RU2753512C2

RU2753512C2 - Антитело против злокачественной клетки, противораковое лекарственное средство и способ тестирования злокачественного новообразования

Info

Publication number: RU2753512C2
Application number: RU2017111584A
Authority: RU
Inventors: Ясухиро МАЦУМУРА; Масахиро ЯСУНАГА; Синдзи САЙДЗОУ; Синго ХАНАОКА
Original assignee: Нэшнл Кэнсер Сентер; Рин Инститьют Инк.
Priority date: 2014-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2021-08-17
Also published as: US20170260284A1; JP2021019616A; CA2960466A1; AU2018274932B2; CA2960466C; CN106999576B; AU2015313268A1; JP6781507B2; MY187050A; EP3192527A4; BR112017004446A2; CN106999576A; US11524074B2; WO2016039321A1; AU2015313268B2; EP3192527A1; US10471146B2; RU2017111584A3; JPWO2016039321A1; AU2018274932A1

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины и химии. 1-3 объекты представляют собой антитело против трансмембранного белка 180 (TMEM-180) или его антигенсвязывающий фрагмент и противораковое лекарственное средство для лечения злокачественного новообразования, отличного от гематологических опухолей, содержащее в качестве своего активного ингредиента антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в том числе содержащее связанное с ним вещество, имеющее противораковую активность. 4 и 5 объекты - нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи или их CDR1-CDR3. 6-8 объекты - экспрессирующий вектор, трансформант и способ получения антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента. 9 и 10 объекты - способ и набор для тестирования злокачественного новообразования на рецидивирование или метастазирование после лечения. Технический результат заключается в связывании получаемого антитела по изобретению с TMEM-180, специфически экспрессирующимся в злокачественных клетках, что позволяет использовать антитело в качестве противоракового лекарственного средства и для измерения количества TMEM-180 в образце при тестировании злокачественного новообразования на рецидивирование или метастазирование после лечения. 10 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 22 табл., 9 пр.

Description

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к новому антителу против TMEM-180, противораковому лекарственному средству, содержащему антитело против TMEM-180, способу тестирования злокачественного новообразования, включающему измерение TMEM-180 в образце, и т.п.

Предшествующий уровень техники

[0002] За последнее время разработано множество молекулярно-направленных лекарственных средств, специфически действующих на конкретную молекулу, для применения в качестве противораковых лекарственных средств. В частности, разработка направлена на различные лекарственные средства на основе антител, имеющие в качестве антигенов молекулы, специфически экспрессирующиеся в конкретных злокачественных клетках, или молекулы, демонстрирующие повышенную экспрессию в злокачественных клетках. При разработке таких лекарственных средств на основе антител сначала сравнивают экспрессию мРНК в ткани злокачественного новообразования, собранной во время хирургической операции, и экспрессию мРНК в нормальной ткани, собранной в расположенном рядом участке, идентифицируют молекулы, специфически экспрессирующие исключительно в ткани злокачественного новообразования, или молекулы, демонстрирующие повышенную экспрессию в ткани злокачественного новообразования, а затем получают антитела с использованием этих молекул в качестве антигенов.

[0003] Рак толстого кишечника возникает из клеток слизистой оболочки кишечника. Ранее для применения против рака толстого кишечника разработан цетуксимаб, лекарственное средство на основе антитела против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (непатентные документы 1-3). Однако, т.к. EGFR также экспрессируется в нормальной ткани, цетуксимаб также обладает потенциальным действием в отношении нормальной ткани, что, таким образом, приводит к потребности в разработке молекулярно-направленного лекарственного средства, направленно воздействующего на молекулы, более специфически экспрессирующиеся при раке толстого кишечника. В связи с этим, т.к. есть лишь небольшое количество слизистой ткани, в которой возникает рак толстого кишечника, трудно идентифицировать молекулу-мишень посредством сравнения злокачественных клеток слизистой оболочки и нормальных клеток слизистой оболочки.

Список ссылок

Непатентные документы

[0004] Непатентный документ 1: Cunningham, D., et al., The New England Journal of Medicine, Vol. 351, No. 4, 2004, pp. 337-345

Непатентный документ 2: Goldstein, N. I., et al., Clin. Cancer Res., Vol. 1, 1311-1318, 1995

Непатентный документ 3: Karapetis, C. S., et al., The New Engl. J. Med., Vol. 359, 1757-1765

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0005] Целью настоящего изобретения является получение противоракового лекарственного средства, с помощью которого можно лечить злокачественное новообразование, посредством обнаружения молекулы-мишени, специфически экспрессирующейся в злокачественных клетках, и посредством специфического воздействия на молекулу-мишень, и получение способа тестирования злокачественного новообразования, включающего этап измерения молекулы-мишени в образце.

Решение проблемы

[0006] Для решения указанных выше проблем авторы настоящего изобретения сравнивали экспрессию мРНК в различных типах линий клеток рака толстого кишечника и нормальных клетках слизистой оболочки, содержащихся в промывочной жидкости, полученной при колоноскопии, посредством анализа с использованием ДНК-микрочипа для поиска молекул, экспрессирующихся исключительно в линиях клеток рака толстого кишечника. В результате идентифицировали трансмембранный белок 180 (TMEM-180) в качестве белка, экспрессирующегося во всех линиях клеток рака толстого кишечника, но экспрессию которого не наблюдают в клетках здоровых индивидуумов. Кроме того, в дополнение к подтверждению того, что TMEM-180 не экспрессируется в нормальной ткани толстого кишечника, посредством количественной ПЦР и гибридизации in situ, также подтверждали, что TMEM-180 не экспрессируется в известных нормальных тканях, таким образом, подтверждали, что TMEM-180 является идеальной молекулой для использования в качестве мишени для противораковых лекарственных средств и в качестве индикатора при тестировании злокачественного новообразования.

Получали антитело против TMEM-180 и подтверждали, что это антитело демонстрирует цитоцидный эффект в отношении клеток рака толстого кишечника, а также с помощью него можно определять рецидивирование, в частности, с более высокой чувствительностью, чем с помощью общепринятых маркеров рака толстого кишечника, что, таким образом, приводит к осуществлению настоящего изобретения.

Т.е. настоящее изобретение является таким, как указано ниже.

[1] Противораковое лекарственное средство, содержащее в качестве своего активного ингредиента антитело против трансмембранного белка 180 (TMEM-180) или его антигенсвязывающий фрагмент.

[2] Противораковое лекарственное средство, содержащее в качестве своего активного ингредиента антитело против TMEM-180, содержащее связанное с ним вещество, имеющее противораковую активность, или его антигенсвязывающий фрагмент.

[3] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: GFSLTRYNVH (SEQ ID NO: 1);

CDR2 тяжелой цепи: VIWTGGSTD (SEQ ID NO: 2);

CDR3 тяжелой цепи: DLGY (SEQ ID NO: 3);

CDR1 легкой цепи: KSSQSLKYRDGKTYLN (SEQ ID NO: 4);

CDR2 легкой цепи: QVSKLDS (SEQ ID NO: 5); и

CDR3 легкой цепи: CQGSYSPHT (SEQ ID NO: 6).

[4] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: GFSLTSYYMQ (SEQ ID NO: 7);

CDR2 тяжелой цепи: FIRSGGSTE (SEQ ID NO: 8);

CDR3 тяжелой цепи: AFYGGYYFDY (SEQ ID NO: 9);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGSNVD (SEQ ID NO: 10);

CDR2 легкой цепи: KASNRYT (SEQ ID NO: 11); и

CDR3 легкой цепи: MQSNTKYT (SEQ ID NO: 12).

[5] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: GFTFSDYAMA (SEQ ID NO: 40);

CDR2 тяжелой цепи: TIIYDGSST (SEQ ID NO: 41);

CDR3 тяжелой цепи: HWYWYFDF (SEQ ID NO: 42);

CDR1 легкой цепи: LASEGISNDLA (SEQ ID NO: 43);

CDR2 легкой цепи: AASRLQD (SEQ ID NO: 44); и

CDR3 легкой цепи: QQSYKYPLT (SEQ ID NO: 45).

[6] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: DCALN (SEQ ID NO: 48);

CDR2 тяжелой цепи: WINTQTGKPTYADDF (SEQ ID NO: 49);

CDR3 тяжелой цепи: EDYGYFDY (SEQ ID NO: 50);

CDR1 легкой цепи: QASQNINKFIA (SEQ ID NO: 51);

CDR2 легкой цепи: YTSTLVS (SEQ ID NO: 52); и

CDR3 легкой цепи: LQYDNLR (SEQ ID NO: 53).

[7] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: NYGMH (SEQ ID NO: 56);

CDR2 тяжелой цепи: SISPSGGSTYYRDSV (SEQ ID NO: 57);

CDR3 тяжелой цепи: SASITAYYYVMDA (SEQ ID NO: 58);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGSNVD (SEQ ID NO: 59);

CDR2 легкой цепи: KASNRYT (SEQ ID NO: 60); и

CDR3 легкой цепи: MQSNSYPPT (SEQ ID NO: 61).

[8] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: NYWMT (SEQ ID NO: 64);

CDR2 тяжелой цепи: SITNTGGSTYYPDSV (SEQ ID NO: 65);

CDR3 тяжелой цепи: AGYSSYPDYFDY (SEQ ID NO: 66);

CDR1 легкой цепи: KAGQNIYNYLA (SEQ ID NO: 67);

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 68); и

CDR3 легкой цепи: QQYSSGW (SEQ ID NO: 69).

[9] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: DYWVS (SEQ ID NO: 72);

CDR2 тяжелой цепи: EIYPNSGATNFNENFK (SEQ ID NO: 73);

CDR3 тяжелой цепи: DGTMGIAYYFDY (SEQ ID NO: 74);

CDR1 легкой цепи: KASQNINRYLN (SEQ ID NO: 75);

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 76); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSWPYT (SEQ ID NO: 77).

[10] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: SYDIS (SEQ ID NO: 80);

CDR2 тяжелой цепи: AINPGSGGTGYNEKFKGK (SEQ ID NO: 81);

CDR3 тяжелой цепи: IHGGYRYWFAY (SEQ ID NO: 82);

CDR1 легкой цепи: RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 83);

CDR2 легкой цепи: DTSKLAS (SEQ ID NO: 84); и

CDR3 легкой цепи: LQRSSYPPT (SEQ ID NO: 85).

[11] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 88);

CDR2 тяжелой цепи: TIWTGGGTNYNSGVQS (SEQ ID NO: 89);

CDR3 тяжелой цепи: EYMGFDY (SEQ ID NO: 90);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 91);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 92); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRT (SEQ ID NO: 93).

[12] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 96);

CDR2 тяжелой цепи: TIWSGGGTNYNSAVQS (SEQ ID NO: 97);

CDR3 тяжелой цепи: EEKGFAY (SEQ ID NO: 98);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 99);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 100); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRA (SEQ ID NO: 101).

[13] Противораковое лекарственное средство по любому из пп. [3]-[12], где антитело против TMEM-180 является таким, что

по меньшей мере одна из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи содержит от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот, или

по меньшей мере одна из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотным последовательностям CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи.

[14] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14.

[15] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16.

[16] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 47;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47.

[17] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55.

[18] Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 63; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 63.

[19] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.

[20] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 79;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 79; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 79.

[21] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 86;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 86; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 86, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 87; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 87.

[22] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 94;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 94; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 94, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 95; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 95.

[23] Противораковое лекарственное средство по п. [1] или [2], где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102;

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102; или

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102, и/или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103;

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 103; или

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 103.

[24] Противораковое лекарственное средство по любому из пп. [1]-[23], где антитело против TMEM-180 содержит один или несколько N-связанных олигосахаридов, связанных с Fc-областью, и фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце N-связанного олигосахарида.

[25] Противораковое лекарственное средство по любому из пп. [1]-[24], направленное против злокачественного новообразования, экспрессирующего TMEM-180.

[26] Противораковое лекарственное средство по любому из пп. [1]-[24], направленное против рака толстого кишечника.

[27] Противораковое лекарственное средство по любому из пп. [1]-[24], вводимое одновременно с вакцинотерапией с использованием композиции, содержащей по меньшей мере один пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 104-170.

[28] Антитело против TMEM-180 по любому из пп. [3]-[24] или его антигенсвязывающий фрагмент.

[29] Нуклеиновая кислота, кодирующая любую из CDR1-CDR3 тяжелых цепей и CDR1-CDR3 легких цепей по любому из пп. [3]-[13].

[30] Нуклеиновая кислота, кодирующая любую из тяжелых цепей и легких цепей по любому из пп. [14]-[23].

[31] Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. [29] или [30].

[32] Трансформант, содержащий экспрессирующий вектор по п. [31].

[33] Способ получения антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий этапы:

экспрессии антитела в трансформанте по п. [32]; и

выделения антитела.

[34] Способ тестирования злокачественного новообразования, включающий этап измерения количества TMEM-180 в образце, полученном от индивидуума.

[35] Способ тестирования злокачественного новообразования по п. [34], где количество TMEM-180 измеряют посредством иммунологического анализа с использованием антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента.

[36] Способ тестирования злокачественного новообразования по п. [35], где антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент является антителом против TMEM-180 или его антигенсвязывающим фрагментом по п. [28].

[37] Способ тестирования злокачественного новообразования по любому из пп. [34]-[36], предназначенный для рака толстого кишечника.

[38] Способ тестирования злокачественного новообразования по п. [34]-[37], используемый для тестирования на рецидивирование или метастазирование после лечения.

[39] Набор для тестирования злокачественного новообразования, содержащий антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент.

[40] Набор для тестирования злокачественного новообразования по п. [39], где антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент является антителом против TMEM-180 или его антигенсвязывающим фрагментом по п. [28].

[41] Набор для тестирования злокачественного новообразования по п. [39] или [40], предназначенный для рака толстого кишечника.

Полезные эффекты изобретения

[0007] Противораковое лекарственное средство, содержащее антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, направленно воздействует на TMEM-180, являющийся белком, специфически экспрессирующимся в конкретных злокачественных новообразованиях, но не экспрессирующимся в нормальной ткани, и считают, что оно позволяет достигать мощного эффекта, специфичного в отношении злокачественных клеток, при немногочисленных побочных эффектах.

Т.к. TMEM-180 специфически экспрессируется в конкретных злокачественных новообразованиях, но не экспрессируется в нормальной ткани, способ тестирования злокачественного новообразования и набор для тестирования, в котором используют антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, позволяют легко осуществлять тестирование злокачественного новообразования. Способ тестирования злокачественного новообразования и набор для тестирования по настоящему изобретению позволяют определять рецидивирование злокачественного новообразования, в частности, с более высокой чувствительностью по сравнению с общепринятыми маркерами рака толстого кишечника.

Кроме того, в соответствии с противораковым лекарственным средством, содержащим антитело против TMEM-180, содержащее связанное с ним вещество, имеющее противораковую активность, или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, противораковое лекарственное средство можно специфически доставлять в злокачественные клетки, экспрессирующие TMEM-180, таким образом, облегчая применение высокотоксичного вещества в качестве вещества, имеющего противораковую активность.

Краткое описание чертежей

[0008] На фиг. 1A показаны уровни экспрессии TMEM-180, полученные в результате исчерпывающего анализа экспрессии на линиях клеток рака толстого кишечника человека и клетках слизистой оболочки толстого кишечника, полученные от здоровых индивидуумов посредством анализа с помощью ДНК-микрочипа. На фиг. 1B показаны результаты анализа экспрессии TMEM-180 в клетках рака толстого кишечника и смежной нормальной ткани толстого кишечника посредством количественной ПЦР. На фиг. 1C и 1D показаны результаты исследования экспрессии TMEM-180 в участках злокачественного новообразования и нормальных участках посредством гибридизации in situ.

На фиг. 2A показаны результаты исследования экспрессии TMEM-180 в различных нормальных тканях с использованием базы данных. На фиг. 2B показаны результаты исследования экспрессии незначительных количеств TMEM-180 в случае молекул, на которые направленно воздействует TMEM-180, и общепринятых противораковых лекарственных средств тем же способом, что и на фиг. 2A.

На фиг. 3 показаны результаты проточной цитометрии различных линий клеток рака толстого кишечника, опухоли головного мозга и гемобластозов с использованием клонов 98, 101 и 212 антитела против TMEM-180.

На фиг. 4 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток рака толстого кишечника с помощью клонов 98, 101 и 212 антитела против TMEM-180. Кроме того, концентрации антитела для каждого клона не выровнены.

На фиг. 5 показаны результаты исследования реакционной способности антитела клона 98 IgM крысы и клона 98 химерного антитела крысы и человека в отношении линии клеток рак толстого кишечника DLD-1 и ее нокаутной по TMEM-180 линии посредством проточной цитометрии.

На фиг. 6 показаны результаты окрашивания ткани рака толстого кишечника человека и близлежащей нормальной ткани с использованием клона 98 антитела IgM крысы.

На фиг. 7 показаны результаты теста цитотоксичности с использованием супернатанта гибридомной культуры, продуцирующей клон 98 антитела IgM крысы. Концентрацию антитела в супернатанте гибридомной культуры измеряли посредством ELISA с использованием IgM-специфического антитела.

На фиг. 8 показаны результаты теста цитотоксичности с использованием супернатанта гибридомной культуры, продуцирующей клон 101 антитела IgM крысы. Концентрацию антитела в супернатанте гибридомной культуры измеряли посредством ELISA с использованием IgM-специфического антитела.

На фиг. 9 показаны результаты измерения концентрации белка TMEM-180 в супернатантах культур злокачественных клеток.

На фиг. 10 показаны результаты измерения концентраций белка TMEM-180 в плазме у пациентом с раком толстого кишечника стадии IV. Кроме того, в таблице, приведенной справа от графика, показаны результаты измерения уровней CEA в образцах, собранных от тех же пациентов.

На фиг. 11 показаны результаты измерения концентраций белка TMEM-180 в плазме до и после хирургического вмешательства у пациентов с раком толстого кишечника стадии III.

На фиг. 12 показаны результаты измерения концентрации белка TMEM-180 в плазме и концентрации CEA до хирургического вмешательства, после хирургического вмешательства и во время рецидива у пациентов с раком толстого кишечника на различных стадиях.

Описание вариантов осуществления

[0009] (Антитело против TMEM-180 и противораковое лекарственное средство)

Один из аспектов противоракового лекарственного средства по настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В настоящем описании антитело против TMEM-180 относится к антителу, специфически связывающемуся с трансмембранным белком 180 (TMEM-180). В настоящем описании в случае упоминания TMEM-180, он может являться TMEM-180, полученным из любого животного, и может являться его мутантом при условии, что он служит в качестве мишени противоракового лекарственного средства или индикатором для способа тестирования злокачественного новообразования. Аминокислотная последовательность TMEM-180 человека приведена в SEQ ID NO: 17 в качестве примера TMEM-180.

[0010] В настоящем описании термин "антитело" относится к белку, имеющему структуру связанных двух тяжелых цепей (H-цепей) и двух легких цепей (L-цепей), стабилизированных парой дисульфидных связей. Тяжелые цепи образованы вариабельной областью VH тяжелой цепи, константными областями CH1, CH2 и CH3 тяжелой цепи и шарнирной областью между CH1 и CH2, в то время как легкие цепи образованы вариабельной областью VL легкой цепи и константной областью CL легкой цепи. Среди этих цепей фрагмент вариабельной области (Fv), образованный VH и VL, напрямую участвует в связывании антигена и является областью, обеспечивающей разнообразие антител. Кроме того, антигенсвязывающую область, образованную VL, CL, VH и CH1, обозначают как Fab-область, в то время как область, образованную шарнирной областью, CH2 и CH3, обозначают как Fc-область.

Среди вариабельных областей область, осуществляющая прямой контакт с антигеном, подвергается значительному изменению, и ее обозначают как определяющую комплементарность область (CDR). Область, иную, чем CDR, остающуюся сравнительно неизменной, обозначают как каркасную область (FR). Каждая из трех CDR присутствует в вариабельных областях легкой цепи и тяжелой цепи, и их обозначают как CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи, соответственно, в порядке, начинающемся с N-конца.

[0011] Антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению может являться моноклональным антителом или поликлональным антителом. Кроме того, антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению может представлять собой любой изотип из IgG, IgM, IgA, IgD или IgE. Его также можно получать посредством иммунизации не принадлежащего человеку животного, такого как мышь, крыса, хомяк, морская свинка, кролик или курица, или оно может являться рекомбинантным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом, полностью человеческим антителом или т.п. Химерное антитело относится к антителу, в котором соединяют фрагменты антител разных видов.

Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, в котором положение, соответствующее антителу человека, заменяют аминокислотной последовательностью, специфичной для антитела нечеловеческого происхождения, и его примером является антитело, содержащее CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи антитела, получаемого посредством иммунизации мыши или крысы, и в котором все другие области, включая каждую из четырех каркасных областей (FR) тяжелой цепи и легкой цепи, получают из антитела человека. Этот тип антитела также можно обозначать как CDR-пересаженное антитело. Термин "гуманизированное антитело" также может включать химерное антитело человека.

[0012] В настоящем описании термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела против TMEM-180 относится к фрагменту антитела против TMEM-180, связывающегося с TMEM-180. Более конкретно, его неограничивающие примеры включают Fab, образованный VL, VH, CL и областью CH1, F(ab')2, полученный посредством соединения двух Fab в шарнирной области с дисульфидными связями, Fv, образованный VL и VH, одноцепочечное антитело в форме scFv, в котором VL и VH соединяют с использованием искусственного полипептидного линкера, а также биспецифические антитела, такие как диатела, scDb, тандемные sdFv, и лейциновые молнии.

[0013] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 98 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: GFSLTRYNVH (SEQ ID NO: 1)

CDR2 тяжелой цепи: VIWTGGSTD (SEQ ID NO: 2)

CDR3 тяжелой цепи: DLGY (SEQ ID NO: 3)

CDR1 легкой цепи: KSSQSLKYRDGKTYLN (SEQ ID NO: 4)

CDR2 легкой цепи: QVSKLDS (SEQ ID NO: 5)

CDR3 легкой цепи: CQGSYSPHT (SEQ ID NO: 6)

[0014] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 101 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: GFSLTSYYMQ (SEQ ID NO: 7)

CDR2 тяжелой цепи: FIRSGGSTE (SEQ ID NO: 8)

CDR3 тяжелой цепи: AFYGGYYFDY (SEQ ID NO: 9)

CDR1 легкой цепи: KASQNVGSNVD (SEQ ID NO: 10)

CDR2 легкой цепи: KASNRYT (SEQ ID NO: 11)

CDR3 легкой цепи: MQSNTKYT (SEQ ID NO: 12)

[0015] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 212 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: GFTFSDYAMA (SEQ ID NO: 40)

CDR2 тяжелой цепи: TIIYDGSST (SEQ ID NO: 41)

CDR3 тяжелой цепи: HWYWYFDF (SEQ ID NO: 42)

CDR1 легкой цепи: LASEGISNDLA (SEQ ID NO: 43)

CDR2 легкой цепи: AASRLQD (SEQ ID NO: 44)

CDR3 легкой цепи: QQSYKYPLT (SEQ ID NO: 45)

[0016] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 129 антитела против TMEM-180 указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: DCALN (SEQ ID NO: 48)

CDR2 тяжелой цепи: WINTQTGKPTYADDF (SEQ ID NO: 49)

CDR3 тяжелой цепи: EDYGYFDY (SEQ ID NO: 50)

CDR1 легкой цепи: QASQNINKFIA (SEQ ID NO: 51)

CDR2 легкой цепи: YTSTLVS (SEQ ID NO: 52)

CDR3 легкой цепи: LQYDNLR (SEQ ID NO: 53)

[0017] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 382 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: NYGMH (SEQ ID NO: 56)

CDR2 тяжелой цепи: SISPSGGSTYYRDSV (SEQ ID NO: 57)

CDR3 тяжелой цепи: SASITAYYYVMDA (SEQ ID NO: 58)

CDR1 легкой цепи: KASQNVGSNVD (SEQ ID NO: 59)

CDR2 легкой цепи: KASNRYT (SEQ ID NO: 60)

CDR3 легкой цепи: MQSNSYPPT (SEQ ID NO: 61)

[0018] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 1361 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: NYWMT (SEQ ID NO: 64)

CDR2 тяжелой цепи: SITNTGGSTYYPDSV (SEQ ID NO: 65)

CDR3 тяжелой цепи: AGYSSYPDYFDY (SEQ ID NO: 66)

CDR1 легкой цепи: KAGQNIYNYLA (SEQ ID NO: 67)

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 68)

CDR3 легкой цепи: QQYSSGW (SEQ ID NO: 69)

[0019] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 669 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: DYWVS (SEQ ID NO: 72)

CDR2 тяжелой цепи: EIYPNSGATNFNENFK (SEQ ID NO: 73)

CDR3 тяжелой цепи: DGTMGIAYYFDY (SEQ ID NO: 74)

CDR1 легкой цепи: KASQNINRYLN (SEQ ID NO: 75)

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 76)

CDR3 легкой цепи: LQHNSWPYT (SEQ ID NO: 77)

[0020] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 699 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: SYDIS (SEQ ID NO: 80)

CDR2 тяжелой цепи: AINPGSGGTGYNEKFKGK (SEQ ID NO: 81)

CDR3 тяжелой цепи: IHGGYRYWFAY (SEQ ID NO: 82)

CDR1 легкой цепи: RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 83)

CDR2 легкой цепи: DTSKLAS (SEQ ID NO: 84)

CDR3 легкой цепи: LQRSSYPPT (SEQ ID NO: 85)

[0021] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 1052 антитела против TMEM-180, указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 88)

CDR2 тяжелой цепи: TIWTGGGTNYNSGVQS (SEQ ID NO: 89)

CDR3 тяжелой цепи: EYMGFDY (SEQ ID NO: 90)

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 91)

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 92)

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRT (SEQ ID NO: 93)

[0022] Один из аспектов антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из шести CDR, указанных ниже. Эти CDR являются последовательностями CDR клона 1105 антитела против TMEM-180 указанными в примерах для последующего описания.

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 96)

CDR2 тяжелой цепи: TIWSGGGTNYNSAVQS (SEQ ID NO: 97)

CDR3 тяжелой цепи: EEKGFAY (SEQ ID NO: 98)

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 99)

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 100)

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRA (SEQ ID NO: 101)

[0023] В каждом из указанных выше аспектов, хотя антитело против TMEM-180 может содержат любую из шести CDR при условии, что наблюдают эффекты по настоящему изобретению, оно также может содержать, например, две или более, три или более, четыре или более, пять или более или все шесть из шести CDR.

[0024] В каждом из указанных выше аспектов по меньшей мере одна из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи может содержать от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот.

[0025] В настоящем описании термин "аминокислота" используют в самом широком смысле, и он включает искусственные варианты и производные аминокислот в дополнение к природным аминокислотам. Аминокислоты можно указывать с использованием общепринятого однобуквенного или трехбуквенного кода. В настоящем описании примеры аминокислот или их производных включают природные белковые L-аминокислоты, неприродные аминокислоты и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, широко известными в этой области как свойства аминокислот. Неограничивающие примеры неприродных аминокислот включают α,α-дизамещенные аминокислоты (такие как α-метилаланин), N-алкил-α-аминокислоты, D-аминокислоты, β-аминокислоты и α-гидроксикислоты, имеющие структуры основной цепи, отличающиеся от встречающихся в природе, аминокислоты, имеющие структуры боковой цепи, отличающиеся от встречающихся в природе (таких как норлейцин или гомогистидин), аминокислоты, имеющие лишний метилен в своей боковой цепи (такие как гомоаминокислота, гомофенилаланин или гомогистидин), и аминокислоты, в которых функциональную группу карбоновой кислоты заменяют группой сульфоновой кислоты в ее боковой цепи (такие как цистеиновая кислота).

[0026] В настоящем описании, в случае упоминания термина "содержащий от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот", хотя и нет конкретных ограничений в отношении количества, например, добавленных, замещенных или делетированных аминокислот, при условии, что полученный таким образом полипептид сохраняет функцию CDR, его примеры включают одну, две, три или четыре инсерции, замены или делеции аминокислот. Замещенные или добавленные аминокислоты могут являться неприродными аминокислотами или аналогами аминокислот в дополнение к природным белковым аминокислотам. Положение делеции, замены или инсерции аминокислоты может являться любым положением в исходной последовательности CDR при условии сохранения функции CDR.

[0027] В каждом из аспектов указанного выше антитела против TMEM-180 по меньшей мере одна из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи может иметь аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к исходным аминокислотным последовательностям CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи.

[0028] В настоящем описании термин "имеющий идентичность 80% или более" означает, что количество общих аминокислотных остатков составляет 80% или более аминокислот из исходной последовательности, когда аминокислотную последовательность полипептида, имеющего исходную последовательность, выравнивают с аминокислотной последовательностью полипептида, имеющего мутантную последовательность таким образом, что существует максимальное совпадение между ними двумя.

Идентичность может представлять собой любую процентную долю 80% или более, при которой сохраняют функцию CDR, и может составлять, например, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более или 99% или более.

[0029] CDR, содержащую аминокислотную последовательность, в которой аминокислоту подвергают инсерции, замене или делеции в аминокислотных последовательностях CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи, или CDR, имеющую идентичность последовательности 80% или более относительно аминокислотных последовательностей CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи, можно получать известным способом, таким как сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, перестановка цепей или "прогулка по CDR". В соответствии с этими способами, антитело или антигенсвязывающие фрагменты, имеющие различные мутации в своих CDR, могут презентироваться на поверхности фага с помощью фагового дисплея, и специалистам в этой области хорошо известны CDR, имеющие более высокую степень созревания аффинности, получаемые посредством скрининга с использованием антигена (см., например, Wu, et al., PNAS, 95: 6037-6042 (1998); Schier, R., et al., J. Mol. Biol., 263, 551-567 (1996); Schier, R., et al., J. Mol. Biol., 255, 28-43 (1996); Yang, W. P., et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403 (1995)).

[0030] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.

аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 13, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 98 антитела против TMEM-180.

[0031] В настоящем описании, в случае от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности тяжелой цепи или легкой цепи, количество аминокислот, подвергнутых инсерции, замене или делеции, может составлять, например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять. Другие термины описаны выше.

[0032] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 14, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 98 антитела против TMEM-180.

[0033] Антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14.

[0034] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 15, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи антитела клона 101 против TMEM-180.

[0035] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 16, является аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи клона 101 антитела против TMEM-180.

[0036] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16.

[0037] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 46, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 212 антитела против TMEM-180.

[0038] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 47, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 212 антитела против TMEM-180.

[0039] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 46, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 47, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47.

[0040] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 54, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 129 антитела против TMEM-180.

[0041] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 55, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 129 антитела против TMEM-180.

[0042] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55.

[0043] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 62, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 382 антитела против TMEM-180.

[0044] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 63, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 382 антитела против TMEM-180.

[0045] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 63, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 63.

[0046] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 70, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 1361 антитела против TMEM-180.

[0047] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 71, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 1361 антитела против TMEM-180.

[0048] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.

[0049] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 78, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 669 антитела против TMEM-180.

[0050] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 79, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 669 антитела против TMEM-180.

[0051] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 79, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 79, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 79.

[0052] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 86.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 86, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 699 антитела против TMEM-180.

[0053] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 87, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 699 антитела против TMEM-180.

[0054] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 86, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 86, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 86, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 87, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 87.

[0055] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 94.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 94, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 1052 антитела против TMEM-180.

[0056] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 95, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 1052 антитела против TMEM-180.

[0057] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 94, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 94, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 94, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 95, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 95.

[0058] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 102, является аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи клона 1105 антитела против TMEM-180.

[0059] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению содержит:

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 103, является аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи клона 1105 антитела против TMEM-180.

[0060] Другой аспект антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению может содержать тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102, тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую от одной до нескольких инсерций, замен или делеций аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 103, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 103.

[0061] Антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению может являться антителом, в котором один или несколько N-связанных олигосахаридов соединяют с Fc-областью и фукозу не соединяют с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце N-связанного олигосахарида.

Например, два участка связывания N-связанного олигосахарида присутствуют в Fc-области антитела IgG, и сложный олигосахарид связывается с этим участком. N-связанные олигосахариды относятся к олигосахаридам, связанным с Asn из последовательности Asn-X-Ser/Thr, имеющей распространенную структуру Man3GlcNAc2-Asn. Их классифицируют на высокоманнозные типы, смешанные типы, сложные типы и т.п. в зависимости от типа олигосахарида, связывающегося с двумя маннозами (Man) на восстанавливающем конце.

Хотя фукоза может связываться с N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) на восстанавливающем конце N-связанных олигосахаридов, известно, что активность ADCC значительно повышается в случае, когда фукоза не связывается с этим участком, по сравнению со случаем, в котором она связывается. Эти данные описаны, например, в WO 2002/031140, и его описание включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Т.к. в результате этого значительного повышения активности ADCC можно снижать дозу антитела в случае его использования в качестве фармацевтического средства, помимо возможности снижения побочных эффектов, также можно снижать медицинские расходы.

[0062] Один из аспектов противоракового лекарственного средства по настоящему изобретению содержит в качестве своего активного ингредиента антитело против TMEM-180, содержащее связанное с ним вещество, имеющее противораковую активность, или его антигенсвязывающий фрагмент. В этом аспекте антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент также могут обладать противораковой активностью сами по себе или могут иметь лишь способность связываться с TMEM-180, не проявляя противораковую активность.

[0063] В настоящем описании термин "вещество, имеющее противораковую активность" относится к веществу, вызывающему по меньшей мере одно из снижения (задержка или приостановка) размера опухоли, ингибирования метастазирования опухоли, ингибирования (задержки или приостановки) роста опухоли и облегчения одного или множество симптомов, ассоциированных со злокачественным новообразованием. Более конкретно, их неограничивающие примеры включают токсины, противораковые лекарственные средства и радиоактивные изотопы.

[0064] Примеры токсинов, имеющих противораковую активность, включают псевдомонадный экзотоксин (PE) и его цитотоксические фрагменты (такие как PE38), дифтерийный токсин и лизин A. Т.к. эти токсины, имеющие противораковую активность, проявляют токсичность исключительно в клетках, распознаваемых антителом против TMEM-180, а именно злокачественных клетках, экспрессирующих TMEM-180, они обеспечивают преимущество, состоящее в возможности достижения конкретных эффектов без неблагоприятного воздействия на окружающие клетки.

[0065] Примеры противораковых лекарственных средств включают низкомолекулярные соединения, такие как адриамицин, дауномицин, митомицин, цисплатин, винкристин, эпирубицин, метотрексат, 5-фторурацил, аклациномицин, азотистый иприт, циклофосфамид, блеомицин, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, виндезин, тамоксифен или дексаметазон, и белки, такие как цитокины, активирующие иммунокомпетентные клетки (такие как интерлейкин 2 человека, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека, макрофагальный колониестимулирующий фактор человека или интерлейкин 12 человека).

[0066] Примеры радиоактивных изотопов, имеющих противораковую активность, включают ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I, ²¹¹At и ⁹⁰Y.

[0067] Вещества, имеющие противораковую активность, можно связывать с антителом против TMEM-180 напрямую или через линкер известным способом или способом, соответствующим ему. Вещество, имеющее противораковую активность, можно заключать в носитель, такой как мицелла или липосома, а затем связывать липосому с антителом против TMEM-180 или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0068] В случае, если указанное выше вещество, имеющее противораковую активность, является белком или полипептидом, его также можно экспрессировать в форме слитого белка, образованного веществом, имеющим противораковую активность, и антителом против TMEM-180, посредством связывания нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению, описываемой далее, кодирующей вещество, имеющее противораковую активность, с использованием ДНК, а затем встраивания в подходящий экспрессирующий вектор.

[0069] В настоящем описании термин "противораковое лекарственное средство" относится к фармацевтическому средству, вызывающему по меньшей мере одно из снижения (задержки или приостановки) размера опухоли, ингибирования метастазирования опухоли, ингибирования (задержки или приостановки) роста опухоли и облегчения одного или множества симптомов, ассоциированных со злокачественным новообразованием.

[0070] Противораковое лекарственное средство по настоящему изобретению также может содержать фармацевтически приемлемый носитель или добавку в дополнение к активному ингредиенту.

Неограничивающие примеры носителей и добавок включают фармацевтически приемлемые органические растворители, такие как вода, солевой раствор, фосфатный буфер, декстроза, глицерин и этанол, а также коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловый полимер, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водорастворимый декстран, натрий-карбоксиметилкрахмал, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, гуммиарабик, казеин, агар, полиэтиленгликоль, диглицерин, глицерин, пропиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновую кислоту, сывороточный альбумин человека, маннит, сорбит, лактозу и поверхностно-активные вещества.

[0071] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать в разных формах, таких как жидкость (например, препарат для инъекций), дисперсия, суспензия, таблетка, пилюля, порошок или суппозиторий. Фармацевтическую композицию, предпочтительно, получают в форме препарата для инъекций и, предпочтительно, вводят парентерально (например, внутривенно, чрескожно, интраперитонеально или внутримышечно).

[0072] фармацевтическая композиция по настоящему изобретению является эффективной для лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего TMEM-180. Неограничивающие примеры злокачественного новообразования, экспрессирующего TMEM-180 включают рак толстого кишечника и опухоли головного мозга.

[0073] Настоящее изобретение также относится к способу лечения злокачественного новообразования, включающему введение противоракового лекарственного средства по настоящему изобретению.

Доза противоракового лекарственного средства по настоящему изобретению является такой, что, например, доза антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента, в качестве неограничивающих примеров, составляет от 0,025 мг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно - от 0,1 мг/кг до 0 мг/кг, более предпочтительно - от 0,1 мг/кг до 25 мг/кг, и даже более предпочтительно - от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг или от 0,1 мг/кг до 3 мг/кг.

[0074] Противораковое лекарственное средство по настоящему изобретению можно комбинировать с другой терапией злокачественного новообразования. Примеры другой терапии злокачественного новообразования включают введение указанных выше других противораковых лекарственных средств, лучевую терапию, хирургическое вмешательство и терапию противораковой вакциной.

В настоящем описании термин "терапия противораковой вакциной" относится к способу профилактики или лечения злокачественного новообразования, включающему повышение иммунитета пациента против злокачественных клеток посредством введения пациенту антигена злокачественной опухоли или стимуляции полученных из пациента иммунных клеток in vitro с использованием антигена злокачественной опухоли, а затем возвращения клеток пациенту. Пептид, полученный из белка, специфически экспрессируемого злокачественными клетками (пептид, полученный из антигена злокачественной опухоли), используют в качестве примера антигена злокачественной опухоли, используемого в терапии противораковой вакциной.

[0075] Пептид, полученный из антигена злокачественной опухоли, активирует цитотоксические T-лимфоциты (CTL) в результате связывания с лейкоцитарным антигеном человека (HLA) на поверхности антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, и презентирования на CTL. Затем активированные CTL атакуют и элиминируют злокачественные клетки, экспрессирующие тот же антиген, из которого получен пептид. Молекулы HLA имеют высокую степень генетического разнообразия и проявляют различные генотипы в зависимости от индивидуума. Последовательности этих пептидов, которые можно получать из конкретного антигенного белка злокачественной опухоли, и которые могут связываться с молекулой HLA конкретного генотипа, можно определять с помощью известного программного обеспечения или т.п.

[0076] Например, эти пептиды, полученные из белка TMEM-180 и способные связываться с HLA типа A2 или HLA типа A24, часто обнаруживаемые у японцев, предсказывали, как указано ниже, с использованием HLA Peptide Binding Predictions, опубликованных Bioinformatics and Molecular Analysis Section, U.S. National Institutes of Health (http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform). В таблицах в качестве "начального положения" указывают положение в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 17.

Т.к. CTL могут активироваться для атаки злокачественных клеток, экспрессирующих белок TMEM-180, в соответствии с терапией противораковой вакциной с использованием этих пептидов злокачественные клетки могут быть эффективно атакованы при использовании комбинации с противораковым лекарственным средством по настоящему изобретению, направленно воздействующим на TMEM-180, что, таким образом, делает возможными профилактику или лечение злокачественного новообразования. Специалист в этой области может получать композиции против злокачественной опухоли, содержащие эти пептиды, известными способами.

[0077]

[Таблица 1-1]

Тип молекулы HLA: A_0201 Пороговое значение: 10 (приблизительный полупериод диссоциации молекулы, содержащей это вещество)
Ранг	Начальное положение	Последовательность	SEQ ID NO
1	132	CLYDgFLTLV	104
2	33	FLLYyVDTFV	105
3	266	FLWFvSMDLV	106
4	322	FLSLcRRWGV	107
5	339	FLLKIGLSLL	108
6	376	KLLTIVVTDL	109
7	401	ALLFgMVALV	110
8	23	ALFTtILHNV	111
9	9	WLLGIPTAVV	112
10	482	QLFTwSQFTL	113
11	109	LALSfLAFWV	114
12	342	KLGLsLLMLL	115
13	2	GLGQpQAWLL	116
14	490	TLHGrRLHMV	117
15	60	LLWNsLNDPL	118
16	64	SLNDpLFGWL	119
17	139	TLVDIHHHAL	120
18	49	KMAFwVGETV	121
19	469	YLLVIVPITC	122
20	505	NLSQaQTLDV	123
21	377	LLTLvVTDLV	124
22	294	LLSDhISLST	125
23	348	LMLLaGPDHL	126
24	258	RQLArHRNFL	127
25	130	CLCLyDGFLT	128
26	425	LLCFyTGHDL	129

[Таблица 1-2]

27	472	VLVPiTCALL	130
28	350	LLAGpDHLSL	131
29	70	FGWLsDRQFL	132
30	324	SLCRrWGVYA	133
31	481	LQLFtWSQFT	134
32	78	FLSSqPRSGA	135
33	204	GLGFIGATQL	136
34	124	GLQFILCLCL	137
35	153	ALSAhDRTHL	138
36	212	QLLRrRVEAA	139
37	17	VVYGsLALFT	140
38	470	LLVLvPITCA	141
39	402	LLFGmVALVT	142
40	271	SMDLvQLFHC	143
41	147	ALLAdLALSA	144
42	332	YAVVrGLFLL	145
43	45	YKINkMAFWV	146
44	282	FNSNfFPLFL	147
45	471	LVLVpITCAL	148
46	88	GLSSrAVVLA	149
47	417	FAPLIGTWLL	150

[Таблица 2]

Тип молекулы HLA: A24 Пороговое значение: 10 (приблизительный полупериод диссоциации молекулы, содержащей это вещество)
Ранг	Начальное положение	Последовательность	SEQ ID NO
1	311	SYVApHLNNL	151
2	331	VYAVvRGLFL	152
3	180	SYAFwNKEDF	153
4	265	NFLWfVSMDL	154
5	286	FFPLfLEHHL	155
6	338	LFLLkLGLSL	156
7	416	TFAPILGTWL	157
8	369	VFTEgTCKLL	158
9	285	NFFPIFLEHL	159
10	51	AFWVgETVFL	160
11	281	HFNSnFFPLF	161
12	376	KLLTIVVTDL	162
13	32	VFLLyYVDTF	163
14	258	RQLArHRNFL	164
15	336	RGLFILKLGL	165
16	503	RQNLsQAQTL	166
17	24	LFTTiLHNVF	167
18	64	SLNDpLFGWL	168
19	277	VFHChFNSNF	169
20	69	LFGWISDRQF	170

[0078] (Нуклеиновая кислота)

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота может являться природной нуклеиновой кислотой или искусственной нуклеиновой кислотой, и ее неограничивающие примеры включают ДНК, РНК и химеры ДНК и РНК. Специалист в этой области может определять последовательность оснований в нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент, известным способом или способом, соответствующим ему, и ее также можно получать известным способом или способом, соответствующим ему.

Неограничивающие примеры нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, включают нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, кодирующую тяжелую цепь или легкую цепь клона 98 антитела против TMEM-180, нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, кодирующую любую из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи клона 98 антитела против TMEM-180, нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, кодирующую тяжелую цепь или легкую цепь клона 101 антитела против TMEM-180, нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, кодирующую любую из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи клона 101 антитела против TMEM-180, нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, кодирующую тяжелую цепь или легкую цепь клона 212 антитела против TMEM-180, и нуклеиновую кислоту, содержащую ДНК, кодирующую любую из CDR1-CDR3 тяжелой цепи и CDR1-CDR3 легкой цепи клона 212 антитела против TMEM-180.

[0079] (Экспрессирующий вектор)

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Экспрессирующий вектор можно соответствующим образом выбирать в соответствии с используемыми клетками-хозяевами, и его примеры включают векторы на основе вируса растений, такие как плазмида, ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), вектор на основе вируса мозаики цветной капусты или вектор на основе вируса табачной мозаики, а также космиду, YAC или полученный из EBV эписомный вектор. Нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению, можно встраивать в эти экспрессирующие векторы известным способом (таким как способ с использованием фермента рестрикции).

[0080] Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может дополнительно содержать промотор для регуляции экспрессии гена антитела, точку начала репликации или ген селективного маркера и т.п. Промотор и точку начала репликации можно соответствующим образом выбирать в соответствии с типами клеток-хозяев и вектора.

[0081] (Трансформант)

Трансформант по настоящему изобретению содержит вектор по настоящему изобретению. Трансформант можно получать посредством трансфекции подходящих клеток-хозяев с использованием вектора по настоящему изобретению. Примеры клеток-хозяев, которые можно использовать, включают эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих (такие как клетки CHO, клетки COS, миеломные клетки, клетки HeLa или клетки Vero), клетки насекомых, растительные клетки и клетки грибов (такие как клетки грибов, принадлежащих к родам Saccharomyces и Aspergillus), и прокариотические клетки, такие как клетки Escherichia coli (E. coli) или Bacillus subtilis.

[0082] (Способ получения антитела)

Хотя нет конкретных ограничений способа, используемого для получения антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, моноклональное антитело против TMEM-180, например, можно получать посредством выделения антитело-продуцирующих клеток из не принадлежащего человеку млекопитающего, иммунизированного с использованием TMEM-180 или его фрагмента, слияния этих клеток с миеломными клетками или т.п. для получения гибридомы, а затем очистки антитела, получаемого с помощью этой гибридомы. Кроме того, можно получать поликлональное антитело против TMEM-180 из сыворотки животного, иммунизированного с использованием TMEM-180 или его фрагмента.

[0083] В случае получения антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению посредством генетической рекомбинации, например, подходящего хозяина трансформируют с использованием экспрессирующего вектора, содержащего нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, а затем этого трансформанта культивируют в подходящих условиях для экспрессии антитела с последующим выделением и очисткой антитела известными способами.

Примеры способов выделения и очистки включают использование колонки для аффинной хроматографии с использованием протеина A или т.п., колонки для другой хроматографии, фильтра, ультрафильтрации, высаливания и диализа, и эти способы также можно соответствующим образом комбинировать.

[0084] Химерное антитело человека и CDR-пересаженное антитело человека можно получать посредством клонирования гена антитела из мРНК гибридомы, продуцирующей антитело иного животного, чем человек, а его затем соединения с частью гена антитела человека с использованием технологии генетической рекомбинации.

Например, в случае химерного антитела человека кДНК синтезируют с помощью мРНК гибридомы, продуцирующей антитело мыши, с использованием обратной транскриптазы, и вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (LH) клонируют посредством ПЦР с последующим анализом их последовательностей. Затем получают 5'-праймеры, содержащие лидерную последовательность, начиная с последовательности оснований антитела, имеющей наиболее высокую степень идентичности, и область от сигнальной последовательности до 3'-конца вариабельной области клонируют посредством ПЦР из указанной выше кДНК с помощью 5'-праймера и 3'-праймера для вариабельной области. С другой стороны, клонируют константные области тяжелой цепи и легкой цепи IgG1 человека и в случае каждой тяжелой цепи и легкой цепи посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами соединяют вариабельные части, полученные из антитела мыши, и константные области, полученные из антитела человека, а затем амплифицируют. Затем полученную ДНК можно встраивать в подходящий вектор с последующей трансформацией для получения химерного антитела человека.

[0085] В случае CDR-пересаженного антитела используемую вариабельную часть антитела мыши и вариабельную часть антитела человека, демонстрирующую наиболее высокую гомологию, выбирают и клонируют с последующей модификацией последовательности оснований CDR посредством сайт-специфического мутагенеза с использованием мегапраймерного способа. В случаях, в которых антиген не может специфически связываться после гуманизации аминокислотной последовательности, составляющей каркасную область, аминокислоты части каркасной области можно преобразовывать из аминокислот человека в аминокислоты крысы.

CDR, содержащие аминокислотную последовательность, содержащую одну или две делеции, замены или инсерции аминокислот в исходной последовательности, и CDR, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую идентичность X% или более по отношению к исходной последовательности, можно получать известным способом, таким как сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, перестановка цепей или "прогулка по CDR".

В соответствии с этими способами, специалистам в этой области хорошо известно, что CDR, имеющие более высокую степень созревания аффинности, получают посредством презентирования антител или фрагментов антител, имеющих различные мутации в CDR, на поверхности фага посредством фагового дисплея с последующим скринингом с использованием антигена (см., например, Wu, et al., PNAS, 95, 6037-6042 (1998); Schier, R., et al., J. Mol. Biol., 263, 551-567 (1996); Schier, R., et al., J. Mol. Biol., 255, 28-43 (1996); Yang, W. P., et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403 (1995)). Настоящее изобретение также относится к антителу, содержащему CDR, подвергаемые созреванию аффинности такими способами.

[0086] Примеры других способов получения антител включают способ Adlib, посредством которого получают антитело-продуцирующую линию из линии клеток DT40, полученной из B-клеток курицы, обработанной трихостатином A (Seo, H., et al., Nat. Biotechnol., 6, 731-736, 2002), и способ, включающий иммунизацию мышей KM, которым вводили ген антитела человека после разрушения гена антитела мыши для получения антитела человека (Itoh, K., et al., Jpn. J. Cancer Res., 92, 1313-1321, 2001; Koide, A., et al., J. Mol. Biol., 284, 1141-1151, 1998), и эти способы можно использовать для получения антитела по настоящему изобретению.

[0087] Антигенсвязывающий фрагмент антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению можно экспрессировать указанными выше способами с использованием ДНК, кодирующей фрагмент, или посредством фрагментации полноразмерного антитела посредством обработки ферментом, таким как папаин или пепсин.

[0088] Антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению может варьироваться в терминах аминокислотной последовательности, молекулярной массы, изоэлектрической точки, наличия или отсутствия олигосахарида или формы и т.п. в соответствии со способом получения или способом очистки. Однако полученное антитело включают в настоящее изобретение при условии, что оно обладает функцией, эквивалентной функции антитела по настоящему изобретению. Например, в случае, если антитело по настоящему изобретению экспрессируют в E. coli или других прокариотических клетках, остаток метионина добавляют на N-конец аминокислотной последовательности исходного антитела. Это антитело также включено в настоящее изобретение.

[0089] В случае, если антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению является антителом, содержащим N-связанный олигосахарид, в котором фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином восстанавливающего конца, антитело можно получать известным способом или способом, соответствующим ему. Способы получения этого антитела описывают, например, в WO 2002/031140 и публикации патентной заявки Японии № 2009-225781, и их описания включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Более конкретно, антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению можно получать, например, посредством трансформации клеток с дефицитом или отсутствием активности фермента, участвующего в синтезе ГДФ-фукозы, или активности α-1,6-фукозилтрансферазы с использованием вектора, содержащего ДНК, кодирующую антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению, а затем культивирования полученного трансформанта с последующей очисткой целевого антитела против TMEM-180.

Примеры ферментов, участвующих в синтезе ГДФ-фукозы, включают ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу (GMP), ГДФ-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (Fx) и ГДФ-бета-L-фукозо-пирофосфорилазу (GFPP).

В настоящем описании, хотя и нет конкретных ограничений, клетки, предпочтительно, являются клетками млекопитающих, и например, можно использовать клетки CHO с дефицитом или отсутствием активности указанного выше фермента.

Хотя есть случаи, в которых композиция антитела, полученного указанным выше способом, может содержать антитело, в котором фукоза связана с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце, доля антитела, в котором фукоза связана таким образом, составляет 20% по массе или менее, предпочтительно - 10% по массе или менее, более предпочтительно - 5% по массе или менее, и наиболее предпочтительно - 3% по массе или менее общей массы антитела.

[0090] Кроме того, антитело, содержащее N-связанный олигосахарид, в котором фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце, можно получать посредством встраивания вектора, содержащего ДНК, кодирующую антитело против TMEM-180 по настоящему изобретению, в яйца насекомых, позволяя яйцам вылупиться и вырасти в насекомых, а затем осуществляя кроссбридинг насекомых, по мере необходимости, для получения трансгенных насекомых с последующим выделением антитела против TMEM-180 из трансгенных насекомых или их секретов. В качестве трансгенных насекомых можно использовать тутовых шелкопрядов, и в этом случае антитело можно выделять из кокона.

Хотя есть случаи, в которых композиция антитела, получаемого этим способом, может содержать антитело, в котором фукоза связана с N-ацетилглюкозамином восстанавливающего конца, доля антитела, в котором фукоза связана таким образом, составляет 20% по массе или менее, предпочтительно - 10% по массе или менее, более предпочтительно - 5% по массе или менее, и наиболее предпочтительно - 3% по массе или менее общей массы тела.

[0091] (Активность антитела по настоящему изобретению)

Механизм эффективности лекарственного средства на основе антитела основан на двух типах биологической активности, ассоциированной с антителом. Первая из них является связывающей активностью, специфической для антигена-мишени, в котором функцию молекулы антигена-мишени нейтрализуют в результате связывания с ним. Нейтрализацию функции молекулы антигена-мишени проявляет Fab-область.

[0092] Другим типом биологическом активности является биологическая активность антитела, обозначаемая как эффекторная активность. Эффекторную активность проявляет Fc-область антитела в форме, например, антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) или прямой индукции апоптоза.

Активность антитела против TMEM-180 по настоящему изобретению можно измерять указанными ниже способами.

[0093] (1) Связывающая активность

Связывающую активность антитела можно измерять известным способом, таким как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ферментный иммунологический анализ (EIA), радиоиммунологический анализ (RIA), флуоресцентный анализ с использованием антител или FACS.

[0094] (2) Активность ADCC

Активность ADCC относится к активности, повреждающей клетку-мишень, если антитело по настоящему изобретению связано с антигеном на поверхности клетки-мишени, и имеющая Fcγ-рецептор клетка (эффекторная клетка) связывается с его Fc-остатком с помощью Fcγ-рецептора.

Активность ADCC можно определять посредством смешивания клетки-мишени, экспрессирующей TMEM-180, эффекторной клетки и антитела по настоящему изобретению и измерения степени ADCC. Примеры эффекторных клеток, которые можно использовать, включают клетки селезенки мыши и моноциты, выделенные из периферической крови или костного мозга человека. В качестве клеток-мишеней можно использовать, например, TMEM-180-положительные клетки слизистой оболочки рака толстого кишечника. Клетки-мишени предварительно метили с помощью метки, такой как ⁵¹Cr, и затем к ним добавляют антитело по настоящему изобретению и инкубируют, с последующим добавлением подходящего соотношения эффекторных клеток и клеток-мишеней и инкубацией. После инкубации собирают супернатант, и можно измерять активность ADCC, подсчитывая уровень указанной выше метки в супернатанте.

[0095] (3) Активность CDC

Активность CDC относится к цитотоксической активности, включающей комплемент.

Активность CDC можно измерять с использованием комплемента вместо эффекторных клеток в тестировании активности ADCC.

[0096] (4) Активность ингибирования роста опухоли

Активность ингибирования роста опухоли можно измерять с использованием моделей опухолей на животных. Например, антитело по настоящему изобретению вводят после трансплантации опухоли под кожу мыши. Эффект ингибирования роста опухоли можно измерять посредством сравнения объема ткани опухоли между группой, которой не вводили дозу, и группой, которой вводили дозу.

Кроме того, активность ингибирования роста опухоли по настоящему изобретению может являться активностью, возникающей в результате ингибирования роста отдельных клеток или возникающей в результате индуцирования гибели клеток.

[0097] (Способ тестирования и набор для тестирования)

Как описано выше, TMEM-180 экспрессируется исключительно в конкретных злокачественных клетках. Таким образом, способ тестирования злокачественного новообразования по настоящему изобретению относится к этапу измерения количества TMEM-180 в образце, полученном от индивидуума.

В настоящем описании, образец, полученный от индивидуума, может являться любым образцом, подходящим для тестирования злокачественного новообразования, и специалист в этой области может соответствующим образом определять его и собирать в соответствии с типом злокачественного новообразования. Неограничивающие примеры образцов включают сыворотку, плазму, цельную кровь, мочу, кал, целомическую жидкость и ткань. В случае тестирования на рак толстого кишечника образец может являться тканью, собранной от индивидуума с помощью колоноскопа или т.п., или клетками слизистой оболочки, содержащимися в смывах после колоноскопии.

[0098] Карциноэмбриональный антиген (CEA) общепринято широко используют в качестве маркера рака толстого кишечника. Хотя уровни CEA в плазме снижаются в результате лечения, такого как хирургическое удаление злокачественного новообразования, т.к. они снова повышаются, сопровождая рецидивирование или метастазирование, измерение уровня CEA используют для мониторинга прогресса после лечения. В случаях, когда наблюдают, что уровень CEA снова повышается, необходимы последующие осмотры, включающие абдоминальную ультрасонографию и абдоминальную КТ. Однако, т.к. только у 45% пациентов с раком толстого кишечника наблюдают повышение уровня CEA, пациентов со злокачественным новообразованием типа, не проявляющего повышение уровня CEA, необходимо подвергать нескольким раундам последующих осмотров для мониторинга их прогресса.

[0099] В отличие от этого, уровни TMEM-180 в плазме повышаются даже у пациентов, не проявляющих повышение уровней CEA, и являются более низкими после хирургического вмешательства, чем до него, как указано в примерах для последующего описания. Кроме того, также наблюдают, что уровни TMEM-180 в плазме временно снижаются после хирургического вмешательства, а затем демонстрируют значительное повышение во время рецидива. Показано, что это повышение наблюдают, в частности, у пациентов, не проявляющих повышение уровней CEA во время рецидива. Таким образом, его считают чрезвычайно применимым маркером, который можно использовать у широкого диапазона пациентов со злокачественным новообразованием.

Способ тестирования злокачественного новообразования по настоящему изобретению можно использовать для диагностики злокачественного новообразования или их можно использовать для подтверждения рецидивирования или метастазирования при мониторинге прогресса после хирургического вмешательства или другого лечения.

[0100] В настоящем описании "этап измерения количества TMEM-180 в образце" включает не только этап подсчета количества TMEM-180, но также включает этап определения наличия или отсутствия TMEM-180, этап определения изменения количества TMEM-180 и этап сравнения с количеством TMEM-180, присутствующим в другом образце.

[0101] Количество TMEM-180 в образце можно измерять любым способом, используемым для измерения количества конкретного белка в образце, и его неограничивающие примеры включают иммунологический анализ (включая агглютинацию и турбидиметрию), вестерн-блоттинг и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Из них легким и применимым является иммунологический анализ с использованием антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента.

Т.к. TMEM-180 является мембранным белком, его количество можно измерять после солюбилизации мембранного белка посредством обработки коммерчески доступным буфером для лизиса клеток, неионным поверхностно-активным веществом, реагентом для солюбилизации мембранного белка или т.п.

[0102] В иммунологическом анализе используют антитело против TMEM-180, меченое, чтобы сделать возможной последующую детекцию, и/или антитело против антитела против TMEM-180, меченое, чтобы сделать возможной последующую детекцию (вторичное антитело). Способы мечения антитела классифицируют на ферментный иммунологический анализ (EIA или ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), флуоресцентный иммунологический анализ (FIA), флуоресцентный поляризационный иммунологический анализ (FPIA), хемилюминесцентный иммунологический анализ (CLIA), флуоресцентный ферментный иммунологический анализ (FLEIA), хемилюминесцентный ферментный иммунологический анализ (CLEIA), электрохемилюминесцентный иммунологический анализ (ECLIA) и т.п., и любой из этих способов можно использовать в способе по настоящему изобретению.

[0103] Антитело, меченое ферментом, таким как пероксидаза или щелочная фосфатаза, используют в способе ELISA, антитело, меченое радиоактивным веществом, таким как ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³H, используют в способе RIA, антитело, меченое флуоресцентным веществом, таким как флуоресцеин изоцианат, родамин, дансил хлорид, фикоэритрин, тетраметилродамин изотиоцианат или флуоресцентный материал ближней ИК-области используют в способе FPIA, и антитело, меченое люминесцентным веществом, таким как люцифераза, люциферин или экворин, используют в способе CLIA. Также можно определять антитела, меченые другими веществами наподобие наночастиц, такие как коллоиды металлов или квантовые точки.

Кроме того, при использовании иммунологического анализа антитело против TMEM-180 также можно определять посредством мечения биотином, а затем связывания с авидином или стрептавидином, меченым ферментом и т.п.

[0104] Среди этих иммунологических анализов, способ ELISA с использованием ферментной метки позволяет легко и быстро измерять антиген.

Способ ELISA включает конкурентный способ и сэндвич-способ. В конкурентном способе антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на микропланшете или другой твердофазной подложке, и образец и меченый ферментом TMEM-180 добавляют к нему, затем позволяя произойти реакции антиген-антитело. После промывки подложки комплексу антиген-антитело позволяют реагировать с субстратом фермента, что приводит к проявлению окраски, с последующим измерением оптического поглощения. Окрашивание является более светлым, если большее количество TMEM-180 содержится в образце, и более темным, если лишь небольшое его количество содержится в образце, количество TMEM-180 можно определять с использованием калибровочной кривой.

В сэндвич-способе антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на твердофазной подложке, после добавления образца и осуществления реакции добавляют меченое ферментом антитело против TMEM-180, распознающее другой эпитоп и позволяют им реагировать. После промывки полученному комплексу позволяют реагировать с субстратом фермента для проявления окраски с последующим измерением оптического поглощения для определения количества TMEM-180. В сэндвич-способе после реакции TMEM-180 в образце с антителом, иммобилизованном на твердофазной подложке, можно добавлять немеченое антитело (первичное антитело), а затем добавлять к нему меченое ферментом антитело к этому немеченому антителу (вторичное антитело).

Примеры субстратов фермента, которые можно использовать в случае, если фермент является пероксидазой, включают 3,3'-диаминобензидин (DAB), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) и o-фенилендиамин (OPD), в то время как примеры субстратов в случае, если фермент является щелочной фосфатазой, включают p-нитрофенилфосфат (NPP).

Альтернативно, антиген TMEM-180 в образце можно иммобилизовать непосредственно на планшете для микротитрования или другой твердофазной подложке, и после осуществления необходимого блокирования добавляют немеченое антитело (первичное антитело) с последующим мечением ферментом и добавлением антитела против этого немеченого антитела (вторичного антитела).

[0105] В настоящем описании нет конкретных ограничений в отношении "твердофазной подложки" при условии, что она является подложкой, на которой можно иммобилизовать антитело, и ее примеры включают планшеты для микротитрования, сделанные из стекла, металла, смолы или т.п. субстратов, бус, нитроцеллюлозных мембран, нейлоновых мембран и мембран PVDF, и целевое вещество можно иммобилизовать на этих твердофазных подложках известными способами.

[0106] Кроме того, среди этих иммунологических анализов предпочтительными являются способы агглютинации, т.к. они позволяют легко определять незначительное количество белка. Примеры способов агглютинации включают латексную агглютинацию, в которой используют частицы латекса, связанные с антителом.

Если антителу против TMEM-180 позволяют связываться с частицами латекса, а затем смешивают с обработанным соответствующим образом образцом, антитело-связанные частицы латекса в конечном итоге агглютинируют при наличии TMEM-180. Таким образом, можно определять концентрацию антигена, подсчитывая количество агломерата, облучая образец светом в ближней ИК-области и измеряя оптическое поглощение (турбидиметрия) или измеряя рассеянный свет (нефелометрия).

[0107] Можно использовать описываемое выше антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий указанные выше последовательности CDR, для антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0108] Набор для тестирования злокачественного новообразования по настоящему изобретению является набором для тестирования на злокачественное новообразование с использованием указанного выше способа тестирования и содержит антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент. В дополнение к антителу против TMEM-180 или его антигенсвязывающему фрагменту, набор для тестирования злокачественного новообразования по настоящему изобретению также может содержать реагенты и устройства, необходимые для измерения количества TMEM-180 в образце посредством иммунологического анализа.

[0109] Один из аспектов набора для тестирования является набором для измерения TMEM-180 сэндвич-способом и содержит планшет для микротитрования, иммобилизованное антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент, меченое щелочной фосфатазой или пероксидазой и субстрат щелочной фосфатазы (такой как NPP) или субстрат пероксидазы (такой как DAB, TMB или OPD).

Иммобилизованное антитело и меченое антитело распознают разные эпитопы.

В этом типе набора иммобилизованное антитело сначала иммобилизуют на планшете для микротитрования, затем соответствующим образом разводят образец и добавляют его, инкубируют, удаляют образец и промывают. Затем добавляют меченое антитело, затем инкубируют и добавляют субстрат для получения окраски. Можно определять количество TMEM-180, измеряя степень окрашивания с использованием спектрофотометра для чтения планшетов для микротитрования и т.п.

[0110] Другой аспект набора для тестирования предназначен для измерения TMEM-180 сэндвич-способом с использованием вторичного антитела и содержит планшет для микротитрования, иммобилизованное антитело против TMEM-180, первичное антитело в форме антитела против TMEM-180, вторичное антитело в форме меченого щелочной фосфатазой или пероксидазой антитела против TMEM-180 и субстрат щелочной фосфатазы (такой как NPP) или субстрат пероксидазы (такой как DAB, TMB или OPD).

Иммобилизованное антитело и первичное антитело распознают разные эпитопы.

В этом типе набора иммобилизованное антитело сначала иммобилизуют на планшете для микротитрования, затем соответствующим образом разводят образец и добавляют его, инкубируют, удаляют образец и промывают. Затем добавляют первичное антитело, затем инкубируют и промывают, после чего добавляют меченое ферментом вторичное антитело и инкубируют, затем добавляя субстрат для проявления окраски. Можно определять количество TMEM-180, измеряя степень окрашивания с использованием спектрофотометра для чтения планшетов для микротитрования и т.п. Использование вторичного антитела позволяет амплифицировать реакцию и повышать чувствительность детекции.

[0111] Набор для тестирования может дополнительно содержать необходимый буферный раствор, раствор для остановки ферментативной реакции или спектрофотометр для чтения планшетов для микротитрования и т.п.

[0112] Меченое антитело не ограничено меченым ферментом антителом, но также может являться антителом, меченым радиоактивным веществом (таким как ²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³H), флуоресцентным веществом (таким как флуоресцеин изоцианат, родамин, дансил хлорид, фикоэритрин, тетраметилродамин изотиоцианат или флуоресцентный материал ближней ИК-области), люминесцентным веществом (таким как люцифераза, люциферин или экворин), наночастицами (такими как коллоиды металлов или квантовые точки) или т.п. Кроме того, в качестве меченого антитела можно использовать биотинилированное антитело и можно добавлять в набор меченый авидин или стрептавидин.

[0113] Еще один аспект набора для тестирования является набором для тестирования, используемым для измерения количества TMEM-180 посредством латексной агглютинации. Этот набор содержит сенсибилизированный антителом против TMEM-180 латекс, и агломераты количественно определяют оптическим способом после смешивания с образцом и антителом против TMEM-180. В набор также предпочтительно включают планшет для реакции агглютинации для визуализации реакции агглютинации.

[0114] Описание всех патентных документов и непатентных документов, процитированных в настоящем описании, включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Примеры

[0115] Хотя далее представлено подробное описание настоящего изобретения на основе примеров, настоящее изобретение ими не ограничено. Специалист в этой области может модифицировать настоящее изобретение в различных формах без отклонения от сущности настоящего изобретения, и все такие модификации включены в объем настоящего изобретения.

[0116] 1. Идентификация молекулы TMEM-180

1) Анализ с помощью ДНК-микрочипа

Использовали аликвоты мРНК по 10 мкг, полученные, соответственно, из пяти типов линий клеток рака толстого кишечника человека (HT29, SW480, LOVO, HCT116 и DLD-1) и двух типов клеток толстого кишечника, полученных от здоровых индивидуумов. Меченую биотином кРНК синтезировали после получения двухцепочечной кДНК из РНК по инструкциям производителя (Affymetrix, Inc.). После фрагментации фрагменты гибридизовали с чипом GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Inc.). Гибриды сканировали с использованием сканера GeneChip 3000 7G (Affymetrix, Inc.). Получали данные CEL, а затем подвергали их статистическому анализу для вычисления значения сигнала в каждом образце. TMEM-180 выбирали в качестве поверхностного маркера, специфичного для клеток рака толстого кишечника, экспрессию которого наблюдали в пяти типах линий клеток рака толстого кишечника человека, но не наблюдали в двух типах клеток толстого кишечника здоровых индивидуумов (фиг. 1A).

[0117] 2) Количественная ПЦР

КДНК в образце клеток ткани рака толстого кишечника (Clontech Laboratories, Inc.) анализировали с помощью анализатора ABI 7500Fast (Applied Biosystems) с использованием прилежащей нормальной ткани толстого кишечника в качестве отрицательного контроля для полученных при хирургическом вмешательстве образцов рака толстого кишечника от пяти пациентов. Использовали 10 мкл 2-кратного TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) и 1 мкл 20-кратного TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционного раствора. Кроме того, количественную ПЦР осуществляли в ускоренном режиме в условиях 40 циклов активации AmpliTaq Gold Enzyme при 95°C и 20 секунд на цикл, денатурации при 95°C в течение 3 секунд и отжига/элонгации в течение 30 секунд при 62°C. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения 7500 Fast System SDS версии 1.3. Результаты вычисления соотношения количества РНК в ткани рака толстого кишечника и количества РНК в нормальной ткани представлены на фиг. 1B для каждого случая. В каждом из случаев подтверждали, что TMEM-180 сильно экспрессируется в ткани рака толстого кишечника по сравнению с нормальной тканью толстого кишечника.

[0118] 3) Гибридизация in situ

Заключенные в парафин срезы ткани рака толстого кишечника (Genostaff Co., Ltd.) подвергали депарафинизации ксиленом, а затем гидратировали этанолом и PBS. Затем срез фиксировали в течение 15 минут 4% параформальдегидом в PBS. После обработки PBS, содержащим 7 мкг/мл протеиназы K (F. Hoffmann-La Roche Ltd.), срез снова фиксировали 4% параформальдегидом в PBS. Срез ацетилировали 0,1 M Трис-HCl (pH 8,0), содержащим 0,25% уксусный ангидрид. После промывки PBS срез дегидратировали этанолом. Затем срез подвергали реакции гибридизации с 300 нг/мл РНК-зонда дигоксигенин-меченого TMEM-180 (последовательность 475 п.н. с 1314-го нуклеотида по 1789-ый нуклеотид записи GeneBank под регистрационным номером NM_024789, Genostaff Co., Ltd.) в течение 16 часов при 60°C. После промывки срез обрабатывали 50 мкг/мл РНКазы A, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,1 M NaCl и 1 мМ ЭДТА. После промывки срезу позволяли реагировать, используя 0,5% блокирующий реакционный раствор (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) с последующей реакцией в течение 1 часа в блокирующем реакционном растворе, содержащем 20% термически обработанную сыворотку овцы (Sigma-Aldrich Co. LLC.). Затем добавляли AP-меченое антитело против DIG (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) и позволяли ему реагировать в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывки проявляли окраску в растворе NBT/NCIP (F. Hoffmann-La Roche Ltd.). Результаты заключения и микроскопического исследования представлены на фиг. 1C и 1D. Подтверждали, что все пять типов ткани рака толстого кишечника являются положительными на TMEM-180, а нормальная слизистая оболочка толстого кишечника - отрицательной.

[0119] 2. Анализ экспрессии TMEM-180 в нормальной ткани

Осуществляли поиск TMEM-180 с использованием общедоступной базы данных PaxDB в форме всеобъемлющей базы данных разнообразных белков (http://pax-db.org/#!home, в которой измерен уровень экспрессии каждого белка посредством анализа уникальных пептидов посредством LC/MS/MS) для исследования измеренных значений в каждом типе нормальной ткани. Помимо TMEM-180, в качестве контролей также исследовали экспрессию следующих молекул.

β-актина (βACT) (молекулы "домашнего хозяйства")

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (молекулы "домашнего хозяйства")

Рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (молекулы-мишени лекарственного средства на основе антитела)

HER2 (молекулы-мишени лекарственного средства на основе антитела)

Карциноэмбрионального антигена (CEA) (молекулы типичного опухолевого маркера)

Результаты внесения данных в файл Excel (2010, Microsoft Corporation) и полученные графики представлены на фиг. 2. Хотя TMEM-180 редко экспрессируется в норме (фиг. 2A), и наблюдали, что он лишь в незначительной степени экспрессируется на тромбоцитах при повышении чувствительности, экспрессия являлась гораздо более низкой, чем у общепринятых молекул-мишеней лекарственных средств на основе антитела против EGFR и HER2 (фиг. 2B), таким образом, подтверждали, что TMEM-180 специфически экспрессируется в ткани злокачественного новообразования.

[0120] 3. Получение антител и FACS различных типов злокачественных клеток

1) Получение антигена

[Реакция ПЦР]

ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием последовательности-метки, встроенной в pET21b с помощью праймеров, указанных ниже.

Используемый в ПЦР фермент: ДНК-полимераза PrimeStar HS (Takara Bio Inc., R010A)

Последовательности праймеров для получения антигена 1 для иммунизации:

(i) cagacctgcacctgaacgtggttgagagctgaggaattgacggtcactgagggactgtaatgctgcacttcgc (SEQ ID NO: 18)

(ii) caaccacgttcaggtgcaggtctgtcttcacgtgctgttgtactggctcgtgttcaagagttcaaactggaggacctg (SEQ ID NO: 19)

(iii) gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc (SEQ ID NO: 20)

(iv) tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg (SEQ ID NO: 21)

Последовательности праймеров для получения антигена 2 для иммунизации:

(i) gcgaagtgcagcattacagtccgatcatctgagtctgctgtgcctcttcattgc (SEQ ID NO: 22)

(ii) caggtcctccagtttgaactcagaagctgcttgcttacgatgattcagcaccaggtcctcgtctac (SEQ ID NO: 23)

(iii) gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc (SEQ ID NO: 24)

(iv) tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg (SEQ ID NO: 25)

[0121] [Обработка ферментом рестрикции]

В течение 2 часов проводили реакцию NdeI (Takara Bio Inc.) и XhoI (Takara Bio Inc.) с экспрессирующим вектором pET21b и продуктами ПЦР по инструкциям производителя, осуществляли электрофорез в 1%-ном агарозном геле, продукты очищали с использованием набора Promega Wizard SV Gal and PCR Clean-up System kit.

[0122] [Реакция лигирования]

Реакцию вектора и вставки проводили в течение 30 минут с использованием Ligation High (Toyobo Co., Ltd.).

[0123] [Трансформация]

Трансформацию осуществляли с использованием Competent High DH5α (Toyobo Co., Ltd.) с последующим культивированием в планшетах, содержащих среду LB (50 мкг/мл).

[0124] [Подтверждение наличия гена]

Плазмиду выделяли из трансформированных E. coli и анализировали последовательность для подтверждения наличия целевой последовательности.

[0125] [Трансформация (E. coli)]

BL21(DE3) трансформировали с использованием плазмиды со встроенной целевой последовательностью.

[0126] [Культивирование]

Трансформированные E. coli инокулировали в 10 мл среды LB и культивировали в течение 16 часов при 37°C, затем среду переносили в 1 л среды LB и культивировали при 37°C. Добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ, когда значение OD при 600 нм достигало 0,6, с последующим дополнительным культивированием в течение 4 часов.

[0127] [Очистка]

Осадок разрушенных E. coli суспендировали в 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl и 6 M GdnHCl с последующим выделением супернатанта из образца после встряхивания в течение 16 часов и очистки с использованием никелевой колонки.

[0128] [Рефолдинг]

Т.к. целевой антиген денатурировался в результате растворения 6 M GdnHCl, осуществляли рефолдинг (развертывание белка) посредством диализа.

Рефолдинг осуществляли в соответствии со следующими этапами в указанных ниже условиях.

(1) 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 3 M GdnHCl, 6 часов

(2) 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 2 M GdnHCl, 6 часов

(3) 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 1 M GdnHCl, 12 часов

(4) 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 0,5 M GdnHCl, 12 часов

(5) 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 150 мМ NaCl, 50 мМ L-Arg, 6 часов

(6) 50 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 150 мМ NaCl, 50 мМ L-Arg, 6 часов

Диализный раствор указанного выше образца заменяли 50 мМ фосфатным буфером (pH 8,0) и 500 мМ NaCl с использованием мембраны для ультрафильтрации (Amicon-Ultra 10K).

[0129] [Измерение CD]

Подтверждали содержание спиральной формы для приближения к теоретическому значению с использованием спектрометра кругового дихроизма (JASCO Corporation, J-725) для подтверждения того, сохраняет ли подвергнутый рефолдингу антиген для иммунизации свою стерическую структуру.

[0130] 2) Получение антител

Эмульсию, полученную посредством смешивания антигена для иммунизации 1 или антигена для иммунизации 2, разведенного в PBS до 100 мкг/мл, с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, вводили в аликвотах 100 мкл с обеих сторон основания хвостовой вены крыс (Japan SLC, Inc., Wistar, самки возрастом от 6 до 8 недель). Кровь собирали из хвостовой вены на 12-13 день после иммунизации и оценивали титры антител в сыворотке посредством ELISA с использованием полученной антисыворотки и антигена для иммунизации для твердофазного анализа или проточной цитометрии с использованием клеток DLD-1 и клеток K562 для выбора индивидуумов для использования в слиянии клеток. Рассекали подвздошные лимфоузлы, паховые лимфоузлы, подмышечные лимфоузлы и подколенные лимфоузлы индивидуумов, выбранных через 14 дней после иммунизации, и клетки лимфоузлов и миеломные клетки мыши p3X63 подвергали слиянию способом с использованием PEG. Супернатант культур выделяли через 10-14 дней после слияния и антитело-продуцирующие гибридомные клетки, положительные на DLD-1 клетки и отрицательные K562 клетки, подвергали селекции посредством проточной цитометрии. Выбранные антитело-продуцирующие гибридомные клетки клонировали по отдельности и адаптировали посредством предельного разведения. Изотипы антител идентифицировали посредством изотип-специфической ELISA (Bethyl Laboratories).

Клонированными по отдельности клонами являлись клон 98, клон 101, клон 212 (являющиеся антителами IgM), клон 129, клон 382, клон 1361 (являющиеся антителами IgG), клон 669, клон 699, клон 1052 и клон 1105 (являющиеся антителами IgM).

[0131] 3) Проточная цитометрия

Злокачественные клетки, предназначенные для измерения, культивировали в среде, а затем добавляли в 96-луночный планшет с V-образным дном (Corning Incorporated) до концентрации 1×10⁵ клеток/лунку. Планшеты центрифугировали в течение 3 минут при 440×g и 4°C с последующим удалением супернатанта, добавлением супернатанта антитело-продуцирующей гибридомной культуры или раствора антител к клеточному осадку в количестве 50 мкл/лунку и его суспендированием. После реакции на льду в течение 45 минут планшет промывали три раза смесью 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА и PBS в количестве 200 мкл/лунку. Удаляли супернатант и к клеточному осадку добавляли вторичное антитело в количестве 50 мкл/лунку, затем суспендируя в нем клетки. В качестве вторичного антитела использовали IgG козы против крысы, меченое AlexaFluor 647, (H-L) (Life Technologies Corporation) после 400-кратного разведения смесью 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА и PBS. После реакции на льду в течение 45 минут планшет промывали три раза смесью 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА и PBS в количестве 200 мкл/лунку. После удаления супернатанта к клеточному осадку добавляли 50 нг/мл пропидия йодида, 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА и PBS в количестве 250 мкл/лунку с последующим суспендированием в нем. Окрашенные таким образом клетки измеряли с использованием проточного цитометра, такого как Guava easyCyte 8HT (Merck Millipore Corporation), с последующим анализом полученных данных с использованием FlowJO (Tomy Digital Biology Co., Ltd.). Анализ FACS осуществляли с использованием клеток рака толстого кишечника, опухоли головного мозга и гемобластоза.

[0132] Результаты анализа FACS с использованием полученного антитела IgM против TMEM-180 представлены на фиг. 3. Клон 98 являлся положительным на все шесть типов рака толстого кишечника и все четыре типа опухоли головного мозга, в то время как клон 101 являлся положительным на четыре типа рака толстого кишечника и отрицательным на все опухоли головного мозга. Клон 212 являлся положительным на все шесть типов рака толстого кишечника и только один тип опухоли головного мозга. Все клоны являлись отрицательными на гемобластозы.

[0133] 4. Флуоресцентное иммуноокрашивание клеток рака толстого кишечника DLD-1

Клетки DLD-1 добавляли на 96-луночный планшет (Corning Incorporated, CellBIND) в концентрации 5×10³ клеток/лунку и подвергали окрашиванию клеток после культивирования в течение 2 дней. Клетки подвергали фиксации и обработке для повышения проницаемости указанным ниже способом. После промывания планшета для культивирования клеток дважды PBS в количестве 200 мкл/лунку, промывочные жидкости удаляли, а затем добавляли 4% параформальдегид-фосфатный буфер (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), содержащий 0,1% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), в количестве 100 мкл/лунку, одновременно охлаждая на льду и фиксируя клетки в течение 10 минут. После удаления фиксирующего раствора планшет однократно промывали PBS в количестве 200 мкл/лунку и однократно смесью 1% FBS в PBS в количестве 200 мкл/лунку для получения планшета с иммобилизованными клетками. Клетки окрашивали указанным ниже способом. А именно, после удаления среды из планшета для культивирования неиммобилизованных клеток и удаления промывочных жидкостей из планшета с иммобилизованными клетками супернатант продуцирующей клетки гибридомной культуры или разбавленный раствор антитела добавляли в количестве 50 мкл/лунку. После реакции на льду в течение 1 часа планшет однократно промывали PBS в количестве 200 мкл/лунку и дважды смесью 1% FBS в PBS в количестве 200 мкл/лунку. После удаления промывочных жидкостей добавляли смесь 5 мкг/мл меченого AlexaFluor 647 IgG козы против крысы (H-L), 2 мкг/мл Хехст 33342 и 1% FBS/PBS в количестве 50 мкл/лунку. После реакции на льду в течение 1 часа планшет промывали дважды PBS в количестве 200 мкл/лунку. Затем добавляли PBS в количестве 50 мкл/лунку с последующим измерением с использованием ArrayScan (Thermo Fisher Scientific Inc.).

Результаты флуоресцентного иммуноокрашивания с использованием клонов 98, 101 и 212 антитела IgM против TMEM-180 представлены на фиг. 4. Клон 98 демонстрировал окрашивание, главным образом, в мембране. Клоны 101 и 212 проявляли более слабую интенсивность флуоресценции, чем клон 98, и цитоплазма тоже окрашивалась.

[0134] 5. FACS родительской линии DLD-1 и нокаутной по TMEM-180 линии с использованием антитела против TMEM-180

1) Получение нокаутных клеток

[Трансфекция]

2,5 мкг плазмиды Sigma CRISPR/Cas9 System (HS0000468201) разводили с помощью 0,5 мл Opti-MEM (Invitrogen Corporation) с последующим добавлением 11 мкл липофектамина LTX. После отстаивания в течение 30 минут при комнатной температуре клетки DLD-1 (6,26×10⁵ клеток/лунку, 6-луночный планшет (Corning Incorporated)) добавляли к препарату ДНК для липофекции.

[0135] [Селекция GFP-экспрессирующих клеток]

Клетки, культивируемые в течение 2 дней после трансфекции, подвергали клеточному сортингу с использованием клеточного сортера FACSAria (BD) для получения лишь тех клеток, которые экспрессируют GFP.

[0136] [Клонирование]

После культивирования GFP-экспрессирующих клетки и подтверждения того, что GFP больше не экспрессируется, клетки подвергали предельному разведению в 96-луночном планшете. Очистку генома осуществляли в лунках, содержащих только одну колонию клеток, с использованием набора PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen Corporation) с последующим определением нокаутных клеток посредством подтверждения наличия целевой последовательности.

[0137] 2) Проточная цитометрия

Проточную цитометрию осуществляли способом, описываемым в указанном выше разделе 3. Клон 98 антитела IgM крысы, используемый в качестве первичного антитела, использовали после разведения супернатанта антитело-продуцирующей гибридомной культуры до 1 мкг/мл. Супернатант гибридомной культуры, продуцирующей клон 365 антитела IgM крысы, использовали в качестве отрицательного контроля после аналогичного разведения до 1 мкг/мл. Клон 98 химерного антитела крысы и человека использовали после двукратного разведения супернатанта культуры клеток, непрерывно экспрессирующих химерное антитело. Клон hTF1849 антитела человека против тканевого фактора, клон B8-4 антитела крысы против EpCAM человека, клон 2F10 антитела мыши против CD44v6 человека (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.) и химерное антитело мыши и человека против EGFR (торговое название: эрбитукс), соответственно, использовали в качестве положительных контролей после разведения до 1 мкг/мл. Для разведения каждого из антител использовали смесь RPMI и 10% FBS. Кроме того, концентрацию антитела в супернатанте гибридомной культуры измеряли посредством ELISA, специфичного на IgM крысы (Bethyl Laboratories). Кроме того, использовали вторичное антитело, представляющее собой любое из меченого AlexaFluor 647 IgG козы против крысы (H+L), меченого AlexaFluor 647 IgG козы против человека (H+L) или меченого AlexaFluor 647 IgG козы против мыши (H+L) (Life Technologies Corporation), соответствующее происхождению первичного антитела, после 400-кратного разведения смесью 0,1% BSA, 2 мМ ЭДТА и PBS.

[0138] 3) Получение химерного антитела человека

Тотальную РНК выделяли из линий гибридомных клеток и синтезировали кДНК вариабельных областей H-цепи антитела и вариабельные области L-цепи антитела с помощью набора SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Takara Bio Inc.) с использованием способа 5'-концевой быстрой амплификации концов кДНК (RACE).

Синтезированную кДНК подвергали амплификации посредством ПЦР и клонировали в pUC19 (Invitrogen Corporation). Вариабельные области H-цепи и вариабельные области L-цепи представлены ниже в таблицах 3-22.

[0139] После амплификации вариабельных областе H-цепи и L-цепи посредством ПЦР вариабельную область H-цепи встраивали в pQCxIP, включающий константную область (Clontech Laboratories, Inc.), в то время как вариабельную область L-цепи встраивали в pQCxIH, включающий константную область (Clontech Laboratories, Inc.), для завершения экспрессирующего вектора. Затем с помощью экспрессирующего вектора трансфицировали клетки 293T с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen Corporation). Линию клеток, непрерывно экспрессирующих антитело человека против TMEM-180, подвергали селекции лекарственным средством с использованием пуромицина (Sigma-Aldrich Co. LLC.) в концентрации 10 мкг/мл и гигромицина B (Invitrogen Corporation) в концентрации 1 мг/мл и адаптировали посредством получения линии клеток, резистентной к обоим лекарственным средствам. Устойчивую линию клеток поддерживали культивированием в DMEM (Sigma) с 10% FBS, 1% пенициллином-стрептомицином (Invitrogen Corporation), 10 мкг/мл пуромицина и 1 мг/мл гигромицина B.

[0140] FACS осуществляли на родительской линии клеток рака толстого кишечника DLD-1 и нокаутной по TMEM-180 линии клеток с использованием клона 98 антитела IgM крысы и химерного антитела IgG человека. Результаты представлены на фиг. 5. Клон 98 антитела IgM крысы и химерное антитело IgG человека демонстрировали значительный сдвиг влево. Не наблюдали различий между родительской линией и нокаутной линией при FACS с использованием антитела против тканевого фактора, антитела против EpCAM, антитела против CD44v6 и антитела против EGFR в качестве контролей. Это свидетельствует о том, что клон 98 антитела IgM крысы и химерное антитело IgG человека специфически распознают TMEM-180.

[0141] 6. Иммуноокрашивание фиксированного формалином среза полученного при хирургическом вмешательстве образца рака толстого кишечника человека с помощью антитела против TMEM-180

Проводили реакцию антитела IgM крысы против TMEM-180 (клона 98) с фиксированным формалином срезом рака толстого кишечника в концентрации 1 мкг/мл. HRP-меченое антитело против крысы использовали в качестве вторичного антитела и срез окрашивали DAB с последующим докрашиванием гематоксилином. Результат представлен на фиг. 6. Показано, что рак толстого кишечника окрашивается специфически. Окрашивались и мембраны, и цитоплазма клеток рака толстого кишечника клетки.

[0142] 7. Цитоцидный эффект антитела IgM против TMEM-180

Клетки DLD-1 и клетки K562 добавляли в 96-луночный планшет в концентрации 1×10³ клеток/100 мкл/лунку с последующим культивированием в течение 24 часов. 50 мкл среды удаляли из каждой лунки 96-луночного планшета с последующим добавлением супернатанта гибридомной культуры, продуцирующей клон 98 антитела IgM крысы, или супернатант гибридомной культуры, продуцирующей клон 101 антитела IgM крысы, в котором концентрацию антитела доводили до 80 мкг/мл, 20 мкг/мл или 5 мкг/мл, в количестве 50 мкл/лунку. В этом случае число n в каждом условии культивирования составляло 3, и лунки, содержащие только среду, использовали в качестве контролей.

Добавляют после культивирования в течение 96 часов, WST-8 (Dojindo Laboratories, Cell Counting Kit-8) добавляли в количестве 10 мкл/лунку с последующим измерением поглощения при 450 нм с помощью спектрофотометра для чтения планшетов для микротитрования после культивирования в течение 3 часов. Строили график относительных значений поглощения для каждой концентрации антитела, нанося концентрацию антитела на горизонтальную ось и приписывая значение 1 оптическому поглощению в лунке, содержащей только среду. Результаты представлены на фиг. 7 и 8. И клон 98, и клон 101 демонстрировали цитоцидные эффекты только против клеток рака толстого кишечника DLD-1 и не демонстрировали цитоцидные эффекты против клеток гематологической опухоли K562. Цитоцидные эффекты также наблюдали в случае других клеток рака толстого кишечника Difi, Car1, SW480 и Colo201. Кроме того, схожие эффекты наблюдали в случае клеток опухоли головного мозга LN229 и клеток рака молочной железы MCF7. Таким образом, прогнозировали, что будут продемонстрированы цитоцидные эффекты против широкого спектра злокачественных новообразований, иных, чем гематологические опухоли.

[0143] 8. Определение последовательностей оснований и CDR вариабельной части каждого клона

1) Выделение тотальной РНК

Тотальную РНК выделяли из каждой антитело-продуцирующей гибридомы с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen).

[0144] 2) Получение кДНК

Синтезировали кДНК с помощью набора SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Takara Bio Inc.) способом 5'-концевой быстрой амплификации концов кДНК (RACE) с использованием тотальной РНК, полученной описываемым выше образом.

[0145] 3) Клонирование гена антитела против TMEM-180

Целевой ген амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы PrimeStar HS (Takara Bio Inc.) и указанной выше кДНК. Амплификацию осуществляли посредством ступенчатой ПЦР в условиях амплификации 5 циклов денатурации в течение 10 секунд при 98°C и отжига/элонгации в течение 90 секунд при 72°C, 5 циклов денатурации в течение 10 секунд при 98°C, отжига в течение 5 секунд при 67°C и элонгации в течение 90 секунд при 72°C, и 25 циклов денатурации в течение 10 секунд при 98°C, отжига в течение 5 секунд при 62°C и элонгации в течение 90 секунд при 72°C.

Устройство для ПЦР: термоциклер Takara ПЦР Thermal Cycler Dice Gradient

Используемые последовательности праймеров:

Праймер для H-цепи:

Прямой праймер: CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT (SEQ ID NO: 26)

Прямой праймер: CTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 27)

Обратный праймер: CCCATGGCCACCARATTCTYATCAGACAG (SEQ ID NO: 28)

Праймер L-цепи:

Прямой праймер: CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT (SEQ ID NO: 29)

Прямой праймер: CTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 30)

Обратный праймер: GTTGTTCAWGARGCACACGACTGAGGCA (SEQ ID NO: 31)

Амплифицированные продукты ПЦР H-цепи и L-цепи фосфорилировали с использованием полинуклеотидкиназы T4 (Takara Bio Inc.). Фосфорилированные продукты ПЦР встраивали в pUC19 (Invitrogen Corporation), расщепленный в участке SmaI с использованием реагента Ligation High (Toyobo Co., Ltd.). После встраивания продуктами ПЦР трансформировали DH5α (Toyobo Co., Ltd.) и выделяли плазмиды из отдельных колоний с использованием набора Plasmid Mini Kit (Qiagen).

[0146] 4) Анализ генов

Гены каждой из клонированных H-цепей и L-цепей анализировали на последовательность оснований в гене с использованием ABI Prism 3100 Genetic Analyzer. Последовательности вариабельной области H-цепи и вариабельной области L-цепи каждого клона представлены в таблицах 3-22.

H-цепь клона 98 (SEQ ID NO: 13)

[Таблица 3]

L-цепь клона 98 (SEQ ID NO: 14)

[Таблица 4]

H-цепь клона 101 (SEQ ID NO: 15)

[Таблица 5]

L-цепь клона 101 (SEQ ID NO: 16)

[Таблица 6]

H-цепь клона 212 (SEQ ID NO: 46)

[Таблица 7]

L-цепь клона 212 (SEQ ID NO: 47)

[Таблица 8]

H-цепь клона 129 (SEQ ID NO: 54)

[Таблица 9]

L-цепь клона 129 (SEQ ID NO: 55)

[Таблица 10]

H-цепь клона 382 (SEQ ID NO: 62)

[Таблица 11]

L-цепь клона 382 (SEQ ID NO: 63)

[Таблица 12]

H-цепь клона 1361 (SEQ ID NO: 70)

[Таблица 13]

L-цепь клона 1361 (SEQ ID NO: 71)

[Таблица 14]

H-цепь клона 669 (SEQ ID NO: 78)

[Таблица 15]

L-цепь клона 669 (SEQ ID NO: 79)

[Таблица 16]

H-цепь клона 699 (SEQ ID NO: 86)

[Таблица 17]

L-цепь клона 699 (SEQ ID NO: 87)

[Таблица 18]

H-цепь клона 1052 (SEQ ID NO: 94)

[Таблица 19]

L-цепь клона 1052 (SEQ ID NO: 95)

[Таблица 20]

H-цепь клона 1105 (SEQ ID NO: 102)

[Таблица 21]

L-цепь клона 1105 (SEQ ID NO: 103)

[Таблица 22]

[0147] 9. Способ тестирования злокачественного новообразования, включающий измерение количества TMEM-180

1) Способ ELISA

Далее описан способ ELISA, используемый в следующих примерах.

(Реагенты)

Использовали следующие реагенты.

96-луночный планшет: C8 Maxi Breakapart (Nunc Co., Ltd. #473768)

Раствор для промывки планшета: PBS/0,05% Tween 20

Блокирующий раствор: PBS/1% BSA

Дилюент для антитела: PBS/0,05% Tween 20/1% BSA

Первичное антитело: IgM 98 (гибридомн культура супернатант)

Вторичное антитело: Поликлональные иммуноглобулины кролика против крысы /HRP (Dako #P0450)

Цветопроявляющий раствор: 1-Step Slow TMB-ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc. #34024)

Стоп-раствор: 2 Н H₂SO₄

[0148] (Способ)

Тестирование осуществляли указанным ниже способом.

(i) Иммобилизация антигена

Супернатант культуры, продуцирующей антитело, или сыворотку человека (разведенную 1/10 и 1/50) добавляли в 96-луночный планшет в количестве 50 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C.

(ii) Блокирование

Планшет с иммобилизованным антигеном промывали пять раз раствором для промывки планшета в количестве 200 мкл/лунку. Затем осуществляли блокирование блокирующим раствором в количестве 200 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре.

(iii) Реакция первичного антитела

Планшет с иммобилизованным антигеном пять раз промывали раствором для промывки планшета в количестве 200 мкл/лунку. Затем добавляли раствор антитела IgM 98 в количестве 100 мкл/лунку и 10 мкг/мл с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре.

(iv) Реакция вторичного антитела

Планшет с иммобилизованным антигеном пять раз промывали раствором для промывки планшета в количестве 200 мкл/лунку. Добавляли вторичное антитело, разведенное в 4000 раз, в количестве 100 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре.

(v) Проявление окраски и остановка реакции

Планшет с иммобилизованным антигеном пять раз промывали раствором для промывки планшета в количестве 200 мкл/лунку. Затем добавляли цветопроявляющий раствор в количестве 100 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли стоп-раствор в количестве 100 мкл/лунку.

(vi) Измерение

После остановки реакции измеряли поглощение при 450 нм.

[0149] 2) Измерение количества белка TMEM-180 в супернатанте культуры злокачественных клеток

Линию клеток рака толстого кишечника DLD-1, принудительно экспрессирующих TMEM-180, родительскую линию и линию с нокдауном по TMEM-180 культивировали и промывали PBS приблизительно после достижения конфлуэнтности. Среду заменяли бессывороточной средой DMEM с последующим культивированием в течение ночи и выделением супернатанта на следующий день. Этот супернатант использовали в качестве исследуемого антигена и иммобилизовали на 96-луночном планшете с последующим анализом ELISA способом, описываемым в разделе 1). Кроме того, аналогичный эксперимент осуществляли на линии клеток опухоли головного мозга LN229.

Результаты представлены на фиг. 9. По сравнению с нормальным контролем (только среда), TMEM-180 демонстрировал высокие уровни во всех образцах. Принудительно экспрессирующая линия клеток, родительская линия клеток и линия клеток с нокдауном демонстрировали высокие уровни в этом порядке в отношении клеток рака толстого кишечника DLD-1. Высокие уровни также наблюдали в клетках опухоли головного мозга.

[0150] 3) Измерение количества белка TMEM-180 в плазме пациентов с раком толстого кишечника стадии IV

После разведения плазмы человека, собранной в ЭДТА (полученной из четырех образцов пациентов со стадией IV и нормальных индивидуумов) при коэффициентах разведения 1/10 и 1/50, плазму использовали в качестве исследуемого антигена и иммобилизовали на 96-луночном планшете с последующим ELISA способом, описываемым в разделе 1).

Результаты представлены на фиг. 10. По сравнению с нормальной плазмой, высокие уровни наблюдали во всех образцах пациентов. Кроме того, уровни TMEM-180 в плазме являлись положительным (выше нормальных) даже у пациентов #2 и #4, отрицательных по CEA.

[0151] 4) Измерение количества белка TMEM-180 в плазме пациентов с раком толстого кишечника стадии III до и после хирургического вмешательства

Количество белка TMEM-180 в плазме пациентов с раком толстого кишечника стадии III до и после хирургического вмешательства измеряли тем же способом, что и в разделе 3).

Результаты представлены на фиг. 11. Уровни TMEM-180 снижались после хирургического вмешательства по сравнению с уровнями до хирургического вмешательства у всех пациентов.

[0152] 5) Количество белка TMEM-180 и опухолевого маркера рака толстого кишечника CEA измеряли в плазме пациентов с раком толстого кишечника стадии III, II, IV и IIIa до и после хирургического вмешательства и во время рецидива. Измерение TMEM-180 осуществляли посредством ELISA сэндвич-типа с использованием клона 669 и клона 1361. Средние уровни TMEM-180 в нормальной плазме 8 индивидуумов, измеряемые посредством ELISA также, как и в случае образцов пациентов, использовали в качестве порогового значения TMEM-180. Нормальное значение, используемое в National Cancer Center Japan, использовали в качестве порогового значения CEA.

Результаты представлены на фиг. 12. Пациенты со стадией II являлись положительными на TMEM-180, несмотря на то, что они являлись отрицательными на уровень CEA до хирургического вмешательства. Кроме того, хотя пациенты со стадией IIIa оставались отрицательными по CEA даже после подтверждения рецидивирования посредством КТ, уровни TMEM-180 снова повышались.

Ниже дополнительно указан сэндвич-способ ELISA, используемый в примере раздела 5).

(Реагенты)

Использовали следующие реагенты.

96-луночный планшет: Maxisoap (Nunc Co., Ltd. #442404)

0,1 M фосфатный буфер

Раствор для промывки планшетов: 10 мМ TBS (pH 7,2)/0,05% Tween 20/140 мМ NaCl

Блокирующий раствор: 10 мМ TBS (pH 7,2)/0,05% Tween 20/140 мМ NaCl/1% BSA

Дилюент: 10 мМ TBS (pH 7,2)/0,05% Tween 20/140 мМ NaCl/1% BSA

Иммобилизованное антитело: клон 669

Меченое антитело: Клон 1361

Стрептавидин HRP (Vector Laboratories #SA-5004)

Стоп-раствор: 2 Н H₂SO₄

(Способ)

Измерение осуществляли указанным ниже способом.

(i) Иммобилизация

Иммобилизованный клон 669 антитела, разведенный 0,1 M фосфатным буфером, добавляли в 96-луночный планшет в количестве 50 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C.

(ii) Блокирование

Планшет с иммобилизованным антителом промывали три раза раствором для промывки планшетов в количестве 200 мкл/лунку. Блокирование осуществляли блокирующим раствором в количестве 200 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 30 минут или более при комнатной температуре.

(iii) Добавление антигена

Планшет с иммобилизованным антителом промывали три раза раствором для промывки планшетов в количестве 200 мкл/лунку. Образец для измерения добавляли в планшет с иммобилизованным антителом в количестве 50 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре.

(iv) Реакция меченого антитела

Планшет с иммобилизованным антителом промывали три раза раствором для промывки планшетов в количестве 200 мкл/лунку. Меченый биотином клон 1361, полученный разработанным способом, добавляли в 96-луночный планшет в количестве 50 мкл/лунку после разведения дилюентом с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре.

(v) Реакция со стрептавидином и HRP

Планшет с иммобилизованным антителом промывали три раза раствором для промывки планшетов в количестве 200 мкл/лунку. Дилюент со стрептавидином и HRP добавляли в количестве 50 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре.

(vi) Проявление окраски и остановка реакции

Планшет с иммобилизованным антителом промывали три раза раствором для промывки планшетов в количестве 200 мкл/лунку. Цветопроявляющий раствор добавляли в количестве 100 мкл/лунку с последующей инкубацией в течение 20 минут при комнатной температуре. Стоп-раствор добавляли в количестве 50 мкл/лунку.

(vii) Измерение

Список последовательностей

[0153] В SEQ ID NO: 1-3, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 98.

В SEQ ID NO: 4-6, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 98.

В SEQ ID NO: 7-9, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 101.

В SEQ ID NO: 10-12, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 101.

В SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 98.

В SEQ ID NO: 15 и 16, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 101.

В SEQ ID NO: 17 указана аминокислотная последовательность белка TMEM-180 человека.

В SEQ ID NO: 18-21, соответственно, указаны праймеры (i)-(iv) для получения антигена для иммунизации 1.

В SEQ ID NO: 22-25, соответственно, указаны праймеры (i)-(iv) для получения антигена для иммунизации 2.

В SEQ ID NO: 26-31 указаны праймеры, используемые для клонирования антитела против TMEM-180.

В SEQ ID NO: 40-42, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 212.

В SEQ ID NO: 43-45, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 212.

В SEQ ID NO: 46 и 47, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 212.

В SEQ ID NO: 48-50, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 129.

В SEQ ID NO: 51-53, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 129.

В SEQ ID NO: 54 и 55, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 129.

В SEQ ID NO: 56-58, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 382.

В SEQ ID NO: 59-61, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 382.

В SEQ ID NO: 62 и 63, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 382.

В SEQ ID NO: 64-66, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 1361.

В SEQ ID NO: 67-69, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 1361.

В SEQ ID NO: 70 и 71, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 1361.

В SEQ ID NO: 72-74, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 669.

В SEQ ID NO: 75-77, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 669.

В SEQ ID NO: 78 и 79, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 669.

В SEQ ID NO: 80-82, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 699.

В SEQ ID NO: 83-85, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 699.

В SEQ ID NO: 86 и 87, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 699.

В SEQ ID NO: 88-90, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 1052.

В SEQ ID NO: 91-93, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 1052.

В SEQ ID NO: 94 и 95, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 1052.

В SEQ ID NO: 96-98, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 тяжелой цепи клона 1105.

В SEQ ID NO: 99-101, соответственно, указаны аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легкой цепи клона 1105.

В SEQ ID NO: 102 и 103, соответственно, указаны аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи клона 1105.

В SEQ ID NO: 104-150 указаны аминокислотные последовательности полученных из TMEM-180 пептидов, связывающихся с HLA типа A2, как прогнозируют с помощью HLA Peptide Binding Predictions.

В SEQ ID NO: 151-170 указаны аминокислотные последовательности полученных из TMEM-180 пептидов, связывающихся с HLA типа A24, как прогнозируют с помощью HLA Peptide Binding Predictions.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> National Cancer Center

<120> Антитело против TMEM-180

<130> G0461AGP01

<160> 170

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 98.

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr Asn Val His

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 98.

<400> 2

Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asp

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 98.

<400> 3

Asp Leu Gly Tyr

1

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 98.

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Lys Tyr Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 98.

<400> 5

Gln Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 98.

<400> 6

Cys Gln Gly Ser Tyr Ser Pro His Thr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 101.

<400> 7

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Tyr Met Gln

1 5 10

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 101.

<400> 8

Phe Ile Arg Ser Gly Gly Ser Thr Glu

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 101.

<400> 9

Ala Phe Tyr Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 101.

<400> 10

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Asp

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 101.

<400> 11

Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 101.

<400> 12

Met Gln Ser Asn Thr Lys Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 131

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Тяжелая цепь клона 98.

<400> 13

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Arg Tyr Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Thr Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Ile Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 14

<211> 132

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Легкая цепь клона 98.

<400> 14

Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln

1 5 10 15

Glu Thr His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ala Ile Gly Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Lys Tyr Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Val Phe Gln Ser

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Glu Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Cys Gln Gly Ser Tyr Ser Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Leu Lys

130

<210> 15

<211> 137

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Тяжелая цепь клона 101.

<400> 15

Met Ala Ile Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Ile Pro His Ser

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Thr Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Phe Ile Arg Ser Gly Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Glu Phe Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ala Phe Tyr Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 16

<211> 130

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Легкая цепь клона 101.

<400> 16

Met Gly Ile Arg Met Glu Ser His Thr Arg Val Phe Ile Phe Leu Leu

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Ala Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Thr Ser Ile Ser Ile Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Phe Thr Ile Ser Asn Met Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Met Gln Ser Asn Thr Lys Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Leu Lys

130

<210> 17

<211> 517

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Белок TMEM-180.

<400> 17

Met Gly Leu Gly Gln Pro Gln Ala Trp Leu Leu Gly Leu Pro Thr Ala

1 5 10 15

Val Val Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Phe Thr Thr Ile Leu His Asn Val

20 25 30

Phe Leu Leu Tyr Tyr Val Asp Thr Phe Val Ser Val Tyr Lys Ile Asn

35 40 45

Lys Met Ala Phe Trp Val Gly Glu Thr Val Phe Leu Leu Trp Asn Ser

50 55 60

Leu Asn Asp Pro Leu Phe Gly Trp Leu Ser Asp Arg Gln Phe Leu Ser

65 70 75 80

Ser Gln Pro Arg Ser Gly Ala Gly Leu Ser Ser Arg Ala Val Val Leu

85 90 95

Ala Arg Val Gln Ala Leu Gly Trp His Gly Pro Leu Leu Ala Leu Ser

100 105 110

Phe Leu Ala Phe Trp Val Pro Trp Ala Pro Ala Gly Leu Gln Phe Leu

115 120 125

Leu Cys Leu Cys Leu Tyr Asp Gly Phe Leu Thr Leu Val Asp Leu His

130 135 140

His His Ala Leu Leu Ala Asp Leu Ala Leu Ser Ala His Asp Arg Thr

145 150 155 160

His Leu Asn Phe Tyr Cys Ser Leu Phe Ser Ala Ala Gly Ser Leu Ser

165 170 175

Val Phe Ala Ser Tyr Ala Phe Trp Asn Lys Glu Asp Phe Ser Ser Phe

180 185 190

Arg Ala Phe Cys Val Thr Leu Ala Val Ser Ser Gly Leu Gly Phe Leu

195 200 205

Gly Ala Thr Gln Leu Leu Arg Arg Arg Val Glu Ala Ala Arg Lys Asp

210 215 220

Pro Gly Cys Ser Gly Leu Val Val Asp Ser Gly Leu Cys Gly Glu Glu

225 230 235 240

Leu Leu Val Gly Ser Glu Glu Ala Asp Ser Ile Thr Leu Gly Arg Tyr

245 250 255

Leu Arg Gln Leu Ala Arg His Arg Asn Phe Leu Trp Phe Val Ser Met

260 265 270

Asp Leu Val Gln Val Phe His Cys His Phe Asn Ser Asn Phe Phe Pro

275 280 285

Leu Phe Leu Glu His Leu Leu Ser Asp His Ile Ser Leu Ser Thr Gly

290 295 300

Ser Ile Leu Leu Gly Leu Ser Tyr Val Ala Pro His Leu Asn Asn Leu

305 310 315 320

Tyr Phe Leu Ser Leu Cys Arg Arg Trp Gly Val Tyr Ala Val Val Arg

325 330 335

Gly Leu Phe Leu Leu Lys Leu Gly Leu Ser Leu Leu Met Leu Leu Ala

340 345 350

Gly Pro Asp His Leu Ser Leu Leu Cys Leu Phe Ile Ala Ser Asn Arg

355 360 365

Val Phe Thr Glu Gly Thr Cys Lys Leu Leu Thr Leu Val Val Thr Asp

370 375 380

Leu Val Asp Glu Asp Leu Val Leu Asn His Arg Lys Gln Ala Ala Ser

385 390 395 400

Ala Leu Leu Phe Gly Met Val Ala Leu Val Thr Lys Pro Gly Gln Thr

405 410 415

Phe Ala Pro Leu Leu Gly Thr Trp Leu Leu Cys Phe Tyr Thr Gly His

420 425 430

Asp Leu Phe Gln Gln Ser Leu Ile Thr Pro Val Gly Ser Ala His Pro

435 440 445

Trp Pro Glu Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala Pro Thr Leu Arg

450 455 460

Gln Gly Cys Phe Tyr Leu Leu Val Leu Val Pro Ile Thr Cys Ala Leu

465 470 475 480

Leu Gln Leu Phe Thr Trp Ser Gln Phe Thr Leu His Gly Arg Arg Leu

485 490 495

His Met Val Lys Ala Gln Arg Gln Asn Leu Ser Gln Ala Gln Thr Leu

500 505 510

Asp Val Lys Met Val

515

<210> 18

<211> 73

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 18

cagacctgca cctgaacgtg gttgagagct gaggaattga cggtcactga gggactgtaa 60

tgctgcactt cgc 73

<210> 19

<211> 78

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 19

caaccacgtt caggtgcagg tctgtcttca cgtgctgttg tactggctcg tgttcaagag 60

ttcaaactgg aggacctg 78

<210> 20

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 20

gagatataca tatgtcggag gtgactcgta gtc 33

<210> 21

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 21

tggtgctcga gaataggctg aacatcaaat g 31

<210> 22

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 22

gcgaagtgca gcattacagt ccgatcatct gagtctgctg tgcctcttca ttgc 54

<210> 23

<211> 66

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 23

caggtcctcc agtttgaact cagaagctgc ttgcttacga tgattcagca ccaggtcctc 60

gtctac 66

<210> 24

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 24

gagatataca tatgtcggag gtgactcgta gtc 33

<210> 25

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 25

tggtgctcga gaataggctg aacatcaaat g 31

<210> 26

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 26

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 27

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 27

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 28

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 28

cccatggcca ccarattcty atcagacag 29

<210> 29

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 29

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 30

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 30

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 31

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтезированный праймер.

<400> 31

gttgttcawg argcacacga ctgaggca 28

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 212.

<400> 32

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 212.

<400> 33

Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 212.

<400> 34

His Trp Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 212.

<400> 35

Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 212.

<400> 36

Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 212.

<400> 37

Gln Gln Ser Tyr Lys Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 38

<211> 136

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Тяжелая цепь клона 212.

<400> 38

Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Asn Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr His Trp Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 39

<211> 127

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Легкая цепь клона 212.

<400> 39

Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr

1 5 10 15

Asp Ala Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly

35 40 45

Ile Ser Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser Leu Lys Ile Ser

85 90 95

Gly Met Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr

100 105 110

Lys Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 212.

<400> 40

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 212.

<400> 41

Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 212.

<400> 42

His Trp Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 212.

<400> 43

Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 212.

<400> 44

Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 212.

<400> 45

Gln Gln Ser Tyr Lys Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 46

<211> 136

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 212.

<400> 46

Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Asn Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Lys Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr His Trp Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 47

<211> 127

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 212.

<400> 47

Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr

1 5 10 15

Asp Ala Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly

35 40 45

Ile Ser Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser Leu Lys Ile Ser

85 90 95

Gly Met Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr

100 105 110

Lys Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 129.

<400> 48

Asp Cys Ala Leu Asn

1 5

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 129.

<400> 49

Trp Ile Asn Thr Gln Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

1 5 10 15

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 129.

<400> 50

Glu Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 129.

<400> 51

Gln Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Phe Ile Ala

1 5 10

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 129.

<400> 52

Tyr Thr Ser Thr Leu Val Ser

1 5

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 129.

<400> 53

Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Arg

1 5

<210> 54

<211> 136

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 129.

<400> 54

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Val Val Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Cys Ala Leu Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Gln Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gln Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Ile Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 55

<211> 126

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 129.

<400> 55

Met Arg Thr Ser Ile Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu His

1 5 10 15

Asp Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Asp Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ile Asn Lys Phe Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Arg His Leu Val His Tyr Thr Ser Thr Leu Val Ser Gly Thr Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Asn Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp

100 105 110

Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 382.

<400> 56

Asn Tyr Gly Met His

1 5

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 382.

<400> 57

Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

1 5 10 15

<210> 58

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 382.

<400> 58

Ser Ala Ser Ile Thr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Ala

1 5 10

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 382.

<400> 59

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Asp

1 5 10

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 382.

<400> 60

Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 382.

<400> 61

Met Gln Ser Asn Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 62

<211> 141

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 382.

<400> 62

Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Gly Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Ala Ser Ile Thr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met

115 120 125

Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 63

<211> 127

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 382.

<400> 63

Met Glu Ser His Thr Arg Val Phe Ile Phe Leu Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ala Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser

20 25 30

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Val Gly Ser Asn Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Met Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn

100 105 110

Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

115 120 125

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 1361.

<400> 64

Asn Tyr Trp Met Thr

1 5

<210> 65

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 1361.

<400> 65

Ser Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

1 5 10 15

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 1361.

<400> 66

Ala Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 1361.

<400> 67

Lys Ala Gly Gln Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 1361.

<400> 68

Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr

1 5

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 1361.

<400> 69

Gln Gln Tyr Ser Ser Gly Trp

1 5

<210> 70

<211> 140

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 1361.

<400> 70

Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Asn Asn Tyr Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Leu Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 71

<211> 126

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 1361.

<400> 71

Met Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Ala Met Arg Cys Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser

100 105 110

Ser Gly Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 669.

<400> 72

Asp Tyr Trp Val Ser

1 5

<210> 73

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 669.

<400> 73

Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Ala Thr Asn Phe Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

<210> 74

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 669.

<400> 74

Asp Gly Thr Met Gly Ile Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 75

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 669.

<400> 75

Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Arg Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 669.

<400> 76

Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr

1 5

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 669.

<400> 77

Leu Gln His Asn Ser Trp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 78

<211> 139

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 669.

<400> 78

Met Gly Trp Ile Cys Ile Ile Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asp Tyr Trp Val Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Ala Thr Asn Phe Asn Glu

65 70 75 80

Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr

100 105 110

Tyr Cys Thr Arg Asp Gly Thr Met Gly Ile Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 79

<211> 127

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 669.

<400> 79

Met Met Ala Ala Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Ala Met Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ile Asn Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asn

100 105 110

Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 699.

<400> 80

Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5

<210> 81

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 699.

<400> 81

Ala Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly Lys

<210> 82

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 699.

<400> 82

Ile His Gly Gly Tyr Arg Tyr Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 699.

<400> 83

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 84

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 699.

<400> 84

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 699.

<400> 85

Leu Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 86

<211> 139

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 699.

<400> 86

Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ala Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile His Gly Gly Tyr Arg Tyr Trp Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 87

<211> 128

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 699.

<400> 87

Met Asp Phe Gln Val Gln Ser Phe Ser Leu Leu Leu Ile Ser Ile Thr

1 5 10 15

Val Ile Val Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr

20 25 30

Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg

100 105 110

Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 1052.

<400> 88

Ser Asn Gly Val Gly

1 5

<210> 89

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 1052.

<400> 89

Thr Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Val Gln Ser

1 5 10 15

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 1052.

<400> 90

Glu Tyr Met Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 91

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 1052.

<400> 91

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Gly

1 5 10

<210> 92

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 1052.

<400> 92

Trp Ala Ser Asn Arg Asp Thr

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 1052.

<400> 93

Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 94

<211> 134

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 1052.

<400> 94

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Gln

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Ser Asn Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Pro Leu Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Val Trp Met Gly Thr Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Gly Val Gln Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Gly Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 95

<211> 127

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 1052.

<400> 95

Met Glu Leu Ile Ser Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Val Tyr Gly Asn Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Phe

20 25 30

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Val Gly Ile Asn Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Arg Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Asp Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Met Gln Ala Glu Asp Pro Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn

100 105 110

Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи клона 1105.

<400> 96

Ser Asn Gly Val Gly

1 5

<210> 97

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи клона 1105.

<400> 97

Thr Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Val Gln Ser

1 5 10 15

<210> 98

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи клона 1105.

<400> 98

Glu Glu Lys Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 99

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR1 легкой цепи клона 1105.

<400> 99

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Gly

1 5 10

<210> 100

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR2 легкой цепи клона 1105.

<400> 100

Trp Ala Ser Asn Arg Asp Thr

1 5

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> CDR3 легкой цепи клона 1105.

<400> 101

Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg Ala

1 5

<210> 102

<211> 134

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи клона 1105.

<400> 102

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Gln

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Ser Asn Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Pro Leu Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Val Trp Met Gly Thr Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Val Gln Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Gly Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Lys Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 103

<211> 127

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи клона 1105.

<400> 103

Met Glu Leu Ile Ser Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Val Tyr Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser

20 25 30

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Val Gly Ile Asn Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Arg Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Asp Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Met Gln Ala Glu Asp Pro Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn

100 105 110

Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

115 120 125

<210> 104

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Предсказанный пептид, связывающийся с HLA типа A2, полученный из

белка TMEM-180.

<400> 104

Cys Leu Tyr Asp Gly Phe Leu Thr Leu Val

1 5 10

<210> 105

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

protein.

<400> 105

Phe Leu Leu Tyr Tyr Val Asp Thr Phe Val

1 5 10

<210> 106

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 106

Phe Leu Trp Phe Val Ser Met Asp Leu Val

1 5 10

<210> 107

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 107

Phe Leu Ser Leu Cys Arg Arg Trp Gly Val

1 5 10

<210> 108

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 108

Phe Leu Leu Lys Leu Gly Leu Ser Leu Leu

1 5 10

<210> 109

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 109

Lys Leu Leu Thr Leu Val Val Thr Asp Leu

1 5 10

<210> 110

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 110

Ala Leu Leu Phe Gly Met Val Ala Leu Val

1 5 10

<210> 111

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 111

Ala Leu Phe Thr Thr Ile Leu His Asn Val

1 5 10

<210> 112

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 112

Trp Leu Leu Gly Leu Pro Thr Ala Val Val

1 5 10

<210> 113

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 113

Gln Leu Phe Thr Trp Ser Gln Phe Thr Leu

1 5 10

<210> 114

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 114

Leu Ala Leu Ser Phe Leu Ala Phe Trp Val

1 5 10

<210> 115

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 115

Lys Leu Gly Leu Ser Leu Leu Met Leu Leu

1 5 10

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 116

Gly Leu Gly Gln Pro Gln Ala Trp Leu Leu

1 5 10

<210> 117

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 117

Thr Leu His Gly Arg Arg Leu His Met Val

1 5 10

<210> 118

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 118

Leu Leu Trp Asn Ser Leu Asn Asp Pro Leu

1 5 10

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 119

Ser Leu Asn Asp Pro Leu Phe Gly Trp Leu

1 5 10

<210> 120

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 120

Thr Leu Val Asp Leu His His His Ala Leu

1 5 10

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 121

Lys Met Ala Phe Trp Val Gly Glu Thr Val

1 5 10

<210> 122

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 122

Tyr Leu Leu Val Leu Val Pro Ile Thr Cys

1 5 10

<210> 123

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 123

Asn Leu Ser Gln Ala Gln Thr Leu Asp Val

1 5 10

<210> 124

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 124

Leu Leu Thr Leu Val Val Thr Asp Leu Val

1 5 10

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 125

Leu Leu Ser Asp His Ile Ser Leu Ser Thr

1 5 10

<210> 126

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 126

Leu Met Leu Leu Ala Gly Pro Asp His Leu

1 5 10

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 127

Arg Gln Leu Ala Arg His Arg Asn Phe Leu

1 5 10

<210> 128

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 128

Cys Leu Cys Leu Tyr Asp Gly Phe Leu Thr

1 5 10

<210> 129

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 129

Leu Leu Cys Phe Tyr Thr Gly His Asp Leu

1 5 10

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 130

Val Leu Val Pro Ile Thr Cys Ala Leu Leu

1 5 10

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 131

Leu Leu Ala Gly Pro Asp His Leu Ser Leu

1 5 10

<210> 132

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 132

Phe Gly Trp Leu Ser Asp Arg Gln Phe Leu

1 5 10

<210> 133

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 133

Ser Leu Cys Arg Arg Trp Gly Val Tyr Ala

1 5 10

<210> 134

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 134

Leu Gln Leu Phe Thr Trp Ser Gln Phe Thr

1 5 10

<210> 135

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 135

Phe Leu Ser Ser Gln Pro Arg Ser Gly Ala

1 5 10

<210> 136

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 136

Gly Leu Gly Phe Leu Gly Ala Thr Gln Leu

1 5 10

<210> 137

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 137

Gly Leu Gln Phe Leu Leu Cys Leu Cys Leu

1 5 10

<210> 138

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 138

Ala Leu Ser Ala His Asp Arg Thr His Leu

1 5 10

<210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 139

Gln Leu Leu Arg Arg Arg Val Glu Ala Ala

1 5 10

<210> 140

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 140

Val Val Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Phe Thr

1 5 10

<210> 141

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 141

Leu Leu Val Leu Val Pro Ile Thr Cys Ala

1 5 10

<210> 142

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 142

Leu Leu Phe Gly Met Val Ala Leu Val Thr

1 5 10

<210> 143

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 143

Ser Met Asp Leu Val Gln Val Phe His Cys

1 5 10

<210> 144

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 144

Ala Leu Leu Ala Asp Leu Ala Leu Ser Ala

1 5 10

<210> 145

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 145

Tyr Ala Val Val Arg Gly Leu Phe Leu Leu

1 5 10

<210> 146

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 146

Tyr Lys Ile Asn Lys Met Ala Phe Trp Val

1 5 10

<210> 147

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 147

Phe Asn Ser Asn Phe Phe Pro Leu Phe Leu

1 5 10

<210> 148

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 148

Leu Val Leu Val Pro Ile Thr Cys Ala Leu

1 5 10

<210> 149

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 149

Gly Leu Ser Ser Arg Ala Val Val Leu Ala

1 5 10

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 150

Phe Ala Pro Leu Leu Gly Thr Trp Leu Leu

1 5 10

<210> 151

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Предсказанный пептид, связывающийся с HLA типа A24, полученный из

белка TMEM-180.

<400> 151

Ser Tyr Val Ala Pro His Leu Asn Asn Leu

1 5 10

<210> 152

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 152

Val Tyr Ala Val Val Arg Gly Leu Phe Leu

1 5 10

<210> 153

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 153

Ser Tyr Ala Phe Trp Asn Lys Glu Asp Phe

1 5 10

<210> 154

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 154

Asn Phe Leu Trp Phe Val Ser Met Asp Leu

1 5 10

<210> 155

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 155

Phe Phe Pro Leu Phe Leu Glu His Leu Leu

1 5 10

<210> 156

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 156

Leu Phe Leu Leu Lys Leu Gly Leu Ser Leu

1 5 10

<210> 157

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 157

Thr Phe Ala Pro Leu Leu Gly Thr Trp Leu

1 5 10

<210> 158

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 158

Val Phe Thr Glu Gly Thr Cys Lys Leu Leu

1 5 10

<210> 159

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 159

Asn Phe Phe Pro Leu Phe Leu Glu His Leu

1 5 10

<210> 160

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 160

Ala Phe Trp Val Gly Glu Thr Val Phe Leu

1 5 10

<210> 161

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 161

His Phe Asn Ser Asn Phe Phe Pro Leu Phe

1 5 10

<210> 162

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 162

Lys Leu Leu Thr Leu Val Val Thr Asp Leu

1 5 10

<210> 163

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 163

Val Phe Leu Leu Tyr Tyr Val Asp Thr Phe

1 5 10

<210> 164

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 164

Arg Gln Leu Ala Arg His Arg Asn Phe Leu

1 5 10

<210> 165

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 165

Arg Gly Leu Phe Leu Leu Lys Leu Gly Leu

1 5 10

<210> 166

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 166

Arg Gln Asn Leu Ser Gln Ala Gln Thr Leu

1 5 10

<210> 167

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 167

Leu Phe Thr Thr Ile Leu His Asn Val Phe

1 5 10

<210> 168

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 168

Ser Leu Asn Asp Pro Leu Phe Gly Trp Leu

1 5 10

<210> 169

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 169

Val Phe His Cys His Phe Asn Ser Asn Phe

1 5 10

<210> 170

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

белка TMEM-180.

<400> 170

Leu Phe Gly Trp Leu Ser Asp Arg Gln Phe

1 5 10

<---

Claims

1. Противораковое лекарственное средство для лечения злокачественного новообразования, отличного от гематологических опухолей, содержащее в качестве своего активного ингредиента антитело против трансмембранного белка 180 (TMEM-180) или его антигенсвязывающий фрагмент,

где антитело против TMEM-180 содержит шесть CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: DYWVS (SEQ ID NO: 72);

CDR2 тяжелой цепи: EIYPNSGATNFNENFK (SEQ ID NO: 73);

CDR3 тяжелой цепи: DGTMGIAYYFDY (SEQ ID NO: 74);

CDR1 легкой цепи: KASQNINRYLN (SEQ ID NO: 75);

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 76); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSWPYT (SEQ ID NO: 77); или

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 88);

CDR2 тяжелой цепи: TIWTGGGTNYNSGVQS (SEQ ID NO: 89);

CDR3 тяжелой цепи: EYMGFDY (SEQ ID NO: 90);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 91);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 92); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRT (SEQ ID NO: 93); или

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 96);

CDR2 тяжелой цепи: TIWSGGGTNYNSAVQS (SEQ ID NO: 97);

CDR3 тяжелой цепи: EEKGFAY (SEQ ID NO: 98);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 99);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 100); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRA (SEQ ID NO: 101).

2. Противораковое лекарственное средство для лечения злокачественного новообразования, отличного от гематологических опухолей, содержащее в качестве своего активного ингредиента антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее связанное с ним вещество, имеющее противораковую активность, где антитело против TMEM-180 содержит шесть CDR, указанных ниже:

CDR1 тяжелой цепи: DYWVS (SEQ ID NO: 72);

CDR2 тяжелой цепи: EIYPNSGATNFNENFK (SEQ ID NO: 73);

CDR3 тяжелой цепи: DGTMGIAYYFDY (SEQ ID NO: 74);

CDR1 легкой цепи: KASQNINRYLN (SEQ ID NO: 75);

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 76); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSWPYT (SEQ ID NO: 77); или

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 88);

CDR2 тяжелой цепи: TIWTGGGTNYNSGVQS (SEQ ID NO: 89);

CDR3 тяжелой цепи: EYMGFDY (SEQ ID NO: 90);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 91);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 92); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRT (SEQ ID NO: 93); или

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 96);

CDR2 тяжелой цепи: TIWSGGGTNYNSAVQS (SEQ ID NO: 97);

CDR3 тяжелой цепи: EEKGFAY (SEQ ID NO: 98);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 99);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 100); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRA (SEQ ID NO: 101).

3. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78, и

4. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 94, и

5. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, где антитело против TMEM-180 содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 80% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102, и

6. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, где антитело против TMEM-180 содержит один или несколько N-связанных олигосахаридов, связанных с Fc-областью, и фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце N-связанного олигосахарида.

7. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, направленное против злокачественного новообразования, экспрессирующего TMEM-180.

8. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, направленное против рака толстого кишечника.

9. Противораковое лекарственное средство по п. 1 или 2, вводимое одновременно с вакцинотерапией с использованием композиции, содержащей по меньшей мере один пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 104-170.

10. Антитело против TMEM-180 по любому из пп. 1-6 или его антигенсвязывающий фрагмент.

11. Нуклеиновая кислота, кодирующая любые из CDR1-CDR3 тяжелых цепей и CDR1-CDR3 легких цепей по п. 1 или 2.

12. Нуклеиновая кислота, кодирующая любые из тяжелых цепей и легких цепей по любому из пп. 3-5.

13. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 11 или 12.

14. Трансформант для получения антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащий экспрессирующий вектор по п. 13.

15. Способ получения антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий этапы:

экспрессии антитела в трансформанте по п. 14; и

выделения антитела.

16. Способ тестирования злокачественного новообразования на рецидивирование или метастазирование после лечения, включающий этап измерения количества TMEM-180 в образце, полученном от индивидуума, с использованием антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 10.

17. Способ тестирования злокачественного новообразования по п. 16, где количество TMEM-180 измеряют посредством иммунологического анализа с использованием антитела против TMEM-180 или его антигенсвязывающего фрагмента.

18. Способ тестирования злокачественного новообразования по п. 16 или 17, предназначенный для рака толстого кишечника.

19. Набор для тестирования злокачественного новообразования на рецидивирование или метастазирование после лечения, содержащий антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент, и реагенты и устройства, необходимые для измерения количества TMEM-180 в образце посредством иммунологического анализа,

CDR1 тяжелой цепи: DYWVS (SEQ ID NO: 72);

CDR2 тяжелой цепи: EIYPNSGATNFNENFK (SEQ ID NO: 73);

CDR3 тяжелой цепи: DGTMGIAYYFDY (SEQ ID NO: 74);

CDR1 легкой цепи: KASQNINRYLN (SEQ ID NO: 75);

CDR2 легкой цепи: NANSLQT (SEQ ID NO: 76); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSWPYT (SEQ ID NO: 77); или

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 88);

CDR2 тяжелой цепи: TIWTGGGTNYNSGVQS (SEQ ID NO: 89);

CDR3 тяжелой цепи: EYMGFDY (SEQ ID NO: 90);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 91);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 92); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRT (SEQ ID NO: 93); или

CDR1 тяжелой цепи: SNGVG (SEQ ID NO: 96);

CDR2 тяжелой цепи: TIWSGGGTNYNSAVQS (SEQ ID NO: 97);

CDR3 тяжелой цепи: EEKGFAY (SEQ ID NO: 98);

CDR1 легкой цепи: KASQNVGINVG (SEQ ID NO: 99);

CDR2 легкой цепи: WASNRDT (SEQ ID NO: 100); и

CDR3 легкой цепи: LQHNSYPRA (SEQ ID NO: 101).

20. Набор для тестирования злокачественного новообразования по п. 19, где антитело против TMEM-180 или его антигенсвязывающий фрагмент является антителом против TMEM-180 или его антигенсвязывающим фрагментом по п. 10.

21. Набор для тестирования злокачественного новообразования по п. 19 или 20, предназначенный для рака толстого кишечника.