KR102364599B1 - Cd40 및 fap에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자 - Google Patents

Cd40 및 fap에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (b) 표적 세포 항원, 특히 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자, 및 상기 분자의 생산 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

CD40 및 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자
본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특히, 이들 이중특이적 항원 결합 분자는 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 영역을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 분자의 생산 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
많은 분자 신호가 강한 후천적 면역 반응의 생성 동안 필요하다. 신호 1은 항원-제시 세포(APC)의 표면 상에 존재하는 T 세포 항원 수용체(TCR)의 동족 항원에 대한 T 세포 항원 수용체의 결합에 수반된다. 신호 2는 T 세포와 APC 사이에 공자극 수용체와 이의 각각의 리간드의 결합으로 이루어진다. 가장 잘 연구되었고 가장 중요한 공자극 효과기 중 하나는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 패밀리 구성원 CD40 및 이의 리간드 CD40L이다(문헌[Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009;229(1):152-72]). TNFR 패밀리의 여러 구성원은 초기 T 세포 활성화 후에 APC 및 T 세포 반응을 지속시키는 기능을 하고, 따라서 면역계의 구성 및 기능에서 중심이 되는 역할을 한다(문헌[Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68]). 상이한 공자극 TNFR 패밀리 구성원의 조합은 APC 및 T 세포 활성화 및 생존의 순차적이고 일시적인 조절을 가능하게 하여 증가된 면역 반응을 야기하는 동시에, APC 및 T 세포 기능의 엄격한 제어를 유지한다. 질병 상태에 따라, 공자극 TNF 패밀리 구성원을 통한 자극은 질병을 악화시키거나 개선할 수 있다. TNFR 패밀리 공자극자의 활성화 또는 차단은 암, 감염성 질병, 이식 및 자가면역을 포함하는 많은 분야의 여러 치료적 적용례에 대해 유망하다.
여러 공자극 분자 중에서도, TNFR 패밀리 구성원 CD40은 성숙, 생존, 항원 제시, 시토카인 생성, 및 APC의 공자극 분자의 발현을 유도함으로써 면역 반응을 촉발함에 있어서 중요한 역할을 하고, 이어서 이는 전염증성 시토카인에 의해 항원-특이적 T 세포 반응 및 NK 세포 활성화를 추진한다. CD40은 감염, 종양 및 자기-항원에 대한 면역 반응을 조절하고, 이의 발현은 APC, 예컨대 B 세포, 수지상 세포(DC), 단핵구 및 대식 세포, 뿐만 아니라 혈소판, 및 비-조혈원 세포, 예컨대 근섬유아세포, 섬유아세포, 상피 세포 및 내피 세포 상의 표면 상에 나타났다(문헌[Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009;229(1):152-72]). CD40 리간드 CD40L은 활성화된 CD4+ 헬퍼 T 세포, 혈소판, 단핵구성 세포, 자연 살해 세포, 비만 세포 및 호염기성 세포 상에 발현된다(문헌[Carbone E. et. al., J Exp Med. 1997;185(12): 2053-2060] 또는 [Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009;229(1):152-72]). CD40 및 CD40L의 발현은 다양한 면역 자극 신호에 대한 반응으로 강하게 상향조절되고, APC와 CD4+ T 세포 사이의 CD40-CD40L 상호작용은 증가된 APC 활성화 및 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응에 기여한다(문헌[Bevan MJ., Nat Rev Immunol. 2014;4(8):595-602]). 유사한 면역 자극 결과가 CD40 작용성 항체를 사용함으로써 관찰되었다(문헌[Vonderheide RH and Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013;19(5):1035-43]).
유형 I 막관통 수용체 CD40의 천연 리간드 CD40L, 유형 II 막관통 단백질 또는 작용성 항체에 의한 유형 I 막관통 수용체 CD40의 결합은 CD40 클러스터링을 촉진하고 세포질 수용체 도메인에 대한 어댑터 단백질의 모집을 유도한다. TNF 수용체-연관 인자(TRAF)로 공지된 이들 어댑터 단백질의 모집은 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK), 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K) 및 정규 및 비-정규 핵 인자 κB(NFκB) 신호전달 경로의 상승적 활성화를 야기한다(문헌[Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009;229(1):152-72]). 결과적으로, 이는 APC 성숙 및 활성화를 야기하고, 이는 항원-특이적 T 세포 반응을 최대화시킨다. 최근 연구는 항종양 면역성의 활용에 있어서 작용성 CD40 항체의 작용의 2개의 상이한 모드를 보여주었다. 후천적 면역계의 활성화를 통해 매개된 종양 세포 사멸에 의한 작용의 간접적 모드 외에, 작용성 CD40 항체는 CD40-발현 고형 종양 세포의 세포 자멸을 통한 직접 종양 세포 사멸을 유도할 수 있다(문헌[Eliopoulos AG. et al., Mol Cell Biol. 2000;20(15):5503-15]). 종양 세포의 직접 CD40 항체-매개된 사멸은 항-CD40 항체를 통한 CD40 결합에 의해 동시에 활성화된 APC에 의해 처리되고 제공될 수 있는 종양 항원의 공급원을 제공할 수 있고, 이는 종양 항원-특이적 T 세포의 내인성 백신 접종으로서 공지된 상정된 메커니즘을 유도할 수 있다. CD40 결합이 효율적인 항암 면역 반응을 시작할 수 있다는 점을 고려하여, 작용성 CD40 항체는 다양한 전임상 종양 모델에서 단일 제제로서 또는 화학 요법과 조합으로 성공적으로 사용되었다(문헌[Vonderheide RH and Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013;19(5):1035-43]).
오늘날까지, 6개의 CD40 mAb가 임상 시험 조사 중이다: Chi Lob 7/4(CD40 작용성 IgG1 키메라 mAb; 문헌[Cancer Research UK; Chowdhury F. et al., Cancer Immunol Res. 2013;2:229-40]), ADC1013(완전 인간, CD40 작용성 IgG1 항체; 문헌[Alligator Bioscience and Johnson & Johnson]; [Mangsbo SM. et al., Clin Cancer Res. 2015 Mar 1;21(5):1115-26]), APX-005(완전히 인간화됨, CD40 작용성 IgG1 mAb; 문헌[Apexigen; Bjorck P. et al. J Immunother Cancer. 2015; 3(Suppl 2): P198]), SEA-CD40(CD40 작용성 IgG1 키메라 mAb; 문헌[Seattle Genetics; Gardai SJ. et al. AACR 106th Annual Meeting 2015; April 18-22, abstract 2472]), 및 RO7009789(완전 인간, CD40과 작용성 IgG2 mAb)가 임상 제I상 연구 조사되었고, 다세투주맙(dacetuzumab)(CD40 부분적 작용성 IgG1 키메라 mAb; 문헌[Seattle Genetics; Khubchandani S. et al., Curr Opin Investig Drugs. 2009;10:579-87])이 임상 제II상 연구 조사되었다. 이들 연구에 조건이 맞는 환자는 고형 종양, 전형적인 호지킨(Hodgkin) 림프종(HL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 또는 무통성 림프종(여포성 림프종을 포함함)을 갖는다. 보체 매개된 세포 독성(CMC) 또는 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 통한 CD40+ 종양 세포의 Fc-의존성 세포 독성에서부터 항종양 T 세포 반응을 유도하는 APC 활성화 및 종양 및 종양 스트로마를 격감시키는 대식 세포 활성화에 이르는 다양한 활성이 이들 CD40 작용성 항체에 대해 나타났다. 지금까지 이러한 관찰된 이질성에 대한 결정적인 설명은 없었다. 그러나, 최근 연구는 작용 다양성의 모드가 에피토프 특이성, 동형 또는 Fc:FcγR 상호작용에 있어서 항-CD40 항체의 차이에 의해 적어도 부분적으로 설명될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 생체내 CD40 작용성 항체는 TNFR-상과의 세포 자멸 유도성 또는 면역 조절성 구성원에 특이적인 작용성 항체에 대해 기재된 바와 같이 표적 세포 이외의 세포 상의 Fc 단편에 의해 결합된 Fcγ 수용체에 대한 표적 세포 상의 이의 Fab 단편에 의해 결합된 가교성 CD40을 요구하는 것으로 드러났다(문헌[Dahan R., Cancer Cell. 2016 Jun 13;29(6):820-31; Li F. and Ravetch J.V. Science, 2011;333, 1030-1034]; [Teng M.W. et al., J. Immunol. 2009;183, 1911-1920]). 제안된 메커니즘은 강한 생체내 효능을 달성하기 위한 표적 세포 상의 CD40 막관통 분자의 Fcγ 수용체 매개된 클러스터링 및 후속의 강화된 CD40 신호전달을 포함한다.
작용성 CD40 항체의 임상적 개발은 유망한 초기 결과를 제공하였다. 제1임상 시험에서, CP-870,893은 진행성 암 환자에서 임상적 효능을 나타냈다. 29명의 진행성 암 환자 중 4명은 CP-870,893의 정맥내 단일 주입을 받은 후에 부분적 반응을 나타냈다(문헌[Vonderheide RH., J Clin Oncol. 2007 Mar 1;25(7):876-83]). 1년 6개월 동안 9회 후속 투여량의 CP-870,893로 치료받은 상기 4명의 환자 중 1명은 5년 초과 동안 완전 관해된 상태로 있었다. 그러나, CP-870,893의 가장 흔한 부작용은 시토카인 방출 증후군 및 혈전 색전 사건이고, 따라서 사용된 투여량 일정 및 투여 경로에 따라, 140명 초과의 환자가 참여한 제1 상 임상 연구는 제한된 임상적 효능을 나타냈고 항체의 국소적 투여가 제안되었다(문헌[Vonderheide RH, Glennie M, Clin Cancer Res. 2013, 19(5), 1035-1043]). 단일 제제 반응의 부족은 넓은 CD40 발현에 의해 야기되는 표적에 대한 엄격성/오프 종양(off tumor) 효과 때문에 부분적으로 발생하고, 이는 투여량 제한 독성을 야기한다(예를 들어 시토카인 방출 증후군). 종양-특이적 표적에 의해 교차 결합될 때 APC를 특이적으로 활성화시키는 작용성 CD40 항체의 개발은 부작용을 감소시키고 투여량 제한을 감소시켜 효율적이고 장기 지속성의 항암 면역성을 생성하는 가능성을 갖는 새로운 치료 옵션을 제공할 수 있다.
입수가능한 전임상 및 임상 데이터는, 암에 대한 효과적인 내인성 면역 반응을 유도하고 증대시킬 수 있는 CD40의 효과적인 작용제에 대한 높은 임상적 필요성이 존재함을 분명하게 나타낸다. 그러나, 효과가 단일 유형의 세포 또는 단일 메커니즘을 통한 작용에 제한되는 일은 거의 없고, 세포간 및 세포내 신호전달 메커니즘을 설명하도록 설계된 연구는 점점 더 복잡해졌다. 공지된 CD40 항체는 투여량 제한 독성, 예컨대 시토카인 방출 증후군 및 혈소판/내피 세포 활성화 때문에 비교적 낮은 투여량으로만 투여될 수 있고, 이는 표적 APC에 대한 경로의 불충분한 활성화 및 좁은 치료 지수를 야기한다. 따라서, 바람직하게는 단일 투형의 세포에 작용하는 "표적화된" 작용제에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 CD40 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 분자는 종양-특이적이거나 종양-연관된 표적에 바람직하게 결합할 수 있는 모이어티와 CD40에 작용적으로 결합할 수 있는 모이어티를 조합시키되, CD40을 통한 APC의 활성화는 표적 세포 항원, 예를 들어 종양 스트로마 세포 상에 발현되는 FAP를 통한, 및 잠재적으로 이차 림프 조직에서 개재하여 발현되는 FAP를 통한 교차 결합에 의해 제공될 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자의 FAP-의존성 교차 결합은 CD40-발현 세포의 활성화를 종양 조직 및 잠재적으로 또한 이차 림프 조직, 예컨대 종양-배수 림프절에 국한시킨다. CD40, 및 활성화된 T 세포 상의 면역 관문 수용체, 예컨대 CTLA-4 또는 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항원 결합 분자와 대조적으로, 종양 표적, 예컨대 FAP에 대한 표적화는 CD40-매개된 APC 활성화를 주로 섬유아세포가 다른 조직과 비교하여 증가된 수준의 FAP를 발현하는 종양 스트로마 및 종양-배수 림프절에서 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 분자는 CD40 수용체를 효과적일뿐만 아니라 목적하는 부위에서 매우 선택적으로 작동시킬 수 있는 동시에 FcγR 교차 결합에 대한 필요성을 극복하여 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 공자극 TNF 수용체 패밀리 구성원 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티(항원 결합 도메인)를, 표적 세포 항원을 표적화하는 하나 이상의 항원 결합 면과 조합시키는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 이들 이중특이적 항원 결합 분자는 유리한데, 이는 이것이 바람직하게는 표적 세포 항원에 대한 이의 결합 능력에 기인하여 표적 세포 항원이 발현되는 부위에서 공자극 CD40 수용체를 활성화시킬 수 있기 때문이다.
한 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 보다 특히, 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인은 효과기 기능을 감소시키는 돌연변이를 포함한다.
한 양태에서, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 결합한다.
추가적 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인인, 이중특이적 항원 결합 분자이 제공된다. 특히, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 결합한다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 여기서 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) (i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP).
추가적 양태에서, 상기에 정의된 바와 같은 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역(VLFAP).
특히, 상기에 정의된 바와 같은 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 (b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함한다.
추가적 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 마우스 CD40에 결합하고, (i) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 (iv) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
또한, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 (b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인 각각은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가적 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 19 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 20, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40); 및
(iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 19 및 서열번호 261로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 20, 서열번호 262 및 서열번호 263으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40)
(iv) 서열번호 22, 서열번호 264 및 서열번호 265의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
또한, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173 및 서열번호 174로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177 및 서열번호 178로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(b) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(c) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(d) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(e) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(f) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(g) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(h) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(i) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(j) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(k) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(l) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(m) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(n) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(o) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
(p) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
보다 특히, 이중특이적 항원 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가적 양태에서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(b) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(c) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(d) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(e) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(f) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(g) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(h) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(i) 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(j) 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(k) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
(l) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
보다 특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하거나, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 25, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 26, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다. 추가적 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 IgG Fc 영역, 특히 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 특히, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 Fc 영역은 (i) 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 Fc 영역, 또는 (ii) 아미노산 돌연변이 D265A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 마우스 IgG1 서브클래스의 Fc 영역이다. 특히, Fc 영역은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 Fc 영역이다.
또 다른 양태에서, 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 놉-인투-홀(knob into hole) 방법에 따라 Fc 영역의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고, Fc 영역의 제2 서브유닛은 홀을 포함한다. 특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 (i) Fc 영역의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 영역의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하거나, (ii) Fc 영역의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 K392D 및 K409D(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 영역의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 E356K 및 D399K(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 보다 특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 Fc 영역의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 영역의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
추가적 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
(b) Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
(b) Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 도메인.
특정 양태에서, Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 크로스-fab 단편이다. 따라서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
(b) Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스-fab 단편.
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서 VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스-fab 단편(여기서, VH-CL 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스-fab 단편(여기서, VL-CH1 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
또한, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편(여기서, Fab 단편 중 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, Fab 단편 중 나머지 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서, VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
추가적 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편(여기서, Fab 단편 중 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, Fab 단편의 나머지 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 Fab 단편(여기서, Fab 단편은 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 또는 2개의 Fab 단편은 크로스오버 Fab 단편이고, 이는 각각 VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하고, 상기 VH-CL 쇄 또는 VL-CH1 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다.
한 양태에서, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서, 상기에 정의된 (a)의 2개의 중쇄 각각은 서로, 임의적으로 펩티드 링커에 의해, 연결되는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 2개의 VH-CH1 쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다:
(a) 각각의 중쇄가 서로, 임의적으로 펩티드 링커에 의해, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 2개의 VH-CH1 쇄, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서, VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 서로, 임의적으로 펩티드 링커에 의해, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 2개의 VH-CH1 쇄, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 Fab 단편 또는 크로스-Fab 단편(여기서, Fab 또는 크로스-Fab 단편은 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 서로, 임의적으로 펩티드 링커에 의해, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 2개의 VH-CH1 쇄, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스-fab 단편(여기서, 상기 크로스-fab 단편의 VH-CL 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 서로, 임의적으로 펩티드 링커에 의해, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 2개의 VH-CH1 쇄, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스-fab 단편(여기서, 상기 크로스-fab 단편의 VL-CH1 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 중 하나 이상은 위치 123의 아미노산에 아르긴(R)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 및 위치 124의 아미노산에 리신(K)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 포함하는 CL 도메인, 및 위치 147의 아미노산에 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 및 위치 213의 아미노산에 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 포함하는 CH1 도메인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유류 세포이다.
또 다른 양태에서, 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법이 제공되되, 이는 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 상기에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 단리하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된, CD40 및 FAP에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 약제로서 사용하기 위한 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자, 또는 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물이 본 발명에 포함된다.
한 양태에서, (i) CD40 발현 항원-제시 세포(APC)에 의한 면역 자극의 유도,
(ii) 종양-특이적 T 세포 반응의 자극,
(iii) 종양 세포의 세포 자멸의 야기,
(iv) 암의 치료,
(v) 암 진행의 지연,
(vi) 암 환자의 생존 연장, 또는
(vii) 감염의 치료
에서 사용하기 위한 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다.
특정 양태에서, 암의 치료에서 사용하기 위한 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 화학 요법제, 방사선 및/또는 암 면역 요법에서 사용하기 위한 다른 제제와 조합으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 세포독성 T 세포 활성의 상향조절 또는 연장을 위한 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다.
추가적 양태에서, 본 발명은, 개체에게 유효량의 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는 개체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하거나 지연시키는 방법을 제공한다.
또한, 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료용 약제의 제조, 특히 암의 치료용 약제의 제조를 위한 상기에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자의 용도, 및 치료적 유효량의 약학적으로 허용되는 형태의 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질병의 치료 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 질병은 암이다. 상기 양태 중 임의의 하나에서, 개체는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1A 내지 1F는 인간 CD40 및 FAP에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자의 개략도를 나타낸다. 도 1A는 하나의 중쇄의 C-말단에 VH 및 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 VL을 갖는 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 1가임). 흑색 점은 놉-인투-홀 돌연변이를 상징한다. 도 1B는 중쇄의 C-말단에서 각각 융합된 2개의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+2 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 2가임). 도 1C는 하나의 중쇄의 C-말단에 VH 및 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 VL을 갖는 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 2개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 2+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 2가이고 FAP에 대해 1가임). 흑색 점은 놉-인투-홀 돌연변이를 상징한다. 도 1D는 중쇄의 C-말단에 각각 융합된 2개의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 2개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 2+2 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 2가이고 FAP에 대해 2가임). 도 1E는 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합된 하나의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 2개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 2+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 2가이고 FAP에 대해 1가임). 흑색 점은 놉-인투-홀 돌연변이를 상징한다. 도 1F는 하나의 FAP 결합 아암(arm)과 조합된 하나의 CD40 결합 아암으로 이루어진 1+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 1가이고 FAP에 대해 1가임). 흑색 점은 놉-인투-홀 돌연변이를 상징한다.
도 2A 및 2B는 FAP 음성 종양 세포(도 2A) 및 FAP 양성 종양 세포(도 2B)에 대한 FAP-표적화된 1가 또는 2가 포맷의 인간 4가 항-CD40 항체의 결합을 나타낸다. 유전자 변형된 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3-huFAP 클론 19는 고수준의 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP)을 발현하는 반면에, 모 세포주 NIH/3T3-wt는 huFAP를 발현하지 않는다. 비-FAP 표적화된 포맷은 아니되, 1 또는 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는, 4가 항-CD40 항원 결합 분자는 NIH/3T3-huFAP 세포에 효율적으로 결합한다(도 2B). 2가 FAP 구축물은 1가 구축물보다 강하게 결합한다. 대조적으로, NIH/3T3-wt 세포에 대한 FAP-표적화된 항-CD40 항체의 결합은 검출되지 않았다(도 2A). 이차 검출 항체로서 사용되는 피코에트린(PE)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI는 유세포 분석법에 의해 측정되었다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 3A 내지 3H는 1가 또는 2가 FAP-표적화된 항-CD40 구축물에 의한 인간 B 세포의 시험관내 활성화를 나타낸다. NIH/3T3-FAP 세포를 사용하여, FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2가 FAP-표적화된 분자와 유사한 B 세포 활성화 마커 발현(CD70, CD80, CD83 및 CD86) 증가를 유도하였다. 또한, FAP-표적화된 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 B 세포 활성화 마커 상향조절은 FAP-독립적 양성 대조군 항체에 의해 유도된 상향조절과 비슷했다. FAP의 부재 하에(NIH/3T3-wt 세포), B 세포 활성화 마커의 증가는 이중특이적 항원 결합 분자의 사용에 의해 관찰되지 않은 반면에, 양성 대조군 항체는 활성화 마커의 상향조절을 유도하였다. 지시된 적정된 항체와 함께 2일 동안 항온처리 후, CD70(도 3A 및 3B), CD80(도 3C 및 3D), CD83(도 3E 및 3F) 및 CD86(도 3G 및 3H) 양성 바이탈(vital) B 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. NIH/3T3-FAP 세포에 대한 효과를 각각 도 3A, 3C, 3E 및 3G에 나타낸 반면에, NIH/3T3-wt 세포에 대한 효과를 각각 도 3B, 3D, 3F 및 3H에 나타냈다.
도 4A 내지 4F 및 5A 내지 5H는 2일의 항온처리 후(도 4A 내지 4F) 또는 5일의 항온처리 후(도 5A 내지 5H) FAP-코팅되거나 코팅되지 않은 다이나비즈(Dynabeads, 등록상표)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 인간 B 세포의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드에 의한 2일의 항온처리 후에, FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2가 FAP-표적화된 분자와 유사한 B 세포 활성화 마커 발현(CD70, CD83 및 CD86) 증가를 유도하였다. 또한, FAP-표적화된 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 B 세포 활성화 마커 상향조절은 FAP-독립적 양성 대조군 항체에 의해 유도된 상향조절과 비슷하였다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 B 세포 활성화 마커의 증가는 관찰되지 않은 반면에, 양성 대조군 항체는 활성화 마커의 상향조절을 유도하였다. FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)에 의한 5일의 B 세포 항온처리 후에, FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물은 B 세포 상에 CD80 및 CD86 발현의 FAP-의존성 상향조절을 유도하였다. RO7009789 또는 교차 결합된 SGN-40에 의해 유도된 CD86의 FAP-독립적 상향조절과 비교하여, FAP-의존성 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 유도된 CD86 상향조절은 약간 낮았다. CD70 및 CD83의 경우, FAP 및 CD40을 표적화하는 이중특이적 항체에 의한 상향조절은 관찰되지 않거나 매우 제한된 상향조절만이 관찰된 반면에, 양성 대조군 항체는 이들 B 세포 활성화 마커에 대한 효과를 분명하게 나타냈다. 지시된 적정된 항체에 의한 2일 또는 5일의 항온처리 후에, CD70(각각 도 4A, 4B, 5A 및 5B), CD80(각각 도 5C 및 5D), CD83(각각 도 4C, 4D, 5E 및 5F) 및 CD86(각각 도 4E, 4F, 5G 및 5H) 양성 바이탈 B 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 6A 및 6B는 5일의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나(도 6A) 코팅되지 않은 비드(도 6B)의 존재 하에 상이한 FAP-표적화된 작용성 항-CD40 항체 및 FAP-표적화되지 않은 작용성 항-CD40 항체로 처리된 인간 B 세포의 IL-6 분비를 나타낸다. FAP의 존재 하에, 1가 및 2가 FAP-표적화된 항-CD40 항체는 FAP-독립적 양성 대조군 항체 RO7009789 및 SGN40과 유사한 증가된 IL-6 분비를 유도하였다. 대조적으로, 표적화되지 않은 음성 대조군 항체로 처리된 B 세포는 처리되지 않은 B 세포와 유사하게 낮은 IL-6 수준을 발현하였다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), IL-6 생산의 증가가 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 검출되지 않았다. ELISA에 의해 측정된, 지시된 적정된 항체에 의해 5일 동안 배양된 인간 B 세포의 상청액에서 IL-6의 양을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 7A 내지 7H는 2일의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의해 야기된 시험관내 인간 단핵구-유래된 DC(moDC)의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드의 존재 하에, FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2가 FAP-표적화된 분자와 유사한 DC 활성화 마커 발현(CD70, CD80 및 CD83) 증가를 유도한 반면에, FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), 활성화 마커 상향조절이 검출되지 않았다. 또한, FAP-표적화된 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 CD80 및 CD83의 상향조절은 FAP-독립적 양성 대조군 항체에 의해 유도된 상향조절과 비슷했다. DC 상에 CD70의 보다 높은 상향조절은 모든 다른 시험된 항체와 비교하여 RO709789의 경우 관찰되었다. 대조적으로, CD86 발현은 처리되지 않은 DC와 비교하여 상이한 항-CD40 항체와 함께 항온처리된 DC에 대해 유의미하게 변하지 않았다. 지시된 적정된 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 CD70(도 7A 및 7B), CD80(도 7C 및 7D), CD83(도 7E 및 7F) 및 CD86(도 7G 및 7H) 양성 바이탈 moDC의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 8A 및 8B는 8시간의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 HEK-블루(HEK-Blue, 상표) CD40L 세포의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드의 존재 하에, FAP에 대해 1가이고 CD40에 대해 2가인 이중특이적 항체는 FAP 및 CD40에 대해 2가인 이중특이적 항체와 유사한 SEAP 생산 증가를 유도한 반면에, FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), SEAP 생산은 검출되지 않았다. 또한, CD40에 대해 4가인 FAP-표적화된 항체에 의한 SEAP 생산의 상향조절이 FAP의 존재 하에 관찰되었다. 그러나, SEAP 생산은 또한 CD40에 대해 4가인 FAP-표적화된 항체로 처리된 리포터 세포의 상청액에서 FAP의 부재 하에 관찰되었다. FAP 결합 도메인 대신에 1 또는 2개의 DP47 도메인을 갖는 인간 CD40에 대해 4가인 음성 대조군 항체는 FAP의 존재 및 부재 하에 HEK-블루(상표) CD40L 세포에서 비슷한 SEAP 생산을 유도하였고, 양성 대조군 항체 SGN-40 + F(ab)는 FAP-코팅된 비드의 존재 하에 인간 CD40에 대해 2가 또는 4가인 FAP-표적화된 이중특이적 항체와 비교하여 유사한 수준의 SEAP를 유도하였다. 650 nm의 파장에서의 흡수를 나타냈고, 이는 SEAP에 의한 가수분해된 기질의 양과 상관관계를 보여준다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 9A 내지 9H는 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의해 활성화된 SIINFEKL-펄스화된 DC의 T 세포 프라이밍을 나타낸다. huCD40 형질전환 마우스로부터 단리되고(인간 CD40 및 마우스 CD40의 유사한 발현 패턴) 적은 양의 SIINFEKL에 의해 펄스화되고 FAP-의존성 이중특이적 항-CD40 항체 및 FAP-코팅된 비드에 의해 자극된 DC는 항원-특이적 T 세포의 강한 증식을 유도하였다. 대조적으로, FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), T 세포 증식은 FAP-표적화된 항-CD40 항체에 의해 자극된 DC에 의해 유도되지 않았다. 4개의 CD40 및 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 뮤린 또는 인간 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 자극된 DC에 의해 유도된 T 세포 증식 수준은 비슷했다. T 세포 활성화 마커 CD44 및 CD25 또는 IFNγ 생산의 유의미한 상향조절이 상이한 작용성 항-CD40 항체로 예비-자극된 DC와 함께 공동-배양된 T 세포의 경우 관찰되지 않았다. 많은 양의 SIINFEKL에 의해 펄스화된 DC만이 처리되지 않은 조건과 비교하여 이들 마커의 분명한 발현 증가를 유도하였다. 지시된 적정된 항체로 예비-항온처리된 huCD40 tg DC와 함께 공동-배양된 증식성(저-CFSE), IFNγ, CD25 및 CD44 양성 바이탈 CFSE-표지된 뮤린 CD3+CD8+ OT-1 T 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 9I 및 9J는 SIINFEKL-펄스화된 FAP-표적화된 항-CD40 항체-활성화된 DC에 의해 프라이밍된 T 세포의 상청액에서 측정된 IL-2 및 IL-12(p40)의 농도를 나타낸다. FAP의 부재 하에 FAP-표적화된 항체에 의해 예비-자극된 huCD40 tg DC와 함께 공동-배양된 OT-1 T 세포와 비교하여, OT-1 T 세포, 및 적은 양의 SIINFEKL로 펄스화되고 FAP-의존성 이중특이적 항-CD40 항체 및 FAP-코팅된 비드에 의해 자극된huCD40 tg DC의 공동-배양물에서, 증가된 IL-2 및 IL-12(p40) 수준이 검출되었다. 또한, 뮤린 2가 FAP-표적화된 항-CD40 항체는 인간 등가물 이중특이적 항원 결합 분자보다 IL-12(p40)의 현저하게 높은 분비를 유도하였다. IL-2 분비는 FAP-의존적 방식으로 항-인간 CD40 및 항-마우스 CD40 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 모두에서 유사한 정도로 증가하였다. ELISA에 의해 측정된, 지시된 적정된 항체와 함께 예비-항온처리된 huCD40 tg DC와 공동-배양된 뮤린 CD3+CD8+ OT-1 T 세포의 상청액에서 IL-2 및 IL-12(p40) 양을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 10 내지 12는 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의해 활성화된 OVA-펄스화된 DC의 T 세포 프라이밍을 나타낸다. huCD40 형질전환 마우스로부터 단리되고 DEC205-OVA 접합체로 처리되고 FAP-의존성 이중특이적 항-CD40 항체 및 FAP-코팅된 비드에 의해 자극된 DC는 항원-특이적 T 세포의 강한 증식 및 CD25 및 CD44 발현을 유도하였다. 대조적으로, FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드) 또는 OVA의 부재 하에(DEC만), T 세포 증식 및 활성화가 FAP-표적화된 항-CD40 항체에 의해 자극된 DC에 의해 유도되지 않았다. 4개의 CD40 및 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 뮤린 또는 인간 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 자극된 DC에 의해 유도된 T 세포 증식, 및 CD25 및 CD44 발현 수준은 비슷했다. 또한, DEC205-OVA 접합체 대신에 많은 양의 SIINFEKL에 의해 펄스화된 DC는 T 세포 증식 및 활성화 마커 CD25 및 CD44의 발현을 유도하였다. OVA의 존재 또는 부재 하에 지시된 적정된 항체와 함께 예비-항온처리된 huCD40 tg DC와 공동-배양된 증식성(저-CFSE)(도 10A 내지 10C), CD25(도 11A 내지 11C) 및 CD44(도 12A 내지12C) 양성 바이탈 CFSE-표지된 뮤린 CD3+CD8+ OT-1 T 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 13A 내지 13C는 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의해 활성화된 OVA-펄스화된 DC와 공동-배양된 T 세포의 상청액에서 측정된 IFNγ 수준을 나타낸다. IFNγ 수준은 FAP의 존재 하에 항-인간 CD40 FAP-표적화 항체로 처리된 DC와 공동-배양된 T 세포를 사용하는 조건에서 상승하였다(도 13A). 또한, IFNγ 분비는 FAP-의존적 방식으로 항-인간 CD40 및 항-마우스 CD40 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 모두에서 유사한 정도로 증가하였다. ELISA에서 측정된, 지시된 적정된 항체와 함께 예비-항온처리된 huCD40 tg DC와 공동-배양된 뮤린 CD3+CD8+ OT-1 T 세포의 상청액에서 IFNγ 양을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 14A 내지 14H는 2일의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 마우스 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 뮤린 B 세포의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드를 사용한 경우, FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2가 FAP-표적화된 분자와 유사한 B 세포 활성화 마커 발현(CD70, CD80 및 CD86) 증가를 유도하였다. 또한, 유의미한 B 세포 활성화 마커 상향조절이 또한 FAP-독립적 양성 대조군 항체 FGK4.5로 처리된 B 세포에 대해 관찰되었다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), B 세포 활성화 마커 CD70 및 CD80의 증가는 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 관찰되지 않았다. 대조적으로, 양성 대조군 항체는 FAP 예비-처리에 관계 없이 CD70 및 CD80의 상향조절을 유도하였다. CD86 상향조절이 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 4가 항-마우스 CD40 항체의 경우 FAP-의존성인 반면에, FAP-독립적 효과는 하나의 FAP 결합 부위만을 갖는 이중특이적 항원 결합 분자에 대해 관찰되었다. 또한, MHC-II 발현의 FAP-독립적 상향조절은 모든 시험된 이중특이적 항원 결합 분자에 대해 관찰되었다. 지시된 적정된 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 CD70(도 14A 및 14B), CD80(도 14C 및 14D), CD86(도 14E 및 14F) 및 MHCII(도 14G 및 14H) 양성 바이탈 B 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 15A 내지 15G는 인간 CD40 및 FAP 또는 DP47에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자의 개략도를 나타낸다. 도 15A는 하나의 중쇄의 C-말단에 VH 및 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 VL을 갖는 하나의 DP47 결합 모이어티와 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-DP47 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 DP47에 대해 1가임). 흑색 점은 놉-인투-홀 돌연변이를 상징한다. 도 15B는 중쇄의 C-말단에 각각 융합된 2개의 DP47 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+2 포맷의 이중특이적 CD40-DP47 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 DP47에 대해 2가임). 도 15C는 하나의 FAP 결합 아암과 조합된 하나의 CD40 결합 아암으로 이루어진 1+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 1가이고 FAP에 대해 1가임). 도 15D는 2개의 CD40 결합 아암 중 하나의 일부로서 하나의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 2개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 2+1 포맷의 예시적인 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다. 도 15E는 중쇄 중 하나의 C-말단에서 융합된 하나의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 1가임). 도 15F는 중쇄 중 하나의 C-말단에서 융합된 하나의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다. VH2a 및 VL2a CD40 결합 도메인은 사내에서 뮤린 S2C6 CD40 결합 도메인의 인간화에 의해 수득되었다. 도 15G는 중쇄 중 하나의 C-말단에서 융합된 하나의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다. VH2d 및 VL2a CD40 결합 도메인은 사내에서 뮤린 S2C6 CD40 결합 도메인의 인간화으로부터 수득되었다. 도 15H는 VL-CH1 쇄가 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된, 크로스오버 fab 단편으로서 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 2개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 2+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다. 도 15I는 VH-CL 쇄가 Fc 놉 쇄의 C-말단에서 융합된, 크로스오버 fab 단편으로서 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 2개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 2+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다.
도 16A는 모 뮤린 FGK4.5 항체(P1AD3449)를 나타낸다. 도 16B 내지 16E는 마우스 CD40 및 FAP 또는 DP47에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자의 개략도를 나타낸다. 도 16B는 하나의 중쇄의 C-말단에 VH 및 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 VL을 갖는 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 4개의 마우스 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 1가임). 흑색 점은 Fc의 DD/KK 돌연변이를 상징하고, Fc 수용체에 대한 결합은 D270A/P329G 돌연변이에 의해 억제된다. 도 16C는 중쇄의 C-말단에서 각각 융합된 2개의 FAP 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 마우스 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+2 포맷의 이중특이적 CD40-FAP 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 2가임). Fc 수용체에 대한 결합은 D270A/P329G 돌연변이에 의해 억제된다. 도 16D는 하나의 중쇄의 C-말단에 VH 및 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 VL을 갖는 하나의 DP47 결합 모이어티와 조합된 4개의 마우스 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+1 포맷의 이중특이적 CD40-DP47 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 DP47에 대해 1가임). 흑색 점은 Fc의 DD/KK 돌연변이를 상징하고, Fc 수용체에 대한 결합은 D270A/P329G 돌연변이에 의해 억제된다. 도 16E는 중쇄의 C-말단에 각각 융합된 2개의 DP47 결합 Fab 도메인과 조합된 4개의 마우스 CD40 결합 Fab 도메인으로 이루어진 4+2 포맷의 이중특이적 CD40-DP47 항체의 개략도를 나타낸다(CD40에 대해 4가이고 DP47에 대해 2가임). Fc 수용체에 대한 결합은 D270A/P329G 돌연변이에 의해 억제된다.
도 17은 FAP 양성 종양 세포에 대한 FAP-표적화된 1가 또는 2가 포맷의 인간 4가, 2가 또는 1가 항-CD40 항체의 결합을 보여준다. 유전자 변형된 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3-mFAP 세포주는 높은 수준의 뮤린 섬유아세포 활성화 단백질(mFAP)을 발현한다. 모든 도시된 구축물은 NIH/3T3-mFAP 세포에 대한 결합 강도(EC50 값 및 신호 강도)가 다르다. 비-FAP-표적화된 포맷은 아니나, 1 또는 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는, 항-CD40 항원 결합 분자(P1AD4574 및 P1AD4465)만이 효율적으로 NIH/3T3-mFAP 세포에 결합한다. C-말단 FAP 결합 도메인을 갖는 2가 FAP 구축물은 C-말단 FAP 결합 도메인을 갖는 1가 구축물보다 강하게 결합한다. 최강 FAP 결합이 1+1 포맷에 대해 관찰되었다. 이차 검출 항체로서 사용되는 피코에트린(PE)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI는 유세포 분석법에 의해 측정되었다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 18은 다우디 세포(Daudi cell)(인간 CD40의 높은 표면 발현 수준을 갖는 B 림프아세포 세포주)에 대한 FAP-표적화된 1가 또는 2가 포맷의 인간 4가, 2가 또는 1가 항-CD40 항체의 결합을 나타낸다. 모든 도시된 구축물은 CD40에 결합하나 CD40-양성 다우디 세포에 대한 결합 강도(EC50 값 및 신호 강도)가 다르다. 2가 항-CD40 항체는 4가 항-CD40 항체에 비해 보다 높은 EC50 수준을 나타내고 높은 결합 안정기에 도달한다. 최저 결합 안정기와 조합된 최고 EC50 값이 1+1 포맷에 대해 관찰되었다. 세포 표면 단백질에 대한 항-CD40 항체의 결합은 FACS 분석을 사용하여 피코에트린(PE)에 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편에 의해 검출되었다. MFI는 유세포 분석법에 의해 측정되었고 블랭크 대조군의 MFI를 감함으로써 기선 보정되었다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 19A 및 19B는 24시간의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나(도 19A) 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)(도 19B)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 HEK-블루(상표) CD40L 세포의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드의 존재 하에, FAP에 대해 1가이고 CD40에 대해 1가 또는 2가인 이중특이적 항체는 FAP 및 CD40에 대해 2가인 이중특이적 항체와 유사한 SEAP 증가를 유도한 반면에, FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), 적은 SEAP 생산이 검출되거나 검출되지 않았다. 또한, CD40에 대해 4가인 FAP-표적화된 항체에 의한 SEAP 생산의 상향조절은 FAP의 존재 하에 관찰되었다. 그러나, SEAP 생산은 또한 CD40에 대해 4가인 FAP-표적화된 항체로 처리된 리포터 세포의 상청액에서 FAP의 부재 하에 관찰되었다. FAP 결합 도메인 대신에 하나의 DP47 도메인을 갖는, 인간 CD40에 대해 4가인 음성 대조군 항체는 FAP의 존재 및 부재 하에 HEK-블루(상표) CD40L 세포에서 비슷한 SEAP 생산을 유도하였고, 양성 대조군 항체 P1AD4470 + F(ab)는 FAP-코팅된 비드의 존재 하에 인간 CD40에 대해 2가 또는 4가인 FAP-표적화된 이중특이적 항체와 비교하여 비슷한 수준의 SEAP 생산을 유도하였다. 650 nm의 파장에서 흡수를 나타냈고, 이는 SEAP에 의해 가수분해된 기질의 양과 상관관계를 보인다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. FAP-코팅된 비드의 존재 하에 HEK-블루(상표) CD40L 세포 활성화의 EC50 값을 표 11에 나타냈다. CD40에 대해 4가인 모든 시험된 항체의 EC50 값은 비슷하였고 CD40에 대해 2가인 도시된 항체의 EC50 값과 비교하여 보다 낮았다. 최고 EC50 값은 1+1 포맷에 대해 관찰되었다.
도 20A 및 20B는 2일의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나(도 20A) 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)(도 20B)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 인간 다우디 세포의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드를 사용한 경우, FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2가 FAP-표적화된 분자와 유사한 B 세포 활성화 마커 발현 CD70 증가를 유도하였다. 또한, FAP-표적화된 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 B 세포 활성화 마커 상향조절은 FAP-독립적 양성 대조군 항체에 의해 유도된 상향조절과 비교하여 보다 높았다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), CD70 증가가 CD40에 대해 1가 또는 2가인 도시된 FAP-표적화된 이중특이적 항체를 사용한 경우 관찰되지 않은 반면에, 4가 CD40 결합 분자는 CD70의 상향조절을 유도하였으나, FAP의 존재 하의 것보다 적은 정도로 유도하였다. 지시된 적정된 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 CD70 양성 바이탈 다우디 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. FAP-코팅된 비드의 존재 하에 활성화의 EC50 값을 표 9에 나타냈다. CD40에 대해 4가인 모든 FAP-표적화된 항체의 EC50 값은 비슷하였고 CD40에 대해 2가인 도시된 항체의 EC50 값에 비해 낮았다. 최고 EC50 값은 양성 대조군 항체 P1AD4470 및 1+1 포맷에 대해 검출되었다.
도 21A 및 21B는 2일의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나(도 21A) 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)(도 21B)의 존재 하에 1가 또는 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 인간 B 세포의 활성화를 나타낸다. FAP-코팅된 비드를 사용한 경우, FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2가 FAP-표적화된 분자와 유사한 B 세포 활성화 마커 발현 CD86 증가를 유도하였다. 교차 결합된 CD40 항체(P1AD4470)에 의해 유도된 CD86의 FAP-독립적 상향조절과 비교하여, FAP-의존성 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 유도된 CD86 상향조절은 약간 낮았다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), CD86 발현 증가는 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 관찰되지 않은 반면에, 양성 대조군 항체는 활성화 마커의 상향조절을 유도하였다. 지시된 적정된 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 CD86 양성 바이탈 B 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. FAP-코팅된 비드의 존재 하에 활성화의 EC50 값을 표 10에 나타냈다. CD40에 대해 4가인 모든 FAP-표적화된 항체의 EC50 값은 비슷했고 CD40에 대해 2가인 도시된 FAP-표적화된 항체의 EC50 값에 비해 보다 낮았다. 최고 EC50 값은 2+1, 2+2 및 1+1 포맷에 대해 검출되었다.
도 22A 및 22B는 FAP의 존재(도 22A) 또는 부재(도 22B) 하에 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의해 활성화된 OVA-펄스화된 DC의 T 세포 프라이밍을 나타낸다. huCD40 형질전환 마우스로부터 단리되고 DEC205-OVA 접합체로 처리되고 FAP-의존성 이중특이적 항-CD40 항체 및 FAP-코팅된 비드로 자극된 DC는 항원-특이적 T 세포의 강한 증식을 유도하였다. 대조적으로, FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), 적은 T 세포 증식 및 활성화가 FAP-표적화된 항-CD40 항체에 의해 자극된 DC에 의해 유도되거나 유도되지 않았다. 1, 2 또는 4개의 CD40 및 1 또는 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 인간 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 자극된 DC에 의해 유도된 T 세포 증식은 비슷했다. DEC205-OVA 접합체 대신에 많은 양의 SIINFEKL로 펄스화된 DC는 강한 T 세포 증식을 유도하였다. OVA의 존재 하에 지시된 적정된 항체와 함께 예비-항온처리된 huCD40 tg DC와 공동-배양된 증식성(저-CFSE) 바이탈 CFSE-표지된 뮤린 CD3+CD8+ OT-1 T 세포의 백분율을 나타냈다(도 22A 및 22B). x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 23A 내지 23E 및 24A 내지 24D는 FAP-발현 뮤린 결장 선암 종양 세포주(MC38-FAP)로 주사하고 FGK4.5(P1AD3449), FGK4.5 x FAP 4+1(P1AD4520), 또는 비히클 단독으로 처리한 마우스의 효소 혈청 수준, 체중, 비장 중량, DC 활성화 및 T 세포 증식을 나타낸다. 비-표적화된 CD40 mAb(FGK4.5)로 처리된 마우스와 대조적으로, FAP-CD40(FGK4.5) 4+1(즉, CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체)에 의한 처리는, 간 손상을 기리키는 혈청 효소의 증가가 관찰되지 않았기 때문에, 간 손상을 유도하지 않았다. 이는 군 당 3마리의 동물에 대해, 도 23A에서 알라닌 아미노 전이효소(ALT)에 대해, 도 23B에서 글루타메이트 탈수소효소(GDH)에 대해, 및 도 23C에서 솔비톨 탈수소효소(SDH)에 대해 나타냈다. 또한, 모 표적화되지 않은 CD40 항체(P1AD3449)로 처리된 마우스와 비교하여 체중 감소 없음(도 23D) 및 비장 중량의 적은 증가(도 23E)가 FGK4.5 x FAP(P1AD4520)로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 치료 주사 3일 후 종양-배수 림프절에서 DC 활성화(도 24A 및 24B) 및 치료 주사 8일 후 종양에서 T 세포 증식(도 24C 및 24D)은 비히클-처리된 동물에 비해 FGK4.5- 및 FGK4.5 x FAP 4+1-처리된 동물에서 유의미하게 증가되었다. 도 23A 내지 23C에서, y-축은 리터 당 유닛 단위의 혈청 효소 수준을 나타내고, x-축은 FGK4.5, FGK4.5 x FAP 4+1 또는 비히클 단독으로 처리된 개별적 마우스를 나타낸다. 도 23D에서, y-축은 FGK4.5, FGK4.5 x FAP 4+1 또는 비히클 단독으로 처리된 마우스의 g 단위의 체중을 나타내고, x-축은 종양 주사 후 일수를 나타낸다. 도 23E는 치료 주사 3일 후 FGK4.5, FGK4.5 x FAP 4+1 또는 비히클 단독으로 처리된 마우스의 비장 중량을 나타낸다. 도 24A 내지 24D는 각각 종양-배수 림프절에서 DC의 CD86(도 24A) 및 CD70 발현(도 24B), 및 치료 주사 3 및 8일 후 종양에서 CD8+ T 세포의 Ki67 발현(도 24C) 및 CD8+ T 세포의 총 수(도 24D)를 나타낸다. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 비대응 2-테일 스튜던트 검정).
도 25A 및 25B는 2일의 항온처리 후에 FAP-코팅되거나(도 25A 및 25C) 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)(도 25B 및 25D)의 존재 하에 2가 FAP-표적화된 인간 항-CD40 구축물에 의한 시험관내 인간 B 세포의 활성화를 나타낸다. 교차 결합된 CD40 항체(P1AA5145)에 의해 유도된 CD70 및 CD86의 FAP-독립적 상향조절과 비교하여, FAP-의존성 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 유도된 CD70 상향조절(도 25A) 및 CD86 상향조절(도 25C)은 약간 낮았다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), CD70(도 25B) 또는 CD86 발현(도 25D)은 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 관찰되지 않은 반면에, 양성 대조군 항체는 활성화 마커의 상향조절을 유도하였다. 지시된 적정된 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 CD70 또는 CD86 양성 바이탈 B 세포의 백분율을 나타냈다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에 일반적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원을 해석하기 위해서, 하기의 정의를 적용하며 적합한 경우에는 단수로 사용된 용어가 복수를 또한 포함할 것이며 이의 역도 마찬가지이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자"란 용어는 이의 가장 넓은 의미로, 항원 결정 인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인" 또는 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"란 용어는 항원 결정 인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 한 양태에서, 항원 결합 도메인은 이의 표적 세포 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 항원 결합 도메인은 이것이 부착된 독립체(예를 들어 CD40 작용제)를 표적 부위, 예를 들어 항원 결정 인자의 특정 유형을 함유하는 종양 세포 또는 종양 스트로마로 향하도록 할 수 있다. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본원에 추가로 정의되는 항체 및 이의 단편을 포함한다. 또한, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본원에 추가로 정의되는 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들어 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인을 기초로 하는 결합 도메인을 포함한다(예를 들어 WO 2002/020565 참조).
항체 또는 이의 단편과 관련하여, "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인"이란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에에 상보적인 영역을 포함하는 분자의 일부를 지칭한다. 특이적 항원 결합을 할 수 있는 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 지칭됨)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 특이적 항원 결합을 할 수 있는 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 또 다른 양태에서, "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인"은 또한 Fab 단편 또는 크로스-Fab 단편일 수 있다.
본원에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원 결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체가, 가능한 변이체 항체, 예를 들어 천연 돌연변이를 함유하거나 단클론 항체 제제의 생산 동안 발생하는 항체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정 인자(에피토프)를 향하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일의 결정 인자를 향한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단일특이적" 항체란 용어는 각각의 결합 부위가 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 상기 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다. "이중특이적"이란 용어는 항원 결합 분자가 2개 이상의 별개의 항원 결정 인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들은 각각 상이한 항원 결정 인자에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정 인자, 특히 2개의 별개의 세포상에서 발현된 2개의 항원 결정 인자에 동시에 결합할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자는 다중특이적 항체의 일부를 형성할 수 있다.
본원 내에 사용되는 바와 같은 "결합가"란 용어는 하나의 별개의 항원 결정 인자에 대해 특이적인 항원 결합 분자에서 하나의 별개의 항원 결정 인자에 대해 특이적인 명시된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, "2가", "4가" 및 "6가"란 용어는 항원 결합 분자에서 각각 특정 항원 결정 인자에 대해 특이적인 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 특정 항원 결정 인자에 대해 1가일 수 있고, 이는 이중특이적 항원 결합 분자가 상기 항원 결정 인자에 대해 단지 하나의 결합 부위를 갖는 것을 의미하거나; 이중특이적 항원 결합 분자는 특정 항원 결정 인자에 대해 2가 또는 4가일 수 있고, 이는 이중특이적 항원 결합 분자가 상기 항원 결정 인자에 대해 각각 2개의 결합 부위 또는 4개의 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
"전장 항체", "완전 항체" 및 "전체 항체"란 용어는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는 데 호환적으로 사용된다. "천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역 글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG-클래스 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)(또한 중쇄 불변 영역이라 칭한다)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 경쇄 불변 도메인(CL)(또한 경쇄 불변 영역이라 칭한다)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)라 칭하는 5가지 유형 중 하나로 할당될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 교차-Fab 단편; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 제5,571,894호 및 미국특허 제5,587,458호를 참조한다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제5,869,046호를 참조한다. 다이아바디는 2가이거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이고, 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134(2003)]에 개시되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도맨티스 인코포레이티드(Domantis, Inc., 미국 매사추세츠주 월탐 소재); 예를 들어 미국특허 제6,248,516 B1호를 참조한다). 항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli) 또는 파지)에 의한 생산에 의해 생산할 수 있다.
완전 항체의 파파인 절단은, 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 또한 상기 경쇄의 불변 도메인 및 상기 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하는, "Fab" 단편이라 칭하는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산한다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, "Fab 단편"이란 용어는 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL), 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 경쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올 기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 제공한다. 본 발명에 따라, "Fab 단편"이란 용어는 또한 하기에 정의되는 "크로스-Fab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"을 포함한다.
"크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 크로스오버 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하며 이는 본 발명의 이중특이적 항체에 포함된다: 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 교환된다, 즉 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다. 크로스오버 Fab 분자를 또한 CrossFab(VLVH)라 칭한다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환될 때, 크로스오버 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다. 크로스오버 Fab 분자를 또한 CrossFab(CLCH1)라 칭한다.
"단쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩티드며, 여기에서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기에서 상기 링커는 30개 이상의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개의 아미노산의 폴리펩티드다. 상기 단쇄 Fab 단편은 상기 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기의 삽입(예를 들어 카바트 넘버링에 따른 가변 중쇄의 위치 44 및 가변 경쇄의 위치 100)을 통해 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수도 있다.
"크로스오버 단쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩티드며, 여기에서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CL-링커-VL-CH1, 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기에서 VH 및 VL은 함께 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 여기에서 상기 링커는 30개 이상의 아미노산의 폴리펩티드이다. 또한, 이들 x-scFab 분자는 시스테인 잔기의 삽입(예를 들어 카바트 넘버링에 따른 가변 중쇄의 위치 44 및 가변 경쇄의 위치 100)을 통해 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수도 있다.
"단쇄 가변 단편(scFv)"은 10 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드와 연결된, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 대개 가요성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 용해도를 위해서 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 상기 VL의 C-말단과 연결시킬 수 있고, 이와 역으로 연결시킬 수도 있다. 상기 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 기능성 항원 결합 부위에 대해, VH 도메인의 특징을 갖거나(즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있음) VL 도메인의 특징을 갖고(즉 VH 도메인과 함께 조립될 수 있음), 이에 따라 전장 항체의 항원 결합 트성을 제공할 수 있는 단쇄 폴리펩티드를 포함한다.
"스캐폴드 항원 결합 단백질"은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 피브로넥틴 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 항원 결합 도메인에 대한 대체 스캐폴드로서 사용되었다, 예를 들어 문헌[Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)] 및 문헌[Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)]을 참조한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 스캐폴드 항원 결합 단백질은 CTLA-4(에비바디(Evibody)), 리포칼린(안티칼린(Anticalin)), 단백질 A-유래된 분자, 예를 들어 단백질 A의 Z-도메인(애피바디(Affibody)), A-도메인(애비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)), 혈청 트랜스페린(트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인(단일-도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인(나노바디, VH), VNAR 단편, 피브로넥틴(애드넥틴(AdNectin)), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 신규의 항원 수용체 베타-락타마제의 가변 도메인(VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴(애필린(Affilin) 분자); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, 마이크로바디, 예를 들어 크노틴과로부터의 단백질, 펩티드 앱타머 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. CTLA-4(세포독성 T 림프구-연관 항원 4)는 주로 CD4+ T 세포 상에 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인, 예컨대 Ig 폴드를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성을 부여하도록 이종 서열로 치환될 수 있다. 또한, 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 에비바디로서 공지되어 있다(예를 들어 US 7,166,697 B1). 에비바디는 항체의 단리된 가변 영역(예를 들어 도메인 항체)과 거의 동일한 크기의 것이다. 추가적 세부 사항을 위해, 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조한다. 리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들어 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 상기는 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 단부에 다수의 루프를 갖는 강성의 베타-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린은 160 내지 180 아미노산 크기이며 리포칼린으로부터 유래된다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US 7,250,297 B1 및 US 2007/0224633을 참조한다. 애피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 도메인은 약 58개의 아미노산의 3-나선형 번들로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위화에 의해 생산된다. 추가적 세부사항을 위해, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462] 및 EP 1641818A1을 참조한다. 애비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중 도메인 단백질이다. 약 35개의 아미노산의 천연 도메인은 한정된 다이설파이드 결합된 구조를 채택한다. 다양성은 A-도메인의 패밀리에 의해 나타나는 천연 변형의 셔플링에 의해 생성된다. 추가적 세부사항을 위해, 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)] 및 [Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조한다. 트랜스페린은 단량체성 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린은 허용(permissive) 표면 루프에서 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스-바디(Trans-body)를 포함한다. 추가적 세부사항을 위해, 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조한다. 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)은 내재 막 단백질의 세포골격에 대한 부착을 매개하는 단백질의 패밀리인 안키린으로부터 유래된다. 단일 안키린 반복부는 2개의 알파-나선 및 베타-회전으로 이루어지는 33 잔기 모티프이다. 상기를 각 반복부의 제1 알파-나선 및 베타-회전 중의 잔기를 무작위화함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작할 수 있다. 이들의 결합 접촉면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(친화도 성숙화 방법). 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)] 및 문헌[J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US 2004/0132028A1을 참조한다. 단일 도메인 항체는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어지는 항체 단편이다. 제1 단일 도메인은 카멜리드의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유래되었다(나노바디 또는 VHH 단편). 또한, 단일 도메인 항체란 용어는 자율적인 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 상어로부터 유래된 VNAR 단편을 포함한다. 파이브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴은 인간 파이브로넥틴 유형 III(FN3)의 15개의 반복 단위의 제10 도메인의 천연 아미노산 서열의 주쇄로 이루어진다. 베타-샌드위치의 하나의 말단에서 3개의 루프는, 애드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가적 세부사항을 위해, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)], US 2008/0139791, WO 2005/056764 및 US 6,818,418 B1을 참조한다. 펩티드 압타머는 활성 부위에서 삽입된 강요된 가변 펩티드 루프를 함유하는 불변 스캐폴드 단백질, 전형적으로 티오레독신(TrxA)으로 이루어진 결합된 인식 분자이다. 추가적 세부사항을 위해, [Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조한다. 마이크로바디는 3 내지 4개의 시스테인 가교를 함유하는 25 내지 50개의 아미노산 길이의 천연 마이크로 단백질로부터 유래된다 - 마이크로 단백질의 예는 KalataBI, 코노톡신 및 노틴(knottin)을 포함한다. 마이크로 단백질은 마이크로 단백질의 전체 폴드에 영향을 주지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 포함한다. 조작된 노틴 도메인의 추가적 세부사항을 위해, WO 2008/098796을 참조한다.
참조 분자로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 분석에서 이의 항원에 대한 상기 참조 분자의 결합을 50% 이상만큼 차단하는 항원 결합 분자를 지칭한다, 환언하면 상기 참조 분자는 경쟁 분석에서 이의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상만큼 차단한다.
"항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 부위"란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보성인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 상기 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분을 에피토프라 칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인(또한 가변 영역이라 칭한다)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 결정 인자"란 용어는 "항원" 및 "에피토프"와 유의어이며, 항원 결합 모이어티가 결합하여, 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자상의 부위(예를 들어 아미노산의 연속적인 신장부 또는 비-연속적인 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체형태적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원 결정 인자는 예를 들어 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 유용한 단백질은 달리 표시되지 않는 한, 임의의 척추동물 공급원, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정한 단백질을 참조하는 경우, 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 단백질뿐만 아니라, 세포 중에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 단백질의 천연 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택성이며 불필요하거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정한 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(비아코어(BIAcore) 장비상에서 분석된다)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는 예를 들어 SPR에 의해 측정되는 바와 같이 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, 항원에 결합하는 분자는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 짝(예를 들어 항원)간의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어 항체와 항원)간의 1:1 상호작용을 반영하는 천연의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 짝 Y에 대한 친화도를 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 상수는 해리속도 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화도는 상기 속도 상수의 비가 동일하게 남아있는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화도를 본원에 기재된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화도의 특정한 측정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"친화도 성숙된" 항체는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도 개선을 야기한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "표적 세포 항원"은 표적 세포, 특히 종양의 표적 세포, 예컨대 암 세포 또는 종양 스트로마의 세포의 표면 상에 존재하는 항원 결정 인자를 지칭한다. 따라서, 표적 세포 항원은 종양-연관 항원이다. 특히, 표적 세포 항원은 활성화된 T 세포 상의 면역 관문 수용체, 예컨대 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 종양 세포의 표면 상의 항원이다. 한 양태에서, 종양 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 암태아성항원(CEA), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장인자 수용체(EGFR), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 종양 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다.
용어 "섬유아세포 활성화 단백질(FAP)"(프롤릴 엔도펩티다제 FAP 또는 세프라제(EC 3.4.21)로도 공지됨)은, 달리 지시되지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어 인간), 비-인간 영장류(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FAP를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 FAP, 및 세포에서의 처리로부터 야기된 임의의 형태의 FAP를 포괄한다. 상기 용어는 또한 FAP의 천연 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 시노몰구스 FAP에 특이적으로 결합할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt(www.uniprot.org) 등록번호 Q12884(버전 149, 서열번호 2), 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에 나타나 있다. 인간 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26에서 760까지이다. His-태그된 간 FAP ECD의 아미노산 서열은 서열번호 142에 나타나 있다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 UniProt 등록번호 P97321(버전 126, 서열번호 143), 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에 나타나 있다. 마우스 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26에서 761까지이다. 서열번호 144는 His-태그된 마우스 FAP ECD의 아미노산을 나타낸다. 서열번호 145는 His-태그된 시노몰구스 FAP ECD의 아미노산을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일의 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "초가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연의 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 상기 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고의 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재한다. (문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102의 아미노산 잔기에 존재한다. (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 초가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭하며, 이들 용어는 상기 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분을 참조하여 본원에서 호환적으로 사용된다. 상기 특정한 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재되었으며, 여기에서 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있도록 되어있다. 상기 인용된 각각의 참고문헌에 의해 정의되는 바와 같은 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 A에 제시한다. 특정한 CDR을 포함하는 정확한 잔기 숫자는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 어느 잔기가 상기 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 제공한 특정한 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의1
Figure 112019111985212-pct00001
카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 한정한다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 "카바트 넘버링" 시스템을 상기 서열 자체에서 벗어난 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 임의의 가변 영역 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "카바트 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역 중의 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 상기 카바트 넘버링 시스템에 따른다.
VH의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이적 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약기된-CDR, 또는 a-CDR이라 칭하는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102 아미노산 잔기에 존재한다. (문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]을 참조한다). 달리 표시하지 않는 한, 가변 도메인의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본원에서 상기 카바트 등에 따라 넘버링한다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"키메라" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 서브클래스(동형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역 글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화된 항체는 하나 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것에 상응하며, FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 원래 항체의 경우로부터 추가로 변형되거나 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 것이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외시킨다.
본원에서 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는 데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 대개 약 231번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 340번 위치의 아미노산 잔기까지 연장된다. 하나의 실시양태에서, 탄수화물 쇄가 CH2 도메인에 부착된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변형 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역의 CH2 도메인에 C-말단인 잔기의 신장부(즉 IgG의 약 341번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 447번 위치의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변형 CH3 도메인(예를 들어 이의 하나의 쇄 중에 도입된 "돌기"("놉") 및 이의 다른 쇄 중에 도입된 상응하는 "공동"("홀")을 갖는 CH3 도메인)일 수 있다; 명백히 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제5,821,333호를 참조한다). 상기와 같은 변형 CH3 도메인을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 2개의 일치하지 않는 항체 중쇄의 이종 이량체화를 촉진할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다.
"놉-인투-홀" 기술은 예를 들어 미국특허 제5,731,168호; 미국특허 제7,695,936호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동 내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩티드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩티드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 제1 폴리펩티드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 티로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구성된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체시킴으로써 제2 폴리펩티드의 접촉면에 생성된다. 돌기 및 공동을, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이 유도에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변경시킴으로써 제조할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 놉 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하며, 홀 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 추가의 특정한 실시양태에서, 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 S354C를 추가로 포함하고, 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C를 추가로 포함한다. 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교를 형성시키고, 따라서 이량체를 더욱 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
"면역 글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역"은 면역 글로불린의 Fc 영역의 천연 대립유전자 변이체뿐만 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 생성시키지만 효과기 기능(예를 들어 항체-의존성 세포 세포독성)을 매개하는 면역 글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변경을 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 생물학적 기능의 실질적인 상실 없이 면역 글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실시킬 수 있다. 상기와 같은 변이체를 활성에 대해 최소의 영향을 미치도록 당해 분야에 공지된 일반적인 법칙에 따라 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)]을 참조한다).
"효과기 기능"이란 용어는, 항체 동형에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적인 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향조절, 및 B 세포 활성화.
Fc 수용체 결합-의존성 효과기 기능은 항체의 Fc 영역과 Fc 수용체(FcR)(조혈 세포 상의 특화된 세포 표면 수용체) 사이의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역 글로불린 상과에 속하고, 항체-의존성 세포-매개된 세포 독성(ADCC)을 통해, 면역 복합체의 식세포 작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 상응하는 항체로 코팅된 적혈구 및 다양한 기타 세포 표적(예를 들어 종양 세포)의 용해 모두를 매개하는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌[Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524] 참조). FcR은 면역 글로불린 동형에 대한 이들의 특이성에 의해 정의된다: IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로 지칭된다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]; [Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34]; [de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341]; 및 [Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248]에 기재되어 있다.
IgG 항체의 Fc 영역에 대한 수용체(FcγR)의 교차 결합은 식세포 작용, 항체-의존성 세포 독성 및 염증 매개체의 방출, 뿐만 아니라 면역 복합체 클리어런스 및 항체 생산의 조절을 포함하는 다양한 효과기 기능을 촉발한다. 인간에게서, FcγR의 3개의 부류는 하기와 같이 특성규명되었다:
- FcγRI(CD64)은 고친화도에 의해 단량체성 IgG와 결합하고 대식 세포, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. 적어도 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링) 중 하나에서 Fc 영역 IgG의 변형은 FcγRI에 대한 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4로 치환된, 위치 233 내지 236의 IgG2 잔기는 103-배만큼 FcγRI에 대한 결합을 감소시켰고 항체-민감화된 적혈구에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다(문헌[Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624]).
- FcγRII(CD32)는 저친화도에 의해 복합화된 IgG에 결합하고 널리 발현된다. 이러한 수용체는 2개의 하위유형인 FcγRIIA 및 FcγRIIB로 나눠질 수 있다. FcγRIIA는 사멸에 수반되는 많은 세포(예를 들어 대식 세포, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되고 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB는 억제 과정에서 역할을 하는 것으로 보이고 B 세포, 대식 세포, 비만 세포 및 호산구 상에서 발견된다. B 세포 상에서, 이는 추가적 면역 글로불린 생산 및 예를 들어 IgE 클래스로의 동형 교환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식 세포 상에서, FcγRIIB는 FcγRIIA를 통해 매개되는 식세포 작용을 억제하는 작용을 한다. 호산구 및 비만 세포 상에서, B-형태는 개별적 수용체에 대한 IgE 결합을 통한 이들 세포의 활성화를 억제하는 것을 보조할 수 있다. FcγRIIA에 대한 감소된 결합은 예를 들어 적어도 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링) 중 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc 영역을 포함하는 항체의 경우 발견된다.
- FcγRIII(CD16)은 중간 내지 낮은 친화도에 의해 IgG에 결합하고 2개의 유형으로 존재한다. FcγRIIIA는 NK 세포, 대식 세포, 호산구 및 일부 단핵구, 및 T 세포 상에서 발견되고 ADCC를 매개한다. FcγRIIIB는 호중구 상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA에 대한 감소된 결합은 예를 들어 적어도 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링) 중 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc 영역을 포함하는 항체의 경우 발견된다.
Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 맵핑, 상기에 언급된 돌연변이 부위 및 FcγRI 및 FcγRIIA에 대한 결합 측정 방법은 문헌[Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]에 기재되어 있다.
용어 "ADCC" 또는 "항체-의존성 세포 독성"은 Fc 수용체 결합에 의해 매개되는 기능이고 효과기 세포의 존재 하에 본원에서 보고된 바와 같이 항체에 의한 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC를 매개하는 초기 단계를 유도하는 항체의 능력은 Fcγ 수용체 발현 세포, 예컨대 FcγRI 및/또는 FcγRIIA를 재조합 발현하는 세포, 또는 NK 세포(본질적으로 FcγRIIIA를 발현함)에 대한 이의 결합을 측정함으로써 조사된다. 특히, NK 세포 상에서 FcγR에 대한 결합이 측정된다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 결합 후에 효과기 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), 및 FcαRI(CD89)를 포함한다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa이다(UniProt 등록번호 P08637, 버전 141을 참조한다).
본원에 사용되는 바와 같은 "CD40"이란 용어는 달리 지시되지 않는 한 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원, 예컨대 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 천연의 CD40을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 CD40뿐만 아니라 세포에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 CD40을 포함한다. 상기 용어는 또한 CD40의 천연 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적 인간 CD40의 아미노산 서열은 서열번호 1(Uniprot P25942, 버전 200)에 나타나 있고, 예시적 마우스 CD40의 아미노산 서열은 서열번호 146(Uniprot P27512, 버전 160)에 나타나 있다. CD40 항원은 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R) 패밀리에 속하는 50 kDa 세포 표면 당단백질이다. (문헌[Stamenkovic et al. (1989), EMBO J. 8: 1403-10]). CD40은 B 림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식 세포, 흉선 상피, 내피 세포, 섬유아세포 및 연성 근육 세포를 포함하는 많은 정상 및 종양 세포 유형에서 발현된다. CD40은 B-림프종에서 및 모든 고형 종양 중 70%에서 발현되고 성숙 신호, 예컨대 IFN-감마 및 GM-CSF에 의해 항원 제시 세포(APC)에서 상향조절된다. 또한, CD40 활성화는 기능적 수지상 세포(DC)로 단핵구의 분화를 유도하고 APC-CD40 유도된 시토카인을 통해 NK 세포의 세포 용해 활성을 향상시킨다. 따라서, CD40은 APC의 성숙, 헬퍼 시토카인의 분비, 공자극 분자의 상향조절 및 효과기 기능의 향상을 유도함으로써 면역 반응의 개시 및 향상에서 필수적 역할을 한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "CD40 작용제"라는 용어는 CD40/CD40L 상호작용에 작용하는 임의의 모이어티를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 CD40은 바람직하게는 인간 CD40을 지칭하고, 따라서 CD40 작용제는 바람직하게는 인간 CD40의 작용제이다. 전형적으로, 모이어티는 작용성 CD40 항체 또는 항체 단편일 것이다.
"항-CD40 항체", "항-CD40", "CD40 항체" 및 "CD40에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어는, 항체가 CD40 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 CD40과 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 양태에서, 관련되지 않은, 비-CD40 단백질에 대한 항-CD40 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 유세포 분석법(FACS)에 의해 측정시 CD40에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, CD40에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-6 M 이하, 예를 들어 10-68 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-8 M 내지 10-10 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"펩티드 링커"란 용어는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커이며, 여기에서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4, 특히 2의 수이다, 즉 상기 펩티드는 GGGGS(서열번호 147) GGGGSGGGGS(서열번호 148), SGGGGSGGGG(서열번호 149) 및 GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 150)로 이루어지는 군으로부터 선택될 뿐만 아니라 서열 GSPGSSSSGS(서열번호 151), (G4S)3(서열번호 152), (G4S)4(서열번호 153), GSGSGSGS(서열번호 154), GSGSGNGS(서열번호 155), GGSGSGSG(서열번호 156), GGSGSG(서열번호 157), GGSG(서열번호 158), GGSGNGSG(서열번호 159), GGNGSGSG(서열번호 160) 및 GGNGSG (서열번호 161)를 포함한다. 특히 관심 펩티드 링커는 (G4S)(서열번호 147), (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS(서열번호 148), (G4S)3(서열번호 152) 및 (G4S)4(서열번호 153)이다.
본원 내에 사용된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 나타낸다.
"융합된" 또는 "연결된"은 성분(예를 들어 항체의 중쇄 및 Fab 단편)이 펩티드 결합에 의해, 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합됨을 의미한다.
참조 폴리펩티드(단백질) 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열을 정렬시킨고 갭을 도입한 후에, 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN. SAWI 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 서열을 정렬시키기에 적합한 매개변수, 예를 들어 비교하는 서열의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 이증특이적 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체를, 상기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실 및/또는 서열 내로의 잔기의 삽입 및/또는 서열 내에서 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구축물에 도달하도록 수행할 수 있으되, 최종 구축물은 목적하는 특징, 예를 들어 항원 결합성을 가져야 한다. 치환 돌연변이 유도를 위한 관심 부위는 HVR 및 골격(FR)를 포함한다. 보존적 치환을 표 B에서 "바람직한 치환"의 제목 하에 제공하고 아미노산 측쇄 클래스 (1) 내지 (6)을 참조하여 하기에 추가로 기재한다. 아미노산 치환을 관심 분자에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
[표 B]
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아미노산을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스에 대해 교환함을 수반할 것이다.
"아미노산 서열 변이체"란 용어는 모 항원 결합 분자(예를 들어 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기 중에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성되는 변이체는 모 항원 결합 분자에 비해 몇몇 생물학적 특성(예를 들어 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항원 결합 분자의 몇몇 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체이며, 이는 편의상 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것을 사용하여 생산될 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항원 결합 분자를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 선별한다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 발명에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)를 HVR에서 수행할 수 있다. 돌연변이 유도를 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham and Wells(1989) Science 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이 유도"라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)의 잔기 또는 기가 확인되며 이들을, 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 항원-항원 결합 분자 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환용 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를, 상기 변이체는, 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 본 발명의 이중적이적 항원 결합 분자를 포함한다. 상기 분자의 다른 삽입 변이체는 이중특이적 항원 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 상기 분자의 글리코실화 변이체를 편의상, 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 획득할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TNF 패밀리 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에서 올리고사카라이드의 변형은 몇몇 개선된 특성을 갖는 변이체를 생산하기 위해 수행될 수도 있다. 하나의 양태에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 변이체가 제공된다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 미국 특허 공보 제 US 2003/0157108(Presta, L.) 또는 US 2004/0093621(교와 하코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 변이체는 이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 것을 제공한다. 상기와 같은 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US 2005/0123546(Umana et al.)을 참조한다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체가 또한 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있으며, 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al.); WO 1998/58964(Raju, S.); 및 WO 1999/22764(Raju, S.)에 개시되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자의 시스테인 조작된 변이체, 예를 들어 상기 분자의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, 치환된 잔기는 분자의 접근 가능한 부위에 존재한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생산할 수 있다. 특정 양태에서, 하기의 잔기 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카바트 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항원 결합 분자를 예를 들어 미국특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"란 용어는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 전령 RNA(mRNA), 바이러스-유래된 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어 아미드 결합, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 아미드 결합)을 포함할 수 있다. "핵산 분자"란 용어는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된 벡터 중에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 이의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소일 수 있거나 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열에 적어도, 예를 들어 95% "일치하는" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고, 상기 참조 서열과 일치함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 상기 참조 서열 중 뉴클레오티드의 5% 이하를 결실시키거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환하거나 상기 참조 서열 중 전체 뉴클레오티드의 5% 이하의 뉴클레오티드의 수를 상기 참조 서열 내에 삽입할 수 있다. 참조 서열의 이러한 변경은 참조 서열의 잔기들간에 개별적으로 또는 참조 서열 내 하나 이상의 연속적인 그룹 중에 산재된, 상기 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 상기 말단 위치 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 실용적인 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는지의 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 것(예를 들어 ALIGN-2)을 사용하여 측정될 수 있다.
"발현 카세트"란 용어는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서도 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 "발현 구축물"과 유의어이며 특정한 유전자를 상기가 표적 세포와 작동적으로 관련되도록 도입시키고 이의 발현을 지시하는 데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 내에 통합된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 상기 발현 벡터가 표적 세포 내에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 상기 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으나, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는 데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하나, 또한 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
제제의 "유효량"은 제제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 생성시키기에 필요한 양을 지칭한다.
제제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료 유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 제제의 치료 유효량은 예를 들어 질병의 부작용을 제거하거나 감소시키거나 지연시키거나 최소화하거나 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 상기 개체 또는 대상체는 인간이다.
"약학 조성물"이란 용어는, 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고 제형이 투여되는 개체에게 허용되지 않는 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 부형제"는 활성 성분 외에, 개체에게 무독성인 약학 조성물의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 비제한적으로 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
"패키지 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적인 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 이의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개인의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적이거나 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 분자를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦춘다.
본원에 사용되는 바와 같은 "암"이란 용어는 증식성 질병, 예컨대 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경관 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계(CNS) 신생물, 척추 종양, 뇌줄기 신경교종, 다형성 신경교아종, 별아교세포종, 신경초종, 뇌실막종, 수아세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종(임의의 상기 암의 난치 버전을 포함함) 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "화학 요법제"란 용어는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 한 양태에서, 화학 요법제는 항대사물질이다. 한 양태에서, 항대사물질은 아미노페린(Aminopterin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 페메트렉시드(Pemetrexed), 랄티트렉시드(Raltitrexed), 클라드리빈(Cladribine), 클로파라빈(Clofarabine), 플루다라빈(Fludarabine), 머캅토푸린(Mercaptopurine), 펜토스타틴(Pentostatin), 티오구아닌(Thioguanine), 카페시타빈(Capecitabine), 시타라빈(Cytarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 플록수리딘(Floxuridine) 및 젬시타빈(Gemcitabine)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 항대사물질은 카페시타빈 또는 젬시타빈이다. 또 다른 양태에서, 항대사물질은 플루오로우라실이다. 한 양태에서, 화학 요법제는 미세관 형성에 영향을 미치는 제제이다. 한 양태에서, 미세관 형성에 영향을 미치는 제제는 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbin), 탁소텔(taxotere), 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 화학 요법제는 알킬화제, 예컨대 사이클로포스파미드이다. 한 양태에서, 화학 요법제는 세포독성 항생제, 예컨대 토포이소머라제(토포이소머라제) II 억제제이다. 한 양태에서, 토포이소머라제 II 억제제는 독소루비신이다.
본 발명의 이중특이적 항체
본 발명은 특히 유리한 특성, 예컨대 생산성, 안정성, 결합 친화도, 생물학적 활성, 표적화 효율, 감소된 독성, 및 환자에게 제공될 수 있연장된 투여량 범위 및 이에 따라 향상된 효능을 갖는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
예시적 이중특이적 항원 결합 분자
한 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 영역.
특정 양태에서, 이들 이중특이적 항원 결합 분자는 CD40에 대한 표적화된 작용성 결합을 특징으로 한다. 특히, 이중특이적 항원 결합 분자는 종양 연관된 표적 세포 항원에 대해 표적화된 CD40 작용제이다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 효과기 기능을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 영역을 포함한다. 효과기 기능을 감소시키거나 무효화시키는 돌연변이를 포함하는 Fc 영역의 사용은 Fc 수용체를 통한 교차 연결에 의해 비특이적 작용을 방지하고 CD40+ 세포의 ADCC를 방지할 것이다.
본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포(전형적으로 암 세포 또는 종양 스트로마임)에서 면역 반응을 선택적으로 유도한다는 점에 있어서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 종래 항체에 비해 유리점을 갖는다. 한 양태에서, 종양-연관된 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장인자 수용체(EGFR), 암태아성항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 종양-연관된 표적 세포 항원은 FAP이다.
이들 이중특이적 항원 결합 분자는 CD40에 대한 FAP-표적화된 작용성 결합을 특징으로 한다. FAP-발현 세포의 존재 하에, 이중특이적 항원 결합 분자는 항원 제시 세포(APC, 실시예 2.1), 인간 B 세포(실시예 2.1.1 및 2.1.3), 인간 다우디 세포(실시예 2.1.2) 및 인간 단핵구-유래된 수지상 세포(moDC, 실시예 2.1.4)를 활성화시킬 수 있다.
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 (iv) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다.
추가적 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173 및 서열번호 174로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177 및 서열번호 178로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(b) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(c) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(d) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(e) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(f) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(g) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(h) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(i) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(j) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(k) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(l) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(m) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(n) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(o) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
(p) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40).
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(b) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(c) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(d) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(e) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(f) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(g) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(h) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(i) 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(j) 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
(k) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
(l) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하거나, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
표적 세포 항원이 FAP인 이중특이적 항원 결합 분자
특정 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. FAP 결합 모이어티는 그 전체가 참고로 포함된 WO 2012/02006에 기재되어 있다. 특히 관심있는 FAP 결합 모이어티는 하기에 기재된다.
한 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 여기서 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 여기서 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 하기를 포함한다:
(a) (i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP).
특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 중쇄 가변 영역(VHFAP)은 (i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역(VLFAP)은 (iv) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 또 다른 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함한다.
추가적 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 (b) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함한다.
한 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
CD40 및 FAP에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 25, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 26, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
추가적 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
특정 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
또 다른 특정 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 179 또는 서열번호 182의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인.
추가적 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서
(i) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또한, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서
(i) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서
(i) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서
(i) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이중특이적 1가 항원 결합 분자(1+1 포맷)
한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 상기 분자는 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 표적 세포 항원은 FAP이다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 25, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 26, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편.
한 양태에서, 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄(HC1), 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄(HC2), 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 및 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 25, 서열번호 33, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 26, 서열번호 34, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편.
하나의 특정 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편.
특정 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다: (i) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, 및 (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편.
또 다른 특정 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다: (i) 서열번호 179 또는 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40) 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, 및 (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편.
특정 양태에서, 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄(HC1), 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄(HC2), 서열번호 165의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 및 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
CD40에 대한 결합에 대해 2가이고 표적 세포 항원에 대한 결합에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자(2+1 포맷)
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 항원 결합 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인.
따라서, CD40에 대해 2가 이고 표적 세포 항원에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) VH 도메인 및 VL 도메인이 각각 상기 2개의 중쇄의 C-말단 중 하나에 펩티드 링커를 통해 연결되는, VH 및 VL 도메인.
특정 양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 152 및 서열번호 153으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 보다 특히, 펩티드 링커는 서열번호 153을 포함한다.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인(여기서 VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 제2 중쇄의 C-말단에 연결된다).
또 다른 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인(여기서, VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 연결되고, VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 홀 중쇄의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인(여기서, VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 연결되고, VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 홀 중쇄의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다:
(a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편, 및
(b) Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 도메인.
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서 VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서, VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
특히, VH 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP)이고, VL 도메인은 서열번호 10 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)이다. 보다 특히, VH 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP)이고, VL 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)이다.
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 또는
(b) 각각 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄.
또 다른 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편(여기서, Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 상기 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 Fab 단편(여기서, Fab 단편은 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
특히, 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편은 크로스오버 fab 단편이다.
한 양태에서, 본 발명은 각각 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 1개의 경쇄, 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
추가적 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스오버 fab 단편(여기서, VH-CL 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, VH-CL 쇄는 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 연결된다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스오버 fab 단편(여기서, VL-CH1 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, VL-CH1 쇄는 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 연결된다.
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 1개의 경쇄, 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄,
(b) 각각 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 1개의 경쇄, 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄,
(c) 각각 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 1개의 경쇄, 제 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄,
(d) 각각 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 1개의 경쇄, 서열번호 255의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 또는
(e) 각각 서열번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 1개의 경쇄, 제 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄.
헤드-투-테일(head-to-tail) 포맷(2+1)의 이중특이적 항원 결합 분자
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는 중쇄,
(b) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는 중쇄,
(c) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(d) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄.
특히, 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 각각 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 및 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
CD40에 대한 결합에 대해 2가이고 표적 세포 항원에 대한 결합에 대해 2가인 이중특이적 항원 결합 분자(2+2 포맷)
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인.
따라서, CD40에 대해 2가이고 표적 세포 항원에 대해 2가인 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편(여기서, Fab 단편 중 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, Fab 단편의 나머지 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다).
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄,
각각 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 및
각각 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 또는
(b) 각각 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄,
각각 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 및
각각 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄.
CD40에 대한 결합에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대한 결합에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자(4+1 포맷)
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 도메인,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 항원 결합 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인.
따라서, CD40에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 도메인은 Fab 단편이고, 이 중 각각의 2개는, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 중쇄에서 서로 융합된다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 특히, 항원 결합 분자는 각각 VHCH1-펩티드 링커-VHCH1 단편을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 148의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL 도메인을 포함하고, VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결된다.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(a) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄,
(b) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄, 및
(c) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인(여기서, VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 제2 중쇄의 C-말단에 연결된다).
특정 양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 152 및 서열번호 153으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 보다 특히, 펩티드 링커는 서열번호 153을 포함한다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 경쇄가 서열번호 26, 서열번호 34, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, 4개의 경쇄,
(b) 각각의 중쇄가 VH-CH1-VH-CH1 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하고, 모든 VH 도메인이 서열번호 25, 서열번호 33, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40)을 포함하는, 2개의 중쇄, 및
(c) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인(여기서, VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 제2 중쇄의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편, (b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특히, VH 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP)이고, VL 도메인은 서열번호 10 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)이다. 보다 특히, VH 도메인 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP)이고, VL 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)이다.
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 4개의 경쇄, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 또는
(b) 각각 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 4개의 경쇄, 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 뮤린 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 4개의 경쇄, 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄.
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄,
(b) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 Fab 단편(여기서, Fab 단편은 (b)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
특히, 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편은 크로스오버 fab 단편이다.
한 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 Fab 단편(여기서, Fab 단편은 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
특히, 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편은 크로스오버 fab 단편이다.
추가적 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄(여기서, VL은 서열번호 26, 서열번호 34, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다), 및
(b) 각각의 중쇄가 VH-CH1-VH-CH1 쇄 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는 2개의 중쇄(여기서, 모든 VH 도메인은 서열번호 25, 서열번호 33, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40)을 포함한다), 및
(c) VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스오버 fab 단편(여기서, VH-CL 쇄는 (b)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, VH-CL 쇄는 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 연결된다.
추가적 양태에서, 하기를 포함하는이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 4개의 경쇄(여기서, VL은 서열번호 26, 서열번호 34, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함한다), 및
(b) 각각의 중쇄가 VH-CH1-VH-CH1 쇄 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는 2개의 중쇄(여기서, 모든 VH 도메인은 서열번호 25, 서열번호 33, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40)을 포함한다), 및
(c) VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스오버 fab 단편(여기서, VL-CH1 쇄는 (b)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다).
한 양태에서, VL-CH1 쇄는 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 연결된다.
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 각각 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 4개의 경쇄, 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 경쇄, 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄,
(b) 각각 서열번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 경쇄, 서열번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄,
(c) 각각 서열번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 경쇄, 서열번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 또는
(d) 각각 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 경쇄, 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄.
CD40에 대한 결합에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대한 결합에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자(4+2 포맷)
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 도메인,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인.
따라서, CD40에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 2가인 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 항원 결합 도메인은 Fab 단편이고, 이 중 각각 2개는, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 서로 융합된다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 특히, 항원 결합 분자는 각각 VHCH1-펩티드 링커-VHCH1 단편을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 148의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 여기서 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 Fab 단편이고, 제1 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, 제2 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결된다. 한 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편은 각각 VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하는 크로스오버 Fab 단편이고, VL-CH1 쇄는 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다.
특정 양태에서, 본 발명은 각각 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 4개의 경쇄, 각각 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 4개의 경쇄, 각각 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는, 뮤린 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생산할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
Fc 도메인은 표적 조직에서 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 특성을 본 발명의 이중특이적 항체에게 부여한다. 그러나, 동시에, 이는 바람직한 항원-함유 세포보다는 Fc 수용체 발현 세포에 본 발명의 이중특이적 항체를 바람직하지 않게 표적화하는 것을 야기할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 천연 IgG Fc 도메인, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 보다 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다.
하나의 이러한 양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)은 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타내고/나타내거나 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 한 양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도 않는다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 억제성 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 억제성 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIB이다. 한 양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 시토카인 분비 중 하나 이상이다. 특정 양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 한 양태에서, Fc 도메인 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대해 실질적으로 유사한 결합은 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화도의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 보다 특히 약 90% 초과를 나타내는 경우 달성된다.
특정 양태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 한 양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 또 다른 양태에서, 아미노산 돌연변이는 2-배 이상, 5-배 이상 또는 10-배 이상만큼 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 한 양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체와 비교하여 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 다른 양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 억제성 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 억제성 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIB이다. 일부 양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합은 감소된다. 일부 양태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다. 한 양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소하지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합(즉, 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존)은 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태(또는 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화도의 약 70% 초과를 나타내는 경우 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 이러한 친화도의 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체-의존성 세포 독성(CDC), 감소된 항체-의존성 세포-매개된 세포 독성(ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식세포 작용(ADCP), 감소된 시토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 활용, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식 세포에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 세포 자멸을 유도하는 감소된 직접 신호전달, 감소된 수지상 세포 성숙 또는 감소된 T 세포 프라이밍.
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다(US 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 7,332,581). FcR에 대한 개선되거나 약화된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다(예를 들어 US 6,737,056; WO 2004/056312 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]).
본 발명의 한 양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A("LALA")를 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적 양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서의 아미노산 치환 및 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S로 이루어진 군으로부터 선택된 추가적 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 WO 2012/130831 A1에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 폐지한다. 또한, 상기 문헌은 이러한 돌연변이체 Fc 도메인의 생산 방법 및 이의 특성, 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능의 결정 방법을 기재한다. 이러한 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A 또는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 IgG1이다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]).
한 양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 넘버링)에서의 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E, S228P 및 P329G를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이러한 아미노산 치환은 생체내 IgG4 항체의 Fab 아암 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조).
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 개선된 결합(모 IgG의 태아로의 이동을 담당함)(문헌[Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593], 및 [Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434])을 갖는 항체는 US 2005/0014934에 기재되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다(US 7,371,826). 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740]; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
Fc 수용체에 대한 결합을 예를 들어 ELISA에 의해서 또는 비아코어 장비(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))와 같은 표준 장비를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 Fc 수용체 자체를 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 적합한 이러한 결합 분석이 본원에 기재되어 있다. 대안적으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화도를 특정한 Fc 수용체, 예를 들어 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다. Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예는 미국특허 제5,500,362호; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국특허 제5,821,337호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.) 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조한다). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
하기 섹션은 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 바람직한 양태를 기재한다. 한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한, 특히 Fcγ 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 상기 Fc 도메인은 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 양태에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다.
이종 이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원 결합 부위를 포함하며, 따라서, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄 중에 포함될 수 있다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공-발현 및 후속 이량체화는 상기 두 폴리펩티드의 다수의 가능한 조합을 도출한다. 따라서, 재조합체 생성에서 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시키기 위해서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입시키는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인에 있다.
특정한 양태에서, 상기 변형은 소위 "놉-인투-홀" 변형으로, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 "놉" 변형 및 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 "홀" 변형을 포함한다. 따라서, 본 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 놉-인투-홀 방법에 따라 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 홀을 포함한다. 특정한 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들어 미국특허 제5,731,168호; 미국특허 제7,695,936호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동 내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩티드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩티드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 제1 폴리펩티드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 티로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구축된다. 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체시킴으로써 제2 폴리펩티드의 접촉면에 생성된다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체시키고, 이에 의해 제2 서브유닛의 CH3 도메인내의 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌기를 생성시키고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체시키고, 이에 의해 제1 서브유닛의 CH3 도메인내의 돌기가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 공동을 생성시킨다. 상기 돌기 및 공동은, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이 유도에 의해서, 또는 펩티드 합성에 의해서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써 생산될 수 있다. 특정한 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 366번 위치의 트레오닌 잔기를 트립토판 잔기로 교체시키고(T366W), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 407번 위치의 티로신 잔기를 발린 잔기로 교체시킨다(Y407V). 하나의 양태에서, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서, 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 교체시키고(T366S) 368번 위치의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 교체시킨다(L368A).
또 다른 추가의 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 교체시키고(S354C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 티로신 잔기를 시스테인 잔기로 교체시킨다(Y349C). 이들 두 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 서브유닛간에 다이설파이드 가교를 형성시키며, 이는 상기 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15]). 특정한 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366S(EU 넘버링)를 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
대안적 양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은 예를 들어 WO 2009/089004에 기재된 바와 같은 정전기적 조타 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 접촉면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기에 의해 교체시킴을 수반함으로써 동종이량체 형성은 정전기적으로 불리하게 되지만 이종 이량체화는 정전기적으로 유리하게 된다.
본원에 보고된 바와 같은 이중특이적 항체의 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결되는 완전한 C-말단일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C-말단 아미노산 잔기 중 하나 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 중쇄의 C-말단은 PG로 종결되는 단축된 C-말단이다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태 중 하나의 양태에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체는 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태 중 하나의 실시양태에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체는 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
Fab 도메인의 변형
한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 Fab 단편 중 하나에서 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 교환된다. 이중특이적 항체는 크로스맵 기술에 따라 생산된다.
하나의 결합 아암에 도메인 교체/교환을 갖는 다중특이적 항체(CrossMabVH-VL 또는 CrossMabCH-CL)가 WO 2009/080252 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191]에 상세히 기재되어 있다. 이는 제1 항원에 대한 경쇄와 제2 항원에 대한 틀린 중쇄와의 오합치에 의해 야기되는 부산물을 명백히 감소시킨다(상기와 같은 도메인 교환이 없는 접근법에 비해).
한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, Fab 단편 중 하나에서 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교환되어 CH1 도메인이 경쇄의 일부이고, CL 도메인이 중쇄의 일부이다. 보다 특히, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교환되어 CH1 도메인은 경쇄의 일부이고, CL 도메인은 중쇄의 일부이다.
특정 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교환되어 CH1 도메인은 경쇄의 일부이고, CL 도메인은 중쇄의 일부이다. 이러한 분자는 1가 이중특이적 항원 결합 분자로 지칭된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다: (a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및 (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편(여기서, 상기 추가적 Fab 단편은 각각 펩티드 링커를 통해 (a)의 중쇄의 C-말단에 연결된다). 특정 양태에서, 추가적 Fab 단편은, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 교체되어 VH 도메인이 경쇄의 일부이고 VL 도메인이 중쇄의 일부인, Fab 단편이다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및 (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편은 크로스오버 Fab 단편이고, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고, VL-CH 쇄는 펩티드 링커를 통해 (a)의 중쇄의 C-말단에 각각 연결된다.
또 다른 양태에서, 정확한 페어링을 추가로 개선하기 위해, (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 하전된 아미노산 치환(소위 "하전된 잔기")을 함유할 수 있다. 이들 변형은 교차되거나 교차되지 않은 CH1 및 CL 도메인에 도입된다. 특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서 CL 도메인 중 하나에서 위치 123(EU 넘버링)의 아미노산은 아르긴(R)으로 교체되었고 위치 124(EU 넘버링)의 아미노산은 리신(K)으로 교체되었고, CH1 도메인 중 하나에서 위치 147(EU 넘버링)의 및 위치 213(EU 넘버링)의 아미노산은 글루탐산(E)으로 교체되었다.
예시적인 본 발명의 항체
한 양태에서, 본 발명은 CD40에 특이적으로 결합하는 새로운 항체 및 항체 단편을 제공한다. 이들 항체는 공지된 CD40 항체에 비해 우수한 특성을 가져 이들 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 또 다른 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자 내로 혼입에 특히 적합하게 만든다. 새로운 항체는 이들 항체가 많은 양으로 높은 역가를 가지도록 생산가능하거나, 이들 항체가 높은 열적 안정성을 갖거나(응집 온도(Tagg)에 측정됨), 이들 항체가 높은 정도의 인간성을 갖고 따라서 인간 신체에서 덜 면역성일 수 있다는 것을 추가로 특징으로 한다. 인간 생식 세포계열 서열과 비교된 VH 및 VL 서열의 인간성 백분율은 문헌[Abhinandan, K. R. and Martin, Andrew C. R. 2007, J. Mol. Biol. 2007, 369, 852-862]에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다. 상응하는 데이터를 표 24 및 25에 나타냈다.
한 양태에서, 하기를 포함하는, CD40에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다:
(i) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(v) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vi) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vii) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(viii) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ix) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(x) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(xi) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(xii) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(xiii) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(xiv) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(xv) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(xvi) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL.
또 다른 양태에서, CD40에 특이적으로 결합하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체가 제공되되, 여기서 상기 항체는 상기에 정의된 (i) 내지 (xv)의 중쇄 가변 영역 VH 및 경쇄 가변 영역 VL 중 임의의 것을 포함한다.
한 양태에서, CD40에 특이적으로 결합하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항제가 제공되되, 여기서 상기 항체는 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
추가적 양태에서, 하기를 포함하는, CD40에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다:
(i) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(v) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vi) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vii) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(viii) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL.
또 다른 양태에서, CD40에 특이적으로 결합하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체가 제공되되, 여기서 상기 항체는 상기에 정의된 (i) 내지 (viii)의 중쇄 가변 영역 VH 및 경쇄 가변 영역 VL 중 임의의 것을 포함한다.
한 양태에서, CD40에 특이적으로 결합하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체가 제공되되, 여기서 상기 항체는 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다. 특히, 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는 CD40에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 전체 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 또는 공-발현되는 다수의(예를 들어 2개 이상의) 폴리뉴클레오티드로서 발현시킬 수 있다. 공-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 회합하여 기능성 항원 결합 분자를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린의 경쇄 부분은 상기 면역 글로불린의 중쇄 부분으로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현시, 상기 중쇄 폴리펩티드는 상기 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 면역 글로불린을 형성할 것이다.
일부 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 본 발명에 따른 이중특이적 분자에 포함되는 폴리펩티드를 암호화한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어 전령 RNA(mRNA)의 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들어 재조합 생산에 의해 수득할 수 있다. 재조합체 생산을 위해서 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 폴리뉴클레오티드 단편이 제공된다. 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 단리되고, 숙주 세포에서 추가적 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 종래의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 당해 분야의 숙련가에게 주지된 방법을 사용하여 적합한 전사/번역 조절 신호와 함께 상기 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기법을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분 또는 핵산 단편일 수 있다. 상기 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 카세트 내로 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 함께 작동가능하게 회합되어 클로닝된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈으로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, (존재하는 경우) 암호화 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있고, 임의의 인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역 등은 암호화 영역의 부분이 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어 단일 벡터 상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어 별도의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더욱 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유하거나 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있으며, 이는 단백질 분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 함께 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 항체 또는 이의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 비제한적으로 전문화된 요소 또는 모티프, 예를 들어 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동성 회합은 유전자 산물의 암호화 영역, 예를 들어 폴리펩티드가, 상기 유전자 산물의 발현을 조절 서열의 영향 또는 통제 하에 두는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 회합하는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩티드 암호화 영역 및 상기와 회합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 생성시키고 상기 두 DNA 단편간의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 회합된다". 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 회합될 것이다. 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 회합되어 세포-특이적 전사를 지시할 수 있다.
적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역을 본원에 개시한다. 다양한 전사 조절 영역이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스로부터의 프로모터 및 인핸서 분절(예를 들어 인트론-A와 함께, 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어 라우스 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 a-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소가 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)가 있다. 상기 발현 카세트는 또한 다른 특징, 예를 들어 복제 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-회합된 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역을 분비 또는 신호 펩티드(본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시한다)를 암호화하는 추가적인 암호화 영역과 회합시킬 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 상기 핵산 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 상류에 둘 수 있다. 상기 신호 가설에 따라, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 거친 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 수출이 개시되었으면, 성숙한 단백질로부터 절단된 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드(이는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성시킨다)를 가짐을 안다. 일부 실시양태에서, 천연의 신호 펩티드, 예를 들어 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 상기와 작동적으로 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 유지하는 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드, 또는 이의 기능성 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환시킬 수 있다.
나중의 정제를 촉진하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 또는 융합 단백질의 표지화를 지원하는 데 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA를, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 상기의 단부에 포함시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 특징 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 통합할 수 있다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자(의 부분)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 단편을 생산하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 지칭한다. 항원 결합 분자를 복제하고 이의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 주지되어 있다. 상기와 같은 세포를 특정한 발현 벡터로 적합하게 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기의 시딩을 위해 증식시켜 임상용으로 충분한 양의 항원 결합 분자를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드를, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우, 세균 중에 생산할 수 있다. 발현 후에, 상기 폴리펩티드를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적이거나 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 진균 및 효모 균주가 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다.
(글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제5,959,177호, 미국특허 제6,040,498호, 미국특허 제6,420,548호, 미국특허 제7,125,978호 및 미국특허 제6,417,429호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조한다. 척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76), 인간 경부암종 세포(HELA), 개 신장세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포(W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방 종양세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 단지 몇 개를 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배신장(HEK) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 이들 시스템에서 외래 유전자를 발현시키는 표준 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 면역 글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를, 상기 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 면역 글로불린이도록 상기 면역 글로불린 쇄의 다른 하나를 또한 발현하도록 조작할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 생산 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 발현에 적합한 조건하에서 본원에 제공된 바와 같이 배양하고, 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 회수함을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 생산된 본 발명의 이중특이적 분자를 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의존할 것이며, 이는 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서 상기 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 융합 단백질의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 연속적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 필수적으로 실시예에 기재된 바와 같이 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. 상기 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 주지된 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 이중특이적 항원 결합 분자는 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 온전하며 적합하게 조립된 것으로 나타났다.
분석
본원에 제공된 항원 결합 분자는 당분야에 공지된 다양한 분석에 의해 이의 결합 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성규명될 수 있다. 특히, 이는 실시예에 보다 상세히 기재되는 분석에 의해 특성규명된다.
1. 결합 분석
상응하는 표적 발현 세포에 대한 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 발현하는 뮤린 섬유아세포 세포주 및 유세포 분석법(FACS)을 사용하여 평가될 수 있다. CD40에 대한 본원에 제공된 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 실시예 4.2.8에 기재된 바와 같이 Raji 세포에 의해 결정될 수 있다.
2. 활성 분석
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 생물학적 활성에 대해 시험된다. 생물학적 활성은 이중특이적 항원 결합 분자의 효능 및 특이성을 포함할 수 있다. 효능 및 특이성은 표적 항원의 결합시 CD40 수용체를 통한 작용성 신호전달을 보여주는 분석에 의해 입증된다. 또한, 시험관내 T 세포 프라이밍 분석은 이중특이적 항원 결합 분자와 함께 항온처리된 수지상 세포(DC)를 사용하여 수행된다.
약학 조성물, 제형 및 투여 경로
추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어 하기의 치료 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자 및 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 유효량의, 약학적으로 허용되는 부형제 중에 용해되거나 분산된 하나 이상의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉 적합한 대로 동물, 예를 들어 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 본 발명에 따른 하나 이상의 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이 본원에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 특히, 상기 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 바와 같은 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어 항균제, 항진균제), 등장성제, 염, 안정화제 및 이들의 조합을 포함한다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충제 중에서 제형화할 수 있다. 상기 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열성 물질 제거수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 항원 결합 분자를 필요에 따라, 하기에 열거되는 다양한 다른 성분과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조에 사용하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조이다. 상기 액체 매질을 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제를 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/㎎ 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 희석제는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 상기 현탁액의 점도를 개선시키는 화합물, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 제제를 함유할 수 있다. 추가로, 상기 활성 화합물의 현탁액을 적합한 대로 유성 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 발생될 수 있다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 부형제는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.)를 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 양태에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국특허 제6,267,958호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제6,171,586호 및 WO 2006/044908에 개시된 것을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
앞서 기재된 조성물 외에, 항원 결합 분자를 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 융합 단백질을 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용되는 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와, 또는 드물게 용해성인 유도체, 예를 들어 드물게 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 상기 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 변한다.
이중특이적 항원 결합 분자를 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 상기는 산 부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노 기에 의해 형성되거나 무기산(예를 들어 염산 또는 인산) 또는 유기산(예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산)에 의해 형성되는 것을 포함한다. 유리 카복시 기에 의해 염은 또한 무기염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
본원의 조성물은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 바와 같은 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분은 적합하게는 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자는 치료 방법에 사용될 수 있다. 치료 방법에서 사용하기 위해, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 타당한 의료 행위에 부합하는 방식으로 제형화되고 투여되고 투약될 수 있다. 이에 있어서 고려 인자는 치료할 특정 장애, 치료 받을 특정 포유동물, 개별적 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가적 양태에서, (i) CD40+ 항원-제시 세포(APC)에 의한 면역 자극의 유도, (ii) 종양-특이적 T 세포 반응의 자극, (iii) 종양 세포의 세포 자멸의 야기, (iv) 암의 치료, (v) 암 진행의 지연, (vi) 암 환자의 생존 연장, (vii) 감염의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 양태에서, 질병의 치료에서 사용하기 위한, 특히 암의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양태에서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은, 치료적 유효량의 이중특이적 항원 결합 분자를 질병을 앓는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 앓는 개체를 치료 하는 방법에서 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 치료할 질병은 암이다. 치료가 필요한 대상체, 환자 또는 "개체"는 전형적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
한 양태에서, i) CD40+ 항원-제시 세포(APC)에 의해 면역 자극을 유도하는 방법, (ii) 종양-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법, (iii) 종양 세포의 세포 자멸을 야기하는 방법, (iv) 암을 치료하는 방법, (v) 암 진행을 지연시키는 방법, (vi) 암 환자의 생존을 연장시키는 방법, 또는 (vii) 감염의 치료 방법이 제공되되, 여기서 상기 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 방법을 포함한다.
추가적 양태에서, 본 발명은 암의 치료가 필요한 개체에서 암의 치료용 약제의 제조 또는 조제에서 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 약제는 질병을 앓는 개체에게 치료적 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 특정 양태에서, 치료할 질병은 증식성 장애, 특히 암이다. 암의 예는 비제한적으로 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피 세포 암종, 골암 및 신장암을 포함한다. 암의 다른 예는 암종, 림프종(예를 들어 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애는 비제한적으로 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연성 조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계에 위치된 신생물을 포함한다. 또한, 전암 상태 또는 병소 및 암 전이가 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신세포암, 피부암, 폐암, 대장암, 유방암, 뇌암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 숙련가는 많은 경우에서 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체가 치유를 제공하지 않을 수 있으나 이점을 제공할 수 있음을 용이하게 인지한다. 일부 양태에서, 몇몇 이점이 있는 생리학적 변화가 또한 치료적으로 유익한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 양이 "유효량" 또는 "치료적 유효량"으로 간주된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 추가적 치료제와 조합으로 사용될 때)은 치료할 질병의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 특정 분자, 질병의 중증도 및 추이, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 예방적 목적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 현재 치료적 개입, 환자 병력 및 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 담당의의 재량에 좌우될 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어떤 경우에도 조성물에서 활성 성분의 농도 및 개별적 개체를 위한 적절한 투여량을 결정할 것이다. 비제한적으로 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 적합하게 환자에게 1회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.1 내지 10 mg/kg)의 이중특이적 항원 결합 분자가 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기에 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 며칠 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 상태에 따라, 목적하는 질병 증상의 억제가 발생할 때까지 치료가 일반적으로 지속될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 예시적 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg 범위일 수 있다. 다른 예에서, 투여량은 또한 투여 당 약 1 μg/kg 체중, 약 5 μg/kg 체중, 약 10 μg/kg 체중, 약 50 μg/kg 체중, 약 100 μg/kg 체중, 약 200 μg/kg 체중, 약 350 μg/kg 체중, 약 500 μg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중 내지 약 1000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에 추론될 수 있는 임의의 범위를 포함한다. 본원에 열거된 수로부터 추론될 수 있는 범위의 예에서, 상기에 기재된 수를 근거하여 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 5 μg/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중 범위 등이 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 1주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회의 투여량의 융합 단백질을 제공 받는다). 특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 3주마다 투여될 것이다. 보다 높은 적재량의 초기 투여량 후에 1회 이상의 보다 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 양생법이 유용할 수 있다. 이러한 치료의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질병 상태의 치료 또는 예방을 위해 사용하기 위해, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 약학 조성물은 치료적 유효량으로 투여되거나 적용된다. 치료적 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용을 고려하여 당업자의 능력 내에 있다. 전신 투여를 위해, 치료적 유효 투여량은 시험관내 분석, 예컨대 세포 배양 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 투여량은 세포 배양에서 결정되는 IC50을 포함하는 순환 농도를 달성하도록 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확히 결정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 초기 투여량은 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터 당분야에 주지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 당업자는 동물 데이터를 기반으로 인간 투여량을 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 양 및 간격은 치료적 효과를 유지하는 데 충분한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 일반적 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.1 내지 1 mg/kg/일 범위이다. 치료적 유효 혈장 수준은 매일 다중 투여량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장 수준은 예를 들어 HPLC에 의해 측정될 수 있다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 연관되지 않는다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료적 유효 국소 투여량을 최적화할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 치료적 유효 투여량은 일반적으로 상당한 독성을 야기하지 않고 치료적 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구는 LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 투여량)를 결정하는 데 사용될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 투여량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기에 적합한 투여량 범위를 정하는 데 사용될 수 있다. 투여량은 바람직하게는 적은 독성과 함께 또는 독성 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 속한다. 투여량은 다양한 인자, 예를 들어 사용된 투여량 형태, 사용된 투여 경로, 개체 상태 등에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별적인 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 융합 단백질로 치료 받는 환자의 담당의는 독성, 기관 기능장애 등에 의해 투여를 어떻게 언제 종결하거나 중단하거나 조절하는 지를 알 것이다. 반대로, 담당의는 또한 임상적 반응이 적절하지 않은 경우 보다 높은 수준으로 치료를 조절하는 것을 알 것이다(독성 방지). 관심 장애의 관리에서 투여된 투여량의 규모는 치료할 질환의 중증도, 투여 경로 등에 따라 변할 것이다. 질환의 중증도는 예를 들어 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 투여량 및 투여량 빈도는 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변할 것이다.
다른 제제 및 치료
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 치료법에서 하나 이상의 다른 제제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 하나 이상의 추가적인 치료제와 공-투여할 수 있다. "치료제"란 용어는 상기와 같은 치료가 필요한 개인에서 증상 또는 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 상기와 같은 추가적인 치료제는 치료할 특정 적응증에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가적 치료제는 또 다른 항암제, 예를 들어 미세관 교란체, 항대사물질, 토포이소머라제 억제제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나제 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포 자멸의 활성화제, 혈관신생 억제제이다. 특정 양태에서, 추가적 치료제는 면역 조절제, 세포 정지제, 세포 부착 억제제, 세포 독성제 또는 세포 정지제, 세포 자멸 활성화제, 또는 세포 자멸 유도제에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 제제이다.
따라서, 암의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이를 포함하는 약학 조성물이 제공되되, 여기서 이중특이적 항원 결합 분자는 화학 요법제, 방사선 및/또는 암 면역 요법에서 사용하기 위한 다른 제제와 조합으로 투여된다.
상기와 같은 다른 제제는 의도된 목적에 유효한 양으로 함께 적합하게 존재한다. 상기와 같은 다른 제제의 유효량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 변한다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 적합한 것으로 경험상/임상적으로 결정된 임의의 투여량으로 임의의 경로에 의해 사용된다.
상기에 나타낸 상기와 같은 병용 요법은 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함된다), 및 별도 투여를 포함하며, 어느 경우든, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여에 앞서, 상기 투여와 동시에 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자이다.
상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택된 질환의 치료에 사용되는 지를 지시한다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 내부에 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다); 및 (b) 내부에 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가적 세포독성제 또는 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서, 제조 물품은 상기 조성물이 특정 질환을 치료할 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
[표 C]
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하기 번호 매긴 문단은 제1 우선권 출원에 따른 본 발명의 양태를 기재한다:
1. (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자.
2. (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 영역
을 추가로 포함하는 문단 1의 이중특이적 항원 결합 분자.
3. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 결합하는, 문단 1 또는 2의 이중특이적 항원 결합 분자.
4. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인인, 문단 1 내지 3 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
5. FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 결합하는, 문단 1 또는 2의 이중특이적 항원 결합 분자.
6. FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
(a) (i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함하는, 문단 1 내지 5 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
7. FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는
(b) 서열번호 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역(VLFAP)
을 포함하는, 문단 1 내지 6 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
8. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, 문단 1 내지 7 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
9. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 (i) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 (iv) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (vi) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, 문단 1 내지 7 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
10. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
(a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
(b) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL
을 포함하는, 문단 1 내지 9 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
11. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
(i) 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
(ii) 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)
을 포함하는, 문단 1 내지 8 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
12. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 문단 1 내지 8 및 11 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
13. (i) 서열번호 25, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 26, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및
(ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP), 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인
을 포함하는 문단 1 내지 8 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
14. Fc 영역이 IgG, 특히 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역인, 문단 2 내지 13 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
15. Fc 영역이 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 문단 2 내지 14 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
16. Fc 영역이 (i) 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스, 또는 (ii) 아미노산 돌연변이 D265A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 마우스 IgG1 서브클래스의 것인, 문단 2 내지 15 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
17. Fc 영역이 Fc 영역의제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함하는, 문단 2 내지 16 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
18. 놉-인투-홀 방법에 따라 Fc 영역의 제1 서브유닛이 놉을 포함하고 Fc 영역의 제2 서브유닛이 홀을 포함하는, 문단 2 내지 17 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
19. (i) Fc 영역의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 S354C 및 T366W(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 영역의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하거나,
(ii) Fc 영역의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 K392D 및 K409D(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하고, Fc 영역의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 E356K 및 D399K(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하는,
문단 2 내지 18 중 어느 하나의 이중특이적 항체.
20. (a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
(b) Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 도메인
을 포함하는 문단 1 내지 19 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
21. (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서 VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다)
을 포함하는 문단 1 내지 19 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
22. (a) CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편(여기서, Fab 단편 중 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, Fab 단편의 나머지 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다)
을 포함하는 문단 1 내지 19 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
23. (a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 VH 및 VL(여기서, VH는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, VL은 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다)
을 포함하는 문단 1 내지 19 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
24. (a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편(여기서, Fab 단편 중 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되고, Fab 단편의 나머지 하나는 (a)의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 C-말단에 연결된다)
을 포함하는 문단 1 내지 19 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
25. (a) 각각의 중쇄가 CD40에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 VH 및 CH1 도메인, 및 Fc 영역 서브유닛을 포함하는, 2개의 중쇄,
(b) 각각의 경쇄가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 VL 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 경쇄, 및
(c) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 Fab 단편(여기서, Fab 단편은 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결된다)
을 포함하는 문단 1 내지 19 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
26. FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 또는 2개의 Fab 단편이 크로스오버 Fab 단편이고, 각각은 VL-CH1 쇄 및 VH-CL 쇄를 포함하며, 상기 VL-CH1 쇄는 (a)의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 연결되는, 문단 22 내지 25 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
27. 이중특이적 항원 결합 분자가 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편을 포함하는 문단 1 내지 26 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
28. (a)의 2개의 중쇄 각각이 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편의 2개의 VH 및 2개의 CH1 도메인을 포함하는, 문단 23 내지 27 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
29. CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 중 하나 이상이
위치 123의 아미노산에 아르긴(R)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 및 위치 124의 아미노산에 리신(K)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 포함하는 CL 도메인, 및
위치 147의 아미노산에 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 및 위치 213의 아미노산에 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)을 포함하는 CH1 도메인
을 포함하는, 문단 23 내지 28 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자.
30. 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
31. 문단 30의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
32. 문단 30의 폴리뉴클레오티드 또는 문단 31의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
33. 문단 32의 숙주 세포를 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 배양시키는 단계, 및 이중특이적 항원 결합 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법.
34. 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
35. 약제로서 사용하기 위한 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물.
36. (i) CD40+ 항원-제시 세포(APC)에 의한 면역 자극의 유도,
(ii) 종양-특이적 T 세포 반응의 자극,
(iii) 종양 세포의 세포 자멸의 야기,
(iv) 암의 치료,
(v) 암 진행의 지연,
(vi) 암 환자의 생존 연장, 또는
(vii) 감염의 치료
에서 사용하기 위한 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물.
37. 암의 치료에서 사용하기 위한 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물.
38. 암의 치료용 약제의 제조에서 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물의 용도.
39. 암을 앓는 개체에게 유효량의 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 개체를 치료하는 방법.
40. 세포독성 T 세포 활성의 상향조절 또는 연장에서 사용하기 위한 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물.
41. 이중특이적 항원 결합 분자가 화학 요법제, 방사선 및/또는 암 면역 요법에서 사용하기 위한 다른 제제와 조합으로 투여되는, 암의 치료에서 사용하기 위한 문단 1 내지 29 중 어느 하나의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 문단 34의 약학 조성물.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태를 실행할 수 있음이 이해된다.
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역 글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석에 의해 측정하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 분절을 적합한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성시키거나, 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 진아트 아게(Geneart AG, 독일 로젠스부르크 소재)에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 입수할 수 없는 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 가까운 상동체로부터의 서열에 기반하여 설계하고 적합한 조직으로부터 기원하는 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 측면에 인접한 유전자 분절을 표준 클로닝/서열분석 벡터 내에 클로닝하였다. 상기 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광학에 의해 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 분절을 각각의 발현 벡터 내로의 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위로 설계하였다. 모든 구축물을 진핵생물 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-단부 DNA 서열로 설계하였다.
단백질 정제
단백질을 표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히, 항체를 단백질 A 세파로스(Sepharose) 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용시키고 PBS로 세척하였다. 항체의 용출을 pH 2.8에서 성취한 다음 샘플을 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS 중에서 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스(Superdex) 200, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체로부터 분리시켰다. 단량체성 항체 분획을 모으고, 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고(필요한 경우), 동결시키고 -20℃ 또는 -80℃에서 저장하였다. 상기 샘플의 부분을 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분광분석법에 의한 후속의 단백질 분석 및 분석학적 특성규명을 위해 제공하였다.
SDS-PAGE
NuPAGE(등록상표) Pre-Cast 젤 시스템(인비트로젠(Invitrogen))을 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 노벡스(Novex, 등록상표) 비스-트리스 Pre-Cast 젤(pH 6.4) 및 NuPAGE(등록상표) MES(환원된 젤, NuPAGE(등록상표) 산화방지제 러닝 완충제 첨가제와 함께) 또는 MOPS(환원되지 않은 젤) 러닝 완충제를 사용하였다.
CE-SDS
이중특이적 항체 및 대조군 항체의 순도, 항체 온전성 및 분자량을 미세 유체 랩칩(Labchip) 기술(캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science, 미국 소재))을 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 5 μl의 단백질 용액을 제조사의 지시에 따라 HT 단백질 발현 시약 키트를 사용하여 CE-SDS 분석을 위해 제조하고 HT 단백질 발현 칩을 사용하여 랩칩 GXII 시스템 상에서 분석하였다. 데이터를 랩칩 GX 소프트웨어 버전 3.0.618.0을 사용하여 분석하였다.
분석학적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머성 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 간단히, 단백질 A 정제된 항체를 에이질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템 상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중의 토소(Tosoh) TSKgel G3000SW 컬럼에 또는 다이오넥스(Dionex) HPLC-시스템 상에서 2xPBS 중의 수퍼덱스(수퍼덱스) 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용시켰다. 상기 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량분석하였다. 바이오래드(BioRad) 젤 여과 표준 151-1901은 표준으로서 작용하였다.
질량 분광분석법
본 섹션은 올바른 조립체를 강조하면서 VH/VL 또는 CH/CL 교환을 갖는 다중특이적 항체(CrossMab)를 기재한다. 예상되는 1차 구조물을 탈글리코실화된 완전한 CrossMab 및 탈글리코실화된/FabALACTICA 또는 대안적으로 탈글리코실화된/GingisKHAN 절단된 CrossMab의 전기분무 이온화 질량 분광분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
상기 CrossMab를 1 ㎎/㎖의 단백질 농도에서 17시간 이하 동안 37℃에서 포스페이트 또는 트리스 완충제 중의 N-글리코시다제로 탈글리코실화시켰다. 상기 FabALACTICA 또는 GingisKHAN(제노비스 에이비(Genovis AB, 스웨덴 소재)) 절단을 100 ㎍ 탈글리코실화된 CrossMab을 사용하여 공급자에 의해 제공된 완충제에서 수행하였다. 질량 분광분석에 앞서, 상기 샘플을 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서 HPLC를 통해 탈염시켰다. 총 질량을 트라이벌사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 소스(애드비온(Advion))가 구비된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달토닉(Bruker Daltonik)) 상에서 ESI-MS를 통해 측정하였다.
실시예 1
CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 이중특이적 구축물의 생성 및 생산
1.1 CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자의 생성
항-CD40 바인더의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 암호화하는 cDNA(WO 2006/128103의 서열번호 10 및 서열번호 16)를 적합한 발현 플라스미드에서 인간 IgG1의 상응하는 불변 중쇄 또는 경쇄에 의해 인 프레임 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터 및 CMV 인핸서 요소에 의해 구동시켰다. 또한, 발현 카세트는 cDNA의 3' 단부에서 합성 폴리A 신호를 함유하였다. 또한, 플라스미드 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 복제 기점(EBV OriP)을 가졌다. CD40 mAb 및 FAP mAb의 가변 도메인의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 표 1 및 2에 나타냈다.
다양한 이중특이적 CD40-FAP 항체를, Fc의 C-말단에 1 또는 2개의 FAP 결합 아암과 조합된 4개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 4+1 및 4+2 포맷, 또는 Fc의 C-말단에 1 또는 2개의 FAP 결합 아암과 조합된 2개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 2+1 및 2+2 포맷으로 생산하였다(도 1A 내지 1D). FAP 바인더 28H1의 생성 및 생산이 본원에 참고로 포함된 WO 2012/020006 A2에 기재되어 있다. 4+1 및 2+1 분자를 생성하기 위해, 놉-인투-홀 기술을 사용하여 이종 이량체화를 달성하였다. S354C/T366W 돌연변이를 제1 중쇄 HC1(Fc 놉 중쇄)에 도입하고, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 제2 중쇄 HC2(Fc 홀 중쇄)에 도입하였다. 4+2 및 2+2 분자에서, WO 2010/145792 A1에 기재된 CrossMab 기술은 정확한 경쇄 페어링을 보장하였다. 이중특이적 포맷과는 관계 없이, 모든 경우에서, WO 2012/130831 A1에 기재된 방법에 따라 효과기 사일런트 Fc(P329G; L234, L235A)를 사용하여 Fcγ 수용체에 대한 결합을 없앴다. 이중특이적 분자의 서열을 표 3 및 4에 나타냈다.
인간 수용체를 표적화하는 분자 외에, 대리 분자를 또한 뮤린 항원을 인식하는 동일한 포맷으로 생성하였다. 이러한 경우, 4+1 분자의 이종 이량체화를 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010,19637-19646]에 기재된 방법에 따라 Fc에서 DD/KK 돌연변이(제1 중쇄에 Lys392Asp 및 Lys409Asp 도입 및 제2 중쇄에 Glu356Lys 및 Asp399Lys 돌연변이 도입)에 의해 달성한 반면에, Fc 수용체에 대한 결합은 문헌[Baudino et al., J. Immunol. (2008), 181, 6664-9] 또는 WO 2016/030350 A1에 기재된 방법에 따라 D270A/P329G 돌연변이에 의해 억제되었다.
모든 유전자를 CMV 프로모터 인핸서 단편과 조합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 제어 하에 일시적으로 발현시켰다. 발현 벡터는 또한 EBNA(엡스타인 바 바이러스 핵 항원)-함유 숙주 세포에서 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유하였다.
[표 1]
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[표 2]
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[표 3]
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[표 4]
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1.2 CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자의 생산
분자를, 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유류 발현 벡터에 의해 현택액에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시키거나 eviFECT를 사용하여 포유류 발현에 의해 현탁액에서 성장하는 CHO K1 세포를 공동-형질감염시킴으로써 생산하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
HEK293 EBNA 세포에서의 생산을 위해, HEK293 EBNA 세포를, 6 mM L-글루타민 및 250 mg/L G418을 함유하는 엑셀(Excell) 배양 배지에서 무혈청 현탁액에서 배양하였다. 생산을 위해, 600 mL 튜브스핀 플라스크(최대 작업 부피 400 mL)에서, 6*108 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 8*108 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 20 mL 예비-가온된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 400 μg DNA의 최종량까지 20 mL CD CHO 배지와 혼합하였다. 1080 μL PEI 용액을 첨가한 후에(2.7 μg/mL), 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 600 mL 튜브스핀 플라스크로 옮기고 3시간 동안 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L Pepsoy 및 1.25 mM VPA를 함유하는 360 mL 엑셀 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 12% 피드(Feed) 7 및 3 g/l 글루코스를 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 60분 동안 2500 x g에서 원심분리에 의한 정제를 위해 수집하였다(시그마(Sigma) 8K 원심분리기). 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 나트륨 아지드를 0.01% w/v의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 유지하였다.
HEK293 EBNA 세포에서의 생산을 위해(현탁액-적합화된 CHO K1 세포(현탁액 배양에서 무혈청 성장에 적합함)에서 HEK293 EBNA), 세포를 eviGrow 배지(에비트리아 아게(evitria AG, 스위스 소재))(화학적으로 정의된 무-동물-성분 무혈청 배지)에서 성장시키고 eviFect(에비트리아 아게(스위스 소재))로 형질감염시켰다. 형질감염 후에, 세포를 eviMake(에비트리아 아게(스위스 소재))(화학적으로 정의된 무-동물-성분 무혈청 배지)에서 37℃ 및 5% CO2에서 7일 동안 유지하였다.
7일 후에, 배양 상청액을 로탄타(Rotanta) 460 RC에서 최대 속도에서 45분 동안 원심분리에 의한 정제를 위해 수집하였다. 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터) 4℃에서 유지하였다. 배양 배지에서 분자의 농도를 단백질 A-HPLC 또는 단백질 A-바이오-레이어 간섭법(Bio-Layer Interferometry; BLI)에 의해 결정하였다.
분비된 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용한 후에 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 친화도 크로마토그래피를 위해, 상청액을 25 ml 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)과 평형을 이루는 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(컬럼 부피(CV) = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 CV 이상의 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)에 의해 세척하여 제거하고, 표적 단백질을 6 CV 20 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨, 100 mM 글리신(pH 3.0)에 용출시켰다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 인산 나트륨(pH 8.0)을 첨가하여 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화 나트륨(pH 6.0), 0.01% 트윈(Tween)20과 평형을 이루는 하이로드(HiLoad) XK16/60 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를, 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
최종 정제 단계 후에 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스)을 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
분자의 총 함량을 25 mM 인산 칼륨, 125 mM 염화 나트륨, 200 mM L-아르긴 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충제에서 25℃에서 TSKgel G3000 SW XL 분석학적 크기 배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
[표 5]
Figure 112019111985212-pct00060
1.3 CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 추가적 이중특이적 항원 결합 분자의 생성
실시예 1.1과 유사하게, 이중특이적 CD40-FAP 항체의 다양한 유형의 구축물을 생산하였다. 예를 들어, 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 하나의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 이중특이적 항체를 생산하였다(도 15A). WO 2010/145792 A1에 기재된 CrossMab 기술을 정확한 경쇄 페어링을 보장하는 데 사용하였기 때문에, 포맷은 1+1 CrossMab로 지칭된다. "헤드-투-테일"로 지칭되는 또 다른 2+1 포맷을 생산하였고(여기서 CD40 결합 Fab가 FAP 결합 Fab의 N-말단에 융합된다)(도 15B), Fc의 C-말단에서 하나의 FAP 결합 CrossFab와 조합된 2개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 추가적 2+1 포맷(도 1E)을 생산하였다. 또한, Fc의 C-말단에서 하나의 FAP 결합 crossfab와 조합된 4개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 4+1 포맷(도 15C)을 생산하였다. 모든 이들 구축물에서, 항-CD40 바인더의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인은 WO 2006/128103에 기재된 CD40 바인더(상기 문헌의 서열번호 10 및 서열번호 16)에 해당한다. FAP 바인더 28H1의 생성 및 생산은 본원에 참고로 포함된 WO 2012/020006 A2에 기재되어 있다. 1+1, 2+1 및 4+1 분자를 생성하기 위해, 놉-인투-홀 기술을 이종 이량체화를 달성하는 데 사용하였다. S354C/T366W 돌연변이는 제1 중쇄 HC1(Fc 놉 중쇄)에 도입되었고, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이는 제2 중쇄 HC2(Fc 홀 중쇄)에 도입되었다. 또한, WO 2010/145792 A1에 기재된 CrossMab 기술은 정확한 경쇄 페어링을 보장하였다. 이중특이적 포맷과 관계 없이, 모든 경우에서, WO 2012/130831 A1에기재된 방법에 따라 효과기 사일런트 Fc(P329G; L234, 234A)를 사용하여 Fcγ 수용체에 대한 결합을 없앴다. 이중특이적 분자의 아미노산 서열을 표 6에 나타냈다.
모든 유전자를 CMV 프로모터 인핸서 단편과 조합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 제어 하에 일시적으로 발현시켰다. 발현 벡터는 또한 EBNA(엡스타인 바 바이러스 핵 항원)-함유 숙주 세포에서 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유하였다.
[표 6]
Figure 112019111985212-pct00061
Figure 112019111985212-pct00062
Figure 112019111985212-pct00063
Figure 112019111985212-pct00064
Figure 112019111985212-pct00065
이중특이적 항체의 발현
항체를 4개의 상이한 펩티드 쇄를 암호화하는 발현 벡터에 의해 현탁액에서 성장하는 HEK 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다. HEK293-F 세포(인비트로젠) 내로의 형질감염을 세포 공급업자의 지시에 따라 무혈청 프리스타일(FreeStyle) 293 발현 배지(인비트로젠)에서 항체 벡터의 맥시프렙(Maxiprep)(퀴아젠(Qiagen)) 제제, F17 배지(인비트로젠, 미국 소재), Peipro(폴리사이언스 유럽 게엠베하(Polyscience Europe GmbH)) 및 1-2*106 생존 세포/ml의 초기 세포 밀도를 사용하여 수행하였다. 세포 배양 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리에 의해 진탕 플라스크 또는 교반된 발효조에서 7일의 배양 후에 채취하고 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다.
이중특이적 항체의 정제
항체를 MabSelectSure-세파로스(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간략히, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)와 평형을 이루는 MabSelect SuRe 수지 상에 포집하고 평형 완충제로 세척하고 25 mM 시트레이트(pH 3.0)로 용출시켰다. 1 M Tris(pH 9.0)로 중화시킨 후에, 응집된 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체 종으로부터 분리하였다. 단량체성 단백질 분획을 모으고 필요에 따라 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(30KD MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다. 샘플 분액을 예를 들어 CE-SDS, 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광분석법 및 내독소 결정에 의한 후속 분석학적 특성규명을 위해 사용하였다.
1.4 CD40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 구축물의 특성규명
1.4.1 인간 또는 마우스 FAP-발현 뮤린 섬유아세포 세포에 대한 결합
세포 표면 FAP에 대한 결합을 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP) 발현 세포 NIH/3T3-huFAP 클론 19 또는 마우스 섬유아세포 활성화 단백질(mFAP) 발현 세포 NIH/3T3-mFAP 클론 26을 사용하여 시험하였다. NIH/3T3-huFAP 클론 19 및 NIH/3T3-mFAP 클론 26을 각각 1.5 μg/mL 퓨로마이신(Puromycin) 선택 huFAP 또는 mFAP 하에 발현하는 발현 벡터 pETR4921에 의해 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포주(ATCC CRL-1658)를 형질감염시킴으로써 생성하였다. FAP에 의해 형질감염되지 않고 FAP를 발현하지 않는 NIH/3T3 야생형(wt) 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
NIH/3T3-huFAP, NIH/3T3-mFAP 또는 NIH/3T3-wt 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)(라이프 테크놀로지스(life technologies), 카탈로그 번호 16140, 로트 번호 1797306A)으로 보충된 1x 둘벡코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM)(깁코(gibco), 카탈로그 번호 42430-025)를 사용하여 배양하였다. NIH/3T3-huFAP 및 NIH/3T3-mFAP 세포의 경우, 1.5 μg/mL 퓨로마이신(깁코, 카탈로그 번호 A11138-03)을 FAP-발현 세포의 선택을 위해 배지에 첨가하였다. NIH/3T3 세포를 무효소 세포 해리 완충제(깁코, 카탈로그 번호 13151014)를 사용하여 플레이트로부터 제거하였다. 0.3x105 NIH/3T3-huFAP 클론 19, NIH/3T3-mFAP 클론 26 또는 NIH/3T3-wt를 200 μl의 1x DMEM 10% FBS에서 환저 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원(greiner bio-one), 셀스타(cellstar), 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5분 동안 1700 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 털어 제거하였다. 세포를 1회 200 μL의 4℃의 찬 FACS 완충제(이바이오사이언스(eBioscience), 카탈로그 번호 00-4222-26)로 세척하였다. 모든 샘플을 지시된 범위의 농도로 이중특이적 항원 결합 분자(일차 항체) 또는 동형 대조군 항체 DP47을 함유하는 50 μL/웰의 4℃의 찬 FACS 완충제에 재현탁시키고(2회 실험) 120분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 3회 200 μL의 4℃의 찬 FACS 완충제로 세척하였다. 세포를 R-피코에트린(PE) 접합된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 109-116-098)를 함유하는 25 μL/웰의 4℃의 찬 이차 항체 용액(이차 항체의 1:50 희석물)으로 추가로 염색하고 60분 동안 4℃에서 어둠에서 항온처리하였다. 세포를 200 μl FACS 완충제로 세척하고 0.2 μg/mL DAPI(로슈(Roche), 카탈로그 번호 10236276001)를 함유하는 85 μL/웰 FACS-완충제에 재현탁시키고 동일한 날에 5-레이저 LSR-포르테사(Fortessa)(비디 바이오사이언스(BD Bioscience), DIVA 소프트웨어를 사용함)를 사용하여 획득하였다. 데이터 분석을 플로우조(FlowJo) 버전 10 소프트웨어(플로우조 엘엘씨)를 사용하여 수행하였다.
도 2A, 2B 및 17에 나타낸 바와 같이, FAP에 대해 1가 또는 2가인 이중특이적 항체는 인간 및 마우스 FAP-발현 표적 세포에 결합한다. 따라서, FAP-표적화된 항-CD40 항원 결합 분자만이 직접적인 종양-표적화 특성을 나타냈다. C-말단 FAP 결합 도메인을 갖는 2가 FAP 구축물은 C-말단 FAP 결합 도메인을 갖는 1가 구축물보다 강하게 결합하였고, 이는 1가 FAP 포맷에 비해 2가에서의 결합력의 증가에 의해 설명된다. 가장 강한 FAP 결합은 1+1 포맷(P1AE0192)의 경우 관찰되었다. NIH/3T3-wt 세포에 대한 FAP-표적화된 항체의 결합 없음이 검출되었다. 상이한 이중특이적 항체에 대해 측정된 EC50 값을 하기 표 7에 나타냈다.
[표 7]
Figure 112019111985212-pct00066
1.4.2 인간 CD40-발현 다우디 세포에 대한 결합
세포 표면 CD40에 대한 결합을 다우디 세포(높은 발현 수준의 인간 CD40을 갖는 인간 B 림프아세포 세포주(ATCC CCL-213))를 사용하여 시험하였다. 다우디 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 16140, 로트 번호 1797306A)으로 보충된 1x 둘벡코 개질된 이글 배지(DMEM)(깁코, 카탈로그 번호 42430-025)를 사용하여 배양하였다. 0.3x105 다우디 세포를 200 μl의 1x DMEM 및 10% FBS에서 환저 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5분 동안 1700 rpm에서 원심분리하고 상청액을 털어 제거하였다. 세포를 1회 200 μL의 4℃의 찬 FACS 완충제(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-4222-26)로 세척하였다. 모든 샘플을 지시된 범위의 농도로 이중특이적 항원 결합 분자(일차 항체) 또는 동형 대조군 항체 DP47를 함유하는 50 μL/웰의 4℃의 찬 FACS 완충제에 재현탁시키고(2회 실험), 120분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 3회 200 μL의 4℃의 찬 FACS 완충제로 세척하였다. 세포를 R-피코에트린(PE) 접합된 어피니퓨어 F(ab')₂단편 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-098)를 함유하는 25 μL/웰의 4℃의 찬 이차 항체 용액(이차 항체의 1:50 희석물)으로 추가로 염색하고 60분 동안 4℃에서 어둠에서 항온처리하였다. 세포를 200 μl FACS 완충제로 세척하고 0.2 μg/mL DAPI(로슈, 카탈로그 번호 10236276001)를 함유하는 85 μL/웰 FACS-완충제에 재현탁시키고 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, DIVA 소프트웨어를 사용함)를 사용하여 동일한 날에 획득하였다. 데이터 분석을 플로우조 버전 10 소프트웨어(플로우조 엘엘씨)를 사용하여 수행하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 모든 도시된 클론은 CD40에 결합하였으나 CD40-양성 다우디 세포에 대한 결합 강도(EC50 값 및 신호 강도)에 있어서 상이하였다. 2가 항-CD40 항체는 4가 항-CD40 항체와 비교하여 보다 높은 EC50 수준을 나타냈고 보다 높은 결합 안정기에 도달하였으며, 이는 항체 당 보다 많은 점유된 CD40 결합 부위 및 2가 CD40 포맷에 비해 4가의 결합력 증가에 의해 설명된다. 최저 결합 안정기와 조합된 최고 EC50 값이 1+1 포맷(P1AE0192)의 경우 관찰되었다. 다우디 세포에 대한 음성 대조군 항체의 결합 없음이 검출되었다. 상이한 이중특이적 항체에 대해 측정된 EC50 값을 하기 표 8에 나타냈다.
[표 8]
Figure 112019111985212-pct00067
실시예 2
FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자의 기능적 특성
2.1 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의한 항원 제시 세포(APC)의 CD40-매개된 활성화
CD40의 결찰은 B 세포 및 수지상 세포(DC) 성숙 및 활성화를 유도하고 이들 세포 유형의 생존을 증대시킨다. CD40 신호전달시에, B 세포 및 DC의 표면 상의 시토카인 생산 및 공자극 분자 발현이 증가한다(문헌[S. Quezada et al., Annu RevImmunol. 2004, 22, 307-328]; [S. Danese et al., Gut. 2004, 53, 1035-1043]; [G. Bishop et al., Adv Exp Med Biol. 2007, 597, 131-151]).
상이한 FAP-의존성 항-CD40 항체의 작용성 특성 및 FAP 특이성을 시험하기 위해, 인간 버피 코트로부터 수득된 APC를 FAP-의존성 작용성 항-인간 CD40 항체, 및 FAP-코팅된 비드 또는 인간 FAP 발현 NIH/3T3 세포와 함께 항온처리하였다. APC 활성화를 FACS에 의해 측정하고, 세포의 상청액을 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 시토카인에 대해 분석하였다.
2.1.1 항원의 공급원으로서 NIH/3T3-huFAP 세포를 사용한 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의한 인간 B 세포의 활성화
FAP를 발현하는 NIH/3T3 세포를 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 항원의 공급원으로서 사용하였다. NIH/3T3-huFAP 세포를 CMV 프로모터 하에 인간 FAP를 암호화하는 발현 pETR4921 플라스미드에 의해 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 형질감염시킴으로써 생성하였다. NIH/3T3-huFAP 세포 또는 NIH/3T3-wt 세포를 RS 2000 방사선 조사기(라드 소스 테크놀로지스(Rad Source Technologies))를 사용하여 27 Gy에 의해 조사시켜 세포 증식을 방지하였다. 10% FBS, 1%(v/v) 페니실린 스트렙토마이신(깁코, 카탈로그 번호 15070-063), 1%(v/v) L-글루타민(깁코, 카탈로그 번호25030-024), 1%(v/v) 나트륨-피루베이트(깁코, 카탈로그 번호 11360-039), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(깁코, 카탈로그 번호 11140-035) 및 50 μM β-머캅토에탄올(깁코, 카탈로그 번호 31350-010)로 보충된 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute) 배지(RPMI) 1640(깁코, 카탈로그 번호 31870-025)으로 이루어진 100 μl의 R10 배지에서 0.2x105 조사된 NIH/3T3 세포를 96-웰 평저 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92696)의 웰 마다 시딩하였다.
다음날, 버피 코트를 스티프텅 취르허 블루츠펜데딘스트 에스알케이(Stiftung Zurcher Blutspendedienst SRK)로부터 입수하였다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 50 mL의 버피 코트를 동일한 부피의 PBS(깁코, 카탈로그 번호 10010023)에 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브(TPP, 카탈로그 번호 91050)에 15 mL의 림포프렙(Lymphoprep, 상표)(스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies), 카탈로그 번호 07851)을 보충하고, 튜브 당 25 mL의 버피 코트/PBS 용액을 림포렙(Lymphorep, 상표) 위에 주의하여 적층하였다. 튜브를 2000 rpm에서 24분 동안 실온에서 적은 가속과 함께 휴식 없이 원심분리하였다. 이후, PBMC를 계면으로부터 수집하고 3회 PBS로 세척하고 10 mL의 PBS에 재현탁시키고, 세포를 세포 유형 및 수에 대해 베크만 쿨터(Beckman Coulter) 세포 계수기 Ac·T(상표) 5diff OV(베크만 쿨터, 카탈로그 번호 6605580)에 의해 분석하였다. PBMC로부터 B 세포를 단리하기 전에, CD14-양성 분획을 CD14 마이크로 비드(밀테니(Miltenyi), 카탈로그 번호 130-050-201)에 의해 CD14-양성 세포를 자성 표지함으로써 제거한 후에, 오토MACS(autoMACS, 등록상표) 프로 세퍼레이터(Pro Separator)(밀테니, 카탈로그 번호 130-092-545)에 의해 단리하였다. CD14-음성 분획을 밀테니 B 세포 단리 키트 II(카탈로그 번호 130-091-151)에 의한 후속 B 세포 단리 및 오토MACS(등록상표) 분리를 위해 사용하였다. 1x105 B 세포를 웰 당 50 μl의 R10 배지에서 NIH/3T3 세포에 첨가하였다. FAP-표적화된 항-인간 CD40 항체를 50 μl의 R10 배지에서 1 μg/mL 내지 0.3 ng/mL 범위의 농도로 B 세포에 첨가하였다(3x 희석 시리즈). 양성 대조군으로서, FAP-독립적 작용성 항-인간 CD40 항체 RO7009789(IgG2, INN: Selicrelumab) 및 SGN-40(IgG1, INN: 다세투주맙)을 사용하였다. 둘 다의 항체는 CD40에 대해 2가였다. SGN-40 항체가 생물학적 활성을 위해 Fc 수용체 교차 결합을 필요로 한다고 문헌에 기재되어 있기 때문에(문헌[C. Law et al., Cancer Res 2005, 65, 8331-8338])(메카니즘은 RO7009789에 대해서 또한 논의 중이다(문헌[R. Dahan et al., Cancer Cell 2016, 29, 1-12]), 이들 2개의 항체를 교차 결합 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-006-008)과 함께 30분 동안 항온처리한 후에, B 세포에 첨가하였다. 48시간 후에, 세포를 96-웰 환저 플레이트 내로 옮기고 1회 PBS로 세척하고 50 μl의 3 μg/mL의 Fc 수용체 차단 마우스 IgG 동형 대조군(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 카탈로그 번호 10400C)과 함께 PBS에서 항온처리하였다. 4℃에서 15분의 항온처리 후에, 세포를 PBS로 세척하고 50 μl의 PBS 중의 형광 표지된 항체의 혼합물을 세포에 첨가하였다. 하기 형광 표지된 항체를 사용하였다: 항-인간 CD83 BV421(바이오레전드, 클론 HB15e, 카탈로그 번호 305324), 항-인간 CD80 BV605(비디 바이오사이언시즈, 클론 L307.4, 카탈로그 번호 563315), 항-HLA-ABC FITC(비디 바이오사이언시즈, 클론 G46-2.6, 카탈로그 번호 555552), 항-인간 CD14 PerCP-Cy5.5(바이오레전드, 클론 HCD14, 카탈로그 번호 325622), 항-인간 CD3 PerCP-Cy5.5(바이오레전드, 클론 UCHT1, 카탈로그 번호 300430), 항-인간 CD70 PE(바이오레전드, 클론 113-16, 카탈로그 번호 355104), 항-인간 CD86 PE-CF594(비디 바이오사이언시즈, 클론 FUN-1, 카탈로그 번호 562390), 항-HLA-DR APC(비디 바이오사이언시즈, 클론 G46-6, 카탈로그 번호 559866) 및 항-인간 CD19 APC-H7(비디 바이오사이언시즈, 클론 SJ25C1, 카탈로그 번호 560177). 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 생존능 염료 좀비 아쿠아(Zombie Aqua, 상표)(바이오레전드, 카탈로그 번호 423102)를 항체 혼합물에 첨가하였다. 4℃에서 30분의 항온처리 후에, 세포를 2회 PBS로 세척한 후에, 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 동일한 날에 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, DIVA 소프트웨어를 사용함)를 사용하여 분석하였다. 데이터 분석을 플로우조 버전 10 소프트웨어(플로우조 엘엘씨)를 사용하여 수행하였다. CD14 및 CD3에 대해 음성이고 CD19에 대해 양성인 살아있는(아쿠아 음성) 세포를 CD70, CD80, CD83 및 CD86 발현에 대해 분석하였다.
도 3A 내지 3H는 인간 CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 1가 또는 2가인 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 세포 활성화 마커 CD70(도 3A 및 3B), CD80(도 3C 및 3D), CD83(도 3E 및 3F) 및 CD86(도 3G 및 3H)의 FAP-의존성 상향조절을 나타낸다. FAP에 대해 1가인 이중특이적 항체는 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 분자와 유사한 활성화 마커 발현 증가를 야기하였다. NIH/3T3-FAP 세포를 사용한 경우, 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 B 세포 활성화 마커의 상향조절은 FAP-독립적 양성 대조군 항체에 의해 유도된 상향조절과 비슷하였다. FAP가 존재하지 않는 경우(NIH/3T3-wt 세포), 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 B 세포 활성화 마커의 증가 없음이 관찰된 반면에, 양성 대조군 항체는 이들 마커의 발현에 있어서 상향조절을 유도하였다.
2.1.2 항원의 공급원으로서 FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)를 사용한 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의한 인간 다우디 세포의 활성화
100 μl의 1x DMEM + 10% FBS 중의 1x105 다우디 세포를 96-웰 평저 플레이트의 웰 마다 첨가하였다. 항원의 공급원으로서 FAP를 발현하는 세포를 사용하는 것 대신에, 스트렙타비딘 다이나비즈(등록상표)(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호: 11205D)를 제조자의 지시에 따라 비오티닐화된 마우스 FAP(사내 생산)(6.5x104 비드: 0.01 μg의 단백질의 결합 능력)로 코팅하고 제조자의 지시에 따라 다우디 세포에 2:1의 비드:세포 비로 50 μl의 R10 배지에서 첨가하였다. FAP-발현 세포 대신에 FAP로 코팅된 비드를 사용하는 것은 보다 안정하고 복제가능한 시스템을 제공하는데, 이는 APC 활성화에 영향을 미칠 수 있는 변동이 심한 세포의 품질 및 세포 생산물의 분비가 잠재적으로 결과를 왜곡하는 인자를 나타내기 때문이다. 대조군으로서 코팅되지 않은 비드를 다우디 세포에 첨가하였다. FAP-표적화된 항-인간 CD40 항체 또는 양성 대조군 항체(섹션 2.1.1에 기재됨)를 50 μl의 R10 배지에서 다우디 세포에 첨가하였다. 2일 후에, 다우디 세포를 2.1.1에 명시된 염색 및 분석 절차에 따라 FACS에 의해 분석하였다.
작용성 항-CD40 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 분석된 B 세포는 모든 항체의 경우 CD70 발현 증가를 나타냈다(도 20A 및 B 참조). 특정 분자의 EC50 값을 하기 표 9에 나타냈다. 이들 발현 마커의 상향조절은 상이한 FAP-표적화된 항체의 경우 FAP에 의존적이었고, 이들 FAP-의존성 항체에 의해 유도된 발현의 증가는 교차 결합된 CD40 항체(P1AD4470)에 의해 유도된 증가와 비교하여 높았다. FAP의 부재 하에(코팅되지 않은 비드), CD70의 증가 없음이 CD40에 대해 1가 또는 2가인 도시된 이중특이적 항체의 경우 관찰된 반면에, 4가 CD40 결합 분자는 CD70의 상향조절을 유도하였으나, FAP의 존재 하에 상향조절보다 적은 정도로 유도하였고, 이는 다우디 세포에서 4가 CD40 바인더의 적지만 검출가능한 FAP-독립적 CD40 활성화를 시사한다.
[표 9]
Figure 112019111985212-pct00068
2.1.3 항원 공급원으로서 FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)를 사용한 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의한 인간 B 세포의 활성화
B 세포는 섹션 2.1.1에 기재된 바와 같이 버피 코트로부터 단리되었고, 100 μl의 R10 배지의 1x105 B 세포를 96-웰 평저 플레이트의 웰 마다 첨가하였다. 스트렙타비딘 다이나비즈(등록상표)(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호:11205D)를 제조자의 지시에 따라 비오티닐화된 인간 또는 마우스 FAP(사내 생산)(6.5x104 비드: 0.01 μg의 단백질의 결합 능력)로 코팅하고, B 세포에 2:1의 비드:세포 비로 50 μl의 R10 배지에서 첨가하였다. 대조군으로서, 코팅되지 않은 비드에 B 세포를 첨가하였다. FAP-표적화된 항-인간 CD40 항체 또는 양성 대조군 항체(섹션 2.1.1에 기재됨)를 50 μl의 R10 배지에서 B 세포에 첨가하였다. 2일 후에, B 세포를 2.1.1에 기재된 염색 및 분석 절차에 따라 FACS에 의해 분석하였다. 대안적으로, B 세포를 5일 동안 작용성 항-CD40 항체의 존재 하에 배양하였고, 110 μl의 상청액을 인간 IL-6 DuoSet ELISA 키트(R&D, 카탈로그 번호 DY206-05)를 사용하여 IL-6 측정을 위해 채취하였다. B 세포가 추가적 B 세포 수용체 자극의 필요 없이 CD40 리간드에 의한 자극시 증가된 양의 IL-6을 생산함이 공지되어 있다(문헌[M. Duddy et al., J. Immunol. 2004, 172, 3422-3427]). ELISA를, 분석의 모든 단계 동안 권고된 양의 절반을 사용한 점을 제외하고, 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행하였다. B 세포를 섹션 2.1.1에 명시된 염색 및 분석 절차에 따라 FACS에 의해 분석하였다.
작용성 항-CD40 항체에 의한 2일의 항온처리 후에 분석된 B 세포는 모든 항체의 경우 CD70, CD83 및 CD86 발현의 증가를 나타냈다(도 4A 내지 4F, 도 21A 및 B, 및 도 25A 내지 D 참조). 특정 분자의 CD86 발현 증가와 관련하여 EC50 값을 하기 표 10에 나타냈다. 이들 발현 마커의 상향조절은 상이한 FAP-표적화된 항체의 경우 FAP에 의존적이었고, FAP-의존성 항체에 의해 유도된 발현 증가는 교차 결합된 CD40 항체 P1AD4470에 의해 유도된 증가와 비교하여 비슷하거나 약간 낮았다.
[표 10]
Figure 112019111985212-pct00069
FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)에 의한 5일의 B 세포 항온처리 후에, 인간 CD40 및 FAP를 표적화하는 항원 결합 분자는 B 세포 상에서 CD80 발현의 FAP-의존성 상향조절을 유도하였다. 1 또는 2개의 FAP 결합 부위를 갖는 항-인간 CD40 항체에 의해 유도된 CD80 발현의 수준은 비슷하였다. 양성 대조군 항-CD40 항체에 의한 B 세포의 처리는 유사한 정도의 CD80 상향조절을 야기하였다. 상승된 FAP-의존성 CD86 발현은 이중특이적 항원 결합 분자의 경우 또한 검출될 수 있다. 또한, 1 또는 2개의 FAP 결합 부위의 존재는 이러한 활성화 마커의 발현 수준에 있어서 큰 차이점이 없었다. 교차 결합된 SGN-40(다세투주맙) 또는 작용성 CD40 항체 selicrelumab(RO 7009789)에 의해 유도된 CD86의 FAP-독립적 상향조절과 비교하여, FAP-의존성 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 유도된 CD86 상향조절은 약간 낮았다. CD70 및 CD83의 경우, FAP 및 CD40을 표적화하는 이중특이적 항체를 사용한 경우 매우 제한된 상향조절이 관찰되거나 관찰되지 않은 반면에, 양성 대조군 항체는 이들 B 세포 활성화 마커에 대한 효과를 분명히 나타냈다(도 5A 내지 5H).
도 6A 및 6B는 B 세포 IL-6 생산에 대한 상이한 작용성 항-CD40 항체의 효과를 나타낸다. FAP 존재 하에, 상청액에서 IL-6 농도는 모든 시험된 작용성 항-인간 CD40 항체의 경우 유사한 정도로 상승하였다(처리되지 않은(UT) 조건과 비교하여 약 6-배 증가). 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)에 의한 B 세포의 항온처리시, IL-6 생산 증가가 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 검출되지 않았고, 이는 이들 분자의 FAP-의존성을 입증한다.
2.1.4 항원 공급원으로서 인간 FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)를 사용한 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의한 인간 단핵구-유래된 DC(moDC)의 활성화
PBMC를 버피 코트로부터 림포프렙(상표) 밀도 원심분리에 의해 단리하였다. 이어서, 단핵구를 2.1.1에 기재된 바와 같이 CD14 마이크로 비드 및 오토MACS(등록상표) 분리에 의해 단리하였다. 단핵구-유래된 DC(moDC)를 생성하기 위해, 3x106 단핵구를 6 웰 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92006)의 웰 마다 1x106 세포/mL의 밀도로 시딩하였다. DC 성숙을 위해, 1%(v/v) 페니실린 스트렙토마이신, 2%(v/v) 인간 혈청(30분 동안 56℃에서 열 불활성화됨)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 H4522, 로트 번호 SLBP1687V), 20 ng/mL 갓 첨가된 재조합 인간 과립구 대식 세포 군체-자극 인자(GM-CSF)(페프로테크(Peprotech), 카탈로그 번호 300-03-20UG, 로트 번호 081230H1213) 및 20 ng/mL의 갓 첨가된 재조합 인간 IL-4(페프로테크, 카탈로그 번호 200-04-100UG, 로트 번호 091514C3116)로 보충된 RPMI 1640으로 이루어진 moDC 배지를 사용하였다. 5일 후에, moDC를 6-웰 플레이트로부터 현탁액 및 반-부착 세포의 부드러운 제거에 의해 채취하고, 인간 IL-4 및 GM-CSF를 함유하는 갓 생산한 moDC 배지에 재현탁시켰다. 2x105 moDC를 100 μl의 moDC 배지에서 96-웰 평저 플레이트의 웰 마다 시딩하였다. 스트렙타비딘 다이나비즈(등록상표)를 비오티닐화된 인간 FAP로 코팅하고 50 μl에서 2:1의 비드/DC 비로(2.1.3에 기재됨) 첨가하였다. 대조군으로서, 코팅되지 않은 비드를 moDC에 첨가하였다. FAP-표적화된 항-인간 CD40 항체를 50 μl에서 DC에 1 μg/mL 내지 0.3 ng/mL 범위의 농도로(3x 희석 시리즈) 첨가하였다. 양성 FAP-독립적 대조군으로서, 작용성 항-인간 CD40 항체 RO7009789 및 교차 결합된 CD40 항체를 사용하였다. 다이나비즈(등록상표) 및 상이한 작용성 항-인간 CD40 항체의 첨가 2일 후에, moDC 활성화를 FACS에 의해 측정하였다. FACS 염색을 항-인간 CD86 BV421(비디 바이오사이언시즈, 클론 FUN-1, 카탈로그 번호 562432), 항-인간 CD80 BV605(비디 바이오사이언시즈, 클론 L307.4, 카탈로그 번호 563315), 항-HLA-ABC FITC(비디 바이오사이언시즈, 클론 G46-2.6, 카탈로그 번호 555552), 항-인간 CD1c PerCp-Cy5.5(비디 바이오사이언시즈, 클론 F10/21A3, 카탈로그 번호 565424), 항-인간 CD70 PE(바이오레전드, 클론 113-16, 카탈로그 번호 355104), 항-인간 CD11c PE-eF610(이바이오사이언스, 클론 3.9, 카탈로그 번호 61-0116-42), 항-인간 CD83 PE-Cy7(비디 바이오사이언시즈, 클론 HB15e, 카탈로그 번호 561132), 항-인간 CD209 APC(비디 바이오사이언시즈, 클론 DCN46, 카탈로그 번호 551545), 항-인간 CD3 Alexa Fluor 700(이바이오사이언스, 클론 OKT3, 카탈로그 번호 56-0037-42), 항-인간 CD14 APC-H7(비디 바이오사이언시즈, 클론 M5E2, 카탈로그 번호 561384) 및 생존능 염료 좀비 아쿠아(상표)(바이오레전드, 카탈로그 번호 423102)로 이루어진 형광 표지된 항체의 혼합물을 사용하여 2.1.1에 명시된 바와 같이 수행하였다. 세포를 동일한 날에 5-레이저 LSR-포르테사를 사용하여 분석하였다. 데이터 분석을 플루오조 버전 10 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 단일의 살아 있는 세포를 CD3 음성 및 CD14 음성 세포에 대해 게이트화시켰다. 이들 집단을 기반으로, CD1c 및 CD11c 양성 세포를 활성화 마커 CD70, CD80, CD83 및 CD86의 발현에 대해 분석하였다.
모든 작용성 항-인간 CD40 항체의 경우, moDC 상의 CD83의 자명하고 유사한 상향조절이 관찰되었다(도 7E 내지 7F). FAP-의존성 항-CD40 항체의 경우, 이러한 상향조절은 FAP-의존적 방식으로 검출되었다. CD40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우, CD80 발현은 약간만 증가하였으나, 이러한 증가는 FAP-의존성이었고, DC 상에서 양성 대조군 항체 RO7009789에 의해 유도된 CD80 상향조절과 비슷했다(도 7C 및 7D). CD86 발현이 처리되지 않은 DC와 비교하여 상이한 항-CD40 항체와 함께 항온처리된 DC 상에서 유의미하게 변하지 않은 반면에(도 7G 및 7H), CD70 발현은 이들 항체의 작용성 효과 때문에 상승하였다(도 7A 및 7B). 또한, 모든 FAP-의존성 항체는 단지 FAP가 존재하는 경우 활성화 특성을 나타냈고, CD70에 대한 이들의 효과는 유사하였다. 그러나, 상향조절된 CD70 발현을 나타내는 moDC의 수는 낮은 범위 내에 있었다(최대 8%의 CD11c 및 CD1c 양성 세포). RO7009789는 본 실험 세팅에서 이중특이적 분자와 비교하여 DC 상에서 CD70을 상향조절하는 보다 높은 효능을 나타냈다.
2.1.5 항원 공급원으로서 뮤린 FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)를 사용한 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의한 HEK-블루(상표) CD40L 세포의 활성화
HEK-블루(상표) CD40L 세포(인비보젠(InvivoGen), 카탈로그 번호 hkb-cd40)를 리포터 세포주로서 사용하여 FAP-표적화된 항-인간 CD40 결합 분자에 의해 매개되는 인간 CD40 자극을 분석하였다. HEK-블루(상표) CD40L 세포는 인간 CD40 수용체 및 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)의 NFκB-유도성 분비를 안정하게 발현하였다. HEK-블루(상표) CD40L 세포 상에서 발현하는 CD40 수용체에 대한 CD40L 또는 작용성 항-CD40 항체의 결합은 신호전달 캐스케이드를 촉발하였고, 이는 NFκB-매개된 SEAP 생산을 야기하였다. 생산된 SEAP의 양은 CD40 수용체 활성화의 정도와 직접적인 연관성이 있다. 상청액에서 분비된 SEAP의 수준은 620 내지 655 nm에서 분광 광도계에 의해 측정될 수 있다. 160 μl 예비-가온된 HEK-블루(상표) 검출 매질(인비보젠, 카탈로그 번호 hb-det2) 중의 0.5x105 HEK-블루(상표) CD40L 세포를 96-웰 평저 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92696)의 웰 마다 시딩하였다. 스트렙타비딘 다이나비즈(등록상표)를 비오티닐화된 뮤린 FAP로 코팅하고 20 μl PBS에서 2:1의 비드:세포 비로 첨가하였다(2.1.3에 기재됨). 대조군으로서, 코팅되지 않은 비드를 리포터 세포에 첨가하였다. FAP-표적화된 항-인간 CD40 항체를 20 μl PBS에서 세포에 6.89 내지 0.0032 nM 범위의 농도로(3x 희석 시리즈) 첨가하였다. 대조군 분자로서, FAP 결합 도메인 및 FAP-독립적 교차 결합된 CD40 항체(P1AD4470) 대신에 인간 CD40에 대해 4가이고 1 또는 2개의 DP47 도메인을 갖는 항체를 사용하였다. 37℃에서 8시간 항온처리 후에, 상청액에서 SEAP 수준을 분광 광도계에 의해 650 nm에서 측정하였다.
모든 작용성 FAP-표적화된 항-인간 CD40 항체의 경우, 자명하고 비슷한 SEAP 생산이 관찰되었다. 인간 CD40에 대해 1가 또는 2가인 FAP-표적화된 이중특이적 항체의 경우, SEAP 생산은 FAP의 존재 하에만 검출되었다. 대조적으로, 인간 CD40에 대해 4가인 FAP-표적화된 이중특이적 항체로 처리된 리포터 세포는 FAP 유용성과 관계 없이 SEAP를 분비하였다. 그러나, FAP의 존재 하에, 보다 높은 SEAP 수준이 이들 항체로 처리한 리포터 세포의 상청액에서 검출되었다. 또한, 인간 CD40에 대해 4가이고 FAP 결합 도메인 대신에 1 또는 2개의 DP47 도메인을 갖는 음성 대조군 항체는 FAP의 존재 및 부재 하에 HEK-블루(상표) CD40L 세포에서 비슷한 SEAP 생산을 유도하였다. 양성 대조군 항체 CD40 IgG(P1AD4470) + F(ab)는 FAP-코팅된 비드의 존재 하에 인간 CD40에 대해 2가 또는 4가인 FAP-표적화된 이중특이적 항체와 비교하여 유사한 수준의 SEAP 생산을 유도하였다(도 8A, 8B, 19A 및 B). CD40 항체 및 상이한 이중특이적 항체에 대해 측정한 EC50 값을 하기 표 11에 나타냈다.
[표 11]
Figure 112019111985212-pct00070
2.2 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의한 DC의 CD40-매개된 활성화 및 T 세포의 후속 프라이밍
효율적으로 T 세포를 프라이밍하는 FAP-의존성 항-인간 CD40 항체에 의해 활성화된 DC의 능력을 입증하기 위해, 시험관내 T 세포 프라이밍 분석을 수립하였다. 이러한 분석을 위해, 인간 CD40 수용체를 발현하는 형질전환 마우스(huCD40tg 마우스)(유사한 인간 및 뮤린 CD40 수용체 발현 패턴을 갖는 마우스; C57BL/6 백그라운드; 타코닉(Taconic)에 의해 생성됨)의 비장으로부터 DC를 단리하고 SIINFEKL 펩티드 또는 난백 알부민(OVA)(DEC-205 수용체-매개된 항원 흡수)에 의해 펄스화하고 상이한 작용성 항-인간 CD40 항체와 함께 항온처리하였다. FAP를, 이중특이적 항원 결합 분자의 FAP-의존성을 나타내기 위해 FAP-코팅된 다이나비즈(등록상표)를 통해 제공하였다. 24시간 후에, CD8 양성 T 세포를 OT1 마우스의 비장으로부터 단리하고(이들 마우스의 CD8-양성 T 세포는 모두 H2-Kb에 있어서 SIINFEKL을 인식하는 형질전환 TCR을 보유한다; C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl, 찰스 리버(Charles River)), 카복시클루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE) 표지하고, 펄스화된 DC에 첨가하였다. 실험 제5일에, DC 및 T 세포 시토카인을 배양된 세포의 상청액에서 분석하고, T 세포를 활성화 및 증식 능력에 대해 분석하였다.
2.2.1 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의해 활성화된 SIINFEKL-펄스화된 DC를 통한 T 세포 프라이밍
DC를 huCD40tg 마우스의 비장으로부터 단리하였다. 비장 DC를 단리하기 위해, huCD40tg 마우스의 비장을 2.25 mL의 행크 평형 염 용액(HBSS) 및 칼슘2+(깁코, 카탈로그 번호 14025-05), 250 μl의 10 mg/mL 콜라게나제 D 용액(최종 농도 1 mg/mL)(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 11088866001) 및 12.5 μl의 10 mg/mL DNase 용액(최종 농도 0.05 mg/mL)(시그마-알드리치, D5025-150KU, 로트 번호 SLBR0535V)을 함유하는 6-웰 플레이트의 하나의 웰 내에 두었다. 21G 바늘(브라운(Braun), 카탈로그 번호 4657527)을 갖춘 3 mL 시린지(BD, 카탈로그 번호 309658)를 사용하여, 비장을 부풀린 후에, 가위의 도움으로 작은 조각으로 찢었다. 37℃에서 25분의 항온처리 후에, 50 μL의 0.5 M 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)(애플리켐(Applichem), 카탈로그 번호 A4892.1000)을 첨가한 후에, 37℃에서 5분 동안 제2 항온처리가 뒤따랐다. 비장 세포 및 작은 조각의 비장 조직을 함유하는 용액을 40 μm 필터(코닝(Corning), 카탈로그 번호 352340)를 통해 50 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 내로 여과하였다. 비장 조직 조각을 필터를 통해 3 mL 시린지 플러그의 단부를 사용하여 부쉈다. 다음 단계에서, 50 mL 튜브를 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 1 mL의 1x 세포 용해 완충제(증류수에 의해 1:10 희석됨)(BD, 카탈로그 번호 555899)를, 적혈구를 용해시키기 위해 비장 세포에 첨가하였다. 실온에서 4분의 항온처리 후에, 20 mL의 R10을 첨가한 후에, 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리 단계를 수행하였다. 상청액을 제거하고, 비장 세포를 30 mL의 R10에 재현탁시키고, 세포 수 및 생존능을 자동화된 EVE 세포 계수기(VWR, 카탈로그 번호 734-2675)를 사용하여 결정하였다. 마우스 CD11c 울트라퓨어(UltraPure) 마이크로 비드(밀테니, 카탈로그 번호 130-108-338)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 오토MACS(등록상표) 분리에 의해 DC를 단리하였다. 이어서, 0.25x105 DC를 50 μl의 R10에서 96-웰 평저 플레이트의 웰 마다 시딩하였다. 이어서, DC를 1 pg/mL의 차선의 농도의 SIINFEKL 펩티드(난백 알부민 잔기 257-264)(유로젠텍(Eurogentec), 카탈로그 번호 AS-60193-5, 로트 번호 1360618)에 의해 펄스화하였다. 이러한 제한된 양의 항원은 상이하게 활성화된 DC로 인한 T 세포 활성화의 변화 검출을 가능하게 한다. 양성 대조군으로서, 추가적 DC 활성화 자극에 관계 없이 높은 T 세포 활성화를 유도하기 위해, SIINFEKL을 1 ng/mL의 농도에서 DC에 첨가하였다. SIINFEKL 항원에 의해 펄스화되지 않은 DC를 음성 대조군으로서 제공하였다. 인간 FAP-코팅되거나 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표)를 50 μL의 R10에서 DC에 2:1 비드:세포 비로 첨가하였다. 후속 단계에서, 상이한 작용성 항-CD40 항체를 50 μL의 R10에서 1 μg/mL 내지 1 ng/mL 범위의 농도에서(10x 희석 시리즈) 첨가하였다. 본 실험 셋업에서, 2개의 FAP 결합 부위를 함유하는 이중특이적 항-인간 CD40 항체를 FAP 결합 도메인 대신에 2개의 DP47 도메인을 갖는 이의 등가물, FAP-독립적 RO7009789, 교차 결합된 SGN-40, 및 뮤린 CD40에 대해 4가이고 FAP에 대해 2가인 뮤린 FAP-의존성 이중특이적 항체(28H1 FAP 바인더)와 비교하였다. 24시간 후에, OT1 마우스의 비장 CD8-양성 세포를 단리하였다. 이렇게 하기 위해, OT1 마우스의 비장을 40 μm 필터를 통해 3 mL 시린지 플러그의 말단을 사용하여 50 mL 튜브 내로 부쉈다. 필터를 R10으로 세척하고, 비장 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 1 mL의 1x 세포 용해 완충제(증류수로 1:10 희석됨)를 세포에 첨가하고, 실온에서 4분의 항온처리 후에, 20 mL의 R10을 첨가하였다. 튜브를 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 비장 세포를 30 mL의 R10에 재현탁시키고, 세포 수 및 생존능을 자동화된 EVE 세포 계수기를 사용하여 결정하였다. CD8-양성 세포를 제조자의 지시에 따라 마우스 CD8a+ T 세포 단리 키트(밀테니, 카탈로그 번호 130-104-075) 및 오토MACS(등록상표) 분리를 사용하여 음성 선택 공정으로 단리하였다. 이어서, 분리 후 음성 분획에서 발견된 CD8-양성 세포를 예비-가온된 PBS로 세척하고 EVE 세포 계수기로 계수하고, 세포 수를 예비-가온된 PBS에서 2x107 세포/mL로 조정하였다. 10 mM CFSE 용액(셀트레이스(CellTrace, 상표) CFSE 세포 증식 키트, 써모피셔, 카탈로그 번호 C34554)을 예비-가온된 PBS에 5000-배 희석하고 1:1 비로 PBS에 재현탁된 세포에 첨가하였다(CFSE 최종 농도 1 μM). 짧은 와류 후에, 세포를 5분 동안 실온에서 항온처리하였다. 표지 반응을, 40 mL의 예비-가온된 R10 배지를 세포에 첨가함으로써 중단하였다. PBS에 의한 2회의 세척 단계 후에, CD8-양성 세포를 R10에 재현탁시키고, 0.5x105 세포를 100 μl R10에서 펄스화된 DC에 첨가하였다. 실험 제5일에 T 세포를 세포내 시토카인 염색(ICS)을 위해 0.5 μg/mL의 SIINFEKL 및 2 μg/mL의 항-마우스 CD28 항체(이바이오사이언스, 클론 37.51, 카탈로그 번호 16-0281-86)에 의해 재자극하였다. SIINFEKL 및 항-CD28 첨가 1시간 후에, Brefeldin A(BFA)(BD, 카탈로그 번호 51-2301KZ)(1:1000)를 세포내 단백질 이동을 차단하기 위해 세포에 첨가하였다. 추가적 4시간의 항온처리 단계 후에, 150 μl의 상청액을 루미넥스(Luminex, 상표) 기반 다중화된 시토카인 측정을 위해 채취하였다. 23개 세트의 시토카인을 측정하기 위해, 바이오-플렉스 프로(Bio-Plex Pro, 상표) 마우스 시토카인 GrpI 패널 23-플렉스 키트(바이로래드, 카탈로그 번호 M60009RDPD)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. T 세포의 유세포 분석법 분석을 위해, 96-웰 평저 플레이트의 세포를 96-웰 환저 플레이트 내로 옮기고 1회 PBS로 세척하고 PBS에서 50 μl의 3 μg/mL의 Fc 수용체 차단 마우스 IgG 동형 대조군과 함께 항온처리하였다. 4℃에서 15분의 항온처리 후에, 세포를 PBS로 세척하고, PBS 중의 형광 표지된 항체의 혼합물 50 μl를 세포에 첨가하였다. 하기 항체를 사용하였다: 항-마우스 CD86 BV785(바이오레전드, 클론 GL-1, 카탈로그 번호 105043), 항-I-A/I-E PerCp-Cy5.5(바이오레전드, 클론 M5/114.15.2, 카탈로그 번호 107626), 항-마우스 CD70 PE(이바이오사이언스, 클론 FR70, 카탈로그 번호 12-0701-82), 항-마우스 CD3 PE-CF594(비디 바이오사이언시즈, 클론 145-2C11, 카탈로그 번호 562286), 항-마우스 CD25 PE-Cy7(이바이오사이언스, 클론 PC61.5, 카탈로그 번호 25-0251-82), 항-마우스 CD11c APC(비디 바이오사이언시즈, 클론 HL3, 카탈로그 번호 561119), 항-마우스 CD44 Alexa Fluor 700(비디 바이오사이언시즈, 클론 IM7, 카탈로그 번호 560567) 및 항-마우스 CD8 APC-Cy7(바이오레전드, 클론 53-6.7, 카탈로그 번호 100714). 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 생존능 염료 좀비 아쿠아(상표)를 항체 혼합물에 첨가하였다. 세포를 30분 동안 4℃에서 세포외 항체 염색 용액과 함께 항온처리하였다. 이후, 세포를 2회 PBS로 세척하고 투과성화시키고 세포 내로 IFNγ에 대해 제조자의 프로토콜에 따라 항-마우스 IFNγ BV421(바이오레전드, 클론 XMG1.2, 카탈로그 번호 505830) 및 Foxp3/전사 인자 염색 완충제 세트(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-5523-00)를 사용하여 세포 내로 염색하였다. 세포를 200 μl의 PBS로 재현탁시키고 동일한 날에 5-레이저 LSR-포르테사를 사용하여 분석하였다. 데이터 분석을 플로우조 버전 10 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. CD8 및 CD3의 발현을 나타내는 살아 있는 세포의 집단을 CFSE 색소 희석, IFNγ 생산, CD44 및 CD25 발현에 대해 분석하였다.
도 9A 내지 9H는 적은 양의 SIINFEKL에 의해 펄스화되고 상이한 작용성 항-CD40 항체에 의해 자극된 DC가 T 세포 증식을 유도할 수 있음을 나타낸다. FAP-의존성 이중특이적 항-CD40 항체의 경우, 증식은 FAP가 분석에서 제공될 때에만 유도된다. 4개의 CD40 및 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 이중특이적 항원 결합 분자의 뮤린 또는 인간 버전에 의해 자극된 DC에 의해 유도된 증식의 수준은 비슷하였다. 이는, DC 상에서 발현되는 인간 CD40 수용체의 하류 신호전달이 huCD40tg 마우스에서 손상되지 않음을 강하게 시사한다. T 세포 활성화 마커 CD44 및 CD25의 유의미한 상향조절 또는 IFNγ 생산이 상이한 작용성 항-CD40 항체에 의해 자극된 DC와 공동배양된 T 세포에 대해 관찰되지 않았다. 많은 양의 SIINFEKL에 의해 펄스화된 DC만이 처리되지 않은 조건과 비교하여 이들 마커의 분명한 변화를 나타냈다.
상청액에서 시토카인 농도 측정은 IL-2(도 9I) 및 IL-12(p40)(도 9J) 발현에 대한 작용성 항-CD40 항체의 효과를 나타냈다. FAP-의존성 인간 항-CD40 항체를 사용한 경우, 상승된 IL-12(p40) 수준이 FAP의 존재 하에만 검출되었다. 그러나, 이중특이적 항원 결합 분자의 뮤린 등가물은 IL-12(p40)의 현저하게 높은 분비를 유도하였다. IL-2 분비는 FAP-의존적 방식으로 항-인간 CD40 및 항-마우스 CD40 이중특이적 항원 결합 분자 둘 다의 경우 유사한 정도로 증가하였다.
2.2.2 FAP-표적화된 항-CD40 결합 분자에 의해 활성화된 OVA-펄스화된 DC를 통한 T 세포 프라이밍
DC를 huCD40tg 마우스의 비장으로부터 단리하고, FAP-코팅되거나 코팅되지 않은 다이나비즈(등록상표) 및 상이한 작용성 항-CD40 항체를 섹션 2.2.1에 기재된 바와 같이 비장 DC에 첨가하였다. DC를, DC에 의한 흡수 및 처리를 요구하지 않는 SIINFEKL에 의해 펄스화하는 것 대신에, OVA 단백질을 항원으로 사용하였다. Toll-유사 수용체(TLR) 자극 독립적 방식으로 OVA 흡수를 촉진하기 위해(추가적 TLR 자극은 DC의 높은 전체적 활성화를 야기하여 작용성 항-CD40 항체에 의한 자극으로 인한 상이한 활성화 상태의 검출을 불가능하게 만들 수 있다), 비오티닐화된 항-마우스 DEC205 항체(밀테니, 클론 NLDC-145, 카탈로그 번호 130-101-854)와 조합된 Ova 항원 전달 시약(밀테니, 카탈로그 번호 130-094-663)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 간략히, DC를 CD8-양성 교차-제시 DC 상에 고로도 발현하는 DEC205 수용체와 결합하는 비오티닐화된 항체와 항온처리하였다(문헌[M. Lahoud et al., Int Immunol. 2000, 12(5), 731-735]). 이후, Ova 전달 시약(FITC 및 OVA에 커플링된 항-비오틴 항체)을 세포에 첨가하여 OVA의 DEC205 수용체-매개된 흡수를 야기하였다. 음성 대조군을 제공하기 위해, DC를 OVA의 첨가 없이 단지 항-DEC205 항체로 표지하였다. 다음 날, CD8-양성 T 세포를 섹션 2.2.1에 기재된 바와 같이 OT1 마우스로부터 단리하고 CFSE 표지하고 DC에 첨가하였다. 실험 제5일에, 150 μl의 상청액을 마우스 IFN-감마 DuoSet ELISA 키트(R&D, 카탈로그 번호 DY485-05)를 사용하여 IFNγ 측정을 위해 채취하였다. ELISA를 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행하였다. T 세포의 FACS 분석을 위해, 96-웰 평저 플레이트의 세포를 96-웰 환저 플레이트로 옮기고 1회 PBS로 세척하고 PBS에서 50 μl의 3 μg/mL의 Fc 수용체 차단 마우스 IgG 동형 대조군과 함께 항온처리하였다. 4℃에서 15분의 항온처리 후에, 세포를 PBS로 세척하고, PBS 중의 형광 표지된 항체의 혼합물 50 μl를 세포에 첨가하였다. 하기 항체를 사용하였다: 항-마우스 CD4 BV421(바이오레전드, 클론 GK1.5, 카탈로그 번호 100438), 항-마우스 CD86 BV785(바이오레전드, 클론 GL-1, 카탈로그 번호 105043), 항-I-A/I-E PerCp-Cy5.5(바이오레전드, 클론 M5/114.15.2, 카탈로그 번호 107626), 항-마우스 CD70 PE(이바이오사이언스, 클론 FR70, 카탈로그 번호 12-0701-82), 항-마우스 CD3 PE-CF594(비디 바이오사이언시즈, 클론 145-2C11, 카탈로그 번호 562286), 항-마우스 CD25 PE-Cy7(이바이오사이언스, 클론 PC61.5, 카탈로그 번호 25-0251-82), 항-마우스 CD11c APC(비디 바이오사이언시즈, 클론 HL3, 카탈로그 번호 561119), 항-마우스 CD44 Alexa Fluor 700(비디 바이오사이언시즈, 클론 IM7, 카탈로그 번호 560567) 및 항-마우스 CD8 APC-Cy7(바이오레전드, 클론 53-6.7, 카탈로그 번호 100714). 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 생존능 염료 좀비 아쿠아(상표)를 항체 혼합물에 첨가하였다. 세포를 30분 동안 4℃에서 50 μl의 염색 항체 혼합물과 함께 항온처리하였다. 이후, 세포를 2회 PBS로 세척하고 200 μl의 PBS에 재현탁시키고 5-레이저 LSR-포르테사를 사용하여 분석하였다. 데이터 분석을 플로우조 버전 10 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 생존 CD3- 및 CD8-양성 세포를 CFSE 신호, CD25 및 CD44 발현에 대해 분석하였다.
도 10A 내지 10C, 11A 내지 11C, 12A 내지 12C 및 22A 및 22B는 OVA 전달 시약과 함께 항온처리되고 인간 CD40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자에 의해 자극된 DC가 CD8 양성 OT1 T 세포 증식(도 10A 내지 10C 및 22A 및 22B), 및 T 세포 활성화 마커 CD25(도 11A 내지 11C) 및 CD44(도 12A 내지 12C)의 발현을 유의미하게 증진시킬 수 있음을 나타낸다. 이들 효과는 FAP-의존적이다. IFNγ ELISA의 결과는 인간 항-CD40 FAP-표적화된 항체에 기인하여 증대된 T 세포 활성화를 확인시켜준다: IFNγ 수준은 항-인간 CD40 FAP-표적화 항체로 처리된 DC와 공동배양된 T 세포를 사용한 조건에서 상승하였다(도 13A 내지 13C). 뮤린 항-CD40 FAP-표적화된 항체의 효과는 비슷하였고, 이는 huCD40tg 마우스 모델이 작용성 항-인간 CD40 항체의 효과를 측정하기 위해 적합한 시스템을 제공한다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 3
FAP-표적화된 항-뮤린 CD40 결합 분자의 기능적 특징
3.1 FAP-표적화된 항-뮤린 CD40 결합 분자에 의한 시험관내 뮤린 B 세포의 CD40-매개된 활성화
C57BL/6J 마우스의 비장을 섹션 2.2.1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 뮤린 B 세포를 비장 세포로부터 제조자의 지시에 따라 마우스 B 세포 단리 키트(밀테니, 카탈로그 번호 130-090-862)를 사용하여 단리하였다. 1x105 B 세포를 100 μl R10에서 96-웰 평저 플레이트의 웰 마다 시딩하였다. 뮤린 비오티닐화된 FAP(사내 생산)(상세한 설명을 위해 2.1.3 참조)로 코팅된 다이나비즈(등록상표) 또는 대조군으로서 코팅되지 않은 다이나비즈를 50 μl R10에서 2:1의 비드:세포 비로 첨가하였다. 작용성 항-뮤린 CD40 항체를 50 μl의 R10에서 B 세포에 첨가하였다. 항체 농도를 1 μg/mL 내지 0.3 ng/mL로 달리 하였다(3x 희석 시리즈). 본 실험 셋업에서, 4개의 항-마우스 CD40 결합 부위 및 1 또는 2개의 FAP 결합 부위(28H1 FAP 바인더, 항-인간 CD40 이중특이적 항원 결합 분자의 FAP 결합 도메인에 해당함)를 갖는 이중특이적 항원 결합 분자를 뮤린 CD40에 대해 2가인 FAP-독립적 FGK4.5 항체(래트 IgG2a, 바이오엑스셀(BioXcell) 카탈로그 번호 BE0016-2)와 비교하였다. FGK4.5의 생물학적 활성은 Fc 수용체 교차 결합에 의존적이었고(문헌[L. Richman et al., Cancer Immunol Res. 2014, 2(1)]), 따라서 FGK4.5를 30분 동안 실온에서 염소 항-래트 IgG (H+L) 교차 결합 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 112-005-003, 로트 번호 123801)와 함께 예비-항온처리하였다. 48시간 후에, B 세포를 FACS에 의해 활성화 마커의 발현에 대해 분석하였다. 이를 위해, B 세포를 96-웰 평저 플레이트 내로 옮기고 PBS로 세척하고 PBS에서 50 μl의 3 μg/mL의 Fc 수용체 차단 마우스 IgG 동형 대조군과 함께 항온처리하였다. 4℃에서 15분의 항온처리 후에, 세포를 PBS로 세척하고 PBS 중의 형광 표지된 항체의 혼합물 50 μl를 세포에 첨가하였다. 하기 항체를 사용하였다: 항-마우스 CD19 BV605(비디 바이오사이언시즈, 클론 1D3, 카탈로그 번호 563148), 항-마우스 CD86 BV785(바이오레전드, 클론 GL-1, 카탈로그 번호 105043), 항-I-A/I-E PerCp-Cy5.5(바이오레전드, 클론 M5/114.15.2, 카탈로그 번호 107626), 항-마우스 CD70 PE(이바이오사이언스, 클론 FR70, 카탈로그 번호 12-0701-82), 항-마우스 CD80 PE-CF594(비디 바이오사이언시즈, 클론 16-10A1, 카탈로그 번호 562504), 항-마우스 CD3 PE-Cy7(비디 바이오사이언시즈, 클론 145-2C11, 카탈로그 번호 552774), 항-마우스 NK1.1 PE-Cy7(바이오레전드, 클론 PK136, 카탈로그 번호 108714), 항-마우스 CD11c APC(비디 바이오사이언시즈, 클론 HL3, 카탈로그 번호 561119), 항-마우스 CD45 Alexa Fluor 700(이바이오사이언스, 클론 30-F11, 카탈로그 번호 56-0451-82), 항-마우스 CD8 APC-Cy7(바이오레전드, 클론 53-6.7, 카탈로그 번호 100714). 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 생존능 염료 좀비 아쿠아(상표)를 항체 혼합물에 첨가하였다. 세포를 30분 동안 4℃에서 염색 혼합물과 함게 항온처리하고 2회 PBS로 세척한 후에, 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. FACS 뷴석을 5-레이저 LSR-포르테사를 사용하여 수행하고 데이터 분석을 플로우조 버전 10 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 생존 단일 세포를 비-B 세포를 제외시키기 위해 CD11c-음성, CD3-음성 및 NK1.1-음성 세포에 대해 게이트화시켰다. CD8-음성, CD19-양성 세포를 B 세포 활성화 마커 CD70, CD80, CD83 및 CD86의 발현에 대해 분석하였다.
뮤린 B 세포를 1 또는 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 FAP-표적화된 항-마우스 CD40 항체와 함께 항온처리하는 것은 B 세포 활성화 마커의 발현을 증가시켰다. CD70 발현은 교차 결합된 FGK4.5 항체를 사용한 조건과 비교하여 이중특이적 항원 결합 분자를 사용한 경우 약간만 증가시켰다(도 14A 및 14B). 그러나, 높은 수준의 CD70을 발현하는 세포의 전체 수는 오히려 낮았다. CD80 발현은 B 세포를 뮤린 CD40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 분자로 처리시 FAP-의존적 방식으로 상향조절되었다(도 14C 및 14D). 이중특이적 분자는 CD80 상향조절의 경우 2가 FAP-독립적 FGK4.5 항체보다 높은 효능을 나타냈다. CD86 발현 증가는 또한 모든 시험된 작용성 항-CD40 항체에 의해 유도되었고, 발현 수준은 모든 항체(도 14E 및 14F)의 경우 비슷하였다. CD86 상향조절은 2개의 FAP 결합 모이어티를 갖는 4가 항-마우스 CD40 항체를 사용한 경우 FAP-의존적인 반면에, FAP-독립적 효과는 하나의 FAP 결합 부위만을 갖는 이중특이적 항원 결합 분자의 경우 관찰되었다. 또한, MHC-II 발현의 FAP-독립적 상향조절은 모든 시험된 이중특이적 항원 결합 분자에 대해 관찰되었다(도 14G 및 14H).
3.2 FAP-표적화된 항-뮤린 CD40 결합 분자에 의한 뮤린 DC 및 T 세포의 생체내 CD40-매개된 활성화
마우스 FAP 발현을 갖는 뮤린 결장 선암 MC38_ FAP 형질감염체 종양 세포주를, 로슈 글리카트 아게(Roche Glycart AG)에서 수행되고 확장 후에 글리카트 인터널 세포 은행(Glycart internal cell bank)에 예치된 생체내-패시지로부터 수득하였다. MC38_muFAP_invipa 세포를 10% FCS(피에이에이 래보래토리즈(PAA Laboratories, 호주 소재)), 1 mM 피루베이트, 1x NEAA 및 6 μg/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 포수된 대기에서 5% CO2에서 배양하고, 시험관내 패시지 14에 95%의 생존능에서 주사하였다. 2x106 종양 세포를 100 μl 세포 현탁액으로(50% RPMI 배지 및 50% 매트리겔(matrigel)) 피하 주사하였다. 실험 개시시 8 내지 9주령의 33마리의 C57Bl/6 암컷 마우스(찰스 리버스(독일 소재)로부터 구매)를 특정 무병원체 조건 하에 12시간의 명 및 12시간의 암의 매일 주기로 기록된 가이드라인(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라 유지하였다. 실험적 연구 프로토콜을 검토하고 지방 자치(P 2011-128)에 의해 승인받았고, 도착 후에 동물을 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 1주일 동안 유지하였다. 이어서, 이들에게 식별을 위해 트랜스폰더를 등 오른편 피하에 이식하고 1주일 이상 동안 회복을 위해 유지하였다. 연속 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 생체내 CD40의 FAP-표적화된 활성화를 연구하기 위해, 마우스에게 제0일에 2x106 MC38-FAP를 피하 주사하였다. 종양이 200 mm3에 도달한 제x일에, 군 당 9마리의 마우스에게 200 μL의 상이한 화합물을 i.p. 주사하였다. 비히클군의 마우스에게 히스티딘 완충제를 주사하고, 처리군의 동물에게 10 mg/kg FGK4.5 또는 15 mg/kg FGK4.5 4+1을 주사하였다. 동물을 매일 임상적 증상 및 역효과, 예컨대 체중 감소의 검출에 대해 조절하였다. 동물에 대한 종결 기준은 임상적 질병, 손상된 운동능력 및 지저분한 털이었다. 치료 주사 72시간 및 8일 후 시점에, 종양, 비장, 종양-배수 및 종양-비-배수 림프절을 군 당 3마리의 마우스로부터 수집하고 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 또한, 모든 희생된 동물의 혈청을 수집하여 간 손상을 가리키는 혈청 효소를 분석하였다.
유세포 분석기 분석을 위해, 모든 수집된 기관의 단일 세포 현탁액을 제조하고 각각 섹션 2.1.1 및 섹션 3.1에 기재된 바와 같이 형광 표지된 항체로 염색하였다. 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 생존능 염료 좀비 아쿠아(상표)를 항체 혼합물에 첨가하였다. 세포를 염색 혼합물과 함께 30분 동안 4℃에서 항온처리하고 2회 PBS로 세척하고 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. FACS 분석을 5-레이저 LSR-포르테사를 사용하여 수행하고, 데이터 분석을 플로우조 버전 10 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. DC를 CD11c 및 MHC 클래스 II에 대해 고도로 양성이고 CD3, NK1.1 및 CD19에 대해 음성인 생존 단일 세포로 확인하였다. CD70 및 CD86 발현(모두 DC 활성화 마커임)을 치료 주사 3일 후에 DC 상에서 분석하였다. 생존 CD45-, CD3- 및 CD8-양성 단일 세포를 CD8+ T 세포로 확인하였다. CD8+ T 세포를 Ki67 FITC(이바이오사이언스, 클론 SolA15, 카탈로그 번호 11-5698-82) 발현에 대해 분석하고, 종양에서 CD8+ T 세포의 총 수를 절대 세포 계수 비즈(인비트로젠, 카탈로그 번호 01-1234)를 사용하여 결정하였다.
도 23A 내지 23C에 나타낸 바와 같이, 제3일에, 간세포 손상을 암시하는 효소는 CD40의 단일 i.p. 투여량으로 주사 맞은 마우스에서 증가하였으나 FAP-CD40 또는 비히클 단독으로 주사 맞은 마우스에서는 증가하지 않았다. 또한, 체중은 감소하였고, 비장 중량은 FAP-CD40 4+1 또는 비히클 단독으로 주사 맞은 마우스와 비교하여 처리 3일 후 CD40-처리된 마우스의 경우 증가하였고(각각 도 23D 및 23E), 이는 모 CD40 항체로 처리된 동물과 비교하여 FAP-표적화된 CD40 항체로 처리된 동물에서 덜 심각한 부작용을 시사한다. FGK4.5보다 적은 정도지만, FAP-표적화된 항-CD40 항체는 비히클-처리된 마우스와 비교하여 처리 3일 후 종양-배수 림프절에서 DC 활성화(CD86 및 CD70 발현)(도 24A 및 24B) 및 처리 8일 후 종양에서 CD8+ T 세포 증식(Ki68 발현 및 세포 수)(도 24C 및 24D)의 유의미한 증가를 유도하였다. 요약컨대, 4+1 포맷의 CD40의 FAP-의존성 활성화를 갖는 FAP-표적화된 항-CD40 분자는 표적화되지 않은 항-CD40 모 항체 FGK4.5와 비교하여 종양-함유 마우스에서 감소된 전신 독성과 함께 강한 DC 및 T 세포 활성화를 유도하였다.
실시예 4
항-CD40 항체 S2C6의 인간화된 변이체의 생성 및 생산
4.1 항-CD40 항체 S2C6의 인간화된 변이체의 제1 생성
4.1.1 방법론
항-CD40 항체 S2C6은 WO 2000/075348에 개시되어 있고 서열번호 129의 VH 도메인 및 서열번호 130의 VL 도메인을 갖는다. 이의 변이체를 하기에 기재된 바와 같이 생산하였다. 항-CD40 바인더 S2C6의 인간화 동안 적합한 인간 수용자 골격의 식별을 위해, 2개의 방법론의 조합을 사용하였다. 한편으로는, 높은 서열 상동을 갖는 수용자 골격을 찾고, 상기 골격 상에 CDR을 이식하고, 어떤 복귀 돌연변이가 예상될 수 있는지를 평가함으로써 고전적 접근법을 수행하였다. 보다 명확히는, 모 항체에 대한 식별된 골격의 각각의 아미노산 차이를 바인더의 구조적 온전성에 대한 영향에 대해 판단하였고, 모 서열에 대한 복귀 돌연변이를 적절한 경우 도입하였다. 구조적 평가는 바이오비아 디스커버리 스튜디오 엔바이론먼트(Biovia Discovery Studio Environment), 버전 4.5를 사용하여 시행되는 사내 항체 구조 상동 모델링 툴에 의해 생성된 모 항체 및 이의 인간화된 버전 둘 모두의 Fv 영역 상동 모델을 기반으로 한다.
다른 한편으로는, 사내 개발된 가상환경에서의 툴을 사용하여 서로에 대한 인간화된 버전의 VH 및 VL 도메인의 배향을 예측하였다(본원에 참고로 포함된 WO 2016/062734 참고). 결과를 모 바인더의 예측된 VH-VL 도메인 배향과 비교하여 기하학에 있어서 출발 항체와 비슷한 골격 조합을 선택하였다. 2개의 도메인의 페어링에서 파괴적 변화를 야기할 수 있는 VH-VL 경계면 영역에서 가능한 아미노산 교환을 검출하는 것이 합리적이다.
4.1.2 골격의 선택 및 이의 조정
수용자 골격를 하기 표 12에 기재된 바와 같이 선택하였다:
[표 12]
Figure 112019111985212-pct00071
포스트-CDR3 골격 영역을 인간 IGHJ 생식 세포계열 IGHJ6*01/02(YYYYYGMDV WGQGTTVTVSS ) 및 인간 IGKJ 생식 세포계열 IGKJ1*01(WT FGQGTKVEIK )로부터 조정하였다. 수용자 골격에 관련 있는 부분은 밑줄로 표시하였다.
구조적 고려사항을 기반으로, 인간 수용자 골격에서 모 바인더의 아미노산으로의 복귀 돌연변이를 VH 영역의 위치 H48(M>I) 및 H71(R>V) 및 VL 영역의 위치 L36(F>Y), L46(R>L) 및 L87(Y>F)에 도입하였다(카바트 넘버링). 또한, CDR-H2에서의 2개의 위치는 전진 돌연변이, 즉, 전체 인간 형질을 증가시키기 위한 모 바인더에서 인간 수용자 생식 세포계열로의 아미노산 교환, 즉, H60(N>A) 및 H64(K>Q)에 대한 유망 대체물로 확인되었다.
추정상의 개발가능성 핫스폿(아스파라긴 탈아미드화)을 다루기 위해, 모 바인더에 대한 추가적 변화를 VH의 위치 H52b(N>Q) 및 H54(N>A) 및 VL의 위치 L27f(N>Q), L28(G>P), L29(N>Q) 및 L30(T>I)에 도입하였다(카바트 넘버링).
하기 표 13에 VH-VL 페어링 매트릭스를 나타냈다:
[표 13]
Figure 112019111985212-pct00072
4.1.3 생산된 인간화된 CD40 항체의 VH 및 VL 도메인
생산된 인간화된 CD40 항체의 VH 도메인을 하기 표 14에서 찾아볼 수 있고, 생산된 인간화된 CD40 항체의 VL 도메인을 하기 표 15에 나열하였다.
[표 14]
Figure 112019111985212-pct00073
[표 15]
Figure 112019111985212-pct00074
S2C6 변이체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 인간화된 아미노산 서열을 DNA로 역번역하고, 생산된 cNDA를 합성한 후에(진아트(GenArt)), 효과기 기능을 없애는 LALA 및 PG 돌연변이(류신 234→알라닌, 류신 235→알라닌, 프롤린 329→글리신)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-Hinge-CH2-CH3을 갖는 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터 내로 클로닝하거나, 인간 C-카파에 대한 융합 단백질로 경쇄 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, LC 및 HC 플라스미드를 HEK293 내로 공통형질감염시키고 7일 후에 상청액으로부터 항체 정제 표준 방법에 의해 정제하였다.
4.2 항-CD40 항체의 인간화된 변이체 S2C6의 제2 생성
4.2.1 방법론
실시예 4.1에서와 같이, 항-CD40 바인더 S2C6의 인간화 동안 적합한 인간 수용자 골격의 식별을 위해, 2개의 방법론의 조합을 사용하였다. 한편으로는, 높은 서열 상동을 갖는 수용자 골격을 찾고, 상기 골격 상에 CDR을 이식하고, 어떤 복귀 돌연변이가 예상될 수 있는지를 평가함으로써 고전적 접근법을 수행하였다. 보다 명확히는, 모 항체에 대한 식별된 골격의 각각의 아미노산 차이를 바인더의 구조적 온전성에 대한 영향에 대해 판단하였고, 모 서열에 대한 복귀 돌연변이를 적절한 경우 도입하였다. 구조적 평가는 바이오비아 디스커버리 스튜디오 엔바이론먼트, 버전 4.5를 사용하여 시행되는 사내 항체 구조 상동 모델링 툴에 의해 생성된 모 항체 및 이의 인간화된 버전 둘 모두의 Fv 영역 상동 모델을 기반으로 한다.
다른 한편으로는, 사내 개발된 가상환경에서의 툴을 사용하여 서로에 대한 인간화된 버전의 VH 및 VL 도메인의 배향을 예측하였다(본원에 참고로 포함된 WO 2016/062734 참고). 결과를 모 바인더의 예측된 VH-VL 도메인 배향과 비교하여 기하학에 있어서 출발 항체와 비슷한 골격 조합을 선택하였다. 2개의 도메인의 페어링에서 파괴적 변화를 야기할 수 있는 VH-VL 경계면 영역에서 가능한 아미노산 교환을 검출하는 것이 합리적이다.
4.2.2 수용자 골격의 선택 및 이의 조정
2개의 상이한 수용자 골격을 하기 표 16 및 표 18에 기재된 바와 같이 선택하였다.
[표 16]
Figure 112019111985212-pct00075
포스트-CDR3 골격 영역을 인간 IGHJ 생식 세포계열 IGHJ6*01/02(YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS) 및 인간 IGKJ 생식 세포계열 IGKJ4*01/02(LTFGGGTKVEIK)로부터 조정하였다. 수용자 골격과 관련 있는 부분을 굵은 글씨로 표시하였다.
구조적 고려사항을 기반으로, 인간 수용자 골격에서 모 바인더로의 복귀 돌연변이를 VH 영역의 위치 H43(Q>K), H44(G>S), H69(M>L), H71(R>V), H73(T>K), H88(V>A) 및 H105(Q>H) 및 VL 영역의 위치 L2(I>V), L4(M>V), L87(Y>F) 및 L104(V>L)에서 도입하였다. 하나의 변이체에서, 돌연변이 T70S(VH)를 포함시켜 이 위치에서 약간 보다 친수성인 잔기의 효과를 연구하였다.
모든 돌연변이체는 N54A 돌연변이(VH)를 포함하여 추정상의 개발가능성 핫스폿(아스파라긴 탈아미드화)을 다뤘다. 모든 위치는 카바트 EU 넘버링 체계에 제공된다.
하기 표 17에 인간화 변이체 VH-VL 페어링 매트릭스가 나타나 있다:
[표 17]
Figure 112019111985212-pct00076
[표 18]
Figure 112019111985212-pct00077
포스트-CDR3 골격 영역을 인간 IGHJ 생식 세포계열 IGHJ6*01/02(YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS) 및 인간 IGKJ 생식 세포계열 IGKJ4*01/02(LTFGGGTKVEIK)로부터 조정하였다. 수용자 골격과 관련된 부분을 굵은 글씨로 표시하였다.
구조적 고려사항을 기반으로, 인간 수용자 골격에서 모 바인더의 아미노산으로의 복귀 돌연변이를 VH 영역의 위치 H44 (G>S), H49(S>G), H71(R>V), H78(L>A), H94(K>R) 및 H105(Q>H) 및 VL 영역의 위치 L42(K>Q), L43(A>S) 및 L87(Y>F)에 도입하였다. 또한, CDR-H2에서의 4개의 위치는 전진 돌연변이, 즉, 전체 인간 형질을 증가시키기 위한 모 바인더에서 인간 수용자 생식 세포계열로의 아미노산 교환, 즉, H60(N>G), H61(Q>D), H62(K>S) 및 H63(F>V)에 대한 유망 대체물로 확인되었다.
모든 돌연변이체는 N54A 돌연변이(VH)를 포함하여 추정상의 개발가능성 핫스폿(아스파라긴 탈아미드화)을 다뤘다. 모든 위치는 카바트 EU 넘버링 체계에 제공된다.
하기 표 19에 인간화 변이체 VH-VL 페어링 매트릭스가 나타나 있다:
[표 19]
Figure 112019111985212-pct00078
4.2.3 생산된 인간화된 CD40 항체의 VH 및 VL 도메인
수용자 골격 1을 기반으로 생산된 인간화된 CD40 항체의 VH 및 VL 도메인을 하기 표 20에서 찾아볼 수 있고, 수용자 골격 2를 기반으로 생산된 인간화된 CD40 항체의 VH 및 VL 도메인을 하기 표 21에 나열하였다.
[표 20]
Figure 112019111985212-pct00079
[표 21]
Figure 112019111985212-pct00080
4.2.4 huIgG1_LALA_PG 포맷의 새로운 인간화된 CD40 항체
VH 및 VL의 새로운 인간화 변이체를 기반으로, 새로운 CD40 항체를 WO 2012/130831 A1에 기재된 방법에 따라 Fcγ 수용체의 결합을 없애는 효과기 사일런트 Fc(P329G; L234, L235A)를 갖는 huIgG1 항체로 발현하였다.
[표 22]
Figure 112019111985212-pct00081
인간 IgG1_LALAPG 항체로서 인간화된 CD40 항체의 전장 서열을 표 23에서 찾아볼 수 있다.
[표 23]
Figure 112019111985212-pct00082
Figure 112019111985212-pct00083
Figure 112019111985212-pct00084
Figure 112019111985212-pct00085
Figure 112019111985212-pct00086
Figure 112019111985212-pct00087
Figure 112019111985212-pct00088
Figure 112019111985212-pct00089
Figure 112019111985212-pct00090
Figure 112019111985212-pct00091
Figure 112019111985212-pct00092
Figure 112019111985212-pct00093
Figure 112019111985212-pct00094
Figure 112019111985212-pct00095
4.2.5 huIgG1_LALA_PG 포맷의 새로운 인간화된 CD40 항체의 생산
항체를 상이한 펩티드 쇄를 암호화하는 발현 벡터에 의한 현탁액에서 성장하는 HEK293-F 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현하였다. HEK293-F 세포(인비트로젠(미국 소재)) 내로의 형질감염을 세포 공급자의 지시에 따라 항체 벡터의 맥시프렙(퀴아젠(독일 소재)) 제제, F17 기반 배지(인비트로젠(미국 소재)), PEIpro(폴리사이언스 유럽 게엠베하) 및 1-2*106 생존 세포/ml의 초기 세포 밀도를 사용하여 무혈청 프리스타일 293 발현 배지(인비트로젠)에서 수행하였다. 세포 배양 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리에 의해 진탕 플라스크 또는 교반된 발효조에서 7일의 배양 후에 채취하고 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다.
항체를 MabSelectSure-세파로스(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간략히, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)와 평형을 이루는 MabSelect SuRe 수지 상에 포집하고 평형 완충제로 세척하고 25 mM 시트레이트(pH 3.0)로 용출하였다. 1 M Tris(pH 9.0)로 중화시킨 후에, 응집된 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체 종으로부터 분리하였다. 단량체성 단백질 분획을 모으고 필요에 따라 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(30KD MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다. 샘플 분액을 예를 들어 CE-SDS, 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광분석법 및 내독소 결정에 의한 후속 분석학적 특성규명을 위해 사용하였다.
상이한 인간화된 CD40 항체에 대한 생산 수율을 MabSelectSure-세파로스(상표) 크로마토그래피를 사용한 분취 친화도 크로마토그래피 후에 수율로부터 계산된 역가 값으로 표 24 및 25에 나타냈다.
최종 정제 단계 후에 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스)을 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
분자의 총 함량을 25 mM 인산 칼륨, 125 mM 염화 나트륨, 200 mM L-아르긴 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충제에서 25℃에서 TSKgel G3000 SW XL 분석학적 크기 배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
모든 항체의 직접 비교를 위해, 열적 안정성을 정적 광산란(SLS)에 의해 및 적용된 온도 스트레스에 대한 반응으로 고유 단백질 형광을 측정함으로써 모니터링하였다. 1 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 30 μg의 여과된 단백질 샘플을 2회 실험으로 옵팀(Optim) 2 기기(아박타 어낼리티컬 리미티드(Avacta Analytical Ltd))에 적용하였다. 온도를 0.1℃/분으로 25℃에서 85℃로 증가시키고, 반경 및 총 산란 강도를 수집하였다. 고유 단백질 형광을 결정하기 위해, 샘플을 266 nm에서 여기시키고, 방출을 275 내지 460 nm에서 수집하였다. 모든 항체의 경우, 응집 온도(Tagg)는 64℃ 내지 69℃였고, 이는 하기 표 24 또는 표 25에 제공된다.
상이한 골격을 갖는 인간화된 CD40 항체의 생산 수율을 하기 표 24 또는 표 25에 나타냈다.
[표 24]
Figure 112019111985212-pct00096
[표 25]
Figure 112019111985212-pct00097
4.2.6 재조합 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD40 세포외 도메인 단백질의 생성
하기 구축물을 HEK293 세포에서 클로닝하고 일시적 발현에 의해 발현하였다:
1) C-말단 His-AviTag(상표) 태그(서열번호 266)를 갖는 인간 CD40 세포외 도메인(서열번호 1의 아미노산 21-193, NCBI 수탁 번호 NP_001241)
2) C-말단 His-AviTag(상표) 태그(서열번호 267)를 갖는 시노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이(macaca fascicularis)) CD40 세포외 도메인(아미노산 21-193, 시노몰구스 CD40 세포외 도메인 서열을 로슈 시노몰구스 cDNA 데이터베이스(공개되지 않은 데이터)로부터 가져왔다).
결합 분석을 위한 CD40 세포외 도메인 항원을 유전자 합성(유로핀즈 제노믹스 게엠베하 서비스(Eurofins Genomics GmbH service, 독일 소재))에 의해 생성하고 독특한 제한 부위를 통해 로슈의 사내 발현 벡터 내로 표준 클로닝 절차를 사용하여 클로닝하였다. 모든 구축물의 클로닝을 서열분석에 의해 확인하였다. 모든 항원을 CMV-프로모터의 제어 하에 발현하였다. CD40 세포외 도메인 구축물의 일시적 발현을 위해, 현탁액-적합화된 HEK293-F 세포(라이프 테크놀로지스(미국 소재))를 각각의 플라스미드로 형질감염시켰다: 일반적으로, 약 2x106 세포/ml의 1 L의 HEK293-F 세포를 제조자의 지시에 따라 PEIpro 형질감염 시약(폴리사이언시즈 유럽 게엠베하(Polysciences Europe GmbH, 독일 소재))에 의해 복합화된 총 500 μg의 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후에, HEK293-F 세포를 6일 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 채취하고, 단백질-함유 상청액을 0.22 μm 진공 여과 시스템(밀리포어)을 사용하여 여과하였다. His-AviTag(상표) 태그된 단백질을 완전-His-Tag 수지(로슈 디아그노틱스(Roche Diagnostics))를 사용하여 IMAC 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 50 mM Na2PO4, 300 mM NaCl(pH 8.0)로 세척한 후에, His- AviTag(상표) 융합 단백질을 500 mM 이미다졸로 보충된 세척 완충제(pH 7.0)를 사용하여 용출하였다. 응집된 단백질을 20 mM Tris, 150 mM NaCl(pH 7.4)에서 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 75, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 융합 단백질로부터 분리하였다. 단량체성 단백질 분획을 모으고 필요에 따라 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(10KD MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다. 샘플 분액을 예를 들어 CE-SDS, 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석법에 의한 후속 분석학적 특성규명을 위해 사용하였다.
CD40 세포외 도메인의 비오티닐화
C-말단 AviTag(상표)를 함유하는 인간 또는 시노몰구스 CD40 세포외 도메인 구축물의 효소 부위 특이적 비오티닐화를 제조자의 지시에 따라 BirA 비오틴-단백질 리가제 키트(Avidity LLC(미국 소재))를 사용하여 수행하였다. 간략히, 1/10 부피의 BiomixA(10X 농도: 0.5 M bicine 완충제, pH 8.3) 및 BiomixB(10X 농도: 100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 500 μM d-비오틴)를 AviTag(상표)-함유 단백질에 첨가한 후에, 10 nmol 단백질 당 2.5 μg의 BirA 리가제를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 1시간 동안 항온처리하고 수퍼덱스75 prep 그레이드 예비-패킹된 하이로드 컬럼(지이 헬쓰케어(스웨덴 소재)) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
4.2.7 인간/시노몰구스 CD40 결합 표면 플라스몬 공명 분광학 분석
약 12000 공명 유닛(RU)의 포착 시스템(10 μg/ml 염소 항-인간 F(ab)'2; 주문 코드: 28958325; 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 에이비(스웨덴 소재))을 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링하였다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충된 염수)(pH 7.4)였다. 유세포를 25℃로 설정하고 - 샘플 블록을 12℃로 설정하고 - 러닝 완충제로 2회 프라이밍하였다. 항체를, 50 nM 용액을 30초 동안 5 μl/분의 유속으로 주사함으로써 포착하였다. 결합을 1:3 희석으로 300 nM에서 출발하여 300초 동안 30 μl/분의 유속으로 용액 중의 다양한 농도로 인간 CD40 세포외 도메인 또는 시노몰구스 원숭이 CD40 세포외 도메인의 주사에 의해 측정하였다. 해리 상을 1200초 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 러닝 완충제로 스위칭함으로써 촉발하였다. 표면을 글리신 pH 2.1 용액으로 30 μl/분의 유속으로 60초 세척하여 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이를 염소 항-인간 F(ab')2 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주사를 감하였다(=이중 참조). 겉보기 KD 및 다른 동력학적 매개변수의 계산을 위해, 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다. 겉보기 Kd를 비아코어TM B4000 평가 소프트웨어(버전 1.1)를 사용하여 계산하였다.
4.2.8 CD40-특이적 인간화된 항체의 특성규명을 위한 세포 결합 분석
CD40 양성 세포(Raji 세포)를 트립신을 사용하여 배양 보틀로부터 탈착시키고 Casy 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. 4℃에서 펠릿화한 후에, 세포를 FACS 완충제(PBS 중 2.5% FCS)에 재현탁시키고 2.0E+06 세포/mL로 조정하고 96-웰 PP V-바닥-플레이트에 분배하였다(25 μL/웰 = 5.0E+04Zellen/웰).
CD40 특이적 항체를 FACS 완충제에 20 μg/mL로 조정하여 10 μg/mL의 최종 농도를 수득하였다. 20 μl를 25 μl 세포 현탁액에 첨가하고 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2회 FACS 완충제에서 세척하였다. 세척한 후에, 세포를 50 μL 이차 항체를 함유하는 FACS-완충제에 재현탁시키고(<huIgG>-Alexa488, c=10 μg/mL) 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2회 FACS 완충제에서 세척하고 FACS 칸토(비디, 파밍젠(BD, Pharmingen))를 사용하여 70 μl/웰 FACS 완충제에 측정을 위해 재현탁시켰다.
표 26에 CD40 항체의 친화도(비아코어에 의해 측정됨) 및 CD40 발현 세포(Raji 세포)에 대한 세포 결합을 나타냈다.
[표 26]
Figure 112019111985212-pct00098
Figure 112019111985212-pct00099
4.2.9 UHR-ESI-QTOF 질량 분광분석법에 의한 항체 특성규명
샘플을 40% 아세토니트릴 및 2% 폼산(v/v)을 사용하여 세파덱스 G25 5x250 mm 컬럼 HPLC(애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences, 독일 프라이부르크 소재))에 의해 탈염시켰다. 총 질량을 트라이버사 나노메이트 소스(TriVersa NanoMate source)(애드비온(Advion, 미국 뉴욕주 이타카 소재))를 갖춘 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달토닉(독일 브레멘 소재)) 상에서 UHR-ESI-QTOF MS에 의해 결정하였다. 데이터 획득을 900 내지 4000 m/z에서(ISCID: 0.0 eV) 수행하였다. 처리되지 않은 질량 스펙트럼을 평가하고 사내 개발된 소프트웨어 툴을 사용하여 개별적 상대적 몰질량으로 변환하였다.
4.2.10 항체의 열적 안정성 평가
샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl(pH 6.0)에 1 mg/mL의 농도로 제조하고 0.4 μm 필터 플레이트를 통해 원심분리에 의해 광학 384-웰 플레이트로 옮기고 파라핀 오일로 덮었다. 샘플을 0.05℃/분의 속도로 25℃에서 80℃로 가열하면서 수력학적 반경을 다이나프로(DynaPro) 플레이트 리더(와트(Wyatt)) 상에서 동적 광산란에 의해 반복적으로 측정하였다. 대안적으로, 샘플을 10 μL 마이크로-큐벳 어레이에 옮기고, 이를 0.1℃/분의 속도로 25℃에서 90℃로 가열하면서, 정적 광산란 데이터 및 266 nm 레이저에 의한 여기시 형광 데이터를 옵팀1000 기기(아박타 인코포레이티드)에 의해 기록하였다. 응집 개시 온도는 수력학적 반경(DLS) 또는 산란된 광 강도(옵팀1000)가 증가하기 시작하는 온도로서 정의된다. 융점은 형광 강도 대 파장의 그래프에서 변곡점으로 정의된다.
실시예 5
새로운 인간화된 CD40 항체 변이체에 의한 이중특이적 구축물의 생성 및 생산
5.1 CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)를 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자의 생성
실시예 4에 기재된 바와 같이 VH 도메인 및 VL 도메인을 암호화하는 cDNA를 적합한 발현 플라스미드의 상응하는 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 경쇄에 의해 인 프레임 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터 및 CMV 인핸서 요소에 의해 구동하였다. 또한, 발현 카세트는 cDNAs의 3' 단부에서 합성 폴리A 신호를 함유하였다. 또한, 플라스미드 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 복제 기점(EBV OriP)을 가졌다.
실시예 1과 유사하게, 상이한 이중특이적 CD40-FAP 항체를 Fc의 C-말단에서 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 4개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 4+1 포맷(도 1A), 또는 Fc의 C-말단에서 1개의 FAP 결합 모이어티(도 1C 및 1E), 또는 Fc의 C-말단에서 2개의 FAP 결합 모이어티(도 1D)와 조합된 2개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 2+1 또는 2+2 포맷으로 생산하였다. 또한, 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 하나의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 이중특이적 항체를 생산하였다(도 1F). FAP 바인더 28H1 및 4B9의 생성 및 생산은 본원에 참고로 포함된 WO 2012/020006 A2에 기재되어 있다. 4+1 및 2+1 분자를 생성하기 위해, 놉-인투-홀 기술을 사용하여 이종 이량체화를 달성하였다. S354C/T366W 돌연변이를 제1 중쇄 HC1(Fc 놉 중쇄)에 도입하고, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 제2 중쇄 HC2(Fc 홀 중쇄)에 도입하였다. 2+2 분자에서, WO 2010/145792 A1에 기재된 CrossMab 기술은 정확한 경쇄 페어링을 보장하였다. 이중특이적 포맷과 관계 없이, 모든 경우, WO 2012/130831 A1에 기재된 방법에 따라 효과기 사일런트 Fc(P329G; L234, 234A)를 사용하여 Fcγ 수용체에 대한 결합을 없앴다. 이중특이적 분자의 서열을 표 27에 나타냈다.
모든 유전자를 CMV 프로모터 인핸서 단편과 조합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 제어 하에 일시적으로 발현시켰다. 또한, 발현 벡터는 EBNA(엡스타인 바 바이러스 핵 항원)-함유 숙주 세포에서 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유하였다.
[표 27]
Figure 112019111985212-pct00100
Figure 112019111985212-pct00101
Figure 112019111985212-pct00102
Figure 112019111985212-pct00103
Figure 112019111985212-pct00104
추가적 이중특이적 항체를 실시예 4.2에 기재된 새로운 새로운 인간화된 CD40 항체 변이체를 사용하여 생산하였다. 이러한 이중특이적 항체의 특정 서열이 하기 표 28에 나타나 있다. 특히, 상이한 이중특이적 CD40-FAP 항체를 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합된 크로스오버 fab 단편으로서 하나의 FAP 결합 모이어티와 조합된 4개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 4+1 포맷(도 15F 및 15G), 또는 VL-CH1 쇄가 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합되는, 크로스오버 fab 단편으로서 하나의 FAP 결합 모이어티(도 15H) 또는 VH-CL 쇄가 Fc 놉 쇄의 C-말단에 융합되는, 크로스오버 fab 단편으로서 하나의 FAP 결합 모이어티(도 15I)와 조합된 2개의 CD40 결합 모이어티로 이루어진 2+1 포맷으로 생산하였다.
[표 28]
Figure 112019111985212-pct00105
Figure 112019111985212-pct00106
Figure 112019111985212-pct00107
Figure 112019111985212-pct00108
Figure 112019111985212-pct00109
Figure 112019111985212-pct00110
Figure 112019111985212-pct00111
Figure 112019111985212-pct00112
5.2 CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자의 생산
CD40 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 이중특이적 항원 결합 분자를, 4개의 상이한 펩티드 쇄를 암호화하는 발현 벡터에 의해 현탁액에서 성장하는 HEK 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현하였다. HEK293-F 세포(인비트로젠) 내로의 형질감염을 무혈청 프리스타일 293 발현 배지(인비트로젠)에서 세포 공급자의 지시에 따라 항체 벡터의 맥시프렙(퀴아젠) 제제, F17 배지(인비트로젠(미국 소재)), Peipro(폴리사이언스 유럽 게엠베하) 및 1-2*106 생존 세포/ml의 초기 세포 밀도를 사용하여 수행하였다. 세포 배양 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리에 의해 진탕 플라스크 또는 교반된 발효조에서 7일의 배양 후에 채취하고 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다.
이중특이적 항체를 MabSelectSure-세파로스(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간략히, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)와 평형을 이루는 MabSelect SuRe 수지 상에 포집하고 평형 완충제로 세척하고 25 mM 시트레이트(pH 3.0)로 용출시켰다. 1 M Tris(pH 9.0)로 중화시킨 후에, 응집된 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체 종으로부터 분리하였다. 단량체성 단백질 분획을 모으고 필요에 따라 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(30KD MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다. 샘플 분액을 예를 들어 CE-SDS, 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분광분석법 및 내독소 결정에 의한 후속 분석학적 특성규명을 위해 사용하였다.
[표 29]
Figure 112019111985212-pct00113
Figure 112019111985212-pct00114
5.3 인간화된 CD40 항체 변이체 및 FAP를 포함하는 이중특이적 항체의 특성규명
5.3.1 인간 또는 마우스 FAP-발현 뮤린 섬유아세포 세포에 대한 결합
세포 표면 FAP에 대한 결합을 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP) 발현 세포 NIH/3T3-huFAP 클론 19, 또는 마우스 섬유아세포 활성화 단백질(mFAP) 발현 세포 NIH/3T3-mFAP 클론 26을 사용하여 실시예 1.4.1에 기재된 바와 같이 시험하였다. 인간화된 CD40 항체 변이체를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 일부에 대해 측정된 EC50 값을 표 7에 나타냈다.
5.3.2 FAP에 대한 결합(표면 플라스몬 공명)
인간 FAP에 결합하는 이중특이적 구축물의 능력을 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을 비아코어 T200(비아코어) 상에서 25℃에서 HBS-EP를 러닝 완충제로서(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20(비아코어)) 사용하여 수행하였다.
His-태그된 인간 이량체성 FAP(재조합 FAP_ECD)를 500 nM huFAP(60초 동안 10 uL/분의 유속), 10 nM 뮤린 FAP(20초 동안 20 uL/분의 유속) 및 10 nM cynoFAP(20초 동안 20 uL/분의 유속)의 주사에 의해 항-His 항체(퀴아젠 카탈로그 번호 34660)에 의해 고정화된 CM5 칩(지이 헬쓰케어) 상에 포착하였다. 18000 공명 유닛(RU) 이하의 항-His 항체에 대한 고정화 수준을 사용하였다. 포착 단계 후에, 이중특이적 항체 및 대조군 분자를 0.78 내지 100 nM의 농도에서 30 μL/분의 유속을 사용하여 280초 동안 및 180초의 해리 상 동안 칩 표면 위에 즉시 통과시켰다. 벌크 굴절률 차이를 FAP가 고정되지 않은 기준 유세포에서 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 결합력을 랭뮤어 1:1 곡선 핏팅을 사용하여 결정하였다. 2가 결합의 경우, 동일한 1:1 핏팅을 사용하여 겉보기 KD 값을 도출하였다.
[표 30]
Figure 112019111985212-pct00115
5.3.3 CD40에 대한 결합(표면 플라스몬 공명)
인간 CD40에 결합하는 이중특이적 구축물의 능력을 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을 비아코어 T200(비아코어) 상에 25℃에서 HBS-EP를 러닝 완충제로서(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20(비아코어)) 사용하여 수행하였다.
실시예 4.2.7에 따라, 결합을 1:3 희석으로 300 nM에서 출발하여 300초 동안 30 μl/분의 유속으로 용액 중의 다양한 농도로 인간 CD40 세포외 도메인의 주사에 의해 측정하였다. 해리 상을 1200초 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 러닝 완충제로 스위칭함으로써 촉발하였다. 표면을 글리신 pH 2.1 용액으로 30 μl/분의 유속으로 60초 세척하여 재생성하였다. 벌크 굴절률 차이를 염소 항-인간 F(ab')2 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주사를 감하였다(=이중 참조). 겉보기 KD 및 다른 동력학적 매개변수의 계산을 위해, 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다. 겉보기 Kd를 비아코어TM B4000 평가 소프트웨어(버전 1.1)를 사용하여 계산하였다.
[표 31]
Figure 112019111985212-pct00116
5.3.4 인간 CD40-발현 다우디 세포에 대한 결합
세포 표면 CD40에 대한 결합을 실시예 1.4.2에 기재된 바와 같이 다우디 세포(인간 CD40의 높은 발현 수준을 갖는 인간 B 림프아세포 세포주)(ATCC CCL-213)를 사용하여 시험하였다. 인간화된 CD40 항체 변이체를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 일부에 대해 측정된 예시적 EC50 값을 표 8에 나타냈다.
5.3.5 인간화된 CD40 항체 변이체를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 기능적 특성
인간화된 CD40 항체 변이체를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 기능적 특성을 실시예 2에 기재된 실험에 따라 분석하였다. 예시적 데이터가 본원 상기에 나타낸 표 9, 10 또는 11에 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to CD40 and to FAP <130> P34214-WO <140> PCT/EP2018/058384 <141> 2018-04-03 <150> EP17164725.8 <151> 2017-04-04 <150> EP18158751.0 <151> 2018-02-27 <160> 269 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 2 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His 20 25 30 Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu 35 40 45 Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly 50 55 60 Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn 65 70 75 80 Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys 85 90 95 Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val 100 105 110 Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala 115 120 125 Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn 130 135 140 Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro 165 170 175 Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile 180 185 190 Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr 195 200 205 Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala 210 215 220 Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly 225 230 235 240 Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly 245 250 255 Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro 260 265 270 Ala Tyr Val 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tacacccaga agtccctgag cctgagcccc ggcggaggcg gcggaagcgg aggaggagga 2040 tccggaggag ggggaagtgg cggcggagga tctgaggtgc agctgctgga atccggcgga 2100 ggcctggtgc agcctggcgg atctctgaga ctgtcctgcg ccgcctccgg cttcaccttc 2160 tcctcccacg ccatgtcctg ggtccgacag gctcctggca aaggcctgga atgggtgtcc 2220 gccatctggg cctccggcga gcagtactac gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc 2280 tcccgggaca actccaagaa caccctgtac ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac 2340 accgccgtgt actactgtgc caagggctgg ctgggcaact tcgactactg gggccagggc 2400 accctggtca ccgtgtccag c 2421 <210> 108 <211> 2397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fchole_PGLALA-28H1 VL <400> 108 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggcta cagcttcacc ggctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccaga gtgatcccca atgccggcgg aaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggccg gttcaccctg agcgtggaca acagcaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc ccgcgagggc 300 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165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (32)

  1. (a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
    (b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및
    (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
    을 포함하고, Fc 영역의 C-말단에 연결된, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    Fc 영역이 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이고,
    Fc 영역이 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도, 효과기 기능, 또는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및 효과기 기능 둘다를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
    (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)
    을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. (a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
    (b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및
    (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
    을 포함하고, Fc 영역의 C-말단에 연결된, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    Fc 영역이 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이고,
    Fc 영역이 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도, 효과기 기능, 또는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및 효과기 기능 둘다를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    (i) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
    (iv) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제4항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제1항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    (i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173 및 서열번호 174로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
    (ii) 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177 및 서열번호 178로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. (a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
    (b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP), 및
    (iv) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)
    을 포함하고, Fc 영역의 C-말단에 연결된, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    Fc 영역이 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이고,
    Fc 영역이 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도, 효과기 기능, 또는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및 효과기 기능 둘다를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    (i) 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및
    (ii) 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    (a) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (b) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (c) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (d) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (e) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (f) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (g) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (h) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (i) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (j) 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (k) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (l) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (m) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (n) 서열번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (o) 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
    (p) 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제1항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제8항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    (a) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (b) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (c) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (d) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (e) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (f) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (g) 서열번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (h) 서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (i) 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (j) 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (k) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
    (l) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제8항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이
    서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는
    서열번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. (i) 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183 및 서열번호 184로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHCD40), 및 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187 및 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLCD40)을 포함하는, CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
    (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VHFAP) 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VLFAP)을 포함하고, Fc 영역의 C-말단에 연결된, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편
    을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    Fc 영역이 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이고,
    Fc 영역이 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도, 효과기 기능, 또는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및 효과기 기능 둘다를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 (i) 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 Fc 영역, 또는 (ii) 아미노산 돌연변이 D265A 및 P329G(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 마우스 IgG1 서브클래스의 Fc 영역인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) Fc 영역에 연결된 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 단편, 및
    (b) Fc 영역의 C-말단에 연결된 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 크로스-fab 단편
    을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  19. 제17항의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주.
  20. 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 제19항의 숙주 세포주를 배양하는 단계, 및 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 단리하는 단계를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법.
  21. (i) 면역 반응의 증강,
    (ii) 종양-특이적 T 세포 반응의 자극,
    (iii) 종양 세포의 세포 자멸의 야기,
    (iv) 암의 치료,
    (v) 암 진행의 지연,
    (vi) 암 환자의 생존 연장, 또는
    (vii) 감염의 치료
    에서 사용하기 위한
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 면역 반응의 증강,
    (ii) 종양-특이적 T 세포 반응의 자극,
    (iii) 종양 세포의 세포 자멸의 야기,
    (iv) 암의 치료,
    (v) 암 진행의 지연,
    (vi) 암 환자의 생존 연장, 또는
    (vii) 감염의 치료
    에서 사용하기 위한 약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에서 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제21항에 있어서,
    암의 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료용 약제의 제조에서 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제21항에 있어서,
    암의 치료용 약제의 제조에서 사용하기 위한 약학 조성물.
  27. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항원 결합 분자가 화학 요법제, 방사선 및 암 면역 요법에서 사용하기 위한 다른 제제로부터 선택되는 하나 이상과 조합으로 투여되는, 암의 치료에서 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제21항에 있어서,
    약학 조성물이 화학 요법제, 방사선 및 암 면역 요법에서 사용하기 위한 다른 제제로부터 선택되는 하나 이상과 조합으로 투여되는, 암의 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물.
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  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3039446A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
RU2019123613A (ru) 2017-01-03 2021-02-05 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, содержащие антитело к4-1вв, клон 20н4.9
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
CA3058477A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
KR20200079492A (ko) * 2017-11-01 2020-07-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이성 2+1 컨터체
WO2019129644A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Julius-Maximilians-Universität Würzburg TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF) RECEPTOR SUPERFAMILY (TNFRSF) RECEPTOR-ACTIVATING ANTIBODY FUSION PROTEINS WITH FcγR-INDEPENDENT AGONISTIC ACTIVITY (TNFRSF RECEPTOR-ACTIVATING ANTIBODY FUSION PROTEINS WITH FCγR-INDEPENDENT AGONISTIC ACTIVITY; TRAAFFIAA)
EP3827019A1 (en) * 2018-07-24 2021-06-02 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
WO2020070041A1 (en) * 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
CA3123493A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
KR20220008820A (ko) 2019-05-15 2022-01-21 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd40과 fap에 결합하는 이중 특이적 항체
JPWO2020230901A1 (ko) * 2019-05-15 2020-11-19
UY38995A (es) 2019-12-20 2021-06-30 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecíficos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores sólidos
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
AU2021271129A1 (en) * 2020-05-14 2022-12-15 Molecular Partners Ag Multispecific proteins
CN117916261A (zh) 2020-11-16 2024-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 与靶向fap的cd40激动剂的组合疗法
KR20230156051A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1-표적화 il-2 변이체 면역접합체 및 fap/4-1bb 결합 분자의 병용 요법
WO2022243261A1 (en) * 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
WO2023025194A1 (zh) * 2021-08-24 2023-03-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 Fap/cd40结合分子及其医药用途
TW202328197A (zh) * 2021-09-24 2023-07-16 大陸商正大天晴藥業集團股份有限公司 抗cd40抗體及其用途
CN116410326A (zh) * 2021-12-30 2023-07-11 三优生物医药(上海)有限公司 抗cd40×cldn18.2双特异性抗体及其用途
CN114480413B (zh) * 2022-01-14 2022-11-04 北京贝来生物科技有限公司 一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006128103A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd40 antibodies and their methods of use
WO2010145792A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding proteins
WO2012020006A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
WO2012130831A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
WO2014207064A1 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules capable of specifically binding to both ctla-4 and cd40
WO2016030350A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
AR042485A1 (es) 2002-12-16 2005-06-22 Genentech Inc Anticuerpo humanizado que se une al cd20 humano
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7993650B2 (en) 2003-07-04 2011-08-09 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for HER2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
CA2552435A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
AU2008323701B2 (en) * 2007-11-07 2015-03-26 Genentech, Inc Methods and compositions for assessing responsiveness of B-cell lymphoma to treatment with anti-CD40 antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
ES2774337T3 (es) 2008-01-07 2020-07-20 Amgen Inc Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática
WO2012002006A1 (ja) 2010-06-29 2012-01-05 コニカミノルタエムジー株式会社 超音波診断装置及びプログラム
LT3489255T (lt) * 2011-02-10 2021-08-25 Roche Glycart Ag Mutantiniai interleukino-2 polipeptidai
UA116192C2 (uk) 2011-08-23 2018-02-26 Рош Глікарт Аг Активуюча т-клітини біоспецифічна антигензв'язуюча молекула
CA2861491C (en) * 2012-02-13 2020-08-25 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
MY175687A (en) * 2012-08-07 2020-07-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
UA118028C2 (uk) * 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
CN105377893A (zh) * 2013-05-07 2016-03-02 豪夫迈·罗氏有限公司 三聚体抗原结合分子
RU2021101502A (ru) * 2014-03-05 2021-06-25 ЮСиЭл БИЗНЕС ЛТД ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР (CAR) С АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИМИ ДОМЕНАМИ К КОНСТАНТНОЙ ОБЛАСТИ β Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА
BR112016029334A2 (pt) * 2014-08-14 2018-01-09 Hoffmann La Roche produto farmacêutico, uso de um anticorpo, kit, método para tratar um paciente com câncer e métodos e usos de novos produtos
DK3209684T3 (da) 2014-10-24 2021-02-22 Hoffmann La Roche VH-VL-interdomænevinkelbaseret antistofhumanisering
SI3789402T1 (sl) 2014-11-20 2022-10-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirano zdravljenje z bispecifičnimi molekulami, ki vežejo antigen in aktivirajo celice T, ter antagonisti za vezavo osi PD-1
WO2017025698A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Queen Mary University Of London Bispecific, cleavable antibodies
WO2020070041A1 (en) * 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006128103A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd40 antibodies and their methods of use
WO2010145792A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding proteins
WO2012020006A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
WO2012130831A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
WO2014207064A1 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules capable of specifically binding to both ctla-4 and cd40
WO2016030350A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Immunol., Vol. 183, pp. 1851-1861 (2009.07.13.)*

Also Published As

Publication number Publication date
JP6997209B2 (ja) 2022-02-04
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KR20190137125A (ko) 2019-12-10
CN110402255B (zh) 2022-12-02
CR20190427A (es) 2019-11-01
US20180340030A1 (en) 2018-11-29
WO2018185045A1 (en) 2018-10-11
BR112019017753A2 (pt) 2020-04-07
TWI704158B (zh) 2020-09-11
CA3053358A1 (en) 2018-10-11
RU2766234C2 (ru) 2022-02-10
RU2019134352A3 (ko) 2021-07-21
CO2019009432A2 (es) 2019-09-18
JP2022017275A (ja) 2022-01-25

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