TW202136292A - 抗ＰＤ—Ｌ１和ＴＧＦβ的雙功能抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種多肽，其從N-端到C-端包含：a)至少一個可操作連接到IgG Fc結合結構域的結合蛋白程式性死亡配體1(PD-L1)的重鏈抗體的重鏈可變區(VHH結構域)；及b)人類TGFβRII或其能夠結合TGFβ的片段。本發明亦提供包含該多肽的抗體及本發明的抗體的胺基酸序列、選殖或表現載體、細胞及用於表現或分離該抗體的方法。亦提供包含本發明的抗體的治療性組合物。本發明亦提供使用該雙特異性抗體治療癌症及其他疾病的方法。

Description

抗PD-L1和TGFβ的雙功能抗體
本發明涉及雙功能抗體。此外，本發明涉及編碼該抗體的聚核苷酸、包含該聚核苷酸的載體、宿主細胞、生產該抗體的方法及使用該雙功能抗體治療癌症、感染或其他人類疾病的免疫療法。
雙功能抗體可與兩個不同的靶點或靶點上的兩個不同表位結合，產生累加或協同效應，優於單特異性抗體或其組合的治療效果。在駱駝科動物中發現的僅有重鏈的抗體的可變結構域VHH，被認為是可自全長免疫球蛋白分離的最小的天然來源的抗原結合片段(12-15 kDa)。VHH體積小且抗原結合親和性高，理論上VHH較習知抗體具有更佳之腫瘤穿透力。此外，VHH在重組表現中蛋白穩定性較高及生產難度小因此用VHH搭建雙功能抗體的相對優勢明顯。
程式性細胞死亡配體1(PD-L1、B7-H1、CD274)是在淋巴系及外周組織中的各種不同細胞類型上誘導表現之免疫球蛋白超家族的成員。程式性細胞死亡-1(PD-1、CD279)是在活化的T細胞及其他免疫細胞上表現的CD28家族的成員。PD-1通路的主要作用是在組織及器官中下調免疫應答。現已發現，腫瘤細胞能夠通過在腫瘤微環境中上調PD-1/PD-L1通路來逃避免疫監視 [Boussiotis 2016 N Engl J Med ]。
TGF-β能夠藉由其對先天性及適應性免疫系統的作用而促進腫瘤發展及免疫逃避。三種TGF-β亞型TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3在許多腫瘤中高表現，且其血清濃度與不良的臨床預後相關。TGF-β在腫瘤微環境中藉由自分泌或旁分泌信號對細胞外基質修飾、促血管生成及上皮間充質轉化(EMT)的誘導而促進腫瘤進展及轉移。TGF-β信號亦可藉由作用於髓系細胞促腫瘤發展及轉移。此外，TGF-β1可以直接作用於T細胞及自然殺傷(NK)細胞，抑制T細胞分裂以及T細胞及NK細胞的腫瘤殺傷效應。
靶向免疫檢查點的抗體臨床上證明是有效且可行的癌症療法，但是並非所有患者均對作為單一藥劑的此等抗體產生響應。在封閉免疫檢查點同時靶向免疫抑制通路可有效增強免疫檢查點的阻斷。因此，設計一個雙功能分子可以同時靶向兩種抑制通路能產生較單一通路阻斷更有效的腫瘤抑制作用。
本發明旨在開發一種新的有效的抗腫瘤治療劑，其包含針對PD-L1的VHH-Fc與TGFβ受體II ECD(胞外結構域)融合的雙功能分子。
本發明是基於下述發現，即含有TGFβ受體II(TGFβRII)的至少能夠結合TGFβ的部分及與免疫檢查點蛋白例如人類、猴或小鼠蛋白程式性死亡配體1(PD-L1)結合的VHH結構域的雙功能多肽，可能是有效的抗腫瘤及抗癌治療劑。與分開給藥該兩種藥劑的效應相比，該蛋白可以在癌症治療中表現出協同效應。
因此，在第一態樣中，本發明提供一種多肽，其從N-端到C-端包含：至少一個可操作連接到IgG Fc結合結構域的結合蛋白程式性死亡配體1(PD-L1)的重鏈抗體的重鏈可變區(VHH結構域)；及人類TGFβRII(例如人類TGFβRII胞外結構域(ECD)，SEQ ID NO：6)或其能夠結合TGFβ的片段。
在一個實施方式中，TGFβ選自TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3。
在一個實施方式中，該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)與SEQ ID NO：1中所示的CDRH1具有至少70%序列同一性的CDRH1； (b)與SEQ ID NO：2中所示的CDRH2具有至少70%序列同一性的CDRH2；及 (c)與SEQ ID NO：3中所示的CDRH3具有至少70%序列同一性的CDRH3。
在特定實施方式中，VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)SEQ ID NO：1中所示的CDRH1，或在胺基酸序列上與該CDRH1相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH1； (b)SEQ ID NO：2中所示的CDRH2，或在胺基酸序列上與該CDRH2相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH2；及 (c)SEQ ID NO：3中所示的CDRH3，或在胺基酸序列上與該CDRH3相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH3。
在特定實施方式中，該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)包含SEQ ID NO：1或由其構成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：2或由其構成的CDRH2；及 (c)包含SEQ ID NO：3或由其構成的CDRH3。
在特定實施方式中，該VHH結構域包含： (a)SEQ ID NO：4的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：4至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：4相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
該多肽亦可包括將該VHH結構域或IgG Fc結合結構域的C-端連接到該人類TGFβRII或其片段的N-端的胺基酸連接物；該連接物包含： (a)SEQ ID NO：5的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：5至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：5相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該人類TGFβRII或其片段包含： (a)SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：6至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：6相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
該TGFβRII或其片段可以保留野生型序列的至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、25%、35%、50%、75%、90%、95%或99%的TGFβ結合活性。
在一個實施方式中，該多肽可以包含： (a)SEQ ID NO：7的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：7至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：7相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
本發明亦提供一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含兩個前述多肽。
該多肽或抗體的序列示出在表1中： 表1. 抗體的序列
WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1 SEQ ID NO 胺基酸序列
VHH CDRH1 1 GHFSNLAVN
CDRH2 2 GILWSGGSTFYADSVKG
CDRH3 3 GTN
VHH 4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHFSNLAVNWFRQAPGKERELVAGILWSGGSTFYADSVKGRFTISRGNAENMLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGTNWGQGTLVTVSS
連接物 5 GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
TGFβRII胞外結構域 6 IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
全長 7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHFSNLAVNWFRQAPGKERELVAGILWSGGSTFYADSVKGRFTISRGNAENMLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGTNWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
在另一態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含編碼上述多肽或上述抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
本發明提供一種選殖或表現載體，其包含該編碼上述多肽或上述抗體或其抗原結合片段的核酸分子。
本發明亦提供一種細胞，其包含上述核酸或上述一或多種選殖或表現載體。
在另一態樣中，本發明提供一種方法，該方法包括培養本發明的細胞且分離該多肽或抗體。
在另一態樣中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明中的多肽或抗體或該抗體的抗原結合片段以及一或多種可藥用賦形劑、稀釋劑或載劑。
本發明亦提供上述多肽或上述抗體對受試者治療腫瘤或抑制腫瘤細胞生長中的用途。
本發明亦提供一種對受試者治療腫瘤或抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法包括向該受試者給藥治療有效量的上述多肽或抗體。
本發明亦提供上述多肽或抗體用以製備用於對受試者治療腫瘤或抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
在本發明中，該腫瘤選自由結腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰臟癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、間皮瘤及骨髓增生異常症候群組成之群。
本發明的特點及優點 針對PD-L1及TGFβ通路兩者的雙功能分子可在癌症治療中提供幾個益處。與抗PD-L1抗體療法相比，該雙功能抗體可提高響應率。
本公開的下述描述僅打算說明本公開的各種不同實施方式。因此，所討論的具體修改不應被解釋為對本公開範圍的限制。對於熟習此項技術者而言，顯然可在不背離本公開的範圍的情況下製造各種不同的等同物、改變及修改，且應理解此等等同的實施方式應包括在本文中。本文中引用的包括出版物、專利及專利申請在內的所有參考文獻均整體藉由參考併入本文。
沒有具體數目的指稱在本文中用於指稱一個或超過一個(即至少一個)指稱物。例如，「多肽複合體」意謂一個多肽複合體或超過一個多肽複合體。
當在本文中使用時，術語「約」或「大約」係指數量、水平、值、數目、頻率、百分率、維度、尺寸、量、重量或長度與參比數量、水平、值、數目、頻率、百分率、維度、尺寸、量、重量或長度相比變動多達30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%。在特定實施方式中，術語「約」或「大約」當在數值之前時表示該值加或減15%、10%、5%或1%的範圍。
在整個本公開中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含」應該被理解為暗示包含所陳述的步驟或要素或成組步驟或要素，但不排除任何其他步驟或要素或成組步驟或要素。「由……構成」意謂包括並限於由「……」代表的要素。因此，短語「由……構成」表明該列出的要素是必需或強制性的，且不可以存在其他要素。「基本上由……構成」意謂包括由「……」代表的任何要素，且限於不干擾或有助於在本公開中為該列出的要素所規定的活性或作用的其他要素。因此，短語「基本上由……構成」表明該列出的要素是必需或強制性的，但其他要素是任選的，且取決於其是否影響該列出的要素的活性或作用，可以存在或不存在。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，係指胺基酸殘基的聚合物或多個胺基酸殘基的聚合物的組裝體。該術語適用於其中一或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物及非天然存在的胺基酸聚合物。術語「胺基酸」係指天然存在及合成的胺基酸以及以與天然存在的胺基酸相似的方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的胺基酸，以及在晚些時候經修飾的胺基酸例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構即連接到氫、羧基、胺基及R基團的α-碳的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此等類似物具有修飾的R基團(例如正白胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。α-碳係指附連到官能基例如羰基的第一個碳原子。β-碳係指連接到該α-碳的第二個碳原子，且該體系使用希臘字母以字母表順序繼續命名該碳。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸的通用化學結構不同的結構，但以與天然存在的胺基酸相似的方式起作用的化學化合物。術語「蛋白質」通常係指大的多肽。術語「肽」通常係指短的多肽。多肽序列通常描述為多肽序列的左側末端是胺基端(N-端)，多肽序列的右側末端是羧基端(C-端)。本文中使用的「多肽複合體」係指包含結合在一起以執行某些功能的一或多個多肽的複合體。在某些實施方式中，該多肽是免疫相關的。
術語「TGFβRII的片段」係指與SEQ ID NO：6基本上一致的序列的任何長度為至少20(例如至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、175或200)個胺基酸且保留該野生型受體或相應的野生型片段的至少一些TGFβ結合活性(例如至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、25%、35%、50%、75%、90%、95%或99%)的部分。通常，此片段是可溶性片段。此片段的實例是具有SEQ ID NO：6的序列的TGFβRII胞外結構域。
術語「基本上一致的」係指多肽與參比胺基酸序列表現出至少50%，理想地60%、70%、75%或80%，更理想地85%、90%或95%，最理想地99%的胺基酸序列同一性。該比較序列的長度通常為至少10個、理想地至少15個連續胺基酸，更理想地至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350個連續胺基酸，最理想地全長胺基酸序列。
當在本公開中使用時，術語「抗體」係指免疫球蛋白或其片段或衍生物，且涵蓋包含抗原結合位點的任何多肽，不論其是在活體外還是活體內生產的。該術語包括但不限於多株、單株、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變及嫁接抗體。術語「抗體」亦包括抗體片段例如scFv、dAb、包含第一VHH結構域及TGFβRII或其片段融合體的雙特異性抗體以及保留抗原結合功能即結合PD-L1的能力的其他抗體片段。
抗原結合片段通常包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)，然而，其並非必須包含兩者。該VH及VL區可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)的高變區，穿插有稱為構架區(FR)的更加保守的區域。本發明中所有CDR定義的編號方式由Kabat編號系統確定。所謂的奈米抗體片段僅由VHH結構域、CH2及CH3結構域構成，但仍保留完整抗體的一些抗原結合功能。
對於抗體而言，「Fc」係指由第一重鏈的第二(CH2)及第三(CH3)恆定區藉由二硫鍵結合到第二重鏈的第二及第三恆定區而構成的抗體部分。抗體的Fc部分負責各種不同的效應物功能例如ADCC及CDC，但在抗原結合中不起作用。
當在本文中使用時，「CH2結構域」係指包括重鏈分子的例如使用習知編號方案從IgG抗體的約第244位胺基酸延伸到第360位胺基酸的部分(第244至360位胺基酸，Kabat編號系統；及第231-340位胺基酸，EU編號系統；參見Kabat, E.等，U.S. Department of Health and Human Services(1983))。
該「CH3結構域」從IgG分子的CH2結構域延伸到C-端，且包含大約108個胺基酸。某些免疫球蛋白類別例如IgM亦包含CH4區。
當在本文中使用時，術語「抗原結合組成部分」係指從抗體的包含一或多個CDR的部分形成的抗體片段或與抗原結合但不包含完整本源抗體結構的任何其他抗體片段。
術語「程式性死亡配體1」、「PD配體1」、「PD-L1」、「PD L1」、「B7同源物1」、「B7-H1」、「B7 H1」、「CD274」可互換使用，且包括人類PD-L1的變體、同種型、種同源物以及與PD-L1具有至少一個共同表位的類似物。
當在本文中使用時，術語「同源物」及「同源的」可互換使用，且係指核酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列與另一個序列在最適比對時具有至少70%(例如至少70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性。
對於胺基酸序列(或核酸序列)而言，「百分(%)序列同一性」被定義為在將序列比對且如有必要引入空位以獲得最大的一致胺基酸(或核酸)數目後，候選序列中與參比序列中的胺基酸(或核酸)殘基一致的胺基酸(或核酸)殘基的百分率。胺基酸殘基的保守取代可以認為是或可以不認為是一致的殘基。出於確定胺基酸(或核酸)序列百分同一性目的的比對，可以例如使用可公開獲得的工具例如BLASTN、BLASTp(可以在美國國家生物技術信息中心(U.S. National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的網站上獲得，參見例如Altschul S.F.等，J. Mol. Biol., 215: 403-410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402(1997))、ClustalW2(可以在歐洲生物信息學研究所(European Bioinformatics Institute)的網站上獲得，也參見Higgins D. G.等，Methods in Enzymology, 266: 383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford, England), 23(21): 2947-8(2007))及ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體來實現。熟習此項技術者可以使用由該工具提供的默認參數，或者為該比對定製適合的參數，例如藉由選擇適合的算法。
當在本文中使用時，術語「結合」係指兩個分子之間例如抗體與抗原之間的非隨機結合反應。在某些實施方式中，本文中提供的多肽複合體及雙特異性多肽複合體以≤ 10-6 M(例如≤ 5×10-7 M、≤ 2×10-7 M、≤ 10-7 M、≤ 5×10-8 M、≤ 2×10-8 M、≤ 10-8 M、≤ 5×10-9 M、≤ 2×10-9 M、≤ 10-9 M或≤ 10-10 M)的結合親和性(KD )特異性結合抗原。當在本文中使用時，KD 係指解離速率與結合速率的比率(koff /kon )，可以使用表面等離子體共振方法，例如使用諸如Biacore的儀器來確定。
術語「可操作連接」係指使用或不使用間隔物或連接物將兩個或更多個感興趣的生物序列以某種方式並置，使得其處於允許其以所打算的方式起作用的關係之中。當用於多肽時，其意指該多肽序列以某種方式連接，以便允許連接產物具有所打算的生物功能。例如，可以將抗體可變區可操作連接到恆定區，以便提供具有抗原結合活性的穩定產物。該術語亦可用於聚核苷酸。作為一個實例，當編碼多肽的聚核苷酸可操作連接到調控序列(例如啟動子、增強子、沉默子序列等)時，其意指該聚核苷酸序列以某種方式連接，以便允許該多肽從該聚核苷酸受調控地表現。
當在本文中使用時，術語「突變」或「突變的」對於胺基酸殘基而言，係指胺基酸殘基的取代、插入或添加。
格式 本發明提供一種多肽，其從N-端到C-端包含：至少一個可操作連接到IgG Fc結合結構域的結合蛋白程式性死亡配體1(PD-L1)的重鏈抗體的重鏈可變區(VHH結構域)；及人類TGFβRII(例如人類TGFβRII胞外結構域(ECD))或其能夠結合TGFβ的片段。TGFβ選自TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3。該多肽亦可包含將該VHH結構域或IgG Fc結合結構域的C-端連接到該人類TGFβRII或其片段的N-端的胺基酸連接物。本發明亦提供一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含兩個上述多肽(圖1)。
在一個實施方式中，該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)與SEQ ID NO：1中所示的CDRH1(GHFSNLAVN)具有至少70%、80%或90%序列同一性的CDRH1； (b)與SEQ ID NO：2中所示的CDRH2(GILWSGGSTFYADSVKG)具有至少70%、80%或90%序列同一性的CDRH2；及 (c)與SEQ ID NO：3中所示的CDRH3(GTN)具有至少70%、80%或90%序列同一性的CDRH3。
在特定實施方式中，VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)SEQ ID NO：1中所示的CDRH1，或在胺基酸序列上與該CDRH1相差1或2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH1； (b)SEQ ID NO：2中所示的CDRH2，或在胺基酸序列上與該CDRH2相差1或2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH2；及 (c)SEQ ID NO：3中所示的CDRH3，或在胺基酸序列上與該CDRH3相差1或2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH3。
在特定實施方式中，該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)包含SEQ ID NO：1或由其構成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：2或由其構成的CDRH2；及 (c)包含SEQ ID NO：3或由其構成的CDRH3。
在特定實施方式中，該VHH結構域包含： (a)SEQ ID NO：4的胺基酸序列(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHFSNLAVNWFRQAPGKERELVAGILWSGGSTFYADSVKGRFTISRGNAENMLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGTNWGQGTLVTVSS)； (b)與SEQ ID NO：4至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：4相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
該多肽亦可包含將該VHH結構域或IgG Fc結合結構域的C-端連接到該人類TGFβRII或其片段的N-端的胺基酸連接物；該連接物包含： (a)SEQ ID NO：5的胺基酸序列(GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)； (b)與SEQ ID NO：5至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：5相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該人類TGFβRII或其片段包含： (a)SEQ ID NO：6的胺基酸序列(IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD)； (b)與SEQ ID NO：6至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：6相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
該TGFβRII或其片段可以保留該野生型序列的至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、25%、35%、50%、75%、90%、95%或99%的TGFβ結合活性。
在一個實施方式中，該多肽可以包含： (a)SEQ ID NO：7的胺基酸序列(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHFSNLAVNWFRQAPGKERELVAGILWSGGSTFYADSVKGRFTISRGNAENMLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGTNWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD)； (b)與SEQ ID NO：7至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：7相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
製備方法 本公開提供編碼本文中提供的多肽複合體及雙特異性多肽複合體的分離的核酸或聚核苷酸。
當在本文中使用時，術語「核酸」或「聚核苷酸」係指採取單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的聚核苷酸，該類似物具有與參比核酸相似的結合性質且以與天然存在的核苷酸相似的方式代謝。除非另有指明，否則特定聚核苷酸序列亦暗示涵蓋其保守修飾的變體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確註明的序列。具體而言，簡併密碼子取代可以藉由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子的第三個位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(參見Batzer等，Nucleic Acid Res. 19: 5081(1991)；Ohtsuka等，J. Biol. Chem. 260: 2605-2608(1985)；及Rossolini等，Mol. Cell. Probes 8: 91-98(1994))。
編碼本文中提供的多肽複合體及雙特異性多肽複合體的核酸或聚核苷酸可以使用重組技術來構建。為此目的，可以使用習知程序對編碼母體抗體的抗原結合組成部分(例如CDR或可變區)的DNA進行分離及測序(例如藉由使用能夠與編碼該抗體的重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。同樣地，亦可以獲得編碼TCR恆定區的DNA。作為實例，可以獲得編碼可變結構域(VH)的聚核苷酸序列及編碼第一TCR恆定區的聚核苷酸序列且將其可操作連接，以允許在宿主細胞中轉錄且表現，以產生該第一多肽。同樣地，將編碼VL的聚核苷酸序列可操作連接到編碼第二TCR恆定區的聚核苷酸序列，以便允許該第二多肽在該宿主細胞中表現。若需要，亦將編碼一或多個間隔物的聚核苷酸序列可操作連接到其他編碼序列，以允許所需產物的表現。
該編碼聚核苷酸序列可經進一步可操作連接到視情況在表現載體中的一或多個調控序列，使得該第一及第二多肽的表現及生產可行且在適當的控制之下。
可以使用此項技術中已知的重組技術將該編碼聚核苷酸序列插入到載體中，用於進一步選殖(DNA的擴增)或表現。在另一個實施方式中，本文中提供的多肽複合體及雙特異性多肽複合體可以藉由此項技術中已知的同源重組來生產。許多載體是可用的。該載體組分通常包括但不限於下述一或多者：信號序列，複製原點，一或多個標誌物基因，增強子元件，啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)及轉錄終止序列。
當在本文中使用時，術語「載體」係指編碼蛋白的聚核苷酸可以可操作插入到其中以便引起該蛋白的表現的媒介。通常，該構建物亦包括適合的調控序列。例如，該聚核苷酸分子可以包括位於編碼指導RNA的核苷酸序列及/或編碼定點修飾的多肽的核苷酸序列的5'-側翼區域中的調控序列，其以能夠在宿主細胞中表現所需轉錄本/基因的方式可操作連接到該編碼序列。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，以便引起其攜帶的遺傳元件在該宿主細胞內的表現。載體的實例包括質粒、噬菌粒、黏粒、人工染色體例如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)、噬菌體例如λ噬菌體或M13噬菌體以及動物病毒。用作載體的動物病毒的類別包括反轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純性疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒及乳多空病毒(例如SV40)。載體可以含有用於控制表現的各種不同元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、可選擇標記序列及報告物序列。此外，該載體可以含有複製原點。載體亦可包括協助其進入細胞的材料，包括但不限於病毒粒子、脂質體或蛋白質包被。
在某些實施方式中，該載體系統包括哺乳動物、細菌、酵母系統等，且包含質粒例如但不限於pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等，以及其他實驗室及可商購的載體。適合的載體可以包括質粒或病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
包含本文中提供的聚核苷酸序列的載體可以被引入到宿主細胞用於選殖或基因表現。當在本文中使用時，短語「宿主細胞」係指其中已引入外源聚核苷酸及/或載體的細胞。
用於在本文的載體中選殖或表現該DNA的適合的宿主細胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物細胞。用於此目的的適合的原核生物包括真細菌例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科例如埃希氏桿菌屬如大腸埃希氏桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬例如鼠傷寒沙門氏菌、沙雷氏菌屬例如黏質沙雷氏菌及志賀氏菌屬，以及芽孢桿菌屬例如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌、假單胞菌屬例如銅綠假單胞菌及鏈黴菌屬。
除了原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母亦為用於編碼該多肽複合體及雙特異性多肽複合體的載體的適合的選殖或表現宿主。釀酒酵母或麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，大量其他屬、種及株是可商購的且在本發明中有用，例如粟酒裂殖酵母，克魯維酵母菌屬宿主例如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC 12,424)、K. bulgaricus(ATCC 16, 045)、K. wickeramii(ATCC 24, 178)、K. waltii(ATCC 56, 500)、K. drosophilarum(ATCC 36, 906)、耐熱克魯維酵母及馬克斯克魯維酵母，耶氏酵母(EP 402, 226)，巴斯德畢赤酵母(EP 183, 070)，假絲酵母，里氏木黴(EP 244, 234)，粗糙脈孢菌，許旺酵母屬例如Schwanniomyces occidentalis，以及絲狀真菌例如脈孢菌、青黴、彎頸黴及麴黴屬宿主例如構巢麴黴及黑麴黴。
用於表現本文中提供的糖基化多肽複合體、雙特異性多肽複合體的適合的宿主細胞源自於多細胞生物體。無脊椎細胞的實例包括植物及昆蟲細胞，大量桿狀病毒毒株及變體以及相應的來自於諸如草地貪夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)及家蠶的宿主的容許性昆蟲宿主細胞已被鑑定。用於轉染的各種不同病毒株是可公開獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1變體及家蠶NPV的Bm-5毒株，且此等病毒可以在此用作根據本發明之病毒，特別是用於草地貪夜蛾細胞的轉染。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草的植物細胞培養物也可用作宿主。
然而，最感興趣的是脊椎動物細胞，且脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中的繁殖已變成日常程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人類胚胎腎細胞系(經亞選殖以備在懸浮培養中生長的293或293細胞，Graham等，J. Gen Virol. 36: 59(1977))例如Expi293、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中華倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980))、小鼠滋養細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980))、猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)、布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)、人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI細胞(Mather等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982))、MRC 5細胞、FS4細胞及人類肝細胞瘤細胞系(Hep G2)。
用上述表現或選殖載體轉化的宿主細胞可以在習知營養培養基中培養，該培養基在適合時進行修改以誘導啟動子、選擇轉化體或擴增選殖載體。
為了生產本文中提供的多肽複合體及雙特異性多肽複合體，可以將該用表現載體轉化的宿主細胞在各種不同的培養基中培養。可商購的培養基例如Ham's F10(Sigma)、最小必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's改良的Eagle's培養基(DMEM)(Sigma)適合於培養該宿主細胞。此外，在Ham等，Meth. Enz. 58: 44(1979)，Barnes等，Anal. Biochem. 102: 255(1980)，美國專利號4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469，WO 90/03430，WO 87/00195或U.S. Pat. Re. 30,985中描述的任何培養基可用作該宿主細胞的培養基。此等培養基中的任一者可以根據需要增補激素及/或其他生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(例如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗體(例如慶大黴素TM 藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內的終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等同的能源。任何其他必需增補劑亦可以熟習此項技術者已知的適合濃度包含在內。培養條件例如溫度、pH等，是以前選擇用來表現的宿主細胞的培養條件，且對於普通技術人員而言是顯而易見的。
在某些實施方式中，該多肽複合體或雙特異性多肽複合體可以直接地或例如藉由另一個偶聯物或藉由連接物間接地連接到偶聯物。例如，該具有反應性殘基例如半胱胺酸的多肽複合體或雙特異性多肽複合體可以連接至巰基反應性試劑，其中反應性基團是例如馬來醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二硫化物或其他巰基反應性偶聯配偶體(Haugland，2003，《螢光探針及研究化學品的分子探針手冊》(Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)，Molecular Probes, Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem. 3: 2；Garman，1997，《非放射活性標記實用方法》(Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach)，Academic Press, London；Means(1990) Bioconjugate Chem. 1: 2；Hermanson, G.，《生物偶聯物技術》(Bioconjugate Techniques)(1996)Academic Press, San Diego,第40-55頁, 643-671)。
作為另一個實例，可以將該多肽複合體或雙特異性多肽複合體偶聯到生物素，接著間接偶聯到與親和素偶聯的第二個偶聯物。作為又一個實例，可以將該多肽複合體或雙特異性多肽複合體連接到與該偶聯物進一步連接的連接物。連接物的實例包括雙功能偶聯劑例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基噻吩烷(IT)、醯亞胺基酯的雙功能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛類(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮基衍生物(例如雙-(對重氮基苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特別優選的偶聯劑包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem. J. 173: 723-737(1978))及N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫連鍵。
該偶聯物可以是可偵測標記物、藥物動力學改良組成部分、純化組成部分或細胞毒性組成部分。可偵測標記物的實例可以包括螢光標記物(例如螢光素、羅丹明、丹磺醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-受質標記物(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi及32P、其他鑭系元素、發光標記物)、發色團組成部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或用於偵測的金。在某些實施方式中，該偶聯物可以是藥物動力學改良組成部分，例如幫助提高抗體的半衰期的PEG。其他適合的聚合物包括例如羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。在某些實施方式中，該偶聯物可以是純化組成部分例如磁珠。「細胞毒性組成部分」可以是對細胞有害或者可以損傷或殺死細胞的任何藥劑。細胞毒性組成部分的實例包括但不限於紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、多柔比星、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素類、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷化劑(例如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C、順式-二氯二胺鉑(II)(DDP，順鉑)、蒽環類(例如道諾黴素(以前稱柔紅黴素)及多柔比星)、抗生素類(例如更生黴素(以前稱放線菌素)、博來黴素、光神黴素及安麴黴素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
用於將偶聯物偶聯到蛋白質例如抗體、免疫球蛋白或其片段的方法可以在例如美國專利號5,208,020、美國專利號6,441,163、WO2005037992、WO2005081711及WO2006/034488中找到，其整體藉由參考併入本文。
藥物組合物 本公開亦提供一種藥物組合物，其包含本文中提供的多肽複合體或雙特異性多肽複合體以及可藥用載體。
術語「可藥用」係指所指定的載體、介質、稀釋劑、賦形劑及/或鹽通常在化學及/或物理上與構成該劑型的其他成分相容，且在生理上與其接受者相容。
「可藥用載體」係指藥物劑型中除了活性成分之外的成分，其是生物活性可接受的且對受試者無毒。用於本文公開的藥物組合物的可藥用載體可以包括例如可藥用液體、凝膠或固體載體、水性介質、非水性介質、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮/分散劑、多價螯合或螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒性輔助物質、此項技術中已知的其他組分或其各種不同組合。
治療方法 亦提供治療方法，該方法包括：向需要的受試者給藥治療有效量的本文中提供的多肽複合體或雙特異性多肽複合體，由此治療或預防病症或障礙。在某些實施方式中，該受試者已鑑定為患有可能對本文中提供的多肽複合體或雙特異性多肽複合體有響應的障礙或病症。
當在本文中使用時，術語「受試者」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人類靈長動物、綿羊、犬、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。除非註明，否則術語「患者」或「受試者」可互換使用。
術語「治療」及「治療方法」係指治療性治療及預防性/預防措施兩者。需要治療者可以包括已經患有特定醫學障礙的個體以及最終可能患上該障礙的個體。
在某些實施方式中，該病症及障礙包括腫瘤及癌症，例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰臟癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈樣肉芽腫、梅克爾細胞癌、其他血液惡性腫瘤例如經典霍奇金淋巴瘤(CHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富T-細胞/組織細胞B-細胞淋巴瘤、EBV陽性及陰性PTLD及EBV相關的瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、漿母細胞性淋巴瘤、結外NK/T-細胞淋巴瘤、鼻咽癌及HHV8相關的原發性彌漫性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)的贅生物例如原發性CNS淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤。
實施例 實施例 1 ：研究材料製備 1. PD-L1抗原及TGFβ抗原製備 帶有His標籤的人類PD-L1胞外結構域(ECD)抗原購自Sino Biological(目錄號10084-H08H)。帶有His標籤的小鼠PD-L1 ECD抗原購自Sino Biological(目錄號50010-M08H)。帶有His標籤的食蟹猴(cyno)PD-L1 ECD抗原購自Sino Biological(目錄號90251-C08H)。人類TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3抗原購自R&D Systems(目錄號7754-BH、7754-BH/CF；目錄號302-B2、302-B2/CF；目錄號8420-B3、8420-B3/CF)。
2. 表現PD-L1的細胞系的建立 表現人類PD-L1的細胞系(W315-CHO-K1.hPro1.C11)、表現小鼠PD-L1的細胞系(W315-293F.mPro1.C1)及表現食蟹猴PD-L1的細胞系(W315-293F.cynoPro1.2A2)在機構內部產生。使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher-11668027)，將CHO-K1或293F細胞用含有編碼全長人類PD-L1或cynoPD-L1或小鼠PD-L1的基因的表現載體轉染。將細胞在含有適合的選擇壓力的培養基中培養。藉由有限稀釋法獲得穩定的細胞系。
3. 基準抗體(BMK)及對照抗體(cAb)的產生 命名為WT112-BMK2-IgG1的TGFβRII ECD融合抗PD-L1 BMK抗體在來自於Merck Patent GmbH的專利US9676863B2中的M7824的序列的基礎上構建。使用Expi293表現試劑盒(ThermoFisher-A14524)將含有重鏈基因的質粒及含有輕鏈基因的質粒共轉染到Expi293細胞。
TGFβRII ECD融合對照抗體WT112-cAb2以與WT112-BMK2-IgG1相同的方式構建。WT112-cAb2的抗體部分是人類IgG1同種型對照抗體；該Fc與TGFβRII ECD之間的連接物是(G4S)4；TGFβRII ECD序列與WT112-BMK2-IgG1中的相同。
4. WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1的產生 WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1是與TGFβRII ECD融合的抗PD-L1 VHH-Fc融合抗體。將編碼抗PD-L1 VHH可變區的DNA插入到含有人類IgG1的Fc的修飾的pcDNA3.3表現載體中。Fc的C-端是編碼TGFβRII ECD的序列，在兩者之間具有(G4S)4連接物，其與WT112-BMK2-IgG1中的連接物相同。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1的示意圖示出在圖1中。
實施例 2 ：活體外表徵 1. 結合人類 TGF-β 的 ELISA 抗體與人類TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的結合藉由ELISA來確定。將ELISA板分別用人類TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3蛋白在4℃包被過夜。在封閉及清洗後，向該板添加各種不同濃度的先導抗體，且在室溫培育1小時。接著將該板清洗且與HRP標記的山羊抗人類IgG抗體(Bethyl)培育1小時。在清洗後添加TMB受質，顯色反應藉由2M HCl來終止。使用讀板器(SpectraMax M5e)讀取450 nm及540 nm處的吸光值。
抗體與包被的人類TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的結合曲線示出在圖2中。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1顯示出與WT112-BMK2-IgG1相近的親和性。其強結合到固定化的TGF-β1(EC50=0.67 nM)及TGF-β3(EC50=0.89 nM)，但不結合到固定化的TGF-β2。
抗體與人類TGF-β2的結合亦藉由用測試抗體固定化的ELISA來確定。在封閉及清洗後，向該板添加各種不同濃度的TGF-β2且在室溫培育1小時。接著將該板清洗且與生物素標記的TGF-β2偵測抗體(R&D，DY240)培育1小時，接著與鏈親合素-HRP培育1小時。在清洗後添加TMB受質，且顯色反應藉由2M HCl來終止。使用微孔板讀板器(SpectraMax M5e)讀取450 nm及540 nm處的吸光值。抗體與可溶性人類TGF-β2的結合曲線示出在圖3中。固定化的WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1可以結合到可溶性TGF-β2，分別具有0.11 nM及0.05 nM的EC50 。
2. 結合人類 PD-L1 的 FACS 將各種不同濃度的測試抗體與表現人PD-L1的W315-CHO-K1.hPro1.C11細胞在4℃培育1小時。在清洗後，將細胞與PE標記的山羊抗人類IgG-Fc抗體(Jackson Immuno Research)培育。最後，藉由流式細胞儀量測該細胞的MFI且藉由FlowJo進行分析。與人類PD-L1轉染的細胞的結合曲線示出在圖4中。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1強結合到細胞表面人類PD-L1，EC50 分別為0.14 nM及0.35 nM。
3. 跨種結合 FACS 藉由FACS確定測試抗體與食蟹猴或小鼠PD-L1的結合。將各種不同濃度的測試抗體與表現食蟹猴PD-L1的W315-293F.cynoPro1.2A2細胞或表現小鼠PD-L1的W315-293F.mPro1.C1細胞在4℃培育1小時，接著藉由PE標記的山羊抗人類IgG-Fc抗體(Jackson Immuno Research)偵測抗體與該細胞的表面的結合。藉由流式細胞儀量測該細胞的MFI且藉由FlowJo進行分析。與cyno PD-L1轉染的細胞的結合示出在圖5中，且與小鼠PD-L1轉染的細胞的結合示出在圖6中。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1可以強結合到細胞表面的食蟹猴及小鼠PD-L1。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1的食蟹猴PD-L1結合EC50 分別為0.63 nM及0.96 nM。小鼠PD-L1結合EC50 分別為0.71 nM及1.3 nM。
4. 與人類 PD-L1 及人類 TGF-β1 的同時結合 藉由ELISA測試抗體與人類TGF-β1及人類PD-L1的同時結合的能力。將ELISA板用人類TGF-β1在4℃包被過夜。在封閉及清洗後，向該板添加梯度稀釋濃度的測試抗體，且在室溫培育1小時。接著將該板清洗且與生物素標記的人類PD-L1 ECD蛋白培育，接著與鏈親合素-HRP(Invitrogen)培育1小時。在清洗後添加TMB受質，顯色反應藉由2M HCl來終止。使用讀板器(SpectraMax M5e)讀取450 nm及540 nm處的吸光值。同樣地，亦藉由用人類PD-L1包被ELISA板測試雙靶點的結合能力。
圖7及圖8中示出的結果表明WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1與PD-L1及TGF- β1可以同時結合，當包被TGF-β1時EC50 分別為0.24及0.17 nM；當包被抗體時EC50 分別為0.03 nM及0.06 nM。
5. 藉由競爭 FACS 偵測的 PD-1/PD-L1 阻斷 將各種不同濃度的先導抗體、陽性及陰性對照抗體與帶有小鼠Fc (mFc)標籤的人類PD-1ECD 蛋白混合，接著與表現人類PD-L1的轉染細胞在4℃培育1小時。人類PD-1ECD蛋白與表現人類PD-L1的細胞的結合藉由PE標記的抗小鼠IgG Fc抗體(Abcam)來偵測。藉由流式細胞儀量測該細胞的MFI且藉由FlowJo進行分析。如圖9中所示，WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1阻斷PD-1與細胞表面PD-L1的結合，IC50 分別為0.03 nM及0.11 nM。
6. 報告基因測定法 (RGA) 藉由RGA測定法偵測抗體對TGF-β1信號傳導的阻斷。該RGA細胞系穩定地表現全長人類Activin蛋白受體II B以及整合SBE螢光素酶報告基因。為了試驗測試抗體的TGF-β1信號傳導阻斷活性，將人類TGF-β1及各種不同濃度的抗體預先混合，添加到該RGA細胞且在37℃、5% CO2 下培育過夜。在培育後，添加重構的螢光素酶受質(Promega，Cat E6130)，且藉由微孔板分光光度計量測螢光素酶強度。如圖10中所示，WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1表現出與WT112-BMK2(IC50 =0.7 nM)可比的0.7 nM的TGF-β1阻斷IC50 。
藉由RGA測定法測試PD-1/PD-L1信號傳導的阻斷。PD-1 RGA細胞系在Jurkat E6-1細胞中穩定地表現全長PD-1以及NFAT螢光素酶報告基因。將該PD-1 RGA細胞與表現人類PD-L1的人工APC(表現人類PD-L1及OKT3 sc-Fv的CHO-K1細胞)在各種不同濃度的測試抗體存在下，在37℃、5% CO2 下培育4-6小時。在培育後，添加重構的螢光素酶受質，且藉由微孔板分光光度計量測螢光素酶強度。如圖11中所示，WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1在RGA測定法中顯示出強的hPD-1/PD-L1信號傳導阻斷活性。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1的IC50分別為0.28及0.59 nM。
7. 同種異體混合淋巴細胞反應 (allo-MLR) 使用Ficoll-Paque PLUS(Stem Cell)梯度離心，從健康供體新鮮分離人類外周血單核細胞(PBMC)。使用CD14微珠(Miltenyi Biotec)，按照製造商的說明書分離單核細胞。將細胞在含有GM-CSF(Amoytop Biotech)及IL-4(R&D)的培養基中培養5至7天，以產生樹突狀細胞(DC)。使用人類CD4+ T細胞富集試劑盒(Stem Cell)，按照製造商的方案分離人類CD4+ T細胞。將純化的CD4+ T細胞與同種異體的未成熟DC(iDC)在各種不同的先導抗體、陽性及陰性對照抗體存在下，在96孔板中共培養。將該板在37℃、5% CO2 下培育。在第3天及第5天收穫上清液，分別用於IL-2及IFN-γ測試。使用匹配的抗體對，藉由ELISA量測人類IL-2及IFN-γ釋放。分別將重組人類IL-2(R&D)及IFN-γ(PeproTech)用作標準品。將板分別用特異性針對人類IL-2(R&D)或IFN-γ(Pierce)的捕獲抗體預包被。在封閉後，將50 µL標準品或樣品移取到每個孔中，且在環境溫度下培育2小時。在除去未結合的物質後，向該孔添加生物素偶聯的特異性針對相應細胞因子的偵測抗體且培育1小時。接著向該孔添加HRP標記的鏈親合素，在環境溫度下培育30分鐘。藉由分發50 µL TMB受質開始顯色，接著藉由50 µL 2N HCl終止反應。使用微孔板分光光度計讀取450 nm及540 nm處的吸光值。圖12中示出的結果證實，在人類CD4+ T細胞allo-MLR測定法中，WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1可以以劑量依賴性方式提高IL-2分泌(圖12A)及IFNɣ分泌(圖12B)。(藉由雙向ANOVA與同種型對照相比進行分析。* p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001)。
8. 血清穩定性 在5% CO2 培養箱中，將WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1在新鮮分離的人類血清(血清含量 ＞ 95%)中在37℃下培育。在指示的時間點從培養箱取出血清處理的樣品的等分試樣，且在液氮中快速冷凍，接著在20℃下儲存。上述處理的抗體樣品進行了雙靶點同時結合ELISA、TGF-β1結合ELISA及PD-L1結合FACS的偵測，偵測方法如上文描述。如圖13中所示，此等用血清處理過的WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1樣品顯示出與靶的正常結合，表明該抗體在人類血清中穩定至少14天。
9. 抗體蛋白加速穩定性研究 9.1 樣品處理及加速穩定性研究 將WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1藉由透析袋(Spectrum-888-10987，MWCO 3.5 kDa)在PBS緩衝液中透析，接著稀釋到2 ug/ml。加速穩定性研究藉由將測試抗體分別在4℃、25℃及40℃下培育1天、4天及7天，以及在-80℃下凍融3個循環來進行(表2)。在每種測試條件下培育後，立即進行樣品的目測檢查，以仔細偵測任何顆粒物的存在。所有樣品看起來是無顆粒物的清亮溶液。每種處理的樣品的抗體穩定性藉由SDS-PAGE、分析型SEC-HPLC、DSF及DLS測定法進行分析。與從-80℃新鮮融化的樣品(表2中的T0)相比，在不同處理後的樣品在DSF及DLS分析中穩定。SEC-HPLC分析表明在PBS緩衝液中在40℃培育4天及7天後，低分子量百分率(LMW%)提高(表2)。在配製緩衝液優化後，抗體在乙酸鈉緩衝液中在40℃下穩定性改善(表3)。
9.2 藉由DSF偵測的熱穩定性 DSF測定法使用實時螢光定量PCR(QuantStudio 7 Flex，Thermo Fisher Scientific)來進行。簡單而言，將19 µL抗體溶液與1 µL 62.5 × SYPRO橙溶液(Invitrogen)混合，且添加到96孔板(Biosystems)。將該板以0.9℃/min的速率從26℃加熱到95℃，且收集得到的螢光資料。計算相對於不同溫度的螢光變化的負導數，且將最大值定義為熔解溫度。資料收集及Tm計算藉由操作軟體(QuantStudioTM實時PCR軟體v1.3)自動進行。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1在PBS緩衝液中的Tm約為65℃(表2)。
9.3 藉由DLS進行的分子半徑量測 分子半徑量測使用DynaPro讀板器III動態光散射(DLS)儀器(Wyatt DynaproTM)來研究。為每種蛋白質樣品收集5次採集，每次採集時間為5秒。在1536孔板(Aurora微孔板)中每個孔含有7.5 μL溶液。對於每次量測而言，計算擴散係數。半徑由操作軟體(DYNAMICS 7.8.1.3)自動計算。表2中示出的結果表明在不同處理後樣品的半徑範圍為25.9 nM至33.5 nM，此與從-80℃新鮮融化的樣品相當(T0的半徑為28 nM)。表 2. 在 PBS 中的加速穩定性結果
處理 外觀 濃度 (mg/mL) DLS 半徑(nm) SEC(HMW/Mono/LMW%) DSF Tm ℃
T0 無顆粒物 2.04 28.0 5.01/94.98 % 64.6
3X 無顆粒物 1.85 30.2 5.23/93.29 /1.49% 65.1
4℃-1天 無顆粒物 1.90 33.5 4.87/93.62/1.51 % 64.8
4℃-4天 無顆粒物 1.86 29.0 4.75/93.93/1.33 % 64.9
4℃-7天 無顆粒物 1.85 27.8 4.52/95.17/0.31 % 65.1
25℃-1天 無顆粒物 1.86 27.9 4.73/93.85/1.25 % 65.1
25℃-4天 無顆粒物 1.81 29.2 4.63/94.06 /1.32% 64.9
25℃-7天 無顆粒物 1.85 28.3 4.38/95.29/0.32 % 64.9
40℃ -1天 無顆粒物 1.85 28.7 4.42/95.58 % 64.9
40℃ -4天 無顆粒物 1.84 25.9 4.64/86.85/8.51% 64.8
40℃ -7天 無顆粒物 1.82 32.5 4.92/81.47/13.16 % 64.6
T0：其已冷凍且融化一次(從-80℃)。 3X：該樣品與T0相比多凍融3次。表 3. 在乙酸鈉緩衝液中在 40 ℃下的加速穩定性測試
處理 配製 濃度 mg/mL SEC(HMW/Mono/LMW%)
T0 20 mM乙酸鈉， 7 %蔗糖， 0.02 % PS80, pH5.0 2.07 1.34/98.67 %
40℃ -1天 2.04 1.10/98.89 %
40℃ -4天 2.02 1.00/98.87/0.13%
40℃ -7天 2.03 1.05/98.65/0.29 %
T0 20 mM乙酸鈉， 7 %蔗糖， 135 mM精胺酸 0.02 % PS80, pH5.0 1.97 1.47/98.53 %
40℃ -1天 1.96 1.21/98.79 %
40℃ -4天 1.96 1.03/98.97%
40℃ -7天 1.96 1.05/98.65/0.29%
10. 藉由 SPR 偵測的與 PD-L1 的全動力學結合親和性 使用Biacore 8K，藉由SPR測定法偵測WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1與人類、小鼠及食蟹猴PD-L1的結合親和性。將抗體捕獲在固定化有抗人類IgG Fc抗體的CM5感測器芯片(GE)上。將不同濃度的人類或食蟹猴PD-L1以30 μL/分鐘的流速進樣在感測器芯片上，進行180秒的結合階段，接著是3600秒的解離。將不同濃度的小鼠PD-L1以30 μL/分鐘的流速進樣在感測器芯片上，進行120秒的結合階段，接著是1200秒的解離。在每個結合循環後，芯片用10 mM甘胺酸(pH 1.5)再生。
從測試傳感圖中減去空白表面及緩衝液通道的傳感圖。對於WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1與小鼠PD-L1的結合而言，在擬合過程中使用0-300 s的曲線。使用朗繆爾分析藉由1:1模型來擬合實驗資料。使用40 kDa的分子量來計算人類、小鼠及食蟹猴PD-L1的莫耳濃度。如表4中所示，WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1對人類及食蟹猴PD-L1具有相近的親和性。表 4. WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1 與人類、食蟹猴及小鼠 PD-L1 的結合親和性
分析物 配體 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
人類PD-L1 WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1 1.15E+06 3.07E-04 2.67E-10
食蟹猴PD-L1 WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1 1.01E+06 4.65E-04 4.61E-10
小鼠PD-L1 WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1 2.58E+05 1.08E-02 4.19E-08
11. 藉由SPR偵測的與FcRn的全動力學結合親和性  使用Biacore 8K偵測抗體與人類FcRn(ARCO，FCM-H5286)的結合親和性。將每種抗體固定化在CM5感測器芯片(GE)上。將不同濃度的人類FcRn以30 μL/分鐘的流速進樣在感測器芯片上，進行60秒的結合階段，接著是90秒的解離。接著在每個結合循環後將該芯片用10 mM甘胺酸(pH 1.5)再生。從測試傳感圖中減去空白表面及緩衝液通道的傳感圖。實驗資料藉由穩態親和性模型來擬合。使用45 kDa的分子量來計算被分析物FcRn的莫耳濃度。運行緩衝液是PBST，pH 6.0。
WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1及WT112-BMK2-IgG1對FcRn的親和性相近(表5)。表 5. 藉由 SPR 偵測的對 FcRn 的親和性
分析物 配體 KD (M)
人類FcRn WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1 1.47E-06
WT112-BMK2-IgG1 1.89E-06
實施例 3 ：活體內抗腫瘤功效研究 在BALB/C雌性小鼠中，在CT26模型中試驗WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1的抗腫瘤功效研究。在該研究中使用8週齡的雌性BALB/C小鼠(浙江維通利華實驗動物技術有限公司)。BALB/C細胞在活體外作為單層培養物在增補有10%胎牛血清、100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素的RPMI 1640培養基中，在37℃下，在含有5% CO2 的空氣氛圍中維持。該腫瘤細胞每週兩次用0.25%胰蛋白酶-EDTA處理進行日常傳代培養。收穫在指數生長階段生長的細胞且計數，用於腫瘤接種。
對於治療模型而言，將每隻小鼠在右後脅部用CT26腫瘤細胞(5.0×105 個細胞在100 μL RPMI中)皮下接種。當平均腫瘤體積達到大約50 mm3 時，將動物隨機分成7組，每組包含10隻小鼠。該小鼠每週三次接受腹膜內注射，總共注射7次。6個組(G2-G7)用等莫耳量的WT112-BMK2-IgG1及WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1分別以低、中和高劑量水平注射。對照組(G1)接受使用介質-PBS的注射。劑量水平對於WT112-BMK2-IgG1而言分別是2 mg/kg、6.5 mg/kg及20mg/kg；對於WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1而言分別是1.2mg/kg、4mg/kg及12 mg/kg。第一次注射的當天被當作第0天。對於所有腫瘤研究而言，將小鼠稱重且每週兩次使用卡尺量測腫瘤生長。該研究中與動物操作、護理及處理有關的所有程序，按照由上海模式生物中心公司(Shanghai Model Organisms Center, Inc.)的動物護理及使用學術委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准的指導方針，且遵照實驗室動物護理評估及認證協會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC)的指南來進行。腫瘤體積使用公式(½(長度 × 寬度2 )來計算。結果用平均值及標準誤差(平均值 ± SEM)來表示。資料藉由Graphpad Prism 6.0來分析，p值藉由T檢驗來分析。p＜0.05認為是統計學顯著的。
如圖14A中所示，所有小鼠在實驗期間正常且緩慢增加體重，表明抗體是無毒的。如圖14B中所示，在第一次給藥後17天，介質組的平均腫瘤體積為2550 mm3 ，此表明CT26模型良好地建立。與介質組相比，WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1顯示出有效的抗腫瘤效果且顯著抑制腫瘤生長。使用下述公式為每個組計算TGI(腫瘤生長指數)：TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] ×100。Ti是在給定天治療組的平均腫瘤體積。T0是在治療的第一天該治療組的平均腫瘤體積。Vi是在與Ti同一天介質對照組的平均腫瘤體積，V0是在治療的第一天該介質組的平均腫瘤體積。每個組在第17天的TGI對於劑量水平為2mg/kg、6.5mg/kg及20mg/kg的WT112-BMK2-IgG1而言分別是3.67%、54.26%及66.46%；對於劑量水平為1.2mg/kg、4mg/kg及12mg/kg的WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1而言分別是42.21%、48.69%及56.05%。WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1在低劑量下表現出優於BMK2的抗腫瘤活性(p＜0.01，藉由G2相比於G5的T-檢驗)，且在中和高劑量下表現出可比的抗腫瘤活性(p=無顯著性(ns)，藉由G3相比於G6及G4相比於G7的T-檢驗)。
圖1示出WT1126-U15T1.G1-1.uIgG1的示意圖。 圖2示出藉由ELISA偵測的與固定化的人類TGF-β1、TGFβ2及TGF-β3的結合。 圖3示出藉由ELISA偵測的與可溶性TGF-β2的結合。 圖4示出藉由FACS偵測的與細胞表面人類PD-L1的結合。 圖5示出藉由FACS偵測的與細胞表面cyno PD-L1的結合。 圖6示出藉由FACS偵測的與細胞表面小鼠PD-L1的結合。 圖7示出用TGF-β1固定化的雙重靶結合ELISA。 圖8示出用人類PD-L1固定化的雙重靶結合ELISA。 圖9示出藉由競爭FACS偵測的PD-1/PD-L1阻斷。 圖10示出在RGA測定法中偵測的TGF- β1信號傳導阻斷。 圖11示出在RGA測定法中偵測的PD-1/PD-L1信號傳導阻斷。 圖12A示出在人類CD4+ T細胞allo-MRL測定法中偵測的IL-2分泌。圖12B示出在人類CD4+ T細胞allo-MRL測定法中偵測的IFN-γ分泌。 圖13示出血清穩定性試驗。 圖14A示出CT26模型的體重生長曲線；圖14B示出CT26模型的腫瘤生長曲線。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007

Claims (19)

  1. 一種多肽，其從N-端到C-端包含： a)至少一個可操作連接到IgG Fc結合結構域的結合人類、食蟹猴或小鼠蛋白程式性死亡配體1(PD-L1)的重鏈抗體的重鏈可變區(VHH結構域)；及 b)人類TGFβRII、或其能夠結合TGFβ1的片段。
  2. 如請求項1之多肽，其中該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)與SEQ ID NO：1中所示的CDRH1具有至少70%序列同一性的CDRH1； (b)與SEQ ID NO：2中所示的CDRH2具有至少70%序列同一性的CDRH2；及 (c)與SEQ ID NO：3中所示的CDRH3具有至少70%序列同一性的CDRH3。
  3. 如請求項2之多肽，其中該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)SEQ ID NO：1中所示的CDRH1或在胺基酸序列上與該CDRH1相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH1； (b)SEQ ID NO：2中所示的CDRH2或在胺基酸序列上與該CDRH2相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH2；及 (c)SEQ ID NO：3中所示的CDRH3或在胺基酸序列上與該CDRH3相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失或取代的CDRH3。
  4. 如請求項2之多肽，其中該VHH結構域包含選自由以下組成之群的至少一者中的一或多個重鏈CDR(CDRH)： (a)包含SEQ ID NO：1或由其構成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：2或由其構成的CDRH2；及 (c)包含SEQ ID NO：3或由其構成的CDRH3。
  5. 如請求項2之多肽，其中該VHH結構域包含： (a)SEQ ID NO：4的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：4至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：4相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
  6. 如請求項1之多肽，其亦包含將該VHH結構域或IgG Fc結合結構域的C-端連接到該人類TGFβRII或其片段的N-端的胺基酸連接物。
  7. 如請求項6之多肽，其中該連接物包含： (a)SEQ ID NO：5的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：5至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：5相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
  8. 請求項1之多肽，其中該人類TGFβRII或其片段包含： (a)SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：6至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：6相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
  9. 如請求項1之多肽，其包含： (a)SEQ ID NO：7的胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO：7至少85%、90%、95%或99%一致的胺基酸序列；或 (c)與SEQ ID NO：7相比具有一或多個胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。
  10. 一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含兩個如請求項1至9中任一項之多肽。
  11. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之抗體的核苷酸序列。
  12. 一種選殖或表現載體，其包含如請求項11之核酸分子。
  13. 一種細胞，其包含如請求項11之核酸或如請求項12之一或多種選殖或表現載體。
  14. 一種製備如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之抗體的方法，該方法包括培養如請求項13之細胞且分離該多肽或該抗體。
  15. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之抗體、以及一或多種可藥用賦形劑、稀釋劑及載劑。
  16. 一種如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之抗體之用途，係用於對受試者治療腫瘤或抑制腫瘤細胞生長。
  17. 一種對受試者治療腫瘤或抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法包括向該受試者給藥治療有效量的如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之抗體。
  18. 一種如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之抗體之用途，係用以製備用於對受試者治療腫瘤或抑制腫瘤細胞生長的藥物。
  19. 如請求項16之多肽或抗體、或如請求項17之方法、或如請求項18之應用，其中該腫瘤選自由結腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰臟癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、間皮瘤及骨髓增生異常症候群組成之群。
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