JP7209284B2 - Ｔｍｅｍ１３２ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法 - Google Patents

Ｔｍｅｍ１３２ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法 Download PDF

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Description

本発明は、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法を提供する。
近年、抗がん剤として、特定の分子に特異的に作用する分子標的薬が多数開発されている。特に、あるがん細胞に特異的に発現している分子や、がん細胞において発現が亢進している分子を抗原とした様々な抗体医薬の開発が進められている。このような抗体医薬の開発では、まず、手術の際に採取したがん組織におけるmRNA発現と、その近傍から採取した正常組織におけるmRNAの発現を比較して、がん組織のみに特異的に発現している分子や、がん組織において発現が亢進している分子を特定し、これを抗原として抗体を作製する。
大腸がんは、大腸粘膜の細胞から発生するがんである。これまでに、上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）を標的とする抗体であるセツキシマブが開発され、大腸がんに使用されている（非特許文献１－３）。しかしながら、EGFRは正常組織でも発現しているため、セツキシマブは正常組織にも作用する可能性があり、より特異的に大腸がんに発現する分子を標的とした分子標的薬の開発が望まれていた。この点、大腸がんが発生する粘膜組織はわずかしか存在しないため、がん化した粘膜細胞と正常な粘膜細胞を比較して標的分子を特定することが難しいという問題があった。これについて、ＴＭＥＭ－１８０が標的分子の候補として開発されている（特許文献１）。
WO2016039321A1
Cunningham D. et al., The New England Journal of Medicine., Vol.351, No.4, 2004, p.p.337-345. Goldstein NI. Et al., Clin Cancer Res. Vol.1, 1311-1318, 1995. Karapetis CS. Et al., The New Engl J Med. Vol.359, 1757-1765.
本発明は、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法を提供する。
本発明者らは、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質は、がんに特異的に発現することを見出した。本発明者らはまた、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質の発現の有無は、特に大腸がんの診断に用いうることを見出した。本発明者らはさらに、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質は、がんの細胞表面に表出すること、および、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質に結合する抗体は、がん細胞の表面に結合し得ることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
例えば、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体であって以下からなる群から選択される抗体、またはその抗原結合性断片：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；および
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；並びに
（５）上記（１）～（４）の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体；および
（６）上記（１）～（４）の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体。
［２］抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
上記（１）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［３］配列番号４で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［４］抗体が、
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
上記（２）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［５］配列番号１２で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［４］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［６］抗体が、
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
上記（３）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［７］配列番号２０で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［６］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［８］抗体が、
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
上記（４）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［９］配列番号２８で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３２で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［８］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［１０］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を含む、がんの診断薬。
［１１］抗体が、上記［１］～［９］のいずれかで定義された抗体である、上記［１０］に記載のがんの診断薬。
［１２］対象においてがん細胞を検出する方法であって、
対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む、方法。
［１３］上記［１２］に記載のがん細胞の検出方法であって、
ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かをＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体により決定する、方法。
［１４］上記［１３］に記載のがん細胞の検出方法であって、
抗体が、上記［１］～［９］のいずれかで定義された抗体である、方法。
［１５］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物。
［１６］抗体が、上記［１］～［９］のいずれかで定義された抗体である、上記［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］抗体が、細胞傷害剤とのコンジュゲートの形態である、上記［１５］または［１６］に記載の医薬組成物。
図１は、がん細胞の表面にＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が発現していることを示す図である。
図２は、新しく得た抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体がＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質を強制発現させたＤＬＤ－１株を染色できることを示す図である。
図３は、大腸がん組織パネルに対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図４は、正常脳組織および正常心臓組織に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図５は、正常肺組織および正常肝臓組織に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図６は、正常腎臓組織および正常小腸組織に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図７は、正常皮膚に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
発明の具体的な説明
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトである。対象は、中皮腫その他の腫瘍または癌に罹患している、またはそのリスクがある対象であり得る。
本明細書では、「処置」とは、治療および予防を意味する。従って、本明細書において「がんを処置することに用いる医薬組成物」とは、がんを治療または予防することに用いる医薬組成物を意味し、抗がん剤を一例として含む意味で用いられる。
本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。
抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖とが会合した構造を取る。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。
本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（単鎖（Ｆｖ）２）が挙げられる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
本発明によれば、
ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体であって以下からなる群から選択される抗体、またはその抗原結合性断片が提供される：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（５）上記（１）～（４）の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体；
（６）上記（１）～（４）の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；
（７）上記（１）～（４）の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体；および
（８）上記（１）～（４）の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、
上記（１）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（１）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（１）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（１ａ）配列番号４で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
上記（１ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（１ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（１ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
上記（２）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（２）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（２）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（２ａ）配列番号１２で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
上記（２ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（２ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（２ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、
上記（３）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（３）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（３）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（３ａ）配列番号２０で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
上記（３ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（３ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（３ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、
上記（４）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（４）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（４）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（４ａ）配列番号２８で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３２で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
上記（４ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
上記（４ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
上記（４ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の一部に結合する抗体が提供される。本発明のある態様では、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の一部は、特に限定されないが例えば、GenBank Accession No.: NP_060340のアミノ酸番号１４３～３１７位の領域またはアミノ酸番号４１１～５９７位の領域であり得る。
本明細書において、「１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する」とは、ＴＭＥＴＭ１３２Ａに対する結合性を有する抗体が得られる限り、どのような挿入、置換、欠失または付加を有していてもよい。「１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する」とは、例えば、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有することを含む意味で用いられ得る。アミノ酸の置換は、例えば、保存的アミノ酸の置換とすることができる。このような挿入、置換、欠失または付加は、部位特異的変異導入法などにより当業者であれば可能である。このような挿入、置換、欠失または付加はまた、競合抗体において発見されることもある。
本明細書において、「８０％以上の同一性を有する」とは、参照抗体に対して目的の抗体のアミノ酸配列の同一性を確認する場合には、２つのアミノ酸配列をアミノ酸配列の一致が最大となるようにアラインメントしたときに、共通するアミノ酸の数が参照抗体のアミノ酸配列に対して８０％以上であることを意味する。上記同一性は、８０％以上とすることができ、８５％以上とすることができ、９０％以上とすることがで、９５％以上とすることができ、９８％以上とすることができ、９９％以上とすることができる。「８０％以上の同一性を有する」抗体は、部位特異的変異導入法などにより当業者であれば可能である。このような挿入、置換、欠失または付加はまた、競合抗体において発見されることもある。
本発明の抗体は、抗原をＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質（例えば、ヒトＴＭＥＭ１３２Ａのアミノ酸配列は、GenBank Accession No.: NP_060340とすることができる）として当業者に周知の方法により得ることができる。すなわち、抗原とアジュバントとを動物に免疫することと、免疫した動物の血漿を得ることによりポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、抗原とアジュバントとを動物に免疫し、免疫した動物からＢリンパ球を得て、ミエローマと細胞融合させてハイブリドーマを形成させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして得てもよい。
キメラ抗体は、本分野において周知の方法により作製することができる。例えば、抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。
ヒト化抗体は、例えば、ヒト以外の動物由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびヒト抗体由来の定常領域とを含む。ヒト化抗体は、例えば、上記のＣＤＲをヒト抗体に移植して得ることができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体を産生する遺伝子改変マウスに抗原を免疫することにより得ることができる。二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープまたは抗原に結合することができる抗体であって、当業者に周知の方法で調製することができる。二重特異性抗体は、例えば、２つの異なる抗体を産生する細胞をさらに融合して、ハイブリッドハイブリドーマを作製する方法や、ＶＨ領域とＶＬ領域を、上記２つの領域間では対を形成できない短いリンカーを介して１本のポリペプチド鎖上で発現させ、別のポリペプチド鎖であって、前記ＶＨ領域とＶＬ領域と対形成する相補的なＶＨ領域とＶＬ領域を有するポリペプチド鎖と複合体を形成させることにより作製できる。
ある抗体と抗原との結合において競合する抗体は、当業者に周知の競合アッセイなどにより得ることができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０～５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、所望の抗体の結合をブロックすることができるならば、同じ抗原に対する結合において競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、抗原を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、ここに候補となる競合抗体存在を添加してインキュベートし、抗原と候補抗体との結合を形成させる。その後、所望の抗体を標識した上でさらにウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。競合する場合には、ウェル中に残存する標識量が少なくなるはずである。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａは、がん細胞に広く発現する。ＴＭＥＭ１３２Ａは、特に、上皮性のがん細胞（例えば、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、および乳がん細胞）に発現する。一方で、ＴＭＥＭ１３２Ａは、正常組織では発現が確認されなかった。従って、本発明によれば、がんの診断方法であって、対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む方法が提供される。本発明によればまた、がん細胞の検出方法であって、対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む方法が提供される。本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を用いて、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することができる。本発明によれば、本発明の抗体を用いて、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することができる。本発明のがんの診断方法は、がんであると診断された対象に対して、化学療法および放射線療法などのがんの治療法を実施することをさらに含んでいてもよい。
本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａは、がん細胞の細胞表面に表出する。従って、本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートが提供される。本発明で用いられる細胞傷害剤としては、例えば、抗がん活性を有する物質が挙げられる。抗がん活性を有する物質は、がんに接触させた場合に、がんのサイズの低下、がんのサイズの増大の遅延若しくは停止、がんの増殖の遅延若しくは停止、またはがんの転移の阻害を生じさせる物質をいう。抗がん活性を有する物質としては、抗がん剤、毒素、およびラジオアイソトープなどが挙げられ、本発明で用いることができる。本発明によればまた、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートを含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物が提供される。がんは上皮性のがん（例えば、大腸がん、膵臓がん、卵巣がん、および乳がん）とすることができる。
本発明のある態様では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）などの細胞傷害活性を有し得る。特にＴＭＥＭ１３２Ａはがん細胞の表面に表出するタンパク質であるため、本発明の抗体の標的として好ましい。
抗体は、そのＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはＩｇＧ１とすることができる。抗体は、そのＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、Ｆｃ領域に１以上のＮ－結合型糖鎖が結合し、該Ｎ－結合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体であってもよい。
本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物または薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物または薬剤は、薬学上許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、有効成分である本発明の抗体の有効量を対象に与えるために適宜投与されうる賦形剤とすることができる。ある態様では、本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤とすることができ、注射用の賦形剤は、無菌の水性溶液、例えば、リンガー溶液、ハンクス溶液または生理食塩水などの薬学的に許容可能な緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液とすることができる。補助剤としては、エタノールなどのアルコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、ポリソルベート８０などの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、製剤化の際に添加することができる。注射用の油性液としては、ゴマ油、ヤシ油および大豆油を用いることができ、補助剤として、安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いることができる。本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤の形で非経口投与（例えば、静脈内投与または胸腔内投与）することができる。
抗体のＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性は、当業者に周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣ活性は、例えば、がん細胞とＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞や単球）を本発明の抗体の存在下で生理的条件下でインキュベートし、中皮腫細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。ＣＤＣ活性は、例えば、がん細胞を補体を含む溶液（例えば、ヒト血清）と抗体存在下で生理的条件下でインキュベートし、がん細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。
細胞傷害活性は、当業者に周知の種々の方法によって増強することができる。例えば、Ｆｃ領域糖鎖のフコースが欠失した抗体、糖鎖にバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸置換によりエフェクター細胞のＦｃ受容体と抗体との結合を増強し、これにより細胞傷害活性を増強する方法が知られ、このように改変した抗体も本発明の抗体として用いることができる。
抗体は、ヒトにおける抗体自体の抗原性を低下させること等を目的として、当業者に周知の方法により、遺伝子改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体とすることができる。本発明の医薬組成物または薬剤においては、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体はまた、二重特異性抗体であってもよい。
また、本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとのコンジュゲートが提供される。本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとのコンジュゲートを含む、がんをイメージングすることに用いるための組成物、がんの診断キット、またはがんの診断薬が提供される。がんをイメージングすることに用いるための組成物、がんの診断キット、またはがんの診断薬では、がんは上皮性のがん細胞（例えば、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、および乳がん細胞）とすることができる。
本発明で用いることができるイメージングプローブとしては、例えば、蛍光イメージングプローブ、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用造影剤などの増強剤（例えば、常磁性イオン）およびＰＥＴ分子イメージングプローブなどのイメージング用の放射性核種が挙げられる。
本発明によれば、がんを処置する医薬の製造のための、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によれば、がんをイメージングすることに用いるための組成物、がんの診断キット、またはがんの診断薬の製造のためのＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。
本発明によれば、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を前記対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によればまた、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片と細胞傷害剤とのコンジュゲートを前記対象に投与することを含む、方法が提供される。
実施例１：ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質の精製とモノクローナル抗体の作製
本実施例では、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質に対する抗体を取得するため、抗原としてＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質を作製して精製タンパク質を得た。
１）抗原作製
ＴＭＥＭ１３２Ａの遺伝子が組み込まれているベクター(ORIGENE RC214846)に対して、以下のプライマーを用いて常法に従ってPCR増幅を行った。ＤＮＡポリメーラーゼとしては、PrimeStar HS DNA polymerase (takara R010A)を用い、各々抗原のＣ末端には６×Ｈｉｓタグ配列を付加するよう設計した。
免疫抗原Ｉ 増幅用プライマー配列
catatgttccacctcaaagggcaggattg （配列番号３３）
gtcgaccttgaagcggtctagcttggcagtc （配列番号３４）
免疫抗原ＩＩ 増幅用プライマー配列
catatgaatacagcaccactgactggagtg （配列番号３５）
gtcgacttccagagaggctacacgcgagtccag （配列番号３６）
ここで、免疫抗原Ｉは、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の一部（GenBank Accession No.: NP_060340のアミノ酸番号１４３～３１７位の領域）に対応し、免疫抗原ＩＩは、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の別の一部（GenBank Accession No.: NP_060340のアミノ酸番号４１１～５９７位の領域）に対応する。
次に、得られたＰＣＲ増副産物を発現ベクターｐＥＴ２１ｂに組込んだ。具体的には、ｐＥＴ２１ｂとＰＣＲ増副産物それぞれに対して、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（Takara）を製造者プロトコルに従って２時間反応させた。その後、１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ切断断片を分離し、ゲルから切り出してpromega wizard SV gal and PCR clean-up systemキットを用いて精製した。
Ligation high（東洋紡）を用いて30分間上記発現ベクターと免疫抗原ＩまたはＩＩを含むインサートを反応させた。
Competent High DH5α（東洋紡）を用いて形質転換させ、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬ）プレートで培養した。形質転換した大腸菌からプラスミドを抽出してシーケンスを行って目的遺伝子がベクターに挿入されていることを確認した。
次に、タンパク質発現用大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）に目的遺伝子を有する発現ベクターを形質転換して導入した。その後、形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）をクローニングした。
形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）を１０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１６時間培養した培地を１ＬのＬＢ培地に移し替え、３７℃で培養した。ＯＤ６００ｎｍの値が０．６になったところで、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導し、さらに４時間培養した。
４時間後、大腸菌を菌体破砕して、その沈殿物を変性緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ塩酸グアニジン）で懸濁し、１６時間浸透させた後に、サンプルの上清を回収してニッケルカラムにて精製した。
２）ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現株細胞の作製
ＴＭＥＭ１３２Ａ遺伝子（Genbank Accession No.: NM_017870.3）及びＦｌａｇ配列を組み込んだpIRES2-AcGFP1(Clontech) plasmid 0.5μgを0.1mLのOpti-MEM(invitrogen)で希釈し、Lipofectionamine LTXを2.5μL添加して、トランスフェクション用の調製液を得た。室温で静置し２５分後、ＤＬＤ１細胞（４×１０4細胞／ウェル）を含む２４ウェルプレート(corning)に上記で得られた調製液を添加した。トランスフェクション後に、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ThermoFisher）を培地に加え１４日間培養した細胞に対してＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（ＢＤ）を用いてＧＦＰ発現細胞のみを取得した。
得られた細胞を９６ウェルプレートに限外希釈した。細胞のコロニーが単一であったウェルに対し、ウエスタンブロットを行った。Ｆｌａｇ配列が確認できた細胞を強制発現細胞とした。
３）抗体作製
ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈した上記免疫抗原Ｉまたは免疫抗原ＩＩとＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔとを１：１で混合して調製したエマルジョンをマウス（日本ＳＬＣ、Ｂａｌｂ／ｃ、メス、６～８週令）腹腔内に１００μＬずつ投与した。以降１４日ごとにアジュバント（Ｇｅｒｂｕ ａｄｊｕｖａｎｔ１００、Ｇｅｒｂｕ ＧｍｂＨ．など）と混合した免疫抗原を腹腔に投与した。３回目の免疫から免疫７日後に、ＰＢＳで１００尾静脈から採血し調製した抗血清を用いて、免疫抗原を固相としたＥＬＩＳＡまたはＤＬＤ－１細胞若しくはＫ５６２細胞に対するフローサイトメトリーで血清抗体価を評価し、細胞融合に用いる免疫マウス個体を選択した。十分に抗体価が上がったと判断した個体には、最終免疫としてＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した免疫抗原を腹腔から１００μＬ、尾静脈から４００μＬ投与した。最終免疫から３日後に脾臓、腸骨リンパ節、鼠径リンパ節、腋下リンパ節および膝下リンパ節を摘出し、ＰＥＧ法にてマウスミエローマ細胞ｐ３Ｘ６３と融合した。融合１０日～１４日後にハイブリドーマの培養上清を回収した。フローサイトメトリーにてＤＬＤ－１細胞に陽性、ＤＬＤ－１ ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現細胞に強陽性、Ｋ５６２細胞に陰性を示す抗体産生ハイブリドーマ細胞を選択した。選択した抗体産生ハイブリドーマ細胞は限界希釈法にて単クローン化、樹立した。このようにして、免疫抗原ＩＩからＴ６－０４２９クローン、Ｔ６－１０２２クローン、およびＴ６－１１７９クローンを、免疫抗原ＩからＴ６－１４７５クローンを得た。これらのクローンから得られたモノクローナル抗体は、Ｔ６－０４２９抗体、Ｔ６－１０２２抗体、Ｔ６－１１７９抗体およびＴ６－１４７５抗体と呼ぶ。抗体のアイソタイプはアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ）で判定した。Ｔ６－０４２９抗体はＩｇＧ２ａ、Ｔ６－１０２２抗体はＩｇＧ２ａ、Ｔ６－１１７９抗体はＩｇＧ１およびＴ６－１４７５抗体はＩｇＧ２ａであった。
実施例２：ＴＭＥＭ１３２Ａに結合するモノクローナル抗体によるがん細胞の認識能
本実施例では、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合するモノクローナル抗体が正常組織とは反応しない一方で、がん細胞を認識することを見出した。
フローサイトメトリー
測定対象とするがん細胞を培地に懸濁し、１×１０5個／ウェルとなるようにＶ底９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加した。プレートを４４０×ｇ、４℃、３分遠心してから上清を除き、細胞ペレットに抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは抗体溶液を５０μＬ／ウェルで加えて懸濁した。４℃で４５分反応させた後、０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ ２００μＬ／ウェルで３回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに二次抗体を５０ μＬ／ウェルで加えて懸濁した。なお二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ－Ｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで４００倍に希釈したものを用いた。４℃で４５分反応させた後、０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ ２００μＬ／ウェルで３回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに１μｇ／ｍＬ Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ／０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ウェルで加えて懸濁した。このように染色した細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）等のフローサイトメーターを用いて測定し、得られたデータをＦｌｏｗＪＯ（トミーデジタルバイオロジー）で解析した。
上記フローサイトメトリーの手法の通りに、ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ－１若しくは実施例１で作製したＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株またはＴＭＥＭ１３２Ａ陰性の細胞株Ｋ５６２とＴ６－０４２９抗体とを用いて抗体のがん細胞認識能を確認した。Ｔ６－０４２９抗体はＡｌｅｘａ６４７標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。結果は、図１に示される通りであった。
図１に示されるように、ＤＬＤ－１株にはＴＭＥＭ１３２Ａ抗体であるＴ６－０４２９抗体が結合することが明らかとなった。また、ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株では、Ｔ６－０４２９抗体がより多く結合することが明らかとなった。さらに、Ｋ５６２株に対しては、Ｔ６－０４２９抗体の結合が確認できなかった。このことから、ＴＭＥＭ１３２Ａは、大腸がんを検出することができることが明らかとなった。また、ＴＭＥＭ１２３２Ａは、がんの細胞膜上に表出していることも明らかとなった。
次に、大腸がん組織アレイを用いてＴＭＥＭ１３２Ａに結合するモノクローナル抗体が大腸がんを検出できることを示した。
まず、Ｔ６－０４２９抗体が免疫組織学染色に利用可能な抗体であることを確認するために、ＤＬＤ－１株とＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株とを対象として、Ｔ６－０４２９抗体を用いて免疫化学染色を行った。
まず、適当量の細胞をチャンバースライドに播種し、３７℃でインキュベーション（ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ）した。上清を除去して、ＤＰＢＳでウェルを洗浄した後、冷アセトンを添加（アセトン固定）した。室温で１０分間静置し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、３％Ｈ2Ｏ2（３０％Ｈ2Ｏ2を超純水で希釈）を添加した。室温で２０分間静置した。PBS-Tで3回洗浄した後に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ－Ｔを添加して、室温で３０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＨＲＰ直接標識－Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＤＡＢ染色（室温で５分間静置）した。超純水で洗浄した後に、ヘマトキシリン染色（室温で２分間静置）した。水道水中に浸漬して、１０分間静置した。さらに、エタノールに２分間×３回、キシレンに２分間×３回それぞれ浸漬して、脱水透徹した。マウントクイックを用いて封入し、乾燥させた後、顕微鏡により染色像を観察した。
結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ－１は、Ｔ６－０４２９抗体陽性であった。また、ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株は、ＴＭＥＭ１３２Ａを強く発現しており、Ｔ６－０４２９抗体に対して強い陽性反応を示した。
大腸がん組織アレイは、BioChain Institue Inc.(Newark, CA)から入手し、実験に用いた。製造者マニュアルに従い、各組織アレイを染色した。抗体としては、Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いた。結果は図３に示される通りであった。図３に示されるように、正常大腸組織には、Ｔ６－０４２９抗体では検出可能な染色像は得られなかったが、大腸がん組織に対しては、その３割程度がＴ６－０４２９抗体陽性であった。このことから、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体は、大腸がんを検出することができることが示された。乳がん組織アレイもBioChain Institue Inc.(Newark, CA)から入手し、同様に確認したところ、約２０％が陽性であることが分かった。このことから、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体は、乳がんを検出することができることが示された。
さらに、Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いて正常組織を認識しうるか否かを確認した。正常組織検体から常法に基づいてパラフィン切片を作製し、Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いて免疫組織学染色を行った。具体的には、薄切サンプルもしくは凍結保存サンプルを風乾（室温で３０分程度）させた。冷アセトンを添加して、室温で１０分間静置（アセトン固定）した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、３％Ｈ2Ｏ2（３０％Ｈ2Ｏ2を超純水で希釈）を添加し、室温で２０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ－Ｔを添加して、室温で３０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＨＲＰ直接標識Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＤＡＢ染色（室温で５分間静置）した。超純水で洗浄した後に、常法に従ってヘマトキシリン染色（室温で２分間静置）した。水道水中に浸漬して、１０分間静置した。さらにエタノールに２分間×３回、キシレンに２分間×３回それぞれ浸漬して、脱水透徹した。マウントクイックを用いて封入し、乾燥させた後、顕微鏡により染色像を観察した。
結果は、図４～７に示される通りであった。図４～７に示されるように、Ｔ６－０４２９抗体は、皮膚、脳、小腸、肝臓、心臓、肺および腎臓のいずれの正常組織でも陰性であった。ただし、正常皮膚組織では限定的な陽性部位が確認された（図７参照）。
また、抗ＴＭＥＭ１３２Ａ抗体を用いて、各種上皮性がん細胞株のＦＡＣＳによる検出を試みた。
具体的には、測定対象とするがん細胞を培地に懸濁し、1×105個/wellとなるようにV底96ウェルプレート(corning)に添加した。プレートを440×g、4℃、3分遠心してから上清を除き、細胞ペレットに抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは抗体溶液を50 μL/wellで加えて懸濁した。氷上で45分反応させた後、0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200 μL/wellで3回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに二次抗体を50 μL/wellで加えて懸濁した。二次抗体としてAlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG(H-L)（Life Technologies）を0.1%BSA/2mM EDTA/PBSで400倍に希釈したものを用いた。氷上で45分反応させた後、0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200 μL/wellで3回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに50 ng/mL Propidium Iodide/0.1%BSA/2mM EDTA/PBSを250 μL/wellで加えて懸濁した。このように染色した細胞をGuava easyCyte 8HT（Merck Millipore）等のフローサイトメーターを用いて測定し、得られたデータをFlowJO（トミーデジタルバイオロジー）で解析した。
がん細胞株としては、乳がん細胞株、大腸がん細胞株、卵巣がん細胞株、膵臓がん細胞株を用いた。
結果は、下記表１に示される通りであった。
Figure 0007209284000001
表１に示されるように、ＴＭＥＭ１３２Ａは、乳がん細胞株、大腸がん細胞株、卵巣がん細胞株および膵臓がん細胞株などのがん細胞の細胞表面に広く発現することがＦＡＣＳ解析により明らかとなった。
このことから、抗ＴＭＥＭ１３２Ａ抗体は、がんの検出に有用であることが明らかとなった。また、抗ＴＭＥＭ１３２Ａ抗体にＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を保持させること（例えば、抗体のアイソタイプをＩｇＧ１やＩｇＧ３などのＡＤＣＣ活性の高いアイソフォームに変換すること）によってがんの処置に有用であることも示唆された。
実施例３：モノクローナル抗体の配列決定
本実施例では、モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を決定した。
実施例１において得られたＴ６－０４２９クローン、Ｔ６－１０２２クローン、Ｔ６－１１７９クローンおよびＴ６－１４７５クローンから、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。上記total RNAから、SMARTer RACE 5’/3’Kit(takara)を用いて5’末端RACE(rapid amplification of cDNA ends)法を用いてcDNAを合成した。
得られたｃＤＮＡを鋳型として、KOD FX Neo（東洋紡）を用いて目的遺伝子を増幅した。増幅条件はDenature 98℃, 10秒、Anneal 68℃, 30秒, Extend, 72℃ 90秒 5サイクル、Denature 98℃, 10秒、Anneal 65℃, 30秒、Extend,68℃ 90秒 5サイクル、Denature 98℃, 10秒、Anneal 63℃, 30秒, Extend 68℃, 90秒 25サイクルのタッチダウンPCR法を用いた。ＰＣＲは、PCR装置（Applied Biosystem ProFlex PCR System）を用いて実施した。
上記ＰＣＲにおいては、以下のプライマー配列を使用した。
重鎖用フォワードプライマー：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号３７）または
CTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号３８）
重鎖用リバースプライマー：
CCCATGGCCACCARATTCTYATCAGACAG（配列番号３９）
軽鎖用フォワードプライマー：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号４０）
CTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号４１）
軽鎖用リバースプライマー：
GTTGTTCAWGARGCACACGACTGAGGCA（配列番号４２）
増幅したＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲ産物をTarget Clone-plus-(東洋紡)を用いてＴＡクローニングを行った。クローニング後、ＤＨ５α（東洋紡）に形質転換し、シングルコロニーからプラスミドをPlasmid Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。クローニングしたＨ鎖、Ｌ鎖各々の遺伝子をABI PRISM 3100 Genetic Analyzerを用いて遺伝子の塩基配列を解析した。結果は、以下表に示される通りであった。重鎖可変領域において、アミノ酸番号１～１９位はシグナル配列であり、軽鎖可変領域において、アミノ酸番号１～２０はシグナル配列であった。ただし、Ｔ６－１４７５クローンの重鎖可変領域に関しては、アミノ酸番号１～１８位がシグナル配列であった。
Ｔ６－０４２９クローンの重鎖可変領域（配列番号４）
ＣＤＲ１：配列番号１、ＣＤＲ２：配列番号２、ＣＤＲ３：配列番号３
Figure 0007209284000002
Ｔ６－０４２９クローンの軽鎖可変領域（配列番号８）
ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、ＣＤＲ３：配列番号７
Figure 0007209284000003
Ｔ６－１０２２クローンの重鎖可変領域（配列番号１２）
ＣＤＲ１：配列番号９、ＣＤＲ２：配列番号１０、ＣＤＲ３：配列番号１１
Figure 0007209284000004
Ｔ６－１０２２クローンの軽鎖可変領域（配列番号１６）
ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、ＣＤＲ３：配列番号１５
Figure 0007209284000005
Ｔ６－１１７９クローンの重鎖可変領域（配列番号２０）
ＣＤＲ１：配列番号１７、ＣＤＲ２：配列番号１８、ＣＤＲ３：配列番号１９
Figure 0007209284000006
Ｔ６－１１７９クローンの軽鎖可変領域（配列番号２４）
ＣＤＲ１：配列番号２１、ＣＤＲ２：配列番号２２、ＣＤＲ３：配列番号２３
Figure 0007209284000007
Ｔ６－１４７５クローンの重鎖可変領域（配列番号２８）
ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、ＣＤＲ３：配列番号２７
Figure 0007209284000008
Ｔ６－１４７５クローンの軽鎖可変領域（配列番号３２）
ＣＤＲ１：配列番号２９、ＣＤＲ２：配列番号３０、ＣＤＲ３：配列番号３１
Figure 0007209284000009
配列表には以下の配列が記載されている。
Figure 0007209284000010

Claims (4)

  1. ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質に結合する抗体を含む、がんの診断薬であって、がんが、乳がん、卵巣がん、および膵臓がんからなる群から選択されるいずれかである、診断薬。
  2. 対象においてがん細胞を検出する方法であって、
    対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かをＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体により決定することを含み、がんは、乳がん、卵巣がん、および膵臓がんからなる群から選択されるいずれかである、方法。
  3. ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物であって、がんは、乳がん、卵巣がん、および膵臓がんからなる群から選択されるいずれかである、医薬組成物。
  4. モノクローナル抗体が、細胞傷害剤とのコンジュゲートの形態である、請求項３に記載の医薬組成物。
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