ES2354865T3 - Anticuerpos anti-cd40 humanizados y métodos para utilizarlos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a la CD40 humana, comprendiendo un dominio variable de cadena pesada humanizado y un dominio variable de cadena ligera humanizado, en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

Description

Anticuerpos anti-CD40 humanizados y métodos para utilizarlos.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional US 60/684,853, presentada el 26 de mayo de 2005.

Antecedentes

Esta invención se refiere generalmente a anticuerpos anti-CD40 humanizados para el uso terapéutico y diagnóstico. Más concretamente, se describen anticuerpos anti-CD40 humanizados y métodos de uso para el tratamiento de diversas enfermedades c trastornos caracterizados por células que expresan la CD40. También se describen composiciones farmacéuticas y productos manufacturados, tales como kits comprendiendo el anticuerpo anti-CD40 humanizado.

La CD40 es una glicoproteína de membrana integral tipo I y un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). La CD40 se expresa en una variedad de tipos de células incluyendo las células B neoplásicas y normales, células interdigitantes, células epiteliales basales y carcinomas. También está presente en monocitos, macrófagos, algunas células endoteliales y células dendríticas foliculares. La CD40 se expresa en la ontogenia temprana de células B, que aparece en precursores de células B después de la aparición de la CD10 y la CD19, pero antes de la expresión de la CD21, la CD23, la CD24, y la aparición de la inmunoglobulina superficial M (sIgM) (Uckun et al., 1990, Blood 15: 2449). Aunque los primeros informes indicaban que la CD40 se perdía en la diferenciación terminal de las células B en las células plasmáticas, se ha detectado CD40 en células plasmáticas derivadas de la médula ósea y de las amígdalas (Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84: 2597).

La interacción de la CD40 con su ligando y contrarreceptor, CD40L (también conocida como CD154, gp39, y TRAP), induce ambas respuestas inmunes, la celular y la humoral. La CD40L es una proteína transmembrana expresada predominantemente en linfocitos o células T CD4^{+} activadas. Al igual que otras proteínas de la familia del TNF, la estructura de la CD40L es la de un trímero no covalente. La señalización mediada por la CD40 parece ser necesaria para la proliferación de células B, el cambio del isotipo (Ig) de la inmunoglobulina, la formulación del centro germinal, y el cometido de las células B de memoria en respuesta al antígeno dependiente de las células T. La unión de la CD40L a la CD40 produce una multimerización de la CD40, la generación de señales de activación para las células que presentan el antígeno como las células dendríticas, monocitos y linfocitos B, y la generación de señales de crecimiento y diferenciación de fibroblastos y células epiteliales activados por citoquinas. Si bien las vías de señalización a través de las cuales las moléculas de la CD40 funcionan en la diferenciación celular no han sido completamente aclaradas, las señales de la CD40 son transducidas del receptor multimerizado a través de la incorporación de una serie de factores asociados al receptor de TNF ("TRAF") (Kehry, 1996, J. Immumol. 156: 2345-2348). Los subconjuntos de TRAF interactúan diferencialmente con miembros de la familia del receptor del TNF, incluyendo la CD40, proporcionando estímulos para una amplia variedad de vías aguas abajo. El TRAF2 y el TRAF1 están implicados en la modulación de la apoptosis (Speiser et al., 1997, J. Exp. Med. 185: 1777-1783; Yeh et al., 1997, Immunity 7: 715-725). Los TRAF 2, 5 y 6 participan en la activación y proliferación de eventos. En las células B normales, la unión de la CD40 con la CD40L incorpora el TRAF2 y el TRAF3 al complejo del receptor e induce la regulación a la baja de los TRAF (Kuhne et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 337-342).

La apoptosis y la señalización mediada por la CD40 están estrechamente vinculadas durante el desarrollo y la diferenciación de las células B. Una función principal de la apoptosis en las células B es la deleción clonal de las células B inmaduras, que se cree que es el resultado de extensos entrecruza miento de la Ig de superficie en células B inmaduras. El destino de las células B maduras también es modulado por una combinación de señalización a través de la Ig de superficie y las señales derivadas forman células T activadas, probablemente mediadas por las moléculas de la CD40L. Una combinación de las señales de la Ig de superficie y la CD40 puede reemplazar la vía apoptótica y mantener la supervivencia de las células B del centro germinal. Este rescate de la apoptosis en los centros germinales es fundamental para el desarrollo de las células B de memoria productoras de anticuerpos de afinidad.

En los tumores malignos de células T y B, a menudo se producen efectos antitumorales (detención del crecimiento con o sin apoptosis) cuando las células malignas son expuestas a estímulos que conducen a la activación de los linfocitos normales. Se ha observado esta detención del crecimiento inducido por la activación con señales a través de o bien receptores de antígenos o receptores coestimuladores (Ashwell et al., 1987, Science 237: 61; Bridges et al., 1987, J. Immumol. 139: 4242; Page y Defranco, 1988 J. Immunol. 140: 3717; y Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 501). La estimulación de la CD40 por cualquiera de entre el anticuerpo anti-CD40 o la CD40L soluble inhibe directamente el crecimiento de linfomas de células B (Funakoshi et al., 1994, Blood 83: 2787-2784).

Se han descrito varios anticuerpos monoclonales murinos (mAb) dirigidos contra la CD40 (Katira et al. 1995, "CD40 Workshop Panel Report"; en: Leukocyte Typing V, Schlossman et al., (eds) 1995, 1: 547-550). Por ejemplo, se demostró que dos mAb, el CD40.7 (M2) y el CD40.8 (M3), inhiben la unión de la CD40 a la CD40L (Fanslow et al. 1995, en: Leukocyte Typing V, Schlossman et al., (eds) 1995, 1: 555-556). La estimulación de la CD40 por los mAb M2 y M3 inhibió el crecimiento de varios linfomas de células B humanos y la regresión de tumores inducidos establecidos in vivo (Funakoshi et al., 1994, Blood 83: 2787-2794; Funakoshi et al., 1996, J. Immunol. 19: 93-101). La patente US 5,182,368 divulga un mAb murino anti-CD40, el G28-5, que puede aumentar la proliferación de células B. Una inmunotoxina monocatenaria basó la región Fv monocatenaria de líneas celulares malignas hematológicas que expresaban la CD40 humana selectivamente asesinadas in vitro por el G28-5 (Francisco et al., 1997, J Biol. Chem. 39: 24165-24169). Sin embargo, el G28-5 no mejora la activación de las células B en presencia de la CD40L y no potencia la unión de la CD40 y la CD40L. La patente US 6,838,261 (y patentes relacionadas US 6,946,129 y 6,843,989) describe una clase de variantes del mAb murino anti-CD40, el S2C6, y su uso en el tratamiento de diversos trastornos, incluyendo el cáncer y enfermedades inmunológicas e inflamatorias. Además de mejorar la estimulación mediada por la CD40L, un anticuerpo anti-CD40 descrito en la patente US 6,838,261 mostró la mejora de la interacción entre la CD40 y la CD40L, y la actividad antineoplásica in vivo. Aunque el S2C6 por sí mismo estimula la proliferación de células B de una manera similar al G28-5, el S2C6 se distingue del G28-5 por su capacidad de aumentar ``la unión a la CD40L y la magnitud posterior de la señal de activación mediada por la CD40L.

Otros mAb murinos anti-CD40, por ejemplo, descritos en la publicación internacional Número WO 95/17202, une la CD40 y muestra eficacia en el tratamiento y prevención de enfermedades caracterizadas por células neoplásicas que expresan la CD40. Aunque los anticuerpos anti-CD40 de ratón tienen una aplicación potencial como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la CD40 en humanos, su inmunogenicidad presenta la posibilidad de una respuesta a los anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano (HEMA) que limitaría su valor.

Tai, Yu-Tzu et al (Cancer Research, 2004, 64, 2846-2852) describe que un anticuerpo anti-CD40 humanizado, denominado en el documento "SGN-40", induce citotoxicidad en células de mieloma múltiple humanas. Se afirma en la página 2846, Col 2, que el "SGN-40" representa un anticuerpo anti-CD40 humanizado diseñado a partir del mAb de ratón SGN-14. No se proporciona ninguna información sobre la secuencia o estructura del anticuerpo "SGN-40" que se utilizó.

Por lo tanto, hay una demanda de anticuerpos anti-CD40 humanizados que se unan específicamente a epítopos definidos de la CD40 y que muestren la especificidad, afinidad y otras características funcionales deseadas del anticuerpo anti-CD40 no humano análogo.

Breve resumen

La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a la CD40 humana, comprendiendo un dominio variable de cadena pesada humanizado y un dominio variable de cadena ligera humanizado, en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente. En una forma de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera indicadas en la SEC ID Nº: 19 y SEQ ID Nº: 22, respectivamente.

La presente invención incluye anticuerpos anti-CD40 humanizados y fragmentos de unión al antígeno del mismo, así como métodos que usan tales anticuerpos y fragmentos anti-CD40 humanizados para el tratamiento de enfermedades y trastornos caracterizados por células que expresan el antígeno de superficie de la CD40. También se incluyen kits y productos manufacturados comprendiendo un anticuerpo anti-CD40 humanizado.

El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede incluir una región constante IgG humana, como, por ejemplo, una región constante IgG de isotipo IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede incluir un dominio constante de cadena ligera, como, por ejemplo, un dominio constante kappa.

En algunas formas de realización, el anticuerpo es hu sgn-26. En algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno compite por la unión con el anticuerpo monoclonal S2C6 que es secretado por un hibridoma que tiene el Nº de registro ATCC PTA-110.

El anticuerpo también puede ser un fragmento de unión al antígeno, tal como un Fab, un Fab', un F(ab')_{2}, un fragmento Fv, un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento scFv o un scFv-Fc. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, pueden ser opcionalmente marcados o conjugados con un agente quimioterapéutico, tal como la auristatina (por ejemplo, MMAE o MMAF).

También se proporciona un kit compuesto por un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno de la invención en un recipiente. El kit opcional puede incluir uno o varios componentes adicionales, como las instrucciones de uso de los anticuerpos para detectar la proteína CD40 en una muestra biológica.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención y uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

Se han divulgado métodos para inhibir el crecimiento de las células que expresan el antígeno de la CD40 humana. Los métodos incluyen administrar a las células un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión al antígeno, cuyo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une al antígeno de la CD40 de superficie de las células humanas. La unión
del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno de la CD40 inhibe el crecimiento o la diferenciación de las células.

En algunas formas de realización, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tenga un trastorno asociado a la CD40. Los métodos incluyen la administración al sujeto de un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión al antígeno, cuyo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a la CD40 humana. La unión del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno a la CD40 inhibe el crecimiento o la diferenciación de las células del trastorno asociado a la CD40. El trastorno asociado a la CD40 puede ser, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma de células T, linfoma de no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom o sarcoma de Kaposi.

En algunas formas de realización, se proporcionan métodos para inducir la reducción de las células B periféricas. Los métodos incluyen la administración a las células de un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión al antígeno, cuyo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a un antígeno de la CD40 de superficie de las células humanas. La unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la CD40 induce la reducción de las células. Las células B periféricas pueden, por ejemplo, exhibir reactividad autoinmune en un sujeto.

La invención se comprenderá mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada incluyendo las formas de realización preferidas, tomada conjuntamente con los dibujos y lista de secuencias adjuntos. El análisis que sigue es descriptivo, ilustrativo y ejemplar y no debe ser considerado una limitación del alcance definido por cualquiera de las reivindicaciones adjuntas.

Descripción breve de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran el polipéptido (SEC ID Nº: 18) y las secuencias de ADN complementarias y de codificación (SEC ID Nº: 17) de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD40 humanizado. La secuencia polipeptídica se anota para indicar la posición de la secuencia líder, la región variable, y la región constante IgG_{1} humana. La figura 1C muestra el polipéptido (SEC ID Nº: 21) y las secuencias de ADN complementarias y de codificación (SEC ID Nº: 20) de un anticuerpo anti-CD40 humanizado. La secuencia polipeptídica se anota para indicar la posición de la secuencia líder, la región variable, y la región constante kappa humana.

La figura 2 muestra el efecto del tratamiento con un anticuerpo de control, un anticuerpo anti-CD40 murino, y un anticuerpo anti-CD40 humanizado en el volumen de un tumor medido durante un período de dos semanas, con el tratamiento empezando 13 días después del trasplante del tumor.

La figura 3 muestra el efecto del tratamiento con un anticuerpo de control, un anticuerpo anti-CD40 murino, y un anticuerpo anti-CD40 humanizado en la supervivencia de ratones portadores de un tumor.

Descripción detallada

Para mayor claridad de la divulgación, y no como limitación, la descripción detallada de la invención se divide en los apartados que siguen.

Cuando se utilizan nombres comerciales en este documento, el nombre comercial también se refiere a la formulación del producto con nombre comercial, al medicamento genérico y a los ingredientes farmacéuticos activos del producto con nombre comercial, a menos que el contexto indique lo contrario.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia pertinente a los métodos y composiciones que se describen.

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Definiciones

Los términos "CD40" y "antígeno de superficie de la CD40" se refieren a una glicoproteína de 50 kD expresada en la superficie de células normales y neoplásicas, que actúa como un receptor de las señales implicadas en la proliferación y diferenciación celular y a la que a veces se le denomina BP50 (Ledbetter et al., 1987, J. Imunol. 138: 788-785). Se ha aislado una molécula de ADNc que codifica la CD40 de una biblioteca preparada de la línea celular Rají de un linfoma de Burkitt (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8: 1403). Una célula que expresa la CD40 es una célula que se caracteriza por la expresión en la superficie de la CD40, incluidas aunque no exclusivamente, las células B normales y neoplásicas, células interdigitantes, células epiteliales basales, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliales, células dendríticas foliculares, células de las amígdalas y células plasmáticas derivadas de la médula ósea. En algunas formas de realización, la molécula de CD40 es una molécula de CD40 humana.

Los términos "epítopo del antígeno de la CD40" y "epítopo de la CD40", se refieren, en la presente memoria, a una molécula (p. ej., un péptido) o un fragmento de una molécula capaz de reaccionar inmunológicamente con un anticuerpo anti-CD40 y, por ejemplo, incluye un determinante antigénico de la CD40 reconocido por el anticuerpo monoclonal S2C6. Los epítopos del antígeno de la CD40 se pueden incluir en proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos o similares. Los epítopos son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, oligopéptido imitadores (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión del anticuerpo al antígeno de la CD40), o combinaciones de los mismos.

En la presente memoria, "unión específica" y "se une específicamente" se refieren a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1x10^{7} M^{-1} y se une al antígeno predeterminado con una afinidad por lo menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) aparte del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado.

"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativa" se definen aquí como glicoproteínas heterotetraméricas, por lo general de alrededor de 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida covalentemente a una cadena pesada por un puente de disulfuro para formar un heterodímero. El heterotetrámero está formado por el enlace disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de dichos heterodímeros. Aunque las cadenas ligeras y pesadas están unidas entre sí por un puente disulfuro, el número de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía según el isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre las cadenas separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en el amino-terminal un dominio variable (V_{H}), seguido de tres o cuatro dominios constantes (C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 y C_{H}4), así como una región bisagra entre C_{H}1 y C_{H}2. Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable amino-terminal (V_{L}) y un dominio constante carboxi-terminal (C_{L}). El dominio V_{L} se asocia de forma no covalente al dominio V_{H}, mientras que el dominio C_{L} se suele enlazar covalentemente al dominio C_{H}1 a través de un puente disulfuro. Se cree que los residuos de ciertos aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663.)

El término "hipervariable" se refiere al hecho de que ciertas secuencias dentro de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y contienen residuos que están directamente implicados en la unión y la especificidad de cada anticuerpo en particular por su determinante antigénico específico. La hipervariabilidad, en ambos dominios variables de cadena ligera y cadena pesada, se concentra en tres segmentos conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR) o lazos hipervariables (HV_{L}). Los CDR se definen por comparación de secuencias en Kabat et al, 1991, en: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., mientras que los HV_{L} son estructuralmente definidos dependiendo de la estructura tridimensional del dominio variable, según lo descrito por Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Cuando estos dos métodos dan como resultado identificaciones ligeramente diferentes de un CDR, se prefiere la definición estructural. Según la definición de Kabat, la CDR-L1 se sitúa aproximadamente en los residuos 24-34, la CDR-L2, en aproximadamente los residuos 50-56, y la CDR-L3, en aproximadamente los residuos 89-97 en el dominio variable de cadena ligera; La CDR-H1 se sitúa en los residuos 31-35, la CDR-H2 en aproximadamente los residuos 50-65, y la CDR-H3 en aproximadamente los residuos 95-102 en el dominio variable de cadena pesada.

Las tres CDR en cada una de las cadenas pesadas y ligeras están separadas por regiones de la estructura (FR), que contienen secuencias que tienden a ser menos variables. Desde el terminal amino hasta el terminal carboxi de los dominios variables de cadena pesada y ligera, las FR y CDR están dispuestas en el orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La configuración esencialmente en lámina \beta de las FR lleva a las CDR dentro de cada una de las cadenas, así como a las CDR de la otra cadena. La conformación resultante contribuye al sitio de unión del antígeno (véase Kabat et al., 1991, NIH Publ. Nº 91-3242, vol. I, páginas 647-669), aunque no todos los residuos de las CDR están directamente involucrados en la unión del antígeno.

Los residuos de la FR y los dominios constantes de Ig no están directamente involucrados en la unión del antígeno, sino que contribuyen a la unión al antígeno y/o median en la función efectora del anticuerpo. Algunos residuos de la FR puede tener un efecto significativo en la unión al antígeno en al menos tres maneras: por la unión no covalente directamente a un epítopo, por la interactuación con uno o más residuos de la CDR, y afectando a la interconexión entre las cadenas ligeras y pesadas. Los dominios constantes no están directamente involucrados en la unión del antígeno, pero median en varias funciones efectoras de Ig, como la participación de los anticuerpos en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).

Las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas de vertebrados son asignadas a una de dos clases claramente diferenciadas, kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basadas en la secuencia de aminoácidos del dominio constante. Comparativamente, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de los mamíferos son asignadas a una de las cinco clases principales, según la secuencia de los dominios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA se dividen a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgA_{1} e IgA_{2}. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las clases de inmunoglobulinas nativas son muy conocidas.

Los términos "anticuerpo", "anticuerpo anti-CD40", "anticuerpo anti-CD40 humanizado", y "anticuerpo anti-CD40 variante humanizado" se usan aquí en el sentido más amplio y abarcan específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos, tales como dominios variables y otras partes de anticuerpos que exhiben una actividad biológica deseada, por ejemplo, de unión a la CD40.

El término "anticuerpos monoclonales" (mAb) se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos, excepto por mutaciones que ocurren naturalmente y que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un determinante antigénico único, también denominado epítopo. El modificador "monoclonal", es indicativo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos dirigidos contra el epítopo idéntico y no se interpretará como que necesita la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse por cualquier técnica o metodología conocida en la materia, por ejemplo, el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, 1975, Nature 256: 495, o métodos de ADN recombinante conocido en la materia (véase, por ejemplo, la Patente US 4,816,567). En otro ejemplo, los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos de un fago, utilizando las técnicas descritas en Clackson et al, 1991, Nature 352: 624-628, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597.

En cambio, los anticuerpos en una preparación de anticuerpos policlonales son normalmente una población heterogénea de isotipos y/o clases de inmunoglobulinas y también exhiben una variedad de especificidad con el epítopo.

En la presente memoria, el término anticuerpo "quimérico" es un tipo de anticuerpo monoclonal en el que una parte o toda la secuencia de aminoácidos es idéntica, homologa o una variación, en una o más regiones o dominios de la cadena ligera y/o pesada, de la secuencia correspondiente de un anticuerpo monoclonal de otra especie o perteneciente a otra clase o isotipo de inmunoglobulina o de una secuencia consenso. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de estos anticuerpos, siempre que el fragmento del anticuerpo exhiba la actividad biológica deseada de su anticuerpo de origen, por ejemplo uniéndose al mismo epítopo (véase, por ejemplo, la Patente US 4,816,567; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Los términos "fragmento de anticuerpo", "fragmento de anticuerpo anti-CD40", "fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado", "fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado variante" se refieren a una parte de un anticuerpo anti-CD40 de longitud completa, en el que se mantiene una región variable o una capacidad funcional, por ejemplo, la unión específica al epítopo de la CD40. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque no exclusivamente, un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, un diacuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo de cadena única, un minicuerpo, un diacuerpo formado a partir de fragmentos de anticuerpos y los anticuerpos multiespecíficos formado a partir de fragmentos de anticuerpos.

Ciertos tipos de fragmentos de anticuerpos pueden ser generados por tratamiento enzimático de un anticuerpo de longitud total. La digestión de papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fe" residual, llamado así por su capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH_{1} de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de unión al antígeno y sigue siendo capaz de entrecruzar el antígeno.

Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la presencia de algunos residuos adicionales en el extremo C-terminal del dominio CH_{1}, incluida una o varias cisternas de la región bisagra del anticuerpo. Fab-SH designa en la presente memoria un Fab' en el que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} son pares de fragmentos Fab' unidos por los residuos de cisteína en la región bisagra. También se conocen otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos.

"Fv" es un fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento del antígeno que consiste en un dímero del dominio variable de cadena ligera y pesada en estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V_{H} y V_{L}. En conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno.

Un fragmento de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" es una variante de Fv de cadena única que comprende los dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, en el que los dominios están presentes en una única cadena polipeptídica y es capaz de reconocer y unirse al antígeno. El polipéptido scFv contiene opcionalmente un enlazador polipéptido situado entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el scFv forme una estructura tridimensional necesaria para la unión del antígeno (véase, por ejemplo, Pluckthun, 1994, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos que tienen dos sitios de unión al antígeno. Cada fragmento contiene un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) concatenado con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}). Utilizando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el enlace entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios enlazados V_{H}-V_{L} son forzados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente, por ejemplo, en la EP 404,097, WO 93/11161; y por Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448.

El término "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos que incluyen un par de segmentos Fd tándem (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecífícos como se describe en, por ejemplo, Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10): 1057-1062.

Un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado incluye una variante de la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina o fragmento del mismo, que es capaz de unirse a un antígeno determinado y que consta de una o más FR teniendo substancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una o más CDR que tienen substancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Esta secuencia de aminoácidos no humanos se conoce aquí como una secuencia de "importación", que suele ser tomada de un dominio de anticuerpo de "importación", en particular un dominio variable. En general, un anticuerpo humanizado incluye por lo menos las CDR o HVL de un anticuerpo no humano, insertado entre las FR de un dominio variable de cadena ligera o pesada humano. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-CD40 humanizado contiene residuos de la CDR y/o HVL o secuencias derivadas del anticuerpo monoclonal murino S2C6 introducido entre las FR de los dominios variables de cadena ligera y pesada de la secuencia consenso humana.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-CD40 humanizado abarca prácticamente todos menos uno, y por lo general dos, dominios variables (tales como los contenidos, por ejemplo, en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fabc y Fv) en el que todas, o sustancialmente todas las CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En otro aspecto, un anticuerpo anti-CD40 humanizado también incluye por lo menos una porción de una región Fe de inmunoglobulina, normalmente de una inmunoglobulina humana. Por lo general, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera así como, por lo menos en el dominio variable, una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir una o más de las regiones bisagra C_{H}1, C_{H}2; C_{H}3, y/o C_{H}4 de la cadena pesada, según corresponda.

Un anticuerpo anti-CD40 humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgA_{1} e IgA_{2}. Por ejemplo, el dominio constante puede ser un dominio constante de fijación de un complemento en el que se desea que los anticuerpos humanizados exhiban actividad citotóxica y el isotipo es normalmente IgG_{1}. En caso de no desear la actividad citotóxica, el dominio constante puede ser de otro isotipo, por ejemplo, IgG_{2}. Un anticuerpo anti-CD40 humanizado alternativo puede comprender las secuencias de más de una clase o isotipo de inmunoglobulina, y la selección de los dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas están dentro de la experiencia normal en la materia.

Las FR y CDR, o HVL, de un anticuerpo anti-CD40 humanizado, no tienen por que corresponder exactamente a las secuencias originales. Por ejemplo, se pueden alterar uno o más residuos en la CDR o HVL de importación, o la secuencia consenso de la FF (por ejemplo, mutagenizado) por sustitución, inserción o deleción de tal manera que los residuos aminoácidos resultantes ya no sean idénticos al residuo original en la posición correspondiente en cualquier secuencia original. Tales alteraciones, sin embargo, no serán normalmente extensivas. Por lo general, al menos el 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias de la CDR de importación y la FR de consenso, más frecuentemente al menos el 90%, y lo más frecuente es que sea mayor del 95% o mayor del 98% o mayor del 99%.

Los residuos de inmunoglobulina que afectan a la interconexión entre las regiones variables de cadena ligera y pesada ("la interconexión de V_{L}-V_{H}") son aquellos que afectan a la proximidad u orientación mutua de las dos cadenas. Algunos residuos que pueden estar implicados en las interacciones intercatenarias incluyen los residuos V_{L} 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 y 98 y los residuos V_{H} 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 y 103 (utilizando el sistema de numeración establecido en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1987)). Otros residuos incluyen los residuos V_{L} 43 y 85 y los residuos V_{H} 43 y 60, como se describe en la patente US 6,407,213. Aunque estos residuos están indicados sólo para la IgG humana son aplicables en todas las especies. Los residuos de anticuerpos de importación que pueden esperarse razonablemente que participen en las interacciones intercatenarias se seleccionan para la sustitución en la secuencia consenso.

Los términos "secuencia consenso" y "anticuerpo consenso" se refieren en la presente memoria a una secuencia de aminoácidos que comprende el residuo de aminoácido que ocurre más frecuentemente en cada lugar en todas las inmunoglobulinas de una determinada clase, isotipo o estructura de la subunidad, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina humana. La secuencia consenso se puede basar en las inmunoglobulinas de una especie en particular o de muchas especies. Se entiende que una secuencia, estructura o anticuerpo "consenso" abarca una secuencia consenso humana como se describe en algunas formas de realización y se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácidos que ocurren más frecuentemente en cada lugar en todas las inmunoglobulinas humanas de una determinada clase, isotipo o estructura de la subunidad. Se proveen estructuras consenso humanas y estructuras consenso que consideran otras especies, además de la humana. Por lo tanto, la secuencia consenso contiene una secuencia de aminoácidos que tiene en cada posición un aminoácido que está presente en una o más inmunoglobulinas conocidas, pero que puede que no reproduzca exactamente toda la secuencia de aminoácidos de cualquier inmunoglobulina sola. La secuencia consenso de la región variable no se obtiene de cualquier anticuerpo o inmunoglobulina producido naturalmente. Las secuencias consenso útiles incluyen una secuencia consenso kappa I de cadena ligera variable humana (SEC ID Nº: 13) y una secuencia consenso del subgrupo III de cadena pesada variable humana (SEC ID Nº: 2) derivadas de los datos proporcionados en Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., y sus variantes. Las FR de las secuencias consenso de cadena ligera y pesada, y variantes de las mismas, proporcionan secuencias útiles para la preparación de anticuerpos anti-CD40 humanizados. Véase, por ejemplo, la patente US 6,037,454 y 6,054,297. En algunas formas de realización, la FR utilizada para preparar los anticuerpos humanizados se obtuvieron a partir de secuencias consenso para una secuencia consenso kappa I de cadena ligera variable humana y de una secuencia consenso del subgrupo III de cadena pesada variable humana.

En la presente memoria, "variante", "variante de anti-CD40", "variante de anti-CD40 humanizado", o "variante humanizado de anti-CD40" se refieren a un anticuerpo anti-CD40 humanizado que tiene al menos una secuencia de CDR o HVL variable de cadena pesada derivada del anticuerpo monoclonal murino S2C6 y secuencias de FR derivadas de secuencias consenso humanas. Las variantes incluyen las que tienen uno o más cambios de aminoácidos en uno o ambos dominios variables de cadena ligera o cadena pesada, siempre que el cambio de aminoácido no altere sustancialmente la unión del anticuerpo a la CD40. Los variantes de anti-CD40 humanizado normalmente incluyen sustituciones de aminoácidos que mejoran el rendimiento del anticuerpo al permitir un plegado mejor de la molécula del anticuerpo.

Un anticuerpo "aislado" es el que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes del entorno natural del anticuerpo son aquellos materiales que puedan interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos de los anticuerpos, y pueden ser enzimas, hormonas u otros solutos proteicos o no proteicos. En un aspecto, el anticuerpo se purifica:

(a)

con un aislamiento mayor del 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y en otro aspecto, con un aislamiento mayor del 99% en peso, o

(b)

en un grado de aislamiento suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o la secuencia de aminoácidos interna mediante el uso de un secuenciador de semiesferas giratorias, o

(c)

hasta su homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras visualizadas utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata.

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Un anticuerpo aislado incluye un anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos uno de los componentes del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente sin embargo, se preparará un anticuerpo aislado mediante por lo menos una etapa de purificación.

El término "rendimiento del anticuerpo" se refiere a los factores que contribuyen al reconocimiento por parte de los anticuerpos del antígeno o la efectividad de un anticuerpo in vivo. Los cambios en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo que pueden afectar a las propiedades de los anticuerpos, tales como el plegado, y pueden influir en factores físicos como la velocidad inicial de la unión del anticuerpo al antígeno (v_{o}), la constante de disociación del anticuerpo del antígeno (Kd), la constante de afinidad del anticuerpo hacia el antígeno, la conformación de los anticuerpos, la estabilidad de las proteínas y la vida media de los anticuerpos.

En la presente memoria, el término "etiquetado con un epítopo" se refiere a un anticuerpo anti-CD40 fusionado a una "etiqueta de epítopo". Una "etiqueta de epítopo" es un polipéptido que tiene un número suficiente de aminoácidos para proporcionar un epítopo para la producción de anticuerpos, sin embargo, está diseñado de tal forma que no interfiera con la actividad deseada del anticuerpo anti-CD40 humanizado. La etiqueta de epítopo suele ser lo suficientemente única para que un anticuerpo cultivado contra la etiqueta de epítopo no produzca sustancialmente una reacción cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos adecuados para la etiqueta generalmente contienen por lo menos 6 residuos de aminoácidos y normalmente contienen de 8 a 50 residuos de aminoácidos, o aproximadamente de 9 a 30 residuos. Ejemplos de etiquetas de epítopo y del anticuerpo que se une al epítopo incluyen el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; la etiqueta c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al, 1985, Mol., Cell. Biol. 5(12): 3610-3616, y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). En algunas formas de realización, la etiqueta de epítopo es un "epítopo salvaje de unión del receptor". En la presente memoria, el término "epítopo salvaje de unión del receptor" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula de IgG (como IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}) que es responsable del aumento de la vida media de la molécula de IgG en suero in vivo.

El término "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Se entiende que el término incluye los isótopos radiactivos (tales como, I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), los agentes quimioterapéuticos, y las toxinas, como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, y los fragmentos de los mismos. Tales agentes citotóxicos se pueden acoplar a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40 humanizado, utilizando los procedimientos estándares conocidos, y utilizarlos, por ejemplo, para tratar a un paciente indicado para la terapia con el anticuerpo.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico de utilidad en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes qimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN^{TM}); alquilosulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aciridinas como benzodopa, carboquone, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluidas la altretamina, trietilenomelamína, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trímetilolomelamína; acetogeninas (especialmente bullatacin y bullatacinona); camptotecina (incluido el análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin y bizelesin); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina, auristatina, (incluyendo los análogos monometil-auristatina E y monometil-auristatina F); duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina, mostazas nitrogenadas, tales como clorambucil, clornafazina, ciclofosfamida, ifosfamida estramustina, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina; trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediinas (por ejemplo, caliquamicina, especialmente caliquamicina gamma II y caliquemicina phi II, véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl.; 33: 183- 186; dinemicina, incluida la dinemicina A, bifosfonatos, como el clodronato; esperamicina, así como neocarcinostatina cromófora y cromoproteínas antibióticas de enediina cromóforas relacionadas), aclacinomísinas, actinomicinas, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamycin^{TM}) (incluidas morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y deoxidoxorrubicina), epirrubucina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato, análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido, nitrato de galio; hidróxido de yurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona, mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina, ácido podofilínico; losoxantrona, 2-etilhidrazida, procarbazina, PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio, ácido tenuazónico; triazicuona, 2,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina 1-2, verrucarina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitabronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (Gemzar^{TM}), 6-tioguanina; mercaptopurina, metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino, vinblastina, platino, etopósido (VP-16), ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina (Navelbine^{TM}); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina, xeloda, ibandronato, CPT-11, inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO), retinoides, tales como ácido retinóico, capecitabina, y sales, ácidos, o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en los tumores como los antiestrógenos y los moduladores selectivos de los receptores estrogénicos(SERM), como, por ejemplo, el tamoxifeno (incluido Nolvadex^{TM}), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston^{TM}); inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, 4(5)-¡midazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace^{TM}), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor^{TM}), letrozol (Femara^{TM}), y anastrozol (Arimidex^{TM}) y antiandrógenos como flutamida, nilutamida, bicaluta-
mida, leuprolida y goserelina, y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

El término "profármaco" en la presente memoria se refiere a un precursor o forma derivada de un principio activo farmacéutico que es menos citotóxico para las células del tumor en comparación con el fármaco original y puede ser enzimáticamente activado o convertido en la forma más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", en Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast y Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, en: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Los profármacos útiles incluyen, aunque no exclusivamente, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por aminoácidos D, profármacos glicosilados, profármacos que contienen beta-lactamo, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida y profármacos que contienen fenilamida opcionalmente sustituida, profármacos de 5-fluorocitosina y 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivatizados en forma de profármaco incluyen, aunque no exclusivamente, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

El término "marca" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo. La marca puede ser detectable en sí (por ejemplo, las marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, pueden catalizar la modificación química de un compuesto o una composición del sustrato que es detectable. El anticuerpo anti-CD40 humanizado marcado se puede preparar y utilizar en varias aplicaciones incluidos los diagnósticos in vitro e in vivo.

Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos, y/o surfactantes. Los liposomas son útiles para la administración a un mamífero de un compuesto o formulación, tal como un anticuerpo anti-CD40 humanizado divulgado en la presente memoria, opcionalmente, junto a o en combinación con uno o más agentes farmacéuticamente activos. Los componentes de los liposomas son comúnmente dispuestos en forma de doble capa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es una distinta de la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que normalmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica distinta a la de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo huésped en particular. Las secuencias de control adecuadas para su uso en las células procariotas, incluyen, por ejemplo, las secuencias promotora, operadora y de sitio de unión al ribosoma. Las secuencias de control eucarióticas incluyen, aunque no exclusivamente, las promotoras, las señales de poliadenilación, y potenciadoras. Estas secuencias de control se pueden utilizar para la expresión y la producción del anticuerpo anti-CD40 humanizado en las células huésped eucarióticas y procarióticas.

Una secuencia de ácido nucleico está "unida operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una presecuencia de ácido nucleico o líder secretora está unida operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si se expresa como un preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma es unido operativamente a una secuencia de codificación si se coloca de tal manera que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y, en el caso de una líder secretora, contigua y en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores están opcionalmente contiguos. La unión se puede realizar ligando en los sitios de restricción
convenientes. Si no existieran tales sitios se pueden utilizar adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos.

En la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas estas designaciones incluyen la progenie de los mismos. Por lo tanto, "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto principal y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o que ocurren naturalmente. Se incluye la progenie mutante que tenga la misma función o actividad biológica que la seleccionada en la célula transformada originalmente. En caso de tener designaciones distintas, éstas quedarán aclaradas por el contexto.

El término "mamífero" a los efectos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para practicar deportes o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, y similares. Preferiblemente, el mamífero es humano.

Un "trastorno", como se usa aquí, es cualquier condición que se beneficiaría de un tratamiento con un anticuerpo anti-CD40 humanizado descrito en la presente memoria. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades incluidas las condiciones patológicas que predisponen a los mamíferos al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitadores o trastornos a tratar incluyen en esta memoria el cáncer, neoplasias hematológicas, tumores benignos y malignos, leucemias y afecciones linfoides e inflamatorias, y trastornos angiogénicos e inmunológicos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a, o describen el estado fisiológico en los mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular descontrolado. Ejemplos de cáncer incluyen, aunque no exclusivamente, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.

En la presente memoria, el término "trastorno asociado a la CD40" o "enfermedad asociada a la CD40" se refiere a una condición en la que está indicada la modificación o eliminación de células que expresan la CD40. Estas incluyen células que expresan la CD40 que demuestren una proliferación anormal o células que expresan la CD40 que están asociadas a un crecimiento maligno o canceroso. Los ejemplos más concretos de cánceres que demuestran la expresión anormal del antígeno de la CD40 incluyen células B linfoblastoides, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfomas de células T, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, tumores endoteliales y epidérmicos y cáncer de páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata, cabeza y cuello, piel (melanoma), vejiga y riñón. Estos trastornos incluyen, aunque no exclusivamente, leucemias, linfomas, incluyendo el linfoma de células B y linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumores sólidos, incluidos sarcomas, como osteosarcoma, sarcoma de Ewing, melanoma maligno, adenocarcinoma, incluido el adenocarcinoma de ovario, sarcoma de Kaposi/tumor de Kaposi y carcinoma de células escamosas.

Un trastorno asociado a la CD40 también incluye enfermedades y trastornos del sistema inmunológico, tales como trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios. Estas condiciones incluyen, aunque no exclusivamente, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES), esclerodermia, síndrome de Sjögren, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), inflamación pulmonar, asma, y púrpura trombocitopénica idiopática (PTI).

La frase "detiene el crecimiento" o "inhibidor del crecimiento" se refiere en la presente memoria a inhibir el crecimiento o proliferación de una célula, especialmente un tipo de células neoplásica que expresa el antígeno de la CD40. Por lo tanto, la inhibición del crecimiento, por ejemplo, reduce significativamente el porcentaje de células neoplásicas en fase S.

El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un agente dentro de la vena de un paciente animal o humano durante un período de tiempo mayor de aproximadamente 15 minutos, generalmente entre 30 a 90 minutos.

El término "bolo intravenoso" o "inyección intravenosa rápida" se refiere a la administración del fármaco en una vena de un animal o humano de tal manera que el cuerpo reciba el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, generalmente 5 minutos o menos.

El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un agente bajo la piel de un paciente animal o humano, preferiblemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, con la administración relativamente lenta y constante desde un receptáculo con el fármaco. El pellizcado o retirada de la piel hacia arriba separándola del tejido subyacente puede crear la bolsa.

El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, preferiblemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, con la administración relativamente lenta y constante desde un receptáculo con fármaco durante un período de tiempo incluyendo, aunque no exclusivamente, 30 minutos o menos o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión se puede hacer mediante la implantación subcutánea de una bomba de administración del fármaco implantada bajo la piel del paciente animal o humano, donde la bomba descarga una cantidad predeterminada de fármaco durante un período predeterminado de tiempo, como 30 minutos, 90 minutos, o un período de tiempo que abarque la duración del régimen de tratamiento.

El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco por debajo de la piel de un paciente animal o humano, donde la administración del bolo de fármaco es menor a aproximadamente 15 minutos, en otro aspecto, menos de 5 minutos, y en otro aspecto más, menos de 60 segundos. Sin embargo, incluso en otro aspecto, la administración se encuentra dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, en las que se crea pellizcando o retirando la piel hacia arriba y separándola del tejido subyacente.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se utiliza para referirse a una cantidad de un agente activo que produce un resultado beneficioso en el paciente, por ejemplo, el efecto de detener el crecimiento o provocar la supresión de la célula. En un aspecto, la cantidad terapéuticamente efectiva tiene actividad apoptótica, o es capaz de inducir la muerte celular. En otro aspecto, la cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una concentración sérica objetivo que ha demostrado ser eficaz en, por ejemplo, ralentizar la progresión de la enfermedad. La eficacia se puede medir de una manera convencional, dependiendo de la condición que se pretenda tratar. Por ejemplo, en enfermedades neoplásicas o trastornos caracterizados por células que expresan la CD40, la eficacia se puede medir evaluando el tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) o determinando las velocidades de respuesta (RR).

Los términos "tratamiento" y "terapia" y similares, en la presente memoria se entiende que incluyen medidas terapéuticas, así como profilácticas o supresoras para una enfermedad o trastorno que conduzca a cualquier efecto clínicamente conveniente o beneficioso, incluyendo, aunque no exclusivamente, la reducción o alivio de uno o más síntomas y la regresión, desaceleración o interrupción de la progresión de la enfermedad o trastorno. Así, por ejemplo, el tratamiento a largo plazo incluye la administración de un agente antes o después de la aparición de un síntoma de una enfermedad o trastorno evitando o eliminando uno o más signos de la enfermedad o trastorno. Como otro ejemplo, el término incluye la administración de un agente después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad. Además, en la presente memoria, "tratamiento" o "terapia" comprende la administración de un agente después de la aparición y después de que se hayan desarrollado los síntomas clínicos, cuando la administración afecte a los parámetros clínicos de la enfermedad o trastorno como el grado de lesión de los tejidos o la cantidad o la extensión de la metástasis, conduzca el tratamiento o no a la mejora de la enfermedad.

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, administración, contraindicaciones y advertencias sobre el uso de tales productos terapéuticos.

La abreviatura "AFP" se refiere a dimetilvalino-valino-dolaisoleuino-dolaproino-fenilalanino-p-fenileno-diamina.

La abreviatura "MMAE" se refiere a monometilauristatina E.

La abreviatura "AEB" se refiere a un éster producido mediante la reacción de auristatina E con ácido paraacetilbenzóico.

La abreviatura "AEVB" se refiere a un éster producido mediante la reacción de auristatina E con ácido benzoilvalérico.

La abreviatura "MMAF" se refiere a dovalíno-valino-dolaisoleuníno-dolaproino-fenilalanina.

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Anticuerpos

En la presente memoria se describen y divulgan anticuerpos anti-CD40 humanizados y composiciones y productos manufacturados comprendiendo un anticuerpo anti-CD40 humanizado. También se describen los agentes de unión que incluyen un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-CD40 humanizado. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados y agentes de unión pueden detener el crecimiento de las células, provocar la eliminación de las células que expresan la CD40 o inducir de otra manera o provocar un efecto citostático o citotóxico en las células diana. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados y agentes de unión se pueden utilizar en el tratamiento de una variedad de enfermedades o trastornos que se caracterizan por la proliferación de células que expresan el antígeno de superficie de la CD40.

Un anticuerpo anti-CD40 humanizado y un agente de unión a la CD40 incluyen cada uno por lo menos una porción que reconoce específicamente un epítopo de CD40 (es decir, un fragmento de unión al antígeno). En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-CD40 humanizado o un agente de unión a la CD40 incluye un fragmento de unión al antígeno que compite por la unión con el anticuerpo S2C6.

En algunas formas de realización, el fragmento de unión al antígeno puede, por ejemplo, bloquear la proliferación o detener de otra manera el crecimiento de una célula o causar su agotamiento, muerte, o de otra manera su supresión, por ejemplo, uniéndose al antígeno de superficie de la CD40. Por ejemplo, en tumores malignos de células T y B, a menudo se producen efectos antitumorales (detención del crecimiento con o sin apoptosis) cuando las células malignas son expuestas a estímulos que conducen a la activación de los linfocitos normales. Se ha observado esta detención del crecimiento inducido por la activación con señales a través de o bien receptores de antígenos o receptores coestimuladores (véase, p. ej., Ashwell et al; 1987, Science 237: 61; Bridges et al., 1987, J. Immumol. 139: 4242; Page y Defranco, 1988, J. Immunol. 140: 3717; y Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 501). La estimulación de la CD40 como resultado de la unión específica por bien un anticuerpo o ligando soluble, inhibe el crecimiento de linfomas de células B (véase, p. ej., Funakoshi et al., 1994, Blood 83: 2787-2794). Los agentes que inhiben el crecimiento de células malignas de esta manera y que se dirigen contra el antígeno de superficie de la CD40, son ejemplos de agentes apropiados.

Los agentes específicos de la CD40 incluyen un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-CD40 humanizado que se une a la CD40 (por ejemplo, CD40 humana o una variante de la misma). Los agentes y anticuerpos específicos de la CD40 pueden ser opcionalmente conjugados con o fusionados a un agente citotóxico o quimioterapéutico. En aspectos en los que el anticuerpo humanizado se une al antígeno de superficie de la CD40 y causa el agotamiento de los tipos de célula que expresan la CD40, la unión se caracteriza generalmente por dirigirse a la célula del antígeno de superficie de la CD40 in vivo. Los agentes de unión al antígeno de la CD40 unen con afinidad y/o avidez suficiente para que el agente específico de la CD40 sirva como agente terapéutico dirigido específicamente a una célula que expresa el antígeno.

En un aspecto, el agente es un anticuerpo humanizado que contiene las CDR del anticuerpo monoclonal murino S2C6. (El anticuerpo S2C6 lo ha descrito, por ejemplo, Paulie et al., 1984, Cancer Immunol. Immunother. 17: 165-179.) El anticuerpo S2C6 ha mostrado ejercer una actividad agonista en células B periféricas humanas, como lo demuestra la capacidad del anticuerpo para estimular la proliferación primaria de células B de una manera dependiente de la dosis (véase, por ejemplo, Paulie et al., 1989, J. Immunol. 142: 590-595), así como la actividad antineoplásica in vivo (véase, por ejemplo, la patente US 6,838,261).

En algunos aspectos, el anticuerpo humanizado aumenta la unión del ligando de la CD40 a la CD40 en al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 60% o al menos el 75%. En la patente US 6,838,261 se describe un método para determinar los aumentos en la unión del ligando de la CD40 a la CD40.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-CD40 humanizado, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno del mismo, tales como los dominios variables de cadena ligera y pesada, comprenden una secuencia de aminoácidos de los residuos derivados de las CDR o HV_{L} del anticuerpo murino S2C6 (véase, por ejemplo, la patente US 6,838,261) y los residuos de aminoácidos derivados de las regiones de la estructura de una inmunoglobulina humana. En un aspecto, los aminoácidos de una región de estructura humana se derivan de las secuencias consenso humana para el dominio variable del subgrupo III de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera kappa como se describe en la patente US 6,037,454. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados incluyen opcionalmente sustituciones específicas de aminoácidos en las regiones de la estructura consenso.

La sustitución específica de residuos de aminoácidos en estas posiciones de la estructura puede mejorar varios aspectos del funcionamiento del anticuerpo incluyendo la afinidad y/o la estabilidad de la unión, más que demostrado en la humanización de anticuerpos formados por "intercambio directo" de CDR o HVL en las regiones de la estructura consenso humana, como se muestra en los ejemplos siguientes.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-CD40 humanizado descrito en la presente memoria comprende al menos un dominio variable de cadena ligera o pesada que comprende las CDR o HV_{L} del anticuerpo monoclonal murino S2C6 y las FR de los dominios variables de cadena ligera y pesada que tienen las sustituciones específicas descritas en la Tabla 5. En las Tablas 3 y 4, respectivamente, se muestra una alineación de las secuencias variables de aminoácidos de cadena pesada con sustituciones y de las secuencias variables de aminoácidos de cadena ligera con sustituciones. Estas secuencias incluyen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-CD40 humanizado es un fragmento del anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos se pueden obtener a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117; y Brennan et al., 1985, Science 229: 81). Por otra parte, los fragmentos se pueden producir directamente en las células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden recuperar fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli y acoplarlos químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (véase, p. ej., Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167). Se pueden aislar fragmentos F(ab')_{2} con otro procedimiento directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los expertos en la materia deducirán otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos.

Algunas formas de realización incluyen un fragmento F(ab')_{2} de un anticuerpo anti-CD40 humanizado que comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente. Estas formas de realización pueden incluir un anticuerpo intacto que comprenda dicho F(ab')_{2}.

En algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluye una región constante que interviene en la función efectora. La región constante puede proporcionar las respuestas de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra una célula diana que exprese la CD40. El o los dominios efectores pueden ser, por ejemplo, una región Fe de una molécula de Ig. Normalmente, el agente de unión a la CD40 incorpora y/o activa leucocitos citotóxicos (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), células fagocitóticas (por ejemplo, macrófagos), y/o componentes complementarios del suero).

El dominio efector de un anticuerpo puede ser de cualquier isotipo y especie de animal vertebrado. Los isotipos de las diferentes especies animales difieren en la capacidad para mediar en las funciones efectoras. Por ejemplo, la capacidad de la inmunoglobulina humana para mediar en la respuesta CDC y ADCC/ADCP se encuentra generalmente en el orden de IgM\approxIgG_{1}\approxIgG_{3}>IgG_{2}>IgG_{4} e IgG_{1}\approxIgG_{3}>IgG_{2}/IgM/IgG_{4}, respectivamente. Las inmunoglobulinas murinas median en la respuesta CDC y ADCC/ADCP generalmente en el orden de la IgM\approxIgG_{3}>>IgG_{2b}>>IgG_{2a}>>IgG_{1} e IgG_{2b}>IgG_{2a}>IgG_{1}>>IgG_{3} murina, respectivamente. En otro ejemplo, la IgG_{2a} murina media en la respuesta ADCC mientras que ambas IgG_{2a} e IgM murinas median en la respuesta CDC.

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Modificaciones del anticuerpo

Los anticuerpos y agentes anti-CD40 humanizados pueden incluir modificaciones del anticuerpo anti-CD40 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora para aumentar la eficacia de los anticuerpos en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Una de estas modificaciones es la introducción de residuo(s) de cisteína en la región Fe, lo que permite la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener mejor capacidad de interiorización y/o mayor capacidad de matar células mediada por un complemento y/o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase, por ejemplo, Carón et al., 1992, J. Exp Med. 176: 1191-1195; y Shopes, 1992, J. Immunol. 148: 2918-2922. Los anticuerpos homodiméricos con una actividad antitumoral potenciada también se pueden preparar utilizando reticulantes heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo para que contenga dos regiones Fe, potenciando la lisis del complemento y las capacidades de respuesta ADCC del anticuerpo. Véase Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.

Se han generado anticuerpos con capacidad mejorada para apoyar la respuesta ADCC modificando el patrón de glicosilación de su región Fe. Esto es posible porque la glicosilación de anticuerpos en el residuo asparagina, N297, en el dominio CH_{2} está implicada en la interacción entre los receptores de IgG y Fc\gamma, requisito previo para la ADCC. Las líneas celulares huésped han sido diseñadas para expresar anticuerpos con glicosilación alterada, como la mayor bisección de la N-acetilglucosamina o menor fucosa. La reducción de fucosa proporciona una mayor potenciación de la actividad ADCC que aumenta la presencia de N-acetilglucosamina de bisección. Por otra parte, la potenciación de la ADCC por la menor fucosa es independiente del polimorfismo del Fc\gammaRIIIa V/F.

La modificación de la secuencia de aminoácidos de la región Fe de los anticuerpos es una alternativa a la ingeniería de glicosilación para potenciar la ADCC. El sitio de unión en la IgG_{1} humana para los receptores Fc\gamma ha sido determinado por el análisis mutacional extensivo. Esto llevó a la generación de anticuerpos de IgG_{1} humanizado con mutaciones de Fe que aumentan la afinidad de unión de Fc\gammaRIIIa y potencian la ADCC in vitro. Además, se han obtenido variantes de Fc con muchas permutaciones diferentes de las propiedades de unión, por ejemplo, mejor unión a receptores específicos Fc\gammaR sin variar ni disminuir la unión a otros receptores Fc\gammaR.

En algunas formas de realización, la región Fe puede ser modificada como se describe en las publicaciones de las solicitudes de patentes US 2006-0003412 y 2006-0008883.

Otro aspecto incluye inmunoconjugados comprendiendo el anticuerpo humanizado o fragmentos del mismo conjugado a un agente citotóxico, como un agente quimioterapéutico, una toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Los fármacos quimioterapéuticos que sirven para la generación de estos inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar para formar inmunoconjugados útiles incluyen difteria de cadena A, fragmentos activos de no unión de la toxina diftérica, exotoxina de cadena A (de Pseudomonas aeruginosa), ricina de cadena A, abrina de cadena A, modeccina de cadena A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas (PAPI, PAPII, y PAP-S) de Phytolaca americana, inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, y similares. Hay una variedad de radionucleidos disponibles para la producción de anticuerpos anti-CD40 humanizados radioconjugados. Los ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados del anticuerpo anti-CD40 humanizado y del agente citotóxico o quimioterapéutico pueden hacerse por métodos conocidos, usando una variedad de agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionales (tales como dimetiladipimidato HCL), ésteres activos (como disuccinimidilsuberato), aldehidos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como el tolueno 2,6-diisocianato), compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina ricina como se describe en Vitetta et al., 1987, Science 238: 1098. El ácido triaminopentaacético de 1-isotiocianatobencil-3-metíldietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 94/11026. También se pueden formar conjugados con un enlazador escindible, como se divulga en la publicación de la solicitud de patente europea EP 0 624 377.

En otra forma de realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como estreptavidina) para su utilización en el preestablecimiento de dianas. En este procedimiento, se administra a un paciente el conjugado anticuerpo-receptor, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación por un agente clarificador y la administración de un "ligando" que une selectivamente el receptor (por ejemplo, avidina), el ligando conjugándose a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados divulgados en la presente memoria también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030; y patentes US 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas que tienen un mayor tiempo de circulación se describen, por ejemplo, en la patente US 5,013,556.

Se pueden generar liposomas particularmente útiles por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina obtenida con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo que se divulgan en la presente memoria pueden ser conjugados con los liposomas como se describe en Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288 a través de una reacción de intercambio de disulfuro. El liposoma contiene opcionalmente un agente quimioterapéutico (como la doxorrubicina). Véase, p. ej., Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19): 1484.

Los anticuerpos descritos y divulgados en la presente memoria también se pueden utilizar en procedimientos de ADEPT (terapia con profármacos dirigidos contra complejos de anticuerpo y enzima) conjugando el anticuerpo a una enzima activadora del profármaco que convierte el profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo), en un fármaco activo contra el cáncer. Véase, por ejemplo, las patentes WO 81/01145, WO 88/07378 y US 4,975,278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para la ADEPT es una enzima capaz de actuar en un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa. Las enzimas específicas que sirven para la ADEPT incluyen, aunque no exclusivamente, la fosfatasa alcalina para convertir profármacos que contengan fosfato en fármacos libres; aril sulfatasa para convertir profármacos que contengan sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa para convertir profármacos de 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco contra el cáncer, 5-fluorouracil proteasas, tales como la serratia proteasa, termolisina, subtílisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L), para convertir profármacos que contengan péptidos en fármacos libres, D-alanilcarboxipeptidasas, para convertir profármacos que contengan sustitutos de aminoácidos D, enzimas de separación de hidratos de carbono tales como la beta-galactosidasa y la neuraminidasa para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; beta-lactamasa para convertir fármacos derivatizados con beta-lactamos en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como la penicilina V amidasa o la penicilina G amidasa, para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenilacetilo o fenoxiacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos con actividad enzimática ("aczimas") para convertir profármacos en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Los conjugados de anticuerpo-aczima se pueden preparar por métodos conocidos para la administración de la aczima a una población de células tumorales, por ejemplo, uniendo covalentemente la enzima al anticuerpo anti-CD40 humanizado/reactivos de reticulación heterobifuncionales explicados arriba. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo divulgado en la presente memoria enlazado a por lo menos una parte funcionalmente activa de una enzima como se ha descrito anteriormente se puede
construir utilizando técnicas de ADN recombinante (véase, p. ej., Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608).

En algunas formas de realización, puede ser conveniente usar un fragmentos de anticuerpo anti-CD40 humanizado en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración en el tumor, por ejemplo. Puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para aumentar su vida media en el suero. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo. En un método, la región apropiada del fragmento de anticuerpo puede ser alterada (por ejemplo, mutada), o el epítopo puede ser incorporado en una etiqueta de péptido que se funde con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el centro, por ejemplo, por síntesis del péptido o del ADN. Véase, p. ej., WO 96/32478.

En otras formas de realización también se incluyen las modificaciones covalentes del anticuerpo anti-CD40 humanizado. Éstas pueden hacerse por síntesis química o por escisión enzimática o química de los anticuerpos, en su caso. Se pueden introducir otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la molécula mediante la reacción de los residuos de aminoácidos identificados del anticuerpo con un agente de derivación orgánica que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos amino- o carboxil-terminales

Las modificaciones covalentes incluyen la modificación de los residuos cisteinilo, los residuos histidilo, los residuos lisinilo y amino-terminal, los residuos arginilo, residuos tirosilo, los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo), y los residuos glutaminilo y asparaginilo o los residuos serilo o treonilo. Otro tipo de modificación covalente implica acoplar glucósidos química o enzimáticamente al anticuerpo.

La eliminación de cualquier resto de hidratos de carbono presente en el anticuerpo se puede lograr química o enzimáticamente. La deglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118: 131. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono sobre los anticuerpos puede lograrse utilizando una variedad de endo- y exo-glicosidasas según lo descrito por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350.

Otro tipo de modificación covalente útil comprende enlazar el anticuerpo a una de una variedad de polímeros no protéicos, por ejemplo, el polietilenoglicol, el polipropilenoglicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en una o más de la patentes US 4,640,835, US 4,496,689, US 4,301,144, US 4,670,417, US 4,791,192 y US 4,179,337.

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Humanización y variantes de la secuencia de aminoácidos

El Ejemplo 1, que sigue a continuación, describe los procedimientos para la humanización de un anticuerpo anti-CD40, mientras que el Ejemplo 2 describe las variantes. En algunas formas de realización, puede ser deseable generar variantes de la secuencia de aminoácidos de estos anticuerpos humanizados, especialmente cuando éstas mejoran la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD40 se pueden preparar introduciendo cambios apropiados en los nucleótidos del ADN del anticuerpo anti-CD40 o por la síntesis de péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones en y/o sustituciones de los residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-CD40 de los ejemplos de esta memoria. Se hace cualquier combinación de las supresiones, inserciones y sustituciones para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos de traducción a posteriori del anticuerpo anti-CD40 humanizado o variante, como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo anti-CD40 que son los lugares preferidos para la mutagénesis se llama "mutagénesis por escaneo de alanina", según lo descrito por Cunningham y Wells (Science 244: 1081-1085 (1989)). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituye por un aminoácido cargado negativamente o neutro (normalmente alanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno de la CD40. Aquellos lugares de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones a continuación se refinan mediante la introducción de otras variantes más en, o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí no tiene por qué ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se realiza un escaneado de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes del anticuerpo anti-CD40 expresadas son examinadas para detectar la actividad deseada.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el amino- y/o carboxil-terminal que varían en longitud de un residuo a los polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como inserciones entre secuencias de múltiples residuos de aminoácidos o individuales. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-CD40 fusionado en una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo anti-CD40 incluyen una fusión en el C-terminal del anticuerpo anti-CD40 de una enzima o un polipéptido que aumente la vida media de los anticuerpos en el suero.

Otro tipo de variante es una variante de la sustitución del aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula del anticuerpo anti-CD40 eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución son las regiones hipervariables aunque también se contemplan las alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1, bajo el epígrafe de "sustituciones preferidas". Si el resultado de tales sustituciones es un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares", o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y examinar los productos.

TABLA 1

1

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Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de los anticuerpos se realiza mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en sus efectos de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar de destino, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos que ocurren naturalmente se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de la cadena lateral:

\bullet

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

\bullet

(2) neutros hidrofílicos: cys, ser, thr;

\bullet

(3) ácidos: asp, glu;

\bullet

(4) básicos: asn, gin, his, lys, arg;

\bullet

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro, y

\bullet

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

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Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases a otra clase.

Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación adecuada de la variante o anticuerpo anti-CD40 humanizado también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad a la oxidación de la molécula, prevenir la reticulación aberrante o proporcionar los puntos establecidos de conjugación a un compuesto citotóxico o citostático. Por el contrario, se pueden añadir una o varias uniones de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como un fragmento Fv).

Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo ulterior han mejorado las propiedades biológicas en relación con el anticuerpo de los que se han generado. Una manera cómoda de generar tales variantes de sustitución es la maduración por afinidad utilizando la visualización de fagos. En pocas palabras, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se visualizan en forma monovalente de las partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto genético III del M13 contenido dentro de cada partícula. Entonces se estudia la actividad biológica de las variantes visualizadas en los fagos (por ejemplo, la afinidad de unión). Para identificar los sitios de la región hipervariable candidatos a la modificación, se puede realizar la mutagénesis por escaneo de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la CD40 humana. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos a la sustitución según las técnicas elaboradas en esta memoria. Una vez que se generan estas variantes, se somete el panel de variantes a estudio como se describe en esta memoria y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes, para un desarrollo ulterior.

Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por "alterar" se entiende la supresión de uno o más restos de hidrato de carbono que se encuentra en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de anticuerpos suele ser de unión en N o unión en O. Unido a N se refiere a la fijación del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparraguina. Las secuencias de tripéptidos asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido, excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática de la fracción de hidratos de carbono a la cadena lateral de asparraguina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxíprolina y 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o varias de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o la sustitución por uno o varios residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación unidos a O).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD40 se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque no exclusivamente, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos naturales) o la preparación de oligonucleótidos por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis de PCR y mutagénesis cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-CD40.

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Anticuerpos humanos

Como alternativa a la humanización de los anticuerpos, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar animales transgénicos (por ej., ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen en la región de unión de la cadena pesada (J_{H}) del anticuerpo en ratones mutantes de la línea germinal y quiméricos produce la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a la línea germinal de estos ratones mutantes se traducirá en la producción de anticuerpos humanos tras la estimulación con el antígeno. Como alternativa a la humanización de los anticuerpos, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar animales transgénicos (por ej., ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen en la región de unión de la cadena pesada (J_{H}) del anticuerpo en ratones mutantes de la línea germinal y quiméricos produce la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a la línea germinal de estos ratones mutantes se traducirá en la producción de anticuerpos humanos tras la estimulación con el antígeno. Véase, p. ej., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno. 07: 33, y las patentes US 5,591,669; 5,589,369; 5,545,807; 6,075,181, 6,150,584, 6,657,103 y 6,713,610. Alternativamente, se puede utilizar la tecnología de visualización de fagos (véase, p. ej., McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552-553) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios génicos de dominios (V) variables de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpos se clonan dentro del marco de un gen de proteína de recubrimiento superior o inferior de un bacteriófago filamentoso, como M13 o fd, y que aparecen como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una hebra del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales de los anticuerpos también producirán la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización del fago se puede realizar en una variedad de formatos, para su revisión, véase, por ejemplo, Johnson y Chiswell, 1993, Current Opinión in Structural Biology 3: 564-571. Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de genes V para la visualización de fagos. Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628 aisló una matriz distinta de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para una matriz distinta de antígenos (incluyendo autoantígenos) fundamentalmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597, o Griffith et al., 1993, EMBO J. 12: 725-734. Véase también las patentes US 5,565,332 y 5,573,905. Como se explicó anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver las patentes US 5,567,610 y 5,229,275).

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Polinucleótidos, vectores, células huésped y métodos recombinantes

Otras formas de realización incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo humanizado. Los polinucleótidos aislados pueden codificar cualquier forma deseada del anticuerpo anti-CD40 como, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de longitud total, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

En un aspecto, la o las secuencias de polinucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

El o los polinucleótidos que conforman una secuencia que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado o un fragmento o una cadena del mismo se pueden fusionar a una o más secuencias reguladoras o de control, como se conoce en la técnica, y pueden estar contenidos en los vectores de expresión adecuados o célula huésped como se conoce en la técnica. Cada una de las moléculas de polinucleótido que codifica los dominios variables de cadena ligera o pesada puede ser independientemente fusionada a una secuencia de polinucleótidos que codifique un dominio constante, como un dominio constante humano, permitiendo la producción de anticuerpos intactos. Alternativamente, se pueden fusionar polinucleótidos, o porciones de los mismos juntos, proporcionando una plantilla para la producción de un anticuerpo monocatenario.

Para la producción recombinante, un polinucleótido que codifique el anticuerpo se inserta en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Hay muchos vectores adecuados disponibles para expresar el anticuerpo recombinante. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque no exclusivamente, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados también se pueden producir como polipéptidos de fusión, en los que se funde el anticuerpo con un polipéptido heterólogo, como una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo amino-terminal de la proteína madura o polipéptido. La secuencia señal heteróloga seleccionada es generalmente una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal del anticuerpo anti-CD40 humanizado, la secuencia señal puede ser sustituida por una secuencia señal procariótica. La secuencia señal puede ser, por ejemplo, fosfatasa alcalina, penicilinasa, lipoproteína, líderes termoestables de enterotoxina II y similares. Para la secreción de la levadura, la secuencia señal nativa puede ser sustituida, por ejemplo, con una secuencia líder obtenida del factor alfa de la levadura invertasa (incluyendo los líderes de factor de Saccharomyces y Kluyveromyces), fosfatasa ácida, glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en WO90/13646. En las células de mamíferos, se puede utilizar la secuencia señal de mamíferos, así como líderes de secreción viral, por ejemplo, la señal del herpes simple gD. El ADN para esta región de precursores se liga en el marco de lectura del ADN que codifica el anticuerpo anti-CD40 humanizado.

Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es la que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, hongos y viruses. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para la levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV y BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 normalmente podrá ser utilizado sólo porque contiene el promotor temprano).

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes típicos de selección codifican las proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en los medios del complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Esas células que se transformaron con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los fármacos y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células huésped de mamíferos son los que permiten la identificación de las células competentes para recoger un ácido nucleico que codifique un anticuerpo anti-CD40 humanizado, como DHFR (dihidrofolato reductasa), timidina quinasa, metalotioneína I y II (como los genes de metalotioneína de primates), adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, y similares.

Por ejemplo, primero se identifican las células transformadas con el gen de selección DHFR cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo conteniendo metotrexato (MTX), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en actividad DHFR (por ejemplo, DG44).

Alternativamente, se pueden seleccionar células huésped (particularmente las huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-CD40, la proteína DHFR tipo salvaje, y otro marcador de selección tal como la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), haciendo crecer las células en un medio que contenga un agente de selección para el marcador de selección tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase, p. ej., la patente US 4,965,199.

Un gen de selección adecuado para utilizar en levadura es el gen TRP1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39). El gen TRP1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N 0 44.076 o PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85: 12). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano. Del mismo modo, las cepas de levadura deficientes de Leu2p como ATCC 20.622 y 38.626 se complementan con plásmidos que llevan el gen LEU2 conocido.

Además, se pueden utilizar vectores derivados del plásmido circular de 1,6 \mum PKD1 para la transformación de levaduras de Kluyveromyces. Alternativamente, se informó de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina recombinante de ternero para K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8: 135). También se han descrito los vectores de expresión multicopia para la secreción de albúmina madura recombinante de suero humano por cepas industriales de Kluyveromyces (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9: 968-975).

Los vectores de expresión y clonación por lo general contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y se une operativamente a la molécula del ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD40 o cadena polipeptídica del mismo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de \beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp), y los promotores híbridos como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo (SD) operativamente unida al ADN que codifica el anticuerpo anti-CD40 humanizado.

Se conocen muchas secuencias promotoras eucarióticas. Prácticamente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT que se encuentra a unas 25 a 30 bases antes del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentran a unas 70 a 80 bases antes del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A para el extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se introducen debidamente en vectores de expresión eucarióticos.

Ejemplos de secuencias promotoras para utilizar con huéspedes de levadura son los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, como la enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Los promotores inducibles tienen la ventaja adicional de poder controlar la transcripción por las condiciones de crecimiento. Estos incluyen regiones de promotor de levadura para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas derivadas asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de la levadura se describen más detalladamente en EP 73,657. También se utilizan potenciadores de la levadura ventajosamente con los promotores de la levadura.

La transcripción del anticuerpo anti-CD40 humanizado desde vectores en células huésped de mamíferos es controlada, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de viruses como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y el virus del simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de golpes de calor, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen viral SV40 de replicación. Los promotores tempranos del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente como un fragmento de restricción HindIII E. En la patente US 4,419,446 se describe un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos con el virus del papiloma bovino como vector. Se describe una modificación de este sistema en la patente US 4,601,978. Véase también Reyes et al., 1982, Nature 297: 598-601, que divulga la expresión del ADNc del \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, se puede utilizar la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous como promotor.

La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado divulgado en la presente memoria por eucariotas superiores suele aumentar introduciendo una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se utiliza un potenciador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en la parte tardía del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en la parte tardía del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, 1982, Nature 297: 17-18 para una descripción de elementos potenciadores de la activación de promotores eucarióticos. El potenciador se pueden empalmar en el vector en la posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el anticuerpo anti-CD40 humanizado, pero preferiblemente en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (células de levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano o nucleadas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias se encuentran normalmente disponibles en las regiones 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas o ADN o ADNc virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo anti-CD40. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en la presente memoria. En algunas forma de realización, los anticuerpos anti-CD40 humanizados pueden expresarse utilizando el sistema CHEF. (Véase, p. ej., la patente US 5,888,809).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en esta memoria son las células procariotas, levaduras, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, enterobacterias como Escherichia coli, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P divulgado en DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitadores.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos y levaduras son huéspedes adecuados para la clonación o expresión para los vectores de codificación del anticuerpo anti-CD40 humanizado. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería es la más utilizada comúnmente entre los microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles aquí, como los huéspedes de Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), thermotolerans K, y K. Yarrowia; marxianus (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis y hongos filamentosos, como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-CD40 humanizado glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados son células de insectos y de plantas, incluyendo, por ejemplo, muchas cepas baculovirales y sus variantes y células huésped de insectos permisivos correspondientes como de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori (gusano de seda). Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles al público, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa califomica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus podrán ser utilizados, particularmente, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco como huéspedes.

En otro aspecto, la expresión del anti-CD40 humanizado se lleva a cabo en células de vertebrados. La propagación de las células de vertebrados en cultivos (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario y las técnicas están ampliamente disponibles. Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos de utilidad son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), células de riñón de hámster (BHK, ATCC CCL 10), células de ovario de hámster chino /-DHFR- (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, por ejemplo, DG44), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23: 243-251), células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70), células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humanas (HeLa, ATCC CCL 2), células de riñón de perro (MDCK, ATCC CCL 34), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75), células de hígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), células MRC 5, células FS4, y la línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos anti-CD40 humanizados, y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para la inducción de los promotores, la selección de transformantes o la amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células huésped para producir un anticuerpo anti-CD40 humanizado descritas en la presente memoria pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO), Minimal Essential Médium ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) y Modified Eagle's Médium de Dulbecco ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) son adecuados para el cultivo de las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en uno o más de Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, patentes US 4,767,704, US 4,657,866, US 4,927,762, US 4,560,655, US 5,122,469, WO 90/103430 y WO 87/00195 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede ser complementado, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como la insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (por ejemplo, gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros complementos en concentraciones adecuadas que conocerán los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, etc., son los utilizados anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión y será evidente para el experto en la materia.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido dentro de la célula, en el espacio periplásmico, o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce dentro de la célula, las células pueden ser alteradas para liberar proteína como un primer paso. Los restos de partículas, ya sea de células huésped o fragmentos de lisis, se pueden retirar, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., 1992, 10: 163-167 BiolTechnology describe un procedimiento para aislar los anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Resumidamente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los restos celulares se pueden retirar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de los sistemas de expresión son generalmente concentrados primero utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. Se puede utilizar una variedad de métodos para aislar los anticuerpos de la célula huésped.

La composición del anticuerpo preparado a partir de las células puede ser purificada mediante, por ejemplo, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica típica de purificación. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede utilizar la proteína A para purificar los anticuerpos basados en cadenas pesadas humanas gammal, gamma2 o gamma4 (véase, por ejemplo, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62: 1-13). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para el humano gamma3 (véase, por ejemplo, Guss et al., 1986 EMBO J. 5: 1567-1575). Una matriz a la que se fija un ligando de afinidad suele ser agarosa, aunque hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y menos tiempo de procesamiento que los que pueden lograrse con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, se puede utilizar la resina Bakerbond ABX^{TM} (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en silicona, cromatografía en heparina Sepharose^{TM}, cromatografía en una resina de intercambio de cationes o aniones (por ejemplo, una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación en sulfato de amonio también están disponibles dependiendo de los anticuerpos que deban recuperarse.

Después de cualquier fase o fases de purificación previas, la mezcla comprendiendo el anticuerpo de interés y los contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo mediante un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, normalmente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

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Condiciones de hibridación

También se divulgan los ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones de rigor bajo, moderado y alto, según se define en la presente memoria, a la totalidad o una parte (por ejemplo, la parte que codifica la región variable) de la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 17, o su complemento, o la SEC ID Nº: 20 o su complemento. La parte de hibridación del ácido nucleico de hibridación tiene normalmente una longitud de por lo menos 15 (por ejemplo, 20, 25, 30 ó 50) nucleótidos. La parte de hibridación del ácido nucleico de hibridación es idéntico en al menos el 80%, por ejemplo, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 98% a la secuencia de una parte o la totalidad de un ácido nucleico que codifica un polipéptido anti-CD40 (por ejemplo, una región variable de cadena ligera o cadena pesada) o su complemento. Los ácidos nucleicos de hibridación del tipo descrito en esta memoria pueden ser utilizados, por ejemplo, como una sonda de clonación, un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, o una sonda de diagnóstico.

A modo de ejemplo y no como limitación, los procedimientos que utilizan condiciones de rigor bajo son las siguientes (véase también Shilo y Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792). En una forma de realización, los filtros conteniendo ADN son previamente tratados durante 6 horas a 40ºC en una solución conteniendo formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: Se usa PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0.2%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano, y 5-20 x 10^{6} cpm de una sonda marcada 32P. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 40ºC, y luego se lavan durante 1,5 horas a 55ºC en una solución con 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA, y SDS al 0,1%. La solución de lavado se reemplaza con una solución fresca y se incuba una 1,50 hora adicional a 60ºC. Los filtros son secados y expuestos para hacer la autorradiografia. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68ºC y se vuelven a exponer a la película. En otra realización, un ejemplo de condiciones de rigor bajo incluye la hibridación en un tampón que comprende formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y el 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano, durante 18-20 horas a 40ºC, lavado en un tampón que consiste en 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA y SDS al 0,1%, durante 1,5 horas a 55ºC, y lavado en un tampón que consiste en 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA y SDS al 0,1%, durante 1,5 horas a 60ºC. En la técnica se conocen otras condiciones de rigor bajo que se pueden utilizar (por ejemplo, como las que se emplean en las hibridaciones entre especies).

A modo de ejemplo y no como limitación, los procedimientos que utilizan condiciones de rigor alto son las siguientes. Se realiza una prehibridación de los filtros conteniendo ADN durante 8 horas o toda la noche a 65ºC en un tampón compuesto por 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65ºC en una mezcla de prehibridación conteniendo 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada 32P. El lavado de los filtros se hace a 37ºC durante 1 h en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. Esto es seguido por un lavado de 0,1X SSC a 50ºC durante 45 minutos antes de la autorradiografía. En la técnica se conocen otras condiciones de alto rigor que se pueden
utilizar.

A modo de ejemplo y no como limitación, los procedimientos que utilizan condiciones de rigor moderado son las siguientes. Se tratan previamente unos filtros conteniendo ADN durante 6 horas a 55ºC en una solución conteniendo 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con una sonda 5-20 x 10^{6} cpm marcada 32P. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55ºC, y luego se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución conteniendo 1X SSC y SDS al 0,1%. Los filtros se secan y se exponen para la autorradiografía. El lavado de los filtros se hace a 37ºC durante 1 h en una solución conteniendo 2X SSC, SDS al 0,1%. En la técnica se conocen bien otras condiciones de rigor moderado que pueden utilizarse (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al., 2001; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y.; véase también Ausubel et al., eds., en Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1999, Current Protocols, © 1994-199 John Wiley and Sons, Inc.).

También se divulgan los polinucleótidos aislados que incluyen secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo teniendo la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es idéntica por lo menos el 80%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10.

También se divulgan los polinucleótidos aislados que incluyen secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo teniendo la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que es idéntica por lo menos el 80%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 16.

En otro aspecto, la o las secuencias de polinucleótidos aislados codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo teniendo una región variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, cada uno incluyendo una secuencia de aminoácidos que es idéntica por lo menos el 80%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y la SEC ID Nº 16, respectivamente.

Según la presente memoria, los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un determinado porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácidos que es el mismo si se compara o alinea para ver la correspondencia máxima. Para determinar el porcentaje de identidad, las secuencias se alinean a efectos de obtener una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una primera secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para obtener la alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótidos como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas / número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapadas) x 100). En algunas formas de realización, las dos secuencias que se comparan tienen la misma longitud después de haber introducido espacios en las secuencias según proceda (por ejemplo, excluyendo la secuencia adicional que se extienda más allá de las secuencias que se comparan). Por ejemplo, cuando se comparan las secuencias de región variable, las secuencias líder y/o de dominio constante no se consideran. Para la comparación de secuencias entre dos secuencias, una CDR "correspondiente" se refiere a una CDR en el mismo lugar en ambas secuencias (por ejemplo, la CDR-H1 de cada secuencia).

La determinación del porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitador, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 2264-2268, modificado en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Este algoritmo se ha incorporado a los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas a un ácido nucleico que codifique a una proteína de interés. Se pueden realizar búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homologas a la proteína de interés. Para obtener las alineaciones de los huecos a efectos comparativos, se puede utilizar el BLAST con espacios como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, se puede utilizar el PSI-Blast para realizar una búsqueda reiterada que detecte las relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitador preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de las secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Este algoritmo se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Al utilizar el programa ALIGN para comparar las secuencias de amino ácidos, con una tabla de pesos de residuos PAM120, se puede utilizar una penalización en la longitud de los espacios de 12 y una penalización de espacios de 4. Se conocen otros algoritmos en la técnica para el análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-8. En FASTA, ktup es una opción de control que ajusta la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda. Si ktup = 2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que se comparan al mirar los pares de residuos alineados, si ktup = 1, se examinan aminoácidos alineados individuales, ktup se puede configurar a 2 ó 1 para secuencias de proteínas, o de 1 a 6 para secuencias de ADN. El valor por defecto, si no se especifica el ktup, es de 2 para las proteínas y 6 para el ADN. Alternativamente, la alineación de secuencias de proteínas puede llevarse a cabo utilizando el algoritmo CLUSTAL W, según lo descrito por Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402.

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Usos no terapéuticos

Los anticuerpos descritos en esta memoria son útiles como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida como una resina Sephadex o filtro de papel, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína CD40 (o fragmento de la misma) para ser purificada, y después se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra, excepto la proteína CD40, que se une al anticuerpo inmovilizado. Por último, se lava el soporte con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará la proteína CD40 del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados también son útiles en las pruebas de diagnóstico para detectar y/o cuantificar la proteína CD40, por ejemplo, detectar la expresión de CD40 en células, tejidos y suero específicos.

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Para aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos se etiquetarán normalmente con un resto detectable. Hay numerosas etiquetas disponibles que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías:

(a)

Radioisótopos, por ejemplo, tales como ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H y ^{131}I. El anticuerpo se puede etiquetar con el radioisótopo, utilizando las técnicas descritas en, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, pubs. La radiactividad se puede medir, por ejemplo, por recuento de centelleo.

(b)

Etiquetas fluorescentes disponibles como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, lisamina, ficoeritrina y rojo de Texas. Las etiquetas fluorescentes puede ser conjugadas con el anticuerpo a través de técnicas conocidas, tales como las descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia se puede cuantificar mediante un fluorímetro.

(c)

Varias etiquetas enzima-sustrato disponibles (véase, por ejemplo, la patente US 4,275,149 que ofrece una revisión de algunas de ellas). La enzima cataliza generalmente una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato que se puede medir espectrofotométricamente. Por otra parte, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente es excitado electrónicamente por una reacción química y puede entonces emitir una luz que se puede medir, mediante un éter quimiolumínico, por ejemplo, o donar la energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas como la luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente US 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, \beta-lactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen, por ejemplo, en O'Sullivan et al., 1981, Methods forthe Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (J. Langone y H. Van Vunakis, eds.), Academic Press, NY, 73: 147-166.

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Los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:

(a)

Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor colorante como ortofenilendiamina (OPD) o hidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB);

(b)

fosfatasa alcalina (FA) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromogénico; y

(c)

\beta-D-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico como p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferi-\beta-D-galactosidasa.

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Hay muchas otras combinaciones de enzima-sustrato disponibles para los expertos en la materia. Para una revisión general de estas, véase las patentes US 4,275,149 y US 4,318,980.

La etiqueta puede ser conjugada indirectamente con el anticuerpo usando una serie de técnicas conocidas. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina y cualquiera de las tres grandes categorías de etiquetas mencionadas arriba puede conjugarse con avidina o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y por lo tanto, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo puede conjugarse con un hapteno pequeño (como la digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionadas anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). Así se puede conseguir la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo.

En otra forma de realización, el anticuerpo anti-CD40 humanizado se utiliza sin etiqueta y se detecta con un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo anti-CD40 humanizado.

Los anticuerpos descritos en esta memoria pueden ser empleados en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos sandwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Véase, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

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Kits de diagnóstico

Un anticuerpo anti-CD40 humanizado se puede utilizar en un kit de diagnóstico, es decir, una combinación de envases de reactivos en cantidades predeterminadas con las instrucciones para realizar la prueba de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima como un precursor de sustrato que proporcione el cromóforo o fluoróforo detectable. Además, se pueden incluir otros aditivos como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diferentes reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimicen la sensibilidad del ensayo. Se pueden proporcionar los reactivos en forma de polvo seco, normalmente liofilizado, incluidos los excipientes que en caso de disolución proporcionará una solución reactiva teniendo la concentración adecuada.

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Usos terapéuticos

En otra forma de realización, un anticuerpo anti-CD40 humanizado divulgado en la presente memoria es útil en el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con la expresión de la CD40 como se describe en este documento.

El anticuerpo anti-CD40 humanizado o agente es administrado por cualquier vía adecuada, incluida la parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si es necesario para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional (incluyendo la perfusión o puesta en contacto de otro modo del injerto con el anticuerpo antes del trasplante). El anticuerpo humanizado anti-CD40 o el agente se puede administrar, por ejemplo, en forma de infusión o bolo. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-CD40 humanizado es adecuadamente administrado por infusión con pulsos, particularmente con dosis en disminución del anticuerpo. En un aspecto, la dosis se administra mediante inyecciones, lo más preferible es que sean inyecciones por vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es por poco tiempo o crónica.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de anticuerpos dependerá de una variedad de factores como el tipo de enfermedad a tratar, según lo definido arriba, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta a los anticuerpos y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o en una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificación inicial candidata para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas o por infusión continua, es la de aproximadamente 1 \mug/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0,1-15 mg/kg) de anticuerpo. Una dosificación típica diaria puede variar desde aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para la administración repetida durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No obstante se pueden utilizar otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es fácilmente controlada por técnicas y ensayos convencionales. Un régimen de dosificación ejemplar es el descrito en WO 94/04188.

La composición de anticuerpos se formulará, dosificará y administrará de forma coherente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, el mamífero en particular que se esté tratando, la condición clínica de cada paciente, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo que se debe administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aliviar o tratar el trastorno asociado con la expresión de la CD40.

El anticuerpo no tiene que ser, pero es opcionalmente, formulado con uno o más agentes utilizados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-CD40 humanizado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores explicados anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosificaciones y vías de administración como las indicadas arriba o aproximadamente del 1 al 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

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Trastornos Asociados a la CD40

Los anticuerpos anti-CD40 o agentes son útiles para tratar o prevenir un cáncer o un trastorno inmunológico que exprese la CD40 caracterizado por la expresión de la CD40, por ejemplo, por la activación inapropiada de células inmunes (por ejemplo, linfocitos o células dendríticas). Tal expresión de la CD40 puede deberse, por ejemplo, al aumento de los niveles de la proteína CD40 en la superficie de las células y/o la antigenicidad alterada de la CD40 expresada. El tratamiento o la prevención de la enfermedad inmunológica, de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, se logra mediante la administración a un sujeto, que necesite dicho tratamiento o prevención, de una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD40 o agente, por el que el anticuerpo (i) se une a las células inmunes activadas que expresan la CD40 y que están asociadas a estado de la enfermedad y (ii) ejerce un efecto citotóxico, citostático o inmunosupresor en las células inmunes activadas.

Las enfermedades inmunológicas que se caracterizan por la activación inapropiada de las células inmunes y que se pueden tratar o prevenir por los métodos descritos en la presente memoria pueden ser clasificadas, por ejemplo, por el o los tipos de reacción o reacciones de hipersensibilidad que subyacen al trastorno. Estas reacciones suelen ser clasificadas en cuatro tipos: reacciones anafilácticas, reacciones citotóxicas (citolíticas), reacciones del complejo inmunológico o reacciones de inmunidad mediada por las células (CMI) (también conocida como reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH)). (Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3ª ed. 1993)).

Ejemplos específicos de tales enfermedades inmunológicas son los siguientes: artritis reumatoide, enfermedades desmielinizantes autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, lupus eritematoso sistémíco, miastenia gravis, enfermedad de Grave, glomerulonefritis, trastorno hepatológico autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), anafilaxia, reacción alérgica, síndrome de Sjögren, diabetes mellitus tipo I, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, polimiositis, dermatomiositis, miositis inflamatoria, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, uveítis autoinmune, enfermedad de Addison, adrenalitis, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, aterosclerosis, lupus eritematoso cutáneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, pénfigo vulgar, pénfigo, dermatitis herpetiforme, alopecia arcata, penfigoide, esclerodermia, esclerosis sistémica progresiva, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmune femenina y masculina, espondolitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad mixta del tejido conectivo, poliarteritis nodosa, vasculitis necrotizante sistémica, dermatitis atópica, rinitis atópica, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumática, asma, aborto recurrente, síndrome antifosfolípidos, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome post cardiotomía, síndrome de Cushing, hepatitis autoinmune crónica activa, pulmón del pajarero, necrólisis epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolitis, alveolitis alérgica, alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, eritema nudoso, pioderma gangrenoso, reacción a la transfusión, arteritis de Takayasu, polimialgia reumática, arteritis de la temporal, esquistosomiasis, arteritis de células gigantes, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, eccema, granulomatosis línfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Caplan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, psoriasis, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis, ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, ciclitis de Fuch, nefropatía por IgA, púrpura de Schönlein-Henoch, enfermedad injerto contra huésped, rechazo del trasplante, cardiomiopatía, síndrome de Eaton-Lambert, policondritis recidivante, crioglobulinemia, macroglobulemia de Waldenstrom, síndrome de Evan, síndrome de distrés respiratorio agudo, inflamación pulmonar, osteoporosis, hipersensibilidad de tipo retardado y disfunción gonadal autoinmune.

Por consiguiente, los métodos descritos en esta memoria abarcan el tratamiento de trastornos de linfocitos B (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes de tipo I), linfocitos Th 1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjögren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, tuberculosis o enfermedad injerto contra huésped), linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico, asma atópico, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica o enfermedad crónica de rechazo de injerto contra huésped). Generalmente, los trastornos relacionados con las células dendríticas implican trastornos de linfocitos Th1 o linfocitos Th2.

En algunas formas de realización, la enfermedad inmunológica mediada por células es un trastorno inmunológico mediado por células T, como un trastorno de células T en el que las células T activadas asociadas con el trastorno expresan la CD40. Los anticuerpos anti-CD40 o agentes se pueden administrar hasta agotar las células T activadas que expresan la CD40. En una forma de realización particular, la administración de anticuerpos anti-CD40 o agentes pueden agotar las células T activadas que expresan la CD40, mientras que las células T en reposo no son sustancialmente agotadas por el anti-CD40 o agente. En este contexto, "no sustancialmente agotada" significa que menos del 60%, o menos de aproximadamente el 70% o menos de aproximadamente el 80% de las células T en reposo no son agotadas.

Los anticuerpos anti-CD40 y agentes como se describe en esta memoria también son útiles para tratar o prevenir un cáncer que exprese la CD40. El tratamiento o la prevención de un cáncer que exprese la CD40, según los métodos descritos en esta memoria, se logra mediante la administración, a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento o prevención, de una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD40 o agente, por la que el anticuerpo o el agente (i) se une a las células cancerosas que expresan la CD40 y (ii) ejerce un efecto citotóxico o citostático para agotar o inhibir la proliferación de las células del cáncer que expresan la CD40.

Los cánceres que expresan la CD40 que pueden tratarse o prevenirse mediante los métodos descritos en este documento son, por ej., leucemia, como leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda (por ejemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica o eritroleucemia), leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, o leucemia linfocítica crónica, policitemia vera, linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin o enfermedad de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada; tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, tumor testicular, cáncer de pulmón, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, cáncer de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo o carcinoma esofágico).

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Composiciones farmacéuticas y su administración

Se puede administrar una composición comprendiendo un agente de unión a la CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) a un sujeto que tenga o esté en riesgo de tener un trastorno inmunológico o un cáncer que exprese la CD40. La invención proporciona además el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un trastorno inmunológico o cáncer que exprese la CD40. El término "sujeto" como se usa aquí, significa cualquier paciente mamífero al que se pueda administrar un agente de unión a la CD40, incluyendo, por ejemplo, mamíferos humanos y no humanos, como primates, roedores y perros. Los sujetos específicamente indicados para el tratamiento utilizando los métodos descritos en esta memoria son los seres humanos. Los anticuerpos o agentes se pueden administrar ya sea solos o en combinación con otras composiciones en la prevención o tratamiento de la enfermedad inmunológica o cáncer que exprese la CD40.

Se conocen varios sistemas de administración y se pueden utilizar para administrar el agente de unión a la CD40. Los métodos de introducción incluyen, aunque no exclusivamente, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal epidural y oral. El agente de unión a la CD40 se puede administrar, por ejemplo, por infusión, bolo o inyección, y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos como agentes quimioterapéuticos. La administración puede ser sistémica o local.

En formas de realización específicas, la composición del agente de unión a la CD40 se administra por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, el implante siendo un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo una membrana, como una membrana silástica o de fibra. Normalmente, cuando se administra la composición, se utilizan materiales a los que el anticuerpo anti-CD40 o agente no se absorbe.

En otras formas de realización, el anticuerpo anti-CD40 o el agente se administra en un sistema de liberación controlada. En una forma de realización, se puede utilizar una bomba (véase, por ejemplo, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed Ing. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989 N. Engl. J. Med. 321: 574). En otra forma de realización se pueden utilizar materiales poliméricos. (Véase, por ejemplo, Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger y Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61. Véase también Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105.) Otros sistemas de liberación controlada se explican, por ejemplo, en Langer, supra.

Un agente de unión a la CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) se puede administrar como composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de unión y uno o más ingredientes farmacéuticamente compatibles. Por ejemplo, la composición farmacéutica suele incluir uno o varios vehículos farmacéuticos (por ejemplo, líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares). El agua es el vehículo más común cuando se administra la composición farmacéutica por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, talco, leche desnatada en polvo, glicerina, propilenoglicol, agua, etanol, etc. Otros excipientes farmacéuticos adecuados incluyen aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina, glicina), surfactantes (por ejemplo, polisorbatos) y azúcares y alcoholes de azúcar (por ejemplo, sacarosa o sorbitol y otros polioles (por ejemplo, trehalosa)). La composición, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse aislada como un supositorio, con aglutinantes y soportes tradicionales como triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir soportes estándares de calidad farmacéutica, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de soportes farmacéuticos se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de los ácidos nucleicos o proteínas, normalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de soporte para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. Las formulaciones corresponden al modo de administración.

En formas de realización típicas, la composición farmacéutica es formulada según los procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Por lo general, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en un tampón acuoso isotóníco estéril. Si fuera necesario, la composición farmacéutica también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local, como lidocaína, para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados entre sí en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Si se debiera administrar la composición farmacéutica por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión conteniendo agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Si se administra la composición farmacéutica por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes puedan ser mezclados antes de su administración.

Además, la composición farmacéutica puede ser proporcionada en forma de kit farmacéutico comprendiendo (a) un recipiente conteniendo el agente de unión a la CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) en forma liofilizada y (b) un segundo recipiente conteniendo un diluyente farmacéuticamente aceptable (p. ej., agua estéril) para inyección. El diluyente farmacéuticamente aceptable puede ser utilizado para la reconstitución o dilución del agente o anticuerpo anti-CD40 liofilizado. Opcionalmente se puede incluir a dicho recipiente o recipientes un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos biológicos o farmacéuticos, cuyo aviso refleje la aprobación de la agencia para la fabricación, uso o venta para la administración en
humanos.

La cantidad de agente de unión a la CD40 (por ejemplo, anticuerpo anti-CD40) que es eficaz en el tratamiento o prevención de una enfermedad inmunológica o cáncer que exprese la CD40 puede ser determinada por técnicas clínicas estándares. Además, en ensayos in vitro, se pueden emplear opcionalmente para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptima. La dosis precisa para emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración, y la etapa del trastorno inmunológico o cáncer que exprese la CD40, y debe decidirse según la valoración del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta de sistemas de ensayo in vitro en modelos animales.

Por ejemplo, se puede determinar la toxicidad y la eficacia terapéutica del agente o anticuerpo anti-CD40 en cultivos celulares o animales experimentales mediante procedimientos farmacéuticos estándares para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación LD_{LD}/ED_{50}. Se prefiere un agente de unión a la CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) que exhiba un índice terapéutico elevado. Si el agente de unión a la CD40 exhibiera efectos secundarios tóxicos, se puede utilizar un sistema de administración que dirija el agente de unión a la CD40 al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células que no expresen la CD40 y, por tanto, reducir los efectos secundarios.

Se pueden utilizar los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y estudios en animales para formular un rango de dosificación para usar en humanos. La dosificación del agente de unión a la CD40 normalmente se encuentra en un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier agente de unión a la CD40 usado en el método, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluya la IC_{50} (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según lo determinado en el cultivo celular. Esta información puede ser utilizada para determinar con precisión las dosis más útiles para los humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

Generalmente, la dosificación de un anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a la CD40 administrado a un paciente con un trastorno inmunológico o cáncer que exprese la CD40 suele ser alrededor de 0,1 mg/kg y 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosificación administrada a un sujeto es de aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto.

Las dosis ejemplares incluyen, aunque no exclusivamente, desde 1 ng/kg hasta 100 mg/kg. En algunas formas de realización, una dosis es de aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg o aproximadamente 16 mg/kg. La dosis se puede administrar, por ejemplo, diariamente, una vez por semana (semanalmente), dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, quincenalmente o mensualmente. En algunas formas de realización específicas, la dosis es de aproximadamente 0,5 mg/kg/semana, aproximadamente 1 mg/kg/semana, aproximadamente 2 mg/kg/semana, aproximadamente 3 mg/kg/semana, aproximadamente 4 mg/kg/semana, aproximadamente 5 mg/kg/semana, aproximadamente 6 mg/kg/semana, aproximadamente 7 mg/kg/semana, aproximadamente 8 mg/kg/semana, aproximadamente 9 mg/kg/semana, aproximadamente 10 mg/kg/semana, aproximadamente 11 mg/kg/semana, aproximadamente 12 mg/kg/semana, aproximadamente 13 mg/kg/semana, aproximadamente 14 mg/kg/semana, aproximadamente 15 mg/kg/semana o aproximadamente 16 mg/kg/semana. En algunas formas de realización, la dosis varía de aproximadamente 1 mg/kg/semana a aproximadamente 15 mg/kg/semana.

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En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a la CD40 puede comprender además un agente terapéutico, ya sea conjugado o no conjugado con el agente de unión. El anticuerpo anti-CD40 o el agente de unión a la CD40 puede ser coadministrado en combinación con uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento o la prevención de los trastornos inmunológicos o los cánceres que expresen la CD40. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un agente citostático, citotóxico o inmunosupresor. La terapia combinada también puede incluir, por ejemplo, la administración de un agente que se dirija un complejo receptor o receptores distintos de la CD40 a la superficie de los linfocitos, células dendríticas o células cancerígenas que expresen la CD40 activados. Un ejemplo de este tipo de agente incluye un segundo anticuerpo no CD40 que se une a una molécula en la superficie de un linfocito, célula dendrítica o célula de cáncer que exprese la CD40 activado. Otro ejemplo incluye un ligando que dirija dicho receptor o complejo receptor. Generalmente, dicho anticuerpo o ligando se une a un receptor de superficie celular en los linfocitos, células dendríticas o células del cáncer que expresen la CD40 activados y aumenta el efecto citotóxico o citostático del anticuerpo anti-CD40 mediante la descarga de una señal citostática o citotóxica al linfocito, célula dendrítica o célula del cáncer que exprese la CD40 activado.

La administración combinatoria puede tener un efecto aditivo o sinérgico sobre los parámetros de la enfermedad (por ejemplo, la gravedad de un síntoma, el número de síntomas, o la frecuencia de recaída).

Con respecto a los regímenes terapéuticos para la administración combinatoria, en una forma de realización específica, un anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a la CD40 se administra simultáneamente con un agente terapéutico. En otra forma de realización específica, el agente terapéutico se administra antes o después de la administración del anticuerpo anti-CD40 o el agente de unión a la CD40, por lo menos una hora y hasta varios meses, por ejemplo, al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes o tres meses, anteriores o posteriores a la administración del anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a la CD40.

Las clases útiles de agentes citotóxicos o inmunosupresores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas (p. ej., MMAE o MMAF), ligandos del surco menor del ADN, inhibidores de replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino, como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinol, compuestos preformados, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiación, esferoides, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de vinca, o similares.

Los agentes citotóxicos o inmunosupresores individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfán, sulfoximina butionina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucil, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (antes actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorrubicina, un estrógeno, 5-fluordeoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenoposida, 6-tioguanina, tiotepa, topotecan, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.

En algunas formas de realización típicas, el agente terapéutico es un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEVB o AEB), ligandos del surco menor del ADN (por ejemplo, enediinas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de vinca, CC-1065, SN 38, topotecan, morfolino-doxorrubicina, rhizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina o mitoxantrona.

En algunas formas de realización, el agente citotóxico es un quimioterapéutico convencional como, por ejemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalán, alcaloides de vinca, metotrexato, mitomicina C o etopósido. Además, los agentes potentes tales como análogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rhizoxina y palitoxina pueden enlazarse a los anticuerpos anti-CD40 o sus agentes.

En formas de realización específicas, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocida en la técnica como dolastatina 10) o un derivado de la misma. Normalmente, el derivado de la auristatina E es, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y cetoácido. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar la auristatina E con ácido paraacetilbenzóico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados típicos de la auristatina incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y estructura de la auristatina E y sus derivados se describen, por ejemplo, en las publicaciones de las solicitudes de patente US 2004-0157782 A1 y 2005-0238649; solicitud de patente internacional PCT/US03/24209, solicitud de patente internacional PCT/US02/13435, y las patentes US 6,884,869, 6,323,315, 6,239,104, 6,034,065, 5,780,588, 5,665,860, 5,663,149, 5,635,483, 5,599,902, 5,554,725, 5,530,097, 5,521,284, 5,504,191, 5,410,024, 5,138,036, 5,076,973, 4,986,988, 4,978,744, 4,879,278, 4,816,444, y 4,486,414.

En algunas formas de realización específicas, el agente terapéutico es un agente ligante del surco menor del ADN. (Véase, p. ej., la patente US 6,130,237). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el ligando del surco menor es un compuesto CBI. En otras formas de realización, el ligando del surco menor es una enediina (p. ej., caliqueamicina).

Los ejemplos de agentes anti-tubulina incluyen, aunque no exclusivamente, taxanos- (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alquiloides de vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina vindesina y vinorelbina), y dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina.

En algunas formas de realización específicas, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en algunas formas de realización específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc., véase también Chari et al., 1992, Cancer Res. 52: 127-131).

En algunas formas de realización, el agente terapéutico no es radioisótopo.

En algunas formas de realización, el agente citotóxico o inmunosupresor es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (p. ej., azotioprina o micofenolato mofetilo), un inhibidor de dihidrofolato reductasa (por ejemplo, metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavirina, azidotimidina, arabinósido de citidina, amantadina, dideoxiuridina, yododesoxiuridina, poscarnet o trifluridina.

En otras formas de realización, el agente citotóxico o inmunosupresor es tacrolimo, ciclosporina o rapamicina. En otras formas de realización, el agente citotóxico es aldesleuquina, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido de arsénico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, darbepoetina alfa, denileuquina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirrubicina, epoetina alfa, estramustina, exemestano, filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, goserelina, idarrubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferón alfa-2a, irinotecán, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina o mostaza nitrogenada, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsaleno, mitomicina C, mitotano, nandrolona, oprelvekina fenpropionato, oxaliplatino, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pentostatina, pipobroman, plicamicina, porfímero sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicasa, revlimid, sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testolactona, tioguanina, toremifeno, tositumomab, trastuzumab, tretinoína, mostaza de uracilo, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina y zoledronato.

En formas de realización adicionales, el fármaco es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado; RITUXAN (rituximab; Genentech, Inc., South San Francisco, CA), un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; un anticuerpo IgG_{2}a murino); Cetuximab Erbitux (ImClone Systems Inc., NY; un anticuerpo quimérico IgG anti-EGFR); Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD); Campath I/H (Leukosite, MA, un anticuerpo IgG_{1} humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo IgG anti-CD33 humanizado); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; un anticuerpo IgG_{1} anti-CD22 humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-Dr10 murino radiomarcado); Allomune (BioTransplant, CA; un mAb anti-CD2 humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; un anticuerpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ y Amgen, CA; un anticuerpo anti-CD22); y CEAcide (Immunomedics, NJ; un anticuerpo anti-CEA humanizado).

Otros anticuerpos adecuados incluyen, aunque no exclusivamente, anticuerpos contra los siguientes antígenos: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Y Lewis Y, Lewis X, alfa fetoproteína, CA 242, fosfatasa alcalina placentaria, antígeno específico de próstata, fosfatasa ácida prostética, factor de crecimiento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor antitransferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, antígeno prostético específico, receptor IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22, gonadotropina coriónica humana, CD38, mucina, P21, MPG, y producto oncógeno Neu.

En algunas formas de realización, el agente terapéutico es un agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimo, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetilo o metotrexato. Alternativamente, el agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide (por ejemplo, cortisol o aldosterona) o un análogo de glucocorticoides (p. ej., prednisona o dexametasona).

Los inhibidores apropiados de cíclooxigenasa incluyen ácido meclofenámico, ácido mefenámico, carprofeno, diclofenaco, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetina y ácido acetilsalicílico.

Los inhibidores apropiados de lipoxigenasa incluyen inhibidores de reducción de la oxidación (p. ej., derivados del butano catecol, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), masoprocol, fenidona, lanopalen, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquilhidroxilamina), e inhibidores no reductores de la oxidación (por ejemplo, hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos y sus derivados, metoxi-tet.-rahidropirano, ácidos boswélicos y derivados acetilados de ácidos boswélicos, y ácidos quinolinometoxifenilacéticos sustituidos con radicales cicloalquilo), y precursores de inhibidores de reducción de la oxidación.

Otros inhibidores apropiados de lipoxigenasa incluyen antioxidantes (p. ej., fenoles, galato de propilo, flavonoides y/o sustratos de origen natural conteniendo flavonoides, derivados hidroxilados de las flavonas, flavonoles, dihidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de chalcona, 4,2',4'-trihidroxichalcona, orto-aminofenoles, N-hidroxiureas, benzofuranoles, ebselen y especies que aumentan la actividad de la reducción de selenoenzimas), agentes quelantes del hierro (p. ej., ácidos hidroxámicos y sus derivados, N-hidroxiureas, 2-bencil-1-naftol, catecoles, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfasalazína, zileutón, ácido 5-hidroxiantranílico y ácidos 4-(omega-arilalquilo)fenilalcanóicos), compuestos conteniendo imidazol (p. ej., ketoconazol e itraconazol), fenotiazinas y derivados de benzopirano.

Otros inhibidores adecuados más de lipoxigenasa incluyen inhibidores de eicosanoides (por ejemplo, ácido octadecatetraenóico, eicosadocosapentanóico, eicosahexaenóico y docosahexaenóico y sus ésteres, PGE1 (prostaglandina E1), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, ácidos 15-monohidroxieicosatetraenóico, 15-monohidroxieicosatrienóico y 15-monohidroxieicosapentaenóico, y leucotrienos B5, C5 y D5), compuestos que interfieren en los flujos de calcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamilo, fuscosida, curcumina, ácido clorogénico, ácido caféico, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóico (ETYA), hidroxifenilretinamida, lonapalen, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicaleína, proxicromil, tioéteres, sulfuro de dialilo y di-(1-propenil)sulfuro.

Los antagonistas de los receptores de leucotrienos incluyen, ontazolast calcitriol, Bayer Bay-X-1005, Ciba-Geigy CGS-25019c, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKIine Beecham SB-201146, SmithKIine Beecham SB-201993, SmithKIine Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX160, Merck y Co. MK-591, Merck y Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKIine Beecham SKandF-104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 y Teijin TEI-1338.

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Productos manufacturados

En otro aspecto, se incluye un producto manufacturado conteniendo materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El producto manufacturado comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente tiene una composición que es eficaz para tratar la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco con un tapón perforable por una aguja hipodérmica. El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-CD40 humanizado. La etiqueta en o asociada al recipiente indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección. El producto manufacturado puede comprender además un segundo recipiente comprendiendo un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina con tampón de fosfato, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. Asimismo, podrá incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.

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Depósitos ATCC

El 25 de mayo de 1999, se hizo un depósito ATCC del anticuerpo monoclonal S2C6 según los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes. La ATCC 10801 se encuentra en la Universidad de Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, EE.UU. A este depósito ATCC se le dio el número de registro PTA-110. La ATCC 10801 se encuentra en la Universidad de Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, EE.UU. Todos los depósito se ofrecen como un servicio para los expertos en la materia y no suponen una admisión de que se requiera un depósito bajo el código USC 35, Sección 112. Lo que se describe en esta memoria no debe limitar su alcance por el anticuerpo depositado, ya que la realización depositada pretende ser un ejemplo único de determinados aspectos de la invención y cualquier anticuerpo que sea funcionalmente equivalente en el ámbito de esta invención. El depósito del material en esta memoria no constituye un reconocimiento de que la descripción que aquí se escribe sea insuficiente para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo su mejor modo, ni debe interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones para las ilustraciones específicas que representa. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de los que se muestran y se describen en este documento serán evidentes para los expertos en la materia de la lectura de la descripción anterior y entran en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

La invención se describe además en los ejemplos siguientes, que no tienen la intención de limitar el alcance de la invención. Las líneas celulares descritas en los siguientes ejemplos se mantuvieron en el cultivo según las condiciones especificadas por la American Type Culture Collection (ATCC) o Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania (DMSZ). Los reactivos del cultivo celular se obtuvieron de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA).

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Ejemplos Ejemplo 1 Producción de anticuerpo anti-CD40 humanizado

Un anticuerpo anti-CD40 humanizado se construyó en general importando las CDR del anticuerpo donante anti-CD40 murino a un anticuerpo humano receptor. El anticuerpo donante fue el anticuerpo monoclonal murino S2C6, descrito en la patente US 6,838,261, y que ha demostrado proporcionar señales estimuladoras del crecimiento potentes a los linfocitos B. Véase, p. ej., Paulie et al., 2000, J. Immunol. 142: 590. Las secuencias consenso para el dominio variable de cadena pesada de subgrupo III humano (SEC ID Nº: 2) y para el dominio variable de cadena pesada de subgrupo I kappa humano (SEC ID Nº: 13) se obtuvieron, en general, como se describe en Carter et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 4285; la patente US 6,037,454 y la patente 6,054,297, para utilizarlas como los dominios de cadena ligera y pesada de los receptores humanos.

El fagómido pEMX1, que se describe en Cunningham et al. (1989, Science 243: 1330-1336), contiene un fragmento de ADN que codifica el dominio variable de cadena ligera de subgrupo I kappa de consenso y un dominio variable de cadena pesada de subgrupo III humano de consenso, y es un vector de utilidad para la mutagénesis, así como para la expresión de los F(ab) en E. coli. El ADN que codifica los dominios variables de consenso es unido operativamente a un promotor de fosfatasa alcalina y secuencia de Shine Dalgarno derivada de un plásmido basado en pUC119, pAK2, como se describe en Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285. Se diseñó un único sitio de restricción SpeI entre los polinucleótidos que codifican los dominios variables de cadena ligera y pesada de F(ab). Se construyó y utilizó el pEMX1 en la preparación de los anticuerpos humanizados divulgados en la presente memoria.

Se construyó un primer anticuerpo monoclonal humanizado S2C6 F(ab), denominado sgn-0, importando las CDR del anticuerpo murino en las regiones de la estructura de la secuencia consenso humana por mutagénesis dirigida al sitio. Se realizó la mutagénesis según los métodos descritos en Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488. En la Tabla 2 se muestran las secuencias de aminoácidos resultantes de los dominios variables de cadena ligera y pesada (sgn-0) de la molécula F(ab) humanizados (SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 14, respectivamente), y se comparan con las del anticuerpo donante, el anticuerpo monoclonal murino S2C6 (mMAb S2C6, también denominado en la presente memoria SGN-14; SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 12, respectivamente), y con las de la secuencia de los anticuerpos receptores de la secuencia consenso humana, HuV_{H}III y HuV_{L}kI (SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 13, respectivamente).

Los plásmidos se transformaron en la cepa XL-1 Blue de E. coli (Strataene, San Diego, CA) para la preparación de ADN de una y de dos hebras. Cada uno de los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada se secuenciaron completamente utilizando el método de los didesoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp). Los plásmidos se transformaron en la cepa 16C9 de E. coli, un derivado de MM294, depositados en placas de LB conteniendo 5 \mug/ml de carbenicilina, y se seleccionó una sola colonia para la expresión de la proteína. El cultivo de 5 ml se añadió a 500 ml de AP5-100 \mug/ml de carbenicilina y se dejó crecer durante 16 horas en un frasco de agitación con deflectores de 4 litros a 37ºC. Se añadió el medio APS consistente en 1,5 g de glucosa, 11,0 g de Hy-case SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificado), 0,19 g de MgSO_{4} (anhidro), 1,07 g de NH_{4}Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl, 120 ml 1M de trietanolamina, pH 7,4 a 1 litro de agua estéril y luego se filtró por un filtro Sealkeen de 0,1 \mum.

Se cosecharon las células por centrifugación en una botella para centrífuga de 1 litro (Nalgene) a 3000X g, y se eliminó el sobrenadante. Después de congelar durante 1 hora, el sedimento se resuspendió en 25 ml 10 mM de MES frío, 10 mM de EDTA, pH 5,0 (tampón A). Se añadieron 250 \mul de 0,1 M PMSF (Sigma) para inhibir la proteólisis y se añadieron 3,5 ml de caldo y 10 mg/ml de lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma) para ayudar a la lisis de la pared celular bacteriana. Después de agitar suavemente sobre el hielo durante 1 hora, se centrifugó la muestra a 40.000 X g durante 15 minutos. El sobrenadante se llevó a 50 ml con tampón A y se cargó en una columna DEAE de 2 ml equilibrada con tampón A. Luego se aplicó un flujo continuo a una columna de proteína G Sepharosa CL-4B (Pharmacia) (0,5 ml de volumen de lecho) equilibrada con tampón A. Se lavó la columna con 10 ml de tampón A y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, en 1,25 ml de 1 M Tris, pH 8,0. Entonces se intercambió el tampón de
F(ab) con PBS utilizando un filtro Centricon 30 (Amicon) y se concentró hasta un volumen final de 0,5 ml. Se realizó una electroforesis del F(ab) en geles de SDS PAGE para determinar la pureza y se verificó el peso molecular mediante espectrometría de masas por electroespray.

El anticuerpo humanizado, sgn-0, demostró una afinidad de unión significativamente reducida a la CD40 inmovilizada en placas de microtitulación, en comparación con el anticuerpo original murino.

TABLA 2

2

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Ejemplo 2 Preparación de anticuerpos variantes del anti-CD40 humanizado

Se realizó una serie de mutaciones al anticuerpo humanizado plantilla, sgn-0, preparado como se describe en el Ejemplo 1. Se realizaron mutaciones específicas en el ADN que codifica los dominios variables de cadena ligera y pesada de sgn-0 por mutagénesis dirigida al sitio, y las secuencias de las variantes producidas a partir de la molécula plantilla se relacionan a continuación en las Tablas 3 y 4.

Se analizó la actividad de unión de los anticuerpos construidos usando estos dominios variables de cadena ligera y pesada. Se diluyó cada anticuerpo a concentraciones equivalentes, y después se diluyó en serie. Se ensayó la unión a la CD40 inmovilizada de los anticuerpos diluidos en placas de microtitulación. Los datos de la unión por afinidad para las variantes del anticuerpo se muestran a continuación en la Tabla 5. Los anticuerpos que indican una actividad de unión próxima a la del anticuerpo murino original fueron sgn-14, sgn-18, sgn-19, sgn-22, sgn-23, sgn-26 y sgn-27, con las variantes sgn-14, sgn-18, sgn-26, y sgn-27 acercándose más a la del anticuerpo murino original, sgn-14, y la variante sgn-26 mostrando el mejor rendimiento en estos ensayos.

TABLA 3 Dominio variable de cadena pesada

4

TABLA 4 Dominio variable de cadena ligera

5

TABLA 5

6

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TABLA 5 (continuación)

7

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Ejemplo 3 Actividad citotóxica in vitro del anticuerpo anti-CD40 humanizado

Líneas celulares de un mieloma múltiple humano CD40^{+} y CD138^{++}, MM.1S, que es sensible a la dexametasona, y MM. 1R, que es resistente a la dexametasona, así como células tumorales recién aisladas (CD40^{+}, CD138^{++}) de dos pacientes con mieloma múltiple, fueron tratadas con concentraciones crecientes (0-100 \mug/ml) de anticuerpo S2C6 humanizado durante 48 horas. La síntesis del ADN se midió por absorción de 3[H]-timidina. Los resultados indicaron que el anticuerpo S2C6 humanizado no estimula la proliferación de MM.1S, MM.1R, o las células de los tumores de los dos pacientes (p>0,1).

Para definir con mayor precisión el efecto citotóxico del anticuerpo S2C6 humanizado contra estas células, se trataron cultivos de MM.1S y MM.1R durante 6 horas con el anticuerpo S2C6 humanizado (10 \mug/ml) y, a continuación se cultivaron juntos partiendo de cero con el inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida (0,2 \mug/ml) durante 48 horas. Se ensayó la viabilidad celular utilizando bromuro 3-(4,5-dimetiltiozol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) de reducción como indicador. El tratamiento con anticuerpo S2C6 humanizado y cicloheximida activó el exterminio del 50-60% de las células en ambas líneas celulares, mientras que el tratamiento con el isotipo Ig de control solo, con o sin cicloheximida, no indujo citotoxicidad. El anticuerpo S2C6 humanizado activó la citotoxicidad del 20-30% de las células en los dos cultivos de las células de los tumores de los pacientes, que fue significativamente mayor en presencia de cicloheximida en una dosis tóxica (0,2 \mug/ml).

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Ejemplo 4 Actividad antitumoral del anticuerpo anti-CD40 humanizado

Se ensayó la actividad anti-tumoral del anticuerpo anti-CD40 humanizado en un modelo xenógrafo de linfoma de ratón SCID. Cinco millones de células tumorales Ramos fueron inyectadas por vía subcutánea en ratones SCID (1 O/grupo) trece días antes de iniciar el tratamiento farmacológico. Se administró el anticuerpo anti-CD40 murino o el S2C6 humanizado por vía intraperitoneal 3 veces por semana (4 mg/kg/dosis) con 8 ó 5 dosis administradas. Se examinó el crecimiento del tumor en los ratones y se midió el volumen del tumor semanalmente durante el período de estudio de 14 días. Los resultados de la figura 2 muestran un aumento de 9 veces en el crecimiento de los tumores en los ratones de control, mientras que en el mismo período, el crecimiento de los tumores en ratones tratados con anticuerpo anti-CD40 murino o S2C6 humanizado era insignificante. Los datos demuestran que el anticuerpo humanizado fue tan eficaz como el anticuerpo anti-CD40 murino en suprimir el crecimiento tumoral en este modelo de linfoma B xenógrafo.

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Ejemplo 5 Supervivencia prolongada por el anticuerpo anti-CD40 humanizado

Se ensayó la eficacia del anticuerpo anti-CD40 humanizado en la supervivencia de ratones portadores de un tumor en un modelo xenógrafo de linfoma de ratón SCID. Se inocularon los ratones SCID (1 O/grupo) por vía intravenosa con un millón de células tumorales Ramos tres días antes del tratamiento con el anticuerpo. Se trataron los ratones con anticuerpo anti-CD40 murino o humanizado o un control de Ig, administrado por vía intraperitoneal dos veces por semana (4 mg/kg/dosis) para un total de cinco dosis. Todos los días se examinaron las jaulas para conocer la mortalidad. Los resultados de la figura 3 muestran que ninguno de los ratones tratados con un anticuerpo de control sobrevivió pasados los 34 días después de la inoculación del tumor, mientras que ocho de los diez ratones tratados con el anticuerpo anti-CD40 murino y los diez ratones tratados con el anticuerpo anti-CD40 humanizado se mantuvieron vivos hasta 90 días después del implante del tumor. Los datos demuestran que el anticuerpo humanizado fue tan eficaz como el anticuerpo anti-CD40 murino en la prolongación de la supervivencia de ratones SCID en este modelo de linfoma B xenógrafo.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se ha elaborado únicamente como ayuda para el lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha puesto mucha atención en la compilación de las referencias, no se pueden evitar errores u omisiones, por lo que la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

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\global\parskip0.000000\baselineskip

<110 Genentech, Inc.

\hskip0.8cm

Seattle Genetics, Inc.

\hskip0.8cm

Leonard G. Presta

\hskip0.8cm

Lori Y. O'Connell

\hskip0.8cm

Doronina, Svetlana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpos anti-CD40 humanizados y métodos de uso

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> Hu CD40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/684,853

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 26-05-2006

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus Musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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9

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<210> 3

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 7

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14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 8

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15

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 9

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16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 10

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17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 11

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18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Mus Musculus

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<400> 12

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19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 13

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20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 15

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22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 113

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 16

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23

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<210> 17

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<211> 1392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 17

24

25

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<210> 18

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<211> 463

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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26

27

28

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 444

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 19

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30

31

32

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<210> 20

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<211> 717

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 20

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33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 238

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Constructo sintético

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<400> 21

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34

35

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 219

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 22

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36

37

Claims (17)

1. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a la CD40 humana, comprendiendo un dominio variable de cadena pesada humanizado y un dominio variable de cadena ligera humanizado, en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

2. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 1, comprendiendo además una región constante de IgG humana.

3. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 2, en el que el isótopo de la región constante de IgG es IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} ó IgG_{4}.

4. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 3, en el que el isótopo de la región constante de IgG es IgG_{1}.

5. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo además un dominio constante de cadena ligera.

6. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 5, en el que el dominio constante de cadena ligera es un dominio constante kappa.

7. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende además una región constante de inmunoglobulina humana.

8. Anticuerpo según la reivindicación 7, comprendiendo las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera indicadas en la SEC ID Nº: 19 y SEQ ID Nº: 22, respectivamente.

9. Fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 1, en el que el fragmento del anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv, un diacuerpo, un anticuerpo monocatenario o un fragmento scFv.

10. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo además una etiqueta detectable.

11. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que está aislado.

12. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno compite por la unión con el anticuerpo monoclonal S2C6 que es secretado por un hibridoma que tiene el nº de registro ATCC PTA-110.

13. Kit comprendiendo, en un recipiente, el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y, opcionalmente, instrucciones para utilizar los anticuerpos para detectar la proteína CD40 en una muestra biológica.

14. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para utilizar como un medicamento.

15. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 14, en el que el medicamento es para tratar un trastorno inmunológico o un cáncer que exprese la CD40, caracterizado por la expresión de la CD40.

16. Composición farmacéutica comprendiendo:

(i)

el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; y

(ii)

un excipiente farmacéuticamente aceptable.

\vskip1.000000\baselineskip

17. Polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.