BR112014028507B1 - Anticorpos cd33 e uso dos mesmos para tratar câncer - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS CD33 E USO DOS MESMOS PARA TRATAR CÂNCER A invenção fornece anticorpos murinos, quiméricos e humanizados que se ligam especificamente a CD33. Os anticorpos são úteis para o tratamento e diagnóstico de vários tipos de câncer, bem como para detectar CD33.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido é uma continuação de 13/804,227 depositado em 14 de março de 2013 e reivindica o beneficio do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/649,110, depositado em 18 de maio de 2012.

ANTECEDENTES DE INVENÇÃO

[002] CD33 é uma proteina de membrana de plasma de 67 kDa que se liga ao ácido siálico e é um membro da familia de proteinas de lectina (siglec) semelhante à Ig de ligação ao ácido siálico (SIGLEC). CD33 é conhecida por ser expressa em células mielóides. A expressão de CD33 também tem sido relatada em uma série de células malignas. Apesar da CD33 tem sido direcionada para o tratamento de câncer, por exemplo, a leucemia mielóide aguda, não existe tratamento direcionado com CD33 eficaz atualmente no mercado. A presente invenção resolve estes e outros problemas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[003] São fornecidos aqui anticorpos monoclonais que se ligam especificamente à proteina CD33 humana e métodos de utilizar esses anticorpos para o tratamento de cânceres que expressem a proteina CD33. Os anticorpos complementaridade (CDRs) da SEQ ID NOs: 19, 20 e 21 na região variável de cadeia pesada e as CDRs das SEQ ID NOs: 22, 23 e 24 na região variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, pelo menos uma CDR tem uma substituição de aminoácido conservada. Em algumas modalidades, quaisquer diferenças nas CDRs da região variável de cadeia pesada madura e região variável de cadeia leve madura a partir das SEQ ID NOS:18 e 8, respectivamente, residem nas posições H60-H65. Os anticorpos monoclonais podem ser anticorpos murinos, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo humanizado preferido é o anticorpo h2H12, tal como aqui descrito. Em um aspecto, a invenção é um anticorpo humanizado que inclui CDRs das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21 na região variável de cadeia pesada e CDRs das SEQ ID NOs: 22, 23, e 24 na região variável de cadeia leve e adicionalmente tem uma região variável de cadeia pesada madura com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 18, e uma região de cadeia leve madura com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 8. Além disso, os seguintes residuos de aminoácidos da cadeia pesada são mantidos: H48 é ocupada por I, a posição H66 é ocupada por K, a posição H67 é ocupada por A, a posição H69 é ocupada por L, a posição H71 é ocupada por A, e posição H94 é ocupada por S; e os seguintes residuos de aminoácidos da cadeia leve são mantidos: L22 é ocupada por N, L46 posição é ocupada por T, a posição L69é ocupada por Q, e a posição L71 por Y. Em uma modalidade adicional, o anticorpo humanizado que inclui CDRs de SEQ ID NOs: 19, 20 e 21 na região variável de cadeia pesada e CDRs de SEQ ID NOs: 22, 23, e 24, na região variável da cadeia leve e, adicionalmente, tem uma região variável de cadeia pesada madura com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 18, e uma região de cadeia leve madura com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 8.

[004] Em outra modalidade, o anticorpo humanizado 2H12 tem uma cadeia pesada madura que está fundida com uma região constante da cadeia pesada e uma cadeia leve madura que está fundida com uma região constante de cadeia leve. Em uma modalidade adicional, a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de região constante humana natural e tem ligação reduzida para um receptor Fey relativa à região constante humana natural. Em outra modalidade, a região constante de cadeia pesada é do isotipo IgGl. Exemplos de sequências de aminoácidos da região constante de cadeia pesada incluem SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:29, uma região constante de cadeia pesada com serina substituindo a cisteina na posição 239, (S239C). As sequências de aminoácidos da região constante de cadeia leve exemplares incluem a SEQ ID NO:25.

[005] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18 e uma região variável de cadeia leve madura possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

[006] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é conjugado com um agente citotóxico ou citostático. Em uma modalidade adicional, o anticorpo humanizado é conjugado com um agente citotóxico. Um agente citotóxico pode ser, por exemplo, um ligante do sulco menor do DNA. Uma pirrol[1,4]benzodiazepina (PBD) é um exemplo de um agente citotóxico que é um ligante do sulco menor do DNA que pode ser conjugado com os anticorpos CD33 humanizados aqui descritos. Em uma modalidade, a PBD é conjugada com o anticorpo CD33 através de um ligante clivável de enzima. Em outra modalidade, o agente citotóxico tem a fórmula em que a linha ondulada indica o sitio de ligação ao ligante.

[007] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado possui uma constante de associação para o ser humano ou macaco cynomolgus CD33 de 0,5 a 2 x 109 M-1.

[008] Em um aspecto, a invenção fornece métodos de tratamento de um paciente possuindo ou em risco de ter um câncer que expressa CD33, por administração ao paciente de um regime eficaz de um anticorpo humanizado CD33 tal como aqui descrito. Os cânceres que expressam CD33 incluem a leucemia mielóide aguda (LMA), sindrome mielodisplásica (SMD), leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielomonocitica crônica (LMMC), distúrbios mieloproliferativos crônicos, leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula B (preB-LLA), leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula T (preT-LLA), mieloma múltiplo (MM), doença de mastócitos, ou Sarcoma mielóide. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humanizado ou quimérico que contém as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das SEQ ID NOs: 19, 20 e 21 na região variável de cadeia pesada, e as CDRs de SEQ ID NOs: 22, 23, e 24 na região variável de cadeia leve.

[009] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado com uma região variável de cadeia pesada madura pelo menos 90% idêntica a Hl, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e uma região variável de cadeia leve madura pelo menos 90% idêntica a LG, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8. Em uma modalidade adicional, o anticorpo humanizado possui uma região variável de cadeia pesada madura pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 18, e uma região variável de cadeia leve madura pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N0:8. Em outra modalidade, as posições H48, H66, H67, H69, H71 e H94 da região variável de cadeia pesada estão ocupados por I, K, A, G, A e S, e as posições L22, L46, L69 e L71 da região variável de cadeia leve são ocupados por N, T, Q e Y. Em algumas modalidades, quaisquer diferenças nas CDRs da região variável de cadeia pesada madura e região variável de cadeia leve madura a partir das SEQ ID NOS. 18 e 8, respectivamente, residem nas posições H60-H65.

[010] Em uma modalidade adicional, o anticorpo humanizado possui CDRs da região variável de cadeia pesada madura que são idênticas às da SEQ ID NO: 18 e CDRs da região variável de cadeia leve madura que são idênticas às da SEQ ID NO:8. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado inclui uma região variável de cadeia pesada madura possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18 e uma região variável de cadeia leve madura possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8.

[011] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é conjugado a um agente citotóxico ou citostático. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é conjugado a um agente citotóxico ou citostático. Em uma modalidade adicional, o anticorpo humanizado é conjugado com um agente citotóxico. Um agente citotóxico pode ser, por exemplo, um ligante do sulco menor do DNA. Uma pirrol[1,4]benzodiazepina (PBD) é um exemplo de um agente citotóxico que é um ligante do sulco menor do DNA que pode ser conjugado com os anticorpos CD33 humanizados aqui descritos. Em uma modalidade, a PBD é conjugada com o anticorpo CD33 através de um ligante clivável de enzima. Em outra modalidade, o agente citotóxico tem a fórmula: em que a linha ondulada indica o sitio de ligação ao ligante.

[012] Em outra modalidade, o anticorpo humanizado possui uma constante de associação para o ser humano ou macaco cynomolgus CD33 de 0,5 a 2 x 109 M-1.

[013] Em outra modalidade, o anticorpo humanizado possui uma cadeia pesada madura que está fundida com uma região constante de cadeia pesada e uma cadeia leve madura que está fundida com uma região constante de cadeia leve. Em uma modalidade adicional, a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de região constante humana natural e tem ligação reduzida para um receptor Fey relativa para a região constante humana natural. Em outra modalidade, a região constante de cadeia pesada é do isotipo IgGl. Exemplos de sequências de aminoácidos de região constante de cadeia pesada incluem SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:29 (S239C). As sequências exemplares de aminoácidos da região constante de cadeia leve incluem SEQ ID NO: 25.

[014] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve ou pesada maduras aqui descritas. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada incluem as SEQ ID NOs: 39 a 47; Ácidos nucleicos exemplares que codificam regiões variáveis da cadeia leve incluem as SEQ ID NOs: 32 a 38.

[015] Em um aspecto, a invenção fornece métodos de tratamento de um paciente possuindo ou em risco de ter um câncer que expressa CD33, por administração ao paciente de um regime eficaz de um anticorpo humanizado CD33 tal como aqui descrito. Os cânceres que expressam CD33 incluem a leucemia mielóide aguda (LMA), sindrome mielodisplásica (SMD), leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielomonocitica crônica (LMMC), distúrbios mieloproliferativos crônicos, leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula B (preB-LLA), leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula T (preT-LLA), mieloma múltiplo (MM), doença de mastócitos, ou Sarcoma mielóide. Os anticorpos humanizados são administrados de preferência em uma composição farmacêutica apropriada. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado administrado é conjugado com um agente citotóxico ou citostático. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado administrado é conjugado com um agente citotóxico ou citostático. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado administrado é conjugado com um agente citotóxico. Um agente citotóxico pode ser, por exemplo, um ligante do sulco menor do DNA. Uma pirrol[1,4]benzodiazepina (PBD) é um exemplo de um agente citotóxico que é um ligante do sulco menor do DNA que pode ser conjugada com os anticorpos CD33 humanizados administradas aqui descritos. Em uma modalidade, a PBD é conjugada com o anticorpo CD33 administrado através de um ligante clivável de enzima. Em outra modalidade, o agente citotóxico tem a fórmula: em que a linha ondulada indica o sitio de ligação ao ligante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] As Figuras IA e IB mostram um alinhamento das sequências de aminoácidos de mAb murino parental (referido como m2H12) com as regiões de cadeia pesada 2H12 humanizada (Figura IA) e variável de cadeia leve (Figura IB) .

[017] A Figura 2 mostra os resultados de um ensaio de citotoxicidade in vitro testando a atividade dos conjugados de anticorpos-fármacos derivados de 2H12 (ADC) contra as linhagens de células AML CD33-positivo, HL-60 e HEL 92.1.7. h2H12d foi conjugada com SGD-1910; m2H12 e h2H12 foram conjugadas com SGD-1269. ADC não ligantes de controle (h00d-SGD-1910 e hOO-SGD-1269) foram testados como um controle da especificidade de antigeno. MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicina) é um conjugado bem descrito de fármaco-anticorpo direcionado para CD33, composto por um anticorpo anti-CD33 hP67.6 ligado ao fármaco citotóxico caliqueamicina, e também foi testado.

DEFINIÇÕES

[018] A invenção fornece, inter alia, anticorpos monoclonais que se ligam especificamente à proteina CD33 humana e conjugados da mesma. Os anticorpos são úteis para o tratamento e diagnóstico de cânceres que expressam CD33, bem como a detecção da proteina CD33.

[019] Um anticorpo "isolado" refere-se a um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de componentes do seu ambiente natural e/ou um anticorpo que é produzido de forma recombinante. Um "anticorpo purificado" é um anticorpo que é tipicamente de pelo menos 50% peso/peso puro de proteinas interferentes e outros contaminantes provenientes da sua produção ou purificação, mas não exclui a possibilidade de que o anticorpo monoclonal esteja combinado com um excesso de veículo(s) farmacêutico aceitável ou outro veículo, destinado a facilitar a sua utilização. Proteínas interferentes e outros contaminantes podem incluir, por exemplo, componentes celulares das células a partir da qual um anticorpo é isolado ou produzido de forma recombinante. Algumas vezes, os anticorpos monoclonais são pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95 ou 99% peso/peso puro de proteínas interferentes e contaminantes a partir da produção ou purificação. Os anticorpos aqui descritos, incluindo anticorpos murinos, quiméricos, e humanizados podem ser fornecidos na forma isolada e/ou purificada.

[020] O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. 0 modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma, descrito primeiro por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente Norte-Americana No. 4,816,567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, por exemplo, ou podem ser produzidos por outros métodos. Os anticorpos aqui descritos são anticorpos monoclonais.

[021] A ligação especifica de um anticorpo monoclonal para o seu antigeno alvo significa uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 109 ou 1010 M-1. A ligação especifica é de forma detectável maior em magnitude, e distinguível a partir da ligação não especifica ocorrendo para pelo menos um alvo não relacionado. A ligação especifica pode ser o resultado da formação de ligações entre os grupos funcionais particulares ou de ajuste espacial especifico (por exemplo, o tipo de chave e fechadura), enquanto que a ligação não especifica é geralmente o resultado de forças de van der Waals.

[022] A unidade estrutural básica do anticorpo é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias de polipeptideo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa) . A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento do antigeno. Esta região variável é inicialmente expressa ligada a um peptideo de sinal clivável. A região variável sem o peptideo de sinal é, algumas vezes, referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável de cadeia leve madura, significa uma região variável de cadeia leve sem o peptideo de sinal de cadeia leve. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primeiramente responsável pela função efetora.

[023] As cadeias leves são classificadas ou como kapa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Nas cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região de "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo igualmente uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. (Ver em geral, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins).

[024] As regiões variáveis maduras de cada par de cadeia leve/pesada formam o sitio de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo intacto tem dois sitios de ligação. Exceto nos anticorpos bifuncionais ou biespecificos, os dois sitios de ligação são o mesmo. As cadeias apresentam todas a mesma estrutura geral de regiões de estrutura relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo ligação a um epitopo especifico. A partir de N- terminal para C-terminal, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos para cada dominio está em conformidade com as definições de Rabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), ou Chothia & Desk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat também fornece uma convenção de numeração utilizada amplamente (numeração de Kabat), em que os residuos correspondentes entre diferentes cadeias pesadas ou entre diferentes cadeias leves são designados do mesmo número.

[025] O termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e fragmentos de ligação. Tipicamente, os fragmentos de anticorpos competem com o anticorpo intacto a partir do qual foram derivados pela ligação especifica ao alvo incluindo cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, diacorpos, Dabs, nanocorpos e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou quimica de imunoglobulinas intactas. 0 termo "anticorpo" também inclui um diacorpo (fragmento Fv homodimérico) ou um minicorpo (VL-VH-CH3), um anticorpo biespecifico ou semelhante. Um anticorpo biespecifico ou bifuncional é um anticorpo hibrido artificial dotado de pares de cadeias pesadas/leve diferentes, e dois sitios de ligação diferentes (ver, por exemplo, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al. , J. Immunol., 148:1547- 53 (1992) ) .

[026] O termo "anticorpo" inclui um anticorpo por si só (anticorpo puro) ou um anticorpo conjugado com um agente citotóxico ou fármaco citostático.

[027] O termo "epitopo" refere-se a um sitio em um antigeno ao qual um anticorpo se liga. Um epitopo pode ser formado a partir de aminoácidos contiguos ou aminoácidos não contiguos justapostos por dobragem terciária de uma ou mais proteinas. Os epitopos formados a partir de aminoácidos contiguos são tipicamente mantidos em exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epitopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais normalmente, pelo menos 5 ou 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear 2-dimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

[028] Os anticorpos que reconhecem o mesmo ou epitopos sobrepostos podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para competir com a ligação de outro anticorpo a um antigeno alvo. 0 epitopo de um anticorpo também pode ser definido por cristalografia de raios-X do anticorpo ligado ao seu antigeno para identificar residuos de contato. Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epitopo, se todas as mutações de aminoácidos no antigeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos possuem epitopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzem ou eliminam a ligação do outro. A competição entre anticorpos é determinada através de um ensaio em que um anticorpo em teste inibe a ligação especifica de um anticorpo de referência a um antigeno comum (ver, por exemplo, Junghans et ai, Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um . a , anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) inibe a ligação do anticorpo de referência em pelo menos 50%, mas preferencialmente 75%, 90% ou 99 % como medida em um ensaio de ligação competitiva. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo de referência, e anticorpos que se ligam a um epitopo adjacente suficientemente proximal ao epitopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estereoquimico. Os anticorpos que competem com o anticorpo h2H12 para se ligarem à proteina CD33 humana estão incluidos na presente descrição.

[029] Um anticorpo 2H12 é um anticorpo que se liga especificamente à proteina CD33 humana, e que compreende três regiões determinantes de complementaridades de cadeia pesada (hCDRs): CDR1 de cadeia pesada, por exemplo, SEQ ID NO:19 ou uma sequência que é substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 19, CDR2 de cadeia pesada, por exemplo, SEQ ID NO:20 ou uma sequência que é substancialmente idêntica à SEQ ID NO:20, e CDR3 de cadeia pesada, por exemplo, SEQ ID NO:21 ou uma sequência que é substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 21; e três CDRs de cadeia leve: CDR1 de cadeia leve, por exemplo, SEQ ID NO: 22 ou uma sequência que é substancialmente idêntica à SEQ ID NO:22, CDR2 de cadeia leve, por exemplo, SEQ ID NO: 23 ou uma sequência que é substancialmente idêntica à SEQ ID NO:23, e CDR3 de cadeia leve, por exemplo, SEQ ID NO: 24 ou uma sequência que é substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 24. Os anticorpos 2H12 incluem anticorpos murino 2H12 (m2H12) e anticorpos quiméricos ou humanizados derivados do anticorpo murino 2H12 .

[030] O termo "paciente" inclui individuos humanos e outros mamiferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.

[031] Para efeitos de classificação de substituições de aminoácidos como conservatives ou não conservatives, os aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas) : met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais neutras hidrofilicas): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gin, sua, his, arg; Grupo V (residues que influenciam a orientação da cadeia) : gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservativas constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.

[032] Identidades de sequência percentual são determinadas com sequências de anticorpos maximamente alinhadas pela convenção da numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo submetida (por exemplo, toda a região variável completa de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de seguência percentual entre as regiões de anticorpos submetidos e de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido na região em ambos os anticorpos submetido e de referência, dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para se converter em porcentagem.

[033] As composições ou métodos "compreendendo" um ou mais elementos recitados podem incluir outros elementos não especificamente recitados. Por exemplo, uma composição que compreende o anticorpo pode conter o anticorpo isoladamente ou em combinação com outros ingredientes.

[034] A designação de um intervalo de valores inclui todos os números inteiros dentro, ou que definem o intervalo.

[035] Uma função efetora do anticorpo refere-se a uma função contribuída por um dominio(s) de Fc de um Ig. Essas funções podem ser, por exemplo, citotoxicidade celular dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente de anticorpos, ou citotoxicidade dependente do complemento. Esta função pode ser efetuada, por exemplo, pela ligação de um domínio(s) de Fc efetor a um receptor de Fc em uma célula imune ou com atividade lítica ou fagocítica, ou por ligação de um domínio(s) efetor Fc para os componentes do sistema complemento. Tipicamente, o efeito(s) mediado por células de ligação a Fc ou componentes do complemento resulta na inibição e/ou depleção de células alvo CD33. Regiões Fc de anticorpos podem recrutar células expressando receptor Fc (FcR), e justapô-las com células alvo revestidas com anticorpo. As células que expressam o FcR de superfície para IgGs incluindo FcyRUI (CD16), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD64) podem atuar como células efetoras para a destruição de células de IgG revestidas. Tais células efetoras incluem monócitos, macrófagos, células natural killer (NK) , neutrófilos e eosinófilos. Acoplamento de FcyR por IgG ativa a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou a fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). ADCC é mediada por células efetoras CD16+ através da secreção de proteínas e proteases de formação de poros da membrana, enquanto a fagocitose é mediada por células efetoras CD32+ e CD64+ (ver Fundamental Immunology, 4th ed. , Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207). Além de ADCC e ADCP, regiões Fc de anticorpos ligados às células também podem ativar a via clássica do complemento para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Clq do sistema complemento se liga às regiões Fc de anticorpos quando complexadas com antigenos. A ligação de Clq a anticorpos ligados à célula pode iniciar uma cascata de acontecimentos que envolvem a ativação proteolitica de C4 e C2 para gerar a convertase C3. A divagem de C3 a C3b pela convertase C3 permite a ativação dos componentes terminais do complemento terminais, incluindo C5b, C6, C7, C8 e C9. Coletivamente, estas proteinas formam poros complexos de ataque à membrana nas células revestidas com anticorpo. Estes poros perturbam a integridade da membrana celular, matando a célula alvo (ver Immunobiology, 6th ed. , Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Chapter 2).

[036] O termo "citotoxicidade celular dependente de anticorpos" ou ADCC é um mecanismo para a indução de morte celular que depende da interação de células alvo revestidas com anticorpo com células imunitárias possuindo atividade litica (também referidas como células efetoras). Tais células efetoras incluem células natural killer, monócitos/macrófagos e neutrófilos. As células efetoras se ligam a um dominio(s) efetor Fc de Ig ligada às células alvo através dos seus sitios de combinação com antigeno. A morte da célula alvo revestida com anticorpo ocorre como . . resultado da atividade das células efetoras.

[037] 0 termo "fagocitose celular dependente de anticorpos", ou ADCP refere-se ao processo pelo qual as células revestidas com anticorpo são internalizadas, quer no todo ou em parte por células fagociticas do sistema imunológico (por exemplo, macrófagos, neutrófilos e células dendriticas) que se ligam a um dominio efetor Fc (s) de Ig.

[038] O termo "citotoxicidade dependente do complemento" ou CDC refere-se a um mecanismo para a indução de morte celular, em que um dominio (s) efetor Fc de um anticorpo ligado ao alvo ativa uma série de reações enzimáticas que culminam na formação de buracos na membrana da célula alvo. Tipicamente, os complexos antigeno- anticorpo tais como aqueles em células alvo revestidas com anticorpo se ligam e ativam o componente do complemento Clq, que por sua vez ativa a cascata de complemento que conduz à morte da célula alvo. A ativação do complemento também pode resultar na deposição de componentes do complemento na superficie da célula alvo, que facilitam ADCC através da ligação de receptores do complemento (por exemplo, CR3) em leucócitos.

[039] Um "efeito citotóxico" refere-se ao esgotamento, eliminação e/ou a morte de uma célula alvo. Um "agente citotóxico" refere-se a um agente que tem um efeito citotóxico sobre uma célula.

[040] Os agentes citotóxicos podem ser conjugados a um anticorpo ou administrados em combinação com um anticorpo.

[041] Um "efeito citostático" refere-se à inibição da proliferação celular. Um "agente citostático" refere-se a um agente que tem um efeito citostático sobre uma célula, inibindo assim o crescimento e/ou a expansão de um subconjunto especifico de células. Agentes citostáticos podem ser conjugados a um anticorpo ou administrados em combinação com um anticorpo.

[042] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado ou aprovável por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou listada na Farmacopeia Norte-Americana ou outras farmacopeias geralmente reconhecidas para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo "ingrediente farmaceuticamente compatível" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veiculo farmacologicamente aceitável, com o qual um anticorpo anti- CD33 é administrado a um indivíduo.

[043] A expressão "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais farmaceuticamente aceitáveis orgânicos ou inorgânicos de um anticorpo anti-CD33-l ou conjugado do mesmo, ou agente administrado com um anticorpo anti-CD33-l. Os sais exemplares incluem sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p toluenossulfonato e pamoato (ou seja, 1,1'metileno-bis-(2-hidróxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula, tal como um ion acetato, ion succinato ou outro contra-ion. O contra-ion pode ser qualquer radical orgânico ou inorgânico, que estabiliza a carga do composto de origem. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais do que um átomo carregado na sua estrutura. Os casos em que vários átomos carregados fazem parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter vários contra-ions. Assim, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-ion.

[044] A menos de outro modo evidente do contexto, o termo "cerca" engloba valores dentro de um desvio padrão de um valor estabelecido.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Geral

[045] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao CD33. Os anticorpos são úteis para o tratamento e diagnóstico de vários cânceres, bem como a detecção de CD33.

II. Moléculas-alvo

[046] A menos que indicado de outra forma, CD33 significa um CD33 humano. Uma sequência humana exemplar é atribuida ao número de acesso Swiss Prot P20138. P20138 é aqui incluida como SEQ ID NO:55. P20138 inclui um peptideo sinal, os aminoácidos 1 a 17; um dominio extracelular com dominios de IgG-semelhantes, os aminoácidos 18 a 259; um dominio transmembranar, aminoácidos 260 a 282; e um dominio citoplasmático, aminoácidos 283 a 364. A menos que evidente de outra forma a partir do contexto o CD33 de referência significa, pelo menos, um dominio extracelular da proteina e, geralmente, a proteina completa que não seja um peptideo de sinal clivável (aminoácidos 1 a 17 de P20138).

III. Anticorpos da invenção Especificidade de ligação e propriedades funcionais

[047] A invenção fornece um anticorpo murino, m2H12, e anticorpos quiméricos ou humanizados derivados de m2H12. Os anticorpos murinos foram selecionados quanto à capacidade para se ligar a ambas proteina CD33 humana e proteina CD33 de cynomolgus. Sequências de aminoácidos da CD33 de cynomolgus são fornecidas como as SEQ ID NOs: 56 e 57 .

[048] A afinidade de formas humanizadas ou quiméricas do anticorpo murino m2H12 (isto é, Ka) pode ser maior do que a do anticorpo m2H12, ou dentro de um fator de cinco ou de um fator de dois (isto é, mais do que ou menor que) daquela do anticorpo murino m2H12 para a CD33 humana. Um método de medir a afinidade de um anticorpo para o seu antigeno alvo é através da determinação da constante de dissociação aparente de um anticorpo. A presente invenção abrange anticorpos (por exemplo, as formas quiméricas e humanizadas do anticorpo de camundongo 2H12) tendo uma constante de dissociação aparente que é essencialmente a mesma que a do murino 2H12 (isto é, dentro do erro experimental), bem como anticorpos que possuem uma constante de dissociação inferior ou mais elevada do que a do anticorpo murino 2H12 para a CD33 humana. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção (por exemplo, as formas quiméricas, humanizadas e humanas do anticorpo de camundongo 2H12) têm uma constante de dissociação aparente no intervalo de 0,1 a 10 vezes, ou de preferência dentro de um intervalo de 0,1 a 5 vezes, 0,1 a 2 vezes, ou mesmo de 0,5 a 2 vezes maior do que a constante de dissociação aparente do anticorpo murino 2H12 para o CD33 humano. Em alguns aspectos, a constante de dissociação aparente (Kd) dos anticorpos para CD33 humano está de preferência no intervalo de 0,1 nM a 50 nM, ainda mais preferencialmente no intervalo de 0,1 nM a 25 nM, ainda de preferência dentro de um intervalo de 0,1 nM a 10 nM, 0,5 nM a 5 nM, OU 0,5 nM a 2,5 nM. Anticorpos quiméricos ou humanizados m2H12 ligam-se especificamente ao CD33 humano na forma nativa e/ou na forma expressa recombinantemente a partir de células CHO, conforme faz o anticorpo murino m2H12 a partir daquelas as quais foi derivado. Anticorpos quiméricos ou humanizados m2H12 se ligam ao mesmo epitopo e/ou competem com m2H12 para a ligação ao CD33 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados ou quiméricos m2H12 também se ligam ao cyno-homólogo de CD33, permitindo assim testes pré-clinicos em primatas não humanos.

[049] Os anticorpos preferidos (por exemplo, anticorpos humanizados ou quiméricos m2H12) inibem o câncer (por exemplo, crescimento, metástase de células e/ou letalidade para os organismos) como mostrado em células cancerosas em cultura de propagação, em um modelo animal ou ensaio clinico. Os modelos animais podem ser formados através da implantação de linhagens de células tumorais humanas que expressam CD33, ou de células tumorais do paciente primário em estirpes adequadas de roedores imunodeficientes, por exemplo, camundongos puros atimicos, NSG, ou camundongos SCID. Estas linhagens de células de tumor podem ser estabelecidas em hospedeiros roedores imunodeficientes ou como tumores sólidos por injeções subcutâneas. ou como tumores disseminados por injeções 28/111 intravenosas. Uma vez estabelecidos dentro de um hospedeiro, estes modelos de tumor podem ser aplicados para avaliar as eficácias terapêuticas dos anticorpos anti-CD33 ou formas conjugadas dos mesmos, tal como descrito nos Exemplos.

B. Anticorpos

[050] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado em que as CDRs a partir de um anticorpo "doador" não-humano são enxertadas em sequências de anticorpo "receptor" humano (ver, por exemplo, Queen, US 5,530,101 e 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; e Foote, US 6,881,557). As sequências de anticorpo receptor podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpos humana madura, um compósito de tais sequências, uma sequência de consenso de sequências de anticorpos humanos, ou uma sequência de uma região de linhagem germinal. Uma sequência receptora preferida para a cadeia pesada é a linhagem germinal VH éxon VH 1-18 e para a J éxon (JH) , éxon JH~6. Para a cadeia leve, uma sequência receptora preferida é a éxon VL1-16 J éxon JK-4 . Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo possuindo algumas ou todas as CDRs totalmente ou substancialmente a partir de um anticorpo doador não humano e as sequências estruturais da região variável e as regiões constantes, se presentes, no todo ou substancialmente a partir das sequências de anticorpos humanos. Da mesma forma, uma cadeia pesada humanizada tem pelo menos uma, duas e, geralmente, todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente a partir de uma cadeia pesada do anticorpo doador, e uma sequência de estrutura de região variável de cadeia pesada e de região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente a partir da estrutura de região variável de cadeia pesada humana e sequências de região constante. Da mesma forma uma cadeia leve humanizada tem, pelo menos, uma, duas e, geralmente, todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente a partir de uma cadeia leve do anticorpo doador, e uma sequência de estrutura da região variável de cadeia leve e região constante de cadeia leve, se presente, substancialmente a partir da estrutura da região variável de cadeia leve humana e sequências da região constante. Exceto os nanocorpos e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. Uma CDR em um anticorpo humanizado ou humano é substancialmente a partir de ou substancialmente idêntica a uma CDR correspondente em um anticorpo não humano quando, pelo menos, 60%, 85%, 90%, 95% ou 100% dos residuos correspondente (como definido por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs. Em algumas modalidades, uma CDR em um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano é substancialmente a partir de ou substancialmente idêntica a uma CDR correspondente em um anticorpo não humano, quando não há mais de 3 substituições de aminoácidos conservativas em cada CDR. As sequências de estrutura de região variável de uma cadeia de anticorpo ou a região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente a partir de uma sequência de estrutura de região variável humana ou região constante humana, respectivamente, quando, pelo menos, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de residues correspondentes definidos por Kabat são idênticos. Em alguns anticorpos humanizados da presente invenção, há pelo menos uma retromutação de 2H12 murino na região estrutural variável da cadeia pesada do anticorpo. Embora os anticorpos humanizados muitas vezes incorporem todas as seis CDRs (de preferência, tal como definidas por Kabat) a partir de um anticorpo de camundongo, eles também podem ser feitos com menos do que todas as CDRs (por exemplo, pelo menos 3, 4, ou 5) CDRs de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320:415-428, 2002; Iwahashi et al. , Mol Immuno. 36:107 9-1091, 1999; Tamura et al. , Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).

[051] Certos aminoácidos a partir dos residues estruturais da região variável humana podem ser selecionados para substituição com base na sua possivel influência na conformação da CDR e/ou ligação ao antigeno. Investigação de tais possiveis influências é por modelação, análise das características dos aminoácidos em determinadas localizações, ou observação empirica dos efeitos de substituição ou mutagênese de determinados aminoácidos.

[052] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um residuo de estrutura de região variável murina e um residuo de estrutura de região variável humana selecionada, o aminoácido da estrutura humana pode ser substituído pelo aminoácido da estrutura equivalente do anticorpo de camundongo quando for razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) liga-se de forma não covalente diretamente ao antigeno, (2) é adjacente a uma região CDR, (3) interage de outra forma com uma região CDR (por exemplo, está dentro de cerca de 6 Â de uma região CDR); ou (4) medeia a interação entre as cadeias pesadas e leves.

[053] A invenção fornece formas humanizadas do anticorpo de camundongo m2H12 incluindo nove regiões maduras variáveis de cadeia pesada humanizada exemplificadas (HA-HI) e sete regiões maduras variáveis de cadeia leve humanizada exemplificadas (LA-GL). As permutações dessas cadeias que têm a ligação mais forte (menor EC50) são HCLA, HCLE, HCLG, HILA, HILE e HILG. Destas permutações, HILG (também conhecida como h2H12) é preferida porque tem a ligação mais forte.

[054] A invenção fornece anticorpos 2H12 nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90% de identidade com HA (SEQ ID NO: 10) e uma região variável de cadeia leve pelo menos 90% de identidade com LA (SEQ ID NO: 2) . Em alguns aspectos, o anticorpo é um anticorpo humanizado, e há pelo menos uma retromutação 2H12 murina na região estrutural variável da cadeia pesada. Em outros aspectos, o anticorpo é um anticorpo humanizado, e há pelo menos uma retromutação 2H12 murina na região estrutural variável da cadeia leve. Além disso, a invenção fornece anticorpos 2H12, nos quais a região variável da cadeia pesada humanizada mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10 a 18, e a região variável da cadeia leve humanizada mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 2 a 8 e quaisquer combinações destas (isto é, o anticorpo pode compreender qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada em par com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve). Por exemplo, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a região variável da cadeia leve humanizada mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a região variável da cadeia leve apresenta, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a cadeia leve da região variável mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a cadeia leve da região variável mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a cadeia leve da região variável mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Em uma outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a cadeia leve da região variável mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%. 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a cadeia leve da região variável mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, a invenção fornece anticorpos nos quais a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, ou 18, e a cadeia leve da região variável mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8.

[055]Em alguns aspectos, estes anticorpos são anticorpos humanizados e algumas ou todas as retromutações nos respectivos anticorpos são retidas. Em alguns anticorpos a posição H94 é ocupada por S. Em alguns anticorpos, de preferência, pelo menos uma das posições H48, H66, H67, H69, H71, e H94 é ocupada pelo aminoácido a partir da posição correspondente do anticorpo murino 2H12. Opcionalmente, em qualquer tal anticorpo, a posição H48 é ocupada por I; posição H66 é ocupada por K; posição H67 é ocupada por A; posição H69 é ocupada por L; posição H71 é ocupada por A; posição H94 é ocupada por S. Em outras modalidades em tais anticorpos, de preferência, pelo menos uma das posições L22, L46, L69, e L71 é ocupada pelo aminoácido a partir da posição correspondente do anticorpo murino 2H12. Opcionalmente, em qualquer tal anticorpo, a posição L22 é ocupada por N; a posição L46 é ocupada por T; a posição L69 é ocupada por Q; e a posição L71 é ocupada por Y.

[056] De preferência, em qualquer um dos anticorpos descritos acima, por exemplo, anticorpos humanizados 2H12 em que a região variável da cadeia pesada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOS: 10 a 18 e a região variável da cadeia leve apresenta, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NOS: 2 a 8, as regiões de CDR são idênticas ou Substancialmente idênticas para as regiões CDR do anticorpo doador de camundongo, ou seja, anticorpo 2H12 murino (SEQ ID NOS: 19 a 24) . As regiões CDR são como definidas por Kabat. Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos HCLA, HCLE, HCLG, HILA, HILE, e HILG.

[057] A invenção fornece variantes do anticorpo humanizado HILG em que a região variável de cadeia pesada madura humanizada apresenta, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 18, e a região variável madura da cadeia leve humanizada mostra, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas de tais anticorpos, a posição H94 é ocupada por S. De preferência, em tais anticorpos, algumas ou todas as retromutações em HILG são retidas. Em outras palavras, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, ou, de preferência todas as 6, de posições de cadeia pesada H48, H66, H67, H69, H71, e H94 são ocupadas por I e KeAeLeAeS , respectivamente. Além disso, pelo menos 1, 2, 3, ou de preferência todas as 4 das posições cadeia leve L22, L46, L69, e L71 são ocupadas por N e T e Q e Y respectivamente. As regiões CDR de tais anticorpos humanizados são de preferência substancialmente idênticas às regiões CDR de HILG, que são as mesmas que as do anticorpo de camundongo doador. As regiões de CDR podem ser definidas por qualquer definição convencional (por exemplo, Chothia) , mas são, de preferência, tal como definido por Kabat. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada que compreende as três CDRs das SEQ ID NO: 18 e as estruturas da região variável com pelo menos 95% de identidade para as estruturas da região variável de SEQ ID NO: 18. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve que compreende as três CDRs das SEQ ID NO: 8 e as estruturas da região variável com pelo menos 95% de identidade com as estruturas da região variável de SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada que compreende as três CDRs das SEQ ID NO: 18 e estruturas da região variável com pelo menos 95% de identidade com as estruturas da região variável de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo as três CDRs das SEQ ID NO: 8, e estruturas da região variável com pelo menos 95% de identidade com as estruturas da região variável de SEQ ID NO: 8.

[058] Na medida em que os anticorpos humanizados apresentem variação do anticorpo humanizado HILG exemplificado, uma possibilidade para tal variação adicional são retromutações adicionais nas estruturas da região variável. Qualquer uma ou todas as posições de retromutações em outras regiões variáveis maduras de cadeias pesada ou leve humanizadas exemplificadas podem também ser feitas (ou seja, 1, 2, 3, 4, ou todas 5 de H38 ocupada por N, H40 ocupada por R, H73 ocupada por K, H82A ocupada por S, H83 e ocupada por T na cadeia pesada e um ou ambos de L3 ocupada por K, e L20 ocupada por I na cadeia leve. No entanto, tais retromutações adicionais não são preferidas porque, em geral, não melhoram a afinidade, e a introdução de mais residuos de camundongo podem dar aumento do risco de imunogenicidade.

[059] Outra variação possivel é a de substituir certos residuos nas CDRs do anticorpo de camundongo com as sequências de residuos correspondentes de CDRs humanas, tipicamente a partir das CDRs das sequências aceitadoras humanas utilizadas na concepção dos anticorpos humanizados exemplificados. Em alguns anticorpos apenas uma parte das CDRs, a saber, o subconjunto de residuos de CDR necessários para a ligação, os chamados SDRs, são necessários para manter a ligação de um anticorpo humanizado. Residuos de CDRs não contatam o antigeno e não nos SDRs podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os residuos H60-H65 em CDR H2 frequentemente não são necessários), a partir de regiões de CDRs de Rabat que se encontram fora de voltas hipervariáveis de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol, 196:901, 1987), por modelação molecular e/ou empiricamente, ou como descrito em Gonzales • - -anticorpos humanizados em posições nas quais um ou mais residues de CDRs doadores está ausente ou em que um doador de toda CDR é omitido, o aminoácido que ocupa a posição pode ser um aminoácido que ocupa a posição correspondente (por numeração de Kabat) na sequência de anticorpo aceitador. O número de tais substituições de aceitador para doador de ácidos aminados nas CDRs para incluir reflete um equilíbrio de considerações concorrentes. Tais substituições são potencialmente vantajosas na diminuição do número de ácidos aminados do camundongo em um anticorpo humanizado e, consequentemente, diminuir a imunogenicidade potencial. No entanto, as substituições também pode causar mudanças de afinidade, e reduções significativas na afinidade são preferencialmente evitadas. Posições de substituição dentro de CDRs e aminoácidos para substituir também pode ser selecionadas empiricamente.

[060] Apesar de outras substituições de aminoácidos não preferidos puderem ser feitas, por exemplo, nos residues estruturais não em contato com as CDRs, ou mesmo alguns potenciais residuos de contato com CDRs, os aminoácidos dentro das CDRs. Muitas vezes, as substituições feitas nas sequências variantes humanizadas são conservadoras no que diz respeito aos aminoácidos HILG substituídos, no caso dos anticorpos humanizados 2H12. De preferência, as substituições relativas para HILG (quer sejam ou não conservadoras) não têm qualquer efeito substancial sobre a afinidade de ligação ou a potência do mAb humanizado, isto é, a sua capacidade para ligar CD33 humano e inibir o crescimento de células cancerosas.

[061] As variantes diferem tipicamente as sequências de regiões maduras variáveis de cadeia pesada e leve de HILG (h2H12) por um pequeno número (por exemplo, normalmente não mais do que 1, 2, 3, 5 ou 10 em qualquer região variável de cadeia leve ou cadeia pesada madura, ou ambas) de substituições, deleções ou inserções.

[062] Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados ou quiméricos têm uma CDR H2 com até 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições, deleções ou inserções em relação ao CDR H2 da cadeia pesada Hl, e CDRs Hl, H3, LI , L2 e L3, cada uma tem até 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções em relação à correspondente CDR de cadeia pesada Hl ou cadeia leve LG. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados ou quiméricos da invenção têm uma, no máximo duas substituições de aminoácidos conservadas de aminoácido (s) que são identificadas como parte de uma CDR. Exemplos de substituições de aminoácidos preferidas incluem as seguintes. Em CDR1 da cadeia leve, um residuo R pode ser substituído por um K na posição 24; G, S, ou T podem ser substituído por A na posição 25; M pode ser substituído por G na posição 33; e T pode ser substituído por S na posição 34. A CDR2 da cadeia leve, um resíduo K pode ser substituído por um resíduo R na posição 53; um resíduo M pode ser substituído por um resíduo 1 na posição 54; um resíduo I pode ser substituído por um resíduo V na posição 55; e um resíduo E pode ser substituído por um resíduo D na posição 56. Em CDR2 da cadeia pesada, um resíduo D pode ser substituído por um resíduo E na posição 61; um resíduo R pode ser substituído por um resíduo K na posição 62; um resíduo Y pode ser substituído por um resíduo F na posição 63; um resíduo R pode ser substituído por um resíduo K na posição 64; e um resíduo de G pode ser substituído por um resíduo A na posição 65.

[063] Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados da invenção compreendem uma região variável da cadeia pesada madura de SEQ ID NO: 18, com uma, duas ou três substituições conservativas nem uma sequência de CDRs conforme listado acima. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados da invenção compreendem uma região variável de cadeia leve madura de SEQ ID NO: 8, com com uma, duas ou três substituições conservativas em uma sequência de CDR conforme listado acima.

C. Seleção da Região Constante

[064] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos humanizados podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante humana. A escolha de uma região constante depende, em parte, se citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente do anticorpo e/ou citotoxicidade dependente de complemento são desejadas. Por exemplo, os isótopos humanos IgGl e IgG3 possuem forte citotoxicidade dependente do complemento, isotipos IgG2 humanos fraca citotoxicidade dependente do complemento, e o IgG4 humano carece de citotoxicidade dependente do complemento. IgGl e IgG3 humano também induzem funções efetoras mediadas por células mais forte do que o IgG2 e IgG4 humana. Regiões constantes da cadeia leve podem ser lambda ou kapa. Os anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros contendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, como cadeias pesadas separadas, cadeias leves, como Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, ou como anticorpos de cadeia simples, em que os dominios variáveis de cadeia pesada e leve estão ligados através de um espaçador.

[065] As regiões constantes humanas mostram variação alotipica e variação isoalotipica entre diferentes indivíduos, ou seja, as regiões constantes podem ser diferentes em diferentes indivíduos em uma ou mais posições polimórficas. Isoalotipos diferem dos alotipos em que o soro reconhecendo um isoalotipo se liga a uma região não polimórfica de um outro ou outros isotipos.

[066] Um ou vários aminoácidos no terminal amino -ou carbóxi da cadeia leve e/ou cadeia pesada, tal como a lisina C-terminal da cadeia pesada, podem ser derivatizados ou perdidos em uma proporção ou a totalidade das moléculas. As substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora, tais como citotoxicidade mediada pelo complemento ou ADCC (ver, por exemplo, Winter et al., US Patent No. 5,624,821; Tso et al., US Patent No. 5,834,597; and Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia- vida nos seres humanos (ver, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004 ).

[067] Exemplos de substituição incluem a substituição de aminoácidos do aminoácido nativo por um residuo de cisteina que é introduzida na posição do aminoácido 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, ou 332, de preferência uma mutação S239C em um isotipo de IgGl humano (a numeração está de acordo com o indice da UE (Kabat, as sequências de proteínas de imunológica (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991); ver US 20100158909, que é aqui incorporada como referência. A presença de um residuo de cisteina adicional permite a formação de ligações dissulfureto intercadeias. Tal formação de ligações dissulfureto intercadeias pode causar impedimento estérico, reduzindo, assim, a afinidade da -interação de ligação da região Fc para FcyR- O residue (s) de cisteina introduzido no, ou em proximidade com a região Fc de uma região constante de IgG também pode servir como local para a conjugação de agentes terapêuticos (por exemplo, o acoplamento de fármacos citotóxicos utilizando reagentes específicos do tiol, tais como derivados de maleimidas de fármacos). A presença de um agente terapêutico causa o impedimento estérico, desse modo reduzindo ainda mais a afinidade da interação de ligação da região Fc para FcyR. Outras substituições em qualguer uma das posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduzem a afinidade para os receptores Fcyz particularmente o receptor FcyRI {ver, por exemplo, US 6,624,821, US 5,624,821.)

[068] O tempo de meia-vida in vivo de um anticorpo pode também influenciar as suas funções efetoras. A meia- vida de um anticorpo pode ser aumentada ou diminuída para modificar as suas atividades terapêuticas. FcRn é um receptor que é estruturalmente semelhante ao antigeno MHC de classe I que se associa não covalentemente com β2- microglobulina. FcRn regula o catabolismo de IgG e a sua transcitose através dos tecidos ((Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). A interação de IgG-FcRn ocorre a pH 6,0 (pH de vesículas intracelulares), mas não a pH 7,4 (o pH do sangue) ; esta interação permite que IgGs ser • - 'reciclados de volta para a circulação (Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). A região de IgGl humana envolvida na ligação a FcRn foi mapeada (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). As substituições de alanina nas posições Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, ou Asn434 de IgGl humano melhoram a ligação (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Moléculas IgGl que abrigam estas substituições têm meia- vida mais longa no soro. Por conseguinte, estas moléculas IgGl modificadas podem seres capaz de desempenhar as suas funções efetoras, e, por conseguinte, exercerem as suas eficácias terapêuticas, durante um longo periodo de tempo em comparação com IgGl não modificado. Outras substituições exemplificativas para aumentar a ligação ao FcRn incluem um Gin na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428. A numeração EU é utilizada para todas as posições da região constante.

[069] Os oligossacarideos ligados de forma covalente ao Asn297 conservado estão envolvidos na capacidade da região Fc de uma IgG para ligar FcyR (Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol. 15:26-31). Engenharia desta glicoforma de IgG pode melhorar significativamente a ADCC mediada por IgG. A adição de modificações N- acetilglucosamina de bissectoras (Umana et al., 1999, Nat. • - 'Biotechnol. 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94) para esta glicoforma ou remoção de fucose (Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33) por esta glicoforma são * dois exemplos de engenharia IgG Fc gue melhora a ligação entre IgG Fc e FcyR, aumentando, assim, a atividade de ADCC mediada por Ig.

[070] A substituição sistemática de aminoácidos expostos ao solvente da região IgGl Fc humana gerou variantes de IgG com as afinidades de ligação FcyR alteradas (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591- 604) . Quando comparada com a de IgGl parental, um subconjunto destas variantes que envolvem substituições em Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334, ou Ser298/Glu333/Lys334 para Ala demonstram aumento em ambas afinidade de ligação para FcyR e atividade de ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336:1239-49). .

[071] A atividade de fixação ao complemento dos anticorpos (tanto de ligação de Clq e atividade CDC) pode ser melhorada através de substituições em Lys326 e Glu333 (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-2575). As mesmas substituições em uma cadeia principal de IgG2 humana - - pode converter um isotipo de anticorpo que se liga fracamente a Clq e é severamente deficiente em atividade de ativação do complemento para uma que pode ligar tanto a Clq e mediar CDC (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:257175) . Vários outros métodos também foram aplicados para melhorar a atividade de fixação do complemento de anticorpos. Por exemplo, o enxerto de uma parte da cauda do terminal carboxila do aminoácido 18 de IgM para o terminal carboxila de IgG aumenta grandemente a sua atividade de CDC. Isto é observado ainda com IgG4, que normalmente não tem qualquer atividade detectável de CDC (Smith et al., 1995, J. Immunol. 154:2226-36). Além disso, substituinte Ser444 localizado perto do terminal carbóxi da cadeia pesada de IgGl com dimerização cauda-a-cauda induzida por Cys de IgGl com um aumento de 200 vezes de atividade de CDC sobre IgGl monomérico (Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22). Além disso, um constructo de diacorpo biespecifico com especificidade para Clq confere igualmente a atividade de CDC (Kontermann et al., 1997, Hat. Biotech. 15:629-31).

[072] A atividade do complemento pode ser reduzida por mutação de pelo menos um dos residuos de aminoácidos 318, 320, e 322 da cadeia pesada de um residuo possuindo uma cadeia lateral diferente, tal como Ala. Outros residuos não iônicos alquil-subst ituidos, tais Gly, Ile, Leu, ou - 'Vai, ou tais resíduos não-polares aromáticos como Phe, Tyr, Trp e Pro no lugar de qualquer um dos três resíduos também reduzir ou abole a ligação de Clq. Ser, Thr, Cys, e Met podem ser usados nos resíduos 320 e 322, mas não 318, para reduzir ou abolir a atividade de ligação de Clq. A substituição do resíduo 318 (Glu) por um resíduo polar pode modificar, mas não abolir a atividade de ligação Clq. Substituir o resíduo 297 (Asn) por Ala resulta na remoção da atividade lítica, mas apenas reduz ligeiramente (cerca de três vezes mais fraca) a afinidade para Clq. Esta alteração destrói o sítio de glicosilação e a presença de carboidratos que é necessária para a ativação do complemento. Qualquer outra substituição nesse local também destrói o sítio de glicosilação. As seguintes mutações e qualquer combinação das mesmas também reduzem a ligação Clq D270A, K322A, P329A, e P311S (ver WO 06/036291). Referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alotipo natural ou qualquer permutação de resíduos que ocupam posições polimórficas dos alotipos naturais. Além disso, até 1, 2, 5, ou 10 mutações podem estar presente em relação a uma região constante humana natural, tais como as indicadas acima, para reduzir a ligação do receptor Fc gama ou aumentar a ligação ao FcRn.

D. Expressão de Anticorpos Recombinantes

[073] Os anticorpos humanizados ou quiméricos são geralmente produzidos por expressão recombinante. Constructos de polinucleotideos recombinante tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão operativamente ligada às sequências de codificação de cadeias de anticorpo, incluindo naturalmente associadas ou regiões de promotor heterólogas. De preferência, as sequências de controle de expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão de elevado nivel das sequências nucleotidicas, e a recolha e purificação dos anticorpos de reação cruzada.

[074] As células de mamíferos são um hospedeiro preferido para a expressão de segmentos de nucleotideos que codificam as imunoglobulinas ou seus fragmentos. Veja Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987) . Um número de linhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de segregar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem as linhagens celulares CHO (por exemplo, DG44), várias linhagens celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L, e não mielomas produtoras de não-anticorpos incluindo células Sp2/0 e NSO. De preferência, as células são não-humanas. Os vetores de expressão para estas células • - podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um intensificador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)),, e sitios de processamento de informação necessários, tais como locais de ligação de ribossomas, locais de splicing de RNA, locais de poliadenilação, e sequências de terminação da transcrição. Sequências de controle da expressão preferidas são promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus do papiloma bovino, e semelhantes. Ver Co et al., <J. Immunol. 148:1149 (1992) .

[075] Os anticorpos humanos contra a proteina CD33 podem ser fornecidos por uma variedade de técnicas descritas a seguir. Os métodos para produzir anticorpos humanos incluem o método trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente Norte- Ãmericana No. 4,634,664; e Engleman et al., Patente Norte- Americana No. 4,634,666; utilização de camundongos transgênicos, incluindo genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991), e métodos de apresentação em fagos (ver, por -'exemplo, Dower et al., Dower et al., WO 91/17271 and McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 and US 5,565,332.

[076] Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo a purificação por HPLC, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes (ver geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)) .

IV. Ácidos Nucleicos

[077] A invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das cadeias leves e pesadas humanizadas descritas acima. Tipicamente, os ácidos nucleicos também codificam um peptideo de sinal fundido com as cadeias pesada e leve maduras. Sequências de ácidos nucleicos de codificação podem estar em ligação operacional com sequências reguladoras para assegurar a expressão das sequências de codificação, tais como um promotor, potenciador, sitio de ligação ao ribossomo, sinal de terminação da transcrição e semelhantes. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves podem ocorrer na forma isolada, ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucleicos podem ser sintetizados por, por exemplo, a sintese de estado sólido ou por PCR de oligonucleotideos sobrepostos. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves podem ser unidos como um ácido nucleico contíguo, por exemplo, dentro de um vetor de expressão, ou podem ser separados, por exemplo, cada um clonado no seu próprio vetor de expressão.

[078] Em uma modalidade, esta invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica uma região variável da cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Este polinucleotídeo isolado pode codificar ainda uma região constante de cadeia pesada de IgG humana. 0 isotipo da região constante da IgG é, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. Em uma modalidade, o isotipo da região constante de IgG é IgGl. Em uma outra modalidade, a região constante de IgGl codificado tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição no resíduo 239, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, isto é, S239C. A descrição também fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado que codifica a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e, ainda, uma célula hospedeira compreendendo esse vetor de expressão. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero, por exemplo, uma célula CHO.

[079] Em uma outra modalidade, esta invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica uma região variável de anticorpo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Este polinucleotideo isolado pode codificar ainda uma região constante de cadeia leve da IgG humana. O isotipo da região constante da cadeia leve de IgG é, por exemplo, uma região constante kapa. A descrição também fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotideo isolado que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e mais ainda, uma célula hospedeira compreendendo esse vetor de expressão. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamifero, por exemplo, uma célula CHO. Em uma outra modalidade, esta invenção fornece um polinucleotideo isolado ou polinucleotideos que codificam para uma região variável de cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e uma região variável de cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o dominio variável da cadeia pesada e o dominio variável da cadeia leve formando um fragmento de ligação ao antigeno ou anticorpo que se liga especificamente ao CD33 humano. Esta invenção também fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotideo isolado ou polinucleotideos que codificam a cadeia pesada de anticorpo da região variável compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e a região variável da cadeia leve de anticorpo - - 'compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão ou vetores também é fornecida. A célula hospedeira é preferencialmente uma célula de mamifero, por exemplo, uma célula CHO.

[080] Em uma outra modalidade, esta invenção fornece primeiro e segundo vetores que compreendem um polinucleotideo que codifica uma região variável da cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e um polinucleotideo que codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o dominio variável de cadeia pesada e o dominio variável da cadeia leve formando um fragmento de anticorpo ou antigeno de ligação que se liga especificamente à CD33 humana. A célula hospedeira compreendendo os vetores são fornecidos, de preferência, células hospedeiras de mamifero, como uma célula CHO.

V. Conjugados de Fármacos Anticorpos.

[081] Os anticorpos anti-CD33 podem ser conjugados com porções citotóxicas para formar conjugados de anticorpos-fármaco (ADCs). Porções particularmente adequadas para conjugação a anticorpos são agentes citotóxicos (por exemplo, agentes quimioterapêuticos), enzimas de conversão de pró-fármacos, os isótopos radioativos ou compostos, ou toxinas (estas porções sendo coletivamente referidas como agentes terapêuticos ou medicamentos). Por exemplo, um anticorpo anti-CD33 pode ser conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, ou uma toxina (por exemplo, um agente » citostático ou citocida, tais como, por exemplo, a abrina, c fc* ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria). Os exemplos de classes úteis de agentes citotóxicos incluem, por exemplo, ligantes do sulco menor de DNA, agentes alquilantes de DNA e inibidores de tubulina. Exemplos de agentes citotóxicos incluem, por exemplo, auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etoposideos, maitansinas e maitansinóides (por exemplo, DM) e DM4), taxanos, benzodiazepinas (por exemplo, pirrol[1,4]benzodiazepinas(PBDs), indolinobenzodiazepinas e oxazolidinobenzodiazepinas) e alcaloides da vinca. As técnicas para a conjugação de agentes terapêuticos para as proteínas, e em particular a anticorpos, são bem conhecidas. (Ver, e.g., Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3):154-169.)

[082] O agente terapêutico (por exemplo, um agente citotóxico) pode ser conjugado com o anticorpo de uma maneira que reduz a sua atividade, a menos que se desprenda do anticorpo (por exemplo, por hidrólise, por degradação do anticorpo, ou por um agente de clivagem) .Tal agente terapêutico pode ser ligado ao anticorpo através de um ligante. Um agente terapêutico conjugado com um ligante também é aqui referido como um agente de ligação de fármacos. A natureza do ligante pode variar amplamente. Os componentes que constituem o ligante são escolhidos em função das suas características, que podem ser ditadas, em parte, pelas condições no local ao qual o conjugado é entregue.

[083] 0 agente terapêutico pode ser ligado ao anticorpo com um agente de ligação clivável que é sensivel à clivagem no ambiente intracelular de células de câncer expressando anti-CD33, mas não é substancialmente sensivel ao ambiente extracelular, de tal modo que o conjugado é cortado do anticorpo quando é internalizado pela célula de câncer expressando anti-CD33 (por exemplo, no endossomal ou, por exemplo, em virtude da sensibilidade ao pH ou da sensibilidade da protease, no ambiente do lisossoma ou no ambiente caveolear). O agente terapêutico pode também ser ligado ao anticorpo com um ligante não clivável. Tal como indicado, o ligante pode compreender uma unidade clivável. Em algumas de tais modalidades, a estrutura e/ou a sequência de unidade clivável é selecionada de tal modo que é clivada pela ação de enzimas presentes no local alvo (por exemplo, a célula alvo). Em outras modalidades, as Unidades de clivagem que são cliváveis por alterações no pH (por exemplo, o ácido ou base lábil), temperatura ou por irradiação (por exemplo, fotolábeis) também podem ser usadas.

[084] Em algumas modalidades, a unidade clivável pode compreender um aminoácido ou uma sequência contígua de aminoácidos. A sequência de aminoácidos pode ser o substrato para uma enzima alvo.

[085] Em alguns aspectos, a unidade clivável é uma unidade peptidil, e é pelo menos dois aminoácidos de comprimento. Agentes de clivagem podem incluir as catepsinas B e D e plasmina (ver, por exemplo, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123) . O mais típico são unidades cliváveis que são suscetíveis ao corte por enzimas que estão presentes nas células que expressam anti-CD33, ou seja, um ligante clivável de enzima. Deste modo, o ligante pode ser clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo uma protease de lisossoma ou endossomal. Por exemplo, um ligante que sofre clivagem pela protease catepsina-B dependente de tiol, que é altamente expresso em tecido canceroso, pode ser utilizado (por exemplo, um ligante compreendendo uma Phe- Leu ou um peptideo Val-Cit ou peptideo Ala-Val). Em algumas modalidades, o ligante compreenderá uma unidade clivável (por exemplo, uma unidade peptidil) e a unidade clivável será diretamente conjugada com o agente terapêutico. Em outras modalidades, a unidade clivável será conjugada com o agente terapêutico através de uma unidade funcional adicional, por exemplo, uma unidade de espaçador auto- imolativa ou uma unidade de espaçador não-auto- imolativa. Uma unidade de espaçador não auto-imolativa é uma em que parte ou a totalidade da unidade de espaçador permanece ligada à unidade de medicamento depois da clivagem de uma unidade clivável (por exemplo, aminoácido) a partir do conjugado de fármaco-anticorpo. Para liberar o fármaco, uma reação de hidrólise independente ocorre dentro da célula alvo para clivar a unidade de espaçador de fármaco. Com uma unidade de espaçador auto-imolativa, o fármaco é liberado, sem a necessidade de fármacos para uma etapa de hidrólise separada. Em uma modalidade, em que o ligante compreende uma unidade clivável e um grupo auto- imolativo, a unidade clivável é clivável pela ação de uma enzima e após a clivagem da unidade clivável, em que o grupo(s) auto-imolativo libera o agente terapêutico. Em algumas modalidades, a unidade clivável do ligante será diretamente ou indiretamente conjugada com o agente terapêutico em uma extremidade, e na outra extremidade vai ser direta ou indiretamente conjugada com o anticorpo. Em algumas de tais modalidades, a unidade clivável será diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de uma Unidade de espaçador auto-imolativa ou não-auto-imolativa) conjugada com o agente terapêutico em uma extremidade, e na outra extremidade vai ser conjugada com o anticorpo através de uma unidade tensora. Uma unidade tensora liga o anticorpo para o resto dos fármacos e/ou ligantes de fármacos. Em uma modalidade, a ligação entre o anticorpo e o restante do fármaco ou ligante do fármaco é através de um grupo de maleimida, por exemplo, através de um ligante maleimidocaproilo. Em algumas modalidades, o anticorpo será ligado ao fármaco através de uma ligação dissulfeto, por exemplo, o dissulfeto ligado conjugado maitansinóide SPDB- DM4 e SPP-DM1.

[086] A ligação entre o anticorpo e o ligante pode ser através de uma série de vias diferentes, por exemplo, através de uma ligação tioéter, através de uma ligação dissulfeto, através de uma ligação amida, ou através de uma ligação éster. Em uma modalidade, a ligação entre o anticorpo anti-CD33 e o ligante é formada entre um grupo tiol de um residue de cisteina do anticorpo e um grupo maleimida do ligante. Em algumas modalidades, as ligações entre cadeias de anticorpo são convertidas em grupos tiol livres, antes da reação com o grupo funcional do ligante. Em algumas modalidades, um residue de cisteina é um introduzido na cadeia pesada ou leve de um anticorpo e feito reagir com o ligante. As posições para a inserção de cisteina por substituição em cadeias pesadas ou leves de anticorpo incluem as descritas no Pedido dos EUA Publicado No. 2007-0092940 e Publicação de Patente Internacional W02008070593, cada um dos quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade e para todos os efeitos.

[087] Em algumas modalidades, os conjugados anticorpo-fármaco têm a seguinte fórmula I: L - (LU-D)p (I) em que L é um anticorpo anti-CD33, LU é uma unidade ligante e D é uma unidade de fármaco (isto é, o agente terapêutico) . O indice p varia de 1 a 20. Tais conjugados compreendem um anticorpo anti-CD33 ligado covalentemente a pelo menos um fármaco através de um ligante. A unidade de ligação é ligado em uma extremidade ao anticorpo e, na outra extremidade ao fármaco.

[088] A carga de fármaco é representada por p, o número de moléculas de fármacos por anticorpo. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 unidades de fármacos (D) por anticorpo. O técnico especialista no assunto apreciará que, em alguns aspectos, o indice p vai variar de 1 a 20 (isto é, ambos os números inteiros e valores não inteiros de 1 a 20). O técnico especialista no assunto apreciará que, em alguns aspectos, o indice p será um número inteiro de 1 a 20, e representará o número de agentes de ligação de fármacos em um anticorpo singular. Em outros aspectos, o símbolo p representa o número médio de moléculas de fármaco por anticorpo-ligantes, por exemplo, o número médio de fármaco por anticorpo-ligantes em uma mistura de reação ou a composição (por exemplo, composição farmacêutica), e pode ser um valor de número inteiro ou não-inteiro. Assim, em alguns aspectos, para composições (por exemplo, composições farmacêuticas), p representa a carga de fármaco média dos conjugados anticorpo-fármaco na composição, e p varia entre 1 e 20.

[089] Em algumas modalidades, p é de cerca de 1 a cerca de 8 fármacos por anticorpo. Em algumas modalidades, p é 1. Em algumas modalidades, o símbolo p representa 2. Em algumas modalidades, p é de cerca de 2 a cerca de 8 fármacos por anticorpo. Em algumas modalidades, p é de cerca de 2 a cerca de 6, 2 e cerca de 5, ou de 2 a cerca de 4 fármacos por anticorpo. Em algumas modalidades, p é de cerca de 2, cerca de 4, cerca de 6 ou cerca de 8 fármacos por anticorpo.

[090] O número médio de medicamentos por unidade de anticorpo em uma preparação a partir de uma reação de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa, teste de ELISA, HIC, e HPLC. A distribuição quantitativa dos conjugados em termos de p pode também ser determinada.

[091] Os conjugados de anticorpo-fármaco com base (exemplificative incluem conjugados anticorpo-fármaco de auristatina, ou seja, conjugados em que o componente de fármaco é um fármaco auristatina. Auristatinas ligam tubulina, foram mostradas para interferir na dinâmica dos microtúbulos e divisão nuclear e celular, e têm atividade anticancerigena. Tipicamente, o conjugado anticorpo-fármaco baseado em auristatina compreende um ligante entre o fármaco auristatina e o anticorpo anti-CD33. As auristatinas podem ser ligadas ao anticorpo anti-CD33 em qualquer posição adequada para conjugação a um ligante. O ligante pode ser, por exemplo, um ligante clivável (por exemplo, um ligante peptidico) ou um ligante não clivável (por exemplo, ligante liberado por degradação do anticorpo) . A auristatina pode ser auristatina E ou um derivado da mesma. A auristatina pode ser, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um ceto-ácido. Por exemplo, auristatina E pode ser reagida com ácido benzóico para-acetil ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outras auristatinas tipicas incluem MMAF (monometil auristatina F) , e MMAE (monometil auristatina E).A sintese e a estrutura de auristatinas exemplares são descritos na Publicação Norte-Americana Nos. 7,659,241, 7,498,298, 2009-0111756, 2009-0018086, e 7,968,687, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade e para todos os efeitos.

[092] Exemplos de conjugados anticorpo-fármaco baseados em auristatina incluem conjugados anticorpo- fármaco vcMMAE, vcMMAF e mcMMAF, como mostrado abaixo, em que Ab é um anticorpo, como aqui descrito e val-cit representa o dipeptideo valina-citrulina: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A carga de fármaco é representada por p, o número de moléculas de fármaco-ligante por anticorpo. Dependendo do contexto, p pode representar o número médio de moléculas de fármaco-ligante por anticorpo, também se refere à carga média de fármaco. A variável p varia de 1 a 20 e de preferência é de 1 a 8. Em algumas modalidades preferenciais, quando p representa o número médio de carga de fármacos, p varia de cerca de 2 a cerca de 5. Em algumas modalidades, p é de cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4 ou cerca de 5. Em alguns aspectos, o anticorpo é conjugado com o ligante através de um átomo de enxofre de um residuo de cisteina. Em alguns aspectos, o residuo de cisteina é aquele que é manipulada no anticorpo. Em outros aspectos, o residuo de cisteina é um residuo de cisteina de dissulfeto intercadeias.

[093] Os conjugados de anticorpos de fármacos exemplares incluem conjugados de anticorpo-fármaco baseados em PBD; isto é, os conjugados ant icorpo-f ármaco em que o componente de fármaco é um fármaco de PBD.

[094] PBDs têm a estrutura geral:

[095] Eles diferem no número, tipo e posição dos substituintes, tanto nos seus anéis aromáticos A e anéis pirrol C, e no grau de saturação do anel C. No anel B existe ou uma imina (N=C), uma carbinolamina (NH-CH(OH)), ou um éter metilico de carbinolamina (NH-CH(OMe)) na posição N10-C11, o qual é a centro electrofilico responsável pela alquilação do DNA. Todos os produtos haturais conhecidos têm uma configuração-(S) na posição quiral C11A que lhes fornece uma torção à direita quando visto entregue a partir do anel C em direção ao anel A. Isto dá-lhes a forma tridimensional apropriada para isso- helicidade com o sulco menor do DNA de forma B, conduzindo a um encaixe justo no local de ligação. A capacidade de PBDs para formar um aduto no sulco menor permite-lhes interferir com o processamento do DNA, por conseguinte, a sua utilização como agentes antitumorais.

[096] A atividade biológica destas moléculas pode ser potenciada pela união de duas unidades de PBD em conjunto através das suas funcionalidades C8/C'-hidroxila através de um grupo ligante alquileno flexivel. Os dimeros de PBD são pensados para formar lesões do DNA sequência- seletiva, tais como a ligação cruzada intercadeia de 5'-Pu- GATC-Py-3' palindrômica que se pensa ser principalmente responsável pela sua atividade biológica.

[097] Em algumas modalidades, os conjugados anticorpo-fármaco à base de PBD compreendem um dimero de PBD ligado a um anticorpo anti-CD33. Os monômeros que formam o dimero de PBD podem ser os mesmos ou diferentes, ou seja, simétrico ou assimétrico. O dimero de PBD pode ser ligado ao anticorpo anti-CD33 em qualquer posição adequada para conjugação a um ligante. Por exemplo, em algumas modalidades, o dimero de PBD terá um substituinte na posição C2 que fornece uma âncora para a ligação do composto ao anticorpo anti-CD33. Em modalidades alternativas, a posição N10 do dimero PBD fornecerá a âncora para a ligação do composto ao anticorpo anti-CD33.

[098] Tipicamente, o conjugado anticorpo-fármaco baseado PBD compreende um ligante entre o fármaco PBD e o anticorpo anti-CD33. O ligante pode compreender uma unidade clivável (por exemplo, um aminoácido ou uma sequência contigua de aminoácidos que é um substrato alvo para uma enzima), ou um ligante não-clivável (por exemplo, o ligante liberado por degradação do anticorpo). O ligante pode ainda compreender um grupo maleimida para a ligação ao anticorpo, por exemplo, maleimidocaproil. O ligante pode, em algumas modalidades, compreendem ainda um grupo auto-imolativo, tais como, por exemplo, uma unidade de álcool p- aminobenzilico (PAB).

[099] Um PBD exemplar para uso conforme um conjugado é descrito no Pedido de Patente Internacional N° WO 2011/130613 e é como se segue, em que a linha ondulada indica o sitio de ligação ao ligante: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Um ligante exemplar é como se segue em que a linha ondulada indica o sitio de ligação para o fármaco e o anticorpo é ligado através do grupo maleimida.

[100] Exemplos de conjugados anticorpo-fármaco baseado em PBDs incluem os conjugados de anticorpo-fármaco como mostrado abaixo, em que Ab é um anticorpo, tal como aqui descrito: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A carga de fármaco é representado por p, o número de moléculas de fármaco-ligante por anticorpo. Dependendo do contexto, p pode representar o número médio de moléculas de fármaco-ligante por anticorpo, também se refere à carga média de fármaco. A variável p varia de 1 a 20 e é de preferência de 1 a 8. Em algumas modalidades preferenciais, quando p representa o número médio de carga de fármacos, p varia de cerca de 2 a cerca de 5. Em algumas modalidades, p é de cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4 ou cerca de 5. Em alguns aspectos, o anticorpo é conjugado com o ligante do fármaco através de um átomo de enxofre de um resíduo de cisteina que é manipulado no anticorpo. Em alguns aspectos, o resíduo de cisteina é manipulado no anticorpo na posição 239 (IgGl), como determinado pelo índice UE (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991) .

VI. Outros anticorpos para CD33

[101] Assim como as formas humanizadas dos anticorpos m2H12 discutidas acima, outros anticorpos que se ligam a um domínio extracelular de CD33 podem ser utilizados em alguns dos métodos da invenção, particularmente no tratamento do câncer. Formas quiméricas ou folheada destes anticorpos podem ser produzidas por métodos convencionais resumidos abaixo.

[102] Um anticorpo quimérico é um anticorpo em que as regiões variáveis maduras de cadeias leve e pesada de um anticorpo não-humano (por exemplo, um camundongo) são combinadas com as regiões constantes de cadeia pesada e leve humana. Tais anticorpos substancialmente ou completamente mantêm a especificidade de ligação do anticorpo de camundongo, e são cerca de dois terços sequência humana.

[103] Um anticorpo folheado é um tipo de anticorpo humanizado que retém alguma e, geralmente, todos as CDRs e alguns dos resíduos estruturais da região variável não humana de um anticorpo não humano, mas substitui outros residues de esqueleto de região variável que podem contribuir para epitopos de células B- ou T-, por exemplo, os residues expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com residues de posições correspondentes da sequência de um anticorpo humano. 0 resultado é um anticorpo em que as CDRs são totalmente ou substancialmente a partir de um anticorpo não humano, e as estruturas da região variável do anticorpo não humano são feitas mais semelhantes à humana pelas substituições.

[104] Qualquer um dos anticorpos pode ser escolhido para ter o mesmo ou especificidade de sobreposição de epitopo como um anticorpo exemplar, tal como o anticorpo m2H12, por um ensaio de ligação competitiva, tal como descrito nos Exemplos, ou de outra forma. Os anticorpos preferidos têm a mesma especificidade de epitopo tal como o anticorpo m2H12. Os técnicos especialistas no assunto são capazes de identificar um epitopo ligado por um anticorpo, utilizando uma variedade de métodos. Por exemplo, matriz à base de varrimento de oligopeptideo ou análise de Pepscan usa uma biblioteca de sequências de oligopeptideos a partir de segmentos que se sobrepõem e que não se sobrepõem de um antigeno alvo, e ensaios para a sua capacidade de se ligar ao anticorpo de interesse. Ver, por exemplo, Geysen et al., PNAS 81:3998- 4002 (1984). Epitopos não-lineares podem ser identificados utilizando, por exemplo, tecnologia CLIPS™, uma variação de escaneamento de oligopeptideo à base de matriz. . Ver, por exemplo, Timmerman et al. , Open Vaccine J. 2:56-67 (2009). A proteina do antigeno pode também ser mutada e, em seguida, usada para avaliar a ligação pelo anticorpo de interesse. A mutagênese dirigida ao local sistemático de proteinas pode ser usada, ou uma biblioteca de mutações pode ser feita e utilizada para o rastreamento de ligação do anticorpo. Bibliotecas de mutação podem ser compradas a partir de, por exemplo, Molecular integral. MS de troca de hidrogênio/deutério pode ser utilizado para identificar epitopos. Os antigenos de interesse são colocados em água deuterada e marcados com deutério. A proteina é então digerida com uma protease e os fragmentos de peptideos resultantes são submetidos a análise de espectro de massa. O antigeno é também avaliado na presença de um anticorpo, e as diferenças na rotulagem dos fragmentos de peptideo indicam áreas de ligação do anticorpo.

VII. Aplicações Terapêuticas

[105] Os anticorpos derivados a partir do anticorpo murino 2H12, por exemplo, anticorpos quiméricos ou humanizados, por si só ou como conjugados dos mesmos de fármacos com anticorpos CD33, podem ser utilizados para tratar o câncer. Alguns de tais cânceres mostram niveis detectáveis de CD33 medidos quer na proteina (por exemplo, por meio de imunoensaio usando um dos anticorpos exemplificados) ou nivel de mRNA. Alguns de tais cânceres mostram niveis elevados de CD33 em relação ao tecido não canceroso do mesmo tipo, de preferência a partir do mesmo paciente. Um nivel exemplar de CD33 em células cancerosas passiveis de tratamento é 5.000-150.000 moléculas CD33 por célula, apesar de niveis mais altos ou mais baixos poderem ser tratados. Opcionalmente, um nivel de CD33 em um câncer é medido antes de realizar o tratamento.

[106] Exemplos de cânceres associados à expressão de CD33 e suscetíveis de tratamento incluem doenças mielóides, tais como, leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia mielóide crônica (LMC), outras desordens mieloproliferativas, incluindo leucemia mielomonocitica crônica e doenças mieloproliferativas crônicas, leucemia promielocitica aguda (LPA), leucemia trombocitica, uma sindrome mielodisplásica, leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula B (preB-LLA), leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula T (preT-LLA), mieloma múltiplo (MM), doença de mastócitos incluindo leucemia de mastócito ou sarcoma de mastócito e ou sarcomas mielóides, anemia refratária, uma sindrome pré-leucêmica, uma leucemia linfóide, ou uma leucemia indiferenciada. 0 tratamento também pode ser aplicado em pacientes que são tratamento haturalmente, que são refratários aos tratamentos convencionais (por exemplo, quimioterapia ou MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicina), ou que recairam após uma resposta a tais tratamentos.

[107] Os anticorpos CD33 derivados do anticorpo murino 2H12, incluindo anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados, tais como anticorpos h2H12, podem ser utilizados para tratar cânceres que expressam a proteina CD33. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um indivíduo com leucemia mielóide aguda positiva CD33 (LMA). Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um indivíduo com AML positiva para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um indivíduo com leucemia mielóide crônica positiva para CD33 (LMC) . Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um indivíduo com LMC positivo para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usada para tratar um indivíduo com leucemia mielomonocitica crônica (LMMC) com CD33 positiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um indivíduo com LMMC crônico de CD33-positivo. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um indivíduo com leucemia de tiroide positiva para CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com leucemia de tiroide positiva para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um individuo com sindrome mielodisplásica positiva CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com sindrome mielodisplásica positiva CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usada para tratar um individuo com doença mieloproliferativa com CD33 positiva. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com doença mieloproliferativa com CD33 positiva. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um individuo com anemia refratária positiva para CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com anemia refratária positiva para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usada para tratar um individuo com sindrome de pré-leucemia positiva para CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com sindrome pré-leucêmica positiva para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um individuo com leucemia linfóide positiva para CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com leucemia linfóide positiva para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um individuo com leucemia indiferenciada positiva para CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com leucemia indiferenciada positiva para CD33. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2Hhl2 é usado para tratar um individuo com leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula B (preB-LLA) positiva para CD33. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com preB-LLA positiva para CD33. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usada para tratar um individuo com leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula T (preT-LLA). Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula T (preT-LLA). Em uma modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um individuo com mieloma múltiplo positivo para CD33 (MM) . Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com MM Positiva para CD33. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2hl2 é usadO para tratar um individuo com a doença mastócitos positiva para CD33, incluindo a leucemia de mastócitos e sarcoma de mastócitos. Em uma outra modalidade, o anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um individuo com a doença mastócitos positiva para CD33, incluindo a leucemia de mastócitos e sarcoma de mastócitos.

[108] O anticorpo CD33 pode ser, por exemplo, um anticorpo não conjugado ou conjugados, por exemplo, um conjugado de fármaco-anticorpo CD33. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 pode ser um anticorpo 2H12 humanizado ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 pode ser um anticorpo que compete com um anticorpo 2H12u murino, humanizado ou quimérico para a ligação especifica ao CD33.

[109] Os anticorpos CD33 derivados de anticorpos murino 2H12 incluindo anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados tais como h2H12, podem ser conjugados com um agente terapêutico, e utilizados para tratar indivíduos com cânceres positivos para CD33. Exemplos de agentes terapêuticos são aqui fornecidos, incluindo os agentes terapêuticos ativos, por exemplo, auristatinas, e agentes terapêuticos altamente ativos, por exemplo, PBDs. Um anticorpo h2H12 conjugado a um agente terapêutico ativo, ou seja, um conjugado anticorpo-fármaco h2H12 (ADC), pode ser usada para tratar um individuo com câncer positivo para CD33. Um anticorpo h2H12 conjugado com uma auristatina pode ser usado para tratar um individuo com câncer positivo para CD33. Um anticorpo h2H12 conjugado com um agente terapêutico altamente ativo pode ser usado para tratar um individuo com câncer positivo para CD33. Um anticorpo h2H12 conjugado com um PBD pode ser usado para tratar um individuo com câncer positivo para CD33.

[110] Algumas células cancerosas desenvolvem resistência a um agente terapêutico após aumentar a expressão de uma proteina aumentam o efluxo do agente terapêutico para fora da célula cancerosa. Tais proteinas incluem P-glicoproteina, proteina associada à resistência a múltiplos fármacos, proteina relacionada com a resistência pulmonar, e a proteina de resistência do câncer da mama. Detecção de resistência a fármacos nas células cancerosas podem ser realizadas pelos técnicos especialistas no assunto. Os anticorpos ou ensaios que detectam proteinas de efluxo são comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, Promega, Millipore, Abeam, e Sigma- Aldrich. Em uma modalidade, um anticorpo derivado de um anticorpo murino 2H12 é usado para tratar um individuo com um câncer resistente a múltiplos fármacos, por exemplo, um câncer resistente a múltiplos fármacos positivo para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo humanizado derivado do anticorpo murino 2H12 é usada para tratar um indivíduo com um câncer resistente a múltiplos fármacos, por exemplo, um câncer resistente a múltiplos fármacos positivo para CD33. Em uma modalidade, um anticorpo h2H12 é utilizado para tratar um indivíduo com um câncer resistente a múltiplos fármacos, por exemplo, um câncer resistente a múltiplos fármacos positivo para CD33. Em uma outra modalidade, um h2H12 ADC é usado para tratar um indivíduo com um câncer resistente a múltiplos fármacos, por exemplo, um câncer resistente a múltiplos fármacos positivo para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo h2H12 conjugado com um agente terapêutico altamente ativo é utilizado para tratar um indivíduo com um câncer resistente a múltiplos fármacos, por exemplo, um câncer resistente a múltiplos fármacos positivo para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo h2H12 conjugado com um PBD é utilizado para tratar um indivíduo com um câncer resistente a múltiplos fármacos, por exemplo, um câncer resistente a múltiplos fármacos positivo para CD33. Em uma outra modalidade, um anticorpo h2H12 conjugado com um PBD é usado para tratar um indivíduo com uma leucemia mielóide aguda (LMA) positiva para CD33 resistente a múltiplos fármacos.

[111] Os anticorpos humanizados ou quiméricos derivados do anticorpo murino 2H12, isoladamente ou como conjugados de fármacos são administrados em um regime eficaz significando uma dose, via de administração e frequência de administração que atrasa o inicio, reduz a _ gravidade, inibe a progressão deterioração e/ou melhora, pelo menos, um sinal ou sintoma de câncer. Se um paciente já sofre de câncer, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente se encontra em risco elevado de câncer em relação à população em geral, mas ainda não está sentindo os sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser observada em um paciente individuo em relação aos controles históricos ou experiência anterior no mesmo paciente. Em outros casos, a eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio pré-clinico ou clinico em uma população de pacientes tratados em relação a uma população de controle de pacientes não tratados.

[112] As dosagens exemplificativas para um anticorpo monoclonal são de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg do peso corporal do paciente, mais tipicamente 1 mg/kg a 30 mg/kg, 1 mg/kg a 20 mg/kg, 1 mg/kg a 15 mg/kg, 1 mg/kg a 12 mg/kg, ou 1 mg/kg a 10 mg/kgl, ou 2 mg/kg a 30 mg/kg, 2 mg/kg a 20 mg/kg, 2 mg/kg a 15 mg/kg, 2 mg/kg a 12 mg/kg, ou 2 mg/kg a 10 mg/kg, ou 3 mg/kg a 30 mg/kg, 3 mg/kg a 20 mg/kg, 3 mg/kg a 15 mg/kg, 3 mg/kg a 12 mg/kg, ou 3 mg/kg a 10 mg/kg. As dosagens exemplificativas para conjugados de fármacos de anticorpos ativos monoclonais dos mesmos, por exemplo, auristatinas, são 1 mg/kg a 7,5 mg/kg, ou 2 mg/kg a 7,5 mg/kg ou 3 mg/kg a 7,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo ou 0,1 a 20, ou 0,5 a 5 mg/kg de peso corporal (por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg) ou 10 a 1500 ou 200 a 1500 mg como uma dose fixa. As dosagens exemplificativas para os conjugados de fármacos de anticorpos monoclonais altamente ativos, por exemplo, PBDs, são 1,0 μg/kg a 1,0 mg/kg, ou 1,0 μg/kg a 500,0 μg/kg de peso corporal do indivíduo. Em alguns métodos, o paciente é então administrado com anticorpo ou ADC cada duas, três ou quatro semanas. A dosagem depende da frequência de administração, da condição do paciente e da resposta ao tratamento prévio, se for o caso, se o tratamento é profilático ou terapêutico e se a doença é aguda ou crônica, entre outros fatores.

[113] A administração pode ser parentérica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal ou intramuscular. A administração pode também ser localizada diretamente em um tumor. Administração para a circulação sistêmica por via de administração intravenosa ou subcutânea é preferida. A administração intravenosa pode ser, por exemplo, por infusão ao longo de um período tal como 30 a 90 min, ou por uma única injeção de bolus.

[114] A frequência de administração depende da meia-vida do anticorpo ou do conjugado anticorpo-fármaco na circulação, a condição do paciente e da via de administração, entre outros fatores. A frequência pode ser diária, semanal, mensal, trimestral, ou em intervalos irregulares em resposta a alterações no estado do paciente ou a progressão do câncer a ser tratado. Uma frequência exemplar para a administração intravenosa é de entre duas vezes por semana e trimestral ao longo de um curso de tratamento continuo, embora a dosagem mais ou menos frequente também é possivel. Outras frequências exemplificativas para administração intravenosa estão entre uma vez por semana ou uma vez por mês durante um curso de tratamento continuo, embora a dosagem mais ou menos frequente também é possivel. Para administração subcutânea, uma frequência de dosagem exemplar é diária e mensal, embora a dosagem mais ou menos frequente também é possivel.

[115] O número de doses administradas depende da natureza do câncer (por exemplo, ou presença de sintomas agudos ou crônicos) e a resposta da desordem para o tratamento. Para distúrbios agudos ou exacerbações agudas de um distúrbio crônico entre 1 e 10 doses são muitas vezes suficientes. Por vezes, uma dose em bólus única, facultativamente na forma dividida, é suficiente para um distúrbio agudo ou exacerbação aguda de uma doença crônica. 0 tratamento pode ser repetido para a recorrência de um distúrbio agudo ou exacerbação aguda. Para doenças crônicas, um anticorpo pode ser administrado em intervalos regulares, por exemplo, semanal, guinzenal, mensal, trimestral, de seis em seis meses para, pelo menos, 1, 5 ou 10 anos, ou a vida do paciente. As composições farmacêuticas para administração parentérica são estéreis e de preferência substancialmente isotônicas e fabricadas sob condições GMP. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, a dosagem para uma administração única). As composições farmacêuticas podem ser formuladas utilizando um ou mais veiculos fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares. A formulação depende da via de administração auxiliares. Para injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou solução salina fisiológica ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no local da injeção). A solução pode conter agentes de formulação, tais como suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, os anticorpos podem estar na forma liofilizada para reconstituição com um veiculo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização. A concentração de anticorpo em uma formulação liquida pode ser, por exemplo, 0,1 a 10 mg/ml, tal como 1,0 mg/ml.

[116] O tratamento com os anticorpos da invenção podem ser combinados com quimioterapia, radiação, tratamento com células tronco, cirurgia, outros tratamentos eficazes contra a desordem a ser tratada. Classes úteis de outros agentes que podem ser administradas com anticorpos humanizados para CD33 incluem, por exemplo, anticorpos para outros receptores expressos em células cancerosas, agentes antitubulinas (po exemplo, auristatinas); ligantes de sulco menor do DNA (por exemplo, PBDs), inibidores da replicação do DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina, tais como cis-platina, mono(platina), bis(platina) e complexos de platina tri-nucleares e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, anti-metabólitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposideos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureias, platinols, compostos de pré- formação, antimetabólitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiação, esteróides, taxanos, inibidores da topoisomerase, alcaloides de vinca, e semelhantes.

[117] O tratamento com um anticorpo derivado de anticorpo murino 2H12, por exemplo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou o anticorpo h2H12, opcionalmente em combinação com qualquer dos outros agentes ou regimes descritos acima sozinhos ou como um conjugado de fármaco- anticorpo, aumentam a sobrevivência ou o tempo de sobrevivência global mediana livre de progressão de doentes com câncer (por exemplo, a LLA, LMC, LMMC) , especialmente quando recidiva ou refratária, por pelo menos 30% ou 40%, mas preferencialmente 50%, 60% a 70% ou até 100% ou mais, em comparação com o mesmo tratamento (por exemplo, quimioterapia), mas sem o anticorpo derivado de anticorpo murino 2H12, sozinho ou como um conjugado anticorpo- fármaco. Em adição ou alternativamente, o tratamento (por exemplo, quimioterapia padrão), incluindo o anticorpo derivado de anticorpo murino 2H12, sozinho ou como um conjugado anticorpo-fármaco, pode aumentar a taxa de resposta completa, a taxa de resposta parcial, ou a taxa de resposta objetiva (completa + parcial) de pacientes com tumores em pelo menos 30% ou 40%, mas preferencialmente 50%, 60% a 70% ou mesmo 100% em comparação com o mesmo tratamento (por exemplo, quimioterapia), mas sem o anticorpo derivado de anticorpo murino 2H12.

[118] Normalmente, em um ensaio clinico (por exemplo, um estudo de fase II, fase II/III ou fase III), os aumentos acima mencionadas na sobrevida livre de progressão mediana e/ou taxa de resposta dos pacientes tratados com a terapia padrão mais o anticorpo derivado de anticorpo murino 2H12, em relação ao grupo de pacientes que recebem terapia padrão (ou mais placebo) de controle, são estatisticamente significativos, por exemplo ao nivel de p = 0,05 ou 0,01 ou mesmo 0,001 nivel. As taxas de resposta completa e parcial são determinadas por critérios objetivos comumente usados em ensaios clinicos para o câncer, por exemplo, conforme listagem ou aceito pelo Instituto Nacional do Câncer e/ou Food and Drug Administration.

VIII. Outras Aplicações

[119] Os anticorpos anti-CD33 aqui descritos podem ser utilizados para a detecção de CD33 no contexto de diagnóstico ou de tratamento ou em investigação clinica. A expressão de CD33 em um câncer fornece uma indicação de que o câncer é suscetível a tratamento com os anticorpos da presente invenção. Os anticorpos podem também ser vendidos como reagentes de pesquisa para a investigação de laboratório para a detecção de células que possuem CD33 e a sua resposta a vários estímulos. Em tais utilizações, os anticorpos monoclonais podem ser marcados com moléculas fluorescentes, moléculas marcadas com rotação, enzimas ou radioisótopos, e pode ser fornecido na forma de kit com todos os reagentes necessários para efetuar o ensaio para o CD33. Os anticorpos aqui descritos, m2hl2 e versões quiméricas ou humanizadas destes, por exemplo, h2H12, podem ser usados para detectar a expressão da proteina CD33 e determinar se um câncer é suscetível a tratamento com CD33 ADCs. Como um exemplo, 2H12 murino e versões quiméricas ou humanizadas destes, por exemplo, h2H12, podem ser usados para detectar a expressão de CD33 em linfócitos, monócitos, linfoblastos, mielomonócitos, ou outras células que expressam CD33. Os anticorpos também podem ser utilizados para purificar a proteina CD33, por exemplo, por cromatografia de afinidade.

[120] Qualquer característica, etapa, elemento, modalidade, ou aspecto da invenção pode ser utilizado em combinação com qualquer outro, a menos que especificamente indicado de outra forma. Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes como meio de ilustração e exemplo para fins de clareza e compreensão, será aparente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS 1. Geração de anticorpos anti-CD33 Materiais

[121] As linhagens celulares descritas nos exemplos seguintes foram mantidas em cultura de acordo com as condições especificadas pela American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) ou a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Braunschweig, Alemanha). As células AML primárias foram mantidas em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) contendo 20% de FBS inativada por calor, suplementadas com 25 ng/ml cada uma de fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), interleucina-3 (IL-3) e fator de célula-tronco (SCF) . Os reagentes de cultura de células foram obtidos a partir de Invitrogen Corp (Carlsbad, CA) e as citocinas foram compradas de PeproTech (Rocky Hill, NJ).

Metodologia: Ensaios de Ligação saturação

[122] Cem mil células CD33-positivas (HL-60, HEL 92.1.7, e células HEK-293F trasnfectadas para expressar CD33 humana ou cynomolgus) foram transferidas a placas com 96 poços. CD33 mAb marcado com AlexaFluor-647 foi adicionado em concentrações variando a partir de 50 nM a 0,85 pM e as células foram incubadas em gelo por 30 minutos. As células foram granuladas por centrifugação, lavadas 3 vezes com uma solução de PBS + 1% BSA, e suspensas novamente em 125 μL de PBS + 1% BSA. Foi analisada a fluorescência utilizando um citômetro de fluxo e a percentagem de sinal fluorescente saturado foi utilizada para determinar a percentagem de ligação e para subsequentemente calcular o Kd aparente.

Ensaios de ligação de competição

[123] Cem mil células CD33-positivas foram transferidas a placas com 96 poços e incubadas por 1 hora em gelo com 1 nM de m2H12 marcado com AlexaFluor-647 e concentrações cada vez maiores (de 0,03 nM a 600 nM) de 2H12 mAb não marcado hibrido, humanizado ou quimérico. As células foram centrifugadas, lavadas 3 vezes com PBS, e suspensas novamente em 125 μL de uma solução de PBS + 1% BSA. Foi analisada a fluorescência utilizando um citômetro de fluxo, e a percentagem de sinal fluorescente saturado foi utilizada para determinar a percentagem de ligação de 2H12 mAb marcado. O EC50 foi extrapolado através do ajuste dos dados a uma curva de dose-resposta sigmoidal com inclinação variável.

Ensaio de Citotoxicidade

[124] Linhagens celulares de AML ou células AML primárias foram tratadas com mAb especifico a CD33 e conjugados anticorpo-fármaco (ADC) por 96 horas a 37°C. Em alguns experimentos, os ADC não ligantes a antigenos foram incluídos como controles negativos. A viabilidade das células para as linhagens celulares foi medida utilizando CelltiterGlo (Promega Corporation, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas por 25 minutos à temperatura ambiente com os reagentes de CelltiterGlo e a luminescência foi medida em um leitor de placa fluorescente Fusion HT (Perkin Elmer, Waltham, MA) . Para as células AML primárias, a viabilidade foi medida através de citometria de fluxo usando Anexina V e coloração de iodeto de propidio. Os resultados foram relatados como IC50, a concentração de composto necessária para atingir uma redução de 50% na viabilidade se comparado com células tratadas por veiculo (controle = 100%).

Produção de conjugados de anticorpo-fármaco

[125] Conjugados de anticorpo-fármaco dos anticorpos CD33 foram preparados como descrito em US20050238649 e W02011/130613 utilizando os anticorpos anti-CD33 aqui descritos. O ligante de fármaco SGD-1269 (mcMMAF) é descrito em US20050238649 e o ligante de fármaco SGD-1910 é descrito em W02011/130613. A preparação de mutantes de cisteina de IgGl mAb é de forma geral descrita em US20100158909. 0 ligante de fármaco SGD-1269 foi conjugado ao anticorpo h2H12 anti-CD33 através do grupo tiol de um residue de cisteina de uma ligação entre cadeias de dissulfeto e a carga média de fármaco foi de cerca de 4 fármacos por anticorpo. 0 ligante de fármaco SGD-1910 foi conjugado com o anticorpo anti-CD33 através de um grupo tiol de um residue de cisteina introduzido na posição 239 da cadeia de IgGl do anticorpo e a carga média de fármaco foi de cerca de 2 fármacos por anticorpo. Anticorpos com cisteina na posição 239 carregam a designação EC, por exemplo, h2H12EC ou hOOEC

Estudo de Atividade In Vivo Modelo AML disseminado

[126] Camundongos CB-17/IcrHsd-PrkdcSCID (SCID) foram inoculados de forma intravenosa com 5xl06 HL-60 de células tumorosas na veia caudal. Um dia após a inoculação do tumor, camundongos (n= 8/grupo) não foram tratados ou receberam dose de forma intraperitoneal a cada quatro dias de um total de duas doses de CD33 mAb e ADC ou controle não ligante mAb e ADC. Mylotarg administrado de forma intraperitoneal a cada sete dias por um total de duas doses foi incluido como controle positivo neste modelo AML sensivel a Mylotarg. Os animais foram submetidos à eutanásia quando a perda de peso corporal foi ^20%, ou quando os camundongos apresentaram sinais de doença avançada manifestada como sintomas do sistema nervoso central que incluiram inchaço do crânio e/ou paralisia dos membros posteriores, ou desenvolvimento de uma massa palpável de tumor disseminado.

Modelos AML subcutâneos

[127] Camudongos SCID foram inoculados de forma subcutânea com 5xl05 de HL-60 ou células tumorosas AML TF1- a. O crescimento do tumor foi monitorado com compassos e o volume médio do tumor foi calculado usado a fórmula (0,5 x [comprimento x largura2]) . Quando o volume médio tumoral atingiu aproximadamente 100 mm3, os camundongos (n=6- 7/grupo) não foram tratados ou receberam dose de forma intraperitoneal sendo uma única dose de CD33 ADC ou controle não ligante ADC. Para o modelo HL-60, os camundongos foram tratados com IVIg humano (injeção intraperitoneal única de 10 mg/kg) por aproximadamente guatro horas antes da administração de anticorpo terapêutico para minimizar a interação do ADC de teste com receptores de Fc nas células AML. Os camundongos foram submetidos à eutanásia quando os volumes tumorais atingiram aproximadamente 1000 mm3. Todos os procedimentos com os animais foram realizados sob protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee em uma instalação credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.

Resultados Geração de CD33 mAb munnho

[128] Os anticorpos direcionados contra o antigeno CD33 humano foram gerados em camundongos Balb/c por imunização com proteina de fusão humana recombinante CD33- Fc. 0 mAb 2H12 (m2H12) murino foi selecionado com base na afinidade para ligação com CD33 humano e com CD33 cynomolgus para permitir testes pré-clinicos em primatas não humanos.

Projeto e teste de anticorpos humanizados

[129] Anticorpos humanizados foram obtidos a partir de anticorpo 2H12 murino. Nove cadeias pesadas humanizadas (HA-HI) e sete cadeias leves humanizadas (LA- LG) foram feitas incorporando antigas mutações em diferentes posições. Veja Figuras IA, B um alinhamento de sequência e Tabelas la4. Tabela 1 Mutações Humanizantes em Variantes de Cadeia Pesada Tabela 2 Mutações Humanizantes em Variantes de Cadeias Leves Tabela 3 Mutações Específicas em Variantes de Cadeia Pesada 2H12 Tabela 4 Mutações Especificas em Variantes de Cadeia leve 2H12

[130] Cadeias humanizadas pesadas e leves foram emparelhadas com luz quimérica e cadeias pesadas (cadeias quiméricas compostas de regiões murinas variáveis e regiões humanas constantes) respectivamente. As variantes humanizadas/quiméricas de CD33 mAb foram testadas quanto a ligação em CD33 expressa em humanos na superfície de células AML HEL 92.1.7 (Tabela 5). As cadeias pesadas HC e Hl foram selecionadas para estudo posterior. Anticorpos humanizados foram expressos representado permutações de cadeias pesadas humanizadas HC e Hl e cadeias leves humanizadas LA, LE e LG e foi determinada a ligação a células que expressam CD33 humano ou cynomolgus (cyno) (Tabela 6) . O anticorpo HILG (2H12 HILG) foi selecionado como o anticorpo humanizado que se assemelhou mais às características da ligação do CD33 mAb m2H12 murino. 0 anticorpo HILG é referenciado como o anticorpo h2H12 (anticorpo 2H12 humano) . 0 KD para m2H12, h2H12, e h2H12 com uma mutação S239C (numeração EU) na cadeia pesada IgGl (referenciada como h2H12EC, para engenharia de cisteina), foi determinado para CD33 expresso em humanos como uma proteina endógena em duas linhagens celulares AML ou como proteina recombinante em uma linhagem celular HEK293F. O KD para estes anticorpos foi também determinado para CD33 expresso em cyno como uma proteina recombinante em uma linhagem celular HEK293F (Tabela 7). Tabela 5 Determinações de Ligações de EC50 para Variantes de CD33 mAb hibrido Quimérico-Humanizado em células AML HEL9217 que expressam CD33 Tabela 6 Determinações de Ligações de EC50 para Variantes de CD33 mAb Humanizado em células que expressam CD33 Humano e CD33 cyno Tabela 7 Medidas de Afinidade de CD33 mAbs Humanizado

Atividade Antitumoral In Vitro de h2H12 ADC

[131] A atividade citotóxica de conjugados de anticorpo-fármaco de h2H12 foi testada usando dois sistemas de ligação de fármaco, SGD-1269 (ligante de fármaco auristatina) e SGD-1910 (ligante de fármaco de dimero de pirolobenzodiazapina) . Um ensaio citotóxico foi realizado em contraste com duas linhagens celulares AML CD33- positivas, HL-60 e HEL 92.1.7, usando anticorpo não conjugado, h2H12- ADCs e ADCs de controle que não se ligam a CD33. Como mostrado na Figura 2, h2H12 e h2H12EC (também apresentaram atividade contra qualquer linhagem celular. Da mesma forma, os ADCs de controle não ligantes (hOOEC-SGD- 1910 e hOO-SGD-1269) não foram citotóxicos. Em contraste, h2H12EC-SGD-1910 foi citotóxico frente a HL-60 (IC50 ~ 1,6 ng/mL) e HEL 92.1.7 (IC50 -12,9 ng/mL) A atividade do h2H12EC-SGD-l910 foi similar à do Mylotarg, um conjugado anticorpo-fármaco direcionado anti-CD33 bem descrito, em células HL-60 e mais potente quando testado em contraste com HEL 92.1.7 (uma linhagem celular resistente a várias fármacos (MDR)), onde o Mylotarg não é efetivo. m2H12-SGD- 1269 e h2H12-SGD-1269 foram ativos contra células HL-60 (IC50 de 1,3 ng/mL e 5,3 ng/mL respectivamente) e em uma menor extensão contra HEL 92.1.7 (Figura 2). Em experimentos separados, h2H12-SGD-1269 e h2H12EC-SGD-1910 foram ainda testados em contraste com um painel expandido de linhagens celulares AML CD33 positivas. Como mostrado na Tabela 8, h2H12-SGD-1269 foi ativo contra 4 de 7 linhagens celulares AML (IC50 média para linhagens celulares responsivas, 72,8 mg/mL), e h2H12EC-SGD-1910 teve atividade potente contra 7 de 7 linhagens celulares AML testadas (IC50 média, 20,4 ng/mL). h2H12EC-SGD-1910 foi mais potente do que Mylotarg, que foi ativo em 3 de 8 linhagens celulares AML CD33 positivas. Nenhuma atividade foi observada quando os ADCs foram testados contra três linhagens celulares que não eram de origem AML e não expressavam CD33 (Tabela 8). Juntos, estes dados demonstram que conjugados anticorpo-fármaco de h2H12 e h2H12EC miram seletivamente células positivas CD33 e exibem atividade citotóxica frente a estas células. Tabela 8 Atividade In vitro de conjugados de fármaco h2H12 e Mylotarg contra linhagens celulares AML MDR, resistência a várias fármacos; +, fluxo de coloração > 2-vezes acima da base, NT, não testado

Atividade Antitumoral In Vivo de h2H12 ADC

[132] A atividade de h2H12-SGD-1269 foi testada em um modelo no qual a linhagem celular HL-60 AML foi introduzida em camundongos SCID para iniciar a doença avançada. Os camundongos foram tratados no dia seguinte com anticorpo h2H12, anticorpo de controle não especifico IVIg negativo, h2H12-SGD-1269, um controle de ADC (hBU12-SGD- 1269) não-ligante ou Mylotarg de acordo com os niveis de dosagem e o cronograma descrito na Tabela 9. A sobrevivência média de camundongos inoculados com HL-60 aumentou de 22 dias nos grupos não tratados ou tratados com IVIg humano para 29 dias (p=0,007), 41 dias (p=0,001) e 52 dias (p< 0,001) em grupos que receberam h2H12 (3 mg/kg) e 1 ou 3 mg/kg de h2H12-SGD-1269 respectivamente (Tabela 9). 0 h2H12EC-SGD-1269 prolongou a sobrevivência de forma similar àquela de camundongos dosados com h2H12-SGD-1269 (sobrevivência média de 50 e 52 dias respectivamente). Mylotarg foi também ativo neste modelo MDR negativo; mais do que 50% dos camundongos tratados com Mylotarg sobreviveram até o fim do estudo no dia 99. A sobrevivência de camundongos tratados com o anticorpo não conjugado h2H12 ou o controle de ADC (hBU12-SGD-1269) não ligante foi prolongada em 6-7 dias se comparado com camundongos de controle não tratados, mas a uma menor extensão do que os camundongos tratados com o ADC especifico para CD33. Tabela 9 Atividade do conjugado de fármaco h2H12-SGD- 1269 no modelo de xenoenxerto de HL-60 AML disseminado 1 Teste versus não tratado 2 Teste versus hlVIg 3 Teste versus hBU12-SGD-1269 (controle ADC não ligante) NS, não significativo; NR, não atingido; , não aplicável; hlVIG, imunoglobulina humana intravenosa; HBU12-SGD-1269, controle ADC não ligante.

[133] A atividade de h2H12EC-SGD-1910 foi testada em dois modelos de xenoenxerto subcutâneos de AML, HL-60 e TF1-Ü. Camundongos SCID portando tumores consagrados (~ lOOmm3) receberam administração de h2H12EC-SGD-l910 ou controle de ADC não-ligante (hOOEC-SGD-1910) como descrito na Tabela 10 para o modelo HL-60 e na Tabela 11 para o modelo de tumor TFl-β. O tratamento com h2H12EC-SGD-1910 reduziu significativamente o crescimento do tumor se comparar camundongos não tratados com camundongos tratados com controle de ADC não-ligante como foi medido pelo tempo médio para os tumores quadruplicarem em volume (Tabelas 10 e 11). A atividade antitumoral observada em ADC especifico para CD33 foi dependente da dose. Para tumores HL-60, uma única dose de 0,1 mg/kg resultou em regressão completa e resistente do tumor em 6 de 6 camundongos tratados. Uma menor dose de 0,03 mg/kg resultou em regressão completa em 1 de 6 camundongos tratados e prolongou o tempo para o tumor quadruplicar para 20 dias comparando com os 15 dias para camundongos não tratados e aqueles dosados de forma similar com controle de ADC não-ligante (hOOd-SGD-1910). No modelo MDR-positivo de tumor TFl-β (Tabela 11), uma única dose de 0,3 mg/kg de h2H12EC-SGD-1910 resultou em regressão completa e resistente do tumor em 5 de 7 camundongos tratados. O tempo médio para o tumor quadruplicar não foi obtido até o fim do estudo no dia 117. Em contraste, os tumores em camundongos dosados de forma similar com controle de ADC (h00EC-SGD-1910) não-ligante quadriplicaram em volume em 27 dias. Da mesma forma, o tempo médio para os tumores quadruplicarem em camundongos dosados com 0,1 mg/kg ou 0,03 mg/kg de h2H12EC-SGD-l910 foi significativamente mais longo (p=0,0001) do que aquele para camundongos não- tratados ou tratados com hOOEC-SGD-1910. O Mylotarg não foi ativo no modelo de tumor TFl-β; o crescimento do tumor em camundongos tratados com Mylotarg não foi diferente do crescimento em camundongos não-tratados. Considerados juntos, os dados demonstram que h2H12-ADC apresenta atividade antitumoral em modelos de xenoenxerto AML que é dependente da dose e significativamente maior do que em ADC não especifico. Tabela 10 Atividade de conjugado de fármaco h2H12EC- SGD-1910 no modelo de xenoenxerto subcutâneo HL-60 AML NS, não significativo; NR, não alcançado; , não aplicável; hlVIg, imunoglobulina humana intravenosa (administrada 4 horas antes da dosagem de ADC); h00EC-SGD-1910, controle de ADC não-ligante; DCR, resposta completa durável (nenhum tumor mensurável no fim -do estudo- no dia 50) Tabela 11 Atividade do conjugado de fármaco h2H12EC- I SGD-1910 no modelo de xenoenxerto subcutâneo TFl-βAML NS, .não significativo; _NR, _não alcançado; ,_ não. aplicável;. hOOEC- SGD-1910, controle de ADC não ligante; DCR, resposta completa durável (nenhum tumor mensurável no fim do estudo no dia 117) LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1, Cadeia leve 2H12 murina DIKMTQSPSSMYASLGERVIINCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVP SRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO:2, 2H12 LA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:3, 2H12 LB DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:4, 2H12 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:5, 2H12- LD - - - DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGQDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:6, 2H12 LE DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:7, 2H12 LF DIQMTQSPSSLSASVGDRVIINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:8, 2H12 LG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVP S RFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:9 Cadeia pesada 2H12 murina 1 QVQLQQSGPE LVRPGTFVKI SCKASGYTFT NYDINWVNQR PGQGLEWIGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKAKATL TADKSSSTAY LQLNNLTSEN SAVYFCASGY EDAMDYWGQG TSVTVSS 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:11 2H12 HB 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TADTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:12 2H12 HC 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCASGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:13 2H12 HD 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDKSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:14 2H12 HE 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWIGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:15 2H12 HF 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVNQR PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:16 2H12 HG 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKAKATL TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:17 2H12 HH 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWMGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKARVTM TTDTSTSTAY MELSSLTSDD TAVYYCARGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:18 2H12 HI 1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYDINWVRQA PGQGLEWIGW IYPGDGSTKY 61 NEKFKAKATL TADTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCASGY EDAMDYWGQG TTVTVSS SEQ ID NO:19 2H12 cadeia pesada CDR1 NYDIN SEQ ID NO:20 2H12 cadeia pesada CDR2 WIYPGDGSTKYNEKFKA SEQ ID NO:21 2H12 cadeia pesada CDR3 GYEDAMDY SEQ ID NO:22 2H12 light chain CDR1 KASQDINSYLS SEQ ID NO:23 2H12 light chain CDR2 RANRLVD SEQ ID NO:24 2H12 cadeia leve CDR3 LQYDEFPLT SEQ ID NO:25< região de cadeia leve constante; PRT/l;homo sapiens> TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:26<CH1-CH3;PRT/l;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:27<cadeia pesada CHI - CH3 (nenhum c-term K);PRT/1;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:28<S239C cadeia pesada CHI - CH3;PRT/1;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:29<S239C cadeia pesada CHI - CH3 (nenhum c-term K);PRT/1;homo sapiens> ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO:30 <h2H12 mAb lider de cadeia leve > MDMRTPAQFLGILLLWFPGIKC SEQ ID NO:31<h2H12 mAb lider de cadeia leve > MGWRWIFLFLLSGTAGVHC SEQ ID NO:32 > 2H12 LA gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaecatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa SEQ ID NO:33 > 2H12 LB gacatcaagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa SEQ ID NO:34 > 2H12 LC gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaecatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgettgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggcaagatttcactctcaccatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa SEQ ID NO:36 > 2H12 LE gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcacttgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa SEQ ID NO:37 > 2H12 LF gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcat tatcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagtccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa SEQ ID NO:38> 2H12 LG gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcaattgtaaggctagtcaggacattaatagctatttgagctggtttcagcagaaac cagggaaagcccctaagaccctgatctatagagcaaatagattggtagatggggtccca tcaaggttctctggcagtggatctgggcaagattatactctcaccatcagcagcctgca gcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacatttg gaggagggaccaaggtggagatcaaa SEQ ID NO:39 > 2H12 HA caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagag gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:40 > 2H12 HB caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaecatgacagctgacacatccaccagcacage ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagag gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaecatgaccacagacacatccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctg gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:42 > 2H12 HD caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacaagtccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagag gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:43 > 2H12 HE Caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgctagag gatatgaagatgetatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:44> 2H12 HF caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgaaccaga ggcctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaecatgaccacagacacatccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattaetgtgetagag gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:45 > 2H12 HG caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgaccacagacacatccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattaetgtgetagag gatatgaagatgetatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:46 > 2H12 HH caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggatgggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccagagtcaccatgaccacagacacatccaccagcacagc etacatggagetgagcagcctgacctetgatgacacagctgtgtattaetgtgetagag gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggt ctcctgcaaggcttctggttacacctttaccaattatgatataaattgggtgagacagg cccctggacaagggcttgagtggattggatggatttatcctggagatggtagtaccaaa tataatgagaaattcaaggccaaggctaccctgacagctgacacatccaccagcacagc ctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgcttctg gatatgaagatgctatggactactgggggcaagggaccacagtcacagtctcctca SEQ ID NO:48<região constante de cadeia leve;DNA; homo sapiens> acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgg aactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacga gaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa agagcttcaacaggggagagtgt SEQ ID NO:49<CH1-CH3;DNA;homo sapiens> gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgg gggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgt cctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcc tcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcaccca gacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttg agcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg gacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagt tcaactggtaegtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgegggaggag cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct gaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccategaga aaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccca tcccgggatgagetgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggetteta tcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaaga ccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctct 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aaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccca tcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttcta tcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaaga ccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctct gcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt SEQ ID NO:53 <h2H12 mAb região de cadeia leve constate > Atggacatgaggacccctgctcagtttcttggaatcttgttgctctggtttccaggtat caaatgt Atgggatggagatggatctttcttttcctcctgtcgggaactgcaggtgtccattgc SEQ ID NO:55 P20138 Proteína CD33, homo sapiens 1 mplllllpll wagalamdpn fwlqvqesvt vqeglcvlvp ctffhpipyy dknspvhgyw 61 fregaiisrd spvatnkldq evqeetqgrf rllgdpsrnn cslsivdarr rdngsyffrm 121 ergstkysyk spqlsvhvtd Ithrpkilip gtlepghskn Itcsvswace qgtppifswl 181 saaptslgpr tthssvliit prpqdhgtnl tcqvkfagag vttertiqln vtyvpqnptt 241 gifpgdgsgk qetragvvhg aiggagvtal lalclcliff ivkthrrkaa rtavgrndth 301 pttgsaspkh qkksklhgpt etsscsgaap tvemdeelhy aslnfhgmnp skdtsteyse 361 vrtq SEQ ID NO:56 Proteina CD33, cynomolgus mpllllpllwagalamdprvrlevqesvtvqeglcvlvpctffhpvpyhtrnspvhgyw fregaivsldspvatnkldqevqeetqgrfrllgdpsrnncslsivdarrrdngsyf fr mekgstkysykstqlsvhvtdlthrpqilipgaldpdhs knltcsvpwaceqgtppifs wmsaaptsigirtthssvliitprpqdhgtnltcqvkfpgagvttertiqlnvsyasqn prtdifIgdgsgkqgvvqgaiggagvtvllalclclifftvkthrrkaartavgridth patgptss khqkksklhgatetsgcsgttItvemdeelhyaslnfhgmnpsedtsteys evrtq SEQ ID NO:57 proteina CD33, cynomolgus mpllllpllwagalamdprvrlevqesvtvqeglcvlvpctf fhpvpyharnspvhgyw fregaivsldspvatnkldqevreetqgrfrllgdpsrnncslsivdarrrdngsyffr mekgstkysykstqlsvhvtdlthrpqilipgaldpdhs knltcsvpwaceqgtppifs wmsaaptslglrtthssvliitprpqdhgtnltcqvkfpgagvttertiqlnvsyasqn prtdifIgdgsgkqgvvqgaiggagvtvllalclclif ftvkthrrkaartavgridth patgptss khqkksklhgatetsgcsgttItvemdeelhyaslnfhgmnpsedtsteys evrtq

Claims (18)

1. Anticorpo isolado que se liga especificamente à proteína CD33 humana, o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs): CDR1 de cadeia pesada que consiste da SEQ ID NO:19, CDR2 de cadeia pesada que consiste da SEQ ID NO:20, e CDR3 de cadeia pesada que consiste da SEQ ID NO:21; e três CDRs de cadeia leve: CDR1 de cadeia leve que consiste da SEQ ID NO:22, CDR2 de cadeia leve que consiste da SEQ ID NO:23, e CDR3 de cadeia leve que consiste da SEQ ID NO:24.

2. Anticorpo, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de um anticorpo murino, um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado.

3. Anticorpo, de acordo a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado.

4. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante da cadeia pesada, e a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve.

5. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante da região constante humana natural que tem ligação reduzida para um receptor FCY em relação à região constante humana natural.

6. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é do isotipo IgG1.

7. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:27 e a região constante de cadeia leve possui uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:25.

8. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada possui uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:29 (S239C), e a região constante de cadeia leve possui uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:25.

9. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO:18, e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO:8.

10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é conjugado a um agente citotóxico.

11. Anticorpo, de acordo a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é conjugado ao anticorpo através de um ligante clivável de enzima.

12. Anticorpo, de acordo a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é um ligante do sulco menor do DNA.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico tem a fórmula

14. Anticorpo, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui uma constante de associação para o ser humano ou macaco cynomolgus CD33 de 0,5 a 2 x 109 M-1.

15. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura possui uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:18 ligada a uma região constante de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27 ou 29, e a região variável de cadeia leve madura possui uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:8 ligada a uma região constante de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, em que o anticorpo é conjugado à uma pirrolbenzodiazepina.

16. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende SEQ ID NOs:47 e 38 codificando uma região variável de cadeia pesada madura e uma região variável de cadeia leve madura, respectivamente.

17. Uso de um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para tratar um paciente tendo ou em risco de ter câncer.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia mielóide aguda (LMA), síndrome mielodisplásica (SMD), leucemia promielocítica aguda (LPA), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielomonocítica crônica (LMMC), distúrbios mieloproliferativos crônicos, leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula B (preB-LLA), leucemia linfoblástica aguda de precursor de célula T (preT-LLA), mieloma múltiplo (MM), doença de mastócitos, ou Sarcoma mielóide.