CN106999576A - 癌细胞特异性抗体、抗癌剂、及癌症的检查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于发现癌特异性表达的靶分子、提供能够特异性地作用于该靶分子从而治疗癌症的抗癌剂，以及提供包括对试样中的靶分子进行测定的工序的癌症检查方法。本发明提供含有抗跨膜蛋白180(TMEM‑180)抗体或其抗原结合片段作为有效成分的抗癌剂。另外，本发明提供癌症检查方法，所述方法包括对从受检者采集的试样中的TMEM‑180的量进行测定的工序。

Description

癌细胞特异性抗体、抗癌剂、及癌症的检查方法
技术领域
本发明涉及新的抗TMEM-180抗体、含有抗TMEM-180抗体的抗癌剂、对试样中的TMEM-180进行测定的癌症检查方法等。
背景技术
近年来，作为抗癌剂，特异性地作用于特定分子的多种分子靶向药物正在被开发。特别地，以在某种癌细胞中特异性表达的分子、在癌细胞中表达水平亢进的分子作为抗原的各种抗体医药的开发正在持续进行。在对这类抗体医药的开发中，首先将手术时采集的癌组织中的mRNA表达与从其附近采集的正常组织中的mRNA的表达进行比较，确定出仅在癌组织中特异性表达的分子、在癌症组织中表达水平亢进的分子，将其作为抗原来制备抗体。
大肠癌是从大肠粘膜的细胞发生的癌症。迄今为止，开发了作为以上皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor；EGFR)为靶标的抗体的西妥昔单抗(Cetuximab)，并将其应用于大肠癌(非专利文献1-3)。但是，由于EGFR在正常组织中也会表达，因此存在西妥昔单抗也在正常组织中也发挥作用的可能性，人们期望开发出以更加特异性地在大肠癌中表达的分子作为靶标的分子靶向药物。但就此点而言，由于发生大肠癌的粘膜组织仅为少量，因此，存在难以通过对癌化的粘膜细胞和正常的粘膜细胞加以比较来确定靶分子的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Cunningham D.等,The New England Journal of Medicine.,Vol.351,No.4,2004,p.p.337-345.
非专利文献2：Goldstein NI.等,Clin Cancer Res.Vol.1,1311-1318,1995.
非专利文献3：Karapetis CS.等,The New Engl J Med.Vol.359,1757-1765.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于发现癌特异性表达的靶分子、提供能够通过特异性地作用于该靶分子而治疗癌症的抗癌剂，以及，提供包括对试样中的靶分子进行测定的工序的癌症检查方法。
解决课题的手段
本申请的发明人为解决上述课题，利用DNA微阵列分析，对各种大肠癌细胞株和大肠内窥镜检查时的清洗液中含有的正常粘膜细胞中的mRNA的表达进行了比较，以探究仅在大肠癌细胞株中表达的分子。结果，作为在所有大肠癌细胞株中均表达、但在健康者的细胞中未发现表达的蛋白质，鉴定出了跨膜蛋白(transmembrane protein)180(TMEM-180)。进而，通过定量PCR和原位杂交法，确认了TMEM-180在正常大肠组织中不表达，同时确认了TMEM-180在主要的正常组织中也不表达，由此，确认TMEM-180是作为抗癌剂的靶标、以及作为癌症的检查中的指标而言理想的分子。
进而，针对TMEM-180制备了抗体，确认到该抗体对于大肠癌细胞呈现细胞杀伤效果，以及较之以往的大肠癌标志物而言能够灵敏度更好地对尤其是复发进行检测，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的项：
〔1〕一种抗癌剂，其含有抗跨膜蛋白180(TMEM-180)抗体或其抗原结合片段作为有效成分；
〔2〕一种抗癌剂，其含有结合有具有抗癌活性的物质的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段作为有效成分；
〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：GFSLTRYNVH(序列号1)；
重链CDR2：VIWTGGSTD(序列号2)；
重链CDR3：DLGY(序列号3)；
轻链CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN(序列号4)；
轻链CDR2：QVSKLDS(序列号5)；及
轻链CDR3：CQGSYSPHT(序列号6)；
〔4〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：GFSLTSYYMQ(序列号7)；
重链CDR2：FIRSGGSTE(序列号8)；
重链CDR3：AFYGGYYFDY(序列号9)；
轻链CDR1：KASQNVGSNVD(序列号10)；
轻链CDR2：KASNRYT(序列号11)；及
轻链CDR3：MQSNTKYT(序列号12)；
〔5〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：GFTFSDYAMA(序列号40)；
重链CDR2：TIIYDGSST(序列号41)；
重链CDR3：HWYWYFDF(序列号42)；
轻链CDR1：LASEGISNDLA(序列号43)；
轻链CDR2：AASRLQD(序列号44)；及
轻链CDR3：QQSYKYPLT(序列号45)；
〔6〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：DCALN(序列号48)；
重链CDR2：WINTQTGKPTYADDF(序列号49)；
重链CDR3：EDYGYFDY(序列号50)；
轻链CDR1：QASQNINKFIA(序列号51)；
轻链CDR2：YTSTLVS(序列号52)；及
轻链CDR3：LQYDNLR(序列号53)；
〔7〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：NYGMH(序列号56)；
重链CDR2：SISPSGGSTYYRDSV(序列号57)；
重链CDR3：SASITAYYYVMDA(序列号58)；
轻链CDR1：KASQNVGSNVD(序列号59)；
轻链CDR2：KASNRYT(序列号60)；及
轻链CDR3：MQSNSYPPT(序列号61)；
〔8〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：NYWMT(序列号64)；
重链CDR2：SITNTGGSTYYPDSV(序列号65)；
重链CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列号66)；
轻链CDR1：KAGQNIYNYLA(序列号67)；
轻链CDR2：NANSLQT(序列号68)；及
轻链CDR3：QQYSSGW(序列号69)；
〔9〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：DYWVS(序列号72)；
重链CDR2：EIYPNSGATNFNENFK(序列号73)；
重链CDR3：DGTMGIAYYFDY(序列号74)；
轻链CDR1：KASQNINRYLN(序列号75)；
轻链CDR2：NANSLQT(序列号76)；及
轻链CDR3：LQHNSWPYT(序列号77)；
〔10〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：SYDIS(序列号80)；
重链CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK(序列号81)；
重链CDR3：IHGGYRYWFAY(序列号82)；
轻链CDR1：RASSSVSYMH(序列号83)；
轻链CDR2：DTSKLAS(序列号84)；及
轻链CDR3：LQRSSYPPT(序列号85)；
〔11〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：SNGVG(序列号88)；
重链CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS(序列号89)；
重链CDR3：EYMGFDY(序列号90)；
轻链CDR1：KASQNVGINVG(序列号91)；
轻链CDR2：WASNRDT(序列号92)；及
轻链CDR3：LQHNSYPRT(序列号93)；
〔12〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：SNGVG(序列号96)；
重链CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS(序列号97)；
重链CDR3：EEKGFAY(序列号98)；
轻链CDR1：KASQNVGINVG(序列号99)；
轻链CDR2：WASNRDT(序列号100)；及
轻链CDR3：LQHNSYPRA(序列号101)；
〔13〕如〔3〕至〔12〕中任一项所述的抗癌剂，其中，对于所述抗TMEM-180抗体而言，
在所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的至少1个中含有1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失；或
所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的至少1个具有与所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列；
〔14〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号13表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号13表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号14表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号14表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔15〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号15表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号15表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号16表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号16表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔16〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号46表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号46表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号47表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号47表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔17〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号54表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号54表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号54表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号55表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号55表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔18〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号62表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号62表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号63表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号63表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔19〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号70表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号70表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号71表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号71表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔20〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号78表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号78表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号79表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号79表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔21〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号86表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号86表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号87表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号87表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔22〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号94表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号94表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号95表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号95表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔23〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号102表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号102表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号103表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号103表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链；
〔24〕如上述〔1〕至〔23〕中任一项所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体中，
在Fc区结合1个以上的N-结合型糖链，所述N-结合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上不结合岩藻糖；
〔25〕如上述〔1〕至〔24〕中任一项所述的抗癌剂，所述抗癌剂以表达TMEM-180的癌症为对象；
〔26〕如上述〔1〕至〔24〕中任一项所述的抗癌剂，所述抗癌剂以大肠癌为对象；
〔27〕如上述〔1〕至〔24〕中任一项所述的抗癌剂，所述抗癌剂与使用了下述组合物的癌症疫苗疗法联合施予，所述组合物含有至少1种包含序列号104～170表示的氨基酸序列的肽；
〔28〕抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段，其是上述〔3〕至〔24〕中任一项中记载的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段；
〔29〕一种核酸，所述核酸编码上述〔3〕至〔13〕中任一项中记载的重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的任一者；
〔30〕一种核酸，所述核酸编码上述〔14〕至〔23〕中任一项如所述的重链及轻链中的任一者；
〔31〕一种表达载体，所述表达载体含有上述〔29〕或〔30〕所述的核酸；
〔32〕一种转化体，所述转化体含有上述〔31〕所述的表达载体；
〔33〕抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的制造方法，所述方法包括：
通过上述〔32〕所述的转化体使抗体表达的工序、和
回收所述抗体的工序；
〔34〕癌症检查方法，所述方法包括对从受检者采集的试样中的TMEM-180量进行测定的工序；
〔35〕如上述〔34〕所述的癌症检查方法，其中，通过使用了抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的免疫分析进行对所述TMEM-180量的测定；
〔36〕如上述〔35〕所述的癌症检查方法，其中，所述抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段是上述〔28〕所述的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段；
〔37〕如上述〔34〕至〔36〕中任一项所述的癌症检查方法，以大肠癌为对象；
〔38〕如上述〔34〕至〔37〕所述的癌症检查方法，所述方法用于对治疗后的复发或转移的检查；
〔39〕癌症检查用试剂盒，所述试剂盒包含抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段；
〔40〕如上述〔39〕所述的癌症检查用试剂盒，其中，所述抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段是上述〔28〕所述的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段；及
〔41〕如上述〔39〕或〔40〕所述的癌症检查用试剂盒，以大肠癌为对象。
本发明的含有抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的抗癌剂以在特定癌症中特异性表达、且在正常组织中不表达的TMEM-180为靶标，因此，能够得到癌细胞特异性的强大效果，而且，从另一方面来说，其副作用也少。
TMEM-180在特定癌症中特异性表达、且在正常组织中不表达，因此，通过本发明的使用抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的癌症检查方法及检查用试剂盒，可简便地实施癌症检查。与以往的大肠癌标志物相比，本发明的癌症检查方法及检查用试剂盒可以以更好的灵敏度检测尤其是癌症的复发。
另外，通过使用本发明的含有结合有具有抗癌活性的物质的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的抗癌剂，可将该抗癌剂特异性地递送至表达TMEM-180的癌细胞，因此，作为具有抗癌活性的物质而言毒性强的物质也可被容易地利用。
附图说明
图1A示出了利用DNA微阵列对人大肠癌细胞株、来自于健康者的大肠粘膜细胞进行综合性表达分析的结果中的TMEM-180表达量。图1B示出了利用定量PCR对大肠癌细胞和相邻的正常大肠组织中的TMEM-180的表达进行分析的结果。图1C及D示出了利用原位杂交对癌变部位及正常部位中的TMEM-180的表达进行调查的结果。
图2A示出了使用数据库对各种正常组织中的TMEM-180的表达进行调查的结果。图2B示出了通过与图2A同样的方法、针对TMEM-180和作为以往的抗癌剂靶标的分子进一步调查微量表达而得到的结果。
图3示出了针对大肠癌、脑肿瘤、血液癌的各种细胞株，使用克隆98、克隆101、及克隆212抗TMEM-180抗体进行流式细胞术(Flow Cytometry)分析而得到的结果。
图4示出了使用克隆98、克隆101、及克隆212抗TMEM-180抗体对大肠癌细胞进行荧光免疫染色的结果。需要说明的是，各克隆的抗体浓度未被统一一致。
图5示出了针对克隆98大鼠IgM抗体和克隆98大鼠-人嵌合抗体，利用流式细胞术对针对DLD-1大肠癌株和其TMEM-180基因敲除(knockout)株的反应性进行调查的结果。
图6示出了使用克隆98大鼠IgM抗体对人大肠癌和附近正常部位进行染色的结果。
图7示出了使用产生克隆98大鼠IgM抗体的杂交瘤培养上清液进行的细胞毒性试验的结果。杂交瘤培养上清液中的抗体浓度通过IgM特异性抗体ELISA测定。
图8示出了使用产生克隆101大鼠IgM抗体的杂交瘤培养上清液进行的细胞毒性试验的结果。杂交瘤培养上清液中的抗体浓度通过IgM特异性抗体ELISA测定。
图9示出了对癌细胞培养上清液中的TMEM-180蛋白质浓度进行测定的结果。
图10示出了针对4名大肠癌IV期患者、对血浆中的TMEM-180蛋白质浓度进行测定的结果。另外，图中右侧的表示出来自相同患者的测试样品中的CEA值的测定结果。
图11示出了针对3名大肠癌III期患者、对术前和术后血浆中的TMEM-180蛋白质浓度进行测定的结果。
图12示出了针对大肠癌各期的患者对术前、术后、及复发时血浆中的TMEM-180蛋白质浓度及CEA浓度进行测定的结果。
具体实施方式
(抗TMEM-180抗体及抗癌剂)
本发明涉及的抗癌剂的一种实施方式含有抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
本说明书中，所谓抗TMEM-180抗体，是指能与跨膜蛋白-180(TMEM-180)特异性结合的抗体。本说明书中，提及TMEM-180时，来自于任意动物的TMEM-180均可，另外，还可以是其突变体，只要能够作为抗癌剂的靶标、以及作为癌症检查方法的指标即可。作为TMEM-180的一个例子，将人TMEM-180的氨基酸序列作为序列号17示出。
本说明书中，“抗体”是指具有通过一对二硫键而稳定化的2条重链(H链)与2条轻链(L链)缔合而成的结构的蛋白质。重链包含重链可变区VH、重链恒定区CH1、CH2、CH3、及位于CH1与CH2之间的铰链区，轻链包含轻链可变区VL和轻链恒定区CL。其中，包含VH和VL的可变区片段(Fv)与抗原结合直接相关，是赋予抗体多样性的区域。另外，包含VL、CL、VH、CH1的抗原结合区域被称为Fab区，包含铰链区、CH2、CH3的区域被称为Fc区。
可变区中，直接与抗原接触的区域的变化特别大，其被称为互补性决定区(complementarity-determining region：CDR)。CDR以外的突变较少的部分被称为框架区(framework region：FR)。轻链和重链的可变区中，分别存在3个CDR，从N末端侧起依次被称为重链CDR1～3及轻链CDR1～3。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。另外，本发明的抗TMEM-180抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE中的任一亚型(isotype)。可以是对小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、鸡等非人动物进行免疫而制备出的抗体，也可以是重组抗体，还可以是嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等。所谓嵌合型抗体，是指将来自于不同种的抗体的片段连接起来得到的抗体。
所谓“人源化抗体”，是指用非人源抗体的特征氨基酸序列在人抗体的对应位置进行替换而得到的抗体，例如，可举出下述抗体，其具有通过对小鼠或大鼠进行免疫制备出的抗体的重链CDR1～3及轻链CDR1～3，但包括重链及轻链各自的4个框架区(FR)在内的其他全部区域来自于人抗体。该抗体有时也被称为CDR移植抗体。术语“人源化抗体”也包含人嵌合抗体的情况。
本说明书中，所谓抗TMEM-180抗体的“抗原结合片段”，是指抗TMEM-180抗体的与TMEM-180结合的片段。具体而言，可举出：Fab，其包含VL、VH、CL及CH1区域；F(ab’)2，其是2个Fab在铰链区介由二硫键连结而成的；Fv，其包含VL及VH；scFv，其是将VL及VH用人工的多肽连接体连接而成的单链抗体；除此以外，还可举出diabody型、scDb型、tandem scFv型、亮氨酸拉链型等双特异性抗体等，但不限于这些。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆98抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：GFSLTRYNVH(序列号1)
重链CDR2：VIWTGGSTD(序列号2)
重链CDR3：DLGY(序列号3)
轻链CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN(序列号4)
轻链CDR2：QVSKLDS(序列号5)
轻链CDR3：CQGSYSPHT(序列号6)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆101抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：GFSLTSYYMQ(序列号7)
重链CDR2：FIRSGGSTE(序列号8)
重链CDR3：AFYGGYYFDY(序列号9)
轻链CDR1：KASQNVGSNVD(序列号10)
轻链CDR2：KASNRYT(序列号11)
轻链CDR3：MQSNTKYT(序列号12)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆212抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：GFTFSDYAMA(序列号40)
重链CDR2：TIIYDGSST(序列号41)
重链CDR3：HWYWYFDF(序列号42)
轻链CDR1：LASEGISNDLA(序列号43)
轻链CDR2：AASRLQD(序列号44)
轻链CDR3：QQSYKYPLT(序列号45)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆129抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：DCALN(序列号48)
重链CDR2：WINTQTGKPTYADDF(序列号49)
重链CDR3：EDYGYFDY(序列号50)
轻链CDR1：QASQNINKFIA(序列号51)
轻链CDR2：YTSTLVS(序列号52)
轻链CDR3：LQYDNLR(序列号53)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆382抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：NYGMH(序列号56)
重链CDR2：SISPSGGSTYYRDSV(序列号57)
重链CDR3：SASITAYYYVMDA(序列号58)
轻链CDR1：KASQNVGSNVD(序列号59)
轻链CDR2：KASNRYT(序列号60)
轻链CDR3：MQSNSYPPT(序列号61)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆1361抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：NYWMT(序列号64)
重链CDR2：SITNTGGSTYYPDSV(序列号65)
重链CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列号66)
轻链CDR1：KAGQNIYNYLA(序列号67)
轻链CDR2：NANSLQT(序列号68)
轻链CDR3：QQYSSGW(序列号69)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆669抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：DYWVS(序列号72)
重链CDR2：EIYPNSGATNFNENFK(序列号73)
重链CDR3：DGTMGIAYYFDY(序列号74)
轻链CDR1：KASQNINRYLN(序列号75)
轻链CDR2：NANSLQT(序列号76)
轻链CDR3：LQHNSWPYT(序列号77)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆699抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：SYDIS(序列号80)
重链CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK(序列号81)
重链CDR3：IHGGYRYWFAY(序列号82)
轻链CDR1：RASSSVSYMH(序列号83)
轻链CDR2：DTSKLAS(序列号84)
轻链CDR3：LQRSSYPPT(序列号85)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆1052抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：SNGVG(序列号88)
重链CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS(序列号89)
重链CDR3：EYMGFDY(序列号90)
轻链CDR1：KASQNVGINVG(序列号91)
轻链CDR2：WASNRDT(序列号92)
轻链CDR3：LQHNSYPRT(序列号93)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的一种实施方式具有以下6个CDR中的至少1个。这些CDR为后述的实施例中所示的克隆1105抗TMEM-180抗体的CDR序列。
重链CDR1：SNGVG(序列号96)
重链CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS(序列号97)
重链CDR3：EEKGFAY(序列号98)
轻链CDR1：KASQNVGINVG(序列号99)
轻链CDR2：WASNRDT(序列号100)
轻链CDR3：LQHNSYPRA(序列号101)
上述各方式中，对于抗TMEM-180抗体而言，只要能发挥本发明的效果，其也可以包含6个CDR中的数个，例如，可包含2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、或6个。
上述各方式中，重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的至少1个可含有1个至多个的氨基酸的添加、取代、或缺失。
本说明书中，“氨基酸”使用其最为广泛的含义，除了天然氨基酸以外，也包含人工的氨基酸突变体、衍生物。氨基酸有时以惯用的单字母记载或三字母记载表示。本说明书中，作为氨基酸或其衍生物，可举出天然蛋白质性L-氨基酸；非天然氨基酸；具有本领域中已知为氨基酸特征的特性的以化学方式合成的化合物等。作为非天然氨基酸的例子，可举出主链结构与天然型不同的α,α-二取代氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、N-烷基-α-氨基酸、D-氨基酸、β-氨基酸、α-羟酸、侧链结构与天然型不同的氨基酸(正亮氨酸、高组氨酸等)、在侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高(homo)”氨基酸、高苯丙氨酸、高组氨酸等)、及侧链中的羧酸官能团被磺酸基取代的氨基酸(半胱氨酸等)，但不限于此。
本说明书中，关于“具有1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失”的情况，对于缺失、取代等的氨基酸的个数而言，只要作为结果而得到的多肽保持作为CDR的功能则没有特别限定，例如，可为1个、2个、3个或4个。对于经取代或添加的氨基酸而言，除了天然的蛋白质性氨基酸以外，也可以是非天然的氨基酸或氨基酸类似物。对于氨基酸的缺失、取代或添加的位置而言，只要能够保持作为CDR的功能，则可以是CDR序列中的任何位置。
上述的抗TMEM-180抗体的各实施方式中，重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的至少1个可以具有与原本的重链CDR1～3及轻链CDR1～3的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
本说明书中，所谓“具有80％以上的同一性”，是指以具有原本的序列的多肽的氨基酸序列和具有突变的序列的多肽的氨基酸序列的一致率为最大的方式进行对齐(alignment)时，共通的氨基酸残基的数量为原本的序列的氨基酸数量的80％以上。
同一性只要为80％以上、且保持作为CDR的功能，则可以是任意的％，可以为例如85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上。
包含在重链CDR1～3及轻链CDR1～3的氨基酸序列中添加、取代、或缺失氨基酸而得到的氨基酸序列的CDR、与重链CDR1～3及轻链CDR1～3的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的CDR可使用位点特异性突变导入法、随机突变导入法、链替换法、CDR步移(walking)法等已知的方法制备。本领域技术人员熟知，根据这些方法，利用噬菌体展示法将在CDR中具有各种突变的抗体或抗体片段呈递至噬菌体表面，并使用抗原进行筛选，由此可得到亲和性更为成熟的CDR(例如，Wu et al.,PNAS,95:6037-6042(1998)；Schier,R.etal.,J.Mol.Bio.263:551-567(1996)；Schier,R.et al.,J.Mol.Biol.255:28-43(1996)；Yang,W.P.et al.,J.Mol.Biol.,254:392-403(1995))。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号13表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号13表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号13表示的氨基酸序列是克隆98抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本说明书中，在重链或轻链的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失这样的情况下，添加、取代、或缺失的氨基酸的数量可为例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个。其他的术语如上文所述。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号14表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号14表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号14表示的氨基酸序列是克隆98抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体也可以包含：含有序列号13表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号13表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号14表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号14表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号15表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号15表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号15表示的氨基酸序列是克隆101抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号16表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号16表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号16表示的氨基酸序列是克隆101抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号15表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号15表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号16表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号16表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、含有与序列号16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号46表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号46表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号46表示的氨基酸序列是克隆212抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号47表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号47表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号47表示的氨基酸序列是克隆212抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号46表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号46表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、含有与序列号46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号47表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号47表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号54表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号54表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有在序列号54表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链。
序列号54表示的氨基酸序列是克隆129抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号55表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号55表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号55表示的氨基酸序列是克隆129抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号54表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号54表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号54表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号55表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号55表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号62表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号62表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号62表示的氨基酸序列是克隆382抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号63表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号63表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号63表示的氨基酸序列是克隆382抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号62表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号62表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号63表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号63表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号70表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号70表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号70表示的氨基酸序列是克隆1361抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号71表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号71表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号71表示的氨基酸序列是克隆1361抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号70表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号70表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号71表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号71表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号78表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号78表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号78表示的氨基酸序列是克隆669抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号79表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号79表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号79表示的氨基酸序列是克隆669抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号78表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号78表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号79表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号79表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号86表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号86表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号86表示的氨基酸序列是克隆699抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号87表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号87表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号87表示的氨基酸序列是克隆699抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号86表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号86表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号87表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号87表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号94表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号94表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号94表示的氨基酸序列是克隆1052抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号95表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号95表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号95表示的氨基酸序列是克隆1052抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号94表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号94表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、或含有与序列号94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号95表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号95表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号102表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号102表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链。
序列号102表示的氨基酸序列是克隆1105抗TMEM-180抗体的重链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式包含：
含有序列号103表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号103表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
序列号103表示的氨基酸序列是克隆1105抗TMEM-180抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的另一种实施方式也可以包含：含有序列号102表示的氨基酸序列的重链、含有在序列号102表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链、含有与序列号102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；和
含有序列号103表示的氨基酸序列的轻链、含有在序列号103表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链、或含有与序列号103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体可以是在Fc区结合1个以上的N-结合型糖链、该N-结合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上不结合岩藻糖的抗体。
例如，在IgG抗体的Fc区中，N-结合型糖链的结合位点存在有2处，复合型糖链在该位点结合。所谓N-结合型糖链，是指与Asn-X-Ser/Thr序列中的Asn结合的糖链，具有共通的Man3GlcNAc2-Asn结构。根据与非还原末端的2个甘露糖(Man)结合的糖链的种类，分类为高甘露糖型、杂合型、及复合型等。
尽管在N-结合型糖链的还原末端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上能够结合岩藻糖，但已知在不结合该岩藻糖的情况下ADCC活性比结合岩藻糖的情况显著上升。这记载于例如国际公开第2002/031140号小册子中，其公开的全部内容通过参考并入本说明书中。
通过显著提高ADCC活性，在将抗体用作为医药时能够减少施予量，因此，能够减轻副作用，并可以降低治疗费用。
本发明涉及的抗癌剂的一种实施方式含有结合有具有抗癌活性的物质的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段作为有效成分。该实施方式中，抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段可以自身具有抗癌活性，也可以仅具有与TMEM-180结合的能力而不具有抗癌活性。
本说明书中，所谓“具有抗癌活性的物质”，是指导致以下情况中的至少一种的物质：肿瘤大小的缩小(延迟或终止)、对肿瘤转移的阻碍、对肿瘤增殖的阻碍(延迟或终止)、及与癌症相关的一种或多种症状的缓解。具体而言，可举出毒素、抗癌剂、放射性同位素，但不限于这些。
作为具有抗癌活性的毒素，例如，可举出绿脓杆菌外毒素(PE)或其细胞毒性片段(例如PE38)、白喉毒素、蓖麻毒素A等。具有抗癌活性的毒素仅针对TMEM-180抗体识别的细胞、即表达TMEM-180的癌细胞发挥毒性，因此，具有不对周围的细胞造成不良影响、能够得到特异性效果的优点。
作为抗癌剂，例如，可举出阿霉素、道诺霉素、丝裂霉素、顺铂、长春新碱、表阿霉素、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿克拉霉素、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、长春地辛、他莫昔芬、地塞米松等低分子化合物、激活免疫活性细胞的细胞因子(例如，人白细胞介素2、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、人巨噬细胞集落刺激因子、人白细胞介素12)等蛋白质。
作为具有抗癌活性的放射性同位素，可举出32P、14C、125I、3H、131I、211At、90Y等。
可利用已知方法或基于已知方法的方法，使具有抗癌活性的物质直接或介由接头(linker)与抗TMEM-180抗体结合。也可将具有抗癌活性的物质封入胶束、脂质体等载体，使该脂质体与抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段结合。
上述具有抗癌活性的物质为蛋白质、多肽的情况下，可将编码本发明的抗TMEM-180抗体的核酸(后述)与编码具有抗癌活性的物质的DNA连结，并插入合适的表达载体，由此作为具有抗癌活性的物质与抗TMEM-180抗体的融合蛋白质而表达。
本说明书中，“抗癌剂”是指导致以下情况中的至少一种的物质：肿瘤大小的缩小(延迟或终止)、对肿瘤转移的阻碍、对肿瘤增殖的阻碍(延迟或终止)、及与癌症相关的一种或多种症状的缓解。
本发明涉及的抗癌剂除了含有有效成分以外，还可含有药学上允许的载体、添加物。
作为载体及添加物的例子，可举出水、盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学上允许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性剂等，但不限于这些。
本发明的医药组合物可制成各种形态，例如，液剂(例如注射剂)、分散剂、悬浮剂、片剂、丸剂、粉末剂、栓剂等。优选形态为注射剂，并优选以非口服的形式(例如，静脉内、经皮、腹腔内、肌肉内)施予。
本发明的医药组合物对于表达TMEM-180的癌症的治疗是有效的。表达TMEM-180的癌症包括大肠癌和脑肿瘤，但不限于此。
本发明还包含包括施予本发明涉及的抗癌剂的癌症治疗方法。
对于本发明的抗癌剂的施予量而言，例如，抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的施予量可以为0.025～50mg/kg，优选为0.1～0mg/kg，更优选为0.1～25mg/kg，进一步优选为0.1～10mg/kg或0.1～3mg/kg的量，但不限于此。
本发明涉及的抗癌剂还可与其他的癌症治疗法组合。作为其他的癌症治疗法，可举出前文记载的抗癌剂以外的抗癌剂的施予、放射线疗法、外科手术、癌症疫苗疗法等。
本说明书中，所谓“癌症疫苗疗法”，是指通过向患者施予癌抗原、或将来自于患者的免疫细胞在体外用癌抗原刺激后输回患者来提高患者自身对癌细胞的免疫力的癌症治疗方法或预防方法。作为可用于癌症疫苗疗法的癌抗原的一例，可使用来自于癌细胞特异性表达的蛋白质的肽(癌抗原源肽)。
癌抗原源肽与树突细胞等抗原呈递细胞表面的人白细胞抗原(HLA)分子结合，被呈递至细胞毒性T细胞(CTL)，从而将CTL激活。被激活的CTL攻击并排斥表达与该肽相同的抗原的癌细胞。HLA分子的遗传多样性高，基因型因人而异。来自于特定的癌抗原蛋白质、且具有与特定基因型的HLA分子结合的可能性的肽的序列可利用已知的软件等确定。
例如，来自于TMEM-180蛋白质、且具有与日本人中常见的HLA A2型或HLA A24型结合的可能性的肽如下(其是使用美国国立卫生研究所Bioinformatics and MolecularAnalysis Section公开的HLA肽结合预测(HLA Peptide Binding Predictions)(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)来预测的)。表中“Start Positions”是在序列号17所示的氨基酸序列中的位置。
通过使用了上述肽的癌症疫苗疗法，可以激活CTL对表达TMEM-180蛋白质的癌细胞的攻击，因此，通过与以TMEM-180作为靶标的本发明涉及的抗癌剂联合使用，能够效率良好地攻击癌细胞，实现对癌症的预防或治疗。本领域技术人员可按照已知的方法制备含有肽的癌症疫苗组合物。
[表1-1]
[表1-2]
[表2]
(核酸)
本发明还包含编码本发明涉及的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的核酸。核酸可以是天然的核酸，也可以是人工的核酸，例如，可举出DNA、RNA、DNA与RNA的杂合体，但不限于此。本领域技术人员可按照已知方法或基于已知方法的方法来确定编码抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的核酸的碱基序列，并利用已知方法或基于已知方法的方法进行制备。
作为编码本发明涉及的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的核酸，例如，可举出含有编码抗TMEM-180抗体克隆98的重链或轻链的DNA的核酸、含有编码抗TMEM-180抗体克隆98的重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的任一者的DNA的核酸、含有编码抗TMEM-180抗体克隆101的重链或轻链的DNA的核酸、含有编码抗TMEM-180抗体克隆101的重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的任一者的DNA的核酸、含有编码抗TMEM-180抗体克隆212的重链或轻链的DNA的核酸、及含有编码抗TMEM-180抗体克隆212的重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的任一者的DNA的核酸，但不限于此。
(表达载体)
本发明涉及的表达载体含有编码本发明涉及的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的核酸。表达载体可根据使用的宿主细胞而适当选择，例如，可举出质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、花椰菜花叶病毒载体、烟草花叶病毒载体等植物病毒载体、粘粒、YAC、EBV来源的附加体等。可用已知的方法(利用限制性内切酶的方法等)将编码本发明的抗TMEM-180抗体的核酸插入这些表达载体。
对于本发明涉及的表达载体而言，可以还含有调节抗体基因表达的启动子、复制起点、选择标记基因等。启动子及复制起点可根据宿主细胞和载体的种类适当选择。
(转化体)
本发明涉及的转化体含有本发明涉及的载体。转化体可通过将本发明的载体转染至合适的宿主细胞而得到。作为宿主细胞，例如，可使用哺乳类细胞(CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、HeLa细胞、Vero细胞等)、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞(酵母属、曲霉属等)等真核细胞、大肠菌(E.Coli)、枯草杆菌等原核细胞。
(抗体的制造方法)
本发明涉及的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的制造方法不受限制，例如，对于抗TMEM-180单克隆抗体而言，可通过以下方法获得：从用TMEM-180或其片段免疫的非人哺乳动物分离产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞等融合从而制备杂交瘤，并对该杂交瘤产生的抗体进行纯化。另外，抗TMEM-180多克隆抗体可从用TMEM-180或其片段免疫的动物的血清中获得。
用基因重组法制备本发明涉及的抗TMEM-180抗体时，例如，可使用含有本发明涉及的核酸的表达载体来转化合适的宿主，在合适的条件下培养该转化体以使得抗体表达，并按照已知的方法对其进行分离纯化。
作为分离纯化方法，例如，可举出使用了蛋白A等的亲和柱、其他色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析，可将这些方法适当组合。
人嵌合抗体及人CDR移植抗体可通过以下方法制备：利用人以外的动物的产生抗体的杂交瘤的mRNA将抗体基因克隆化，通过基因重组技术将其与人抗体基因的一部分连结。
例如，人型嵌合抗体的情况下，利用逆转录酶从产生小鼠抗体的杂交瘤的mRNA合成cDNA，通过PCR克隆重链可变区(VH)及轻链可变区(LH)，对序列进行分析。接着，从一致率高的抗体碱基序列来制备含有前导序列的5’引物，通过5’引物和可变部3’引物，利用PCR从上述cDNA克隆从信号序列到可变区3’末端为止的序列。另一方面，克隆人IgG1的重链及轻链的恒定区，针对重链和轻链分别将来自于小鼠抗体的可变区与来自于人抗体的恒定区通过利用了PCR的重叠悬挂(Overlapping Hanging)法连结，并进行扩增。将得到的DNA插入合适的载体，对其进行转化，从而得到人型嵌合抗体。
CDR移植抗体的情况下，选择并克隆与使用的小鼠抗体可变部同源性最高的人抗体可变部，利用使用了Megaprimer法的部位选择性突变导入，来改变CDR的碱基序列。构成框架区的氨基酸序列在人源化后无法实现与抗原的特异性结合的情况下，可将框架区的部分氨基酸从人型变换为大鼠型。
包含在原本的序列中具有1或2个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列的CDR、包含与原本的序列具有X％以上的同一性的氨基酸序列的CDR可使用部位特异性突变导入法、随机突变导入法、链替换法、CDR步移法等已知的方法制备。
本领域技术人员熟知，根据这些方法，利用噬菌体展示法将在CDR中具有各种突变的抗体或抗体片段呈递至噬菌体表面，并使用抗原进行筛选，由此可得到亲和性更为成熟的CDR(例如，Wu et al.,PNAS,95:6037-6042(1998)；Schier,R.et al.,J.Mol.Bio.263:551-567(1996)；Schier,R.et al.,J.Mol.Biol.255:28-43(1996)；Yang,W.P.et al.,J.Mol.Biol.,254:392-403(1995))。本发明也包含含有利用这样的方法成熟的CDR的抗体。
作为其他的抗体的制造方法，有利用来自于经过曲古柳菌素A处理的鸡B细胞的DT40细胞株得到产生抗体的细胞株的Adlib法(Seo,H.et al.,Nat.Biotechnol.,6:731-736,2002)、通过免疫破坏小鼠抗体基因且导入了人抗体基因的KM小鼠来制备人抗体的方法(Itoh,K.et al.,Jpn.J.Cancer Res.,92:1313-1321,2001；Koide,A.et al.,J.Mol.Biol.,284:1141-1151,1998)等，这些方法也可应用于生产本发明涉及的抗体。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的抗原结合片段可用编码该片段的DNA通过上述方法实现表达，另外，也可在得到全长抗体后用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶处理，进行片段化。
对于本发明涉及的抗TMEM-180抗体而言，氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、形态可能根据制备方法、纯化方法的不同而不同。但是，只要得到的抗体具有与本发明的抗体同等的功能，则也包含在本发明中。例如，使本发明的抗体在大肠菌等原核细胞中表达的情况下，在原本的抗体的氨基酸序列N末端附加有甲硫氨酸残基。这样的抗体也包括在本发明中。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体为具有还原末端N-乙酰葡糖胺未结合岩藻糖的N-结合型糖链的抗体的情况下，该抗体可按照已知的方法或基于已知方法的方法来制造。该抗体的制造方法记载于例如国际公开第2002/031140号小册子、日本特开2009-225781号公报中，其公开的全部内容通过参考并入本说明书。
具体而言，可通过以下方法得到：例如，使用含有编码本发明涉及的抗TMEM-180抗体的DNA的载体，将与GDP-岩藻糖的合成相关的酶的活性、或α-1,6-岩藻糖基转移酶的活性降低或欠缺的细胞转化，培养得到的转化体，然后纯化作为目标的抗TMEM-180抗体。
作为与GDP-岩藻糖的合成相关的酶，例如，可举出GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMP)、GDP-酮-6-脱氧甘露糖3,5-表异构酶4-还原酶(Fx)、GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GFPP)。
此处，细胞没有特别限定，优选哺乳动物细胞，可使用例如上述使酶活性降低或缺失的CHO细胞。
尽管利用上述方法而得到的抗体组合物也可能含有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上结合岩藻糖的抗体，但结合岩藻糖的抗体的比例为抗体总量的20重量％以下，优选为10重量％以下，进一步优选为5重量％以下，最优选为3重量％以下。
另外，具有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上不结合岩藻糖的N-结合型糖链的抗体可通过以下方法获得：将含有编码本发明涉及的抗TMEM-180抗体的DNA的载体导入昆虫卵，孵化并使昆虫成长，根据需要进行交配来制备转基因昆虫，从该转基因昆虫或其分泌物中提取抗TMEM-180抗体。作为昆虫可使用蚕，该情况下，可从茧中提取抗体。
尽管利用该方法而得到的抗体组合物也可能含有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上结合岩藻糖的抗体，但结合岩藻糖的抗体的比例为抗体总量的20重量％以下，优选为10重量％以下，进一步优选为5重量％以下，最优选为3重量％以下。
(本发明的抗体的活性)
抗体医药的药效机制基于抗体所具有的2种生物活性。一种为靶抗原特异性结合活性，即通过结合而中和靶抗原分子的功能的活性。靶抗原分子的功能的中和介由Fab区发挥。
另一种为被称为效应器(effector)活性的抗体生物活性。效应器活性介由抗体的Fc区以抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity；ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)、直接诱导凋亡等形式发挥。
本发明涉及的抗TMEM-180抗体的活性可通过以下的方法来测定。
(1)结合活性
抗体的结合活性可通过已知的方法，例如，ELISA(酶联免疫吸附测定)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)、荧光抗体法、FACS法等进行测定。
(2)ADCC活性
所谓ADCC活性，是指本发明的抗体结合至靶细胞的细胞表面抗原时，其Fc部分与具有Fcγ受体的细胞(效应器细胞)介由Fcγ受体而结合，从而对靶细胞赋予不良影响的活性。
ADCC活性可通过将表达TMEM-180的靶细胞、效应器细胞和本发明的抗体混合、并测定ADCC的水平而得知。作为效应器细胞，例如，可利用小鼠脾细胞、从人末梢血、骨髓中分离的单核细胞。作为靶细胞，可使用例如TMEM-180阳性大肠癌粘膜细胞。将靶细胞预先用51Cr等标记，向其添加本发明的抗体并进行孵育，然后添加相对于靶细胞而言为合适的比例的效应细胞并进行孵育。孵育后，采集上清液，可通过对上清液中的上述标记进行计数，来测定ADCC活性。
(3)CDC活性
所谓CDC活性，是指由补体系统导致的细胞毒活性。
CDC活性可通过在ADCC活性的试验中使用补体代替效应器细胞来测定。
(4)肿瘤增殖抑制活性
肿瘤增殖抑制活性可利用肿瘤模型动物进行测定。例如，将肿瘤移植至小鼠的皮下，并施予本发明的抗体。可通过对非施予组和施予组中的肿瘤组织的体积进行比较，来测定肿瘤增殖抑制效果。
需要说明的是，本发明的肿瘤增殖抑制活性可以是导致抑制细胞个体的增殖的活性，也可以是导致诱导细胞死亡的活性。
(检查方法及检查用试剂盒)
如上所述，TMEM-180仅在特定的癌细胞中表达。因此，本发明涉及的癌症检查方法包括对从受检者采集的试样中的TMEM-180量进行测定的工序。
本说明书中，从受检者采集的试样可以是适合癌症检查的任选的试样，本领域技术人员可根据癌症种类适当决定及采集。可举出例如血清、血浆、全血、尿、粪便、体腔液、组织，但不限于此。大肠癌检查的情况下，可将经由大肠内窥镜等从受检者采集的组织、大肠内窥镜检查后的清洗液中含有的粘膜细胞作为试样。
一直以来，作为大肠癌标志物，广泛使用癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen；CEA)。血浆CEA值在经过利用手术的癌切除等治疗后降低，但伴随复发、转移而再度上升，因此，对CEA值的测定被用于治疗后的持续观察。发现CEA值的再度上升时，需要利用腹部超声检查、腹部CT进行精密检查。但是，大肠癌患者中，CEA值上升的情况仅有45％，对于CEA值不上升的类型的癌症患者而言，为了持续观察必须每次接受精密检查。
与此相对，如后述的实施例所示，在CEA值未上升的患者中也发现了血浆TMEM-180值上升，并且术后较之术前而言降低。进而，还发现血浆TMEM-180值在术后暂时降低，在复发时显著上升。尤其是在复发时CEA值未上升的患者中也确认到上升。因此，可认为其是能够在癌症患者中广泛使用、且有用性极高的标志物。
本发明涉及的癌症检查方法可用于癌症的诊断，另外，也可在术后等治疗后的持续观察中用于对复发、转移的确认。
本说明书中，对于“对试样中的TMEM-180量进行测定的工序”而言，不仅包括对TMEM-180的量进行测定的工序，也包括检测TMEM-180量的有无的工序、确定TMEM-180量的增减的工序、与其他的试样中的TMEM-180量进行比较的工序。
试样中的TMEM-180量的测定可使用用于测定试样中的特定的蛋白质含量的任意的方法进行，例如，可举出免疫分析(包括凝集法、比浊法)、Western印迹法、表面等离子共振(SPR)法等，但不限于此。其中，使用抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的免疫分析是简便且有用的。
由于TMEM-180为膜蛋白质，因此，也可用市售的细胞溶解缓冲液、非离子性表面活性剂、膜蛋白质可溶化试剂等进行处理，将膜蛋白质可溶化后测定其量。
免疫分析使用以能够检测的方式标记的抗TMEM-180抗体、及/或以能够检测的方式标记的、针对抗TMEM-180抗体的抗体(二抗体)。根据抗体的标记法，分类为酶免疫分析(EIA或ELISA)、放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(FIA)、荧光偏振免疫分析(FPIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、荧光酶免疫分析(FLEIA)、化学发光酶免疫分析(CLEIA)、电化学发光免疫分析(ECLIA)等，上述中的任一种均可用于本发明的方法中。
ELISA法中，使用以过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体，RIA法中，使用以125I、131I、35S、3H等放射性物质标记的抗体，FPIA法中，使用以荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、丹磺酰氯、藻红蛋白、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、近红外荧光材料等荧光物质标记的抗体，CLIA法中，使用以荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白(aequorin)等发光物质标记的抗体。此外，也可对用胶体金、量子点等纳米粒子标记的抗体进行检测。
另外，免疫分析中，还可用生物素标记抗TMEM-180抗体，并使其与经酶等标记的亲和素或链亲和素结合来检测。
免疫分析中，使用酶标记的ELISA法可以简便迅速地测定抗原。
ELISA法包括竞争法和夹心法。竞争法中，在微孔板等固相载体上固定抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段，添加试样和经酶标记的TMEM-180，引发抗原抗体反应。洗涤后，与酶底物反应，使其显色，测定吸光度。试样中的TMEM-180越多则显色越弱，试样中的TMEM-180越少则显色越强，因此，可使用校正曲线求出TMEM-180量。
夹心法中，在固相载体上固定抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段，添加试样，使其反应后，进一步添加用酶标记的识别其他的表位的抗TMEM-180抗体并进行反应。洗涤后，使其与酶底物反应并显色，测定吸光度，由此可求出TMEM-180量。夹心法中，也可在使固定在固相载体上的抗体与试样中的TMEM-180反应后添加非标记抗体(一抗)，再添加经酶标记的针对该未标记抗体的抗体(二抗)。
对于酶底物而言，酶为过氧化物酶的情况下，可使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)等，为碱性磷酸酶的情况下，可使用对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny phosphate,NPP)等。
或者，也可以将试样中的TMEM-180抗原直接固定在微量滴定板等固相载体上，实施必需的封闭后，添加非标记抗体(一抗)，再添加经酶标记的针对该非标记抗体的抗体(二抗)。
本说明书中，“固相载体”只要是能够固定抗体的载体则没有特别限定，可举出玻璃制、金属性、树脂制等的微量滴定板、基板、珠、硝化纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等，靶物质可按照已知的方法固定在这些固相载体上。
另外，免疫分析中，作为可以简便地检测微量蛋白质的方法，凝集法是优选的。作为凝集法，例如，可举出使抗体与乳胶粒子结合的乳胶凝集法。
使乳胶粒子与抗TMEM-180抗体结合、并与经过适当处理的试样混合，若存在TMEM-180，则抗体结合乳胶粒子会凝集。因此，可通过使用近红外光照射试样、通过基于吸光度的测定(比浊法)或基于散射光的测定(散射比浊法)对凝集块加以定量，来求出抗原的浓度。
作为抗TMEM-180抗体或其抗体结合片段，也可使用具有上述的CDR序列的本发明涉及的抗TMEM-180抗体或其抗体结合片段。
本发明涉及的癌症的检查用试剂盒是用于使用上述的检查方法来进行癌症检查的试剂盒，其包含抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段。本发明涉及的癌症检查用试剂盒中，除了包含抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段以外，还可包含利用免疫分析对试样中的TMEM-180量进行测定所必需的试剂、装置。
检查用试剂盒的一种实施方式包含：用于利用夹心法测定TMEM-180的微量滴定板；捕捉用的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段；经碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段；及，碱性磷酸酶底物(NPP等)或过氧化物酶的底物(DAB、TMB、OPD等)。
捕捉用抗体和标记抗体识别不同的表位。
这样的试剂盒中，首先，将捕捉用抗体固定在微量滴定板上，将试样适当稀释并添加至滴定板中后进行孵育，然后除去试样进行洗涤。接着，添加经标记的抗体并进行孵育，添加底物并使其显色。可通过使用微量滴定板检测仪等对显色进行测定，来求出TMEM-180量。
检查用试剂盒的另一种实施方式是用于使用二抗、利用夹心法测定TMEM-180的试剂盒，其包含：微量滴定板；捕捉用的抗TMEM-180抗体；作为一抗的抗TMEM-180抗体；作为二抗的、用碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的抗TMEM-180抗体；及，碱性磷酸酶(NPP等)或过氧化物酶的底物(DAB、TMB、OPD等)。
捕捉用抗体和一抗识别不同的表位。
这样的试剂盒中，首先，将捕捉用抗体固定在微量滴定板上，将试样适当稀释并添加至滴定板中后孵育，然后除去试样进行洗涤。接下来，添加一抗进行孵育及洗涤，进而添加经过酶标记的二抗进行孵育，然后添加底物使其显色。通过使用微量滴定板检测仪等测定显色，可求出TMEM-180量。通过使用二抗，反应被放大，从而能够提高检测灵敏度。
检查用试剂盒还可进一步包含必需的缓冲液、酶反应终止液、微孔板检测仪等。
标记抗体不限于酶标记的抗体，也可以是用放射性物质(25I、131I、35S、3H等)、荧光物质(荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、丹磺酰氯、藻红蛋白、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、近红外荧光材料等)、发光物质(荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白等)、纳米粒子(胶体金、量子点)等标记的抗体。另外，也可将生物素化抗体用作标记抗体，并向试剂盒中添加经标记的亲和素或链亲和素。
作为检查用试剂盒的另一种实施方式，可举出利用乳胶凝集法测定TMEM-180量的试剂盒。该试剂盒含有抗TMEM-180抗体增敏乳胶(sensitization latex)，将试样和抗TMEM-180抗体混合，利用光学方法对凝集块进行定量。试剂盒优选包含将凝集反应可视化的凝集反应板。
本说明书中引用的所有专利文献及非专利文献的全部内容通过并入本说明书。
实施例
以下，基于实施例具体地说明本发明，但本发明并不被这些实施例以任何方式限定。本领域技术人员能够在不脱离本发明宗旨的情况下将本发明变更为各种方式，这些变更也包含在本发明的范围内。
1.TMEM-180分子的鉴定
1)DNA微阵列分析
使用来自于5种人大肠癌细胞株(HT29、SW480、LOVO、HCT116、DLD-1)和2种健康人源游离大肠细胞的mRNA各10μg。按照制造商(Affymetrix)的说明，利用RNA经由双链cDNA合成被生物素标记的cRNA。在片段化后，与GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Affymetrix)进行杂交。使用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)扫描，在取得CEL数据后进行统计处理，算出各试样的信号值。选出在5种人大肠癌细胞株确认到表达、并且在2种健康人大肠细胞中确认不到表达的TMEM-180作为大肠癌细胞特异性表面标志物(图1A)。
2)定量PCR法
针对5名大肠癌患者的手术标本，以相邻的正常大肠组织作为阴性对照，用ABI7500Fast(Applied Biosystems)对大肠癌细胞组织试样cDNA(Clontech)进行分析。20μL反应液中，使用10μL的2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)、1μL的20X TaqMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems)。另外，在快速运行(Fast run)模式下以AmpliTaq Gold Enzyme启动温度(Activation)95℃、20秒、40个循环；变性温度95℃、3秒；退火/延伸温度(Anneal/Extend)62℃、30秒来进行。用7500Fast System SDS软件Ver.1.3进行分析。对于各病例，计算大肠癌组织中的RNA量相对于正常组织中的RNA量之比，结果示于图1B。在任一例病例中均确认到TMEM-180在大肠癌组织中的表达比正常大肠组织更强。
3)原位杂交法
将大肠癌组织石蜡切片(Genostaff Co.Ltd.)用二甲苯脱蜡处理后，用乙醇、PBS进行水合处理。将切片在4％多聚甲醛·PBS中固定15分钟。用含有7μg/ml蛋白酶K(Roche)的PBS处理后，在4％多聚甲醛·PBS中再次固定。用0.25％乙酸酐0.1M TrisHCl PH8.0进行乙酰化。用PBS洗涤后，在乙醇中脱水。于60℃与300ng/ml用地高辛(digoxigenin)标记的TMEM-180的RNA探针(475bp,GeneBank登记号码NM_024789的基因序列第1314～1789位，Genostqaff Co.Ltd.)进行16小时的杂交反应。在洗涤后用50μg/ml的RNaseA·10mMTrisHCl PH8.0·0.1M NaCl·1mM EDTA处理。再次洗涤后，使用0.5％封闭反应液(Roche)进行反应，之后添加20％热处理羊血清(Sigma)，在封闭反应液中反应1小时。添加AP标记抗DIG抗体(Roche)，于室温进行2小时的反应。洗涤后，在NBT/BCIP液(Roche)中显色。包埋后用显微镜进行观察的结果示于图1C及D。确认到TMEM-180在5种大肠癌组织中全部为阳性，在正常大肠粘膜中为阴性。
2.TMEM-180在正常组织中的表达分析
利用公共数据库PaxDB(蛋白质丰度综合数据库，http://pax-db.org/#！home，通过利用LC/MS/MS分析各蛋白质的特异性肽测定其表达水平)，以TMEM-180进行检索，调查了在各正常组织中的测定值。除了TMEM-180以外，作为对照也调查了以下的分子的表达。
β肌动蛋白(βACT)(持家分子)
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(持家分子)
上皮生长因子受体(EGFR)(抗体药物的靶分子)
HER2(抗体药物的靶分子)
癌胚抗原(CEA)(代表性的肿瘤分子标志物)
将数据输入Excel(2010，Microsoft)文档制作图表，结果示于图2。TMEM-180在正常情况下几乎不表达(图2A)，提高灵敏度后发现在血小板中有微量的表达，但远远低于作为现有抗体药物靶分子的EGFR、HER2(图2B)，由此确认了TMEM-180在癌组织中的特异性表达。
3.抗体制备及针对各种癌细胞的FACS
1)抗原制备
[PCR反应]
对于并入pET21b中的tag序列，使用以下的引物实施PCR扩增。
使用的PCR酶：PrimeStar HS DNA聚合酶(takara R010A)
免疫抗原1制备用引物序列
(i)
cagacctgcacctgaacgtggttgagagctgaggaattgacggtcactgagggactgtaatgctgcacttcgc(序列号18)
(ii)
caaccacgttcaggtgcaggtctgtcttcacgtgctgttgtactggctcgtgttcaagagttcaaactggaggacctg(序列号19)
(iii)gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc(序列号20)
(iv)tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg(序列号21)
免疫抗原2制备用引物序列
(i)
gcgaagtgcagcattacagtccgatcatctgagtctgctgtgcctcttcattgc(序列号22)
(ii)
caggtcctccagtttgaactcagaagctgcttgcttacgatgattcagcaccaggtcctcgtctac(序列号23)
(iii)gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc(序列号24)
(iv)tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg(序列号25)
[限制性内切酶处理]
对于表达用载体pET21b及PCR产物，按照制造商的方案使NdeI(takara)、XhoI(takara)反应2小时，实施1％琼脂糖凝胶电泳后，使用promega wizard SV gel and PCRclean-up system试剂盒纯化。
[连接反应]
使用Ligation high(toyobo)，使载体与插入片段反应30分钟。
[转化]
使用Competent High DH5α(TOYOBO)进行转化，在LB培养基(50μg/ml)平板中培养。
[基因确认]
从转化的大肠菌中提取质粒，进行序列分析，确认目的序列。
[转化(大肠菌)]
用插入了目的序列的质粒转化BL21(DE3)。
[培养]
接种至10mL的LB培养基，将于37℃培养16小时后的培养基移至1L的LB培养基中，于37℃培养。在OD 600nm的值达到0.6时，将IPTG以最终浓度成为1mM的方式添加，再培养4小时。
[纯化]
将经菌体破碎的大肠菌的沉淀悬浮于50mM Tris-HCl,500mM NaCl,6M GdnHCl中，回收振荡16小时后的试样的上清液，用镍柱纯化。
[重折叠(refolding)]
目的抗原由于溶解在6M GdnHCl中而变性，因此，通过透析法进行了重折叠(蛋白质的重新折叠)。
关于重折叠的条件，按照以下步骤进行。
(1)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,3M GdnHCl；6小时
(2)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,2M GdnHCl；6小时
(3)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1M GdnHCl；12小时
(4)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,0.5M GdnHCl；12小时
(5)50mM Tris-HCl pH8.5,150mM NaCl,50mM L-Arg；6小时
(6)50mM Tris-HCl pH8.5,150mM NaCl,50mM L-Arg；6小时
对上述的试样使用超滤膜(Amicon-Ultra 10K)，置换为50mM磷酸缓冲液pH8.0,500mM NaCl。
[CD测定]
为了确认重折叠后的免疫抗原是否保持了立体结构，使用圆二色性分散仪(日本分光J-725)，确认了螺旋含量接近理论值。
2)抗体制备
将用PBS稀释为100μg/ml的免疫抗原1或免疫抗原2与弗氏完全佐剂(Freundcomplete adjuvant)以1：1混合，向大鼠(日本SLC，Wister，雌性，6～8周龄)尾根部两腋处分别施予100μL制备的乳剂。使用在免疫12天～13天后从大鼠尾静脉采血制备的抗血清，通过将免疫抗原固相化的ELISA或利用DLD-1细胞及K562细胞的流式细胞术来评价血清抗体效价，选择用于细胞融合的个体。从在免疫14天后选择的个体中摘出骼淋巴结、鼠蹊淋巴结、腋下淋巴结及膝下淋巴结，用PEG法将淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞p3X63融合。在融合10天～14天后回收培养上清液，用流式细胞术选择在DLD-1细胞中呈现阳性、且在K562细胞中呈现阴性的产生抗体的杂交瘤细胞。选择的产生抗体的杂交瘤细胞通过有限稀释法单克隆化，建立细胞株。通过亚型特异性ELISA(Bethyl)判定抗体的亚型。
单克隆化后的克隆株为克隆98、克隆101、克隆212(以上为IgM抗体)、克隆129、克隆382、克隆1361(以上为IgG抗体)、克隆669、克隆699、克隆1052、克隆1105(以上为IgM抗体)。
3)流式细胞术
将作为测定对象的癌细胞悬浮于培养基中，以成为1×105个/孔的方式添加至V底96孔板(corning)。将板于440×g、4℃离心3分钟后，除去上清液，向细胞沉淀以50μL/孔添加产生抗体的杂交瘤的培养上清液或抗体溶液，进行悬浮。在冰上反应45分钟后，用200μL/孔的0.1％BSA/2mM EDTA/PBS洗涤3次。除去上清液，向细胞沉淀添加50μL/孔的二抗，进行悬浮。作为二抗，使用了将AlexaFluor647山羊抗大鼠IgG(H-L)(Life Technologies)用0.1％BSA/2mM EDTA/PBS稀释为400倍的抗体。在冰上反应45分钟后，用200μL/孔的0.1％BSA/2mM EDTA/PBS洗涤3次。除去上清液，向细胞沉淀添加250μL/孔的50ng/ml碘化丙啶/0.1％BSA/2mM EDTA/PBS，进行悬浮。使用Guava easyCyte 8HT(Merck Millipore)等流式细胞仪测定这样染色的细胞，用FlowJO(TOMY DIGITAL BIOLOGY CO.,LTD.)分析得到的数据。在FACS中，使用大肠癌、脑肿瘤、血液系统肿瘤进行了分析。
利用获得的抗TMEM-180IgM抗体进行FACS分析的结果示于图3。克隆98在全部6种大肠癌细胞及全部4种脑肿瘤细胞中为阳性，克隆101在4种大肠癌细胞中为阳性、在脑肿瘤细胞中全部为阴性。克隆212在全部6种大肠癌细胞中为阳性，仅在1种脑肿瘤细胞中为阳性。对于血液系统肿瘤，所有克隆均为阴性。
4.DLD-1大肠癌细胞的荧光免疫染色
将DLD-1细胞以成为5×103个/孔的方式添加至96孔板(Corning，CellBIND)，培养2天后，供于细胞染色。细胞的固定/透过处理通过以下方式进行。用200μL/孔的PBS洗涤细胞培养板2次后，除去洗涤液，在冰冷下添加100μL/孔的4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(Wako)(添加有0.1％量的Triton X-100(Wako))，固定10分钟。除去固定液，用200μL/孔的PBS洗涤一次，用200μL/孔的1％FBS/PBS洗涤一次，制成细胞固定板。细胞染色通过以下方式实施。从未固定的细胞培养板除去培养基，从细胞固定板除去洗涤液，以50μL/孔添加产生抗体的杂交瘤的培养上清液或抗体稀释液。在冰上反应1小时后，用200μL/孔的PBS洗涤1次，用200μL/孔的1％FBS/PBS洗涤2次。除去洗涤液，以50μL/孔添加5μg/ml的AlexaFluor647山羊抗大鼠IgG(H-L)/2μg/ml Hoechst 33342/1％FBS/PBS。在冰上反应1小时后，用200μL/孔的PBS洗涤2次。添加50μL/孔的PBS，通过ArrayScan(Thermo Scientific)进行测定。
基于抗TMEM-180IgM抗体的克隆98、101及212的荧光免疫染色结果示于图4。克隆98主要为膜被染色。克隆101、212与克隆98相比荧光强度较弱，细胞质也被染色。
5.利用抗TMEM-180抗体对DLD-1母株和TMEM-180基因敲除株进行的FACS
1)基因敲除细胞的制备
[转染]
以0.5mL的Opti-MEM(invitrogen)稀释2.5ug的Sigma CRISPR/Cas9System(HS0000468201)质粒，添加11uL的Lipofection amine LTX。于室温静置30分钟后，向DLD1细胞(6.25x105个细胞/孔6孔板(corning))添加制备的DNA-Lipofection溶液。
[GFP表达细胞的选择]
对于在转染后培养2天而得到的细胞，使用FACSAria细胞分选仪(BD)，仅获取GFP表达细胞。
[克隆]
培养GFP表达细胞，确认GFP不再表达后，在96孔板中无限稀释。针对细胞的克隆为单一的孔，用PureLink Genomic DNA Mini Kit(Invitrogen)对基因组进行纯化，确认目的序列，判定基因敲除细胞。
2)流式细胞术
流式细胞术的步骤基于前文所述的3.。对于作为一抗的大鼠IgM抗体克隆98而言，将产生抗体的杂交瘤的培养上清液稀释为1μg/ml使用。作为阴性对照，将产生克隆356大鼠IgM抗体的杂交瘤的培养上清液稀释为1μg/ml使用克隆98。针对大鼠-人嵌合抗体，将恒定表达嵌合抗体的细胞的培养上清液稀释2倍使用。作为阳性对照，分别使用了稀释为1μg/ml的大鼠抗人组织因子(Tissue Factor)抗体克隆hTF1849、大鼠抗人EpCAM抗体克隆B8-4、小鼠抗人CD44v6抗体克隆2F10(MBL)、小鼠-人嵌合抗EGFR抗体(商品名为Erbitux)。各抗体的稀释使用RPMI/FBS10％来进行。需要说明的是，杂交瘤培养上清液中的抗体浓度通过大鼠IgM特异性ELISA(Bethyl)测定。另外，根据一抗的来源，作为二抗，将AlexaFluor647山羊抗大鼠IgG(H-L)、AlexaFluor647山羊抗人IgG(H+L)或AlexaFluor647山羊抗小鼠IgG(H+L)(Life Technologies)中的任一种用0.1％BSA/2mM EDTA/PBS稀释400倍而使用。
3)人嵌合抗体的制备
从杂交瘤细胞株提取总RNA，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(takara)，用5’末端RACE(cDNA末端快速扩增)法合成抗体H链的可变区和L链的可变区的cDNA。
针对合成的cDNA，通过PCR进行扩增，克隆进pUC19(Invitrogen)。H链的可变区及L链的可变区示于后文揭载的表3～22。
通过PCR扩增H链及L链的可变区后，将H链的可变区插入已组入恒定区的pQCxIP(Clontech)，将L链的可变区插入已组入恒定区的pQCxIH(Clontech)，完成表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表达载体转染至293T细胞。用10μg/mL嘌呤霉素(Sigma)和1mg/mL潮霉素B(Invitrogen)进行药物筛选，获得双重耐药性株，从而构建人型抗TMEM-180抗体恒定表达细胞株。构建的细胞株用DMEM(Sigma)10％FBS、1％青霉素·链霉素(Invitrogen)、10μg/mL嘌呤霉素、1mg/mL潮霉素B进行维持培养。
使用克隆98大鼠IgM抗体和人嵌合IgG抗体，对大肠癌DLD-1的母株和TMEM-180基因敲除株进行FACS。结果示于图5。克隆98大鼠IgM抗体及人嵌合IgG抗体均在基因敲除细胞中呈现了显著的左方位移。作为对照而使用了抗组织因子抗体、抗EpCAM抗体、抗CD44v6抗体、抗EGFR抗体的FACS中，母株和基因敲除株没有差异。这表明，克隆98大鼠IgM抗体和人嵌合IgG抗体均特异性地识别TMEM-180。
6.人大肠癌手术标本福尔马林固定切片的利用抗TMEM-180抗体的免疫染色
对于大肠癌福尔马林固定石蜡切片，使1μg/ml的抗TMEM-180IgM大鼠抗体(克隆98)与之反应。二抗使用HRP标记的抗大鼠抗体，用DAB显色，用苏木精实施后染色。结果示于图6。大肠癌细胞被特异性染色。大肠癌细胞除了膜以外，细胞质也被染色。
7.抗TMEM-180IgM抗体的细胞杀伤效果
向96孔板添加1×103个/100μL/孔的DLD-1细胞以及K562细胞，培养24小时。从96孔板的各孔移除50μL培养基。以50μL/孔添加抗体浓度配制成80μg/ml、20μg/ml、5μg/ml的产生大鼠IgM抗体克隆98的杂交瘤的培养上清液或产生1大鼠IgM抗体克隆10的杂交瘤的培养上清液。需要说明的是，各培养条件的n数量为3，作为对照，准备了仅添加了培养基的孔。培养96小时后，添加10μL/孔的WST-8(同仁化学，Cell Counting Kit-8)，在培养3小时后用微孔板检测仪测定450nm的吸光度。以抗体浓度作为横轴，以仅添加了培养基的孔的吸光度为1，基于各抗体浓度的吸光度的相对值绘图。结果示于图7及图8。克隆98和克隆101均仅对于大肠癌DLD-1细胞呈现了细胞杀伤效果，对于血液肿瘤K562未呈现细胞杀伤效果。对于其他的大肠癌细胞DiFi、Car1、SW480、Colo201也确认到细胞杀伤效果。另外，对于脑肿瘤细胞LN229及乳腺癌细胞MCF7也确认到同样的效果。由此预见到，对于除了血液肿瘤以外的极广范围的癌症具有效果。
8.各克隆的可变部基因序列和CDR的确定
1)总RNA的提取
使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)从各产生抗体的杂交瘤提取总RNA。
2)cDNA的制备
使用上述中得到的总RNA，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(takara)用5’末端RACE(cDNA末端快速扩增)法合成cDNA。
3)抗TMEM-180抗体基因的克隆
对于上述的cDNA，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(takara)扩增目的基因。使用了降落(touch down)PCR法，扩增条件为：变性98℃、10秒；退火/延伸72℃、90秒、5循环；变性98℃、10秒；退火67℃、5秒；延伸2℃、90秒、5循环；变性98℃、10秒；退火62℃、5秒；延伸72℃、90秒、25循环。
PCR装置：Takara PCR Thermal Cycler Dice Gradient
使用的引物序列
H链用
正向引物：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(序列号26)
正向引物：CTAATACGACTCACTATAGGGC(序列号27)
反向引物：CCCATGGCCACCARATTCTYATCAGACAG(序列号28)
L链用
正向引物：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(序列号29)
正向引物：CTAATACGACTCACTATAGGGC(序列号30)
反向引物：GTTGTTCAWGARGCACACGACTGAGGCA(序列号31)
使用T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide Kinase)(takara)将扩增的H链及L链的PCR产物磷酸化。使用Ligation High(TOYOBO)试剂将经过磷酸化的PCR产物插入在SmaI位点切割后的pUC19(Invitrogen)。插入后，转化至DH5α(TOYOBO)，使用Plasmid Mini Kit(QIAGEN)从单克隆提取质粒。
4)基因的分析
使用ABI PRISM 3100Genetic Analyzer分析克隆的H链、L链各基因的基因碱基序列。各克隆的H链可变区及L链可变区的序列示于表3～22。
克隆98H链(序列号13)
[表3]
克隆98L链(序列号14)
[表4]
克隆101H链(序列号15)
[表5]
克隆101L链(序列号16)
[表6]
克隆212H链(序列号46)
[表7]
克隆212L链(序列号47)
[表8]
克隆129H链(序列号54)
[表9]
克隆129L链(序列号55)
[表10]
克隆382H链(序列号62)
[表11]
克隆382L链(序列号63)
[表12]
克隆1361H链(序列号70)
[表13]
克隆1361L链(序列号71)
[表14]
克隆669H链(序列号78)
[表15]
克隆669L链(序列号79)
[表16]
克隆699H链(序列号86)
[表17]
克隆699L链(序列号87)
[表18]
克隆1052H链(序列号94)
[表19]
克隆1052L链(序列号95)
[表20]
克隆1105H链(序列号102)
[表21]
克隆1105L链(序列号103)
[表22]
9.测定TMEM-180量的癌症检查方法
1)ELISA方案
首先，用于以下实施例的ELISA法的方案如下所示。
(试剂)
使用了以下的试剂。
(步骤)
按照以下的步骤进行。
(i)抗原固相化
向96孔板添加50μL/孔的细胞培养液上清液或人血浆(稀释为1/10和1/50)，于4℃孵育过夜。
(ii)封闭
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤5次。用200μL/孔的封闭液封闭，于室温孵育1小时。
(iii)一抗反应
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤5次。添加100μL/孔、10μg/ml的IgM 98抗体溶液，于室温孵育1小时。
(iv)二抗反应
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤5次。添加100μL/孔、稀释4000倍的二抗溶液，于室温孵育1小时。
(v)显色·终止
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤5次。添加100μL/孔的显色液，于室温孵育15分钟。添加100μL/孔的终止液。
(vi)测定
反应终止后，测定450nm的吸光度。
2)癌细胞培养上清液中的TMEM-180蛋白质含量的测定
培养大肠癌细胞DLD-1株的TMEM-180强制表达株、母株、及TMEM-18基因敲除株，在成为大致汇合的状态时，用PBS洗涤。置换为无血清DMEM培养基，过夜培养，在次日回收培养上清液。将该上清液作为试样抗原在96孔板上固相化，按照1)的方法实施ELISA。另外，使用脑肿瘤株LN229进行了同样的实验。
结果示于图9。与正常(仅含有培养基)对照相比，TMEM-180在全部试样中均呈现了高值。在大肠癌DLD-1中，按照强制表达株、母株、基因敲除株的顺序依次呈现了高值。在脑肿瘤细胞中也呈现了高值。
3)大肠癌IV期患者血浆中的TMEM-180蛋白质含量的测定
将EDTA采血的人血浆(4例IV期和正常)稀释为1/10和1/50后，将其作为试样抗原在96孔板上固相化，按照1)的方法实施ELISA。
结果示于图10。与正常血浆相比，在全部患者试样中均呈现了高值。另外，在为CEA阴性的#2患者和#4患者中，血浆TMEM-180呈现阳性(高于正常试样的值)。
4)大肠癌III期患者的术前·术后的血浆中TMEM-180蛋白质含量的测定
通过与3)同样的方法，针对大肠癌III期患者的术前术后的血浆，测定了TMEM-180蛋白质含量。
结果示于图11。全部患者中，与术前相比，TMEM-180值在术后降低。
5)测定III期、II期、IV期、及IIIa期的大肠癌患者的手术前后、及复发时的血浆中TMEM-180蛋白质含量和大肠癌肿瘤标志物CEA。TMEM-180的测定通过使用克隆669和克隆1361的夹心ELISA法进行。TMEM-180的临界值(cut off)采用通过与患者试样同样的ELISA法测得的8人份的正常血浆中值的平均值。CEA的临界值采用国立研究开发法人国立癌症研究中心采用的正常值。
结果示于图12。II期的患者中，术前CEA值为阴性，与此相对，TMEM-180呈现阳性。另外，IIIa期的患者中，在通过CT确认到复发的时间点，CEA值依然为阴性，但TMEM-180再次上升。
需要说明的是，用于5)的实施例的夹心ELISA法的方案如下所示。
(试剂)
使用了以下的试剂。
(步骤)
按照以下的步骤进行。
(i)固相化
将固相化抗体克隆669用0.1M磷酸缓冲液稀释，向96孔板添加50μL/孔的稀释溶液，于4℃孵育过夜。
(ii)封闭
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤3次。用200μL/孔封闭液封闭，于室温孵育30分钟以上。
(iii)添加抗原
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤3次。向固相化完成的板添加50μL/孔的测定试样，于室温孵育1小时。
(iv)标记抗体反应
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤3次。将使用规定的方法制备的生物素标记的克隆1361用稀释液稀释，向96孔板添加50μL/孔的稀释溶液，于室温孵育1小时。
(v)链亲和素HRP反应
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤3次。添加50μL/孔的链亲和素HRP稀释溶液，于室温孵育1小时。
(vi)显色·终止
利用200μL/孔的板洗涤液，将完成固相化的板反复洗涤3次。添加100μL/孔的显色液，于室温孵育20分钟。添加50μL/孔的终止液。
(vii)测定
反应终止后，测定450nm的吸光度。
序列表自由文本
序列号1～3分别表示克隆98的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号4～6分别表示克隆98的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号7～9分别表示克隆101的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号10～12分别表示克隆101的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号13及14分别表示克隆98的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号15及16分别表示克隆101的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号17表示人TMEM-180蛋白质的氨基酸序列。
序列号18～21分别表示免疫抗原1制备用引物(i)～(iv)。
序列号22～25分别表示免疫抗原2制备用引物(i)～(iv)。
序列号26～31表示在抗TMEM-180抗体基因的克隆中使用的引物。
序列号40～42分别表示克隆212的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号43～45分别表示克隆212的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号46及47分别表示克隆212的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号48～50分别表示克隆129的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号51～53分别表示克隆129的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号54及55分别表示克隆129的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号56～58分别表示克隆382的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号59～61分别表示克隆382的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号62及63分别表示克隆382的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号64～66分别表示克隆1361的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号67～69分别表示克隆1361的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号70及71分别表示克隆1361的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号72～74分别表示克隆669的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号75～77分别表示克隆669的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号78及79分别表示克隆669的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号80～82分别表示克隆699的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号83～85分别表示克隆699的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号86及87分别表示克隆699的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号88～90分别表示克隆1052的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号91～93分别表示克隆1052的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号94及95分别表示克隆1052的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号96～98分别表示克隆1105的重链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号99～101分别表示克隆1105的轻链CDR1～3的氨基酸序列。
序列号102及103分别表示克隆1105的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。
序列号104～150表示通过HLA肽结合预测(HLAPeptide Binding Preditions)而预测的与HLA A2型结合的源于TMEM-180肽的氨基酸序列。
序列号151～170表示通过HLA肽结合预测而预测的与HLA A24型结合的源于TMEM-180肽的氨基酸序列。

Claims (41)

1.一种抗癌剂，其含有抗跨膜蛋白180(TMEM-180)抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
2.一种抗癌剂，其含有结合有具有抗癌活性的物质的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
3.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：GFSLTRYNVH(序列号1)；
重链CDR2：VIWTGGSTD(序列号2)；
重链CDR3：DLGY(序列号3)；
轻链CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN(序列号4)；
轻链CDR2：QVSKLDS(序列号5)；及
轻链CDR3：CQGSYSPHT(序列号6)。
4.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：GFSLTSYYMQ(序列号7)；
重链CDR2：FIRSGGSTE(序列号8)；
重链CDR3：AFYGGYYFDY(序列号9)；
轻链CDR1：KASQNVGSNVD(序列号10)；
轻链CDR2：KASNRYT(序列号11)；及
轻链CDR3：MQSNTKYT(序列号12)。
5.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：GFTFSDYAMA(序列号40)；
重链CDR2：TIIYDGSST(序列号41)；
重链CDR3：HWYWYFDF(序列号42)；
轻链CDR1：LASEGISNDLA(序列号43)；
轻链CDR2：AASRLQD(序列号44)；及
轻链CDR3：QQSYKYPLT(序列号45)。
6.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：DCALN(序列号48)；
重链CDR2：WINTQTGKPTYADDF(序列号49)；
重链CDR3：EDYGYFDY(序列号50)；
轻链CDR1：QASQNINKFIA(序列号51)；
轻链CDR2：YTSTLVS(序列号52)；及
轻链CDR3：LQYDNLR(序列号53)。
7.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：NYGMH(序列号56)；
重链CDR2：SISPSGGSTYYRDSV(序列号57)；
重链CDR3：SASITAYYYVMDA(序列号58)；
轻链CDR1：KASQNVGSNVD(序列号59)；
轻链CDR2：KASNRYT(序列号60)；及
轻链CDR3：MQSNSYPPT(序列号61)。
8.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：NYWMT(序列号64)；
重链CDR2：SITNTGGSTYYPDSV(序列号65)；
重链CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列号66)；
轻链CDR1：KAGQNIYNYLA(序列号67)；
轻链CDR2：NANSLQT(序列号68)；及
轻链CDR3：QQYSSGW(序列号69)。
9.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：DYWVS(序列号72)；
重链CDR2：EIYPNSGATNFNENFK(序列号73)；
重链CDR3：DGTMGIAYYFDY(序列号74)；
轻链CDR1：KASQNINRYLN(序列号75)；
轻链CDR2：NANSLQT(序列号76)；及
轻链CDR3：LQHNSWPYT(序列号77)。
10.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：SYDIS(序列号80)；
重链CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK(序列号81)；
重链CDR3：IHGGYRYWFAY(序列号82)；
轻链CDR1：RASSSVSYMH(序列号83)；
轻链CDR2：DTSKLAS(序列号84)；及
轻链CDR3：LQRSSYPPT(序列号85)。
11.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：SNGVG(序列号88)；
重链CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS(序列号89)；
重链CDR3：EYMGFDY(序列号90)；
轻链CDR1：KASQNVGINVG(序列号91)；
轻链CDR2：WASNRDT(序列号92)；及
轻链CDR3：LQHNSYPRT(序列号93)。
12.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体具有以下6个CDR中的至少1个：
重链CDR1：SNGVG(序列号96)；
重链CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS(序列号97)；
重链CDR3：EEKGFAY(序列号98)；
轻链CDR1：KASQNVGINVG(序列号99)；
轻链CDR2：WASNRDT(序列号100)；及
轻链CDR3：LQHNSYPRA(序列号101)。
13.如权利要求3至12中任一项所述的抗癌剂，其中，对所述抗TMEM-180抗体而言，
在所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的至少1个中含有1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失；或
所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的至少1个具有与所述重链CDR1～3及轻链CDR1～3的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号13表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号13表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号14表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号14表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
15.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号15表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号15表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号16表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号16表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
16.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号46表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号46表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号47表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号47表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
17.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号54表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号54表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号54表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号55表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号55表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
18.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号62表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号62表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号63表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号63表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
19.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号70表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号70表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号71表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号71表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
20.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号78表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号78表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号79表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号79表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
21.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号86表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号86表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号87表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号87表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
22.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号94表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号94表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号95表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号95表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
23.如权利要求1或2所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体包含：
含有序列号102表示的氨基酸序列的重链；
含有在序列号102表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重链；或
含有与序列号102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链；
及/或，
含有序列号103表示的氨基酸序列的轻链；
含有在序列号103表示的氨基酸序列中含1个至多个氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的轻链；或
含有与序列号103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链。
24.如权利要求1至23中任一项所述的抗癌剂，其中，所述抗TMEM-180抗体中，在Fc区结合1个以上的N-结合型糖链，所述N-结合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上不结合岩藻糖。
25.如权利要求1至24中任一项所述的抗癌剂，所述抗癌剂以表达TMEM-180的癌症为对象。
26.如权利要求1至24中任一项所述的抗癌剂，所述抗癌剂以大肠癌为对象。
27.如权利要求1至24中任一项所述的抗癌剂，所述抗癌剂与使用了下述组合物的癌症疫苗疗法联合施予，所述组合物含有至少1种包含序列号104～170表示的氨基酸序列的肽。
28.抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段，其是权利要求3至24中任一项中记载的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段。
29.一种核酸，所述核酸编码权利要求3至13中任一项中记载的重链CDR1～3及轻链CDR1～3中的任一者。
30.一种核酸，所述核酸编码权利要求14至23中任一项中记载的重链及轻链中的任一者。
31.一种表达载体，所述表达载体含有权利要求29或30所述的核酸。
32.一种转化体，所述转化体含有权利要求31所述的表达载体。
33.抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的制造方法，所述方法包括：
通过权利要求32所述的转化体使抗体表达的工序、和
回收所述抗体的工序。
34.癌症检查方法，所述方法包括对从受检者采集的试样中的TMEM-180量进行测定的工序。
35.如权利要求34所述的癌症检查方法，其中，通过使用了抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段的免疫分析来进行对所述TMEM-180量的测定。
36.如权利要求35所述的癌症检查方法，其中，所述抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段是权利要求28所述的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段。
37.如权利要求34至36中任一项所述的癌症检查方法，以大肠癌为对象。
38.如权利要求34至37所述的癌症检查方法，所述方法用于对治疗后的复发或转移的检查。
39.癌症检查用试剂盒，所述试剂盒包含抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段。
40.如权利要求39所述的癌症检查用试剂盒，其中，所述抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段是权利要求28所述的抗TMEM-180抗体或其抗原结合片段。
41.如权利要求39或40所述的癌症检查用试剂盒，以大肠癌为对象。
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