BR112020006860A2

BR112020006860A2 - composição para depleção de células t citotóxicas

Info

Publication number: BR112020006860A2
Application number: BR112020006860-8A
Authority: BR
Inventors: Ryuta Mukasa; Naoki KIYOSAWA; Shinnosuke Yamada
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date: 2017-10-05
Filing date: 2018-10-04
Publication date: 2020-10-20
Also published as: EP3693012A1; JP2024010208A; JPWO2019070013A1; TW201927336A; JP7384668B2; CA3078436A1; EP3693012A4; KR20200060407A; WO2019070013A1; US20200262917A1; CN111447952A

Abstract

É provida uma nova composição. É provida uma composição para depleção de células T citotóxicas, compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (i) ter atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, o número de células positivas para LAG-3 in vivo; e (iii) ligar-se a células T humanas ativadas.

Description

COMPOSIÇÃO PARA DEPLEÇÃO DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a, por exemplo, uma composição para esgotamento de células T citotóxicas, compreendendo um anticorpo, um fragmento de ligação do mesmo ou semelhante, uso do anticorpo, o fragmento de ligação do mesmo ou similares para esgotamento de células T citotóxicas, e um método para esgotar células T citotóxicas, compreendendo a etapa de administração do anticorpo, fragmento de ligação do mesmo ou semelhante. Antecedentes da Técnica

[002] Os linfócitos T (células T) são células que desempenham um papel central na resposta imune e, portanto, as células T tendo várias especificidades de antígeno, que se diz numerar de 10 milhões a 1 bilhão de clones, estão presentes in vivo, de modo a lidar com antígenos diversos. Quando um antígeno invade o corpo, apenas um número muito limitado de clones específicos para o antígeno de tais repertórios de células T enormes é proliferado e ativado para trabalhar para defender o corpo através da produção de citocinas e da atividade citotóxica etc. Em doenças autoimunes, várias condições patológicas são consideradas desencadeadas por respostas imunes anormais a alguns auto- antígenos. Mesmo em tais situações, a maioria dos outros clones que não têm essa especificidade de antígeno não é proliferada e ativada e, em vez disso, permanece em estado de repouso. Portanto, a remoção seletiva de apenas células T ativadas pode suprimir a imunidade especificamente, sem afetar a maioria das células T tendo outras especificidades de antígeno e, portanto, pode ser um método útil de tratamento ou prevenção contra doenças autoimunes, rejeição de transplantes, doenças alérgicas etc. Enquanto isso, em uma situação em que as células T que regulam negativamente o sistema imunológico, tais como, as células T reguladoras, são ativadas principalmente, a remoção dessas células pode ser um método útil de tratamento ou prevenção contra tumores malignos, infecções crônicas etc.

[003] O LAG-3 (CD223) é uma molécula transmembranar de passagem única que pertence à superfamília da imunoglobulina e é conhecido por ser expressado seletivamente em células T ativadas (Literatura Não Pertencente à Patente 1). É relatado que, quando o anti-soro de coelho tendo atividade citotóxica dependente de complemento (CDC) contra a molécula de LAG-3 de rato é administrado a um modelo de transplante cardíaco alogênico de rato, as células LAG-3 positivas em um enxerto diminuem, de modo que o período para a rejeição do enxerto é levemente estendida (Literatura Não Pertencente à Patente 2). Também é relatado que o anticorpo quimérico anti-LAG-3 humano A9H1I2 tendo reatividade cruzada com babuínos e exibindo atividade citotóxica mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) suprime a reação de hipersensibilidade do tipo retardada de babuínos, embora sua resposta à dose não seja clara (Literatura Não Pertencente à Patente 3) e anticorpos humanizados da mesma foram produzidos (Literatura Pertencente à Patente 2).

[004] Sabe-se que o LAG-3 se liga a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade (ou do complexo genético principal de histocompatibilidade) (MHC), transmitindo assim alguns sinais inibitórios para as células T para regular negativamente a função das células T

(Literatura Não Pertencente à Patente 1). Para a ligação de LAG-3 a moléculas de classe II de MHC, os domínios N- terminais 1 e 2 dos quatro domínios extracelulares semelhantes a imunoglobulina de LAG-3 são considerados importantes (Literatura Não Pertencente à Patente 4), e também é relatado que tal supressão da função das células T via LAG-3 é exercida cooperativamente com outros sinais que suprimem a função das células T através da molécula PD-1l, etc. (Literatura Não Pertencente à Patente 5). De fato, novos métodos de tratamento do câncer para ativar a função das células imunes, inibindo a função de supressão das células T de LAG-3 para atacar as células cancerígenas, foram ativamente desenvolvidos nos últimos anos (Literaturas Não Pertencentes à Patentes 6 e 7). Portanto, no caso de aplicar um anticorpo para LAG-3 que esgota células LAG-3 positivas pela atividade de ADCC, etc., a doenças autoimunes, um anticorpo que não tem atividade de inibir a função de supressão de células T inerente a LAG-3 é considerado mais desejável, uma vez que, portanto, não há risco de doenças autoimunes piorarem devido à ativação anormal do sistema imunológico.

No anti-soro de coelho de LAG-3 anti-rato tendo atividade de CDC e no anticorpo quimérico anti-LAG-3 humano A9H12 exibindo atividade de ADCC (IMP731: Literaturas Não Pertencentes à Patentes 1 e 2) descritas acima, as células LAG-3 positivas não estão completamente esgotadas (Literaturas Não Pertencentes à Patentes 2 e 3) e, portanto, são assumidas as possibilidades de efeitos colaterais devido à reação anormal das células T restantes que não foram esgotadas e são assumidas influências negativas na supressão de doenças autoimunes.

[005] Entre os subconjuntos de células T, células T CD4+ (positivas) CD28- (negativas), células T CD8+CD28-, células T CD4+CD57+ e células T CD8+CD57+ são grupos de células T citotóxicas que expressam altamente a perforina, a granzima B, etc. (Literaturas Não Pertencentes à Patentes 12 e 13). Embora os fármacos esteroides sejam amplamente usados no tratamento de doenças do sistema imunológico, existe uma população refratária a esteroides de pacientes com doenças do sistema imunológico, tal como asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) (Literatura Não Pertencente à Patente 14). Nos últimos anos, as células T citotóxicas, como mencionado acima, foram relatadas como uma das principais células inflamatórias envolvidas nas condições patológicas de certas doenças autoimunes (Literaturas Não Pertencentes à Patentes 12 e 15). As células T citotóxicas têm uma alta ação citotóxica, enquanto foi relatada resistência à ação anti-inflamatória provocada pelo tratamento com esteroides ou indução de apoptose (Literatura Não Pertencente à Patente 16). Lista de citações Literatura sobre patentes

[006] Literatura de patente 1: US 2011/0070238 Al

[007] Literatura de Patente 2: WO 2014/140180

[008] Literatura Não Pertencente à Patente

[009] Literatura Não Pertencente à Patente 1: Triebel, F., LAG-3: a regulator of T-cell and DC responses and its use in therapeutic vaccination., Trends Immunol., dez. de 2003; Vol. 24 (No. 12): págs. 619-22

[0010] Literatura Não Pertencente à Patente 2: Haudebourg, T. et al., Depletion of LAG-3 positive cells in cardiac allograft reveals their role in rejection and tolerance., Transplantation, dez. se 2007; Vol. 84 (Nº 11): págs. 1500-06

[0011] Literatura Não Pertencente à Patente 3: Haudebourg, T. et al., Antibody mediated depletion of lymphocyte-activation gene-3 (LAG-3 (+) |)-activated T lymphocytes prevents delayed-type hypersensitivity in non- human primates, Clin. Exp. Immunol., maio de 2011; Vol. 164 (Nº 2): págs. 265-74

[0012] Literatura Não Pertencente à Patente 4: Huard, B. et al., Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein, Proc. Natl. Acad. Sci. EVA, 27 de maio de 1997; Vol. 94 (Nº 11): págs. 5744-49

[0013] Literatura Não Pertencente à Patente 5: Okazaki, T. et al., PD-l and LAG-3 inhibitory co-receptors act synergistically to prevent autoimmunity in mice, J. Exp. Med., 7 de fev. de 2011; Vol. 208 (No. 2): págs. 395-407

[0014] Literatura Não Pertencente à Patente 6: Nguyen, L.T. and Ohashi, P.S., Clinical blockade of PDl and LAG3-- potential mechanisms of action, Nat. Rev. Immunol., jan. de 2015; Vol. 15 (No. 1): págs. 45-56

[0015] Literatura Não Pertencente à Patente 7: Turnis, M.E. et al., Inhibitory receptors as targets for cancer immunotherapy, Eur. J. Immunol. jul. de 2015; Vol. 45 (No. 7): págs. 1892-905

[0016] Literatura Não Pertencente à Patente 8: Huarqd, B. et al., T cell major histocompatibility complex class II molecules down-regulate CD4+ T cell clone responses following LAG-3 binding, Eur. J. Immunol., maio de 1996;

Vol. 26 (No. 5): págs. 1180-06

[0017] Literatura Não Pertencente à Patente 9: Macon- Lemaitre, L and Triebel, F, The negative regulatory function of the lIymphocyte-activation gene-3 co-receptor (CD223) on human T cells, Immunology, jun. de 2005; Vol. 115 (No. 2): págs. 170-08

[0018] Literatura Não Pertencente à Patente 10: Li, M. et al., Reconstitution of human Fc gamma RIII cell type specificity in transgenic mice, J. Exp. Med., 1 de maio de 1996; Vol. 183 (No. 3): págs. 1259-63

[0019] Literatura Não Pertencente à Patente 11: Miller, Stephen D. et al., Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Mouse, Current Protocols in Immunology, Capítulo 15 (UNIDADE 15.1), Wiley, 2010: págs. 15.1.1-15.1.20

[0020] Literatura Não Pertencente à Patente 12: STRIOGA, M. et al., CD8+ CD28- and CD8+ CD57+ T cells and their role in health and disease, Immunology, 2011; Vol. 134 (Nº 1): págs. 17-32

[0021] Literatura Não Pertencente à Patente 13: Maly K, Schirmer M, The story of CD4+ CD28- T cells revisited: solved or still ongoing?, J. Immunol. Res., 2015; Vol. 2015: Material Nº 348746

[0022] Literatura Não Pertencente à Patente 14: Barnes, P., Corticosteroid resistance in patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease, J. Allergy Clin. Immunol., 2013; Vol. 131 (Nº 3): págs. 636-645

[0023] Literatura Não Pertencente à Patente 15: Broux, B, et al., Pathogenic features of CD4+CD28- T cells in immune disorders, Trends. Mol. Med., 2012; Vol. 18 (Nº 8): págs. 446-453

[0024] Literatura Não Pertencente à Patente 16: Hodge, G. and Hodge, S., Steroid Resistant CD8+CD28null NKT-Like Pro-inflammatory Cytotoxic Cells in Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Front. Immunol., 2016; Vol. 7: pág. 617 Sumário da Invenção Problema Técnico

[0025] Destina-se prover uma composição para o esgotamento de células T citotóxicas, etc.

Solução para o Problema

[0026] A presente invenção refere-se a: (1) uma composição para esgotamento de células T citotóxicas, compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (i) tendo atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, oO número de células LAG-3 positivas in vivo; e (iii) ligação a células T humanas ativadas; (2) a composição de acordo com (1), em que a célula T citotóxica é selecionada do grupo que consiste em: uma célula T perforina positiva, uma célula T granzima B positiva, uma célula T CD28 negativa e CD4 positiva, uma Célula T CD28 negativa e CD28 positiva, uma célula T CD57 positiva e CD4 positiva e uma célula T CD57 positiva e CD28 positiva; (3) a composição de acordo com (1) ou (2), em que a célula T citotóxica é LAG-3 positiva; (4) a composição de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo se liga ao domínio 3 do LAG-3 humano e tem as propriedades descritas em (1) a (iii) abaixo:

(1) suprimir, em uma forma de baixo teor de fucose, encefalomielite autoimune experimental in vivo;

(ii) permitir que o LAG-3 humano se ligue às moléculas de classe IT do complexo principal de histocompatibilidade humana na presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo; e

(iii) permitir que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas na presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo;

(5) a composição de acordo com qualquer um de (1) a (4), para uso no tratamento ou na prevenção de uma doença resistente a imunossupressores associada a células T citotóxicas;

(6) a composição de acordo com (5), em que o imunossupressor é um esteroide;

(7) a composição de acordo com (5), em que o imunossupressor é um inibidor de calcineurina;

(8) a composição de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano ou um fragmento de ligação do mesmo;

(9) a composição de acordo com (4), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia leve compreendendo "CDRLl tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50 ou Figura 65, CDRL2 tendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 ou Figura 66 e CDRL3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52 ou Figura 67 e uma cadeia pesada compreendendo CDRH1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47 ou Figura 62, CDRH2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48 ou Figura 63 e CDRH3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49 ou Figura 64;

(10) a composição de acordo com (9), em que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação do mesmo;

(11) a composição de acordo com (10), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28 ou Figura 43 com o aminoácido correspondente à posição 68, sendo Gly Ou substituído por Ala, e o aminoácido correspondente à posição 103, sendo Asn ou substituído por Asp, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou Figura 47 com o aminoácido correspondente à posição 21 sendo Asp ou substituído por Asn, o aminoácido correspondente à posição 31 sendo Leu ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 33 sendo Ala ou substituído por (TIle, o aminoácido correspondente à posição 41 é Ile ou é substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 58 é Gln ou substituído por Lys, o aminoácido correspondente à posição 63 sendo Ala ou substituído por Ser, o aminoácido correspondente à posição 80 sendo Ser ou substituído por Asp, o aminoácido correspondente à posição 85 sendo Ser ou substituído por Gly, o aminoácido correspondente à posição 87 sendo Ser ou substituído por Tyr, o aminoácido correspondente à posição 98 sendo Leu ou substituído por Val, o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Phe ou substituído por

Ala, o aminoácido correspondente à posição 105 sendo Thr ou substituído por Phe, o aminoácido correspondente à posição 124 sendo Val ou substituído por Leu, e o aminoácido correspondente à posição 126 sendo Ile ou substituído por Leu;

(12) a composição de acordo com (10) ou (11), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 129 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 140 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 e 30;

(13) a composição de acordo com qualquer uma de (10) a (12), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende:

uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 234 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 470 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 e 30;

(14) a composição de acordo com qualquer uma de (10) a (13), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é selecionado do grupo que consiste em [i] a [x] abaixo:

[i] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 34 (Figura 49);

[ii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 32 (Figura 47);

[iii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 36 (Figura 51);

[iv] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 34 (Figura 49);

[v] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 36 (Figura 51);

[vi] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 38 (Figura 53);

[vii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 40 (Figura 55);

[viii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 32 (Figura 47);

[ix] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 38 (Figura 53); e

[x] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 40 (Figura 55);

(15) a composição de acordo com (14), compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo:

uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácidos tendo 95% ou mais de identidade, respectivamente, com as sequências de aminoácidos do região variável da cadeia leve e região variável da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (14);

(16) a composição de acordo com (14), compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma segunda molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas tendo uma primeira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (14) ou uma sequência de nucleotídeos complementar ao mesmo, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma quarta molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas com uma terceira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo de acordo com (14) ou uma sequência de nucleotídeos complementar ao mesmo;

(17) a composição de acordo com (14), compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo tendo uma propriedade descrita em (i) ou (ii) abaixo:

(i) ligação a um sítio no domínio 3 do LAG-3 humano que é reconhecido pelo anticorpo ou pelo fragmento de ligação do mesmo de acordo com (14); ou

(ii) competir com o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (14) para ligação ao domínio 3 do LAG-3 humano;

(18) a composição de acordo com qualquer um de (1) a (17), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo está em uma forma de baixo teor de fucose;

(19) a composição de acordo com qualquer uma de (1) a (18), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é obtido por um método para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, compreendendo a etapa de cultivar uma célula compreendendo um molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do mesmo ou um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico, ou uma célula que produz o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo;

(20) a composição de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que a presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo permite que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas;

(21) a composição de acordo com qualquer uma de (1) a (3) e (20), em que o LAG-3 humano se liga a moléculas de classe IT do complexo principal de histocompatibilidade humana na presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo;

(22) a composição de acordo com (20) ou (21), em que O anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose;

(23) um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo que é usado para esgotamento de células T citotóxicas e tem as propriedades descritas em (i) a (iii)

abaixo:

(1) tendo atividade de ADCC in vitro;

(ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, o número de células LAG-3 positivas in vivo; e

(iii) ligação a células T humanas ativadas;

(24) uso de um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo para esgotamento de células T citotóxicas:

(i) tendo atividade de ADCC in vitro;

(ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, oO número de células LAG-3 positivas in vivo; e

(iii) ligação a células T humanas ativadas;

(25) um método para esgotar células T citotóxicas, compreendendo a administração de um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo:

(i) tendo atividade de ADCC in vitro;

(iii) ligação a células T humanas ativadas;

(26) a composição de acordo com qualquer um de (1) a (22), para uso em combinação com fármacos adicionais;

(27) uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas perforina positivas, granzima B positivas, CD28 negativas e CD4 positivas, CD28 negativas e CD8 positivas, CD57 positivas e CD4 positivas e/ou CD57 positivas e CD8 positivas, compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo:

(1) tendo atividade de ADCC in vitro;

(iii) ligação a células T humanas ativadas;

(28) a composição farmacêutica de acordo com (27), em que o tratamento ou a prevenção compreende determinar que uma célula T citotóxica contida em uma amostra biológica ou uma fração da membrana celular é perforina positiva, granzima B positiva, CD28 negativa e CD4 positiva, CD28 negativa e CD28 positiva, CD57 positiva e CD4 positiva e/ou CD57 positiva e CD28 positiva;

(29) a composição farmacêutica de acordo com (28), em que a amostra biológica é derivada de um indivíduo que sofre da doença associada às células T citotóxicas ou para o qual se deseja evitar o sofrimento da doença associada às células T citotóxicas;

(30) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das (27) a (29), em que a doença associada às células T citotóxicas é fibrose pulmonar idiopática, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), esclerose múltipla, doença de Graves, espondilite anquilosante, pars planitis, asma, artrite reumatoide, polimiosite ou dermatomiosite, miosite por corpos de inclusão, síndrome coronariana aguda, lupus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, esclerodermia, doença de Crohn, colite ulcerativa, anemia aplásica, Síndrome mielodisplásica, síndrome de Sjógren, granulomatose de Wegener, psoríase, diabetes tipo 2, reação de hospedeiro- versus-enxerto, hepatite B crônica e/ou sarcoidose;

(31) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (30), em que a doença associada às células T citotóxicas é LAG-3 positiva;

(32) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (31), em que o anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo se liga ao domínio 3 do LAG-3 humano e tem as propriedades descritas em (1) a (iii) abaixo:

(1) suprimir, sob uma forma de baixo teor de fucose, encefalomielite autoimune experimental in vivo;

(33) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (32), em que a doença associada às células T citotóxicas é resistente a imunossupressores;

(34) a composição farmacêutica de acordo com (33), em que o imunossupressor é um esteroide;

(35) a composição farmacêutica de acordo com (33), em que o imunossupressor é um inibidor de calcineurina;

(36) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (35), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano, ou um fragmento de ligação do mesmo;

(37) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das (27) a (36), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia leve compreendendo CDRL1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ

ID NO: 50, CDRL2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51 e CDRL3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52, e uma cadeia pesada compreendendo CDRH1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47, CDRH2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48 e CDRH3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49;

(38) a composição farmacêutica de acordo com (37), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação do mesmo;

(39) a composição farmacêutica de acordo com (38), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28 com o aminoácido correspondente à posição 68 sendo Gly ou substituído por Ala, e o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Asn ou substituído por Asp, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 com o aminoácido correspondente à posição 21 sendo Asp ou substituído por Asn, o aminoácido correspondente à posição 31 sendo Leu ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 33 sendo Ala ou substituído por Tle, o aminoácido correspondendo à posição 41 sendo Ile ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 58 sendo Gln ou substituído por Lys, o aminoácido correspondente à posição 63 sendo Ala ou substituída por Ser, o aminoácido correspondente à posição 80 sendo Ser ou substituído por Asp, o aminoácido correspondente à posição 85 sendo Ser ou substituído por Gly, o aminoácido correspondente à posição 87 sendo Ser ou substituído por Tyr, o aminoácido correspondente à posição 98 sendo Leu ou substituído por Val, o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Phe ou substituído por Ala, o aminoácido correspondente à posição 105 sendo Thr ou substituído por Phe, o aminoácido correspondente à posição 124 sendo Val ou substituído por Leu, e o aminoácido correspondente à posição 126 sendo Ile ou substituído por Leu;

(40) a composição farmacêutica de acordo com (38) ou (39), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 129 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 140 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28 e 30;

(41) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (38) a (40), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo compreende: uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 234 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo o aminoácido ao aminoácido 470 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28 e 30;

(42) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (38) a (41), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é selecionado do grupo que consiste em [1]

a [x] abaixo:

(43) a composição farmacêutica de acordo com (42), compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo: uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácidos tendo 95% ou mais de identidade, respectivamente, com as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (42);

(44) a composição farmacêutica de acordo com (42), compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma segunda molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas a uma primeira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (42) ou uma sequência de nucleotídeos complementar ao mesmo, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma quarta molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas a uma terceira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (42) ou uma sequência de nucleotídeos complementar ao mesmo;

(45) a composição farmacêutica de acordo com (42), compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo tendo uma propriedade descrita em (i) ou (ii) abaixo:

(i) ligação a um sítio no domínio 3 do LAG-3 humano que é reconhecido pelo anticorpo ou pelo fragmento de ligação do mesmo de acordo com (42); ou

(ii) competir com o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (42) pela ligação ao domínio 3 do LAG-3 humano;

(46) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (45), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose;

(47) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (46), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é obtido por um método para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, compreendendo a etapa de cultivar uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do mesmo ou um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico, ou uma célula que produz o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo;

(48) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma de (27) a (31), em que a presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo permite que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas;

(49) a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das (27) a (31) e (48), em que o LAG-3 humano se liga às moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade humana na presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo;

(50) a composição farmacêutica de acordo com (48) ou (49), em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose;

(51) a composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (27) a (50), para uso em combinação com fármacos adicionais;

(52) um método para tratar ou prevenir uma doença associada a células T citotóxicas perforina positivas, granzima B positivas, CD28 negativas e CD4 positivas, CD28 negativas e CD8 positivas, CD57 positivas e CD4 positivas e/ou CD57 positivas e CD8 positivas e CD8 positivas, compreendendo a etapa de administrar a composição de acordo com qualquer um de (1) a (22) ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (27) a (51) a um indivíduo que sofre da doença associada a células T citotóxicas ou para a quem se deseja evitar o sofrimento da doença associada às células T citotóxicas;

(53) o método de acordo com (52), em que a doença associada às células T citotóxicas é resistente a imunossupressores;

(54) o método de acordo com (53), em que o imunossupressor é um esteroide;

(55) o método de acordo com (53), em que o imunossupressor é um inibidor de calcineurina;

(56) o método de acordo com qualquer um de (52) a (55), compreendendo adicionalmente a etapa de determinar se uma amostra biológica contendo células T citotóxicas ou uma fração da membrana celular é ou não perforina positiva, granzima B positivas, CD28 negativa e CD4 positiva, CD28 negativa e CD28 positiva, CD5S7 positiva e CD4 positiva e/ou CD57 positiva e CD28 positiva;

(57) o método de acordo com (56), em que a amostra biológica é derivada do indivíduo que sofre da doença associada às células T citotóxicas ou para o qual se deseja evitar o sofrimento da doença associada às células T citotóxicas; e semelhantes. Efeitos vantajosos da Invenção

[0027] A composição fornecida pela presente invenção esgota as células T citotóxicas e, portanto, pode ser usada para o tratamento e/ou a prevenção de doenças associadas às células T citotóxicas (mencionadas mais adiante). Breve descrição dos Desenhos

[0028] [Figura 1] A Figura 1 é um diagrama que mostra os resultados do teste, por citometria de fluxo, da atividade de ligação de anticorpos de rato anti-LAG-3 (rLAZ04, rLA212, rLA225, rLAS869 e rLAlI264) a blastos de PHA humanos que expressam LAG-3. O eixo vertical representa a intensidade média de fluorescência medida por citometria de fluxo.

[0029] [Figura 2] A Figura 2 é um diagrama que mostra a atividade de ADCC de anticorpos de rato anti-LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAlI264). As células 293T-lacZ expressando LAG-3 humano foram usadas como células alvo, e PBMCs humanas foram usadas como células efetoras.

[0030] [Figura 3] A Figura 3A é um diagrama que mostra a atividade inibidora dos anticorpos de rato anti-LAG-3s (rYrLA204, rLA212, rLAZ25, rLAS869 e rLAlI264) em um teste de ligação de classe II a LAG-3/MHC. A IgG2b de rato foi usada como controle negativo, e um anticorpo anti-LAG-3 de rato que foi desenvolvido separadamente e reconhece o domínio 1 de LAG-3 foi usado como controle positivo, respectivamente. Cada anticorpo foi avaliado em 10 upug/mL. A Figura 3B é um diagrama que mostra que o anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico IMP73l1, que é um anticorpo conhecido, exibe atividade inibidora no teste de ligação de classe II a LAG- 3/MHC. 17B4, que é um anticorpo anti-LAG-3 humano de camundongo disponível comercialmente, também exibiu atividade inibidora.

[0031] [Figura 4] A Figura 4 é um diagrama que mostra a atividade inibidora dos anticorpos de rato anti-LAG-3 (rYrLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAlI264) em um teste de adesão de células Raji/293T-hLAG-3. A IgG2b de rato foi usada como controle negativo, e o anticorpo anti-LAG-3 de rato (clone 6D7) que foi desenvolvido nos Exemplos 2-)6 e o domínio reconhecido 1 de LAG-3 foi usado como controle positivo, respectivamente. Cada anticorpo foi avaliado em 10 ug/mL.

[0032] [Figura 5] A Figura 5A é um diagrama que mostra os resultados do teste do epitopo humano de ligação a LAG-3 de anticorpos de rato anti-LAG-3 (rLAZ204, rLA212 e rLA225 por citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade média de fluorescência medida por citometria de fluxo. A ligação do anticorpo anti-FLAG, usado como controle positivo, também é mostrada. Cada anticorpo foi avaliado em ug/mL.

[0033] A Figura 5B é um diagrama que mostra os resultados do teste do epitopo de ligação a LAG-3 humano do anticorpo quimérico anti-LAG-3 humano IMP73l1, que é um anticorpo convencional na Lista de Citações, por citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade média de fluorescência medida por citometria de fluxo. O anti-soro obtido do rato imunizado no Exemplo 1)-l foi usado com diluição de 500 vezes como anti-soro. Cada um dos outros anticorpos foi avaliado em 10 ug/mL. 6D7 é o anticorpo anti- LAG-3 de rato que foi desenvolvido no Exemplo 2)-6 e reconhece o domínio 1 do LAG-3.

[0034] [Figura 6] A Figura 6 é um diagrama que mostra os resultados do teste da atividade de ligação do anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cLA212 a células 293T-lacZ que expressam LAG-3 humano por citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade média de fluorescência medida por citometria de fluxo.

[0035] [Figura 7] A Figura 7 é uma tabela que mostra a capacidade de ligação de anticorpos humanizados anti-LAG-3 como constantes de dissociação.

[0036] [Figura 8] A Figura 8 é um diagrama que mostra os resultados do teste da atividade de ligação de 10 tipos de anticorpos humanizados anti-LAG-3 e do anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cLA212 a 293T-lacZ que expressam LAG-3 humano por citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade média de fluorescência medida por citometria de fluxo.

[0037] [Figura 9] A Figura 9 é um diagrama que mostra a atividade de ADCC de 10 tipos de anticorpos humanizados anti-LAG-3 e o anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cLA212. As células 293T-lacZ expressando LAG-3 humano foram usadas como células alvo, e PBMCs humanas foram usadas como células efetoras.

[0038] [Figura 10] A Figura 10 é um diagrama que investiga a influência do anticorpo humanizado anti-LAG-3 hLA212 H3/L2 e do anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico IMP731 na função de supressão de células T do LAG-3. A produção de IL-2 em sobrenadantes da cultura foi medida quando PBMCs humanas foram estimuladas com SEB por 4 dias na presença de cada anticorpo. Cada anticorpo foi avaliado em ug/mL.

[0039] [Figura 11] A Figura 11 é um diagrama que mostra os resultados do teste da atividade de ligação das células hLA212 H4/L2 a 293T-lacZ do anticorpo humanizado anti-LAG-3 que expressam LAG-3 humano por citometria de fluxo. O eixo vertical representa a intensidade média de fluorescência medida por citometria de fluxo.

[0040] [Figura 12] A Figura 12 é um diagrama que mostra a atividade de ADCC do anticorpo humanizado anti-LAG-3 hLA2Z12 H4/L2. As células 293T-lacZ expressando LAG-3 humano foram usadas como células alvo, e PBMCs humanas foram usadas como células efetoras.

[0041] [Figura 13] A Figura 13 é um diagrama que mostra que a expressão de LAG-3 humano em camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FCyRIIIA humano é consistente com a expressão de LAG-3 de camundongo. Expressão de LAG-3 humano e de camundongo em células T ativadas, obtida por estimulação de glóbulos brancos obtidos do sangue periférico de camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humanos/FCyRIIIA humano (Tg) e camundongos do tipo selvagem de controle (não- Tg) com Con A, foram investigados por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados quando células T CD3 positivas foram refinadas e identificadas (gated) para análise são mostrados. Os quadrantes do gráfico foram estabelecidos usando amostras livres de anticorpos colorantes para LAG-3 humano e de camundongo.

[0042] [Figura 14] A Figura 14 é um diagrama que mostra a atividade de esgotamento do anticorpo humanizado anti-LAG-

3 hLA212 H4/L2 contra células que expressam LAG-3 in vivo. O eixo vertical representa a positividade humana para LAG-3 em células T do sangue periférico de camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humanos/FCyRIIIA humano dois dias após a administração do anticorpo e Con A. O anticorpo foi administrado intraperitonealmente na dose de 30 mg/kg imediatamente antes da administração de Con A.

[0043] [Figura 15] A Figura 15 é um diagrama que mostra que o anticorpo humanizado anti-LAG-3 hLA212 H4/L2 tem uma atividade de suprimir um modelo de doença autoimune in vivo. Os escores clínicos de EAE em camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FCyYRIIIA humano nos quais a EAE foi induzida e aos quais o anticorpo humanizado anti-LAG-3 hLA212 H4/L2 ou um anticorpo de controle foram mostrados ao longo do tempo. Cada anticorpo foi administrado por via intravenosa a uma dose de 30 mg/kg no dia da sensibilização e sete dias depois.

[0044] [Figura 16] A Figura 16 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLAZ204 (SEQ ID No: 1).

[0045] [Figura 17] A Figura 17 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLAZ04 (SEQ ID No: 2).

[0046] [Figura 18] A Figura 18 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAZ04 (SEQ ID No: 3).

[0047] [Figura 19] A Figura 19 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAZO04 (SEQ ID No: 4).

[0048] [Figura 20] A Figura 20 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 5).

[0049] [Figura 21] A Figura 21 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 6).

[0050] [Figura 22] A Figura 22 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 7).

[0051] [Figura 23] A Figura 23 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 8).

[0052] [Figura 24] A Figura 24 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 9).

[0053] [Figura 25) A Figura 25 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 10).

[0054] [Figura 26] A Figura 26 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 11).

[0055] [Figura 27] A Figura 27 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 12).

[0056] [Figura 28] A Figura 28 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 13).

[0057] [Figura 29) A Figura 29º é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 14).

[0058] [Figura 30) A Figura 30 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 15).

[0059] [Figura 31] A Figura 31 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 16).

[0060] [Figura 32] A Figura 32 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 17).

[0061] [Figura 33] A Figura 33 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA1l264 (SEQ ID No: 18).

[0062] [Figura 34] A Figura 34 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 19).

[0063] [Figura 35) A Figura 35 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 20).

[0064] [Figura 36] A Figura 36 é uma sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de aminoácidos do sinal de secreção da cadeia leve humana e a região constante da cadeia x humana (SEQ ID No: 21).

[0065] [Figura 37] A Figura 37 é uma sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de aminoácidos do sinal de secreção da cadeia pesada humana e a região constante de IgGl humana (SEQ ID No: 22).

[0066] [Figura 38] A Figura 38 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo cLA212 (SEQ ID No: 23).

[0067] [Figura 39) A Figura 39º é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo cLA212 (SEQ ID No: 24).

[0068] [Figura 40] A Figura 40 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo cLA212 (SEQ ID No: 25).

[0069] [Figura 41] A Figura 41 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo cLA212 (SEQ ID No: 26).

[0070] [Figura 42] A Figura 42 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada H2 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 27).

[0071] [Figura 43] A Figura 43 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada H2 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 28).

[0072] [Figura 44] A Figura 44 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada H3 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 29).

[0073] [Figura 45] A Figura 45 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada H3 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 30).

[0074] [Figura 46] A Figura 46 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L1 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 31).

[0075] [Figura 47) A Figura 47 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve Ll do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 32).

[0076] [Figura 48] A Figura 48 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L2 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 33).

[0077] [Figura 49) A Figura 49º é a sequência de aminoácidos da cadeia leve L2 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 34).

[0078] [Figura 50] A Figura 50 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L3 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 35).

[0079] [Figura 51] A Figura 51 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve L3 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 36).

[0080] [Figura 52] A Figura 52 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L4 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 37).

[0081] [Figura 53] A Figura 53 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve L4 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 38).

[0082] [Figura 54] A Figura 54 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L5 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 39).

[0083] [Figura 55) A Figura 55 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve L5 do anticorpo hLA212 (SEQ ID No: 40).

[0084] [Figura 56] A Figura 56 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA204 (SEQ ID No: 41).

[0085] [Figura 57] A Figura 57 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLAZ04 (SEQ ID No: 42).

[0086] [Figura 58] A Figura 58 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLAZ04 (SEQ ID No: 43).

[0087] [Figura 59) A Figura 59 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLAZ204 (SEQ ID No: 44).

[0088] [Figura 60) A Figura 60 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA204 (SEQ ID No: 45).

[0089] [Figura 61] A Figura 61 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA204 (SEQ ID No: 46).

[0090] [Figura 62] A Figura 62 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 47).

[0091] [Figura 63] A Figura 63 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 48).

[0092] [Figura 64] A Figura 64 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 49).

[0093] [Figura 65) A Figura 65 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 50).

[0094] [Figura 66] A Figura 66 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 51).

[0095] [Figura 67] A Figura 67 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA212 (SEQ ID No: 52).

[0096] [Figura 68] A Figura 68 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 53).

[0097] [Figura 69) A Figura 69 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 54).

[0098] [Figura 70] A Figura 70 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 55).

[0099] [Figura 71] A Figura 71 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 56).

[00100] [Figura 72] A Figura 72 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 57).

[00101] [Figura 73] A Figura 73 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA225 (SEQ ID No: 58).

[00102] [Figura 74] A Figura 74 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 59).

[00103] [Figura 75] A Figura 75 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 60).

[00104] [Figura 76] A Figura 76 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 61).

[00105] [Figura 77] A Figura 77 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 62).

[00106] [Figura 78] A Figura 78 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 63).

[00107] [Figura 79] A Figura 79º é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA869 (SEQ ID No: 64).

[00108] [Figura 80] A Figura 80 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 65).

[00109] [Figura 81] A Figura 81 é a sequência de aminoácidos da CDRH2 da cadeia pesada do anticorpo rLA1l264 (SEQ ID No: 66).

[00110] [Figura 82] A Figura 82 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 67).

[00111] [Figura 83] A Figura 83 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 68).

[00112] [Figura 84] A Figura 84 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 69).

[00113] [Figura 85] A Figura 85 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLAl264 (SEQ ID No: 70).

[00114] [Figura 86] A Figura 86 é o iniciador RG2AR3 (SEQ

ID No: 71).

[00115] [Figura 87] A Figura 87 é o iniciador RKR5 (SEQ ID No: 72).

[00116] [Figura 88] A Figura 88 é o iniciador 3.3-F1l (SEQ ID No: 73).

[00117] [Figura 89] A Figura 89 é O iniciador 3.3-R1 (SEQ ID No: 74).

[00118] [Figura 90] A Figura 90 é o iniciador 212H-F (SEQ ID No: 75).

[00119] [Figura 91] A Figura 91 é o iniciador 212H-R (SEQ ID No: 76).

[00120] [Figura 92] A Figura 92 é o iniciador 212L-F (SEQ ID No: 77).

[00121] [Figura 93] A Figura 93 é o iniciador 212L-R (SEQ ID No: 78).

[00122] [Figura 94] A Figura 94 é o iniciador LAG-3-H1 (SEQ ID No: 79).

[00123] [Figura 95] A Figura 95 é o iniciador LAG-3-H2 (SEQ ID No: 80).

[00124] [Figura 96] A Figura 96 é o iniciador LAG-3-H3 (SEQ ID No: 81).

[00125] [Figura 97] A Figura 97 é o iniciador LAG-3-H4 (SEQ ID No: 82).

[00126] [Figura 98] A Figura 98 é o iniciador LAG-3-H5 (SEQ ID No: 83).

[00127] [Figura 99] A Figura 99 é o iniciador LAG-3-H6 (SEQ ID No: 84).

[00128] [Figura 100] A Figura 100 é uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do LAG- 3 humano (SEQ ID No: 85).

[00129] [Figura 101] A Figura 101 é a sequência de aminoácidos do LAG-3 humano (SEQ ID No: 86).

[00130] [Figura 102] A Figura 102 é um diagrama que mostra que nas células T CD8 humanas ativadas, a expressão de LAG-3 humano se correlaciona com a expressão de perforina. A expressão de LAG-3 e perforina em células PBMC humanas estimuladas com o Ativador T Humano CD3/CD28 Dynabeads foi investigada por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados quando células T CD3 positivas e CD8 positivas foram refinadas e identificadas para análise são mostrados. Os quadrantes do gráfico foram estabelecidos usando amostras livres de anticorpos colorantes para LAG-3 humano e perforina humana (diagrama mais à esquerda).

[00131] [Figura 103] A Figura 103 é um diagrama que mostra que nas células T CD8 humanas ativadas, a maioria das células CD28 negativas expressa LAG-3. A expressão de LAG-3 e CD28 em células PBMC humanas estimuladas com Ativador T Humano Dynabeads CD3/CD28 foi investigada por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados quando células T CD3 positivas e CD8 positivas foram refinadas e identificadas para análise são mostrados. Os quadrantes do gráfico foram estabelecidos usando amostras livres de anticorpos colorantes para LAG-3 humano e CD28 humano (diagrama mais à esquerda).

[00132] [Figura 104] A Figura 104 é um diagrama que mostra que nas células T CD8 humanas ativadas, a maioria das células CD57 positivas expressa LAG-3. A expressão de LAG-3 e CDS57 em células PBMC humanas estimuladas com Ativador T Humano CD3/CD28 Dynabeads foi investigada por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados quando células T

CD3 positivas e CD8 positivas foram refinadas e identificadas para análise são mostrados. Os quadrantes do gráfico foram estabelecidos usando amostras livres de anticorpos colorantes para LAG-3 humano e CD57 humano (diagrama mais à esquerda).

[00133] [Figura 105] A Figura 105 é um diagrama que mostra que oO anticorpo para LAG-3 esgota seletivamente células T CD8 positivas para perforina. As células obtidas pela estimulação de PBMCs humanas com o Ativador T Humano CD3/CD28 Dynabeads na presença do anticorpo humanizado anti- LAG-3 hNhLA212 H4/L2, tacrolimo (Tac) ou dexametasona (Dex) por 4 dias foram analisadas por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados, quando PBMCs derivadas de dois doadores foram usadas, são mostrados (PBMC1 e PBMC2). A Figura 105A mostra o número total de células T, e a Figura 105B mostra o número de células T CD8 positivas para perforina.

[00134] [Figura 106] A Figura 106 é um diagrama que mostra que o anticorpo para LAG-3 esgota as células T CD28 negativas. Células obtidas pela estimulação de PBMCs humanas com o Ativador T Humano CD3/CD28 Dynabeads na presença do anticorpo humanizado anti-LAG-3 hLA212 H4/L2 (concentração final: 10, 1 e 0,l pg/ml), um anticorpo de controle (concentração final: 10 ug/mL), tacrolimo (Tac) ou dexametasona (Dex) por 4 dias foram analisados por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados quando PBMCs derivados de dois doadores foram usados são mostrados (PBMC1 e PBMC2). A Figura 106A mostra o número de células T CD4 CD28 negativas, e a Figura 106B mostra o número de células T CD8 CD28 negativas.

[00135] [Figura 107] A Figura 107 é um diagrama que mostra que o anticorpo para LAG-3 esgota as células T CD57 positivas. Células obtidas pela estimulação de PBMCs humanas com o Ativador T Humano CD3/CD28 Dynabeads na presença do anticorpo humanizado anti-LAG-3 hLA212 H4/L2 (concentração final: 10, 1 e 0,1 ug/ml), um anticorpo de controle (concentração final: 10 vg/mL), tacrolimo (Tac) ou dexametasona (Dex) por 4 dias foram analisadas por citometria de fluxo (coloração múltipla). Os resultados, quando PBMCs derivadas de dois doadores foram usadas, são mostrados (PBMC1 e PBMC2). A Figura 107A mostra o número de células T CD4 CD57 positivas, e a Figura 107B mostra o número de células T CD8 CD57 positivas. Descrição das Modalidades

1. Definição

[00136] Na presente invenção, o termo “gene” significa uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica os aminoácidos de uma proteína, ou sua fita complementar. O termo “gene” deve incluir, por exemplo, um polinucleotídeo, um oligonucleotídeo, DNA, mRNA, CDNA e cRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica os aminoácidos de uma proteína ou uma sequência de nucleotídeos “complementar ao mesmo. Esse gene é um nucleotídeo de fita simples, dupla ou tripla ou mais. O termo “gene” também deve incluir uma associação de fitas de DNA e RNA, uma mistura de ribonucleotídeos (RNAS) e desoxirribonucleotídeos (DNAs) em um nucleotídeo de fita única e um nucleotídeo de fita dupla ou tripla ou mais, compreendendo essa fita de nucleotídeo. Exemplos do “gene LAG-3” da presente invenção podem incluir DNA, mRNA, cDNA e

CRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da proteína de LAG-3.

[00137] Na presente invenção, o termo “nucleotídeo” tem o mesmo significado que “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico”, e também inclui, por exemplo, DNA, RNA, uma sonda, um oligonucleotídeo, um polinucleotídeo e um iniciador. Esse nucleotídeo é um nucleotídeo de fita simples, fita dupla ou tripla ou mais. O termo “nucleotídeo” também deve incluir uma associação de fitas de DNA e RNA, uma mistura de ribonucleotídeos (RNAs) e desoxirribonucleotídeos (DNAs) em uma fita de nucleotídeo, e uma associação de duas fitas ou três ou mais fitas compreendendo essa fita de nucleotídeo.

[00138] Na presente invenção, os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” têm o mesmo significado.

[00139] Na presente invenção, o termo “antígeno” tem o mesmo significado que “imunogênio”.

[00140] Na presente invenção, o termo “célula” também inclui, por exemplo, várias células derivadas de animais individuais, células subcultivadas, células de cultura primária, linhas celulares, células recombinantes e células microbianas.

[00141] Na presente invenção, cada um de um anticorpo que se liga ao LAG-3 e um anticorpo que reconhece o LAG-3 pode ser referido como um “anticorpo anti-LAG-3” ou abreviado como um “anticorpo para LAG-3”. O anticorpo anti-LAG-3 inclui anticorpos monoclonais, anticorpos quimerizados, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos quiméricos e similares.

[00142] O termo “fragmento de ligação de um anticorpo” na presente invenção significa um fragmento de anticorpo que exerce pelo menos uma parte das funções exercidas pelo anticorpo original. Exemplos do “fragmento de ligação do anticorpo” podem incluir, mas não estão limitados a, Fab, F(ab')», scFv, Fab!” e imunoglobulina de cadeia única. Tal fragmento de ligação do anticorpo pode ser obtido tratando uma molécula de comprimento total da proteína de anticorpo com uma enzima, tal como papaína ou pepsina ou pode ser uma proteína recombinante produzida em uma célula hospedeira apropriada usando um gene recombinante.

[00143] Na presente invenção, o “sítio” ao qual um anticorpo se liga, isto é, o “sítio” reconhecido por um anticorpo, significa um peptídeo parcial ou uma conformação parcial em um antígeno que é ligado ou reconhecido pelo anticorpo. Na presente invenção, esse sítio também é referido como epitopo ou sítio de ligação a anticorpo. Exemplos do sítio na proteína de LAG-3, que é ligado ou reconhecido pelo anticorpo anti-LAG-3, podem incluir um peptídeo parcial ou uma conformação parcial na proteína de LAG-3.

[00144] As cadeias pesada e leve de uma molécula de anticorpo são conhecidas por cada uma ter três regiões determinantes de complementaridade (CDRsS) . As regiões determinantes da complementaridade também são chamadas de domínios hipervariáveis. Essas regiões estão localizadas nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo. Esses sítios têm uma estrutura primária particularmente altamente variável e são usualmente separados em três posições nas respectivas estruturas primárias das fitas de polipeptídeos das cadeias pesada e leve. Na presente invenção, as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo são referidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3 do terminal amino da sequência de aminoácidos da cadeia pesada para as regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada e como CDRL1, CDRL2 e CDRL3 a partir do terminal amino da sequência de aminoácidos da cadeia leve para as regiões determinantes da complementaridade da cadeia leve. Esses sítios são proximais entre si na estrutura tridimensional e determinam a especificidade do antígeno a ser ligado. As porções diferentes de CDRHl a CDRH3 na sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada são chamadas estruturas (regiões estruturais: daqui por diante, FR), e as porções do terminal amino até, mas não incluindo, CDRHI1, logo após CDRH1l até, mas não incluindo, CDRH2, logo após CDRH2 até, mas não incluindo, CDRH3, e logo após CDRH3 até o terminal carboxil são chamados respectivamente FRH1 a FRH4. Da mesma forma, as porções diferentes de CDRL1 a CDRL3 na sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve também são FRs, e as porções do terminal amino até, mas não incluindo CDRL1, de logo após CDRL1 até, mas não incluindo CDRL2, logo após CDRL2 até, mas não incluindo, CDRL3, e logo após CDRL3 até o terminal carboxil são chamados respectivamente FRL1 a FRI4. Ou seja, na(s) sequência(s) de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, FRH1I-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 e FRL1- CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 são continuamente alinhadas do lado do terminal amino em direção ao terminal carboxil nesta ordem.

[00145] Na presente invenção, o termo “mutante de anticorpo” significa um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do anticorpo original por substituição, exclusão, adição e/ou inserção (daqui por diante, coletivamente referido como uma “mutação”) do(s) aminoácido(s) e se liga à proteína de LAG-

3. O número de aminoácidos mutados no anticorpo mutante é 1, 1a2,1a3,1a4,1a5,1a6, 1a 7,128 la9, la 10, 1 a 12, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25, 1 a 30, 1 a 40 ou la

50. O mutante de anticorpo também é abrangido pelo “anticorpo” da presente invenção.

[00146] Na presente invenção, o termo “vários” em “l a vários” refere-se a 3 a 10.

[00147] Na presente invenção, exemplos de atividades ou propriedades exercidas pelo anticorpo para LAG-3 podem incluir atividades biológicas ou propriedades físico- químicas e podem incluir especificamente várias atividades biológicas, atividade de ligação contra um antígeno Ou epitopo, estabilidade durante a produção ou o armazenamento e estabilidade térmica.

[00148] Na presente invenção, a expressão “hibridização sob condições rigorosas” significa hibridização sob condições que envolvem hibridização a 65ºC em uma solução contendo 5 x SSC, seguida de lavagem a 65ºC por 20 minutos em uma solução aquosa contendo 2 x SSC-SDS a 0,1%, a 65ºC por 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,5 x SSC-SDS a 0,1% e a 65ºC por 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,2 x SSC-SDS a 0,1%, ou hibridização sob condições equivalentes às mesmas. SSC significa uma solução aquosa de NaCl 150 mM-citrato de sódio 15 mM, e “n x SSC” significa SSC com uma concentração de n vezes.

[00149] Na presente invenção, o termo “citotoxicidade” refere-se a alguma alteração patológica provocada nas células e significa não apenas trauma direto, mas todo tipo de dano estrutural ou funcional às células, incluindo clivagem de DNA, formação de dímeros básicos, quebra cromossômica, dano a aparelho mitótico, e redução das atividades de várias enzimas.

[00150] Na presente invenção, o termo “atividade citotóxica” significa uma atividade que causa a citotoxicidade mencionada acima.

[00151] Na presente invenção, o termo “atividade citotóxica mediada por célula dependente de anticorpo”, também chamada “atividade citotóxica celular dependente de anticorpo” ou “atividade de ADCC”, significa o efeito ou a atividade de células alvo prejudiciais por células NK ou similares via anticorpos.

[00152] Na presente invenção, o termo “reação de hospedeiro-versus-enxerto” significa o estado hiperimune de um receptor observado após o transplante de órgão, e o dano ao órgão transplantado por esse estado.

[00153] Na presente invenção, o termo “doença do enxerto contra hospedeiro” significa sintomas, causados pelo ataque imunológico das células transplantadas a um receptor após o transplante de células hematopoiéticas.

[00154] Na presente invenção, o termo “esgotamento” refere-se a um estado em que o número de células incluídas em um determinado grupo de células foi reduzido ou não foi aumentado por atividade citotóxica ou semelhantes. Da mesma forma, o termo “esgotamento” refere-se a diminuir ou não aumentar o número de células incluídas em um grupo celular específico por atividade citotóxica ou semelhante.

[00155] Na presente invenção, o termo “célula T citotóxica” significa uma célula T tendo citotoxicidade para células incluídas em um grupo de células específico, e exemplos das mesmas podem incluir subconjuntos de células T, tais como, células T CD4+ (positivas) CD28- (negativas), células T CD8+CD28-, células T CD4+ CD57+, células T CD8+ CD57+, células T perforina+ e células T granzima B+. Essas células T citotóxicas foram relatadas como uma das principais células inflamatórias envolvidas em doenças do sistema imunológico ou doenças autoimunes, tais como asma e asma grave (daqui por diante, coletivamente referidas como “asma” ) ou doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) . (Literatura Não Pertencente à Patenteada 12 e 15), e tendo alta ação citotóxica, enquanto foi relatada resistência à ação anti-inflamatória provocada pelo tratamento com esteroides ou resistência à indução de apoptose (Literatura Não Pertencente à Patente 16).

2. Proteína antigênica (2-1) Propriedades

[00156] A proteína de LAG-3 (que pode ser daqui por diante denominada “LAG-3”) é uma proteína receptora transmembranar e é composta por uma região extracelular, composta por domínios semelhantes à imunoglobulina (IgDl a 4), que contém um sítio de ligação de ligando, uma região transmembranar de passagem única do tipo I e uma região intracelular. LAG-3 tem o mesmo significado que CD223.

[00157] Na presente invenção, o LAG-3 é derivado de vertebrados, de preferência, derivado de mamíferos, mais de preferência derivado de humanos.

[00158] A proteína de LAG-3 tem as seguintes propriedades: (i) ligação a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em células apresentadoras de antígeno;

(ii) ligação a moléculas de classe II de MHC e transmissão de sinais inibitórios a células T que expressam tais moléculas, para regular negativamente a função das células T;

(iii) a proteína de LAG-3 na presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos (que será daqui por diante referida “sequência de aminoácidos de LAG-3”) de acordo com qualquer uma de (a) a (d) abaixo, consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos de LAG-3, ou consiste na sequência de aminoácidos de LAG-3:

(a) a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 86 (Figura 101);

(b) uma sequência de aminoácidos que exibe 80% ou mais, 82% ou mais, 84% ou mais, 86% ou mais, 88% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 94% ou mais, 96 % ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 86 (Figura 101) e é compreendida em um polipeptídeo tendo atividade de ligação de classe II a molécula de MHC;

(c) uma sequência de aminoácidos que é derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 86 (Figura 101) pela substituição, exclusão, adição ou inserção de 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a15,1a10,1 28,1 a6,1a5,1a4,1a3,1 0102 00 1 aminoácido(s) e está compreendida em um polipeptídeo tendo atividade de ligação a moléculas de classe II de MHC; e

(d) uma sequência de aminoácidos que é codificada pela sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo (molécula de ácido nucleico) que hibridiza sob condições rigorosas com um polinucleotídeo (molécula de ácido nucleico) tendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID No: 86 (Figura 101) e está compreendida em um polipeptídeo tendo atividade de ligação de classe II a molécula de MHC.

[00159] O polipeptídeo de acordo com qualquer um de (b) a (d) pode ter outras atividades de LAG-3, além da atividade de ligação de classe II a molécula de MHC.

[00160] (iv) A proteína de LAG-3 pode ser obtida de células, tecidos ou tecidos cancerígenos que expressam LAG- 3, células derivadas de tecidos, culturas de células e semelhantes, de um vertebrado, de preferência, de um mamífero, mais de preferência de um roedor, tal como um camundongo ou um rato, e um humano, ainda mais de preferência, de um humano, um rato ou um camundongo.

[00161] A expressão de LAG-3 é observada em células T ativadas, sítios de inflamação e similares in vivo, e quase nenhuma expressão ou um nível de expressão muito baixo é visto em células de tecidos normais.

[00162] A proteína de LAG-3 pode ser uma proteína nativa (não recombinante) ou recombinante. A proteína de LAG-3 também se destina a incluir produtos de fusão com outro peptídeo ou outra proteína, tal como um carreador ou uma etiqueta. A proteína de LAG-3 pretende ainda incluir formas providas com uma modificação química, incluindo a adição de um polímero, tal como PEG e/ou com uma modificação biológica, incluindo uma modificação da cadeia de açúcar. Além disso, a proteína de LAG-3 pretende incluir um fragmento de proteína de LAG-3. Dos fragmentos de proteína de LAG-3, aqueles tendo as propriedades descritas em (i) e/ou (ii) acima são chamados fragmentos de ligação à proteína de LAG-3. (2-2) Gene de antígeno

[00163] O gene LAG-3 na presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeos (daqui por diante denominada “sequência de genes LAG-3”) de acordo com qualquer um de (a) a (c) abaixo, consiste em uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência do gene LAG-3 ou consiste na sequência do gene LAG-3: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 86 (Figura 101); (b) a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo (molécula de ácido nucleico) que hibridiza sob condições rigorosas com um polinucleotídeo (molécula de ácido nucleico) que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 86 (Figura 101) e codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo tendo atividade de ligação de classe II a molécula de MHC; e (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 86 (Figura 101) pela substituição, exclusão, adição ou inserção de 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1a 15, 1a 10, 1a 8, 1 a 6, 1a 5, 1a4,1a3,10u20ul base(s) e codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo tendo atividade de ligação de classe II a molécula de MHC.

[00164] O polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de acordo com (b) ou (c) pode ter outras atividades de LAG-3, além da atividade de ligação de classe II a molécula de MHC.

[00165] A expressão e o nível de expressão do gene LAG- 3 podem ser analisados com um transcrito do gene LAG-3 ou com a proteína de LAG-3 como um índice. O primeiro índice pode ser determinado por RT-PCR, hibridização por Northern blot ou semelhantes, enquanto o último índice pode ser determinado por um imunoensaio, tais como, citometria de fluxo, Western blotting, coloração imuno-histoquímica ou semelhantes, respectivamente.

(2-3) Preparação de proteína antigênica

[00166] A proteína de LAG-3 pode ser preparada por purificação ou isolamento de tecidos de animais (incluindo fluidos corporais), células derivadas dos tecidos, ou culturas das células, recombinação de genes, tradução in vitro, síntese química, etc.

(2-3-1) Purificação ou isolamento de LAG-3 não recombinante

[00167] A proteína de LAG-3 não recombinante pode ser purificada ou isolada de células que expressam LAG-3. Exemplos de células que expressam LAG-3 podem incluir os descritos em (iv) de (2-1), mas a origem da proteína de LAG- 3 não recombinante não está limitada aos mesmos.

[00168] A purificação ou O isolamento de tais tecidos células, culturas celulares ou semelhantes, pode ser realizada(o) por uma combinação de abordagens bem conhecidas pelos habilitados na técnica, tal como fracionamento e cromatografia.

(2-3-2) Preparação da proteína de LAG-3 recombinante

[00169] A proteína de LAG-3 também pode ser preparada em uma forma recombinante. Especificamente, as células hospedeiras são transfectadas com um gene que codifica a sequência de aminoácidos da proteína de LAG-3 ou um fragmento de proteína de LAG-3, e a proteína de LAG-3 pode ser recuperada a partir de culturas das células. Além disso, a proteína de LAG-3 pode ser expressada não apenas como uma molécula com o mesmo terminal amino (terminal N) e/ou terminal carboxi (terminal C) que os nativos, mas também como uma proteína de fusão com um sinal secretor, um sinal de localização intracelular, uma etiqueta para purificação por afinidade, ou um peptídeo parceiro. A proteína de LAG-3 pode ser purificada ou isolada dessas culturas de células recombinantes por uma combinação apropriada de métodos, tais como fracionamento e cromatografia descritas em (2-3-1 Purificação ou isolamento da proteína de LAG-3 não recombinante. Além disso, a solução contendo proteína de LAG-3 pode ser submetida à troca de tampão e/ou concentração usando filtração em gel ou um concentrador tal como Centriprep. (2-3-3) Tradução in vitro

[00170] A proteína de LAG-3 também pode ser preparada por tradução in vitro. Esse método de tradução não é particularmente limitado, desde que o método emprega um sistema de tradução sem células envolvendo: enzimas necessárias para a transcrição e tradução, substratos e substâncias energéticas. Exemplos dos mesmos podem incluir um método usando o Sistema de Tradução Rápida (RTS) fabricado pela Roche Diagnostics K.K. (2-3-4) Síntese química

[00171] A proteína de LAG-3 também pode ser preparada por síntese química. Exemplos do método de síntese química podem incluir métodos de síntese de peptídeos em fase sólida, tais como, métodos de síntese de Fmoc e Boc.

3. Anticorpo (3-1) Classificação do anticorpo

[00172] Na presente invenção, o anticorpo para LAG-3 pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal. Exemplos do anticorpo monoclonal podem incluir anticorpos derivados de animais não humanos (anticorpos de animais não humanos), anticorpos derivados de humanos (anticorpos humanos) anticorpos quimerizados (anticorpos quiméricos) e anticorpos humanizados.

[00173] Exemplos do anticorpo animal não humano podem incluir anticorpos derivados de vertebrados, tais como mamíferos e aves. Exemplos do anticorpo derivado de mamífero podem incluir anticorpos derivados de roedores, tais como anticorpos de camundongo e anticorpos de rato. Exemplos do anticorpo derivado de pássaro podem incluir anticorpos de frango. Exemplos do anticorpo monoclonal de rato anti-LAG-3 humano podem incluir, mas não estão limitados a, rLA2ZOA4, rLA212, rLA225, 41LA869 e rLA1l264.

[00174] Exemplos do anticorpo quimerizado podem incluir, mas não estão limitados a, um anticorpo compreendendo regiões variáveis derivadas de anticorpos de animais não humanos ligadas a regiões constantes de anticorpos humanos (imunoglobulina humana). Exemplos do anticorpo quimerizado compreendendo regiões variáveis derivadas de anticorpos animais não humanos ligadas a regiões constantes de anticorpos humanos podem incluir aquelas que têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivadas do anticorpo monoclonal de rato rLA204, rLA212, rLAZ25, 41LA869 ou rLA1l264, e tendo regiões constantes de cadeia pesada e leve humana (que são referidas como “cLA204”, “cLA212”, “cLA2Z25”, “cLASG69” ou “cLA1l264”, respectivamente).

[00175] Exemplos do anticorpo humanizado podem incluir, mas não estão limitados a, um anticorpo humano (regiões variáveis da imunoglobulina humana) enxertado com CDRs nas regiões variáveis de um anticorpo animal não humano, um anticorpo humano enxertado com as CDRs, bem como com sequências de FRs de um anticorpo animal não humano, e um anticorpo tendo aminoácidos de anticorpos humanos ou outros aminoácidos substituídos por um ou dois ou mais aminoácidos derivados de anticorpos de animais não humanos em qualquer um desses anticorpos humanos (humanizados). Exemplos de CDRs nas regiões variáveis de um anticorpo animal não humano podem incluir CDRH1 a CDRH3 na região variável da cadeia pesada e CDRL1 a CDRL3 na região variável da cadeia leve derivada de rLAZ204, rLA212, rLA225, rLA225, rLA86G69 ou rLA1l 264 mencionados acima. Exemplos do anticorpo humanizado compreendendo CDRH1l a CDRH3 na região variável da cadeia pesada e CDRL1 a CDRL3 na região variável da cadeia leve derivada de rLA212 podem incluir hLA212 H2/Ll a H2/L5, hLA212 H3/L1 a H3/L5 e hLA212 H4/L2.

[00176] O anticorpo humano não é especificamente limitado, desde que o anticorpo reconheça a proteína de LAG- 3, mas exemplos do mesmo podem incluir um anticorpo humano que se liga ao mesmo sítio que um anticorpo que tem as CDRs do anticorpo para LAG-3, e uma ligação de anticorpos humanos para o mesmo sítio em LAG-3 que qualquer um dos anticorpos animais não humanos, os anticorpos quiméricos, os anticorpos humanizados e semelhantes, e um anticorpo competindo com qualquer um desses anticorpos para ligação a LAG-3.

[00177] O anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser constituído por porções derivadas de uma pluralidade de anticorpos diferentes, desde que o anticorpo tenha atividade de ligação a LAG-3. Exemplos de tal anticorpo podem incluir um anticorpo compreendendo cadeias pesadas e/ou leves trocadas entre uma pluralidade de anticorpos diferentes, um anticorpo compreendendo cadeias pesadas e/ou leves de comprimento total trocadas entre si, um anticorpo compreendendo regiões variáveis ou constantes trocadas entre si, e um anticorpo compreendendo todas ou algumas CDRs trocadas entre elas. As regiões variáveis das cadeia pesada e leve do anticorpo quimérico podem ser derivadas de diferentes anticorpos de LAG-3. CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 nas regiões variáveis das cadeia pesada e leve do anticorpo humanizado podem ser derivados de dois ou mais anticorpos de LAG-3 diferentes. CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo humano podem ser uma combinação de CDRs portadas por dois ou mais anticorpos de LAG-3 diferentes. O anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo composto por tais porções derivadas de uma pluralidade de anticorpos diferentes, cada um tem as seguintes propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4) além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, adicionalmente mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00178] Exemplos do isotipo do anticorpo monoclonal podem incluir, mas não estão particularmente limitados a,

IgG, tais como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgM, IgA, tais como, IgAl e IgA2, IgbD e IgE e podem de preferência incluir IgG e IgM. O isotipo e a subclasse do anticorpo monoclonal podem ser determinados por, por exemplo, um teste de Ouchterlony, um ensaio imunossorvente ligado a enzima (daqui por diante referido como “ELISA”) ou um radioimunoensaio (daqui por diante referido como “RIA”). Um kit comercialmente disponível para identificação (por exemplo, Kit Tipificador de Camundongo; Bio-Rad Laboratories, Inc. e KIT DE ISOTIPIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE RATO: AbLD Serotec) também pode ser usado. (3-2) Especificidade de ligação de anticorpo

[00179] Na presente invenção, o anticorpo para LAG-3 reconhece a proteína de LAG-3. Em outras palavras, oO anticorpo para LAG-3 liga-se à proteína de LAG-3. Esse anticorpo também é expressado como um “anticorpo anti-LAG- 3”. De preferência, o anticorpo usado na presente invenção reconhece especificamente a proteína de LAG-3. Em outras palavras, o anticorpo usado na presente invenção liga-se de preferência especificamente à proteína de LAG-3 (as propriedades acima serão referidas coletivamente como “atividade de ligação à LAG-3” do anticorpo). Mais de preferência, o anticorpo usado na presente invenção se liga especificamente à(s) região (ões) extracelular (es) da proteína de LAG-3, ainda mais de preferência, o anticorpo se liga especificamente aos domínios semelhantes à imunoglobulina (que serão daqui por diante referidos como “domínios semelhantes a Ig”) da proteína de LAG-3, ainda mais de preferência, o anticorpo se liga especificamente ao domínio 3 semelhante a Ig.

[00180] Na presente invenção, o termo “reconhecimento específico”, isto é, “ligação específica”, significa ligação que não é adsorção não específica. Exemplos de critérios para determinar se a ligação é específica ou não podem incluir uma constante de dissociação (daqui por diante denominada “KD”). De preferência, o anticorpo usado na presente invenção tem um valor de KD de 1 x 10? ou menor, 5 x 10-6º ou menor, 2 x 10-º ou menor, ou 1 x 10-º ou menor, mais de preferência 5 x 107 ou menor, 2 x 107 ou menor, ou 1 x 107? ou menor, ainda mais de preferência 5 x 107º ou menor, 2 x 10-º ou menor, ou 1 x 10º ou menor, ainda mais de preferência 5 x 10º? ou menor, 2 x 10º ou menor, ou 1 x 10º ou menor, mais de preferência 5 x 107º ou menor, 2 x 10º ou menor, ou 1 x 10-*º ou menor para a proteína de LAG-3.

[00181] Na presente invenção, a ligação do anticorpo ao antígeno pode ser ensaiada ou determinada por análise por ELISA, RIA, ressonância plasmônica de superfície (daqui em diante, referida como “SPR”), ou semelhantes. Exemplos de equipamentos usados na análise de SPR podem incluir BIAcore (TM) (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), ProteOn (TM) (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi (TM) (fabricado por BioNavis Oy Ltd.), Spreeta (TM) (fabricado pela Texas Instruments Inc.), SPRi-Plex II (TM) (fabricado pela Horiba, Ltd.) e Autolab SPR (TM) (fabricado pela Metrohm Japan Ltd.). A ligação do anticorpo ao antígeno expressado na superfície celular pode ser ensaiada por citometria de fluxo, ELISA de Célula ou semelhantes. (3-3) Atividade citotóxica de anticorpo

[00182] De acordo com um aspecto, o anticorpo anti-LAG- 3 usado na presente invenção tem atividade citotóxica celular dependente de anticorpo (ADCC), de preferência tem atividade de ADCC in vitro, mais de preferência tem atividade de ADCC contra células T que expressam LAG-3. O anticorpo anti-LAG- 3 usado na presente invenção pode ter atividade citotóxica dependente de complemento (CDC) e/ou atividade fagocitócica celular dependente de anticorpo (ADCP) além da atividade de ADCC. Na presente invenção, o termo “atividade de ADCC in vitro” também é simplesmente referido como “atividade de ADCC”.

[00183] A atividade da ADCC pode ser ensaiada por um método conhecido. As células que expressam o antígeno de interesse (células alvo) e as células efetoras capazes de matar as células alvo são usadas no ensaio de atividade da ADCC. As células efetoras reconhecem as regiões Fc de anticorpos que se ligam às células alvo via receptores Fcy. As células efetoras matam as células alvo por sinais transduzidos dos receptores Fcy. No caso de ensaio da atividade de ADCC de um anticorpo tendo uma região Fc derivada de humanos, células NK humanas são usadas como células efetoras. As células NK humanas podem ser preparadas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) por um método conhecido na técnica. Alternativamente, as PBMCs podem ser usadas diretamente como células efetoras.

(3-4) Número de células LAG-3 positivas in vivo, reduzindo a atividade do anticorpo

[00184] Na presente invenção, de acordo com um aspecto, o anticorpo para LAG-3 reduz o número de células LAG-3 positivas, de preferência reduz o número de células LAG-3 positivas in vivo e, mais de preferência, reduz o número de células LAG-3 positivas in vivo em uma forma de baixo teor de fucose.

[00185] As células LAG-3 positivas incluem células forçadas a expressar LAG-3 e células tendo expressão de LAG- 3 induzida por estimulação, mas não estão limitadas as mesmas, desde que sejam células que expressem LAG-3.

[00186] O número de células LAG-3 positivas pode ser contado por um método convencional, tal como citometria de fluxo.

[00187] Na presente invenção, o termo “forma de baixo teor de fucose” significa um estado em que (1) a quantidade de fucose (resíduos de fucose) que se liga a um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo nas cadeias de açúcar do tipo complexo ligado a N-glicosídeo é menor que a quantidade de fucose (resíduos de fucose) que se liga ao anticorpo original (precursor) ou um fragmento de ligação do mesmo nas cadeias de açúcar do tipo complexo ligado ao N-glicosídeo, (ii) a quantidade de fucose (resíduos de fucose) que se liga a um anticorpo ou a um fragmento de ligação do mesmo nas cadeias de açúcar do tipo complexo ligado ao N-glicosídeo é menor que a quantidade de fucose (resíduos de fucose) que se liga naturalmente a um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo nas cadeias de açúcar do tipo complexo ligado ao N- glicosídeo, ou (iii) a quantidade de fucose (resíduos de fucose) ou cadeias de açúcar compreendendo fucose (resíduos de fucose) que se liga a um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo nas cadeias de açúcar do tipo complexo ligado ao N-glicosídeo está no ou abaixo do limite de detecção em uma análise física ou química (de preferência espectrometria de massa). No caso em que a quantidade de fucose (resíduos de fucose) que se liga a um anticorpo modificado ou a um fragmento de ligação do mesmo nas cadeias de açúcar do tipo complexo ligado a N-glicosídeo é menor do que a anterior à modificação, o anticorpo modificado ou o fragmento de ligação do mesmo é menor entendido como uma “forma de baixo teor de fucose”. A forma modificada de hLA2Z12 H4/L2 descrita abaixo, que é um anticorpo humanizado, é um aspecto do anticorpo na forma de baixo teor de fucose. Um anticorpo ou um fragmento de ligação em uma forma de baixo teor de fucose tem maior afinidade pelos receptores FcyIIIA e maior atividade de ADCC do que quando não está na forma de baixo teor de fucose. (3-5) Atividade inibidora da encefalomielite autoimune experimental in vivo do anticorpo

[00188] Na presente invenção, de acordo com um aspecto, o anticorpo para LAG-3 tem atividade inibidora de encefalomielite, de preferência tendo atividade inibidora de encefalomielite autoimune experimental in vivo, mais de preferência tem atividade inibidora de encefalomielite autoimune experimental in vivo em uma forma de baixo teor de fucose.

[00189] Na presente invenção, encefalomielite autoimune experimental significa encefalomielite induzida por injeção de um peptídeo derivado de MOG (glicoproteína da mielina do oligodendrócito), que é uma das proteínas componentes da mielina nervosa central, a camundongos em conjunto com o adjuvante de Freund.

[00190] À atividade inibidora da encefalomielite autoimune experimental pode ser avaliada por observação diária de escores clínicos que refletem os graus de paralisia. O escore clínico pode ser definido, por exemplo, como a seguir: Escore 0: Assintomático; Escore 1: miopatia caudal; Escore 2: marcha anormal ou perda do reflexo de endireitamento; Escore 3: Paralisia parcial das pernas traseiras; Escore 4: Paralisia parcial dos membros anteriores; e Escore 5: Morte ou eutanásia.

(3-6) Atividade de ligação de células T humanas ativada do anticorpo

[00191] Na presente invenção, de acordo com um aspecto, o anticorpo para LAG-3 se liga a células T humanas ativadas, de preferência se liga a células T humanas ativadas LAG-3 positivas. A ligação do anticorpo às células T humanas ativadas pode ser testada ou detectada, por exemplo, por citometria de fluxo.

(3-7) Presença de anticorpo que permite que o LAG-3 humano se ligue às moléculas humanas de MHC de classe II

[00192] De acordo com um aspecto da presente invenção, o LAG-3 humano pode se ligar a moléculas de classe II de MHC humanas na presença do anticorpo ou, na presente invenção, o anticorpo para LAG-3 não inibe a ligação do LAG-3 humano a moléculas de classe IT de MHC humanas.

[00193] A ligação de proteínas de fusão da região extracelular da molécula LAG-3 e a parte Fc da IgG a células Raji que expressam endogenamente altamente moléculas de classe II de MHC podem ser avaliadas, por exemplo, por ensaio ou detecção por citometria de fluxo.

(3-8) Presença de anticorpo que permite ao LAG-3 humano exercer a função de supressão de células T humanas

[00194] De acordo com outro aspecto, o LAG-3 humano exerce uma função de supressão de células T humanas na presença do anticorpo para LAG-3 da presente invenção.

[00195] O termo “função de supressão de células T” na presente invenção significa reduzir ou suprimir a quantidade de citocina produzida após estimulação de células T.

[00196] A função de supressão de células T pelo LAG-3 humano pode ser ensaiada, por exemplo, pela quantificação de citocinas produzidas quando as células T humanas são estimuladas para induzir a expressão de LAG-3.

[00197] Na presente invenção, a estimulação de células T humanas não é especificamente limitada, mas exemplos das mesmas podem incluir estimulação com antígenos específicos, anticorpos anti-CD3, combinações de anticorpos anti-CD3 e anticorpos anti-CD28, superantígenos, células derivadas de outros doadores, de preferência estimulação com Enterotoxina B estafilocócica, células derivadas de outros doadores tendo diferentes MHC e semelhantes.

[00198] Exemplos de citocinas podem incluir citocinas produzidas a partir de células T ativadas, de preferência, várias interleucinas e interferons, mais de preferência interleucina 2 (IL-2) e interferon 74.

(3-9) Anticorpo monoclonal

[00199] A presente invenção prover um anticorpo monoclonal anti-LAG-3 e um fragmento de ligação do mesmo. O anticorpo monoclonal inclui anticorpos monoclonais derivados de animais não humanos, como anticorpos de rato, anticorpos de camundongo, anticorpos de coelho, anticorpos de galinha, anticorpos de peixe, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fragmentos de ligação dos mesmos e formas modificadas dos mesmos. Destes, exemplos do anticorpo monoclonal de rato podem incluir rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAI264.

[00200] O rLA204 é um anticorpo monoclonal de rato anti- LAG-3 humano obtido pelo método descrito no Exemplo 1. A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de rLA204 é descrita na SEQ ID No: 1 (Figura 16), e sequência de aminoácidos da mesma está descrito na SEQ ID No: 2 (Figura 17). A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de rLA204 é descrita na SEQ ID No: 3 (Figura 18), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 4 (Figura 19). A sequência de aminoácidos de CDRH1 de rLA204 é descrita na SEQ ID No: 41 (Figura 56), a sequência de aminoácidos de CDRH2 do mesmo é descrita na SEQ ID No: 42 (Figura 57), a sequência de aminoácidos de CDRH3 é descrita na SEQ ID No: 43 (Figura 58), a sequência de aminoácidos de CDRL1 é descrita na SEQ ID No: 44 (Figura 59), a sequência de aminoácidos de CDRL2 é descrita na SEQ ID No: 45 (Figura 60), e a sequência de aminoácidos de CDRL3 é descrita na SEQ ID No: 46 (Figura 61), respectivamente.

[00201] O rLA212 é um anticorpo monoclonal de rato anti- LAG-3 humano obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 1. A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de rLA212 é descrita na SEQ ID No: 5 (Figura 20), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 6 (Figura 21). A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de rLA212 é descrita na SEQ ID No: 7 (Figura 22), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 8 (Figura 23). A sequência de aminoácidos de CDRH1 de rLA212 é descrita na SEQ ID No: 47 (Figura 62), a sequência de aminoácidos de CDRH2 é descrita na SEQ ID No: 48 (Figura 63), a sequência de aminoácidos de CDRH3 é descrita na SEQ ID No: 49 (Figura 64), a sequência de aminoácidos de CDRL1 é descrita na SEQ ID No: 50 (Figura 65), a sequência de aminoácidos de CDRL2 é descrita na SEQ ID No: 51 (Figura 66), e a sequência de aminoácidos de CDRL3 da mesma é descrita na SEQ ID No: 52 (Figura 67), respectivamente.

[00202] O rLA225 é um anticorpo monoclonal de rato anti- LAG-3 humano obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 1. A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de rLA225 é descrita na SEQ ID No: 9 (Figura 24), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: (Figura 25). A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de rLA225 é descrita na SEQ ID No: 11 (Figura 26), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 12 (Figura 27). A sequência de aminoácidos de CDRH1 de rLA225 é descrita na SEQ ID No: 53 (Figura 68), a sequência de aminoácidos de CDRH2 é descrita na SEQ ID No: 54 (Figura 69), a sequência de aminoácidos de CDRH3 é descrita na SEQ ID No: 55 (Figura 70), a sequência de aminoácidos de CDRL1 é descrita na SEQ ID No: 56 (Figura 71), a sequência de aminoácidos de CDRL2 é descrita na SEQ ID No: 57 (Figura 72), e a sequência de aminoácidos de CDRL3 da mesma é descrita na SEQ ID No: 58 (Figura 73).

[00203] O rLA869 é um anticorpo monoclonal de rato anti- LAG-3 humano obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 1. A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de rLA869 é descrita na SEQ ID No: 13 (Figura 28), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No:

14 (Figura 29). A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de rLA869 é descrita na SEQ ID No: (Figura 30), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 16 (Figura 31). A sequência de aminoácidos de CDRH1 de rLA869 é descrita na SEQ ID No: 59 (Figura 74), a sequência de aminoácidos de CDRH2 é descrita na SEQ ID No: 60 (Figura 75), a sequência de aminoácidos de CDRH3 é descrita na SEQ ID No: 61 (Figura 76), a sequência de aminoácidos de CDRL1 da mesma é descrita na SEQ ID No: 62 (Figura 77), a sequência de aminoácidos de CDRL2 da mesma é descrita na SEQ ID No: 63 (Figura 78), e a sequência de aminoácidos de CDRL3 da mesma é descrita na SEQ ID No: 64 (Figura 79).

[00204] O rLA1264 é um anticorpo monoclonal de rato anti- LAG-3 humano obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 1. A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de rLAl264 é descrita na SEQ ID No: 17 (Figura 32), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 18 (Figura 33). A sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de rLAl264 é descrita na SEQ ID No: 19 (Figura 34), e sua sequência de aminoácidos é descrita na SEQ ID No: 20 (Figura 35). A sequência de aminoácidos de CDRH1 de rLAl264 é descrita na SEQ ID No: 65 (Figura 80), a sequência de aminoácidos de CDRH2 é descrita na SEQ ID No: 66 (Figura 81), a sequência de aminoácidos de CDRH3 é descrita na SEQ ID No: 67 (Figura 82), a sequência de aminoácidos de CDRL1 da mesma é descrita na SEQ ID No: 68 (Figura 83), a sequência de aminoácidos de CDRL2 da mesma é descrita na SEQ ID No: 69 (Figura 84), e a sequência de aminoácidos de CDRL3 da mesma é descrita na SEQ ID No: 70

(Figura 85).

[00205] Outros exemplos do anticorpo monoclonal anti- LAG-3 humano podem incluir o anticorpo de camundongo anti- LAG-3 humano A9H12 (ver WO2008/132601).

[00206] Na presente invenção, um anticorpo mutante exibe de preferência, por exemplo, sensibilidade reduzida à degradação ou oxidação de proteínas, uma atividade biológica aprimorada, uma capacidade melhorada de ligação de antígeno ou conferência de certas propriedades físico-químicas Ou funcionais. Exemplos de um tal mutante de anticorpo podem incluir um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do anticorpo original por uma substituição conservadora de aminoácidos de 1 ou 2 ou mais, de preferência 1 a vários aminoácidos. A substituição conservadora de aminoácidos é uma substituição que ocorre em um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais de aminoácidos relacionadas.

[00207] Grupos aminoácidos preferidos são como a seguir: um grupo ácido incluindo ácido aspártico e ácido glutâmico; um grupo básico incluindo lisina, arginina e histidina; um grupo não polar incluindo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano; e uma família polar não carregada, incluindo glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos preferidos são como a seguir: um grupo hidroxi alifático incluindo serina e treonina; um grupo contendo amida incluindo asparagina e glutamina; um grupo alifático incluindo alanina, valina, leucina e isoleucina; e um grupo aromático incluindo fenilalanina, triptofano e tirosina. Tal substituição de aminoácidos no mutante de anticorpo é, de preferência, realizada sem reduzir a atividade de ligação de antígeno do anticorpo original (precursor).

[00208] O ácido aspártico contido em uma proteína é facilmente convertido em ácido isoaspártico por isomerização quando um aminoácido ligado ao mesmo no lado C terminal tem uma pequena cadeia lateral. Por outro lado, a asparagina é facilmente convertida em ácido aspártico por desamidação e pode adicionalmente ser convertida em ácido isoaspártico por isomerização. A progressão dessa isomerização ou desamidação pode influenciar a estabilidade da proteína. Por conseguinte, o ácido aspártico ou a asparagina na proteína ou, por exemplo, um aminoácido adjacente à mesma, pode ser substituído(a) por um aminoácido diferente, de modo a evitar essa isomerização ou desamidação. De preferência, um mutante de anticorpo tendo uma substituição de aminoácidos mantém a atividade de ligação de antígeno do anticorpo original.

[00209] A presente invenção também abrange, por exemplo: um mutante de anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de rLA204, rLA212, rLA225, rLAZ225, rLA869, rLA1l264 ou A9H12 da presente invenção por substituição conservadora de aminoácidos; e um anticorpo de camundongo, um anticorpo de rato, um anticorpo quimerizado, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano compreendendo uma CDR tendo uma sequência de aminoácidos na qual uma mutação conservadora de aminoácidos é introduzida na sequência de aminoácidos de qualquer um de CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 derivado de rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1l264 ou A9HI12.

[00210] O mutante do anticorpo da presente invenção abrange um mutante de anticorpo de ligação a LAG-3 humano compreendendo CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 tendo sequências de aminoácidos em que 1 a vários, de preferência 1 a 3, mais de preferência 1 ou 2, mais de preferência 1 aminoácido(s) é (são) substituído(s) por um aminoácido(s) diferente(s) nas sequências de aminoácidos de qualquer um ou dois ou mais CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 derivados de rLA2Z04, rLA212, rLA212, rLA225, rLA8S6G9, rLAl264 ou A9H1I2 da presente invenção.

[00211] O mutante de anticorpo também inclui um anticorpo tendo CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 derivado de uma pluralidade de anticorpos. Exemplos de um tal mutante podem incluir um anticorpo mutante compreendendo CDRH3 derivado de um determinado anticorpo e CDRH1, CDRH2 e CDRL1 a CDRL3 a CDRL3 derivado de outro anticorpo.

[00212] O “anticorpo” de acordo com a presente invenção também abrange esses mutantes de anticorpos.

[00213] As regiões constantes do anticorpo da presente invenção não são particularmente limitadas. De preferência, regiões constantes derivadas de um anticorpo humano são usadas no anticorpo para LAG-3 para esgotamento de células T citotóxicas. Exemplos da região constante da cadeia pesada do anticorpo humano podem incluir Cyl, Cy2, Cy3, CY4, Cu, Cô, Cal, Ca2 e Ce. Exemplos da região constante da cadeia leve do anticorpo humano podem incluir CK e CA.

(3-10) Anticorpo quimérico

[00214] O anticorpo quimerizado anti-LAG-3 Ou O fragmento de ligação do mesmo usado na presente invenção tem as propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3- 2) e (3-3), de preferência (3-4) em além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00215] A sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de cLA212 exemplificada como anticorpo quimérico humano-rato da presente invenção e a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos da cadeia leve da mesma são mostradas respectivamente na SEQ ID No: 23, 24, 25 e 26 (Figuras 38, 39, 40 e 41). As posições de nucleotídeos 1 a 57 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada e as posições 1 a 19 na sequência de aminoácidos da cadeia pesada representam "uma sequência sinal, que normalmente não está contida nas sequências de nucleotídeos e nas sequências de aminoácidos da maioria cadeias pesadas maduras. Da mesma forma, cada uma das posições de nucleotídeo 1 a 60 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve e das posições de aminoácido 1 a 20 na sequência de aminoácidos da cadeia leve representa uma sequência sinal, que é normalmente não está contida nas sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos das cadeias leves mais maduras.

[00216] Os anticorpos quiméricos de rato-humano cLA2Z04, cCcLA225, cLAS869 e cLAlI264 são descritos em outros lugares.

[00217] Outros exemplos do anticorpo quimérico da presente invenção podem incluir IMP731 (quimera tipo A9H12; ver WoO2008/132601), que é um anticorpo quimérico camundongo- humano do anticorpo de camundongo anti-LAG-3 humano A9H12. (3-11) Fragmento de ligação do anticorpo

[00218] De acordo com um aspecto, o anticorpo usado na presente invenção pode ser um fragmento de ligação do anticorpo anti-LAG-3. O fragmento de ligação do anticorpo significa um fragmento que mantém pelo menos uma parte das funções do anticorpo. Exemplos dessas funções do anticorpo podem geralmente incluir atividade de ligação de antígeno, atividade reguladora da atividade do antígeno, e atividade citotóxica celular dependente de anticorpo (ADCC). De preferência, o fragmento de ligação do anticorpo anti-LAG-3 usado na presente invenção tem as propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4) em além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00219] O fragmento de ligação do anticorpo não está particularmente limitado desde que o fragmento do anticorpo mantenha pelo menos uma porção das atividades do anticorpo. Exemplos do mesmo podem incluir, mas não estão limitados a, Fab, F(ab'!)», Fv, Fv de cadeia única (scFv) compreendendo Fvs das cadeia pesada e leve ligados por meio de um ligante apropriado, fragmentos de anticorpos biespecíficos anticorpos lineares, anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos e Fab, que é um fragmento monovalente de regiões variáveis de anticorpo obtido pelo tratamento de F(ab'"), sob condições redutoras. O fragmento de ligação do anticorpo também pretende incluir uma molécula compreendendo o fragmento do anticorpo, bem como outras porções, tais como scFv retendo uma porção ligante.

[00220] Uma molécula que é derivada da proteína do anticorpo pela exclusão de 1 a vários ou mais aminoácido(s) no seu terminal amino e/ou terminal carboxi e mantém pelo menos uma porção das funções do anticorpo também está abrangida no significado do fragmento de ligação do anticorpo. Por exemplo, sabe-se que a cadeia pesada de um anticorpo produzido por células de mamífero cultivadas carece de um resíduo de lisina no terminal carboxi (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). Além disso, sabe- se que a cadeia pesada desse anticorpo carece de dois resíduos de aminoácidos (glicina e lisina) no terminal carboxi e, em vez disso, tendo um resíduo de prolina amidado no terminal carboxi (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). A exclusão e a modificação nessas sequências de cadeia pesada, no entanto, não influenciam a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno ou à suas funções efetoras (ativação do complemento, efeitos citotóxicos celulares dependentes de anticorpos, etc.). Essa forma modificada do fragmento de ligação do anticorpo também é abrangida pelo anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada (descrita mais adiante).

[00221] Na presente invenção, o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo pode ser um anticorpo multiespecífico tendo especificidade por pelo menos 2 tipos de antígenos diferentes. O anticorpo multiespecífico não se limita a um anticorpo biespecífico, que se liga a 2 tipos de antígenos diferentes, e um anticorpo tendo especificidade para 3 ou mais tipos de antígenos diferentes também é abrangido no significado do termo “anticorpo multiespecífico” da presente invenção.

[00222] O anticorpo multiespecífico da presente invenção pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de ligação do mesmo (por exemplo, anticorpo biespecífico de F(ab'):). O anticorpo biespecífico também pode ser preparado ligando as cadeias pesada e leve (pares HL) de dois tipos de anticorpos. Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser obtido por fusão de dois ou mais tipos de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais para preparar células de fusão produtoras de anticorpos biespecíficos (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539). O anticorpo multiespecífico também pode ser preparado da mesma maneira que acima.

[00223] De acordo com um aspecto, o anticorpo para LAG- 3 da presente invenção é um anticorpo de cadeia única (cadeia única Fv; daqui em diante, referido como “scFv”). Um scFv é obtido pela ligação das regiões V das cadeia pesada e leve do anticorpo através de um ligante de polipeptídeo (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, Rosenburg e Moore, ed., Springer Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 ( 1994) e Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126- 1136). Além disso, um bi-scFv compreendendo dois scFvs ligados através de um ligante de polipeptídeo pode ser usado como um anticorpo biespecífico. Alternativamente, um multi- scFv compreendendo três ou mais scFvs pode ser usado como um anticorpo multiespecífico.

[00224] A presente invenção inclui uma imunoglobulina de cadeia única compreendendo sequências das cadeia pesada e leve de comprimento total do anticorpo ligadas por meio de um ligante apropriado (Lee, H-S, et al., Molecular Immunology (1999), 36, p. 61-71; e Schirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2 (1) p. 73-76). Uma tal imunoglobulina de cadeia única pode ser dimerizada para assim manter uma estrutura e atividades semelhantes às do anticorpo, que originalmente era um tetrâmero. Na presente invenção, o anticorpo pode ser um anticorpo que tem uma única região variável da cadeia pesada e não tem sequência de cadeia leve. Foi relatado que esse anticorpo, chamado anticorpo de domínio único (sdAb) ou nanocorpo, mantém a capacidade de se ligar a um antígeno

(Muyldermans S. et al., Protein Eng. (1994), 7 (9), 1129-35; and Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993), 363 (6428), 446-8) . Esses anticorpos também estão abrangidos no significado do fragmento funcional do anticorpo. (3-12) Anticorpo humanizado e anticorpo humano

[00225] De acordo com um aspecto, a presente invenção prover um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação do mesmo.

[00226] De preferência, o anticorpo humanizado anti-LAG- 3 ou o fragmento de ligação do mesmo usado na presente invenção tem as propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4) além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00227] Exemplos preferidos do anticorpo humanizado usado na presente invenção podem incluir anticorpos humanizados tendo a cadeia pesada CDRHl1 a CDRH3 e a cadeia leve CDRL1l a CDRL3 de rLAZ204, rLA212, rLAZ25, rLA8GO, rLAl264, A9H12 ou H5L7, como descrito abaixo em A a F.

[00228] (A. Anticorpo humanizado tendo anticorpo da cadeia pesada CDRH1 a CDRH3 e da cadeia leve de CDRL1 a CDRL3 rLA204)

[00229] Exemplos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 ou o fragmento de ligação do mesmo da presente invenção podem incluir um anticorpo humanizado que consiste em uma cadeia pesada tendo uma região variável compreendendo CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 41 (Figura 56), CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 42 (Figura 57), e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 43 (Figura 58), e uma cadeia leve tendo uma variável região compreendendo CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 44 (Figura 59), CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 45 (Figura 60) e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID No: 46 (Figura 61), e reconhece a proteína de LAG-3, um fragmento de ligação da mesma ou um mutante da mesma. (B. Anticorpo humanizado tendo anticorpo da cadeia pesada CDRH1 a CDRH3 e da cadeia leve de CDRL1 a CDRL3 de rLA212)

[00230] Exemplos alternativos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo podem incluir um anticorpo humanizado que consiste em uma cadeia pesada tendo uma região variável compreendendo CDRHl que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 47 (Figura 62), CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 48 (Figura 63), e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 49 (Figura 64), e uma cadeia leve tendo uma região variável que compreende CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 50 (Figura 65), CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 51 (Figura 66), e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 52 (Figura 67) e reconhece a proteína de LAG-3, um fragmento de ligação da mesma ou um mutante da mesma. (C. Anticorpo humanizado tendo anticorpo da cadeia pesada CDRH1 a CDRH3 e da cadeia leve CDRL1 a CDRL3 de rLA225)

[00231] Exemplos alternativos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo podem incluir um anticorpo humanizado que consiste em uma cadeia pesada tendo uma região variável compreendendo CDRH1l que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 53 (Figura 68), CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 54 (Figura 69), e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 55 (Figura 70), e uma cadeia leve tendo uma região variável que compreende CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 56 (Figura 71), CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 57 (Figura 72), e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 58 (Figura 73), e reconhece a proteína de LAG-3, um fragmento de ligação da mesma ou um mutante da mesma. (D. Anticorpo humanizado tendo anticorpo da cadeia pesada CDRH1 a CDRH3 e da cadeia leve de CDRL1 a CDRL3 de rLA869)

[00232] Exemplos alternativos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo podem incluir um anticorpo humanizado que consiste em uma cadeia pesada tendo uma região variável compreendendo CDRHl que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 59 (Figura 74), CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 60 (Figura 75), e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 61 (Figura 76), e uma cadeia leve tendo uma região variável que compreende CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 62 (Figura 77), CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 63 (Figura 78), e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No : 64

(Figura 79), e reconhece a proteína de LAG-3, um fragmento de ligação da mesma ou um mutante da mesma. (E. Anticorpo humanizado anticorpo de cadeia pesada CDRH1 a CDRH3 e da cadeia leve CDRL1 a CDRL3 de rLAl264)

[00233] Exemplos alternativos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo podem incluir um anticorpo humanizado que consiste em uma cadeia pesada tendo uma região variável compreendendo CDRH1l que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 65 (Figura 80), CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 66 (Figura 81), e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 67 (Figura 82), e uma cadeia leve tendo uma região variável que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 68 (Figura 83), CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 69 (Figura 84), e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID No: 70 (Figura 85), e reconhece a proteína de LAG-3, um fragmento de ligação da mesma, ou um mutante da mesma.

(F. Anticorpo humanizado tendo anticorpo da cadeia pesada CDRH1 a CDRH3 e da cadeia leve CDRL1 a CDRL3 A9H12 ou H5L7)

[00234] Exemplos alternativos dos mesmos podem incluir um anticorpo humanizado que compreende anticorpo de CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 A9H12 ou H5L7, e reconhece a proteína de LAG-3, um fragmento de ligação da mesma, ou um mutante da mesma.

[00235] Exemplos preferidos do anticorpo humanizado usado na presente invenção incluem os descritos em A a F acima. Exemplos mais preferidos do anticorpo humanizado podem incluir, mas não estão limitados a, hLA212 H2/L1 a hLA212 H2/L5, hLA212 H3/Ll1 a hLA212 H3/L5S e hLA212 H4/L2 (ver [i] a [x] abaixo) e os anticorpos humanizados IMP731 H5L7, HI1L7, J7L7, H4L7, J11L7, H2L7, J13L7, H7L7, JOL7, HOL7 e HSL7BW (Literatura Referente à Patente 2). Por exemplo, os exemplos mais preferidos do anticorpo humanizado usado na presente invenção também incluem um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos humanizados hLA212 H2/L1 a hLA212 H2/L5, hLA212 H3/Ll a hLA212 H3/L5, hLAZ212 H4/L2, HSL7 e HSL7BW e uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve de qualquer um dos anticorpos humanizados hLA212 H2/L1 a hLA212 H2/L5, hLA212 H3/L1 a hLA212 H3/L5, hLA212 H4, LLA, e HS5L7BW.

[1]

[00236] [i-1] hNLA212 H3/L2 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 29 (Figura 44) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: (Figura 45) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 33 (Figura 48) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID Não: 34 (Figura 49) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição para o esgotamento de células T citotóxicas, O método para o tratamento ou a prevenção de uma doença associada às células T citotóxicas, o uso para tratamento ou prevenção, etc., da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação a LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3), a propriedade descrita em (3-8), isto é, a presença do anticorpo permitindo que o LAG- 3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas (ver os Exemplos) e tendo as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-7).

[00237] [i-2] hLA212 H4/L2 é um anticorpo humanizado que foi obtido no Exemplo 8 e cuja modificação da cadeia de açúcar é ajustada, e é uma forma de baixo teor de fucose de hLA212 H3/L2. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 29 (Figura 44) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 30 (Figura 45) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 33 (Figura 48) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID Não: 34 (Figura 49) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado por métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição para o esgotamento de células T citotóxicas, o método para o tratamento ou a prevenção de uma doença associada às células T citotóxicas, o uso para tratamento ou prevenção, etc., da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3, a atividade de ADCC in vitro a atividade de redução do número de células LAG-3 positivas, a atividade inibidora da encefalomielite autoimune experimental, e a atividade de ligação de célula T humana ativada descrita em (3-2) a (3-6) tem as propriedades descritas em (3-7), ou seja, a presença do anticorpo que permite que o LAG-3 humano se ligue às moléculas de classe II de MHC humanas (ver os Exemplos), e tendo as propriedades descritas em (3-8), isto é, a presença do anticorpo que permite ao LAG-3 humano exercer uma função de supressão de células T humanas.

[00238] [ii] hLA212 H2/Ll é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 27 (Figura 42) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 28 (Figura 43) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da sua cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 31 (Figura 46) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID Não: 32 (Figura 47) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, O tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3- 8).

[00239] [iii] hLA212 H3/L3 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 29 (Figura 44) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: (Figura 45) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 35 (Figura 50) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 36 (Figura 51) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, o tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00240] [iv] hLA212 H2/L2 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 27 (Figura 42) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 28 (Figura 43) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 33 (Figura 48) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 34

(Figura 49) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, o tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos), e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00241] [v] hLA212 H2/L3 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 27 (Figura 42) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 28 (Figura 43) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 35 (Figura 50) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 36 (Figura 51 (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, O tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00242] [vi] hLA212 H2/L4 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 27 (Figura 42) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 28 (Figura 43) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da sua cadeia leve compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 37 (Figura 52) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 38 (Figura 53) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, o tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), possui a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00243] hLA212 H2/L5 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 27 (Figura 42) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 28 (Figura 43) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 39 (Figura 54) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 40 (Figura 55) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, O tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00244] [viii] hLA212 H3/Ll1 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 29 (Figura 44) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: (Figura 45) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da sua cadeia leve compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 31 (Figura 46) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID Não: 32 (Figura 47) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, o tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00245] [ix] hLAZ12 H3/L4 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 29 (Figura 44) (onde a região variável é de 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 30 (Figura 45) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da sua cadeia leve compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 37 (Figura 52) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 38 (Figura 53) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, o tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG-3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3- 8).

[00246] [x] hLA212 H3/L5 é o anticorpo humanizado obtido no Exemplo 6. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada desse anticorpo compreende as posições de nucleotídeos 58 a 1410 de SEQ ID No: 29 (Figura 44) (onde a região variável é 58 a 420), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID No: 30 (Figura 45) (onde a região variável é de 20 a 140). A sequência de nucleotídeos da cadeia leve da mesma compreende as posições de nucleotídeos 61 a 702 de SEQ ID No: 39 (Figura 54) (onde a região variável é 61 a 387), e sua sequência de aminoácidos compreende as posições 21 a 234 da SEQ ID No: 40 (Figura 55) (onde a região variável é de 21 a 129). Pode ser avaliado pelos métodos descritos nos Exemplos que o anticorpo tem propriedades físicas que são adequadas para a composição, O tratamento ou a prevenção etc. da presente invenção (dados não mostrados), tem a atividade de ligação ao LAG3 e a atividade de ADCC in vitro descrita em (3-2) e (3-3) (ver os Exemplos) e tem as atividades, as propriedades etc., descritas em (3-4) a (3-8).

[00247] De [1] a [x] acima, as atividades descritas em (3-4) e (3-5) podem ser, de preferência, avaliadas em uma forma de baixo teor de fucose. Na presente invenção, o termo “propriedades físicas” significa a estabilidade do anticorpo e do fragmento de ligação do mesmo usado na presente invenção como uma forma física, que pode ser avaliada usando um índice conhecido. Exemplos de estabilidade como forma física podem incluir termoestabilidade e estabilidade de armazenamento e exemplos de seus índices podem incluir valores de Tm obtidos a partir de termogramas e alterações na atividade de ligação de antígeno sob condições de armazenamento ou condições de deterioração acelerada ou alterações ao longo do tempo.

[00248] Além disso, o anticorpo hLA212 H4/L2 foi administrado aos camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FCyRIIIA humano do Exemplo 10 em uma dose única, como resultado, não sendo observada perda de peso e outros eventos tóxicos notáveis. Assim, o anticorpo usado na presente invenção possui vantajosamente segurança que é adequada para o esgotamento de células T citotóxicas e para métodos para o tratamento ou a prevenção de doenças associadas às células T citotóxicas (definidas em outra parte), etc.

[00249] Dos exemplos mais preferidos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 e fragmento de ligação do mesmo usado na presente invenção descrita acima, hLA212 H3/L2, hLA212 H2/Ll1, hLA212 H3/L3, hLA2Z12 H3/L6, hLA212 H4/L2, HSL7 e HSL7BW são ainda mais preferíveis.

[00250] Os hLA212 H2/L1 a H2/L5, hLA212 H3/L1 a H3/L5, hLA212 H4/L2, H5L7, HSL7BW etc., incluídos na faixa mais preferida do anticorpo humanizado anti-LAG-3 usado na presente invenção podem compreender um cadeia pesada que consiste em uma sequência de aminoácidos na qual 1 a vários, de preferência 1 ou 2 aminoácidos são substituídos por outros aminoácidos em FRH1 a FRH4 da sequência de aminoácidos da cadeia pesada e uma cadeia leve que consiste em uma sequência de aminoácidos em que l1 ou mais, de preferência qualquer número de aminoácidos selecionados de 1 a 14 é(são) substituído(s) por outros aminoácidos em FRLl a FRL4 da sequência de aminoácidos da cadeia leve.

[00251] Mais de preferência, na cadeia leve do anticorpo humanizado, tal como hLA212 H2/Ll1 a H2/L5, hLA212 H3/L1 a H3/L5 ou hLA212 H4/L2, aminoácido 1 de FRLl, isto é, aminoácido 1 na região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 21 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Asp ou Asn, aminoácido 11 de FRL1, isto é, aminoácido 11 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 31 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Leu ou Met, aminoácido 13 de FRLl, isto é, aminoácido 13 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 33 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ala ou Ile, aminoácido 21 de FRL1, isto é, aminoácido 21 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 41 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ile ou Met, aminoácido 4 de FRL2, isto é, o aminoácido 38 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 58 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Gln ou Lys, aminoácido 9 de FRL2, isto é, aminoácido 43 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 63 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ala ou Ser, aminoácido 4 de FRL3, isto é, aminoácido 60 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 80 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ser ou Asp, aminoácido 9 de FRL3, isto é, aminoácido 65 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 85 da SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ser ou Gly, aminoácido 11 de FRL3, isto é, aminoácido 67 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 87 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ser ou Tyr, aminoácido 22 de FRL3, isto é, aminoácido 78 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 98 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Leu ou Val, aminoácido 27 de FRL3, isto é, aminoácido 83 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 103 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Phe ou Ala, aminoácido 29 de FRL3, isto é, aminoácido 85 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 105 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Thr ou Phe, aminoácido 7 de FRL4, isto é, aminoácido 104 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 124 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Val ou Leu, e o aminoácido 9 de FRI4, isto é, o aminoácido 106 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 126 de SEQ ID No: 32 ou Figura 47) é Ile ou Leu.

[00252] Mais de preferência, na cadeia pesada do anticorpo humanizado, tal como, hLA212 H2/Ll a H2/L5, hLA212 H3/L1 a H3/L5 ou hLA212 H4/L2, aminoácido 14 de FRH2, isto é, aminoácido 49 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 68 de SEQ ID No: 28 ou Figura 43) é Gly ou Ala, e o aminoácido 25 de FRH3, isto é, o aminoácido 84 da região variável madura (o aminoácido correspondente à posição 103 de SEQ ID No: 28 ou Figura 43) é Asn ou Asp.

[00253] A presente invenção também abrange um anticorpo que compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo 80% ou mais, 82% ou mais, 84% ou mais, 86% ou mais, 86% ou mais, 88% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 94% ou mais, 96% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais à sequência de aminoácidos de todo o comprimento ou às regiões variáveis da cadeia pesada e/ou a cadeia leve de qualquer um dos anticorpos rLA2Z04, rLA212, rLAZ225, rLA869, rLAlI264, cCcLAZO4, cLA212, cLA225, cLA8S6G9, rLAl1264 e A9HI2, e os anticorpos humanizados hLAZ12 H2/L1 a hLA212 H2/L5/hLA212 H3, hLA212 H4/L2, HSL7 e HS5L7BW da presente invenção e se liga ao LAG-3, ou à um fragmento de ligação do mesmo. Essa identidade de sequência é, de preferência, 94% ou mais, mais de preferência 96% ou mais, ainda mais de preferência 98% ou mais, idealmente 99% ou mais. Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo tem as propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4), além do acima, mais de preferência (3 -5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00254] A identidade ou homologia entre dois tipos de sequências de aminoácidos pode ser determinada usando os parâmetros padrão do algoritmo Blast versão 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, e David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402) . O algoritmo Blast também está disponível, por exemplo, pelo acesso à Internet em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.

[00255] A presente invenção também abrange um anticorpo que compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é derivada da sequência de aminoácidos de comprimento completo ou de região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de qualquer um dos anticorpos rLA2Z04, rLA212, rLAZ25, rLAS69, rLAI264, CcLA204, CcLA212, cLAZ25, cLAS8G69, cLAIZ264 e A9HI2 e os anticorpos hLA212 H2/Ll a hLAZ212 H2/L5, hNLA212 H2/L1 a hLA212/H2/L1 a HLA, e HS5L7BW da presente invenção pela substituição, exclusão, adição e/ou inserção de 1 a 50, la 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1a 15, 1 a 10, 1 a8,1a6,1a5,1a4, 1a3, 1 0uU20ul aminoácido(s) e se liga a LAG-3, ou um fragmento de ligação do mesmo. Tal mutação de aminoácido é, de preferência, uma substituição. O número de aminoácidos mutados é de preferência 1 a 5, mais de preferência 1 a 4, ainda mais de preferência 1 a 3, ainda mais de preferência 1 ou 2, mais de preferência 1. Além disso, o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo tem propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4) além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, adicionalmente mais de preferência em todos os (3-2) a (3-8).

[00256] A presente invenção também abrange um anticorpo que compreende — uma cadeia pesada e/ou cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos de um nucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com um nucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de comprimento completo ou de região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de qualquer um dos anticorpos rLA2Z04, rLA212, rLAZ225, rLA869, rLA1I264, cLAZO4, cLA212, cLA225, CLAS869, cCcLAIZ64 e A9HI2, e os anticorpos hLA212 H2/L1 a hLAZ12 H2/L5, hLA212 H3/Ll1 a hLA212 H3/L5, hNLA212 H4/L2, H5L7 e HSL7BW da presente invenção, e se ligam ao LAG-3, ou um fragmento de ligação dos mesmos. O anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo tem as propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4), além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00257] De acordo com outro aspecto, a presente invenção prover um anticorpo humano ou um fragmento de ligação do mesmo. O anticorpo humano ou fragmento de ligação do mesmo não é especificamente limitado, desde que seja um anticorpo derivado do homem que se ligue ao LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo, mas que possua as propriedades, funções atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4) além do acima, adicionalmente mais de preferência (3- 5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

(3-13) Ligação do anticorpo ao epitopo

[00258] Um “anticorpo que se liga ao mesmo local” como no caso do anticorpo usado na presente invenção também pode ser usado na presente invenção. Um “anticorpo que se liga ao mesmo sítio” que um determinado anticorpo significa um anticorpo diferente que se liga a um sítio em uma molécula de antígeno reconhecida pelo anticorpo. Se um segundo anticorpo se ligar a um peptídeo parcial ou a uma estrutura tridimensional parcial em uma molécula de antígeno ligada por um primeiro anticorpo, o primeiro e o segundo anticorpos são determinados como ligação ao mesmo sítio. Alternativamente, o primeiro e o segundo anticorpos são determinados como se ligando ao mesmo sítio, confirmando que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação de antígeno, isto é, o segundo anticorpo interfere na ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, mesmo se a sequência de peptídeos ou a estrutura tridimensional do sítio de ligação específico não for determinada. Quando o primeiro e o segundo anticorpos se ligam ao mesmo sítio, e o primeiro anticorpo tem um efeito tal como a atividade da ADCC, oO segundo anticorpo também tem uma probabilidade extremamente alta de ter a mesma atividade. Assim, se um segundo anticorpo anti-LAG-3 se ligar a um sítio ligado por um primeiro anticorpo anti-LAG-3, o primeiro e o segundo anticorpos serão determinados como ligação ao mesmo sítio na proteína de LAG-

3. Alternativamente, o primeiro e o segundo anticorpos anti- LAG-3 são determinados como se ligando ao mesmo sítio na proteína de LAG-3, confirmando que o segundo anticorpo anti- LAG-3 compete com o primeiro anticorpo anti-LAG-3 pela ligação à proteína de LAG-3.

[00259] Na presente invenção, um anticorpo que se liga a um sítio na proteína de LAG-3 reconhecida pelo anticorpo monoclonal também é incluído no anticorpo que pode ser usado na presente invenção. O anticorpo e fragmento de ligação do mesmo têm as propriedades, funções, atividades, etc., descritas em (3-2) e (3-3), de preferência (3-4), além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, ainda mais de preferência todos de (3-2) a (3-8).

[00260] O sítio de ligação a anticorpo pode ser determinado por um método bem conhecido pelos habilitados na técnica, tal como um imunoensaio. Por exemplo, uma série de peptídeos é preparada por clivagem sequencial apropriada da sequência de aminoácidos do antígeno a partir do seu terminal C ou terminal N, e a reatividade do anticorpo ao mesmo é estudada para determinar aproximadamente um sítio de reconhecimento. Então, peptídeos mais curtos são sintetizados, e a reatividade do anticorpo a esses peptídeos pode ser estudada desse modo para determinar o sítio de ligação. Os peptídeos do fragmento de antígeno podem ser preparados usando uma técnica, tal como recombinação de genes ou síntese de peptídeos.

[00261] Quando o anticorpo se liga ou reconhece uma conformação parcial do antígeno, o sítio de ligação para o anticorpo pode ser determinado pela identificação de resíduos de aminoácidos no antígeno adjacente ao anticorpo usando análise estrutural de raios-X. Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento e o antígeno ou seu fragmento podem ser ligados um ao outro e cristalizados, seguido por análise estrutural para identificar cada resíduo de aminoácido no antígeno tendo uma distância de interação com o anticorpo. A distância de interação é de 8 angstroms ou menor, de preferência 6 angstroms ou menor, mais de preferência 4 angstroms ou menor. Um ou mais desses resíduos de aminoácidos tendo uma distância de interação com o anticorpo podem constituir um sítio (epitopo) no antígeno ao qual o anticorpo se liga. Dois ou mais desses resíduos de aminoácidos podem não estar adjacentes um ao outro na sequência primária.

[00262] O epitopo do anticorpo para LAG-3 da presente invenção está presente no LAG-3 humano ou na sua sequência de aminoácidos. O anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que pode ser usado na presente invenção, Ou a forma modificada do mesmo também abrange um anticorpo, um fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada do mesmo que se liga a esse epitopo, competindo com o anticorpo usado na presente invenção para se ligar ao epitopo ou ter uma distância de interação com esses resíduos de aminoácidos. (3-14) Forma modificada de anticorpo

[00263] A presente invenção prover uma composição compreendendo uma forma modificada do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo. A forma modificada do anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo significa que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é provido com uma modificação química ou biológica. A forma quimicamente modificada inclui, por exemplo, uma forma tendo um esqueleto de aminoácidos conjugado com uma porção química, e uma forma tendo uma cadeia de carboidratos ligada a N ou ligada a O, quimicamente modificada. A forma biologicamente modificada inclui, por exemplo, uma forma que sofreu modificação pós- tradução (por exemplo, glicosilação ligada a N ou ligada a O, processamento N-terminal ou C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico ou oxidação de metionina), e uma forma contendo um resíduo de metionina adicionado ao terminal N por expressão usando células hospedeiras procarióticas. Essa forma modificada também deve incluir uma forma rotulada para permitir a detecção ou o isolamento do anticorpo ou do antígeno, por exemplo, uma forma rotulada com enzima, uma forma rotulada com fluorescência ou uma forma rotulada com afinidade. Tal forma modificada do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é útil para melhorar a estabilidade ou retenção de sangue do anticorpo original ou do fragmento de ligação original do mesmo, reduzir a antigenicidade ou para a detecção ou o isolamento do anticorpo ou do antígeno, etc.

[00264] Exemplos da porção química contida na forma quimicamente modificada podem incluir polímeros solúveis em água, tais como, copolímeros de polietilenoglicol etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano e álcool polivinílico.

[00265] Exemplos da forma biologicamente modificada podem incluir uma forma modificada por tratamento enzimático, tratamento celular ou semelhantes, uma forma fundida com outro peptídeo, tal como um rótulo, adicionado por recombinação genética, e uma forma preparada a partir de células hospedeiras que expressam uma enzima modificadora da cadeia de açúcar endógena ou exógena.

[00266] A atividade citotóxica celular dependente de anticorpo do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo pode ser aumentada regulando a modificação (glicosilação, defucosilação, etc.) da cadeia de açúcar ligada ao anticorpo ou ao fragmento de ligação. Por exemplo, os métodos descritos em WO99/54342, WOOO0/61739 e WO02/31140 são conhecidos como uma técnica de regulação da modificação da cadeia de açúcar do anticorpo, embora essa técnica não esteja limitada à mesma. Na presente invenção, a forma modificada do anticorpo também inclui um anticorpo que sofreu a modificação da cadeia de açúcar assim regulada.

[00267] Tal modificação pode ser feita em uma posição arbitrária ou em uma posição desejada no anticorpo Ou fragmento de ligação do mesmo. As mesmas ou duas ou mais modificações diferentes podem ser feitas em uma ou duas ou mais posições nas mesmas.

[00268] Na presente invenção, o termo “forma modificada do fragmento de anticorpo” também pretende incluir até um “fragmento da forma modificada do anticorpo”.

[00269] Na presente invenção, a forma modificada do anticorpo ou a forma modificada do fragmento de ligação do mesmo é também simplesmente referida como um “anticorpo” ou um “fragmento de ligação do anticorpo”.

[00270] Como descrito acima, hLA212 H4/12 é o anticorpo humanizado que foi obtido no Exemplo 8 e cuja modificação da cadeia de açúcar é ajustada. Esse anticorpo humanizado também é abrangido pelo anticorpo que pode ser usado na presente invenção.

[00271] O anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que pode ser usado na presente invenção e formas modificadas da mesma, como descrito acima, têm de preferência propriedades físicas, farmacocinética, retenção de sangue, Segurança, etc., que são adequados para a composição para esgotamento de células T citotóxicas, o método para tratar ou prevenir uma doença associada a células T citotóxicas, O uso para tratamento ou prevenção, etc., da presente invenção.

(3-15) Atividade de esgotamento contra célula T citotóxica

[00272] O anticorpo para LAG-3 que pode ser usado para o esgotamento de células T citotóxicas é, de preferência, um anticorpo que exibe atividade citotóxica, tais como, atividade de ADCC, atividade CDC e/ou atividade ADCP contra células que expressam LAG-3, mais de preferência um anticorpo para LAG-3 ter atividade de ADCC melhorada, atividade CDC e/ou atividade ADCP. Exemplos do anticorpo para LAG-3 com baixo teor de fucose ou afucosilado tendo atividade de ADCC intensificada, isto é, o anticorpo para LAG-3 em uma forma de baixo teor de fucose, podem incluir hLA212 H4/L2 e HSL7BW.

[00273] A atividade de esgotamento exercida pelo anticorpo para LAG-3 contra células T citotóxicas pode ser avaliada com base em um ensaio conhecido na técnica. Exemplos de um ensaio in vitro podem incluir os descritos nos Exemplos 13 e 14, e exemplos de um ensaio in vivo podem incluir os descritos no Exemplo 11-1), embora o ensaio não esteja limitado aos mesmos. 4, Método para a produção de anticorpos (4-1) Método usando hibridoma

[00274] O anticorpo anti-LAG-3 pode ser preparado de acordo com o método de Kohler e Milstein (Kohler e Milstein, Nature (1975), 256, págs. 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal aAntibodies, págs. 365-367, Plenum Press, NY (1980)). Assim, as células produtoras de anticorpos anti- LAG-3 são isoladas dos baços de animais imunizados com a proteína de LAG-3 ou a sua forma solúvel e as células são fundidas com células de mieloma, estabelecendo assim hibridomas. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de culturas desses hibridomas.

(4-1-1) Preparação de antígeno

[00275] O antígeno para a preparação do anticorpo anti- LAG-3 pode ser obtido de acordo com, por exemplo, o método para preparar uma proteína de LAG-3 nativa ou recombinante descrita em outros parágrafos da presente invenção. Exemplos do antígeno que pode ser assim preparado pode incluir a proteína de LAG-3, um fragmento de proteína de LAG-3 compreendendo uma sequência parcial com pelo menos 6&

aminoácidos consecutivos da proteína de LAG-3, e derivados dos mesmos compreendendo adicionalmente uma sequência de aminoácidos arbitrária ou um carreador adicionado à mesma (daqui em diante, coletivamente referido como “antígeno LAG- 3”; que tem o mesmo significado que “proteína de LAG-3”).

[00276] O antígeno LAG-3 recombinante pode ser preparado transfectando células hospedeiras com um gene compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do antígeno LAG-3, e recuperando o antígeno das culturas das células. Um tal antígeno recombinante pode ser uma proteína de fusão com outra proteína, tal como uma região Fc de imunoglobulina. Um antígeno LAG-3 obtido em um sistema de tradução in vitro sem células de um gene que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do antígeno LAG-3 também está incluído no antígeno —LAG-3 recombinante. O antígeno LAG-3 não recombinante pode ser purificado e isolado de células que expressam LAG-3 ou semelhantes.

[00277] De modo a obter um anticorpo monoclonal anti- LAG-3, cuja presença permite ao LAG-3 exercer uma função de supressão de ação das células T, ou que não suprime ou inibe a função de supressão de ação das células T de LAG-3, um mutante de LAG-3 no qual os domínios 1 e 2 do tipo imunoglobulina são excluídos, por exemplo, pode ser usado como um imunogênio preferível.

(4-1-2) Produção de anticorpo monoclonal anti-LAG-3

[00278] O anticorpo monoclonal é tipicamente produzido através das seguintes etapas de: (a) preparar um antígeno, (b) preparar células produtoras de anticorpos,

(c) preparar células de mieloma (daqui por diante designadas “mielomas”), (d) fundir as células produtoras de anticorpos com os mielomas, (e) triar um grupo de hibridoma que produz o anticorpo de interesse, e (f) obter clones de célula única (clonagem).

[00279] Esse método de produção envolve adicionalmente as etapas de (g) cultura dos hibridomas, criação de animais transplantados com hibridoma, etc., e (h) ensaio Ou determinação da atividade biológica do anticorpo monoclonal, etc., se necessário.

[00280] Daqui por diante, o método para preparar o anticorpo monoclonal será descrito em detalhes com referência a essas etapas. No entanto, o método para preparar o anticorpo não se limita a essas etapas, e células produtoras de anticorpos que não sejam células do baço, por exemplo, podem ser usadas.

a) Purificação do antígeno

[00281] Essa etapa é realizada de acordo com o método para preparar a proteína de LAG-3 descrita acima em (2-3). (b) Etapa de preparação da célula produtora de anticorpos

[00282] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante tal como um adjuvante de Freund completo ou incompleto ou sulfato de alumínio e potássio, e os animais de laboratório são imunizados com o imunogênio resultante. Qualquer animal de laboratório usado em um método de preparação de hibridoma conhecido na técnica pode ser usado sem limitações. Especificamente, por exemplo, camundongos ratos, cabras, ovelhas, gado ou cavalos podem ser usados. Do ponto de vista das células de mieloma prontamente disponíveis para serem fundidas com células produtoras de anticorpos isoladas, etc., os animais a serem imunizados são, de preferência, camundongos ou ratos.

[00283] A cepa de camundongos ou ratos realmente usados não é particularmente limitada. No caso dos camundongos, por exemplo, A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 5S7BL, C5S7BL, C57L, DBA, FL, HTH, HTl, LP, NZB, NZW, RF, R III, SIL, SWR, WB ou 129 podem ser usados. No caso de ratos, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN ou Fischer podem ser usados.

[00284] Esses camundongos e ratos estão disponíveis em criadores ou distribuidores de animais de laboratório, por exemplo, CLEA Japan, Inc. ou Charles River Laboratories Japan Inc.

[00285] Desses camundongos e ratos, uma cepa de camundongo BALB/c ou cepas de rato Wistar e Low são particularmente preferidas como animais a serem imunizados tendo em consideração a compatibilidade de fusão com as células de mieloma descritas mais adiante.

[00286] Além disso, em consideração à homologia entre antígenos humanos e de camundongo, também são de preferência usados camundongos cujo mecanismo biológico para remover autoanticorpos, isto é, camundongos com doenças autoimunes.

[00287] Neste contexto, estes camundongos ou ratos têm, de preferência, 5 a 12 semanas de idade, mais de preferência 6 a 8 semanas de idade, no momento da imunização.

[00288] Os animais podem ser imunizados com a proteína de LAG-3 usando, por exemplo, o método de Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. IL. II. IIL.,

Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964).

[00289] Exemplos de métodos para determinar os títulos de anticorpos podem incluir, mas não estão limitados a, imunoensaios, tais como RIA e ELISA.

[00290] As células produtoras de anticorpos derivadas de células do baço ou linfócitos isolados dos animais imunizados, podem ser preparadas de acordo com um método conhecido na técnica, por exemplo, Kohler et al., Nature (1975) 256, pág. 495; Kohler et al., Eur. J. Immnol. (1977) 6, pág. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, pág. 550; Walsh, Nature, (1977) 266, pág. 495.

[00291] No caso das células do baço, pode ser adotado um método geral, que envolve o corte dos baços, a filtragem das células através de uma malha de aço inoxidável, e então a colocação em suspensão das células resultantes no meio essencial mínimo (MEM) de Eagle ou semelhantes, para isolar as células produtoras de anticorpo.

(c) Etapa de preparação do mieloma

[00292] As células de mieloma usadas na fusão celular não são particularmente limitadas e podem ser selecionadas adequadamente para uso a partir de linhas celulares conhecidas na técnica. Por exemplo, uma linha deficiente em hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT), isto é, X63-Ag8 (X63),NSI-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63- Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Agl4 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XX0, ou BU.l, derivado de camundongo, derivado de rato 210.RSY3.A9g.1.2.3 (Y3), ou UZ266AR (SKO- 007), GM1500-GTG-Al2 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2

(HMy2), ou 8226AR/NIP4-1 (NP41) derivado de humano, e semelhantes, cujos procedimentos de triagem já foram estabelecidos, são de preferência usados tendo em consideração a conveniência na seleção de hibridomas das células fundidas. Essas linhas deficientes em HGPRT estão disponíveis, por exemplo, na American Type Culture Collection (ATCC).

[00293] Essas linhas celulares são subcultivadas em um meio apropriado, por exemplo, um meio de 8-azaguanina [meio RPMI-1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina e soro bovino fetal (daqui em diante, referido como “FBS”) e suplementado adicionalmente com 8-azaguaninal]l, um meio de Dulbecco modificado com Iscove (daqui em diante, referido como “IMDM”) ou um meio Eagle modificado com Dulbecco (daqui em diante, referido como “DMEM”) e então subcultivado em um meio normal [por exemplo, meio ASF104 (fabricado pela Ajinomoto Co., Inc.) contendo 10% de FBS] por 3 a 4 dias antes da fusão celular, para garantir que oO número de células seja igual ou maior que 2 x 107 células no dia da fusão celular.

(d) Etapa de fusão da célula produtora de anticorpos com a célula do mieloma

[00294] As células produtoras de anticorpos podem ser fundidas com as células do mieloma sob condições que impedem a viabilidade celular de ser extremamente reduzida, de acordo com qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, Weir, DM, Handbook of Experimental Immunology Vol. LI. II. IIL., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), e Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles Cc Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964)). Por exemplo, um método químico que envolve a mistura de células produtoras de anticorpos com células de mieloma em uma solução de alta concentração de um polímero, tal como polietilenoglicol, ou um método físico usando estimulação elétrica pode ser usado. (e) Etapa de triagem para o grupo de hibridoma que produz anticorpos de interesse

[00295] O método para selecionar os hibridomas obtidos por fusão celular não é particularmente limitado, e um método de seleção de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Kohler et al., Nature (1975) 256, pág. 495; Milstein et al., Nature (1977) 266, pág. 550) é tipicamente usada. Esse método é eficaz para a obtenção de hibridomas usando uma linha celular de mieloma deficiente em HGPRT, que não pode sobreviver na presença de aminopterina. Especificamente, células e hibridomas não fundidos podem ser cultivados em um meio HAT para permitir que apenas hibridomas resistentes à aminopterina vivam e cresçam seletivamente. (f) Etapa de obtenção do clone de célula única (clonagem)

[00296] Os hibridomas podem ser clonados usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, metilcelulose, agarose macia ou método de diluição limitante (ver, por exemplo, Barbara, B.M. e Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, São Francisco (1980)). O método de diluição limitante é preferido. (g) Etapa de cultura de hibridoma e etapa de criação de animal transplantado com hibridoma

[00297] Os hibridomas selecionados podem ser cultivados desse modo para produzir anticorpos monoclonais. De preferência, os hibridomas desejados são clonados e depois submetidos à produção de anticorpos.

[00298] O anticorpo monoclonal produzido por esse hibridoma pode ser recuperado de culturas do hibridoma. Além disso, um anticorpo recombinante pode ser recuperado de culturas de células introduzidas com o gene de anticorpo monoclonal. Alternativamente, o hibridoma pode ser injetado intraperitonealmente em camundongos da mesma cepa (por exemplo, BALB/cAnNCrj descritos acima) ou camundongos Nu/Nu e deixado crescer. Então, o anticorpo monoclonal pode ser recuperado de suas ascites.

(h) Etapa de ensaio ou determinação da atividade biológica do anticorpo monoclonal

[00299] Vários testes biológicos podem ser selecionados e aplicados ao mesmo de acordo com o objetivo.

(4-2) Método de imunização celular

[00300] Células que expressam a proteína de LAG-3 nativa, células que expressam a proteína de LAG-3 recombinante ou um fragmento da mesma, ou semelhantes, podem ser usadas como imunógenos, desse modo, para preparar um anticorpo anti-LAG-3 pelo método de hibridoma descrito acima.

[00301] Essas células que expressam LAG-3 são usadas em uma quantidade de 1 x 10º a 1 x 10º células, de preferência 1 x 10º a 1 x 10º células, mais de preferência 0,5 a 2 x 107 células, ainda mais de preferência 1 x 107 células, por tiro de imunização. O número de células usadas para imunização pode ser alterado de acordo com o nível de expressão da proteína de LAG-3. os imunogênios são geralmente administrados intraperitonealmente e podem ser administrados através de uma via intradérmica ou semelhantes. Os hibridomas podem ser preparados pela aplicação do método descrito no parágrafo (4-1-2). (4-3) Recombinação genética

[00302] De modo a preparar o anticorpo usado na presente invenção, um nucleotídeo (um nucleotídeo de cadeia pesada) compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de sua cadeia pesada e um nucleotídeo (um nucleotídeo de cadeia leve) compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o aminoácido sequência de sua cadeia leve, ou um vetor tendo uma inserção do nucleotídeo da cadeia pesada e um vetor tendo uma inserção do nucleotídeo da cadeia leve são introduzidos nas células hospedeiras e, então, as células são cultivadas, e o anticorpo pode ser recuperado das culturas. O nucleotídeo da cadeia pesada e o nucleotídeo da cadeia leve podem ser inseridos em um vetor.

[00303] Células procarióticas ou eucarióticas podem ser usadas como células hospedeiras. No caso de uso de células eucarióticas hospedeiras, podem ser usadas células animais, células vegetais ou micróbios eucarióticos.

[00304] Exemplos de células animais podem incluir células derivadas de mamíferos, isto é, células COS derivadas de macacos (Gluzman, Y. Cell (1981), 23, págs. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblasto de camundongo NIH3T3 (ATCC Nº CRL- 1658), uma linhagem celular NSO de camundongo (ECACC), células de ovário de hamster chinês (células CHO, ATCC CCL- 61), linhas deficientes em diidrofolato redutase das mesma (CHOdhfr-; Urlaub, G. e Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1980), 77, págs. 4126-4220), CHOKISV (Lonza Biologics), células derivadas de aves, tal como frangos, e células derivadas de insetos.

[00305] Além disso, células que são modificadas para ajustar a modificação de proteínas da cadeia de açúcar, tais como anticorpos, podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, células CHO modificadas de modo que a fucose ligada à N-acetilglucosamina nas extremidades redutoras das cadeias de açúcar sejam reduzidas ou removidas das cadeias de açúcar ligadas ao complexo N-glicosídeo do tipo complexo que se ligan à região Fc do anticorpo podem ser usadas para expressão de anticorpos desse modo para preparar um anticorpo com baixo teor de fucose ou desfucosilado (também referido como uma forma modificada do anticorpo) (WO00/61739, WOO02/31140, etc.).

Exemplos de micróbios eucarióticos podem incluir leveduras. Exemplos de células procarióticas podem incluir E. coli e Bacillus subtilis.

[00306] Um peptídeo sinal para a secreção do anticorpo (um anticorpo monoclonal derivado de qualquer animal, um anticorpo de rato, um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, etc.) não está limitado ao sinal secretor de um anticorpo da mesma espécie, do mesmo tipo, e do mesmo subtipo do anticorpo da presente invenção, ou do anticorpo do próprio sinal secretor da presente invenção. Qualquer sinal secretor de um anticorpo de um tipo ou subtipo diferente do mesmo ou qualquer sinal secretor de uma proteína derivada de uma espécie eucariótica diferente do mesmo ou de uma espécie procariótica pode ser selecionado e usado.

(4-4) Métodos para projetar e preparar anticorpos humanizados

[00307] Exemplos do anticorpo humanizado podem incluir, mas não estão limitados a, um anticorpo derivado de humano tendo CDRs substituídas pelas CDRs de um anticorpo animal não humano (ver Nature (1986), 321, págs. 522-525), um anticorpo humano enxertado com as sequências de CDR e com alguns resíduos de aminoácidos das regiões estruturais por enxerto de CDR (ver WO90/07861 e US6972323), e qualquer um dos referidos anticorpos humanizados, em que um ou dois ou mais aminoácido(s) derivado(s) de anticorpos de animais não humanos foram substituídos por aminoácido(s) derivado(s) de anticorpos humanos. (4-5) Método para a preparação de anticorpos humanos

[00308] Exemplos adicionais do anticorpo que podem ser usados na presente invenção podem incluir um anticorpo humano. O anticorpo humano anti-LAG-3 significa um anticorpo anti-LAG-3 que consiste na sequência de aminoácidos de um anticorpo derivado de humano. O anticorpo humano anti-LAG-3 pode ser obtido por um método usando camundongos produtores de anticorpos humanos portando fragmentos de DNA genômico humano compreendendo genes de cadeia pesada e leve de anticorpos humanos (ver, por exemplo, Tomizuka, K.et al., Nature Genetics (1997) 16, págs. 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; e Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (2000) 97, págs. 722-727).

[00309] Especificamente, esses animais produtores de anticorpos humanos podem ser: animais recombinantes que são obtidos rompendo os locais genéticos das cadeias pesada e leve da imunoglobulina endógena de mamíferos não humanos e, em vez disso, introduzindo-os nos locais genéticos das cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana via vetores de cromossomo artificial de levedura (YAC) ou semelhantes, e animais recombinantes que são criados ao cruzar esses animais.

[00310] Alternativamente, as células eucarióticas podem ser transfectadas (transformadas) com cDNAs que codificam as cadeias pesada e leve, respectivamente, desse anticorpo humano, de preferência com vetores compreendendo os cDNAs, por uma técnica de recombinação genética. As células transfectadas (transformadas) que produzem o anticorpo monoclonal humano recombinante podem ser cultivadas. Esse anticorpo pode ser obtido a partir do sobrenadante da cultura.

[00311] Neste contexto, por exemplo, células eucarióticas, de preferência células de mamíferos, tais como, células CHO, linfócitos ou mielomas, podem ser usadas como hospedeiros.

[00312] Além disso, um método para a obtenção de um anticorpo humano derivado de exibição de fago selecionado de uma biblioteca de anticorpos humanos (ver, por exemplo, Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; e Siriwardena, D. et. al., Opthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431) é conhecido.

[00313] Por exemplo, um método de exibição de fagos (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs. 1105-1116) pode ser usado, o que envolve permitir que as regiões variáveis de um anticorpo humano sejam expressadas como um anticorpo de cadeia única (scFv) em uma superfície de fago e selecionando um fago que se liga ao antígeno.

[00314] O fago selecionado com base na sua capacidade de se ligar ao antígeno pode ser submetido a análise gênica para determinar sequências de DNA que codificam as regiões variáveis do anticorpo humano que se liga ao antígeno.

[00315] Se a sequência de DNA de uma ligação de scFv ao antígeno for determinada, um vetor de expressão tendo essa sequência pode ser preparado e introduzido em hospedeiros apropriados para permitir que eles expressem o anticorpo humano (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, MWO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, págs. 433-455, e Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs. 1105-1116).

(4-6) Método para preparar fragmento de ligação do anticorpo

[00316] O método para a preparação de um anticorpo de cadeia única é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, as patentes US Nos 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513 e

5.455.030). Nesse scFv, uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve são ligadas por meio de um ligante que os impede de formar um conjugado, de preferência um ligante de polipeptídeo (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1988), 85, págs. 5879-5883). A região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve em um scFv podem ser derivadas do mesmo anticorpo ou podem ser derivadas de anticorpos diferentes.

[00317] Por exemplo, um peptídeo arbitrário de cadeia única consistindo em 12 a 19 resíduos é usado como o ligante de polipeptídeo que liga essas regiões variáveis.

[00318] De modo a obter o DNA que codifica scFv, das sequências de DNA que codificam a cadeia pesada ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo e o DNA que codifica cadeia leve ou a região variável da cadeia leve, cada porção de DNA codifica a sequência de aminoácidos inteira Ou desejada é usada como modelo e amplificada por PCR usando um par de iniciadores flanqueando as duas extremidades do modelo. Subsequentemente, o DNA que codifica a porção ligante polipeptídica é adicionalmente amplificado em combinação com um par de iniciadores que flanqueia ambas as extremidades do DNA, de modo a que o fragmento obtido possa ser ligado nas suas extremidades aos DNA das cadeia pesada e leve, respectivamente.

[00319] O DNA que codifica scFv pode ser usado para preparar, de acordo com um método de rotina, um vetor de expressão contendo o DNA e as células hospedeiras podem ser transformadas com o vetor de expressão. Além disso, as células hospedeiras podem ser cultivadas, e o scFv pode ser recuperado das culturas de acordo com um método de rotina.

[00320] Além disso, para obter qualquer outro fragmento de ligação do anticorpo, um gene que codifica o fragmento de ligação é obtido de acordo com o método descrito acima e introduzido nas células. O fragmento de ligação de interesse pode ser recuperado a partir de culturas das células.

[00321] O anticorpo pode ser multimerizado desse modo para aumentar sua afinidade pelo antígeno. Neste caso, oS anticorpos do mesmo tipo podem ser multimerizados, ou uma pluralidade de anticorpos que reconhecem uma pluralidade de epitopos, respectivamente, do mesmo antígeno pode ser multimerizada. Exemplos de métodos para multimerizar esses anticorpos podem incluir a ligação de dois scFvs a um domínio CH3 de IgG, a ligação do mesmo à estreptavidina, e a introdução de um motivo de hélice-volta-hélice.

[00322] O anticorpo pode ser uma mistura de uma pluralidade de tipos de anticorpos anti-LAG-3 que diferem na sequência de aminoácidos, isto é, um anticorpo policlonal. Exemplos do anticorpo policlonal podem incluir uma mistura de uma pluralidade de tipos de anticorpos que diferem em uma porção ou na totalidade de suas CDRs. Um tal anticorpo policlonal pode ser recuperado de culturas de diferentes células produtoras de anticorpos que foram cultivadas de forma mista (WO2004/061104). Alternativamente, os anticorpos preparados separadamente podem ser misturados. O anti-soro, que é uma modalidade do anticorpo policlonal, pode ser preparado imunizando animais com o antígeno desejado e recuperando soro dos animais de acordo com um método padrão.

[00323] Os anticorpos conjugados com várias moléculas, tal como polietilenoglicol (PEG), também podem ser usados como formas modificadas do anticorpo.

[00324] O anticorpo pode adicionalmente ser qualquer um dos conjugados formados por esses anticorpos com outros fármacos (imunoconjugados). Exemplos de um tal anticorpo podem incluir um anticorpo conjugado com um material radioativo ou um composto tendo ação farmacológica (Nature Biotechnology (2005), 23, págs. 1137-1146).

[00325] O anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, e as formas modificadas do mesmo, como exemplificado Ou descrito em (3-11), (3-14), (4-6), etc., também são chamados de “moléculas que compreendem o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo”.

(4-7) Purificação do anticorpo

[00326] O anticorpo obtido pode ser purificado para ser homogêneo. Métodos usuais de separação e purificação de proteínas podem ser usados para a separação e a purificação do anticorpo.

[00327] O anticorpo pode ser separado e purificado por abordagem(ns) apropriadamente selecionadas ou combinadas, por exemplo, colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, relargagem, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa e/ou focalização isoelétrica (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); e Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ), apesar do método de separação e purificação não está limitado aos mesmos.

[00328] Exemplos de cromatografia incluem cromatografia por afinidade, cromatografia por troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia em fase reversa e cromatografia por adsorção.

[00329] Essas abordagens de cromatografia podem ser realizadas usando cromatografia em fase líquida, tal como HPLC ou FPLC.

[00330] Exemplos de colunas usadas na cromatografia por afinidade podem incluir colunas de proteína A, proteína G e antígeno.

[00331] Exemplos das colunas de proteína A incluem Hyper D (fabricado pela Pall Corp.), POROS (fabricado pela Applied Biosystems, Inc.) e Sepharose F.F. (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).

[00332] Além disso, o anticorpo pode ser purificado usando sua atividade de ligação contra o antígeno usando um carreador imobilizado por antígeno.

(4-8) Nucleotídeos que codificam anticorpo, vetor recombinante e célula recombinante

[00333] Um nucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, ou a forma modificada do mesmo (daqui por diante, esse nucleotídeo é referido como “gene de anticorpo”), um vetor recombinante tendo uma inserção do gene, uma célula compreendendo o gene ou o vetor (daqui por diante, essa célula é referida como uma “célula transfectada por gene de anticorpo”) e uma célula que produz o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo ou à forma modificada do mesmo (daqui por diante, essa célula é referida como “célula produtora de anticorpo”) também são usados para preparar a composição da presente invenção.

[00334] De preferência, o gene de anticorpo compreende uma sequência de nucleotídeos descrita em qualquer uma de (a) a (e) abaixo (daqui em diante, referida como “sequência do gene de anticorpo”), consiste em uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência do gene de anticorpo, ou consiste na sequência do gene de anticorpo: (a) uma combinação de uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos de rato rLA204, rLA212, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAl264, e o anticorpo de rato A9H12, seus anticorpos quiméricos cLAZ04, CcLA212, cLA225, cLA869 CLA1l264 e quimera tipo A9H12 (IMP731), nos quais as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve são substituídas pelas dos anticorpos humanos, e seus anticorpos humanizados hLA212 H2/L1 a hLA212 H2/L5, LA212 H3/Ll a hLA212 H3/L5, H5L7, e HSL7BW e uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve da mesma;

(b) uma combinação de uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo CDRH1 a CDRH3 de qualquer um dos anticorpos de rato rLA204, rLA212, rLA225, rLA8S69 e rLA1I264, e o anticorpo de camundongo A9H12, seus anticorpos quiméricos cLA2Z04, CLA212, cCLA225, cLA869, cLAl264 e quimera tipo A9H12 (IMP731) nas quais as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve são substituídas pelas dos anticorpos humanos, e seus anticorpos humanizados hLA212 H2/L1 a hLA212 H2/L5, LA212 H3/L1 a hLA212 H3/L5, H5L7, e HSL7BW e uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo CDRL1 a CDRL3 da mesma;

(c) uma combinação de uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada, compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos de rato rLAZ04, rLA2Z12, rLAZ25, rLAS8G69 e rLAlI264 e o anticorpo de camundongo A9H12, seus anticorpos quiméricos cLA204, cLA212, CcLA225, cLA869 e cLAlI264 e quimera tipo A9H12 (IMP731) nos quais as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve são substituídas pelas dos anticorpos humanos, e seus anticorpos humanizados hLA212 H2/L1 a hLA212 H2/L5, LA212 H3/L1 a hLA212 H3/L5, HSL7, e HSL7BW e uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve;

(d) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com um nucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma de (a) a (c), e codifica a sequência de aminoácidos de um anticorpo que se liga a LAG- 3; e (e) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma de (a) a (c) pela substituição, exclusão, adição e/ou inserção de 1 a 50, la 45, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1a 10, 1 a 8, 1 a6, 1a5, 1 a4, 1a3, 1 0u2 0ul base(s), e codifica uma sequência de aminoácidos de um anticorpo que se liga ao LAG-3, em que oO anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de acordo com (d) ou (e) tem propriedades, funções, atividades, etc. , descritas em (3-2) e (3-3), de preferência em um ou mais de (3-4) além do acima, mais de preferência (3-5) além do acima, ainda mais de preferência em todos de (3-2) a (3- 8).

[00335] No entanto, o gene de anticorpo não está limitado aos mencionados (a) a (e).

[00336] O anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação do mesmo, ou a forma modificada do mesmo, pode ser obtido por um método para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada do mesmo, compreendendo as etapas de cultura de células transfectadas por genes de anticorpo e recuperar um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada do mesmo da cultura, como descrito em (4-3).

5. Composição

[00337] A presente invenção prover uma composição para esgotamento de células T citotóxicas, compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada do mesmo.

[00338] A composição da presente invenção é capaz de trazer benefícios clínicos ao esgotar as células T7 citotóxicas nos cuidados médicos para doenças que envolvem células T citotóxicas (daqui em diante, referidas “doenças associadas às células T citotóxicas”), de preferência os cuidados médicos para doenças resistentes a imunossupressores associadas a células T citotóxicas. Exemplos de tal doença podem incluir doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC; Literatura Não Pertencente à Patente 16), esclerose múltipla (Literatura Não Pertencente à Patente 15), doença de Graves (Sun, Z. et al., J. Clin. Immunol., 2008; Vol. 28 (Nº 5): p. 464-472), espondilite anquilosante (Schirmer, M. et al., Arthritis. Res., 2002; Vol. 4 (Nº 1): págs. 71-76), pars planitis (Pedroza-Seres, M. et al., Br. J. Ophthalmol., 2007; Vol. 91 (Nº 10): págs. 1393-1398), asma (Hamzaoui, A. et al., Mediadores. Inflamm., 2005; Nº 3: págs. 160-166), artrite reumatoide (Wang, EC. Et al., Arthritis. Rheum., 1997; Vol. 40 (Nº 2): págs. 237-248; e Scarsi, M. et al., J. Rheumatol., 2010; Vol. 37 (Nº 5): págs. 911-916), polimiosite ou dermatomiosite (Fasth, AE. Et al., J. Immunol., 2009; Nº 183 (Vol. 7): págs. 4792-4799) miosite por corpos de inclusão (Keller, CW. Et al., Ann. Clin. Transl. Neurol., 2017; Vol. 4 (Nº 6): págs. 422-445), síndrome coronariana aguda (Literatura Não Pertencente à Patente 15), lupus eritematoso sistêmico (Zabinska et al., 2016 , J. Immunol Res. 1058165), nefrite lúpica (Zabinska et al., 2016, J Immunol Res. 1058165), esclerodermia (Li et al., 2017, J Invest Dermatol. 137 (5): 1042-1050), doença de Crohn (Dai et al., 2017, Clin Res Hepatol Gastroenterol. 41 (6) : 693-702), colite ulcerativa (Dai et al., 2017, Clin Res Hepatol Gastroenterol. 41 (6): 6693-702), anemia aplásica (Kook et al., 2001, Exp Hematol. 29 (11): 1270-7), síndrome mielodisplásica (Kook et al., 2001, Exp Hematol. 29 (11)

1270-7), síndrome de Sjogren (Smolenska et al., 2012, Cell Immunol. 278 (1-2): 143-51), granulomatose de Wegener (Lamprecht et al., 2001, Thorax. 56 (10): 751-7), psoríase (Lima et al., 2015, Br J Dermatol.173 (4): 998-1005), diabetes tipo 2 (Giubilato et al., 2011, Eur Heart JJ. 32 (10): 1214-26), reação hospedeiro-versus-enxerto (Mendes et al., 2008, Clinics (São Paulo). 63 (5): 667-76), hepatite B crônica (Wang et al., 2009, Immunol Invest. 2009; 38 (5)

434-46) e sarcoidose (Roberts et al., 2005, Doença Pulmonar Difusa Vascular e Sarcoidose Dis. 22 (1): 13-9). Isto é, de preferência, a composição da presente invenção é útil para o tratamento ou a prevenção de DPOC resistente a imunossupressores, doença de Graves resistente a imunossupressores, espondilite anquilosante resistente a imunossupressores, pars planite resistente a imunossupressores, asma resistente a imunossupressores, artrite reumatoide resistente a imunossupressores, polimiosite ou dermatomiosite resistente a imunossupressores, miosite por corpos de inclusão resistente a imunossupressores, síndrome coronariana aguda resistente a imunossupressores, lupus eritematoso sistêmico resistente a imunossupressores, nefrite por lúpus resistente a imunossupressores, esclerodermia resistente a imunossupressores, doença de Crohn resistente a imunossupressores, colite ulcerativa resistente a imunossupressores, anemia aplásica resistente a imunossupressores, síndrome mielodisplásica resistente a imunossupressores, síndrome de Sjogren resistente a imunossupressores, granulomatose de Wegener resistente a imunossupressores, diabetes tipo 2 resistente a imunossupressores, reação de hospedeiro-versus-enxerto resistente a imunossupressores, hepatite B crônica resistente a imunossupressores, sarcoidose resistente a imunossupressores e similares (daqui por diante, coletivamente referidos como uma “doença resistente a imunossupressores associada a células T citotóxicas”).

[00339] Por exemplo, as células T citotóxicas e as doenças associadas às células T citotóxicas foram relatadas da seguinte forma: uma correlação entre o número de células T CD4+ CD28- e uma piora do prognóstico foi relatada para fibrose pulmonar idiopática (Gilani et al., PLoS One 2010, (1): e8959); a gravidade da doença da espondilite anquilosante se correlaciona com o número de células T CD8+CD28- no sangue (Schirmer, M. et al., Arthritis. Res., 2002; Vol. 4 (Nº 1): págs. 71-76); o envolvimento de células T CD8+CD28- foi sugerido na exacerbação de lupus eritematoso sistêmico e nefrite lúpica (Zabinska et al., 2016, J Immunol Res. 1058165); foi sugerido o envolvimento de células T CD8+CD28- em condições patológicas no estágio inicial da esclerodermia (Li et al., 2017, J Invest Dermatol. 137 (5): 1042-1050); as células T CD28- estão envolvidas nas condições patológicas da polimiosite ou dermatomiosite (Fasth, AE. Et al., J. Immunol., 2009; Vol. 183 (Nº 7): págs. 4792-4799);

as células T CD28- estão envolvidas nas condições patológicas da miosite por corpos de inclusão (Pandya et al., 2010, Arthritis Rheum. 62 (11): 3457-66); o prognóstico na doença de Crohn e na colite ulcerativa piora com o aumento da porcentagem de células T CD8+CD28- (Dai et al., 2017, Clin Res Hepatol Gastroenterol. 41 (6): 693-702); pacientes com anemia aplásica ou síndrome mielodisplásica têm um número aumentado de células T CD8+CD28- (Kook et al., 2001, Exp Hematol. 29 (11): 1270-7); o número de células T CD4+CD28- serve como um fator prognóstico para esclerose múltipla (Peeters et al., 2017, Front Immunol. 8: 1160); uma correlação entre o número de células T CD8+CD28- e a gravidade é encontrada na síndrome de Sjogren (Smolenska et al., 2012, Cell Immunol. 278 (1-2): 143-51); as células T CD28- estão envolvidas nas condições patológicas da granulomatose de Wegener (Lamprecht et al., 2001, Thorax. 56 (10): 751-7); as células T CD4+CD28- estão envolvidas nas condições patológicas da psoríase (Lima et al., 2015, Br J Dermatol. 173 (4): 998-1005); as células T CD4+CD28- estão envolvidas nas condições patológicas do diabetes tipo 2 (Giubilato et al., 2011, Eur Heart J. 32 (10): 1214-26); a doença de Graves exibe um número aumentado de células T CD28- (Sun, Z. et al., J.

Clin.

Immunol., 2008; Vol. 28 (Nº 5): págs. 464-472); uma correlação entre o número de células T CD8+CD28- e o início da doença é encontrada na reação hospedeiro-versus-enxerto (Mendes et al., 2008, Clinics (São Paulo). 63 (5): 667-76); a asma exibe um número aumentado de células T CD8+CD28- (Hamzaoui, A. et al., Mediators.

Inflamm., 2005; No. 3: págs. 160-166); as células CD4+CD28- estão envolvidas nas condições patológicas da hepatite B crônica (Wang et al., 2009, Immunol Invest. 2009; 38 (5) 434-46); e a sarcoidose exibe um número aumentado de células T CD4+CD28- (Roberts et al., 2005, Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. 22 (1): 13-9).

[00340] Por exemplo, a resistência imunossupressora foi relatada da seguinte forma: a artrite reumatoide resistente a abatacept envolve um grande número de células T CD8+CD28- (Scarsi et al., 2011, J. Rheumatol. 38 (10): 2105-11); e células T CD8+CD28- estão envolvidas na resistência aos esteroides de DPOC (Literatura Não Pertencente à Patente 16).

[00341] Na presente invenção, o termo “imunossupressor” significa um fármaco que atua para suprimir o sistema imunológico e é usado para tratamento, etc. de doenças autoimunes, e inclui, por exemplo, antifolatos, inibidores de calcineurina, corticosteróides (também “simplesmente chamados de “esteroides”), globulinas antitimocíticas, antimetabólitos de ácidos nucleicos, inibidores da síntese de ácidos nucleicos, produtos biológicos direcionados a antígenos da superfície celular ou produtos biológicos direcionados a citocinas ou receptores de citocinas. Exemplos específicos dos mesmos podem incluir metotrexato que é um antifolato, ciclosporina e tacrolimo que são inibidores de calcineurina, metilprednisolona, prednisolona e dexametasona que são corticosteróides, ciclofosfamida e azatioprina que são inibidores da síntese de ácidos nucléicos, zetbulin, linfoglobulina, e tiomoglobulina que são globulinas antitimócitos, micofenolato de mofetila, que é um antimetabolito de ácido nucleico, Alemtuzumab, Rituximab, Abatacept e Denosumab, que são produtos biológicos direcionados a antígenos da superfície celular, e Adalimumab, Infliximab, Etanercept, Tocilizumab e agonista fingolimod de S1PR1 (um dos receptores de esfingosina-l) que são produtos biológicos direcionados a citocinas Ou receptores de citocinas.

[00342] Na presente invenção, o termo “resistência imunossupressora” refere-se à um estado em que a doença não pode ser suficientemente controlada, mesmo por tratamento com o imunossupressor, como descrito acima, e inclui, por exemplo, o caso em que o tratamento com o imunossupressor como descrito acima, é ineficaz ou insuficientemente eficaz, O caso em que a doença se repete, e o caso em que o tratamento com o imunossupressor é difícil de realizar devido a reações adversas.

[00343] Na presente invenção, o tratamento ou a prevenção de uma doença inclui, mas não está limitado a, prevenção do aparecimento da doença, de preferência, da doença em um indivíduo que expressa a proteína de LAG-3, a supressão ou inibição da exacerbação ou sua progressão da mesma, O alívio de um ou dois ou mais sintoma(s) exibido(s) por um indivíduo afetado pela doença, a supressão ou remissão da exacerbação ou progressão da mesma, o tratamento ou a prevenção de uma doença secundária, etc.

[00344] A presente invenção prover uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo, ou uma forma modificada do mesmo. A composição farmacêutica da presente invenção é de preferência aplicável ao tratamento e/ou tratamento de uma doença associada a células T citotóxicas. Mais de preferência, uma amostra biológica contendo células T citotóxicas ou uma fração da membrana celular é determinada como perforina positiva, granzima B positiva, CD28 negativa e CD4 positiva, CD28 negativa e CD8 positiva, CD57 positiva e CD4 positiva e/ou CD57 positiva e CD8 positiva, ainda mais de preferência perforina positiva, granzima B positiva, CD28 negativa e CD4 positiva, CD28 negativa e CD8 positiva, CD57 positiva e CD4 positiva e/ou CD57 positiva e CD8 positiva. Ainda mais de preferência, a amostra biológica é derivada de um indivíduo que sofre da doença associada às células T citotóxicas ou para quem se deseja evitar sofrer da doença associada às células T citotóxicas. A amostra biológica é, de preferência, uma amostra contendo células T citotóxicas derivadas de um sítio de lesão ou coletadas de um sítio de lesão, mais de preferência uma amostra contendo células T citotóxicas infiltradas em um sítio de lesão.

[00345] A doença associada às células T citotóxicas que podem ser tratadas ou prevenidas com a composição farmacêutica da presente invenção é, de preferência, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), esclerose múltipla, doença de Graves, espondilite anquilosante, pars planitis, asma, artrite reumatoide, polimiosite ou dermatomiosite, miosite por corpos de inclusão, síndrome coronariana aguda, lupus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, esclerodermia, doença de Crohn, colite ulcerativa, anemia aplásica síndrome mielodisplásica, síndrome de Sjôgren, granulomatose de Wegener, psoríase, diabetes tipo 2, reação de hospedeiro ao enxerto, hepatite B crônica e/ou sarcoidose.

[00346] A doença associada às células T citotóxicas que podem ser tratadas ou prevenidas com a composição farmacêutica da presente invenção é, de preferência, LAG-3 positiva e é, mais de preferência, uma doença associada às células T citotóxicas para as quais uma amostra biológica derivada de um indivíduo que sofre da doença ou para quem se deseja evitar o sofrimento da doença, é determinada como LAG-3 positiva. A amostra biológica é, de preferência, uma amostra contendo células T citotóxicas derivadas de um sítio de lesão ou coletadas de um sítio de lesão, mais de preferência uma amostra contendo células T citotóxicas infiltradas em um sítio de lesão.

[00347] A composição ou a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo em um método para tratar ou prevenir uma doença associada a células T citotóxicas. Ou seja, a presente invenção também provê um método para o tratamento ou a prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas perforina positivas, granzima B positivas, CD28 negativas e CD4 positivas, CD28 negativas e CD8 positivas, CD57 positivas e CD4 positivas e/ou CD57 positivas e/CD8 positivas, compreendendo a etapa de administração da composição ou da composição farmacêutica da presente invenção a um indivíduo que sofre da doença associada às células T citotóxicas ou para quem se deseja evitar o sofrimento da doença associada às células T citotóxicas. O escopo da expressão “é desejável evitar o sofrimento da doença” também inclui ser submetido a procedimentos de prevenção ou preventivos, sendo destinado a receber procedimentos de prevenção ou preventivos, e sendo programado para realizar procedimentos de prevenção ou preventivos. O escopo do termo “prevenção” inclui a prevenção do aparecimento, recorrência ou agravamento dos sintomas, etc., e exemplos dos mesmos podem incluir o caso de administrar a composição ou a composição farmacêutica da presente invenção a um indivíduo com sintomas que foram melhorados ou aprimorados por tratamento ou semelhantes, com a finalidade de manter o estado ou impedir a recorrência. Na presente invenção, um atraso no agravamento ou na progressão de uma doença, condições patológicas ou sintomas também é abrangido pelo escopo do termo “tratamento ou prevenção”.

[00348] A composição ou a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-LAG-3 ou o fragmento de ligação do anticorpo, e diluentes, veículos (carreadores), solubilizadores, emulsificantes, conservantes, e/ou aditivos farmacologicamente aceitáveis.

[00349] O termo “quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz” significa uma quantidade que exerce efeitos terapêuticos ou profiláticos sobre uma doença específica por meio de uma forma de dosagem e via de administração específicas e tem o mesmo significado que uma “quantidade farmacologicamente eficaz”.

[00350] A composição ou a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender materiais para alterar, manter ou reter o pH, a pressão osmótica, a viscosidade, a transparência, a cor, a isotonicidade, a esterilidade ou a estabilidade, a solubilidade, a liberação sustentada, a capacidade de absorção, a permeabilidade, a forma de dosagem, a resistência, as propriedades, a forma, etc., da composição ou do anticorpo incluído na mesma (daqui por diante, referidos como “materiais farmacêuticos”). Os materiais farmacêuticos não são particularmente limitados desde que os materiais sejam farmacologicamente aceitáveis. Por exemplo, nenhuma toxicidade ou baixa toxicidade é uma propriedade, de preferência, possuída por esses materiais farmacêuticos.

[00351] Exemplos de materiais farmacêuticos podem incluir, mas não são limitados a, aminoácidos, tais como glicina, alanina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina, agentes antibacterianos, agentes antioxidantes, tais como, ácido ascórbico, sulfato de sódio ou bissulfito de sódio, tampões, tais como, fosfofato, citrato, tampões borato, bicarbonato de sódio, e solução de ácido tris- clorídrico (Tris-HCl), cargas, tais como, manitol e glicina, agentes quelantes, tais como, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), agentes complexantes, tais como, cafeína, polivinil pirrolidina, B-ciclodextrina e hidroxipropil-fp-ciclodextrina, diluentes, tais como, glicose, manose ou dextrina, monossacarídeos, dissacarídeos, outros carboidratos, tais como, glicose, manose e dextrina, agentes colorantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, conservantes, tais como, polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinilpirrolidona, polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons formadores de sal, cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio, solventes, tais como, glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol, álcoois de açúcar, tal como manitol ou sorbitol, agentes de suspensão, tensoativos, tais como, PEG, éster de sorbitano, polissorbatos, por exemplo, polissorbato e polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, Ou colesterol, intensificadores de estabilidade, tais como sacarose e sorbitol, intensificadores de elasticidade, tais como, cloreto de sódio, cloreto de potássio, manitol e sorbitol, agentes de transporte, diluentes, excipientes e/ou aditivos farmacêuticos.

[00352] A quantidade desses materiais farmacêuticos que é adicionada é de 0,001 a 1000 vezes, de preferência de 0,01 a 100 vezes, mais de preferência de 0,1 a 10 vezes o peso do anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo, ou a forma modificada do mesmo.

[00353] Uma composição ou uma composição farmacêutica compreendendo um imunolipossoma compreendendo o anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo, ou a forma modificada do anticorpo ou fragmento de ligação encapsulado em um lipossoma, ou uma forma de anticorpo modificada que compreende o anticorpo conjugado com um lipossoma (Patente US Nº 6214388, etc.) também está incluída na composição ou na composição farmacêutica da presente invenção.

[00354] Os excipientes ou veículos (transportadores) são usualmente líquidos ou sólidos e não são particularmente limitados, desde que sejam materiais usados para administração oral ou parenteral, tais como, água injetável, solução salina, líquidos cefalorraquidianos artificiais, etc. Exemplos de solução salina podem incluir solução salina neutra e solução salina contendo albumina.

[00355] Exemplos de tampões podem incluir um tampão Tris ajustado para trazer o pH final da composição ou da composição farmacêutica para 7,0 a 8,5, um tampão acetato ajustado para levar o pH final para 4,0 a 5,5, um tampão citrato ajustado para trazer o pH final de 5,0 a 8,0, e um tampão de histidina ajustado para trazer o pH final para 5,0 a 8,0.

[00356] A composição ou a composição farmacêutica da presente invenção é um sólido, um líquido, uma suspensão ou semelhantes. Outro exemplo da composição ou da composição farmacêutica da presente invenção pode incluir preparações liofilizadas. As preparações liofilizadas podem ser formadas usando um excipiente tal como sacarose.

[00357] A via de administração da composição ou da composição farmacêutica da presente invenção pode ser qualquer uma de administração entérica, administração local e administração parentérica. Exemplos das mesmas podem incluir administração intravenosa, administração intra- arterial, administração intramuscular, administração intradérmica, administração hipodérmica, administração intraperitoneal, administração transdérmica, administração intraóssea e administração intra-articular.

[00358] A constituição da composição ou da composição farmacêutica pode ser determinada de acordo com o método de administração, a afinidade de ligação do anticorpo para a proteína de LAG-3, etc. O anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo, ou à forma modificada do mesmo tendo uma maior afinidade (valor KD mais baixo) para a proteína de LAG-3 pode exercer sua eficácia em uma dose mais baixa.

[00359] A dose do anticorpo anti-LAG-3 não é limitada, desde que a dose seja uma quantidade farmacologicamente eficaz. A dose pode ser determinada adequadamente de acordo com a espécie de um indivíduo, o tipo de doença, sintomas, sexo, idade, condições pré-existentes, a afinidade de ligação do anticorpo à proteína de LAG-3 ou sua atividade biológica e outros fatores. Uma dose usualmente de 0,01 a

1000 mg/kg, de preferência 0,1 a 100 mg/kg, pode ser administrada entre uma vez ao dia e uma vez a cada 180 dias ou duas ou três ou mais vezes ao dia.

[00360] Exemplos da forma da composição ou da composição farmacêutica podem incluir injeções (incluindo preparações liofilizadas e gotas), supositórios, preparações de absorção transnasal, preparações de absorção transdérmica, formulações sublinguais, cápsulas, comprimidos, pomadas, grânulos, aerossóis, pílulas, pós, suspensões, emulsões, colírios e formulações de implantes biológicos.

[00361] A composição ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-LAG-3 ou o fragmento de ligação do mesmo, ou a forma modificada do mesmo como um ingrediente ativo pode ser administrada simultaneamente com ou separadamente de um fármaco adicional. Por exemplo, a composição ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo como ingrediente ativo pode ser administrada após a administração do fármaco adicional, ou o fármaco adicional pode ser administrado após a administração da composição ou da composição farmacêutica. Alternativamente, a composição Ou a composição farmacêutica e o fármaco adicional podem ser administrados simultaneamente.

[00362] Exemplos do fármaco adicional que é usado em combinação com a composição ou a composição farmacêutica da presente invenção podem incluir antifolatos, inibidores de calcineurina, corticosteróides, globulinas antitimocíticas, antimetabólitos de ácidos nucleicos, inibidores de síntese de ácidos nucleicos, produtos biológicos direcionados a antígenos de superfície celular e produtos biológicos direcionados a citocinas ou receptores de citocinas, e esses são preferíveis para o tratamento ou a prevenção de doenças autoimunes e/ou a rejeição de transplantes. Exemplos do fármaco adicional podem incluir Metotrexato, que é um antifolato, Ciclosporina e Tacrolimo que são inibidores da calcineurina, Metilprednisolona e Prednisolona, que são corticosteróides, Ciclofosfamida e Azatioprina, que são inibidores da síntese de ácidos nucleicos, Zetbulin, Linfoglobulina e Timoglobulina, que são globulinas antitimócitos, Micofenolado de mofetil que é um antimetabolito de ácido nucleico, Alemtuzumab, Rituximab, Abatacept e Denosumab, que são produtos biológicos direcionados a antígenos de superfície celular, e Adalimumab, Infliximab, Etanercept, Tocilizumab e anticorpos anti-Orail que são produtos biológicos direcionados a citocinas ou receptores de citocinas. Além disso, a composição ou a composição farmacêutica da presente invenção também pode ser usada para o tratamento ou a prevenção de doenças autoimunes e/ou a rejeição de transplantes em combinação com imunoglobulina intravenosa (IVIg), troca de plasma, etc. Tais fármacos e terapias adicionais também podem ser combinados com a composição da presente invenção para Oo tratamento ou a prevenção de doenças que não sejam doenças autoimunes e a rejeição de transplantes.

[00363] Exemplos de fármacos e terapias que podem ser combinados com a composição ou a composição farmacêutica da presente invenção no tratamento ou na prevenção de tumores malignos podem incluir agentes anticâncer, tais como vários fármacos moleculares direcionados, agentes quimioterapêuticos, terapias de radiação e vários agentes imunoterapêuticos tipificados pelo anticorpo anti-PD-l, anticorpo anti-PD-L1 e anticorpo anti-CTLA-4.

[00364] Um desses fármacos e terapias adicionais, Ou dois, três ou mais dos mesmos podem ser administrados ou recebidos. Estes são coletivamente referidos como “uso combinado do fármaco adicional” ou “combinação com o fármaco adicional”. A presente invenção também abrange a composição da presente invenção compreendendo esse fármaco adicional ou usado em combinação com outra terapia, além do anticorpo para LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo, ou a forma modificada do mesmo, como um aspecto do “uso combinado do fármaco adicional ou “a combinação com o fármaco adicional”.

[00365] A presente invenção também prover um método para esgotar células T citotóxicas, uso de um anticorpo para LAG- 3 para esgotar células T citotóxicas ou para preparar uma composição ou uma composição farmacêutica para esgotamento de células T citotóxicas, uso de um anticorpo para LAG-3 para o tratamento ou a prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas, um anticorpo para LAG-3 para oO tratamento ou a prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas e um anticorpo para LAG-3 para uso no tratamento ou na prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas. A presente invenção também inclui um kit para esgotamento de células T citotóxicas e um kit para o tratamento ou a prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas, compreendendo um anticorpo para LAG-3.

Exemplos

[00366] Daqui por diante, a presente invenção será descrita mais detalhadamente, especificamente com referência aos Exemplos. No entanto, a presente invenção não se destina a ser limitada a eles.

[00367] Os procedimentos relacionados à manipulação gênica nos Exemplos abaixo foram realizados de acordo com os métodos descritos em “Clonagem Molecular” (Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou de acordo com os métodos descritos em outros manuais experimentais usados por aqueles habilitados na técnica, ou usando reagentes ou kits comercialmente disponíveis de acordo com os manuais de instruções, a menos que especificado de outra forma.

Exemplo 1. Preparação do anticorpo de rato anti-LAG-3 humano 1)-1 imunização

[00368] Um mutante deficiente no primeiro e no segundo domínios (uma região das posições 23 a 262) do terminal N dos quatro domínios extracelulares do tipo imunoglobulina do LAG-3 humano (SEQ ID No: 86: Figura 101) foi clonado no pcDNA3.1 (Life Technologies Corp.) para preparar uma grande quantidade de plasmídeo de expressão pcDNA3.1-hLAG-3 D3D4 usando um kit EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen NV). Após o pré-tratamento de ambas as pernas de um rato WKY/Izm fêmea (Japan SLC, Inc.) com hialuronidase (Sigma-Aldrich), oO PpcDNA3.1-hLAG-3 D3D4 foi injetado intramuscularmente nos mesmos sítios. Subsequentemente, usando o ECM830 (BTX Global Logistics), os mesmos sítios foram submetidos a eletroporação in vivo usando um eletrodo de duas agulhas. Uma vez a cada duas semanas, a mesma eletroporação in vivo foi repetida 3 ou 5 vezes no total, e posteriormente os linfonodos do rato foram coletados para serem usados no desenvolvimento de hibridomas.

1) -2 Preparação de hibridoma

[00369] As células dos linfonodos ou do baço foram fundidas eletricamente com células SP2/0-agl4 de mieloma de camundongo usando o Sistema de Produção de Hibridoma Hybrimune (fabricado por Cyto Pulse Sciences, Inc.). As células fundidas foram diluídas com Meio de Seleção ClonaCell-HY D (fabricado pela StemCell Technologies Inc.) e cultivadas. As colônias de hibridoma que apareceram foram recuperadas para preparar hibridomas monoclonais. Cada colônia de hibridoma assim recuperada foi cultivada, e o sobrenadante da cultura de hibridoma obtido foi usado para triar um hibridoma produtor de anticorpo anti-LAG-3. 1)-3 Triagem de anticorpos por Cell-ELISA

[00370] Os plasmídeos de expressão (pcDNA3.1/hLAG-3 e pcDNA3.1/cynoLAG-3) construídos pela clonagem de LAG-3 humano ou de macaco cinomolgo no pcDNA3.1 ou um plasmídeo de controle foram introduzidos nas células HEK293 usando Lipofectamine 2000 (fabricado por Life Technologies Corp.), e as células foram cultivadas em uma microplaca de 96 poços (fabricada pela Corning Inc.) durante a noite sob condições de 37ºC e 5% de CO; em um meio DMEM contendo 10% de FBS. Após a remoção do sobrenadante da cultura, foi adicionado cada sobrenadante da cultura de hibridoma, e a placa foi deixada em repouso a 4 “*C por 1 hora. As células nos poços foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS. Em seguida, o anticorpo IgG-Peroxidase anti-rato produzido em coelho (fabricado pela Sigma-Aldrich Corp.) foi diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS, e a placa foi mantida a 4ºC por 1 hora. As células nos poços foram lavadas 5 vezes com PBS contendo 5% de FBS. Em seguida, uma solução cromogênica OPD (preparada pela dissolução do dicloridrato de o-

fenilenodiamina (fabricado pela Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) e HO, nas concentrações de 0,4 mg/mL e 0,6% (v/v), respectivamente, no solvente OPD (citrato trissódico 0,05 M e hidrogenofosfato dissódico 0,1 M dodeca- hidratado, pH 4,5) foi adicionado a 25 npuL/poço. A reação de cor foi realizada com agitação ocasional e interrompida pela adição de 25 ul/poço de HCl 1 M. Em seguida, a absorbância foi medida a 490 nm usando um leitor de placas (ENVISION; PerkinElmer, Inc.). De modo a selecionar hibridomas que produzem um anticorpo que se liga especificamente ao LAG-3 expressado na superfície da membrana celular, os hibridomas que produziram um sobrenadante da cultura exibindo maior absorbância para as células HEK293 transfectadas com vetor de expressão de LAG-3 do que para as células HEK293 transfectadas com plasmídeo de controle livres do gene LAG- 3 foram selecionados como hibridomas de produção de anticorpos anti-LAG-3 positivos. 1) -4 Triagem de anticorpos por citometria de fluxo

[00371] Foi ainda confirmado por citometria de fluxo que o anticorpo produzido pelos hibridomas determinados para serem positivos pelo Cell-ELISA no Exemplo 1) -3 se liga a células T humanas ativadas por PHA (fito-hemaglutinina) (blastos de PHA), um tipo de célula mais fisiologicamente relevante expressando LAG-3. Às PBMCs humanas estimuladas com 2 ug/mL de PHA (fabricado por Sigma-Aldrich) por três dias, foi adicionado um sobrenadante da cultura de hibridoma para suspensão, seguido de reação a 4ºC por 30 minutos. Após lavagem com um tampão FACS (PBS, BSA a 0,1% e azida de sódio a 0,1%), um anticorpo secundário, tal como um conjugado de PE anti-IgG de rato (fabricado pela Jackson ImmunoResearch

Laboratories, Inc.) diluído 200 vezes com um tampão FACS compreendendo corante reativo flourescente IV próximo do Kit de Colorante de Célula Morta Fixável LIVE/DEAD fabricado pela Invitrogen Corp.) foi adicionado ao mesmo para suspensão, seguido de repouso a 4ºC por 30 minutos. Após lavagem com um tampão FACS, as células foram recolocadas em suspensão em PBS contendo 1 a 2% de paraformaldeído, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (CantolII: fabricado por Becton, Dickinson and Company ou FC500: fabricado por Beckman Coulter Inc.). Os dados foram analisados usando FlowJjo (fabricado pela Tree Star Inc) Após remoção das células mortas positivas para o corante reativo fluorescente IV próximo do Kit de coloração de Células Mortas Fixável LIVE-DEAD, por refinamento e identificação, foi plotado um histograma da intensidade de fluorescência das células vivas. 1)-5 Triagem pelo ensaio de ADCC 1) -5-1 Preparação das células alvo

[00372] As células 293FT (Invitrogen Corp.) foram transfectadas com pLenti6/V5-GW/lacZz e ViraPower (TM) Packaging Mix (Invitrogen Corp.) de acordo com os protocolos anexos para preparar um lentivírus recombinante para expressar o gene da B-galactosidase. As células 293T foram infectadas pelo lentivírus recombinante obtido de acordo com o protocolo dos Sistemas de Expressão Lentiviral ViraPower (Invitrogen Corp). As células infectadas com vírus foram selecionadas usando 10 upg/mL de Blasticidina (Invitrogen Corp.) para obter uma linha que expressa B-galactosidase de forma estável. Um plasmídeo de expressão do LAG-3 humano de comprimento completo foi introduzido nas células 293T que expressam fB-galactosidase de forma estável (daqui por diante, daqui por diante referida como 293T-lacZ) usando Lipofectamine 2000 (fabricado pela Invitrogen Corp.), e as células foram cultivadas para 1 dia e depois dissociadas e recuperadas usando TrypLExpress (fabricado pela Invitrogen Corp). As células foram lavadas duas vezes com RPMI1640 sem fenol vermelho contendo 5% de FBS (daqui em diante, referido como um “meio para ADCC”). O número de células vivas foi contado pelo teste de exclusão por corante azul de tripano. As células foram recolocadas em suspensão em 1 x 10º células/ml em um meio para ADCC e usadas como células alvo. 1) -5-2 Preparação de células efetoras

[00373] As PBMCs foram separadas do sangue periférico humano por centrifugação por Ficoll, e uma suspensão ajustada a uma densidade de células vivas de 1,2 x 10º células/mL em um meio para ADCC foi usada como células efetoras. 1) -5-3 Ensaio ADCC

[00374] A uma microplaca de 96 poços com fundo em U contendo 50 uL/poço do sobrenadante da cultura de hibridoma, foram adicionados 50 unL/poço das células alvo de 1)-5-1, seguidos de 4ºC por 30 minutos. Depois de adicionar 150 nul/poço de um meio para ADCC à mesma, seguido de agitação, a placa foi centrifugada em temperatura ambiente a 1200 rpm por 5 minutos para remover 200 ul/poço do sobrenadante. Em seguida, foram adicionados 125 uL/poço das células efetoras de 1)-5-2, seguidos de centrifugação em temperatura ambiente a 1200 rpm por 5 minutos. Posteriormente, as células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37ºC e 5% de CO;. No dia seguinte, 50 ul do sobrenadante foram recuperados em uma placa preta (fabricada pela Corning Inc). Adicionaram-

se 50 pl de um sistema de ensaio B-Glo (fabricado pela Promega Corp.). A intensidade da luminescência foi medida usando um leitor de placas (ENVISION; fabricado por PerkinElmer, Inc). A porcentagem de células lisadas pela atividade de ADCC foi calculada de acordo com a fórmula a seguir. Porcentagem de células lisadas (%) = (A - B)/(C - B) X 100 A: Contagem de cada poço de amostra B: Média de liberação espontânea (poços sem adição de anticorpos) (n = 3)

[00375] Ao adicionar o anticorpo, 50 ul de um meio para ADCC foram adicionados ao mesmo. Exceto por isso, foi realizada a mesma operação que no poço de amostra.

C: Média de contagens liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas com um tensoativo) (n = 3)

[00376] Ao adicionar o anticorpo e adicionar as células efetoras, 50 uL e 75 uL de um meio para ADCC foram adicionados ao mesmo, respectivamente. Para o ensaio, 175 ul da solução do sistema de ensaio B-Glo foram adicionados a cada poço contendo as células alvo e misturados com os mesmos. Uma alíquota de 100 ul foi adicionada a uma placa preta para realizar o ensaio.

1) -6 Triagem pelo teste de ligação de classe IT de LAG-3/MHC

[00377] Isso foi conduzido de acordo com um relatório anterior (Literatura Não Pertencente à Patente 8). Ou seja, uL/poço de LAG-3-Fc (fabricado pela R&D Systems, Inc.) diluídos com RPMI1l640 contendo 10% de FBS a 25 nM foram adicionados a uma microplaca de 96 poços com fundo em U, e 20 uL/poço do sobrenadante da cultura de hibridoma foram adicionados à mesma, seguido de agitação e repouso a 4ºC por minutos. Em seguida, foram adicionados 10 uL/poço (2,5 x 105 células/poço) de células Raji, que expressam endogenamente moléculas de classe II de MHC, seguidas de agitação e repouso a 4ºC por mais 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS ou um tampão FACS e, em seguida, um conjugado de PE anti-IgG humano (fabricado pela Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 200 vezes com um tampão FACS foi adicionado ao mesmo para suspensão, seguido de repousar em 4ºC por 20 minutos. Após lavagem com PBS ou um tampão FACS, as células foram recolocadas em suspensão em PBS contendo 1 a 2% de paraformaldeído, seguido de detecção usando um citômetro de fluxo (CantoII: fabricado por Becton, Dickinson and Company ou FC500: fabricado por Beckman Coulter Inc). Os dados foram analisados usando FlowJo (fabricado pela Tree Star Inc.), e à porcentagem de inibição foi calculada pela fórmula a seguir. Porcentagem de inibição (%) = 100 - (A - B)/(C - B) X 100 A: Intensidade média de fluorescência de cada poço de amostra B: Intensidade média de fluorescência de base

[00378] Ao adicionar LAG-3-Fc e o anticorpo, 20 uL de um meio foram adicionados a cada vez. Exceto por isso, foi realizada a mesma operação que no poço de amostra. C: Intensidade média de fluorescência da ligação máxima

[00379] Ao adicionar o anticorpo, foram adicionados 20 nL de um meio do mesmo. 1)-7 Purificação de anticorpo monoclonal

[00380] Um anticorpo monoclonal de rato anti-LAG-3 humano foi purificado a partir do sobrenadante da cultura de hibridoma. Ou seja, o sobrenadante da cultura de hibridoma foi primeiro aplicado a uma coluna ProteinG (fabricada pela

GE Healthcare) equilibrada com PBS. Após lavagem da coluna com PBS, as frações contendo anticorpos foram coletadas por eluição com uma solução aquosa de glicina/ácido clorídrico 0,1 M (pH 2,7). Às frações coletadas, foi adicionado Tris- HCl 1M (pH 9,0) para ajuste de pH 7,0 a 7,5 e, posteriormente, o Dispositivo de Filtro UF Centrífugo VIVASPIN20 (fração de peso molecular UF30K, fabricado por Sartorius AG) foi usado para substituir o tampão por PBS e concentrar o anticorpo para ajustar para 2 mg/mL ou mais. Finalmente, a filtração com um filtro Minisart-Plus (fabricado pela Sartorius AG) foi realizada para resultar em uma amostra purificada. Exemplo 2. Avaliação in vitro de anticorpos de rato de anti- LAG-3 humano (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1264) 2)-1 Atividade de ligação dos anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1I264) a células T humanas ativadas

[00381] A atividade de ligação dos anticorpos de rato anti-LAG-3 humano rLAZ04, rLA212, rLAZ225, rLA869 e rLAl264 purificados pelo método descrito no Exemplo 1)-7 para células T humanas ativadas foi investigada. Como mostrado na Figura l, todos os anticorpos de rato de anti-LAG-3 humano ligados aos blastos com PHA preparados como células T humanas ativadas in vitro de uma maneira dependente da concentração. 2)-2 Atividade de ADCC de anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1l264)

[00382] A atividade de ADCC dos anticorpos de rato anti- LAG-3 humano purificados rLAZ04, rLA212, rLAZ225, rLA869 e rLAl1264 foi investigada pelo método a seguir. A uma microplaca de 96 poços com fundo em U contendo 50 uL/poço da solução de anticorpo, foram adicionados 50 unL/poço das células alvo (que serão daqui por diante referidas como células 293T-lacZ/hLAG-3) do Exemplo 1)-5-l1, seguido de repouso a 4 ºC por 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 75 uL/poço de células efetoras preparadas como no Exemplo 1)-5-2 (que no entanto foi colocado em suspensão a 2 x 105º células/mL), seguido de centrifugação em temperatura ambiente a 1200 rpm por 5 minutos, e depois as células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e 5% de CO2. No dia seguinte, 50 ul do sobrenadante foram recuperados em uma placa preta (fabricada pela Corning Inc). Foi adicionada uma solução do sistema de ensaio fB-Glo (fabricado pela Promega Corp.) a 50 1pl/poço. A intensidade da luminescência foi medida usando um leitor de placas (ENVISION; fabricado por PerkinElmer, Inc). A porcentagem de células lisadas pela atividade do ADCC foi calculada de acordo com a fórmula a seguir. Porcentagem de células lisadas (%) = (A - B)/(C - B) X 100 A: Contagem de cada poço de amostra B: Média de contagens de liberação espontânea (poços sem adição de anticorpos) (n = 3)

[00383] Ao adicionar o anticorpo, 50 ul de um meio para ADCC foram adicionados ao mesmo. Exceto por isso, foi realizada a mesma operação que no poço de amostra.

C: Média de contagens de liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas com um tensoativo) (n = 3)

[00384] Ao adicionar o anticorpo e adicionar as células efetoras, 50 uL e 75 uL de um meio para ADCC foram adicionados ao mesmo, respectivamente. Para o ensaio, 175 ul da solução do sistema de ensaio B-Glo foram adicionados a cada poço contendo as células alvo e misturados com os mesmos. Uma alíquota de 100 ul foi adicionada a uma placa preta para realizar o ensaio.

[00385] Como mostrado na Figura 2, todos os anticorpos de rato de anti-LAG-3 humano mostraram uma atividade de ADCC in vitro dependente da concentração nas células que expressam LAG-3 humano. Em contraste, esses anticorpos não mostraram atividade de ADCC nas células 293T-lacZ nas quais o gene LAG-3 humano não foi transfectado, portanto a ação foi específica.

2)-3 Investigação da atividade inibitória dos anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1264) no teste de ligação de classe II de LAG-3/MHC

[00386] Foi investigado pelo teste de ligação LAG-3/MHC classe II de acordo com o Exemplo 1)-6 se os anticorpos anti- LAG-3 purificados (rLAZ204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLALl264) tinham uma atividade inibidora contra a ligação de As moléculas de LAG-3 a MHC de classe II, que foram relatadas como sendo seus ligantes. Como mostrado na Figura 3A, os resultados revelaram que todos os 5 clones de anticorpos mostraram quase nenhuma atividade inibitória no teste de ligação de LAG-3/MHC de classe II e não tiveram influência na ligação a moléculas de classe II de MHC, que é considerado necessário que o LAG-3 exerça uma função de supressão de células T. Em contraste, como mostrado na Figura 3B, O anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico IMP731 (Literatura de Patentes 1) que é um anticorpo convencional na Lista de Citação mostrou uma poderosa atividade inibitória de maneira dependente da concentração no Teste de ligação de classe II de LAG-3/MHC.

2) -4 Investigação da atividade inibitória dos anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1264) no teste de adesão de célula Raji/293T-hLAG-3

[00387] No teste de ligação de classe II de LAG-3/MHC de acordo com o Exemplo 2)-3, a ligação do conjugado PE anti- IgG humano anticorpo secundário para detectar a ligação de LAG-3-Fc a células Raji pode ser inibida por impedimento estérico causado por ligação do anticorpo anti-LAG-3 ao LAG- 3-Fc, e, portanto, a possibilidade de aparentemente mostrar uma baixa intensidade de fluorescência não pode ser completamente excluída, apesar do anticorpo não inibir diretamente a ligação de classe IT de LAG-3/MHC. Portanto, como um sistema de avaliação sem o uso de um anticorpo secundário para detecção, o seguinte sistema de teste de adesão de células Raji/293T-hLAG-3 foi construído para avaliar o anticorpo.

[00388] O plasmídeo de expressão de LAG-3 humano pcDNA3.1/hLAG-3 foi introduzido em células 293T usando Lipofectamine 2000 (fabricado pela Life Technologies Corp.), e as células foram inoculadas em uma microplaca de 96 poços revestida com BioCoat Poly-D-Lisina (fabricado por Becton, Dickinson and Company) e cultivado durante a noite. Enquanto isso, as células Raji foram rotuladas em um meio (RPMI1640 contendo 10% de FBS) com corante fluorescente BCECF-AM (fabricado pela DOJINDO LABORATORIES, usado a 10 UM) a 37ºC por 1 hora, seguido por lavagem e então suspensão em um meio a 1,6 x 10º células/mL. Após a transfecção, o meio das células (células 293T-hLAG-3) cultivadas durante a noite foi removido, e 50 uL/poço de um meio e 25 uL/poço de uma solução de anticorpo foram adicionados ao mesmo, seguidos de pré- incubação a 37ºC por 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 25 uL/poço das células Raji rotuladas com BCECF- AM, seguidas de centrifugação a 900 rpm por 30 segundos e incubação a 37ºC por 1 hora. Após a reação, o poço foi lavado com meio duas a três vezes para remover as células não aderentes, e as células foram lisadas em 100 uL/poço de um tampão Tris (25 mM, pH 8,0) contendo 0,1% de NP-40, para medir a intensidade de fluorescência do poço com um leitor de placas (ENVISION: fabricado pela PerkinElmer Inc). A percentagem de inibição foi calculada pela seguinte fórmula. Porcentagem de inibição (%) = 100 - (A - B)/(C - B) X 100 A: Intensidade de fluorescência de cada poço de amostra B: Intensidade de fluorescência de base

[00389] Ao adicionar as células Raji e o anticorpo, foi adicionado um meio aos mesmos. Exceto por isso, foi realizada a mesma operação que no poço de amostra.

C: intensidade de fluorescência de ligação máxima

[00390] Ao adicionar o anticorpo, foi adicionado um meio ao mesmo.

[00391] Como mostrado na Figura 4, os resultados revelaram que todos os anticorpos de rato anti-LAG-3 purificados rLA2Z0A4, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAlI264 mostraram quase nenhuma atividade inibitória no teste de adesão de células Raji/293T-hLAG-3, suportando a noção de que os anticorpos não tiveram influência na ligação às moléculas de classe II de MHC, o que é considerado necessário para o LAG-3 exercer uma função de supressão de células T. Em contraste, o anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico IMP731 (Literatura de Patentes 1), que é um anticorpo convencional na Lista de Citação, mostrou uma poderosa atividade inibitória com uma porcentagem de inibição de 90% a uma concentração de 10 ug/mL nesse teste. 2)-5 Identificação do epitopo dos anticorpos de rato anti- LAG-3 obtidos (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1264)

[00392] Com base no fato de que os anticorpos de rato anti-LAG-3 rLAZ04, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAlI264 são anticorpos desenvolvidos usando um mutante deficiente no 1º e no 2º domínios (daqui por diante serão referidos, respectivamente, como domínios 1 e 2) do terminal N dos quatro domínios semelhantes à imunoglobulina presentes na região extracelular de LAG-3 como imunógeno, a fim de revelar qual dos 3º e 4º domínios restantes (daqui por diante serão referidos respectivamente como domínios 3 e 4) do terminal N a que esses anticorpos se ligam, a ligação dos anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos a células que expressam os domínios 3 e 4, ou apenas o domínio 4, foi investigada por citometria de fluxo.

[00393] Cada plasmídeo de expressão (clonado no pcDNA3.1) do domínio 3 em diante (263-525) ou do domínio 4 em diante (353-525) do LAG-3 humano com uma sequência de etiqueta FLAG (DYKDDDDK) adicionada ao terminal N foi introduzido nas células HEK293T usando Lipofectamine 2000 (fabricado pela Life Technologies Corp.), e as células foram cultivadas por 1 dia e depois recuperadas, para investigar a atividade de ligação dos anticorpos por citometria de fluxo, de acordo com o método descrito no Exemplo 1)-4 . Quanto aos resultados, todos os anticorpos de rato anti-LAG- 3 purificados rLAZ04, rLA212 e rLA225 se ligaram às células que expressam a construção que contém os domínios 3 e 4, enquanto que nenhum deles se ligou às células que expressam a construção que contém apenas o domínio 4, como mostrado na

Figura 5A. Esses resultados revelaram que todos os anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos rLA204, rLA212 e rLA225 se ligavam ao domínio 3 dos quatro domínios semelhantes à imunoglobulina presentes na região extracelular do LAG-3.

[00394] O mesmo tipo de experimento usando um sobrenadante da cultura de hibridoma revelou que os anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos rLA869 e rLA1l264 também se ligavam ao domínio 3.

[00395] A Figura 5B mostra os resultados da investigação do domínio de ligação do anticorpo anti-LAG-3 humano quimérico humano IMP731, que é um anticorpo convencional na Lista de Citações, pelo mesmo método. Além dos dois tipos de construções na Figura 5A, foram usados plasmídeos de expressão do domínio 2 em diante (posições de aminoácidos 173-525 da sequência de aminoácidos de LAG-3 humano na SEQ ID No: 86, Figura 101) do LAG-3 humano com uma sequência de etiquetas FLAG (DYKDDDDK) adicionada ao terminal N e o comprimento total do LAG-3 humano (ambos foram construídos usando pcDNA3.1; a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do LAG-3 humano é descrita na SEQ ID No: 85, Figura 100). O IMP731 e o clone de anticorpo de rato anti-LAG-3 humano desenvolvido no Exemplo 2)-6 se ligaram às células que expressam o comprimento total do LAG- 3 humano, mas não se ligaram aos mutantes (FLAG-D2D3D4, FLAG- D3D4, e FLAG-D4) deficientes no domínio 1, revelando assim que se ligam ao domínio 1. Ou seja, foi revelado que os anticorpos de rato anti-LAG-3 obtidos rLAZ04, rLA212, rLA225, rLA869 e rLAlI264, que se ligam ao domínio 3 dos quatro domínios semelhantes à imunoglobulina presentes na região extracelular do LAG-3, reconhecem um epitopo que é diferente do IMP731, que se liga ao domínio 1. 2) -6 Obtenção de anticorpo de rato anti-LAG-3 humano usando a proteína de LAG-3 purificada como imunogênio

[00396] Como um método de imunização alternativo ao Exemplo 1)-l1, foram obtidos anticorpos de rato de anti-LAG- 3 humano usando uma proteína de LAG-3 purificada como um imunógeno. Uma emulsão formada pela mistura de uma proteína com uma etiqueta His adicionada ao terminal C da região extracelular (1-450) do LAG-3 humano com o Adjuvante Completo de Freund (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (em uma razão de volume de 1:2) foi administrada às bases da cauda de ratos WKY/Izm fêmeas de 8 semanas de idade (Japan SLC, Inc.) em uma quantidade de 200 ug por camundongo. Três semanas depois, apenas uma proteína antigênica foi administrada às bases da cauda em uma quantidade de 200 ug por camundongo e, duas semanas depois, foram coletados linfonodos para desenvolver hibridomas pelo método do Exemplo 1)-2. A triagem pelos métodos dos Exemplos 1)-3 e 1) 4, etc., e a análise do epitopo de anticorpo monoclonal obtido pelo método do Exemplo 2)-5 revelaram que, dos quatro domínios semelhantes à imunoglobulina presentes na região extracelular de LAG-3, 58% dos clones avaliados se ligaram ao domínio 1, e 26% dos mesmos se ligaram ao domínio 2, de modo que os anticorpos monoclonais contra porções próximas ao terminal N eram de preferência obtidos. Destes, a maioria dos clones que se ligavam fortemente a células T humanas ativadas (blastos de PHA) na citometria de fluxo, incluindo o clone 6D7, se ligou ao domínio 1 do LAG-3, e todos eles mostraram forte atividade inibitória no teste de ligação de classe IT de LAG-3/MHC descrito no Exemplo 2)-3. Esses resultados são totalmente consistentes com a descoberta convencional (Literatura Não Pertencente à Patente 4) de que os domínios 1 e 2 do terminal N dos quatro domínios extracelulares semelhantes a imunoglobulina do LAG-3 são importantes para a ligação do LAG-3 às moléculas de classe II de MHC e indicar que, para obter um anticorpo que não iniba a ligação do LAG-3 às moléculas de classe II de MHC, isto é, a função de supressão de células T do LAG-3, é necessário desenvolver um anticorpo monoclonal desenvolvendo tal método de imunização como no Exemplo 1)-1. Exemplo 3. Determinação da sequência de nucleotídeos de cDNA que codifica regiões variáveis de anticorpos de rato de anti- LAG-3 humano (rLA204, rLA212, rLA225, rLA225, rLA869 e rLA1 264) 3)-1 Determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de rLA204 3)-1-1 Preparação do RNA total a partir de hibridoma que produz rLA204

[00397] A fim de amplificar os cDNAs compreendendo as regiões variáveis do rLAZ04, o RNA total foi preparado do hibridoma que produz rLA204 usando oO reagente TRIzol (Ambion/Thermo Fisher Scientific Inc.).

3) -1-2 Síntese de cDNA (cDNA Pronto para 5'-RACE)

[00398] O CDNA (CDNA Pronto para 5" -RACE) foi sintetizado usando cerca de 1 ug do RNA total preparado no Exemplo 3) -1-1 e um Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc).

3) -1-3 Amplificação por PCR em 5'-RACE e sequenciamento de CDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rLA204

[00399] Os iniciadores usados para amplificação por PCR do cDNA que codifica a região variável do gene da cadeia pesada de rLA204 eram oligonucleotídeos tendo as sequências de UPM (Mistura A de Iniciador Universal; provido com o Kit de Amplificação de CcDNA SMARTer RACE) e 5"- CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'" (RG2AR3: SEQ ID NO: 71). O UPM usado foi provido com o Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.), enquanto o RG2AR3 foi configurado a partir de sequências de regiões constantes da cadeia pesada de ratos em um banco de dados.

[00400] O cDNA compreendendo a região variável da cadeia pesada de rLA204 foi amplificado por PCR em 5'"-RACE usando este conjunto de iniciadores e o cCDNA (cDNA Pronto para 5'- RACE) sintetizado no Exemplo 3)-1-2 como um modelo. Esta PCR foi realizada no programa de PCR Touchdown de acordo com o manual do Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.) usando a polimerase KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.).

[00401] O cDNA compreendendo a região variável da cadeia pesada amplificado por PCR em 5'-RACE foi purificado usando um Kit de Purificação por PCR MinElute (Qiagen N.V.) e depois clonado usando um Kit de Clonagem por PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.). O cDNA compreendendo a região variável da cadeia pesada clonada foi analisado por sequenciação.

[00402] Os iniciadores de sequenciação usados foram um iniciador com a sequência 5" -CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC- 3” (RG2AR3; SEQ ID No: 71) configurado a partir das sequências das regiões constantes da cadeia pesada de ratos em um banco de dados, e NUP (Iniciador Universal Aninhado A: provido com Kit de amplificação de cDNA da SMART RACE).

[00403] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rLA204 é mostrada na SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID NO: 2.

3) -1-4 Amplificação por PCR em 5'/-RACE e sequenciamento de CDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rLA204

[00404] Os iniciadores usados para amplificação por PCR do cDNA que codifica a região variável do gene da cadeia leve de rLA204 foram UPM (Mistura do Iniciador Universal A; provido com o Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE) e um oligonucleotídeo tendo a sequência de 5"- TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5: SEQ ID NO: 72). O UPM utilizado foi fornecido com o Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.), enquanto o RKR5 foi configurado a partir de sequências de regiões constantes da cadeia leve de ratos em um banco de dados.

[00405] O cDNA compreendendo a região variável da cadeia leve de rLAZ04 foi amplificado por 5'-RACE PCR usando este conjunto de iniciadores e o CDNA (CcDNA Pronto para 5'-RACE) sintetizado no Exemplo 3)-1-2 como um modelo. Essa PCR foi realizada no programa de PCR Touchdown de acordo com o manual do Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.) usando a polimerase KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.).

[00406] O cDNA compreendendo a região variável da cadeia leve amplificado por PCR em 5' -RACE foi purificado usando um Kit de Purificação por PCR MinElute (Qiagen N.V.) e depois clonado usando um Kit de Clonagem por PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.). O cDNA que codifica a região variável da cadeia leve clonada foi analisado por sequenciação.

[00407] Os iniciadores de sequenciação usados foram um iniciador com a sequência 5'"-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC- 3" (RKR5; SEQ ID No: 72) configurados das sequências de regiões constantes da cadeia leve de ratos em um banco de dados, e NUP (Iniciador Universal Aninhado A: provido com o Kit de Amplificação de cDNA da SMART RACE).

[00408] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rLA204 é mostrada na SEQ ID NO: 3, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID NO: 4. 3) -2 Determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de rLA212

[00409] A sequência foi determinada da mesma maneira que no Exemplo 3)-1.

[00410] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rLA212 é mostrada na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID NO: 6. A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve da mesma é mostrada na SEQ ID NO: 7, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID NO: 8. 3) -3 Determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de rLA225

[00411] A sequência foi determinada da mesma maneira que no Exemplo 3)-1l.

[00412] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rLA225 é mostrada na SEQ ID No: 9, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 10. A sequência de nucleotídeos do CDNA que codifica a região variável da cadeia leve da mesma é mostrada na SEQ ID No: 11, e sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 12. 3) -4 Determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de rLA869

[00413] A sequência foi determinada da mesma maneira que no Exemplo 3)-1l.

[00414] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rLA869 é mostrada na SEQ ID No: 13, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 14. A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve da mesma é mostrada na SEQ ID No: 15, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 16.

3) -5 Determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável de rLA1264

[00415] A sequência foi determinada da mesma maneira que no Exemplo 3)-1.

[00416] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rLAl264 é mostrada na SEQ ID No: 17, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 18. A sequência de nucleotídeos do CDNA que codifica a região variável da cadeia leve da mesma é mostrado na SEQ ID No: 19, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 20.

Exemplo 4. Desenvolvimento de anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico (cLA212) 4)-1 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK

[00417] Um plasmídeo pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) foi digerido com as enzimas de restrição XbaI e Pmel.

O fragmento obtido de aproximadamente 5,4 kb foi ligado a um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA mostrada na SEQ ID No: 21 e que codifica um sinal secretor da cadeia leve humana e uma região constante da cadeia K humana usando um kit de clonagem por PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar pcDNA3.3/LK.

[00418] A PCR foi realizada com pcDNA3.3/LK como um modelo usando o conjunto de iniciadores mostrado abaixo. O fragmento obtido de aproximadamente 3,8 kb foi fosforilado e depois autoligado para construir um vetor de expressão da cadeia leve de anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK tendo uma sequência sinal, um sítio de clonagem, e uma região constante da cadeia leve humana, a jusante do promotor de CMV.

Conjunto de iniciadores 5" = TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3"' (3.3-Fl: SEQ ID NO: 73) 5" -GCTATGGCAGGGCCTGCCGECCCCGACGTTG-3" (3.3-R1: SEQ ID NO: 74) 4) -2 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada tipo anticorpo IgGl quimérico e humanizado pCMA-G1

[00419] O fragmento de DNA obtido do qual o sinal secretor da cadeia leve e a região constante da cadeia K humana foram removidos digerindo pCMA-LK com XbaI e PmeI foi ligado a um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA mostrada na SEQ ID No: 22 e codificando os aminoácidos de uma sequência sinal da cadeia pesada humana e uma região constante de IgGl humana usando um kit de clonagem por PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão da cadeia pesada de anticorpo quimérico e humanizado tipo IgGl pCMA-G1 tendo uma sequência sinal, um sítio de clonagem, e uma região constante da cadeia pesada de IgGl humana, a jusante do promotor de CMV. 4) -3 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada cLA212

[00420] Um fragmento de DNA compreendendo um cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada foi amplificado com KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) e o conjunto de iniciadores mostrado abaixo, usando oO cDNA obtido no Exemplo 3)-2 e compreendendo a região variável da cadeia pesada de rLA212 como um modelo, e o fragmento de DNA amplificado foi inserido no sítio clivado por enzima de restrição BlpI do vetor de expressão da cadeia pesada do tipo IgGl quimérica e humanizada pCMA-G1 usando um kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão da cadeia pesada cLA212. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA-G1/cLA212”. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada cLA212 é mostrada na SEQ ID No: 23, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 24. Conjunto de iniciadores para cadeia pesada cLA212 5" -CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGÇE-3' (212H- F; SEQ ID No: 75) 5" -CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3" (212H- R; SEQ ID No: 76) 4) -4 Construção do vetor de expressão da cadeia leve cLA212

[00421] Um fragmento de DNA compreendendo um cDNA que codifica a região variável da cadeia leve foi amplificado com KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) e o conjunto de iniciadores mostrado abaixo, usando o CDNA obtido no Exemplo 3)-2 e compreendendo a região variável da cadeia leve de rLA212 como um modelo, e o fragmento de DNA amplificado foi inserido no sítio clivado pela enzima de restrição BsiWI do vetor geral de expressão da cadeia leve quimérica e humanizada pCMA-LK usando um kit de clonagem por PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão da cadeia leve cLA212. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA-LK/cLA212”. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve cLA212 é mostrada na SEQ ID No: 25, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada na SEQ ID No: 26. Conjunto de iniciadores para cadeia leve cLA212. 5" -ATCTCCGGCGCGTACGGCAACATTGTGATGACCCAGTCTCCCAAATCC-3" (212L-F; SEQ ID No: 77) 5" -=GGAGGGGGCEGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTCGGTCCCAGC-3" (212L- R; SEQ ID No: 78) 4) -5 Produção de cLA212

[00422] As células 293F FreeStyle (Invitrogen Corp.) foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual. 1,2 x 10º células 293F FreeStyle (Invitrogen Corp.) na fase de crescimento logarítmico foram inoculadas em um balão Erlenmeyer Fernbach de 3 L (Corning Inc.), ajustadas para 2,0 x 10º células/ml por diluição com meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp .) e, em seguida, cultivadas com agitação a 90 rpm a 37 ºC por 1 hora em uma incubadora de 8% de COr. 1,8 mg de polietilenoimina (Polysciences $24765) foram dissolvidos em 20 ml de meio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Em seguida, cada vetor de expressão da cadeia H (0,24 mg) e cada vetor de expressão da cadeia L (0,36 mg) preparado usando NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.) foram adicionados a 20 ml de meio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). 20 ml da solução mista vetor de expressão/Opti-Pro SFM foram adicionados a 20 ml da solução mista polietilenoimina/Opti-Pro SFM, e a mistura foi agitada suavemente, deixada por 5 minutos, e depois adicionada às células 293F FreeStyle. As células foram cultivadas por agitação a 90 rpm a 37 “*C por 4 horas em uma incubadora de 8% de COr. Em seguida, foram adicionados 600 ml de meio EX- CELL VPRO (SAFC Biosciences), 18 ml de GlutaMAX 1 (GIBCO/Thermo Fisher Scientific Inc.), e 30 ml de ultrafiltrado de leveduras Yeastolate (GIBCO/Thermo Fisher Scientific Inc.). As células foram cultivadas por agitação a 90 rpm a 37 ºC por 7 dias em uma incubadora de 8% de CO>, e o sobrenadante da cultura obtido foi filtrado através de um filtro de cápsula descartável (Advantec HCCS-045-E1H).

[00423] O anticorpo quimérico humano rLA212 obtido pela combinação de pCMA-G1/cLA212 e pcMA-LK/cLA212 foi designado como “cLA212”. 4) -6 Purificação de cLA212

[00424] O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo 4)-5 por cromatografia por afinidade com Proteína A (de 4 a 6ºC). A etapa de substituição do tampão após a purificação por cromatografia por afinidade da rProteína A foi realizada de 4 a 6ºC. Primeiro, o sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna enchida com MabSelectSuRe (fabricado pela GE Healthcare) equilibrado com PBS. Após a entrada de toda a solução de cultura na coluna, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade de pelo menos duas vezes o volume da coluna. A seguir, as frações contendo anticorpos foram coletadas por eluição com uma solução de cloridrato de arginina 2 M (pH 4,0). As fracções foram substituídas por tampão com HBSor (histidina 25 mM e sorbitol a 5%, pH 6,0) por diálise (Thermo

Fisher Scientific Inc., Cassete de diálise Slide-A-Lyzer) Finalmente, as frações foram concentradas e ajustadas para uma concentração de IgG de 25 mg/ml ou mais, usando um dispositivo de filtro UF centrífugo VIVASPIN 20 (ponto de corte de peso molecular: UF10K, Sartorius AG, a 4ºC) e usadas como uma amostra purificada. Finalmente, a filtração com um filtro Minisart-Plus (Sartorius AG) foi realizada para resultar em uma amostra purificada. 4)-7 Atividade de ligação de antígeno do anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico (cLA212)

[00425] O plasmídeo de expressão pcDNA3.1-hLAG-3 do LAG- 3 humano foi introduzido nas células 293T-lacZ (descritas no Exemplo 1)-5-1), usando Lipofectamine 2000 (fabricado pela Invitrogen Corp.), e as células foram cultivadas por 1 dia e posteriormente usadas para citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 1) 4, exceto que um conjugado de PE anti- IgG humano (fabricado pela Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 200 vezes com um tampão FACS foi usado como um anticorpo secundário. Como mostrado na Figura 6, foi revelado que o anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cCcLA212 se ligou às células 293T-lacZ que expressam LAG-3 humano de uma maneira dependente da concentração e, portanto, também manteve a atividade de ligação após quimimerização. Exemplo 5. Configuração da versão humanizada (hLA212) do anticorpo de rato anti-LAG-3 humano (rLA212) 5-1 Configuração do anticorpo de rato humanizado anti-LAG-3 humano 5) -1-1 Modelagem molecular de regiões variáveis de rLA212

[00426] A modelagem molecular das regiões variáveis de rLA212 foi realizada por um método conhecido como modelagem de homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). As regiões variáveis de rLA212 determinadas no Exemplo 3)-2 foram comparadas com as sequências primárias (estruturas tridimensionais derivadas de estruturas de cristal de raios- X estão disponíveis) de regiões variáveis de imunoglobulina humana registradas no Banco de Dados de Proteína (Nuc.Acid Res.35 D301-D303 (2007)). Como resultado, 2GHW e 2ARJ foram selecionados como tendo a maior homologia de sequência para as regiões variáveis das cadeia pesada e leve de rLA212. As estruturas tridimensionais das regiões estruturais foram desenvolvidas através por obtenção de “modelos estruturais” combinando as coordenadas de 2GHW e 2ARJ correspondentes à cadeia pesada e à cadeia leve de rLA212. Subsequentemente, as conformações típicas de CDRs foram incorporadas nos modelos estruturais. Finalmente, foi realizado um cálculo de energia para excluir o contato interatômico desvantajoso, a fim de obter possíveis modelos moleculares das regiões variáveis de rLA212 em termos de energia. Esses procedimentos foram realizados usando o programa de análise estrutural tridimensional de proteínas comercialmente disponível Discovery Studio (fabricado por Accelrys, Inc). 5)-1-2 Configuração de sequências de aminoácidos do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212

[00427] O anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 foi construído por um método geralmente conhecido como enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86, 10029-10033 (1989)). Um anticorpo aceitador foi selecionado com base na identidade de aminoácidos nas regiões estruturais.

[00428] As sequências das regiões estruturais do rLA212 foram comparadas com as regiões estruturais das sequências de consenso dos subgrupos humanos e das sequências da linha germinativa definidas em KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Institutos Nacionais de Saúde de Serviço Público de Saúde, Bethesda, MD. (1991)). Como resultado, a sequência de consenso do subgrupo 3 da cadeia gama humana para a cadeia pesada e a sequência de consenso do subgrupo 1 da cadeia capa humana para a cadeia leve foram selecionadas, respectivamente, como aceitadoras, por terem alta identidade de sequência nas regiões estruturais. Os resíduos de aminoácidos nas regiões estruturais dos aceitadores foram alinhados com os resíduos de aminoácidos de rLA212 para identificar as posições em que diferentes aminoácidos foram usados. As posições desses resíduos foram analisadas usando o modelo tridimensional de rLA212 construído no Exemplo 5)-1-1. Em seguida, os resíduos do doador a serem enxertados nos aceitadores foram selecionados de acordo com os critérios fornecidos por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86, 10029-10033 (1989)). Alguns resíduos de doadores assim selecionados foram transferidos para os anticorpos aceitadores para construir as sequências humanizadas de hLA212 como descrito nos Exemplos abaixo. 5) -2 Humanização da cadeia pesada de rLA212 5) -2-1 Cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2

[00429] Cadeia pesada humanizada de hLA212 configurada pela substituição da arginina na posição de aminoácido 16 por glicina, lisina na posição de aminoácido 19 por arginina, treonina na posição de aminoácido 42 por glicina, arginina na posição de aminoácido 43 por lisina, alanina no aminoácido posição 49 por glicina, ácido aspártico na posição de aminoácido 84 por asparagina, serina na posição de aminoácido 88 por alanina, treonina na posição de aminoácido 93 por valina, valina na posição de aminoácido 115 por treonina, e metionina na posição de aminoácido 116 por leucina, na região variável da cadeia pesada cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID No: 24 foi designada como “cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2” (que também pode ser referida como “hLA212 H2”).

[00430] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2 é descrita na SEQ ID No: 28 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 28, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 19, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 a 140, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 141 a 470, respectivamente, correspondem à sequência sinal, à região variável da cadeia pesada, e a região constante da cadeia pesada. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 28 é descrita na SEQ ID No: 27 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 27, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 57, a sequência que consiste nos nucleotídeos 58 a 420, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 421 a 1410 codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia pesada, e a sequência da região constante da cadeia pesada. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 27 ea sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 28 também são respectivamente descritas nas Figuras 42 e 43.

5) -2-2 Cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H3

[00431] Uma cadeia pesada humanizada de hLA212 configurada pela substituição da arginina na posição de aminoácido 16 por glicina, lisina na posição de aminoácido 19 por arginina, treonina na posição de aminoácido 42 por glicina, arginina na posição de aminoácido 43 por lisina, serina no aminoácido posição 88 por alanina, treonina na posição de aminoácido 93 por valina, valina na posição de aminoácido 115 por treonina, e metionina na posição de aminoácido 116 por leucina, na região variável da cadeia pesada cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID No: 24 foi configurada como “cadeia pesada humanizada do tipo hLA2Z12 H3” (que também pode ser referida como “hLA212 H3”).

[00432] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H3 é descrita na SEQ ID No: 30 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 30, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 19, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 a 140, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 141 a 470, respectivamente, correspondem à sequência sinal, à região variável da cadeia pesada, e a região constante da cadeia pesada. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 30 é descrita na SEQ ID No: 29 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 29, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 57, a sequência que consiste nos nucleotídeos 58 a 420, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 421 a 1410 codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia pesada, e a sequência da região constante da cadeia pesada. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No:

29 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 30 também são descritas respectivamente nas Figuras 44 e 45. 5) -3 Humanização da cadeia leve de rLA212 5) -3-1 Cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L1

[00433] Cadeia leve humanizada de hLA212 configurada pela substituição de asparagina na posição de aminoácido 1 por ácido aspártico, valina na posição de aminoácido 3 por glutamina, lisina na posição de aminoácido 9 por serina, metionina na posição de aminoácido 11 por leucina, isoleucina na posição de aminoácido 13 por alanina, metionina na posição de aminoácido 21 por isoleucina, asparagina na posição de aminoácido 22 por treonina, lisina na posição de aminoácido 38 por glutamina, serina na posição de aminoácido 43 por alanina, ácido aspártico na posição de aminoácido 60 por serina, treonina na posição de aminoácido 63 por serina, glicina na posição de aminoácido 65 por serina, tirosina na posição de aminoácido 67 por serina, asparagina na posição de aminoácido 76 por serina, valina na posição de aminoácido 78 por leucina, alanina no amino posição ácida 80 por prolina, alanina na posição aminoácido 83 por fenilalanina, fenilalanina na posição aminoácido 85 por treonina, alanina na posição aminoácido 100 por glutamina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 103 por lisina, leucina na posição de aminoácido 104 por valina, leucina na posição de aminoácido 106 por isoleucina, e alanina na posição de aminoácido 109 por treonina, na região variável da cadeia leve cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID No: 26 foi designada como “cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L1” (que também pode ser referida como “hLA212 L1”).

[00434] A sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L1 é descrita na SEQ ID No: 32 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 32, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 20, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 21 a 129, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 130 a 234, respectivamente, correspondem à sequência sinal, à região variável da cadeia leve, e à região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 32 é descrita na SEQ ID No: 31 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 31, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 60, a sequência que consiste nos nucleotídeos 61 a 387, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 388 a 702 codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia leve , ea sequência da região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 31 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 32 também são descritas respectivamente nas Figuras 46 e 47. 5) -3-2 Cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L2

[00435] Cadeia leve hLA212 humanizada configurada pela substituição de asparagina na posição de aminoácido 1 por ácido aspártico, valina na posição de aminoácido 3 por glutamina, lisina na posição de aminoácido 9 por serina, metionina na posição de aminoácido 11 por leucina, isoleucina com amino posição de ácido 13 por alanina, metionina na posição de aminoácido 21 por isoleucina, asparagina na posição de aminoácido 22 por treonina, lisina na posição de aminoácido 38 por glutamina, ácido aspártico na posição de aminoácido 60 por serina, treonina na posição de aminoácido

63 por serina, glicina na posição de aminoácido 65 por serina, asparagina na posição de aminoácido 76 por serina, valina na posição de aminoácido 78 por leucina, alanina na posição de aminoácido 80 por prolina, alanina na posição de aminoácido 83 por fenilalanina, fenilalanina na posição de aminoácido 85 por treonina, alanina na posição aminoácido 100 por glutamina, ácido glutâmico na posição aminoácido 103 por lisina, leucina no aminoácido posição 104 por valina, leucina na posição aminoácido 106 por isoleucina, e alanina na posição aminoácido 109 por treonina, na região variável da cadeia leve cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID No: 26 foi designada como “cadeia leve humanizado do tipo hLA212 L2” (que também pode ser referida como “hLA212 L2”).

[00436] A sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L2 é descrita na SEQ ID No: 34 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 34, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 20, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 21 a 129, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 130 a 234, respectivamente, correspondem à sequência sinal, à região variável da cadeia leve, e à região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 34 é descrita na SEQ ID No: 33 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 33, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 60, a sequência que consiste nos nucleotídeos 61 a 387, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 388 a 702 codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia leve, e a sequência da região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 33 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 34 também são descritas respectivamente nas Figuras 48 e 49. 5) -3-3 Cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L3

[00437] Cadeia leve hLA212 humanizada configurada pela substituição de valina na posição de aminoácido 3 por glutamina, lisina na posição de aminoácido 9 por serina, metionina na posição de aminoácido 11 por leucina, isoleucina na posição de aminoácido 13 por alanina, metionina no aminoácido posição 21 por isoleucina, asparagina na posição de aminoácido 22 por treonina, treonina na posição de aminoácido 63 por serina, asparagina na posição de aminoácido 76 por serina, valina na posição de aminoácido 78 por leucina, alanina na posição de aminoácido 80 por prolina, alanina na posição de aminoácido 83 por fenilalanina, alanina na posição de aminoácido 100 por glutamina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 103 por lisina, leucina na posição de aminoácido 104 por valina, leucina na posição de aminoácido 106 por isoleucina, e alanina na posição de aminoácido 109 por treonina, na região variável da cadeia leve cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID No: 26 foi designada como “cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L3” (que também pode ser referida como “hLA212 13”).

[00438] A sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L3 é descrita na SEQ ID No: 36 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 36, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 20, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 21 a 129, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 130 a 234, respectivamente, correspondem à sequência sinal, a região variável da cadeia leve, e a região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 36 é descrita na SEQ ID No: 35 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 35, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 60, a sequência que consiste nos nucleotídeos 61 a 387, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 388 a 702 codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia leve, e à sequência da região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 35 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 36 são respectivamente descritas também nas Figuras 50 e 51. 5-3-4 Cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L4

[00439] Cadeia leve hLA212 humanizada configurada pela substituição de asparagina na posição de aminoácido 1 por ácido aspártico, valina na posição de aminoácido 3 por glutamina, lisina na posição de aminoácido 9 por serina, asparagina na posição de aminoácido 22 por treonina, ácido aspártico na posição de aminoácido 60 por serina, treonina na posição de aminoácido 63 por serina, glicina na posição de aminoácido 65 por serina, tirosina na posição de aminoácido 67 por serina, asparagina na posição de aminoácido 76 por serina, alanina na posição de aminoácido 80 por prolina, alanina na posição de aminoácido 83 por fenilalanina, fenilalanina na posição de aminoácido 85 por treonina, alanina na posição de aminoácido 100 por glutamina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 103 por lisina, e alanina na posição de aminoácido 103 por treonina, na região variável da cadeia leve cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID

No: 26 foi designada como “cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L4” (que também pode ser referida como “hLA212 L4”).

[00440] À sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L4 é descrita na SEQ ID No: 38 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 38, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 20, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 21 a 129, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 130 a 234, respectivamente, correspondem à sequência sinal, a região variável da cadeia leve, e a região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 38 é descrita na SEQ ID No: 37 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 37, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 60, a sequência que consiste nos nucleotídeos 61 a 387, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 388 a 702 codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia leve, e a sequência da região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 37 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 38 são respectivamente descritas também nas Figuras 52 e 53. 5) -3-5 Cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L5

[00441] Cadeia leve humanizada de hLA212 configurada pela substituição de valina na posição de aminoácido 3 por glutamina, lisina na posição de aminoácido 9 por serina, asparagina na posição de aminoácido 22 por treonina, treonina na posição de aminoácido 63 por serina, asparagina na posição de aminoácido 76 por serina, alanina na posição de aminoácido 80 por prolina, alanina na posição de aminoácido 100 por glutamina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 103 por lisina, e alanina na posição de aminoácido 109 por treonina, na região variável da cadeia leve cLA212 quimérica mostrada na SEQ ID No: 26 foi designada como “cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L5” (que também pode ser referida como “hLA212 L5”).

[00442] A sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L5 é descrita na SEQ ID No: 40 da Listagem de Sequências. Na sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 40, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 1 a 20, a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 21 a 129, e a sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos 130 a 234, respectivamente, correspondem à sequência sinal, a região variável da cadeia leve, e a região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 40 é descrita na SEQ ID No: 39 da Listagem de Sequências. Na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 39, a sequência que consiste nos nucleotídeos 1 a 60, a sequência que consiste nos nucleotídeos 61 a 387, e a sequência que consiste nos nucleotídeos 388 a 702, codificam respectivamente a sequência sinal, a sequência da região variável da cadeia leve, e a sequência da região constante da cadeia leve. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 39 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 40 são respectivamente descritas também nas Figuras 54 e 55.

5)-4 Configuração de hLA212 humanizado por combinação de cadeia pesada e cadeia leve

[00443] Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L1 foi configurado e designado como “hLA212 H2/L1 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H2/L1”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L2 foi configurado e designado como “hLA212 H2/L2 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H2/L2”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L3 foi configurado e designado como “hLA212 H2/L3 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H2/L3”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L4 foi configurado e designado como “hLA212 H2/L4 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H2/L4”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H2 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L5 foi configurado e designado como “hLA212 H2/L5 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H2/L5”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H3 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L1 foi configurado e designado como “hLA212 H3/L1 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H3/L1”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H3 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L2 foi configurado e designado como “hLA212 H3/L2 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H3/L2”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada humanizada do tipo hLA212 H3 e na cadeia leve humanizada do tipo hLA212 L3 foi configurado e designado como “hLA212 H3/L3 humanizado” (que também pode ser referido como

“hLA212 H3/L3”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada do tipo hLA212 H3 humanizado e na cadeia leve do tipo hLA212 L4 humanizado foi configurado e designado como “hLA212 H3/L4 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H3/L4”). Um anticorpo que consiste na cadeia pesada do tipo hLA212 H3 humanizado e na cadeia leve do tipo hLA212 L5 humanizado foi configurado e designado como “hLA212 H3/L5 humanizado” (que também pode ser referido como “hLA212 H3/L5”). Os anticorpos configurados como acima podem ser produzidos de acordo com o Exemplo 6 e avaliados de acordo com o Exemplo 7 e Exemplo 8. Exemplo 6. Expressão e purificação de anticorpo humanizado (hLA212) do anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cLA212 6) -1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada de hLA212 6) -1-1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada do tipo hLA212 H2

[00444] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 H2 mostrada nas posições de nucleotídeos 36 a 437 da sequência de nucleotídeos de NhLA212 H2 de SEQ ID No: 27 foi sintetizado (Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). O fragmento de DNA sintetizado foi inserido em um sítio do vetor de expressão da cadeia pesada tipo anticorpo IgGl quimérico e humanizado pCMA-G1 clivado pela enzima de restrição BlpI, usando um kit de clonagem por PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de hLA212 H2. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 H2”. 6) -1-2 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada do tipo hLA212 H3

[00445] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 H3 mostrada nas posições de nucleotídeos 36 a 437 da sequência de nucleotídeos de hLA212 H3 de SEQ ID No: 29 foi sintetizado (Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). Do mesmo modo que no Exemplo 6)-1-1, foi construído um vetor de expressão de hLA212 H3. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 H3”. 6) -2 Construção de vetores de expressão da cadeia leve de hLA212 6) -2-1 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hLA212 L1

[00446] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 L1 mostrada nas posições de nucleotídeos 37 a 402 da sequência de nucleotídeos de NhLA212 L1 de SEQ ID No: 31 foi sintetizado (Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). O fragmento de DNA sintetizado foi inserido em um sítio do vetor de expressão da cadeia leve do anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK clivado pela enzima de restrição BsiWI, usando um kit de clonagem por PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão hLA212 L1. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 L1”. 6) -2-2 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hLA212 L2

[00447] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 L2 mostrada nas posições de nucleotídeos 37 a 402 da sequência de nucleotídeos de NhLA212 L2 de SEQ ID No: 33 foi sintetizado

(Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). Do mesmo modo que no Exemplo 6)-2-1, foi construído um vetor de expressão hLA212 L2. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 L2”. 6) -2-3 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hLA212 L3

[00448] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 L3 mostrada nas posições de nucleotídeos 37 a 402 da sequência de nucleotídeos de NhLA212 L3 de SEQ ID No: 35 foi sintetizada (Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). Da mesma maneira que no Exemplo 6)-2-l1, foi construído um vetor de expressão hLA212 L3. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 L3”. 6) -2-4 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hLA212 L4

[00449] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 L4 mostrada nas posições de nucleotídeos 37 a 402 na sequência de nucleotídeos de NhLA212 14 de SEQ ID No: 37 foi sintetizado (Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). Da mesma maneira que no Exemplo 6)-2-l1, foi construído um vetor de expressão hLA212 L4. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 L4”. 6) -2-5 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hLA212 L5

[00450] Um fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a região variável de hLA212 L5 mostrada nas posições de nucleotídeos 37 a 402 na sequência de nucleotídeos de NhLA212 L5 de SEQ ID No: 39 foi sintetizado

(Fragmentos de DNA em Sequências, Geneart AG). Do mesmo modo que no Exemplo 6)-2-1, foi construído um vetor de expressão hLA212 L5. O vetor de expressão obtido foi designado como “pCMA/hLA212 L5”. 6) -3 Preparação de anticorpos hLA212 6) -3-1 Produção de anticorpos hLA212

[00451] A produção foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 4) -5. Ou seja, hLA212 H2/Ll1 foi obtido pela combinação de PCMA/hLA212 H2 e PCMA/hLA212 L1; o hLA212 H2/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/hLA212 H2 e PCMA/hLA212 L2; o hLA212 H2/L3 foi obtido pela combinação de PpCMA/NhLA212 H2 e pCMA/hLA2Z12 L3; o hLA212 H2/L4 foi obtido pela combinação de pCMA/hLA212 H2 e pCMA/hLA212 14; O hLA212 H2/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/hLA212 H2 e PCMA/hLA212 L5; o hLA212 H3/L1 foi obtido pela combinação de PCMA/hLA212 H3 e pCcMA/hLA212 Ll1; o hLA212 H3/L2 foi obtido pela combinação de pCMA/hLA212 H3 e pCMA/hLA212 12; O hLA212 H3/L3 foi obtido pela combinação de pCMA/hLA212 H3 e PCMA/hLA212 L3; o hLA212 H3/L4 foi obtido pela combinação de PCMA/hLA212 H3 e pCcMA/hLA212 L4; e hLA212 H3/L5 foi obtido pela combinação de pCMA/hLA212 H3 e pCMA/hLA212 L5. 6) -3-2 Purificação do anticorpo hLA212

[00452] O sobrenadante da cultura obtido em 6)-3-1 foi submetido à purificação da mesma maneira que no Exemplo 4)-

6. Exemplo 7. Avaliação in vitro do anticorpo humanizado anti- LAG-3 humano (hLA212) 7) -1 Ensaio de atividade de ligação de antígeno de anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano (hLA212) usando Biacore

[00453] As células 293F FreeStyle (Invitrogen Corp.)

foram usadas para expressar a proteína etiquetada com His no terminal C, LAG-3 D3D4-His, compreendendo os 3º e 4º domínios (uma região das posições 263-450) do terminal N dos quatro domínios extracelulares semelhantes à imunoglobulina do LAG- 3 humano. O sobrenadante da cultura obtido foi submetido à substituição do tampão (HEPES 20 mM, NaCl 300 mM e pH 7,5), para purificar a proteína de D3D4-His de LAG-3 humano usando uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare) e uma coluna Superdex75 (GE Healthcare). O tampão final foi PBS.

[00454] O anticorpo foi analisado quanto à sua constante de dissociação para o antígeno (LAG-3 D3D4-His) usando Biacore T200 (GE Healthcare) pelo método de captura, que envolve a captura do anticorpo como um ligando com um anticorpo IgG (Fc) anti-humano imobilizado (Kit de captura de anticorpos humanos, GE Healthcare) e ensaio com o antígeno como analito. O anticorpo IgG anti-humano (Fc) foi ligado covalentemente a um chip sensor CM5 (GE Healthcare) por acoplamento de amina, visando aproximadamente 1000 RU. De maneira similar, esse anticorpo foi imobilizado em uma célula de referência. O tampão de corrida usado foi HBS-EP+ (HEPES mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM e Tensoativo P20 a 0,05%) . Após cada anticorpo ter sido adicionado por cerca de 1 minuto ao chip imobilizado por anticorpo IgG anti-humano (Fc), foram adicionadas diluições em série (0,06 a 20 nM) do antígeno a uma vazão de 90 upl/minuto por 300 segundos e, subsequentemente, a fase de dissociação foi monitorada por 3600 segundos. Adicionou-se uma solução de cloreto de magnésio 3M como uma solução regeneradora a uma vazão de 10 ul/minuto por 30 segundos. Os dados foram analisados usando um modelo de ligação 1:1 em software analítico (Biacore T200

Evaluation Software, versão 1.0) para calcular uma constante de taxa de associação ka, uma constante de taxa de dissociação kd, e uma constante de dissociação (KD; KD = kd/ka). A Figura 7 mostra a constante de dissociação. 7)-2 Investigação da atividade de ligação do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano (hLA212) a células que expressam LAG-3 humano por citometria de fluxo

[00455] O plasmídeo humano de expressão de LAG-3 pcDNA3.1/hLAG-3 foi introduzido nas células 293T-lacZ (descritas no Exemplo 1)-5-1), usando Lipofectamine 2000 (fabricado pela Invitrogen Corp.), e as células foram cultivadas por 1 dia e posteriormente usadas para citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 1)-4, mas um conjugado de PE anti-IgG humano (fabricado por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluído 200 vezes com um tampão FACS foi usado como anticorpo secundário. Como mostrado na Figura 8, foi revelado que todos os 10 clones dos anticorpos humanizados anti-LAG-3 humano hLA212 H2/Ll, hLA212 H2/L2, hLA212 H2/L3, hLA212 H2/L4, hLA212 H2/L5, hLA212 H3/L1, hLA212 H3/L2, hLA212 H3/L3, hLA212 H3/L4, and hLA212 H3/L5) exibiram atividade de ligação dependente da concentração às células 293T-lacZ que expressam LAG-3 humano, em comparação ao anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cLA212, e assim mantiveram a atividade de ligação mesmo após a humanização. 7)-3 Atividade de ADCC do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano (hLA212)

[00456] A atividade de ADCC dos anticorpos humanizados anti-LAG-3 humano (hLA212) foi investigada pelo método descrito no Exemplo 2)-2. Como mostrado na Figura 9, os resultados revelaram que todos os 10 clones dos anticorpos humanizados anti-LAG-3 derivado de humano hLA212 H2/L1, hLA212 H2/L2, hLA212 H2/L3, hLA212 H2/L4, hLA212 H2/L5, hLA2Z12 H3/L1, hLA212 H3/L2, hLA212 H3/L3, hLA212 H3/L4, and hLA212 H3/L5) exibiram atividade de ADCC dependente da concentração contra as células 293T-lacZ que expressam LAG- 3 humano, quase comparável ao anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico cLA212 e, portanto, mantiveram a atividade de ADCC mesmo após a humanização. 7)-4 Investigação da influência do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H3/L2 na função de supressão de células T do LAG-3

[00457] Sabe-se que o LAG-3 se liga a moléculas de classe II de MHC, transmitindo assim alguns sinais inibitórios às células T para regular a função das células T negativamente (Literatura Não Pertencente à Patente 1). Para a ligação de LAG-3 a moléculas de classe II de MHC, os domínios 1 e 2 do terminal N dos quatro domínios extracelulares do tipo imunoglobulina do LAG-3 são considerados importantes (Literatura Não Pertencente à Patente 4). Foi revelado no Exemplo 2 que todos os 5 clones dos anticorpos de rato de anti-LAG-3 humano (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 e rLA1264) obtidos pelo método do Exemplo 1 reconheceram o domínio 3 e não exibiram atividade inibidora no teste de ligação de classe II de LAG-3/MHC e no teste de adesão de células Raji/293T-hLAG-3, enquanto o anticorpo humano anti-LAG-3 quimérico IMP731 que é um anticorpo convencional no domínio reconhecido da Lista de Citação 1 e exibiu uma poderosa atividade inibidora no teste de ligação de classe II de LAG- 3/MHC e no teste de adesão de células Raji/293T-hLAG-3. A partir desses resultados, assumiu-se que os clones obtidos pelo método do Exemplo 1 e os anticorpos humanizados anti- LAG-3 derivados dos mesmos não influenciam a função de supressão de células T inerente a LAG-3, enquanto IMP731 a inibe. De modo a confirmar isso experimentalmente, a influência do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLAZ212 H3/L2 na função de supressão de células T do LAG-3 foi investigada de acordo com um relatório anterior (Literatura Não Pertencente à Patente 9). As PBMCs separadas do sangue periférico humano por centrifugação de Ficoll foram disseminadas em uma microplaca de 96 poços em uma quantidade de 2 x 10º células/poço, e o anticorpo foi adicionado a ela, seguido de pré-incubação a 37ºC por 30 minutos. A concentração de IL-2 no sobrenadante da cultura quando a SEB (Enterotoxina estafilocócica B, fabricada pela Sigma- Aldrich) foi adicionada a uma concentração final de 1 ng/mL, e as células foram cultivadas por 4 dias foram quantificadas por um Kit de imunoensaio de IL-2 humana (fabricado pela PerkinElmer Inc). Como resultado, o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H3/L2 quase não teve influência na produção de IL-2, enquanto o IMP731 aumentou a produção de IL-2, como mostrado na Figura 10. Isto é, como inicialmente previsto, foi revelado que o anticorpo humanizado anti-LAG- 3 humano hLA212 H3/L2 não teve influência na função de supressão de células T do LAG-3, enquanto IMP731 inibiu isso, arriscando assim a ativação adversa do sistema imunológico. Exemplo 8. Preparação de anticorpo humanizado no qual sua modificação da cadeia de açúcar é ajustada

[00458] Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo as posições de aminoácidos 20 a 470 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve compreendendo as posições de aminoácido 21 a 234 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID No: 34 (Figura 49) foi desfucosilado de acordo com um método conhecido, para ajustar a ligação da modificação da cadeia de açúcar à proteína do anticorpo, e o anticorpo obtido foi designado como hLA212 H4/L2. Essa forma modificada foi submetida à espectrometria de massa. Como resultado, o(s) pico(s) derivado(s) de uma cadeia H contendo fucose foi(ram) igual(ais) ou inferior(es) ao limite de detecção. Na presente invenção, um anticorpo cuja modificação da cadeia de açúcar é ajustada, como hLA212 H4/12, também é referido como “anticorpo” ou “forma modificada do anticorpo”. Exemplo 9. Avaliação in vitro do anticorpo humanizado anti- LAG-3 humano hLA212 H4/L2 9) -1 Atividade de ligação do anticorpo humanizado anti-LAG- 3 humano hLA212 H4/L2 a células que expressam LAG-3

[00459] A ligação do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hAG212 H4/L2 a células 293T-lacZ que expressam LAG-3 humano foi investigada por citometria de fluxo de acordo com o método descrito no Exemplo 7)-2. Como resultado, foi observada a ligação dependente da concentração de hLA212 H4/L2, como mostrado na Figura 11. 9) -2 Atividade de ADCC in vitro do anticorpo humanizado anti- LAG-3 humano hLA212 H4/L2

[00460] A atividade de ADCC in vitro do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2 foi avaliada pelo método descrito no Exemplo 7)-2. Como resultado, o hLA212 H4/L2 exibiu uma atividade de ADCC dependente da concentração contra as células 293T-lacZ que expressam LAG- 3 humano, como mostrado na Figura 12. Em contraste, não exibiu atividade de ADCC nas células 293T-lacZ que não expressam LAG-3. Exemplo 10. Desenvolvimento de camundongos transgênicos duplos de FC/YRIIIA humano/LAG-3 humano

[00461] Foi revelado que o anticorpo humanizado anti- LAG-3 humano hLA212 H4/L2 se liga a LAG-3 humano, como mostrado no Exemplo 9, mas não reage de maneira cruzada com o LAG-3 dos roedores. Portanto, para permitir a avaliação in vivo de hNLA212 H4/L2, camundongos transgênicos de BAC (cromossomo artificial bacteriano) permitiram expressar LAG- 3 humano fisiologicamente usando o mecanismo de regulação de expressão do LAG-3 de camundongo. Além disso, FcyIIIA humano é necessário para que a atividade do ADCC seja intensificada ajustando a modificação da cadeia de açúcar como em hLA212 H4/L2 (Junttila, TT, et al., Cancer Res., Vol. 70 (Nº 11): págs. 4481-9 (2010)) e, portanto, o BAC que compreende o gene FCyRIIIA humano foi adicionalmente introduzido de acordo com um relatório anterior (Literatura Não Pertencente à Patente 10). 10)-1 Construção do vetor de expressão de BAC recombinante usando a reação de Red/ET

[00462] Um clone de BAC recombinante do LAG-3 humano RecBAC foi construído usando a Tecnologia de Recombinação de Red/ET (Zhang Y et al., A new logic for DNA engineering using recombination in E. Coli., Nature 20 (1998) 123-128), que é uma reação de recombinação homóloga ativa em Escherichia coli.

[00463] Foram obtidos clones do genoma BAC, RP11-101F21 e RP23-3001, cada um compreendendo um local de gene LAG-3 humano ou LAG-3 de camundongo. Como mostrado na lista abaixo, a sequência do íntron 5 do gene LAG-3 humano, as sequências em ambas as extremidades da sequência de DNA genômico do códon de partida da tradução ao códon de parada do gene LAG- 3 humano, e a extremidade 3' e a extremidade 5'/ da sequência de DNA genômico do códon de partida da tradução para o códon de parada do gene LAG-3 do clone BAC de camundongo foram usadas como sequências-chave para a reação de recombinação homóloga ativa em Escherichia coli. LAG-3-H1: Sequência próxima ao códon de partida do gene LAG- 3 humano [5' JATGTGGGAGGCTCAGTTCCTGGGCTTGCTGTTTC[3'] (SEQ ID No: 79) LAG-3-H2: Sequência próxima ao códon de parada do gene LAG- 3 humano [5' | GCCCGAGCCCGAGCCCGAGCCGGAGCAGCTCTGA[3'] (SEQ ID No: 80) LAG-3-H3: sítio de inserção Rpsl-kan, o lado 5º [5' JGeAGTATGTGTTGACTGGTTGATAACTATCG[3'] (SEQ ID No: 81) LAG-3-H4: sítio de inserção Rpsl-kan, o lado 3' [5' JGCCATGACAGATTAGCCATGTCTGCAGCAC [3'] (SEQ ID No: 82) LAG-3-H5: UTR 5' do gene LAG-3 de camundongo [5' | CAGGACCTTTTTCTAACCTCCCTTGGAGGGCTGGEGAGEGCCCGGECCATAGAGGA G[3'] (SEQ ID No: 83) LAG-3-H6: UTR 3" do gene LAG-3 de camundongo [5' | CCTGGAGCCGAGGCAGCCAGCAGGTCTCAGCAGCTCCGCCCGCCEGCCEGCEeGc C[3'] (SEQ ID No: 84)

[00464] Primeiro, de modo a inserir uma cassete de marcador de seleção positiva/negativa (Rpsl-kan) para oO íntron 5 do gene LAG-3 do clone de BAC humano, fragmento (s) de DNA conectando a sequência LAG-3-H3, Rpsl-kan, e a sequência LAG-3-H4 em tandem foi construída por PCR usando LA-Taq (Takara Bio Inc.) (fragmento de quebra de LAG-3 Rpsl- Kan). O clone de BAC humano contendo o local do gene LAG-3 e o fragmento de quebra LAG-3 Rpsl-Kan foram introduzidos em cepas de Escherichia coli tendo capacidade de reação Red/ET de induzir a reação Red/ET no hospedeiro Escherichia coli, e colônias com a resistência a cloranfenicol e a resistência à canamicina foram selecionadas, triando assim um clone de BAC recombinante no qual o fragmento de quebra LAG-3 Rpsl- kan foi inserido no íntron 5 do local do gene LAG-3 (intermediário de LAG-3 humano). Em seguida, para subclonar a sequência de DNA genômico do gene LAG-3 humano com oO cassete Rpsl-kan inserido no mesmo para um vetor de plasmídeo do intermediário de LAG-3 humano, um cassete de DNA conectando H2-H6-SacBpBluescript-H5-Hl em tandem foi construído (plasmídeo de pré-transferência DE LAG-3). Da mesma maneira que acima, um plasmídeo linearizado de pré- transferência de LAG-3 foi introduzido em cepas de Escherichia coli tendo capacidade de reação de Red/ET juntamente com o intermediário de LAG-3 humano para induzir a reação de Red/ET no hospedeiro Escherichia coli, e colônias resistentes à ampicilina e canamicina foram selecionadas triando assim um plasmídeo tendo a sequência de DNA genômico do gene LAG-3 humano com o cassete Rpsl-kan inserido no mesmo (plasmídeo de transferência de LAG-3 humano).

[00465] Em seguida, a sequência de DNA genômico do gene LAG-3 humano tendo a sequência H5 e a sequência H6 derivadas de uma sequência do genoma de camundongo em ambas as extremidades com o cassete Rpsl-kan inserido na mesma foi excisada do vetor plasmídeo de transferência de LAG-3 humano por uma reação de enzima de restrição (fragmento de transferência de LAG-3 humano). Da mesma maneira que acima, o(s) fragmento (s) de transferência de LAG-3 humano foi (foram) introduzido(s) em cepas de Escherichia coli tendo capacidade de reação de Red/ET, juntamente com o clone de BAC de LAG-3 de camundongo, para induzir a redução de Red/ET no Escherichia coli hospedeiro, e colônias resistentes a cloranfenicol e canamicina foram selecionadas, triando assim um clone de BAC recombinante do gene LAG-3 humano/LAG-3 de camundongo no qual a sequência de DNA genômico do códon de partida de tradução para o códon de parada do gene LAG-3 do camundongo foi substituído com precisão pela sequência de DNA genômico do códon de partida da tradução para o códon de parada dos fragmentos de transferência de LAG-3 humano (intermediário RecBAC de LAG-3 de camundongo/LB-3 humano).

[00466] Finalmente, a sequência do íntron 5 do local do gene LAG-3 humano foi amplificada por PCR e usada como uma sequência de DNA para remover Rpsl-Kan inserido no íntron 5 do gene LAG-3 humano por seleção negativa (fragmentos de reparo do LAG-3 humano). Da mesma maneira que acima, o(s) fragmento (s) de reparo de LAG-3 humano foi (foram) introduzido(s) em cepas de Escherichia coli tendo capacidade de reação de Red/ET juntamente com o intermediário RecBAC de LAG-3 de camundongo/LAG-3 humano para induzir a reação de Red/ET no Escherichia coli hospedeiro, e colônias resistentes a cloranfenicol e estreptomicina foram selecionadas, construindo assim um clone de BAC recombinante do gene LAG-3 de camundongo/LAG-3 humano no qual a sequência de DNA genômico do códon de partida de tradução para o códon de parada do gene LAG-3 de camundongo foi substituído com precisão pela sequência de DNA genômico do gene LAG-3 humano do códon de partida da tradução para o códon de parada (RecBAC de LAG-3 humano). As sequências de DNA genômico com Hl a H6 conectadas pela reação de Red/ET foram verificadas por análise de sequência. 10) -2 Purificação de fragmentos de DNA de BAC de alta pureza

[00467] As células DH10B transformadas pelo clone de BAC recombinante que é uma construção para expressar o gene RecBAC de LAG-3 humano foram cultivadas em um meio de ágar LB contendo cloranfenicol, e uma única colônia foi selecionada e cultivada por agitação em meio líquido a noite toda e o dia todo.

[00468] O clone de BAC recombinante de RecBAC de LAG-3 humano foi purificado usando um kit de extração de plasmídeo (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, kit Nucleobond BAC100) de acordo com o método de Abe, et al., com modificação parcial (Exp Anim. 2004 53 (4): 311-20. Estabelecimento de um protocolo eficiente de transgênese de BAC e sua aplicação na caracterização funcional do local de camundongo Brachyury. Abe K, Hazama M, Katoh H, Yamamura K, Suzuki M), seguido pela adição de PI-SceIl, permitindo assim a reação a 37 “C por 16 horas para digestão.

[00469] O clone de BAC recombinante linearizado de RecBAC de LAG-3 humano foi aplicado a um gel de agarose SeaKem GTG a 1% (Takara Bio Inc.), e a eletroforese foi realizada sob condições de 6 v/cm, 0,1 a 40 s, 15 h e 14ºC usando um aparelho de eletroforese em campo pulsado (CHEF DR-II, Bio-Rad Laboratories, Inc). Ao visualizar uma parte da amostra como um marcador de guia usando um transiluminador UV, o clone de BAC recombinante RecBAC de LAG-3 humano linearizado separado no gel de agarose foi excisado com uma lâmina sem irradiação UV. O fragmento de DNA de cadeia longa obtido foi extraído do gel de agarose pelo método de eletroeluição e dialisado com um tampão TE preparado para microinjeção a 4ºC por 2 horas. O fragmento de DNA purificado foi aplicado à eletroforese em campo pulsado para confirmar que o fragmento de DNA de cadeia longa foi altamente purificado sem fragmentação, e a concentração de DNA foi determinada usando um espectrofotômetro NanoDrop (AGC TECHNO GLASS CO., LTD). Uma solução do fragmento de DNA foi diluída para 0,5 ng/ul para preparar uma solução de uma construção de expressão para a criação de camundongos transgênicos. 10-3) Microinjeção embrionária de camundongo C57BL/6J

[00470] O PMSG e o hCG foram administrados a camundongos fêmeas C57BL/6J para induzir a superovulação, seguidos pelo acasalamento com camundongos machos da mesma cepa e, então, os ovos fertilizados foram coletados.

[00471] Usando um micromanipulador, as construções de expressão de BAC FcyR humano/RecBAC de LAG-3 purificadas foram injetadas diretamente nos núcleos masculinos dos embriões do estágio pronuclear de camundongos C57BL/6J. Os embriões injetados com DNA foram transplantados para as trompas de falópio de camundongos fêmea receptores induzidos por pseudogravidez.

10-4) Triagem por Southern dos fundadores

[00472] As progênies obtidas por dispensação espontânea dos ovos fertilizados com camundongo C57BL/6J com as construções de expressão de BAC FcyR humano/RecBAC de LAG-3 humano injetadas no mesmo foram amamentadas até o desmame. Os indivíduos candidatos a fundadores de camundongos transgênicos de BAC FcyR humano RecBAC de LAG-3 humano, foram desmamados com 3 semanas de idade e etiquetados na orelha para identificação dos indivíduos. Posteriormente, os tecidos da cauda foram biopsiados e armazenados a -80ºC até a análise.

[00473] Os tecidos da cauda dos indivíduos candidatos dos camundongos transgênicos humanos de BAC FeyR humano/RecBAC de LAG-3 humano que foram armazenados a -80ºC foram fundidos em temperatura ambiente, e um tampão de lise contendo 1% de SDS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 mg/ml de actinase E (KAKEN PHARMACEUTICAL CO., LTD.) e 0,15 mg/ml de proteinase K (Merck KGaA) foram adicionados aos mesmos, seguido de agitação a 55º*C por 16 horas para solubilizar os tecidos. As proteínas que se ligam ao DNA genômico e solubilizadas dos tecidos foram removidas por extração com fenol e extração com fenol/clorofórmio. O RNA misturado com o DNA genômico foi degradado com RNase A (Sigma-Aldrich) e, posteriormente, um DNA genômico de polímero foi precipitado por precipitação com isopropanol. O DNA genômico precipitado foi lavado com etanol a 70%, seco ao ar, e posteriormente redissolvido em 50 pl de TE.

[00474] A concentração de DNA da solução de DNA genômico preparada a partir de cada amostra foi determinada por espectroscopia por absorção, e o volume da solução de DNA genômico equivalente a 5 ug de DNA foi calculado a partir do valor da concentração de DNA de cada amostra.

[00475] AÃo DNA genômico preparado a partir de cada amostra, o DNA de controle positivo (o DNA genômico do camundongo de controle ao qual foi adicionada a construção de expressão usada para microinjeção), e o DNA de controle negativo (o DNA genômico do camundongo de controle), foi adicionada uma enzima de restrição, seguida de reação a 37ºC por 16 horas. Os fragmentos do DNA genômico produzido foram precipitados por precipitação com isopropanol, lavados com etanol a 70%, secos ao ar e redissolvidos posteriormente em TE. Os fragmentos de DNA genômico foram aplicados a um gel de agarose a 1,2% para eletroforese, e os fragmentos de DNA genômico separados no gel de agarose foram visualizados usando um transiluminador UV e fotografados em escala.

[00476] O gel de agarose foi imerso em ácido clorídrico 0,25 N e agitado suavemente por 10 minutos. Depois disso, foi adicionalmente imerso em hidróxido de sódio 0,4 N e agitado suavemente por 10 minutos. Os fragmentos de DNA genômico separados no gel de agarose foram transferidos para uma membrana de náilon (Hybond-XL; GE Healthcare) em temperatura ambiente por 16 horas pelo método capilar usando hidróxido de sódio 0,4 N. A membrana de náilon com os fragmentos de DNA genômico transferidos na mesma foi imersa em 2 x SSC, agitados suavemente por 10 minutos, depois seca ao ar, e armazenados em temperatura ambiente até o uso para hibridização.

[00477] Usando um kit de rotulação de DNA (Megaprime DNA Labeling System; GE Healthcare), os fragmentos de DNA foram rotulados com [32P] pelo método inicial aleatório. Usando colunas de rotação Sephadex (ProbeQuant G-50 Micro Columns; GE Healthcare), os fragmentos rotulados com [32P] foram purificados para resultar em sondas rotuladas com [32P].

[00478] A membrana de náilon com os fragmentos de DNA genômico transferidos na mesma foi colocada em um tampão de hibridização, seguida de pré-incubação a 65ºC por 1 hora.

Depois disso, a sonda rotulada com [32P] desnaturada por aquecimento a 95ºC por 5 minutos e resfriamento imediato com gelo por 5 minutos foi adicionada à mesma, seguida de incubação a 65ºC por 4 horas. A membrana de náilon foi retirada após a conclusão da incubação e lavada com SDS a 0,1% e 0,5 x SSC a 65ºC por cerca de 15 minutos. A radioatividade derivada da sonda ligada à membrana foi monitorada com um medidor de levantamento, e a lavagem foi repetida até a radioatividade se tornar aproximadamente constante.

[00479] A membrana lavada foi coberta com Saran Wrap (R), laminada com uma película de raios-X (BioMax MS; Eastman Kodak Company) em uma câmara escura, e colocada em um cassete de autorradiografia. Após exposição a 4ºC por 1 semana, à película de raios-X foi desenvolvida. Sinais específicos derivados das construções de expressão de BAC FeyR humano/RecBAC LAG-3 humano foram detectados por autorradiografia, e indivíduos dando os sinais específicos para hibridização com as sondas rotuladas com [32P] foram identificados como os indivíduos fundadores dos camundongos transgênicos de BAC FoyR humano/RecBAC de LAG-3.

10-5) Criação e proliferação de camundongos F1

[00480] Os animais descendentes dos indivíduos fundadores foram obtidos e genotipados para obter linhas de camundongos Tg estabelecidas. Os fundadores de camundongos Tg identificados pela análise por Southern e os camundongos CS57BL/6J do tipo selvagem foram fertilizados in vitro ou acasalados naturalmente para criar indivíduos Fl. As linhas estabelecidas, onde a transferência dos transgenes para os indivíduos Fl foi confirmada por genotipagem, foram proliferadas por fertilização in vitro ou acasalamento natural com camundongos C57BL/6J7 do tipo selvagem, e camundongos com LAG-3 humano e FCyYRIIIA humano introduzidos de forma heterozigótica, que foi revelada por genotipagem, foram usados para os experimentos. 10-6) Confirmação de fenótipos de camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FC/RIIIA humano

[00481] A expressão dos genes introduzidos nos camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FCyRIIIA humano obtidos foi investigada por citometria de fluxo. O sangue periférico foi coletado da veia da cauda de cada camundongo em um capilar hematócrito heparinizado, e os glóbulos vermelhos foram hemolisados por PharmLyse (fabricado por Becton, Dickinson and Company) para obter glóbulos brancos. Os glóbulos brancos foram parcialmente usados para análise da expressão de FCyWYRIIIA humana por citometria de fluxo, e o restante foi estimulado por 3 dias com um meio contendo 2 ug/mL de Concanavalina A (Con A: Sigma-Aldrich) para induzir a expressão de LAG-3 para obter células T ativadas. Nas últimas células, foi adicionado um anticorpo para LAG-3 anti-camundongo rotulado com PE (fabricado por Becton, Dickinson and Company), um anticorpo para LAG-3 anti-humano rotulado com ATTO647 (fabricado por Enzo Life Sciences, Inc.), um anticorpo CD3 anti-camundongo rotulado com FITC (fabricado por Becton, Dickinson and Company) e um Kit de Coloração de Célula Morta Fixável LIVE/DEAD-corante reativo fluorescente próximo de IV (fabricado pela Invitrogen Corp.) para suspensão, a seguir repousar a 4ºC por 30 minutos. Para uso na identificação das posições das populações negativas, um controle livre do anticorpo de LG-3 anti-camundongo rotulado com PE e do anticorpo de LG-3 anti-camundongo rotulado com ATTO647. Após lavagem com um tampão FACS, as células foram recolocadas em suspensão em PBS contendo paraformaldeído a 1%, seguido de detecção usando um citômetro de fluxo (CantoII: fabricado por Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando FlowJwJo (fabricado pela Tree Star Inc). Após remoção das células mortas positivas para oO corante reativo fluorescente próximo ao IV do Kit de coloração de células mortas LIVE-DEAD por refino e identificação, as células vivas foram analisadas.

Como resultado, apenas a expressão de LAG- 3 de camundongo foi encontrada, e a expressão de LAG-3 humano não foi encontrada em células T ativadas por Con A derivadas dos camundongos de controle do tipo selvagem, enquanto a expressão de ambos o LAG-3 de camundongo e o LAG-3 humano foi encontrada em células T ativadas por Con A derivadas dos camundongos transgênicos duplos LAG-3 humano/FCyRIIIA humano, e os pontos no gráfico de pontos que representam as células individuais foram distribuídos quase na diagonal, como mostra a Figura 13. Quase nenhuma expressão de LAG-3 de camundongo ou LAG-3 humano foi encontrada em células T em repouso que não foram ativadas.

Esses resultados revelaram que, nos camundongos transgênicos duplos LAG-3 humano/FCyRIIIA humano desenvolvidos, o LAG-3 humano foi expressado de acordo com o padrão de expressão endógena do LAG-3 de camundongo, como planejado inicialmente, usando a abordagem transgênica de BAC.

Além disso, para o FCyYRIIIA humano, foram confirmados resultados comparáveis a um relatório anterior (Literatura Não Pertencente à Patente 10), em que a expressão foi observada em cerca de 47% das células NK do sangue periférico (CD3-DX5+) do camundongos transgênicos duplos LAG-3 humano/FCyRIIIA humano. Exemplo 11. Avaliação in vivo do anticorpo humanizado anti- LAG-3 humano hLA212 H4/L2 11-1) Atividade de esgotamento de célula LAG-3 positiva do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2

[00482] Usando camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FCeyRIIIA humano do Exemplo 10, investigou-se se o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano obtido hLA212 H4/L2 tem a atividade de esgotar células LAG-3 positivas in vivo. Imediatamente após o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano LAG-3 hLA212 H4/L2 (30 mg/kg) ou um solvente foi administrado por via intraperitoneal a camundongos transgênicos duplos de LAG-3 humano/FCyRIIIA humano, Con A (fabricado por Sigma- Aldrich) tendo ação de ativação de células T policlonais foi administrado por via intravenosa a uma dose de 15 mg/kg. Os glóbulos vermelhos foram hemolisados a partir do sangue coletado 2 dias depois com PharmLyse (fabricado por Becton, Dickinson e Company) para obter glóbulos brancos, e os glóbulos brancos foram usados para citometria de fluxo. Os glóbulos brancos foram autorizados a reagir com FcBlock (fabricado por Becton, Dickinson e Company) e, posteriormente, um anticorpo para LAG-3 anti-camundongo rotulado com PE (fabricado por Becton, Dickinson e Company), um anticorpo para LAG-3 anti-humano rotulado com ATTO647 (fabricado pela Enzo Life Sciences, Inc.), um anticorpo CD3 anti-camundongo rotulado com FITC (fabricado pela Becton, Dickinson and Company), e um corante reativo fluorescente próximo ao IV do Kit de Coloração de Células Mortas Fixável LIVE/DEAD (fabricado pela por Invitrogen Corp.) foram adicionados ao mesmo para suspensão, seguido de repousar a 4ºC por 30 minutos.

Para uso na identificação das posições das populações negativas, um controle livre do anticorpo para LAG-3 anti-camundongo rotulado com PE e do anticorpo anti-LAG-3 humano rotulado com ATTOG647. Após lavagem com um tampão FACS, as células foram recolocadas em suspensão em PBS contendo paraformaldeído a 1%, seguido de detecção usando um citômetro de fluxo (CantoII: fabricado por Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowio (fabricado pela Tree Star Inc). Após remoção das células mortas positivas para o corante reativo fluorescente próximo ao IV do Kit de coloração de Células Mortas Fixável LIVE-DEAD por refino e identificação, as células vivas foram analisadas.

Como resultado do cálculo da positividade para LAG-3 humano em células T CD3 positivas, como mostrado na Figura 14, verificou-se que quase não havia células LAG-3 positivas humano nas células T do sangue periférico de camundongos transgênicos duplos não tratados de LAG-3 humano/FCyRIIIA humano, enquanto uma média de 24% das células T do sangue periférico no grupo sem administração de anticorpos se tornou positiva para LAG-3 humano como um resultado da administração do Con A tendo ação de ativação de células T policlonais.

Em contraste, a positividade para LAG-3 humano nas células T do sangue periférico dos camundongos “administrados com Con A, aos quais foi administrado hLA212 H4/L2, diminuiu de maneira notável.

Uma tendência semelhante foi observada nas células T esplênicas e nas células T do sangue periférico obtidas um dia após a administração do Con A, e também foram obtidos resultados semelhantes para a positividade para LAG-3 e CD69 de camundongo, que é outro marcador de ativação. Esses resultados revelaram que o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humanizado obtido hLA212 H4/L2 tinha a atividade de esgotar células LAG-3 positivas in vivo.

11-2) Atividade do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2 no modelo de doença autoimune dependente de célula T

[00483] De modo a revelar se o anticorpo humanizado anti- LAG-3 humano hLA212 H4/L12 tendo a atividade de esgotamento de células LAG-3 positivas in vivo é útil no tratamento de doenças autoimunes, sua eficácia contra um modelo de EAE (encefalomielite autoimune experimental) (Literatura Não Pertencente à Patente 11) que é um modelo típico de doença autoimune dependente de células T (esclerose múltipla) foi investigada.

[00484] Uma solução obtida pela dissolução de um peptídeo (aminoácido 35-55, PEPTIDE INSTITUTE, INC.), derivado de MOG (Glicoproteína Oligodendrócita da Mielina que é uma das proteínas componentes da mielina nervosa central, em solução salina normal a uma concentração de 4 mg/mL foi misturado com uma mistura de 8 mg/ml de Micobactéria Morta de Tuberculose H37Ra (fabricado pela Becton, Dickinson e Company) e o Adjuvante Incompleto de Freund (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em quantidades iguais para resultar em uma emulsão. Essa emulsão foi injetada por via subcutânea no Dia O em ambos os flancos dos camundongos transgênicos duplos humanos de LAG- 3 humano/FCeyRIIIA humano em uma quantidade de 50 upL cada, e 0,2 pg de toxina pertussis diluída com solução salina normal foram administrados por via intravenosa aos mesmos, para induzir EAE. Posteriormente, os escores clínicos de EAE foram observados diariamente como a seguir. Ou seja, Escore O: Assintomático; Escore 1: Miopatia caudal; Escore 2: Marcha anormal e perda do reflexo de endireitamento; Escore 3: Paralisia das pernas traseiras; Escore 4: Paralisia parcial dos membros anteriores; e Pontuação 5: Morte ou eutanásia. O anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2 e um anticorpo de controle foram administrados por via intravenosa, cada um na dose de 30 mg/kg nos Dias 0 e 7. Como resultado, a média dos escores clínicos de EAE no grupo administrado com anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLAZ12 H4/L2 foi suprimido para 50% ou menos durante o período de observação, em comparação com o grupo administrado com anticorpo de controle, como mostrado na Figura 15. Além disso, no grupo administrado com hLA212 H4/L2, a perda de peso com a progressão da EAE também foi suprimida. Esses resultados revelaram que o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2 tendo uma atividade para esgotar células LAG-3 positivas in vivo suprime EAE, que é um modelo típico de doença autoimune dependente de célula T, e pode ser um medicamento terapêutico para doenças autoimunes humanas. Exemplo 12. Relação entre LAG-3 e expressão de perforina, CD28 ou CD57 em células T humanas ativadas

[00485] As PBMCs foram separadas do sangue periférico humano por centrifugação em Ficoll e adicionadas a uma microplaca de 96 poços com fundo em U, em uma quantidade de 4 x 10º células/poço. Adicionou-se IL-2 humana (PeproTech, Inc., concentração final: 100 ng/mL) e o ativador T humano CD3/CD28 Dynabeads (Life Technologies Corp., 4 xXx 105 células/poço), e as células T foram ativadas por cultura por

4 dias.

As células obtidas foram recuperadas, recolocadas em suspensão em um tampão FACS (PBS, BSA a 0,1% e azida de sódio a 0,1%), e depois reagiram com o bloco BD Fc humano (Becton, Dickinson and Company) em temperatura ambiente por 10 minutos.

Subsequentemente, a superfície celular foi colorada por reação a 4ºC por 30 minutos com anticorpos rotulados com fluorescência diluídos com um tampão FACS contendo um corante reativo fluorescente próximo a IV do Kit de coloração de células mortas fixável LIVE/DEAD (fabricado pela Invitrogen Corp.), seguido de lavagem com um tampão FACS.

Os anticorpos rotulados com fluorescência usados foram várias combinações de um anticorpo CD8 anti-humano rotulado com FITC, um anticorpo CD3 anti-humano rotulado com PerCP-Cy5.5, um anticorpo CD28 anti-humano rotulado com APC, e um anticorpo anti-CD57 humano rotulado com Pacific Blue (todos da Becton, Dickinson and Company), um anticorpo anti-CD28 humano rotulado com PE (BioLegend, Inc.), e um anticorpo anti-LAG- 3 humano e um anticorpo de controle de isotipo rotulado usando um kit de rotulação de PE (Laboratórios Dojindo)

Para algumas amostras, a perforina intracelular também foi corada usando um kit de Solução de Fixação/Permeabilização Cytofix/Cytoperm BD (Becton, Dickinson and Company) e um anticorpo anti-perforina humana rotulado com APC (eBiosciences, Inc.). As células assim lavadas foram recolocadas em suspensão em PBS contendo 1% de paraformaldeído, seguido de detecção usando um citômetro de fluxo (CantoII fabricado por Becton, Dickinson and Company ou MACSQuantX fabricado por Miltenyi Biotech). Os dados foram analisados usando FlowJjo (fabricado pela Tree Star Inc)

Após remoção das células mortas positivas para o corante reativo flourescente próximo a IV Fixável próximo a IV do Kit de Coloração de Células Mortas Fixável LIVE/DEAD por refino e identificação, apenas as células vivas foram analisadas por refino e identificação de células T CD8 positivas e CD3 positivas.

[00486] Os resultados da análise da relação entre a expressão de perforina intracelular e LAG-3 e são mostrados na Figura 102. No diagrama mais à direita, as populações de células foram distribuídas quase na diagonal, revelando que nas células T CD8 humanas ativadas, LAG-3 e perfurina intracelular são expressadas quase em paralelo. Nesse experimento, o controle de isotipo rotulado com PE (diagrama do meio) do anticorpo para LAG-3 exibe uma distribuição de intensidade de fluorescência na direção do eixo horizontal, que é raramente diferente da de uma amostra não rotulada (diagrama da esquerda), confirmando a especificidade da coloração de LAG-3 humano.

[00487] A Figura 103 mostra os resultados da análise da relação entre a expressão de LAG-3 e CD28. No diagrama mais à direita, menos de 50% das células positivas para CD28 eram LAG-3 positivas, enquanto a população de células CD28 negativas mudou para o lado positivo para LAG-3 como um todo, em comparação com as células positivas para CD28, e 2/3 das células CD28 negativas foram LAG-3 positivas, revelando que nas células T CD8 humanas ativadas, a expressão de LAG-3 é mais prevalecente em células CD28 negativas do que em células positivas para CD28.

[00488] A Figura 104 mostra os resultados da análise da relação entre a expressão de LAG-3 e CD57. No diagrama mais à direita, 42% das células negativas para CD57 eram LAG-3 positivas, enquanto a população de células CD57 positivas mudou em grande parte para o lado positivo para LAG-3 como um todo, em comparação com as células negativas para CD57, e 79% das células CD57 positivas foram LAG-3 positivas, revelando que nas células T CD8 humanas ativadas, a expressão de LAG-3 é mais prevalecente nas células CD57 positivas do que nas células negativas para CD57. Exemplo 13. Efeito do anticorpo para LAG-3 nas células T CD8 positivas para perforina

[00489] O efeito do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2, do inibidor da calcineurina tacrolimo, e do corticosteroide dexametasona, foi investigado no sistema experimental do Exemplo 12. PBMCs humanas foram pré- incubadas com hLA212 H4/L2 (concentração final: 10 ug/mL) um anticorpo IgG humano de controle (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., concentração final: 10 ug/mL), tacrolimo (Focus Corp., concentração final: 10 nM), ou dexametasona (Enzo Life Sciences, Inc., concentração final: 1 uM) a 37ºC por 30 minutos, e depois cultivada com Ativador T Humano Dynabeads CD3/CD28 por 4 dias, como descrito no Exemplo 12, e as células obtidas foram submetidas à citometria de fluxo. As concentrações desses anticorpos e dos compostos foram ajustadas para concentrações consideradas como exibindo a máxima eficácia com base em relatórios anteriores (Henderson, DJ et al., Immunol., 1991; Vol. 73 (No. 3): págs. 316-321; e Brunetti, M. et al., Pharmacol. Exp. Ther., 1998; Vol. 285 (No. 2): págs. 915-919), etc.

[00490] Os resultados são mostrados na Figura 105. Como mostrado na Figura 105A, a adição de hLA212 H4/L2 Ou tacrolimo reduziu levemente o número total de células T após a cultura, em comparação com o controle, e os resultados obtidos pela adição de dexametasona raramente eram diferentes daqueles do controle. Esse ensaio foi realizado usando PBMCs derivadas de dois doadores, e tendências semelhantes foram observadas (PBMC1 e PBMC2).

[00491] Por outro lado, como mostrado na Figura 105B, o número de células T CD8 positivas para perforina foi evidentemente reduzido por hLA212 H4/L2 em comparação com o controle. Por outro lado, os resultados obtidos pela adição de tacrolimo raramente eram diferentes dos do controle e, no caso da adição de dexametasona, o número de células T CD8 positivas para perforina aumentou no PBMCl, em comparação com o controle, e foi no mesmo nível que no controle para PBMC2. Esses resultados revelaram que o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2 esgota seletivamente as células T CD8 positivas para perforina em comparação com sua influência nas células T como um todo, e o inibidor da calcineurina tacrolimo e o corticosteroide dexametasona não têm esse efeito. Embora os dados não sejam mostrados, o anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H4/L2 também reduziu o número de células T CD8 positivas para granzimas. Exemplo 14. Efeito do anticorpo para LAG-3 nas células T CD28 negativas e células T CD57 positivas

[00492] O efeito do anticorpo humanizado anti-LAG-3 humanizado —hLA212 H4/L2, do inibidor de calcineurina tacrolimo e do corticosteroide dexametasona em células T CD28 negativas e células T CD57 positivas foi investigado no sistema de ensaio do Exemplo 13. As PBMCs humanas foram pré- incubadas com hLA212 H4/L2 (concentração final: 10, 1 e 0,1 uvg/mL), um anticorpo IgG humano de controle (Jackson

ImmunoResearch Laboratories, Inc., concentração final: 10 uvg/mL), tacrolimo (Focus Corp., concentração final: 10 nM) ou dexametasona (Enzo Life Sciences, Inc., concentração final: 1 uM) a 37ºC por 30 minutos e depois cultivadas com o ativador T Humano Dynabeads CD3/CD28 por 4 dias, como descrito no Exemplo 12, e as células obtidas foram submetidas a citometria de fluxo. Fora das células vivas, uma fração CD3 positiva e CD8 negativa e uma fração CD3 positiva e CD8 positiva foram analisadas como células T CD4 e células T CD8, respectivamente.

[00493] Os resultados da análise do efeito nas células T CD28 negativas são mostrados na Figura 106. Como mostrado na Figura 106B, hLA212 H4/L2 evidentemente reduziu o número de células T CD8 CD28 negativas, como nas células T CD8 perforina positivas do Exemplo 13. Esse efeito foi dependente da concentração de hLA212 H4/L2. Resultados semelhantes foram obtidos usando PBMCs derivadas de qualquer um dos dois doadores. Por outro lado, no caso de adição de tacrolimo ou dexametasona, não foi observada redução evidente no número de células T CD8 negativas CD28, como encontrado para o anticorpo para LAG-3. Como mostrado na Figura 106A, o anticorpo para LAG-3 hLA212 H4/L2 também reduziu o número de células T CD4 CD28 negativas, embora não tão notavelmente quanto observado nas células T CD8 negativas CD28, enquanto o tacrolimo e a dexametasona eram pouco eficazes Ou aumentaram notavelmente o número de células.

[00494] Os resultados da análise do efeito nas células T CD57 positivas são mostrados na Figura 107. Como mostrado na Figura 107B, hLA212 H4/L2 evidentemente reduziu o número de células T CD8 CD57 positivas, como nas células T CD8 perforina positivas do Exemplo 13, e células T CD8 CD28 negativas. Este efeito foi dependente da concentração de hLA212 H4/L2. Resultados semelhantes foram obtidos usando PBMCs derivadas de qualquer um dos dois doadores. Por outro lado, no caso de adição de tacrolimo ou dexametasona, não foi observada redução evidente no número de células T CD8 CD57 positivas como encontrado para o anticorpo para LAG-3. Como mostrado na Figura 107A, o anticorpo para LAG-3 hLA212 H4/L2 também reduziu o número de células T CD4 CD57 positivas, embora não tão notavelmente quanto observado nas células T CD8 CD57 positivas, enquanto esse efeito foi dificilmente observado no tacrolimo e na dexametasona.

[00495] O anticorpo humanizado anti-LAG-3 humano hLA212 H3/L2, O anticorpo quimérico humano-camundongo anti- LAG-3 humano A9H12, e o anticorpo quimérico anti-LAG-3 humano humano-rato cLA212, que não estavam na forma de baixo teor de fucose, exibiram uma tendência para reduzir o número de células T CD28 negativas e o número de células T CD57 positivas (dados não mostrados), embora mais fracamente do que hLA212 H4/L2, que está na forma de baixo teor de fucose.

[00496] Esses resultados revelaram que o anticorpo anti- LAG-3 esgota as células T CD28 negativas citotóxicas e as células T CD57 positivas, relatadamente envolvidas na resistência a esteroides de doenças do sistema imunológico, e a atividade de esgotamento de células T é intensificada em uma forma de baixo teor de fucose. Isto indicou a possibilidade de que o anticorpo anti-LAG-3 pudesse servir como um fármaco promissor para o esgotamento de células T citotóxicas no tratamento médico de doenças resistentes a imunossupressores associadas a células T citotóxicas.

Aplicabilidade Industrial

[00497] As composições da presente invenção são úteis para o esgotamento de células T citotóxicas. Texto Sem Listagem de Sequências

[00498] SEQ ID No: 1: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLAZ04 (Figura 16)

[00499] SEQ ID No: 2: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA204 (Figura 17)

[00500] SEQ ID No: 3: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAZ04 (Figura 18)

[00501] SEQ ID No: 4: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA204 (Figura 19)

[00502] SEQ ID No: 5: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA212 (Figura 20)

[00503] SEQ ID No: 6: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA212 (Figura 21)

[00504] SEQ ID No: 7: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA212 (Figura 22)

[00505] SEQ ID No: 8: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA212 (Figura 23)

[00506] SEQ ID No: 9: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA225 (Figura 24)

[00507] SEQ ID No: 10: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA225 (Figura 25)

[00508] SEQ ID No: 11: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA225 (Figura 26)

[00509] SEQ ID No: 12: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA225 (Figura 27)

[00510] SEQ ID No: 13: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA869 (Figura 28)

[00511] SEQ ID No: 14: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLA869 (Figura 29)

[00512] SEQ ID No: 15: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA869 (Figura 30)

[00513] SEQ ID No: 16: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLA869 (Figura 31)

[00514] SEQ ID No: 17: Sequência de nucleotídeos de cDNA que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLAl264 (Figura 32)

[00515] SEQ ID No: 18: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rLAl264 (Figura 33)

[00516] SEQ ID No: 19: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAl264 (Figura 34)

[00517] SEQ ID No: 20: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rLAl264 (Figura 35)

[00518] SEQ ID No: 21: Sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de aminoácidos do sinal de secreção da cadeia leve humana e da região constante da cadeia x humana (Figura 36)

[00519] SEQ ID No: 22: Sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de aminoácidos do sinal de secreção da cadeia pesada humana e da região constante de IgGl humana (Figura 37)

[00520] SEQ ID No: 23: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo cLA212 (Figura 38)

[00521] SEQ ID No: 24: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo cLA212 (Figura 39)

[00522] SEQ ID No: 25: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo cLA212 (Figura 40)

[00523] SEQ ID No: 26: Sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo cLA212 (Figura 41)

[00524] SEQ ID No: 27: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada H2 do anticorpo hLA212 (Figura 42)

[00525] SEQ ID No: 28: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada H2 do anticorpo hLA212 (Figura 43)

[00526] SEQ ID No: 29: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada H3 do anticorpo hLA212 (Figura 44)

[00527] SEQ ID No: 30: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada H3 do anticorpo hLA212 (Figura 45)

[00528] SEQ ID No: 31: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve Ll1 do anticorpo hLA212 (Figura 46)

[00529] SEQ ID No: 32: Sequência de aminoácidos da cadeia leve L1 do anticorpo hLA212 (Figura 47)

[00530] SEQ ID No: 33: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L2 do anticorpo hLA212 (Figura 48)

[00531] SEQ ID No: 34: Sequência de aminoácidos da cadeia leve L2 do anticorpo hLA212 (Figura 49)

[00532] SEQ ID No: 35: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L3 do anticorpo hLA212 (Figura 50)

[00533] SEQ ID No: 36: Sequência de aminoácidos da cadeia leve L3 do anticorpo hLA212 (Figura 51)

[00534] SEQ ID No: 37: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L4 do anticorpo hLA212 (Figura 52)

[00535] SEQ ID No: 38: Sequência de aminoácidos da cadeia leve L4 do anticorpo hLA212 (Figura 53)

[00536] SEQ ID No: 39: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve L5 do anticorpo hLA212 (Figura 54)

[00537] SEQ ID No: 40: Sequência de aminoácidos da cadeia leve L5 do anticorpo hLA212 (Figura 55)

[00538] SEQ ID No: 41: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLAZ204 (Figura 56)

[00539] SEQ ID No: 42: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLAZ04 (Figura 57)

[00540] SEQ ID No: 43: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLAZ204 (Figura 58)

[00541] SEQ ID No: 44: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLAZ04 (Figura 59)

[00542] SEQ ID No: 45: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLAZ04 (Figura 60)

[00543] SEQ ID No: 46: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLAZ04 (Figura 61)

[00544] SEQ ID No: 47: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA212 (Figura 62)

[00545] SEQ ID No: 48: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLA212 (Figura 63)

[00546] SEQ ID No: 49: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLA212 (Figura 64)

[00547] SEQ ID No: 50: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA212 (Figura 65)

[00548] SEQ ID No: 51: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA212 (Figura 66)

[00549] SEQ ID No: 52: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA212 (Figura 67)

[00550] SEQ ID No: 53: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA225 (Figura 68)

[00551] SEQ ID No: 54: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLA225 (Figura 69)

[00552] SEQ ID No: 55: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLA225 (Figura 70)

[00553] SEQ ID No: 56: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA225 (Figura 71)

[00554] SEQ ID No: 57: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA225 (Figura 72)

[00555] SEQ ID No: 58: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA225 (Figura 73)

[00556] SEQ ID No: 59: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLA869 (Figura 74)

[00557] SEQ ID No: 60: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLA869 (Figura 75)

[00558] SEQ ID No: 61: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLA869 (Figura 76)

[00559] SEQ ID No: 62: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA869 (Figura 77)

[00560] SEQ ID No: 63: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLA869 (Figura 78)

[00561] SEQ ID No: 64: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA869 (Figura 79)

[00562] SEQ ID No: 65: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH1 do anticorpo rLAl264 (Figura 80)

[00563] SEQ ID No: 66: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH2 do anticorpo rLAl264 (Figura 81)

[00564] SEQ ID No: 67: Sequência de aminoácidos da cadeia pesada CDRH3 do anticorpo rLAl264 (Figura 82)

[00565] SEQ ID No: 68: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL1 do anticorpo rLA1l264 (Figura 83)

[00566] SEQ ID No: 69: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL2 do anticorpo rLAl264 (Figura 84)

[00567] SEQ ID No: 70: Sequência de aminoácidos da cadeia leve CDRL3 do anticorpo rLA1l264 (Figura 85)

[00568] SEQ ID No: 71: Iniciador RG2AR3 (Figura 86)

[00569] SEQ ID No: 72: Iniciador RKR5 (Figura 87)

[00570] SEQ ID No: 73: Iniciador 3.3-Fl (Figura 88)

[00571] SEQ ID No: 74: Iniciador 3.3-Rl1 (Figura 89)

[00572] SEQ ID No: 75: Iniciador 212H-F (Figura 90)

[00573] SEQ ID No: 76: Iniciador 212H-R (Figura 91)

[00574] SEQ ID No: 77: Iniciador 212L-F (Figura 92)

[00575] SEQ ID No: 78: Iniciador 212L-R (Figura 93)

[00576] SEQ ID No: 79: Oligonucleotídeo LAG-3-H1 (Figura 94)

[00577] SEQ ID No: 80: Oligonucleotídeo LAG-3-H2 (Figura 95)

[00578] SEQ ID No: 81: Oligonucleotídeo LAG-3-H3 (Figura

26)

[00579] SEQ ID No: 82: Oligonucleotídeo LAG-3-H4 (Figura 97)

[00580] SEQ ID No: 83: Oligonucleotídeo LAG-3-H5 (Figura 98)

[00581] SEQ ID No: 84: Oligonucleotídeo LAG-3-H6 (Figura 299)

[00582] SEQ ID No: 85: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do LAG-3 humano (Figura 100)

[00583] SEQ ID No: 86: Sequência de aminoácidos de LAG- 3 humano (Figura 101)

Claims

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Composição para depleção de células T citotóxicas, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo anti- LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo, tendo as propriedades descritas em (1) a (iii) abaixo: (1) ter atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, o número de células positivas para LAG-3 in vivo; e (iii) ligar-se a células T humanas ativadas.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula T citotóxica é selecionada do grupo que consiste em: uma célula T positiva para perforina, uma célula T positiva para granzima B, uma célula T negativa para CD28 e positiva para CD4, uma célula T negativa para CD28 e positiva para CD8, uma célula T positiva para CD57 e positiva para CD4, e uma célula T positiva para CD57 e positiva para CD8.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula T citotóxica é positiva para LAG-3.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação do mesmo se liga ao domínio 3 do LAG-3 humano e tem as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (1) suprimir, em uma forma de baixo teor de fucose, encefalomielite autoimune experimental in vivo; (ii) permitir que o LAG-3 humano se ligue às moléculas de classe IT do complexo principal de histocompatibilidade humana na presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo; e (iii) permitir que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas na presença do anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de uma doença resistente a imunossupressores, associada a células T citotóxicas.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o imunossupressor é um esteroide.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o imunossupressor é um inibidor de calcineurina.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano ou um fragmento de ligação do mesmo.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia leve compreendendo CDRL1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50 ou Figura 65, CDRL2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51 ou Figura 66 e CDRL3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52 ou Figura 67, e uma cadeia pesada compreendendo CDRH1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47 ou Figura 62, CDRH2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ

ID NO: 48 ou Figura 63 e CDRH3 tendo a sequência de aminoácidos representado pela SEQ ID NO: 49 ou Figura 64.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação do mesmo.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28 ou Figura 43, com o aminoácido correspondente à posição 68 sendo Gly Ou substituído por Ala, e o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Asn ou substituído por Asp, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou Figura 47 com o aminoácido correspondente à posição 21 sendo Asp ou substituído por Asn, o aminoácido correspondendo à posição 31 sendo Leu ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 33 sendo Ala ou substituído por Ile, o aminoácido correspondente à posição 41 sendo Ile ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 58 sendo Gln ou substituído por Lys, o aminoácido correspondente à posição 63 sendo Ala ou substituído por Ser, o aminoácido correspondendo à posição 80 sendo Ser ou substituído por Asp, o aminoácido correspondente à posição 85 sendo Ser ou substituído por Gly, o aminoácido correspondente à posição 87 sendo Ser ou substituído por Tyr, o aminoácido correspondente à posição 98 sendo Leu ou substituído por Val, o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Phe ou substituído por Ala, o aminoácido correspondente à posição 105 sendo Thr ou substituído por Phe, o aminoácido correspondente à posição 124 sendo Val ou substituído por Leu, e o aminoácido correspondente à posição 126 sendo Ile ou substituído por Leu.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 129 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e um aminoácido da região variável da cadeia pesada sequência compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 140 de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28 e 30.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 234 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 470 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 e 30.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é selecionado do grupo que consiste em [1] a [x] abaixo:

[i] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 34 (Figura 49);

[ii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 32 (Figura 47);

[iii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 36 (Figura 51);

[iv] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 34 (Figura 49);

[v] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 36 (Figura 51);

[vi] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 38 (Figura 53);

[vii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 40 (Figura 55);

[viii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 32 (Figura 47);

[ix] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste no aminoácido posições 21 a 234 de SEQ ID NO: 38 (Figura 53); e

[x] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 40 (Figura 55).

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo: uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácidos tendo 95% ou mais de identidade, respectivamente, com as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e à região variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo conforme definido na reivindicação 14.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma segunda molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições severas para uma primeira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento de ligação da mesma, conforme definida na reivindicação 14, ou uma sequência de nucleotídeos complementar à mesma, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma quarta molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições severas para uma terceira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo conforme definido na reivindicação 14 ou uma sequência de nucleotídeos complementar à mesma.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo tendo uma propriedade descrita em (i) ou (ii) abaixo: (1) ligar-se a um local no domínio 3 do LAG-3 humano que é reconhecido pelo anticorpo ou pelo fragmento de ligação do mesmo conforme definido na reivindicação 14; ou (ii) competir com o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo, conforme definido na reivindicação 14, para ligação no domínio 3 do LAG-3 humano.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose.

19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é obtido por um método para produzir o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo, compreendendo a etapa de cultivar uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da mesma ou um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico, ou uma célula que produz o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo.

20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a presença do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo permite que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 20, caracterizada pelo fato de que o LAG-3 humano se liga a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade humana na presença do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose.

23. Anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo, caracterizado pelo fato que é usado para a depleção de células T citotóxicas, e tem as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (1) ter atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, o número de células positivas para LAG-3 in vivo; e (iii) ligar-se a células T humanas ativadas.

24. Uso de um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (1) a (iii) abaixo, caracterizado pelo fato de ser para a depleção de células T citotóxicas: (1) ter atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, o número de células positivas para LAG-3 in vivo; e (iii) ligar-se a células T humanas ativadas.

25. Método para depleção de células T citotóxicas, caracterizado pelo fato de compreender a administração de um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (i) ter atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, o número de células positivas para LAG-3 in vivo; e (iii) ligar-se a células T humanas ativadas.

26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de ser para uso em combinação com um fármaco adicional.

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento ou à prevenção de uma doença associada a células T citotóxicas positivas para perforina, positivas para granzima B, negativas para CD28 e CD4, negativas para CD28 e positivas para CD8, positivas para CD57 e positivas para CD4 e/ou positivas para CD57 e positivas para CD8 e positivas para CD8, compreendendo um anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento de ligação do mesmo tendo as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (1) ter atividade de ADCC in vitro; (ii) reduzir, em uma forma de baixo teor de fucose, oO número de células positivas para LAG-3 in vivo; e (iii) ligar-se a células T humanas ativadas.

28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o tratamento ou a prevenção compreende determinar que uma célula T citotóxica contida em uma amostra biológica ou em uma fração da membrana celular é positiva para perforina, positiva para granzima B, negativa para CD28 e positiva para CD4, negativa para CD28 e positiva para CD8, positiva para CD57 e positiva para CD4 e/ou positiva para CD57 e positiva para CD8.

29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a amostra biológica é derivada de um indivíduo que sofre da doença associada às células T citotóxicas ou para quem é desejado evitar o sofrimento da doença associada às células T citotóxicas.

30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizada pelo fato de que a doença associada às células T citotóxicas é fibrose pulmonar idiopática, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), esclerose múltipla, doença de Graves, espondilite anquilosante, pars planitis, asma, artrite reumatoide, polimiosite ou dermatomiosite, miosite por corpo de inclusão, síndrome coronariana aguda, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, esclerodermia, doença de Crohn, colite ulcerativa, anemia aplástica, Síndrome mielodisplásica, síndrome de Sjogren, granulomatose de Wegener, psoríase, diabetes tipo 2, reação de enxerto- versus-hospedeiro, hepatite B crônica e/ou sarcoidose.

31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizada pelo fato de que a doença associada às células T citotóxicas é positiva para LAG-3.

32. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LAG-3 ou o fragmento de ligação do mesmo se liga ao domínio 3 do LAG-3 humano e tem as propriedades descritas em (i) a (iii) abaixo: (1) suprimir, em uma forma de baixo teor de fucose, encefalomielite autoimune experimental in vivo; (ii) permitir que o LAG-3 humano se ligue às moléculas de classe IT do complexo principal de histocompatibilidade humanas na presença do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo; e

(iii) permitir que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas na presença do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo.

33. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizada pelo fato de que a doença associada às células T citotóxicas é resistente a imunossupressores.

34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o imunossupressor é um esteroide.

35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o imunossupressor é um inibidor de calcineurina.

36. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 35, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano ou um fragmento de ligação do mesmo.

37. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia leve compreendendo CDRL1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 50, CDRL2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 51 e CDRL3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 52, e uma cadeia pesada compreendendo CDRH1 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 47 CDRH2 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 48 e CDRH3 tendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 49.

38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação do mesmo.

39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28 com o aminoácido correspondente à posição 68 sendo Gly ou substituído por Ala, e o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Asn ou substituído por Asp, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 com o aminoácido correspondente à posição 21 sendo Asp ou substituído por Asn, o aminoácido correspondente à posição 31 sendo Leu ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 33 sendo Ala ou substituído por (Ile, o aminoácido correspondente à posição 41 sendo Ile ou substituído por Met, o aminoácido correspondente à posição 58 sendo Gln ou substituído por Lys, o aminoácido correspondente à posição 63 sendo Ala ou substituído por Ser, o aminoácido correspondente à posição 80 sendo Ser ou substituído por Asp, o aminoácido correspondente à posição 85 sendo Ser ou substituído por Gly, o aminoácido correspondente à posição 87 sendo Ser ou substituído por Tyr, o aminoácido correspondente à posição 98 sendo Leu ou substituído por Val, o aminoácido correspondente à posição 103 sendo Phe ou substituído por Ala, o aminoácido correspondente à posição

105 sendo Thr ou substituído por Phe, o aminoácido correspondente à posição 124 sendo Val ou substituído por Leu, e o aminoácido correspondente à posição 126 sendo Ile ou substituído por Leu.

40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 129 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e um aminoácido da região variável da cadeia pesada sequência compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 140 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28 e 30.

41. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo compreende: uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo o aminoácido 21 ao aminoácido 234 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 e 40, e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo o aminoácido 20 ao aminoácido 470 de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 e 30.

42. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 41, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é selecionado do grupo que consiste em [i] a [x] abaixo: [i] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 34 (Figura 49);

[vi] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 38 (Figura 53); [vii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 28 (Figura 43) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 40 (Figura 55); [viii] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 32 (Figura 47); [ix] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que consiste no aminoácido posições 21 a 234 de SEQ ID NO: 38 (Figura 53); e [x] um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que consiste nas posições de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 30 (Figura 45) e uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em posições de aminoácidos 21 a 234 de SEQ ID NO: 40 (Figura 55).

43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo: uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácidos tendo 95% ou mais de identidade, respectivamente, com as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo, conforme definido na reivindicação 42.

44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma segunda molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições severas para uma primeira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento de ligação da mesma, conforme definido na reivindicação 42, ou uma sequência de nucleotídeos complementar à mesma, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos de uma quarta molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições severas para uma terceira molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo conforme definido na reivindicação 42 ou uma sequência de nucleotídeos complementar à mesma.

45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo tendo uma propriedade descrita em (1) ou (ii) abaixo: (1) ligar-se a um local no domínio 3 do LAG-3 humano que é reconhecido pelo anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo conforme definido na reivindicação 42; ou (ii) competir com o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo conforme definido na reivindicação 42 pela ligação ao domínio 3 do LAG-3 humano.

46. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 45, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose.

47. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 46, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo é obtido por um método para produzir o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo, compreendendo a etapa de cultivar uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo um sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da mesma ou um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico, ou uma célula que produz o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo.

48. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada pelo fato de que a presença do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo permite que o LAG-3 humano exerça uma função de supressão de células T humanas.

49. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31 e 48, caracterizada pelo fato de que o LAG-3 humano se liga a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade humanas na presença do anticorpo ou do fragmento de ligação do mesmo.

50. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que Oo anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo está na forma de baixo teor de fucose.

51. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 50, caracterizada pelo fato de ser para uso em combinação com um fármaco adicional.

52. Método para tratar ou prevenir uma doença associada a células T citotóxicas positivas para perforina, positivas para granzima B, negativas para CD28 e positivas para CDA4, negativas para CD28 e CD8, positivas para CD57 e positivas para CD4 e/ou positivas para CD57 e positivas para CD8 e positivas para CD8, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa administrar a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 51, a um indivíduo que sofre da doença associada a células T citotóxicas ou para quem se deseja evitar o sofrimento da doença associada a células T citotóxicas.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a doença associada às células T citotóxicas é resistente a imunossupressores.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o imunossupressor é um esteroide.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o imunossupressor é um inibidor de calcineurina.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 55, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de determinar se uma amostra biológica contendo células T citotóxicas ou uma fração da membrana celular (são)é positiva(s) para perforina, positiva(s) para granzima B, negativa(s) para CD28 e negativa(s) para CD4 negativa, negativa(s) para CD28 e positiva(s) para CD8, positiva(s) para CD57 e positiva(s) para CD4 e/ou positiva(s para CD57 e positiva(s) para CD8.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é derivada do indivíduo que sofre da doença associada às células T citotóxicas ou para quem é desejado evitar o sofrimento da doença associada às células T citotóxicas.