KR100991010B1

KR100991010B1 - 인간화 항-ｃｄ４０ 항체 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR100991010B1
Application number: KR1020077030332A
Authority: KR
Inventors: 레오나드 지. 프레스타; 로리 와이. 오코넬; 스베틀라나 오. 도로니나
Original assignee: 제넨테크, 인크.; 시애틀 지네틱스, 인크.
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2010-10-29
Also published as: NO341793B1; AU2006249305B2; MA29595B1; US20090181015A1; US20130023047A1; CA2609269C; RU2007148932A; WO2006128103A2; RU2407544C2; JP5027804B2; NO20076404L; US8492531B2; CA2609269A1; EP1885399A4; DE602006017690D1; EP1885399A2; US20140193405A1; ECSP078026A; EP1885399B1; ATE485057T1

Abstract

인간화 항-CD40 항체 및 항원-결합 단편 및 CD40 항원의 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 방법이 제공된다.

인간화 항-CD40 항체, 항원-결합 단편, CD40 항원

Description

인간화 항-ＣＤ４０ 항체 및 그의 사용 방법{HUMANIZED ANTI-CD40 ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE}

본 발명은 일반적으로 진단 및 치료용의 인간화 항 CD40 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, CD40을 발현하는 세포를 특징으로 하는 다양한 질환 또는 질환의 치료를 위한 인간화 항 CD40 항체 및 그의 사용 방법을 개시한다. 상기 인간화 항 CD40 항체를 포함하는 약학 조성물 및 킷트와 같은 제품을 또한 개시한다.

본 출원은 2005년 5월 26일자로 출원된 미국 가 출원 제 60/684,853 호의 이점을 청구하며, 그의 개시 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

CD40은 I형 필수 막 당단백질이며 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과의 일원이다. CD40은 정상 및 종양 B 세포, 지상돌기접착상 세포, 기저 상피세포 및 암종을 포함한 각종 세포유형 상에서 발현된다. 상기는 또한 단핵구, 대식세포, 일부 내피 세포, 및 여포성 수상돌기 세포 상에 존재한다. CD40은 CD10 및 CD19의 출현에 이어서, 그러나 CD21, CD23, CD24의 발현, 및 표면 면역글로불린 M (sIgM)의 출현 전에 B 세포 전구체 상에 나타나는 B 세포 개체발생 중 조기 발현된다(Uckun 등, 1990, Blood 15:2449). 초기 보고서들은 CD40이 B 세포가 혈장 세포로 말단 분화 시 사멸된다고 지적하였지만, CD40은 편도 및 골수 유래 혈장 세포 상에서 검 출되었다 (Pellat-Decounynck 등, 1994, Blood 84:2597).

CD40과 그의 리간드 및 역 수용체, CD40L (또한 CD154, gp39 및 TRAP라고도 칭함)과의 상호작용은 체액 및 세포 매개된 면역 반응을 모두 포함한다. CD40L은 활성화된 림프구, CD4⁺ T 세포 상에서 우세하게 발현되는 막통과 단백질이다. TNF 계열의 다른 단백질들처럼, CD40L의 구조는 비공유 삼량체의 구조이다. CD40 매개된 신호전달은 B 세포 증식, 면역글로불린 (Ig) 아이소타입 스위칭, 배중심 조직화, 및 T 세포 의존성 항원에 반응하는 기억 B 세포 참여에 필요한 것으로 보인다. CD40L의 CD40 결합은 CD40 다량체화, 항원 제공 세포, 예를 들어 수상돌기 세포, 단핵구, 및 B 세포에 대한 활성화 신호의 발생, 및 사이토킨-활성화된 섬유아세포 및 상피 세포에 대한 분화 신호를 생성시킨다. 세포 분화에서 CD40 분자가 작용하는 신호전달 경로가 완전히 추론되지는 않았지만, CD40 신호는 상기 다량체화된 수용체로부터 일련의 TNF 수용체 관련된 인자들 ("TRAF")의 모집을 통해 전달된다 (Kehry, 1996, J. Immumol. 156:2345-2348). TRAF의 서브셋들은 CD40을 포함한 TNF 수용체 계열 구성원들과 차별적으로 상호작용하여 광범위하게 다양한 하부 경로들에 자극을 제공한다. TRAF1 및 TRAF2는 세포자멸사의 조절에 관여한다 (Speiser 등, 1997, J. Exp. Med. 185:1777-1783; Yeh 등, 1997, Immunity 7:715-725). TRAF 2, 5 및 6은 증식 및 활성화 사건들에 참여한다. 정상 B 세포에서, CD40L에의 CD40의 결합은 TRAF2 및 TRAF3을 수용체 복합체에 보충시키며 다른 TRAF의 하향 조절을 유도한다 (Kuhne 등, 1997, J. Exp. Med. 186:337-342).

세포자멸사 및 CD40-매개된 신호전달은 B 세포 발생 및 분화 중에 가깝게 연결된다. B 세포에서 세포자멸사의 주요 작용은 미숙한 B 세포의 클론 결실이며, 이는 미숙한 B 세포에서 표면 Ig의 광범위한 교차 결합으로부터 발생하는 것으로 생각된다. 성숙한 B 세포의 운명은 또한 표면 Ig를 통한 신호전달과, 추정 상 CD40L 분자에 의해 매개되는 활성화된 T 세포로부터 유래된 신호와의 조합에 의해 조절된다. 표면 Ig 및 CD40으로부터의 신호들의 조합은 상기 세포자멸사 경로를 무시하여 배중심 B 세포 생존을 유지시킬 수 있다. 배중심에서 이러한 세포자멸사로부터의 구조는 친화성 항체 생산 기억 B 세포의 발생에 중요하다.

T 및 B 세포 악성종양에서, 항종양 효과 (세포자멸사가 있거나 없는 성장 정지)는 종종 악성 세포가 정상 림프구의 활성화를 유도하는 자극에 노출될 때 발생한다. 이러한 활성화 유도된 성장 정지는 항원 수용체 또는 공동자극 수용체를 통한 신호의 경우 관찰되었다 (Ashwell 등, 1987, Science 237:61; Bridges 등, 1987, J. Immunol. 139:4242; Page and Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717; and Beckwith 등, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501). 항-CD40 항체 또는 용해성 CD40L에 의한 CD40 자극은 B 세포 림프종 성장을 직접 억제한다 (Funakoshi 등, 1994, Blood 83:2787-2784).

여러 가지 CD40에 대한 쥐 단일클론 항체들 (mAb)이 개시되었다 (Katira 등 1995, "CD40 Workshop Panel Report"; In: Leukocyte Typing V, Schlossman 등, (eds)1995, 1:547-550). 예를 들어 2 개의 mAb, CD40.7 (M2) 및 CD40.8 (M3)은 CD40L에 대한 CD40의 결합을 억제하는 것으로 나타났다 (Fanslow 등, 1995, In: Leukocyte Typing V, Schlossman 등, (eds)1995, 1:555-556). mAb M2 및 M3에 의한 CD40 자극은 여러 가지 인간 B 세포 림프종의 성장을 억제하고 생체 내에서 확립된 종양의 퇴화를 유도하였다 (Funakoshi 등, 1994, Blood 83:2787-2794; Funakoshi 등, 1996, J. Immunol. 19:93-101). 미국 특허 제 5,182,368 호는 B 세포 증식을 증가시킬 수 있는 항-CD40 쥐 mAb, G28-5를 개시한다. G28-5의 단쇄 면역독소 계 단쇄 Fv 부위는 생체 외에서 인간 CD40 발현 혈액 암 세포주를 선택적으로 죽인다 (Francisco 등, 1997, J Biol. Chem. 39:24165-24169). 그러나, G28-5는 CD40L의 존재 하에서 B 세포의 활성화를 향상시키지 않으며 CD40과 CD40L의 결합을 강화시키지 않는다. 미국 특허 제 6,838,261 호 (및 관련된 미국 특허 제 6,946,129 호 및 6,843,989 호)에는 다양한 형태의 항 CD40 쥐 mAb, S2C6의 부류, 및 다양한 질환들, 예를 들어 암 및 면역 및 염증 질환의 치료에서의 그의 용도가 개시되어 있다. CD40L 매개된 자극을 향상시키는 것 이외에, 미국 특허 제 6,838,261 호에 개시된 항 CD40 항체는 CD40과 CD40L 간의 상호작용의 증대, 및 생체 내 종양 억제 활성을 나타내었다. S2C6은 단독으로 G28-5와 유사한 방식으로 B 세포 증식을 자극할 것이나, S2C6은 CD40L 결합 및 후속적인 상기 CD40L 매개된 활성화 신호의 크기를 증가시키는 능력에 의해 G28-5와 구분된다.

예를 들어 국제 공보 WO 95/17202에 개시된 다른 쥐 항 CD40은 CD40과 결합하며 CD40을 발현하는 종양 세포를 특징으로 하는 질환의 치료 및 예방에 효능을 보인다. 쥐 항 CD40 항체는 인간에서 CD40 관련된 질환의 치료에 치료제로서 효능 있는 적응성을 갖지만, 그의 면역원성은 항체 반응, 예를 들어 그의 가치를 제한하 는 인간 항 마우스 항체 (HAMA) 반응의 중화 가능성을 제공한다.

따라서, 한정된 CD40 에피토프에 특이적으로 결합하고 항원 결합 특이성, 친화성, 및 유사한 비인간 항 CD40 항체의 다른 목적하는 작용 특징을 나타내는 인간화 항 CD40 항체가 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 인간화 항 CD40 항체 및 그의 항원 결합 단편뿐만 아니라, CD40 표면 항원을 발현하는 세포를 특징으로 하는 질환 및 질환의 치료를 위한 상기와 같은 항 CD40 항체 및 단편의 사용 방법을 포함한다. 또한 인간화 항 CD40 항체를 포함하는 킷트 및 제품을 포함한다.

일부 실시태양에서, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 부위 영역을 포함한다. 상기 중쇄 가변 부위 영역은 서열번호: 2의 인간 가변 영역 중쇄 서브그룹 III 공통 아미노산 서열의 아미노산 서열과 90% 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖는 틀 부위, 및 서열번호: 3의 상응하는 중쇄 CDR과 90% 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13의 인간 가변 영역 경쇄 서브그룹 카파 I 공통 아미노산 서열과 90% 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖는 틀 부위, 및 서열번호: 14의 상응하는 경쇄 CDR과 90% 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 각각의 중쇄 CDR은 서열번호: 3의 상응하는 중쇄 CDR에 90% 이상 일치한다. 일부 실시태양에서, 상기 중쇄 CDR은 서열번호: 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 각각의 경쇄 CDR은 서열번호: 14의 상응하는 경쇄 CDR에 90% 이상 일치한다. 일부 실시태양에서, 상기 경쇄 CDR은 서열번호: 14의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호: 14, 서열번호: 15, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 및 서열번호: 14, 서열번호: 15, 또는 서열번호: 16의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시태양에서, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호: 3 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 5 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 15; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 또는 각각 서열번 호: 11 및 서열번호: 16을 포함한다.

상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG 불변 영역, 예를 들어 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 IgG 불변 영역를 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 카파 불변 영역을 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 항체는 hu sgn-0, hu sgn-1, hu sgn-2, hu sgn-4, hu sgn-14, hu sgn-15, hu sgn-16, hu sgn-17, hu sgn-18, hu sgn-19, hu sgn-22, hu sgn-23, hu sgn-26 또는 hu sgn-27이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 ATCC 수탁 번호 PTA-110을 갖는 하이브리도마에 의해 분비되는 단일클론 항체 S2C6과 결합을 경쟁한다.

상기 항체는 또한 항원 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 다이아바디 (diabody), 단쇄 항체, scFv 단편 또는 scFv-Fc일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 임의로 표지하거나 또는 화학요법제, 예를 들어 아우리스타틴 (예를 들어 MMAE 또는 MMAF)에 접합시킬 수 있다.

용기 중에 항 CD40 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 킷트를 또한 제공한다. 상기 킷트는 추가적인 성분(들), 예를 들어 생물학적 샘플 중의 CD40 단백질을 검출하기 위한 항체의 사용 설명서를 임의로 포함할 수 있다.

항 CD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제(들)를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다.

일부 실시태양에서, 인간화 중쇄 가변 부위 및/또는 인간화 경쇄 가변 부위 를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어 서열번호: 14, 서열번호: 15, 또는 서열번호: 16의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

일부 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 각각 서열번호: 3 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 5 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 15; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 또는 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화한다.

일부 실시태양에서, 인간 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포에 항 CD40 항체 또는 항원 결합 단편을 투여함을 포함하며, 이때 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 세포 표면 CD40 항원에 결합한다. 상기 CD40 항원에 대한 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 결합은 상기 세포의 성장 또는 분화를 억제한다.

일부 실시태양에서, CD40 관련된 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공 한다. 상기 방법은 상기 환자에게 항 CD40 항체 또는 항원 결합 단편을 투여함을 포함하며, 이때 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 CD40에 결합한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 CD40에의 결합은 상기 CD40 관련된 질환의 세포의 성장 또는 분화를 억제한다. 상기 CD40 관련된 질환은 예를 들어 만성 림프구성 백혈병, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비 호지킨 림프종, 호지킨병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 카포시육종일 수 있다.

일부 실시태양에서, 말초 B 세포의 고갈을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포에 항 CD 항체 또는 항원 결합 단편을 투여함을 포함하며, 이때 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 세포 표면 CD40 항원에 결합한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 CD40 항원에의 결합은 상기 세포의 고갈을 유도한다. 상기 말초 B 세포는 예를 들어 환자에서 자가면역 반응성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면 및 서열 목록과 함께, 바람직한 실시태양들을 포함하는 하기의 상세한 설명을 참고로 가장 잘 이해될 것이다. 하기의 논의는 묘사적이고 설명적이며 예시적이고 첨부된 청구의 범위 중 임의의 것에 의해 한정되는 범위를 제한하는 것으로서 해석하지 않는다.

도 1A 및 1B는 인간화 항 CD 항체의 중쇄의 폴리펩타이드 (서열번호: 18) 및 암호화 (서열번호: 17) 및 상보적인 DNA 서열을 나타낸다. 상기 폴리펩타이드 서열에는 선두 서열, 가변 부위, 및 인간 IgG₁ 불변 영역의 위치를 가리키는 주석을 달았다. 도 1C는 인간화 항 CD 항체의 경쇄의 폴리펩타이드 (서열번호: 21) 및 암호화 (서열번호: 20) 및 상보적인 DNA 서열을 나타낸다. 상기 폴리펩타이드 서열에는 선두 서열, 가변 부위, 및 인간 카파 불변 영역의 위치를 가리키는 주석을 달았다.

도 2는 종양 이식 후 13 일째에 치료를 시작하여, 2 주의 기간에 걸쳐 측정된 종양 부피에 대한 대조용 항체, 쥐 항 CD40 항체, 및 인간화 항 CD40 항체의 치료 효과를 나타낸다.

도 3은 종양을 갖는 마우스의 생존에 대한 대조용 항체, 쥐 항 CD40 항체, 및 인간화 항 CD40 항체의 치료 효과를 나타낸다.

설명의 명확성을 위해서, 제한 없이, 본 발명의 상세한 설명을 하기와 같이 세분한다.

본 발명에 상표명을 사용할 때, 달리 나타내지 않는 한, 상기 상표명은 또한 제형, 일반적인 약물, 및 제품의 활성 약학 성분(들)의 상표명을 지칭한다.

달리 한정하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 개시된 방법 및 조성물에 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

정의

"CD40" 및 "CD40 표면 항원"이란 용어는 정상 및 종양 B 세포의 표면상에서 발현되는 50 kD 당단백질을 지칭하며, 세포 증식 및 분화에 관여하는 신호에 대한 수용체로서 작용하고 때때로 Bp50이라 칭한다 (Ledbetter 등, 1987, Imunol. 138:788-785). CD40을 암호화하는 cDNA 분자를 버킷 림프종 세포 주 라지 (Raji)로부터 제조된 라이브러리로부터 단리하였다 (Stamenkovic 등, 1989, EMBO J. 8:1403). CD40을 발현하는 세포는 CD40의 표면 발현을 특징으로 하는 임의의 세포, 예를 들어 비 제한적으로 정상 및 종양 B 세포, 지상돌기접착상 세포, 기저 상피세포, 암종 세포, 대식세포, 내피 세포, 여포성 수상돌기 세포, 편도 세포, 및 골수 유래된 혈장 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 CD40 분자는 인간 CD40 분자이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "CD40 항원 에피토프" 및 "CD40 에피토프"란 용어는 항 CD40 항체와 면역반응할 수 있는 분자 (예를 들어 펩타이드) 또는 분자의 단편을 지칭하며 예를 들어 S2C6 단일클론 항체에 의해 인식되는 CD40 항원 결정인자를 포함한다. CD40 항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편, 펩타이드 등에 포함될 수 있다. 상기 에피토프는 가장 통상적으로는 단백질, 짧은 올리고펩타이드, 올리고펩타이드 유사물질 (즉 CD40 항원의 항체 결합 성질을 모방하는 유기 화합물), 또는 이들의 조합이다.

본 발명에 사용된 "특이적 결합" 및 "특이적으로 결합하는"은 소정의 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 전형적으로는, 상기 항체는 약 1 x 10⁷ M^-1 이상의 친화성으로 결합하며, 상기 소정의 항원에 상기 소정의 항원 이외의 비 특이적 항원 (예를 들어 BSA, 카제인) 또는 밀접하게 관련된 항원에 결합하기 위한 친화성보다 2 배 이상 큰 친화성으로 결합한다.

"고유 항체" 및 "고유 면역글로불린"은 본 발명에서 2 개의 동일한 경 (L) 쇄와 2 개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된, 전형적으로는 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질로서 정의된다. 각각의 경쇄는 하나의 다이설파이드 결합에 의해 중쇄에 공유 결합하여 이종이량체를 형성한다. 상기 이종사량체는 상기와 같은 이종이량체의 2 개의 동일한 중쇄 간의 공유 다이설파이드 결합에 의해 형성된다. 상기 경쇄 및 중쇄는 하나의 다이설파이드 결합에 의해 함께 결합되지만, 상기 2 개의 중쇄들간의 다이설파이드 결합의 수는 면역글로불린 아이소타입에 의해 변한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄간 다이설파이드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노 말단에 가변 영역 (V_H), 후속적으로 3 또는 4 개의 불변 영역 (C_H1, C_H2, C_H3 및 C_H4)뿐만 아니라 C_H1과 C_H2 간에 경첩 부위를 갖는다. 각각의 경쇄는 2 개의 영역, 즉 아미노 말단 가변 영역 (V_L) 및 카복시 말단 불변 영역 (C_L)을 갖는다. 상기 V_L 영역은 상기 V_H 영역과 비 공유적으로 회합하는 반면, 상기 C_L 영역은 통상적으로 다이설파이드 결합을 통해 상기 C_H1 영역에 공유 결합한다. 특정한 아미노산 잔기들이 상기 경 및 중쇄 가변 영역들 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다 (Chothia 등, 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663).

"초가변성 (hypervariable)"이란 용어는 상기 가변 영역 내의 몇몇 서열들이 항체들간 서열에 있어서 광범위하게 상이하며 그의 특이적인 항원 결정인자들에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관련되는 잔기들을 함유한다는 사실을 지칭한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 있어서 초가변성은 상보성 결정 부위 (CDR) 또는 초가변성 루프 (HVL)로서 공지된 3 개의 분절들에 집중된다. CDR은 문헌 [Kabat 등, 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.]에서의 서열 비교에 의해 한정되는 반면, HVL은 문헌 [Chothia and Le나 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]에 개시된 바와 같이, 상기 가변 영역의 3 차원 구조에 따라 구조적으로 한정된다. 이들 두 가지 방법으로 CDR의 약간 상이한 정의가 발생하는 경우, 상기 구조적 정의가 바람직하다. 카바트 (Kabat)에 의해 한정된 바와 같이, CDR-L1은 경쇄 가변 영역에서 대략 잔기 24-34에, CDR-L2는 대략 잔기 50-56에, CDR-L3은 대략 잔기 89-97에 위치하며; CDR-H1은 중쇄 가변 영역에서 대략 잔기 31-35에, CDR-H2는 대략 잔기 50-65에, CDR-H3은 대략 잔기 95-102에 위치한다.

상기 중쇄 및 경쇄 각각 내의 3 개의 CDR들은 틀 부위 (RF)에 의해 분리되며, 상기 부위는 덜 가변적인 경향이 있는 서열들을 함유한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지, 상기 FR 및 CDR은 하기의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 상기 FR의 큰 β 시트 배치는 상기 각각의 쇄 내부의 CDR을 서로뿐만 아니라 다른 쇄로부터의 CDR에 가깝게 한다. 생성되는 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만 (Kabat 등, 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 참조), 모든 CDR 잔기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.

FR 잔기 및 Ig 불변 영역은 항원 결합에 직접 관여하는 것이 아니고, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 효과기 작용을 매개한다. 일부 FR 잔기는 적어도 3 가지 방식으로, 즉 에피토프에 직접 비 공유 결합함으로써, 하나 이상의 CDR 잔기와 상호작용함으로써, 및 중쇄와 경쇄 간의 계면에 영향을 미침으로써 항원 결합에 현저한 효과를 가질 수 있다. 상기 불변 영역은 항원 결합에 직접 관여하는 것이 아니라, 다양한 Ig 효과기 작용, 예를 들어 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP)을 매개한다.

척추동물 면역글로불린의 경쇄를 상기 불변 영역의 아미노산 서열을 근거로, 2 개의 확실리 다른 부류, 즉 카파 (κ) 및 람다 (λ) 중 하나로 지정한다. 비교에 의해, 포유동물 면역글로불린의 중쇄를 불변 영역의 서열에 따라 5 개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 하나로 지정한다. IgG 및 IgA를 하위부류 (아이소타입), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가 분류한다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 영역들을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. 상기 고유 면역글로불린 부류의 서브유닛 구조 및 3 차원 배치는 널리 공지되어 있다.

"항체", "항 CD40 항체", "인간화 항 CD40 항체" 및 "변형 인간화 항 CD40 항체"라는 용어는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체 (완전 길이 단일클론 항체), 다클론 항체, 다중특이 항체 (예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편, 예를 들어 가변 영역 및 목적하는 생물 활성, 예를 들어 CD40 결합을 나타내는 항체의 다른 부분을 포함한다.

"단일클론 항체" (mAb)란 용어는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다; 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 천연 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 결정인자 (또한 에피토프라 칭한다)에 대해 매우 특이적이다. 수식 어구인 "단일클론의"는 동일한 에피토프에 대한 실질적으로 동종인 항체 집단을 가리키며 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 필요한 생산으로서 해석되지 않는다. 단일클론 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 기법 또는 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler 등, 1975, Nature 256:495]에 처음으로 개시된 하이브리도마 방법, 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 제 4,816,567 호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또 다른 예에서, 단일클론 항체를 또한 문헌 [Clackson 등, 1991, Nature 352:624-628, 및 Marks 등, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597]에 개시된 기법을 사요하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

대조적으로, 다클론 항체의 제조에서 상기 항체는 전형적으로는 면역글로불린 아이소타입 및/또는 부류의 이종 집단이며 또한 다양한 에피토프 특이성을 나타낸다.

본 발명에 사용된 "키메릭"이란 용어는 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 부위 또는 영역 중의 완전한 아미노산 서열의 일부가 또 다른 종으로부터 또는 또 다른 면역글로불린 부류 또는 아이소유형에 속하거나 또는 공통 서열로부터의 단일클론 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 유사하거나 상기의 변형인 단일클론 항체의 유형이다. 키메릭 항체는, 상기 항체 단편이 그의 모 항체의 목적하는 생물 활성, 예를 들어 동일 에피토프에의 결합을 나타내는 한, 상기와 같은 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌 [Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855] 참조).

"항체 단편", "항 CD40 항체 단편", "인간화 항 CD40 항체 단편", "변형 인간화 항 CD40 항체 단편"이란 용어는 완전 길이 항 CD40 항체의 일부를 지칭하며, 이때 가변 부위 또는 작용성, 예를 들어 특이적인 CD40 에피토프 결합은 유지된다. 항체 단편의 예로는 비 제한적으로 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체, 미니바디, 항체 단편으로부터 형성된 다이아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 있다.

특정 유형의 항체 단편은 완전 길이 항체의 효소 처리에 의해 생성될 수 있다. 항체의 파파인 절단은 "Fab" 단편이라 칭하는 2 개의 동일한 항원 결합 단편 (이들은 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는다), 및 소위 쉽게 결정화하는 능력으로 인해 잔류 "Fc" 단편을 생성시킨다. 상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 C_H1 영역을 함유한다. 펩신 처리는 2 개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원과 교차 결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

Fab' 단편은 상기 Ch 영역의 C 말단에 몇 개의 추가적인 잔기, 예를 들어 항체 경첩 부위로부터의 하나 이상의 시스테인의 존재에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab-SH는 여기에서 상기 불변 영역의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'를 가리킨다. F(ab')₂ 항체 단편은 상기 경첩 부위에서 시스테인 잔기에 의해 결합된 Fab' 단편 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 공지되어 있다.

"Fv"는 밀착된 비 공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이량체로 이루어진 완전 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 배치에서, 각 가변 영역의 3 개의 CDR은 상호작용하여 상기 V_H-V_L 이량체의 표면상에 항원 결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6 개의 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다.

"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 영역을 포함하는 단쇄 Fv 변이체이며, 여기에서 상기 영역들은 단일 폴리펩타이드 쇄 중에 존재하고 항원을 인식하고 결합할 수 있다. 상기 scFv 폴리펩타이드는 상기 scFv가 항체 결합에 목적하는 3 차원 구조를 형성할 수 있게 하는 V_H와 V_L 영역 사이에 배치된 폴리펩타이드 링커를 임의로 함유한다 (예를 들어 Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 참조).

"다이아바디"란 용어는 2 개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 각각의 단편은 경쇄 가변 영역 (V_L)에 연쇄상으로 연결된 중쇄 가변 영역 (V_H)을 함유한다. 동일한 쇄 상에서 상기 두 영역 간 접합을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 결합된 V_H-V_L 영역을 또 다른 쇄의 상보적인 영역과 강제로 접합시켜 2 개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 다이아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]에 보다 충분히 개시되어 있다.

"선형 항체"란 용어는 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 단편 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함하는 항체를 지칭한다. 선형 항체는 예를 들어 문헌 [Zapata 등 1995, Protein Eng. 8 (10):1057-1062]에 개시된 바와 같이 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

인간화 항체 또는 인간화 항체 단편은 면역글로불린 산 서열 변이체, 또는 그의 단편을 포함하며, 이들은 소정의 항원에 결합할 수 있고 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 하나 이상의 FR 및 비 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 상기 비 인간 아미노산 서열을 본 발명에서는 "수입 (import)" 서열이라 지칭하며, 이를 전형적으로는 "수입" 항체 영역, 특히 가변 영역으로부터 취한다. 일반적으로, 인간화 항체는 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 FR 사이에 삽입된, 비 인간 항체의 적어도 CDR 또는 HVL을 포함한다. 몇몇 태양에서, 인간화 항 CD40 항체는 인간 공통 서열 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 FR 사이에 삽입된 쥐 단일클론 항체 S2C6으로부터 유래된 CDR 및/또는 HVL 잔기 또는 서열을 함유한다.

또 다른 태양에서, 인간화 항 CD40 항체는 하나 이상 및 전형적으로는 2 개의 가변 영역 (에를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc 및 Fv 단편 중에 함유된) 거의 전부를 포함하며, 여기에서 상기 CDR의 전부 또는 거의 전부는 비 인간 면역글로불린의 것들에 상응하며, 상기 FR의 전부 도는 거의 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들이다. 또 다른 태양에서, 인간화 항 CD40 항체는 또한 면역글로불린 Fc 부위의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함한다. 통상적으로, 상기 항체는 경쇄뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 영역을 모두 함유할 것이다. 상기 항체는 또한 적합한 대로, 중쇄의 C_H1, 경첩, C_H2, C_H3 및/또는 C_H4 부위 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

인간화 항 CD40 항체는 임의의 부류의 면역글로불린, 예를 들어 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 임의의 아이소타입, 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂ 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 불변 영역은 인간화 항체가 세포독성 활성을 나타내고 아이소타입이 전형적으로는 IgG₁인 것을 목적으로 하는 경우 보체 고정 불변 영역일 수 있다. 상기와 같은 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우, 상기 불변 영역은 또 다른 아이소유형, 예를 들어 IgG₂일 수 있다. 또 다른 인간화 항 CD40 항체는 하나보다 많은 면역글로불린 부류 또는 아이소유형으로부터의 서열들을 포함할 수 있으며, 목적하는 효과기 작용을 최적화하기 위해서 특정한 불변 영역을 선택하는 것은 당해 분야의 통상적인 기술 내에 있다.

인간화 항 CD40 항체의 FR 및 CDR, 또는 HVL은 모 서열에 정확하게 상응할 필요가 없다. 예를 들어, 수입 CDR, 또는 HVL, 또는 공통 FR 서열 중의 하나 이상의 잔기는 생성 아미노산 잔기가 어느 한 모 서열 중의 상응하는 위치에서 원래 잔기에 더 이상 동일하지 않게 치환, 삽입 도는 결실에 의해 변경될 수 있다 (예를 들어 돌연변이될 수 있다). 그러나, 상기와 같은 변경은 전형적으로는 광범위하지 않을 것이다. 대개, 상기 인간화 항체 잔기의 75% 이상, 보다 대개는 90% 이상, 가장 흔히는 95% 초과, 또는 98% 초과, 또는 99% 초과로 모 공통 FR 및 수입 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다.

중쇄 및 경쇄 가변 부위 사이의 계면 ("V_L-V_H 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기는 상기 두 쇄의 근접성 또는 배향에 서로에 대해 영향을 미치는 것이다. 쇄간 상호작용에 관여할 수 있는 몇몇 잔기는 V_L 잔기 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 및 98, 및 V_H 잔기 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 및 103을 포함한다 (문헌 [Kabat 등, 면역학적 관심 단백질의 서열, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1987]에 나열된 넘버링 시스템 사용). 추가의 잔기는 미국 특허 제 6,407,213 호 (본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된다)에 개시된 바와 같이 V_L 잔기 43 및 85, 및 V_H 잔기 43 및 60을 포함한다. 이들 잔기를 단지 인간 IgG에 대해 나타내지만, 이들의 종간 적용도 가능하다. 쇄간 상호작용에 관여하는 것으로 합리적으로 예상되는 수입 항체 잔기들을 상기 공통 서열 내로의 치환을 위해 선택한다.

본 발명에 사용된 "공통 서열" 및 "공통 항체"란 용어는 임의의 특정 부류, 아이소타입, 또는 서브유닛 구조의 모든 면역글로불린 중의 각 위치, 예를 들어 인간 면역글로불린 가변 영역에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 공통 서열은 특정 종 또는 다수의 종들의 면역글로불린을 기본으로 할 수 있다. "공통" 서열, 구조 또는 항체는 몇몇 실시태양에 개시된 바와 같은 공통 인간 서열을 포함하고, 임의의 특정 부류, 아이소타입, 또는 서브유닛 구조의 모든 인간 면역글로불린 중의 각 위치에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 인간 이외에 다른 종들을 고려하는 공통 인간 구조 및 공통 구조를 제공한다. 따라서, 상기 공통 서열은 각 위치에 하나 이상의 공지된 면역글로불린 중에 존재하지만 임의의 단일 면역글로불린의 전체 아미노산 서열과 정확히 중복될 수 없는 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 상기 가변 부위 공통 서열은 임의의 천연 생성 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득되지 않는다. 유용한 공통 서열은 문헌 [Kabat 등, 1991, 면역학적 관심 단백질의 서열, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.]에 제공된 데이터로부터 유래된, 인간 가변 경쇄 카파 I 공통 서열 (서열번호: 13) 및 인간 가변 중쇄 서브그룹 III 공통 서열 (서열번호: 2) 및 그의 변이체를 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 공통 서열 및 그의 변이체의 FR은 인간화 항 CD40 항체의 제조에 유용한 서열을 제공한다. 예를 들어 미국 특허 제 6,037,454 호 및 제 6,054,297 호를 참조하시오. 몇몇 실시태양에서, 상기 인간화 상체의 제조에 사용된 FR은 인간 가변 경쇄 카파 I 공통 서열 및 인간 가변 중쇄 서브그룹 III 공통 서열에 대한 공통 서열로부터 유래하였다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "변이체", "항 CD40 변이체", "인간화 항 CD40 변이체" 또는 "변형 인간화 항 CD40"은 각각 인간 공통 서열로부터 유래한 쥐 단일클론 항체 S2C6 및 FR 서열로부터 유래한 적어도 중쇄 가변 CDR 또는 HVL 서열을 갖는 인간화 항 CD40 항체를 지칭한다. 변이체는 아미노산 변화가 상기 항체의 CD40에의 결합을 실질적으로 손상시키지 않는 한, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 중 하나 또는 2 개 모두 중에 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 것들을 포함한다. 인간화 항 CD40 변이체는 전형적으로는 상기 항체 분자의 개선된 주름을 허용함으로써 항체 성능을 개선시키는 아미노산 치환을 포함한다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및/도는 회수된 것이다. 상기 항체의 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질로, 효소, 호르몬 또는 다른 단백질성 또는 비 단백질성 용질일 수 있다. 하나의 태양에서, 상기 항체를

(a) 로우리 방법에 의해 측정 시 항체 중량의 95% 초과 단리, 및 또 다른 태양에서 99% 초과 단리로, 또는

(b) 회전 컵 서열화기를 사용한 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 수득하기에 충분한 단리 정도로, 또는

(c) 쿠마씨 블루 또는 바람직하게는 은 착색을 사용하여 가시화할 때 환원 또는 비 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질한 정도로

정제할 것이다.

단리된 항체는 재조합 세포 내에서 제자리 항체를 포함하며, 따라서 상기 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분은 존재하지 않을 것이다. 그러나 통상적으로는, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"항체 성능"이란 용어는 항원의 항체 인식 또는 생체 내 항체의 유효성에 기여하는 인자를 지칭한다. 항체의 아미노산 서열의 변화는 항체 성질, 예를 들어 폴딩에 영향을 미칠 수 있으며 물리적 인자, 예를 들어 항원에의 초기 항체 결합률 (υ₀), 항원으로부터 항체의 해리 상수 (Kd), 항원에 대한 항체의 친화성 상수, 항체의 형태, 단백질 안정성, 및 항체의 반감기에 영향을 미칠 수 있다.

본 발명에 사용된 "에피토프 표지된"이란 용어는 "에피토프 표지"에 융합된 항 CD40 항체를 지칭한다. "에피토프 표지"는 항체 생산을 위해 에피토프를 제공하기에 충분한 수의 아미노산을 갖지만, 상기 인간화 항 CD40 항체의 목적하는 활성을 방해하지 않도록 디자인된 폴리펩타이드이다. 상기 에피토프 표지는 대개 상기 에피토프 표지에 대해 발생한 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차 반응하지 않도록 충분히 독특하다. 적합한 표지 폴리펩타이드는 일반적으로는 6 개 이상의 아미노산 잔기를 함유하며 대개는 약 8 내지 50 개, 또는 약 9 내지 30 개의 잔기를 함유한다. 에피토프 표지 및 에피토프와 결합하는 항체의 예는 flu HA 표지 폴리펩타이드 및 그의 항체 12CA5 (Field 등, 1988 Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165); c-myc 표지 및 상기에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan 등, 1985, Mol. Cell. Biol. 5 (12):3610-3616); 및 헤르페스 단순 바이러스 당단백질 D (gD) 표지 및 그의 항체 (Paborsky et al 1990, Protein Engineering 3 (6):547-553). 몇몇 실시태양에서, 상기 에피토프 표지는 "구조 (salvage) 수용체 결합 에피토프"이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "구조 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는데 기여할 수 있는 상기 IgG 분자 (예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 부위의 에피토프를 지칭한다.

"세포독성제"란 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포를 파괴시키는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ 및 Re¹⁸⁶), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 및 그의 단편을 포함하고자 한다. 상기와 같은 세포독성제를 항체, 예를 들어 인간화 항 CD40 항체에, 공지된 표준 과정을 사용하여 커플링시킬 수 있으며 예를 들어 항체에 의한 치료가 지시된 환자를 치료하는데 사용할 수 있다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드 (CYTOXAN^TM); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포아미드, 트라이에틸렌티오포스포아미드, 및 트라이메틸올멜라민; 아세토제닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (예를 들어 합성 동족체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카젤레신, 및 바이젤레신 합성 동족체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴, 아우리스타틴 (동족체 모노메틸-아루리스타틴 E 및 모노메틸-아루리스타틴 F 포함); 듀오카마이신 (합성 동족체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘류쎄로빈; 판크라티스타틴; 사크로딕틴; 스폰지스타틴; 질소 겨자, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메콜레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴; 트로포스파미드, 유라실 겨자; 니트로소유레아, 예를 들어 카뮤스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생물질, 예를 들어 에네딘 항생물질 (예를 들어 칼리케마미신, 특히 칼리케미신 감말I 및 칼리케마미신 필1, 예를 들어 Angew, Chem. Intl. Ed. 뚜히, 33:183-186 참조; 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 바이스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미딘; 뿐만 아니라 네오카지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모단백질 에네딘 항생물질 크로모모포어), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카바비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신^TM) (모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루부신, 에소루비신, 아이다루비신, 마셀로마이신, 마이토마이신, 예를 들어 마이토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘르라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조토신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실 (5-FU); 폴산 동족체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 동족체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 동족체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모퓨어, 시타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록슈리딘; 안드로젠, 예를 들어 칼류스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨라톤; 항-아드라날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트라이로스탄; 폴산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레뷸린산; 에닐유라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데모콜신; 다이아지쿠온; 엘포니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 마탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존, 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK (등록상표); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로제르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 유레탄; 빈데신; 다카바진; 마노뮤스틴; 미타브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 패클리탁셀 (TAXOL (등록상표), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 도세탁셀 (TAXOTERE (등록상표), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (Gemzar^TM); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 동족체, 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 (Navelbin^TM); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈; 및 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 상기 중 임의의 유도체가 있다. 또한 상기 정의 내에 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로젠 및 선택적인 에스트로젠 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (Nolvadex^TM), 랄록시펜, 드로록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케톡시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston^TM); 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 부신에서 에스트로젠 생산을 조절한다, 예를 들어 4 (5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메제스트롤 아세테이트 (Megace^TM), 엑세메스탄, 포메스탄, 파드로졸, 보로졸 (Rivisor^TM), 레트로졸 (Femara^TM), 및 아나스트로졸 (Arimidex^TM); 및 항안드로젠, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 상기 중 임의의 유도체가 포함된다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "전구약물"이란 용어는 모 약물에 비해 종양 세포에 덜 세포독성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 활성인 형태로 전환될 수 있는 전구체 또는 유도체 형태의 약학적으로 활성 물질을 지칭한다. 예를 들어 문헌 [Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella 등, 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt 등, (ed.), pp. 247-267, Humana Press] 참조. 유용한 전구약물로는 비 제한적으로 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물 펩타이드 함유 전구약물, D-아미노산 개질된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물, 및 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로유리딘 전구약물이 있다. 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 비 제한적으로 상술한 화학요법제들이 있다.

"표지"란 용어는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 상기 표지는 그 자체를 검출하거나 (예를 들어 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는 효소 표지의 경우에, 검출할 수 있는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다. 표지된 인간화 항 CD40 항체를 제조하여 생체 외 및 생체 내 진단을 포함한 다양한 용도에 사용할 수 있다.

"리포솜"은 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소낭이다. 리포솜은 임의로 하나 이상의 약학적으로 활성인 작용제에 커플링되거나 상기와 함께, 화합물 또는 제형, 예를 들어 본 발명에 개시된 인간화 항 CD40 항체를 포유동물에게 전달하는데 유용하다. 상기 리포솜의 성분들은 흔히 생물막의 지질 배열과 유사하게, 이층 구조로 배열된다.

"단리되" 핵산 분자는 통상적으로 항체 핵산의 천연 공급원 중에 회합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 천연 세포로 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어 상기 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는 경우 항체를 통상적으로 발현하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.

"조절 서열"이란 용어는 특정한 숙주 유기체 중의 작동가능하게 결합된 암호화 서열의 발현에 필요한 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 원핵 세포에 사용하기에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 오퍼레이터, 및 리보솜 결합 부위 서열을 포함한다. 진핵 조절 서열은 비 제한적으로 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인헨서를 포함한다. 이들 조절 서열을 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 인간화 항 CD40 항체의 발현 및 생산에 사용할 수 있다.

핵산 서열은 또 다른 핵산 서열과 작동적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 결합"된다. 예를 들어, 핵산 전서열 또는 분비 선두는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 결합되거나; 프로모터 또는 인헨서는 상기가 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 서열에 작동가능하게 결합되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 상기가 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로, "작동가능하게 결합된"은 결합되는 DNA 서열이 연속되고 분비 선두의 경우에 연속적이고 판독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인헨서는 임의로 연속적이다. 결합을 편리한 제한 부위에서의 연결에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환적으로 사용되며 모든 상기와 같은 표시는 그의 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 주제 세포 및 상기로부터 전달 수에 관계없이 유래되는 배양물을 포함한다. 모든 자손이 의도적인 또는 천연 돌연변이로 인해, DNA 내용물 중에 정확하게 동일할 수 없음은 또한 물론이다. 통상적으로 형질전환된 세포에서 선별되는 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 분명한 표시를 하고자 하는 경우, 내용으로부터 명백할 것이다.

치료를 위한 "포유동물"이란 용어는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물, 예를 들어 인간, 가축 및 식용 동물, 및 동물원, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 지칭한다. 바람직하게는 상기 포유동물은 인간이다.

본 발명에 사용된 "질환"은 본 발명에 개시된 인간화 항 CD40 항체에 의한 치료로부터 이점을 얻는 임의의 상태이다. 상기는 만성 및 급성 질환 또는 질환, 예를 들어 포유동물이 문제의 질환에 걸릴 소인이 있는 병리학적 상태들을 포함한다. 본 발명에서 치료하려는 비 제한적인 예 또는 질환으로는 암, 혈액암, 양성 및 악성 종양, 백혈병 및 림프종 및 염증, 혈관형성 및 면역학적 질환이 있다.

"암" 및 "암성"이란 용어는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 개시함을 지칭한다. 암의 예로는 비 제한적으로 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 있다.

본 발명에 사용된 "CD40 관련 질환" 또는 "CD40 관련 질환"이란 용어는 CD40을 발현하는 세포의 변경 또는 제거가 지시되는 상태를 지칭한다. 여기에는 이상 증식을 나타내는 CD40 발현 세포 또는 암 또는 악성 성장과 관련되는 CD40 발현 세포가 포함된다. CD40 항원의 이상 발현을 나타내는 암의 보다 특정한 예로는 B 림프모구성 세포, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 카포시 육종, 골육종, 표피 및 내피 종양, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선, 두경부, 피부 (흑색종), 방광 및 신장암이 있다. 상기와 같은 질환은 비 제한적으로 백혈병, 림프종, 예를 들어 B 세포 림프종 및 비 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증; 고형 종양, 예를 들어 육종, 예를 들어 골육종, 유잉 육종, 악성 흑색종, 선암종, 예를 들어 난소 선암종, 카포시 육종/카포시 종양 및 편평 세포 암종을 포함한다.

CD40 관련된 질환은 또한 면역계 질환 및 질환, 예를 들어 자가면역 질환 및 염증질환을 포함한다. 상기와 같은 상태는 비 제한적으로 류마티스성 관절염 (RA), 전신 홍반성 루프스 (SLE), 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 대장염 및 크론병), 폐 염증, 천식 및 특발성 혈소판감소자색반 (ITP)을 포함한다.

"성장 정지" 또는 "성장 억제"란 어구는 본 발명에 사용 시 세포, 특히 CD40 항원을 발현하는 종양 세포유형의 성장 또는 증식을 억제함을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 성장 억제는 S 기의 종양 세포 퍼센트를 현저히 감소시킨다.

"정맥 내 주입"이란 용어는 대략 15 분 초과, 일반적으로는 대략 30 내지 90 분의 기간에 걸쳐 동물 또는 인간 환자의 정맥 내로 작용제를 도입시킴을 지칭한다.

"정맥 내 일시주사" 또는 "정맥 내 찌르기"란 용어는 대략 15 분 이하, 일반적으로는 5 분 이하 동안 신체가 약물을 수용하도록 동물 또는 인간의 정맥 내로 약물을 투여함을 지칭한다.

"피하 투여"란 용어는 약물 용기로부터 비교적 느리고, 지속적인 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에 작용제를 도입시킴을 지칭한다. 피부를 하부 조직으로부터 집어올리거나 잡아당겨 상기 포켓을 생성시킬 수도 있다.

"피하 주입"이란 용어는 비 제한적으로 30 분 이하, 또는 90 분 이하의 기간 동안 약물 용기로부터 비교적 느리고, 지속적인 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에 작용제를 도입시킴을 지칭한다. 임의로, 상기 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 이때 상기 펌프는 소정량의 약물을 소정의 기간 동안, 예를 들어 30 분, 90 분, 또는 치료 섭생의 길이에 걸쳐 있는 기간 동안 전달한다.

"피하 일시주사"란 용어는 동물 또는 인간 환자의 피부 바로 아래에서 약물을 투여함을 지칭하며, 이때 일시주사 약물 전달은 대략 15 분 미만; 또 다른 태양에서, 5 분 미만, 더욱 또 다른 태양에서 60 초 미만이다. 더욱 또 다른 태양에서, 투여를 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에 하며, 이때 상기 포켓은 상기 피부를 하부 조직으로부터 집어올리거나 잡아당겨 생성시킬 수도 있다.

"치료 유효량"이란 용어는 유리한 환자 결과, 예를 들어 성장 정지 효과 또는 세포의 결실을 일으키는 활성제의 양을 지칭한다. 하나의 태양에서, 상기 치료 유효량은 세포자멸사 활성을 갖거나, 또는 세포사를 유도할 수 있다. 또 다른 태양에서, 상기 치료 유효량은 예를 들어 질환 진행을 늦추는데 유효한 것으로 나타난 표적 혈청 농도를 지칭한다. 효능을 치료하려는 상태에 따라, 통상적인 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어, CD40을 발현하는 세포를 특징으로 하는 종양 질환 또는 질환에서, 효능은 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하거나, 또는 반응 속도 (RR)를 측정함으로써 측정할 수 있다.

"치료" 및 "요법" 등의 용어는 본 발명에 사용된 바와 같이, 질환 또는 질환의 치료뿐만 아니라 예방 또는 억제 수단을 포함하여 임의의 임상적으로 바람직하거나 유리한 효과, 예를 들어 비 제한적으로 하나 이상의 증상의 경감 또는 완화, 질환 또는 질환 진행의 퇴행, 저지 또는 정지를 유도함을 의미한다. 따라서, 예를 들어 치료란 용어는 질환 또는 질환의 증상 개시 전 또는 개시에 이어서 작용제를 투여하여 상기 질환 또는 질환의 하나 이상의 징후를 예방 또는 제거함을 포함한다. 또 다른 예로서, 상기 용어는 상기 질환의 임상적 발현 후에 작용제를 투여하여 상기 질환의 증상들에 대항함을 포함한다. 더욱이, 발병 후 및 임상 증상이 나타난 후에 작용제를 투여하는 것은, 투여가 상기 질환 또는 질환의 임상 매개변수, 에를 들어 조직 손상의 정도 또는 전이의 양 또는 정도에 영향을 미치는 경우, 상기 치료가 상기 질환을 개선시키는 것과 관계없이 본 발명에 사용된 "치료" 또는 "요법"을 포함한다.

"패키지 삽입물"이란 용어는 상기와 같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적인 패키지 내에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭한다.

"AFP"란 약어는 다이메틸발린-발린-돌라아이소류신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌다이아민을 지칭한다.

"MMAE"란 약어는 모노메틸 아우리스타틴 E를 지칭한다.

"AEB"란 약어는 파라아세틸 벤조산과 아우리스타틴 E를 반응시켜 생성된 에스터를 지칭한다.

"AEVB"란 약어는 아우리스타틴 E와 벤조일발레르산을 반응시켜 생성된 에스터를 지칭한다.

"MMAF"란 약어는 도발린-발린-돌라아이소류닌-돌라프로인-페닐알라닌을 지칭한다.

항체

인간화 항 CD40 항체, 및 인간화 항 CD40 항체를 포함하는 조성물 및 제품을 본 발명에 개시하고 기술한다. 또한 인간화 항 CD40 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 결합제를 개시한다. 상기 인간화 항 CD40 항체 및 결합제는 세포의 성장을 저지시키거나, CD40을 발현하는 세포의 결실을 유도하거나, 달리 표적 세포에 대한 세포독성 또는 세포정지 효과를 유도 또는 일으킬 수 있다. 상기 인간화 항 CD40 항체 및 결합제를 상기 CD40 표면 항원을 발현하는 세포의 증식을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 질환의 치료에 사용할 수 있다.

인간화 항 CD40 항체 및 CD40 결합제는 각각 CD40 에피토프를 특이적으로 인식하는 적어도 일부 (즉 항원 결합 단편)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 항 CD40 항체 또는 CD40 결합제는 항체 S2C6과 결합 경쟁하는 항원 결합 단편을 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 항원 결합 단편은 예를 들어 CD40 표면 항원의 결합을 통해, 예를 들어 증식을 차단하거나 세포의 성장을 달리 저지하거나 또는 그의 결실, 세포사 또는 달리 그의 결실을 일으킬 수 있다. 예를 들어, T 및 B 세포 암에서, 항종양 효과 (예를 들어 세포결실 또는 세포자멸사가 있거나 없는 성장 정지)는 종종 악성 세포가 정상 림프구의 활성화를 유도하는 자극에 노출될 때 발생한다. 이러한 활성화 유도된 성장 정지는 항원 수용체 또는 공동자극 수용체를 통한 신호에 의해 관찰되었다 (예를 들어 Ashwell 등, 1987, Science 237:61; Bridges 등, 1987, J. Immunol. 139:4242; Page and Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717; 및 Beckwith 등, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501 참조). 항체 또는 용해성 리간드에 의한 특이적인 결합의 결과로서, CD40 자극은 B 세포 림프종 성장을 억제한다 (예를 들어 Funakoshi 등, 1994, Blood 83:2787-2794 참조). 이러한 방식으로 악성 세포 성장을 억제하고 CD40 표면 항원에 대한 작용제는 적합한 작용제의 예이다.

CD40 특이적 작용제는 CD40 (예를 들어 인간 CD40 또는 그의 변이체)에 결합하는 인간화 항 CD40 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 CD40 특이적 작용제 및 항체를 임의로 세포독성 또는 화학요법제와 접합시키거나 융합시킬 수 있다. 상기 인간화 항체가 CD40 표면 항원에 결합하고 상기 CD40 발현 세포 유형의 결실을 일으키는 태양에서, 결합은 일반적으로는 상기 CD40 표면 항원 세포의 생체 내 귀환을 특징으로 한다. 적합한 결합제는 CD40 항원과, 상기 CD40 특이적 작용제가 상기 항원을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화함으로서 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성 및/또는 갈망으로 결합한다.

하나의 태양에서, 상기 작용제는 쥐 단일클론 항체 S2C6의 CDR을 함유하는 인간화 항체이다. (상기 S2C6 항체는 예를 들어 문헌 [Paulie 등, 1984, Cancer Immunol. Immunother. 17:165-179]에 개시되어 있다). 상기 S2C6 항체는 용량 의존적인 방식으로 (예를 들어 Paulie 등, 1989, J, Immunol. 142:590-595 참조)뿐만 아니라 생체 내 항종양 활성 (예를 들어 미국 특허 제 6,838,261 호 참조)으로 1 차 B 세포 증식을 자극하는 항체의 능력에 의해 입증되는 바와 같이 인간 말초 B 세포에 대해 작용물질 활성을 발휘하는 것으로 나타났다.

일부 태양에서, 상기 인간화 항체는 CD40 리간드의 CD40에의 결합을 45% 이상, 50% 이상, 60% 이상 또는 75% 이상까지 증가시킨다. CD40 리간드의 CD40에의 결합 증가를 측정하는 방법은 미국 특허 제 6,838,261 호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.

일부 실시태양에서, 상기 인간화 항 CD40 항체는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하여, S2C6 쥐 항체의 CDR 또는 HVL로부터 유래된 잔기의 아미노산 서열 (예를 들어 미국 특허 제 6,838,261 호), 및 인간 면역글로불린의 틀 부위로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 태양에서, 상기 인간 틀 부위 아미노산은 상기 중쇄 서브그룹 III 가변 영역 및 카파 경쇄 가변 (미국 특허 제 6,037,454 호에 개시된 바와 같다)에 대한 인간 공통 서열로부터 유래한다. 상기 인간화 항 CD40 항체는 공통 틀 부위 중에 특이적인 아미노산 치환을 임의로 포함한다.

상기 틀 위치에서 아미노산 잔기의 특이적인 치환은, 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 인간 공통 틀 부위 내로의 CDR 또는 HVL의 "직접적인 교환"에 의해 형성된 인간화 항체에서 입증된 것에 대해, 다양한 태양의 항체 성능, 예를 들어 결합 친화성 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 인간화 항 CD40 항체는 표 5에 개시된 특이적 치환을 갖는 인간 공통 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 FR 및 쥐 단일클론 항체 S2C6의 CDR 또는 HVL을 포함하는 적어도 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 치환을 갖는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 치환을 갖는 가변 경쇄 아미노산 서열의 정렬을 각각 표 3 및 4에 나타낸다. 상기 서열은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 상기 인간화 항 CD40 항체는 항체 단편이다. 다양한 기법들이 항체 단편의 생산을 위해 개발되었다. 단편들은 완전 항체의 단백질 분해 절단에 의해 유도될 수 있다 (예를 들어 Morimoto 등, 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; 및 Brennan 등, 1985, Science 229:81 참조). 한편으로, 상기 단편들은 재조합 숙주 세포에서 직접 생산될 수 있다. 예를 들어 Fab'-SH 단편은 이 콜라이로부터 직접 회수하여 화학적으로 커플링시켜 F(ab')₂ 단편을 형성시킬 수 있다 (예를 들어 Carter 등, 1992, Bio/Technology 10:163-167 참조). 또 다른 접근법에 의해, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 항체 단편의 제조를 위한 다른 기법들은 숙련가들에게 자명할 것이다.

몇몇 실시태양은 각각 서열번호: 3 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 5 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 15; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 또는 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항 CD40 항체의 F(ab')₂ 단편을 포함한다. 상기와 같은 실시태양은 상기와 같은 F(ab')₂를 포함하는 완전 항체를 포함할 수 있다.

다른 실시태양은 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 및 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항 CD40 항체의 F(ab')₂ 단편을 포함한다.

더욱 다른 실시태양은 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 및 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항 CD40 항체의 F(ab')₂ 단편을 포함한다.

일부 실시태양은 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 함유하는 인간화 항 CD40 항체의 F(ab')₂ 단편을 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 효과기 작용을 매개하는 불변 영역를 포함한다. 상기 불변 영역는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP) 및/또는 CD40 발현 표적 세포에 대한 보체 의존성 세포독성 (CDC) 반응을 제공할 수 있다. 상기 효과기 영역(들)은 예를 들어 Ig 분자의 Fc 부위일 수 있다. 전형적으로는, 상기 CD40 결합제는 세포독성 백혈구 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 식작용 세포 (예를 들어 대식세포) 및/또는 혈청 보완 성분)를 모집하고/하거나 활성화시킨다.

상기 항체의 효과기 영역은 임의의 적합한 척추동물 종 및 아이소타입으로부터일 수 있다. 상이한 동물 종으로부터의 아이소타입들은 효과기 작용을 매개하는 능력이 다르다. 예를 들어 CDC 및 ADCC/ADCP를 매개하는 인간 면역글로불린의 능력은 일반적으로는 각각 IgM∼IgG₁∼IgG₃>IgG₂>IgG₄ 및 IgG₁∼IgG₃>IgG₂/IgM/IgG₄의 순이다. 쥐 면역글로불린은 CDC 및 ADCC/ADCP를 일반적으로는 각각 쥐 IgM∼IgG₃>>IgG_2b>IgG_2a>>IgG₁ 및 IgG_2b>IgG₂a>IgG₁>>IgG₃의 순으로 매개한다. 또 다른 예에서, 쥐 IgG_2a는 ADCC를 매개하는 반면 쥐 IgG_2a와 IgM은 모두 CDC를 매개한다.

항체 개질

인간화 항 CD40 항체 및 작용제는 인간화 항 CD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 개질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 암 치료에서 항체의 유효성을 향상시키기 위해서 상기 항체를 효과기 작용에 대해 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 상기와 같은 개질은 시스테인 잔기(들)의 Fc 부위 내로의 도입, 이에 의한 상기 부위 중의 쇄간 다이설파이드 결합 형성이다. 상기와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내면화 능력 및/또는 증가된 보체 매개된 세포 사멸 및/또는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 예를 들어 문헌 [Caron 등, 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; 및 Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922]을 참조하시오. 향상된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체를 또한 문헌 [Wolff 등, 1993, Cancer Research 53:2560-2565]에 개시된 바와 같은 이종이작용성 교차 링커를 사용하여 제조할 수 있다. 한편으로, 항체를 이중 Fc 부위를 갖도록 공학 처리하여 보체 분해를 향상시키고 상기 항체의 ADCC 능력을 향상시킨다. 예를 들어 문헌 [Stevenson 등, 1989, 항-Cancer Drug Design 3:219-230]을 참조하시오.

ADCC를 지지하는 개선된 능력을 갖는 항체를 그의 Fc 부위의 글리코실화 패턴을 개질시킴으로써 생성시켰다. 이는 C_H2 영역 중의 아스파라진 잔기, N297에서 항체 글리코실화가 ADCC에 필수적인 IgG와 Fcγ 수용체 간의 상호작용에 관여하므로 가능하다. 숙주 세포주는 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 발현하도록, 예를 들어 N-아세틸글루코스아민 또는 환원된 퓨코오스의 증가된 양분을 발현하도록 공학 처리하였다. 퓨코오스 환원은 양분된 N-아세틸글루코스아민의 존재를 증가시키는 것보다 ADCC 활성에 대한 더 큰 향상을 제공한다. 더욱이, 저 퓨코오스 항체에 의한 ADCC의 향상은 FcγRIIIa V/F 다형체와 무관하다.

항체의 Fc 부위의 아미노산 서열을 개질시키는 것은 ADCC를 향상시키기 위해 공학 처리하는 글리코실화의 대안이다. Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG₁ 상의 상기 결합 부위는 광범위한 돌연변이 분석에 의해 결정되었다. 이는 생체 외에서 FcγRIIIa에 대한 결합 친화성을 증가시키고 ADCC를 향상시키는 Fc 돌연변이를 갖는 인간화 IgG₁ 항체의 생성을 유도한다. 또한, 결합 성질의 다수의 상이한 치환들, 예를 들어 다른 FcγR 수용체에의 불변 결합 또는 감소된 결합으로 특이적인 FcγR 수용체에 대한 개선된 결합을 갖는 Fc 변이체들이 수득되었다.

일부 실시태양에서, 상기 Fc 부위를 미국 특허 출원 공보 제 2006-0003412 호 및 2006-0008883 호 (이들의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 바와 같이 개질시킬 수 있다.

또 다른 태양은 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 긴원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉 방사능접합체)에 접합된 인간화 항체 또는 그의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함한다.

상기와 같은 면역접합체의 발생에 유용한 화학요법제를 상술하였다. 유용한 면역접합체의 제조에 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사신, 알레유라이트 포르디 단백질, 다이안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 카란티아 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트라이코테센 등을 포함한다. 다양한 방사성핵종들을 방사성접합된 인간화 항 CD40 항체의 생산을 위해 입수할 수 있다. 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re가 있다.

인간화 항 CD40 항체 및 세포독성 또는 화학요법제의 접합체를 공지된 방법에 의해, 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체 (예를 들어 다이메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스터 (예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스- (p-디아아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스 활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta 등, 1987, Science 238:1098]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 상기 항체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 킬레이트제이다. 예를 들어 국제 공보 WO 94/11026 참조. 접합물을 또한 절단 가능한 링커, 예를 들어 공개된 EP 특허 출원 제 0 624 377 호에 개시된 것을 사용하여 형성시킬 수 있으며; 상기의 내용은 본 발명에 참고로 인용되어 있다.

또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 종양 예비표적화에 사용하기 위해서 "수용체" (예를 들어 스트렙트아비딘)에 접합시킬 수 있다. 상기 과정에서, 상기 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 제거제를 사용하여 상기 순환으로부터 결합되지 않은 접합체를 제거하고 이어서 상기 수용체 (예를 들어 아비딘) (세포독성제 (예를 들어 방사성핵종)에 접합되는 리간드)에 선택적으로 결합하는 "리간드"를 투여한다.

본 발명에 개시된 인간화 항 CD40 항체를 또한 면역리포솜으로서 제형화할 수 있다. 상기 항체를 함유하는 리포솜을 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein 등, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang 등, 1980, Proc. Natl. Sci. USA 77:4030; 및 미국 특허 제 4,485,045 및 4,544,545 호에 개시된 바와 같은 방법에 의해 제조한다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜이 예를 들어 미국 특허 제 5,013,556 호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포솜을 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜을 한정된 기공 크기의 펄터를 통해 압출시켜 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 수득한다. 본 발명에 개시된 항체의 Fab' 단편을 문헌 [Martin 등, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288]에 개시된 바와 같은 리포솜에 다이설파이드 교환 반응을 통해 접합시킬 수 있다. 화학요법제 (예를 들어 독소루비신)를 임의로 상기 리포솜 내에 함유시킨다. 예를 들어 문헌 [Gabizon 등, 1989, J. National Cancer Inst. 81 (19):1484]을 참조하시오.

본 발명에 개시되고 기술된 항체는 또한 전구 약물 (예를 들어 펩티딜 화학요법제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 상기 항체를 접합시킴으로써 ADEPT (항체-지향된 효소 전구약물 요법) 과정에 사용될 수 있다. 예를 들어 WO 81/01145, WO 88/07378, 및 미국 특허 제4,975,278 호를 참조하시오. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 이를 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키기 위한 그러한 방식으로 전구약물 상에서 작용할 수 있는 효소이다. ADEPT에 유용한 특이적 효소는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 인산염-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 알칼라인 포스파타제; 황산염-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 아릴설파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는 시토신 디아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 세라티아 프로타제 (serratia protease)와 같은 프로타제, 써모라이신 (thermolysin), 서브틸리신 (subtilisin), 카복시펩티다제 (carboxypeptidases), 및 카텝신 (cathepsins) (예컨대 카텝신 B 및 L)과 같은 펩타다제; D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는 D-알라닌카복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 β-락타메이즈; 및 그의 아민 질소가 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은, 페니실린 아미다제를 포함한다. 별볍으로, 효소 활성을 갖는 항체 ("아브자임 [abzyme]")가 상기 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Massey, 1987, Nature 328: 457-458]을 참조하시오). 항체-아브자임 접합체는 종양 세포 모집단에 아브자임의 전달을 위해 공지된 방법, 예를 들면, 상기 효소와 상기에 언급된 인간화 항-CD40 항체/이형이관능성 가교제의 공유 결합에 의해 제조될 수 있다. 별볍으로, 상기에 기술된 바와 같은 효소의 적어도 기능적으로 활성 부위에 연결된 본원에 기술된 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질이 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Neuberger 등, 1984, Nature 312:604-608]을 참조하시오).

특정 실시태양에서, 예를 들어, 종양 침투를 증가시키기 위하여, 온전한 항체보다는 인간화 항-CD40 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 상기 항체 단편을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 이는 구조 (salvage) 수용체 결합 에프토프의 상기 항체 단편 내로의 도입에 의해 달성될 수 있다. 일 방법에서, 항체 단편의 적절한 영역은 변경 (예컨대, 돌연변이)될 수 있거나, 에피토프는, 예를 들면, DNA 또는 펩티드 합성에 의해, 그의 말단 또는 중간에 항체 단편에 융합되는 펩티드 표지 내로 도입될 수 있다. 예컨대, 국제 특허 WO 96/32478호를 참조하시오.

다른 실시태양에서, 인간화 항-CD40 항체의 공유 변형이 또한 포함된다. 이들은, 만약 적용가능하다면, 화학적 합성에 의해 또는 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 다른 유형의 항체 공유 변형이 항체의 표적된 아미노산 잔기와 선택된 곁사슬 또는 상기 아미노- 또는 -카복시-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와의 반응에 의해 상기 분자 내로 도입될 수 있다.

공유 변형은 시스테닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 티로실 잔기, 카복시 곁 기 (아스파르틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴, 또는 트레오닐 잔기의 변형을 포함한다. 공유 변형의 또 다른 유형은 상기 항체에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소학적으로 결합시키는 것을 포함한다.

상기 항체에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소학적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin 등, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge 등, 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 의해 기술된다. 항체 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura 등, 1987, Meth. Enzymol. 138:350]에 기술된 바와 같이 다양한 엔도 (endo)- 및 엑소 (exo)-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.

미국 특허 제4,640,835호, 미국 특허 제4,496,689호, 미국 특허 제4,301,144호, 미국 특허 제4,670,417호, 미국 특허 제4,791,192호 및 미국 특허 제4,179,337호의 하나 이상에 개시된 방법으로, 유용한 공유 변형의 또 다른 유형은 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 연결하는 것을 포함한다.

인간화 및 아미노산 서열 변이체

하기 실시예 1은 항-CD40 항체의 인간화를 위한 과정을 기술한 반면 실시예 2는 변이체를 기술한다. 특정 실시태양에서, 특히 이들이 인간화 항체의 결합 친화도 또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는, 이들 인간화 항체의 아미노산 서열 변이체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다.

항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-CD40 항체 DNA 내로 적절한 뉴클레오티드 변형을 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들면, 본원 실시예의 항-CD40 항체의 아미노산 서열 내로 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 만약 최종 컨스트럭트가 목적하는 특성을 갖는다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 컨스트럭트를 달성하기 위해 이루어진다. 상기 아미노산 변형은 또한 글리코실화 부위의 갯수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은, 인간화 또는 변이체 항-CD40 항체의 후-번역 과정을 변경시킬 수 있다.

돌연변이에 바람직한 위치인 항-CD40 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이, "알라닌 주사 돌연변이 (alanine scanning mutagenesis)"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 일 군이 동정되고 (예컨대, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기) CD40 항원과 상기 아미노산의 상호작용에 영향을 미치기 위하여 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (전형적으로 알라닌)으로 치환된다. 그 후에 상기 치환에 대한 기능성 민감성을 입증하는 이들 아미노산 부위가 치환 부위에, 또는 부위를 위해 추가로 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이의 특성은 본질적으로 미리 결정될 필요는 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 성과를 분석하기 위하여, 알라닌 주사 또는 무작위 돌연변이가 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 항-CD40 항체 변이체가 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입 뿐만 아니라, 하나의 잔기로부터 백개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지의 길이로 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 에피토프 표지에 융합된 항-CD40 항체를 포함한다. 항-CD40 항체 분자의 다른 삽입성 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항-CD40 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.

변이체의 다른 유형은 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항-CD40 항체 분자 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 다른 잔기가 삽입된다. 치환성 돌연변이의 가장 관심있는 부위는 초가변성 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 심사숙고된다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 1에 나타내었다. 만약 이러한 치환이 생물학적 활성에 있어서 변화를 가져온다면, "예시적 치환"으로 명명되거나, 아미노산 종류와 관련하여 하기에 추가로 기술된 바와 같이, 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝된다.

표 1

항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들면 쉬트 또는 헬릭스 형태와 같은 치환 영역 내 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 곁 사슬을 유지하는데 대한 이들의 효과를 상당히 변화시키는 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연적으로 발생한 잔기는 보통 곁-사슬 특성에 따라 하기 그룹으로 구분된다:

· (1) 소수성: 노르류신 (norleucine), met, ala, val, leu, ile;

· (2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

· (3) 산성: asp, glu;

· (4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;

· (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

· (6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 종류들 중의 하나의 요소를 다른 종류로 교환하는 것을 수반할 것이다.

인간화 항-CD40 항체 또는 변이체의 적절한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한, 상기 분자의 산화 안정성을 향상시키고, 비정상적 가교를 방지하고, 또는 세포독성 또는 세포증식억제 화합물에 대한 접합의 확립된 지점을 제공하기 위하여, 일반적으로 세린으로, 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 그의 안정성을 향상시키기 위하여 항체에 추가될 수 있다 (항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에 특히 그러하다).

치환성 변이체의 유형은 모 항체 (예컨대, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변성 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이후의 개발을 위해 선택된 결과 변이체(들)는 이들이 그로부터 형성되는 모 항체에 비하여 향상된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환성 변이체를 제조하는데 편리한 방법이 파아지 디스플레이 (phage display)를 이용한 친화력 성숙 (affinity maturation)이다. 간략히 설명하면, 몇몇 초가변성 영역 부위들 (예컨대, 6-7 부위들)이 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 형성하기 위하여 돌연변이된다. 이렇게 형성된 항체 변이체는 각각의 입자 내로 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에의 융합체로서 필라멘트성 파아지 입자들로부터 일가 (monovalent) 형식으로 디스플레이된다. 파아지-디스플레이된 변이체는 그 후에 그들의 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변성 영역 부위를 동정하기 위하여, 알라닌 주사 돌연변이가 항원 결합에 크게 관여하는 초가변성 영역 잔기를 동정하기 위하여 수행될 수 있다. 별볍으로, 또는 추가로, 항체와 인간 CD40 사이의 접촉 지점을 동정하기 위하여 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 접족 잔기 및 이웃하는 잔기는 본원에 상세히 설명된 기술에 따른 치환의 후보자이다. 일단 이러한 변이체가 형성되면, 한 패널의 변이체들이 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝되고 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체들이 이후의 개발을 위해 선발될 수 있다.

항체의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 상기 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. "변경시키는" 것은 상기 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다.

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 곁 사슬에 탄수화물 모이어티의 부착을 말한다. 삼중펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 곁 사슬의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이들 삼중펩티드 서열들 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다. O-연결 글리코실화는, 하이드록시아미노산, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다고 하더라도, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중의 하나의 부착을 말한다.

항체에 글리코실화 부위의 부가는 상기에 기술된 (N-연결 글리코실화 부위에 대한) 삼중펩티드 서열들 중의 하나 이상을 포함하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 용이하게 달성된다. 상기 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대한) 원래 항체의 아미노산 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가에 의해, 또는 이들 잔기로의 치환에 의해 이루어질 수 있다.

항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 제조된다. 이들 방법들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 천연 자원으로부터의 분리 (자연적으로 발생하는 아미노산 서열 변이체인 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이, PCR 돌연변이, 및 앞서 제조된 항-CD40 항체의 변이체 또는 비-변이체 변형물의 카세트 돌연변이에 의한 제조를 포함한다.

인간 항체

인간화의 대안으로서, 인간 항체가 형성될 수 있다. 예를 들면, 면역접종 시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자 도입 동물 (예컨대, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식-계열 (germ-line) 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 아이소타입접합 결실은 내인성 항체 생산의 완벽한 억제를 가져온다는 것이 기술되었다. 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 접종 시 인간 항체의 생산을 유도할 것이다. 인간화의 대안으로서, 인간 항체가 형성될 수 있다. 예를 들면, 면역접종 시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자 도입 동물 (예컨대, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식-계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 아이소타입접합 결실은 내인성 항체 생산의 완벽한 억제를 가져온다는 것이 기술되었다. 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 접종 시 인간 항체의 생산을 유도할 것이다. 문헌 [Jakobovits 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551; Jakobovits 등, 1993, Nature 362:255-258; Bruggermann 등, 1993, Year in Immuno. 7:33]; 및 미국 특허 제5,591,669호; 제5,589,369호; 제5,545,807호; 제6,075,181호; 제6,150,584호; 제6,657,103호; 및 제6,713,610호를 참조하시오.

별볍으로, 파아지 디스플레이 기술 (예컨대, 문헌 [McCafferty 등, 1990, Nature 348:552-553] 참조)이 비면역 공여자 유래 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터, in vitro로 인간 항체 및 항체 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은, 필라멘트성 박테리오파아지의 대 (major) 또는 소 (minor) 외피 단백질 유전자 중의 하나에 틀-내 클로닝되고, 파아지 입자의 표면에 기능성 항체 단편으로서 발현된다. 상기 필라멘트성 입자는 파아지 게놈의 단일-가닥 DNA 복제수를 포함하고 있기 때문에, 항체의 기능적 특성에 근거한 선택은 또한 그러한 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 가져온다. 따라서, 상기 파아지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파아지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있다; 이의 검토를 위하여, 예컨대 문헌 [Johnson and Chiswell, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571]을 참조하시오. V-유전자 분절의 몇몇 공급원이 파아지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson 등, 1991, Nature 352:624-628]에서는 면역화시킨 마우스의 비장으로부터 유래한 V 유전자의 소규모 무작의 복합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 (anti-oxazolone) 항체의 다양한 배열이 분리된다. 비면역화시킨 인간 공여자 유래 V 유전자의 레퍼토리가 제작될 수 있고 다양한 배열의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체가 문헌 [Marks 등, 1991, J. MoI. Biol. 222:581-597, 또는 Griffith 등,1993, EMBO J. 12:725-734]에 기재된 기술에 따라 본질적으로 분리될 수 있다. 또한 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호를 참조하시오. 상기에 기술된 바와 같이, 인간 항체는 또한 활성화된 B 세포에 의해 in vitro에서 형성될 수 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조하시오).

폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법

다른 실시형태는 인간화 항-CD40 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 상기 폴레뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 및 상기 인간화 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 완전한 길이의 단일클론 항체, Fab, Fab1, F(ab')₂, 및 Fv 단편, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하는, 임의의 목적하는 형태의 항-CD40 항체를 암호화할 수 있다.

일부 실시형태는 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 11의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태는 서열번호: 14, 서열번호: 15, 또는 서열번호: 16의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일 측면에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 각각 서열번호: 3 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 5 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 8 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 9 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 15; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 또는 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

다른 측면에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오디트 서열(들)은 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 및 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

또 다른 측면에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 및 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

또 다른 측면에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

인간화 항-CD40 항체 또는 그의 단편 또는 사슬을 암호화하는 서열을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드(들)는, 당분야에 공지된 바와 같은, 하나 이상의 조절 또는 제어 서열에 융합될 수 있고, 당분야에 공지된 바와 같은 적당한 발현 벡터 또는 숙주 세포 내로 포함될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자들 각각은 온전한 항체의 생산을 가능케 하는, 인간 불변 도메인과 같은, 불변 도메인을 암호하하는 폴리뉴클레오티드 서열에 개별적으로 융합될 수 있다. 별볍으로, 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부분은 함께 융합되어 단쇄 항체의 생산을 위한 주형을 제공할 수 있다.

재조합 생산을 위하여, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝 (DNA의 증폭)을 위해 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입된다. 재조합 항체의 발현을 위해 많은 적당한 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 하기 성분을 포함한다: 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

인간화 항-CD40 항체는 또한 상기 항체가 시그날 서열과 같은 이종 폴리펩티드 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드에 융합되는 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 선택되는 이종 시그날 서열은 일반적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨) 것들이다. 인간화 항-CD40 항체 시그날 서열을 인식하여 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 시그날 서열은 원핵 시그날 서열로 치환될 수 있다. 시그날 서열은, 예를 들면, 알칼라인 포스파타제, 페니실리나제, 지질단백, 열-안정성 엔테로톡신 II 리더 (leader) 등일 수 있다. 효모 분비를 위해, 천연 시그날 서열은, 예를 들면, 효모 역전효소 (ivertase) 알파-인자 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 산성 포스파타제, C. 알비칸스 글루코아밀라제로부터 수득된 리더 서열, 또는 WO90/13646에 개시된 시그날로 치환될 수 있다. 포유동물 세포에서, 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 허피스 심플렉스 gD 시그날 뿐만 아니라 포유동물 시그날 서열이 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역의 DNA는 인간화 항-CD40 항체를 암호화하는 DNA에 해독틀 (reading frame)로 라이게이션된다.

발현 및 클로닝 벡터는 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 벡터가 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이 서열은 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제를 하도록 하고 복제 기원 또는 자동 복제 서열을 포함하는 서열이다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모, 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322 유래 복제 기원은 대부분의 그람-음성 세균에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기원은 효모에 대해 적합하며, 다양한 바이러스 기원들 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터들에 대해서는 요구되지 않는다 (SV40 기원은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커라고도 불리는, 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않는 중요한 영양분, 예컨대 간균의 D-알라닌 라세마제 (racemase)를 암호화하는 유전자를 공급하는 단백질을 암호화한다.

선택 방식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자가 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 그로 인해 선택 요법에서 생존할 수 있다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산, 및 하이그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 인간화 항-CD40 항체를 암호화하는 핵산을 취하는데 유용한 세포의 확인을 가능케 하는 것들, 예를 들면 DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타제), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예컨대, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 디아미나제, 오르니틴 디카복실라제 등이다.

예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 우선 DHFR의 경쟁적 길항제인, 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예컨대, DG44)이다.

별볍으로, 항-CD40 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선택 마커, 예를 들어, 아미노글라이코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 암호화하는 DNA 서열들로 형질전환 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 아미노글라이코시드 항생제를 포함하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조하시오.

효모에서의 사용을 위해 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자이다 (Stinchcomb 등, 1979, Nature 282: 39). 이 TRP1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12)에 대핸 선택 마커를 제공한다. 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 병소의 존재는 그 후에 트립토판의 존재 하에 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, ATCC 20,622 및 38,626과 같은 Leu2p-결핍 효모 균주가 LEU2 유전자를 함유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1 유래 벡터가 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별볍으로, 재조합 소 카이모신의 대량 생산ㅇㄹ 위한 발현 시스템이 K. lactis에 대해 보고되었다 (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 클루이베로마이세스의 상업적인 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-복제수 발현 벡터가 또한 기술되었다 (Fleer 등, 1991, Bio/Technology 9:968-975).

발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-CD40 항체 또는 그의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼라인 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 세균 프로모터들이 또한 적합하다. 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 상기 인간화 항-CD40 항체를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 포함할 것이다.

많은 진핵세포 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위의 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 포함한다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80 염기 상류에 존재하는 다른 서열은 CNCAAT 영역으로, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리 (tail)의 부가를 위한 시그날이 될 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 존재한다. 이러한 모든 서열은 진핵세포 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코스 아이소머라제, 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.

유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가 잇점을 갖는다. 이들은 알코올 디하이드로게나제 2, 아이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 유도 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소용 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 포로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 인간화 항-CD40 항체 전사는, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우, 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육아종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40) 유래 프로모터에 의해, 이종 포유동물 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터에 의해, 또는 열-충격 프로모터에 의해 조절된다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기원을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 용이하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 용이하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하는 포유동물 숙주 내에서 DNA를 발현하는 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 개시되어 있다. 또한 허피스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes 등, 1982, Nature 297:598-601]을 참조한다. 별볍으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스 장 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 보다 고등한 진핵세포에 의한 인간화 항-CD40 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 벡터 내로 인핸서 서열의 삽입에 의해 종종 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자들 (예컨대, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백, 및 인슐린)로부터 현재 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스 유래 인핸서가 사용된다. 그 예는 복제 기원의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 하류 쪽의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소는 문헌 [Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]을 참조한다. 인핸서는 5' 또는 3' 말단 위치에서 인간화 항-CD40 항체-암호화 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 말단에 위치한다.

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체 유래 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 대체로 진핵 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 5' 및, 때로는 3', 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항-CD40 항체를 암호화하는 mRNA의 비번역 부분 내 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 분절을 포함한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그 안에 기술된 발현 벡터를 참조하시오. 일부 실시형태에서, 인간화 항-CD40 항체는 CHEF 시스템을 이용하여 발현될 수 있다. (예컨대, 미국 특허 제5,888,809호를 참조하시오; 이의 내용은 본원에 참고로 도입된다)

본원에서 벡터 내에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)과 같은 다른 균주들이 적합하다고 하더라도, 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.

원핵생물 외에, 필라멘트성 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 인간화 항-CD40 항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 제빵용 효모가 저등 진핵 숙주 미생물 사이에 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 일반적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.

글리코실화 인간화 항-CD40 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포성 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포, 예컨대, 많은 베큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda, 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus, 모기), 드로조필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori, 누에)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포를 포함한다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주는 예컨대 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa califomica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공공연하게 이용가능하고, 이러한 바이러스가 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.

면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.

다른 측면에서, 인간화 항-CD40의 발현은 척추동물 세포에서 수행된다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었고 기술들이 폭넓게 이용가능하다. 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라이 (현탁 배양으로부터 서브클로닝된 293 또는 293 세포[Graham 등, 1977, J Gen Virol. 36: 59]), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR" (CHO, Urlaub 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; 예컨대, DG44), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포 (CVl ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포 (Mather 등, 1982, Annals NY. Acad. Sci. 383: 44-68 ), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포는 인간화 항-CD40 항체 생산을 위한 상기에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.

본원에 기술된 인간화 항-CD40 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄 (Ham's) F1O (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 하나 이상의 문헌 [Ham 등, 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes 등, 1980, Anal Biochem. 102: 255], 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호, 미국 특허 제5,122,469호, WO 90/103430, 및 WO 87/00195에 기술된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 젠타마이신), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 보충물들이 또한 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 숙련자에게 명백할 것이다.

재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 항체가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1 단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter 등, 1992, Bio/Technology 10:163-167]에는 E. coli의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차가 설명되어 있다. 간략히 설명하면, 세포 페이스트는 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에서 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 다양한 방법들이 숙주 세포로부터 항체를 분리하기 위해 사용될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 통상적인 정제 기술이다. 친화도 리간도로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Lindmark 등, 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13] 참조). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입 및 인간 감마3에 대해 추천된다 (예컨대, 문헌 [Guss 등, 1986 EMBO J. 5:1567-1575] 참조). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 빈번하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX (등록상표) 수지 (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (등록상표) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.

임의의 예비 정제 단계(들)에 이어서, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5 사이의 pH에서, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예컨대, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

혼성화 조건

본원에 정의된 바와 같은, 낮은, 온화한, 그리고 높은 수준의 엄격한 조건 하에서 서열번호: 17 또는 그의 보체, 또는 서열번호: 20 또는 그의 보체로 표시되는 염기 서열의 전체 또는 일부분 (예컨대, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 혼성화되는 핵산이 또한 포함된다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 전형적으로 15개 이상 (예컨대, 20, 25, 30 또는 50개) 뉴클레오티드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 항-CD40 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역), 또는 그의 보체를 암호화하는 핵산의 일부분 또는 전체의 서열과 80% 이상, 예컨대, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일하다. 본원에 기술된 유형의 혼성화 핵산은, 에를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머, 예컨대, PCR 프라이머, 또는 진단 프로브로 사용될 수 있다.

제한이 아닌 예시로서, 낮은 수준의 엄격성 조건을 이용한 과정은 다음과 같다 (또한 문헌 [Shilo 및 Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792]음 참조하시오). 일 실시형태에서, DNA를 포함하는 필터를 35% 폼아마이드, 5× SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA5 0.1% PVP, 0.1% 피콜, 1% BSA, 및 500 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 내에서 40℃에서 6시간 동안 전처리한다. 혼성화는 하기 변형을 이용하여 동일한 용액 내에서 수행된다: 0.02% PVP, 0.02% 피콜 (Ficoll), 0.2% BSA, 100 μg/ml 연어 정자 DNA, 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트, 및 5-20×lO⁶ cpm ³²P-표지 프로브가 사용된다. 필터를 40℃에서 18-20시간 동안 혼성화 혼합물 내에서 배양한 후, 2× SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 함유하는 용액 내 55℃에서 1.5시간 동안 세척한다. 세척 용액을 새 용액으로 교체하고, 60℃에서 1.5시간 동안 추가로 배양한다. 필터를 건조 블롯팅시키고 자가방사선술 (autoradiography)에 노출시킨다. 필요하다면, 필터를 65-68℃에서 3회 세척하고 필름에 재-노출시킨다. 다른 실시형태에서, 낮은 엄격성 조건의 예는 35% 폼아마이드, 5× SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.2% BSA, 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA, 및 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트를 함유하는 완충액 내 40℃에서 18-20시간 동안의 혼성화, 2× SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 함유하는 완충액 내 55℃에서 1.5시간 동안의 세척, 및 2× SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS을 함유하는 완충액 내 60℃에서 1.5시간 동안의 세척을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 낮은 수준의 엄격성 조건이 당분야에 공지되어 있다 (예컨대, 교잡-종 혼성화에 사용된 바와 같음).

제한이 아닌 예시로서, 높은 수준의 엄격성 조건을 이용한 과정은 다음과 같다. DNA를 포함하는 필터의 예비혼성화는 6× SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.02% BSA, 및 500 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 완충액 내 65℃에서 8시간 내지 밤새 수행된다. 필터를 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 5-20×lO⁶ cpm ³²P-표지 프로브를 함유하는 예비혼성화 혼합물 내 65℃에서 48시간 동안 혼성화시킨다. 필터의 세척은 2× SSC, 0.01% PVP, 0.01% 피콜, 및 0.01% BSA를 함유하는 용액 내 37℃에서 1시간 동안 수행된다. 자가방사선술 전에 50℃에서 45분간 0.1× SSC로의 세척이 수반된다. 다른 높은 수준의 엄격성 조건이 당분야에 공지되어 있다.

제한이 아닌 예시로서, 온화한 수준의 엄격성 조건을 이용한 과정은 다음과 같다: DNA를 포함하는 필터를 6× SSC, 5× 덴하츠 용액 (Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 내 55℃에서 6시간 동안 전처리한다. 혼성화는 5-20×lO⁶ cpm ³²P-표지 프로브를 이용하여 동일한 용액 내에서 수행된다. 필터를 55℃에서 18-20시간 동안 혼성화 혼합물 내에 배양한 후, 1× SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 용액 내 60℃에서 30분간 2회 세척한다. 필터를 건조 블롯팅시키고 자가방사선술에 노출시킨다. 필터의 세척은 2× SSC, 0.1% SDS를 함유하는 용액 내 37℃에서 1시간 동안 수행된다. 다른 온화한 수준의 엄격성 조건은 당분야에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook 등, 2001; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N. Y.]을 참조하시오; 또한 문헌 [Ausubel 등, eds., in Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1999, Current Protocols,ⓒ 1994-199 John Wiley and Sons, Inc.]을 참조하시오).

일부 실시형태는 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 11의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태는 서열번호: 14, 서열번호: 15, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 각각 서열번호: 3 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 5 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 8 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 9 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 15; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 또는 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

다른 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 및 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

또 다른 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 각각 서열번호: 7 및 서열번호: 14; 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 16; 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16; 및 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 16의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

또 다른 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.

본원에 사용된 바와 같이, 두 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 구조 내에서, 용어 "동일한" 또는 "백분율 동일성 (percentage identity)"은 최대 대응을 위해 비교하고 정렬될 때, 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정된 비율을 갖는 두 개 이상의 서열 또는 부분서열을 말한다. 백분율 동일성을 결정하기 위하여, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열 내에 갭이 도입될 수 있음). 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 대한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 그 후에 비교된다. 제1 서열 내 한 위치가 제2 서열 내 동일한 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 점유되어 있으면, 이 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 백분율 동일성은 이 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 숫자의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/총 위치의 # (예컨대, 중첩 위치) × 100). 일부 실시형태에서, 비교되는 두 서열은 갭이 서열들 내로 적절하게 도입된 후에 동일한 길이를 갖는다 (예컨대, 비교되는 서열을 벗어나 연장된 부가적인 서열을 배제함). 예를 들면, 가변 영역 서열을 비교할 때, 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 두 서열간의 서열 비교를 위하여, "대응 (corresponding)" CDR은 두 서열 모두에 동일한 위치에 있는 CDR (예컨대, 각 서열의 CDR-H1)을 말한다.

두 서열간의 백분율 동일성 또는 백분율 유사성 (percent similarity)의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한적 예는 Karlin 및 Altschul의 알고리즘 (Karlin 및 Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268), 이의 변형 알고리즘 (Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)이다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul 등, 1990, J. MoI. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 도입된다. BLAST 뉴클레오티드 조사는 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산에 대해 동종인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위하여, NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12를 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 조사는 목적하는 단백질에 동종인 아미노산 서열을 수득하기 위하여, XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬 (gapped alignments)을 얻기 위하여, 문헌 [Altschul 등, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 개시된 바와 같이 갭 BLAST가 이용될 수 있다. 별볍으로, PSI-Blast가 분자간 거리 상호관계 (Id.)를 검출하는 반복 조사를 수행하기 위해 사용될 수 있다. BLAST, 갭 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램들 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 (default) 매개변수가 사용될 수 있다. 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한, 비-제한적인 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘이다[Myers 및 Miller, CABIOS (1989)]. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부분인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점, 및 4의 갭 벌점이 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 부가적인 알고리즘이 당분야에 공지되어 있고 문헌 [Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]에 기술된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기술된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup는 조사의 민감도 및 속도를 설정하는 대조군 옵션이다. 만약 ktup = 2라면, 비교되는 두 서열 내 유사 영역이 정렬된 잔기의 쌍들을 조사함으로써 발견된다; 만약 ktup = l이라면, 단일 정렬 아미노산이 조사되고, ktup는 단백질 서열에 대해서는 2 또는 1로, DNA 서열에 대해서는 1 내지 6으로 설정될 수 있다. 만약 ktup이 특정되지 않는다면, 디폴트는 단백질에 대해서는 2이고 DNA에 대해서는 2이다. 별볍으로, 단백질 서열 정렬은 문헌 [Higgins 등, 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에 기술된 바와 같은, CLUSTAL W 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.

비-치료 용도

본원에 기재된 항체는 친화도 정제 제제로서 유용하다. 이 방법에서, 항체는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 세파덱스 수지 또는 필터 페이퍼에 고정된다. 고정된 항체는 정제되는 CD40 단백질 (또는 그의 단편)을 포함하는 시료와 접촉하고, 그 후에 고정된 항체에 결합된 CD40 단백질을 제외한 시료 내 모든 물질들을 충분히 제거하게 될 적절한 용매로 세척한다. 마지막으로, 지지체를 항체로부터 CD40 단백질을 분비하게 될, 글리신 완충액 (pH 5.0)과 같은 적절한 용매로 지지체를 세척한다.

인간화 항-CD40 항체는 또한, 예를 들면, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 CD40 발현을 검출하는, CD40 단백질을 검출하고/하거나 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.

진단 적용을 위하여, 항체는 일반적으로 검출가능 모이어티로 표지될 것이다. 일반적으로 하기 카테고리로 나뉘어지는 많은 표지들이 이용가능하다:

(a) 방사성 동위원소, 예를 들면, 예컨대 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I. 항체는, 예를 들면, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들면, 신틸레이션 계수 (scintillation counting)에 의해 측정될 수 있다.

(b) 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트, europium chelates)와 같은 형광 표지 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실 (dansyl), 리사민 (Lissamine), 피코에리쓰린 (phycoerythrin), 및 텍사스 레드 (Texas Red)가 이용가능하다. 형광 표지는, 예를 들면, 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상동]에 기재된 바와 같은, 공지된 기술을 통해 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하다 (예컨대, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 일부에 대한 검토를 제공한다). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변형을 촉진시킨다. 예를 들면, 효소는 분광광도적으로 측정될 수 있는 기질 내 색 변화를 촉진시킬 수 있다. 별볍으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광에 있어서의 변화를 정량하는 기술은 상기에 기술되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 그 후에, 예를 들면, 화학발광기를 이용하여 측정될 수 있는 빛을 방출하거나 형광 수용체에 에너지를 제공한다. 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예컨대 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예컨대 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들면, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 예를 들면 하기를 포함한다:

(a) 기질로서 하이드로젠 퍼옥시다제와 호스래디쉬 퍼옥사다제 (HRPO)로, 상기 하이드로젠 퍼옥시다제는 오쏘페닐렌 다이아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB)와 같은 염료 전구체를 산화시킨다;

(b) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼라인 포스파타제 (AP); 및

(c) p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제와 같은 발색 기질 또는 4-메틸룸벨리페릴 (methylumbelliferyl)-β-D-갈락토시다제와 같은 형광 기질과 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal).

수많은 다른 효소-기질 조합이 당분야의 숙련자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 미국 특허 제4,318,980호를 참조하시오.

표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들면, 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 별볍으로, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예컨대, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

다른 실시형태에서, 인간화 항-CD40 항체는 비표지 상태로 사용되고 인간화 항-CD40 항체에 결합하는 표지된 항체로 검출된다.

본원에 기술된 항체는 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조하시오.

진단 킷트

인간화 항-CD40 항체는 진단 킷트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 킷트, 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 킷트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들면, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.

치료 용도

다른 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화 항-CD40 항체는 본원에 기술된 바와 같은 CD40의 발현과 관련된 다양한 질환의 치료에 유용하다.

인간화 항-CD40 항체 또는 제제는 비경구, 피하, 복막내, 폐내, 및 비강내를 포함하는, 임의의 적절한 수단에 의해 투여되고, 만약 국소 면역억제 치료가 요구된다면, 병변내 투여 (관류 또는 별볍으로 이식 전에 항체와 이식편을 접촉시키는 것을 포함함)가 이용된다. 인간화 항-CD40 항체 또는 제제는, 예를 들면, 주입액 (infusion) 또는 볼루스 (bolus)로서 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 인간화 항-CD40 항체는 특히 항체의 용량을 감소시키면서, 펄스 주입 (pulse infusion)에 의해 적절히 투여된다. 일 측면에서, 투약은 부분적으로 투여가 단기 또는 만성인지 여부에 따라서, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.

질환의 예방 또는 치료를 위하여, 항체의 적합한 투여량은, 상기에 정의된 바와 같이, 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 사전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량과 같이 다양한 요인들에 따라 결정될 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절히 투여된다.

질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 20 mg/kg (예컨대, 0.1-15 mg/kg)의 항체는, 예를 들면, 하나 이상의 개별적인 투여에 의해서건 지속적인 주입에 의해서건, 환자에 투여를 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 일일 투여량은 상기에 언급된 요인들에 따라서 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 조건에 따라서는, 수일 이상에 걸친 반복된 투여를 위하여, 치료가 질환 증상의 목적하는 억제가 나타날 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 관찰된다. 예시적인 투여 요법이 WO 94/04188에 기술되어 있다.

항체 조성물이 의약품 임상 관리기준에 부합하는 방식으로 제형화되고, 투약되며, 투여될 것이다. 이러한 관계에서 고려해야할 요인은 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 환자 개개인의 임상 조건, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 전문의에게 공지된 다른 요인들을 포함한다. 투여되는 항체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려 요인들에 의해 결정될 것이고, 이는 CD40 발현과 관련된 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 요구되는 최소량이다.

항체는, 선택적이지만, 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 제형화되는 것을 필요로 하지 않는다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형 내 존재하는 인간화 항-CD40 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 다른 요인들에 따라서 달라진다. 이들은 일반적으로 앞서 사용된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

CD40-관련 장애

항-CD40 항체 또는 제제는 CD40의 발현, 예컨대, 면역 세포 (예컨대, 림프구 또는 수지상 세포)의 부적절한 활성화를 특징으로 하는 CD40-발현 암 또는 면역 장애를 치료하거나 예방하는데 유용하다. CD40의 이러한 발현은, 예를 들면, 세포 표면 상의 증가된 CD40 단백질 및/또는 발현된 CD40의 변화된 항원성에 기인할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따른, 면역 장애의 치료 또는 예방은 이러한 치료 또는 예방이 요구되는 환자에게 유효량의 항-CD40 항체 또는 제제를 투여하고, 그로 인해 상기 항체가 (i) CD40을 발현하고 이 질환 상태와 관련이 있는 활성화된 면역 세포에 결합하고 (ii) 활성화된 면역 세포에 세포독성, 세포증식억제, 또는 면역억제 효과를 나타냄으로써 달성된다.

면역 세포의 부적절한 활성화를 특징으로 하고 본원에 기술된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 면역 질환은, 예를 들면, 이 장애의 근거가 되는 과민 반응(들)의 유형(들)에 의해 구분될 수 있다. 이들 반응은 전형적으로 4개의 유형으로 구분된다: 초과민 (anaphylactic) 반응, 세포독성 (세포용해) 반응, 면역 복합 반응, 또는 세포-매개 면역 (CMI) 반응 (지연-매개 과민 (DTH) 반응으로도 언급됨). (예컨대, 문헌 [Fundamental Immunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993)]을 참조하시오.)

이러한 면역 질환의 구체적인 예는 다음을 포함한다: 류마티스성 관절염, 자가면역 말이집탈락병 (예컨대, 다발 경화증, 알러지성 뇌척수염), 내분비 안구병증, 포도망막염, 전신성 홍반 루푸스, 중증근육무력증, 그레이브스병, 사구체신염, 자가면역 간장 장애, 염증성 배변 질환 (예컨대, 크론병 또는 궤양대장염), 과민증, 알러지반응, 쇼그렌 증후군, 타입 I 당뇨병, 원발성 담즙성 간경변증, 베게너 육아종증, 섬유근육통, 다발근육염, 피부근육염, 염증성 근육염, 다발성 내분비 상실, 슈미트 증후군, 자가면역 포도막염, 에디슨병, 부신염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 위선위축, 만성 간염, 루포이드 간염, 죽상동맥경화증, 아급성 피부 홍반 루푸스, 부갑상선기능감퇴증, 드레슬러 증후군, 자가면역 저혈소판증, 특발 혈소판감소성 자반증, 용혈빈혈, 심상성 천포창, 천포창, 포진피부염, 원형탈모증, 유사천포창, 공피증, 진행성 전신 경화증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 손발가락경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직 척추염, 궤양대장염, 혼합결합조직병, 결절다발동맥염, 전신성 괴사혈관염, 아토피 피부염, 아토피 비염, 굳패스츄어 증후군, 샤가스병, 사르코이드증, 류마티스열, 천식, 반복 유산, 항-인지질 증후군, 농부폐, 다형홍반, 후심장절개 증후군, 쿠싱 증후군, 자가면역 만성활동간염, 새-사육가 폐, 독성표피괴사용해, 알포트 증후군, 폐포염, 알러지성 폐포염, 섬유성 폐포염, 사이질 폐질환, 결절홍반, 괴저농피증, 수혈부작용, 타카야수 동맥염, 류마티스성 다발근육통중, 관자동맥염, 주혈흡충증, 거세포 동맥염, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군, 습진, 림프종모양육아종증, 베체트병, 케이플란 증후군, 카와사키병, 뎅기, 뇌척수염, 심장내막염, 심근내섬유증, 안구내염, 지속융기홍반, 건선, 태아적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 사상충증, 섬모체염, 만성 섬모체염, 이형만성 섬모체염, 푹스 섬모체염, IgA 신장병증, 헤노호-쉔라인 자색반증, 이식대숙주병, 이식거부반응, 심근병증, 이튼-람버트 증후군, 재발성 다발신경병증, 한랭글로불린형증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 에반스 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐염증, 골다공증, 지연형 과민반응 및 자가면연 생식샘 상실.

따라서, 본원에 기술된 방법은 B 림프구 (예컨대, 전신 홍반 루푸스, 굳패스츄어 증후군, 및 타입 I 당뇨병), Thi-림프구 (예컨대, 류마티스성 관절염, 다발경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브병, 원발성 담즙 간경병증, 베게너 육아종증, 결핵, 또는 이식대숙주병), 또는 Th2-림프구 (예컨대, 아토피성 피부염, 전신 홍반 루푸스, 아토피성 천식, 코결막염, 알러지성 비염, 오멘 증후군, 전신 경화증, 또는 만성 이식대숙주병)의 질환의 치료를 포함한다. 일반적으로, 수지상 세포를 포함하는 질환은 Thi-림프구 또는 Th2-림프구의 장애를 포함한다.

일부 실시형태에서, 면역 장애는, 그 질환과 관련된 활성화된 T 세포가 CD40을 발현하는 T 세포 장애와 같은, T 세포-매개 면역 장애이다. 항-CD40 항체 또는 제제는 이러한 CD40-발현 활성화 T 세포를 고갈시키기 위하여 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 제제의 투여는 CD40-발현 활성화 T 세포를 고갈시킬 수 있는 반면, 휴지기 T 세포는 실질적으로 항-CD40 또는 제제에 의해 고갈되지 않는다. 이러한 관계에서, "실질적으로 고갈되지 않는"다는 것은 휴지기 T 세포의 약 60% 미만, 또는 약 70% 미만 또는 약 80% 미만이 고갈되지 않는 것을 의미한다.

본원에 기술된 항-CD40 항체 및 제제는 또한 CD40-발현 암을 치료하거나 예방하는데 유용하다. 본원에 기술된 방법에 따라, CD40-발현 암의 치료 또는 예방은 유효량의 항-CD40 항체 또는 제제를 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하고, 그로 인해 상기 항체 또는 제제가 (i) CD40-발현 암 세포에 결합하고 (ii) CD40-발현 암 세포를 고갈시키거나 그의 증식을 억제하기 위하여 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 나타냄으로써 달성된다.

본원에 기술된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 CD40-발현 암은, 예를 들면, 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병과 같은 백혈병 (예컨대, 골수모구성, 풋골수세포, 골수단핵구성, 단핵세포, 또는 적백혈병), 만성 백혈병, 만성 골수구성 (과립구) 백혈병, 또는 만성 림프성 백혈병; 진성적혈구증가증; 림프종 (예컨대, 호지킨병 또는 비-호지킨병); 다발골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 중쇄병; 육종 및 암종과 같은 고형암 (예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 뼈육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉종양, 평활근육종, 횡문근육종, 대장암종, 결장직장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암종, 기저세포암종, 샘암종, 한선암종, 피지샘암종, 유두암종, 유두상선암종, 낭샘암종, 속질암종, 기관지원성 암종, 콩팥세포암종, 간암, 담관암종, 융모막암종, 고환종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환종양, 폐암종, 소세포폐암종, 비소세포폐암종, 방광암종, 상피성 암종, 신경아교종, 별아교세포종, 속질모세포종, 머리인두종, 뇌실막세포종, 솔방울샘종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 코인두암종, 또는 식도암종)을 포함한다.

약학적 조성물 및 그의 투여

CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)를 포함하는 조성물이 면역 장애 또는 CD40-발현 암이 발병했거나 발병할 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명은 나아가 CD40 발현 암 또는 면역 장애의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "환자"는 예컨대, 인간 및 비-인간 포유동물, 예컨대 영장류, 설치류, 및 개류를 포함하는, CD40-결합제가 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미한다. 본원에 기술된 방법을 이용한 치료에 보다 명확히 의도된 환자는 인간을 포함한다. 항체 또는 제제는 단독으로 또는 면역 장애 또는 CD40-발현 암의 예방 및 치료에 사용되는 다른 조성물과 병용하여 투여될 수 있다.

다양한 전달 시스템이 알려져 있고 CD40 결합제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 도입 방법은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로를 포함한다. CD40 결합제는, 예를 들면, 주입액, 볼루스, 또는 주사에 의해 투여될 수 있고, 화학요법 제제와 같은 다른 생물학적 활성 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다.

특정 실시형태에서, CD40 결합제 조성물은 카데터를 이용하여, 좌약을 이용하여, 또는 임플란트가 다공성, 비-다공성, 또는 아교성 물질, 예를 들면 막, 예컨대 시알라스틱 (sialastic) 막, 또는 필터인 임플란트를 이용하여, 주사에 의해 투여된다. 전형적으로, 상기 조성물이 투여될 때, 항-CD40 항체 또는 제제가 흡착되지 않는 물질을 사용한다.

다른 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 제제는 제어 방출 시스템으로 전달된다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald 등, 1980, Surgery 88:507; Saudek 등, 1989, JV. Engl. J. Med. 321:574]을 참조하시오). 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61]을 참조하시오. 또한 문헌 [Levy 등, 1985, Science 228:190; During 등, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard 등, 1989, J. Neurosurg. 71:105]을 참조하시오). 다른 제어 방출 시스템이, 예를 들면, 문헌 [Langer, 상동]에 기술되어 있다.

CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)는 치료학적 유효량의 상기 결합제 및 하나 이상의 약학적으로 호환가능한 성분을 함유하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들면, 약학 조성물은 전형적으로 하나 이상의 약학적 담체를 포함한다 (예컨대, 멸균액, 예컨대 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 물 및 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광물유, 참기름 등). 물은 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 더욱 일반적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 특히 주사가능 용액으로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는, 예를 들면, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 다른 적합한 약학적 부형제는 아미노산 (예컨대, 아르기닌, 히스티딘, 글리세린), 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트) 및 당 및 당 알코올 (예컨대, 수크로스 또는 소르비톨 및 다른 폴리올류 (예컨대, 트레할로스))를 포함한다. 요구된다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지연-방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트라이글리세라이드와 같은 담체와 함께, 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 문헌 [E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적합한 투여를 위한 형태를 제공하기 위하여 적당량의 담체와 함께, 전형적으로 정제된 형태로, 치료학적 유효량의 핵산 또는 단백질을 포함할 것이다. 제형은 투여 방식에 부합한다.

전형적 실시형태에서, 약학 조성물은 인간에게로의 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 통상적인 방법에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 내 용액이다. 필요한 경우에, 약학 조성물은 또한 주사 부위에 고통을 완화시키기 위하여 용해제와 리그노카인 (lignocaine)과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 개별적으로 또는, 예를 들면 활성 제제의 양을 표시하는 앰플 또는 사세이 (sachette)와 같이 용접 밀폐된 용기 내 동결 건조된 분말 또는 무수분 농축물로서, 단일 투여 형태 내에 함께 혼합된 형태로 공급된다. 약학 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 주입병을 이용하여 투여될 수 있다. 약학 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 투여 전에 상기 성분들이 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.

또한, 약학 조성물은 (a) 동결건조된 형태로 CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)를 포함하는 용기 및 (b) 주사용 약학적으로 허용가능한 희석제 (예컨대, 멸균수)를 포함하는 제2 용기를 포함하는 약학적 킷트로서 제공될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 동결건조된 항-CD40 항체 또는 제제의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 지시 사항이 이러한 용기(들)에 부수적으로 포함될 수 있는데, 이 지시 사항은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 상기 기관에 의한 허가를 나타낸다.

면역 장애 또는 CD40-발현 암의 치료 또는 예방에 효과적인 CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, in vitro 분석이 최적의 투여량 범위를 결정하는 것을 보조하기 위하여 선택적으로 사용될 수 있다. 제형에 사용되어지는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 면역 장애 또는 CD40-발현 암의 단계에 의존할 것이고, 주치의의 판단 및 개별적 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 효과적인 투여량은 in vitro 또는 동물 모델 데스트 시스템으로부터 얻어진 용량-의존성 곡선으로부터 추정될 수 있다.

예를 들면, 항-CD40 항체 또는 제제의 독성 및 치료학적 유효량은 LD₅₀ (모집단의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED_5O (모집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 표준 약학적 방법에 의해 세포 배양액 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량비가 치료 지수 (therapeutic index)이고, 이는 비율 LD₅₀/ED_5O로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 CD40-결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)가 바람직하다. CD40-결합제가 독성 부작용을 나타내는 경우에, 이환 조직 부위에 상기 CD40-결합제를 표적하는 전달 시스템이 비-CD40-발현 세포에 대한 가능한 손상을 최소화하기 위해 사용될 수 있고, 그로 인해, 부작용을 감소시킬 수 있다.

세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 결과가 인간에서의 사용을 위한 투여량의 범위를 결정하는데 사용될 수 있다. CD40 결합제의 투여량은 전형적으로 약간 또는 거의 독성을 나타내지 않는 ED₅₀을 포함하는 혈중 농도의 범위 내에 놓인다. 상기 투여량은 사용된 투여량 및 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 방법에 사용된 임의의 CD40 결합제에 대하여, 치료학적으로 유효한 용량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 용량은 세포 배양액에서 결정된 바와 같이 IC₅₀ (즉, 증상의 반-최대 억제 [half-maximal inhibition]를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 혈중 혈장 농도를 달성하도록 동물 모델에서 결정될 수 있다. 이러한 정보는 인간에게 유용한 투여량을 더욱 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈중 내 수준이, 예를 들면, 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다.

일반적으로, 면역 장애 또는 CD40-발현 암을 갖는 환자에게 투여되는 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여량은 전형적으로 환자 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg이다. 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다.

이에 한정되는 것은 아니지만, 예시적인 용량은 1 ng/kg 내지 100 mg/kg을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 13 mg/kg, 약 14 mg/kg, 약 15 mg/kg 또는 약 16 mg/kg이다. 상기 용량은, 예를 들면, 매일, 일주일에 1회 (매주), 일주일에 2회, 일주일에 3회, 일주일에 4회, 일주일에 5회, 일주일에 6회, 격주 또는 매달 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 용량은 약 0.5 mg/kg/주, 약 1 mg/kg/주, 약 2 mg/kg/주, 약 3 mg/kg/주, 약 4 mg/kg/주, 약 5 mg/kg/주, 약 6 mg/kg/주, 약 7 mg/kg/주, 약 8 mg/kg/주, 약 9 mg/kg/주, 약 10 mg/kg/주, 약 11 mg/kg/주, 약 12 mg/kg/주, 약 13 mg/kg/주, 약 14 mg/kg/주, 약 15 mg/kg/주 또는 약 16 mg/kg/주이다. 일부 실시형태에서, 상기 용량은 약 1 mg/kg/주 내지 약 15 mg/kg/주 범위이다.

일부 실시형태에서, CD40 결합제를 함유하는 약학 조성물은 상기 결합제에 접합되거나 접합되지 않은, 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제는 면역 장애 또는 CD40-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 병용 요법은 세포증식억제, 세포독성, 또는 면역억제 제제를 포함할 수 있다. 병용 요법은 또한, 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암세포의 표면에 CD40 이외에 다른 수용체 또는 수용체 복합체를 표적하는 제제의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 제제의 예는 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암세포의 표면에 있는 분자에 결합하는 제2, 비-CD40 항체를 포함한다. 다른 예는 이러한 수용체 또는 수용체 복합체를 표적하는 리간드를 포함한다. 전형적으로, 이러한 항체 또는 리간드는 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암세포 상의 세포 표면 수용체에 결합하여 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암세포에 세포증식억제 또는 세포독성 신호를 전달함으로써 항-CD40 항체의 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 증강시킨다.

이러한 병용 투여는 질환 파라미터 (예컨대, 증상의 중증도, 증상의 갯수, 또는 재발 빈도)에 대해 부가적이거나 상승적인 효과를 가질 수 있다.

병용 투여를 위한 치료 계획과 관련하여, 특정 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제가 치료제와 동시에 투여된다. 다른 특정 실시형태에서, 치료제는 적어도 1시간 및 수 개월까지 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여 전에 또는 수반되어, 예를 들면 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 하루, 일주일, 한달, 또는 3개월까지 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여 전에 또는 수반되어 투여된다.

세포독성 또는 면역억제 제제의 유용한 종류는, 예를 들면, 항튜블린 제제, 아우리스타틴 (auristatin)(예컨대, MMAE, 또는 MMAF), DNA 소 고랑 결합제 (minor groove binders), DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예컨대, ds-플라틴 [ds-platin], 모노(플라티늄), 비스(플라티늄) 및 트라이-핵 플라티늄 복합체 및 카보플라틴과 같은 플라티늄 복합체), 안트라사이클린, 항생제, 항폴린산제 (antifolates), 항대사물질, 화학요법 민감제, 두오카르마이신 (duocarmycins), 에포토사이드, 플루오르화 피리미딘, 이온운반체, 렉시트롭신 (lexitropsins), 니트로소우레아 (nitrosoureas), 플라티놀 (platinols), 전-형성 화합물, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선 민감제, 스테로이트, 탁산, 국소이성화효소 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.

개별적인 세포독성 또는 면역억제 제제는, 예를 들면, 안드로겐, 안트라마이신 (AMC), 아스파라기나제, 5-아자사이티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부설판, 부티오닌 설폭시민, 캄토테신, 카보플라틴, 카르뮤스틴 (BSNU), CC-1065, 클로로암부칠, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 시타라빈 (cytarabine), 시티딘 아라비노사이드, 시토칼라신 B, 데카르바진, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 다우노루비신, 데카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 에스트로겐, 5-플루오르데옥시우리딘, 5-플루오르우라실, 그래미시딘 D, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴 (CCNU), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미쓰라마이신, 마이토마이신 C, 마이토크산트론, 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 팔리카마이신 (palicamycin), 프로카르비진, 스트렙토조토신, 테노포사이드, 6-티오구아닌, 티오TEPA, 토포데칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 VM-26을 포함한다.

일부 전형적인 실시형태에서, 상기 치료제는 세포독성 제제이다. 적합한 세포독성 제제는, 예를 들면, 돌라스타틴 (예컨대, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB 또는 AEVB), DNA 소 고랑 결합제 (예컨대, 에네디인 [enediynes] 및 렉스트롭신 [lexitropsins]), 두오카르마이신 [duocarmycin], 탁산 (예컨대, 파클리탁셀 및 도데탁셀), 퓨로마이신, 빈카 알칼로이드, CC-1065, SN-38, 토포데칸, 몰포리노-독소루비신, 라이족신 (rhizoxin), 사이아노몰포리노-독소루비신, 에치노마이신 (echinomycin), 콤브레타스타틴 (combretamycin), 네트롭신 (netropsin), 에포틸론 (epotilone) A 및 B, 에스트라무스틴 (estramustine), 크립토파이신 (cryptophysisn), 세마도틴 (cemadotin), 메이탄시노이드 (maytansinoids), 디스코데르모라이드 (discodermolide), 엘레우쎄로빈 (eleutherobin), 또는 마이토크산트론 (mitoxantrone)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 세포독성 제제는 예를 들면, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 마이토마이신 C 또는 에토포사이드와 같은 통상적인 화학요법제이다. 또한, CC-1065 유사체, 칼리체아마이신 (calicheamicin), 메이스타틴 (maytansine), 돌라스타틴 (dolastatin) 10의 유사체, 라이족신, 및 팔리톡신 (palytoxin)과 같은 강력한 제제가 항-CD40 항체 또는 그의 제제에 연결될 수 있다.

특정 실시형태에서, 세포독성 또는 세포증식억제 제제는 아우리스타틴 E (또한 당분야에는 돌라스타틴-10으로도 알려짐) 또는 그의 유도체이다. 전형적으로, 아우리스타틴 E 유도체는, 예컨대, 아우리스타틴 E 및 케토산 사이에 형성된 에스테르이다. 예를 들면, 아우리스타틴 E는 AEB 및 AEVB를 생산하기 위하여 각각 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴 유도체는 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 아우리스타틴 E 및 그의 유도체의 합성 및 구조는, 예를 들면, 미국 특허 공개 제2004-0157782 A1호 및 제2005-0238649호; 국제 특허 출원 제PCT/US03/24209호, 국제 특허 출원 제PCT/US02/13435호, 및 미국 특허 제6,884,869호; 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 기술되어 있으며; 이의 내용은 본원에 참고로서 도입된다.

특정 실시 형태에서, 세포독성 제제는 DNA 소 고랑 결합제이다 (예컨대, 미국 특허 제6,130,237호를 참조하시오). 예를 들면, 일부 실시형태에서, 상기 소 고랑 결합제는 CBI 화합물이다. 다른 실시형태에서, 상기 소 고랑 결합제는 에네디인 (예컨대, 칼리체아마이신 [calicheamicin])이다.

항-튜블린 제제의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 탁산 (예컨대, 탁솔(등록상표) [파클리탁셀], 탁소테레(Taxotere)(등록상표) [도세탁셀]), T67 (툴라릭, Tularik), 빈카 알칼로이드 (예컨대, 빈크리스타틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 돌라스타틴 (예컨대, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함한다. 다른 항튜블린 제제는, 예를 들면, 바카틴 (baccatin) 유도체, 탁산 유사체 (예컨대, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸 (nocodazole), 콜히친 및 콜치미드 (colcimid), 에스트라무스틴, 크립토파이신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드, 및 엘레우쎄로빈을 포함한다.

일부 실시형태에서, 세포독성 제제는 항-튜블린 제제의 또 다른 그룹인 메이탄시노이드이다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 메이탄시노이드는 메이탄신 (maytansine) 또는 DM-I (ImmunoGen, Inc.; 문헌 [Chari 등, 1992, Cancer Res. 52:127-131] 참조)이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 방사성 동위원소이다.

일부 실시형태에서, 세포독성 또는 면역억제 제제는 항대사산물이다. 항대사산물은, 예를 들면, 퓨린 길항제 (예컨대, 아조티로프린 [zothioprine] 또는 마이코페놀레이트 모페틸 [mycophenolate mofetil]), 디하이드로폴레이트 리덕타제 억제제 (예컨대, 메토트렉세이트), 에이사이클로비어 (acyclovir), 갠시클로비어 (gangcyclovir), 지도부딘 (zidovudine), 비다라빈 (vidarabine), 리바바린 (ribavarin), 아지도티미딘 (azidothymidine), 시티딘 아라비노사이드 (cytidine arabinoside), 아만타딘 (amantadine), 다이데옥시우리딘, 아이오도데옥시우리딘, 포스카르넷 (poscarnet), 또는 트라이플루리딘 (trifluridine)일 수 있다.

다른 실시형태에서, 세포독성 또는 면역억제 제제는 타크로리무스 (tacrolimus), 사이클로스포린 또는 라파마이신 (rapamycin)이다. 또 다른 실시형태에서, 세포독성 제제는 알데스레우킨 (aldesleukin), 알렘츠주마브 (alemtuzumab), 알리트레티노인 (alitretinoin), 알로푸리놀 (allopurinol), 알트레타민 (altretamine), 아미포스틴 (amifostine), 아나스트라졸 (anastrozole), 삼산화비소 (arsenic trioxide), 벡사로텐 (bexarotene), 벡사로텐, 칼루스테론 (calusterone), 카페시타빈 (capecitabine), 셀레콕시브 (celecoxib), 클라드리빈 (cladribine), 다르베포에틴 알파 (Darbepoetin alfa), 데니류킨 디프티톡스 (Denileukin diftitox), 덱스라족산 (dexrazoxane), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피루비신, 에포에틴 알파 (Epoetin alfa), 에스트라무스틴, 엑세메스탄 (exemestane), 필그라스팀 (Filgrastim), 플록스우리딘 (floxuridine), 플루다라빈 (fludarabine), 풀벤스트란트 (fulvestrant), 겜시타빈 (gemcitabine), 겜츠주마브 오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin), 고세렐린 (goserelin), 이다루비신 (idarubicin), 이포스파미드, 이마티니브 메실레이트 (imatinib mesylate), 인터페론 알파-2a, 이리노테칸 (irinotecan), 레트로졸 (letrozole), 류코보린 (leucovorin), 레바미솔 (levamisole), 메클로레타민 (meclorethamine) 또는 질소 머스타드 (nitrogen mustard), 메제스트롤 (megestrol), 메스나 (mesna), 메토트렉세이트, 메톡살렌 (methoxsalen), 마이토마이신 C, 마이토탄 (mitotane), 난드로롤론 펜프로피오네이트 (nandrolone phenpropionate), 오프렐베킨 (oprelvekin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 파미드로네이트 (pamidronate), 페가데마세 (pegademase), 페가스파라가세 (pegaspargase), 페그필그라스팀 (pegfilgrastim), 펜토스타틴 (pentostatin), 피포브로만 (pipobroman), 플리카마이신 (plicamycin), 포르피머 소듐 (porfimer sodium), 프로카바진 (procarbazine), 퀴나크라인 (quinacrine), 라스부리카제 (rasburicase), 레블리미드 (revlimid), 사르그라모스팀 (Sargramostim), 스트렙토조토신 (streptozocin), 탐옥시펜 (tamoxifen), 테모졸로미드 (temozolomide), 테니포시드 (teniposide), 테스토락톤 (testolactone), 티오구아닌 (thioguanine), 토레미펜 (toremifene), 토시투모마브 (Tositumomab), 트라츠주마브 (Trastuzumab), 트레티노인 (tretinoin), 우라실 머스타드 (uracil mustard), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 (vinorelbine) 및 졸레드로네이트 (zoledronate)이다.

부가적인 실시형태에서, 상기 약제는 인간화 항-HER2 단일클론 항체; RITUXAN (리툭시마브 [rituximab]; Genentech, Inc., South San Francisco, CA); 키메라 항-CD20 단일클론 항체); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; 생쥐 IgG2a 항체); 세툭시마브 에르비툭스 (Cetuximab Erbitux)(Imclone Systems Inc., NY; 항-EGFR IgG 키메라 항체); 비탁신 (Vitaxin)(Medlmmune, Inc., MD); 캄페스 (Campath) I/H (Leukosite, MA; 인간화 IgGl 항체); 스마트 MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; 인간화 항-CD33 IgG 항체); 림포사이드 (LymphoCide)(Immunomedics, Inc., NJ; 인간화 항-CD22 IgG 항체); 스마트 ID1O (Protein Design Labs, Inc., CA; 인간화 항-HLA-DR 항체); 온코라임 (Oncolym)(Techniclone, Inc., CA; 방사성표지 생쥐 항-HLA-DrlO 항체); 알로뮨 (Allomune)(BioTransplant, CA; 인간화 항-CD2 mAb); 아바스틴 (Avastin)(Genentech, Inc., CA; 항-VEGF 인간화 항체); 에프라츠주마브 (Epratuzamab)(Immunomedics, Inc., NJ and Amgen, CA; 항-CD22 항체); 및 세아시드 (CEAcide)(Immunomedics, NJ; 인간화 항-CEA 항체)이다.

다른 적합한 항체는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기 항원에 대한 항체를 포함한다: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, 루이스 (Lewis) Y, 루이스 X, 알파 태아단백, CA 242, 태반 알칼라인 포스파타제, 전립선 특이 항원, 전립선산 포스파타제 (prostatic acid phosphatase), 표피 성장 인자, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE -4, 항-트랜스페린 수용체, p97, MUC1-KLH, CEA, gp10O, MART1, 전립선 특이 항원, IL-2 수용체, CD20, CD52, CD33, CD22, 인간 융모성 성선자극호르몬 (chorionic gonadotropin), CD38, 뮤신 (mucin), P21, MPG, 및 Neu 발암유전자 산물을 포함한다.

일부 실시형태에서, 치료제는 면역억제 제제이다. 면역억제 제제는, 예를 들면, 갠시클로비어, 에탄에르셉트 (etanercept), 타크롤리무스 (tacrolimus), 사이클로스포린, 라파마이신, 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸 또는 메토트렉세이트일 수 있다. 별볍으로, 면역억제 제제는, 예를 들면, 글루코코르티코이드 (예컨대, 코티솔 또는 알도스테론) 또는 글루코코르티코이드 유사체 (예컨대, 프레드니손 [prednisone] 또는 덱사메타손)일 수 있다.

적합한 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase) 억제제는 메클로페남산 (meclofenamic acid), 메페남산 (mefenamic acid), 카르프로펜 (carprofen), 다이클로페낙 (diclofenac), 다이플루니살 (diflunisal), 펜부펜 (fenbufen), 페노프로펜 (fenoprofen), 이부프로펜 (ibuprofen), 인도메타신 (indomethacin), 케토프로펜 (ketoprofen), 나부메톤 (nabumetone), 나프록센 (naproxen), 설린닥 (sulindac), 테녹시캄 (tenoxicam), 톨메틴 (tolmetin), 및 아세틸살리실산 (acetylsalicylic acid)을 포함한다.

적합한 리포옥시게나제 (lipoxygenase) 억제제는 산화환원 (redox) 억제제 (예컨대, 카테콜 부탄 유도체, 노르다이하이드로구아이아레트산 [nordihydroguaiaretic acid, NDGA], 마소프로콜 [masoprocol], 페니돈 [phenidone], 이아노팔렌 [Ianopalen], 인다졸리논 [indazolinones], 나파자트롬 [naphazatrom], 벤조퓨라놀 [benzofuranol], 알킬하이드록실아민), 및 비-산화환원 억제제 (예컨대, 하이드록시티아졸 [hydroxythiazoles], 메톡시알킬티아졸 [methoxyalkylthiazoles], 벤조피란 및 그의 유도체, 메톡시테트라하이드로피란 [methoxytetrahydropyran], 보스웰산 [boswellic acids] 및 보스웰산의 아세틸화 유도체, 및 사이클로알킬 라디칼을 갖는 퀴놀린메톡시페닐아세트산 [quinolinemethoxyphenylacetic acids]), 및 산화환원 억제제의 전구체를 포함한다.

다른 적합한 리포옥시게나제 억제제는 항산환제 (예컨대, 페놀, 프로필 갈레이트, 플라보노이드 및/또는 플라보노이드 함유 자연 발생 성분, 플라본의 하이드록실화 유도체, 플라보놀, 다이하이드로퀘르세틴, 루테올린 (luteolin), 갈란긴 (galangin), 오로볼 (orobol), 찰콘 유도체, 4,2',4'-트라이하이드록시찰톤 (trihydroxychalcone), 오르쏘-아미노페놀, N-하이드록시우레아, 벤조푸라놀 (benzofuranols), 엡셀렌 (ebselen) 및 감소하는 셀레노효소의 활성을 증가시키는 종류), 철 킬레이트제 (예컨대, 하이드록삼산 및 그의 유도체, N-하이드록시우레아, 2-벤질-1-나프톨, 카테콜, 하이드록실아민, 카르노솔 트롤록스 [carnosol trolox] C, 카테콜, 나프톨, 설파살라진, 질레우톤 [zyleuton], 5-하이드록시안트라닐산 [5-hydroxyanthranilic acid] 및 4-(오메가-아릴알킬)페닐알카노산), 이미다졸-함유 화합물 (예컨대, 케토코나졸 [ketoconazole] 및 이트라코나졸), 페노티아진 (phenothiazines) 및 벤조피란 유도체를 포함한다.

또 다른 적합한 리포옥시게나제 억제제는 에이코사노이드 (eicosanoids)의 억제제 (예컨대, 옥타데카테트라에노산 [octadecatetraenoic], 에이코사테트라에노산 [eicosatetraenoic], 도코사펜타에노산 [docosapentaenoic], 에이코사헥사에노산 [eicosahexaenoic] 및 도코사헥사에노산 [docosahexaenoic] 및 그의 에스테르, PGE1 (프로스타글란딘 E1), PGA2 (프로스타글란딘 A2), 비프로스톨 (viprostol), 15-모노하이드록시에이코사노산, 15-모노하이드록시-에이코사트라이에노산 및 15-모노하이드록시에이코사펜타에노산, 및 류코트리엔 [leukotrienes] B5, C5 및 D5), 칼슘 흐름을 방해하는 화합물, 페노티아진 (phenothiazines), 다이페닐부틸아민 (diphenylbutylamines), 베라파밀 (verapamil), 푸코사이드 (fuscoside), 커큐민 (curcumin), 클로로젠산 (chlorogenic acid), 카페인산 (caffeic acid), 5,8,11,14-에이코사테트라에노산 (ETYA), 하이드록시페닐레틴아마이드 (hydroxyphenylretinamide), 이오나팔렌 (Ionapalen), 에스쿨린 (esculin), 다이에틸카르바마진 (diethylcarbamazine), 페난트롤린 (phenantroline), 바이칼레인 (baicalein), 프록시크로밀 (proxicromil), 티오에테르 (thioethers), 다이알릴 설파이드 및 다이-(1-프로페닐) 설페이트를 포함한다.

류코트리엔 수용체 길항제는 칼시트리올 (calcitriol), 온타졸라스트 (ontazolast), 바이에르 Bay-x-1005, 시바-게이지 (Ciba-Geigy) CGS-25019C, 엡셀렌, 레오 덴마크 (Leo Denmark) ETH-615, 릴리 (Lilly) LY-293111, 오노 (Ono) ONO-4057, 테루모 (Terumo) TMK-688, 베링거 잉겔하임 (Boehringer Ingleheim) BI-RM-270, 릴리 LY 213024, 릴리 LY 264086, 릴리 LY 292728, 오노 ONO LB457, 화이자 (Pfizer) 105696, 퍼듀 프레데릭 (Perdue Frederick) PF 10042, 롱프랑 로리 (Rhone-Poulenc Rorer) RP 66153, 스미스클라인 비챰 (SmithKline Beecham) SB-201146, 스미스클라인 비챰 SB-201993, 스미스클라인 비챰 SB-209247, 시얼리 (Searle) SC-53228, 수미타모 (Sumitamo) SM 15178, 아메리칸 홈 프로덕츠 (American Home Products) WAY 121006, 바이에르 Bay-o-8276, 워너-램버트 (Warner-Lambert) CI-987, 워너-램버트 CI-987BPC-15LY 223982, 릴리 LY 233569, 릴리 LY-255283, 마크로넥스 (MacroNex) MNX-160, 머크 (Merck and Co.) MK-591, 머크 MK-886, 오노 ONO-LB-448, 퍼듀 프레데릭 PF-5901, 롱프랑 로리 RG 14893, 롱프랑 로리 RP 66364, 롱프랑 로리 RP 69698, 시오노오기 (Shionoogi) S-2474, 시얼리 SC-41930, 시얼리 SC-50505, 시얼리 SC-51146, 시얼리 SC-52798, S스미스클라인 비챰 SKandF-104493, 레오 덴마크 SR-2566, 타나베 (Tanabe) T-757 및 테이진 (Teijin) TEI-1338을 포함한다.

제조 품목

다른 측면에서, 상기에 기술된 장애의 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조 품목이 포함된다. 제조 품목은 용기와 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사, 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들어질 수 있다. 용기는 그 상태를 치료하기에 효과적인 조성물을 수용하고 멸균 입구 포트를 가질 수 있다. 예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다. 조성물 내 활성 제제는 인간화 항-CD40 항체이다. 용기 상에 또는 그와 연관된 라벨은 조성물이 정선한 상태를 치료하는데 사용됨을 지시한다. 제조 품목은 추가로 인산염-완충 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조 품목은 다른 완충액, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기, 및 사용을 위한 지시사항이 담긴 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

ATCC 기탁

단일클론 항체 S2C6의 ATCC 기탁은 특허 진행을 목적으로 하는 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약의 조항에 따라 1999년 5월 25일자로 이루어졌다. ATCC는 미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 대로 10801 (10801 University Boulevard, Manassas, Virgina 20110-2209, USA)에 위치하고 있다. ATCC 기탁은 기탁번호 PTA-110을 부여하였다. ATCC는 미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 대로 10801에 위치하고 있다. 임의의 기탁은 당분야의 숙련자에게 편리하게 제공되며 이는 기탁이 35 U.S.C. 단락 112 하에서 요구되는 승인이 아니다. 기탁된 실시형태가 발명의 특정 측면의 단일 예시로서 의도되고 기능적으로 동등한 임의의 항체가 본 발명의 범위 내에 포함되기 때문에, 본원에 기술된 것은 기탁된 항체에 의해 그 범위 내로 제한되지 않는다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 서면상의 기재가 그의 최선의 방식을 포함하여 발명의 임의의 측면의 실시를 허용하기에 부적합함을 승인하는 것이 아니며, 그것이 나타내는 특정한 실례로 청구범위의 범위를 제한하는 것으로도 해석되지 않는다. 실제로, 본원에 나타내고 기술된 이들에 덧붙여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 기재로부터 당분야의 숙련자에게 자명해질 것이고 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.

본 발명은 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아닌, 하기 실시예에서 더 구체적으로 설명된다. 하기 실시예에 기술된 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC) 또는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany (DMSZ)에 의해 특정된 조건에 따라 배양액 내에서 유지되었다. 세포 배양 시약은 인비트로젠 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)으로부터 입수하였다.

실시예

실시예 1: 인간화 항-CD40 항체의 생산

인간화 항-CD40 항체는 일반적으로 생쥐 항-CD40 공여자 항체의 CDRs를 수용자 인간 항체 내로 이입시킴으로써 제조되었다. 공여자 항체는 미국 특허 제6,838,261호에 기술되고 B-림프구에 대해 강력한, 성장-촉진 신호를 제공하는 것으로 입증된 생쥐 단일클론 항체 S2C6이었다. 예컨대, 문헌 [Paulie 등, 2000, J. Immunol 142:590을 참조하시오. 인간 아형 III 중쇄 가변 도메인 (서열번호: 2) 및 인간 카파 아형 I 경쇄 가변 도메인 (서열번호: 13)의 보존적 서열을 인간 수용자 중쇄 및 경쇄 도메인으로 사용하기 위하여 일반적으로 문헌 [Carter 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:4285]; 미국 특허 제6,037,454호, 및 미국 특허 제6,054,297호에 기재된 바와 같이 수득하였다.

문헌 [Cunningham 등, 1989, Science 243:1330-1336]에 기술된 플라스미드 pEMX1은 인간 보존적 카파-아형 I 경쇄 가변 도메인 및 보존 인간 아형 II 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 포함하고, 이. 콜라이에서 F(ab)s의 발현 뿐만 아니라 돌연변이를 위한 벡터로 유용하다. 상기 보존적 가변 도메인을 암호화하는 DNA는 문헌 [Carter 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:4285]에 기술된 바와 같이, pUC119-기반 플라스미드, pAK2 유래 알칼라인 포스파타제 프로모터 및 샤인-달가노 서열에 작동가능하게 연결된다. 특이적 SpeI 제한효소 부위가 F(ab) 경쇄 및 중쇄 가변 도매인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 조작되어 삽입된다. pEMX1이 제작되고 본원에 기술된 인간화 항체를 제조하기 위해 사용된다.

sgn-0로 언급되는, 부위-지정 돌연변이에 의해 인간 보존적 서열 골격 영역 내로 생쥐 항체의 CDRs 이입시켜 제1 인간화 mAb S2C6 F(ab)를 제조하였다. 돌연변이는 일반적으로 문헌 [Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488]에 기술된 방법에 따라 수행되었다. 그 결과 인간화 F(ab) 분자 (sgn-0) 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 표 2에 나타내었고 (각각 서열번호: 3 및 서열번호: 14), 공여자 항체, 생쥐 단일클론 항체 S2C6의 서열 (mMAb S2C6, 본원에서 SGN-14로도 언급됨; 각각 서열번호: 1 및 서열번호: 12), 및 이들을 인간 보존적 서열 수용자 항체, HuVH III 및 HuVLκ I의 서열 (각각 서열번호: 2 및 서열번호: 13)과 비교하였다.

이중 및 단일 가닥 DNA를 제조하기 위하여 플라스미드를 이. 콜라이 균주 XL-1 Blue (Strataene, San Diego, CA)에 형질전환시켰다. 각각의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 데옥시뉴클레오티드 방법 (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.)을 이용하여 완전히 서열을 분석하였다. 플라스미드를 MM294의 유도체인 이. 콜라이 균주 16C9에 형질전환시키고, 5 μg/ml 카르베니실린 (carbenicillin)을 함유하는 LB 플레이트 상에 도말하고, 단백질 발현에 대해 단일 콜로니를 선발하였다. 5 ml 배양액을 500 ml AP5-100 μg/ml 카르베니실린에 첨가하고 및 4 L 조절 (baffled) 진탕 플라스크에서 37℃에서 16시간 동안 성장하도록 배양하였다. APS 배지는 1 L 물에 1.5 g 글루코스, 11.O g 하이카제 (Hycase) SF, 0.6 g 효모 추출물 (보증품), 0.19 g MgSO4 (무수화물), 1.07 g NH₄Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl, 120 ml 1M 트라이에탄올아민 (pH 7.4)으로 이루어지고 0.1 μm 실킨 (Sealkeen) 필터를 통해 멸균되었다.

세포를 1 L 원심분리 병 (Nalgene)에서 3000 ×g로 원심분리에 의해 수확하고, 상등액을 제거하였다. 1시간 동안 동결시킨 후, 침전물을 25 ml 냉각 10 mM MES, 10 mM EDTA, pH 5.0 (완충액 A)에 재현탁하였다. 250 μl의 0.1 M PMSF (Sigma)를 단백질분해를 억제하기 위해 첨가하고 3.5 ml의 스톡 10 mg/ml 암탉 달걀 흰자 라이소자임 (Sigma)을 세균 세포벽의 용해를 촉진하기 위해 첨가하였다. 얼음 상에서 1시간 동안 가볍게 진탕한 후, 시료를 15분간 40,000 ×g에서 원심분리하였다. 상등액에 완충액 A를 혼합하여 50 ml로 만든 후 완충액 A로 평형화된 2 ml DEAE 컬럼 상에 로우딩하였다. 그 후에 유량-관통 (flow-through)을 완충액 A로 평형화된 단백질 G-세파로스 CL-4B 컬럼 (Pharmacia)(0.5 ml 기저 컬럼)에 적용하였다. 상기 컬럼을 10 ml 완충액 A로 세척하고 3 ml 0.3 M 글리신 (pH 3.0)을 이용하여 1.25 ml의 1 M TRIS (pH 8.0) 내로 용출하였다. 그리고 나서 F(ab)를 센트리콘-30 필터 (Amicon)를 이용하여 PBS로 완충액 교환을 수행하였고 최종 부피가 0.5 ml이 되도록 농축하였다. F(ab)의 SDS PAGE 겔을 순도를 확인하기 위해 걸었고 전자분무 질량 분광계를 이용하여 분자량을 확인하였다.

인간화 항체, sgn-0은 모 생쥐 항체와 비교하여 미세역가 플레이트 상에 고정된 CD40에 대해 현저히 감소된 결합 친화도를 나타내었다.

표 2

실시예 2: 인간화 항-CD40 변이체 항체의 제조

일련의 돌연변이가 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된, 주형 인간화 항체, sgn-0에 대해 제조되었다. 특정 돌연변이체가 부위-지정 돌연변이에 의해 sgn-0의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 DNA에 대해 제조되었고, 주형 분자로부터 생산된 변이체의 서열을 하기 표 3 및 4에 열거하였다.

이들 변이체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 이용하여 제작된 항체의 결합 친화도를 분석하였다. 각각의 항체를 동일한 농도로 희석한 후, 연속적으로 희석하였다. 희석된 항체를 미세분석 플레이트 상에 고정된 CD40에 대한 결합에 대하여 분석하였다. 변이체 항체에 대한 친화도 결합 데이터를 하기 표 5에 나타내었다. 모 생쥐 항체의 결합 활성에 근접한 결합 활성을 나타내는 항체는 sgn-14, sgn-18, sgn-19, sgn-22, sgn-23, sgn-26, 및 sgn-27이었고, 변이체 sgn-14, sgn-18, sgn-26, 및 sgn-27는 모 생쥐 항체 SGN-14와 더욱 근접한 결합 활성을 나타내었고, 변이체 sgn-26는 이 분석에서 가장 우수한 성능을 나타내었다.

표 3

표 4

표 5

실시예 3: 인간화 항-CD40 항체의 in vitro 세포독성 활성

두명의 다발골수종 환자로부터 새롭게 분리된 종양 세포 (CD40⁺, CD138⁺⁺) 뿐만 아니라 CD40⁺ 및 CD138⁺⁺ 인간 다발골수종 세포주, MM.1S (덱사메타손 민감성), 및 MM.1R (덱사메타손 저항성)을 인간화 S2C6 항체를 증가하는 농도 (0-100 μg/ml)로 48시간 동안 처리하였다. DNA 합성이 ³[H]-티미딘 섭취에 의해 측정되었다. 그 결과, 인간화 S2C6 항체는 MM.1S, MM.1R, 또는 두 명의 환자로부터 분리된 종양 세포의 증식을 촉진시키지 못하였다 (p>0.1).

이들 세포에 대한 인간화 S2C6 항체의 세포독성 효과를 구체적으로 규명하기 위하여, MM.1S 및 MM.1R의 배양액을 인간화 S2C6 항체 (10 μg/ml)로 6시간 동안 처리한 후 추가적인 48시간 동안 de novo 단백질 합성 억제제인 사이클로헥시미드 (cycloheximide)(0.2 μg/ml)와 함께 배양하였다. 지시자로서 환원 3-(4,5-다이메틸티오졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT)를 이용하여 세포 생존성을 분석하였다. 인간화 S2C6 항체 및 사이클로헥시미드의 처리는 두 세포주 모두에서 50-60% 세포 사멸을 유발한 반면, 사이클로헥시미드 처리 또는 비처리 시, 아이소타입 대조군 Ig 단독 처리는 세포독성을 유발하지 않았다. 인간화 S2C6 항체는 두명의 환자 종양 세포 배양액에서 20-30% 세포독성을 유발하였는데, 이는 비독성 용량 (0.2 μg/ml)에서 사이클로헥시미드의 존재 시에 현저히 증가되었다.

실시예 4: 인간화 항-CD40 항체의 항-종양 활성

인간화 항-CD40 항체의 항-종양 활성을 SCID 림프종 이종이식 모델에서 분석하였다. 5백만개의 Ramos 종양 세포를 약물 치료를 시작하기 13일 전에 SCID 마우스 (10/그룹) 내로 피하 주사하였다. 생쥐 항-CD40 항체 또는 인간화 S2C6을 투여된 8 또는 5회분 용량으로 일주일에 3회 (4 mg/kg/용량) 복막내로 주입하였다. 종양 성장에 대해 마우스를 조사하였고, 종양 부피를 14일 연구 기간동안 매주마다 측정하였다. 도 2에 나타낸 결과는 대조군 마우스에서는 종양 성장이 거의 9-배 증가한 반면, 동일한 기간에 걸쳐, 생쥐 항-CD40 항체 또는 인간화 S2C6로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 무시할만한 수준임을 보여준다. 상기 결과는 인간화 항체가 B 림프종 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제하는데 생쥐 항-CD40 항체만큼 효과적임을 입증한다.

실시예 5: 인간화 항-CD40 항체에 의한 연장된 생존

종양이 있는 마우스의 생존에 대한 인간화 항-CD40 항체의 효과를 SCID 마우스 림프종 이종이식 모델에서 분석하였다. 항체 치료 3일 전에 백만개의 Ramos 종양 세포를 SCID 마우스 (10/그룹)의 피하에 접종하였다. 마우스를 생쥐 또는 인간화 항-CD40 항체, 또는 Ig 대조군으로 총 5회 용량에 대해 일주일에 2회 (4 mg/kg/용량) 복강내로 투여하여 처리하였다. 사망률에 대해서 마우스 우리를 매일 조사하였다. 도 3에 나타낸 결과는 대조군으로 처리된 마우스는 모두 종양 접종 후 34일 이상 생존하지 못한 반면, 생쥐 항-CD40 항체로 처리된 10마리중 8마리 마우스 및 인간화 항-CD40 항체로 처리된 모든 10마리 마우스가 종양 이식 후 90일째에도 생존하였음을 보여준다. 상기 결과는 인간화 항체가 B 림프종 이종이식 모델에서 SCID 마우스이 연장된 생존에 생쥐 항-CD40 항체만큼 효과적임을 입증한다.

특허 출원, 특허, 및 과학적 간행물을 포함하는, 다양한 참조가 본원에 인용되고, 그의 내용은 그 전체로서 참조로서 본원에 포함된다. 본원에서 임의의 참조의 인용 및 확인은 이러한 참조가 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용가능하다는 승인으로서 해석되지 않을 것이다.

본원에 기술된 기술의 적용은 본원에 기술된 특정 실시형태에 의한 범위 내로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 변형이 본원에 포함된 기술 및 그에 수반되는 실시예에 비추어 당분야의 통상적인 기술을 갖는 자의 능력 내에 포함될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. Seattle Genetics, Inc. Presta, Leonard O'Connell, Lori Doronina, Svetlana <120> Humanized Anti-CD40 Antibodies and Methods of Use <130> Hu CD40 <150> US 60/684,853 <151> 2005-05-26 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> MusMusculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Ile Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 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Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 17 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagaa 60 gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 120 tgtgcagctt ctggctacag cttcaccggt tattacatcc actgggtccg tcaggccccg 180 ggtaagggcc tggaatgggt tgcaagggtt attcctaacg ccggcggtac cagttataac 240 cagaagttca agggccgttt cacattgagc gtcgacaatt ccaaaaacac agcatacctg 300 cagatgaaca gcctgcgtgc tgaggacact gccgtctatt attgtgctcg agagggtatc 360 tactggtggg gtcaaggaac cctggtcacc gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgactg tgccctctag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 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<210> 21 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser 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Claims

인간화 중쇄 가변 도메인과 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 상기 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 각각 서열번호: 10 및 서열번호: 16의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 인간 IgG 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 IgG 불변 영역의 아이소타입이 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 항체 또는 항원-결합 단편.
제3항에 있어서, 상기 IgG 불변 영역의 아이소타입이 IgG1인 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제5항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 카파 불변 영역인 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 항체.
제7항에 있어서, 각각 서열번호: 19 및 서열번호: 22에 개시된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.
제7항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 절편, 다이아바디, 단쇄 항체, scFv 단편 또는 scFv-Fc인 항원 결합 단편
제1항 내지 제4항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 화학요법제에 접합된 항체 또는 항원-결합 단편
제11항에 있어서, 상기 화학요법제가 아우리스타틴(auristatin)인 항체 또는 항원-결합 단편.
제12항에 있어서, 상기 아우리스타틴이 MMAE 또는 MMAFT인 항체 또는 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
항체 또는 항원-결합 단편이 ATCC 기탁번호 PTA-110을 갖는 하이브리도마에 의해 분비되는 단일클론 항체와 결합하기 위해 경쟁하는, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편.
용기 내에 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, 및 생물학적 시료 내 CD40 단백질을 검출하기 위해 상기 항체를 사용하기 위한 지시 사항을 선택적으로 포함하는 킷트.
하기를 포함하는 만성 림프성 백혈병, 버킷 림프종, 다발골수종, T 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 호지킨 질환, 발데스트롬 마크로글로불린혈증, 카포시 육종 또는 면역 질환 치료용 약학 조성물:

(i) 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편; 및

(ii) 약학적으로 허용가능한 부형제.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
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