KR102466763B1 - 항- psma 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

항-전립선 특이 세포막 항원 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 4월 13일 출원된 미국 가특허출원 62/321975에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 내용은 본 명세서에서 그의 전문이 참고문헌으로 통합된다.
본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.
14%의 남성이 그의 생애 동안 전립선 암 진단을 받았던 것으로 나타났다. 2012년에는 280만 건 정도의 전립선 암이 진단되었고, 10만명 당 21.4명이 사망하였다. 그러나 수술, 방사선요법, 화학요법 및 안드로겐 고갈 요법과 같은 현재의 접근법은 이들 말기 암을 위한 효과가 제한적이다. 따라서 지금까지, 라디칼 수술은 여전히 전립선 암의 주요 치료법이다. 따라서, 최신의 정밀의약, 특히 종양 표적화 항체를 기반으로 하는 정밀의약은 전립선 치료의 성과를 개선시킬 것으로 기대된다.
전립선 특이적 막 항원 (PSMA)는 전립선 상피세포의 특이적 마커로서 검증되어 왔으며(Horoszewicz J.S. et al. (1987) Anticancer Res, 7(5B): 927-35; Israeli, R.S., et al. (1993) Cancer Res, 53(2): 227-30; Israeli, R.S., et al. (1994) Cancer Res, 54(7): 1807-11; Wright, G.L., Jr., et al. (1995) Urol Oncol, 1(1): 18-28; Troyer, J.K. et al. (1995) Int J Cancer, 62(5): 552-8; Sokoloff, R.L., et al. (2000) Prostate, 43(2): 150-7), 이는 전립선 암 표적화된 정밀의약의 발전을 위한 토대를 마련하였다. 조직학적 연구는 거의 모든 전립선 암이 PSMA를 발현하는 것을 지시하였고 (Bostwick, DG, et al. (1998) Cancer, 82(11): 2256-61; Kusumi, T., et al. (2008) Pathol Int, 58(11): 687-94; Mannweiler, S., et al. (2009) Pathol Oncol Res, 15(2): 167-72; Ananias, H.J., et al. (2009) Prostate, 69 (10): 1101-8), 더 높은 악성 또는 전이가 있거나 안드로겐 고갈 요법에 저항성이 있는 암은 보통 훨씬 더 많이 PSMA를 발현한다 (Ananias, HJ, et al. (2009) Prostate, 69(10): 1101-8; Wright, G.L., Jr., et al. (1995) Urol Oncol, 1(1): 18-28; Wright, G.L., Jr., et al. (1996) Urology, 48(2): 326-34; Sweat, S.D., et al. (1998) Urology, 52(4): 637-40). PSMA가 전립선 특이적 마커로 생각되었더라도, 이후의 연구 결과는 소장 세포, 신장 근위 세뇨관 및 타액샘도 역시 낮은 수준의 PSMA를 발현하는 것을 지시하였다 (Troyer, JK et al. (1995) Int J Cancer, 62(5): 552-8). 주목할만한 것은 정상 조직에서 PSMA 발현 수준이 종양에 비해 100 내지 1000배 더 낮고 (Sokoloff, R.L. et al. (2000) Prostate, 43(2): 150-7), 이들 정상 조직이 보통 순환하는 항체에 쉽게 접근가능하지 않은 점이며 (Troyer, J.K. et al. (1995) Int J Cancer, 62(5): 552-8), 이는 또한 PSMA 표적화된 영상화 및 치료법의 안전성을 보장하였다.
PSMA는 글루타메이트 카복시펩티다제이고 (Pinto, J.T., et al. (1996) Clin Cancer Res, 2(9): 1445-51), 전립선 암에서 그의 기능은 불분명하다. 그러나 높은 PSMA 발현은 암의 높은 침윤과 관련되는 것으로 드러났다. 따라서 PSMA 표적화된 영상화 및 치료법은 전립선 암의 진단 및 치료 성과를 상당히 개선시킬 것이다. 전립선에 추가하여, PSMA는 많은 고형 종양의 신생혈관에서 많이 발현되는 반면 정상 혈관에서는 존재하지 않는다 (Sokoloff, R.L., et al. (2000) Prostate, 43(2): 150-7). 따라서, PSMA는 전립선 암뿐만 아니라 다른 고형 종양을 위한 신생혈관 표적화 요법에도 이상적인 마커이다.
항체는 암세포에서 발현되는 종양 관련 또는 종양 특이적 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 종양 표적화를 위한 가장 효율적인 도구이고, 이는 조기 종양 검출을 위한 PET, SPECT 또는 MRI 영상화와 같은 종양 표적화된 영상화 및 치료법, 항체 컨쥬게이트 및 암 치료를 위한 방사선요법, 키메라 항원 수용체 T 세포 또는 NK 세포 요법을 포함하는 항체 기반의 정밀의약으로의 지평을 열고 있다. 불행하게도 현재 시판되는 PSMA 항체는 없다.
따라서, 암 치료를 위해 PSMA를 표적하는 조성물 및 방법이 당해 기술분야에 필요하다. 본 발명은 이러한 충족되지 않은 필요를 만족시킨다.
본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로 PSMA의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 단편의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 PSMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 예시적인 조성물은 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 항체-약물 컨쥬게이트, PSMA-표적화 영상화제, 키메라 항원 수용체, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 등을 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다.
본 명세서에서 사용된 다음의 용어 각각은 이 섹션에서 이와 관련된 의미를 가진다.
관사 "하나 (a)" 및 "하나 (an)"는 본 명세서에서 항목의 문법적 객체 중 하나 또는 하나 이상 (예로, 적어도 하나)을 언급하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양, 일시적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 "약"은 특정된 수치로부터 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1% 또는 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미하고, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적절하다.
범위: 본 발명의 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 관점이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식에서의 설명은 편의성 및 간략화를 위한 것이며 본 발명의 범위에 관한 융통성 없는 제한으로 고려되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6와 같은 하위 범위뿐만 아니라, 해당 범위 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
상세한 설명
본 발명은 암을 치료하고 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 상기 조성물은 PSMA의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명은 PSMA에 결합하는 항체 단편의 발견에 기초한다. 상기 단편은 항체 라이브러리를 발현하는 효모-디스플레이 시스템에서 확인되었다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 항체 단편은 전립선 암 및 다른 고형 종양의 신생 혈관에서 발견되는 PSMA를 표적하는 치료적 및 진단적 조성물을 제형화하는데 사용된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 항체 또는 항체 단편이 약물을 종양 위치로 표적하는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)이다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 T-세포 항원 (예로, CD3)에 결합하는 제 2 항체 또는 항체 단편을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체이다. 일 구현예에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편, 이중특이적 항체 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 분리된 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편, 이중특이적 항체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된 세포를 포함한다.
본 발명은 전립선 암을 포함하나 이에 한정되지 않는 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 방법은 항체 또는 항체 단편, 이중특이적 항체 또는 키메라 항원 수용체를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항체 또는 항체 단편, 이중특이적 항체 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항체 또는 항체 단편, 이중특이적 항체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 표적화된 영상화제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 검출하는 방법을 제공한다. 항체 또는 항체 단편은 이에 제한되지는 않지만 PET, SPECT, MRI 또는 광학적 영상화를 포함하는 다양한 영상화 양식에 사용되는 표적화된 영상화제를 제공하기 위해 임의의 영상화제에 컨쥬게이션될 수 있다.
조성물
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 대형 효모 디스플레이 인간 scFv 라이브러리의 제작 및 고친화성 항-PSMA scFv의 단리에 기초한다. PSMA에 대한 단리된 scFv의 친화성은 9 × 10-10 nM로 측정되었다. 또한, scFv의 기능성을 증가시킨 여러 돌연변이가 생성되었다. scFv의 전장 항체로의 전환은 그의 친화성을 1 x 10-10 nM으로 증가시켰다
하이브리도마 기술학은 단일클론 항체 제조를 위한 잘 개발된 전통적인 방식이다. 그러나, 항체의 마우스 기원은 인간에서의 그 적용을 크게 방해한다. 인간화가 마우스 항체의 면역원성을 부분적으로 감소시킬 수 있고 인간화 항체가 현재 임상에서 널리 사용되고 있지만, 면역원성과 관련된 부작용은 소정 수준의 마우스의 아미노산이 항체에 대한 항원 결합 활성을 유지하도록 남아있어야 하기 때문에 인간화가 결코 100%에 도달할 수 없어 약 50%의 환자에서 발생한다. 약 3 nM의 친화성을 갖는 J591는 연구 및 일부 임상시험에서 널리 사용되었던 인간화 PSMA 항체이다 (McDevitt, M.R., et al. (2000) Cancer Res, 60 (21): 6095-100). 따라서, 완전 인간 항체는 임상 적용에 가장 바람직한 항체이다.
유전자전환 마우스 Humab-마우스 및 제노마우스는 Medarex /GenPharm International 및 Abgenix에 의해 전통적으로 하이브리도마 방법을 통해 완전 인간 항체의 개발을 위해 개발되었다. PSMA 개발 회사, LLC (Progenics Pharmaceuticals, Inc.)는 각각 1×10-9 nM, 7.9×10-10 nM, 5.1×10-10 nM 및 2.1×10-10 nM의 친화성을 갖는 완전 인간 항-PSMA 항체를 개발하는데 제노마우스를 사용하였다 (미국 특허 8,470,330).
유전자전환 마우스와 비교하여, 항체 라이브러리는 완전 인간 항체 제조에 더욱 편리하고 동등하게 효율적이다. 이론적 근거는 건강한 또는 특정 공여자로부터 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)를 분리하고, mRNA를 추출하고, 항체의 가변 영역을 증폭시키고, 단일 사슬 항체 (scFv) 또는 Fab 형식으로 조립하고, 분자 생물학적 전략을 통해 파지 또는 효모 표면에 디스플레이하는 것이다. 항체 라이브러리의 장점은 라이브러리 크기가 충분히 크면 고친화성 항체를 바로 분리할 수 있는 것이다. 라이브러리가 인간 B 세포로 제작되는 경우, 유래된 항체는 100% 인간 기원이 되며 임상 적용 시 면역원성 문제가 없을 것이다.
복잡한 사슬 구조와 4개의 사슬간 디설파이드 결합으로 인해, 전장 항체는 대장균 또는 효모에 의해 발현되기 어렵다. 따라서, 가장 많이 디스플레이되는 항체 형식은 scFv 및 Fab이다. scFv는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 반면, Fab는 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 제 1 불변 영역도 역시 포함한다. 소정의 경우, Fv, scFv, Fab 또는 scFv-Fc와 같은 작은 항체 단편과 비교하여, 전장의 항체는 가장 안정한 구조, 가장 긴 순환 시간, 가장 높은 친화성, 표지 또는 변형에 대한 최상의 저항성을 가질 수 있으며, 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 매개한다. 따라서 전장의 항체는 병원에서 가장 널리 사용되는 형식이다.
항체 라이브러리를 사용하기 위한 전략은 먼저 scFv 또는 Fab와 같은 항체 단편을 발견하고 나서 이를 전장의 항체로 전환시키는 것이다. 많은 scFv 또는 Fab가 기능을 저하시키지 않으면서 성공적으로 전장 항체로 전환될 수 있지만, 일부 단편 항체는 일단 전장의 항체로 전환되면 친화성을 상실할 것이고 (Schirrmann, T., et al. Molecules, (2011) 16(1): 412-26; Baker, K.P., et al. (2003) Arthritis Rheum, 48(11): 3253-65; Thie, H., et al. (2011) PLoS One, 6(1): e15921), 이는 불변 영역의 첨가의 결과로서 결합 부위의 입체구조 변화로 인한 것일 수 있다. scFv의 견지에서, 사슬간 링커는 일부 scFv에서 항원 결합 검증에 기여할 수 있으며, 이는 전장 항체로 전환될 때 제거될 것이고, 따라서 항원 결합 친화성을 손상시킨다. 따라서, 고친화성 scFv 또는 Fab는 고친화성 완전 항체 유도체를 보장하지 못할 수 있다. 각 전환은 독특한 사례로 간주되어야 하며 실험에 의해 검증될 필요가 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)를 포함하는 조성물을 제공한다. ADC는 항원 특이적 독성 전달을 위한 항체를 작동시키는 플랫폼 전략이다. 일반적으로 종양 표적화 항체인 항체를 슈퍼 독성 약물과 컨쥬게이션하여 표적화된 방식으로 정상 조직을 남기면서 종양 세포를 선택적으로 살상하는 것이 이론적 근거이다. ADC에서 사용된 약물은 주로 두 종류로 나뉘며, 하나는 아우리스타틴 (MMAE, MMAF) (Stephan, JP, et al. (2008) Bioconjug Chem, 19(8): 1673-83; Younes, A., et al. (2010) N Engl J Med, 363(19): 1812-21; Okeley, N.M., et al. (2010) Clin Cancer Res, 16(3): 888-970) 및 메이탄노시노이드 (DM1 and DM4) (Lambert, J.M. et al. (2014). J Med Chem, 57(16): 6949-64; Bender, B., et al. (2014) AAPS J, 16(5): 994-1008; Raufi, A., A.S. Ebrahim et al. (2013) Cancer Manag Res, 5: 225-33)와 같은 미세튜불린 저해제이고; 다른 유형은 칼리케아미신 (calicheamicin)과 같은 이중가닥 DNA 절단제이다. 슈퍼독성으로 인해, 소정의 약물은 화학치료제로서 단독으로 사용될 수 없으며, 부작용을 줄이고 치료 효능을 개선시키기 위해 항체와 컨쥬게이션되어야 한다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이중특이적 단일클론 항체 (BsMAb, BsAb)는 새로운 항체를 사용하여 강력한 항 종양 무기를 만드는 또 다른 전략이다. BsAb는 두 개의 상이한 단일클론 항체 단편으로 구성되어 결과적으로 두 개의 상이한 유형의 항원에 결합하는 인공 단백질이다. 이 접근법의 가장 널리 사용되는 적용은 Bsmabs가 세포독성 세포 (CD3와 같은 수용체 사용) 및 종양 세포와 같은 표적에 동시에 결합하여 파괴되도록 조작되는 암 면역요법에 있다 (M
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uller D et al. (2010) BioDrugs, 24(2): 89-98; Chames P1 et al. (2009) MAbs, 1(6): 539-47). 이중특이적 T-세포 인게이저 (BiTE) 및 이중-친화성 재표적화 (DART)은 소단편 BsAb의 예이고, 구멍-내-돌기 IgG, 교차Mab, 트리오Mab, DVD Ig와 같은 다양한 더 큰 BsAb도 역시 개발되었다 (Kontermann RE et al. (2015) Drug Discov. Today, 20 (7): 838-47). BsAbs에서 한쪽 팔은 항-CD3 또는 항-CD16 항체와 같은 T 또는 NK 세포 활성화 항체일 수 있으며 나머지 팔은 종양 표적화 항체일 수 있거나; 둘 다의 팔이 종양 성장의 상승적 억제를 위해 상이한 종양 마커를 표적한다.
일 구현예에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 조성물은 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포이다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 발명은 T 또는 NK 세포가 종양 세포 상의 특이적 단백질 (항원)을 인식하도록 허용하는 표면 상에 CAR을 생산하도록 유전적으로 조작된 T 또는 NK 세포를 제공한다. scFv는 이러한 조작을 위해 가장 많이 사용되는 수용체이며 암 치료를 위해 병원에서 성공적으로 사용되어 왔다 (Grupp SA et al. (2013) N Engl J Med, 368 (16): 1509-18; Porter DL et al. (2011) N Engl J Med, 365 (8): 725-33). scFv는 힌지 및 막통과 도메인을 통해 신호전달 세포내 도메인에 융합된다. 이러한 분자는 그 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 T- 또는 NK-세포의 활성화를 유도한다. T 또는 NK 세포가 이러한 CAR을 발현할 때, 이들은 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하고 살상한다. 종양 관련 항원에 대해 여러 CAR이 개발되어 왔으며, 이러한 CAR-발현 T 세포를 이용한 입양 이전 접근법은 현재 다양한 암 치료를 위한 임상 시험 중에 있다.
항체
일 구현예에서, 본 발명은 PSMA의 세포외 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편이 결합하는 PSMA의 세포외 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 용어 "에피토프"는 항체에 결합하는 항원의 영역을 말한다. 이것은 제 1 항체의 영역에 결합이 제 2 항체 또는 다른 이가 분자의 상기 영역에 결합을 방지하는 제 1 항체에 의해 인식되는 항원의 영역이다. 상기 영역은 특정 코어 서열 또는 항체 클래스에 의해 선택적으로 인식되는 서열을 포함한다. 일반적으로, 에피토프는 인접한 또는 미인접한 아미노산 서열에 의해 형성될 수 있는 국소 표면 구조에 의해 구성된다.
또 다른 구현예에서, 용어 "선택적으로 인식한다", "선택적으로 결합한다" 또는 "선택적으로 인식된"은 당해 기술분야에 공지되고 본 명세서에서 기술된, 예를 들어 ELISA 및 콜드 치환 검정법과 같은 기법에 의해 결정된 바, 에피토프에 대한 항체 또는 다른 이가 분자의 결합이 관련되지 않은 에피토프에 대한 이가 분자의 결합 또는 에피토프에 대한 관련되지 않은 이가 분자의 결합보다 적어도 2배 이상, 바람직하게는 2 내지 5배 이상, 가장 바람직하게는 5배 이상 큰 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 용어 "항체"는 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 말한다. 사람과 마우스를 포함한 대부분의 포유동물에서, 이 형태는 사량체이며 두 개의 면역글로불린 사슬의 두 개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 가지고, 각 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL과 CL을 포함하고 각 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3 및 Cγ4를 포함한다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 (VL 및 VH)은 함께 항원에 대한 결합을 담당하고, 불변 영역 (CL, Cγ1, Cγ2, Cγ3 및 Cγ4, 상세하게 Cγ1, Cγ2 및 Cγ3은 항체 효과기 기능을 담당한다. 일부 포유동물에서, 예를 들어 낙타와 라마의 경우, 전장의 항체가 면역글로불린 도메인 VH, Cγ2 및 Cγ3을 포함하는 두 개의 중쇄로만 구성될 수 있다. 본원에서 "면역글로불린 (Ig)"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성된 단백질을 의미한다. 면역글로불린은 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 면역글로불린은 전장의 항체, 항체 단편 및 VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4 및 CL을 포함하나 이에 한정되지 않는 개별 면역글로불린 도메인을 포함하나 이에 한정되지는 않는 많은 구조적 형태를 가질 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 미가공 항체가 상이한 "클래스"에 할당될 수 있다. 미가공 항체의 다섯 가지 주요한 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이들 중 몇 개는 "서브클래스" (이소형), 예로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 나뉜다. 항체의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 삼차원 입체구조는 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 용어 "항체" 또는 "항원-결합 단편"은 미가공 분자뿐만 아니라 원하는 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있는 Fab, scFv-Fc 이가 분자, F(ab')2 및 Fv와 같은 기능적 단편을 각각 의미한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(1) Fab, 항체 분자의 단가 항원-결합 단편을 포함하고, 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 미가공 경쇄 및 하나의 중쇄의 부분을 수득하도록 생산될 수 있는 단편;
(2) Fab', 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 미가공 경쇄 및 중쇄의 부분을 수득하도록 얻을 수 있는 항체 분자의 단편; 항체 분자 당 두 개의 Fab' 단편이 획득되고;
(3) (Fab')2, 전체 항체를 후속적 환원 없이 효소 펩신으로 처리하여 획득될 수 있는 항체의 단편; F (ab')2는 두 개의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 두 개의 Fab' 단편의 이량체이고;
(4) Fv, 두 개의 사슬로서 발현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 단편;
(5) 단일 사슬 항체 (SCA 또는 scFv), 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 분자; 및
(6) scFv-Fc, 단일 사슬 Fv (scFv)를 IgG 및 Fc 영역과 같은 면역글로불린 (Ig)으로부터의 힌지 영역과 융합시켜 생성된다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 단일클론 항체이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 항원-결합 단편은 단일 사슬 Fv (scFv), 다이아체, 일렬 scFv, scFv-Fc 이가 분자, Fab, Fab', Fv 또는 F(ab')2이다.
일 구현예에서, 용어 "이가 분자" 또는 "BV"는 동시에 두 개의 별도의 표적에 결합할 수 있는 분자를 말한다. 이가 분자는 두 개 및 단지 두 개의 결합 도메인을 갖는 것으로 제한되지 않으며 다가 분자 또는 연결된 단가 분자로 구성된 분자일 수 있다. 이가 분자의 결합 도메인은 동일한 에피토프 또는 동일한 표적 상에 또는 상이한 종으로부터 기원한 표적 상에 위치한 상이한 에피토프를 선택적으로 인식할 수 있다. 결합 도메인은 이에 제한되지 않지만 디설파이드 결합, 펩타이드 가교 결합, 아미드 결합 및 당해 기술분야에 공지된 다른 천연 또는 합성 결합을 포함하는 임의의 많은 방식으로 연결될 수 있다 (Spatola et al., “emistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins,”B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983) (general review); Morley, J. S., J 14, 177-185; Spatola et al., Life Sci (1986) 38, 1243-1249; Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314; Almquist et al., J Med Chem (1980) 23, 1392-1398; Jennings-White et al., Tetrahedron Lett (1982) 23, 2533; Szelke et al., 유럽 특허출원 EP 45665; Chemical Abstracts 97, 39405 (1982); Holladay, et al., Tetrahedron Lett (1983) 24, 4401-4404; 및 Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31, 189-199).
본 발명은 대형 효모 디스플레이 인간 scFv 라이브러리로부터 분리된 항-PSMA 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 일 구현예에서, 이의 항원 결합 단편은 고친화성 항-PSMA scFv gy1이고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커를 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 조성물은 본원에서 gy1로 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, gy1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, gy1은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, gy1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서 항체 또는 항체 단편은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를 포함하며, 서열번호 39는 서열번호 11에 대한 V -> A 점 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서 항체 또는 항체 단편은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 포함하며, 서열번호 41은 서열번호 13에 대한 G -> E 점 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 포함하며, 서열번호 43은 서열번호 19에 대한 V -> A 점 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 포함하며, 서열번호 45는 서열번호 25에 대한 S -> F 점 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 포함하며, 서열번호 47은 서열번호 31에 대한 I -> V 점 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하며, 서열번호 49는 서열번호 33에 대한 D -> G 점 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 포함하며, 서열번호 51은 서열번호 35에 대한 G -> E 점 돌연변이를 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서 상기 조성물은 본원에서 gy1-st로서 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, gy1-st는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 포함한다. 일 구현예에서, gy1-st는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커를 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서 상기 조성물은 본원에서 gy1-2로서 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, gy1-2는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 포함한다.일 구현예에서, gy1-2는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2; 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커를 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 상기 조성물은 본원에서 gy1-3으로서 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, gy1-3은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.일 구현예에서, gy1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3; 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 scFv는 또 다른 단편 항체 또는 완전 항체로 조작되고, 단편 항체는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv-Fc, scFv-CH2, scFv-CH3 또는 완전 항체를 말한다.
일 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 scFv를 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 조성물은 gy1-2 scFv를 포함하는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, gy1-2 scFv를 포함하는 항체는 본원에서 PSMAb로서 표시된다. 일 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 신호 펩타이드를 갖는 중쇄를 포함하며, 신호 펩타이드를 갖는 중쇄는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 신호 펩타이드는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호 59의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 신호 펩타이드를 갖는 경쇄를 포함하며, 신호 펩타이드를 갖는 경쇄는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 경쇄 신호 펩타이드는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호 67의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
원하는 서열 정렬을 달성하는데 사용될 수 있는 서열 정렬 방법은 일부 구현예에서, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 쌍으로의 정렬 방법 또는 다중-서열 정렬 방법을 포함하지만, 이에만 제한되지는 않는다. 서열 정렬은 다양한 텍스트-기반 파일 포맷으로 저장될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은 소정의 구현예에서 READASQ, EMBOSS 및 바이오펄, 바이오루비와 같은 변화 프로그램 및 프로그래화 패키지를 사용하여 임의의 포맷, 예를 들어 FASTA 또는 진뱅크, 스위스프로트, 앙트레 및 EMBL 포맷을 변환함으로써 달성된다. 당업자라면 임의의 프로그램 또는 저장 매체를 사용하여 필요에 따라 서열을 변환, 수정, 점수 매김, 업데이트 및/또는 저장할 수 있는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 용어 "서열 정렬"은 당업자라면 이해되는 바와 같이, 핵산 또는 아미노산 서열 정렬을 수행하여 용이하게 탐색, 평가 및 수학 및 통계적 계산에 착수될 수 있는 결과를 수득하는데 사용되는 임의의 프로그램 또는 방법의 사용을 포함한다. 일 구현예에서, 서열 또는 구조 정렬 방법은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 당업자라면 이해할 바와 같이 서열 및 구조적 상동성에 기초한 정렬을 포함한다.
일 구현예에서, 용어 "상동성", "상동체" 또는 "상동성"은 서열 동일성 또는 구조적 동일성 또는 기능적 동일성을 말한다. 용어 "상동성" 및 다른 유사 형태를 사용함으로써, 유사하게 기능하거고/거나 서열 동일성을 포함하고/거나 구조적으로 보존됨으로써 기준 서열에 근접하는 임의의 분자는 핵산 또는 펩타이드 여부에 상관없이 본 발명의 부분으로서 고려되어야 하는 것으로 이해될 것이다. 또 다른 구현예에서, 용어 "상동성", "상동체"또는 "상동성"는 임의의 경우에 아미노산 서열 또는 핵산 서열 여부에 상관없이 언급된 서열이 표시된 서열과 적어도 86% 상응성을 나타내는 것을 가리킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 90% 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 92% 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 95% 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 95% 이상의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 97% 이상의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 97% 내지 100% 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 100% 상응성을 나타낸다. 유사하게, 일 구현예에서, 특정 서열에 대한 상응성에 대한 언급은 본원에서 정의된 해당 서열에 대한 상동성뿐만 아니라 직접적인 상응성 둘 다를 포함한다. 따라서 일 구현예에서, 용어 "비-상동성"은 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 표시된 서열과 85% 이하의 상응성을 나타내는 것을 말한다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 75% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 제시된 서열과 65 내지 74% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 제시된 서열과 55 내지 64% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 제시된 서열과 45 내지 54% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 35 내지 44% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 35 내지 44% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 15 내지 34% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 5 내지 14% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열은 표시된 서열과 0.1 내지 4% 이하의 상응성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어 "비-상동성"은 용어 "낮은 서열 유사성"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 경쇄는 상기 나열되거나 상동성이 70% 이상, 예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인, 예를 들어 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들), 결실 또는 삽입을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄는 상기 나열되거나 상동성이 70% 이상, 예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인, 예를 들어 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들), 결실 또는 삽입을 갖는 FR1, FR2 및 FR3 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄는 상기 나열되거나 상동성이 70% 이상, 예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인, 예를 들어 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들), 결실 또는 삽입을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄는 상기 나열되거나 상동성이 70% 이상, 예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인, 예를 들어 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들), 결실 또는 삽입을 갖는 FR1, FR2 및 FR3 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 완전 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유형 중 하나이다. 또 다른 구현예에서, gy1 scFv를 IgG1 완전 항체로 조작하였다.
일 구현예에서, 완전 항체는 람다, 카파의 불변 영역 또는 이들로부터의 돌연변이된 영역을 갖는다. 다른 구현예에서, gy1 scFv는 CL2 불변 영역을 사용하여 완전 항체로 조작되었다.
일 구현예에서, 중쇄는 서열번호 59 또는 상동성이 70% 이상, 예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인, 예를 들어 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들), 결실 또는 삽입을 갖는 불변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄는 서열번호 67 또는 상동성이 70% 이상, 예를 들어 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인, 예를 들어 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 돌연변이(들), 결실 또는 삽입을 갖는 불변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 신호 펩타이드와 가변 영역 사이, 가변 영역과 불변 영역 사이의 링커 펩타이드 (들)이 존재할 수도 있고 없을 수도 있고; 이러한 링커 펩타이드의 일례는 제한효소 부위에 의해 인코딩된다.
일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 효모 세포 표면 상에 전시되며; 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 나노입자 표면 상에 코팅되고; 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 T 세포, NK 세포 또는 다른 인간 또는 다른 포유동물 세포와 같은 포유동물 세포 표면 상에 전시되다; 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 효모, 대장균 또는 포유동물 세포에 의해 분비 단백질로서 생산된다.
일 구현예에서, 용어 "결합하다" 또는 "결합" 또는 문법적 동등물은 서로에 대해 친화성을 갖는 조성물을 말한다. "특이적 결합"은 결합이 두 분자 사이에서 선택적인 것이다. 특이적 결합의 상세한 예는 항체와 항원 사이에서 일어나는 것이다. 전형적으로, 해리 상수 (KD)가 약 1 × 10-5 M 이하 또는 약 1 × 10-6 M 또는 약 1 × 10-7 M 이하인 경우 특이적 결합은 비-특이적 결합과 구별될 수 있다 특이적 결합은 예를 들어 화학적 교차 결합 존재 또는 부재 시 ELISA, 면역침전, 공동침전 또는 투-하이브리드 검정 등에 의해 검출될 수 있다. 적절한 조절이 "특이적" 및 "비-특이적" 결합을 구별하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 1 nM 범위 내의 Kd로 그의 표적을 결합시키고; 또 다른 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 0.1 nM 범위 내의 Kd로 그의 표적을 결합시킨다. 또 다른 구현예에서, gy1 scFv는 Kd = 1.165 nM의 친화도를 갖고, IgG1 완전 항체 PSMAb는 Kd = 0.1 nM의 친화성을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 변형을 갖는다. 변형은 본원에서 하기에 더 상세히 정의된 것이다. 일부 구현예에서, 변형은 N-말단 변형이다. 또 다른 구현예에서, 변형은 C-말단 변형이다. 또 다른 구현예에서, 변형은 단백질의 중간에 있다. 일 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 분비가능한 형태는 면역글로불린 (Ig) 힌지 영역에 결합을 허용하는 N-말단 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 Ig 힌지 영역은 면역글로불린 힌지 영역으로부터 나오지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 변형은 항체 또는 항체 단편 상의 직접적인 변형이다. 다른 구현예에서, 변형은 하나 이상의 다른 펩타이드, 단백질, 화학물질, 탄수화물 또는 심지어 이차 항체에 의해 가교되는 간접적인 변형이다.
본 발명에 의해 포괄되는 추가적인 번역후 변형은 예를 들어 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 사슬, N-말단 또는 C-말단의 프로세싱, 아미노산 골격에 대한 화학적 분체의 부착, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 사슬의 화학적 변형 및 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 첨가 또는 결실을 포함한다.
일 구현예에서, 용어 "폴리펩타이드"는 일반적으로 본 발명의 항체, 항원-결합 단편 또는 변이체를 말한다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 기술분야에 정의되어 왔다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예로, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예로, 아스파라긴산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예로, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예로, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예로, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예로, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 미가공 폴리펩타이드와 비교하여 돌연변이된 폴리펩타이드의 활성을 증진시키는 보존적인 치환이 아니다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 합성 또는 재조합 공정에 의해 제조 될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 생물리학적 또는 생물학적 성질을 변경시키도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 프로테아제에 대한 안정성을 증가시키거나, 그의 친지질성, 용해성 또는 미가공 수용체에 대한 결합 친화성을 변형시키도록 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 단편은 항체의 단백질 분해성 가수분해에 의해 또는 단편을 인코딩하는 DNA의 대장균 또는 포유동물 세포 (예로, 중국 햄스터 난소세포 배양 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 획득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신으로 항체를 효소적으로 절단하여 F(ab')2로 표시된 5S 단편을 제공함으로써 생산될 수 있다. 이 단편은 티올 환원제 및 선택적으로 디설파이드 결합의 절단으로부터 생성된 설프히드릴기를 위한 차단기를 사용하여 3.5S Fab' 단가 단편을 생산하도록 추가로 절단될 수 있다. 대안적으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 두 개의 단가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접적으로 생산한다. 이들 방법은 예를 들어 골든버그, 미국 특허 4,036,945 및 4,331,647 및 이에 포함된 참고 문헌에 기술되어 있으며, 이들 특허는 그 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된다. 또한 Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959 참조. 단편이 미가공 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 단가 경쇄-중쇄 단편을 형성하는 중쇄의 분리, 단편의 추가 절단 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술과 같은 항체를 절단하는 다른 방법도 역시 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 항체 또는 단백질의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 언급된 폴리펩타이드, 항체 또는 단백질에 대해 변경되는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명에서, 폴리펩타이드의 변이체는 언급된 단백질의 항체-결합 성질을 보유한다. 또 다른 구현예에서, "변이체"는 본 발명의 항원-결합 단편을 말한다. 또한 또 다른 구현예에서, 변이체는 표적 또는 마커에 대한 특이성을 보유하는 항원-결합 단편의 변이체이다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있는데, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 갖는다 (예로, 류신과 이소류신의 치환). 또 다른 구현예에서, 변이체는 하나 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 갖는 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환된 것이고, 다른 구현예에서, 상기의 반대는 "비-보존적 치환"의 경우이다. 유사한 전하를 갖는 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 기술분야에서 정의되어 왔다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예로, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예로, 아스파라긴산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예로, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예로, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예로, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예로, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발에 의해서와 같이인코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 생물학적 활성을 스크리닝하여 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정할 수 있다. 돌연변이 유발 후, 인코딩된 단백질은 일상적으로 발현될 수 있고, 인코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성은 본원에 기술된 기술을 사용하거나 당해 기술분야에 공지된 기술을 일상적으로 개량함으로써 결정될 수 있다. 유사한 사소한 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 다를 포함 할 수 있다. 어떠한 아미노산 잔기가 면역학적 반응성을 파괴하지 않으면서 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 예를 들어 DNASTAR 소프트웨어와 같은 당해 기술분야에 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다.
일 구현예에서, 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 프레임워크 영역은 명확하게 정의되어 왔다. 예로, Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, National Institutes of Health, USA (5th ed. 1991) 참조. 각 가변 도메인에는 일반적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 네 개의 FR이 있다. 일부 구현예에서, "FR"은 또한 CDR 영역의 외부이지만 접경하거나 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 항체 가변 영역, 예로 항체의 가변 영역 내의 항체 분자의 인식 요소로서 작용하는 아미노산 잔기와 직접적으로 상호작용하는 영역을 말한다. 일 구현예에서, 용어 "프레임워크 영역"은 CDR에 의해 분리된 프레임워크의 각 도메인을 의미하도록 의도된다. 일부 구현예에서, 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 비교적 보존된다. 항체의 결합된 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역은 항원에 대한 적절한 결합을 위해 CDR을 위치시키고 정렬시키는 역할을 한다.
일 구현예에서, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접한 항원 결합 부위를 포함하는 아미노산 잔기를 말한다. 다른 구현예에서, 용어 "CDR"은 Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 및 Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), 또한 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)에 의해 기술된 바와 같은 영역을 포함할 것이다. 가변 도메인의 CDR의 아미노산은 항체의 아미노산 잔기의 카밧 번호매김 시스템을 사용하여, 처음 카밧에 의해 서열 다양성에 기초하여 인간 중쇄 가변 도메인 (VH)에서 아미노산 잔기 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 및 인간 경쇄 가변 도메인 (VL)에서 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)으로 구성된 것으로 정의되었다. Kabat et al., sequences of proteins of immunological interest, US Dept. Health and Human Services, NIH, USA (5th ed. 1991). Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)은 항원 결합 활성에 중요한 것으로 밝혀진 가변 도메인 영역의 삼차원 구조 루프에 포함된 잔기에 기초하여 CDR의 또 다른 정의를 제시하였던 점 참조. 초티아 등은 CDR을 인간 중쇄 가변 도메인 (VH)에서 아미노산 잔기 26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-102 (H3) 및 인간 경쇄 가변 도메인 (VL)에서 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)로 구성된 것으로서 정의하였다. 카밧 및 초티아의 CDR 정의를 조합하여, CDR은 카밧 번호매김 시스템에 기초하여 인간 VH에서 아미노산 잔기 26-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 및 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)로 구성된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 중쇄 또는 경쇄와 관련하여 사용되는 "가변 영역"은 분자 상에 항원 결합을 부여하고 불변 영역이 아닌 항체의 아미노 말단 부분을 의미하도록 의도된다. 이 용어는 전체 가변 영역의 모든 결합 기능의 일부를 유지하는 이의 기능적 단편을 포함하도록 의도된다. 따라서, 용어 "이종중합 가변 영역 결합 단편"은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 또는 이들의 기능적 단편이 이종중합 복합체로 조립된 것을 의미하도록 의도된다. 이종중합 가변 영역 결합 단편은 예를 들어 Fab, F(ab)2, Fv, 단일 사슬 Fv(scfv) 등과 같은 기능적 단편을 포함한다. 이러한 기능 단편은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 이종중합 가변 영역의 기능적 단편을 설명할 때 이들 용어를 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려진 정의에 상응하도록 의도된다. 이러한 용어는 예를 들어 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); Pl
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uckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178: 497-515 (1989) 및 현재 E. D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990)에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 단리된 폴리펩타이드의 이소형태이다. 일 구현예에서, "이소형태"은 동일한 단백질 또는 폴리펩타이드의 또 다른 이소형태와 단지 약간의 차이를 갖는, 예를 들어 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드의 분자의 버전을 말한다. 일 구현예에서, 이소형태는 상이하지만 관련된 유전자로부터 생산되거나, 다른 구현예에서는 대안의 스플라이싱에 의해 동일한 유전자로부터 생성된다. 다른 구현예에서, 이소형태는 단일 핵산 다형성에 의해 유발된다.
일 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 미가공 단백질의 단편이다. 일 구현예에서, "단편"은 전장의 단백질 또는 폴리펩타이드보다 짧거나 아미노산이 적은 단백질 또는 폴리펩타이드를 말한다. 또 다른 구현예에서, 단편은 전장의 핵산보다 짧거나 더 적은 핵산을 포함하는 핵산을 말한다. 또 다른 구현예에서, 단편은 N-말단 단편이다. 또 다른 구현예에서, 단편은 C-말단 단편이다. 일 구현예에서, 본 발명의 단편은 단백질, 펩타이드 또는 핵산의 서열내 절편이다. 일 구현예에서, 상기 단편은 단백질, 펩타이드 또는 핵산의 기능적 서열내 절편이다. 또 다른 구현예에서, 상기 단편은 단백질, 펩타이드 또는 핵산 내의 기능적 서열내 절편이다. 또 다른 구현예에서, 단편은 N-말단 기능적 단편이다. 일 구현예에서, 단편은 C-말단 기능적 단편이다.
일 구현예에서, 용어 "기능적 단편"은 미가공 또는 야생형 항체 또는 폴리펩타이드의 변형된 버전 임에도 불구하고 야생형과 비교하여 어느 정도의 생물학적 활성을 유지하는 단편을 말한다. 이러한 활성도는 "활성"이 자연적인 생물리학적 또는 생화학적 특징 예로 결합 능력, 친화성, 반감기 등을 말하는 야생형과 비교하여 중간 내지 높은 정도의 범위를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드의 유도체를 포함한다. "유도체"는 일부 구현예에서, 해당 단백질의 미가공 서열의 전장 미만을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, "유도체"는 미가공이 아닌 서열, 예로 문제의 미가공 단백질의 일부를 형성하지 않는 서열을 (그 말단 및/또는 상기 서열 자체 내에) 추가로 포함할 수 있다. 용어 "유도체"는 또한 미가공 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 잔기 측쇄에 화학기를 결합시킴으로써 생성된 분자 종을 그의 범위 내에 포함하며, 상기 화학기는 상기 미가공 단백질에 존재하는 천연 발생 아미노산 잔기의 일부를 형성하지 않는다.
항체 및 항체 단편을 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. (예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조).
항체는 본 발명의 항-PSMA 에피토프를 포함하는 PSMA 또는 PSMA의 펩타이드 단편과 같은 표적 항원으로 마우스, 래트, 토끼, 염소, 영장류, 인간 및 닭을 포함하는 다양한 동물을 면역화하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 동물의 면역화 전에 정제된다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환, 친화 크로마토 그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 친화 크로마토그래피 또는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 많은 다른 기술이 혈청, 복수액 또는 하이브리도마 상청액으로부터 다중클론 또는 단일클론 항체를 분리하는데 사용될 수 있다.
"정제된"은 단일클론 항체가 정상적으로 단일클론 항체와 관련된 단백질의 적어도 일부로부터 단리되고, 바람직하게는 단백질 이외의 모든 세포성 물질로부터 단리되는 것을 의미한다.
또한 증가된 용해도, 안정성 및 폴리펩타이드의 생체내 또는 시험관내 순환 시간 또는 감소된 면역원성과 같은 추가적인 이점을 제공할 수 있는 본 발명의 항체의 화학적으로 변형된 유도체가 본 발명에 의해 제공된다 (미국 특허 4,179,337 참조). 유도체화를 위한 화학적 분체는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등과 같은 수용성 중합체로부터 선택될 수 있다. 항체는 분자 내의 임의의 위치에서 또는 분자 내의 미리 결정된 위치에서 변형될 수 있으며, 1개, 2개, 또는 3개 이상의 부착된 화학적 분체를 포함할 수 있다.
중합체는 임의의 분자량 일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 바람직한 분자량은 취급 및 제조의 용이성을 위해 약 1kDa 내지 약 100kDa 사이 범위이다 (용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜의 제조에서 일부 분자가 명시된 분자량보다 다소간의 중량인 것을 나타냄). 원하는 치료 프로파일 (예로, 원하는 서방 기간, 존재 시 생물학적 활성에 미치는 효과, 취급의 용이성, 항원성 정도 또는 부족 및 기타 공지된 치료적 단백질 또는 유사체에 미치는 폴리에틸렌 글리콜의 효과)에 따라 다른 크기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2560, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000 kDa의 평균 분자량을 가질 수 있다.
상기에 주목한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 분지형 구조를 가질 수 있다. 분지형 폴리에틸렌 글리콜은 예를 들어, 미국 특허 5,643,575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleic acids 18: 2745-2750 (1999); 및 Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10: 638-646 (1999)]에 기술되고, 이들 각각의 개시 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.
폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 다른 화학적 분체)는 항체의 기능성 또는 항원성 도메인에 미치는 효과를 고려하여 항체에 부착되어야 한다. 당업자에게 입수가능한 많은 부착 방법, 예로 본원에 참고문헌으로 인용된 유럽 특허 EP 0 401 384 (PEG의 G-CSF에 커플링)가 있다 (또한 Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (트레실 염화물을 사용한 GM-CSF의 페길화 보고). 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 자유 아미노 또는 카르복시기와 같은 반응성기를 통해 아미노산 잔기를 통해 공유 결합 될 수 있다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 것이다. 자유 아미노기를 갖는 아미노산 잔기는 예를 들어 라이신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있고; 자유 카르복시기를 갖는 것은 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 설프히드릴기도 역시 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키는 반응기로서 사용될 수 있다. 치료 목적으로 바람직한 것은 N-말단 또는 리신기에서의 부착과 같은 아미노기에서의 부착이다.
상기 제시된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 임의의 많은 아미노산 잔기에 대한 결합을 통해 단백질, 예로 항체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 라이신, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루탐산 또는 시스테인 잔기에 대한 공유 결합을 통해 단백질에 연결될 수 있다. 단백질의 특정 아미노산 잔기 (예로, 라이신, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루탐산 또는 시스테인) 또는 하나 이상의 유형의 아미노산 잔기 (예로, 리신, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루탐산, 시스테인 및 이들의 조합)에 폴리에틸렌 글리콜을 부착하기 위해 하나 이상의 반응 화학을 채용할 수 있다.
핵산
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 서열 (항체 단편 또는 이의 변이체를 포함하거나 대안적으로 이로 구성되는 분자 포함)을 포함하거나 대안적으로 이로 구성되는 폴리핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 높은 엄격도 하에서 또는 대안적으로 예로 상기 정의된 바와 같은 중간 또는 낮은 엄격도 혼성화 조건 하에서 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 폴리핵산 서열을 갖는 핵산에 상보적인 폴리핵산에 혼성화하는 폴리핵산을 포괄한다.
또 다른 구현예에서, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 폴리핵산을 획득하고, 폴리핵산의 핵산 서열을 결정한다. 대안적으로, 항체 (이의 항체 단편 또는 변이체를 포함하거나, 대안적으로 이들로 구성된 분자 포함)을 인코딩하는 폴리핵산은 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성된다. 특정 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 입수가능하지 않지만 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 면역글로불린을 인코딩하는 핵산은 특정 종에 대한 미가공 또는 최적화된 코돈으로 화학적으로 합성되거나, 적합한 공급원 (예로, 본 발명의 항체를 발현하도록 선별된 하이브리도마 세포와 같은, 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 항체 cDNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A + RNA)으로부터, 예로 항체를 인코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고핵산 프로브를 사용한 클로닝에 의해 획득될 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 용어 "핵산"은 디옥시리보핵산 (DNA) 및 적절한 경우 리보핵산 (RNA) 또는 이의 모방체와 같은 폴리핵산 또는 올리고핵산을 말한다. 이 용어는 또한 등가물로서, 핵산 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하고, 기술된 구현예에 적용가능한 경우, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중가닥 폴리핵산을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 천연 발생 핵산 염기, 당 및 뉴클레오시드 간 공유 결합 (프레임워크)으로 구성된 올리고핵산 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비-천연 발생 부분을 갖는 올리고핵산으로 구성된 올리고핵산을 포함한다. 이러한 변형되거나 치환된 올리고핵산은 예를 들어, 증진된 세포 섭취, 핵산 표적에 대한 증진된 친 화성 및 뉴클레아제 존재 시 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질 때문에 종종 미가공 형태보다 바람직하다.
당업자라면 이해할 바와 같이, 단백질 또는 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 유전자의 단편 또는 유도체는 전체 야생형 유전자 또는 서열과 동일한 방식으로 여전히 기능할 수 있다. 마찬가지로, 핵산 서열의 형태는 야생형 서열과 비교하여 변이를 가질 수 있지만, 이러한 변이에도 불구하고 동일한 생물학적 효과를 나타내는 야생형 기능을 보유하는 단백질 또는 펩타이드 또는 그의 단편을 인코딩한다. 이들 각각은 본 발명의 개별적인 구현예를 예시한다.
본 발명의 핵산은 당해 기술분야에 공지된 임의의 합성 또는 재조합 공정에 의해 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 생물학적 또는 생물학적 성질을 변경시키도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키거나 (예로, "말단-캡핑"), 코돈 최적화에 의해 발현 수준을 증가시키거나, 상보적 서열에 대한 친유성, 용해성 또는 결합 친화성을 변형 시키도록 변형될 수 있다.
특정 목적을 달성하기 위해 핵산을 변형시키는 방법은, 예를 들어 Sambrook et al. (1989)에 개시된다. 더욱이, 본 발명의 핵산 서열은 관심있는 단백질을 인코딩하지 않는 핵산 서열의 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 서열에 의해 인코딩된 것과 유사한 단백질을 인코딩하지만, 유전자 코드의 축퇴로 인한 코돈 서열 또는 대립유전자 변이의 견지에서 상이한 (종 집단에 아미노산 변화를 유발할 수도 아닐 수도 있는 천연 발생 염기 변화) DNA 서열을 제공하고, 이는 본원에 기술된 본 발명의 단백질을 마찬가지로 인코딩할 수 있다. 점 돌연변이 또는 이로써 인코딩된 폴리펩타이드의 활성, 반감기 또는 생산을 증진시키도록 유도된 변형 (삽입, 결실 및 치환 포함)에 의해 유발되는 DNA 서열의 변화도 역시 본 발명에 포괄된다.
본원에서 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예로, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고핵산 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열 결정된다. 일단 단리되면 DNA를 발현 벡터에 삽입한 다음, 재조합 숙주 세포에서 항체의 합성을 확득하기 위해 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 효모 세포 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. 항체의 재조합 생산은 하기에 보다 자세하게 기술되어 있다.
일 구현예에서, 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 scFv gy1을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL FR1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL CDR1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL FR2를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL CDR2를인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL FR3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL CDR3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 VL FR4를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH FR1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH CDR1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH FR2를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH CDR2를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH FR3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH CDR3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, VH FR4를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, scFv 링커를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 36의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 핵산 분자는 gy1을 인코딩한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 gy1을 인코딩한다. 예를 들어, 일 구현예에서, gy1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, gy1을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, gy1을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 링커 scFv를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; FR1 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; scFv 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 인코딩한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 39는 서열번호 11에 대한 V -> A 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 38의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 41은 서열번호 13에 대한 G -> E 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 40의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 43는 서열번호 19에 대한 V -> A 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 45는 서열번호 25에 대한 S -> F 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 47는 서열번호 31에 대한 I -> V 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 49는 서열번호 33에 대한 D -> G 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 51는 서열번호 35에 대한 G -> E 점 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 돌연변이체 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 조성물은 본원에서 gy1-st로 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, gy1-st를 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, gy1-st를 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 링커 scFv를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 38의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; FR1 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; scFv 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 조성물은 본원에서 gy1-2로 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, gy1-2를 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 염기 서열; 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 염기 서열을 포함한다.일 구현예에서, gy1-2를 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 링커 scFv를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 40의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 42의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; FR1 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; scFv 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 조성물은 본원에서 gy1-3으로 표시되는 scFv를 포함하는 항체 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, gy1-3을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.일 구현예에서, gy1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR2를인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 링커 scFv를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, VL FR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VL FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VL FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; FR1 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; VH FR3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; VH FR4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; scFv 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 PSMAb를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 신호 펩타이드를 갖는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 신호 펩타이드를 갖는 중쇄는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 59의 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 신호 펩타이드를 갖는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 신호 펩타이드를 갖는 경쇄는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 67의 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 신호 펩타이드를 갖는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 52의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 54의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 58의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 신호 펩타이드를 갖는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 60의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 경쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 62의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 64의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 66의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포괄한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 핵산 분자는 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 82% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 다양한 단백질 발현 시스템을 사용하여 항-PSMA 항체 또는 항체 단편의 재조합 단백질을 발현하거나 생산하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 또한 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 시험관내, 생체외 또는 생체내 재조합 DNA 기술에 의해 내부로 도입되었던 형질전환된 세포 및 이의 자손을 제공한다. 형질전환된 세포, 진핵세포 또는 원핵세포는 정제를 위한 재조합 항체 또는 항체 단편을 생산하는 데 또는 종양의 진단 또는 치료와 같은 다양한 목적으로의 제자리 또는 분비성 발현에 사용될 수 있다. 형질전환된 세포는 증식되고 도입된 핵산은 전사되거나 인코딩된 단백질이 발현될 수 있다. 자손 세포는 복제 동안 발생하는 돌연변이가 있을 수 있으므로, 부모 세포와 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 형질전환된 세포는 박테리아, 곰팡이, 식물, 곤충 및 동물 (예로, 사람을 포함한 포유동물) 세포와 같은 원핵세포 및 진핵세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 세포는 생체외 배양물, 세포, 조직 또는 기관에 존재하거나 대상에 존재할 수 있다.
전형적으로 세포 변형은 벡터를 채용한다. 용어 "벡터"는 예로 플라스미드, 바이러스성 벡터와 같은 바이러스 또는 유전자 조작을 위한 핵산의 삽입 또는 도입에 의해 조작될 수 있거나 (예로, "클로닝 벡터"), 삽입된 폴리핵산을 전사하거나 번역하는 데 사용될 수 있는 (예로, "발현 벡터") 당해 기술분야에 공지된 다른 운반체를 말한다 이러한 벡터는 발현 조절 요소와 작동가능하게 연결된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 도입하고, 시험관내 (예로, 용액 또는 고체상), 세포 또는 생체내에서 인코딩된 단백질을 발현 시키는데 유용하다.
일 구현예에서, 발현 벡터(들)은 통상적인 기술에 의해 숙주 세포에 전달되고, 다음으로 형질전환된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 (예로, 전체 항체, 이의 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부, 또는 단일 사슬 항체 또는 이의 단편 또는 변이체)를 인코딩하는, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 전체 항체 분자의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 모두를 인코딩하는 벡터가 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현된다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 생산되어 이후에 정제될 수 있는 운반체를 예시할 뿐만 아니라, 적절한 핵산 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본 발명의 항체 분자를 제자리 발현할 수 있는 세포도 역시 예시한다. 이들은 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체 단편 또는 이의 변이체 (단일 사슬 항체)를 발현하도록 조작된 박테리오파지 입자, 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코즈미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예로, 대장균, B. 섭틸리스)와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예로, 사카로마이세스, 피 키아); 항체 인코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템 (예로, 배큘로바이러스); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예로, 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV, 담배 모자이크 바이러스 TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예로, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 (예로, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 (예로, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, CMV 프로모터 또는 EF1α 프로모터) 유래한 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예로, COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NS0 세포)를 포함한다. 바람직하게는, 대장균과 같은 박테리아 세포, 더욱 바람직하게 진핵 세포가 특히 재조합 항체 분자 전체의 발현을 위해 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)와 같은 포유동물 세포는 항체를 위한 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking et al., Gene 45: 101 Bio et al., Bio/Techniques 10: 169 (1992), Keen and Hale, Cytotechnology 18: 207 (1996)). 이들 참고 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
세포 또는 숙주 발현 벡터를 형질전환시키는데 사용되는 벡터는 일반적으로 세포에서의 증식을 위한 적어도 복제원점을 포함한다. 전사 및 번역을 용이하게 하기 위해, 벡터 내에 존재하는 본원에 기재된 바와 같은 발현 조절요소를 포함하는 조절요소가 포함된다. 용어 "발현 조절요소"는 최소한으로 발현에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 성분을 포함하도록 의도되고, 프로모터 또는 인핸서 이외의 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열, 다중유전자 또는 폴리시스트론 메시지의 작성을 위한 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), mRNA의 프레임을 맞춘 번역을 허용하는 정확한 판독 프레임을 유지하는 인트론을 위한 스프라이싱 신호, 관심있는 유전자의 전사체, 정지 코돈 등의 적절한 폴리아테닐화를 제공하는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
벡터는 선별 마커를 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, "선별 마커"는 유전자를 포함하는 세포의 선별을 허용하는 유전자를 의미한다. "양성 선별"은 양성 선별에 노출 시 선별 마커를 포함하는 세포만이 생존하는 과정을 말한다. 약물 저항성은 양성 선별 마커의 일 예이고; 상기 마커를 포함하는 세포는 선별 약물을 포함하는 배양 배지에서 생존하고, 마커를 포함하지 않는 세포는 죽을 것이다. 이러한 마커는 특히 G418에 대한 저항성을 부여하는 neo, 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygr 또는 퓨로마이신에 저항성을 부여하는 puro와 같은 약물 저항성 유전자를 포함한다. 다른 양성 선별 마커 유전자는 상기 마커를 포함하는 세포의 확인 또는 스크리닝을 허용하는 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 특히 형광성 단백질 (GFP), lacZ 유전자, 알칼라인 포스파타제 유전자 및 CD8과 같은 표면 마커의 유전자를 포함한다.
벡터는 음성 선별 마커를 포함할 수 있다. "음성 선별"은 음성 선별 마커를 포함하는 세포가 적절한 음성 선별 제제에 노출 시 살상되는 과정을 말한다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스-티미딘 키나제 (HSV-tk) 유전자 (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977))를 포함하는 세포는 약물 갱시클로비르 (GANC)에 민감하다. 유사하게, gpt 유전자는 6-티오잔틴에 민감한 세포를 만든다.
포유동물 발현 시스템은 또한 생체내 및 생체외 발현을 위해 특이적으로 설계된 벡터를 포함한다. 이러한 시스템은 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다 (미국 특허 5,604,090). AAV 벡터는 인간 및 마우스에서 치료적 유익을 위해 충분한 수준으로 인자 IX의 발현을 제공하는 것으로 이전에 밝혀져 왔다 (Kay et al., Nat. Genet. 24: 257 (2000); Nakai et al., Blood 91: 4600 (1998)). 아데노바이러스 벡터 (미국 특허 5,700,470, 5,731,172 및 5,928,944), 헤르페스 심플렉스 벡터 (미국 특허 5,501,979) 및 레트로바이러스 (예로, 렌티바이러스 벡터는 분열 세포뿐만 아니라 비-분열 세포 및 발포성 바이러스를 감염시키는데 유용함) 벡터 (미국 특허 5,624,820, 5,693,508, 5,665,577, 6,013,516 및 5,674,703 및 국제특허출원 WO92/05266 및 WO92/14829) 및 파필로마 바이러스 벡터 (예로, 인간 및 소 유두종 바이러스)는 모두 유전자 치료법에 채용되어 왔다 (미국 특허 5,719,054). 벡터는 또한 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 기반의 벡터를 포함한다 (미국 특허 5,561,063). 장관의 세포에 유전자를 효율적으로 전달하는 벡터가 개발되었고, 또한 사용될 수 있다 (예로, 미국 특허 5,821,235, 5,786,340 및 6,110,456 참조). 효모에서, 예를 들어 상동성 재조합을 통해 염색체 내로의 외래 핵산 서열의 도입을 용이하게 하는 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 효모 인공 염색체 (YAC)는 전형적으로 삽입된 핵산이 통상적인 벡터에 비해 너무 큰 경우에 사용된다 (예로, 약 12kb 이상).
일 구현예에서, 본 발명에 사용하는 파지미드 벡터는 본 발명의 항체/항체 주형/FR 라이브러리의 생산에 적합한 당해 기술분야에서 입수가능한 임의의 것을 포함하며, 파지미드 벡터 pCB04, pIT1, pIT2, CANTAB 6, pComb 3 HS를 포함한다. 필라멘트형 벡터 및 파지미드의 제작 방법은 예를 들어 미국 특허 6,054,312 및 6,803,230에 기술되어 있다. 세포질 박테리오파지 또는 용해성 파지로 공지된 비-필라멘트형 박테리오파지 벡터가 관여하는 박테리오파지 디스플레이 시스템은 또한, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 제 5,766,905호에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 박테리아 발현 구조물은 이에 한정되지는 않지만, pCAL, pUC, pET, pETBlue™(Novagen), pBAD, pLEX, pTrcHis2, pSE280, pSE380, pSE420 (Invitrogen), pKK223-2 (Clontech), pTrc99A, pKK223-3, pRIT2T, pMC1871, pEZZ 18 (Pharmacia), pBluescript II SK (Stratagene), pALTER-Ex1, pALTER-Ex2, pGEMEX (Promega), pFivE (MBI), pQE (Qiagen) 시판되는 입수가능한 발현 구조물 및 이의 유도체 및 당해 기술분야에 공지된 다른 것을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 구조물은 또한 바이러스, 플라스미드, 미드, 파지 미드, 코스미드 또는 박테리오파지를 포함할 수 있다.
핵산을 포함하여 다양한 조성물을 세포 내로 도입시키기 위한 리포좀의 사용은 당업자에게 공지되어 있다 (예로, 미국 특허 4,844,904, 5,000,959, 4,863,740 및 4,975,282 참조). 국제특허출원 WO 94/20078 및 미국 특허 6,096,291에 기술된 천연 중합체 또는 천연 중합체의 유도체 또는 가수분해물을 포함하는 담체는 폴리펩타이드 및 폴리핵산과 같은 분자의 점막 전달에 적합하다. 유전자 치료법에 유용한 피페라진 기반의 양친화성 양이온성 지질도 공지되어있다 (예로, 미국 특허 5,861,397 참조). 양이온성 지질 시스템이 또한 공지되어 있다 (예로, 미국 특허 5,459,127 참조). 따라서, 바이러스 또는 비-바이러스성 벡터를 세포 또는 조직내로, 시험관내, 생체내 및 생체외로 전달하는 수단이 포함된다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 발현 조절 서열의 기능을 보장하기 위해 "작동가능하게 연결" 예로 위치될 수 있다. 이들 발현 구조물은 전형적으로 에피좀 또는 세포의 염색체 DNA의 도입 부분으로서 세포에서 복제 가능하며, 발현에 채용되는 각각의 원핵세포 균주를 위한 적절한 복제원점을 포함할 수 있다. 통상적으로, 발현 구조물은 예를 들어 테트라사이클린 저항성, 암피실린 저, 카나마이신 저항성 또는 클로람페니콜 저항성과 같은 선별 마커를 포함하여, 원하는 핵산 서열로 형질 전환된 박테리아 세포의 검출 및/또는 선별을 용이하게 한다 (예로, 미국 특허 4,704,362 참조). 그러나, 이들 마커는 배타적이지 않고, 당업자에게 공지된 바와 같이 수많은 다른 마커가 채용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 발현 구조물은 양성 및 음성 선별 마커 모두를 포함한다.
유사하게, 리포터 유전자는 전사된 산물의 확인을 용이하게 하기 위해 발현 구조물 내에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 사용된 리포터 유전자는 β갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 루시퍼라제 및 형광성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
원핵 프로모터 서열은 인코딩된 폴리핵산 서열의 발현을 조절하고, 본 발명의 일부 구현예에서는 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리핵산에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 이들 프로모터는 구성발현성 또는 유도성이고, 본 발명의 폴리펩타이드의 고수준 및 저수준 발현의 수단을 제공하고, 일부 구현예에서는 본 발명의 다수의 폴리펩타이드의 조절된 발현을 제공하며, 이는 일부 구현예에서는 융합 단백질로서 발현된다.
T7 프로모터 시스템, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (Trp) 프로모터 시스템, Trc/Tac 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, tetA 프로모터 시스템, 아라비노스 조절성 프로모터 시스템, 파지 T5 프로모터 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템을 포함하는 많은 공지된 박테리아 프로모터가 채용될 수 있으며, 다른 것들도 또한 본 발명의 구현예는 포함한다. 전형적으로 프로모터는 선택적으로 작동자 서열로 발현을 조절할 것이며, 예를 들어 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보좀 결합 부위 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 구현예에 따라, 벡터는 발현 조절 서열, 프로모터의 전사 활성을 조절할 수 있는 인핸서, 프로모터에 인접한 삽입물의 클로닝을 용이하게 하는 적당한 제한효소 부위 및 RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열과 같은 기타 필요한 정보 프로세싱 부위뿐만 아니라 삽입된 핵산의 발현을 용이하게 할 수 있는 임의의 다른 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 폴리핵산, 벡터, 항체 및/또는 이의 단편 및/또는 이를 포함하는 조성물의 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 데 사용 방법을 포함한다.
PSMA의 검출
본원에서 제공된 항체, 항원-결합 단편 또는 조성물은 진단적 또는 치료적 절차에 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
일 구현예에서, 본원에서는 대상에서 종양 또는 암 성장의 존재를 진단하는 방법이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 본 명세서에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물과 함께 대상으로부터 단리된 조직 시료을 시료화하고, 이로써 조직 시료에 대한 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 특이적 결합이 대상에서 종양의 존재 또는 암 성장을 나타내는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하지만 항체 또는 항원-결합 단편의 그 표적에 대한 결합을 길항하지 않는 이차 시약을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, "이차 시약"은 광활성화 가능한 제제, 형광 발색단, 방사성 동위원소, 생체발광성 단백질, 생체발광성 펩타이드, 형광성 태그, 형광성 단백질 또는 형광성 펩타이드이다.
일 구현예에서, 용어 "암" 및 "암성"은 일 구현예에서 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 조건을 말하거나 이를 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 (지질육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 신경종, 수막종, 샘암종, 흑색종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 용어 "암"은 난소암, 유방암, 교모세포종, 위장암을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 구현예에서, 암은 전립선 암이다.
또 다른 구현예에서, "시료화"는 항체 또는 항원-결합 단편이 표적에 특이적으로 결합될 때 항체 또는 항원-결합 단편과 복합체화 되거나 컨쥬게이션되어 검출가능한 "신호"를 방출하는 이차 시약의 검출을 가능하게 하는 검출 검정법을 사용하여 시료를 시험하거나 분석하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 검출은 이에 한정되지는 않지만 면역학적 검정 (예로, 면역조직화학, ELISA 등) 또는 현미경 영상화와 같은 당해 기술분야에서 일상적으로 사용되는 검정법을 사용하여 달성된다.
일 구현예에서, 용어 "표지된"은 스크리닝으로 검출을 가능하게 하기 위해 부착된 하나 이상의 원소, 동위원소 또는 화학적 화합물을 갖는 본 발명의 항체를 말한다. 일반적으로 표지는 세 가지 종류로 나뉜다: a) 항체에 의해 인식되는 융합 파트너로 도입된 에피토프일 수 있는 면역 표지, b) 방사성 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소 표지 및 c) 형광성 및 비색측정 염료 또는 다른 표지 방법을 가능하게 하는 바이오틴과 같은 분자가 포함될 수 있는 소분자 표지. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 바이오틴으로 표지된다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 바이오틴화 항체는 예를 들어 영상화제 또는 하나 이상의 리간드 분자를 확인하는 수단으로서 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표지는 일단 항체 또는 항원-결합 단편에 결합되면 검출되거나 시각화될 수 있는 나노입자일 수 있다. 표지는 임의의 위치에서 화합물 내에 도입될 수 있으며 단백질 발현 동안 시험관내 또는 생체내에서 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 및 본원에 제공된 이차 시약에 의해 형성된 컨쥬게이트는 이에 한정되지는 않지만 유동 세포계측법, ELISA, 웨스턴 블럿팅, 면역조직화학법, 막 검정법 및 진단적 및 치료적 방법과 같은 다양한 적용에, 본원에 추가로 기술되는 바 또는 당해 기술분야에 일상적으로 적용되는 바와 같이 사용된다.
비정상적인 PSMA 발현을 갖는 종양의 영상화
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 표적 항원, 단백질 또는 다른 분자의 부적절한 발현이 관여하는 질환을 갖는 대상에게 투여된다. 예를 들어, 일 구현예에서, PSMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 투여하여 대상에서 PSMA의 존재, 풍부, 위치 또는 이들의 조합을 검출할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 이것은 예를 들어 존재하는 단백질의 양, 단백질 국소화, 번역후 변형, 입체구조적 상태, 돌연변이체 또는 병원체 단백질의 존재 등의 변경으로 인한 이상 단백질로 특성화되는 질환 및 장애를 포함하도록 의미한다. 유사하게, 질환 또는 장애는 다당류 및 갱글리오시드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 분자의 변경에 의해 특성화될 수 있다. 과잉은 분자 수준에서의 과발현, 작용 부위에서의 연장되거나 축적된 출현, 또는 정상에 비해 단백질의 증가된 활성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 원인에 기인할 수 있다. 이 정의 내에는 단백질의 감소를 특징으로 하는 질환 및 장애가 포함된다. 이러한 감소는 분자 수준에서의 발현 감소, 작용 부위에서의 단축되거나 감소된 출현, 단백질의 돌연변이체 형태 또는 정상에 비해 단백질 감소된 활성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 원인에 기인 할 수 있다. 이러한 단백질의 과잉 또는 감소는 단백질의 정상적인 발현, 출현 또는 활성과 비교하여 측정될 수 있으며, 상기 측정은 본 발명의 항체의 개발 및/또는 임상 시험에서 중요한 역할을 할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 대상에게 투여될 때 전립선 암 세포과 같은 종양 세포 상에 발현된 항원에 결합하고; 또 다른 구현예에서, 대상에게 투여된 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 폐암, 간암, 췌장암, 결장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 전립선 암, 방광암, 흑색종, 신경아교종 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 PMSA 양성 신생혈관을 갖는 종양과 같은 고형 종양의 신생혈관 상에 발현된 항원에 결합한다.
일 구현예에서, PSMA-포함 종양을 영상화하는 방법이 본원에 제공된다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 이차 시약에 작동가능하게 연결된 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 적용하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 전립선 또는 다른 유형의 고형 종양은 일단 항체 또는 항원-결합 단편이 그의 표적에 결합하면 시각화될 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, 이차 시약은 광활성화 가능한 제제, 형광 발색단, 방사성 동위원소, 생체발광성 단백질, 생체발광성 펩타이드, 형광성 태그, 형광성 단백질 또는 형광성 펩타이드이다. 이차 시약의 비-제한적인 예는 하기에 제공된다.
일 구현예에서, 검출가능한 표지 또는 이에 부착된 이차 시약은, 이에 한정되지 않지만 형광성 표지 (예로, 플루오레신, 이소티오시아네이트 (FITC), 시아닌 염료 등), 친화성 표지 (예로, 바이오틴, 아비딘, 단백질 A 등), 효소 표지 (예로, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 동위원소 표지 (예로, 124I) 또는 항체의 검출 및 단리를 허용하는 기타 검출가능한 분체와 같은 표지를 포함한다.
변경된 가변 영역의 집단 내의 결합 종의 확인을 위한 검출 방법은 직접 또는 간접적일 수 있으며, 예를 들어 광 방출, 방사성 동위원소, 비색측정 염료 및 플루오로크롬의 측정을 포함할 수 있다. 직접 검출은 결합된 항원 또는 리간드의 양을 평가하도록 중간의 또는 이차 측정 절차가 없이 작동하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 일반적으로 예를 들어 방사성, 광 방출 또는 형광성 분체에 의해 자체 표지된 리간드를 채용한다. 대조적으로, 간접 검출은 중간의 또는 이차 측정 절차를 통해 작동하는 방법을 포함한다. 이들 방법은 일반적으로 항원 또는 리간드와 특이적으로 반응하는 분자를 채용하며, 직접적으로 이 차 시약에 의해 자체 표지되거나 검출될 수 있다. 예를 들어, 리간드에 특이적인 항체는 리간드에 특이적인 제 1 항체와 상호작용할 수 있는 이차 항체를 사용하고, 다시 직접 검출을 위해 상기 기술된 검출 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 간접 방법은 효소 표지에 의한 검출을 추가적으로 채용할 수 있다. 또한, 촉매 항체의 스크리닝의 상세한 예의 경우, 기질의 소실 또는 산물의 출현은 결합 친화성 또는 촉매 활성의 간접적인 척도로서 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 근적외선 염료로 표지된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 IRDye800CW 또는 인도시아닌 그린 (ICG)으로 표지될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 111In, 177Lu, 90Y, 166Ho, 153Sm, 215Bi 및 225Ac를 포함하나 이에 한정되지 않는 방사성 금속 이온을 폴리펩타이드에 컨쥬게이션하는데 유용한 거대고리 킬레이팅제에 부착된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체에 부착된 거대고리 킬레이팅제와 관련된 방사성 금속 이온은 111In이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드에 부착된 거대고리 킬레이팅제와 관련된 방사성 금속 이온은 90Y이다. 상세한 구현예에서, 거대고리 킬레이팅제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N'''-테트라아세트산 (DOTA)이다. 상세한 구현예에서, 거대고리 킬레이팅제는 쿼드라쳐-(5-이소티오시아나토-2-메톡시페닐)-1,4,7,10-테트라아자-시클로-데칸-1,4,7,10-테트라아세트산이다. 다른 상세한 구현예에서, DOTA는 링커 분자를 통해 본 발명의 항체에 부착된다. DOTA와 같은 거대고리 킬레이팅제를 폴리펩타이드에 컨쥬게이션하는데 유용한 링커 분자의 예는 당해 기술분야에 공통적으로 공지되어 있다. 예를 들어 본원에서 그들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 DeNardo et al., Clin Cancer Res. 4(10): 2483-90, 1998; Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4): 553-7, 1999; and Zimmerman et al, Nucl. Med. Biol. 26 (8): 943-50, 1999 참조. 또한, 미국 특허 5,652,361 및 5,756,065는 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 킬레이팅제 및 이들을 제조하고 사용하는 방법을 개시하고, 본원에서 그들의 전문이 참고문헌으로 인용된다.
치료 방법
본 발명은 또한 상기 항체 또는 항원-결합 단편으로 상기 종양 세포를 표적화하는 단계를 포함하는, 대상에서 PSMA-발현 암을 치료하는 방법을 제공한다.
소정의 구현예에서, 상기 방법은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 독소, 방사성 동위원소, 나노입자 또는 생체-활성 펩타이드인 생물학적 활성 제제 또는 이러한 제제의 조합에 작동가능하게 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 PSMA 고발현 세포를 상기 항체 또는 항원 결합 단편으로 표적화하는 단계를 포함하는, 전립선 암 또는 신생혈관에서 PSMA 고발현을 갖는 고형 종양과 같은 비정상적인 PSMA 발현을 갖는 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 PSMA 고발현과 연관된 종양을 가진 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 독소, 방사성 동위원소, 나노입자 또는 생체-활성 펩타이드인 생물학적 활성 제제 또는 이러한 제제의 조합에 작동가능하게 연결된다. 이러한 종양은 전립선 암, 폐암, 간암, 췌장암, 결장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 전립선 암, 방광암, 흑색종, 신경아교종 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 본원에서는 대상에서 종양을 저해하거나 억제하는 방법이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에서는 대상에서 고형 종양의 진행을 지연시키는 방법이 제공된다. 또한 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상은 고형 종양의 혈관에 대한 면역 반응을 일으키고, 이로써 대상에서 고형 종양의 진행을 지연시킨다.
일 구현예에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 분자 및 서열의 적절한 기능 또는 발현을 보장하는 방식으로 두 개 이상의 분자 또는 서열의 위치 설정/연결을 말한다.
일 구현예에서, 용어 "치료적 유효량"은 주어진 조건 및 투여 요법에 치료적 효과를 제공하는 양을 말한다. 본 발명에서, 치료적 효과는 종양 성장, 침윤, 전파, 전이 또는 재발의 예방 또는 억제, 바람직하게는 종양 부하의 감소 또는 환자 성과의 개선이다.
일 구현예에서, 용어 "예방하거나 치료하는"은 다음의 임의의 하나 이상을 말한다: 증상 발병의 지연, 증상의 중증도 감소, 급성 에피소드의 중증도 감소, 증상의 횟수 감소, 질환-관련 증상의 발병 감소, 증상 대기 시간의 감소, 증상의 완화, 이차 증상 감소, 이차 감염 감소, 환자 생존의 연장, 질환의 재발 방지, 재발 에피소드의 횟수 또는 빈도 감소, 증상 에피소드 간 대기 시간의 증가, 정체된 진행 시간의 증가, 완화의 가속화, 완화의 유도, 완화의 강화, 회복 속도 증가 또는 대체 치료제에 대한 효능 증가 또는 이에 대한 저항성 감소. 일 구현예에서, "치료하는"은 요법적 치료 및 예방적 또는 방지 조치 모두를 말하며, 목적은 상기에 기술된 바와 같은 표적화된 병리적 상태 또는 장애를 예방시키거나 감소시키는 것이다.
또 다른 구현예에서, "증상"은 본 명세서에서 상기 기술된 바와 같은 질환 또는 병리학적 상태의 소견이다.
또 다른 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 단백질 분해 저해제, 약제학적 담체, 희석제 및 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드, 항체 또는 항원-결합 단편을 단독으로 또는 일부 구현예에서는 제 2 약제학적 활성 제제와 조합하여 포함한다. 일 구현예에서, 용어 "약제학적 활성 제제"는 지시된 목적을 만족시키는 임의의 약제를 말한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 활성 제제는 화학요법 약물, 방사선요법 약물, 혈관신생 저해제, 종양 영상화 프로브, 면역조절제 또는 임의의 다른 종양 요법 및/또는 영상화 약물/제제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 구현예에서, 본원에서는 대상에서 종양의 치료를 위해 본 발명의 생물학적 활성 제제 및 항체 또는 항원-결합 단편을 전달하는 방법이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 활성 제제 및 항체 또는 항원-결합 단편을 동시에 그러나 개별적으로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 활성 제제 및 항체 또는 항원-결합 단편을 별도로 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 그 자체가 "생물학적 활성"이며, 이는 심지어 변형 후, 상세하게 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제하는 표적 항원에 결합 시에도, 또한 조절 상세하게 항원-매개성 신호전달 및 항원-매개성 질환의 예방 또는 치료의 억제의 견지에서 이들의 상응하는 모 항체의 생물학적 작용 또는 증진된 작용을 발휘할 수 있음을 의미한다. 본원에 기술된 임의의 생물학적 활성 제제와 관련하여 사용될 때 용어 "생물학적 활성"은 또한 당업자라면 이해할 바와 같이 예방적, 진단적 또는 치료적 효과를 유도할 수 있는 방식으로 면역 반응을 조절할 수 있는 제제의 능력을 말한다. 일부 구현예에서, 이러한 생물학적 활성을 달성하는데 사용되는 제제는 당업자라면 이해할 바와 같이 사이토카인, 효소, 케모카인, 방사성 동위원소, 효소적 활성 독소, 치료용 나노입자 또는 화학치료제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
대안적인 구현예에서, 항체의 폴리펩타이드는 항체 의존성 효소 매개성 전구약물 요법 (ADEPT)을 채용하기 위해 의도된 목적으로 효소로 기능하도록 컨쥬게이션되거나 작동가능하게 연결된다. ADEPT는 전구약물 (예로, 펩티딜 화학치료제)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체 또는 Fc 융합체를 컨쥬게이션하거나 작동가능하게 연결시킴으로써 사용될 수 있다. ADEPT에 유용한 면역복합체의 효소 성분은 전구약물에 작용하여 이를 더 큰 활성, 세포독성 형태로 전환시킬 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 본원에 제공된 변형된 분자의 다른 추가적인 변형이 본원에 고려된다. 예를 들어, 폴리펩타이드/항체는 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중 합체에 연결될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에서 제공된 항체/폴리펩타이드는 하나 이상의 면역조절제와 함께 투여된다. 이러한 제제는 하나 이상의 사이토카인의 생산을 증가 또는 감소시키거나, 자체-항원 제시를 상향- 또는 하향-조절하거나, MHC 항원을 차단하거나, 하나 이상의 유형의 면역세포의 증식, 분화, 이동 또는 활성화 상태를 촉진시킬 수 있다. 면역조절제는 이에 한정되지는 않지만 다음을 포함한다: 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕시브, 디클로페낙, 에토돌락, 페노프로펜, 인도메타신, 케토라락, 옥사프로진, 나부멘톤, 설린닥, 톨멘틴,로 페콕시브, 나프록센, 케토프로펜 및 나부메톤과 같은 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID); 스테로이드 (예로, 글루코코티코이드, 덱사메타손, 코티손, 하이드록시 코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론, 트림시놀론, 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리엔과 같은 아자피리 디코사노이드); 뿐만 아니라 안트라랄, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐과 같은 국소 스테로이드; TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL-2, IL-4, IL-10과 같은 사이토카인; BATF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD15, CD17, CD18, CD2O, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD52, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, 보체인자 (C5, D) CTLA4, 에오탁신, Fas, ICAM, ICOS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFNAR, IgE, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9 IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, 인테그린, LFA-1, LFA-3, MHC, 셀렉틴, TGF-β, TNF-α, TNF-β, TNF-R1, 엔브렐®(에타네르셉트), 휴미라® (아달리무마브), 레미케이드 (인플릭시마브), PD1 항체 (OPDIVO®(니볼루마브), KEYTRUDA®(펨브로리주마브)) 또는 PD-L1 항체 (두르발루마브, MPDL3280A)를 포함하는 T-세포 수용체에 대한 항체, 용해성 수용체 및 수용체-Fc 융합체를 포함하는 사이토카인, 케모카인 또는 수용체 길항제; 이종 항-림프구 글로불린; 2-아미노-6-아릴-5 치환된 피리미딘, MHC 결합 펩타이드 및 MHC 단편에 대한 항-이디오형 항체, 아자티오프린, 브리퀴나르, 브로모크립틴, 시클로포스파마이드, 시클로스포린 A, D-페니실라민, 데옥시스페구아린, FK506, 글루타르알데히드, 골드, 하이드록시클로로킨, 레플루노미드, 말로노니트릴로아미드 (예로, 레플루노미드), 메토트렉세이트, 미노사이클린, 미조리빈, 마이코 페놀레이트 모페틸, 라파마이신 및 설파사사진과 같은 기타 면역조절성 분자.
대안의 구현예에서, 본 발명의 항체는 사이토카인과 함께 투여된다. 본원에 사용된 바, "사이토카인"은 세포간 매개인자로서 또 다른 세포에 작용하는, 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질의 일반명 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포 인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에는 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양괴사인자-α 및 -β; 뮬러-억제 물질; 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩타이드; 인히틴; 액티빈; 혈관 내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장인자; 혈소판 성장인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질 전환 성장인자 (TGF); 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도인자; 인터페론-알파, 베타 및 감마와 같은 인터페론; 대식구-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니 자극인자 (CSF); 과립구-대식구-CSF (GM-CSF); 과립구-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15와 같은 인터루킨 (IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양괴사인자; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 포함한 기타 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 미가공 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
화학치료제 또는 다른 세포독성 제제는 전구약물로서 투여될 수 있다. 용어 "전구약물"은 모 약물과 비교하여 종양 세포에 대한 세포독성이 적고, 효소적으로 활성화되거나 더 활성이 큰 모 형태로 전환될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 예를 들어, Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14: 375-382; 및 Stella et al., “A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.): 247-267, Humana Press, 1985 참조. 본원에서 제공된 바와 같은 조성물 및 방법과 함께 용도를 발견할 수 있는 전구약물은 이에 한정되지는 않지만 인산염-포함 전구약물, 티오인산염-포함 전구약물, 황산염 포함 전구약물, 펩타이드-포함 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-포함 전구약물, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아미드-포함 전구약물 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드-포함 전구약물, 5-플루오로시토신 및 더 활성이 큰 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 기타 5- 플루오로우리딘 전구약물을 포함한다. 본원에서 제공된 조성물 및 방법의 항체/폴리펩타이드와 함께 사용하는 전구약물 형태로 유도체화 될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 임의의 전술한 화학치료제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 항체/폴리펩타이드와 상기 명시된 생물학적 활성 제제, 예로 사이토카인, 효소, 케모카인, 방사성 동위원소, 효소적 활성 독소 또는 화학치료제의 임의의 조합이 적용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 항체/폴리펩타이드는 둘 모두가 원하는 예방적, 진단적 또는 치료적 효과를 달성하도록 생물학적 활성 제제와 작동가능하게 연결되어 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있거나, 본원에서 제공된 항체/폴리펩타이드는 생물학적 활성 제제와 조합하여 별도로 투여되는 방식으로 (예로, 컨쥬게이션되지 않음) 단지 사용될 수 있다.
PSMA 표적화 항체 약물 컨쥬게이트
일 구현예에서, 본 발명은 화학치료제, 약물, 성장 저해제, 독소 (예로, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소 (예로, 방사성 컨쥬게이트)와 같은 세포독성 제제에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 제공한다. 일 상세한 구현예에서, 약물은 튜불린 저해제 및 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴 및 칼리케아미신과 같은 DNA 절단시약을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 ADC를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 일 관점에서, ADC는 세포독성 제제 또는 검출가능한 제제에 공유 결합된 임의의 상기 PSMA 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
세포독성 제제 또는 세포증식 억제제, 예로 암의 치료에서 종양 세포를 살상하거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트의 사용은 (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; 미국 특허 4,975,278) 종양에 약물 분체의 표적 전달 및 이의 세포내 축적을 허용하며, 컨쥬게이션되지 않은 이들 약물 제제의 전신적 투여는 정상 세포뿐만 아니라 제거하려는 종양 세포에 허용가능하지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있다 (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986): 603-05; Thorpe, (1985) “Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 이에 의해 최소의 독성으로 최대의 효능을 찾는다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체 둘 모두가 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986) 상기 참조). 항체-독소 컨쥬게이트에 사용되는 독소는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 젤다나마이신과 같은 소분자 독소를 포함한다 (Mandler et al (2000) Jour of the Nat.Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), and calicheamicin (Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 기작에 의해 세포독성 및 세포증식억제 효과에 영향을 미칠 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이션될 때 불활성이거나 덜 활성되는 경향이 있다.
항체 약물 컨쥬게이트의 예는 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에 발견되는 CD20 항원에게로 유도된 마우스 IgG1 카파 단일클론 항체 및 티오우레아 링커-킬레이팅제에 의해 결합된 111In 또는 90Y로 구성된 항체-방사성 동위원소 컨쥬게이트인 제발린® (이브리투모마브 티우제탄, Biogen/Idec)이다 (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7): 766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12): 4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69).
추가적으로, 칼리케아미신에 연결된 인간 CD33 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트인 MYLOTARG™ (젬투주마브, Wyeth Pharmaceuticals)는 2000년에 주사에 의한 급성 골수성 백혈병 치료제로 승인 받았다 (Drugs of the Future (2000) 25 (7)): 686; 미국 특허 4,970,198; 5,079,233; 5,585,089; 5,606,040; 5,693,762; 5,739,116; 5,767,285; 5,773,001).
마침내, 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE), 돌라스타틴의 합성 유사체와 같은 아우리스타틴 펩타이드, 는 키메라 단일클론 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액학적 악성 종양의 CD30에 특이적)에 컨쥬게이션시켰다 (Doronina et al 2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784). cAC10은 치료 개발 중이다.
또한, ADC의 생성에 유용한 화학치료제가 본 명세서에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아우루기노사로부터의), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신킨, 아류라이트 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 제로닌, 미토젤린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232 참조. 다양한 방사성 핵종이 방사성 컨쥬게이션된 항체의 생산에 사용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성 제제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예로, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예로, 디숙시니미딜 수베레이트), 알데하이드 (예로, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예로, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예로, 비스-(p-디아조늄 벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예로, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예로, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로 벤젠)와 같은 다양한 이중기능성 단백질-커플링제를 사용하여 만들어진다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al (1987) Science, 238: 1098에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사 핵산을 항체에 컨쥬게이션하는 대표적인 킬레이팅제이다 (국제특허출원 WO94/11026).
항체 및 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리코테센 및 CC1065와 같은 하나 이상의 소분자 독소 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 컨쥬게이트도 역시 본원에서 고려된다.
메이탄시노이드:
메이탄시노이드 약물 분체로서 사용하기에 적합한 메이탄신 (Maytansine) 화합물은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 원료로부터 단리되거나, 유전공학 기술 (Yu et al (2002) PNAS 99: 7968-7973 참조)을 사용하여 생산될 수 있거나, 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조된 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체로부터 얻을 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 분체는 다음과 같은 변형된 방향족 고리를 갖는 것들을 포함한다: C-19-데클로로 (미국 특허 4,256,746) (안사미토신 P2의 리튬 알루미늄 하이드라이드 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드 록시 (또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로 (미국 특허 4,361,650 및 4,307,016) (스트렙토마이세스 또는 액티노마이세스를 사용한 탈메틸화 및 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/- 데클로로 (미국 특허 4,294,757) (아실클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨).
예시적인 메이탄시노이드 약물 분체는 또한 다음과 같은 변형을 갖는 것들을 포함한다: C-9-SH (미국 특허 4,424,219) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) (미국 특허 4,331,598); C-14 하이록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 4,450,254) (Nocardia로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시 (미국 특허 4,364,866) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시 (미국 특허 4,313,946 및 4,315,929) (트레위아 누들플로라로부터 분리됨); C-18-N- 데메틸 (미국 특허 4,362,663 및 4,322,348) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 (미국 특허 4,371,533) (메이탄시놀의 삼염화 티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨).
메이탄시노이드를 포함하는 ADC, 이의 제조 방법 및 이의 치료적 용도는, 예를 들어 본원에서 참고문헌으로 명백하게 통합되는 미국 특허 5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996)은 인간 결장직장암에게 유도되는 단일클론 항체 C242에 연결된 DM1으로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 ADC를 기술하고 있다. 컨쥬게이트는 배양된 대장암 세포에 대해 세포독성이 높은 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 검정법에서 항종양 활성을 보였다. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)는 메이탄시노이드가 디설파이드 링커를 통해 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 마우스 항체 A7 또는 HER-2/neu 종양원유전자에 결합하는 또 다른 마우스 단일클론 항체 TA.1에 컨쥬게이션된 ADC를 기술한다. TA.1-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은 세포 당 3 × 105개 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 테스트되었다. 약물 컨쥬게이트는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 수준의 세포독성을 나타냈으며, 이는 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. A7-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.
예시적인 메이탄시노이드 구현예는 DM1 (식 중, 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 공유 결합을 표시함)이다.
Figure 112018125405303-pct00003
아우리스타틴 및 돌라스타틴:
일부 구현예에서, ADC는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴 (미국 특허 5,635,483; 5,780,588)에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 동력학, GTP 가수분해, 핵 및 세포 분열 (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584)에 개입하고, 항암제 (미국 특허 5,663,149) 및 항진균 활성 (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965)을 가지는 것으로 관찰되었다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 분체는 펩타이드성 약물 분체의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복시) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (국제특허출원 WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 구현예는 “ et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented Mar. 28, 2004에 개시되고, 본원에 개시 내용이 참고문헌으로 전문이 통합되는 미국 특허공개 2005/0238649에 기술된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 분체 DE 및 DF를 포함한다.
다양한 링커 성분과 함께 MMAE 및 MMAF를 사용하는 ADC가 개시되었다 (미국 특허공개 2005/0238649, 미국 특허 08968742).
예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAE (식 중, 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 공유 결합을 표시함)이다.
Figure 112018125405303-pct00004
또 다른 예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAF이고, 식 중 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 공유 결합을 표시한다 (미국 특허공개 2005/0238649):
Figure 112018125405303-pct00005
전형적으로, 펩타이드-기초 약물 분체는 두 개 이상의 아미노산 및/또는 펩타이드 단편 사이에 펩타이드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩타이드 결합은, 예를 들어 펩타이드화학의 분야에서 공지된 액상 합성법에 따라 제조될 수 있다 (E. Schr
Figure 112018125405303-pct00006
der and K. L
Figure 112018125405303-pct00007
bke, “”참조). 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 분체는 다음의 방법에 따라 제조될 수 있다: 미국 특허 5,635,483; 5,780,588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863; 및 Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784.
칼리케아미신:
다른 구현예에서, ADC는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 이중가닥 DNA 절단을 일으킬 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 컨쥬게이트의 제조에 대해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296 (모두 American Cyanamid 소유) 참조. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γI, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) 및 American Cyanamid의 전술한 미국 특허). 항체가 컨쥬게이션될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 모두 세포내 작용 부위를 가지고 있으며 원형질막을 바로 통과하지 못한다. 따라서, 항체 매개성 내재화를 통한 이들 제제의 세포내 섭취는 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
기타 세포독성 제제:
본 발명의 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실 및 미국 특허 5,053,394 및 5,770,710에 기술된 종합적으로 LL-E33288로 알려진 제제의 패밀리 뿐만 아니라 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아우루기노사로부터의), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신킨, 아류라이트 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 제로닌, 미토젤린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232 참조.
본 발명은 또한 핵산분해 활성 (예로, 리보뉴클레아제 또는 디옥시리보뉴클레아제, Dnase와 같은 DNA 엔도뉴클레아제)을 갖는 항체와 화합물 사이에 형성된 ADC를 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위해, 항체는 높은 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 컨쥬게이션된 항체의 생산에 사용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 컨쥬게이트가 검출에 사용될 때, 신티그라피 연구용 방사성 원자 예를 들어 tc99m 또는 I123 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화용 (자기공명 영상화, mri로도 공지됨) 스핀 표지 예를 들어 요오드-123, 다시 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 기타 표지는 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 생합성될 수 있거나, 예를 들어 수소 대신에 불소-19가 관여하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 펩타이드의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)은 요오드-123을 도입하는데 사용될 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)은 다른 방법을 자세하게 기술하고 있다.
PSMA 표적화 항체-약물 컨쥬게이트 화합물:
본 발명은 특히 약물의 표적화된 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트 화합물을 제공한다. 본 발명자들은 항체-약물 컨쥬게이트 화합물이 PSMA를 발현하는 세포에 대해 강력한 세포독성 및/또는 세포증식억제 활성을 가지는 점을 발견하였다. 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 적어도 하나의 약물 단위에 공유 결합된 항체 단위를 포함한다. 약물 단위는 직접적으로 또는 링커 단위 (-LU-)를 통해 공유 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 화합물은 다음의 식을 갖는다:
Ab-(LU-D)p
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물; 식 중,
Ab는 항체 단위, 예로 PSMAb와 같은 gy1 또는 이의 돌연변이된 변이체 유래의 본 발명의 완전 항체 또는 항체 단편이고,
(LU-D)는 링커 단위-약물 단위 분체이고,
LU-는 링커 단위이고,
-D는 표적 세포에 대한 세포증식억제 또는 세포독성 활성을 갖는 약물 단위이고,
p는 1 내지 20의 정수이다.
일부 구현예에서, p는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 구현예에서, p는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 구현예에서, p는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, p는 2 또는 4이다.
일부 구현예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 화합물은 다음의 식을 갖는다:
Ab-(Aa-Ww―Yy-D)p
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물: 식 중,
Ab는 항체 단위, 예로 PSMAb와 같은 gy1 또는 이의 돌연변이된 변이체 유래의 본 발명의 완전 항체 또는 항체 단편이고,
-Aa-Ww―Yy― 는 링커 단위 (LU)이고, 식 중,
-A-는 스트레처 단위이고,
a는 0 또는 1이고,
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위이고,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
-Y-는 자가-희생적 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이고,
-D는 표적 세포에 대한 세포증식억제 또는 세포독성 활성을 갖는 약물 단위이고,
p는 1 내지 20의 정수이다.
일부 구현예에서, a는 0 또는 1이고, w는 0 또는 1이고, y는 0, 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, a는 0 또는 1이고, w는 0 또는 1이고, y는 0 또는 1이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 구현예에서, p는 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 구현예에서, p는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, p는 2 또는 4이다. 일부 구현예에서, w가 0이 아닐 때, y는 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, w가 1 내지 12 일 때, y는 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, w는 2 내지 12이고, y는 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, a는 1이고 w 및 y는 0이다.
다수의 항체를 포함하는 조성물의 경우, 약물 부하는 p, 항체 당 평균 약물 분자 수로 나타낸다. 약물 부하는 항체 당 1 내지 20개 약물 (D)의 범위일 수 있다. 컨쥬게이션 반응의 준비에서 항체 당 평균 약물 수는 질량 분광측정법, ELISA 검정법 및 HPLC와 같은 통상적인 수단에 의해 특성화될 수 있다. p의 견지에서 항체-약물-컨쥬게이트의 정량적 분포도 또한 결정될 수 있다. 일부의 경우, p가 다른 약물 부하로 항체-약물-컨쥬게이트로부터의 소정 값인 균질한 항체-약물-컨쥬게이트의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동법과 같은 수단에 의해 달성 될 수 있다. 예시적인 구현예에서, p는 2 내지 8이다.
항체-약물 컨쥬게이트 화합물의 생성은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 간략하게, 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 항체 단위로서 gy1 또는 이의 돌연변이된 변이체 유래의 본 발명의 완전 항체 또는 항체 단편, 약물 및 선택적으로 약물과 결합제를 결합시키는 링커를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 본원의 다른 곳에서 기재한 바와 같이, gy1 또는 점 돌연변이를 갖는 이의 변이체로부터 유도된 항체 또는 항체 단편이다. 다수의 상이한 반응이 결합제에 약물 및/또는 링커의 공유 결합을 위해 사용가능하다. 이것은 종종 결합제의 아미노산 잔기, 예로 라이신의 아민기, 글루탐산 및 아스파라긴산의 유리 카복실산기, 시스테인의 설프히드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 분체를 포함하는 항체 분자의 반응에 의해 달성된다. 공유 결합의 가장 공통적으로 사용되는 비-특이적 방법 중 하나는 화합물의 카르복시 (또는 아미노) 기를 항체의 아미노 (또는 카르복시) 기에 연결시키는 카보디이미드 반응이다. 추가적으로, 화합물의 아미노기를 항체 분자의 아미노기와 연결시키는 데 디알데히드 또는 이미도에스테르와 같은 이중기능성 제제가 사용되어 왔다. 또한 결합제에 약물을 부착하는 데 쉬프 염기 반응도 사용가능하다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시기를 포함하는 약물의 페리오데이트 산화가 관여하여 알데히드를 형성한 다음 결합제와 반응시킨다. 부착은 결합제의 아미노기로의 쉬프 염기의 형성을 통해 일어난다. 이소티오시아네이트는 또한 결합제에 약물을 공유 결합시키는 커플링 제제로서 사용될 수 있다. 다른 기술은 당업자에게 알려져 있으며 본 발명의 범위 내에 있다.
소정의 구현예에서, 링커의 전구체인 중간체는 적절한 조건 하에 약물과 반응한다. 소정의 구현예에서, 반응성 기는 약물 및/또는 중간체 상에서 사용된다. 약물과 중간체 또는 유도체화 약물 간의 반응 산물은 이후 적절한 조건 하에서 gy1 또는 이의 변이체 유래의 완전 항체 또는 항체 단편와 반응한다.
PSMA-표적화 CAR-T 또는 CAR-NK
T 세포를 B 세포 악성 종양과 같은 암 세포 상의 적합한 세포-표면 분자로 재유도하는 데 의존하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 변형된 자가 T 세포 (CART) 치료법을 사용하는 최신 개발은 면역계의 능력을 B 세포 악성 종양 및 기타 암을 치료하는 데 적용하는 유망한 결과를 보여준다 (예로, Sadelain et al., Cancer Discovery 3: 388-398 (2013) 참조). 마우스 유래의 CART19 (예로, "CTL019")의 임상 결과는 CLL 및 어린 시절 ALL로 고생한 환자에서 완전한 완화를 확립할 수 있음을 보여주었다 (Kalos et al., Sci Transl Med 3: 95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365: 725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368: 1509-1518 (2013)). 유전적으로 변형된 T 세포 상의 키메라 항원 수용체가 표적화된 세포를 인식하고 파괴하는 능력 외에도, 성공적인 치료용 T 세포 요법은 시간 경과 시 증식하고 영속될 능력을 가지고, 백혈병 세포 탈출을 모니터링할 필요가 있다. T 세포의 가변 품질은 이것이 에너지, 억제 또는 피로의 결과 여부에 상관없이 CAR로 형질전환된 T 세포의 성능에 영향을 미치지만 수련된 의료진은 이 시점에서 통제가 제한적이다. 효과적이려면, CAR로 변형된 환자 T 세포는 CAR의 항원에 반응하여 영속하고, 증식하는 능력을 유지할 필요가 있다. ALL 환자 T 세포는 마우스 scFv를 포함하는 CART19로 수행할 수 있는 것이 확인되었다 (예로, Grupp et al., NEJM 368: 1509-1518 (2013) 참조).
본 발명은 조작된 T 세포를 재유도하여 PSMA 양성 종양 세포를 인식하여 살상할 키메라 항원 수용체 (CAR) 구조물 내에 도입된 PMSA에 결합하는 완전 인간 항체 단편 (예로, scFv)을 제공함으로써 환자에서 면역 반응을 조절하는 것을 다룬다.
따라서, 일 관점에서, 본 발명은 PSMA 결합 도메인, 막통과 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다 (예로, 보조자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인). 일 구현예에서, CAR은 본원에 기재된 완전 인간 항-PSMA 결합 도메인, 본원에 기재된 막통과 도메인 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예로, 보조자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 인코딩된 인간 항-PSMA 결합 도메인은 본원에 기술된 완전 인간 항-PSMA 결합 도메인의 하나 이상 (예로, 모두 세 개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 및/또는 본원에 기술된 완전 인간 항-PSMA 결합 도메인의 하나 이상 (예로, 모두 세 개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3), 예로 하나 이상 예로 모두 세 개의 LC CDR 및/또는 하나 이상 예로 모두 세 개의 HC CDR을 포함하는 완전 인간 항-PSMA 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 경쇄 가변 영역은 본원에서 기술된 하나, 두 개, 세 개 또는 모두 네 개의 프레임워크 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 중쇄 가변 영역은 하기에 기술된 하나, 두 개, 세 개 또는 모두 네 개의 프레임워크 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 완전 인간 항-PSMA 결합 도메인은 하기 기술된 인간 경쇄 가변 영역 및/또는하기 기술된 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 항-PSMA 결합 도메인은 하기 기술된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 일 구현예에서, 항-PSMA 결합 도메인 (예로, scFv)은 하기 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 중 적어도 하나, 두 개 또는 세 개의 변형 (예로, 치환)이지만 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 가진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 하기 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열; 및/또는 하기 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 중 적어도 하나, 두 개 또는 세 개의 변형 (예로, 치환)이지만 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 가진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 하기 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열 일 구현예에서, 인코딩된 인간 항-PSMA 결합 도메인은 하기 기술되는 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 항-PSMA 결합 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 기술되는 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 인간 항-PSMA 결합 도메인은 scFv이고, 경쇄 가변 영역은 링커 예로 본원에 기술된 링커를 통해 중쇄 가변 영역에 부착된다. 일 구현예에서, 인코딩된 인간 항-PSMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 식 중 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다. 또 다른 구현예에서, 인코딩된 인간 항-PSMA 결합 도메인은 서열번호 37에 기술된 바와 같은 링커 서열을 포함한다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예로 다음의 임의의 배향일 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
소정의 구현예에서, 항-PSMA 결합 도메인은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 항-PSMA 결합 도메인은 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 gy1, gy1-st, gy1-2, gy1-3 또는 PSMAb를 포함한다.
예를 들어, 소정의 구현예에서, 항-PSMA 결합 도메인은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 68 및 서열번호 69 중 하나 이상을 포함한다.
예를 들어, 소정의 구현예에서, 항-PSMA 결합 도메인은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64 및 서열번호 66 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다
일 구현예에서, 인코딩된 막통과 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD27, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막통과 도메인이다. 일 구현예에서, 인코딩된 막통과 도메인은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 막통과 도메인은 서열번호 75의 아미노산 서열 또는 서열번호 75의 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열 중 하나, 두 개 또는 세 개 (예로, 치환)이지만 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예로, 치환)을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 막통과 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 74의 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 인코딩된 항-PSMA 결합 도메인은 힌지 영역, 예로 본원에 기술된 힌지 영역에 의해 막통과 도메인에 연결된다. 일 구현예에서, 인코딩하는 힌지 영역은 서열번호 73의 아미노산 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 힌지 영역을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 72의 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 보조자극 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 보조자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 획득된 기능적 신호전달 도메인이다. 일 구현예에서, 인코딩된 보조자극 도메인은 서열번호 77의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 보조자극 도메인은 서열번호 77의 아미노산 서열 또는 서열번호 77의 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열 중 하나, 두 개 또는 세 개 (예로, 치환)이지만 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예로, 치환)을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 보조자극 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 76의 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 세포내 신호전달 도메인, 예로 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 기능적 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 79의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인코딩된 보조자극 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열 또는 서열번호 79의 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열 중 하나, 두 개 또는 세 개 (예로, 치환)이지만 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예로, 치환)을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 보조자극 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 78의 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR 구조물은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 보조자극 신호 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 리더 서열, 예로 서열번호 71의, 예로 본원에 기술된 리더 서열을 포함하는 CAR 구조물; 본원에 기재된 인간 항-PSMA 결합 도메인, 예로 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 인간 항-PSMA 결합 도메인, 예로 서열번호 1 내지 서열번호 69로부터 나열된 서열 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 항-PSMA 결합 도메인; 예로 서열번호 73의 본원에 기술된 힌지 영역; 본원에 기술된 막통과 도메인, 예로 서열번호 75를 포함하는 막통과 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인, 예로 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 구조물을 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일 구현예에서, 인코딩된 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 도메인, 예로 본원에 기술된 보조자극 도메인, 예로 서열번호 77의 서열을 갖는 4-1BB 보조자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예로 본원에 기술된 일차 신호전달 도메인, 예로 서열번호 79의 서열을 갖는 CD3 제타 보조자극 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR 구조물을 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열번호 71의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 리더 서열 또는 이와 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR은 서열번호 81의 아미노산 서열 또는 이와 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 서열번호 80 또는 이와 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
본 발명은 본원에 기술된 CAR을 인코딩하는 본 발명의 핵산 서열을 발현하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 T-세포이다. 본 발명의 T-세포는 배양된 T-세포, 예로 일차 T-세포 또는 배양된 T-세포주로부터의 T-세포 또는 포유동물로부터 수득된 T-세포와 같은 임의의 T-세포일 수 있다. 포유동물로부터 얻은 경우, T-세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. T-세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. T-세포는 바람직하게는 인간 T-세포 (예로, 사람으로부터 단리됨)이다. T-세포는 CD4+/CD8+ 이중 양성 T-세포, CD4+ 헬퍼 T-세포, 예로, Th 및 Th2 세포, CD8 T-세포 (예로, 세포독성 T-세포), 종양 침윤 세포, 기억 T-세포, 미성숙 T-세포 등을 포함하여 임의의 발생 단계일 수 있다. 일 구현예에서, T-세포는 CD8+ T-세포 또는 CD4+ T-세포이다. T-세포주는 아메리카 타입 배양물 콜렉션 (ATCC, Manassas, VA) 및 독일 미생물 및 세포 배양물 콜렉션 (DSMZ)에서 입수가능하며, 예를 들어 Jurkat 세포 (ATCC TIB-152), Sup-T1 세포 (ATCC CRL-1942), RPMI 8402 세포 (DSMZ ACC-290), Karpas 45 세포 (DSMZ ACC-545) 및 이들의 유도체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 자연 킬러 (NK) 세포이다. NK 세포는 선천성 면역계에서 역할을 하는 세포독성 림프구의 일종이다. NK 세포는 대과립 림프구로서 정의되며, B 및 T 림프구를 유발하는 공통 림프성 전구세포로부터 분화된 세 번째 종류의 세포를 구성한다 (예로, Immunobiology, 5th ed., Janeway et al., eds., Garland Publishing, New York, NY (2001) 참조). NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화되고 성숙한다. 성숙 이후에, NK 세포는 독특한 세포독성 과립을 갖는 대형 림프구로서 혈액 순환에 들어간다. NK 세포는 예를 들어 일부 종양 세포 및 바이러스 감염 세포와 같은 비정상적인 세포를 인식하고 살상할 수 있으며 세포내 병원체에 대한 선천적인 면역 방어에 중요하다고 생각된다. T-세포와 관련하여 상기 기술한 바와 같이, NK 세포는 배양된 NK 세포, 예로 원발성 NK 세포 또는 배양된 NK 세포주로부터의 NK 세포 또는 포유동물로부터 획득된 NK 세포와 같은 임의의 NK 세포일 수 있다. 포유동물로부터 획득된 경우, NK 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는 수많은 공급원으로부터 획득될 수 있다. NK-세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. NK 세포는 바람직하게는 인간 NK 세포 (예로, 사람으로부터 단리됨)이다. NK 세포주는 예로 아메리칸 타입 배양물 콜렉션 (ATCC, Manassas, VA)으로부터 입수가능하고, 예를 들어 NK-92 세포 (ATCC CRL-2407), NK92MI 세포 (ATCC CRL-2408) 및 이의 유도체를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예로 CART 세포의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, CART 세포의 집단은 본원에 기술된 항-PSMA 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제 1 세포 및 상이한 항-PSMA 결합 도메인, 예로 제 1 세포에서 항-PSMA 결합 도메인과 상이한 본원에 기술된 항-PSMA 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제 2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR-발현 세포의 집단은, 예로 본원에 기술된 바와 같은 항-PDSMA 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제 1 세포 및 PSMA (예로, PSCA)가 아닌 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제 2 세포를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CAR-발현 세포의 집단은, 예로 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제 1 세포 및 이차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제 2 세포를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 집단 내의 하나 이상의 세포가 본원에 기술된 항-PSMA 도메인을 갖는 CAR를 발현하고, 제 2 세포가 또 다른 제제 예로 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 제제를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제제는 저해성 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 저해성 분자는 예로 일부 구현예에서, 면역 효과기 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 저해성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 일 구현예에서, 저해성 분자를 억제하는 제제는 예로 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인과 같은 양성 신호를 세포에 제공하는 제 2 폴리펩타이드와 관련된 제 1 폴리펩타이드, 예로 저해성 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제제는 예로 PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타와 같은 저해성 분자 또는 임의의 이들 단편 (예로, 임의의 이들 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인 (예로, 보조자극 도메인 (예로, 본원에 기술된 바와 같이 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인 (예로, 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제 2 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 제제는 PD1의 제 1 폴리펩타이드 또는 이의 단편 (예로, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부) 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인의 제 2 폴리펩타이드 (예로, 본원에 기술된 CD28 신호전달도메인 및/또는 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 하나 이상의 CAR 구조물을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일 관점에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사물로서 제공된다. 일 관점에서, 핵산 분자는 DNA 구조물로서 제공된다.
원하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하거나, 이를 포함하는 것으로부터 공지된 벡터로부터 유전자를 유도하거나, 표준 기술을 사용하여 이를 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 추출함으로써 획득될 수 있다. 대안적으로, 관심있는 유전자는 클론되기 보다는 합성적으로 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 도입 유전자의 장기간 안정된 통합 및 딸 세포에서의 증식을 허용하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비-증식성 세포를 형질도입시킬 수 있는 점에서 마우스 백혈병 바이러스와 같은 종양원-레트로바이러스로부터 유래된 벡터보다 추가된 장점을 가진다. 또한 이것은 낮은 면역원성이라는 부가적인 장점도 가진다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 원하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다. 또 다른 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산의 발현은 슬리핑 뷰티 (sleeping beauty), 크리스퍼, CAS9 및 아연 핑거 뉴클레아제와 같은 트랜스포손을 사용하여 달성될 수 있다. 본원에 참고문헌으로 인용되는 June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716 참조.
간략하게 요약하면, CAR을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결시키고 발현 벡터에 상기 구조물을 도입함으로써 달성된다. 상기 벡터는 복제 및 도입 진핵생물에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다.
본 발명의 발현 구조물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예로, 본원에 그들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 Nos. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 참조. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자요법 벡터를 제공한다.
핵산은 많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열결정 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스성 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스성 벡터 기술은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY 및 다른 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 기술된다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제원점, 프로모터 서열, 편리한 제한효소 부위 및 하나 이상의 선별가능한 마커를 포함한다 (예로, 국제특허출원 WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 6,326,193 참조).
많은 바이러스 기반의 시스템은 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예로, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선별된 유전자는 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자로 포장될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 분리하여 생체내 또는 생체외에서 대상의 세포로 전달할 수 있다. 많은 레트로바이러스 시스템이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 많은 아데노바이러스 벡터가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가적인 프로모터 요소, 예로 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 많은 프로모터가 개시 부위의 하류에 기능적인 요소를 포함하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 개시 부위의 상류 30 내지 110bp 영역에 위치한다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 유연하기 때문에 요소가 서로 역전되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성 감소가 시작하기 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 개별 요소가 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 것으로 보인다.
포유동물 T 세포에서 CAR 형질전환 유전자를 발현할 수 있는 프로모터의 예로는 EF1a 프로모터가 있다. 미가공 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로 효소적 전달을 부여하는 연장인자-1 복합체의 알파 소단위의 발현을 유도한다. EF1a 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되어 왔고, 렌티바이러스 벡터 내에 클로닝된 형질전환 유전자로부터 CAR 발현을 유도하는데 효과적인 것으로 나타났다. 예로 Milone et al., Mol. Ther. 17 (8): 1453-1464 (2009) 참조. 일 관점에서, EF1a 프로모터는 서열번호 100으로서 제공된 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예는 중간초기 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리 뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강한 구성발현성 프로모터 서열이다. 그러나, 다른 구성발현성 프로모터 서열은 또한 이에 한정되지는 않지만, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복서열 (LTR) 프로모터, MoMuLV 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 중간초기 프로모터, 라우육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 이에 한정되지는 않지만 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 연장인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같은 인간 유전자 프로모터를 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성발현성 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현을 원할 때 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 켤 수 있거나, 발현을 원하지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
CAR 폴리펩타이드 또는 이의 단백질의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 포함하여 바이러스 벡터를 통해 형질전환되거나 감염되는 세포 집단으로부터 발현 세포의 동정 및 선별을 용이하게 할 수 있다. 다른 관점에서, 선별 마커는 별도의 DNA 단편 상에 운반되어 공동형질전환 절차에 사용될 수 있다. 선별가능한 마커 및 리포터 유전자 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하도록 적절한 조절 서열로 인접될 수 있다. 유용한 선별 마커는 예를 들어 네오 (neo) 등과 같은 항생제-저항성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수여자 생물 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않는 유전자이며, 일부 쉽게 검출가능한 성질, 예로 효소적 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수여자 세포에 도입되고 난 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 분비성 알칼라인포스파타아제 또는 녹색 형광성 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예로, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 획득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 발현 수준이 가장 높은 최소의 5'-인접 영역을 갖는 구조물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-추진 전사를 조절하는 능력을 위해 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
세포 내로 유전자를 도입하고 발현시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 숙주 세포, 예로 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 당해 기술분야의 임의의 방법에 의해 바로 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전법, 리포펙션, 입자 충격법, 미세주입법, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY 참조. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 바람직한 방법은 칼슘 포스페이트 형질전환이다.
관심있는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물 예로 인간 세포에 유전자를 삽입하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스성 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,350,674 및 5,585,362 참조.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소 구, 비드 및 물-내-오닐 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반의 시스템과 같은 콜로이드성 분산 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 운반체로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀 (예로, 인공막 소포)이다. 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크론 이하 크기 전달 시스템을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 전달과 같은, 핵산의 최첨단 표적화 전달의 다른 방법이 사용가능하다.
비-바이러스성 전달 시스템이 사용되는 경우, 대표적인 전달 운반체는 리포좀이다. 지질 제형의 사용이 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 다른 관점에서, 핵산은 지질과 결합될 수 있다. 지질과 결합된 핵산은 리포좀의 수용성 내부에 피막화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포솜에 포집되거나, 리포좀과 복합화되거나, 지질을 포함하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 현탁액으로서 포함되거나, 미셀과 함께 복합화되거나, 달리 지질과 결합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터와 연관된 조성물은 용액에서 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예로, 이들은 이중층 구조에, 미셀로서 또는 "붕괴된"구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액에 산재될 수 있어, 가능하게는 크기 또는 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성한다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방성 물질이다. 예로, 지질은 지방산, 알코올, 아민, 아미노알코올 및 알데히드와 같은 긴-사슬 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 포함하는 화합물의 종류뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 생기는 지방 방울을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 시판 공급원으로부터 획득될 수 있다. 예로, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO로부터 구입할 수 있고; 디에틸포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, NY)로부터 획득될 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring로부터 획득될 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)로부터 획득될 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에서 지질의 저장 용액은 약 -20℃에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 바로 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포좀"은 밀폐된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 운반체를 포괄하는 일반명 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수용성 매질을 갖는 소포성 구조를 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 다중층 리포좀은 수용성 매질로 분리된 다중 지질층을 갖는다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 이들은 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포집한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상적인 소포성 구조보다 용액에서 상이한 구조를 가진 조성물도 역시 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취하거나 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 달리 세포를 본 발명의 저해제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 검증하기 위해, 다양한 검정법을 수행할 수 있다. 이러한 검정법은 예를 들어 서던 및 노던 블럿팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 공지된 "분자 생물학적" 검정법; 예로 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴블럿)에 의해 또는 본 발명의 범위에 속하는 제제를 확인하기 위해 본원에 기술된 검정법에 의해 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 검정법을 포함한다.
본 발명은 또한 CAR 인코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 관점에서, CAR 벡터는 세포, 예로 T 세포 또는 NK 세포에 직접적으로 형질도입될 수 있다. 일 관점에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예로 하나 이상의 플라스미드 (예로, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 이중 미세염색체), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구조물을 포함하나 이에 한정되지는 않는 벡터이다. 일 관점에서, 벡터는 포유동물 T 세포에서 CAR 구조물을 발현 할 수 있다. 일 관점에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다.
T 세포의 공급원
증식 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원이 대상으로부터 획득된다. 용어 "대상"은 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예로, 포유동물)를 포함하도록 의도된다. 대상의 예로는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 유전자전환 종을 포함할 수 있다. T 세포는 말초혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함한 많은 출처로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 소정의 관점에서, 당해 기술분야에서 입수가능한 임의의 많은 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 소정의 관점에서, T 세포는 피콜 (Ficoll)™분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 많은 기술을 사용하여 대상으로부터 수집된 혈액의 단위로부터 획득될 수 있다. 일 바람직일 관점에서, 개인의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집법에 의해 얻어진다. 성분채집 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 포함한다. 일 관점에서, 성분채집법에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고 후속 프로세싱 단계를 위해 서포를 적절한 완충액 또는 배지에 둘 수 있다. 본 발명의 일 관점에서, 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한다. 대안적인 관점에서, 세척 용액은 칼슘을 결여하고 마그네슘을 결여할 수 있거나, 모든 2가 양이온이 아니더라도 많은 부분을 결여시킬 수 있다. 칼슘 부재 시의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 당업자라면 바로 인식할 바와 같이, 반-자동화된 "플로우-스루 (flow-through)" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, 백스터 CytoMate 또는 헤모네틱스 셀 세이버 5 등)를 제조사의 지침에 따라 사용하는 것과 같이 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 세척 단계를 수행할 수 있다. 세척 후, 세포는 예를 들어 무-Ca, 무-Mg PBS, 플라스마라이트 A 또는 완충제 존재 또는 부재의 식염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁할 수 있다. 대안적으로, 성분채집 시료의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
일 관점에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 단핵구를 예를 들어 퍼콜TM 구배를 통한 원심분리 또는 역유동 원심 용출에 의해 고갈시킴으로써 말초혈액 임파구로부터 분리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일 관점에서, T 세포는 DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T와 같은 항-CD3/항-CD28 (예로, 3 x 28)-컨쥬게이션된 비드와 함께 원하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 기간 동안 배양하여 분리된다. 일 관점에서, 상기 기간은 약 30분이다. 또 다른 관점에서, 상기 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 이들 사이의 모든 정수값의 범위이다. 추가의 관점에서, 상기 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 또 다른 바람직일 관점에서, 상기 기간은 10 내지 24시간이다. 일 관점에서, 배양 시간은 24 시간이다. 종양 조직 또는 면역저하된 개인로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL)를 분리하는 것과 같이 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 거의 없는 상황에서 T 세포를 분리하는 데 더 긴 항온 배양 시간이 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 배양 시간을 사용하면 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순하게 단축 또는 연장시킴으로써 및/또는 T 세포 대 비드의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써 T 세포의 하위집단이 배양 개시 시 또는 처리 동안의 다른 시점에서 이를 선호 또는 비선호로 우선적으로 선택될 수 있다. 또한, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, 배양 개시 시 또는 다른 원하는 시점에서 T 세포의 하위집단을 우선적으로 선호 또는 비선호로 선택할 수 있다. 당업자는 다수의 선별 라운드가 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 것을 인식할 것이다. 소정의 관점에서, 선별 절차를 수행하고 활성화 및 증식 과정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 추가로 선택 라운드를 받을 수도 있다.
음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 독특한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성적으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동세포계측법을 통한 세포 선별 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 소정의 관점에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 농축하거나 양성적으로 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 소정의 관점에서, T 조절 세포는 항-C25 컨쥬게이션된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
일 구현예에서, IFN-γTNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자 예로 다른 사이토카인 중 하나 이상을 발현하는 T 세포 집단을 선택할 수 있다. 세포 발현을 스크리닝하는 방법은 예로 국제특허출원 WO 2013/126712에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선별에 의해 원하는 세포 집단을 분리하기 위해, 세포 및 표면의 농도 (예로, 비드와 같은 입자)를 다양화할 수 있다. 소정의 관점에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 현저하게 감소시키는 (예로, 세포 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 관점에서, 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일 관점에서, 10억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 관점에서, 1억개 이상의 세포/ml가 사용된다. 또 다른 관점에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 관점에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100백만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 관점에서, 125 또는 150백만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28 음성 T 세포와 같은 관심있는 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 종양 세포가 많은 시료 (예로, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터 더욱 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포의 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고 획득하는데 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 CD28 발현이 약한 CD8+ T 세포를 더욱 효율적으로 선별할 수 있다.
관련된 관점에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면 (예로, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의하게 희석함으로써 입자와 세포 간의 상호 작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합될 원하는 항원의 많은 양을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 CD28의 높은 수준을 발현하고 희석된 농도의 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일 관점에서, 사용된 세포의 농도는 5 × 10e6개/ml이다. 다른 관점에서, 사용된 농도는 1 × 106개/㎖ 내지 약 1 × 105개/㎖ 범위 및 이들 사이의 임의의 정수값이다.
다른 관점에서, 세포는 2 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 동안 교반기에서 배양될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않더라도, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단 내의 과립구 및 일정 정도로 단핵구를 제거함으로써 더욱 균일한 산물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당해 기술분야에 공지되어 있고 이 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 포함하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 7.5% DMSO 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 5% 덱스트로스, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 포함하는 배양 배지 또는 예를 들어 헤스판 및 플라스마라이트 A를 포함하는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것이 관여하고, 다음으로 세포는 분당 1℃의 속도로 -80℃까지 동결되고 액체 질소 저장탱크의 증기 상에 저장된다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 동결뿐만 아니라 다른 제어된 동결 방법도 사용할 수 있다.
소정의 관점에서, 냉동보존된 세포는 본원에 기술된 바와 같이 해동되어 세척되고, 본 발명의 방법을 사용한 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 정치된다.
또한, 본원에서 기술된 바와 같은 증식된 세포가 필요할 수 있는 일정 시점 전에 대상로부터의 혈액 시료 또는 성분채집 산물의 수집이 본 발명의 맥락에서 고려된다. 이와 같이, 증식될 세포의 공급원은 필요한 모든 시점에서 수집되고, T 세포와 같은 원하는 세포는 본원에 기술된 질환 또는 병태와 같이 이로부터 이익을 얻을 임의의 많은 질환 또는 병태에 대하여 나중에 T 세포 요법에 사용하기 위해 단리되고 동결될 수 있다. 일 관점에서, 혈액 시료 또는 성분채집은 일반적으로 건강한 대상으로부터 취해진다. 소정의 관점에서, 혈액 시료 또는 성분채집은 질환을 발병시질 위험이 있지만 질환이 아직 발병하지 않은 일반적으로 건강한 대상으로부터 취해지고, 관심있는 세포는 나중에 사용하기 위해 단리되고 동결된다. 소정의 관점에서, T 세포는 증식되고, 동결되어, 나중에 사용될 수 있다. 소정의 관점에서, 시료은 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후이지만 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가의 관점에서, 세포는 이에 한정되지는 않지만 나탈리주마브, 에팔리주마브, 항바이러스제, 화학요법, 방사선요법, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506와 같은 면역억제제 및 항체 또는 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이토잔, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228와 같은 기타 면역억제제 및 방사선 조사를 포함하여, 임의의 많은 적절한 치료 양식 전에 수집될 수 있다.
본 발명의 추가의 관점에서, T 세포는 환자에게 기능적 T 세포를 남기는 치료 후에 환자로부터 직접적으로 획득된다. 이와 관련하여, 소정의 암 치료, 상세하게 환자가 정상적으로 치료로부터 회복될 기간 동안 치료 직후에 면역계를 손상시키는 약물로의 치료 이후에, 획득된 T 세포의 품질이 최적이거나 생체외에서 증식하는 능력이 개선될 수 있는 것이 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기술된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생장 및 생체내 증식을 위해 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락 내에서, 이러한 회복 단계 동안 T 세포, 수지상 세포 또는 조혈 계열의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 고려된다. 또한, 소정의 관점에서, 가동화 (예로, GM-CSF로의 가동화) 및 컨디셔닝 요법이 대상에서 컨디션을 만드는데 사용될 수 있고, 특정 세포 유형의 재군집, 재순환, 재생 및/또는 증식이 특히 치료 후 정의된 기간 동안 선호된다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 증식
T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허출원 20060121005에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증식될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상의 보조자극 분자를 자극하는 리간드를 부착시켰던 표면과의 접촉에 의해 증식될 수 있다. 상세하게, T 세포 집단은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 조합으로 단백질 키나제 C 활성인자 (예로, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 본원에 기술된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에 보조 분자를 공동자극하기 위해 보조 분자를 결합시키는 리간드가 사용된다. 예로, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8 T 세포의 증식을 자극하기 위해 항-CD3 항체와 항-CD28 항체가 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)를 포함하고, 당해 기술분야에 공통적으로 공지된 다른 방법으로서 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8): 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2): 53-63, 1999).
소정의 관점에서, T 세포를 위한 일차 자극 신호 및 보조자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 제제는 용액이거나 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 제제는 동일한 표면 (예로, "시스" 형태) 또는 별도의 표면 (예로, "트랜스" 형태)에 결합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 결합될 수 있고 다른 제제는 용액에서 결합될 수 있다. 일 관점에서, 보조자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액이거나 표면에 결합된다. 소정의 관점에서, 둘 다의 제제는 모두 용액일 수 있다. 일 관점에서, 상기 제제는 용해성 형태일 수 있고, 이어서 Fc 수용체 또는 항체 또는 제제에 결합할 다른 제제를 발현하는 세포와 같은 표면에 교차-결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어 본 발명에서 T 세포를 활성화하고 증식시키는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)에 관한 미국 특허출원 20040101519 및 20060034810 참조.
일 관점에서, 두 개 제제는 동일한 비드, 예로 "시스" 또는 별도의 비드, 예로 "트랜스"의 비드 상에 고정화된다. 예로서, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 보조자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며; 두 제제는 동등한 분자량으로 동일한 비드에 공동-고정화된다. 일 관점에서, CD4+ T 세포 증식 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체의 1 : 1 비율이 사용된다. 본 발명의 소정의 관점에서, 비드에 결합된 항 CD3 : CD28 항체의 비율은 T 세포 증식의 증가가 1 : 1의 비율을 사용하여 관찰된 증식과 비교하여 관찰되도록 사용된다. 일 상세한 관점에서, 1 : 1의 비율을 사용하여 관찰된 증식과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일 관점에서, 비드에 결합된 CD3 : CD28 항체의 비율은 100 : 1 내지 1 : 100 범위 및 이들 사이의 모든 정수값이다. 본 발명의 일 관점에서, 항-CD28 항체는 항-CD3 항체보다 많이 입자에 결합되어 있고, 예로 CD3 : CD28의 비율은 1 미만이다. 본 발명의 소정의 관점에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2 : 1보다 크다. 일 상세한 관점에서, 비드에 결합된 항체의 1 : 100의 CD3 : CD28 비율이 사용된다. 일 관점에서, 비드에 결합된 항체의 1 : 75의 CD3 : CD28 비율이 사용된다. 추가의 관점에서, 비드에 결합된 항체의 1: 50의 CD3 : CD28 비율이 사용된다. 일 관점에서, 비드에 결합된 항체의 1 : 30의 CD3 : CD28 비율이 사용된다. 일 바람직일 관점에서, 비드에 결합된 항체의 1 : 10의 CD3 : CD28 비율이 사용된다. 일 관점에서, 비드에 결합된 항체의 1 : 3의 CD3 : CD28 비율이 사용된다. 또한 일 관점에서, 비드에 결합된 항체의 3 : 1의 CD3: CD28 비율이 사용된다.
1 : 500 내지 500 : 1 범위의 세포 대 입자의 비율 및 이들 사이의 정수값을 사용하여 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극할 수 있다. 당업자가 바로 인식할 수 있는 바와 같이, 세포 대 입자의 비율은 표적 세포와 비교한 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 수 개의 세포만을 결합시킬 수 있지만 더 큰 비드는 많은 세포를 결합시킬 수 있다. 소정의 관점에서, 입자 대 세포의 비율은 1 : 100 내지 100 : 1 범위 및 이들 사이의 임의의 정수이고, 추가의 관점에서 상기 비율은 1 : 9 내지 9 : 1 및 이들 사이의 임의의 정수값도 역시 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. T 세포 자극을 유도하는 T 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 결합된 입자의 비율은 상기 주목된 바와 같이 다양할 수 있지만, 소정의 바람직한 값은 1 : 100, 1 : 50, 1 : 40, 1 : 30, 1 : 20, 1 : 10, 1 : 9, 1 : 8, 1 : 7, 1 : 6, 1 : 5, 1 : 4, 1 : 3, 1 : 2, 1 : 1, 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 7 : 1, 8 : 1, 9 : 1, 10 : 1 및 15 : 1을 포함하고, 하나의 바람직한 비율은 T 세포 당 적어도 1 : 1이다. 일 관점에서, 1 : 1 이하의 입자 대 세포의 비율이 사용된다. 일 상세한 관점에서, 바람직한 입자: 세포 비율은 1: 5이다. 추가의 관점에서, 세포 대 입자의 비율은 자극 당일에 의존하여 달라질 수 있다. 예를 들어, 일 관점에서, 입자 대 세포의 비율은 첫날에 1: 1 내지 10: 1 범위이고, 추가적인 입자는 세포에 1: 1 내지 1 : 10 (첨가 당일의 세포 계수 기준)의 최종 비율로 매일 또는 격일로 이후 10일 동안 첨가된다. 일 상세한 관점에서, 세포 대 입자의 비율은 자극의 첫날에는 1 : 1이고, 자극의 세 번째 및 다섯 번째 날에는 1 : 5로 조정된다. 일 관점에서, 입자는 자극의 첫날에 1 : 1의 및 세 번째 및 다섯 번째 날에는 1 : 5의 최종 비율까지 매일 또는 격일 기준으로 첨가된다. 일 관점에서, 세포 대 입자의 비율은 자극의 첫날에는 2 : 1이고, 자극의 세 번째 및 다섯 번째 날에는 1 : 10로 조정된다. 일 관점에서, 입자는 자극의 첫날에 1 : 1의 및 세 번째 및 다섯 번째 날에는 1 : 10의 최종 비율까지 매일 또는 격일 기준으로 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비율이 본 발명에서의 사용에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 상세하게, 비율은 입자 크기 및 세포 크기와 유형에 따라 달라질 것이다. 일 관점에서, 가장 전형적인 사용 비율은 첫날에 1 : 1, 2 : 1 및 3 : 1 부근이다.
본 발명의 추가의 관점에서, T 세포와 같은 세포를 제제-코팅된 비드와 결합시키고, 후속하여 비드 및 세포를 분리한 다음 세포를 배양한다. 대안의 관점에서, 배양 전, 제제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가의 관점에서, 비드 및 세포는 먼저 자력과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어 세포 표면 마커의 증가된 연결을 유도함으로써 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드 (3 × 28 비드)를 T 세포와 접촉시킴으로써 연결될 수 있다. 일 관점에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1 : 1의 비율의 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충액, 예를 들어 PBS (칼슘 및 마그네슘과 같은 이가의 양이온 없음)에서 조합한다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있는 것을 바로 이해할 것이다. 예로, 표적 세포는 시료에서 매우 드물고 시료의 단지 0.01%만을 포함하거나, 전체 시료 (예로, 100%)가 관심있는 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포수가 본 발명의 맥락에 속한다. 소정의 관점에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 현저하게 감소시키는 (예로, 세포 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 관점에서, 약 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일 관점에서, 1억개 이상의 세포/ml가 사용된다. 또 다른 관점에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 관점에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100백만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 관점에서, 125 또는 150백만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28 음성 T 세포와 같은 관심있는 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 더욱 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포의 집단은 소정의 관점에서 치료적 가치를 가질 수 있고 획득하는데 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 CD28 발현이 약한 CD8+ T 세포를 더욱 효율적으로 선별할 수 있다.
본 발명의 일 관점에서, 혼합물은 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 이들 사이의 임의의 시간 정수값 동안 배양될 수 있다. 일 관점에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 일 관점에서, 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양된다. 일 관점에서, 비드 및 T 세포는 2 내지 3일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 주기의 자극이 역시 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청 (예로, 우태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예로, 최소 필수 배지 또는 RPMI 1640 배지 또는 X-vivo 15 (Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산 나트륨 및 비타민이 첨가된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, 옵티마이저를 포함될 수 있고, 혈청이 없거나 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 호르몬의 한정된 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 증식에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된다. 항생제, 예로 페니실린과 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되며 대상에 주입할 세포 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장 지원에 필요한 조건 예를 들어 적절한 온도 (예로, 37℃) 및 대기 (예로, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
다양한 자극 시간에 노출되었던 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초혈액 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 가진다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하여 T 세포를 체외에서 증식시키면 약 8 내지 9일 이전에 TH 세포가 우세하게 구성되는 반면, 약 8 내지 9일 후에는 T 세포가 점차 TC 세포의 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, TH 세포를 우세하게 포함하는 T 세포 집단을 대상에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원- 특이적 소집합이 분리되었던 경우, 이 소집합을 더 크게 확장하는 것이 유익할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커에 추가하여, 다른 표현형 마커는 유의하게 변화하지만, 대부분 세포 증식 과정 동안 재현가능하다. 따라서, 이러한 재현가능성은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 산물을 재단하는 능력을 가능하게 한다.
일단 PSMA CAR이 제작되면, 다양한 검정법이 이에 한정되지는 않지만 항원 자극 후 T 세포를 증식시키고, 재자극의 부재 시 T 세포 증식을 지속하는 능력 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성과 같은 분자의 활성을 평가하는 데 사용될 수 있다. PSMA CAR의 효과를 평가하기 위한 검정법은 하기에 더 자세하게 기술된다.
일차 T 세포에서의 CAR 발현의 웨스턴블럿 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 예로, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조. 매우 간략하게, CAR을 발현하는 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1 : 1 혼합물)는 시험관내에서 10일 이상 증식시킨 후 환원 조건 하에서 용해 및 SDS-PAGE를 시행한다. 전장 TCR-ζ세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ사슬을 포함하는 CAR은 TCR-ζ사슬에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블럿팅에 의해 검출된다. 동일한 T 세포 소집합은 공유 결합 이량체 형성을 평가하는 비-환원 조건에서의 SDS-PAGE 분석에 사용된다.
항원 자극 이후 CAR+ T 세포의 시험관내 증식은 유동세포계측법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 αCD3/αCD28 aAPCs로 자극되고, 이어서 분석할 프로모터의 조절 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입된다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다.
재-자극 부재 시 지속된 CAR+ T 세포 증식도 역시 측정될 수 있다. 예로, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조. 간략하게, 평균 T 세포 부피 (fl)는 0일째 αCD3/αCD28 코팅된 자성 비드로 자극하고 1일째 표시된 CAR로 형질도입시킨 후 쿨터 멀티사이저 III 입자 계수기를 사용하여 배양 8일째 측정된다.
PSMA 표적화된 이중특이적 항체
천연 항체와는 달리, 이중특이적 항체 (BsAb)는 종양 세포 상의 하나 및 종양 부위에 면역학적 효과기 세포를 효율적으로 채용하여 이들이 종양 세포를 특이적으로 살상하도록 활성화하는 효과기 세포 상에 나머지 항원으로, 두 가지 상이한 종양 항원을 표적하는 이중특이성을 보유하는 인공 항체이다. 전자, 예로 두 가지 상이한 종양 관련 항원을 표적하는 BsAb의 예는 Her2 및 VEGF에 동시에 결합하는 bH1 (Bostrom J1 et al. 2009, Science 323: 1610-4), 또는 ErBb2/ErBb3 이중 표적화 이중특이적 scFv (Robinson MK et al. 2008, Br J Cancer 99: 1415-25)이다. 두 가지 종양 관련 항원은 둘 다 종양 세포 상에 또는 종양 세포 상에 하나 및 종양 미세환경 세포 예로 섬유아세포, 혈관 세포, 내피 세포, 혈관주위 세포 또는 종양 미세환경의 면역 세포 (대식구, B 세포, T 세포 등)와 같은 종양 세포 관련 세포 상에 나머지가 발현될 수 있다. 후자, 예로 하나의 종양 관련 항원 및 면역 활성화가능한 항원을 표적하는 BsAb의 예는 Her2, CD19 또는 CD123과 같은 종양 항원을 표적으로하는 한 팔을 가진 BsAb 및 T 세포, NK 세포 또는 대식구 등과 같은 종양 세포 및 면역 세포가 관여할 수 있는 CD3 또는 CD16과 같은 면역 활성화가능한 항원을 표적하는 나머지 팔을 갖는 BsAb이다 (Kontermann RE, et al. 2015, Drug Discovery Today 20: 838-847).
항-CD3 항체를 포함한 BsAb는 T 세포 및 종양 세포와 연합하여 종양 세포의 살상을 유도한다 (Muller and Kontermann, BioDrugs 2010; 24: 89-98, Baeuerle and Reinhardt 2009, Cancer Research 96: 4941). 블리나투모마브 (Bargou et al, Science 2008, 321: 974-976)는 CD19 및 CD3를 표적하여 세포독성을 유도하는 BiTE라고 명명된 단일 사슬 항체 구조물이다. 다른 항체 단편 기반의 T 세포가 관여하는 이중특이적 항체가 기술되어 있다 (Moore et al. 2011, Blood 117: 4542-4551, Baeuerle et al. Current opinion in Molecular Therapeutics 2009, 11: 22-30). BiTE™형식은 두 개의 다른 항체로부터 유래한 가변 영역을 연결하는 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물이다. 그러나 블리나투모마브는 생체내에서 반감기가 좋지 않으며 생산과 안정성 견지에서 제조하기가 어렵다. 따라서, T-세포를 종양 세포로 표적화할 수 있고 개선된 제조 능력을 갖는 개선된 이중특이적 항체가 필요하다.
BsAb는 화학적 교차-결합, 하이브리도마 기술 또는 유전학적 방법에 의해 생성될 수 있는 하이브리드 단백질이다. 화학적 교차-결합 방법에서는 두 종류의 단일클론 항체 및 이의 단편을 환원제에 의해 해리시켜 단가 항체 및 이의 단편을 생성시켰다. 결과로 생성된 BsAb는 상이한 모 항체로부터의 두 개의 단가 항체 및 이의 단편의 화학적 교차 결합을 통해 제조된다. 이 전략은 대규모 BsAb의 신속한 생산에 사용될 수 있지만 BsAb는 교차 결합 동안 때로 비활성화될 수 있으며 산물의 균질성을 보장하기 어렵다. BsAb의 생산을 위한 또 다른 전략은 하나의 단일클론 항체를 분비하는 확립된 하이브리도마 세포주를 다른 항원으로 면역화된 비장 세포와 융합시키거나, 두 개의 상이한 단일클론 항체를 분비하는 두 개의 확립된 하이브리도마 세포주를 서로 융합시켜 하이브리드 하이브리도마를 만드는 하이브리도마 기술이다. 전자의 결과로 생성된 하이브리도마는 이량체 하이브리도마 및 사량체 하이브리도마로 불린다. 일반적으로 하이브리도마 기술에 의해 생산된 BsAb는 높은 생체활성을 유지한다. 그러나, 절차가 지루하고 시간이 많이 걸리며, BsAb를 동시에 생성된 다른 비활성인 원치 않는 항체로부터 분리하는 것이 쉽지 않다. 이들 BsAb 형식은 또 다른 예측가능한 문제를 발생시켰다: BsAb에 포함된 너무 큰 크기 및 마우스 성분은 환자에서 면역원성이며, 병원에서 이들 BsAb의 재사용을 방지할 수 있는 인간 항-마우스 항체 (HAMA)의 생산을 유도할 것이다. 또한, BsAb의 이들 형식의 생산 및 정제는 비용이 많이 들고, 이는 병원에서 BsAb의 적용을 제한한다. 이러한 전통적인 방법을 유전자 재조합 접근법으로 대체하는 것이 이 분야의 발전을 가속화하여 왔다. 소분자 항체 기술을 기반으로 하여, 유전자 조작에 의한 BsAb의 생산은 공정의 안정성, 대량 생산, 저비용 및 사용 용이성과 같은 상기에 언급된 것보다 유리하다. 유전자공학은 두 종류의 scFv를 연결하여 다양한 소분자 BsAb 형식의 개발을 가져왔다. 서로 다른 연결로 분류된 BsAb 형식에는 세 가지 종류가 있다. (1) 미니-항체는 두 개의 scFv 단편을 올리고머화된 도메인 (예로, Fos 또는 Jun 전사인자로부터 유래한 류신 지퍼 모티프)과 함께 연결하여 조립된 이종이량체이다. (2) 다이아체는 두 개의 단일 사슬 VH1-VL2 및 VH2-VL1에 의해 조립되는 비공유 결합된 이량체이며, 두 사슬은 짧은 링커로 연결되어 동일한 사슬의 V-도메인 사이에 쌍을 형성하기에는 너무 짧다. 따라서, 각 사슬은 단독으로 항원과 결합할 수 없지만, 두 사슬 (VH1-VL2 및 VH2-VL1)의 공동발현은 두 종류의 항원에 결합할 수 있는 이종이량체 다이아체의 조립을 유도한다. (3) ScBsAb: 상이한 특이성을 갖는 두 개의 상이한 scFv를 연결하는 데 인터링크를 사용하였고, 단일 폴리펩타이드로서 숙주 세포에서 ScBsAb가 발현되었다. scFv 내의 두 개 도메인 사이의 인터링크는 종종 (Gly4Ser)3이다. 두 개의 scFv 사이의 인터링크에 관하여, 이를 설계하기 위한 두 가지 전략이 있다. 불균질한 가변 영역들 간의 잘못된 쌍 형성을 피하기 위해, 인터링크는 종종 Gly4Ser와 같은 10개 미만의 아미노산 잔기인 짧은 펩타이드 링커이다. 또 다른 전략은 인터링커를 위해 더 긴 링커를 선택하는 것이다. 다른 말로, 인터링커를 설계하는 데 가장 중요한 점은 가변 도메인들 간의 적절한 쌍 형성 및 단백질 폴딩을 보장하여 생물학적 활성과 안정성을 유지하는 BsAb를 형성하는 것이다. 정제를 용이하게 하고 혈장 반감기를 연장시키기 위한 몇 가지 새로운 성질이 도입되어야 한다.
BsAb-매개성 면역요법은 종양의 임상적 생체요법에서 유망한 역할을 한다. BsAb에 의해 매개되는 종양-살상 효과는 면역계를 자극하고, 종양에 매우 특이적이며, MHC 제한이 없는 것을 기초로 한다. 따라서 BsAb-매개성 치료법은 수술, 방사선요법 및 화학요법과 같은 전통적인 방법과 상보적이다. BsAb는 종양을 치료할 수 있을뿐만 아니라 장기간 면역 기능을 제공하고 유지하도록 면역계를 자극한다. 마우스 및 병원에서의 실험 결과에 기초하여, 시험용으로 제조된 최적의 BsAb는 다음과 같은 적어도 다섯 가지의 특징을 가져야 한다: 1) 높은 특이성 및 친화성을 갖는 적절한 종양 항원을 표적하고; 2) BsAb가 종양 항원에 결합할 때만 결합하여 효과기 세포-세포독성 세포 상의 인자를 촉발시키고, 교차 결합을 유도하고; 3) BsAb는 종양 부위에서 백혈구의 해당군에 의해 선택적으로 생산되는 효과적인 세포독성 및 염증을 촉진할 수 있고; 4) BsAb는 반복 사용 후 인간 항-마우스 반응의 유도를 최소화하기 위해 인간화되어야 하고; 마지막으로, 5) BsAb는 종양 내에 침투하기에 충분히 작을뿐만 아니라 충분한 시간 동안 혈액 순환이 되도록 충분히 커야 한다.
상기 기술된 이들 사실에 기초하여, 여러 종류의 면역 효과기 세포를 유발하고 상이한 종양 세포를 표적하는 수많은 BsAb가 지난 몇 년 동안 개발되었고, 효과기 세포로는 T 림프구, NK 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, LAK 세포 (림포카인-활성화된 세포독성 세포) 및 TIL 세포 (종양 침윤 림프구) 등을 포함한다. T 세포는 공통적으로 면역 반응의 주요 특이적 세포로서 인식된다. 모든 성숙한 T 세포의 표면 상에 발현된 CD3은 T 세포의 공통 표면 마커이다. CD3는 전체 TCR-CD3 복합체를 형성하면서 비공유적으로 TCR에 결합하고, 항원 자극에 대한 면역 반응을 수반한다. 이제 CD3는 가장 널리 성공적으로 사용된 면역 효과기 세포 상의 표면 촉발 분자이다. BsAb 내의 항-CD3 항체가 T 세포 표면 상의 CD3 분자에 결합하면 종양 세포를 살상하기 위해 다음과 같은 수많은 효과가 나타날 것이다. 이들 효과는 다음을 포함한다: (1) T 세포의 증식 및 분화. 첫째, BsAb는 나머지 T 세포를 활성화시켜 미성숙한 효과기 T 세포로부터 유래한 Th 세포와 Tc 세포를 CD4+ 또는 CD8+로 활성화할 수 있다. 둘째, BsAb는 수많은 기억 세포를 활성화시켜 증식하고 종양 세포를 공격하고 살상할 효과기 T 세포로 분화할 수 있다. 효과기 세포의 수는 종양 제거율과 직접적으로 관련된다. (2) 사이토카인의 방출: BsAb에 의해 활성화된 CD4+ Th 세포는 많은 양의 IL-2를 분비할 수 있다. IL-2는 자가분비에서 Th 세포의 증식을 자극할뿐만 아니라, 주변분비에서 선천적 CD8+ T 세포를 활성화하여 Tc 세포를 만들고 Tc 세포의 세포독성을 증가시킨다. 또한, IL-2는 T 세포를 활성화하기 위한 보조자극 신호이다. 따라서, IL-2는 BsAb-매개성 면역 효과에 중요한 역할을 한다. TNF-α 및 IFN-γ와 같은 일부 다른 사이토카인은 T-세포 활성화 과정에서 생산되며, 세포간 배지를 통해 '표준 대기' 종양 세포의 성장을 억제함으로써 '표준 대기' 효과를 나타낼 수 있다. (3) 세포독성: BsAb에 의해 매개되는 시험관내 실험은 CD8+ Tc가 종양 세포와 직접적으로 상호작용하고 과립 세포외입을 통해 세포독성 물질을 방출하여 표적 세포를 파괴하고, 이는 종양 세포를 표적한 후 4 내지 6시간 내에 신속하게 일어난다. 세포독성 물질의 주요 성분은 퍼포린 및 세린 에스터라제 또는 그랜자임이다. 퍼포린은 원형질막을 공격하여 이온 통로를 형성하여 많은 이온과 물의 침투를 유발하여 세포의 용해 및 괴사를 일으키는 한편 그랜자임은 세포내 DNase를 활성화하여 핵 DNA의 용해를 유발하고, 결과로 표적 세포의 세포사멸을 가져올 수 있는, 림프독소와 유사하다.
현재, Fv 단편은 완전 항원 결합 부위의 최소의 단위이고 (전체 항체의 약 1/6), Fc 영역이 없으며, 면역원성이 더 낮고, 혈관 벽 및 고형 종양의 벽 내로 쉽게 침투하기 때문에 BsAb의 제작에 널리 사용된다. 그러나, VH 및 VL 도메인 사이의 공유 결합이 생성될 수 없기 때문에, Fv는 불안정하고 생체내에서 해리되기 쉽다. Fv 단편의 안정성을 개선하기 위해, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 인트라링커가 소위 ScFv를 형성하는데 사용된다. 인트라링커는 일반적으로 (Gly4Ser)3와 같이 길이가 15개 아미노산 잔기인 짧은 유연성 펩타이드이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 인트라링커는 항-CD3 ScFv에서 사용되었고, 상이한 인트라링커가 항-PSMA scFv에 사용되었다.
표준 IgG 형식을 갖는 이중특이적 항체는 네 개의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 포함하기 때문에 생산하기가 어려울 수 있다. 작고, 더 쉽게 생산된 이중특이적 분자의 효능이 비호지킨 림프종에서 임상적으로 입증되었다. 예로, Bargou et al. (2008), Science 321(5891): 974-977 참조.
이 작은 단일 사슬 분자의 생체내 반감기가 짧기 때문에 계속적인 정맥내 주입에 의한 장기간 투여가 이러한 결과를 달성하는 데 사용되었다. 따라서, 유사한 치료적 효능을 보유하고, 생산하기 쉽고, 더 긴 반감기를 포함하여 바람직한 약동학 적 성질을 갖는 이중특이적 치료제가 당해 기술분야에 필요하다.
본원에 기술된 바와 같은 이중특이적 Fc (Bs-Fc)는 두 개의 상이한 단백질에 결합할 수 있고 항체의 Fc 영역 또는 이의 일부를 포함한다. Bs-Fc는 Fc 영역이 결여된 이중특이적 단일 사슬 분자과 비교하여 바람직한 약동학적 성질을 가질 수 있다. Bs-Fc에 의해 결합된 하나의 단백질은 T 세포, NK 세포, 호중구 또는 대식세포와 같은 면역 효과기 세포 상에서 발현될 수 있고, 다른 단백질은 표적 세포, 예를 들어 암 세포, 병원체에 감염된 세포 또는 섬유화를 일으키는 섬유아세포와 같은 질환을 매개하는 세포 상에서 발현될 수 있다. 본원에 기술된 Bs-Fc 분자는 표적 세포의 존재 시 면역 효과기 세포의 활성화 및/또는 면역 효과기 세포의 존재 시 표적 세포의 살상을 유도할 수 있다.
일 관점에서, 본 명세서에서는 Bs-Fc로서 (도 25a 내지 도 25d), (a) 식 V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc을 갖는 폴리펩타이드 사슬, 식 중 Fc는 Fc 폴리펩타이드 사슬이고, V1, V2, V3 및 V4는 각각 상이한 아미노산 서열을 가진 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4은 링커이고, L2 및/또는 L4는 존재 또는 부재할 수 있는 사슬 (도 25a); 또는 (b) 식 Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4를 갖는 폴리펩타이드 사슬, 식 중 Fc는 Fc 폴리펩타이드 사슬이고, V1, V2, V3 및 V4는 각각 상이한 아미노산 서열을 가진 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4은 링커이고, L2 및/또는 L4는 존재 또는 부재할 수 있고, Fc의 디설파이드 결합이 N 말단 (도 25c) 또는 C 말단 (도 25d)에 있는, 사슬을 포함할 수 있는 것이 제공되고, 상기 Bs-Fc는 면역 효과기 세포에 의해 표적 단백질을 전시하는 표적 세포의 세포용해를 매개하고, 면역 효과기 세포에 의해 표적 단백질을 전시하지 않는 표적 세포의 세포용해는 매개하지 않고/거나 상기 Bs-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합할 수 있다. 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 사슬의 Fc 폴리펩타이드 사슬은 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 사슬일 수 있다. V1은 중쇄 가변 (VH) 영역일 수 있고, V2는 경쇄 가변 (VL) 영역일 수 있다. 대안의 구현예에서, V1은 VL 영역일 수 있고, V2는 VH 영역일 수 있다. V3 및 V4는 각각 VH 및 VL 영역일 수 있거나, V3 및 V4는 각각 VL 및 VH 영역일 수 있으며, 도 25b는 예를 나타낸다. L1 및 L3은 적어도 15개의 아미노산 길이일 수 있고, L2는 12개 미만의 아미노산 길이일 수 있다. V1 및 V2는 IgG 및/또는 scFv 항체의 일부일 때 표적 세포 또는 면역 효과기 세포에 결합할 수 있고, V3 및 V4는 IgG 및/또는 scFv 항체의 일부일 때 표적 세포 또는 면역 효과기 세포에 결합 할 수 있다.
본 발명에서는, Gly4Ser 인터링커로 연결되고 조작된 IgG4 Fc에 융합된 단일-사슬 이중특이적 항체 (ScBsAb)가 순환 수명을 연장하도록 제작되었다.
본 발명의 일 구현예에서, ScBsAb의 두 개 scFv 중 하나는 항-CD3 scFv이었다. 본 발명의 일 구현예에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 82에 나타낸 핵산 서열 및 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 OKT3 항체로부터 유래하였다. 본 발명의 일 구현예에서, 항-CD3 scFv는 서열번호 88에 나타낸 핵산 서열 및 서열번호 89에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간화 OKT3 항체로부터 유래하였다.
일 구현예에서, ScBsAb의 다른 scFv는 PSMA를 표적한다. 일 구현예에서, 항-PSMA scFv는 본원의 다른 곳에서 기술한 바와 같이 gy1, gy1-st, gy1-2 또는 gy1-3이다. 예를 들어, 일 구현예에서, BsAb의 PSMA-결합 부분은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49 및 서열번호 51 중 하나 이상을 포함한다. 소정의 구현예에서, BsAb의 PSMA-결합 부분은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48 및 서열번호 50 중 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다.
본 발명의 일 구현예에서, ScBsAb에서 항-PSMA scFv는 본원에 기술된 gy1 또는 gy1 변이체와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
ScBsAb의 순환 수명을 연장하기 위해서는 크기가 사구체 여과의 분자량 컷오프, 예로 약 60 kDa 초과로 증가되어야 한다 (Pisal DS et al. 2010, J Pharm Sci. 99: 2557-2575). 태그 또는 융합 단백질 중에서, Fc는 관심있는 단백질의 크기를 확대할뿐만 아니라 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와의 상호 작용에 의해 순환 시간을 연장하기 때문에 완벽한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, Fc 도메인은 ScBsAb에 융합되었다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, IgG4 Fc는 ScBsAb에 융합되었다.
CD3 상의 BsAb의 결합은 이들 기능을 통해 T 세포의 고갈을 촉발시키기 때문에 ADCC 및 CDC 기능은 BsAb에서 원하지 않는다. IgG4는 C1q를 결합시키지 않기 때문에 CDC가 없다. 또한, IgG4는 Fcγ억제에 비교적 높은 친화성을 유지하면서 Fcγ활성화에 대한 친화성이 낮기 때문에 IgG4는 매우 약한 ADCC를 갖는다. ADCC를 완전히 없애기 위해 우리는 Fc 수용체에 대한 IgG4의 결합을 억제하기 위해 N297을 A297로 돌연변이시켰다. 그러나 FcRn에 결합하는 IgG는 Fc 글리코실화에 의존하지 않기 때문에 N297A 돌연변이는 IgG4 Fc 융합된 단백질의 반감기에 영향을 미치지 않을 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, N297A 돌연변이된 IgG4 Fc는 ScBsAb에 융합되어 순환 수명을 연장시킨다. 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 96 및 97에 나타낸다.
힌지 영역에서의 S228 및 IgG4의 CH3에서의 R409 모두가 IgG4의 Fab 팔 교환 (FAE)에 필요하며, 이는 치료적 IgG4 항체 나탈리주마브에서 관찰되는 것과 같은 생리 조건에서 발생한다. 그래서 우리는 FAE를 피하기 위해 ScBsAb와 Fc 사이에 IgG1 힌지를 사용하였다. IgG1 힌지 사용의 다른 장점은 IgG1 힌지가 IgG4 (12개 아미노산)보다 길어서 (15개 아미노산) 더 유연한 것이다. 이황화 결합 불일치를 피하기 위해, CL로의 Fab 형성을 부여하는 C220은 A (C220A)로 돌연변이된다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, ScBsAb와 Fc 사이의 링커는 IgG1 힌지이고; 또 다른 소정의 구현예에서, ScBsAb와 Fc 사이의 링커는 C220A 돌연변이된 IgG1 힌지이며, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 94 및 95에 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에서, ScBsAb 발현용 발현 벡터는 다음의 5가지 옵션으로부터 선택된 발현 카세트를 가진다:
카세트 1: (Kozak) -SP-MCS-G4S-scFv2-mIgG1 힌지 - mIgG4 Fc
카세트 2: SP-MCS-G4S-scFv2-mIgG1 힌지 - mIgG4 Fc
카세트 3: (Kozak) -SP-scFv1-G4S-scFv2-mIgG1 힌지 - mIgG4 Fc
카세트 4: SP-scFv1-G4S-scFv2-mIgG1 힌지 - mIgG4 Fc
카세트 5: scFv1-G4S-scFv2-mIgG1 힌지 - mIgG4 Fc
(약어: SP: 신호 펩타이드; MCS: 다중 클론 부위; mIgG1 힌지: 돌연변이된 IgG1 힌지; mIgG4 Fc: 돌연변이된 IgG4 Fc)
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 서열번호 99를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 일 상세한 구현예에서, 조성물은 서열번호 98의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 서열번호 101를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 일 상세한 구현예에서, 조성물은 서열번호 100의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 서열번호 103을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 일 상세한 구현예에서, 조성물은 서열번호 102의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PSMA 및 항-CD3 ScBsAb는 서열번호 105의 아미노산 또는 이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PSMA 및 항-CD3 ScBsAb는 서열번호 106의 아미노산 또는 이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PSMA 및 항-CD3 ScBsAb는 서열번호 108의 아미노산 또는 이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PSMA 및 항-CD3 ScBsAb는 서열번호 109의 아미노산 또는 이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, BsAb 발현 벡터는 서열번호 104의 핵산 서열 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, BsAb 발현 벡터는 서열번호 107의 핵산 서열 또는 서열번호 108의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이와 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
마우스 항체로부터 유래된 대부분의 마우스 항체 또는 BsAb의 경우, 마우스 항체에 의해 유도된 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 문제는 병원에서 반복 사용 및 용량을 강하게 제한한다. 마우스 항체는 병원에서 사용되는 항체의 준비를 위한 긴급 사안인 이질성을 최소화하도록 인간화되어야 한다. 본 발명에 사용된 항-PDSMA ScBsAb에서의 CD3 분자에 대한 scFv는 인간화된 scFv이고, PSMA scFv는 BsAb의 완전 인간 항체이고, 이는 BsAb의 면역원성을 유의하게 최소화하고 암 치료의 전반적인 성과를 향상시킬 것이다.
조합 요법
본원에 기술된 항체, 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체를 포함하는 조성물은 다른 공지된 제제 및 치료법과 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "조합으로" 투여되는 것은 장애가 있는 대상의 고통 과정 동안 두 가지 (이상)의 상이한 치료가 대상에게 전달되는 것, 예로 두 가지 이상의 치료가 대상이 장애가 있는 것으로 진단된 후 및 장애가 치유되거나 제거되거나 치료가 다른 이유로 중단되기 전에 전달된 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 두 번째 전달이 시작될 때 여전히 일어나기 때문에 투여의 견지에서 중첩된다. 이는 본 명세서에서 때로 "동시적"또는 "동시적 전달"이라고도 한다. 다른 실시예에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 각 사례의 일부 구현예에서, 치료는 조합된 투여 때문에 더 효과적이다. 예를 들어, 두 번째 치료가 더 효과적이고, 예로 더 적은 두 번째 치료로 동일한 효과가 나타나거나, 첫 번째 치료의 부재 시 두 번째 치료가 투여된 경우 관찰된 것보다 두 번째 치료가 증상을 더 큰 정도로 감소시키거나, 유사한 상황이 첫 번째 치료로 관찰된다. 일부 구현예에서, 증상의 감소 또는 장애와 관련된 다른 매개변수가 다른 것의 부재 시 전달되는 하나의 치료로 관찰되는 것보다 더 크다. 두 가지 치료의 효과는 부분적으로 부수적이거나, 전체적으로 부수적이거나, 부수적인 것보다 클 수 있다. 전달은 첫 번째 치료의 효과가 두 번째 치료가 전달될 때 여전히 검출가능한 것일 수 있다.
본원에 기술된 항체, 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체 및 적어도 하나의 추가적인 치료제는 동시에, 동일하거나 별도의 조성물로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여를 위해, 본원에 기술된 CAR-발현 세포를 먼저 투여할 수 있고, 추가적인 제제를 구 번째로 투여할 수 있거나 투여 순서를 역전시킬 수 있다.
추가의 관점에서, 본원에 기술된 항체, 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체를 포함하는 조성물은 수술, 화학요법, 방사선, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506와 같은 면역억제제, CAMPATH와 같은 다른 면역억제제, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요업, 사이토카인, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 방사선 조사, Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108: 963-971에 기술된 바와 같은 펩타이드 백신과 조합하여 치료 요법에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 항체, 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체를 포함하는 조성물은 화학치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 예시적인 화학치료제는 항안드로겐 (안드로겐 길항제), 안트라사이클린 (예로, 독소루비신 (예로, 리포좀성 독소루비신)), 빈카알칼로이드 (예로, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐린), 알킬화제 (예로, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 데모졸로미드), 면역세포 항체 (예로, 알럼투주마브, 젬투주마브, 리투주마브, 토시투모마브), 항대사제 (예로, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 탈아미나제 저해제 (예로, 플루다라빈) 포함), mTOR 저해제, TNFR 글루코코티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질 (GITR) 작동제, 프로테아좀 저해제 (예로, 아클라시노 마이신 A, 글리오톡신 또는 보테조미브), 탈리도마이드 또는 탈리도마이드 유도체 (예, 레날리도마이드)와 같은 면역조절제를 포함한다.
조합 요법에 사용이 고려되는 일반적인 화학치료제는 아나스트로졸 (Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®블레오마이신 설페이트 (blenoxane®부설판 (myleran®부설판 주시 (Busulfex®카페시타빈 (Xeloda®N4-카보플라틴 (Paraplatin®카무스틴 (BiCNU®클로르암부실 (Leukeran®시스플라틴 (Platinol®클라드리빈 (Leustatin®시클로포스파미드 (Cytoxan®또는 Neosar®시타라빈, 사이토신 아라비노사이드 (Cytosar-U®시타라빈 리포좀 주사 (DepoCyt®다카바진 (DTIC-Dome®닥티노마신 (액티노마이신 D, Cosmegan), 다우노루비신 염산 (Cerubidine®다우노루비신 시트레이트 리포좀 주사 (DaunoXome®덱사메타손, 도세탁셀 (Taxotere®독소루비신 염산 (아드리아마이신®, Rubex®에토포사이드 (Vepesid®플루다라빈 인산 (Fludara®5-플루오로우라실 (Adrucil®Efudex®플루타미드 (Eulexin®테자시티빈, G젬시타빈 (디플루오로데옥시티딘), 하이드록시우레아 (Hydrea®이다루비신 (이다루비신®), 이포스파미드 (IFEX®이리노테칸 (Camptosar®L-아스파라기나제 (ELSPAR®류코보린 칼슘, 멜팔란 (Alkeran®6-머캅토퓨린 (Purinethol®메토트렉세이트 (Folex®미토잔트론 (Novantrone®마일로타르그, 파크리탁셀l (Taxol®피닉스 (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카무스틴 이식편을 갖는 폴리페프로산 20 (Gliadel®태목시펜 시트레이트 (Nolvadex®테니포사이드 (Vumon®6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (Tirazone®주사용 토포테칸 염산 (Hycamptin®빈블라스틴 (Velban®빈크리스틴 (Oncovin®및 비노렐린 (Navelbine®을 포함한다.
예시적인 항안드로겐 (안드로겐 길항제) 제제는 비칼루타미드, 고세렐린 아세테이트 SR 데포를 포함한다.
예시적인 알킬화제는 이에 한정되지 않고도, 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠, 우라실 머스타드 (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil Nitrogen Mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), 클로르메틴 (Mustargen®), 시클로포스파미드 (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune??), 이포스파미드 (Mitoxana®), 멜팔란 (Alkeran®), 클로르암부실 (Leukeran®), 피포브로만 (Amedel®, Vercyte®), 트리에틸렌멜라민 (Hemel®, Hexylen®, Hexastat®), 티오에틸렌티오포스포라민, 테모졸로미드 (Temodar®), 티오테파 (Thioplex®), 부설판 (Busilvex®, Myleran®), 카무스틴 (BiCNU®), 로무스틴 (CeeNU®), 스트렙토조신 (Zanosar®) 및 다카르바진 (DTIC-Dome®)을 포함한다. 추가적인 예시적인 알킬화제는 이에 한정되지 않고도 옥살리플라틴 (Eloxatin®); 테모졸로미드(Temodar® 및 Temodal®); 닥티노마이신 (액티노마이신-D, Cosmegen®라고도 알려짐); 멜판란 (L-PAM, L-사코라이신 및 페닐알라닌 머스타드, Alkeran®라고도 알려짐); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), Hexylen®라고도 알려짐); 카무스틴 (BiCNU®); 벤다무스틴 (Treanda®); 부설판 (Busulfex® 및 Myleran®); 카보플라틴 (Paraplatin®); 로무스틴 (CCNU, CeeNU®라고도 알려짐); 시스플라틴 (CDDP, Platinol® 및 Platinol®-AQ라고도 알려짐); 클로르암부실 (Leukeran®); 시클로포스파미드 (Cytoxan® 및 Neosar®); 다카바진 (DTIC, DIC 및 이미다졸 카복사미드, DTIC-Dome®라고도 알려짐); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), Hexylen®라고도 알려짐); 이포스파미드 (Ifex®); 프레드니무스틴; 프로카바진 (Matulane®); 메클로레타민 (질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 염산라고도 알려짐); 스트렙토조신 (Zanosar®); 티오테파 (티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA, Thioplex®라고도 알려짐); 시클로포스파미드 (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); 및 벤다무스틴 염산 (Treanda®)을 포함한다.
예시적인 mTOR 저해제는 예로 템시로리무스; 리다포로리무스 (이전에 데페로리무스로 알려짐, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, AP23573 및 MK8669로도 알려져 있고 국제특허출원 PCT WO 03/064383에 기술됨; 에베로무스 (Afinitor®또는 RAD001); 라파마이신 (AY22989, Sirolimus®시마피모드 (CAS164301-51-3); 엠시로무스, (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸몰폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드로시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)몰포리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파틸L-세린-, 내부염 (SF1126, CAS 936487-67-1) 및 XL765를 포함한다.
예시적인 면역조절제는 예로, 아퓨투주마브 (Roche (R)로부터 입수가능함); 페그필그라스팀 (Neulasta®); 레날리도미드 (CC-5013, Revlimid®); 탈리도미드 (Thalomid®), 액티미드 (actimid) (CC4047); 및 IRX-2 (인터류킨 1, 인터류킨 2 및 인터페론 γ를 포함하는 인간 사이토킨의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX Therapeutics로부터 입수가능함)를 포함한다.
예시적인 안트라사이클린은 예로 독소루비신 (Adriamycin® 및 Rubex®); 블레오마이신 (Lenox®); 다우노루비신 (다우노루비신 염산, 다우노마이신 및 루비도마이신 염산, Cerubidine®); 리포좀 다우노루비신 (다우노루비신 시트레이트 염산, DaunoXome®); 미토잔트론 (DHAD, Novantrone®); 에피루비신 (Ellence??); 이다루비신 (Idamycin®, Idamycin PFS®); 미토마이신 C (Mutamycin®); 젤다나마이신; 허비마이신; 라비도마이신; 및 데사아세틸라비도마이신을 포함한다.
예시적인 빈카알칼로이드는 예로 비노레린 타르트레이트 (Navelbine®), 빈크리시틴 (Oncovin®) 및 빈데신 (Eldisine®); 빈블라스틴 (빈블라스틴 설페이트, 빈카 류코블라스틴 및 VLB라고도 알려짐, Alkaban-AQ® 및 Velban®); 및 비노렐빈 (Navelbine®)을 포함한다.
예시적인 프로테오좀 저해제는 보르테조미브 (Velcade®카르필조미브 (PX-171-007, (S)-4-메틸N―((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-몰포리노아세트아미노)-4-페닐부탄아미노)-펜탄아미드); 마리조미브 (NPI-0052); 이자조미브 시트레이트 (MLN-9708); 델란조미브 (CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아조릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드 (ONX-0912)를 포함한다.
예시적인 GITR 작동제는 예로 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체 (예로, 이가 항-IGITR 항체), 예로, 미국 특허 6,111,090, 유럽 특허 090505B1, 미국 특허 8,586,023, PCT 국제특허출원 WO 2010/003118 및 2011/090754에 기술된 GITR 융합 단백질 또는 예로 미국 특허 7,025,962, 유럽 특허 1947183B1, 미국 특허 7,812,135, 미국 특허 8,388,967, 미국 특허 8,591,886, 유럽 특허 EP 1866339, PCT 국제특허출원 WO 2011/028683, PCT 국제특허출원 WO 2013/039954, PCT 국제특허출원 WO2005/007190, PCT 국제특허출원 WO 2007/133822, PCT 국제특허출원 WO2005/055808, PCT 국제특허출원 WO 99/40196, PCT 국제특허출원 WO 2001/03720, PCT 국제특허출원 WO99/20758, PCT 국제특허출원 WO2006/083289, PCT 국제특허출원 WO 2005/115451, 미국 특허 7,618,632 및 PCT 국제특허출원 WO 2011/051726에 기술된 항-GITR 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 대상은 미가공 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체의 투여와 관련된 부작용을 감소시키거나 완화시키는 제제가 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 환자는 미가공 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체의 활성을 증진시키는 제제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제제는 저해성 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 저해성 분자, 예로 프로그램된 데스 1 (PD1)은 일부 구현예에서 면역 효과기 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 저해성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 저해에 의한 저해성 분자의 억제는 미가공 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체 성능을 최적화할 수 있다. 구현예에서, 저해성 핵산, 예로 siRNA 또는 shRNA와 같은 저해성 핵산을 사용하여 CAR-발현 세포 또는 이중특이적 Ab 반응 세포에서 저해성 분자의 발현을 억제할 수 있다. 일 구현예에서, 저해제는 shRNA이다. 일 구현예에서, 저해성 신호의 저해제는 예로 저해성 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예로, 제제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다 (예로, 이필리무마브 (MDX-010 및 MDX-101이라고도 지칭하고 Yervoy®로서 시판됨 Bristol-Myers Squibb); 트레멜리무마브 (파이자로부터 입수가능한 IgG2 단일클론 항체, 이전에 티실리무마브, CP-675,206라고도 알려짐)). 일 구현예에서, 상기 제제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 제제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA도 역시 포함하는 수용체의 CD28 패밀리의 저해성 구성원이다. PD1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8: 765-75). PD1, PD-L1 및 PD-L2에 대한 두 개의 리간드는 PD1에 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32: 634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81: 281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54: 307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10: 5094). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국소적 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다. PD1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편 및 다른 저해제는 당해 기술분야에서 입수가능하며, 본원에 기술된 PSMA 표적화된 마가공 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 니볼루마브 (BMS-936558 또는 MDX1106라고도 역시 지침됨; Bristol-Myers Squibb)은 PD 1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 단일클론 항체이다. PD1에 특이적으로 결합하는 니볼루마브 (클론 5C4) 및 다른 인간 단일클론 항체가 미국 특허 8,008,449 및 국제특허출원 WO2006/121168에 개시되어 있다. 피디리주마브 (CT-011; Cure Tech)는 PD1 피디리주마브에 결합하는 인간화 IgG1k 단일클론 항체이며, 다른 인간화 항-PD1 단일클론 항체는 국제특허출원 WO2009/101611에 개시되어 있다. 람브로리주마브 (MK03475라고도 역시 지칭됨; Merck)은 PD1에 결합하는 인간화 IgG4 단일클론 항체이다. 람브로리주마브 및 다른 인간화 항-PD1 항체는 미국 특허 8,354,509 및 국제특허출원 WO2009/114335에 개시되어 있다. MDPL3280A (Genentech/Roche)는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화 IgG1 단일클론 항체이다. PD-L1에 대한 MDPL3280A 및 다른 인간 단일클론 항체는 미국 특허 7,943,743 및 미국 출원공개 20120039906에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 결합제는 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역이 국제특허출원 WO2010/077634의 서열번호 20 및 21에 나타나 있음) 및 MDX-1 105 (BMS-936559라고도 역시 지칭되고, 예로 국제특허출원 WO2007/005874에 개시된 항-PD-L1 결합제)를 포함한다. AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; 예로, 국제특허출원 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)는 PD1 및 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 용해성 수용체이다. 다른 항-PD1 항체는 특히 AMP 514 (Amplimmune), 예로 미국 특허 8,609,089, US 2010028330 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD1 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 제제는 예로 제 1 도메인 및 제 2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있으며, 제 1 도메인은 저해성 분자 또는 이의 단편이고 제 2 도메인은 양성 신호와 관련된 폴리펩타이드, 예로 본원에 기술된 바와 같은 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 양성 신호와 관련된 폴리펩타이드는 CD28, CD27, ICOS의 보조자극 도메인, 예로 CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 일차 신호전달도메인, 예로 본원에 기술된 CD3 제타를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 CAR을 발현한 동일한 세포에 의해 발현된다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 세포, 예로 항-PSMA CAR을 발현하지 않는 T 세포에 의해 발현된다.
제형 및 투여 경로
본 발명의 항체, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체는 광범위한 범위에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체는 치료용, 진단용 또는 연구용 시약이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체는 치료제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체는 산업적 용도로 사용된다. 본 발명의 항체는 단일클론 또는 다중클론성인 항체 조성물에서 용도를 찾을 수 있다. 본 발명의 항체는 작동제, 길항제, 중화, 저해성 또는 자극성일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체는 표적 항원을 보유하는 표적 세포, 예를 들어 암 세포를 살상하는데 사용된다. 대안의 구현예에서, 본 발명의 항체는 표적 항원을 차단하거나, 길항하거나, 작동시키는데 사용된다. 대안의 구현예에서, 본 발명의 항체는 표적 항원을 차단하거나, 길항하거나, 작동시키고, 표적 항원을 보유하는 표적 세포를 살상하는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 표적 세포는 종양 세포 또는 이의 신생혈관 구조이다. 일 구현예에서, 신생혈관 구조는 혈관신생에서 중요한 역할을 하며, 또한 본원에서 제공된 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이중특이적 항체의 표적으로 고려된다.
본 발명은 또한 적합한 포장 재료 내에 포장된 약제학적 제형을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, Car T 또는 Car NK 세포, 또는 이의 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 키트는 발현 조절요소를 추가로 포함하는 핵산; 발현 벡터; 바이러스성 발현 벡터; 아데노-관련 바이러스 발현 벡터; 아데노바이러스성 발현 벡터; 및 레트로바이러스성 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 Car T 또는 Car NK 세포와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 세포를 포함한다.
추가적인 구현예에서, 키트는 세포에서 항체 또는 이중특이적 항체 또는 항체, 항원-결합 단편 또는 이의 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 발현시키기 위한 지침을 포함하는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 또한 추가적인 구현예에서, 키트는 본 발명의 항체 또는 항체 단편, ADC, CAR-발현 세포 또는 이의 이중특이적 항체로 대상 (예로, 천식이 있거나 발병할 위험이 있는 대상)을 생체내 또는 생체외에서 치료하기 위한 지침을 포함하는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포장 재료"는 키트의 구성요소를 수용하는 물리적 구조를 말한다. 포장 재료는 구성요소를 무균으로 유지할 수 있으며 이러한 목적으로 공통적으로 사용되는 재료 (예로, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰풀 등)로 만들 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 예를 들어 본 발명의 방법을 실행하는, 예로 일반 감기를 치료하는 적절한 서면 지침을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법에서 키트 성분을 사용하기 위한 지침을 추가적으로 포함할 수 있다.
지침은 본 명세서에 기술된 임의의 본 발명의 방법을 실행하기 위한 지침을 포함 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상에게 투여하기 위한 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 지침에는 만족할만한 임상 종결점 또는 발생할 수 있는 임의의 이상 증상 또는 식품의약품 안전청이 인간 대상에게 사용하도록 요구하는 추가 정보가 추가적으로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 백신의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 용어 백신은 임의의 면역조절 조성물을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 이러한 백신은 본 발명의 폴리 펩타이드에 추가하여 아쥬반트, 항원, 면역-조절 화합물 또는 이들의 조합을 포함할 수있다.
일부 구현예에서, 아쥬반트는 이에 한정되는 않지만 다음을 포함할 수 있다: (A) 알루미늄 화합물 (예로, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 히드록시 인산 알루미늄, 옥시수산화물, 오르토인산염, 황산염 등 [예로 참고문헌 96의 제 8장 및 제 9장 참조]) 또는 상이한 알루미늄 화합물의 혼합물, 화합물은 임의의 적합한 형태를 취하고 (예로, 겔, 결정, 무정형 등), 흡착이 바람직함; (B) MF59 (5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% Span 85, 미세액화기를 사용하여 마이크론 이하 입자로 제형화됨); (C) 리포좀; (D) ISCOM, 추가적인 계면활성제가 부족할 수 있음; (E) SAF, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121 및 thr-MDP, 마이크론 이하 에멀전으로 미세액화되거나 더 큰 입자 크기의 에멀전을 생성하도록 볼텍싱됨; (F) Ribi™아쥬반트 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80 및 모노포스포릴지질 A (MPL), 트레할로스 디마이콜레이트 (TDM) 밀 세포벽 골격 (CWS)로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게 MPL+CWS (Detox™(G) QuilA 또는 QS21과 같은 사포닌 아쥬반트, Stimulon™라고도 알려짐; (H) 키토산; (I) 완전 프런드 아쥬반트 (CFA) 및 불완전 프런드 아쥬반트 (IFA); (J) 인터류킨 (예로, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론 (예로, 인터페론-γ), 대식구 콜로니 자극인자, 종양 괴사인자 등과 같은 사이토카인; (K) 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 3-O-탈아실화된 MPL (3dMPL); (L) 예를 들어, QS21 및/또는 물-내-오일 에멀전과 3dMPL의 조합; (M) CpG 모티브를 포함, 예로 선택적으로 사이토신 대신에 사용되는 5-메틸사이토신과 적어도 하나의 CG 이핵산을 포함하는 올리고핵산; (N) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르; (O) 옥톡시놀과 조합으로 폴리옥시에틸렌 소비탄 에스테르 표면활성제 또는 옥톡시놀과 같은 적어도 하나의 추가적인 비이온성 표면활성제와 조합으로 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 표면활성제; (P) 면역-자극 올리고핵산 (예로, CpG 올리고핵산) 및 사포닌; (O) 면역-자극제 및 금속염의 입자; (R) 사포닌 및 물-내-오일 에멀전; (S) 시포닌 (예로, QS21)+3dMPL+IL12 (선택적으로 + 스테롤); (T) 대장균 열-불안정 엔테로톡신(“”또는 K63 또는 R72 돌연변이체와 같은 독소제거된 돌연변이체; (V) 이중가닥 RNA; (W) 아미노알킬 글루코사미드 인산염과 같은 모노포스포릴 지질 A 모방체, 예로 RC-529; (X) 포스포스파젠 (PCPP); 또는 (Y) 에스테르화 하이알루론산 미세구와 같은 생체접착제 또는 폴리(아크릴산), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 다당류 및 카복실메틸셀룰로스의 교차결합된 유도체와 같은 뮤코접착제.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물의 투여는 병리학적 상태의 중증도를 감소시키도록 의도된다. 용어 "병리학적 상태의 중증도를 감소시키는"은 본원에 개시된 방법, 화합물 및 조성물을 통한 임의의 감소가 본 발명에 의해 포괄되도록 고려하는 것으로 이해해야 한다. 중증도의 감소는 일 실시예에서 생존의 증진, 또는 또 다른 실시예에서 질환 진행을 정지시키는 것, 또는 또 다른 실시예에서 질환 진행의 지연을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 투약은 투여된 분자/화합물 또는 이를 포함하는 조성물에 대한 세포 반응성에 의존한다. 일반적으로, 상기 목적으로 사용된 용량은 다양할 것이지만, 의사에 의해 결정된 바와 같이 원하는 효과를 발휘시키는 유효량일 것이다. 본원에서 사용된 바, 용어 "약제학적 유효량"은 환자에게 증상 또는 다른 바람직한 표현형에서 원하는 완화를 생산할 본원에 기술된 화합물의 양을 말한다.
본 발명의 일 구현예에서, 화합물의 농도는 치료될 병태의 특성, 환자의 병태, 투여 경로 및 조성물의 개별 내성을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 임의의 조성물은 본원에 기술된 임의의 형태 또는 구현물로 화합물을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 임의의 조성물은 본원에 기술된 임의의 형태 또는 구현물에서 필수적으로 화합물로 구성될 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "포함하다"는 본 발명의 화합물과 같은 지시된 활성 제제의 포함뿐만 아니라 다른 활성 제제 및 약제학 산업에서 알려진 적으로 허용가능한 담체, 부형제, 연화제, 안정화제 등의 포함을 말한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 필수적으로 본원에 기술된 폴리펩타이드/폴리뉴클레오티드/벡터로 구성될 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "필수적으로 구성되는"은 특정 부류의 제제의 활성 성분만이 지시된 활성 성분 인 조성물을 말하지만, 지시된 활성 성분의 치료 효과에 직접적으로 관여하는 다른 화합물이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "필수적으로 구성되는"은 특정 기작을 표적하거나 특정 경로를 통해 작용하는 활성 성분만이 지시된 활성 성분인 조성물을 말하지만, 지시된 활성 성분의 치료 효과에 직접적으로 관여하고, 예를 들어 지시된 제제의 활성에 직접적으로 관련되는 않지만 관련된 작용 메커니즘을 갖는 다른 화합물이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "필수적으로 구성되는"은 활성 성분만이 지시된 활성 성분인 조성물을 말하지만, 지시된 활성 성분의 치료 효과에 직접적으로 관여하지 않지만 제형을 안정화하고 보존하는 다른 화합물이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "필수적으로 구성되는"은 활성 성분의 방출을 용이하게 하는 성분을 말할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "구성되는"은 활성 성분 및 약학 적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 말한다.
특정한 경우의 활성 화합물의 실제 양은 사용되는 특정 화합물, 제형화된 특정 조성물, 적용 방식 및 치료되는 특정 병태 및 유기체에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 주어진 숙주에 대한 용량은 통상적인 고려 사항, 예로 대상 화합물과 공지된 제제의 차별적인 활성의 통상적인 비교에 의해, 예로 적절한 통상적인 약리학적 프로토콜에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 일시적인 병태의 급성 치료를 위해 급성 투여되거나, 특히 진행성, 재발성 또는 퇴행성 질환의 경우에 만성적으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 동시에 투여될 수 있거나, 또 다른 구현예에서, 이들은 시차로 방식으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 시차 방식은 질환의 단계 또는 상태에 의해 지시될 수 있다.
비경구 운반체 (피하, 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사용)에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱 스트로스 및 염화나트륨, 수화된 링거 및 고정된 오일이 포함된다. 정맥 운반체는 유동성 및 영양 보충제, 링거 덱스트로스에 기초한 것과 같은 전해질 보충제 등을 포함한다. 예는 표면활성제 및 다른 약제학적으로 허용가능한 아쥬반트의 첨가 여부에 관계없이 물 및 오일과 같은 멸균 액체이다. 일반적으로, 물, 생리식염수, 수용성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이, 세하게 주사가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다. 오일의 예는, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄오일, 올리브유, 해바라기유 및 어류-간유와 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일이다.
일 구현예에서, 투여 경로는 비경구 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 경로는 안내, 결막, 국소, 경피, 피내, 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 질내, 직장내, 종양내, 암부근, 점막내, 근육내, 혈관내, 뇌실내, 두개내, 흡입 (에어로졸), 비강 흡인 (스프레이), 비강내 (점적), 설하, 경구, 에어로졸 또는 좌제 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 용량 요법은 치료되는 병태의 정확한 특성, 병태의 중증도, 환자의 연령 및 일반적인 신체적 상태, 체중 및 개별 환자의 반응과 같은 요인에 기초하여 숙련된 의사에 의해 결정될 것이다. 개별 환자.
비강내 투여 또는 흡입에 의한 적용을 위해, 화합물의 용액 또는 현탁액을 적합한 알맞은 담체의 존재 시 혼합하고 에어로졸화하거나 분무화한다. 이러한 에어로졸은 본원에 기술된 임의의 제제를 포함할 수 있다.
비경구 적용을 위해, 좌제 및 관장제를 포함하는 현탁액, 에멀전 또는 임플란트뿐만 아니라 주사 가능한 멸균 용액, 바람직하게는 유성 또는 수용성 용액이 특히 적합하다. 앰풀은 편리한 단위 용량이다. 이러한 좌제는 본원에 기술된 임의의 제제를 포함할 수 있다.
지속되거나 유도된 방출 조성물은 예로 리포좀 또는 활성 화합물이 차별적으로 분해가능한 코팅, 예로 미세캡슐화, 다중 코팅 등에 의해 보호되는 것으로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 즉각적 또는 느린 방출을 위해 제형화될 수 있다. 또한, 새로운 화합물을 동결-건조시키고, 예를 들어 주사제 제조용으로 획득된 동결건조물을 사용할 수도 있다.
액체 제형을 위해, 약제학적으로 허용가능한 담체는 수용성 또는 비-수용성 용액, 현탁액, 에멀전 또는 오일일 수 있다. 비-수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸올레이트와 같은 사용가능한 유기 에스테르이다.
수용성 담체는 식염수 및 완충된 배지를 포함하는, 물, 알코올성/수용성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 오일의 예는, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄오일, 올리브유, 해바라기유 및 어류-간유와 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 사용되는 조성물은 단독으로 또는 조성물 내에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 통상적인 부형제, 예로 활성 화합물과 유해한 반응을 일으키지 않는 비경구, 장내 (예로, 경구) 또는 국소적 적용에 적합한 약제학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 담체 물질과 혼합되어 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 이에 한정되지는 않지만, 물, 염 용액, 알코올, 아라비아검, 식물성 오일, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스 또는 전분과 같은 탄수화물, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 히알루론산, 콜라겐, 향유, 지방산 모노 글리세리드 및 디글리세라이드, 펜타에리스리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 약제학적으로 제제는 멸균되고, 원하는 경우 활성 화합물과 유해한 반응을 일으키지 않는 보조제, 예로 활택제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충액, 착색제, 향료 및/또는 방향제 등과 혼합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이들은 원하는 경우 다른 활성 제제, 예로 비타민과도 조합될 수 있다.
약제학적 조성물은 "약학적으로 허용가능한" 및 "생리적으로 허용가능한" 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 일 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "생리학적으로 허용가능한"은 안전하고, 본 발명에 사용하는 유효량의 하나 이상의 화합물의 원하는 투여 경로에 적절한 전달을 제공하는 임의의 제형을 말한다. 이 용어는 화합물의 안정성 및 투여 경로에 따라 pH가 pH 4.0 내지 pH 9.0 범위의 특정 바람직한 값으로 유지되는 완충된 제형의 사용을 말한다. 이 용어는 약제학적 투여와 양립할 수 있는 용매 (용성 또는 비-수용성), 용액, 에멀전, 분산 배지, 코팅제, 등장성 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한다. 이러한 제형은 액체; 에멀젼, 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르 또는 고체 형태; 정제 (코팅 또는 비코팅), 캡슐 (경질 또는 연질), 분말, 과립, 결정 또는 마이크로비드에 포함될 수 있다. 보조 활성 화합물 (예로, 방부제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)도 조성물에 도입될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 질소 머스타드 (예로, 시클로포스파미드 및 이포스파마드), 아지리딘 (예로, 티오테파), 알킬설포네이트 (예로, 부설판), 니트로소우레아 (예로, 카무스틴 및 스트렙토조신), 백금 복합체 (예로, 카보플라틴 및 시스플라틴), 비-고전적인 알킬화제 (예로, 다카바진 및 데모졸아미드), 엽산 유사체 (예로, 메토트렉세이트), 퓨린 유사체 (예로, 플루다라빈 및 메캅토퓨린), 아데노신 유사체 (예로, 클라드리빈 및 펜토스타틴), 피리미딘 유사체 (예로, 플루오로우라실 (단독 또는 조합으로) 및 젬시타빈), 치환된 우레아 (예로, 하이드록시우레아), 항종양 항생제 (예로, 블레오마이신 및 독소루비신), 에피포도필로톡신 (예로, 에토포사이드 및 테니포사이드), 미세소관제 (예로, 도세탁셀 및 파크리탁셀), 캄프토테신 유사체 (예로, 이리노테칸 및 토포테칸), 효소 (예로, 아스파라기나제), 사이토카인 (예로, 인터류킨-2 및 인터페론-α), 단일클론 항체 (예로, 트라스투주마브 및 베바시주마브), 재조합 독소 및 면역독소 (예로, 재조합 콜레라 독소-B 및 TP-38), 암 유전자요법, 물리요법 (예로, 고열치료, 방사선요법 및 수술) 및 암 백신 (예로, 텔로머라제에 대한 백신)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 화학치료제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 (예로, 항체 및 이중특이적 분자)은 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위 내에 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물이 있다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 매우 근접하여 위치하는 점에서 유리하다. 대안적으로, 본 발명의 인간 항체, 다중 특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 별도로 투여할 수 있다.
약제학적 조성물은 특정한 국소 또는 전신 투여 경로와 양립가능하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 특정 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 대한 투여 경로의 상세한 비-제한적인 예는 흡입 또는 비강내 전달이다. 추가적인 경로로는 정맥내, 피내, 피하, 경구, 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여와 같은 비경구 투여가 포함된다.
비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음을 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 무균 희석제; 벤질알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 아황산 수소 나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민 테트라 세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장 조정제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다.
주사용 약제학적 조성물은 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균 물, 크레모포 ELTM (BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 표면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 항균 및 항진균제는 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아르 알루미늄 및 젤라틴을 포함하면 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 적절한 용매 중에 상기 성분 중 하나 또는 조합을 혼합 한 후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 상기와 같이 염기성 분산 매지 및 다른 성분을 포함하는 멸균 운반체에 도입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 예로, 예를 들어 진공 건조 및 동결-건조를 포함하며, 이는 활성 성분의 분말 + 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 원하는 성분을 수득한다.
경점막 또는 경피적 투여를 위해, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당해 기술분야에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어 경점막 투여, 계면활성제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이, 흡입 장치 (예로, 흡인기) 또는 좌제를 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 연고, 살브, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
하위서열 및 변형된 형태 및 이들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 항체는 조절된 방출 제형 또는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트와 같은 시간 지연 물질과 같은, 신체로부터의 신속한 제거로부터 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 또한 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 사용하여 전달되어 국소 또는 전신 지속적 투여 또는 제어된 방출을 달성할 수 있다.
에틸렌 비닐아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 물질은 또한 Alza 회사 및 Nova 제약회사로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액 (항체 또는 바이러스 코팅 단백질을 사용하여 세포 또는 조직을 표적하는 리포좀 포함)을 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용할 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 예를 들어 미국 특허 4,522,811에 기술된 바와 같다.
본 발명의 방법에서 투여를 위한 조성물에 적합한 추가적인 약제학적 제형은 당해 기술분야에 공지되어 있다 (예로, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; 및 Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993) 참조). 약제학적 제형은 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 포장될 수 있다. 본원에서 사용되는 바 "용량 단위 형태"는 치료되는 대상을 위한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 구별된 단위를 말하고; 각각의 단위는 약제학적 담체 또는 부형제와 관련하여 원하는 치료 효과를 생산하도록 계산된 선결정된 정량의 활성 화합물을 포함한다.
본원에서 제공된 약제학적 조성물은 주로 인간에게 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 당업자라면 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여에 적합한 점을 이해할 것이다. 조성물을 다양한 동물에게 투여에 적합도록 만들기 위해 인간에게 투여에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되어 있으며, 보통의 숙련된 약리학자는 실험을 거의 하지 않고 이러한 변형을 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상은 인간 및 다른 영장류 및 다른 포유동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 폴리펩타이드에 대한 서열, 구조적 또는 기능적 상동성을 나타내는 임의의 수단에 의해 자연적으로 또는 합성적으로 획득된 임의의 아미노산 서열이 본 발명의 부분으로 고려되는 점을 이해해야 한다.
일 실시예에서, 용어 "약"은 정량적 용어 ±5%, 또 다른 실시예에서 ±10%, 또 다른 실시예에서 ±15%, 또 다른 실시예에서 ±20 %를 의미한다.
용어 "대상"은 일 구현예에서 병태 또는 그 후유증에 대한 치료가 필요하거나 이에 취약한 인간을 포함하는 포유동물을 말한다. 대상은 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트 및 마우스 및 인간을 포함할 수 있다. 용어 "대상"은 모든 관점에서 정상적인 개인을 배제하지 않는다.
임의의 간행물, 특허 출원 또는 발행된 특허에 대한 언급은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 완전히 통합된 것으로 고려되어야 함을 이해해야 한다.
치료적 화합물에 의해 조절되는 특정 활성을 측정하기 위한 임의의 검정법이 화합물 또는 이의 조합의, 일 구현예에서 효능을 결정하는 수단으로서, 또 다른 구현예에서 화합물의 최적 로딩을, 또 다른 구현예에서는 시기 및 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 관련하여 읽혀질 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 현재까지 바람직한 구현예가 도면에 도시된다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다.
도 1은 gy1 scFv가 PSMA+ 세포에 특이적으로 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. PSMA 상의 ScFv gy1 결합을 유동세포계측법을 사용하여 LNCap FGC 세포에서 연구하였다. 간략하게, LNCap FGC 세포를 베르센 용액으로 탈착시키고, PBS로 세척하여 얼음 위에 1시간 동안 배양한 후 gy1-포함 효모 상청액을 FACS 완충액으로 3배 희석시켰다. 세포를 차가운 PBS로 세 번 세척한 후 암소에서 얼음 위에 1시간 동안 FACS 완충액에서 1: 200 희석된 항-V5-알렉사647과 함께 배양하였다. 미결합된 항-V5-알렉사647을 차가운 PBS로 세 번 세척한 다음 세포를 8 uL 비아-프로브 (BD biosciences)를 포함한 300 uL FACS에서 재현탁시켰다. LNCap FGC 세포 상에서 Gy1 결합은 살아있는 세포만이 개방되는 유동세포계측법을 사용하여 검출되어 분석되었다. 유동세포계측법 대조군은 다음을 포함한다: (1) 염색되지 않은 세포; 및 (2) 항-V5-알렉사647로 염색된 세포. 회색의 실선은 염색되지 않은 세포를 나타내고; 검정색의 점선은 항-V5-알렉사647 염색된 세포를 나타내는 한편; 검정색 실선은 gy1 scFv, 다음으로 항-V5-알렉사647로 염색된 세포를 나타낸다.
도 2는 gy1 scFv가 LnCap 세포 상에 항원 결합 시 유의하게 내재화되는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. LnCap FGC 세포를 두 개의 48 웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, 효모 상청액을 포함하는 100 μl gy1 scFv를 200 uL 부피 (100 uL 상층액 + 100 uL 세포 배지)로 4 uL 항-V5-알렉사467와 1시간 동안 실온에서 미리 배양하였다. 이어서, 세포를 배지로 한 번 세척하고 37℃ 및 4℃에서 각각 1시간 동안 암소에서 200 μL gy1 포함 배지 (100 μl 신선한 배지 + 100 μl 미리 배양한 gy1-염료 배지)로 배양하였다. 대조군으로서, 세포는 또한 둘 다의 온도에 대해 동일한 농축된 항-V5-알렉사467와 배양되었다. 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 200 uL 트립신을 웰에 첨가하여 세포 표면 단백질을 RT에서 30분 동안 소화시켰다. 이어서, 500 uL 배지를 각 웰에 첨가하여 트립신 처리를 중단시키고, 세포를 두 번 세척한 다음 유동세포계측법 분석을 위해 비아-프로브 포함 FACS 완충액에 현탁시켰다. 왼쪽 패널은 4℃ 배양된 세포를 나타내고, 오른쪽 패널은 37º배양된 세포를 나타낸다. 회색의 실선은 평범한 배지에서만 배양된 세포를 나타내고; 검은색의 점선은 항-V5-알렉사647과 배양된 세포를 나타내는 한편; 검정색의 실선은 미리-형성된 gy1-항-V5-알렉사647 복합체와 배양된 세포를 나타낸다.
도 3은 gy1 scFv에 대한 친화성을 측정하는 실험 결과를 나타낸다. gy1 scFv 친화성을 포획 ELISA를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 항-플래그 항체 (Sigma)를 4℃에서 밤샘 동안 PBS에서 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 PBSTM으로 차단시키고 3배로 일련 희석된 gy1 scFv와 세 번 배양하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 바이오틴화된 PSMA와 함께 배양하고, 결합을 스트렙타비딘-HRP로 검출하고, TMB를 사용한 비색측정 발색에 의해 분석한 다음 종결 완충액을 처리하였다. OD450에서의 흡광도를 측정하고 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 친화성을 계산하였다.
도 4a 내지 도 4c는 대장균에서의 gy1 scFv 발현의 실험 결과를 나타낸다. gy1 scFv는 0.05 mM IPTG로 유도된 벡터 pET302를 사용하여 30℃에서 4시간 동안 대장균 BL21에서 발현되었다. 대장균 세포를 초음파 분쇄기를 사용하여 용해시키고, gy1 단백질을 HisTrp HP 컬럼을 사용하여 정제 하였다. 도 4a: SDS-PAGE는 유도된 대장균에서 용해성 gy1 발현을 나타낸다. 레인 1: 마커; 레인 2: 유도되지 않은 전체 세포 용해; 레인 3 내지 5: 유도된 세포 용해, 전체 세포 (3), 상청액 (4) 및 침전 (5). 도 4b: SDS-PAGE는 정제된 gy1 단백질을 나타낸다. 레인 1: 마커; 레인 2: 세포 용해의 유도되지 않은 상청액; 레인 3: 세포 용해의 유도된 상청액; 및 레인 4: 정제된 gy1 scFv. 도 4c: 웨스턴블럿 분석은 항-His6 Ab에 의해 정제된 gy1 재조합 단백질을 검증한다. 레인 1: 세포 용해의 유도되지 않은 상청액; 레인 2: 세포 용해의 유도된 상청액; 및 레인 3: 정제된 gy1 scFv.
도 5는 대장균 발현 gy1 scFv가 PSMA+ 세포 상에 특이적으로 결합함을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 유동세포계측법을 사용하여 대장균 발현된 gy1 scFv와 PMSA 양성 및 음성 세포의 결합을 연구 하였다. 전립선 암세포, LNCaP, C4-2, PC3-PSMA+ 및 PC3-PSMA- 세포를 베르센 용액으로 탈착시키고, 100 nM gy1 또는 대조군 scFv NCP1과 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세척하여 FITC-컨쥬게이션된 마우스 항-6His IgG (AbD Serotec; Bio-Rad)를 4℃에서 30분 동안 암소에서 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 유동세포계측법으로 분석하였다. 동시에, PSMA 단백질 발현이 PE 컨쥬게이션된 시판되는 항-PMA 단일클론 항체에 의해 검출되었다.
도 6은 세포 ELISA에 의해 대장균 발현된 gy1 scFv의 친화성을 보증하는 실험 결과를 나타낸다. PSMA 양성 세포주 C4-2 상에서 대장균 발현 gy1 scFv의 친화성을 측정하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트에서 배양된 C4-2는 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 3% H2O2 , 및 6% 소혈청 알부민으로 순차적으로 차단되었다. 이어서 세포를 3배로 일련 희석된 gy1 및 대조군 scFv NCP1과 8100 nM에서 0.005 nM까지 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 결합은 HRP-컨쥬게이션된 마우스 항-6His로 검출되었고, 비색측정 신호는 TMB에 의해 발색되어 종결 완충액으로 중단되었다. 450 nm에서 흡광도는 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어를 사용하여 gy1 친화성을 계산하는데 사용되었다.
도 7은 gy1 scFv가 항원 결합 시 내재화될 수 있는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 항원 결합 시 gy1 내재화는 전립선암 세포, 예로 LnCap, C4-2, PC3-PSMA+ 및 PC3-PSMA-에서 연구되었다. 50% 충만도로 커버슬립에서 자란 세포는 37℃에서 2시간 동안 200 nM gy1 또는 NCP1와 배양되었다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 내재화된 gy1을 FITC- 컨쥬게이션된 마우스 항-6His IgG에 의해 검출하였다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 내재화는 공초점 영상화 시스템 하에서 관찰되었다.
도 8a 및 도 8b는 gy1의 세포내 트래피킹을 시각화한 실험 결과를 나타낸다. 도 8a: C4-2 세포를 gy1 scFv와 4시간 동안 배양한 다음, 항-His IgG 및 FITC-컨쥬게이션된 이차 항체로 검출하였다. 엔도좀, 리소좀, ER, 골지체 및 DAPI (청색)에 대한 상이한 세포 소기관 마커 (RFP- 지, 적색)를 사용하여 소기관 및 핵을 공동염색하였다. 도 8b: 골지체 및 ER에 대한 gy1 및 마커의 공동-국소화를 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간의 상이한 배양 시간 동안 추가로 연구하였다.
도 9는 PC3-PSMA+/PC3-PSMA- 마우스 모델을 사용한 검증 실험의 결과를 나타낸다. PSMA 양성 및 음성 이종이식 누드 마우스 모델은 루시퍼라제-발현 PC3-PSMA+ 및 PC3-PSMA- 세포를 사용하여 확립되었다. 이종이식 종양 모델은 5 x 106개의 반딧불이 루시퍼라제-발현 PC3-PSMA+ 또는 PC3-PSMA- 세포를 0.1 mL PBS에서 각 마우스의 오른쪽 엉덩이에 피하로 주사함으로써 개발되었다. 접종 2주 후, 종양 조직을 분리하고, H & E 및 면역조직화학 염색을 수행하여 조직 형태 및 PSMA 발현 수준을 확인하였다.
도 10은 IRDye800cw 표지가 gy1의 PSMA 결합을 저하시키지 않는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 적외선 염료 IRDye800cw 표지된 gy1 scFv의 결합 친화성을 양성 대조군으로서 표지되지 않은 gy1을 사용하여 PC3-PSMA+ 세포 상에서 평가하였다. 결과는 염료 표지가 gy1의 PSMA 결합을 저하시키지 않는 것을 나타냈다.
도 11은 전립선 종양 모델에서 gy1 scFv의 동적 생체분포를 평가한 실험 결과를 나타낸다. PC3-PSMA+/PC3-PSMA-이종이식 누드 마우스에서 gy1 scFv의 동적 분포는 0.2 μmol/kg IRDye800cw-표지된 gy1 scFv의 꼬리-정맥 주사 후 745 nm의 여기 파장에서 제노겐 IVIS 역학적 영상화 시스템을 사용하여 연구되었다. 전립선 종양 조직을 확인하기 위해 생체발광 영상화 (BLI)를 획득하였다 (왼쪽). IRDye800cw-표지된 gy1의 분포는 각 그룹의 동일한 마우스에서 지시된 시점에 모니터링되었다. 대표적인 결과가 관찰되었다.
도 12는 gy1 scFv의 생체내 PSMA 표적화를 나타낸다. 주사 6시간 후, gy1 scFv는 최상의 종양 위치 신호를 나타낸다. 본원에서는 PSMA 양성 또는 음성 종양을 갖는 두 군의 마우스가 관찰된다.
도 13a 및 도 13b는 정맥내 주사 12시간 후 마우스 기관에서 gy1 scFv 생체분포를 평가한 실험 결과를 나타낸다. 도 13a: 주입 12시간 후, 마우스를 희생시키고 조직 및 기관을 수확하였다. 상이한 마우스 기관에서 IRDye800cw-표지된 gy1의 생체분포를 제노겐 IVIS 역학적 영상화 시스템을 사용하여 분석하였다. 1, 뇌; 2, 폐; 3, 심장; 4, 간; 5, 비장; 6, 신장; 7, 소장; 8, 뼈; 9, PC3-PSMA+ 또는 PC3-PSMA-종양 조직; 10, 근육. 도 13b: 상이한 기관의 형광 정량화를 IVIS 소프트웨어로 측정된 종양 및 상이한 기관에서의 IRDye800cw 신호 강도를 사용하여 연구하였다. 막대, 평균값; 오차 막대, SD; n = 5; ** P < 0.01.
도 14a 및도 14b는 PSMAb 발현 및 친화성을 측정하는 실험 결과를 나타낸다. 도 14a: 정제된 PSMAb의 SDS-GAGE. 레인 1: 항체 정제 전에 CHO 세포 상청액; 레인 2: 변성된 정제된 PSMAb; 레인 3: 미변성된 정제된 PSMAb. 도 14b: PSMAb의 친화성 측정. PSMA 양성 세포주 C4-2 상에서 PSMAb 친화성을 측정하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트에서 배양된 C4-2는 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 3% H2O2 , 및 6% 소혈청 알부민으로 순차적으로 차단되었다. 이어서 세포를 3배로 일련 희석된 PSMAb와 100 nM에서 0.19 nM까지 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 결합은 HRP-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fc Ab로 검출되었고, 비색측정 신호는 TMB에 의해 발색되어 종결 완충액으로 중단되었다. 450 nm에서 흡광도는 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어를 사용하여 친화성을 계산하는데 사용되었다.
도 15는 PSMAb가 PSMA+ 세포주 상에 특이적으로 결합하는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. PSMA 양성 및 음성 세포에 대한 PSMAb의 결합은 유동세포계측법을 사용하여 연구되었다. 상부열: 음성 대조군 IgG (회색); PSMAb (검정색); 하부열: 음성 대조군 IgG (회색); 양성 대조군 항체 LNI-17 (검정색).
도 16은 PC3-PSMA+ 세포 상의 PSMAb 결합이 재조합 PSMA 단백질에 의해 차단되는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 2 nM 농도의 PSMAb를 각각 0, 2, 6 및 10 nM 재조합 PSMA 또는 10 nM 대조군 단백질 BSA와 함께 RT에서 2시간 동안 미리 배양한 다음 PC3-PSMA+ 세포와 함께 배양하였다. PC3-PSMA+ 세포에서의 PSMAb 결합에 미치는 차단 효과를 유동세포계측법으로 연구하였다. 음성 대조군: 회색의 실선; PSMAb 2 nM: 검정색의 실선; 10 nM BSA에 의해 차단된 PSMAb 2 nM: 회색의 점선; 2nM PSMAb에 의해 차단된 2nM PSMA: 검정색의 점선; 6 nM PSMA에 의해 차단된 PSMAb 2 nM: 검정색의 점선; 10 nM PSMA에 의해 차단된 PSMAb 2 nM: 회색의 점선.
도 17a 내지 도 17d는 PSMAb의 PSMA 특이적 내재화를 조사한 실험 결과를 나타낸다. PSMAb 내재화는 전립선 암 세포, 예로 C4-2 (도 17a), PC-3 (도 17b), LnCap (도 17c) 및 DU-145 (도 17d) 세포에서 연구되었다. 50% 충만도로 커버슬립에서 자란 세포는 37℃에서 2시간 동안 200 nM PSMAb 또는 대조군 인간 IgG1과 배양되었다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 내재화된 PSMAb를 FITC 컨쥬게이션된 항-인간 IgG Fc 항체에 의해 검출하였다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 내재화는 공초점 영상화 시스템 하에서 관찰되었다.
도 18a 내지 도 18c는 PSMAb에 의한 생체내 PSMA 표적화를 조사한 실험 결과를 나타낸다. 종양 표적화의 효율 및 PSMAb의 수술내 광학적 영상화의 잠재력은 IRDye800CW 표지된 PSMAb를 사용하여 연구되었다. 50 μg 표지된 PSMAb/마우스가 PC3-PSMA+ (도 18a) 또는 PC3-PSMA- (도 18a) 이종 이식 모델 내에 꼬리 정맥으로 주사되었고, PSMAb의 생체분포를 4시간, 24시간, 30시간, 48시간, 54시간, 102시간, 126시간 및 174시간에서 제노겐 IVIS 역학적 영상화 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 주사 후 48시간 동안 각 군에서 4마리의 마우스의 이미지를 도 18c에 나타내었다. 생체내 광학적 영상화는 PSMAb가 전신에 걸쳐 급속히 확산되고 주사 후 24 시간부터 종양 조직에서 검출될 수 있으며 PSMA+ 종양에서는 특이적으로 유지되는 반면 점차적으로 체내에서 제거되지만 PSMA 종양에서는 유지되지 않음을 보여주었다
도 19는 SMCC-DM1을 도시하는 개략도이다.
도 20은 MC-VC-PAB-MMAE 및 MC-VC-PAB-MMAE를 도시한 개략도이다.
도 21은 PSMAb-ADC가 PSMA+ 세포 상에 효율적 결합을 유지하는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 유동세포계측법을 사용하여 PSMAb 컨쥬게이트와 DM1, MMAE 또는 MMAF의 PSMA 특이적 결합을 PC-3 (상부) 및 C4-2 세포 (하부)에서 연구하였다.
도 22a 및 도 22b는 PSMAb-ADC가 PSMA+ 세포에 효율적으로 흡수되는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. DM1과 PSMAb 컨쥬게이트의 PSMA 특이적 내재화는 PC-3 (도 22a) 및 C4-2 세포 (도 22b)에서 연구되었다. 50% 충만도로 커버슬립에서 자란 세포는 37℃에서 2시간 동안 200 nM PSMAb-ADC 또는 대조군 인간 IgG1-ADC와 배양되었다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 내재화된 PSMAb를 FITC 컨쥬게이션된 항-인간 IgG Fc 항체에 의해 검출하였다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 내재화는 공초점 영상화 시스템 하에서 관찰되었다.
도 23a 내지 도 23c는 PSMAb ADC의 PSMA 특이적 세포독성을 평가한 실험 결과를 나타낸다. PSMAb 기반의 ADC의 세포독성은 PSMA- 세포주 PC-3 및 PSMA+ 세포주 C4-2에서 평가되었다. 간략하게, C4-2 및 PC-3 세포를 96 웰 플레이트에 10% FBS, 2000개 세포/200 mL/웰을 갖는 DMEM 배지에 접종하였다. 다음 날, 세포 밀도는 약 20 내지 30%이었고, 배지는 333.33 nM, 133.33 nM, 66.67 nM, 33.33 nM, 6.67 nM, 3.33 nM, 0.67 nM, 0.33 nM, 0.067 nM, 0.0067 nM, 0.00067 nM 및 0.000067 nM의 농도에서 PSMAb-DM1, PSMAb-MMAE 또는 PSMAb-MMAF를 포함하는 새로운 배지로 각 농도에서 세 번 반복하여 교환되었다. 배지는 각 웰을 위해 동일한 약물 농도로 매일 교환되었다. 4일 배양 후, 세포 생존도를 제조사의 프로토콜에 따라 아라마블루 키트를 사용하여 평가하였다. C4-2 세포 상에서 PSMAb-DM1 (도 23a), PSMAb-MMAE (도 23b) 및 PSMAb-MMAF (도 23c)에 대해 계산된 IC50은 각각 0.12nM, 0.59nM 및 0.92nM이었다.
도 24a 및 도 24r은 PSMAb ADC가 PSMA 양성 세포 상에 특이적으로 세포사멸을 유도하는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. PC-3 및 C4-2 세포를 2 × 105개/2 ml 배지/웰의 밀도로 6 웰 플레이트에 접종하고 밤샘 동안 배양하였다. 다음날, 배지를 교환하고 세포를 2 mL 배지에서 50 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml, 1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.01 μg/ml 및 0.001 μg/ml의 농도로 PSMAb- μg/ml와 배양하였다. 인간 IgG 및 PSMAb를 50 mg/ml 농도로 대조군으로서 사용하였다. 48시간 배양 후 세포를 트립신 처리하고, PBS로 두 번 세척하고, 아넥신-V/PI로 염색하고, 유동세포계측법을 사용하여 세포사멸을 검출하였다. 아넥신-V(+)/PI(-)로의 신호는 초기 세포사멸을 나타내고, 이중 양성 염색 예로 아넥신-V(+)/PI(+)는 후기 세포사멸을 나타낸다. 총 세포사멸은 초기 및 후기 세포사멸의 합계이다. C4-2 (도 24A 내지 도 24C, 도 24G 내지 도 24I, 도 24M 내지 도 24O) 및 PC-3 (도 24D 내지 도 24F, 도 24J 내지 도 24L, 도 24P 내지 도 24R) 세포 상에서 PSMAb-DM1 (도 24A 내지 도 24F), PSMAb-MMAE (도 24G 내지 도 24L) 및 PSMAb-MMAF (도 24M 내지 도 24R)의 결과는 유동세포계측법에서 관찰되었고 (도 24A, 도 24D, 도 24G, 도 24J, 도 24M 및 도 24P), 총 세포 사멸 (도 24B, 도 24E, 도 24H, 도 24K, 도 24N 및 도 24Q) 및 초기 세포사멸 (도 24C, 도 24F, 도 24I, 도 24L, 도 24O 및 도 24R)의 백분율을 계산하였다.
도 25a 내지 도 25d는 이중특이적 항체의 다양한 입체구조를 나타낸다.
실험적 실시예
본 발명은 다음의 실험적 실시예를 참조로하여 더욱 자세하게 설명된다. 이들 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며, 달리 명시하지 않는 한 제한하려는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 다음의 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교의 결과로서 명백 해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명이 없으면, 당업자는 전술한 설명 및 다음의 도시적 예를 사용하여 본 발명을 만들고 이용하고 청구된 방법을 실행할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 다음의 작동적 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 상세하게 지적하며, 본 발명의 나머지 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 효모 디스플레이 인간 라이브러리의 패닝
1 x 1011개 효모 디스플레이의 미가공 인간 scFv 라이브러리가 제작되었고 인간 PSMA의 세포외 도메인은 R & D system으로부터 구입되었다. 라이브러리 패닝의 방법은 이전에 기술되었다 (Zhao et al., J Immunol Methods. 2011; 363 (2): 221-32). 간략하게, 재조합 PSMA 단백질을 바이오틴 처리하고 유도된 효모 디스플레이 scFv 라이브러리와 배양하였고; PSMA 결합 효모 세포는 스트렙타비딘 (SA) 컨쥬게이션된 마이크로비드, 다음으로 유동세포계측 활성화된 세포 선별 (FACS)을 사용하여 분리되었으며; scFv 유전자는 분리된 효모 세포로부터 증폭시키고 분비성 발현 효모 균주 YVH10에 클로닝시켰고; 개별적인 분비성 scFv 발현이 96 웰 플레이트에서 유도되고 PSMA 결합 클론이 고처리량 ELISA에 의해 확인되었다.
PSMA 재조합 단백질의 바이오틴화
PSMA 재조합 단백질 완충액을 4℃에서 PBS에 대한 투석을 통해 PBS 내로 교환하고, 농도를 0.5 mg/mL로 조정하였다. EZ-링크 설포-NHS-바이오틴 시약 (10 mM, 냉수에 용해) (Life Technologies)을 PSMA 재조합 단백질과 혼합하여 1 : 20의 최종 몰비 (단백질 : 바이오틴)로 만들었다. PSMA 재조합 단백질 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 반응하지 않은 유리 바이오틴 시약을 투석으로 제거하고 바이오틴화된 단백질을 분주하여 -80℃에서 보관하였다.
자성 비드를 이용한 효모 디스플레이 scFv 라이브러리 패닝
효모 디스플레이 scFv 라이브러리를 -80℃에서 해동하고 5분 동안 3000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고 효모 세포를 12 L SD-CAA 배지 (1 리터 SD-CAA 배지는 5 g 카사미노산, 암모늄 SO4 및 아미노산이 없는 1.7 g 효모 질소 베이스, 5.3 g 암모늄 설페이트, 10.2 g Na2HPO4 · 7H2O, 8.6 g NaH2PO4 · H2O, 20 g의 덱스트로스 포함)로 재현탁하였다. 세포를 30℃에서 밤샘 동안 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 다음날, 효모 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 수확하였고, 적절한 양을 12 L S-CAA-GRD 유도 배지 (1 리터 S-CAA-GRD 배지는 5 g 카사미노산, 암모늄 SO4 및 아미노산이 없는 1.7 g 효모 질소 베이스, 5.3 g 암모늄 설페이트, 10.2 g Na2HPO4 · 7H2O, 8.6 g NaH2PO4 · H2O, 20 g 덱스트로스, 20 g 갈락토스 및 20 g 라피노스) 내에 재현탁하여 최종 농도 OD600 = 0.5가 되었고, 20℃에서 밤샘 동안 유도되었다. 유도된 효모 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 수확하였고, 2 L PBE 완충액 (PBE 완충액은 2 mM EDTA 및 0.5% BSA를 포함하는 PBS 완충액)에 의해 두 번 세척하고 최종적으로 200 mL PBE에 재현 탁하였다. 세포는 실온 (RT)에서 1.5시간 동안 그리고 4℃에서 30분 동안 40 ug 바이오틴화된 PSMA 단백질과 함께 항온 배양되었다. 다음의 단계는 4℃ 또는 얼음 위에서 수행되었다. 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 수확하였고 2 L PBE로 두 번 세척하고 PBE 200 mL에 재현하였다. 다음으로, 2 mL의 스트렙타비딘 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 세포에 첨가하고 1시간 동안 느리게 흔들어 주면서 배양하였다. 1 리터의 PBE를 세포에 첨가하고, 용액을 볼텍싱하여 세포가 단일 세포에서 분리된 것을 확인하였고, 70 um 스트레이너를 사용하여 여과하였다. 16개의 Miltenyi LS 컬럼을 PSMA 결합 효모 세포 분리에 사용하였다. 간략하게, 7 mL의 변형된 세포 현탁액을 컬럼에 첨가하였다. 각 7 mL의 세포가 컬럼에 유입되고 흐름이 멈추면 컬럼을 자성으로부터 제거하여 자석으로 바로 돌려두었다. 이것은 컬럼에서 철 비드를 재정렬하고 물리적으로 구슬 사이에 포집된 세포가 통과하도록 허용한다. 컬럼을 자석에 다시 넣고, 1 mL의 세척 완충액을 첨가하였으며, 세척액이 흐른 후에 또 다른 7 mL의 세포를 컬럼에 첨가하였다. 컬럼 제거 절차를 각 세포 로딩 사이에서 반복하였다. 일단 모든 세포가 컬럼에 로딩되면, 컬럼을 3 mL의 세척 완충액으로 세척하였다. 이 세척은 컬럼의 공극 부피에 있는 세포를 제거한다. 컬럼을 자성으로부터 제거하고 이전과 같이 즉시 교체하였다. 세척이 두 번 반복되었다. 컬럼에 점적이 정지되면 컬럼을 자성으로부터 제거하고 다음으로 7 mL의 세척 완충액을 첨하였다. 플런저를 사용하여 남은 모든 세포를 15 mL 원추형 튜브에 밀어 넣었다.
수확된 세포를 비특이적 세포를 추가로 제거하기 위해 두 개의 새로운 컬럼에 한 번 더 로딩하였다. 최종 용출된 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 수확하였다. 세포를 SD-CAA 플레이트에 도말하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 총 2.5 Х 107 개의 클론이 일차 자성 선별로부터 획득되었다. 세포를 긁어내어 이차 자성 선별을 유도하였다. 일정 분량을 -80℃에서 10% 글리세롤을 포함한 SD-CAA에 저장하였다.
5 Х 109개의 일차 자성 선별된 효모 세포는 20℃에서 밤새 유도하기 위해 200 mL S-CAA-GRD 배지에 접종하였다. 다음날, 2.5 Х 109개의 유도된 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 수확하였고, 15 mL의 PBE로 두 번 세척하였다. 세포를 PBE 3 mL에 재현탁시킨 후 RT에서 1.5시간 다음으로 4℃에서 30분 동안 3 ug 바이오틴화된 PSMA 단백질과 함께 배양하였다. 다음의 단계는 모두 4℃ 또는 얼음 위에서 수행되었다. 배양 후, 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화한 다음, PBE 15 mL로 세 번 세척하였다. 세포를 다시 펠렛화하고 PBE 3 mL에 재현탁하였으며, 1시간 동안 4℃에서 50μl의 항-바이오틴 항체가 컨쥬게이션된 마이크로비드와 함께 배양하였다. 세포를 PBE로 한 번 세척하고, PBE 15 mL에 재현탁시키고, 70 μm 스트레이너로 여과하고, 상기 기술한 바와 같이 Miltenyi Macs LS 컬럼을 사용하여 PSMA 결합 효모 세포를 단리하였다. 이차 자성 선별은 5.1 Х 106개의 클론을 발생시켰다.
PSMA 특이적 효모 집단을 더 농축하기 위해 삼차 자성 선별을 수행하였다. 간략하게, 1 x 109개의 세포를 50 mL S-CAA-GRD에서 20℃로 밤샘 동안 유도하고 5 x 108개 세포를 추가의 패닝 (panning)을 위해 가져왔다. 세포를 PBE 15 mL로 두 번 세척하고 3 mL PBE에 재현탁시킨 후 RT에서 1.5시간 다음으로 4℃에서 30분 동안 1 ug 바이오틴화된 PSMA 단백질과 함께 배양하였다. 다음의 단계는 모두 4℃ 또는 얼음 위에서 수행되었다. 배양 후, 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화한 다음, PBE 15 mL로 세 번 세척하였다. 세포를 다시 펠렛화하고 PBE 3 mL에 재현탁하였으며, 1시간 동안 4℃에서 50 μl 스트렙타비딘 컨쥬게이션된 마이크로비드와 함께 배양하였다. 세포를 PBE로 한 번 세척하고, PBE 15 mL에 재현탁시키고, 70 μm 스트레이너로 여과하고, 상기 기술한 바와 같이 Miltenyi Macs LS 컬럼을 사용하여 PSMA 결합 효모 세포를 단리하였다. 삼차 자성 선별은 1 Х 107개의 클론을 발생시켰다.
유동 선별을 사용한 효모 디스플레이 scFv 라이브러리 패닝
삼차 자성 선별로부터 획득한 효모 세포를 삼차의 유동 선별에 추가로 적용하였다. 모든 원심분리는 3000 rpm으로 5분이었으며, 모든 단계는 4℃ 또는 얼음 위에 달리 명시되지 않은 경우에 진행하였다. 삼차 자성 선별로부터 단리된 2 Х 109개 세포를 밤샘 동안 20℃에서 100 mL S-CAA-GRD 배지에서 유도하였고, 이로부터 1 Х 108개 세포가 일차 유동 선별을 위해 취해졌다. 세포를 펠렛화하고, PBE 15 mL로 두 번 세척하고 1 mL PBE에 재현탁시킨 후 RT에서 1.5시간 다음으로 4℃에서 30분 동안 0.2 ug 바이오틴화된 PSMA 단백질과 함께 배양하였다. 세포를 PBE로 세 번 세척한 다음, 암소에서 1시간 동안 4℃로 PBE 1 mL에서 50μl 항-V5-알렉사647 (AbD Stereo) 및 50 μl 스트렙타비딘-PE (SA-PE) (BD biosciences)와 함께 배양하였다. 염색 후, 세포를 15 mL PBE로 세 번 세척하고, 유동세포계측법에 의한 유동 선별을 위해 1 mL PBE에 재현탁하였고, 알렉사647 및 PE 이중 양성 세포를 PSMA 결합 집단으로 분류하였다. 또한 나란히 설정된 염색 대조군은 (1) 염색을 하지 않은 대조군; (2) 항-V5-알렉사647 염색 단독; 및 (3) SA-PE 염색 단독을 포함하였다. 1.2 Х 106개 이중 양성 세포를 선별하여 SD-CAA 플레이트 상에 30℃에서 2일간 배양하였다.
일차 유동 선별로부터 분리된 세포를 이차 및 삼차 유동 선별에 추가로 적용하였다. 시료 준비는 이차 유동 선별에서 50 ng 바이오틴화 PSMA 단백질 및 항-바이오틴-FITC (Abcam)가 염색 대신에 사용되는 것을 제외하고는 일차 유동 선별과 유사하였고; 삼차 유동 선별에서 바이오틴화된 PSMA 단백질은 2 ng으로 추가로 감소하였고 SA-PE가 PSMA 결합 검출에 사용되었다. 마지막으로, 1 x 106개 및 2 x 104개 세포 (상위 0.1% 집단)가 이차 및 삼차 유동 선별에서 선별되었다.
실시예 2: 개별 항-PSMA 클론의 확인
농축된 디스플레이 scFv 라이브러리의 분비성 scFv 라이브러리로의 전환
디스플레이 EBY100 세포에서 scFv 유전자를 보유하는 플라스미드를 추출하고, scFv 유전자 단편을 증폭시켜 분비성 벡터 pYS1 내에 클로닝하고 분비성 scFv 발현을 위해 효모 YVH10 균주로 형질 전환시켰다.
효모 플라스미드 추출 키트 (Zymo Research)의 프로토콜에 따라 삼차 유동 선별 동안 선별된 상위 0.1% 집단의 증식 후에 효모 플라스미드를 추출하였고, scFv 유전자 단편을 다음의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다: 정방향 5'-GACTACAAGGACGACGATGAC-3' (서열번호 111) 및 역방향 5'-AGTAGAATCAAGACCTAGTAGAGGG-3' (서열번호 112). 이어서, 증폭된 scFv 유전자 단편을 정제하였고, Sfi I/Not I 선형화된 분비성 scFv 발현 벡터 pYS1과 함께 효모 균주 YVH10 내에 공동형질전환시켰다. scFv 유전자/벡터의 몰비는 3 : 1이었고 1 μg 벡터가 형질전환에 사용되었다. YVH10 유능한 세포 준비 및 형질전환은 이전에 기술되었다 (Zhao et al., J Immunol Methods. 2011; 363 (2): 221-32). 형질전환된 세포를 SD-CCA-Trp (SD-CAA + 0.008% 트립토판) 상에 30℃에서 2일간 배양하였다.
PSMA 결합 scFv 클론의 확인
배양된 384개의 분비성 scFv 클론을 채취하여 SD-CAA-Trp에서 배양되었으며, 용해성 scFv 발현을 S-CAA-GRD-Trp에서 96 딥 웰 플레이트로 20℃에서 2일 동안 유도하였다. PSMA 결합 scFv는 ELISA를 사용하여 확인되었다. 간략하게, ELISA 플레이트를 4℃에서 밤샘 동안 50 μl/웰l 1μg/mL 항-플래그 항체 (시그마)로 코팅하고, PBST (0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS)로 두 번 세척하였으며, PBSTM (5% 비지방 건조 우유 (Biorad)를 포함하는 PBST)에서 2시간 동안 실온에서 차단되었다. 다음으로, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBSTM으로 1 : 1 희석시킨 100 uL scFv을 포함하는 상청액과 함께 배양하고, PBST로 여섯 번 세척한 다음, PBSTM에서 0.4 ug/mL, 50 mL/웰 바이오틴화 PSMA 단백질과 함께 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 여섯 번 세척한 후, PBSTM에서 100 uL 1 : 1000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP (BD Biosciences)와 1시간 동안 플레이트를 배양하고, 다시 여섯 번 세척하고, TMB (KPL) 및 정지 완충액을 플레이트와 순차적으로 배양하여 비색측정 검정법을 발색시켰다. OD450에서 흡광도를 측정하였다. 분석된 384개의 클론 중 260개가 양성 신호를 보였다 (OD450 값은 배경 값의 두 배 이상이었다). 96개의 무작위로 추출된 클론을 PSMA 결합에 대해 추가로 분석하였다. 결과는 PSMA에 특이적으로 결합하지만 대조군 단백질 Fc (인간 IgG1 Fc 재조합 단백질)에 결합하지 않는 모두 중 30개의 클론을 플라스미드 추출을 위해 선택하였고, scFv 단편을 PCR 증폭하여 Qiagen PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후 서열결정하였다. PCR 프라이머는 정방향: CTATTGCCAGCATTGCTGC (SEQ ID NO: 113), 역방향: ATAGGGACCTAGACTTCAGG (SEQ ID NO: 114)이고; 서열결정 프라이머는 정방향: CCTTCTACTCCTCCTACACC (SEQ ID NO: 115), 역방향: GGAGGGCGTGAATGTAAGC (SEQ ID NO: 116)이었다. 서열결정 분석은 모든 클론이 서열번호 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50에 나타낸 일부 점 돌연변이를 갖는, 거의 동일한 scFv 서열, 예로 서열번호 2, 4 및 20에 나타낸 바와 같은 gy1을 갖는 점을 보여 주었다.
실시예 3: 항-PSMA scFv의 특성화
효모 디스플레이 라이브러리 패닝은 PSMA의 재조합 세포외 도메인을 사용하였으며, 이것은 살아있는 세포 표면 상에 발현된 것과는 상이한 입체형태를 가질 수 있다. 따라서 gy1 scFv의 세포 표면 상에 발현되는 미가공 입체구조적 PSMA에 결합 능력 및 항원 결합 시의 내재화를 평가할 필요가 있다.
세포 표면 상에 발현된 PSMA에 gy1 scFv의 결합
PSMA 상의 scFv gy1 결합을 유동세포계측법을 사용하여 LNCap FGC 세포 상에서 연구하였다. 간략하게, LNCaP FGC 세포는 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640에서 5% CO2와 함께 37℃에서 배양되었다. 세포를 PBS로 세척하고, 0.02% 베르센 완충액 (1.37 M의 NaCl, 26.8 mM KCl, 80.7 mM Na2HPO4, 14.7 mM KH2PO4, 5.4 mM 디소듐 EDTA, 0.2% D-글루코스)와 배양에 의해 탈착시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고, FACS (0.2% FBS를 포함하는 PBS) 완충액으로 3배 희석시킨 gy1-포함 효모 상청액과 함께 얼음 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 차가운 PBS로 세 번 세척한 후 암소에서 얼음 위에 1시간 동안 FACS 완충액에서 1: 200 희석된 항-V5-알렉사647과 함께 배양하였다. 미결합된 항-V5-알렉사647을 차가운 PBS로 세 번 세척한 다음 세포를 8 uL 비아-프로브 (BD biosciences)를 포함한 300 uL FACS에서 재현탁시켰다. LNCap FGC 세포 상에서 Gy1 결합은 살아있는 세포만이 개방되는 유동세포계측법을 사용하여 검출되어 분석되었다. 유동세포계측법은 다음을 포함한다: (1) FACS 완충액을 포함하는 비아-프로브에 재현탁된 죽은 세포. 죽은 세포는 -80℃ 및 37℃에서 두 번의 주기로 세포를 동결-해동시켜 준비하였다: (2) 비아-프로브 없이 FACS 완충액에 재현탁된 죽은 세포; (3) 비아-프로브로 염색되지 않은 세포; 및 (4) 비아-프로브만 사용한 항-V5-알렉사647 염색. 결과는 gy1 scFv가 Ln-Cap FGC 세포 상에 유의하게 결합할 수 있음을 보여주었다 (도 1).
내재화
종양 세포 내로 선택적으로 약물을 전달하는 데 사용되는 경우 내재화가 항체의 전제 조건이다. ADC, 면역 독소 및 나노의약의 개발을 위한 gy1의 잠재력을 평가하기 위해, gy1 내재화를 유동세포계측법을 사용하여 조사하였다. 유동세포계측법은 내재화 분석을 위한 공초점에 대한 간단한 대안이다. 내재화가 37℃에서 매우 효율적이지만 4℃에서는 일어나지 않는 능동적인 과정이라는 점이 이유이다. 염료-표지 항체를 각각 37℃ 및 4℃에서 배양하면, 항체 분자가 세포 표면 상에 결합하여 일부가 37℃에서 내재화되는 반면, 항체는 내재화가 일어나지 않기 때문에 4℃에서만 세포 표면 상에 결합할 것이다. 다음으로 트립신을 사용하여 염료로 표지된 항체를 포함한 모든 세포 표면 단백질을 제거한다. 세포에서의 양성 염색 신호는 내재화가 일어났음을 지시하는 한편, 음성 염색 신호는 내재화가 일어나지 않음을 의미한다.
간략하게, LnCap FGC 세포를 두 개의 48 웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, 효모 상청액을 포함하는 100 μl gy1 scFv를 200 uL 부피 (100 uL 상층액 + 100 uL 세포 배지)로 4 uL 항-V5-알렉사467와 1시간 동안 실온에서 미리 배양하였다. 이어서, 세포를 배지로 한 번 세척하고 37℃ 및 4℃에서 각각 1시간 동안 암소에서 200 μL gy1 포함 배지 (100 μl 신선한 배지 + 100 μl 미리 배양한 gy1-염료 배지)로 배양하였다. 대조군으로서, 세포는 또한 둘 다의 온도에 대해 동일한 농축된 항-V5-알렉사467와 배양되었다. 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 200 uL 트립신을 웰에 첨가하여 세포 표면 단백질을 RT에서 30분 동안 소화시켰다. 이어서, 500 uL 배지를 각 웰에 첨가하여 트립신 처리을 중지시키고, 세포를 두 번 세척한 다음, 유동세포계측법 분석을 위해 FACS 완충액을 포함하는 비아-프로브에 현탁시켰다. 죽은 세포 대조군도 역시 상기와 같이 설정되었다.
유동세포계측법 결과는 gy1 scFv를 4℃에서 Ln-Cap FGC 세포와 함께 항온 배양하였을 때 항체가 세포 표면에만 결합할 수 있는 반면, 배양 온도가 37℃이었을 때 gy1 scFv가 세포에 결합할 수있을뿐만 아니라 유의하게 내재화될 수 있는 점을 보여주었고, 이는 gy1 항체 또는 항체 단편을 사용하여 PSMA 표적화된 약물 전달의 토대를 마련하였다 (도 2).
친화성 측정
SD-CAA-Trp 배지에서 배양된 용해성 gy1 발현 YVH10 클론을 500 mL까지 확장시킨 다음 세포를 펠렛 화하고 동일한 부피의 YEPD-GRD-Trp 유도 배지 (YEPD 배지에는 펩톤 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 덱 스트로스 20g/L 포함)에 재현탁시켰다. YEPD-GRD-Trp는 1 g/L 덱스트로스, 20 g/L 갈락토스, 20 g/L 라피노즈 및 0.008% 트립토판을 포함하는 YEPD 배지이며, 20℃에서 4일간 scFv 발현을 유도한다. scFv는 C 말단에 6xHis 태그를 가지고 있기 때문에 scFv는 니켈 컬럼을 사용하여 정제되었다. 상청액을 0.45 um 필터로 여과하였고, 동일한 부피 EQ 완충액 (0.3 M NaCl, 0.05 M 인산염 완충액, pH 8.0)과 혼합하여 pH를 8.0으로 조정하고, 5 컬럼 부피 EQ 완충액으로 평형화된 HisTrp HP 컬럼 (GE 헬스 케어) 상에 로딩되었다. 컬럼을 10 컬럼 부피 이상의 세척 완충액 (10 mM 이미다졸을 포함하는 EQ 완충액)으로 세척하고, scFv를 용출 완충액 (250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액)으로 용출시켰다. 이어서, scFv를 원심분리 필터 유닛 (Amico)으로 농축시키고, 이미다졸을 PBS로 투석하여 제거하였다. 일정 분량의 scFv는 -80℃에서 저장되었다.
포획 ELISA를 사용하여 gy1 scFv의 친화성을 측정하였다. scFv의 N 및 C 말단에는 플래그 태그 및 V5 태그가 있으며, 따라서 이들 태그에 대한 항체를 사용하여 ELISA 분석을 위한 scFv를 포획한다. 간략하게, 항-플래그 항체 (Sigma)를 4℃에서 밤샘 동안 PBS에서 1 μg/mL, 50 μl/웰로 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 두 번 세척하고, PBSTM으로 실온에서 2시간 동안 차단시키고, PBSTM로 100 nM부터 시작하여 0.137 nM까지 3배 일련 희석된 gy1 scFv와 함께 실온에서 1시간 동안 세 벌을 배양하였다. 플레이트를 PBST로 6번 세척한 다음 PBSTM에서 0.5 μg/mL 바이오틴화된 PSMA와 함께 RT에서 1시간 더 배양하였다. 6번 세척한 후, 플레이트를 30분 동안 실온에서 PBSTM에 1 : 1000 희석된 스트렙타비딘-HRP (BD Bioscience)와 함께 배양하였다. 플레이트를 6번 다시 세척하고, TMB와 함께 20분 동안 실온에서 배양한 후, 비색측정 반응을 정지 완충액으로 중단시키고 흡광도를 OD450에서 판독하였다. 친화성은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 계산하였으며, Kd = 1.165 nM이었다 (도 3).
실시예 4: 대장균에서의 Gy1 발현 및 정제
효모에서 발현된 재조합 단백질의 과다 당화는 보통 그들의 임상적 적용을 제한할 수 있는 면역원성 문제를 일으킨다. 이 잠재적인 문제를 극복하기 위해, 대장균에서 gy1 scFv의 원핵성 발현이 시도되었다. gy1 유전자를 증폭하여 원핵생물 발현 벡터 pET302 (pET302-gy1으로 명명함)에 클로닝한 후 대장균 BL21 내에 형질전환시키고, 0.05mM 이소프로필-1-티오-b-갈락토피라노시드 (IPTG)에 의한 발현을 4시간 동안 30℃에서 유도하였다. 대장균 세포를 초음파 분쇄기를 사용하여 용해시킨 다음, 상기 기술한 바와 같이 HisTrp HP 컬럼을 사용하여 gy1 단백질을 정제하였다 (도 4). 항-HER2 scFv (NCP1으로 명명됨)를 동일한 방식으로 발현하여 정제하였고, 음성 대조군으로서 사용하였다.
유동세포계측법을 사용하여 대장균에서 발현된 gy1 scFv와 PMSA 양성 및 음성 세포의 결합을 연구하였다. 간략하게, 전립선 암세포, LNCaP, C4-2, PC3-PSMA+ 및 PC3-PSMA- 세포를 베르센 용액 (1.37 M NaCl, 26.8 mM KCl, 80.7 mM Na2HPO4, 14.7 mM KH2PO4, 5.4 mM 디소듐 EDTA, 0.2% D-포도당)으로 탈착시키고, 1 Х 106개 세포/mL의 밀도로 PBS에 현탁시켰고, 세포는 PBS로 세척하였으며, 100 nM gy1 또는 대조군 scFv NCP1과 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세척하여 FITC-컨쥬게이션된 마우스 항-6His IgG (AbD Serotec; Bio-Rad)를 4℃에서 30분 동안 암소에서 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 유동세포계측법으로 분석하였다. 동시에, PSMA 단백질 발현이 PE 컨쥬게이션된 시판되는 항-PMA 단일클론 항체 (Biolegend, CA, USA)에 의해 검출되었다. 결과는 대장균 발현된 gy1이 단지 PSMA 양성 세포에 결합할 수 있지만 음성 세포에는 결합할 수 없음을 보여 주었다 (도 5).
실시예 5: 세포 ELISA에 의한 gy1 친화성 측정
대장균 발현된 gy1 scFv의 세포 표면 PSMA에 대한 결합 친화력을 평가하기 위해, 96-웰 플레이트에서 PSMA-양성 C4-2 세포를 웰 당 5 x 104개로 접종하고 밤샘 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 내인성 퍼옥시다제를 차단하도록 20분 동안 3% H2O2로 처리하기 전에 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 이후에 실온에서 30분 동안 6% 소혈청 알부민으로 차단시켰다 세 배 일련 희석된 gy1 및 대조군 scFv NCP1을 8100 nM에서 0.005 nM까지 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 PBST로 세척하고 실온에서 1시간 동안 HRP-컨쥬게이션된 마우스 항-6His 항체 (AbD Serotec, Bio-Rad, Oxford, UK)와 함께 배양하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB, eBioscience, CA, USA)을 첨가하여 비색 신호를 생성하고 15분 동안 1 M H2SO4로 배양하여 정지시켰다. 흡광도를 선라이즈 마이크로플레이트 판독기 (Tecan, Groedig, Austria)를 사용하여 450 nm에서 측정하였고, 결합 곡선을 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. gy1 친화성은 단일-부위 결합 쌍곡선 방정식의 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었다. 대장균 발현된 scFv gy1의 친화성은 Kd = 4.134 nM으로 계산되었다 (도 6)
실시예 6: 공초점 영상화를 이용한 gy1 내재화 검정
대장균 발현된 gy1 scFv를 사용하여 공초점 영상화를 이용한 내재화를 연구하였다. 50% 충만도로 커버슬립에서 자란 전립선 암 세포 예로 LnCap, C4-2, PC3-PSMA+ 및 PC3-PSMA-은 37℃에서 2시간 동안 200 nM gy1 또는 NCP1와 배양되었다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정시켰다. 내재화된 gy1은 FITC-컨쥬게이션된 마우스 항-6His IgG (AbD Serotec; Bio-Rad)에 의해 검출되었다. 다음으로 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하여 핵을 시각화하였다. 마지막으로, 세포를 PBS로 세척하고 슬라이드에 올리고 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (FluoView FV1000, Olympus) 하에 관찰하였다. 결과는 강한 형광 신호가 PSMA 양성 세포주 LNCaP, C4-2 및 PC3-PSMA+의 세포질에서 관찰될 수 있음을 보여주었다. 한편 PSMA 음성 PC3-PSMA 세포에서는 형광 신호가 검출될 수 없다 (도 7). 이들 결과는 또한 gy1이 PSMA 양성 세포로 효과적으로 내재화될 수 있음을 입증하였다.
내재화 후 gy1의 세포내 수송을 조사하기 위해, C4-2 세포에서 엔도좀, 리소좀, 골지체 및 ER (적색 형광)을 포함하는 소정의 세포 소기관과 gy1 (녹색 형광)의 공동-국소화를 검사하기 위해 면역 형광 염색을 수행하였다. 세포 소기관의 염색은 CellLight® 리소좀-RFP, CellLight® 엔도좀-RFP, CellLight® 골지-RFP 및 CellLight® ER-RFP를 포함한 CellLight® 시약 (Invitrogen Life technologies, CA, USA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 세포 영상은 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (FluoView FV1000, 올림푸스)에 의해 캡처되었다. 결과는 4시간 배양한 후, gy1이 엔도좀과 리소좀에 우세하게 축적되는 것을 보여주었고 (노란색 형광, 도 8a), gy1이 엔도좀-리소좀 경로를 통해 표적 세포로 내재화되는 것을 암시한다. 배양 시간의 상이간 기간 동안 gy1 및 골지체 또는 ER의 신호 사이에는 중첩이 없었다 (도 8b).
내재화된 단백질은 주로 두 개의 트래피킹 경로를 가지고 있다. 하나는 리소좀의 엔도좀을 통해 직접 전달되고, 다른 하나는 골지체로부터 ER까지 도달하며, 이는 역행성 트래피킹이라고 불리고 공통적으로 재순환 운반에 사용된다. gy1이 골지체 또는 ER과 공동-염색됨으로써 gy1이 또한 제 2 경로를 사용할 수 있는지 여부를 추가로 조사하였다. 결과는 서로 다른 시점에서 배양된 경우에도 gy1 및 골지체 또는 ER (그림 8B) 간에는 공동-국소화가 관찰되지 않았음을 보여주었으며, 이는 gy1 내재화 후 제 2 트래피킹 경로의 가능성을 배제시킨다.
실시예 7: gy1에 의한 생체내 종양 표적화
생체내 PSMA 표적화를 위한 gy1의 능력 및 효율을 평가하고, PCa에 대한 gy1 기반의 수술내 광학적 영상화의 실행가능성을 평가하기 위해, PSMA 양성 및 음성 이종이식 누드 마우스 모델을 루시퍼라제-발현 PC3-PSMA+ 및 PC3-PSMA- 세포를 사용하여 확립하였다. 이종이식 종양 모델은 5 x 106개의 반딧불이 루시퍼라제-발현 PC3-PSMA+ 또는 PC3-PSMA- 세포를 0.1 mL PBS에서 각 마우스의 오른쪽 엉덩이에 피하로 주사함으로써 개발되었다. 접종 2주 후, 종양 조직을 분리하고, H & E 및 면역조직화학 염색을 수행하여 조직 형태 및 PSMA 발현 수준을 확인하였다. 결과는 PSMA가 PC3-PSMA+ 전립선 암 조직에서는 검출될 수 있지만, PC3-PSMA- 전립선 암 조직에서는 검출될 수 없음을 보여 주었다 (도 9). 루시퍼라제 발현은 제노겐 IVIS 역학적 영상화 시스템 (도 11, 좌측 패널)에 의한 두 이종이식 모델에서도 역시 검증되었다. 이 PSMA 양성 및 음성 전립선 암 이종이식 마우스 모델 쌍이 gy1 표적화 평가에 사용되었다.
생체내 광학적 영상화 연구를 위해, gy1 및 NCP1 단백질을 제조사의 지침에 따라 1 mg/mL의 농도에서 1 : 20의 단백질/염료 비율로 IRDye800cw 표지화 키트 (Li-Cor Biosciences, 미국 네브라스카)를 사용하여 IRDye800으로 표지하였다. 투석을 통해 여분의 염료를 제거하였다. 염료 표지화는 유동세포계측법 분석에 의해 PC3-PSMA+ 세포 상에서 검증된 gy1의 PSMA 결합 친화성을 저하시키지 않았다 (도 10). 각 마우스의 경우, 0.2 μmol/kg의 IRDye800-표지된 gy1 또는 NCP1을 정맥내로 주사하고 마우스를 지시된 시점에서 마취시키고, IRDye800 형광을 제노겐 IVIS 역학적 영상화 시스템 하의 여기 파장 745 nm에서 실시간 방식으로 모니터링하였다. 동일한 조명 설정 (1초 노출, f/정지 = 2)이 모든 영상에 사용되었다. 생체내 전신 근적외선 형광 영상화 (FLI)와 동시에, 12시간 동안 처리된 각 군에서 5마리의 마우스를 희생시키고 상이한 조직을 분리하고 그들의 형광 강도를 분석하였다. 형광 강도는 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 계산하고 광자 유속 (p/s/cm2/sr)으로 나타내었다.
결과는 IRDye800으로 표지된 gy1이 1시간 후에 전신에 걸쳐 신속하게 확산되고, 2시간부터 종양 조직에서 검출될 수 있음을 보여주었다. 다음으로 IRDye800로 표지된 gy1은 체내에서 점차 제거되었으나 PSMA 양성 종양 조직에서는 여전히 특이적으로 유지되지만 PSMA 음성 종양 조직에서는 유지되지 않았다 (도 11 우측 패널, 도 12). 종양에서 가장 높은 신호/배경 비율은 주사 후 6시간에 획득되었으며 종양의 신호는 24시간 후에 거의 검출되지 않았다. gy1 주사 후 12시간에 각 군의 5마리 마우스를 희생시키고 추가의 생체 분포 평가를 위해 상이한 조직을 수집하였다. FLI 데이터와 일치하여 PC3-PSMA+ 실험군의 종양 조직에서 가장 강한 형광 신호가 검출될 수 있지만, 신장, 간 및 비장에서는 상대적으로 약한 신호가 검출될 수 있는 한편 다른 조직에서는 무시할만한 신호만 검출될 수 있다. 한편으로 PC3-PSMA- 군에서는 종양 조직에서 명백한 형광 신호가 검출되지 않았다 (도 13a 및 도 13b). 이들 데이터는 gy1이 PSMA 양성 종양 조직을 생체내에서 특이적으로 표적화하고, 이에 분포할 수 있음을 시사하고, 이는 수술내 광학적 영상화, PET 영상, 나노의약 및 항체 약물 컨쥬게이트와 같은 gy1을 사용하는 PSMA 표적화된 영상화 및 치료 전략의 개발을 장려한다.
실시예 8: 완전 항체로의 gy1의 조작
서열번호들 40/41, 42/43, 44/45, 46/47 (gy1-2)의 돌연변이를 갖는 gy1 scFv를 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 신호 펩타이드 및 불변 영역을 접목하여 완전 항체로 조작하였다. 항체 생식계열 세포 데이타베이스의 서열 분석에 의해, IGHV3-30-3*02 및 IGLV1-50*01 신호 펩타이드 및 IgG1 및 CL1 불변 영역이 각각 중쇄 및 경쇄를 위해 선택되었다. 중쇄 및 경쇄의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호들 52/53 및 60/61에 나타내고, 성숙한 중쇄 및 경쇄 (신호 펩타이드 절단 후) 서열을 서열번호 68 및 69에 나타낸다. 조작된 완전 항체는 PSMAb로 명명되었다. 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열은 CHO 세포 발현을 위해 코돈 최적화되었고, 합성되어 벡터 pcDNA3에 각각 클로닝되었다. 재조합 PSMAb는 제조사의 프로토콜 (FreeStyle?? CHO Expression of life technologies)에 따라 현탁 CHO 세포 (CHO-S)에 1 : 4의 비율로 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 일시적 공동-형질전환에 의해 발현되었다. 7일 발현 후, 상청액을 수집하고 PSMAb를 HiTrap rProtein A FF 컬럼 (GE healthcare life sciences)을 사용하여 정제하였다. 간략하게, 상청액을 동일한 부피 완충액 A (20 mM 소듐포스페이트 완충액, pH 7.0)와 혼합하고, 0.45 um 막을 통해 여과하였으며, 5 컬럼 부피의 완충액 A로 평형화된 HiTrap rProtein A FF 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 10 컬럼 부피 A로 세척하고 항체를 완충액 B (0.1M 시트르산, pH 3.5)로 용출시키고 완충액 C (1.0M 트리스-HCl pH 9.0)로 중화시켰다. 항체를 투석에 의해 PBS 내로 완충액 교환하고, 분주하고 -80℃에 보관하였다 (도 14a).
실시예 9: PSMAb 완전 항체의 특성화
친화성 측정
ELISA를 사용하여, 음성 대조군을 위해 PSMAb 대신에 대조군 인간 IgG1 (시그마)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술된 바와 같이 PSMAb의 친화성을 측정하였고, HRC-컨쥬게이션된 항-인간 IgG Fc Ab (1: 20000, Abcam)를 이차 항체로서 사용하였다. PSMAb의 3배 일련 희석은 100 nM부터 시작하여 0.19 pM까지이었다. PSMAb의 계산된 친화성은 0.1 nM이다 (도 14b)
세포 결합 및 차단 검정
세포 표면 상에 발현된 PSMA에 PSMA 결합은 여러 전립선 세포주, 예로 PSMA+ 세포 C4-2, LNCaP, PC-3-PSMA+ 및 PSMA- 세포 PC-3 및 DU-145에서 유동세포계측법에 의해 연구되어 왔다. 간략하게, 탈착된 세포를 3번 세척한 후 PSMAb, 음성 대조군 인간 IgG (Sigma) 또는 양성 대조군 항체 LNI-17 (Biolegend)와 배양한 다음 1 : 20으로 희석된 PE 컨쥬게이션된 이차 항체 (Biolegend)와 함께 배양하였다. 세포 결합 신호는 유동세포계측법에 의해 검출되었다. 결과는 PSMAb가 PSMA-양성 세포에는 결합할 수 있지만, 음성 세포에는 결합하지 않아서 LNI-17 염색에 의해 검증된 PSMA 발현 수준과 일치하는 것을 보여주었다 (도 15).
PSMA+ 세포에 대한 PSMAb의 결합이 PSMA 특이적임을 확인하기 위해, 재조합 PSMA 단백질 또는 대조 단백질 BSA를 사용하여 차단 검정법을 수행하였다. 차단 검정법은 세포와의 배양 전에, 2nM 농도의 PSMAb를 2,6 및 10 nM 재조합 PSMA 또는 대조군으로서 10 nM BSA와 함께 RT에서 2시간 동안 미리 배양한 것을 제외하고는, 상기에 기술한 바와 같이 유동세포계측법을 사용하여 PC3-PSMA+ 세포 상에서 연구되었다. 결과는 PSMA 재조합 단백질이 항체의 동일한 농도, 예로 2nM에서도 (도 16), PC3-PSMA+ 세포에 대한 PSMAb의 결합을 완전히 차단할 수 있음을 보여주었다.
PSMAb의 내재화
대조군 인간 IgG1을 음성 대조군으로 사용하고 이차 항체를 FITC 컨쥬게이션된 항-인간 IgG Fc 항체 (1 : 50, Santa Cruz biotechnology, USA)인 점을 제외하고는 실시예 6에서 기술한 바와 같이 전립선 암 세포 C4-2, LNCaP, PC-3 및 DU-145에 대해 PSMAb의 내재화를 연구하였다. 결과는 PSMAb가 선택적으로 및 효과적으로 PSMA 양성 세포 내로 내재화될 수 있음을 보여주었다 (도 17).
실시예 10: PSMAb의 생체내 종양 표적화
종양 표적화의 효율성과 PSMAb의 수술내 광학적 영상화의 잠재력을 평가하기 위해 PSMAb를 근적외선 염료 IRDye800CW로 표지하였고, 50 μg 표지된 PSMAb/마우스를 PC3-PSMA+ 또는 PC3-PSMA-이종이식 모델에 꼬리-정맥 주사하였으며, PSMAb의 실시간 생체분포를 실시예 7에 기술된 바와 같이 제노겐 IVIS 역학적 영상화 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 생체내 광학적 영상화는 PSMAb가 전신에 걸쳐 급속히 확산되고 주사 후 24 시간부터 종양 조직에서 검출될 수 있으며 PSMA+ 종양에서는 특이적으로 유지되는 반면 점차적으로 체내에서 제거되지만 PSMA 종양에서는 유지되지 않음을 보여주었다 (도 18a 내지 도 18 b). 좋은 신호/배경 비율은 주사 후 48 시간에 관찰되었다 (도 18a 내지 도 18c). scFv와 비교하여, 완전 항체는 순환 시간이 더 길고 따라서 광학적 영상화을 위한 신호/배경 비율이 더 우수한다.
실시예 11: DM1 항체 약물 컨쥬게이션
PSMA 표적화된 ADC를 개발하기 위해, PSMAb를 안정한 링커 SMCC를 통해 DM1과 컨쥬게이션시켰다 (도 19). 간략하게, PSMAb를 50 mM 인산칼륨, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.2로 완충액 교환하고, 농도를 4 mg/mL로 조정하였다. SMCC-DM1 (Concortis Biosystems)을 DMA에 용해시켜 10 mM의 최종 농도를 얻었다. 항체 용액의 각 부피에 0.43% 부피 DMA를 첨가하고 혼합한 다음 2.67% 부피의 10 mM SMCC-DM1을 첨가한다. DMA의 최종 농도는 3% (v/v)이고 약물/Ab 비율은 10 : 1이다. 용액을 혼합하면서 실온에서 3시간 동안 진행시킨 다음, 완충액을 투석에 의해 PBS로 교환하였다. 약물/Ab 컨쥬게이션 비율은 컨쥬게이트의 252 및 280 nm에서의 흡광도에 기초하여 이전에 기술한 바와 같이 3.3에서 측정되었다 (미국 특허 20060088539 A1).
실시예 12: MMAE 및 MMAF 항체 약물 컨쥬게이션
PSMA 표적화된 ADC를 개발하기 위해, PSMAb는 절단가능한 링커 Mc-vc-PAB를 통해 각각 MMAE 및 MMAF와 컨쥬게이션되었다 (도 20). 항체 농도를 0.025M 붕산 나트륨 pH 8, 0.025 M NaCl, 1 mM DTPA에서 8 mg/mL로 조정하고, 37℃에서 2시간 동안 2.75 몰 당량의 TCEP에 의해 부분적으로 감소시켰다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고 항체 농도를 5.625 mg/mL로 조정하고 차가운 아세토니트릴에 용해된 0.25 부피의 700 mM MC-vc-PAB-MMAE 및 MC-vc-PAB-MMAF와 혼합하고, 반응이 얼음에서 30분 동안 계속되도록 하였다. 과량의 MC-vc-PAB-MMAE 또는 MC-vc-PAB-MMAF를 시스테인 (1 mM 최종 농도)으로 켄칭시켰다. PD-10 컬럼을 사용하여 항체 약물 컨쥬게이트를 기술된 바와 같이 정제하였다 (Kevin J. Hamblett et al., 2004, Clin Cancer Res, 10: 7063). 설명된 바와 같이 250 및 280 nM에서의 흡광도 비율을 측정함으로써 항체 당 3.5 및 3.03에서 MMAE 및 MMAF의 약물 부하가 결정된다 (Kevin J. Hamblett et al., 2004, Clin Cancer Res, 10; 7063).
실시예 13: PSMAb는 약물 컨쥬게이션 후 PSMA 결합 및 내재화 능력을 보유한다
DM1, MMAE 또는 MMAF와의 컨쥬게이션 후, PSMA 결합 및 PSMAb 약물 컨쥬게이트의 내재화를 각각 상기 기술한 바와 같이 유동세포계측법 및 공초점 영상화에 의해 평가하였다. 결과는 PSMAb 약물 컨쥬게이트의 항원 결합 및 내재화가 잘 유지되었음을 보여주었다 (도 21 및 도 22).
실시예 14: PMSA 항체 약물 컨쥬게이트의 PMSA 특이적 세포독성
PSMAb 기반의 ADC의 세포독성은 PSMA- 세포주 PC-3 및 PSMA+ 세포주 C4-2에서 평가되었다. 간략하게, C4-2 및 PC-3 세포를 96 웰 플레이트에 10% FBS, 2000개 세포/200 mL/웰을 갖는 DMEM 배지에 접종하였다. 다음 날, 세포 밀도는 약 20 내지 30%이었고, 배지는 333.33 nM, 133.33 nM, 66.67 nM, 33.33 nM, 6.67 nM, 3.33 nM, 0.67 nM, 0.33 nM, 0.067 nM, 0.0067 nM, 0.00067 nM 및 0.000067 nM의 농도에서 PSMAb-DM1, PSMAb-MMAE 또는 PSMAb-MMAF를 포함하는 새로운 배지로 각 농도에서 세 번 반복하여 교환되었다. 배지는 각 웰을 위해 동일한 약물 농도로 매일 교환되었다. 4일 배양 후, 세포 생존도를 제조사의 프로토콜에 따라 알라마블루 키트 (Invitrogen)를 사용하여 평가 하였다. 결과는 PSMAb-DM1, PSMAb-MMAE 및 PSMAb-MMAF는 PC-3 세포 상에 독성이 없지만, C4-2 세포 상에 용량 의존성 독성을 PSMAb-DM1, PSMAb-MMAE 및 PSMAb-MMAF에 대해 각각 0.12 nM, 0.59 nM 및 0.92 nM의 ID50을 가짐을 보여주었다 (도 23).
실시예 15: PSMA-ADC는 PSMA+ 세포의 세포사멸을 특이적으로 유도한다
PSMA 특이적 세포 살상에서 PSMAb ADC의 기작을 더 연구하기 위해 PSMAb ADC 유도된 세포 사멸이 PC-3 및 C4-2 세포에서 연구되었다. 간략하게, PC-3 및 C4-2 세포를 2 Х 105개/2 mL 배지/웰의 밀도로 6 웰 플레이트에 접종하였고, 밤샘 동안 배양되었다. 다음날, 배지를 교환하고 세포를 2 mL 배지에서 50 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.01 μg/mL 및 0.001 μg/mL의 농도로 PSMAb- μg/mL와 배양하였다. 인간 IgG 및 PSMAb를 50 mg/mL 농도로 대조군으로서 사용하였다. 48시간 배양 후, 세포를 트립신 처리하고 PBS로 두 번 세척하였으며, 제조사의 지침에 따라 아넥신-V/PI (Roche)로 염색하였다. 세포사멸은 유동세포계측법을 사용하여 아넥신-V(+)/PI(-)로의 신호는 초기 세포사멸을 나타내고, 이중 양성 염색 예로 아넥신-V(+)/PI(+)는 후기 세포사멸을 나타낸다. 총 세포사멸은 초기 및 후기 세포사멸의 합계이다. 결과는 세 가지 PSMAb 기반의 ADC 모두, 예로 PSMAb-DM1, PSMAb-MMAE 및 PSMAb-MMAF는 초기 및 후기 세포사멸을 효과적으로 유도할 수 있었으며 PSMAb-DM1은 주로 후기 세포사멸을, PSMAb-MMAE및 PSMAb-MMAF는 주로 초기 세포사멸을 유도하였다 (도 24).
실시예 16: 서열
서열번호 1 PSMA의 세포외 도메인:
KSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
서열번호 2 gy1 scFv 핵산 서열:
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCGGATCCTCTAGGTCAAGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCAGCGGAGGCGGCGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACTTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 3 gy1 scFv 아미노산 서열:
QSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKVTVLGGSSRSSSSGGGGSGGGGEVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGSTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSS
서열번호 4 gy1 VL 핵산 서열:
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
서열번호 5 gy1 VL 아미노산 서열:
QSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKVTVL
서열번호 6 gy1 VL 프레임 영역 1 (FR1) 핵산 서열:
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGC
서열번호 7 gy1 VL 프레임 영역 1 (FR1) 아미노산 서열:
QSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGS
서열번호 8 gy1 VL CDR1 핵산 서열:
AGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCAT
서열번호 9 gy1 VL CDR1 아미노산 서열:
SSNIGAGSH
서열번호 10 gy1 VL 프레임 영역 2 (FR2) 핵산 서열:
GTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTAT
서열번호 11 gy1 VL 프레임 영역 2 (FR2) 아미노산 서열:
VHWYQQVPGTAPKLLIY
서열번호 12 gy1 VL CDR2 핵산 서열:
GGAAACACC
서열번호 13 gy1 VL CDR2 아미노산 서열:
GNT
서열번호 14 gy1 VL 프레임 영역 3 (FR3) 핵산 서열:
AATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGT
서열번호 15 gy1 VL 프레임 영역 3 (FR3) 아미노산 서열:
NRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYC
서열번호 16 gy1 VL CDR3 영역 핵산 서열:
GCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATA
서열번호 17:
ATWDDSLNGVI
서열번호 18:
TTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
서열번호 19 gy1 VL 프레임 영역 4 (FR4) 아미노산 서열:
FGGGTKVTVL
서열번호 20 gy1 VH 핵산 서열:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACTTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 21 gy1 VH 아미노산 서열:
EVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGSTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSS
서열번호 22 gy1 VH 프레임 영역 1 (FR1) 핵산 서열:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT
서열번호 23 gy1 VH 프레임 영역 1 (FR1) 아미노산 서열:
EVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAAS
서열번호 24 gy1 VH CDR1 핵산 서열:
GGATCCACCCTCAGTGGCTATGCT
서열번호 25 gy1 VH CDR1 아미노산 서열:
GSTLSGYA
서열번호 26 gy1 VH 프레임 영역 2 (FR2) 핵산 서열:
ATGCACTGGGCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTT
서열번호 27 gy1 VH 프레임 영역 2 (FR2) 아미노산 서열:
MHWVRQAPGKGLEWVAV
서열번호 28 gy1 VH CDR2 영역 핵산 서열:
ATATCATATGATGGAAGCAATAAA
서열번호 29 gy1 VH CDR2 영역 아미노산 서열:
ISYDGSNK
서열번호 30 gy1 VH 프레임 영역 3 (FR3) 핵산 서열:
TACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGT
서열번호 31 gy1 VH 프레임 영역 3 (FR3) 아미노산 서열:
YYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYC
서열번호 32 gy1 VH CDR3 영역 핵산 서열:
GCTAAAGGCCTTACTTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATC
서열번호 33 gy1 VH CDR3 영역 아미노산 서열:
AKGLTWGLGDNDALDI
서열번호 34 gy1 VH 프레임 영역 4 (FR4) 핵산 서열:
TGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 35 gy1 VH 프레임 영역 4 (FR4) 아미노산 서열:
WGPGTVTVSS
서열번호 36 gy1 scFv 링커 핵산 서열:
GGCGGATCCTCTAGGTCAAGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCAGCGGAGGCGGCGGT
서열번호 37 gy1 scFv 링커 아미노산 서열:
GGSSRSSSSGGGGSGGGG
서열번호 38 점 돌연변이를 갖는 gy1 VL 프레임 영역 2 (FR2) 핵산 서열:
GTACACTGGTACCAGCAGGCTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTAT
서열번호 39 점 돌연변이를 갖는 gy1 VL 프레임 영역 2 (FR2) 아미노산 서열:
VHWYQQAPGTAPKLLIY (V=>A)
서열번호 40 점 돌연변이를 갖는 gy1 VL CDR2 핵산 서열:
GAAAACACC
서열번호 41 점 돌연변이를 갖는 gy1 VL CDR2 아미노산 서열:
E N T (G=>E)
서열번호 42 점 돌연변이를 갖는 gy1 VL 프레임 영역 4 (FR4) 핵산 서열:
TTCGGCGGAGGGACCAAGGCCACCGTCCTA
서열번호 43 점 돌연변이를 갖는 gy1 VL 프레임 영역 4 (FR4) 아미노산 서열:
F G G G T K A T V L (V=>A)
서열번호 44:
GGATTCACCCTCAGTGGCTATGCT
서열번호 45 점 돌연변이를 갖는 gy1 VH CDR1 아미노산 서열:
G F T L S G Y A (S=>F)
서열번호 46:
TACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGT
서열번호 47 점 돌연변이를 갖는 gy1 VH 프레임 영역 3 (FR3) 아미노산 서열:
Y Y A D S V K G R F T V S R D N S K N T L F L Q M N S L R P E D T A V Y Y C (I=>V)
서열번호 48 점 돌연변이를 갖는 gy1 VH CDR3 영역 핵산 서열:
GCTAAAGGCCTTACTTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGGTATC
서열번호 49 점 돌연변이를 갖는 gy1 VH CDR3 영역 아미노산 서열:
A K G L T W G L G D N D A L G I (D=>G)
서열번호 50:
TGGGGCCCCGAGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 51 점 돌연변이를 갖는 gy1 VH 프레임 영역 4 (FR4) 아미노산 서열:
W G P E T T V T V S S (G=>E)
서열번호 52 PSMAb 중쇄 핵산 서열:
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACCTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 53 PSMAb 중쇄 아미노산 서열:
M E F G L S W V F L V A L L R G V Q C E V Q L V E S G G A L A K P G G S L R L S C A A S G F T L S G Y A M H W V R Q A P G K G L E W V A V I S Y D G S N K Y Y A D S V K G R F T V S R D N S K N T L F L Q M N S L R P E D T A V Y Y C A K G L T W G L G D N D A L D I W G P G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
서열번호 54 PSMAb 중쇄 신호 펩타이드 핵산 서열:
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT
서열번호 55 PSMAb 중쇄 신호 펩타이드 아미노산 서열:
M E F G L S W V F L V A L L R G V Q C
서열번호 56 PSMAb 중쇄 가변 영역 핵산 서열:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACCTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 57 PSMAb 중쇄 가변 영역 아미노산 서열:
E V Q L V E S G G A L A K P G G S L R L S C A A S G F T L S G Y A M H W V R Q A P G K G L E W V A V I S Y D G S N K Y Y A D S V K G R F T V S R D N S K N T L F L Q M N S L R P E D T A V Y Y C A K G L T W G L G D N D A L D I W G P G T T V T V S S
서열번호 58 PSMAb 중쇄 불변 영역 핵산 서열:
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
서열번호 59 PSMAb 중쇄 불변 영역 아미노산 서열:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 60 PSMAb 경쇄 핵산 서열:
ATGGCCTGGTCTCCTCTCCTCCTCACTCTCCTCGCTCACTGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGAAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGCCACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGA
서열번호 61 PSMAb 경쇄 아미노산 서열:
M A W S P L L L T L L A H C T G S W A Q S V L T Q P P S V S G A P G Q S V I I S C T G S S S N I G A G S H V H W Y Q Q V P G T A P K L L I Y E N T N R P S G V P D R F S G S K S G T S G S L A I T G L Q P E D E A D Y Y C A T W D D S L N G V I F G G G T K A T V L G Q P K A A P S V T L F P P S S E E L Q A N K A T L V C L I S D F Y P G A V T V A W K A D S S P V K A G V E T T T P S K Q S N N K Y A A S S Y L S L T P E Q W K S H R S Y S C Q V T H E G S T V E K T V A P T E C S
서열번호 62 PSMAb 경쇄 신호 펩타이드 핵산 서열:
ATGGCCTGGTCTCCTCTCCTCCTCACTCTCCTCGCTCACTGCACAGGGTCCTGGGCC
서열번호 63 PSMAb 경쇄 신호 펩타이드 아미노산 서열:
M A W S P L L L T L L A H C T G S W A
서열번호 64 PSMAb 경쇄 가변 영역 핵산 서열:
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGAAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGCCACCGTCCTA
서열번호 65 PSMAb 경쇄 가변 영역 아미노산 서열:
Q S V L T Q P P S V S G A P G Q S V I I S C T G S S S N I G A G S H V H W Y Q Q V P G T A P K L L I Y E N T N R P S G V P D R F S G S K S G T S G S L A I T G L Q P E D E A D Y Y C A T W D D S L N G V I F G G G T K A T V L
서열번호 66 PSMAb 경쇄 불변 영역 핵산 서열:
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
서열번호 67 PSMAb 경쇄 불변 영역 아미노산 서열:
G Q P K A A P S V T L F P P S S E E L Q A N K A T L V C L I S D F Y P G A V T V A W K A D S S P V K A G V E T T T P S K Q S N N K Y A A S S Y L S L T P E Q W K S H R S Y S C Q V T H E G S T V E K T V A P T E C S
서열번호 68 신호 펩타이드 없는 PSMAb 중쇄 아미노산 서열:
E V Q L V E S G G A L A K P G G S L R L S C A A S G F T L S G Y A M H W V R Q A P G K G L E W V A V I S Y D G S N K Y Y A D S V K G R F T V S R D N S K N T L F L Q M N S L R P E D T A V Y Y C A K G L T W G L G D N D A L D I W G P G T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
서열번호 69 신호 펩타이드 없는 PSMAb 경쇄 아미노산 서열:
Q S V L T Q P P S V S G A P G Q S V I I S C T G S S S N I G A G S H V H W Y Q Q V P G T A P K L L I Y E N T N R P S G V P D R F S G S K S G T S G S L A I T G L Q P E D E A D Y Y C A T W D D S L N G V I F G G G T K A T V L G Q P K A A P S V T L F P P S S E E L Q A N K A T L V C L I S D F Y P G A V T V A W K A D S S P V K A G V E T T T P S K Q S N N K Y A A S S Y L S L T P E Q W K S H R S Y S C Q V T H E G S T V E K T V A P T E C S
서열번호 70 CD8a 리더 핵산 서열:
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
서열번호 71 CD8a 리더 아미노산 서열:
MALPVTALLLPLALLLHAARP
서열번호 72 CD8a 힌지 핵산 서열:
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACGGCGCCCACCATCGCGTCGCCCCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
서열번호: 73 CD8a 힌지 아미노산 서열:
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
서열번호 74 CD8a 막통과 도메인 핵산 서열
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
서열번호 75 CD8a 막통과 도메인 아미노산 서열:
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
서열번호 76 4-1BB 세포내 도메인 (ICD) 핵산 서열:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
서열번호 77 4-1BB 세포내 도메인 (ICD) 아미노 서열:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
서열번호 78 CD3 제타 핵산 서열
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
서열번호 79 CD3 제타 아미노산 서열:
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 80 gy1-2 CAR 구조물 핵산 서열:
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGTCTAGACAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGAAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGCCACCGTCCTAGGCGGATCCTCTAGGTCAAGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCAGCGGAGGCGGCGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACCTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAAGATCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
서열번호 81 gy1-2 CAR 구조물 아미노산 서열
MALPVTALLLPLALLLHAARPSRQSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYENTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKATVLGGSSRSSSSGGGGSGGGGEVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGFTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSSRSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 82 mOKT3 마우스 scFv 핵산 서열:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCGGAACTGGCGCGCCCGGGCGCGAGCGTGAAAATGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCCGCTATACCATGCATTGGGTGAAACAGCGCCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGAGCCGCGGCTATACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGATAAAGCGACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCTATTATGATGATCATTATTGCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGATTATGAGCGCGAGCCCGGGCGAAAAAGTGACCATGACCTGCAGCGCGAGCAGCAGCGTGAGCTATATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGCTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCGAGCGGCGTGCCGGCGCATTTTCGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCGGCATGGAAGCGGAAGATGCGGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCGTTTACCTTTGGCAGCGGCACCAAACTGGAAATTAACCGC
서열번호 83 mOKT3 마우스 scFv 아미노산 서열:
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
서열번호: 84 mOKT3 VH 핵산 서열:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCGGAACTGGCGCGCCCGGGCGCGAGCGTGAAAATGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCCGCTATACCATGCATTGGGTGAAACAGCGCCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGAGCCGCGGCTATACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGATAAAGCGACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCTATTATGATGATCATTATTGCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGC
서열번호 85 mOKT3 VH 아미노산 서열:
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
서열번호 86 mOKT3 VL 핵산 서열:
CAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGATTATGAGCGCGAGCCCGGGCGAAAAAGTGACCATGACCTGCAGCGCGAGCAGCAGCGTGAGCTATATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGCTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCGAGCGGCGTGCCGGCGCATTTTCGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCGGCATGGAAGCGGAAGATGCGGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCGTTTACCTTTGGCAGCGGCACCAAACTGGAAATTAACCGC
서열번호 87 mOKT3 VL 아미노산 서열:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
서열번호 88 hOKT3 인간화 scFv 핵산 서열:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCCGCTATACCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGAGCCGCGGCTATACCAACTATAACCAGAAAGTGAAAGATCGCTTTACCATTAGCACCGATAAAAGCAAAAGCACCGCGTTTCTGCAGATGGATAGCCTGCGCCCGGAAGATACCGGCGTGTATTTTTGCGCGCGCTATTATGATGATCATTATTGCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGCGCGAGCAGCAGCGTGAGCTATATGAACTGGTATCAGCAGACCCCGGGCAAAGCGCCGAAACGCTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCTTTACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATATTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCGTTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGCAGATTACCCGC
서열번호 89 hOKT3 인간화 scFv 아미노산 서열:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
서열번호 90 hOKT3 VH 핵산 서열:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCCGCTATACCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGAGCCGCGGCTATACCAACTATAACCAGAAAGTGAAAGATCGCTTTACCATTAGCACCGATAAAAGCAAAAGCACCGCGTTTCTGCAGATGGATAGCCTGCGCCCGGAAGATACCGGCGTGTATTTTTGCGCGCGCTATTATGATGATCATTATTGCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGC
서열번호 91 hOKT3 VH 아미노산 서열:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
서열번호 92 hOKT3 VL 핵산 서열:
GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGCGCGAGCAGCAGCGTGAGCTATATGAACTGGTATCAGCAGACCCCGGGCAAAGCGCCGAAACGCTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCTTTACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATATTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCGTTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGCAGATTACCCGC
서열번호 93 hOKT3 VL 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
서열번호 94 돌연변이된 IgG1 힌지 핵산 서열:
GAGCCCAAATCTGCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
서열번호 95 돌연변이된 IgG1 힌지 아미노산 서열:
EPKSADKTHTCPPCP
서열번호 96 돌연변이된 IgG4 Fc (N297A) 핵산 서열:
GCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCGCTAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열번호 97 돌연변이된 IgG4 Fc (N297A) 아미노산 서열:
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 98 돌연변이된 IgG1 힌지-IgG4 Fc 핵산 서열:
GAGCCCAAATCTGCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCGCTAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열번호 99 돌연변이된 IgG1 힌지-IgG4 Fc 아미노산 서열:
EPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 100 scFv1 MCS-G4S-hOKT3 scFv-IgG1 힌지-IgG4 Fc 발현 카세트 핵산 서열:
ACTAGTGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTCTTCCTGGTGGCTATCTTGAAGGGTGTCCAGTGTGAATTCAAGCTTTCTAGAAGCGCTGCTAGCGGTGGAGGTGGATCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCAGGGGGGGGAGTCGTGCAGCCCGGTCGGTCTCTGCGTCTGTCTTGTAAGGCATCCGGTTATACTTTTACCAGGTACACAATGCACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTATATCAACCCATCCAGGGGCTACACCAACTATAATCAGAAGGTGAAGGACCGGTTCACCATCTCTACAGATAAGAGCAAGTCTACAGCCTTTCTGCAGATGGACTCCCTGAGACCTGAGGATACCGGCGTGTACTTCTGCGCTCGCTACTATGACGATCATTACTGTCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCATCTTCCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGACACCCGGCAAGGCCCCTAAGAGATGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCTCTCGCTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTATACCTTTACAATCAGCTCTCTGCAGCCTGAGGATATCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCCAGCAATCCATTCACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGCAGATCACCAGGCTCGAGCCAAAGAGCGCCGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCAGCTCCCGAGTTTCTGGGCGGCCCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATCAGCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTTGCTTCTACATACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCTAAGGGACAGCCTCGCGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCTCCATCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAGACTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAATCACTGTCACTGTCCCTGGGCAAGTAGGCGGCCGC
서열번호 101 scFv1 MCS-G4S-hOKT3 scFv-IgG1 힌지-IgG4 Fc 발현 카세트 아미노산 서열:
MEFGLSWVFLVAILKGVQC-MCS-QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRLEPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 102 scFv1 MCS-G4S-mOKT3 scFv-IgG1 힌지-IgG4 Fc 발현 카세트 핵산 서열:
ACTAGTGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTCTTCCTGGTGGCTATCTTGAAGGGTGTCCAGTGTGAATTCAAGCTTTCTAGAAGCGCTGCTAGCGGTGGAGGTGGATCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCCGAACTGGCCCGTCCCGGAGCAAGCGTGAAAATGTCCTGTAAAGCAAGTGGCTATACCTTCACCAGGTACACAATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTATATCAACCCCTCTAGGGGCTACACAAACTATAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGATAAGTCCAGCTCTACAGCTTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGCGCTAGATACTATGACGATCATTACTGTCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCAGCTATCATGTCCGCCTCCCCTGGAGAGAAGGTGACCATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGTCTTACATGAATTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACAAGCCCTAAGAGATGGATCTACGACACCTCTAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCAGCTCACTTTCGCGGCTCCGGCAGCGGCACCTCTTATTCCCTGACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAGGATGCCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCATCAAATCCTTTCACCTTCGGTTCAGGGACAAAACTGGAGATCAATAGGCTCGAGCCAAAGAGCGCCGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCAGCTCCCGAGTTTCTGGGCGGCCCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATCAGCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTTGCTTCTACATACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCTAAGGGACAGCCTCGCGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCTCCATCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAGACTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAATCACTGTCACTGTCCCTGGGCAAGTAGGCGGCCGC
서열번호 103 scFv1 MCS-G4S-mOKT3 scFv-IgG1 힌지-IgG4 Fc 발현 카세트 아미노산 서열:
MEFGLSWVFLVAILKGVQC-MCS-QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRLEPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 104 항-PSMA 및 hOKT3 이중특이적 Ab 핵산 서열 (gy1-2):
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTCTTCCTGGTGGCTATCTTGAAGGGTGTCCAGTGTGAATTCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGAAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGCCACCGTCCTAGGCGGATCCTCTAGGTCAAGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCAGCGGAGGCGGCGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACCTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCGGTGGAGGTGGATCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCAGGGGGGGGAGTCGTGCAGCCCGGTCGGTCTCTGCGTCTGTCTTGTAAGGCATCCGGTTATACTTTTACCAGGTACACAATGCACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTATATCAACCCATCCAGGGGCTACACCAACTATAATCAGAAGGTGAAGGACCGGTTCACCATCTCTACAGATAAGAGCAAGTCTACAGCCTTTCTGCAGATGGACTCCCTGAGACCTGAGGATACCGGCGTGTACTTCTGCGCTCGCTACTATGACGATCATTACTGTCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCATCTTCCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGACACCCGGCAAGGCCCCTAAGAGATGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCTCTCGCTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTATACCTTTACAATCAGCTCTCTGCAGCCTGAGGATATCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCCAGCAATCCATTCACCTTTGGCCAGGGCACAAAGCTGCAGATCACCAGGCTCGAGCCAAAGAGCGCCGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCAGCTCCCGAGTTTCTGGGCGGCCCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATCAGCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTTGCTTCTACATACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCTAAGGGACAGCCTCGCGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCTCCATCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAGACTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAATCACTGTCACTGTCCCTGGGCAAGTAG
서열번호 105 항-PSMA 및 hOKT3 이중특이적 Ab의 아미노산 서열 (gy1-2):
MEFGLSWVFLVAILKGVQCEFQSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYENTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKATVLGGSSRSSSSGGGGSGGGGEVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGFTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSSASGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRLEPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 106 신호 펩타이드 없는 항-PSMA 및 hOKT3 이중특이적 Ab 아미노산 서열 (gy1-2):
EFQSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYENTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKATVLGGSSRSSSSGGGGSGGGGEVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGFTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSSASGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRLEPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 107 항-PSMA 및 mOKT3 이중특이적 Ab 핵산 서열 (gy1-2):
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTCTTCCTGGTGGCTATCTTGAAGGGTGTCCAGTGTGAATTCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGTGTCATTATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTCTCATGTACACTGGTACCAGCAGGTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGAAAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGGTTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGTGCAACATGGGATGACAGTCTGAATGGTGTAATATTCGGCGGAGGGACCAAGGCCACCGTCCTAGGCGGATCCTCTAGGTCAAGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCAGCGGAGGCGGCGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCCTGGCCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTACTATTGTGCTAAAGGCCTTACCTGGGGACTCGGTGACAATGATGCTCTCGATATCTGGGGCCCCGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCGGTGGAGGTGGATCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCCGAACTGGCCCGTCCCGGAGCAAGCGTGAAAATGTCCTGTAAAGCAAGTGGCTATACCTTCACCAGGTACACAATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTATATCAACCCCTCTAGGGGCTACACAAACTATAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGATAAGTCCAGCTCTACAGCTTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGCGCTAGATACTATGACGATCATTACTGTCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGTCTTCCGGAGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCAGCTATCATGTCCGCCTCCCCTGGAGAGAAGGTGACCATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGTCTTACATGAATTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACAAGCCCTAAGAGATGGATCTACGACACCTCTAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCAGCTCACTTTCGCGGCTCCGGCAGCGGCACCTCTTATTCCCTGACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAGGATGCCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCATCAAATCCTTTCACCTTCGGTTCAGGGACAAAACTGGAGATCAATAGGCTCGAGCCAAAGAGCGCCGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCAGCTCCCGAGTTTCTGGGCGGCCCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATCAGCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTTGCTTCTACATACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACAATCAGCAAGGCTAAGGGACAGCCTCGCGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCTCCATCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAGACTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAATCACTGTCACTGTCCCTGGGCAAGTAG
서열번호 108 항-PSMA 및 mOKT3 이중특이적 Ab 아미노산 서열 (gy1-2):
MEFGLSWVFLVAILKGVQCEFQSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYENTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKATVLGGSSRSSSSGGGGSGGGGEVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGFTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSSASGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRLEPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 109 항-PSMA 및 mOKT3 이중특이적 Ab 아미노산 서열 (gy1-2):
EFQSVLTQPPSVSGAPGQSVIISCTGSSSNIGAGSHVHWYQQVPGTAPKLLIYENTNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLQPEDEADYYCATWDDSLNGVIFGGGTKATVLGGSSRSSSSGGGGSGGGGEVQLVESGGALAKPGGSLRLSCAASGFTLSGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKGLTWGLGDNDALDIWGPGTTVTVSSASGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRLEPKSADKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 110 EF1a 프로모터 서열:
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
예시적인 실시예들
본 명세서의 다른 곳에서 기술된 실시예에 추가하여, 본 발명의 예시적인 실시예는 이에 한정되지 않고 다음을 포함한다:
1. 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물로서, 상기 항체 또는 항체 단편은 다음 중 하나 이상을 포함한다:
a) 서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 7과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR1;
b) 서열번호 9의 아미노산 서열 및 서열번호 9와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
c) 서열번호 11, 서열번호 11과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 39 및 서열번호 39와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR2;
d) 서열번호 13, 서열번호 13과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 41 및 서열번호 41과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;
e) 서열번호 15의 아미노산 서열 및 서열번호 15와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR3;
f) 서열번호 17의 아미노산 서열 및 서열번호 17과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
g) 서열번호 19, 서열번호 19와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 43 및 서열번호 43과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR4;
h) 서열번호 23의 아미노산 서열 및 서열번호 23과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR1;
i) 서열번호 25, 서열번호 25와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 45 및 서열번호 45와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
j) 서열번호 27의 아미노산 서열 및 서열번호 27과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR2;
k) 서열번호 29의 아미노산 서열 및 서열번호 29와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
l) 서열번호 31, 서열번호 31과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 47 및 서열번호 47과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR3;
m) 서열번호 33, 서열번호 33과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 49 및 서열번호 49와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
n) 서열번호 35, 서열번호 35와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 51 및 서열번호 51과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR4; 및
o) 서열번호 37의 아미노산 서열 및 서열번호 37과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커 도메인.
2. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 구현예 1의 조성물.
3. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 1의 조성물.
4. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 39, 서열번호 45 및 서열번호 51을 포함하는 구현예 1의 조성물.
5. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 및 서열번호 47을 포함하는, 구현예 1의 조성물.
6. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 45 및 서열번호 49를 포함하는, 구현예 1의 조성물.
7. 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물로서, 상기 항체 또는 항체 단편은 다음 중 하나 이상을 포함한다:
a) 서열번호 55의 아미노산 서열 및 서열번호 55와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 신호 펩타이드;
b). 서열번호 57의 아미노산 서열 및 서열번호 57과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
c) 서열번호 59의 아미노산 서열 및 서열번호 59와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역;
d) 서열번호 63의 아미노산 서열 및 서열번호 63과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 신호 펩타이드;
e) 서열번호 65의 아미노산 서열 및 서열번호 65와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
f) 서열번호 67의 아미노산 서열 및 서열번호 67과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역.
8. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 구현예 7의 조성물.
9. 항체 또는 항체 단편이 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 구현예 7의 조성물.
10. 항체 또는 이의 항체 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE로 이루어진 군으로부터 선택되거나, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgA 또는 IgE의 면역글로불린 불변 및/또는 가변 도메인을 갖는, 구현예 9의 조성물.
11. 항체 또는 항원-결합 단편은 람다, 카파 또는 이의 변이체의 부분 또는 완전 경쇄 불변 영역을 포함하는, 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 조성물.
12. 항체 또는 항체 단편이 재조합 항체인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
13. 항체 또는 항체 단편이 단일클론 항체인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
14. 항체 또는 항체 단편이 다중클론 항체인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
15. 항체 또는 항체 단편이 단일클론 및/또는 다중클론 항체의 혼합물인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
16. 항체 또는 항체 단편이 인간 항체인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
17. 항체 또는 항체 단편이 인간화 항체인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
18. 항체 또는 항체 단편이 키메라 항체인, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물.
19. 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 단리된 핵산 분자는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
a) 서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 7과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 9의 아미노산 서열 및 서열번호 9와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 인코딩하는 뉴크레오타이드 서열;
c) 서열번호 11, 서열번호 11과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 39 및 서열번호 39와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 13, 서열번호 13과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 41 및 서열번호 41과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 15의 아미노산 서열 및 서열번호 15와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
f) 서열번호 17의 아미노산 서열 및 서열번호 17과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
g) 서열번호 19, 서열번호 19와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 43 및 서열번호 43과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
h) 서열번호 23의 아미노산 서열 및 서열번호 23과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR1를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
i) 서열번호 25, 서열번호 25와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 45 및 서열번호 45와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
j) 서열번호 27의 아미노산 서열 및 서열번호 27과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
k) 서열번호 29의 아미노산 서열 및 서열번호 29와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
l) 서열번호 31, 서열번호 31과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 47 및 서열번호 47과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR3를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
m) 서열번호 33, 서열번호 33과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 49 및 서열번호 49와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
n) 서열번호 35, 서열번호 35와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 51 및 서열번호 51과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
o) 서열번호 37의 아미노산 서열 및 서열번호 37과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커 도메인를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
20. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 19의 조성물.
21. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 19의 조성물.
22. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 39를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 45를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 51을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 19의 조성물.
23. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 41을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 43을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 45를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 47을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 19의 조성물.
24. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 45를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 49를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 19의 조성물.
25. 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 단리된 핵산 분자는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
a) 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 6과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 FR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 8과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 10, 서열번호 10과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 38 및 서열번호 38과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 FR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 12, 서열번호 12와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 40 및 서열번호 40과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 14와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 FR3를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
f) 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 16과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
g) 서열번호 18, 서열번호 18과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 42 및 서열번호 42와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
h) 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 22와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 FR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
i) 서열번호 24, 서열번호 24와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 44 및 서열번호 44와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
j) 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 26과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 FR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
k) 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 28과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
l) 서열번호 30, 서열번호 30과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 46 및 서열번호 46과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 FR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
m) 서열번호 32, 서열번호 32와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 48 및 서열번호 48과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
n) 서열번호 34, 서열번호 34와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 50 및 서열번호 50과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 FR4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
o) 서열번호 36의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 36과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 링커 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
26. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 25의 조성물.
27. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 25의 조성물.
28. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 38의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 50의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 25의 조성물.
29. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 40의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 46의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 25의 조성물.
30. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 25의 조성물.
31. 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 단리된 핵산 분자는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
a) 서열번호 55의 아미노산 서열 및 서열번호 55와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 57의 아미노산 서열 및 서열번호 57과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 59의 아미노산 서열 및 서열번호 59와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 63의 아미노산 서열 및 서열번호 63과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 65의 아미노산 서열 및 서열번호 65와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
f) 서열번호 67의 아미노산 서열 및 서열번호 67과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
32. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 31의 조성물.
33. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 31의 조성물.
34. 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물로서, 상기 단리된 핵산 분자는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
a) 서열번호 54의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 54과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 56과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 58의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 58과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 62의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 62과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 64의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 64와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
f) 서열번호 66의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 66과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
35. 단리된 핵산 분자 서열이 서열번호 52의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 60의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 구현예 34의 조성물.
36. 상기 조성물이 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터인, 구현예 19 내지 35 중 어느 하나의 조성물.
37. 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 36의 조성물.
38. 상기 조성물이 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 세포인, 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 조성물.
39. 상기 조성물이 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 세포인, 구현예 19 내지 35 중 어느 하나의 조성물.
40. 상기 세포가 파지, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포 또는 CHO, HEK293 또는 PER.C6과 같은 포유동물 세포인, 구현예 38 또는 39의 조성물.
41. 상기 세포가 단백질 발현을 위해 조작된 동물과 같은 시험관내 또는 생체내 발현 시스템인, 구현예 38 내지 40 중 어느 하나의 조성물.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, PSMA의 발현과 관련된 질환을 갖는 대상을 치료하는 방법.
43. 상기 조성물은 생물학적 활성 제제에 공유 또는 비공유 결합으로 작동가능하게 연결된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트이고, 상기 제제는 독소, 방사성 핵종, 나노입자, 효소, 생체-활성 펩타이드 또는 뉴클레오타이드인, 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 조성물.
44. 상기 항체 약물 컨쥬게이트는 다음의 식을 갖는, 구현예 43의 조성물:
Ab-(LU-D)p
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물: 식 중,
Ab는 항체 또는 항체 단편이고,
(LU-D)는 링커 단위-약물 단위 분체이고,
LU-는 링커 단위이고,
-D는 독소, 방사성 동위원소, 나노입자, 효소, 생체-활성 펩타이드 또는 뉴클레오타이드를 나타내는 약물 단위이고;
p는 1 내지 20의 정수이다.
45. 상기 항체 약물 컨쥬게이트는 다음의 식을 가진, 구현예 43의 조성물:
Ab-(Aa-Ww―Yy-D)p
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물: 식 중,
Ab는 항체 또는 항체 단편이고;
-Aa-Ww―Yy― 는 링커 단위 (LU)이고, 식 중,
-A-는 스트레처 단위이고,
a는 0 또는 1이고,
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위이고,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
-Y-는 자가-희생적 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이고,
-D는 독소, 방사성 동위원소, 나노입자, 효소, 생체-활성 펩타이드 또는 뉴클레오타이드를 나타내는 약물 단위이고;
p는 1 내지 20의 정수이다.
46. 상기 독소, 방사성 동위원소, 나노입자, 생체-활성 펩타이드 또는 뉴클레오타이드는 담체를 통해 직접적으로 항체 또는 항체 단편에 표지되고, 다음의 식을 갖는, 구현예 43의 조성물:
Ab-{담체-(LU-D)p}n
또는
Ab-{담체-(Aa-Ww―Yy-D)p}n
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물: 식 중,
Ab는 항체 또는 항체 단편이고;
(LU-D)는 링커 단위-약물 단위 분체이고,
LU-는 링커 단위이고,
-Aa-Ww―Yy― 는 링커 단위 (LU)이고, 식 중,
-A-는 스트레처 단위이고,
a는 0 또는 1이고,
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위이고,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
-Y-는 자가-희생적 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이고,
-D는 독소, 방사성 동위원소, 나노입자, 효소, 생체-활성 펩타이드 또는 뉴클레오타이드를 나타내는 약물 단위이고;
p는 1 내지 20 범위의 정수이고,
담체는 약물 단위와 간접적인 항체 컨쥬게이션을 위해 약물 단위(들)를 로딩하는 데 사용되는 중합체, PEG, 펩타이드, 당, 화합물 또는 뉴클레오타이드이고,
N은 1 내지 20 범위의 정수이다.
47. 상기 링커(들)은 절단가능하거나 절단가능하지 않고, 안정하거나 산-불안정한, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
48. 상기 링커(들)은 펩타이드(들), 중합체(들), PEG, 당(들), 화합물(들), 뉴클레오타이드(들)인, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
49. 상기 링커는 SMCC, MC, MP, val-cit?iVC?j,ala-phe?CPAB?CSPP?CSPDB, SIAB?CMC-vc, MC-vc-PAB, 하이드라존 또는 말레이미도카프로일인, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
50. 상기 독소는 DM1, DM4, MMAE, MMAF, 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 칼리케아미신 또는 독소루비신과 같은 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 돌라스타틴, 독소루비신 또는 이들의 조합인, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
51. 상기 독소는 사포닌, 디프테리아 독소, 디프테리아 독소 A, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 외독소 PE38, 카스파제-3, 카스파제-9, 그랜자임 B, 림포톡신, 퍼포린, 세포사멸 유발인자, DNAse, DNAse A, 시토크롬 C, 보툴리눔, 안지오제닌, 콜리신, 리신 A 또는 이들의 조합의 부분, 단위 또는 완전 독소인, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
52. 상기 방사성 동위원소가 α,
Figure 112018125405303-pct00008
, 또는 양전자 방사선을 방출하는, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
53. 상기 방사성 동위원소는 몰리브덴-99, 테크네튬-99m, 비스무스-213, 크롬-51, 코발트-60, 구리-64, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 홀뮴-166, 요오드-125, 이리듐-192, 철-59, 루테튬-177, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 셀레늄-75 , 나트륨-24 (15시간), 스트론튬-89, 크세논-133, 이테르븀-169, 이트륨-90, 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 코발트-57, 갈륨-67, 인듐-111, 요오드-123, 요오드-131, 크립톤-81m, 루비듐-82, 스트론튬-92, 탈륨-201, 로듐-86, 로듐-188, 구리-67, 브롬-77, 납-212, 라듐-224, 라듐-223Ra, 브롬-76, 요오드-124, 이트륨-86, 테크네튬-94m, 갈륨-68, 갈륨-66, 구리-60, 지르코늄-89, 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 불소-18, 루비듐-82으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
54. 상기 나노입자는 영상화 프로브, 영상화 조영제, 유전자, 약물, 전구-약물 또는 이들의 조합을 포함하는 진단, 치료 또는 요법제인, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
55. 상기 생체-활성 펩타이드는 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터루킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-10, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-18, 인터류킨-21, 인터류킨-23, 감마 TNF, 베타 TGF, GM-CSF, G-CSF와 같은 여러 사이토카인 중 하나 또는 이들의 조합인, 구현예 43 내지 46 중 어느 하나의 조성물.
56. 상기 조성물은 인간 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 상에 존재하는, 동일하거나 상이한 항원 상의 두 개 이상의 상이한 에피토프에 결합하는 다중 특이적 항체를 포함하는, 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 조성물.
57. 상기 다중 특이적 항체가 이중특이적 항체인, 구현예 56의 조성물.
58. 상기 이중특이적 항체가 다음을 포함하는, 구현예 57의 조성물:
(a) 다음의 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 사슬: V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc; 식 중 Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 사슬이고; V1, V2, V3 및 V4 중 두 개는 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 영역이고 다른 두 개는 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역이고; L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2는 존재하거나 부재할 수 있고; L4는 C220에서 돌연변이를 갖는 IgG1 힌지이고;
(b) 다음의 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4; 식 중 Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 사슬이고; Fc의 디설파이드 결합은 Fc의 N 또는 C 말단에 존재할 수 있고; V1, V2, V3 및 V4 중 두 개는 VH 영역이고 다른 두 개는 VL 영역이고; L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2는 존재하거나 부재할 수 있고; L4는 C220에서 돌연변이를 갖는 IgG1 힌지이고;
(c) 다음의 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 사슬: 표적 분체-L4-Fc; 식 중 Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 사슬이고; L4는 C220에서 돌연변이를 갖는 IgG1 힌지이고; 또는
(d) 다음의 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 사슬: Fc-L4-표적화 부위; 식 중 Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩타이드 사슬이고; L4는 C220에서 돌연변이를 갖는 IgG1 힌지이고,
상기 이중특이적 항체는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합하고/거나 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개하고,
상기 이중특이적 항체는 이량체이다.
59. 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩타이드 사슬은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 폴리펩타이드 사슬인, 구현예 58의 조성물.
60. 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩타이드 사슬은 L234A, L235A, N297A 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 폴리펩타이드 사슬인, 구현예 58의 조성물.
61. 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩타이드 사슬은 L234A, L235A, N297A 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG4 Fc인, 구현예 58의 조성물.
62. 상기 L4는 C220A, C220G, C220S와 같은 C220에서 돌연변이를 갖는 IgG1 힌지인, 구현예 58의 조성물.
63. 제 1 항원 결합 영역 및 제 2 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제 2 항원 결합 영역은 인간 CD3 상의 에피토프에 결합하고 제 1 항원 결합 영역은 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 인간 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 상의 에피토프에 결합하는, 구현예 58 내지 62 중 어느 하나의 조성물.
64. 상기 이중특이적 항체가 이가, 삼가 또는 사가인, 구현예 58 내지 62 중 어느 하나의 조성물.
66. 상기 이중특이적 항체가 일렬 scFv (taFv 또는 scFv2), 다이아체, dAb2A/HH2, 구멍-내-돌기 유도체, SEED-lgG, 헤테로Fc-scFv, Fab-scFv, scFv-Jun/Fos, Fab'- Jun/Fos, 트리체, DNL-F(ab)3, scFv3-CH1/CL, Fab-scFv2, IgG-scFab, IgG-scFv, scFv- IgG, scFv2-Fc, F(ab')2-scFv2, scDB-Fc, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H/L, DVD-lg, tandAb, scFv-dhlx-scFv, dAb2-lgG, dAb-IgG, dAb-Fc-dAb 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 58 내지 62 중 어느 하나의 조성물.
67. 상기 이중특이적 항체는 다이아체 또는 트리체인, 구현예 58 내지 62 중 어느 하나의 조성물.
68. 상기 이중특이적 항체는 제 1 항원 결합 영역 및 제 2 항원 결합 영역을 포함하고, 상기 제 2 항원 결합 영역은 인간 CD3 상의 에피토프에 결합하고, 상기 제 1 항원 결합 영역은 인간 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 상의 에피토프에 결합하고, 상기 제 2 항원 결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 58 내지 67 중 어느 하나의 조성물:
a) 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 (VH) 및 서열번호 87의 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체, 및
b) 서열번호 9의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열번호 93의 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 항체.
69. 상기 제 2 항원-결합 영역 (인간 CD3)를 위한 항체 또는 항원 결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 68의 조성물:
a) 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 영역, 및
b) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 영역.
70. 상기 이중특이적 항체는 서열번호 101의 아미노산 서열 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 인코딩하는 신호 펩타이드 -scFv1- MCS -scFv2 - IgG1 힌지 - IgG4 Fc 발현 카세트를 포함하는, 구현예 68의 조성물.
71. 상기 이중특이적 항체는 서열번호 100의 핵산 서열 또는 서열번호 102의 핵산 서열을 포함하는 신호 펩타이드 -scFv1- MCS -scFv2 - IgG1 힌지 - IgG4 Fc 발현 카세트를 포함하는, 구현예 68의 조성물.
72. 상기 이중특이적 항체는 a) 서열번호 105의 아미노산 서열; b) 서열번호 106의 아미노산 서열; c) 서열번호 108의 아미노산 서열; d) 서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 56 내지 71 중 어느 하나의 조성물.
73. 상기 이중특이적 항체는 a) 서열번호 104의 핵산 서열; b) 서열번호 107의 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 56 내지 71 중 어느 하나의 조성물.
74. 구현예 56 내지 73 중 어느 하나에서 언급된 이중특이적 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
75. 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 74의 조성물.
76. 상기 조성물이 상기 벡터를 포함하는 세포인, 구현예 74의 조성물.
77. 상기 세포가 파지, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포 또는 CHO, HEK293 또는 PER.C6과 같은 포유동물 세포, 또는 인간으로부터 유래된 임의의 세포인, 구현예 76의 조성물.
78. 상기 세포가 단백질 발현을 위해 조작된 동물과 같은 시험관내 또는 생체내 발현 시스템인, 구현예 76 또는 77의 조성물.
79. 상기 조성물은 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하고, 상기 CAR은 상기 항체 또는 항체 단편, 막통과 도메인 및 하나 이상의 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 조성물.
80. 상기 CAR은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막통과 도메인을 포함하는 막통과 도메인을 포함하는, 구현예 79의 조성물.
81. 상기 막통과 도메인은 서열번호 75 및 서열번호 75와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 80의 조성물.
82. 상기 항체 또는 항체 단편은 힌지 영역에 의해 막통과 도메인에 연결되는, 구현예 79의 조성물.
83. 상기 힌지 영역은 서열번호 73 및 서열번호 73과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 82의 조성물.
84. 하나 이상의 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, 구현예 79의 조성물.
85. 상기 하나 이상의 보조자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로부터 획득된 기능적 신호전달 도메인인, 구현예 84의 조성물.
86. 상기 보조자극 도메인은 서열번호 77 및 서열번호 77과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 84 또는 85의 조성물.
87. 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는, 구현예 79의 조성물.
88. 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 77, 서열번호 77과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 79 및 서열번호 79와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 87의 조성물.
89. 리더 서열을 추가로 포함하는, 구현예 79의 조성물.
90. 상기 리더 서열은 서열번호 71을 포함하는, 구현예 89의 조성물.
91. 상기 CAR은 서열번호 81 및 서열번호 81과 약 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 79의 조성물.
92. 상기 조성물은 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하고, 상기 CAR은 항체 또는 항체 단편, 막통과 도메인 및 하나 이상의 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 구현예 19 내지 35 중 어느 하나의 조성물.
93. 상기 조성물은 상기 CAR을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터인, 구현예 92의 조성물.
94. 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구현예 93의 조성물.
95. 상기 벡터는 프로모터를 추가로 포함하는, 구현예 93의 조성물.
96. 상기 프로모터는 EF-1 프로모터인, 구현예 95의 조성물.
97. 상기 EF-1 프로모터는 서열번호 110의 서열을 포함하는, 구현예 96의 조성물.
98. 상기 조성물은 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하고, 상기 CAR은 항체 또는 항체 단편, 막통과 도메인 및 하나 이상의 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 구현예 92의 조성물.
99. 상기 세포는 인간 T 세포인, 구현예 98의 조성물:
100. 상기 T 세포는 CD8+ T 세포인, 구현예 99의 조성물.
101. 구현예 93 내지 97 중 어느 하나의 조성물로 T 세포를 형질도입시키는 것을 포함하는, 세포의 제조 방법.
102. 구현예 79 내지 100 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, PSMA의 발현과 관련된 질환을 갖는 대상을 치료하는 방법.
103. 상기 조성물은 자가 T 세포인, 구현예 102의 방법.
104. 상기 조성물은 동종 T 세포인, 구현예 102의 방법.
105. 구현예 43 내지 55 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, PSMA의 발현과 관련된 질환을 갖는 대상을 치료하는 방법.
106. 구현예 56 내지 78 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, PSMA의 발현과 관련된 질환을 갖는 대상을 치료하는 방법.
107. 포유동물에서 PSMA의 발현과 연관된 질환의 존재를 진단하는 방법으로서, 상기 포유동물로부터 단리된 조직 시료를 구현예 1 내지 18의 조성물과 함께 시료화하는 것을 포함하고, 상기 조직 시료에 대한 상기 항체 또는 항체 단편의 특이적 결합이 상기 포유동물에서 PSMA의 발현과 연관된 질환의 존재를 나타내는, 방법.
108. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제, 희석제, 아쥬반트, 사이토카인, 케모카인, 화학요법 약물, 다른 치료 약물 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 구현예 1 내지 41 중 어느 하나의 조성물.
109. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제, 희석제, 아쥬반트, 사이토카인, 케모카인, 화학요법 약물, 다른 치료 약물 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 구현예 43 내지 55 중 어느 하나의 조성물.
110. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제, 희석제, 아쥬반트, 사이토카인, 케모카인, 화학요법 약물, 다른 치료 약물 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 구현예 56 내지 78 중 어느 하나의 조성물.
111. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정화제, 희석제, 아쥬반트, 사이토카인, 케모카인, 화학요법 약물, 다른 치료 약물 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 구현예 79 내지 100 중 어느 하나의 조성물.
112. 대상에서 PSMA의 발현과 연관된 질환을 영상화하는 방법으로서, 상기 항체 또는 항체 단편이 시약에 작동가능하게 연결된, 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
113. 상기 시약은 광활성화 가능한 제제, 형광 발색단, 방사성 동위원소, 생체발광성 단백질, 생체발광성 펩타이드, 형광성 태그, 형광성 단백질, 형광성 펩타이드, 영상화 조영제, 효소, 핵자기 공명 활성 시약 또는 나노입자인, 구현예 112의 방법.
114. 상기 PSMA 발현과 관련된 질환은 암 또는 악성 종양과 같은 증식성 질환 또는 전립선 암과 같은 전암성 상태 또는 종양 세포 또는 신생혈관 상에 PMSA 고발현을 갖는 다른 고형 종양으로부터 선택되고, 상기 고형 종양은 악성 상피 종양, 림프종, 모세포종, 육종 (지질육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 신경초종, 수막종, 악성 샘종, 흑색종, 백혈병 또는 악성 림프증식성 장애, 상세하게 예를 들어 육종, 난소암, 유방암, 교모세포종, 위암, 결장암, 결장직장암, 폐암, 간암, 갑상샘암, 림프종, 비인두암, 상악동 암, 신장암, 전립선 암, 방광암, 췌장암, 담낭암, 담관암을 포함하는, 구현예 42, 102, 105 내지 107 및 112의 구현예 중 어느 하나의 방법.
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 공개 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본 발명은 특정 실시예를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면 서 본 발명의 다른 구현예 및 변형예가 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구현예 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zhao, Aizhi Wen, Weihong Han, Yueheng <120> Anti-PSMA antibodies and use thereof <130> P18-183-INP-FOX <150> 62/321975 <151> 2016-04-13 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 707 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ser Ser Asn Glu Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys 1 5 10 15 Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr 20 25 30 Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln 35 40 45 Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser 50 55 60 Val Glu Leu Ala His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr 65 70 75 80 His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe 85 90 95 Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser 100 105 110 Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu 115 120 125 Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys 130 135 140 Leu Glu Arg Asp Met Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala 145 150 155 160 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tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1419 <210> 53 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ala Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Ser Gly Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 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tgcactgggt gaagcagagg 960 ccaggacagg gcctggagtg gatcggctat atcaacccct ctaggggcta cacaaactat 1020 aatcagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accaccgata agtccagctc tacagcttac 1080 atgcagctgt ccagcctgac cagcgaggac tctgccgtgt actattgcgc tagatactat 1140 gacgatcatt actgtctgga ttattggggc cagggcacca cactgacagt gtcttccgga 1200 ggaggaggca gcggaggagg aggctctggc ggcggcggct cccagatcgt gctgacccag 1260 tccccagcta tcatgtccgc ctcccctgga gagaaggtga ccatgacatg cagcgccagc 1320 tcttccgtgt cttacatgaa ttggtatcag cagaagtccg gcacaagccc taagagatgg 1380 atctacgaca cctctaagct ggcctccgga gtgccagctc actttcgcgg ctccggcagc 1440 ggcacctctt attccctgac aatcagcggc atggaggctg aggatgccgc tacctactat 1500 tgtcagcagt ggtcatcaaa tcctttcacc ttcggttcag ggacaaaact ggagatcaat 1560 aggctcgagc caaagagcgc cgacaagacc cacacatgcc ccccttgtcc agctcccgag 1620 tttctgggcg gcccatccgt gttcctgttt ccacccaagc ccaaggatac actgatgatc 1680 agccggaccc cagaggtgac atgcgtggtg gtggacgtgt ctcaggagga ccccgaggtg 1740 cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaatg ccaagaccaa gcccagggag 1800 gagcagtttg cttctacata ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca tcaggattgg 1860 ctgaacggca aggagtataa gtgcaaggtg tccaataagg gcctgccttc ttccatcgag 1920 aagacaatca gcaaggctaa gggacagcct cgcgagccac aggtgtacac cctgcctcca 1980 tctcaggagg agatgacaaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctat 2040 ccctccgaca tcgctgtgga gtgggagagc aatggccagc ctgagaacaa ttacaagacc 2100 acaccccctg tgctggacag cgatggctct ttctttctgt atagcagact gaccgtggat 2160 aagtctcgct ggcaggaggg caacgtgttc tcctgttccg tgatgcacga ggcactgcac 2220 aaccactaca ctcagaaatc actgtcactg tccctgggca agtag 2265 <210> 108 <211> 754 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PSMA & mOKT3 bispecific Ab amino acid sequence (gy1-2) <400> 108 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Phe Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 20 25 30 Gly Ala Pro Gly Gln Ser Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Asn Ile Gly Ala Gly Ser His Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly 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270 Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 275 280 285 Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala 290 295 300 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg 305 310 315 320 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly 325 330 335 Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr 340 345 350 Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 355 360 365 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr 370 375 380 Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile 405 410 415 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 420 425 430 Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp 435 440 445 Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr 450 455 460 Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser 465 470 475 480 Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala 485 490 495 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly 500 505 510 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp 515 520 525 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 530 535 540 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 545 550 555 560 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 580 585 590 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg 595 600 605 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 610 615 620 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 625 630 635 640 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 645 650 655 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 660 665 670 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 675 680 685 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 690 695 700 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 705 710 715 720 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 725 730 735 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 740 745 750 Gly Lys <210> 109 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PSMA & mOKT3 bispecific Ab amino acid sequence (gy1-2) <400> 109 Glu Phe Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro 1 5 10 15 Gly Gln Ser Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly 20 25 30 Ala Gly Ser His Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Thr 65 70 75 80 Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp 85 90 95 Asp Ser Leu Asn Gly Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ala Lys 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 145 150 155 160 Ser Gly Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Thr Trp Gly Leu Gly Asp Asn Asp Ala 225 230 235 240 Leu Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 260 265 270 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 275 280 285 Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 290 295 300 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser 325 330 335 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 340 345 350 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp 355 360 365 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr 385 390 395 400 Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met 405 410 415 Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 420 425 430 Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu 435 440 445 Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser 450 455 460 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 465 470 475 480 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 485 490 495 Lys Leu Glu Ile Asn Arg Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His 500 505 510 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 515 520 525 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 530 535 540 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 545 550 555 560 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 565 570 575 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 580 585 590 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 595 600 605 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 610 615 620 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 625 630 635 640 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 645 650 655 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 660 665 670 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 675 680 685 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 690 695 700 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 705 710 715 720 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 725 730 735 <210> 110 <211> 1184 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960 tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020 cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080 tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140 agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 gactacaagg acgacgatga c 21 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 agtagaatca agacctagta gaggg 25 <210> 113 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 ctattgccag cattgctgc 19 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 atagggacct agacttcagg 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 ccttctactc ctcctacacc 20 <210> 116 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 ggagggcgtg aatgtaagc 19

Claims (21)

  1. 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen, PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원 결합 단편은 다음:
    (i) 서열번호 9(LCDR1), 서열번호 13 또는 41(LCDR2) 및 서열번호 17(LCDR3) 을 포함하는 경쇄 영역, 및
    (ii) 서열번호 25 또는 45(HCDR1), 서열번호 29(HCDR2) 및 서열번호 33 또는 49(HCDR3)를 포함하는 중쇄 영역
    을 포함하는 것인,
    전립선 특이적 막 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    경쇄 영역은 서열번호 5, 7, 11, 15, 19, 39, 43, 61, 63, 65, 67 및 69 중 하나 이상을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    중쇄 영역은 서열번호 21, 23, 27, 31, 35, 47, 51, 53, 55, 57, 59 및 68 중 하나 이상을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    항체 또는 단편은 서열번호 3 및 37 중 하나 이상을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgA 또는 IgE의 면역글로불린 불변 및/또는 가변 도메인을 갖는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    항체 또는 단편은
    (i) 재조합 항체, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일클론 및/또는 다중클론 항체의 혼합물, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체이거나, 또는
    (ii) 세포독성 제제, 약물, 성장 저해제, 독소, 방사성 동위원소, 또는 나노입자와 컨쥬게이트된 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 동일하거나 상이한 항원 상의 두 개 이상의 상이한 에피토프에 결합하는 다중 특이적 항체로서,
    에피토프 중 하나는 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 상에 있고, 다중 특이적 항체는 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 영역 및 중쇄 영역을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  8. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 막통과 도메인, 및 하나 이상의 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 단리된 키메라 항원 수용체(CAR).
  9. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 단리된 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 단리된 핵산 분자로서,
    CAR는 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 막통과 도메인, 및 하나 이상의 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 단리된 핵산 분자.
  10. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터를 포함하는 배양된 숙주 세포.
  12. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제8항에 따른 CAR, 제9항에 따른 핵산 분자, 제10항에 따른 벡터 또는 제11항에 따른 숙주 세포를 포함하는, 증식성 질환을 치료하기 위한 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    대상체에서 PSMA의 발현과 연관된 증식성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 포유동물에서 PSMA의 발현과 연관된 증식성 질환의 존재를 진단하기 위한 조성물로서,
    상기 진단은 상기 포유동물로부터 분리된 조직 시료를 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 함께 시료화하는 것을 포함하고, 이에 의해 상기 조직 시료에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 특이적 결합이 상기 포유동물에서 PSMA의 발현과 연관된 질환의 존재를 나타내는 것인, 조성물.
  15. 대상체에서의 PSMA의 발현과 연관된 증식성 질환을 영상화하기 위한 조성물로서,
    조성물은 시약에 작동가능하게 연결되는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 시약은 광활성화 가능한 제제, 형광 발색단, 방사성 동위원소, 생체발광성 단백질, 생체발광성 펩타이드, 형광성 태그, 형광성 단백질, 형광성 펩타이드, 영상화 조영제, 효소, 핵자기 공명 활성 시약 또는 나노입자인 것인, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 증식성 질환은 암인 것인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 암은 전립선 암인 것인, 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 증식성 질환은 암인 것인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 암은 전립선 암인 것인, 조성물.
  21. 제12항에 있어서, 조성물은 약학적 조성물이고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3103936A1 (en) * 2018-06-18 2019-12-26 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (psma) and uses thereof
CN109627340B (zh) * 2018-12-05 2021-02-12 上海交通大学 Cd3和prlr双特异性抗体及其构建与应用
US10913770B2 (en) * 2019-05-14 2021-02-09 Vision Global Holdings Limited Mertansine polypeptide conjugates
TW202132353A (zh) * 2020-02-18 2021-09-01 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 一種分離的結合抗原ｐｓｍａ的蛋白及其用途
CN110922486B (zh) * 2020-02-18 2020-05-22 和铂医药(上海)有限责任公司 一种分离的结合抗原psma的蛋白及其用途
JP2024500189A (ja) 2020-12-21 2024-01-04 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド プロテアーゼ活性化ｃｄ４５ゲートｃａｒ
JP2024505075A (ja) 2021-01-29 2024-02-02 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド 同種細胞産物のＴ細胞認識を軽減するための、ＴＡＰ２、ＮＬＲＣ５、β２ｍ、ＴＲＡＣ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ及びＲＦＸＡＮＫのうち１つ以上のノックダウン又はノックアウト
CN114306277B (zh) * 2021-11-02 2023-08-04 中国人民解放军空军军医大学 一种靶向psma的巨噬细胞膜包裹的仿生纳米药物载体及应用
WO2023192842A2 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 Orimabs Ltd. Anti-psma antibodies, variants, and uses thereof
JP7225458B1 (ja) 2022-05-10 2023-02-20 株式会社エクサウィザーズ 情報処理方法、コンピュータプログラム及び情報処理装置
US20240042030A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030027253A1 (en) 2000-11-28 2003-02-06 Presnell Scott R. Cytokine receptor zcytor19
JP2008530243A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 メダレックス， インク． フコシル残基を欠く前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）に対するモノクローナル抗体
JP2008529556A (ja) * 2005-02-18 2008-08-07 メダレックス， インク． 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）に対するヒトモノクローナル抗体
US20110236390A1 (en) 2009-10-30 2011-09-29 Juan Carlos Almagro IL-17A Antagonists
US20120213771A1 (en) 2010-04-13 2012-08-23 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148463A1 (en) * 1997-04-14 2003-08-07 Micromet Ag Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
IL147638A0 (en) * 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen
US7521053B2 (en) * 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
EP3184539A3 (en) 2001-10-23 2017-09-13 PSMA Development Company L.L.C. Psma antibodies
WO2005062977A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 The Regents Of The University Of California Prostate cancer specific internalizing human antibodies
WO2008140493A2 (en) * 2006-11-21 2008-11-20 The Regents Of The University Of Californina Anti-egfr family antibodies, bispecific anti-egfr family antibodies and methods of use thereof
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
US8734774B2 (en) * 2010-04-02 2014-05-27 University Of Rochester Protease activated cytokines
CA2810030A1 (en) * 2010-09-02 2012-03-08 Excelimmune, Inc. Staphylococcus aureus specific human recombinant polyclonal antibodies and uses thereof
BR112015017981A2 (pt) * 2013-01-28 2017-11-21 Evec Inc anticorpo humano específico para metapneumovírus humano, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, seu uso e composição farmacêutica o compreendendo, bem como ácido nucleico isolado, vetor de expressão recombinante e célula hospedeira
FI126746B (en) * 2014-04-07 2017-05-15 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Antibody to HT-2 toxin-HT-2 toxin antibody complex
JOP20160154B1 (ar) 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030027253A1 (en) 2000-11-28 2003-02-06 Presnell Scott R. Cytokine receptor zcytor19
JP2008530243A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 メダレックス， インク． フコシル残基を欠く前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）に対するモノクローナル抗体
JP2008529556A (ja) * 2005-02-18 2008-08-07 メダレックス， インク． 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）に対するヒトモノクローナル抗体
US20110236390A1 (en) 2009-10-30 2011-09-29 Juan Carlos Almagro IL-17A Antagonists
US20120213771A1 (en) 2010-04-13 2012-08-23 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof

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