KR20190004802A - Tnf 계열 리간드 삼량체 및 pd1 결합 잔기를 포함하는 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 신규한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함한다.

Description

TNF 계열 리간드 삼량체 및 PD1 결합 잔기를 포함하는 항원 결합 분자
본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 신규한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인(ectodomain) 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 분자의 제조 방법 및 상기 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
TNF(tumor necrosis factor, 종양 괴사 인자) 수용체 상과(superfamily)의 분자와 상호작용하는 리간드는 면역계의 구성 및 기능에서 중요한 역할을 한다. 면역 반응, 조혈작용 및 형태형성과 같은 정상적인 기능을 조절하는 동시에, TNF 계열 리간드(사이토카인으로도 불림)는 종양형성, 이식 거부반응, 패혈성 쇼크, 바이러스 복제, 골흡수, 류마티스성 관절염 및 당뇨에서 한 역할을 한다(문헌[Aggarwal, 2003]). TNF 리간드 계열은, "TNF 상동성 도메인"(THD)에 의해 형성된 보존된 C-말단 도메인의 존재를 특징으로 하는 19개의 II형(즉, 세포내 N 말단 및 세포외 C-말단) 막관통 단백질을 코딩하는 18개의 유전자를 포함한다. 상기 도메인은 수용체 결합을 담당하므로, TNF 계열 리간드 구성원의 생물 활성에 중요하다. 계열 구성원들 사이의 서열 동일성은 약 20 내지 30%이다(문헌[Bodmer, 2002]). TNF 리간드 계열의 구성원들은 자기-조립형, 비공유성 삼량체로서 그의 생물학적 기능을 발휘한다(문헌[Banner et al., Cell 1993, 73, 431-445]). 따라서, TNF 계열 리간드들은 TNFR 상과의 상응하는 수용체들에 결합하고, 상기 수용체들을 활성화시킬 수 있는 삼량체를 형성한다.
TNF 수용체 상과의 구성원인 4-1BB(CD137)는 처음에 그 발현이 T-세포 활성화에 의해 유도되는 분자로서 확인되었다(문헌[Kwon and Weissman, 1989]). 후속 연구들은 T- 및 B-림프구(문헌[Snell et al., 2011]; 문헌[Zhang et al., 2010]), NK-세포(문헌[Lin et al., 2008]), NKT-세포(문헌[Kim et al., 2008]), 단핵구(문헌[Kienzle and von Kempis, 2000]; 문헌[Schwarz et al., 1995]), 호중구(문헌[Heinisch et al., 2000]), 비만세포(문헌[Nishimoto et al., 2005]) 및 수지상 세포뿐 아니라, 내피 및 평활근 세포(문헌[Broll et al., 2001]; 문헌[Olofsson et al., 2008])와 같은 비-조혈 기원을 갖는 세포들에서 4-1BB의 발현을 입증하였다. 상이한 세포 유형들에서 4-1BB의 발현은 주로 유도성이며, 다양한 자극 신호들, 예를 들어, T-세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체 유발뿐 아니라, 전-염증성 사이토카인의 공-자극 분자 또는 수용체를 통해 유도된 신호전달에 의해 주도된다(문헌[Diehl et al., 2002]; 문헌[von Kempis et al., 1997]; 문헌[Zhang et al., 2010]).
4-1BB 리간드(4-1BBL 또는 CD137L)의 발현은 더 제한되며, B-세포, 수지상 세포(DC) 및 대식세포와 같은 전문적 항원 제공 세포(APC) 상에서 관찰된다. 4-1BBL의 유도성 발현은 αβ 및 γδ T-세포 아집단 둘 다를 포함한 T-세포, 및 내피 세포에 특징적이다(문헌[Shao and Schwarz, 2011]에서 검토됨).
CD137 신호전달은 NK 세포의 IFNγ 분비 및 증식을 자극할 뿐 아니라(문헌[Buechele et al., 2012]; 문헌[Lin et al., 2008]; 문헌[Melero et al., 1998]), 그의 증가된 생존 및 사이토카인을 분비하고 공-자극 분자를 상향조절하는 능력에 의해 나타나듯이 DC 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(문헌[Choi et al., 2009]; 문헌[Futagawa et al., 2002]; 문헌[Wilcox et al., 2002]). 그러나, CD137은 T-세포의 CD4+ 및 CD8+ 아집단 둘 다에서 TCR-유도된 활성화를 조절하는 공-자극 분자로서 가장 잘 규정된다. TCR 유발과 함께, 작용성(agonistic) 4-1BB-특이적 항체는 T-세포의 증식을 증대시키고, 림포카인 분비를 자극하고, 활성화-유도된 세포 사멸에 대한 T-림프구의 민감성을 감소시킨다(문헌[Snell et al., 2011]에서 검토됨).
시험관내에서 T-세포에 대한 4-1BB 항체의 상기 공-자극 효과에 따라, 많은 실험 종양 모델에서 종양 함유 마우스에 상기 항체를 투여하면 강력한 항-종양 효과를 이끌어낸다(문헌[Melero et al., 1997]; 문헌[Narazaki et al., 2010]). 그러나, 4-1BB는 통상적으로 다른 면역조절 화합물(문헌[Curran et al., 2011]; 문헌[Guo et al., 2013]; 문헌[Morales-Kastresana et al., 2013]; 문헌[Teng et al., 2009]; 문헌[Wei et al., 2013]), 화학치료 시약(문헌[Ju et al., 2008]; 문헌[Kim et al., 2009]), 종양-특이적 백신접종(문헌[Cuadros et al., 2005]; 문헌[Lee et al., 2011]) 또는 방사선치료(문헌[Shi and Siemann, 2006])와 함께 투여될 때에만 항-종양제로서 그의 효능을 나타낸다. 생체내 고갈 실험은 CD8+ T-세포가 4-1BB-특이적 항체의 항-종양 효과에서 가장 결정적인 역할을 하는 것을 입증하였다. 그러나, 항-4-1BB를 포함하는 종양 모델 또는 병용 요법에 따라서, DC, NK-세포 또는 CD4+ T-세포와 같은 다른 유형의 세포들의 기여도 보고된 바 있다(문헌[Melero et al., 1997]; 문헌[Murillo et al., 2009]; 문헌[Narazaki et al., 2010]; 문헌[Stagg et al., 2011]).
4-1BB 작용물질은 또한, 상이한 림프구 아집단에 대한 그의 직접적인 효과 이외에, 종양 혈관 내피 상에서의 세포간 부착 분자 1(ICAM1) 및 혈관 세포 부착 분자 1(VCAM1)의 4-1BB-매개된 상향조절을 통해, 종양내 활성화된 T-세포의 침윤 및 체류를 유도할 수 있다(문헌[Palazon et al., 2011]).
4-1BB 유발은 또한 종양 미세환경에서 또는 만성 감염시에 면역 내성의 파괴에 기여할 수 있는 가용성 항원에 노출됨으로써 유도된 T-세포 무반응(anergy) 상태를 역전시킬 수 있다(문헌[Wilcox et al., 2004]).
생체내에서 4-1BB 작용성 항체의 면역조절 성질은 항체 분자 상에 야생형 Fc-부분의 존재를 필요로 함으로써, TNFR-상과의 다른 세포자살-유도 또는 면역조절 구성원에 특이적인 작용성 항체들에 대해 기술되었듯이 Fc-수용체 결합이 상기 시약들의 약리학적 활성에 필요한 중요한 사건임을 시사하는 것으로 보인다(문헌[Li and Ravetch, 2011]; 문헌[Teng et al., 2009]). 그러나, 기능적으로 활성인 Fc 도메인을 갖는 4-1BB-특이적 작용성 항체의 전신 투여는 또한, 마우스에서 기능성 Fc-수용체의 부재 하에서 감소되거나 상당히 개선되는 간 독성과 연관된 CD8+ T-세포의 증식을 유도한다(문헌[Dubrot et al., 2010]). 인간 임상 시험 (ClinicalTrials.gov, NCT00309023)에서, 12주 동안 3주에 1회씩 투여된 Fc-반응능(Fc-competent) 4-1BB 작용성 항체(BMS-663513)는 흑색종, 난소 또는 신장 세포 암종을 갖는 환자에서 질환의 안정화를 유도하였다. 그러나, 또 다른 시험에서 제공된 동일 항체(NCT00612664)는 4급 간염을 유발하여 시험 종료를 초래하였다(문헌[Simeone and Ascierto, 2012]).
총괄하여, 이용가능한 전임상 및 임상 데이터는 효과적인 4-1BB 작용물질이 임상적으로 높은 필요성이 있음을 명백하게 입증한다. 그러나, 신세대 약물 후보들은 조혈 세포 및 내피 세포의 표면 상에 4-1BB를 효과적으로 고정시켜야할 뿐 아니라 통제불가능한 부작용을 방지하기 위해 Fc-수용체에 대한 결합 이외의 다른 기전을 통해 상기 고정을 달성할 수 있어야 한다. 후자는 종양-특이적 또는 종양-결합 잔기에 우선적인 결합 및 상기 잔기 상에서의 올리고머화를 통해 성취될 수 있다.
4-1BB 리간드 및 단일쇄 항체 단편(문헌[Mueller et al., 2008]; 문헌[Hornig et al., 2012]) 또는 중쇄의 C-말단에 융합된 단일 4-1BB 리간드(문헌[Zhang et al, 2007])의 1개의 세포외 도메인으로 이루어진 융합 단백질이 제조되었다. 국제 특허공개공보 제2010/010051호는 서로에 결합되고 항체 일부에 융합되는 3개의 TNF 리간드 엑토도메인으로 이루어지는 융합 단백질의 제조를 개시하고 있다.
프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(PD1 또는 CD279)은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 계열의 수용체의 억제성 구성원이다. PD1은 세포 표면 수용체이고, 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다(문헌[Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82]; 문헌[Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8]). PD1의 구조는 면역글로불린 가변성-유형 세포외 도메인, 및 면역수용체 티로신-계 억제성 모티프(ITIM) 및 면역수용체 티로신-계 스위치 모티프(ITSM)를 함유하는 세포질 도메인으로 이루어진 단량체성 유형 1 막관통 단백질이다. 활성화된 T 세포는 PD1을 일시적으로 발현하지만, PD1의 지속된 과발현 및 이의 리간드 PDL1은 면역 소비를 촉진하여, 바이러스 감염, 종양 회피, 증가된 감염 및 사망률을 야기한다. PD1 발현은 T 세포 수용체를 통한 항원 이식에 의해 유도되고, 이의 발현은 연속적인 T 세포 수용체 신호전달을 통해 주로 유지된다. 연장된 항원 노출 후, PD1 좌는 재메틸화되는데 실패하고, 연속적인 과발현을 촉진한다. PD1 경로의 차단은 암 및 만성 바이러스 감염에서 소모된 T 세포 작용성을 회복할 수 있다(문헌[Sheridan, Nature Bio기술 30 (2012), 729-730]). PD1에 대한 단클론성 항체는, 예를 들어, 국제특허공개공보 제2003/042402호, 제2004/004771호, 제2004/056875호, 제2004/072286호, 제2004/087196호, 제2006/121168호, 제2006/133396호, 제2007/005874호, 제2008/083174호, 제2008/156712호, 제2009/024531호, 제2009/014708호, 제2009/101611호, 제2009/114335호, 제2009/154335호, 제2010/027828호, 제2010/027423호, 제2010/029434호, 제2010/029435호, 제2010/036959호, 제2010/063011호, 제2010/089411호, 제2011/066342호, 제2011/110604호, 제2011/110621호, 제2012/145493호, 제2013/014668호, 제2014/179664호 및 제2015/112900호에 기술된다. 2개의 PD1 단클론 항체, 옵디보(Opdivo)(니볼루맙) 및 키트루다(Keytruda)(펨브롤리주맙)은 이미 특정 암의 치료를 위해 시판 중이다. 그러나, 항-종양 활성을 강제함에도 불구하고, 치료적 PD1 봉쇄 후 종양 성장의 재발이 증가적으로 관찰되었다(문헌[Koyama et al., Nature Communications 2016, DOI: 10.1038/ncomms10501]).
종양 미소환경에서 CD137/PD1의 이중 표적화는 국소적인 억제를 파괴하고, 후속적으로 암 세포를 괴사시키는 효과기 T 세포의 작용성인 보호 및 팽창을 야기하는 것으로 나타났다(문헌[Wei et al., 2014]). 항-4-1BB 항체 및 항-PD1 항체의 조합에 의해 처리된 마우스가 상기 항체 단독에 의해 처리된 마우스에 비해 최선의 항-종양 응답을 가짐은 피하 종양에 대한 마우스에서 나타났다(문헌[Shindo et al., 2015]). 종양 마우스 모델에서 항-PD1 항체 및 4-1BB 작용성 항체의 조합의 투여는 효과적인 장기-지속 전신 항종양 응답을 야기하지만, 단독으로 제공된 4-1BB 작용제의 공지된 독성은 약간 증가되었다(문헌[Chen et al., 2014]). 따라서, 개선된 안전성 프로파일을 갖는 항-PD1 항체 및 4-1BB 항체 둘 다의 긍정적인 효과를 조합하는 신규한 분자에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 신규한 항원 결합 분자는 PD1 잔기를 공자극성 TNF 리간드 삼량체를 형성할 수 있고 약학적으로 유용하도록 충분히 안정한 잔기와 조합한다. 놀랍게도, 본 발명의 항원 결합 분자는, 삼량체화 TNF 리간드 엑토도메인 중 하나가 분자의 다른 2개의 TNF 리간드 엑토도메인과 다른 폴리펩티드 상에 위치하더라도, 삼량체성이고, 이에 따라 생물학적으로 활성인 TNF 리간드를 제공한다. 항-PD1 잔기에 의해 표적화된 본 발명의 항원 결합 분자는 종양 미소환경에서 증가된 활성을 갖고, 이에 따라 단독의 통상적인 4-1BB 작용성 항체에 비해 안전 문제를 덜 유발하여야 한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위(subunit)으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때, 상기 항원 결합 분자는 (i) 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 각각 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, (ii) 상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, (iii) 상기 제1 폴리펩티드가 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 각각 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드는 CH1 및 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양상에서, 본 발명은 본 발은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 상기 항원 결합 분자는 (i) 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, (ii) 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, TNF 계열 리간드 구성원은 인간 T-세포 활성화를 공자극하는 것이다. 따라서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원이 인간 T-세포 활성화를 공자극하는 것을 특징으로 한다. 더욱 특히, TNF 계열 리간드 구성원은 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
특정 양상에서, TNF 계열 리간드 구성원은 4-1BBL이다.
다른 양상에서, TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 특히, TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드, 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드(이때, 상기 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합된다) 각각을 포함하고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CL 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때, 상기 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때, 상기 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명은, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체, 항체 단편 및 스캐폴드(scaffold) 항원 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특히, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 항체 단편, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, aVH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체 단편인, 본원에서 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특히, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일 쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체 및 aVH로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 스캐폴드 항원 결합 단백질인, 본원에서 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자 또는 scFv 분자인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 더욱 특히, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 Fab 분자이다.
본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양상에서, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 잔기를 포함하고, 이는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 1가임을 의미한다. 다른 양상에서, 본 발명은 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 2가임을 의미한다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (c) (i) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (d) (i) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (e) (i) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (f) (i) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는 (g) (i) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (f) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (g) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (h) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (i) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (j) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 (k) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양상에서, 본 발명은 펩티드 연결기가 (G4S)2, 즉 서열번호 117의 펩티드 연결기인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 양상에서, 펩티드 연결기는 모든 경우에 (G4S)2이다.
본 발명은 또한, 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
한 양상에서, (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 또한 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하고, 이때 상기 Fab 중쇄는 C-말단에서 Fc 도메인 내의 CH2 도메인의 N-말단에 융합된다.
다른 양상에서, Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 특정 양상에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 양상에서, 본 발명은 Fc 도메인의 제1 아단위가 아미노산 치환 S354C 및 T366W(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위가 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특히, Fc 도메인은 IgG 중쇄의 위치 234 및 235(EU 넘버링) 및/또는 329(EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특히, 위치 234 및 235(EU 넘버링) 및/또는 329(EU 넘버링)에서의 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 넘버링)를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는, 본 발명에 따른 삼량체성 TNF 계열 리간드-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 제2 중쇄 또는 제2 경쇄에 융합된 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드, 및 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 제2 경쇄 또는 제2 중쇄에 융합된 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 펩티드를 각각 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양상에서, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 VH 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 일부인 VL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, 본 발명는 펩티드 연결기가 (G4S)2, 즉 서열번호 117의 펩티드 연결기인 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 양상에서, 제1, 제2 및 제3 펩티드 연결기는 (G4S)2이다.
또한, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 넘버링)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고, 위치 124(EU 넘버링)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 넘버링) 및 위치 213(EU 넘버링)에서의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, (a) 각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자, 및 (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 34 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, (ii) 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78 및 서열번호 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 (iii) 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, (b) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, (c) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는 (d) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특히, 이러한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 도메인을 포함한다.
특히, (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 (b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 본원에 상기 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 특정 양상에서, 본 발명은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 Fab 도메인을 포함하는 본원에 상기 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
이러한 양상에서, 항원 결합 분자가 (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄, 또는 (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양상에서, 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (b) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (c) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (b) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
본 발명의 다른 양상에 따라서, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명은 또한, 본 발명의 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터, 및 본 발명의 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
다른 양상에서, 본 발명의 숙주 세포를 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 제조 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 상기 본 발명의 방법에 의해 생성된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에는 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 포함된다. 한 양상에서, 이를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다. 특정 양태에서, 암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다. 다른 양상에서, 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 연장하는데 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다.
개체에서 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 특히 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 및 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물의 치료 효과량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 질병의 치료 방법을 위한, 상기 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도가 또한 제공된다. 특정 양태에서, 상기 질병은 암이다. 효과량의 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명을 약학 조성물을 암을 갖는 개체에게 투여함을 포함하는, 암을 갖는 개체에서 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 연장하는 방법이 또한 제공된다. 임의의 상기 양태에서, 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1은 키메라 항체 클론 PD1-0103에 의한 PD1의 봉쇄가 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 IFN-감마 분비를 강하게 향상시킴을 도시한다. IFN-감마 분비는 참고 항체 MDX5C4 또는 MK-3475에 비해 높다.
도 2는 PD1 인간화된 클론 PD1-0103-0312 및 PD1-103-314의 봉쇄가 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-g) 분비를 키메라 클론 PD1-0103에 비해 더욱 강하게 증가시킴을 도시한다.
도 3은 키메라 항체 클론 PD1-0103 및 인간화된 클론 PD1-0103-0312 및 PD1-103-314에 의한 PD1의 봉쇄가 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF) 분비를 강하게 증가시킴을 증명한다. TNF-알파 분비는 참고 항체 MDX5C4 또는 MK-3475에 비해 크다.
도 4A는 증가하는 농도의 상이한 항-PD1 항체(키메라 항체 클론 PD1-0103 및 인간화된 클론 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315)의 존재 하의 CD4+ T 세포 생산 그란자임 B의 빈도를 도시하고, 도 4B는 증가된 농도의 상이한 항-PD1 항체의 존재 하에 MLR의 상청액에서 흡광도(광학 밀도, O.D.)에 의해 검출된 IFN-γ의 양을 도시한다.
도 5A는 PDL1 단독과 비교되는, 키메라 항-PD1 항체 클론 PD1-0103의 존재 하의 억제된 T 세포 수용체 신호전달의 재활성화에 대한 PD1/PD-L1 봉쇄의 영향을 도시하고, 도 5B는 상이한 항-PD1 항체(키메라 항체 클론 PD1-0103 및 인간화된 클론 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315)의 존재 하의 억제된 T 세포 수용체 신호전달의 재활성화에 대한 PD1/PD-L1 봉쇄의 영향이 존재함을 도시한다.
도 6은 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드의 어셈블리를 위한 성분을 도시한다. 도 6A는 돌연변이 E123R 및 Q124K를 갖는 인간 CL 도메인(하전된 변이체)에 C-말단에서 융합된 이량체성 4-1BB(71-254) 리간드를 도시하고, 도 6B는 돌연변이 K147E 및 K213E를 갖는 인간 CH1 도메인(하전된 변이체)에 이의 C-말단에서 융합된 단량체성 4-1BB(71-254) 리간드를 도시한다. 도 6C는 돌연변이가 없는 인간 CL 도메인에 C-말단에서 융합된 이량체성 4-1BB(71-254) 리간드를 도시하고, 도 6D는 돌연변이가 없는 인간 CH1 도메인에 이의 C-말단에서 융합된 단량체성 4-1BB(71-254) 리간드를 도시한다. 도 6E는 인간 IgG1 Fc 홀 도메인에 N-말단에서 융합된 이량체성 4-1BB(71-254) 리간드를 도시하고, 도 6F는 인간 IgG1 Fc 놉 도메인에 N-말단에서 융합된 단량체성 4-1BB(71-254) 리간드를 도시한다.
도 7은 본 발명의 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자 구축물 7.1 내지 7.6의 구조를 개략적으로 도시한다. 이러한 구축물의 제조 및 생산은 실시예 2에 기술된다. VH 및 VL 도메인은 항-PD1 항체(특히 0103-0314)의 도메인이고, 두꺼운 점은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형을 나타낸다. *는 CH1 및 CL 도메인(소위 하전된 변이체)의 아미노산 변형을 기호로 나타낸다. 도 7A는 하전된 변이체 및 hu 4-1BBL(71-254)을 갖는 구축물 7.1을 도시하고, 하전된 변이체가 없는 상응하는 구축물이 도 7B에 도시된다. 도 7D에 도시된 구축물 7.4는 3개의 hu 4-1BBL(71-248) 및 하전된 변이체를 포함하고, 하전된 변이체가 없는 상응하는 구축물은 도 7E에 도시된다. 도 7C는 Fc 쇄의 C-말단에 hu 4-1BBL(71-254)을 갖는 2가 구축물을 도시하고, hu 4-1BBL(71-248)을 갖는 상응하는 구축물은 도 7F에 도시된다.
도 8은 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드의 어셈블리를 위한 성분을 도시한다. 도 8A는 돌연변이 E123R 및 Q124K를 갖는 인간 CL 도메인(하전된 변이체)에 C-말단에서 융합된 이량체성 4-1BB(71-248) 리간드를 도시하고, 도 8B는 돌연변이 K147E 및 K213E를 갖는 인간 CH1 도메인(하전된 변이체)에 이의 C-말단에서 융합된 단량체성 4-1BB(71-248) 리간드를 도시한다. 도 8C는 돌연변이가 없는 인간 CL 도메인에 C-말단에서 융합된 이량체성 4-1BB(71-248) 리간드를 도시하고, 도 8D는 돌연변이가 없는 인간 CH1 도메인에 이의 C-말단에서 융합된 단량체성 4-1BB(71-248) 리간드를 도시한다. 도 8E는 인간 IgG1 Fc 홀 도메인에 N-말단에서 융합된 이량체성 4-1BB(71-248) 리간드를 도시하고, 도 8F는 인간 IgG1 Fc 놉 도메인에 N-말단에서 융합된 단량체성 4-1BB(71-248) 리간드를 도시한다.
도 9는 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드의 어셈블리를 위한 성분을 도시하고, 이량체성 4-1BB 리간드 및 단량체성 4-1BB 리간드는 각각 다른 폴리펩티드 쇄, 특히 Fc 도메인의 아단위 중 하나에 이의 N-말단에서 융합된다. 도 9A는 N-말단에서 융합된 이량체성 리간드를 도시하고, 도 9B는 N-말단에서 융합된 단량체성 리간드를 도시한다. 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자 구축물 7.11 및 7.12의 개략적인 도면은 각각 도 9C 및 도 9D에 도시된다. 도 9C는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인이 Fc 놉 쇄에 부착되고, 이량체성 4-1BBL이 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합되고, 단량체성 4-1BBL이 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합되는 항원 결합 분자를 도시한다. 도 9D는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인이 Fc 놉 쇄에 부착되고, 이량체성 4-1BBL이 또한 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합되고, 단량체성 4-1BBL이 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합되는 항원 결합 분자를 도시한다.
구축물 7.13 및 7.14의 개략적인 도면은 각각 도 10A 및 도 10B에 도시된다. 도 10A는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인이 Fc 홀 쇄에 부착되고, 이량체성 4-1BBL이 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합되고, 단량체성 4-1BBL이 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합되는 항원 결합 분자를 도시한다. 도 10B는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인이 Fc 홀 쇄에 부착되고, 이량체성 4-1BBL이 또한 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합되고, 단량체성 4-1BBL이 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합되는 항원 결합 분자를 도시한다.
도 11A 내지 11D는 대조군 분자의 개략적인 도면을 도시한다. 도 11A 및 도 11B는 각각 구축물 7.1 및 7.3의 "비표적화된" 변이체를 도시하고, 항-PD1 Fab 도메인은 DP47(생식계열) Fab 도메인에 의해 치환된다. 상기 분자는 각각 대조군 B 및 대조군 C로 지칭된다. 도 11C는 대조군 D로 지칭되는 구축물 7.4의 비표적화된 변이체이다. 대조군 분자의 제조는 실시예 2.9에 기술된다. 도 11D는 PGLALA 돌연변이를 갖는 단일특이적 IgG1 분자를 도시하고, Fab 도메인은 DP47 Fab 도메인(대조군 F) 또는 PD1 0103-0314 Fab 도메인(대조군 M)이다. 이러한 분자는 실시예 2.10에 기술된다.
도 12A는 본 발명의 PD1 표적화된 분할된 삼량체성 C-말단 4-1BB 리간드-함유 항원 결합 분자의 동시 결합을 위한 SPR 실험의 설정을 도시한다. PD1(0314)-표적화된 분할된 4-1BBL(71-254) Fc kih 항원 결합 분자 구축물 7.1의 인간 4-1BB 및 인간 PD1에 대한 동시 결합은 도 12B에 도시된다. 2가 PD1(0314) 표적화된 분할된 4-1BBL(71-254) Fc kih 항원 결합 분자(구축물 7.3)의 인간 4-1BB 및 인간 PD1에 대한 동시 결합은 도 12C에 도시된다. PD1(0314) 표적화된 분할된 4-1BBL(71-248) Fc kih 항원 결합 분자(구축물 7.5)의 인간 4-1BB 및 인간 PD1에 대한 동시 결합은 도 12D에 도시되고, 2가 PD1(0314) 표적화된 분할된 4-1BBL(71-248) Fc kih 항원 결합 분자(구축물 7.6)의 인간 4-1BB 및 인간 PD1에 대한 동시 결합은 도 12E에 도시된다.
도 13A 내지 13H는 실시예 5.1에 기술된 새로이 단리된 PBMC에 대한 PD1-표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자의 결합을 도시한다. 시험된 구축물의 농도(x-축)에 대한 PE-접합된 2차 검출 항체의 형광 강도의 기하 평균(y-축)이 도시된다. 더욱 양호한 개관을 위해, 그래프를 2개로 분할하였고(각각 도 13A, 13B, 13C 및 13D, 및 도 13E, 13F, 13G 및 13H), 이에 의해 대조군 F 및 대조군 M의 곡선을 모든 그래프에 참고로 도시하였다. 새로운 인간 CD45+ CD3+ CD4+ T 세포(도 13A 및 13E), 새로운 인간 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포(도 13B 및 13F), 새로운 인간 CD45+ CD3+ CD4neg CD8neg γδ T 세포(도 13C 및 13G) 및 CD45+ CD3neg CD19+ B 세포(도 13D 및 13H)에 대한 결합을 모니터링하였다.
도 14A 내지 14H는 실시예 5.1에서 기술된 바와 같이 시험된 활성화된 인간 PBMC에 대한 PD1-표적화된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자의 결합을 도시한다. 시험된 구축물의 농도(x-축)에 대한 PE-접합된 2차 검출 항체의 형광 강도의 기하 평균(y-축)이 도시된다. 음성 대조군으로서, 대조군 F가 사용되었다. 더욱 양호한 개관을 위해 그래프를 2개로 분할하였고(즉, 도 14A, 14B, 14C 및 14D, 및 도 14E, 14F, 14G 및 14H), 이에 의해 대조군 F 및 대조군 M의 곡선을 모든 그래프에 참고로 도시하였다. 작용성 항-인간 CD28 및 항-인간 CD3에 의한 활성화 후, 항체 4-1BB 발현이 다수의 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포(도 14A 또는 14E 참조) 또는 CD45+ CD3+ CD4+ T 세포(도 14B 및 14F) 상에서 상향조절되고, 다수의 인간 CD45+ CD3+ CD4neg CD8neg γδ T 세포(도 14C 또는 14G) 또는 CD45+ CD3neg CD19+ B 세포(도 14D 또는 14H)로 덜 연장된다.
도 15A 및 15B는 인간-PD1 발현 CHO-k1-huPD1 클론 5 세포에 대한 PD1-표적화된 또는 비표적화된 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 결합을 도시한다. 상기 방법은 실시예 5.2에 기술된다. 결합은 R-피코에리트린-플루오로크롬 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편에 의해 검출되었고, 유세포분석에 의해 측정된 기하 평균은 y-축 상에 도시된다. PD1 표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 및 이의 대조군의 사용된 농도는 x-축 상에 도시된다. 더욱 양호한 개관을 위해, 그래프를 2개로 분할하였고(도 15A 및 도 15B), 이에 의해 대조군 F 및 대조군 M에 대한 곡선은 둘 다 참고로 도시된다.
도 16A 및 16B는 실시예 5.2에 기술된 바와 같이 시험된 인간-4-1BB 발현 HeLa-hu4-1BBL-NFkB-luc 클론 26 세포에 대한 PD1-표적화된 또는 비표적화된 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 결합을 도시한다. 결합은 R-피코에리트린-플루오로크롬 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편에 의해 검출되었고, 유세포분석에 의해 측정된 기하 평균은 y-축 상에 도시된다. PD1 표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 및 이의 대조군의 사용된 농도는 x-축 상에 도시된다. 더욱 양호한 개관을 위해, 그래프를 2개로 분할하였고(도 16A 및 16B로 지칭됨), 이에 의해 대조군 F 및 대조군 M의 곡선은 둘 다 그래프에 참고로 도시된다.
도 17은 리포터 세포주를 사용한 실시예 6.1에 기술된 NFκB 활성 분석의 일반 원리를 예시하는 도식을 나타낸다. 인간 4-1BB 발현 HeLa 리포터 세포주를 사용한 활성화 분석 구성을 나타냈다. 리포터 세포 상에서 발현된 4-1BB의 가교결합은 NFκB 활성화 및 NFκB-매개된 루시퍼라제 발현을 유도한다. 세포의 용해 후에 루시퍼라제는 루시페린의 옥시루시페린으로의 산화를 촉진할 수 있다. 상기 화학 반응은 NFκB-매개된 루시퍼라제 발현의 강도와 명확하게 상관되며, 광 방출 강도(방출광의 단위)에 의해 측정될 수 있다.
도 18A 내지 18D는 실시예 6에 기술된 분석으로 측정된 바와 같은 NFκB-활성화-유도된 루시퍼라제 발현 및 활성을 나타낸다. 초당 방출광의 단위(URL)를 0.5 초/웰 동안 측정하고 PD1-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구축물의 사용 농도에 대해 플로팅한다. 인간 4-1BB-발현 HeLa-리포터 세포를 가교결합 인간-PD1 발현 CHO-k1-huPD1 클론 5 세포의 부재(도 18A 및 18B) 또는 존재(도 18C 및 18D) 하에 6시간 동안 배양하였다. CHO-k1-huPD1 클론 5 세포에 대한 인간 4-1BB-발현 HeLa 리포터 세포의 세포 비는 각각의 그래프에 표시된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 설명하기 위해, 하기의 정의들이 적용될 것이고, 적절한 경우, 단수형으로 사용된 용어는 또한 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 이의 가장 일반적인 의미에서 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
본원에서 사용된 용어 "PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기" 또는 "PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인"은 PD1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 말한다. 한 양상에서, 항원 결합 잔기는 이의 PD1을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 특정 양상에서, 항원 결합 잔기는 그것이 부착되는 물질(예를 들어, TNF 계열 리간드 삼량체)을 표적 부위로, 예를 들어, PD1 또는 PD1를 갖는 T 세포를 갖는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 기질로 유도할 수 있다. PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 본원에서 더 정의되는 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 또한, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 본원에서 더 정의되는 바와 같은 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들어, 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인을 기반으로 하는 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 국제 특허공개공보 제2002/020565호 참조).
항체 또는 이의 단편과 관련하여, 용어 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기"는 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고, 상기 항원의 일부 또는 전체에 상보적인 영역을 포함하는 분자의 부분을 말한다. 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는, 예를 들어, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불린다)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 일반적인 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구축물들을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다. 즉, 상기 집단을 구성하는 개개 항체들은 동일하고/하거나, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 생성시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미미한 양으로 존재한다)를 제외하고, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.
본원에서 사용된 용어 "단일특이적"은 그 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다. 용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 별개의 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 상기 부위 각각은 상이한 항원 결정기에 대해 특이적이다. 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정기, 특히 2개의 별개의 세포 상에서 발현된 2개의 항원 결정기에 동시에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합가(valent)"는 항원 결합 분자에 특정 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항원 결합 분자에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 의미한다.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연 IgG-클래스 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 경쇄 불변 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)로 불리는 5가지 유형들 중 하나로 지정될 수 있으며, 상기 유형들 중 일부는 아형(subtype), 예를 들어, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체가 아닌 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 교차-Fab 단편; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; 또한 국제 특허공개공보 제93/16185호; 및 미국 특허공보 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해서는, 미국 특허공보 제5,869,046호를 참조한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들어, 유럽 특허공보 제404 097호; 국제 특허공개공보 제1993/01161호; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조). 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양상에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월탐 소재); 예를 들어, 미국 특허공보 제6,248,516 B1호 참조)이다. 항체 단편은, 본원에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해성 절단, 및 재조합 숙주 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
온전한 항체의 파파인 절단은, 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인을 함유하는 "Fab" 단편으로 불리는, 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 따라서, 용어 "Fab 단편"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 말한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 수개의 잔기들의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부분을 갖는 F(ab')2 단편을 제공한다.
용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차형 Fab 단편"은, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 말한다. 교차형 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하며 본 발명의 이중특이성 항체에 포함된다. 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다. 즉, 교차형 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 교차형 Fab 분자는 또한 교차Fab(VLVH)로도 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는 경우, 교차형 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 교차형 Fab 분자는 또한 교차Fab(CLCH1)로 지칭된다.
"단일쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 연결기로 이루어진 폴리펩티드이고, 이때 상기 항체 도메인들 및 상기 연결기는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (a) VH-CH1-연결기-VL-CL, b) VL-CL-연결기-VH-CH1, c) VH-CL-연결기-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-연결기-VH-CL의 순서 중 하나를 가지고; 상기 연결기는 30개 이상의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일쇄 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 상기 단일쇄 Fab 분자들은 시스테인 잔기의 삽입(예를 들어, 카밧 넘버링 체계에 따른 가변 중쇄 중 위치 44 및 가변 경쇄 중 위치 100)에 의한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다.
"교차형 단일쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 연결기로 이루어진 폴리펩티드이며, 이때 상기 항체 도메인 및 상기 연결기는 N-말단에서 C-말단 방향으로 순서 a) VH-CL-연결기-VL-CH1 및 b) VL-CH1-연결기-VH-CL 중 하나를 가지고; VH 및 VL은 함께, 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 상기 연결기는 30개 이상의 아미노산의 폴리펩티드이다. 또한, 상기 x-scFab 분자들은 시스테인 잔기의 삽입(예를 들어, 카밧 넘버링 체계에 따른 가변 중쇄 중 위치 44 및 가변 경쇄 중 위치 100)에 의한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다.
"단일쇄 가변 단편(scFv)"은 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 연결기 펩티드에 의해 연결되는, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들의 융합 단백질이다. 연결기는 통상적으로 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐 아니라 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결시킬 수 있거나 그 반대도 가능하다. 상기 단백질은 불변 영역들의 제거 및 연결기의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는, 예를 들어, 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기술되어 있다. 또한, 항체 단편은, VL 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위로 조립될 수 있는 VH 도메인의 특징을 갖거나, VH 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위로 조립될 수 있는 VL 도메인의 특징을 가짐으로써 전장 항체의 항원 결합 성질을 제공하는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.
"스캐폴드 항원 결합 단백질"은 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들어, 피브로넥틴 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 항원-결합 도메인에 대한 대체 스캐폴드로서 사용되었다(예를 들어, 문헌[Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)] 및 문헌[Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discov Today 13: 695-701 (2008)] 참조). 본 발명의 한 양상에서, 스캐폴드 항원 결합 단백질은 CTLA-4(에비바디(Evibody)), 리포칼린(Lipocalin)(안티칼린(Anticalin)), 단백질 A-유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디(Affibody)), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)), 혈청 트랜스페린(트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인(단일-도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인(나노바디, aVH), VNAR 단편, 피브로넥틴(어드넥틴(AdNectin)), C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 새로운 항원 수용체 베타-락타마제의 가변 도메인(VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴(어필린(Affilin) 분자); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠(kunitz) 유형 도메인, 크노틴(knottin) 계열로부터의 단백질과 같은 미소체(microbody), 펩티드 압타머 및 피브로넥틴(어드넥틴)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 CD28-계열 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 접힘(fold)을 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 성질을 부여하는 이종 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로도 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허공보 제7,166,697 B1호). 에비바디는 항체(예를 들어, 도메인 항체)의 단리된 가변 영역과 대략 동일한 크기이다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조한다.
리포칼린(Lipocalin)은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 소형 소수성 분자를 운반하는 세포외 단백질의 한 계열이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 말단에서 다수의 루프를 갖는 견고한 베타-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린(Anticalin)은 160 내지 180개 아미노산의 크기이며, 리포칼린으로부터 유도된다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], 미국 특허공보 제7,250,297 B1호 및 미국 특허공개공보 제20070224633호를 참조한다.
어피바디(affibody)는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는, 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유도된 스캐폴드이다. 상기 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선형 다발로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기들의 무작위선정에 의해 제작되었다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 유럽 특허공개공보 제1641818 A1호를 참조한다.
아비머(Avimer)는 A-도메인 스캐폴드 계열로부터 유도된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 천연 도메인은 한정된 다이설파이드 결합 구조를 취한다. A-도메인의 계열에 의해 나타난 자연적 변이의 셔플링에 의해 다양성이 발생된다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조한다.
트랜스페린은 단량체성 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 허용적인 표면 루프 내에 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예로는 트랜스-바디(Trans-body)가 포함된다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조한다.
설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPin)은 세포골격에 대한 내재성 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 한 계열인 안키린으로부터 유도된다. 단일 안키린 반복서열은 2개의 알파-나선 및 베타-회전으로 이루어지는 33개 잔기 모티프이다. 이들은 각 반복서열의 첫번째 알파-나선 및 베타-회전에서 잔기들을 무작위선정함으로써 상이한 표적 항원들에 결합하도록 조작될 수 있다. 이의 결합 계면은 모듈의 수를 증가시킴으로서 증가될 수 있다(친화도 증진 방법). 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)] 및 문헌[J. MoI. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 미국 특허공개공보 제2004/0132028 A1호를 참조한다.
단일-도메인 항체는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 첫번째 단일 도메인은 카멜리드(camelid)로부터의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유도되었다(나노바디 또는 VHH 단편). 또한, 용어 단일-도메인 항체는 상어로부터 유도된 자율적 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 VNAR 단편을 포함한다.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 어드넥틴(Adnectin)은 제3형 인간 피브로넥틴(FN3)의 15개 반복 단위들의 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 주쇄로 이루어진다. 베타-샌드위치의 한 말단에서 3개의 루프가, 어드넥틴이 해당 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], 미국 특허공개공보 제2008/0139791호, 국제 특허공개공보 제2005/056764호 및 미국 특허공보 제6,818,418 B1호를 참조한다.
펩티드 압타머(peptide aptamer)는 불변 스캐폴드 단백질, 전형적으로는 활성 부위에 삽입된 제한적 가변 펩티드 루프를 함유하는 티오레독신(TrxA)으로 이루어지는 조합적 인식 분자이다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조한다.
미소체(microbody)는 3 내지 4개의 시스테인 가교를 함유하는, 25 내지 50개 아미노산 길이를 갖는 천연 미소단백질(microprotein)로부터 유도되며, 미소단백질의 예로는 칼라타BI(KalataBI) 및 코노톡신 및 크노틴이 포함된다. 미소단백질은 미소단백질의 전체 접힘에 영향을 미치지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 국제 특허공개공보 제2008/098796호를 참조한다.
기준 분자와 "동일 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 기준 분자의 결합을 50% 이상 차단하는 항원 결합 분자를 말하며, 반대로, 기준 분자는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상 차단한다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 그와 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 말한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분은 에피토프로 지칭된다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인(가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결정기"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며, 항원 결합 잔기가 결합되어 항원 결합 잔기-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들어, 아미노산의 연속 신장부 또는 비-연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구조)를 말한다. 유용한 항원 결정기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서, 다른 질병에 걸린 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청내에서 유리하는 상태로, 및/또는, 세포외 기질(ECM) 중에서 발견할 수 있다. 본원에서 항원으로 유용한 단백질은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질을 언급할 때, 상기 용어는 "전장"의 비가공된 단백질뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯되는 임의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
용어 "PD1에 특이적으로 결합할 수 있는"는 항원 결합 분자가 PD1의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도를 갖고 PD1에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자는 비제한적으로, 항체, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일 쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, aVH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질을 포함한다. 한 양상에서, 비관련된 비-PD1 단백질에 대한 항-PD1 항원 결합 분자의 결합의 정도는, 예컨대, 방사면역분석(RIA)에 의해 측정된 PD1에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 특히, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하 또는 0.001 nM 이하(예컨대, 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 양태에서, 항-PD1 항원 결합 분자는 상이한 종으로부터의 PD1에 결합한다. 특히, 항-PD1 항원 결합 분자는 인간 및 사이노몰거스 PD1에 결합한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이며 원치않거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 또는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(바이아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석법(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 한 양태에서, 비관련 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는, 예를 들어, SPR로 측정시 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양태에서, 항원에 결합하는 분자는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 따라서, 등가의 친화도들은 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한, 상이한 속도 상수들을 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들어, T 세포 또는 B 세포, 암세포 또는 종양 기질의 세포와 같은 종양내 세포의 표면 상에 존재하는 항원 결정기를 말한다. 특정 양태에서, 표적 세포 항원은 세포의 표면 상의 항원이다. 한 양태에서, 표적 세포 항원은 PD1이다.
용어 "PD1"(프로그램화된 세포 사멸 단백질 1로도 공지됨)은 1992년에 최초로 개시된 288개 아미노산의 유형 I 막 단백질이다(문헌[Ishida et al., EMBO J., 11 (1992), 3887-3895]). PD1은 연장된 CD28/CTLA-4 계열의 T 세포 조절자의 구성원이고 2개의 리간드 PD-L1(B7-H1, CD274) 및 PD-L2(B7-DC, CD273)를 갖는다. 단백질의 구조는 세포외 IgV 도메인, 및 이어서 막관통 영역 및 세포내 테일을 포함한다. 세포내 테일은 면역수용체 티로신-계 억제성 모티프 및 면역수용체 티로신-계 스위치 모티프에 위치하는 2개의 인산화 부위를 함유하고, PD1가 TCR 신호를 음으로 조절함을 시사한다. 이것은 리간드 결합시 PD1의 세포질 테일에 대한 SHP-1 및 SHP-2 포스파타제의 결합과 일치한다. PD1가 네이브 T 세포 상에서 발현되지 않지만, T 세포 수용체 (TCR)-매개된 활성화에 따라서 상향조절되고, 활성화된 및 소비된 T 세포 둘 다에서 관찰된다(문헌[Agata et al., Int. Immunology 8 (1996), 765-772]). 이러한 소비된 T 세포 기능장애 표현형을 갖고, 적절히 응답할 수 없다. PD1가 상대적으로 넓은 발현 패턴을 갖더라고, 이의 가장 중요한 역할은 아마 T 세포에 대한 공동억제 수용체로서의 역할일 것이다(문헌[Chinai et al, Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595]). 따라서, 현재의 치료 접근법은 PD1과 리간드의 상호작용을 차단하여 T 세포 응답을 강화시키는 것에 초점을 맞춘다. 용어 "프로그램화된 사멸 1", "프로그램화된 세포 사멸 1", "단백질 PD-1", "PD-1", PD1", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-I"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 인간 PD1의 변이체, 이소폼, 종 동족체, 및 PD1과 하나 이상의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 인간 PD1의 아미노산 서열은 유니프롯(Uniprot)(www.Uniprot.org) 수탁번호 Q15116(서열번호 94)에 제시된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR(VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3))을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. 대표적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재한다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)]). 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 초가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭되며, 상기 용어들은 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역 부분과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 문헌[Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기술되었으며, 여기서 정의들은 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 아집단을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 속해야 한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 A에 나타냈다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당해 분야에 숙련된 자라면 통상적으로 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 결정할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의1
Figure pct00001
1표 A에서 모든 CDR 정의의 번호는 카밧 등에 의해 나타낸 넘버링 체계 관례에 따른다(하기 참조).
2표 A에서 사용된 바와 같이 소문자 "b"를 갖는 "AbM"은 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 말한다.
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 체계를 정의하였다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터를 의지하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 "카밧 번호"의 상기 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카밧 번호"는 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 넘버링 체계를 말한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역에 특정 아미노산 잔기 위치의 번호에 대한 언급은 카밧 넘버링 체계를 따른다.
VH에서의 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역들 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 카밧 등의 상기 문헌에 따라 번호가 부여된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 분자(예를 들어, 항체)의 맥락에서 "친화도 증진된"은, 예를 들어, 돌연변이에 의해 기준 항원 결합 분자로부터 유도된 항원 결합 분자가 기준 항체와 동일 항원에 결합하고, 바람직하게는 동일 에피토프에 결합하고; 기준 항원 결합 분자보다 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것을 말한다. 친화도 증진은 일반적으로 항원 결합 분자의 1개 이상의 CDR 중 1개 이상의 아미노산 잔기의 변형을 수반한다. 전형적으로, 친화도 증진된 항원 결합 분자는 초기 기준 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"수용체(acceptor) 인간 프레임워크"는, 본 발명에 있어서, 하기에 정의되는 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 양태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 서열에 있어 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 동일하다.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 양태에서, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들어, CDR)의 전체 또는 거의 전체가 비-인간 항체에 상응하고, FR의 전체 또는 거의 전체가 인간 항체에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체"의 다른 형태는, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관해 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변화된 항체이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리(repertory) 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 명확하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 대략 위치 231에서의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340에서의 아미노산 잔기까지 이른다. 한 양상에서, 탄수화물 쇄가 CH2 도메인에 결합된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인까지 C-말단 잔기들의 신장부(즉, IgG의 대략적 위치 341에서의 아미노산 잔기로부터 대략적 위치 447에서의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들어, 이의 한 쇄에 도입된 "돌출부"(놉) 및 이의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동(cavity)"(홀)을 갖는 CH3 도메인; 특별히 본원에 참고로 인용된 미국 특허공보 제5,821,333호 참조)일 수 있다. 상기 변이체 CH3 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 2개의 비-동일 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 한 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys 226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은, EU 인덱스(EU index)로도 불리는 EU 넘버링 체계에 따른다.
"놉-인투-홀" 기술은, 예를 들어, 미국 특허공보 제5,731,168호; 제7,695,936호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록, 제1 폴리펩티드의 계면에 돌출부(놉) 및 제2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동(홀)을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 돌출부 및 공동은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 제조될 수 있다. 특정 양태에서, 놉 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 홀 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 아단위는 추가로 아미노산 치환 S354C를 포함하고, 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 아단위는 추가로 아미노산 치환 Y349C를 포함한다. 상기 2개 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 아단위들 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여 이량체를 더 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)]). 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 EU 인덱스에 따른다.
"면역글로불린의 Fc 영역과 등가의 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 대립유전자 변이체뿐 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 야기하지만 효과기 기능(예를 들어, 항체-의존성 세포성 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변이를 갖는 변이체를 포함하는 것이다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 손실없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 상기 변이체들은 활성에 최소의 영향을 미치기 위해 당해 분야에 공지된 일반적인 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990)] 참조).
용어 "효과기 기능"은 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 후속 결합이 효과기 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)가 포함된다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa(유니프롯 수탁번호 P08637(버전 141) 참조)이다.
용어 "TNF 계열 리간드 구성원" 또는 "TNF 계열 리간드"는 전염증성 사이토카인을 말한다. 일반적으로 사이토카인, 및 특히 TNF 리간드 계열의 구성원들은 면역계의 자극 및 조정에 중요한 역할을 한다. 현재, 19개의 사이토카인이 서열, 기능적 및 구조적 유사성을 기준으로 TNF(종양 괴사 인자) 리간드 상과의 구성원으로 확인되었다. 이들 리간드는 모두 C-말단 세포외 도메인(엑토도메인), N-말단 세포내 도메인 및 단일 막관통 도메인을 갖는 II형 막관통 단백질이다. TNF 상동성 도메인(THD)으로 알려진 C-말단 세포외 도메인은 상과 구성원 사이에 20 내지 30% 아미노산 동일성을 가지며 수용체에 대한 결합을 담당한다. TNF 엑토도메인은 또한 TNF 리간드가 이의 특이적 수용체들에 의해 인식되는 삼량체성 복합체를 형성하는 것을 담당한다.
TNF 리간드 계열의 구성원들은 림프독소 α(Lymphotoxin α)(LTA 또는 TNFSF1으로도 알려짐), TNF(TNFSF2로도 알려짐), LTβ(TNFSF3으로도 알려짐), OX40L(TNFSF4로도 알려짐), CD40L(CD154 또는 TNFSF5로도 알려짐), FasL(CD95L, CD178 또는 TNFSF6으로도 알려짐), CD27L(CD70 또는 TNFSF7로도 알려짐), CD30L(CD153 또는 TNFSF8로도 알려짐), 4-1BBL(TNFSF9로도 알려짐), TRAIL(APO2L, CD253 또는 TNFSF10으로도 알려짐), RANKL(CD254 또는 TNFSF11로도 알려짐), TWEAK(TNFSF12로도 알려짐), APRIL(CD256 또는 TNFSF13으로도 알려짐), BAFF(CD257 또는 TNFSF13B로도 알려짐), LIGHT(CD258 또는 TNFSF14로도 알려짐), TL1A(VEGI 또는 TNFSF15로도 알려짐), GITRL(TNFSF18로도 알려짐), EDA-A1(엑토디스플라신 A1로도 알려짐) 및 EDA-A2(엑토디스플라신 A2로도 알려짐)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간), 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 TNF 계열 리간드를 말한다. 본 발명의 특정 양태에서, TNF 계열 리간드 구성원은 OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1BBL, CD40L 및 GITRL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, TNF 계열 리간드 구성원은 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
TNF 계열 리간드 구성원의 추가의 정보, 특히 서열은 유니프롯(www.uniprot.org)과 같은 공적으로 접근할 수 있는 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 TNF 리간드는 하기의 아미노산 서열을 갖는다: 인간 림프독소 α(유니프롯 수탁번호 P01374, 서열번호 95), 인간 TNF(유니프롯 수탁번호 P01375, 서열번호 96), 인간 림프독소 β(유니프롯 수탁번호 Q06643, 서열번호 97), 인간 OX40L(유니프롯 수탁번호 P23510, 서열번호 98), 인간 CD40L(유니프롯 수탁번호 P29965, 서열번호 99), 인간 FasL(유니프롯 수탁번호 P48023, 서열번호 100), 인간 CD27L(유니프롯 수탁번호 P32970, 서열번호 101), 인간 CD30L(유니프롯 수탁번호 P32971, 서열번호 102), 4-1BBL(유니프롯 수탁번호 P41273, 서열번호 103), TRAIL(유니프롯 수탁번호 P50591, 서열번호 104), RANKL(유니프롯 수탁번호 O14788, 서열번호 105), TWEAK(유니프롯 수탁번호 O43508, 서열번호 106), APRIL(유니프롯 수탁번호 O75888, 서열번호 107), BAFF(유니프롯 수탁번호 Q9Y275, 서열번호 108), LIGHT(유니프롯 수탁번호 O43557, 서열번호 109), TL1A(유니프롯 수탁번호 O95150, 서열번호 110), GITRL(유니프롯 수탁번호 Q9UNG2, 서열번호 111) 및 엑토디스플라신 A(유니프롯 수탁번호 Q92838, 서열번호 112).
"엑토도메인"은 세포외 공간(즉, 표적 세포 밖의 공간)으로 연장되는 막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 통상적으로 표면과의 접촉을 개시하는 단백질의 부분들로서, 상기 접촉은 신호 전달을 유도한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 구성원들의 엑토도메인은 세포외 공간(세포외 도메인)으로 연장되는 TNF 리간드 단백질의 부분을 말할 뿐 아니라, 삼량체화 및 상응하는 TNF 수용체에 대한 결합을 담당하는 이의 더 짧은 부분 또는 단편도 포함한다. 따라서, 용어 "TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이의 단편"은 세포외 도메인을 형성하는 TNF 계열 리간드 구성원의 세포외 도메인, 또는 수용체에 결합할 수 있는 이의 부분(수용체 결합 도메인)을 말한다.
용어 "공자극 TNF 계열 리간드 구성원" 또는 "공자극 TNF 계열 리간드"는 T-세포의 증식 및 사이토카인 생성을 공자극할 수 있는 TNF 계열 리간드 구성원의 아군(subgroup)을 말한다. 이들 TNF 계열 리간드는 이의 상응하는 TNF 수용체와의 상호작용시 TCR 신호를 공자극할 수 있으며, 이의 수용체와의 상기 상호작용은 T-세포 활성화를 야기하는 신호전달 연쇄반응을 개시하는 TNFR-연관 인자(TRAF)의 동원을 유도한다. 공자극 TNF 계열 리간드는 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L 및 LIGHT로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 특히 공자극 TNF 계열 리간드 구성원은 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
본원에서 상기 기술된 바와 같이, 4-1BBL은 II형 막관통 단백질이며 TNF 리간드 계열의 한 구성원이다. 서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 완전 또는 전장 4-1BBL은 세포의 표면 상에서 삼량체를 형성하는 것으로 기술되었다. 삼량체의 형성은 4-1BBL의 엑토도메인의 특정 모티프들에 의해 가능해진다. 상기 모티프들은 본원에서 "삼량체화 영역"으로 지칭된다. 인간 4-1BBL 서열의 아미노산 50-254(서열번호 113)는 4-1BBL의 세포외 도메인을 형성하지만, 이의 단편도 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 용어 "4-1BBL의 엑토도메인 또는 이의 단편"은 서열번호 4(인간 4-1BBL의 아미노산 52 내지 254), 서열번호 1(인간 4-1BBL의 아미노산 71 내지 254), 서열번호 3(인간 4-1BBL의 아미노산 80 내지 254) 및 서열번호 2(인간 4-1BBL의 아미노산 85 내지 254)로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 5(인간 4-1BBL의 아미노산 71 내지 248), 서열번호 8(인간 4-1BBL의 아미노산 52 내지 248), 서열번호 7(인간 4-1BBL의 아미노산 80 내지 248) 및 서열번호 6(인간 4-1BBL의 아미노산 85 내지 248)으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말하지만, 삼량체화될 수 있는 엑토도메인의 다른 단편도 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서 상기 기술된 바와 같이, OX40L은 또 다른 II형 막관통 단백질이며 TNF 리간드 계열의 또 다른 구성원이다. 완전 또는 전장 인간 OX40L은 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 OX40L 서열의 아미노산 51 내지 183(서열번호 114)은 OX40L의 세포외 도메인을 형성하지만, 이의 단편도 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 용어 "OX40L의 엑토도메인 또는 이의 단편"은 서열번호 114(인간 OX40L의 아미노산 51 내지 183) 또는 서열번호 115(인간 OX40L의 아미노산 52 내지 183)로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말하지만, 삼량체화될 수 있는 엑토도메인의 다른 단편도 본 발명에 포함된다.
용어 "펩티드 연결기"는 1개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 말한다. 펩티드 연결기는 당해 분야에 공지되어 있거나, 본원에 기술되어 있다. 적합한 비-면역원성 연결기 펩티드는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기(여기서, "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 1 내지 4의 수, 특히 2이다), 즉, GGGGS(서열번호 116), GGGGSGGGGS(서열번호 117), SGGGGSGGGG(서열번호 118), (G4S)3 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 119), GGGGSGGGGSGGGG 또는 G4(SG4)2(서열번호 120), 및 (G4S)4 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 121), 및 서열 GSPGSSSSGS(서열번호 122), GSGSGSGS(서열번호 123), GSGSGNGS(서열번호 124), GGSGSGSG(서열번호 125), GGSGSG(서열번호 126), GGSG(서열번호 127), GGSGNGSG(서열번호 128), GGNGSGSG(서열번호 129) 및 GGNGSG(서열번호 130)를 포함한다. 특정 관심 펩티드 연결기는 (G4S)1 또는 GGGGS(서열번호 86), (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS(서열번호 117) 및 GSPGSSSSGS(서열번호 122), 더욱 특히 (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS(서열번호 117)이다.
용어 "아미노산"은 본원에 사용될 때 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
본원에서 사용된 "융합 폴리펩티드" 또는 "단일 융합 폴리펩티드"는 항원 결합 잔기의 일부 또는 Fc 부분에 융합된 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개 또는 2개의 엑토도메인으로 이루어진 단일쇄 폴리펩티드를 말한다. 융합은 항원 결합 잔기의 N 또는 C-말단 아미노산을 펩티드 연결기에 의해 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인의 C- 또는 N-말단 아미노산에 직접 결합시킴으로써 일어날 수 있다.
"융합된" 또는 "연결되는"은 구성성분들(예를 들어, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 폴리펩티드 및 엑토도메인)이 펩티드 결합에 의해 직접적으로, 또는 1개 이상의 펩티드 연결기에 의해 결합된 것을 의미한다.
기준 폴리펩티드(단백질) 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN.SAWI 또는 메갈린(Megalign)(디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어와 같은 공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:
100 x 분율 X/Y
이때, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체는, 상기 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물을 수득할 수 있으나, 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어, 항원-결합 특성을 가져야 한다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 프레임워크(FR)를 포함한다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"이란 제목 하에 표 B에 나타내었으며, 아미노산 측쇄 클래스 (1) 내지 (6)과 관련하여 하기에서 더 기술된다. 아미노산 치환은 해당 분자 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
[표 B]
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아미노산은 공통적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스들 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 포함한다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 모 항원 결합 분자(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기들에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 수득된 변이체는 모 항원 결합 분자에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 변화(예를 들어, 개선)를 가지고/가지거나, 모 항원 결합 분자의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 성질을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 증진된 항체로서, 이것은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 증진 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항원 결합 분자를 파지상에 디스플레이시키고 특정 생물 활성(예를 들어, 결합 친화도)을 스크리닝한다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 상기 변이들이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에 이루어질 수 있다. 돌연변이유발에 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기들(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 그들이 목적하는 성질을 보유하는지를 측정하기 위해 변이체들을 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 100개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 포함된다. 상기 분자의 다른 삽입 변이체는 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변이된다. 상기 분자의 글리코실화 변이체는, 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 편리하게 수득될 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된, 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 특정한 개선된 성질을 갖는 변이체를 생성하기 위해 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 중 상기 올리고사카라이드의 변형이 수행될 수 있다. 한 양상에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 변이체가 제공된다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들어, 미국 특허공개공보 제2003/0157108호(프레스타(Presta, L.)) 또는 제2004/0093621호(쿄와 하꼬 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)) 참조). 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 예를 들어, Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들어, 국제 특허공개공보 제2003/011878호(진-메이렛(Jean-Mairet) 등); 미국 특허공보 제6,602,684호(우마나(Umana) 등); 및 미국 특허공개공보 제2005/0123546호(우마나 등) 참조). Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 1개 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있으며, 예를 들어, 국제 특허공개공보 제1997/30087호(파텔(Patel) 등); 제1998/58964호(라주(Raju, S.)); 및 제1999/22764호(라주)에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 분자의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 시스테인 조작된 변이체, 예를 들어, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, 치환된 잔기는 분자의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고, 항체를 다른 잔기, 예를 들어, 약물 잔기 또는 연결기-약물 잔기에 접합시켜 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항원 결합 분자는, 예를 들어, 미국 특허공보 제7,521,541 호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
특정 양상에서, 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 당해 분야에 공지되어 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비-단백성 잔기를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비-제한 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 이의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 이의 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 결합되는 중합체의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들은 같거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특정한 성질 또는 기능, 이중특이성 항체 유도체가 정의된 조건 하에 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다. 다른 양상에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비-단백성 잔기의 접합체가 제공된다. 한 양태에서, 비-단백성 잔기는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상 세포에 유해하지 않으나 항체-비-단백성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 비-단백성 잔기를 가열시키는 파장을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
다른 양상에서, 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 면역접합체가 수득될 수 있다. "면역접합체"는 세포독성 약제를 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스-유래 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 절편, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 말한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 분리된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하는 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 또 다른 예는 이종 숙주 세포들내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐 아니라 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 상기 분자를 또한 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 상기 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미하는 것이다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열 중 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열 중 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 일부의 뉴클레오티드가 기준 서열 중에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 상기 변이는, 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 기준 서열 중 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기들 중의 잔기들 사이에 개별적으로 배치된, 상기 말단 위치들 사이 어디에서나 일어날 수 있다. 실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로, 폴리펩티드에 대해 상기 논의한 것(예를 들어, ALIGN-2)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소를 사용하여 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편내에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열들 중에서, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중 특이성 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이며, 표적 세포에서 작동가능하게 결합되는 특정 유전자를 도입하고, 상기 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용되는 DNA 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구축물로서의 벡터뿐 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 발현 벡터가 표적 세포 내부에 있으면, 상기 유전자에 의해 코딩되는 리보핵산 분자 또는 단백질은 세포 전사 및/또는 번역 절차에 의해 생성된다. 한 양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들어, 배양된 포유동물 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
약제의 "효과량"은 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기하기 위해 필요한 양을 말한다.
약제, 예를 들어, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량에서 필요한 시간 동안 효과적인 양을 말한다. 약제의 치료 효과량은, 예를 들어, 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나, 방지한다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 개체 또는 대상은 인간이다.
용어 "약학 조성물"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 그런 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 부형제"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 조성물내 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 부형제로는 완충제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문자적 변형, 예를 들어, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 양태에서, 본 발명의 분자는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "암"은, 예를 들어, 이의 난치성 형태를 포함하여, 림프종, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 림프구성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 복부암, 위암, 대장암(CRC), 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암, 뇌하수체 선종 및 유잉(Ewing) 육종, 흑색종, 다발성 골수종, B-세포암(림프종), 만성 림프구성 백혈병, 또는 상기 암들중 하나 이상의 조합과 같은 증식성 질환을 말한다.
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
본 발명은 생산성, 안정성, 결합 친화도, 생물 활성, 표적화 효율 및 감소된 독성과 같은 특히 유리한 성질을 갖는 신규한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원이 인간 T-세포 활성화를 공자극하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 특정 양상에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인이 모든 경우에서 동일한 것을 특징으로 한다.
추가 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 본원에서 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때 상기 항원 결합 분자는 (i) 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, (ii) 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, (iii) 제1 폴리펩티드가 VH-CL 도메인 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드 VL 또는 VH에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 본원에 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때 상기 항원 결합 분자는 (i) 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, (ii) 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하거나, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택되는, 인간 T-세포 활성화를 공자극하는 TNF 계열 리간드 구성원을 포함한다. 더욱 특히, TNF 계열 리간드 구성원은 4-1BBL이다.
다른 양상에서, TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 특히, TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, TNF 계열 리간드 구성원은 OX40L이다. 특정 양상에서, TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인이 서열번호 114 또는 서열번호 115의 아미노산 서열, 특히 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 이때 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 초과의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 2개의 TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인 또는 이들의 2개의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기가 2개의 상이한 표적 세포 항원에 겨합하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체 단편, Fab 분자, 교차형 Fab 분자, 단일쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, aVH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 aVH 또는 스캐폴드 항원 결합 단백질이다. 한 양상에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
특히, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 또는 2개의 잔기를 포함한다.
특정 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자 또는 교차형 Fab 분자인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 특히, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab이다.
다른 양상에서, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편이 이의 C-말단에서 제3의 펩티드 연결기에 의해 경쇄 상의 CL 도메인에 융합되는, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편이 이의 C-말단에서 제3의 펩티드 연결기에 의해 경쇄 상의 CH1 도메인에 융합되는, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편이 이의 C-말단에서 제3의 펩티드 연결기에 의해 중쇄 상의 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특정 양상에서, 본 발명은, 펩티드 연결기가 (G4S)2인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 양상에서, 제1 펩티드 연결기는 (G4S)2(서열번호 117)이고, 제2 펩티드 연결기는 GSPGSSSSGS(서열번호 122)이고, 제3 펩티드 연결기는 (G4S)2(서열번호 117)이다. 특히, 본 발명은 제1 펩티드 연결기가 (G4S)2(서열번호 117)이고, 제2 펩티드 연결기가 (G4S)2(서열번호 117)이고, 제3 펩티드 연결기가 (G4S)2(서열번호 117)인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
특히, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자(이때, Fab 중쇄는 C-말단에서 Fc 도메인 내의 CH2 도메인의 N-말단에 융합된다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 특정 양상에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체로서, 이의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 아단위는 서로와 안정하게 결합할 수 있다.
Fc 도메인은, 표적 조직에서의 양호한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 유리한 조직-혈액 분포비를 포함하여 유리한 약동학적 성질을 본 발명의 항원 결합 분자에 제공한다. 그러나, 동시에, Fc 도메인은, 바람직한 항원-함유 세포가 아니라 Fc 수용체를 발현하는 세포로 본 발명의 이중특이성 항체의 바람직하지 않은 표적화를 유도할 수 있다. 따라서, 특정 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 한 양상에서, 상기 Fc는 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 양상에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 양상에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 특정 양상에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 특히 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특히 인간 FcγRIIIa이다. 한 양상에서, Fc 도메인은 효과기 기능을 유도하지 않는다. 감소된 효과기 기능은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수의 감소, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 세포자살을 유도하는 직접 신호전달의 감소, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍(priming).
특정 양상에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc-영역내에 도입됨으로써 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는, 인간 Fc-영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인(이때, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다)을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에 존재한다. 특히, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(EU 넘버링)의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 특히, Fc 도메인은 IgG 중쇄의 위치 234 및 235(EU 넘버링) 및/또는 329(EU 넘버링)에 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특히, IgG 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", EU 넘버링)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는, 본 발명에 따른 삼량체성 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 아미노산 치환 L234A 및 L235A는 소위 LALA 돌연변이를 말한다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 배제시키며, 상기 돌연변이 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 이의 성질을 측정하는 방법을 또한 기술하고 있는 국제 특허공개공보 제2012/130831 A1호에 기술되어 있다. "EU 넘버링"는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 EU 인덱스에 따른 넘버링 체계를 말한다.
감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인을 포함한다(미국 특허공보 제6,737,056호). 상기 Fc 돌연변이체로는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(미국 특허공보 제7,332,581호).
다른 양상에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 보다 특정 양상에서, Fc 도메인은 위치 S228(카밧 번호)에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정 양상에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G(EU 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이의 Fcγ 수용체 결합 성질은 또한 국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술되어 있다.
돌연변이 Fc 도메인은 당해 분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 코딩 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들어, 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은, 예를 들어, ELISA에 의해, 또는 바이아코어(BIAcore) 기기(지이 헬스케어(GE Healthcare))와 같은 표준 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있으며, Fc 수용체는, 예를 들어 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적절한 상기 결합 분석법은 본원에서 기술된다. 또는, Fc 수용체에 대한, Fc 도메인의 결합 친화도 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화도는, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포와 같이 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 효과기 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석법은 본원에서 기술된다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 다른 예는 미국 특허공보 제5,500,362호; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국 특허공보 제5,821,337호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다(예를 들어, 유동세포분석을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨) 참조). 상기 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 다르게는 또는 추가로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 양태에서, 보체 성분, 특히 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된 일부 양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은, 본 발명의 이중특이성 항체가 C1q에 결합할 수 있으며, 따라서 CDC 활성을 갖는지 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다(예를 들어, 국제 특허공개공보 제2006/029879호 및 제2005/100402호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
특정 양상에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
한 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인(이때, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다)을 포함한다. 따라서, 이들은, 전형적으로 2개의 비-동일 폴리펩티드 쇄("중쇄")에 포함되는 Fc 도메인의 2개 아단위들 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 잔기들을 포함한다. 상기 폴리펩티드들의 재조합 동시-발현 및 후속 이량체화는 2개의 폴리펩티드들의 여러 가능한 조합들을 유도한다. 따라서, 재조합체 생산에서 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 아단위들 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 상기 변형은 특히 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
특정 양상에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나에 놉 변형 및 Fc 도메인의 2개 아단위 중 다른 하나에 홀 변형을 포함하는 소위 "놉-인투-홀" 변형이다. 따라서, 특정 양상에서, 본 발명은, 제1 중쇄의 Fc 부분이 제1 이량체화 모듈을 포함하고 제2 중쇄의 Fc 부분이 제2 이량체화 모듈을 포함하여 IgG 분자의 2개의 중쇄의 이종이량체화를 가능하게 하고, 제1 이량체화 모듈이 놉-인투-홀 기술에 따른 놉을 포함하고 제2 이량체화 모듈이 홀을 포함하는 IgG 분자를 포함하는, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
놉-인투-홀 기술은, 예를 들어, 미국 특허공보 제5,731,168호; 제7,695,936호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은, 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록 제1 폴리펩티드의 계면에 돌출부(놉) 및 제2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동(홀)을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 보상적인 공동이 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다.
따라서, 특정 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제2 아단위의 CH3 도메인 내의 공동에 위치할 수 있는 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 돌출부가 생성되고, Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제1 아단위의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다.
돌출부 및 공동은, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 제조될 수 있다.
특정 양상에서, Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서, 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서, 위치 407에서의 티로신 잔기가 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 더욱 특히, Fc 도메인의 제2 아단위에서, 추가로 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 세린 잔기로 치환되고(T366S), 위치 368에서의 류신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된다(L368A). 더욱 특히, Fc 도메인의 제1 아단위에서, 위치 354에서의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제2 아단위에서, 위치 349에서의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기한다. 상기 다이설파이드 가교는 이량체를 더 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)]).
다른 양상에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형은, 예를 들어, 국제 특허공개공보 제2009/089004호에 기술된 바와 같이 정전기 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은, 동종이량체 생성은 정전기적으로 불리하지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 아단위의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 포함한다.
CH1/CL 도메인에서의 변형
정확한 쌍형성(pairing)을 더 개선하기 위해, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 상이한 하전된 아미노산 치환(소위 "하전된 잔기")을 함유할 수 있다. 상기 변형들은 교차되거나 비-교차된 CH1 및 CL 도메인 내에 도입된다. 특정 양상에서, 본 발명은, CL 도메인들중 하나에서 위치 123(EU 넘버링)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 넘버링)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, CH1 도메인들중 하나에서 위치 147(EU 넘버링) 및 위치 213(EU 넘버링)에서의 아미노산들이 글루탐산(E)으로 치환된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 넘버링)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 넘버링)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 넘버링) 및 위치 213(EU 넘버링)에서의 아미노산들이 글루탐산(E)으로 치환된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
따라서, 특정 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) 아미노산 돌연변이 E123R 및 Q124K를 포함하는 CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드, 및 아미노산 돌연변이 K147E 및 K213E를 포함하는 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되고, 이때 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
다른 양상에서, 본 발명은 각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 제2 중쇄 또는 제2 경쇄에 융합된 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드, 및 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 제2 경쇄 또는 제2 중쇄에 융합된 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 펩티드를 각각 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양상에서, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양상에서, 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양상에서, 본 발명은, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 넘버링)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 넘버링)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 넘버링) 및 위치 213(EU 넘버링)에서의 아미노산들이 글루탐산(E)으로 치환된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 변형은, 예를 들어 쌍형성오류와 같은 바람직하지 않는 영향을 방지하는 유리한 성질을 갖는 소위 하전된 잔기들을 유도한다.
특히, CL 도메인은 아미노산 돌연변이 E123R 및 Q124K를 포함하고, CH1 도메인은 아미노산 돌연변이 K147E 및 K213E를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 스캐폴드 항원 결합 단백질인, 본원에서 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양상에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 잔기를 포함하고, 이는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 1가임을 의미한다. 다른 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 2가임을 의미한다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (b) (i) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (c) (i) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (d) (i) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (e) (i) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, (f) (i) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는 (g) (i) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (f) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (g) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (h) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (i) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (j) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 (k) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 본원에서 상기 정의된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 특정 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 양상에서, PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성되는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 구성되는 VL 도메인, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성되는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성되는 VL 도메인을 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
특정 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 이때 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가 양상에서, 항원 결합 분자가 (a) 각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 경쇄를 포함하는, 본원에 상기 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양상에서, 본 발명은 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자, 및 (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 항원 결합 분자가 (a) (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 및 (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양상에서, 항원 결합 분자가 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, (ii) 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78 및 서열번호 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 (iii) 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79 및 서열번호 81로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, (b) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, (c) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는 (d) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, (b) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, (c) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는 (d) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, 항원 결합 분자가 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 특정 양상에서, 항원 결합 분자가 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하고, 이때, 상기 항원 결합 분자는 상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하는 것을 특징으로 하고, 상기 제1 폴리펩티드는 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 펩티드 연결기를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
특정 양상에서, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 도메인을 포함한다.
특히, (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 (b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는, 본원에 상기 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양상에서, (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 (b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는, 본원에 상기 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 특정 양상에서, 본 발명은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 Fab 도메인을 포함하는, 본원에 상기 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
이러한 양상에서, 항원 결합 분자가 (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄, 또는 (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다
특정 양상에서, 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (b) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (c) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 (d) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 특정 양상에서, 항원 결합 분자가 (a) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (b) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (c) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 (d) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 전체 항원 결합 분자를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현되거나 동시-발현되는 다중(예를 들어, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드들에 의해 코딩된 폴리펩티드들은, 예를 들어, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 기능성 항원 결합 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린의 경쇄 부분은 면역글로불린의 중쇄 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 동시-발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 면역글로불린을 생성할 것이다.
일부 양상에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩한다. 특히, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 코딩하는 서열, (b) 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 및 (c) 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 코딩하는 서열, (b) 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 및 (c) 4-1BBL의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는, 4-1BB 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 2개의 4-1BBL 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개의 4-1BBL 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 코딩하는 서열, (b) 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 OX40L의 2개의 엑토도메인 또는 이의 2개의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 및 (c) OX40L의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는, OX40L 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 특정 cDNA 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 특정 cDNA 서열 중 하나와 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
다른 양상에서, 핵산 분자는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 32, 33, 40, 41, 48, 49, 56, 57, 64, 65, 72 및 73 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 추가 양상에서, 핵산 분자는 서열번호 9, 10, 11 및 12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
또 다른 양상에서, 핵산 분자는 서열번호 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 및 150로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
특정 양상에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 예를 들어, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들어, 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자(단편)의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다(예를 들어, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재되어 있는 기술 참조). 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편(즉, 코딩 영역)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우, 코딩 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 인접(flanking) 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물들에, 예를 들어, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 번역후 또는 번역과 동시에 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 코딩 영역을 코딩할 수 있다. 이종 코딩 영역은, 제한하지 않고, 분화된(specialized) 요소 또는 모티프, 예를 들어, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 결합은, 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어, 폴리펩티드 코딩 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 결합되는 것이다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들어, 인핸서, 작동유전자, 억제유전자 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다.
적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(예를 들어, 인트론-A와 함께, 급속 초기발현(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어, 초기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들어, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편(이로 한정되지는 않는다)이 포함된다. 다른 전사 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들뿐 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐 아니라, 유도성 프로모터(예를 들어, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR), 또는 아데노-결합 바이러스(AAV)의 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징들도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 추가의 코딩 영역과 결합될 수 있다. 예를 들어, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 분비를 목적하는 경우, 신호 서열을 코딩하는 DNA는 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 코딩하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드가 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어, 분비된 형태 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지할 것이다. 특정 양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작동가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 또는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
후속의 정제를 촉진하거나(예를 들어, 히스티딘 태그) 융합 단백질의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 코딩하는 DNA가 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 말단에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 양상에서, 숙주 세포는 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자(의 일부)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어, 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 말한다. 항원 결합 분자를 복제하고 이의 발현을 촉진하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 적절하게 형질감염되거나 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 항원 결합 분자를 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며, 더 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균류 및 효모 균주를 포함하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조).
(글리코실화) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들어, (유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES: 상표) 기술을 기재하고 있는) 미국 특허공보 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호 참조). 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)])를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포로는 배양 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 한 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 상기 시스템들에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 둘 다 갖는 면역글로불린이도록 면역글로불린 쇄들 중 나머지 쇄를 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 발현에 적합한 조건 하에, 본원에서 제공된 바와 같은 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 매질)로부터 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에서, 구성성분들(표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 1개의 폴리펩티드, 및 상기 TNF 계열 리간드 계열 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드)은 유전적으로 서로에 융합되지 않는다. 상기 폴리펩티드들은, 그 구성성분들(TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편, 및 CH 또는 CL과 같은 다른 구성성분들)이 직접적으로 또는 연결기 서열을 통해 서로에 융합되도록 설계된다. 연결기의 조성 및 길이는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있으며, 효능에 대해 검사될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자의 상이한 구성성분들 사이의 연결기 서열의 예는 본원에 제공된 서열들에서 확인된다. 바람직한 경우, 융합 단백질의 개개 구성성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 혼입시키기 위해 추가의 서열, 예를 들어, 엔도펩티다제 인식 서열도 또한 포함될 수 있다.
특정 양태에서, 항원 결합 분자의 일부를 형성하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기(예를 들어, Fab 단편)는 적어도, 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 이의 단편의 일부를 형성할 수 있고, 상기 항체 및 이의 단편으로부터 유도될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비-천연 항체는 고상-펩티드 합성을 이용하여 구성될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들어, 미국 특허공보 제4,186,567호에 기술된 바와 같이), 또는 예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다(예를 들어, 맥카퍼티(McCafferty)의 미국 특허공보 제5,969,108호 참조).
임의의 동물 종의 면역글로불린이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비-제한적 면역글로불린은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원을 가질 수 있다. 융합 단백질이 인간에 사용하기 위한 것인 경우, 면역글로불린의 불변 영역이 인간으로부터 유래된, 면역글로불린의 키메라 형태를 사용할 수 있다. 면역글로불린의 인간화 또는 완전 인간 형태는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, 윈터(Winter)의 미국 특허공보 제5,565,332호 참조). 인간화는, (a) 핵심 프레임워크 잔기(예를 들어, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 갖거나 갖지 않는 인간(예를 들어, 수용체 항체) 프레임워크 및 불변 영역 상으로 비-인간(예를 들어, 공여체 항체) CDR의 그라프팅, (b) 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)의 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 그라프팅, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 구획으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것을 포함하는(이로 한정되지는 않는다) 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들어, 다음 문헌들에 더 기술되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허공보 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; 문헌[Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 그라프팅을 기술하고 있음); 문헌[Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("표면처리(resurfacing)"를 기술하고 있음); 문헌[Dall' Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음). 본 발명에 따른 특정한 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-374 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기술되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 상기 항체로부터 유도될 수 있다(예를 들어, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 자극에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 유전자전이 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 및 문헌[MaCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다.
특정 양상에서, 본 발명의 항원 결합 분자에 포함된, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기(예를 들어, Fab 단편)는, 예를 들어, 국제 특허공개공보 제2012/020006호(친화도 증진에 관한 실시예 참조) 또는 미국 특허공개공보 제2004/0132066호에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정기에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자의 능력은, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 기술(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]) 및 전통적인 결합 분석법(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석법을 이용하여, 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항원 결합 분자에 의해 결합되는 동일 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 지도작성을 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Human Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적인 경쟁 분석법에서는, 항원에 결합하는 제1 표지된 항원 결합 분자 및 항원에 대한 결합에 대해 제1 항원 결합 분자와 경쟁하는 이의 능력에 대해 검사되는 제2의 비표지 항원 결합 분자를 포함하는 용액 중에서, 고정화된 항원을 배양한다. 상기 제2 항원 결합 분자는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로, 제1 표지된 항원 결합 분자는 포함하지만 제2의 비표지된 항원 결합 분자는 포함하지 않는 용액 중에서 고정화 항원을 배양한다. 제1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 배양한 후, 과잉 미결합 항체를 제거하고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화 항원과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 검사 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제2 항원 결합 분자가 항원에 대한 결합에 대해 제1 항원 결합 분자와 경쟁하는 것을 나타낸다(문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
본원에 기술된 바와 같이 제조된 본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 기본적으로 실시예에 기술된 바와 같이 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 이의 단편의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 실시예에서 기술된 바와 같이 발현된 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 입증되는 바와 같이 온전하고 적절히 구성된 것으로 나타났다.
분석
본원에 제공된 항원 결합 분자는, 당해 분야에 공지된 다양한 분석법들에 의해 이의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나 특징규명될 수 있다. 생물 활성은, 예를 들어, 상이한 면역 세포들, 특히 T-세포의 활성화 및/또는 증식을 증대시키는 능력을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 면역조절 사이토카인(예, 인터페론-감마(IFN-감마) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파))의 분비를 증대시킨다. 증대시키거나 증대시킬 수 있는 다른 면역조절 사이토카인은, 예를 들어, IL12, 그랜자임 B 등이다. 생물 활성은 또한 사이노몰거스 결합 교차반응성뿐 아니라, 상이한 세포 유형에 대한 결합을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 항원 결합 분자가 또한 제공된다.
1. 친화도 분석
상응하는 TNF 수용체에 대한 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 친화도는, 바이아코어 기기(지이 헬스케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 나타낸 방법에 따라 측정될 수 있다. PD1에 대한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 친화도는 또한, 바이아코어 기기(지이 헬스케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예증적이고 예시적인 양태는 실시예 4에서 기술된다. 한 양상에 따라서, KD는 25℃에서 바이아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
2. 결합 분석 및 다른 분석
상응하는 수용체 발현 세포에 대한 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들어, 유동세포분석(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 한 양상에서, TNF 수용체를 발현하는 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 결합 분석에 사용된다. 상기 세포들은 단리 후에(나이브 PBMC) 또는 자극 후에(활성화된 PBMC) 직접 사용된다. 다른 양상에서, 상응하는 TNF 수용체 발현 세포에 대한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합을 입증하기 위해 활성화된 마우스 비장세포(TNF 수용체 분자를 발현하는)를 사용하였다.
다른 양상에서, PD1을 발현하는 세포주를 사용하여 표적 세포 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 입증하였다.
다른 양상에서, 경쟁 분석법을 이용하여 표적 또는 TNF 수용체 각각에 결합하기 위해 특이적 항체 또는 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 경쟁 항원 결합 분자는 특이적 항-표적 항체 또는 특이적 항-TNF 수용체 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 그에 항체가 결합하는 에피토프의 지도작성을 위한 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
3. 활성 분석
한 양상에서, 특이적 표적 세포 항원에 및 생물 활성을 갖는 특이적 TNF 수용체에 결합하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들어, 표적 세포 항원을 발현하는 세포 상에서 TNF 수용체를 통한 작용성 신호전달을 포함할 수 있다. 상기 분석법들에 의해 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 것으로 확인된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자도 또한 제공된다.
특정 양상에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 상기 생물 활성에 대해 검사된다. 본 발명의 분자들의 생물 활성을 검출하기 위한 분석법들은 실시예 5 및 6에서 기술된 것들이다. 또한, 세포 용해(예를 들어, LDH 방출을 측정함으로써), 유도된 세포자살 동력학(예를 들어, 카스파제3/7 활성을 측정함으로써) 또는 세포자살(예를 들어, TUNEL 분석법을 이용하여)을 검출하기 위한 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 상기 복합체들의 생물 활성은, NK 세포, NKT-세포 또는 γδ T-세포와 같은 다양한 림프구 아집단의 생존, 증식 및 림포카인 분비에 대한 이의 영향을 평가하거나, 수지상 세포, 단핵구/대식세포 또는 B-세포와 같은 항원 제공 세포의 표현형 및 기능을 조절하는 이의 능력을 평가함으로써 평가될 수 있다.
약학 조성물, 제형 및 투여 경로
다른 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 하기 치료 방법들 중 임의의 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 1개 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 또 다른 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 1개 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 치료제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제에 용해되거나 분산된 하나 이상의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자를 치료 효과량 포함한다. "약학적 또는 약리학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체(recipient)에게 일반적으로 무독성인, 즉, 예를 들어, 인간과 같은 동물에 적절하게 투여될 때, 해롭거나, 알레르기성이거나 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 하나 이상의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자 및 선택적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는, 본원에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있을 것이다. 특히, 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 "약학적으로 허용되는 부형제"는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 임의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장화제, 염, 안정화제 및 이의 혼합물을 포함한다
비경구 조성물로는 주사, 예를 들어, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 기관지내 또는 복강내 주사에 의해 투여하도록 설계된 것들이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예를 들어, 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 융합 단백질은 사용 전에, 적당한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-비함유수로 조성되기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사액은, 본 발명의 융합 단백질을, 필요에 따라, 하기에 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주사전에 충분한 식염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들어, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 부형제로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능케 하는 약제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절하게 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들어, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어, 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세리드 또는 리포좀이 포함된다.
활성 성분들은, 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 거대유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 특정 양태에서, 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물중에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 혼합물을 사용하여 이루어질 수 있다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 부형제로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허공개공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기술되어 있다. 한 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 혼합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형이 미국 특허공보 제6,267,958호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 미국 특허공보 제6,171,586호 및 국제 특허공개공보 제2006/044908호에 기술된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
전술한 조성물 이외에, 융합 단백질은 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 상기 지효성(long acting) 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내에)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 융합 단백질은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일중 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은, 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 중에 배합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들로는 산 부가염, 예를 들어, 단백성 조성의 유리 아미노기에 의해 생성된 염, 또는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산에 의해 생성된 염이 포함된다. 유리 카복실기에 의해 생성된 염도 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기로부터; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다.
본 발명의 조성물은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로에 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적인 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 적절히 함께 존재한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 치료 방법에 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 올바른 의료 행위에 따른 방식으로 제형화되고 조제되고 투여된다. 이와 관련하여 고려될 요인들로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지되어 있는 기타 요인들이 포함된다.
한 양상에서, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 다른 양상에서, 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 양상에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은, 개체에게 치료 효과량의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양상에서, 치료될 질환은 암이다. 암의 예로는 고형 종양, 방광암, 신세포 암종, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 뼈암, 및 신장암, 흑색종, B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 비-호지킨 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병이 포함된다. 따라서, 암의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 치료를 필요로 하는 대상, 환자 또는 "개체"는 전형적으로 포유동물, 더욱 특히는 인간이다.
다른 양상에서, 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한, 특히 바이러스 감염의 치료를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 다른 양상에서, 예를 들어, 루푸스 질환과 같은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 제조하는데 있어서 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 한 양상에서, 상기 약제는 질환을 갖는 개체에게 치료 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 양태에서, 치료될 질환은 증식성 질환, 특히 암이다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 암의 예로는 고형 종양, 방광암, 신세포 암종, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 뼈암, 및 신장암, 흑색종, B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 비-호지킨 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병이 포함된다. 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 질환으로는 복부, 뼈, 유방, 소화기관, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식계에 위치한 종양이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 전암성 병태 또는 병변 및 암 전이도 또한 포함된다. 특정 양태에서, 암은 신세포암, 피부암, 폐암, 대장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 숙련된 전문가라면 일부 경우에서 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수는 없고 단지 부분적 이점만을 제공할 수 있음을 인지할 수 있다. 일부 양상에서, 다소의 이점을 갖는 생리학적 변화도 또한 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 양상에서, 생리적 변화를 제공하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로 간주된다.
다른 양상에서, 본 발명은 감염성 질환의 치료, 특히 바이러스 감염의 치료 또는 자가면역 질환, 예를 들어, 루푸스 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 개체에게 치료 효과량의 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 본 발명의 융합 단백질을 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 양상에서, 치료될 질환은 증식성 질환이다. 특정 양상에서, 질환은 암이다. 다른 양상에서, 질환은 감염성 질환 또는 자가면역 질환이다. 특정 양상에서, 상기 방법은 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들어, 치료될 질환이 암인 경우 항암제를 투여하는 것을 또한 포함한다. 임의의 상기 양태들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 병행 치료 개입, 환자의 병력 및 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 책임지는 의사는 아무튼 조성물 중 활성 성분의 농도 및 개개 대상에 적절한 용량을 결정할 것이다. 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 10 mg/kg)의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가, 예를 들어, 하나 이상의 별개 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 한 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 융합 단백질의 한 예시적인 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 다른 예로, 용량은 또한 투여당, 약 1 μg/kg 체중, 약 5 μg/kg 체중, 약 10 μg/kg 체중, 약 50 μg/kg 체중, 약 100 μg/kg 체중, 약 200 μg/kg 체중, 약 350 μg/kg 체중, 약 500 μg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중, 약 1,000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 예로, 전술한 숫자들에 준하여, 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 μg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들어, 약 6개 용량의 융합 단백질을 투여받도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 하나 이상의 저용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 일반적으로 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용된다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위한 용도로, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자, 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 당해 분야에 숙련된 자의 능력에 속한다.
전신 투여의 경우, 치료 효과적인 용량은 초기에 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석으로부터 평가될 수 있다. 이어서, 세포 배양물에서 측정시 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 용량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 상기 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 생체내 데이터, 예를 들어, 동물 모델로부터 평가될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 동물 데이터에 근거하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어, HPLC로 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 섭취의 경우, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수도 있다. 당해 분야에 숙련된 자는 과도한 실험없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 치료 효과적 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(한 개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(한 개체군의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수로서, 비 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 수득된 데이터를, 인간에 사용하기에 적합한 범위의 투여량을 제형화하는데 이용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 든다. 상기 투여량은 다양한 요인들, 예를 들어, 사용되는 투여 형태, 사용되는 투여 경로, 대상의 병태 등에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 병태에 비추어 개개 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, 본원에 전체로 참고로 인용된 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 융합 단백질로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능부전 등으로 인해 투여를 어떻게 및 언제 종료하거나, 중단하거나 조정할지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해하는 독성), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알 것이다. 해당 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료될 병태의 중증도에 따라, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 병태의 중증도는, 예를 들어, 부분적으로, 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 빈도도 또한 개개 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 제제 및 치료
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 치료에서 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 상기 추가의 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분들을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 추가의 치료제는 또 다른 항암제이다.
상기 다른 약제들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다. 상기 다른 약제들의 효과량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의한 기타 요인들에 따라 달라진다. TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 측정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급한 상기 병용 치료는 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일 조성물 또는 별개의 조성물에 포함되는 경우) 및 별도의 투여를 포함하며, 별도 투여의 경우, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다.
제품
본 발명의 다른 양상에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자이다.
표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 아니면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 양태에서의 상기 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
다르게는 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
[표 C]
서열
Figure pct00003
Figure pct00004
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인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공되어 있다. 항체 쇄들의 아미노산은 상기 정의된 바와 같은 카밧[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 따른 EU 넘버링 체계에 따라 번호를 붙이고 지칭된다.
하기 넘버링된 항들은 본 발명의 양상이다:
1. (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
2. 제1항에 있어서,
(c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 추가로 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서
(a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드
를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
(i) 상기 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나,
(ii) 상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나,
(iii) 상기 제1 폴리펩티드가 VH-CL 도메인 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는,
TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
TNF 계열 리간드 구성원이 인간 T 세포 활성화를 공동 자극하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
TNF 계열 리간드 구성원이 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
TNF 계열 리간드 구성원이 4-1BBL인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
항원 결합 분자가 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
항원 결합 분자가 (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체 단편, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일 쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, aVH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
분자가 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가
(a) (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
(b) (i) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
(c) (i) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
(d) (i) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
(e) (i) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
(f) (i) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
(g) (i) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가
(a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(f) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(g) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(h) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(i) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(j) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(k) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가
(a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메;
(d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
(e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 도메인이 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 도메인이 위치 234 및 235(EU 넘버링) 및/또는 329(EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 Fc 도메인인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 도메인의 제1 아단위가 아미노산 치환 S354C 및 T366W(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위가 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄;
C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 제2 중쇄 또는 제2 경쇄에 융합된 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드; 및
C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 제2 경쇄 또는 제2 중쇄에 융합된 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 펩티드
를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 부분인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 부분인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 부분인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 부분인 VH 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 부분인 VL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CL 도메인에서, 위치 123(EU 넘버링)의 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되고, 위치 124(EU 넘버링)의 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고, TNF 계열 리간드 구성원에 인접한 CH1 도메인에서, 위치 147(EU 넘버링) 및 위치 213(EU 넘버링)의 아미노산이 글루탐산(E)에 의해 치환되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
항원 결합 분자가 (a) 각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, (b) 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
27. 제1항 내지 제20항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄;
(ii) 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78 및 서열번호 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(iii) 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79 및 서열번호 81로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(b) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
(d) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
29. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 Fab 도메인, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하되, 상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서, 사익 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
30. 제29항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 도메인을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
31. 제29항에 있어서,
(a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄; 또는
(b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄
를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
32. 제29항에 있어서,
PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 Fab 도메인을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
33. 제29항 또는 제32항에 있어서,
항원 결합 분자가 (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄, 또는 (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
34. 제31항에 있어서,
(a) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(c) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(d) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
36. 제35항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
37. 제35항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제36항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
38. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 제조 방법으로서,
제37항에 따른 숙주 세포를 상기 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및
상기 항원 결합 분자를 회수하는 단계
를 포함하는, 제조 방법.
39. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
40. 약제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 제39항에 따른 약학 조성물.
41. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 제39항에 따른 약학 조성물.
42. 암의 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도.
43. 약학적으로 허용되는 형태인 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 질병을 치료하는 방법.
44. 제43항에 있어서,
질병이 암인, 방법.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
유전자 합성
필요한 경우, 목적하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성하거나 자동 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 진아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르크)에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 가장 근사한 동족체로부터의 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 적절한 조직에서 유래한 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 분리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 인접한 유전자 절편을 표준 클로닝/서열화 벡터 내에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터내에 서브클로닝시키기 위해 적당한 제한효소 부위를 갖는 유전자 절편들을 설계하였다. 모든 구축물들은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계되었다.
세포 배양 기술
표준 세포 배양 기술을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 기술된 바와 같이 이용하였다.
단백질 정제
표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 간략하게, 항체들을 단백질 A 세파로스 컬럼(지이 헬스케어)에 적용하고 PBS로 세척하였다. 항체의 용출을 pH 2.8에서 달성한 후 샘플을 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS 중에서 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200, 지이 헬스케어)에 의해 단량체성 항체들로부터 분리하였다. 단량체성 항체 분획들을 모으고, (필요한 경우) 예를 들어, 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고, 냉동시키고 -20℃ 또는 -80℃에서 저장하였다. 예를 들어, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분석법에 의한 후속 단백질 분석 및 분석적 특징규명을 위해 샘플들의 일부를 제공하였다.
SDS-PAGE
뉴페이지(NuPAGE)(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐 (Invitrogen))을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% 뉴페이지(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 비스-트리스(Bis-TRIS) 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 뉴페이지(등록상표) MES(환원 겔, 뉴페이지(등록상표) 산화방지제 실행 완충액(running buffer) 첨가제 사용) 또는 MOPS(비-환원 겔) 실행 완충액을 사용하였다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피
항체들의 응집 및 올리고머 상태를 측정하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 HPLC 크로마토그래피로 수행하였다. 간략하게, 단백질 A 정제된 항체를 애질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템 상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중에서 토소(Tosoh) TSK겔 G3000SW 컬럼에 적용하거나, 디오넥스 HPLC-시스템상에서 2 x PBS 중에서 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬스케어)에 적용하였다. 용출된 단백질은 UV 흡광도 및 피크 면적 적분에 의해 정량화하였다. 바이오래드 겔 여과 표준물(BioRad Gel Filtration Standard) 151-1901이 표준물로 사용되었다.
질량 분광법
본 섹션은 이의 정확한 조립을 강조하여 VH/VL 교환(VH/VL 크로스맙(CrossMab)을 갖는 다중특이성 항체의 특징규명을 기술한다. 예상된 1차 구조는 탈글리코실화된 온전한 크로스맙 및 탈글리코실화/플라스민 절단되거나 양자택일적으로 탈글리코실화/제한 LysC 절단된 크로스맙의 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
37℃에서 1 mg/mL의 단백질 농도에서 포스페이트 또는 트리스 완충액 중에서 N-글리코시다제 F를 사용하여 17시간 이하 동안 VH/VL 크로스맙을 탈글리코실화시켰다. 플라스민 또는 제한 LysC(로슈(Roche)) 절단은 각각 실온에서 120시간 동안 및 37℃에서 40분 동안, 트리스 완충액 pH 8 중에서 100 μg 탈글리코실화 VH/VL 크로스맙를 사용하여 수행하였다. 질량 분석 전에, 샘플들을 세파덱스 G25 컬럼(지이 헬스케어) 상에서 HPLC에 의해 탈염시켰다. 총 질량은 트라이버사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 광원(애드비온(Advion))이 장착된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달토닉(Bruker Daltonik)) 상에서 ESI-MS에 의해 측정하였다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하는, 각각의 항원에 대한 다중특이적 항체의 결합 및 결합 친화도의 측정(바이아코어(BIACORE))
생성된 항체들의 각각의 항원들에 대한 결합은 바이아코어 기기(지이 헬스케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사하였다. 간략하게, 친화도 측정을 위해 염소-항-인간 IgG, JIR 109-005-098 항체를, 각 항원에 대한 항체를 제공하기 위해 아민 커플링을 통해 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 결합은 25℃(또는 양자택일적으로 37℃)에서 HBS 완충액(HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈 20, pH 7.4)) 중에서 측정하였다. 항원(알앤디 시스템즈(R&D Systems) 또는 사내 정제됨)을 용액 중에서 다양한 농도로 첨가하였다. 결합은 80초부터 3분까지의 항원 주입에 의해 측정하고; 해리는 칩 표면을 HBS 완충액으로 3 내지 10분 동안 세척하여 측정하고, KD 값을 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 평가하였다. 시스템 고유 기준선 드리프트의 보정을 위해서 및 잡음 신호 감소를 위해 음성 대조군 데이터(예를 들어, 완충액 곡선)를 샘플 곡선으로부터 차감하였다. 센서그램의 분석 및 친화도 데이터의 산출을 위해 각각의 바이아코어 평가 소프트웨어를 이용하였다.
실시예 1
1.1 항-PD1 항체의 생성
마우스의 면역화
100 μg 벡터 DNA(플라스미드 15300_hPD1-fl)를 피내 적용한 후, 전기천공(1,000 V/cm, 기간 0.1 ms, 간격 0.125 s의 2회 사각펄스; 이어서 287.5 V/cm, 기간 10 ms, 간격 0.125 s의 4회 사각펄스)에 의해 전장 인간 PD-1을 코딩하는 플라스미드 발현 벡터를 사용하여, NMRI 마우스를 유전적으로 면역화시켰다. 마우스들은 0, 14, 28, 42, 56, 70 및 84일에 6회 연속 면역접종을 받았다. 혈액을 36, 78 및 92일에 채취하고 혈청을 준비하고, 이것을 ELISA(하기 참조)에 의한 역가 측정에 사용하였다. 최고 역가를 갖는 동물들을 96일에 50 μg의 재조합 인간 PD1 인간 Fc 키메라의 정맥내 주사에 의한 추가접종을 위해 선별하고, 추가접종 3일 후에 비장세포를 골수종 세포주에 융합시켜, 하이브리도마 기술에 의해 단일클론 항체를 단리하였다.
혈청 역가의 측정(ELISA)
재조합 PD1 인간 Fc 키메라를 PBS 중 0.3 μg/mL, 100 μL/웰로 96-웰 눈크 맥시소프(NUNC Maxisorp) 플레이트 상에 고정화시킨 후, PBS, 200 μL/웰 중 2% 크로테인 C(Crotein C)로 플레이트를 차단하고; PBS, 100 μL/웰 중 0.5% 크로테인 C 중에서 항혈청의 연속 희석물을 2중으로 적용하고; HRP-접합된 염소 항-마우스 항체(잭슨 임뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)/디아노바(Dianova) 115-036-071; 1/16 000)로 검출하였다. 모든 단계에서, 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 모든 단계들 사이에, 플레이트를 PBS 중 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. BM 블루 POD 기질 용액(로슈) 100 μL/웰을 첨가하여 신호를 발생시키고; 1 M HCl 100 μL/웰을 첨가하여 중단시켰다. 흡광도는 기준으로서 690 nm에 대해 450 nm에서 판독하였다. 역가는 반-최대 신호를 야기하는 항혈청의 희석률로 정의되었다.
1.2 특징규명 항-PD1 항체/인간 PD1에 대한 항-PD1 항체의 결합
hu PD1에 대한 ELISA
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트(MicroCoat) #11974998001)를 25 μL/웰 비오티닐화 PD1-ECD-AviHis로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(인간 항 PD1; 로슈/마우스 항-PD1; 바이오레전드(Biolegend); 카탈로그 번호 329912)를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)/양-항-마우스-POD(지이 헬스케어; NA9310)를 1:2,000/1:1,000 희석 하에 첨가하고, RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 TMB 기질(로슈 카탈로그 번호 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 1 및 2에 요약하여 EC50-값(ng/mL)으로서 열거되어 있다.
PD1에 대한 세포 ELISA
부착성 CHO-K1 세포주를 전장 인간 PD1을 코딩하는 플라스미드 15311_hPD1-fl_pUC_Neo로 안정하게 형질감염시키고, G418(플라스미드 상의 네오마이신 내성 마커)을 사용하여 선별하고 384-웰 평저 플레이트에 0.01x10E6 세포/웰의 농도로 접종하고 밤새 성장시켰다.
다음날, 25 μL/웰의 PD1 샘플 또는 인간 항-PD1(로슈)/마우스 항-PD1(바이오레전드; 카탈로그 번호 329912) 기준 항체를 첨가하고 4℃에서(내재화를 방지하기 위해) 2시간 동안 배양하였다. 조심스럽게 세척(1x90 μL/웰 PBST)한 후, 1xPBS-완충액에 희석된 30 μL/웰 0.05% 글루타르알데하이드(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 G5882, 25%)를 첨가하여 세포를 고정시키고 RT에서 10분 동안 배양하였다. 세척(3x90 μL/웰 PBST)한 후, 검출을 위해 25 μL/웰의 2차 항체: 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)/양-항-마우스-POD(GE NA9310)를 첨가한 다음 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(3x90 μL/웰 PBST) 후에, 25 μL/웰 TMB 기질 용액(로슈 11835033001)을 첨가하고 1.0 내지 2.0의 OD까지 배양하였다. 플레이트를 370/492 nm에서 측정하였다.
세포 ELISA 결과는 하기 표 2에 요약하여 "EC50 CHO-PD1"-값(ng/mL)으로 열거되어 있다.
cyno PD1에 대한 ELISA
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 25 μL/웰 비오티닐화 cyno PD1-ECD-비오틴으로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(인간 항 PD1; 로슈)를 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)를 1:1,000 희석 하에 첨가하고, RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 TMB 기질(로슈, 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 1 및 2에 요약하여 EC50-값(ng/mL)으로서 열거되어 있다.
PD 리간드 1 치환 분석
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 25 μL/웰 비오티닐화 PD1-ECD-AviHis로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(마우스 항-PD1; 바이오레전드; 카탈로그 번호 329912)를 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 PD-L1(재조합 인간 B7-H1/PD-L1 Fc 키메라; 156-B7, 알앤디)을 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)를 1:1,000 희석 하에 첨가하고, RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 TMB 기질(로슈, 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 2에 요약하여 IC50-값(ng/mL)으로서 열거되어 있다.
PD 리간드 2 치환 분석
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 25 μL/웰 비오티닐화 PD1-ECD-AviHis로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(마우스 항 huPD1; 로슈)를 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 PD-L2(재조합 인간 B7-DC/PD-L2 Fc 키메라; 1224-PL-100, 알앤디)를 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)를 1:2,000 희석 하에 첨가하고, RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 TMB 기질(로슈, 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 1에 요약하여 IC50-값(ng/mL)으로서 열거되어 있다.
에피토프 매핑 ELISA/결합 경쟁 분석
눈크 맥시소프 플레이트(눈크c #464718)를 25 μL/웰 포획 항체(염소 항 마우스 IgG; JIR; 115-006-071)로 코팅하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 플레이트를 RT에서 진탕기 상에서 2% BSA 함유 PBS 완충액으로 1시간 동안 차단하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL 마우스 항-PD1 샘플을 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 포획 항체를 RT에서 진탕기 상에서 30 μL/웰 마우스 IgG(JIR; 015-000-003)로 1시간 동안 차단하였다. 동시에 비오티닐화 PD1-ECD-AviHis를 RT에서 진탕기 상에서 제2 샘플 항체와 함께 1시간 동안 예비배양하였다. 분석 플레이트를 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰)한 후에, PD1 항체 혼합물을 분석 플레이트로 옮기고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 스트렙타비딘 POD(로슈, #11089153001)를 1:4,000 희석 하에 첨가하고 RT에서 진탕기 상에서 1시간 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 μL/웰) 후에, 25 μL/웰 TMB 기질(로슈, #11835033001)을 첨가하고 1.5 내지 2.5의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다. 에피토프 군들은 기준 항체에 대한 계층적 군집화(hierarchical clustering)에 의해 정의하였다.
[표 1]
예시적인 PD1 항체의 결합, PD-L1 억제 및 에피토프 영역 군(ELISA)
Figure pct00012
[표 2]
모 마우스 항체 PD1-0103으로부터 유래하는 인간화된 PD1 항체의 생화학- 및 세포-결합(ELISA)
Figure pct00013
인간화된 항-PD1 항체의 바이아코어 특징규명
표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 분석을 이용하여 여러 뮤린 PD1 결합기뿐 아니라 상업적인 인간 PD1 결합 기준 항체 사이의 결합의 동적 파라미터를 측정하였다. 따라서, 항-인간 IgG를 (바이아코어) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링시킴으로써 고정화시켰다. 이어서, 샘플을 포획하고, hu PD1-ECD를 상기 샘플들에 결합시켰다. 센서 칩 표면은 매 분석 주기 후에 재생시켰다. 평형 상수 및 동적 속도 상수들은 최종적으로, 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합화시켜 수득하였다.
약 2000 공명 단위(RU)의 20 μg/mL 항-인간 IgG(지이 헬스케어 #BR-1008-39)를, 지이 헬스케어에서 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 바이아코어 T200에서 CM5 센서칩의 유동 세포 1 및 2(양자택일로: 3 및 4) 상에 커플링시켰다.
샘플 및 실행 완충액은 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3　mM EDTA, 0.05%(v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4)이었다. 유동 세포 온도는 25℃로 설정하였고 샘플 구획 온도는 12℃로 설정하였다. 시스템은 실행 완충액으로 프라이밍되었다.
샘플을 10 nM의 농도로 20초 동안 주입하여 제2 유동 세포에 결합시켰다. 이어서, 완전한 일련의 인간 PD1-ECD 농도(144 nM, 48 nM, 16 nM, 5.33 nM, 1.78 nM, 0.59 nM, 0.20 nM 및 0 nM)를 각 샘플 위로 120초 동안 주입한 후, 30/300초의 해리 시간 및 3 M MgCl2를 사용한 2단계 20초 재생 단계가 이어졌으며, 상기 재생 단계 중 마지막 단계는 실행 완충액으로 "주입후 추가 세척"을 포함하였다.
최종적으로, 이중의 참조 데이터를 바이아코어 T200 평가 소프트웨어(Evaluation Software)를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합화시켰다. 수득된 K D, k a 및 k d 값들은 표 3에 나타냈다.
[표 3]
바이아코어에 의해 측정된 키메라 PD1-0103 및 인간화 PD1-Ab에 대한 동적 속도 상수 및 평형 상수
Figure pct00014
표 3에 나타낸 바와 같이, 키메라 PD1-0103의 인간화 변이체들(제조는 실시예 1.3 참조) 모두 모 항체(키메라 PD1-0103)와 유사한 동적 성질들을 나타낸다.
동력학
CM5 센서 시리즈 S를 바이아코어 4000 시스템에 장착하고 검출 스팟을 제조사의 지시에 따라 유체역학적으로 지정하였다.
다중클론 토끼 IgG 항체 <IgGFCγM>R (잭슨 임뮤노리서치 래버러토리즈 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.))를 10000 Ru에서 유동 세포 1,2,3 및 4 중의 검출 스팟 1 및 5 상에 고정화시켰다. 커플링은 EDC/NHS 화합물을 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 유동 세포들 중 남은 스팟들은 기준의 역할을 하였다. 샘플 완충액은 1 mg/mL 카복시메틸덱스트란이 보충된 시스템 완충액이었다.
한 실시양태에서, 분석은 25℃에서 수행하였다. 또 다른 실시양태에서, 분석은 37℃에서 수행하였다. 50 nM의 각 뮤린 단일클론 항체를 10 μL/분으로 1분 동안 주입시켜 센서 표면 상에 포획시켰다. 이어서, 각각의 항원들을 100 nM, 2x 33 nM, 11 nM, 4　nM, 1 nM 및 시스템 완충액 0 nM의 일련의 농도에서 30 μL/분으로 4분의 결합 단계 시간 동안 주입하였다. 해리는 추가로 4분 동안 모니터하였다. 포획 시스템은 30 μL/분으로 10 mM 글리신(pH 1.5)의 3분 주입을 이용하여 재생시켰다. 관련된 동적 데이터는 바이아코어 평가 소프트웨어를 제조사의 지시에 따라 사용하여 산출하였다.
에피토프 매핑
바이아코어 4000 기기에 바이아코어 CAP 센서를 장착하고 제조사가 권장한 바와 같이 제조하였다. 상기 기기 완충액은 HBS-ET(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% w/v 트윈 20)이었다. 상기 기기는 25℃에서 운전되었다.
모든 샘플을 시스템 완충액에 희석하였다. 35 kDa 비오티닐화 항원 PD1-ECD-AviHis를 200 RU에서 유동 세포 1, 2, 3 및 4 중의 스팟 1 및 5에서 30 μL/분으로 1분 동안 주입시켜 CAP 센서 표면 상에 포획시켰다. 스팟 2, 3 및 4는 기준의 역할을 하였다. 또 다른 실시양태에서, 35 kDa 비오티닐화 항원 PD1-ECD-AviHis를 200 RU에서 동일한 방식으로 CAP 센서 상에 포획시켰다.
이어서, 1차 항체를 100 nM에서 30 μL/분으로 3분 동안 주입한 후 2차 항체를 100 nM에서 30 μL/분으로 3분 동안 주입하였다. 1차 항체는 표면 제시된 항원의 완전한 포화까지 주입하였다. 1차 및 2차 항원 주입 단계의 마지막에, 각 항체들의 결합 반응을 모니터링하기 위해 기록점 "말기 결합"(BL)을 설정하였다. 2차 항체 결합 반응 "BL2"와 1차 항체 반응 "BL1" 사이의 비율인 몰비를 산출하였다. 상기 몰비는, 항원이 이미 1차 항체에 의해 복합체화된 경우, 2차 항체의 항원 접근성의 지표로서 사용되었다.
복합체들은, 2 M 구아니딘-HCL 250 mM NaOH 재생 완충액을 제조사에서 권장한 대로 30 μL/분으로 2분 동안 주입한 후, 시스템 완충액을 30 μL/분으로 1분 동안 주입시켜 센서 표면으로부터 완전히 제거하였다.
1.3 혼합된 림프구 반응(MLR)에서 시토킨 생산에 대한 상이한 항-PD1 항체의 효과
3A) 혼합 림프구 반응(MLR)은 한 개체(공여체 X)로부터 또 다른 개체(공여체 Y)의 림프구까지 림프구의 활성화를 측정하는 면역 세포 분석법이다. 혼합 림프구 반응을 이용하여 림프구 효과기 세포에 대한 PD1 경로 차단의 효과를 입증하였다. 분석에서는 T 세포를 항-PD1 mAb의 존재 또는 부재 하에서 활성화 및 그의 IFN-감마 분비에 대해 검사하였다.
동종이계 MLR을 수행하기 위해, 미지의 HLA 유형을 갖는, 적어도 4명의 건강한 공여체들로부터의 말초혈 단핵 세포(PBMC)를, 류코셉(Leukosep)(그레이너 바이오 원(Greiner Bio One), 227 288)을 이용한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 간략하게, 헤파린첨가 혈액 샘플을 3배 부피의 PBS로 희석하고, 희석된 혈액 25 mL 분취량을 50 mL 류코셉 튜브에 적층시켰다. 실온에서 800 x g에서 15분 동안 원심분리(휴지 없이) 후에, 림프구 함유 분획들을 수거하고, PBS에 세척하고, 기능 분석에 직접 사용하거나 냉동 매질(10% DMSO, 90% FCS)에 1.0E+07 세포/mL로 재현탁하고 액체 질소 중에 저장하였다. 2명의 상이한 공여체들로부터의 PBMC를 1:1 자극자/반응자 세포 비로 혼합함으로써 개별적인 2-방향 MLR 반응을 촉발시키고, 상이한 농도 범위의, 정제된 항-PD1 단일클론 항체들 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103의 존재 또는 부재 하에, 37℃, 5% CO2에서 평저 96-웰 플레이트에서 적어도 2중으로 공-배양을 6일 동안 수행하였다. 기준 항-PD1 항체로서, 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 또는 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하였다. 음성 대조군으로서 항체를 사용하지 않거나 이소타입 대조군 항체를 사용하였으며, rec hu IL-2(20 EU/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다. 6일 후에, 사이토카인 측정을 위해 각 배양물로부터 100 μL의 매질을 취하였다. IFN-감마의 수준은 OptEIA ELISA 키트(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 측정하였다.
결과는 표 4(IFN-g 분비/방출)에 나타냈다. 항-PD1 단일클론 항체는 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 농도 의존성 방식으로 촉진하였다. IFNg 분비의 % 증가율의 값은, 어떤 차단 mAb도 첨가하지 않고(E-c로서 기저 동종이계 자극 유도된 IFNg 값) MLR의 IFN-g 생성에 대해서, 및 20 EU/mL rec hu IL-2의 첨가 하에(양성 대조군 = E+c로서 100% IFNg 값) MLR의 IFN-g 생성에 대해 산출하였으며, 식: 상대 자극[%] = ((E샘플 - E-c)/(E+c - E-c)*100에 따라 산출하였다.
[표 4]
양성 대조군으로서 재조합 인간 IL-2 처리(20 EU/mL)(= 100% 증가)의 효과와 비교시 동종이계 자극 및 항-PD-1 항체로 처리후 IFN 감마 분비의 백분율
Figure pct00015
여러 PD1 차단 항체들 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103은 인터페론 감마(IFN-g)의 분비를 증대시킴으로써 강한 면역 조절 활성을 나타냈다(모든 항체들에 대해 데이터 나타내지 않음).
3B) 또 다른 실험에서, 키메라 PD1-0103(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스)를 갖는 인간 IgG1 이소타입)을 평가하였다. 키메라 PD1-0103에 의한 PD1의 차단은 동종이계 자극 1차 인간 T 세포에 의한 IFN-감마 분비를 크게 증대시킨다. 키메라 PD1-0103은 기준 항-PD1 항체들보다 더 효능이 강하다(도 1 참조).
비교를 위해, 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 및 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 기준 항-PD1 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하고 사용하였다.
3C) 추가 실험에서, 항-PD-1 항체 PD1-0103의 인간화 변이체들(도 2 및 3에서 인간화 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0314)의 면역 조절 활성, a) IFN 방출(분비), b) TNF-알파 방출(분비)을 전술한 바와 같이 MLR에서 평가하였다. 키메라 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변이체들의 효과를, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 및 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 기준 항-PD1 항체와 비교하였다. MLR 배양 6일 후에, 50 μL의 상청액을 취하고 바이오-플렉스 프로(Bio-Plex Pro: 상표) 인간 사이토카인 Th1/Th2 분석법(바이오-래드 래버러토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories Inc.))을 이용하여 여러 사이토카인들을 단일 배양물 중에서 측정하였다(모든 사이토카인에 대해 데이터 나타내지 않음).
키메라 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변이체들(PD1-0103_0312 및 PD1-0103_0314)은 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 증대시키는데 있어서, 기준 항-PD1 항체들에 비해 더 효능이 강하였다(도 2 참조).
또한, 키메라 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변이체들은 항원 제시 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파)(도 3 참조) 및 IL-12(데이터 나타내지 않음) 분비를 증가시키고, T 세포를 자극하는 단핵구/대식세포 또는 항원 제시 세포의 능력을 증대시킨다.
1.4 동종이계 성숙 수지상 세포와 함께 배양된 인간 CD4 T 세포에 의한 세포독성 그란자임 B 방출 및 IFN-γ 분비에 대한 항-PD1 봉쇄의 효과
동종이계 배경에서 항-PD-1 처리의 효과를 더 조사하기 위해, 새로 정제된 CD4 T 세포를 단핵구-유래 동종이계 성숙 수지상 세포(mDC)의 존재 하에서 5일 동안 공배양시키는 분석법을 개발하였다. 1주 전에 플라스틱 부착을 통해 새 PBMC로부터 단핵구를 단리한 후, 비-부착 세포를 제거하였다. 이어서, 이들을 GM-CSF(50 ng/mL) 및 IL-4(100 ng/mL)를 함유하는 매질 중에서 5일 동안 배양하여 단핵구들로부터 미성숙 DC를 생성하였다. iDC 성숙화를 유도하기 위해, 배양 매질에 TNF-알파, IL-1베타 및 IL-6 (각각 50 ng/mL)을 추가 2일 동안 첨가하였다. 이어서, 유세포분석(LSR포르테사(LSRFortessa), 비디 바이오사이언시즈)을 통해 주조직적합성 복합체 클래스 II(MHCII), CD80, CD83 및 CD86의 표면 발현을 측정함으로써 DC 성숙화를 평가하였다.
최소 혼합 림프구 반응(mMLR) 당일에, 비관련 공여체로부터 수득된 108개 PBMC로부터 마이크로비드 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 통해 CD4 T 세포를 농축시켰다. 배양 전에, CD4 T 세포를 5 μM의 카복시-플루오레세인-숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지하였다. 이어서, 105개 CD4 T 세포를, 도면에서 달리 나타내지 않는 한, 10 μg/mL의 농도에서, 차단 항-PD1 항체(PD1-0103, 키메라 PD1-0103, 또는 도 4A 및 4B에서 0312, 0313, 0314, 0315로 약칭되어 있는 인간화 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315)의 존재 또는 부재 하에, 성숙 동종이계-DC와 함께(5:1) 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다.
5일 후에, 세포-배양 상청액을 수거하고, 나중에 ELISA(알앤디 시스템즈)에 의해 IFN-감마 수준을 측정하기 위해 사용하고, 세포를 37℃에서 골지 플러그( Golgi Plug)(브레펠딘(Brefeldin) A) 및 골지 스탑(Golgi Stop)(모넨신(Monensin))의 존재 하에서 5시간 동안 더 방치하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 표면 상에서 항-인간 CD4 항체 및 생존/사멸(Live/Dead) 정착성 염료 아쿠아(Aqua)(인비트로겐(Invitrogen))로 염색한 후에 픽스/펌(Fix/Perm) 완충액(비디 바이오사이언시즈)으로 고정/투과시켰다. 그랜자임 B(비디 바이오사이언시즈), IFN-감마 및 IL-2(둘 다 이바이오사이언스(eBioscience)로부터)에 대한 세포내 염색을 수행하였다.
상이한 농도의 PD1-0103의 인간화 변이체들(도면에서 0312, 0313, 0314, 0315로 약칭되어 있는 인간화 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, 또한 하기 실시예 6 참조)을 또한 검사하고, 이들이 그랜자임 B 및 인터페론 감마를 증대시키는데 있어서 동일하게 우수함을 밝혀냈다. DP47은 Fc감마R에 의한 인식을 방지하기 위해 Fc 부분에 LALA 돌연변이를 갖는 비결합 인간 IgG이며, 음성 대조군으로 사용되었다. 결과는 도 4A 및 4B에 도시된다.
1.5 키메라 항체 유도체
항-PD1 마우스 항체 PD1-0098, PD1-0103의 가변 중쇄 및 경쇄 영역들을 PCR을 통해 증폭시키고, 이들을, 효과기 기능을 제거하는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스)(류신 234가 알라닌으로, 류신 235가 알라닌으로, 프롤린 329가 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3과의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터 내에 클로닝시키고 인간 C-카파에 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터 내에 클로닝시켜 키메라 PD1 항체들을 생성하였다. 이어서, LC 및 HC 플라스미드를 HEK293에 동시형질감염시키고, 7일 후에 항체 정제에 대한 표준 방법으로 상청액으로부터 정제하였다. 상기 키메라 PD1-항체들은 키메라 chiPD1-0098 (chiPD1-0098) 및 키메라 PD1-0103(chiPD1-0103)으로 다시 명명하였다. 비교를 위해, 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 및 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 기준 항-PD1 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하고 사용하였다.
1.6 항-PD1 항체 PD-0103의 인간화된 변이체(huMab PD-0103)의 생성, 발현 및 정제, 및 특징규명
뮤린 항-PD1 항체 0103의 VH 및 VL 도메인의 인간화
뮤린 항-PD1 항체 0103의 뮤린 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 43 및 44)을 기반으로, 인간화 항-항-PD1 항체 변이체들을 생성하였다.
인간화 VH-변이체는 여러개의 돌연변이를 갖는 인간 J-요소 생식계열 IGHJ5-01과 함께 인간 생식계열 IMGT_hVH_3_23을 기반으로 한다(서열번호 45 생성).
VL의 인간화 변이체는 인간 J-요소 생식계열 IGKJ1-01과 함께 인간 생식계열 IMGT_hVK_4_1, IMGT_hVK_2_30, IMGT_hVK_3_11 및 IMGT_hVK_1_39를 기반으로 한다. 상이한 돌연변이들에 의해 서열번호 46 내지 서열번호 49의 인간화 변이체들이 생성되었다.
PD1-0103의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들에 대한 인간화 아미노산 서열들을 DNA로 역-번역하고, 생성된 cDNA를 합성(젠아트(GenArt))한 다음, 효과기 기능을 제거하는 LALA 및 PG 돌연변이(류신 234가 알라닌으로, 류신 235가 알라닌으로, 프롤린 329가 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3과의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터 내에 클로닝시키거나 인간 C-카파에 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터 내에 클로닝시켰다. 이어서, LC 및 HC 플라스미드를 HEK293에 동시형질감염시키고, 7일 후에 항체 정제에 대한 표준 방법으로 상청액으로부터 정제하였다. 생성된 인간화 PD1-항체들은 다음과 같이 명명하였다:
[표 5]
PD1-0103의 인간화 변이체 항체들의 VH 및 VL 서열
Figure pct00016
[표 6]
PD1-0103의 인간화된 변이체 항체의 HVR 서열
Figure pct00017
인간화 PD1-0103 항체 변이체 및 모 키메라 PD1-0103을 전술한 바와 같이 특징규명하였다. 결과는 표 7에 나타냈다.
[표 7]
인간화된 PD1-0103 항체 변이체 및 모 키메라 PD1-0103에 대한 결과의 요약
Figure pct00018
1.7 PD1 항체의 중화 효능
시험관내에서 억제된 T 세포 반응의 복구를 모방하는데 있어서 사내 제조된 PD-1 항체의 중화 효능을 검사하기 위해, 상업적으로 시판하는 PD1/PD-L1 리포터 분석법(프로메가(Promega))을 이용하였다. 상기 시스템은 PD1+ NFAT Jurkat 세포, 및 또한 활성화 신호를 제공하는 PD-L1+ CHO 상대물로 이루어진다. 원칙적으로, 리포터 시스템은 3 단계를 기반으로 한다: (1) TCR-매개 NFAT 활성화, (2) PD-1/PD-L1 축에 의한 활성화시 NFAT 신호의 억제, 및 (3) PD-1 차단 항체에 의한 NFAT 신호의 회복.
재료 및 방법:
- PD-L1 매질: PAN 바이오테크(PAN Biotech)(#P04-03609); FBS(10%) 및 L-Gln(4 mM)
- 분석 매질: RPMI 1640(#31870; 인비트로겐), 25 mM HEPES, 2 mM L-Gln, FBS(2%)
- 상기 분석에 사용된 세포(둘 다 프로메가에서 구매된 세포 유형):
PD-L1+ CHO 세포(배치 번호 #139147): 2-3x104 세포/96 웰
PD-1+ NFAT Jurkat 세포(배치 번호 #133024): 3.5x104 세포/웰.
1일에, PD-L1+ 세포를 해동하고, 상기 언급된 매질에 지시된 세포 농도로 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 매질을 제거하고 PD-L1+ 세포를 제조된 항체들과 함께 지시된 농도에서 (분석 매질 중에서) 배양하였다. 동시에, PD-1+ NFAT Jurkat 세포를 해동하고, 상기 언급된 세포 수를 PD-L1+ 세포로 옮기고 상기 세포와 공-배양하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 배양한 후, 바이오-글로(Bio-Glo) 기질을 실온으로 가온시켰다(첨가 1 내지 2시간 전에). 세포 배양 플레이트를 배양기에서 꺼내어 실온으로 조정한 후(10분) 웰 당 80 μL 바이오-글로 용액을 첨가하고, 5 내지 10분 동안 배양한 후, 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 판독기에서 키트 제조사의 권장사항에 따라서 발광을 측정하였다. 결과는 도 5A 및 5B에서 볼 수 있으며, 상기 도면들에는 TCR 자극시 상이한 PD-1 항체들에 의한 NFAT 신호의 PD-1/PD-L1 매개된 억제의 복구가 나타나 있다: 도 5A: 키메라 PD1_0103은 기준 항체와 비교시 재현가능하게 우수한 효과를 나타냈다. 기준항체로서 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항-PD1 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하였다. 도 5B: PD1_0103의 4개 인간화 변이체들은 리드(lead) 항체와 유사한 시험관내 효능을 나타내었으며, 또한 기준 항체보다 약간 더 우수하였다.
실시예 2
PD1-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인(아미노산 71 내지 254 및 71 내지 248)의 부분을 코딩하는 DNA 서열의 상이한 단편을 유니프롯 데이터베이스의 P41273 서열(서열번호 103)에 따라 합성하였다.
2.1 하전된 잔사를 갖는 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 PD1(0314) 표적화된 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구축물 7.1)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 6A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL.
4-1BB 리간드(71-254)의 1개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 6B에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
정확한 쌍형성을 개선하기 위하여, 하기 돌연변이를 교차된 CH-CL에 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에서, 돌연변이 E123R 및 Q124K를 도입하였다. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에서, 돌연변이 K147E 및 K213E를 국제 특허공개공보 제2015/150447호에 기술된 바와 같이 인간 CH1 도메인 내로 클로닝시켰다.
PD1, 클론 0314(또는 0103-0314)에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. PD1 결합기의 생성 및 제조는 실시예 1에 기술되어 있다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
모든 구축물들에 있어서, 놉 쇄에 S354C/T366W 돌연변이 및 홀 쇄에 상응하는 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이와 함께 놉-인투-홀 이종이량체화 기술을 사용하였다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체성 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화된 항-PD1-Fc 홀 쇄, 및 항-PD1 경쇄를 함유하는 조합은 이종이량체의 생성을 가능하게 하고, 이는 어셈블링된 삼량체성 4-1BB 리간드 및 PD1 결합 Fab를 포함한다(도 7, 구축물 7.1).
표 8은 CH1-CL 교차 및 하전된 잔사를 함유하는 1가 PD1(0314)-인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다(구축물 7.1).
[표 8]
1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-254)-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.1의 서열
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
2.2 하전된 잔사가 없는 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 PD1(0314) 표적화된 4- 1BB 리간드(71-254) 삼량체 -함유 Fc ( kih ) 융합 항원 결합 분자의 제조(구축물 7.2)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 6C에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 CL.
4-1BB 리간드(71-254)의 1개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 6D에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 CH1.
PD1, 클론 0103-0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임에 서브클로닝하였다.
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제하였다(국제 특허공개공보 제2012/130831호).
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀 쇄 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 7, 구축물 7.2).
표 9는 하전된 잔기 없이 CH1-CL 교차를 함유하는 1가 항-PD1(0314) 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구축물 7.2)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 9]
1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-254)-함유 Fc(kih) 융합 분자의 서열(구축물 7.2)
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
2.3 각각의 중쇄의 C-말단에서 융합된 이량체성 및 단량체성 4- 1BB 리간드를 갖는 2가 PD1(0314) 표적화 4- 1BB 리간드(71-254) 삼량체 -함유 Fc ( kih ) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 7.3)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 6E에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 6F에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
PD1, 클론 0103-0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉, 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-FAP huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-FAP huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄, 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 PD1 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 7, 구축물 7.3).
표 10은 2가 PD1(0314)-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.3(각각 중쇄의 C-말단에서 융합된 2개의 항-PD1 Fab, 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 PD1 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 10]
2가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-254)-함유 Fc(kih) 융합 분자의 서열(구축물 7.3)
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
2.4 하전된 잔사를 갖는 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 PD1(0314) 표적화된 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구축물 7.4)
(G4S)2 연결기에 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 8A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 8B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 CH1.
정확한 쌍형성을 개선하기 위하여, 하기 돌연변이를 교차된 CH-CL에 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에서, 돌연변이 E123R 및 Q124K를 도입하였다. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에서, 돌연변이 K147E 및 K213E를 국제 특허공개공보 제2015/150447호에 기술된 바와 같이 인간 CH1 도메인 내로 클로닝시켰다.
PD1, 클론 0103-0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임에서 서브클로닝하였다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체성 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화된 항-PD1(0314)-Fc 홀 쇄, 및 항-PD1(0314) 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 가능하게 하고, 이는 어셈블링된 삼량체성 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함한다(도 7, 구축물 7.4).
표 11은 하전된 잔사를 갖는 CH1-CL 교차를 함유하는 1가 PD1(0314)-인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다(구축물 7.4).
[표 11]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)(구축물 7.4)의 서열
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
2.5 하전된 잔사가 없는 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 PD1(0314) 표적화된 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구축물 7.5)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고, 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 8C에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 8D에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 CH.
PD1, 클론 0103-0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임에 서브클로닝하였다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉 쇄, 단량체성 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화된 항-PD1 Fc 홀 쇄, 및 항-PD1 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 가능하게 하고, 이는 어셈블링된 삼량체성 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함한다(도 7, 구축물 7.5).
표 12는 하전된 잔사가 없는 CH1-CL 교차를 함유하는 1가 PD1(0314)-인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다(구축물 7.5).
[표 12]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)의 서열(구축물 7.5)
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
2.6 각각의 중쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 2가 PD1(0314) 표적화된 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구축물 7.6)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 8E에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합하였다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된 폴리펩티드는 도 8F에 기술된 바와 같다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드.
PD1, 클론 0103-0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉, 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임에 서브클로닝하였다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-PD1 huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-PD1 huIgG1 놉 이량체성 리간드 쇄, 및 항-PD1 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 가능하게 하고, 이는 어셈블링된 삼량체성 4-1BB 리간드 및 2개의 PD1 결합 Fab를 포함한다(도 7, 구축물 7.6).
표 13은 2가 PD1(0314)-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.6(2개의 항-PD1 Fab를 갖는 PD1 분할된 삼량체, 각각의 중쇄의 C-말단에서 각각 융합된 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 13]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 2가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)의 서열(구축물 7.6)
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
2.7 각각의 중쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 1가 PD1(0314) 표적화된 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(놉 쇄 상의 항-PD1, 구축물 7.11 및 7.12)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 9A에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀 또는 놉 쇄의 C-말단으로 프레임에서 서브클로닝하였다: 인간 IgG1 Fc, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드의 1개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 9B에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉 또는 홀 쇄의 C-말단으로 프레임에서 서브클로닝하였다: 인간 IgG1 Fc, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드.
PD1, 클론 0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 놉의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄로 프레임에서 서브클로닝하였다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 huIgG1 홀 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-PD1 huIgG1 놉 쇄, 및 항-PD1 경쇄의 조합은 이종이량체의 생성을 가능하게 하고, 이는 어셈블링된 삼량체성 4-1BB 리간드 및 1개의 PD1 결합 Fab를 포함한다(도 9C 및 9D, 구축물 7.11 및 7.12).
표 14는 1가 PD1(0314)-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.11(1개의 항-PD1 Fab를 갖는 PD1 분할된 삼량체, Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드, 및 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 14]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)의 서열(구축물 7.11)
Figure pct00037
Figure pct00038
표 15는 1가 PD1(0314)-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.12(1개의 항-PD1 Fab를 갖는 PD1 분할된 삼량체, Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드, 및 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 15]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)의 서열(구축물 7.12)
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
2.8 각각의 중쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 1가 PD1(0314) 표적화된 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(홀 쇄 상의 항-PD1, 구축물 7.13 및 7.14)
(G4S)2 연결기에 의해 분리된 4-1BB 리간드의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 9A에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀 또는 놉 쇄의 C-말단으로 프레임에서 서브클로닝하였다: 인간 IgG1 Fc, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드의 1개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 9B에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉 또는 홀 쇄의 C-말단으로 프레임에서 서브클로닝하였다: 인간 IgG1 Fc, (G4S)2 연결기, 인간 4-1BB 리간드.
PD1, 클론 0314에 특이적인 결합기를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임에서 서브클로닝하였다.
국제 특허공개공보 제2012/130831호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 huIgG1 놉 쇄, 및 항-PD1 경쇄를 함유하는 조합은 이종이량체의 생성을 가능하게 하고, 이는 어셈블링된 삼량체성 4-1BB 리간드 및 1개의 PD1 결합 Fab를 포함한다(도 10A 및 10B, 구축물 7.13 및 7.14).
표 16은 1가 PD1(0314)-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.13(1개의 항-PD1 Fab를 갖는 PD1 분할된 삼량체, Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드, 및 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 16]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)의 서열(구축물 7.13)
Figure pct00042
Figure pct00043
표 17은 1가 PD1(0314)-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구축물 7.14(1개의 항-PD1 Fab를 갖는 PD1 분할된 삼량체, Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드, 및 Fc 홀 쇄의 C-말단에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 17]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 1가 PD1(0314)-표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-248)의 서열(구축물 7.14)
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
2.9 비표적화된 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조(대조군 분자)
항-PD1 결합기(VH 및 VL)가 항원에 결합하지 않는 생식계열 대조군(DP47로 지칭됨)으로 대체된 것만을 제외하고는, PD1-표적화된 항원 결합 분자에 대해 상기 기술된 바와 같이 대조군 분자를 제조하였다.
대조군 B는 하전된 잔사를 갖는 CH-CL 교차를 함유하는 비표적화된 1가 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 항원 결합 분자(도 11A)이다. 이것은 구축물 7.1과 상응하지만, PD1 결합기의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역은 생식계열 대조군(DP47)의 가변 영역으로 대체되었고, 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임에서 서브클로닝되었다.
항-PD1 결합기(VH 및 VL)를 항원에 결합하지 않는, DP47로 지칭된 생식계열 대조군으로 대체한 것을 제외하고는, 2가 변이체 대조군 C(도 11B)를 변이체 구축물 7.3 및 7.6과 유사하게 제조하고, 1가 변이체 대조군 D(도 11C)를 구축물 7.3(4-1BB 리간드(71-248) 삼량체 함유)과 유사하게 제조하였다.
표 18은 4-1BB 리간드 함유 아암(arm) 중에 하전된 잔사를 갖는 CH1-CL 교차를 갖는 DP47-비표적화된 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(대조군 B)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 18]
DP47 비표적화된 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 서열(DP47 분할된 4-1BBL 삼량체)(대조군 B)
Figure pct00047
Figure pct00048
표 19는 2가 DP47-비표적화된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 분자(대조군 C)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 19]
Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 2가 DP47-비표적화된 인간 4-1BB 리간드(71-254)의 서열(대조군 C)
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
표 20은 하전된 잔사를 갖는 CH-CL 교차를 함유하는 1가 DP47-비표적화된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합(대조군 D)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 20]
하전된 잔사를 갖는 CH-CL 교차를 갖는 1가 DP47 비표적화된 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합의 cDNA 및 아미노산 서열(대조군 D)(* 하전된 잔사)
Figure pct00052
2.10 대조군으로서 인간 IgG1 항원 결합 분자의 제조
분석에 사용된 추가의 대조군 분자(대조군 F)는, 국제 특허공개공보 제12/130831호에 기술된 방법에 따라 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시키기 위해 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 함유하는 비표적화 DP47, 생식계열 대조군 인간 IgG1이었다.
표 21은 비표적화 DP47 huIgG1 PGLALA(대조군 F)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 21]
비표적화 DP47 huIgG1 PGLALA(대조군 F)의 서열
Figure pct00053
표 22는 항-PD1 huIgG1 PGLALA(클론 0314)(즉, 대조군 M)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 22]
항-PD1(0314) huIgG1 PGLALA의 cDNA 및 아미노산 서열(대조군 M)
Figure pct00054
Figure pct00055
실시예 3
1가 및 2가 항-PD1 표적화된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 및 대조군 분자의 생산 및 정제
표적화 및 비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 분자 코딩 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 분자를 생성하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 구축물 7.1, 7.2, 7.4, 7.6 및 상응하는 대조군 분자 대조군 B 및 D의 경우, 1:1:1:1 비("벡터 Fc 홀 쇄":"벡터 PD1 경쇄":"벡터 Fc 놉 쇄":"벡터 4-1BBL 경쇄")를 이용하였다. 구축물 7.3, 7.6, 7.11, 7.12, 7.13, 7.14 및 대조군 C의 경우, 1:1:1 비("벡터Fc 홀 쇄":"벡터 Fc 놉 쇄":"벡터 항-PD1 경쇄")를 취하였다. 분석에서 대조군으로 사용된 인간 IgG는 이중특이성 구축물들의 경우에서와 같이 생성하였다(형질감염의 경우에만 경쇄용 벡터 및 중쇄용 벡터를 1:1로 사용하였다).
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 30억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 20 mL의 예열된 CD CHO 매질로 대체하였다. 발현 벡터(200 μg의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 매질에 혼합하였다. 540 μL의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 이어서, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기 하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이 및 1.2 mM 발프로산이 보충된 160 mL의 엑셀 매질을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에 12% 피드 7 및 글루코스(최종 농도 3 g/L)를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 상청액을 적어도 400 x g에서 30 내지 40분 동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 분비된 단백질을 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상청액을 인산나트륨(20 mM), 시트르산나트륨(20 mM) 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어 컬럼(CV = 5 내지 15 mL, 지이 헬스케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신 완충액(pH 2.5)으로 선형 구배(20 CV) 또는 단계 용출(8 CV)을 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 추가의 4개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산나트륨 pH 8.0을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시킨 다음, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈20 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬스케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 표적화 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 순도 및 분자량은, 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재 하에서 SDS-PAGE, 및 쿠마시 심플블루(상표) 세이프스테인(인비트로겐 USA)을 사용한 염색, 또는 캘리퍼 랩칩 GXII(퍼킨 엘머)를 사용한 CE-SDS에 의해 분석하였다. 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 %(w/v) NaN3, pH 6.7 실행 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 23은 FAP(4B9) 표적화 및 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 및 대조군 분자의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
[표 23]
PD1 표적화 및 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 및 대조군 분자의 생화학적 분석
Figure pct00056
실시예 4
표면 플라즈몬 공명에 의한 PD1-표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자의 동시 결합
4.1 표면 플라즈몬 공명을 위한 항원의 제조, 정제 및 특징규명
4-1BB Fc(kih) 융합 분자의 제조
인간 4-1BB(Q07011에 따른 인간 4-1BB의 아미노산 24 내지 186, 서열번호 163)를, 놉 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. AcTEV 프로테아제 절단 부위를 항원 엑토도메인과 인간 IgG1의 Fc 사이에 도입하였다. 유도된 비오티닐화에 대한 Avi 태그를 항원 Fc-놉의 C-말단에 도입하였다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항원-Fc 놉 쇄와 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 Fc 홀 쇄의 조합은 4-1BB 엑토도메인 함유 쇄의 단일 카피를 포함하므로, 단량체 형태의 Fc-결합된 항원을 생성한다. 표 24는 항원 Fc-융합 구축물의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 24]
단량체성 항원 Fc(kih) 융합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열
Figure pct00057
Figure pct00058
모든 4-1BB-Fc 융합 분자 코딩 서열들을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
비오티닐화 단량체성 항원/Fc 융합 분자의 제조를 위해, 지수적으로 성장하는 현탁 HEK293-EBNA 세포를, 융합 단백질의 2개 성분(놉 및 홀 쇄)뿐 아니라 비오티닐화 반응에 필수적인 효소인 BirA를 코딩하는 3개의 벡터로 동시-형질감염시켰다. 상응하는 벡터들은 2:1:0.05 비("항원 ECD-AcTEV-Fc 놉":"Fc 홀":"BirA")로 사용하였다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 40억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 예열된 CD CHO 매질로 대체하였다. 발현 벡터를 200 μg의 벡터 DNA를 함유하는 20 mL의 CD CHO 매질에 재현탁하였다. 540 μL의 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 이어서, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기 하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 매질을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 보충제와 함께 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 배양물에 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상청액을 210 g에서 15분 동안 스핀다운시켜 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을, 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상청액을 40 mL의 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산나트륨(pH 7.5)으로 평형화된 하이트랩(HiTrap) 단백질A HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬스케어) 상에 부하시켰다. 적어도 10개 컬럼 부피의 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산나트륨, 0.5 M 염화나트륨 함유 완충액(pH 7.5)으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20개 컬럼 부피의 20 mM 시트르산나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20, pH 3.0 상에서 생성된 염화나트륨의 선형 pH-구배(0으로부터 500 mM까지)를 사용하여 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 10개 컬럼 부피의 20 mM 시트르산나트륨, 500 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20, pH 3.0으로 세척하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/40(v/v)의 2 M 트리스, pH 8.0을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과한 다음, pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬스케어) 상에 부하시켰다.
인간 수용체에 대한 친화도 측정을 위해, 인간 4-1BB의 엑토도메인을 또한 avi(GLNDIFEAQKIEWHE, 서열번호 168) 및 헥사히스티딘 태그를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
단백질 생성은 Fc-융합 단백질에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 분비된 단백질은 킬레이트화 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 1차 크로마토그래피 단계는 20 mM 인산나트륨, 500 nM 염화나트륨, pH 7.4에서 평형화된 NiNTA 슈퍼플로우 카트리지(Superflow Cartridge)(5 mL, 키아겐(Qiagen)) 상에서 수행하였다. 용출은, 5%로부터 45%까지의 용출 완충액(20 mM 인산나트륨, 500 nM 염화나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)의 12개 컬럼 부피에 걸친 구배를 적용함으로써 수행하였다. 단백질을 농축하고 여과한 다음, pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 75 컬럼(지이 헬스케어) 상에 부하시켰다(표 25).
[표 25]
단량체성 인간 4-IBB His 분자의 서열
Figure pct00059
인간 PD1 Fc 융합 항원을 알앤디 시스템즈(카탈로그 번호 1086-PD-050)에서 구입하였다.
4.2 표면 플라즈면 공명에 의한 표적화된 C-말단 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자의 동시 결합의 측정
인간 4-1BB Fc(kih) 및 인간 PD1에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을 바이아코어 T200 상에서 25℃에서 실행 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 서팩턴트 P20, 바이아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 수행하였다.
비오티닐화된 인간 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 200 공명 단위(RU) 이하의 부동태화 수준을 사용하였다. 표적화된 삼량체성 C-말단 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 분자는 90초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 μL/분의 유량으로 200 nM의 농도 범위에서 통과시키고, 해리를 0초로 설정하였다. 인간 PD1-Fc(알앤디 시스템즈)를 500 nM의 농도에서 90초에 걸쳐 유동 세포를 통해 30 μL/분의 유량으로 제2 분석물로서 주입하였다(도 12A). 해리를 120초 동안 모니터링하여다. 벌크 굴절률 차이를 어떠한 단백질도 부동태화되지 않은 참고 유동 세포에서 수득된 응답을 차감함으로써 교정하였다. 모든 이중특이적 구축물은 인간 4-1BB 및 인간 PD1에 동시에 결합할 수 있다(도 12B, 12C, 12D 및 12E).
실시예 5
PD1 표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능적 특징규명
5.1. PD1 표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 새로운 활성화된 인간 PMBC 상의 결합
취리히 헌혈 센터에서 백혈구연층을 수득하였다. 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 백혈구연층을 동일 부피의 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스(Gibco by Life Technologies), 카탈로그 번호 14190 326)로 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91050)에 15 mL 히스토파크(Histopaque) 1077(시그마 라이프 사이언스(SIGMA Life Science), 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 디아트리조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 보충하고, 희석된 백혈구연층 내용물을 히스토파크 1077 위에 적층시켰다. 상기 관들을 450 x g에서 30분 동안 원심분리하였다. 이어서, PBMC를 계면으로부터 수거하고, DPBS로 3회 세척하고, 10% 태아 소 혈청(FBS, US-유래, PAN 바이오텍, P30-2009, 로트 P150307GI, 감마선-조사되고, 마이코플라스마가 없고 56℃에서 35분 동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스(GlutaMAX)-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨 피루바트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)이 보충된 RPMI 1640 매질(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 매질에 재현탁하였다.
PBMC를 단리 직후에 사용하거나(새로운 인간 PBMC 상의 결합), T 세포의 세포 표면 상의 4-1BB 발현을 유도하도록 자극하였다(활성화된 인간 PBMC 상의 결합). 인간 T 세포 상의 4-1BB 상향조절을 유도하기 위하여, PBMC를 10% 태아 소 혈청(FBS, US-유래, PAN 바이오텍, P30-2009, 로트 P150307GI, 감마 조사됨, 마이코플라즈마 부재, 열 불활성화된 35분 56℃), 1% 글루타맥스(GlutaMAX)-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050-038), 200 U/mL 프로류킨(Proleukin)(노바티스 파마 슈바이츠 아게(Novartis Pharma Schweiz AG), CHCLB-P-476-700-10340, 로트 AA4493BAL) 및 2 μg/mL PHA-L(시그마, 카탈로그 번호 L2769)가 1x106 세포/mL의 농도로 보충된 RPMI 1640(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 42401-042)에서 3일 동안 배양하였다. 3일 후, 사전-활성화된 인간 PBMC를 수확하고, 10% FBS, 1 mM 나트륨-피루바트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1% 글루타맥스-I, 1% MEM-비 필수 아미노산 용액(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 mM 베타-머캅토에탄올(시그마 M3148)이 공급된 RPMI 1640에서 1x106 세포/mL의 최종 농도까지 재현탁하였다. 이어서, 10 μg/mL 항-인간 CD3(클론 OKT3, 마우스 IgG2a, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317315) 및 2 μg/mL 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 마우스 IgG1, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302923)로 4℃에서 밤새 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트(TTP, 카탈로그 번호 92006)에 세포를 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 2일 동안 추가로 항온처리하였다.
결합 분석을 위하여, 0.1x106의 새로운 활성화된 PBMC를 환저 현탁액 세포 96-웰 플레이트(그라이너 바이오-온, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트르 4℃에서 5분 동안 350 x g로 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 1:5,000 희석된 고정성 생존력 염료 eF660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 100 μL/웰 DPBS 중에서 어둠 속에서 4℃에서 30분 동안 세포를 염색하였다. 세포를 200 μL 빙랭 DPBS 완충액으로 1회 세척하였다. 이어서, 적정된 농도의 구축물 7.1, 구축물 7.3, 구축물 7.5 및 구축물 7.6을 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 차가운 FACS 완충액(2% FBS, 5 mM EDTA pH8(암레스코(Amresco), 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 S2002)가 공급된 DPBS), 및 대조군인 대조군 B, 대조군 C, 대조군 D, 대조군 M 및 대조군 F를 첨가하고, 세포를 4℃에서 60분 동안 항온처리하고, 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 3회 세척하였다. 0.67 mg/mL 항-인간 CD45-AF488(클론 HI30, 마우스 igG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 304019), 0.33 mg/mL 항-인간 CD8a-BV510(클론 SK1, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 344732), 0.23 mg/mL 항-인간 CD4-BV421(클론 OKT4, 마우스 IgG2bk, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317434), 0.67 mg/mL 항-인간 CD3-PerCP-Cy5.5(클론 UCHT1, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300430), 0.67 mg/mL 항-인간 CD19-PE/Cy7(클론 HIB19, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302216), 5 μg/mL PE-접합된 아피니퓨어(AffiniPure) 항-인간 IgG F(ab')2-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 116 098)을 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 차가운 FACS 완충액에 세포를 추가로 재현탁하고, 4℃에서 30분 동안 재현탁하였다. 세포를 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 2회 세척하고, 이어서 1% 폼알데하이드(시그마, HT501320-9.5L)가 공급된 DPBS로 고정하였다. 세포를 100 mL/웰 FACS-완충액에 재현탁하고, MACS 콴트 애널라이저(Quant Analyzer) 10(밀테니 바이오텍을 사용하여 획득하였다. 플로우조(FlowJo) V10(플로우조 엘엘씨(FlowJo, LLC)) 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6.04(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software, Inc))를 사용하여 데이터를 분석하였다.
게이트를 살아있는 CD45+ CD3+ CD19neg CD8neg CD4+ T 세포, CD45+ CD3+ CD19neg CD4neg CD8+ T 세포, CD45+ CD3+ CD4neg CD8neg γδ T 세포 및 CD45+ CD3neg CD19+ B 세포 상에 설정하고, PE-접합된 아피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcg-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 형광 강도의 기하 평균을 적정된 농도의 PD1-표적화된 또는 DP47-비표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자에 대해 블로팅하였다. 도 13A 내지 13H에 도시된 바와 같이, 단지 건강한 공여자로부터의 단리된 인간 PBMC를 레스팅(resting)할 때, PD1 표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자(구축물 7.1, 구축물 7.3, 구축물 7.5 및 구축물 7.6) 및 PD1 표적화된 인간 IgG 대조군 M은 CD3+ CD4+, CD3+ CD8+ 및 CD3+ CD4neg CD8neg γδ T 세포에 결합하였다. 반면에, DP47-비표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자(대조군 B, C 및 D)는 임의의 새롭게 단리된 PBMC에 결합하지 않았다. 따라서, 새롭게 단리된 인간 PBMC 상에서, 대다수의 세포는 4-1BB를 발현하지 않은 반면, T 세포의 집단은 검출가능한 양의 PD1을 발현하였다. 표 26에서, EC50 값이 새롭게 단리된 인간 PBMC에 대한 결합 곡선에 대해 요약되었다.
[표 26]
새롭게 단리된 레스팅 인간 PBMC에 대한 결합 곡선의 EC50 값
Figure pct00060
도 14A 내지 14H에 도시된 바와 같이, 활성화 후, 살아있는 CD45+ CD3+ CD19neg CD8neg CD4+ T 세포, CD45+ CD3+ CD19neg CD4neg CD8+ T 세포, CD45+ CD3+ CD4neg CD8neg γδ T 세포 및 CD45+ CD3neg CD19+ B 세포는 인간 4-1BB 및 인간 PD1을 발현한다. 유일한 PD1 결합 분자(대조군 M) 또는 유일한 인간 4-1BB 결합 분자(대조군 B, 대조군 C 및 대조군 D)는 이에 의해 활성화된 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, γδ T 세포 및 B 세포 상에서 고도로 상향조절되는 반면, 4-1BB가 CD8+ T 세포, γδ T 세포 및 B 세포 상에서 및 보다 적은 정도까지 CD4+ T 세포 상에서 주로 상향조절됨을 증명하였다. PD1-표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자(구축물 7.1, 구축물 7.3, 구축물 7.5 및 구축물 7.6)는 PD1 및 인간 4-1BB에 결합하고, 이는 정합 대조군과 비교하여 더욱 높은 형광 강도의 기하 평균에 의해 반영된다. 표 27에서, EC50 값은 활성화된 인간 PBMC에 대한 결합 곡선에 대해 요된다.
[표 27]
활성화된 인간 PBMC에 대한 결합 곡선의 EC50 값
Figure pct00061
5.2 인간 PD1 및 인간 4-1BB 형질감염된 종양 세포의 결합
종양 세포를 발현하는 PD1 및 4-1BB에 대한 결합 분석을 위하여, 2개의 유전적으로 변형된 종양 세포를 사용하였다. 인간 발현 HeLa-hu4-1BB-NFkB-luc 클론 26 세포의 생성은 실시예 5.3.1에 기술된다. 인간 PD1 발현 종양 세포주의 경우, CHO-k1 세포를 다음과 같이 인간 PD1로 형질감염시켰다: 모 부착성 CHO-K1 세포주(ATCC CCL-61)를 전장 인간 PD1을 위한 플라스미드 15311_hPD1-fl_pUC_Neo 코딩 및 G418(플라스미드에 대한 네오마이신 내성 마커)에 의한 선택으로 안정적으로 형질감염시켰다.
DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326)에 재현탁된 0.1x106 종양 세포를 환저 현탁액 세포 96-웰 플레이트(그라이너 바이오-온, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 200 μL DPBS로 1회 세척하였다. 세포를 1:5,000 희석된 고정성 생존력 염료 eFluor 660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 100 μL/웰의 4℃ 차가운 DPBS 완충액에 재현탁하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 200 μL/웰 4℃ 차가운 DPBS 완충액으로 1회 세척하고, 일련의 농도로 PD1-표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자를 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 차가운 FACS 완충액(2% FBS, 5 mM EDTA pH8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치 S2002)가 공급된 DPBS)에 재현탁하고, 이어서 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 광범위한 세척 후, 5 μg/mL PE-접합된 아피니퓨어 항-인간 IgG F(ab')2-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 116 098)을 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 차가운 FACS 완충액으로 세포를 4℃에서 30분 동안 추가로 염색하였다. 세포를 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 2회 세척하고, 세포를 1% 폼알데하이드(시그마, HT501320-9.5L)를 함유하는 50 μL/웰 DPBS에 고정하였다. 세포를 100 mL/웰 FACS-완충액에 재현탁하고, MACS 콴트 애널라이저 10(밀테니 바이오텍)을 사용하여 획득하였다. 플로우조 V10(플로우조, LLC) 및 그래프패드 프리즘 6.04(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
게이트를 살아있는 종양 세포 상에서 설정하고, PE-접합된 아피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcg-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 형광 강도의 기하 평균을 적정된 농도의 PD1-표적화된 4-1BB 분할된 삼량체성 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 또는 이의 대조군에 대해 블로팅하였다. 도 15A 및 15B에 도시된 바와 같이, 단지 PD1-표적화된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드 융합 분자 구축물 7.1, 구축물 7.3, 구축물 7.5 및 구축물 7.6 및 대조군 M이 PD1-발현 CHO-k1-huPD1 클론 5에 결합하는 반면, 비-PD1 표적화된 대조군 분자 대조군 B, 대조군 C, 대조군 D 및 대조군 F는 종양 세포에 결합하지 않았다. 도 16A 및 16B에서, 단지 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드-함유 융합 분자 구축물 7.1, 구축물 7.3, 구축물 7.5 및 구축물 7.6 및 대조군 B, 대조군 C 및 대조군 D가 인간 4-1BB-발현 HeLa-hu4-1BB-NFkB-luc 클론 26에 결합한 반면, 어떠한 융합된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드도 함유하지 않는 대조군(대조군 F 및 대조군 M)은 인간 4-1BB 발현 종양 세포에 결합하지 않았다. 표 28에서, 곡선의 EC50 값이 열거된다.
[표 28]
인간 PD1 또는 인간 4-1BB 발현 종양 세포에 대한 결합 곡선의 EC50 값
Figure pct00062
실시예 6
PD1 표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생물학적 활성
인간 4-1BB 발현 HeLa 리포터 세포주의 NF-kB 활성화
6.1 HeLa 세포 발현 인간 4-1BB 및 NF-kB-루시퍼라제의 생성
인간-유두종-바이러스-18-유도된 자궁경부 암종 세포주 HeLa(ATCC CCL-2)를 CMV-프로모터 및 퓨로마이신 내성 유전자의 조절 하에 인간 4-1BB(유니프롯 수탁번호 Q07011)의 서열을 함유하는 발현 벡터 pETR10829에 기초한 플라스미드로 형질도입시켰다. 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 16000-044, 로트 번호 941273, 감마-조사됨, 마이코플라즈마 부재, 56℃에서 35분 동안 열 불활성화됨), 1% 글루타맥스-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050-038) 및 3 μg/mL 퓨로마이신(인비보젠(InvivoGen), 카탈로그 번호 ant-pr-1)가 공급된 DMEM-매질(깁코 바이 라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호 42430-025)에서 세포를 배양하였다.
4-1BB-형질도입된 HeLa 세포를 유동세포분석에 의해 4-1BB 발현에 대해 검사하였다: 0.1 μg PerCP/Cy5.5 접합된 항-인간 4-1BB 마우스 IgG1λ 클론 4B4-1(바이오레전드 카탈로그 번호 309814) 또는 이의 이소타입 대조군(PerCP/Cy5.5 접합된 마우스 IgG1λ 이소타입 대조군 항체 클론 MOPC-21, 바이오레전드 카탈로그 번호400150)을 함유하는 100 μL FACS 완충액(2% FBS, 5 mM EDTA pH 8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 S2002)가 공급된 DPBS)에 2x106개의 살아있는 세포를 재현탁하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.06 μg DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 300 μL FACS 완충액에 재현탁하고, 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다. 한계 희석을 수행하여 다음과 같이 단일 클론을 생성하였다: 인간-4-1BB-형질도입된 HeLa 세포를 10, 5 및 2.5 세포/mL의 농도로 매질에 재현탁하고, 200 μL의 세포 현탁액을 환저 조직-배양물 처리된 96-웰 플레이트(6개 플레이트/세포 농도, TPP 카탈로그 번호 92697)로 옮겼다. 단일 클론을 수거하고, 증식시키고 전술한 바와 같이 4-1BB 발현에 대해 검사하였다. 4-1BB의 최고 발현을 나타낸 클론(클론 5)을, NF-κB-루시퍼라제 발현-벡터 5495p 트랜루센트(Tranlucent) HygB를 사용한 후속 형질감염을 위해 선택하였다. 상기 벡터는 하이그로마이신 B에 대한 내성 및 NF-κB-반응 요소(파노믹스(Panomics), 카탈로그 번호 LR0051)의 조절 하에 루시퍼라제를 발현하는 능력 둘 다를 갖는 형질감염 세포를 제공한다. 인간-4-1BB HeLa 클론 5 세포를 70% 밀집도까지 배양하였다. 50 μg(40 μL)의 선형화된(제한 효소 AseI 및 SalI) 5495p 트랜루센트 HygB 발현 벡터를 멸균 0.4 cm 진 펄서(Gene Pulser)/마이크로펄서(MicroPulser) 큐벳(바이오래드(Biorad), 카탈로그 번호 165-2081)에 가하였다. 400 μL의 무보충 DMEM 중의 2.5x106개 인간-4-1BB HeLa 클론 5 세포를 첨가하고 플라스미드 용액과 조심스럽게 혼합하였다. 지수 펄스, 전기용량 500 μF, 전압 160V, 무한 저항 하의 설정에서 진 펄서 엑셀(Gene Pulser Xcell) 전체 시스템(바이오래드, 카탈로그 번호　165-2660)을 이용하여 세포의 형질감염을 수행하였다. 펄스 직후에, 형질감염된 세포를, 10% FBS 및 1% 글루타맥스-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038)가 공급된 37℃ 따뜻한 DMEM-매질(깁코 바이 라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호 42430-025) 15 mL를 함유한 75 cm2 조직 배양 플라스크(TPP, 카탈로그 번호 90075)로 옮겼다. 다음날, 3 μg/mL 퓨로마이신(인비보젠, 카탈로그 번호 ant-pr-1) 및 200 μg/mL 하이그로마이신 B(로슈, 카탈로그 번호 10843555001)를 함유하는 배양 매질을 첨가하였다. 생존 세포들을 증식시키고, 전술한 바와 같이 한계 희석을 수행하여 단일 클론들을 생성하였다. 클론들을 전술한 바와 같이 4-1BB 발현에 대해 검사하고 다음과 같이 NF-κB-루시퍼라제 활성에 대해 검사하였다: 클론들을 선택 매질에 수거하고, 세포 계수기 바이-셀(Cell Counter Vi-cell) xr 2.03(베크만 쿨터(Beckman Coulter), 카탈로그 번호 731050)을 사용하여 계수하였다. 세포를 0.33x106 세포/mL의 세포 밀도로 맞추고, 상기 세포 현탁액 150 μL를 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, 대조군으로서, 표준 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(TPP 카탈로그 번호 92096)로 옮겨서 다음날 생존 및 세포 밀도를 검사하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 상이한 농도의 재조합 인간 종양 괴사 인자 알파(rhTNF-a, 페프로테크(PeproTech), 카탈로그 번호 300-01A)를 함유하는 매질 50 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 0 ng/웰의 rhTNF-a의 최종 농도를 제공하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 배양한 다음 200 μL/웰 DPBS로 3회 세척하였다. 리포터 용해 완충액(Reporter Lysis Buffer)(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고(40 μL), 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 냉동된 세포 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온에서 해동하였다. 100 μL의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스(SpectraMax) M5/M5e 마이크로플레이트 리더 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(SoftMax Pro Software)(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 가능한 한 신속하게 플레이트를 측정하였다. 대조군(rhTNF-α 무첨가)보다 높은, 측정된 URL을 루시퍼라제 활성으로 취하였다. 최고의 루시퍼라제 활성 및 상당한 수준의 4-1BB 발현을 나타내는 추가 사용을 위해 NF-κB-luc-4-1BB-HeLa 클론 26을 선택하였다.
6.2 PD1-발현 CHO-k1-huPD1 클론 5 세포과 공동-배양된 HeLa 리포터 세포 발현 인간 4-1BB의 NF-kB 활성화
NFkB-luc-4-1BB-HeLa 클론 26 세포를 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326)로 세척하고, 0.05% 트립신 EDTA(깁코 바이 라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호 25300 054)로 37℃에서 5분 동안 처리하였다. 세포를 수확하고, 10% 태아 송아지 혈청(FBS, US-유래, PAN 바이오텍, P30-2009, 로트 P150307GI, 감마-조사됨, 마이코플라즈마 부재, 56℃에서 50분 동안 열 불활성화됨) 및 1% 글루타맥스-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038)가 공급된 DMEM 매질(깁코 바이 라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호 42430 025)에서 재현탁하였다. 셀 카운터 바이-셀 xr 2.03(베크만 쿨터, 카탈로그 번호 731050)을 사용하여 세포를 계수하고, 0.2x106 세포/mL의 세포 밀도로 설정하였다. 100 μL(2x104 세포)의 이러한 세포 현탁액을, 뚜껑을 갖는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그라이너 바이오 원, 카탈로그 번호 655083)의 각각의 웰로 전달하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 50 μL의 매질은 상이한 적정된 분할된 삼량체성 4-1BB 리간드-함유 융합 분자 구축물 7.1, 구축물 7.3, 구축물 7.5 및 구축물 7.6 또는 정합 대조군 대조군 B, 대조군 C, 대조군 D, 대조군 F 및 대조군 M을 함유하였다. PD1-결합-매개된 가교결합을 위하여, PD1-발현 CHO-k1-huPD1 클론 5 세포를 사용하였다.
부착성 CHO-k1-huPD1 클론 5 세포를 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326)로 세척하고, 효소-부재 PBS-계 세포 해리 완충액(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 13151-014)으로 37℃에서 10분 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 수확하고, 셀 카운터 바이-셀 xr 2.03을 사용하여 계수하였다. 세포를 10% FBS 및 1% L-글루타맥스-I가 공급된 DEM에 2x106 세포/mL까지 재현탁하고, 웰 당 50 μL를 첨가하였다. 가교결합 PD1-발현 CHO-k1-huPD1 클론 5 세포를 첨가한 후, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 항온처리하였다. 백색 평저 96-웰 플레이트를 200 μL/웰 DPBS로 3회 세척하였다. 40 μL의 새롭게 제조된 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 : E3971)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 냉동된 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온까지 해동하였다. 100 μL의 검출 완충액을 각각의 웰에 첨가하고, 하기 설정으로 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 리더 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰리큘라 디바이시스)를 사용하여 가능한 빨리 플레이트를 측정하였다: 루시퍼라제(RLUs)의 경우, 500 ms 적분시, 필터 없음, 모든 파장 수집 및 탑 리딩.
PD1-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(PD1 분할 4-1BBL 삼량체)는 PD1-발현 종양 세포의 존재 하에 리포터 세포주에서 NFκB 신호전달 경로의 활성화를 유발하였다. 대조적으로, 동일한 분자의 비표적화 변이체는 검사된 어떤 농도에서도 상기 효과를 유발하지 못하였다(도 17C 및 17D). PD1-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 존재 하에서조차 PD1-음성 종양 세포와 함께 NF-κB 수용체 세포주를 배양했을 때 NF-κB 활성화를 검출할 수 없었기 때문에, 표적화 4-1BBL의 상기 활성은 종양 세포의 세포 표면에서 PD1의 발현에 분명하게 의존하였다(도 17A 및 17B). 구축물 7.1, 7.3, 7.5 및 7.6에 대해 측정된 활성을 제시한다. PD1 발현 종양 세포의 존재 하에 측정된 EC50 값은 하기 표 29에 제공된다.
[표 29]
NFkB-활성화-유도된 루시퍼라제 활성-곡선의 EC50 값
Figure pct00063
참조문헌
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antigen Binding Molecules comprising a TNF family ligand trimer and PD1 binding moiety <130> P33618-EP <140> PCT/EP2017/061241 <141> 2017-05-11 <150> EP 16169487.2 <151> 2016-05-13 <160> 171 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 130 135 140 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 145 150 155 160 Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 165 170 175 Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 35 40 45 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu 50 55 60 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 65 70 75 80 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala 85 90 95 Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala 100 105 110 Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 115 120 125 Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu 130 135 140 Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile 145 150 155 160 Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 175 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly 20 25 30 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 35 40 45 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 50 55 60 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu 85 90 95 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 100 105 110 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 130 135 140 Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 165 170 175 Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu 180 185 190 Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 <210> 5 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 130 135 140 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 145 150 155 160 Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 165 170 175 Gly Leu <210> 6 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Val 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PD1-0050 <400> 38 Arg Ala Ser 1 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain HVR-L3, PD1-0050 <400> 39 Asn Asn Glu Asp Pro Tyr 1 5 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain VH, PD1-0050 <400> 40 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Met Asp Tyr Tyr Gly Ser Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain VL, PD1-0050 <400> 41 Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 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light chain HVR-L1, PD1-0073 <400> 53 Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 1 5 <210> 54 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain HVR-L2, PD1-0073 <400> 54 Trp Ala Ser 1 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain HVR-L3, PD1-0073 <400> 55 His Tyr Ser Ile Pro Trp 1 5 <210> 56 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain VH, PD1-0073 <400> 56 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 107 <212> 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Sequence <220> <223> light chain HVR-L1, PD1-0078 <400> 61 Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 1 5 <210> 62 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain HVR-L2, PD1-0078 <400> 62 Ser Ala Ser 1 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain HVR-L3, PD1-0078 <400> 63 His Tyr Ser His Pro Phe 1 5 <210> 64 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain VH, PD1-0078 <400> 64 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Thr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 65 <211> 107 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cacccatcag 1440 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtgacaa gacccacacc 1500 tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct ggcggccctt ctgtgttcct gttcccccca 1560 aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 1620 gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 1680 aatgccaaga ccaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1740 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1800 aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1860 ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1920 tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1980 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 2040 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 2100 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 2160 ggtaaa 2166 <210> 136 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of monomeric hu 4-1BBL (71-254) 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cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggaac ccaagtcttg t 891 <210> 137 <211> 2511 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-PD1(0314) Fc hole chain fused to dimeric hu 4-1BBL (71-254) <400> 137 gaagtgcagc tgctcgaaag cggcggggga ctggtccagc ccggcggttc cctgaggctg 60 tcttgcgccg cttcagggtt cagcttttcc tcttacacca tgagttgggt cagacaggca 120 cctggcaagg gactggagtg ggtcgccaca atcagcggtg gcgggcgcga catttattac 180 ccagattccg tgaaaggacg gttcaccatc tctagggaca actcaaagaa tactctgtat 240 ttgcagatga acagcctgag agctgaggat acagcagttt actactgtgt gctcctgacc 300 ggccgcgtct attttgccct tgactcctgg ggacaaggca ctctggtgac cgtatctagt 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660 aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtgga ggcggcggaa gcggaggagg aggatccaga 1380 gagggccctg agctgagccc cgatgatcct gctggactgc tggacctgcg gcagggcatg 1440 tttgctcagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgatg gccccctgtc ctggtacagc 1500 gatcctggac tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa 1560 gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 1620 gtggtggccg gcgaaggatc tggctctgtg tctctggccc tgcatctgca gcctctgaga 1680 agcgctgctg gcgctgcagc tctggcactg acagtggatc tgcctcctgc cagctccgag 1740 gcccggaata gcgcatttgg gtttcaaggc aggctgctgc acctgtctgc cggccagagg 1800 ctgggagtgc atctgcacac agaggccagg gctagacacg cctggcagct gacacagggc 1860 gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgacc cccgagattc cagccggcct gccttctcca 1920 agaagcgaag gcggaggcgg atctggcggc ggaggatcta gagagggacc cgaactgtcc 1980 cctgacgatc cagccgggct gctggatctg agacagggaa tgttcgccca gctggtggct 2040 cagaatgtgc tgctgattga cggacctctg agctggtact ccgacccagg gctggcaggg 2100 gtgtccctga ctgggggact gtcctacaaa gaagatacaa aagaactggt ggtggctaaa 2160 gctggggtgt actatgtgtt ttttcagctg gaactgaggc gggtggtggc tggggagggc 2220 tcaggatctg tgtccctggc tctgcatctg cagccactgc gctctgctgc tggcgcagct 2280 gcactggctc tgactgtgga cctgccacca gcctctagcg aggccagaaa cagcgccttc 2340 gggttccaag gacgcctgct gcatctgagc gccggacagc gcctgggagt gcatctgcat 2400 actgaagcca gagcccggca tgcttggcag ctgactcagg gggcaactgt gctgggactg 2460 tttcgcgtga cacctgagat ccctgccgga ctgccaagcc ctagatcaga a 2511 <210> 138 <211> 1929 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of anti-PD1(0314) Fc knob chain fused to monomeric hu 4-1BBL (71-254) <400> 138 gaagtgcagc tgctcgaaag cggcggggga ctggtccagc ccggcggttc cctgaggctg 60 tcttgcgccg cttcagggtt cagcttttcc tcttacacca tgagttgggt cagacaggca 120 cctggcaagg gactggagtg ggtcgccaca atcagcggtg gcgggcgcga catttattac 180 ccagattccg tgaaaggacg gttcaccatc tctagggaca actcaaagaa tactctgtat 240 ttgcagatga acagcctgag agctgaggat acagcagttt actactgtgt gctcctgacc 300 ggccgcgtct attttgccct tgactcctgg ggacaaggca ctctggtgac cgtatctagt 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccctg cagagatgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgt ctggtcaagg gcttctaccc cagcgatatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac tccaaactga ccgtggacaa gagccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcgga ggcggcggaa gcggaggagg aggatccaga 1380 gagggccctg agctgagccc cgatgatcct gctggactgc tggacctgcg gcagggcatg 1440 tttgctcagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgatg gccccctgtc ctggtacagc 1500 gatcctggac tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa 1560 gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 1620 gtggtggccg gcgaaggatc tggctctgtg tctctggccc tgcatctgca gcctctgaga 1680 agcgctgctg gcgctgcagc tctggcactg acagtggatc tgcctcctgc cagctccgag 1740 gcccggaata gcgcatttgg gtttcaaggc aggctgctgc acctgtctgc cggccagagg 1800 ctgggagtgc atctgcacac agaggccagg gctagacacg cctggcagct gacacagggc 1860 gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgacc cccgagattc cagccggcct gccttctcca 1920 agaagcgaa 1929 <210> 139 <211> 2130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of dimeric hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc knob chain <400> 139 agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60 atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120 agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180 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gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660 aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg 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cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300 ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gtaaa 1335 <210> 160 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DP47 heavy chain (hu IgG1 PGLALA) <400> 160 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 161 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PD1(0314) heavy chain (huIgG1 PGLALA) <400> 161 gaagtgcagc tgctcgaaag cggcggggga ctggtccagc ccggcggttc cctgaggctg 60 tcttgcgccg cttcagggtt cagcttttcc tcttacacca tgagttgggt cagacaggca 120 cctggcaagg gactggagtg ggtcgccaca atcagcggtg gcgggcgcga catttattac 180 ccagattccg tgaaaggacg gttcaccatc tctagggaca actcaaagaa tactctgtat 240 ttgcagatga acagcctgag agctgaggat acagcagttt actactgtgt gctcctgacc 300 ggccgcgtct attttgccct tgactcctgg ggacaaggca ctctggtgac cgtatctagt 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350 <210> 162 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1(0314) heavy chain (huIgG1 PGLALA) <400> 162 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 163 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 164 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Fc hole chain <400> 164 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 165 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of human 4-1BB antigen Fc knob chain <400> 165 ctgcaggacc cctgcagcaa ctgccctgcc ggcaccttct gcgacaacaa ccggaaccag 60 atctgcagcc cctgcccccc caacagcttc agctctgccg gcggacagcg gacctgcgac 120 atctgcagac agtgcaaggg cgtgttcaga acccggaaag agtgcagcag caccagcaac 180 gccgagtgcg actgcacccc cggcttccat tgtctgggag ccggctgcag catgtgcgag 240 caggactgca agcagggcca ggaactgacc aagaagggct gcaaggactg ctgcttcggc 300 accttcaacg accagaagcg gggcatctgc cggccctgga ccaactgtag cctggacggc 360 aagagcgtgc tggtcaacgg caccaaagaa cgggacgtcg tgtgcggccc cagccctgct 420 gatctgtctc ctggggccag cagcgtgacc cctcctgccc ctgccagaga gcctggccac 480 tctcctcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct cacccaaatc tgcagacaaa 540 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 600 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 660 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 720 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 780 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 840 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 900 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 960 gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1020 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1080 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1140 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1200 ctgtctccgg gtaaatccgg aggcctgaac gacatcttcg aggcccagaa gattgaatgg 1260 cacgag 1266 <210> 166 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc hole chain <400> 166 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 167 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BB antigen Fc knob chain <400> 167 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys 165 170 175 Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 180 185 190 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 195 200 205 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 210 215 220 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 225 230 235 240 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 245 250 255 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 260 265 270 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 275 280 285 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 290 295 300 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 305 310 315 320 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 325 330 335 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 340 345 350 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 355 360 365 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 370 375 380 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 385 390 395 400 Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Trp His Glu 420 <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avi tag <400> 168 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 169 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of human 4-1BB His <400> 169 ctgcaggacc cctgcagcaa ctgccctgcc ggcaccttct gcgacaacaa ccggaaccag 60 atctgcagcc cctgcccccc caacagcttc agctctgccg gcggacagcg gacctgcgac 120 atctgcagac agtgcaaggg cgtgttcaga acccggaaag agtgcagcag caccagcaac 180 gccgagtgcg actgcacccc cggcttccat tgtctgggag ccggctgcag catgtgcgag 240 caggactgca agcagggcca ggaactgacc aagaagggct gcaaggactg ctgcttcggc 300 accttcaacg accagaagcg gggcatctgc cggccctgga ccaactgtag cctggacggc 360 aagagcgtgc tggtcaacgg caccaaagaa cgggacgtcg tgtgcggccc cagccctgct 420 gatctgtctc ctggggccag cagcgtgacc cctcctgccc ctgccagaga gcctggccac 480 tctcctcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct caggcctgaa cgacatcttc 540 gaggcccaga agatcgagtg gcacgaggct cgagctcacc accatcacca tcac 594 <210> 170 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BB His <400> 170 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu 165 170 175 Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala 180 185 190 His His His His His His 195 <210> 171 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PD1 (0312) light chain <400> 171 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (36)

  1. (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
    상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    (c) 안정하게 결합할 수 있는 제1 및 제2 아단위로 이루어진 Fc 도메인을 추가로 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서
    (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
    (i) 상기 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나,
    (ii) 상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드의 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하거나,
    (iii) 상기 제1 폴리펩티드가 VH-CL 도메인 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는,
    TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 계열 리간드 구성원이 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 계열 리간드 구성원이 4-1BBL인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 계열 리간드 구성원의 엑토도메인이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
    상기 제1 폴리펩티드가 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기; 및
    (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
    상기 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제1 폴리펩티드에 연결되고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가
    (a) (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
    (b) (i) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
    (c) (i) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
    (d) (i) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
    (e) (i) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
    (f) (i) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (g) (i) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가
    (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (f) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (g) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (h) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (i) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (j) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (k) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가
    (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (b) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄;
    C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 제2 중쇄 또는 제2 경쇄에 융합된 제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드; 및
    C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 제2 경쇄 또는 제2 중쇄에 융합된 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 이의 C-말단에서 제2 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 이의 C-말단에서 제3 펩티드 연결기에 의해 경쇄의 부분인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 Fab 도메인; 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
    상기 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고, 상기 제1 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 펩티드 연결기에 의해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄; 또는
    (i) Fc 도메인의 제1 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 계열 리간드 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, (ii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VH 도메인, Fc 도메인의 제2 아단위, 및 펩티드 연결기에 의해 서로 연결되고 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 상기 TNF 계열 리간드 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄, 및 (iii) PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 도메인의 VL 도메인을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 카밧 EU 인덱스(Kabat EU index)에 따라 넘버링(numbering)된 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는 IgG1 Fc 도메인인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제13항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제1 경쇄;
    (ii) 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78 및 서열번호 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
    (iii) 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79 및 서열번호 81로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  22. 제1항 내지 제13항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
    (b) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
    (c) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (d) 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  23. 제1항 내지 제13항, 제16항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 도메인을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제13항, 제16항, 제18항 내지 제20항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄; 또는
    (b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  25. 제1항 내지 제13항, 제17항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (c) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (d) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83 또는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  27. 제26항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  28. 제26항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 제조 방법으로서,
    제28항에 따른 숙주 세포를 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및
    상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 단리하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  31. 약제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 제30항에 따른 약학 조성물.
  32. 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 연장하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 제30항에 따른 약학 조성물.
  33. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에 사용하기 위한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  34. 암의 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도.
  35. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 제30항에 따른 약학 조성물의 효과량을 암을 갖는 개체에게 투여함을 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 방법.
  36. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 제30항에 따른 약학 조성물의 효과량을 암을 갖는 개체에게 투여함을 포함하는, 암을 갖는 개체에서 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 연장하는 방법.
KR1020187036101A 2016-05-13 2017-05-11 Tnf 계열 리간드 삼량체 및 pd1 결합 잔기를 포함하는 항원 결합 분자 KR20190004802A (ko)

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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10513558B2 (en) 2015-07-13 2019-12-24 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PD1 antibodies, activatable anti-PD1 antibodies, and methods of use thereof
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
MY189018A (en) 2015-11-18 2022-01-19 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
PL3559034T3 (pl) 2016-12-20 2021-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona dwuswoistymi przeciwciałami anty-CD20/anty-CD3 i agonistami 4-1BB (CD137)
TW201829469A (zh) 2017-01-03 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 包含抗4-1bb純系20h4.9之雙特異性抗原結合分子
CA3047707A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A pd1-41bbl fusion protein and methods of use thereof
US11299530B2 (en) 2017-01-05 2022-04-12 Kahr Medical Ltd. SIRP alpha-CD70 fusion protein and methods of use thereof
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
PT3565828T (pt) 2017-01-05 2022-02-08 Kahr Medical Ltd Proteína de fusão sirp1 alfa-41bbl e seus métodos de utilização
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
UA125700C2 (uk) 2017-04-03 2022-05-18 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Імунокон'югати антитіла до pd-1 з мутантом il-2
WO2018187215A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific 4-1bb agonist molecules
SG11201909154SA (en) * 2017-04-05 2019-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
PE20210652A1 (es) * 2018-04-13 2021-03-26 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
US20210214417A1 (en) 2018-07-11 2021-07-15 Kahr Medical Ltd. SIRPalpha-4-1BBL VARIANT FUSION PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF
JP7221379B2 (ja) 2018-10-01 2023-02-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子
WO2020127618A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
CN110592140A (zh) * 2019-09-30 2019-12-20 王清路 Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法
EP4087866A1 (en) * 2020-01-09 2022-11-16 F. Hoffmann-La Roche AG New 4-1bbl trimer-containing antigen binding molecules
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
EP4149964A2 (en) * 2020-05-15 2023-03-22 Apogenix AG Multi-specific immune modulators
WO2023088876A1 (en) * 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
CN114984207B (zh) * 2022-05-09 2024-01-26 浙江特瑞思药业股份有限公司 一种抗pd-1纳米抗体制剂

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7802170A (nl) 1977-04-18 1978-10-20 Hitachi Metals Ltd Sierraad.
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
WO2003042402A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
FI2206517T3 (fi) 2002-07-03 2023-10-19 Ono Pharmaceutical Co Immuunopotentioivia koostumuksia käsittäen anti-PD-L1 -vasta-aineita
WO2004056875A1 (en) 2002-12-23 2004-07-08 Wyeth Antibodies against pd-1 and uses therefor
KR20050107399A (ko) 2003-01-23 2005-11-11 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 인간 ｐｄ-1에 대하여 특이성을 갖는 물질
CA2515100A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-19 Micromet Ag Trimeric polypeptide construct to induce an enduring t cell response
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
AU2003272065A1 (en) 2003-04-03 2004-10-25 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Broad-spectrum in-vivo effective superantigen toxin antagonists based on the interaction between cd28 and the superantigen and uses thereof
JP4871126B2 (ja) 2003-07-04 2012-02-08 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
RS58420B1 (sr) 2003-11-05 2019-04-30 Roche Glycart Ag Cd20 antitela sa povećanim afinitetom za vezivanje fc receptora i efektornom funkcijom
SG149004A1 (en) 2003-12-05 2009-01-29 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
PL1737891T3 (pl) 2004-04-13 2013-08-30 Hoffmann La Roche Przeciwciała przeciw selektynie p
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP3530736A3 (en) 2005-05-09 2019-11-06 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
MX349137B (es) 2005-06-08 2017-07-13 Dana-Farber Cancer Inst Metodos y composiciones para el tratamiento de infecciones persistentes y cancer por inhibicion de la ruta de muerte celular programada (pd-1).
SI1907424T1 (sl) 2005-07-01 2015-12-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana monoklonska protitelesa proti programiranem smrtnem ligandu 1 (PD-L1)
RU2478400C2 (ru) 2006-12-27 2013-04-10 Эмори Юниверсити Композиции и способы лечения инфекций и опухолей
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
AU2008266951B2 (en) 2007-06-18 2013-12-12 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor PD-1
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
WO2009024531A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating and diagnosing hematologic malignancies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
PT2242773T (pt) 2008-02-11 2017-09-15 Cure Tech Ltd Anticorpos monoclonais para o tratamento de tumores
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
KR101001360B1 (ko) 2008-06-16 2010-12-14 (주)기가레인 전자 기기의 접지에 전기적으로 연결되는 인쇄회로기판
PT2310509E (pt) 2008-07-21 2015-05-19 Apogenix Gmbh Moléculas de tnfsf em cadeia simples
US20110159023A1 (en) 2008-08-25 2011-06-30 Solomon Langermann Pd-1 antagonists and methods for treating infectious disease
RS54233B1 (en) 2008-08-25 2015-12-31 Amplimmune Inc. PD-1 ANTAGONIST COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR THEIR APPLICATION
US8927697B2 (en) 2008-09-12 2015-01-06 Isis Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
WO2010029434A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Isis Innovation Limited Pd-1 specific antibodies and uses thereof
DK2342226T3 (en) 2008-09-26 2016-09-26 Dana Farber Cancer Inst Inc HUMAN ANTI-PD-1, PD-L1 AND PD-L2 ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
BRPI0921321A2 (pt) 2008-11-28 2018-10-16 Emory University métodos para o tratamento de indwcções e tumores
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
EP2504028A4 (en) 2009-11-24 2014-04-09 Amplimmune Inc SIMULTANEOUS INHIBITION OF PD-L1 / PD-L2
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
CN102892786B (zh) 2010-03-11 2016-03-16 Ucb医药有限公司 Pd-1抗体
SI2603530T1 (en) 2010-08-13 2018-02-28 Roche Glycart Ag Anti-FAP antibodies and methods of use
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
AU2012237456B2 (en) * 2011-04-01 2017-06-29 Universitat Stuttgart Recombinant TNF ligand family member polypeptides with antibody binding domain and uses thereof
LT2699264T (lt) 2011-04-20 2018-07-10 Medimmune, Llc Antikūnai ir kitos molekulės, kurios jungiasi prie b7-h1 ir pd-1
WO2013014668A1 (en) 2011-07-24 2013-01-31 Curetech Ltd. Variants of humanized immunomodulatory monoclonal antibodies
CN104334573A (zh) * 2012-04-30 2015-02-04 比奥孔有限公司 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法
AU2014259719B2 (en) 2013-05-02 2019-10-03 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against programmed death-1 (PD-1)
EP3083687A2 (en) * 2013-12-17 2016-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
HUE049982T2 (hu) * 2014-11-14 2020-11-30 Hoffmann La Roche TNF-családba tartozó ligandum-trimert tartalmazó antigénkötõ molekulák
WO2017055404A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
EP3150636A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
EP3455254B1 (en) * 2016-05-11 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety

Also Published As

Publication number Publication date
PH12018502367A1 (en) 2019-09-09
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