TW202328197A - 抗cd40抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了抗CD40抗體及其用途，例如特異性結合CD40的小鼠、人、嵌合或人源化的抗體或其抗原結合片段，還提供了編碼所述抗體及其抗原結合片段的核酸分子，以及用於表達所述抗體或其抗原結合片段的表達載體和宿主細胞。進一步提供了所述抗體及其抗原結合片段的製備方法和使用方法，包括治療和預防免疫疾病。

Description

抗CD40抗體及其用途
本發明屬於生物技術領域，具體涉及特異性結合CD40的抗體和其抗原結合片段，並且涉及使用這類抗體和抗原結合片段的方法。
CD40是一種I型跨膜糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員。CD40組成性地表達於抗原呈遞細胞(包括樹突狀細胞、B細胞和巨噬細胞)，還少量表達於在非造血細胞如上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、角質細胞等。此外，CD40還表達於多種腫瘤細胞，例如B淋巴瘤細胞。CD40的主要配體CD40L(CD154)，是一種II型跨膜糖蛋白，CD40L主要表達於活化的CD4 +T淋巴細胞、活化的B細胞、記憶T細胞、活化的NK細胞和活化的血小板中。
CD40/CD40L信號途徑參與有機體的體液免疫反應和細胞免疫反應，在B細胞的活化、增殖與分化，抗體的產生、抗體類別轉換等T細胞依賴的抗體免疫反應以及炎症反應中起關鍵調節作用。研究表明，自身免疫性疾病患者的組織和器官中浸潤大量針對自身抗原的T細胞和B細胞，且表現為CD40和/或CD40L持續性高表達。原發性乾燥症候群患者IHC染色結果顯示，CD40在唾液腺上皮細胞富集並伴隨著血清中的抗SSA等自身抗體增高。此外，CD40/CD40L信號途徑在發炎性腸病中的關鍵作用已在小鼠等動物模型中證實。
因此，特異性結合CD40並抑制CD40/CD40L信號途徑的抗體，對免疫疾病例如發炎性疾病和自身免疫病的治療具有潛在的臨床價值。例如，Novartis公司開發的抗CD40抗體Iscalimab(CFZ533)，目前正在用於治療CD40媒介的免疫疾病的臨床試驗中，結果顯示，Iscalimab以10 mg/kg靜脈注射劑量施用於原發性乾燥症候群患者(入組條件為血清自身抗體陽性)時，62%(13/21)患者ESSDAI疾病活動評分低於5分，治療效果顯著優於安慰劑組的36%(4/11)。目前全球免疫疾病患者的數量龐大，因此，亟需開發更多具有更好藥物特性的抗CD40抗體。
一方面，本發明提供了分離的結合CD40的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段是鼠類抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段是單株抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、多特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb、分離的CDR、單鏈Fv分子、重組多肽、融合蛋白、雙特異性分子或其組合。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段結合人CD40。在另一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段結合CD40(例如人CD40和食蟹猴(cynomolgous)CD40)。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段阻斷CD40與CD40L相互作用。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段抑制CD40活性。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1(HCDR1)、重鏈CDR2(HCDR2)和重鏈CDR3(HCDR3)，其中，(1) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR3的胺基酸序列；(2) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列；(3) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列；(4) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR3的胺基酸序列；(5) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR3的胺基酸序列；(6) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR3的胺基酸序列；(7) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR3的胺基酸序列；(8) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR3的胺基酸序列；(9) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR3的胺基酸序列；或(10) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR3的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，其中，(1) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、2和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、2和5所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(2) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、3和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、3和5所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(3) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、4和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、4和5所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(4) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：18、19和20所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：18、19和20所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(5) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：24、25和26所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：24、25和26所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(6) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：32、33和34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：32、33和34所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(7) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：40、41和42所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：40、41和42所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；或(8) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：46、47和48所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：46、47和48所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR1(LCDR1)、輕鏈CDR2(LCDR2)和輕鏈CDR3(LCDR3)，其中，(1) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(2) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(3) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(4) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(5) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(6) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(7) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(8) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR3的胺基酸序列；或(9) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR3的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR1，輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中，(1) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(2) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：21、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：21、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(3) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：27、28和29所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：27、28和29所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(4) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：35、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：35、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(5) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：43、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：43、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；或(6) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：49、50和51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：49、50和51所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中，(1) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(2) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(3) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(4) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(5) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(6) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(7) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(8) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(9) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(10) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(11) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR3的胺基酸序列；(12) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR3的胺基酸序列；或(13) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR3的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中，(1) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、2、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、2、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(2) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、3、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、3、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(3) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、4、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、4、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(4) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：18、19、20、21、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：18、19、20、21、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(5) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(6) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：32、33、34、35、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：32、33、34、35、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(7) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：40、41、42、43、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：40、41、42、43、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；或(8) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：46、47、48、49、50和51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：46、47、48、49、50和51所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NOs：9、10、11、12、13、22、30、38、44或52所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NOs：9、10、11、12、13、22、30、38、44或52所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NOs：14、15、16、17、23、31、39、45或53所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NOs：14、15、16、17、23、31、39、45或53所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，(1) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：9和14所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：9和14所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(2) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和15所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和15所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(3) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：11和15所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：11和15所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(4) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和16所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和16所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(5) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：11和16所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：11和16所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(6) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和17所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(7) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：12和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：12和17所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(8) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：13和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：13和17所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(9) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：22和23所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：22和23所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(10) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：30和31所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：30和31所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(11) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；(12) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：44和45所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：44和45所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列；或(13) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：52和53所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：52和53所示的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含重鏈可變區和重鏈恆定區，所述輕鏈包含輕鏈可變區和輕鏈恆定區，其中重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含上述的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列，重鏈恆定區包含人IgG1，IgG2或IgG4恆定區，優選IgG1和IgG4恆定區，輕鏈恆定區包含人κ恆定區或人λ恆定區。在一些具體的實施方案中，所述重鏈恆定區包含SEQ ID NOs：54、55或56所示胺基酸序列或與SEQ ID NOs：54、55或56所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列，所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：57所示胺基酸序列或者與SEQ ID NO：57所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)，或由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，重鏈和輕鏈透過二硫鍵相互連接，其中每條重鏈包含上述的重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區，其中重鏈可變區(VH)包含框架區(FR)和上述的重鏈互補決定區(HCDR)，每條輕鏈包含上述的輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區，其中輕鏈可變區(VL)包含FR和上述的輕鏈互補決定區(LCDR)，其中重鏈可變區的C-末端連接至重鏈恆定區的N-末端，輕鏈可變區的C-末端連接至輕鏈恆定區的N-末端。本發明的抗體可以是，例如IgG1，IgG2或IgG4同種型的全長抗體。在另一些實施方案中，本發明的抗體可以是單鏈抗體(scFv)、或抗體片段，例如Fab、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb或分離的CDR。
一方面，本發明提供一種結合CD40的分離的抗體或其抗原結合片段，所述的抗體或其抗原結合片段由融合瘤產生，所述的融合瘤選自本文稱為A01、A02、A03、B01、B02和B03的融合瘤組成的組。因此，本發明還包括融合瘤A01、A02、A03、B01、B02和B03以及產生本文揭露的抗體的任何融合瘤產生的抗體或其抗原結合片段。
一方面，本發明提供與本發明任何例示性抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40上相同表位的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，本發明提供與本發明任何例示性抗CD40抗體或其抗原結合片段競爭結合CD40的抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本發明還提供重組多肽或融合蛋白，其包含一種或多種本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段與至少一種其他功能片段，所述其他功能片段包括但不限於另一種胜肽、蛋白質、細胞因子或受體配體。這些重組多肽或融合蛋白可以透過基因改造、化學法等進行製備。
在另一方面，本發明還提供一種雙特異性分子，其包含一種或多種本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段與至少一些不同於本發明的抗體或抗原結合片段特異性的其他功能部分(例如，另一種抗體或其抗原結合片段)，所述雙特異性分子能夠與至少兩個不同結合位點或標的結合。本文所用的“雙特異性分子”涵蓋具有兩種(即雙特異性分子)、三種(即三特異性分子)、四種(即四特異性分子)或更多種的特異性的分子。這些雙特異性分子可以透過基因改造、化學法等進行製備。
在另一方面，本發明還提供一種免疫綴合物，其包含本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分，其中本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分與治療劑(例如細胞毒素劑或成像劑等)相連接，例如抗體-藥物偶聯物(ADC)。本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分可以是嵌合抗原受體(CAR)的一部分。本發明還提供了包含所述嵌合抗原受體的免疫細胞，例如T細胞(即，CAR-T細胞)。此外，本發明還提供了基因載體，所述基因載體包含編碼本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分的基因，並且能使所述基因進入哺乳動物細胞(優選人細胞)，並在其中表達。這些基因載體包括但不限於，裸質體載體、酵母載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘病毒載體、棒狀病毒載體或桿狀病毒載體。用於將DNA插入這些基因載體中的技術是本領域普通技術人員所熟知的。
在另一方面，本發明還提供一種藥物組成物，其包含本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段，和一種或多種藥學上可接受的載劑。在另一些實施方案中，本發明還提供了包含本發明的重組多肽、融合蛋白、雙特異性分子、免疫綴合物、嵌合抗原受體或基因載體，以及藥學上可接受的載劑的藥物組成物。
在另一方面，本發明還提供編碼本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段的分離的核酸。本發明還提供包括所述核酸的表達載體，以及包含所述表達載體的宿主細胞。
在另一方面，本發明還提供一種製備抗CD40抗體或其抗原結合片段的方法，其包括以下步驟：(i)在宿主細胞中表達抗CD40抗體或其抗原結合片段，和(ii)從宿主細胞或其細胞培養物中分離抗CD40抗體或其抗原結合片段。
在其他方面，本發明提供用於在受試者中治療或預防免疫疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分、編碼核酸、藥物組成物、重組多肽、融合蛋白、雙特異性分子、免疫綴合物、嵌合抗原受體或基因載體。在某些實施方式中，受試者是人。
在一些實施方案中，所述免疫疾病包括但不限於發炎性疾病、過敏反應、自身免疫性疾病或移植相關疾病。在一些具體的實施方案中，所述免疫疾病包括但不限於：過敏反應、艾迪生氏病(Addison’s disease)、僵直性脊柱炎、脊柱關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、冠心病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、腎炎、賴特症候群、甲狀腺炎、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林-巴利症候群(GBS)、橋本氏病、溶血性貧血、特發性血小板減少性症、系統性紅斑狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力、銀屑病、硬皮病、關節炎、類肉瘤病、乾燥症候群、乾眼症、化膿性汗腺炎、移植相關疾病、血管炎和/或發炎性腸病。
在一些實施方案中，在所述方法還包括施用第二治療劑，所述第二治療劑包括非甾體抗炎藥(NSAID)、水楊酸鹽、羥化氯喹、柳氮磺吡啶、皮質類固醇、細胞毒性藥物、或免疫抑制藥物和/或抗體。
基於以下具體描述和實施例，當前揭露內容的其他特徵和優勢之處將會更加明晰，具體描述和實施例不應解讀為限制性的。在本發明中引用的所有文獻、Genbank記錄、專利和已揭露專利申請的內容透過引用的方式明確地包含在本文中。
發明詳述
應當理解，本文所用的術語只是為了描述具體實施例，並非旨在進行限制。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。
術語“CD40”包括CD40變異體，同源物，直系同源物和旁系同源物。例如，在一些實施例中，對人CD40蛋白特異的抗體可以在某些情況下與另一物種(例如猴)的CD40蛋白發生交叉反應。在另一些實施方案中，對人CD40蛋白特異的抗體可以完全地對人CD40蛋白特異而不與其他物種或其他類型的蛋白發生交叉反應，或者僅與某些其他物種但並非所有其他物種的CD40蛋白發生交叉反應。
CD40是已知的並且可以將其稱為B細胞表面抗原CD40、Bp50、CD40L受體、CDW40、MGC9013、p50和腫瘤壞死因子受體超家族成員5(TNFRSF5)。“人CD40”或“hCD40”在本文中可以互換，是指具有人CD40胺基酸序列的蛋白，例如包含SEQ ID NO:62所示的胺基酸序列的CD40蛋白。術語“猴CD40”或“cyno CD40”等在本文中可以互換，是指具有猴CD40胺基酸序列的蛋白，例如包含SEQ ID NO:63所示的胺基酸序列的CD40蛋白。
如本文所用的術語“抗體”是指具有至少一個抗原(例如CD40)結合結構域的結合蛋白。本發明的抗體或其抗原結合片段可以是整個抗體或其任何片段，包括單株抗體或其片段和抗體變異體或其片段。抗體或其抗原結合片段的實例包括單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、分離的CDR區、單鏈Fv(scFv)和本領域任何已知的其他抗體片段。本文揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。術語“同種型”是指由重鏈恆定區基因編碼的抗體種類。在一些實施方案中，本文揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段是IgG1和IgG4同種型。本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段可以衍生自任何物種，包括但不限於小鼠、大鼠、兔、靈長類動物、美洲駝和人。本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段可以是鼠類抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。除非另有說明，否則本發明的“抗體”包括全長抗體及其任何抗原結合部分(即“抗原結合片段”)或單鏈。通常，全長抗體是包含兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，其中重鏈和輕鏈透過二硫鍵連接。每條重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域組成，即CH1，CH2和CH3。每條輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區還可以劃分為高變區(即，互補決定區(CDR))和序列較為保守的框架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序排布。抗體的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括多種免疫系統細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一成分(C1q)。
抗體的“抗原結合片段”或“抗體結合部分”是指抗體的一個或多個片段，其保留特異性結合抗原(例如，CD40蛋白)的功能。已證實，抗體的抗原結合功能可以透過全長抗體的片段來實施。涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分/片段”中的實例包括：(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含在鉸鍊區透過二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)由VH結構域組成的dAb片段(參見Ward et al., Nature. 341:544-546(1989))；(vi)分離的互補決定區(CDR)；以及(vii)奈米抗體，一種包含單個可變結構域和兩個恆定結構域的重鏈可變區。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由不同基因編碼，但可以採用重組的方法透過連接子將VH和VL連接成單蛋白鏈，其中VL和VH配對形成單價分子稱單鏈Fv(scFv)；參見Bird et al.,Science.242:423-426(1988)；Huston et al., Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883(1988)，這些單鏈抗體也涵蓋在術語抗原結合部分/片段中。此外，包含該抗原結合部分/片段的重組多肽、融合蛋白和雙特異性分子也涵蓋在術語抗原結合部分/片段中。這些抗體片段可以由本領域技術人員已知的常規技術獲得，且片段可以透過與全長抗體相同的方法進行功能篩選。
“小鼠抗體”或“鼠源抗體”是指可變區中框架區和CDR區均來自小鼠種系免疫球蛋白序列的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區也來自小鼠種系免疫球蛋白序列。本發明的小鼠抗體可包括不由小鼠種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，透過體外隨機突變或點突變或透過體內體細胞突變引入的突變)，但“小鼠抗體”不包括在小鼠框架序列中插入源自其他哺乳動物種系CDR序列的抗體。
“嵌合抗體”是指透過將來自非人來源的遺傳物質和來自人的遺傳物質組合而成的抗體。或更籠統地說，嵌合抗體是指具有來自一種物種的遺傳物質和來自另一物種的遺傳物質的抗體。在本發明中，嵌合抗體也被表示為“Chi”。
“人源化抗體”是下述抗體：所述抗體含有衍生自非人抗體的互補決定區(CDR)和衍生自人抗體的框架區以及恆定區。例如，本文提供的結合CD40的人源化抗體可以包含衍生自一種或多種鼠類抗體的CDR以及人框架區和人恆定區。因此，在一些實施方案中，本文提供的人源化抗體與所述抗體的CDR所衍生自的鼠類抗體結合CD40上的相同表位。本文提供了例示性人源化抗體。包含本文提供的重鏈CDR和輕鏈CDR的另外的結合CD40的人源化抗體或其變異體可以使用任何人框架序列產生，並且也包括在本發明中。在一些實施方案中，適用於在本發明中使用的框架序列包括在結構上與本文提供的框架序列類似的那些框架序列。可以在框架區中進行另外修飾以改變本文提供的抗體的特性。此類另外的框架修飾可以包括化學修飾，點突變以降低免疫原性或去除T細胞表位，或回復突變為原始種系序列中的殘基。在一些實施方案中，此類修飾包括對應於本文示例的突變的那些修飾，包括對種系序列的回復突變。例如，在一些實施方案中，本文提供的人源化抗體的VH和/或VL的人框架區中的一個或多個胺基酸被回復突變為親本鼠類抗體中對應的胺基酸。在本發明中，人源化抗體也被表示為“hz”。
術語“Fc結構域”或“Fc區”是指包含根據Kabat編號系統定義的CH2和CH3恆定結構域的抗體序列。Fc區可以來自人IgG。例如，Fc區可以來自人IgG1或人IgG4 Fc區。
本文所述的“衍生的”，在用於相對於參考抗體或其他結合蛋白的分子或多肽時，意指能夠與參考抗體或其他結合蛋白特異性地結合相同表位的分子或多肽。
“分離的”是指已經從其天然環境中分離的目標化合物(例如，抗體、抗原結合片段或核酸)。
“特異性結合抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本文中與術語“與抗原特異性結合的抗體”可互換使用。“特異性結合人CD40”的抗體是指與人CD40(還可能是其他非人物種的CD40)結合但基本上不結合非CD40的抗體。優選地，抗體以“高親和力”結合人CD40，即K D為5.0×10 -8M或更小，1.0×10 -8M或更小，優選為5.0×10 -9M或更小，更優選為1.0×10 -9M或更小。
術語“基本上不結合”蛋白質或細胞是指不與蛋白質或細胞結合，或不以高親和力與其結合，即結合蛋白質或細胞的K D為1.0×10 -6M或更高，優選為1.0 ×10 -5M或更高，1.0×10 -4M或更高，更優選為1.0×10 -3M或更高，1.0×10 -2M或更高。
術語“高親和力”對IgG而言，是指結合抗原的K D為5.0×10 -8M或更小，1.0×10 -8M或更小，優選為5.0×10 -9M或更小，更優選為1.0×10 -9M或更小。但對於其他抗體同種型，“高親和力”結合可能有所不同。例如，IgM同種型的“高親和力”結合，是指結合抗原的K D為1.0×10 -6M或更小，優選1.0×10 -7M或更小，更優選1.0×10 -8M或更小。
“同一性”是指兩個或多個核酸序列之間或兩個或多個多肽序列之間的相似性。本發明的序列同一性至少為85%，90%或95%，優選為至少95%。非限制性實施例包括：85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以透過National Center For Biotechnology Institute網站上的BLASTN/BLASTP算法的默認設置來進行。
“競爭結合”的抗體指部分或完全阻斷其他抗體與標的結合的抗體。兩種抗體是否彼此競爭結合標的，即一種抗體是否阻斷另一抗體結合標的且至何種程度，可以使用本領域已知的競爭實驗來確定，例如固相直接或間接放射免疫測定(RIA)，固相直接或間接酶免疫測定(EIA)，夾心式競爭測定等。在某些實施方案中，抗體與另一抗體競爭結合標的並使另一抗體與標的的結合阻斷至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
兩種或多種抗體“結合相同表位”意指抗體結合胺基酸殘基的相同區段，如透過給定方法測定。用於確定抗體是否與本文所述抗體結合“CD40上相同的表位”的技術包括例如表位作圖方法，諸如，抗原：抗體複合物的晶體的x射線分析和氫/氘交換質譜法(HDX-MS)。
術語“EC 50”，又稱半數有效濃度，是指在特定暴露時間後，能達到50%最大效應的抗體濃度。術語“IC 50”，又稱半數抑制濃度，是指相對於不存在抗體的情況，將特異性生物學或生化功能抑制50%的抗體濃度。EC 50和IC 50兩者均可以透過ELISA或FACS分析或本領域已知的任何其他方法進行測量。
“K D”指平衡解離常數，其獲自K d比K a(即，K d/K a)的比率並且表示為莫耳濃度(M)。抗體的K D值可以使用本領域充分建立的方法來測定。用於測定抗體的K D的優選方法是透過使用表面等離子共振技術，優選使用生物感測器系統諸如BIACORE ®表面等離子共振系統分析。
“交聯”是指在由抗CD40的抗體結合到順式或反式FcγRIIb所誘導的細胞上CD40的高階多聚化，從而導致誘導CD40的促效活性。
“患者”或“受試者”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，優選哺乳動物，例如非人的靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛和馬。
“有效劑量”或“有效量”是指足以實現或至少部分實現期望效果的量。藥物或治療劑的治療“有效量”或“有效劑量”是指當單獨或與另一治療劑組合使用時，足以防止或改善疾病或病症相關症狀的量，優選引起疾病症狀的嚴重程度降低、無症狀期頻率和持續時間增加、或防止由疾病引起的損傷或無能的量。治療有效量與被治療的疾病相關，其中本領域技術人員可以方便地判別出實際的有效量。
除特別聲明外，本發明中的“約”是指在所給定的具體數值範圍±5%範圍內波動，優選在±2%範圍內波動，更優選在±1%範圍內波動。例如pH值為約5.5表示pH為5.5±5%，優選pH為5.5±2%，更優選pH為5.5±1%。除非另外特別說明，否則單數的使用包括複數。
除非另外特別說明，否則詞語“一個”或“一種”意指“至少一個”或“至少一種”，短語“至少一個”的含義等同於“一個或多個”的含義，“和/或”的使用意指“和”或者“或”。
如本文中所述，任何百分比範圍、比率範圍或整數範圍應當理解為包括在列舉的範圍內的任意整數的值，除非另外指出。
在本文中，除非上下文另有規定，詞語“包含”、“包括”和“含有”將被理解為表示包括所述的步驟或要素或一組步驟或要素，但不排除任何其他步驟或要素或一組步驟或要素。“由……組成”所表示的是包括並且限於短語“由……組成”之後的內容。因此，短語“由……組成”表示所列出的要素是需要的或必需的，並且沒有其他要素可存在。“基本由……組成”所表示的是包括列於此短語之後的任意要素，並且限於不妨礙或有助於所列的要素的如在本發明詳述的活性或作用的其他要素。因此，短語“基本由……組成”表示所列出的要素是需要的或必需的，但其他要素是可選的並可取決於其是否影響所列出的要素的活性或作用而存在或不存在。
本發明的多個方面在以下更加具體地加以描述。
本發明的例示性抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區、輕鏈可變區和CDR的胺基酸序列ID(SEQ ID NO.)提供於下表1中。一些抗體具有相同的CDR，一些抗體具有相同的VH或VL。抗體的重鏈恆定區可以是人IgG1，IgG2或IgG4恆定區，優選IgG1和IgG4恆定區，例如包含SEQ ID NOs：54、55或56所示胺基酸序列或與SEQ ID NOs：54、55或56所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列。抗體的輕鏈恆定區可以是人κ恆定區或人λ恆定區，例如包含SEQ ID NO：57所示胺基酸序列或者與SEQ ID NO：57所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列。這些抗體也可以包含小鼠IgG1或IgG4重鏈恆定區和/或小鼠κ恆定區或λ恆定區。 表1 可變區和CDR的胺基酸序列ID(SEQ ID NO.)
抗體 HCDR1 HCDR2 HCDR3 VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 VL
小鼠和嵌合A01 1 2 5 9 6 7 8 14
hzA01-1.1 3 10 15
hzA01-1.2 11
hzA01-2.1 10 16
hzA01-2.2 11
hzA01-3.1 10 17
hzA01-3.3 4 12
hzA01-3.4 2 13
小鼠和嵌合A02 18 19 20 22 21 23
小鼠和嵌合A03 24 25 26 30 27 28 29 31
小鼠和嵌合B01 32 33 34 38 35 36 37 39
小鼠和嵌合B02 40 41 42 44 43 45
小鼠和嵌合B03 46 47 48 52 49 50 51 53
鑒於抗體可變區的胺基酸序列，本領域技術人員可以常規的方法確定哪些殘基構成特定的CDR。如本領域技術人員公知，可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如用Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact等編號系統/方法定義；或用Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact等編號系統/方法中的二種或多種組合定義(例如，HCDR1用AbM定義、HCDR2和LCDR1-3用Kabat定義、和HCDR3用IMGT定義)；還可以用包含了Kabat和Chothia的Combined編號系統來定義，其中Combined編號系統是將Kabat和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍(例如，Kabat定義的HCDR1為H31-H35，Chothia定義的HCDR1為H26-H32，則Combined定義的HCDR1為H26-H35)。在不同的編號系統中，CDR的精確編號和放置有所不同。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋透過任何已知方案界定的互補決定區。
雖然本發明中請求保護的CDR是基於表1和表9示出的序列，但是根據其它CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
與人CD40結合的其他抗CD40抗體的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以與本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合並配對”。優選地，當VH和VL鏈(或其CDR)混合並配對時，特定VH/VL對中的VH序列可以由結構相似的VH序列取代。同樣，優選地將特定VH/VL對中的VL序列取代為結構相似的VL序列。
因此，在一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包括： (a)重鏈可變區，其包含列於表1中的胺基酸序列；和 (b)輕鏈可變區，其包含列於表1中的胺基酸序列，或另一種抗CD40抗體的VL，其中該抗體或其抗原結合部分特異性結合人CD40。
在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包括： (a)列於表1的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和 (b)列於表1的LCDR1，LCDR2和LCDR3，或另一種抗CD40抗體的輕鏈可變區CDR，其中該抗體或其抗原結合部分特異性結合人CD40。
在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包括列於表1的HCDR2以及其他抗CD40抗體的CDR，例如其他抗CD40抗體的HCDR1和/或HCDR3，和/或其他抗CD40抗體LCDR1，LCDR2和/或LCDR3。
此外，本領域內公知，CDR3結構域獨立於CDR1和/或CDR2結構域，可以單獨確定抗體對同種抗原的結合特異性，並且可以預測到基於該CDR3序列可產生具有相同結合特異性的多種抗體。
在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含列於表1的HCDR2，以及列於表1的HCDR3和/或列於表1的LCDR3，或另一種抗CD40抗體的HCDR3和/或LCDR3，其中該抗體或其抗原結合部分特異性結合人CD40。這些抗體優選與本發明的抗CD40抗體(a)競爭結合CD40；(b)保留功能特徵；(c)結合相同的表位；和/或(d)具有具有相似的結合親和力。在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分還包含列於表1的LCDR2，或另一種抗CD40抗體的LCDR2，其中該抗體或其抗原結合部分特異性結合人CD40。在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分還包括列於表1的HCDR1和/或列於表1的LCDR1，或另一種抗CD40抗體的HCDR1和/或LCDR1，其中該抗體或其抗原結合部分特異性結合人CD40。
在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合部分的重鏈可變區和/或輕鏈可變區或CDR1、CDR2和CDR3序列可以包含一個或多個保守修飾。本領域應理解，一些保守序列修飾不會使抗原結合性消失。
因此，在一個實施方式中，本發明的抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含CDR1、CDR2和CDR3，其中： (a)HCDR1序列包含表1列出的序列，和/或其保守修飾；和/或 (b)HCDR2序列包含表1列出的序列，和/或其保守修飾；和/或 (c)HCDR3序列包含表1列出的序列，和/或及其保守修飾；和/或 (d)LCDR1和/或LCDR2和/或LCDR3序列包含表1列出的序列；和/或其保守修改；且 (e)抗體或其抗原結合部分特異性結合人CD40。
本文所用的術語“保守序列修飾”是指不顯著影響或改變抗體結合特性的胺基酸修飾。這樣的保守修飾包括胺基酸取代、添加和刪除。可以透過本領域已知的標準技術將修飾引入本發明的抗體中，例如點突變和PCR媒介的突變。保守胺基酸取代是指胺基酸殘基被具有類似結構或化學特性(例如，相似側鏈)的胺基酸殘基取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本領域中已知。這些胺基酸殘基家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸，精胺酸，組胺酸)，酸性側鏈(例如，天冬胺酸，麩胺酸)，不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸，天冬醯胺，麩醯胺酸，絲胺酸，蘇胺酸，酪胺酸，半胱胺酸，色胺酸)，非極性側鏈(例如，丙胺酸，纈胺酸，亮胺酸，異亮胺酸，脯胺酸，苯丙胺酸，甲硫胺酸)，β支鏈側鏈(例如，蘇胺酸，纈胺酸，異亮胺酸）和芳香族側鏈(例如，酪胺酸，苯丙胺酸，色胺酸，組胺酸)的胺基酸。因此，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分的CDR區中一個或多個胺基酸殘基可以被同一側鏈家族的其他胺基酸殘基取代，且得到的抗體可以使用本文所述的功能檢測對其進行功能測試。
本發明的抗體或其抗原結合片段包含的可變區(包括CDR區和/或框架框架區)修飾，或者，本發明的抗體或其抗原結合部分還可以包含Fc修飾，例如改變抗體的效應功能。因此，本發明的一個實施方案提供分離的抗CD40單株抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，重鏈可變區包含本發明上述序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，輕鏈可變區包含本發明上述序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，但包含不同於本發明上述序列的框架序列框架。這樣的框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公開DNA數據庫或公開參考文獻中獲得。這樣的框架序列優選地是與本發明的抗CD40抗體所用的框架序列在結構上相似的那些。可以將CDR1、CDR2和CDR3序列移植到與該框架序列的種系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架區中，或者可以將CDR序列移植到與種系序列相比具有一個或多個突變的框架區中。例如，在一些情況下，對框架區中的殘基進行突變是有益的，可以維持或增強抗體的抗原結合能力(參見，例如，U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一種類型的可變區修飾是將CDR1、CDR2和/或CDR3區內的胺基酸殘基進行突變，從而改善目標抗體的一種或多種特性(例如，親和力，理化性質)。可以透過點突變或PCR媒介的突變引入突變，並可透過本領域已知的體外或體內測定評估突變對抗體結合或其他功能特性的影響。可以是對胺基酸進行取代、添加或刪除，優選為取代。此外，通常改變每個CDR區內不多於一個、兩個、三個、四個或五個的殘基。
在一個實施方案中，本發明提供的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含：(a) HCDR1區，其包含本發明的序列，或具有1、2、3、4或5個胺基酸取代，刪除或添加的胺基酸序列；(b)HCDR2區，其包含本發明的序列，或具有1、2、3、4或5個胺基酸取代，刪除或添加的胺基酸序列；(c)HCDR3區，其包含本發明的序列，或具有1、2、3、4或5個胺基酸取代，刪除或添加的胺基酸序列；(d)LCDR1區，其包含本發明的序列，或具有1、2、3、4或5個胺基酸取代，刪除或添加的胺基酸序列；(e)LCDR2區，其包含本發明的序列，或具有1、2、3、4或5個胺基酸取代，刪除或添加的胺基酸序列；和(f)LCDR3區，其包含本發明的序列，或具有1、2、3、4或5個胺基酸取代，刪除或添加的胺基酸序列。
本發明的抗體或其抗原結合片段包括VH和/或VL的框架區修飾，以改善抗體特性。通常，此類框架區修飾可以降低抗體的免疫原性。例如，將一個或多個框架殘基“回復突變”為相應的種系序列。這些殘基可以透過將抗體框架序列與得到抗體的種系序列相比較而辨識出來。
另一種類型的框架修飾包括對框架區、或者甚至一個或多個CDR區的一個或多個殘基進行突變，以去除T細胞表位，從而減少抗體可能導致的免疫原性。該方法也稱為“去免疫原性”，在美國專利公開號20030153043中有更詳細描述。
此外，本發明的抗體或其抗原結合片段包括Fc修飾，Fc修飾可以是胺基酸插入、缺失或取代，通常用來改變抗體一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。
此外，本發明的抗體或其抗原結合片段還可以進行化學修飾(例如，連接一個或多個化學功能基團)，或修飾以改變其糖基化，來改變抗體的一種或多種功能特性。在其他實施方案中，透過聚乙二醇化(例如，透過使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)反應來修飾Fc區。
在另一個實施方案中，改變本發明的抗體或其抗原結合片段的糖基化。這樣的糖化修飾可以透過例如改變抗體序列中的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個胺基酸替換，以消除一個或多個可變區的框架區的糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這樣的去糖基化可以增加抗體對抗原的親和性。參見，例如美國專利5,714,350和6,350,861。
本發明提供的抗體或其抗原結合片段結合CD40，從而抑制CD40活性。“CD40活性”包括但不限於B細胞的活化，例如B細胞的增殖、抗體的產生、抗體同種型轉換或分化為漿細胞；T細胞的活化，例如T細胞的增殖或細胞因子分泌；樹突狀細胞的活化，例如樹突狀細胞的增殖、分化成熟；和巨噬細胞的活化。此外，“CD40活性”還包括抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等。
在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得B細胞的活化受到抑制。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得B細胞的增殖受到抑制。
在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得T細胞活化受到抑制。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得T細胞的增殖和/或細胞因子的產生受到抑制。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得選自由以下組成的組的一種或多種細胞因子的產生受到抑制：IL-2、IFNγ、TNF、IL-l、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-17和GM-CSF。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得細胞因子IFNγ的產生受到抑制。
因此，一方面，本發明提供了調節免疫反應的方法，其包括使T細胞和抗原呈遞細胞與本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段接觸。在一個實施方案中，可以在混合淋巴細胞反應(MLR)中測量本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對免疫反應的調節。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段抑制MLR中淋巴細胞的細胞因子的產生。在另一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段抑制MLR中細胞因子IFNγ的產生。
在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得樹突狀細胞的活化受到抑制。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得樹突狀細胞的分化成熟受到抑制。
在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得腫瘤細胞凋亡受到抑制。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40並使得Ramos細胞凋亡受到抑制。
本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段結合CD40時無明顯的促效活性。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對腫瘤細胞的凋亡無明顯的促效活性。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對Ramos細胞的凋亡無明顯的促效活性。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對B細胞的活化無明顯的促效活性。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對B細胞的增殖無明顯的促效活性。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對樹突狀細胞的活化無明顯的促效活性。在一個實施方案中，本發明提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段對樹突狀細胞的分化成熟無明顯的促效活性。
另一方面，本發明提供了藥物組成物，其包含一種或多種本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載劑。如本文中所用，“藥學上可接受的載劑”包括生理上相容的任一和所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌劑、等滲劑及其組合。合適的“藥學上可接受的載劑”的選擇和使用在Gennaro，ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams& Wilkins 2003)中有教導。
可以透過任何合適的方法或途徑施用抗體或藥物組成物。施用途徑包括例如靜脈內、肌內、皮下、腸道外、脊柱或表皮施用(例如透過注射或輸注)。基於給藥途徑，可以將活性成分塗佈在材料中，以保護其不受酸和可能使其失活的其他自然條件的影響。本文所用的短語“腸道外施用”是指除腸內和局部施用以外的施用方式，通常採用注射，並且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。或者，藥物組成物可以透過非腸道外途徑施用，例如局部、表皮或粘膜途徑施用，如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部施用。
對於抗體的施用，劑量可以為約0.0001至100 mg/kg宿主體重的範圍內。
本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分具有多種體外和體內應用，涉及免疫疾病的診斷、治療和/或預防。“治療”是指減輕症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重程度的方法。本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分、編碼核酸、藥物組成物、重組多肽、融合蛋白、雙特異性分子、免疫綴合物、嵌合抗原受體或基因載體可以施用至人受試者，以治療所述受試者的免疫疾病。
另一方面，本發明提供了一種在受試者中治療或預防免疫疾病的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的本發明的抗CD40抗體或其抗原結合部分、編碼核酸、藥物組成物、重組多肽、融合蛋白、雙特異性分子、免疫綴合物、嵌合抗原受體或基因載體。在一些實施方案中，所述受試者是人。
在一些具體的實施方案中，在所述應用和方法中，所述免疫疾病包括但不限於發炎性疾病、過敏反應、自身免疫性疾病或移植相關疾病。發炎性疾病是指由於過度或失控的發炎性反應所導致的過度的發炎性症狀、宿主組織損害或功能喪失的任何疾病、紊亂或症狀，包括皮膚、腎、胃腸道和呼吸道的過敏性炎症、銀屑病、腎炎、附睾炎、發炎性腸病和哮喘等。自身免疫性疾病是指由免疫系統過度活化引起的有機體攻擊和損害自身組織的任何疾病、紊亂或症狀，例如，發性硬化症、關節炎、重症肌無力、銀屑病、硬皮病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎和I型糖尿病等。
在一些具體的實施方案中，在所述應用和方法中，所述免疫疾病包括但不限於：過敏反應、艾迪生氏病(Addison’s disease)、僵直性脊柱炎、脊柱關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、冠心病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、腎炎、賴特症候群、甲狀腺炎、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林-巴利症候群(GBS)、橋本氏病、溶血性貧血、特發性血小板減少性症、系統性紅斑狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力、銀屑病、硬皮病、關節炎、類肉瘤病、乾燥症候群、乾眼症、化膿性汗腺炎、移植相關疾病、血管炎和/或發炎性腸病。
在一些實施方案中，移植相關疾病的實例包括但不限於：移植免疫排斥和移植抗宿主病(GVHD)。
在一些實施方案中，發炎性腸病的實例包括但不限於：克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
在一些實施方案中，關節炎的實例包括但不限於：類風濕性關節炎、幼年型關節炎和銀屑病關節炎。
在一些實施方案中，腎炎的實例包括但不限於：狼瘡腎炎。
在一些實施方案中，銀屑病的實例包括但不限於：尋常型銀屑病、膿皰型銀屑病、紅皮病型銀屑病和關節病型銀屑病。
在所述應用和方法中，本發明的抗體可以單獨施用，或者與第二治療劑聯合施用。在一些實施方案中，所述第二治療劑包括非甾體抗炎藥(NSAID)、水楊酸鹽、羥化氯喹、柳氮磺吡啶、皮質類固醇、細胞毒性藥物、或免疫抑制藥物和/或抗體。非甾體抗炎藥包括但不限於布洛芬、萘普生、雙氯芬酸、吲哚美星、酮托洛酸、美洛昔康、萘西康、四洛芬酸和蘇林達。免疫抑制藥物和/或抗體包括但不限於環孢黴素、他克莫司(Tacrolimus)、雷帕黴素、黴酚酸酯、CTLA4-Ig融合體、抗B淋巴細胞刺激抗體和抗T細胞抗體(例如抗CD-3)。胞毒性藥物包括但不限於甲胺蝶呤和環磷醯胺。本文討論的治療劑的聯合可以作為在藥學可接受載劑中的單一組成物同時施用，或者作為分開的組成物同時施用，其中各藥劑處於藥學可接受載劑中。在另一個實施方案中，治療劑的聯合可以按序施用。
此外，如果進行多次聯合療法施用，且藥劑按序施用，則在各時間點的按序施用的次序可以反轉或保持相同，按序施用可以與同時施用或其任何組合相結合。
儘管為了清楚理解的目的，已經透過舉例說明和實施例相當詳細地描述了前述發明，但是根據本發明的教義，本領域的普通技術人員將顯而易見的是，可另外對本發明進行某些改變和修改而不背離所附申請專利範圍的精神和範圍。本發明透過以下實施例進一步說明，並非旨在進行限制。本領域的技術人員將容易地辨識多種非關鍵性參數，所述參數可發生改變或修改以產生基本上類似的結果。
除非另外指出，否則本發明的實踐將採用本領域技術範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學的常規方法。
本發明還提供了以下一些具體的實施方案，但本發明的保護範圍不限於此：
實施方案1. 一種分離的抗CD40抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
(i) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，其中， (1) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR3的胺基酸序列； (2) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列； (3) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列； (4) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR3的胺基酸序列； (5) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR3的胺基酸序列； (6) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR3的胺基酸序列； (7) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR3的胺基酸序列； (8) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR3的胺基酸序列； (9) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR3的胺基酸序列；或 (10) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR3的胺基酸序列；和/或
(ii) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (2) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (3) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (4) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (5) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (6) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (7) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (8) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR3的胺基酸序列；或 (9) 輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR3的胺基酸序列。
實施方案2. 根據實施方案1所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
(i) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，其中， (1) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、2和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、2和5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、3和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、3和5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、4和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、4和5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：18、19和20所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：18、19和20所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：24、25和26所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：24、25和26所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (6) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：32、33和34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：32、33和34所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (7) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：40、41和42所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：40、41和42所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (8) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：46、47和48所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：46、47和48所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；和/或
(ii) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：21、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：21、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：27、28和29所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：27、28和29所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：35、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：35、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：43、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：43、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (6) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：49、50和51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：49、50和51所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
實施方案3. 根據實施方案1所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (2) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (3) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (4) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (5) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (6) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (7) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (8) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (9) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (10) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (11) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (12) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR3的胺基酸序列；或 (13) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR3的胺基酸序列。
實施方案4. 根據實施方案1-3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、2、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、2、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、3、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、3、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、4、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、4、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：18、19、20、21、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：18、19、20、21、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (6) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：32、33、34、35、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：32、33、34、35、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (7) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：40、41、42、43、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：40、41、42、43、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (8) 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：46、47、48、49、50和51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：46、47、48、49、50和51所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
實施方案5. 根據實施方案1-4中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈可變區，所述重鏈可變區包含9、10、11、12、13、22、30、38、44或52所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NOs：9、10、11、12、13、22、30、38、44或52所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；和/或 (ii) 輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NOs：14、15、16、17、23、31、39、45或53所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NOs：14、15、16、17、23、31、39、45或53所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
實施方案6. 根據實施方案1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中， (1) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：9和14所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：9和14所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和15所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和15所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：11和15所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：11和15所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和16所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和16所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：11和16所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：11和16所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (6) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和17所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (7) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：12和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：12和17所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (8) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：13和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：13和17所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (9) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：22和23所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：22和23所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (10) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：30和31所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：30和31所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (11) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (12) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：44和45所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：44和45所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (13) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：52和53所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：52和53所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
實施方案7. 根據實施方案1-6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，所述重鏈恆定區包含SEQ ID NOs：54、55或56所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：54、55或56所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列，所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：57所示胺基酸序列或者與SEQ ID NO：57所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列。
實施方案8. 根據實施方案1-7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段：(a) 結合人CD40；(b) 結合猴CD40；(c) 阻斷CD40與CD40L相互作用；和/或 (d) 抑制CD40活性。
實施方案9. 根據實施方案1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是嵌合或人源化的。
實施方案10. 根據實施方案1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是IgG1、IgG2或IgG4同種型。
實施方案11. 根據實施方案1-10中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段選自單株抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、多特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分離的CDR區、單鏈Fv分子或其組合。
實施方案12. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段結合相同表位。
實施方案13. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段競爭結合CD40。
實施方案14. 一種分離的核酸分子，其編碼實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
實施方案15. 一種表達載體，其包含實施方案14所述的核酸分子。
實施方案16. 一種宿主細胞，其包含實施方案14所述的核酸分子或實施方案15所述的表達載體。
實施方案17. 一種重組多肽或融合蛋白，其包含實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
實施方案18. 一種雙特異性分子，其包含實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
實施方案19. 一種免疫綴合物，其包含實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段以及與其連接的治療劑，例如細胞毒素劑或成像劑。
實施方案20. 一種藥物組成物，其包含實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和一種或多種藥學上可接受的載劑。
實施方案21. 一種在有需要的受試者中治療或預防免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，或者實施方案20所述的藥物組成物。
實施方案22. 根據實施方案21所述的方法，其中所述免疫疾病包括但不限於發炎性疾病、過敏反應、自身免疫性疾病或移植相關疾病。
實施方案23. 根據實施方案21所述的方法，其中所述免疫疾病包括但不限於過敏反應、艾迪生氏病、僵直性脊柱炎、脊柱關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、冠心病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、腎炎、賴特症候群、甲狀腺炎、格雷夫斯病、格林-巴利症候群、橋本氏病、溶血性貧血、特發性血小板減少性症、系統性紅斑狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力、銀屑病、硬皮病、關節炎、類肉瘤病、乾燥症候群、乾眼症、化膿性汗腺炎、移植相關疾病、血管炎和/或發炎性腸病。
實施方案24. 根據實施方案21-23中任一項所述的方法，其中所述方法還包括施用治療有效量的第二治療劑。
實施方案25. 根據實施方案24所述的方法，其中所述第二治療劑包括非甾體抗炎藥、水楊酸鹽、羥化氯喹、柳氮磺吡啶、皮質類固醇、細胞毒性藥物、或免疫抑制藥物和/或抗體。 實施例
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明做了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。 實施例 1 小鼠抗 CD40 單株抗體的製備重組蛋白的製備
將編碼含小鼠抗體重鏈Fc的人CD40重組蛋白(hCD40-mFc，SEQ ID NO:64)和猴CD40重組蛋白(cynoCD40-mFc，SEQ ID NO:65)的cDNA透過基因合成獲得，分別次選殖到表達載體pcDNA3.1(+)中，轉染到CHO細胞進行暫態表達。收集細胞培養上清液，使用MabSelect Sure LX純化管柱(GE)純化重組蛋白hCD40-mFc和cynoCD40-mFc。 穩定細胞株的建構
分別將編碼全長hCD40(SEQ ID NO:62)和cynoCD40(SEQ ID NO:63)的cDNA透過基因合成獲得，然後次選殖到表達載體pcDNA3.1(+)中，得到pcDNA3.1-hCD40和pcDNA3.1-cynoCD40重組質體。然後按照Lipofectamin3000轉染試劑(Thermo, Cat: L3000015)的操作說明，將兩個重組質體分別轉染到CHO-K1細胞中，獲得穩定細胞株CHO-K1-hCD40和CHO-K1-cynoCD40。
分別將編碼全長hCD40L(SEQ ID NO:66)和cynoCD40L(SEQ ID NO:67)的cDNA透過基因合成獲得，然後次選殖到表達載體pcDNA3.1(+)中，得到pcDNA3.1-hCD40L和pcDNA3.1-cynoCD40L重組質體。然後按照Lipofectamin3000轉染試劑(Thermo, Cat: L3000015)的操作說明，將兩個重組質體分別轉染到CHO-K1細胞中，分別獲得穩定細胞株CHO-K1-hCD40L和CHO-K1-cynoCD40L。
按照lipofectamin3000轉染試劑(Thermo, Cat: L3000015)的操作說明，將質體pGL4.32 [luc2P/NF-ĸB-RE/Hygro] Vector(Promega, Cat: E8491)轉染到HEK293T細胞，得到穩定細胞株293T-NFĸB。然後再將pcDNA3.1/Zeo(+)載體的BamHI和XhoI位點插入全長hCD40(SEQ ID NO:62)的編碼序列，得到重組質體pcDNA3.1/Zeo(+)-hCD40。按照lipofectamin3000轉染試劑(Thermo, Cat: L3000015)的操作說明，將重組質體pcDNA3.1/Zeo(+)-hCD40轉染到293T-NFĸB細胞中，獲得293T-hCD40-NFĸB穩定細胞株。 小鼠免疫
純化的重組蛋白hCD40-mFc(SEQ ID NO:64)作為抗原，將hCD40-mFc與完全弗氏佐劑(Sigma, Cat: F5881-10X10mL)按照體積比1:1充分混合並乳化，透過皮下注射免疫小鼠。初次免疫2-4周後，將hCD40-mFc或cynoCD40-mFc與Alum佐劑(Thermo, Cat: 77161)按照體積比1:1的比例充分混合並乳化，以皮下注射和肌肉注射交替的方式每隔2周進行一次加強免疫，共免疫6周。免疫結束後，收集每只小鼠的血清進行抗CD40特異性抗體血清效價的檢測。選取血清效價較高的小鼠進行後續的脾細胞融合。 融合瘤的製備和篩選
融合前3-4天，透過腹腔注射hCD40-mFc，對小鼠進行融合前衝擊免疫。融合當天，無菌取小鼠脾臟，進行研磨和紅血球裂解，然後以電融合緩衝液(BTX, Cat: 47-0001)重新懸浮，獲得單細胞懸浮液，按細胞數目2:1的比例與對數生長期的骨髓瘤細胞SP2/0混合，採用電融合儀(BTX)完成細胞融合。將融合後的細胞與含有1×HAT的融合瘤培養基(Gibco, Cat: 12045-076)混勻，在37℃、5% CO 2條件培養7天後獲得融合瘤細胞。收集融合瘤細胞培養上清液，用於小鼠抗體的篩選。
選取經ELISA和FACS檢測具有hCD40結合活性的融合瘤細胞進行擴增培養，待細胞達到一定數目後透過有限稀釋法進行次選殖。然後將次選殖的融合瘤細胞於37℃、5% CO 2培育培養7天後，收集次選殖的融合瘤細胞培養上清液，用於小鼠抗體的進一步篩選。 小鼠抗體的表達和純化
將篩選的融合瘤細胞培養10天後，離心收集細胞培養上清液，然後將細胞培養上清液上樣至蛋白G柱(Genscript, Cat:L00209-10)中，用PBS緩衝液淋洗蛋白G柱，再用100 mM甘胺酸(pH 2.8)洗提與蛋白G柱結合的抗體，並立即用1 M Tris-HC中和洗提液。然後，採用超濾的方法將小鼠抗體置換到PBS緩衝液中。 實施例 2 小鼠抗 CD40 抗體的特徵鑑定ELISA測定抗CD40抗體的結合活性
用PBS緩衝液(pH 7.4)稀釋hCD40-His蛋白(Acro, Cat: CD0-H5228)至濃度為0.1 µg/mL，並按100 µL/孔塗佈於96孔盤，4℃培育過夜。用PBST(含0.5% Tween-20的PBS)洗滌96孔盤，然後加入200 µL/孔的封阻液(含1% BSA的PBST)，於室溫封阻2小時。棄去封阻液，加入100 µL/孔的融合瘤細胞培養上清液，於室溫培育2小時。PBST洗滌96孔盤後，加入按體積比1:10000稀釋的HRP偶聯山羊抗鼠IgG(H+L)抗體(Jackson Immuno, Cat: 115-035-062)，室溫培育1小時。PBST洗滌96孔盤後，加入100 µL/孔的TMB溶液，室溫避光培育5分鐘，並用0.5 M H 2SO 4終止反應。使用Bio-rad iMark酶標儀讀取OD450值。 FACS檢測抗CD40抗體的結合活性
將細胞濃度為5×10 5個/mL的CHO-K1-hCD40細胞懸浮液按100 µL/孔加到96孔U型底孔盤中，然後加入100 µL/孔的融合瘤細胞培養上清液，混勻後於4℃培育1小時。用含2% FBS的PBS洗滌細胞後，加入按體積比1:500稀釋的PE偶聯山羊抗鼠IgG(H+L)抗體(Abcam, Cat: ab97041)，於4℃培育1小時。用含2% FBS的PBS洗滌細胞，然後將細胞重新懸浮於含2% FBS的PBS中，使用流式細胞儀(BD Accuri C6)檢測染色的平均螢光強度(MFI)來分析抗CD40抗體與CHO-K1-hCD40細胞的結合。 抗CD40抗體阻斷293T-hCD40-NFĸB細胞與CD40L結合的活性
當293T-hCD40-NFĸB細胞上的hCD40與CD40L相互作用後，誘導螢光訊號的表達向上調控。具體地，將對數生長期的293T-hCD40-NFĸB細胞重新懸浮於含2% FBS的DMEM培養基中，調節細胞濃度至5×10 5個/mL，然後按10 µL/孔加到384孔白盤中，並加入融合瘤細胞培養上清液或梯度稀釋的純化的小鼠抗CD40抗體(抗體終濃度範圍為0.064 ng/mL~5000 ng/mL，按5倍梯度稀釋)，於37℃振盪培育20分鐘。然後每孔加入10 µL終濃度為10 µg/mL的人CD40L蛋白(Acro, Cat: CDL-H52Db)，於37℃振盪培育20分鐘後將384孔盤轉移至37℃、5% CO 2條件下靜置培育5~6小時。培育後按螢火蟲螢光素酶試劑盒(vazyme, Cat: DD1201-03)的操作說明加入檢測試劑，使用酶標儀(Thermo Varioskan Flash)讀取螢光訊號，透過相對螢光強度(RLU)來分析抗CD40抗體對CD40L媒介的293T-hCD40-NFĸB細胞螢光訊號向上調控的阻斷活性，並透過Graphpad Prism計算IC 50值。如圖1A和1B所示，多個純化的小鼠抗CD40抗體具有阻斷293T-hCD40-NFĸB細胞與CD40L結合的活性。 抗CD40抗體對Ramos細胞凋亡的抑制活性
由CD40/CD40L媒介的MAPK活化途徑是一種抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的潛在機制。以內源性表達CD40的人B淋巴瘤細胞Ramos(Burkitt淋巴瘤細胞)為模型，檢測抗CD40抗體對Ramos細胞凋亡的抑制活性。具體地，將細胞濃度為1×10 6個/mL的Ramos細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔U型底孔盤中，加入梯度稀釋的純化的小鼠抗CD40抗體(終濃度範圍是0.02 ng/mL~2000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)，並加入終濃度為2 µg/mL的人CD40L蛋白(Acro, Cat: CDL-H52Db)和終濃度為60 ng/mL的重組人IL-4(Acro, Cat:IL4-H4218)。混勻後於37℃、5% CO 2條件下培育過夜，用含2% FBS的PBS洗滌細胞，然後加入PE偶聯的小鼠抗人CD95抗體(Biolegend, Cat: 305608)，混勻後於4℃培育30分鐘。洗滌細胞後用含2% FBS的PBS重新懸浮細胞，採用流式細胞儀(Sartorius IQue3)檢測螢光訊號，透過染色的平均螢光強度(MFI)來分析腫瘤細胞凋亡分子CD95的表達情況，並透過Graphpad Prism計算IC 50值。如圖2所示，多個純化的小鼠抗CD40抗體具有抑制CD40L和IL-4誘導的Ramos細胞凋亡的活性。 實施例 3 嵌合抗 CD40 抗體的製備嵌合抗體的建構
將實施例2篩選的融合瘤細胞(例如，A01、A02、A03、B01、B02和B03等)按照RNA提取試劑盒(Takara, Cat: 9767)的操作說明分離細胞中的總RNA，並透過逆轉錄試劑盒(Thermo, Cat: K1652)合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA作為模板，分別與小鼠lgG引物和Kappa引物混合，使用聚合酶鏈式反應(PCR)技術選殖並測序，獲得小鼠IgG抗體可變區序列。
採用化學合成方法，將小鼠抗體的VH和VL的DNA序列分別與人IgG4(SEQ ID NO:54)重鏈恆定區和Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:57)的DNA序列連接，然後選殖到pcDNA3.1(+)載體中建構重組人-鼠嵌合抗體。這些嵌合抗體分別命名為：Chi-A01、Chi-A02、Chi-A03、Chi-B01、Chi-B02和Chi-B03。 參照抗體的建構
選擇Iscalimab(CFZ533)作為參照抗體，根據美國專利US9221913B2記載的胺基酸序列，採用化學合成方法獲得抗體重鏈和輕鏈的DNA序列，選殖到pcDNA3.1(+)載體建構參照抗體(重鏈和輕鏈的胺基酸序列參見本發明的SEQ ID NOs:58和59，重鏈可變區和輕鏈可變區用下劃線示出)，參照抗體在本文中也稱為BM(即Benchmark的縮寫)。 嵌合抗體和參照抗體的表達和純化
嵌合抗體和參照抗體採用expiCHO系統(Gibco, Cat: A29129)並按照其轉染試劑盒的操作說明進行暫態轉染表達，轉染後將細胞置於37℃、含8% CO 2條件下振盪培養6天。離心收集細胞培養上清液，然後將細胞培養上清液上樣至蛋白A柱(G.E. Healthcare, Cat: 17-5474)中，用10個管柱體積的PBS緩衝液洗滌蛋白A柱，再用醋酸緩衝液(300 mM醋酸，pH 3.6)洗提與蛋白A柱結合的抗體，並立即用1 M Tris-HCl中和洗提液。然後，將嵌合抗體超濾置換到PBS緩衝液中。 實施例 4 嵌合抗 CD40 抗體的特徵鑑定FACS檢測抗CD40抗體的結合活性
具體方法參見實施例2，但有些地方稍作改變：用梯度稀釋的嵌合抗CD40抗體和BM(終濃度範圍為0.064 ng/mL~5000 ng/mL，按5倍梯度稀釋)替代融合瘤細胞培養上清液；並用PE偶聯驢抗人IgG(H+L)(Abcam, Cat: ab102439)替代PE偶聯山羊抗鼠IgG(H+L)抗體。
圖3示出嵌合抗體與CHO-K1-hCD40細胞的結合活性，其中Chi-A01和Chi-A02與CHO-K1-hCD40細胞的結合EC 50與BM相當。 抗CD40抗體對Ramos細胞凋亡的抑制活性
具體方法參見實施例2，但有些地方稍作改變：用梯度稀釋的嵌合抗CD40抗體、BM和IgG4同型對照抗體(終濃度範圍為0.064 ng/mL~1000 ng/mL，按5倍梯度稀釋)替換梯度稀釋的純化的小鼠抗體(終濃度範圍是0.02 ng/mL~2000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)。
表2和表3示出嵌合抗體對CD40L和IL-4誘導的Ramos細胞凋亡的抑制活性，其中，Chi-A01和Chi-A02抑制50%由CD40L和IL-4誘導的腫瘤細胞凋亡的濃度(IC 50)約為5 pM，而BM的IC 50為18.32 pM(約為Chi-A01和Chi-A02的3-4倍)，說明Chi-A01和Chi-A02對Ramos細胞凋亡的抑制活性優於BM。
抑制%=(Ramos與CD40L和IL-4培育後誘導凋亡的MFI - Ramos與CD40L和IL-4以及抗CD40抗體培育後誘導凋亡的MFI)/(Ramos與CD40L和IL-4培育後誘導凋亡的MFI - Ramos僅與培養基培育後自然凋亡的MFI)×100%，根據公式計算可知，Chi-A01和Chi-A02的平均最大抑制率與BM相當。 表2 嵌合抗體Chi-A01、Chi-A02和Chi-A03對Ramos細胞凋亡的抑制活性
濃度ng/mL BM Chi-A01 Chi-A02 Chi-A03 IgG4同型對照
IC 50 抑制% IC 50 抑制% IC 50 抑制% IC 50 抑制% IC 50 抑制%
1000 18.32 pM 98 5.08 pM 95 4.99 pM 94 134 pM 98 NA -3
200 99 96 97 90 -6
40 97 95 97 66 -20
8 85 96 98 18 0
1.6 41 82 85 -10 -10
0.32 12 17 20 -9 -9
0.064 4 0 5 -8 -12
表3 嵌合抗體Chi-B01、Chi-B02和Chi-B03對Ramos細胞凋亡的抑制活性
濃度ng/mL BM Chi-A01 Chi-B01 Chi-B02 Chi-B03
IC 50 抑制% IC 50 抑制% IC 50 抑制% IC 50 抑制% IC 50 抑制%
1000 24.71 pM 101 4.13 pM 100 30.14 pM 93 27.49 pM 75 11.87 pM 70
200 100 101 96 88 84
40 98 99 93 92 90
8 72 101 55 59 90
1.6 5 79 2 5 31
0.32 -10 39 -12 -5 16
0.064 -24 10 -33 -16 -8
0.0128 -26 11 -24 -18 -10
註：NA表示未擬合出IC 50值。 抗CD40抗體對Ramos細胞凋亡的促效活性
已知促效性抗CD40抗體CP-870893(內部製備，重鏈和輕鏈序列參見本發明的SEQ ID NOs:60和61)與Ramos細胞結合後能產生誘導Ramos凋亡的刺激信號。採用Ramos細胞檢測嵌合抗CD40抗體的促效活性，具體地，將細胞濃度為5×10 5個/mL的Ramos細胞懸浮液按100 µL/孔加到96孔U型底孔盤，並加入梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍是0.01 ng/mL~10000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)，混勻後於37℃、含5% CO 2的培養條件下培育過夜。用含2% FBS的PBS洗滌細胞，然後加入PE偶聯的小鼠抗人CD95抗體(Biolegend, Cat: 305608)，混合後於4℃培育30分鐘。洗滌細胞後用含2% FBS的PBS重新懸浮細胞，採用流式細胞儀(Sartorius IQue3)檢測螢光訊號，透過染色的平均螢光強度(MFI)來分析腫瘤細胞凋亡分子CD95的表達情況。結果見圖4，嵌合抗體Chi-A02、Chi-B02和Chi-B03對Ramos細胞凋亡具有弱促效活性，而嵌合抗體Chi-A01、Chi-A03、Chi-B01和BM對Ramos細胞凋亡不產生促效活性。 實施例 5 人源化抗 CD40 抗體的設計和製備人源化抗體的設計
採用CDR-graft方法，將小鼠抗體A01的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列經蛋白質數據庫比對分析，篩選出具有最高序列同源性的人胚系抗體序列。將小鼠抗體的互補決定區(CDR)嫁接到篩選出的人胚系抗體序列的框架中，並進一步突變CDR和/或框架中的胺基酸殘基以獲得更多候選的可變區序列。
輕鏈VL：人胚系框架序列IGKV1-39*01和IGKJ1*01的組合用於人源化序列設計，建構輕鏈變異體hzA01L1(SEQ ID NO:15)；人胚系框架序列IGKV3-20*01和IGKJ1*01的組合用於人源化序列設計，建構輕鏈變異體hzA01L2(SEQ ID NO:16)；人胚系框架序列IGKV2-30*02和IGKJ2*02的組合用於人源化序列設計，建構輕鏈變異體hzA01L3(SEQ ID NO:17)。
重鏈VH：人胚系框架序列IGHV4-4*08和IGHJ3*01的組合用於人源化序列設計，建構重鏈變異體hzA01H1、hzA01H3和hzA01H4(分別參見SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)；人胚系框架序列IGHV3-33*01和IGHJ3*01的組合用於人源化序列設計，建構重鏈變異體hzA01H2(SEQ ID NO:11)。 人源化抗體的建構
採用化學合成方法對上述人源化抗體的VH和VL的DNA序列分別與人IgG4(SEQ ID NO:54)重鏈恆定區和Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO:57)的DNA序列連接，然後選殖到pcDNA3.1(+)載體中建構重組人源化抗體。表4示出人源化抗體的VH和VL序列的配對。 表4 人源化抗體的可變區序列
抗體 VL VH
hzA01-1.1 hzA01L1 hzA01H1
hzA01-1.2 hzA01L1 hzA01H2
hzA01-2.1 hzA01L2 hzA01H1
hzA01-2.2 hzA01L2 hzA01H2
hzA01-3.1 hzA01L3 hzA01H1
hzA01-3.3 hzA01L3 hzA01H3
hzA01-3.4 hzA01L3 hzA01H4
人源化抗體的表達和純化
人源化抗體採用expiCHO表達系統(Gibco, Cat: A29129)並按照其轉染試劑盒的操作說明進行暫態轉染，轉染後將細胞置於37℃、含8% CO 2的條件下振盪培養6天。離心收集細胞培養上清液，然後將細胞培養上清液與蛋白A磁珠(GenScript, Cat: L00273)於室溫振盪培育2小時，用PBS溶液洗滌後，再用醋酸緩衝液(300 mM醋酸，pH 3.6)洗提與蛋白A磁珠結合的抗體，並立即用1 M Tris-HCl中和洗提液。然後，採用超濾的方法將人源化抗體置換到PBS緩衝液中。 實施例 6 人源化抗 CD40 抗體的特徵鑑定抗CD40抗體的親和力測定
透過ForteBio分子相互作用儀檢測人源化抗CD40抗體與hCD40-His蛋白(Acro, Cat: CD0-H5228)和CynoCD40-His蛋白(Acro, Cat: CD0-C52H6)的親和力。首先，將AHC生物感測器(Fortebio, Cat: 18-5060)活化，然後將AHC生物感測器浸入終濃度為5 µg/mL的抗CD40抗體溶液中，以捕捉抗體。再用AHC生物感測器分別結合梯度稀釋(終濃度範圍是1.56 nM~100 nM，按2倍梯度稀釋)的hCD40-His蛋白和CynoCD40-His蛋白。採用Fortebio分子相互作用儀(Fortebio Octet RED96e)實時檢測反應訊號從而獲得結合和解離曲線。每個循環解離完成後，將AHC生物感測器再生，繼而進行下一次捕捉，循環往復完成不同抗體對CD40親和力的測定。透過Fortebio Data Analysis 11.0軟體以1:1(Langmuir)結合模型分析所得數據，測定K a(K on)和K d(K dis)值，並透過K D=K d/K a計算解離常數K D，更加詳細的檢測方法和相關資訊參見www.fortebio.com。結果見表5，人源化抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4與人或食蟹猴CD40抗原的結合親和力K D在0.1 nM至1 nM之間，與嵌合Chi-A01的親和力相當。 表5 Fortebio檢測人源化抗CD40抗體與CD40的親和力
抗體 hCD40-His蛋白 CynoCD40-His蛋白
K on（1/Ms） K dis（1/s） K D（M） K on（1/Ms） K dis（1/s） K D（M）
BM 4.74E+05 5.61E-05 1.18E-10 7.69E+05 4.30E-05 5.59E-11
Chi-A01 1.85E+06 2.83E-04 1.53E-10 1.70E+06 2.76E-04 1.62E-10
Chi-A03 5.86E+05 1.47E-03 2.51E-09 ND ND ND
Chi-B01 3.21E+05 2.46E-03 7.66E-09 ND ND ND
hzA01-1.1 1.25E+06 1.01E-03 8.08E-10 1.60E+06 9.23E-04 5.76E-10
hzA01-1.2 8.08E+05 4.84E-02 5.99E-08 ND ND ND
hzA01-2.1 1.45E+06 2.55E-03 1.76E-09 1.88E+06 2.82E-03 1.50E-09
hzA01-2.2 8.93E+05 1.01E-01 1.13E-07 ND ND ND
hzA01-3.1 1.64E+06 6.01E-04 3.66E-10 1.88E+06 6.86E-04 3.65E-10
hzA01-3.3 1.63E+06 4.14E-04 2.55E-10 1.99E+06 4.84E-04 2.43E-10
hzA01-3.4 1.72E+06 4.54E-04 2.64E-10 2.03E+06 5.32E-04 2.62E-10
ND：表示未檢測。 FACS檢測抗CD40抗體的結合活性
具體方法參見實施例2，但有些地方稍作改變：用293T-hCD40-NFĸB細胞替代CHO-K1-hCD40細胞，用梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍0.006 ng/mL~1000 ng/mL，按3倍梯度稀釋)替代融合瘤細胞培養上清液；並用PE偶聯驢抗人IgG(H+L)抗體(Abcam, Cat: ab102439)替代PE偶聯山羊抗鼠IgG(H+L)抗體，並用流式細胞分析儀(Sartorius IQue3)替代流式細胞儀（BD Accuri C6）。
結果見圖5，在10~100 ng/mL濃度範圍內，人源化抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4與293T-hCD40-NFĸB細胞的結合達到飽和，且飽和濃度所對應的MFI值與BM具有相同位準。 抗CD40抗體阻斷CHO-K1-hCD40L細胞與hCD40-mFc、CHO-K1-CynoCD40L細胞與cynoCD40-mFc結合的活性
將細胞濃度為3×10 5個/mL的CHO-K1-hCD40L細胞懸浮液和CHO-K1-CynoCD40L細胞懸浮液各自按100 µL/孔分別加到96孔U型底孔盤中，並相應地加入終濃度為2 µg/mL的hCD40-mFc蛋白(內部製備，SEQ ID NO:64)或終濃度為2 µg/mL的cynoCD40-mFc蛋白(內部製備，SEQ ID NO:65)，然後加入梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍312.5 ng/mL~40000 ng/mL，按2倍梯度稀釋)，混勻後於4℃培育1小時。用含2% FBS的PBS洗滌細胞，加入按體積比1:500稀釋的PE偶聯山羊抗鼠IgG(H+L)抗體(Abcam, Cat: ab97041)，於4℃培育0.5小時。用含2% FBS的PBS洗滌細胞，然後將細胞重新懸浮於含2% FBS的PBS中，使用流式細胞儀(Sartorius IQue3)檢測螢光訊號，透過染色的平均螢光強度(MFI)來分析抗CD40抗體阻斷CHO-K1-hCD40L細胞與hCD40-mFc蛋白、CHO-K1-cynoCD40L細胞與cynoCD40-mFc蛋白結合的活性，並透過GraphPad Prism軟體計算IC 50值。結果見表6，人源化抗體hzA01-3.1和hzA01-3.4在細胞層級的阻斷IC 50與BM相當。 表6人源化抗CD40抗體阻斷CHO-K1-hCD40L細胞和CHO-K1-CynoCD40L細胞與CD40結合的活性
抗體 阻斷CHO-K1-hCD40L細胞與hCD40-mFc蛋白結合的活性 （IC 50，單位：nM） 阻斷CHO-K1-cynoCD40L細胞與cynoCD40-mFc蛋白的活性 （IC 50，單位：nM）
BM 20.55 24.14
Chi-A01 21.27 25.22
hzA01-3.1 22.83 25.51
hzA01-3.3 38.42 35.77
hzA01-3.4 19.81 22.87
抗CD40抗體阻斷293T-hCD40-NFĸB細胞與CHO-K1-hCD40L細胞結合的活性
將細胞濃度為2.5×10 5個/mL的293T-hCD40-NFĸB細胞稀懸浮液按20 µL/孔加到96孔盤中，然後加入梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍是0.007 ng/mL~2000 ng/mL，按6倍梯度稀釋)，同時按細胞數目1:1的比例加入CHO-K1-hCD40L細胞懸浮液，混勻後於室溫培育20分鐘。然後將96孔盤轉移至37℃、含5% CO 2的條件下靜置培育5~6小時。培育後按螢火蟲螢光素酶試劑盒(vazyme, Cat: DD1201-03)的操作說明加入檢測試劑，使用酶標儀(Thermo Varioskan Flash)檢測細胞螢光訊號，透過相對螢光強度(RLU)分析抗CD40抗體對CD40L媒介的293T-hCD40-NFĸB細胞螢光訊號向上調控的阻斷活性。結果見圖6，在0~2 µg/mL的濃度範圍內，人源化抗體hzA01-1.1、hzA01-2.1、hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4均顯示出顯著的阻斷活性。 抗CD40抗體對Ramos細胞凋亡的抑制活性
具體方法參見實施例2，但有些地方稍作修改：用梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍為0.007 ng/mL~2000 ng/mL，按6倍梯度稀釋)替換梯度稀釋的純化的小鼠抗CD40抗體(終濃度範圍是0.02 ng/mL~2000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)。
結果見圖7，在0~2 µg/mL濃度範圍內，人源化抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4都表現出持續抑制活性，其抑制IC 50比BM低3~4倍。 抗CD40抗體對Ramos細胞凋亡的促效活性
具體方法參見實施例4，但有些地方稍作改變：用梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍為0.01 nM~2000 nM，按5倍梯度稀釋)替換梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍為0.01 ng/mL~10000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)。
結果見圖8，人源化抗體hzA01-1.1和hzA01-2.1具有弱促效活性，人源化抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4在0.01 nM~2000 nM濃度範圍內均不產生比BM顯著的促效活性。 抗CD40抗體對外周血B淋巴細胞活化的抑制活性
人外周血來源的B淋巴細胞(PBMC-B)上表達的CD40能與CD40L結合，誘導B細胞活化，從而引起細胞表面活化信號向上調控(例如CD86)。採用人B淋巴細胞純化試劑盒(Stemcell, Cat: 17954)分離純化來自健康人PBMC的B淋巴細胞，將細胞濃度為1×10 6個/mL的外周血B淋巴細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔U型底孔盤中，並加入梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍為0.002 ng/mL~2000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)，然後按細胞數目1:1的比例加入CHO-K1-hCD40L細胞懸浮液。於37℃、含5% CO 2的條件下培育過夜。含2% FBS的PBS溶液洗滌細胞，然後加入PE偶聯的小鼠抗人CD86抗體(Biolegend, Cat: 305438)，與細胞混勻後於4℃培育30分鐘。含2% FBS的PBS溶液洗滌細胞並重新懸浮，採用流式細胞儀(Sartorius IQue3)檢測B凋亡細胞所表達的共刺激分子CD86的平均螢光強度(MFI)，並透過Graphpad Prism分析計算IC 50值。結果見圖9，人源化抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4均表現出對CD40L誘導的人外周血B淋巴細胞CD86表達的抑制活性，且IC 50比BM低約2~4倍。 抗CD40抗體對外周血B淋巴細胞增殖的抑制活性
人外周血來源的B淋巴細胞(PBMC-B)上表達的CD40能與CD40L結合，誘導B細胞增殖。將細胞濃度為1×10 6個/mL的人外周血B淋巴細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔U型底孔盤，加入梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍是0.000035 nM~35 nM，按10倍梯度稀釋)，並加入終濃度為2 µg/mL的人CD40L蛋白(Acro, Cat: CDL-H52Db)與終濃度為60 ng/mL的重組人IL-4蛋白(Acro, Cat: IL4-H4218)。混勻後於37℃、含5% CO 2條件下培育培養5天。收集細胞，用PBS緩衝液洗滌細胞並重新懸浮，然後加入CellTiter Glo螢光素酶細胞活性檢測試劑(Promega, Cat: G7572)，用螢光酶標儀(Thermo Varioskan Flash)檢測細胞螢光訊號，透過相對螢光強度(RLU)來分析人外周血B淋巴細胞的增殖，並透過Graphpad Prism計算IC 50值。結果見圖10，人源化抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4抑制CD40L和IL-4誘導的人外周血B淋巴細胞增殖的IC 50比BM低約3~6倍。 抗CD40抗體誘導外周血B淋巴細胞增殖的活性
將細胞濃度為1×10 6個/mL的健康人外周血B淋巴細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔U型底孔盤，加入梯度稀釋的抗CD40抗體(終濃度範圍為0.00035 nM~350 nM，按10倍梯度稀釋)，於37℃、含5% CO 2的條件下培育培養5天。收集細胞，用PBS緩衝液洗滌細胞並重新懸浮，然後加入CellTiter Glo螢光素酶細胞活性檢測試劑(Promega, Cat: G7572)，採用螢光酶標儀(Thermo Varioskan Flash)檢測細胞螢光訊號，透過相對螢光強度(RLU)來分析外周血B淋巴細胞的增殖。結果見圖11，人源化抗體hzA01-3.1在高濃度(350 nM)時誘導微弱的增殖，而人源化抗體hzA01-3.3和hzA01-3.4在0~350 nM濃度範圍內均不產生比BM顯著的促效活性。 抗CD40抗體對混合淋巴細胞反應(MLR)的抑制作用
按照單核細胞分離試劑盒(Stemcell, Cat: 19359)的操作說明從健康人PBMC中分離單核細胞，然後調節細胞濃度至1×10 6個/mL。按照DC細胞培養試劑盒(Stemcell, Cat: 10985)的操作說明加入DC細胞分化誘導劑，並於37℃、含5% CO 2的培養條件下培育培養5天，再加入DC細胞成熟刺激劑，繼續培養2天，使單核細胞分化為完全成熟的DC細胞(mDC)。
按照EasySep TMCD4陽性T細胞分離試劑盒(Stemcell, Cat: 17952)的操作說明從健康人PBMC中分離CD4 +T細胞，然後調節細胞濃度到2×10 6個/mL。將mDC細胞按1×10 4個/孔加到96孔U型底孔盤中，並加入梯度稀釋的抗CD40抗體或IgG4同型對照抗體(終濃度範圍是10 ng/mL~10000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)，混勻後於室溫培育30分鐘，隨後按mDC與CD4 +T細胞數目1:20的比例加入CD4 +T細胞懸浮液，混勻後於37℃、含5% CO 2的條件下培養96小時，離心收集培養上清液。
按照IFNγ檢測試劑盒(R&D, Cat: DY285B)的操作說明，透過ELISA檢測培養上清液中的IFNγ，使用酶標儀(Bio-rad iMark)讀取OD450吸光值，並透過Graphpad Prism計算分析IFNγ濃度。結果如圖12所示，人源化抗體hzA01-3.3在10 ng/mL~10000 ng/mL濃度範圍內呈濃度依賴性抑制混合淋巴細胞反應，且在飽和濃度(1000 ng/mL~10000 ng/mL)時的IFNγ釋放量低於BM，說明在飽和濃度時hzA01-3.3對混合淋巴細胞反應的抑制能力優於BM。 抗CD40抗體對樹突狀細胞成熟的促效活性
按照單核細胞分離試劑盒(Stemcell, Cat: 19359)的操作說明從PBMC中分離單核細胞，經DC細胞分化誘導劑(Stemcell, Cat: 10988)誘導培養5天，收集不完全成熟DC細胞(imDC)，並調節細胞濃度至1×10 6個/mL。imDC細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔盤中，然後加入梯度稀釋的抗CD40抗體或IgG4同型對照抗體(終濃度範圍是100 ng/mL~10000 ng/mL，按10倍梯度稀釋)，於37℃、含5% CO 2的條件培育過夜。收集細胞，用含2% FBS的PBS洗滌細胞並重新懸浮，加入APC偶聯的小鼠抗人CD83抗體(BD, Cat: 551073)，混勻後於4℃培育30分鐘，用含2% FBS的PBS洗滌細胞並重新懸浮，採用流式細胞儀(Sartorius IQue3)檢測細胞螢光訊號，透過染色的平均螢光強度(MFI)來分析細胞表面CD83的表達情況。CD83的表達是成熟DC細胞的特異性標誌，結果見圖13，CP-870893具有明顯刺激imDC細胞成熟的作用，而人源化抗體hzA01-3.3和BM均未針對imDC細胞的成熟產生明顯的促效活性。 實施例 7 抗 CD40 抗體的 Fc 效應
人B細胞、DC細胞和PBMC等細胞表面表達Fc受體(FcR)，當抗CD40抗體的Fc端與FcR結合時，可能媒介抗體Fc交聯(Fc Crosslinking)而產生促效活性，或者媒介抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC)或補體依賴性細胞毒性作用(CDC)而導致B細胞耗竭。
將細胞濃度為1×10 6個/mL的Ramos細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔U型底孔盤中，並加入抗CD40抗體(終濃度範圍是1 µg/mL~10 µg/mL，10倍梯度稀釋)，混勻後於室溫培育20分鐘。然後加入終濃度為2 µg/mL的抗人IgG Fcγ抗體(Jackson Immuno, Cat: 109-005-190)，混勻後於37℃、含5% CO 2的條件下培育過夜。離心收集細胞，用含2% FBS的PBS洗滌並重新懸浮細胞，採用流式分析儀(Sartorius IQue3)檢測細胞螢光訊號，並透過染色的平均螢光強度(MFI)來分析Ramos細胞上凋亡分子CD95的表達情況。結果如表7所示，在1 µg/mL~10 µg/mL濃度範圍內，人源化抗體hzA01-3.3未產生顯著高於BM的交聯刺活化性，且交聯促效活性遠低於CP-870893。 表7 抗CD40抗體的Fc交聯活性的測定
抗體 MFI值
1 µg/mL抗體 10 µg/mL抗體
BM 12499 12077
hzA01-3.3 14089 12289
CP-870893 136374 135373
以Ramos細胞作為標的細胞，Jurkat-NFAT-Luc細胞(Promega)作為效應細胞，評價抗CD40抗體媒介的ADCC效應。具體地，將細胞濃度為1×10 6個/mL的Ramos細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔盤中，加入梯度稀釋的抗CD40抗體或Rituximab(終濃度範圍是0.46 ng/mL~1000 ng/mL，按3倍梯度稀釋)，混勻後於室溫培育20分鐘。然後將細胞濃度為5×10 6個/mL的Jurkat-NFAT-Luc細胞懸浮液按100 µL/孔加到96孔盤中，其中標的細胞數目：效應細胞數目的比例是1:10，混勻後於37℃培育5小時。離心收集細胞，PBS洗滌後，加入Luc螢光檢測試劑(蘇州瑞安, Cat: RA-GL03)，採用螢光酶標儀(Thermo Varioskan Flash)檢測細胞螢光訊號，並透過相對螢光訊號(RLU)值來分析抗CD40抗體媒介的ADCC效應。結果見圖14，Rituximab具有顯著的ADCC效應，而人源化抗體hzA01-3.3與BM均未顯示出ADCC活性。
將細胞濃度為1×10 6個/mL的Ramos細胞懸浮液按50 µL/孔加到96孔盤中，並加入50 µL/孔的梯度稀釋的抗CD40抗體或Rituximab(終濃度範圍是2.4 ng/mL~40000 ng/mL，按4倍梯度稀釋)，同時加入25 µL/孔的人血清補體蛋白(Quidel, Cat: A112)，混勻後於37℃、含5% CO 2的培養條件下培育過夜。按CellTiter Glo螢光素酶細胞活性檢測試劑盒(Promega, Cat: G7572)的操作說明加入檢測試劑，採用螢光酶標儀(Thermo Varioskan Flash)檢測細胞螢光訊號，並透過相對螢光訊號(RLU)來分析存活的細胞。結果表明，Rituximab具有顯著的CDC毒殺活性，而人源化抗體hzA01-3.3與BM相同，都未顯示出CDC毒殺作用(圖15)，CDC毒殺率%=(標的細胞螢光值-抗體組螢光值)÷(標的細胞螢光值-檢測試劑處理的標的細胞螢光值)×100%。 實施例 8 人源化抗 CD40 抗體的體內藥效
將健康人的PBMC細胞移植於NDG免疫缺陷小鼠體內進行免疫重建，建構產生人源抗體的小鼠模型。一方面，人PBMC反應於小鼠抗原，會產生人抗小鼠IgG抗體和人抗小鼠IgM抗體，另一方面，小鼠體內的人PBMC細胞接受KLH等外源蛋白刺激後會產生抗KLH特異性抗體。產生人源抗體的小鼠模型的建構方法如下，選擇6~8周齡的雌性NDG免疫缺陷小鼠(購買自百奧賽圖)，第0天，給每只小鼠尾靜脈注射1×10 7個健康人PBMC細胞；第0~5天，每天給每只小鼠腹腔注射10 µg重組人IL-4(Acro, Cat: IL4-H4218)；並在第0天和第7天，給每只小鼠腹腔注射50 µg KLH蛋白(Sigma, Cat: H7017-20MG)。按照表8進行小鼠分組，從第0天開始，每只小鼠按每週給藥1次的頻率，連續3次透過腹腔注射抗體藥物。
在第8、14和21天，採集每只小鼠的血樣並分離獲得血清。按照人IgG ELISA檢測試劑盒(Thermo, Cat: BMS2091)和人IgM ELISA檢測試劑盒(Novus, Cat: NBP2-60477)的操作說明，分別檢測小鼠血清中的人抗小鼠IgG抗體和人抗小鼠IgM抗體的濃度。使用酶標儀(Bio-rad iMark)讀取OD450吸光值，並透過Graphpad Prism計算分析血清中人抗小鼠IgG抗體和人抗小鼠IgM抗體的濃度。另外，採用如下方法檢測小鼠血清中抗KLH抗體的效價：將濃度為2 µg/mL的KLH蛋白(Sigma, Cat: H7017-20MG)按100 µL/孔加到96孔盤中，於4℃培育過夜。PBST洗滌96孔盤後，加入200 µL/孔的封阻液(含1% BSA的PBST)，於室溫封阻2小時。棄去封阻液，然後加入100 µL/孔的梯度稀釋的小鼠血清，於室溫培育2小時。PBST洗滌96孔盤後，加入以體積比1:10000稀釋的HRP偶聯山羊抗人IgG(H+L)抗體(Jackson Immuno, Cat: 109-035-088)，室溫培育1小時。PBST洗滌96孔盤後，加入100 µL/孔的TMB溶液，室溫避光培育5分鐘，並用0.5 M H 2SO 4終止反應，在Bio-rad iMark酶標儀讀取450 nM吸光度。結果顯示，與IgG4同型組相比，人源化抗體hzA01-3.3能顯著抑制人抗小鼠IgG抗體和人抗小鼠IgM抗體的產生(圖16A和16B)；且hzA01-3.3治療組未針對KLH產生特異性抗體(數據未顯示)。
在第22天，處死小鼠後摘取脾臟，秤重並分析各組小鼠的脾臟係數(脾臟係數=脾臟重量/小鼠體重×1000)。結果參見表8，IgG4同型對照組小鼠脾臟明顯腫大且脾臟係數明顯增高；而hzA01-3.3(0.5 mg/kg)組和hzA01-3.3(5 mg/kg)組小鼠的脾臟腫大有明顯緩解，hzA01-3.3呈劑量依賴地降低小鼠的脾臟係數；hzA01-3.3(5 mg/kg)組和BM(5 mg/kg)組小鼠的脾臟係數相當。 表8 NDG小鼠脾臟係數的測定
小鼠分組（n=只數） 平均脾重（g） 平均體重（g） 脾臟係數
空白對照, n=3 0.04±0.01 23.33±2.71 1.81±0.40
IgG4同型對照, n=4 0.24±0.03 22.50±1.27 10.82±1.14
hzA01-3.3（0.5 mg/kg）, n=5 0.15±0.03 23.14±1.65 6.31±1.06
hzA01-3.3（5 mg/kg）, n=5 0.13±0.04 22.56±2.16 5.50±1.42
BM（5 mg/kg）, n=5 0.13±0.03 24.04±0.38 5.58±1.09
註：空白對照是未經免疫重建和給藥的NDG小鼠；IgG4同型對照為Anti-HEL-Human IgG4(S228P L235E) Isotype-control(Biointron, Cat: B109805)
另外，採用流式細胞術分析各組小鼠脾臟內浸潤的人T淋巴細胞和B淋巴細胞含量，具體地，取小鼠脾臟製備成單細胞懸浮液，並調節細胞濃度至1×10 6個/mL，按100 µL/孔加到96孔U型底孔盤中，分別加入PE偶聯小鼠抗人CD4抗體(Biolegend, Cat: 980804)和APC偶聯小鼠抗人CD19抗體(BD, Cat: 555415)，混勻後於4℃培育30分鐘，用含2% FBS的PBS洗滌並重新懸浮細胞，採用流式細胞儀(Thermo Attune Nxt)檢測細胞螢光訊號，並透過染色細胞數目的百分比(%)來分析小鼠脾臟內浸潤的人CD4 +T細胞和CD19 +B細胞含量。結果表明(圖17)，在第22天，IgG4同型對照組小鼠的脾臟有大量人CD4 +T細胞和人CD19 +B細胞浸潤；而hzA01-3.3(0.5 mg/kg)和hzA01-3.3(5 mg/kg)組小鼠脾臟內浸潤的T細胞和B細胞則顯著低於IgG4同型組，hzA01-3.3呈劑量依賴性降低人T細胞和B細胞浸潤含量。
本發明的序列資訊總結於表9中。 表9 序列資訊
描述 序列/SEQ ID NO.
小鼠、嵌合和人源化A01的HCDR1 GFSLPTSGVH  (SEQ ID NO:1)
小鼠、嵌合A01和hzA01-3.4的HCDR2 VIWAGGDTNYNSALMS  (SEQ ID NO:2)
hzA01-1.1、hzA01-1.2、hzA01-2.1、hzA01-2.2和hzA01-3.1的HCDR2 VIWAGGDTN  (SEQ ID NO:3)
hzA01-3.3的HCDR2 VIWAGGDTNYNSALKS  (SEQ ID NO:4)
小鼠、嵌合和人源化A01的HCDR3 LGHGHFDV  (SEQ ID NO:5)
小鼠、嵌合和人源化A01的LCDR1 RSSQSLVHSSGNTYLQ  (SEQ ID NO:6)
小鼠、嵌合和人源化A01的LCDR2 KVSNRFS  (SEQ ID NO:7)
小鼠、嵌合和人源化A01的LCDR3 SQTTHVPWT  (SEQ ID NO:8)
小鼠和嵌合A01的VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLPTSGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGDTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQKDDTAIYYCLGHGHFDVWGAGTTVTVSS  (SEQ ID NO:9) CAAGTTCAGTTGAAAGAATCCGGGCCTGGTCTCGTTGCTCCTTCCCAGAGTCTCTCCATAACCTGCACAGTGAGCGGCTTTTCTTTGCCCACCAGTGGAGTGCACTGGGTGCGACAGCCACCTGGAAAAGGTCTTGAGTGGTTGGGTGTGATCTGGGCAGGTGGGGACACCAATTATAACTCCGCCCTGATGAGCCGCCTCTCCATCTCCAAGGATAATTCTAAGTCTCAGGTGTTCCTGAAAATGAACTCCCTTCAGAAGGACGATACCGCCATCTACTATTGCCTGGGACACGGGCATTTTGACGTGTGGGGTGCTGGGACAACCGTGACCGTGAGCTCT  (SEQ ID NO:68)
hzA01-1.1、hzA01-2.1和hzA01-3.1的VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLPTSGVHWIRQPPGKGLEWIGVIWAGGDTNYNPSLKSRVTISKDNSKNQVFLKLSSVTAADTAVYYCLGHGHFDVWGQGTLVTVSS  (SEQ ID NO:10) CAAGTGCAACTGCAGGAATCTGGCCCAGGCCTTGTTAAACCATCTGAAACCCTGAGCTTGACTTGCACTGTGAGTGGCTTCAGCTTGCCAACTTCCGGTGTGCACTGGATTAGACAGCCCCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATCGGCGTGATTTGGGCCGGCGGAGACACCAATTACAACCCAAGCCTGAAGAGTCGGGTGACCATCTCCAAGGATAATTCCAAGAACCAAGTGTTTCTCAAACTGTCCTCTGTGACGGCTGCTGATACCGCTGTCTACTACTGTCTCGGCCACGGGCATTTCGACGTTTGGGGGCAGGGTACATTGGTGACCGTAAGCAGC  (SEQ ID NO:69)
hzA01-1.2和hzA01-2.2的VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLPTSGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWAGGDTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCLGHGHFDVWGQGTLVTVSS  (SEQ ID NO:11) CAAGTTCAGCTCGTAGAATCTGGTGGTGGAGTGGTTCAACCAGGCAGGAGCTTGAGGCTGTCATGTGCCGCATCTGGGTTCTCACTCCCCACCTCTGGCGTGCACTGGGTTAGACAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAATGGGTCGCTGTGATTTGGGCAGGAGGAGACACTAACTATGCCGACTCTGTTAAGGGACGGTTTACAATCAGCAGAGATAACTCAAAAAACACCGTGTACTTGCAGATGAATTCACTGAGGGCTGAAGACACAGCGGTGTATTACTGCCTCGGTCACGGCCACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGTACACTTGTGACTGTCAGCAGC  (SEQ ID NO:70)
hzA01-3.3的VH QVQLKESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLPTSGVHWIRQPPGKGLEWIGVIWAGGDTNYNSALKSRVTISKDNSKSQVFLKLSSVTAADTAVYYCLGHGHFDVWGQGTLVTVSS  (SEQ ID NO:12) CAGGTGCAGCTCAAAGAAAGTGGGCCTGGGTTGGTCAAACCTTCTGAGACCCTGAGTCTGACCTGCACCGTATCAGGGTTTAGCTTGCCAACTAGCGGCGTACATTGGATCAGGCAGCCACCAGGCAAGGGACTCGAATGGATCGGCGTGATTTGGGCCGGGGGCGATACCAATTACAATTCAGCTCTCAAGTCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACAACAGTAAAAGCCAGGTCTTCCTGAAGCTGTCCAGTGTGACAGCTGCTGACACCGCCGTGTACTATTGTCTGGGGCACGGACATTTCGACGTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACAGTGAGCAGC  (SEQ ID NO:71)
hzA01-3.4的VH QVQLKESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLPTSGVHWIRQPPGKGLEWIGVIWAGGDTNYNSALMSRVTISKDNSKSQVFLKMSSVTAADTAVYYCLGHGHFDVWGQGTLVTVSS  (SEQ ID NO:13) CAGGTGCAGTTGAAAGAATCTGGACCCGGGCTTGTCAAGCCATCAGAAACTCTGAGTCTTACCTGCACCGTTTCAGGGTTTTCCCTCCCAACATCCGGCGTTCACTGGATTCGGCAGCCTCCTGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGCGTCATTTGGGCAGGAGGAGATACAAATTATAACTCAGCCCTGATGTCCCGGGTGACCATCTCAAAGGATAACTCCAAATCCCAGGTTTTTCTGAAGATGTCCAGCGTAACCGCCGCAGATACAGCCGTCTACTATTGCCTGGGTCATGGACATTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCCTCGTCACTGTCTCCAGT  (SEQ ID NO:72)
小鼠和嵌合A01的VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSSGNTYLQWYLQKPGQSPGLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIK  (SEQ ID NO:14) GATGTTGTGATGACACAGACACCTCTGTCCTTGCCAGTCAGCTTGGGAGATCAGGCTTCAATCAGCTGCAGGTCCTCTCAGAGTCTCGTACATTCATCAGGAAACACCTACCTCCAGTGGTACTTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCTGGACTGCTGATCTACAAGGTCTCCAATAGGTTTTCTGGAGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGTAGCGGCACAGACTTTACTCTGAAAATTTCACGAGTGGAAGCAGAAGATTTGGGGGTCTATTTTTGCTCCCAGACAACTCACGTGCCATGGACCTTTGGCGGAGGGACTAAACTGGAGATCAAG  (SEQ ID NO:73)
hzA01-1.1和hzA01-1.2的VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSSGNTYLQWYQQKPGKAPGLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQTTHVPWTFGQGTKVEIK  (SEQ ID NO:15) GATATCCAGATGACCCAATCACCCTCTAGCCTCAGTGCAAGTGTGGGAGATAGGGTAACTATCACCTGCAGAAGTAGTCAATCACTGGTGCACAGTTCCGGAAACACCTACCTGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCTGGGAAGGCACCAGGCCTGCTGATATACAAAGTTAGTAACAGGTTTTCCGGGGTGCCAAGCCGATTTAGCGGATCTGGCTCCGGGACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCAGAAGACTTTGCCACCTATTATTGCAGCCAGACTACACACGTACCTTGGACCTTTGGACAGGGTACAAAAGTGGAGATAAAG  (SEQ ID NO:74)
hzA01-2.1和hzA01-2.2的VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLVHSSGNTYLQWYQQKPGQAPRLLIYKVSNRFSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCSQTTHVPWTFGQGTKVEIK  (SEQ ID NO:16) GAGATTGTCCTTACTCAGTCTCCTGGCACTCTGAGCTTGTCACCTGGAGAGCGAGCTACTTTGAGCTGCCGGTCATCACAGTCATTGGTCCACAGCTCAGGCAACACATACCTCCAGTGGTACCAACAGAAGCCAGGACAGGCTCCACGCCTCCTGATCTACAAGGTCAGCAATCGGTTTAGCGGAATCCCAGACCGCTTTTCAGGCAGCGGTAGCGGCACAGATTTTACTTTGACTATCTCTAGACTGGAGCCCGAGGATTTTGCCGTGTACTATTGCAGCCAGACAACTCATGTGCCTTGGACTTTCGGCCAGGGAACAAAGGTGGAGATCAAA  (SEQ ID NO:75)
hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4的VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSSGNTYLQWYLQRPGQSPGLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQGTKLEIK  (SEQ ID NO:17) GATGTTGTAATGACTCAGAGTCCACTGTCTCTTCCAGTCACCCTGGGGCAGCCTGCATCTATTTCCTGCCGGAGCTCACAAAGCCTGGTGCACTCCAGTGGAAATACCTACCTGCAGTGGTATTTGCAAAGGCCCGGACAGTCTCCAGGTCTGTTGATATATAAGGTATCCAATAGGTTCAGTGGGGTGCCAGACCGATTTTCTGGATCAGGTTCAGGCACCGATTTTACCCTCAAGATCTCAAGAGTGGAAGCCGAAGACGTGGGCGTCTACTACTGCAGCCAGACTACCCACGTGCCTTGGACCTTTGGACAGGGGACCAAACTGGAGATTAAA  (SEQ ID NO:76)
小鼠和嵌合A02的HCDR1 GFSLTSSGVH  (SEQ ID NO:18)
小鼠和嵌合A02的HCDR2 VIWAGGDTSYNSALMS  (SEQ ID NO:19)
小鼠和嵌合A02的HCDR3 LGHGHLDV  (SEQ ID NO:20)
小鼠和嵌合A02的LCDR1 RSSQSLVHSSGNTYLHWYLQ  (SEQ ID NO:21)
小鼠和嵌合A02的LCDR2 KVSNRFS  (SEQ ID NO:7)
小鼠和嵌合A02的LCDR3 SQTTHVPWT  (SEQ ID NO:8)
小鼠和嵌合A02的VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSSGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGDTSYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCLGHGHLDVWGAGTTVTVSS  (SEQ ID NO:22)
小鼠和嵌合A02的VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSSGNTYLHWYLQKPGQSPGLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIK  (SEQ ID NO:23)
小鼠和嵌合A03的HCDR1 GYSITSDYSWH  (SEQ ID NO:24)
小鼠和嵌合A03的HCDR2 YIYSSGHTYYNPSLKS  (SEQ ID NO:25)
小鼠和嵌合A03的HCDR3 YYYGRSYFDN  (SEQ ID NO:26)
小鼠和嵌合A03的LCDR1 SASSSVNYMH  (SEQ ID NO:27)
小鼠和嵌合A03的LCDR2 DTSKLAS  (SEQ ID NO:28)
小鼠和嵌合A03的LCDR3 QQWSSNPLT  (SEQ ID NO:29)
小鼠和嵌合A03的VH DVQLQESGPDRVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIYSSGHTYYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAIYYYGRSYFDNWGRGTTLTVSS  (SEQ ID NO:30)
小鼠和嵌合A03的VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVNYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK  (SEQ ID NO:31)
小鼠和嵌合B01的HCDR1 GYTFTNYGMN  (SEQ ID NO:32)
小鼠和嵌合B01的HCDR2 WINPYTGEPTYADDFKG  (SEQ ID NO:33)
小鼠和嵌合B01的HCDR3 KPPFDY  (SEQ ID NO:34)
小鼠和嵌合B01的LCDR1 RSSKSLLHSNGNTYLY  (SEQ ID NO:35)
小鼠和嵌合B01的LCDR2 RVSNLAS  (SEQ ID NO:36)
小鼠和嵌合B01的LCDR3 MQHVEYPFT  (SEQ ID NO:37)
小鼠和嵌合B01的VH QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFAFSVETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARKPPFDYWGQGTTLTVSS  (SEQ ID NO:38)
小鼠和嵌合B01的VL DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQILIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHVEYPFTFGSGTKLEIK  (SEQ ID NO:39)
小鼠和嵌合B02的HCDR1 GYTFTSYVMY  (SEQ ID NO:40)
小鼠和嵌合B02的HCDR2 YVNPYNDGTNYNEKFKG  (SEQ ID NO:41)
小鼠和嵌合B02的HCDR3 GAMDY  (SEQ ID NO:42)
小鼠和嵌合B02的LCDR1 RSSKSLLHSQGNTYLY  (SEQ ID NO:43)
小鼠和嵌合B02的LCDR2 RVSNLAS  (SEQ ID NO:36)
小鼠和嵌合B02的LCDR3 MQHVEYPFT  (SEQ ID NO:37)
小鼠和嵌合B02的VH EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMYWVKQKPGQGLEWIGYVNPYNDGTNYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAMDYWGQGTSVTVSS  (SEQ ID NO:44)
小鼠和嵌合B02的VL DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSQGNTYLYWFLQRPGQSPQILIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHVEYPFTFGSGTKLEIK  (SEQ ID NO:45)
小鼠和嵌合B03的HCDR1 GFTFSDFYME  (SEQ ID NO:46)
小鼠和嵌合B03的HCDR2 ASRDKANDYTTEYSPSVQG  (SEQ ID NO:47)
小鼠和嵌合B03的HCDR3 DVGRSYALDY  (SEQ ID NO:48)
小鼠和嵌合B03的LCDR1 SASSSVTYMH  (SEQ ID NO:49)
小鼠和嵌合B03的LCDR2 VTSKLAS  (SEQ ID NO:50)
小鼠和嵌合B03的LCDR3 QQWSRKPPT  (SEQ ID NO:51)
小鼠和嵌合B03的VH EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRDKANDYTTEYSPSVQGRFIVSRDSSQSILYLQMNALRTEDTAIYYCARDVGRSYALDYWGQGTSVTVSS  (SEQ ID NO:52)
小鼠和嵌合B03的VL QVVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYVTSKLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSRKPPTFGAGTKLELK  (SEQ ID NO:53)
嵌合和人源化抗體的重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK   (SEQ ID NO:54) GCTTCAACAAAAGGACCCTCTGTTTTTCCTCTCGCACCCTGTTCCCGCAGCACAAGCGAGTCTACTGCCGCACTCGGCTGTCTGGTTAAAGACTATTTTCCTGAGCCCGTGACCGTGAGTTGGAACAGCGGTGCCCTGACCTCAGGAGTGCATACCTTTCCGGCAGTGTTGCAGTCATCAGGTCTGTATAGCCTGAGCAGTGTTGTGACAGTGCCCTCAAGTAGCTTGGGCACAAAGACATATACTTGTAACGTCGATCATAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCACCTTGCCCTCCATGTCCTGCACCAGAGTTCGAAGGCGGCCCTTCTGTCTTCTTGTTTCCCCCAAAGCCGAAGGATACCTTGATGATCTCTAGAACGCCAGAAGTGACATGCGTAGTGGTTGACGTAAGCCAGGAAGACCCAGAAGTGCAGTTTAATTGGTATGTGGACGGGGTTGAGGTTCATAACGCGAAGACTAAGCCTCGAGAAGAACAATTCAATTCCACTTATAGAGTGGTGTCCGTGCTTACCGTGCTGCATCAAGATTGGTTGAATGGGAAAGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAATAAAGGCCTCCCATCTTCAATTGAAAAGACAATTTCCAAAGCCAAGGGACAACCCCGAGAGCCACAGGTCTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTTTCATTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCTGTTGAGTGGGAGTCAAATGGTCAACCAGAAAACAACTATAAAACCACCCCTCCCGTGCTGGATTCAGACGGTTCTTTTTTTCTGTATTCCAGACTCACAGTCGACAAGAGCAGATGGCAGGAAGGGAACGTCTTTTCCTGTTCAGTGATGCACGAGGCTCTGCATAATCACTACACCCAAAAGTCCTTGTCTCTGAGTTTGGGCAAA  (SEQ ID NO:77)
野生型IgG4重鏈恆定區ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK  (SEQ ID NO:55) 含有1個胺基酸突變的IgG4重鏈恆定區（S228P）：ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK  (SEQ ID NO:56)
嵌合和人源化抗體的輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC  (SEQ ID NO:57) CGCACAGTGGCTGCTCCCTCAGTATTTATCTTTCCTCCAAGCGACGAGCAACTGAAGTCTGGGACGGCTTCCGTGGTGTGTCTGCTGAATAATTTTTATCCTAGAGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAAGTAGACAATGCCTTGCAGAGTGGAAACAGCCAGGAGTCCGTGACGGAACAGGACTCCAAAGATTCCACTTACTCCTTGTCCTCAACCCTTACTTTGAGCAAAGCCGATTATGAAAAGCATAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGGTTGAGTTCACCTGTCACCAAAAGCTTCAACCGAGGGGAATGT  (SEQ ID NO:78)
Iscalimab(CFZ533)的重鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  (SEQ ID NO:58)
Iscalimab(CFZ533)的輕鏈 DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC  (SEQ ID NO:59)
CP-870893的重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  (SEQ ID NO:60)
CP-870893的輕鏈 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC  (SEQ ID NO:61)
人CD40（hCD40）：MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ  (SEQ ID NO:62)
猴CD40（cynoCD40）： MVRLPLQCVLWGCLLTAVYPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCTSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQRALVVIPICLGILFVILLLVLVFIKKVAKKPNDKVPHPKQEPQEINFPDDLPGSNPAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ  (SEQ ID NO:63)
人CD40-mFc（hCD40-mFc）：MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLREPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK  (SEQ ID NO:64)
猴CD40-mFc（cynoCD40-mFc）： MVRLPLQCVLWGCLLTAVYPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCTSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQREPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK  (SEQ ID NO:65)
人CD40L（hCD4L）：MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL  (SEQ ID NO:66)
猴CD40L（cynoCD40L）：MIETYNQPSPRSAATGLPVRMKIFMYLLTIFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGEKSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEEKKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL  (SEQ ID NO:67)
圖1A-1B示出純化的小鼠抗CD40抗體阻斷293T-hCD40-NFĸB細胞與CD40L蛋白結合的活性； 圖2示出純化的小鼠抗CD40抗體對CD40L和IL-4所誘導的Ramos細胞凋亡的抑制活性； 圖3示出嵌合抗CD40抗體Chi-A01、Chi-A02和Chi-A03與CHO-K1-hCD40細胞的結合活性； 圖4示出嵌合抗CD40抗體Chi-A01、Chi-A02、Chi-A03、Chi-B01、Chi-B02和Chi-B03對Ramos細胞凋亡的促效活性，CP-870893對Ramos細胞凋亡的促效活性作為陽性對照示出； 圖5示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4與293T-hCD40-NFĸB細胞的結合活性； 圖6示出人源化抗CD40抗體hzA01-1.1、hzA01-2.1、hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4阻斷293T-hCD40-NFĸB細胞與CHO-K1-hCD40L細胞結合的活性； 圖7示出人源化抗CD40抗體hzA01-1.1、hzA01-2.1、hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4對CD40L和IL-4所誘導的Ramos細胞凋亡的抑制活性； 圖8示出人源化抗CD40抗體hzA01-1.1、hzA01-2.1、hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4對Ramos細胞凋亡的促效活性，CP-870893對Ramos細胞凋亡的促效活性作為陽性對照示出； 圖9示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4對CD40L誘導的人外周血B淋巴細胞共刺激分子CD86表達的抑制活性； 圖10示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4對CD40L和IL-4誘導的人外周血B淋巴細胞增殖的抑制活性； 圖11示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.1、hzA01-3.3和hzA01-3.4誘導人外周血B淋巴細胞增殖的促效活性，CP-870893誘導人外周血B淋巴細胞增殖的促效活性作為陽性對照示出； 圖12示出在MLR反應中反應於人源化抗CD40抗體hzA01-3.3的IFNγ釋放量，其中mDC和DC(未經分化培養)組未加入抗CD40抗體和IgG4同型對照抗體，作為陰性對照示出； 圖13示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3對imDC細胞成熟的促效活性，CP-870893對imDC細胞成熟的促效活性作為陽性對照示出； 圖14示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3媒介的ADCC效應，Rituximab媒介的ADCC活性作為陽性對照示出； 圖15示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3媒介的CDC效應，Rituximab媒介的CDC活性作為陽性對照示出； 圖16A示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3治療後NDG小鼠血清中人抗小鼠IgM抗體的濃度，圖16B示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3治療後NDG小鼠血清中人抗小鼠IgG抗體的濃度； 圖17A示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3治療後小鼠脾臟內浸潤的人CD4 +T細胞含量，17B示出人源化抗CD40抗體hzA01-3.3治療後小鼠脾臟內浸潤的人CD19 +B細胞含量，其中，透過t檢驗與IgG4同型對照組進行比較，*表示P≤0.05，**表示P ＜ 0.01，***表示P ＜ 0.001；
TW202328197A_111136162_SEQL.xml

Claims (15)

  1. 一種分離的抗CD40抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，其中， (1)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR3的胺基酸序列； (2)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列； (3)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列； (4)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR3的胺基酸序列； (5)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR3的胺基酸序列； (6)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR3的胺基酸序列； (7)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR3的胺基酸序列； (8)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR3的胺基酸序列； (9)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR3的胺基酸序列；或 (10) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR2的胺基酸序列和重鏈CDR3包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR3的胺基酸序列；和/或 (ii) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (2)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (3)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (4)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (5)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (6)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (7)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (8)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR3的胺基酸序列；或 (9)   輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR2的胺基酸序列和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR3的胺基酸序列。
  2. 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，其中， (1)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、2和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、2和5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、3和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、3和5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、4和5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、4和5所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：18、19和20所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：18、19和20所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：24、25和26所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：24、25和26所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (6)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：32、33和34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：32、33和34所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (7)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：40、41和42所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：40、41和42所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (8)   重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：46、47和48所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：46、47和48所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；和/或 (ii) 輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1)   輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2)   輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：21、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：21、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3)   輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：27、28和29所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：27、28和29所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4)   輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：35、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：35、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5)   輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：43、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：43、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (6)   輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：49、50和51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：49、50和51所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
  3. 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含： 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：9中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：14中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (2)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (3)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：15中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (4)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (5)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：11中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：16中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (6)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：10中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (7)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：12中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (8)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：13中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：17中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (9)   重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：22中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：23中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (10) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：30中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：31中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (11) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：38中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：39中輕鏈CDR3的胺基酸序列； (12) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：44中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：45中輕鏈CDR3的胺基酸序列；或 (13) 重鏈CDR1包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR1的胺基酸序列，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR2的胺基酸序列，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：52中重鏈CDR3的胺基酸序列，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR1的胺基酸序列，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR2的胺基酸序列，和輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：53中輕鏈CDR3的胺基酸序列。
  4. 根據請求項1-3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含： 重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中， (1)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、2、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、2、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、3、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、3、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：1、4、5、6、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：1、4、5、6、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：18、19、20、21、7和8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：18、19、20、21、7和8所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：24、25、26、27、28和29所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (6)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：32、33、34、35、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：32、33、34、35、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (7)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：40、41、42、43、36和37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：40、41、42、43、36和37所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (8)   重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3分別包含SEQ ID NOs：46、47、48、49、50和51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：46、47、48、49、50和51所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
  5. 根據請求項1-4中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含： (i)    重鏈可變區，所述重鏈可變區包含9、10、11、12、13、22、30、38、44或52所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NOs：9、10、11、12、13、22、30、38、44或52所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；和/或 (ii)   輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NOs：14、15、16、17、23、31、39、45或53所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NOs：14、15、16、17、23、31、39、45或53所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
  6. 根據請求項1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中， (1)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：9和14所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：9和14所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (2)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和15所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和15所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (3)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：11和15所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：11和15所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (4)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和16所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和16所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (5)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：11和16所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：11和16所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (6)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：10和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：10和17所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (7)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：12和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：12和17所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (8)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：13和17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：13和17所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (9)   重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：22和23所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：22和23所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (10) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：30和31所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：30和31所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (11) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：38和39所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； (12) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：44和45所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：44和45所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；或 (13) 重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含SEQ ID NOs：52和53所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：52和53所示的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列。
  7. 根據請求項1-6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，所述重鏈恆定區包含SEQ ID NOs：54、55或56所示的胺基酸序列或與SEQ ID NOs：54、55或56所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列，所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：57所示胺基酸序列或者與SEQ ID NO：57所示胺基酸序列相比具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除和添加的胺基酸序列。
  8. 根據請求項1-7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段：(a) 結合人CD40；(b) 結合猴CD40；(c) 阻斷CD40與CD40L相互作用；和/或 (d) 抑制CD40活性。
  9. 根據請求項1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是嵌合或人源化的； 任選地，所述抗體或其抗原結合片段是IgG1、IgG2或IgG4同種型； 任選地，所述抗體或其抗原結合片段選自單株抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、多特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分離的CDR區、單鏈Fv分子或其組合。
  10. 一種分離的核酸分子，其編碼請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  11. 一種表達載體，其包含請求項10所述的核酸分子。
  12. 一種宿主細胞，其包含請求項10所述的核酸分子或請求項11所述的表達載體。
  13. 一種重組多肽或融合蛋白，其包含請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  14. 一種藥物組成物，其包含請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和一種或多種藥學上可接受的載劑。
  15. 一種在有需要的受試者中治療或預防免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，或者請求項14所述的藥物組成物； 任選地，所述免疫疾病包括但不限於發炎性疾病、過敏反應、自身免疫性疾病或移植相關疾病； 任選地，所述免疫疾病包括但不限於過敏反應、艾迪生氏病、僵直性脊柱炎、脊柱關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、冠心病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、I型糖尿病、附睾炎、腎炎、賴特症候群、甲狀腺炎、格雷夫斯病、格林-巴利症候群、橋本氏病、溶血性貧血、特發性血小板減少性症、系統性紅斑狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力、銀屑病、硬皮病、關節炎、類肉瘤病、乾燥症候群、乾眼症、化膿性汗腺炎、移植相關疾病、血管炎和/或發炎性腸病； 任選地，所述方法還包括施用治療有效量的第二治療劑； 任選地，所述第二治療劑包括非甾體抗炎藥、水楊酸鹽、羥化氯喹、柳氮磺吡啶、皮質類固醇、細胞毒性藥物、或免疫抑制藥物和/或抗體。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD120103A1 (zh) 1975-07-07 1976-05-20
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
TWI704158B (zh) * 2017-04-04 2020-09-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 能夠特異性結合至cd40及fap之新穎雙特異性抗原結合分子
US11525005B2 (en) * 2017-06-01 2022-12-13 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-CD40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof
KR20210097750A (ko) * 2018-11-30 2021-08-09 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 Cd40 항체 약학 조성물 및 이의 용도
CN111763259B (zh) * 2020-09-03 2020-12-15 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 抗cd40抗体及其用途

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