合物治疗疾病或病症的方法，编码多肽复合物和/或双特异性抗原结合多肽复合物的多核苷酸，含有多核苷酸的载体和宿主细胞，包含多肽复合物和/或双特异性抗原结合多肽复合物的组合物和药物组合物。

Description

具有改善的稳定性和表达的多肽复合物
交叉引用
本申请要求2021年1月19日提交的国际专利申请PCT/CN2021/072601的权益，该申请通过提述完整并入本文。
发明领域
本公开一般涉及包含融合于经修饰的TCR恒定区的抗体可变区的多肽复合物和多特异性多肽复合物，以及其制备方法和用途。
背景技术
诸如双特异性抗体的多特异性分子正在成为一种新的治疗剂类别。双特异性抗体结合两种不同靶标或两种不同表位的独特能力实现了常规抗体无法获得的许多新的作用机制(MOA)。为了将这些新的MOA应用于临床开发，我们开发了名为WuXiBodyTM的双特异性平台，其可以将两种亲本抗体组装成具有所需效价和功能的双特异性分子，参见PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)，其完整内容在此通过引用并入本文。
例如，如PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中所公开的，WuXiBodyTM平台采用某些TCR恒定区(Cβ/Cα)来替换抗体Fab的CH1和CL结构域。嵌合Fab具有独特的重链轻链界面，其与常规抗体Fab不同。嵌合和常规Fab以不同形式组装可以产生具有不同结构和效价的各种双特异性分子。
非常需要设计出具有所需的表达水平、稳定性和/或对抗原的亲和力的多特异性例如双特异性分子。本公开描述了具有所需稳定性和/或蛋白质表达水平的一些多特异性例如双特异性多肽复合物，其通过例如Cα和/或Cβ的C末端区域和/或在空间上靠近Cα和/或Cβ的C末端的残基的工程化改造。
发明概述
在一个方面，本公开提供了一种多肽复合物，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，其中C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性，其中C1包含工程化的Cβ且C2包含工程化的Cα，或C1包含工程化的Cα且C2包含工程化的Cβ。
在一个方面，本公开提供了一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分缔合的第一抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，且所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，所述非天然链间键位于C1中包含的第一突变残基和C2中包含的第二突变残基之间，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，其中C1包含工程化的Cβ且C2包含工程化的Cα；或C1包含工程化的Cα且C2包含工程化的Cβ，并且其中第一抗体具有第一抗原特异性，第二抗原结合部分具有与第一抗原特异性不同的第二抗原特异性。
在某些实施方案中，本文公开的多肽复合物包含位于Cα和/或Cβ的C末端区域或空间上靠近Cα和/或Cβ的C末端的残基处的至少一个突变。在一些实施方案中，与没有这类突变的Cα和/或Cβ相比，所述至少一个突变提高了Cα的稳定性、Cβ的稳定性、和/或Cα-Cβ界面稳定性。在一些实施方案中，公开的具有所述至少一个突变的多肽复合物与没有这种突变的多肽复合物相比，具有改进的表达水平、稳定性和/或对抗原的亲和力。
在一个方面，本公开提供了本文提供的双特异性多肽复合物的双特异性片段。在一个方面，本公开提供了包含本文提供的多肽复合物的缀合物，或本文提供的双特异性多肽复合物与模块缀合。
在一个方面，本公开提供了编码本文提供的多肽复合物或本文提供的双特异性多肽复合物的分离的多核苷酸。在一个方面，本公开提供了包含本文提供的多核苷酸的分离的载体。在一个方面，本公开提供了包含本文提供的分离的多核苷酸或本文提供的分离的载体的宿主细胞。在一个方面，本公开提供了一种表达本文提供的多肽复合物或本文提供的双特异性多肽复合物的方法，该方法包括在表达所述多肽复合物或双特异性多肽复合物的条件下培养本文提供的宿主细胞。
在一个方面，本公开提供了一种产生本文提供的多肽复合物的方法，包括：a)向宿主细胞引入编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一TCR恒定域(C1)，所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定域(C2)，其中C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性；b)允许宿主细胞表达所述多肽复合物。
在一个方面，本公开提供了一种产生本文提供的双特异性多肽复合物的方法，包括：a)向宿主细胞引入编码第一多肽的第一多核苷酸、编码第二多肽的第二多核苷酸、编码第三多肽的第三多核苷酸和编码第四多肽的第四多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一TCR恒定区(C1)，所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，所述第三多肽包含第二抗体的VH，且所述第四多肽包含第二抗体的VL，其中C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性且所述第二抗体具有第二抗原特异性；b)允许宿主细胞表达所述双特异性多肽复合物。
在一个方面，本公开提供了一种产生本文提供的双特异性多肽复合物的方法，包括：a)向宿主细胞引入编码第一多肽的第一多核苷酸、编码第二多肽的第二多核苷酸、编码第三多肽的第三多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)和恒定区(CH1)可操作地连接于第二抗体的第二重链可变域(VH)可操作地连接于第一TCR恒定区(C1)，所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第二抗体的第二轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，所述第三多肽包含第一抗体的VL，其中C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性且所述第二抗体具有第二抗原特异性；b)允许宿主细胞表达所述双特异性多肽复合物。在某些实施方案中，产生本文提供的双特异性多肽复合物的方法还包括分离所述多肽复合物。
在某些实施方案中，产生本文提供的双特异性多肽复合物的方法还包括分离所述多肽复合物。
在一个方面，本公开提供了包含本文提供的多肽复合物或本文提供的双特异性多肽复合物的组合物。在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文提供的多肽复合物或本文提供的双特异性多肽复合物，以及药学上可接受的载体。
在一个方面，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者中的病况的方法，包括给受试者施用治疗有效量的本文提供的多肽复合物或本文提供的双特异性多肽复合物。在某些实施方案中，当第一抗原和第二抗原都被调节时，可以缓解、消除、治疗或预防所述病况。
在某些实施方案中，在C1中包含的第一突变残基和C2中包含的第二突变残基之间形成非天然链间键。在某些实施方案中，第一和第二突变残基中的至少一个是半胱氨酸残基。在某些实施方案中，非天然链间键是二硫键。在某些实施方案中，第一突变残基包含在C1的接触界面内，和/或第二突变残基包含在C2的接触界面内。在某些实施方案中，至少一个天然半胱氨酸残基在C1和/或C2中不存在或存在。在某些实施方案中，工程化的Cβ的位置C74处的天然半胱氨酸残基不存在或存在。在某些实施方案中，在Cβ中不存在天然C74。在某些实施方案中，天然二硫键(Cα上的C96和Cβ上的A128，D129和C130)可能存在或不存在。
在某些实施方案中，至少一个天然N-糖基化位点在C1和/或C2中不存在或存在。在某些实施方案中，在C1和/或C2中不存在天然N-糖基化位点。
在某些实施方案中，如本文所公开的二聚体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个非天然链间键。在某些实施方案中，至少一个非天然链间键是二硫键。在某些实施方案中，二聚体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、12、13、14、15或更多个二硫键。
在某些实施方案中，第一VH在第一接合域处可操作地连接于C1，第一VL在第二接合域处可操作地连接于C2。在某些实施方案中，第一VH经由连接子在第一结合域处与C1缔合，第一VL经由连接子在第二接合域处与C2缔合。
在某些实施方案中，第一和/或第二接合域包含抗体V/C接合区的C末端片段的适当长度(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基)，以及TCR V/C接合区的N末端片段的适当长度(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基)。
在某些实施方案中，工程化的Cβ在接触界面内选自氨基酸残基9-35、52-66、71-86和122-127的氨基酸残基处包含突变的残基，例如突变的半胱氨酸残基；和/或工程化的Cα在接触界面内选自氨基酸残基6-29、37-67和86-95的氨基酸残基处包含突变的残基，例如突变的半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，工程化的Cβ包含突变残基K9E。
在某些实施方案中，工程化的Cβ包含突变的半胱氨酸残基，其在选自以下的位置处发生取代：S56C，S16C，F13C，V12C，E14C，L62C，D58C，S76C和R78C，和/或工程化的Cα包含突变的半胱氨酸残基，其在选自以下的位置处发生取代：T49C，Y11C，L13C，S16C，V23C，Y44C，T46C，L51C和S62C。
在某些实施方案中，工程化的Cβ和工程化的Cα包含一对突变的半胱氨酸残基，其替代一对氨基酸残基，选自：Cβ中的S16C和Cα中的Y11C、Cβ中的F13C和Cα中的L13C、Cβ中的S16C和Cα中的L13C、Cβ中的V12C和Cα中的S16C、Cβ中的E14C和Cα中的S16C、Cβ中的F13C和Cα中的V23C、Cβ中的L62C和Cα中的Y44C、Cβ中的D58C和Cα中的T46C、Cβ中的S76C和Cα中的T46C、Cβ中的S56C和Cα中的T49C、Cβ中的S56C和Cα中的L51C、Cβ中的S56C和Cα中的S62C、以及Cβ中的R78C和Cα中的S62C，并且其中所述一对半胱氨酸残留物能够形成非天然链间二硫键。
在某些实施方案中，至少一个天然糖基化位点不存在或存在于工程化的Cβ和/或工程化的Cα中。在某些实施方案中，工程化的Cβ中的天然糖基化位点是N69，和/或工程化的Cα中的糖基化位点选自N34，N68，N79及其任何组合。
在某些实施方案中，工程化的Cβ缺乏或保留涵盖天然Cβ的氨基酸残基101-117的FG环，和/或涵盖天然Cβ的氨基酸残基66-71的DE环。
在某些实施方案中，第一多肽还包含抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域。
在某些实施方案中，第一抗原特异性和第二抗原特异性针对的是两种不同的抗原，或者同一抗原上的两种不同的表位。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分与CTLA-4结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与CTLA-4结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分结合4-1BB。在某些实施方案中，第一抗原结合部分结合4-1BB。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第一和第二抗原结合部分与HER2的两个单独的域分别结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与HER2 D2结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与HER2 D4结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与HER2 D4结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与HER2D2结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-17结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-20结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-20结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-17结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-4结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-13结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-13结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-4结合。
在某些实施方案中，本文公开的多肽复合物的缔合是通过连接子，二硫键，氢键，静电相互作用，盐桥或疏水性-亲水性相互作用，或其组合。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含具有第二抗原特异性的第二抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab。在某些实施方案中，第一抗原特异性和第二抗原特异性针对的是两种不同的抗原，或者同一抗原上的两种不同的表位。
在某些实施方案中，第一和第二抗原特异性中的一种针对T细胞特异性受体分子和/或天然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子，另一种针对肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，第一和第二抗原特异性中的一种针对CD3，另一种针对肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，第一和第二抗原特异性中的一种针对CD3，另一种针对CD19。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分还包含第一二聚化结构域，第二抗原结合部分还包含第二二聚化结构域，其中第一和第二二聚化结构域是缔合的。
在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域的缔合是通过连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水性-亲水性相互作用，或其组合。
在某些实施方案中，第一和/或第二二聚化结构域包含抗体铰链区域的至少一部分，任选地衍生自IgG1，IgG2或IgG4。
在某些实施方案中，第一和/或第二二聚化结构域还包含抗体铰链区、抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域的至少一部分。在某些实施方案中，第一二聚化结构域在第三接合域处可操作地连接于第一TCR恒定区(C1)。
在某些实施方案中，第二二聚化结构域与第二抗原结合部分的重链可变结构域可操作地连接。
在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域不同，并且以阻碍同二聚化和/或偏好异二聚化的方式缔合。
在某些实施方案中，第一和第二二聚体域能够通过把手入孔(knobs-into-hole)、疏水相互作用、静电相互作用、亲水性相互作用或增加的柔性来缔合。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含至少一个残基被至少一个有助于鼠TCR的稳定性的相应氨基酸残基取代，以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。
在某些实施方案中，工程化的Cα在C末端包含一个或多个突变残基，例如1、2、3、4、5或6个突变残基，其中突变残基构成来源于以下的片段：人IgG1铰链序列，人κ轻链C末端序列，PDB-5DK3(人IgG4)CH1区序列，人λ轻链C末端区序列，PDB-1IGT(小鼠IgG2a)CH1区序列，PDB-1IGT(小鼠IgG2a)κ轻链C末端区序列，人IgG2铰链区序列(例如，ERKCC-ERKSC，SEQ IDNO：3)，PDB-5E8E(人IgA)CH1区序列，PDB-5E8E(人IgA)κ轻链C末端区序列，PDB-1DEE(人IgM)CH1区序列，人IgE CH1区序列或人IgD CH1区序列。
在某些实施方案中，Cα的一个或多个修饰(例如在其C末端)可改进本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。在某些实施方案中，将CαC末端残基(在CαC末端区处的残基，例如在位置81-96，84-95，92-95，92-96处的氨基酸残基)由人类IgG1序列区段或人κ轻链C末端片段替换可以改善本文所公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα的C末端处的突变，其中所述C末端包含从人IgG1铰链序列衍生的氨基酸序列，例如“EPKS”(SEQ ID NO：4)和“VEPKS”(SEQ ID NO：5)。例如，工程化的Cα包括Cα的C末端处的突变，其中用“VEPKS”(SEQ ID NO：5)替换“PESS”(SEQ ID NO：6)。再例如，工程化的Cα包括在Cα的C末端处的突变，用“EPKS”(SEQ ID NO：4)替换“PESS”(SEQ IDNO：6)。在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα的C末端处的突变，其中所述C末端包含从人κ轻链C末端残基衍生的氨基酸序列，例如“NRGE”(SEQ ID NO：7)。例如，工程化的Cα包括在Cα的C末端处的突变，用“NRGE”(SEQ ID NO：7)替换“PESS”(SEQ ID NO：6)。
在某些实施方案中，Cβ上至少一个氨基酸残基例如在结构上或空间上靠近Cα的C末端的残基的修饰也可以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个残基突变为来自鼠TCR的相应的一个或多个氨基酸残基，以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。例如，工程化的Cα包括选自取代P92S、E93D、S94V和S95P的至少一个突变残基，和/或工程化的Cβ包含选自取代E17K和S21A的至少一个突变残基。在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基P92S、E93D、S94V和S95P。在某些实施方案中，工程化的Cβ包括突变残基E17K和S21A。在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基P92S、E93D、S94V和S95P，并且工程化的Cβ包括突变的残基E17K和S21A。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或工程化的Cβ包含选自Cα上S22F、T33I和A73T以及Cβ上E17K、H22R、D38P和S53D的一个，两个，三个，四个，五个，六个或七个突变。
在某些实施方案中，至少一个天然半胱氨酸残基可以在工程化的Cα和Cβ中不存在或存在。在某些实施方案中，天然残基A128，D129和C130不存在于Cβ和/或天然残基C96不存在于Cα中。在某些实施方案中，天然残基A128，D129和C130存在于Cβ中和/或天然残基C96存在于Cα中，使得存在由两个Cys残基形成的原始TCR天然二硫键键。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个突变残基以形成一个或多个非天然二硫键，所述突变残基选自：Cα上的P8C，Cα上的A9C，Cα上的V10C，Cα上的F26C，Cα上的F29C，Cα上的T33C，Cα上的Q34C，Cα上的V35C，Cα上的S36C，Cα上的S38C，Cα上的K39C，Cα上的F78C，Cα上的N80C，Cα上的S81C，Cα上的I82C，Cα上的P84C，Cα上的D86C，Cα上的T87C，Cα上的F88C，Cα上的F89C，Cα上的P90C，以及Cβ上的A18C。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个突变的残基的组以形成非天然二硫键，选自：Cα上的F26C和F78C，Cα上的S36C和N80C，Cα上的S38C和N80C，Cα上的K39C和N80C，Cα上的Q34C和S81C，Cα上的V35C和S81C，Cα上的S36C和S81C，Cα上的Q34C和I82C，Cα上的P8C和P84C，Cα上的F29C和P84C，Cα上的T33C和P84C，Cα上的P8C和D86C，Cα上的P8C和T87C，Cα上的A9C和F88C，Cα上的V10C和F89C，Cα上的P90C和Cβ上的A18C，Cα上的P8C、D86C、P90C和Cβ上的A18C，Cα上的P8C和D86C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的F26C和F78C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的S36C和N80C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的S38C和N80C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的K39C和N80C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的Q34C和S81C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的V35C和S81C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的S36C和S81C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的Q34C和I82C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的P8C和P84C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的F29C和P84C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的T33C和P84C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的P8C和D86C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的P8C和T87C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的A9C和F88C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的V10C和F89C。
在某些实施方案中，工程化的Cβ包含突变残基：Cβ上的A18C。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包括突变残基：Cα上的P90C和Cβ上的A18C。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包括突变残基：Cα上的8C、D86C和P90C以及Cβ上的A18C。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基：Cα上的P8C和D86C。
在某些实施方案中，工程化的Cβ在Cβ的C末端包含Gly氨基酸残基，使得Gly氨基酸残基邻近或形成铰链区的一部分。
在某些实施方案中，工程化的Cα在其C末端或C末端附近包含1至22个氨基酸残基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，16、17、18、19、20、21或22个)的缺失。在某些实施方案中，工程化的Cα在其C末端或C末端附近包含8个氨基酸残基(例如，氨基酸残基88-95)的缺失，例如氨基酸残基“FFPSPESS”(SEQ ID NO：9)的缺失。在某些实施方案中，工程化的Cα在其C末端或C末端附近包含4个氨基酸残基(例如氨基酸残基92-95)的缺失，例如氨基酸残基“PESS”(SEQ ID NO：6)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含在Cβ的C末端的氨基酸残基甘氨酸，以及在Cα的C末端用“VEPKS”(SEQ ID NO：5)代替“PESS”(SEQ ID NO：6)的突变。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，和Cβ上的A128，D129和C130)，在CβC末端的氨基酸残基甘氨酸，以及在Cα的C末端用“NRGE”(SEQ IDNO：7)代替“PESS”(SEQ ID NO：6)的突变。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，Cβ上的A128，D129和C130)，以及在Cα的C末端的突变P92S，E93D，S94V和S95P，以及Cβ上的E17K和S21A。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，和Cβ上的A128，D129和C130)，在CβC末端的氨基酸残基甘氨酸，以及在Cα的C末端用“VEPKS”(SEQID NO：5)代替“PESS”(SEQ ID NO：6)的突变。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，和Cβ上的A128，D129和C130)，在CβC末端的氨基酸残基甘氨酸，以及在Cα的C末端用“NRGE”(SEQ IDNO：7)代替“PESS”(SEQ ID NO：6)的突变。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基F26C和F78C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基S36C和N80C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基S38C和N80C，以及CαC末端4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基K39C和N80C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基Q34C和S81C，以及CαC末端4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基V35C和S81C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基S36C和S81C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基Q34C和I82C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基P8C和P84C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基Cα上的F29C和P84C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基T33C和P84C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基P8C和D86C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基P8C和T87C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基A9C和F88C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα包括Cα上的突变残基V10C和F89C，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包含Cα上的P90C和Cβ上的A18C的突变残基，以及CαC末端的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包含突变，即Cα上的S22F、T33I和A73T以及Cβ上的E17K、H22R、D38P和S53D。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包含7处突变，即Cα上的S22F、T33I和A73T以及Cβ上的E17K、H22R、D38P和S53D以及原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，以及Cβ上的A128、D129和C130)。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包括Cα上的突变P8C，D86C和P90C，以及Cβ上的A18C。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包括Cα上的突变P8C和D86C，并包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，以及Cβ上的A128、D129和C130)。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包含Cα上的突变P90C和Cβ上的A18C，并包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，以及Cβ上的A128、D129和C130)。
在某些实施方案中，工程化的Cα和工程化的Cβ包括Cα上的突变P8C，D86C和P90C，Cβ上的A18C，并包含原始TCR天然二硫键(Cα上的C96，以及Cβ上的A128、D129和C130)。
在某些实施方案中，工程化的C2包括SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、79和80中的任何一种，和/或工程化的C1包括SEQ ID No：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中的任何一种。在某些实施方案中，工程化的C1包括SEQ ID No：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、79和80中的任何一种，和/或工程化的C2包括SEQ ID No：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中的任何一种。在某些实施方案中，工程化的C1和工程化的C2分别包含选自下组的序列对：SEQ ID NOs:10/11、12/13、14/15、16/17、18/19、20/21、22/23、24/25、26/27、28/29、30/31、32/33、34/35、36/37、38/39、40/41、42/43、44/45、46/47、48/49、50/51、52/53、54/55、56/57、58/59、60/61、62/63、64/65、79/43和80/51。在某些实施方案中，工程化的C2和工程化的C1分别包含选自下组的序列对：SEQ ID NOs:12/13、14/15、16/17、18/19、20/21、22/23、24/25、26/27、28/29、30/31、32/33、34/35、36/37、38/39、40/41、42/43、44/45、46/47、48/49、50/51、52/53、54/55、56/57、58/59、60/61、62/63、64/65、79/43和80/51。
在某些实施方案中，工程化的C2和工程化的C1分别包含SEQ ID NO：42和43的一对序列。在某些实施方案中，工程化的C1和工程化的C2分别包含SEQ ID NO：42和43的一对序列。
在某些实施方案中，工程化的C2和工程化的C1分别包含SEQ ID NO：50和51的一对序列。在某些实施方案中，工程化的C1和工程化的C2分别包含SEQ ID NO：50和51的一对序列。
在某些实施方案中，工程化的C2和工程化的C1分别包含SEQ ID NO：79和43的一对序列。在某些实施方案中，工程化的C1和工程化的C2分别包含SEQ ID NO：79和43的一对序列。
在某些实施方案中，工程化的C2和工程化的C1分别包含SEQ ID NO：80和51的一对序列。在某些实施方案中，工程化的C1和工程化的C2分别包含SEQ ID NO：80和51的一对序列。
在某些实施方案中，本文提供的多肽复合物可以制备成Fab、(Fab)2、双抗体、三抗体、triFab、串联连接Fab、Fab-Fv、串联连接的V结构域、串联连接的scFv等形式。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文提供的多肽复合物用于检测、诊断、预后或治疗疾病或病况。
根据参考附图进行的对以下若干实施方案的详细描述，本公开的前述和其他特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1A显示了第一批T8311蛋白在纯化后在非还原或还原条件下的SDS-PAGE表征。图1B显示第一批T8311蛋白在纯化后的SEC-HPLC表征。
图2A和2C显示第二批T8311蛋白在纯化后在非还原或还原条件下的SDS-PAGE表征。图2B和2C显示第二批T8311蛋白在纯化后的SEC-HPLC表征。
图3显示了在温度升高时第一批T8311蛋白的DSF概况。
图4显示了T8311蛋白的DSC曲线，T8311-57和T8311-61的曲线向右迁移，表明它们与T8311-1相比具有相对更强的对温度升高的抵抗性。
图5显示了T8311蛋白的DLS曲线。
图6显示了T8311-1、T8311-57和T8311-61的质谱。
图7显示了T8311蛋白对表达靶标的细胞的结合曲线。
图8显示了检查T8311蛋白的功能的报告基因测定结果。T8311-57和T8311-61在使用表达PD-L1的细胞的激活4-1BB介导的NF-KB途径方面显示出良好的激动剂效果。G34(T8311-U14T2.G34-1.uIgG1)在使用表达PD-L1的细胞的RGA试验中显示出弱激动剂效果。
图9显示了T8311蛋白的PK分析结果。T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1与其他抗体相比，显示更长的t1/2，更大的AUC和更低的清除率。
图10显示了纯化后W3618蛋白的SDS-PAGE(A)和SEC-HPLC(B)表征。
图11显示了温度升高时W3618蛋白的DSF概况。
图12显示了TRAC_Human Cα(SEQ ID NO:1)和如本文公开的工程化的Cα，即TRAC_WuXiBody 1.0(SEQ ID NO:10)的序列和编号。
图13显示了TRBC2_Human Cβ(SEQ ID NO:2)和如本文公开的工程化的Cβ，即TRBC_WuXiBody 1.0(SEQ ID NO:8)的序列和编号。
图14示出了两种WuXibody形式E17R和G25R以及对照形式G34。
图15显示了W3618蛋白的PK分析结果。与W3618-U4T1.E17R-1.uIgG1相比，W3618-U4T1.E17R-57.uIgG1和W3618-U4T1.E17R-61.uIgG1显示更长的t1/2，更大的AUC和更低的清除率。
图16显示了W329001-U3T3蛋白在纯化后在非还原或还原条件下的SDS-PAGE表征(上方图)，以及在纯化后的SEC-HPLC表征(下方图)。
图17显示了温度升高时W329001-U3T3蛋白的DSF概况。
图18显示了W329001-U3T3蛋白的PK分析结果。与W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1相比，W329001-U3T3.G25R-57.uIgG1和W329001-U3T3.G25R-61.uIgG1显示更长的t1/2，更大的AUC和更低的清除率。
图19显示了W329001-U4T4蛋白在纯化后在非还原或还原条件下的SDS-PAGE表征(上方图)，以及在纯化后的SEC-HPLC表征(中间图和下方图)。
图20显示了温度升高时W329001-U4T4蛋白的DSF概况。
图21显示了W329001-U4T4.G25R-57.uIgG1和W329001-U4T4.G25R-61.uIgG1蛋白的PK分析结果。与W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1相比，W329001-U4T4.G25R-57.uIgG1和W329001-U4T4.G25R-61.uIgG1显示更长的t1/2，更大的AUC和更低的清除率。
图22显示了W329001-U4T4.G25R-57.uIgG1和W329001-U4T4.G25R-78.uIgG1蛋白的PK分析结果的比较。
图23显示了W329001-U4T4.G25R-61.uIgG1和W329001-U4T4.G25R-79.uIgG1蛋白的PK分析结果的比较。
发明详述
以下对本公开的描述仅用于例示本公开的各种实施方案。因此，所讨论的特定修改不应被解释为对本公开范围的限制。对于本领域技术人员来说，显然可以在不脱离本公开的范围的情况下进行各种等同、改变和修改，并且应当理解，本文包括这种等同的实施方案。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。如果本文引用的某些参考文献的内容相矛盾或与本公开不一致，则以本公开为准。
本文使用的某些术语在PCT/CN2018/L06766(WO2019/057122)中定义和/或解释。除非另有说明，否则将那些定义和/或解释并入本文并适用于本公开。
A.多肽复合物
在一个方面，本公开提供了一种多肽复合物，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，其中C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性，其中C1包含工程化的Cβ且C2包含工程化的Cα，或C1包含工程化的Cα且C2包含工程化的Cβ。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分缔合的第一抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，且所述第二多肽从N末端到C末端包含所述第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，所述非天然链间键位于C1中包含的第一突变残基和C2中包含的第二突变残基之间，并且所述非天然链间键能够稳定该二聚体，其中C1包含工程化的Cβ且C2包含工程化的Cα；或C1包含工程化的Cα且C2包含工程化的Cβ，并且其中第一抗体具有第一抗原特异性，第二抗原结合部分具有与第一抗原特异性不同的第二抗原特异性。
取决于多特异性形式和/或编号方便，如本文所公开的编号序列，例如第一、第二和第三可以是不同的。例如，第一VH可以编号为第二VH，第一VL可以编号为第二VL。再例如，第二抗原结合部分可以编号为第一抗原结合部分，并且第一抗原结合部分可以编号为第二抗原结合部分。如图14所示，取决于优先级和/或方便性，VH1可以编号为VH2，并且VL1可以编号为VL2，等等。
在某些实施方案中，本文公开的多肽复合物包含在Cα和/或CβC末端区处或在空间上靠近Cα和/或Cβ的C末端的残基处的至少一个突变。在一些实施方案中，与没有这种突变的Cα和/或Cβ相比，所述至少一个突变提高了Cα的稳定性、Cβ的稳定性和/或Cα-Cβ界面稳定性。在一些实施方案中，与没有这种突变的多肽复合物相比，具有所述至少一个突变的公开的多肽复合物具有改善的表达水平、稳定性和/或对抗原的亲和力。
i.TCR恒定区
本文提供的多肽复合物包含衍生自TCR的恒定区。天然TCR由两条多肽链组成，一般具有两种类型：一条链由α和β链(即α/βTCR)组成，另一条链由γ和δ链组成(即γ/δTCR)。这两种类型在结构上相似但具有不同的位置和功能。大约95％的人T细胞具有α/βTCR，而剩余5％具有γ/δTCR。还发现了α链的前体并命名为前α链。两条TCR多肽链各自包含免疫球蛋白结构域和膜近端区。免疫球蛋白区包含可变区和恒定区，其特征在于存在免疫球蛋白型折叠。每条TCR多肽链具有半胱氨酸残基(例如，在恒定结构域的C末端或在膜近端区的N末端)，其可以一起形成二硫键，使得两条TCR链拴系在一起。
人TCRα链恒定区(称为Cα)称为TRAC，具有NCBI登录号P01848或SEQ ID NO：1的氨基酸序列，如图12所示。
人TCRβ链恒定区(称为Cβ)具有两种不同的变体，称为TRBC1和TRBC2(IMGT命名)(参见TOYONAGA B等人，PNAs,Vol.82,pp.8624-8628,Immunology(1985))。TrBC2_human(Cβ)的氨基酸序列如图13的SEQ ID NO：2所示。
具体地，天然TCRβ链含有在位置74处的天然半胱氨酸残基，其未配对，因此在天然α/βTCR中不形成二硫键。在某些实施方案中，在本文提供的多肽复合物中，该天然半胱氨酸残基不存在或突变成另一个残基。这对于避免不正确的链内或链间配对可能有用。在某些实施方案中，天然半胱氨酸残基被取代成另一个残基，例如丝氨酸或丙氨酸(例如，C74A)。在某些实施方案中，取代可以改善体外的TCR重折叠效率。
在本公开中，本文提供的多肽复合物的第一和第二TCR恒定区能够形成在TCR恒定区之间包含至少一个非天然链间键的二聚体，所述链间键能够稳定该二聚体。在一些实施方案中，本文公开的多肽复合物包含Cα和/或CβC末端区或空间上靠近Cα和/或Cβ的C末端的残基处的至少一个突变，以改善Cα的稳定性、Cβ的稳定性和/或Cα-Cβ界面稳定性。
在一个TCR恒定区上的一个氨基酸残基和另一个TCR恒定区上的另一个氨基酸残基之间形成了链间键。在某些实施方案中，非天然链间键可以是能够将两个TCR恒定区缔合成二聚体的任何键或相互作用。合适的非天然链间键的实例包括二硫键，氢键，静电相互作用，盐桥或疏水性-亲水相互作用，把手入孔或其组合。非天然链间键的实例描述于PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，TCR恒定区二聚体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非天然链间键。任选地，所述1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非天然链间键中的至少一个是二硫键，氢键，静电相互作用，盐桥或疏水性-亲水性相互作用，或其任何组合。
包含突变残基的TCR恒定区在本文中也称为“工程化的”TCR恒定区，例如工程化的Cα或工程化的Cβ。在某些实施方案中，多肽复合物的第一TCR恒定区(C1)包括工程化的TCRα链(Cα)，第二TCR恒定区(C2)包含工程化的TCRβ链(Cβ)。在某些实施方案中，C1包括工程化的Cβ，C2包括工程化的Cα。
在某些实施方案中，工程化的TCR恒定区包含一个或多个突变的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，一个或多个突变的残基包含在第一和/或第二工程化的TCR恒定区的接触界面内。
如本文所用的术语“接触界面”是指多肽上多肽相互作用或彼此缔合的特定区域。接触界面包含一个或多个氨基酸残基，其能够与相互作用发生时产生接触或缔合的相应氨基酸残基相互作用。接触界面中的氨基酸残基可以是或不是连续的序列。例如，当界面是三维时，界面内的氨基酸残基可以分开在线性序列上的不同位置处。
在某些实施方案中，工程化的Cβ包含在选自下组的接触界面内的突变的残基(例如突变的半胱氨酸残基)：氨基酸残基9-35、52-66、71-86和122-127。在某些实施方案中，工程化的Cα包含在选自下组的接触界面内的突变的残基(例如突变的半胱氨酸残基)：氨基酸残基6-29、37-67和86-95。除非规定，否则本公开中TCR恒定区中的氨基酸残基的编号如图12和13所示。
在某些实施方案中，可以在工程化的Cα和工程化的Cβ之间形成一个或多个二硫键。Cβ中的突变半胱氨酸残基可以是选自下组的取代：S56C，S16C，F13C，V12C，E14C，F13C，L62C，D58C，S76C和R78C，和/或Cα中的突变半胱氨酸残基可以是选自下组的取代：T49C，Y11C，L13C，S16C，V23C，Y44C，T46C，L51C和S62C。在某些实施方案中，突变的半胱氨酸残基的对可以是选自下组的取代的对：Cβ中的S16C和Cα中的Y11C，Cβ中的F13C和Cα中的L13C，Cβ中的S16C和Cα中的L13C，Cβ中的V12C和Cα中的S16C，Cβ中的E14C和Cα中的S16C，Cβ中的F13C和Cα中的V23C，Cβ中的L62C和Cα中的Y44C，Cβ中的D58C和Cα中的T46C，Cβ中的S76C和Cα中的T46C，Cβ中的S56C和Cα中的T49C，Cβ中的S56C和Cα中的L51C，Cβ中的S56C和Cα中的S62C，以及Cβ中的R78C和Cα中的S62C，并且其中该对半胱氨酸残基能够形成非天然的链间二硫键。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个突变残基以形成一个或多个非天然二硫键，其选自：Cα上的P8C，Cα上的A9C，Cα上的V10C，Cα上的F26C，Cα上的F29C，Cα上的T33C，Cα上的Q34C，Cα上的V35C，Cα上的S36C，Cα上的S38C，Cα上的K39C，Cα上的F78C，Cα上的N80C，Cα上的S81C，Cα上的I82C，Cα上的P84C，Cα上的D86C，Cα上的T87C，Cα上的F88C，Cα上的F89C，Cα上的P90C，以及Cβ上的A18C。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个突变残基的组以形成非天然二硫键，选自：Cα上的F26C和F78C，Cα上的S36C和N80C，Cα上的S38C和N80C，Cα上的K39C和N80C，Cα上的Q34C和S81C，Cα上的V35C和S81C，Cα上的S36C和S81C，Cα上的Q34C和I82C，Cα上的P8C和P84C，Cα上的F29C和P84C，Cα上的T33C和P84C，Cα上的P8C和D86C，Cα上的P8C和T87C，Cα上的A9C和F88C，Cα上的V10C和F89C，Cα上的P90C和Cβ上的A18C，Cα上的P8C、D86C、P90C和Cβ上的A18C，Cα上的P8C和D86C。
如本文中贯穿说明书所用，关于TCR恒定区的“XnY”旨在意味着TCR恒定区上的第n个氨基酸残基X(基于本文所提供的图12-13中的编号)被氨基酸残基Y替换，其中x和y分别是特定氨基酸残基的单字母缩写。应当注意，数量n仅基于图12-13中提供的编号，并且它可能与其实际位置不同。
除了非天然氨基酸残基之外，在某些实施方案中工程化的TCR恒定区还可包括对野生型TCR恒定区序列中的一个或多个天然残基的另外的修饰。这种另外修饰的实例包括，例如对天然半胱氨酸残基的修饰，对天然糖基化位点的修饰，和/或对天然环的修饰。
在某些实施方案中，至少一个天然半胱氨酸残基在工程化的Cβ中不存在或存在。例如，Cβ的位置C74的天然半胱氨酸残基可以存在或不存在于工程化的Cβ中。
不希望被任何理论束缚地，据信本文提供的多肽复合物的优点在于它同时容忍Cβ上的天然半胱氨酸残基的存在和不存在。虽然提出过(参见，例如美国专利No.7,666,604)天然半胱氨酸残基在可溶性TCR异二聚体上的存在对TCR的配体结合能力有害，但本文提供的多肽复合物能够容忍该天然半胱氨酸残基的存在，而不会对其抗原结合活性产生负面影响。此外，本文提供的多肽复合物在没有天然半胱氨酸残基的情况以高水平表达，尽管Wu等人，mAbs,7(2),pp.364-376(2005)给出了相反的教导，Wu等人提出TCR异二聚体中的天然二硫键对于稳定TCR异二聚体有利。
在某些实施方案中，可以在本公开中提供的多肽复合物中修饰(例如除去)或保留在天然TCR恒定区中存在的一个或多个天然糖基化位点。本文对于多肽序列所用的术语“糖基化位点”是指具有以下侧链的氨基酸残基，该侧链可以附着碳水化合物部分(例如寡糖结构)。多肽如抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接指的是碳水化合物部分附着在天冬酰胺残基的侧链，例如，在三肽序列如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。O-连接的糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附着于羟氨酸，最常见附着于丝氨酸或苏氨酸。通过改变氨基酸序列使得一种或多种上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)或一种或多种丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)被取代，可以方便地完成天然糖基化位点的去除。
在某些实施方案中，在本文提供的多肽复合物中，在工程化的TCR恒定区中(例如在第一和/或第二TCR恒定区中)不存在或存在至少一个天然糖基化位点。不希望受到任何理论的束缚，据信本文提供的多肽复合物可以容忍所有或部分糖基化位点的去除，而不影响蛋白质表达和稳定性，这与现有的教导相反，现有的教导是N-连接的糖基化位点在TCR恒定区上的存在(例如Cα(即N34，N68和N79)和Cβ(即N69))是蛋白质表达和稳定性所必需的(参见Wu等人，Mabs,7:2,364-376,2015)。
在某些实施方案中，在本文提供的多肽复合物中，至少一个N-糖基化位点，例如N34，N68，N79和N61在工程化的Cα中不存在或存在。在某些实施方案中，至少一个N-糖基化位点例如N69，在工程化的Cβ中不存在或存在。
在某些实施方案中，天然TCR恒定区中存在的一种或多种天然二级结构可被修饰(例如除去)或保留在本公开中提供的多肽复合物中。在某些实施方案中，天然环(例如天然Cβ的FG环和/或DE环)被修饰(例如除去)或保留在本文提供的多肽复合物中。术语“FG环”和“DE环”是主要在TCRβ链恒定结构域中发现的结构。FG环涵盖天然Cβ的氨基酸残基101-117，是一种异常伸长的、溶剂暴露的结构元件，其形成针对CD3的α/βTCR腔。DE环涵盖天然Cβ的氨基酸残基66-71。在某些实施方案中，FG环的序列不存在和/或被YPSN(SEQ ID NO:81)替换。在某些实施方案中，天然DE环的序列不存在和/或被QSGR(SEQ ID NO:82)替换。
在某些实施方案中，工程化的Cα和Cβ包含至少一个取代残基，该残基被有助于鼠TCR的稳定性的至少一个对应氨基酸残基取代，以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。
在某些实施方案中，工程化的Cα在C末端包含一个或多个突变残基，例如1、2、3、4、5或6个突变残基，其中突变残基构成衍生自以下的片段：人IgG1铰链序列，人κ轻链C末端序列，PDB-5DK3(人IgG4)CH1区序列，人λ轻链C末端区序列，PDB-1IGT(小鼠IgG2a)CH1区序列，PDB-1IGT(小鼠IgG2a)κ轻链C末端区序列，人IgG2铰链区序列(例如，ERKCC-ERKSC，SEQ IDNO：3)，PDB-5E8E(人IgA)CH1区序列，PDB-5E8E(人IgA)κ轻链C末端区序列，PDB-1DEE(人IgM)CH1区序列，人IgE CH1区序列或人IgD CH1区序列。
在某些实施方案中，Cα的例如在其C末端的一个或多个修饰可以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。在某些实施方案中，将CαC末端残基(Cα的C末端区的残基，例如位置81-96、84-95、92-95或92-96的氨基酸残基)用人IgG1序列区段或人κ轻链C末端区段替换可以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。在某些实施方案中，工程化的Cα包含在CαC末端的突变，其中C末端包含衍生于人IgG1铰链序列的氨基酸序列，例如“EPKS”(SEQ ID NO：4)和“VEPKS”(SEQ ID NO：5)。例如，工程化的Cα包括C末端处的突变，其中用“VEPKS”(SEQ ID NO：5)代替了“PESS”(SEQ ID NO：6)。再例如，工程化的Cα包括C末端处的突变，其中用“EPKS”(SEQ ID NO：4)代替了“PESS”(SEQ ID NO：6)。在某些实施方案中，工程化的Cα包括在C末端的突变，其中C末端包含衍生自人Kappa轻型C末端残基的氨基酸序列，例如“NRGE”(SEQ ID NO：7)。例如，工程化的Cα包括C末端的突变，其中用“NRGE”(SEQ ID NO：7)代替了“PESS”(SEQ ID NO：6)。
在某些实施方案中，对Cβ上的至少一个氨基酸残基(例如在结构上或空间上靠近Cα的C末端的残基)的修饰也可以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个突变残基，其被来自鼠TCR的相应的一个或多个氨基酸残基取代，以改善本文公开的多肽复合物的稳定性和/或表达水平。例如，工程化的Cα包括选自取代P92S、E93D、S94V和S95P的至少一个突变残基，和/或工程化的Cβ包含选自取代E17K和S21A的至少一个突变残基。在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基P92S、E93D、S94V和S95P。在某些实施方案中，工程化的Cβ包括突变残基E17K和S21A。在某些实施方案中，工程化的Cα包括突变残基P92S、E93D、S94V和S95P，并且工程化的Cβ包括突变的残基E17K和S21A。
在某些实施方案中，工程化的Cα和/或工程化的Cβ包含从Cα上的S22F，T33I和A73T以及TCR Cβ上的E17K，H22R，D38P和S53D中选择的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个突变。
在本文提供的多肽复合物中，衍生自TCR的恒定区与衍生自抗体的可变区可操作地连接。抗体的重链或轻链可变区可以与TCR恒定区在有或没有间隔子的情况下可操作地连接。
在某些实施方案中，第一抗体重链可变结构域(VH)在第一接合结构域处融合于第一TCR恒定区(C1)，第一抗体轻链可变结构域(VL)在第二接合结构域处融合于第二TCR恒定区(C2)。
在某些实施方案中，第一接合结构域包含抗体V/C接合区的C末端片段的至少一部分，以及TCR V/C接合区的N末端片段的至少一部分。
如本文所用的术语“抗体V/C接合区”是指抗体可变结构域和恒定结构域的边界，例如，重链可变结构域和CH1结构域之间或轻链可变结构域和轻链恒定结构域之间的边界。类似地，术语“TCR V/C接合区”是指TCR可变域和恒定域的边界，例如，TCRα可变域和恒定域之间或TCRβ可变域和恒定域之间的边界。
接合结构域(例如第一接合结构域和第二接合结构域)描述于PCT/CN2018/l06766(WO 2019/057122)中，并且通过引用并入本文。
在某些实施方案中，第一多肽包含的序列包含如式(I)中可操作地连接的结构域：VH-HCJ-C1，第二多肽包含的序列包含如式(II)中可操作地连接的结构域：VL-LCJ-C2，其中：
VH是抗体的重链可变结构域；
HCJ是如上文定义的第一接合结构域；
C1是如上文所定义的第一TCR恒定结构域；
VL是抗体的轻链可变结构域；
LCJ是如上文所定义的第二接合结构域；
C2是如上文所定义的第二TCR恒定结构域。
多种HCJ和LCJ的序列描述于PCT/CN2018/L06766(WO2019/057122)，并通过引用并入本文。
美国专利号9,683,052公开了TCR恒定区之间的接触界面内的某些残基可以工程化改造到Fc区中，以促进两条重链的异二聚体配对。本文公开的TCR恒定区之间的接触界面内的这种残基和/或相应的残基也可以工程化改造到Fab区中，例如CH1和CL结构域中，以促进轻链和重链之间的配对。
II.抗体可变区
本文提供的多肽复合物包含第一抗体的第一重链可变域(VH)和第一轻链可变结构域(VL)。在常规的天然抗体中，可变区包括被侧翼的框架(FR)区插入的三个CDR区域，例如来自N末端到C末端如下式所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。本文提供的多肽复合物可包含但不限于这种常规抗体可变区。例如，可变结构域可以包含抗体重链或轻链的所有3个或少于3个CDR，以及所有4个或少于4个FR，只要该可变结构域能够与抗原特异性结合。
第一抗体具有第一抗原特异性。换句话说，VH和VL形成能特异性结合抗原或表位的抗原结合位点。抗原特异性可以针对任何合适的抗原或表位，例如，外源性抗原、内源性抗原、自身抗原、新抗原、病毒抗原或肿瘤抗原。外源性抗原通过吸入、摄取或注射进入身体，并且可以通过内吞作用或吞噬作用由抗原呈递细胞(APC)呈递并形成MHC II类复合物。内源性抗原则由于细胞代谢、细胞内病毒或细菌感染而在正常细胞内产生，其可以形成MHCI类复合物。自身抗原(例如肽、DNA或RNA等)被患有自身免疫疾病的患者的免疫系统识别，而在正常情况下，该抗原不应成为免疫系统的靶标。新抗原是正常身体完全没有的抗原，并且由于某种疾病例如肿瘤或癌症而产生。在某些实施方案中，抗原与某些疾病(例如肿瘤或癌症、自身免疫疾病、感染性和寄生性疾病、心血管疾病、神经病、神经精神病学病况、损伤、炎症、凝血病症)有关。在某些实施方案中，抗原与免疫系统(例如，免疫细胞如B细胞，T细胞，NK细胞，巨噬细胞等)有关。
在某些实施方案中，第一抗原特异性针对免疫相关的抗原或其表位。免疫相关的抗原的实例包括T细胞特异性受体分子和/或天然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子。
T细胞特异性受体分子允许T细胞结合另一细胞(被称为抗原呈递细胞或APC)呈递的表位/抗原，并且如果存在另外的信号的话，被激活且做出应答。T细胞特异性受体分子可以是TCR，CD3，CD28，CD134(也称为OX40)，4-1BB，CD5和CD95(也称为Fas受体)。
NK细胞特异性受体分子的实例包括CD16，低亲和力Fc受体和NKG2D和CD2。
在某些实施方案中，第一抗原特异性针对肿瘤相关的抗原或其表位。术语“肿瘤相关的抗原”是指在肿瘤细胞表面上或可在表面上呈递的抗原，以及位于肿瘤细胞上或肿瘤细胞内的抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以仅由肿瘤细胞而非正常的(即非肿瘤的)细胞呈递。在一些其他实施方案中，肿瘤相关的抗原可以仅在肿瘤细胞上表达，或者可以代表与非肿瘤细胞相比的肿瘤特异性突变。在一些其他实施方案中，肿瘤相关的抗原可以在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中发现，但与非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞上过表达，或者由于与非肿瘤组织相比肿瘤组织不那么紧密而在肿瘤细胞中可被抗体达到而结合。在一些实施方案中，肿瘤相关的抗原位于肿瘤的血管系统上。在PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述了肿瘤相关的表面抗原的说明性实例，并通过引用并入本文。
在某些实施方案中，第一抗原特异性针对选自下组的一种抗原或其表位：CD3、4.1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD16、CD47、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD123、CD133、CEA、cdH3、EpCAM、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII(EGFR的突变形式)、HER2、HER3、dLL3、BCMA、唾液酸基-Lea、5T4、ROR1、黑色素瘤相关的软骨素硫酸盐蛋白聚糖、间皮素、叶酸受体1、VEGF受体、EpCAM、HER2/neu、HER3/neu、G250、CEA、MAGE、蛋白聚糖、VEGF、FGFR、αVβ3-整联蛋白、HLA、HLA-DR、ASC、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11、CD13、CD14、CD21、CD23、CD24、CD28、CD30、CD37、CD40、CD41、CD44、CD52、CD64、c-erb-2、CALLA、MHCII、CD44v3、CD44v6、p97、神经节苷脂GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b、GT3、GQ1、NY-ESO-1、NFX2、SSX2、SSX4 Trp2、gp100、酪氨酸酶、Muc-1、端粒酶、生存素、G250、p53、CA125 MUC、Wue抗原、Lewis Y抗原、HSP-27、HSP-70、HSP-72、HSP-90、Pgp、MCSP、EpHA2和细胞表面靶标GC182、GT468或GT512、IL-17、IL-20、IL-13和IL-4。
抗体可变域可以衍生自亲本抗体。亲本抗体可以是任何类型的抗体，包括例如全人抗体，人源化抗体或动物抗体(例如小鼠，大鼠，兔，绵羊，牛，狗等)。亲本抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
在某些实施方案中，亲本抗体是单克隆抗体。可以通过本领域已知的各种方法产生单克隆抗体，例如杂交瘤技术、重组方法、噬菌体展示或其任何组合。在PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述了产生抗体的示例性方法，并通过引用并入本文。
本文所述的亲本抗体可以被进一步修饰，例如，将CDR序列移植到不同的框架或支架中，以取代一个或多个框架区中的一个或多个氨基酸残基，以替换在一个或多个CDR区中的一个或多个残基进行亲和力成熟，等等。这些可以由本领域技术人员使用常规技术来实现。
亲本抗体也可以是本领域已知的治疗性抗体，例如由FDA批准的用于治疗或诊断用途，或处于临床试验中用于治疗病况，或处于研发中的那些抗体。可以从公共数据库例如www.ncbi.nlm nih gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/获得已知抗体的可变区的多核苷酸序列和蛋白质序列。治疗性抗体的实例包括但不限于PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中公开的治疗抗体，并通过引用并入本文。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分与CTLA-4结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与CTLA-4结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与4-1BB结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部与4-1BB结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与PD-L1结合。在某些实施方案中，第一和第二抗原结合部分与HER2的两个分别的结构域结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与HER2 D2结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与HER2 D4结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与HER2 D4结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与HER2 D2结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-17结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-20结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-20结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-17结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-4结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-13结合。在某些实施方案中，第一抗原结合部分与IL-13结合。在某些实施方案中，第二抗原结合部分与IL-4结合。
已知CDR负责抗原结合，然而已发现并非所有6个CDR都是必不可少的或不可改变的。换句话说，可以替换或改变或修饰一个或多个CDR，但基本上保持对抗原的特异性结合亲和力。
双特异性多肽复合物
在一个方面，本公开提供了双特异性多肽复合物。如本文所用的术语“双特异性”是指，存在两种抗原结合部分，每种抗原结合部分能够与不同的抗原或同一抗原的不同表位特异性结合。本文提供的双特异性多肽复合物包含第一抗原结合部分，其包含与第一TCR恒定区(C1)可操作地连接的第一重链可变域，以及与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接的第一轻链可变域，其中C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然和稳定化的链间键的二聚体。本文提供的双特异性多肽复合物还包含第二抗原结合部分，其包含第二抗原结合位点但不含衍生自TCR恒定区的序列。
在某些实施方案中，本发明提供了双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分缔合的第一抗原结合部分，其中：
第一种抗原结合部分包含：
第一多肽，其从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，其从N末端到C末端包含，第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1包括工程化的Cβ，C2包括工程化的Cα；或C1包括工程化的
Cα，C2包括工程化的Cβ，
C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，该非天然链间键在C1中包含的第一突变残基和C2中包含的第二突变残基之间，并且该非天然链间键能够稳定所述二聚体，
Cα和/或Cβ包含在Cα和/或Cβ的C末端区处或者在空间上靠近Cα和/或Cβ的C末端的氨基酸位置处的至少一个突变，以进一步稳定所述二聚体，并且
所述第一抗体具有第一抗原特异性，
第二抗原结合部分具有与第一抗原特异性不同的第二抗原特异性。
本文提供的双特异性多肽复合物具有错配的重链和轻链可变结构域的倾向性显著降低，具有增加的稳定性和/或表达水平。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性多肽复合物的第二抗原结合部分包含第二抗体的第二重链可变域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)。在某些实施方案中，VH2和VL2中的至少一个可操作地连接于抗体恒定区，或VH2和VL2两者分别可操作地连接于抗体重链恒定区和轻链恒定区。在某些实施方案中，第二抗原结合部分还包含与VH2可操作地连接的抗体恒定CH1结构域，以及与VL2可操作地连接的抗体轻链恒定结构域。例如，第二抗原结合部分包含Fab。
当在一个细胞中表达第一、第二、第三和第四可变域(例如，VH1、VH2、VL1和VL2)时，非常需要VH1与VL1特异性配对且VH2与VL2特异性配对，使得所得到的双特异性蛋白质产物将具有正确的抗原结合特异性。然而，在现有技术例如杂交-杂交瘤(或四杂交瘤)中，发生VH1、VH2、VL1和VL2的随机配对，因此产生高达十种不同的种类，其中仅一种是功能性的双特异性抗原结合分子。这不仅降低了产量，而且使目标产物的纯化变得复杂。
在一个说明性实例中，第一抗原结合结构域包含与VL1-C2配对的VH1-C1，第二抗原结合结构域包含与VL2-CL配对的VH2-CH1。令人惊讶地发现，C1和C2优先彼此缔合，并且不太倾向于与CL或CH1缔合，从而阻碍不想要的配对例如C1-CH、C1-CL、C2-CH和C2-CL的形成并显著减少。作为C1-C2特异性缔合的结果，VH1与VL1特异性配对，从而产生第一抗原结合位点，并且CH1与CL特异性配对，从而允许VH2-VL2的特异性配对，这提供了第二抗原结合位点。因此，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分不倾向于错配，并且例如VH1-VL2、VH2-VL1、VH1-VH2、VL1-VL2之间的错配比否则当第一和第二抗原结合部分都是天然Fab的对应物时的情况(例如以VH1-CH1，VL1-CL，VH2-CH1和VL2-CL的形式)显著降低。
在某些实施方案中，当从细胞中表达时，本文提供的双特异性多肽复合物与可比条件下表达的参考分子相比将具有显著更少的错配产物(例如，少至少1、2、3、4、5种或更多种的错配产物)和/或显著更高的产量(例如，高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％或更高的产量)，其中所述参考分子除了用天然的CH1代替C1和用天然的CL代替C2之外，与双特异性多肽复合物相同。
在某些实施方案中，第一和/或第二抗原结合部分是多价的，例如二价，三价，四价。如本文所用的术语“价”是指在给定分子中存在的抗原结合位点的指定数量。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”表示在抗原结合分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点均用于相同抗原或相同表位的特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。类似地，三价分子可以是双特异性的，例如当两个结合位点对第一抗原(或表位)是单特异性和第三结合位点对第二抗原(或表位)是特异性的时候。在某些实施方案中，在本文提供的双特异性多肽复合物中的第一和/或第二抗原结合部分可以是二价、三价或四价的，其中至少两个结合位点对相同抗原或表位具有特异性。在某些实施方案中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。在某些实施方案中，在二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价是在结构上相同的(即具有相同的序列)，或在结构上不同(即具有不同序列，尽管具有相同的特异性)。
在某些实施方案中，第一和/或第二抗原结合部分是多价的，并且包含两个或更多个可操作地连接在一起(有或没有间隔子)的抗原结合位点。
在某些实施方案中，第一和/或第二抗原结合部分包含以下一种或多种：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd、Fv和scFv片段、以及Spiess等人2015，见上和Brinkmann等人2017，见上中描述的其他片段、或其组合，其在重链和/或轻链有或无间隔子地连接在一起，并且形成至少一种抗原结合部分。
在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含第二抗体的两个或更多个Fab。两个Fab可以彼此可操作地连接，例如，第一Fab可以通过重链，有或没有间隔子地共价连接到第二Fab。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分还包含第一二聚化结构域，第二抗原结合部分还包含第二二聚化结构域。如本文所用的术语“二聚化结构域”是指能够彼此缔合以形成二聚体，或者在一些实例中实现两个肽的自发二聚化的肽结构域。
在某些实施方案中，第一二聚化结构域可以与第二二聚化结构域缔合。该缔合可以通过任何合适的相互作用或连接或键合，例如，通过连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水性-亲水性相互作用或其组合。示例性二聚化结构域包括但不限于，抗体铰链区、抗体CH2结构域、抗体CH3结构域和能够彼此二聚化和缔合的其他合适的蛋白质单体。铰链区、CH2和/或CH3结构域可以衍生自任何抗体同种型，例如IgG1、IgG2和IgG4。
在某些实施方案中，第一和/或第二二聚化结构域包含至少一部分的抗体铰链区。在某些实施方案中，第一和/或第二二聚化结构域可以进一步包含抗体CH2结构域、和/或抗体CH3结构域。在某些实施方案中，第一和/或第二二聚化结构域包含至少一部分的铰链-Fc区，即铰链-CH2-CH3结构域。在某些实施方案中，第一二聚化结构域可以与第一TCR恒定区的C末端可操作地连接。在某些实施方案中，第二二聚化结构域可以与第二抗原结合部分的抗体CH1恒定区的C末端可操作地连接。
在某些实施方案中，第一二聚化结构域在第三接合结构域处可操作地连接于第一TCR恒定区(C1)(之间有或没有间隔子)。PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述了第三接合结构域的各种设计和序列，并通过引用并入本文。
在某些实施方案中，第一二聚化结构域可与工程化TCR恒定区的C末端可操作地连接，并一起形成嵌合恒定区。换句话说，嵌合恒定区包括与工程化TCR恒定区可操作地连接的第一二聚化结构域。
在某些实施方案中，嵌合恒定区包括附接于衍生自IgG1、IgG2或IgG4的第一铰链-Fc区的工程化的Cβ。这种嵌合恒定区的示例性序列在PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述，并且通过引用并入本文。
在某些实施方案中，嵌合恒定区包括附接于衍生自IgG1、IgG2或IgG4的第一铰链的工程化的Cα。这种嵌合恒定区的示例性序列在PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述，并通过引用并入本文。
在某些实施方案中，嵌合恒定区还包含第一抗体CH2结构域和/或第一抗体CH3结构域。例如，嵌合恒定区还包含附接于第三接合结构域的C末端的第一抗体CH2-CH3结构域。这种嵌合恒定区的示例性序列在PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述，并通过引用并入本文。
嵌合恒定区和第二TCR恒定区的这些对是有用的，因为它们可以被操纵以融合于所需的抗体可变区，以便提供如本文所公开的多肽复合物。例如，抗体重链可变区可以融合到嵌合恒定区(包含C1)，从而产生本文提供的多肽复合物的第一多肽链；并且类似地，抗体轻链可变区可以融合到第二TCR恒定结构域(包含C2)，从而产生本文提供的多肽复合物的第二多肽链。
嵌合恒定区和第二TCR恒定结构域的这些对可用作平台，从而产生本文提供的双特异性多肽复合物的第一抗原结合部分。例如，第一抗体的可变区可以融合于平台序列的N末端(例如，分别将VH融合于嵌合恒定结构域和将VL融合于TCR恒定结构域)。为了产生双特异性多肽复合物，第二抗原结合部分可以设计和生产为缔合到本文提供的双特异性多肽复合物中。
在某些实施方案中，第二二聚化结构域包括铰链区。铰链区可以衍生自抗体，例如IgG1，IgG2或IgG4。在某些实施方案中，第二二聚化结构域可以任选地进一步包含抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域，例如铰链-Fc区。铰链区可以附接于第二抗原结合位点(例如，Fab)的抗体重链。
在双特异性多肽复合物中，第一和第二二聚化结构域能够缔合成二聚体。在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域不同，并且以阻止同二聚化和/或有利于异二聚化的方式缔合。例如，可以选择第一和第二二聚化结构域，使得它们不相同并且它们优先在彼此之间形成异二聚体，而不是在自身之间形成同二聚体。在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域能够通过形成把手-入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水性相互作用或增加的柔性而缔合成异二聚体。
在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域包括分别突变的CH2和/或CH3结构域，以能够形成把手入孔。可以通过在第一CH2/CH3多肽中将较小的氨基酸残基替换为较大的氨基酸残基来获得把手，和可以通过将较大残基替换成较小残基来获得孔。有关把手入孔的突变位点的详细信息，请参阅Ridgway等人1996，见上文，Spiess等人2015，见上文和Brinkmann等人2017年，见上文。
在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域包括含有S139C和T151W取代(把手)的IgG1同种型的第一CH3结构域，以及含有Y134C、T151S、L153A和Y192V取代(孔)的IgG1同种型的第二CH3结构域。在另一个实施方案中，第一和第二二聚化结构域包括含有S136C和T148W取代(把手)的IgG4同种型的第一CH3结构域，以及含有Y131C、T148S、L150A和Y189V取代(孔)的IgG4同种型的第二CH3结构域。在PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述了第一和第二二聚化结构域的另外的说明性实例，并通过引用并入本文。
在某些实施方案中，第一和第二二聚化结构域还包括第一铰链区和第二铰链区。例如，可以将带电荷的取代对引入IgG1和IgG2的铰链区以促进异二聚化。有关详细信息，请参阅Brinkmann等人2017，见上文。
双特异性形式
本文提供的双特异性多肽复合物可以是本领域已知的任何合适的双特异性的形式。在某些实施方案中，双特异性多肽复合物基于参考双特异性抗体形式。如本文中关于双特异性形式所用的术语“基于”意味着本文提供的双特异性多肽复合物具有与参考双特异性抗体的双特异性形式相同的形式，不同之处在于修饰了一种抗原结合部分以包含VH可操作连接于C1和VL可操作地连接于C2，其中C1和C2如本文所公开的缔合。本领域已知的参考双特异性抗体形式的实例包括但不限于：(i)具有对称Fc的双特异性抗体，(ii)具有不对称Fc的双特异性抗体；(iii)附加有另外的抗原结合部分的常规抗体，(iv)双特异性抗体片段，(v)附加有另外的抗原结合部分的常规抗体片段，(vi)附加有人白蛋白或人白蛋白结合肽的双特异性抗体。
双特异性IgG对于每种抗原是单价的，并且可以通过在单个宿主细胞中共表达两条轻链和两条重链来制备。将附接的IgG工程化以形成双特异性IgG，其通过将轻链或重链的氨基或羧基末端与另外的抗原结合单元附接来进行。另外的抗原结合单元可以是单结构域抗体(未配对的VL或VH)，例如DVD-IG，配对的抗体可变结构域(例如Fv或scFv)或工程化的蛋白质支架。可以修饰双特异性IgG中的任何抗原结合单元，特别是配对的VH-CH1/VL-CL，以如本文所公开的将CH1替换成C1和将CL替换成C2，从而产生本文所述的双特异性多肽复合物。
双特异性抗体片段是衍生自抗体但缺乏一些或全部的抗体恒定结构域的抗原结合片段。这种双特异性抗体片段的实例包括，例如单结构结构域抗体，Fv，Fab和双抗体等。为了产生如本文提供的双特异性多肽复合物，双特异性抗体片段中的抗原结合位点(例如，特定配对的VH-CH1/VL-CL)可以被修饰以包括如本文所公开的多肽复合物(例如VH-C1/C1-C2)。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性多肽复合物基于“全”抗体的形式，例如全IgG或IgG样分子，以及小的重组形式，例如串联单链可变片段分子(taFv)、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)和这些的多种其他衍生物(参见Byrne H.等人(2013)Trends Biotech,31(11):621-632所述的双特异性抗体形式)。基于形式的双特异性抗体的实例包括但不限于四杂交瘤、化学偶联Fab(抗原结合性片段)和BiTE(双特异性T细胞衔接物)。
在某些实施方案中，如本文所提供的双特异性多肽复合物是基于选自以下的双特异性形式：Triomab；杂交杂交瘤(四杂交瘤)；多特异性anticalin平台(Pieris)；双抗体；单链双抗体；串联单链Fv片段；TandAb，三特异性抗体(Affimed)；Dart(双亲和性再靶向；Macrogenics)；双特异性Xmab(Xencor)；双特异性T细胞衔接体(Bite；Amgen；55kDa)；三抗体；三抗体(Fab-scFv)融合蛋白(CreativeBiolabs)多功能重组抗体衍生物；Duobody平台(Genmab)；Dock和lock平台；把手入孔(KIH)平台；人源化双特异性IgG抗体(REGN1979)(Regeneron)；Mab2双特异性抗体(F-Star)；DVD-Ig(双重可变结构域免疫球蛋白)(Abbvie)；kappa-lambda抗体；TBTI(四价双特异性串联Ig)；和CrossMab。
在某些实施方案中，如本文所提供的双特异性多肽复合物基于选自双特异IgG样抗体(BsIgG)的双特异性形式，包含：CrossMab；DAF(二合一)；DAF(四合一)；DutaMab；DT-IgG；把手入孔普通LC；把手入孔组装；带电荷对；Fab臂交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；kappa-lamda体；和正交Fab。有关双特异性抗体形式的详细描述，请参见Spiess C.，Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性多肽复合物基于选自具有附加的抗原结合部分的IgG附加抗体的双特异性形式，其包含：DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFv-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；和DVI-IgG(四合一)(见上文)。
在某些实施方案中，如本文提供的双特异性多肽复合物基于选自双特异性抗体片段的形式，包含：Nanobody；Nanobody-HAS；BiTE；Diabody；DART；TandAb；scDiabody；sc-Diabody-CH3；Diabody-CH3；Triple Body；Miniantibody；Minibody；TriBi minibody；scFv-CH3 KIH；Fab-scFv；scFv-CH-CL-scFv；F(ab')2；F(ab')2-scFv2；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；四价HCAb；scDiabody-Fc；双抗体-Fc；串联scFv-Fc；和Intrabody(见上文)。
在某些实施方案中，如本文提供的双特异性多肽复合物基于双特异性的形式，例如Dock和Lock；ImmTAC；HSAbody；scDiabody-HAS；和串联scFv-毒素(见上文)。
在某些实施方案中，如本文提供的双特异性多肽复合物基于选自双特异性抗体缀合物的形式，包含：IgG-IgG；COV-X-Body；和scFv1-PEG-scFv2(见上文)。
在某些实施方案中，第一抗原结合部分和第二结合部分可以缔合成Ig样结构。Ig样结构类似于具有Y形构建体的天然抗体，具有两个用于抗原结合的臂和一个用于结合和稳定化的茎。对天然抗体的相似性可以提供各种优点，例如良好的体内药代动力学，所需的免疫应答和稳定性等。已经发现，包括本文提供的第一抗原结合部分与本文提供的第二抗原结合缔合的Ig样结构具有热稳定性，其与Ig(例如IgG)的热稳定性相当。在某些实施方案中，本文提供的Ig样结构至少为天然IgG的70％，80％，90％，95％或100％。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四条多肽链：i)VH1-C1-铰链-CH2-CH3；ii)VL1-C2；iii)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，和iv)VL2-CL，其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个可以促进二聚化的链间键。参见，例如图14(E17R)。在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含三种多肽链的对：i)VH1-CH1-VH2-C1-铰链-CH2-CH3；ii)VL2-C2；和iii)VL1-CL，其中C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形成一个或多个可以促进二聚化的链间键。参见，例如图14(G25R)。
PCT/CN2018/106766(WO 2019/057122，例如其中的图1和22)示出了许多双特异性抗体形式，其通过引用并入本文。可以将本文公开的工程化的Cα和Cβ应用于如PCT/CN2018/106766(WO2019/057122)中描述的任何双特异性抗体形式。
双特异性复合物的抗原特异性
本文提供的双特异性复合物具有两种抗原特异性。第一和第二抗原结合部分分别针对第一和第二抗原特异性。
第一和第二抗原特异性可以是相同的，换句话说，第一和第二抗原结合部分结合相同的抗原分子或相同抗原分子的同一表位。
或者，第一和第二抗原特异性可能是不同的。例如，第一和第二抗原结合部分可以结合不同的抗原。这种双特异性多肽复合物可用于，例如使两种不同的抗原紧密接近，从而促进它们的相互作用(例如，使免疫细胞与肿瘤抗原或病原体抗原紧密接近，因此促进免疫系统识别或消除这种抗原)。再例如，第一和第二抗原结合部分可以结合一种抗原的不同(和任选的非重叠)表位。这可能有助于提高对靶抗原的识别或结合，特别是易受突变的抗原(例如病毒抗原)的识别或结合。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性复合物的抗原特异性之一针对T细胞特异性受体分子和/或天然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合部分中的一种能够与CD3，TCR，CD28，CD16，NKG2D，Ox40，4-1BB，CD2，CD5或CD95特异性结合，另一种能够特异性结合肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，本文提供的双特异性复合物的抗原特异性之一针对T细胞特异性受体分子和/或天然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子，并且另一种抗原特异性针对肿瘤相关表面抗原。在某些实施方案中，双特异性络合物的第一抗原结合部分能够与T细胞特异性受体分子和/或天然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子(例如CD3)特异性结合，以及第二抗原结合部分能够与肿瘤相关抗原(如CD19)特异性结合，或反之亦然。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四条多肽链，包含：i)VH1可操作地连接于第一嵌合恒定区；ii)VL1可操作地连接于第二嵌合恒定区；iii)VH2可操作地连接于常规抗体重链恒定区，和iv)VL2可操作地连接于常规抗体轻链恒定区。在某些实施方案中，第一嵌合恒定区可包含C1-铰链-CH2-CH3，每个如上文定义。在某些实施方案中，第二嵌合恒定区可包含C2，如上文定义。在某些实施方案中，常规抗体重链恒定区可包含CH1-铰链-CH2-CH3，每个如上文定义。在某些实施方案中，常规抗体轻链恒定区可包含CL，如上文定义。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含选自下组的三序列组合：SEQ IDNO：66、67和68(表22)，其中第一抗原结合部分与PD-L1结合，第二抗原结合部分结合4-1BB。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含选自下组的四序列组合：SEQ IDNO：69、70、71和72(表23)，其中第一抗原结合部分与HER2 D2结合，第二抗原结合部分与HER2 D4结合。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含选自下组的三序列组合：SEQ IDNO：73、74和75(表24)，其中第一抗原结合部分与IL-17结合，第二抗原结合部分结合IL-20。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含选自下组的三序列组合：SEQ IDNO：76、77和78(表25)，其中第一抗原结合部分与IL-4结合，第二抗原结合部分结合IL-13。
制备方法
本公开提供了编码本文提供的多肽复合物以及双特异性多肽复合物的分离的核酸或多核苷酸。
如本文所用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物、具有与参考核酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢的多核苷酸。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，可以通过生成以下序列来实现简并密码子取代，该序列中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人，Nucleic AcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
编码本文提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物的核酸或多核苷酸可以使用重组技术构建。为此，可以分离编码亲本抗体的抗原结合部分(例如CDR或可变区)的DNA并使用常规程序测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。同样，还可以获得编码TCR恒定区的DNA。作为示例，获得编码可变域(VH)的多核苷酸序列和编码第一TCR恒定区(C1)的多核苷酸序列，并可操作地连接以允许在宿主细胞中转录和表达以产生第一多肽。类似地，将编码V1的多核苷酸序列与编码C1的多核苷酸序列可操作地连接，以允许在宿主细胞中表达第二多肽。如果需要，将一个或多个间隔子的编码多核苷酸序列也与其他编码序列可操作地连接以允许所需产物的表达。
编码多核苷酸序列可以进一步与一个或多个调节序列可操作地连接，任选地在表达载体中，使得第一和第二多肽的表达或产生是可行的并且在适当的控制下。
编码多核苷酸序列可以插入载体中以使用本领域已知的重组技术进一步克隆(扩增DNA)或表达。在另一个实施方案中，可以通过本领域已知的同源重组来制备本文提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物。有许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标记基因，增强子元件，启动子(例如，SV40，CMV，EF-1α)和转录终止序列。
如本文所用的术语“载体”是指其中编码蛋白质的多核苷酸可以可操作地插入，以便引起该蛋白质的表达的媒介物。通常，该构建体还包括适当的调节序列。例如，多核苷酸分子可以包括位于编码引导RNA的核苷酸序列和/或编码定点修饰多肽的核苷酸序列的5'侧翼区的调节序列，其可操作地连接于编码序列，该连接方式能够在宿主细胞中表达所需的转录物/基因。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以便引起其携带的遗传元件在宿主细胞内的表达。载体的实例包括质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)，或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可含有各种用于控制表达的元件，包括启动子序列，转录起始序列，增强子序列，可选择的元件和报告基因。此外，载体可能包含复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的物质，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。
在一些实施方案中，载体系统包括哺乳动物，细菌，酵母体系等，并包括质粒，例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等以及其他实验室和市售的载体。合适的载体可包括质粒或病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
包含本文提供的多核苷酸序列的载体可以引入宿主细胞以进行克隆或基因表达。如本文所用的短语“宿主细胞”是指已经引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
用于克隆或表达载体中DNA的合适的宿主细胞是上文所述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，例如埃希氏菌属如大肠杆菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia Marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌属如铜绿假单胞菌，和链霉菌属。
除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母对于编码多肽复合物和双特异性多肽复合物的载体来说是合适的克隆或表达宿主，酿酒酵母或常见面包酵母，是在低等真核生物宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、物种和菌株通常可用且可用于本文，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)；克鲁维酵母宿主，例如乳酸克鲁维酵母，脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)，K.bulgaricus(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)，K.thermotolerans和K.marxianus；耶氏酵母(EP 402,226)、毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌如例如，脉孢菌属，青霉菌属，弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属宿主例如构巢曲霉和黑曲霉。
适用于糖基化的本文提供的多肽复合物、双特异性多肽复合物的表达的合适宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及相应的容许的昆虫宿主细胞，来自宿主例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，果蝇和家蚕(Bombyx Mori)。用于转染的各种病毒株是公开可获的，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且这类病毒可根据本公开作为病毒使用，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。植物细胞棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，对脊椎动物细胞兴趣最大，并且脊椎动物在培养中的增殖(组织培养)已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆以悬浮培养生长的293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))，如Expi293；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞可以在常规营养培养基(适合时可修改)中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增克隆载体。
为了产生本文提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物，用表达载体转化的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如Ham的F10(Sigma)，最小基本培养基(MEM)(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco修改Eagle培养基(DMEM)(Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，Ham等人Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980),Pat.No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或专利Re.30,98557,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO87/00195；或专利Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等同的能量源。可以以合适的浓度纳入任何其他必要的补充剂，这将是本领域技术人员已知的。培养条件，例如温度、pH等，是选择用于表达的宿主细胞先前使用的条件，并且对于普通的熟练技术人员将是明显的。
在一个方面，本公开提供了一种表达本文提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物的方法，包括在表达多肽复合物或双特异性多肽复合物的条件下培养本文提供的宿主细胞。
在某些实施方案中，本公开提供了一种产生本文提供的多肽复合物的方法，包括a)向宿主细胞引入：编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包括第一抗体的第一重链可变域(VH)与第一TCR恒定区(C1)可操作地连接，所述第二多肽从N末端到C末端包括第一抗体的第一轻链可变域(VL)与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接，其中：C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且该非天然链间键能够稳定C1和C2的二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性；b)允许宿主细胞表达所述多肽复合物。
在某些实施方案中，本公开提供了一种产生本文提供的双特异性多肽复合物的方法，包括a)向宿主细胞引入：编码第一多肽的第一多核苷酸、编码第二多肽的第二多核苷酸以及编码第二抗原结合部分的一种或多种(例如一种或两种)另外的多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包括第一抗体的第一重链可变域(VH)与第一TCR恒定区(C1)可操作地连接，所述第二多肽从N末端到C末端包括第一抗体的第一轻链可变域(VL)与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接，其中：C1和C2能够形成包含至少一个非天然链间键的二聚体，所述非天然链间键位于C1中包含的第一突变残基和C2中包含的第二突变残基之间，并且所述非天然链间键能够稳定C1和C2的二聚体，所述第一抗原结合部分和第二抗原结合部分具有比当第一抗原结合部分是天然Fab对应物时降低的错配，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性且所述第二抗体具有第二抗原特异性；b)允许宿主细胞表达所述双特异性多肽复合物。
在某些实施方案中，该方法还包括分离多肽复合物。
当使用重组技术时，本文提供的多肽复合物、双特异性多肽复合物可以在细胞内、在周质空间中产生或直接分泌到培养基中。如果产物在细胞内产生，第一步是移出颗粒状碎片(是宿主细胞或裂解的片段)，例如通过离心或超滤。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的过程。简而言之，细胞浆料在约30分钟内在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻。可以通过离心移出细胞碎片。如果产物分泌到培养基中，则通常首先浓缩来自这种表达系统的上清液，其使用市售的蛋白质浓度过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。蛋白酶抑制剂如PMSF可以包含在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止不定污染物的生长。
可以使用例如羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析，DEAE-纤维素离子交换层析，硫酸铵沉淀，盐析和亲和层析来纯化从细胞制备的本文提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物，其中亲和层析是优选的纯化技术。
在本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物包含免疫球蛋白Fc结构域的情况下，蛋白A可以用作亲和配体，这取决于存在于多肽复合物中的Fc结构域的种类和同种型。蛋白质A可基于人γ1、γ2或γ4重链用于纯化多肽复合物(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3推荐使用蛋白G(Guss等人，Embo J.5：1567 1575(1986))。附着亲和配体的基质最常是琼脂糖，但其他基质也可用。机械稳定的基质如受控的孔隙玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允许比使用琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。
如果本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物包含CH3结构域，则BakerbondABX树脂(J.T.Baker)可用于纯化。根据要回收的抗体，也可使用其他用于蛋白质纯化的技术，例如离子交换柱上的分馏，乙醇沉淀，反相HPLC，二氧化硅层析，在肝素SEPHAROSETM上的层析，在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析，色谱聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，包含目的多肽复合物和污染物的混合物可以进行低pH疏水相互作用层析，其使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M的盐)下进行。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性多肽复合物可以使用常规方法容易地以高产率纯化。双特异性多肽复合物的一个优点是重链和轻链可变结构域序列之间的错配显著降低。这减少了不需要的副产物的产生，并使得可以使用相对简单的纯化过程以高产率获得高纯度产物。
衍生物
在某些实施方案中，所述多肽复合物或双特异性多肽复合物可以用作与所需缀合物缀合的基础。
涵盖多种缀合物可以与本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物连接(参见例如“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(eds.),Carger Press,New York,(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、络合、缔合、共混或加入等与多肽复合物或双特异性多肽复合物连接。
在某些实施方案中，本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物可以工程化改造成含有表位结合部分之外的特异性位点以用于结合一种或多种缀合物。例如，这种位点可包括一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以促进与缀合物的共价连接。
在某些实施方案中，所述多肽复合物或双特异性多肽复合物可以直接地或间接地(例如通过另一个缀合物或通过接头)连接到缀合物。
例如，具有反应性残基如半胱氨酸的多肽复合物或双特异性多肽络合物可以与硫醇反应性试剂连接，其中反应基团是例如马来酰亚胺，碘乙酰胺、二硫化吡啶或其他硫醇反应性缀合伙伴(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,BioconjugateChem.3:2；Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,AcademicPress,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G.in BioconjugateTechniques(1996)Academic Press,San Diego,pp.40-55,643-671)。
再比如，所述多肽复合物或双特异性多肽复合物可以与生物素缀合，然后间接缀合到与抗生物素蛋白缀合的第二缀合物。再比如，所述多肽复合物或双特异性多肽复合物可以连接于接头，该接头进一步连接于缀合物。接头的实例包括双官能偶联剂，例如N-琥珀酰亚胺酰-3-(2-吡啶二硫基)丙酸盐(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基噻吩(IT)，亚氨酸酯的双官能衍生物(如二甲基己二亚酰胺HCl盐)，活性酯(如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛(如戊二醛)，双叠氮化合物(如双(p-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(如双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)，以及his活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸盐(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫代)戊酸(SPP)以提供二硫键。
缀合物可以是可检测标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测标记的实例可包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)，酶-底物标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)，放射性同位素(例如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素)，发光标记，发色团部分，洋地黄毒苷，生物素/亲和素，DNA分子或用于检测的金。在某些实施方案中，缀合物可以是药代动力学修饰部分，例如PEG，有助于增加抗体的半衰期。其他合适的聚合物包括例如羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，乙二醇/丙二醇的共聚物等。在某些实施方案中，缀合物可以是纯化部分，例如磁珠。“细胞毒性部分”可以是对细胞有害或可能损害或杀灭细胞的任何药剂。细胞毒性部分的实例包括但不限于紫杉醇，松胞菌素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替诺泊苷，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基蒽醌二酮，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素及其类似物，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，烷基化剂(例如氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
用于将缀合物与蛋白质例如抗体、免疫球蛋白或其片段缀合的方法可见于，例如美国专利号5,208,020；美国专利号6,441,163；WO2005037992；WO2005081711；和WO2006/034488，其通过引用整体并入本文。
药物组合物
本公开还提供了包含本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
术语“药学上可接受”表示指定的载体、媒介物、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成制剂的其他成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
“药学上可接受的载体”是指除活性成分之外的药物制剂中的成分，其对于受试者是生物活性可接受和无毒的。用于本文公开的药物组合物的药学上可接受的载体可包括，例如，药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮液/分散剂、隔绝剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的其他组分或其各种组合。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂，例如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，硫代甘油，巯基乙酸，硫代山梨糖醇，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在本文所提供的药物组合物中包含一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸减少了多肽复合物或双特异性多肽复合物的氧化。这种氧化的减少防止或减少了结合亲和力的损失，从而改善了抗体稳定性并最大化了保质期。因此，在某些实施方案中，提供了包含本文公开的多肽复合物或双特异性多肽复合物和一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸的组合物。
为了进一步示例说明，药学上可接受的载体可以包括例如水性媒介物，例如氯化钠注射剂，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物例如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以加入到多剂量容器中的药物组合物中，包括酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
药物组合物可以是液体溶液，悬浮剂，乳剂，丸剂，胶囊剂，片剂，缓释制剂或粉剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。
在某些实施方案中，将药物组合物配制成可注射的组合物。可以以任何常规形式制备可注射药物组合物，例如液体溶液，悬浮剂，乳剂或适于产生液体溶液、悬浮剂或乳剂的固体形式。用于注射的制备物可以包括准备用于注射的无菌和/或非热原性溶液，无菌干燥可溶产品如冻干粉(准备在使用前与溶剂组合)，包括皮下注射片剂，准备用于注射的无菌悬浮液，准备刚好在使用前与媒介物组合的无菌干燥的不溶性产品，以及无菌和/或非热原性乳液。溶液可以是水性或非水性的。
在某些实施方案中，单位剂量的肠胃外制备物包装在安瓿、小瓶或带针的注射器中。如本领域已知和实践的，用于肠胃外施用的所有制备物应是无菌的且不是热原性的。
在某些实施方案中，通过将如本文公开的多肽复合物或双特异性多肽复合物溶解在合适的溶剂中来制备无菌的冻干粉末。溶剂可以包含改善稳定性的赋形剂或粉末或从粉末制备的重构溶液的其他药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水，右旋糖，山梨醇，果糖，玉米糖浆，木糖醇，甘油，葡萄糖，蔗糖或其他合适的试剂。溶剂可以包含缓冲剂，例如柠檬酸盐，磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂，在一个实施方案中，其为约中性pH。溶液随后无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供期望的制剂。在一个实施方案中，将所得溶液分配到小瓶中用于冻干。每个小瓶可以包含单剂量或多剂量的本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物或其组合物。可以接受超出一个剂量或一组剂量所需(例如约10％)的少量过量灌装小瓶，以利于准确样品抽取和准确给药。冻干的粉末可以在适当的条件下，例如在约4℃至室温储存。
冻干粉末用注射用水的重构提供了用于肠胃外施用的制剂。在一个实施方案中，为了重构，将无菌的和/或非热原性水或其他液体合适的载体加入到冻干的粉末中。精确的量取决于所选择的疗法，并可以凭经验确定。
治疗方法
还提供了治疗方法，包括：向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物，从而治疗或预防病况或病症。在某些实施方案中，受试者已经鉴定为患有可能应答本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物的病症或病况。
如本文所用，“治疗”或“处理”病况包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速度，降低病况发展的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减轻或停止与病况相关的症状，生成病况的完全或部分消退，治愈病况或其一些的组合。
本文提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物的治疗有效量将取决于本领域已知的多种因素，例如体重，年龄，既往病史，当前用药，受试者的健康状况以及潜在的交叉反应，过敏，敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。如这些和其他情况或要求所示，本领域普通技术人员(例如医师或兽医)可以按比例减少或增加剂量。
在某些实施方案中，以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，约0.01mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，约2mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约15mg/kg，约20mg/kg，约25mg/kg，约30mg/kg，约35mg/kg，约40mg/kg，约45mg/kg，约50mg/kg，约55mg/kg，约60mg/kg，约65mg/kg，约70mg/kg，约75mg/kg，约80mg/kg，约85mg/kg，约90mg/kg，约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物。在这些实施方案的某些中，以约50mg/kg或更少的剂量施用本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物，并且在这些实施方案的某些中，剂量是10mg/kg或更少，5mg/kg或更少，1mg/kg或更少，0.5mg/kg或更少，或0.1mg/kg或更少。在某些实施方案中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在治疗过程中变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单剂量，或者可以随时间施用数个分开的剂量。
本文提供的多肽复合物或本文提供的双特异性多肽复合物可以通过本领域已知的任何途径施用，例如肠胃外(例如皮下，腹膜内，静脉内，包括静脉内输注，肌内，或皮内注射)或非肠胃外(例如口服，鼻内，眼内，舌下，直肠或局部)途径。
在某些实施方案中，由本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物治疗的病况或病症是癌症或癌性病况、自身免疫性疾病、感染性和寄生性疾病、心血管疾病、神经病、神经精神病况、损伤、炎症或凝血病症。
关于癌症，“治疗”或“处理”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移，预防或延迟肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移的发展，或其一些组合。关于肿瘤，“治疗”或“处理”包括消除全部或部分肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延迟肿瘤的发展，或其一些组合。
例如，关于本文公开的多肽复合物或双特异性多肽复合物用于治疗癌症的治疗有效量是能够实现以下的多肽复合物的剂量或浓度：消除全部或部分肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长，抑制介导癌性病况的细胞的生长或增殖，抑制肿瘤细胞转移，改善与肿瘤或癌性病况相关的任何症状或标记，预防或延迟肿瘤或癌性病况的发展，或其一些组合。
在某些实施方案中，所述病况和病症包括肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肾细胞癌，结肠直肠癌，卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，膀胱癌，食道癌，间皮瘤，黑色素瘤，头颈癌，甲状腺癌，肉瘤，前列腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，胸腺癌，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，真菌样霉菌病，默克尔细胞癌，和其他血液系统恶性肿瘤，例如经典霍奇金淋巴瘤(CHL)，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤，EBV阳性和阴性PTLD，以及与EBV相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，浆母细胞性淋巴瘤，结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻咽癌和HHV8相关原发渗出性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)的肿瘤，例如原发性CNS淋巴瘤，脊髓轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。
在某些实施方案中，所述病况和病症包括CD19相关疾病或病况，例如B细胞淋巴瘤，任选的霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，卵泡淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)，小淋巴细胞淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)，或套细胞淋巴瘤(MCL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，或Waldenstrom巨球蛋白血症(WM)。
在某些实施方案中，所述病况和病症包括可通过调节CTLA-4和/或PD-1的免疫应答治疗的过度增殖性病况或感染性疾病。过度增殖性病况的实例包括但不限于实体肿瘤，血液癌，软组织肿瘤和转移性病变。
所述多肽复合物或双特异性多肽复合物可以单独给药，也可以与一种或多种另外的治疗手段或药剂组合施用。
在某些实施方案中，当用于治疗癌症或肿瘤或增殖性疾病时，本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物可以与治疗癌症的化疗、放射疗法、手术(例如，肿瘤切除术)、一种或多种抗镇吐药或针对由化疗所致的并发症的其他治疗、或用于治疗癌症或相关的任何医学病症的任何其他治疗剂组合施用。如本文所用，“组合施用”包括作为同一药物组合物的一部分同时施用，作为分开的组合物同时施用，或作为分开的组合物在不同的时间施用。在另一药剂之前或之后施用的组合物被认为是与该药剂“组合”施用，如该词语“组合”在本文使用的，即使组合物和第二药剂通过不同的途径施用。在可能的情况下，根据另外的治疗剂产品信息表中列出的时间表或根据医师桌面手册(Physicians'Desk Reference,第70版(2016))或本领域众所周知的方案施用与本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物组合施用的另外的治疗剂。
在某些实施方案中，治疗剂可以诱导或加强对癌症的免疫应答。例如，肿瘤疫苗可用于诱导对某些肿瘤或癌症的免疫应答。细胞因子治疗也可用于增强对免疫系统的肿瘤抗原呈递。细胞因子治疗的实例包括但不限于干扰素，例如干扰素α，干扰素β，干扰素γ，集落刺激因子，如巨噬细胞-CSF，粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞-CSF，白细胞介素如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11和IL-12，肿瘤坏死因子例如TNF-α和TNF-β。也可以使用灭活免疫抑制靶标的药剂，例如TGF-β抑制剂，IL-10抑制剂和Fas配体抑制剂。另一组药剂包括激活对肿瘤或癌细胞的免疫应答性的那些药剂，例如，增强T细胞活化(例如T细胞共刺激分子如CTLA-4、ICOS和OX-40的激动剂)以及增强树突细胞功能和抗原呈递的那些药剂。
试剂盒
本公开还提供了包含本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可用于检测生物样品中的一种或多种感兴趣的靶标的存在或水平，或捕获或富集该靶标。生物样品可包含细胞或组织。
在一些实施方案中，试剂盒包括与可检测标记缀合的本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物。在某些其他实施方案中，试剂盒包含未标记的本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物，并且还包含第二标记抗体，其能够与本文提供的未标记的多肽复合物或双特异性多肽复合物结合。该试剂盒还可以包括使用说明书，以及将试剂盒中的各种组件分开的包装。
在某些实施方案中，本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物与基材或装置缔合。可用的基材或装置可以是例如磁珠，微量滴定板或测试条。这种试剂盒可用于结合测定(例如ELISA)，免疫测定，捕获或富集生物样品中的靶分子。
提供以下实施例以更好地说明本公开，并且不应被解释为限制本发明的范围。整个或部分地，下面描述的所有特定组合物、材料和方法均落入本公开的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不旨在限制本发明，但仅仅是为了说明落入本发明的范围内的具体实施方案。本领域技术人员可以在没有利用发明能力和不脱离本发明的范围的情况下，可以开发等同组合物、材料和方法。应当理解，在本文描述的过程中可以进行许多变化，同时仍然在本公开的范围内。发明人的意图是这种变化包括在本公开的范围内。
实施例
1.方法
1.1.在表1和10中列举的双特异性抗体的生成
通过PCR从现有的内部DNA模板中分别扩增编码VL、VH、Ck和CH1的多核苷酸。由Genewiz Inc.合成编码Cα和Cβ区的多核苷酸。将编码抗体的天然或嵌合轻链序列的多核苷酸插入含有CMV启动子和κ或λ信号肽的线性化载体中。
将抗靶标1的VH-CH1和抗靶标2的VH-Cβ的DNA片段插入含有人IgG1或人IgG4(S228P)恒定区CH2-CH3的线性化载体中，根据形式例如E17R和G25R，带有(G4S)n接头。例如，(G4S)n接头可以位于两个结合部分之间(例如，在第一结合部分的CH1和第二结合部分的VH2之间)或Fc和结合部分之间。在某些实施方案中，E17R没有(G4S)n接头。在某些实施方案中，G25R在两个结合部分之间具有(G4S)n接头。
载体含有CMV启动子和人抗体重链信号肽。
1.2.表达和纯化
根据制造商的说明，使用Expi293表达系统试剂盒(ThermoFisher-A14635)将重链和轻链表达质粒共转染到Expi293细胞中。转染后五天，收集上清液，使用蛋白A柱(GeHealthcare-17543 802)纯化蛋白质。通过Nano Drop测量抗体浓度。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC评估蛋白质的纯度。
1.3.差示扫描荧光测定法(DSF)
使用QuantStudioTM 7Flex Real-time PCR系统(Applied Biosystems)研究了抗体的熔解温度(Tm)。
将19μL抗体溶液与1μL 62.5x SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合，然后转移到96孔板(Biosystems)中。将板以0.9℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集得到的荧光数据。计算相对于不同温度的荧光变化的负导数，并将最大值定义为熔融温度Tm。数据收集和Tonset/Tm计算由操作软件(QuantStudio Real Time PCR软件v1.3)自动进行。。
1.4.差示扫描量热法(DSC)
DSC分析由Malvern DSC系统进行。在分析之前，首先用制剂缓冲液将蛋白质样品稀释至1mg/mL。将400μL相应的制剂缓冲液加入到96孔板中作为参考，并加入400μL蛋白质样品。在DSC系统中以90℃/h的加热速率将样品从10℃加热至95℃。通过供应商软件(MicroCal PEAQ DSC软件1.30和Malvern)分析DSC结果(Tm Onset和Tm值)。
1.5通过动态光散射(DLS)的Tagg-开始(Tagg-onset)测量
使用Dynapro Plate Reader III(Wyatt Dynaprotm)研究了Tagg-开始测量。对每种蛋白质样品收集3次采集，同时每次采集时间为5秒。1536板(Aurora microplate)的每个孔含有7.5μl抗体溶液和5μl硅油。将板以0.125℃/min的速率从40℃加热至80℃。对于每次测量，确定扩散系数并针对温度进行绘图。通过操作软件(DYNAMICS 7.8.1.3)自动计算Tagg-开始值。
1.6 40℃加速热稳定性试验
使用Eppendorf恒温混合器在40℃孵育抗体，并在0天，1天，3天，7天，14天，27天和34天后通过Nanodrop 2000测量280nm的蛋白质溶液的吸收值，记录外观并通过SEC-HPLC检测纯度。
1.7O-聚糖质谱
将20μg蛋白质样品(基于蛋白质浓度计算样品体积)加入1.5ml管中。使蛋白质样品达到20μL，其中具有4μL 5X Rapid PNGase F缓冲液，1μL 1mol/L DTT和纯化的水。将所得蛋白质样品充分混合并在75℃温育5～7分钟。然后将样品冷却至室温并加入1μl RapidPNGase F，充分混合，并在50℃温育10～15分钟。温育后，向样品加入30μL纯净的水并充分混合，得到脱糖基化的样品。然后将脱糖基化的样品用玻璃衬管小瓶转移到HPLC小瓶中进行分析。
1.8与表达靶标的细胞的结合
将表达人PD-L1的细胞W315-CHOK1.hPro1.C11(1×105个细胞/孔)和表达4-1BB的细胞WBP342-CHO-K1.hPro1.C1在4℃与各种浓度的测试抗体一起孵育1小时。洗涤后，加入二抗R-PE山羊抗人IgG(Jackson-109-115-098)并在4℃与细胞一起温育1小时。然后将细胞洗涤并重悬于具有1％BSA的DPBS中。通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo分析。
1.9报告基因测定
收获效应细胞WBP342-CHO-K1.hPro1.NFκB.C1D8和表达PD-L1的细胞W315-CHOK1.hPro1.C11，洗涤并重悬在F-12K完全培养基中。将在完全培养基中的各种浓度的测试抗体加入到表达PD-L1的CHO-K1细胞中。然后将RGA效应细胞WBP342-CHO-K1.hPro1.NFκB.C1D8细胞(稳定地表达全长的人4-1BB以及稳定地整合NFκB荧光素酶报告基因)添加到每个孔。人IgG1同种型抗体被用作阴性对照。将板在37℃，5％CO2温育4-6小时。孵育后，加入重构的Nano-Glo荧光素酶底物(Promega)，通过微孔板读数器测量荧光素酶强度。
1.10啮齿动物药代动力学(PK)
在本研究中使用了一组5只动物。分别将10mg/kg的抗体一次性在10分钟静脉内输注内施用给动物。在研究日-1收集基线样品(预剂量)。在大鼠中完成给药后的0.5h，2h，6h，24h，48h，72h，120h，168h，240h，288h，336h和504h收集PK样品。
在预剂量(Day-1)和在给药后168h和240h收集抗药物抗体(ADA)样品。通过ELISA测定血清样品中抗体和ADA的血清浓度。
2.结果
2.1.1T8311 WuXiBodyTM分子的工程化设计(2+2，对称)
在该示例性实施方案中，将对称2+2WuXiBodyTM分子(称为T8311-U14T2.G25R-？.uIgG1系列)的Cα区和Cα-Cβ接口区工程化改造。使用Rosetta设计引入了某些突变。(Froning等人，NATURE COMMUNICATIONS,(2020)11:2330,https://doi.org/10.1038/ s41467-020-16231-7)。T8311-U14T2.G25R-？.uIgG1分子的Cα序列(TCR alpha序列)和Cβ序列(TCR beta序列)列于表1。可以缩短“T8311-U14T2.G25R-？.uIgG1”系列分子的名称。例如，T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1可以称为T8311-57或设计57。
表22中列出了T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1(表1中也称为T8311-1)的全长氨基酸序列。表1中列出的每种其他抗体(例如，T8311-8，T8311-26，T8311-29等)包含除了Cα和Cβ序列如表1所示外，其他序列与T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1相同的氨基酸序列。例如，T8311-1在Cα区包含SEQ ID NO：10，在Cβ区和铰链区域包含SEQ ID NO：11；T8311-8在Cα区包含SEQ ID NO：12，在Cβ区和铰链区域包含SEQ ID NO：13。T8311-1和T8311-8在抗体的其他区域中包含相同的序列，差别在于如表1所示的Cα和Cβ序列：SEQ ID NO：10和11(T8311-1)与SEQ ID NO：12和13(T8311-8)。
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2.1.2T8311 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)的蛋白质产生
表2汇总了通过在Expi293中的瞬时表达获得的蛋白质的产率和纯度，包括T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1、T8311-U14T2.G25R-8.uIgG1、T8311-U14T2.G25R-26.uIgG1、T8311-U14T2.G25R-29.uIgG1、T8311-U14T2.G25R-45.uIgG1至T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1。在一步蛋白A纯化后，所有双特异性抗体的纯度达到>90％。如表2所示，T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1将表达水平(例如，一步纯化后的产率)分别改善了46-86％和12-39％。图1和图2显示了纯化后两批蛋白质的SDS-PAGE和SEC-HPLC表征。这些双特异性抗体在非还原条件下的表观分子量为250kDa，和在还原条件下为75kDa、25kDa，表明完整和良好组装的双特异性分子。
表2.T8311分子的蛋白质产生的汇总。
2.1.3T8311 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)的DSF表征
T8311系列的纯化蛋白质的热稳定性通过DSF表征，结果列于表3中。大多数T8311系列具有或多或少改善的Tm-开始和Tm1，特别是T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1。与参考WuXiBodyTM分子(T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1)相比，T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1将Tm-开始改进了6-8℃，将Tm1改进了3℃。图3显示了在温度升高时第一批次的T8311 WuXiBodyTM分子的DSF谱。
表3.T8311分子的DSF表征的汇总。
2.1.4T8311 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)的DSC表征
使用DSC进一步表征参考T8311 2+2分子(T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1)，以及其他一些T8311分子。图4显示T8311分子具有向右迁移的DSC曲线，表明它们具有相对更强的对温度增加的抵抗性。表4列出了Tm-开始和Tm1的值。T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1是两个表现最佳的分子。U14T2.G25R-57.uIgG1将Tm-开始增加了8.8℃，并将Tm1改进了3.6℃达到64.0℃，接近常规IgG4抗体的Tm1(～65℃)。T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1还分别将Tm-开始和Tm1显著改进了5.5℃和2.8℃。
表4.基于T8311分子的设计的DSC表征的汇总。
2.1.5T8311 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)上的设计的DLS表征
还通过DLS表征了一些T8311 WuXiBodyTM分子，如图5所示。所得的Tagg-开始值列于表5。T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1是Tagg-开始值方面排名前2名的变体。与参考分子(T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1)相比，两种设计均与将Tagg-开始改进了约3-4℃。
表5.通过DLS表征的T8311分子的Tagg-开始值。
2.1.6T8311 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)的40℃加速热稳定性试验
进一步在热应激条件下检查T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1、T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1。将5mg/ml和>90％纯度制备的分子在40℃温育两周。在第1天，第3天，第7天和第14天监测这些样品的纯度。表6列出了两种抗体的纯度变化。
在第14天，参考抗体(T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1)的纯度已经下降到低于90％的值，而在第14天，T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1(设计57的Cα和Cβ序列的设计)和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1(设计61)保持高于90％，显示这两种设计在改善抗体的长期热稳定性起到重要的作用。T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1的Cα和Cβ序列的设计(序列)称为设计57，且T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1的Cα和Cβ序列的设计(序列)称为设计61。这些数据的进一步分析表明，设计57和设计61主要通过降低聚集分数来增加抗体的长期热稳定性，这也与DLS结果一致。
表6.T8311分子的浓度和纯度变化。所有样品都在缓冲液：20mM His，70mM海藻糖，0.01％PS-80，0.2M Arg PH7.0中
2.1.7通过质谱表征O-聚糖
通过质谱检查所选WuXiBodyTM分子的糖基化条件。已知参考WuXiBodyTM分子具有O-糖基化位点。在还原性质谱中，在参考分子的VL-Cα轻链上观察到核心-1结构化O-聚糖(GlcNAc+Hex+2*NeuAc)的质量。然而，在设计57和设计61的VL-Cα链上未观察到O-聚糖信号(图6)。
2.1.8与表达靶标的细胞的结合
为了确认Cα和/或Cβ区中的这些突变不影响T8311 bsAb的结合能力，进行了在表达每种靶标(抗原)的工程化细胞上的FACS结合。如图7和表7所示，与参考分子相比，T8311变体非常好地保持靶标结合能力。
表7.T8311 WuXiBodyTM bsAb及其设计变体对每个靶标的FACS结合的EC50和最大MFI值。
图7显示了T8311 WuXiBodyTM bsAb对两种靶标的FACS结合。较粗的曲线是对每种靶标的阳性对照。表7列出了EC50和最大MFI值。
2.1.9报告基因测定
在报告基因测定中检查T8311 WuXiBodyTM bsAb的功能。当由表达靶A的细胞交联时，T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1、T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1在激活靶标B介导的NF-KB途径中显示出可比的激动剂效应。数据显示在表8和图8中。
表8.报告基因测定的详细结果(EC50和最大)
图8显示了检查T8311 bsAb的功能的报告基因测定结果。
2.1.10啮齿动物PK
在大鼠中评估设计的WuXiBodyTM分子的PK。SD大鼠静脉内施用10mg/kg的单剂量。通过ELISA法测量分子的血浆浓度。收集样品21天。为了进行并排比较，我们还使用scFab建立了一个对照形式G34。如表9A所示，设计8、设计26、设计29和设计45显示出与参考(T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1)可比的药物暴露和PK参数。G34形式如图14所示，其包含scFab而非Cα和Cβ。如表9B所示，设计57和设计61具有显著改善的药物暴露。与参考分子11.1ml/天/kg的清除率相比，T8311-U14T2.G25R-57.uIgG1和T8311-U14T2.G25R-61.uIgG1的清除率分别降至6.6ml/天/kg和6.7ml/天/kg(表9B)。该改善达到40％，并实现了与常规单克隆抗体接近的水平。然而，对照形式G34显示了最差的PK行为。
表9A.T8311 WuXiBodyTM分子的PK结果
表9B.T8311 WuXiBodyTM分子的PK结果
2.2.1W3618分子(1+1，不对称)上的WuXiBodyTM工程化。
2.2.2W3618 WuXiBodyTM分子的蛋白质产生
表11总结了通过在Expi293中的瞬时表达获得的W3618-U4T1.E17R-1.uIgG1、W3618-U4T1.E17R-57.uIgG1和W3618-U4T1.E17R-61.uIgG1的产率和纯度。3步纯化后，所有bsAb的纯度达到>90％。图10显示了纯化后蛋白质的相关SDS-PAGE和SEC-HPLC表征。这些bsAb在非还原条件下的表观分子量为150kDa，在还原条件下为50kDa、25kDa，表明是完整和组装较好的双特异性分子。
表11.W3618分子的一些设计的蛋白质产生的汇总。
2.2.3W3618 WuXiBodyTM分子的DSF
W3618系列纯化蛋白的热稳定性通过DSF表征，结果列于表12中。与参考WuXiBodyTM分子(W3618-U4T1.E17R-1.uIgG1)相比，设计57(W3618-U4T1.E17R-57.uIgG1)和设计61(W3618-U4T1.E17R-61.uIgG1)将Tm-开始改进了2-4℃，并将Tm1改进了4℃。
表12.W3618分子的DSF表征的汇总。
图11显示了W3618 WuXiBodyTM分子在温度升高时的DSF谱。
2.2.4啮齿动物PK
如图15所示，在W3618中的设计57和设计61显著改善了药物暴露。与参考分子(W3618-U4T1.E17R-1.uIgG1)9.94ml/天/kg的清除率相比，W3618-U4T1.E17R-57.uIgG1和W3618-U4T1.E17R-61.uIgG1的清除率分别降至6.35ml/天/kg和5.54ml/天/kg。设计57和设计61还极大改善了W3618-U4T1.E17R-1.uIgG1的半衰期，从176小时分别提高为289小时和388小时(表13)。该改善超过40％，并达到与常规单克隆抗体接近的水平。
表13.W3618 WuXiBodyTM分子的PK结果
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2.3.1W329001-U3T3 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)上的WuXiBodyTM工程化
2.3.2.W329001-U3T3 WuXiBodyTM分子的蛋白质产生
W329001-U3T3 WuXiBodyTM分子基于公开可获的FIT-Ig(IL17 x IL20)的序列(参见WO 2017/136820，FIT-Ig)生成，称为W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1。
表15总结了通过在Expi293中的瞬时表达获得的W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1、W329001-U3T3.G25R-57.uIgG1和W329001-U3T3.G25R-61.uIgG1的产率和纯度。2步纯化后，所有这些bsAb的纯度达到>90％。图16显示了纯化后蛋白质的相关SDS-PAGE和SEC-HPLC表征。这些bsAb在非还原条件下的表观分子量为250kDa，在还原条件下为75kDa、25kDa和25kDa，表明完整和组装较好的双特异性分子。
表15.W329001-U3T3分子的一些设计的蛋白质产生的汇总。
2.3.3.W329001-U3T3 WuXiBodyTM分子的DSF
W329001-U3T3系列纯化蛋白的热稳定性通过DSF表征，结果列于表16中。与参考WuXiBodyTM分子(W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1)相比，设计57(W329001-U3T3.G25R-57.uIgG1)和设计61(W329001-U3T3.G25R-61.uIgG1)将Tm1改进了1℃。
表16.W329001-U3T3分子的DSF表征的汇总。
图17显示了W329001-U3T3 WuXiBodyTM分子在温度升高时的DSF谱。
2.3.4.啮齿动物PK
如图18所示，在W329001-U3T3中的设计57和设计61显著改善了药物暴露。与参考分子(W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1)9.6ml/天/kg的清除率相比，W329001-U3T3.G25R-57.uIgG1和W329001-U3T3.G25R-61.uIgG1的清除率分别降至8.63ml/天/kg和6.06ml/天/kg。设计57和设计61相比于W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1还改善了半衰期，从167小时分别提高为213小时和341小时(表17)。通过抗原-Fc ELISA方法检测时，也观察到类似的改善。该改善极大，并达到与常规单克隆抗体接近的水平。
表17.W329001-U3T3 WuXiBodyTM分子的PK结果
2.4.1.W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子(2+2，对称)上的WuXiBodyTM工程化
2.4.2.W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子的蛋白质产生
W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子基于CODV-Ig(IL4 x IL13)的公开可获序列(参见Anke Steinmetz等人,“CODV-Ig,a universal bispecific tetravalent andmultifunctional immunoglobulin format for medical applications”,MABS,2016,VOL.8,NO.5,867-878)生成，称为W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1。
表19总结了通过在Expi293中的瞬时表达获得的W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1、W329001-U4T4.G25R-57.uIgG1、W329001-U4T4.G25R-61.uIgG1、W329001-U4T4.G25R-78.uIgG1和W329001-U4T4.G25R-79.uIgG1的产率和纯度。1步纯化后，所有这些bsAb的纯度达到>90％。图19显示了纯化后蛋白质的相关SDS-PAGE和SEC-HPLC表征。这些bsAb在非还原条件下的表观分子量为250kDa，在还原条件下为75kDa、25kDa和25kDa，表明完整和组装较好的双特异性分子。
表19.W329001-U4T4分子的一些设计的蛋白质产生的汇总
2.4.3.W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子的DSF
W329001-U4T4系列纯化蛋白的热稳定性通过DSF表征，结果列于表20中。与参考WuXiBodyTM分子(W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1)相比，设计57(W329001-U4T4.G25R-57.uIgG1)、设计61(W329001-U4T4.G25R-61.uIgG1)、设计78(W329001-U4T4.G25R-78.uIgG1)和设计79(W329001-U4T4.G25R-79.uIgG1)将Tm1改进了6-9℃。
表20.W329001-U4T4分子的DSF表征的汇总
图20显示了W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子在温度升高时的DSF谱。
2.4.4.啮齿动物PK
如图21所示，在W329001-U4T4中的设计57和设计61显著改善了药物暴露。与参考分子(W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1)5.16ml/天/kg的清除率相比，W329001-U4T4.G25R-57.uIgG1和W329001-U4T4.G25R-61.uIgG1的清除率分别降至4.75ml/天/kg和3.39ml/天/kg。设计57和设计61还相比于W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1改善了半衰期，从220小时分别提高为225小时和344小时(表21)。通过抗原-Fc ELISA方法检测时，也观察到类似的改善。该改善极大，并达到与常规单克隆抗体接近的水平。
在图22和图23中，当比较设计57和设计78(设计57添加有CαC末端PESS)以及设计61和设计79(设计61添加有CαC末端PESS)之间的大鼠PK结果时，通过Fc-Fc或抗原-Fc检测方法没有观察到显著差异(表21)。通过DSF(图20)和O-糖基化(数据未显示)的表征也没有显示明显差异。
表21A.W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子的PK结果
表21B.W329001-U4T4 WuXiBodyTM分子的PK结果
表22：T8311-U14T2.G25R-1.uIgG1的全长序列
表23：W3618-U4T1.E17R-1.uIgG1的全长序列
表24：W329001-U3T3.G25R-1.uIgG1的全长序列
表25：W329001-U4T4.G25R-1.uIgG1的全长序列
虽然已经参考特定实施方案特别示出和描述本公开，但是本领域技术人员应当理解，可以在其中进行形式和细节的各种变化，而在不背离本公开的精神和范围。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 具有改善的稳定性和表达的多肽复合物
<130> IEC216012PCT
<150> PCT/CN2021/072601
<151> 2021-01-19
<150> CN 202210037175.4
<151> 2022-01-13
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAC_Human CAlpha
<400> 1
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90
<210> 2
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBC2_Human CBeta
<400> 2
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly
130
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区序列
<400> 3
Glu Arg Lys Cys Cys Glu Arg Lys Ser Cys
1 5 10
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端氨基酸序列
<400> 4
Glu Pro Lys Ser
1
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端氨基酸序列
<400> 5
Val Glu Pro Lys Ser
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端氨基酸序列
<400> 6
Pro Glu Ser Ser
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端氨基酸序列
<400> 7
Asn Arg Gly Glu
1
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化CBeta
<400> 8
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C末端氨基酸序列
<400> 9
Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
1 5
<210> 10
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 10
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 11
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 11
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 12
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 12
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys
85 90 95
<210> 13
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 13
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 14
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 14
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Val Glu Pro Lys Ser
85 90 95
Cys
<210> 15
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 15
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 16
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 16
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Asn Arg Gly Glu Cys
85 90 95
<210> 17
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 17
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 18
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 18
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
85
<210> 19
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 19
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 20
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 20
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Cys Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Cys Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
85 90
<210> 21
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 21
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 22
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 22
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Cys Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Cys
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
85 90
<210> 23
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 23
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 24
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 24
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Cys Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Cys
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
85 90
<210> 25
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 25
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 26
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 26
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Cys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Cys
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
85 90
<210> 27
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 27
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
<210> 28
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 28
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Cys Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Cys Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
85 90
<210> 29
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 29
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
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Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
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<220>
<223> TCR
<400> 30
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Cys Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
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65 70 75 80
Cys Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
85 90
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<220>
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115 120 125
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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<213> 人工序列
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<223> TCR
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Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Cys Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Cys Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
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<213> 人工序列
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<223> TCR
<400> 61
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
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Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Cys Ser Pro Glu Ser Ser Cys
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20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
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Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
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Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Cys Thr Phe Phe Cys Ser Pro Glu Ser Ser Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 65
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Cys Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
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Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
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100 105 110
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115 120 125
Arg Ala Asp Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Glu Asn
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Gly Ala Val Trp Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
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Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp
260 265 270
Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr
275 280 285
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290 295 300
Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser
305 310 315 320
Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Ala
325 330 335
Ala Gly Arg Ile Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu
340 345 350
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
355 360 365
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
370 375 380
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
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Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
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Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
485 490 495
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
500 505 510
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
515 520 525
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
545 550 555 560
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
660 665 670
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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705
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65 70 75 80
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Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
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Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
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Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln
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Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<213> 人工序列
<220>
<223> chain 2
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
115 120 125
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
145 150 155 160
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys
165 170 175
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg
180 185 190
Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
195 200 205
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
210 215 220
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 3
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 72
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 4
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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100 105 110
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Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
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Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys
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Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu
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Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 73
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 1
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Tyr Gly Asn Thr Gln Tyr Ser Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Leu Trp Phe Gly Glu Ser Ser Pro His Asp Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
225 230 235 240
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
245 250 255
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr His
260 265 270
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
275 280 285
Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
290 295 300
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
305 310 315 320
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
325 330 335
Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
355 360 365
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
370 375 380
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
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405 410 415
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala
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Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
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Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
450 455 460
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
465 470 475 480
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
485 490 495
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
500 505 510
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
515 520 525
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
530 535 540
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
545 550 555 560
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
565 570 575
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
580 585 590
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
595 600 605
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
610 615 620
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
625 630 635 640
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
645 650 655
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
660 665 670
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
675 680 685
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
690 695 700
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
705 710
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 2
<400> 74
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 75
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 3
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 76
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 1
<400> 76
Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro
225 230 235 240
Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
245 250 255
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro
260 265 270
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu
275 280 285
Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp
290 295 300
Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu
305 310 315 320
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr
325 330 335
Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val
340 345 350
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
355 360 365
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
370 375 380
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
385 390 395 400
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
405 410 415
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
420 425 430
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
435 440 445
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
450 455 460
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
465 470 475 480
Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
485 490 495
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
500 505 510
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
515 520 525
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
530 535 540
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
545 550 555 560
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
565 570 575
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
580 585 590
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
595 600 605
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
610 615 620
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
625 630 635 640
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
645 650 655
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
660 665 670
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
675 680 685
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
690 695 700
Ser Leu Ser Pro Gly
705
<210> 77
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 2
<400> 77
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala
85 90 95
Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 78
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chain 3
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Pro Asp Ile Gln Asn
100 105 110
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
115 120 125
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
145 150 155 160
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys
165 170 175
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu
180 185 190
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 79
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 79
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Cys Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Cys Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 80
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR
<400> 80
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Cys Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 81
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 81
Tyr Pro Ser Asn
1
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 82
Gln Ser Gly Arg
1

Claims (36)

1.一种多肽复合物，包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中：所述第一抗原结合部分包含
第一多肽，其从N末端到C末端包含第一抗体的第一重链可变域(VH)可操作地连接于第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，其从N末端到C末端包含第一抗体的第一轻链可变域(VL)可操作地连接于第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1包括工程化的Cβ或工程化的Cα，
C2包括工程化的Cα或工程化的Cβ，
C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且所述非天然链间键能够稳定所述多肽复合物，所述工程化的Cα和/或工程化的Cβ还包括在工程化的Cα和/或工程化的Cβ的C末端区域或者空间上靠近工程化的Cα和/或工程化的Cβ的C末端的一个或多个氨基酸位置处的至少一个突变，其中所述至少一个突变提高了工程化的Cα的稳定性、工程化的Cβ的稳定性和/或工程化的Cα-Cβ的界面稳定性，和
所述第一抗体具有第一抗原特异性；和
所述第二抗原结合部分具有第二抗原特异性。
2.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα包含至少一个选自P92S、E93D、S94V和S95P的突变残基，和/或所述工程化的Cβ包含至少一个选自E17K和S21A的突变残基。
3.如权利要求1-2中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα和/或Cβ包含一个或多个突变残基以形成一个或多个非天然二硫键，所述突变残基选自：Cα上的P8C，Cα上的A9C，Cα上的V10C，Cα上的F26C，Cα上的F29C，Cα上的T33C，Cα上的Q34C，Cα上的V35C，Cα上的S36C，Cα上的S38C，Cα上的K39C，Cα上的F78C，Cα上的N80C，Cα上的S81C，Cα上的I82C，Cα上的P84C，Cα上的D86C，Cα上的T87C，Cα上的F88C，Cα上的F89C，Cα上的P90C，以及Cβ上的A18C。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα在其C末端包含“FFPSPESS”(SEQ ID NO：9)或“PESS”(SEQ ID NO：6)的缺失。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα包含在Cα的C末端处的突变，其中用“VEPKS”(SEQ ID NO：5)代替“PESS”(SEQ ID NO：6)。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα包含在Cα的C末端处的突变，其中用“NRGE”(SEQ ID NO：7)代替“PESS”(SEQ ID NO：6)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα和所述工程化的Cβ包含Cα上的突变S22F，T33I和A73T以及Cβ上的突变E17K，H22R，D38P和S53D。
8.如权利要求1、3和4中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα包括Cα上的突变残基P8C和D86C，以及Cα的C末端处的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
9.如权利要求1、3和4中任一项所述的多肽复合物，其中所述工程化的Cα和所述工程化的Cβ包含Cα上的突变残基P90C和Cβ上的突变残基A18C，以及Cα的C末端处的4个氨基酸残基(氨基酸残基92-95)的缺失。
10.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C2包括SEQ ID NOs:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、79和80的任何一种，和/或工程化的C1包括SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中的任何一种。
11.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C1包括SEQ ID NOs:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、79和80的任何一种，和/或工程化的C2包括SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中的任何一种。
12.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C1和所述工程化的C2分别包括选自下组的序列对：SEQ ID NO:10/11、12/13、14/15、16/17、18/19、20/21、22/23、24/25、26/27、28/29、30/31、32/33、34/35、36/37、38/39、40/41、42/43、44/45、46/47、48/49、50/51、52/53、54/55、56/57、58/59、60/61、62/63、64/65、79/43和80/51。
13.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C2和所述工程化的C1分别包括选自下组的序列对：SEQ ID NO:12/13、14/15、16/17、18/19、20/21、22/23、24/25、26/27、28/29、30/31、32/33、34/35、36/37、38/39、40/41、42/43、44/45、46/47、48/49、50/51、52/53、54/55、56/57、58/59、60/61、62/63、64/65、79/43和80/51。
14.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C2和所述工程化的C1分别包含SEQ ID No：42和43的序列对，或者所述工程化的C1和所述工程化的C2分别包含SEQ IDNO：42和43的序列对。
15.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C2和所述工程化的C1分别包括SEQ ID NO：50和51的序列对，或所述工程化的C1和所述工程化的C2分别包含SEQ ID NO：50和51的序列对。
16.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C2和所述工程化的C1分别包括SEQ ID NO：79和43的序列对，或所述工程化的C1和所述工程化的C2分别包含SEQ ID NO：79和43的序列对。
17.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述工程化的C2和所述工程化的C1分别包括SEQ ID NO：80和51的序列对，或所述工程化的C1和所述工程化的C2分别包含SEQ ID NO：80和51的序列对。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一和第二抗原特异性中的一种针对外源性抗原、内源性抗原、自身抗原、新抗原、病毒抗原或肿瘤抗原。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一和第二抗原特异性中的一种针对T细胞特异性受体分子和/或天然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子，而另一种针对肿瘤相关抗原。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一和第二抗原特异性中的一种针对PD-L1，另一种针对4-1BB。
21.如权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一和第二抗原特异性中的一种针对HER2 D2，另一种针对HER2 D4。
22.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一和第二抗原特异性中的一种针对IL-17，另一种针对IL-20。
23.如权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一和第二抗原特异性中的一种针对IL-4，另一种针对IL-13。
24.一种缀合物，其包含与模块缀合的权利要求1-23中任一项的多肽复合物。
25.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-23中任一项的多肽复合物。
26.一种分离的载体，其包含权利要求25的多核苷酸。
27.一种宿主细胞，其包含权利要求25的分离的多核苷酸或权利要求26的分离的载体。
28.一种表达权利要求1-23中任一项的多肽复合物的方法，包括在表达所述多肽复合物的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述多肽复合物的多核苷酸。
29.一种产生权利要求1-23中任一项的多肽复合物的方法，包括：
a)向宿主细胞引入：
编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽从N末端到C末端包括第一抗体的第一重链可变域(VH)与第一TCR恒定区(C1)可操作地连接，以及编码第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽从N末端到C末端包括第一抗体的第一轻链可变域(VL)与第二TCR恒定区(C2)可操作地连接，
其中：
C1和C2能够形成包含在C1和C2之间的至少一个非天然链间键的二聚体，并且该非天然链间键能够稳定C1和C2的二聚体，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性；
b)允许宿主细胞表达所述多肽复合物。
30.如权利要求29所述的方法，还包括：
向宿主细胞引入一种或多种编码所述第二抗原结合部分的多核苷酸，
其中所述第二抗原结合部分具有不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性。
31.权利要求29-30中任一项的方法，还包括分离所述多肽复合物。
32.一种组合物，其包含权利要求1-23中任一项的多肽复合物。
33.一种药物组合物，其包含权利要求1-23中任一项的多肽复合物和药学上可接受的载体。
34.一种治疗有需要的受试者的病况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-23中任一项的多肽复合物。
35.权利要求34所述的方法，其中当所述第一抗原和所述第二抗原均被调节时，能缓解、消除、治疗或预防所述病况。
36.一种试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求1-23中任一项的多肽复合物。
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