KR20240073140A - 비-푸코실화된 항-cd40 항체의 용량 및 투여 - Google Patents

비-푸코실화된 항-cd40 항체의 용량 및 투여 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 및 만성 감염성 질환의 치료를 위한 비-푸코실화된 항-CD40 항체의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

비-푸코실화된 항-CD40 항체의 용량 및 투여{DOSAGE AND ADMINISTRATION OF NON-FUCOSYLATED ANTI-CD40 ANTIBODIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 10월 29일자 제출된 미국 임시 출원 No. 62/072,031 및 2015년 3월 18일자 제출된 미국 임시 출원 No. 62/134,955의 이익을 주장하며, 이들은 모두 모든 취지에서 여기 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시는 암 및 만성 감염성 질환의 치료를 위한 비-푸코실화된 항-CD40 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
CD40은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리의 일원이다. 그것은 50 kDa의 겉보기 MW를 가진 단일 사슬 타입 I 경막 단백질이다. CD40는 또한 항원-제시 세포와 T 세포 간 접촉-의존성 상호적 상호작용을 촉진함으로써 면역 시스템을 활성화하는 기능을 한다. 다수의 항-CD40 항체가 임상 시험에서 테스트되었지만 지금까지 어느 것도 충분한 활성을 나타내지 않았다. 본 개시는 이 문제 및 다른 문제를 해결한다.
본 개시는 치료가 필요한 환자에게 항-CD40 항체를 투여함에 의한 암의 치료 방법을 제공한다. 항-CD40 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역과 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 잔기 N297에 N-글리코시드-결합된 당 사슬을 가지며, N-글리코시드-결합된 당 사슬의 5% 미만이 푸코오스 잔기, 즉 N-아세틸글루코사민("GlcNAc")에 대한 α1,6 결합을 통해 당 사슬의 환원 말단에 결합된 푸코오스를 포함한다. 항-CD40 항체의 투여는 0.1-300μg/kg(킬로그램 환자체중 당 μg 항체)의 투여량 수준이다. 한 구체예에서, 항-CD40 항체 투여량 수준은 0.6-150μg/kg이다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체 투여량 수준은 1.0-100μg/kg이다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체 투여량 수준은 5-25μg/kg이다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체 투여량 수준은 8-12μg/kg이다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체 투여량 수준은 약 10μg/kg이다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체 투여량 수준은 10μg/kg이다.
다른 양태에서, 본 개시는 치료가 필요한 환자에게 항-CD40 항체를 투여함에 의한 암의 치료 방법을 제공한다. 항-CD40 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역과 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 잔기 N297에 N-글리코시드-결합된 당 사슬을 가지며, N-글리코시드-결합된 당 사슬의 5% 미만이 푸코오스 잔기, 즉 N-아세틸글루코사민("GlcNAc")에 대한 α1,6 결합을 통해 당 사슬의 환원 말단에 결합된 푸코오스를 포함한다. 항-CD40 항체의 투여는 0.1-2000μg/kg(킬로그램 환자체중 당 μg 항체)의 투여량 수준이다. 한 구체예에서, 투여량 수준은 10-1000μg/kg이다. 다른 구체예에서, 투여량 수준은 50-800μg/kg이다. 추가 구체예에서, 투여량 수준은 75-600μg/kg이다. 다른 구체예에서, 투여량 수준은 100-500μg/kg이다. 추가 구체예에서, 투여량 수준은 100-300μg/kg, 300-500μg/kg, 500-700μg/kg, 700-900μg/kg, 및 900-1100μg/kg으로부터 선택된 범위이다. 다른 구체예에서, 투여량 수준은 100-150μg/kg, 150-200μg/kg, 200-250μg/kg, 250-300μg/kg, 300-350μg/kg, 350-400μg/kg, 400-450μg/kg, 450-500μg/kg, 500-550μg/kg, 550-600μg/kg, 600-650μg/kg, 650-700μg/kg, 700-750μg/kg, 750-800μg/kg, 800-850μg/kg, 850-900μg/kg, 900-950μg/kg, 950-1000μg/kg, 1000-1050μg/kg, 및 1050-1100μg/kg으로부터 선택된 범위이다. 추가 구체예에서, 투여량 수준은 약 60μg/kg, 약 100μg/kg, 약 150μg/kg, 약 200μg/kg, na약 250μg/kg, 약 300μg/kg, 약 350μg/kg, 약 400μg/kg, 약 450μg/kg, 약 500μg/kg, 약 550μg/kg, 약 600μg/kg, 약 650μg/kg, 약 700μg/kg, 약 750μg/kg, 약 800μg/kg, 약 850μg/kg, 약 900μg/kg, 약 950μg/kg, 약 1000-1050μg/kg, 약 1050μg/kg, 및 1110μg/kg으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 항-CD40 항체는 3주마다 투여된다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 6주마다 투여된다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 10주마다 투여된다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 12주마다 투여된다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 15주마다 투여된다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 18주마다 투여된다.
다른 구체예에서, 환자는 CD40 양성 암을 가진다. 다른 구체예에서, 환자는 CD40 음성 암을 가진다. 추가 구체예에서, 환자는 고상 종양인 암을 가진다. 또 다른 구체예에서, 환자는 혈액암인 암을 가진다. 다른 구체예에서, 암은 흑색종, 전이성 유방암을 포함하는 유방암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 또는 전립선암이다.
추가 양태에서, 본 개시는 항-CD40 항체와 면역 체크포인트를 차단하는 항체의 조합을 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 면역 체크포인트를 차단하는 항체의 일례는 항-세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4) 항체이다. 항-CTLA4 항체의 예들은, 예를 들어 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함한다. 면역 체크포인트를 차단하는 항체의 다른 예는 항-프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD1) 항체이다. 항-PD1 항체의 예들은, 예를 들어 니볼루맙, 피딜리주맙, 또는 펨브롤리주맙을 포함한다. 면역 체크포인트를 차단하는 항체의 추가의 예는 항-프로그램된 사멸-리간드(PD-L1) 항체이다. 항-PD-L1 항체의 예들은, 예를 들어 MEDI4736 및 MPDL3280A를 포함한다.
다른 구체예에서, 환자는 CD40 양성 암을 가지고, 항-CD40 항체와 면역 체크포인트를 차단하는 항체, 예를 들어 항-CTLA4 항체, 항-PD1 항체, 또는 항-PD-L1 항체의 조합으로 치료된다. 다른 구체예에서, 환자는 CD40 음성 암을 가지고, 항-CD40 항체와 면역 체크포인트를 차단하는 항체, 예를 들어 항-CTLA4 항체, 항-PD1 항체, 또는 항-PD-L1 항체의 조합으로 치료된다. 추가 구체예에서, 환자는 고상 종양인 암을 가지고, 항-CD40 항체와 면역 체크포인트를 차단하는 항체, 예를 들어 항-CTLA4 항체, 항-PD1 항체, 또는 항-PD-L1 항체의 조합으로 치료된다. 또 다른 구체예에서, 환자는 혈액암인 암을 가지고, 항-CD40 항체와 면역 체크포인트를 차단하는 항체, 예를 들어 항-CTLA4 항체, 항-PD1 항체, 또는 항-PD-L1 항체의 조합으로 치료된다. 다른 구체예에서, 암은 흑색종, 전이성 유방암을 포함하는 유방암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 또는 전립선암이고, 항-CD40 항체와 면역 체크포인트를 차단하는 항체, 예를 들어 항-CTLA4 항체, 항-PD1 항체, 또는 항-PD-L1 항체의 조합으로 치료된다.
정의
"폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 사슬"은 천연 생성되든 합성 생성되는 펩티드 결합에 의해서 이어진 아미노산 잔기들의 중합체이다. 약 10개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 통상 "펩티드"라고 언급된다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 비-펩티드 치환체가 단백질이 생성되는 세포에 의해서 단백질에 첨가될 수 있으며, 이것은 세포의 종류에 따라 다양할 것이다. 단백질은 본원에서 그것의 아미노산 백본 구조의 측면에서 정의된다; 탄수화물 기와 같은 치환체는 일반적으로 명시되지는 않지만 그럼에도 존재할 수 있다.
용어 "아미노-말단"과 "카복실-말단"은 본원에서 폴리펩티드 내의 위치를 표시하기 위해 사용된다. 문맥이 허용하는 경우 이들 용어는 근접성 또는 상대적 위치를 표시하기 위해 폴리펩티드의 특정한 서열 또는 일부분을 참조하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드 내에서 기준 서열에 대해 카복실-말단 위치된 특정 서열은 기준 서열의 카복실 말단부에 가까이 위치되지만 반드시 완전한 폴리펩티드의 카복실 말단부인 것은 아니다.
용어 "항체"는 본원에서 항원의 존재에 반응하여 신체에 의해서 생성되며 항원에 결합하는 면역글로불린 단백질, 뿐만 아니라 그것의 항원-결합 단편 및 조작된 변이체를 표시하기 위해 사용된다. 따라서, 용어 "항체"는, 예를 들어 전장 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 포함하는 무손상 단클론성 항체(예를 들어, 하이브리도마 기술을 사용하여 생성된 항체) 및 항원-결합 항체 단편, 예컨대 F(ab')2 및 Fab 단편을 포함한다. 유전자 조작된 무손상 항체 및 단편, 예컨대 키메라 항체, 인간화 항체, 단쇄 Fv 단편, 단쇄 항체, 디아바디, 미니바디, 선형 항체, 다가 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 하이브리드 항체 등이 또한 포함된다. 따라서, 용어 "항체"는 항체의 항원-결합 부위를 포함하며 그것의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질을 포함하도록 광범위하게 사용된다.
"항체의 항원-결합 부위"는 그것의 항원에 결합하기에 충분한 항체의 일부분이다. 최소한 이러한 영역은 전형적으로 가변 도메인 또는 그것의 유전자 조작된 변이체이다. 단일-도메인 결합 부위는 낙타과 항체(Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recog. 12:131-140, 1999; Nguyen et al., EMBO J. 19:921-930, 2000 참조)로부터 또는 단일-도메인 항체를 생성할 수 있는 다른 종들의 VH도메인("dAbs"; Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; Winter et al.의 미국특허 No. 6,248,516 참조)으로부터 발생될 수 있다. 특정 변형에서, 항원-결합 부위는 자연 또는 비-자연(예를 들어, 돌연변이된) 발생 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 그것의 조합의 단지 두 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 폴리펩티드 영역이다(예를 들어, Pessi et al., Nature 362:367-369, 1993; Qiu et al., Nature Biotechnol. 25:921-929, 2007 참조). 더 통상적으로, 항체의 항원-결합 부위는 공통 에피토프에 결합하는 중쇄 가변(VH) 도메인과 경쇄 가변(VL) 도메인을 모두 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 항체는 항원-결합 부위에 더하여 하나 이상의 성분, 예컨대 예를 들어 항체의 제2 항원-결합 부위(이것은 동일하거나 상이한 에피토프 또는 동일하거나 상이한 항원에 결합할 수 있다), 펩티드 링커, 면역글로불린 불변 영역, 면역글로불린 힌지, 양친매성 나선(Pack and Pluckthun, Biochem. 31:1579-1584, 1992 참조), 비-펩티드 링커, 올리고뉴클레오티드(Chaudri et al. FEBS Letters 450:23-26, 1999 참조), 세포증식억제성 또는 세포독성 약물 등을 포함할 수 있고, 모노머 또는 멀티머 단백질일 수 있다. 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 분자의 예들은 본 분야에 공지이며, 예를 들어 Fv, 단쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디, dAbs, 미니바디, 나노바디, Fab-scFv 융합체, 이중특이적 (scFv)4-IgG, 및 이중특이적 (scFv)2-Fab를 포함한다(예를 들어, Hu et al, Cancer Res. 56:3055-3061, 1996; Atwell et al., Molecular Immunology 33:1301-1312, 1996; Carter and Merchant, Curr. Opin. Biotechnol. 8:449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; 및 Lu et al., J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002. 참조).
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자(들)에 의해서 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 말한다. 면역글로불린의 한 가지 형태는 척추동물에서 자생(즉, 천연) 항체의 기본 구조 유닛을 구성한다. 이 형태는 테트라머이고, 동일한 두 쌍의 면역글로불린 사슬로 구성되는데, 각 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 가진다. 각 쌍에서 경쇄 및 중쇄 가변 영역(VL 및 VH)은 함께 주로 항원에 대한 결합을 담당하고, 불변 영역은 주로 항체 이펙터 기능을 담당한다. 면역글로불린 단백질의 다섯 가지 부류(IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE)가 고등 척추동물에서 확인되었다. IgG가 주 부류를 포함한다; 그것은 통상 혈장에서 발견되는 두 번째로 가장 풍부한 단백질로서 존재한다. 인간에서 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 칭해지는 4개의 하위부류로 구성된다. IgG 부류의 중쇄 불변 영역은 그리스문자 기호 γ로 식별된다. 예를 들어, IgG1 하위부류의 면역글로불린은 γ1 중쇄 불변 영역을 함유한다. 각 면역글로불린 중쇄는 종에 주어진 하위부류에 대해 본질적으로 변치않는 불변 영역 단백질 도메인(CH1, 힌지, CH2, 및 CH3; IgG3은 또한 CH4 도메인을 함유한다)으로 구성되는 불변 영역을 지닌다. 인간 및 비-인간 면역글로불린 사슬을 암호화하는 DNA 서열은 본 분야에 공지이다(예를 들어, Ellison et al., DNA 1:11-18, 1981; Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Amster et al., Nuc. Acids Res. 8:2055-2065, 1980; Rusconi and Kohler, Nature 314:330-334, 1985; Boss et al., Nuc. Acids Res. 12:3791-3806, 1984; Bothwell et al., Nature 298:380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42:333-341, 1995; Karlin et al., J. Mol. Evol. 22:195-208, 1985; Kindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18:165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993; 및 GenBank Accession No. J00228 참조). 면역글로불린 구조 및 기능의 리뷰는 Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; 및 Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994를 참조한다. 용어 "면역글로불린"은 본원에서 그것의 통상적인 의미로 사용되며, 무손상 항체, 그것의 성분 사슬, 또는 문맥에 따라서는 사슬의 단편을 표시한다.
전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25 Kd 또는 214개 아미노산)는 아미노-말단에서 가변 영역 유전자(약 110개 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화되고 카복실-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50 Kd 또는 446개 아미노산)는 가변 영역 유전자(약 116개 아미노산을 암호화함) 및 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론 불변 영역 유전자(약 330개 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화되며, 후자는 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE로서 항체의 동형을 한정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J"영역에 의해 이어지며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다(일반적으로 Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2nd ed. 1989), Ch. 7 참조).
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(본원에서 각각 "경쇄 가변 도메인"("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변 도메인"("VH 도메인")이라고도 언급된다)은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 하는 3개의 초가변 영역이 개재된 "프레임워크" 영역으로 구성된다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적 결합을 위해 CDR을 정렬시키는 역할을 한다. 따라서, 용어 "초가변 영역" 또는 "CDR"은 주로 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 아미노-말단에서 카복실-말단으로 VL 및 VH 도메인은 모두 다음의 프레임워크(FR) 및 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각 도메인에 대한 아미노산의 배정은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989를 따른다. Kabat는 또한 널리 사용되는 넘버링 관습(Kabat 넘버링)을 제공하며, 여기서 상이한 중쇄 또는 상이한 경쇄 간 상응하는 잔기에는 동일한 번호가 배정된다. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본원에서 각각 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3으로 언급되고, VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본원에서 각각 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3으로 언급된다.
문맥상 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 사용된 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해서 생성된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "단클론성 항체"는 임의의 진핵세포, 원핵세포, 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래된 항체를 말하며, 그것이 생성되는 방법은 아니다.
용어 "키메라 항체"는 제1 종으로부터 유래된 가변 도메인 및 제2 종으로부터 유래된 불변 도메인을 가진 항체를 말한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는, 예를 들어 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 세그먼트로부터 유전자 조작에 의해서 구성될 수 있다. 아래 정의된 대로 용어 "인간화 항체"는 키메라 항체를 포함하도록 의도되지 않는다. 인간화 항체는 그것의 구성에 있어서 키메라이지만(즉, 하나보다 많은 단백질 종으로부터의 영역을 포함한다), 이들은 본원에서 정의된 대로, 키메라 면역글로불린 또는 항체에서 발견되지 않는 추가의 특징(즉, 도너 CDR 잔기 및 어셉터 프레임워크 잔기를 포함하는 가변 영역)을 포함한다.
용어 "인간화 VH 도메인" 또는 "인간화 VL 도메인"은 비-인간 도너 면역글로불린(예를 들어, 마우스 또는 래트)로부터 전부 또는 실질적으로 일부 또는 모든 CDR 및 인간 면역글로불린 서열로부터 전부 또는 실질적으로 가변 영역 프레임워크 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인을 말한다. CDR을 제공하는 비-인간 면역글로불린은 "도너"라고 불리고, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "어셉터"라고 불린다. 일부 예에서, 인간화 항체는 적절한 결합 특성을 증진시키기 위해서 인간 가변 도메인 프레임워크 영역 내에 비-인간 잔기를 보유할 수 있다(예를 들어, 프레임워크에서 돌연변이가 항체가 인간화될 때 결합 친화성을 보존하기 위해 필요할 수 있다).
"인간화 항체"는 인간화된 VH 도메인과 인간화된 VL 도메인 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 항체이다. 면역글로불린 불변 영역(들)은 존재할 필요가 없지만, 이들이 있다면, 이들은 전부 또는 실질적으로 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터이다.
그것의 표적 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1. 의 친화성을 의미한다. 특이적 결합은 크기에 있어서 검출할 수 있을만큼 높고 적어도 하나의 무관한 표적에 대해 발생하는 비-특이적 결합으로부터 구별할 수 있다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간적 핏(예를 들어, 열쇠와 자물쇠 타입) 간에 결합이 형성된 결과일 수 있지만, 비-특이적 결합은 일반적으로 반데르발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 반드시 단클론성 항체가 하나의 유일한 하나의 표적에 결합한다는 것을 내포하지는 않는다.
본원에서 설명된 단백질과 관련하여, SEQ ID NO에 의해서 명시된 것들에 상응하는 아미노산 잔기에 대한 언급은 이러한 잔기의 번역 후 변형을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "희석제"는 본원에서 설명된 예시적인 또는 적절한 농도 또는 농도들을 변경하거나 달성하는데 적합한 용액을 말한다.
용어 "용기"는 물체 또는 액체가, 예를 들어 저장을 위해 위치되거나 함유될 수 있는 어떤 것을 말한다(예를 들어, 홀더, 리셉타클, 베셀 등).
용어 "투여 경로"는 치료 단백질을 송달하기 위한 본 분야에서 인정되는 투여 경로, 예컨대 예를 들어 비경구, 정맥내, 근육내, 또는 피하 경로를 포함한다. 암의 치료를 위한 항체의 투여를 위해, 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 순환에의 투여가 바람직할 수 있다. 고상 종양을 특징으로 하는 암의 치료를 위해, 투여는 또한 그렇게 하는 것이 바람직하다면 종양에 직접 국소화될 수 있다.
용어 "치료"는 질환을 치유, 고침, 경감, 지연, 완화, 변경, 구제, 개량, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로 질환을 가진 환자에게 치료제를 투여하는 것을 말한다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상을 포함한다.
용어 "유효량", "유효 투여량" 또는 "유효 용량"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한, 예를 들어 질환 또는 장애의 발생을 억제하거나 그것의 하나 이상의 증상을 개량하기에 충분한 양을 말한다. 제약 조성물의 유효량은 "유효 섭생"으로 투여된다. 용어 "유효 섭생"은 투여되는 조성물의 양과 질환 또는 장애의 예방적 또는 치료적 치료를 달성하기에 충분한 용량 빈도의 조합을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 명시된 값으로부터 플러스 또는 마이너스 10%의 대략적인 범위를 표시한다. 예를 들어, "약 20μg/Kg"이란 말은 18-22μg/Kg의 범위를 포함한다. 본원에서 사용된 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 20μg/Kg"은 "약 20μg/Kg"과 또한 "20μg/Kg"을 의미한다.
도 1은 PBMC의 표면에 존재하는 인간 CD40 단백질에 대한 SEA-CD40(실선) 및 다세투주맙(점선)의 결합을 제공한다.
도 2a 및 2b는 인간 FcγIIIa 수용체 변이체에 대한 SEQ-CD40(검은색 및 흰색 사각형) 및 다세투주맙(검은색 및 흰색 원)의 결합 친화성을 제공한다. 도 2a는 그래프 표현을 제공하고, 도 2b는 KD 값을 제공한다. SEA-CD40 값은 좌측 칼럼에 제시되고, 다세투주맙 값은 우측 칼럼에 제시된다.
도 3은 SEA-CD40으로 처리한 결과로서 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 B-세포 고갈의 투여량 관계 및 시간 과정을 제공한다.
도 4a 및 4b는 SEA-CD40 또는 동형 대조군(SEA-h00)으로 24시간 치료 후 인간 전혈에 의한 대표적인 사이토카인 생성을 나타낸다. 항체는 μg/mL 단위로 투여되었다. 도 4a는 종양 괴사 인자-α의 생성을 나타내고, 도 4b는 MIP-1β의 생성을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 SEA-CD40 또는 동형 대조군(SEA-h00)으로 24시간 처리 후 인간 PBMC에 의한 대표적인 사이토카인 생성을 나타낸다. 항체는 μg/mL 단위로 투여되었다. 도 5a는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 생성을 나타내고, 도 5b는 MIP-1β의 생성을 나타낸다.
도 6은 SEQ-CD40(검은색 사각형); 다세투주맙(회색 원); 또는 SEA-CD40 F(ab')2(회색 사각형)으로 처리한 결과로서 인간 PBMC로부터 B-세포 고갈의 시간 과정을 제공한다.
도 7은 SEQ-CD40(검은색 사각형); 다세투주맙(회색 원); 또는 SEA-CD40 F(ab')2(회색 사각형)으로 처리한 결과로서 PBMC에 의한 인터페론-γ(IFNγ) 생성을 제공한다.
도 8은 SEQ-CD40(검은색 사각형); 다세투주맙(회색 원); 또는 SEA-CD40 F(ab')2(회색 사각형)으로 처리한 결과로서 PBMC에 의한 항원 제시 세포 성숙화의 마커인 HLA-DR/DQ/DP의 유도를 나타낸다.
도 9는 SEA-CD40의 다양한 농도로 처리된 PBMC에서 면역 활성화 마커에 대한 농도 대 정규화된 반응 곡선을 제공한다.
도 10a 및 10b는 SEA-CD40 또는 다세투주맙과 함께 인큐베이션된 PBMC에 의한 M1 flu 펩티드에 대한 면역 반응을 비교한다. 도 10a는 항원 특이적 T-세포의 수준을 퍼센트로 나타내고, 도 10b는 IFN-γ 생성 수준을 나타낸다.
도 11은 SEA-CD40과 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체의 조합과 함께 인큐베이션된 PBMC에 의한 M1 flu 펩티드에 대한 면역 반응의 증진을 나타낸다. IFNγ 수준이 도 11에 제시된다.
도 12는 SEA-CD40과 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체의 조합과 함께 인큐베이션된 PBMC에 의한 M1 flu 펩티드에 대한 면역 반응의 증진을 나타낸다. 항원 특이적 T-세포의 수준이 도 12에 제시된다.
도 13은 공통 종양 항원 펩티드(MAGEA1/MAGE3/NY-ESO)에 대한 암을 가진 도너로부터의 PBMC의 면역 반응(IFNγ 생성)을 제공한다. PBMC는 5일 동안 SEA-CD40 또는 SGN-40의 증가하는 농도의 존재 또는 부재하에 인큐베이션되었다.
도 14는 공통 종양 항원 펩티드(MAGEA1/MAGE3/NY-ESO)에 대한 암을 가진 도너로부터의 PBMC의 면역 반응(IFNγ 생성)을 제공한다. PBMC는 SEA-CD40의 증가하는 농도 및/또는 항-CTLA4 또는 항-PD1 차단 항체의 일정한 농도의 존재 또는 부재하에 인큐베이션되었다.
도 15a 및 15b는 뮤린 Fcγ 수용체에 대한 푸코실화된 및 비-푸코실화된 항-마우스 CD40 항체의 결합을 나타낸다. Fcγ 수용체는 FcγRI(도 15a) 또는 FcγRIV(도 15b)였다.
도 16은 마우스 B16 흑색종 모델에서 푸코실화된 및 비-푸코실화된 항-CD40 항체 대용물의 생체내 활성을 나타낸다.
도 17은 SEA-CD40, 항체 21.4.1 및 CD40 헥사머 리간드의 B-세포 활성화 활성을 나타낸다. 실험은 정제된 B-세포 배양물을 사용하여 수행되었다.
도 18은 SEA-CD40, 항체 21.4.1 및 CD40 헥사머 리간드의 B-세포 활성화 활성을 나타낸다. 실험은 PBMC 배양물을 사용하여 수행되었다.
도 19는 SEA-CD40, 항체 21.4.1, 다세투주맙 또는 SEA-동형 대조군의 단구/대식세포 활성화 활성을 나타낸다.
도 20은 SEA-CD40, 항체 21.4.1, 다세투주맙 또는 SEA-동형 대조군에 의한 인터페론-γ(IFN-γ)의 유도를 나타낸다.
도 21은 SEA-CD40, 항체 21.4.1, 다세투주맙 또는 SEA-동형 대조군에 의한 인터류킨 10(IL10)의 유도를 나타낸다.
도 22는 SEA-CD40, 항체 21.4.1 또는 다세투주맙에 의한 인터페론-γ(IFN-γ) 수준의 유도를 나타낸다. 인큐베이션은 flu 펩티드의 존재하에 행해졌다.
도 23은 SEA-CD40, 항체 21.4.1 또는 다세투주맙에 의한 flu-항원 특이적 T-세포 반응의 유도를 나타낸다.
도 24는 flu 펩티드 및 SEA-CD40, 항체 21.4.1 또는 다세투주맙과 함께 PBMC를 인큐베이션한 후 IL10 수준의 변화를 나타낸다.
본 개시는 비-푸코실화된 항-CD40 항체, SEA-CD40의 활성에 대한 설명을 제공한다. SEA-CD40은 길항성 항체이며, Fcγ 수용체 III에 대한 증진된 결합을 가지고, 놀랍게도 CD40 신호화 경로의 증진된 활성화를 나타낸다. CD40 경로의 증진된 활성 때문에 SEA-CD40은 면역 시스템의 효능있는 활성제이며, 암을 치료하거나, 또는 감염성 질환, 특히 만성 바이러스성 질환, 예컨대 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 시토메갈로바이러스, 존 커닝햄 바이러스, 및 인간 유두종 바이러스를 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 감염성 질환은, 예를 들어 결핵을 포함한다. 면역 시스템의 증진된 활성화는 푸코실화된 모 항체와 비교하여 SEA-CD40이 낮은 수준으로 투약되는 것을 허용한다.
CD40 설명 및 기능
CD40은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체의 수퍼패밀리의 일원이다. 그것은 50 kDa의 겉보기 MW를 가진 단쇄 타입 I 경막 단백질이다. 그것의 성숙한 폴리펩티드 코어는 237개 아미노산으로 구성되며, 이중 173개 아미노산은 TNF 수용체 패밀리 일원의 특징적인 4개의 시스테인-부화 반복부로 조직된 세포외 도메인(ECD)을 포함한다. 2개의 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위는 ECD의 막 근접 영역에 존재하고, 잠재적인 O-결합된 글리코실화 부위는 부재한다. 22개 아미노산 경막 도메인이 ECD와 CD40의 42개 아미노산 세포질 꼬리를 연결한다. CD40-매개 신호 변환에 수반되는 서열 모티프가 CD40 세포질 꼬리에서 확인되었다. 이들 모티프는 TNF-R-관련 인자(TRAF)라고 불리는 세포질 인자와 상호작용하여 MAP 키나아제 및 NFκB의 활성화를 포함하는 다수의 하류 사건을 촉발시키고, 이것은 차례로 여러 가지 염증-, 생존-, 및 성장-관련 유전자의 전사 활성을 조정한다. 예를 들어, van Kooten and Banchereau, J. Leukoc. Biol. 67:2-17 (2000); Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009) 참조.
조혈 시스템 내에서 CD40은 분화의 여러 단계에서 B 세포, 단구, 대식세포, 혈소판, 소포성 수지상 세포, 수지상 세포(DC), 호산구 및 활성화된 T 세포에서 발견될 수 있다. 정상적인 비-조혈 조직에서 CD40은 신장 상피 세포, 각질세포, 활액막 및 진피 기원의 섬유아세포, 및 활성화된 내피에서 검출되었다. CD40의 가용성 버전은 아마도 일차 전사체의 차등 스플라이싱 또는 메탈로프로테이나아제 TNFα 전환 효소에 의한 제한된 단백질 가수분해를 통해서 CD40-발현 세포로부터 방출된다. 예를 들어, van Kooten and Banchereau, J. Leukoc. Biol. 67:2-17 (2000); Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009) 참조.
CD40에 대한 내인성 리간드(CD40L)는 CD154라고도 알려진 39 kDa의 타입 II 막 당단백질이다. CD40L은 TNF 수퍼패밀리의 일원이며, 세포 표면에서 트라이머로서 발현된다. CD40L은 활성화된 CD4+, CD8+ 및 γδT 세포 상에서 일시적으로 발현된다. CD40L은 또한 정제된 단구, 활성화된 B 세포, 상피 및 혈관 내피 세포, 평활근 세포 및 DC 상에서 가변적 수준으로 검출되지만, 이들 세포 타입에서 CD40L 발현의 기능적 관련성은 명확히 정의되지 않았다(van Kooten 2000; Elgueta 2009). 그러나, 활성화된 혈소판 상에서 CD40L의 발현은 혈전성 질환의 병리과정에 연루되었다. 예를 들어, Ferroni et al., Curr. Med. Chem. 14:2170-2180 (2007) 참조.
CD40/CD40L 상호작용의 가장 특징적인 기능은 항원-제시 세포와 T 세포 간의 접촉-의존성 상호적 상호작용에서 그것의 역할이다. 예를 들어, van Kooten and Banchereau, J. Leukoc. Biol. 67:2-17 (2000); Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009) 참조. 항원-활성화된 B 세포 상의 CD40에 대한 활성화된 T 세포 상의 CD40L의 결합은 신속한 B 세포 확장을 추진할 뿐만 아니라 B 세포가 기억 B 세포 또는 혈장 세포로 분화하기 위한 필수적인 신호를 제공한다. CD40 신호화는 배중심의 형성을 담당하고, 여기서 B 세포는 IgG, IgA, 및 IgE 동형의 높은 친화성 항체를 생성하는 능력을 취득하기 위한 친화성 성숙화 및 동형 전환을 겪는다. 예를 들어, Kehry, J. Immunol. 156:2345-2348 (1996) 참조. 따라서, 기능적 CD40/CD40L 상호작용을 방지하는 CD40L 유전자좌에 돌연변이를 가진 개체는 순환하는 IgM의 과-출현 및 IgG, IgA, 및 IgE의 생성에 대한 무능력을 특징으로 하는 원발성 면역결핍 X-결합된 과-IgM 증후군으로 고통받는다. 이들 환자는 억제된 속발성 체액성 면역 반응, 재발성 발열성 감염에 대한 증가된 감수성, 및 암종 및 림프종의 더 높은 빈도를 나타낸다. CD40 또는 CD40L 유전자좌를 비활성화하기 위한 마우스의 유전자 녹아웃 실험은 X-결합된 과-IgM 환자에서 보이는 주요 결함을 재현한다. 이들 KO 마우스는 또한 손상된 항원-특이적 T-세포 프라이밍을 나타내며, 이는 CD40L/CD40 상호작용이 또한 세포-매개 면역 반응을 장착하기 위한 결정적 요인임을 시사한다. 예를 들어, Elgueta et al., Immunol. Rev. 229:152-172 (2009) 참조.
생체내에서 CD40L 또는 항-CD40에 의한 CD40 라이게이션의 면역-자극성 효과는 동계 종양들에 대한 면역 반응과 상호관련되었다. 예를 들어, French et al., Nat. Med. 5:548-553 (1999) 참조. 종양 세포에 대한 결핍된 면역 반응은 PD-1 또는 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 분자의 발현, MHC 항원의 감소된 발현, 종양-관련 항원의 불량한 발현, 적절한 유착, 또는 공-자극성 분자, 및 종양 세포에 의한 TGFβ와 같은 면역억제 단백질의 생산과 같은 요인들의 조합으로부터의 결과일 수 있다. 항원 제시 및 형질전환된 세포에 대한 CD40 라이게이션은 유착 단백질(예를 들어, CD54), 공-자극성 분자(예를 들어, CD86) 및 MHC 항원의 상향조절, 뿐만 아니라 염증성 사이토카인 분비를 가져오며, 이로써 잠재적으로 항종양 면역 반응을 유도 및/또는 증진시킨다. 예를 들어, Gajewski et al., Nat. Immunol. 14:1014-1022 (2013) 참조.
CD40 가교의 일차 결과는 T-세포에 대해 종양-관련 항원을 가공하고 제시하는 골수 및 B 세포 능력의 DC 활성화(주로 라이센싱이라고 한다) 및 강화이다. 선천적 면역 반응을 활성화하는 직접적인 능력을 갖는 것 이외에, CD40 신호화의 독특한 결과는 '교차-프라이밍'이라고 알려진 과정에서 CD8+ 세포독성 T-세포(CTL) 전구체에 대한 종양-유래 항원의 APC 제시이다. 이 CD40-의존성 활성화 및 성숙한 DC에 의한 CTL 전구체의 종양-특이적 이펙터 CTL로의 분화는 종양 세포에 대한 세포-매개된 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, Kurts et al., Nat. Rev. Immunol. 10:403-414 (2010) 참조.
SEA-CD40 모 분자인 다세투주맙을 포함하는 효현성 CD40 mAb는 단일 제제 및 조합 화학요법 환경에서 고무적인 임상 활성을 나타냈다. 다세투주맙은 NHL에서의 1상 연구 및 확산성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)에서의 2상 연구에서 일부 임상 활성을 나타냈다. 예를 들어, Advani et al., J. Clin. Oncol. 27:4371-4377 (2009) 및 De Vos et al., J. Hematol. Oncol. 7:1-9 (2014) 참조. 추가로, CD40에 대한 인간화된 IgG2 효현제 항체인 CP-870,893은 파클리탁셀 또는 카보플라틴 또는 겜시타빈과 조합되었을 때 고상 종양 처방에서 고무적인 활성을 나타냈다. 이들 연구에서 항원 제시 세포의 활성화, 사이토카인 생산, 및 항원-특이적 T-세포의 발생이 보였다. 예를 들어, Beatty et al., Clin. Cancer Res. 19:6286-6295 (2013) 및 Vonderheide et al., Oncoimmunology 2:e23033 (2013) 참조.
항-CD40 항체
면역 기능에서 그것의 역할 때문에 항체들이 CD40 항원에 대해 생성되었다. 이러한 항체는 세 그룹으로 분류되었는데, 이들은 CD40 활성을 억제하는 길항성 항체, CD40 활성을 부분적으로 유도하는 효현성 항체, 및 CD40 활성을 완전히 자극하는 완전 효현성 항체이다. 각 그룹의 일원들이 임상 시험에서 테스트되었지만 어느 것도 현재까지 승인되지 않았다.
SEA-CD40
본 개시는 비-푸코실화된 hS2C6 항체, SEA-CD40을 제공한다. S2C6은 본원에서 mS2C6이라고 언급된 인간 방광 암종에 대해 발생된 뮤린 단클론성 항체로서 원래 분리되었다. 예를 들어, Paulie et al., Cancer Immunol. Immunother. 17:165-179 (1984) 참조. S2C6 항체는 CD40 신호화 경로의 부분적 효현제이며, 따라서 다음의 활성을 가진다: 인간 CD40 단백질에 대한 결합, 사이노몰거스 CD40 단백질에 대한 결합, CD40 신호화 경로의 활성화, CD40과 그것의 리간드인 CD40L의 상호작용의 강화. 예를 들어, 미국특허 No. 6,946,129 참조.
개발중인 다음 단계에서 S2C6은 인간화되었고, 이 인간화된 항체는 본원에서 인간화된 S2C6이라고 언급되며, 또는 달리 다세투주맙, 또는 푸코실화된, 인간화된 S2C6(fhS2C6), 또는 SGN-40이라고 언급된다. 예를 들어, WO 2006/128103 참조. SGN-40은 인간 임상 시험에서 테스트되었고, 추가의 개발을 보증하기 위한 충분한 활성은 없는 것으로 밝혀졌다.
SEA-CD40은 비-푸코실화된 인간화된 S2C6 항체이다. SEA-CD40의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 2에 개시된다. 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-113이고, 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-113이다. SEA-CD40의 항체 백본의 생성은 WO 2006/128103에 개시되며, 이것은 참고로 여기 포함된다.
본 개시는 nf hS2C6 또는 SEA-CD40이라고 언급되는, 비-푸코실화된, 인간화된 S2C6 항체를 제공한다. Fc 수용체에 대한 증진된 결합에 더하여, SEA-CD40은 또한 모 항체인 다세투주맙과 비교하여 CD40 경로의 활성을 증진시킨다. 따라서, SEA-CD40 항체는 상이한 투여 일정을 사용하여 더 낮은 투여량으로 환자에게 투여된다.
비-푸코실화된 항체
SEA-CD40은 비-푸코실화된 항체이며, FcγIII 수용체에 대해 증진된 결합, 및 놀랍게도 면역 세포에서 CD40 신호화 경로를 활성화하는 증진된 능력을 나타낸다.
비-푸코실화된 항체의 제조 방법
본 개시는 감소된 코어 푸코실화를 가진 인간화된 S2C6 항체의 제조 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 "코어 푸코실화"는 N-결합된 글리칸의 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민("GlcNAc")에 푸코오스의 부가("푸코실화")를 말한다.
SEA-CD40 항체 백본의 Fc 영역(또는 도메인)에 결합된 복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬의 푸코실화가 감소된다. 본원에서 사용된 "복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬"은 전형적으로 아스파라긴 297에 결합된다(Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따라서, "Sequences of Immunological Interest, 5th Ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Healtth & Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991). 본원에서 사용된 복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬은 주로 다음의 구조를 가진 이중안테나 복합체 당 사슬을 가진다:
여기서 ±는 당 분자가 존재할 수 있거나 부재할 수 있음을 나타내고, 숫자는 당 분자 사이의 결합의 위치를 나타낸다. 상기 구조에서, 아스파라긴에 결합한 당 사슬 말단은 환원 말단(오른쪽에)이라고 불리고, 반대측은 비-환원 말단이라고 불린다. 푸코오스는 일반적으로, 전형적으로 α1,6 결합(GlcNAc의 6-위치가 푸코오스의 1-위치에 결합된다)에 의해서, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민("GlcNAc")에 결합된다. "Gal"은 갈락토오스를 말하고, "Man"은 만노오스를 말한다.
"복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬"은 1) 코어 구조의 비-환원 말단 측이 갈락토오스-N-아세틸글루코사민(또는 "gal-GlcNAc"라고도 한다)의 하나 또는 이상의 분지를 가지고, Gal-GlcNAc의 비-환원 말단 측은 선택적으로 시알산, 2등분된 N-아세틸글루코사민을 가진 복합체 타입; 또는 2) 코어 구조의 비-환원 말단 측이 고 만노오스 N-글리코시드-결합된 당 사슬과 복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬의 분지를 모두 가진 하이브리드 타입을 포함한다.
일부 구체예에서, "복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬"은 코어 구조의 비-환원 말단 측이 갈락토오스-N-아세틸글루코사민(또는 "gal-GlcNAc"라고도 한다)의 0, 하나 또는 그 이상의 분지를 가지고, Gal-GlcNAc의 비-환원 말단 측은 선택적으로 시알산, 2등분된 N-아세틸글루코사민 등과 같은 구조를 더 가진 복합체 타입을 포함한다.
본 발명에 따라서, 전형적으로 푸코오스의 단지 소량이 SEA-CD40 분자의 복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬(들)에 포함된다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 항체의 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 3% 미만이 푸코오스에 의한 코어 푸코실화를 가진다. 일부 구체예에서, 항체의 약 2%가 푸코오스에 의한 코어 푸코실화를 가진다.
일부 구체예에서, 푸코오스 유사체(또는 푸코오스 유사체의 대사물질 또는 생성물)의 단지 소량이 복합체 N-글리코시드-결합된 당 사슬(들)에 포함된다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, SEA-CD40 항체의 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 3% 미만이 푸코오스 유사체 또는 푸코오스 유사체의 대사물질 또는 생성물에 의한 코어 푸코실화를 가진다. 일부 구체예에서, SEA-CD40 항체의 약 2%가 푸코오스 유사체 또는 푸코오스 유사체의 대사물질 또는 생성물에 의한 코어 푸코실화를 가진다.
푸코오스 유사체와 함께 항체-생산 세포를 인큐베이션함으로써 비-푸코실화된 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어 WO 2009/135181에 설명된다. 간단히 말해, 인간화된 S2C6 항체를 발현하도록 조작된 세포는 푸코오스 유사체 또는 푸코오스 유사체의 세포내 대사물질 또는 생성물의 존재하에 인큐베이션된다. 본원에서 사용된 대로, 세포내 대사물질은, 예를 들어 GDP-변형된 유사체 또는 완전히 또는 부분적으로 탈에스테르화된 유사체일 수 있다. 생성물은, 예를 들어 완전히 또는 부분적으로 탈에스테르화된 유사체일 수 있다. 일부 구체예에서, 푸코오스 유사체는 푸코오스 구조 경로에서 효소(들)를 억제할 수 있다. 본원에서 사용된 세포내 대사물질은, 예를 들어 GDP-변형 유사체 또는 완전히 또는 부분적으로 탈에스테르화된 유사체일 수 있다. 생성물은, 예를 들어 완전히 또는 부분적으로 탈에스테르화된 유사체일 수 있다. 일부 구체예에서, 푸코오스 유사체는 푸코오스 구제 경로에서 효소(들)를 억제할 수 있다. 예를 들어, 푸코오스 유사체(또는 푸코오스 유사체의 세포내 대사물질 또는 생성물)은 푸코키나아제, 또는 GDP-푸코오스-피로포스포릴라아제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 푸코오스 유사체(또는 푸코오스 유사체의 세포내 대사물질 또는 생성물)는 푸코실트랜스페라아제(바람직하게 1,6-푸코실트랜스페라아제, 예를 들어 FUT8 단백질)를 억제한다. 일부 구체예에서, 푸코오스 유사체(또는 푸코오스 유사체의 세포내 대사물질 또는 생성물)는 푸코오스에 대한 새(de novo) 합성 경로에서 효소의 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 푸코오스 유사체(또는 푸코오스 유사체의 세포내 대사물질 또는 생성물)는 GDP-만노오스 4,6-디히드라테아제 또는/또는 GDP-푸코오스 신테타아제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 푸코오스 유사체(또는 푸코오스 유사체의 세포내 대사물질 또는 생성물)는 푸코오스 수송제(예를 들어, GDP-푸코오스 수송제)를 억제할 수 있다.
한 구체예에서, 푸코오스 유사체는 2-플루오로푸코오스이다. 성장 배지 중의 푸코오스 유사체 및 다른 푸코오스 유사체를 사용하는 방법이, 예를 들어 WO 2009/135181에 개시되며, 이것은 참고로 여기 포함된다.
코어 푸코실화를 감소시키기 위해 셀라인을 조작하는 다른 방법은 유전자 녹아웃, 유전자 녹인 및 RNA 간섭(RNAi)을 포함했다. 유전자 녹아웃에서는 FUT8(알파 1,6-푸코실트랜스페라아제 효소)를 암호화하는 유전자가 비활성화된다. FUT8은 N-글리칸의 Asn-결합된(N-결합된) GlcNac의 위치 6으로 GDP-푸코오스로부터의 푸코실 잔기의 전달을 촉매한다. FUT8은 Asn297에서 N-결합된 이중안테나 탄수화물에 푸코오스를 첨가하는 것을 담당하는 유일한 효소인 것으로 보고된다. 유전자 녹인은 GNTIII 또는 골지 알파 만노시다아제 II와 같은 효소를 암호화하는 유전자를 부가한다. 세포에서 이러한 효소의 수준의 증가는 푸코실화 경로로부터 단클론성 항체를 우회시키고(감소된 코어 푸코실화를 초래함), 2등분된 N-아세틸글루코사민의 양을 증가시킨다. RNAi는 전형적으로 또한 FUT8 유전자 발현을 표적화하며, 이는 감소된 mRNA 전사체 수준 또는 전체적인 녹아웃 유전자 발현을 초래한다. 이들 방법 중 어느 것을 사용하여 비-푸코실화된 항체, 예를 들어 SEA-CD40 항체를 생산할 수 있는 셀라인을 생성할 수 있다.
당업자는 항체 상의 푸코실화의 양을 결정하기 위해 많은 방법이 이용될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 방법은, 예를 들어 PLRP-S 크로마토그래피 및 전자분무 이온화 쿼드러폴 TOF MS를 통한 LC-MS를 포함한다.
환자에게 투여되었을 때 비-푸코실화된 항체 SEA-CD40은 대식세포로 단구 성숙화의 활성화를 유도하고, 예를 들어 인터페론-γ(IFN-γ)을 포함하는 사이토카인 및 면역 시스템 시험감염에 대해 확실한 T-세포 반응을 도출하는 케모카인의 생산을 유도한다. 항체 24.4.1과 같은 완전히 효현성인 항체와 달리, SEA-CD40은 인터류킨-10(IL-10)과 같은 면역-축소 사이토카인의 생산을 유도하지 않는다. IL-10은 차례로 T-조절성 세포의 활성을 유도하고, 이것은 면역 반응을 축소시킨다. 따라서, SEA-CD40은 T-조절성 세포의 활성을 촉진하지 않고 확실한 T-세포 매개된 면역 반응을 유도하는데 유용하다.
SEA-CD40의 용량 및 투여
비경구 투여를 위한 제약 조성물은 바람직하게 멸균이며 실질적으로 등장성이고 GMP 조건하에 제조된다. 제약 조성물은 단위 제형(dosage form)으로 제공될 수 있다(즉, 단일 투여를 위한 용량). 제약 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 조제될 수 있다. 조제는 선택된 투여 경로에 따른다. 주사의 경우 항체는, 바람직하게는 주사 부위에서 불편함을 감소시키기 위해 생리학적으로 양립되는 버퍼 중에, 수용액으로 조제될 수 있다. 용액은 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 조제를 위한 제제를 함유할 수 있다. 또는 달리, 항체는 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원-무함유 물로 복원할 수 있는 동결건조된 형태일 수 있다.
SEA-CD40은 정맥내 투여된다. 다른 구체예에서, SEA-CD40은 피하 투여된다. 추가 구체예에서, SEA-CD40은 종양 부위에 피하 투여된다.
비-푸코실화된 SEA-CD40 항체는 놀랍게도 그것의 모 항체, 다세투주맙과 비교하여 증진된 면역 활성화 활성을 가진다. 따라서, SEA-CD40은 다세투주맙과 비교하여 더 낮은 투여량으로 상이한 일정으로 환자에 투여될 수 있다.
예를 들어, SEA-CD40은 0.1-2000μg/kg(킬로그램 환자체중 당 μg 항체)의 수준으로 환자에게 투여될 수 있다. 다른 가능한 용량 범위는 10-1000μg/kg, 50-800μg/kg, 75-600μg/kg, 100-500μg/kg이다. 다른 가능한 용량 범위는 다음과 같다: 100-300μg/kg, 300-500μg/kg, 500-700μg/kg, 700-900μg/kg, 및 900-1100μg/kg. 더 많은 용량 범위는 다음과 같다: 100-150μg/kg, 150-200μg/kg, 200-250μg/kg, 250-300μg/kg, 300-350μg/kg, 350-400μg/kg, 400-450μg/kg, 450-500μg/kg, 500-550μg/kg, 550-600μg/kg, 600-650μg/kg, 650-700μg/kg, 700-750μg/kg, 750-800μg/kg, 800-850μg/kg, 850-900μg/kg, 900-950μg/kg, 950-1000μg/kg, 1000-1050μg/kg 및 1050-1100μg/kg. 다른 가능한 용량 범위는 0.3-200μg/kg, 0.6-150μg/kg, 1.0-100μg/kg, 2-50μg/kg, 5-25μg/kg, 7.5-15μg/kg 및 8-12μg/kg이다.
다른 구체예에서, SEA-CD40은 0.6μg/kg, 1.0μg/kg, 2.5μg/kg, 5.0μg/kg, 7.5μg/kg, 10μg/kg, 30μg/kg, 50μg/kg, 75μg/kg, 100μg/kg, 또는 200μg/kg으로 환자에게 투여된다. 바람직한 구체예에서, SEA-CD40은 10μg/kg으로 환자에게 투여된다.
추가 구체예에서, SEA-CD40은 약 60μg/kg, 약 100μg/kg, 약 150μg/kg, 약 200μg/kg, 약 250μg/kg, 약 300μg/kg, 약 350μg/kg, 약 400μg/kg, 약 450μg/kg, 약 500μg/kg, 약 550μg/kg, 약 600μg/kg, 약 650μg/kg, 약 700μg/kg, 약 750μg/kg, 약 800μg/kg, 약 850μg/kg, 약 900μg/kg, 약 950μg/kg, 약 1000-1050μg/kg, 약 1050μg/kg, 및 1110μg/kg으로 환자에게 투여된다.
일부 구체예에서, SEA-CD40은 면역 피로의 가능성을 감소시킬 수 있는 방식으로 투여된다. 예를 들어, SEA-CD40은 3주 간격, 6주 간격, 8주 간격, 10주 간격, 12주 간격, 또는 14주 간격으로 투여될 수 있다. 간격은 또한 월 일정 기준으로, 예를 들어 1개월 간격, 2개월 간격, 또는 3개월 간격일 수 있다.
SEA-CD40이 종양-관련 항원에 대해 반응하도록 면역 시스템을 활성화하기 때문에 그것의 사용은 CD40을 발현하는 암에 제한되지 않는다. 따라서, SEA-CD40은 CD40 양성 및 CD40 음성 암을 치료하는데 모두 사용될 수 있다.
SEA-CD40은 바람직하게는, 특히 암이 낮은 수준의 CD40을 발현하거나 CD40을 검출 가능하게 발현하지 않는 경우, 면역 반응성이라고 알려진 종양을 치료하기 위해 사용된다. 면역 반응성 암은, 예를 들어 흑색종, 방광암, 폐암, 예를 들어 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 난소암, 신장암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암, 두경부암, 전립선암, 교모세포종, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 또는 다발성 골수종을 포함한다.
다른 구체예에서, SEA-CD40은 고상 종양을 치료하기 위해 사용된다. 추가 구체예에서, SEA-CD40은 혈액암, 예를 들어 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 포함하는 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 또는 다발성 골수종을 치료하기 위해 사용된다.
SEA-CD40 조합 요법
그것의 면역 자극성 기능 때문에 SEA-CD40은 면역 시스템을 활성화하는 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 면역 자극성 기능을 가진 약물은, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 T-세포 조정제, 면역 활성제, 및 면역원성 세포 사멸을 유도하는 화학치료제를 포함한다. 일례로서, 특정 항체는 T-세포 상에서 면역 체크포인트로서 작용하는 분자의 활성을 차단함으로써 기능한다. 따라서, SEA-CD40은 면역 체크포인트 단백질을 표적화하는 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
T-세포 조정제
T-세포는 신체로부터 암을 인식하고 제거하는 면역 시스템의 능력에서 어떤 역할을 한다. T-세포 조정제는 면역 체크포인트의 기능을 차단하는 항체를 포함한다. 예를 들어, Pardoll, Nature Rev. Cancer, 12:252-264 (2012) 참조. 면역 체크포인트를 차단하는 항체는, 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-CTLA4 항체를 포함한다. 다른 체크포인트 억제제/활성제는 LAG3 및 TIM3을 포함한다. 일부 단백질에 대한 항체, 예를 들어 41BB, CD27, ICOS, 및 OX40에 대한 항체는 T-세포 활성을 조정하거나 또는 바람직하게는 T-세포 활성을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 다른 T-세포 조정제는 효소 인돌라민 2,3-디옥시게나아제(IDO)의 억제제를 포함한다.
항-CTLA4 항체는 분화 152 또는 CD152의 클러스터라고도 알려진 단백질 세포독성 림프구 4(CTLA-4)를 인식한다. CTLA-4 단백질은 T-세포 상에서 발현되며, 이것은 면역 시스템에 의한 공격에 적합한 항원을 인식한다. CTLA-4의 활성화는 면역 반응을 축소시킨다. 예를 들어, Nirschi and Drake, Clin. Cancer Res., 19: 4917-4924 (2013) 참조. CTLA-4에 특이적이며 그것의 활성을 차단하는 항체는 암에 대한 면역 반응을 상향조절함으로써 암을 치료하는데 사용되었다. CTLA-4 항체의 예들은 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함한다. SEA-CD40은 암을 치료하기 위해 이필리무맙 또는 트레멜리무맙과 조합하여 투여될 수 있다.
항-PD1 항체는 단백질 프로그램된 사멸-1(PD-1)을 인식한다. CTLA-4와 마찬가지로 PD-1은 T 세포에서 발현되고 면역 반응을 축소시킨다. 예를 들어, Nirschi and Drake, Clin. Cancer Res., 19:4917-4924 (2013) 참조. PD-1에 특이적이며 그것의 활성을 차단하는 항체는 암에 대한 면역 반응을 상향조절함으로써 암을 치료하는데 사용되었다. PD-1 항체의 예들은 MEDI0680, AMP-224, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 피딜리주맙을 포함한다. 체크포인트 억제제로서 작용하며 SEA-CD40과 조합하여 사용될 수 있는 다른 PD-1 결합 단백질은, 예를 들어 B7-DC-Fc를 포함한다. SEA-CD40은 암을 치료하기 위해 MEDI0680, AMP-224, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 피딜리주맙과 조합하여 투여될 수 있다.
PD-L1은 PD-1 단백질의 리간드이다. PD-L1은 암세포 상에서 발현되고, PD-1과 그것의 상호작용은 PD-L1-발현 암세포가 면역 시스템을 피하는 것을 허용한다. 항-PD-L1 항체가 생성되었고 암을 치료하는데 사용되었다. PD-L1 항체의 예들은, 예를 들어 MEDI4736, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C 및 MPDL3280A를 포함한다. SEA-CD40은 암을 치료하기 위해 MEDI4736, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C 또는 MPDL3280A와 조합하여 투여될 수 있다.
면역 체크포인트 단백질의 기능을 차단하는 다른 항체는, 예를 들어 LAG3 및 TIM3에 대해 지정된 항체를 포함하며, SEA-CD40과 조합하여 사용될 수 있다.
41BB, CD27, ICOS 및 OX40에 대한 항체는 T-세포 활성을 활성화하기 위해 사용되며, SEA-CD40과 조합하여 사용될 수 있다. OX40 항체는, 예를 들어 MEDI6469 및 MEDI6383을 포함한다. 효현성 항-CD27 항체의 예는 CDX-1127이며, 이것은 SEA-CD40과 조합하여 사용될 수 있다.
효소 인돌라민 2,3-디옥시게나아제(IDO)는 아미노산 트립토판의 변성을 촉매한다. IDO의 억제제는 소 분자, 예컨대 로즈마린산, COX-2 억제제, 및 알파-메틸-트립토판일 수 있다.
면역원성 세포 사멸을 유도하는 화학치료제
대부분의 인간에서 수백만의 세포가 세포자살을 통해 죽고 면역 반응의 발생 없이 제거된다. 그러나, 일부 화학치료제로의 치료 후에는 면역 세포가 종양을 침윤하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 화학치료제에 의해 죽은 일부 종양 세포는 백신으로 작용하며 종양-특이적 면역 반응을 생성한다. 이 현상은 면원원성 세포 사멸(ICD)이라고 언급된다. 예를 들어, Kroemer et al., Annu. Rev. Immunol., 31: 51-72 (2013) 참조. ICD를 유도하는 화학치료제의 능력은 실험적으로 결정될 수 있다. 두 가지 기준이 충족되어야 한다. 먼저, 화학치료제로 시험관내 처리된 암세포를 면역적격 마우스에 주사하여 애주번트의 부재하에 종양 항원에 특이적인 보호성 면역 반응을 도출해야 한다. 두 번째, 생체내 발생한 ICD, 예를 들어 잠재적 ICD-유도 화학치료제를 사용하여 치료된 마우스 동계 모델이 면역 시스템에 의존성인 종양 내 면역 반응을 추진해야 한다.
ICD를 유도하는 화학치료제는, 예를 들어 안트라사이클린, 항-EGFR 항체, 보테조밉, 시클로포스파미드, 겜시타빈, 종양의 조사, 및 옥살리플라틴을 포함한다. SEA-CD40은 환자에서 증진된 면역 반응을 생성하고 암을 치료하기 위해 이들 제제 중 어느 것과 조합하여 사용될 수 있다.
면역 활성화
암은 또한 면역 시스템을 직접 자극하는 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어 GM-CSF, IFN-감마, 인터류킨-2, GVAX, 및 TLR9 효현제를 포함한다. 다른 면역 활성제는, 예를 들어 암 백신, 바실루스 칼메트-게랭(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG), 비특이적 면역자극제(예를 들어, 이미퀴모드) 및 CAR-T 세포와 같은 세포성 요법을 포함한다. SEA-CD40은 환자에서 증진된 면역 반응을 생성하고 암을 치료하기 위해 이들 제제 중 어느 것과 조합하여 사용될 수 있다.
다른 조합들
SEA-CD40과의 다른 조합은 암의 치료에 사용될 수 있다. 예들은, 예를 들어 항-PD1 항체, 예를 들어 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 피딜리주맙, MEDI0680, or AMP-224과 조합된 SEA-CD40; 겜시타빈과 파클리탁셀 또는 시스플라틴 또는 옥살리플라틴과 함께 또는 이들 없이 조합된 SEA-CD40; BRAF 억제제, 예를 들어 베무라페닙 또는 다브라페닙과 조합된 SEA-CD40; 또는 시클로포스파미드, 아드리아마아신, 빈크리스틴, 및 프레드니손(CHOP) 또는 리툭시맙, 이포스파미드, 카보플라틴, 및 에토피사이드(RICE) 또는 리툭시맙, 겜시타빈, 덱사메타손 및 시스플라틴(RGDP)과 조합된 SEA-CD40을 포함한다.
실시예
다음의 실시예들은 예시로서 제공되며 청구된 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 비-푸코실화된 hS2C6 항체의 합성
SEQ ID NO: 1 및 2의 중쇄 및 경쇄를 가진 인간화된 항-CD40 항체인 S2C6을 CHO 세포에서 발현시켰다. 푸코실화 억제제인 2-플루오로푸코오스가 항체의 생산 동안 세포 배양 배지에 포함되었으며, 그 결과 비-푸코실화된 항체 SEA-CD40을 얻었다. 예를 들어, Okeley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 110:5404-55409 (2013) 참조. 세포 성장을 위한 기본 배지는 푸코오스를 함유하지 않았고, 2-플루오로푸코오스가 단백질 푸코실화를 억제하기 위해 배지에 첨가되었다(상동). 항체에 푸코오스의 통합은 PLRP-S 크로마토그래피 및 전자분무 이온화 쿼드로폴 TOF MS를 통해서 LC-MS에 의해 측정되었다(상동). 데이터는 나타내지 않는다.
실시예 2: 비-푸코실화된 hS2C6 항체의 특성화
SEA-CD40의 CD40 결합 친화성 결정: 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 분리를 위하여 인간 전혈을 Astarte Biologics에서 공급받았다. 간단히 말해, 혈액을 헤파린 튜브에 수집하고 채혈 4시간 이내에 Seattle Genetics로 이송했다. 도착시 혈액을 50mL 원뿔형 튜브(falcon)에 알리쿼트로 나누어 넣고, 혈소판 부화 분획을 분리하기 위한 중단 없이 25℃에서 20분간 Eppendorf 5810R(A-4-62 로터)에서 200g로 회전시켰다. 원심분리 후 3개의 분리된 층이 형성되었다: 하부층, 적혈구(총 부피의 50-80%를 차지함); 중간층, 백혈구의 매우 얇은 띠; 상부층, 담황색의 혈소판 부화 혈장(PRP).
혈소판 부화된 상부 담황색 층을 1mL 피펫으로 제거했다. 일단 혈소판 부화 혈장이 제거되면 혈액을 동일한 부피의 멸균 PBS(Gibco, lot 1618435, ept 2016-07)로 희석했다. 실온으로 가온된 Histopaque-1077(Sigma, lot number RNBD2965, Expt. 5/2017) 15mL를 혈액 아래에 깔았다. Histopaque 샘플을 중단 없이 25℃에서 25분간 1500rpm으로 회전시켰다. 원심분리 후 3개의 층이 다시 형성된다: 하부층, 적혈구(총 부피의 50-80%를 차지함); 중간층, 백혈구의 두꺼운 띠("연막"이라고도 함); 상부층, PBS 및 나머지 혈소판.
상부 PBS/혈소판 층을 1mL 피펫으로 제거하고 버렸다. 백혈구의 두꺼운 띠를 부드럽게 제거하고 깨끗한 50mL 멸균 원뿔형 튜브에 넣었다. 튜브를 50mL까지 채우고 세포를 10분간 800g으로 회전시켰다. 세척 용액을 제거하고 펠릿을 10분간 ACK 적혈구 용해 버퍼(Gibco, lot 1618488) 10mL에 재현탁했다. 다음에, 50mL 원뿔형 튜브를 35mL 멸균 PBS로 마무리하고 10분간 800g으로 회전시켰다. 세척 용액을 제거하고 펠릿을 50mL PBS에 재현탁했다. 샘플 500μL를 제거하고 PBMC를 Vi-cell-XR(Beckman Coulter)로 계수했다. 세포를 다시 10분간 800g으로 회전시켰다. 세척 용액을 제거하고 펠릿을 FAC 염색 용액(BD) 중에 1x106/ml로 재현탁했다. 재현탁된 PBMC 100μL를 96-웰 U-바닥 플레이트(Corning)에 평판하고 얼음 위에 두었다. 비-특이적 FcγRIIIa 결합을 차단하기 위해서 PBMC를 30분간 100μg/mL의 인간 Fc-단편(Calbiochem)으로 전처리했다. 바이오틴화된 SEA-h00(비-푸코실화 대조군 항체), SEA-CD40 또는 SGN-40의 10-배 연속 희석액을 제조하여 (100, 10, 1, .1, .01, .001, .0001μg/ml)의 희석액 연속물을 생성했다.
샘플을 얼음 냉각된 FAC 버퍼에서 2번 세척하고 30분간 얼음 위에서 포화 농도의 PE-스트렙타비딘(BD)과 함께 인큐베이션했다. 샘플을 얼음 냉각된 FAC 버퍼에서 2번 세척하고 FAC 버퍼 200μL에 재현탁했다. BD LSRII 및 DIVA 소프트웨어를 사용하여 결합을 평가했다. FCS를 FlowJo에서 분석했고, 양성으로 염색된 세포의 GeoMean 형광을 결정하여 Prism Graph Pad에서 플롯팅했다. 데이터를 Prism에서 하나의 결합 부위를 가정한 비-선형 회귀에 맞춰 피팅했고, μg/mL 계산을 SEA-CD40의 분자량으로 나눔으로써 결합 KD 값을 계산했다.
결과: 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 상의 CD40에 대한 SEA-CD40, 및 모 항체 다세투주맙의 결합 친화성을 유세포계수법에 의해서 결정했다. 적절한 동형 대조군의 바탕 결합을 차감하고, 평균 형광 강도(MFI)를 항체 농도에 대해 플롯팅했다. 결과는 도 1에 도시된다. SEA-CD40 및 모 항체 다세투주맙은 결합 곡선이 사실상 중첩하며, 둘 다 대략 1.17nM의 농도에서 PBMC를 포화시켰다. 이들 데이터는 푸코실화의 변화가 CD40에 대한 SEA-CD40 친화성에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
SEA-CD40의 FcγRIIIa 결합 친화성 결정:
인간 FcγRIIIa의 높은(158V) 또는 낮은(158F) 버전을 발현하는 CHO 세포를 생성했다. 20x106 세포를 원심분리하고 20mL 1x PBS로 한번 세척하고 8mL BD 염색 버퍼에 재현탁했다. 세포를 100uL 부피 중 2.0x106 세포/mL 밀도로 알리쿼트로 나누었다. 0.20x106 세포를 각 웰에 알리쿼트로 나누어 넣었다. 세포를 실온에서 5분간 1250rpm으로 원심분리했다.
항체를 0.14ug/mL(SGN) 또는 0.04ug/mL(SEA)로 희석했다. 희석은 표 1에 제공된다.
바이오틴화된 abs
희석액		 농도 Mg/ml 항체 부피(ul) 염색 버퍼 부피 최고 염색
농도 ug/ml
SGN-40-바이오틴 3.29 18.23 581.7 100
SEA40-바이오틴 3.27 15.11 584.7 100
h00-SGN-바이오틴 1.55 38.7 561.0 100
h00-SEA-바이오틴 3.61 16.6 583 100
회전된 세포로부터 상청액을 흡인하고, 상응하는 항체 희석액 60uL를 다중채널 피펫으로 첨가했다. 상응하는 농도는 100, 33.3, 11.1, 3.7, 1.23, 0.41, 0.14 mcg/mL였다. 샘플을 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션했다. 샘플을 원심분리하고 웰당 200μL BD 염색 버퍼로 2번 세척했다. 스트렙타비딘-PE 1mL를 20mL 염색 버퍼(2°초과)에 첨가하여 스트렙타비딘 버퍼를 제조했다. 스트렙타비딘 버퍼 100μL를 각 샘플에 첨가하고, 이들을 4℃에서 암소에서 30분간 인큐베이션했다. 다음에, 샘플을 원심분리하고 웰당 200uL BD 염색 버퍼로 2번 세척했다. 샘플을 LSRII 및 그래프 MFI에서 HTS 모드로 유세포분석법에 의해서 분석하여 PRISM에서 Kd를 계산했다.
결과: FcγRIIIa의 낮은(158F) 또는 높은(158V) 친화성 형태를 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 대한 SEA-CD40 및 모 항체 다세투주맙의 결합이 평가되었다. 결과는 도 2a 및 2b에 도시된다. SEA-CD40은 FcγRIIIa의 낮은(158F) 및 높은(158V) 형태에 모두 유사한 친화성으로 결합된다(각각 KD 27.5nM 및 5.2nM). 낮은 친화성(158F) 형태에 대한 SEA-CD40 결합은 푸코실화된 모 항체 다세투주맙보다 유의하게 더 좋았고(KD 302.7nM), SEA-CD40은 심지어 푸코실화된 다세투주맙 모 항체보다 더 잘 높은 친화성 158V 형태에 결합했다(각각 5.2nM vs. 37.9nM).
SEA-CD40 매개된 ADCC 활성: 인간 PBMC를 상기와 같이 분리하고 6, 24, 또는 48시간 동안 SEA-CD40 또는 SEA-동형 대조군(SEA-h00)의 다양한 농도로 처리했다. 배양물을 CD19+ B 세포에 대해 염색하고, 세포의 수를 유세포계수법에 의해서 정량했다.
결과: 인간 PBMC 배양물은 6, 24, 및 48시간 동안 SEA-CD40 또는 비-결합한 SEA-동형 대조군(SEA-h00)의 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 0.0001μg/mL로 처리되었고, CD40 양성 세포의 수가 평가되었다. 결과는 도 4에 도시된다. SEA-CD40 처리는, 심지어 낮은 서브 μg/mL 농도 아래까지, 투여량- 및 시간-의존적 방식으로 CD40+ CD19+ B 세포에 유의한 감소를 가져왔다. 단구/DC의 수에 대한 SEA-CD40의 유의한 효과는 없었다(단구/DC 데이터는 나타내지 않음).
인간 전혈 또는 PBMC에서 사이토카인 생성의 평가:
인간 전혈을 Astarte Biologics에서 공급받았다. 간단히 말해, 혈액 100mL를 헤파린 튜브에 수집하고 채혈 4시간 이내에 Seattle Genetics로 이송했다. 혈액의 절반은 전혈 배양을 위해 따로 두고 나머지 절반을 사용하여 상기 설명된 대로 PBMC를 분리했다. 전혈 100μL를 3-96 평탄 바닥 조직 배양 플레이트(Costar)에 알리쿼트로 나누었다. 분리된 PBMC를 Viacell에서 계수하고, 10% FBS(Atlanta Biologics), 1X 페니실린/strepA, 및 X 글루타민(PBMC 배지)을 함유하는 DMEM에 1x 106 세포/mL로 재현탁했다. PBMC의 경우, 현탁된 정제된 PBMC 100μL를 3-96 평탄 바닥 조직 배양 플레이트에 알리쿼트로 나누었다. SEA-h00 및 SEA-CD40의 10X 연속 희석액을 PBMC 배지에서 제조했고, 전혈 및 분리된 PBMC 배양물을 SEA-h00 또는 SEA-CD40의 감소하는 농도(100, 10, 1.0, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 또는 0μg/ml)로 처리했다. SEA-CD40 처리는 매 시간 지점에서 전혈 및 PBMC 배양물에 대해 둘 다 중복 수행되었다. 미리 정해진 시간 지점(6, 24, 및 48시간)의 각각에서 전혈 또는 정제된 PBMC를 함유하는 96-웰 플레이트를 5분간 800rpm으로 Eppendorf 5810R에서 플레이트 어뎁터와 함께 회전시켰다. 혈청 또는 조직 배양 상청액을 제거하고 96 스트립 튜브 랙으로 옮겨서 샘플을 가공시까지 -80℃에서 냉동시켰다.
냉동된 조직 배양 상청액 및 혈청을 4℃에서 하룻밤 해동시키고 Millipore의 Luminex multiplex Kit를 사용하여 사이토카인 생성을 위해 가공했다. 주문 제작한 키트는 IFNγ, IL-12p40, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1α, IL-1β, MIP-1β, TNF-α, sCD40L을 분석하도록 설계되었다. 피분석물은 이전 연구에서 다세투주맙을 사용하여 관찰된 사이토카인에 기초하여 선별되었다. 조직 배양 상청액 및 혈청 샘플을 제조자의 지시에 따라서 가공했다. 간단히 말해, 어쎄이 플레이트를 웰당 세척 버퍼 200μL로 세척하고, 이어서 표준물질 또는 버퍼 25μL, 바탕질 또는 샘플 25μL, 및 다중화된 피분석물 비드 25μL를 각 웰에 첨가했다. 샘플을 4℃에서 세게 진동시키면서 하룻밤 인큐베이션했다. 플레이트를 세척 버퍼로 2번 세척했다. 검출 항체 25μL를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE) 25μL를 첨가하고 샘플을 30분간 실온에서 인큐베이션했다. 플레이트를 세척 버퍼로 2번 세척하고, 비드를 피복 유체 150μL으로 재현탁했다. 샘플을 Xponent 소프트웨어 시스템과 조합된 Luminex MagPix 시스템을 사용하여 분석했다. 사이토카인 수준을 표준 곡선으로부터 계산했다.
결과: 인간 전혈 배양물은 6, 24, 또는 48시간 동안 SEA-동형 대조군 또는 SEA-CD40(100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 0.0001μg/mL)으로 처리되었다. 혈청 또는 조직 배양 상청액이 수집되었고, 다중화된 Luminex 분석에 의해서 염증성 사이토카인이 평가되었다. 데이터는 SEA-동형 대조군과 비교하여 사이토카인 생산의 증가 배수로서 플롯팅된다. 전혈에서 6, 24, 및 48시간에서 IFNγ, MIP1β, 및 TNFα의 SEA-CD40-자극된 확실한 생산이 아래 표 2에 제시된다. SEA-CD40 수준은 가장 왼쪽 칼럼에 제공된다. 활성은 0.010μg/mL SEA-CD40만큼 낮은 수준에서 관찰되었다. 24시간째에 MIP1β 및 TNFα의 자극은 도 4a 및 4b에 도시된다.
전혈
6시간 IFNγ IL-8 MCP-1 MIP1α MIP1β TNFα
100.00 4.52 2.01 2.75 1.30 30.86 3.22
10.00 10.81 1.05 2.33 1.04 26.69 1.90
1.00 4.99 1.13 1.62 0.93 4.59 2.20
0.10 3.42 0.84 0.96 1.02 0.88 1.65
0.01 1.83 1.00 1.29 1.26 0.96 0.98
0.00 1.20 0.94 1.25 1.24 0.93 1.04
0.00 1.16 1.05 1.29 1.15 0.98 1.02
　 　 　 　 　 　 　
24시간 IFNγ IL-8 MCP-1 MIP1α MIP1β TNFα
100.00 3.01 1.95 2.19 2.28 6.77 3.51
10.00 3.23 1.52 2.84 2.34 8.42 3.26
1.00 2.31 1.70 2.36 1.75 6.77 3.62
0.10 1.32 1.36 1.19 0.89 3.95 2.12
0.01 0.95 1.10 1.01 0.74 0.96 2.11
0.00 0.55 0.92 1.04 0.95 1.15 1.03
0.00 0.40 0.82 0.79 1.01 1.66 1.44
　 　 　 　 　 　 　
48시간 IFNγ IL-8 MCP-1 MIP1α MIP1β TNFα
100.00 3.59 1.11 1.19 1.26 2.03 3.47
10.00 2.37 1.21 1.22 1.24 2.27 2.71
1.00 2.15 1.08 1.07 1.07 1.76 2.63
0.10 1.01 0.76 1.05 1.09 1.43 2.53
0.01 0.86 0.81 1.16 1.17 1.27 1.93
0.00 0.87 0.97 1.18 1.18 0.97 1.18
0.00 0.96 0.93 0.87 1.05 0.68 1.17
인간 PBMC는 6, 24, 또는 48시간 동안 SEA-동형 대조군 또는 SEA-CD40(100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 0.0001μg/mL)으로 처리되었다. 혈청 또는 조직 배양 상청액이 수집되었고, 다중화된 Luminex 분석에 의해서 염증성 사이토카인이 평가되었다. 데이터는 SEA-동형 대조군과 비교하여 사이토카인 생산의 증가 배수로서 플롯팅된다. 6, 24, 및 48시간에서 IFNγ, MIP1β, 및 TNFα의 SEA-CD40-자극된 확실한 생산이 아래 표 3에 제시된다. μg/mL 단위의 SEA-CD40 수준은 가장 왼쪽 칼럼에 제공된다. 활성은 0.010μg/mL SEA-CD40만큼 낮은 수준에서 관찰되었다. 24시간째에 MIP1β 및 TNFα의 자극은 도 5a 및 5b에 도시된다.
PBMC
6시간 IFNγ IL-8 MCP-1 MIP1α MIP1β TNFα
100 8.75 1.18 3.00 2.51 6.91 11.66
10 13.68 1.16 7.70 3.11 11.59 17.72
1 6.21 0.89 2.71 1.48 4.55 5.58
0.1 3.89 0.89 1.61 1.26 3.40 3.04
0.01 1.49 0.75 1.07 1.26 2.11 2.26
0.001 1.60 0.71 0.89 1.31 1.30 1.28
0.0001 1.58 0.71 0.77 0.83 1.33 1.10
　 　 　 　 　 　 　
24시간 IFNγ IL-8 MCP-1 MIP1α MIP1β TNFα
100 8.51 4.79 5.69 2.84 13.43 19.91
10 8.98 3.96 7.87 1.91 7.58 14.97
1 3.32 1.35 3.10 1.28 8.73 3.79
0.1 1.80 1.04 1.38 1.03 5.85 5.58
0.01 1.66 0.85 1.28 1.08 2.87 1.22
0.001 1.12 0.71 0.90 0.96 1.18 2.75
0.0001 0.40 0.71 0.80 0.74 1.11 1.02
　 　 　 　 　 　 　
48시간 IFNγ IL-8 MCP-1 MIP1α MIP1β TNFα
100 17.92 2.58 11.47 1.51 2.81 14.02
10 8.81 3.61 3.39 1.46 2.33 5.58
1 4.09 2.07 2.36 1.32 1.91 6.47
0.1 1.82 1.19 0.84 0.96 1.00 2.30
0.01 1.03 1.02 1.41 0.95 1.13 2.09
0.001 0.83 0.86 1.13 0.93 0.96 1.93
0.0001 0.82 0.97 0.97 0.91 1.05 1.73
PBMC 상의 활성화 마커의 평가: 공-자극성 분자 표면 발현을 상기 설명된 사이토카인 분석으로부터 남은 세포 펠릿에서 평가했다. 세포 펠릿을 BD FAC 버퍼 50mL에 재현탁하고 96-웰 둥근바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겨서 얼음 위에서 30분간 인간 100ug/mL Fc-단편(Millipore)으로 Fc 수용체를 차단했다. 1:100으로 희석된 PE-CD86(BD) 및 MHCII(Pan 항-DR,DP,DQ 항체 BD)로 이루어진 마스터 믹스를 100mg/mL 인간 Fc 단편을 함유하는 BD FAC 버퍼에서 제조했다. 마스터 믹스 5μL를 90μL를 함유한 각 웰에 첨가하고, 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, 세포를 5분간 미리 냉각된 Eppendorf 5810R 원심분리기에서 400g으로 회전시켰다. 상청액을 제거하고 세포를 BD Fac 버퍼 200mL으로 세척했다. 세포를 2번 세척한 다음 FAC 버퍼 200mL에 재현탁했다. 다음에, 샘플을 DIVA 소프트웨어(BD biosciences)로 LSRII(BD biosciences)에서 분석했다. CD86 및 MHCII geo 평균 형광을 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 평가했다. SEA-h00와 SEA-CD40 간의 비율을 계산하고, 변화 배수를 사용하여 SEA-CD40 효능의 범위를 계산했다.
결과: 사이토카인 생산을 도출하는 것에 더하여 CD40의 활성화는 항원 제시 세포의 성숙화를 촉진한다. DC 성숙화 후에 CD86 및 MHCII을 포함하는 활성화 마커의 상향조절이 이어질 수 있다. 인간 PBMC 배양물이 6, 24, 또는 48시간 동안 SEA-CD40 및 SEA-동형 대조군으로 자극되었고, MHC II형 항원(HLA DR, DP, DQ) 및 CD86의 표면 발현이 평가되었다. 동형 대조군은 아니었지만 SEA-CD40 자극은 0.01μg/mL만큼 낮은 농도에서 MHCII(표 4)와 CD86(데이터는 도시되지 않음) 모두의 유의한 증가를 가져왔다.
MHCII
SEA-CD40 6시간 24시간 48시간
100 1.13 1.64 2.10
10 1.10 1.62 2.10
1 1.14 1.76 1.57
0.1 0.90 1.19 1.50
0.01 0.90 1.21 1.38
0.001 1.00 1.07 1.10
0.0001 0.85 1.05 0.99
SEA-CD40에 의한 면역 활성화에서 푸코오스의 역할: 인간 PBMC를 상기 설명된 대로 분리했다. PBMC를 SEA-Cd40, 모 항체 SGN40, 또는 SEA-CD40의 F(ab)'2 버전의 다양한 농도로 처리하고 24시간 동안 인큐베이션했다. B 세포 고갈의 평가를 위하여 PBMC 배양물을 PE-CD19로 염색하고, B-세포 수를 유세포계수법에 의해서 정량했다. 사이토카인 생산의 평가를 위하여 PBMC 조직 배양 상청액을 수집하고 사이토카인 생산을 Luminex 플랫폼에서 다중화 분석에 의해서 평가했다. IFNγ 생산은 도 7에 도시되며(ng/mL), 다른 사이토카인에서도 유사한 경향이 보였다. 항원 제시 세포 성숙화의 평가를 위하여 PBMC를 24시간 인큐베이션 후 수집하고, PE-항-CD86 또는 APC-pan MHC II형 항원(DR, DQ, DP) 항체로 염색하고, 양성 세포의 퍼센트를 유세포계수법에 의해서 평가했다. 데이터는 pan MHC 마커에 대한 평균 형광 강도로서 도시된다.
결과: B 세포 고갈을 평가하기 위해서 인간 PBMC 배양물이 SEA-CD40, 다세투주맙, 또는 SEA-CD40 F(ab')2의 여러 농도로 24시간 동안 처리되었다. 결과는 도 6에 도시된다. B 세포의 ADCC-매개된 고갈은 다세투주맙-처리된 배양물과 비교하여 SEA-CD40-처리된 배양물에서 유의하게 더 높았고, 이 활성은 SEA-CD40 F(ab)'2에서 상실되었다.
추가로, 면역 활성화 종점(사이토카인 및 APC 활성화/성숙화 마커)이 24시간 동안 자극된 SEA-CD40, 다세투주맙, 및 SEA-CD40 F(ab')2 PBMC 배양물에서 평가되었다. 사이토카인 생산(도 7)과 APC 성숙화(도 8) 모두의 SEA-CD40 자극은 다세투주맙 또는 SEA-CD40 F(ab)'2에 대한 것보다 유의하게 더 높았다. 이들 데이터는 IgG 도메인에서 푸코오스의 결여가 CD40 결합을 변경시키지 않지만 FcγRIIIa 결합을 증가시키고, 그 결과 증가된 CD40 활성 및 궁극적으로 증가된 CD40 면역 조정 활성을 가져온다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 비-푸코실화된 hS2C6 항체의 면역 조정 활성
SEA-CD40의 활성 투여량의 확인: SEA-CD40은 항원-제시 세포를 활성화하는 투여량 수준에서 활성인 것으로 제안되며, 이것은 MHC I형 또는 II형, 또는 CD86과 같은 활성화 마커의 상향조절에 의해서 특성화될 수 있다. 6시간에서 48시간까지 SEA-CD40의 다양한 농도로 처리한 후에 PBMC 상의 활성화 마커를 상기 설명된 대로 평가했다(PBMC 상의 활성화 마커의 평가). 각 활성화 마커에 대해 동형 대조군 SEA-CD40 처리와 SEA-CD40 처리 간의 차이를 계산하고 SEA-CD40 농도 및 처리 시간에 대해 플롯팅했다. 가장 가파른 반응-농도 곡선은 CD86 및 MHCII의 경우 24시간째에, MHCI의 경우 48시간째에 관찰되었다. 반응-농도 데이터(24hr CD86, 24hr MHCII 및 48hr MHCI)를 다음의 식을 사용하여 비선형 회귀에 의해서 피팅했으며, 여기서 0% 및 100% 반응은 각 활성화 마커에 대한 데이터 세트에서 최소 및 최대 값으로써 정의된다. EC50은 50% 반응을 제공하는 SEA-CD40의 농도이다.
결과: 활성화 마커에 대한 정규화된 반응 대-log(농도) 및 비선형 피팅된 회귀선이 도 9에 도시된다. MHCI, CD86 및 MHCII에 대해서 추정된 EC50 값은 각각 0.011, 0.14 및 0.41μg/mL였다. SEA-CD40은, 인간에서 10μg/kg의 IV 투여량에 의해서 달성가능한 이론적 혈장 Cmax에 상응하는, 0.2μg/mL에서 각각 MHCI, CD86 및 MHCII의 대략 90%, 60%, 및 30% 최대 상향조절을 유도하도록 추정된다. 이 투여량은 이론적인 제1 예상된 활성 투여량으로 제안된다.
실시예 4: 비-푸코실화된 hS2C6 항체의 면역 조정 활성
SEA-CD40에 의해서 생성된 T-세포 반응: Astarte Biologics에서 항-M1 T 셀라인을 M1 flu 펩티드에 대해 고도로 반응성인 것으로 나타난 HLA-A2 도너로부터 생성했다. 이들 세포를 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하고 자가 PBMC와 조합했다. 배양물을 5일 동안 SEA-CD40 또는 다세투주맙의 감소하는 농도(1, 0.1, 0.01μg/ml)의 존재 또는 부재하에 10μg/ml M1 flu 펩티드로 자극했다. 배양 상청액을 수집하고 Luminex 플랫폼에서 다중화 분석에 의해서 사이토카인에 대해 분석했고, M1 특이적 테트라머 결합에 의해서 항원 특이적 T-세포를 확인했다.
결과: M1 flu 펩티드에 대해 고도로 반응성인 것으로 나타난 HLA-A2 도너로부터의 PBMC가 5일 동안 SEA-CD40 또는 다세투주맙의 감소하는 농도의 존재 또는 부재하에 M1 flu 펩티드로 자극되었다. 결과는 도 10a 및 10b에 도시된다. SEA-CD40 자극된 배양물은 IFNγ 생산에 의해 보여진 대로 M1 flu 항원에 대해 증가된 반응성을 나타냈고, 증가된 테트라머 결합에 의해 결정된 대로 항원 특이적 T-세포에 증가를 나타냈다. SEA-CD40은 0.1ug/mL까지 아래로 항원 특이적 T-세포 반응을 자극했으며, 이 활성은 다세투주맙과 관련된 반응보다 더 확실했다.
항-면역 체크포인트 억제제 항체와 조합된 SEA-CD40에 의해서 생성된 T-세포 반응: Astarte Biologics에서 항-M1 T 셀라인을 M1 flu 펩티드에 대해 고도로 반응성인 것으로 나타난 HLA-A2 도너로부터 생성했다. 이들 세포를 CFSE로 표지하고 자가 PBMC와 조합했다. 배양물을 SEA-CD40의 감소하는 농도(1, 0.1, 0.01 ug/ml) 및/또는 항-CTLA4 또는 항-PD-1 항체 1ug/mL의 존재 또는 부재하에 10ug/mL M1 flu 펩티드로 5일 동안 자극했다. 배양 상청액을 수집하고, Luminex 플랫폼에서 다중화 분석에 의해서 사이토카인에 대해 분석하고, 항원 특이적 T-세포를 M1 특이적 테트라머 결합에 의해서 확인했다.
결과: M1 flu 펩티드에 대해 고도로 반응성인 것으로 나타난 HLA-A2 도너로부터의 PBMC가 SEA-CD40의 감소하는 농도 및/또는 항-CTLA4 차단 항체 또는 항-PD-1 항체의 일정한 농도의 존재 또는 부재하에 M1 flu 펩티드로 자극되었다. 결과는 도 11 및 12에 도시된다. SEA-CD40, 항-CTLA4 항체 및 항-PD-1 항체 단독은 항원 특이적 T-세포 반응을 자극했지만, SEA-CD40과 항-CTLA4 항체 또는 항-PD-1 항체가 조합되었을 때는 IFN-γ 생산의 증가에 의해 보여진 대로 M1 flu 항원에 대한 증가된 반응(도 11) 및 증가된 테트라머 결합에 의해 결정된 대로 항원 특이적 T-세포의 증가(도 12, 테트라머/APC를 사용함 - MBL로부터의 HLA-A*02:01 인플루엔자-M1 (GILGFVFTL) 테트라머)가 관찰되었다. SEA-CD40은 0.1ug/mL까지 아리로 항원 특이적 T-세포 반응을 자극했으며, 이 활성은 면역 체크포인트 항체와의 조합에 의해서 증진되었다.
암 환자로부터의 PCMC에서 SEA-CD40에 의해서 생성된 T-세포 반응: 항-CD40 항체만의 평가를 위해서 PBMC를 종양 환자 혈액 10mL로부터 분리했고, 25만 개의 세포를 24웰 플레이트에 평판했다. SEA-CD40만의 증가하는 농도, 또는 MageA1/ Mage A3/NY-ESO를 함유하는 조합된 펩티드 풀 1μg/mL, 및 SEA-CD40 또는 SGN-40의 증가하는 농도로 샘플을 처리했다. 샘플을 5일 동안 37℃에서 10% CO2 중에서 배양했고, 조직 배양 상청액을 수집했고, INF-γ 수준을 평가했다.
면역 체크포인트 차단 항체와 조합된 SEA-CD40의 평가를 위해서 PBMC를 유방암, 췌장암, 흑색종 암으로 진단된 환자의 혈액 10mL로부터 분리했고, 25만 개의 세포를 24웰 플레이트에 평판했다. SEA-CD40의 증가하는 농도, MageA1/MageA3/NY-ESO를 함유하는 조합된 펩티드 풀 1μg/mL, 및 항-PD1 또는 항-CTLA4 1μg/mL로 샘플을 처리했다. 샘플을 5일 동안 37℃에서 10% CO2 중에서 배양했고, 조직 배양 상청액을 수집했고, INF-γ 수준을 평가했다.
결과: 도너로부터 PBMC가 상기 설명된 대로 전혈로부터 분리되었다. 상기와 같이, 도너는 흑색종으로 진단된 3명의 환자, 유방암으로 진단된 3명의 환자, 및 췌장암으로 진단된 3명의 환자였다. 도너 PBMC는 5일 동안 SEA-CD40 또는 SGN-40의 증가하는 농도의 존재 또는 부재하에 공통 종양 항원 단백질(MAGEA1/MAGE3/NY-ESO)의 펩티드의 풀로 자극되었다. 조직 배양 상청액이 수집되었고 INF-γ 생산이 평가되었다. 결과는 도 13에 도시된다. 9명의 환자 중 6명은 SGN-40 처리와 비교하여 SEA-CD40 처리에 의해서 유의하게 증진된 항원 의존성 INF-γ 반응을 나타냈다. SEA-CD40 처리된 PBMC에서 자극은 10μg/mL만큼 낮은 농도에서 관찰되었다.
도너로부터 PBMC가 상기 설명된 대로 전혈로부터 분리되었다. 상기와 같이, 도너는 흑색종으로 진단된 3명의 환자, 유방암으로 진단된 3명의 환자, 및 췌장암으로 진단된 3명의 환자였다. 도너 PBMC는 SEA-CD40의 증가하는 농도 및/또는 항-CTLA4 또는 항-PD1 차단 항체의 일정한 농도의 존재 또는 부재하에 공통 종양 항원 단백질(MAGEA1/MAGE3/NY-ESO)의 펩티드의 풀로 자극되었다. 결과는 도 14에 도시된다. SEA-CD40 및 체크포인트 차단 표적 PD1 및 CTLA4에 대한 항체는 항원 특이적 T-세포 반응만을 자극했지만, SEA-CD40이 항-CTLA4 또는 항-PD1 항체와 조합되었을 때는 INF-γ 생산에 의해 측정된 대로 종양 항원에 대한 확실한 신호가 관찰되었다.
실시예 5: 비-푸코실화된 항-CD40 항체의 활성에 대한 마우스 모델
마우스 모델은 새로운 암 치료제의 효능 및 메커니즘을 평가하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 암의 마우스 모델에서 SEA-CD40의 연구는 SEA-CD40이 뮤린 CD40을 인식하지 않기 때문에 어려웠다. 따라서, 비-푸코실화된 항-CD40 항체의 활성을 평가하기 위하여 동계 뮤린 종양 모델이 개발되었다. 인간 IgG1 및 인간 FcγRIII/CD16의 뮤린 기능적 등가물은 각각 뮤린 IgG2a 및 FcγRIV이고, 뮤린 FcγRIV에 대한 뮤린 IgG2a의 결합은 ADCC를 매개한다. 예를 들어, Bruhns, Blood 119:5640-5649 (2012) 및 Nimmeriahn et al., Immunity 23:41-51 (2005) 참조. 래트 항체 1C 10을 사용하여 SEA-CD40의 대용물을 생성했다. 예를 들어, Heath et al., Eur. J. Immunol. 24:1828-1834 (1994) 참조. 간단히 말해, 뮤린 CD40, 1C10 항체를 인식하는 래트 단클론성 항체의 VL 및 VH 유전자 단편을 각각 뮤린 Ckappa 및 뮤린 IgG2a CH1-CH2-CH3 단편에 프레임 내 5' 클로닝했다. CHO 세포에서 결과의 유전자의 발현은 래트 VL 및 VH 도메인과 IgG2a 동형의 뮤린 경쇄 및 중쇄 도메인을 가진 키메라 IC10 항체를 생성했다(mIgG2a 1C10). mIgG2a IC10은 실시예 1에 설명된 방법을 사용하여 CHO 세포 성장 배지에서 2-플루오로푸코오스의 존재하에 발현되었으며, 이로써 mIgG2a 1C10의 비-푸코실화된 형태가 생성되었다(mIgG2a SEA 1C10). 푸코실화된 mIgG2a 1C10 및 mIgG2a SEA 1C10을 마우스 B16 흑색종 모델을 사용하여 항-종양 활성에 대해 테스트했다.
뮤린 Fcγ 수용체에 대한 비-푸코실화된 뮤린 항체 결합의 평가: 뮤린 FcγRI 또는 FcγRIV를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 푸코실화된 mIgG2a 1C10 또는 비-푸코실화된 mIgG2a 1C10 (mIgG2a SEA-1C10)의 증가하는 농도와 함께 인큐베이션했다. 샘플을 세척하고, PE-항-마우스 IgG의 포화량을 첨가하여 30분간 얼음 위에서 샘플과 함께 인큐베이션했다. 샘플을 다시 세척하고, 표지된 세포를 유세포분석법에 의해서 분석했다.
결과: 뮤린 FcγRI 또는 FcγRIV(인간 FcγRIII/CD16에 대한 뮤린 등가물)를 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 대한 대용물 항-CD40 항체의 결합이 평가되었다. 결과는 도 15a 및 15b에 도시된다. 예상된 대로, mIgG2a 1C10은 FcγRI에 대해 mIgG2a SEA 1C10와 유사한 친화서응로 결합되었다. 예를 들어, 도 15a를 참조한다. 그러나, 비-푸코실화된 mIgG2a SEA 1C10은 푸코실화된 모 항체 mIgG2a 1C10보다 유의하게 더 높은 친화성으로 FcγRIV에 결합되었다. 예를 들어, 도 15b를 참조한다.
뮤린 종양 모델에서 비-푸코실화된 항-CD40 항체의 평가: 250.0E+3 B16F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 제공했다. 마우스를 평균 대략 50㎣의 종양 크기를 가진 각 코호트로 무작위화했다. 다음에, 마우스에 동형 대조군(mIgG2a), 푸코실화된 mIgG2a 1C10, 또는 비-푸코실화된 mIgG2a 1C10(mIgG2a SEA 1C10)를 총 3회 투여량으로 격일로 복강내 주사했다. 종양 크기가 1000㎣에 도달할 때까지 마우스를 모니터했으며, 이때 마우스를 죽였다.
결과: B16F10 동계 흑색종 모델을 사용하여 우리의 비-푸코실화된 항-CD40 항체 대용물의 생체내 효능이 평가되었다. C57BL/6 마우스에 B16F10 흑색종 세포가 이식되었고, 이후 mIgG2a 동형 대조군, 푸코실화된 mIgG2a 1C10, 또는 비-푸코실화된 mIgG2a 1C10(mIgG2a SEA 1C10)으로 처리되었다. 종양 부하를 모니터하고, 종양 크기가 1000㎣에 도달했을 때 마우스가 희생되었다. 결과는 도 16에 도시된다. 비-푸코실화된 SEA-1C10 mIgG2a로 처리된 마우스는 푸코실화된 모 1C10 IgG2a 항체와 비교하여 유의한 생존 이익 및 종양 지연을 나타냈다.
실시예 6: SEA-CD40은 B-세포를 고갈시키고 T-세포 활성화를 촉진한다
SEA-CD40 활성을 관련된 푸코실화된 항체 및 완전히 효현성인 항-CD40 항체, 클론 21.4.1과 비교했다. 항체 21.4.1은 PDL1과 조합하여 고상 종양의 임상 시험에서 현재 테스트중인 항체 CP-870,893의 모 클론인 인간 항-CD40 IgG2k 효현성 항체이다. 항체 21.4.1의 아미노산 서열 정보는, 예를 들어 미국특허 No. 7,338,660을 참조하며, 이것은 모든 취지에서 여기 포함된다. 항체들에서 3개의 기능적 영역을 테스트했다: 인간 B-세포 분화, 활성화 및 고갈을 추진하는 능력, 일차 인간 PBMC 배양물을 활성화하는 능력, 및 항원 특이적 반응을 추진하는 능력.
항-CD40 항체에 의한 B-세포 활성화의 평가: 신선한 인간 전혈로부터의 정제된 B-세포 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 실험을 수행했다. B-세포를 RosetteSep 분리 키트를 사용하여 신선한 인간 전혈로부터 분리했다. 분리된 정제된 B-세포를 24시간 동안 SEA-CD40, 항체 21.4.1 또는 헥사머 CD40 리간드, Enzo Life Sciences의 증가하는 농도(10, 1, 0.1, 0.01, 또는 0.001μg/mL)와 함께 배양했다. B-세포 활성화를 유세포계수법에 의해서 CD80의 상향조절로서 평가했다.
PBMC를 상기 설명된 대로 분리한 다음 24시간 동안 SEA-CD40, 항체 21.4.1 또는 헥사머 CD40L의 증가하는 농도(10, 1, 0.1, 0.01, 또는 0.001μg/mL)와 함께 배양했다. B-세포의 총 수를 유세포계수법에 의해서 평가되는 CD19 염색으로 평가했다.
결과: SEA-CD40 면역 조정 활성은 항체의 Fc 부분 및 그것의 CD16, FcγRIII 수용체와의 상호작용에 의존한다. 결과는 도 17에 도시된다. SEA-CD40은 SEA-CD40의 가교에 필요한 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 결여한 정제된 B-세포 배양물에서 B-세포 활성화를 유도하지 않는다. 이것은 CD40 리간드와 유사한 순수한 B-세포 배양물에서 B-세포 활성화를 추진할 수 있는 CD40 활성화 항체 21.4.1과의 차이이다.
PBMC는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포를 포함한다. 이 세포 집단에 대한 결과는 도 18에 도시된다. PBMC 배양물에서 SEA-CD40은 B-세포의 ADCC 고갈을 촉진할 수 있었지만, 항체 21.4.1 처리는 B-세포를 고갈시키지 않았다.
항-CD40 항체에 의한 단구/대식세포 활성화의 평가: 인간 PBMC 배양물을 상기 설명된 대로 분리했다. PBMC 배양물을 SEA-CD40, 다세투주맙, 항체 21.4.1 또는 SEA-동형 대조군의 증가하는 농도(0.0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 또는 10μg/mL)로 24시간 동안 자극했다. CD80의 상향조절은 단구 성숙화의 마커이다. CD80의 표면 발현을 유세포계수법에 의해서 평가했다.
결과: 결과는 도 19에 도시된다. PBMC의 SEA-CD40 처리는 CD80 상향조절에 의해서 측정된 대로 단구/대식세포의 확실한 활성화를 유도하며, 이 활성은 CD40 활성화 항체 21.4.1에서 보인 활성화와 동등하다.
항-CD40 항체에 의한 사이토카인 유도의 평가: 인간 PBMC 배양물을 상기 설명된 대로 분리했다. PBMC 배양물을 SEA-CD40, 다세투주맙, 항체 21.4.1 또는 SEA-동형 대조군의 증가하는 농도(0.0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 또는 10μg/mL)로 24시간 동안 자극했다. 자극 후 조직 배양 상청액을 수집하고 염증성 사이토카인을 다중화된 Luminex 분석에 의해서 평가했다.
결과: 결과는 도 20 및 21에 도시된다. 도 20은 SEA-CD40 및 CD40 활성화 항체 21.4.1이 사이토카인 IFN-γ 및 확실한 T-세포 반응을 도출하는데 중요한 케모카인을 유도한다는 것을 보여준다. 도 21은 항체에 의한 인터류킨 10(IL-10)의 유도를 보여준다. IL-10 생산을 촉진하는 항체 21.4.1과는 반대로, SEA-CD40은 면역 축소 사이토카인 IL-10의 수준을 감소시킨다.
항-CD40 항체에 의한 T-세포 유도의 평가: 인간 PBMC 배양물을 상기 설명된 대로 분리했다. 1X106 PBMC를 DMEM + 10% FBS에서 배양하고 M1 flu 펩티드 5ug 및 SEA-CD40, 다세투주맙 또는 항체 21.4.1의 증가하는 농도(0.0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 또는 10μg/mL)와 함께 5일 동안 인큐베이션했다. 다음에, 세포 및 세포 상청액을 수집했다. 상청액에서 IFN-γ 수준을 평가했다. Flu 항원-특이적 T-세포를 유세포계수법을 사용하여 테트라머 염색에 의해서 평가했다. 세포의 T-조절성 세포, CD4+, CD25+, CD127 저 집단의 퍼센트를 유세포계수법을 사용하여 결정했다.
결과: 결과는 도 22-24에 도시된다. 5일 인큐베이션 후 SEA-CD40은 다세투주맙 또는 항체 21.4.1과 비교하여 IFN-γ의 더 높은 수준을 유도했다. 예를 들어, 도 22를 참조한다. 도 23은 SEA-CD40이 항체 21.4.1에서 보인 것과 유사하게 확실한 flu 항원 특이적 T-세포 반응을 유도한다는 것을 보여준다. 그러나, 도 24는 SEA-CD40이 또한 flu 펩티드 자극 후에 존재하는 면역 억제성 T-조절성 세포의 수를 감소시킨다는 것을 보여준다. 이 활성은 SEA-CD40에 의한 PBMC의 처리 후 보여진 감소된 IL10 생산과 관련된 것 같다. 반대로, 항체 21.4.1과 함께 인큐베이션 후 PBMC는 도 24에 나타낸 대로 T-조절성 세포의 증가된 수를 나타냈다.
본원에서 설명된 실시예 및 구체예는 단지 예시의 목적인 것과 이들에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이며 이들은 본 출원의 정신 및 이해범위와 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다는 것이 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 취지에서 그 전체가 여기 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SEATTLE GENETICS, INC. <120> DOSAGE AND ADMINISTRATION OF NON-FUCOSYLATED ANTI-CD40 ANTIBODIES <130> 0040-00712PC <150> US 62/072,031 <151> 2014-10-29 <150> US 62/134,955 <151> 2015-03-18 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hS2C6 heavy chain <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hS2C6 light chain <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (22)

  1. 암의 치료 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 환자에게 항-CD40 항체를 투여하는 단계를 포함하며,
    여기서, 항-CD40 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함하고; 불변 영역은 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 잔기 N297에 N-글리코시드-결합된 당 사슬을 가지며, N-글리코시드-결합된 당 사슬의 5% 미만이 푸코오스 잔기를 포함하고; 항-CD40 항체는 0.1-2000μg/kg 환자 체중의 투여량 수준으로 투여되는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 투여량(dose) 수준은 10-1000μg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 투여량 수준은 50-800μg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 투여량 수준은 75-600μg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 투여량 수준은 100-500μg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 투여량 수준은 100-300μg/kg, 300-500μg/kg, 500-700μg/kg, 700-900μg/kg, 및 900-1100μg/kg으로 구성되는 군으로부터 선택된 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 투여량 수준은 100-150μg/kg, 150-200μg/kg, 200-250μg/kg, 250-300μg/kg, 300-350μg/kg, 350-400μg/kg, 400-450μg/kg, 450-500μg/kg, 500-550μg/kg, 550-600μg/kg, 600-650μg/kg, 650-700μg/kg, 700-750μg/kg, 750-800μg/kg, 800-850μg/kg, 850-900μg/kg, 900-950μg/kg, 950-1000μg/kg, 1000-1050μg/kg, 및 1050-1100μg/kg으로 구성되는 군으로부터 선택된 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 투여량 수준은 약 60μg/kg, 약 100μg/kg, 약 150μg/kg, 약 200μg/kg, 약 250μg/kg, 약 300μg/kg, 약 350μg/kg, 약 400μg/kg, 약 450μg/kg, 약 500μg/kg, 약 550μg/kg, 약 600μg/kg, 약 650μg/kg, 약 700μg/kg, 약 750μg/kg, 약 800μg/kg, 약 850μg/kg, 약 900μg/kg, 약 950μg/kg, 약 1000-1050μg/kg, 약 1050μg/kg, 및 1110μg/kg으로 구성되는 군의 일원인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 항-CD40 항체는 3주마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 항-CD40 항체는 6주마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 환자는 CD40 양성 암을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 환자는 CD40 음성 암을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 암의 치료 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 환자에게 항-CD40 항체와 항-CTLA4 항체를 투여하는 단계를 포함하며,
    여기서, 항-CD40 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함하고; 불변 영역은 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 잔기 N297에서 글리코실화되고, 글리코실화된 것의 5% 미만이 푸코오스 잔기를 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 항-CTLA4 항체는 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 암의 치료 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 환자에게 항-CD40 항체와 항-PD1 항체를 투여하는 단계를 포함하며,
    여기서, 항-CD40 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함하고; 불변 영역은 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 잔기 N297에서 글리코실화되고, 글리코실화된 것의 5% 미만이 푸코오스 잔기를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 항-PD1 항체는 니볼루맙, 피딜리주맙, 및 펨브롤리주맙으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 암의 치료 방법으로서, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 환자에게 항-CD40 항체와 항-PD-L1 항체를 투여하는 단계를 포함하며,
    여기서, 항-CD40 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함하고; 불변 영역은 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 잔기 N297에서 글리코실화되고, 글리코실화된 것의 5% 미만이 푸코오스 잔기를 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 MEDI4736 및 MPDL3280A로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 암은 혈액암인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 암은 고상 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 13 항, 제 15 항 또는 제 17 항에 있어서, 암은 혈액암인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 13 항, 제 15 항 또는 제 17 항에 있어서, 암은 고상 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
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