BR112020009805A2

BR112020009805A2 - antígeno do mesmo que liga especificamente cd47 humano, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, sequência de ácidos nucleicos, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, para tratar um câncer que expressa cd47 num indivíduo e para induzir apoptose de uma célula que expressa cd47, e, anticorpo mascarado

Info

Publication number: BR112020009805A2
Application number: BR112020009805-1A
Authority: BR
Inventors: Shyra Gardai; Matthew Levengood; Vivian Trang; Lori Westendorf; Christopher Carosino; Michael Feldhaus; Che-Leung Law
Original assignee: Seattle Genetics, Inc.
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2020-10-13
Also published as: AU2018375375A1; EA202091339A1; JP2024026144A; TW201925227A; JP2021503927A; WO2019108733A3; JP7391845B2; US20190185561A1; ZA202002923B; US20220135674A1; SG11202004864TA; MA51208A; US11180552B2; CA3083946A1; KR20200091901A; EP3717515A2; CN111448213A; MX2020005463A; WO2019108733A2; IL274519A

Abstract

Trata-se de anticorpos humanizados, incluindo anticorpos mascarados que se ligam especificamente a CD47. São fornecidos métodos para usar anticorpos anti-CD47, incluindo anticorpos mascarados, para modular a atividade (por exemplo, inibir a proliferação de) uma célula que expressa CD47, bem como para o tratamento de uma ou mais doenças ou distúrbios (por exemplo, câncer) associados a células que expressam CD47.

Description

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ANTICORPO HUMANIZADO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO QUE LIGA ESPECIFICAMENTE CD47 HUMANO, O ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR O ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, PARA TRATAR UM CÂNCER QUE EXPRESSA CD47 NUM INDIVÍDUO E PARA INDUZIR APOPTOSE DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA CD47, E, ANTICORPO MASCARADO

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório US n° 62/593.712, depositado em 1 de dezembro de 2017, que está incorporado a título de referência, em sua totalidade, para qualquer finalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere ao campo de terapia contra câncer à base de anticorpo. Em particular, a presente invenção se refere a anticorpos anti-CD47 humanizados inovadores e conjugados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que podem, opcionalmente, ser associados com a um agente de mascaramento removível, e seu uso no tratamento de cânceres que expressam CD47.

FUNDAMENTOS

[003] O agrupamento de diferenciação 47 (CD47), conhecido também como proteína associada à integrina (IAP), é um receptor transmembranar que pertence à superfamília de imunoglobulina de proteínas. CD47 é expresso ubiquamente em células e serve como um marcador para o auto-reconhecimento, impedindo a fagocitose por servir como um sinal de “não me coma”. CD47 medeia seus efeitos através de interações com várias outras proteínas, incluindo a trombospondina (TSP) e a proteína alfa reguladora de sinal (SIRPĮ). A interação entre SIRPĮ em células fagocíticas e

2 / 177 CD47 em células-alvo ajuda a assegurar que as células-alvo não sejam engolidas.

[004] Certos tipos de câncer cooptam o mecanismo de evasão imunológica à base de CD47 de uma célula mediante o aumento da expressão de CD47 na superfície celular da célula de câncer, evitando assim a depuração pelo sistema imunológico. Entretanto, as terapias conhecidas na técnica que alvejam células que expressam CD47 num indivíduo alvejam tanto células cancerosas como não cancerosas, o que leva a toxicidades no indivíduo, tais como depleção de plaquetas e hemácias periféricas. Consequentemente, existe uma necessidade por composições e métodos para alvejar seletivamente CD47 em células de câncer sem alvejar células não cancerosas.

SUMÁRIO

[005] A presente divulgação tem por base a descoberta de anticorpos anti-CD47 humanizados inovadores e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. Em certos aspectos da invenção, são fornecidos anticorpos anti- CD47 humanizados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que compreendem um agente de mascaramento removível (por exemplo, um agente de mascaramento de bobina em espiral) que impede a ligação dos anticorpos anti-CD47 ou dos fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos a uma proteína CD47. Em certas modalidades, o agente de mascaramento pode ser removido (por exemplo, clivado) por uma ou mais moléculas (por exemplo, proteases) que estão presentes num ambiente de célula de câncer. A remoção do agente de mascaramento restaura a capacidade dos anticorpos anti-CD47 ou dos fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos para se ligarem a CD47, permitindo assim o alvejamento específico dos anticorpos anti-CD47 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos à proteína CD47 no contexto de células de câncer.

[006] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga

3 / 177 especificamente CD47 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 16, 19, 21 e 23; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 17, 20, 22 e 24; e HCDR3 das SEQ ID NO: 18; em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 31 e 34; LCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 32 e 35; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33 e 36; em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[007] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 16, 19, 21 e 23; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 17, 20, 22 e 24; e HCDR3 de SEQ ID NO: 18; em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 31 e 34; LCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 32 e 35; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33 e 36; em que a região variável de cadeia pesada compreende: a) um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, em que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91

4 / 177 e H94 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; ou c) um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; ou d) um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; e em que a região variável de cadeia leve compreende: a) um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 92, em que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[008] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 16, 17 e 18; SEQ ID NOs: 19, 20 e 18; SEQ ID NOs: 21, 22 e 18; SEQ ID NOs: 16, 20 e 18; e SEQ ID NOs: 23, 24 e 18. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionadas a partir de SEQ ID NOs: 31, 32 e 33; SEQ ID NOs: 31, 32 e 36; e SEQ ID NOs: 34, 35 e 33. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 19, 20, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 19, 20, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 21, 22, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 21, 22, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs:

5 / 177 16, 20, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 16, 20, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 23, 24, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 23, 24, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 31, 32, e 36; SEQ ID NOs: 19, 20, 18, 31, 32, e 36; SEQ ID NOs: 21, 22, 18, 31, 32, e 36; 16, 20, 18, 31, 32, e 36; e SEQ ID NOs: 23, 24, 18, 31, 32, e 36.

[009] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 25, 28 e 29; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 26 e 30; e HCDR3 de SEQ ID NO: 27; e em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 37 e 40; LCDR2 da SEQ ID NO: 38; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 39 e 41; em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[0010] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 25, 28, e 29;

6 / 177 HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 26 e 30; e HCDR3 da SEQ ID NO: 27; e em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 37 e 40; LCDR2 da SEQ ID NO: 38; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 39 e 41; em que a região variável de cadeia pesada compreende: a) um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, em que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; ou c) um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; ou d) um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; e em que a região variável de cadeia leve compreende: a) um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 92, em que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[0011] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 25, 26 e 27; SEQ ID NOs: 28, 26 e 27; SEQ ID NOs: 29, 30 e 27; e SEQ ID NOs: 29, 26 e 27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionadas a partir de

7 / 177 SEQ ID NOs: 37, 38 e 39; SEQ ID NOs: 40, 38 e 39; e SEQ ID NOs: 37, 38 e

41. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 40, 38, e 39; SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 37, 38, e 41; SEQ ID NOs: 28, 26, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 28, 26, 27, 40, 38, e 39; SEQ ID NOs: 28, 26, 27, 37, 38, e 41; SEQ ID NOs: 29, 30, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 29, 30, 27, 40, 38, e 39; SEQ ID NOs: 29, 30, 27, 37, 38, e 41; SEQ ID NOs: 29, 26, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 29, 26, 27, 40, 38, e 39; e SEQ ID NOs: 29, 26, 27, 37, 38, e 41.

[0012] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve compreendem SEQ ID NOs: 2 e 10; SEQ ID NOs: 3 e 11; SEQ ID NOs: 3 e 12; SEQ ID NOs: 3 e 13; SEQ ID NOs: 3 e 14; SEQ ID NOs: 4 e 11; SEQ ID NOs: 4 e 12; SEQ ID NOs: 4 e 13; SEQ ID NOs: 4 e 14; SEQ ID NOs: 5 e 11; SEQ ID NOs: 5 e 12; SEQ ID NOs: 5 e 13; SEQ ID NOs: 5 e 14; SEQ ID NOs: 6 e 11; SEQ ID NOs: 6 e 12; SEQ ID NOs: 6 e 13; SEQ ID NOs: 6 e 14; SEQ ID NOs: 7 e 11; SEQ ID NOs: 7 e 12; SEQ ID NOs: 7 e 13; SEQ ID NOs: 7 e 14; SEQ ID NOs: 8 e 11; SEQ ID NOs: 8 e 12; SEQ ID NOs: 8 e 13; SEQ ID NOs: 8 e 14; SEQ ID NOs: 3 e 15.

[0013] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada

8 / 177 compreende HCDR1 da SEQ ID NO: 16, HCDR2 da SEQ ID NO: 17 e HCDR3 da SEQ ID NO: 18; e em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 da SEQ ID NO: 31, LCDR2 da SEQ ID NO: 32 e LCDR3 da SEQ ID NO: 33; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 3 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 13; e em que o anticorpo reduziu a hemaglutinação de hemácias em comparação para Ab47. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

[0014] Em algumas modalidades do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecidas no presente documento, a região variável de cadeia pesada compreende: a) um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, em que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; ou c) um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat; ou d) um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[0015] Em algumas tais modalidades, H29 é F, H44 é R ou G, H49 é

9 / 177 A, H82 é M ou I, H89 é I ou V, H91 é F ou Y e H94 é R, de acordo com numeração de Kabat.

[0016] Em algumas modalidades do anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecidas no presente documento, a região variável de cadeia leve compreende: a) um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 92, em que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[0017] Em algumas tais modalidades, L4 é M, L21 é L, L49 é K, L69 é T ou S, e L85 é V ou T, de acordo com a numeração de Kabat.

[0018] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é de um isótipo de IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) intensificada em comparação com seu anticorpo parental. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) intensificada em comparação com seu anticorpo parental. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem citotoxicidade dependente de complemento (CDC) intensificada em comparação com seu anticorpo parental. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um fragmento Fv, um diacorpo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento scFv ou um scFv-Fc. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo induz a apoptose de células que expressam CD47 in vitro e/ou in vivo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem fucosilação de núcleo

10 / 177 reduzida em comparação com seu anticorpo parental. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é afucosilado. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo bloqueia uma interação entre CD47 e SIRPĮ. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem hemaglutinação reduzida de hemácias em comparação com Ab47.

[0019] Em algumas modalidades, é fornecida uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, é fornecido um vetor de expressão que compreende a sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico ou o vetor de expressão. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula hospedeira que expressa um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, um método para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno fornecido no presente documento compreende cultivar a célula hospedeira. Em algumas modalidades, o método compreende ainda isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0020] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento.

[0021] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem: a) identificar um indivíduo como tendo um câncer que expressa CD47; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do

11 / 177 mesmo fornecido no presente documento.

[0022] Em algumas tais modalidades, a etapa a) compreende: i) isolar tecido de câncer; e ii) detectar CD47 no tecido de câncer isolado.

[0023] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem: a) identificar um indivíduo como tendo níveis elevados de infiltração de macrófago em tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento.

[0024] Em algumas tais modalidades, a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar macrófagos no tecido de câncer isolado e em tecido não canceroso; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso. Em algumas modalidades, o manchamento de macrófago é realizado com um anticorpo anti-CD163.

[0025] Em algumas modalidades, os métodos para tratar câncer compreendem identificar um indivíduo como tendo um câncer que expressa CD47 e níveis elevados de infiltração de macrófago no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[0026] Em algumas modalidades, é fornecido um método para induzir a apoptose de uma célula que expressa CD47 que compreende colocar a célula em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, a célula está in vitro. Em algumas modalidades, a célula está in vivo.

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[0027] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo mascarado que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína de CD47 humano e pelo menos um domínio de mascaramento, em que pelo menos um domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionado a partir das SEQ ID NOs: 44 a 55, 75 a 86, 94 e 95. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo mascarado que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento e pelo menos um domínio de mascaramento. Em algumas modalidades, pelo menos um domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 44 a 55, 75 a 86, 94 e 95.

[0028] Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio de mascaramento reduz a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno à proteína de CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é reduzida pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é reduzida entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

[0029] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada é ligada a um primeiro domínio de mascaramento; ou em que a cadeia leve é ligada a um segundo domínio de mascaramento; ou em que a cadeia pesada é ligada a um primeiro domínio de mascaramento e a cadeia leve é ligada a um segundo domínio de mascaramento. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de mascaramento compreende uma

13 / 177 sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 75, 77, 79, 81, 83, 85 e 94; e o segundo domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51, 53, 55, 76, 78, 80, 82, 84, 86 e 95. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de mascaramento e o segundo domínio de mascaramento são um par de domínios de mascaramento selecionados a partir de: SEQ ID NOs: 44 e 45; SEQ ID NOs: 46 e 47; SEQ ID NOs: 48 e 49; SEQ ID NOs: 50 e 51; SEQ ID NOs: 52 e 53; SEQ ID NOs: 54 e 55; SEQ ID NOs: 75 e 76; SEQ ID NOs: 77 e 78; SEQ ID NOs: 79 e 80; SEQ ID NOs: 81 e 82; SEQ ID NOs: 83 e 84; SEQ ID NOs: 85 e 86; e SEQ ID NOs: 94 e 95. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de mascaramento é ligado à terminação N da cadeia pesada e o segundo domínio de mascaramento é ligado à terminação N da cadeia leve.

[0030] Em algumas modalidades, cada domínio de mascaramento compreende um ligante clivável por protease e é ligado à cadeia pesada ou cadeia leve por meio do ligante clivável por protease. Em algumas modalidades, o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP). Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir de um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13. Em algumas modalidades, após a clivagem por uma MMP, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem de MMP. Em algumas modalidades, o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

[0031] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, o

14 / 177 anticorpo mascarado compreende uma cadeia pesada ligada a um primeiro domínio de mascaramento e que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve ligada a um segundo domínio de mascaramento e que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.

[0032] Em algumas modalidades, é fornecido uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo mascarado fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, é fornecido um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula hospedeira que expressa anticorpo mascarado fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, um método para produzir o anticorpo mascarado fornecido no presente documento compreende cultivar a célula hospedeira. Em algumas modalidades, o método compreende ainda isolar o anticorpo mascarado.

[0033] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo mascarado fornecido no presente documento.

[0034] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem: a) identificar um indivíduo como tendo níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo mascarado fornecido no presente documento, em que cada domínio de mascaramento do anticorpo mascarado compreende um ligante clivável por protease e em que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP). Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir de um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13. Em algumas

15 / 177 modalidades, a MMP é selecionada a partir de MMP2, MMP7, MMP9 e MMP13. Em algumas modalidades, a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso do indivíduo; ii) detectar MMPs no tecido de câncer isolado e no tecido não canceroso; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[0035] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem: a) identificar um indivíduo como tendo um câncer que expressa CD47; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo mascarado fornecido no presente documento.

[0036] Em algumas modalidades, a etapa a) compreende: i) isolar tecido de câncer; e ii) detectar CD47 no tecido de câncer isolado.

[0037] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem: a) identificar um indivíduo como tendo níveis elevados de infiltração de macrófago em tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo mascarado fornecido no presente documento.

[0038] Em algumas modalidades, a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar macrófagos no tecido de câncer isolado e em tecido não canceroso; e

16 / 177 iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso. Em algumas modalidades, o manchamento de macrófago é realizado com um anticorpo anti-CD163.

[0039] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem identificar um indivíduo como tendo (a) níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante e (b) um câncer que expressa CD47. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem identificar um indivíduo como tendo (a) níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante, e (b) níveis elevados de infiltração de macrófago no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende identificar um indivíduo como tendo (a) um câncer que expressa CD47, e (b) níveis elevados de infiltração de macrófago no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreendem identificar um indivíduo como tendo (a) níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante, (b) um câncer que expressa CD47 e (c) níveis elevados de infiltração de macrófago no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[0040] Em algumas modalidades, o anticorpo mascarado compreende pelo menos um domínio de mascaramento que compreende um ligante clivável por protease, e em que o ligante clivável por protease é clivado no microambiente de tumor. Em algumas modalidades, a seguinte clivagem do ligante clivável por protease no microambiente de tumor, o domínio de mascaramento é liberado a partir do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante clivável

17 / 177 por protease compreende a sequência de aminoácidos IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) ou GPLGVR (SEQ ID NO: 57). Em algumas modalidades, o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de MMP. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir de um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13. Em algumas modalidades, após a liberação do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem um restante de aminoácido em ponta do ligante clivável por protease. Em algumas modalidades, o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

[0041] Em várias modalidades, o câncer que expressa CD47 é um câncer hematológico ou um câncer sólido. Em algumas modalidades, o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de um linfoma não Hodgkin, linfoma B-linfoblástico; leucemia linfocítica crônica de célula B/linfoma linfocítico pequeno, síndrome de Richter, linfoma folicular, mieloma múltiplo, mielofibrose, policitemia vera, linfoma de célula T cutânea, gamopatia monoclonal de significância desconhecida (MGUS), síndrome mielodisplástica (MDS), linfoma de célula grande imunoblástica, linfoma B- linfoblástico precursor, leucemia mieloide aguda (AML) e linfoma de célula grande anaplástica. Em algumas modalidades, o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer espinhal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer endometrial, câncer colorretal, câncer anal, câncer endometrial, câncer do esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, carcinoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, melanoma, câncer de próstata, câncer de pituitária, câncer de estômago, câncer uterino, câncer vaginal e câncer de tiroide. Em algumas modalidades, o câncer que expressa

18 / 177 CD47 é selecionado a partir de câncer de pulmão, sarcoma, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer gástrico, melanoma e câncer de mama.

[0042] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou o anticorpo mascarado, é administrado em combinação com um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune escolhida de uma ou mais de proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante 1 de morte programada (PD-L1), PD-L2, proteína 4 associada ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), imunoglobulina de célula T e domínio de mucina contendo 3 (TIM-3), gene 3 ativação de linfócito (LAG-3), molécula de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM-1), CEACAM-5, supressor de Ig domínio V de ativação de célula T (VISTA), atenuador de linfócito B e T (BTLA), imunorreceptor de célula T com domínios de Ig e ITIM (TIGIT), receptor 1 tipo imunoglobulina associada a leucócito (LAIR1), CD160, 2B4 ou TGFR. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou o anticorpo mascarado, é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD40 agonístico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 agonístico tem baixos níveis de fucosilação ou é afucosilado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou o anticorpo mascarado, é administrado em combinação com um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC), em que o anticorpo do ADC se liga especificamente a uma proteína que é expressa na superfície extracelular de uma célula de câncer e o anticorpo é conjugado a um ligante de fármaco que compreende um agente citotóxico. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é uma auristatina. Em algumas modalidades, o anticorpo do ADC é conjugado com um ligante de fármaco selecionado a partir de vcMMAE e mcMMAF.

[0043] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD47 ou

19 / 177 fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo do anticorpo mascarado exibe hemaglutinação reduzida in vitro em comparação com seu anticorpo anti- CD47 parental. Em algumas modalidades, o anticorpo parental é Ab47. Em algumas modalidades, a administração do anticorpo anti-CD47 ou o anticorpo mascarado não induz hemaglutinação no indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado induz a apoptose de células que expressam CD47 in vitro e/ou in vivo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado induz a apoptose de células que expressam CD47 in vivo. Em algumas modalidades, as células que expressam CD47 são células de câncer.

[0044] Num aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve variável e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY), e um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88 [Figura 1A], em que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[0045] Num outro aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY), e um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89 [Figura 1B], em que

20 / 177 a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com numeração de Kabat.

[0046] Em ainda outro aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY), e um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90 [Figura 1C], em que a posição de framework H29, H49 e H82 é um resíduo de doador, de acordo com numeração de Kabat.

[0047] Em ainda outro aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY), e um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91 [Figura 1D], em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com numeração de Kabat.

[0048] Em ainda outro aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 31 (RASQTISDYLH), 32 (FASQSIS) e 33 (QNGHGFPRT); e um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na

21 / 177 SEQ ID NO: 92 [Figura 1G], em que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat.

[0049] Em ainda outro aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 31 (RASQTISDYLH), 32 (FASQSIS) e 33 (QNGHGFPRT); e um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93 [Figura 1H], em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador, de acordo com numeração de Kabat.

[0050] Numa modalidade, a posição de framework L4 é ocupada por M, L21 é ocupada por L, L49 é ocupada por K, L69 é ocupada por T ou S e L85 é ocupada por V ou T, de acordo com a numeração de Kabat.

[0051] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[0052] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende ainda uma mutação G91A em LCDR3, de acordo com a numeração de Kabat.

[0053] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é de um isótipo de IgG1.

[0054] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

[0055] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a

22 / 177 antígeno tem fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

[0056] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem fucosilação de núcleo reduzida em comparação com seu anticorpo parental.

[0057] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno bloqueia uma interação entre CD47 e SIRPĮ.

[0058] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem hemaglutinação reduzida de hemácias em comparação com seu anticorpo parental.

[0059] Num aspecto, é fornecida uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano.

[0060] Numa modalidade, o fragmento de ligação a antígeno compreende um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um fragmento Fv, um diacorpo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de scFv ou um scFv-Fc.

[0061] Num aspecto, é fornecido um método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende um agente de mascaramento (denominado também como um “domínio de mascaramento”), em que o agente de mascaramento compreende um ou mais peptídeos de bobina em espiral que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[0062] Numa modalidade, uma ligante clivável por protease liga o agente de mascaramento para o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

23 / 177

[0063] Numa modalidade, o ligante clivável por protease tem uma sequência de aminoácidos que compreende IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) ou GPLGVR (SEQ ID NO: 57).

[0064] Numa modalidade, o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

[0065] Numa modalidade, o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13.

[0066] Numa modalidade, o agente de mascaramento é liberado a partir do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo subsequente à clivagem de um sítio de clivagem de MMP num microambiente de tumor por uma MMP.

[0067] Numa modalidade, o anticorpo anti-CD47 clivado tem um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem da MMP.

[0068] Numa modalidade, o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

[0069] Numa modalidade, um ou mais peptídeos de bobina em espiral compreendem uma ou mais sequências selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55. Numa modalidade, um ou mais peptídeo de bobina em espiral compreendem uma ou mais sequências selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 e 86. Numa modalidade, um ou mais peptídeos de bobina em espiral compreendem uma ou mais sequências selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 94 e 95.

[0070] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a CD47 é reduzido pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[0071] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a

24 / 177 antígeno que se liga a CD47 é reduzido entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[0072] Numa modalidade, o câncer que expressa CD47 é um câncer hematológico que causa um câncer sólido.

[0073] Numa modalidade, o câncer hematológico é selecionado a partir de um linfoma não Hodgkin, linfoma B-linfoblástico; leucemia linfocítica crônica de célula B/linfoma linfocítico pequeno, síndrome de Richter, linfoma folicular, mieloma múltiplo, mielofibrose, policitemia vera, linfoma de célula T cutânea, gamopatia monoclonal de significância desconhecida (MGUS), síndrome mielodisplástica (MDS), linfoma de célula grande imunoblástica, linfoma B-linfoblástico precursor, leucemia mieloide aguda (AML) e linfoma de célula grande anaplástica.

[0074] Numa modalidade, o câncer que expressa CD47 é um tumor sólido.

[0075] Numa modalidade, o tumor sólido é selecionado a partir de câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer espinhal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer endometrial, câncer colorretal, câncer anal, câncer endometrial, câncer do esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de pele, melanoma, câncer de próstata, câncer de pituitária, câncer de estômago, câncer uterino, câncer vaginal e câncer de tiroide.

[0076] Numa modalidade, o tumor sólido é selecionado a partir de câncer de pulmão, sarcoma, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer gástrico, melanoma, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço e câncer de mama.

[0077] Numa modalidade, o indivíduo é um humano que sofre de um

25 / 177 câncer sólido.

[0078] Numa modalidade, o anticorpo anti-CD47 é administrado em combinação com um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune escolhida de uma ou mais de proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante 1 de morte programada (PD-L1), PD-L2, proteína 4 associada ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), imunoglobulina de célula T e domínio de mucina contendo 3 (TIM-3), gene 3 ativação de linfócito (LAG-3), molécula de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM-1), CEACAM-5, supressor de Ig domínio V de ativação de célula T (VISTA), atenuador de linfócito B e T (BTLA), imunorreceptor de célula T com domínios de Ig e ITIM (TIGIT), receptor 1 tipo imunoglobulina associada a leucócito (LAIR1), CD160, 2B4 ou TGFR.

[0079] Num aspecto, é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína de CD47 humano que compreende um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende um ou mais peptídeos de bobina em espiral que compreende a sequência de SEQ ID NO: 95 (QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGS) e/ou SEQ ID NO: 94 (QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGS), e em que o um ou mais peptídeos de bobina em espiral reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com a proteína de CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[0080] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID

26 / 177 NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[0081] Numa modalidade, o agente de mascaramento é fixado ao anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo via um ligante clivável por protease.

[0082] Numa modalidade, o ligante clivável por protease tem uma sequência de aminoácidos que compreende IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) ou GPLGVR (SEQ ID NO: 57).

[0083] Numa modalidade, o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

[0084] Numa modalidade, o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13.

[0085] Numa modalidade, o agente de mascaramento é removido do anticorpo anti-CD47 após a clivagem de um sítio de clivagem de MMP por uma MMP.

[0086] Numa modalidade, o anticorpo anti-CD47 tem um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem de MMP após a clivagem de um sítio de clivagem de MMP por uma MMP.

[0087] Numa modalidade, o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

[0088] Numa modalidade, a ligação é reduzida pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[0089] Numa modalidade, a ligação é reduzida entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[0090] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 42 e uma sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 43.

27 / 177

[0091] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região Fc variante que confere a função efetora aumentada selecionada a partir de atividade de ADCC e/ou CDC.

[0092] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é afucosilado.

[0093] Num aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, em que o anticorpo é um isótipo de IgG1.

[0094] Numa modalidade, o anticorpo compreende atividade de ADCC intensificada, ADCP intensificada e/ou CDC intensificada.

[0095] Num aspecto, é fornecido um método para o tratamento de um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende as etapas de: a) identificar o indivíduo como tendo níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreendem um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende peptídeos de bobina em espiral que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento, se o indivíduo tiver níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante.

[0096] Numa modalidade, a MMP é selecionada a partir do grupo consistindo em: MMP2, MMP7, MMP9 e MMP13.

[0097] Numa modalidade, a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso do indivíduo; ii) detectar MMPs no tecido de câncer isolado e no tecido não canceroso; e

28 / 177 iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[0098] Num aspecto, é fornecido um método para o tratamento de um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende as etapas de: a) identificar o indivíduo como tendo níveis elevados de CD47 no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreendem um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende peptídeos de bobina em espiral que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento, se o indivíduo tiver níveis elevados de CD47 no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante.

[0099] Numa modalidade, a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar CD47 no tecido de câncer isolado e tecido não canceroso circundante; e iii) comparar a quantidade de manchamento de CD47 no tecido de câncer em relação ao manchamento de CD47 no tecido não canceroso.

[00100] Num aspecto, é fornecido um método para o tratamento de um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende as etapas de: a) identificar o indivíduo como tendo níveis elevados de infiltração de macrófago em tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do

29 / 177 mesmo que compreendem um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende um ou mais peptídeos de bobina em espiral que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ao CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento, se o indivíduo tiver níveis elevados de infiltração de macrófago no câncer em relação ao tecido não canceroso.

[00101] Numa modalidade, a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar macrófagos no tecido de câncer isolado e em tecido não canceroso; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[00102] Numa modalidade, o manchamento de macrófago é realizado com um anticorpo anti-CD163.

[00103] Num aspecto, é fornecido um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15, em que o anticorpo compreende ainda a sequência LRSG, SG ou VR na terminação N da HCVR e/ou da LCVR.

[00104] Num aspecto, um método para tratar câncer através da administração de uma combinação da anticorpo CD47 mascarado da invenção com um anticorpo CD40 agonístico.

[00105] Numa modalidade, o anticorpo CD40 agonístico tem baixos

30 / 177 níveis de fucosilação, por exemplo, anticorpo SEA-CD40.

[00106] Num aspecto, é fornecido um método para tratar câncer através da administração de uma combinação do anticorpo CD47 mascarado, de acordo com a reivindicação 37, com um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC), em que o anticorpo do ADC se liga especificamente a uma proteína que é expressa na superfície extracelular de uma célula de câncer e o anticorpo é conjugado a um ligante de fármaco que compreende um agente citotóxico.

[00107] Numa modalidade, o agente citotóxico é um auristatina.

[00108] Numa modalidade, o anticorpo do ADC é conjugado a um ligante de fármaco selecionado a partir de vcMMAE e mcMMAF.

[00109] O resumo da divulgação descrito acima é não limitante, e outros recursos e vantagens dos anticorpos divulgados e métodos para produzir e usar os mesmos ficarão evidentes a partir dos seguintes desenhos, da descrição detalhada, dos exemplos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00110] A Figura 1A a Figura 1J representam alinhamentos de sequências de anticorpos. A Figura 1A mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia pesada hB6H12 com a sequência de doador VH humana, HV3-23/HJ4. A Figura 1B mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia pesada hB6H12 com a sequência de doador VH humana, HV3-48/HJ4. A Figura 1C mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia pesada hB6H12 com a sequência de doador VH humana, HV3- 66/HJ4. A Figura 1D mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia pesada hB6H12 com a sequência de doador VH humana, HV3-74/HJ4. A Figura 1E mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia pesada hB6H12. A Figura 1F mostra um alinhamento de sequências de cadeia pesada hB6H12.3 (hvH1) em comparação com mB6H12 e Ab47. A Figura 1G mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia leve hB6H12

31 / 177 com a sequência de doador VH humana, KV1-3/KJ2. A Figura 1H mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia leve hB6H12 com sequência de doador VH humana, KV1-27/KJ2. A Figura 1I mostra um alinhamento de sequências de variantes de cadeia leve hB6H12. A Figura 1J mostra um alinhamento de sequências de cadeia leve hB6H12.3 (hvK3) em comparação com mB6H12 e Ab47.

[00111] As Figuras 2A a 2C representam a afinidade de ligação de anticorpo e a cinética. A Figura 2A mostra FACS celular de saturação de CD47 com anticorpos anti-CD47 exemplificadores. A Figura 2B mostra ELISA de saturação de CD47 com anticorpos anti-CD47 exemplificadores. A Figura 2C mostra cinética de ligação de CD47 com anticorpos anti-CD47 exemplificador.

[00112] A Figura 3A a Figura 3B representam fagocitose mediada por anticorpo. A Figura 3A e Figura 3B mostram fagocitose mediada por anticorpo de hemácias humanas CD47+ (RBC) com anticorpos anti-CD47 exemplificadores.

[00113] A Figura 4A a Figura 4B representam hemaglutinação mediada por anticorpo. A Figura 4A mostra uma captação de imagem da formação de RBCs sem sedimentação dispersas. A Figura 4B mostra a porcentagem de hemaglutinação de RBCs com anticorpos anti-CD47 Ab47 e hB6H12.3.

[00114] A Figura 5A e Figura 5B representam ativação de receptores FcȖ mediada por anticorpo. A atividade de repórter de luciferase NFAT foi medida a partir de células Jurkat transfectadas com FcȖRI (Figura 5A) ou FcȖRIIIa-H de alta afinidade (Figura 5B) e expostas a células WIL2S revestidas com concentrações crescentes de hB6H12.3, Ab47 ou B6H12 de camundongo.

[00115] A Figura 6A e Figura 6B representam ADCC mediada por célula NK e ativação de Fc RIIIA. As células WIL2S carregadas com cromo

32 / 177 revestidas com mB6H12, Ab47 ou hB6H12.3 foram expostas às células Jurkat que expressam de forma estável a variante V/V de alta afinidade de FcȖRIIIa e a ativação de receptor avaliada como atividade de luciferase acionada por NFAT. A ADCC (Figura 6A) e ativação de FcȖRIIIa (Figura 6B) foram comparadas entre mB6H12, Ab47 e hB6H12.3.

[00116] A Figura 7A a Figura 7D representam a função supressora de anticorpos anti-CD47. Os monócitos diferenciados com um fenótipo de macrófago associado a tumor (TAM) mostraram níveis aumentados de marcadores de ativação de macrófago CD86 (Figura 7A) e MHCII (Figura 7B) quando expostos a anticorpos anti-CD47. A ativação de célula T mediada por TCR foi avaliada através da detecção da regulação ascendente de MHCII (Figura 7C) e secreção de IFNȖ (Figura 7D) em células T.

[00117] A Figura 8A a Figura 8D representam uma comparação entre hB6H12.3 e o anticorpo anti-CD47 5F9. A ativação de FcȖRI foi detectada em células Jurkat repórter de luciferase NFAT (Figura 8A). A ativação de FcȖRII foi avaliada em células Jurkat repórter de luciferase NFAT (Figura 8B). A atividade de ADCC mediada por NK foi determinada (Figura 8C). A secreção de IFNȖ de células T foi avaliada (Figura 8D).

[00118] A Figura 9A e Figura 9B representam dados de espectrometria de massa para anticorpo mascarado reativado por MMP2. A massa de cadeia leve deconvoluída para Vel-IPV-hB6H12.3 antes (Figura 9A) e depois (Figura 9B) da clivagem com MMP2 humana recombinante. O m/z esperado para a cadeia leve intata é 28681 (observado: 28680,8). O m/z esperado para anticorpo clivado por MMP2 (LRSG-hB6H12.3) é 23969 (observado: 23968,4).

[00119] A Figura 10 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a células de câncer de bexiga humanas SW780. Os anticorpos hB6H12 mascarados com Vel-IPV foram testados juntamente com comparadores pré-ativados com MMP2. Os anticorpos Vel-IPV clivados

33 / 177 possuíram uma sequência LRSG restante nas terminações N de anticorpo.

[00120] A Figura 11 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a células de câncer de bexiga humanas SW780. Os anticorpos hB6H12 mascarados com Vel-IPV foram testados juntamente com comparadores pré-ativados com MMP2. Os anticorpos IPV em ponta e Vel- IPV clivados possuíram uma sequência LRSG restante nas terminações N de anticorpo. O anticorpo clivado foi gerado através da clivagem com MMP2, enquanto o anticorpo IPV em ponta foi gerado de forma recombinante.

[00121] A Figura 12 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a hemácias humanas. Os anticorpos hB6H12 mascarados com Vel- IPV foram testados juntamente com comparadores reativados (IPV em ponta- hB6H12.3 ou Vel-IPV-hB6H12.3 clivado com MMP2). Os anticorpos IPV em ponta e Vel-IPV clivados possuíram uma sequência LRSG restante nas terminações N de anticorpo. O anticorpo clivado foi gerado através da clivagem com MMP2, enquanto o anticorpo IPV em ponta foi gerado de forma recombinante.

[00122] A Figura 13 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a rhCD47 por conforme detectado por ELISA. Vel-IPV-hB6H12.3 exibiu ligação significativamente prejudicada. A ligação poderia ser restaurado mediante a clivagem por rhMMP2.

[00123] A Figura 14 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a rhCD47 conforme detectado por ELISA. Tanto hB6H12.3 como hB6H12.3 G91A exibiram um Bmax maior que Ab47.

[00124] A Figura 15 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a células de câncer de bexiga humanas SW780. A ligação de Ab47 e hB6H12.3 foi comparada com variantes que contêm uma mutação G91A em CDR-L3.

[00125] A Figura 16 representa a ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a hemácias humanas. A ligação de Ab47 e hB6H12.3 foi

34 / 177 comparada com variantes que contêm uma mutação G91A em CDR-L3.

[00126] A Figura 17A e Figura 17B representam a atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor de xenoenxerto L428 em camundongos NSG. Os anticorpos foram administrados intraperitonealmente (i.p.) a cada quatro dias para quatro doses (q4dx4) em 1 ou 10 mg/kg (Figura 17A). A análise de tecido de tumor usando o marcador de macrófago anti- F4/80 mostrou a presença de macrófagos murinos no modelo de tumor de xenoenxerto L428 (Figura 17B).

[00127] A Figura 18A a Figura 18D representam a atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor de xenoenxerto L428 em camundongos NSG. Os anticorpos foram administrados i.p. q4dx4 em 1 ou 10 mg/kg (Figura 18A). A análise de tecido de tumor usando o marcador de macrófago anti-F4/80 revelou a presença de macrófagos murinos no modelo de tumor de xenoenxerto Detroit 562 (Figura 18B). A atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor de xenoenxerto SUDHL8 em camundongos NSG também foi analisada (Figura 18C). Os anticorpos foram administrados i.p. q4dx4 em 1 ou 10 mg/kg. A análise de tecido de tumor usando o marcador de macrófago anti-F4/80 mostrou a presença de macrófagos murinos no modelo de tumor de xenoenxerto SUDHL8 (Figura 17B).

[00128] A Figura 19A a Figura 19D representam a atividade de anticorpos anti-CD47 em modelos de tumor possuindo que têm um baixo teor de macrófagos intrínsecos. Um modelo de câncer de fibrosarcoma HT1080 (Figura 19A & Figura 19B) e um modelo de câncer hepatocelular HepG2 (Figura 19C & Figura 19D) estão representados. Os anticorpos foram administrados i.p. q4dx4 em 10 mg/kg. A análise de tecido de tumor usando o marcador de macrófago anti-F4/80 mostrou a presença de macrófagos murinos no modelo de câncer de fibrosarcoma HT1080 (Figura 19B) e no modelo de câncer hepatocelular HepG2 (Figura 19D).

[00129] A Figura 20 representa a atividade de anticorpos anti-CD47

35 / 177 em modelos de tumor que têm baixo teor de macrófagos intrínsecos, que pode ser amplificada quando combinada com um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC) e monometil auristatina E (MMAE) (que é conhecido por conduzir a infiltração de macrófagos). O anticorpo anti-CD47 foi administrado i.p. q4dx4 em 5 mg/kg, enquanto o MMAE ADC foi dado uma vez em 1 mg/kg.

[00130] A Figura 21A e Figura 21B mostram que um anticorpo anti- CD47 reativo a camundongo, mIAP301, pode ser mascarado utilizando usando as mesmas sequências de VEL e IPV usadas no anticorpo hB6H12.3 humano (Figura 21A). O mascaramento com esses construtos bloqueou a ligação de anticorpo aos tumores positivos para CD47 murino (Figura 21b), e impediu a funcionalidade conforme medido por fagocitose de RBC. Em modelos de tumor que têm baixo teor de macrófago intrínseco, o anticorpo anti-CD47 foi administrado i.p. q4dx4 em 5 mg/kg, enquanto o MMAE ADC foi dado uma vez em 1 mg/kg.

[00131] A Figura 22A e Figura 22B representa anticorpos mascarados e parentais marcados com 3H que foram administrados a camundongos BALB/c. Os anticorpos foram monitorizados por contagem de cintilação. A contagem de plaquetas de camundongo (Figura 22A) e a farmacocinética de anticorpo de murino (Figura 22b) são mostradas. Na Figura 22B, o ponto no tempo para análise do anticorpo mIAP301 foi de 24 horas após a última dose do anticorpo.

[00132] A Figura 23A a Figura 23D. O anticorpo anti-CD47 de camundongo mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor no modelo de linfoma A20, mas causou a depleção de RBC concomitante (Figura 23A). O anticorpo Vel-IPV-mIAP301 mascarado conferiu atividade similar, mas anulou efeitos sobre a depleção de RBCs (Figura 23B). Vel-IPV-mIAP301 evitou dissipação por antígeno de RBC, mas manteve a ligação de tumor (Figura 23C & Figura 23D).

36 / 177

[00133] A Figura 24 mostra que o anticorpo anti-CD47 de camundongo mIAP301 conduz a atividade anti-tumor no modelo de câncer de cólon MC38, que é conhecido como sendo responsivo a agentes de oncologia imune (I/O). A atividade do anticorpo mIAP301 mascarado neste modelo mostrou eficácia superior conforme denotado pelo animal que exibe uma resposta completa. A reprovocação deste animal resultou na rejeição completa do tumor, demonstrando a indução de uma resposta de célula T de memória de vida longa.

[00134] A Figura 25A a Figura 25B. O anticorpo parental e o anticorpo anti-CD47 murino mascarado mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor aumentada em combinação com o anticorpo substituto anti-PD-1, que resultou em 4/6 animais que exibem respostas completas (CRs) (Figura 25A). O anticorpo parental e o anticorpo anti-CD47 murino mascarado mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor aumentada em combinação com o anticorpo substituto intensificado com SEA alvejado para CD40 de ativação de macrófago 1C10 (Figura 25B).

[00135] A Figura 26 representa a estabilidade de diversas variantes B6H12 humanizados de bobina em espiral em camundongos BALB/c em três dias após a dose. A estabilidade foi determinada por densitometria de Western blot após a separação de cadeias pesadas mascaradas e não mascaradas por SDS-PAGE reduzido.

[00136] A Figura 27A a Figura 27B. Os níveis de eritrócitos após uma dose única de bolus IV de 0,1, 1, 10 ou 30 mg/kg de um IgG1 hB6H12 “Ab47” humanizado foram detectados (Figura 27A). As doses maiores que 1 mg/kg não foram toleradas, e animais em todos os níveis de dose exibiram sinais clínicos atribuídos à hemólise e tratamento com o artigo de teste. Os níveis de eritrócitos após uma dose única de bolus IV de 0,1, 1 ou 10 mg/kg de um IgG1 hB6H12 “Ab47” alternativamente humanizado e mascarado com Vel-IPV são mostrados, o que demonstra tolerabilidade aumentada

37 / 177 aproximadamente 10 vezes no nível de dose máxima testado (Figura 27B). Todas as doses de Vel-IPV-Ab47 foram toleradas, e sinais clínicos não foram detectados em qualquer nível de dose.

[00137] A Figura 28 representa níveis de anticorpos circulantes após uma dose única de bolus IV de 1 mg/kg de Ab47 e Vel–IPV-Ab47. Embora a dose de 1 mg/kg de Ab47 fosse abaixo do limite de detecção para o ensaio TAb (anticorpo total) genérico no dia de estudo 3, 1 mg/kg de Vel-IPV-Ab47 foi detectável através de todo o curso do estudo, terminando no dia de estudo

15.

[00138] A Figura 29 representa níveis de eritrócitos após uma dose única de bolus IV de 1 mg/kg de Ab47, hB6H12.3 ou controle. Tanto Ab47 como hB6H12.3 demonstraram depleção dos eritrócitos.

[00139] A Figura 30 representa níveis de plaquetas após uma dose única de bolus IV de 1 mg/kg de Ab47, hB6H12.3 ou controle. Ab47 demonstrou uma redução de 60% em níveis de plaquetas pré-dose, enquanto hB6H12.3 não teve uma redução de plaquetas além de 20%, que também foi observado para o grupo de controle. Tanto Ab47 como hB6H12.3 resultaram em plaquetas elevadas a partir do Dia 7 até o final do estudo, Dia 15.

[00140] A Figura 31 representa níveis de eritrócitos após uma dose única de bolus IV de 10 ou 20 mg/kg de um Vel-IPV-hB6H12.3, o que mostrou uma tolerabilidade aumentada aproximadamente 20 vezes em relação ao hB6H12.3 não mascarado em 1 mg/kg. Além da tolerabilidade intensificada por meio de parâmetros hematológicos, não foram observados sinais clínicos nos grupos tratados com anticorpo mascarado, enquanto foram observados em 1 mg/kg para hB6H12.3 não mascarado.

[00141] A Figura 32 representa níveis de eritrócitos após uma dose única de bolus IV de 20 mg/kg de Vel-IPV-hB6H12.3, 20 mg/kg de SEA-Vel- IPV-hB6H12.3, 1 mg/kg de hB6H12.3 e controle para referência. Os anticorpos hB6H12.3 tanto mascarados com SEA como não mascarados com

38 / 177 SEA foram tolerados de modo similar apesar da intensificação da funcionalidade efetora através de engenharia de anticorpos.

[00142] A Figura 33 representa a detecção de macrófagos via imuno- histoquímica usando um anticorpo anti-CD163 em amostras de tecido câncer de mama e tecido normal.

[00143] A Figura. 34 representa as sequências de bobina em espiral M11, M15 e Vel. Também são mostradas as sequências de clivagem de MMP2.

[00144] A Figura. 35A a Figura 35B Níveis de MMP de tumor em cânceres humanos e murinos selecionados em relação àqueles presentes nos sistemas de cultura de células.

[00145] A Figura. 36A a Figura 36B representa auristatinas que contêm MMAE selecionado (LIV1A e CD30) em combinação com um anticorpo anti-CD47 no modelo de xenoenxerto de câncer de mama MCSF7 para Liv1A ADC e o modelo de linfoma L428 para CD30 ADC.

[00146] A Figura. 37A a Figura 37F representam concentrações de mIAP301 e Vel-IPV-mIAP301 mascarado e Vel-M2-mIAP301 em plasma (Figura 37A e Figura 37B), baço (Figura 37C e Figura 37D) e tumor (Figura 37E e Figura 37F).

[00147] A Figura. 38A a Figura 38B representam a percentagem de anticorpo clivado em plasma, fígado e tumor (Figura 38A). Os tumores HT1080 colhidos a partir de camundongos tratados com Ab47 ou Vel-IPV- Ab47 durante 4 ou 7 dias foram submetidos à citometria de fluxo para determinar a extensão de que o anticorpo foi capaz de se ligar a e saturar o CD47 expresso em tumor (Figura 38B).

[00148] A Figura 39A a Figura 39C A tolerabilidade de Ab47 mascarado (Figura 39A) ou hB6H12.3 mascarado (Figura 39B) foi determinada mediante a medição da proteína quimioatrativa de monócitos 1 (MCP-1) de citocina plasmática circulante. A análise farmacocinética usando

39 / 177 uma ELISA TAb genérico foi realizada em hB6H12.3 mascarado e não mascarado (Figura 39C).

[00149] A Figura 40A a Figura 40B representam a atividade anti-tumor relativa mediante a medição do volume de tumor médio em modelos de xenoenxerto de Vel-IPV-hB6H12.3 e SEA-Vel-IPV-hB6H12.3, bem como o SEA hB6H12.3 fucosilado e não fucosilado num modelo de macrófago elevado (Detroit562) (Figura 40A) e baixo (HT1080) (Figura 40B).

[00150] A Figura 41A a Figura 41B representam a medição de níveis de citocina de MCP-1 circulante com o anticorpo Vel-IPV-hB6H12.3 e SEA- Vel-IPV-hB6H12.3 (Figura 41A). A análise farmacocinética usando um ELISA TAb genérico foi realizada entre anticorpos Vel-IPV-hB6H12.3 SEA e não SEA (Figura 41B).

[00151] A Figura 42 descreve a medição de fagocitose de hemácias humanas positivas para CD47 após incubação com hB6H12.3 (“Anti-CD47”), Vel-IPV-hB6H12.3 (“Anti-CD47 mascarado”), Vel-IPV-hB6H12.3 clivado por MMP (“Anti-CD47 mascarado ativado por MMP”) ou nenhum anticorpo (“Não tratado”).

[00152] A Figura 43 representa hemácias humanas numa placa de fundo redondo, após incubação com Vel-IPV-Ab47 (“Ab47 mascarado”), Vel-IPV-Ab47 clivado por MMP (“Ab47 mascarado clivado por MMP”) ou nenhum anticorpo (“Não tratado”).

[00153] A Figura 44 representa a medição de células positivas para anexina V após incubação com hB6H12.3, 5F9 ou um controle de isótipo de IgG1.

[00154] A Figura 45A a Figura 45C representam a medição de ligação de Vel-IPV-hB6H12.3-FITC e hB6H12.3-FITC à amostra de sangue total de 16 dentre 17 amostras de pacientes (Figura 45A) ou de uma amostra atípica (Figura 45B); e valores de EC50 obtidos usando um ELISA após a incubação de plasma com CD47 recombinante e hB6H12.3 (“Doador 1-hB6H12.3

40 / 177 enriquecido”) ou Vel-IPV-hB6H12.3 (Sarcoma Pt1-10) (Figura 45C).

[00155] A Figura 46A a Figura 46B representam a produção de citocina representativa induzida pela incubação de amostras de sangue total de paciente com câncer incubadas com hB6H12.3 ou Vel-IPV-hB6H12.3 durante 20 horas a 37 C. A Figura 46A mostra a produção de IP-10 e a Figura 46B mostra a produção de IL-1RA.

[00156] A Figura 47 mostra o manchamento de anexina V em células de tumor HT1080 a partir de camundongos de modelo de xenoenxerto HT1080 administrados com hB6H12.3, Vel-IPV-hB6H12.3 ou controle de isótipo de hIgG1 (“isótipo H00”).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00157] Os anticorpos IgG3 anti-CD47 conhecidos na técnica, no momento do depósito, exibem toxicidades tais como a depleção de hemácias periféricas e a depleção de plaquetas, o que diminui a sua utilidade como agentes terapêuticos eficazes contra distúrbios associados a CD47, tais como, por exemplo, cânceres que expressam CD47. Os requerentes descobriram surpreendentemente anticorpos IgG1 anti-CD47 inovadores e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que podem ser ativados por meio do desmascaramento no contexto de um microambiente de tumor, para alvejar de modo eficaz os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção especificamente para tumores sólidos que expressam CD47. Os anticorpos anti-CD47 humanizados e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (mascarados ou não mascarados) aqui descritos são úteis para o tratamento de distúrbios relacionados a CD47, por exemplo, tais como cânceres que expressam CD47.

[00158] Em certas modalidades exemplificadoras, são fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que compreendem uma máscara removível (por exemplo, uma máscara de bobina em espiral) que bloqueia a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do

41 / 177 mesmo ao seu alvo antigênico. Em certas modalidades, uma máscara removível é fixada à terminação N de uma ou mais dentre as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo via uma sequência de ligante clivável à matriz metaloproteinase (MMP).

[00159] No microambiente de tumor, a proteólise alterada leva ao crescimento de tumor não regulado, remodelação de tecidos, inflamação, invasão de tecidos e metástases (Kessenbrock (2011) Cell 141:52). As MMPs representam a família mais proeminente de proteinases associadas à tumorigênese, e as MMPs medeiam muitas das alterações no microambiente durante a progressão do tumor. Id. Mediante a exposição do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção a uma MMP, a sequência de ligante de MMP é clivada, permitindo assim a remoção da máscara de bobina em espiral e possibilitando que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se ligue ao seu antígeno alvo de uma maneira específica de microambiente de tumor.

[00160] Os anticorpos IgG1 anti-CD47 inovadores e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção (tanto mascarados e não mascarados) demonstram vantajosamente farmacocinética aumentada e efeitos fora do alvo diminuídos em comparação com anticorpos IgG3 anti- CD47 conhecidos na técnica no momento do depósito. Os anticorpos anti- CD47 humanizados inovadores aqui descritos exibem, vantajosamente, um ou mais dos seguintes: 1) ligação a antígeno aumentada em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 2) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) intensificada em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 3) fagocitose intensificada (por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo intensificada (ADCP)) em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 4) hemaglutinação (HA) de hemácias reduzida, em relação a um anticorpo de referência (por

42 / 177 exemplo, um anticorpo parental murino); 5) ligação ao mesmo epítopo CD47 tridimensional (isto é, não linear).

[00161] Para que a invenção possa ser mais prontamente compreendida, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que definido especificamente em outro lugar neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado comumente entendido por um versado na técnica a qual esta invenção pertence. I. DEFINIÇÕES

[00162] Como usado neste documento, incluindo nas reivindicações anexas, as formas singulares de palavras “um”, “uma” e “o(a)” incluem suas referências plurais correspondentes, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[00163] Um “conjugado de fármaco de anticorpo” se refere a um anticorpo conjugado a um agente citotóxico ou agente citostático. Tipicamente, os conjugados de fármaco de anticorpo se ligam a um antígeno alvo (por exemplo, CD47) sobre uma superfície de célula, seguido da internalização do conjugado de fármaco de anticorpo na célula e liberação subsequente do fármaco na célula.

[00164] Um “polipeptídeo” ou “cadeia de polipeptídeo” é um polímero de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas, quer produzido naturalmente ou sinteticamente. Os polipeptídeos com menos que cerca de 10 resíduos de aminoácidos são comumente denominados como “peptídeos”.

[00165] Uma “proteína” é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipeptídeos. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicos, tais como grupos de carboidrato. Os carboidratos e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína por meio da célula em que a proteína é produzida e irá variar com o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos de suas

43 / 177 estruturas de cadeia principal de aminoácidos. Os substituintes, tais como grupos de carboidratos são geralmente não especificados, mas podem estar presentes, no entanto.

[00166] Os termos “terminal amino” e “terminal carbóxi” denotam posições dentro de polipeptídeos. Onde o contexto permite, estes termos são usados com referência a uma determinada sequência ou parte de um polipeptídeo para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma certa sequência posicionada em terminal carbóxi em relação a uma sequência de referência dentro de um polipeptídeo está situada proximal à terminação carbóxi da sequência de referência, mas não está necessariamente na terminação carbóxi do polipeptídeo completo.

[00167] Para propósitos de classificação de substituições de aminoácido como conservativas ou não conservativas, as seguintes substituições de aminoácidos são consideradas substituições conservativas: serina substituída por treonina, alanina ou asparagina; treonina substituída por prolina ou serina; asparagina substituída por ácido aspártico, histidina ou serina; ácido aspártico substituído por ácido glutâmico ou asparagina; ácido glutâmico substituído por glutamina, lisina ou ácido aspártico; glutamina substituída por arginina, lisina ou ácido glutâmico; histidina substituída por tirosina ou asparagina; arginina substituída por lisina ou glutamina; metionina substituída por isoleucina, leucina ou valina; isoleucina substituída por leucina, valina ou metionina; leucina substituída por valina, isoleucina ou metionina; fenilalanina substituída por tirosina ou triptofano; tirosina substituída por triptofano, histidina ou fenilalanina; prolina substituída por treonina; alanina substituída por serina; lisina substituída por ácido glutâmico, glutamina ou arginina; valina substituída por metionina, isoleucina ou leucina; e triptofano substituído por fenilalanina ou tirosina. As substituições conservativas podem também se referir a substituições entre aminoácidos na mesma classe. As classes são conforme exposto a seguir: Grupo I (cadeias

44 / 177 laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe.

[00168] Duas sequências de aminoácidos têm “100% de identidade de sequência de aminoácidos” se os resíduos de aminoácidos das duas sequências de aminoácidos forem os mesmos quando alinhados para correspondência máxima. As comparações de sequências podem ser realizadas usando programas de software padrão, tais como aqueles incluídos em LASERGENE bioinformatics computing suite, que é produzido por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Outros métodos para comparar duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos mediante a determinação do alinhamento ideal são bem conhecidos pelos versados na técnica. (Consultar, por exemplo, Peruski e Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” em Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing (2a edição, Academic Press, Inc. 1998).) Duas sequências de aminoácidos são consideradas como tendo “identidade de sequência substancial” se as duas sequências tiverem pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência uma em relação à outra.

[00169] A porcentagem de identidades de sequência é determinada com as sequências de anticorpo alinhadas ao máximo pela convenção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo em questão (por exemplo, todo o domínio variável de uma cadeia pesada ou leve) estiver sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência,

45 / 177 a porcentagem de identidade de sequência entre as regiões de anticorpo em questão e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido, tanto na região de anticorpo em questão como de referência, dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter para porcentagem.

[00170] As composições ou métodos “que compreendem” um ou mais elementos citados podem incluir outros elementos não especificamente citados. Por exemplo, uma composição que compreende anticorpo pode conter o anticorpo isoladamente ou em combinação com outros ingredientes.

[00171] A designação de uma faixa de valores inclui todos os números inteiros dentro ou que definem a faixa.

[00172] Em anticorpos ou outras proteínas descritas neste documento, a referência a resíduos de aminoácidos que correspondem àqueles especificados por SEQ ID NO inclui modificações pós-tradução de tais resíduos

[00173] O termo “anticorpo” denota proteínas de imunoglobulina produzidas pelo corpo em resposta à presença de um antígeno e que se ligam ao antígeno, bem como fragmentos de ligação a antígeno e variantes geneticamente modificadas dos mesmos. Daí, o termo “anticorpo” inclui, por exemplo, anticorpos monoclonais intactos (por exemplo, anticorpos produzidos usando tecnologia de hibridoma) e fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, tais como um F(ab’)2, um fragmento Fv, um diacorpo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento scFv ou um scFv-Fc. Geneticamente, os anticorpos intactos geneticamente modificados e fragmentos, tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fragmentos Fv de cadeia única, anticorpos de cadeia única, diacorpos, minicorpos, anticorpos lineares ou anticorpos híbridos multivalentes ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) e similares, também estão incluídos. Desta forma, o termo “anticorpo” é usado para incluir

46 / 177 expansivamente qualquer proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo e que é capaz de se ligar especificamente ao seu antígeno.

[00174] O termo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inclui um anticorpo “nu” ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que não está ligado (isto é, ligado de forma covalente ou não covalente) a um composto de mascaramento da invenção. O termo anticorpo também abrange um anticorpo “mascarado” ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que é ligado de forma covalente ou não covalente a um ou mais compostos de mascaramento, tais como, por exemplo, peptídeos de bobina em espiral, conforme descrito adicionalmente na presente invenção. O termo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inclui um anticorpo “conjugado” ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou um “conjugado de fármaco de anticorpo (ADC)”, em que um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é ligado de forma covalente ou não covalente a um agente farmacêutico, por exemplo, a um fármaco citostático ou citotóxico. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo nu ou fragmento de ligação a antígeno que é opcionalmente conjugado com um agente farmacêutico, por exemplo, com um fármaco citostático ou citotóxico. Em outras modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo mascarado ou fragmento de ligação a antígeno que é opcionalmente conjugado com um agente farmacêutico, por exemplo, com um fármaco citostático ou citotóxico.

[00175] O termo “anticorpos geneticamente modificados” se refere a um anticorpo em que a sequência de aminoácidos foi variada a partir daquela do anticorpo nativo ou parental. As variações possíveis são muitas e vão desde a alteração de apenas um ou alguns aminoácidos até o redesenho completo de, por exemplo, a região variável ou constante. As alterações na

47 / 177 região constante são, em geral, feitas para melhorar ou alterar características como, por exemplo, ligação de complemento e outras funções efetoras. Tipicamente, as alterações na região variável são feitas para melhorar as características de ligação a antígeno, melhorar a estabilidade da região variável e/ou reduzir o risco de imunogenicidade.

[00176] O termo “anticorpo quimérico” se refere a um anticorpo em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes num anticorpo derivado de uma espécie particular (por exemplo, ser humano) ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes num anticorpo derivado de uma outra espécie (por exemplo, camundongo) ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada.

[00177] Um “sítio de ligação a antígeno de um anticorpo” é aquela porção de um anticorpo que é suficiente para se ligar ao seu antígeno. O mínimo de tal região é tipicamente um domínio variável ou uma variante geneticamente modificada do mesmo. Os sítios de ligação de domínio único podem ser gerados a partir de anticorpos de camelídeos (consultar Muyldermans e Lauwereys, Mol. Recog. 12: 131-140, 1999; Nguyen et al., EMBO J. 19:921-930, 2000) ou de domínios VH de outras espécies para produzir anticorpos de domínio único (“dAbs,” consultar Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; patente US n° 6.248.516 a Winter et al). Comumente, um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo compreende tanto um domínio variável de cadeia pesada (VH) como um domínio variável de cadeia leve (VL) que se ligam a um epítopo comum. Dentro do contexto da presente invenção, um anticorpo pode incluir um ou mais componentes além de um sítio de ligação a antígeno, tal como, por exemplo, um segundo sítio de ligação a antígeno de um anticorpo (que pode se ligar a um epítopo igual ou

48 / 177 diferente ou a antígeno igual ou diferente), um ligante peptídico, uma região constante de imunoglobulina, uma dobradiça de imunoglobulina, uma hélice anfipática (consultar Pack e Pluckthun, Biochem. 31: 1579-1584, 1992), um ligante não peptídico, um oligonucleotídeo (consultar Chaudri et al, FEBS Letters 450:23-26, 1999), um fármaco citostático ou citotóxico e similares, e pode ser uma proteína monomérica ou multimérica. Os exemplos de moléculas que compreendem um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, Fv, Fv (scFv) de cadeia única, Fab, Fab’, F(ab’)2, F(ab)c, diacorpos, minicorpos, nanocorpos, fusões Fab-scFv, (scFv)4-IgG biespecífico e (scFv)2-Fab biespecífico. (Consultar, por exemplo, Hu et al, Cancer Res. 56:3055-3061, 1996; Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1312, 1996; Carter e Merchant, Curr. Op. Biotechnol. 8:449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; e Lu et al., J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002.)

[00178] O termo “imunoglobina” se refere a uma proteína consistindo num ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por gene (ou genes) de imunoglobina. Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de anticorpos nativos (isto é, naturais ou parentais) em vertebrados. Esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, sendo que cada par tem uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada (VL e VH) são, juntas, principalmente responsáveis pela ligação a um antígeno, e as regiões constantes são principalmente responsáveis pelas funções efetoras do anticorpo. Cinco classes de proteína de imunoglobulina (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE) foram identificadas em vertebrados superiores. IgG compreende a classe principal, e normalmente existe como a segunda proteína mais abundante encontrada no plasma. Em seres humanos, IgG consiste em quatro subclasses, designadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada cadeia pesada de imunoglobulina possui uma região constante consistindo em domínios de

49 / 177 proteína da região constante (CH1, dobradiça, CH2, e CH3; IgG3 também contém um domínio CH4) que são essencialmente invariáves para uma determinada subclasse numa espécie.

[00179] As sequências de DNA que codificam cadeias de imunoglobulinas humanas e não humanas são conhecidas na técnica. (Consultar, por exemplo, Ellison et al, DNA 1: 11-18, 1981; Ellison et al, Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nucl. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Amster et al., Nucl. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi e Kohler, Nature 314:330-334, 1985; Boss et al., Nucl. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwell et al., Nature 298:380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlin et al., J. Mol. Evol. 22: 195-208, 1985; Kindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18: 165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993; e n° de acesso GenBank J00228.) Para uma análise da estrutura e função de imunoglobulina consulte Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; e Padlan, Mol. Immunol. 31: 169- 217, 1994. O termo “imunoglobulina” é usado na presente invenção por seu significado comum, denotando um anticorpo intacto, as suas cadeias componentes ou fragmentos de cadeias, dependendo do contexto.

[00180] As “cadeias leves” de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 25 kDa ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável na terminação amino (que codifica cerca de 110 aminoácidos) e por uma região constante kappa ou lambda na terminação carboxila. As “cadeias pesadas” de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 50 kDa ou 446 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável (que codifica cerca de 116 aminoácidos) e um gene de região constante gama, mu, alfa, delta ou epsilon (que codifica cerca de 330 aminoácidos), sendo que o último define o isótipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE,

50 / 177 respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região “D” de cerca de 10 ou mais aminoácidos. (Consultar, em geral, Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2a edição, 1989), Capítulo 7).

[00181] Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (denominada também aqui como um “domínio variável de cadeia leve” (“domínio VL”) ou “domínio variável de cadeia pesada” (“domínio VH”), respectivamente) consiste em uma região “framework” interrompida por três “regiões de determinação de complementaridade” ou “CDRs”. As regiões estruturais servem para alinhar as CDRs para a ligação específica a um epítopo de um antígeno. Desta forma, o termo “CDR” se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis principalmente pela ligação ao antígeno. A partir da terminação amino à terminação carboxila, tanto os domínios VL como VH compreendem o seguinte framework (FR) e regiões CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[00182] A atribuição de aminoácidos a cada domínio de região variável é de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991). Kabat também fornece uma convenção de numeração amplamente usada (numeração de Kabat) em que os resíduos correspondentes entre regiões variáveis de cadeia pesada diferentes ou entre regiões variáveis de cadeia leve diferentes são atribuídos com o mesmo número. CDRs 1, 2 e 3 de um domínio VL também são denominadas no presente documento, respectivamente, como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. CDRs 1, 2 e 3 de um domínio VH também são denominadas no presente documento, respectivamente, como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3. Se assim for observado, a atribuição de CDR pode ser de acordo com IMGT® (Lefranc et

51 / 177 ai., Developmental & Comparative Immunology 27:55-77; 2003) em vez de Kabat.

[00183] A numeração da região constante de cadeia pesada é via o índice EU conforme apresentado em Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991).

[00184] Exceto onde o contexto dita o contrário, o termo “anticorpo monoclonal” não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridomas. O termo “anticorpo monoclonal” pode incluir um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucarionte, procarionte ou de fago. Em modalidades particulares, os anticorpos aqui descritos são anticorpos monoclonais.

[00185] O termo “domínio VH humanizado” ou “domínio VL humanizado” se refere a um domínio VH ou VL de imunoglobulina que compreende alguns ou todas as CDRs total ou substancialmente a partir de uma imunoglobulina de doador não humano (por exemplo, um camundongo ou rato) e sequências de framework de domínio variável total ou substancialmente a partir de sequências de imunoglobulina humanas. A imunoglobulina não humana que fornece as CDRs é chamada de “doadora” e a imunoglobulina humana que fornece o framework é chamada de “aceitadora”. Em alguns casos, os anticorpos humanizados irão reter alguns resíduos não humanos nas regiões de framework de domínio variável humanas para intensificar as características de ligação adequadas (por exemplo, mutações nos frameworks pode ser necessária para preservar a afinidade de ligação quando um anticorpo é humanizado).

[00186] Um “anticorpo humanizado” é um anticorpo que compreende um ou ambos dentre um domínio VH humanizado e um domínio VL humanizado. A região (ou regiões) constante de imunoglobulina não precisa estar presente, mas se estiver, são total ou substancialmente a partir de regiões

52 / 177 constantes de imunoglobulina humanas.

[00187] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado em que as CDRs de um anticorpo “doador” não humano são enxertados em sequências de anticorpo “aceitador” humano (consultar, por exemplo, Queen, US 5.530.101 e 5.585.089; Winter, US 5.225.539; Carter, US 6.407.213; Adair, US 5.859.205; e Foote, US 6.881.557). As sequências de anticorpo aceitador pode ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humano maduro, um compósito de tais sequências, uma sequência de consenso de sequências de anticorpo humano ou uma sequência de região de linhagem germinativa. As sequências aceitadoras humanas podem ser selecionadas para um grau alto de identidade de sequência nos frameworks de região variável com sequências doadoras para combinar formas canônicas entre as CDRs doadoras e aceitadoras entre outros critérios. Desta forma, um anticorpo humanizado é um anticorpo que tem CDRs total ou substancialmente a partir de um anticorpo doador e sequências de framework de região variável e regiões constantes, se presentes, total ou substancialmente a partir de sequências de anticorpo humano. De modo similar, uma cadeia pesada humanizada tem, tipicamente, todas as três CDR total ou substancialmente a partir de uma cadeia pesada de anticorpo doador, e uma sequência de framework de região variável de cadeia pesada e região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente a partir do framework de região variável de cadeia pesada humana e sequências de região constante. De modo similar, uma cadeia leve humanizada tem, tipicamente, todas as três CDR total ou substancialmente a partir de uma cadeia leve de anticorpo doador, e uma sequência de framework de região variável de cadeia leve e região constante de cadeia leve, se presente, substancialmente a partir do framework de região variável de cadeia leve humana e sequências de região constante. Uma CDR num anticorpo humanizado é substancialmente a partir de uma CDR correspondente num

53 / 177 anticorpo não humano quando pelo menos cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de resíduos correspondentes (conforme definido pela numeração de Kabat) ou em que cerca de 100% de resíduos correspondentes (conforme definido pela numeração de Kabat), são idênticos entre as respectivas CDRs. As sequências de framework de região variável de uma cadeia de anticorpos ou a região constante de uma cadeia de anticorpos são substancialmente a partir de uma sequência de framework de região variável humana ou região constante humana, respectivamente, quando pelo menos cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de resíduos correspondentes (conforme definido pela numeração de Kabat para a região variável e numeração EU para a região constante), ou cerca de 100% de resíduos correspondentes (conforme definido pela numeração de Kabat para a região variável e numeração EU para a região constante) são idênticos.

[00188] Embora os anticorpos humanizados muitas vezes incorporem todas as seis CDRs (de preferência, conforme definido por Kabat ou IMGT®) a partir de um anticorpo de camundongo, também podem ser feitos com menos que todas as seis CDRs (por exemplo, pelo menos 3, 4 ou 5) CDRs de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164: 1432- 1441, 2000).

[00189] Uma CDR num anticorpo humanizado é “substancialmente a

54 / 177 partir de” uma CDR correspondente num anticorpo não humano quando pelo menos 60%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de resíduos correspondente (conforme definido por Kabat (ou IMGT)) são idênticos entre as respectivas CDRs. Em variações particulares de um domínio VH ou VL humanizado em que as CDRs são substancialmente a partir de uma imunoglobulina não humana, as CDRs do domínio VH ou VL humanizado não têm mais do que seis (por exemplo, não mais que cinco, não mais que quatro, não mais que três, não mais que duas ou não mais que uma) substituições de aminoácidos (de preferência, substituições conservativas) em todas as três CDRs em relação às CDRs VH ou VL não humanas correspondentes. As sequências de framework de região variável de um domínio VH ou VL de anticorpo ou, se presente, uma sequência de uma região constante de imunoglobulina, são “substancialmente a partir de” uma sequência de framework VH ou VL humana ou região constante humana, respectivamente, quando pelo menos cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de resíduos correspondentes (conforme definido pela numeração de Kabat para a região variável e numeração EU para a região constante), ou cerca de 100% de resíduos correspondentes (conforme definido pela numeração de Kabat para a região variável e numeração EU para a região constante) são idênticos. Daí, todas as partes de um anticorpo humanizado, exceto as CDRs, são tipicamente total ou substancialmente a partir de partes correspondentes de sequências de imunoglobulina humana natural.

[00190] Os anticorpos são tipicamente fornecidos na forma isolada. Isto significa que um anticorpo é tipicamente pelo menos cerca de 50% em p/p puro de proteínas interferentes e outros contaminantes que surgem de sua

55 / 177 produção ou purificação, mas não exclui a possibilidade de que o anticorpo seja combinado com um excesso de carreador (ou carreadores) farmacêutico aceitável ou outro veículo destinado a facilitar o seu uso. Às vezes os anticorpos são pelo menos cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% em p/p puro de proteínas interferentes e contaminantes a partir de produção ou purificação. Os anticorpos, incluindo anticorpos isolados, podem ser conjugados a agentes citotóxicos e fornecidos como conjugados de fármaco de anticorpo e/ou mascarado, por exemplo, com bobinas em espiral associadas.

[00191] A ligação específica de um anticorpo ao seu antígeno alvo se refere tipicamente a uma afinidade de pelo menos cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108, cerca de 109 ou cerca de 1010 M-1. A ligação específica é maior de maneira detectável em magnitude e distinguível da ligação não específica que ocorre em pelo menos um alvo não específico. A ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre grupos funcionais particulares ou ajuste espacial particular (por exemplo, do tipo trava e chave), enquanto a ligação não específica é tipicamente o resultado de forças de van der Waals.

[00192] O termo “epítopo” se refere a um sítio de um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado por aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pelo enovelamento terciário de uma ou mais proteínas. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos mediante a exposição a agentes desnaturantes, por exemplo, solventes, enquanto os epítopos formados por enovelamento terciário são tipicamente perdidos mediante o tratamento com agentes desnaturantes, por exemplo, solventes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos cerca de 3 e mais geralmente pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7 ou cerca de 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo,

56 / 177 cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Consultar, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

[00193] Os anticorpos que reconhecem os mesmos epítopos ou epítopos sobrepostos podem ser identificados num imunoensaio simples que mostra a capacidade de um anticorpo para competir com a ligação de um outro anticorpo a um antígeno alvo. O epítopo de um anticorpo também pode ser definido por cristalografia de raios x do anticorpo ligado ao seu antígeno para identificar resíduos de contato.

[00194] Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo, se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro (desde que tais mutações não produzam uma alteração global na estrutura de antígeno). Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzam ou eliminem a ligação do outro anticorpo.

[00195] A competição entre anticorpos pode ser determinada por um ensaio no qual um anticorpo de teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (consultar, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50: 1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste inibir a ligação do anticorpo de referência.

[00196] Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o bloqueio estérico ocorra. Os anticorpos identificados por um ensaio de competição incluem também aqueles que indiretamente competem com um anticorpo de referência, causando uma alteração

57 / 177 conformacional na proteína alvo, evitando assim a ligação do anticorpo de referência a um epítopo diferente daquele ligado pelo anticorpo de teste.

[00197] Uma função efetora de anticorpo se refere a uma função contribuída por uma região Fc de uma Ig. Tais funções podem ser, por exemplo, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Tal função pode ser efetuada, por exemplo, por meio da ligação de uma região Fc a um receptor Fc numa célula imune com atividade fagocítica ou lítico ou por meio da ligação de uma região Fc a componentes do sistema de complemento. Tipicamente, o efeito (ou efeitos) mediado por células de ligação de Fc ou componentes de complemento resulta na inibição e/ou depleção da célula alvejada para CD47. As regiões Fc de anticorpos podem recrutar células que expressam receptor Fc (FcR) e justapor-las com células-alvo revestidas com anticorpo. As células que expressam FcR de superfície para IgG, incluindo FcȖRIII (CD16), FcȖRII (CD32) e FcȖRIII (CD64) podem atuar como células efetoras para a destruição de células revestidas com IgG. Tais células efetoras incluem monócitos, macrófagos, células natural killer (NK), neutrófilos e eosinófilos. A participação de FcȖR por IgG ativa ADCC ou ADCP. ADCC é mediada por células efetoras CD16+ através da secreção de proteases e proteínas de formação de poro de membrana, enquanto a fagocitose é mediada por células efetoras CD32+ e CD64+ (consultar Fundamental Immunology, 4aedição, Paul ed., Lippincott- Raven, N.Y., 1997, Capítulos 3, 17 e 30; Uchida et al., J. Exp. Med. 199:1659-69, 2004; Akewanlop et al., Cancer Res. 61:4061-65, 2001; Watanabe et al., Breast Cancer Res. Treat. 53: 199-207, 1999).

[00198] Além de ADCC e ADCP, as regiões Fc de anticorpos ligados a célula podem também ativar a via clássica do complemento para elicitar CDC. C1q do sistema de complemento se liga às regiões Fc de anticorpos quando são complexadas com antígenos. A ligação de C1q a anticorpos ligados à

58 / 177 célula pode iniciar uma cascata de eventos que envolvem a ativação proteolítica de C4 e C2 para gerar a C3 convertase. A clivagem de C3 a C3b pela C3 convertase permite a ativação de componentes de complemento terminal incluindo C5b, C6, C7, C8 e C9. Coletivamente, estas proteínas formam poros de complexo de ataque de membrana nas células revestidas com anticorpo. Estes poros interrompem a integridade da membrana celular, exterminando a célula alvo (consultar Immunobiology, 6a edição, Janeway et al, Garland Science, N. Y., 2005, Capítulo 2).

[00199] O termo “citotoxicidade celular dependente de anticorpo”ou “ADCC” se refere a um mecanismo para a indução de morte celular que depende da interação de células-alvo revestidas com anticorpo com células imunes que possuem atividade lítica (também denominadas como células efetoras). Tais células efetoras incluem células natural killer, monócitos/macrófagos e neutrófilos. As células efetoras se fixam a uma região Fc de Ig ligada a células-alvo via seus sítios de combinação de antígeno. A morte da célula alvo revestida com anticorpo ocorre como resultado da atividade das células efetoras. Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo IgG1 anti-CD47 da invenção medeia ADCC igual ou aumentada em relação a um anticorpo parental e/ou em relação a um anticorpo IgG3 anti-CD47.

[00200] O termo “fagocitose celular dependente de anticorpo”ou “ADCP” se refere ao processo pelo qual as células revestidas com anticorpo são internalizados, quer no todo ou em parte, por células imunes fagocíticas (por exemplo, por macrófagos, neutrófilos e/ou células dendríticas) que se ligam a uma região Fc de Ig. Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo IgG1 anti-CD47 da invenção medeia ADCP igual ou aumentada em relação a um anticorpo parental e/ou em relação a um anticorpo IgG3 anti- CD47.

[00201] O termo “citotoxicidade dependente de complemento” ou

59 / 177 “CDC” se refere a um mecanismo para induzir a morte celular em que uma região Fc de um anticorpo ligado a alvo ativa uma série de reações enzimáticas que culminam na formação de orifícios na membrana da célula alvo.

[00202] Tipicamente, os complexos de antígeno-anticorpo, tais como aqueles em células-alvo revestidas com anticorpo se ligam e ativam o componente de complemento C1q, que por sua vez ativa a cascata de complemento que leva à morte de célula alvo. A ativação do complemento também pode resultar na deposição de componentes de complemento na superfície de célula alvo que facilitam a ADCC por meio da ligação de receptores de complemento (por exemplo, CR3) em leucócitos.

[00203] Um “efeito citotóxico” se refere à depleção, eliminação e/ou extermínio de uma célula alvo. Um “agente citotóxico” se refere a um composto que tem um efeito citotóxico numa célula, mediando, assim, a depleção, eliminação e/ou extermínio de uma célula alvo. Em certas modalidades, um agente citotóxico é conjugado a um anticorpo ou administrado em combinação com um anticorpo. Os agentes citotóxicos adequados são descritos adicionalmente no presente documento.

[00204] Um “efeito citostático” se refere à inibição da proliferação celular. Um “agente citostático” se refere a um composto que tem um efeito citostático sobre uma célula, mediando assim a inibição de crescimento e/ou expansão de um tipo de célula específico e/ou subconjunto de células. Os agentes citostáticos adequados são descritos adicionalmente no presente documento.

[00205] Os termos “unidade de expressão” e “cassete de expressão” são usados de forma intercambiável neste documento e denotam um segmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de interesse e capaz de fornecer a expressão do segmento de ácido nucleico de uma célula hospedeira. Uma unidade de expressão tipicamente compreende um promotor

60 / 177 de transcrição, um quadro de leitura aberto que codifica o polipeptídeo de interesse e um terminador de transcrição, operacionalmente ligados. Além de um promotor transcrição e terminador, uma unidade de expressão ainda pode incluir outros segmentos de ácidos nucleicos tais como, por exemplo, um intensificador ou um sinal de poliadenilação.

[00206] O termo “vetor de expressão” se refere a uma molécula de ácido nucleico, linear ou circular, que compreende uma ou mais unidades de expressão. Além de uma ou mais unidades de expressão, um vetor de expressão também pode incluir segmentos adicionais de ácidos nucleicos tais como, por exemplo, uma ou mais origens de replicação ou um ou mais marcadores selecionáveis.

[00207] Vetores de expressão são geralmente derivados do plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos.

[00208] O termo “paciente” ou “indivíduo” inclui indivíduos humanos e outros indivíduos mamíferos, tais como primatas não humanos, coelhos, ratos, camundongos e similares e espécies transgênicas dos mesmos, que recebem tratamento profilático ou terapêutico. Em certas modalidades exemplificadoras, um indivíduo é um paciente humano que sofre de ou em risco de desenvolver câncer, por exemplo, um tumor sólido, que, opcionalmente, segrega uma ou mais proteases capazes de clivar um domínio de mascaramento (por exemplo, um domínio de mascaramento de bobina em espiral) de um anticorpo anti-CD47 aqui descrito.

[00209] O termo “quantidade eficaz”, no contexto de tratamento de um distúrbio que expressa CD47 por meio da administração de um anticorpo anti- CD47 conforme aqui descrito, se refere a uma quantidade de tal anticorpo que é suficiente para inibir a ocorrência ou melhorar um ou mais sintomas de um distúrbio relacionado a CD47 (por exemplo, um câncer que expressa CD47). Uma quantidade eficaz de um anticorpo é administrada num “regime eficaz”. O termo “regime eficaz” se refere a uma combinação de quantidade do

61 / 177 anticorpo a ser administrado e da frequência de dosagem adequada para realizar o tratamento profilático ou terapêutico do distúrbio (por exemplo, o tratamento profilático ou terapêutico de um câncer que expressa CD47).

[00210] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado ou aprovável por uma agência reguladora do Governo Federal ou um Estado ou listados na U.S. Pharmacopeia ou outra Farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em seres humanos. O termo “ingrediente farmaceuticamente compatível” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável com o qual um anticorpo anti-CD47 é formulado.

[00211] A frase “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a sais inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais exemplificadores incluem sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato,p- toluenossulfonato e pamoato (isto é, 1,1’-metileno̻bis- (2-hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode compreender ainda uma molécula adicional tal como, por exemplo, um íon acetato, um íon sucinato ou outro contraíon. Um contraíon pode ser qualquer porção química orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga sobre o composto parental. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais de um átomo carregado em sua estrutura. Os casos em que múltiplos átomos carregados fazem parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter múltiplos contraíons. Daí, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contraíons.

[00212] A menos que seja evidente de outro modo a partir do contexto, quando um valor é expresso como “cerca de” X ou “aproximadamente” X, o

62 / 177 valor declarado de X será entendido como sendo preciso a ±10%.

[00213] Os solvatos no contexto da invenção são aquelas formas dos compostos da invenção que formam um complexo no estado sólido ou líquido, através da coordenação com moléculas de solvente. Os hidratos são uma forma específica de solvatos, em que a coordenação ocorre com água. Em certas modalidades exemplificadoras, os solvatos no contexto da presente invenção são hidratos.

[00214] O termo “hemaglutinação” se refere ao processo pelo qual as hemácias são aglutinadas. A hemaglutinação é um efeito colateral indesejável conhecido de anticorpos anti-CD47 na técnica. Os anticorpos anti-CD47 humanizados da invenção opcionalmente medeiam a hemaglutinação reduzida em relação a um anticorpo anti-CD47 parental murino e/ou em relação a um ou mais anticorpos anti-CD47 conhecidos na técnica. II. ANTICORPOS ANTI-CD47 E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO A

ANTÍGENO

[00215] A presente invenção fornece a anticorpos isolados, recombinantes e/ou sintéticos anti-CD47 humanos, de primata, roedor, mamífero, quiméricos, humanizados e/ou enxertados em CDR e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, bem como composições e moléculas de ácidos nucleicos que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma porção de uma molécula de anticorpo anti-CD47. A presente invenção inclui ainda, porém sem limitação, métodos de fabricação e uso de tais ácidos nucleicos e anticorpos, incluindo composições de diagnóstico e terapêuticas, métodos e dispositivos. Em certas modalidades exemplificadoras, são fornecidos anticorpos IgG1 anti-CD47 humanizados. Em outras modalidades exemplificadoras, são fornecidos anticorpos IgG1 anti-CD47 humanizados mascarados. Em ainda outras modalidades exemplificadoras, são fornecidos anticorpos IgG1 anti-CD47 humanizados que compreendem uma ponta.

63 / 177

[00216] Em modalidades particulares da invenção, são fornecidos anticorpos anti-CD47 humanizados que têm uma ou mais dentre as seguintes atividades: 1) ligação a antígeno aumentada em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 2) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) intensificada em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 3) fagocitose intensificada (por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP)) em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 4) hemaglutinação (HA) de hemácias reduzida, em relação a um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo parental murino); 5) ligação a um epítopo CD47 tridimensional (isto é, não linear).

[00217] Os anticorpos anti-CD47 exemplificadores e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção incluem os seguintes pares de cadeia pesada / cadeia leve de anticorpo CD47: hB6H12.1 – hvH1 / hvK1; hB6H12.2 – hvH1 / hvK2; hB6H12.3 – hvH1 / hvK3; hB6H12.4 – hvH1 / hvK4; hB6H12.5 – hvH2 / hvK1; hB6H12.6 – hvH2 / hvK2; hB6H12.7 – hvH2 / hvK3; hB6H12.8 – hvH2 / hvK4; hB6H12.9 – hvH3 / hvK1; hB6H12.10 – hvH3 / hvK2; hB6H12.11 – hvH3 / hvK3; hB6H12.12 – hvH3 / hvK4; hB6H12.13 – hvH4 / hvK1; hB6H12.14 – hvH4 / hvK2; hB6H12.15 – hvH4 / hvK3; hB6H12.16 – hvH4 / hvK4; hB6H12.17 – hvH5 / hvK1; hB6H12.18 – hvH5 / hvK2; hB6H12.19 – hvH5 / hvK3; hB6H12.20 – hvH5 / hvK4; hB6H12.21 – hvH6 / hvK1; hB6H12.22 – hvH6 / hvK2; hB6H12.23 – hvH6 / hvK3; hB6H12.24 – hvH6 / hvK4; hB6H12.3 (mutante de desamidação) – hvH1 / hvK3 G91A; Ab47 – HV3-7/HJ4 / KV3D-11/KJ1; e mB6H12 – vH1 / vL. As sequências de região variável de cadeia pesada de anticorpo anti-CD47 exemplificadoras, regiões variáveis de cadeia leve, CDRs de cadeia pesada e CDRs de cadeia leve podem ser encontradas na Tabela 1 a Tabela 6. As sequências de aminoácidos para a cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo anti-CD47 humanizado exemplificador podem

64 / 177 ser encontradas na Tabela 7. TABELA 1. SEQUÊNCIAS VARIÁVEIS DE CADEIA PESADA DERIVADAS DO ANTICORPO B6H12 MURINO. CDRS DE KABAT ESTÃO SUBLINHADAS E CDRS DE IMGT ESTÃO EM NEGRITO. Variante Sequência mB6h12 vH EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATIT

SGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAM DYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 1) Ab47vH (HV3- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKGLEWVATIT 7/HJ4) SGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLAGNA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2) hvH1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKRLEWVATIT

SGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYFCARSLAGNA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3) hvH2 EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATIT

SGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAM DYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 4) hvH3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATIT

SGGTYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYFCARSLAGNA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5) hvH4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVATIT

SGGTYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLAGNA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6) hvH5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKGLEWVATIT

SGGTYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARSLAGNA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) hvH6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLVWVATIT

SGGTYTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLAGNA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) TABELA 2. SEQUÊNCIAS VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE DERIVADAS DO ANTICORPO B6H12 MURINO. CDRS DE KABAT ESTÃO SUBLINHADAS E CDRS DE IMGT ESTÃO EM NEGRITO. Variante Sequência mB6h12 vL DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQTISDYLHWYQQKSHESPRLLIKFASQS

ISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHGFPRTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 9) Ab47vL (KV3D- EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTISDYLHWYQQKPGQAPRLLIKFASQSI 11/KJ1) SGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHGFPRTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 10) hvK1 EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKFASQ SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAVYYCQNGHGFPRTFGQGTKLEIK( R) (SEQ ID NO: 11) hvK2 EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKFASQ SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHGFPRTFGQGTKLEIK( R) (SEQ ID NO: 12) hvK3 EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKFASQ SISGVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHGFPRTFGQGTKLEIK( R) (SEQ ID NO: 13) hvK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQTISNYLAWYQQKPGKVPKLLIKFAST LQSGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDVATYYCQNGHGFPRTFGQGTKLEIK( R) (SEQ ID NO: 14)

65 / 177 hvK3 (G91A) EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKFASQ

SISGVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYCQNAHGFPRTFGQGTKLEIK R (SEQ ID NO: 15) TABELA 3. SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS VARIANTES (KABAT). CDR Sequência hvH1 & hvH5 HCDR1 (Kabat) GYGMS (SEQ ID NO: 16) hvH1 HCDR2 (Kabat) TITSGGTYTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 17) hvH1- hvH6 HCDR3 (Kabat) SLAGNAMDY (SEQ ID NO: 18) hvH2 & hvH3 HCDR1 (Kabat) SYAMS (SEQ ID NO: 19) hvH2, hvH3, & hvH5 HCDR2 (Kabat) TITSGGTYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 20) hvH4 HCDR1 (Kabat) SYGMN (SEQ ID NO: 21) hvH4 HCDR2 (Kabat) TITSGGTYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 22) hvH6 HCDR1 (Kabat) SYGMH (SEQ ID NO: 23) hvH6 HCDR2 (Kabat) TITSGGTYTSYADSVKG (SEQ ID NO: 24) TABELA 4. SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS VARIANTES (IMGT). CDR Sequência hvH1 & hvH5 HCDR1 (IMGT) GFTFSGYG (SEQ ID NO: 25) hvH1-hvH3, hvH5-hvH6 HCDR2 (IMGT) ITSGGTYT (SEQ ID NO: 26) hvH1- hvH6 HCDR3 (IMGT) ARSLAGNAMDY (SEQ ID NO: 27) hvH2 & hvH3 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA (SEQ ID NO: 28) hvH4 & hvH6 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG (SEQ ID NO: 29) hvH4 HCDR2 (IMGT) ITSGGTYI (SEQ ID NO: 30) TABELA 5. SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS VARIANTES (KABAT). CDR Sequência hvK1-hvK3 LCDR1 (Kabat) RASQTISDYLH (SEQ ID NO: 31) hvK1-hvK3 LCDR2 (Kabat) FASQSIS (SEQ ID NO: 32) hvK1- hvK4 LCDR3 (Kabat) QNGHGFPRT (SEQ ID NO: 33) hvK4 LCDR1 (Kabat) RASQTISNYLA (SEQ ID NO: 34) hvK4 LCDR2 (Kabat) FASTLQS (SEQ ID NO: 35) hvK3 (G91A) LCDR3 (Kabat) QNAHGFPRT (SEQ ID NO: 36) TABELA 6. SEQUÊNCIAS DE CDR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS VARIANTES (IMGT). CDR Sequência hvK1-hvK3 LCDR1 (IMGT) QTISDY (SEQ ID NO: 37) hvK1-hvK4 LCDR2 (IMGT) FAS (SEQ ID NO: 38) hvK1- hvK4 LCDR3 (IMGT) QNGHGFPRT (SEQ ID NO: 39) hvK4 LCDR1 (IMGT) QTISNY (SEQ ID NO: 40) hvK3 (G91A) LCDR3 (IMGT) QNAHGFPRT (SEQ ID NO: 41) TABELA 7. SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA E LEVE COMPLETAS DE UM ANTICORPO ANTI-CD47 MASCARADO DE ACORDO COM UMA MODALIDADE PREFERENCIAL DA INVENÇÃO. AS

SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA E CADEIA LEVE ESTÃO EM TEXTO SIMPLES (SEQ ID NOS: 42 E 43, RESPECTIVAMENTE), AS

66 / 177

SEQUÊNCIAS DE MASCARAMENTO ESTÃO EM NEGRITO E AS SEQUÊNCIAS DE CLIVAGEM DE PROTEASE ESTÃO SUBLINHADAS. Cadeia de Sequência anticorpo

QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSGEVQLLES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKRLEWVATITSGGTYTYYP DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTLVT

VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF Cadeia PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC pesada PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK (SEQ ID NO: 42) Sequência de mascaramen QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGS (SEQ ID NO: 94) to de cadeia pesada

QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSGEIVMTQSP

DFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKFASQSISGVPSRFSGS Cadeia leve GSGSDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHGFPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD

EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 43) Sequência de mascaramen QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGS (SEQ ID NO: 95) to de cadeia leve hB6H12.1

[00218] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 3 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR

67 / 177 que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 3 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 11. hB6H12.2

[00219] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 3 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 3 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 12. hB6H12.3

[00220] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 3 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo

68 / 177 anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 3 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 13. hB6H12.4

[00221] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 3 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo,

69 / 177 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 3 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 14. hB6H12.5

[00222] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 4 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 4 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 11. hB6H12.6

[00223] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 4 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs

70 / 177 de cadeia leve das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 4 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 12. hB6H12.7

[00224] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 4 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com

71 / 177 a SEQ ID NO: 4 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 13. hB6H12.8

[00225] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 4 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 4 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 14. hB6H12.9

[00226] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 5 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das

72 / 177 SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 5 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 11. hB6H12.10

[00227] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 5 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 5 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de

73 / 177 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 12. hB6H12.11

[00228] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 5 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 5 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 13. hB6H12.12

[00229] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 5 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 19, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47

74 / 177 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 28, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 5 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 14. hB6H12.13

[00230] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 6 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 21, 22, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 30 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 6 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,

75 / 177 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 11. hB6H12.14

[00231] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 6 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 21, 22, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 30 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 6 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 12. hB6H12.15

[00232] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 6 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 21, 22, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia

76 / 177 pesada das SEQ ID NOs: 29, 30 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 6 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 13. hB6H12.16

[00233] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 6 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 21, 22 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 30 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 6 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 14.

77 / 177 hB6H12.17

[00234] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 7 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 20, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 7 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 11. hB6H12.18

[00235] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 7 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 20, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID

78 / 177 NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 7 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 12. hB6H12.19

[00236] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 7 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 20, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 7 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 13. hB6H12.20

79 / 177

[00237] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 7 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 20 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 7 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 14. hB6H12.21

[00238] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 8 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 23, 24, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou

80 / 177 fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 8 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 11. hB6H12.22

[00239] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 8 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 23, 24, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 8 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 12. hB6H12.23

[00240] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti-

81 / 177 CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 8 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 23, 24, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 8 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 13. hB6H12.24

[00241] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 8 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 23, 24, e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35, e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 29, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR /

82 / 177 LCVR SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 8 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 14. hB6H12.3 G91a

[00242] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 3 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 15. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 34, 35 e 36;. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 40, 38 e 41. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 15. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 3 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 15. Ab47

83 / 177

[00243] Em certas modalidades exemplificadoras, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 2 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 10. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 10. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 2 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 10. mB6H12

[00244] Em certas modalidades exemplificativas, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de uma HCVR apresentada como SEQ ID NO: 1 e/ou CDRs de uma LCVR apresentada como SEQ ID NO: 9. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 31, 32 e 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 25, 26 e 27 e/ou CDRs de cadeia leve das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou

84 / 177 fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende o par HCVR / LCVR SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 9. Em outras modalidades, um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma HCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 1 e/ou compreende uma LCVR que tem pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) com a SEQ ID NO: 9.

[00245] Os anticorpos anti-CD47 e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser expressos numa forma modificada. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, aminoácidos particularmente carregados, pode ser adicionada à terminação N de um anticorpo anti-CD47 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante o armazenamento e manipulação subsequente. Além disso, porções químicas de peptídeo podem ser adicionadas a um anticorpo anti-CD47 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final de uma molécula de anticorpo ou pelo menos um fragmento da mesma. Tais métodos são descritos em muitos manuais laboratoriais padrão, tais como Sambrook, supra; Ausubel, et al., ed., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001).

[00246] Os anticorpos anti-CD47 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos aqui descritos tipicamente se ligam a CD47 com uma constante de ligação de equilíbrio ̰ 1 ȝM, por exemplo, ̰100 nM, de preferência, ̰10 nM, e mais preferencialmente ̰ 1 nM, conforme medido usando ensaios de ligação padrão, por exemplo, o ensaio de ligação à base de Biacore.

[00247] As moléculas de anticorpo da presente invenção podem ser

85 / 177 caracterizadas em relação a um anticorpo anti-CD47 de referência, por exemplo, B6H12, 2D3, MABL, CC2C6 ou BRIC126. O anticorpo B6H12 é descrito, por exemplo, na patente US n° 5.057.604 e 9.017.675, e está disponível comercialmente junto à Abcam, PLC, Santa Cruz Biotechnology, Inc., e eBioscience, Inc.

VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[00248] Os anticorpos anti-CD47 e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128; Wright e Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe e Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180), e a interação intramolecular entre porções da glicoproteínaa que pode afetar a conformação e superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Jefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner (1996) Current Op. Biotech. 7:409-416). Os oligossacarídeos podem também servir para alvejar uma determinada glicoproteína para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específico. Por exemplo, foi relatado que em IgG agalactosilada, a porção química de oligossacarídeo “vira” para fora do espaço inter-CH2 e os resíduos de acetilglucosamina N-terminal se tornam disponíveis para se ligarem à proteína de ligação manose (Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1:237-243). A remoção por glicopeptidase dos oligossacarídeos a partir de CAMPATH-1H (um anticorpo IgG1 monoclonal murino humanizado recombinante que reconhece o antígeno CDw52 de linfócitos humanos) produzidos em ovário de hamster chinês (CHO) resultou numa redução completa em lise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318), enquanto a remoção seletiva de resíduos de ácido siálico usando neuraminidase não resultou em perda de DMCL. A glicosilação de anticorpos foi relatado também como afetando a

86 / 177 citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em particular, as células CHO com expressão regulada por tetraciclina de Į(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma formação de catalisação de glicosiltransferase de GlcNAc de bisecção, foram relatadas como tendo atividade de ADCC melhorada (Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17:176- 180).

[00249] A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N se refere à ligação da porção química de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina- X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para fixação enzimática da porção química de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas num polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação de ligação a O se refere à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.

[00250] As variantes de glicosilação de anticorpos são variantes nas quais o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Por alteração se entende deletar uma ou mais porções químicas de carboidrato encontradas no anticorpo, adição de uma ou mais porções químicas de carboidrato ao anticorpo, alteração da composição de glicosilação (padrão de glicosilação), a extensão de glicosilação, etc.

[00251] A adição de sítios de glicosilação a um anticorpo anti-CD47 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode ser realizada mediante a alteração da sequência de aminoácidos de modo que contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descrita acima (para sítios de glicosilação ligada a N). A alteração também pode ser por meio da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original

87 / 177 (para sítios de glicosilação ligada a O). De modo similar, a remoção de sítios de glicosilação pode ser realizada por meio da alteração de aminoácido dentro dos sítios de glicosilação nativa do anticorpo.

[00252] A sequência de aminoácidos é normalmente alterada mediante a alteração da sequência de ácidos nucleicos subjacente. Estes métodos incluem o isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeos (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese por cassete de uma variante anterior preparada ou uma versão não variante do anticorpo.

[00253] A glicosilação (incluindo o padrão de glicosilação) de anticorpos pode também ser alterada sem alterar a sequência de aminoácidos ou a sequência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação depende grandemente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Uma vez que o tipo de célula usado para expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como agentes terapêuticos potenciais é raramente a célula nativa, variações significativas no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas. Consultar, por exemplo, Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070. Além da escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, a formulação de meios, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação obtido num organismo hospedeiro particular, incluindo a introdução ou superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (patente US n° 5047335; 5510261; 5278299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, pode ser enzimaticamente removida da glicoproteína, por exemplo usando endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente modificada, por exemplo, se tornar defeituosa no

88 / 177 processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estas e técnicas similares são bem conhecidas na técnica.

[00254] A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser prontamente analisada através de técnicas convencionais de análise de carboidratos, incluindo cromatografia de lectina, RMN, espectrometria de massa, HPLC, GPC, análise de composição de monossacarídeo, digestão enzimática sequencial, e HPAEC-PAD, que usa cromatografia de troca aniônica de pH alto para separar oligossacarídeos com base em carga. Os métodos para liberar oligossacarídeos para fins analíticos também são conhecidos, e incluem, sem limitação, o tratamento enzimático (comumente realizado usando peptídeo-N-glicosidase F/endo-ȕ-galactosidase), eliminação usando ambiente alcalino rigoroso para liberar principalmente estruturas ligadas a O e métodos químicos que usam hidrazina anidra para liberar oligossacarídeos tanto ligados a N como a O.

[00255] Uma forma preferencial de modificação de glicosilação de anticorpos é fucosilação de núcleo reduzida. “Fucosilação de núcleo” se refere à adição de fucose (“fucosilação”) a N-acetilglucosamina (“GlcNAc”) no terminal de redução de um glicano ligado a N.

[00256] Uma “cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo” é tipicamente ligada à asparagina 297 (de acordo com o número de Kabat). Conforme aqui usado, a cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo tem uma cadeia de açúcar compósita biantenária, principalmente que tem a seguinte estrutura:

89 / 177 em que +/- indica a molécula de açúcar que pode estar presente ou ausente, e os números indicam a posição de ligações entre as moléculas de açúcar. Na estrutura acima, o terminal de cadeia de açúcar que se liga à asparagina é chamado de um terminal redutor (à direita), e o lado oposto é chamado de um terminal não redutor. A fucose é normalmente ligada a N- acetilglucosamina (“GlcNAc”) do terminal redutor, tipicamente por uma ligação Į1,6 (a posição 6 de GlcNAc é ligada à posição 1 de fucose). “Gal” se refere a galactose e “Man” se refere a manose.

[00257] Uma “cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo” inclui 1) um tipo complexo, em que o lado do terminal não redutor da estrutura de núcleo tem uma ou mais ramificações de galactose-N-acetilglucosamina (também denominada como “gal-GlcNAc”) e o lado do terminal não redutor de Gal-GlcNAc tem opcionalmente um ácido siálico, que bissecta N- acetilglucosamina ou similares; ou 2) um tipo híbrido, em que o lado do terminal não redutor da estrutura de núcleo tem ambas as ramificações de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo com alto teor de manose e cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo.

[00258] Em algumas modalidades, a “cadeia de açúcar ligada a N- glicosídeo complexo” inclui um tipo complexo, em que o lado do terminal não redutor da estrutura de núcleo tem zero, uma ou mais ramificações de galactose-N-acetilglucosamina (também denominada como “gal-GlcNAc”) e o lado do terminal não redutor de Gal-GlcNAc tem opcional e adicionalmente uma estrutura tal como um ácido siálico, que bissecta N-acetilglucosamina ou similares.

[00259] De acordo com os presentes métodos, tipicamente apenas uma pequena quantidade de fucose é incorporada na cadeia (ou cadeias) de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo de anticorpos humanizados ou quiméricos. Por exemplo, em diversas modalidades, menos que cerca de 60%, menos que cerca de 50%, menos que cerca de 40%, menos que cerca de 30%, menos que

90 / 177 cerca de 20%, menos que cerca de 15%, menos que cerca de 10%, menos que cerca de 5% ou menos que cerca de 3% das moléculas de um anticorpo têm uma fucosilação de núcleo por fucose. Em algumas modalidades, cerca de 2% das moléculas do anticorpo têm fucosilação de núcleo por fucose.

[00260] Em certas modalidades, apenas uma quantidade menor de um análogo de fucose (ou um metabólito ou produto do análogo de fucose) é incorporada na cadeia (ou cadeias) de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo. Por exemplo, em diversas modalidades, menos que cerca de 60%, menos que cerca de 50%, menos que cerca de 40%, menos que cerca de 30%, menos que cerca de 20%, menos que cerca de 15%, menos que cerca de 10%, menos que cerca de 5% ou menos que cerca de 3% de anticorpos humanizados ou quiméricos têm fucosilação de núcleo por um análogo de fucose ou um metabólito ou produto do análogo de fucose. Em algumas modalidades, cerca de 2% de anticorpos humanizados ou quiméricos têm fucosilação de núcleo por um análogo de fucose ou um metabólito ou produto do análogo de fucose.

[00261] Os métodos para fabricar anticorpos não fucosilados mediante a incubação de células de produção de anticorpo com um análogo de fucose são descritos, por exemplo, no documento n° WO2009/135181. Resumidamente, as células que foram geneticamente manipuladas para expressar anticorpos humanizados ou quiméricos são incubadas na presença de um análogo de fucose ou um metabólito intracelular ou produto do análogo de fucose. Um metabólito intracelular pode ser, por exemplo, um análogo modificado com GDP ou um análogo total ou parcialmente desesterificado. Um produto pode ser, por exemplo, um análogo total ou parcialmente desesterificado. Em algumas modalidades, um análogo de fucose pode inibir uma enzima (ou enzimas) na via de salvamento de fucose. Por exemplo, um análogo de fucose (ou um metabólito intracelular ou produto do análogo de fucose) pode inibir a atividade de fucoquinase, ou GDP-fucose- pirofosforilase. Em algumas modalidades, um análogo de fucose (ou um

91 / 177 metabólito intracelular ou produto do análogo de fucose) inibe fucosiltransferase (de preferência, uma 1,6-fucosiltransferase, por exemplo, a proteína FUT8). Em algumas modalidades, um análogo de fucose (ou um metabólito intracelular ou produto do análogo de fucose) pode inibir a atividade de uma enzima na via de síntese de novo para fucose. Por exemplo, um análogo de fucose (ou um metabólito intracelular ou produto do análogo de fucose) pode inibir a atividade de GDP-manose 4,6-desidratase e/ou GDP- fucose sintetase. Em algumas modalidades, o análogo de fucose (ou um metabólito intracelular ou produto do análogo de fucose) pode inibir um transportador de fucose (por exemplo, transportador de GDP-fucose).

[00262] Numa modalidade, o análogo de fucose é 2-flurofucose. Os métodos de uso de análogos de fucose em meio de crescimento e outros análogos de fucose são divulgados, por exemplo, no documento n° WO/2009/135181, que está aqui incorporado por referência.

[00263] Outros métodos para manipular geneticamente linhagens de células para reduzir a fucosilação de núcleo incluíram os knockouts de gene, knockins de gene e interferência de RNA (RNAi). Em knockouts de gene, o gene que codifica FUT8 (enzima alfa 1,6-fucosiltransferase) é inativado. FUT8 catalisa a transferência de um resíduo de fucosila a partir de GDP- fucose para a posição 6 de GlcNac ligada a Asn (ligada a N) de um N-glicano. FUT8 é relatado como sendo a única enzima responsável pela adição de fucose ao carboidrato biantenário ligado a N em Asn297. Os knockins de gene adicionam genes que codificam enzimas tais como GnTIII ou uma alfa manosidase II de Golgi. Um aumento nos níveis de tais enzimas em células desvia anticorpos monoclonais da via de fucosilação (levando à diminuição da fucosilação de núcleo), e com quantidade aumentada de N-acetilglucosaminas de bissecção. RNAi tipicamente também alveja expressão de gene FUT8, levando a níveis de transcrição de mRNA diminuídos ou ao knockout da expressão de gene totalmente. Qualquer um destes métodos pode ser usado

92 / 177 para gerar uma linhagem de células que seria capaz de produzir um anticorpo não fucosilado, por exemplo, um anticorpo humanizado ou quimérico.

[00264] Muitos métodos estão disponíveis para determinar a quantidade de fucosilação num anticorpo. Os métodos incluem, por exemplo, LC-MS via cromatografia PLRP-S e ionização por eletrospray de quadrupolo TOF MS.

AGENTES DE MASCARAMENTO DE BOBINA EM ESPIRAL

[00265] Em certas modalidades da invenção, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo está associado com a um agente de mascaramento de bobina em espiral (também denominado como um “domínio de mascaramento de bobina em espiral” ou um “domínio de mascaramento”) que impede a ligação do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo a CD47. Em várias modalidades, um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo associado a um domínio de mascaramento é denominado como um “anticorpo mascarado”.

[00266] Uma bobina em espiral é um motivo estrutural em proteínas e peptídeos em que duas ou mais hélices alfa enrolam em torno de si para formar uma super-hélice. Pode existir duas, três ou quatro hélices em feixe de bobina em espiral e as hélices podem se estender na direção igual (paralela) ou opostas (anti-paralela).

[00267] As bobinas em espiral compreendem, tipicamente, elementos de sequência de três e quatro resíduos cujo padrão de hidrofobicidade e composição de resíduo são compatíveis com a estrutura das hélices alfa anfipáticas. Os três e quatro elementos de sequência de resíduos alternados constituem repetições hepta em que os aminoácidos são designados com ‘a’, ‘b’, ‘c’, ‘d’, ‘e’, ‘f’ e ‘g’. Os resíduos nas posições ‘a’ e ‘d’ são geralmente hidrofóbicos e formam um padrão de zigue-zague de botões e orifícios que intertravam com um padrão similar em outro filamento para formar um

93 / 177 núcleo hidrofóbico de ajuste apertado. Dos resíduos restantes, ‘b’, ‘c’ e ‘f’ tendem a ser carregados. Portanto, a formação de uma repetição hepta depende das propriedades físicas de hidrofobicidade e carga que são necessárias numa posição particular, não sobre um aminoácido específico. Em certas modalidades exemplificadoras, as bobinas em espiral da presente invenção são formadas a partir de dois peptídeos de formação de bobina em espiral.

[00268] Os exemplos de fórmulas de consenso para repetições hepta em peptídeos de formação de bobina em espiral são fornecidos pelo documento n° W02011034605, aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00269] As fórmulas de consenso exemplificadoras de acordo com certas modalidades são apresentadas a seguir: Fórmula 1: (X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7)n, em que: X1 é um aminoácido hidrofóbico ou asparagina; X2, X3 e X6 são qualquer aminoácido; X4 é um aminoácido hidrofóbico; X5 e X7 são, cada um, um resíduo de aminoácido carregado; e n é um número inteiro positivo.

[00270] Formula 2: (X1’, X2’, X3’, X4’, X5, X6, X7)n, em que: X1’ é um aminoácido hidrofóbico ou asparagina; X2’, X’3 e X’6 são, cada um, qualquer resíduo de aminoácido; X4’ é aminoácido hidrofóbico; X5’ e X7’ são, cada um, um resíduo de aminoácido carregado; em que n na fórmula 1 e 2 é maior ou igual a 2; e n é um número inteiro positivo.

[00271] Em certas modalidades em que os peptídeos de Fórmula 1 e Fórmula 2 formam uma bobina em espiral, X5 de Fórmula 1 é oposto em carga a X’7 de Fórmula 2, e X7 da Fórmula 1 é oposto em carga a X’5 de

94 / 177 Fórmula 2. As repetições hepta dentro de um peptídeo de formação de bobina em espiral podem ser iguais ou diferentes um do outro enquanto em conformidade com a Fórmula 1 e/ou 2.

[00272] As bobinas em espiral podem ser homodiméricas ou heterodiméricas. Os exemplos de peptídeos que podem formar bobina em espiral de acordo com certas modalidades exemplificadoras são mostrados na Tabela 8. As sequências de peptídeos podem ser usadas tal como é, ou seus componentes podem ser usados em outras combinações. Por exemplo, o peptídeo de formação de bobina em espiral Vel pode ser usado com outras sequências de ligante. As sequências mostradas para cadeias leves também podem ser usadas com cadeias pesadas e vice-versa.

[00273] Em certas modalidades exemplificadoras, é fornecido um anticorpo bivalente que compreende dois pares de cadeia leve e pesada, em que as terminações N de uma ou mais dentre as cadeias leves e/ou as cadeias pesadas estão ligadas via ligantes que compreendem um sítio de clivagem da protease a peptídeos de formação de bobina em espiral que se associam para formar uma bobina em espiral, reduzindo a afinidade de ligação do par de cadeias leve e pesada a um alvo. Opcionalmente, os peptídeos se associam sem a formação de uma ponte dissulfeto.

[00274] Opcionalmente, os dois pares de cadeia leve e pesada são iguais. Opcionalmente, os dois pares de cadeia leve e pesada são diferentes. Opcionalmente, as cadeias leves incluem uma região variável de cadeia leve e uma região constante da cadeia leve e as cadeias pesadas incluem uma região variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada. Opcionalmente, a região de cadeia pesada inclui regiões CH1, dobradiça, CH2 e CH3. Opcionalmente, as duas cadeias leves estão ligadas a um primeiro peptídeo heterólogo e as duas cadeias pesadas a um segundo peptídeo heterólogo.

[00275] Opcionalmente, o sítio de clivagem de protease é um sítio de

95 / 177 clivagem MMP1 ou MMP2.

[00276] Opcionalmente, o alvo é CD47.

[00277] Opcionalmente, a ligação a antígeno é reduzida 100 vezes por meio da presença de um agente de mascaramento (por exemplo, um agente de mascaramento de bobina em espiral). Opcionalmente, a ligação a antígeno é reduzida 200 a 1500 vezes por meio da presença de um agente de mascaramento (por exemplo, um agente de mascaramento de bobina em espiral). Opcionalmente, a citotoxidade do conjugado é reduzida pelo menos 100 vezes pela presença de um agente de mascaramento (por exemplo, um agente de mascaramento de bobina em espiral). Opcionalmente, a citotoxidade do conjugado é reduzida pelo menos 200 a 1500 vezes pela presença de um agente de mascaramento (por exemplo, um agente de mascaramento de bobina em espiral).

[00278] Opcionalmente, os peptídeos de formação de bobina em espiral estão ligados às terminações N das cadeias leves e pesadas na mesma orientação. Opcionalmente, os peptídeos de formação de bobina em espiral estão ligados às terminações N das cadeias pesadas e leves em orientações opostas. Opcionalmente, múltiplas cópias do peptídeo de formação de bobina em espiral estão ligados in tandem às terminações N das cadeias pesadas e leves.

[00279] Os peptídeos de formação de bobina em espiral exemplificadores, ligantes e sítios de protease de acordo com certas modalidades da invenção são mostrados na Figura 34.

[00280] De acordo com certas modalidades exemplificadoras, um peptídeo que compreende ou consiste na SEQ ID NO: 51 (Vel LC na Tabela 8) é usado para fornecer um ligante, incluindo um sítio de clivagem de protease e um peptídeo de formação de bobina em espiral ligado à terminação N da cadeia leve, e um peptídeo de sequência SEQ ID NO: 50 (Vel HC na Tabela 8) para fornecer um ligante, incluindo um sítio de clivagem de

96 / 177 protease e o peptídeo de formação de bobina em espiral ligado à terminação N da cadeia pesada, ou vice-versa. Os peptídeos que compreendem estas sequências podem ser ligados a qualquer um dos anticorpos aqui divulgados.

[00281] Em certas modalidades exemplificadoras, as substituições de aminoácidos num peptídeo variante que forma uma bobina em espiral são substituições conservadoras. Em outras modalidades exemplificadoras, um padrão de repetição hepta é retido num peptídeo variante de modo que um peptídeo de formação de bobina em espiral possa ser subdividido em segmentos hepta contíguos em conformidade com uma fórmula que categoriza aminoácidos que ocupam posições na fórmula por tipo de aminoácido, tal como na Fórmula 1 e/ou na Fórmula 2. Em certas modalidades, não existe mais de 1 ou 2 substituições por heptavalente de aminoácidos, e quaisquer tais substituições são conservadoras. Em outras modalidades, uma variante pode ter pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um peptídeo de formação de bobina em espiral aqui descrito e ser capaz de formar uma bobina em espiral.

[00282] Os peptídeos exemplificadores que formam bobinas em espiral são apresentados na Tabela 8A e Tabela 8B. TABELA 8A. SEQUÊNCIAS DE DOMÍNIO DE MASCARAMENTO DE ACORDO COM CERTAS MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS. AS SEQUÊNCIAS DE CLIVAGEM ESTÃO SUBLINHADAS. Peptídeo de Sequência mascaramento A2B1 HC GASTSVDELQAEVDQLQDENYALKTKVAQLRKKVEKLSEGGGGGPLGVRG GGGS (SEQ ID NO: 44) A2B1 LC GASTTVAQLRERVKTLRAQNYELESEVQRLREQVAQLASGGGGGPLGVRGG GGS (SEQ ID NO: 45) M11 HC LEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRARNRVSQYRTRYGGGGGPLGVRGG GGS (SEQ ID NO: 46) M11 LC LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRYGGGGGPLGVRGG GGS (SEQ ID NO: 47) M15 HC LEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGGGGGGPLGVRG GGGS (SEQ ID NO: 48)

97 / 177 M15 LC LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGGGGGGPLGVRG GGGS (SEQ ID NO: 49) Vel HC GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 50) Vel LC GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 51) Fos-Jun HC GALTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGGGGPLGVR GGGGS (SEQ ID NO: 52) Fos-Jun HC GARIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNYGGGGGPLG VRGGGGS (SEQ ID NO: 53) A4B4 HC GKIAALKQKIAALKYKNAALKKKIAALKQGGGGGPLGVRGGGGS (SEQ ID NO: 54) A4B4 LC GEIAALEQEIAALEKENAALEWEIAALEQGGGGGPLGVRGGGGS (SEQ ID NO: 55) TABELA 8B. SEQUÊNCIAS DE DOMÍNIO DE MASCARAMENTO DE ACORDO COM CERTAS MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS. AS SEQUÊNCIAS DE CLIVAGEM ESTÃO SUBLINHADAS. OS RESÍDUOS EAC ESTÃO INCLUÍDOS. Peptídeo de Sequência mascaramento CA2B1 HC EACGASTSVDELQAEVDQLQDENYALKTKVAQLRKKVEKLSEGGGGGPLG VRGGGGS (SEQ ID NO: 75) CA2B1 LC EACGASTTVAQLRERVKTLRAQNYELESEVQRLREQVAQLASGGGGGPLG VRGGGGS (SEQ ID NO: 76) CM11 HC EACLEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRARNRVSQYRTRYGGGGGPLG VRGGGGS (SEQ ID NO: 77) CM11 LC EACLEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRYGGGGGPLG VRGGGGS (SEQ ID NO: 78) CM15 HC EACLEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGGGGGGPL GVRGGGGS (SEQ ID NO: 79) CM15 LC EACLEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGGGGGGPLG VRGGGGS (SEQ ID NO: 80) CVel HC EACGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 81) CVel LC EACGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 82) CFos-Jun HC EACGALTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGGGGP LGVRGGGGS (SEQ ID NO: 83) CFos-Jun LC EACGARIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNYGGGG GPLGVRGGGGS (SEQ ID NO: 84) CA4B4 HC EACGKIAALKQKIAALKYKNAALKKKIAALKQGGGGGPLGVRGGGGS (SEQ ID NO: 85) CA4B4 LC EACGEIAALEQEIAALEKENAALEWEIAALEQGGGGGPLGVRGGGGS (SEQ ID NO: 86)

LIGANTES E SÍTIOS DE CLIVAGEM

[00283] Em certas modalidades da invenção, um ligante é usado para ligar um agente de mascaramento de bobina em espiral a um anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Os ligantes podem ser quaisquer segmentos de aminoácidos convencionalmente usados como ligante para unir domínios peptídicos. Os ligantes adequados podem variar em

98 / 177 comprimento, tal como a partir de 1 a 20, 2 a 15, 3 a 12, 4 a 10, 5, 6, 7, 8, 9 ou

10. Alguns tais ligantes incluem um segmento de poliglicina. Alguns tais ligantes incluem um ou mais resíduos de serina, muitas vezes em posições que flanqueiam os resíduos de glicina. Outros ligantes incluem um ou mais resíduos de alanina. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma ponte neutra entre componentes. A glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi que até alanina e é muito menos restrita do que resíduos com cadeias laterais mais longas (consultar Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Alguns ligantes exemplificadores estão na forma S(G)nS, em que n é de 5 a

20. Outros ligantes exemplificadores são (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n [(GSGGS) é a SEQ ID NO: 59) e (GGGS)n, [(GGGS) é a SEQ ID NO: 60), onde n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina e outros ligantes flexíveis conhecidos na técnica. Alguns exemplos de ligantes são Ser- (Gly)10-Ser (SEQ ID NO: 61), Gly-Gly- Ala-Ala (SEQ ID NO: 62), Gly-Gly- Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 63), Leu- Ala- Ala- Ala- Ala (SEQ ID NO: 64), Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 65), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 66), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 67), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 68), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 69), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 70) e similares.

[00284] O sítio de protease é, de preferência, reconhecido e clivado por uma protease expressa extracelularmente para que entre em contato com um anticorpo mascarado, liberando o anticorpo mascarado e permitindo que o mesmo entre em contato com seu alvo, tal como um domínio extracelular de receptor ou ligando solúvel. Vários sítios de metaloproteinase de matriz (MMP1-28) são adequados. As MMPs desempenham um papel em remodelação de tecidos e estão implicadas em processos neoplásicos, tais como a morfogênese, angiogênese e metástase. Alguns sítios de protease

99 / 177 exemplificadores são PLG-XXX (SEQ ID NO: 71), uma sequência endógena bem conhecida para MMPs, PLG-VR (SEQ ID NO: 72) (W02014193973) e IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) (Turk et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 661- 667), LSGRSDNY (SEQ ID NO: 74) (Cytomyx) e GPLGVR (SEQ ID NO: 57) (Chang et al., Clin. Cancer Res. 1 de janeiro de 2012; 18(1):238-47). Os exemplos adicionais de MMPs são fornecidos nos documentos n° US 2013/0309230, WO 2009/025846, WO 2010/081173, WO 2014/107599, WO 2015/048329, US 20160160263 e Ratnikov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111: E4148-E4155 (2014). TABELA 9. SEQUÊNCIAS DE CLIVAGEM DE PROTEASE. O SÍTIO DE CLIVAGEM DE MMP É INDICADO POR *, ENQUANTO OS SÍTIOS DE CLIVAGEM DE UPA/MATRIPTASE/LEGUMAINA SÃO INDICADOS POR **. Nome de sítio de clivagem Sequência M2 GPLG*VR** (SEQ ID NO: 57) IPV IPVS*LR**SG (SEQ ID NO: 58)

LIGAÇÃO DE AGENTES DE MASCARAMENTO DE BOBINA EM ESPIRAL A ANTICORPOS ANTI-CD47

[00285] Os peptídeos de formação de bobina em espiral estão ligados às terminações N de regiões variáveis de anticorpo via um ligante incluindo um sítio de protease. Um anticorpo típico inclui uma região variável de cadeia leve e pesada, em tal caso um peptídeo de formação de bobina em espiral é ligado às terminações N de cada. Um anticorpo bivalente tem dois sítios de ligação, os quais podem ou não ser iguais. Num anticorpo monoespecífico normal, os sítios de ligação são iguais e o anticorpo tem dois pares de cadeias leves e pesadas idênticas. Neste caso, cada cadeia pesada é ligada ao mesmo peptídeo de formação de bobina em espiral e cada cadeia leve ao mesmo peptídeo de formação de bobina em espiral (que pode ou não ser igual ao peptídeo ligado à cadeia pesada). Num anticorpo biespecífico, os sítios de ligação são diferentes e formados a partir de dos pares de cadeias pesadas e leves diferentes. Em tal caso, a região variável de cadeia pesada e leve de um

100 / 177 sítio de ligação são, respectivamente, ligadas a peptídeos de formação de bobina em espiral à medida que são as regiões variáveis de cadeia leve e pesada do outro sítio de ligação. Tipicamente ambas as regiões variáveis de cadeia pesada estão ligadas ao mesmo tipo de peptídeo de formação de bobina em espiral à medida que são ambas as regiões variáveis de cadeia leve.

[00286] Um peptídeo de formação de bobina em espiral pode ser ligado a uma região variável de anticorpo via um ligante que inclui um sítio de protease. Tipicamente, o mesmo ligante com o mesmo sítio de clivagem de protease é usado para ligar cada região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo a um peptídeo de bobina em espiral. O sítio de clivagem de protease deve ser aquele passível de clivagem por uma protease presente extracelularmente na patologia ou tecido alvo pretendido, tal como um câncer, de modo que a clivagem do ligante libere o anticorpo a partir da bobina em espiral que mascara sua atividade, permitindo que o anticorpo se ligue ao seu alvo pretendido, tal como um antígeno de superfície celular ou ligando solúvel.

[00287] Assim como as regiões variáveis, um anticorpo mascarado inclui, tipicamente, toda ou parte de uma região constante, o que pode incluir qualquer uma ou todas dentre uma região constante de cadeia leve, regiões CH1, dobradiça, CH2 e CH3. Conforme com outros anticorpos, um ou mais resíduos C-terminais podem ser proteoliticamente processados ou derivatizados.

[00288] As bobinas em espiral podem ser formadas a partir do mesmo peptídeo que forma um homodímero ou dois peptídeos diferentes que formam um heterodímero. Para a formação de um homodímero, as cadeias de anticorpo leves e pesadas são ligadas ao mesmo peptídeo de formação de bobina em espiral. Para a formação de um heterodímero, as cadeias de anticorpo leves e pesadas são ligadas a peptídeos de bobina em espiral diferentes. Para alguns pares de peptídeos de formação de bobina em espiral,

101 / 177 é preferencial que um do par seja ligado à cadeia pesada e outro à cadeia leve de um anticorpo, embora a orientação inversa também seja possível.

[00289] Cada cadeia de anticorpo pode ser ligada a um único peptídeo de formação de bobina em espiral ou múltiplos tais peptídeos em tandem (por exemplo, duas, três, quatro ou cinco cópias de um peptídeo). Neste último caso, os peptídeos de ligação em tandem são normalmente iguais. Também se ligação em tandem for empregada, as cadeias leves e pesadas são normalmente ligadas ao mesmo número de peptídeos.

[00290] A ligação de cadeias de anticorpo a peptídeos de formação de bobina em espiral pode reduzir a afinidade de ligação de um anticorpo em pelo menos cerca de 10 vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 100 vezes, cerca de 200 vezes, cerca de 500 vezes, cerca de 1000 vezes ou cerca de 1500 vezes em relação ao mesmo anticorpo sem tal ligação ou após a clivagem de tal ligação. Em algumas de tais anticorpos, a afinidade de ligação é reduzida entre cerca de 50 e 1500 vezes, entre cerca de 100 e 1500 vezes, entre cerca de 200 e 1500 vezes, entre cerca de 500 e 1500 vezes, entre cerca de 50 e 1000 vezes, entre cerca de 100 e 1000 vezes, entre cerca de 200 e 1000 vezes, entre cerca de 500 e 1000 vezes, entre cerca de 50 e 500 vezes ou entre cerca de 100 e 500 vezes. As funções efetoras do anticorpo, tais como ADCC, fagocitose e CDC ou citotoxicidade como um resultado da ligação a um fármaco num conjugado de fármaco de anticorpo podem ser reduzidas pelos mesmos fatores ou faixas. Após a clivagem proteolítica que serve para desmascarar um anticorpo ou de outro modo remover a máscara do anticorpo, o anticorpo restaurado tipicamente tem uma função efetora ou afinidade que está dentro de um fator de 2, 1,5 ou, de preferência, inalterada dentro do erro experimental em comparação com um anticorpo de controle de outro modo idêntico que nunca foi mascarado.

CONJUGADOS DE FÁRMACO DE ANTICORPO

[00291] Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD47 da invenção

102 / 177 podem ser combinados com os conjugados de fármaco de anticorpo (ADCs). Os ADCs particulares podem compreender agentes citotóxicos (por exemplo, agentes quimioterapêuticos), enzimas de conversão de fármaco, compostos ou isótopos radioativos, ou toxinas (sendo que estas porções químicas são coletivamente denominadas como um agente terapêutico). Por exemplo, um ADC pode ser conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, ou uma toxina (por exemplo, um agente citostático ou citocida, tal como, por exemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria). Os exemplos de classes úteis de agentes citotóxicos incluem, por exemplo, aglutinantes de sulco menor de DNA, agentes alquilantes de DNA e inibidores de tubulina. Os agentes citotóxicos exemplificadores incluem, por exemplo, auristatinas, camptotecinas, caliqueamicinas, duocarmicinas, etoposídeos, maitansinoides (por exemplo, DM1, DM2, DM3, DM4), taxanos, benzodiazepinas (por exemplo, pirrolo[1,4]benzodiazepinas, indolinobenzodiazepinas e oxazolidinobenzodiazepinas incluindo dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina, dímeros de indolinobenzodiazepina e dímeros de oxazolidinobenzodiazepina) e alcaloides de vinca.

[00292] Um ADC pode ser conjugado a uma enzima de conversão de pró-fármaco. A enzima de conversão de pró-fármaco pode ser recombinantemente fundida ao anticorpo ou quimicamente conjugada ao mesmo usando métodos conhecidos. As enzimas de conversão de pró-fármaco exemplificadoras são carboxipeptidase G2, beta-glucuronidase, penicilina-V- amidase, penicilina-G-amidase, ȕ- lactamase, ȕ-glucosidase, nitrorredutase e carboxipeptidase A.

[00293] As técnicas para conjugar agentes terapêuticos a proteínas e, em particular, a anticorpos, são bem conhecidas. (Consultar, por exemplo, Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14: 1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3): 154-169.) O agente terapêutico pode ser conjugado de

103 / 177 um modo que reduza sua atividade a menos que seja removido por clivagem do anticorpo (por exemplo, por hidrólise, por degradação proteolítica ou por um agente de clivagem). Em alguns aspectos, o agente terapêutico é fixado ao anticorpo com um ligante clivável que é sensível à clivagem no ambiente intracelular da célula de câncer que expressa CD47, mas não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, de modo que o conjugado seja clivado do anticorpo quando o mesmo é internalizado pela célula de câncer que expressa CD47 (por exemplo, no endossoma ou, por exemplo, em virtude da sensibilidade ao pH ou sensibilidade à protease, no ambiente do lisossoma ou no ambiente caveolear). Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode também ser fixado ao anticorpo com um ligante não clivável.

[00294] Em certas modalidades exemplificadoras, um ADC pode incluir uma região de ligante entre um agente citotóxico ou citostático e o anticorpo. Conforme notado supra, tipicamente, o ligante pode ser clivável sob condições intracelulares, de modo que a clivagem do ligante libere o agente terapêutico do anticorpo no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossoma ou caveolea). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma enzima protease ou peptidase intracelular, incluindo uma protease lisossômica ou endossômica. Os agentes de clivagem podem incluir as catepsinas B e D e plasmina (consultar, por exemplo., Dubowchik e Walker, Pharm. Therapeutics 83:67- 123, 1999). Mais típicos são os ligantes de peptidila que são cliváveis por enzimas que estão presentes nas células que expressam CD47. Por exemplo, pode ser usado um ligante de peptidila que é clivável pela protease dependente de tiol catepsina-B, que é altamente expressa em tecido canceroso (por exemplo, um ligante que compreende um peptídeo Phe-Leu ou Val-Cit).

[00295] Um ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o ligante sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, pode ser usado um ligante

104 / 177 ácido-lábil que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou similares). (Consultar, por exemplo, as Patentes US n° 5.122.368;.

5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999; Neville et al, Biol. Chem. 264: 14653-14661, 1989.) Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como aqueles no sangue, mas são instáveis em pH inferior a 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma.

[00296] Outros ligantes são cliváveis sob condições redutoras (por exemplo, um ligante de dissulfeto). Os ligantes de dissulfeto incluem aqueles que podem ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3 (2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3 (2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio) tolueno), SPDB e SMPT. (Consultar, por exemplo, Thorpe et al., Cancer Res. 47:5924-5931, 1987; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Consultar também a Patente US n° 4.880.935).

[00297] O ligante também pode ser um ligante de malonato (Johnson et al, Anticancer Res. 15: 1387- 93, 1995), um ligante de maleimidobenzoila (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3: 1299-1304, 1995) ou um ligante de 3’-N- amida (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3: 1305-12, 1995).

[00298] O ligante também pode ser um ligante não clivável, tal como um ligante de maleimido-alquileno ou maleimida-arila que está diretamente fixado ao agente terapêutico e é liberado por degradação proteolítica do anticorpo.

[00299] Tipicamente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, o que significa que não mais que cerca de 20%, tipicamente não mais que cerca de 15%, mais tipicamente não mais que cerca

105 / 177 de 10%, e ainda mais tipicamente não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 3% ou não mais que cerca de 1% dos ligantes numa amostra do ADC é clivado quando o ADC está presente num ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, incubando independentemente com plasma tanto (a) o ADC (a “amostra de ADC”) como (b) uma quantidade molar igual de anticorpo não conjugado ou agente terapêutico (a “amostra de controle”) durante um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e, então, comparando a quantidade de anticorpo não conjugado ou agente terapêutico presente na amostra de ADC com aquela presente na amostra de controle, conforme medido, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.

[00300] O ligante também pode promover a internalização celular. O ligante pode promover a internalização celular quando conjugado ao agente terapêutico (isto é, no meio da porção química de ligante-agente terapêutico do ADC ou derivado de ADC, conforme aqui descrito). Alternativamente, o ligante pode promover a internalização celular quando conjugado tanto ao agente terapêutico como ao anticorpo (isto é, no meio do ADC, conforme aqui descrito).

[00301] O anticorpo pode ser conjugado ao ligante via um heteroátomo do anticorpo. Estes heteroátomos podem estar presentes no anticorpo em seu estado natural ou podem ser introduzidos no anticorpo. Em alguns aspectos, o anticorpo será conjugado ao ligante via um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina. Em alguns aspectos, o anticorpo será conjugado a ligante via um átomo de enxofre de um resíduo de cisteína. Os métodos para conjugar ligante e ligante de fármacos a anticorpos são conhecidos na técnica.

[00302] Os conjugados de fármaco de anticorpo exemplificadores incluem conjugados de fármaco de anticorpo à base de auristatina, o que significa que o componente de fármaco é um fármaco de auristatina. As

106 / 177 auristatinas que se ligam à tubulina foram mostradas como interferindo com a dinâmica de microtúbulos e divisão nuclear e celular, e têm atividade anti- câncer. Tipicamente, o conjugado de fármaco de anticorpo à base de auristatina compreende um ligante entre o fármaco de auristatina e o anticorpo anti-CD47. O ligante pode ser, por exemplo, um ligante clivável (por exemplo, um ligante de peptidila) ou um ligante não clivável (por exemplo, ligante liberado por degradação do anticorpo). As auristatinas incluem MMAF e MMAE. A síntese e a estrutura de auristatinas exemplificadoras são descritas na Publicação US n° 7.659.241, 7.498.298, 2009-0111756, 2009-0018086 e 7.968.687, cada uma das quais está aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todos os fins.

[00303] Outros conjugados de fármaco de anticorpo exemplificadores incluem conjugados de fármaco de anticorpo de maitansinoide que significa que o componente de fármaco é um fármaco de maitansinoide, e conjugados de fármaco de anticorpo de benzodiazepina, o que significa que o componente de fármaco é uma benzodiazepina (por exemplo, dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina, dímeros de indolinobenzodiazepina e dímeros de oxazolidinobenzodiazepina).

[00304] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD47 da invenção pode ser combinado com um ADC com especificidade de ligação a um alvo diferente. Os ADCs exemplificadores que podem ser combinados com o anticorpo anti-CD47 incluem brentuximabe vedotina (ADC anti-CD30), enfortumabe vedotina (ADC anti-nectina-4), ladiratuzumabe vedotina (ADC anti-LIV-1), denintuzumabe mafodotina (ADC anti-CD19), glembatumumabe vedotina (ADC anti-GPNMB), ADC anti-TIM-1, polatuzumabe vedotina (ADC anti-CD79b), ADC anti-MUC16, depatuxizumabe mafodotina, telisotuzumabe vedotina, ADC anti-PSMA, ADC anti-C4.4a, ADC anti- BCMA, ADC anti-AXL, tisotuumabe vedotina (ADC anti-fator de tecido). Expressão de molécula de anticorpo

107 / 177

[00305] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser expressos numa célula hospedeira que contém DNA endógeno que codifica um anticorpo ou anticorpo mascarado da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito na Patente US n°

5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 e 5.733.761. Consultar também, por exemplo, Sambrook, et al., supra, e Ausubel, et al., supra. Aqueles versados na técnica têm conhecimento dos numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína da presente invenção. As células de mamíferos são ilustrativas de culturas de células úteis para a produção dos anticorpos, anticorpos mascarados, porções especificadas ou variantes dos mesmos. Os sistemas de células de mamífero serão muitas vezes na forma de monocamadas de células, embora as suspensões de células de mamífero ou biorreatores também possam ser usados. Várias linhagens de células hospedeiras capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas foram desenvolvidas na técnica e incluem as linhagens de células COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL- 10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células HeLa e similares, que estão prontamente disponíveis junto à, por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, VA. As células hospedeiras bacterianas e de levedura podem também ser usadas e são bem conhecidas pelo versados na técnica. Outras células úteis para a produção de ácidos nucleicos ou proteínas da presente invenção são conhecidas e/ou estão disponíveis, por exemplo, a partir do catálogo de linhagens de células e hibridomas da American Type Culture Collection ou outras fontes conhecidas ou comerciais.

[00306] Os vetores de expressão podem incluir uma ou mais das seguintes sequências de controle de expressão, tais como, porém sem limitação, uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, promotores

108 / 177 SV40 precoces ou tardios, o promotor de CMV (Patente n° 5.168.062;

5.385.839), um promotor de HSV tk, um promotor de PGK (fosfoglicerato quinase), um promotor de EF-1 alfa (Patente US n° 5.266.491), pelo menos um promotor de imunoglobulina humana; um intensificador e/ou sítios de informações de processamento, tais como sítios de ligação ao ribossoma, sítios de splicing de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição de SV40 T Ag poli A grande) e sequências de terminação da transcrição). Consultar, por exemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra.

[00307] Os vetores de expressão incluem opcionalmente pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem, por exemplo, porém sem limitação, metotrexato (MTX), di-hidrofolato redutase (DHFR, patente n° 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017), ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico ou glutamina sintetase (GS, patente n° 5.122.464; 5.770.359; e 5.827.739), a resistência para a cultura de células eucarióticas, e genes de resistência a tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias ou procariotas. Os meios de cultura e condições adequadas para as células hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica. Os vetores adequados ficarão prontamente evidentes para o versado na técnica. A introdução de construto de vetor numa célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídios catiônicos, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos estão descritos na técnica, tais como Sambrook, supra; Ausubel, supra.

[00308] A inserção de ácido nucleico deve ser operacionalmente ligada a um promotor adequado. Os construtos de expressão irão conter ainda sítios para iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossoma para tradução. A porção de codificação das transcrições

109 / 177 maduras expressas pelos construtos incluirão preferencialmente um códon de iniciação de translação no início e um códon de terminação (por exemplo, UAA, UGA e UAG) adequadamente posicionado na extremidade do mRNA a ser traduzido, com UAA e UAG preferencial para a expressão de célula eucariótica ou mamífera.

[00309] A inserção de ácido nucleico é opcionalmente em quadro com uma sequência de bobina em espiral e/ou uma sequência de clivagem de MMP, por exemplo, na terminação N de uma ou mais sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Alternativamente, uma sequência de bobina em espiral e/ou uma sequência de clivagem de MMP pode ser adicionada pós- tradução a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, por exemplo, via uma ligação de dissulfeto ou similares.

[00310] Quando as células hospedeiras eucarióticas são empregadas, as sequências de terminador de transcrição ou poliadenilação são tipicamente incorporadas no vetor. Um exemplo de uma sequência de terminador é a sequência de poliadenilação do gene de hormônio de crescimento bovino. As sequências para splicing preciso da transcrição também podem ser incluídas. Um exemplo de uma sequência de splicing é o íntron VP1 de SV40 (Sprague, et al. (1983) J. Virol. 45:773-781). Adicionalmente, as sequências de genes para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vector, como conhecido na técnica. Purificação e isolamento de anticorpo

[00311] Os anticorpos anti-CD47 ou anticorpos mascarados descritos no presente documento podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo, porém sem limitação, purificação de proteína A, sulfato de amônio ou precipitação de etanol, extração ácida, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxiapatita,

110 / 177 cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser empregada para a purificação. Consultar, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y., (1997-2001).

[00312] Os anticorpos e anticorpos mascarados descritos no presente documento podem incluir produtos purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, células de levedura, planta superior, inseto e mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado num procedimento de produção recombinante, o anticorpo ou anticorpo mascarado da presente invenção pode ser glicosilado ou pode ser não glicosilado, com glicosilado sendo preferencial. Tais métodos são descritos em muitos manuais laboratoriais padrão, tais como Sambrook, supra; Ausubel, supra, Colligan, Protein Science, supra.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO

[00313] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção pode estar na forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma, ou na forma de DNA, incluindo, porém sem limitação, cDNA e DNA genômico obtido por meio de clonagem ou produzido sinteticamente, ou quaisquer combinações dos mesmos. O DNA pode ser de fita tripla, fita dupla ou fita simples ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos uma fita do DNA ou RNA pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita senso, ou pode ser uma fita de não codificação, também denominada como fita antissenso.

[00314] As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico que compreendem um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, porém sem limitação, pelo menos uma porção especificada de pelo menos uma CDR, como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de pelo menos uma cadeia pesada

111 / 177 ou cadeia leve; moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de codificação para um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado, ou uma região variável de anticorpo mascarado ou anticorpo anti-CD47; e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeos substancialmente diferente daquelas descritas acima, mas que, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam pelo menos um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado, conforme aqui descrito e/ou conforme conhecido na técnica. Dado que o código genético é bem conhecido na técnica, é de rotina para um versado na técnica gerar tais variantes degeneradas de ácidos nucleicos que codificam anticorpos anti-CD47 ou anticorpos mascarados específicos da presente invenção.

[00315] Conforme indicado no presente documento, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico que codifica uma molécula de anticorpo anti-CD47 podem incluir, porém sem limitação, aquelas que codificam a sequência de aminoácidos de um fragmento de anticorpo, por si própria; a sequência de codificação para todo o anticorpo ou uma porção do mesmo; a sequência de codificação para um anticorpo, fragmento ou porção, bem como sequências adicionais, tais como um ou ambos de um agente de mascaramento (por exemplo, um agente de mascaramento de bobina em espiral) e/ou uma sequência de clivagem de MMP, ou tal como a sequência de codificação de pelo menos um líder de sinal ou peptídeo de fusão, com ou sem as sequências de codificação adicionais acima mencionadas, tais como pelo menos um íntron, juntamente com sequências de não codificação adicionais incluindo, porém sem limitação, sequências 5 ‘e 3’ de não codificação, tais como as sequências transcritas não traduzidas que desempenham um papel na transcrição, processamento de mRNA incluindo sinais de splicing e poliadenilação (por exemplo, ligação ao ribossoma e estabilidade de mRNA); uma sequência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, tais como aqueles

112 / 177 que fornecem funcionalidades adicionais. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um anticorpo pode ser fundida a uma sequência marcadora, tal como uma sequência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do anticorpo fundido que compreende uma porção ou fragmento de anticorpo.

CONSTRUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

[00316] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser produzidos usando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação ou combinações dos mesmos, conforme bem conhecido na técnica. Os ácidos nucleicos podem compreender convenientemente sequências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem que compreende um ou mais sítios de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleido. Além disso, as sequências traduziveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleido traduzido da presente invenção. Por exemplo, uma sequência marcadora de hexa-histidina fornece um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucleico da presente invenção, excluindo a sequência de codificação, é opcionalmente um vetor, adaptador ou ligante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. As sequências adicionais podem ser adicionadas a tais sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo ou para melhorar a introdução do polinucleotídeo numa célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores e ligantes é bem conhecido na técnica. (Consultar, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra.)

[00317] As composições de ácido nucleico isoladas desta invenção, tais como RNA, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas usando inúmeras metodologias

113 / 177 de clonagem conhecidas por versados na técnica. Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeo que hibridam seletivamente, sob condições rigorosas, com os polinucleotídeos da presente invenção são usadas para identificar a sequência desejada numa biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA, e a construção de bibliotecas genômicas e de cDNA, é bem conhecido por aqueles versados na técnica. (Consultar, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra). III. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

[00318] A invenção fornece métodos para tratar distúrbios associados a células que expressam CD47, por exemplo, cânceres. As células podem ou não expressar níveis elevados de CD47 em relação a células que não estão associadas a um distúrbio de interesse. Como um resultado, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo, por exemplo, um indivíduo com um câncer, usando os anticorpos anti-CD47 ou anticorpos mascarados descrito aqui. O método compreende administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado ou uma composição que compreende um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado a um indivíduo que necessita do mesmo.

[00319] Conforme usado no presente documento, os termos “indivíduo” e “paciente” se referem a organismos a serem tratados pelos métodos da presente invenção. Tais organismos incluem, de preferência, porém sem limitação, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, suínos, caninos, felinos e similares), e mais preferencialmente, inclui seres humanos. Conforme usado no presente documento, os termos “tratar”, “tratamento” e “tratando” incluem qualquer efeito, por exemplo, diminuir, reduzir, modular, melhorar ou eliminar, que resulta na melhoria da condição, doença, distúrbio e similares, ou melhorar um sintoma da mesma, tal como, por exemplo, número reduzido de células de câncer, tamanho de tumor reduzido, taxa reduzida de infiltração de células de câncer em órgãos

114 / 177 periféricos, ou taxa reduzida de metástase tumoral ou crescimento do tumor.

[00320] Os efeitos terapêuticos positivos em câncer podem ser medidos de várias maneiras (Consultar, W. A. Weber, J. Null. Med. 50:1S- 10S (2009); Eisenhauer et al., supra). Em algumas modalidades preferenciais, a resposta a um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado é avaliada usando critérios RECIST 1.1. Em algumas modalidades, o tratamento obtido por uma quantidade terapeuticamente eficaz é qualquer um dentre uma resposta parcial (PR), uma resposta completa (CR), sobrevivência livre de progressão (SLP), sobrevivência livre de doença (DFS), resposta objetiva (OR) ou sobrevivência global (OS). O regime de dosagem de uma terapia descrita no presente documento que é eficaz para tratar um paciente de câncer hepático primário ou secundário pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade e peso do paciente, e a capacidade da terapia para elicitar uma resposta anti-câncer no indivíduo. Embora numa modalidade do método de tratamento os medicamentos e usos da presente invenção possam não ser eficazes na obtenção de um efeito terapêutico positivo em cada indivíduo, o mesmo deve ser feito num número estatisticamente significativo de indivíduos, conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica tal como o teste t de Student, o teste chi2, o teste U, de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere- Terpstra e o teste de Wilcoxon.

[00321] “Critérios de resposta RECIST 1.1”, conforme usado no presente documento, significa as definições apresentadas em Eisenhauer et al., E. A. et al., Eur. J Cancer 45:228-247 (2009) para lesões-alvo ou lesões não- alvo, conforme adequado, com base no contexto em que a resposta está sendo medida.

[00322] “Tumor”, à medida que se aplica a um indivíduo diagnosticado com, ou com suspeita de ter, um câncer hepático primário ou secundário, se refere a uma neoplasia maligna ou potencialmente maligna ou massa de

115 / 177 tecido de qualquer tamanho. Um tumor sólido é um crescimento anormal ou massa de tecido que normalmente não contém cistos ou áreas líquidas. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados pelo tipo de células que formam os mesmos. Os exemplos de tumores sólidos são sarcomas, carcinomas e linfomas. As leucemias (cânceres do sangue) geralmente não formam tumores sólidos (Instituto Nacional do Câncer, dicionário de termos de câncer). Os sarcomas exemplificadores não limitantes incluem o sarcoma de tecido mole e osteosarcoma.

[00323] “A carga tumoral” também denominada como “carga de tumor”, se refere à quantidade total de material tumoral distribuído por todo o corpo. A carga tumoral se refere ao número total de células de câncer ou ao tamanho total de tumor (ou tumores) por todo o corpo, incluindo os gânglios linfáticos e medula óssea. A carga de tumor pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, mediante a medição das dimensões de tumor (ou tumores) após a remoção do indivíduo, por exemplo, usando calibres, ou enquanto no corpo usando técnicas de imagem, por exemplo, ultrassom, varredura óssea, varreduras por tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (IRM).

[00324] O termo “tamanho de tumor” se refere ao tamanho total do tumor que pode ser medido como o comprimento e largura de um tumor. O tamanho de tumor pode ser determinado por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, mediante a medição das dimensões de tumor (ou tumores) após a remoção do indivíduo, por exemplo, usando calibres, ou enquanto no corpo usando técnicas de imagem, por exemplo, varredura óssea, ultrassom, varreduras por TC ou IRM.

[00325] Conforme usado no presente documento, o termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de um composto (por exemplo, um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada numa

116 / 177 ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada a uma via de administração ou formulação particular. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de componente ativo se situa na faixa de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por exemplo, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg. A dosagem administrada pode variar dependendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente particular e o seu modo e via de administração; a idade, saúde e peso do receptor; o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, a natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento concorrente, frequência de tratamento, e o efeito desejado. A dosagem inicial pode ser aumentada além do nível superior a fim de rapidamente alcançar o nível de tecido ou nível de sangue desejado. Alternativamente, a dosagem inicial pode ser menor que o ideal e a dosagem diária pode ser progressivamente aumentada durante o curso do tratamento. A dosagem humana pode ser otimizada, por exemplo, num estudo de escalonamento de dose de Fase I convencional projetado para ser executado a partir de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A frequência de dosagem pode variar dependendo de fatores tais como via de administração, a quantidade de dosagem, meia-vida sérica do anticorpo, e a doença a ser tratada. As frequências de dosagem exemplificadoras são uma vez por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. A formulação de fármacos à base de anticorpo monoclonal está dentro da habilidade comum na técnica. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal é liofilizado e, então, reconstruído em solução salina tamponada, no momento da administração.

[00326] Em certas modalidades exemplificadoras, a presente invenção fornece um método para tratar câncer numa célula, tecido, órgão, animal ou paciente. Em modalidades particulares, a presente invenção fornece um método para tratar um câncer sólido num ser humano. Os cânceres exemplificadores são aqueles que possuem expressão de CD47 numa célula

117 / 177 que tem o câncer (isto é, “cânceres que expressam CD47”). Os exemplos de cânceres incluem, porém sem limitação, tumores sólidos, tumores de tecidos moles, tumores hematopoiéticos que dão origem a tumores sólidos e lesões metastáticas. Os exemplos de tumores hematopoiéticos que têm o potencial de dar origem a tumores sólidos incluem, porém sem limitação, linfomas de células B grandes difusos (DLBCL), linfoma folicular, síndrome mielodisplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma não Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, síndrome de Richter (transformação de Richter) e similares. Os exemplos de tumores sólidos incluem, porém sem limitação, malignidades, por exemplo, sarcomas (incluindo sarcoma de tecido mole e osteosarcoma), adenocarcinomas e carcinomas, dos vários sistemas de órgãos, tais como aqueles que afetam a cabeça e pescoço (incluindo faringe), tiroide, pulmão (carcinoma de pulmão de células pequenas ou células não pequenas (NSCLC)), mama, linfoide, trato gastrointestinal (por exemplo, oral, esofágico, estômago, fígado, pâncreas, intestino delgado, cólon e reto, canal anal), órgãos genitais e trato genito-urinário (por exemplo, renal, urotelial, bexiga, ovário, uterino, cervical, endométrio, próstata, testicular), sistema nervoso central (por exemplo, células neurais ou gliais, por exemplo, neuroblastoma ou glioma), pele (por exemplo, melanoma) e similares. Em certas modalidades, o tumor sólido é um teratoma positivo para receptor de NMDA. Em outras modalidades, o câncer é selecionado a partir de câncer de mama, câncer de cólon, câncer pancreático (por exemplo, tumores neuroendócrinos pancreáticos (PNET) ou um adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC)), câncer de estômago, câncer de útero e câncer de ovário.

[00327] Em certas modalidades, o câncer é selecionado a partir de, porém sem limitação, leucemias, tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia de células pilosas (HCL),

118 / 177 leucemia prolinfocítica de células T (T-PLL), leucemia linfocítica granular grande, leucemia de célula T de adulto e leucemia monocítica aguda (AMoL).

[00328] Numa modalidade, o câncer é um tumor sólido que está associada a ascite. A ascite é um sintoma de muitos tipos de câncer e pode também ser causada por uma série de condições, tais como doença hepática avançada. Os tipos de câncer que são propensos a causar ascite incluem, porém sem limitação, câncer da mama, pulmão, intestino grosso (cólon), estômago, pâncreas, ovário, útero (endométrio), peritôneo e similares. Em algumas modalidades, o tumor sólido associado a ascite é selecionado a partir de câncer de mama, câncer de cólon, câncer pancreático, estômago, câncer uterino e câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer está associado a derrames pleurais, por exemplo, câncer de pulmão.

[00329] Os cânceres hematológicos adicionais que dão origem a tumores sólidos incluem, porém sem limitação, linfoma não Hodgkin (por exemplo, linfoma de células B grandes difuso, linfoma de células do manto, linfoma linfoblástico B, linfoma de células T periférico e linfoma de Burkitt), linfoma linfoblástico B; leucemia linfocítica crônica de células B/linfoma linfocítico pequeno; linfoma linfoplasmacítico; linfoma de células B de zona marginal esplênico (± linfócitos vilosos); plasmacitoma/mieloma de células plasmáticas; linfoma de células B de zona marginal extranodal do tipo MALT; linfoma de células B de zona marginal nodal (± células B monocitoides); linfoma folicular; linfomas de células B grandes difusos; linfoma de Burkitt; linfoma linfoblástico T precursor; linfoma de células T de adulto (positivo para HTLV 1); linfoma de células T/NK extranodal, tipo nasal; linfoma de células T tipo enteropatia; linfoma de células T Ȗ-į hepatoesplênico; linfoma de células T semelhante à paniculite subcutânea; síndrome de sezary/micose fungoide; linfoma anaplásico de células grandes, células T/nulas, tipo cutâneo primário; linfoma anaplásico de células grandes, células T/nulas, tipo sistémico primário; linfoma de células T periférico, e não

119 / 177 de outro modo caracterizada; angioimunoblástica T-célula linfoma, mieloma múltiplo, policitemia vera ou mielofibrose, cutânea T-célula linfoma, linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de zona marginal, linfoma do SNC, linfoma de células grandes imunoblástico, linforma linfoblástico B precursor e similares.

[00330] Em modalidades particulares, o câncer é sarcoma, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer gástrico, melanoma e/ou câncer de mama.

[00331] Os anticorpos anti-CD47 e anticorpos mascarados, conforme descrito no presente documento, também podem ser usados para tratar distúrbios associados ao câncer, por exemplo, encefalopatia induzida por câncer.

[00332] Os métodos e composições da invenção podem ser usados em combinação com outros agentes terapêuticos e/ou modalidades. O termo administrado “em combinação”, conforme usado no presente documento, é entendido como significando que dois (ou mais) tratamentos diferentes são distribuídos para o indivíduo durante o curso da aflição do indivíduo com o distúrbio, de modo que os efeitos dos tratamentos sobre o paciente sobreponham num ponto no tempo. Em certas modalidades, a distribuição de um tratamento ainda está ocorrendo quando começa a distribuição do segundo, para que haja sobreposição em termos de administração. Isto é às vezes denominado neste documento como distribuição “simultânea” ou “concorrente”. Em outras modalidades, a distribuição de um tratamento termina antes de começar a distribuição do outro tratamento. Em algumas modalidades de ambos os casos, o tratamento é mais eficaz devido à administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, um efeito equivalente é visto com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz os sintomas a uma extensão maior, do que seria visto se o segundo tratamento fosse administrado na ausência do

120 / 177 primeiro tratamento, ou a situação análoga é vista com o primeiro tratamento. Em algumas modalidades, a distribuição é de modo que a redução de um sintoma, ou outro parâmetro relacionado ao distúrbio seja maior do que o que seria observado com um tratamento distribuído na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou maior do que aditivo (isto é, uma resposta sinérgica). A distribuição pode ser de modo que o efeito do primeiro tratamento distribuído seja ainda detectável quando o segundo é distribuído.

[00333] Numa modalidade, os métodos da invenção incluem administrar ao indivíduo um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado conforme descrito no presente documento, por exemplo, uma composição ou preparação, em combinação com uma ou mais terapias adicionais, por exemplo, cirurgia, radioterapia ou administração de uma outra preparação terapêutica. Numa modalidade, a terapia adicional pode incluir quimioterapia, por exemplo, um agente citotóxico. Numa modalidade adicional, a terapia pode incluir uma terapia alvejada, por exemplo, um inibidor de tirosina quinase, um inibidor de proteassoma ou um inibidor de protease. Numa modalidade, a terapia adicional pode incluir um composto anti-inflamatório, anti-angiogênico, anti-fibrótico ou anti-proliferativo, por exemplo, um esteroide, um imunomodulador biológico, tal como um inibidor de uma molécula imune de ponto de verificação, um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, um aptâmero, um siRNA, uma molécula antissenso, uma proteína de fusão, uma citocina, um receptor de citocina, um broncodilatador, uma estatina, um agente anti-inflamatório (por exemplo, metotrexato) ou um NSAID. Noutra modalidade, a terapia adicional pode incluir agentes terapêuticos de combinação de classes diferentes. A preparação de anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado e a terapia adicional podem ser administradas de maneira simultânea ou sequencial.

[00334] Uma “molécula de ponto de verificação imunológico”,

121 / 177 conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula no sistema imunológico que tanto apresenta um sinal (uma molécula estimuladora) ou recusa um sinal (um inibidor de molécula). Muitos cânceres evadem o sistema imunológico mediante a inibição da sinalização de células T.

[00335] As moléculas de ponto de verificação imunológico exemplificadoras incluem, porém sem limitação, a proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante de morte programada 1 (PD-L1), PD-L2, proteína associada a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4), imunoglobulina de células T e domínio de mucina que contém 3 (TIM-3), gene de ativação de linfócito 3 (LAG-3), molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM-1), CEACAM-5, supressor de Ig de domínio V de ativação de células T (VISTA), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunorreceptor de células T com domínios Ig e ITIM (TIGIT), receptor semelhante à imunoglobulina associado a leucócitos 1 (LAIR1), CD160, TGFR, receptor de adenosina 2A (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), B7-H4 (também chamado VTCN1), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), 2B4, receptor semelhante à imunoglobulina de células assassinas (KIR) e similares.

[00336] Um “inibidor de ponto de verificação imunológico”, conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula (por exemplo, uma molécula pequena, um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, etc.) que inibem e/ou bloqueiam uma ou mais moléculas de ponto de verificação inibitórias.

[00337] Os inibidores de ponto de verificação imunológico exemplificadores incluem, porém sem limitação, os seguintes anticorpos monoclonais: inibidores de PD-1 como pembrolizumabe (Keytruda, Merck) e nivolumabe (Opdivo, Bristol-Myers Squibb); inibidores de PD-L1 como atezolizumabe (Tecentriq, Genentech), avelumabe (Bavencio, Pfizer), durvalumabe (Imfinzi, AstraZeneca); e inibidores de CTLA-1 como

122 / 177 ipilimumab (Yervoy, Bristol-Myers Squibb).

[00338] Os agentes citotóxicos exemplificadores incluem agentes anti- microtúbulos, inibidores da topoisomerase, antimetabólitos, inibidores da síntese e degradação de proteínas, inibidores mitóticos, agentes alquilantes, agentes de platinação, inibidores da síntese de ácidos nucleicos, inibidores da histona desacetilase (inibidores de HDAC, por exemplo, vorinostat (SAHA, MK0683), entinostat (MS-275), panobinostat (LBH589), tricostatina A (TSA), mocetinostat (MGCD0103), belinostat (PXD101), romidepsina (FK228, depsipeptídeo)), inibidores de metiltransferase de DNA, mostardas de nitrogênio, nitrosoureinas, etileniminas, sulfonatos de alquila, triazenos, análogos de folato, análogos de nucleosídeos, inibidores de ribonucleotídeo redutase, alcaloides de vinca, taxanos, epotilonas, agentes intercalantes, agentes capazes de interferir com uma via de transdução de sinal, agentes que promovem apoptose e radiação ou conjugados de moléculas de anticorpo que ligam proteínas de superfície para distribuir um agente tóxico. Numa modalidade, o agente citotóxico que pode ser administrado com uma preparação descrita no presente documento é um agente à base de platina (tal como cisplatina), ciclofosfamida, dacarbazina, metotrexato, fluorouracila, gemcitabina, capecitabina, hidroxiureia, topotecano, irinotecano, azacitidina, vorinostat, ixabepilona, bortezomibe, taxanos (por exemplo, paclitaxel ou docetaxel), citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, colchicina, antraciclinas (por exemplo, doxorubicina ou epirubicina) daunorubicina, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, adriamicina, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, ricina ou maitansinoides.

[00339] Os métodos e composições da invenção podem ser usados no tratamento de indivíduos com câncer positivo para CD47. Numa modalidade,

123 / 177 o câncer positivo para CD47 expressa uma ou mais metaloproteinases de matriz (MMPs). MMPs exemplificadoras incluem, porém sem limitação, MMP1 a MMP28. As MMPs particularmente exemplificadoras incluem MMP2 e MMP9. Numa modalidade, o câncer positivo para CD47 é um tumor em que os macrófagos de infiltração estão presentes.

[00340] Os métodos e composições da invenção podem ser usados no tratamento de indivíduos com um câncer positivo para CD47 que expressa uma ou mais MMPs e contém macrófagos de infiltração.

[00341] Os métodos para determinar a presença de cânceres positivos para CD47, a expressão de MMP e a presença de macrófagos de infiltração de tumor são conhecidos na técnica.

[00342] A avaliação de cânceres positivos para CD47 num indivíduo pode ser determinada por métodos convencionais que incluem imuno- histoquímica (IHC), Western blot, citometria de fluxo ou métodos de sequenciamento de RNA. IHC, Western blot e citometria de fluxo podem ser analisados com qualquer anticorpo anti-CD47 conhecido na técnica, bem como os anticorpos anti-CD47 divulgados no presente documento.

[00343] A avaliação da infiltração de macrófagos nos tecidos pode ser conduzida por meio do monitoramento acerca de marcadores de superfície de macrófagos, incluindo F4/80 para macrófagos de camundongo ou CD163, CD68, CD11b ou por métodos convencionais que incluem imuno- histoquímica (IHC), Western blot, citometria de fluxo ou métodos de sequenciamento de RNA.

[00344] A avaliação de proteases em tecidos pode ser monitorada usando uma variedade de técnicas, incluindo tanto aquelas que monitoram a atividade de protease, bem como aquelas que podem detectar a atividade proteolítica. Os métodos convencionais que podem detectar a presença de proteases num tecido, o que poderia incluir as formas tanto ativas como inativas da protease, incluem IHC, sequenciamento de RNA, Western blot ou

124 / 177 métodos à base de ELISA. Podem ser usadas técnicas adicionais para detectar a atividade de protease em tecidos, o que inclui zimografia, em zimografia in situ por microscopia de fluorescência ou o uso de substratos proteolíticos fluorescentes. Além disso, o uso de substratos proteolíticos fluorescentes pode ser combinado com imuno-captura de proteases específicas. Adicionalmente, os anticorpos dirigidos contra o sítio ativo de uma protease podem ser usados por uma variedade de técnicas, incluindo IHC, microscopia de fluorescência, Western blot, ELISA ou citometria de fluxo (consultar, Sela-Passwell et al. Nature Medicine. 18:143-147. 2012; LeBeau et al. Cancer Research. 75:1225-

1235. 2015; Sun et al. Biochemistry. 42:892-900. 2003; Shiryaev et al. 2:e80.

2013.)

[00345] Ao longo da descrição, onde composições e kits são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos ou onde os processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é considerado que, adicionalmente, existem composições e kits da presente invenção consistindo essencialmente em, ou consistem, nos componentes citados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção consistindom essencialmente, ou consistem, nas etapas de método e processamento citadas. IV. FORMULAÇÕES E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00346] Para uso terapêutico, um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado é, de preferência, combinado com um carreador farmaceuticamente aceitável. Conforme usado no presente documento, “carreador farmaceuticamente aceitável” significa tampões, carreadores e excipientes adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão de risco/benefício razoável. O carreador (ou carreadores) deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes das formulações e não deletério ao

125 / 177 recipiente. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes de retardamento de absorção e isotônicos e similares, que são compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

[00347] Adequadamente, as composições de anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado da presente invenção podem compreender pelo menos um dentre quaisquer excipientes adequados, tais como, porém sem limitação, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservantes, adjuvantes ou similares. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são preferenciais. Os exemplos não limitantes de, e métodos de preparação de tais soluções estéreis são bem conhecidos na técnica, tais como, porém se limitação, aqueles descritos em Gennaro, Ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edição, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.)

1990. Podem ser rotineiramente selecionados carreadores farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para o modo de administração, solubilidade e/ou estabilidade da composição de variante, fragmento ou molécula de anticorpo bem conhecida na técnica ou conforme aqui descrito.

[00348] Os excipientes farmacêuticos e aditivos úteis na presente composição incluem, porém sem limitação proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra-, e oligossacarídeos; açúcares derivatizados tais como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e similares; e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, compreendendo isoladamente ou em combinação 1 a 99,99% em peso ou volume. Os excipientes de proteína exemplificadores incluem albumina sérica tal como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e similares. Os componentes de molécula de anticorpo/aminoácido representativos que também podem

126 / 177 funcionar numa capacidade tamponante, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e similares.

[00349] Os excipientes de carboidrato adequados para o uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-mannose, sorbose e similares; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e similares; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e similares; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e similares. Os excipientes de carboidrato preferenciais para uso na presente invenção são manitol, trealose e rafinose.

[00350] As composições de molécula de anticorpo podem também incluir um tampão ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de uma base ou ácido orgânico. Os tampões representativos incluem sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, u ácido ftálico; Tampões Tris, de cloridrato de trometamina ou fosfato.

[00351] Adicionalmente, as composições de molécula de anticorpo da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos tais como polivinilpirrolidonas, ficolls (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil-ȕ-ciclodextrina), polietilenoglicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes anti-estáticos, tensoativos (por exemplo, polissorbatos, tais como “TWEEN 20” e “TWEEN 80”), lipídios (por exemplo, fosfolipídios, ácidos graxos), esteroides (por exemplo, colesterol) e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).

[00352] Estes e outros aditivos e/ou excipientes farmacêuticos conhecidos adequados para o uso nas composições de moléculas de anticorpo

127 / 177 de acordo com a invenção são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme listado em “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19a edição, Williams & Williams, (1995), e no “Physician’s Desk Reference”, 52a edição, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998). Os materiais de excipiente ou carreador preferencial são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos.

[00353] A presente invenção fornece composições estáveis que compreendem pelo menos uma molécula de anticorpo anti-CD47 numa formulação farmaceuticamente aceitável. As formulações conservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou opcionalmente selecionado a partir de pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexa-hidrato), alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos num diluente aquoso. Qualquer concentração ou mistura adequada pode ser usada na técnica, tal como 0,001 a 5%, ou qualquer faixa ou valor na mesma, tal como, porém sem limitação, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4,1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0,3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ou qualquer faixa ou valor na mesma. Os exemplos não limitantes incluem, sem conservante, 0,1 a 2% de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9 ou 1,0%), 0,1 a 3% de álcool benzílico (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0 ou 2,5%), 0,001 a 0,5% de timerosal(por exemplo, 0,005 ou 0,01%), 0,001 a 2,0% de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9 ou 1,0%), 0,0005 a 1,0% alquilparabeno (ou alquilparabenos) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005,0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9 ou 1,0%) e similares.

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[00354] As composições farmacêuticas que contêm um anticorpo anti- CD47 ou anticorpo mascarado conforme divulgado no presente documento, podem ser apresentadas numa forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas por qualquer método adequado. Uma composição farmacêutica deve ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Os exemplos de vias de administração são administração intravenosa (IV), intradérmica, inalação, transdérmica, tópica, transmucosa e retal. Uma via de administração preferencial para anticorpos monoclonais é a infusão IV. As formulações úteis podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica farmacêutica. Por exemplo, consultar Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) supra. Os componentes de formulação adequadas para a administração parenteral incluem um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como EDTA; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose.

[00355] Para a administração intravenosa, os carreadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). O carreador deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra micro-organismos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido) e misturas adequadas dos mesmos.

[00356] As formulações farmacêuticas são, de preferência, estéreis. A esterilização pode ser realizada por qualquer método adequado, por exemplo, filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é

129 / 177 liofilizada, a esterilização de filtro pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição.

[00357] As composições desta invenção podem ser numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, e lipossomas. A forma preferencial depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições preferenciais típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infusíveis. O modo de administração preferencial é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraocular, intraperitoneal, intramuscular). Numa modalidade preferencial, a preparação é administrada por injeção ou infusão intravenosa. Noutra modalidade preferencial, a preparação é administrada por injeção subcutânea ou intramuscular.

[00358] As frases “administração parenteral” e “administrado parenteralmente” conforme usado no presente documento significam modos de administração além da administração entérica e tópica, normalmente por injeção e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intravítreo, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, inalada, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal.

[00359] A presente invenção fornece um kit que compreende material de embalagem e pelo menos um frasco que compreende uma solução de pelo menos um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente num diluente aquoso. O diluente aquoso compreende ainda, opcionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Os conservantes incluem aqueles selecionados a partir de fenol, m- cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de

130 / 177 benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos. A concentração de conservante usada na formulação é uma concentração suficiente para render um efeito antimicrobiano. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são prontamente determinadas pelo versado na técnica.

[00360] Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tampões, antioxidantes, intensificadores de conservante, podem ser opcional e preferencialmente adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é, de preferência, adicionado para fornecer controle de pH melhorado. As formulações podem cobrir uma ampla faixa de valores de pH, tal como a partir de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 10,0, a partir de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 9,0 ou cerca de pH 6,0 a cerca de pH 8,0.

[00361] Outros aditivos, tais como solubilizantes farmaceuticamente aceitáveis como TWEEN 20 (monolaurato de sorbitano polioxietileno (20)), TWEEN 40 (monopalmitato de sorbitano polioxietileno (20)), TWEEN 80 (monooleato de sorbitano polioxietileno (20)), Pluronic F68 (copolímeros em bloco de polioxietileno polioxipropileno) e PEG (polietilenoglicol) ou tensoativos não iônicos, tais como polissorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, polilas Pluronic®, outros copolímeros em bloco, e agentes quelantes, tais como EDTA e EGTA podem ser opcionalmente adicionados às formulações ou composições para reduzir a agregação. Estes aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente de plástico é usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável mitiga a propensão para que a proteína agregar.

[00362] Vários sistemas de distribuição podem ser usados para administrar anticorpos anti-CD47 ou anticorpos mascarados para um indivíduo. Em certas modalidades exemplificadoras, a administração de um

131 / 177 anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado é por meio de infusão intravenosa. Em algumas modalidades, a administração é por meio de uma infusão intravenosa de duas horas.

[00363] Qualquer uma das formulações descritas acima pode ser armazenada numa forma líquida ou congelada e pode ser opcionalmente submetida a um processo de conservação. Em algumas modalidades, as formulações descritas acima são liofilizadas, isto é, são submetidas à liofilização. Em algumas modalidades, as formulações descritas acima são submetidas a um processo de conservação, por exemplo, liofilização, e são subsequentemente reconstituídas com um líquido adequado, por exemplo, água. Por liofilizado, entende-se que a composição foi seca por congelamento sob um vácuo. A liofilização é tipicamente realizada por meio do congelamento de uma formulação particular, de modo a que os solutos sejam separados do solvente (ou solventes). O solvente é, então, removido por sublimação (isto é, secagem primária) e em seguida por dessorção (isto é, secagem secundária).

[00364] As formulações da presente invenção podem ser usadas com os métodos aqui descritos ou com outros métodos para o tratamento da doença. As formulações de anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado podem ser ainda mais diluídas antes da administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, as formulações serão diluídas com solução salina e retidas em sacos IV ou seringas antes da administração a um indivíduo. Consequentemente, em algumas modalidades, os métodos para o tratamento de um câncer que expressa CD47 num indivíduo irá compreender a administração a um indivíduo que necessita do mesmo de uma dose semanal de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado.

[00365] Ficará prontamente evidente para aqueles versados na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos descritos aqui

132 / 177 podem ser feitas usando equivalentes adequados sem que se afaste do escopo das modalidades aqui divulgadas. Agora tendo descrito certas modalidades em detalhe, as mesmas serão mais claramente compreendidas mediante a referência aos exemplos a seguir, que são incluídos para fins de ilustração apenas e não se destinam a serem limitantes. Todas as patentes, pedidos de patente e referências descritos no presente documento estão incorporados a título de referência em suas totalidades, para todos os fins.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPO

[00366] Variantes humanizadas do anticorpo anti-CD47 B6H12 murino foram geradas. Para a geração de DNA e Vetor, as sequências de domínios variáveis de anticorpos foram sintetizadas usando PCR não modelo. Em resumo, a sequência de gene virtual é convertida em sequências de oligonucleotídeos usando o pacote de software de propriedade da ATUM. Os oligonucleotídeos são sintetizados, reunidos e amplificados usando PCR. O amplicon de comprimento completo a partir da reação de PCR é clonado no vetor usando o sítio SapI, transformado em E. coli e as colônias exclusivas são isoladas. As colônias foram cultivadas durante a noite em meio líquido e o DNA de plasmídeo foi isolado, purificado (Machery-Nagel Midi Prep Kit) e a sequência verificada usando sequenciamento de Sanger. Os domínios variáveis de cadeia leve são clonados no vetor Kappa-Hs e os domínios de cadeia pesada são clonados nos vetores IgG1.01-Fc-Hs. Para expressão de anticorpo, uma razão de 1:1 de vetores de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo é diluída em meios LifeTech Optimem com reagente de transfecção PolyPlus FectoPro. O DNA/reagente de transfecção é, então, adicionado a células HEK293 específicas de Atum em meios LifeTech ExpiExpression e cultivadas durante 5 dias. A cultura é colhida por centrifugação e filtração de 0,2 um. Para a purificação de anticorpo é usado GE mAbSelect Sure para a purificação da IgG. Antes da eluição, a resina é lavada com 10 CV de NaCl 1

133 / 177 M em PBS, e 10 CV de PBS. A IgG é eluída usando tampão de citrato de Na 20 mM pH 3,2. A amostra é trocada de tampão usando as colunas Pierce Zeba em PBS. A amostra é, então, esterilizada por filtração antes de uma amostra ser tomada para a caracterização. A caracterização inclui concentração A280 e eletroforese reduzida e não reduzida usando o Agilent P200 TapeStation 2200 com P200 Tapescreens.

[00367] As mutações específicas do anticorpo B6H12 parental são descritas nas Tabelas 10 a 13 conforme apresentado abaixo. TABELA 10. MUTAÇÕES DE HUMANIZAÇÃO EM VARIANTES DE CADEIA PESADA HB6H12 Sequência de aceitador de Resíduos de framework de Resíduos de CDR de Variante vH éxon IGHV doador murino aceitador humano hvH1 IGHV3-23/HJ4 H44, H49, H89, H91, H94 nenhum hvH2 IGHV3-23/HJ4 H49, H91, H94 H31, H33, H60 hvH3 IGHV3-23/HJ4 H49, H82, H91, H94 H31, H33, H60 hvH4 IGHV3-48/HJ4 H49 H31, H60 hvH5 IGHV3-66/HJ4 H29, H49, H82 H60 hvH6 IGHV3-74/HJ4 H49 H31, H58, H60 TABELA 11. MUTAÇÕES DE HUMANIZAÇÃO EM VARIANTES DE CADEIA LEVE KAPPA hB6H12 Sequência de aceitador de Resíduos de framework de Resíduos de CDR de Variante vK éxon IGKV doador murino aceitador humano hvK1 IGKV6-21/KJ2 L4, L21, L85 nenhum hvK2 IGKV6-21/KJ2 L4, L21 nenhum hvK3 IGKV6-21 /KJ2 L4, L21, L69 nenhum hvK4 IGKV1-27 /KJ2 L21, L49, L69 L31, L34, L53, L54, L55 TABELA 12. MUTAÇÕES DE FRAMEWORK MURINO ESPECÍFICO EM VARIANTES DE CADEIA PESADA hB6H12 Variante 29 44 49 82 89 91 94 % de Humano hvH1 F R* A* M I* F* R* 87,8 hvH2 F G A* M V F* R* 92,9 hvH3 F G A* I* V F* R* 91,8 hvH4 F G A* M V Y R 92,9 hvH5 F* G A* I* V Y R 89,8 hvH6 F G A* M V Y R 92,9 *Resíduos murinos.

TABELA 13. MUTAÇÕES DE FRAMEWORK MURINO ESPECÍFICO EM VARIANTES DE CADEIA LEVE KAPPA hB6H12 Variante 4 21 49 69 85 % de Humano hvK1 M* L* K T V* 85,3 hvK2 M* L* K T T 86,3 hvK3 M* L* K S* T 85,3 hvK4 M L* K* S* T 89,5

134 / 177 *Resíduos murinos.

EXEMPLO 2: ANTICORPOS ANTI-CD47 HUMANIZADOS

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[00368] Os anticorpos foram expressos via transfecção transitória de células Expi HEK ou Expi CHO ou transfecção estável de CHO-DG44 e purificadas usando colunas MabSelect SURE (GE Healthcare). A purificação de cromatografia por exclusão de tamanho preparatória usando colunas Superdex (GE Healthcare) foi realizada para anticorpos mascarados que eram menos que 90% monoméricos.

LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO POR CITOMETRIA DE FLUXO E ELISA

[00369] Os anticorpos B6H12 anti-CD47 humanizados com sequências de cadeia pesada e leve variadas foram avaliados acerca de suas afinidades de ligação a CD47 humano, por meio de ELISA de saturação ou análise FACS celular e EC50s ou Kds calculadas. Apenas os anticorpos compreendidos da sequência de cadeia pesada 1 (hvH1) (compartimento A; anticorpos 1 a 4) ou sequência de cadeia pesada 5 (hvH5) (compartimento B, anticorpos 17 a 20) foram capazes de se ligar a CD47. Os anticorpos a partir destes compartimentos ligados com afinidades Kd (Figura 2A) e EC50 (Figura 2B) similares ao anticorpo murino mB6H12 e ao anticorpo humanizado alternativamente Ab47.

[00370] Para a análise FACS celular, células de linfoma de câncer L450cy foram tratadas com concentrações crescentes de anticorpos B6H12 humanizados, que foram constatados como retendo a ligação a CD47 e os valores de Kd determinados. Os frameworks de humanização alternativos reteram Kds de ligação similares ao anticorpo parental murino e ao anticorpo humanizado alternadamente Ab47 (Figura 2A).

[00371] Além da avaliação de ligação celular, a afinidade dos anticorpos B6H12 humanizados para CD47 foi determinada por ELISA. As placas revestidas com CD47 humano foram tratadas com concentrações crescentes de anticorpos B6H12 humanizados, que foram constatados como

135 / 177 retendo a ligação a CD47 e os valores de EC50 determinados. Os frameworks de humanização alternativos reteram Kds de ligação similares ao anticorpo parental murino e ao anticorpo humanizado alternadamente Ab47 (Figura 2B).

[00372] Além de avaliar EC50 de ligação no ensaio ELISA, a cinética de ligação também foi avaliada. Inesperadamente, os anticorpos no Compartimento A, (hB6H12.3 e hB6H12.4) exibiram ligação máxima significativamente maior (Bmax) do que o anticorpo parental máxima, mB6H12, anticorpos no Compartimento B (hB6h12.19 e hB6H12.20), ou um anticorpo humanizado alternativo, Ab47 (Figura 2C).

LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO POR CITOMETRIA DE FLUXO

[00373] 2 x 105 de células indicadas (SW780 ou hemácias humanas) foram combinadas com uma diluição em série do anticorpo indicado no tampão de manchamento (PBS, 5% de FBS, 0,2% de NaN3). As amostras foram incubadas durante 1 hora em gelo e lavadas duas vezes com tampão de manchamento gelado. As células foram ressuspensas com anti-IgG humana- AF647 (JacksonImmunoResearch, diluição de 1:200 em tampão de manchamento), durante 1 hora em gelo. As células foram lavadas duas vezes com tampão de manchamento gelado e ressuspensas em tampão de manchamento. As células marcadas foram examinadas por citometria de fluxo num citômetro de fluxo Invitrogen Attune NXT fechado para excluir as células não viáveis e analisadas usando o software FlowJo 10. A Kdfoi calculada usando GraphPad Prism 6 usando a regressão não linear.

LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO POR ELISA

[00374] CD47-Fc humano recombinante solúvel (R&D Systems) foi diluído até uma concentração adequada em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6. Para cada poço de uma placa de ELISA Maxisorb de 96 poços foram adicionados 100 µl de antígeno solúvel. A placa foi vedada e armazenada a 4oC durante a noite. A placa foi, então, lavada 3 a 5 vezes com tampão de

136 / 177 lavagem PBS-T (PBS, pH 7,4 + 0,05% de Tween-20). Os poços foram bloqueados usando 300 µl/poço de tampão PBS-T contendo BSA durante 1 hora à temperatura ambiente, então, lavados 3 a 5 vezes com PBS-T. As diluições de anticorpos foram preparadas em tampão de bloqueio e adicionadas a cada cavidade num volume de 100 µl. Os anticorpos foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente e, então, lavados 3 a 5 vezes com PBS-T. Os anticorpos secundários conjugados a HRP (anti-Fc humano ou anti-cadeia leve kappa humana) foram então adicionados e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 a 5 vezes com PBS-T. O ELISA foi desenvolvido mediante a adição de 100 µl de solução de TMB e incubação durante 3 a 15 min à temperatura ambiente. Para parar a reação, 100 µl de ácido sulfúrico 1 N foram adicionados a cada poço. A absorvância a 450 nm foi determinada usando um leitor de placas Spectramax 190 (Molecular Biosciences) e os dados plotados usando GraphPad Prism 6. FAGOCITOSE MEDIADA POR B6H12

[00375] A caracterização funcional de anticorpos B6H12 humanizados foi realizada incluindo fagocitose humana de hemácias humanas e hemaglutinação. As hemácias humanas marcadas com corante vermelho fluorescente PKH foram opsonizadas durante 30 minutos com concentrações crescentes de anticorpos B6H12 humanizados a partir dos compartimentos A e B. RBCs foram lavadas e alimentadas a uma razão de 10:1 aos macrófagos monócitos durante 2 horas. As amostras foram lavadas 3 vezes com tampão de lise hipotônica ACK que permite a lise e remoção de hemácias não ingeridos. As amostras foram submetidas à citometria de fluxo e a fagocitose avaliada. Os anticorpos a partir dos Compartimentos A e B exibiram uma capacidade similar para mediar a fagocitose de hemácias humanas. Surpreendentemente, o anticorpo hB6H12.3 a partir do compartimento A mediou a fagocitose melhor do que o anticorpo parental murino e no mesmo nível que o anticorpo humanizado Ab47 alternativo.

137 / 177

[00376] Os anticorpos B6H12 humanizados a partir dos compartimentos A e B medeiam a fagocitose de hemácias humanas positivas para CD47 de forma similar. hB6H12.3 estimulou a atividade de promoção fagocítica superior em 1 µg/ml em comparação com o mB6H12 murino e atividade de promoção fagocítica similar em comparação com Ab47 (Figura 3A e a Figura 3B). HEMAGLUTINAÇÃO MEDIADA POR B6H12

[00377] A marca característica de B6H12 é a capacidade de promover a hemaglutinação de hemácias humanas. A hemaglutinação é um exemplo de uma interação homotípica que permite que duas células que expressam CD47 agreguem ou aglomerem quando tratadas com um anticorpo CD47. A retícula aglutinada mantém as RBCs numa distribuição suspensa que pode ser quantificada visualmente por análise de imagem ou pelo nível de agregação conforme monitorado por citometria de fluxo. As hemácias humanas suspensas em PBS e colocadas em placa de 96 poços de fundo redondo foram expostas a concentrações crescentes de anticorpos anti-CD47. Após 30 minutos a 37 °C, a hemaglutinação foi monitorada opticamente por uma alteração em densidade de RBC e por citometria de fluxo como um aumento na agregação celular. Os anticorpos no Compartimento A, em particular hB6H12.3, mostraram uma redução na hemaglutinação em comparação com o anticorpo parental mB6H12 e o anticorpo humanizado alternadamente Ab47 (Figura 4A).

[00378] Para avaliar a hemaglutinação, a captura de imagem padrão foi realizada e a formação de RBCs sem sedimentação dispersas avaliada. Além disso, as placas foram varridas usando o analisador GE In Cell e o diâmetro do ponto aparente dentro do poço foi avaliado. Num esforço para avaliar a hemaglutinação num ensaio que é favorável para o monitoramento clínico, a citometria de fluxo foi usada e a hemaglutinação foi avaliada como o aumento total em SSC/FSC de RBC aparente, que é um método para o monitoramento

138 / 177 de agregação. Este método foi usado para avaliar a hemaglutinação induzida pelos anticorpos anti-CD47 humanizados hB6H12.3 e Ab47 (Figura 4A e Figura 4B). ATIVAÇÃO MEDIADA POR B6H12 DE RECEPTORES FcȖ

[00379] In vivo, monócitos, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas pode mediar ADCP via FcȖRIIa, FcȖRI e FcȖRIIIa. Embora todos os três receptores possam participar de ADCP, acredita-se que FcȖRIIa seja o receptor FcȖ predominante envolvido neste processo. As células Jurkat estavelmente transfectadas com FcȖRI humano ou o FcȖRIIa-H conectado a um construto de repórter de NFAT-luciferase foram expostas a células WIL2S revestidas com concentrações crescentes de B6H12 de camundongo, Ab47 ou hB6H12.3. A ativação de FcȖR foi monitorada pela produção de luciferase. Os resultados são mostrados nas Figuras 5A e 5B. As células revestidas tanto com Ab47 como com hB6H12.3 ativaram de forma dependente de dose o receptor FcȖRI, entretanto, apenas hB6H12.3 foi capaz de acionar a ativação de FcȖRIIa-H, o receptor que está mais estreitamente ligado à mediação direta de atividade de ADCP.

[00380] A ativação mediada por anticorpo por receptores FcȖ envolvidos na fagocitose celular mediada por anticorpos foi avaliada usando células Jurkat geneticamente manipuladas que expressam estavelmente o FcȖRI ou FcȖRIIa-H (uma variante H131 de alta afinidade) e um elemento de resposta NFAT que aciona a expressão de luciferase de vagalume como células efetoras. A atividade biológica de anticorpo é quantificada através da luciferase produzida como um resultado da ativação da via de NFAT; a atividade de luciferase na célula efetora é quantificada com leitura de luminescência (Figura 5A e Figura 5B).

ATIVIDADE DE ADCC MEDIADA POR CÉLULA NK

[00381] A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediada por célula NK e a ativação de FcȖRIIIa por mB6H12, Ab47 e

139 / 177 hB6H12.3 foi examinada. As células Wils-2 carregadas com cromo revestidas com concentrações crescentes de anticorpo foram expostas a células natural killer (NK) humanas primárias durante 4 horas e a lise específica avaliada acerca da liberação de cromo radioativo no meio de cultura de tecido. Alternativamente, as células Wils-2 revestidas com concentração crescente de mB6H12, Ab47 ou hB6H12.3 foram expostas às células Jurkat que expressam estavelmente a variante V/V de alta afinidade de FcȖRIIIa e ativação de receptor avaliada quanto a atividade de luciferase acionada por NFAT. hB6H12.3 exibiu ativação de FcȖRIIIa e ADCC superior em comparação tanto com ambos Ab47 como com o anticorpo parental B6H12 murino. Os resultados são mostrados nas Figuras 6A e 6B. A cadeia principal de IgG1 de hB6H12.3 medeia a atividade de ADCC e aciona a sinalização de FcȖRIII, uma funcionalidade que está ausente com os anticorpos clínicos de IgG4 atuais.

[00382] Para realizar o ensaio de ADCC, as células NK humanas purificadas selecionadas negativamente a partir de Astarte Biologics foram descongeladas e ressuspensas em RPMI/1% de FBS em uma concentração de 7,2 x 105 células CD16+/Ml (de modo que 70 µl conteve aproximadamente 5 x 104 células efetoras). 5 x 106 células-alvo (células WIL2S) foram coletadas, centrifugadas e ressuspensas em 100 µl de FBS. 100 µl (aproximadamente 100 ȝCi) de Cr-51 foram adicionados às células e misturados delicadamente. As células foram colocadas numa incubadora umidificada com CO2 a 37 °C para marcar durante 1 hora. As células foram batidas ocasionalmente para manter suspensas. As células foram lavadas três vezes com RPMI/1% de FBS, tomando cuidado para descartar o sobrenadante radioativo em receptáculo de resíduo adequado. As células foram, então, ressuspensas em 10 ml de RPMI/1% de FBS e contadas. 7,2 x 105 células foram removidas e suspensas num volume total de 10 ml de meio de ensaio de modo que 70 ȝl fossem equivalentes a aproximadamente 5 x 103 células-alvo.

140 / 177

[00383] Para a diluição de anticorpo e montagem de placa, os anticorpos foram diluídos em meio de ensaio (prep a 3 X). Os anticorpos foram adicionados à placa imediatamente antes da adição de células-alvo marcadas com Cr. Aos poços de controle, 70 ȝl e 140 ȝl de meio de ensaio foram adicionados em vez do anticorpo. Estes poços representam controles de liberação espontânea e total, respectivamente. As células-alvo foram misturadas e 70 ȝl foram adicionados a cada poço de teste e controle da placa de 96 poços. Os alvos com anticorpos foram incubados numa incubadora a 37 °C durante 30 minutos. 70 µl (5 x 104) de células efetoras foram adicionados a cada poço de teste. Para os poços de liberação total, 70 ȝl de triton X-100 a 3% foram adicionados e pipetados para cima e para baixo três vezes para misturar. As placas foram retornadas para a incubadora umidificada com CO2 a 37 °C durante 4 horas.

[00384] Tomados em conjunto, os dados demonstram que os anticorpos anti-CD47 humanizados da invenção possuem propriedades superiores e inesperadas em relação ao anticorpo parental murino. Os anticorpos anti-CD47 humanizados exibem capacidade fagocítica / de ADCP superior, conforme demonstrado pela fagocitose de RBC (Figura 3B) e sinalização de FcȖRII (Figura 5B). Os anticorpos anti-CD47 humanizados exibem lise celular / ADCC superior, conforme demonstrado pela lise celular mediada por células NK (Figura 6A) e sinalização de FcȖRIII (Figura 6B). Os anticorpos anti-CD47 humanizados exibem sinalização de FcyRI superior (Figura 5A). Finalmente, os anticorpos anti-CD47 humanizados também exibem um perfil de toxicidade superior, conforme demonstrado pela hemaglutinação reduzida, conforme demonstrado nos ensaios de hemaglutinação (Figura 4A e Figura 4B). Constatou-se que o anticorpo anti- CD47 humanizado, hB6H12.3, é particularmente eficaz. FUNÇÃO DE SUPRESSÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD47.

[00385] Além de bloquear a atividade fagocítica, a interação de CD47

141 / 177 com SIRPĮ também reduz a produção de citocinas inflamatórias através da ativação de SHP1 e inativação de sinais a jusante, tais como Vav. Os monócitos humanos foram tratados com LPS para acionar a produção de citocina na presença ou ausência dos diversos anticorpos anti-CD47 humanizados e parentais. O tratamento com todos os anticorpos alvo de CD47 pode intensificar significativamente citocinas acionadas por LPS. Uma consequência da melhor produção de citocinas e da ativação celular inata é a capacidade de acionar respostas de células T secundárias. Os macrófagos associados a tumor são conhecidos por exibirem um fenótipo supressor que é incapaz de suportar e pode suprimir ativamente a ativação de células T secundárias. As células mononucleares humanas foram diferenciadas e polarizadas com IL10 e MSCF para conduzi-las para um fenótipo semelhante a TAM imunossupressor. Estes monócitos diferenciados têm capacidade para suprimir a proliferação acionada por CD3/CD28 de células T autólogas. A adição de tratamento anti-CD47 neste paradigma teve capacidade para ativar TAMs e mover os mesmos para um fenótipo M0/M1 adicional (aumento de CD86/MHCII). Consultar, por exemplo, as Figuras 7A 7B e 7C. Esta alteração em fenótipo semelhante a TAM se correlacionou com uma capacidade de suportar a ativação e proliferação de células T mediada por CD3/CD28. Consultar, por exemplo, a Figura 7D.

[00386] Os ensaios de supressor que usam monócitos humanos diferenciados em macrófagos semelhantes a tumor com IL-10 foram cocultivados com células T autólogas e a capacidade para suportar a ativação mediada por receptor de células T foi avaliada. CD47 foi adicionado às culturas e foi constatado como causando a regulação ascendente de marcadores de ativação dos macrófagos conforme medido pela regulação ascendente de CD86 e MHCII. Além disso, o suporte de ativação de células T mediada por TCR foi avaliada por meio da regulação ascendente de MHCII sobre as células T e a secreção de IFNȖ (Figura 7A a Figura 7D).

142 / 177 COMPARAÇÃO COM OUTROS ANTICORPOS ANTI-CD47

[00387] hB6H12.3 foi comparado com outros anticorpos CD47 conhecidos, 5F9 e CC-9002 (Consultar o documento n° WO2011/143624). Na comparação, a atividade de FcȖRI e FcȖRII foi medida no mesmo ensaio de célula Jurkat de NFAT-luciferase conforme descrito supra. hB6H12.3 exibiu uma capacidade superior para ativar FcȖRI e FcȖRII em relação aos anticorpos 5F9 e CC-90002 IgG4 (Figura 8A e Figura 8B).

[00388] Além disso, a secreção de IFNȖ e ADCC mediada por NK foi medida conforme descrito supra. Mais uma vez, hB6H12.3 exibiu uma capacidade superior para mediar ADCC e estimular a secreção de IFNy em relação ao 5F9 e CC-90002 (Figura 8C e Figura 8D). EXEMPLO 3: ANTICORPOS ANTI-CD47 HUMANIZADOS

A CLIVAGEM DE ANTICORPOS MASCARADOS USANDO MMPS HUMANAS RECOMBINANTES PARA ESTUDOS FUNCIONAIS E DE LIGAÇÃO

[00389] MMPs recombinantes foram todos ativado através de incubação com acetato de 4-aminofenila mercúrico 1,25 mM (APMA) durante 1 a 2 horas a 37 °C. Tipicamente, 1 a 2 µg de rhMMP2 ativado foi adicionado a 0,25 a 0,5 mg de anticorpo mascarado e incubado durante 4 a 16 horas a 37 °C. A extensão de clivagem de anticorpos foi avaliada usando LC- MS de fase inversa de anticorpo reduzido usando um Waters Acquity/Xevo UPLC equipado com uma coluna de 3 µm PLRP-MS (Agilent). Os dados foram analisados usando o software UNIFI (Waters). A reativação com MMPs resulta em clivagem sítio-especifica da máscara no sítio de clivagem pretendido. Mediante a reativação completa de anticorpos mascarados, os produtos clivados foram purificados usando a resina de proteína A MabSelect SuRe antes do uso em ensaios de ligação.

[00390] Os dados de espectrometria de massa foram gerados para um anticorpo mascarado reativado com MMP2. A massa de cadeia leve

143 / 177 desconvoluída para Vel-IPV-hB6H12.3 antes (Figura 9A) e após (Figura 9B) a clivagem com MMP2 humana recombinante. O m/z esperado para a cadeia leve intata é 28681 (observado: 28680,8). O m/z esperado para anticorpo clivado por MMP2 (LRSG-hB6H12.3) é 23969 (observado: 23968,4).

[00391] Os anticorpos anti-CD47 que contém uma sequência de “ponta” na terminação N que permaneceriam pós-proteólise foram também gerados por através da expressão transitória em células Expi-HEK ou Expi- CHO. Por exemplo, para um anticorpo mascarado que emprega a sequência de clivagem de MMP IPVS-LRSG, a sequência LRSG permanece após a ativação de MMP. Avaliação da especificidade de protease de sequências de clivagem à base de

MMP

[00392] MMPs foram ativadas via incubação com acetato de 4- aminofenila mercúrico 1,25 mM (APMA) a 37 °C durante 1 hora e até 24 horas. A legumaina foi ativada através via incubação de 2 horas a 37 °C em acetato de sódio 50 mM, NaCl 100 mM, pH 4,0.

[00393] Para avaliar o perfil de clivagem das sequências de clivagem, os anticorpos (10 µg) foram incubados durante a noite a 37 °C com 400 pmol/min de proteases normalizados, conforme indicado pelos valores relatados por fabricante. A extensão de clivagem de anticorpos foi avaliada usando LC-MS de fase inversa de anticorpo reduzido usando um Waters Acquity/Xevo UPLC equipado com uma coluna de 3 µm PLRP-MS (Agilent). Os dados foram analisados usando o software UNIFI (Waters).

[00394] O perfil de clivagem de protease de dois sítios de clivagem da protease (IPV e M2) foi testado contra um painel de proteases associadas a tumor, tais como MMPs de murino/rato e ser humano, a família ADAMs, uPA, matriptase e legumaina. Adicionalmente, a clivagem das sequências por proteases extracelulares tPA e o Fator Xa também foram testados. Os perfis de clivagem de protease nestes três sítios de clivagem de protease são

144 / 177 mostrados na Tabela 14.

[00395] Os peptídeos (fundidos em N-terminal à cadeia principal de anticorpo hBU12) foram incubados a 37 °C durante a noite com 400 pmol/min de protease normalizada e avaliados acerca da clivagem. O sítio M2 foi clivado pela maioria das MMPs, bem como uPA e matriptase. O sítio IPV foi clivado por quase todas as MMPs exceto MMP13 e foi intocado por outras classes de proteases. TABELA 14. PERFIS DE CLIVAGEM DE PROTEASE EM DOIS SÍTIOS DE CLIVAGEM DE PROTEASE DIFERENTES. Sequência de clivagem: Enzima M2 IPV GPLG*VR** IPVS*LR**SG MMP2 humana Completa Completa MMP7 humana Completa Completa MMP9 humana Completa Completa MMP13 humana Completa Mínimo MMP2 murina Completa Parcial MMP7 murina Parcial Completa MMP9 de rato Parcial Completa uPA Parcial Nenhum Matriptase Completa Mínimo Legumaina Nenhum Mínimo tPA -- Nenhum Fator Xa Mínimo Nenhum ADAMs (hu, mu) Nenhum Nenhum

[00396] O sítio de clivagem de MMP é indicado por *, enquanto os sítios de clivagem de uPA/matriptase/legumaina são indicados por **. A clivagem em cada sítio é suficiente para restabelecer a ligação de anticorpo LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD47

MASCARADOS

[00397] A ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a células de câncer de bexiga humano SW780 foi realizada. Os anticorpos hB6H12 mascarados com Vel-IPV foram testados juntamente com comparadores pré- ativados com MMP2. Os anticorpos Vel-IPV clivados possuíram uma sequência LRSG restante nas terminações N de anticorpo (Figura 10 e Tabela 15). TABELA 15. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD)

145 / 177 PARA CÉLULAS SW780 OBTIDAS POR LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO (FIGURA 10). Anticorpo Kd (nM) Vel-IPV-hB6H12.3 clivado 11,4 Vel-IPV-hB6H12.4 clivado 9,2 Vel-IPV-hB6H12.19 clivado 26,6 Vel-IPV-hB6H12.20 clivado 30,2 Vel-IPV-hB6H12.3 > 2000 Vel-IPV-hB6H12.4 > 2000 Vel-IPV-hB6H12.19 > 2000 Vel-IPV-hB6H12.20 > 2000

[00398] Os anticorpos hB6H12 mascarados com Vel-IPV foram testados juntamente com comparadores pré-ativados com MMP2. Os anticorpos IPV em ponta e Vel-IPV possuíram uma sequência LRSG restante nas terminações N de anticorpo. O anticorpo clivado foi gerado através de clivagem com MMP2 enquanto o anticorpo IPV em ponta foi gerado de modo recombinante (Figura 11 e Tabela 16). Conforme usado no presente documento, uma “ponta”, um “anticorpo em ponta” ou um “fragmento de ligação a antígeno em ponta” se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno após a clivagem por uma MMP ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que foi gerado de modo recombinante, isto é, produzido sem o domínio de bobina em espiral e, portanto, nenhuma clivagem foi realizada. A clivagem de MMP leva a uma sequência de ácido amino curta restante. Para o sítio de clivagem de IPV, a sequência restante ou em ponta deve ser LRSG ou SG. Para o sítio de clivagem M2, a sequência restante ou em ponta deve ser VR. TABELA 16. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD) PARA CÉLULAS SW780 OBTIDAS POR LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO (FIGURA 11). Anticorpo Kd (nM) hB6H12.3 19,2 Ab47 8,0 Vel-IPV-hB6H12.3 > 2000 stubIPV-hB6H12.3 18,1 Vel-IPV-hB6H12.3 clivado 14,2

[00399] A ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a hemácias humanas foi realizada. Os anticorpos hB6H12 mascarados com Vel-IPV

146 / 177 foram testados juntamente com comparadores reativados (IPV em ponta- hB6H12.3 ou Vel-IPV-hB6H12.3 clivado com MMP2). Os anticorpos IPV em ponta e Vel-IPV possuíram uma sequência LRSG restante nas terminações N de anticorpo. O anticorpo clivado foi gerado através de clivagem com MMP2, enquanto o anticorpo IPV em ponta foi gerado de modo recombinante (Figura 12 e Tabela 17). TABELA 17. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD)

PARA HEMÁCIAS HUMANAS OBTIDAS POR LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO (FIGURA 12). Anticorpo Kd (nM) hB6H12.3 58,2 Ab47 26,5 Vel-IPV-hB6H12.3 > 2000 stubIPV-hB6H12.3 46,8 Vel-IPV-hB6H12.3 clivado 41,7

[00400] A ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a rhCD47 por ELISA foi realizada. Vel-IPV-hB6H12.3 exibiu ligação significativamente prejudicada. A ligação poderia ser restaurada mediante a clivagem por rhMMP2 (Figura 13 e Tabela 18). TABELA 18. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD) PARA rhCD47 POR ELISA (FIGURA 13). Anticorpo Kd (nM) hB6H12.3 1,7 Vel-IPV-hB6H12.3 1,7 Vel-IPV-hB6H12.3 clivado > 250

[00401] A ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a rhCD47 por ELISA foi realizada com hB6H12.3 G91A, que tem uma mutação pontual G91A em LCDR3. Tanto hB6H12.3 como hB6H12.3 G91A exibiram um Bmax maior que Ab47 (Figura 14 e Tabela 19). TABELA 19. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD) PARA rhCD47 POR ELISA (FIGURA 14). Anticorpo Kd (nM) Ab47 1,0 hB6H12.3 1,4 hB6H12.3 G91A 2,7

[00402] A ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a células de

147 / 177 câncer de bexiga humano SW780 foi realizada. A ligação de Ab47 e hB6H12.3 foi comparada com variantes que contêm uma mutação G91A em LCDR3 (Figura 15 e Tabela 20). TABELA 20. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD) PARA CÉLULAS DE CÂNCER DE BEXIGA HUMANO SW780 OBTIDAS POR LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO (FIGURA 15). Anticorpo Kd (nM) Ab47 6,8 Ab47 G91A 19,8 hB6H12.3 20,5 hB6H12.3 G91A 62,3

[00403] A ligação de saturação de anticorpos anti-CD47 a hemácias humanas foi realizada. A ligação de Ab47 e hB6H12.3 foi comparada com variantes que contêm uma mutação G91A em LCDR3 (Figura 16 e Tabela 21). TABELA 21. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO (KD)

PARA HEMÁCIAS HUMANAS OBTIDAS POR LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO (FIGURA 16). Anticorpo Kd (nM) Ab47 12,1 Ab47 G91A 100,3 hB6H12.3 68,9 hB6H12.3 G91A > 150 EXEMPLO 4: EXPERIMENTOS IN VIVO

[00404] A avaliação da infiltração de macrófagos nos tecidos pode ser conduzida por meio do monitoramento acerca de marcadores de superfície de macrófagos, incluindo F4/80 para macrófagos de camundongo ou CD163, CD68, CD11b ou por métodos convencionais que incluem imuno- histoquímica (IHC), Western blot, citometria de fluxo ou métodos de sequenciamento de RNA.

[00405] A avaliação de proteases em tecidos pode ser monitorada usando uma variedade de técnicas, incluindo tanto aquelas que monitoram a atividade de protease, bem como aquelas que podem detectar a atividade proteolítica. Os métodos convencionais que podem detectar a presença de

148 / 177 proteases num tecido, o que poderia incluir as formas tanto ativas como inativas da protease, incluem IHC, sequenciamento de RNA, Western blot ou métodos à base de ELISA. Podem ser usadas técnicas adicionais para detectar a atividade de protease em tecidos, o que inclui zimografia, em zimografia in situ por microscopia de fluorescência ou o uso de substratos proteolíticos fluorescentes. Além disso, o uso de substratos proteolíticos fluorescentes pode ser combinado com imuno-captura de proteases específicas. Adicionalmente, os anticorpos dirigidos contra o sítio ativo de uma protease podem ser usados por uma variedade de técnicas, incluindo IHC, microscopia de fluorescência, Western blot, ELISA ou citometria de fluxo (consultar, Sela-Passwell et al. Nature Medicine. 18:143-147. 2012; LeBeau et al. Cancer Research. 75:1225-

1235. 2015; Sun et al. Biochemistry. 42:892-900. 2003; Shiryaev et al. 2:e80.

2013.)

[00406] A atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor de xenoenxerto de linfoma L428 em camundongos NSG foi determinada. Este modelo de xenoenxerto tem alta infiltração de macrófagos, conforme evidenciado por manchamento robusto de camundongos F4/80 por IHC. Consultar, por exemplo, a Figura 17B. Os anticorpos foram administrados i.p. q4dx4 em 1 ou 10 mg/kg. O anticorpo mascarado Vel-IPV-hB6H12.3, bem como anticorpos não mascarados Ab47 e hB6H12.3 reduziram, todos, de modo eficaz o volume de tumor ao longo da duração do estudo, a uma dose de 10 mg/kg. A uma dose de 1 mg/kg, tanto Vel-IPV-hB6H12.3 como hB6H12.3 não mascarado fornecem o atraso de crescimento de tumor. O anticorpo mascarado, Vel-IPV-hB6H12.3, foi ligeiramente menos ativo do que o hB6H12.3 não mascarado nesta dose. (Figura 17A).

[00407] A atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor de cabeça e pescoço de xenoenxerto Detroit 562 em camundongos NSG foi determinada. Este modelo de xenoenxerto tem alta infiltração de macrófagos, conforme evidenciado por manchamento robusto de camundongos F4/80 por

149 / 177 IHC. Consultar, a Figura 18B. q4dx4 em 5 mg/kg. Os anticorpos Ab47, hB6H12.3 e Vel-IPV-hB6H12.3 reduziram de modo eficaz o volume de tumor ao longo da duração do estudo (Figura 18A).

[00408] A atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor de fibrosarcoma de xenoenxerto HT1080 (Figura 19A e 19B) e num modelo de tumor de hepatocelular de xenoenxerto HEPG2 (Figura 19C e 19D) em camundongos NSG foi determinada. Estes modelos de xenoenxerto têm baixa infiltração de macrófago, conforme evidenciado pelo manchamento limitado de camundongo F4/80 por IHC.q4dx4 a 10 mg/kg. Os anticorpos Ab47, hB6H12.3 e Vel-IPV-hB6H12.3 reduziram e/ou desaceleraram o volume de tumor de modo eficaz ao longo da duração do estudo.

[00409] Além de avaliar a atividade anti-tumor e a sua correlação com a infiltração de macrófagos, os níveis de MMP dentro desses tumores, bem como a avaliação de desmascaramento de anticorpo foi avaliada. Os tumores de xenoenxerto e modelos de tumores singeneicos foram colhidas e submetidas à avaliação de sequência de RNA e proteína para monitorar os níveis de MMPs dentro destes tumores, bem como obter um entendimento da correlação entre os níveis de proteína e RNA dentro do TME. A análise de proteína usando a plataforma multiplex Luminex revelou que todos os tumores usados para investigar a atividade anti-tumor de Vel-IPV-hB6H12.3 continham níveis robustos de tanto MMP2 como 9 (Tabela 22). Adicionalmente, quando se compara os níveis de MMP de tumor com aqueles presentes dentro de sistemas de cultura de células, constatou-se um aumento acentuado nos níveis de MMP no sítio do tumor que excedeu bem os níveis observados apenas em condições de cultura de tecido in vitro (Figura 35A e 35B). TABELA 22. NÍVEIS DE MMP2 E MMP9 EM TUMORES SELECIONADOS (pg/ml). Tumores Modelo de MMPs HT1080 HEPG2 L428 Xenoenxerto MMP2 7506 787 204

150 / 177 MMP9 2020 771 47 MMPs HT1080 HEPG2 L428 Modelos MMP2 8453 27765 47899 singeneicos MMP9 28137 20845 22661

[00410] A atividade de anticorpos anti-CD47 num modelo de tumor com baixo teor de macrófagos intrínsecos pode ser amplificada quando combinada com um ADC de auristatina MMAE que é conhecido por conduzir a infiltração de macrófagos. Isto foi demonstrado no modelo de tumor de xenoenxerto HepG2 em camundongos NSG. Os anticorpos anti-CD47 foram administrados i.p. q4dx4 em 5 mg/kg, enquanto o MMAE ADC foi dosado uma vez em 1 mg/kg. A combinação de anticorpos foi mais eficaz na redução do volume do tumor do que qualquer anticorpo sozinho (Figura 20). Os experimentos adicionais com outras auristatinas que contêm MMAE (LIV1A e CD30) demonstraram capacidade de combinação similar com anticorpo anti-CD47 no modelo de xenoenxerto de câncer de mama MCSF7 para Liv1A ADC e o modelo de linfoma L428 para CD30 ADC (Figuras 36A e 36B).

[00411] O anticorpo anti-CD47 reativo de camundongo mIAP301 (Oldenborg et al., J. Exp. Med. 193:855-861, 2001) poderia ser mascarado usando a mesma sequência VEL e IPV usada no anticorpo hB6H12.3 humano. O mascaramento com estes construtos bloqueou a ligação de anticorpo aos tumores positivos para CD47 murino (Figura 21A) e impediu a funcionalidade conforme medido por fagocitose de RBC (Figura 21B).

[00412] O anticorpo anti-CD47 de camundongo mIAP301 aciona a depleção de plaquetas em camundongos BALB/c quando administrado numa dose IV única de 10 mg/kg. Em contraste, esta depleção não foi observada quando os camundongos foram administrados com anticorpos Vel-M2- mIAP301 e Vel-IPV-mIAP301 mascarados a uma dose de 10 mg/kg IV (Figura 22A).

[00413] O anticorpo Vel-IPV-mIAP301 mascarado melhorou muito a farmacocinética no plasma de camundongos BALB/c em comparação com mIAP301 não mascarado, demonstrando que o anticorpo mascarado tem

151 / 177 capacidade para evitar a disposição de fármaco mediada por alvo encontrada por anticorpos anti-CD47 típicos. Os anticorpos Vel-IPV-mIAP301 e mIAP301 foram marcados com 3H-proprionato via conjugação de lisina e foram administrados aos camundongos BALB/c a uma dose IV de 1 mg/kg. A concentração de anticorpo foi determinada por contagem de cintilação de plasma retirado em pontos no tempo diferentes (Figura 22B). A concentração de mIAP301 no plasma foi abaixo de quantidades detectáveis dentro de 15 min, enquanto as concentrações de Vel-IPV-mIAP301 poderiam ser medidas até 7 dias após a dose.

[00414] A biodistribuição de Vel-IPV-mIAP301 mascarado e Vel-M2- mIAP301 e mIAP301 não mascarado foi testada em camundongos BALB/c contendo A20 usando anticorpos marcados com 3H em doses de 1 e 10 mg/kg. Os anticorpos foram administrados uma vez que os tumores alcançaram 250 mm3. Em pontos no tempo designados, os camundongos foram sacrificados e a concentração de anticorpo no plasma, sangue, tumor, baço e fígado foi determinada por contagem de cintilação. Conforme mostrado na Figura 37A e 37B, a concentração de mIAP301 no plasma é negligenciável dentro de uma hora após a administração. Entretanto, o anticorpo significativamente menos mascarado está presente no baço, quando comparado com o anticorpo mIAP301 não mascarado (Figura 37C e 37D). Resultados similares foram observados no fígado. (Dados não mostrados). Em contraste, evitando a disposição mediada por alvo de CD47 em tecidos normais, os anticorpos Vel- M2-mIAP301 e Vel-IPV-mIAP301 mascarados demonstram níveis aumentados no tumor em comparação com mIAP301 (Figura 37E e 37F).

[00415] O anticorpo anti-CD47 de camundongo mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor no modelo de linfoma A20, mas causou a depleção de RBC concomitante (Figura 23A e Figura 23B). O anticorpo Vel-IPV- mIAP301 mascarado conferiu atividade similar, mas anulou efeitos sobre a depleção de RBCs. O anticorpo Vel-IPV-mIAP301 evitou a dissipação por

152 / 177 antígeno de RBC, mas também manteve a ligação de tumor (Figura 23C e Figura 23D) O modelo de linfoma A20 é descrito em detalhe adicional em Donnou et al. (Advances in Hematology, Article ID 701704, 2012) e Liu et al. (Nature Medicine, 21:1209-1215, 2015).

[00416] O anticorpo anti-CD47 de camundongo mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor no modelo de câncer de cólon MC38, que é conhecido como sendo responsivo a agentes de oncologia imune. A atividade do anticorpo mIAP301 mascarado neste modelo mostrou eficácia superior conforme denotado pelo animal que exibe uma resposta completa (Figura 24). A reprovocação deste animal resultou na rejeição completa do tumor, demonstrando a indução de uma resposta de célula T de memória de vida longa (dados não mostrados). O modelo de câncer do cólon MC38 é descrito em detalhe adicional em Liu et al. (supra).

[00417] Além de testar a atividade combinatória do anticorpo anti- CD47 humano com ADCs contra Liv1a ou CD30, também se avaliou a atividade combinatória com outros agentes imunomoduladores. Para realizar isto, mudou-se para um sistema de camundongo completo imunológico e usou-se o anticorpo anti-CD47 substituto MIAP que alveja murino. Usando o modelo A20 demonstrou-se que o anticorpo anti-CD47 mascarado sinergiza com um anticorpo anti-PD-1 substituto, bem como um anticorpo anti-SEA- CD40, SEA-1C10. Estes dados fornecem evidência de que o envolvimento dos ramos tanto inato como adaptativo do sistema imunológico, juntamente com um agente alvejado para CD47 mascarado tem capacidade para combinar para acionar respostas anti-tumor robustas.

[00418] O anticorpo anti-CD47 de murino mascarado e parental mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor aumentada em combinação com o anticorpo substituto anti-PD-1 que resultou em 4/6 animais que exibem respostas CR (Consultar, Dahan et al. Cancer Cell. 28:285-295. 2015, para referência ao anticorpo PD-1, clone RMP1-14) (Figura 25A). O anticorpo

153 / 177 anti-CD47 de murino parental mIAP301 conduziu a atividade anti-tumor aumentada em combinação com o anticorpo substituto intensificado com SEA alvejado para CD40 de ativação de macrófago 1C10 (Consultar, WO2016/069919 para referência ao anticorpo 1C10; consultar, Lindberg et al. J. Biol. Chem. 269: 1567-1570. 1994, para referência ao anticorpo mIAP301) (Figura 25B).

[00419] Os dados que mostram anti-CD47 em combinação com anti- PD-1 ou anti-CD40 indicam que a terapia anti-CD47 pode intensificar a atividade de agentes que intensificam a atividade de células T, conforme no contexto de anticorpos inibidores de ponto de verificação (anticorpos anti-PD- 1), bem como aqueles agentes que intensificam a atividade de célula inata (anticorpos anti-CD40 ou outros inibidores de CD40). Isto sustenta a noção de que um anticorpo anti-CD47 pode ser pareado com múltiplos agentes de modulação imune na clínica que suportam os ramos tanto inatos como adaptativos de um resposta anti-tumor. EXEMPLO 5: ANTICORPOS MASCARADOS COM DOMÍNIO DE

BOBINA EM ESPIRAL

[00420] A estabilidade de anticorpos B6H12 humanizados mascarados que contêm domínios de bobina em espiral diferentes foi avaliada usando a administração intravenosa a camundongos BALB/c. Os anticorpos foram dosados a 5 mg/kg. No determinado ponto no tempo (3 dias), o plasma foi coletado dos camundongos dosados. O anticorpo humano foi purificado a partir de plasma usando resina IgSelect. O anticorpo capturado foi reduzido e separado por SDS-PAGE, então, sondado por Western blot usando um anticorpo anti-Fc humano conjugado com HRP. A porcentagem de anticorpo clivado foi avaliada por densitometria de bandas correspondentes às cadeias pesadas mascaradas e não mascaradas, que se diferem em tamanho em cerca de 5 kDa (Figura 26).

[00421] A Tabela 23 mostra os efeitos de mascaramento com pares de

154 / 177 peptídeo de formação de bobina em espiral diferentes incorporados num anticorpo B6H12 humanizado que compreende uma cadeia pesada (SEQ ID NO: 2) e uma cadeia leve (SEQ ID NO: 10) e testados em linhagens de células diferentes. O anticorpo também é chamado de Ab47 nos exemplos. A Kd (nM) é mostrada para cada anticorpo, que foi derivado a partir da ligação de saturação em cada respectiva linhagem de células. Uma alta concentração de 2000 nM foi usada para cada experimento de ligação. Conforme mostrado na Tabela 23, uma variedade de domínios de bobina em espiral teve capacidade para inibir a ligação de Ab47 a CD47 expresso na superfície celular, mesmo quando testado em concentrações maiores que 2 micromolares, enquanto o anticorpo Ab47 não mascarado exibiu uma IC50 de 3,3 a 21 nM.

[00422] A estabilidade e a ativação de anticorpos B6H12 humanizados mascarados que contêm a sequência de clivagem e bobina em espiral de Vel- IPV foram avaliadas em camundongos nus que contêm um xenoenxerto de fibrosarcoma HT1080 humano. Os anticorpos foram dosados a 5 mg/kg IP. Em determinados pontos no tempo (1, 3, 4 dias), os camundongos foram sacrificados e os tecidos e plasma coletados. Os tecidos foram homogeneizados e o anticorpo humano foi purificado a partir de amostras biológicas usando resina IgSelect. O anticorpo capturado foi reduzido e separado por SDS-PAGE, então, sondado por Western blot usando um anticorpo anti-Fc humano conjugado com HRP. A porcentagem de anticorpo clivado foi avaliada por densitometria de bandas correspondentes às cadeias pesadas mascaradas e não mascaradas, que se diferem em tamanho em cerca de 5 kDa (Figuras 38A e 38B). Muito pouco anticorpo não mascarado (< 5 %) foi detectado no plasma ou fígado em qualquer ponto no tempo testado. Entretanto, mais de 20 a 30% de clivagem foram detectados em tumores, com a quantidade máxima de clivagem ocorrendo em 3 a 4 dias após a dose. Adicionalmente, os tumores HT1080 colhidos a partir de camundongos

155 / 177 tratados com Ab47 ou Vel-IPV-Ab47 durante 4 ou 7 dias foram submetidos à citometria de fluxo para determinar a extensão de que o anticorpo foi capaz de se ligar a e saturar o CD47 expresso em tumor (Figura 38B). TABELA 23. AFINIDADE (NM), DERIVADA POR CITOMETRIA DE FLUXO DE LIGAÇÃO DE SATURAÇÃO, DE UM ANTICORPO B6H12 HUMANIZADO (AB47) QUE CONTÉM DOMÍNIOS DE ANTICORPO DE MASCARAMENTO DIFERENTES. Bobina em espiral HT1080 SW780 HCT116 Raji Ab47 21 9,6 7,8 3,3 A2B1 > 2000 > 2000 1775 CA2B1 > 2000 > 2000 > 2000 Vel > 2000 > 2000 > 2000 CVel > 2000 > 2000 > 2000 > 2000 M11 > 2000 > 2000 > 2000 CM11 > 2000 > 2000 > 2000 M15 > 2000 > 2000 > 2000 CM15 > 2000 > 2000 > 2000 Fos-Jun > 2000 > 2000 > 2000 CFos-Jun > 2000 > 2000 > 2000 A4B4 1181 1684 1116 466 Dobradiça > 2000 476 118 104 ATIVIDADE E FARMACOCINÉTICA DE ANTICORPOS ANTI-CD47

HUMANIZADOS E DEMONSTRAÇÃO DA TOLERABILIDADE MELHORADA ATRAVÉS DO MASCARAMENTO EM MACACOS CINOMOLGOS

[00423] Para testar a capacidade de mascaramento para melhorar a farmacocinética e tolerabilidade de variantes de anticorpo IgG1 anti-CD47, uma série de estudos de dose única IV foi conduzida em macacos cinomolgos. Os anticorpos IgG1 anti-CD47 testados tiveram reação cruzada com CD47 humano e cinomolgo que é altamente conservado entre estas espécies em expressão e sequência. A avaliação da atividade de protease por zimografia em gel in situ de um painel de tecidos humanos e de macaco cinomolgo indicou que níveis de atividade de protease também foram altamente conservados entre estas espécies. Além disso, os macacos cinomolgos têm interações de FcȖR altamente similares com anticorpos IgG1 e são considerados toxicologicamente preditivos de efeitos relacionados à função

156 / 177 efetora de anticorpos IgG1 humanos, tornando-os um modelo adequado para avaliar os efeitos de anticorpos IgG1 anti-CD47 (Warncke et al. J. Immunol. 188:4405-4411. 2012). Tomados em conjunto, o macaco cinomolgo representa uma espécie relevante para avaliar atividades diferentes de anticorpos anti-CD47 sozinhos e ainda como esta atividade é alterada com mascaramento e função efetora alterada. B6H12 ALTERNATIVAMENTE HUMANIZADO, Ab47

[00424] Para determinar a tolerabilidade e PK de B6H12 num construto de IgG1 alternativamente humanizado e ainda demonstrar a prova de conceito da capacidade da sequência de clivagem e mascaramento de Vel- IPV para alterar a tolerabilidade e farmacocinética, os macacos cinomolgos virgens foram dosados por via intravenosa com 0,1, 1, 10 e 30 mg/kg do anticorpo anti-CD47 B6H12 IgG1 alternativamente humanizado, Ab47. O Ab47 à base de IgG1 humanizado demonstrou atividade aumentada, demonstrada como perda de massa de hemácias por meio de análise de hematologia, em comparação com os dados publicados do anticorpo mB6H12 numa plataforma de IgG4 humanizada (Liu, 2015). Enquanto IgG4 B6H12, que é desprovido de função efetora para permitir alta atividade de ADCC, ADCP e CDC além de bloquear interações com CD47, demonstrasse tolerabilidade de doses até 30 mg/kg em macacos cinomolgos (Liu, 2015), Ab47 não foi tolerado em doses maiores que 1 mg/kg (Figura 27A). Ab47 VERSUS Vel-IPV-Ab47

[00425] Para demonstrar a capacidade do mascaramento de Vel-IPV para mitigar a atividade de Ab47, os macacos cinomolgos foram administrados com doses de 0,1, 1 e 10 mg/kg. Notavelmente, as doses aproximadamente 10 vezes maiores foram toleradas melhor do que Ab47 não mascarado, conforme demonstrado por níveis similares de perda de massa de hemácias em amostras de sangue coletadas para análise de hematologia em animais tratados com 1,0 mg/kg de Ab47 e 10 mg/kg do Vel-IPV-Ab47

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(Figura 27B). Os animais tratados com Ab47 demonstraram sinais clínicos consistentes associados à hemólise e uma falta de tolerabilidade (descarga urogenital vermelho, amostras hemolisadas, emese e hipoatividade) enquanto houve uma ausência completa de sinais clínicos adversos observados em animais tratados com anticorpo mascarado.

Este aumento em tolerabilidade com Ab47 mascarado também foi demonstrado na capacidade de mascaramento para diminuir aumentos em citocinas de plasma circulantes, tais como proteína quimioatrativa de monócitos 1, MCP-1. A doses mais altas testadas de Vel-IPV-Ab47 (10 mg/kg) demonstraram níveis similares ao controle e à dose mais baixa de Ab47 testada, 0,1 mg/kg (Figura 39A). Adicionalmente, o mascaramento melhorou a PK da molécula dramaticamente.

Onde a dose de 1 mg/kg de Ab47 foi abaixo do limite de detecção para o ensaio TAb (anticorpo total) genérico no Dia de Estudo 3, 1 mg/kg de Vel-IPV-Ab47 foi detectável através de todo o curso do estudo, Dia de Estudo 15 (Figura 28). O ELISA TAb genérico usa placas de microtitulação de 96 poços revestidas com mAb anti-kappa de cadeia leve humana que se liga a kappa de cadeia leve humana de Ab47 e Vel-IPV-Ab47. Isto não tem reação cruzada com kappa de cadeia leve de macaco cinomolgo.

As amostras de estudo foram diluídas na faixa dinâmica do ensaio para Ab47 (10 (LLOQ) a 1280 ng/ml (ULOQ)) ou Vel-IPV-Ab47 (20 (LLOQ) a 2560 ng/ml (ULOQ)) com plasma em K2EDTA de macaco cinomolgo agrupado virgem.

As amostras diluídas, juntamente com QCs e calibradores, foram submetidas a uma diluição mínima exigida (MRD) de 1:20 com tampão de ensaio antes da adição às placas bloqueadas e lavadas.

Após a incubação durante 1 hora em RT, as placas foram lavadas e o analito ligado (Ab47 ou Vel-IPV-Ab47) foi detectado com mAb anti-kappa de cadeia leve humana biotinilado (clone idêntico como o reagente de captura) seguido da adição de peroxidase de raiz-forte em polímero conjugada com estreptavidina (poli- HRP-SA). Subsequente à incubação e lavagem, o substrato de HRP 3,3’,5,5’-

158 / 177 tetrametil- benzidina (TMB) foi adicionado às placas e a cor desenvolvida durante 10 minutos. A reação foi parada com HCl 1 N e as placas foram lidas num leitor de placas Spectromax M5 a 450 nm a 630 nm. Os valores de absorbância líquidos foram importados para Watson LIMS v. 7.4.2 e uma regressão não linear 5-PL foi realizada para a conversão de absorção para ng/ml de anticorpo total presente nas amostras. Ab47 VERSUS hB6H12.3

[00426] B6H12. 3 humanizado, que apresenta Kd diferencial, Bmax aumentado e hemaglutinação diminuída, foi administrado num único bolus IV a uma dose de 1 mg/kg a macacos cinomolgos para testar a atividade diferencial in vivo. Embora tanto hB6H12.3 como Ab47 a 1 mg/kg resultem em níveis similares de depleção de eritrócito (Figura 29), Ab47 demonstrou também a depleção de aproximadamente 40% de níveis de plaquetas pré-dose a 1 mg/kg, enquanto hB6H12.3 teve apenas uma depleção de 20%, similar aos níveis de controle, provavelmente devido à inclinação de amostragem (Figura 30). Um aumento de plaquetas iniciando no Dia de Estudo 7 ocorreu após o tratamento com ambos os anticorpos, provavelmente devido a uma medula óssea geralmente estimulada. hB6H12.3 VERSUS Vel-IPV-hB6H12

[00427] Para demonstrar a capacidade do mascaramento de Vel-IPV para mitigar a atividade de hB6H12.3, os macacos cinomolgos foram administrados com doses de 10 e 20 mg/kg de anticorpo. O teste de hematologia de 20 mg/kg, a dose mais alta testada, demonstrou diminuições similares em perda de massa de hemácia, como observado com 1 mg/kg de hB6H12.3, entretanto, com tolerabilidade aumentada em relação ao hB6H12.3 não mascarado numa dose 20 vezes menor (Figura 31). De modo similar, o mascaramento de hB6H12.3 também demonstrou reduções em citocinas circulantes, incluindo circulante MCP-1, exigindo 20 vezes a dose de hB6H12.3 mascarado para render respostas similares àquelas obtidos com

159 / 177 hB6H12.3 não mascarado (Figura 39B). Os animais administrados com Vel- IPV-hB6H12.3 não experimentaram sintomas clínicos relacionados ao tratamento, enquanto os sintomas clínicos relacionados à hemólise foram observados com hB6H12.3 não mascarado a 1 mg/kg. A análise farmacocinética usando um ELISA TAb genérico demonstrou um perfil farmacocinético melhorado, em comparação com hB6H12.3 não mascarado (Figura 39C). Vel-IPV-hB6H12.3 SEA-Vel-IPV-hB6H12.3

[00428] Para intensificar ainda mais a atividade da IgG1, anticorpo anti-CD47 mascarado, Vel-IPV-hB6H12.3, o anticorpo foi produzido usando tecnologia patenteada da Seattle Genetics para produzir anticorpos geneticamente manipulados com açúcar, SEA, anticorpos não fucosilados com função efetora intensificada (US 8.163.551). A atividade anti-tumor relativa em modelos de xenoenxerto de Vel-IPV-hB6H12.3 e SEA-Vel-IPV- hB6H12.3, bem como o SEA hB6H12.3 fucosilado e não fucosilado foi avaliada num modelo de macrófago elevado (Detroit562) e baixo (HT1080). A remoção da fucosilação de núcleo e SEA-hB6H12.3 e SEA-Vel-IPV- hB6H12.3 resultante não forneceu evidência de benefícios para a atividade anti-tumor em ambos os modelos (Figuras 40A e 40B). À medida que estes modelos são executados em camundongos incompletos em termos imunológicos, os mesmos não aproveitam a função efetora intensificada conferida com uma cadeia principal de SEA, o anticorpo substituto murino mIAP301 também foi não fucosilado e a atividade anti-tumor com o vel-IPV- mIAP301 fucosilado e não fucosilado foi testada no modelo de linfoma singeneico A20 de alta atividade, bem como o modelo singeneico CT26 de atividade menor. A remoção da fucose de núcleo para produzir o anticorpo SEA não pareceu conferir benefício anti-tumor adicional.

[00429] Embora a tecnologia SEA com outros anticorpos tenha resultado em atividade aumentada, quando o anticorpo é mascarado, tanto as

160 / 177 versões SEA como não SEA são bem toleradas com perda de massa de hemácia similar em análise de hematologia a um nível de dose máximo idêntico testado, 20 mg/kg (Figura 32). Nenhum sinal clínico adverso foi observado durante o tratamento com qualquer anticorpo, entretanto, os níveis de citocina de MCP-1 circulante foram aumentados para o anticorpo SEA (Figura 41A). A análise farmacocinética usando um ELISA TAb genérico demonstrou perfis farmacocinéticos genericamente similares entre anticorpos Vel-IPV-hB6H12.3 SEA e sem SEA, com ambos melhorados em comparação com hB6H12.3 não mascarado (Figura 41B). EXEMPLO 6: TRATAMENTO DE TUMORES EM INDIVÍDUOS COM

BIOMARCADORES SELECIONADOS

[00430] A divulgação prevê ainda o tratamento de indivíduos com tumores com os anticorpos anti-CD47 da invenção com base em biomarcadores selecionados dentro dos referidos indivíduos. A seleção de indivíduos para tratamento com os anticorpos anti-CD47 da invenção será baseada 1) nos níveis mais altos e na atividade de MMPs dentro do tecido de tumor em relação ao tecido sem tumor circundante; 2) nos níveis mais altos de expressão de CD47 no tecido de tumor em relação ao tecido sem tumor circundante; e 3) no nível mais alto de infiltração de macrófagos no tecido de tumor em relação ao tecido sem tumor circundante.

[00431] Os métodos para determinar os níveis e a atividade de biomarcadores selecionados incluem imuno-histoquímica e análise de enzimologia. Por exemplo, os níveis de infiltração de macrófagos pode ser determinado por imuno-histoquímica usando um anticorpo anti-CD163 como um marcador.

[00432] Para demonstrar a capacidade para detectar macrófagos de infiltração de tumor numa amostra de tecido de tumor versus sem tumor, foram usadas amostras de núcleo de câncer da mama e amostras de tecido de mama normal. A imuno-histoquímica foi realizada usando um anticorpo anti-

161 / 177 CD163. Os resultados demonstram que os macrófagos de infiltração de tumor podem ser facilmente detectados em amostras de tumor em relação a amostras sem tumor (Figura 33). EXEMPLO 7: FAGOCITOSE E HEMAGLUTINAÇÃO DE CÉLULAS POSITIVAS PARA CD47 POR Vel-IPV-hB6H12.3

[00433] A fagocitose de RBCs positivas para CD47 foi monitorada a fim de avaliar o impacto do mascaramento da funcionalidade de anticorpo. As hemácias humanas foram marcadas com corante fluorescente vermelho PKH e opsonizadas durante 30 minutos com 1 µg/ml de hB6H12.3 não mascarado, Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado ou Vel-IPV-hB6H12.3 ativado com MMP. As hemácias foram lavadas, então, incubadas com os macrófagos de monócito a uma razão de 10:1 durante duas horas. As amostras foram, então, lavadas três vezes com tampão de lise hipotônico ACK. A extensão de fagocitose foi avaliada mediante o monitoramento da captação de RBCs humanas marcadas de modo fluorescente por macrófagos humanos via citometria de fluxo.

[00434] Conforme mostrado na Figura 42, Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado não exibiu um aumento em fagocitose acima de níveis de fundo de RBCs não tratadas, enquanto tanto hB6H12.3 como Vel-IPV-hB6H12.3 ativado com MMP mostraram níveis similares de fagocitose de RBC.

[00435] A promoção de hemaglutinação de RBCs humanas por anticorpos Ab47 mascarados foi testada conforme descrito no Exemplo 2. As RBCs humanas foram expostas a concentrações crescentes de Vel-IPV-Ab47 mascarado ou Vel-IPV-Ab47 clivada por MMP durante trinta minutos a 37 °C. A hemaglutinação foi monitorada por meio da avaliação óptica do diâmetro do ponto aparente dentro de cada poço.

[00436] Conforme mostrado na Figura 43, a hemaglutinação foi inibida quando Ab47 foi mascarado, e a hemaglutinação foi restaurada quando a máscara foi removida por MMPs. EXEMPLO 8: hB6H12.3 INDUZ APOPTOSE DIRETAMENTE

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[00437] Ligação de CD47 de superfície celular pode induzir apoptose. Foi relatado que clone B6H12 de mAb anti-CD47 pode induzir apoptose apenas quando imobilizado a uma superfície; entretanto, hB6H12.3 demonstrou atividade de apoptose sem ser ligado a uma superfície. Oito linhagens de células diferentes (A431, HEK293, Hela, HepG2, HPAF11, I540Cy, MCF7 e THP1) foram colocadas, cada uma, em placas a 50.000 células por poço durante 24 horas. As células foram tratadas com concentrações de 5 a 0,05 µg/ml de hB6H12.3, 5F9 ou um controle de isótipo de IgG1 durante 18 horas. As células foram, então, coletadas, lavadas duas vezes, manchadas para apoptose com marcador anexina V, e a apoptose foi quantificada usando citometria de fluxo.

[00438] Conforme mostrado na Figura 44, em todos os oito tipos de células, as células tratadas com hB6H12.3 exibiram níveis maiores de apoptose, conforme determinado por níveis relativos de manchamento de anexina, do que as células do mesmo tipo tratadas com 5F9 ou controle de isótipo de IgG1. EXEMPLO 9: ESTABILIDADE DE hB6H12.3 EM SANGUE TOTAL E

PLASMA

[00439] As amostras de sangue total recém-colhidas (citrato de sódio a 4%) a partir de 17 pacientes com vários tipos de cânceres (10 sarcoma, 3 NSCLC, 3 câncer de cólon e 1 melanoma) foram obtidas a partir de BioIVT. Os anticorpos hB6H12.3 e Vel-IPV-hB6H12.3 mascarados foram marcados diretamente com isotiocianato de fluoresceína (FITC). As amostras do sangue total fresco foram incubadas com concentrações crescentes (concentração máxima, 20 µg/ml) de hB6H12.3 marcado com FITC ou Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado marcado com FITC durante 20 horas a 37 °C. A ligação dos anticorpos às células de sangue foi caracterizada por citometria de fluxo.

[00440] Uma porção de cada uma das amostras de sangue total de sarcoma foi usada para extrair plasma, e 20 µg/ml de CD47 recombinante

163 / 177 foram adicionados às amostras de plasma. As amostras de plasma que contém CD47 recombinante foram, então, incubadas com 20 µg/ml de hB6H12.3 ou Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado durante quatro dias a 37 °C. A extensão de clivagem do mascaramento de Vel-IPV foi avaliada usando um ELISA de ligação a CD47, conforme descrito no Exemplo 2. Vel-IPV-hB6H12.3 não se liga a CD47 recombinante na concentração enriquecida em plasma (20 µg/ml); portanto, qualquer ligação de anticorpo-CD47 detectada no plasma incubado com Vel-IPV-hB6H12.3 é devido à ligação de Vel-IPV-hB6H12.3 clivado a CD47.

[00441] Das 17 amostras de sangue testadas, Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado mostrou mais que 10% de ligação a apenas uma amostra atípica (sarcoma, consultar a Figura 45B), na concentração superior. Nenhuma ligação por Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado foi detectada em qualquer uma das outras 16 amostras (dados representativos mostrados na Figura 45A). Conforme mostrado na Figura 45C, não mais que 2% de Vel-IPV-hB6H12.3 mascarado foram clivados em qualquer uma dentre as dez amostras de plasma a partir de pacientes com sarcoma. EXEMPLO 10: PRODUÇÃO DE CITOCINAS EM RESPOSTA A hB6H12.3

[00442] As amostras do sangue total fresco a partir de pacientes de câncer (10 sarcoma, 3 NSCLC, 3 câncer de cólon e 1 melanoma) foram incubadas com concentrações crescentes (concentração máxima, 20 µg/ml) de hB6H12.3 marcado com FITC ou Vel-IPV-hB6H12.3 marcado com FITC ou com 0,1 µg/ml de LPS durante 20 horas a 37 °C. Os níveis de citocinas foram avaliados usando um painel de microesfera magnética de quimiocina e citocina 38-plex.

[00443] Numa maioria de amostras de pacientes testadas, a produção de citocinas modesta foi induzida por hB6H12.3, mas a produção de citocina mínima foi induzida por Vel-IPV-hB6H12.3. As citocinas IP-10, IL1-Ra,

164 / 177 MIP-1Į e MIP-1Į foram mais comumente induzidas por hB6H12.3. Os níveis de IL1-Ra (Figura 46B), MIP-1Į e MIP-1ȕ foram abaixo de 200 pg/ml na concentração máxima de hB6H12.3 testado, enquanto os níveis de IP-10 alcançaram 4000 a 5000 ng/ml (Figura 46A). Os níveis de citocinas produzidos por Vel-IPV-hB6H12.3 foram menores que aqueles produzidos por hB6H12.3 em todos os casos, e foram tipicamente 100 a 1000 vezes menores. EXEMPLO 11: hB6H12.3 INDUZ A APOPTOSE IN VIVO

[00444] Os camundongos nus que contêm xenoenxertos de fibrosarcoma HT1080 foram administrados com uma dose IP de 5 mg/kg de hB6H12. 3, Vel-IPV-hB6H12.3 ou um controle de isótipo de hIgG1 quando os tumores alcançaram 200 mm3. Em determinados pontos no tempo (24 e 96 horas), os camundongos foram sacrificados e os tumores coletados. Os tumores foram homogeneizados e as células de tumor de fibrosarcoma de xenoenxerto HT1080 humano foram ressuspensas em 1 milhão de células/ml em 1 X tampão de manchamento Anexina V (10 x tampão de manchamento contendo HEPES 50 mM, NaCl 700 mM, CaCl2 12,5 mM, pH 7,4, diluído 1:10 em água). As células foram transferidas para uma placa de fundo redondo de 96 poços (100 µl/poço) e 5 ul de reagente de manchamento de anexina V FITC e 1 ul de 100 µg/ml de tampão de manchamento Vivo/Morto ultra-violeta foram adicionados a cada poço. As células foram manchadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 1550 g durante 5 minutos, o sobrenadante foi removido, e as células foram lavadas 3 X com 1 X tampão de manchamento de Anexina V gelado. As células foram ressuspensas em 100 µl de 1 X tampão de manchamento de Anexina V. A apoptose foi avaliada por citometria de fluxo num citômetro LSRII como percentagem de células positivas para a ligação de Anexina V à fosfatidil-serina de superfície. As células que mancharam positivamente com a mancha Vivo/Morto foram excluídas da análise.

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[00445] Conforme mostrado na Figura 47, os tumores tratados tanto com hB6H12.3 como com Vel-IPV-hB6H12.3 exibiram células apoptóticas Anexina V+ aumentadas 96 horas após o tratamento quando comparado com amostras de tumor tratadas com controle de isótipo e não tratadas.

CERTAS MODALIDADES NÃO LIMITANTES

[00446] Modalidade 1. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende: CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY); e um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, em que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[00447] Modalidade 2. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende: CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY); e um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[00448] Modalidade 3. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo

166 / 177 que a variável de cadeia pesada compreende: CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY); e um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[00449] Modalidade 4. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, sendo que a variável de cadeia pesada compreende: CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 16 (GYGMS), 17 (TITSGGTYTYYPDSVKG) e 18 (SLAGNAMDY); e um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[00450] Modalidade 5. O anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a região variável de cadeia leve compreende: CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 31 (RASQTISDYLH), 32 (FASQSIS) e 33 (QNGHGFPRT); e um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 92, em que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[00451] Modalidade 6. O anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno, de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a região variável de cadeia leve compreende: CDRs apresentadas como SEQ ID NOs: 31 (RASQTISDYLH), 32 (FASQSIS) e 33 (QNGHGFPRT); e

167 / 177 um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador, de acordo com a numeração de Kabat.

[00452] Modalidade 7. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que H29 é ocupado por F, H44 é ocupado por R ou G, H49 é ocupado por A, H82 é ocupado por M ou I, H89 é ocupado por I ou V, H91 é ocupado por F ou Y, e H94 é ocupado por R, de acordo com a numeração de Kabat.

[00453] Modalidade 8. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 5, em que L4 é ocupado por M, L21 é ocupado por L, L49 é ocupado por K, L69 é ocupado por T ou S, L85 é ocupado por V ou T, de acordo com a numeração de Kabat.

[00454] Modalidade 9. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[00455] Modalidade 10. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 5, que compreende ainda uma mutação G91A em LCDR3, de acordo com a numeração de Kabat.

[00456] Modalidade 11. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é de um isótipo de IgG1.

[00457] Modalidade 12. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

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[00458] Modalidade 13. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

[00459] Modalidade 14. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, que tem fucosilação de núcleo reduzida em comparação com seu anticorpo parental.

[00460] Modalidade 15. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno bloqueia uma interação entre CD47 e SIRPĮ.

[00461] Modalidade 16. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem hemaglutinação reduzida de hemácias em comparação com seu anticorpo parental.

[00462] Modalidade 17. Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4.

[00463] Modalidade 18. O fragmento de ligação a antígeno da modalidade 1, que compreende um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um fragmento Fv, um diacorpo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de scFv ou um scFv-Fc.

[00464] Modalidade 19. Um método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende um ou mais peptídeos de bobina em espiral que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo

169 / 177 sem o agente de mascaramento.

[00465] Modalidade 20. O método da modalidade 19, em que um ligante clivável por protease fixa o agente de mascaramento ao anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00466] Modalidade 21. O método da modalidade 20, em que o ligante clivável por protease tem uma sequência de aminoácidos que compreende IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) ou GPLGVR (SEQ ID NO: 57).

[00467] Modalidade 22. O método da modalidade 20, em que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

[00468] Modalidade 23. O método da modalidade 22, em que o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir do grupo consistindo num sítio de clivagem de MMP2, num sítio de clivagem de MMP7, num sítio de clivagem de MMP9 e num sítio de clivagem de MMP13.

[00469] Modalidade 24. O método da modalidade 22, em que o agente de mascaramento é liberado do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo subsequente à clivagem de um sítio de clivagem de MMP num microambiente de tumor por uma MMP.

[00470] Modalidade 25. O método da modalidade 24, em que o anticorpo anti-CD47 clivado tem um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem de MMP.

[00471] Modalidade 26. O método da modalidade 25, em que o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

[00472] Modalidade 27. O método da modalidade 19, em que um ou mais peptídeos de bobina em espiral compreendem uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 e 56.

[00473] Modalidade 28. O método da modalidade 19, em que o

170 / 177 anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a CD47 é reduzido pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[00474] Modalidade 29. O método da modalidade 19, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a CD47 é reduzido entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[00475] Modalidade 30. O método da modalidade 19, em que o câncer que expressa CD47 é um câncer hematológico que causa um câncer sólido.

[00476] Modalidade 31. O método da modalidade 30, em que o câncer hematológico é selecionado a partir do grupo consistindo em linfoma não Hodgkin, linfoma B-linfoblástico; leucemia linfocítica crônica de célula B/linfoma linfocítico pequeno, síndrome de Richter, linfoma folicular, mieloma múltiplo, mielofibrose, policitemia vera, linfoma de célula T cutânea, gamopatia monoclonal de significância desconhecida (MGUS), síndrome mielodisplástica (MDS), linfoma de célula grande imunoblástica, linfoma B-linfoblástico precursor, leucemia mieloide aguda (AML) e linfoma de célula grande anaplástica.

[00477] Modalidade 32. O método da modalidade 19, em que o câncer que expressa CD47 é um tumor sólido.

[00478] Modalidade 33. O método da modalidade 32, em que o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer espinhal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de cólon/reto, câncer anal, câncer endometrial, câncer do esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de pele, câncer de próstata, câncer de pituitária, câncer de estômago, câncer uterino, câncer vaginal e câncer de tiroide.

171 / 177

[00479] Modalidade 34. O método da modalidade 32, em que o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, sarcoma de tecido mole, câncer colorretal, câncer da cabeça e pescoço e câncer de mama.

[00480] Modalidade 35. O método da modalidade 19, em que o indivíduo é um ser humano que sofre de um câncer sólido.

[00481] Modalidade 36. O método da modalidade 19, em que o anticorpo anti-CD47 é administrado em combinação com um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune escolhida de uma ou mais de proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante 1 de morte programada (PD- L1), PD-L2, proteína 4 associada ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), imunoglobulina de célula T e domínio de mucina contendo 3 (TIM-3), gene 3 ativação de linfócito (LAG-3), molécula de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM-1), CEACAM-5, supressor de Ig domínio V de ativação de célula T (VISTA), atenuador de linfócito B e T (BTLA), imunorreceptor de célula T com domínios de Ig e ITIM (TIGIT), receptor 1 tipo imunoglobulina associada a leucócito (LAIR1), CD160, 2B4 ou TGFR.

[00482] Modalidade 37. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína de CD47 humano que compreende um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende um ou mais peptídeos de bobina em espiral que compreende a sequência de SEQ ID NO: 95 (QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGS) e/ou SEQ ID NO: 94 (QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGS), e em que o um ou mais peptídeos de bobina em espiral reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno com a proteína de CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a

172 / 177 antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[00483] Modalidade 38. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 37, que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

[00484] Modalidade 39. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 37, em que o agente de mascaramento é fixado ao anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo via um ligante clivável por protease.

[00485] Modalidade 40. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 39, em que o ligante clivável por protease tem uma sequência de aminoácidos que compreende IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) ou GPLGVR (SEQ ID NO: 57).

[00486] Modalidade 41. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 39, em que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

[00487] Modalidade 42. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 41, em que o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir do grupo consistindo num sítio de clivagem de MMP2, num sítio de clivagem de MMP7, num sítio de clivagem de MMP9 e num sítio de clivagem de MMP13.

[00488] Modalidade 43. O anticorpo da modalidade 37, em que o agente de mascaramento é removido do anticorpo anti-CD47 após a clivagem de um sítio de clivagem de MMP por uma MMP.

[00489] Modalidade 44. O anticorpo da modalidade 43, em que o anticorpo anti-CD47 tem um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem de MMP após a clivagem de um sítio de clivagem de MMP por uma

173 / 177 MMP.

[00490] Modalidade 45. O anticorpo da modalidade 44, em que o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

[00491] Modalidade 46. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 37, em que a ligação é reduzida pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[00492] Modalidade 47. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 37, em que a ligação é reduzida entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento.

[00493] Modalidade 48. 48 O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 37, que compreende uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 42 e uma sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 43.

[00494] Modalidade 49. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de qualquer uma das modalidades 37 a 48, que compreende uma região Fc variante que confere função efetora intensificada selecionada a partir da atividade de ADCC e/ou CDC.

[00495] Modalidade 50. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da modalidade 49, que é afucosilado.

[00496] Modalidade 51. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, em que o anticorpo é um isótipo de IgG1.

[00497] Modalidade 52. O anticorpo da modalidade 51, que compreende atividade de ADCC intensificada, ADCP intensificada e/ou CDC intensificada.

[00498] Modalidade 53. Um método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende as etapas de:

174 / 177 a) identificar o indivíduo como tendo níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende peptídeo de bobina em espiral que reduz a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento, se o indivíduo tiver níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante.

[00499] Modalidade 54. O método da modalidade 53, em que a MMP é selecionada a partir do grupo consistindo em: MMP2, MMP7, MMP9 e MMP13.

[00500] Modalidade 55. O método da modalidade 53, em que a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso do indivíduo; ii) detectar MMPs no tecido de câncer isolado e no tecido não canceroso; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[00501] Modalidade 56. Um método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende as etapas de: a) identificar o indivíduo como tendo níveis elevados de CD47 no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende peptídeo de bobina em espiral que reduz a

175 / 177 afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento, se o indivíduo tiver níveis elevados de CD47 no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante.

[00502] Modalidade 57. O método da modalidade 56, em que a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar CD47 no tecido de câncer isolado e tecido não canceroso circundante; e iii) comparar a quantidade de manchamento de CD47 no tecido de câncer em relação ao manchamento de CD47 no tecido não canceroso.

[00503] Modalidade 58. Um método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo que compreende as etapas de: a) identificar o indivíduo como tendo níveis elevados de infiltração de macrófago em tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreendem um agente de mascaramento, em que o agente de mascaramento compreende um ou mais peptídeos de bobina em espiral que reduzem a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ao CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o agente de mascaramento, se o indivíduo tiver níveis elevados de infiltração de macrófago no câncer em relação ao tecido não canceroso.

[00504] Modalidade 59. O método da modalidade 58, em que a etapa a) compreende:

176 / 177 i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar macrófagos no tecido de câncer isolado e em tecido não canceroso; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

[00505] Modalidade 60. O método da modalidade 58, em que o manchamento de macrófago é realizado com um anticorpo anti-CD163.

[00506] Modalidade 61. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD47 humano, que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15, em que o anticorpo compreende ainda a sequência LRSG, SG ou VR na terminação N da HCVR e/ou da LCVR.

[00507] Modalidade 62. Um método para tratar câncer através da administração de uma combinação do anticorpo CD47 mascarado da modalidade 37 com um anticorpo CD40 agonístico.

[00508] Modalidade 63. O método da modalidade 62, em que o anticorpo CD40 agonístico tem níveis baixos de fucosilação, por exemplo, anticorpo SEA-CD40.

[00509] Modalidade 64. Um método para tratar câncer através da administração de uma combinação do anticorpo CD47 mascarado da modalidade 37 com um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC), em que o anticorpo do ADC se liga especificamente a uma proteína que é expressa na superfície extracelular de uma célula de câncer e o anticorpo é conjugado a um ligante de fármaco que compreende um agente citotóxico.

[00510] Modalidade 65. O método da modalidade 64, em que o agente

177 / 177 citotóxico é uma auristatina.

[00511] Modalidade 66. O método da modalidade 64, em que o anticorpo do ADC é conjugado a um ligante de fármaco selecionado a partir do grupo consistindo em vcMMAE e mcMMAF.

Claims

1 / 25 REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 16, 19, 21 e 23; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 17, 20, 22 e 24; e HCDR3 das SEQ ID NO: 18; em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 31 e 34; LCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 32 e 35; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33 e 36; em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

2. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 16, 19, 21 e 23; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 17, 20, 22 e 24; e HCDR3 de SEQ ID NO: 18; em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 31 e 34; LCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 32 e 35; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 33 e 36; em que a região variável de cadeia pesada compreende:

2 / 25 a) um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, e que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; ou c) um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; ou d) um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; e em que a região variável de cadeia leve compreende: c) um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 92, e que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador de acordo com numeração de Kabat; ou d) um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador de acordo com a numeração de Kabat.

3. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 16, 17 e 18; SEQ ID NOs: 19, 20 e 18; SEQ ID NOs: 21, 22 e 18; SEQ ID NOs: 16, 20 e 18; e SEQ ID NOs: 23, 24 e 18.

4. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 31, 32 e

3 / 25 33; SEQ ID NOs: 31, 32 e 36; e SEQ ID NOs: 34, 35 e 33.

5. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 19, 20, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 19, 20, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 21, 22, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 21, 22, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 16, 20, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 16, 20, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 23, 24, 18, 31, 32, e 33; SEQ ID NOs: 23, 24, 18, 34, 35, e 33; SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 31, 32, e 36; SEQ ID NOs: 19, 20, 18, 31, 32, e 36; SEQ ID NOs: 21, 22, 18, 31, 32, e 36; 16, 20, 18, 31, 32, e 36; e SEQ ID NOs: 23, 24, 18, 31, 32, e 36.

6. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 25, 28 e 29; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 26 e 30; e HCDR3 de SEQ ID NO: 27; e em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 37 e 40; LCDR2 da SEQ ID NO: 38; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 39 e 41; em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de

4 / 25 identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

7. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 25, 28, e 29; HCDR2 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 26 e 30; e HCDR3 da SEQ ID NO: 27; e em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 37 e 40; LCDR2 da SEQ ID NO: 38; e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 39 e 41; em que a região variável de cadeia pesada compreende: a) um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, e que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; ou c) um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; ou d) um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; e em que a região variável de cadeia leve compreende: c) um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 92, e que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador de acordo com numeração de Kabat; ou d) um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na

5 / 25 SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador de acordo com a numeração de Kabat.

8. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 25, 26 e 27; SEQ ID NOs: 28, 26 e 27; SEQ ID NOs: 29, 30 e 27; e SEQ ID NOs: 29, 26 e 27.

9. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 37, 38 e 39; SEQ ID NOs: 40, 38 e 39; e SEQ ID NOs: 37, 38 e 41.

10. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 selecionada a partir das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 40, 38, e 39; SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 37, 38, e 41; SEQ ID NOs: 28, 26, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 28, 26, 27, 40, 38, e 39; SEQ ID NOs: 28, 26, 27, 37, 38, e 41; SEQ ID NOs: 29, 30, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 29, 30, 27, 40, 38, e 39; SEQ ID NOs: 29, 30, 27, 37, 38, e 41; SEQ ID NOs: 29, 26, 27, 37, 38, e 39; SEQ ID NOs: 29, 26, 27, 40, 38, e 39; e SEQ ID NOs: 29, 26, 27, 37, 38, e 41.

11. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8.

12. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno

6 / 25 do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 e 15.

13. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve compreendem SEQ ID NOs: 2 e 10; SEQ ID NOs: 3 e 11; SEQ ID NOs: 3 e 12; SEQ ID NOs: 3 e 13; SEQ ID NOs: 3 e 14; SEQ ID NOs: 4 e 11; SEQ ID NOs: 4 e 12; SEQ ID NOs: 4 e 13; SEQ ID NOs: 4 e 14; SEQ ID NOs: 5 e 11; SEQ ID NOs: 5 e 12; SEQ ID NOs: 5 e 13; SEQ ID NOs: 5 e 14; SEQ ID NOs: 6 e 11; SEQ ID NOs: 6 e 12; SEQ ID NOs: 6 e 13; SEQ ID NOs: 6 e 14; SEQ ID NOs: 7 e 11; SEQ ID NOs: 7 e 12; SEQ ID NOs: 7 e 13; SEQ ID NOs: 7 e 14; SEQ ID NOs: 8 e 11; SEQ ID NOs: 8 e 12; SEQ ID NOs: 8 e 13; SEQ ID NOs: 8 e 14; SEQ ID NOs: 3 e 15.

14. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que liga especificamente CD47 humano caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 da SEQ ID NO: 16, HCDR2 da SEQ ID NO: 17 e HCDR3 da SEQ ID NO: 18; e em que a região variável de cadeia leve compreende LCDR1 da SEQ ID NO: 31, LCDR2 da SEQ ID NO: 32 e LCDR3 da SEQ ID NO: 33; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 3 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 13; e em que o anticorpo reduziu a hemaglutinação de hemácias em comparação para

7 / 25 Ab47.

15. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

16. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende: a) um framework de IGHV3-23 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 88, e que as posições de framework H44, H49, H82, H89, H91 e H94 são resíduos de doador de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGHV3-48 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 89, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; ou c) um framework de IGHV3-66 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 90, em que as posições de framework H29, H49 e H82 consistem num resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat; ou d) um framework de IGHV3-74 humana/HJ4 apresentado na SEQ ID NO: 91, em que a posição de framework H49 é um resíduo de doador de acordo com a numeração de Kabat.

17. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que H29 é F, H44 é R ou G, H49 é A, H82 é M ou I, H89 é I ou V, H91 é F ou Y e H94 é R de acordo com numeração de Kabat.

18. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende: a) um framework de IGKV6-21 humana/KJ2 apresentado na

8 / 25 SEQ ID NO: 92, e que as posições de framework L4, L21, L69 e L85 são resíduos de doador de acordo com numeração de Kabat; ou b) um framework de IGKV1-27 humana/KJ2 apresentado na SEQ ID NO: 93, em que as posições de framework L21, L49 e L69 são resíduos de doador de acordo com a numeração de Kabat.

19. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que L4 é M, L21 é L, L49 é K, L69 é T ou S e L85 é V ou T de acordo com a numeração de Kabat.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é de um isótipo de IgG1.

21. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

22. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

23. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem citotoxicidade dependente de complemento (CDC) intensificada em comparação com seu anticorpo parental.

24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo

9 / 25 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um Fab, um Fab', a F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento de scFv ou um scFv-Fc.

25. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo induz apoptose de células que expressam CD47 in vitro e/ou in vivo.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que tem fucosilação de núcleo reduzida em comparação com seu anticorpo parental.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que é afucosilado.

28. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno bloqueia uma interação entre CD47 e SIRPα.

29. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tem hemaglutinação reduzida de hemácias em comparação com Ab47.

30. Sequência de ácidos nucleicos caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

31. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29.

32. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que

10 / 25 compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 28.

33. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que expressa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

34. Método para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 32 ou a 33.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende isolar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

36. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

37. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende: a) identificar um indivíduo como tendo um câncer que expressa CD47; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende: i) isolar tecido de câncer; e ii) detectar CD47 no tecido de câncer isolado.

39. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende:

11 / 25 a) identificar um indivíduo como tendo níveis elevados de infiltração de macrófago em tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar macrófagos no tecido de câncer e no tecido não canceroso isolados; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o manchamento de macrófago é realizado com um anticorpo anti-CD163.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é um câncer hematológico ou um câncer sólido.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 42, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de um linfoma não Hodgkin, linfoma B-linfoblástico; leucemia linfocítica crônica de célula B/linfoma linfocítico pequeno, síndrome de Richter, lindoma folicular, mieloma múltiplo, mielofibrose, policitemia vera, linfoma de célula T cutânea, gamopatia monoclonal de significância desconhecida (MGUS), síndrome mielodisplástica (MDS), linfoma de célula grande imunoblástica, linfoma B-linfoblástico precursor, leucemia mieloide aguda (AML) e linfoma de célula grande anaplástica.

12 / 25

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 42, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer espinhal, câncer cerebral, cervical câncer, endometrial câncer, câncer colorretal, anal câncer, endometrial câncer, câncer do esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, carcinoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, melanoma, câncer de próstata, câncer de pituitária, câncer de estômago, câncer uterino, câncer vaginal e câncer de tiroide.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 42, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir do câncer de pulmão, sarcoma, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer gástrico, melanoma e câncer de mama.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrada em combinação com um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune escolhida de uma ou mais de proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante 1 de morte programada (PD-L1), PD-L2, proteína 4 associada ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), imunoglobulina de célula T e domínio de mucina contendo 3 (TIM-3), gene 3 ativação de linfócito (LAG-3), molécula de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM-1), CEACAM-5, supressor de Ig domínio V de ativação de célula T (VISTA), atenuador de linfócito B e T (BTLA), imunorreceptor de célula T com domínios de Ig e ITIM (TIGIT), receptor 1 tipo imunoglobulina associada a leucócito (LAIR1), CD160, 2B4 ou TGFR.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

13 / 25 36 a 46, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD40 agonístico.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD40 agonístico tem baixos níveis de fucosilação ou é afucosilado.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 48, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrado em combinação com um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC), em que o anticorpo do ADC se liga especificamente a uma proteína que é expressa na superfície extracelular de uma célula de câncer e o anticorpo é conjugado a um ligante de fármaco que compreende um agente citotóxico.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é uma auristatina.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo do ADC é conjugado a um ligante de fármaco selecionado a partir do grupo consistindo em vcMMAE e mcMMAF.

52. Método para induzir apoptose de uma célula que expressa CD47 caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a célula in vitro.

54. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a célula é in vivo.

55. Anticorpo mascarado caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína de CD47 humano e pelo menos um

14 / 25 domínio de mascaramento, em que pelo menos um domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionado a partir das SEQ ID NOs: 44 a 55, 75 a 86, 94 e 95.

56. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um domínio de mascaramento reduz a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno à proteína de CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

57. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é reduzida pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

58. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é reduzida entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

59. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada é ligada a um primeiro domínio de mascaramento; ou em que a cadeia leve é ligada a um segundo domínio de mascaramento; ou em que a cadeia pesada é ligada a um primeiro domínio de mascaramento e a cadeia leve é ligada a um segundo domínio de mascaramento.

60. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID

15 / 25 NOs: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 75, 77, 79, 81, 83, 85 e 94; e o segundo domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51, 53, 55, 76, 78, 80, 82, 84, 86 e 95.

61. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de mascaramento e o segundo domínio de mascaramento são um par de domínios de mascaramento selecionados a partir de: SEQ ID NOs: 44 e 45; SEQ ID NOs: 46 e 47; SEQ ID NOs: 48 e 49; SEQ ID NOs: 50 e 51; SEQ ID NOs: 52 e 53; SEQ ID NOs: 54 e 55; SEQ ID NOs: 75 e 76; SEQ ID NOs: 77 e 78; SEQ ID NOs: 79 e 80; SEQ ID NOs: 81 e 82; SEQ ID NOs: 83 e 84; SEQ ID NOs: 85 e 86; e SEQ ID NOs: 94 e 95.

62. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de mascaramento é ligado à terminação N da cadeia pesada e o segundo domínio de mascaramento é ligado à terminação N da cadeia leve.

63. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 62, caracterizado pelo fato de que cada domínio de mascaramento compreende um ligante clivável por protease e é ligado à cadeia pesada ou cadeia leve por meio do ligante clivável por protease.

64. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

65. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir de um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13.

66. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 64 ou 65, caracterizado pelo fato de que, após a clivagem por uma MMP, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do

16 / 25 mesmo compreende um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem de MMP.

67. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

68. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 67, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

69. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 68, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada ligada a um primeiro domínio de mascaramento e que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve ligada a um segundo domínio de mascaramento e que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.

70. Anticorpo mascarado caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, e pelo menos um domínio de mascaramento.

71. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 44-55, 75 a 86, 94 e 95.

72. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que cada domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 44 a 55, 75 a 86, 94 e 95.

73. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das

17 / 25 reivindicações 70 a 72, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um domínio de mascaramento reduz a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno à proteína de CD47 humano em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

74. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é reduzida pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

75. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é reduzida entre cerca de 200 vezes e cerca de 1500 vezes em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo sem o pelo menos um domínio de mascaramento.

76. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 75, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada é ligada a um primeiro domínio de mascaramento; ou em que a cadeia leve é ligada a um segundo domínio de mascaramento; ou em que a cadeia pesada é ligada a um primeiro domínio de mascaramento e a cadeia leve é ligada a um segundo domínio de mascaramento.

77. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 75, 77, 79, 81, 83, 85 e 94; e o segundo domínio de mascaramento compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51, 53, 55, 76, 78, 80, 82, 84, 86 e 95.

78. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 77,

18 / 25 caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de mascaramento e o segundo domínio de mascaramento são um par de domínios de mascaramento selecionados a partir de: SEQ ID NOs: 44 e 45; SEQ ID NOs: 46 e 47; SEQ ID NOs: 48 e 49; SEQ ID NOs: 50 e 51; SEQ ID NOs: 52 e 53; SEQ ID NOs: 54 e 55; SEQ ID NOs: 75 e 76; SEQ ID NOs: 77 e 78; SEQ ID NOs: 79 e 80; SEQ ID NOs: 81 e 82; SEQ ID NOs: 83 e 84; SEQ ID NOs: 85 e 86; e SEQ ID NOs: 94 e 95.

79. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 78, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de mascaramento é ligado à terminação N da cadeia pesada e o segundo domínio de mascaramento é ligado à terminação N da cadeia leve.

80. Anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que cada domínio de mascaramento compreende um ligante clivável por protease e é ligado à cadeia pesada ou cadeia leve por meio do ligante clivável por protease.

81. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

82. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir de um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13.

83. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que, após a clivagem por uma MMP, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um restante de aminoácido em ponta do sítio de clivagem de MMP.

84. Anticorpo mascarado de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o restante de aminoácido em ponta compreende

19 / 25 a sequência LRSG, SG ou VR na terminação N do anticorpo.

85. Sequência de ácidos nucleicos caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 84.

86. Vetor de expressão caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 85.

87. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 86, ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 78.

88. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que expressa o anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a

84.

89. Método para produzir o anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 76, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 87 ou

88.

90. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que compreende isolar o anticorpo mascarado.

91. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 84.

92. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) identificar um indivíduo como tendo níveis elevados de MMP no câncer em relação ao tecido não canceroso circundante; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 84, em que cada domínio de mascaramento do anticorpo

20 / 25 mascarado compreende um ligante clivável por protease e em que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP).

93. Método de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir de um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13.

94. Método de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizado pelo fato de que o MMP é selecionado a partir do grupo consistindo em: MMP2, MMP7, MMP9 e MMP13.

95. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 a 94, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso do indivíduo; ii) detectar MMPs no tecido de câncer isolado e no tecido não canceroso; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

96. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende: a) identificar um indivíduo como tendo um câncer que expressa CD47; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 84.

97. Método de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende: i) isolar tecido de câncer; e ii) detectar CD47 no tecido de câncer isolado.

21 / 25

98. Método para tratar um câncer que expressa CD47 num indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende: a) identificar um indivíduo como tendo níveis elevados de infiltração de macrófago em tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso; e b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo mascarado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 84.

99. Método de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende: i) isolar o tecido de câncer e tecido não canceroso circundante do indivíduo; ii) detectar macrófagos no tecido de câncer e no tecido não canceroso isolados; e iii) comparar a quantidade de manchamento no tecido de câncer em relação ao tecido não canceroso.

100. Método de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o manchamento de macrófago é realizado com um anticorpo anti-CD163.

101. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 100, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é um câncer hematológico ou um câncer sólido.

102. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de um linfoma não Hodgkin, linfoma B-linfoblástico; leucemia linfocítica crônica de célula B/linfoma linfocítico pequeno, síndrome de Richter, lindoma folicular, mieloma múltiplo, mielofibrose, policitemia vera, linfoma de célula T cutânea, gamopatia monoclonal de significância desconhecida (MGUS), síndrome mielodisplástica (MDS),

22 / 25 linfoma de célula grande imunoblástica, linfoma B-linfoblástico precursor, leucemia mieloide aguda (AML) e linfoma de célula grande anaplástica.

103. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer espinhal, câncer cerebral, cervical câncer, endometrial câncer, câncer colorretal, anal câncer, endometrial câncer, câncer do esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de pele, câncer de próstata, câncer de pituitária, câncer de estômago, câncer uterino, câncer vaginal e câncer de tiroide.

104. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD47 é selecionado a partir de câncer de pulmão, sarcoma, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer gástrico, melanoma e câncer de mama.

105. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 104, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 é administrada em combinação com um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune escolhida de uma ou mais de proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante 1 de morte programada (PD-L1), PD-L2, proteína 4 associada ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), imunoglobulina de célula T e domínio de mucina contendo 3 (TIM-3), gene 3 ativação de linfócito (LAG-3), molécula de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembrionário 1 (CEACAM-1), CEACAM-5, supressor de Ig domínio V de ativação de célula T (VISTA), atenuador de linfócito B e T (BTLA), imunorreceptor de célula T com domínios de Ig e ITIM (TIGIT), receptor 1 tipo imunoglobulina associada a leucócito (LAIR1), CD160, 2B4 ou TGFR.

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106. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 105, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD40 agonístico.

107. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD40 agonístico tem baixos níveis de fucosilação ou é afucosilado.

108. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 107, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é administrado em combinação com um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC), em que o anticorpo do ADC se liga especificamente a uma proteína que é expressa na superfície extracelular de uma célula de câncer e o anticorpo é conjugado a um ligante de fármaco que compreende um agente citotóxico.

109. Método de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é uma auristatina.

110. Método de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o anticorpo do ADC é conjugado a um ligante de fármaco selecionado a partir do grupo consistindo em vcMMAE e mcMMAF.

111. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 110, caracterizado pelo fato de que o anticorpo mascarado compreende pelo menos um domínio de mascaramento que compreende um ligante clivável por protease, e em que o ligante clivável por protease é clivado no microambiente de tumor.

112. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a seguinte clivagem do ligante clivável por protease no microambiente de tumor, o domínio de mascaramento é liberado a partir do anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

113. Método de acordo com a reivindicação 111 ou 112,

24 / 25 caracterizado pelo fato de que o ligante clivável por protease compreende a sequência de aminoácidos IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) ou GPLGVR (SEQ ID NO: 57).

114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 113, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável por protease compreende um sítio de clivagem de MMP.

115. Método de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de MMP é selecionado a partir do grupo consistindo em um sítio de clivagem de MMP2, um sítio de clivagem de MMP7, um sítio de clivagem de MMP9 e um sítio de clivagem de MMP13.

116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 115, caracterizado pelo fato de que, após a liberação do anticorpo anti- CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem um restante de aminoácido em ponta do ligante clivável por protease.

117. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o restante de aminoácido em ponta compreende a sequência de LRSG, SG, ou VR na terminação N do anticorpo.

118. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 117, caracterizado pelo fato de que, após a clivagem no microambiente tumoral, o anticorpo anti-CD47 liberado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a CD47 com uma afinidade pelo menos cerca de 100 vezes mais forte do que a afinidade do anticorpo mascarado para o CD47.

119. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 117, caracterizado pelo fato de que, após a clivagem no microambiente de tumor, o anticorpo anti-CD47 liberado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a CD47 com uma afinidade de 200 vezes a 1500 vezes mais forte do que a afinidade do anticorpo mascarado para CD47.

120. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

25 / 25 36 a 51 e 91 a 119, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo anti-CD47, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, do anticorpo mascarado exibe hemaglutinação reduzida in vitro em comparação com seu anticorpo anti- CD47 parental.

121. Método de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o anticorpo parental é Ab47.

122. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 51 e 91 a 121, caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado não induz a hemaglutinação no indivíduo.

123. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 51 e 91 a 122, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado induz apoptose de células que expressam CD47 in vitro e/ou in vivo.

124. Método de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD47 ou anticorpo mascarado induz apoptose de células que expressam CD47 in vivo.

125. Método de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que as células que expressam CD47 são células cancerosas.