BR112019017753A2 - molécula biespecífica, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para a produção de uma molécula e para o tratamento de um indivíduo, composição e uso da molécula biespecífica - Google Patents

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Abstract

a invenção refere-se a novas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao cd40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em particular proteína de ativação de fibroblastos (fap), e aos métodos de produção dessas moléculas e aos métodos de uso das mesmas.

Description

“MOLÉCULA BIESPECÍFICA, POLINUCLEOTIDEO, VETOR, CÉLULA, MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA MOLÉCULA E PARA O TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO E USO DA MOLÉCULA BIESPECÍFICA” Campo da invenção [001] A invenção refere-se a novas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico, que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo. Em particular, estas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno compreendem ainda (c) uma região Fc composta por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável. A invenção referese ainda a métodos de produção destas moléculas e a métodos de utilização da mesma.
Antecedentes da Invenção [002] Múltiplos sinais moleculares são necessários durante a geração de uma resposta imune adaptativa potente. O sinal um envolve a ligação de um receptor de antígeno de célula T (TCR) ao seu antígeno cognato, apresentado na superfície de células que apresentam o antígeno (APCs). O sinal dois consiste no envolvimento de receptores co-estimulatórios com seus respectivos ligantes entre células T e APCs. Um dos efetores coestimuladores mais bem estudados e mais importantes é o membro da família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) CD40 e seu ligante CD40L (Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009; 229 (I): 152-72). Vários membros da família TNFR, incluindo o CD40, funcionam após a ativação das células T iniciais para sustentar as respostas das células T e APC e, portanto, desempenham um papel fundamental na organização e função do sistema imunológico (Watts TH (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23 a 68). A combinação
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2/387 de diferentes membros da família co-estimuladores TNFR permite uma regulação sequencial e transitória da ativação e sobrevivência das células T e APC, resultando em respostas imunes aumentadas, mantendo um controle rigoroso da função das células T e APC. Dependendo do estado da doença, a estimulação via membros da família de co-estimuladores TNF pode exacerbar ou melhorar as doenças. A ativação ou o bloqueio de co-estimuladores da família TNFR mostra-se promissora para várias aplicações terapêuticas em vários campos, incluindo câncer, doenças infecciosas, transplantes e autoimunidade.
[003] Entre várias moléculas co-estimulatórias, o CD40 membro da família TNFR desempenha um papel fundamental no desencadeamento de respostas imunes, induzindo maturação, sobrevivência, apresentação de antígenos, produção de citocinas e expressão de moléculas co-estimuladoras de APCs, que então direcionam respostas de células T específicas de antígenos e ativação de células NK por citocinas pró-inflamatórias. O CD40 regula as respostas imunes contra infecções, tumores e auto-antígenos e sua expressão foi demonstrada na superfície de APCs, como células B, células dendríticas (DCs), monócitos e macrófagos, bem como plaquetas e células de origem não hematopoiética, tais como miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliais e endoteliais (Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009; 229 (I): 152-72). O ligando de CD40, CD40L é expresso em células T auxiliares CD4+ ativadas, plaquetas, células monocíticas, células natural killers, mastócitos e basófilos (Carbone E. etal., J Exp Med. 1997; 185 (12): 2053- 2060 ou Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009; 229 (I): 152-72). A expressão de CD40 e CD40L fortemente regulada positivamente em resposta a vários sinais imunoestimuladores e a interação CD40-CD40L entre APC e células T CD4 + contribui para o aumento da ativação de APC e respostas de célula T CD8 + específicas de antígeno (Bevan MJ., Nat Rev Immunol. 2014; 4 (8): 595-602).
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Observaram-se resultados imunoestimuladores semelhantes utilizando anticorpos agonistas de CD40 (Vonderheide RH e Glennie MJ., Clin Cancer Res. 2013; 19 (5): 1035-43).
[004] O envolvimento do receptor transmembranar tipo I CD40 pelo seu ligando natural CD40L, uma proteína transmembranar de tipo II ou por anticorpos agonistas promove o agrupamento de CD40 e induz o recrutamento de proteínas adaptadoras para o domínio do receptor citoplasmático. O recrutamento dessas proteínas adaptadoras conhecidas como fatores associados ao receptor de TNF (TRAFs) leva à ativação sinérgica de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K), bem como fator nuclear canônico e não canônico kB (NFkB) vias de sinalização (Elgueta R. et al., Immunol Rev. 2009; 229 (I): 152-72). Por sua vez, isso resulta em maturação e ativação de APC, que maximiza as respostas de células T específicas para o antígeno. Estudos recentes mostraram dois modos diferentes de ação de anticorpos CD40 agonistas no aproveitamento da imunidade antitumoral. Para além do seu modo indireto de destruição mediada por células tumorais mediada através da ativação do sistema imune adaptativo, anticorpos CD40 agonistas podem induzir a morte direta de células tumorais através da indução da apoptose de células tumorais sólidas que expressam CD40 (Eliopoulos AG. Et al., Mol Cell Biol 2000, 20 (15): 5503-15). A morte direta mediada por anticorpos CD40 de células tumorais pode fornecer uma fonte de antígenos tumorais que podem ser processados e apresentados por APC simultaneamente ativados por envolvimento de CD40 via anticorpos antiCD40 que então podem induzir células T específicas para antígeno tumoral, um mecanismo como vacinação endógena. Dado que o envolvimento de CD40 pode se encaixar em uma resposta imune anti-câncer eficiente, os anticorpos CD40 agonistas foram usados com sucesso em uma variedade de modelos de tumor pré-clínico, tanto como agente único como em combinação com
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4/387 quimioterapia (Vonderheide RH e Glennie MJ., Clin Câncer Res. 2013; 19 (5): 1035-43).
[005] Até o momento, seis CD40 mAb estão sob investigação em ensaios clínicos: Chi Lob 7/4 (mAb quimérico IgG 1 agonista de CD40; Cancer Research UK; Chowdhury F. et al., Cancer Immunol Res. 2013; 2: 229-40), ADC1013 (totalmente humano, anticorpo lgG1 agonista de CD40; Alligator Bioscience e Johnson & Johnson; Mangsbo SM et al., Clin Cancer Res. 2015 Mar 1; 21 (5): 1115-26), APX-005 (totalmente humanizado, mAb de lgG1 agonista de CD40; Apexigen; Bjorck P. et al., J Immunother Cancer, 2015; 3 (Suppl 2): P198), SEA-CD40 (mAb quimérico de lgG1 agonista de CD40; Seattle Genetics; Gardai SJ. Et al.; 18-22 de Abril, resumo 2472), bem como R07009789 (mAb de lgG2 super agonista de CD40 totalmente humano) são investigados em estudos cíclicos de fase I e dacetuzumab (AcM quimérico de lgG1 parcial agonista CD40; Seattle Genetics; Khubchandani S. et al., Curr Opin Investig Drugs. 2009; 10: 579-87) é investigado em um estudo clínico de fase II. Os pacientes elegíveis para estes estudos têm tumores sólidos, linfoma de Hodgkin clássico (HL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) ou linfoma indolente (incluindo linfoma folicular). Diversas atividades variando de citotoxicidade dependente de Fc de células tumorais CD40 + via citotoxicidade mediada por complemento (CMC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) para ativação de APC para induzir respostas de células T antitumorais, bem como ativação de macrófagos para depleção de tumor e estroma tumoral demonstrado para estes anticorpos agonistas CD40. Até agora não há explicação conclusiva para essa heterogeneidade observada. No entanto, estudos recentes indicam que este modo de diversidade de ação pode ser explicado, pelo menos em parte, pelas diferenças dos anticorpos anti-CD40 na especificidade do epítopo, isotipo ou interação Fc: FcyR. Por exemplo, parece que os anticorpos agonistas de CD40 in vivo requerem ligação cruzada
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5/387 de CD40, ligado pelo seu fragmento de Fab na célula alvo, a um receptor Fcy, ligado pelo seu fragmento Fc em uma célula que não a célula alvo, como descrito para anticorpos agonistas específico para outros membros indutores de apoptose ou imunomoduladores da superfamília TNFR (Dahan R., Célula Câncer. 2016 Jun 13; 29 (6): 820-31; Li F. e Ravetch JV Science, 2011; 333, 1030-1034 Teng MW etal., J. Immunol. 2009; 183, 1911-1920). O mecanismo proposto inclui aglomeração mediada por receptor de Fcy de moléculas transmembranares de CD40 em células alvo e subsequente sinalização aumentada de CD40 para conseguir uma eficácia potente in vivo.
[006] O desenvolvimento clínico de anticorpos CD40 agonistas forneceram resultados iniciais promissores. Em um primeiro ensaio clínico, o CP-870.893 demonstrou eficácia clínica em pacientes com câncer avançado. Quatro de 29 pacientes com câncer avançado apresentaram respostas parciais após receberem uma única infusão intravenosa de CP-870,893 (Vonderheide RH., J. Clin. Oncol. 2007 1 de março; 25 (7): 876-83). Um destes quatro pacientes tratados com 9 doses subsequentes de CP-870,893 durante um ano e meio permaneceu em remissão completa por mais de 5 anos. No entanto, os efeitos colaterais mais comuns da CP-870.893 são síndromes de liberação de citocinas e eventos tromboembólicos, de forma que com os esquemas posológicos e as vias de administração utilizados os dados combinados dos estudos clínicos de fase 1 com mais de 140 pacientes indicam apenas uma limitada eficácia clínica e foi sugerida uma administração local do anticorpo (Vonderheide RH, Glennie M, Clin Cancer Res. 2013, 19 (5), 1035-1043). A falta de respostas de agente único ocorre, em parte, devido a efeitos graves de tumor alvo/ desligado causados pela expressão ampla de CD40, que resulta em toxicidade limitadora de dose (por exemplo, síndrome de liberação de citocina). O desenvolvimento de um anticorpo CD40 agonista que ativa de forma específica as APCs quando o CD40 é reticulado por um alvo específico
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6/387 do tumor podería reduzir os efeitos colaterais e diminuir as limitações de dose, oferecendo novas opções terapêuticas com potencial para gerar uma imunidade anticâncer eficiente e duradoura.
[007] Os dados pré-clínicos e clínicos disponíveis demonstram claramente que existe uma elevada necessidade clínica de agonistas eficazes de CD40 que sejam capazes de induzir e intensificar respostas imunes endógenas eficazes ao câncer. No entanto, quase nunca os efeitos são limitados a um único tipo de células ou atuam por meio de um único mecanismo, e estudos destinados a elucidar mecanismos de sinalização inter e intracelular têm revelado níveis crescentes de complexidade. Os anticorpos CD40 conhecidos só podem ser administrados em doses relativamente baixas devido a toxicidades limitantes da dose, tais como síndrome de liberação de citocinas e ativação de células trombocitárias/ endoteliais, resultando em uma ativação insuficiente da via nas APC alvo e em um estreito índice terapêutico. Assim, há a necessidade de agonistas “direcionados” que de forma preferencial atuem em um único tipo de célula.
[008] A invenção refere-se a novas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, capazes de se ligarem de forma específica ao CD40 e a um antígeno da célula alvo. As moléculas de ligação ao antígeno da invenção combinam uma porção, capaz de se ligar de forma preferencial a alvos específicos do tumor ou associados a tumores com uma porção, capaz de se ligar agonisticamente ao CD40, em que a ativação de APCs através do CD40 proporcionada por reticulação através da célula alvo antígeno, por exemplo, FAP expressa em células de estroma tumoral e potencialmente também através de FAP expressas de modo intermediário em tecidos linfoides secundários. A ligação cruzada dependente de FAP das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno limita a ativação de células que expressam CD40 ao tecido tumoral e potencialmente também a tecidos
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7/387 linfoides secundários, tais como nódulos linfáticos de drenagem tumoral. Em contraste com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, capazes de se ligarem de forma específica ao CD40 e aos receptores do ponto de verificação imune em células T ativadas, tais como CTLA-4 ou PD-1, direcionamento para um alvo tumoral, tal como FAP ativa a ativação de APC mediada por CD40 principalmente no estroma tumoral e nodos linfáticos de drenagem tumoral em que os fibroblastos expressam níveis aumentados de PAF em comparação com outros tecidos. As moléculas de ligação ao antígeno desta invenção podem, assim, ser capazes de desencadear o receptor de CD40 não apenas eficazmente, mas também de forma muito seletiva no local desejado, ultrapassando a necessidade de reticulação de FcyR, reduzindo assim os efeitos colaterais.
Descrição Resumida da Invenção [009] A presente invenção refere-se a moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que combinam pelo menos uma porção (domínio de ligação ao antígeno), capaz de se ligar de forma específica ao CD40 coestimulador do membro da família do receptor TNF, com pelo menos um lado de ligação ao antígeno direcionado para um antígeno da célula alvo. Estas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico são vantajosas uma vez que, de preferência, ativam receptores CD40 co-estimuladores no local em que o antígeno da célula alvo é expresso, devido sua capacidade de ligação para um antígeno da célula alvo.
[010] Em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo.
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8/387 [011] Em um aspecto particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável. Mais em particular, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável compreende mutações que reduzem a função efetora.
[012] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, liga-se a um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 1.
[013] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo é um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica à proteína de ativação de fibroblastos (FAP). Em particular, o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, liga-se a um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 2. Assim, em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP.
[014] Em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
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ID Ns: 3, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 4 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 5 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 6, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 7 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 8, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 11, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 12 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 13 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 14, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 15 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 16.
[015] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui definido anteriormente, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma
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10/387 sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[016] Em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno como aqui definida anteriormente, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9, e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[017] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 19, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 20, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 21, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 22, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 23, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 24.
[018] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, se liga ao CD40 de
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11/387 camundongo e compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Ns: 27, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 28 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 29 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 30, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 31, e (vi) CDR-L3 que compreende o aminoácido sequência da SEQ ID Ns: 32.
[019] Além disso, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende (a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 26, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 33 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 34. Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que cada um dos domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligarem de forma específica ao CD40 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Ns: 26.
[020] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende:
(i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 19 e SEQ ID Ns: 35,
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12/387 (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 20, SEQ ID Ns: 36,
SEQ ID Ns: 37, SEQ ID Ns: 38, SEQ ID Ns: 39, SEQ ID Ns: 40, SEQ ID Ns: 41,
SEQ ID Ns: 42, SEQ ID Ns: 43 e SEQ ID Ns: 44 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 21, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende:
(iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 22, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 23 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 24.
[021] Ainda em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende:
(i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 19 e SEQ ID Ns: 261, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 20, SEQ ID Ns: 262 e SEQ ID Ns: 263, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 21, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende:
(iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da
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SEQ ID Ns: 22, SEQ ID Ns: 264 e SEQ ID Ns: 265, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 23 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 24.
[022] Além disso, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173 e SEQ ID Ns: 174, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177 e SEQ ID Ns: 178.
[023] Em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 177, ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 178, ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
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SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
SEQ ID Ns
SEQ ID N!
171 e uma VL que compreende
177, ou (e) uma VH que compreende
171 e uma VL que compreende
178, ou (f) uma VH que compreende
173 e uma VL que compreende
175, ou (g) uma VH que compreende
173 e uma VL que compreende
178, ou (h) uma VH que compreende
174 e uma VL que compreende
175, ou (i) uma VH que compreende
174 e uma VL que compreende
177, ou (j) uma VH que compreende
171 e uma VL que compreende
176,ou (k) uma VH que compreende
172 e uma VL que compreende
175,ou (l) uma VH que compreende
172 e uma VL que compreende
176,ou (m) uma VH que compreende
172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da a sequência de aminoácidos da
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SEQ ID Ns: 177, ou (n) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 178, ou (o) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 176, ou (p) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 176.
[024] Mais em particular, é proporcionada uma ligação de antígeno biespecífico, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175.
[025] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188.
[026] Em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se
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16/387 ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 180 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 185, ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 181 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 185, ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 185, ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 186, ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 180 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 186, ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 181 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 186, ou (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 186, ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 183 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
SEQ ID Ns: 187, ou
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17/387 (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 183 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 188, ou (k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 184 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 187, ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 184 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID Ns: 188.
[027] Mais em particular, é proporcionada uma ligação específica ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185 ou em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185.
[028] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46, SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID Ns: 55, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 56, SEQ ID Ns: 57, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60,
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SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64.
[029] Em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que cada uma das porções capazes de se ligarem de forma específica ao CD40 compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 47 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 57.
[030] Além disso, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[031] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
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19/387 (i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46, SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID NQ: 55 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 56, SEQ ID Ns: 57, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60, SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64 e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[032] Em um aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é um anticorpo humanizado ou quimérico. Em um aspecto adicional, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende uma região Fc de IgG, em particular uma região Fc de lgG1 ou uma região Fc de lgG4. Em particular, a região Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo a um receptor Fc e/ ou função efetora. Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a região Fc é (i) da subclasse lgG1 humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) ou (ii) de subclasse lgG1 de camundongo
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20/387 com as mutações de aminoácidos D265A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Particularmente, a região Fc é da subclasse lgG1 humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[033] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno como aqui definida anteriormente, em que a primeira subunidade da região Fc compreende “maçanetas” (knobs) e a segunda subunidade da região Fc compreende “furos” (holes) de acordo com o método das maçanetas em furos. Em particular, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que (i) a primeira subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e a segunda subunidade da região Fc compreende o aminoácido as substituições Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice de Kabat EU), ou (ii) a primeira subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e a segunda subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos E356K e D399K (numeração de acordo com o índice de Kabat EU). Mais em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a primeira subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e a segunda subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[034] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) pelo menos dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de
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21/387 forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
[035] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) pelo menos dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
[036] Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc é um fragmento reticulado. Assim, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) pelo menos dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
[037] Em um aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) uma VH e uma VL de uma ligação específica ao domínio de ligação ao antígeno ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
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22/387 [038] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que a cadeia VH-CL está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[039] Ainda em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[040] Além disso, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao FAP, em que um dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e o outro dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[041] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo
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23/387 um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um VH e um VL de um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[042] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) dois fragmentos de Fab, capazes de ligação específica a FAP, em que um dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e o outro dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[043] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um
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24/387 domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que os fragmentos de Fab estão ligados ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[044] Em outro aspecto, o fragmento de Fab ou os dois fragmentos de Fab, capazes de ligação específica a FAP são fragmentos de Fab de cruzamento que compreende cada um uma cadeia VL-CH1 e uma cadeia VH-CL, e em que a cadeia VH-CL ou a cadeia VL-CH1 ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[045] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende quatro fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma específica ao CD40. Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que cada uma das duas cadeias pesadas de (a), tal como aqui definido anteriormente compreende duas cadeias VH-CHI de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que estão ligadas entre si, opcionalmente por um ligante peptídico.
[046] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo duas cadeias VH-CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que estão ligadas entre si, opcionalmente por um ligante peptídico, e uma subunidade da região Fc, (b) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e
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25/387 (c) um VH e um VL de um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[047] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo duas cadeias VH-CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que estão ligadas entre si, opcionalmente por um ligante peptídico, e uma subunidade da região Fc, (b) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab ou fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o fragmento de Fab ou de Fab cruzado está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[048] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo duas cadeias VH-CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que estão ligadas entre si, opcionalmente por um ligante peptídico, e uma subunidade da região Fc, (b) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que a cadeia VH-CL do referido fragmento de
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26/387 cruzamento cruzado está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[049] Ainda em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo duas cadeias VH-CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que estão ligadas entre si, opcionalmente por um ligante peptídico, e uma subunidade da região Fc, (b) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que a cadeia VL-CHI do referido fragmento de cruzamento cruzado está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[050] Em outro aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que um ou mais dos fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma específica ao CD40 compreende um domínio CL que compreende uma arginina (R) no aminoácido na posição 123 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e uma lisina (K) no aminoácido na posição 124 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU), e um domínio CH1 que compreende um ácido glutâmico (E) no aminoácido na posição 147 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e um ácido glutâmico (E) no aminoácido na posição 213 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[051] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrita anteriormente. A invenção proporciona ainda
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27/387 um vetor, em particular um vetor de expressão, que compreende o polinucleotídeo isolado da invenção e uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo isolado ou o vetor de expressão da invenção. Em alguns aspectos, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, em particular uma célula de mamífero.
[052] Em outro aspecto, é proporcionado um método de produção de uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrita anteriormente, que compreende cultivar a célula hospedeira como descrita acima sob condições adequadas para a expressão da molécula biespecífica de ligação ao antígeno e isolar a molécula biespecífica de ligação ao antígeno. A invenção também abrange a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que se liga de forma específica ao CD40 e ao FAP, produzido pelo método da invenção.
[053] A invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrita anteriormente e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[054] Também é englobada pela invenção a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica que compreende a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, para uso como medicamento.
[055] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção, para uso (i) na indução da estimulação imunológica por CD40 expressando células que apresentam o antígeno (APCs), (ii) na estimulação da resposta das células T específicas de tumor,
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28/387 (iii) em causar apoptose de células tumorais, (iv) no tratamento de câncer, (v) em retardar a progressão do câncer, (vi) em prolongar a sobrevivência de um paciente que sofre de câncer, (vii) no tratamento de infecções.
[056] Em um aspecto específico, é proporcionada a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção, para uso no tratamento de câncer. Em outro aspecto específico, a invenção proporciona a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrita anteriormente para uso no tratamento de câncer, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno administrada em combinação com um agente quimioterapêutico, radiação e/ ou outros agentes para uso na imunoterapia de câncer. Em outro aspecto, é proporcionada a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção, para uso na regulação positiva ou prolongamento da atividade das células T citotóxicas.
[057] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção, para inibir a crescimento das células tumorais. Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento ou atraso de câncer em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrita anteriormente, ou a composição farmacêutica da invenção.
[058] Também é proporcionado o uso da molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrita anteriormente para a fabricação de
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29/387 um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo com essa necessidade, em particular para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, bem como como método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto específico, a doença é câncer. Em qualquer um dos aspectos acima, o indivíduo é um mamífero, em particular um humano.
Breve Descrição das Figuras [059] As Figuras 1A a 1F mostram representações esquemáticas das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, que se ligam de forma específica ao CD40 humano e ao FAP. A Figura 1A mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com uma porção de ligação a FAP com VH no terminal C de uma cadeia pesada e VL no terminal C da outra cadeia pesada (tetravalente para CD40 e monovalente para FAP). O ponto preto simboliza as mutações da maçaneta no furo. A Figura 1B mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40FAP no formato 4 + 2 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com dois domínios Fab de ligação a FAP fundidos cada um no terminal C das cadeias pesadas (tetravalente para CD40 e bivalente para FAP). A Figura 1C mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 2 + 1 que consiste em dois domínios Fab de ligação a CD40 combinados com uma porção de ligação a FAP com VH no terminal C de uma cadeia pesada e VL no terminal C da outra cadeia pesada (bivalente para CD40 e monovalente para FAP). O ponto preto simboliza as mutações da maçaneta no furo. A Figura 1D mostra uma representação
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30/387 esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 2 + 2 que consiste em dois domínios Fab de ligação a CD40 combinados com dois domínios Fab de ligação a FAP fundidos cada um no terminal C das cadeias pesadas (bivalente para CD40 e bivalente para FAP). A Figura 1E mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 2 + 1 que consiste em dois domínios Fab de ligação a CD40 combinados com um domínio Fab de ligação a FAP fundido no terminal C de uma das cadeias pesadas (bivalente para CD40 e monovalente para FAP). O ponto preto simboliza as mutações da maçaneta no furo. A Figura 1F mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 1 + 1 que consiste em um braço de ligação a CD40 combinado com um braço de ligação a FAP (monovalente para CD40 e monovalente para FAP). O ponto preto simboliza as mutações da maçaneta no furo.
[060] As Figuras 2A e 2B mostram a ligação de anticorpos antiCD40 tetravalentes humanos em um formato monovalente ou bivalente direcionado para FAP a células tumorais negativas para FAP (Figura 2A) e células tumorais positivas para FAP (Figura 2B). O clone 19 de fibroblastos embrionários de camundongo modificados transgênico NIH/ 3T3-huFAP expressa níveis elevados de proteína de ativação de fibroblastos humanos (huFAP), enquanto que a linha celular parental NIH/ 3T3-wt não expressa huFAP. Apenas as moléculas de ligação ao antígeno tetravalente anti-CD40, quer com uma ou duas porções de ligação a FAP, mas não com os formatos não visados por FAP, ligam-se eficientemente a células NIH/ 3T3-huFAP (Figura 2B). A construção de FAP bivalente se liga mais fortemente que a construção monovalente. Em contraste, não foi detectada ligação dos anticorpos anti-CD40 direcionados para FAP às células NIH/ 3T3-wt (Figura 2A). É mostrada a ligação como mediana da intensidade de fluorescência (MFI) do fragmento IgG F(ab’)2 de cabra específico de IgG Fc anti-humano marcado
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31/387 com ficoeritrina (PE) que é utilizado como anticorpo de detecção secundário. MFI foi medido por citometria de fluxo. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[061] As Figuras 3A a 3H mostram a ativação in vitro de células B humanas através de construções anti-CD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes. Com células NIH/ 3T3-FAP, o anticorpo biespecífico monovalente para FAP induziu um aumento semelhante da expressão do marcador de ativação de células B (CD70, CD80, CD83 e CD86) como a molécula alvo de FAP bivalente. Além disso, a regulação positiva do marcador de ativação de células B pelas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico direcionadas a FAP foi comparável com a regulação positiva induzida pelos anticorpos de controle positivo independentes de FAP. Na ausência de FAP (células NIH/ 3T3-wt) não foi observado aumento dos marcadores de ativação de células B com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos de controle positivo induziram uma sobrerregulação do marcador de ativação. É mostrada a porcentagem de células B CD80 (Figura 3A e 3B), CD80 (Figura 3C e 3D), CD83 (Figura 3E e 3F) e CD86 (Figura 3G e 3H), após 2 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos. O efeito nas células NIH/ 3T3-FAP é mostrado na Figura 3A, 3C, 3E e 3G, respectivamente, enquanto o efeito nas células NIH/ 3T3-wt é mostrado na Figura 3B, 3D, 3F e 3H, respectivamente.
[062] As Figuras 4A a 4F e 5A a 5H mostram a ativação in vitro de células B humanas através de construções humanas anti-CD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP ou não revestidas após 2 dias (Figura 4A a 4F) ou 5 dias de incubação (Figura 5A a 5H). Após 2 dias de incubação com esferas revestidas com FAP, os anticorpos biespecíficos monovalentes para FAP induziram um aumento semelhante da expressão do marcador de ativação de
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32/387 células B (CD70, CD83 e CD86) como moléculas direcionadas para FAP bivalentes. Além disso, a regulação positiva do marcador de ativação de células B pelas moléculas de ligação ao antígeno biespecífico direcionadas a FAP foi comparável com a regulação positiva induzida pelos anticorpos de controle positivo independentes de FAP. Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não foi observado aumento de marcadores de ativação de células B com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos de controle positivo induziram uma sobrerregulação de marcadores de ativação. Após 5 dias, a incubação de células B com construções de anti-CD40 humanas direcionadas de FAP Dynabeads® revestidas com FAP induziu uma sobrerregulação dependente de FAP da expressão de CD80 e CD86 em células B. Em comparação com a regulação positiva de CD86 independente de FAP induzida por R07009789 ou SGN-40 reticulada, a regulação positiva de CD86 induzida por moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno dependentes de FAP foi ligeiramente inferior. Para CD70 e CD83, não se observou nenhuma ou muito pouca regulação positiva com os anticorpos biespecíficos visando FAP e CD40, enquanto os anticorpos de controle positivo mostraram claramente um efeito sobre esses marcadores de ativação de células B. É mostrada a porcentagem de CD70 (Figura 4A, 4B, 5A e 5B, respectivamente), CD80 (Figura 5C e 5D, respectivamente), CD83 (Figura 4C, 4D, 5E e 5F, respectivamente) e CD86 (Figura 4E, 4F, 5G e 5H, respectivamente) células B vitais positivas após 2 dias ou 5 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[063] As Figuras 6A e 6B mostram a secreção de IL-6 de células B humanas tratadas com diferentes anticorpos anti-CD40 agonistas direcionados e não direcionados para FAP na presença de esferas revestidas com FAP (Figura 6A) ou não revestidas (Figura 6B) após 5 dias incubação. Na
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33/387 presença de FAP, o anticorpo anti-CD40 direcionado contra FAP monovalente bem como o bivalente induziu uma secreção de IL-6 aumentada semelhante em comparação com os anticorpos de controle positivos independentes de FAP R07009789 e SGN40. Em contraste, as células B tratadas com os anticorpos de controle negativo não direcionados expressaram níveis de IL-6 baixos semelhantes às células B não tratadas. Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não foi detectado aumento na produção de IL-6 com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno. É mostrada a quantidade de IL-6 no sobrenadante de células B humanas cultivadas durante cinco dias com os anticorpos titulados indicados medidos por ELISA. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[064] As Figuras 7A a 7H mostram a ativação in vitro de DC derivadas de monócitos humanos (moDCs) por construções humanas antiCD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP ou não revestidas após 2 dias de incubação. Na presença de esferas revestidas com FAP, o anticorpo biespecífico monovalente para FAP induziu um aumento similar de expressão de marcadores de ativação DC (CD70, CD80 e CD83) como molécula bivalente direcionada para FAP, enquanto na ausência de FAP (esferas não revestidas) nenhuma sobrerregulação do marcador de ativação foi detectada. Além disso, a regulação positiva de CD80 e CD83 por moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno direcionadas a FAP foi comparável à regulação positiva induzida pelos anticorpos de controle positivo independentes de FAP. Uma maior regulação positiva de CD70 nas DCs foi observada para o RO709789 em comparação com todos os outros anticorpos testados. Em contraste, a expressão de CD86 não foi significativamente alterada em DCs incubadas com os diferentes anticorpos anti-CD40 em comparação com DCs não tratadas. É mostrada a porcentagem de moDCs positivos vitais CD70 (Figura 7A e 7B),
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CD80 (Figura 7C e 7D), CD83 (Figura 7E e 7F) e CD86 (Figura 7G e 7H) após 2 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[065] As Figuras 8A e 8B mostram a ativação in vitro de células HEK-Blue™ CD40L por construções humanas anti-CD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP ou não revestidas após 8 horas de incubação. Na presença de esferas revestidas com FAP o anticorpo biespecífico monovalente para FAP e bivalente para CD40 induziu um aumento similar de produção de SEAP como o anticorpo biespecífico bivalente para FAP e CD40, enquanto que na ausência de FAP (esferas não revestidas) não foi detectada produção de SEAP. Além disso, observou-se um aumento na produção de SEAP pelos anticorpos direcionados para FAP tetravalente para CD40 na presença de FAP. No entanto, a produção de SEAP também foi observada na ausência de FAP no sobrenadante de células repórter tratadas com anticorpos tetravalentes para CD40 alvo de FAP. O anticorpo de controle negativo tetravalente para CD40 humano com um ou dois domínios DP47 em vez de um domínio de ligação a FAP induziu produção de SEAP comparável em células CD40L HEK-Blue™ na presença e ausência de FAP e o anticorpo de controle positivo SGN-40 + F(ab) induziu níveis semelhantes de produção de SEAP em comparação com anticorpos biespecíficos direcionados a FAP bivalentes ou tetravalentes para CD40 humano na presença de esferas revestidas com FAP. É mostrada a absorção a um comprimento de onda de 650 nm que se correlaciona com a quantidade de substrato hidrolisado por SEAP. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[066] As Figuras 9A a 9H mostram a iniciação de células T de DCs pulsadas com SIINFEKL ativadas por moléculas de ligação anti-CD40 direcionadas para FAP. DCs isoladas de camundongos transgênicos huCD40
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35/387 (padrão de expressão similar de CD40 humano e CD40 de camundongo), pulsadas com baixas quantidades de SIINFEKL e estimuladas com anticorpos biespecíficos anti-CD40 dependentes de FAP bem como esferas revestidas com FAP induzem uma forte proliferação de antígeno-específico de células T. Em contraste, na ausência de FAP (esferas não revestidas) não foi induzida proliferação de células T por DCs estimuladas com anticorpos anti-CD40 direcionados para FAP. Os níveis de proliferação de células T induzidos por DCs estimuladas com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno murinas ou humanas com quatro unidades de ligação a CD40 e duas de FAP foram comparáveis. Não se observou regulação positiva significativa dos marcadores de ativação de células T, a produção de CD44 e CD25 ou IFNy para células T co-cultivadas com DCs pré-estimuladas com diferentes anticorpos anti-CD40 agonísticos. Apenas DCs pulsadas com quantidades elevadas de SIINFEKL induziram um aumento claro da expressão destes marcadores em comparação com a condição não tratada. É mostrada a porcentagem de células T CD3 + CD8 + OT-1 de murino marcadas com CFSE vitais positivas para proliferação (CFSE-baixa), IFNy, CD25 e CD44 cocultivadas com huCD40 tg DCs pré-incubadas com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[067] As Figuras 9I e 9J mostram a concentração de IL-2 e IL-12 (p40) medida no sobrenadante de células T iniciadas por DC ativadas por anticorpo anti-CD40 direcionado por FAP pulsado com SIINFEKL. Na cocultura de células T OT-1 e huCD40 tg DC pulsadas com baixas quantidades de SIINFEKL e estimuladas com anticorpos biespecíficos anti-CD40 dependentes de FAP, bem como esferas revestidas com FAP, aumentaram IL2 e IL-12 (p40) os níveis foram detectados em comparação com as células T OT-1 co-cultivadas com huCD40 tg DC pré-estimuladas com anticorpos direcionados para FAP na ausência de FAP. Além disso, o anticorpo anti-CD40
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36/387 direcionado para FAP murino bivalente induziu uma secreção marcadamente mais elevada de IL-12 (p40) como a molécula biespecífica de ligação ao antígeno equivalente humana. A secreção de IL-2 foi aumentada para um grau semelhante com ambas, as moléculas de ligação de antígeno CD40 antihumano e antígeno CD40 anti-camundongo de um modo dependente de FAP. É mostrada a quantidade de IL-2 e IL-12 (p40) no sobrenadante de células T CD3 + CD8 + OT-1 murinas co-cultivadas com huCD40 tg DC pré-incubadas com os anticorpos titulados indicados medidos por ELISA. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[068] As Figuras 10 a 12 mostram a iniciação de células T de DCs pulsadas com OVA ativadas por moléculas de ligação anti-CD40 direcionadas para FAP. As DC isoladas de camundongos transgênicos huCD40, tratadas com o conjugado DEC205-OVA e estimuladas com anticorpos biespecíficos anti-CD40 dependentes de FAP, bem como contas revestidas com FAP, induziram uma proliferação forte e CD25, bem como a expressão de CD44 de células T específicas de antígeno. Em contraste, na ausência de FAP (esferas não revestidas) ou OVA (apenas DEC), não foi induzida proliferação e ativação de células T por DCs estimuladas com anticorpos anti-CD40 direcionados para FAP. A proliferação de células T e CD25, bem como os níveis de expressão de CD44 induzidos por DC estimuladas com as moléculas de ligação de antígeno biespecífico murinas ou humanas, com quatro porções de ligação CD40 e duas de FAP foram comparáveis. DCs pulsadas com quantidades elevadas de SIINFEKL em vez do conjugado DEC205-OVA também induziram uma forte proliferação de células T e expressão dos marcadores de ativação CD25 e CD44. É mostrada a porcentagem de células T CD3 + CD8 + OT-1 de células CD3+ CD8+ murinas positivas proliferativas (CFSE-baixa) (Figura 10A a 10C), CD25 (Figura 11A a 11C) e CD44 (Figura 12A a 12C) co-cultura com huCD40 tg DC pré-incubadas
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37/387 com os anticorpos titulados indicados na presença ou ausência de OVA. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[069] As Figuras 13A a 13C mostram os níveis de IFNy medidos nos sobrenadantes de células T co-cultivadas com DCs pulsadas com OVA ativadas por moléculas de ligação anti-CD40 direcionadas para FAP. Os níveis de IFNy foram elevados em condições com células T co-cultivadas com DCs tratadas com o anticorpo anti-CD40 FAP direcionado para o alvo na presença de FAP (Figura 13A)., de forma adicional, a secreção de IFNy foi aumentada para um grau semelhante com ambas as moléculas de ligação ao antígeno CD40 anti-humano e anti-CD40 anti-camundongo de um modo dependente de FAP. É mostrada a quantidade de IFNy no sobrenadante de células T CD3 + CD8 + OT-1 murinas co-cultivadas com huCD40 tg DC pré-incubadas com os anticorpos titulados indicados medidos por ELISA. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[070] As Figuras 14A a 14H mostram a ativação in vitro de células B murinas por construções de camundongo anti-CD40 de camundongo direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP ou não revestidas após 2 dias de incubação. Com esferas revestidas com FAP, o anticorpo biespecífico monovalente para FAP induziu um aumento semelhante da expressão do marcador de ativação de células B (CD70, CD80 e CD86) como a molécula alvo de FAP bivalente. Além disso, foi também observada uma regulação positiva significativa do marcador de ativação de células B para células B tratadas com o anticorpo de controle positivo independente de FAP FGK4.5. Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não se observou aumento dos marcadores de ativação das células B CD70 e CD80 com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno. Em contraste, o anticorpo de controle positivo induziu uma sobrerregulação de CD70 e CD80, independentemente do pré-tratamento com FAP. Enquanto a
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38/387 regulação positiva de CD86 era dependente de FAP com o anticorpo tetravalente anti-CD40 de camundongo possuindo duas porções de ligação a FAP, observou-se um efeito independente de FAP para a molécula biespecífica de ligação ao antígeno possuindo apenas um sítio de ligação de FAP., de forma adicional, foi observada uma regulação positiva independente da FAP da expressão de MHC-II para todas as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno testadas. É mostrada a porcentagem de células B CD80 (Figura 14A e 14B), CD80 (Figura 14C e 14D), CD86 (Figura 14E e 14F) e MHCII (Figura 14G e 14H), positivas após 2 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[071] As Figuras 15A a 15G mostram representações esquemáticas das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, que se ligam de forma específica ao CD40 humano e ao FAP ou DP47. A Figura 15A mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40DP47 no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com uma porção de ligação a DP47 com VH no terminal C de uma cadeia pesada e VL no terminal C da outra cadeia pesada (tetravalente para CD40 e monovalente para DP47). O ponto preto simboliza as mutações da maçaneta no furo. A Figura 15B mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-DP47 no formato 4 + 2 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com dois domínios Fab de ligação a DP47 fundidos cada um no terminal C das cadeias pesadas (tetravalente para CD40 e bivalente para DP47). A Figura 15C mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 1 + 1 que consiste em um braço de ligação a CD40 combinado com um braço de ligação a FAP (monovalente para CD40 e monovalente para FAP). A Figura 15D mostra um esquema esquemático de um anticorpo biespecífico CD40-FAP exemplificativo no formato 2 + 1 que consiste em dois
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39/387 domínios Fab de ligação a CD40 combinados com um domínio Fab de ligação a FAP como parte de um dos dois braços de ligação a CD40. A Figura 15E mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40FAP no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com um domínio Fab de ligação a FAP fundido no terminal C de uma das cadeias pesadas (tetravalente para CD40 e monovalente para FAP). A Figura 15F mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com um domínio Fab de ligação a FAP fundido no terminal C de uma das cadeias pesadas. Os domínios de ligação a VH2a e VL2a CD40 foram obtidos a partir de uma humanização interna do domínio de ligação S2C6 CD40 de murino. A Figura 15G mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 combinados com um domínio Fab de ligação a FAP fundido no terminal C de uma das cadeias pesadas. Os domínios de ligação a VH2d e VL2a CD40 foram obtidos a partir de uma humanização interna do domínio de ligação S2C6 CD40 de murino.
[072] A Figura 16A mostra o anticorpo FGK4.5 murino parental (P1AD3449). As Figuras 16B a E mostram representações esquemáticas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam de forma específica a CD40 de camundongo e a FAP ou DP47. A Figura 16B mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 de camundongo combinados com uma unidade de ligação a FAP com VH no terminal C de uma cadeia pesada e VL no terminal C da outra cadeia pesada (tetravalente para CD40 e monovalente para FAP). O ponto preto simboliza as mutações DD/ KK no Fc e a ligação aos receptores Fc é inibida pelas mutações D270A/ P329G. A Figura 16C mostra uma representação esquemática de um
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40/387 anticorpo biespecífico CD40-FAP no formato 4 + 2 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 de camundongo combinados com dois domínios Fab de ligação a FAP fundidos cada um no terminal C das cadeias pesadas (tetravalente para CD40 e bivalente para FAP). A ligação aos receptores Fc é inibida pelas mutações D270A/ P329G. A Figura 16D mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-DP47 no formato 4 + 1 que consiste em quatro domínios de Fab de ligação a CD40 de camundongo combinados com uma porção de ligação a DP47 com VH no terminal C de uma cadeia pesada e VL no terminal C da outra cadeia pesada (tetravalente para CD40 e monovalente para DP47). O ponto preto simboliza as mutações DD/ KK no Fc e a ligação aos receptores Fc é inibida pelas mutações D270A/ P329G. A Figura 16E mostra uma representação esquemática de um anticorpo biespecífico CD40-DP47 no formato 4 + 2 que consiste em quatro domínios Fab de ligação a CD40 de camundongo combinados com dois domínios Fab de ligação a DP47 fundidos cada um no terminal C das cadeias pesadas (tetravalente para CD40 e bivalente para DP47). A ligação aos receptores Fc é inibida pelas mutações D270A/ P329G.
[073] A Figura 17 mostra a ligação de anticorpos anti-CD40 tetravalentes, bivalentes ou monovalentes humanos em um formato monovalente ou bivalente direcionado para FAP para células tumorais positivas para FAP. A linha celular NIH/ 3T3-mFAP de fibroblastos embrionários de camundongo modificados transgênicos expressa níveis elevados de proteína de ativação de fibroblastos murinos (mFAP). Todas as construções representadas variam na sua força de ligação (valores EC50 bem como intensidade do sinal) às células NIH/ 3T3-mFAP. Apenas as moléculas de ligação ao antígeno anti-CD40 com uma ou duas porções de ligação a FAP mas não os formatos não alvos de FAP (P1AD4574 e P1AD4465) ligam-se eficientemente células NIH/ 3T3-mFAP. As construções de FAP bivalentes com
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41/387 domínios de ligação FAP terminal C ligam-se mais fortemente do que a construção monovalente com domínios de ligação FAP terminal C. A ligação de FAP mais forte foi observada para o formato 1 + 1. É mostrada a ligação como mediana da intensidade de fluorescência (MFI) do fragmento IgG F(ab’)2 de cabra específico de IgG Fc anti-humano marcado com ficoeritrina (PE) que é utilizado como anticorpo de detecção secundário. MFI foi medido por citometria de fluxo. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[074] A Figura 18 mostra a ligação de anticorpos anti-CD40 tetravalentes, bivalentes ou monovalentes humanos em um formato monovalente ou bivalente direcionado para FAP a células Daudi, uma linha celular de linfoblastos B com elevados níveis de expressão de superfície de CD40 humano. Todas as construções representadas ligam-se ao CD40, mas variam na sua força de ligação (valores EC50 bem como intensidade do sinal) às células Daudi positivas para CD40. Anticorpos anti-CD40 bivalentes apresentam níveis mais elevados de EC50 e atingem platôs de ligação mais elevados em comparação com anticorpos tetravalentes anti-CD40. O maior valor de EC50 combinado com o menor platô de ligação foi observado para o formato 1 + 1. A ligação de anticorpos anti-CD40 a proteínas da superfície celular foi detectada com um fragmento IgG F(ab’)2 de cabra específico IgG Fc anti-humano conjugado com ficoeritrina (PE) utilizando análise FACS. A MFI foi medida por citometria de fluxo e a linha de base corrigida subtraindo a MFI do controle em branco. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[075] As Figuras 19A e 19B mostram a ativação in vitro de células HEK-Blue™ CD40L por construções humanas anti-CD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP (Figura 19A) ou não revestidas (Figura 19B) após 24 horas de incubação. Na presença de esferas revestidas com FAP, o anticorpo biespecífico monovalente
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42/387 para FAP e mono ou bivalente para CD40 induziu um aumento similar de produção de SEAP como o anticorpo biespecífico bivalente para FAP e CD40, enquanto que na ausência de FAP (esferas não revestidas) não ou baixa produção de SEAP foi detectada. Além disso, observou-se um aumento na produção de SEAP pelos anticorpos direcionados para FAP tetravalente para CD40 na presença de FAP. No entanto, a produção de SEAP também foi observada na ausência de FAP no sobrenadante de células repórter tratadas com anticorpos tetravalentes para CD40 alvo de FAP. O anticorpo de controle negativo tetravalente para CD40 humano com um domínio DP47 em vez de um domínio de ligação de FAP induziu produção SEAP comparável em células HEK-Blue™ CD40L na presença e ausência de FAP e o anticorpo de controle positivo P1AD4470 + F(ab) induziu níveis semelhantes da produção de SEAP em comparação com anticorpos biespecíficos direcionados a FAP bivalente ou tetravalente para CD40 humano na presença de esferas revestidas com FAP. É mostrada a absorção a um comprimento de onda de 650 nm que se correlaciona com a quantidade de substrato hidrolisado por SEAP. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos. Os valores de EC50 da ativação de células HEK-Blue™ CD40L na presença de esferas revestidas com FAP estão resumidos na Tabela 11. Os valores EC50 de todos os anticorpos testados para CD40 foram comparáveis e inferiores aos valores de EC50 dos anticorpos representados bivalentes CD40. O valor mais alto de EC50 foi detectado para o formato 1 + 1.
[076] As Figuras 20A e 20B mostram a ativação in vitro de células Daudi humanas por construções humanas anti-CD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP (Figura 20A) ou Dynabeads® não revestidas (Figura 20B) após 2 dias incubação. Com contas revestidas com FAP, os anticorpos biespecíficos monovalentes para FAP induziram um aumento semelhante da expressão do
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43/387 marcador de ativação de células B CD70 como moléculas bivalentes orientadas para FAP. Além disso, a regulação positiva do marcador de ativação das células B pelas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno direcionadas a FAP foi superior comparável à regulação positiva induzida pelos anticorpos de controle positivo independentes de FAP. Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não se observou aumento de CD70 com os anticorpos biespecíficos indicados para FAP mono- ou bivalentes para CD40, enquanto moléculas de ligação a CD40 tetravalentes induzem uma sobrerregulação de CD70, mas em menor extensão do que na presença de PAF. É mostrada a porcentagem de células Daudi vitais positivas para CD70 após 2 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos. Os valores de EC50 de ativação na presença de esferas revestidas com FAP estão resumidos na Tabela 9. Os valores EC50 de todos os anticorpos direcionados para FAP tetravalentes para CD40 eram comparáveis e inferiores em comparação com os valores EC50 dos anticorpos representados bivalentes para CD40. Os valores mais elevados de EC50 foram detectados para o anticorpo de controle positivo P1AD4470 e o formato 1 + 1.
[077] As Figuras 21A e 21B mostram a ativação in vitro de células B humanas por construções humanas anti-CD40 direcionadas a FAP mono- ou bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP (Figura 21 A) ou Dynabeads® não revestidas (Figura 21B) após 2 dias incubação. Com esferas revestidas com FAP, os anticorpos biespecíficos monovalentes para FAP induziram um aumento semelhante da expressão do marcador de ativação de células B, CD86, como as moléculas alvo de FAP bivalentes. Em comparação com a regulação positiva independente de FAP de CD86 induzida por anticorpo de CD40 reticulado (P1AD4470), a sobrerregulação de CD86 induzida por moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, dependentes de FAP, foi ligeiramente inferior. Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não
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44/387 se observou aumento da expressão de CD86 com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos de controle positivo induziram uma regulação positiva dos marcadores de ativação. É mostrada a porcentagem de células B vitais CD86 positivas após 2 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos. Os valores de EC50 de ativação na presença de esferas revestidas com FAP estão resumidos na Tabela 10. Os valores EC50 de todos os anticorpos direcionados para FAP tetravalente para CD40 eram comparáveis e inferiores em comparação com os valores EC50 dos anticorpos visados para FAP bivalentes para CD40. Os valores mais altos de EC50 foram detectados para os formatos 2 + 1,2 + 2 e 1 +1.
[078] As Figuras 22A e 22B mostram a iniciação de células T de DCs pulsadas com OVA ativadas por moléculas de ligação anti-CD40 direcionadas para FAP na presença (Figuras 22A) ou ausência (Figuras 22B) de FAP. As DC isoladas de camundongos transgênicos huCD40, tratadas com o conjugado DEC205-OVA e estimuladas com anticorpos biespecíficos antiCD40 dependentes de FAP bem como contas revestidas com FAP induzem uma forte proliferação de células T específicas de antígeno. Em contraste, na ausência de FAP (esferas não revestidas), a proliferação e a ativação de células T não ou pequenas foram induzidas por DCs estimuladas com anticorpos anti-CD40 direcionados para FAP. A proliferação de células T induzida por DCs estimuladas com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno humanas com um, dois ou quatro CD40 e uma ou duas porções de ligação a FAP foi comparável. DCs pulsadas com quantidades elevadas de SIINFEKL em vez do conjugado DEC205-OVA induziram uma forte proliferação de células T. É mostrada a porcentagem de células T CD3 + CD8 + OT-1 murinas marcadas com CFSE vitais em proliferação (CFSE-baixa) cocultivadas com huCD40 tg DCs pré-incubadas com os anticorpos titulados
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45/387 indicados na presença de OVA (Figura 22A e 22B). O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
[079] As Figuras 23A a 23E e 24A a 24D mostram níveis séricos de enzima, peso corporal, peso do baço, ativação de DC e proliferação de células T em camundongos injetados com uma linha celular de tumor de adenocarcinoma do cólon murino expressando FAP (MC38-FAP) e tratados com FGK4.5 (P1AD3449) ou FGK4.5 x FAP 4 + 1 (P1AD4520) ou apenas veículo. Ao contrário dos ratos tratados com o mAb CD40 não alvo (FGK4.5), o tratamento com FAP-CD40 (FGK4.5) 4 + 1 (isto é, um anticorpo biespecífico tetravalente para CD40 e monovalente para FAP) não induziu lesão hepática como não foi observado aumento das enzimas séricas indicativas de lesão hepática. Isto é mostrado para 3 animais por grupo na Figura 23A para aminotransferase de alanina (ALT), na Figura 23B para desidrogenase de glutamato (GDH) e na Figura 23C para desidrogenase de sorbitol (SDH). Além disso, nenhuma diminuição no peso corporal (Figura 23D) e menor aumento no peso do baço (Figura 23E) foi observada em camundongos tratados com FGK4.5 x FAP (P1AD4520) em comparação com camundongos tratados com o anticorpo CD40 não direcionado (P1AD3449). A ativação de DC nos gânglios linfáticos de drenagem de tumores três dias após injeção terapêutica (Figura 24A e 24B) e a proliferação de células T no tumor oito dias após a terapia de injeção (Figura 24C e 24D) aumentou significativamente em FGK4.5 e FGK4.5 animais tratados com FAP 4 + 1 em comparação com animais tratados com veículo. Nas Figuras 23A a 23C o eixo y mostra os níveis de enzima no soro em unidades por litro e o eixo x mostra camundongos individuais tratados com FGK4.5, FGK4.5 x FAP4 + 1 ou apenas veículo. Na Figura 23D o eixo y mostra o peso corporal em grama de camundongos tratados com FGK4.5, FGK4.5 x FAP4 + 1 ou apenas veículo e o eixo dos x mostra os dias após injeção do tumor. A Figura 23E mostra o peso do baço de camundongos tratados com
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FGK4.5, FGK4.5 x FAP4 + 1 ou veículo sozinho três dias após a injeção terapêutica. As Figuras 24A a 24D mostram a expressão CD86 (Figura 24A) e CD70 (Figura 24B) de DCs no nódulo linfático drenante de tumor e a expressão Ki67 de células T CD8 + (Figura 24C) e o número total de células T CD8 + (Figura 24D) no tumor três e oito dias após a injeção da terapia, respectivamente. ((* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, teste de Student não pareado, bicaudal).
[080] As Figuras 25A e 25B mostram a ativação in vitro de células B humanas por construções anti-CD40 humanas direcionadas a FAP bivalentes na presença de Dynabeads® revestidas com FAP (Figura 25A e 25C) ou não revestidas (Figura 25B e 25D) após 2 dias de incubação. Em comparação com a regulação positiva independente de FAP de CD70 e CD86 induzida pelo anticorpo de ligação cruzada CD40 (P1AA5145), a sobrerregulação de CD70 (Figura 25A) e regulação positiva de CD86 (Figura 25C) induzida por moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, dependentes de FAP, foi ligeiramente inferior. Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não se observou aumento de CD70 (Figura 25B) ou expressão de CD86 (Figura 25D) com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos de controle positivo induziram uma regulação positiva dos marcadores de ativação. É mostrada a porcentagem de células B vitais CD70 ou CD86 positivas após 2 dias de incubação com os anticorpos titulados indicados. O eixo x mostra a concentração de construções de anticorpos.
Descrição Detalhada da Invenção Definições [081] Salvo indicação em contrário, os termos peritos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que os de forma geral utilizados na técnica à qual esta invenção pertence. Para fins de interpretação desta especificação, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que
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47/387 apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e viceversa.
[082] Como aqui utilizado, o termo “molécula de ligação ao antígeno” refere-se no seu sentido mais lato a uma molécula que se liga de forma específica a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são anticorpos, fragmentos de anticorpo e proteínas de ligação ao antígeno de estrutura.
[083] Como aqui utilizado, o termo “domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula-alvo” ou “porção capaz de se ligar especificamente a um antígeno de célula-alvo” referese a uma molécula polipeptídica que se liga de forma específica a um determinante antigênico. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ativar a sinalização através do seu antígeno da célula alvo. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno é capaz de dirigir a entidade à qual está ligado (por exemplo, o agonista de CD40) a um local alvo, por exemplo, a um tipo específico de célula Tumoral ou estroma tumoral contendo o determinante antigênico. Os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a um antígeno da célula alvo incluem anticorpos e seus fragmentos, como, de forma adicional, definido no presente documento, de forma adicional, domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo incluem proteínas de ligação ao antígeno de estrutura como aqui, de forma adicional, definido, por exemplo, domínios de ligação que são com base em proteínas de repetição desenhadas ou domínios de repetição desenhados (ver, por exemplo, WO 2002/020565).
[084] Em relação a um anticorpo ou seu fragmento, o termo “domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo” refere-se à parte da molécula que compreende a área que se liga de forma específica e é complementar a parte ou todo um antígeno.
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Um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação ao antígeno específico pode ser proporcionado, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis do anticorpo (também denominados regiões variáveis do anticorpo). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação ao antígeno específico compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH). Em outro aspecto, o “domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo” pode também ser um fragmento de Fab ou um fragmento de Fab cruzado.
[085] O termo “anticorpo” aqui utilizado no sentido mais amplo e engloba vias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos e multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.
[086] O termo “anticorpo monoclonal” como aqui utilizado referese a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, estando estas variantes de forma geral presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que incluem de forma comum diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal direcionado contra um único determinante em um antígeno.
[087] O termo anticorpo “monoespecífico”, como aqui utilizado, denota um anticorpo que possui um ou mais sítios de ligação, cada um dos
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49/387 quais se liga ao mesmo epitopo do mesmo antígeno. O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é, capaz de se ligar de forma específica a pelo menos dois determinantes antigênicos distintos. De forma comum, uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende dois locais de ligação ao antígeno, cada um dos quais específico para um determinante antigênico diferente. Em certas formas de realização, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é, capaz de se ligar simultaneamente a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas. Uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita, também pode fazer parte de um anticorpo multiespecífico.
[088] O termo “valente” como utilizado no presente pedido denota a presença de um número específico de locais de ligação específicos para um determinante antigênico distinto em uma molécula de ligação ao antígeno que são específicos para um determinante antigênico distinto. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação específicos para um determinado determinante antigênico, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. Em aspectos particulares da invenção, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno de acordo com a invenção podem ser monovalentes para um determinado determinante antigênico, significando que têm apenas um sítio de ligação para o referido determinante antigênico ou podem ser bivalentes ou tetravalentes para um determinado determinante antigênico, significando que eles têm dois locais de ligação ou quatro sítios de ligação, respectivamente, para o referido determinante antigênico.
[089] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são aqui utilizados indistintamente para referir
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50/387 um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa. “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variadas. Por exemplo, anticorpos de classe IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por dissulfureto, do terminal N ao terminal C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também chamada de domínio variável ou um domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também chamados de região constante de cadeia. Similarmente, do terminal N ao C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante de cadeia leve (CL), também chamado de região constante de cadeia leve. A cadeia pesada de um anticorpo pode ser atribuída a um de cinco tipos, denominados a (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser divididos em subtipos, por exemplo, γ1 (lgG1), γ2 (lgG2), γ3 (lgG3), γ4 (lgG4), a1 (lgA1) e a2 (lgA2). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um de dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.
[090] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab’ , Fab'-SH, F (ab')2; diacorpos, triacorpos, tetracorpos, fragmentos de “Fab cruzado”; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv); e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, ver, por exemplo, Pluckthun, em The
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Pharmacology of Monoclonal Anticorpos, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova lorque, pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e Patentes U.S. Nos 5,571,894 e 5,587,458. Para discussão de fragmentos de Fab e F(ab’)2 que compreende resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e possuindo semi-vida in vivo aumentada, ver Patente U.S. Ns 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos, ver, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al. f Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger e outros, Proc Natl Acad Sci US A 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreende todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por exemplo, Patente U.S. Ns 6,248,516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por vias técnicas, incluindo, mas não se limitando a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, assim como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), como aqui descrito.
[091] A digestão com papaína de anticorpos intactos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab” contendo cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Como aqui utilizado, Assim, o termo “fragmento de Fab” referese a um fragmento de anticorpo que compreende um fragmento de cadeia leve que compreende um domínio VL e um domínio constante de uma cadeia leve (CL) e um domínio VH e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Os fragmentos de Fab’ diferem dos fragmentos de Fab pela adição de
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52/387 alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH são fragmentos de Fab’ em que o (s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab’)2 que possui dois locais de combinação com o antígeno (dois fragmentos de Fab) e uma parte da região Fc. De acordo com a presente invenção, o termo “fragmento de Fab” também inclui “fragmentos de Fab cruzado” ou “fragmentos de Fab de cruzamento” como definido abaixo.
[092] O termo “fragmento de Fab cruzado” ou “fragmento x Fab” ou “fragmento de Fab cruzado” refere-se a um fragmento de Fab, em que as regiões variáveis ou as regiões constantes da cadeia pesada e leve são trocadas. Duas composições de cadeia diferentes de uma molécula de Fab cruzada são possíveis e compreendidas nos anticorpos biespecíficos da invenção: Por um lado, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, isto é, a molécula de Fab de cruzamento compreende uma cadeia peptídica composta de a região variável de cadeia leve (VL) e a região constante da cadeia pesada (CH1) e uma cadeia peptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e pela região constante da cadeia leve (CL). Esta molécula de cruzamento de Fab é também referida como CrossFab (VLVH). Por outro lado, quando as regiões constantes da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, a molécula de Fab de cruzamento compreende uma cadeia peptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e a região constante da cadeia leve (CL) e um peptídeo composto pela região variável de cadeia leve (VL) e pela região constante da cadeia pesada (CH1). Esta molécula de cruzamento de Fab é também referida como CrossFab (CLCH1).
[093] Um “fragmento de Fab de cadeia simples” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável da cadeia pesada do
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53/387 anticorpo (VH), um domínio constante do anticorpo 1 (CH1), um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), uma domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do terminal N para o terminal C: a) ligante VH-CH1-VL-CL, b) ligante VL-CL -VH-CH1, c) Ligante VH-CL-VL-CH1 ou d) Ligante VL-CH1-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de forma preferida entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos de Fab de cadeia simples são estabilizados através da ligação dissulfureto natural entre o domínio CL e o domínio CH1, de forma adicional, estas moléculas Fab de cadeia simples podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfureto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).
[094] Um “fragmento de Fab de cadeia simples cruzada” ou “xscFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo, um domínio constante de anticorpo 1 (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção terminal N para terminal C: a) VH-CL-ligante-VL-CH1 e b) VL-CH1-ligante-VH-CL; em que VH e VL formam em conjunto um sítio de ligação ao antígeno, que se liga de forma específica a um antígeno e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de forma adicional, estas moléculas x-scFab podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfureto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).
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54/387 [095] Um “fragmento variável de cadeia única (scFv)” é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, ligada a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é de forma geral rico em glicina para flexibilidade, assim como serina ou treonina para solubilidade, e pode ligar o terminal N da VH com o terminal C da VL, ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Os anticorpos scFv são, por exemplo, descritos em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96), de forma adicional, os fragmentos de anticorpo compreendem polipeptídeos de cadeia simples com as características de um domínio VH, nomeadamente sendo capazes de se reunirem com um domínio VL, ou de um domínio VL, nomeadamente serem capazes de se unir com um domínio VH a um local funcional de ligação ao antígeno e desse modo proporcionando a propriedade de ligação ao antígeno de anticorpos de comprimento total.
[096] “Proteínas de ligação de antígeno de suporte” são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, fibronectina e proteínas de repetição de anquirina (DARPins) têm sido utilizadas como estruturas alternativas para domínios de ligação ao antígeno, ver, por exemplo, Gebauer e Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation anticorpo therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13: 245-255 (2009) e Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). Em um aspecto da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno de estrutura selecionada a partir do grupo que consiste de CTLA-4 (Evocorpo), Lipocalinas (Anticalina), uma molécula derivada de Proteína A, tal como o domínio Z de Proteína A (Aficorpo), um Domínio A (Avimer/ Maxicorpo), uma transferrina sérica (trans-corpo); uma proteína repetida de anquirina (DARPin), um domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo (anticorpo de domínio
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55/387 nico, sdAb), um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (nanocorpo, aVH), fragmentos VNAR, uma fibronectina (AdNectin) um domínio de lectina do tipo C (tetranectina); um domínio variável de uma nova beta-lactamase do receptor de antígeno (fragmentos VNAR), uma faixa-cristalina humana ou ubiquitina (moléculas de Affilin); um domínio do tipo kunitz de inibidores de proteases humanas, microrganismos, tais como as proteínas da família knottin, aptâmeros de peptídeos e fibronectina (adnectina). O CTLA-4 (Antígeno 4 Associado aos Linfócitos T Citotóxicos) é um receptor da família CD28 expresso principalmente em células T CD4 + . Seu domínio extracelular tem uma dobra de Ig de domínio variável. Os laços correspondentes às CDRs de anticorpos podem ser substituídos por sequência heteróloga para conferir diferentes propriedades de ligação. Moléculas CTLA-4 manipuladas para terem diferentes especificidades de ligação são também conhecidas como Evicorpos (por exemplo, US 7166697 B1). Os anticorpos estão em torno do mesmo tamanho que a região variável isolada de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio). Para mais detalhes ver Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001). As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam pequenas moléculas hidrofóbicas, como esteróides, bilinas, retinóides e lipídios. Eles têm uma estrutura secundária de folha-beta rígida com um número de loops na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser projetada para se ligar a diferentes antígenos-alvo. As anticalinas têm entre 160 e 180 aminoácidos de tamanho e são derivadas de lipocalinas. Para mais detalhes ver Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US 7250297 B1 e US 20070224633. Um anticorpo é uma estrutura derivado da Proteína A de Staphylococcus aureus que pode ser modificado para se ligar ao antígeno. O domínio consiste em um feixe de três hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Bibliotecas foram geradas por randomização de resíduos de superfície. Para mais detalhes, consulte Protein
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Eng. Des. Sei. 2004, 17, 455-462 e EP 1641818A1. Avimers são proteínas de múltiplos domínios derivadas da família de andaimes do domínio A. Os domínios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptam uma estrutura ligada por dissulfureto definida. A diversidade é gerada pelo embaralhamento da variação natural exibida pela família dos domínios A. Para mais detalhes veja Nature Biotechnology 23 (12), 1556 - 1561 (2005) e Expert Opinion on Investigational Drugs 16 (6), 909-917 (junho de 2007). Uma transferrina é uma glicoproteína de transporte de soro monomérica. As transferinas podem ser manipuladas para se ligarem a diferentes antígenos alvo através da inserção de sequências peptídicas em um circuito de superfície permissivo. Exemplos de andaimes de transferrina modificados incluem o transcorpo. Para mais detalhes, ver J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999). As Proteínas de Repetição de Ankyrin Desenhadas (DARPins) são derivadas da Ankyrin, que é uma família de proteínas que medeiam a ligação de proteínas de membrana integrais ao citoestrutura. Uma única repetição de anquirina é um motivo de 33 resíduos que consiste em duas hélices alfa e uma volta beta. Eles podem ser manipulados para se ligarem a diferentes antígenos-alvo por randomização de resíduos na primeira hélice-alfa e uma volta-beta de cada repetição. Sua interface de ligação pode ser aumentada aumentando o número de módulos (um método de maturação por afinidade). Para mais detalhes, ver J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100 (4), 1700-1705 (2003) e J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US 20040132028 A1. Um anticorpo de domínio único é um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio de anticorpo variável monomérico. Os primeiros domínios únicos foram derivados do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo de camelídeos (nanocorpos ou fragmentos VHH). Além disso, o termo anticorpo de domínio único inclui um domínio variável de cadeia pesada humana (aVH) autônomo ou fragmentos VNAR derivados de tubarões. A fibronectina é uma estrutura que pode ser
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57/387 projetado para se ligar ao antígeno. As adnectinas consistem de uma espinha dorsal da sequência natural de aminoácidos do 10s domínio das 15 unidades de repetição da fibronectina humana tipo III (FN3). Três voltas em uma extremidade do sanduíche β-podem ser projetadas para permitir que uma Adnectina reconheça de forma específica um alvo terapêutico de interesse. Para mais detalhes, consulte Protein Eng. Des. Sei. 18, 435-444 (2005), US 20080139791, WO 2005056764 e US 6818418 B1. Os aptâmeros peptídicos são moléculas de reconhecimento combinatório que consistem em uma proteína de suporte constante, de forma comum tiorredoxina (TrxA) que contém uma alça peptídica variável restringida inserida no sítio ativo. Para mais detalhes, consulte o Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005). Microcorpos são derivados de microproteínas naturais de 25-50 aminoácidos de comprimento que contêm 3-4 pontes de cisteína - exemplos de microproteínas incluem KalataBI e conotoxina e knottins. As microproteínas têm uma alça que pode ser projetada para incluir até 25 aminoácidos sem afetar a dobra total da microproteína. Para mais detalhes de domínios knottin projetados, consulte o documento WO 2008098796.
[097] Uma “molécula de ligação ao antígeno, que se liga ao mesmo epítopo” como uma molécula de referência refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno que bloqueia a ligação da molécula de referência ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais, e inversamente, a molécula de referência bloqueia a ligação da molécula de ligação ao antígeno ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.
[098] O termo “domínio de ligação ao antígeno” ou “sítio de ligação ao antígeno” refere-se parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga de forma específica e complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Quando um antígeno é grande, uma molécula de ligação ao antígeno pode ligar-se apenas a uma parte particular do
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58/387 antígeno, parte a qual é denominada epítopo. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser proporcionado, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis (também denominados regiões variáveis). De preferência, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH).
[099] Como aqui utilizado, o termo “determinante antigênico” é sinônimo de “antígeno” e “epítopo” e refere-se a um sítio (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica à qual se liga uma fração de ligação ao antígeno, formando um complexo antígeno de ligação ao antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, na superfície de células tumorais, na superfície de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, na superfície de células imunológicas, livres em soro sanguíneo e/ ou em a matriz extracelular (ECM). As proteínas úteis como antígenos aqui podem ser qualquer forma nativa das proteínas de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. Em uma forma de realização particular, o antígeno é uma proteína humana. Quando é feita aqui referência a uma proteína específica, o termo engloba a proteína não processada “completa”, assim como qualquer forma da proteína que resulta do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural da proteína, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas.
[0100] Por “ligação específica” entende-se que a ligação seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas ou não específicas. A capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno se ligar a
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59/387 um antígeno específico pode ser medida quer através de um ensaio imuno absorvente ligado a enzima (ELISA) quer outras técnicas familiares para um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmídica de superfície (SPR) (analisado em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em uma forma de realização, a extensão da ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno medida, por exemplo, por SPR. Em certas formas de realização, uma molécula que se liga ao antígeno tem uma constante de dissociação (Kd) de 1 mM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ou 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
[0101] “Afinidade” ou “afinidade de ligação” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como aqui utilizado, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1: 1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y de forma geral pode ser representada pela constante de dissociação (Kd), que é a razão de constantes de dissociação e de taxa de associação (kdesligado e kligado, respectivamente). Assim, afinidades equivalentes podem compreender constantes de velocidade diferentes, desde que a razão das constantes de velocidade permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos no estado da técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Um método particular para medir a afinidade é a Ressonância de Plasmon Surface (SPR).
[0102] Um anticorpo “amadurecido por afinidade” refere-se a um
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60/387 anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), comparado a um anticorpo original que não possui tais alterações, resultando em uma melhora na afinidade do anticorpo para antígeno.
[0103] Um “antígeno da célula alvo” como usado aqui refere-se a um determinante antigênico apresentado na superfície de uma célula alvo, em particular uma célula alvo em um tumor, tal como uma célula cancerosa ou uma célula do estroma tumoral. Assim, o antígeno da célula alvo é um antígeno associado a tumores. Em particular, um antígeno de célula alvo não inclui receptores de checkpoint imunológico em células T ativadas, tais como CTLA4, PD-1 ou PD-L1. Em certas formas de realização, o antígeno da célula alvo é um antígeno na superfície de uma célula Tumoral. Em um aspecto, o antígeno da célula-alvo tumoral é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), Antígeno Carcinoembrionário (CEA), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina associado a Melanoma (MCSP), Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), CD19, CD20 e CD33. Em particular, o antígeno da célula alvo tumoral a proteína de ativação de fibroblastos (FAP).
[0104] O termo “proteína de ativação de fibroblastos (FAP)”, também conhecido como Prolil endopeptidase FAP ou Seprase (EC 3.4.21), refere-se a qualquer FAP nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) não humanos primatas (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. O termo engloba o FAP “completo”, não processado, bem como qualquer forma de FAP que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de FAP, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. Em uma forma de realização, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, humana, de camundongo e/ ou cynomolgus. A
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61/387 sequência de aminoácidos da PAF humana é mostrada no UniProt (www.uniprot.org). Q12884 (versão 149, SEQ ID Ns: 2), ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. O domínio extracelular (ECD) da FAP humana estende-se desde a posição de aminoácido 26 até 760. A sequência de aminoácidos de um ECD de FAP humano marcado com His mostrada na SEQ ID Ns: 142. A sequência de aminoácidos de FAP de camundongo apresentada na adesão UniProt. Ns. P97321 (versão 126, SEQ ID Ns: 143), ou NCBI RefSeq NP_032012.1. O domínio extracelular (ECD) de FAP de camundongo estende-se desde a posição de aminoácido 26 até 761. A SEQ ID Ns: 144 mostra o aminoácido de um ECD de camundongo FAP marcado com His. A SEQ ID Ns: 145 mostra o aminoácido de um ECD FAP cynomolgus marcado com His. De preferência, uma molécula de ligação anti-FAP da invenção liga-se ao domínio extracelular da FAP.
[0105] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo de forma geral possuem estruturas semelhantes, com cada domínio que compreende quatro regiões estruturais (FR) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVR). Ver, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.
[0106]Q termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado aqui, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). De forma geral, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). HVRs de forma geral compreendem
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62/387 resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo esta última a mais alta variabilidade de sequência e/ ou envolvida no reconhecimento de antígeno. Loops hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3). (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 e 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico, 5â Ed. Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Regiões hipervariáveis (HVRs) também são referidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs), e estes termos são aqui utilizados indistintamente em referência a porções da região variável que formam as regiões de ligação ao antígeno. Esta região particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept, de Saúde e Serviços Humanos, “Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico” (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados um contra o outro. No entanto, a aplicação de qualquer definição para referir uma CDR de um anticorpo ou suas variantes pretende estar dentro do âmbito do termo como definido e utilizado neste documento. Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs como definido por cada uma das referências citadas acima são expostos a seguir na Tabela A como uma comparação. Os números exatos de resíduos que abrangem uma CDR específica irão variar dependendo da sequência e tamanho da CDR. Os peritos no assunto podem determinar rotineiramente quais os resíduos que compreendem uma CDR particular dada a sequência de
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63/387 aminoácidos da região variável do anticorpo.
TABELA A. Definições do CDR1
CDR Kabat Cotia AbM2
Vh CDR1 31 a 35 26 a 32 26 a 35
Vh CDR2 50 a 65 52 a 58 50 a 58
Vh CDR3 95 a 102 95 a 102 95 a 102
VlCDRI 24 a 34 26 a 32 24 a 34
Vl CDR2 50 a 56 50 a 52 50 a 56
VL CDR3 89 a 97 91 a 96 89 a 97
[0107] 1 A numeração de todas as definições de CDR na Tabela A está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver abaixo).
[0108] 2 “AbM” com letra minúscula “b”, como usado na Tabela A, refere-se às CDRs como definido pelo software de modelagem de anticorpos “AbM” da Oxford Molecular.
[0109] Kabat etal. também definiu um sistema de numeração para sequências de regiões variáveis que é aplicável a qualquer anticorpo. Um vulgar técnico no assunto pode atribuir inequivocamente este sistema de “numeração Kabat” a qualquer sequência de região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Como aqui utilizado, a “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, “Sequência of Proteins of Immunological Interest” (1983). Salvo indicação em contrário, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em uma região variável de anticorpo estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[0110] Com a exceção de CDR1 em VH, as CDRs de forma geral compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. As CDRs também compreendem “resíduos determinantes de especificidade” ou “SDRs”, que são resíduos que entram em contato com o antígeno. Os SDRs
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64/387 estão contidos em regiões dos CDRs chamados CDRs abreviados ou CDRs. Exemplos de a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31-34 de L1,50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3. (Ver Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). Salvo indicação em contrário, resíduos HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são aqui numerados de acordo com Kabat etal. supra.
[0111] “Framework” ou “FR” refere-se a resíduos do domínio variável que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável de forma geral consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências HVR e FR de forma geral aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)FR3-H3 (L3)-FR4.
[0112] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[0113] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ, e μ respectivamente.
[0114] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácido de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos pelo menos
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65/387 um, e de forma comum dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àqueles de um anticorpo não humano, e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, referese a um anticorpo que sofreu humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidos pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi, de forma adicional, modificada ou alterada da do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação de C1q e/ ou Fc ligação de receptor (FcR).
[0115] Um anticorpo “humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por uma célula humana ou humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificadoras de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui de forma específica um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antígeno não humanos.
[0116] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” aqui utilizado para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de anticorpo que contêm pelo menos uma parte da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Uma região IgG Fc compreende um domínio IgG CH2 e um IgG CH3. O “domínio CH2” de uma região Fc de IgG humana normalmente estende-se desde um resíduo de aminoácido na posição 231 atum resíduo de aminoácido na posição 340. Em uma forma de realização, uma cadeia de hidrato de carbono ligada ao domínio CH2. O domínio CH2 aqui pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou domínio CH2 variante. O
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66/387 “domínio CH3” compreende o trecho de resíduos terminal C para um domínio CH2 em uma região FC (ou seja, de um resíduo de aminoácido em cerca da posição 341 para um resíduo de aminoácido em cerca da posição 447 de uma IgG). A região CH3 aqui pode ser um domínio CH3 de sequência nativa ou um domínio CH3 variante (por exemplo, um domínio CH3 com uma protuberância introduzida (“maçaneta”) em uma cadeia da mesma e uma “cavidade” introduzida correspondente (“furo”) na outra cadeia do mesmo; ver Patente US Ns 5,821,333, expressamente incorporada aqui por referência). Tais domínios CH3 variantes podem ser utilizados para promover a heterodimerização de duas cadeias pesadas de anticorpos não idênticas como aqui descrito. Em uma forma de realização, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana estendese desde Cys226, ou desde Pro230, ao terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina terminal C (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que aqui especificado de outro modo, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da UE, também designado por índice EU, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0117] A tecnologia “maçaneta em furo - knob-\fíto-hole’’ é descrita, por exemplo, na US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al.f Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De forma geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“maçaneta”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (“buraco”) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal forma que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promovem a formação de heterodímeros e impedem a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de
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67/387 aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). A protuberância e cavidade podem ser feitas alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica do local, ou por síntese peptídica. Em uma forma de realização específica, uma modificação de maçaneta compreende a substituição de aminoácidos T366W em uma das duas subunidades do domínio Fc, e a modificação do furo compreende as substituições de aminoácidos T366S, L368A e Y407V na outra das duas subunidades do domínio Fc. Em uma forma de realização específica adicional, a subunidade do domínio Fc que compreende a modificação da maçaneta compreende, de forma adicional, a substituição de aminoácidos S354C e a subunidade do domínio Fc que compreende a modificação do furo compreende, de forma adicional, a substituição de aminoácidos Y349C. A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte dissulfureto entre as duas subunidades da região Fc, estabilizando assim o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
[0118] Uma “região equivalente região Fc de uma imunoglobulina” pretende incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina, bem como variantes com alterações que produzem substituições, adições ou eliminações, mas que não diminuem substancialmente a capacidade de a imunoglobulina para mediar as funções efetoras (tal como citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser eliminados do terminal N ou terminal C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial da função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas a partir de acordo com
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68/387 regras gerais conhecidas na técnica, de modo a terem um efeito mínimo na atividade (ver, por exemplo, Bowie, J. U. etal., Science 247:1306-10 (1990)).
[0119] O termo “função efetora” refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina, captação de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam o antígeno, regulação para baixo de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de células B.
[0120] As funções efetoras dependentes da ligação ao receptor de Fc podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com receptores FC(FcR), que são receptores de superfície celular especializados em células hematopoiéticas. Os receptores Fc pertencem à superfamília de imunoglobulinas e demonstraram mediar tanto a remoção de patógenos revestidos de anticorpos pela fagocitose de complexos imunes, quanto a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) revestidos com o anticorpo correspondente, via citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) (ver, por exemplo, Van de Winkel, JG e Anderson, CL, J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Os FcRs são definidos pela sua especificidade para os isotipos das imunoglobulinas: os receptores Fc para anticorpos IgG são referidos como FcyR. A ligação ao receptor de Fc descrita, por exemplo, em Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994)25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; e Gessner, J.E. et al. Ann. Hematol 76 (1998)231-248.
[0121] A reticulação de receptores para a região Fc de anticorpos
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IgG (FcyR) desencadeia uma ampla variedade de funções efetoras, incluindo fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpos e liberação de mediadores inflamatórios, bem como depuração do complexo imune e regulação da produção de anticorpos. Em humanos, três classes de FcyR foram caracterizadas, quais sejam:
- FcyRI (CD64) liga-se à IgG monomérica com alta afinidade e é expresso em macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. A modificação na região Fc de IgG pelo menos em um dos resíduos de aminoácidos E233G236, P238, D265, N297, A327 e P329 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) reduz a ligação a FcyRI. Os resíduos de lgG2 nas posições 233236, substituídos em lgG1 e lgG4, reduziram a ligação a FcyRI em 10 vezes e eliminaram a resposta de monócitos humanos a eritrócitos sensibilizados por anticorpos (Armour, KL, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999)2613-2624);
- FcyRII (CD32) liga-se a IgG complexada com uma afinidade média a baixa e é amplamente expresso. Este receptor pode ser dividido em dois sub-tipos, FcyRIIA e FcyRIIB. FcyRIIA é encontrado em muitas células envolvidas na morte (por exemplo, macrófagos, monócitos, neutrófilos) e parece capaz de ativar o processo de morte. FcyRIIB parece desempenhar um papel em processos inibitórios e é encontrado em células B, macrófagos e em mastócitos e eosinófilos. Nas células B, parece funcionar para suprimir a produção de imunoglobulinas e a mudança do isotipo para, por exemplo, a classe IgE. Nos macrófagos, FcyRIIB age inibindo a fagocitose mediada por FcyRIIA. Em eosinófilos e mastócitos, a forma B pode ajudar a suprimir a ativação dessas células através da ligação de IgE a seu receptor separado. A ligação reduzida para FcyRIIA encontra-se, por exemplo, para anticorpos que compreende uma região Fc de IgG com mutações pelo menos em um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 e K414 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
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- FcyRIII (CD16) liga-se a IgG com afinidade média a baixa e existe como dois tipos. FcyRIIIA é encontrado em células NK, macrófagos, eosinófilos e alguns monócitos e células T e media o ADCC. FcyRIIIB é altamente expresso em neutrófilos. A ligação reduzida a FcyRIIIA encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreende uma região Fc de IgG com mutação pelo menos em um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 e D376 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0122] O mapeamento dos sítios de ligação na lgG1 humana para os receptores Fc, os locais de mutação acima mencionados e os métodos para medir a ligação a FcyRI e FcyRIIA são descritos em Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.
[0123] O termo “ADCC” ou “citotoxicidade celular dependente de anticorpo” é uma função mediada pela ligação do receptor Fc e refere-se à lise de células alvo por um anticorpo como aqui reportado na presença de células efetoras. A capacidade do anticorpo para induzir os passos iniciais que medeiam o ADCC é investigada medindo a sua ligação a receptores Fcy que expressam células, tais como células, expressando recombinantemente FcyRI e/ ou FcyRIIA ou células NK (expressando essencialmente FcyRIIIA). Em particular, a ligação a FcyR em células NK é medida.
[0124] Um “receptor Fc ativador” é um receptor Fc que, após o envolvimento de uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam a célula portadora de receptor para realizar funções efetoras. Receptores Fc ativadores incluem FcyRllla (CD16a), FcyRI (CD64), FcyRlla (CD32) e FcaRI (CD89). Um receptor Fc ativante particular é o FcyRllla humano (ver n.s de acesso UniProt P08637, versão 141).
[0125] O termo “CD40”, como aqui utilizado, refere-se a qualquer CD40 nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, tais como
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71/387 primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. O termo abrange o CD40 “completo”, não processado, bem como qualquer forma de CD40 resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD40, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um CD40 humano exemplificativo mostrada na SEQ ID Ns: (Uniprot P25942, versão 200) e a sequência de aminoácidos de um CD40 de camundongo exemplificativo mostrada na SEQ ID Ns: 146 (Uniprot P27512, versão 160). O antígeno CD40 é uma glicoproteína da superfície celular de 50 kDa que pertence à família do Receptor do Fator de Necrose Tumoral (TNF-R). (Stamenkovic et al. (1989), EMBO J. 8: 1403-10). O CD40 é expresso em muitos tipos de células normais e tumorais, incluindo linfócitos B, células dendríticas, monócitos, macrófagos, epitélio do timo, células endoteliais, fibroblastos e células musculares lisas. O CD40 é expresso em todos os linfomas B e em 70% de todos os tumores sólidos e é supra-regulado em células que apresentam os antígenos (APCs) por sinais de maturação, como IFN-faixa e GM-CSF. A ativação de CD40 também induz a diferenciação de monócitos em células dendríticas funcionais (DC) e aumenta a atividade citolítica de células NK através de citocinas induzidas por APC-CD40. Assim, o CD40 desempenha um papel essencial na iniciação e aumento das respostas imunes, induzindo a maturação de APCs, a secreção de citocinas auxiliares, a regulação positiva de moléculas co-estimuladoras e o aumento das funções efetoras.
[0126] O termo “agonista de CD40”, tal como aqui utilizado, inclui qualquer porção que agonize a interação CD40/ CD40L. O CD40 como utilizado neste contexto refere-se de forma preferencial ao CD40 humano, assim o agonista do CD40 é de preferência um agonista do CD40 humano. De forma comum, a parte será um anticorpo CD40 ou fragmento de anticorpo
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72/387 agonista.
[0127] Os termos “anticorpo anti-CD40”, “anti-CD40”, “anticorpo CD40 e” um anticorpo que se liga de forma específica ao CD40 “referem-se a um anticorpo que é, capaz de se ligar ao CD40 com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como diagnóstico e/ ou agente terapêutico na segmentação de CD40. Em um aspecto, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD40 a uma proteína não CD40 não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao CD40 conforme medido, por exemplo, por um rádio imuno ensaio (RIA) ou citometria de fluxo (FACS). Em certas formas de realização, um anticorpo que se liga a CD40 tem uma constante de dissociação (KD) de 1 mM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ou 0,001 nM (por exemplo, 10’6 M ou menos, por exemplo, de 10’68 M a 10’13 M, por exemplo, de 10’8 M a 10’10 M).
[0128] O termo “ligante peptídico” refere-se a um peptídeo que compreende um ou mais aminoácidos, de forma comum cerca de 2 a 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica ou são aqui descritos. Peptídeos de ligação adequados, não imunogênicos são, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4) não ou G4 (SG4)n, em que “n” de forma geral é um número entre 1 e 10, de forma comum entre 2 e 4, em particular 2, isto é, os peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste de GGGGS (SEQ ID Ns: 147) GGGGSGGGGS (SEQ ID Ns: 148), SGGGGSGGGG (SEQ ID Ns: 149) and GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID Ns: 150), mas também incluem as sequências GSPGSSSSGS (SEQ ID Ns: 151), (G4S)3 (SEQ ID Ns: 152), (G4S)4 (SEQ ID Ns: 153), GSGSGSGS (SEQ ID Ns: 154), GSGSGNGS (SEQ ID Ns: 155), GGSGSGSG (SEQ ID Ns: 156), GGSGSG (SEQ ID Ns: 157), GGSG (SEQ ID Ns: 158), GGSGNGSG (SEQ ID Ns: 159), GGNGSGSG (SEQ ID Ns: 160) and GGNGSG (SEQ ID Ns: 161). Os ligantes peptídicos de interesse particular são (G4S) (SEQ ID Ns: 147), (G4S)2
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73/387 ou GGGGSGGGGS (SEQ ID Ns: 148), (G4S)3 (SEQ ID Ns: 152) e (G4S)4 (SEQ ID Ns: 153).
[0129]O termo “aminoácido” como utilizado neste pedido indica o grupo de α-aminoácidos de carboxila que compreende alanina (código de três letras: ala, um código de letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gin, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tyr, Y) e valina (vai, V).
[0130] Por “fundido” ou “conectado” entende-se que os componentes (por exemplo, uma cadeia pesada de um anticorpo e um fragmento de Fab) são ligados por ligações peptídicas, diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.
[0131] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeo (proteína) de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento sequências e introduzindo lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservatives como parte da identidade da sequência. O alinhamento para fins de determinação da identidade da sequência percentual de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras dentro da habilidade na técnica, por exemplo, utilizando software de computador disponível publicamente, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAWI ou Megalign (DNASTAR). Os peritos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de toda a extensão das sequências comparadas.
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Para os fins aqui descritos, no entanto, são gerados % de valores de identidade de sequência de aminoácidos utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório de Direitos Autorais dos EUA, Washington D.C., 20559, em que está registrado no Registro de Direitos Autorais dos EUA Ns TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., no sul de São Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o digital UNIX V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações em que o ALIGN-2 é utilizado para comparações de sequências de aminoácidos, a% de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode de forma alternativa ser expressa como um dado aminoácido A sequência A que tem ou compreende uma certa identidade de sequência de aminoácidos% com, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:
100 vezes a fração X/ Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a% de identidade de sequência de aminoácidos de A a B não será igual à% de identidade de sequência de aminoácidos de B a A. A menos que especificado de outra forma, todas as% Os valores de identidade de
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75/387 sequência de aminoácidos usados aqui são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.
[0132] Em certas formas de realização, contemplam-se variantes da sequência de aminoácidos das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e / ou outras propriedades biológicas das moléculas de ligação ao antígeno contendo o TNF ligando o trimero. Podem ser preparadas variantes da sequência de aminoácidos das moléculas de ligação de antígeno contendo o ligando TNF e trado, introduzindo modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica as moléculas, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ ou inserções e/ ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno. Os locais de interesse para a mutagênese substitucional incluem os HVRs e o Framework (FRs). As substituições conservatives são fornecidas na Tabela B sob o título “Substituições Preferidas” e ainda descritas abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos (I) a (6). As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas na molécula de interesse e os produtos rastreados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/ melhorada, imunogenicidade diminua ou ADCC ou CDC melhorado.
TABELA B
Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas
Ala (A) Vai; Leu; lie Vai
Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (n) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
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Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Giy(g) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
He O) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
Leu (L) Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe lie
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; lie Leu
Phe (F) Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tyr Tyr
Pro (p) Ala Ala
Ser (s) Thr Thr
Thr(T) Vai; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Vai (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
[0133] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, He;
(2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) acético: Asp, Glu;
(4) básico: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;
(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0134] Substituições não conservadoras implicarão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0135] O termo “variantes da sequência de aminoácidos” inclui
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77/387 variantes substanciais em que existem substituições de aminoácidos em um ou mais resíduos da região hipervariável de uma molécula de ligação ao antígeno parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). De forma geral, a (s) variante (s) resultante (s) selecionada (s) para estudos posteriores terão modificações (por exemplo, melhoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação à molécula de ligação ao antígeno parental e/ ou terão substancialmente reteve certas propriedades biológicas da molécula de ligação ao antígeno parental. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, utilizando técnicas de maturação de afinidade com base em exibição de fagos, tais como as aqui descritas. Em resumo, um ou mais resíduos HVR são mutados e as moléculas de ligação ao antígeno variantes exibidas no fago e pesquisadas quanto a uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação). Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade da molécula de ligação ao antígeno se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservatives (por exemplo, substituições conservatives como aqui fornecidas) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Um modo útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese designado “mutagênese de varrimento de alanina” como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de
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78/387 aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais. De forma alternativa, ou, de forma adicional, uma estrutura cristalina de um complexo molécula de ligação antígeno-antígeno para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. Variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[0136] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ ou carboxila que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um ou vários resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção com um resíduo metionila terminal N. Outras variantes de inserção da molécula incluem a fusão ao terminal N ou C a um polipeptídeo que aumenta a semivida no soro das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico.
[0137] Em certas formas de realização, as moléculas de ligação ao antígeno biespecífico aqui proporcionadas são alteradas para aumentar ou diminuir a extensão na qual o anticorpo glicosilado. As variantes de glicosilação das moléculas podem ser convenientemente obtidas alterando a sequência de aminoácidos de tal forma que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos. Quando a molécula de ligação ao antígeno contendo o ligando do TNF e o trímero compreende uma região Fc, o hidrato de carbono a ela ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem de forma comum um oligossacarídeo ramificado, bianternário, que é de forma geral ligado por uma ligação não a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Veja, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários hidratos de carbono, por exemplo, manose, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como
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79/387 uma fucose ligada a um GlcNAc no “caule” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas formas de realização, podem ser feitas modificações do oligossacarídeo na molécula de ligação ao antígeno contendo o trífer do ligando da família do TNF, de modo a criar variantes com certas propriedades melhoradas. Em um aspecto, variantes de moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno ou anticorpos da invenção são proporcionadas com uma estrutura de hidrato de carbono que não tem fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tais variantes de fucosilação podem ter função ADCC melhorada, ver por exemplo, Publicação de Patente US Nos. 2003/0157108 (Presta, L.) ou US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Em outro aspecto, variantes das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno ou anticorpos da invenção são proporcionadas com oligossacarídeos bisseccionados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado região Fc bissectado por GlcNAc. Tais variantes podem ter fucosilação reduzida e/ ou função ADCC melhorada. Ver, por exemplo, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.): Patente US Ns 6.602.684 (Umana et al.): e US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidas variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpo podem ter função de CDC melhorada e são descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.): WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0138] Em certos aspectos, pode ser desejável criar variantes manipuladas com cisteína das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção, por exemplo, “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos da molécula são substituídos com resíduos de cisteína. Em aspectos particulares, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis da molécula. Substituindo esses resíduos com cisteína, grupos tiol reativos são assim posicionados em locais acessível do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo
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80/387 a outras porções, tais como porções de fármacos ou porções de ligantefármaco, para criar um imunoconjugado. Em certos aspectos, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração UE) da cadeia pesada; e S400 (numeração UE) da região Fc da cadeia pesada. As moléculas de ligação ao antígeno modificadas por cisteína podem ser geradas como descrito, por exemplo, na Patente U.S. Ns 7.521.541.
[0139] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construção, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA plasmídico (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéter convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo.
[0140] Por molécula de ácido nucleico “isolado” ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula polinucleotídica contida em células que normalmente contém a molécula polinucleotídica, mas a molécula polinucleotídica está presente extracromossomáticamente ou em uma localização cromossômica que diferente da sua localização cromossômica natural. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, assim como formas de cadeia positiva e negativa, e
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81/387 formas de cadeia dupla. Polinucleotídeos isolados ou ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, local de ligação ao ribossoma ou um terminador de transcrição.
[0141] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo possuindo uma sequência nucleotídica de pelo menos, por exemplo, 95% “idêntico” a uma sequência nucleotídica de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência nucleotídica do polinucleotídeo seja idêntica sequência de referência exceto que A sequência polinucleotídica pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da sequência nucleotídica de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo com uma sequência nucleotídica pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5’ ou 3' da sequência nucleotídica de referência ou em qualquer local entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contínuos na sequência de referência. Como uma questão prática, se qualquer sequência polinucleotídica particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica da presente invenção pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos, tais como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).
[0142] O termo “cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma sie de
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82/387 elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmideo, cromossoma, DNA mitocondrial, DNA plasmático, vírus ou fragmento de ácido nucleico. De forma comum, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a transcrever e um promotor. Em certas formas de realização, o cassete de expressão da invenção compreende sequências polinucleotídicas que codificam moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos.
[0143] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construção de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é utilizada para introduzir e dirigir a expressão de um gene específico ao qual está operacionalmente associado em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto replicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão esteja dentro da célula alvo, a molécula ou proteína de ácido ribonucleico que é codificada pelo gene é produzida pela maquinaria de transcrição e/ ou tradução celular. Em uma forma de realização, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências polinucleotídicas que codificam moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos.
[0144] Os termos “célula hospedeira”, “linha celular hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de forma alternada e referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a
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83/387 descendência de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células Transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucléico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A descendência mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é aqui incluída. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizado para gerar as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da presente invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos, tais como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/ 0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, levedura células, células de inseto e células vegetais, para mencionar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.
[0145] Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.
[0146] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, retarda, minimiza ou previne efeitos adversos de uma doença.
[0147] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas
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84/387 não humanos, como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um humano.
[0148] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma que permita que a atividade biológica de um ingrediente ativo contida seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[0149] Um “excipiente farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, que não um ingrediente ativo, que não ótimo para um sujeito. Um excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, um estabilizador ou um conservante.
[0150] O termo “folheto informativo” é usado para se referir a instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ ou avisos referentes ao uso de tais produtos terapêuticos.
[0151] Como usado aqui, “tratamento” (e suas variações gramaticais, tais como “tratar” ou “tratar”) refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo a ser tratado, e pode ser realizada para profilaxia ou durante o tratamento de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não se limitam a prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação da doença, estado de doença e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas formas de realização, as moléculas da invenção são utilizadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou retardar a
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85/387 progressão de uma doença.
[0152] O termo “câncer”, como usado aqui, refere-se a doenças proliferativas, como linfomas, leucemias linfocíticas, câncer de pulmão, câncer de pulmão de não pequenas células (NSCL), câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino , carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer do glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, neoplasias do sistema nervoso central (CNS), tumores do eixo vertebral, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisário e sarcoma de Ewings, incluindo versões refratárias de qualquer um dos cânceres acima, ou uma combinação de um ou mais dos cânceres acima.
[0153] O termo “agente quimioterapêutico”, tal como é aqui utilizado, refere-se a um composto químico útil no tratamento de câncer. Em um aspecto, o agente quimioterápico é um antimetabólito. Em um aspecto, o antimetabólito é selecionado a partir do grupo que consiste em aminopterina, metotrexato, pemetrexedo, raltitrexed, cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina, pentostatina, tioguanina, capecitabina, citarabina, fluorouracil, floxuridina e gemcitabina. Em um aspecto particular, o antimetabólito é capecitabina ou gemcitabina. Em outro aspecto, o antimetabólito é fluorouracil.
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Em um aspecto, o agente quimioterápico é um agente que afeta a formação de microtúbulos. Em um aspecto, o agente que afeta a formação de microtúbulos é selecionado a partir do grupo que consiste em: paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbin, taxotere, etoposide e teniposide. Em outro aspecto, o agente quimioterapêutico um agente alquilante, tal como ciclofosfamida. Em um aspecto, o agente quimioterapêutico é um antibiótico citotóxico, tal como um inibidor da topoisomerase II. Em um aspecto, o inibidor da topoisomerase II é a doxorrubicina.
Anticorpos biespecíficos da invenção [0154] A invenção proporciona novas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno com propriedades em particular vantajosas, tais como produtividade, estabilidade, afinidade de ligação, atividade biológica, eficiência de direcionamento, toxicidade reduzida, uma faixa de dosagem alargada que pode ser dada a um paciente e assim uma eficácia possivelmente melhorada.
Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas exemplares [0155] Em um aspecto, a invenção proporciona moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo e (c) uma região Fc composta por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0156] Em um aspecto particular, estas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno são caracterizadas por ligação agonista direcionada ao CD40. Em particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é um agonista de CD40 que é direcionado contra um antígeno de célula alvo associado a tumor. Em outro aspecto particular, as moléculas biespecíficas de
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87/387 ligação ao antígeno da invenção compreendem uma região Fc composta por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável que compreende mutações que reduzem a função efetora. O uso de uma região Fc compreendendo mutações que reduzem ou abolem a função efetora impedirá o agonismo inespecífico pela reticulação via receptores Fc e prevenirá ADCC de células CD40 + .
[0157] As moléculas de ligação ao antígeno biespecífico, como aqui descritas, possuem a vantagem sobre os anticorpos convencionais capazes de se ligarem de forma específica ao CD40, na medida em que induzem de forma seletiva a resposta imune nas células alvo, que são de forma comum células cancerígenas ou estroma tumoral. Em um aspecto, o antígeno de célula-alvo associado ao tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP), Proteoglicano de Condroitina Sulfato (MCSP) associado ao Melanoma, Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), Antígeno Carcinoembrionário (CEA), CD19 CD20 e CD33.
[0158] Em um aspecto particular, o antígeno da célula alvo associado ao tumor é FAP.
[0159] Estas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno são caracterizadas por ligação agonista direcionada a FAP para CD40. Na presença de células que expressam FAP, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno são capazes de ativar células que apresentam o antígeno (APC, Exemplo 2.1), para ativar células B humanas (Exemplos 2.1.1 e 2.1.3), células Daudi humanas (Exemplo 2.1. 2) e células dendríticas derivadas de monócitos humanos (moDCs, Exemplo 2.1.4).
[0160] Em um aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende: (i) CDR-H1 que compreende a sequência
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88/387 de aminoácidos da SEQ ID Ns: 19 (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 20, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 21, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende: (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 22, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 23, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 24.
[0161] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende: (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 27 (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 28 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 29 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende: (iv)) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 30, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 31 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 32.
[0162] Em um aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 26.
[0163] Em outro aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID
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Ns: 33 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 34.
[0164] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46, SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID Ns: 55, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 56, SEQ ID Ns: 57, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60, SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64.
[0165] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 57.
[0166] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173 e SEQ ID Ns: 174e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende
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90/387 a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177 e SEQ ID Ns: 178.
[0167] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 177, ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 178, ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 177, ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 178, ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 178, ou (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
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SEQ ID Ns: 175, ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 177, ou (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 176, ou (k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 176, ou (m) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 177, ou (n) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 178, ou (o) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 176, ou (p) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 176.
[0168] Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que
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92/387 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175.
[0169] Ainda em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188.
[0170] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 180 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 181 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
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SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 180 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 181 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 183 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 187, ou (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 183 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 188, ou (k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 184 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 187, ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 184 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 188.
[0171] Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179: 185 ou em que o
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94/387 domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185.
[0172] Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno em que o antígeno da célula-alvo é FAP.
[0173] Em um aspecto particular, o antígeno da célula alvo é Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP). As porções de ligação a FAP foram descritas no documento WO 2012/02006, que é incluído por referência na sua totalidade. As porções de ligação de FAP de interesse particular são descritas abaixo.
[0174] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica à FAP se liga a um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 2.
[0175] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica proteína de ativação de fibroblastos (FAP) compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 3, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 4 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 5 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 6, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 7, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 8, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que
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95/387 compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 11, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 12, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 13 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 14, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 15 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 16.
[0176] Em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 3, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 4 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 5 e a região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 6, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 7 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 8. Em outro aspecto, o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 11, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 12 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 13 e a região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 14, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 15, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 16.
[0177] Em um aspecto adicional, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno,
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96/387 capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96% 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0178] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10 ou o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0179] Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, que se ligam a CD40 e FAP.
[0180] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de
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97/387 cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46, SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID Ns: 55, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 56, SEQ ID Ns: 57, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60, SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64, e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0181] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ Ns: 182, SEQ Ns: 183 e SEQ Ns: 184, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e
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98/387 (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0182] Em um aspecto particular, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0183] Em outro aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende um aminoácido da SEQ ID Ns: 179
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99/387 ou SEQ ID Ns: 182 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0184] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que:
(i) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 26 e (ii) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10.
[0185] Além disso, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que (i) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência
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100/387 de aminoácidos da SEQ ID Ns: 26 e (ii) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0186] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que:
(i) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 47 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 57 e (ii) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0187] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que:
(i) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns:
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177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (ii) o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
Moléculas de ligação de antígeno biespecíficas e monovalentes (formato 1 + 1) [0188] Em um aspecto, a invenção refere-se a moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que compreende (a) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um CD40, (b) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo e (c) Domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável.
[0189] Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a referida molécula compreende (a) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável. Em um aspecto, o antígeno da célula alvo é FAP.
[0190] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a referida molécula compreende:
(i) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46,
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SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID Ns: 55, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 56, SEQ ID Ns: 57, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60, SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64, e (ii) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0191] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 141, uma segunda cadeia pesada (HC2) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 140, uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 138 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 137.
[0192] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a referida molécula compreende:
(i) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 33, SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ
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ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 34, SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (ii) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0193] Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a referida molécula compreende:
(i) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (ii) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada
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104/387 (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0194] Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a referida molécula compreende (i) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, e (ii) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende um aminoácido sequência da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0195] Em outro aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a referida molécula compreende (i) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 ou SEQ ID Ns: 182, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, e (ii) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
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105/387 [0196] Em um aspecto particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 163, uma segunda cadeia pesada (HC2) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 164, uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162.
Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno bivalentes para ligação AO CD40 E MONOVALENTE PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DA CÉLULA-ALVO (FORMATO 2 + 1} [0197] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao antígeno da célula-alvo, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável.
[0198] Assim, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno bivalente para o CD40 e monovalente para o antígeno da célula alvo.
[0199] Em um aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VH e o domínio VL estão
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106/387 ligados, cada um, através de um ligante peptídico a um dos terminais C das duas cadeias pesadas.
[0200] Em um aspecto particular, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Ns: 147, SEQ ID Ns: 148, SEQ ID Ns: 152 e SEQ ID Ns: 153. Mais em particular, o ligante peptídico compreende a SEQ ID Ns: 153.
[0201] Em um aspecto particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VH está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C de uma das cadeias pesadas e em que o domínio VL está ligado através de um ligante peptídico para o terminal C da segunda cadeia pesada.
[0202] Em outro aspecto particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VH está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C da cadeia pesada do maçaneta de Fc e em que o domínio VL está ligado através de um ligante peptídico para o terminal C da cadeia pesada do furo Fc.
[0203] Em um aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
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107/387 (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, e ao domínio Fc, e (b) um domínio VH e VL, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VL está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C da cadeia pesada da maçaneta de Fc e em que o domínio VH está ligado através de um ligante peptídico para o terminal C da cadeia pesada do furo Fc.
[0204] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
[0205] Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) uma VH e uma VL de uma ligação específica ao domínio de ligação ao antígeno ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[0206] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc,
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108/387 (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um VH e um VL de um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[0207] Em particular, o domínio é VH uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 ou da SEQ ID Ns: 17 e o domínio VL é uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende um aminoácido sequência da SEQ ID Ns: 10 ou da SEQ ID Ns: 18. Mais em particular, o domínio é VH uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e o domínio VL é uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0208] Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 82, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 88, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 89 ou (b) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 133, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 134, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 135.
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109/387 [0209] Em outro aspecto particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, e ao domínio Fc, e (b) um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o fragmento de Fab está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C de uma das cadeias pesadas.
[0210] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o fragmento de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[0211] Em particular, o fragmento de Fab, capaz de ligação específica é um fragmento de Fab de cruzamento.
[0212] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 137, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 138, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 139, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência
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110/387 de aminoácidos da SEQ ID Ns: 136.
[0213] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab de cruzamento, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma cadeia VL-CH1 e uma cadeia VH-CL, em que a cadeia VH-CL está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[0214] Em um aspecto, a cadeia VH-CL está ligada ao terminal C da cadeia pesada da maçaneta FC.
[0215] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab de cruzamento, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma cadeia VL-CH1 e uma cadeia VH-CL, em que a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[0216] Em um aspecto, a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C
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111/387 da cadeia pesada da maçaneta FC.
[0217] Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 165, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 167 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 168, ou (b) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 248, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 251 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 252, ou (c) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 248, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 138, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 253 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 252, ou (d) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 248, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 254, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 255 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 252, ou (e) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência
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112/387 de aminoácidos da SEQ ID Ns: 256, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 254, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 257 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 258.
Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno no formato cabeça-cauda (2 + 1) [0218] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) uma cadeia pesada que compreende um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e a uma subunidade da região Fc, (b) uma cadeia pesada que compreende um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, um domínio VL e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e a uma subunidade da região Fc, (c) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (d) uma cadeia leve que compreende um domínio VH e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP.
[0219] Em particular, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 164, uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 166, duas cadeias leves que compreende cada uma a sequência de ácidos da SEQ ID Ns: 165 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162.
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113/387
Moléculas de ligação ao antígenos biespecíficas bivalentes para ligação a CD40 E BIVALENTES PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DE CÉLULAS ALVO (FORMATO 2 + 2) [0220] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar de forma específica ao CD40, (b) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar de forma específica ao antígeno da célula-alvo, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável.
[0221] Assim, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno bivalente para o CD40 e bivalente para o antígeno da célula alvo.
[0222] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) dois fragmentos de Fab, capazes de ligação específica a FAP, em que um dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e o outro dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a).
[0223] Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma
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114/387 molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 86, duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 87, e duas cadeias pesadas, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 90, ou (b) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 137, duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 138, e duas cadeias pesadas, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 136.
Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno tetravalentes para LIGAÇÃO AO CD40 E MONOVALENTES PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DA CÉLULA-ALVO (FORMATO 4 + 1) [0224] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável:
[0225] Assim, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno tetravalente para o CD40 e monovalente para o antígeno da célula alvo.
[0226] Em um aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que os quatro domínios de ligação ao antígeno, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, são fragmentos de Fab e
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115/387 cada um deles dois são fundidos um ao outro na cadeia pesada, opcionalmente via um ligante peptídico. Em um aspecto particular, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 148. Mais em particular, a molécula de ligação ao antígeno compreende duas cadeias pesadas que compreende cada uma um fragmento VHCH1-ligante peptídicoVHCH1. Em um aspecto particular, o ligante peptídico tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 148.
[0227] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo compreende um domínio VH e VL e em que o domínio VH está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C do primeira subunidade do domínio Fc e o domínio VL está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C da segunda subunidade do domínio Fc.
[0228] Em um aspecto particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) duas cadeias pesadas, em que cada uma das cadeias pesadas compreende um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, fundido com um domínio VH e CH1 de um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e um Subunidade da região Fc e (c) um domínio VH e VL, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VH está ligado via um ligante peptídico ao terminal C de uma das cadeias pesadas e em que o domínio VL está ligado através de um ligante peptídico para o terminal C da segunda
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116/387 cadeia pesada.
[0229] Em um aspecto particular, o ligante peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID Ns: 147, SEQ ID Ns: 148, SEQ ID Ns: 152 e SEQ ID Ns: 153. Mais em particular, o ligante peptídico compreende a SEQ ID Ns: 153.
[0230] Em um aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 34, SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, (b) duas cadeias pesadas, em que cada uma da cadeia pesada compreende VH-CH1-VH-CH1 e uma subunidade da região Fc e em que ambos os domínios VH compreendem uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 33, SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e (c) um domínio VH e VL, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que o domínio VH está ligado via um ligante peptídico ao terminal C de uma das cadeias pesadas e em que o domínio VL está ligado através de um ligante peptídico para o terminal C da segunda cadeia pesada.
[0231] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) quatro fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma
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117/387 específica ao CD40, (b) um domínio VH e um VL, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável.
[0232] Em particular, o domínio é VH uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 ou da SEQ ID Ns: 17 e o domínio VL é uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende um aminoácido sequência da SEQ ID Ns: 10 ou da SEQ ID Ns: 18. Mais em particular, o domínio é VH uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e o domínio VL é uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
[0233] Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 82, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 83, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 84 ou (b) quatro cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 133, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 131, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 132.
[0234] Em outro aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, murino que compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada uma que compreende a sequência
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118/387 de aminoácidos da SEQ ID Ns: 97, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 95, e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ: 96 [0235] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) duas cadeias pesadas, em que cada uma das cadeias pesadas compreende um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, fundido com um domínio VH e CH1 de um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e um Subunidade da região Fc e (c) um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o fragmento de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (b).
[0236] Em particular, o fragmento de Fab, capaz de ligação específica é um fragmento de Fab de cruzamento.
[0237] Em um aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende:
(a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e
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119/387 (c) um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o fragmento de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a).
[0238] Em particular, o fragmento de Fab, capaz de ligação específica é um fragmento de Fab de cruzamento.
[0239] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, em que o VL compreende uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 34, SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: o.: 178, SEQ ID Ns: s.: 185, SEQ ID Ns: o.: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (b) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo uma cadeia VH-CH1-VH-CH1 e uma subunidade da região Fc, em que ambos os domínios VH compreendem uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 33, SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: o.: 174, SEQ ID Ns: o.: 179, SEQ ID Ns: o.: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e (c) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma cadeia VL-CHI e uma cadeia VH-CL, em que a cadeia VH-CL está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (b).
[0240] Em um aspecto, a cadeia VH-CL está ligada ao terminal C da cadeia pesada da maçaneta FC.
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120/387 [0241] Em um outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) quatro cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, em que o VL compreende uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 34, SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: o.: 178, SEQ ID Ns: s.: 185, SEQ ID Ns: o.: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (b) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo uma cadeia VH-CH1-VH-CH1 e uma subunidade da região Fc, em que ambos os domínios VH compreendem uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 33, SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: o.: 174, SEQ ID Ns: o.: 179, SEQ ID Ns: o.: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e (c) um fragmento de cruzamento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma cadeia VL-CH1 e uma cadeia VH-CL, em que a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (b).
[0242] Em um aspecto, a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C da cadeia pesada da maçaneta FC.
[0243] Em um aspecto particular, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) quatro cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 165, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162, uma primeira cadeia pesada
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121/387 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 169 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 170, ou (b) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 243, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 244 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 245, ou (c) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 243, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 246 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 247, ou (d) duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 248, uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 162, uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 249 e uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 250.
Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno tetravalentes para LIGAÇÃO AO CD40 E BIVALENTE PARA LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DA CÉLULA-ALVO (FORMATO 4 + 2).
[0244] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende:
(a) quatro domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar de forma específica ao CD40,
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122/387 (b) dois domínios de ligação ao antígeno capazes de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo, e (c) um domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável:
[0245] Assim, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno tetravalente para o CD40 e bivalente para o antígeno da célula alvo.
[0246] Em um aspecto, é fornecida uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que os quatro domínios de ligação ao antígeno, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, são fragmentos de Fab e cada um deles dois são fundidos um ao outro, opcionalmente via um ligante peptídico. Em um aspecto particular, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 148. Mais em particular, a molécula de ligação ao antígeno compreende duas cadeias pesadas que compreende cada uma um fragmento VHCH1-ligante peptídico-VHCH1. Em um aspecto particular, o ligante peptídico tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 148.
[0247] Em outro aspecto, é proporcionada uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que os domínios de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a um antígeno da célula alvo são fragmentos de Fab e em que o primeiro fragmento de Fab está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C da primeira subunidade do domínio Fc e o segundo fragmento de Fab está ligado através de um ligante peptídico ao terminal C da segunda subunidade do domínio Fc. Em um aspecto, os dois fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma específica ao antígeno da célula alvo são fragmentos de Fab de cruzamento que compreende cada um uma cadeia VL-CH1 e uma cadeia VH-CL, e em que a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas.
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123/387 [0248] Em um aspecto particular, a invenção fornece uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende quatro cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 86, duas cadeias leves, cada uma que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 87, e dois cadeias pesadas que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 85.
[0249] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, murino que compreende quatro cadeias leves, cada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 100, duas cadeias leves, que compreende cada uma a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 99, e duas cadeias pesadas que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 98.
Modificações do domínio Fc reduzindo a ligação ao receptor Fc e/ ou a FUNÇÃO EFETORA.
[0250] As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção compreendem ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0251] Em certos aspectos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo aqui proporcionado, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc humana lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4) que compreende uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[0252] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis aos anticorpos biespecíficos da invenção, incluindo uma semi-vida longa no soro que contribui para uma boa acumulação no tecido alvo e uma
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124/387 razão de distribuição tecido-sangue favorável. Ao mesmo tempo pode, no entanto, conduzir a direcionamento indesejável dos anticorpos biespecíficos da invenção para células que expressam receptores Fc em vez de para as células portadoras de antígeno preferidas. Consequentemente, em formas de realização particulares, o domínio Fc dos anticorpos biespecíficos da invenção exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc IgG nativo, em particular um domínio Fc de lgG1 ou um domínio Fc de lgG4. Mais em particular, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 1.
[0253] Em um tal aspecto, o domínio FC (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende o referido domínio Fc) exibe menos de 50%, de forma preferencial menos de 20%, de forma mais preferencial menos de 10% e de forma mais preferencial menos de 5% de afinidade para um receptor Fc, em comparação com um domínio Fc lgG1 nativo (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende um domínio Fc lgG1 nativo) e/ ou inferior a 50%, de forma preferida inferior a 20%, de forma mais preferida inferior a 10% e, de forma muito preferida, menos de 5% da função efetora, em comparação com um domínio Fc IgG 1 nativo (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende um domínio Fc lgG1 nativo). Em um aspecto, o domínio FC (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ ou induz a função efetora. Em um aspecto particular, o receptor Fc é um receptor Fc. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy ativador humano, de forma mais específica FcyRllla, FcyRI ou FcyRlla humano, de forma mais específica FcyRllla humana. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc inibitório.
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Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fc humano inibidor, de forma mais específica FcyRIIB humano. Em um aspecto, a função efetora é uma ou mais das secreções de CDC, ADCC, ADCP e citocina. Em um aspecto particular, a função efetora é ADCC. Em um aspecto, o domínio do domínio Fc exibe afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação com um domínio Fc lgG1 nativo. É alcançada uma ligação substancialmente semelhante ao FcRn quando o domínio FC (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, em particular superior a cerca de 80%, com maior particularidade superior a cerca de 90% do afinidade de ligação de um domínio lgG1 Fc nativo (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende um domínio lgG1 Fc nativo) a FcRn.
[0254] Em um aspecto particular, o domínio Fc é modificado para ter uma afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, quando comparado com um domínio Fc não modificado. Em um aspecto particular, o domínio Fc da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ ou função efetora. De forma comum, a mesma mutação de um ou mais aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um aspecto, a mutação de aminoácido reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc. Em outro aspecto, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em um aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende um domínio Fc manipulado apresenta menos de 20%, em particular menos de 10%, com maior particularidade menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc
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126/387 em comparação com anticorpos biespecíficos da invenção que compreende um domínio Fc não modificado. Em um aspecto particular, o receptor Fc é um receptor Fc. Em outros aspectos, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc inibitório. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fc humano inibidor, de forma mais específica FcyRIIB humano. Em alguns aspectos, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy ativador humano, de forma mais específica FcyRllla, FcyRI ou FcyRlla humano, de forma mais específica FcyRllla humana. De preferência, a ligação a cada um destes receptores é reduzida. Em alguns aspectos, a afinidade de ligação a um componente do complemento, de forma específica afinidade de ligação a C1q, também é reduzida. Em um aspecto, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não é reduzida. A ligação substancialmente semelhante ao FcRn, ou seja preservação da afinidade de ligação do domínio Fc ao referido receptor, é alcançada quando o domínio FC (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% da ligação afinidade de uma forma não modificada do domínio FC (ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende a referida forma não modificada do domínio Fc) a FcRn. O domínio Fc, ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que compreende o referido domínio Fc, pode exibir mais do que cerca de 80% e até mais do que cerca de 90% dessa afinidade. Em certas formas de realização, o domínio Fc da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção engatada para ter uma função efetora reduzida, quando comparada com um domínio Fc não modificado. A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade reduzida dependente do complemento (CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) reduzida, fagocitose
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127/387 celular dependente de anticorpo reduzida (ADCP), reduzida secreção de citocina, redução da captação de antígeno mediada pelo complexo imune por células que apresentam o antígeno, redução da ligação a células NK, redução da ligação a macrófagos, redução da ligação a monócitos, redução da ligação a células polimorfonucleares, diminuição da sinalização direta induzindo apoptose, redução da maturação de células dendríticas ou priming de células T reduzido.
[0255] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente U.S. Ns 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US Ns 7,332,581). Certas variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída aos FcRs são descritas (por exemplo, Patente U.S. Ns 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields, R.L. et ai., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
[0256] Em um aspecto da invenção, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição de E233, L234, L235, N297, P331 e P329. Em alguns aspectos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (“LALA”). Em tal forma de realização, o domínio Fc um domínio Fc de lgG1, em particular um domínio Fc de lgG1 humano. Em um aspecto, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em um aspecto mais específico, a substituição de aminoácidos é P329A ou P329G, em particular P329G. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e uma outra substituição de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em formas de realização mais particulares, o domínio Fc compreende
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128/387 as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”). A combinação de substituições de aminoácidos “P329G LALA”, quase completamente, elimina a ligação ao receptor Fc de um domínio Fc lgG1 humano, como descrito no Pedido de Patente PCT NWO 2012/130831 A1. O referido documento descreve também métodos para preparar tais domínios Fc mutantes e métodos para determinar as suas propriedades, tais como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras. Esse anticorpo é uma lgG1 com as mutações L234A e L235A ou com as mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU et al., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
[0257] Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de lgG4. Em uma forma de realização mais específica, o domínio Fc um domínio Fc de lgG4 que compreende uma substituição de aminoácidos na posição S228 (numeração de Kabat), em particular a substituição de aminoácidos S228P. Em uma forma de realização mais específica, o domínio Fc um domínio Fc de lgG4 que compreende as substituições de aminoácidos L235E e S228P e P329G. Esta substituição de aminoácidos reduz a troca in vivo do braço Fab de anticorpos lgG4 (ver Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)).
[0258] Anticorpos com semi-vidas aumentadas e melhor ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer, RL etal., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, e Kim, JK et al., J. Immunol. 24 (1994)2429-2434), são descritos em US 2005/0014934. Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356,
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360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, a substituição do resíduo da região Fc 434 (Patente US Ns 7,371,826). Veja também Duncan, A.R. e Winter, G„ Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5,624,821; e WO 94/29351 relativa a outros exemplos de variantes da região Fc.
[0259] A ligação a receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) utilizando instrumentação padrão, tal como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores Fc, tais como podem ser obtidos por expressão recombinante. Um ensaio de ligação adequado aqui descrito. De forma alternativa, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou moléculas de ligação de antígeno biespecífico de ativação celular que compreende um domínio Fc para receptores Fc pode ser avaliada utilizando linhas celulares conhecidas por expressarem receptores Fc particulares, tais como células NK humanas expressando o receptor Fcyllla. A função efetora de um domínio Fc, ou moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção que compreende um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos no estado da técnica. Um ensaio adequado para medir ADCC é aqui descrito. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente U.S. Ns 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sei US A 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sei US A 82, 1499-1502 (1985); Patente U.S. Ns 5,821,337; Bruggemann et al. J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (ver, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI ™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural killer (NK). De forma alternativa, ou, de forma adicional, a atividade de ADCC da
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130/387 molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como o divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci US A 95, 652-656 (1998).
[0260] A seção seguinte descreve aspectos preferidos das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção que compreende modificações do domínio Fc reduzindo a ligação ao receptor Fc e/ ou a função efetora. Em um aspecto, a invenção refere-se molécula biespecífica de ligação ao antígeno (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo e c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo a um receptor Fc, em particular para o receptor Fc. Em outro aspecto, a invenção refere-se à molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a função efetora. Em particular, o domínio Fc é da subclasse lgG1 humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
Modificações do domínio Fc promovendo a heterodimerização.
[0261] As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção compreendem diferentes locais de ligação ao antígeno, fundidos a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, pelo que as duas
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131/387 subunidades do domínio Fc podem estar compreendidas em duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A co-expressão recombinante destes polipeptídeos e a dimerização subsequente conduz a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção na produção recombinante, será assim vantajoso introduzir no domínio Fc das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção uma modificação que promova a associação dos polipeptídeos desejados.
[0262] Por conseguinte, em aspectos particulares, a invenção refere-se à molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc. O local da interação proteína-proteína mais extensa entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humano está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um aspecto, a referida modificação está no domínio CH3 do domínio Fc.
[0263] Em um aspecto específico, a modificação é uma modificação chamada “knob-'mto-hole, que compreende uma modificação “knob em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação “hole na outra das duas subunidades do domínio Fc. Assim, a invenção refere-se à molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno celular alvo e (c)) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que
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132/387 a primeira subunidade do domínio Fc compreende maçanetas e a segunda subunidade do domínio Fc compreende furos de acordo com o método dos maçanetas em furos. Em um aspecto particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0264] A tecnologia de maçaneta no furo é descrita, por exemplo, na US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway eía/.f Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De forma geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“maçaneta”) na interface de um primeiro polipeptideo e uma cavidade correspondente (“buraco”) na interface de um segundo polipeptideo, de tal forma que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promovem a formação de heterodímeros e impedem a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptideo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptideo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por pequenas (por exemplo, alanina ou treonina).
[0265] Por conseguinte, em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro o domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um
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133/387 resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com um lado menor volume da cadeia, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável. A protuberância e cavidade podem ser feitas alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica do local, ou por síntese peptídica. Em um aspecto específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina em a posição 407 é substituída por um resíduo de valina (Y407V). Em um aspecto, na segunda subunidade do domínio Fc, de forma adicional, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A).
[0266] Ainda em um outro aspecto, na primeira subunidade do domínio Fc, de forma adicional, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C), e na segunda subunidade do domínio Fc, de forma adicional, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteina (Y349C). A introdução destes dois resíduos de cisteina resulta na formação de uma ponte dissulfureto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando, de forma adicional, o dímero (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). Em um aspecto particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
[0267] Em um aspecto alternativo, uma associação promotora de modificações da primeira e segunda subunidade do domínio Fc compreende
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134/387 uma modificação mediando efeitos de direção eletrostática, por exemplo, como descrito na publicação PCT WO 2009/089004. De forma geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados, de forma que a formação de homodímeros se torne eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização é eletrostaticamente favorável.
[0268] O terminal C da cadeia pesada do anticorpo biespecífico, tal como aqui relatado, pode ser uma terminação terminal C completa com os resíduos de aminoácidos PGK. O terminal C da cadeia pesada pode ser um terminal C encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido do terminal C foram removidos. Em um aspecto preferido, o terminal C da cadeia pesada uma terminação C encurtada que termina em PG. Em um aspecto de todos os aspectos como aqui relatado, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 terminal C, tal como aqui especificado, compreende o dipeptídeo glicina-lisina terminal C (G446 e K447, numerando de acordo com o índice de Kabat EU). Em uma forma de realização de todos os aspectos aqui descritos, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 terminal C, tal como aqui especificado, compreende um resíduo de glicina terminal C (G446, numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
Modificações nos domínios Fab.
[0269] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno celular alvo e (c) Domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que em um dos fragmentos de Fab os sítios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL são trocados. Os
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135/387 anticorpos biespecíficos são preparados de acordo com a tecnologia Crossmab.
[0270] Anticorpos multiespecíficos com uma substituição/ troca de domínios em um braço de ligação (CrossMabVH-VL ou CrossMabCH-CL) são descritos em detalhe no documento WO 2009/ 080252 e Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Eles claramente reduzem os subprodutos causados pelo desencontro de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada incorreta contra o segundo antígeno (comparado a abordagens sem essa troca de domínio).
[0271] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno celular alvo e (c) Domínio Fc composto de uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que em um dos fragmentos de Fab os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro de forma que o domínio CH1 seja parte da cadeia leve e o domínio CL seja parte da cadeia pesada. Mais em particular, no segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, os domínios constantes CL e CH1 são substituídos uns pelos outros de forma que o domínio CH1 seja parte da cadeia leve e o domínio CL seja parte da cadeia pesada.
[0272] Em um aspecto particular, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo, em que os domínios constantes CL e CH1 são substituídos uns pelos outros de forma que o domínio CH1 seja parte da cadeia leve e o domínio CL seja parte da cadeia pesada. Tal molécula é denominada
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136/387 molécula biespecífica de ligação ao antígeno monovalente.
[0273] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma específica ao CD40 e ao domínio Fc, e (b) dois Fab adicionais fragmentos capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo, em que os referidos fragmentos de Fab adicionais estão ligados, cada um, através de um ligante peptídico ao terminal C das cadeias pesadas de (a). Em um aspecto particular, os fragmentos de Fab adicionais são fragmentos de Fab, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro de forma que o domínio VH seja parte da cadeia leve e o domínio VL seja parte da cadeia pesada.
[0274] Assim, em um aspecto particular, a invenção compreende uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de ligação específica a CD40 e ao domínio Fc, e (b) dois fragmentos de Fab adicionais capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo, em que os referidos dois fragmentos de Fab adicionais capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo são fragmentos de Fab cruzados em que os domínios variáveis VL e VH estão substituídos um pelo outro e as cadeias VL-CH estão ligados por meio de um ligante peptídico ao terminal C das cadeias pesadas de (a).
[0275] Em outro aspecto, e para melhorar ainda mais o emparelhamento correto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) um segundo fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno de célula alvo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável,
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137/387 pode conter diferentes substituições de aminoácidos carregados (os chamados “resíduos carregados”). Estas modificações são introduzidas nos domínios CH1 e CL cruzados ou não cruzados. Em um aspecto particular, a invenção referese a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que em um dos domínios CL o aminoácido na posição 123 (numeração UE) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração UE) foi substituída por lisina (K) e em que em um dos domínios CH1 os aminoácidos na posição 147 (numeração UE) e na posição 213 (numeração UE) foram substituídos por ácido glutâmico (E).
Anticorpos exemplificativos da invenção [0276] Em um aspecto, a invenção fornece novos anticorpos e fragmentos de anticorpos que se ligam de forma específica ao CD40. Estes anticorpos têm propriedades superiores em comparação com os anticorpos CD40 conhecidos que os tornam especialmente adequados para a incorporação em moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que compreende outra porção de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo. Os novos anticorpos são ainda caracterizados por serem produzidos em grandes quantidades e com altos títulos, que apresentam alta estabilidade térmica (medida pela temperatura de agregação Tagg), ou por possuírem alto grau de humanidade e, portanto, podem ser menos imunogênicas no corpo humano. A porcentagem de humanidade das sequências VH e VL em comparação com as sequências da linha germinativa humana pode ser determinada pelos métodos descritos em Abhinandan, K. R. e Martin, Andrew C. R. 2007, J. Mol. Biol. 2007, 369, 852862. Os dados correspondentes são mostrados nas Tabelas 24 e 25.
[0277] Em um aspecto, é proporcionado um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende (i) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende
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138/387 uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, (ii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
177, (iii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
178, (iv) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
177, (v) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
178, (vi) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175 ou (vii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 178, ou (viii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende
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139/387 uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
175, ou (viii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 177, ou (ix) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
176,ou (x) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
175,ou (xi) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
176,ou (xii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
177,ou (xiii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
178,ou (xiv) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende
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140/387 uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 173 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 176, ou (xv) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 176.
[0278] Em outro aspecto, é proporcionado um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende qualquer região variável de cadeia pesada VH e uma região variável de cadeia leve VL de (i) a (xv) como definido anteriormente.
[0279] Em um aspecto, é proporcionado um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175.
[0280] Em um outro aspecto, é proporcionado um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende (i) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, (ii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 180 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185,
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141/387 (iii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 181 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185, (iv) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 172 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
185, (v) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns:
186, (vi) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 180 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (vii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 181 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (viii) uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 1182 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186.
[0281] Em outro aspecto, é proporcionado um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende qualquer uma da região variável de cadeia pesada VH e uma região variável de cadeia leve VL de (i) a
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142/387 (viii) como definido aqui antes.
[0282] Em um aspecto, é proporcionado um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185. Em particular, é proporcionado um anticorpo que se liga de forma específica a CD40, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 182 e uma região variável de cadeia leve VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185.
POLINUCLEOTÍDEOS [0283] A invenção proporciona ainda polinucleotídeos isolados que codificam uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como aqui descrito, ou um seu fragmento ou polinucleotídeos que codificam um anticorpo, como aqui descrito.
[0284] Os polinucleotídeos isolados que codificam moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica a molécula de ligação ao antígeno inteira ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar através, por exemplo, ligações dissulfureto ou outros meios para formar uma molécula funcional de ligação ao antígeno. Por exemplo, a porção da cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção da cadeia pesada da imunoglobulina. Quando co-expressos, os polipeptídeos da cadeia pesada irão associar-se aos polipeptídeos da cadeia leve para formar a imunoglobulina.
[0285] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica um
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143/387 polipeptídeo compreendido na molécula biespecífica de acordo com a invenção como aqui descrito.
[0286] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que codifica uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica para um antígeno celular alvo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
[0287] Em certas formas de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outras formas de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.
Métodos Recombinantes [0288] Moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção podem ser obtidas, por exemplo, por produção recombinante. Para a produção recombinante, é proporcionado um ou mais polinucleotídeos codificando a molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou seus fragmentos polipeptídicos. O um ou mais polinucleotídeos que codificam a molécula biespecífica de ligação ao antígeno são isolados e inseridos em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ ou expressão em uma célula hospedeira. Tal polinucleotídeo pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais. Em um aspecto da invenção, é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, que compreende um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Os métodos que são bem conhecidos dos peritos no assunto podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo a sequência de codificação da molécula biespecífica de ligação ao antígeno (fragmento) juntamente com sinais de controle de transcrição/ tradução
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144/387 apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinação in vivo/ recombinação genética. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); e Ausubel et al., PROTOCOLOS ATUAIS EM BIOLOGIA MOLECULAR, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989). O vetor de expressão pode fazer parte de um plasmídeo, vírus ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão em que o polinucleotídeo que codifica a molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou os seus fragmentos polipeptídicos (isto a região codificante) clonado em associação operável com um promotor e/ ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução. Como aqui utilizado, uma “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo promotores, locais de ligação ao ribossoma, terminadores de transcrição, introns, regiões 5’ e 3' não traduzidas e semelhantes, não fazem parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões codificadoras podem estar presentes em uma construção polinucleotídica única, por exemplo, em um único vetor ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificadora, ou pode compreender duas ou mais regiões codificadoras, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são separados pós ou co-translacionalmente nas proteínas finais via Clivagem proteolítica. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificadoras heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo que codifica a molécula
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145/387 biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos polipeptídicos, ou variantes ou seus derivados. As regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto génico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências reguladoras de modo a colocar a expressão do produto génico sob a influência ou controle da sequência reguladora (s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região codificante de polipeptídeo e um promotor associado com estes) estão “associados de forma operativa” se a indução da função promotora resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto génico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão para dirigir a expressão do produto génico ou interferir com a capacidade do molde de DNA para ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de células que dirija a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo estimuladores, operadores, repressores e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados ao polinucleotideo para dirigir a transcrição específica da célula.
[0289] Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são aqui divulgados. Uma variedade de regiões de controle da transcrição é conhecida pelos peritos no assunto. Estes incluem, sem limitação, regiões de controle da transcrição, que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitadas a, segmentos promotores e potenciadores de
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146/387 citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce) e retrovirus (como, por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como actina, proteína de choque térmico, hormona de crescimento bovina e â-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão genética em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e intensificadores específicos de tecido, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores de tetraciclinas indutíveis). Do mesmo modo, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida dos peritos no assunto. Estes incluem, mas não estão limitados a locais de ligação de ribossoma, códons de iniciação e terminação de tradução e elementos derivados de sistemas virais (em particular um local de entrada de ribossoma interno, ou IRES, também referido como uma sequência de CITE). O cassete de expressão pode também incluir outras características, tais como uma origem de replicação e/ ou elementos de integração do cromossoma, tais como repetições terminais longas retrovirais (LTRs), ou repetições terminais invertidas adeno-associadas (AAV) (ITRs).
[0290] As regiões de codificação polinucleotídica e de ácido nucleico da presente invenção podem estar associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos secretórios ou de sinalização, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se se desejar a secreção da molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou dos seus fragmentos polipeptídicos, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico que codifica a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos polipeptídicos. De acordo com a hipótese do sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um
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147/387 peptídeo sinal ou sequência líder de secreção que é clivada da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia proteica em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso tenha sido iniciada. Os peritos no assunto sabem que os polipeptídeos segregados pelas células dos vertebrados têm de forma geral um peptídeo de sinal fundido com o terminal N do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo traduzido para a produção de uma forma segregada ou “madura” do polipeptídeo. Em certas formas de realização, é utilizado o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um peptídeo sinal da cadeia pesada ou da cadeia pesada de imunoglobulina, ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de dirigir a secreção do polipeptídeo que está de forma operativa associado a ele. De forma alternativa, pode ser utilizado um peptídeo sinal de mamífero heterólogo, ou um seu derivado funcional. Por exemplo, a sequência ler do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência ler do ativador do plasminogênio tecidual humano (TPA) ou da β-glucuronidase do camundongo.
[0291] O DNA que codifica uma sequência proteica curta que pode ser utilizada para facilitar purificação posterior (por exemplo, um marcador de histidina) ou auxiliar na marcação da proteína de fusão pode ser inclua nas extremidades do polinucleotídeo que codifica uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou os seus fragmentos polipeptídicos.
[0292] Em um outro aspecto da invenção, é proporcionada uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em certos aspectos, é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar quaisquer das características, isoladamente ou em combinação, aqui descritas em relação a polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em um aspecto, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica
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148/387 (parte de) uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção da invenção. Como aqui utilizado, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulado para gerar as proteínas de fusão da invenção ou seus fragmentos. As células hospedeiras adequadas para replicação e para suportar a expressão de moléculas de ligação ao antígeno são bem conhecidas na técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas conforme apropriado com o vetor de expressão particular e podem ser cultivadas grandes quantidades de células contendo vetor para a sementeira de fermentadores de larga escala para obter quantidades suficientes da molécula de ligação ao antígeno para aplicações cíclicas. Células hospedeiras adequadas incluem microrganismos procarióticos, tais como E. coli, ou vias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chin (CHO), células de inseto ou semelhantes. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias em particular quando a glicosilação não é necessária. Após expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda purificado. Além dos procariotas, os micróbios eucariotas, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificadores de polipeptídeos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação totalmente humano. Ver Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), e Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).
[0293] As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) são também derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas numerosas estirpes baculovirais que podem ser utilizadas em conjunto com
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149/387 células de inseto, em particular para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiras. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (descrevendo a tecnologia
PLANTICORPOS™ para produzir anticorpos em plantas transgênicas). Células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhas de células de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293T como descrito, por exemplo, em Graham et al., J.G. Virol 36, 59 (1977)), células de rim de hamster beb (BHK), células de sertulo de camundongo (células TM4 como descrito, por exemplo, em Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células de fado de rato de balo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de fado humano (Hep G2), células tumorais mamárias de camundongo (MMT 060562), células TRI (como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals NY Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 e células FS4. Outras linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chin (CHO), incluindo células dhfr-CHO (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sei US A 77, 4216 (1980)); e linhas celulares de mieloma, tais como YO, NS0, P3X63 e Sp2/ 0. Para uma revisão de certas linhas celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteínas, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Pressão, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos, células de levedura, células de inseto, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas
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150/387 alguns, mas também células compreendidas dentro de um animal transgénico, planta transgénica ou tecido vegetal ou animal cultivado. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de forma preferida, uma célula de mamífero, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), uma célula de rim embrionário humano (HEK) ou uma célula linfóide (por exemplo, Y0, NSO, Sp20 célula). As tecnologias padrão são conhecidas na técnica para expressar genes estranhos nestes sistemas. As células que expressam um polipeptídeo que compreende a cadeia pesada ou leve de uma imunoglobulina, podem ser manipuladas de modo a também expressar a outra das cadeias de imunoglobulina, de tal forma que o produto expresso é uma imunoglobulina que possui uma cadeia pesada e uma leve.
[0294] Em um aspecto, proporciona-se um método de produção de uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou dos seus fragmentos polipeptídicos, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira que compreende polinucleotídeos codificando a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos polipeptídicos, como aqui proporcionado, sob condições adequadas para expressão da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos polipeptídicos, e recuperação da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos polipeptídicos da célula hospedeira (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[0295]As moléculas biespecíficas da invenção preparadas como aqui descrito podem ser purificadas por técnicas conhecidas na técnica, tais como cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho e semelhantes. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores, tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade, etc., e serão evidentes
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151/387 para os peritos no assunto. Para purificação por cromatografia por afinidade, pode ser utilizado um anticorpo, ligando, receptor ou antígeno ao qual a molécula biespecífica de ligação ao antígeno se liga. Por exemplo, para purificação por cromatografia de afinidade de proteínas de fusão da invenção, pode ser utilizada uma matriz com proteína A ou proteína G. A cromatografia sequencial de Proteína A ou G por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular pode ser utilizada para isolar uma molécula de ligação ao antígeno essencialmente como descrito nos exemplos. A pureza da molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou seus fragmentos pode ser determinada por qualquer um de uma variedade de métodos analíticos bem conhecidos, incluindo eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão e semelhantes. Por exemplo, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno expressas como descrito nos Exemplos mostraram-se intactas e adequadamente montadas, como demonstrado por SDS-PAGE redutor e não redutor.
Ensaios [0296] As moléculas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas podem ser caracterizadas quanto suas propriedades de ligação e/ ou atividade biológica por diversos ensaios conhecidos na técnica. Em particular, eles são caracterizados pelos ensaios descritos em mais detalhe nos exemplos.
1. Ensaio de ligação [0297] A ligação da molécula biespecífica de ligação ao antígeno aqui proporcionada correspondentes às células que expressam o alvo podem ser avaliadas, por exemplo, utilizando uma linha celular murina de fibroblastos que expressam a análise da Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP) e citometria de fluxo (FACS). A ligação das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas ao CD40 pode ser determinada utilizando células Raji como descrito no Exemplo 4.2.8.
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2. Ensaios de atividade [0298] As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção são testadas quanto à atividade biológica. A atividade biológica pode incluir eficácia e especificidade das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno. A eficácia e especificidade são demonstradas por ensaios que mostram sinalização agonista através do receptor CD40 após ligação do antígeno alvo. Além disso, realizam-se ensaios de iniciação de células T in vitro utilizando células dendríticas (DCs) que foram incubadas com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno.
Composições Farmacêuticas, Formulações e Vias de Administração [0299] Em um outro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreende qualquer uma das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, tal como descrito abaixo.
[0300] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno dissolvidas ou dispersas em um excipiente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmacêutica ou farmacologicamente aceitável” referem-se a entidades moleculares e composições que são de forma geral não tóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, isto é, não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação inconveniente quando administrada a um
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153/387 animal, tal como por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contenha pelo menos uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será conhecida pelos peritos no assunto luz da presente invenção, como exemplificado por Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18 Ed. Mack Printing Company, 1990, aqui incorporada por referência. Em particular, as composições são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Como aqui utilizado, “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, sais, estabilizadores e combinações destes, tal como ser conhecido por um técnico no assunto.
[0301] As composições parenterais incluem aquelas concebidas para administração por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial intramuscular, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, de forma preferencial em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ ou dispersão. De forma alternativa, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água isenta de pirogênios estéreis, antes da utilização. As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando as moléculas de ligação ao antígeno da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados abaixo, conforme necessário. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por
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154/387 filtração através de membranas de filtração estéreis. De forma geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem sob vácuo ou secagem por congelação que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma forma previamente esterilizada em meio líquido filtrado do mesmo. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido deve ser primeiro isotônico antes da injeção com solução salina ou glucose suficientes. A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e preservada contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos. Será apreciado que a contaminação com endotoxina deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, inferior a 0,5 ng/ mg de proteína. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;
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155/387 contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metílicos (por exemplo, complexos de proteína-Zn); e/ ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). As suspensões aquosas para injeção podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano ou semelhantes. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas, de forma adicional, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como grampos de etilo ou triglicerídeos, ou lipossomas.
[0302] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição coloidal de fármacos (por exemplo, lipossomas, albumina microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed. Mack Printing Company, 1990). Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Em formas de realização particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser alcançada pela utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.
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156/387 [0303] Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis aqui incluídos incluem agentes de dispersão de drogas intersticial, tais como glicoproteínas de hialuronidase neutras ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase solúveis em PH-20 humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de sHASEGPs e modos de utilização, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patente US Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
[0304] Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados são descritos na patente US Ns 6.267.958. Formulações aquosas de anticorpo incluem as descritas na Patente US Ns 6.171.586 e no WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.
[0305] Além das composições descritas anteriormente, as moléculas de ligação ao antígeno podem também ser formuladas como uma preparação de depósito. Tais formulações de atuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, as proteínas de fusão podem ser formuladas com materiais de polímero ou hidrofílicos adequados (por exemplo como emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados pouco soleis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.
[0306] Composições farmacêuticas que compreende as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção podem ser fabricadas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais transportadores, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis
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157/387 que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.
[0307] As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno podem ser formuladas em uma composição em uma forma livre de ácido ou base, neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico ou ácido mandélico. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico; ou bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos do que as correspondentes formas de base livre.
[0308] A composição aqui também pode conter mais do que um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente uns aos outros. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.
[0309] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são de forma geral estéreis. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Métodos terapêuticos e composições [0310] Qualquer uma das moléculas biespecíficas de ligação ao
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158/387 antígeno aqui proporcionadas pode ser utilizada em métodos terapêuticos. Para uso em modos terapêuticos, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção podem ser formuladas, doseadas e administradas de um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico do doente individual, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o agendamento da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos.
[0311] Em um aspecto, as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção para uso como um medicamento são proporcionadas.
[0312] Em outros aspectos, moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção para uso (i) na indução de estimulação imunológica por células que apresentam o antígenos CD40 + (APC), (ii) na estimulação da resposta de células T específicas de tumor, (iii) na causa de apoptose de tumor células, (iv) no tratamento de câncer, (v) no retardamento da progressão do câncer, (vi) no prolongamento da sobrevivência de um doente que sofre de câncer, (vii) no tratamento de infecções proporcionadas. Em um aspecto particular, são proporcionadas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção para uso no tratamento de uma doença, em particular para uso no tratamento de câncer.
[0313] Em certos aspectos, são proporcionadas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção para uso em um método de tratamento. Em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, tal como aqui descrita, para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo que dela necessite. Em certos aspectos, a invenção proporciona uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno para uso em um método de tratamento de um indivíduo possuindo uma doença que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente
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159/387 eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é o câncer. O sujeito, paciente ou “indivíduo” necessitado de tratamento é de forma comum um mamífero, de forma mais específica um humano.
[0314] Em um aspecto, é fornecido um método para i) induzir estimulação imunológica por células que apresentam o antígeno CD40 + (APCs), (ii) estimular a resposta de células T específicas de tumor, (iii) causar apoptose de células tumorais, (iv) tratar câncer (v) retardar a progressão do câncer, (vi) prolongar a sobrevivência de um doente que sofra de câncer ou (vii) tratar infecções, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0315] Em um outro aspecto, a invenção proporciona a uso da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção na fabricação ou preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo que dela necessite. Em um aspecto, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma doença que compreende administrar a um indivíduo tendo a doença uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, em particular o câncer. Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer de endométrio, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de sangue, câncer de pele, carcinoma de células escamosas, câncer ósseo e câncer renal. Outros exemplos de câncer incluem carcinoma, linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Outros distúrbios de proliferação celular que
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160/387 podem ser tratados utilizando a molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou anticorpo da invenção incluem, mas não se limitam a neoplasmas localizadas em: abdome, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas, (adrenal, paratireóide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireóide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, partes moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também estão incluídas condições ou lesões précancerígenas e metástases de câncer. Em certas formas de realização, o câncer é escolhido do grupo que consiste em câncer das células renais, câncer da pele, câncer do pulmão, câncer colorretal, câncer da mama, câncer do cérebro, câncer da cabeça e pescoço. Um técnico no assunto reconhece prontamente que, em muitos casos, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou o anticorpo da invenção podem não proporcionar uma cura, mas podem proporcionar um benefício. Em alguns aspectos, uma mudança fisiológica com algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Assim, em alguns aspectos, uma quantidade da molécula ou anticorpo biespecífico de ligação ao antígeno da invenção que proporciona uma alteração fisiológica é considerada uma “quantidade eficaz” ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz”.
[0316] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção (quando utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da via de administração, do peso corporal do paciente, da molécula específica, da gravidade e do curso da doença, se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é administrada para fins preventivos ou terapêuticos propósitos, intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, a história clínica do paciente e a resposta à molécula biespecífica de ligação ao antígeno,
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161/387 e a discrição do médico assistente. O médico responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a concentração do (s) ingrediente (s) ativo (s) em uma composição e dose (s) apropriada (s) para o sujeito individual. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração de bolus e infusão de pulso são aqui contemplados.
[0317] A molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção é adequadamente administrada ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/ kg a 15 mg/ kg (por exemplo, 0,1 mg/ kg - 10 mg/ kg) da molécula biespecífica de ligação ao antígeno pode ser uma dosagem inicial candidata para administração à paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar de cerca de 1 pg/ kg a 100 mg/ kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria de forma geral mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplificativa da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção estaria na faixa de cerca de 0,005 mg/ kg a cerca de 10 mg/ kg. Em outros exemplos, uma dose também pode compreender cerca de 1 pg/ kg de peso corporal, cerca de 5 pg/ kg de peso corporal, cerca de 10 pg/ kg de peso corporal, cerca de 50 pg/ kg de peso corporal, cerca de 100 pg/ kg de peso corporal, cerca de 200 pg/ kg de peso corporal, cerca de 350 pg/ kg de peso corporal, cerca de 500 pg/ kg de peso corporal, cerca de 1 mg/ kg de peso corporal, cerca de 5 mg/ kg de peso corporal, cerca de 10 mg/ kg de peso corporal, cerca de 50 mg/ kg de peso corporal, cerca de 100 mg/ kg de peso corporal, cerca de 200 mg/ kg de peso corporal, cerca de 350 mg/ kg de peso corporal, cerca de 500 mg/ kg de peso corporal, até cerca de 1000 mg/ kg de
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162/387 peso corporal ou mais por administração e qualquer intervalo derivável. Em exemplos de um intervalo derivável dos números aqui listados, uma faixa de cerca de 0,1 mg/ kg de peso corporal a cerca de 20 mg/ kg de peso corporal, cerca de 5 pg/ kg de peso corporal a cerca de 1 mg/ kg de peso corporal, etc. ser administrado, com base nos números descritos acima. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/ kg, 2,0 mg/ kg, 5,0 mg/ kg ou 10 mg/ kg (ou qualquer sua combinação) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, tal que o doente recebe de cerca de dois a cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses da proteína de fusão). Em um aspecto particular, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno será administrada a cada três semanas. Uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses menores, pode ser administrada. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[0318] A molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção será de forma geral utilizada em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Para uso para tratar ou prevenir um estado patológico, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção, ou suas composições farmacêuticas, administrada ou aplicada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro das capacidades dos peritos no assunto, especialmente à luz da descrição detalhada aqui proporcionada. Para administração sistêmica, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro, tais como ensaios de cultura de células. Uma dose pode então ser formulada em modelos animais para alcançar um intervalo de concentração circulante que inclui o IC50 como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis
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163/387 em seres humanos. As dosagens iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Um técnico no assunto pode prontamente otimizar a administração para humanos com base em dados de animais.
[0319] A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis no plasma da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção que sejam suficientes para manter o efeito terapêutico. Dosagens usuais para administração por injeção variam entre cerca de 0,1 e 50 mg/ kg/ dia, de forma comum entre cerca de 0,1 e 1 mg/ kg/ dia. Níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes podem ser alcançados pela administração de múltiplas doses por dia. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por HPLC. Em casos de administração local ou captação seletiva, a concentração local eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou anticorpo da invenção pode não estar relacionada com a concentração no plasma. Um técnico no assunto será capaz de otimizar dosagens locais eficazes terapeuticamente sem experimentação indevida.
[0320] Uma dose terapeuticamente eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção aqui descrita proporcionará de forma geral benefício terapêutico sem causar toxicidade substancial. A toxicidade e a eficácia terapêutica de uma proteína de fusão podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em cultura de células ou animais experimentais. Ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados para determinar a LD50 (a dose letal para 50% de uma população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% de uma população). A proporção da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão LD50/ ED50. São preferidas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que exibem grandes índices terapêuticos. Em um aspecto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno
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164/387 ou o anticorpo da invenção exibe um elevado índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagens adequadas para uso em seres humanos. A dosagem está de forma preferencial dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, a forma de dosagem utilizada, a via de administração utilizada, a condição do sujeito e semelhantes. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo mico individual tendo em vista a condição do doente (ver, por exemplo, Fingí et al., 1975, em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cap. 1, p. 1, aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[0321] O médico assistente para pacientes tratados com proteínas de fusão da invenção sabería como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido a toxicidade, disfunção orgânica e semelhantes. Por outro lado, o médico assistente também sabería ajustar o tratamento para níveis mais altos se a resposta clínica não fosse adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada na gestão do distúrbio de interesse variará com a gravidade da condição a ser tratada, com a via de administração e semelhantes. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos padrão de avaliação prognostica. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose também variam de acordo com a idade, peso corporal e resposta do paciente individual.
Outros agentes e tratamentos [0322] A molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção pode ser administrada em combinação com um ou mais outros agentes em terapia. Por exemplo, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou o anticorpo da invenção da invenção podem ser co-administrados com pelo
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165/387 menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” abrange qualquer agente que possa ser administrado para o tratamento de um sintoma ou doença em um indivíduo que necessite de tal tratamento. Esse agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não se afetem adversamente uns aos outros. Em certas formas de realização, um agente terapêutico adicional é outro agente anticancerígeno, por exemplo, um disruptor de microtúbulos, um antimetabólito, um inibidor da topoisomerase, um intercalador de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor da cinase, um antagonista do receptor, um ativador de apoptose de células tumorais, ou um agente antiangiogênico. Em certos aspectos, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor da adesão celular, um agente citotóxico ou citostático, um ativador da apoptose celular ou um agente que aumenta a sensibilidade das células a indutores apoptóticos.
[0323] Assim, desde que sejam moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção ou composições farmacêuticas que as compreende para uso no tratamento de câncer, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é administrada em combinação com um agente quimioterapêutico, radiação e/ ou outros agentes para uso em imunoterapia de câncer.
[0324] Esses outros agentes estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz de tais outros agentes dependem da quantidade de proteína de fusão utilizada, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou o anticorpo da invenção são de forma geral utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração como aqui descrito, ou cerca de 1 a 99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja
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166/387 empiricamente/ clinicamente determinado a ser apropriado.
[0325] Tais terapias de combinação acima referidas abrangem administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas composições ou em composições separadas) e administração separada, caso em que, a administração da molécula biespecífica de ligação ao antígeno ou anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente, e/ ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ ou adjuvante.
Artigos de Fabricação [0326] Em outro aspecto da invenção, é proporcionado um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa é perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção.
[0327] O rótulo ou folheto informativo indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um outro agente
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167/387 citotico ou de outro método terapêutico. O artigo de fabricação nesta forma de realização da invenção pode ainda compreender um folheto informativo indicando que as composições podem ser utilizadas para o tratamento de uma condição particular.
[0328] De forma alternativa, ou, de forma adicional, o artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Tabela C(Sequências):
SEQ ID Ne: Nome Sequência
1 hu CD40 UniProt Ns P25942, versão 200 MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
2 hu FAP UniProt Ns Q12884, versão 168 MKTWVKIVFG VATSAVLALL VMCIVLRPSR VHNSEENTMR ALTLKDILNG TFSYKTFFPN WISGQEYLHQ SDNANIVLYN IETGQSYTIL SNRTMKSVNA SNYGLSPDRQ FVYLESDYSK LWRYSYTATY YIYDLSNGEF VRGNELPRPI QYLCWSPVGS KLAYVYQNNI YLKQRPGDPP FQITFNGREN KIFNGIPDWV YEEEMLATKY ALWWSPNGKF LAYAEFNDTD IPVIAYSYYG DEQYPRTINI PYPKAGAKNP VVRIFIIDTT YPAYVGPQEV PVPAMIASSD YYFSWLTWVT DERVCLQWLK RVQNVSVLSI CDFREDWQTW DCPKTQEHIE ESRTGWAGGF FVSTPVFSYD AISYYKIFSD KDGYKHIHYI KDTVENAIQI TSGKWEAINI FRVTQDSLFY SSNEFEEYPG RRNIYRISIG SYPPSKKCVT CHLRKERCQY YTASFSDYAK YYALVCYGPG IPISTLHDGR TDQEIKILEE NKELENALKN IQLPKEEIKK LEVDEITLWY KMILPPQFDR SKKYPLLIQV YGGPCSQSVR SVFAVNWISY LASKEGMVIA LVDGRGTAFQ GDKLLYAVYR KLGVYEVEDQ ITAVRKFIEM
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
GFIDEKRIAI WGWSYGGYVS SLALASGTGL FKCGIAVAPV SSWEYYASVY TERFMGLPTK DDNLEHYKNS TVMARAEYFR NVDYLLIHGT ADDNVHFQNS AQIAKALVNA QVDFQAMWYS DQNHGLSGLS TNHLYTHMTH FLKQCFSLSD
3 FAP (28H1) CDR-H1 SHAMS
4 FAP (28H1) CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
5 FAP (28H1) CDR-H3 GWLGNFDY
6 FAP (28H1) CDR-L1 RASQSVSRSYLA
7 FAP (28H1) CDR-L2 GASTRAT
8 FAP (28H1) CDR-L3 QQGQVIPPT
9 FAP (28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQ YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVS S
10 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS RSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQVIPPTFGQGTKVEIK
11 FAP(4B9) CDR-H1 SYAMS
12 FAP(4B9) CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
13 FAP(4B9) CDR-H3 GWFGGFNY
14 FAP(4B9) CDR-L1 RASQSVTSSYLA
15 FAP(4B9) CDR-L2 VGSRRAT
16 FAP(4B9) CDR-L3 QQGIMLPPT
17 FAP(4B9) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVS S
18 FAP(4B9) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVT SSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK
19 hu CD40 CDR-H1 GYYIH
20 hu CD40 CDR-H2 RVIPNAGGTSYNQKFKG
21 hu CD40 CDR-H3 EGIYW
22 hu CD40 CDR-L1 RSSQSLVHSNGNTFLH
23 hu CD40 CDR-L2 TVSNRFS
24 hu CD40 CDR-L3 SQTTHVPWT
25 hu CD40 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSF TGYYIHWVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGT SYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLR AEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSS
26 hu CD40 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLV HSNGNTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNR
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
FSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIK
27 mu CD40 CDR-H1 DYYMA
28 mu CD40 CDR-H2 SISYDGSSTYYRDSVKG
29 mu CD40 CDR-H3 HSSYFDY
30 mu CD40 CDR-L1 ASDSVSTLMH
31 mu CD40 CDR-L2 LASHLES
32 mu CD40 CDR-L3 QQSWNDPWT
33 mu CD40 VH EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTF SDYYMAWVRQAPTKGLEWVASISYDGSST YYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRS EDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTVSS
34 mu CD40 VL DTVLTQSPALAVSPGERVTISCRASDSVST LMHWYQQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPA RFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYYCQQ SWNDPWTFGGGTKLELK
35 hu CD40 CDR-H1 longo GYSFTGYYIH
36 hu CD40 CDR-H2 (hVH_1, hVH_2) RVIPNNGGTSYNQKFKG
37 hu CD40 CDR-H2 (hVH_3) RVIPNAGGTSYNQKFKG
38 hu CD40 CDR-H2 (hVH_4) RVIPQAGGTSYNQKFKG
39 hu CD40 CDR-H2 (hVH_5) RVIPNNGGTSYNQKFQG
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
40 hu CD40 CDR-H2 (hVH_6) RVIPNNGGTSYAQKFKG
41 hu CD40 CDR-H2 (hVH_7) RVIPNNGGTSYAQKFQG
42 hu CD40 CDR-H2 (hVH_5_N288A) RVIPNAGGTSYNQKFQG
43 hu CD40 CDR-H2 (hVH_6_N288A) RVIPNAGGTSYAQKFKG
44 hu CD40 CDR-H2 (hVH_7_N288A) RVIPNAGGTSYAQKFQG
45 hu CD40 hVH_1 ver tabela 14
46 hu CD40 hVH_2 ver tabela 14
47 hu CD40 hVH_3 ver tabela 14
48 hu CD40 hVH_4 ver tabela 14
49 hu CD40 hVH_5 ver tabela 14
50 hu CD40 hVH_6 ver tabela 14
51 hu CD40 hVH_7 ver tabela 14
52 hu CD40 hVH_2_N288A ver tabela 14
53 hu CD40 hVH_5_N288A ver tabela 14
54 hu CD40 hVH_6_N288A ver tabela 14
55 hu CD40 hVH_7_N288A ver tabela 14
56 hu CD40 hVK_1 ver tabela 15
57 hu CD40 hVK_2 ver tabela 15
58 hu CD40 hVK_3 ver tabela 15
59 hu CD40 hVK_4 ver tabela 15
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
60 hu CD40 hVK_5 ver tabela 15
61 hu CD40 hVK_6 ver tabela 15
62 hu CD40 hVK_7 ver tabela 15
63 hu CD40 hVK_8 ver tabela 15
64 hu CD40 hVK_9 ver tabela 15
65 DP47-CDR H1 SYAMS
66 DP47-CDR H2 AISGSGGSTYYADSVKG
67 DP47-CDR H3 GSGFDY
68 DP47-CDR L1 RASQSVSSSYLA
69 DP47-CDR L2 GASSRAT
70 DP47-CDR L3 QQYGSSPLT
71 DP47 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS
72 DP47 VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QYGSSPLTFGQGTKVEIK
73 hu CD40 VH (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
74 hu CD40 VL (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
75 FAP 28H1 VH (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
76 FAP 28H1 VL (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
77 DP47 VH (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
78 DP47 VL (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
79 mu CD40 VH (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
80 mu CD40 VL (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 2
81 CD40 IgG cadeia pesada ver tabela 3
82 CD40 cadeia leve ver tabela 3
83 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1 -Fck/?ob_PGLALA -28H1 VH ver tabela 3
84 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1 -Fc/?o/e_PGLALA- 28H1 VL ver tabela 3
85 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA- 28H1 VLCH1 EE ver tabela 3
86 CD40 cadeia leve RK ver tabela 3
87 28H1 VHCL ver tabela 3
88 huCD40_Fc/?ote_PGLALA _28H1 VL ver tabela 3
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
89 huCD40_Fck/?ob_PGLAL A_28H1 VH ver tabela 3
90 huCD40- Fc_PGLALA_28H1_VLCH 1 EE ver tabela 3
91 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1 -Fck/?ob_PGLALA- DP47 VH ver tabela 3
92 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1 -Fc/?o/e_PGLALA- DP47 VL ver tabela 3
93 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA- DP47 VLCH1 EE ver tabela 3
94 DP47VHCL ver tabela 3
95 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcKK DAPG -28H1 VH ver tabela 3
96 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcDD_DAPG -28H1 VL ver tabela 3
97 mu CD40 cadeia leve ver tabela 3
98 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- Fc_DAPG-28H1 VLCH1 ver tabela 3
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
99 28H1 VHCL (mu) ver tabela 3
100 mu CD40 cadeia leve;’ RK’ ver tabela 3
101 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcKK_DAPG-DP47 VH ver tabela 3
102 muCD40 VHCH1-mu CD40 VHCH1- FcDD_DAPG-DP47 VL ver tabela 3
103 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- Fc_DAPG-28H1 VLCH1 ver tabela 3
104 DP47 VHCL (mu) ver tabela 3
105 CD40 IgG cadeia pesada (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 4
106 CD40 cadeia leve (Sequência de nucleotídeo) ver tabela 4
107 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1 -Fck/?ob_PGLALA -28H1 VH ver tabela 4
108 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1 -Fc/?o/e_PGLALA- 28H1 VL ver tabela 4
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177/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
109 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA- 28H1 VLCH1 EE ver tabela 4
110 CD40 cadeia leve RK ver tabela 4
111 28H1 VHCL ver tabela 4
112 huCD40_Fc/?ote_PGLALA _28H1 VL ver tabela 4
113 huCD40_Fc k/?ob_PGLALA_28H1 VH ver tabela 4
114 huCD40- Fc_PGLALA_28H1_VLCH 1 EE ver tabela 4
115 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc knob_ PGLALA- DP47 VH ver tabela 4
116 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc /?ote_PGLALA- DP47 VL ver tabela 4
117 CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-Fc_PGLALA- DP47 VLCH1 EE ver tabela 4
118 DP47 VHCL ver tabela 4
119 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcKK DAPG -28H1 VH ver tabela 4
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
120 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcDD_DAPG -28H1 VL ver tabela 4
121 mu CD40 cadeia leve ver tabela 4
122 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- Fc_DAPG-28H1 VLCH1 ver tabela 4
123 28H1 VHCL (mu) ver tabela 4
124 mu CD40 cadeia leve;’ RK’ ver tabela 4
125 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcKK_DAPG-DP47 VH ver tabela 4
126 muCD40 VHCH1-mu CD40 VHCH1- FcDD_DAPG-DP47 VL ver tabela 4
127 muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- Fc_DAPG-28H1 VLCH1 ver tabela 4
128 DP47 VHCL (mu) ver tabela 4
129 CD40 (S2C6) VH EVQLQQSGPD LVKPGASVKI SCKASGYSFT GYYIHWVKQS HGKSLEWIGR VIPNNGGTSY NQKFKGKAIL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCAREG
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
IYWWGHGTTL TVSS
130 CD40 (S2C6) VL DVVVTQTPLS LPVSLGAQAS ISCRSSQSLV HSNGNTFLHW YLQKPGQSPK LLIYTVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQTTHVP WTFGGGTKLE IQ
131 hVH3_CD40 VHCH1- VHCH1-Fc k/?ob_PGLALA -4B9 VH ver tabela 27
132 hVH3_CD40 VHCH1- VHCH1-Fc /?ote_PGLALA- 4B9 VL ver tabela 27
133 hVK2_CD40 cadeia leve ver tabela 27
134 hVH3_CD40 VHCH1- Fc k/?ob_PGLALA -4B9 VH ver tabela 27
135 hVH3_CD40 VHCH1- Fc /?ote_PGLALA -4B9 VL ver tabela 27
136 hVH3_CD40-Fc knob _PGLALA_4B9_VLCH1’ EE’ ver tabela 27
137 hVK2_CD40 LC, RK’ ver tabela 27
138 4B9 VHCL ver tabela 27
139 hVH3_CD40-Fc /?ote_PGLALA’ EE’ ver tabela 27
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
140 hVH3_CD40-Fc /?ote_PGLALA’ EE’ ver tabela 27
141 4B9-Fc k/?ob_PGLALA ver tabela 27
142 hu FAP ectodomínio + poly-lys-tag + hise-tag RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKT FFPNWISGQEYLHQSDNANIVLYNIETGQS YTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLES DYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNEL PRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEML ATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAY SYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIID TTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLT WVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WQTW DC P KTQE ΗIE ES RTG W AGG FFVST PVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVE NAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFE EYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKER CQYYTASFSD YAKYYALVCYG PG IPISTLH DGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIK KLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQV YGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVI ALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVE DQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYV SSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASV YTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEY FRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALV
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
NAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYT HMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
143 camundongo FAP UniProt Ns P97321
144 Murino FAP ectodomínio + poly-lys-tag + hise-tag RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKT YFPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRES YIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLES DYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYEL PRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEML ATKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYS YYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIV DTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSWL TWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRE DWHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFV STPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDT VENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNE FEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCVTCHLR KERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPIS TLHDGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLP KVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQFDRSKKY PLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASK EGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYRKLGV YEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWS YGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWE YYASIYSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMA RAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIA
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182/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
KALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILSGRSQ NHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHH HHHH
145 Cynomolgus FAP ectodomínio + poly-lys-tag + his6-tag RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKT FFPNWISGQEYLHQSDNANIVLYNIETGQS YTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLES DYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNEL PRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEML ATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAY SYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPFVRIFIID TTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLT WVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WQTW DC P KTQE ΗIE ES RTG W AGG FFVST PVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVE NAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFE DYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKE RCQYYTASFSDYAKYYALVCYG PG IPISTL HDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEI KKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQ VYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMV IALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVE DQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYV SSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASV YTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEY FRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALV
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 473/744
183/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
NAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYT HMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
146 murino CD40 UniProt P27512, versão 160 MVSLPRLCAL WGCLLTAVHL GQCVTCSDKQ YLHDGQCCDL CQPGSRLTSH CTALEKTQCH PCDSGEFSAQ WNREIRCHQH RHCEPNQGLR VKKEGTAESD TVCTCKEGQH CTSKDCEACA QHTPCIPGFG VMEMATETTD TVCHPCPVGF FSNQSSLFEK CYPWTSCEDK NLEVLQKGTS QTNVICGLKS RMRALLVIPV VMGILITIFG VFLYIKKVVK KPKDNEILPP AARRQDPQEM EDYPGHNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQVT DSIALRPLV
147 Peptídeo ligante (G4S) GGGGS
148 Peptídeo ligante (G4S)2 GGGGSGGGGS
149 Peptídeo ligante (SG4)2 SGGGGSGGGG
150 Peptídeo ligante G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
151 peptídeo ligante GSPGSSSSGS
152 (G4S)3 peptídeo ligante GGGGSGGGGSGGGGS3
153 (G4S)4 peptídeo ligante GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 474/744
184/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
154 peptídeo ligante GSGSGSGS
155 peptídeo ligante GSGSGNGS
156 peptídeo ligante GGSGSGSG
157 peptídeo ligante GGSGSG
158 peptídeo ligante GGSG
159 peptídeo ligante GGSGNGSG
160 peptídeo ligante GGNGSGSG
161 peptídeo ligante GGNGSG
162 28H1 cadeia leve cruzado VHCL ver tabela 6
163 28H1 (VLCH1)_Fc knob_ PGLALA ver tabela 6
164 CD40 (VHCH1 carregado)_Fc hote_PGLALA ver tabela 6
165 CD40 cadeia leve (carregado) ver tabela 6
166 CD40 (VHCH1 carregado)_28H1 (VLCH1)_FC knob_ PGLALA ver tabela 6
167 CD40 (VHCH1 carregado)_Fc k/?ob_PGLALA_28H1 (VLCH1) ver tabela 6
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 475/744
185/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
168 CD40 (VHCH1 carregado)_Fc f?ote_PGLALA ver tabela 6
169 CD40 (VHCH1 carregado_CD40 (VHCH1 carregado)-Fc k/?ob_PGLALA_28H1 (VLCH1) ver tabela 6
170 CD40 (VHCH1 carregado_CD40 (VHCH1 carregado)-Fc f?ote_PGLALA ver tabela 6
171 VH1a (CD40) ver tabela 20
172 VH1b (CD40) ver tabela 20
173 VH1C(CD40) ver tabela 20
174 VH1d (CD40) ver tabela 20
175 VL1a(CD40) ver tabela 20
176 VL1b (CD40) ver tabela 20
177 VL1C(CD40) ver tabela 20
178 VL1d (CD40) ver tabela 20
179 VH2a (CD40) ver tabela 21
180 VH2b (CD40) ver tabela 21
181 VH2C(CD40) ver tabela 21
182 VH2d (CD40) ver tabela 21
183 VH2ab (CD40) ver tabela 21
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 476/744
186/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
184 VH2aC(CD40) ver tabela 21
185 VL2a (CD40) ver tabela 21
186 VL2b (CD40) ver tabela 21
187 VL2ab (CD40) ver tabela 21
188 VL2aC(CD40) ver tabela 21
189 P1AE0400 Cadeia pesada ver tabela 23
190 P1AE0400 cadeia leve ver tabela 23
191 P1AE0401 cadeia pesada ver tabela 23
192 P1AE0401 cadeia leve ver tabela 23
193 P1AE0402 cadeia pesada ver tabela 23
194 P1AE0402 cadeia leve ver tabela 23
195 P1AE0403 cadeia pesada ver tabela 23
196 P1AE0403 cadeia leve ver tabela 23
197 P1AE0404 cadeia pesada ver tabela 23
198 P1AE0404 cadeia leve ver tabela 23
199 P1AE0405 cadeia pesada ver tabela 23
200 P1AE0405 cadeia leve ver tabela 23
201 P1AE0406 cadeia pesada ver tabela 23
202 P1AE0406 cadeia leve ver tabela 23
203 P1AE0407 cadeia pesada ver tabela 23
204 P1AE0407 cadeia leve ver tabela 23
205 P1AE0817 cadeia pesada ver tabela 23
206 P1AE0817 cadeia leve ver tabela 23
207 P1AE0818 cadeia pesada ver tabela 23
208 P1AE0818 cadeia leve ver tabela 23
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 477/744
187/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
209 P1AE0819 cadeia pesada ver tabela 23
210 P1AE0819 cadeia leve ver tabela 23
211 P1AE0993 cadeia pesada ver tabela 23
212 P1AE0993 cadeia leve ver tabela 23
213 P1AE0996 cadeia pesada ver tabela 23
214 P1AE0996 cadeia leve ver tabela 23
215 P1AE0997 cadeia pesada ver tabela 23
216 P1AE0997 cadeia leve ver tabela 23
217 P1AE0998 cadeia pesada ver tabela 23
218 P1AE0998 cadeia leve ver tabela 23
219 P1AE0999 cadeia pesada ver tabela 23
220 P1AE0999 cadeia leve ver tabela 23
221 P1AE1000 cadeia pesada ver tabela 23
222 P1AE1000 cadeia leve ver tabela 23
223 P1AE1001 cadeia pesada ver tabela 23
224 P1AE1001 cadeia leve ver tabela 23
225 P1AE1002 cadeia pesada ver tabela 23
226 P1AE1002 cadeia leve ver tabela 23
227 P1AE1003 cadeia pesada ver tabela 23
228 P1AE1003 cadeia leve ver tabela 23
229 P1AE1004 cadeia pesada ver tabela 23
230 P1AE1004 cadeia leve ver tabela 23
231 P1AE1005 cadeia pesada ver tabela 23
232 P1AE1005 cadeia leve ver tabela 23
233 P1AE1006 cadeia pesada ver tabela 23
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 478/744
188/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
234 P1AE1006 cadeia leve ver tabela 23
235 P1AE1007 cadeia pesada ver tabela 23
236 P1AE1007 cadeia leve ver tabela 23
237 P1AE1125 cadeia pesada ver tabela 23
238 P1AE1125 cadeia leve ver tabela 23
239 P1AE1126 cadeia pesada ver tabela 23
240 P1AE1126 cadeia leve ver tabela 23
241 P1AE1135 cadeia pesada ver tabela 23
242 P1AE1135 cadeia leve ver tabela 23
243 VL2a (CD40) cadeia leve (carregado) ver tabela 28
244 VH2a (CD40) (VHCH1 carregado_VH2a (CD40) (VHCH1 carregado)-Fc k/?ob_PGLALA_28H1 (VLCH1) ver tabela 28
245 VH2a (CD40) (VHCH1 carregado_VH2a (CD40) (VHCH1 carregado)-Fc f?ote_PGLALA ver tabela 28
246 VH2d (CD40) (VHCH1 carregado_VH2d (CD40) (VHCH1 carregado)-Fc k/?ob_PGLALA_28H1 (VLCH1) ver tabela 28
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 479/744
189/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
247 VH2d (CD40) (VHCH1 carregado_VH2d (CD40) (VHCH1 carregado)-Fc hote_PGLALA ver tabela 28
248 VL1a (CD40) cadeia leve (carregado) ver tabela 28
249 VH1a (CD40) (VHCH1) _VH1a (CD40) (VHCH1) Fc knob_PGLALA_28H1 (VLCH1) (carregado) ver tabela 28
250 VH1a (CD40) (VHCH1) _VH1a (CD40) (VHCH1)Fc /?o/e_PGLALA (carregado) ver tabela 28
251 VH1a(CD40) (VHCH1) Fc k/?ob_PGLALA_28H1 (VLCH1) (carregado) ver tabela 28
252 VH1a(CD40) (VHCH1) Fc /?ote_PGLALA (carregado) ver tabela 28
253 VH1a(CD40) (VHCH1) Fc k/?ob_PGLALA_4B9 (VLCH1) (carregado) ver tabela 28
254 4B9 cadeia leve cruzado VLCH ver tabela 28
255 VH1a(CD40) (VHCH1) Fc ver tabela 28
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 480/744
190/387
SEQ ID Ne: Nome Sequência
k/?ob_PGLALA_4B9 (VHCL) (carregado)
256 VL1a (CD40) cadeia leve ver tabela 28
257 VH1a(CD40) (VHCH1) Fc k/?ob_PGLALA_4B9 (VHCL) ver tabela 28
258 VH1a(CD40) (VHCH1) Fc f?ote_PGLALA ver tabela 28
259 P1AE0816 cadeia pesada (controle) ver tabela 23
260 P1AE0816 cadeia leve (controle) ver tabela 23
261 hu CD40 CDR-H1 (VH2ab) GYYMH
262 hu CD40 CDR-H2 (VH2ab) RVIPNAGGTSYNQKFKG
263 hu CD40 CDR-H2 (VH2ac) RVIPNAGGTSYNQKVKG
264 hu CD40 CDR-L1 (VL2ab) RASQSLVHSNGNTFLH
265 hu CD40 CDR-L1 (VL2ac) RSSQSIVHSNGNTFLH
266 Hu_CD40_ECD_His_Avi EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVS DCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCH QHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEE GWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIAT GVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWT
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
SCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRG GGGSHHHHHHGSGLNDIFEAQKIEWHE
267 cyn o_C D40_EC D_H i s_Av i EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVS DCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCH QHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEE GLHCTSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIAT GVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWT SCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQR GGGGSHHHHHHGSGLNDIFEAQKIEWHE
268 Selicrelumab lgG2 cadeia pesada (controle) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSG GTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNR LRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVEC PPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTRFVVSVLTVVHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPG
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SEQ ID Ne: Nome Sequência
269 Selicrelumab lgG2 cadeia leve (controle) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIY SWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
[0329] Os seguintes parágrafos numerados (paras) descrevem aspectos da presente invenção de acordo com a primeira prioridade de aplicação:
1. Uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo;
2. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno do paras 1, de forma adicional, (c) uma região Fc composta por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
3. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de para 1 ou para 2, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, se liga a um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 1;
4. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um
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193/387 dos paras 1 a 3, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligação específica Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP);
5. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de para 1 ou para 2, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, se liga a um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 2;
6. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 5, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 3, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 4 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 5 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 6, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 7, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 8, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 11, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 12, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 13 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 14, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 15 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 16;
7. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um
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194/387 dos paras 1 a 6, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
8. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 7, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende: (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Ns: 19, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 20, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 21, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende: (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 22, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 23, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 24;
9. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 7, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma região variável de cadeia pesada
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195/387 (VHCD40) que compreende: (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Ns: 27, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 28, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 29, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende: (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 30, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 31, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 32;
10. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 9, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 26, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 33 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 34.
11. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 8, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende:
(i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46, SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID Ns: 55, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 5, SEQ ID Ns: 5, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60,
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SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64;
12. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 8 ou 11, em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 47 e uma VL que compreende o aminoácido sequência da SEQ ID Ns: 57;
13. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 8, que compreende (i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 25, SEQ ID Ns: 45, SEQ ID Ns: 46, SEQ ID Ns: 47, SEQ ID Ns: 48, SEQ ID Ns: 49, SEQ ID Ns: 50, SEQ ID Ns: 51, SEQ ID Ns: 52, SEQ ID Ns: 53, SEQ ID Ns: 54 e SEQ ID Ns: 55, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 26, SEQ ID Ns: 56, SEQ ID Ns: 57, SEQ ID Ns: 58, SEQ ID Ns: 59, SEQ ID Ns: 60, SEQ ID Ns: 61, SEQ ID Ns: 62, SEQ ID Ns: 63 e SEQ ID Ns: 64, e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18;
14. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 2 a 13, em que a região Fc é uma região IgG, em particular uma
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197/387 região Fc de IgG 1 ou uma região Fc de lgG4;
15. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 2 a 14, em que a região Fc compreende uma ou mais substituição de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do anticorpo a um receptor Fc e/ ou função efetora;
16. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 2 a 15, em que a região Fc é (i) da subclasse lgG1 humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU), ou (ii)) da subclasse IgG 1 de camundongo com as mutações de aminoácidos D265A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU);
17. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 2 a 16, em que a região Fc compreende uma modificação promovendo a associação da primeira e segunda subunidade da região Fc;
18. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 2 a 17, em que a primeira subunidade da região Fc compreende maçanetas e a segunda subunidade da região Fc compreende furos de acordo com o método das maçanetas em furos;
19. O anticorpo biespecífico de qualquer um dos paras 2 a 18, em que (i) a primeira subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e a segunda subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com Kabat EU index), ou (ii) a primeira subunidade da região Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e a segunda subunidade da região Fc compreende as
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198/387 substituições de aminoácidos E356K e D399K (numeração de acordo com o índice de Kabat EU);
20. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 19, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) pelo menos dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
21. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 19, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) uma VH e uma VL de uma ligação específica ao domínio de ligação ao antígeno ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a);
22. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos par. 1 a 19, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica a CD40, e uma região Fc, e (b) dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao FAP, em que um dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e o outro dos fragmentos de Fab
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199/387 está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a);
23. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 19, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um VH e um VL de um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o VH está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e em que o VL está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a);
24. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 19, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) dois fragmentos de Fab, capazes de ligação específica a FAP, em que um dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a) e o outro dos fragmentos de Fab está ligado ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas de (a);
25. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer
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200/387 um dos paras 1 a 19, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende (a) duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio VH e CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e uma subunidade da região Fc, (b) duas cadeias leves, cada cadeia leve compreendendo um domínio VL e CL de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (c) um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que os fragmentos de Fab estão ligados ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a);
26. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 22 a 25, em que o fragmento de Fab ou os dois fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma específica a FAP são fragmentos de Fab cruzados que compreende cada um uma cadeia VL-CH1 e uma cadeia VH-CL; em que a cadeia VL-CH1 está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de (a);
27. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 26, em que cada uma das duas cadeias pesadas de (a) compreende dois domínios VH e dois domínios CH1 de um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a CD40;
28. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 23 a 27, em que cada uma das duas cadeias pesadas de (a) compreende dois domínios VH e dois domínios CH1 de um fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica ao CD40;
29. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 23 a 28, em que um ou mais dos fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, compreende
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201/387 um domínio CL que compreende uma arginina (R) no aminoácido na posição 123 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e uma lisina (K) no aminoácido na posição 124 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU), e um domínio CH1 que compreende um ácido glutâmico (E) no aminoácido na posição 147 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU) e um ácido glutâmico (E) no aminoácido na posição 213 (numeração de acordo com o índice de Kabat EU);
30. Um polinucleotideo que codifica a molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29.
31. Vetor de expressão que compreende o polinucleotideo da reivindicação 30;
32. Uma célula hospedeira que compreende o polinucleotideo de para 30 ou o vetor de expressão de para 31;
33. Um método para a produção de uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende a cultura da célula hospedeira de para 32 sob condições adequadas para a expressão da molécula biespecífica de ligação ao antígeno, e isolando a molécula biespecífica de ligação ao antígeno;
34. Uma composição farmacêutica que compreende a molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável;
35. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29, ou a composição farmacêutica do para 34, para uso como medicamento;
36. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29, ou a composição farmacêutica do paras 34, para uso (i) na indução da estimulação imunológica por células que apresentam os antígenos CD40+ (APCs),
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202/387 (ii) na estimulação da resposta das células T específicas de tumor, (iii) em causar apoptose de células tumorais, (iv) no tratamento de câncer, (v) em retardar a progressão do câncer, (vi) em prolongar a sobrevivência de um paciente que sofre de câncer, (vii) no tratamento de infecções;
37. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29, ou a composição farmacêutica do paras 34, para uso no tratamento de câncer;
38. Uso da molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29, ou a composição farmacêutica do para 34, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer;
39. Método de tratamento de um indivíduo com câncer que compreende a administração ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29, ou a composição farmacêutica do paras 34;
40. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de qualquer um dos paras 1 a 29, ou a composição farmacêutica do para 34, para uso na regulação positiva ou prolongamento da atividade das células T citotóxicas; e
41. A molécula biespecífica de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um dos paras 1 a 29 ou a composição farmacêutica de acordo com o paras 34 para uso no tratamento de câncer, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é administrada em combinação com um agente quimioterápico, radiação e/ ou outros agentes para uso em imunoterapia de câncer.
Exemplos [0330] Os seguintes são exemplos de métodos e composições da
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203/387 invenção. Entende-se que várias outras formas de realização podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE [0331] Métodos padrão foram usados para manipular o DNA como descrito em Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Pressão, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. A informação geral sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas é dada em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed., Publicação NIH N91-3242.
Sequenciamento de DNA [0332] As sequências de DNA foram determinadas por sequenciação de cadeia dupla.
SÍNTESE DE GENES [0333] Os segmentos de genes desejados foram gerados por PCR utilizando modelos apropriados ou foram sintetizados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por síntese de genes automatizada. Nos casos em que não estava disponível qualquer sequência genética exata, os iniciadores oligonucleotídicos foram concebidos com base em sequências de homólogos mais próximos e os genes foram isolados por RT-PCR a partir de RNA originário do tecido apropriado. Os segmentos de genes flanqueados por locais singulares de divagem por endonucleases de restrição foram clonados em vetores de clonagem/ sequenciação convencionais. O DNA plasmídico foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração foi determinada por espectroscopia de UV. A sequência de DNA dos fragmentos de genes subclonados foi confirmada por sequenciação de DNA. Os segmentos de
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204/387 genes foram desenhados com locais de restrição adequados para permitir a subclonagem nos respectivos vetores de expressão. Todas as construções foram concebidas com uma sequência de DNA de extremidade 5’ que codifica um peptídeo líder que visa proteínas para secreção em células eucarióticas.
Purificação de proteínas [0334] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células filtradas, referindo-se a protocolos padrão. Em resumo, os anticorpos foram aplicados a uma coluna de Proteína A-Sepharose (GE healthcare) e lavados com PBS. A eluição de anticorpos foi alcançada a pH 2,8, seguida de neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada dos anticorpos monoméricos por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em 20 mM de histidina, 150 mM de NaCI pH 6,0. As frações de anticorpo monomérico foram reunidas, concentradas (se necessário) utilizando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 SC ou -80 SC. Parte das amostras foram fornecidas para posterior análise de proteínas e caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou espectrometria de massa.
SDS-PAGE [0335] O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Em particular, 10% ou 4-12% de géis pré-moldados NuPAGE® Novex® Bis-TRIS (pH 6,4) e um NuPAGE® MES (géis reduzidos, com aditivo tampão de corrida Antioxidante NuPAGE®) ou MOPS (géis não reduzidos) buffer de execução foi usado.
CE-SDS [0336] A pureza, a integridade dos anticorpos e o peso molecular dos anticorpos biespecíficos e de controle foram analisados por CE-SDS utilizando a tecnologia micro fluídica Labchip (Caliper Life Science, EUA).
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Foram preparados 5 de proteína de proteína para análise CE-SDS utilizando o Kit de Reagente de Proteína Expresso HT de acordo com as instruções do fabricante e analisados no sistema LabChip GXII utilizando um chip HT Protein Expressão. Os dados foram analisados utilizando o software LabChip GX versão 3.0.618.0.
Cromatografia analítica de exclusão de tamanho [0337] Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para a determinação da agregação e estado oligomérico dos anticorpos foi realizada por cromatografia HPLC. Em resumo, os anticorpos purificados com Proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel G3000SW em NaCI 300 mM, KH2PO4/ K2HPO4 50 mM, pH 7,5 em um sistema Agilent HPLC 1100 ou a uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2 x PBS em um Dionex Sistema HPLC. A proteína eluída foi quantificada por absorvância de UV e integração de áreas de pico. A Norma de Filtração de Gel BioRad 151-1901 serviu como padrão.
Espectrometria de massa [0338] Esta seção descreve a caracterização dos anticorpos multiespecíficos com troca VH/ VL ou CH/ CL (CrossMabs) com ênfase em sua montagem correta. As estruturas primárias esperadas foram analisadas por espectrometria de massa com ionização por eletro pulverização (ESI-MS) dos CrossMabs intactos desglicosilados e CrossMabs desglicosilados/ FabALACTICA ou de forma alternativa desglicosilados/ digeridos com GingisKHAN.
[0339] Os CrossMabs foram desglicosilados com N-Glicosidase F em um fosfato ou tampão Tris a 37 durante até 17 h a uma concentração de proteína de 1 mg/ ml. As digestões de FabALACTICA ou GingisKHAN (Genovis AB; Suécia) foram realizadas nos tampões fornecidos pelo vendedor com 100 pg de CrossMabs desglicosilados. Antes da espectrometria de massa, as
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206/387 amostras foram dessalinizadas via HPLC em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa total foi determinada via ESI-MS em um sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) equipado com uma fonte TriVersa NanoMate (Advion).
Exemplo 1 [0340] Geração e Produção de construções biespecíficas visando o CD40 e a proteína de ativação de fibroblastos (FAP) [0341] 1.1 Geração de moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno visando CD40 e proteína de ativação de fibroblastos (FAP) [0342] Os cDNA que codificam domínios variáveis de cadeia pesada e leve do ligante anti CD40 (SEQ ID Ns: 10 e SEQ ID Ns: 16 de WO 2006/128103) foram clonados em enquadramento com as correspondentes cadeias pesada ou leve constantes de lgG1 humana em expressão adequada plasmídeos. A expressão da cadeia pesada e leve acionada por um promotor quimérico de MPSV que consiste no promotor nuclear de MPSV e em um elemento potenciador de CMV. O cassete de expressão também contém um sinal poliA sintético na extremidade 3’ dos cDNAs, de forma adicional, os vetores plasmídicos abrigam uma origem de replicação (EBV OriP) para manutenção epissómica dos plasmídeos. As sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios variáveis do mAb CD40 e do mAb FAP são apresentadas na Tabela 1 e 2, respectivamente.
[0343]Foram preparados diferentes anticorpos biespecíficos de CD40-FAP nos formatos 4 + 1 e 4 + 2 que consiste em quatro porções de ligação a CD40 combinadas com um ou dois braços de ligação a FAP no terminal C de um Fc ou em 2 + 1 e 2 + 2 formatos que consiste em duas porções de ligação a CD40 combinadas com um ou dois braços de ligação a FAP no terminal C de um FC(Figuras 1A a 1D). A geração e preparação do ligante de FAP 28H1 está descrita no documento WO 2012/020006 A2,
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207/387 que é aqui incorporado por referência. Para gerar as moléculas 4 + 1 e 2 + 1, a tecnologia knob-vnto-hole foi usada para alcançar a heterodimerização. As mutações S354C/ T366W foram introduzidas na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada da maçaneta Fc) e as mutações Y349C/ T366S/ L368A/ Y407V foram introduzidas na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada do furo Fc). Nas moléculas 4 + 2 e 2 + 2, a tecnologia CrossMab, conforme descrito no documento WO 2010/145792 A1, assegurou o emparelhamento correto da cadeia leve. Independente do formato biespecífico, em todos os casos foi utilizado um efetor silencioso FC (P329G; L234, L235A) para anular a ligação aos receptores Fcy de acordo com o método descrito em WO 2012/130831 A1. Sequências das moléculas biespecíficas são mostradas na Tabela 3 e 4.
[0344]Além de moléculas que têm como alvo os receptores humanos, também moléculas substitutas foram geradas nos mesmos formatos que reconhecem os antígenos murinos. Nestes casos, a heterodimerização de moléculas 4 + 1 foi alcançada por mutações DD/ KK (introdução do Lys392Asp e Lys409Asp na primeira cadeia pesada e introdução da mutação Glu356Lys e Asp399Lys na segunda cadeia pesada) no Fc de acordo com o método, descrito por Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010, 19637-19646, enquanto que a ligação aos receptores Fc foi inibida por mutações D270A/ P329G de acordo com o método descrito em Baudino et al., J. Immunol. (2008), 181, 6664-9 ou no documento WO 2016/030350 A1.
[0345]Todos os genes foram expressos transitoriamente sob o controle de um promotor quimérico de MPSV que consiste no promotor nuclear de MPSV combinado com o fragmento potenciador do promotor de CMV. O vetor de expressão também contém a região oriP para replicação epissômica em células hospedeiras contendo EBNA (Antígeno Nuclear de
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Vírus de Epstein Barr).
Tabela 1: Sequências de aminoácidos dos domínios variáveis dos anticorpos
CD40, O ANTICORPO FAP E O ANTICORPO DP47.
)esc ição Sequência >E Q 0 Je
hu :d4( VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTS YNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSS
hu :d4( VL )IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRF( GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIK
FAP 28H1 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGECTí YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS 9
FAP 28H1 VL ilVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDF FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
3P4/ VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS G
3P4/ VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPC RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK T<.
mu :d4( VH EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSn YRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTVSS
mu :d4( VL )TVLTQSPALAVSPGERVTISCRASDSVSTLMHWYQQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARI SGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYYCQQSWNDPWTFGGGTKLELK
Tabela 2: Sequências de nucleotídeos dos domínios variáveis dos
ANTICORPOS CD40, O ANTICORPO FAP E O ANTICORPO DP47
Descrição Sequência SEQ ID Ne:
hu CD40 VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGT GCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCG CCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACT GGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGG GTGGCCAGAGTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAG CTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAG CGTGGACAACAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGAT GAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACT 73
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Descrição Sequência SEQ ID Ne:
ATTGTGCCCGCGAGGGCATCTATTGGTGGGGCCAG GGAACACTCGTGACCGTGTCCAGC
hu CD40 VL GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCT GCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG GAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACA CCTTCCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAG GCCCCCAAGCTGCTGATCTACACCGTGTCCAACCGG TTCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCT GCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTATTTCTGCAGCCA GACCACCCACGTGCCCTGGACATTTGGACAGGGCA CCAAGGTGGAAATCAAG 74
FAP 28H1 VH GAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGT GCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCG CCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCT GGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGG GTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTA CGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCC GGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTAC TGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC 75
FAP 28H1 VL GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTGAG CCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCA GAGCCAGCCAGAGCGTGAGCCGGAGCTACCTGGCC TGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACT 76
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Descrição Sequência SEQ ID Ne:
GCTGATCATCGGCGCCAGCACCCGGGCCACCGGCA TCCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACC GACTTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGGAACCCGA GGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGG TGATCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTG GAAATCAAG
DP47 VH GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG CCAGCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATA CTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGAT GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATT ACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGGC CAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC 77
DP47 VL GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGTCA CTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACCCTGAGCTGCAG AGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCTCTTACCTGGCCT GGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTG CTGATCTACGGCGCCTCTTCTAGAGCCACCGGCATC CCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGA CTTCACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGA CTTTGCCGTGTATTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAG CCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAA TCAAA 78
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Descrição Sequência SEQ ID Ne:
mu CD40 VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCCGACGGCGGACTGGT GCAGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCG CCTCCGGCTTCACCTTCTCCGACTACTACATGGCCT GGGTGCGACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGG GTGGCCTCCATCTCCTACGACGGCTCCTCCACCTAC TACCGGGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCT CGGGACAACGCCAAGTCCACCCTGTACCTGCAGAT GGACTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCTACCTACT ACTGCGGCAGACACTCCTCCTACTTCGACTACTGGG GCCAGGGCGTGATGGTCACCGTGTCCTCT 79
mu CD40 VL GACACTGTACTGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTG TCTCCAGGAGAGAGGGTTACCATCTCCTGTAGGGCC AGTGACAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAA CAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTAT CTAGCATCACACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGG TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC ACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACC TATTACTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCGTGGACG TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAA 80
Tabela 3: Sequências de aminoácidos da IgG CD40 e as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno
Construção Sequência SEQ ID Ne:
P1AD4470 CD40 IgG
CD40 IgG Cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT 81
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
pesada LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CD40 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 82
P1AD4453 CD40 x FAP (28H1)(4 + 1)
CD40 VHCH1 -CD40 VHCH1 -Fc knob_PGL/\L A-28H1 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK 83
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 503/744
213/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
VDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLE WVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYL QMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS HAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WLGNFDYWGQGTLVTVSS
CD40 VHCH1-CD40 VHCH1-FC /?o/e_PGLALA -28H1 VL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLE WVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYL 84
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 504/744
214/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
QMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRS YLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQG TKVEIK
CD40 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 82
P1AD4455 CD40 x FAP (28H1) (4 + 2)
CD40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT 85
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 505/744
215/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
VHCH1-CD40 VHCH1- Fc_PGLALA- 28H1 VLCH1’ EE’ LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLE WVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYL QMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRS YLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQG TKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC
CD40-cadeia leve; DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS 86
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 506/744
216/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
,RK’ GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
28H1 VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGN FDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC 87
P1AA9641 CD40 x FAP (28H1)(2 + 1)
GD40-FC /?o/e_PGLALA 28 H1 VL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ 88
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 507/744
217/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQVIPPTFGQGTKVEIK
huCD40_Fc knob_PGLM_ A_28H1 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGS LRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAI WASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS 89
+ CD40 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK 82
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 508/744
218/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
P1AA9663 CD40 x FAP (28H1) (2 + 2)
CD40-28H1 2 + 2;,EE’ huCD40- FC-PGLALA- 28H1_VLCH1’ EE’ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSC 90
+ CD40 LC; ,RK’ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS 86
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 509/744
219/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
+ 28H1 VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGN FDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC 87
P1AD4574 CD40 x DP47 (4 + 1)
CD40 VHCH1-CD40 VHCHI-Fc knob_PGLM_ A-DP47 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLE WVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYL QMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV 91
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 510/744
220/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGS GFDYWGQGTLVTVSS
CD40 VHCH1-CD40 VHCH1- Fc/?ote_PGLA LA-DP47 VL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLE WVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYL QMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR 92
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 511/744
221/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQG TKVEIK
+ CD40 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 82
P1AD4465 CD40 x DP47 (4 + 2)
CD40 VHCH1-CD40 VHCH1- FC-PGLALA- DP47 VLCH1’ EE’ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLE 93
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 512/744
222/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
WVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYL QMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQG TKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC
+ CD40 cadeia leve;’ RK’ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 86
+ DP47VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM 94
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 513/744
223/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
SWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFD YWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
P1AD4520 or P1AD9139 mu CD40 (FGK4.5) x FAP (28H1) (4 + 1)
muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcKK DAPG - 28H1 VH EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYM AWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRF TISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYF DYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASS TKVDKKIVPRDCGGGGSGGGGSEVQLVESDGGLV QPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLE WVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYF PEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVV VAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIE KTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMI TNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGS YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHT 95
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 514/744
224/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
EKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWV RQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDY WGQGTLVTVSS
muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcDD_DAPG -28H1 VL EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYM AWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRF TISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYF DYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASS TKVDKKIVPRDCGGGGSGGGGSEVQLVESDGGLV QPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLE WVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYF PEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVV VAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIE KTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMI TNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGS YFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHT EKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVL TQS PGTLSLS PG E RATLSCRASQSVS RSYLAWYQ QKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTL 96
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 515/744
225/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
TISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
mu CD40 cadeia leve DTVLTQSPALAVS PG E RVTISC RASDS VSTLM HWY QQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARFSGSGSGTDF TLTIDPVEADDTATYYCQQSWNDPWTFGGGTKLE LKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NEC 97
P1AD4558 mu CD40 (FGK5.4) x FAP (28H1) (4 + 2)
muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FC-DAPG- 28H1 VLCH1’ EE’ EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYM AWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRF TISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYF DYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVEGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASS TKVDEKIVPRDCGGGGSGGGGSEVQLVESDGGLV QPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLE WVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVEGYF PEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDEKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVV VAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIE 98
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 516/744
226/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
KTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMI TNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGS YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHT EKSLSHSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIV LTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWY QQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFP EPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVT VPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
28H1 VHCL (mu) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGN FDYWGQGTLVTVSSASDAAPTVSIFPPSSEQLTSG GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNS WTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA THKTSTSPIVKSFNRNEC 99
mu CD40 cadeia leve;’ RK’ DTVLTQSPALAVS PG E RVTISC RASDS VSTLM HWY QQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARFSGSGSGTDF TLTIDPVEADDTATYYCQQSWNDPWTFGGGTKLE LKRADAAPTVSIFPPSSRKLTSGGASVVCFLNNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NEC 100
P1AD4521 mu CD40-DP47 (4 + 1)
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 517/744
227/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FcKKDAPG- DP47 VH EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYM AWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRF TISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYF DYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASS TKVDKKIVPRDCGGGGSGGGGSEVQLVESDGGLV QPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLE WVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYF PEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVV VAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIE KTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMI TNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGS YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHT EKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWV RQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWG QGTLVTVSS 101
muCD40 EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYM AWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRF TISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYF 102
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 518/744
228/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
VHCH1-mu CD40 VHCH1- FcDD_DAPG- DP47 VL DYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASS TKVDKKIVPRDCGGGGSGGGGSEVQLVESDGGLV QPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLE WVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYF PEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVV VAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIE KTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMI TNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGS YFVYSDLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHT EKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVL TQS PGTLSLS PG E RATLSCRASQSVSSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK
+ mu CD40 cadeia leve DTVLTQSPALAVS PG E RVTISC RASDS VSTLM HWY QQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARFSGSGSGTDF TLTIDPVEADDTATYYCQQSWNDPWTFGGGTKLE LKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NEC 97
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 519/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
P1AD4555 mu CD40-DP47 (4 + 2)
muCD40 VHCH1- muCD40 VHCH1- FC-DAPG- DP47 VLCH1’ EE’ EVQLVESDGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYM AWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRF TISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYF DYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVEGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASS TKVDEKIVPRDCGGGGSGGGGSEVQLVESDGGLV QPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLE WVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGVMVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVEGYF PEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDEKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVV VAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIE KTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMI TNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGS YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHT EKSLSHSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIV LTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFP EPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVT 103
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 520/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
VPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
+ mu CD40 cadeia leve; ,RK’ DTVLTQSPALAVS PG E RVTISC RASDS VSTLM HWY QQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARFSGSGSGTDF TLTIDPVEADDTATYYCQQSWNDPWTFGGGTKLE LKRADAAPTVSIFPPSSRKLTSGGASVVCFLNNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NEC 100
DP47 VHCL (mu) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFD YWGQGTLVTVSSASDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTD QDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT STSPIVKSFNRNEC 104
Tabela 4: Sequências de nudeotídeos das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno
Construção Sequência SEQ ID Ne:
CD40 IgG Cadeia pesada GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC 105
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 521/744
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GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGCGTGTTCCCACTGGCC CCAAGCAGCAAGTCTACCAGCGGAGGAACAGCCGCCCT GGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCAGTGA CAGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTGACATCTGGCGTG CACACATTCCCAGCCGTGCTGCAGTCTAGCGGCCTGTA CAGCCTGTCCAGCGTGGTGACAGTGCCAAGCAGCTCTC TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAA GAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCACCATGTCCAG CCCCAGAGCTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCCAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAAC CCCCGAGGTGACATGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACG AGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGA GTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGG AGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTG ACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAA TCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGG GAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTAGGGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGG
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 522/744
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TAAA
CD40 cadeia leve GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGC CAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGAGCA GCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTTCCTG CACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCT GCTGATCTACACCGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGC CCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTC ACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGC CACCTATTTCTGCAGCCAGACCACCCACGTGCCCTGGA CATTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACG GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTG CTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT 106
CD40 x FAP (28H1)(4+1)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- Fc/?o/e_PGLAL A-28H1 VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT 107
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 523/744
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CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTTCCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCC CCTAGCAGCAAGTCTACCAGCGGAGGAACAGCCGCCCT GGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTG CACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTA CTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCC TGGGAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAA GAGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGG ATCCGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGTGGGGGAGGCCTG GTGCAGCCAGGGGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGC TTCCGGCTACTCTTTTACCGGGTATTATATCCATTGGGT GCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCA CGCGTGATCCCTAACGCAGGCGGCACCTCTTATAATCA GAAGTTTAAAGGGCGCTTTACCCTGTCCGTGGACAATTC CAAGAATACTGCTTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGCGC CGAAGATACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGAAGGGA TCTATTGGTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCA TCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 524/744
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ACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAG GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCC CTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCC AAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCA ACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGG CGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGG AGGGGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTG CTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGAT CTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTC TCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGG CAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCG GCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTC ACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTA CTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGC
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 525/744
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CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- Fc/?o/e_PGLAL A-28H1 VL GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTTCCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCC CCTAGCAGCAAGTCTACCAGCGGAGGAACAGCCGCCCT GGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTG CACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTA CTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCC TGGGAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAA GAGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGG ATCCGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGTGGGGGAGGCCTG GTGCAGCCAGGGGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGC TTCCGGCTACTCTTTTACCGGGTATTATATCCATTGGGT GCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCA CGCGTGATCCCTAACGCAGGCGGCACCTCTTATAATCA GAAGTTTAAAGGGCGCTTTACCCTGTCCGTGGACAATTC CAAGAATACTGCTTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGCGC CGAAGATACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGAAGGGA TCTATTGGTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCA TCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC 108
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 526/744
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ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT GGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGTGGT GGCGGATCTGGGGGCGGTGGATCTGAGATCGTGCTGA CCCAGTCTCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGA
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GAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTG AGCCGGAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGG CCAGGCCCCCAGACTGCTGATCATCGGCGCCAGCACCC GGGCCACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGG AACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGC CAGGTGATCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGT GGAAATCAAG
CD40 cadeia leve ver acima 106
CD40 x FAP (28H1) (4 + 2)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1FC-PGLALA28H1 VLCH1’ EE’ GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTTCTACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCC CCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCT GGGCTGCCTCGTGGAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTG CACACCTTTCCAGCCGTGCTCCAGAGCAGCGGCCTGTA CTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCC TGGGAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAA 109
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 528/744
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GAGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCCGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGTGGGGGAGGCCTGG TGCAGCCAGGGGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCT TCCGGCTACTCTTTTACCGGGTATTATATCCATTGGGTG CGGCAGGCTCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCAC GCGTGATCCCTAACGCAGGCGGCACCTCTTATAATCAG AAGTTTAAAGGGCGCTTTACCCTGTCCGTGGACAATTCC AAGAATACTGCTTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCC GAAGATACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGAAGGGAT CTATTGGTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCAT CCGCTAGCACCAAGGGACCTTCCGTGTTTCCCCTGGCT CCCAGCTCCAAGTCTACCTCTGGGGGCACAGCTGCTCT GGGATGTCTGGTGGAAGATTA1 1 1 1CCTGAACCTGTGAC CGTGTCATGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGGGTG CACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTAT AGCCTGAGCAGCGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCT GGGCACACAGACATATATCTGTAATGTGAATCACAAACC CTCTAATACCAAAGTGGATGAGAAAGTGGAACCTAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCC CTGAAGCTGCTGGCGGCCCATCTGTGTTTCTGTTCCCC CCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCC CGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGG ACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCGCGGGAAGAACA GTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAG TGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAG TGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGGAGCCCCCATCGA GAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAAC
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239/387
CTCAGGTGTACACCCTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCTG ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGG CTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCA ACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAA GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAAC GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCCTGGCG GAGGGGGAGGATCTGGGGGAGGCGGAAGTGGGGGAG GGGGTTCCGGAGGCGGCGGATCAGAAATTGTGCTGACC CAGTCCCCCGGCACCCTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAG AGCCACCCTGAGCTGTAGGGCCTCCCAGAGCGTGTCCA GAAGCTATCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAG GCCCCCAGACTGCTGATCATTGGCGCCTCTACCAGAGC CACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCG GCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGACTGGAACCC GAGGACTTTGCCGTGTACTATTGCCAGCAGGGCCAAGT GATCCCCCCCACCTTTGGCCAGGGAACAAAGGTGGAAA TCAAGTCCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCAGTGTTC CCACTGGCACCATCCAGCAAGTCCACAAGCGGAGGAAC CGCCGCTCTGGGCTGTCTCGTGAAAGACTACTTTCCAG AGCCAGTGACCGTGTCCTGGAATAGTGGCGCTCTGACT TCTGGCGTGCACACTTTCCCCGCAGTGCTGCAGAGTTC TGGCCTGTACTCCCTGAGTAGCGTCGTGACAGTGCCCT CCTCTAGCCTGGGCACTCAGACTTACATCTGCAATGTGA ATCATAAGCCTTCCAACACAAAAGTGGACAAAAAAGTGG AACCCAAATCTTGC
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGC 110
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 530/744
240/387
CD40-cadeia leve; ,RK’ CAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGAGCA GCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTTCCTG CACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCT GCTGATCTACACCGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGC CCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTC ACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGC CACCTATTTCTGCAGCCAGACCACCCACGTGCCCTGGA CATTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACG GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT CGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTG CTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
28H1 VHCL GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCC GGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCG ACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCA TCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTG AAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAA CACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGG ACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGC AACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGT GTCCAGCGCTAGCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCT TCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCT 111
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 531/744
241/387
TCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGA GGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG TCCGGCAACAGCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTC CAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCC TGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCC TGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGAC CAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGC
CD40 x FAP (28H1)(2 + 1)
pETR17111 huCD40_Fc/?o/ e_PGLALA_28 H1 VL GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC 112
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 532/744
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CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT GGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGTGGT GGCGGATCTGGGGGCGGTGGATCTGAGATCGTGCTGA CCCAGTCTCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGA GAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTG AGCCGGAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGG CCAGGCCCCCAGACTGCTGATCATCGGCGCCAGCACCC GGGCCACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGG AACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGC CAGGTGATCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGT GGAAATCAAGTGA
pETR17112 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC 113
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 533/744
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huCD40_Fck/?o b_PGLALA_28 H1 VH GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAG GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAG
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 534/744
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CAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCC CTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCC AAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCA ACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGG CGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGG AGGGGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTG CTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGAT CTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTC TCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGG CAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCG GCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTC ACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTA CTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCTGA
+ CD40 LC pETR15390 ver acima 106
CD40 x FAP (28H1) (2 + 2)
pETR17113 huCD40FC-PGLALA-2 8H1_VLCH1’ EE’ GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA 114
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 535/744
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GCGCTAGCACCAAGGGACCTTCCGTGTTTCCCCTGGCT CCCAGCTCCAAGTCTACCTCTGGGGGCACAGCTGCTCT GGGATGTCTGGTGGAAGATTA1 1 1 1CCTGAACCTGTGAC CGTGTCATGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGGGTG CACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTAT AGCCTGAGCAGCGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCT GGGCACACAGACATATATCTGTAATGTGAATCACAAACC CTCTAATACCAAAGTGGATGAGAAAGTGGAACCTAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCC CTGAAGCTGCTGGCGGCCCATCTGTGTTTCTGTTCCCC CCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCC CGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGG ACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCGCGGGAAGAACA GTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAG TGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAG TGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGGAGCCCCCATCGA GAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAAC CTCAGGTGTACACCCTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCTG ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGG CTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCA ACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAA GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAAC GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCCTGGCG GAGGGGGAGGATCTGGGGGAGGCGGAAGTGGGGGAG GGGGTTCCGGAGGCGGCGGATCAGAAATTGTGCTGACC
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 536/744
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CAGTCCCCCGGCACCCTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAG AGCCACCCTGAGCTGTAGGGCCTCCCAGAGCGTGTCCA GAAGCTATCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAG GCCCCCAGACTGCTGATCATTGGCGCCTCTACCAGAGC CACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCG GCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGACTGGAACCC GAGGACTTTGCCGTGTACTATTGCCAGCAGGGCCAAGT GATCCCCCCCACCTTTGGCCAGGGAACAAAGGTGGAAA TCAAGTCCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCAGTGTTC CCACTGGCACCATCCAGCAAGTCCACAAGCGGAGGAAC CGCCGCTCTGGGCTGTCTCGTGAAAGACTACTTTCCAG AGCCAGTGACCGTGTCCTGGAATAGTGGCGCTCTGACT TCTGGCGTGCACACTTTCCCCGCAGTGCTGCAGAGTTC TGGCCTGTACTCCCTGAGTAGCGTCGTGACAGTGCCCT CCTCTAGCCTGGGCACTCAGACTTACATCTGCAATGTGA ATCATAAGCCTTCCAACACAAAAGTGGACAAAAAAGTGG AACCCAAATCTTGCTGA
+ CD40 LC; ,RK’ pETR15391 ver acima 110
+ 28H1 VHCL pETR15114 ver acima 111
CD40 x DP47 (4 + 1)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- Fck/?o£>_PGLAL GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG 115
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A-DP47 VH CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTTCCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCC CCTAGCAGCAAGTCTACCAGCGGAGGAACAGCCGCCCT GGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTG CACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTA CTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCC TGGGAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAA GAGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGG ATCCGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGTGGGGGAGGCCTG GTGCAGCCAGGGGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGC TTCCGGCTACTCTTTTACCGGGTATTATATCCATTGGGT GCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCA CGCGTGATCCCTAACGCAGGCGGCACCTCTTATAATCA GAAGTTTAAAGGGCGCTTTACCCTGTCCGTGGACAATTC CAAGAATACTGCTTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGCGC CGAAGATACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGAAGGGA TCTATTGGTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCA TCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG
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TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGC TGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAG GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCC CTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCC AAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCA ACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGG CGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGG AGGGGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGAGGTGCAATTG TTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCAGCGGATTCACCTTTA GCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGG
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 539/744
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TGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATC TGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTA TATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGG CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- Fc /?ote_PGLALADP47 VL GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGC AGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAG CGGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGA GGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAG GGTGATCCCCAACGCCGGCGGCACCAGCTACAACCAGA AGTTCAAGGGCAGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGC AAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGC CGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGGC ATCTACTGGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAG CAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCG CCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCC GTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGG CCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCA GCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGA GCCCAAGAGCTGCGACGGCGGCGGCGGCAGCGGCGG CGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGG CGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGC TGCGCCGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACTACAT CCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAG TGGGTGGCCAGGGTGATCCCCAACGCCGGCGGCACCA 116
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 540/744
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GCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAGGTTCACCCTGAGC GTGGACAACAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGGGAGGGCATCTACTGGTGGGGCCAGGGCACCC TGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCG GCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTA CTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCT GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCAC ACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCG GCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGAC ACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGT GGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGC CAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGA CTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCA ACAAGGCCCTGGGCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGC AAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCA CCCTGCCCCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCA GGTGAGCCTGAGCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCC CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACA GCGACGGCAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTG
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 541/744
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GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTG CAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCC AGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGCGGCGGCGG CAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGG CGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCC GGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCC TGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTA CCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCC AGGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCAGCAGGGCCACCG GCATCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAC CGACTTCACCCTGACCATCAGCAGGCTGGAGCCCGAGG ACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGC CCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAA G
+ CD40 LC pETR15390 ver acima 106
CD40 x DP47 (4 + 2)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- FC-PGLALA- DP47 VLCH1’ EE’ GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGC GGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATCCACTGGGTGCG CCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGA GTGATCCCCAATGCCGGCGGAACCAGCTACAACCAGAA GTTCAAGGGCCGGTTCACCCTGAGCGTGGACAACAGCA AGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCC GAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCCGCGAGGGCAT CTATTGGTGGGGCCAGGGAACACTCGTGACCGTGTCCA GCGCTTCTACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCC CCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCT 117
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 542/744
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GGGCTGCCTCGTGGAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTG CACACCTTTCCAGCCGTGCTCCAGAGCAGCGGCCTGTA CTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCAGCC TGGGAACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAA GAGCTGCGACGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCCGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGTGGGGGAGGCCTGG TGCAGCCAGGGGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCT TCCGGCTACTCTTTTACCGGGTATTATATCCATTGGGTG CGGCAGGCTCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCAC GCGTGATCCCTAACGCAGGCGGCACCTCTTATAATCAG AAGTTTAAAGGGCGCTTTACCCTGTCCGTGGACAATTCC AAGAATACTGCTTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCC GAAGATACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGAAGGGAT CTATTGGTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCAT CCGCTAGCACCAAGGGACCTTCCGTGTTTCCCCTGGCT CCCAGCTCCAAGTCTACCTCTGGGGGCACAGCTGCTCT GGGATGTCTGGTGGAAGATTA1 1 1 1CCTGAACCTGTGAC CGTGTCATGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGGGTG CACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTAT AGCCTGAGCAGCGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCT GGGCACACAGACATATATCTGTAATGTGAATCACAAACC CTCTAATACCAAAGTGGATGAGAAAGTGGAACCTAAGTC CTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCC CTGAAGCTGCTGGCGGCCCATCTGTGTTTCTGTTCCCC CCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCC CGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGG
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ACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCGCGGGAAGAACA GTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAG TGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAG TGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGGAGCCCCCATCGA GAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAAC CTCAGGTGTACACCCTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCTG ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGG CTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCA ACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAA GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAAC GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCCTGGCG GAGGGGGAGGATCTGGGGGAGGCGGAAGTGGGGGAG GGGGTTCCGGAGGCGGAGGATCCGAAATCGTGTTAACG CAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG AGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCA GCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAG GCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGC CACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCG GGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCT GAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGC TCACCGCTGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAAT CAAAAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCAGTGTTCC CACTGGCACCATCCAGCAAGTCCACAAGCGGAGGAACC GCCGCTCTGGGCTGTCTCGTGAAAGACTACTTTCCAGA GCCAGTGACCGTGTCCTGGAATAGTGGCGCTCTGACTT
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 544/744
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CTGGCGTGCACACTTTCCCCGCAGTGCTGCAGAGTTCT GGCCTGTACTCCCTGAGTAGCGTCGTGACAGTGCCCTC CTCTAGCCTGGGCACTCAGACTTACATCTGCAATGTGAA TCATAAGCCTTCCAACACAAAAGTGGACAAAAAAGTGGA ACCCAAATCTTGC
+ CD40 LC; ,RK’ pETR15391 ver acima 110
+ DP47VHCL pETR15119 GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACA GCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCC AGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATT AGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGT GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGA ACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAG GACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATT TGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGA GTGCTAGCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCA CCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTTCTGT CGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCA AGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGG CAACAGCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGG ACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCA AGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAA GTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTC TTTCAACCGGGGCGAGTGC 118
mu CD40-28H1 (4 + 1)
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 545/744
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CD40 VHCH1- CD40 VHCH1FcKKDAPG 28H1 VH pETR15732 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGACGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCGCCAGC GGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGGCCTGGGTGCG ACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGCA TCAGCTACGACGGCAGCAGCACCTACTACAGAGACAGC GTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAA GAGCACCCTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAGAAGCG AGGACACCGCTACCTACTACTGCGGCAGACACAGCAGC TACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCGTGATGGTCACCGT GTCTAGCGCCAAGACCACACCCCCCAGCGTGTACCCTC TGGCTCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTC ACACTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCC TGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCTCTCTGTCTAGCG GCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTG TACACCCTGTCCTCCAGCGTGACCGTGCCTTCCTCCAC CTGGCCTTCCCAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACC CTGCCAGCTCCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCC CGGGACTGCGGAGGGGGCGGTTCCGGCGGAGGAGGAI CCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGATGGGGGCCTGGT GCAGCCCGGAAGAAGCCTGAAACTGCCCTGTGCTGCCT CTGGCTTCACATTCTCTGATTACTATATGGCTTGGGTGC GCCAGGCTCCAACAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCATCC ATCTCTTACGACGGCTCCTCCACTTACTACAGGGACTCT GTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGATAACGCCAA GTCTACACTGTACCTGCAGATGGATTCCCTGCGCTCCGA GGACACAGCCACATATTACTGTGGCAGGCACTCCTCCTA CTTTGATTATTGGGGACAGGGCGTGATGGTCACAGTGT CCAGCGCTAAGACCACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTG 119
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 546/744
256/387
GCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGAC CCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTG TGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGG CGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGT ACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACC TGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCC TGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCC GGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCC GAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAA GGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCT GCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGT GCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACA CAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGC ACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGA ACAGCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTA CACCATCCCCCCACCCAAAAAACAGATGGCCAAGGACA AGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCG AGGACATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCC GCCGAGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGAAGAC CGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGC AGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGT AGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGA GAAGTCCCTGAGCCACTCCCCCGGCGGCGGAGGCGGT TCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGGGGAAGTGGCG GCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGG AGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCT
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 547/744
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GCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATG TCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATG GGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACG CCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGAC AACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTG CGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGG GCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCAC CCTGGTCACCGTGTCCAGC
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- FcDD_DAPG - 28H1 VL pETR15731 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGACGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCGCCAGC GGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGGCCTGGGTGCG ACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGCA TCAGCTACGACGGCAGCAGCACCTACTACAGAGACAGC GTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAA GAGCACCCTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAGAAGCG AGGACACCGCTACCTACTACTGCGGCAGACACAGCAGC TACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCGTGATGGTCACCGT GTCTAGCGCCAAGACCACACCCCCCAGCGTGTACCCTC TGGCTCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTC ACACTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCC TGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCTCTCTGTCTAGCG GCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTG TACACCCTGTCCTCCAGCGTGACCGTGCCTTCCTCCAC CTGGCCTTCCCAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACC CTGCCAGCTCCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCC CGGGACTGCGGAGGGGGCGGTTCCGGCGGAGGAGGAI CCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGATGGGGGCCTGGT GCAGCCCGGAAGAAGCCTGAAACTGCCCTGTGCTGCCT 120
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 548/744
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CTGGCTTCACATTCTCTGATTACTATATGGCTTGGGTGC GCCAGGCTCCAACAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCATCC ATCTCTTACGACGGCTCCTCCACTTACTACAGGGACTCT GTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGATAACGCCAA GTCTACACTGTACCTGCAGATGGATTCCCTGCGCTCCGA GGACACAGCCACATATTACTGTGGCAGGCACTCCTCCTA CTTTGATTATTGGGGACAGGGCGTGATGGTCACAGTGT CCAGCGCTAAGACCACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTG GCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGAC CCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTG TGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGG CGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGT ACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACC TGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCC TGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCC GGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCC GAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAA GGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCT GCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGT GCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACA CAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGC ACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGA ACAGCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTA CACCATCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACA AGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCG AGGACATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCC
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 549/744
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GCCGAGAACTACGACAACACCCAGCCCATCATGGACAC CGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCGACCTGAACGTGC AGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGT AGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGA GAAGTCCCTGAGCCACAGCCCAGGCGGCGGAGGCGGA TCTGGCGGAGGAGGTTCCGGAGGTGGCGGATCTGGGG GCGGTGGATCTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGC ACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGA GCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCCGGAGCTACCT GGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGA CTGCTGATCATCGGCGCCAGCACCCGGGCCACCGGCAI CCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACT TCACCCTGACCATCAGCCGGCTGGAACCCGAGGACTTC GCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTGATCCCCCC CACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
mu CD40 cadeia leve pETR13185 GACACTGTACTGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCT CCAGGAGAGAGGGTTACCATCTCCTGTAGGGCCAGTGA CAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACC AGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTATCTAGCATCACA CCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTG GAGGCTGATGACACTGCAACCTATTACTGTCAGCAGAGT TGGAATGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCT GGAATTGAAACGTGCCGATGCTGCACCAACTGTATCGAT TTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGC CTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGA CATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACA AAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCA 121
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 550/744
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AAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTG ACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGT GAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAG AGCTTCAACAGGAATGAGTGT
mu CD40-28H1 (4 + 2)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- FC-DAPG- 28H1 VLCH1 pETR15744 GAAGTGCAGCTGGTGGAATCCGACGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCGCCTCC GGCTTCACCTTCTCCGACTACTACATGGCCTGGGTGCG ACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCTCCA TCTCCTACGACGGCTCCTCCACCTACTACCGGGACTCT GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCTCGGGACAACGCCAA GTCCACCCTGTACCTGCAGATGGACTCCCTGCGGAGCG AGGACACCGCTACCTACTACTGCGGCAGACACTCCTCC TACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCGTGATGGTCACCGT GTCCTCTGCTAAGACCACCCCCCCCTCCGTGTACCCTCI GGCTCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACTCCATGGTCA CCCTGGGCTGTCTGGTGGAAGGCTACTTCCCCGAGCCT GTGACCGTGACCTGGAACTCCGGCTCTCTGTCCTCTGG CGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCGACCTGT ACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACC TGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCC TGCCAGCAGCACCAAGGTGGACGAGAAAATCGTGCCCC GGGACTGCGGCGGTGGAGGTTCCGGAGGCGGCGGATC CGAGGTGCAGCTGGTGGAAAGTGATGGGGGCCTGGTG CAGCCCGGAAGAAGCCTGAAACTGCCCTGCGCCGCTTC TGGCTTTACCTTTAGCGATTACTATATGGCTTGGGTGCG CCAGGCTCCAACAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCATCTA 122
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 551/744
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TCAGCTACGATGGCAGCAGCACCTACTATAGAGACAGC GTGAAGGGGAGATTCACCATCAGCAGAGATAACGCTAA GAGCACACTGTACCTGCAGATGGATAGCCTGAGATCCG AGGATACCGCCACATATTACTGTGGCCGGCACAGCAGC TACTTTGATTATTGGGGACAGGGCGTGATGGTCACAGTG TCTAGCGCTAAGACTACCCCTCCTAGCGTGTACCCCCTG GCACCAGGTTCCGCTGCTCAGACCAACAGCATGGTCAC ACTGGGATGCCTGGTGGAAGGATATTTTCCTGAACCCGT GACAGTGACATGGAATAGCGGCTCCCTGTCTAGCGGAG TGCATACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGAGCGATCTGTATA CACTGAGCAGCTCTGTGACAGTGCCTTCCAGCACCTGG CCCAGCCAGACAGTGACCTGTAATGTGGCTCATCCCGC CTCTAGCACCAAAGTGGATGAGAAAATCGTGCCCCGGG ACTGCGGCTGCAAGCCCTGTATCTGTACCGTGCCCGAG GTGTCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCCAAGGAC GTGCTGACAATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGT GGTGGTGGCCATCTCCAAGGACGATCCCGAGGTGCAGT TCAGTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACAGCC CAGACAAAGCCCAGAGAGGAACAGATCAACTCCACCTT CAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACT GGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACTCC GCCGCCTTTGGCGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAA GACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACAA TCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTG TCCCTGACCTGCATGATCACCAAC1 1 1 1TCCCAGAGGAC ATCACCGTGGAATGGCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCG AGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGGACACCGAC GGCTCCTACTTCGTGTACTCCAAGCTGAACGTGCAGAA
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 552/744
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GTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTTCCG TGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAG TCCCTGTCCCACTCCCCTGGAAAAGGCGGAGGCGGATC TGGTGGCGGAGGATCTGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGC GGTGGATCTGAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCAC CCTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCT GCAGAGCCTCTCAGTCCGTGTCCCGGTCTTACCTGGCC TGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCCCGGCTGCT GATCATCGGAGCTTCTACCAGAGCCACCGGCATCCCCG ACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACC CTGACCATCTCTCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGT GTACTACTGCCAGCAGGGCCAAGTGATCCCCCCCACCT TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGTCCAGCGCT AAGACCACCCCCCCCTCCGTGTATCCTCTGGCCCCTGG ATCTGCCGCCCAGACCAACTCCATGGTCACCCTGGGCT GCCTCGTGAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTG ACCTGGAACTCCGGCTCCCTGTCTAGCGGCGTGCACAC CTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCGACCTGTACACCCTGA GCAGCTCCGTGACCGTGCCTTCCTCCACCTGGCCTTCC CAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACCCTGCCAGCTC CACAAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGACTGC
28H1 VHCL (mu) pETR15650 GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGC AGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCC GGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCG ACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCA TCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTG AAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAA CACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGG
123
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 553/744
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ACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGC AACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGT GTCCAGCGCTTCTGATGCCGCCCCTACCGTATCGATTTT CCCACCCTCCAGCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGAGCT AGCGTCGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGAC ATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGCGGCA GAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACCGACCAGGACAGCA AGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTGACCCTG ACCAAGGACGAGTACGAGCGGCACAACAGCTACACATG CGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCAGCCCCATCGTGA AGTCCTTCAACCGGAACGAGTGC
mu CD40 cadeia leve;’ RK’ pETR15649 GACACTGTACTGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCT CCAGGAGAGAGGGTTACCATCTCCTGTAGGGCCAGTGA CAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACC AGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTATCTAGCATCACA CCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTG GAGGCTGATGACACTGCAACCTATTACTGTCAGCAGAGT TGGAATGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCT GGAATTGAAACGTGCCGATGCTGCACCAACTGTATCGAT TTTCCCACCATCCAGTCGGAAGTTAACATCTGGAGGTGC CTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGA CATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACA AAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCA AAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTG ACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGT GAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAG AGCTTCAACAGGAATGAGTGT 124
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 554/744
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mu CD40-DP47 (4 + 1)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- FcKKDAPG- DP47 VH pETR15734 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGACGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCGCCAGC GGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGGCCTGGGTGCG ACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGCA TCAGCTACGACGGCAGCAGCACCTACTACAGAGACAGC GTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAA GAGCACCCTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAGAAGCG AGGACACCGCTACCTACTACTGCGGCAGACACAGCAGC TACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCGTGATGGTCACCGT GTCTAGCGCCAAGACCACACCCCCCAGCGTGTACCCTC TGGCTCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTC ACACTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCC TGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCTCTCTGTCTAGCG GCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTG TACACCCTGTCCTCCAGCGTGACCGTGCCTTCCTCCAC CTGGCCTTCCCAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACC CTGCCAGCTCCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCC CGGGACTGCGGAGGGGGCGGTTCCGGCGGAGGAGGAI CCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGATGGGGGCCTGGT GCAGCCCGGAAGAAGCCTGAAACTGCCCTGTGCTGCCT CTGGCTTCACATTCTCTGATTACTATATGGCTTGGGTGC GCCAGGCTCCAACAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCATCC ATCTCTTACGACGGCTCCTCCACTTACTACAGGGACTCT GTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGATAACGCCAA GTCTACACTGTACCTGCAGATGGATTCCCTGCGCTCCGA GGACACAGCCACATATTACTGTGGCAGGCACTCCTCCTA CTTTGATTATTGGGGACAGGGCGTGATGGTCACAGTGT 125
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 555/744
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CCAGCGCTAAGACCACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTG GCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGAC CCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTG TGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGG CGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGT ACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACC TGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCC TGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCC GGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCC GAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAA GGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCT GCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGT GCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACA CAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGC ACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGA ACAGCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTA CACCATCCCCCCACCCAAAAAACAGATGGCCAAGGACA AGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCG AGGACATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCC GCCGAGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGAAGAC CGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGC AGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGT AGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGA GAAGTCCCTGAGCCACTCCCCCGGCGGCGGAGGCGGT TCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGGGGAAGTGGCG GCGGAGGATCTGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGA
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 556/744
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GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCAGCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAG CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGG GTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGA CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAG GCAGCGGATTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGC
CD40 VHCH1CD40 VHCH1FcDD_DAPGDP47 VL pETR15733 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGACGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCGCCAGC GGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGGCCTGGGTGCG ACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGCA TCAGCTACGACGGCAGCAGCACCTACTACAGAGACAGC GTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAA GAGCACCCTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAGAAGCG AGGACACCGCTACCTACTACTGCGGCAGACACAGCAGC TACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCGTGATGGTCACCGT GTCTAGCGCCAAGACCACACCCCCCAGCGTGTACCCTC TGGCTCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTC ACACTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCC TGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCTCTCTGTCTAGCG GCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTG TACACCCTGTCCTCCAGCGTGACCGTGCCTTCCTCCAC CTGGCCTTCCCAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACC CTGCCAGCTCCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCC CGGGACTGCGGAGGGGGCGGTTCCGGCGGAGGAGGAI CCGAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGATGGGGGCCTGGT 126
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 557/744
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GCAGCCCGGAAGAAGCCTGAAACTGCCCTGTGCTGCCT CTGGCTTCACATTCTCTGATTACTATATGGCTTGGGTGC GCCAGGCTCCAACAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCATCC ATCTCTTACGACGGCTCCTCCACTTACTACAGGGACTCT GTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGATAACGCCAA GTCTACACTGTACCTGCAGATGGATTCCCTGCGCTCCGA GGACACAGCCACATATTACTGTGGCAGGCACTCCTCCTA CTTTGATTATTGGGGACAGGGCGTGATGGTCACAGTGT CCAGCGCTAAGACCACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTG GCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGAC CCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTG TGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGG CGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGT ACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACC TGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCC TGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCC GGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCC GAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAA GGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCT GCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGT GCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACA CAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGC ACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGA ACAGCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTA CACCATCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACA AGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCG
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 558/744
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AGGACATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCC GCCGAGAACTACGACAACACCCAGCCCATCATGGACAC CGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCGACCTGAACGTGC AGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGT AGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGA GAAGTCCCTGAGCCACAGCCCAGGCGGCGGAGGCGGA TCTGGCGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGCGGAAGCGGAG GGGGAGGCTCTGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCCGGC ACCCTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACCCTGAG CTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCTCTTACCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTG CTGATCTACGGCGCCTCTTCTAGAGCCACCGGCATCCC CGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCA CCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTTGCC GTGTATTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCCTGAC CTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAA
+ mu CD40 cadeia leve ver acima 121
mu CD40 x DP47 (4 + 2)
CD40 VHCH1- CD40 VHCH1- FC-DAPG- 28H1 VLCHT EE’ pETR15748 GAAGTGCAGCTGGTGGAATCCGACGGCGGACTGGTGC AGCCTGGCAGATCTCTGAAGCTGCCTTGTGCCGCCTCC GGCTTCACCTTCTCCGACTACTACATGGCCTGGGTGCG ACAGGCCCCTACCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCTCCA TCTCCTACGACGGCTCCTCCACCTACTACCGGGACTCT GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCTCGGGACAACGCCAA GTCCACCCTGTACCTGCAGATGGACTCCCTGCGGAGCG AGGACACCGCTACCTACTACTGCGGCAGACACTCCTCC TACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCGTGATGGTCACCGT 127
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 559/744
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GTCCTCTGCTAAGACCACCCCCCCCTCCGTGTACCCTCI GGCTCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACTCCATGGTCA CCCTGGGCTGTCTGGTGGAAGGCTACTTCCCCGAGCCT GTGACCGTGACCTGGAACTCCGGCTCTCTGTCCTCTGG CGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCGACCTGT ACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACC TGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCC TGCCAGCAGCACCAAGGTGGACGAGAAAATCGTGCCCC GGGACTGCGGCGGTGGAGGTTCCGGAGGCGGCGGATC CGAGGTGCAGCTGGTGGAAAGTGATGGGGGCCTGGTG CAGCCCGGAAGAAGCCTGAAACTGCCCTGCGCCGCTTC TGGCTTTACCTTTAGCGATTACTATATGGCTTGGGTGCG CCAGGCTCCAACAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCATCTA TCAGCTACGATGGCAGCAGCACCTACTATAGAGACAGC GTGAAGGGGAGATTCACCATCAGCAGAGATAACGCTAA GAGCACACTGTACCTGCAGATGGATAGCCTGAGATCCG AGGATACCGCCACATATTACTGTGGCCGGCACAGCAGC TACTTTGATTATTGGGGACAGGGCGTGATGGTCACAGTG TCTAGCGCTAAGACTACCCCTCCTAGCGTGTACCCCCTG GCACCAGGTTCCGCTGCTCAGACCAACAGCATGGTCAC ACTGGGATGCCTGGTGGAAGGATATTTTCCTGAACCCGT GACAGTGACATGGAATAGCGGCTCCCTGTCTAGCGGAG TGCATACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGAGCGATCTGTATA CACTGAGCAGCTCTGTGACAGTGCCTTCCAGCACCTGG CCCAGCCAGACAGTGACCTGTAATGTGGCTCATCCCGC CTCTAGCACCAAAGTGGATGAGAAAATCGTGCCCCGGG ACTGCGGCTGCAAGCCCTGTATCTGTACCGTGCCCGAG GTGTCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCCAAGGAC
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 560/744
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GTGCTGACAATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGT GGTGGTGGCCATCTCCAAGGACGATCCCGAGGTGCAGT TCAGTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACAGCC CAGACAAAGCCCAGAGAGGAACAGATCAACTCCACCTT CAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACT GGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACTCC GCCGCCTTTGGCGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAA GACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACAA TCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTG TCCCTGACCTGCATGATCACCAAC1 1 1 1TCCCAGAGGAC ATCACCGTGGAATGGCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCG AGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGGACACCGAC GGCTCCTACTTCGTGTACTCCAAGCTGAACGTGCAGAA GTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTTCCG TGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAG TCCCTGTCCCACTCCCCTGGAAAAGGCGGAGGCGGATC TGGTGGCGGAGGATCTGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGC GGAGGATCCGAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCAC CCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCT GGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTC ATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGA CAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTC TCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGT ATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTGACGTTCG GCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAAAGCAGCGCTAAG ACCACCCCCCCCTCCGTGTATCCTCTGGCCCCTGGATC TGCCGCCCAGACCAACTCCATGGTCACCCTGGGCTGCC
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 561/744
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TCGTGAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGACC TGGAACTCCGGCTCCCTGTCTAGCGGCGTGCACACCTT TCCAGCTGTGCTGCAGTCCGACCTGTACACCCTGAGCA GCTCCGTGACCGTGCCTTCCTCCACCTGGCCTTCCCAG ACCGTGACATGCAACGTGGCCCACCCTGCCAGCTCCAC AAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGACTGC
+ mu CD40 cadeia leve; ,RK’ ver acima 124
DP47 VHCL (mu) pETR15652 GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACA GCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCC AGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATT AGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGT GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGA ACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAG GACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATT TGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGA GCGCTTCTGATGCCGCCCCTACCGTATCGAI I I ICCCAC CCTCCAGCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGAGCTAGCGT CGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAA CGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGCGGCAGAAC GGCGTGCTGAATAGCTGGACCGACCAGGACAGCAAGGA CTCCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTGACCCTGACCA AGGACGAGTACGAGCGGCACAACAGCTACACATGCGAG GCCACCCACAAGACCAGCACCAGCCCCATCGTGAAGTC CTTCAACCGGAACGAGTGC 128
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 562/744
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1.2 Produção de moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno visando CD40 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) [0346] As moléculas foram produzidas por co-transfecção de células HEK293-EBNA crescendo em suspensão com os vetores de expressão de mamífero utilizando polietilenimina (PEI) ou co-transfecção de células CHO K1 crescendo em suspensão com a expressão de mamífero utilizando eviFECT. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes.
[0347] Para produção em células HEK293 EBNA, as células HEK293 EBNA foram cultivadas em suspensão isenta de soro em meio de cultura Excell contendo 6 mM de L-glutamina e 250 mg/ L de G418. Para a produção em frascos de tubos de ensaio de 600 mL (volume máximo de trabalho de 400 mL) 600 milhões de células HEK293 EBNA foram semeadas 24 horas antes da transfecção. Para transfecção, 800 milhões de células foram centrifugadas durante 5 min a 210 x g e o sobrenadante foi substituído por 20 mL de meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD CHO atuma quantidade final de 400 de DNA. Após adição de 1080 de solução de PEI (2,7 / mL) a mistura foi submetida a vértice durante 15 são e subsequentemente incubada durante 10 min temperatura ambiente. Em seguida, as células foram misturadas com a solução de DNA/ PEI, transferidas para um frasco de tubos de ensaio de 600 mL e incubadas durante 3 horas a 37 SC em uma incubadora com uma atmosfera de CO2 a 5%. Após incubação, foi adicionado meio de Excell de 360 mL, contendo Lglutamina 6 mM, Pepsoy 5 g/ L e VPA 1,25 mM e as células foram cultivadas durante 24 horas. Um dia após a transfecção adicionou-se 12% de alimento 7 e 3 g/ L de glicose. Após 7 dias, o sobrenadante do cultivo foi coletado para purificação por centrifugação por 60 min a 2500 x g (centrífuga Sigma 8K). A solução foi filtrada para esterilização (filtro de 0,22) e adicionou-se azida de
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273/387 sódio atuma concentração final de 0,01% p/ v e mantida a 4 SC.
[0348] Para produção em células HEK293 EBNA HEK293 EBNA em células CHO K1 adaptadas a suspensão (adaptadas ao crescimento sem soro em cultura em suspensão) as células foram cultivadas em meio eviGrow (evitria AG, Suíça), um soro quimicamente definido, livre de componentes animais sem o meio e transfectados com eviFect (evitria AG, Suíça). Após a transfecção, as células foram mantidas em eviMake (evitria AG, Suíça), em um meio isento de soro quimicamente definido, isento de componentes animais, a 37 SC e 5% de CO2 durante 7 dias.
[0349] Após 7 dias, o sobrenadante do cultivo foi coletado para purificação por centrifugação por 45 min na velocidade máxima em um Rotanta 460 RC. A solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 pm) e mantida a 4 SC. A concentração das moléculas no meio de cultura foi determinada por HPLC de Proteína A ou Interferometria de Proteína A-Bio-Camada (BLI).
[0350] A proteína segregada foi purificada a partir de sobrenadantes de culturas celulares por cromatografia de afinidade utilizando cromatografia de afinidade com Proteína A, seguida de um passo cromatográfico de exclusão de tamanho. Para cromatografia de afinidade, o sobrenadante foi carregado em uma coluna HiTrap MabSelet SuRe (Volume da Coluna (CV) = 5 mL, GE Healthcare) equilibrada com 25 mL de fosfato de sódio 20 mM, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com pelo menos 10 CV 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5 e a proteína alvo foi eluída em 6 CV 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, 100 mM glicina, pH 3,0. A solução de proteína foi neutralizada pela adição de 1/10 de fosfato de sódio a 0,5 M, pH 8,0. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad XK16/ 60 Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0, Tween 20 a 0,01%. A
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274/387 concentração proteica da amostra de proteína purificada foi determinada medindo a densidade óptica (DO) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos.
[0351] A pureza e o peso molecular da molécula após o passo de purificação final foram analisados por análises CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor. O sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) foi usado de acordo com as instruções do fabricante.
[0352] O conteúdo agregado da molécula foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em fosfato de potássio 25 mM, cloreto de sódio 125 mM, mono-hidrocloreto de L-arginina 200 mM, NaN3 a 0,02% (p/ v), pH 6,7 de tampão de corrida a 25 SC.
Tabela 5: Rendimento de produção e qualidade de moléculas de ligação de
ANTÍGENO CD40 BIESPECÍFICAS
Construção Rendimento [mg/L] Concentração [mg/ml] Monômero [%] HMW [%] LMW [%]
huCD40-28H1;4 + 1 48,2 8,9 97,8 1,2 1,0
huCD40-28H1; 4 + 2 48,1 9,2 99,7 0,3 -
huCD40-28H1; 2 + 1 10,1 2,0 99,5 0,5 -
huCD40-28H1; 2 + 2 26,7 2,0 100,0 - -
huCD40-DP47; 4 + 1 15,5 2,3 98,7 1,3 -
huCD40-DP47; 4 + 2 33,8 3,6 96,8 3,2 -
huCD40 IgG 190,3 11,8 99,8 0,2 -
muCD40-28H1;4 + 1 3,4 0,5 92,4 7,6 -
muCD40-28H1; 4 + 2 3,9 1,6 98,9 0,4 0,7
muCD40 IgG 19,8 5,0 97,8 - 2,2
muCD40-DP47; 4 + 1 2,2 0,3 90,6 9,4 -
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Construção Rendimento [mg/L] Concentração [mg/ml] Monômero [%] HMW [%] LMW [%]
muCD40-DP47; 4 + 2 1,5 0,6 86,5 7,8 5,7
1.3 Geração de outras moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno
VISANDO CD40 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) [0353] Em analogia com o Exemplo 1.1, foram preparados diferentes tipos de construções de anticorpos biespecíficos CD40-FAP. Por exemplo, preparou-se um anticorpo biespecífico constituído por uma unidade de ligação a CD40 combinada com uma porção de ligação a FAP (Figura 15A). Como a tecnologia CrossMab, conforme descrito no documento WO 2010/145792 A1, foi usada para garantir o emparelhamento correto da cadeia leve, o formato é chamado de 1 + 1 crossmab. Outro formato 2 + 1 chamado “cabeça a cauda” foi preparado em que um Fab de ligação a CD40 é fundido ao terminal N de um Fab de ligação a FAP (Figura 15B) e um formato adicional 2 + 1 que consiste em duas unidades de ligação de CD40 combinadas com qualquer uma das reticulações de ligação FAP no terminal C de um FC(Figura 1E) foi produzida. Além disso, foi preparado um formato 4 + 1 que consiste em quatro unidades de ligação a CD40 combinadas com uma placa cruzada de ligação a FAP no terminal C de um FC (Figura 15C). Em todas estas construções, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve do ligante antiCD40 correspondem ao ligante de CD40 como descrito no documento WO 2006/128103 (SEQ ID Ns: 10 e SEQ ID Ns: 16 do referido documento). A geração e preparação do ligante de FAP 28H1 está descrita no documento WO 2012/020006 A2, que é aqui incorporado por referência. Para gerar as moléculas 1 +1,2 + 1 e 4 + 1, a tecnologia knob-\fíto-hole foi usada para alcançar a heterodimerização. As mutações S354C/ T366W foram introduzidas na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada de maçaneta Fc) e as
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276/387 mutações Y349C/ T366S/ L368A/ Y407V são introduzidas na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada de furo Fc). Além disso, a tecnologia CrossMab, conforme descrito no documento WO 2010/145792 A1, garante o emparelhamento correto da cadeia leve. Independentemente do formato biespecífico, em todos os casos foi utilizado um Fc silencioso efetor (P329G; L234, 234A) para anular a ligação aos receptores Fcy de acordo com o método descrito em WO 2012/130831 A1. Sequências de aminoácidos das moléculas biespecíficas são mostradas na Tabela 6.
[0354] Todos os genes são expressos transientemente sob o controle de um promotor quimérico de MPSV que consiste no promotor nuclear de MPSV combinado com o fragmento potenciador do promotor de CMV. O vetor de expressão também contém a região oriP para replicação epissômica em células hospedeiras contendo EBNA (Antígeno Nuclear de Vírus de Epstein Barr).
Tabela 6: Sequências de aminoácidos das moléculas biespecíficas de ligação
AO ANTÍGENO
Construção Sequência SEQ ID Ne:
P1AE0192 CD40 x FAP (28H1) (1 + 1) crossmab
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQ APGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSAS VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
28H1 (VLCH1)_FC knob_ ΕIVLTQS PGTLSLSPG E RATLSC RASQSVSRSYLAWYQQK PGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPE DFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAP 163
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
PGLALA SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CD40 (VHCH1 carregado)_Fc Z?o/e_PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSL SLSPG 164
CD40 cadeia leve (carregado) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC 165
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278/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
P1AE0408 CD40 x FAP (28H1) (2 + 1) topo a base
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQ APGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSAS VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
CD40 cadeia leve (carregado) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC 165
CD40 (VHCH1 carregado)_28 H1 (VLCH1)_FC knob_ PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEIVLTQSPGT LSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIG ASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQG QVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV 166
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279/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CD40 (VHCH1 carregado)_Fc /?o/e_PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSL SLSPGK 164
CD40 x FAP (28H1) (2 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQ APGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSAS VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
CD40 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 165
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
(carregado) SLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC
CD40 (VHCH1 carregado)_Fc knob_PGL/\L A_28H1 (VLCH1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLS PGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVI PPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 167
CD40 (VHCH1 carregado)_Fc /?o/e_PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL 168
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPG
P1AE0637 CD40 x FAP (28H1) (4 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQ APGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSAS VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
CD40 cadeia leve (carregado) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC 165
CD40 (VHCH1 carregado_CD 40 (VHCH1 carregado)-Fc knob_PGLM_ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGG 169
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
A_28H1 (VLCH1) GLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWV ARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRA EDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD EKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTK VEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CD40 (VHCH1 carregado_CD 40 (VHCH1 carregado)-Fc /?o/e_PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWV ARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRA EDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP 170
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD EKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Expressão dos anticorpos biespecíficos [0355] Os anticorpos foram expressos por transfecção transiente de células HEK crescidas em suspensão com vetores de expressão codificando as 4 cadeias peptídicas diferentes. A transfecção em células HEK293-F (Invitrogen) foi realizada de acordo com as instruções do fornecedor de células utilizando preparações Maxiprep (Qiagen) dos vetores de anticorpo, meio F17 (Invitrogen, EUA), Peipro (Polyscience Europe GmbH) e uma densidade celular inicial de 1- 2 milhões de células viáveis/ ml em meio de expressão FreeStyle 293 isento de soro (Invitrogen). Os sobrenadantes da cultura de células foram recolhidos após 7 dias de cultura em frascos de agitação ou fermentadores agitados por centrifugação a 14000 g durante 30 minutos e filtrados através de um filtro de 0,22 μιτι.
Purificação dos anticorpos biespecíficos [0356] Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes de culturas celulares por cromatografia de afinidade utilizando cromatografia MabSeletSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Suécia). Em resumo, os sobrenadantes de culturas celulares filtradas esterilizadas foram capturados em uma resina MabSelet SuRe equilibrada com tampão PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCI 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4), lavado com tampão de equilíbrio e eluído com 25 mM de acetato, pH 3,0. Após neutralização com Tris
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M pH 9,0, a proteína agregada foi separada das espies de anticorpo monomérico por cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0. As frações de proteína monoméricas foram reunidas, concentradas, se necessário, utilizando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO) e armazenadas a -80 SC. Alíquotas de amostras foram usadas para posterior caracterização analítica, por exemplo, por CE-SDS, cromatografia por exclusão de tamanho, espectrometria de massa e determinação de endotoxina.
1.4 Caracterização de construções biespecíficas visando CD40 e FAP
1.4.1 Ligação a células de fibroblastos murinos que expressam FAP humanas OU DE CAMUNDONGO [0357] A ligação a FAP da superfície celular foi testada utilizando células expressando a proteína ativadora de fibroblastos humanos (huFAP) clone NIH/ 3T3-huFAP 19 ou proteínas ativadoras de fibroblastos de camundongo (mFAP) clone NIH/ 3T3-mFAP clone 26. clone NIH/ 3T3-huFAP 19 e o clone NIH/ 3T3-mFAP 26 foi gerado por transfecção da linha celular NIH/ 3T3 de fibroblastos embrionáricos de camundongo (ATCC CRL-1658) com o vetor de expressão pETR4921 para expressar sob 1,5 purificação com puromicina huFAP ou mFAP, respectivamente. Células do tipo selvagem NIH/ 3T3 (wt) que não foram transfectadas com FAP e que não expressam FAP foram utilizadas como controle negativo.
[0358] As células NIH/ 3T3-huFAP, NIH/ 3T3-mFAP ou NIH/ 3T3wt foram cultivadas com 1 x Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (gibco, lote Ns 42430-025) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) (tecnologias de vida, Lote Ns 16140, Lote Ns 1797306A). Para as células NIH/ 3T3-huFAP e NIH/ 3T3-mFAP, adicionou-se 1,5 pg/ mL de puromicina (gibco, lote Ns A11138-03) ao meio para seleção de células que expressam FAP. As células NIH/ 3T3 foram removidas da placa utilizando tampão de dissociação
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285/387 celular isento de enzimas (gibco, lote Ns 13151014). O clone NIH/ 3T3-huFAP de 0,3 x 105 clone 19, clone NIH/ 3T3-mFAP 26 ou NIH/ 3T3 foi adicionado em 200 μΙ_ de 1 x DMEM 10% FBS a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo um, cellstar, lote Ns 650185). As placas foram centrifugadas 5 minutos a 1700 rpm e os sobrenadantes foram removidos. As células foram lavadas uma vez com 200 μΙ_ de tampão FACS frio a 4 SC (eBioscience, Lote Ns 00-4222-26). Todas as amostras foram ressuspensas em 50 pL/ poço de tampão FACS frio de 4 SC contendo as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno (anticorpo primário) ou anticorpo de controle do isotipo DP47 na faixa de concentrações indicada (em duplicados) e incubadas durante 120 minutos a 4 SC. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com 200 pL de tampão FACS frio a 4 SC. As células foram ainda coradas com 25 pL/ poço de solução de anticorpo secundário frio a 4 SC (diluição 1:50 de anticorpo secundário) contendo conjugado com R-ficoeritrina (PE) AffiniPure F (ab ')2 Fragmento IgG Anti-Humano de Cabra, Específico do Fragmento Fey (Jackson ImmunoResearch, Lote Ns 109-116-098) e incubado durante 60 minutos a 4 SC no escuro. As células foram lavadas com 200 pL de tampão FACS e ressuspensas em 85 pL/ poço de tampão FACS contendo 0,2 mg/ mL de DAPI (Roche, Lote Ns 10236276001) e adquiridas no mesmo dia utilizando LSRFortessa de 5 laser (BD Bioscience com DIVA Programas). A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10 (FlowJo LLC).
[0359] Como mostrado nas Figuras 2A, 2B e Figura 17, os anticorpos biespecíficos monovalentes ou bivalentes para FAP ligam-se a células alvo expressando FAP humanas e de camundongo. Portanto, apenas moléculas de ligação ao antígeno anti-CD40 direcionadas para FAP apresentam propriedades diretas direcionadas para o tumor. As construções de FAP bivalente com domínios de ligação FAP C-terminais ligam-se mais fortemente do que a construção monovalente com o domínio de ligação FAP
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286/387 terminal C explicado por um ganho de avidez no bivalente em relação ao formato FAP monovalente. A ligação de FAP mais forte foi observada para o formato 1 + 1 (P1AE0192). Não foi detectada ligação dos anticorpos direcionados para FAP às células NIH/ 3T3-wt. Os valores de EC50 medidos para diferentes anticorpos biespecíficos são mostrados na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7: Caracterização de ligação de FAP humana de 28H1 em diferentes
FORMATOS DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS.
Molécula ECso [nM]
P1AD4470 CD40 lgG1 PGLALA n/a
P1AE0637 CD40 x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 10,46
P1AD4453 CD40 x FAP 4 + 1 47,14
P1AD4574 CD40 x DP47 4 + 1 n/a
P1AD4455 CD40 x FAP 4 + 2 3,64
P1AD4465 CD40 x DP474 + 2 n/a
P1AA9641 CD40 x FAP 2 + 1 32,96
P1AE0408 CD40 x FAP 2 + 1 topo a base 7,99
P1AA9663 CD40 x FAP 2 + 2 3,65
P1AE0192 CD40 x FAP 1 + 1 1,15
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 24,26
P1AE0890 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 30,42
1.4.2 Ligação a células Daudi que expressam CD40 humanas [0360]A ligação ao CD40 da superfície celular foi testada utilizando células Daudi, uma linha celular de linfoblastos B humanos com elevados níveis de expressão de CD40 humano (ATCC CCL-213). As células Daudi foram cultivadas com 1 x Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (gibco, Lote Ns 42430-025) suplementado com Soro Bovino Fetal a 10% (FBS) (tecnologias de vida, Lote Ns 16140, Lote Ns 1797306A). Adicionaram-se 0,3 x 105 células Daudi em 200 pL de 1 x DMEM com 10% de FBS a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo (greiner bio-one, cellstar, Lote Ns 650185). As placas foram centrifugadas 5 minutos a 1700 rpm e os sobrenadantes foram removidos.
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287/387
As células foram lavadas uma vez com 200 pÇ de tampão FACS frio a 4 SC (eBioscience, Lote Ns 00-4222-26). Todas as amostras foram ressuspensas em 50 pL/ poço de tampão FACS frio a 4 SC contendo as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno (anticorpo primário) ou anticorpo de controle do isotipo DP47 na faixa de concentrações indicada (em duplicados) e incubadas durante 120 minutos a 4 SC. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com 200 pL de tampão FACS frio a 4 SC. As células foram ainda coradas com 25 pL/ poço de solução de anticorpo secundário frio a 4 SC (diluição 1:50 de anticorpo secundário) contendo conjugado com R-ficoeritrina (PE) AffiniPure F (ab ') 2 Fragmento IgG Anti-Humano de Cabra,, Fragmento Fcy Específico (Jackson ImmunoResearch, Lote Ns 109-116-098) e incubado durante 60 minutos a 4 SC no escuro. As células foram lavadas com 200 pL de tampão FACS e ressuspensas em 85 pL / poço de tampão FACS contendo 0,2 pg/ mL de DAPI (Roche, lote Ns 10236276001) e adquiridas no mesmo dia utilizando um laser de 5 raios LSR-Fortessa (BD Bioscience Software DIVA). A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10 (FlowJo LLC).
[0361] Como se mostra na Figura 18, todos os clones representados ligam-se ao CD40 mas variam na sua força de ligação (valores EC50 bem como intensidade do sinal) às células Daudi positivas para CD40. Anticorpos anti-CD40 bivalentes apresentam maiores níveis de EC50 e atingem platôs de ligação mais elevados em comparação com anticorpos tetravalentes anti-CD40 explicados por sítios de ligação de CD40 mais ocupados por anticorpo e um ganho de avidez do tetravalente em relação aos formatos CD40 bivalentes. O maior valor de EC50 combinado com o menor platô de ligação foi observado para o formato 1 + 1 (P1AE0192). Não foi detectada ligação do anticorpo de controle negativo às células Daudi. Os valores de EC50 medidos
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288/387 para diferentes anticorpos biespecíficos são mostrados na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8: Caracterização da ligação ao CD40 humano de anticorpos CD40
EM DIFERENTES FORMATOS DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS
Molécula EC50[nM]
P1AD4470 CD40 lgG1 PGLALA 0,104
P1AE0637 CD40 x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,015
P1AD4453 CD40 x FAP 4 + 1 0,027
P1AD4574 CD40 x DP47 4 + 1 0,031
P1AD4455 CD40 x FAP 4 + 2 0,030
P1AD4465 CD40 x DP474 + 2 0,036
P1AA9641 CD40 x FAP 2 + 1 0,079
P1AE0408 CD40 x FAP 2 + 1 topo a base 0,044
P1AA9663 CD40 x FAP 2 + 2 0,096
P1AE0192 CD40 x FAP 1 + 1 21,628
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,046
P1AE0890 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,048
Exemplo 2 [0362] Propriedades funcionais de moléculas de ligação de CD40 anti-humano orientadas para FAP
2.1 Ativação mediada por CD40 de células que apresentam o antígeno (APCs) POR MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE CD40 ANTI-HUMANO DIRECIONADAS PARA FAP [0363] A ligação do CD40 induz a maturação de células B e células dendríticas (DC), bem como a ativação e promove a sobrevivência destes tipos de células. Ao CD40 que sinaliza a produção de citocinas e a expressão de moléculas co-estimulatórias na superfície das células B e DCs está aumentada (S. Quezada et al., Annu Revlmmunol. 2004, 22, 307-328; S. Danese et al., Gut. 2004, 53 1035-1043; G. Bishop e outros, Adv Exp Med Biol. 2007, 597, 131-151).
[0364] De modo a testar as propriedades agonistas e a especificidade de FAP dos diferentes anticorpos anti-CD40 dependentes de FAP, as APCs obtidas de camadas de buffy humanas foram incubadas com os
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289/387 anticorpos anti-CD40 humanos agonistas dependentes de FAP e as esferas revestidas com FAP ou FAP humana expressando células NIH/ 3T3. A ativação de APC foi medida por FACS e o sobrenadante das células foi analisado quanto a citocinas por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).
2.1.1 Ativação de células B humanas por moléculas de ligação de CD40 antiHUMANO DIRECIONADAS A FAP UTILIZANDO CÉLULAS NIH/ 3T3-HUFAP COMO FONTE
DE ANTÍGENO [0365] Células NIH/ 3T3 expressando FAP foram usadas como fonte de antígeno para as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno. As células NIH/ 3T3-huFAP foram geradas por transfecção de células NIH/ 3T3 de fibroblastos embrionários de camundongo (ATCC CRL-1658) com o plasmídeo de expressão pETR4921 codificando FAP humana sob um promotor de CMV. As células NIH/ 3T3-huFAP ou células NIH/ 3T3-wt foram irradiadas com 27 Gy utilizando um irradiador RS 2000 (Rad Source Technologies para impedir a proliferação das células. 0,2 x 105 células NIH/ 3T3 irradiadas em 100 pL de meio R10 que consiste em Meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (gibco, Lote Ns 31870-025) fornecido com 10% de FBS, 1% (v/ v) Penicilina Estreptomicina (gibco, Lote Ns 15070-063), 1% (v/ v) L-Glutamina (gibco, Lote NQ 25030-024), 1% (v/ v) Piruvato de Sódio (gibco, Lote Ns 11360039), 1% (v/ v) de MEM não Os aminoácidos essenciais (gibco, Lote Ns 11140035) e β-Mercaptoetanol 50 pL (gibco, Lote Ns 31350-010) foram semeados por poço de uma placa de fundo plano de 96 poços (TPP, Lote Ns 92696).
[0366] No dia seguinte, obteve-se uma camada leopardo da Stiftung Zurcher Blutspendedienst SRK. De modo a isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), 50 mL de camada leucoplaquetária foram diluídos no mesmo volume de PBS (gibco, Lote Ns 10010023). Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL (TPP, Lote Ns 91050) foram fornecidos com 15 mL de Lymphoprep™ (STEMCELL
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Technologies, Lote Ns 07851) e 25 mL da solução de buffy/ PBS por tubo foram cuidadosamente colocados acima do Lymphorep™. Os tubos foram centrifugados a 2000 rpm por 24 minutos a temperatura ambiente com baixa aceleração e sem quebra. Posteriormente, as PBMCs foram coletadas da interface, lavadas três vezes com PBS, ressuspensas em 10 mL de PBS e as células foram analisadas quanto ao tipo e número de células com um contador de células Beckman Coulter Ac T ® 5diff OV (Beckman Coulter, Lote Ns 6605580). Antes do isolamento das células B das PBMCs, a fração positiva para CD14 foi removida por marcação magnética das células positivas para CD14 com microesferas de CD14 (Miltenyi, Lote Ns 130-050-201) e subsequente isolamento com o autoMACS® Pro. Separador (Miltenyi, Lote Ns 130-092-545). A fração negativa para CD14 foi utilizada para isolamento subsequente de células B com o estojo de isolamento de células B Miltenyi II (Lote Ns 130-091-151) e separação autoMACS. Foram adicionadas 1 χ 105 células B em 50 pL de meio R10 por poço às células NIH/ 3T3. Anticorpos antiCD40 humanos orientados para FAP foram adicionados em 50 pL de meio R10 às células B em concentrações que variaram de 1 pg/ mL a 0,3 ng/ mL (série de diluições 3x). Como controle positivo, foram utilizados os anticorpos antiCD40 humanos agonistas independentes de FAP R07009789 (lgG2, INN: Selicrelumab) e SGN-40 (lgG1, INN: Dacetuzumab). Ambos os anticorpos são bivalentes para o CD40. Uma vez que é descrito na literatura que o anticorpo SGN-40 requer reticulação do receptor Fc para atividade biológica (C. Law et al., Cancer Res 2005, 65, 8331-8338), um mecanismo que está sendo discutido R07009789 (R. Dahan et al., Cancer Cell 2016, 29, 1-12), estes dois anticorpos foram incubados com um fragmento F(ab’)2 específico do fragmento de IgG Fc de cabra anti-reticulada (Jackson ImmunoResearch, lote Ns 109-006008) por 30 minutos antes da adição às células B. Após 48 horas as células foram transferidas para uma placa de 96 poços de fundo redondo, lavadas uma
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291/387 vez com PBS e incubadas com 50 μΙ_ de 3 pg/ mL de Controle de Isotipo de IgG de Rato que bloqueia o receptor de FC(ThermoFisher Scientific, lote Ns 10400C) em PBS. Após 15 minutos de incubação a 4 SC, as células foram lavadas com PBS e foram adicionados 50 pL de uma mistura de anticorpos marcados com fluorescência em PBS células. Utilizaram-se os seguintes anticorpos marcados com fluorescência: BV83 de CD83 anti-humano (Biolegend, clone HB15e, Lote Ns 305324), BV605 anti-humano CD605 (BD Biosciences, clone L307.4, Lote Ns 563315), anti-HLA -ABC FITC(BD Biosciences, clone G46-2.6, Lote Ns 555552), CD14 PerCP-Cy5.5 anti-humano (Biolegend, clone HCD14, Lote Ns 325622), CD3 anti-humano PerCP-Cy5.5 (Biolegend, clone UCHT1, Lote Ns 300430), PE CD70 anti-humano (Biolegend, clone 113-16, Lote Ns 355104), CD86 PE-CF594 anti-humano (BD Biosciences, clone FUN-1, lote Ns 562390), APC anti-HLA-DR (BD Biosciences, clone G466, Lote Ns 559866) e APC-H7 CD19 anti-humana (BD Biosciences, clone SJ25C1, Lote Ns 560177). De modo a distinguir entre células vivas e células mortas, adicionou-se à mistura de anticorpos o corante de viabilidade Zombie Aqua™ (Biolegend, Lote Ns 423102). Após 30 minutos de incubação a 4 SC, as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois ressuspensas em 200 pL de PBS. As células foram analisadas no mesmo dia utilizando um laser LSRFortessa de 5 lasers (software BD Bioscience with DIVA). A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10 (FlowJo LLC). Células vivas (aqua negativas), negativas para CD14 e CD3 e positivas para CD19 foram analisadas para expressão de CD70, CD80, CD83 e CD86.
[0367] As Figuras 3A a 3H mostram a regulação positiva dependente de FAP de marcadores de ativação de células B CD70 (Figuras 3A e 3B), CD80 (Figuras 3C e 3D), CD83 (Figuras 3E e 3F) e CD86 (Figuras 3G e 3H) por ligação de antígeno biespecífico moléculas tetravalentes para CD40 humano e mono- ou bivalente para FAP. O anticorpo biespecífico monovalente
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292/387 para FAP induziu um aumento semelhante da expressão do marcador de ativação como a molécula com duas porções de ligação a FAP. Com as células NIH/ 3T3-FAP, a regulação positiva dos marcadores de ativação de células B pelas moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno foi comparável à regulação positiva induzida pelos anticorpos de controle positivo independentes de FAP. Sem a presença de PAF (células NIH/ 3T3-wt) não foi observado aumento dos marcadores de ativação das células B com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos de controle positivo induziram uma sobrerregulação na expressão destes marcadores.
2.1.2 Ativação de células Daudi humanas por moléculas de ligação de CD40 ANTI-HUMANO ORIENTADAS PARA FAP USANDO DYNABEADS® REVESTIDAS COM FAP
COMO FONTE DE ANTÍGENO [0368] Adicionaram-se 1 χ 105 células Daudi em 100 pL de 1 x DMEM mais 10% de FBS por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Em vez de utilizar células que expressam FAP como fonte de antígeno, estreptavidina Dynabeads® (ThermoFisher Scientific, Ns de catálogo: 11205D) foram revestidas com FAP de camundongo biotinilada (produzida internamente) (capacidade de ligação de 6,5 χ 104 contas: 0,01 pg de proteína) de acordo com as instruções do fabricante e adicionadas às células Daudi em uma proporção de esferas: células de 2: 1 em 50 pL de meio R10. O uso de esferas revestidas com FAP em vez de células que expressam FAP fornece um sistema mais estável e reproduzível, uma vez que a qualidade flutuante das células e a secreção de produtos celulares que podem influenciar o status de ativação de APC representam fatores que potencialmente distorcem os resultados. Como grânulos de controle não revestidos foram adicionados às células Daudi. Foram adicionados anticorpos anti-CD40 anti-humanos orientados para FAP ou anticorpos de controle positivo (descritos na seção 2.1.1) em 50 pL de meio R10 às células Daudi. Após 2 dias, as células Daudi
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293/387 foram analisadas por FACS seguindo os procedimentos de coloração e análise especificados em 2.1.1.
[0369] As células B analisadas após 2 dias de incubação com anticorpos anti-CD40 agonistas mostraram um aumento na expressão de CD70 para todos os anticorpos (ver Figuras 20A e B). Os valores de EC50 de moléculas específicas estão resumidos na Tabela 9 abaixo. A regulação positiva destes marcadores de expressão foi dependente de FAP no caso dos diferentes anticorpos direcionados para FAP e o aumento da expressão induzida por estes anticorpos dependentes de FAP foi superior comparado com o aumento induzido pelo anticorpo de CD40 reticulado (P1AD4470). Na ausência de FAP (esferas não revestidas) não se observou aumento de CD70 com os anticorpos biespecíficos representados mono ou bivalentes para CD40, enquanto moléculas de ligação a CD40 tetravalentes induziram uma sobrerregulação de CD70, mas em menor extensão do que na presença de FAP indicando uma baixa, mas detectável, ativação de CD40 independente de CD40 de ligante de CD40 tetravalente em células Daudi.
Tabela 9: Ativação de células Daudi humanas usando Dynabeads®
REVESTIDAS COM FAP
Molécula EC50[nM]
P1AD4470 CD40 lgG1 0,756
P1AE0637 CD40 x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,029
P1AD4453 CD40 x FAP 4 + 1 0,015
P1AD4574 CD40 x DP47 4 + 1 0,166
P1AD4455 CD40 x FAP 4 + 2 0,039
P1AD4465 CD40 x DP474 + 2 n/a
P1AA9641 CD40 x FAP 2 + 1 0,068
P1AE0408 CD40 x FAP 2 + 1 topo a base 0,094
P1AA9663 CD40 x FAP 2 + 2 0,124
P1AE0192 CD40 x FAP 1 + 1 0,409
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,055
P1AE0890 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,058
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2.1.3 Ativação de células B humanas por moléculas de ligação de CD40 antiHUMANO ORIENTADAS PARA FAP UTILIZANDO DYNABEADS® REVESTIDAS COM FAP
COMO FONTE DE ANTÍGENO [0370] As células B foram isoladas a partir de camadas leucoplaqueiras como descrito na seco 2.1.1 e foram adicionadas 1 χ 105 células B em 100 pL de meio R10 por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Streptavidin Dynabeads® (ThermoFisher Scientific, lote Ns : 11205D) foram revestidos com FAP humano ou de camundongo biotinilado (produzido internamente) (capacidade de ligação de 6,5 χ 104 esferas: 0,01 pg de proteína) de acordo com as instruções do fabricante e adicionados à Células B em uma proporção de esferas: células de 2: 1 em 50 pL de meio R10. Como grânulos de controle não revestidos foram adicionados às células B. Os anticorpos anti-CD40 humanos orientados para FAP ou anticorpos de controle positivo (descritos na seção 2.1.1) foram adicionados em 50 pL de meio R10 às células B. Após 2 dias, as células B foram analisadas por FACS seguindo os procedimentos de coloração e análise especificados em 2.1.1. De forma alternativa, as células B foram cultivadas durante cinco dias na presença dos anticorpos anti-CD40 agonísticos e foram tomados 110 pL de sobrenadante para medição de IL-6 utilizando o kit IL-6 DuoSet ELISA humano (R & D, Cat. NDY206-05). Sabe-se que as células B produzem quantidades aumentadas de IL-6 após estimulação com o ligando de CD40 sem a necessidade de estímulos adicionais ao receptor de células B (M. Duddy et al., J. Immunol. 2004, 172, 3422-3427). O ELISA foi realizado como descrito no protocolo fornecido pelo fabricante com a única diferença de usar metade das quantidades recomendadas para cada etapa do ensaio. As células B foram analisadas por FACS seguindo os procedimentos de coloração e análise especificados na seção 2.1.1.
[0371] As células B analisadas após 2 dias de incubação com
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295/387 anticorpos anti-CD40 agonísticos mostraram um aumento na expressão de CD70, CD83 e CD86 para todos os anticorpos (ver Figuras 4A a 4F, Figuras 21A e B e Figuras 25A a D). Os valores de EC50 relativos ao aumento da expressão de CD86 de moléculas específicas estão resumidos na Tabela 10 abaixo. A regulação positiva destes marcadores de expressão foi dependente de FAP no caso dos diferentes anticorpos direcionados para FAP e o aumento da expressão induzida por estes anticorpos dependentes de FAP foi comparável ou ligeiramente inferior ao aumento induzido pelo anticorpo de ligação cruzada CD40 P1AD4470.
Tabela 10: Ativação de células B humanas utilizando Dynabeads®
REVESTIDAS COM FAP APRESENTADAS COMO AUMENTO DA EXPRESSÃO DE CD86
Molécula EC50 [nM]
P1AD4470 CD40 lgG1 0,072
P1AE0637 CD40 x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,202
P1AD4453 CD40 x FAP 4 + 1 0,280
P1AD4574 CD40 x DP47 4 + 1 n/a
P1AD4455 CD40 x FAP 4 + 2 0,325
P1AD4465 CD40 x DP474 + 2 n/a
P1AA9641 CD40 x FAP 2 + 1 0,909
P1AE0408 CD40 x FAP 2 + 1 topo a base 0,658
P1AA9663 CD40 x FAP 2 + 2 1,004
P1AE0192 CD40 x FAP 1 + 1 0,742
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,329
P1AE0890 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,345
[0372] Após 5 dias de incubação de células B com Dynabeads® revestidas com FAP, as moléculas de ligação ao antígeno que se destinam a CD40 e FAP humanas induziram uma regulação positiva da expressão de CD80 dependente de FAP em células B. Os níveis de expressão de CD80 induzidos por anticorpos anti-CD40 humanos com um ou dois locais de ligação a FAP foram comparáveis. O tratamento de células B com anticorpos antiCD40 de controle positivo conduziu a um grau semelhante de sobrerregulação
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296/387 de CD80. A expressão de CD86 elevada, dependente de FAP, pode também ser detectada com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno. Mais uma vez, a presença de um ou dois locais de ligação da FAP não efetuaram grandes diferenças nos níveis de expressão deste marcador de ativação. Em comparação com a regulação positiva independente de FAP de CD86 induzida por SGN-40 reticulado (dacetuzumab) ou anticorpo selicrelumab de CD40 agonista (RO 7009789), a sobrerregulação de CD86 induzida por moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno dependente de FAP foi ligeiramente inferior. Para o CD70 e o CD83, não se observou nenhuma ou muito pouca regulação positiva com os anticorpos biespecíficos visando FAP e CD40, enquanto os anticorpos de controle positivo mostraram claramente um efeito sobre esses marcadores de ativação de células B (Figuras 5A a 5H).
[0373] As Figuras 6A e 6B mostram os efeitos de diferentes anticorpos anti-CD40 agonistas na produção de IL-6 de células B. Com a FAP, a concentração de IL-6 nos sobrenadantes foi elevada a uma extensão semelhante para todos os anticorpos CD40 anti-humanos agonistas testados (aumento de cerca de 6 vezes em comparação com condições não tratadas (UT)). Após a incubação das células B com Dynabeads® não revestidas, não foi detectado nenhum aumento na produção de IL-6 com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno, demonstrando a dependência de FAP destas moléculas.
2.1.4 Ativação de DCs derivadas de monócitos humanos (moDCs) por MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE CD40 ANTI-HUMANO ORIENTADAS PARA FAP USANDO Dynabeads® revestidas com FAP humana como fonte de antígeno.
[0374] As PBMCs foram isoladas de revestimentos buffy pela centrifugação por densidade Lymphoprep™. Posteriormente, os monócitos foram isolados com microesferas CD14 e separação autoMACS® como descrito em 2.1.1. De modo a gerar DCs derivadas de monócitos (moDCs), 3 χ 106
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297/387 monócitos foram semeados por poço de uma placa de 6 poços (TPP, Lote Ns 92006) com uma densidade de 1 χ 106 células por mL. Para o meio moDC de maturação DC que consiste em RPMI 1640 suplementado com 1% (v/ v) de estreptomicina penicilina, 2% (v/ v) de soro humano (inativado pelo calor durante 30 minutos a 56 SC) (Sigma-Aldrich, Lote Ns H4522, Lote Ns SLBP1687V), 20 ng / mL de fator estimulante de colônias de granulócitos recombinantes humano recém-adicionado a macrófagos humanos (GM-CSF) (Peproteh, Lote Ns 300-03-20UG, Lote Ns 081230H1213) e 20 ng / mL de IL-4 humana recombinante recentemente adicionada (Peproteh, Lote Ns 200-04100UG, lote Ns 091514C3116). Após cinco dias, recolheram-se moDCs das placas de 6 poços por remoção suave de células em suspensão e semiaderentes e ressuspenderam-se em meio moDC fresco contendo IL-4 humana e GM-CSF. 2 χ 105 moDCs foram semeados em 100 pL de meio moDC por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Streptavidin Dynabeads® foram revestidos com FAP humana biotinilada e adicionados em 50 pL na relação grânulo/ DC de 2: 1 (como descrito em 2.1.3). Como grânulos de controle não revestidos foram adicionados aos moDCs. Anticorpos anti-CD40 anti-humanos orientados para FAP foram adicionados em 50 pL às DCs em concentrações variando de 1 pg/ mL a 0,3 ng/ mL (3x séries de diluição). Como positivo, independente de FAP controla o anticorpo anti-CD40 humano agonista R07009789 e o anticorpo de CD40 reticulado foi usado. Dois dias após a adição do Dynabeads® e dos diferentes anticorpos CD40 anti-humanos agonistas, a ativação moDC foi medida por FACS. A coloração FACS foi realizada como especificado em 2.1.1 utilizando uma mistura de anticorpos marcados com fluorescência que consiste em CD86 anti-humano BV421 (BD Biosciences, clone FUN-1, Lote Ns 562432), CD80 anti-humano BV605 (BD Biosciences, clone L307.4, Lote Ns 563315), FITC anti-HLA-ABC(BD Biosciences, clone G46-2.6, Lote Ns 555552), CDC PerCp-Cy5.5 anti-humano
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298/387 (BD Biosciences, clone F10/ 21 A3, Lote Ns 565424), PE de CD70 anti-humano (Biolegend, clone 113-16, Lote Ns 355104), CD11c PE-eF610 anti-humano (eBioscience, clone 3.9, Lote Ns 61-0116-42), CD83 anti-humano PE-Cy7 (BD Biosciences, clone HB15e, Lote Ns 561132), APC CD209 anti-humano (BD Biosciences, clone DCN46, Lote Ns 551545), CD3 Alexa Fluor 700 anti-humano (eBioscience, clone OKT3, Lote Ns 56-0037-42), APC-H7 CD14 anti-humano (BD Biosciences, clone M5E2, Lote Ns 561384) e corante de viabilidade Zombie Aqua™ (Biolegend, Lote Ns 423102). As células foram analisadas no mesmo dia usando um laser de 5-LSR-Fortessa. A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10. Células vivas, individuais foram bloqueadas para células negativas para CD3 e negativas para CD14. Com base nessa população, células positivas CD1c e CD11c foram analisadas para a expressão dos marcadores de ativação CD70, CD80, CD83 e CD86.
[0375] Para todos os anticorpos anti-CD40 humanos agonistas, observou-se uma sobrerregulação pronunciada e semelhante de CD83 nos DCMs (Figuras 7E a 7F). No caso dos anticorpos anti-CD40 dependentes de FAP, esta sobrerregulação foi detectada de um modo dependente de FAP. Com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno visando o CD40 e FAP, a expressão de CD80 foi apenas ligeiramente aumentada, contudo este aumento foi dependente de FAP e comparável regulação positiva de CD80 induzida pelo anticorpo de controle positivo R07009789 nas DC(Figuras 7C e 7D). Enquanto a expressão de CD86 não foi significativamente alterada em DCs incubadas com os diferentes anticorpos anti-CD40 em comparação com DC não tratadas (Figuras 7G e 7H), a expressão de CD70 foi elevada devido aos efeitos agonistas destes anticorpos (Figuras 7A e 7B). Mais uma vez, ambos os anticorpos dependentes de FAP mostraram apenas propriedades de ativação quando a FAP estava presente e os seus efeitos no CD70 eram semelhantes. Contudo, o número de moDCs com expressão de CD70 regulada
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299/387 positivamente estava em um intervalo baixo (máximo 8% de células CD11c e CD1c positivas). R07009789 mostrou uma maior potência para regular positivamente CD70 em DCs em comparação com as moléculas biespecíficas neste cenário experimental.
2.1.5 Ativação de células HEK-Blue™ CD40L por moléculas de ligação de CD40 ANTI-HUMANO ORIENTADAS PARA FAP USANDO DYNABEADS® MURINO REVESTIDO COM FAP COMO FONTE DE ANTÍGENO.
[0376] Utilizaram-se células HEK-Blue™ CD40L (InvivoGen, Cat.No. hkb-cd40) como linha celular reptora para analisar a estimulação de CD40 humano mediada por moléculas de ligação a CD40 anti-humano direcionadas para FAP. As células HEK-Blue™ CD40L expressam estavelmente o receptor CD40 humano e a secreção induzível por NFkB de fosfatase alcalina embrionária (SEAP). A ligação do CD40L ou do anticorpo anti-CD40 agonístico ao receptor CD40 expresso em células HE40-Blue CD40L desencadeia uma cascata de sinalização que conduz à produção de SEAP mediada por NFkB. A quantidade de SEAP produzido correlaciona-se diretamente com a extensão da ativação do receptor CD40. Os níveis de SEAP secretado no sobrenadante podem ser medidos com um espectrofotômetro a 620-655 nm. Foram semeadas 0,5 x 105 células HEK-Blue™ CD40L em 160 pL de meio de detecção HEK-Blue™ pré-aquecido (InvivoGen, Lote Ns hb-det2) por poço de uma placa de fundo plano de 96 poços (TPP, Cat. No 92696). Streptavidin Dynabeads® foram revestidos com FAP murino biotinilado e adicionados em 20 pL de PBS em uma proporção de esferas: células de 2: 1 (como descrito em 2.1.3). Como grânulos de controle não revestidos foram adicionados às células repórter. Anticorpos CD40 anti-humanos orientados para FAP foram adicionados em 20 pL de PBS às células em concentrações que variam de 6,89 nM a 0,0032 nM (3x séries de diluição). Como moléculas de controle foram utilizados anticorpos tetravalentes para CD40 humano com
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300/387 um ou dois domínios DP47 em vez de um domínio de ligação a FAP e um anticorpo de CD40 reticulado independente de FAP (P1AD4470). Após 8 horas de incubação a 37 SC os níveis de SEAP no sobrenadante foram medidos por um espectrofotómetro a 650 nm.
[0377] Para todos os anticorpos CD40 anti-humanos agonistas, orientados para FAP, foi observada uma produção de SEAP pronunciada e comparável. No caso de anticorpos biespecíficos direcionados para FAP mono ou bivalente para a produção de SEAP CD40 humano foi detectado apenas na presença de FAP. Em contraste, as células repórter tratadas com anticorpos biespecíficos direcionados a FAP tetravalentes para CD40 humano segregaram SEAP independentemente da disponibilidade de FAP. No entanto, na presença de PAF, foram detectados níveis mais elevados de SEAP no sobrenadante de células repórteres tratadas com estes anticorpos. Além disso, o anticorpo de controle negativo tetravalente para CD40 humano com um ou dois domínios DP47 em vez de um domínio de ligação a FAP induziu produção de SEAP comparável em células HEK-Blue™ CD40L na presença e ausência de FAP. O anticorpo de controle positivo CD40 IgG (P1AD4470) + F(ab) induziu níveis semelhantes de produção de SEAP em comparação com anticorpos biespecíficos direcionados a FAP bivalentes ou tetravalentes para CD40 humano na presença de contas revestidas com FAP (Figuras 8A, 8B, 19 A e B). Os valores de EC50 medidos para o anticorpo CD40 bem como para os diferentes anticorpos biespecíficos são mostrados na Tabela 11 abaixo.
Tabela 11: Ativação de células HEK-Blue™ CD40L usando Dynabeads®
MURINO REVESTIDO COM FAP
Molécula EC50[nM]
P1AD4470 CD40 lgG1 PGLALA 0,125
P1AE0637 CD40 x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,031
P1AD4453 CD40 x FAP 4 + 1 0,067
P1AD4574 CD40 x DP47 4 + 1 0,421
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Molécula EC50[nM]
P1AD4455 CD40 x FAP 4 + 2 0,077
P1AA9641 CD40 x FAP 2 + 1 0,197
P1AE0408 CD40 x FAP 2 + 1 topo a base 0,167
P1AA9663 CD40 x FAP 2 + 2 0,238
P1AE0192 CD40 x FAP 1 + 1 0,639
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,044
P1AE0890 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 0,0005
2.2 Ativação mediada por CD40 de DCs por moléculas de ligação anti-CD40
DIRECIONADAS PARA FAP E SUBSEQUENTE PRIMING DE CÉLULAS T [0378]De modo a demonstrar a capacidade das DC ativadas pelos anticorpos anti-CD40 humanos dependentes de FAP para estimular eficientemente células T, foram estabelecidos ensaios de iniciação de células T in vitro. Para estes ensaios DCs dos baços de camundongos transgênicos expressando o receptor CD40 humano (camundongos huCD40tg) (camundongos com padrão de expressão de receptor de CD40 humano e murino semelhantes; C57BL/ 6 de fundo; gerado pela Taconic) foram isolados, pulsados com o peptídeo SIINFEKL ou com ovalbumina (OVA) (captação de antígeno mediada por receptor DEC-205) e incubada com diferentes anticorpos CD40 anti-humanos agonistas. A FAP foi fornecida via Dynabeads® revestida com FAP para mostrar a dependência de FAP das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno. 24 horas mais tarde células T CD8 positivas foram isoladas de baços de camundongos OT1 (células T positivas para CD8 destes camundongos possuem todas um TCR transgênico reconhecendo SIINFEKL no contexto de H2-Kb; C57BL/ 6-Tg (TcraTcrb) 110OMjb/ Cri, Charles River), ter succinimidico de carboxifluorescea (CFSE) marcado e adicionado DCs pulsadas. No dia cinco do experimento, as citocinas CD e T foram analisadas nos sobrenadantes das células cultivadas e as células T foram analisadas quanto à ativação e capacidade proliferativa.
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2.2.1 Injeção de células T via DCs pulsadas com SIINFEKL ativadas por MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ANTI-CD40 DIRECIONADAS PARA FAP [0379] DCs foram isoladas dos baços de camundongos huCD40tg. Para isolar DC esplênicas, o baço de um rato huCD40tg foi colocado em um poço de uma placa de 6 poços contendo 2,25 mL de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) com Cálcio 2 + (gibco, Lote Ns 14025-05), 250 pL de uma solução a 10 mg/ mL de colagenase D (concentração final 1 mg/ mL) (Sigma-Aldrich, Lote Ns 11088866001) e 12,5 pL de uma solução de DNAase 10 mg/ mL (concentração final 0,05 mg/ mL) (Sigma -Aldrich, D5025-150KU, Lote Ns SLBR0535V). Utilizando uma seringa de 3 mL (BD, Lote Ns 309658) com uma agulha 21G (Braun, Lote Ns 4657527), o baço foi inflado e subsequentemente, com a ajuda de uma tesoura, rasgados em pequenos pedaços. Após 25 minutos de incubação a 37 SC, foram adicionados 50 pL de ácido etilenodiaminotetracico 0,5 M (EDTA) (Applichem, Lote Ns A4892.1000), seguido de um segundo passo de incubação a 37 SC durante cinco minutos. A solução contendo esplenócitos e pequenos pedaços de tecido esplênico foi filtrada através de um filtro de 40 pm (Corning, Lote Ns 352340) em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Pedaços de tecido esplênico foram esmagados através do filtro com o final de uma seringa de 3 mL. Na etapa seguinte, o tubo de 50 mL foi centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos à temperatura ambiente, o sobrenadante foi descartado e 1 mL de 1 x tampão de lise celular (diluído 1:10 com água destilada) (BD, Lote Ns 555899) foi adicionado aos esplenócitos, a fim de lisar os glóbulos vermelhos. Após quatro minutos de incubação à temperatura ambiente, adicionaram-se 20 mL de R10 seguindo-se um passo de centrifugação a 1500 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido, os esplenócitos foram ressuspensos em 30 mL de R10 e a contagem de células, bem como a viabilidade, foram determinadas com o contador automático de células EVE (VWR, Lote Ns 734-2675). As microesferas CD11c UltraPure de camundongo (Miltenyi, Lote Ns 130-108-338) foram utilizadas de acordo com as instruções do
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303/387 fabricante para isolar DCs por separação de autoMACS®. Posteriormente 0,25 x 105 DCs foram semeadas em 50 pl_ de R10 por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. As DCs foram então pulsadas com o peptídeo SIINFEKL (resíduos de ovalbumina 257-264) (Eurogentec, Lote Ns AS-60193-5, Lote Ns 1360618) em uma concentração sub-ótima de 1 pg/ mL. Esta quantidade limitada de antígeno permite detectar variações na ativação de células T devido a DCs ativadas de forma diferente. Como controle positivo para induzir uma ativação de células T elevada, independentemente de estímulos adicionais de ativação de DC, o SIINFEKL foi adicionado a uma concentração de 1 ng/ mL às DCs. DCs que não foram pulsadas com o antígeno SIINFEKL serviram como controle negativo. Dynabeads® revestidas ou não revestidas com FAP humana foram adicionadas em 50 pL de R10 às DCs a uma proporção de 2: 1 de esferas: células. No passo seguinte, foram adicionados diferentes anticorpos agonistas anti-CD40 em 50 pL de R10 em concentrações que variavam entre 1 pg/ mL e 1 ng/ mL (série de diluições de 10x). Neste arranjo experimental, o anticorpo CD40 anti-humano biespecífico contendo dois sítios de ligação FAP foi comparado ao seu equivalente com dois domínios DP47 em vez de domínios de ligação FAP, ao R07009789 independente de FAP e SGN-40 reticulado e a um FAP murino Tetravalente de anticorpo biespecífico dependente de CD40 murino e bivalente para FAP (ligante de FAP 28H1). Após 24 horas, células CD8 positivas para o baço de camundongos OT1 foram isoladas. Para fazer isso, o baço de um camundongo OT1 foi esmagado através de um filtro de 40 pm com o final de uma seringa de 3 mL em um tubo de 50 mL. O filtro foi lavado com R10 e os esplenitos foram centrifugados a 1500 rpm durante 5 minutos temperatura ambiente. Adicionou-se 1 mL de tampão de lise celular 1 x (diluído 1:10 com água destilada) às células e após quatro minutos de incubação à temperatura ambiente, adicionaram-se 20 mL de R10. O tubo foi centrifugado a 1500 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. Os esplenócitos foram ressuspensos em 30 mL de R10 e as contagens de células, bem como a
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304/387 viabilidade, foram determinadas com o contador automático de células EVE. As células positivas para CD8 foram isoladas em um processo de seleção negativo utilizando o Kit de Isolamento de Células T CD8a + de camundongo (Miltenyi, Lote Ns 130-104-075) e separação autoMACS de acordo com as instruções do fabricante. As células CD8 positivas que foram encontradas na fração negativa após a separação foram depois lavadas com PBS pré-aquecido, contadas com o contador de células EVE e o número de células foi ajustado para 2xlO7 células/ mL em PBS pré-aquecido. A solução 10 mM CFSE (CellTrace @ CFSE Cell Proliferation Kit, ThermoFisher, Lote Ns C34554) foi diluída 5000 vezes em PBS préaquecido e adicionada às células ressuspensas em PBS em uma proporção de 1:1 (concentração final CFSE 1 μΜ). Após um pequeno vórtice, as células foram incubadas durante cinco minutos à temperatura ambiente. A reação de marcação foi parada adicionando 40 mL de meio R10 pré-aquecido às células. Após duas etapas de lavagem com PBS, as células CD8-positivas foram ressuspensas em R10 e 0,5 x 105 células foram adicionadas em 100 pL de R10 DCs pulsadas. No dia cinco do experimento, as células T foram reestimuladas quanto à coloração intracelular de citocinas (ICS) com 0,5 pg/ mL de SIINFEKL e 2 pg/ mL de anticorpo CD28 anti-camundongo (eBioscience, clone 37,51, Lote Ns 16-0281-86). Uma hora após a adição de SIINFEKL e anti-CD28, foi adicionada Brefeldina A (BFA) (BD, Lote Ns 51-2301KZ) (1: 1000) às células de modo a bloquear o transporte da proteína intracelular. Após mais quatro horas de incubação, foram tomados 150 pL do sobrenadante para a medição de citocinas multiplexadas à base de Luminex ™. De modo a medir um conjunto de 23 citocinas, utilizou-se o estojo de Cytokine Grpl Panel 23-Plex de Bio-Plex Pro ™ Camundongo (BioRad, Cat. não s M60009RDPD) de acordo com as instruções do fabricante. Para análise de citometria de fluxo das células T, as células nas placas de 96 poços de fundo plano foram transferidas para placas de fundo redondo de 96 poços, lavadas uma vez com PBS e incubadas com 50 pL de 3 pg/ mL de IgG de IgG de Rato bloqueador do receptor Fc. Controle de
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Isotipos em PBS. Após 15 minutos de incubação a 4 SC, as células foram lavadas com PBS e foram adicionados 50 μΙ_ de uma mistura de anticorpos marcados com fluorescência em PBS células. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD86 anticamundongo BV785 (Biolegend, clone GL-1, Lote Ns 105043), anti-IA/ OU SEJA PerCp-Cy5.5 (Biolegend, clone M5/ 114.15.2, Lote Ns 107626), anti-camundongo CD70 PE (eBioscience, clone FR70, Lote Ns 12-0701-82), CD3 PE-CF594 anticamundongo (BD Biosciences, clone 145-2C11, Lote Ns 562286), anti- rato CD25 PE-Cy7 (eBioscience, clone PC61.5, Lote Ns 25-0251-82), APC CD11c anticamundongo (BD Biosciences, clone HL3, Ns de Cat. 561119), CD44 anticamundongo Alexa Fluor 700 (BD Biosciences, clone IM7, Lote Ns 560567) e APCCy7 anti-camundongo CD8 (Biolegend, clone 53-6,7, Lote Ns 100714). A fim de distinguir entre células vivas e mortas, o corante de viabilidade Zombie Aqua™ foi adicionado à mistura de anticorpos. As células foram incubadas durante 30 minutos a 4 SC com a solução de anticorpo de coloração extracelular. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS, permeabilizadas e coradas intracelularmente para IFNy usando IFNyVB421 anti-camundongo (Biolegend, clone XMG1.2, Lote Ns 505830) com o Conjunto de Tampões Foxp3/ Fator de Transcrição (eBioscience, Cat. No 00-5523-00) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram ressuspensas em 200 pL de PBS e analisadas no mesmo dia utilizando um LSR-Fortessa de 5 lasers. A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10. A população de células vivas que apresentavam expressão de CD8 e CD3 foi analisada quanto diluição de corante CFSE, produção de IFNy, expressão de CD44 e CD25.
[0380] As Figuras 9A a 9H mostram que DCs pulsadas com baixas quantidades de SIINFEKL e estimuladas com diferentes anticorpos agonistas antiCD40 são capazes de induzir proliferação de células T. No caso dos anticorpos biespecíficos anti-CD40 dependentes de FAP, a proliferação apenas induzida quando a FAP proporcionada no ensaio. Os níveis de proliferação induzidos por
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DCs estimulados com a versão murina ou humana das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico com quatro porções de ligação a CD40 e duas por FAP foram comparáveis. Isto sugere fortemente que a sinalização a jusante do receptor CD40 humano expresso em DCs não é prejudicada nos camundongos huCD40tg. não se observou regulação positiva significativa dos marcadores de ativação de células T, a produção de CD44 e CD25 ou IFNy Para células T co-cultivadas com DCs que foram estimuladas com diferentes anticorpos anti-CD40 agonísticos. Apenas as DCs pulsadas com quantidades elevadas de SIINFEKL mostraram alterações nítidas destes marcadores em comparação com a condição não tratada.
[0381] A medição da concentração de citocinas no sobrenadante mostrou um efeito dos anticorpos anti-CD40 agonistas na expressão de IL-2 (Figura 9I) e IL-12 (p40) (Figura 9J). Com o anticorpo anti-CD40 humano dependente de FAP, níveis elevados de IL-12 (p40) foram detectados apenas na presença de FAP. No entanto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno equivalente murino induziu uma secreção marcadamente mais elevada de IL-12 (p40). A secreção de IL-2 foi aumentada para um grau semelhante com ambas, as moléculas de ligação de antígeno CD40 anti-humano e antígeno CD40 anti-camundongo de um modo dependente de FAP.
2.2.2 Injeção de células T através de DCs pulsadas com OVA ativadas por MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ANTI-CD40 DIRECIONADAS PARA FAP [0382] As DCs foram isoladas dos baços de camundongos huCD40tg e Dynabeads® revestidas ou não revestidas com FAP, bem como diferentes anticorpos agonistas anti-CD40 foram adicionados às DCs esplénicas, como descrito na seção 2.2.1. Em vez de DCs pulsantes com SIINFEKL, que não requer captação e processamento pelas DCs, a proteína OVA foi usada como antígeno. A fim de promover a captação de OVA em um estímulo Toll-like receptor (TLR) de forma independente (estímulos TLR adicionais podem levar a uma alta ativação global de DCs, impossibilitando a detecção de diferentes estados de ativação
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307/387 devido à estimulação com anticorpos anti-CD40 agonísticos) o Reagente de Entrega de Antígeno Ova (Miltenyi, Lote Ns 130-094-663) em combinação com um anticorpo DEC205 anti-camundongo biotinilado (Miltenyi, clone NLDC-145, Lote Ns 130-101-854) foi utilizado de acordo ao protocolo do fabricante. Em resumo, as DCs são incubadas com um anticorpo biotinilado que se liga ao receptor DEC205, que é altamente expresso em DCs de apresentação cruzada CD8-positivas (M. Lahoud et al., Int Immunol. 2000, 12 (5), 731-735). Posteriormente, o reagente de entrega de Ova, um anticorpo anti-biotina acoplado a FITC e OVA, é adicionado às células levando à captação de OVA mediada pelo receptor DEC205. De modo a proporcionar um controle negativo, as DC foram marcadas apenas com o anticorpo anti-DEC205 sem a adição de OVA. No dia seguinte, células T positivas para CD8 foram isoladas de camundongos OT1, marcados com CFSE e adicionados às DCs como descrito na seção 2.2.1. No dia cinco da experiência, tomaram-se 150 pL de sobrenadante para medições de IFNy Utilizando o kit de IFN-faixa DuoSet ELISA de camundongo (R & D, Cat. NDY485-05). O ELISA foi realizado conforme descrito no protocolo fornecido pelo fabricante. Para análise FACS das células T, as células nas placas de 96 poços de fundo plano foram transferidas para placas de fundo redondo de 96 poços, lavadas uma vez com PBS e incubadas com 50 pL de 3 pg/ mL de controle do isotipo IgG de ratinho bloqueador do receptor de Fc em PBS. Após 15 minutos de incubação a 4 SC as células foram lavadas com PBS e foram adicionados 50 pL de uma mistura de anticorpos marcados com fluorescência em PBS células. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD4 anti-camundongo BV421 (Biolegend, clone GK1.5, Lote Ns 100438), CD86 anti-camundongo BV785 (Biolegend, clone GL-1, Lote Ns 105043), anti-IA/ l-E PerCp-Cy5.5 (Biolegend, clone M5/114.15.2, Lote Ns 107626), PE de CD70 anti-camundongo (eBioscience, clone FR70, Lote Ns 12-0701-82), CD3 PE anti-camundongo -CF594 (BD Biosciences, clone 145-2C11, Lote Ns 562286), CD25 PE-Cy7 anti-camundongo (eBioscience, clone PC61.5, Lote Ns 25-0251-82), APC CD11c anti-camundongo (BD
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Biosciences, clone HL3, Lote Ns 561119), CD44 anti-camundongo, Alexa Fluor 700 (BD Biosciences, clone IM7, Lote Ns 560567) e anti-camundongo CD8 APC-Cy7 (Biolegend, clone 53-6.7, lote Ns 100714). A fim de distinguir entre células vivas e mortas, o corante de viabilidade Zombie Aqua™ foi adicionado à mistura de anticorpos. As células foram incubadas durante 30 minutos a 4 SC com 50 pL da mistura de anticorpos corantes. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 200 pL de PBS e analisadas utilizando 5-laser LSRFortessa. A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10. Células viáveis positivas para CD3 e CD8 foram analisadas quanto à expressão de sinal CFSE, CD25 e CD44.
[0383] As Figuras 10A a 10C, 11A a 11C, 12A a 12C e 22A a 22B mostram que as DC incubadas com o reagente de entrega de OVA e estimuladas com a molécula biespecífica de ligação ao antígeno que visa o CD40 e FAP humanos podem aumentar significativamente a proliferação de células OT1 positivas para CD8 (Figuras 10A a 10C e 22A a 22B) bem como a expressão dos marcadores de ativação de células T CD25 (Figuras 11A a 11C) e CD44 (Figuras 12A a 12C). Estes efeitos foram dependentes do FAP. Os resultados do IFNy ELISA confirmam a ativação aumentada de células T devido ao anticorpo anti-CD40 humano orientado para FAP: os níveis de IFNy estavam elevados em condições com células T co-cultivadas com DCs tratadas com o anticorpo anti-CD40 humano FAP direcionado (Figuras 13A a 13C). Os efeitos do anticorpo murino anti-CD40 orientados para FAP foram comparáveis, sustentando a hipótese de que o modelo de camundongo huCD40tg proporciona um sistema adequado para medir os efeitos de anticorpos CD40 anti-humanos agonistas.
Exemplo 3 [0384] Propriedades funcionais de moléculas de ligação de CD40 anti-murino orientadas para FAP
3.1 Ativação in vitro, mediada por CD40, de células B murinas por moléculas de
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LIGAÇÃO A CD40 ANTI-MURINO DIRECIONADAS POR FAP [0385] Os baços de camundongos C57BL/ 6J foram processados como descrito na seção 2.2.1. As células B murinas foram isoladas a partir de esplenitos utilizando o kit de isolamento de células B de camundongo (Miltenyi, Lote Ns 130-090-862) de acordo com as instruções do fabricante. Semearam-se 1 χ 105 células B em 100 pL de R10 por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Dynabeads® revestidas com FAP murino biotinilado (produção interna) (ver 2.1.3 para descrição detalhada) ou Dynabeads® não revestidas como controle foram adicionadas em 50 pL de R10 em uma razão esferas: células de 2:1. Os anticorpos anti-CD40 anti-murinos agonistas foram adicionados em 50 pL de R10 células B. As concentrações de anticorpos variaram de 1 pg/ mL a 0,3 ng/ mL (3x séries de diluição). Nesta configuração experimental, moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno transportando quatro locais de ligação de CD40 anti-camundongo e um ou dois locais de ligação FAP (28H1 FAP ligante, equivalente ao domínio de ligação FAP em moléculas de ligação de antígeno CD40 anti-humano) foram comparados com o FAP Anticorpo FGK4.5 independente (lgG2a de rato, lote Ns BioXcell BE0016-2), que é bivalente para CD40 de murino. A atividade biológica de FGK4.5 é dependente da reticulação do receptor FC(L. Richman et al., Cancer Immunol Res. 2014, 2 (I)), pelo que o FGK4.5 foi pré-incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente com um anticorpo de reticulação de IgG (H + L) de cabra anti-rato (Jackson ImmunoResearch, Cat. não 112-005-003, Lote não 123801). Após 48 horas, as células B foram analisadas quanto à expressão de marcadores de ativação por FACS. Para este fim, as células B foram transferidas para placas de 96 poços de fundo plano, lavadas com PBS e incubadas com 50 pL de 3 pg/ mL de Controle do Isotipo de IgG de Rato bloqueador do receptor de Fc em PBS. Após 15 minutos de incubação a 4 SC, as células foram lavadas com PBS e foram adicionados 50 pL de uma mistura de anticorpos marcados com fluorescência em PBS células. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD19 anti-camundongo
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BV605 (BD Biosciences, clone 1D3, Lote Ns 563148), anti-camundongo CD86 BV785 (Biolegend, clone GL-1, Lote Ns 105043), anti-IA/ OU SEJA PerCp-Cy5.5 (Biolegend, clone M5/ 114.15.2, Lote Ns 107626), PE de CD70 anti-camundongo (eBioscience, clone FR70, Lote Ns 12-0701-82), CD80 anti-camundongo de camundongo. CF594 (BD Biosciences, clone 16-10A1, Lote Ns 562504), CD3 PECy7 anti-camundongo (BD Biosciences, clone 145-2C11, Lote Ns 552774), anticamundongo NK1.1 PE-Cy7 (Biolegend, clone PK136, Lote Ns 108714), APC CD11c anti-camundongo (BD Biosciences, clone HL3, Lote Ns 561119), CD45 Alexa Fluor 700 anti-camundongo (eBioscience, clone 30-F11, Lote Ns 56-0451-82), APC-Cy7 CD8 anti-camundongo (Biolegend, clone 53-6,7, Lote Ns 100714). Para distinguir entre células vivas e mortas, o corante de viabilidade Zombie Aqua™ foi adicionado à mistura de anticorpos. As células foram incubadas durante 30 minutos a 4 SC com a mistura de coloração, lavadas duas vezes com PBS e depois ressuspensas em 200 pL de PBS. A análise FACS foi realizada com um LSRFortessa de 5 laser e a análise de dados foi realizada utilizando o software FlowJo versão 10. Células individuais, viáveis foram bloqueadas para células CD11cnegativas, negativas para CD3 e negativas para NK1.1, a fim de excluir células nãoB. Células CD8- negativas, CD19-positivas foram analisadas quanto expressão dos marcadores de ativação das células B CD70, CD80, CD83 e CD86.
[0386] A incubação de células B murinas com os anticorpos CD40 anti-camundongo direcionados por FAP com uma ou duas porções de ligação a FAP aumentou a expressão de marcadores de ativação de células B. A expressão de CD70 foi apenas ligeiramente aumentada com as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno em comparação com as condições com o anticorpo FGK4.5 reticulado (Figuras 14A e 14B). No entanto, o número total de células expressando altos níveis de CD70 foi bastante baixo. A expressão de CD80 foi regulada positivamente de um modo dependente de FAP, mediante o tratamento de células B com as moléculas biespecíficas que têm
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311/387 como alvo CD40 e FAP de murino (Figuras 14C e 14D). Moléculas biespecíficas apresentaram maior potência do que o anticorpo bivalente FGK4.5 independente de FAP no caso de aumento de CD80. O aumento da expressão de CD86 foi também induzido por todos os anticorpos anti-CD40 agonísticos testados e os níveis de expressão foram comparáveis para todos os anticorpos (Figuras 14E e 14F). Enquanto a regulação positiva de CD86 era dependente de FAP com o anticorpo tetravalente anti-CD40 de camundongo possuindo duas porções de ligação a FAP, observou-se um efeito independente de FAP para a molécula biespecífica de ligação ao antígeno possuindo apenas um sítio de ligação de FAP. Além disso, observou-se uma expressão positiva independente de FAP da expressão de MHC-II para todas as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno testadas (Figuras 14G e 14H).
[0387] 3.2 Ativação in vivo mediada por CD40 de DCs murinas e células T por moléculas de ligação a CD40 anti-murino direcionadas a FAP [0388] A linha celular de tumor transfectante MC38_ FAP de adenocarcinoma de cólon de murino com expressão de FAP de camundongo foi obtida a partir de uma passagem in vivo realizada na Roche Glycart AG e após expansão depositada no banco de células interno de Glycart. Células MC38_muFAPJnvipa foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FCS (PAA Laboratories, Áustria), 1 mM de Piruvato, 1 x NEAA e 6 pg/ mL de Puromicina. As células foram cultivadas a 37 SC em uma atmosfera saturada com água a 5% de CO2 e foram injetadas na passagem in vitro 14 com uma viabilidade de 95%. 2 x 106 células tumorais foram injetadas subcutaneamente em uma suspensão de células de 100 pL (meio RPMI a 50% e matrigel a 50%). 33 camundongos fêmeas C57BI/ 6 com uma idade de 8-9 semanas no início da experiência (adquirida em Charles Rivers, Alemanha) foram mantidas sob condição isenta de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz e 12 h de escuridão de acordo com o
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312/387 cometido, diretrizes (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (P 2011-128) e após a chegada os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. Posteriormente, foram implantados com um transponder por via subcutânea no lado direito das costas para identificação e mantidos mais uma semana para recuperação. A monitoramento contínua da saúde foi realizada regularmente. Para estudar a ativação direcionada por FAP de camundongos in vivo CD40 injetou-se subcutaneamente no dia 0 de estudo com 2 x 106 de MC38-FAP. No dia x, quando os tumores atingiram 200 mm3, 9 camundongos por grupo foram injetados i.p. com 200 μΙ_ dos diferentes compostos. Os camundongos no grupo de veículos foram injetados com tampão Histidina e os animais nos grupos de tratamento foram injetados com 10 mg/ kg de FGK4.5 ou 15 mg/ kg de FGK4.5 4 + 1. Os animais foram controlados diariamente para sintomas clínicos e detecção de efeitos adversos, como perda de peso. Os critérios de terminação para animais foram doença clínica, locomoção prejudicada e pêlo sujo. Nos pontos de tempo 72h e 8d pós-injeção de terapia, os linfonodos tumorais, do baço, drenando o tumor e não-drenando o tumor foram coletados de três camundongos por grupo e analisados por citometria de fluxo. Além disso, o soro de todos os animais sacrificados foi coletado para analisar enzimas séricas indicativas de lesão hepática.
[0389] Para a análise do citómetro de fluxo, suspensões de células individuais de todos os órgãos recolhidos foram preparadas e coradas com anticorpos marcados com fluorescência, como descrito na seção 2.1.1. e seção 3.1, respectivamente. Para distinguir entre células vivas e mortas, o corante de viabilidade Zombie Aqua™ foi adicionado à mistura de anticorpos. As células foram incubadas durante 30 minutos a 4 SC com a mistura de coloração, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 200 μΙ_ de PBS. A análise FACS foi realizada com um LSR-Fortessa de 5 laser e a análise de dados foi realizada utilizando o
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313/387 software FlowJo versão 10. As DC foram identificadas como células únicas viáveis, altamente positivas para CD11c e MHC de classe II e negativas para CD3, NK1.1 e CD19. A expressão de CD70 e CD86, ambos marcadores de ativação DC, foi analisada em CDs três dias após a injeção da terapia. Células individuais viáveis CD45, CD3 e CD8 positivas foram identificadas como células T CD8 + . As células T CD8 + foram analisadas quanto expressão de Ki67 FITC (eBioscience, clone SolA15, Lote Ns 11-5698-82) e os números totais de células T CD8 + nos tumores foram determinados utilizando contas de contagem de células absolutas (Invitrogen, Lote Ns 01 -1234).
[0390] Como mostrado nas Figuras 23A a 23C, no dia 3 as enzimas sugestivas de lesão hepatocelular foram aumentadas em camundongos injetados com uma única injeção i.p. dose de CD40, mas não em camundongos injetados FAP-CD40 ou veículo sozinho. Além disso, o peso corporal foi falecido e o peso do baço foi aumentado de camundongos tratados com CD40 três dias após o tratamento em comparação com camundongos injetados com FAP-CD40 4 + 1 ou veículo isolado (Figuras 23D e 23E, respectivamente) indicando efeitos colaterais menos graves em animais tratados com os anticorpos contra CD40 direcionados para FAP em comparação com animais tratados com o anticorpo parental de CD40. Embora em menor grau que o FGK4.5, os anticorpos anti-CD40 direcionados para FAP induziram um aumento significativo na ativação DC(expressão de CD86 e CD70) em linfonodos com drenagem tumoral três dias após o tratamento (Figuras 24A e 24B) e linfócitos T CD8+ proliferação (expressão Ki68 e número de células) em tumores oito dias após o tratamento (Figuras 24C e 24D) em comparação com camundongos tratados com veículo. Em resumo, a molécula anti-CD40 direcionada para FAP com ativação de CD40 dependente de FAP em formato 4 + 1 induz a ativação de células T e DC potente em camundongos portadores de tumor com toxicidade sistêmica reduzida comparada ao
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314/387 anticorpo parental anti-CD40 anti-alvo FGK4.5.
Exemplo 4 [0391] Geração e Produção de variantes humanizadas do anticorpo anti-CD40 S2C6
4.1 Primeira geração de variantes humanizadas do anticorpo anti-CD40 S2C6
4.1.1 Metodologia [0392] O anticorpo anti-CD40 S2C6 é divulgado no documento WO 2000/075348 e tem o domínio VH da SEQ ID Ns: 129 e o domínio VL da SEQ ID Ns: 130. Suas variantes foram criadas conforme descrito a seguir. Para a identificação de uma estrutura aceitadora humana adequada durante a humanização do ligante anti-CD40 S2C6, utilizou-se uma combinação de duas metodologias. Por um lado, uma abordagem clássica foi realizada pela pesquisa de um arcabouço aceitador com alta homologia de sequência, enxerto das CDRs neste arcabouço e avaliação de quais mutações reversas podem ser consideradas. Mais explicitamente, cada diferença de aminoácidos das estruturas identificadas com o anticorpo parental foi julgada por impacto na integridade estrutural do ligante, e atrás mutações em direção à sequência parental foram introduzidas sempre que apropriado. A avaliação estrutural foi com base em modelos de homologia da região Fv do anticorpo parental e suas versões humanizadas criadas com uma ferramenta de modelagem de homologia de estrutura de anticorpo implementada usando o Biovia Discovery Studio Environment, versão 4.5.
[0393] Por outro lado, utilizou-se uma ferramenta in silico desenvolvida internamente para prever a orientação dos domínios VH e VL das versões humanizadas entre si (ver WO 2016062734 aqui incorporado como referência). Os resultados foram comparados com a orientação predita do domínio VH-VL do ligante parental para selecionar combinações de estruturas que estão próximas em geometria ao anticorpo de partida. O racional é detectar possíveis trocas de aminoácidos na região da interface VH-VL que
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315/387 podem levar a mudanças disruptivas no emparelhamento dos dois domínios.
4.1.2 Escolha do arcabouço do aceitador e suas adaptações [0394] A estrutura aceitadora foi escolhida como descrito na
Tabela 12 abaixo:
Tabela 12: Estrutura aceitadora
Linha germinativa da região V de Murino Escolha da linha germinativa da região V do receptor humano Identidade à linha germinativa da região V humana após o enxerto (BLASTp):
S2C6 VH IGHV1 -26*01 IGHV1-2*01 91,8%
S2C6 VL IGKV1-110*01 IGKV2-30*02 92,0%
[0395] As regiões de estrutura pós-CDR3 foram adaptadas a partir da linhagem germinativa IGHJ humana IGHJ6 * 01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS) e da linha germinativa IGKJ humana IGKJ1 * 01 (WTFGQGTKVEIK). A parte relevante para a estrutura do aceitador é indicada como sublinhada.
[0396] Com base em considerações estruturais, as mutações reversas da estrutura aceitadora humana para o aminoácido no ligante parental foram introduzidas nas posições H48 (M > I) e H71 (R > V) da região VH e nas posições L36 (F > Y), L46 (R > L) e L87 (Y > F) da região VL (numeração de Kabat). Além disso, duas posições em CDR-H2 foram identificadas como candidatas promissoras para mutações avançadas, isto é, trocas de aminoácidos do ligante parental para linha germinativa de receptor humano a fim de aumentar o caráter humano geral, a saber H60 (N > A) e H64 (K > Q).
[0397] De modo a abordar possíveis hotspots de desenvolvabilidade (desaminação de asparagina), foram introduzidas outras alterações relativamente ao ligante parental nas posições H52b (N > Q) e H54 (N > A) em VH, e L27f (N > Q), L28 (G > P), L29 (N > Q) e L30 (T > I) em VL (numeração de Kabat).
[0398] Na seguinte Tabela 13, a matriz de emparelhamento VH-VL
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316/387 é mostrada:
l· ΉΛ4 hVK_2 £ ΜΛ4 hVK_4 9 ΉΛ4 9 ΉΛ4 Z ΉΛ4 8 ΉΛ4 6 ΉΛ4
IMGT_hVK_2_30_base_enxe rto bF36Y_bR46L bF36Y_bR46L_bY87F bF36Y_ bR46L _ bY87F dG28P bF36Y_ bR46L _ bY87F dT30l OO _Q I _l — CD O CO CC I- X I I CL > 00 C0 <N CO 0 LL TD 42 | bF36Y_ bR46L _ bY87F dN27fQ 00 _Q I _l CD cc _Q Ό > CD co Z LL Ό _Q bF36Y_ bR46L _ bY87F dN27fQ dN29Q
hVH_1 IMGT_hVH_1_2_base_enxerto
hVH_2 bM48l_bR71V X X X X X X X X
hVH_3 bM48l_bR71 V_dN54A X X X X X X X X
hVH_4 bM48l_bR71 V_dN52bQ_dN254A X X X X X X X X
hVH_5 bM48l_bR71 V_fK64Q X X
hVH_6 bM48l_bR71 V_fN60A X X
hVH_7 bM48l_bR71 VJN60AJK64Q X X
[0399] As mutações anteriores prefixadas com b, as mutações iniciais prefixadas com f e as mutações para abordar hotspots de desenvolvimento com prefixo d
4.1.3 Domínios VH e VL dos anticorpos CD40 humanizados resultantes [0400] Os domínios VH resultantes de anticorpos CD40 humanizados podem ser encontrados na Tabela 14 abaixo e os domínios VL resultantes de anticorpos CD40 humanizados estão listados na Tabela 15 abaixo.
Tabela 14: Sequências de aminoácidos dos domínios VH de anticorpos CD40
HUMANIZADOS
Descrição Sequência SEQ ID Ne:
IMGT_hVH _1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWMGrvipnnggtsynqkfkgRVTSTRDTSISTAYMELSR LRSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 45
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IMGT_hVH _2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnnggtsynqkfkgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 46
IMGT_hVH _3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnaggtsynqkfkgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 47
IMGT_hVH _4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipqaggtsynqkfkgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 48
IMGT_hVH _5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnnggtsynqkfqgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 49
IMGT_hVH _6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnnggtsyaqkfkgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 50
IMGT_hVH _7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnnggtsyaqkfqgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 51
IMGT_hVH -2-N288A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnaggtsynqkfkgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 52
IMGT_hVH -5-N288A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnaggtsynqkfqgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 53
IMGT_hVH -6-N288A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnaggtsyaqkfkgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 54
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IMGT_hVH -7-N288A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWVRQAP GQGLEWIGrvipnaggtsyaqkfqgRVTSTVDTSISTAYMELSRL RSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTVSS 55
Tabela 15: Sequências de aminoácidos dos domínios VL de anticorpos CD40 HUMANIZADOS
Descrição Sequência SEQ ID Ne:
IMGT_hVK_1 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsngntflhWFQQRP GQSPRRLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 56
IMGT_hVK_2 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsngntflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 57
IMGT_hVK_3 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsngntflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 58
IMGT_hVK_4 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsnpntflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 59
IMGT_hVK_5 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsngniflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 60
IMGT_hVK_6 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsnpniflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 61
IMGT_hVK_7 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsqgntflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV 62
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GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK
IMGT_hVK_8 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsngqtflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 63
IMGT_hVK_9 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCrssqsIvhsqgqtflhWYQQRP GQSPRLLIYtvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYFCsqtthvpwtFGQGTKVEIK 64
[0401] As sequências de aminoácidos humanizadas para regiões variáveis de cadeia pesada e leve de variantes S2C6 foram novamente traduzidas para DNA e os cNDA resultantes foram sintetizados (GenArt) e depois clonados em vetores de expressão de cadeia pesada como proteínas de fusão com estruturas de lgG1 humanas/ CH1-Hing humana. CH2-CH3 com mutações LALA e PG (Leucina 234 para Alanina, Leucina 235 para Alanina, Prolina 329 para Glicina) revogando funções efetoras ou em vetores de expressão de cadeia leve como proteínas de fusão para C-kappa humano. Os plasmídeos LC e HC foram então co-transfectados em HEK293 e purificados após 7 dias a partir de sobrenadantes por métodos padrão para purificação de anticorpos.
4.2 Segunda geração de variantes humanizadas do anticorpo anti-CD40 S2C6
4.2.1 Metodologia [0402] Como para o Exemplo 4.1, para a identificação de uma estrutura aceitadora humana adequada durante a humanização do ligante antiCD40 S2C6 foi usada uma combinação de duas metodologias. Por um lado, uma abordagem clássica foi realizada pela pesquisa de um arcabouço aceitador com alta homologia de sequência, enxerto das CDRs neste arcabouço e avaliação de quais mutações reversas podem ser consideradas. Mais explicitamente, cada diferença de aminoácidos das estruturas identificadas com o anticorpo parental foi julgada por impacto na integridade
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320/387 estrutural do ligante, e atrás mutações em direção à sequência parental foram introduzidas sempre que apropriado. A avaliação estrutural foi com base em modelos de homologia da região Fv do anticorpo parental e suas versões humanizadas criadas com uma ferramenta de modelagem de homologia de estrutura de anticorpo implementada usando o Biovia Discovery Studio Environment, versão 4.5.
[0403] Por outro lado, utilizou-se uma ferramenta in silico desenvolvida internamente para prever a orientação dos domínios VH e VL das versões humanizadas entre si (ver WO 2016062734 aqui incorporado como referência). Os resultados foram comparados com a orientação predita do domínio VH-VL do ligante parental para selecionar combinações de estruturas que estão próximas em geometria ao anticorpo de partida. O racional é detectar possíveis trocas de aminoácidos na região da interface VH-VL que podem levar a mudanças disruptivas no emparelhamento dos dois domínios.
4.2.2 Escolha do arcabouço do aceitador e suas adaptações [0404] Duas estruturas aceitadoras diferentes foram escolhidas como descrito na Tabela 16 e na Tabela 18 abaixo.
Tabela 16: Estrutura aceitadora 1: “IGHV1-IGKV2D”
Linha germinativa da região V de Murino Escolha da linha germinativa da região V do receptor humano Identidade à linha germinativa da região V humana após o enxerto (BLASTp):
S2C6 VH IGHV1 -26*01 IGHV1-2*05 91,8 %
S2C6 VL IGKV1-110*01 IGKV2D-29*02 88,0 %
[0405] As regiões de estrutura pós-CDR3 foram adaptadas a partir da linha germinativa de IGHJ humano IGHJ6 * 01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS) e da linha germinativa IGKJ humana IGKJ4 * 01/02 (LTFGGGTKVEIK). A parte relevante para o framework aceitador é indicada em negrito.
[0406] Com base em considerações estruturais, as mutações
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321/387 reversas da estrutura do aceitador humano para o aminoácido no ligante parental foram introduzidas nas posições H43 (Q > K), H44 (G > S), H69 (M > L), H71 (R > V).), H73 (T > K), H88 (V > A) e H105 (Q > H) da região VH e nas posições L2 (I > V), L4 (Μ > V), L87 (Y > F) e L104 (V > L) da região VL. Em uma variante, a mutação T70S (VH) foi incluída para estudar o efeito de um resíduo ligeiramente mais hidrofílico nesta posição.
[0407] Todas as variantes incluem a mutação N54A (VH) para abordar um potencial hotspot de desenvolvabilidade (desaminação da asparagina). Todas as posições são dadas no esquema de numeração Kabat EU.
[0408] Na seguinte Tabela 17, a matriz de emparelhamento da variante de humanização VH-VL é mostrada:
VL1a VL1b VL1c VL1d
CO > bM4V, bY87F bl2V, bM4V, bY83F bl2V, bM4V, bY783F, bV104L
VH1a bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A X x x x
VH1b bQ43K, bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A X x x x
VH1c bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A, bQ105H X x x x
VH1d bG44S, bM69L, bR71V, bT73K, bV88A, xT70S X x x x
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322/387 [0409] A mutação N54A aplica-se a todas as variantes VH e não é explicitamente mencionada. Mutações anteriores prefixadas com b, mutações diretas prefixadas com f e outras mutações prefixadas com x
Tabela 18: Estrutura aceitadora 2: “IGHV3-IGKV1”
Linha germinativa da região V de Murino Escolha da linha germinativa da região V do receptor humano Identidade à linha germinativa da região V humana após o enxerto (BLASTp):
S2C6 VH IGHV1-26*01 IGHV3-23*02 79,6%
S2C6 VL IGKV1-110*01 IGKV1-39*01 79,0%
[0410] As regiões de estrutura pós-CDR3 foram adaptadas a partir da linhagem germinativa humana IGHJ IGHJ6 * 01/02 (YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS) e da linha germinativa IGKJ humana IGKJ4 * 01/02 (LTFGGGTKVEIK). A parte relevante para o framework aceitador é indicada em negrito.
[0411] Com base em considerações estruturais, as mutações reversas da estrutura aceitadora humana para o aminoácido no ligante parental foram introduzidas nas posições H44 (G > S), H49 (S > G), H71 (R > V), H78 (L > A), H94 (K > R) e H105 (Q > H) da região VH e nas posições L42 (K > Q), L43 (A > S) e L87 (Y > F) da região VL. Além disso, quatro posições em CDRH2 foram identificadas como candidatas promissoras para mutações diretas, isto é, trocas de aminoácidos do ligante parental para linha germinativa de receptor humano a fim de aumentar o caráter humano geral, a saber H60 (N > G), H61 (Q > D), H62 (K > S) e H63 (F > V).
[0412] Todas as variantes incluem a mutação N54A (VH) para abordar um potencial hotspot de desenvolvimento (desaminação de asparagina). Todas as posições são dadas no esquema de numeração Kabat
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EU.
[0413] Na Tabela 19 seguinte, a matriz de emparelhamento da variante de humanização VH-VL é mostrada:
VL2a VL2b
CO bK42Q, bA43S, bY87F
VH2a bS49G, bR71V, bL78A, bK94R X X
VH2b bG44S, bS49G, bR71V, bL78A, bK94R X X
VH2c bS49G, bR71V, bL78A, bK94R, bQ105H X X
VH2d bS49G, fN60G, fQ61 D, fK62S, fF63V, bR71 V, bL78A, bK94R X X
[0414] Mutações anteriores prefixadas com b, mutações diretas prefixadas com f.
4.2.3 Domínios VH e VL dos anticorpos CD40 humanizados resultantes [0415] Os domínios VH e VL resultantes de anticorpos CD40 humanizados com base na estrutura aceitadora 1 podem ser encontrados na Tabela 17 abaixo e os domínios VH e VL resultantes de anticorpos CD40 humanizados com base na estrutura aceitadora 2 estão listados na Tabela 18 abaixo.
Tabela 20: Sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de anticorpos
CD40 HUMANIZADOS COM BASE NA ESTRUTURA DO ACEITADOR 1
Descrição Sequência SEQ ID Ne:
VH1a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMG RVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTA YMELSRLRSD DT A V YYC A REG IYWWGQGTTVTVSS 171
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VH1b qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgysftgyyihwvrq A PG KS L EWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSI ST A YMELSRLRSD DT A V YYC A REG IYWWGQGTTVTVSS 172
VH1c qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgysftgyyihwvrq APGQSLEWMG RVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTA YMELSRLRSD DTAVYYCA REGIYWWGHGTTVTVSS 173
VH1d qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgysftgyyihwvrq APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLSVDKSISTA YMELSRLRSD DTAVYYCA REG I YWWGQGTTVTVSS 174
VL1a DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK 175
VL1b DIVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHWY LQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK 176
VL1c D V V VTQT P LS LS VT PG Q P AS ISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK 177
VL1d D V VVTQT P LS LS VT PGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIK 178
Tabela 21: Sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de anticorpos
CD40 HUMANIZADOS COM BASE NA ESTRUTURA ACEITADORA 2
Descrição Sequência SEQ ID Ne:
VH2a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVR QAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSK 179
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NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSS
VH2b EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVR QAPGKSLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSK NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSS 180
VH2c evqllesggglvqpggslrlscaasgysftgyyihwvr QAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSK NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGHGTTVTVSS 181
VH2d evqllesggglvqpggslrlscaasgysftgyyihwvr QAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKGRFTISVDNSK NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSS 182
VH2ab evqllesggglvqpggslrlscaasgysftgyymhwv RQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVS S 183
VH2ac evqllesggglvqpggslrlscaasgysftgyyihwvr QAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKVKGRFTISVDNSK NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSS 184
VL2a DIQMTQS PSSLSAS VG D RVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK 185
VL2b D IQMTQS PSSLSAS VG D R VTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK 186
VL2ab D IQMTQS PSSLSAS VG D RVTITCRASQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK 187
VL2ac D IQMTQS PSSLSAS VG D RVTITCRSSQSIVHSNGNTFLH 188
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WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIK
4.2.4 NOVOS ANTICORPOS CD40 HUMANIZADOS NO FORMATO HUIgGI_LALA_PG [0416] Com base nas novas variantes de humanização de VH e VL, os novos anticorpos CD40 foram expressos como anticorpos hulgGI com um Fc silencioso efetor (P329G; L234, L235A) para anular a ligação aos receptores Fcy De acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831 A1.
Tabela 22: Nomenclatura para combinações VH/ VL expressas como anticorpos huIgGI _LALA_PG
VL1a VL1b VL1c VL1d VL2a VL2b VL2ab VL2ac
VH1a P1AE08 17 P1AE1 001 P1AE0 993 P1AE0 996
VH1b P1AE10 02 P1AE1 003 P1AE1 004 P1AE1 005
VH1c P1AE09 97 P1AE1 006 P1AE0 818 P1AE0 998
VH1d P1AE09 99 P1AE1 007 P1AE1 000 P1AE0 819
VH2a P1AE0 400 P1AE0 404
VH2b P1AE0 401 P1AE0 405
VH2c P1AE0 402 P1AE0 406
VH2d P1AE0 403 P1AE0 407
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VH2ab P1AE 1125 P1AE 1126
VH2ac P1AE 1134 P1AE 1135
[0417] As sequências completas de anticorpos CD40 humanizados como anticorpos lgG1_LALAPG humanos podem ser encontradas na Tabela 20.
Tabela 23: Sequências de aminoácidos dos anticorpos CD40 IgG1_LALAPG
HUMANIZADOS
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
P1AE0400 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 189
P1AE0400 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA 190
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Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P1AE0401 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKSLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 191
P1AE0401 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 192
P1AE0402 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGHGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI 193
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329/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0402 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 194
P1AE0403 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 195
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Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
P1AE0403 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 196
P1AE0404 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 197
P1AE0404 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 198
P1AE0405 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ 199
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Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
cadeia pesada APGKSLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0405 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 200
P1AE0406 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGHGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE 201
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Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0406 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 202
P1AE0407 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 203
P1AE0407 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA 204
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Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P1AE0816 cadeia pesada (controle) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNNGGTSYNQKFQGRVTISVDKSIST AYM E LSS L RSE DTAVYYCAREGIYWWG H GTT VT VSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 259
P1AE0816 cadeia leve (controle) DVVVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 260
P1AE0817 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI 205
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 624/744
334/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0817 cadeia leve DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 206
P1AE0818 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYM E LS RL RS D DTAVYYCA REG IYWWG HGTT VT VSS AST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 207
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 625/744
335/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
P1AE0818 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 208
P1AE0819 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLSVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 209
P1AE0819 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 210
P1AE0993 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ 211
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 626/744
336/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
cadeia pesada APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0993 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 212
P1AE0996 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE 213
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 627/744
337/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0996 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 214
P1AE0997 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYM E LS RL RS D DTAVYYCA REG IYWWG HGTT VT VSS AST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 215
P1AE0997 cadeia leve DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL 216
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 628/744
338/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P1AE0998 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYM E LS RL RS D DTAVYYCA REG IYWWG HGTT VT VSS AST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 217
P1AE0998 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 218
P1AE0999 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLSVDKSIST AYMELSRLRSD DTAVYYCA R E GIYW WGQGTT VT VSS AST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI 219
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 629/744
339/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE0999 cadeia leve DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 220
P1AE1000 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLSVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 221
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 630/744
340/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
P1AE1000 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 222
P1AE1001 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 223
P1AE1001 cadeia leve DIVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 224
P1AE1002 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ 225
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 631/744
341/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
cadeia pesada APGKSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE1002 cadeia leve DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 226
P1AE1003 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGKSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE 227
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 632/744
342/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE1003 cadeia leve DIVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 228
P1AE1004 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGKSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 229
P1AE1004 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA 230
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 633/744
343/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P1AE1005 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGKSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 231
P1AE1005 cadeia leve DVVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLH WYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 232
P1AE1006 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDKSIST AYM E LS RL RS D DTAVYYCA REG IYWWG HGTT VT VSS AST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI 233
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 634/744
344/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE1006 cadeia leve DIVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 234
P1AE1007 cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQ APGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLSVDKSIST AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG 235
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 635/744
345/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
P1AE1007 cadeia leve DIVVTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGNTFLHW YLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 236
P1AE1125 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYMHWVR QAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG IYWWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG 237
P1AE1125 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSLVHSNGNTFLH WYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 238
P1AE1126 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYMHWVR 239
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 636/744
346/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
cadeia pesada QAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG
P1AE1126 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 240
P1AE1135 cadeia pesada EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQ APGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKVKGRFTISVDNSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE 241
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 637/744
347/387
Anticorpo Sequência SEQ ID Ne:
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG
P1AE1135 cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 242
4.2.5 Produção dos novos anticorpos CD40 humanizados no formato hu!gG1_LALA_PG [0418] Os anticorpos foram expressos por transfecção transiente de células HEK293-F cultivadas em suspensão com vetores de expressão codificando as diferentes cadeias peptídicas. A transfecção em células HEK293-F (Invitrogen, EUA) foi realizada de acordo com as instruções do fornecedor de células utilizando preparações Maxiprep (Qiagen, Alemanha) dos vetores de anticorpo, meio com base em F17 (Invitrogen, EUA), PEIpro (Polyscience Europe GmbH) e uma inicial, densidade celular de 1 a 2 milhões de células viáveis / ml em meio de expressão FreeStyle 293 livre de soro (Invitrogen). Os sobrenadantes da cultura de células foram recolhidos após 7 dias de cultura em frascos de agitação ou fermentadores agitados por centrifugação a 14000 g durante 30 minutos e filtrados através de um filtro de 0,22 pm.
[0419] Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes de culturas celulares por cromatografia de afinidade utilizando cromatografia MabSeletSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Suécia). Em resumo, os
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348/387 sobrenadantes de cultura de células filtradas estéreis foram capturados em uma resina MabSelet SuRe equilibrada com tampão PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCI 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4), lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com citrato 25 mM, pH 3,0. Após neutralização com Tris 1 M pH 9,0, a proteína agregada foi separada das espies de anticorpo monomérico por cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0. As frações de proteína monoméricas foram reunidas, concentradas, se necessário, utilizando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO) e armazenadas a -80 SC. Alíquotas de amostras foram usadas para posterior caracterização analítica, por exemplo, por CE-SDS, cromatografia por exclusão de tamanho, espectrometria de massa e determinação de endotoxina.
[0420] O rendimento de produção para os diferentes anticorpos CD40 humanizados mostrado na Tabela 21 como valores de título calculados a partir do rendimento após cromatografia de afinidade preparativa utilizando cromatografia MabSeletSure-Sepharose™.
[0421] A pureza e o peso molecular da molécula após o passo de purificação final foram analisados por análises CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor. O sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) foi usado de acordo com as instruções do fabricante.
[0422] O conteúdo agregado da molécula foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em fosfato de potássio 25 mM, cloreto de sódio 125 mM, mono-hidrocloreto de L-arginina 200 mM, NaN3 a 0,02% (p/ v), pH 6,7 de tampão de corrida a 25 SC.
[0423] Para comparação direta de todos os anticorpos, a estabilidade térmica foi monitorada por espalhamento de luz estática (SLS) e pela medição da fluorescência da proteína intrínseca em resposta ao estresse de temperatura aplicado. 30 pg de amostra de proteína filtrada com uma
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349/387 concentração de proteína de 1 mg/ ml foi aplicada em duplicado a um instrumento Optim 2 (Avacta Analytical Ltd). A temperatura foi aumentada de 25 para 85 SC a 0,1 SC/ min, com o raio e a intensidade de dispersão total a ser recolhida. Para determinação da fluorescência da proteína intrínseca, a amostra foi excitada a 266 nm e a emissão foi recolhida entre 275 nm e 460 nm. Para todos os anticorpos, a temperatura de agregao (Tagg) estava entre 64 e 69 SC e estapresentada na Tabela 24 ou na Tabela 25 abaixo.
[0424] O rendimento de produção para os anticorpos CD40 humanizados com as diferentes estruturas é mostrado na Tabela 24 ou na Tabela 25 abaixo.
Tabela 24: Título de produção, humanidade e temperatura de agregação de
ANTICORPOS CD40 HUMANIZADOS COM BASE NA ESTRUTURA DO ACEITADOR 2.
Anticorpo VH/VL Titulação [pg/ ml] humanidade (VH/ VL em %) Tagg
P1AD4470 controle 140 77,6/ 78 68
P1AE0400 VL2a/VH2a 219 77,6/ 78 69
P1AE0401 VL2a/VH2b 162 76,5/ 78 69
P1AE0402 VL2a/VH2c 196 77,6/ 78 69
P1AE0403 VL2a/VH2d 137 80,6/ 78 67
P1AE0404 VL2b/VH2a 165 77,6/ 76 69
P1AE0405 VL2b/VH2b 128 76,5/ 76 69
P1AE0406 VL2b/VH2c 154 77,6/ 76 69
P1AE0407 VL2b/VH2d 102 80,6/ 76 67
Tabela 25: Título de produção, humanidade e temperatura de agregação de
ANTICORPOS CD40 HUMANIZADOS COM BASE NA ESTRUTURA DO ACEITADOR 1
Anticorpo VH/VL Titulação [pg/ ml] humanidade (VH/ VL em %) Tagg
P1AE0816 controle 8,5 84,7/ 84 64
P1AE0817 VH1a/VL1a 62 86,7/ 87 67
P1AE0818 VH1c/VL1c 47 86,7/ 85 66
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Anticorpo VH/VL Titulação [pg/ ml] humanidade (VH/ VL em %) Tagg
P1AE0819 VH1d/VL1d 90 85,7/ 85 67
P1AE0993 VH1a/VL1c 34 86,7/ 85 67
P1AE0996 VH1a/VL1d 16 86,7/ 85 67
P1AE0997 VH1c/VL1a 44 86,7/ 87 66
P1AE0998 VH1c/VL1d 24 86,7/ 85 66
P1AE0999 VH1d/VL1a 34 85,7/ 87 67
P1AE1000 VH1d/VL1c 16 85,7/ 85 66
P1AE1001 VH1a/VL1b 34 86,7/ 86 65
P1AE1002 VH1b/VL1a 46 85,7/ 87 67
P1AE1003 VH1b/VL1b 49 85,7/ 86 66
P1AE1004 VH1b/VL1c 60 85,7/ 85 67
P1AE1005 VH1b/VL1d 7 85,7/ 85 65
P1AE1006 VH1c/VL1b 24 86,7/ 86 65
P1AE1007 VH1d/VL1b 34 85,7/ 86 67
4.2.6 Geração de proteína de domínio extracelular CD40 humana e de macaco
CYNOMOLGUS RECOMBINANTE [0425] As seguintes construções foram clonadas e expressas por expressão transitória em células HEK293:
1) Domínio extracelular de CD40 humano (aminoácidos 21-193 da SEQ ID Ns: 1, número de acesso da NCBI NP_001241) com etiqueta HisAviTag™ terminal C (SEQ ID Ns: 266)
2) domínio extracelular de CD40 de macaco Cynomolgus (macaca fascicularis) (aminoácidos 21-193, sequência do domínio extracelular de cynomolgus CD40 foi retirado da base de dados de cDNA de Roche cynomolgus, dados não publicados) com etiqueta terminal C His-AviTag™ (SEQ ID Ns: 2 267) [0426] Os antígenos do domínio extracelular do CD40 para a análise da ligação foram gerados por síntese genética (servi Eurofins
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Genomics GmbH, Alemanha), clonados através de locais de restrição únicos no vetor de expressão em casa da Roche utilizando procedimentos convencionais de clonagem. A clonagem de todas as construções foi verificada por sequenciamento. Todos os antígenos foram expressos sob o controle do promotor de CMV. Para expressão transiente das construções do domínio extracelular de CD40, células HEK293-F adaptadas a suspensão (Life Technologies, EUA) foram transfectadas com os respectivos plasmídeos: Em geral, 1 L de células HEK293-F a cerca de 2 x 106 células/ ml foram transfectadas com um total de 500 pg de DNA plasmídico complexado pelo Reagente de Transfecção PEIpro (Polysciences Europe GmbH, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Após a transfecção, as células HEK293-F foram incubadas durante 6 dias. As células foram subsequentemente colhidas por centrifugação e o sobrenadante contendo proteína foi filtrado utilizando um sistema de filtração a vácuo de 0,22 pm (Millipore). As proteínas marcadas com His-AviTag™ foram purificadas por cromatografia de afinidade em IMAC utilizando resina completa de His-Tag (Roche Diagnostics). Após lavagem com Na2PO4 50 mM, NaCI 300 mM, pH 8,0, as proteínas de fusão His-AviTag™ foram eluídas utilizando tampão de lavagem suplementado com Imidazol 500 mM a pH 7,0. A proteína agregada foi separada das proteínas de fusão monoméricas por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 75, GE Healthcare) em Tris 20 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4. As frações de proteína monoméricas foram reunidas, concentradas, se necessário, utilizando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (10KD MWCO) e armazenadas a -80 SC. Alíquotas de amostras foram usadas para posterior caracterização analítica, por exemplo, por CE-SDS, cromatografia por exclusão de tamanho e espectrometria de massa.
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Biotinilação do domínio extracelular de CD40:
[0427]A biotinilação específica do local enzimático de construções de domínios extracelulares de CD40 humano ou cynomolgus contendo um AviTag™ terminal C foi realizada utilizando o estojo biotinaproteina BirA (Avidity LLC, US A) de acordo com a instrução dos fabricantes. Em resumo, volume 1/10 de BiomixA (concentração 10X: tampão bicina 0,5 M, pH 8,3) e BiomixB (concentração 10X: ATP 100mM, MgOAc 100mM, d-biotina 500μΜ) foram adicionados à proteína contendo AviTag™ seguida pela adição de 2,5 pg de BirA ligase por 10 nmol de proteína. A mistura reacional foi incubada a 30 SC durante 1 h e purificada por cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna HiLoad préembalada da classe prep de Superdex75 (GE Healthcare, Suécia).
4.2.7 Ensaio de Espectroscopia de Ressonância de Plasmônio na Superfície de Ligação CD40 Humano/ cynomolgus [0428]Cerca de 12.000 unidades de ressonância (RU) do sistema de captura (10 pg/ ml F(ab)’ 2 humano; código de pedido: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suécia) foram acopladas em um chip CM5 (GE Healthcare BR -1005-30) a pH 5,0 utilizando um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. A amostra e tampão do sistema foi PBS-T (solução salina tamponada com fosfato 10 mM incluindo Tween 20 a 0,05%) pH 7,4. A célula de fluxo foi ajustada para 25 SC - e o bloco de amostra foi ajustado para 12 SC - e preparado com tampão de operação duas vezes. O anticorpo foi capturado por injeção de uma solução a 50 nM durante 30 segundos a um fluxo de 5 pL/ min. A associação foi medida por injeção de domínio extracelular de CD40 humano ou de CD40 de macaco cynomolgus em várias concentrações em solução durante 300 seg a um fluxo de 30 pL/ min começando com 300 nM em diluições de 1: 3. A fase de dissociação foi monitorada por até 1200
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353/387 segundos e desencadeada pela mudança da solução de amostra para o buffer de operação. A superfície foi regenerada por 60 segundos de lavagem com uma solução de glicina a pH 2,1 a um caudal de 30 pL/ min. As diferenças de índice de refração foram corrigidas subtraindo a resposta obtida de uma superfície de cabra anti-humana F(ab’)2. Injeções em branco também são subtraídas (= referência dupla). Para o cálculo do KD aparente e outros parâmetros cinéticos foi utilizado o modelo de Langmuir 1: 1. O Kd aparente foi calculado usando o software de avaliação Biacore™ B4000 (versão 1.1).
4.2.8 Ensaio de ligação celular para caracterização de anticorpos HUMANIZADOS ESPECÍFICOS PARA CD40 [0429] Células CD40 positivas (células Raji) foram retiradas do frasco de cultura utilizando Tripsina e foram contadas utilizando um contador de células Casy. Após peletização a 4 SC, as células foram ressuspensas em tampão FACS (2,5% de FCS em PBS), ajustadas para 2,0 E + 06 células/ mL e dispensadas em placas de fundo em PP de 96 poços (25 pL / poço = 5.0 E + 04 Zellen/ poço).
[0430]0s anticorpos específicos para CD40 foram ajustados para 20 pg/ mL em tampão FACS, resultando em uma concentração final de 10 pg/ mL. Foram adicionados 20 pL a 25 pL de suspensão celular e incubados durante 1 h a 4 SC. As células foram então lavadas duas vezes em tampão FACS. Após lavagem, as células foram ressuspensas em 50 pL de tampão FACS contendo anticorpo secundário (chulgG > -Alexa488, C= 10 pg/ mL) e incubadas 1 h a 4 SC. As células foram então lavadas duas vezes em tampão FACS e ressuspensas em tampão FACS de 70 pL/ poço para medição utilizando um FACS Canto (BD, Pharmingen).
[0431] Na Tabela 26 é mostrada a afinidade dos anticorpos CD40 humanizados (medidos por Biacore) e a ligação celular a células que
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354/387 expressam CD40 (células Raji).
Tabela 26: Afinidade e ligação celular de anticorpos CD40 humanizados
PARA CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD40
ID VH /VL Afinidade [nM] Ka (1/Ms) Kd (1/s) EC50 [pg/ml] ligação celular (Raji)
P1AD4470 controle 4,6 1,69E + 06 7,81 E-03 0,09
P1AE0400 VL2a/VH2a 4,2 1,68E + 06 6,99E-03 0,12
P1AE0401 VL2a/VH2b 4,6 1,69E + 06 7,87E-03 0,13
P1AE0402 VL2a/VH2c 4,2 1,67E + 06 7,09E-03 0,13
P1AE0403 VL2a/VH2d 29 1,40E + 06 4,07E-02 0,12
P1AE0404 VL2b/VH2a 4,2 1,63E + 06 6,93E-03 0,11
P1AE0405 VL2b/VH2b 5,1 1,61E + 06 8,14E-03 0,09
P1AE0406 VL2b/VH2c 4,2 1,67E + 06 7,09E-03 0,09
P1AE0407 VL2b/VH2d 30 1,19E + 06 3,55E-02 0,12
P1AE0816 controle 8,7 2,53E + 06 2,19E-02 0,09
P1AE0817 VH1a/VL1a 2,5 2,40E + 06 5,93E-03 0,09
P1AE0818 VH1c/VL1c 3,2 2,63E + 06 8,47E-03 0,14
P1AE0819 VH1d/VL1d 3,4 2,59E + 06 8,77E-03 0,11
P1AE0993 VH1a/VL1c 3,4 2,68E + 06 8,98E-03 0,13
P1AE0996 VH1a/VL1d 3,5 2,59E + 06 9,08E-03 0,12
P1AE0997 VH1c/VL1a 2,3 2,59E + 06 6,03E-03 0,12
P1AE0998 VH1c/VL1d 3,3 2,70E + 06 8,96E-03 0,12
P1AE0999 VH1d/VL1a 2,4 2,45E + 06 5,92E-03 0,15
P1AE1000 VH1d/VL1c 3,2 2,68E + 06 8,62E-03 0,14
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355/387
ID VH /VL Afinidade [nM] Ka (1/Ms) Kd (1/s) ECõo [pg/ml] ligação celular (Raji)
P1AE1001 VH1a/VL1b 2,7 2,56E + 06 6,81 E-03 0,08
P1AE1002 VH1b/VL1a 2,2 2,54E + 06 5,57E-03 0,13
P1AE1003 VH1b/VL1b 2,5 2,46E + 06 6,06E-03 0,13
P1AE1004 VH1b/VL1c 3 2,63E + 06 7,95E-03 0,14
P1AE1005 VH1b/VL1d 3,2 2,58E + 06 8,16E-03 0,11
P1AE1006 VH1c/VL1b 2,6 2,53E + 06 6,51 E-03 0,14
P1AE1007 VH1d/VL1b 2,7 2,50E + 06 6,62E-03 0,12
4.2.9 Caracterização de anticorpos por espectrometria de massa UHR-ESIQTOF [0432]As amostras foram dessalinizadas por HPLC em uma coluna Sephadex G25 5 x 250 mm (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemanha) utilizando acetonitrila a 40% com ácido fórmico a 2% (v/ v). A massa total foi determinada por UHR-ESI-QTOF MS em um sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha) equipado com uma fonte TriVersa NanoMate (Advion, Ithaca, NY). A aquisição de dados foi realizada a 900-4000 m/ z (ISCID: 0,0 eV). Os espectros de massa bruta foram avaliados e transformados em massas molares relativas individuais usando uma ferramenta de software desenvolvida internamente.
4.2.10 Avaliação da estabilidade térmica de anticorpos [0433] As amostras são preparadas a uma concentração de 1 mg/ mL em 20 mM Histidina/ cloreto de histidina, 140 mM NaCI, pH 6,0, transferidas para uma placa óptica de 384 poços por centrifugação através de uma placa
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356/387 filtrante de 0,4 μιτι e cobertas com óleo de parafina. O raio hidrodinâmico é medido repetidamente por dispersão de luz dinâmica em um DynaPro Plate Reader (Wyatt) enquanto as amostras são aquecidas com uma taxa de 0,05 SC/ min de 25 SC a 80 SC. De forma alternativa, as amostras foram transferidas para um arranjo de micro-cuvetes de 10 pL e dados estáticos de espalhamento de luz, bem como dados de fluorescência após excitação com um laser de 266 nm foram registrados com um instrumento OptimIOOO (Avacta Inc.), enquanto eles foram aquecidos a uma taxa de 0,1 SC/ min de 25 SC a 90 SC. A temperatura de início da agregação é definida como a temperatura na qual o raio hidrodinâmico (DLS) ou a intensidade da luz dispersa (OptimIOOO) começa a aumentar. A temperatura de fusão é definida como o ponto de inflexão em um gráfico mostrando a intensidade da fluorescência vs. o comprimento de onda.
Exemplo 5 [0434] Geração e Produção de construções biespecíficas com novas variantes de anticorpos CD40 humanizados
5.1 Geração de moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno visando CD40 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) [0435] Os cDNA que codificam um domínio VH e um domínio VL como descrito no Exemplo 4 foram clonados em estrutura com as correspondentes cadeias pesada ou leve constantes de lgG1 humana em plasmídeos de expressão adequados. A expressão da cadeia pesada e leve acionada por um promotor quimérico de MPSV que consiste no promotor nuclear de MPSV e em um elemento potenciador de CMV. O cassete de expressão também contém um sinal poliA sintético na extremidade 3’ dos cDNAs., de forma adicional, os vetores plasmídicos abrigam uma origem de replicação (EBV OriP) para manutenção epissómica dos plasmídeos.
[0436]Analogamente ao Exemplo 1, preparam-se diferentes
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357/387 anticorpos biespecíficos de CD40-FAP no formato 4 + 1 constituído por quatro porções de ligação a CD40 combinadas com uma porção de ligação a FAP no terminal C de um FC(Figura 1 A) ou em 2 + 1 e 2 Formatos + 2 que consiste em duas porções de ligação a CD40 combinadas com qualquer uma porção de ligação a FAP no terminal C de uma FC(Figuras 1C e 1E) ou duas porções de ligação a FAP no terminal C de um FC(Figura 1D)., de forma adicional, preparado um anticorpo biespecífico constituído por uma unidade de ligação a CD40 combinada com uma porção de ligação a FAP (Figura 1F). A geração e preparação de ligantes de FAP 28H1 e 4B9 está descrita no documento WO 2012/020006 A2, que é aqui incorporado por referência. Para gerar as moléculas 4+1 e 2 + 1, a tecnologia knob-vnto-hole é usada para alcançar a heterodimerização. As mutações S354C/ T366W são introduzidas na primeira cadeia pesada HC1 (cadeia pesada de maçaneta Fc) e as mutações Y349C/ T366S/ L368A/ Y407V são introduzidas na segunda cadeia pesada HC2 (cadeia pesada de furo Fc). Na molécula 2 + 2, a tecnologia CrossMab, conforme descrito no documento WO 2010/145792 A1, garante o emparelhamento correto da cadeia leve. Independentemente do formato biespecífico, em todos os casos é utilizado um Fc silencioso efetor (P329G; L234, 234A) para anular a ligação aos receptores Fcy de acordo com o método descrito em WO 2012/130831 A1. Sequências das moléculas biespecíficas são mostradas na Tabela 27.
[0437] Todos os genes são expressos transientemente sob o controle de um promotor quimérico de MPSV que consiste no promotor nuclear de MPSV combinado com o fragmento potenciador do promotor de CMV. O vetor de expressão também contém a região oriP para replicação epissômica em células hospedeiras contendo EBNA (Antígeno Nuclear de Vírus de Epstein Barr).
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Tabela 27: Sequências de aminoácidos das moléculas biespecíficas de LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
Construção Sequência SEQ ID Ne:
CD40 (hVH3/hVK2) x FAP (4B9) (4 + 1) com VH/VL no terminal C
hVH3_CD40 VHCH1- VHCHI-Fc knob_PGU\ LA -4B9 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQGLEWIGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVT STVDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAREGIYWW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG ASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQGLEWIG RVIPNAGGTSYNQKFKGRVTSTVDTSISTAYMELSR LRSDDTVVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEV QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNY WGQGTLVTVSS 131
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359/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
hVH3_CD40 VHCH1- VHCH1-FC /?o/e_PGLAL A-4B9 VL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQGLEWIGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVT STVDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAREGIYWW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG ASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAPGQGLEWIG RVIPNAGGTSYNQKFKGRVTSTVDTSISTAYMELSR LRSDDTVVYYCAREGIYWWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIV LTQSPGTLSLSPG E RATLSC RASQS VTSSYLAWYQ QKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK 132
hVK2_CD40 cadeia leve DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL 133
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 650/744
360/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
CD40 (hVH3/hVK2) x FAP (4B9) (2 + 1) com VH/VL no terminal C
hVH3_CD40 VHCH1- Fc knob_PGU\ LA -4B9 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQGLEWIGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVT STVDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAREGIYWW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 134
hVH3_CD40 VHCH1- Fc /?o/e_PGLAL A -4B9 VL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQGLEWIGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVT STVDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAREGIYWW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS 135
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 651/744
361/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPP SRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRA SQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLP PTFGQGTKVEIK
hVK2_CD40 cadeia leve DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC 133
CD40 (hVH3/hVK2) x FAP (4B9) (2 + 2)
hVH3_CD40 FC-PGLALA _4B9_VLCH 1 (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIH WVRQAPGQGLEWIGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVT STVDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAREGIYWW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDE 136
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 652/744
362/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRA SQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLP PTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC
hVK2_CD40 LC(carregad o) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC 137
4B9 VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS WVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGF NYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH 138
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 653/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
QGLSSPVTKSFNRGEC
CD40 (hVH3/hVK2) x FAP (4B9) (2 + 1) terminal C de Fab cruzado
hVH3_CD40 -Fc knob_PGU\ LA Cterm_x4B9_ FAP_VL_CH 1 (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWV RQAPGQGLEWIGrvipnaggtsynqkfkgRVTSTVDTSIS TAYMELSRLRSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVT SSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQ GTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC 139
hVH3_CD40 -Fc Z?o/e_PGLAL A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWV RQAPGQGLEWIGrvipnaggtsynqkfkgRVTSTVDTSIS TAYMELSRLRSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYF 140
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 654/744
364/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
(carregado) PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG
+ hVK2_CD40 LC(carregad o) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC 137
+ 4B9 VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS WVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGF NYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC 138
CD40 (hVH3/hVK2) x FAP (4B9) (1+1)
4B9-Fc knob_PGLA ΕIVLTQS PGTLSLSPG E RATLSC RASQSVTSSYLAW YQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTD 141
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 655/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
LA FTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG
hVH3_CD40 -Fc /?o/e_PGLAL A (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASgysftgyyihWV RQAPGQGLEWIGrvipnaggtsynqkfkgRVTSTVDTSIS TAYMELSRLRSDDTVVYYCARegiywWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG 140
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 656/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
+ hVK2_CD40 LC(carregad o) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYQQRPGQSPRLLIYTVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC 137
+ 4B9 VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS WVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGF NYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC 138
[0438] Prepararam-se outros anticorpos biespecíficos com as novas variantes de anticorpo CD40 humanizado como descrito no Exemplo 4.2. As sequências específicas de tais anticorpos biespecíficos são mostradas na Tabela 28 abaixo. Em particular, prepararam-se diferentes anticorpos biespecíficos CD40-FAP no formato 4 + 1 que consiste em quatro porções de ligação a CD40 combinadas com uma porção de ligação FAP como fragmento de Fab cruzado fundido com o terminal C da cadeia do núcleo FC(Figuras 15F e 15G) ou no formato 2 + 1 que consiste em duas porções de ligação a CD40 combinadas com qualquer uma porção de ligação FAP como fragmento de cruzamento, em que a cadeia VL-CH1 está fundida no terminal C da cadeia de controle FC(Figura 15H) ou uma porção de ligação FAP como fragmento de cruzamento de Fab, em que a cadeia de VH-CL é fundida no terminal C da cadeia da maçaneta de FC(Figura 15I).
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 657/744
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Tabela 28: Sequências de aminoácidos de moléculas biespecíficas de ligação
AO ANTÍGENO
Construção Sequência SEQ ID Ne:
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP (28H1) (4 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLG NFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
VL2a (CD40) cadeia leve (carregado) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNG NTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC 243
VH2a (CD40) (VHCH1 carregado_V H2a (CD40) (VHCH1 carregado)Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYI HWVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGR FTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIY WWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGG 244
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 658/744
368/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
knob_PGLM_ A_28H1 (VLCH1) GLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPG KGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSK NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTT VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKG PSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
VH2a (CD40) (VHCH1 carregado_V H2a (CD40) (VHCH1 carregado)- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYI HWVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGR FTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIY WWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS 245
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 659/744
369/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
Fc /?ote_PGLAL A NTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPG KGLEWVGRVIPNAGGTSYNQKFKGRFTISVDNSK NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTT VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
P1AE0890 CD40 (VH2d/VL2a) x FAP (28H1) (4 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLG NFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
VL2a (CD40) cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNG NTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFS 243
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 660/744
370/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
(carregado) GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
VH2d (CD40) (VHCH1 carregado_V H2d (CD40) (VHCH1 carregado)Fc knob_PGLM_ A_28H1 (VLCH1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYI HWVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESG GGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAP GKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKGRFTISVDNS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERA 246
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 661/744
371/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
TLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKG PSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
VH2d (CD40) (VHCH1 carregado_V H2d (CD40) (VHCH1 carregado)Fc /?ote_PGLAL A EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYI HWVRQAPGKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKG RFTISVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESG GGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAP GKGLEWVGRVIPNAGGTSYGDSVKGRFTISVDNS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 247
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 662/744
372/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
P1AE2024 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (28H1) (4 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLG NFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
VL1a (CD40) cadeia leve (carregado) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC 248
VH1a (CD40) (VHCH1) _VH1a (CD40) (VHCH1) Fc knob_PGLM_ A_28H1 (VLCH1) (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAP GQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDK 249
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 663/744
373/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQGQVIPPTFGQGTKVE1KSSASTKG PSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
VH1a (CD40) (VHCH1) _VH1a (CD40) (VHCHI)-Fc /?ote_PGLAL A (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQAP 250
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 664/744
374/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
GQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKGRVTLTVDK SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIYWWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
P1AE2302 CD40 (VH1 a/VL1 a) x FAP (28H1) (2 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
28H1 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAM SWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLG NFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 162
VL1a (CD40) cadeia leve (carregado) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVV 248
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 665/744
375/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc knob_PGLM_ A_28H1 (VLCH1) (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGT LSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQ APRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 251
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc /?ote_PGLAL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI 252
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 666/744
376/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
A (carregado) YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP G
P1AE2402 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (4B9) (2 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
4B9 cadeia leve cruzado VHCL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM SWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFG GFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 138
VL1a (CD40) cadeia leve (carregado) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ 248
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 667/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc knob_PGLM_ A_4B9 (VLCH1) (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGT LSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQ APRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRL EPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 253
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc /?ote_PGLAL A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG 252
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 668/744
378/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
(carregado) GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP G
P1AE2408 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (4B9) (2 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
4B9 cadeia leve cruzado VLCH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLA WYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTK VEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC 254
VL1a (CD40) cadeia leve (carregado) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG 248
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 669/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
LSSPVTKSFNRGEC
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc knob_PGLM_ A_4B9 (VHCL) (carregado) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ GTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC 255
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc /?ote_PGLAL A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG 252
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 670/744
380/387
Construção Sequência SEQ ID Ne:
(carregado) GTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP G
P1AE2487 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (4B9) (2 + 1) fusão de terminal C de Fab cruzado
4B9 cadeia leve cruzado VLCH EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLA WYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTK VEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC 254
VL1a (CD40) cadeia leve DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVHSNGN TFLHWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQTTHVPWTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG 256
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 671/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
LSSPVTKSFNRGEC
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc knob_PGLM_ A_4B9 (VHCL) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ GTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC 257
VH1a (CD40) (VHCH1) Fc /?ote_PGLAL A QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYI HWVRQAPGQSLEWMGRVIPNAGGTSYNQKFKG RVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGI YWWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG 258
Petição 870190083303, de 26/08/2019, pág. 672/744
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Construção Sequência SEQ ID Ne:
GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP G
5.2 Produção de moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno visando
CD40 E PROTEÍNA DE ATIVAÇÃO DE FIBROBLASTOS (FAP) [0439] As moléculas de ligação ao antígeno biespecífico direcionadas contra CD40 e a proteína de ativação de fibroblastos (FAP) foram expressas por transfecção transiente de células HEK criadas em suspensão com vetores de expressão codificando as 4 cadeias peptídicas diferentes. A transfecção em células HEK293-F (Invitrogen) foi realizada de acordo com as instruções do fornecedor de células utilizando preparações Maxiprep (Qiagen) dos vetores de anticorpo, meio F17 (Invitrogen, EUA), Peipro (Polyscience Europe GmbH) e uma densidade celular inicial de 1- 2 milhões de células viáveis/ ml em meio de expressão FreeStyle 293 isento de soro (Invitrogen). Os sobrenadantes da cultura de células foram recolhidos após 7 dias de cultura em frascos de agitação ou fermentadores agitados por centrifugação a 14000 g durante 30 minutos e filtrados através de um filtro de 0,22 pm.
[0440] Os anticorpos biespecíficos foram purificados a partir de sobrenadantes de culturas celulares por cromatografia de afinidade utilizando
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383/387 cromatografia MabSeletSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Suia). Em resumo, os sobrenadantes de culturas celulares filtradas esterilizadas foram capturados em uma resina MabSelet SuRe equilibrada com tampão PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCI 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4), lavados com tampão de equilrio e eluos com 25 mM de cirato, pH 3,0. Após neutralização com Tris 1 M pH 9,0, a proteína agregada foi separada das espies de anticorpo monomérico por cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0. As frações de proteína monoméricas foram reunidas, concentradas, se necessário, utilizando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30KD MWCO) e armazenadas a -80 SC. Alíquotas de amostras foram usadas para posterior caracterização analítica, por exemplo, por CE-SDS, cromatografia por exclusão de tamanho, espectrometria de massa e determinação de endotoxina.
Tabela 29: Rendimento de produção e qualidade de moléculas de ligação de
ANTÍGENO CD40 BIESPECÍFICAS
Construção Rendimento [mg/L] após a purificação da proteína A e SEC Pureza (por % de CESDS)) Pureza (por % de SEC)) Afinidade ao FAP hamano [nM]
P1AE2024 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (28H1) (4 + 1) terminal C de fab cruzado (/mob_VL_CH1) 6,6 mg/L 98,2 97,8 1,2
P1AE2302 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (28H1) (2 + 1) terminal C de fab cruzado (/mob_VL_CH1) 12 mg/L 99 99,7 0,3
P1AE2402 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (4B9) (2 + 1) terminal C de fab cruzado (/mob_VL_CH1) 21 mg/L 96,4 99,2 17,3
P1AE2408 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (4B9) (2 + 1) terminal C de fab cruzado (/mob_VH_Ck) 18 mg/L 91,3 95,2 15,3
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Construção Rendimento [mg/L] após a purificação da proteína A e SEC Pureza (por % de CESDS)) Pureza (por % de SEC)) Afinidade ao FAP hamano [nM]
P1AE0408 CD40 x FAP (28H1)(2 + 1) topo a base 42 mg/L 97,8 96,2 1,5
P1AE0637 CD40 x FAP (28H1) (4 + f) (knob_VL_CH1) 9,7 mg/L 98,7 100 0,1
P1AE0889 CD40 (VH2a/VL2a) x FAP (28H1)4 + 1 terminal C de Fab cruzado 17 mg/L 96,4 99 nd
P1AE2487 CD40 (VH1a/VL1a) x FAP (4B9) (2 + 1) terminal C de fab cruzado (knoòVHCk) nd nd 99,2 nd
5.3 Caracterização dos anticorpos biespecíficos que compreende variantes
DO ANTICORPO CD40 HUMANIZADO E FAP
5.3.1 Ligação a células de fibroblastos murinos que expressam FAP humanas OU DE CAMUNDONGO [0441] A ligação a FAP da superfície celular foi testada utilizando células que expressam proteína ativadora de fibroblastos humanos (huFAP) NIH/ clone 19 3T3-huFAP ou células que expressam proteína ativadora de fibroblastos de camundongo (mFAP) foram testadas como descrito no Exemplo 1.4. 1 Os valores de EC50 medidos para algumas das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que compreende variantes do anticorpo CD40 humanizado são mostrados na Tabela 7.
5.3.2 Ligação à FAP (ressonância plasmônica de superfície) [0442] A capacidade das construções biespecíficas de se ligar à PAF humana foi avaliada pela ressonância plasmônica de superfície (SPR). Todas as experiências de SPR foram realizadas em um Biacore T200 (Biacore) a 25 SC com HBS-EP como tampão de corrida (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCI 0,15 M, EDTA3 mM, Tensoativo 0,005% P20, (Biacore).
[0443] O FAP dimérico humano marcado com His (FAP_ECD
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385/387 recombinante) foi capturado em um chip CM5 (GE Healthcare) imobilizado com anticorpo anti-His (Cat. Qiagen Ns 34660) por injeção de 500 nM de huFAP durante 60 são a um caudal de 10 uL/ min, 10 nM de FAP murino durante 20 são a um caudal de 20/ min e 10 nM de ciNOFAP durante 20 são a um caudal de 20/ min. Níveis de imobilização para o anticorpo anti-His de até 18000 unidades de ressonância (RU) foram utilizados. Após o passo de captura, os anticorpos biespecíficos bem como as moléculas de controle foram imediatamente passados sobre a superfície do chip em uma concentração variando de 0,78-100 nM com um caudal de 30 μΙ_/ minuto durante 280 são e uma fase de dissociação de 180 s. As diferenças de índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo-se a resposta obtida em uma célula de fluxo de referência, em que nenhuma FAP foi imobilizada. A avidez foi determinada usando o ajuste de curva Langmuir 1:1. Para ligação bivalente, foi utilizado o mesmo ajuste de 1: 1, levando a um valor aparente de KD.
Tabela 30: Ligação de moléculas de ligação de antígeno CD40 x FAP
BIESPECÍFICAS EXEMPLIFICATIVAS A FAP ECD HUMANA RECOMBINANTE (BlACORE)
Ligando KD* (Avidez) ka(1/Ms) kd (1/s)
Controle 4B9 lgG1 0,08 nM 2,19E + 06 1,72E-04
P1AD9139 4 + 1 com fusão VH/VL no terminal C 2,7 nM 5,76E + 05 1.55E-03
P1AE0192 1 + 1 crossMab 2,2 nM 6,63E + 05 1,45E-03
P1AE0408 2 + 1 formato topo a base 6,0 nM 2,91 E + 05 1,74E-03
P1AE0637 4 + 1 terminal C de Fab cruzado 7,3 nM 2,82E + 05 2.05E-03
Nota: Todos os KDs dependem das condições experimentais específicas.
5.3.3 Ligação ao CD40 (ressonância plasmônica de superfície) [0444] A capacidade das construções biespecíficas de se ligar ao CD40 humano foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Todas as experiências de SPR foram realizadas em um Biacore T200 (Biacore) a 25 SC com HBS-EP como tampão de corrida (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCI
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0,15 M, EDTA3 mM, Tensoativo 0,005% P20, (Biacore).
[0445] De acordo com o Exemplo 4.2.7, a associação foi medida por injeção de domínio extra celular CD40 humano em vias concentrações em solução durante 300 seg a um fluxo de 30 μΙ_/ min comendo a 300 nM em diluições 1: 3. A fase de dissociação foi monitorada por até 1200 segundos e desencadeada pela mudança da solução de amostra para o buffer de operação. A superfície foi regenerada por 60 segundos de lavagem com uma solução de glicina a pH 2,1 a um caudal de 30 μΙ_/ min. As diferenças de índice de refração foram corrigidas subtraindo a resposta obtida de uma superfície de cabra anti-humana F(ab’)2. Injeções em branco também são subtraídas (= referência dupla). Para o cálculo do KD aparente e outros parâmetros cinéticos foi utilizado o modelo de Langmuir 1: 1. O Kd aparente foi calculado usando o software de avaliação Biacore™ B4000 (versão 1.1).
Tabela 31: Ligação de moléculas de ligação de antígeno CD40 x FAP
BIESPECÍFICAS EXEMPLIFICATIVAS A CD40_ECD HUMANO RECOMBINANTE (BIACORE)
Ligando Descrição de formato KD ka (1/Ms) kd (1/s)
P1AE0192 1 + 1 crossMab 3,7 nM 2,09E + 06 7,77E-03
P1AE0408 2 + 1 formato topo a base 3,6 nM 2,34E + 06 8,43E-03
P1AE0637 4 + 1 fusão de terminal C de Fab cruzado 4,0 nM 1,79E + 06 7,22E-03
Nota: Todos os KDs dependem das condições experimentais específicas.
5.3.4 Ligação a células Daudi que expressam CD40 humanas [0446] A ligação ao CD40 da superfície celular foi testada utilizando células Daudi, uma linha celular de linfoblastos B humanos com elevados níveis de expressão de CD40 humano (ATCC CCL-213) como descrito no Exemplo 1.4.2. Os valores exemplificativos de EC50 medidos para algumas das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que compreende
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387/387 variantes do anticorpo CD40 humanizado são mostrados na Tabela 8.
5.3.5 Propriedades funcionais da molécula biespecífica de ligação ao ANTÍGENO QUE COMPREENDE VARIANTES DO ANTICORPO CD40 HUMANIZADO [0447] As propriedades funcionais das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico que compreende variantes do anticorpo de CD40 humanizado foram analisadas de acordo com as experiências descritas no Exemplo 2. Os dados exemplificativos são fornecidos nas Tabelas 9, 10 ou 11 como mostrado aqui anteriormente.

Claims (32)

  1. Reivindicações
    1. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, caracterizada por compreender:
    (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, e (b) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo.
  2. 2. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender, de forma adicional, (c) uma região Fc composta por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.
  3. 3. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, se ligar a um polipeptídeo que compreende ou que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 1.
  4. 4. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno da célula alvo, ser um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica à Proteína de Ativação de Fibroblastos (FAP).
  5. 5. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreender:
    (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 3, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID
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    2/12
    Ns: 4 e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 5 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 6, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 7, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 8, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 11, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 12, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 13 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 14, (v) CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 15 e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 16.
  6. 6. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreender:
    (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%,
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    3/12
    99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
  7. 7. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende: (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 19, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 20, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 21, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende: (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 22, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 23, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 24.
  8. 8. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende: (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 27, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 28, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 29, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende: (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 30, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 31, e (vi) CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 32.
  9. 9. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40,
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    4/12 compreender:
    (a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 25 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 26, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 33 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 34.
  10. 10. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender:
    (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173 e SEQ ID Ns: 174e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177 e SEQ ID Ns: 178.
  11. 11. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender:
    (i) uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ ID Ns: 182, SEQ ID Ns: 183 e SEQ ID Ns: 184, e (ii) uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que
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    5/12 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188.
  12. 12. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 10, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender:
    (a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 177, ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 178, ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 177, ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 178, ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 175, ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 178, ou
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    6/12 (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175, ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 177, ou (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 176, ou (k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 175, ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 176, ou (m) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 177, ou (n) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 172 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 178, ou (o) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 173 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 176, ou (p) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 174 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 176.
  13. 13. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de
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    7/12 acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 10 ou 12, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 171 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 175.
  14. 14. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 11, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender:
    (a) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 185, ou (b) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 180 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 185, ou (c) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 181 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 185, ou (d) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 185, ou (e) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 186, ou (f) uma VH que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 180 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidosda
    SEQ ID Ns: 186, ou (g) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
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    8/12
    SEQ ID Ns: 181 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (h) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 186, ou (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 183 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 187, ou (j) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 183 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 188, ou (k) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 184 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 187, ou (l) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 184 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da
    SEQ ID Ns: 188.
  15. 15. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 11 ou 14, caracterizada pelo domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreender uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 179 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185 ou em que o domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 182 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 185.
  16. 16. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por
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    9/12 compreender:
    (i) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao CD40, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 171, SEQ ID Ns: 172, SEQ ID Ns: 173, SEQ ID Ns: 174, SEQ ID Ns: 179, SEQ ID Ns: 180, SEQ ID Ns: 181, SEQ Ns: 182, SEQ Ns: 183 e SEQ Ns: 184, e uma região variável de cadeia leve (VLCD40) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 175, SEQ ID Ns: 176, SEQ ID Ns: 177, SEQ ID Ns: 178, SEQ ID Ns: 185, SEQ ID Ns: 186, SEQ ID Ns: 187 e SEQ ID Ns: 188, e (ii) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 9 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 10, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 18.
  17. 17. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 16, caracterizada pela região Fc ser um IgG, em particular uma região Fc de lgG1 ou uma região Fc de lgG4 e em que a região Fc compreende uma ou mais substituição de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do anticorpo a um receptor Fc e/ ou função efetora.
  18. 18. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 17, caracterizada pela região Fc ser (i) da subclasse IgG 1 humana com as mutações de aminoácidos L234A,
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    10/12
    L235A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU), ou (ii) da subclasse lgG1 de camundongo com as mutações de aminoácidos D265A e P329G (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).
  19. 19. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pela molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreender:
    (a) pelo menos dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) um domínio de ligação ao antígeno, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
  20. 20. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pela molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreender:
    (a) pelo menos dois fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40, ligado a uma região Fc, e (b) um fragmento de Fab cruzado, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, ligado ao terminal C da região Fc.
  21. 21. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pela molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreender quatro fragmentos de Fab, capazes de se ligar de forma específica ao CD40.
  22. 22. POLINUCLEOTIDEO, caracterizado por codificar a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
  23. 23. VETOR de expressão, caracterizado por compreender o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 22.
  24. 24. CÉLULA hospedeira, caracterizada por compreender o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 22 ou o vetor de expressão,
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    11/12 conforme definido na reivindicação 23.
  25. 25. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA MOLÉCULA biespecífica de ligação ao antígeno, caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 24, sob condições adequadas para a expressão da molécula biespecífica de ligação ao antígeno e isolamento da molécula biespecífica de ligação ao antígeno.
  26. 26. COMPOSIÇÃO farmacêutica, caracterizada por compreender a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  27. 27. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados por ser para uso como um medicamento.
  28. 28. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados por ser para uso:
    (i) na indução da estimulação imunológica por CD40 expressando células que apresentam o antígeno (APCs), (ii) na estimulação da resposta das células T específicas de tumor, (iii) em causar apoptose de células tumorais, (iv) no tratamento de câncer, (v) em retardar a progressão do câncer, (vi) em prolongar a sobrevivência de um paciente que sofre de câncer, (vii) no tratamento de infecções.
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    12/12
  29. 29. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados por ser para uso no tratamento de câncer.
  30. 30. USO DA MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 26, caracterizados por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
  31. 31. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO com câncer, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da molécula biespecífica de ligação ao antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 26.
  32. 32. MOLÉCULA BIESPECÍFICA de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizados por ser para uso no tratamento de câncer, em que a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é administrada em combinação com um agente quimioterápico, radiação e/ ou outros agentes para uso em imunoterapia de câncer.
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