ES2864756T3

ES2864756T3 - Dosificación y administración de anticuerpos anti-CD40 no fucosilados

Info

Publication number: ES2864756T3
Application number: ES15854895T
Authority: ES
Inventors: Shyra Gardai; Che-Leung Law; Stanford Peng; Jing Yang; Haley Neff-Laford
Original assignee: Seattle Genetics Inc
Current assignee: Seagen Inc
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: US20220249662A1; CA2963720A1; PL3212230T3; EP3212230B1; JP2020050677A; DK3212230T3; EP3212230A1; EA036498B1; US20220265822A1; ZA201702347B; JP2023126406A; US20170333556A1; JP2017533909A; SG10201913099YA; WO2016069919A1; JP7165166B2; JP6833080B2; US20240075135A1; SG11201702598XA; HUE054075T2

Abstract

Un anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método las etapas de administrar, a un paciente que necesite dicho tratamiento, una composición que comprende el anticuerpo anti- CD40, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa; y en donde el anticuerpo anti-CD40 se administra a un nivel de dosis comprendido entre 0,1 y 2000 μg/kg (μg por kilogramo de peso corporal del paciente).

Description

DESCRIPCIÓN

Dosificación y administración de anticuerpos anti-CD40 no fucosilados

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a métodos de uso de un anticuerpo anti-CD40 no fucosilado para el tratamiento del cáncer y de enfermedades infecciosas crónicas.

Antecedentes de la invención

CD40 es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF, siglas del inglés tumor necrosis factor). Se trata de una proteína transmembrana monocatenaria de tipo I con un PM (peso molecular) aparente de 50 kDa. Algunas células cancerosas expresan CD40, por ejemplo, células de linfoma y varios tipos de células de tumores sólidos. CD40 también actúa activando el sistema inmunitario facilitando la interacción recíproca dependiente del contacto entre células presentadoras de antígeno y células T. En el documento WO 2009/094391 A1, publicado el 30 de julio de 2009, se desvelan anticuerpos CD40 optimizados y métodos de uso de los mismos. Aunque se han probado diversos anticuerpos anti-CD40 en ensayos clínicos, hasta ahora ninguno ha mostrado tener suficiente actividad. La presente divulgación resuelve este y otros problemas.

Breve sumario de la invención

La presente divulgación proporciona un método para el tratamiento del cáncer, administrando, a un paciente que necesite dicho tratamiento, un anticuerpo anti-CD40. El anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana. La región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE establecido en Kabat y menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido incluyen un resto de fucosa, es decir, una fucosa unida al extremo reductor de la cadena de azúcar mediante un enlace a1,6 a la N-acetilglucosamina ("GlcNAc"). La administración del anticuerpo anti-CD40 se realiza a un nivel de dosis comprendido entre 0,1 y 300 jg/kg (|jg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del paciente). En una realización, el nivel de dosis de anticuerpo anti-CD40 está comprendido entre 0,6 y 150 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis de anticuerpo anti-CD40 está comprendido entre 1,0 y 100 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis de anticuerpo anti-CD40 está comprendido entre 5 y 25 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis de anticuerpo anti-CD40 está comprendido entre 8 y 12 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis de anticuerpo anti-CD40 es de aproximadamente 10 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis del anticuerpo anti-CD40 es de 10 jg/kg.

La invención proporciona un anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método, las etapas de administrar, a un paciente que necesite dicho tratamiento, una composición que comprenda el anticuerpo anti-CD40. El anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana. La región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE establecido en Kabat y menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido incluyen un resto de fucosa, es decir, una fucosa unida al extremo reductor de la cadena de azúcar mediante un enlace a1,6 a la N-acetilglucosamina ("GlcNAc"). La administración del anticuerpo anti-CD40 se realiza a un nivel de dosis comprendido entre 0,1 y 2000 jg/kg ( jg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del paciente). En una realización, el nivel de dosis está comprendido entre 10 y 1000 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis está comprendido entre 50 y 800 jg/kg. En una realización adicional, el nivel de dosis está comprendido entre 75 y 600 jg/kg. En otra realización, el nivel de dosis está comprendido entre 100 y 500 jg/kg. En realizaciones adicionales, el nivel de dosis se encuentra en un intervalo seleccionado entre los siguientes: 100-300 jg/kg, 300-500 jg/kg, 500-700 jg/kg, 700-900 jg/kg y 900 1100 jg/kg. En otras realizaciones, el nivel de dosis se encuentra en un intervalo seleccionado entre los siguientes: 100-150 jg/kg, 150-200 jg/kg, 200-250 jg/kg, 250-300 jg/kg, 300-350 jg/kg, 350-400 jg/kg, 400-450 jg/kg, 450 500 jg/kg, 500-550 jg/kg, 550-600 jg/kg, 600-650 jg/kg, 650-700 jg/kg, 700-750 jg/kg, 750-800 jg/kg, 800 850 jg/kg, 850-900 jg/kg, 900-950 jg/kg, 950-1000 jg/kg, 1000-1050 jg/kg y 1050-1100 jg/kg. En realizaciones adicionales, el nivel de dosis se selecciona entre los siguientes: 60 jg/kg, 100 jg/kg, 150 jg/kg, 200 jg/kg, 250 jg/kg, 300 jg/kg, 350 jg/kg, 400 jg/kg, 450 jg/kg, 500 jg/kg, 550 jg/kg, 600 jg/kg, 650 jg/kg, 700 jg/kg, 750 jg/kg, 800 jg/kg, 850 jg/kg, 900 jg/kg, 950 jg/kg, 1000-1050 jg/kg, 050 jg/kg y 1110 jg/kg.

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD40 se administra cada tres semanas. En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD40 se administra cada seis semanas. En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD40 se administra cada diez semanas. En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD40 se administra cada doce semanas. En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD40 se administra cada quince semanas. En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD40 se administra cada dieciocho semanas.

En otra realización, el paciente tiene un cáncer CD40 positivo. En otra realización, el paciente tiene un cáncer CD40 negativo. En una realización adicional, el paciente tiene un cáncer que es un tumor sólido. Incluso en otra realización, el paciente tiene un cáncer que es una neoplasia sanguínea. En otra realización, el cáncer es un melanoma, un cáncer de mama, incluyendo cáncer de mama metastásico, un cáncer de pulmón, incluyendo un cáncer de pulmón no microcítico, o cáncer de páncreas.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento del cáncer, administrando al paciente una combinación del anticuerpo anti-CD40 y un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario. Un ejemplo de un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4, del inglés cytotoxic T-lymphocyte-associatedprotein 4). Como ejemplos de anticuerpos anti-CTLA4 se incluyen, por ejemplo, ipilimumab o tremelimumab. Otro ejemplo de un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-proteína 1 de muerte celular programada (PD1, del inglés programmed cell death protein 1). Como ejemplos de anticuerpos anti-PD1 se incluyen, por ejemplo, nivolumab, pidilizumab o pembrolizumab. Otro ejemplo de un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario es un anticuerpo anti ligando 1 de muerte programada (PD-L1, del inglés programmed death-ligand 1). Como ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 se incluyen, por ejemplo, MEDI4736 y MPDL3280A.

Por tanto, la invención también proporciona una composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer junto con un anticuerpo anti-CTLA4, comprendiendo el método, administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento, el anticuerpo anti-CTLA4 y la composición de anticuerpo anti-CD40 que comprende un anticuerpo anti-CD40, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa.

También se proporciona una composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer junto con un anticuerpo anti-PD-1, comprendiendo el método, administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento, el anticuerpo anti-PD-1 y la composición de anticuerpo CD-40 que comprende un anticuerpo anti-CD40, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa.

Se proporciona además una composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer junto con un anticuerpo anti-PD-L1, comprendiendo el método, administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento, el anticuerpo anti-PD-L1 y la composición de anticuerpo anti-CD40 que comprende un anticuerpo anti-CD40, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa.

En otra realización, el paciente tiene un cáncer CD40 positivo y se trata con una combinación del anticuerpo anti-CD40 y un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización, el paciente tiene un cáncer CD40 negativo y se trata con una combinación del anticuerpo anti-CD40 y un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En una realización adicional, el paciente tiene un cáncer que es un tumor sólido y se trata con una combinación del anticuerpo anti-CD40 y un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L1. Incluso en otra realización, el paciente tiene un cáncer que es una neoplasia sanguínea y se trata con una combinación del anticuerpo anti-CD40 y un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización, el cáncer es un melanoma, un cáncer de mama, incluyendo cáncer de mama metastásico, un cáncer de pulmón, incluido un cáncer de pulmón no microcítico, o cáncer de páncreas, y se trata con una combinación del anticuerpo anti-CD40 y un anticuerpo que bloquea un punto de control inmunitario, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o un anticuerpo anti-PD-L1.

Definiciones

Un "polipéptido" o una "cadena polipeptídica" es un polímero de restos de aminoácidos conectados mediante enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos se denominan comúnmente "péptidos".

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de hidratos de carbono. Los hidratos de carbono y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. En el presente documento, las proteínas se definen en cuanto a sus estructuras de la cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes, tales como los grupos de hidratos de carbono, generalmente no se especifican, aunque no obstante pueden estar presentes.

En el presente documento, las expresiones "extremo amino" y "extremo carboxilo" se utilizan para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permita, estos términos se usan con referencia a una secuencia o parte particular de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia colocada en el extremo carboxilo de una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está ubicada cerca del extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

En el presente documento, el término "anticuerpo" se usa para indicar proteínas de inmunoglobulina producidas por el organismo en respuesta a la presencia de un antígeno y que se unen al antígeno, así como a fragmentos de unión a antígeno y a variantes genomodificadas de los mismos. De esta manera, el término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos que comprenden cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, anticuerpos producidos utilizando tecnología de hibridoma) y fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, tales como fragmentos F(ab')²y Fab. También se incluyen anticuerpos y fragmentos intactos genomodificados, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fv monocatenarios, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos híbridos multivalentes o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) y similares. Por tanto, el término "anticuerpo" se usa ampliamente para incluir cualquier proteína que comprenda un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo y que sea capaz de unirse específicamente a su antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno de un anticuerpo" es la parte de un anticuerpo que es suficiente para unirse a su antígeno. La mínima región de este tipo suele ser un dominio variable o una variante genomodificada del mismo. Los sitios de unión de un solo dominio se pueden generar a partir de anticuerpos de camélidos (véase Muyldermans y Lauwereys, J. Mol. Recog. 12:131-140, 1999; Nguyen et al., EMBO J. 19:921-930, 2000) o de dominios VH de otras especies para producir anticuerpos de un sólo dominio ("dAbs", single-domain antibodies; véase Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; patente de Estados Unidos N.° 6.248.516 de Winter et al.). En determinadas variaciones, un sitio de unión a antígeno es una región polipeptídica que solo tiene 2 regiones determinantes de la complementariedad (CDR, complementarity determining regions) de un dominio variable de cadena ligera o dominio variable de cadena pesada de origen natural o no natural (por ejemplo, mutagenizado), o una combinación de los mismos (véase, por ejemplo, Pessi et al., Nature 362:367-369, 1993; Qiu et al., Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007). Más habitualmente, un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende tanto un dominio variable de cadena pesada (VH, heavy chain variable) como un dominio variable de cadena ligera (VL, light chain variable) que se unen a un epítopo común. Dentro del contexto de la presente invención, además de un sitio de unión a antígeno un anticuerpo puede incluir uno o más componentes, tales como, por ejemplo, un segundo sitio de unión a antígeno de un anticuerpo (que puede unirse al mismo epítopo o a uno diferente o al mismo antígeno o a uno diferente), un enlazador peptídico, una región constante de inmunoglobulina, una bisagra de inmunoglobulina, una hélice anfipática (véase Pack y Pluckthun, Biochem.

31:1579-1584, 1992), un enlazador no peptídico, un oligonucleótido (véase Chaudri et al., f Eb S Letters 450:23-26, 1999), un fármaco citostático o citotóxico y similares, y puede ser una proteína monomérica o multimérica. En la técnica se conocen ejemplos de moléculas que comprenden un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo e incluyen, por ejemplo, Fv, Fv monocatenario (scFv, single-chain Fv), Fab, Fab', F(ab')², F(ab)^c, diacuerpos, dAbs, minicuerpos, nanocuerpos, fusiones Fab-scFv, (scFv)⁴-IgG biespecífico y (scFv)²-Fab biespecífico. (Véase, por ejemplo, Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996; Atwell et al., Molecular Immunology 33:1301-1312, 1996; Carter y Merchant, Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; y Lu et al., J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002.)

El término "inmunoglobulina", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que consta de uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por uno o más genes de inmunoglobulina. En los vertebrados, una forma de inmunoglobulina constituye la unidad estructural básica de los anticuerpos nativos (es decir, naturales). Esta forma es un tetrámero y consta de dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par, una cadena ligera y una pesada. En cada par, las regiones variables de la cadena ligera y pesada (VL y VH) son, conjuntamente, las principales responsables de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son las principales responsables de las funciones efectoras del anticuerpo. En vertebrados superiores, se han identificado cinco clases de proteínas de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE). La IgG comprende la clase principal; normalmente existe como la segunda proteína más abundante que se encuentra en el plasma. En los seres humanos, la IgG consta de cuatro subclases, denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las regiones constantes de la cadena pesada de la clase IgG se identifican con el símbolo griego y. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante de cadena pesada y1. Cada cadena pesada de inmunoglobulina posee una región constante que consta de dominios proteicos de región constante (CH1, bisagra, CH2 y CH3; la IgG3 también contiene un dominio CH4) que son esencialmente invariables para una subclase dada en una especie. En la técnica se conocen secuencias de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina humana y no humana. (Véase, por ejemplo, Ellison et al., DNA 1:11-18, 1981; Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Amster et al., Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi y Kohler, Nature 314:330-334, 1985; Boss et al., Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwell et al., Nature 298:380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlin et al., J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985; Kindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18:165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993; y número de registro de GenBank J00228.) Para una revisión acerca de la estructura y función de las inmunoglobulinas, véase Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49 140, 1987; y Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. En el presente documento, el término "inmunoglobulina" se usa por su significado común, que, dependiendo del contexto, indica un anticuerpo intacto, sus cadenas componentes, o fragmentos de cadenas.

Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos), están codificadas por un gen de la región variable en el extremo amino (que codifica aproximadamente 110 aminoácidos) y por un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo carboxilo. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos), están codificadas por un gen de la región variable (que codifica aproximadamente 116 aminoácidos) y por un gen de la región constante gamma, mu, alfa, delta, o épsilon (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos), definiendo este último el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Dentro de cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están conectadas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. (Véase, en líneas generales, Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2a ed. 1989), cap. 7).

Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (también denominada en el presente documento "dominio variable de cadena ligera" ("dominio VL") o "dominio variable de cadena pesada" ("dominio VH"), respectivamente) consta de una región "marco conservada" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones marco conservadas sirven para alinear las CDR para la unión específica a un epítopo de un antígeno. Por tanto, la expresión "región hipervariable" o "CDR" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son principalmente responsables de la unión al antígeno. Desde el extremo amino al extremo carboxilo, ambos dominios VL y VH comprenden las siguientes regiones marco conservadas (FR) y CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989. Kabat también proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que se asigna el mismo número a los restos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras. En el presente documento, las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VL, también se denominan, respectivamente, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; En el presente documento, las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VH, también se denominan, respectivamente, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

A menos que el contexto indique otra cosa, la expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que procede de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago y no al método mediante el que se produce.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que tiene dominios variables procedentes una primera especie y regiones constantes procedentes de una segunda especie. Las inmunoglobulinas quiméricas o los anticuerpos quiméricos se pueden construir, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos génicos de inmunoglobulinas que pertenecen a especies diferentes. La expresión "anticuerpo humanizado", definida más adelante, no pretende abarcar anticuerpos quiméricos. Aunque los anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (es decir, comprenden regiones de más de una especie de proteína), incluyen características adicionales (es decir, regiones variables que comprenden restos de CDR donantes y restos de la región marco conservada aceptores) que no se encuentran en las inmunoglobulinas o en los anticuerpos quiméricos, como se define en el presente documento.

La expresión "dominio VH humanizado" o "dominio VL humanizado", se refiere a un dominio VH o VL de inmunoglobulina que comprende algunas o todas las CDR total o sustancialmente de una inmunoglobulina de un donante no humano (por ejemplo, de un ratón o una rata) y secuencias marco conservadas de la región variable total o sustancialmente de secuencias de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona la región marco conservada se denomina "aceptora". En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden conservar restos no humanos dentro de las regiones marco conservadas del dominio variable humano para mejorar las características de unión adecuadas (por ejemplo, cuando se humaniza un anticuerpo, pueden ser necesarias mutaciones en las regiones marco conservadas para preservar la afinidad de unión).

Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende uno o ambos de un dominio VH humanizado y un dominio VL humanizado. No es necesario que haya una o más regiones constantes de inmunoglobulina, pero en caso de haberlas, proceden total o sustancialmente de regiones constantes de inmunoglobulina humana.

La unión específica de un anticuerpo con su antígeno diana significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 o 1010 M-1. La unión específica es, de manera detectable, de mayor magnitud y puede diferenciarse de la unión inespecífica que se produce en al menos una diana no relacionada. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o de un ajuste espacial particular (por ejemplo, tipo cerradura y llave), mientras que la unión inespecífica suele ser el resultado de fuerzas de van der Waals. Sin embargo, la unión específica no implica necesariamente que un anticuerpo monoclonal se una a una sola diana.

Con respecto a las proteínas descritas en el presente documento, la referencia a los restos de aminoácidos correspondientes a los especificados por SEQ ID NO, incluye las modificaciones postraduccionales de dichos restos.

El término "diluyente", como se usa en el presente documento, se refiere a una solución adecuada para alterar o lograr una concentración o concentraciones ilustrativas o apropiadas como se describe en el presente documento.

El término "recipiente" se refiere a algo en lo que se puede colocar o incluir un objeto o líquido, por ejemplo, para su almacenamiento (por ejemplo, un soporte, receptáculo, vaso, o similar).

La expresión "vía de administración" incluye vías de administración reconocidas en la técnica para suministrar una proteína terapéutica tal como, por ejemplo, por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración de un anticuerpo para el tratamiento del cáncer, se puede desear la administración en la circulación sistémica mediante administración intravenosa o subcutánea. Para el tratamiento de un cáncer caracterizado por un tumor sólido, la administración también puede localizarse directamente en un tumor, si así se desea.

El término "tratamiento" se refiere a la administración de un agente terapéutico a un paciente que tiene una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, retrasar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o afectar a la enfermedad.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

La expresión "cantidad eficaz", "dosis eficaz", o "dosificación eficaz", se refiere a una cantidad que es suficiente para conseguir o conseguir al menos parcialmente, el efecto deseado, por ejemplo, suficiente para inhibir la aparición o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o un trastorno. Se administra una cantidad eficaz de una composición farmacéutica en un "régimen eficaz". La expresión "régimen eficaz" se refiere a una combinación de la cantidad de la composición que se administra y la frecuencia de dosificación adecuada para lograr el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad o del trastorno.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" indica un intervalo aproximado de más o menos el 10 % de un valor especificado. Por ejemplo, la frase "aproximadamente 20 pg/kg" abarca un intervalo de 18 22 pg/kg. Como se usa en el presente documento, la palabra aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por tanto, "aproximadamente 2o pg/kg" significa "aproximadamente 20 pg/kg" y también "20 pg/kg".

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona la unión de SEA-CD40 (línea continua) y dacetuzumab (línea discontinua) con la proteína CD40 humana presente en la superficie de las CMSP.

Las Figuras 2A y 2B proporcionan las afinidades de unión de SEA-CD40 (cuadrados blancos y negros) y dacetuzumab (círculos blancos y negros) con las variantes del receptor FcYllla humano. La figura 2A proporciona una representación gráfica y la figura 2B proporciona valores de K^d. Los valores de SEA-CD40 se muestran en la columna de la izquierda; los valores de dacetuzumab se muestran en la columna de la derecha.

La Figura 3 proporciona una relación entre la dosis y la evolución temporal del empobrecimiento de células B de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana como resultado del tratamiento con SEA-CD40.

Las Figuras 4A y 4B demuestran una producción representativa de citocinas en sangre completa humana después de veinticuatro horas de tratamiento con SEA-CD40 o con un control de isotipo (SEA-h00). Los anticuerpos se administraron en unidades de pg/ml. La Figura 4A muestra la producción de factor de necrosis tumoral a y la Figura 4B muestra la producción de MIP-1p.

Las Figuras 5A y 5B demuestran la producción representativa de citocinas en CMSP humana después de veinticuatro horas de tratamiento con SEA-CD40 o con un control de isotipo (SEA-h00). Los anticuerpos se administraron en unidades de pg/ml. La Figura 5A muestra la producción de factor de necrosis tumoral a (TNF-a) y la Figura 5B muestra la producción de MIP-1p.

La Figura 6 proporciona una evolución temporal del empobrecimiento de células B de CMSP humana, como resultado del tratamiento con SEA-CD40 (cuadrados negros); dacetuzumab (círculos grises); o con F(ab')²de SEA-CD40 (cuadrados grises).

La Figura 7 proporciona la producción de interferón-Y (IFNy) por las CMSP, como resultado del tratamiento con SEA-CD40 (cuadrados negros); dacetuzumab (círculos grises); o con F(ab')²de SEA-CD40 (cuadrados grises).

La Figura 8 demuestra la inducción de HLA-DR/DQ/DP como marcador de maduración de células presentadoras de antígeno por las CMSP como resultado del tratamiento con SEA-CD40 (cuadrados negros); dacetuzumab (círculos grises) o F(ab')²de SEA-CD40 (cuadrados grises).

La Figura 9 proporciona curvas de concentración frente a respuesta normalizada de marcadores de inmunoactivación en CMSP tratadas con diversas concentraciones de SEA-CD40.

Las Figuras 10A y 10B comparan la respuesta inmunitaria contra el péptido M1 de la gripe por las CMSP incubadas con SEA-CD40 o dacetuzumab. La Figura 10A muestra los niveles porcentuales de células T específicas de antígeno; La Figura 10B muestra los niveles de producción de IFN-y.

La Figura 11 demuestra la mejora de la respuesta inmunitaria contra el péptido M1 de la gripe por las CMSP incubadas con una combinación de SEA-CD40 y un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-pD-1. En la Figura 11 se muestran los niveles de IFNy.

La Figura 12 demuestra la mejora de la respuesta inmunitaria contra el péptido M1 de la gripe por las CMSP incubadas con una combinación de SEA-CD40 y un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-pD-1. En la Figura 12 se muestran los niveles de células T específicas de antígeno.

La Figura 13 proporciona la respuesta inmunitaria (producción de IFNy) de las CMSP de donantes con cáncer contra péptidos antigénicos tumorales comunes (MAGEA1/MAGE3/NY-ESO). Las CMSP se incubaron en presencia o en ausencia de concentraciones crecientes de SEA-CD40 o SGN-40 durante 5 días.

La Figura 14 proporciona la respuesta inmunitaria (producción de IFNy) de las CMSP de donantes con cáncer contra péptidos antigénicos tumorales comunes (MAGEA1/MAGE3/NY-ESO). Las CMSP se incubaron en presencia o en ausencia de concentraciones crecientes de SEA-CD40 y/o con una concentración constante de un anticuerpo bloqueador anti-CTLA4 o anti-PD1.

Las Figuras 15A y 15B demuestran la unión de anticuerpos anti-CD40 de ratón fucosilados y no fucosilados contra receptores Fcy murinos. Los receptores Fcy eran FcyRI (Figura 15A) o FcyRIV (Figura 15B).

La Figura 16 demuestra la actividad in vivo de sustitutos de anticuerpos anti-CD40 fucosilados y no fucosilados en el modelo de melanoma B16 de ratón.

La Figura 17 demuestra la actividad de activación de células B de SEA-CD40, del anticuerpo 21.4.1 y del ligando hexamérico CD40. Los experimentos se realizaron utilizando cultivos de células B purificadas.

La Figura 18 demuestra la actividad de activación de células B de SEA-CD40, anticuerpo 21.4.1 y ligando hexamérico CD40. Los experimentos se realizaron utilizando cultivos de CMSP.

La Figura 19 demuestra la actividad de activación de monocitos/macrófagos de SEA-CD40, anticuerpo 21.4.1, dacetuzumab y un control de isotipo SEA.

La Figura 20 demuestra la inducción de niveles de interferón-Y (IFN-y) por SEA-CD40, del anticuerpo 21.4.1, dacetuzumab o un control de isotipo SEA.

La Figura 21 demuestra la inducción de niveles de interleucina 10 (IL10) por SEA-CD40, anticuerpo 21.4.1, dacetuzumab o un control de isotipo SEA.

La Figura 22 demuestra la inducción de niveles de interferón-Y (IFN-y) por SEA-CD40, anticuerpo 21.4.1 o dacetuzumab. La incubación se realizó en presencia de péptido de la gripe.

La Figura 23 demuestra la inducción de una respuesta de células T específica del antígeno de la gripe por SEA-CD40, anticuerpo 21.4.1 o dacetuzumab.

La Figura 24 demuestra cambios en los niveles de IL10 después de la incubación de CMSP con péptido de la gripe y SEA-CD40, anticuerpo 21.4.1 o dacetuzumab.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona una descripción de la actividad de un anticuerpo anti-CD40 no fucosilado, SEA-CD40. SEA-CD40 es un anticuerpo agonista y tiene una unión mejorada a los receptores III de Fcy y, sorprendentemente, presenta una activación mejorada de la ruta de señalización de CD40. Debido a su activación mejorada de la ruta de CD40, SEA-CD40 es un fuerte activador del sistema inmunitario y puede utilizarse para tratar el cáncer o para tratar enfermedades infecciosas, particularmente enfermedades víricas crónicas, tales como hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus de John Cunningham y virus del papiloma humano. Otras enfermedades inflamatorias, incluyen, por ejemplo, tuberculosis. La activación mejorada del sistema inmunitario permite que SEA-CD40 se dosifique a niveles bajos, en comparación con un anticuerpo precursor fucosilado.

Descripción y función de CD40.

CD40 es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF, siglas del inglés tumor necrosis factor). Se trata de una proteína transmembrana monocatenaria de tipo I con un PM (peso molecular) aparente de 50 kDa. Su núcleo polipeptídico maduro consta de 237 aminoácidos, de los cuales, 173 aminoácidos comprenden un dominio extracelular (ECD, siglas del inglés extracellular domain) organizado en 4 repeticiones ricas en cisteína que son características de los miembros de la familia de receptores del TNF. En la región proximal de la membrana del ECD hay dos posibles sitios de glucosilación ligados a N, mientras que no hay posibles sitios de glucosilación ligados a O. Un dominio transmembrana de 22 aminoácidos conecta el e Cd con la cola citoplásmica de 42 aminoácidos de CD40. Se han identificado motivos de secuencia implicados en la transducción de señales mediada por CD40 en la cola citoplásmica de CD40. Estos motivos interactúan con factores citoplásmicos denominados factores asociados a TNF-R (TRAFs, TNF-R-associated factors) para desencadenar múltiples eventos posteriores, incluida la activación de MAP cinasas y NFkB, que a su vez modulan las actividades transcripcionales de una variedad de genes relacionados con la inflamación, la supervivencia y el crecimiento. Véase, por ejemplo, van Kooten y Banchereau, J. Leukoc. Biol. 67:2-17 (2000); Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009).

En el sistema hematopoyético, CD40 se puede encontrar en las células B en múltiples fases de diferenciación, monocitos, macrófagos, plaquetas, células dendríticas foliculares, células dendríticas (DC, dendritic cells), eosinófilos y células T activadas. En tejidos no hematopoyéticos normales, se ha detectado CD40 en células epiteliales renales, queratinocitos, fibroblastos de origen dérmico y de membrana sinovial y endotelio activado. Una versión soluble de CD40 se libera de las células que expresan CD40, posiblemente a través del corte y empalme diferencial del transcrito primario o de la proteólisis limitada por la enzima convertidora de metaloproteinasa TNFa. Posiblemente la liberación de CD40 puede modificar respuestas inmunitarias al interferir con la interacción de CD40/CD40L. Véase, por ejemplo, van Kooten y Banchereau, J. Leukoc. Biol. 67:2-17 (2000); Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009).

El ligando endógeno de CD40 (CD40L) es una glucoproteína de membrana de tipo II de 39 kDa también conocida como CD154. CD40L es un miembro de la superfamilia del TNF y se expresa como un trímero en la superficie celular. CD40L se expresa transitoriamente en células T CD4+, CD8+ y y§ activadas. CD40L también se detecta a niveles variables en monocitos purificados, en células B activadas, en células endoteliales epiteliales y vasculares, en células de músculo liso y en las DC, pero la relevancia funcional de la expresión de CD40L en estos tipos de células no se ha definido claramente (van Kooten 2000; Elgueta 2009). Sin embargo, la expresión de CD40L en plaquetas activadas se ha implicado en la patogenia de enfermedades trombóticas. Véase, por ejemplo, Ferroni et al., Curr. Med. Chem.

14: 2170-2180 (2007).

La función mejor caracterizada de la interacción CD40/CD40L es su papel en la interacción recíproca dependiente de contacto entre las células presentadoras de antígeno y las células T. Véase, por ejemplo, van Kooten y Banchereau, J. Leukoc. Biol. 67:2-17 (2000); Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009). La unión de CD40L en células T activadas con CD40 en células B activadas por antígeno no solo impulsa la rápida expansión de las células B, sino que también proporciona una señal esencial para que las células B se diferencien en células B de memoria o células plasmáticas. La señalización de CD40 es responsable de la formación de centros germinales en los que las células B experimentan una maduración por afinidad y un cambio de isotipo para adquirir la capacidad de producir anticuerpos de alta afinidad de los isotipos IgG, IgA e IgE. Véase, por ejemplo, Kehry, J. Immunol. 156: 2345-2348 (1996). Por tanto, los individuos con mutaciones en el locus CD40L que impiden la interacción funcional CD40/CD40L padecen el síndrome de hiper-IgM ligado al cromosoma X de inmunodeficiencia primaria que se caracteriza por una representación excesiva de IgM circulante y por la incapacidad de producir IgG, IgA e IgE. Estos pacientes demuestran respuestas inmunitarias humorales secundarias suprimidas, mayor susceptibilidad a infecciones pirogénicas recurrentes y mayor frecuencia de carcinomas y linfomas. Los experimentos de desactivación génica (knockout, KO) en ratones para inactivar el locus CD40 o CD40L, reproducen los principales defectos observados en los pacientes con hiper-IgM ligada al cromosoma X. Estos ratones con genes desactivados (KO), también muestran una alteración en el cebado de células T específicas de antígeno, lo que sugiere que la interacción CD40L/CD40 también es un factor crítico para generar respuestas inmunitarias mediadas por células. Véase, por ejemplo, Elgueta et al., Immunol. Rev.

229:152-172 (2009).

Los efectos inmunoestimuladores del ligamiento de CD40 por CD40L o anti-CD40 in vivo se han correlacionado con respuestas inmunitarias contra tumores singénicos. Véase, por ejemplo, French et al., Nat. Med. 5: 548-553 (1999). Una respuesta inmunitaria deficiente contra las células tumorales puede ser el resultado de una combinación de factores tales como la expresión de moléculas de puntos de control inmunitario, tales como PD-1 o CTLA-4, la disminución de la expresión de antígenos del MHC, la mala expresión de antígenos asociados a tumores, la adhesión apropiada, o las moléculas coestimuladoras, y la producción de proteínas inmunosupresoras como TGFp por parte de las células tumorales. El ligamiento de CD40 en células transformadas y presentadoras de antígeno, da como resultado una regulación positiva de proteínas de adhesión (por ejemplo, CD54), de moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD86) y de antígenos del MHC, así como la secreción de citocinas inflamatorias, por lo que se puede inducir y/o mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral, así como la inmunogenicidad de las células tumorales. Véase, por ejemplo, Gajewski et al., Nat. Immunol. 14:1014-1022 (2013).

Una consecuencia principal del entrecruzamiento de CD40 es la activación de DC (a menudo denominada autorización) y la potenciación de la capacidad de las células B y mieloides para procesar y presentar antígenos asociados a tumores a las células T. Además de tener una capacidad directa para activar la respuesta inmunitaria innata, una consecuencia exclusiva de la señalización de CD40 es la presentación de APC de antígenos procedentes de tumores a precursores de células T citotóxicas (CTL, cytotoxic T cell) CD8+ en un proceso conocido como "cebado cruzado". Esta activación y diferenciación dependiente de CD40 de precursores de CTL por DC maduras en CTL efectoras específicas de tumor, pueden mejorar las respuestas inmunitarias mediadas por células contra las células tumorales. Véase, por ejemplo, Kurts et al., Nat. Rev. Immunol. 10:403-414 (2010).

Los MAb CD40 agonistas, incluido dacetuzumab, la molécula precursora de SEA-CD40, han mostrado una actividad clínica favorable en entornos de quimioterapia de agente único y de combinación. Dacetuzumab demostró cierta actividad clínica en un estudio en fase 1 en LNH y en un estudio en fase 2 en linfoma difuso de células B grandes (LDCBG). Véase, por ejemplo, Advani et al., J. Clin. Oncol. 27: 4371-4377 (2009) y De Vos et al., J. Hematol. Oncol.

7:1-9 (2014). Además, CP-870,893, un anticuerpo agonista de IgG2 humanizado contra CD40, mostró una actividad favorable en indicaciones de tumores sólidos cuando se combinó con paclitaxel o carboplatino o gemcitabina. En estos estudios, se observó activación de células presentadoras de antígeno, producción de citocinas y generación de células T específicas de antígeno. Véase, por ejemplo, Beatty et al., Clin. Cancer Res. 19:6286-6295 (2013) y Vonderheide et al., Oncoimmunology 2:e23033 (2013).

Anticuerpos anti-CD40

Debido a su papel en la función inmunitaria, se han generado anticuerpos contra el antígeno CD40. Dichos anticuerpos se pueden clasificar en tres grupos, anticuerpos antagonistas, que inhiben la actividad de CD40; anticuerpos parcialmente agonistas, que inducen parcialmente la actividad de CD40; y anticuerpos completamente agonistas, que estimulan completamente la actividad de CD40. Los miembros de cada uno de los grupos se han probado en ensayos clínicos; ninguno ha sido aprobado hasta la fecha.

SEA-CD40

La presente divulgación proporciona un anticuerpo hS2C6 no fucosilado, SEA-CD40. S2C6 se aisló originalmente como un anticuerpo monoclonal murino producido contra un carcinoma de vejiga humano al que se hace referencia en el presente documento como mS2C6. Véase, por ejemplo, Paulie et al., Cancer Immunol. Immunother. 17:165-179 (1984). El anticuerpo S2C6 es un agonista parcial de la ruta de señalización de CD40 y, por tanto, tiene las siguientes actividades: unión a la proteína CD40 humana, unión a la proteína CD40 de macaco cangrejero (cynomolgus), activación de la ruta de señalización de CD40, potenciación de la interacción de CD40 con su ligando, CD40L. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.°°6.946.129.

Como una etapa posterior en el desarrollo, S2C6 se humanizó y este anticuerpo humanizado se conoce como S2C6 humanizado, en el presente documento, y como alternativa, como dacetuzumab, o S2C6 fucosilado, humanizado (fhS2C6) o SGN-40. Véase, por ejemplo, el documento WO 2006/128103. El SGN-40 se probó en ensayos clínicos en humanos y se descubrió que no era lo suficientemente activo como para explicar un mayor desarrollo.

SEA-CD40 es un anticuerpo S2C6 humanizado no fucosilado. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de SEA-CD40 se desvelan como SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. La región variable de la cadena pesada va de los aminoácidos 1 a113 de la SEQ ID NO: 1; la región variable de la cadena ligera va de los aminoácidos 1 a 113 de la SEQ ID NO: 2. La generación de la cadena principal del anticuerpo de SEA-CD40 se desvela en el documento WO 2006/128103.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo S2C6 humanizado, no fucosilado, denominado en el presente documento nf hS2C6 o SEA-CD40. Además de una unión mejorada con los receptores de Fc, SEA-CD40 también mejora la actividad de la ruta de CD40, en comparación con dacetuzumab, el anticuerpo precursor. Por tanto, el anticuerpo SEA-CD40, se administra a pacientes a dosis más bajas y utilizando diferentes pautas de administración.

Anticuerpos no fucosilados

SEA-CD40 es un anticuerpo no fucosilado y presenta una unión mejorada a los receptores FcyIII y una capacidad sorprendentemente mejorada para activar la ruta de señalización de CD40 en las células inmunitarias.

Métodos de producción de anticuerpos no fucosilados

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para preparar anticuerpos S2C6 humanizados con fucosilación núcleo reducida. Como se usa en el presente documento, "fucosilación núcleo" se refiere a la adición de fucosa ("fucosilación") a la N-acetilglucosamina ("GlcNAc") en el extremo reductor de un glucano ligado a N.

La fucosilación de cadenas de azúcar complejas ligadas a N-glucósido unidas a la región (o al dominio) Fc de la cadena principal del anticuerpo SEA-CD40 se reduce. Como se usa en el presente documento, normalmente, una "cadena de azúcar compleja ligada a N-glucósido" se une a la asparagina 297 (según el índice de la UE como se expone en Kabat, "Sequences of Immunological Interest, 5a ed., Pub. N.° 91-3242, U.S. Dept. Healtth & Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991). Como se usa en el presente documento, la cadena de azúcar compleja ligada a N-glucósido tiene una cadena de azúcar compuesta biantenaria, que tiene principalmente la siguiente estructura:

donde indica que la molécula de azúcar puede estar presente o ausente, y los números indican la posición de los enlaces entre las moléculas de azúcar. En la estructura anterior, el extremo de la cadena de azúcar que se une a la asparagina se denomina extremo reductor (a la derecha) y el lado opuesto se denomina extremo no reductor. Normalmente, la fucosa se une a la N-acetilglucosamina ("GlcNAc") del extremo reductor, normalmente por un enlace a1,6 (la posición 6 de la GlcNAc está ligada a la posición 1 de la fucosa). "Gal" se refiere a galactosa y "Man" se refiere a manosa.

Una "cadena de azúcar compleja ligada a N-glucósido" incluye 1) un tipo complejo, en el que el lado del extremo no reductor de la estructura núcleo tiene una o más ramas de galactosa-N-acetilglucosamina (también denominada "gal-GlcNAc") y el lado del extremo no reductor de Gal-GlcNAc tiene opcionalmente un ácido siálico, que bisectan la N-acetilglucosamina o similar; o 2) un tipo híbrido, en el que el lado del extremo no reductor de la estructura núcleo tiene las dos ramas de una cadena de azúcar con alto contenido de manosa ligada a N-glucósido y una cadena de azúcar compleja unida a N-glucósido.

En algunas realizaciones, la "cadena de azúcar compleja ligada a N-glucósido" incluye un tipo complejo en el que el lado del extremo no reductor de la estructura núcleo tiene cero, una o más ramas de la galactosa-N-acetilglucosamina (también denominada "gal-GlcNAc") y el lado del extremo no reductor de Gal-GlcNAc tiene, opcionalmente además, una estructura, tal como un ácido siálico, que bisecta la N-acetilglucosamina o similar.

Según los presentes métodos, normalmente, en la(s) cadena(s) compleja(s) de azúcar ligada(s) a N-glucósido de la molécula SEA-CD40, sólo se incorpora una pequeña cantidad de fucosa. Por ejemplo, en varios aspectos, menos de aproximadamente el 60 %, menos de aproximadamente el 50 %, menos de aproximadamente el 40 %, menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 15 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 5 % o menos de aproximadamente el 3 % del anticuerpo, tiene fucosilación núcleo por fucosa. En algunas realizaciones, aproximadamente el 2 % del anticuerpo tiene fucosilación núcleo por fucosa.

En determinadas realizaciones, en la(s) cadena(s) compleja(s) de azúcar ligada(s) a N-glucósido, sólo se incorpora una pequeña cantidad de un análogo de fucosa (o un metabolito o producto del análogo de fucosa). Por ejemplo, en varios aspectos, menos de aproximadamente el 40 %, menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 15 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 5 % o menos de aproximadamente el 3 % del anticuerpo SEA-CD40 tiene fucosilación núcleo por un análogo de fucosa o un metabolito o producto del análogo de fucosa. En algunas realizaciones, aproximadamente el 2 % del anticuerpo SEA-CD40 tiene fucosilación núcleo por un análogo de fucosa o un metabolito o producto del análogo de fucosa.

Por ejemplo, en el documento WO/2009/135181, se describen métodos para producir anticuerpos no fucosilados incubando células productoras de anticuerpos con un análogo de fucosa. Resumiendo, las células que se han genomodificado para expresar el anticuerpo S2C6 humanizado se incuban en presencia de un análogo de fucosa o de un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa. Como se usa en el presente documento, un metabolito intracelular puede ser, por ejemplo, un análogo modificado con GDP o un análogo total o parcialmente desesterificado. Un producto puede ser, por ejemplo, un análogo total o parcialmente desesterificado. En algunas realizaciones, un análogo de fucosa puede inhibir una o más enzimas en la ruta de rescate de la fucosa. Por ejemplo, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir la actividad de la fucocinasa o GDP-fucosa-pirofosforilasa. En algunas realizaciones, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) inhibe la fucosiltransferasa (preferentemente una 1,6-fucosiltransferasa, por ejemplo, la proteína FUT8). En algunas realizaciones, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir la actividad de una enzima en la ruta sintética de novo de la fucosa. Por ejemplo, un análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir la actividad de la GDP-manosa 4,6-deshidratasa y/o de la GDP-fucosa sintetasa. En algunas realizaciones, el análogo de fucosa (o un metabolito intracelular o producto del análogo de fucosa) puede inhibir un transportador de fucosa (por ejemplo, el transportador de GDP-fucosa).

En una realización, el análogo de fucosa es 2-fluorofucosa. Por ejemplo, en el documento WO/2009/135181, se desvelan métodos de uso de análogos de fucosa en medio de crecimiento y otros análogos de fucosa.

Otros métodos de ingeniería de líneas celulares para reducir la fucosilación núcleo incluyen desactivaciones génicas, inserciones génicas e interferencia por ARN (iARN). En las desactivaciones génicas, el gen que codifica a FUT8 (enzima alfa 1,6-fucosiltransferasa) está inactivo. FUT8 cataliza la transferencia de un resto de fucosilo de la GDP-fucosa en la posición 6 de GlcNac ligado a Asn (ligado a N) de un N-glucano. Se informa que FUT8 es la única enzima responsable de añadir fucosa al hidrato de carbono biantenario ligado a N en Asn297. Las inserciones génicas añaden genes que codifican enzimas tales como GNTIII o una alfa manosidasa II de Golgi. Un aumento en las células, de los niveles de dichas enzimas, desvía a los anticuerpos monoclonales de la ruta de fucosilación (lo que conduce a una fucosilación núcleo disminuida) y tienen una mayor cantidad de N-acetilglucosaminas que se bisectan. La iARN normalmente también se dirige a la expresión del gen FUT8, lo que conduce a disminuir los niveles de transcritos de ARNm o a desactivar la expresión génica por completo. Cualquiera de estos métodos puede utilizarse para generar una línea celular que pueda producir un anticuerpo no fucosilado, por ejemplo, un anticuerpo SEA-CD40.

Los expertos reconocerán que se dispone de muchos métodos para determinar la cantidad de fucosilación en un anticuerpo. Los métodos incluyen, por ejemplo, LC-MS a través de cromatografía PLRP-S y TOF MS de cuadrupolo de ionización por electropulverización.

Cuando el anticuerpo SEA-CD40 no fucosilado se administra a un paciente, induce la activación de la maduración de los monocitos en macrófagos e induce la producción de citocinas, incluyendo, por ejemplo, interferón-Y (IFN-y) y quimiocina que suscitan una respuesta contundente de las células T a las exposiciones del sistema inmunitario. A diferencia de los anticuerpos totalmente agonistas, como el anticuerpo 24.4.1., SEA-CD40 no induce la producción de citocinas inmunodepresoras, tales como interleucina-10 (IL-10). A su vez, IL-10 induce actividad de células T reguladoras, que disminuye la respuesta inmunitaria. Por tanto, SEA-CD40 es útil para la inducción de una contundente respuesta inmunitaria mediada por células T sin promover la actividad de células T reguladoras.

Dosificación y administración de SEA-CD40

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son preferentemente estériles y sustancialmente isotónicas y se fabrican en condiciones GMP (Good Manufacturing Practice, prácticas correctas de fabricación). Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en forma de dosis unitaria (es decir, la dosificación para una sola administración). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular utilizando uno o más transportadores, diluyentes, excipientes o auxiliares. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para inyección, los anticuerpos se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles para reducir las molestias en el lugar de la inyección. La solución puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril apirógena, antes de su uso.

SEA-CD40 se puede administrar por vía intravenosa. En otras realizaciones, SEA-CD40 se puede administrar por vía subcutánea. En una realización adicional, SEA-CD40 se puede administrar por vía subcutánea en el lugar de un tumor.

El anticuerpo SEA-CD40 no fucosilado tiene una actividad inmunoactivadora sorprendentemente mejorada en comparación con la de su anticuerpo precursor, dacetuzumab. Por tanto, SEA-CD40 se puede administrar a pacientes a dosis más bajas y en diferentes pautas en comparación con dacetuzumab.

Como ejemplo, SEA-CD40 se puede administrar a pacientes a niveles entre 0,1-2000 jg/kg (|jg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del paciente). Otros posibles intervalos de dosificación son 10-1000 jg/kg, 50-800 jg/kg, 75-600 jg/kg, 100-500 jg/kg. Otros posibles intervalos de dosificación son los siguientes: 100-300 jg/kg, 300 500 jg/kg, 500-700 jg/kg, 700-900 jg/kg y 900-1100 jg/kg. Incluso más intervalos de dosis son los siguientes: 100 150 jg/kg, 150-200 jg/kg, 200-250 jg/kg, 250-300 jg/kg, 300-350 jg/kg, 350-400 jg/kg, 400-450 jg/kg, 450 500 jg/kg, 500-550 jg/kg, 550-600 jg/kg, 600-650 jg/kg, 650-700 jg/kg, 700-750 jg/kg, 750-800 jg/kg, 800 850 jg/kg, 850-900 jg/kg, 900-950 jg/kg, 950-1000 jg/kg, 1000-1050 jg/kg y 1050-1100 jg/kg. Otros posibles intervalos de dosificación son 0,3-200 jg/kg, 0,6-150 jg/kg, 1,0-100 jg/kg, 2-50 jg/kg, 5-25 jg/kg, 7,5-15 jg/kg y 8 12 jg/kg.

En otras realizaciones, SEA-CD40 se debe administrar a pacientes a 0,6 jg/kg, 1,0 jg/kg, 2,5 jg/kg, 5,0 jg/kg, 7,5 jg/kg, 10 jg/kg, 30 jg/kg, 50 jg/kg, 75 jg/kg, 100 jg/kg o 200 jg/kg. En una realización preferida, SEA-CD40 se debe administrar a pacientes a 10 jg/kg.

En realizaciones adicionales, SEA-CD40 se debe administrar a pacientes a aproximadamente 60 jg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 150 pg/kg, aproximadamente 200 pg/kg, aproximadamente 250 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 350 pg/kg, aproximadamente 400 pg/kg, aproximadamente 450 pg/kg, aproximadamente 500 pg/kg, aproximadamente 550 pg/kg, aproximadamente 600 pg/kg, aproximadamente 650 pg/kg, aproximadamente 700 pg/kg, aproximadamente 750 pg/kg, aproximadamente 800 pg/kg, aproximadamente 850 pg/kg, aproximadamente 900 pg/kg, aproximadamente 950 pg/kg, aproximadamente 1000-1050 pg/kg, aproximadamente 1050 pg/kg y 1110 pg/kg.

En algunas realizaciones, SEA-CD40 se debe administrar de manera que se reduzca la probabilidad de que se produzca agotamiento inmunitario. Por ejemplo, SEA-CD40 se debe administrar a intervalos de tres semanas, a intervalos de seis semanas, a intervalos de ocho semanas, a intervalos de diez semanas, a intervalos de doce semanas o a intervalos de 14 semanas. Los intervalos también pueden seguir una pauta mensual, por ejemplo, intervalos de un mes, intervalos de dos meses o intervalos de tres meses.

Dado que SEA-CD40 activa el sistema inmunitario para responder contra antígenos relacionados con tumores, su uso no se limita a cánceres que expresan CD40. Por tanto, SEA-CD40 se puede utilizar para tratar cánceres CD40 positivos y CD40 negativos.

SEA-CD40 se usa preferentemente para tratar tumores que se sabe que son inmunosensibles, particularmente si el cáncer expresa niveles bajos de CD40 o no expresa CD40 de forma detectable. Los cánceres inmunosensibles incluyen, por ejemplo, melanoma; cáncer de vejiga; cáncer de pulmón, por ejemplo, cáncer de pulmón microcítico y cáncer de pulmón no microcítico; cáncer de ovario; cáncer de riñón; cáncer de páncreas; cáncer de mama; cáncer cervicouterino; cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata; glioblastoma; linfoma no hodgkiniano; leucemia linfocítica crónica; carcinoma hepatocelular; o mieloma múltiple.

En otra realización, SEA-CD40 se utiliza para tratar tumores sólidos. En una realización adicional, SEA-CD40 se utiliza para tratar neoplasias sanguíneas, por ejemplo, linfoma, incluyendo linfoma no hodgkiniano y linfoma hodgkiniano; leucemia linfocítica crónica; o mieloma múltiple.

Politerapia con SEA-CD40

Debido a su función inmunoestimuladora, SEA-CD40 se puede utilizar junto con otros agentes terapéuticos que activen el sistema inmunitario. Los fármacos con función inmunoestimuladora incluyen, por ejemplo, moduladores de células T, incluyendo inhibidores de puntos de control inmunitario; inmunoactivadores; y agentes quimioterapéuticos que inducen la muerte celular inmunogénica. Como ejemplo, determinados anticuerpos funcionan bloqueando la actividad de moléculas que sirven como puntos de control inmunitario en células T. Por lo tanto, SEA-CD40 puede utilizarse junto con anticuerpos que se dirigen a proteínas de puntos de control inmunitario.

Moduladores de células T

Las células T juegan un papel en la capacidad del sistema inmunitario para reconocer y eliminar los cánceres del organismo. Los moduladores de células T incluyen anticuerpos que bloquean la función de puntos de control inmunitario. Véase, por ejemplo, Pardoll, Nature Rev. Cancer, 12:252-264 (2012). Como anticuerpos que bloquean puntos de control inmunitario se incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll y anticuerpos anti-CTLA4. Otros inhibidores/activadores de puntos de control incluyen LAG3 y TIM3. Pueden utilizarse anticuerpos contra algunas proteínas para modular la actividad de las células T o, preferentemente, para activar la actividad de las células T, por ejemplo, anticuerpos contra 41BB, CD27, ICOS y OX40. Otros moduladores de células T incluyen inhibidores de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO).

Los anticuerpos anti-CTLA4 reconocen a la proteína 4 del linfocito citotóxico (CTLA-4,), también conocida como grupo de diferenciación 152 o CD152. La proteína CTLA-4 se expresa en células T, que reconocen a antígenos que son adecuados para el ataque por el sistema inmunitario. La activación de CTLA-4 amortigua la respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo, Nirschi y Drake, Clin. Cancer Res., 19:4917-4924 (2013). Se han utilizado anticuerpos específicos para CTLA-4 y que bloquean su actividad para tratar el cáncer mediante la regulación positiva de la respuesta inmunitaria a los cánceres. Como ejemplos de anticuerpos CTLA-4 se incluyen ipilimumab o tremelimumab. SEA-CD40 puede administrarse junto con ipilimumab o tremelimumab para tratar el cáncer.

Los anticuerpos anti-PD1 reconocen a la proteína de muerte programada-1 (PD-1). Al igual que CTLA-4, PD-1 se expresa en las células T y amortigua la respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo, Nirschi y Drake, Clin. Cancer Res., 19:4917-4924 (2013). Se han utilizado anticuerpos específicos para PD-1 y que bloquean su actividad para tratar el cáncer mediante la regulación positiva de la respuesta inmunitaria a los cánceres. Como ejemplos de anticuerpos PD-1 se incluyen MEDI0680, AMP-224, nivolumab, pembrolizumab y pidilizumab. Como otra proteína de unión a PD-1 que actúa como inhibidor de puntos de control y que puede utilizarse junto con SEA-CD40 se incluye, por ejemplo, B7-DC-Fc. SEA-CD40 puede administrarse junto con MEDI0680, AMP-224, nivolumab, pembrolizumab o pidilizumab, para tratar el cáncer.

PD-L1 es un ligando de la proteína PD-1. PD-L1 se expresa en células cancerosas y su interacción con PD-1 permite que las células cancerosas que expresan PD-L1 eviten el sistema inmunitario. Se han generado y utilizado anticuerpos anti-PD-LI para tratar el cáncer. Como ejemplos de anticuerpos PD-L1 se incluyen, por ejemplo, MEDI4736, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C y Mp Dl3280A. SEA-CD40 se puede administrar en combinación con MEDI4736, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C o MPDL3280A, para tratar el cáncer.

Otros anticuerpos que bloquean la función de proteínas de puntos de control inmunitario incluyen anticuerpos dirigidos, por ejemplo, contra LAG3 y TIM3, y pueden utilizarse junto con SEA-CD40.

Los anticuerpos contra 41BB, CD27, ICOS y OX40, se utilizan para activar la actividad de las células T y pueden utilizarse junto con SEA-CD40. Como anticuerpos OX40 se incluyen, por ejemplo, MEDI6469 y MEDI6383. Un ejemplo de un anticuerpo anti-CD27 agonista es CDX-1127, que puede utilizarse junto con SEA-CD40.

La enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) cataliza la degradación del aminoácido triptófano. Los inhibidores de IDO pueden ser moléculas pequeñas, tales como ácido rosmarínico, inhibidores de COX-2 y alfa-metil-triptófano.

Agentes quimioterapéuticas que inducen la muerte celular inmunogénica

En la mayoría de los seres humanos, millones de células mueren por apoptosis y se eliminan sin generar ninguna respuesta inmunitaria. Sin embargo, después del tratamiento con algunos agentes quimioterapéuticos, se ha observado que las células inmunitarias se infiltran en los tumores. Por tanto, algunas células tumorales destruidas por agentes quimioterapéuticos actúan como vacunas y provocan una respuesta inmunitaria específica del tumor. Este fenómeno se conoce como muerte celular inmunogénica (MCI). Véase, por ejemplo, Kroemer et al., Annu. Rev. Immunol., 31:51-72 (2013). La capacidad de un agente quimioterapéutico para inducir la MCI puede determinarse experimentalmente. Deben cumplirse dos criterios. En primer lugar, la inyección de un ratón inmunocompetente con células cancerosas que han sido tratadas in vitro con un agente quimioterapéutico, debe suscitar una respuesta inmunoprotectora que sea específica de antígenos tumorales, en ausencia de adyuvante. En segundo lugar, la MCI que se produce in vivo, por ejemplo, en un modelo singénico de ratón con tratamiento utilizando un posible agente quimioterapéutico inductor de m Ci, debe impulsar una respuesta inmunitaria en el tumor que dependa del sistema inmunitario.

Como agentes quimioterapéuticos que inducen la MCI se incluyen, por ejemplo, antraciclinas, anticuerpos anti-EGFR, bortezomib, ciclofosfamida, gemcitabina, irradiación del tumor y oxaliplatino. SEA-CD40 puede utilizarse junto con cualquiera de estos agentes para generar una respuesta inmunitaria mejorada y tratar el cáncer en un paciente.

Inmunoactivación

El cáncer también se puede tratar administrando agentes que estimulen directamente el sistema inmunitario. Dichos agentes incluyen, por ejemplo, GM-CSF, IFN-gamma, interleucina-2, GVAX y agonistas de TLR9. Otros inmunoactivadores incluyen, por ejemplo, vacunas contra el cáncer, el bacilo de Calmette-Guérin (BCG), inmunoestimuladores inespecíficos (por ejemplo, imiquimod) y terapias celulares como células T con CAR (chimeric antigen receptor, receptor de antígeno quimérico). SEA-CD40 puede utilizarse junto con cualquiera de estos agentes para generar una respuesta inmunitaria mejorada y tratar el cáncer en un paciente.

Otras combinaciones

Para tratar el cáncer pueden utilizarse otras combinaciones con SEA-CD40. Como ejemplos se incluyen, por ejemplo, SEA-CD 40 junto con un anticuerpo anti-PD1, por ejemplo, nivolumab, pembrolizumab y pidilizumab, MEDI0680 o AMP-224; SEA-CD40 junto con gemcitabina, con o sin paclitaxel o cisplatino u oxaliplatino; SEA-CD-40 junto con un inhibidor de BRAF, por ejemplo, vemurafenib o dabrafenib; o SEA-CD40 junto con ciclofosfamida, adriamicina, vincristina y prednisona (CHOP) o rituximab, ifosfamida, carboplatino y etopósido (RICE) o rituximab, gemcitabina, dexametasona y cisplatino (RGDP).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Síntesis del anticuerpo hS2C6 no fucosilado

El anticuerpo anti-CD40 humanizado, S2C6, con las cadenas pesada y ligera de las SEQ ID NO: 1 y 2, se expresaron en células CHO. Un inhibidor de la fucosilación, la 2-fluorofucosa, que se incluyó en los medios de cultivo celular durante la producción de anticuerpos, dio como resultado el anticuerpo SEA-CD40, no fucosilado. Véase, por ejemplo, Okeley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 110:5404-55409 (2013). El medio base para el crecimiento celular carecía de fucosa y para inhibir la fucosilación de las proteínas se añadió 2-flurofucosa al medio. Igual que la referencia anterior. La incorporación de fucosa en anticuerpos se midió mediante LC-MS a través de cromatografía PLRP-S y TOF MS de cuadrupolo de ionización por electropulverización. Igual que la referencia anterior. Datos no mostrados.

Ejemplo 2: Caracterización del anticuerpo hS2C6 no fucosilado

Determinación de la afinidad de unión de SEA-CD40 por CD40: Para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), Astarte Biologics suministró sangre completa humana. Resumiendo, se recogió sangre en tubos de heparina y cuatro horas después de su extracción se enviaron a Seattle Genetics. A su llegada, la sangre se dividió en alícuotas en tubos cónicos de 50 ml (falcon) y durante 20 minutos se centrifugó a 200 g en un Eppendorf 5810R (rotor A-4-62) a 25 °C, sin pausa para separar la fracción rica en plaquetas. Después de la centrifugación, se formaron tres capas distintas: capa inferior, glóbulos rojos (que representa el 50-80 % del volumen total); capa central, banda muy fina de glóbulos blancos; capa superior, plasma rico en plaquetas (PRP) de color pajizo.

La capa superior de color pajizo con enriquecimiento de plaquetas, se eliminó con una pipeta de un ml. Una vez que se eliminó el plasma rico en plaquetas, la sangre se diluyó con idénticos volúmenes de PBS estéril (Gibco, lote 1618435, ept 2016-07). Debajo de la sangre, se puso una capa de 15 ml de Histopaque-1077 (Sigma, número de lote RNBD2965, Expt. 5/2017) calentados a temperatura ambiente. Las muestras con Histopaque se centrifugaron a 1500 rpm durante 25 minutos a 25 °C con estallido. Después de la centrifugación se volvieron a formar tres capas: capa inferior, glóbulos rojos (que representa el 50-80 % del volumen total); capa central, banda gruesa de glóbulos blancos (denominada también "capa leucoplaquetaria"); capa superior, PBS y plaquetas restantes.

La capa superior con PBS/plaquetas se eliminó con una pipeta de 1 ml y se desechó. La banda gruesa de glóbulos blancos se eliminó cuidadosamente y se colocó en un tubo cónico estéril limpio de 50 ml. Los tubos se llenaron hasta 50 ml y las células se centrifugaron a 800 g durante 10 minutos. La solución de lavado se eliminó, y durante diez minutos, los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis ACK (por las siglas deAmmonium-Chloride-Potassium, cloruro de amonio y potasio) de glóbulos rojos (Gibco, lote 1618488). A continuación, los tubos cónicos de cincuenta mililitros se completaron con 35 ml de PBS estéril y las células se centrifugaron a 800 g durante diez minutos. La solución de lavado se eliminó y el sedimento se resuspendió en 50 ml de PBS. Se eliminaron quinientos pl de muestra y con un contador Vi-cell-XR (Beckman Coulter) se realizó el recuento de CMSP. Las células se centrifugaron de nuevo a 800 g durante diez minutos. La solución de lavado se eliminó y el sedimento se resuspendió a 1x106/ml en solución de tinción de FACs (fluorescence activated cell sorting, separación de células activadas por fluorescencia) (BD). En una placa con fondo en U de 96 pocillos (Corning) se cultivaron 100 pl de CMSP resuspendidas y se colocaron en hielo. Para bloquear la unión inespecífica de FcYRIIIa, las CMSP se trataron previamente con 100 pg/ml de fragmentos de Fc humano (Calbiochem,) durante treinta minutos. Se prepararon diluciones en serie con factor 10 de SEA-h00 biotinilado (anticuerpo de control no fucosilado), SEA-CD40 o s GN-40, para crear una serie de diluciones de (100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 pg/ml).

Las muestras se lavaron dos veces en tampón de FACs helado y durante treinta minutos se incubaron en hielo con concentraciones saturantes de FE(ficoeritrina)-estreptavidina (BD). Las muestras se lavaron dos veces en tampón de FACs helado y se resuspendieron en 200 pl de tampón de FACs. La unión se evaluó utilizando un citómetro de flujo LSRII de BD y el programa informático DIVA. Los f Cs (Flow Cytometry Standard, patrones de citometría de flujo) se analizaron en FlowJo y se determinó la fluorescencia media geométrica (GeoMean) de las células teñidas positivamente y se representó gráficamente en Prism Graph Pad. Los datos se ajustaron a una regresión no lineal asumiendo un sitio de unión en Prism y los valores de KD de unión se calcularon dividiendo el cálculo de pg/ml entre el peso molecular de SEA-CD40.

Resultados: La afinidad de unión de SEA-CD40 y del anticuerpo precursor dacetuzumab, con CD40 en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana, se determinó mediante citometría de flujo. Se restó la unión de fondo de un control de isotipo apropiado y se representó gráficamente la intensidad de fluorescencia media (IFM) frente a la concentración de anticuerpo. En la Figura 1 se muestran los resultados. SEA-CD40 y el anticuerpo precursor dacetuzumab dieron curvas de unión prácticamente solapantes y ambas CMSP saturadas a concentraciones de aproximadamente 1,17 nM. Estos datos sugieren que los cambios en la fucosilación no afectan a la afinidad de SEA CD40 por CD40.

Determinación de la afinidad de unión de SEA-CD40 por FcyRIIIa: Se generaron células CHO que expresaban la versión (158V) de alta afinidad o la versión (158F) de baja afinidad de FcyRIIIa humano. Se centrifugaron 20x106 células, se lavaron una vez en 20 ml de PBS 1x y se resuspendieron en 8 ml de tampón de tinción BD. Las células se dividieron en partes alícuotas con la siguiente densidad: 2,0x106 células/ml en un volumen de 100 pl. En cada pocillo, se dividieron en partes alícuotas 0,20x106 células. Las células se centrifugaron a 1250 rpm, durante cinco minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos se diluyeron a 0,14 pg/ml (SGN) o 0,04 pg/ml (SEA). En la Tabla 1 se proporcionan las diluciones.

Tabla 1

continuación

Los sobrenadantes de las células centrifugadas se aspiraron y con una pipeta multicanal se añadieron 60 |jl de las diluciones de los anticuerpos correspondientes. Las concentraciones correspondientes fueron 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,23, 0,41, 0,14 mcg/ml. Las muestras se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las muestras se centrifugaron y se lavaron dos veces con 200 j l de tampón de tinción BD por pocillo. Para preparar un tampón de estreptavidina, a 20 ml de tampón de tinción BD (exceso de 2°) se añadió un mililitro de estreptavidina-FE. A cada muestra se añadieron 100 j l de tampón de estreptavidina y se incubaron durante 30 min en la oscuridad a 4 °C. A continuación, las muestras se centrifugaron y se lavaron dos veces con 200 j l de tampón de tinción BD por pocillo. Para calcular los valores de Kd en PRIZM, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo en modo HTS en el LSRII y el gráfico de IFM.

Resultados: Se evaluó la unión de SEA-CD40 y del anticuerpo precursor dacetuzumab con células de ovario de hámster chino (CHO, Chínese Hámster Ovary) que expresaban la forma (158F) de baja actividad o la forma (158V) de alta actividad de FcyRIIIa. Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B. SEA-CD40 se unió tanto a la forma (158F) de baja actividad como a la forma (158V) de alta actividad de FcyRIIIa, con una afinidad similar (K^d27,5 nM y 5,2 nM, respectivamente). La unión de SEA-CD40 con la forma (158F) de baja afinidad, fue significativamente mejor que la del anticuerpo precursor fucosilado dacetuzumab (K^d302,7 nM), y SEA-CD40 se unió incluso a la forma 158V de alta afinidad mejor que el precursor dacetuzumab fucosilado (5,2 nM frente a 37,9 nM respectivamente).

Actividad ADCC mediada por SEA-CD40: Se aislaron CMSP humana como se ha indicado anteriormente y durante 6, 24 o 48 horas, se trataron con diversas concentraciones de SEA-CD40 o con un control de isotipo SEA (SEA-h00). Los cultivos se tiñeron con respecto a células B CD19+ y el número de células se cuantificó mediante citometría de flujo.

Resultados: Cultivos de CMSP humana se trataron con 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 o 0,0001 jg/m l de SEA CD40 o con un control de isotipo SEA sin unión (SEA-h00) durante 6, 24 y 48 horas y después se evaluó el número de células CD40 positivas. En la Figura 4 se muestran los resultados. El tratamiento con SEA-CD40 produjo una disminución significativa de células B CD40+ CD19+ de una manera dependiente de la dosis y del tiempo, incluso hasta concentraciones bajas sub jg/ml. No hubo ningún efecto significativo de SEA-CD40 sobre el número de monocitos/DC (no se muestran los datos de monocitos/DC).

Evaluación de la producción de citocinas en sangre completa humana o en CMSP: Astarte Biologics suministró sangre completa humana. Resumiendo, se recogieron 100 ml de sangre en tubos de heparina y 4 horas después de la extracción se enviaron a Seattle Genetics. La mitad de la sangre se apartó para cultivos de sangre completa, mientras que la otra mitad se usó para aislar CMSP como se ha descrito anteriormente. En 3-96 placas de cultivo tisular de fondo plano (Costar) se tomaron partes alícuotas de 100 j l de sangre completa. Las CMSP aisladas se contaron en un Viacell y se resuspendieron a 1 x 106 células/ml en DMEm que contenía FBS al 10 % (Atlanta Biologics), penicilina IX/estrepA y glutamina X (medio de CMSP). Para la CMSP, cien j l de CMSP purificas y resuspendidas se dividieron en alícuotas en 3-96 placas de cultivo tisular de fondo plano. Se hicieron diluciones en serie 10X de SEA-h00 y SEA-CD40 en medios de CMSP y se trataron cultivos de sangre completa y de CMSP aisladas con concentraciones en descenso de SEA-h00 o SEA-CD40 (100, 10, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 o 0 jg/ml). El tratamiento con SEA-CD40 se realizó por duplicado tanto en cultivos de sangre completa como en cultivos de CMSP en cada punto temporal. En cada uno de los puntos temporales predeterminados (6, 24 y 48 horas) se centrifugó una placa de 96 pocillos que contenía sangre completa o CMSP purificadas con un adaptador de placa en una centrífuga Eppendorf 5810R a 800 rpm durante 5 minutos. Se eliminaron los sobrenadantes de suero o cultivo tisular y se transfirieron a una gradilla de tubos de 96 tiras y las muestras se congelaron a -80 °C hasta su procesamiento.

Los sobrenadantes de cultivo tisular y el suero congelados se descongelaron durante la noche a 4 °C y se procesaron para la producción de citocinas utilizando un kit múltiple Luminex de Millipore. Se diseñaron kits personalizados para analizar IFNy, IL-12p40, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1a, IL-1p, MIP-1p, TNF-a, sCD40L. Los analitos se seleccionaron basándose en las citocinas observadas con dacetuzumab en estudios anteriores. Los sobrenadantes del cultivo tisular y las muestras de suero se procesaron según las instrucciones del fabricante. Resumiendo, las placas de ensayo se lavaron con 200 j l de tampón de lavado por pocillo, seguido de la adición de 25 j l de estándar o tampón, 25 j l de matriz o muestra y 25 j l de perlas de analito multiplexadas en cada pocillo. Las muestras se incubaron durante la noche con agitación intensa a 4 °C. Las placas de ensayo se lavaron dos veces con tampón de lavado. Se añadieron veinticinco j l de anticuerpos de detección a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Se añadieron veinticinco j l de estreptavidina-ficoeritrina (ES-FE) y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante treinta minutos. La placa se lavó dos veces con tampón de lavado y las perlas se resuspendieron con 150 j l de líquido envolvente. Las muestras se analizaron utilizando sistemas Luminex MagPix junto con el sistema del programa informático Xponent. Los niveles de citocinas se calcularon a partir de la curva estándar.

Resultados: Los cultivos de sangre completa humana se trataron con un control de isotipo SEA o SEA-CD40 (100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 o 0,0001 |jg/ml) durante 6, 24 o 48 horas. Los sobrenadantes de suero o cultivo tisular se recogieron y las citocinas inflamatorias se evaluaron mediante análisis Luminex multiplexado. Los datos se representan gráficamente como un factor de aumento de la producción de citocinas en comparación con un control de isotipo SEA. SEA-CD40 estimuló una producción contundente de IFNy, MIP1p y TNFa a las 6, 24 y 48 horas en sangre completa, como se muestra en la Tabla 2, a continuación. En las columnas más a la izquierda se proporcionan los niveles de SEA-CD40. Se observó actividad a niveles tan bajos como 0,010 jg/m l de SEA-CD40. La estimulación de MIP1 y TNFa a las veinticuatro horas se muestra en las Figuras 4A y 4B.

Tabla 2

CMSP humana se trataron con un control de isotipo SEA o SEA-CD40 (100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 o 0,0001 jg/ml) durante 6, 24 o 48 horas. Los sobrenadantes de suero o cultivo tisular se recogieron y las citocinas inflamatorias se evaluaron mediante análisis Luminex multiplexado. Los datos se representan gráficamente como un factor de aumento de la producción de citocinas en comparación con un control de isotipo SEA. SEA-CD40 estimuló una producción contundente de IFNy, MIP1p y TNFa a las 6, 24 y 48 horas en CMSP, como se muestra en la Tabla 3, a continuación. En las columnas más a la izquierda se proporcionan los niveles de SEA-CD40 en jg/ml. Se observó actividad a niveles tan bajos como 0,010 jg/m l de SEA-CD40. En las Figuras 5A y 5B se muestra la estimulación de MIP1p y TNFa a las veinticuatro horas.

Tabla 3

Evaluación de marcadores de activación en CMSP: La expresión en la superficie de la molécula coestimuladora se evaluó en los sedimentos celulares restantes del análisis de citocinas descrito anteriormente. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 ml de tampón de FACs BD y se transfirieron a placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos. Los receptores de Fc se bloquearon con 100 pg/ml de fragmentos Fc humanos (Millipore) durante 30 minutos en hielo. Se preparó una mezcla maestra compuesta por FE-CD86 (BD) y MHCII (anticuerpo universal anti-DR, DP, DQ de BD) diluida a 1:100 en tampón de FACs de b D que contenía 100 pg/ml de fragmentos Fc humanos. Se añadieron cinco pl de la mezcla maestra a cada pocillo que contenía noventa pl y las muestras se incubaron durante una hora en hielo. A continuación, las células se centrifugaron durante cinco minutos a 400 g en una centrífuga Eppendorf 5810R previamente enfriada. Los sobrenadantes se eliminaron y las células se lavaron con 200 pl de tampón de Facs b D. Las células se lavaron dos veces y después se resuspendieron en 200 ml de tampón de FACs. A continuación, las muestras se analizaron en un citómetro de flujo LSRII (BD biosciences) con el programa informático DIVA (BD biosciences). Utilizando el programa informático de análisis FlowJo, se evaluó la fluorescencia media geométrica de CD86 y MHCII. Se calculó una relación entre SEA-h00 y SEA-CD40 y para calcular un intervalo de fuerza de SEA-CD40 se utilizó el factor de cambio.

Resultados: La activación de CD40, además de suscitar la producción de citocinas, promueve la maduración de células presentadoras de antígeno. La maduración de DC puede ir seguida de una regulación positiva de los marcadores de activación, incluidos CD86 y MHCII. Los cultivos de CMSP humana se estimularon con SEA CD40 y con un control de isotipo SEA durante 6, 24 o 48 horas y se evaluó la expresión en la superficie de los antígenos del MHC de clase II (HLA, DR, DP, DQ) y CD86. La estimulación de SEA-CD40, pero no la del control de isotipo, dio como resultado un aumento significativo tanto en MHCII (Tabla 4) como en CD86 (datos no mostrados) a concentraciones tan bajas como de 0,01 pg/ml.

Tabla 4: MHCII

Papel de la fucosa en la inmunoactivación con SEA-CD40: Las CMSP humana se aislaron como se ha descrito anteriormente. Las CMSP se trataron con diversas concentraciones de SEA-CD40, el anticuerpo precursor SGN40, o una versión F(ab)'2 de SEA-CD40 y se incubaron durante 24 horas. Para evaluar el empobrecimiento de células B, los cultivos de CMSP se tiñeron con FE-CD19 y el número de células B se cuantificó mediante citometría de flujo. Para evaluar la producción de citocinas, se recogieron sobrenadantes de cultivo tisular de CMSP y la producción de citocinas se evaluó mediante análisis múltiple en la plataforma Luminex. La producción de IFNy se muestra en la Figura 7, (ng/ml) y se observaron tendencias similares en otras citocinas. Para evaluar la maduración de las células presentadoras de antígeno, las CMSP se recogieron después de una incubación de veinticuatro horas y se tiñeron con un anticuerpo anti-CD86-FE o con antígeno APC universal de MHC de clase II (DR, DQ, DP) y el porcentaje de células positivas se evaluó mediante citometría de flujo. Los datos se muestran como intensidad de fluorescencia media en los marcadores universales de MHC.

Resultados: Para evaluar el empobrecimiento de células B, cultivos de CMSP humana se trataron con múltiples concentraciones de SEA-CD40, dacetuzumab o F(ab')2 de SEA-CD40 durante veinticuatro horas. En la Figura 6 se muestran los resultados. El empobrecimiento de células B mediado por ADCC fue significativamente mayor en los cultivos tratados con SEA-CD40 en comparación con los cultivos tratados con dacetuzumab y esta actividad se perdió con el F(ab)'2 de SEA-CD40.

Además, se evaluaron los criterios de valoración de la inmunoactivación (citocinas y marcadores de activación/maduración de APC) en cultivos de CMSP con SEA-CD40, dacetuzumab y F(ab')2 de SEA-CD40 estimulados durante veinticuatro horas. La estimulación de SEA-CD40 tanto de la producción de citocinas (Figura 7) como de la maduración de APC (Figura 8), fue significativamente mayor que la de dacetuzumab o F(ab)'2 de SEA-CD40. Estos datos demuestran que la ausencia de fucosa en el dominio de IgG no altera la unión de CD40, pero aumenta la unión de FcYRIIIa dando como resultado un aumento de la actividad de CD40 y, en última instancia, un aumento de la actividad inmunomoduladora de CD40.

Ejemplo 3: Actividad inmunomoduladora del anticuerpo hS2C6 no fucosilado

Identificación de dosis activas de SEA-CD40: Se propone que SEA-CD40 es activo a niveles de dosis que activen las células presentadoras de antígeno, lo que puede caracterizarse por una regulación positiva de los marcadores de activación, tales como el MHC de clase I o lI o CD86. Los marcadores de activación se evaluaron en las CMSP después del tratamiento con diversas concentraciones de SEA-CD40 de 6 a 48 horas como se ha descrito anteriormente (Evaluación de marcadores de activación en CMSP). Se calculó la diferencia entre los tratamientos con el control de isotipo SEA-h00 y SEA-CD40 para cada marcador de activación y se representó gráficamente frente a las concentraciones de SEA-CD40 y el tiempo de tratamiento. Las curvas de respuesta-concentración más pronunciadas se observaron a las 24 horas para CD86 y MHCII y a las 48 horas para MHCI. Los datos de respuesta a la concentración (CD86 a las 24 h, MHCII a las 24 h y MHCI a las 48 h) se ajustaron mediante regresión no lineal utilizando la siguiente ecuación, donde las respuestas de 0 % y 100 % se definen como los valores más pequeños y más grandes en el conjunto de datos de cada marcador de activación. La CE50 es la concentración de SEA-CD40 que da una respuesta del 50 %.

RGSpUGSÍ3 ^{- ^ ^ ^ ( lo g io C E S O - lo g io C o n c e n tr a c ió n )}

Resultados: La respuesta normalizada frente al log (concentración) y las líneas de regresión ajustadas no lineales de los marcadores de activación se ilustran en la Figura 9. Los valores estimados de CE50 para MHCI, CD86 y MHCII, fueron 0,011, 0,14 y 0,41 pg/ml, respectivamente. Se estima que SEA-CD40 induce aproximadamente un 90 %, un 60 % y un 30 % de regulación positiva máxima de MHCI, CD86 y MHCII, respectivamente, a 0,2 pg/ml, lo que corresponde a una Cmáx plasmática teórica alcanzable con una dosis IV de 10 pg/kg en seres humanos. Esta dosis se propone como la primera dosis activa teórica prevista.

Ejemplo 4: Actividad inmunomoduladora del anticuerpo hS2C6 no fucosilado

Respuesta de células T generada por SEA-CD40: Se generó una línea de células T anti-M1 en Astarte Biologics de un donante de HLA-A2 que demostró ser muy reactiva al péptido M1 de la gripe (flu). Estas células se marcaron con éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE, carboxyfluorescein succinimidyl ester) y se combinaron con CMSP autólogas. Los cultivos se estimularon con 10 pg/ml de péptido M1 de la gripe en presencia o en ausencia de concentraciones decrecientes (1, 0,1, 0,01 pg/ml) de SEA-CD40 o dacetuzumab durante 5 días. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y se analizaron en busca de citocinas mediante análisis múltiple en la plataforma Luminex y las células T específicas de antígeno se identificaron mediante la unión específica al tetrámero de M1.

Resultados: Las CMSP de un donante de HLA-A2 que demostraron ser muy reactivas al péptido M1 de la gripe, se estimularon con péptido M1 de la gripe en presencia o en ausencia de concentraciones decrecientes de SEA-CD40 o dacetuzumab durante cinco días. Los resultados se muestran en las Figuras 10A y 10B. Los cultivos estimulados con SEA-CD40 mostraron una respuesta aumentada al antígeno de la gripe M1 como se observa por un aumento en la producción de IFNy y un aumento en las células T específicas de antígeno según lo determinado por el aumento de la unión al tetrámero. SEA-CD40 estimuló una respuesta de células T específica de antígeno hasta 0,1 pl/ml y esta actividad fue más contundente que la respuesta asociada a dacetuzumab.

Respuesta de células T generada por SEA-CD40 jun to con anticuerpos anti-inhibidores de puntos de control inmunitario: Se generó una línea de células T anti-M1 en Astarte Biologics de un donante de HLA-A2 que demostró ser muy reactiva al péptido M1 de la gripe (flu). Estas células se marcaron con CFSE y se combinaron con CMSP autólogas. Los cultivos se estimularon con 10 pl/ml de péptido M1 de la gripe en presencia o en ausencia de concentraciones decrecientes (1, 0,1, 0,01 pl/ml) de SEA-CD40 y/o 1 pl/ml de un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1 durante cinco días. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y se analizaron en busca de citocinas mediante análisis múltiple en la plataforma Luminex y las células T específicas de antígeno se identificaron mediante la unión específica al tetrámero de M1.

Resultados: Las CMSP de un donante de HLA-A2, que mostraron ser muy reactivas al péptido M1 de la gripe, se estimularon con péptido M1 de la gripe en presencia o en ausencia de concentraciones decrecientes de SEA-CD40 y/o con una concentración constante de un anticuerpo bloqueador anti-CTLA4 o un anticuerpo anti-PD-1. Los resultados se muestran en Figuras 11 y 12. Mientras que SEA-CD40, los anticuerpos anti-CTLA4 y los anticuerpos anti-PD-1 solos, estimularon una respuesta de células T específica de antígeno, se observó un aumento de la respuesta al antígeno de la gripe M1a través de un aumento de la producción de IFN-y (Figura 11) y se observó un aumento de las células T específicas de antígeno, determinado por un aumento de la unión al Tetrámero (Figura 12, utilizando el Tetrámero/APC - HLA-A*02:01 péptido M1 de la gripe (GILGFVFTL) de MBL) cuando se combinaron los anticuerpos SEA-CD40 y anti-CTLA4 o los anticuerpos anti-PD-1. SEA-CD40 estimuló una respuesta de células T específica de antígeno hasta 0,1 pl/ml y esta actividad se potenció mediante la combinación con un anticuerpo de punto de control inmunitario.

Respuesta de células T generada por SEA-CD40 en CMSP de pacientes con cáncer: Para la evaluación de anticuerpos anti-CD40 solos, se aislaron CMSP de 10 ml de sangre de un paciente con tumor y se cultivaron 0,25 millones de células en una placa de 24 pocillos. Las muestras se trataron con concentraciones crecientes de SEA-CD40 solamente, o con 1 pl/ml de un conjunto de péptidos combinados que contenía MageA1/MageA3/NY-ESO y una concentración creciente de SEA-CD40 o SGN-40. Las muestras se cultivaron durante cinco días en CO²al 10 % a 37 °C, se recogieron los sobrenadantes del cultivo tisular y se evaluaron los niveles de INF-y.

Para la evaluación de SEA-CD40 junto con los anticuerpos bloqueadores de puntos de control inmunitario, se aislaron CMSP de 10 ml de sangre de pacientes diagnosticados con cualquiera de cáncer de mama, de páncreas, de melanoma, y se cultivaron 0,25 millones de células en una placa de 24 pocillos. Las muestras se trataron con concentraciones crecientes de SEA-CD40, con 1 pg/ml de un conjunto de péptidos combinados que contenía MageA1/MageA3/NY-ESO y con 1 pg/ml de anti-PD1 o anti-CTLA4. Las muestras se cultivaron durante 5 días en CO²al 10 % a 37 °C, se recogieron los sobrenadantes del cultivo tisular y se evaluaron los niveles de INF-y.

Resultados: Las CMSP de donantes se aislaron de sangre completa como se ha descrito anteriormente. Los donantes eran tres pacientes diagnosticados de melanoma, tres pacientes diagnosticados de cáncer de mama y tres pacientes diagnosticados de cáncer de páncreas. Las CMSP de los donantes se estimularon durante 5 días con un conjunto de péptidos de las proteínas antigénicas tumorales comunes (MAGEA1/MAGE3/NY-ESO) en presencia o en ausencia de concentraciones crecientes de SEA-CD40 o SGN-40. Se recogieron los sobrenadantes del cultivo tisular y se evaluó la producción de INF-y. En la Figura 13 se muestran los resultados. Seis de los nueve pacientes presentaron una respuesta a INF-y dependiente de antígeno que mejoró significativamente mediante el tratamiento con SEA-CD40 en comparación con el tratamiento con SGN-40. En las CMSP tratadas con SEA-CD40, se observó estimulación a concentraciones tan bajas como 10 pg/ml.

Las CMSP de donantes se aislaron de sangre completa como se ha descrito anteriormente. Al igual que antes, los donantes eran tres pacientes diagnosticados de melanoma, tres pacientes diagnosticados de cáncer de mama y tres pacientes diagnosticados de cáncer de páncreas. Las CMSP de los donantes se estimularon con un conjunto de péptidos de las proteínas antigénicas tumorales comunes (MAGEA1/MAGE3/NY-ESO) en presencia o en ausencia de concentraciones crecientes de SEA-CD40 y/o con una concentración constante de un anticuerpo bloqueador anti-CTLA4 o anti-PD1. En la Figura 14 se muestran los resultados. Aunque SEA-CD40 y los anticuerpos contra el bloqueo del punto de control se dirigen a PD1 y a CTLA4, estimularon solo una respuesta de células T específica de antígeno, cuando SEA-CD40 se combinó con los anticuerpos anti-CTLA4 o con los anticuerpos anti-PD1, se observó una señal contundente contra el antígeno tumoral medida mediante la producción de INF-y.

Ejemplo 5: Modelos de ratón para evaluar la actividad de anticuerpos anti-CD40 no fucosilados

Se ha demostrado que los modelos de ratón son muy útiles para evaluar la eficacia y los mecanismos de nuevas terapias contra el cáncer. El estudio de SEA-CD40 en modelos de cáncer de ratón ha sido difícil porque SEA-CD40 no reconoce a CD40 murino. Por lo tanto, para evaluar la actividad de los anticuerpos anti-CD40 no fucosilados se desarrolló un modelo de tumor murino singénico. Los equivalentes funcionales murinos de la IgG1 humana y de FcyRIII/CD16 humanos son la IgG2a y el FcyRIV murinos, respectivamente, y la unión de la IgG2a murina con el FcyRIV murino actúa como mediadora en la ADCC. Véase, por ejemplo, Bruhns, Blood 119:5640-5649 (2012) y Nimmeriahn et al., Immunity 23:41-51 (2005). El anticuerpo de rata 1C 10 se utilizó para generar un sustituto de SEA-CD40. Véase, por ejemplo, Heath et al., Eur. J. Immunol. 24:1828-1834 (1994). Resumiendo, los fragmentos génicos VL y VH de un anticuerpo monoclonal de rata que reconoce el CD40 murino, el anticuerpo 1C10, se clonaron en fase 5' con Ckappa murino y los fragmentos CH1-CH2-CH3 de la IgG2a murina, respectivamente. La expresión de los genes resultantes en células CHO, generó un anticuerpo 1C10 quimérico con dominios VL y VH de rata y dominios de cadena ligera y pesada murina del isotipo IgG2a (mIgG2a 1C10). mIgG2a 1C10 se expresó en presencia de 2-fluorofucosa en el medio de crecimiento de células CHO utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1, para generar una forma no fucosilada de mIgG2a 1C10 (mIgG2a SEA 1C10). utilizando un modelo de melanoma B16 de ratón, se probó la actividad antitumoral de mIgG2a 1C10 y de mIgG2a SEA 1C10 fucosilados.

Evaluación de la unión de anticuerpos murinos no fucosilados con receptores Fcy murinos: Células CHO que expresaban de manera estable el FcyRI o FcyRIV murino, se incubaron con concentraciones crecientes de mIgG2a 1C10 fucosilado o mIgG2a 1C10 no fucosilado (mIgG2a SEA-1C10). Las muestras se lavaron y se añadió una cantidad saturante de anti-IgG de ratón-FE y se incubaron con las muestras en hielo durante treinta minutos. Las muestras se lavaron de nuevo y las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo.

Resultados: Se evaluó la unión de los anticuerpos anti-CD40 sustitutos con las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban el FcyRI o FcyRIV murino (el equivalente murino al Fcy RIII/CD16 humano). Los resultados se muestran en las Figuras 15A y 15B. Como era de esperar, mIgG2a 1C10 se unió a FcyR1 con una afinidad similar a la de mIgG2a SEA 1C10. Véase, por ejemplo, la Figura 15A. Sin embargo, mIgG2a s Ea 1C10 no fucosilado se unió a FcyRIV con una afinidad significativamente mayor que la del anticuerpo precursor fucosilado mIgG2a 1C10. Véase, por ejemplo, la Figura 15B.

Evaluación de anticuerpos anti-CD40 no fucosilados en un modelo de tum or murino: Por vía subcutánea, se administraron 250.0E+3 células de melanoma B16F10 a ratones C57BL/6. Los ratones se asignaron al azar en cohortes, cada una de ellas con un tamaño de tumor de aproximadamente 50 mm3 de media. A continuación, los ratones recibieron, cada dos días durante un total de tres dosis, inyecciones interperitoneales de un control de isotipo (mIgG2a), mIgG2a 1C10 fucosilado o mIgG2a 1C10 no fucosilado (mIgG2a SEA 1C10). Los ratones se monitorizaron hasta que el tumor alcanzó un tamaño de 1000 mm3, momento en el que los ratones se sacrificaron.

Resultados: Para evaluar la eficacia in vivo de nuestros sustitutos de anticuerpo anti-CD40 no fucosilado, se utilizó el modelo de melanoma singénico B16F10. A ratones C57BL/6 se les implantaron células de melanoma B16F10 y después se trataron con un control de isotipo mIgG2a, mIgG2a 1C10 fucosilado o mIgG2a 1C10 no fucosilado (mIgG2a SEA 1C10). La carga tumoral se monitorizó y los ratones se sacrificaron cuando el tumor alcanzó un tamaño de 1000 mm3. En la Figura 16 se muestran los resultados. Los ratones tratados con mIgG2a SEA-1C10 no fucosilado mostraron un beneficio de supervivencia significativo y un retraso del tumor en comparación con el anticuerpo IgG2a 1C10 precursor fucosilado.

Ejemplo 6: SEA-CD40 causa empobrecimiento de células B y promueve la activación de células T

La actividad de SEA-CD40 se comparó con la de un anticuerpo fucosilado relacionado y con la de un anticuerpo anti-CD40 completamente agonista, el clon 21.4.1. El anticuerpo 21.4.1 es un anticuerpo agonista anti-IgG2k CD40 humano que es el clon precursor de CP-870,893, un anticuerpo que actualmente se está probando en un ensayo clínico de tumores sólidos junto con PDL1. Para obtener información sobre la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 21.4.1, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 7.338.660. Se probaron tres áreas funcionales de los anticuerpos: capacidad para impulsar la diferenciación, la activación y el empobrecimiento de células B humanas, la capacidad para activar cultivos primarios de CMSP humana y la capacidad para impulsar una respuesta específica de antígeno.

Evaluación de la activación de células B por anticuerpos anti-CD-40: Los experimentos se realizaron utilizando células B purificadas de sangre completa humana reciente o de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método las etapas de administrar, a un paciente que necesite dicho tratamiento, una composición que comprende el anticuerpo anti-CD40,

en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa; y

en donde el anticuerpo anti-CD40 se administra a un nivel de dosis comprendido entre 0,1 y 2000 jg/kg (|jg por kilogramo de peso corporal del paciente).

2. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 1, en donde el nivel de dosis está comprendido entre 10 y 1000 jg/kg, entre 50 y 800 jg/kg, entre 75 y 600 jg/kg o entre 100 y 500 jg/kg.

3. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 1, en donde el nivel de dosis está:

(a) en un intervalo seleccionado del grupo que consiste en 100-300 jg/kg, 300-500 jg/kg, 500-700 jg/kg, 700 900 jg/kg y 900-1100 jg/kg;

(b) en un intervalo seleccionado del grupo que consiste en 100-150 jg/kg, 150-200 jg/kg, 200-250 jg/kg, 250 300 jg/kg, 300-350 jg/kg, 350-400 jg/kg, 400-450 jg/kg, 450-500 jg/kg, 500-550 jg/kg, 550-600 jg/kg, 600 650 jg/kg, 650-700 jg/kg, 700-750 jg/kg, 750-800 jg/kg, 800-850 jg/kg, 850-900 jg/kg, 900-950 jg/kg, 950 1000 jg/kg, 1000-1050 jg/kg y 1050-1100 jg/kg; o

(c) seleccionado del grupo que consiste en 60 jg/kg, 100 jg/kg, 150 jg/kg, 200 jg/kg, 250 jg/kg, 300 jg/kg, 350 jg/kg, 100 jg/kg, 450 jg/kg, 500 jg/kg, 550 jg/kg, 600 jg/kg, 650 jg/kg, 700 jg/kg, 750 jg/kg, 800 jg/kg, 850 jg/kg, 900 jg/kg, 950 jg/kg, 1000-1050 jg/kg, 1050 jg/kg y 1110 jg/kg.

4. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición se administra cada tres semanas o cada seis semanas.

5. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el paciente tiene un cáncer CD40 positivo o un cáncer CD40 negativo.

6. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido.

7. Una composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer junto con un anticuerpo anti-CTLA4, comprendiendo el método, administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento, el anticuerpo anti-CTLA4 y la composición de anticuerpo anti-CD40 que comprende un anticuerpo anti-CD40, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa.

8. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 7, en donde el anticuerpo anti-CTLA4 se selecciona del grupo que consiste en ipilimumab y tremelimumab.

9. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 7 u 8, en donde el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido.

10. Una composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer junto con un anticuerpo anti-PD-1, comprendiendo el método, administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento, el anticuerpo anti-PD-1 y la composición de anticuerpo CD-40 que comprende un anticuerpo anti-CD40,

en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa.

11. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 10, en donde el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en nivolumab, pidilizumab y pembrolizumab.

12. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 10 u 11, en donde el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido.

13. Una composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso en un método de tratamiento del cáncer junto con un anticuerpo anti-PD-L1, comprendiendo el método, administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento, el anticuerpo anti-PD-LI y la composición de anticuerpo anti-CD40 que comprende un anticuerpo anti-CD40, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y una región constante humana; en donde la región constante tiene una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en el resto N297 según el índice de la UE; y en donde menos del 5 % de las cadenas de azúcar ligadas a N-glucósido en la composición comprenden un resto de fucosa.

14. La composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 13, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en durvalumab (MEDI4736) y atezolizumab (MPDL3280A).

15. La composición de anticuerpo anti-CD40 para su uso según la reivindicación 13 o 14, en donde el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido.

16. El anticuerpo anti-CD40 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-6, en donde el nivel de dosis es de:

(a) 0,6 |jg/kg, 1,0 pg/kg, 2,5 pg/kg, 5,0 pg/kg, 7,5 pg/kg, 10 pg/kg, 30 pg/kg, 50 pg/kg, 75 pg/kg, 100 pg/kg o 200 pg/kg;

(b) está en un intervalo seleccionado de 0,3-200 pg/kg, 0,6-150 pg/kg, 1,0-100 pg/kg, 2-50 pg/kg, 5-25 pg/kg, 7,5 15 pg/kg y 8-12 pg/kg; o

(c) 10 pg/kg.