CN115403670A - 抗cd40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性识别人、食蟹猴和小鼠CD40分子且弱激动所述CD40分子的抗CD40抗体或其抗原结合片段，以及包含所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物、药物组合物和组合产品。本发明还涉及编码所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的核酸及包含所述核酸的宿主细胞，以及制备所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的方法。本发明还涉及所述抗CD40抗体或其抗原结合片段在受试者中预防或治疗肿瘤或感染性疾病的用途。

Description

抗CD40抗体及其用途
本发明涉及抗CD40抗体或其抗原结合片段。具体而言，本发明涉及特异性识别人、食蟹猴和小鼠CD40分子且弱激动所述CD40分子的抗CD40抗体或其抗原结合片段，以及包含所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物、药物组合物和组合产品。本发明还涉及编码所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的核酸及包含所述核酸的宿主细胞，以及制备所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的方法。本发明还涉及所述抗CD40抗体或其抗原结合片段在受试者中预防或治疗肿瘤或感染性疾病的用途。
背景技术
CD40激动剂的临床试验显示其(例如selicrelumab、dacetuzumab、APX005M等)在多种适应症中均表现出临床活性(Hassan SB等人,Anti-CD40-mediated cancerimmunotherapy:an update of recent and ongoing clinical trials.ImmunopharmacolImmunotoxicol 2014；36:96–104)。但是，这些研究也显示所述CD40激动剂与导致剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity)的不良事件相关。最常见的不良事件包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome；CRS)以及肝毒性。目前临床试验常用的是带有正常Fc功能的CD40激动剂，这类激动剂根据激动活性可以分为两类，其中某些激动剂因为可以非特异性过度激活免疫反应而有很大的毒性，不太适合作为治疗药剂，而另外一些需要通过交联效应(Crosslinking效应)才能形成具有免疫活性的抗CD40单克隆抗体，通过有限可控的激活表达CD40的免疫细胞而形成局部的免疫增强反应，从而在有限范围杀伤肿瘤细胞。
近些年来，治疗指数(TI)越来越成为评价药物安全性的重要指标。TI是将引起治疗效果的药物量与引起毒性的药物量进行比较，这意味着在施用给患者的药物剂量下，如果药物的药效越高、毒性越低，则治疗指数越高、安全性越高。而现有技术中，目前已知的抗CD40抗体治疗指数较低，在实际施用给患者的剂量下，抗体在病灶位置形成的免疫细胞杀伤活性与在其他部位引起的非特异性激动活性(例如肝毒性)的比值不高。因此，本领域需要开发新的CD40激动剂，其在提供足够的免疫刺激的同时，又可以降低传统CD40激动剂所导致的不良事件。
另外，在新的CD40激动剂开发过程中，临床前阶段的动物模型评价是评估药物安全性和治疗效果的重要环节。啮齿类动物(例如，小鼠)被广泛应用于建立人类疾病的动物模型。但是，与小鼠CD40无交叉反应性的抗CD40抗体(例如Roche开发的selicrelumab)需要在转人CD40基因小鼠肿瘤模型中使用才可以反映其体内药效和安全性。在小鼠模型中测试抗CD40双特异性抗体的药效方面，也迫切需要开发同时具有小鼠CD40交叉反应性的激动性抗CD40抗体。
发明概述
本发明提供了一种治疗指数很高的激动型抗CD40抗体，所述抗体能够在受试者中提供足够的免疫刺激的同时，减弱CD40活化后所致的非特异性免疫激活的不利影响，其具有以下一个或多个特性：
(1)以高亲和力结合并活化CD40，例如，以约10-7M至约10-10M结合CD40，例如人CD40、食蟹猴CD40和小鼠CD40，如通过ForteBio动力学结合测定法所测量；
(2)增强CD40与CD40L的结合；
(3)通过结合抗原呈递细胞上表达的CD40，激活抗原呈递细胞，例如，所述抗原呈递细胞包括树突细胞(DC)、B细胞、单核细胞、巨噬细胞；
(4)诱导表达CD40的B细胞表达CD95；
(5)在形成交联效应时显著增强B细胞介导的免疫应答；
(6)在没有形成交联效应时几乎不增强或微弱增强B细胞介导的免疫应答。
本发明的抗CD40抗体具有完全的人序列，是一种人抗体。预期本发明的抗CD40抗体对人类受试者具有最小的免疫原性，诱导更少的抗药物抗体(ADA)，从而使与ADA相关的对治疗性抗CD40抗体的清除率降至最低，人类受试者对该治疗性抗CD40抗体将会具有良好的耐受性。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含三个互补决定区，分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述重链可变区包含三个互补决定区，分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
(a)LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)LCDR2包含选自SEQ ID NO:2、5、6、7中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:2、5、6、7中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(c)LCDR3包含选自SEQ ID NO:3、4中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:3、4中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体，
(d)HCDR1包含选自SEQ ID NO:8、12、14、20中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:8、12、14、20中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)HCDR2包含选自SEQ ID NO:9、21中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:9、21中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(f)HCDR3包含选自SEQ ID NO:10、11、13、15、16、17、18、19中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:10、11、13、15、16、17、18、19中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体，
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:12的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:15的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:16的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:17的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:18的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:19的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；或
(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:20的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:21的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含：
含有如氨基酸序列RSSQGIRSSLA(SEQ ID NO:1)的LCDR1、含有如氨基酸序列GX1SSLX2X3(SEQ ID NO:56)的LCDR2和含有如氨基酸序列QQLX4SFPST(SEQ ID NO:57)的LCDR3，其中X1为A或者G；X2为E或者L；X3为G或者V；X4为N或者A；以及
含有如氨基酸序列GFTX5GSYEMX6(SEQ ID NO:58)的HCDR1、含有如氨基酸序列YISSX7GETTD(SEQ ID NO:59)的HCDR2和含有如氨基酸序列DVFFFX8X9SX10X11X12X13AYGMDV(SEQ ID NO:60)的HCDR3，其中X5为F、A或者P；X6为N或者D；X7为S或者A；X8为D或者S；X9为S或者P；X10为G或者R；X11为D、P、S或者F；X12为P、N或者R；X13为G或者H。
在一些具体的实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含：
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:4的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:11的LCDR3；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:5的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:13的LCDR3；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:6的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:15的LCDR3；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:16的LCDR3；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:17的LCDR3；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:18的LCDR3；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:19的LCDR3；或
(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:7的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:21的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中：
(i)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:23、29、33、39、53中的任一氨基酸序列，所述重链可变区含有SEQ ID NO:25、31、35、37、41、43、45、47、49、51、55中的任一氨基酸序列；或者
(ii)所述轻链可变区含有与SEQ ID NO:23、29、33、39、53中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链可变区含有与SEQ ID NO:25、31、35、37、41、43、45、47、49、51、55中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含：
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:25的重链可变区；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:25的重链可变区；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:31的重链可变区；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链可变区；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:37的重链可变区；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:41的重链可变区；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:43的重链可变区；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链可变区；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:47的重链可变区；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:49的重链可变区；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:51的重链可变区；或
(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:55的重链可变区，
优选地，所述抗CD40抗体或抗原结合片段为完全人抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是人IgG1或人IgG4抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体是抗原结合片段，包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体在其免疫球蛋白Fc区的CH2结构域中的糖基化位点被去除，例如，将人IgG Fc区的CH2结构域中的N297残基突变以去除该糖基化位点，例如，将N297残基变成Gly、Ala、Gln、Asp或Glu，优选地，将N297残基变成Gln。
在第二方面，本发明提供了制备本发明的抗CD40抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码本发明的抗CD40抗体的核酸的条件下培养导入有编码本发明的抗CD40抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，分离所述抗CD40抗体，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗CD40抗体。
在第三方面，本发明提供了免疫缀合物，其包含本发明的抗CD40抗体和其它物质，例如细胞毒性剂。
在第四方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗CD40抗体或免疫缀合物，以及任选地药用辅料。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗CD40抗体或免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选地药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、其他抗体(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)、细胞毒性剂。
在一些实施方案中，本发明提供了组合产品，其包含本发明的抗CD40抗体或免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体，优选地抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在第五方面，本发明提供了在受试者中预防或治疗受试者或个体肿瘤或感染性疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗CD40抗体、免疫缀合物、药物组合物、或组合产品。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体、免疫缀合物、药物组合物、或组合产品预防或治疗的肿瘤是癌症，例如，表达CD40分子的癌症或者不表达CD40分子的癌症；或者本发明的抗CD40抗体、免疫缀合物、药物组合物、或组合产品预防或治疗的感染性疾病为例如细菌感染、病毒感染、真菌感染或原生动物感染，优选地所述感染性疾病是慢性感染，在所述感染中受试者或个体的免疫力低下。
在第六方面，本发明提供了检测样品中CD40的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗CD40抗体，用于实施以下步骤：
(a)将样品与本发明的抗CD40抗体接触；和
(b)检测所述抗CD40抗体和CD40间的复合物的形成；任选地，所述抗CD40抗体是被可检测地标记的，
由此，判断来自受试者或个体的样品中的CD40表达水平。
附图简述
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1显示了CD40抗原P17-Fc分别与两种对照抗体达西珠单抗和Bleslumab单抗的结合。使用同种型人IgG1抗体作为阴性对照。图中的横坐标是抗体浓度。
图2显示了未生物素标记的P17-Fc和生物素标记的P17-Fc分别与两种对照抗体达西珠单抗和Bleslumab的结合的比较。图中“P17-Fc-CD40-ble”表示“未生物素标记的P17-Fc与Bleslumab单抗的结合(文中也称为CD40-Ble或者CD40-ble)”；“P17-Fc-CD40-dac”表示“未生物素标记的P17-Fc与达西珠单抗的结合(文中也称为CD40-Dac或者CD40-dac)”。
图3显示了针对人天然抗体噬菌体展示文库的三轮淘选后的噬菌体库ELISA结果。图中“VCSM13”表示“VCSM13辅助噬菌体”，获自Stratagene(美国)。
图4显示了从人天然抗体噬菌体展示文库中筛选到的C8克隆CD40 Fab分子与CD40的结合亲和力，Bleslumab单抗用作阳性对照，同种型人IgG1抗体用作阴性对照。图中的横坐标是抗体浓度。
图5A显示了C8克隆的抗CD40 Fab分子与在CHO细胞上稳定表达的人CD40的结合。
图5B显示了C8克隆的抗CD40 Fab分子与在CHO细胞上稳定表达的食蟹猴CD40的交叉反应性。
图6A显示了全长抗CD40候选抗体与在CHO细胞上稳定表达的人CD40的亲和力。
图6B显示了全长抗CD40候选抗体与在CHO细胞上稳定表达的食蟹猴CD40的亲和力。
图6C显示了全长抗CD40候选抗体与在CHO细胞上稳定表达的小鼠CD40的亲和力。同种型人IgG1抗体用作阴性对照。
图7显示了全长抗CD40抗体对CD40L与表达CD40的CHO细胞结合的影响。
图8A和图8B显示了抗CD40抗体诱导的iDC活化试验，这通过ELISA测定的IL-12分泌量和通过FACS测定的CD83表达来展示。
图9显示了通过FACS测量的抗CD40抗体诱导Ramos细胞上的CD95表达。
图10A显示了施用抗CD40抗体后的Ramos细胞小鼠肿瘤模型最终肿瘤体积。
图10B显示了施用抗CD40抗体后的Ramos细胞小鼠肿瘤模型最终肿瘤重量。
图10C显示了施用抗CD40抗体后的Ramos细胞小鼠肿瘤模型肿瘤体积随时间的变化。图中NS表示无显著性差异；与PBS组比较，＊表示p＜0.05；＊＊表示p＜0.01，＊＊＊表示p＜0.001。
图10D显示了MC-38细胞肿瘤模型中施用抗CD40抗体后的最终肿瘤重量。
图11A显示了亲和力变体全长候选抗体在CHO-K细胞上的非特异性结合。
图11B显示了亲和力变体全长候选抗体在HEK293细胞上的非特异性结合。
图12A和图12B显示了亲和力变体全长候选抗体与在CHO细胞上稳定表达的人CD40的亲和力。
图12C和图12D显示了亲和力成熟全长候选抗体与在CHO细胞上稳定表达的小鼠CD40的亲和力。
图13A和图13B显示了在有交联剂情况下，通过FACS测量的C8分子及其亲和力变体全长候选抗体诱导Ramos细胞上的CD95表达。
图13C和图13D显示了在无交联剂情况下，通过FACS测量的C8分子及其亲和力变体全长候选抗体诱导Ramos细胞上的CD95表达。
图14A－图14D显示了在有交联剂情况下，C8分子及其亲和力变体全长候选抗体诱导NF-κB荧光素酶报告基因表达的能力。
图15A－图15D显示了在无交联剂情况下，C8分子及其亲和力变体全长候选抗体诱导NF-κB荧光素酶报告基因表达的能力。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“CD40表达细胞”是指表达CD40分子的任何细胞，包括但不限于抗原呈递细胞(APC)，包括树突细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞和单核细胞。CD40还表达在其它类型细胞上，例如上皮细胞、内皮细胞和血小板。也已经在多种肿瘤细胞上证实了CD40表达，包括B细胞淋巴瘤和肾癌细胞。在一个具体实施方案中，CD40表达细胞包括表达CD40的细胞系，例如Jurkat细胞、Raji细胞、Ramos细胞和Daudi细胞。在另一实施方案中，CD40表达细胞是肿瘤细胞或癌细胞。在另一实施方案中，CD40表达细胞包括被发现浸润肿瘤的B细胞、NK细胞、T细胞，也称为肿瘤浸润淋巴细胞。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞使用T细胞受体(TCR)识别该复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、B淋巴母细胞样细胞和衍生自单核细胞的树突细胞(DC)。
术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原并使其能够被T细胞识别的过程，例如，将抗原加工后作为MHC-I和/或MHC-II缀合物的组分。
“MHC分子”包括两种类型的分子，MHC I类和MHC II类。MHC I类分子将抗原呈递给特异性CD8+ T细胞，MHC II类分子将抗原呈递给特异性CD4+ T细胞。外源性递送至APC的抗原主要用于与MHC II类结合。相反地，内源性递送至APC的抗原主要用于与MHC I类结合。
术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞(包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞))介导的任何应答。T细胞介导的应答包括例如T细胞的细胞毒性和增殖。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。
“抗体片段”或“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体(重链抗体)；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的CD40结合的能力。例如，结合人CD40的本发明抗体也可以结合另一物种的CD40。通过在结合测定法(例如SPR、ELISA)中检测与纯化的CD40抗原的特异性反应性或与生理CD40表达细胞结合或以其它方式功能性相互作用来测量交叉反应性。确定交叉反应性的方法包括例如通过使用OctetTM QKe仪器的生物层干涉测定法(BLI)或使用BiacoreTM 2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析或流式细胞术技术。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。在一个给定的重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(http://imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的AbM编号位置而确定。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR根据AbM编号方案确定位置。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区和CDR中的残基位置(包括重链可变区残基)时，是指根据AbM编号系统的编号位置。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。
术语“共刺激分子”是指为T细胞或B细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子及其配体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28等。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括γ-干扰素。
“免疫缀合物”是与一个或多个其他物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。
诱导CDC或ADCC使用的术语“诱导”和“增加”是指刺激特定的直接细胞杀伤机制。例如，在一个实施方式中，本发明的抗CD40抗体通过激活CD40表达细胞引起的ADCC导致至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％的肿瘤细胞或者受病毒、细菌等感染的细胞裂解。
术语“激动”是指使所给出分子(例如，共刺激分子)的某些参数(例如，活性)升高。例如，这个术语包括使得所给出的分子(例如，CD40)被提高至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的活性的物质。因此，激动作用不必是100％。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应子功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。
“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
术语“Fc受体”是指这样的Fc受体，其与免疫球蛋白Fc区结合后，激发了刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
术语“有效量”指本发明的抗CD40抗体或缀合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
“治疗指数”(therapeutic index，TI)通常是指半数致死量(LD50)与半数有效量(ED50)的比值，为药物的安全性指标。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”是指哺乳动物中细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
术语“感染性疾病”是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或者原生动物例如寄生虫感染。
术语“慢性感染”是指这样的感染，其中传染原(例如，病原体如病毒、细菌、原生动物例如寄生虫、真菌或诸如此类)已经在感染的宿主中诱导了免疫应答，但尚未如在急性感染过程中一样被从宿主中清除或消除。慢性感染可以是持续性的、潜伏性的或缓慢的。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接被标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体进行的第一抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。
“分离的”抗CD40抗体是指已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗CD40抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。“分离的编码抗CD40抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗CD40抗体的链或其片段，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂、载体、赋形剂或稳定剂等。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物，包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂；抗代谢物；天然产物；抗生素；酶；杂类试剂；激素和拮抗剂；抗雌激素；抗雄激素；以及非类固醇抗雄激素等。化疗剂的例子参见WO2015/153513或WO2016/028672或WO2015/138920中所公开的那些。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包括免疫检查点分子抑制剂和共刺激性分子激活剂。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂例子参见WO2015/153513、WO2016/028672或WO2015/138920中所公开的那些。
术语“载体(vector)”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
II.本发明的抗CD40抗体
本发明提供了可以降低或避免传统CD40激动剂所导致的不良事件的新一代抗人CD40抗体。
本发明的抗CD40抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含三个互补决定区，分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述重链可变区包含三个互补决定区，分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
(a)LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)LCDR2包含选自SEQ ID NO:2、5、6、7中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:2、5、6、7中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(c)LCDR3包含选自SEQ ID NO:3、4中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:3、4中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体，
(d)HCDR1包含选自SEQ ID NO:8、12、14、20中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:8、12、14、20中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)HCDR2包含选自SEQ ID NO:9、21中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:9、21中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(f)HCDR3包含选自SEQ ID NO:10、11、13、15、16、17、18、19中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:10、11、13、15、16、17、18、19中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体，
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含：
含有如氨基酸序列RSSQGIRSSLA(SEQ ID NO:1)的LCDR1、含有如氨基酸序列GX1SSLX2X3(SEQ ID NO:56)的LCDR2和含有如氨基酸序列QQLX4SFPST(SEQ ID NO:57)的LCDR3，其中X1为A或者G；X2为E或者L；X3为G或者V；X4为N或者A；以及
含有如氨基酸序列GFTX5GSYEMX6(SEQ ID NO:58)的HCDR1、含有如氨基酸序列YISSX7GETTD(SEQ ID NO:59)的HCDR2和含有如氨基酸序列DVFFFX8X9SX10X11X12X13AYGMDV(SEQ ID NO:60)的HCDR3，其中X5为F、A或者P；X6为N或者D；X7为S或者A；X8为D或者S；X9为S或者P；X10为G或者R；X11为D、P、S或者F；X12为P、N或者R；X13为G或者H。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中：
(i)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:23、29、33、39、53中的任一氨基酸序列，所述重链可变区含有SEQ ID NO:25、31、35、37、41、43、45、47、49、51、55中的任一氨基酸序列；或者
(ii)所述轻链可变区含有与SEQ ID NO:23、29、33、39、53中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链可变区含有与SEQ ID NO:25、31、35、37、41、43、45、47、49、51、55中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体在其Fab片段的C端与免疫球蛋白Fc区连接，任选地，通过氨基酸接头连接，例如通过长度介于1与20个氨基酸之间的氨基酸接头连接。在一些实施方案中，所述氨基酸接头中有至少90％为甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc区来自IgG1。在一些实施方案中，所述Fc区来自人IgG1。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的氨基酸变化包括氨基酸的取代、添加或缺失。优选地，本文所述的氨基酸变化为氨基酸取代，更优选地保守取代。
在一些实施方案中，本发明所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。在一些实施方案中，取代为保守取代。保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文中所提供的抗CD40抗体经改变以增加或降低其糖基化的程度。对抗CD40抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。当抗CD40抗体包含Fc区时，也可以改变Fc区糖基化。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖修饰以提高抗体依赖的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体在其免疫球蛋白Fc区的CH2结构域中的糖基化位点被去除，例如，将人IgG Fc区的CH2结构域中的N297残基突变以去除该糖基化位点，例如，将N297残基变成Gly、Ala、Gln、Asp或Glu，优选地，将N297残基变成Gln。
本发明的抗CD40抗体能够以高亲和力结合CD40，例如，以约10-7M至约10-10M结合CD40，例如人CD40、食蟹猴CD40和小鼠CD40，如通过ForteBio动力学结合测定法所测量。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体以约0.5×10－8M至2×10－8M的亲和力结合人CD40抗原。本发明的抗CD40抗体与食蟹猴CD40和小鼠CD40具有交叉反应性。
本发明的抗CD40抗体增强针对抗原(例如，肿瘤相关抗原(TAA))的免疫应答，例如通过增强B细胞介导的免疫应答、B细胞活化和/或细胞因子产生来增强针对抗原(例如，肿瘤相关抗原(TAA))的免疫应答。
在一个实施方案中，本发明的抗CD40抗体能够增强对抗原的免疫应答，且诱导对CD40表达细胞(例如，表达CD40的肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。另外，如所测量的通过CD95的表达增加，本发明的抗CD40抗体诱导细胞凋亡。
在另一个实施方案中，本发明的抗CD40抗体能够增强对抗原的免疫应答，而不诱导CD40表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或CD40表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)，因此，本发明的抗CD40抗体对于不表达CD40的肿瘤细胞或对于感染性疾病也能够通过增强对抗原的免疫应答，例如，通过增强B细胞介导的免疫应答而发挥作用。
在一个实施方案中，本发明的抗CD40抗体经修饰以包含无效应子功能的恒定区。例如，当本发明的抗CD40抗体包含Fc区时，通过将Fc区中的糖基化位点N297残基突变成Gly、Ala、Gln、Asp或Glu等，可以减小或消除本发明抗CD40抗体的效应子功能。另外，当本发明的抗CD40抗体包含Fc区时，还可以在Fc区包含减少本发明的抗CD40抗体对FcγRIIIA(CD16A)的结合亲和力的修饰，用于减小或消除Fc区引起的效应子功能。在一个实施方案中，所述修饰在Fc区的CH2结构域中，例如在重链第329位置(EU编号)处(例如，P329G)。在一个实施方案中，本发明的抗CD40抗体包含在重链第234和235位置(EU编号)处的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是L234A和L235A(也称为“LALA突变”)。
在一个实施方案中，本发明的抗CD40抗体能够增强免疫应答而不依赖于抗体与Fc受体结合。例如，本发明的抗CD40抗体可以展现出有效的CD40激动特征而不与Fc受体例如FcγR交联。这些激动特征包括例如测量B细胞活性增加和/或B细胞激活增加而确定。
在另一实施方案中，本发明的抗CD40抗体增强CD40与CD40表达细胞上的CD40L(CD154)的结合。在具体实施方案中，本发明的抗CD40抗体增强可溶性CD40L与CD40表达细胞的结合至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。在具体实施方案中，例如通过FACS、生物层干涉测量法(BLI)或Biacore所测量，抗CD40抗体增强可溶性CD40L与CD40表达细胞的结合至少约50％。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体当与Ramos细胞一起温育时，诱导CD95的表达。在一些实施方案中，当本发明的抗CD40抗体与人B细胞一起温育时，增加B细胞增殖。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体当与树突细胞一起温育时，增加IL-12的分泌和CD83表达。
本发明的抗CD40抗体在施用给受试者后，预计不会导致剂量限制性毒性、细胞因子释放综合征(CRS)和与循环肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)浓度升高相关的肝毒性等不良反应或者不良反应较弱。
III.免疫缀合物
本发明还涉及与其他物质缀合的本发明抗CD40抗体(“免疫缀合物”)。在一些实施方案中，其它物质是例如治疗剂(如细胞毒性剂)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素；生长抑制剂；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。
适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子还参见例如WO2015/153513或WO2015/138920等。
本发明的抗CD40抗体也可以连接至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
IV.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗CD40抗体或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:23、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:23、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。
本发明还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸相比编码具有一个或多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的多肽序列的核酸：包含编码选自SEQ ID NO:23、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQ ID NO:23、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pcDNA3.3载体。
一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。
另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
在一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或293细胞。
V.本发明的抗CD40抗体的生产和纯化
在一个实施方案中，本发明提供了制备抗CD40抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗CD40抗体的核酸的条件下培养包含编码所述抗CD40抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述抗CD40抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗CD40抗体。
为了重组产生本发明的抗CD40抗体，首先分离编码本发明抗CD40抗体的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明抗CD40抗体的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。
如本文所述制备的本发明的抗CD40抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗CD40抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
VI.本发明的抗CD40抗体的活性测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗CD40抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗CD40抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CD40的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用SPR或生物膜层干涉测定本发明的抗CD40抗体对CD40的结合。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗CD40抗体的测定法。生物学活性可以包括例如对细胞表面CD40(例如人CD40、猴CD40、小鼠CD40)的结合、增强CD40/CD40L的结合、对抗原呈递细胞的激活、诱导表达CD40的肿瘤细胞表达CD95、增强B细胞介导的免疫应答等。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达CD40或经改造而表达CD40细胞系。所述经改造而表达CD40细胞系是正常情况下不表达CD40的、将编码CD40的DNA转染入细胞之后表达CD40的细胞系。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换抗CD40抗体来进行任何上述测定法。
VII.药物组合物和药物制剂
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗CD40抗体或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本发明的抗CD40抗体或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂，优选地抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)的组合。
在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症。在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗感染，例如慢性感染，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、原生动物感染等。
本发明还包括包含抗CD40抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和/或包含编码抗CD40抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗CD40抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗CD40抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗癌活性成分或抗感染活性成分，例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗CD40抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VIII.组合产品或试剂盒
在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。在一些实施方案中，其它抗体例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症等。
在一些方案中，所述组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合施用给受试者。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗CD40抗体、药物组合物、免疫缀合物或组合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗CD40抗体、药物组合物、免疫缀合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品还包括指导施用的包装插页。
IX.本发明的抗CD40抗体的用途
在一个方面，本发明涉及调节个体中免疫反应的方法。该方法包括向对象施用有效量的本文公开的抗CD40抗体或包含所述抗CD40抗体的药物组合物或免疫缀合物或组合产品，从而调节对象中的免疫反应。在一个实施方案中，本文公开的治疗有效量的抗CD40抗体或药物组合物或免疫缀合物或组合产品恢复、增强、刺激或增加对象中的免疫反应。
在一些实施方案中，本发明涉及在个体中提高CD40的活性、增强CD40与CD40L的结合、诱导IL-12等细胞因子分泌的方法，该方法包括向对象施用有效量的本文公开的抗CD40抗体或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。
在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的肿瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗CD40抗体或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。
在另一方面，本发明涉及在受试者中引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗CD40抗体或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的肿瘤或感染性疾病)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。备选地或组合下，受试者因感染而免疫受损或具有因感染而免疫受损的风险。
在一些实施方案中，本文所述的肿瘤，例如癌症，包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，多个器官系统的肉瘤和癌(括腺癌和鳞状细胞癌)，如侵袭肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道的(例如，结肠)、胰腺、生殖泌尿道(例如，肾、膀胱上皮细胞)、前列腺和咽的那些癌。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌中的非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，如在肺、食道、皮肤、头颈区域、口腔、肛门和子宫颈的那些癌。在一个实施方案中，癌症是黑色素瘤，例如，晚期黑色素瘤。在一个实施方案中，癌症是淋巴瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠腺癌、乳腺癌。前述癌的转移性病灶也可以使用本发明的方法和组合物治疗或预防。
用于治疗的优选癌症的非限制性例子包括淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌(例如，转移性乳腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，IV期或复发性非小细胞肺癌、NSCLC腺癌、或NSCLC鳞状细胞癌)、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、白血病(例如，慢性髓性白血病)、皮肤癌(例如，黑色素瘤(例如，III期或IV期黑色素瘤)或Merkel细胞癌)、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、脊髓发育不良综合征、膀胱癌(例如，移行细胞癌)、肾癌(例如，肾细胞癌，例如，透明细胞肾细胞癌，例如，晚期或转移性透明细胞肾细胞癌)和结肠癌。另外，难治性或复发性恶性肿瘤(例如，胰腺癌)可以使用本文所述的抗CD40抗体或包含其的药物组合物或免疫缀合物或组合产品治疗。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体通过结合B细胞或者抗原呈递细胞表面的CD40，从而产生级联效应，激活T细胞，从而治疗肿瘤。
在一些实施方案中，对于表面过表达CD40的肿瘤，本发明的抗CD40抗体通过ADCC、CTL和/或诱导肿瘤细胞凋亡而治疗肿瘤。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或包含其的免疫缀合物或组合物或组合产品会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本文所述的预防或治疗方法还包括向所述受试者或个体联合施用本文公开的抗CD40抗体或药物组合物或免疫缀合物或组合产品，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术(例如肿瘤切除术)；放射疗法(例如，外粒子束疗法，它涉及其中设计照射区域的三维适形放射疗法)、局部照射(例如，指向预选靶或器官的照射)或聚焦照射)等。聚焦照射可以选自立体定位放射手术、分割立体定位放射手术和强度调节型放射疗法。聚焦照射可以具有选自粒子束(质子)、钴-60(光子)和直线加速器(X射线)的辐射源，例如，如WO 2012/177624中描述。
放射疗法可以通过几种方法之一或方法组合施用，所述方法包括而不限于外粒子束疗法、内部放射疗法，植入物照射、立体定位放射手术、全身放射疗法、放疗法和永久或短暂间质近距放射疗法。
在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂(例如共刺激分子的激活剂或免疫检查点分子的抑制剂)。
示例性的其它抗体包括但不限于免疫检查点分子的抑制剂(例如，抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM-3、抗CEACAM或抗LAG-3)；刺激免疫细胞的抗体(例如，激动性GITR抗体或CD137抗体)等。优选地，其他抗体选自抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体。更优选地，所述抗PD-1抗体是百时美施贵宝(BMS)公司的纳武单抗(Nivolumab)、默克(Merck)公司的派姆单抗(Pembrolizumab)；所述抗PD-L1抗体是罗氏(Roche)研发的atezolizumab、德国默克(MerckKGaA)和美国辉瑞(Pfizer)合作开发的avelumab、阿斯利康研发的durvalumab。
在一些实施方案中，免疫调节剂是共刺激分子的激活剂或激动剂。在一个实施方案中，共刺激分子的激动剂选自以下分子的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段、或可溶性融合物)：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体。
本发明的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一制剂或分开的制剂中)和分开施用。在分开施用的情况中，可以在施用其他疗法之前、同时和/或之后实施本发明的抗CD40抗体或免疫缀合物等的施用。
在一个实施方案中，抗CD40抗体的施用和其他疗法(例如治疗方式或治疗剂)的施用彼此在约一个月内，或约一、两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。
本发明的抗CD40抗体(以及包含其的药物组合物或免疫缀合物)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括但不限于单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗CD40抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗CD40抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗CD40抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗CD40抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗CD40抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。可以由技术人员确定抗CD40抗体的剂量和治疗方案。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物或组合物或组合产品替换抗CD40抗体来进行上述的任何预防或治疗。
X.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗CD40抗体可以用于检测CD40在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法。在某些实施方案中，生物样品是血液、血清或生物来源的其他体液样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗CD40抗体。在另一个方面中，提供检测CD40在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测CD40蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，CD40是人CD40。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗CD40抗体在允许抗CD40抗体与CD40结合的条件下接触，并检测在抗CD40抗体和CD40之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在CD40。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗CD40抗体被用于选择适合利用抗CD40抗体治疗的受试者，例如其中CD40是用于选择所述受试者的生物标志物。
在一个实施方案中，可以使用本发明的抗CD40抗体诊断癌症或肿瘤，例如评价(例如，监测)对象中本文所述疾病(例如，过度增生性或癌性疾病)的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的抗CD40抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，萤光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用抗CD40抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测CD40。
在一些实施方案中，提供了一种治疗肿瘤或感染的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，包含癌细胞的受试者样品)检验CD40的存在，因而确定CD40值，将CD40值与对照值(例如健康个体的样品中的CD40的值)比较，并且如果CD40值小于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的抗CD40抗体(例如，本文所述的抗CD40抗体)，因而治疗肿瘤或感染。
能够理解的是，在本发明各部分中描述的各个实施方案，例如疾病、治疗剂、治疗方式和施用等同样适用于本发明的其他部分的实施方案，或可以与其他部分的实施方案组合。在本发明各部分中描述的适用于抗CD40抗体的性质、用途、和方法等实施方案，同样适用于包含抗CD40抗体的组合物、缀合物、组合产品和试剂盒等。
XI.本发明的示例性抗CD40抗体的序列
本发明的示例性抗CD40抗体的序列如下表所示。
表1本发明示例性抗体轻链可变结构域(VL)中的CDR序列(以AbM编号方式定义)
Figure BDA0003084934070000241
表2本发明示例性抗体重链可变结构域(VH)中的CDR序列(以AbM编号方式定义)
Figure BDA0003084934070000242
Figure BDA0003084934070000251
表3本发明示例性抗体的可变区核苷酸序列和氨基酸序列
Figure BDA0003084934070000252
Figure BDA0003084934070000261
Figure BDA0003084934070000271
Figure BDA0003084934070000281
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1：抗CD40抗体的制备
1.1.制备P17-Fc抗原
将人CD40的胞外结构域(CD40 ECD)(Uniprot：P25942的21-193位)基因片段融合至人IgG1 Fc片段的DNA序列N端，合成编码该CD40 ECD-Fc融合蛋白的核苷酸序列，并克隆入pcDNA3.3(Invitrogen)载体的多克隆位点，获得了表达CD40 ECD-Fc融合蛋白的表达载体，在本文中也称为P17-Fc融合蛋白表达载体。
将P17-Fc融合蛋白表达载体导入CHO-K细胞(Thermo Fisher)进行真核表达(详细制备步骤参考书籍《Therapeutic Fc-Fusion Proteins》(Steven M.Chamow等人，45-62页“Methods of Production for Fc-Fusion Proteins”相关内容)，得到P17-Fc融合蛋白。通过标准ELISA方法测定P17-Fc融合蛋白与抗CD40抗体达西珠单抗(Dacetuzumab)(参见EP1885399B1，以下可简称CD40-Dac)和Bleslumab(参见US20100234578，以下可简称CD40-Ble)的结合情况来验证制备的P17-Fc融合蛋白的免疫原性。如图1所示，P17-Fc融合蛋白表现出对达西珠单抗和Bleslumab的亲和力。
1.2.P17-Fc融合蛋白的生物素化
按照制造商的说明，使用EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit,Thermo Fisher,货号:21435)，将计算量的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素标记到至P17-Fc融合蛋白上。通过生物素定量试剂盒(ThermoFisher，28005)测量生物素标记的P17-Fc融合蛋白(文中也称为“P17-Fc-生物素”、“生物素化的P17-Fc融合蛋白”)的数量。
进一步地，使用与实施例1.1同样的方法，通过针对达西珠单抗和Bleslumab的ELISA测定法验证了生物素化的P17-Fc融合蛋白的构象。
如图2所示，与未经生物素化的P17-Fc融合蛋白对达西珠单抗和Bleslumab的结合相比较，生物素化的P17-Fc融合蛋白显示出与这两种抗CD40抗体的相似结合。
用类似的方法制备IL-23-Fc-生物素(IL-23序列来源为Uniprot：Q9NPF7)，用于后续的抗体库筛选中去除结合Fc的噬菌体。
用类似的方法制备P17-His蛋白(P17的序列同Uniprot：P25942的21-193位)，其C端具有6个组氨酸标签。
1.3.抗体库筛选
全人源抗体库的构建和筛选方法参见专利申请CN202010236256.8。使用实施例1.1的生物素化P17-Fc融合蛋白筛选全人源抗体噬菌体展示库，以获得特异性结合人CD40的展示在噬菌体上的抗CD40 Fab抗体片段。
具体筛选方法如下：采用磁珠法进行抗体库的筛选，在使用实施例1.1的生物素化P17-Fc融合蛋白对全人源抗体噬菌体展示库进行每一轮淘选之前，通过用实施例1.1的IL-23-Fc-生物素淘选该抗体库来去除结合Fc的噬菌体，然后再用生物素标记的P17-Fc融合蛋白筛选能特异性结合人CD40蛋白的噬菌体单克隆。经过洗涤去除非特异性吸附的噬菌体后，收集得到的噬菌体，采用大肠杆菌SS320细胞扩增后继续用于下一轮的淘选。
在每一轮淘选中，计算输入噬菌体(input phage)与输出噬菌体(output phage)的比值(ratio)，用作CD40特异性噬菌体富集的指标。
通过噬菌体库ELISA也证实了每个文库对CD40的富集，其中在三轮淘选后，结合CD40的噬菌体高度富集，如图3所示。
测试筛选到的噬菌体Fab与P17-Fc-生物素和IL23-Fc-生物素的结合。选择仅对P17-Fc-生物素显示特异性亲和力的噬菌体克隆，提取DNA并进行测序。
获得了1个含有独特Fab序列的噬菌体克隆C8，其编码核苷酸和氨基酸序列如下所示。编码C8 Fab轻链可变区(C8-WT-VL)的核苷酸序列
GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGACTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATTACTTGCCGGTCAAGTCAGGGCATTCGCAGTTCTTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAACCTCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCCTCCAGTTTGGAAGGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGCTCAATAGTTTCCCGTCCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:22)
编码C8 Fab的轻链可变区(C8-WT-VL)的氨基酸序列
DIQLTQSPSSLTASVGDRVTITCRSSQGIRSSLAWYQQKPGKPPKLLIYGASSLEGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSFPSTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:23)
编码C8 Fab的重链可变区(C8-WT-VH)的核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACGGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCGGTAGTTATGAAATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCCGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATATATAAGTAGCAGTGGTGAAACGACCGACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCGTCTCCAGAGACAACAGTAAGAATTTACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGACGTGTTTTTTTTTGATAGTAGTGGTGACAATGGGGCCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCATCA(SEQ ID NO:24)
编码C8 Fab的重链可变区(C8-WT-VH)的氨基酸序列
EVQLLESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFGSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGETTDYADSVKGRFTVSRDNSKNLLYLQLEGMNSLRAEDTAVYYCARDVFFFDSSGDNGAYGMDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:25)
将该噬菌体C8克隆的编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列分别连接入pcDNA3.3载体，并在CHO-K细胞(Thermo Fisher)中以Fab片段形式表达并纯化。通过ELISA法对Fab候选分子进行针对P17-Fc的亲和力检测，结果如图4所示。
由图4可见，C8克隆Fab结合CD40的EC50值约为0.4764μg/mL，阳性对照Bleslumab单抗结合CD40的EC50值约为0.04701μg/mL。
进一步地，为了测试抗CD40 Fab对细胞表面上表达的CD40的亲和力，制备了在细胞表面表达人CD40(Uniprot编号P25942)的CHO-K细胞；以及在细胞表面表达食蟹猴CD40(Uniprot编号G7PG38)的CHO-K细胞。具体而言，将人CD40(Uniprot编号P25942)编码序列克隆入pcDNA3.3(Invitrogen)载体的多克隆位点，获得了表达人CD40的表达载体；然后将该表达人CD40的表达载体导入CHO-K细胞(Thermo Fisher)进行真核表达，获得了在细胞表面表达人CD40的CHO-K细胞(下文中也称为“CHO-K-huCD40细胞”)。类似地，获得了在细胞表面表达食蟹猴CD40的CHO-K细胞(下文中也称为“CHO-K-cynoCD40细胞”)。
将CHO-K-huCD40细胞或CHO-K-cynoCD40细胞以1.0×105个细胞/孔接种到96孔板，并添加稀释的C8抗CD40 Fab候选分子。在4℃孵育30分钟后，洗涤细胞，并添加100μLAPC标记的山羊抗人IgG第二抗体(Jackson ImmunoResearch Inc，货号：109-136-097，别藻蓝蛋白标记的特异性结合F(ab’)2片段的山羊抗人IgG第二抗体F(ab’)2片段(Allophycocyanin(APC)AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG,F(ab’)2fragment specific))，在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术(BeckmanCoulter)检测C8抗CD40 Fab候选分子与细胞表面表达的CD40分子的结合。
图5A显示了不同浓度的C8克隆抗CD40 Fab分子与CHO-K-huCD40细胞表现出结合亲和力，且在3.2μg/mL－80μg/mL的C8 Fab浓度范围内，该结合亲和力呈现为C8 Fab浓度依赖性。
图5B显示了C8克隆抗CD40 Fab分子与CHO-K-cynoCD40细胞也表现出结合亲和力，所使用的C8 Fab浓度为80μg/mL。由此可见，该C8克隆Fab分子对食蟹猴CD40具有交叉反应性。
1.4.全长抗体的表达、纯化和浓度测定
将实施例1.3的C8克隆Fab候选分子进行全长抗体构建，其中将人IgG1 Fc的序列连接至该Fab分子重链序列的C端。
具体而言，分别将获得的编码抗体重链可变区的核苷酸序列和编码抗体轻链可变区的核苷酸序列构建至经过改造的含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒pcDNA3.3(Invitrogen)上，按照制造商的说明，使用ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)在CHO-K细胞中共表达抗体的全长重链和轻链，然后通过蛋白A亲和层析进行纯化，获得C8克隆抗CD40全长抗体。
对纯化的全长抗体通过A280吸收值进行浓度测定及SDS-PAGE、差示扫描荧光法(DSF)和尺寸排阻层析(SEC)验证全长抗体的质量。经质检合格后，分装并保存于－80℃。具体方法参见专利申请号CN 202010236256.8中所述。
编码C8全长抗体的轻链(C8-WT-LC)氨基酸序列
DIQLTQSPSSLTASVGDRVTITCRSSQGIRSSLAWYQQKPGKPPKLLIYGASSLEGGVPSRFSGSGSGTDFTLTI
SSLQPEDFATYYCQQLNSFPSTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:26)
编码C8全长抗体的重链(C8-WT-HC)的氨基酸序列
EVQLLESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFGSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGETTDYADSVKGRFTVSRDNSKNLLYLQLEGMNSLRAEDTAVYYCARDVFFFDSSGDNGAYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:27)
实施例2：抗CD40抗体的基于细胞的功能测定
2.1.候选抗CD40全长抗体的CD40结合特性和种属交叉反应性
为了证实本发明实施例1.4制备的全长抗CD40抗体对CD40的结合活性和交叉反应性，将CHO-K-huCD40细胞或CHO-K-cynoCD40细胞以1.0×105个细胞/孔接种96孔板。将100μL稀释的实施例1.4制备的抗CD40候选抗体添加至96孔板。在4℃孵育30分钟后，洗涤细胞，并添加100μL APC标记的抗人IgG第二抗体(别藻蓝蛋白标记的特异性结合Fcγ片段的山羊抗人IgG第二抗体(Allophycocyanin(APC)AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific)，Jackson ImmunoResearch Inc，货号：109-135-098)，再在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术检测全长抗CD40抗体与细胞上表达的CD40分子的结合。结果如图6A和图6B所示。
由图6A和图6B可见，在对C8克隆Fab片段进行全长抗体构建后，C8克隆抗CD40全长抗体仍保留了C8克隆Fab片段对人CD40的亲和力和对食蟹猴CD40的交叉反应性。
与实施例1.3类似地，制备了表达全长小鼠CD40(Uniprot编号P27512)的CHO-K细胞(下文中也称为“CHO-K-mouseCD40细胞”)。使用CHO-K-mouseCD40细胞，测试了实施例1.4制备的候选C8全长抗CD40抗体与小鼠CD40的交叉反应性。将CHO-K-mouseCD40细胞以1.0×105个细胞/孔接种至96孔板。将100μL稀释的抗CD40候选抗体和两种对照抗体(达西珠单抗、APX005)分别添加到96孔板中。在4℃孵育30分钟后，洗涤细胞，并添加FITC标记的抗人IgG Fcγ第二抗体(能与Fcγ片段进行特异性反应的亲和纯化F(ab’)2片段化山羊抗人IgG二抗(AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific)，Jackson Immunoresearch，货号：109-006-098)，在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行测试。结果如图6C所示。
由图6C可见，C8克隆全长抗体分子显示出与小鼠CD40的显著结合活性，而对照抗体达西珠单抗和APX005均没有针对小鼠CD40的交叉反应活性。
2.2.候选抗CD40抗体对CD40与CD40L结合的影响
为了测试实施例1.4制备的全长抗CD40抗体对CD40与CD40L结合的影响，将表达人CD40的CHO-K细胞(即，CHO-K-huCD40细胞)以1.0×105细胞/孔接种96孔板，并将100μL稀释的抗CD40全长抗体或同种型对照(即，纯化的人IgG1同种型对照重组抗体(Biolegend,货号403502))添加到96孔板中。在4℃孵育30分钟后，洗涤细胞。
将CD40L(ACRO Biosystems，货号CDL-H5248)按照实施例1所述方式进行生物素化，生物素化的CD40L蛋白稀释至200ng/mL，并将100μL稀释的生物素化的CD40L(本文中也称为：CD40L-生物素)添加至96孔板。在4℃下孵育30分钟后，将细胞洗涤，然后添加100μLPE标记的链亲和素(eBioscience货号12-4317-87)，4℃下再孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行测试。
如图7所示，候选抗体C8克隆在浓度为0.01－20μg/mL时显示出增强CD40与CD40L结合的活性，为具有成为CD40激动型潜力的抗CD40抗体。对照抗体Bleslumab单抗显著地抑制CD40与CD40L的结合，达西珠单抗在较低浓度下不影响CD40与CD40L的结合，在较高浓度下抑制CD40与CD40L的结合。
2.3.候选抗CD40抗体介导的未成熟树突状细胞激活的测定
未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,iDC)经过抗CD40抗体激活后会转化为成熟DC细胞，在本实施例中通过测试成熟DC细胞分泌的IL-12细胞因子、CD83标志物的表达等来评价候选抗体介导的iDC激活活性。
通过添加有1000U/mL rhGM-CSF(PeproTech货号：300-03-50)和500U/mL rhIL-4(PeproTech货号：200-04-50)并补充有10％FCS的RPMI 1640培养基将从人外周血液制备的单核细胞发育为iDC细胞，然后以5.0×104个iDC细胞/孔接种6孔板。将候选抗CD40全长抗体和各对照抗体、CD40L(ACRO Biosystems，货号CDL-H5248)的稀释液添加至iDC细胞并培养三天，收集培养液和细胞。
通过ELISA或流式细胞术对收集的培养液测定IL-12分泌、对收集的细胞测定CD83标志物的表达。
如图8A和图8B所示，C8克隆全长抗体显示出显著且剂量依赖性的iDC激活活性。在此方面，类似于达西珠单抗，C8克隆全长抗体是一个CD40弱激动剂。作为对照的CD40L导致大量的IL-12分泌。
2.4.候选抗CD40抗体介导的Ramos细胞中的CD95诱导
Ramos细胞是一种细胞表面天然表达有CD40分子的人淋巴瘤细胞。为了测试抗CD40抗体是否与Ramos细胞上的CD40结合并激活CD40的下游信号传导通路，将Ramos细胞(ATCC No.：CRL-1596)以1.0×105个细胞/孔铺入含有补充了10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(下文中也称为“完全RPMI 1640培养基”)的微量滴定板孔中。将稀释的抗CD40抗体或将CD40L(首孔10μg/mL，2倍梯度稀释，4个浓度点，详细浓度见图9所示)加入Ramos细胞中，并在37℃温育过夜。然后通过流式细胞术测定Ramos细胞表面诱导的CD95表达。
如图9所示，与作为阴性对照的hIgG1比较，C8克隆全长抗体显示出剂量依赖的CD95诱导活性，且显示出具有弱激动活性。
实施例3：抗CD40抗体的体内药效试验
3.1.抗CD40激动型抗体在Ramos细胞的小鼠CDX模型中抑制肿瘤生长
肿瘤细胞系异种移植(CDX，cell derived xenograft)模型是一种将肿瘤细胞系移植到裸鼠或者NSG小鼠体内而构建的肿瘤模型。在本实施例中，通过将Ramos细胞移植到小鼠皮下构建了小鼠CDX模型，并测试了候选抗CD40抗体在该小鼠CDX模型中的抗肿瘤功效。
六周龄的雌性裸鼠(维通利华Balb/c Nude)在第0天(以接种肿瘤细胞那天为起始，定义为0天，第二天定义为1天)皮下注射500万个人淋巴瘤Ramos细胞。当平均肿瘤体积达到250mm3时，每组动物8只，通过腹膜内注射施予所有小鼠0.2mg/kg，1mg/kg或5mg/kg(下文中，mg/kg也缩写为mpk)C8抗CD40全长抗体。一周三次给药(TIW)，持续两周。在每次注射之前测量肿瘤体积，并在第一次给药后两周测量肿瘤重量。最终的肿瘤体积和肿瘤重量分别示于图10A和图10B，肿瘤体积的变化示于图10C。
与对照抗体APX005M(本文中也称为APX或者APX005)(参见US20170246297，Apexigen公司)相比，C8抗CD40全长抗体表现出相似的抗肿瘤功效。
各组抗体的TGI(肿瘤生长抑制率)如表4所示。
表4:APX005和C8抗CD40全长抗体的TGI
Figure BDA0003084934070000331
3.2.抗CD40激动型抗体在MC-38细胞的小鼠模型中抑制肿瘤生长
MC38是高表达小鼠p53蛋白(mp53)的鼠结肠腺癌细胞系，其不表达CD40分子。
在MC-38细胞的小鼠皮下移植模型中测试了候选抗CD40抗体的抗肿瘤功效。
六周龄的雌性小鼠(维通利华C57BL/6)腋窝皮下注射了100万个小鼠结肠腺癌细胞(MC-38细胞)(国家实验细胞资源共享平台，货号3111C0001CCC000523)。当平均肿瘤体积达到80-100mm3时，(每组8只)通过腹膜内注射施予小鼠1.5mg/kg，5mg/kg或15mg/kg(“mg/kg”下文中也缩写为“mpk”)C8抗CD40抗体。一周三次给药(TIW)，持续三周。在每次注射之前测量肿瘤体积，并在第一次给药后三周测量肿瘤重量。最终的肿瘤重量示于图10D。
由图10D可见，与阴性对照PBS相比，抗CD40激动型抗体C8分子表现出梯度浓度的抗肿瘤功效。
实施例4.C8克隆抗CD40抗体的亲和力变体
为了获得C8克隆的全长抗体对CD40抗原亲和力的改变，本实施例对C8克隆的全长抗体进行了进一步的亲和力变体设计和功能测定。
4.1.亲和力变体噬菌体展示文库的构建
首先，对实施例1.3获得的C8-WT-VL和C8-WT-VH采用AbM编号方式定义CDR和框架区，然后设计一系列引物分别对其CDR进行单点或者连续三点突变，以进行亲和力变体噬菌体展示文库的构建。
4.2亲和力变体噬菌体展示文库的筛选
亲和力变体噬菌体展示文库的筛选采用的是免疫管筛选(即固相筛选)，使用抗原蛋白P17-His(使用实施例1中的类似方法制备)包被免疫管，通过将结合抗原的免疫管和亲和力变体噬菌体展示文库进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-3轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆抗体可以大量富集。对该噬菌体展示文库筛选C8亲和力变体的具体实施方法参见专利申请号202010236256.8中的免疫管筛选方法。
经对亲和力变体噬菌体展示文库筛选C8亲和力变体后，在ELISA水平获得诸多能够高特异性结合P17-His抗原的候选抗体。根据Fab分子的结合亲和力，从中选择了前11个结合亲和力最大的候选分子进行全长抗体构建，其中将人IgG1 Fc silent(N297Q突变)的序列(即，huIgG1(N297Q))连接至Fab分子的重链序列，以获得轻链均为κ型的全人IgG1(N297Q)抗体。
4.3.亲和力变体候选克隆的全长抗体制备
具体方法参照实施例1.4的“全长抗体的表达、纯化和浓度测定”。获得了C8-1抗体、C8-2抗体、C8-3抗体、C8-4抗体、C8-5抗体、C8-6抗体、C8-7抗体、C8-8抗体、C8-9抗体、C8-10抗体、C8-11抗体。C8亲本抗体和各变体抗体的可变区核苷酸和氨基酸序列如表3所示。
4.4.亲和力变体候选抗体非特异性结合测定
初步检测了所获得的亲和力变体候选抗体对不同细胞的非特异性结合与使用的抗体浓度之间的关系。HEK293细胞和CHO-K细胞均是不在细胞表面天然表达CD40分子的细胞，因此，特异性结合CD40的抗体将不会特异性地结合HEK293细胞和CHO-K细胞。本实验所采用的阳性对照为专利CN202010825379.5中描述的F4AM4抗体，F4AM4抗体为全人源抗体，其抗体轻重链序列分别如表5中F4AM4-LC和F4AM4-HC所示。
在实验中，将HEK293(ATCC:CRL-3216)和CHO-K(ATCC:CCL-61)细胞分别以1.0×105个细胞/孔接种96孔板。将100μL梯度稀释的实施例4.3制备的抗CD40候选抗体添加至96孔板。在4℃孵育60分钟后，用FACS缓冲液(PBS+5％FBS+2％BSA)洗涤细胞5次，并添加100μLPE标记的抗人IgG-Fc第二抗体(Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(PE),pre-adsorbed，Abcam，货号:ab98596)，再在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行测试。
如图11A和11B所示，较高浓度的C8-8克隆在HEK293及CHO-K细胞上均显示有非特异性结合；C8-6在高浓度(100μg/mL)与HEK293上有一定非特异性结合，其他候选克隆及IgG1均与这两个细胞株没有非特异性结合。因此，在后续实验中，使用没有非特异性结合的候选分子进行下一步的试验。
表5阳性对照抗体轻重链序列
Figure BDA0003084934070000351
4.5.亲和力变体候选抗体的基于细胞的功能测定
4.5.1.亲和力变体候选抗体的CD40结合和交叉反应性
为了证实实施例4.3的亲和力变体抗体的结合活性和交叉反应性，将人工构建的表达全长人CD40的CHO-K细胞(CHO-K-huCD40细胞)以1.0×105个细胞/孔接种96孔板。将100μL稀释的实施例4.3制备的抗CD40候选抗体添加至96孔板。在4℃孵育30分钟后，用FACS缓冲液(PBS+5％FBS+2％BSA)洗涤细胞5次，并添加100μL APC标记的抗人IgG第二抗体，再在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行测试。
如图12A和图12B所示，在对亲和力变体Fab进行全长抗体构建后，所有候选抗体均显示出了对人CD40的亲和力，且与对照抗体APX005相当(由于APX005在临床II期结果上显示出对胰腺癌比较好的疗效，所以在C8抗体亲和力变体的相关实验中，将对照抗体设定为APX005；APX005序列来源为Apexigen Inc.US20120301488，由三优生物制备)。
使用人工构建的表达全长小鼠CD40(Uniprot#P27512)的CHO-K细胞(CHO-K-mouseCD40细胞)，测试了实施例4.3制备的亲和力变体候选抗体与小鼠CD40的交叉反应性。将表达小鼠CD40的CHO-K细胞以1.0×105个细胞/孔接种至96孔板。将100μL稀释的亲和力变体候选抗体和对照抗体(APX005)分别添加到96孔板中。在4℃孵育30分钟后，洗涤细胞，并添加FITC标记的抗人IgGFcγ(能与Fcγ片段进行特异性反应的，亲和纯化F(ab’)2片段化山羊抗人IgG二抗(AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG,Fcγfragmentspecific)，Jackson Immunoresearch，货号：109-006-098)，在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术进行测试。
如图12C和图12D所示，C8-6显示比母本C8-WT有更好的小鼠CD40抗原结合活性。C8-1、C8-2、C8-7、C8-8、C8-9、C8-10、C8-11均显示出与小鼠CD40抗原的结合活性。
4.5.2.亲和力变体候选抗体介导的Ramos细胞中的CD95诱导(有交联剂，即存在Crosslinking效应)
为了测试亲和力变体候选抗体在有交联剂的情况下是否与Ramos细胞上的CD40结合并激活CD40的下游信号传导通路，将Ramos细胞(ATCC No.：CRL-1596)以1.0×105个细胞/孔铺入完全RPMI 1640培养基中。将稀释的亲和力变体候选抗体、对照抗体APX005及CD40L(首孔20μg/mL，3倍梯度稀释，8个浓度点)加入Ramos细胞中，同时加入交联剂(能与Fcγ片段进行特异性反应的，亲和纯化F(ab’)2片段化山羊抗人IgG二抗(AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific)，Jackson Immunoresearch，货号：109-006-098)，交联剂浓度20μg/mL，并在37℃温育过夜。然后通过流式细胞术测定CD95表达。
如图13A和图13B所示，所有亲和力变体抗体均显示与APX005相当的CD95诱导活性，无显著性差异。
4.5.3.亲和力变体候选抗体介导的Ramos细胞中的CD95诱导(无交联剂，即不存在Crosslinking效应)
为了测试亲和力变体候选抗体在无交联剂的情况下是否与Ramos细胞上的CD40结合并激活CD40的下游信号传导通路，将Ramos细胞(ATCC No.：CRL-1596)以1.0×105个细胞/孔铺入完全RPMI 1640培养基中。将稀释的亲和力变体候选抗体、对照抗体APX005及CD40L(首孔20μg/mL，3倍梯度稀释，8个浓度点)加入Ramos细胞中，并在37℃温育过夜。然后通过流式细胞术测定CD95表达。
如图13C和图13D所示，所有亲和力变体抗体均显示比APX005及CD40L更弱的CD95诱导活性，其中C8-2、C8-6、C8-9、C8-10、C8-11更是显示出比APX005弱10倍左右的CD95诱导活性。这表明在没有交联剂的情况下本发明的候选分子与APX005相比，显示出显著较低的CD40分子激活能力，能够预期在弱激动CD40分子的同时，具有比APX005相比显著更小的毒副作用。目前进行临床试验的抗CD40激动型抗体的主要不良事件为肝毒性，这是由于肝脏细胞表面大量表达FcR受体，而临床试验所用的激动型抗体(例如APX005)往往带有正常Fc功能，能够和肝细胞表面的FcR受体形成交联效应(Crosslinking效应)进而在肝细胞表面非特异性激活表达CD40的免疫细胞，导致肝毒性，其治疗指数较低。通过分析交联效应产生的机制可以发现，引起肝毒性的交联效应是由于Fc受体的结合产生的，而如果能够控制Fc受体产生的交联效应而显著增强在病灶位置的激活效应即可以控制肝毒性并提高治疗指数，这对抗体药物分子在有无交联效应下的激动活性差别提出了很高的要求。
为了实现杀伤药效和毒性的比值最大化，本发明希望通过Crosslinking效应存在与否时扩大激动效应的最大差别程度来提高治疗指数，即在形成交联效应时显著产生免疫激活反应，在没有交联效应时不产生或仅产生微弱的免疫激活效应。从本实施例中可以看出，相对于APX005分子，其在有无交联剂时的免疫细胞激动活性差别较小，也就是最终成药后药效和毒性的比值较小，而本发明的候选抗体能够在有无交联剂时，实现药效和毒性的比值最大化，最大限度的实现在肿瘤微环境内激活免疫细胞的杀伤作用，而避免了在非肿瘤位置的非特异性激活免疫细胞导致的肝毒性等毒副作用。如果利用本发明的候选抗体构建双抗即可利用这个特点实现在病灶位置特异性高强度激活免疫细胞，而在不能形成交联效应的肝细胞等位置实现低激动活性，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞而不引起肝毒性等不良事件的目的，有效提高治疗指数并提高安全性。
4.5.4.Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因稳转细胞株制备
首先将载体pGL4.32[Luc2p/NF-κB-RE/Hygro]质粒(Promega，货号E8491)通过电转仪(Invitrogen，NeonTM Transfection System，MP922947)电转化至Jurkat细胞(
Figure BDA0003084934070000361
TIB-152TM)中。电转化后，将所得到的细胞分别转移至含有体积百分比为10％FBS(Gibco，15140-141)且不含抗生素的RPMI 1640培养基(Hyclone，SH30243.01)中，然后将细胞接种入6孔板细胞培养皿中培养48小时，接着以平均1500个细胞/孔的密度将细胞分装至96孔细胞培养板中，加入终浓度为500μg/mL的潮霉素B(源培，S160J7)进行筛选，2-3周左右观察细胞株克隆生长情况，并挑取形成克隆的细胞株转移至24孔板中，待细胞培养扩大后，取部分克隆转移至96孔白底板中(Corning，3610)，进行佛波酯(使用浓度10ng/ml)和离子霉素(使用浓度1nM)刺激，37摄氏度，5％CO2培养箱中培养6h后加入:Bright-Lite底物(Vazyme,DD1204-03)，在酶标仪(Molecular Devices：Spectramax i3x)读取信号值后评价不同克隆NF-κB的表达水平从获得高表达NF-κB基因的Jurkat细胞系。对于NF-κB的表达水平较高的Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因稳转细胞克隆进行冻存备用。
4.5.5.Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株构建
在本实施例中，构建的Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株，用于筛选能够激活CD40下游信号活性的候选抗体分子。采用了实施例4.5.4制备的Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因稳转细胞株，在此基础上稳转CD40的全长表达基因序列(Uniprot Gene ID:P25942)，筛选单克隆细胞株。在此细胞株培养体系中加入CD40L重组蛋白，通过结合CD40激活胞内NF-κB荧光素酶报告基因转录和表达，并加入荧光素酶的催化底物产生荧光信号。Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株制备过程如下：
表达人CD40(Met1-Gln277)全长的质粒的构建：通过基因合成技术合成含有人源CD40蛋白的DNA片段，并将其克隆至pLVX-Puro表达载体(Clontech,632164)。通过化转的方法导入大肠杆菌。挑取大肠杆菌单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提并再次测序确认。电转：使用Gibco的RPMI 1640无血清培养基(货号：11875085)培养实施例4.5.4制备的Jurkat细胞。电转前一天，将细胞传代至2×105/mL，次日使用Invitrogen的电转试剂盒(货号：MPK10096)和电转仪(货号：MP922947)将构建好的质粒转入Jurkat NF-κB荧光素酶报告基因稳转细胞株细胞中。将电转后的细胞移至RPMI 1640培养基中，放置于37℃细胞培养箱中培养48h。电转后细胞铺板：将电转后的Jurkat细胞按1000个细胞/孔铺到96孔板中，加入终浓度2μg/mL的嘌呤霉素，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养，14天后补充加入有2μg/mL的嘌呤霉素的RPMI1640培养基。克隆挑选、细胞扩大培养和FACS鉴定：挑取96孔板中长出的单细胞克隆，转移至24孔培养板中继续扩大培养，之后通过FACS鉴定人CD40稳转成功的细胞株。
4.5.6.亲和力变体的候选抗体激活CD40下游NF-κB荧光素酶报告基因信号活性(有交联剂，即存在Crosslinking效应)
本实施例中，为了测试亲和力变体候选抗体在有交联剂的情况下是否具有激活CD40信号通路功能，采用实施例4.5.5制备的Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株作为材料，检测候选分子结合CD40从而激活下游NF-κB荧光素酶报告基因表达的能力。具体实施方式如下：
使用RPMI 1640培养基梯度稀释母本C8分子及亲和力变体候选抗体、对照抗体APX005(首孔10μg/mL，3倍梯度稀释，8个浓度点)，加入10μg/mL的交联剂(能与Fcγ片段进行特异性反应的，亲和纯化F(ab’)2片段化山羊抗人IgG二抗(AffiniPure F(ab’)2FragmentGoat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific)，Jackson Immunoresearch，货号：109-006-098)进行预混，将抗体及交联剂的预混液每孔50μL加入到96孔板中；将Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株复苏，将传代2-4次且生长状态良好的细胞用于实验，将细胞用RPMI 1640培养基洗涤重悬，计数后将细胞密度调整为2×106个细胞/mL，以每孔50μL加至有抗体及交联剂的预混液的96孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中孵育6h。培养结束后，每孔加入30μL荧光素酶底物Bright-Lite(Vazyme,DD1204-03)，震荡5min后检测96孔板荧光值。
如图14A、图14B、图14C和图14D所示，在有交联剂的情况下，母本C8分子及所有亲和力变体抗体均显示与APX005相当的激活CD40下游NF-κB荧光素酶报告基因信号活性，无显著性差异。
4.5.7.亲和力变体的候选抗体激活CD40下游NF-κB荧光素酶报告基因信号活性(无交联剂，即不存在Crosslinking效应)
本实施例中，为了测试亲和力变体候选抗体在无交联剂的情况下是否具有激活CD40信号通路功能，采用Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株作为材料，检测候选分子结合CD40从而激活下游NF-κB荧光素酶报告基因表达的能力。具体实施方式如下：
使用RPMI 1640培养基梯度稀释母本C8分子及各亲和力变体候选抗体、对照抗体APX005(首孔10μg/mL，3倍梯度稀释，8个浓度点)，将稀释好的候选抗体及对照抗体每孔50μL加入到96孔板中；将Jurkat CD40/NF-κB荧光素酶报告基因细胞株复苏，将传代2-4次且生长状态良好的细胞用于实验，将细胞用RPMI 1640培养基洗涤重悬，计数后将细胞密度调整为2×106个细胞/mL，以每孔50μL加至有抗体的96孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中孵育6h。培养结束后，每孔加入30μL荧光素酶底物Bright-Lite(Vazyme,DD1204-03)，震荡5min后检测96孔板荧光值。
如图15A、图15B、图15C和图15D所示，在无交联剂的情况下，APX005显示出比较强的的激活CD40下游NF-κB荧光素酶报告基因信号活性，而亲和力突变体候选抗体除C8-7和C8-9有一定激活能力外，其他候选抗体均无激活能力，能够预期这些分子在弱激动CD40分子的同时，具有比APX005相比显著更小的毒副作用。从图14A－图14D和图15A－图15D中各候选分子对CD40信号通路激活情况对照来看，在有无Crosslinking效应的情况下，母本C8分子及各亲和力变体候选分子在激活CD40信号通路的情况基本和图13A－图13D中B细胞激活的情况一致，这也从分子机制上验证了B细胞(Ramos细胞)激活试验结果。从试验结果可以看出本发明中抗CD40抗体引起的B细胞激活是通过激活CD40信号通路形成的。
4.6.亲和力变体的候选抗体亲和动力学检测
在本实施例中，采用Fortebio Octet RED96仪器，检测了C8亲本抗体(C8-WT)和亲和力变体抗体与人CD40抗原(P17-His)的亲和力。
材料准备：称取1g的BSA，量取500μL的Tween 20，加入到1000mL的1×PBS，混匀。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M pH 2.0的甘氨酸溶液加入0.9mL的超纯水，混匀。抗体以KB缓冲液稀释成10μg/mL，抗原以KB缓冲液稀释成系列浓度梯度，依次为40nM、20nM、10nM、5nM、0nM。
实验流程：避光预湿传感器(Protein A sensor)至少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。其中，样品板1的第1、10和12列加入200μL/孔的KB缓冲液，第11列加入0.01M pH2.0的甘氨酸溶液，第2-8列加入制备好的样品溶液(一个样品加5个孔)，第九列按照浓度从高到低依次加入P17-His。数据结果详见表6。
表6 C8亲本抗体(C8-WT)和亲和力变体抗体的亲和力检测结果
抗体名称 KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s) R<sup>2</sup>
APX005 6.30E-09 1.98E+06 1.24E-02 0.973
C8-WT 1.93E-08 8.53E+05 1.64E-02 0.974
C8-1 1.27E-08 1.16E+06 1.48E-02 0.969
C8-2 1.19E-08 9.32E+05 1.11E-02 0.968
C8-3 4.51E-09 2.46E+06 1.11E-02 0.972
C8-4 5.34E-09 1.36E+06 7.25E-03 0.969
C8-5 8.23E-09 9.94E+05 8.18E-03 0.982
C8-6 9.04E-09 1.09E+06 9.84E-03 0.99
C8-7 1.24E-08 8.95E+05 1.11E-02 0.99
C8-8 1.03E-08 1.07E+06 1.10E-02 0.982
C8-9 9.27E-09 1.21E+06 1.12E-02 0.987
C8-10 6.82E-09 1.24E+06 8.47E-03 0.984
C8-11 9.24E-09 1.60E+06 1.48E-02 0.976
由表6可见，C8亲本抗体(C8-WT)和亲和力变体抗体以约0.5×10－8M至2×10－8M的亲和力结合人CD40抗原，其中所有亲和力变体抗体的亲和力较C8亲本抗体(C8-WT)的亲和力改善，为亲和力成熟抗体。

Claims (19)

1.抗CD40抗体或抗原结合片段，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含三个互补决定区，分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述重链可变区包含三个互补决定区，分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
(a)LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)LCDR2包含选自SEQ ID NO:2、5、6、7中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:2、5、6、7中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(c)LCDR3包含选自SEQ ID NO:3、4中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:3、4中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体，
(d)HCDR1包含选自SEQ ID NO:8、12、14、20中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:8、12、14、20中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)HCDR2包含选自SEQ ID NO:9、21中的任一氨基酸序列、或SEQ ID NO:9、21中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体；
(f)HCDR3包含选自SEQ ID NO:10、11、13、15、16、17、18、19中的任一氨基酸序列、或SEQID NO:10、11、13、15、16、17、18、19中的任一氨基酸序列的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的变体，
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。
2.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，包含
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:12的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:15的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:16的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:17的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:18的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:19的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3；或
(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:20的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:21的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的HCDR2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的不超过2个或不超过1个氨基酸变化的LCDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，包含：
含有如氨基酸序列RSSQGIRSSLA(SEQ ID NO:1)的LCDR1、含有如氨基酸序列GX1SSLX2X3(SEQ ID NO:56)的LCDR2和含有如氨基酸序列QQLX4SFPST(SEQ ID NO:57)的LCDR3，其中X1为A或者G；X2为E或者L；X3为G或者V；X4为N或者A；以及
含有如氨基酸序列GFTX5GSYEMX6(SEQ ID NO:58)的HCDR1、含有如氨基酸序列YISSX7GETTD(SEQ ID NO:59)的HCDR2和含有如氨基酸序列
DVFFFX8X9SX10X11X12X13AYGMDV(SEQ ID NO:60)的HCDR3，其中X5为F、A或者P；X6为N或者D；X7为S或者A；X8为D或者S；X9为S或者P；X10为G或者R；X11为D、P、S或者F；X12为P、N或者R；X13为G或者H；
例如，所述抗CD40抗体或抗原结合片段包含：
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:4的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:11的LCDR3；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:5的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:13的LCDR3；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:6的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:15的LCDR3；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:16的LCDR3；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:17的LCDR3；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:18的LCDR3；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:2的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HCDR1、氨基酸序列SEQ IDNO:9的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:19的LCDR3；或
(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的LCDR1、氨基酸序列SEQ ID NO:7的LCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:3的LCDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的HCDR1、氨基酸序列SEQID NO:21的HCDR2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的LCDR3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，包含轻链可变区和重链可变区，其中：
(i)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:23、29、33、39、53中的任一氨基酸序列，所述重链可变区含有SEQ ID NO:25、31、35、37、41、43、45、47、49、51、55中的任一氨基酸序列；或者
(ii)所述轻链可变区含有与SEQ ID NO:23、29、33、39、53中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述重链可变区含有与SEQ ID NO:25、31、35、37、41、43、45、47、49、51、55中的任一氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
例如，所述抗CD40抗体或抗原结合片段包含：
(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:25的重链可变区；
(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:25的重链可变区；
(iii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:31的重链可变区；
(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链可变区；
(v)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:37的重链可变区；
(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:41的重链可变区；
(vii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:43的重链可变区；
(viii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链可变区；
(ix)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:47的重链可变区；
(x)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:49的重链可变区；
(xi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:51的重链可变区；或
(xii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的轻链可变区和氨基酸序列SEQ ID NO:55的重链可变区，
优选地，所述抗CD40抗体或抗原结合片段为完全人抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是人IgG1或人IgG4抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，其具有以下一个或多个特性：
(1)以高亲和力结合并活化CD40，例如，以约10-7M至约10-10M Kd结合CD40，例如人CD40、食蟹猴CD40和小鼠CD40，如通过ForteBio动力学结合测定法所测量；
(2)增强CD40与CD40L的结合；
(3)通过结合抗原呈递细胞上表达的CD40，激活抗原呈递细胞，例如，所述抗原呈递细胞包括树突细胞(DC)、B细胞、单核细胞、巨噬细胞；
(4)诱导表达CD40的B细胞表达CD95；
(5)增强B细胞介导的免疫应答；
(5)在形成交联效应时显著增强B细胞介导的免疫应答；
(6)在没有形成交联效应时几乎不增强或微弱增强B细胞介导的免疫应答。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段，其中免疫球蛋白Fc区的CH2结构域中的糖基化位点被消除，例如，将人IgG Fc区的CH2结构域中的N297残基突变以消除该糖基化位点，例如，将N297残基变成Gly、Ala、Gln、Asp或Glu，优选地，将N297残基变成Gln。
9.分离的核酸，其编码权利要求1至8中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段。
10.包含权利要求9的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体，例如pcDNA3.3载体。
11.包含权利要求9的核酸或权利要求10的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞，最优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。
12.制备权利要求1至8中任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求11的宿主细胞，任选地分离所述抗CD40抗体或抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗CD40抗体或抗原结合片段。
13.免疫缀合物，其包含权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段和其它物质，例如细胞毒性剂。
14.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段或权利要求13的免疫缀合物，以及任选地药用辅料。
15.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段或权利要求13的免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选地药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、其他抗体(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)、细胞毒性剂。
16.组合产品，其包含权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段或权利要求13的免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、细胞毒性剂、其它抗体，优选地抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
17.权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段或权利要求13的免疫缀合物的用途，用于制备在受试者中预防或治疗肿瘤或感染性疾病的药物。
18.权利要求17的用途，其中所述肿瘤是癌症，例如，淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌(例如，转移性乳腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，IV期或复发性非小细胞肺癌、NSCLC腺癌、或NSCLC鳞状细胞癌)、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、白血病(例如，慢性髓性白血病)、皮肤癌(例如，黑色素瘤(例如，III期或IV期黑色素瘤)或Merkel细胞癌)、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、脊髓发育不良综合征、膀胱癌(例如，移行细胞癌)、胰腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌，例如，透明细胞肾细胞癌，例如，晚期或转移性透明细胞肾细胞癌)和结肠癌(例如，结肠腺癌)，特别地，所述肿瘤是淋巴瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠腺癌、乳腺癌；或者所述感染性疾病为例如细菌感染、病毒感染、真菌感染或原生动物感染，优选地所述感染性疾病是慢性感染。
19.检测样品中CD40的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段，用于实施以下步骤：
(a)将样品与权利要求1至8中任一项的抗CD40抗体或抗原结合片段接触；和
(b)检测所述抗CD40抗体或抗原结合片段和CD40之间的复合物的形成；任选地，所述抗CD40抗体或抗原结合片段是被可检测地标记的。
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