WO2019070013A1 - 細胞傷害性ｔ細胞枯渇用組成物 - Google Patents

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直樹 清澤
真之亮 山田
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the present invention provides a composition for cytotoxic T cell depletion comprising an antibody, a binding fragment thereof and the like, an antibody for cytotoxic T cell depletion, use of a binding fragment thereof and the like, and administering the antibody, a binding fragment thereof and the like And methods of depleting damaging T cells including T.
  • T lymphocytes are cells that play a central role in the immune response, and have various antigen specificities called 10 million to 1 billion clones in vivo to cope with various antigens. T cells are present. When an antigen intrudes into the body, only a limited number of antigen-specific clones in such a large repertoire of T cells proliferate and activate, and act on bioprotection through cytokine production and cytotoxic activity. In autoimmune diseases, it is thought that various pathological conditions are formed triggered by abnormal immune responses to some self antigens. Even in such a situation, most other clones not having antigen specificity are in a quiescent state without being proliferated and activated.
  • T cells having other antigen specificities it becomes possible to specifically suppress immunity without affecting most of T cells having other antigen specificities, and it is possible to self-react. It can be a useful therapeutic or preventive method for immune diseases, rejection of transplants, allergic diseases and the like. On the other hand, in the situation where T cells that negatively control the immune system such as regulatory T cells are mainly activated, removing them can be a useful treatment or prevention for malignant tumors, chronic infections, etc. .
  • LAG-3 (CD 223) is a single-pass transmembrane molecule belonging to the immunoglobulin superfamily and is a molecule known to be approximately selectively expressed in activated T cells (Non-patent Document 1). .
  • Administration of a rabbit antiserum with complement dependent cytotoxicity (CDC) activity against rat LAG-3 molecules in a rat allogeneic heart transplantation model reduces LAG-3 positive cells in the graft and results in graft loss It has been reported that the time until it is rejected is slightly extended (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 3 anti-human LAG-3 chimeric antibody A9H12, which is cross-reactive in baboon and exhibits antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity, suppresses the delayed hypersensitivity reaction in baboon while its dose response is unclear It has also been reported that to do (Non-patent Document 3) and that a humanized product thereof was produced (Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 1 By binding to major histocompatibility complex (MHC) class II molecules, LAG-3 is known to transmit some inhibitory signals to T cells and negatively regulate T cell functions.
  • Non-Patent Document 4 Of the four extracellular immunoglobulin-like domains of LAG-3, N-terminal domains 1 and 2 are considered to be important for the binding of LAG-3 and MHC class II molecules (Non-patent Document 4) It is also reported that this LAG-3 mediated suppression of T cell function is exerted cooperatively with other T cell function mediated signals such as PD-1 molecule (non-patent) Literature 5).
  • Non-patent Document 6 Non-patent Document 6
  • LAG-3 antibody that removes LAG-3 positive cells by ADCC activity or the like in other words, a LAG-3 antibody that depletes LAG-3 positive cells to an autoimmune disease
  • LAG-3 inherently An antibody that does not have an activity to inhibit the T cell suppressive function is considered to be more desirable because there is no risk that the immune system is abnormally activated and the autoimmune disease is aggravated.
  • CD4 + (positive) CD28-(negative) T cells, CD8 + CD28-T cells, CD4 + CD57 + T cells, CD8 + CD57 + T cells are cytotoxic T cell groups that highly express perforin, granzyme B, etc. (non-patented) Document 12, non-patent document 13).
  • Steroid drugs are widely used for the treatment of immune system diseases, but there is a patient population intractable for steroids in immune system diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (Non-patent Document 14).
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • cytotoxic T cells as described above have been reported as one of the main inflammatory cells involved in pathological conditions (Non-patent documents 12 and 15). While cytotoxic T cells have high cytotoxic activity, resistance to anti-inflammatory activity or apoptosis induction by steroid treatment has been reported (Non-patent Document 16).
  • Triebel, F. (Triebel, F.), Rug 3: The Revival Observer Cell & Dice Responses & It's Teen in Therapeutic Vaccination (LAG-3: a regulator of T-cell and DC responses and its use in therapeutic vaccination.), Torrens in Immunology (Trends Immunol.), December 2003; 24 (12): 619-22.
  • Haudeburg, Ty et al. (Haudelaub, T. et al.), Depletion of lag 3 positive cells in cardiak allograft, Livile there roll in rejection and tolerance (Depletion of LAG-3 positive cells in cardiac allografts reveals their role in rejection and tolerance.), Transplantation, Dec.
  • the present invention (1) A composition for cytotoxic T cell depletion comprising an anti-LAG-3 antibody or a binding fragment thereof having the following properties (i) to (iii): (I) with in vitro ADCC activity; (Ii) reduce the number of LAG-3 positive cells in vivo in low fucose form; and (Iii) bind to human activated T cells, (2) Cytotoxic T cells are selected from the group consisting of perforin positive T cells, granzyme B positive T cells, CD28 negative CD4 positive T cells, CD28 negative CD8 positive T cells, CD57 positive CD4 positive T cells and CD57 positive CD8 positive T cells.
  • composition according to (5), wherein the immunosuppressant is a steroid
  • composition according to (5) or (6), wherein the immunosuppressant is a calcineurin inhibitor
  • the antibody or binding fragment thereof comprises CDRL1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50 or FIG. 65, CDRL2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 51 or FIG. 66, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52 or FIG.
  • Light chain containing CDR L3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or FIG.
  • composition according to (4) comprising a heavy chain comprising CDRH3 having (10) The composition according to (9), wherein said antibody or binding fragment thereof is a humanized antibody or binding fragment thereof, (11) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 or FIG. 43, an amino acid corresponding to position 68 is Gly or Ala is substituted for the antibody or a binding fragment thereof, and an amino acid corresponding to position 103 In the heavy chain containing the amino acid sequence in which is Asn or substituted with Asp, and in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or FIG.
  • the amino acid corresponding to position 21 is Asp or Asn
  • the amino acid corresponding to position 31 is Leu or is substituted by Met
  • the amino acid corresponding to position 33 is Ala or is substituted by Ile
  • the corresponding amino acid is Ile or substituted with Met
  • the amino acid corresponding to position 58 is Gln or substituted with Lys
  • the amino acid corresponding to the position No. is Ala or is substituted by Ser
  • the amino acid corresponding to the position No. 80 is Ser or substituted with Asp
  • amino acid corresponding to position 87 which is substituted by Gly, is Ser or Tyr, and the amino acid corresponding to position 98 is Leu or Val, 103
  • the amino acid corresponding to the position No. is Phe or is substituted with Ala
  • the amino acid corresponding to the position No. 105 is Thr or substituted with Phe
  • a light chain comprising an amino acid sequence which is substituted by Leu or has an amino acid corresponding to position 126 is Ile or substituted by Leu;
  • the amino acid sequence of the light chain of said antibody or its binding fragment comprises amino acids 21 to 234 of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 and 40, heavy chain
  • the composition according to any one of (10) to (13), wherein said antibody or binding fragment thereof is selected from the group consisting of the following [i] to [x]: [I]
  • An antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG.
  • an antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45) and a light chain having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 40 (FIG. 55) Its binding fragment, (15) It comprises an antibody or binding fragment thereof having a light chain variable region and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence 95% or more identical to the amino acid sequence of the light chain variable region and heavy chain variable region possessed by the antibody or binding fragment thereof.
  • Cytotoxic T cell-related diseases include idiopathic pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), multiple sclerosis, Graves' disease, ankylosing spondylitis, squamitis, asthma, rheumatoid arthritis, polymyositis, Dermatomyositis, inclusion body myositis, acute coronary syndrome, systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, scleroderma, Crohn's disease, ulcerative colitis, aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, Sjogren's syndrome, Wegener's granulomatosis, psoriasis,
  • the pharmaceutical composition according to any one of (27) to (29), which is type 2 diabetes, host-to-graft reaction, chronic hepatitis B, and / or sarcoidosis.
  • the antibody or the binding fragment thereof has an amino acid corresponding to position 68, which is GIy or substituted with Ala, and an amino acid corresponding to position 103 is Asn
  • the amino acid corresponding to position 21 is Asp or Asn
  • the amino acid corresponding to the position number is Leu or is substituted by Met
  • the amino acid corresponding to the position 33 is Ala or is substituted by Ile
  • the amino acid corresponding to the position 41 is Ile
  • the amino acid corresponding to position 58 which is substituted by Met or No.
  • amino acid 58 is Gln or is substituted by Lys, corresponding to position 63.
  • the amino acid is Ala or substituted with Ser
  • the amino acid corresponding to position 80 is Ser or substituted with Asp
  • the amino acid corresponding to position 85 is Ser or Gly
  • the amino acid corresponding to position 87 is substituted or Ser is substituted with Tyr
  • the amino acid corresponding to position 98 is Leu or substituted for Val
  • Amino acid is Phe or is substituted by Ala
  • the amino acid corresponding to position 105 is Thr or is substituted by Phe
  • the amino acid corresponding to position 124 is Val or Leu (38), comprising a light chain comprising an amino acid sequence which is substituted
  • the amino acid corresponding to the position 126 is Ile or Leu.
  • composition (40)
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of said antibody or binding fragment thereof comprises amino acids 21 to 129 of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 and 40
  • the pharmaceutical composition according to (38) or (39), wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region comprises amino acids 20 to 140 of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 30.
  • the amino acid sequence of the light chain of said antibody or its binding fragment comprises amino acids 21 to 234 of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38 and 40, heavy chain
  • the pharmaceutical composition according to any one of (38) to (41), wherein said antibody or binding fragment thereof is selected from the group consisting of the following [i] to [x]: [I]
  • An antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG.
  • an antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45) and a light chain having an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 40 (FIG. 55) Its binding fragment, (43) It comprises an antibody or binding fragment thereof having a light chain variable region and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence 95% or more identical to the amino acid sequence of the light chain variable region and heavy chain variable region possessed by the antibody or binding fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition according to (42), (44) A second nucleic acid molecule which hybridizes under stringent conditions with a first nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain variable region of the antibody or a binding fragment thereof or a nucleotide sequence complementary thereto
  • composition provided by the present invention depletes cytotoxic T cells, it can be used for the treatment and / or prevention of cytotoxic T cell related diseases (described later).
  • the vertical axis shows the average fluorescence intensity measured by flow cytometry.
  • Human LAG-3 expressing 293T-lacZ cells were used as target cells and human PBMC as effector cells.
  • FIG. 3A shows the inhibitory activity of rat anti-LAG-3 antibodies (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264) in the LAG-3 / MHC class II binding test.
  • rat IgG2b was used, and as positive control, a rat anti-LAG-3 antibody that recognizes domain 1 of LAG-3 separately prepared was used. All antibodies were evaluated at 10 ⁇ g / mL.
  • FIG. 3B shows that a known antibody, human chimerized anti-LAG-3 antibody IMP 731 shows inhibitory activity in a LAG-3 / MHC class II binding test.
  • the commercially available mouse anti-human LAG-3 antibody 17B4 also showed inhibitory activity.
  • FIG. 5A shows a flow cytometry analysis of human LAG-3 binding epitopes of rat anti-LAG-3 antibodies (rLA204, rLA212 and rLA225).
  • FIG. 5B is a diagram showing human LAG-3 binding epitope of human chimerized anti-LAG-3 antibody IMP 731 which is a prior art antibody, verified by flow cytometry.
  • the vertical axis shows the average fluorescence intensity measured by flow cytometry. Antiserum used antisera obtained from the immunized rat of Example 1) -1 at a 500-fold dilution. All other antibodies were evaluated at 10 ⁇ g / mL.
  • 6D7 is a rat anti-LAG-3 antibody that recognizes domain 1 of LAG-3 prepared in Example 2) -6.
  • the vertical axis shows the average fluorescence intensity measured by flow cytometry.
  • the vertical axis shows the average fluorescence intensity measured by flow cytometry.
  • Human LAG-3 expressing 293T-lacZ cells were used as target cells and human PBMC as effector cells.
  • IL-2 production to the culture supernatant was determined upon stimulation of human PBMC with SEB for 4 days in the presence of each antibody. All antibodies were evaluated at 10 ⁇ g / mL.
  • FIG. 8 shows that expression of human LAG-3 in human LAG-3 / human Fc ⁇ RIIIA double transgenic mice is consistent with expression of mouse LAG-3.
  • the vertical axis represents human LAG-3 positive rate in peripheral blood T cells 2 days after administration of antibody and Con A to human LAG-3 / human Fc ⁇ RIIIA double transgenic mice.
  • the antibody was administered intraperitoneally immediately before Con A administration at a dose of 30 mg / kg.
  • the clinical score of EAE in mice in which EAE was induced in human LAG-3 / human Fc ⁇ RIIIA double transgenic mice and administered with humanized anti-LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 or control antibody is shown over time.
  • Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA204 antibody (SEQ ID NO: 1) Amino acid sequence of the heavy chain variable region of rLA 204 antibody (SEQ ID NO: 2) Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA204 antibody (SEQ ID NO: 3) Amino acid sequence of light chain variable region of rLA204 antibody (SEQ ID NO: 4) Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA212 antibody (SEQ ID NO: 5) Amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA212 antibody (SEQ ID NO: 6) Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA212 antibody (SEQ ID NO: 7) Amino acid sequence of light chain variable region of rLA212 antibody (SEQ ID NO: 8) Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of
  • LAG-3 and CD28 in cells stimulated with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 in human PBMC was examined by flow cytometry (multiple staining).
  • the result of having gated to the CD3 positive CD8 positive T cell for the analysis is shown.
  • the four divisions of the graph were set using a sample (left figure) containing no staining antibody against human LAG-3 and human CD28.
  • the expression of LAG-3 and CD57 in cells stimulated with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 in human PBMC was examined by flow cytometry (multiple staining).
  • FIG. 6 shows that LAG-3 antibody selectively depletes perforin positive CD8 T cells.
  • Human PBMCs were stimulated with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 for 4 days in the presence of humanized anti-LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2, tacrolimus (Tac), dexamethasone (Dex), and the obtained cells were flow-stained. It analyzed by the metric method (multiple staining).
  • FIG. 105A shows the total number of T cells
  • FIG. 105B shows the number of perforin positive CD8 T cells.
  • FIG. 6 shows that LAG-3 antibody depletes CD28 negative T cells.
  • FIG. 106A shows the number of CD28 negative CD4 T cells
  • FIG. 106B shows the number of CD28 negative CD8 T cells.
  • FIG. 6 shows that LAG-3 antibody depletes CD57 positive T cells.
  • Human PBMC in the presence of humanized anti-LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 (final concentration 10, 1, 0.1 ⁇ g / mL), control antibody (final concentration 10 ⁇ g / mL), tacrolimus (Tac), dexamethasone (Dex)
  • the cells were stimulated with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 for 4 days, and the obtained cells were analyzed by flow cytometry (multiple staining).
  • the results using PBMCs from two donors are shown (PBMC1 and PBMC2).
  • FIG. 107A shows the number of CD57 positive CD4 T cells
  • FIG. 107B shows the number of CD57 positive CD8 T cells.
  • gene means a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid of a protein or a complementary strand thereof, eg, a nucleotide sequence encoding an amino acid of a protein or a nucleotide complementary to that sequence
  • Polynucleotides having a sequence, oligonucleotides, DNA, mRNA, cDNA, cRNA and the like are included in the meaning of "gene”.
  • Such a gene is a single-stranded, double-stranded or triple-stranded nucleotide, and an association of DNA and RNA chains, and ribonucleotides (RNA) and deoxyribonucleotides (DNA) are mixed on one nucleotide chain. Also, double-stranded or triple-stranded or more nucleotides containing such nucleotide chains are included in the meaning of "gene”.
  • Examples of the “LAG-3 gene” of the present invention include DNAs, mRNAs, cDNAs, cRNAs and the like containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of LAG-3 protein.
  • nucleotide is synonymous, and, for example, DNA, RNA, probe, oligonucleotide, polynucleotide, primer and the like are included in their meanings.
  • a nucleotide is a single-stranded, double-stranded or three or more-stranded nucleotide, and an association of a DNA strand and an RNA strand, and ribonucleotides (RNA) and deoxyribonucleotides (DNA) on a single nucleotide strand. Contaminated ones and assemblies of double-stranded or three or more strands containing such nucleotide chains are also included in the meaning of "nucleotide".
  • polypeptide In the present invention, “polypeptide”, “peptide” and “protein” are synonymous.
  • antigen may be used in the meaning of "immunogen”.
  • cells also include various cells derived from animal individuals, subcultured cells, primary cultured cells, cell lines, recombinant cells, microorganisms and the like.
  • an antibody that binds to LAG-3 and an antibody that recognizes LAG-3 may both be referred to as "anti-LAG-3 antibody” or abbreviated as "LAG-3 antibody”.
  • Anti-LAG-3 antibodies include monoclonal antibodies, chimerized antibodies, humanized antibodies, human antibodies, chimeric antibodies and the like.
  • the "binding fragment of antibody” in the present invention means an antibody fragment that fulfills at least a part of the function exerted by the original antibody.
  • the “binding fragment of antibody” include, but are not limited to, Fab, F (ab ′) 2, scFv, Fab ′, single-chain immunoglobulin and the like, for example.
  • the binding fragment of such an antibody is a recombinant protein produced in a suitable host cell using a recombinant gene, in addition to those obtained by treating the full-length molecule of the antibody protein with an enzyme such as papain or pepsin. May be
  • the "site" to which an antibody binds that is, the "site” that an antibody recognizes means a partial peptide or partial conformation on an antigen to which the antibody binds or recognizes. In the present invention, such a site is also referred to as an epitope, a binding site of an antibody.
  • a site on LAG-3 protein which the anti-LAG-3 antibody binds or recognizes a partial peptide or partial conformation on LAG-3 protein can be exemplified.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the complementarity-determining region also called hypervariable region, is a site within the variable regions of the antibody heavy and light chains, where the variability of the primary structure is particularly high, and the heavy and light chains are The primary structure of the polypeptide chain is usually separated into three places.
  • the complementarity determining region of the heavy chain is denoted as CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence
  • the complementarity determining region of the light chain is light chain amino acid.
  • the amino terminal side of the sequence is referred to as CDRL1, CDRL2 and CDRL3.
  • FR frameworks
  • portions other than CDRL1 to CDRL3 in the light chain variable region amino acid sequence are also FR, from the amino terminus to the front of CDRL1, from CDRL1 to the front of CDRL2, from CDRL2 to the front of CDRL3, and The next to the carboxyl terminus of CDRL3 are referred to as FRL1 to FRL4, respectively. That is, in (variable amino acid sequence) of heavy chain and light chain variable regions, the amino terminal in the order of FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 and FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 They line up continuously from the side to the carboxyl terminus.
  • the "antibody variant” has an amino acid sequence formed by substitution, deletion, addition and / or insertion (hereinafter collectively referred to as "mutation") of amino acids in the amino acid sequence possessed by the original antibody. And a polypeptide that binds to the LAG-3 protein.
  • the number of mutated amino acids in such antibody variants is 1, 1, 2, 2, 3, 4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 7, 8, 9, 10. 1 to 7, 1 to 7, 1 to 8, 1 It is 9 to 1, 1 to 10, 1 to 12, 1 to 15, 1 to 20, 1 to 25, 1 to 30, 1 to 40 or 1 to 50.
  • Such antibody variants are also encompassed in the "antibody” of the present invention.
  • Examples of the activity / properties exhibited by LAG-3 antibody in the present invention include biological activity, physicochemical properties, etc. Specifically, various biological activities, binding activities to antigens and epitopes, production and storage The stability at the time, the thermal stability, etc. can be raised.
  • hybridize under stringent conditions refers to hybridization in a solution containing 5 ⁇ SSC at 65 ° C., and then in an aqueous solution containing 2 ⁇ SSC-0.1% SDS 20 minutes at 65 ° C., 20 minutes at 65 ° C. in an aqueous solution containing 0.5 ⁇ SSC-0.1% SDS, and 65 ° C. in an aqueous solution containing 0.2 ⁇ SSC-0.1% SDS The hybridization is performed under the conditions for washing for 20 minutes, respectively, or conditions equivalent thereto.
  • SSC is an aqueous solution of 150 mM NaCl-15 mM sodium citrate, and n ⁇ SSC means n-fold concentration of SSC.
  • cytotoxicity refers to causing a pathological change in cells in any way, and is not limited to direct trauma, such as DNA breakage, base dimer formation, chromosome breakage, It means damage to the structure and function of all cells, including damage to the cell division apparatus and reduction in various enzyme activities.
  • cytotoxic activity means causing the above-mentioned cytotoxicity.
  • antibody-dependent cellular cytotoxicity refers to "antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity", and means an activity of NK cells or the like to injure a target cell via an antibody.
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • the "host-to-graft reaction” refers to the state of the recipient's immune enhancement observed after organ transplantation and injury of the transplanted organ by this.
  • graft-versus-host disease refers to a condition developed by immune attack on a recipient by transplanted cells after hematopoietic cell transplantation.
  • depletion decreases or increases the number of cells contained in a specific cell group. Not in the state.
  • deplete decreases or increases the number of cells contained in a particular cell group, such as by cytotoxic activity It means that.
  • cytotoxic T cells refers to T cells having cytotoxicity to cells contained in a specific cell group, for example, CD4 + (positive) CD28-(negative) T cells, CD8 + CD28 -T cell subsets such as T cells, CD4 + CD57 + T cells, CD8 + CD57 + T cells, perforin + T cells, granzyme B + T cells, etc. can be mentioned.
  • Cytotoxic T cells are one of the major inflammatory cells involved in immune system diseases and autoimmune diseases such as asthma and severe asthma (hereinafter collectively referred to as "asthma") and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). It has been reported (Non-patent document 12, Non-patent document 15) and has high cytotoxic effect, while resistance to anti-inflammatory action or apoptosis induction by steroid treatment has been reported (Non-patent document 16)
  • LAG-3 protein (hereinafter, also simply referred to as "LAG-3") is a transmembrane receptor protein, and it is extracellular with a ligand binding site consisting of immunoglobulin-like domains (IgD1 to 4). It consists of a region, a type I single transmembrane region, and an intracellular region. LAG-3 is synonymous with CD223.
  • LAG-3 is of vertebrate origin, preferably of mammalian origin, and more preferably of human origin.
  • the LAG-3 protein has the following properties. (I) bind to major histocompatibility complex (MHC) class II molecules on antigen presenting cells. (Ii) By binding to MHC class II molecules, they transmit inhibitory signals to T cells expressing the molecules and negatively regulate the function of the T cells.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the LAG-3 protein comprises the amino acid sequence described in any one of the following (a) to (d) (hereinafter referred to as "LAG-3 amino acid sequence") or Consisting of an amino acid sequence comprising a -3 amino acid sequence or consisting of a LAG-3 amino acid sequence: (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86 (FIG. 101); (B) 80% or more, 82% or more, 84% or more, 86% or more, 88% or more, 90% or more, 92% or more, 94% or more, 96% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86 (FIG.
  • LAG-3 protein expresses LAG-3 in vertebrates, preferably mammals, more preferably rodents and humans such as mice and rats, even more preferably humans, rats and mice These cells can be obtained from the cells, tissues or cancer tissues, cells derived from such tissues, cultures of such cells, etc. LAG-3 is expressed in activated T cells and the like at inflammatory sites in vivo, and is scarcely expressed or at very low expression levels in cells of normal tissues.
  • the LAG-3 protein may be either natural (non-recombinant) or recombinant.
  • fusions with other peptides and proteins such as carriers and tags are also included in the meaning of LAG-3 protein.
  • chemical modifications including polymer addition such as PEG and / or biological modifications including glycosylation are also included in the meaning of LAG-3 protein.
  • LAG-3 protein fragments are also included in the meaning of LAG-3 protein.
  • those having the properties described in the above (i) and / or (ii) are called LAG-3 protein binding fragments.
  • the LAG-3 gene comprises the nucleotide sequence described in any one of the following (a) to (c) (hereinafter referred to as "LAG-3 gene sequence"): Or consists of a nucleotide sequence comprising LAG-3 gene sequence, or consists of LAG-3 gene sequence:
  • A A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86 (FIG. 101);
  • B Hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide (nucleic acid molecule) consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86 (FIG.
  • polypeptide having the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence described in (b) or (c) may have other activities possessed by LAG-3 in addition to the MHC class II molecule binding activity.
  • LAG-3 gene may be determined using either the transcript of LAG-3 gene or LAG-3 protein as an indicator, the former by RT-PCR method, Northern blot hybridization method, etc. The latter can be measured by an immunoassay such as flow cytometry, western blotting, immunohistological staining and the like.
  • LAG-3 protein is purified and isolated from animal tissue (including body fluid), cells derived from the tissue or cell culture, gene recombination, in vitro translation, chemical synthesis, etc. It can be prepared by (2-3-1) Purification and Isolation of Non-Recombinant LAG-3
  • Non-recombinant LAG-3 protein can be purified and isolated from cells expressing LAG-3.
  • cells expressing LAG-3 those described in (iv) of (2-1) can be exemplified, but the origin of non-recombinant LAG-3 protein is not limited thereto. .
  • LAG-3 protein can also be prepared as a recombinant form. That is, a gene encoding the amino acid sequence of LAG-3 protein or LAG-3 protein fragment can be introduced into a host cell, and LAG-3 protein can be recovered from the culture of such cells.
  • a fusion protein with a secretion signal an intracellular localization signal, a tag for affinity purification, and a partner peptide, as well as a molecule having the same amino terminal (N terminal) and / or carboxy terminal (C terminal) as the natural type. It can also be expressed.
  • LAG-3 protein For purification and isolation of LAG-3 protein from such recombinant cell culture, the purification and isolation of the non-recombinant LAG-3 protein described in (2-3-1), the fractions described in isolation, chromatography, etc. It can carry out by combining the operation of.
  • the LAG-3 protein-containing solution can be subjected to buffer exchange and / or concentration with a concentration device such as gel filtration or Centriprep.
  • LAG-3 protein can also be prepared by in vitro translation.
  • Such translation method is not particularly limited as long as it is a method utilizing a cell-free translation system including an enzyme, a substrate, and an energy substance necessary for transcription and translation, but, for example, Roche Diagnostics Co., Ltd. There is a way to use the Rapid Translation System (RTS).
  • RTS Rapid Translation System
  • Chemical Synthesis LAG-3 protein can also be prepared by chemical synthesis. Examples of chemical synthesis methods include peptide solid phase synthesis methods such as Fmoc synthesis method and Boc synthesis method.
  • LAG-3 antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • monoclonal antibodies include non-human animal-derived antibodies (non-human animal antibodies), human-derived antibodies (human antibodies), chimerized antibodies (also referred to as "chimeric antibodies”), humanized antibodies and the like.
  • non-human animal antibodies include antibodies derived from vertebrates such as mammals and birds.
  • mammalian-derived antibodies include murine antibodies, rat antibodies such as rodent-derived antibodies, and the like.
  • avian-derived antibodies include chicken antibodies.
  • anti-human LAG-3 rat monoclonal antibodies include, but are not limited to, rLA204, rLA212, rLA225, 4LA869, rLA1264 and the like.
  • chimerized antibodies include, but are not limited to, antibodies formed by binding a variable region derived from a non-human animal antibody and a human antibody (human immunoglobulin) constant region.
  • chimeric antibodies in which the variable region derived from the non-human animal antibody and the human antibody constant region are combined include heavy and light chain variable regions derived from the above-described rat monoclonal antibodies rLA204, rLA212, rLA225, 4LA869 or rLA1264; Examples thereof include those having human heavy chain and light chain constant regions (referred to as “cLA204”, “cLA212”, “cLA225”, “cLA869” or “cLA1264”, respectively) and the like.
  • a humanized antibody one obtained by grafting a CDR in a variable region of a non-human animal antibody to a human antibody (a variable region of a human immunoglobulin), a part of the FR sequence of the non-human animal antibody is also grafted to a human antibody And those obtained by substituting one or more amino acids derived from any of those non-human animal antibodies with human or other amino acids, but are not limited thereto.
  • CDRs in the variable region of the non-human animal antibody it is possible to exemplify CDRH1 to CDRH3 in the heavy chain variable region derived from rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 or rLA1264 described above and CDRL1 to CDRL3 in the light chain variable region.
  • L2 etc. can be raised.
  • the human antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that recognizes LAG-3 protein, but a human antibody that binds to the same site as the antibody having a CDR of LAG-3 antibody, the aforementioned non-human animal antibody Examples include human antibodies that bind to the same site on LAG-3 with any one of chimeric antibodies and humanized antibodies, and antibodies that compete with such antibodies for binding to LAG-3. .
  • the antibody in the present invention may be an antibody composed of portions derived from a plurality of different antibodies as long as it has an activity of binding to LAG-3, for example, a heavy chain and a plurality of different antibodies. And / or replacement of the light chain, replacement of the entire length of heavy chain and / or light chain, replacement of only the variable region or only constant region, replacement of all or part of CDRs, etc. Can.
  • the heavy and light chain variable regions of the chimeric antibody may be derived from different LAG-3 antibodies.
  • the CDRH1 to CDRH3 and the CDRL1 to CDRL3 in the variable regions of the heavy and light chains of the humanized antibody may be derived from two or more LAG-3 antibodies.
  • CDRH1 to CDRH3 and CDRL1 to CDRL3 in the variable regions of the heavy and light chains of a human antibody may be a combination of CDRs possessed by two or more LAG-3 antibodies.
  • An antibody or a binding fragment thereof composed of parts derived from such multiple different antibodies is preferably (3-2) and (3-3) described below, preferably in addition to (3-4) ), More preferably in addition to (3-5), and even more preferably (3-2) to (3-8) all have the properties, functions, activities and the like described in each.
  • the isotype of the monoclonal antibody is not particularly limited, and examples thereof include IgG such as IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, IgA such as IgM, IgA1 and IgA2, IgD, IgE and the like, preferably IgG And IgM.
  • the isotype and subclass of the monoclonal antibody may be determined, for example, by the Ouchterlony method, Enzyme-linked immuno-sorbent assay: hereinafter referred to as "ELISA” method, Radio immunoassay (hereinafter referred to as "RIA”) method or the like.
  • ELISA Enzyme-linked immuno-sorbent assay
  • RIA Radio immunoassay
  • LAG-3 antibody recognizes LAG-3 protein.
  • LAG-3 antibody binds to LAG-3 protein.
  • Such antibodies are also referred to as "anti-LAG-3 antibodies”.
  • suitable antibodies for use in the present invention specifically recognize LAG-3 protein.
  • the preferred antibody used in the present invention specifically binds to the LAG-3 protein (hereinafter collectively referred to as “LAG-3 binding activity of the antibody.” Furthermore, the more preferred used in the present invention The antibody specifically binds to the extracellular domain of LAG-3 protein, and the more preferred antibody specifically binds to an immunoglobulin like domain (hereinafter referred to as "Ig like domain”) possessed by LAG-3 protein, Even more preferred antibodies specifically bind to such Ig-like domain 3.
  • Ig like domain immunoglobulin like domain
  • telomere binding means binding that is not nonspecific adsorption.
  • KD dissociation constant
  • the KD value for the LAG-3 protein of the suitable antibody used in the present invention is 1 ⁇ 10 ⁇ 5 or less, 5 ⁇ 10 ⁇ 6 or less, 2 ⁇ 10 ⁇ 6 or less or 1 ⁇ 10 ⁇ 6 or less, more preferably 5 ⁇ 10 -7 or less, 2 ⁇ 10 -7 or less or 1 ⁇ 10 -7 or less, more preferably 5 ⁇ 10 -8 or less, 2 ⁇ 10 -8 or less or 1 ⁇ 10 -8 or less, still more Preferably, it is 5 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 2 ⁇ 10 ⁇ 9 or less or 1 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, optimally 5 ⁇ 10 ⁇ 10 or less, 2 ⁇ 10 ⁇ 10 or less or 1 ⁇ 10 ⁇ 10 or less.
  • Binding between an antigen and an antibody in the present invention can be measured or determined by ELISA method, RIA method, Surface Plasmon Resonance (hereinafter referred to as "SPR") analysis method or the like.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • BIAcoreTM manufactured by GE Healthcare
  • ProteOnTM manufactured by BioRad
  • SPR-NaviTM manufactured by BioNavis
  • SpreetaTM manufactured by Texas Instruments
  • SPRi-Plex IITM manufactured by Horiba
  • Autolab SPRTM manufactured by Metrohm
  • the binding between the antigen expressed on the cell surface and the antibody can be measured by flow-sertometry, Cell ELISA, etc.
  • the anti-LAG-3 antibody used in the present invention has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity, preferably ADCC activity in vitro. And more preferably has ADCC activity on T cells expressing LAG-3.
  • the anti-LAG-3 antibody used in the present invention may have complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity and / or antibody-dependent cell-mediated phagocytic activity (ADCP) activity in addition to the ADCC activity.
  • ADCC activity may be simply referred to as "ADCC activity”.
  • ADCC activity can be measured by known methods.
  • cells expressing the target antigen (target cells) and effector cells that kill the target cells are used. Effector cells recognize the Fc region of an antibody bound to a target cell via Fc ⁇ receptor. The signal transmitted from the Fc ⁇ receptor causes the effector cell to kill the target cell.
  • human NK cells are used as effector cells.
  • Human NK cells can be prepared from human peripheral blood mononuclear cells (PMBC) by known methods. Alternatively, PBMC can be used as effector cells as they are.
  • LAG-3 antibody reduces the number of LAG-3 positive cells in one embodiment, preferably in vivo (in vivo).
  • the number of LAG-3 positive cells is reduced in vivo, and more preferably the number of LAG-3 positive cells is reduced in vivo in a low fucose form.
  • LAG-3 positive cells include cells in which LAG-3 is forcibly expressed, cells in which LAG-3 expression is induced by stimulation, etc. However, cells that express LAG-3 are limited thereto I will not.
  • the number of LAG-3 positive cells can be counted by standard methods, for example, flow cytometry.
  • the “low fucose form” means that (i) the amount of fucose (fucose residue) in the N-glycosidic bond complex type sugar chain bound to a certain antibody or a binding fragment thereof is the original (parent) An amount less than the amount of fucose (fucose residue) in the N-glycosidic bond complex-type sugar chain bound to the antibody or binding fragment thereof, (ii) N-glycoside bound to an antibody or binding fragment thereof A form in which the amount of fucose (fucose residue) in the conjugated complex-type sugar chain is smaller than the amount of fucose (fucose residue) in the N-glycosidic-linked complex-type carbohydrate which is naturally bound to the antibody or its binding fragment Or (iii) a sugar chain containing fucose (fucose residue) or fucose (fucose residue) in the N-glycosidic bond complex-type
  • fucose residue in the N-glycosidic-linked complex-type sugar chain linked to a certain modified antibody or binding fragment thereof is small compared to that before such modification, such a modified antibody or It is understood that the binding fragment is in "low fucose form".
  • Modified form hLA212_H4 / L2 of the humanized antibody described later is also an embodiment of the antibody in the low fucose form.
  • the antibody or binding fragment in the low fucose form has a high affinity for Fc ⁇ receptor IIIA and a strong ADCC activity, as compared to those not in the low fucose form.
  • the LAG-3 antibody has an encephalomyelitis inhibitory activity in one embodiment, and preferably in vivo In vivo, it has experimental autoimmune encephalomyelitis inhibitory activity, and more preferably it has experimental autoimmune encephalomyelitis inhibitory activity in vivo in a low fucose form.
  • experimental autoimmune encephalomyelitis is caused by injection of a peptide derived from MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein), which is one of central myelin constituent proteins, into mice together with Freund's Adjuvant into mice. Means flame.
  • MOG Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein
  • the experimental autoimmune encephalomyelitis inhibitory activity can be measured by daily observation of a clinical score reflecting the degree of paralysis.
  • the clinical score can be set, for example, as follows: Score 0: no symptoms, score 1: tail weakness, score 2: gait abnormality, loss of righting reflex, score 3: hindlimb paralysis, score 4: forelimb Partial paralysis, score 5: death or euthanasia.
  • the LAG-3 antibody binds to human activated T cells, preferably to LAG-3 positive activated human T cells Join.
  • the binding of the antibody to activated human activated T cells can be measured or detected, for example, by flow cytometry.
  • human LAG-3 and human MHC Class II Molecules Bind in the Presence of Antibody
  • human LAG-3 and human MHC class II molecules bind in the presence of antibody
  • LAG-3 antibody does not inhibit the binding of human LAG-3 and human MHC class II molecules.
  • the binding of the fusion protein of the extracellular region of LAG-3 molecule and the Fc portion of IgG to Raji cells that endogenously express MHC class II molecules over and above is evaluated by measuring or detecting, for example, by flow cytometry. can do.
  • Human LAG-3 exerts human T cell suppressive function in the presence of antibody
  • human LAG-3 exerts human T cell suppressive function in the presence of LAG-3 antibody in the present invention Play.
  • T cell suppressive function means reduction or suppression of the amount of cytokine produced upon stimulation of T cells.
  • T cell suppression function by human LAG-3 can be measured, for example, by quantifying a cytokine produced upon stimulation of human T cells to induce LAG-3 expression.
  • stimulation of human T cells is not particularly limited. It is possible to use Staphylococcal Enterotoxin B, stimulation by cells derived from another donor with different MHC, and the like.
  • cytokines include cytokines produced from activated T cells, preferably various interleukins and interferons, and more preferably interleukin 2 (IL-2) and interferon ⁇ .
  • the present invention provides an anti-LAG-3 monoclonal antibody and a binding fragment thereof.
  • monoclonal antibodies include rat antibodies, mouse antibodies, rabbit antibodies, chicken antibodies, monoclonal antibodies derived from non-human animals such as fish antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, their binding fragments, modified products thereof, etc. included.
  • examples of rat monoclonal antibodies include rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264 and the like.
  • RLA204 is an anti-human LAG-3 rat monoclonal antibody obtained by the method described in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of rLA204 is set forth in SEQ ID NO: 1 (FIG. 16) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 2 (FIG. 17).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of rLA204 is set forth in SEQ ID NO: 3 (FIG. 18) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 4 (FIG. 19).
  • the amino acid sequence of CDRH1 of rLA204 is SEQ ID NO: 41 (FIG. 56), the amino acid sequence of CDRH2 is SEQ ID NO: 42 (FIG.
  • the amino acid sequence of CDRH3 is SEQ ID NO: 43 (FIG. 58)
  • the amino acid sequence of CDRL1 is the sequence The amino acid sequence of CDR L2 is described in SEQ ID NO: 45 (FIG. 60), and the amino acid sequence of CDR L3 in SEQ ID NO: 46 (FIG. 61), respectively.
  • RLA212 is an anti-human LAG-3 rat monoclonal antibody obtained by the method described in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of rLA212 is set forth in SEQ ID NO: 5 (FIG. 20) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 6 (FIG. 21).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of rLA212 is set forth in SEQ ID NO: 7 (FIG. 22) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 8 (FIG. 23).
  • the amino acid sequence of CDRH1 of rLA212 is SEQ ID NO: 47 (FIG. 62), the amino acid sequence of CDRH2 is SEQ ID NO: 48 (FIG.
  • the amino acid sequence of CDRH3 is SEQ ID NO: 49 (FIG. 64)
  • the amino acid sequence of CDR L1 is the sequence The amino acid sequence of CDR L2 is described in SEQ ID NO: 51 (FIG. 66), and the amino acid sequence of CDR L3 in SEQ ID NO: 52 (FIG. 67), respectively.
  • RLA 225 is an anti-human LAG-3 rat monoclonal antibody obtained by the method described in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of rLA225 is set forth in SEQ ID NO: 9 (FIG. 24) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 10 (FIG. 25).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of rLA225 is set forth in SEQ ID NO: 11 (FIG. 26) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 12 (FIG. 27).
  • the amino acid sequence of CDRH1 of rLA225 is SEQ ID NO: 53 (FIG. 68), the amino acid sequence of CDRH2 is SEQ ID NO: 54 (FIG.
  • the amino acid sequence of CDRH3 is SEQ ID NO: 55 (FIG. 70)
  • the amino acid sequence of CDR L1 is the sequence
  • the amino acid sequence of CDRL2 is set forth in SEQ ID NO: 57 (FIG. 72)
  • the amino acid sequence of CDRL3 is set forth in SEQ ID NO: 58 (FIG. 73) at 56 (FIG. 71).
  • RLA869 is an anti-human LAG-3 rat monoclonal antibody obtained by the method described in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of rLA869 is set forth in SEQ ID NO: 13 (FIG. 28) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 14 (FIG. 29).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of rLA869 is set forth in SEQ ID NO: 15 (FIG. 30) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 16 (FIG. 31).
  • the amino acid sequence of CDRH1 of rLA869 is SEQ ID NO: 59 (FIG. 74), the amino acid sequence of CDRH2 is SEQ ID NO: 60 (FIG.
  • the amino acid sequence of CDRH3 is SEQ ID NO: 61 (FIG. 76)
  • the amino acid sequence of CDR L1 is the sequence
  • the amino acid sequence of CDRL2 is set forth in SEQ ID NO: 63 (FIG. 78) and the amino acid sequence of CDRL3 is set forth in SEQ ID NO: 64 (FIG. 79) at number 62 (FIG. 77).
  • RLA1264 is an anti-human LAG-3 rat monoclonal antibody obtained by the method described in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of rLA1264 is set forth in SEQ ID NO: 17 (FIG. 32) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 18 (FIG. 33).
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of rLA1264 is set forth in SEQ ID NO: 19 (FIG. 34) and the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 20 (FIG. 35).
  • the amino acid sequence of CDRH1 of rLA1264 is SEQ ID NO: 65 (FIG. 80), the amino acid sequence of CDRH2 is SEQ ID NO: 66 (FIG.
  • the amino acid sequence of CDRH3 is SEQ ID NO: 67 (FIG. 82)
  • the amino acid sequence of CDR L1 is the sequence
  • the amino acid sequence of CDRL2 is set forth in SEQ ID NO: 69 (FIG. 84) and the amino acid sequence of CDRL3 is set forth in SEQ ID NO: 70 (FIG. 85) at number 68 (FIG. 83).
  • anti-human LAG-3 monoclonal antibodies examples include anti-human LAG-3 mouse antibody A9H12 (see WO2008 / 132601) and the like.
  • antibody variants preferably have reduced sensitivity to degradation or oxidation of proteins, improved biological activity, improved antigen binding ability, or impart of physicochemical properties or functional properties, etc. .
  • antibody variants include antibodies having an amino acid sequence in which one or more, preferably one to several amino acids in the amino acid sequence possessed by the antibody are conservatively substituted. Conservative amino acid substitutions are those that occur within a group of amino acids that are related to amino acid side chains.
  • amino acid substitution in such antibody variants is preferably performed within the range that does not reduce the antigen binding activity of the original (parent) antibody.
  • Aspartic acid contained in the protein is easily converted to isoaspartic acid by isomerization when the amino acid linked to the C-terminal side has a small side chain, while deamidating to aspartic acid in the case of asparagine It is susceptible to conversion and may be further converted to isoaspartic acid by isomerization. If such isomerization or deamidation proceeds, protein stability may be affected. Therefore, in order to avoid such isomerization and deamidation, aspartate and asparagine in the protein or amino acids adjacent thereto can be substituted with other amino acids. It is preferable that the antibody variant in which such amino acid substitution has been made retains the antigen binding activity possessed by the original antibody.
  • Antibody variants having an amino acid sequence in which conservative amino acid substitution has been made in the amino acid sequence possessed by rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264 or A9H12 of the present invention, and rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, LA2264 or A9H12 are derived from A mouse antibody, a rat antibody, a chimerized antibody, a humanized antibody, a human antibody and the like comprising the CDR having an amino acid sequence having a conservative amino acid mutation in any amino acid sequence of CDRH1 to CDRH3 and CDRL1 to CDRL3 are also disclosed in the present invention. Is included.
  • a variant of an antibody comprising CDRH1 to CDRH3 and CDRL1 to CDRL3 having an amino acid sequence in which one or two, and optimally one amino acid is substituted by another amino acid, and human LAG-3 Those that bind to are included in the variants of the antibody of the present invention.
  • antibodies having CDRH1 to CDRH3 and CDRL1 to CDRL3 derived from a plurality of antibodies are also included in antibody variants.
  • antibody variants derived from an antibody with only CDRH3, and CDRH1 and CDRH2 and CDRL1 to CDRL3 derived from another antibody.
  • antibody variants are also encompassed in the term "antibody".
  • the constant region of the antibody in the present invention is not particularly limited, but as LAG-3 antibody for cytotoxic T cell depletion, human antibody is preferably used.
  • heavy chain constant regions of human antibodies include C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ and the like.
  • light chain constant regions of human antibodies include CC, C ⁇ , and the like.
  • the anti-LAG-3 chimerized antibody or binding fragment thereof used in the present invention comprises (3-2) and (3-3), preferably in addition thereto (3-4) More preferably, in addition to (3-5), and even more preferably (3-2) to (3-8), all have the properties, functions, activities and the like described in the foregoing.
  • the heavy chain nucleotide and amino acid sequences and light chain nucleotide and amino acid sequences of cLA 212 exemplified as rat-human chimerized antibodies of the present invention are shown in SEQ ID NOs: 23, 24, 25 and 26 (FIGS. 38, 39, 40 and 41). Respectively.
  • Nucleotide numbers 1 to 57 in the nucleotide sequence of the heavy chain and amino acids 1 to 19 in the amino acid sequence of the heavy chain are signal sequences, and are usually included in the nucleotide and amino acid sequences of most mature heavy chains, respectively. Absent.
  • nucleotide numbers 1 to 60 in the nucleotide sequence of the light chain and amino acids 1 to 20 in the amino acid sequence of the light chain are signal sequences, and usually the nucleotide and amino acid sequences of most mature light chains Not included.
  • rat-human chimeric antibodies cLA204, cLA225, cLA869 and cLA1264 have been described elsewhere.
  • IMP 731 chimeric type A9H12: see WO2008 / 132601 which is a mouse-human chimera of anti-human LAG-3 mouse antibody A9H12 can be exemplified.
  • the antibody used in the present invention may be a binding fragment of anti-LAG-3 antibody.
  • the binding fragment of an antibody means a fragment which retains at least a part of the function of the antibody.
  • Such antibody functions generally include an antigen binding activity, an activity that regulates the activity of an antigen, an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity, and the like.
  • Binding fragments of suitable anti-LAG-3 antibodies for use in the present invention are (3-2) and (3-3), preferably in addition thereto (3-4), more preferably in addition thereto (3-5), and even more preferably all of (3-2) to (3-8) have the properties, functions, activities, etc. described in (5).
  • the binding fragment of the antibody is not particularly limited as long as it is a fragment of the antibody that retains at least a part of the activity of the antibody, and examples thereof include Fab, F (ab ') 2, Fv, heavy chain and light Single chain Fv (scFv), diabody (diabodies), linear antibody, and multispecific antibody formed from antibody fragment, F (ab ') 2 formed by linking chain Fv with appropriate linker under reducing conditions
  • Fab 'and the like which are monovalent fragments of the variable region of the treated antibody, it is not limited thereto.
  • a molecule containing a portion other than a fragment of an antibody, such as a scFv having a linker portion is also included in the meaning of a binding fragment of an antibody.
  • a molecule in which one to several or more amino acids and / or carboxy terminal amino acids of the antibody protein are deleted and which retains at least a part of the function of the antibody is also a binding fragment of the antibody Included in the meaning.
  • the lysine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain of an antibody produced in mammalian cultured cells is deleted (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), It is known that glycine at the carboxyl terminus of the chain and two amino acid residues of lysine are deleted and that a proline residue newly located at the carboxyl terminus is amidated (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007) ).
  • deletions and modifications of these heavy chain sequences do not affect the antigen binding ability and effector functions (such as complement activation and antibody-dependent cellular cytotoxicity) of the antibody. Modifications of such antibody binding fragments are also encompassed in the antibody or its binding fragments, or modifications thereof (described later).
  • the antibody or binding fragment thereof may be a multispecific antibody having specificity for at least two different antigens.
  • a multispecific antibody is not limited to a bispecific antibody that binds to two different antigens, and an antibody having specificity for three or more different antigens is also a subject of the present invention. Within the meaning of "antibody” is included.
  • the multispecific antibodies of the invention may be full length antibodies or binding fragments thereof (e.g. F (ab ') 2 bispecific antibodies).
  • Bispecific antibodies can also be made by linking the heavy and light chains (HL pair) of the two antibodies. Alternatively, they can be obtained by fusing two or more types of hybridomas producing monoclonal antibodies to produce bispecific antibody-producing fusion cells (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537). -539). Multispecific antibodies can also be prepared by similar methods.
  • the LAG-3 antibody in the present invention is a single chain antibody (hereinafter referred to as "scFv").
  • the scFv is obtained by linking the heavy chain V region and the light chain V region of an antibody with a polypeptide linker (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, edited by Rosenburg and Moore, Springer Verlag, New York, p. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136).
  • a BiscFv produced by linking two scFvs with a polypeptide linker can be used as a bispecific antibody.
  • MultiscFv can also be used as a multispecific antibody from three or more scFv.
  • single chain immunoglobulin full chain immunoglobulin in which the full-length sequences of antibody heavy and light chains are linked using an appropriate linker is included (Lee, HS, et al., Molecular Immunology (1999) 36, p. 61-71; Shirrmann, T. et. Al., MAbs (2010), 2, (1) p. 1-4).
  • Such single-chain immunoglobulins can retain their structure and activity similar to that of an antibody that is originally tetramer by dimerizing.
  • the antibody may be an antibody having a single heavy chain variable region and no light chain sequence.
  • Such an antibody is called a single domain antibody (sdAb) or a nanobody, and it has been reported that the antigen binding ability is maintained (Muyldemans S. et. Al. , Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. Al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). These antibodies are also included in the meaning of functional fragments of antibodies.
  • the present invention provides a humanized antibody or a binding fragment thereof.
  • Preferred humanized anti-LAG-3 antibodies or binding fragments thereof for use in the present invention are (3-2) and (3-3), preferably in addition thereto (3-4), more preferably In addition to them, (3-5), and even more preferably (3-2) to (3-8) all have the properties, functions, activities and the like described in the above.
  • Suitable humanized antibodies for use in the present invention include the CDRH1 to CDRH3 and light chains of the heavy chain of rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, A9H12 or H5L7, as described in AF below. And humanized antibodies having CDRL1 to CDRL3 of
  • the humanized anti-LAG-3 antibody or binding fragment thereof of the present invention includes, for example, CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 (FIG. 56), CDRH2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 (FIG. 57) And a heavy chain having a variable region containing CDRH3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43 (FIG. 58), and CDR L1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 (FIG.
  • B A humanized antibody having CDRH1 to CDRH3 of the heavy chain of the rLA212 antibody and CDRL1 to CDRL3 of the light chain
  • CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 (FIG. 63)
  • a heavy chain having a variable region containing CDRH3 consisting of the amino acid sequence shown in CDRH2 and SEQ ID NO: 49 (FIG. 64)
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50 (FIG.
  • a light chain having a variable region comprising CDRL2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52 and CDRL3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52 (FIG. 67), and a humanized antibody or binding fragment thereof that recognizes LAG-3 protein Or variants thereof.
  • CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 53 (FIG. 68), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 (FIG. 69)
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 56 (FIG.
  • a humanized antibody having CDRH1 to CDRH3 of the heavy chain of the D. rLA869 antibody and CDRL1 to CDRL3 of the light chain Furthermore, as another humanized anti-LAG-3 antibody or a binding fragment thereof, for example, CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59 (FIG. 74), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60 (FIG. 75)
  • CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59 (FIG. 74), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60 (FIG. 75)
  • a heavy chain having a variable region containing CDRH3 consisting of the amino acid sequence shown in CDRH2 and SEQ ID NO: 61 (FIG. 76), and CDRL1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 (FIG.
  • CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65 (FIG. 80), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66 (FIG. 81)
  • a light chain having a variable region comprising CDRL2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70 and CDRL3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70 (FIG. 85), and a humanized antibody or binding fragment thereof that recognizes LAG-3 protein Or variants thereof.
  • a humanized antibody or a binding fragment thereof that recognizes LAG-3 protein or a variant thereof can be mentioned, which comprises CDRH1 to CDRH3 and CDRL1 to CDRL3 contained in A9H12 antibody or H5L7 antibody.
  • Preferred humanized antibodies for use in the present invention include those described above A to F, and examples of more suitable humanized antibodies include hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, hLA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L5 And hLA212_H4 / L2 (see [i] to [x] below) and humanized versions of IMP 731 H5L7, H1L7, J7L7, H4L7, J11L7, H2L7, J13L7, H7L7, J0L7, H0L7 and H5L7BW (Patent Document 2) And the like, but not limited thereto, for example, any of hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, hLA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L5, hLA212_H4 / L2, H5L7 and H5L7BW
  • [I] [1 of 1] hLA212_H3 / L2 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 29 (FIG. 44), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45)
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 33 (FIG. 48) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 34 (FIG. 49).
  • the antibody is a composition suitable for cytotoxic T cell depletion according to the present invention, a method for treating or preventing cytotoxic T cell related diseases, physical properties suitable for use for treatment or prophylaxis (data not shown), (3 -2), and the LAG-3 binding activity described in (3-3) and the in vitro ADCC activity and the properties described in (3-8), that is, human LAG-3 suppresses human T cells in the presence of the antibody It can be evaluated, for example, by the method described in the examples that the function is exhibited (see examples) and the activities, properties and the like described in (3-4) to (3-7).
  • hLA212_H4 / L2 is a glycosylated modified humanized antibody obtained in Example 8 and is one of hLA212_H3 / L2 in a low fucose form.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 29 (FIG. 44), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45)
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 33 (FIG.
  • the antibody is a composition suitable for cytotoxic T cell depletion according to the present invention, a method for treating or preventing cytotoxic T cell related diseases, physical properties suitable for use for treatment or prophylaxis (data not shown), (3 LAG-3 binding activity described in (2) to (3-6), in vitro ADCC activity, LAG3-positive cell number reducing activity, experimental autoimmune encephalomyelitis inhibitory activity and human activated T cell binding activity And having the properties described in (3-7), that is, in the presence of the antibody, human LAG-3 and human MHC class II molecules bind (see Examples), and the properties described in (3-8), that is, the presence of the antibody
  • the ability of human LAG-3 to exert a human T cell suppressive function can be evaluated, for example, by the method described in the Examples.
  • [Ii] hLA212_H2 / L1 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 27 (FIG. 42), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 (SEQ ID NO: 28) (FIG. 43).
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 31 (FIG. 46) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO 32 (FIG. 47).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [Iii] hLA212_H3 / L3 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 29 (FIG. 44), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45)
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 35 (FIG. 50) (the variable region is 61 to 387), and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 36 (FIG. 51).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [Iv] hLA212_H2 / L2 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 27 (FIG. 42), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 (SEQ ID NO: 28) (FIG. 43).
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 33 (FIG. 48) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 34 (FIG. 49).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [V] hLA212_H2 / L3 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 27 (FIG. 42), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 (SEQ ID NO: 28) (FIG. 43).
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 35 (FIG. 50) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 36 (FIG. 51).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [Vi] hLA212_H2 / L4 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 27 (FIG. 42), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 (SEQ ID NO: 28) (FIG. 43).
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 37 (FIG. 52) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 38 (FIG. 53).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [Vii] hLA212_H2 / L5 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 27 (FIG. 42), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 (SEQ ID NO: 28) (FIG. 43).
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 39 (FIG. 54) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 40 (FIG. 55).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [Viii] hLA212_H3 / L1 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 29 (FIG. 44), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45) Among them, the variable region is 20 to 140), the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 31 (FIG. 46) (the variable region is 61 to 387), and the amino acid sequence is SEQ ID NO 32 (FIG. 47).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [Ix] hLA212_H3 / L4 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 29 (FIG. 44), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45) Among them, the variable region is 20 to 140), the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 37 (FIG. 52) (the variable region is 61 to 387), and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 38 (FIG. 53).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG-3 binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity suitable for the composition of the present invention, treatment or prevention etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in (see Examples) and (3-4) to (3-8).
  • [X] hLA212_H3 / L5 is the humanized antibody obtained in Example 6.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain of the antibody is nucleotide number 58 to 1410 (including the variable region 58 to 420) of SEQ ID NO: 29 (FIG. 44), and the amino acid sequence is amino acid number 20 to 470 of SEQ ID NO: 30 (FIG. 45)
  • the variable region is 20 to 140
  • the nucleotide sequence of the light chain is nucleotide number 61 to 702 of SEQ ID NO: 39 (FIG. 54) (the variable region is 61 to 387)
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 40 (FIG. 55).
  • Amino acid numbers 21 to 234 (of which variable regions are 21 to 129), respectively.
  • the antibody has physical properties (data not shown), LAG3-binding activity described in (3-2) and (3-3) and in vitro ADCC activity (the data are not shown) suitable for the composition of the present invention, etc. It can be evaluated, for example, by the method described in Examples, that the activity, properties and the like described in Examples) and (3-4) to (3-8).
  • the activities described in (3-4) and (3-5) can be preferably evaluated in a low fucose form.
  • "physical properties" refers to the stability of an antibody used in the present invention and a binding fragment thereof etc., and can be evaluated using a known index. Thermal stability, storage stability, etc. can be raised as the stability as a product, and Tm values derived from thermograms, changes in antigen binding activity under storage conditions or accelerated deterioration conditions, or aging over time as their indices Change can be raised.
  • the antibodies used in the present invention have safety suitable for treatment or prevention of cytotoxic T cell depletion, cytotoxic T cell related diseases (as defined elsewhere), etc. Is desirable.
  • hLA212_H3 / L2, hLA212_H2 / L1, hLA212_H3 / L3, hLA212_H3 / L6, hLA212_H4 / L2 are more preferred.
  • H5L7 and H5L7BW are more preferred.
  • HLA212_H2 / L1 to H2 / L5, hLA212_H3 / L1 to H3 / L5, hLA212_H4 / L2, H5L7 and H5L7BW, etc. which are included in the range of more preferable humanized anti-LAG-3 antibodies used in the present invention
  • amino acid sequences FRL1 to FRL4 a heavy chain consisting of an amino acid sequence in which one to several, preferably one or two amino acids are substituted with another amino acid, and a light chain amino acid sequence FRH1 to FRH4 And a light chain consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids, preferably 1 to 14 amino acids in any number, are substituted with other amino acids.
  • the first amino acid of FRL1 ie, the first amino acid of the mature variable region (sequence The amino acid corresponding to the position 32 of FIG. 32 or FIG. 47 is Asp or Asn, the 11th amino acid of FRL1, ie, the 11th amino acid of the mature variable region (SEQ ID NO: 32 or 31 of FIG.
  • Amino acid corresponding to the position is Leu or Met
  • amino acid 13 of FRL1 ie, amino acid 13 corresponding to the position 33 of SEQ ID NO: 32 or FIG. 47
  • amino acid 21 of FRL1 ie, amino acid 21 of the mature variable region
  • the amino acid corresponding to the position 32 of FIG. 32 or FIG. 47 is Ile or Met
  • the amino acid 4 of FRL2 ie, the amino acid 38 of the mature variable region (SEQ ID NO 32 or 58 of FIG. 47).
  • Amino acid corresponding to the position is Gln or Lys
  • amino acid 9 of FRL2 ie, amino acid 43 of the mature variable region (amino acid corresponding to position 63 of SEQ ID NO: 32 or FIG. 47) is Ala or Ser
  • Amino acid number 4 of FRL3 ie, amino acid number 60 of the mature variable region (amino acid corresponding to position 80 in SEQ ID NO: 32 or FIG. 47) is Ser or Asp
  • Amino acid number 65 of the mature variable region is Ser or Gly. No. 11 of FRL3, ie, amino acid No.
  • 67 of the mature variable region is Ser or Tyr, and amino acid No. 22 of FRL3, ie mature
  • the 78th amino acid of the variable region (the amino acid corresponding to the position 98 of SEQ ID NO: 32 or FIG. 47) is Leu or Val, and the 27th amino acid of FRL3, ie, the 83rd amino acid of the mature variable region (SEQ ID NO:
  • the amino acid corresponding to the position 32 of FIG. 32 or FIG. 47 is Phe or Ala, the 29th amino acid of FRL3, ie, the 85th amino acid of the mature variable region (the position 105 of SEQ ID NO: 32 or FIG.
  • Amino acid (Thr) or Phe corresponding to (SEQ ID
  • the amino acid (the amino acid corresponding to the position 124 of SEQ ID NO: 32 or FIG. 47) is Val or Leu, the 9th amino acid of FRL4, ie, the 106th amino acid of the mature variable region (SEQ ID NO: 32 or FIG.
  • the amino acid corresponding to the position 126) is Ile or Leu.
  • amino acid No. 49 of FRH2, ie, amino acid 49 of the mature variable region amino acid No. 49 of FRH2, ie, amino acid 49 of the mature variable region (sequence
  • the amino acid corresponding to position 68 of FIG. 28 or FIG. 43 is Gly or Ala
  • the 25th amino acid of FRH3, ie, the 84th amino acid of the mature variable region SEQ ID NO: 28 or 103 of FIG. 43
  • the amino acid (corresponding to the position) is Asn or Asp.
  • RLA204, rLA225, rLA826, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869, rLA1264 and A9H12 of the present invention and humanized hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, hLA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L5, L5
  • the amino acid sequence of the full or variable region of the heavy chain and / or light chain of any one of H5L7BW and H5L7BW, respectively, 80% or more, 82% or more, 84% or more, 86% or more, 88% or more, 90% or more % Or more, 92% or more, 94% or more, 96% or more, 98% or more or 99% or more of the heavy chain and / or light chain containing the same amino acid sequence, and which binds to LAG-3 or the binding thereof Fragments are also present invention It is included.
  • Such sequence identity is preferably at least 94%, more preferably at least 96%, even more preferably at least 98%, optimally at least 99%.
  • their antibodies or binding fragments thereof are preferably (3-2) and (3-3), preferably in addition to (3-4), more preferably in addition to (3-5), Even more preferably, all of (3-2) to (3-8) have the properties, functions, activities and the like described in the above.
  • the identity or homology between the two amino acid sequences can be determined from Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • Blast algorithm can also be used, for example, by accessing http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ on the Internet.
  • the present invention rLA 204, rLA 212, rLA 825, rLA 1264, cLA 204, cLA 212, cLA 225, cLA 869, cLA 1264 and A9H12, and hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, hLA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L7, HLhLh, HLhLh, HLhLhLhHh 1 to 50, 1 to 45, 1 to 40, 1 to 35, 1 to 30 in the amino acid sequence of the full length or variable region of the heavy chain and / or light chain of any one of 1 to 25 1 to 20 1 to 15 1 to 10 1 to 8 1 to 6 1 to 5 1 to 4 1 to 3 1 or 2
  • single amino acid substitutions, deletions, And / or insert comprises a heavy chain and / or light chain comprising an amino acid sequence comprising, and antibodies or binding fragments thereof that bind to L
  • Such amino acid mutations are preferably substitutions, and the number of amino acids to be mutated is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 3, still more preferably Is one or two, optimally one.
  • their antibodies or binding fragments thereof are preferably (3-2) and (3-3), preferably in addition to (3-4), more preferably in addition to (3-5) And even more preferably all of the properties, functions, activities and the like described in (3-2) to (3-8).
  • the present invention provides a human antibody or a binding fragment thereof.
  • the human antibody or binding fragment thereof is not particularly limited as long as it is a human-derived antibody or binding fragment thereof which binds to LAG-3, but (3-2) and (3-3), preferably In addition to (3-4, more preferably in addition to (3-5), still more preferably (3-2) to (3-8), all of the properties, functions, activities, etc. described in Each has.
  • antibody that binds to the same site as the antibody used in the present invention can also be used in the present invention.
  • an antibody that binds to the same site as an antibody refers to another antibody that binds to a site on an antigen molecule that the antibody recognizes. If the second antibody binds to the partial peptide or partial conformation on the antigen molecule to which the first antibody binds, it can be determined that the first antibody and the second antibody bind to the same site.
  • the second antibody competes for the binding of the first antibody to the antigen, ie confirming that the second antibody interferes with the binding of the first antibody to the antigen, the peptide sequence of the specific binding site or Even if the three-dimensional structure has not been determined, it can be determined that the first antibody and the second antibody bind to the same site. Furthermore, when the first antibody and the second antibody bind to the same site, and the first antibody has an effect such as ADCC activity, the probability that the second antibody has similar activity is extremely high. Therefore, if the second anti-LAG-3 antibody binds to the binding site of the first anti-LAG-3 antibody, it is determined that the first antibody and the second antibody bind to the same site on the LAG-3 protein be able to.
  • the second anti-LAG-3 antibody competes with the binding of the first anti-LAG-3 antibody to the LAG-3 protein, then the first antibody and the second antibody form LAG-3 protein It can be determined that the antibody binds to the same site of
  • antibodies that bind to a site on LAG-3 protein that a monoclonal antibody recognizes are also included in antibodies that can be used in the present invention.
  • Such antibodies and their binding fragments are preferably (3-2) and (3-3), preferably in addition to (3-4), more preferably in addition to (3-5), More preferably, all (3-2) to (3-8) have the properties, functions, activities and the like described in the above.
  • the binding site of an antibody can be determined by methods well known to those skilled in the art, such as immunoassays. For example, after preparing a series of peptides in which the amino acid sequence of the antigen is appropriately truncated from the C-terminus or N-terminus, the reactivity of the antibody against them is examined, and after rough recognition sites are determined, shorter peptides are synthesized Binding sites can be determined by examining the reactivities of antibodies to those peptides. Antigen fragment peptides can be prepared using techniques such as gene recombination and peptide synthesis.
  • the binding site of such antibody is determined by using X-ray structural analysis to identify amino acid residues on the antigen adjacent to the antibody. be able to. For example, by combining and crystallizing an antibody or a fragment thereof and an antigen or a fragment thereof and analyzing the structure, amino acid residues on the antigen having an interaction distance with the antibody can be identified.
  • the interaction distance is 8 ⁇ or less, preferably 6 ⁇ or less, and more preferably 4 ⁇ or less.
  • Amino acid residues having an interaction distance with such an antibody may constitute one or more antigen binding sites (epitopes) of the antibody. When two or more such amino acid residues are present, each amino acid may not be adjacent to each other on the primary sequence.
  • the epitope of the LAG-3 antibody in the present invention is present in human LAG-3 or its amino acid sequence.
  • An antibody, a binding fragment thereof or a modified form thereof, which binds to such an epitope, competes with the antibody used in the present invention for binding to such an epitope, or has an interaction distance with such an amino acid residue is also disclosed. It is encompassed in an antibody which can be used in the present invention, a binding fragment thereof or a modified product thereof.
  • the present invention provides a composition comprising a modified form of an antibody or a binding fragment thereof.
  • the modified form of the antibody or its binding fragment means that the antibody or its binding fragment is chemically or biologically modified.
  • Chemical modifications include attachment of chemical moieties to the amino acid backbone, chemical modifications of N-linked or O-linked carbohydrate chains, and the like.
  • Biologically modified forms include post-translational modifications (eg, glycosylation to N- or O-link, N- or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, methionine oxidation) And those obtained by adding a methionine residue at the N-terminus by expression using a prokaryotic host cell.
  • modified antibodies or binding fragment thereof is useful for improving the stability and retention in blood of the original antibody or binding fragment thereof, reducing antigenicity, detecting or isolating such an antibody or antigen, etc. .
  • Examples of the chemical moiety contained in the chemical modification can include water-soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol and the like.
  • Bioly modified products include those modified by enzyme treatment or cell treatment, fusions to which other peptides such as tags have been added by genetic recombination, and endogenous or foreign sugar chain modifying enzymes Cells prepared using as a host cells expressing.
  • Antibody-dependent cytotoxic activity can be enhanced by modulating the glycosylation (glycosylation, defucosification, etc.) bound to the antibody or its binding fragment.
  • glycosylation glycosylation, defucosification, etc.
  • modified forms of antibodies also include antibodies in which the sugar chain modification has been adjusted.
  • Such modifications may be made at any position in the antibody or binding fragment thereof, or at a desired position, and the same or two or more different modifications may be made at one or more positions.
  • modified antibody fragment also includes “fragment of modified antibody” in its meaning.
  • a modified form of an antibody and a modified form of its binding fragment may be simply referred to as "antibody” or "binding fragment of antibody”.
  • antibody or "binding fragment of antibody”.
  • hLA212_H4 / L2 is the humanized antibody with modified sugar chain modification obtained in Example 8.
  • humanized antibodies are also encompassed in the antibodies that can be used in the present invention.
  • the antibody, binding fragment thereof and modified form thereof which can be used in the present invention are preferably compositions for cytotoxic T cell depletion of the present invention, treatment or prevention of cytotoxic T cell related diseases. And physical properties, pharmacokinetics, retention in blood, safety, etc. suitable for use for treatment or prevention.
  • a LAG-3 antibody that can be used for cytotoxic T cell depletion is preferably an ADCC activity, a CDC activity and / or an ADCP for LAG-3 expressing cells. It is an antibody that exhibits cytotoxic activity such as activity, more preferably a LAG-3 antibody with enhanced ADCC activity, CDC activity and / or ADCP activity.
  • LAG-3 antibodies in which the ADCC activity has been enhanced by hypofucosification, afucosylation, etc., ie, LAG-3 antibodies in a hypofucose form include hLA212_H4 / L2, H5L7BW, etc.
  • LAG-3 antibody against cytotoxic T cells can be evaluated based on assays known in the art, and described in Examples 13 and 14 as in vitro assays, in vivo As the assay of the above, those described in Example 11-1) can be exemplified, but are not limited thereto.
  • An antigen for producing an anti-LAG-3 antibody can be prepared according to the method for preparing natural or recombinant LAG-3 protein described in the other part of the present invention, etc. It can be acquired. Antigens that can be prepared as such include LAG-3 protein or a LAG-3 protein fragment comprising at least 6 consecutive partial amino acid sequences thereof, or to which any amino acid sequence or carrier is added. Derivatives and the like (hereinafter collectively referred to as "LAG-3 antigen": the same as "LAG-3 protein”) can be mentioned.
  • a recombinant LAG-3 antigen is prepared by introducing a gene containing a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence possessed by LAG-3 antigen into a host cell and recovering the antigen from a culture of the cell. Can. Such recombinant antigens may be fusion proteins with other proteins such as immunoglobulin Fc regions.
  • the recombinant LAG-3 antigen also includes the LAG-3 antigen obtained in a cell-free system by a gene containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the LAG-3 antigen by an in vitro translation system. .
  • Non-recombinant LAG-3 antigen can be purified and isolated from cells expressing LAG-3.
  • an anti-LAG-3 monoclonal antibody that exerts the T cell function suppressive function of LAG-3 even in the presence or does not suppress or inhibit the T cell functional suppressive function of LAG-3
  • LAG-3 mutants in which immunoglobulin-like domains 1 and 2 have been deleted can be used.
  • a culture step of a hybridoma As necessary, (g) a culture step of a hybridoma, a breeding step of an animal to which a hybridoma is transplanted, and the like, and (h) a measurement step / judging step of biological activity of a monoclonal antibody are added.
  • the method for producing a monoclonal antibody is described in detail below along the above steps, but the method for producing the antibody is not limited thereto, and for example, antibody-producing cells other than splenocytes can also be used.
  • step (B) Step of Preparing Antibody-Producing Cells
  • the antigen obtained in step (a) is mixed with Freund's complete or incomplete adjuvant or an adjuvant such as potassium alum to immunize experimental animals as an immunogen.
  • animals used in known hybridoma production methods can be used without problems. Specifically, for example, mice, rats, goats, sheep, cattle, horses and the like can be used. However, it is preferable to use a mouse or a rat as an animal to be immunized from the viewpoint of the availability of myeloma cells to be fused with the antibody-producing cells that have been extracted.
  • mice and rats to be actually used are not particularly limited, and in the case of mice, for example, A, AKR, BALB / c, BALB / c An NCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L , DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIII, SJL, SWR, WB, 129 etc., in the case of a rat, for example, Wistar, Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN, Fischer, etc. can be used.
  • mice and rats can be obtained, for example, from Nippon Crea, Japan Charles River, etc. from laboratory animal breeding dealers.
  • the BALB / c strain in mice and the Wistar and Low strains in rats are particularly preferable as the animals to be immunized, in consideration of fusion compatibility with the later-described myeloma cells.
  • mice in which the biological mechanism for removing autoantibodies has been reduced that is, autoimmune disease mice, in consideration of the homology between human and mouse antigens.
  • the age of these mice or rats at the time of immunization is preferably 5 to 12 weeks, and more preferably 6 to 8 weeks.
  • antibody titer measurement methods include immunoassays such as RIA method and ELISA method, but are not limited to these methods.
  • Antibody-producing cells derived from spleen cells or lymphocytes isolated from immunized animals are described, for example, by Kohler et al. , Nature (1975) 256, p. 495 ,; Kohler et al. , Eur. J. Immnol. (1977) 6, p. 511 ,; Milstein et al. , Nature (1977), 266, p. 550 ,; Walsh, Nature, (1977) 266, p. It can be prepared according to known methods such as 495,).
  • spleen cells In the case of spleen cells, a general method may be employed in which the spleen is minced and the cells are filtered through a stainless mesh and suspended in Eagle's minimal essential medium (MEM) or the like to separate antibody-producing cells.
  • MEM Eagle's minimal essential medium
  • (C) Step of preparing myeloma There is no particular limitation on the myeloma cell used for cell fusion, and it can be appropriately selected from known cell lines, but the convenience in selecting hybridomas from fused cells is taken into consideration. Then, the HGPRT (Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) -deficient strain whose selection procedure has been established, that is, X63-Ag8 (X63), NS1-ANS / 1 (NS1), P3X63-Ag8.
  • HGPRT Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase
  • These cell lines can be prepared by using an appropriate culture medium, for example, 8-azaguanine culture medium [RPMI-1640 culture medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamycin, and fetal bovine serum (hereinafter referred to as “FBS”) Added culture medium], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as "IMDM”), or subcultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (hereinafter referred to as "DMEM”)
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • (E) Step of Selecting Hybridoma Group Producing Target Antibody The method of selecting hybridomas obtained by cell fusion is not particularly limited, but usually the HAT (hypoxanthine aminopterin thymidine) selection method (Kohler et al. , Nature (1975) 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p. 550) are used. This method is effective in obtaining hybridomas using myeloma cells of HGPRT-deficient strains that can not survive in aminopterin. That is, by culturing unfused cells and hybridomas in HAT medium, only those hybridomas resistant to aminopterin can be selectively left to grow.
  • HAT hyperxanthine aminopterin thymidine
  • Step of obtaining single cell clone Step of obtaining single cell clone (cloning)
  • a cloning method of a hybridoma for example, known methods such as methyl cellulose method, soft agarose method, limiting dilution method and the like can be used (for example, Barbara, B. M. and Stanley, M. S .: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)), preferably the limiting dilution method.
  • the monoclonal antibodies produced by such hybridomas can be recovered from cultures of the hybridomas. Alternatively, it can be recovered as a recombinant antibody from a culture of cells into which the monoclonal antibody gene has been introduced. In addition, hybridomas can be injected into the peritoneal cavity of mice of the same strain (eg, BALB / cAnNCrj described above) or Nu / Nu mice, and the hybridomas can be recovered from the ascites by growing the hybridomas. (H) Measurement Step / Determination Step of Biological Activity of Monoclonal Antibody Various biological tests can be selected and applied according to the purpose.
  • LAG-3 antibodies By using cells expressing a natural LAG-3 protein, cells expressing a recombinant LAG-3 protein or a fragment thereof as an immunogen, it is possible to LAG-3 antibodies can be prepared.
  • Cells expressing LAG-3 are 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 cells, preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 8 cells, more preferably 0.5 to 2 ⁇ 10 7 cells, even more preferably Although 1 ⁇ 10 7 cells are used for one immunization, the number of cells to be immunized can be changed according to the expression level of LAG-3 protein.
  • Such an immunogen is generally administered intraperitoneally, but can also be administered intradermally.
  • the method described in (4-1-2) can be applied as a method for producing a hybridoma.
  • the antibody used in the present invention includes a nucleotide (heavy chain nucleotide) including a nucleotide sequence encoding the heavy chain amino acid sequence and a nucleotide sequence encoding the light chain amino acid sequence Introducing a nucleotide (light chain nucleotide) or a vector into which such heavy chain nucleotide is inserted and a vector into which the light chain nucleotide is inserted into a host cell, culturing the cell and recovering the antibody from the culture It can be prepared by Heavy chain nucleotides and light chain nucleotides may be inserted into one vector.
  • prokaryotic cells or eukaryotic cells can be used as host cells.
  • eukaryotic cells animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used.
  • mammalian-derived cells ie, monkey-derived COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblast NIH 3 T 3 (ATCC No. CRL-1658), mouse NS0 cell line (ECACC), Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61), its dihydrofolate reductase deficient line (CHOdhfr-: Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1980) 77, p. 4126-4220), CHOK1 SV (Lonza Biologics), cells from birds such as chickens, cells from insects, etc. can be mentioned. .
  • mammalian-derived cells ie, monkey-derived COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblast NIH 3 T 3 (ATCC No
  • cells modified to control sugar chain modification of proteins such as antibodies can also be used as hosts.
  • an antibody using CHO cells modified to reduce or eliminate fucose binding to N-acetylglucosamine at the reducing end of the carbohydrate among N-glycosidic bond complex-type sugar chains binding to the Fc region of the antibody It is possible to prepare a reduced or defucosated antibody (also referred to as a modified antibody) by expressing E. coli (WO 00/61739, WO 02/31140, etc.).
  • yeast etc. can be mentioned, for example.
  • prokaryotic cells examples include Escherichia coli, Bacillus subtilis and the like.
  • an antibody As a signal peptide for secreting an antibody (a monoclonal antibody derived from various animals, a rat antibody, a mouse antibody, a chimerized antibody, a humanized antibody, a human antibody etc.), an antibody of the same type, same type and same type as the said antibody Secretory signal of the antibody as well as the secretory signal of the antibody itself, but of secretory signals of other types or subtypes of antibodies, or secretory signals of proteins from other eukaryotic species or prokaryotes If there is, you can select and use any one.
  • an antibody a monoclonal antibody derived from various animals, a rat antibody, a mouse antibody, a chimerized antibody, a humanized antibody, a human antibody etc.
  • an antibody of the same type, same type and same type as the said antibody Secretory signal of the antibody as well as the secretory signal of the antibody itself, but of secretory signals of other types or subtypes of antibodies, or secretory signals of proteins from
  • the antibodies that can be used in the present invention can further include human antibodies.
  • the anti-LAG-3 human antibody means an anti-LAG-3 antibody consisting of the amino acid sequence of a human-derived antibody.
  • the anti-LAG-3 human antibody is a method using a human antibody-producing mouse having a human genomic DNA fragment containing heavy and light chain genes of human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p Kuroiwa, Y. et. Al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et. Al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.
  • human antibody-producing animals are disrupted by the loci of endogenous immunoglobulin heavy and light chains of non-human mammals, and instead, they are replaced by humans via a yeast artificial chromosome (YAC) vector or the like. It may be a recombinant animal into which immunoglobulin heavy chain and light chain loci have been introduced, or a recombinant animal produced by crossing the animals.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • eukaryotic cells are transformed with a cDNA encoding each of heavy and light chains of such human antibody, preferably a vector containing the cDNA, by genetic recombination technology to produce a recombinant human monoclonal antibody.
  • This antibody can also be obtained from the culture supernatant by culturing transformed cells.
  • eukaryotic cells preferably CHO cells
  • mammalian cells such as lymphocytes and myelomas
  • a method for obtaining a phage display-derived human antibody selected from a human antibody library (Wormstone, IM et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Mé, S. et. Al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena, D. et. Al., Opthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431, etc.) are also known.
  • a phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105) in which the variable region of human antibody is expressed on the phage surface as a single chain antibody (scFv) and phages that bind to the antigen are selected. -1116) can be used.
  • the DNA sequence encoding the variable region of human antibody binding to the antigen can be determined.
  • a human antibody can be obtained by preparing an expression vector having the sequence and introducing it into an appropriate host for expression (WO 92/01047, WO 92 / 20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
  • any single-chain peptide consisting of 12 to 19 residues is used as a polypeptide linker for linking variable regions.
  • the DNA encoding the scFv is a DNA encoding the heavy chain or heavy chain variable region of the antibody, and a DNA encoding the light chain or light chain variable region, all or desired amino acid sequence of those sequences
  • the DNA fragment to be encoded is used as a template and amplified by PCR using a primer pair that defines both ends, and then DNA encoding the polypeptide linker moiety is further ligated to heavy chain and light chain respectively. It is obtained by combining and amplifying the primer pair prescribed in.
  • an expression vector containing the DNA and a host cell transformed with the expression vector can be prepared according to a conventional method, and by culturing the host cell, The scFv can be recovered from such cultures according to methods.
  • Binding fragments of other antibodies can also be obtained by obtaining a gene encoding the binding fragment according to the method described above, introducing it into cells, and recovering the binding fragment from the culture of the cells.
  • the antibodies may be multimerized to increase their affinity for the antigen.
  • the antibody to be multimerized may be a single antibody or multiple antibodies that recognize multiple epitopes of the same antigen. Examples of methods for multimerizing antibodies include binding of an IgG CH3 domain to two scFvs, binding to streptavidin, introduction of a helix-turn-helix motif, and the like.
  • the antibody may be a mixture of multiple types of anti-LAG-3 antibodies differing in amino acid sequence, ie, a polyclonal antibody.
  • the polyclonal antibody can include, for example, a mixture of multiple types of antibodies in which part or all of the CDRs are different.
  • Such polyclonal antibodies can be cocultured from cells producing different antibodies and recovered from the culture (WO 2004/061104). It is also possible to mix separately prepared antibodies.
  • an antiserum which is one embodiment of a polyclonal antibody can be prepared by immunizing an animal with a desired antigen and recovering the serum from the animal according to a conventional method.
  • antibodies conjugated to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the antibody may further be one in which these antibodies and other agents form a conjugate (immunoconjugate).
  • conjugate examples include those in which the antibody is linked to a radioactive substance or a compound having pharmacological activity (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
  • antibodies as exemplified or described in (3-11), (3-14), (4-6), etc., binding fragments thereof, and modified products thereof are defined as “molecules containing antibody or binding fragment thereof” Also called.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity.
  • separation and purification methods used for ordinary proteins may be used.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, polyacrylamide gel electrophoresis for preparation, isoelectric focusing electrophoresis, etc. (Strategies for Protein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (198) )) It is not intended to be limited thereto.
  • Chromatography includes affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like.
  • chromatographies can be performed using liquid phase chromatographies, such as HPLC and FPLC.
  • Examples of columns used for affinity chromatography include protein A column, protein G column, antigen column and the like.
  • Examples of the protein A column include Hyper D (manufactured by Pall Corporation, POROS (manufactured by Applied Systems)), Sepharose F. F. (manufactured by GE Healthcare), and the like.
  • a nucleotide encoding an antibody, a recombinant vector, a recombinant cell A nucleotide encoding an antibody or a binding fragment thereof or a modified form thereof (referred to as “antibody gene”), a recombinant vector into which the gene is inserted, Cells into which a gene or vector has been introduced (referred to as “antibody-transgenic cells”), cells producing other antibodies or binding fragments or modified products thereof (referred to as “antibody-producing cells”) are also for preparing the composition of the present invention used.
  • the antibody gene comprises a nucleotide sequence according to any one of the following (a) to (e) (hereinafter referred to as "antibody gene sequence") or a nucleotide sequence comprising an antibody gene sequence: Consists of or consisting of antibody gene sequences: (A) Rat antibodies rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, and rLA1264 and mouse antibody A9H12, which is a chimeric antibody cLA204, cLA212, cLA225, cLA869, in which the constant regions of their heavy and light chains are replaced with those of human antibodies.
  • the heavy chain amino acid sequence of any one of cLA1264 and chimeric A9H12 (IMP 731) and their humanized hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, LA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L5, H5L7 and H5L7BW is encoded.
  • a chimeric A9H12 (IMP 731), and a heavy chain comprising a CDRH1 to CDRH3 of one of the humanized antibodies hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, LA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L5, H5L7 and H5L7BW
  • C Rat antibodies rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264 and mouse antibody A9H12, a chimeric antibody cLA204, cLA212, cLA225, cLA869, which have constant regions of their heavy and light chains replaced with human antibodies.
  • cLA1264 and chimeric A9H12 (IMP 731), and amino acids of heavy chain variable region of any one of hLA212_H2 / L1 to hLA212_H2 / L5, LA212_H3 / L1 to hLA212_H3 / L5, H5L7 and H5L7BW, which are humanized versions thereof
  • antibody gene is not limited to those described in (a) to (e) above.
  • the antibody or its binding fragment or a modified form thereof comprises the steps of culturing an antibody gene-transduced cell as described in (4-3), and recovering the antibody or its binding fragment or its modified form from the culture And a process for producing the antibody or its binding fragment or a modified form thereof.
  • compositions for cytotoxic T cell depletion comprising an anti-LAG-3 antibody or a binding fragment thereof or a modification thereof.
  • the composition of the present invention is preferably used in immunosuppressant-resistant cytotoxic T cell related diseases in medical treatment for diseases involving cytotoxic T cells (hereinafter referred to as "cytotoxic T cell related diseases").
  • cytotoxic T cell related diseases include chronic obstructive pulmonary disease (COPD: non-patent document 16), multiple sclerosis (non-patent document 15), Graves' disease (Sun, Z. et al., J. Clin. Immunol., 2008). 28 (5): 464-472), ankylosing spondylitis (Schirmer, M. et al., Arthritis.
  • Non-patent Document 15 systemic lupus erythematosus (Zabinska et al. 2016, J Immunol Res. 1058165), lupus nephritis (Zabinska et al. 2016, J Immunol Res. 1058165), Scleroderma (Li et al. 2017, J Invest Dermatol. 137 (5): 1042-1050), Crohn's disease (Dai et al.
  • composition of the present invention is preferably selected from immunosuppressant-resistant COPD, immunosuppressant-resistant Graves's disease, immunosuppressant-resistant ankylosing spondylitis, immunosuppressant-resistant squamitis , Immunosuppressant-resistant asthma, immunosuppressant-resistant rheumatoid arthritis, immunosuppressant-resistant polymyositis and dermatomyositis, immunosuppressant-resistant inclusion body myositis, immunosuppressant-resistant acute coronary syndrome , Immunosuppressive resistant systemic lupus erythematosus, immunosuppressive resistant lupus nephritis, immunosuppressive resistant scleroderma, immunosuppressive resistant Crohn's disease, immunosuppressive resistant ulcerative colitis, Immunosuppressant resistant aplastic anemia, immunosuppressant resistant myelodysplastic syndrome, immunosuppressive resistant Sjogren's syndrome
  • cytotoxic T cells and cytotoxic T cell related diseases for example, the following reports have been made: In idiopathic pulmonary fibrosis, a correlation has been reported between the number of CD4 + CD28-T cells and poor prognosis. (Gilani et. Al., PLoS One 2010, 5 (1): e8959); In ankylosing spondylitis, there is a correlation between disease severity and the number of CD8 + CD28- T cells in the blood (Schirmer, M.
  • CD8 + CD28-T cells have been suggested to be involved in exacerbation (Zabinska et al. 2016). J Immunol Res. 1058165); for scleroderma, CD8 + CD2 -T cells have been suggested to be involved in early stage disease (Li et al. 2017, J Invest Dermatol. 137 (5): 1042-1050); CD28-T cells are involved in polymyositis and dermatomyositis It is involved in the pathology (Fasth, AE. Et al., J.
  • CD28-T cells are the pathology Involved (Pandya et al. 2010, Arthritis Rheum. 62 (11): 3457-66); Crohn's disease and ulcerative colitis have a poor prognosis when the percentage of CD8 + CD28- T cells is increased (Dai et al. 2017, Clin Res Hepatol Gast 41 (6): 693-702); in aplastic anemia and myelodysplastic syndromes, the number of CD8 + CD28-T cells in patients is increasing (Kook et al. 2001, Exp Hematol.
  • CD4 + CD28-T cell count is a prognostic predictor (Peeters et al. 2017, Front Immunol. 8: 1160); for Sjogren's syndrome, CD8 + CD28-T cell count and There is a correlation in severity (Smolenska et al. 2012, Cell Immunol. 278 (1-2): 143-51); for Vegener's granulomatosis, CD28-T cells are involved in the pathology (Lamprechht. Et al. 2001, Thorax. 56 (10): 751-7); for psoriasis, CD4 + CD28-T cells are involved in the pathology (Lima et al.
  • CD8 + CD28-T cells The number of CD8 + CD28-T cells is increasing in asthma (Hamzaoui, A. et al., Mediators. Inflamm., 2005; 3; 160- P. 166); for chronic hepatitis B, CD4 + CD28-T cells are involved in the pathology (Wang et al. 2009, Immunol Invest. 2009; 38 (5): 434-46); in sarcoidosis, CD4 + CD28- The number of T cells is increasing (Roberts et al. 2005, Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. 22 (1): 13-9).
  • the term "immunosuppressive agent” means a drug that acts in a suppressive manner on the immune system, which is used for the treatment of autoimmune diseases, etc., and it is an antifolate, calcineurin inhibitor, corticosteroids (Also referred to as “steroids”), antithymocyte globulin agents, nucleic acid anti-metabolites, nucleic acid synthesis inhibitors, biological agents targeting cell surface antigens, biological agents targeting cytokine or cytokine receptors, and the like.
  • steroids corticosteroids
  • the term "immunosuppressive drug resistance” refers to a state in which the disease is not sufficiently controlled even by the treatment with the above-mentioned immunosuppressant, and ineffective or effective in the treatment with the above-mentioned immunosuppressant. Insufficient cases, cases of recurrence of the disease, cases where side effects make treatment with the drug difficult, and the like.
  • a disease for the treatment or prevention of a disease, such disease, preferably prevention of onset of such disease in an individual expressing LAG-3 protein, suppression or inhibition of progression of the disease, or suffering from such disease It includes, but is not limited to, alleviation of one or more symptoms exhibited by an individual, suppression or amelioration of progression or progression, or treatment or prevention of a secondary disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an anti-LAG-3 antibody or a binding fragment thereof or a modified form thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be suitably applied to the treatment and / or treatment of cytotoxic T cell related diseases, more preferably perforin positive, granzyme B positive, CD28 negative CD4 positive, CD28 negative CD8 Positive, CD57 positive, CD4 positive, and / or CD57 positive, CD8 positive, more preferably, perforin positive, granzyme B positive, CD28 negative CD4, CD28 negative, CD8 positive, CD57 positive, CD4 positive, and / or, It is characterized in that CD57 positive CD8 positive is determined for a biological sample comprising cytotoxic T cells or a cell membrane fraction thereof, and even more preferably, said biological sample is a cytotoxic T cell Derived from or derived from an individual suffering from or for whom it is desirable to avoid the disease And wherein the door.
  • Such biological sample is preferably a sample containing cytotoxic T cells derived from or collected
  • the cytotoxic T cell related disease which can be treated or prevented by the pharmaceutical composition of the present invention is preferably chronic obstructive pulmonary disease (COPD), multiple sclerosis, Graves' disease, ankylosing spondylitis, squamitis , Asthma, rheumatoid arthritis, polymyositis and dermatomyositis, inclusion body myositis, acute coronary syndrome, systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, scleroderma, Crohn's disease, ulcerative colitis, aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, Sjogren's syndrome, Wegener's granulomatosis, psoriasis, type 2 diabetes, host-to-graft reaction, chronic hepatitis B, and / or sarcoidosis.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • multiple sclerosis Graves' disease
  • cytotoxic T cell related diseases which can be treated or prevented by the pharmaceutical composition of the present invention are preferably LAG-3 positive, more preferably suffering from cytotoxic T cell related diseases. It is a disease determined to be LAG-3 positive for biological samples from individuals who are or are desired to avoid disease. Such biological sample is preferably a sample containing cytotoxic T cells derived from or collected from a lesion site, more preferably a cytotoxicity invading the lesion site. It is a sample containing sexual T cells.
  • compositions or pharmaceutical compositions of the invention may be administered to an individual in a method of treatment or prevention of cytotoxic T cell related diseases. That is, the present invention is suffering from or suffering from a cytotoxic T cell related disease of perforin positive, granzyme B positive, CD28 negative CD4 positive, CD28 negative CD8 positive, CD57 positive CD4 positive, and / or CD57 positive CD8 positive. Also provided is a method of treating or preventing a cytotoxic T cell related disease comprising administering to the individual it is desirable to avoid A. or a composition or pharmaceutical composition of the invention.
  • the scope of “desirable to avoid morbidity” also includes prophylactic or prophylactic treatment to be administered, which is intended for prophylactic or prophylactic treatment, or scheduled for prophylactic or prophylactic treatment.
  • the scope of “prevention” includes the prevention of onset, recurrence or symptom aggravation, etc.
  • the composition of the present invention for the purpose of maintaining the condition or preventing recurrence for individuals whose symptoms have been ameliorated or ameliorated by treatment etc.
  • the administration of a substance or a pharmaceutical composition can be exemplified.
  • delaying the aggravation or progression of a disease, a pathological condition or a symptom is also included in the scope of “treatment or prevention”.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention a therapeutically or prophylactically effective amount of an anti-LAG-3 antibody or a binding fragment of the antibody and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, solubilizer, emulsifier, preservative And / or adjuvants can be included.
  • terapéuticaally or prophylactically effective amount means an amount that exerts a therapeutic or prophylactic effect for a particular disease, dosage form and administration route, and is synonymous with “pharmacologically effective amount”.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention pH, osmotic pressure, viscosity, transparency, color, isotonicity, sterility, stability, solubility, sustained release, absorption of the composition or the antibody contained therein
  • substance for preparation a substance for changing, maintaining, or holding the properties, permeability, dosage form, strength, properties, shape, etc.
  • the substance for preparation is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable substance.
  • non-toxic or low toxicity is a property which the substance for formulation suitably comprises.
  • Examples of the substance for preparation include, but are not limited to, the following: amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine, antibacterial agents, ascorbic acid Antioxidants such as sodium sulfate or sodium bisulfite, buffers such as phosphoric acid, citric acid, borate buffer, sodium hydrogencarbonate, tris-hydrochloric acid (Tris-Hcl) solution, fillers such as mannitol or glycine, ethylene diamine Chelating agents such as tetraacetic acid (EDTA), caffeine, polyvinyl pyrrolidine, complexing agents such as ⁇ -cyclodextrin and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, extenders such as glucose, mannose or dextrin, monosaccharides, disaccharides Glucose, mannose and dextrin And other carbohydrates, coloring agents, flavoring agents, diluents, emul
  • Preservatives such as methyl paraben, propyl paraben, chlorexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide, solvents such as glycerin, propylene glycol or polyethylene glycol, sugar alcohols such as mannitol or sorbitol, suspending agents, PEG, sorbitan ester, polysorbate 20 And polysorbate 80, etc.
  • surfactants such as lecithin or cholesterol
  • stabilization enhancers such as sucrose or sorbitol, sodium chloride Potassium, potassium chloride, mannitol and elasticity enhancers such as sorbitol, transport agent, diluent, excipient, and / or pharmaceutically adjuvants.
  • the addition amount of the substance for these preparations is 0.001 to 1000 times, preferably 0.01 to 100 times, more preferably, the weight of the anti-LAG-3 antibody or its binding fragment or its modified form. It is 0.1 to 10 times.
  • An immunoliposome containing an anti-LAG-3 antibody or its binding fragment or a modified form thereof in a liposome, a composition or a drug containing an antibody modified form (such as US Pat. No. 6,214,388) formed by binding of the antibody and the liposome A composition is also included in the composition or the pharmaceutical composition of the present invention.
  • excipients and carriers are not particularly limited as long as they are usually liquid or solid, and water for injection, saline, artificial cerebrospinal fluid, or any other substance used for preparation for oral administration or parenteral administration.
  • physiological saline include neutral ones and those containing serum albumin.
  • Tris buffer prepared so that the final pH of the composition or the pharmaceutical composition is 7.0 to 8.5, an acetate buffer similarly prepared so as to be 4.0 to 5.5, The citrate buffer similarly prepared to be 5.0-8.0, the histidine buffer similarly prepared to be 5.0-8.0, etc. can be illustrated.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention is a solid, liquid, suspension or the like. Lyophilized formulations can be mentioned. For shaping a freeze-dried preparation, excipients such as sucrose can be used.
  • the route of administration of the composition or pharmaceutical composition of the present invention may be any of enteral administration, topical administration and parenteral administration, for example, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, intradermal administration, subcutaneous administration Intraperitoneal administration, percutaneous administration, intraosseous administration, intraarticular administration and the like.
  • composition of such composition or pharmaceutical composition can be determined depending on the method of administration, the LAG-3 protein binding affinity of the antibody, and the like.
  • the dosage of the anti-LAG-3 antibody is not limited as long as it is a pharmacologically effective amount, and the species of the individual, type of disease, symptom, sex, age, chronic disease, LAG-3 protein binding affinity of the antibody Or it may be determined appropriately depending on the biological activity and other factors, but usually 0.01 to 1000 mg / kg, preferably 0.1 to 100 mg / kg, once every 1 to 180 days, or It can be administered twice or three or more times a day.
  • the form of the composition or the pharmaceutical composition includes an injection (lyophilized preparation, including drops), suppositories, nasal absorption preparations, transdermal absorption preparations, sublingual preparations, capsules, tablets, ointments, granules Agents, aerosols, pills, powders, suspensions, emulsions, eye drops, bioimplantable preparations and the like can be exemplified.
  • injection lyophilized preparation, including drops
  • suppositories nasal absorption preparations, transdermal absorption preparations, sublingual preparations, capsules, tablets, ointments, granules Agents, aerosols, pills, powders, suspensions, emulsions, eye drops, bioimplantable preparations and the like can be exemplified.
  • composition or pharmaceutical composition containing the anti-LAG-3 antibody or its binding fragment or a modified form thereof as an active ingredient can be administered simultaneously with or separately from other medicines.
  • the drug may be administered, or the composition or pharmaceutical composition and the other drug may be administered simultaneously.
  • compositions or pharmaceutical composition of the present invention include, for example, antifolates, calcineurin inhibitors, corticosteroids, antithymocyte globulin agents, nucleic acid antimetabolites, nucleic acid synthesis Inhibitors, biologics that target cell surface antigens, or biologics that target cytokines or cytokine receptors, etc. can be mentioned, which are for the treatment or prevention of rejection of autoimmune diseases and / or transplants. Preferred.
  • Methotrexate an antifolate, Cyclosporin, Tacrolimus, calcineurin inhibitor, Methylprednisolone, adrenocortical steroid, Methylprednisolone, Prednisolone, a nucleic acid synthesis inhibitor, Cyclophosphamide, Azathioprine, an antithymocyte globulin agent Zetbulin, Lymphoglobuline, Thymoglobulin, Mycophenolate mofetil, a nucleic acid antimetabolite, Alemtuzumab, Rituximab, Abatacept, Denosumab, a biological product targeting a cytokine or cytokine receptor, etc.
  • compositions or pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with high-dose intravenous immunoglobulin (IV Ig) therapy, plasma exchange therapy and the like to treat or prevent rejection of autoimmune diseases and / or transplants. it can.
  • IV Ig intravenous immunoglobulin
  • these other medicaments and therapies can also be combined with the compositions of the invention in the treatment or prevention of autoimmune diseases and diseases other than rejection of transplants.
  • anticancer agents such as various molecular targeting agents, chemotherapeutic agents, radiation therapy, anti-PD-1
  • cancer immunotherapeutic agents such as antibodies, anti-PD-L1 antibodies, and anti-CTLA-4 antibodies.
  • compositions of the invention that are used or used in combination with other therapies as a "combination with other medication” or “combination with other medication” aspect.
  • the present invention relates to a method of depleting cytotoxic T cells, use of LAG-3 antibody for depleting cytotoxic T cells or for preparing a composition or pharmaceutical composition for cytotoxic T cell depletion, cells
  • LAG-3 antibody for the treatment or prevention of damaging T cell related diseases
  • LAG-3 antibody for the treatment or prevention of cytotoxic T cell related diseases
  • treatment or prevention of cytotoxic T cell related diseases Also provided is a LAG-3 antibody for use in A kit for cytotoxic T cell depletion comprising LAG-3 antibody, and a kit for treating or preventing cytotoxic T cell related diseases are also included in the present invention.
  • Example 1 Preparation of rat anti-human LAG-3 antibody 1) -1 Immunization 1st and 2nd from the N terminus (No. 23-262) of 4 extracellular immunoglobulin-like domains of human LAG-3 (SEQ ID NO: 86: FIG. 101)
  • pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4 was intramuscularly injected to the same site. Subsequently, in vivo electroporation was performed at the same site using ECM 830 (BTX) using a 2-needle electrode. After repeating the same in vivo electroporation a total of three or five times every two weeks, rat lymph nodes were collected and used for hybridoma production.
  • OPD solution 0.05 M trisodium citrate, 0.1 M dibasic hydrogen phosphate, 12 water pH 4.5
  • 25 ⁇ L / well of o-phenylenediamine dihydrochloride manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • H 2 O 2 were respectively added so as to be 0.4 mg / mL and 0.6% (v / v).
  • the color reaction was carried out with occasional stirring, and after stopping color reaction by adding 25 ⁇ L / well of 1 M HCl, absorbance at 490 nm was measured with a plate reader (ENVISION: PerkinElmer).
  • LAG-3 expression vector introduced Hybridomas producing culture supernatants exhibiting higher absorbance in HEK 293 cells were selected as positive for anti-LAG-3 antibody production.
  • the FACS buffer contains LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye (manufactured by Invitrogen) 200
  • a secondary antibody such as Anti-Rat IgG PE conjugate (manufactured by Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluted by a factor of two was added and suspended, and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cells were resuspended in PBS containing 1 to 2% paraformaldehyde, and detection was carried out using a flow cytometer (Canto II: manufactured by BD or FC500: manufactured by Beckman Coulter).
  • 293T-lacZ human LAG-3 full-length expression plasmid into 293T cells
  • 293T-lacZ stably expressing this ⁇ -lactosidase using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen), and culturing it for 1 day
  • the cells are washed twice with phenol red-free RPMI 1640 containing 5% FBS (hereinafter abbreviated as “media for ADCC”), the number of viable cells is measured by trypan blue dye exclusion test, and 1 ⁇ 10 5 cells / media for ADCC.
  • the cells resuspended to ml were used as target cells.
  • PBMCs were isolated from human peripheral blood by Ficoll centrifugation and suspended to a viable cell density of 1.2 ⁇ 10 6 cells / mL in ADCC medium. , Used as effector cells.
  • Cell lysis rate (%) (A-B) / (C-B) x 100
  • B: Average value of spontaneous release (non antibody added wells) counts (n 3).
  • 50 ⁇ l and 75 ⁇ l of medium for ADCC were added at the time of antibody addition and effector cell addition, respectively.
  • 175 ⁇ l of ⁇ -Glo assay system solution was added to the wells containing cells and mixed, and 100 ⁇ l of the mixture was added to the black plate to carry out the measurement.
  • Non-patent Document 8 20 ⁇ L / well of LAG-3-Fc (manufactured by R & D Systems) diluted to 25 nM with RPMI 1640 containing 10% FBS is added to a 96-well U-bottom microplate, and 20 ⁇ L / well of hybridoma culture supernatant is added thereto and stirred. And left at 4 ° C. for 20 minutes. Thereto was added 10 ⁇ L / well (2.5 ⁇ 10 5 cells / well) of Raji cells which endogenously highly express MHC class II molecules, stirred, and left still at 4 ° C. for 30 minutes.
  • LAG-3-Fc manufactured by R & D Systems
  • Inhibition rate (%) 100-(A-B) / (C-B) x 100
  • A Average fluorescence intensity of sample wells
  • B Average fluorescence intensity of background.
  • C Average fluorescence intensity of maximal binding. At the time of antibody addition, 20 ⁇ L of culture medium was added.
  • the rat anti-human LAG-3 monoclonal antibody was purified from hybridoma culture supernatant. That is, first, hybridoma culture supernatant was applied to a Protein G column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with PBS. After washing the column with PBS, it was eluted with 0.1 M aqueous glycine / hydrochloric acid (pH 2.7), and fractions containing the antibody were collected.
  • the collected fractions are adjusted to pH 7.0-7.5 by adding 1 M Tris-HCl (pH 9.0), and then buffer with PBS with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fractional molecular weight UF 30 K, Sartorius). While performing substitution, concentration of the antibody was performed, and the antibody concentration was adjusted to 2 mg / mL or more. Finally, it was filtered through Minisart-Plus filter (manufactured by Sartorius) to obtain a purified sample.
  • Example 2 In vitro evaluation of rat anti-human LAG-3 antibodies (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264) 2)-1 Obtained rat anti-LAG-3 antibodies (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264) human activated T cells Binding to Human Activated T Cells The ability of purified rat anti-human LAG-3 antibodies rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264 to human activated T cells was examined by the method described in Example 1) -7. As shown in FIG. 1, all of these rat anti-human LAG-3 antibodies bound to PHA blast prepared as in vitro activated human T cells in a concentration dependent manner.
  • rat anti-LAG-3 antibodies (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264)
  • Purified rat anti-human LAG-3 antibodies rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264 have ADCC activities as follows: It examined by the method. Add 50 ⁇ L / well of target cells of Example 1) -5-1 (hereinafter referred to as 293T-lacZ / hLAG-3 cells) to a 96-well U-bottom microplate containing 50 ⁇ L / well of antibody solution and Let stand for 30 minutes.
  • Cell lysis rate (%) (A-B) / (C-B) x 100
  • B: Average value of spontaneous release (non antibody added wells) counts (n 3).
  • 50 ⁇ l and 75 ⁇ l of medium for ADCC were added at the time of antibody addition and effector cell addition, respectively.
  • 175 ⁇ l of ⁇ -Glo assay system solution was added to the wells containing cells and mixed, and 100 ⁇ l of the mixture was added to the black plate to carry out the measurement.
  • Example 1 Purified anti-LAG-3 antibodies (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264) are reported as LAG-3 and its ligand according to the LAG-3 / MHC class II binding test described in -6. We examined whether it had the activity to inhibit the binding of certain MHC class II molecules. As a result, as shown in FIG. 3A, all the antibodies of these five clones showed almost no inhibitory activity in the LAG-3 / MHC class II binding test, and are considered to be necessary for exerting the T cell inhibitory function of LAG-3. It has been found that it does not affect binding to MHC class II molecules. On the other hand, as shown in FIG. 3B, the human chimeric anti-LAG-3 antibody IMP 731 (patent document 1), which is a prior art antibody, has strong concentration-dependent inhibitory activity in LAG-3 / MHC class II binding test. Indicated.
  • Human LAG-3 expression plasmid pcDNA3.1 / hLAG-3 was introduced into 293T cells using Lipofectamine 2000 (manufactured by Life Technologies) and seeded in BioCoat Poly-D-Lysine coated 96-well microplate (manufactured by BD) And cultured overnight.
  • Raji cells are labeled in the medium (RPMI 1640 with 10% FBS) with BCECF-AM (made by Dojindo, 10 ⁇ M) for 1 hour at 37 ° C. and washed, 1.6 ⁇ 10 6 cells / cell. It suspended in the culture medium so that it might become mL.
  • the medium of overnight cultured cells (293T-hLAG-3 cells) was removed, 50 ⁇ l / well of medium and 25 ⁇ l / well of antibody solution were added, and preincubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, BCECF-AM labeled Raji cells were added at 25 ⁇ L / well, centrifuged at 900 rpm for 30 seconds, and then incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • Inhibition rate (%) 100-(A-B) / (C-B) x 100
  • A Fluorescence intensity of sample well
  • B Fluorescence intensity of background. Media was added at the time of Raji cells and antibody addition. Other than that, the same operation as the sample well was performed.
  • C Fluorescence intensity of maximum binding. Media was added at the time of antibody addition.
  • Rat anti-LAG-3 antibody rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264 is the extracellular domain of LAG-3 Since the antibody is produced by using as a immunogen a variant in which the first and second N-terminal (hereinafter referred to as domain 1 and 2 respectively) of the four immunoglobulin-like domains present in B are deleted, the remaining N A cell in which only domains 3 and 4 or domain 4 were expressed, in order to clarify which domain from the third to the fourth (hereinafter referred to as domains 3 and 4 respectively) these antibodies bind Flow of Binding of Obtained Rat Anti-LAG-3 Antibody to It was examined by cytometry.
  • Lipofectamine 2000 (all were cloned into pcDNA3.1) an expression plasmid of domain 3 or less (263-525) or domain 4 or less (353-525) of human LAG-3 to which a FLAG tag sequence (DYKDDDDK) was added at the N terminus
  • the cells were introduced into HEK293T cells using Life Technologies), cultured for 1 day, collected, and collected.
  • the binding properties of the antibodies were examined by flow cytometry according to the method described in Example 1) -4. As a result, as shown in FIG.
  • FIG. 5B The result of examining the binding domain of human chimerized anti-human LAG-3 antibody IMP 731 which is a prior art antibody in a similar manner is shown in FIG. 5B.
  • a FLAG tag sequence DYKDDDDK
  • Example 1 After 3 weeks, 200 ⁇ g / mouse of antigen protein alone was administered to the ridge, and 2 weeks after that, lymph nodes were collected, and hybridomas were produced by the method of Example 1) -2. Examples 1) -3 and 1) -4 and the like were screened, and the epitope of the obtained monoclonal antibody was analyzed by the method of Example 2) -5, and 58% of the evaluated clones were LAG-3. Of the four immunoglobulin-like domains present in the extracellular region, it was revealed that 26% of the four immunoglobulin-like domains were bound to domain 2 and that monoclonal antibodies against the portion near the N-terminus were preferentially obtained.
  • N-terminal domains 1 and 2 out of four extracellular immunoglobulin-like domains of LAG-3 are important for the binding of LAG-3 to MHC class II molecules
  • Example 1 It is shown that it is necessary to make monoclonal antibodies by devising an immunization method such as 1) -1.
  • Example 3 Determination of the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of rat anti-human LAG-3 antibody (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 and rLA1264) 3) -1 Determination of the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of rLA204 3)- 1-1.
  • Preparation of total RNA from rLA204-producing hybridoma In order to amplify cDNA containing the variable region of rLA204, total RNA was prepared from rLA204-producing hybridoma using TRIzol Reagent (Ambion).
  • the cDNA containing the heavy chain variable region of rLA204 was amplified by 5'-RACE PCR using the combination of this primer and the cDNA synthesized in Example 3) -1-2 (5'-RACE-Ready cDNA) as a template .
  • PCR was carried out with a touchdown PCR program according to the manual of SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) using KOD-Plus- (TOYOBO) as Polymerase.
  • the cDNA containing the variable region of the heavy chain amplified by 5'-RACE PCR is purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) and then cloned and cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) Sequence analysis of the nucleotide sequence of the cDNA containing the chain variable region was performed.
  • oligonucleotide having the sequence of 5′-CTCAGAGTTCCAGGTCACACTGTGACTGGC-3 ′ (RG2AR3; SEQ ID NO: 71) designed from the sequence of the constant region of rat heavy chain in the database as a sequence primer, and NUP (Nested Universal Primer A: SMARTer RACE cDNA Amplification (Supplied with Kit) was used.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain of rLA204 determined is shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the cDNA containing the light chain variable region of rLA204 was amplified by 5'-RACE PCR using the combination of this primer and the cDNA synthesized in Example 3) -1-2 (5'-RACE-Ready cDNA) as a template .
  • PCR was carried out with a touchdown PCR program according to the manual of SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) using KOD-Plus- (TOYOBO) as Polymerase.
  • the cDNA containing the variable region of the light chain amplified by 5'-RACE PCR is purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) and then cloned and cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) Sequence analysis of the nucleotide sequence of the cDNA containing the chain variable region was performed.
  • oligonucleotide having the sequence of 5′-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3 ′ (RKR5; SEQ ID NO: 72) designed from the sequence of the constant region of rat light chain in the database as a sequence primer, and NUP (Nested Universal Primer A: SMARTer RACE cDNA Amplification (Supplied with Kit) was used.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain of rLA204 determined is shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain of rLA212 determined is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain is shown in SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain of rLA225 determined is shown in SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain is shown in SEQ ID NO: 11 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain of rLA869 determined is shown in SEQ ID NO: 13 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain is shown in SEQ ID NO: 15 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain of rLA1264 determined is shown in SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain is shown in SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • Example 4 Preparation of Human Chimerized Anti-Human LAG-3 Antibody (cLA212) 4) -1 Construction of Chimeric and Humanized Antibody Light Chain Expression Vector pCMA-LK A fragment of about 5.4 kb obtained by digestion, and a DNA fragment containing a human light chain secretion signal shown in SEQ ID NO: 21 and a DNA sequence encoding a human ⁇ chain constant region are in In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech) ) To create pcDNA3.3 / LK.
  • PCR is performed with the following primer set, and the resulting approximately 3.8 kb fragment is phosphorylated and then self-ligated to determine the signal sequence, cloning site, and human light chain downstream of the CMV promoter.
  • a chimeric and humanized antibody light chain expression vector pCMA-LK having a constant region was constructed.
  • Primer set 5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3 '(3.3-F1; SEQ ID NO: 73) 5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCCCCCCGA CGTTG-3 '(3.3-R1; SEQ ID NO: 74)
  • cLA212 Heavy Chain Expression Vector The cDNA containing the variable region of the heavy chain of rLA212 obtained in Example 3) -2 was used as a template and KOD-Plus- (TOYOBO) and the following primer set were used for the heavy chain In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech) at the site where the DNA fragment containing the cDNA encoding the variable region of the chain was amplified and the chimeric and humanized IgG1 type heavy chain expression vector pCMA-G1 was digested with restriction enzyme BlpI The cLA212 heavy chain expression vector was constructed by using and inserting. The resulting expression vector was designated "pCMA-G1 / cLA212".
  • the nucleotide sequence of cLA212 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 23 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • Primer set 5 'for cLA212 heavy chain 5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGAGTCTGGGGGAGG-3 '(212H-F; SEQ ID NO: 75) 5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCAG-3 '(212H-R; SEQ ID NO: 76)
  • cLA212 light chain expression vector The cDNA containing the light chain variable region of rLA212 obtained in Example 3) -2 was used as a template and KOD-Plus- (TOYOBO) and the following primer set for light In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech) at the site where the DAN fragment containing the cDNA encoding the chain variable region was amplified and the chimeric and humanized light chain expression general-purpose vector pCMA-LK was digested with restriction enzyme BsiWI The light chain expression vector of cLA212 was constructed by inserting it. The obtained expression vector was named "pCMA-LK / cLA212".
  • cLA212 light chain primer set 5'-ATCTCC GGCGCGTACGGCAACATTGTGATGACCCAGTCTCCCAAATCC-3 '(212L-F; SEQ ID NO: 77) 5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTCGGTCCCAGC-3 '(212L-R; SEQ ID NO: 78)
  • H chain expression vector (0.24 mg) and L chain expression prepared by dissolving 1.8 mg of Polyethyleneimine (Polyscience # 24765) in 20 ml of Opti-Pro SFM medium (Invitrogen) and using NucleoBond Xtra (TaKaRa)
  • the vector (0.36 mg) was added to 20 ml of Opti-Pro SFM medium (Invitrogen).
  • 20 ml of the expression vector / Opti-Pro SFM mixed solution was added to 20 ml of the polyethyleneimine / Opti-Pro SFM mixed solution, the mixture was gently stirred, allowed to stand for 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F cells.
  • the human chimeric antibody of rLA212 obtained by the combination of pCMA-G1 / cLA212 and pCMA-LK / cLA212 was named “cLA212”.
  • the antibody was purified from the culture supernatant obtained in Example 4) -5 by rProtein A affinity chromatography (at 4-6 ° C.). The buffer displacement step after rProtein A affinity chromatography purification was performed at 4-6 ° C. First, the culture supernatant was applied to a column filled with MabSelectSuRe (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with PBS. After all of the culture solution entered the column, the column was washed with a column volume of twice or more of PBS. Then, it was eluted with 2 M arginine hydrochloride solution (pH 4.0), and the fractions containing the antibody were collected.
  • MabSelectSuRe manufactured by GE Healthcare
  • the fraction was subjected to solution substitution to HBSor (25 mM histidine / 5% sorbitol, pH 6.0) by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). Finally, the solution was concentrated with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fractional molecular weight UF10K, Sartorius, 4 ° C.) to adjust the IgG concentration to 2 mg / ml or more, and used as a purified sample. Finally, the resultant was filtered with Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
  • HBSor 25 mM histidine / 5% sorbitol, pH 6.0
  • VIVASPIN 20 fractional molecular weight UF10K, Sartorius, 4 ° C.
  • Example 5 Design of Humanized Version (hLA212) of Rat Anti-Human LAG-3 Antibody (rLA212) 5-1 Humanized Design of Rat Anti-Human LAG-3 Antibody rLA212 5) -1-1 Molecular Modeling of the Variable Region of rLA212 rLA212 Molecular modeling of variable regions was performed by a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primary sequence of the variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) ) was compared to the variable region of rLA212 determined in Example 3) -2.
  • 2GHW and 2ARJ were selected as having the highest sequence identity to the heavy chain and light chain variable regions of rLA212.
  • the three-dimensional structure of the framework region was created by combining the 2GHW and 2ARJ coordinates corresponding to the heavy and light chains of rLA212 to obtain a "framework model”. Then, representative conformations for each CDR were incorporated into the framework model. Finally, in order to obtain a possible molecular model of the variable region of rLA212 in terms of energy, energy calculations were performed to remove the disadvantageous interatomic contacts. The above procedure was performed using a commercially available protein three-dimensional structure analysis program Discovery Studio (manufactured by Accelrys).
  • the sequences of the framework regions of rLA212 are described by KABAT et al.
  • the framework regions of human subgroup consensus sequence and Germline sequence defined in (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) were compared.
  • the consensus sequence of human gamma chain subgroup 3 for heavy chain and the consensus sequence of human kappa chain subgroup 1 for light chain have high sequence identity in their framework regions, Selected as an acceptor.
  • the amino acid residues of the framework region for the acceptor were aligned with the amino acid residues for rLA212 to identify positions where different amino acids were used.
  • the amino acid sequence of humanized hLA212_H2 type heavy chain is set forth in SEQ ID NO: 28 in the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, a sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and a sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues are respectively signal sequence and heavy chain
  • the variable region corresponds to the heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 is set forth in SEQ ID NO: 27 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 1 to 57, a sequence consisting of nucleotides 58 to 420, a sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 is respectively a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, a heavy chain It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 are also described in FIGS. 42 and 43, respectively.
  • hLA212_H3 Type Heavy Chain In the heavy chain of chimeric cLA 212 shown in SEQ ID NO: 24, arginine at amino acid No. 16 of the variable region portion is glycine, and lysine at amino acid No.
  • hLA212_H3 type heavy chain (sometimes referred to as "hLA212_H3").
  • the amino acid sequence of the humanized hLA212_H3 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 30 of the sequence listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, a sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and a sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues are respectively signal sequence and heavy chain
  • the variable region corresponds to the heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 is set forth in SEQ ID NO: 29 of the Sequence Listing.
  • sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 420, the sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 are respectively signal sequence, heavy chain variable region sequence, heavy chain determination It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 are also described in FIGS. 44 and 45, respectively.
  • Phenylalanine at amino acid number 85 threonine
  • alanine at amino acid number 100 glutamine
  • glutamic acid at amino acid number 103 lysine
  • leucine at amino acid number 104 valine
  • leucine at amino acid number 106 isoleucine
  • humanized hLA212 light chain designed by replacing alanine at amino acid No. 109 with threonine was named “humanized hLA212_L1 type light chain” (sometimes referred to as “hLA212_L1”).
  • the amino acid sequence of the humanized hLA212_L1 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 32 in the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, a sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and a sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues are respectively signal sequence and light chain
  • the variable region corresponds to the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 is set forth in SEQ ID NO: 31 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 are also described in FIGS. 46 and 47, respectively.
  • hLA212_L2 Type Light Chain In the light chain of the chimeric cLA 212 shown in SEQ ID NO: 26, asparagine as amino acid No. 1 of amino acid No. 1 of the variable region part, valine as amino acid No. 3 as glutamine Lysine of amino acid No. 9 to serine, methionine of amino acid No. 11 to leucine, isoleucine of amino acid No. 13 to alanine, methionine of amino acid No. 21 to isoleucine, asparagine of amino acid No.
  • threonine Lysine at amino acid number 38 is glutamine, aspartic acid at amino acid number 60 is serine, threonine at amino acid number 63 is serine, glycine at amino acid number 65 is serine, asparagine at amino acid number 76 is serine , Amino acid number 78 In leucine, alanine at amino acid number 80 is proline, alanine at amino acid number 83 is phenylalanine, phenylalanine at amino acid number 85 is threonine, alanine at amino acid number 100 is glutamine, glutamic acid at amino acid number 103 A humanized hLA212 light chain designed by replacing lysine with leucine at amino acid number 104 with valine, leucine with amino acid number 106 with isoleucine, and alanine with amino acid number 109 with threonine is referred to as “humanized hLA212_L2 It was named as “type light chain” (sometimes called "hLA212_L2
  • the amino acid sequence of the humanized hLA212_L2 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 34 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, a sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, a sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues are respectively signal sequence and light chain
  • the variable region corresponds to the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 is set forth in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 are respectively signal sequence, light chain variable region sequence, light chain It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 are also described in FIGS. 48 and 49, respectively.
  • the valine at the third amino acid number of the variable region part is glutamine and the lysine at the amino acid number nine is serine
  • the 11th methionine is leucine
  • the isoleucine of 13th amino acid is alanine
  • the methionine of 21st amino acid is isoleucine
  • the asparagine of 22nd amino acid is threonine
  • the threonine of 63rd amino acid is serine
  • the 76th asparagine is serine
  • the valine at amino acid number 78 is leucine
  • the alanine at amino acid number 80 is proline
  • the alanine at amino acid number 83 is phenylalanine
  • the alanine at amino acid number 100 is glutamine
  • Number 103 eyes A humanized hLA212 light chain designed by replacing a minic acid with lysine, a leucine
  • the amino acid sequence of the humanized hLA212_L3 type light chain is described in SEQ ID NO: 36 of the sequence listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, a sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues and a sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues are respectively signal sequence and light chain
  • the variable region corresponds to the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 is set forth in SEQ ID NO: 35 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 are also described in FIGS. 50 and 51, respectively.
  • the amino acid sequence of the humanized hLA212_L4 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 38 in the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, a sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and a sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues are respectively signal sequence and light chain
  • the variable region corresponds to the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is set forth in SEQ ID NO: 37 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 are also described in FIGS. 52 and 53, respectively.
  • humanized hLA212 light chain designed by replacing glutamic acid at position 103 with lysine and alanine at amino acid 109 with threonine may be referred to as "humanized hLA212_L5 type light chain" (sometimes referred to as "hLA212_L5") I named it.
  • the amino acid sequence of humanized hLA212_L5 type light chain is described in SEQ ID NO: 40 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, a sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and a sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues are respectively signal sequence and light chain
  • the variable region corresponds to the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 is set forth in SEQ ID NO: 39 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain It encodes a regular region array.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 are also described in FIGS. 54 and b55, respectively.
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H2 type heavy chain and a humanized hLA212_L3 type light chain was designed and designated as “humanized hLA212_H2 / L3” (sometimes referred to as “hLA212_H2 / L3”).
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H2 type heavy chain and a humanized hLA212_L4 type light chain was designed and designated as “humanized hLA212_H2 / L4” (sometimes called “hLA212_H2 / L4”).
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H2 type heavy chain and a humanized hLA212_L5 type light chain was designed and designated as “humanized hLA212_H2 / L5” (sometimes called “hLA212_H2 / L5”).
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H3 type heavy chain and a humanized hLA212_L1 type light chain was designed and named "humanized hLA212_H3 / L1" (sometimes called "hLA212_H3 / L1").
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H3 type heavy chain and a humanized hLA212_L2 type light chain was designed and named "humanized hLA212_H3 / L2" (sometimes called “hLA212_H3 / L2").
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H3 type heavy chain and a humanized hLA212_L3 type light chain was designed and designated as "humanized hLA212_H3 / L3" (sometimes referred to as "hLA212_H3 / L3").
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H3 type heavy chain and a humanized hLA212_L4 type light chain was designed and named "humanized hLA212_H3 / L4" (sometimes called “hLA212_H3 / L4").
  • An antibody consisting of a humanized hLA212_H3 type heavy chain and a humanized hLA212_L5 type light chain was designed and designated as “humanized hLA212_H3 / L5” (sometimes referred to as “hLA212_H3 / L5”).
  • the antibody designed as described above can be prepared according to Example 6 and evaluated according to Example 7 and Example 8.
  • Example 6 Expression and Purification of Humanized Anti-LAG-3 Antibody cLA212 Humanized Antibody (hLA212) 6) -1 Construction of hLA212 Heavy Chain Expression Vector 6) -1-1 Construction of hLA212_H2 Type Heavy Chain Expression Vector SEQ ID NO: 27 A DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of hLA212_H2 shown in nucleotide numbers 36 to 437 of the nucleotide sequence of hLA212_H2 was synthesized (GENEART, Inc., Strings DNA Fragments).
  • HLA212_H2 expression vector by inserting the synthesized DNA fragment into the site where the chimeric and humanized antibody IgG1 type heavy chain expression vector pCMA-G1 was digested with restriction enzyme BlpI using In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech) Built. The obtained expression vector was designated as "pCMA / hLA212_H2".
  • hLA212_H3 Type Heavy Chain Expression Vector
  • hLA212_L2 Type Light Chain Expression Vector
  • a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of hLA212_L2 shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hLA212_L2 shown in SEQ ID NO: 33 was synthesized (GENEART Company Strings DNA Fragments).
  • hLA212_L3 type light chain expression vector A DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of hLA212_L3 shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hLA212_L3 shown in SEQ ID NO Company Strings DNA Fragments).
  • Example 6 An hLA212_L3 expression vector was constructed in the same manner as in -2-1. The obtained expression vector was named "pCMA / hLA212_L3".
  • hLA212_L4 Type Light Chain Expression Vector
  • a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of hLA212_L4 shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hLA212_L4 shown in SEQ ID NO: 37 was synthesized (GENEART Company Strings DNA Fragments).
  • hLA212_L5 Type Light Chain Expression Vector A DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of hLA212_L5 shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hLA212_L5 shown in SEQ ID NO: 39 was synthesized (GENEART Company Strings DNA Fragments).
  • hLA212_H2 / L1 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H2 and pCMA / hLA212_L1.
  • hLA212_H2 / L2 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H2 and pCMA / hLA212_L2.
  • hLA212_H2 / L3 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H2 and pCMA / hLA212_L3.
  • hLA212_H2 / L4 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H2 and pCMA / hLA212_L4.
  • hLA212_H2 / L5 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H2 and pCMA / hLA212_L5.
  • hLA212_H3 / L1 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H3 and pCMA / hLA212_L1.
  • hLA212_H3 / L2 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H3 and pCMA / hLA212_L2.
  • hLA212_H3 / L3 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H3 and pCMA / hLA212_L3.
  • hLA212_H3 / L4 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H3 and pCMA / hLA212_L4.
  • hLA212_H3 / L5 was obtained by the combination of pCMA / hLA212_H3 and pCMA / hLA212_L5. 6) Purification of hLA212 Antibody 6) The culture supernatant obtained in 6-3-1 was purified in the same manner as in Example 4) -6.
  • Example 7 In vitro evaluation of humanized anti-human LAG-3 antibody (hLA212) 7) -1 Measurement of antigen binding activity of humanized anti-human LAG-3 antibody (hLA212) by Biacore: Four extracellular immunoglobulin-like components of human LAG-3 The protein LAG-3_D3D4-His in which a His tag was added to the C terminus of the N-terminal third and fourth (region # 263-450) of the domain was expressed in FreeStyle 293F cells (Invitrogen).
  • the obtained culture supernatant was buffer-replaced (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7.5), and HisTrap HP column (GE Healthcare) and Superdex 75 column (GE Healthcare) were used to carry out human LAG-3_D3D4-His.
  • the protein was purified.
  • the final buffer was PBS.
  • LAG-3_D3D4-His Measurement of dissociation constant between antibody and antigen (LAG-3_D3D4-His) was performed using Biacore T200 (GE Healthcare) and immobilized anti-human IgG (Fc) antibody (Human Antibody Capture kit, GE Healthcare) To capture the antibody as a ligand and to measure the antigen as an analyte.
  • the anti-human IgG (Fc) antibody was covalently bound to a sensor chip CM5 (GE Healthcare) with an amine coupling method to a target of about 1000 RU. It was fixed to the reference cell as well.
  • Non-patent Document 1 N-terminal domains 1 and 2 are considered to be important for the binding of LAG-3 and MHC class II molecules (Non-patent document 4) ).
  • the five clones of rat anti-human LAG-3 antibodies obtained by the method of Example 1 all recognize domain 3, and LAG-3 / MHC class II binding test and 293T-
  • the human chimerized anti-human LAG-3 antibody IMP 731 which is a prior art antibody, did not show any inhibitory activity in hLAG-3 / Raji cell adhesion test, but recognized domain 1 and LAG-3 / MHC class II binding test It was revealed in Example 2 that they showed strong inhibitory activity in the 293T-hLAG-3 / Raji cell adhesion test.
  • IMP 731 increased IL-2 production while the produced humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H3 / L2 hardly affected IL-2 production.
  • the humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H3 / L2 produced does not affect the T cell suppressive function of LAG-3, whereas IMP 731 inhibits it to reversely immunize it. It has become clear that there is a risk of activating the system.
  • Example 8 Preparation of Humanized Antibody with Modified Carbohydrate Modification
  • a heavy chain comprising amino acid numbers 20 to 470 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 (FIG. 45) and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 (FIG. 49)
  • a humanized antibody comprising a light chain comprising amino acid numbers 21 to 234 is regulated by defucosifying a sugar chain modification that binds to the antibody protein according to a known method, and the obtained antibody is hLA212_H4 / L2 I named it.
  • the modified form was subjected to mass spectrometry, and it was found that the peak of the fucose-containing heavy chain was below the detection limit.
  • an antibody having a modified sugar chain such as hLA212_H4 / L2 is also referred to as "antibody” or "modified antibody”.
  • Example 9 In vitro evaluation of humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 9) -1 Binding activity of humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 to LAG-3 expressing cells By the method described in Example 7) -2. Binding of humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 to human LAG-3 expressing 293T-lacZ cells was examined by flow cytometry. As a result, as shown in FIG. 11, concentration dependent binding of hLA212_H4 / L2 was observed.
  • Example 10 Generation of Human LAG-3 / Human Fc ⁇ RIIIA Double Transgenic Mice
  • the humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 binds to human LAG-3 as shown in Example 9, rodent LAG-3 It is clear that they do not cross. Therefore, in order to allow in vivo evaluation of hLA212_H4 / L2, a BAC (Bacterial Atrial Chromosome) transgenic mouse is generated, in which human LAG-3 is physiologically expressed using the expression regulation mechanism of mouse LAG-3. It was decided to.
  • human Fc ⁇ IIIA is required to enhance ADCC activity by modulation of sugar chain modification such as hLA212_H4 / L2 (Junttila, T. T., et al., Cancer Res., Vol. 70 ( No. 11): pp 4481-9 (2010)), BAC containing the human Fc ⁇ RIIIA gene was also introduced according to the previous report (Non-patent document 10).
  • BAC genomic clones RP11-101F21 and RP23-30O1, were obtained, containing human LAG-3 and mouse LAG-3 loci respectively.
  • the sequence of intron 5 of the human LAG-3 gene, the sequence of both ends of the genomic DNA sequence from the translation initiation codon to the termination codon of the human LAG-3 gene, and LAG-3 of the mouse BAC clone The 3 'end and 5' end of the genomic DNA sequence from the translation initiation codon to the termination codon of the gene were used as key sequences for active homologous recombination reaction in E. coli.
  • linearized LAG-3 pretransfer plasmid is introduced together with human LAG-3 Intermediate into an E. coli strain capable of Red / ET reaction, and Red / ET reaction is carried out in this host E. coli.
  • the plasmid carrying the genomic DNA sequence of the human LAG-3 gene into which the Rpslkan cassette had been inserted was screened by inducing and picking up ampicillin and kanamycin resistant colonies (human LAG-3 transfer plasmid).
  • the genomic DNA sequence of the human LAG-3 gene having the H5 and H6 sequences derived from the mouse genome sequence at both ends and the Rpsl-kan cassette inserted by restriction enzyme reaction It was excised from the plasmid vector (human LAG-3 transfer fragment).
  • a human LAG-3 transfer fragment is introduced together with a mouse LAG-3 BAC clone into an E. coli strain capable of Red / ET reaction in the same manner as described above, and the Red / ET reaction is induced in this host E.
  • the intron 5 sequence of the human LAG-3 locus was amplified by PCR and used as a DNA sequence for removing Rpsl-Kan inserted into intron 5 of the human LAG-3 gene by negative selection (human LAG-3 Repair fragment).
  • a human LAG-3 repair fragment is introduced together with mouse LAG-3 / human LAG-3 RecBAC Intermediate into an E. coli strain capable of Red / ET reaction in the same manner as described above, and the Red / ET reaction is carried out in this host E. coli.
  • the genomic DNA sequence from the translation initiation codon of the mouse LAG-3 gene to the termination codon is derived from the translation initiation codon of the human LAG-3 gene and the termination codon from the translation initiation codon of the human LAG-3 gene by The construction of a recombinant BAC clone of the mouse LAG-3 / human LAG-3 gene correctly substituted with the genomic DNA sequence up to (human LAG-3 RecBAC) was performed. Sequence analysis confirmed the genomic DNA sequences of H1-H6 joined in the Red / ET reaction.
  • a linearized human LAG-3 RecBAC recombinant BAC clone is applied to 1% SeaKem GTG agarose gel (Takara Bio), and 6 v / cm, 0 using a pulse field electrophoresis apparatus (Bio-Rad, CHEF DR-II) The electrophoresis was performed under the conditions of 1-40 sec, 15 hr and 14 ° C.
  • the linearized human LAG-3 RecBAC recombinant BAC clone separated in the agarose gel was excised with a razor without UV irradiation by visualizing a part of the sample as a guide marker with a UV transilluminator.
  • the resulting long DNA fragment was extracted from the agarose gel by electroelution, and dialyzed at 4 ° C. for 2 hours with a TE buffer prepared for microinjection.
  • the purified DNA fragment is applied to pulse field electrophoresis to confirm that the longer chain DNA fragment is highly purified without fragmentation, and its DNA concentration is measured by NanoDrop spectrophotometer (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) It was determined.
  • a solution of this DNA fragment was diluted to 0.5 ng / ⁇ l to prepare a solution of an expression construct for producing a transgenic mouse.
  • the purified human LAG-3 RecBAC / human Fc ⁇ R BAC expression construct was directly injected into the male nucleus of pronuclear stage embryos of C57BL / 6J mice using a micromanipulator.
  • the DNA-injected embryos were transferred into the oviduct of pseudopregnant-induced female recipient mice.
  • Tail tissue of a candidate human LAG-3 RecBAC / human Fc ⁇ R BAC transgenic mouse stored at -80 ° C is thawed at room temperature, and 1 mg SDS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 mg / ml Actinase E (Kakken) Pharmaceuticals and Lysis buffer containing 0.15 mg / ml proteinase K (Merck) were added and shaken at 55 ° C. for 16 hours to solubilize the tissue. Phenol and phenol / chloroform extractions were performed to remove proteins that bind to solubilized genomic DNA from the tissue.
  • RNA contaminating the genomic DNA was digested with RNase A (Sigma), high molecular weight genomic DNA was precipitated by isopropanol precipitation. The precipitated genomic DNA was washed with 70% ethanol, air-dried, and redissolved in 50 ⁇ l of TE.
  • the DNA concentration of the genomic DNA solution prepared from each sample was determined by absorption method, and the volume of the genomic DNA solution corresponding to 5 ⁇ g of DNA was calculated from the value of the DNA concentration of each sample.
  • genomic DNA prepared from each sample positive control DNA (genomic DNA of control mouse added with expression construct used for microinjection), and negative control DNA (genomic DNA of control mouse), 37 ° C., The reaction was carried out for 16 hours.
  • the fragment of genomic DNA produced was precipitated by isopropanol precipitation, washed with 70% ethanol, air-dried and then redissolved in TE.
  • These genomic DNA fragments were applied to a 1.2% agarose gel and electrophoresed, and the genomic DNA fragments separated in the agarose gel were visualized by a UV transilluminator and photographed with a scale.
  • the agarose gel was immersed in 0.25 N hydrochloric acid and gently shaken for 10 minutes, then immersed in 0.4 N sodium hydroxide and gently shaken for another 10 minutes.
  • the genomic DNA fragments separated in the agarose gel were transferred to a nylon membrane (Hybond-XL; GE Healthcare) for 16 hours at room temperature by capillary method using 0.4 N sodium hydroxide.
  • the nylon membrane to which the genomic DNA fragment had been transferred was immersed in 2 ⁇ SSC, gently shaken for 10 minutes, air-dried, and stored at room temperature until it was used for hybridization.
  • the DNA fragment was labeled with [32 P] by random prime method using DNA labeling kit (Megaprime DNA Labeling System; GE Healthcare).
  • the [32P] -labeled fragment was purified using a Sephadex spin column (ProbeQuant G-50 Micro Columns; GE Healthcare) as a [32P] -labeled probe.
  • the nylon membrane to which the genomic DNA fragment had been transferred was placed in a hybridization buffer and preincubated at 65 ° C. for 1 hour. Thereafter, the mixture was heated at 95 ° C. for 5 minutes, and immediately after that, ice-cold denatured [32 P] labeled probe was added for 5 minutes and incubated at 65 ° C. for 4 hours. After the incubation was completed, the nylon membrane was removed and washed with 0.1% SDS, 0.5 ⁇ SSC at 65 ° C. for about 15 minutes. The radioactivity derived from the probe bound to the membrane was monitored by a survey meter, and this washing was repeated until the radioactivity became almost constant.
  • the washed membranes were covered with Saran Wrap® and overlaid in a dark room with X-ray film (BioMax MS; Kodak) and placed in an autoradiography cassette.
  • the X-ray film was developed after one week exposure at 4 ° C.
  • An individual that detects a specific signal derived from a human LAG-3 RecBAC / human Fc ⁇ R BAC expression construct by autoradiography and provides a specific signal by hybridization with a [32P] -labeled probe is human LAG-3.
  • RecBAC / human Fc ⁇ R BAC transgenic mice were identified as founder individuals.
  • mice Production and breeding of F1 mice
  • the offspring of founder individuals were obtained, genotyping was performed, and Tg mice were lined.
  • a Tg mouse founder identified by Southern analysis and a wild type C57BL / 6J mouse were subjected to in vitro fertilization or natural mating to produce an F1 individual.
  • the transgenes were transferred to F1 individuals by genotyping, and the lines that were able to be organized were subjected to reproduction by in vitro fertilization or natural mating with wild-type C57BL / 6J mice, and both human LAG-3 and human Fc ⁇ RIIIA were genotyping. Heterozygous mice were used for experiments.
  • PE-labeled anti-mouse LAG-3 antibody manufactured by BD
  • ATTO 647-labeled anti-human LAG-3 antibody manufactured by Enzo Life Sciences
  • FITC-labeled anti-mouse CD3 antibody manufactured by BD
  • LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye manufactured by Invitrogen was added and suspended, and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
  • a control without PE labeled anti-mouse LAG-3 antibody and ATTO 647 labeled anti-human LAG-3 antibody was prepared and treated in the same manner for use in identifying the position of the negative population.
  • Con A-activated T cells derived from human LAG-3 / human Fc ⁇ RIIIA double transgenic mice show expression of both mouse LAG-3 and human LAG-3, and the dot plot dots representing individual cells are almost identical It was distributed diagonally. The expression of mouse LAG-3 and human LAG-3 was hardly observed in the non-activated resting T cells. From these results, in the prepared human LAG-3 / human Fc ⁇ RIIIA double transgenic mouse, as originally planned by using the technique of BAC transgenic, human LAG-3 expresses endogenous mouse LAG-3 It became clear to express according to the pattern.
  • Example 11 In vivo evaluation of humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 11-1) LAG-3 positive cell removing activity of humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2
  • Example 10 human LAG-3 / human Fc ⁇ RIIIA double Using transgenic mice, it was examined whether the obtained humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 has an activity of removing LAG-3 positive cells in vivo.
  • Con A having polyclonal T cell activation activity (Sigma) was administered intravenously at a dose of 15 mg / kg.
  • erythrocytes were hemolyzed from blood collected by Pharm Lyse (manufactured by BD) to obtain leukocytes, which were used for flow cytometry.
  • FcBlock manufactured by BD
  • PE-labeled anti-mouse LAG-3 antibody manufactured by BD
  • ATTO 647-labeled anti-human LAG-3 antibody manufactured by Enzo Life Sciences
  • FITC-labeled anti-mouse CD3 antibody BD
  • LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye manufactured by Invitrogen
  • EAE pertussis toxin diluted with physiological saline.
  • score 0 asymptomatic
  • score 1 tail weakness
  • score 2 gait abnormality
  • loss of righting reflex
  • score 3 hind limb paralysis
  • score 4 partial paralysis of forelimb
  • score 5 death or euthanasia.
  • Humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 and control antibody were intravenously administered at a dose of 30 mg / kg on Days 0 and 7, respectively.
  • the average value of the clinical score of EAE is suppressed to 50% or less during the observation period as compared to the control antibody administration group.
  • weight loss associated with EAE progression was also suppressed.
  • the humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 having the activity of removing LAG-3 positive cells in vivo suppresses EAE, which is a typical T-cell dependent autoimmune disease model. It became clear that it could be used as a therapeutic agent for human autoimmune diseases.
  • Example 12 Relationship between LAG-3 and Perforin, CD28, and CD57 Expression in Human Activated T Cells
  • PBMC peripheral blood by Ficoll centrifugation, and added to a 96-well U-bottom microplate at 4 ⁇ 10 5 cells / well.
  • Human IL-2 (Peprotech, final concentration 100 ng / mL) and Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 (Life Technologies, 4 ⁇ 10 5 / well) were added and cultured for 4 days to activate T cells.
  • the obtained cells were collected, suspended in FACS buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.1% sodium azide), and reacted with Human BD Fc Block (BD) at room temperature for 10 minutes.
  • FACS buffer PBS, 0.1% BSA, 0.1% sodium azide
  • the cell surface is stained by reacting it with a fluorescently labeled antibody diluted with a FACS buffer containing LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye (manufactured by Invitrogen) at 4 ° C. for 30 minutes. Washed with FACS buffer.
  • FITC labeled anti-human CD8 antibody As a fluorescent labeled antibody, FITC labeled anti-human CD8 antibody, PerCP-Cy5.5 labeled anti-human CD3 antibody, APC labeled anti-human CD28 antibody, PacificBlue labeled anti-human CD57 antibody (all are BD company), PE labeled anti-human CD28 antibody Anti-human LAG-3 antibody and isotype control antibody labeled using (Biolegend), PE labeling kit (Dojindo) were used in various combinations. For some samples, intracellular intracellular perforin was also stained using BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization Solution Kit (BD) and APC labeled anti-human perforin antibody (eBiosciences).
  • BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization Solution Kit BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization Solution Kit (BD) and APC labeled anti-human perforin antibody (eBiosciences).
  • the washed cells were resuspended in PBS containing 1% paraformaldehyde, and detection was performed with a flow cytometer (Canto II manufactured by BD or MACSQuant X manufactured by Miltenyi). Data analysis was performed by FlowJo (manufactured by TreeStar). LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR fluorescent reactive dye-positive dead cells were gated out, then live cells alone were further gated and analyzed in CD3 positive CD8 positive CD8 T cells.
  • FIG. 103 shows the results of analysis of the relationship between LAG-3 and CD28 expression.
  • less than 50% of LAG-3 positive cells were found in CD28 positive cells, whereas in the case of CD28 negative cells, the cell population was generally LAG-3 positive compared to CD28 positive cells.
  • expression of LAG-3 is more expressed in CD28 negative cells as compared to CD28 positive cells because Was found to be recognized.
  • FIG. 104 shows the results of analysis of the relationship between LAG-3 and CD57 expression.
  • 42% of the CD57-negative cells are LAG-3 positive, whereas the CD57-positive cells are generally LAG-3 positive compared to the CD57 negative cells.
  • LAG-3 positive because of a large shift and a proportion of 79% of the cells became LAG-3 positive, in human activated CD8 T cells, expression of LAG-3 was more pronounced in CD57 positive cells compared to CD57 negative cells. It became clear that it was recognized.
  • Example 13 Effect of LAG-3 Antibody on Perforin-Positive CD8 T Cells
  • Humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2, calcineurin inhibitor tacrolimus, and corticosteroid dexamethasone in the experimental system of Example 12 were examined.
  • Human PBMCs are hLA212_H4 / L2 (final concentration 10 ⁇ g / mL), control human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories, final concentration 10 ⁇ g / mL), tacrolimus (Focus, final concentration 10 nM), and dexamethasone (ENZO Life Sciences) After pre-incubation for 30 minutes at 37 ° C.
  • the cells were cultured for 4 days with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 as in Example 12, and the obtained cells were subjected to flow cytometry.
  • concentrations of these antibodies and compounds are as described previously (Henderson, DJ et al., Immunol., 1991; 73 (3): 316-321: Brunetti, M. et al., Pharmacol. Exp. Ther., 1998; 285 (2): 915-919), etc., the concentration is considered to be the concentration considered to exhibit the maximum efficacy.
  • Example 14 Action of LAG-3 antibody on CD28 negative T cells and CD57 positive T cells Humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 on calcineurin inhibitor on CD28 negative T cells and CD57 positive T cells in the assay system of Example 13 The effects of certain tacrolimus and corticosteroid dexamethasone were examined.
  • Human PBMC were treated with hLA212_H4 / L2 (final concentrations 10, 1, and 0.1 ⁇ g / mL), control human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories, final concentration 10 ⁇ g / mL), tacrolimus (Focus, final concentration 10 nM), And pre-incubation with dexamethasone (ENZO Life Sciences, final concentration 1 ⁇ M) at 37 ° C. for 30 minutes, culture the cells with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 for 4 days as in Example 12, and flow the obtained cells Subject to cytometry. Among live cells, CD3 positive CD8 negative fractions were analyzed as CD4 T cells, and CD3 positive CD8 positive fractions as CD8 T cells.
  • FIG. 106B The results of analyzing the effect on CD28 negative T cells are shown in FIG.
  • the number of CD28 negative CD8 T cells was significantly reduced by hLA212_H4 / L2, as in the case of the perforin positive CD8 T cells of Example 13, as shown in FIG. 106B.
  • This effect was dependent on the concentration of hLA212_H4 / L2, with similar results when using either PBMC from two donors.
  • tacrolimus and dexamethasone were added, no significant decrease in the number of CD28 negative CD8 T cells as observed with the LAG-3 antibody was observed. Also, as shown in FIG.
  • the CD28 negative CD4 T cells are not as remarkable as CD28 negative CD8 T cells
  • the LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 shows a decrease in the number of cells
  • tacrolimus and dexamethasone show little effect Or rather increased.
  • FIG. 107B The result of analyzing the effect on CD57 positive T cells is shown in FIG.
  • the number of CD57 positive CD8 T cells was markedly reduced by hLA212_H4 / L2, as in FIG. 107B.
  • This effect was dependent on the concentration of hLA212_H4 / L2, with similar results when using either PBMC from two donors.
  • tacrolimus and dexamethasone were added, the remarkable decrease in the number of CD57 positive CD8 T cells as observed with the LAG-3 antibody was not observed. Also, as shown in FIG.
  • the LAG-3 antibody hLA212_H4 / L2 shows a decrease in the number of cells, and tacrolimus and dexamethasone have such an effect. was hardly observed.
  • the humanized anti-human LAG-3 antibody hLA212_H3 / L2 the anti-human LAG-3 mouse-human chimeric antibody A9H12, and the anti-human LAG-3 rat-human chimeric antibody cLA212, which are not in the low fucose form, are in the low fucose form Although weak compared to hLA212_H4 / L2, it showed a tendency to reduce the number of CD28 negative T cells and CD57 positive T cells (data not shown).
  • anti-LAG-3 antibody depletes CD28 negative T cells and CD57 positive T cells considered to be involved in steroid resistance in cytotoxic and immune system diseases, and such T cell depleting activity It has been revealed that hypofucosation is enhanced, and it has been shown that it may be a promising cytotoxic T cell depleting drug in the treatment of immunosuppressant-resistant cytotoxic T cell related diseases.
  • compositions of the invention are useful for cytotoxic T cell depletion.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA204 antibody (FIG. 16)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA204 antibody
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA204 antibody (FIG. 18)
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of light chain variable region of rLA204 antibody (FIG. 19)
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA212 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of light chain variable region of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 9 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA 225 antibody
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA 225 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 11 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA 225 antibody
  • SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence of light chain variable region of rLA 225 antibody
  • SEQ ID NO: 13 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA869 antibody
  • SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA869 antibody
  • SEQ ID NO: 15 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA869 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 16 Amino acid sequence of light chain variable region of rLA869 antibody
  • SEQ ID NO: 17 Nucleotide sequence of cDNA encoding amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA1264 antibody
  • SEQ ID NO: 18 amino acid sequence of heavy chain variable region of rLA1264 antibody
  • SEQ ID NO: 19 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain variable region of rLA1264 antibody
  • SEQ ID NO: 20 Amino acid sequence of light chain variable region of rLA1264 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 21 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of human light chain secretion signal and human ⁇ chain constant region
  • SEQ ID NO: 22 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of human heavy chain secretion signal and human IgG1 constant region
  • SEQ ID NO: 23 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain of cLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 24 amino acid sequence of heavy chain of cLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 25 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain of cLA212 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 26 Amino acid sequence of light chain of cLA212 antibody (FIG. 41)
  • SEQ ID NO: 27 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain H2 of hLA212 antibody (FIG. 42)
  • SEQ ID NO: 28 Amino acid sequence of heavy chain H2 of hLA212 antibody (FIG. 43)
  • SEQ ID NO: 29 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of heavy chain H3 of hLA212 antibody (FIG. 44)
  • SEQ ID NO: 30 Amino acid sequence of heavy chain H3 of hLA212 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 31 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain L1 of hLA212 antibody (FIG. 46)
  • SEQ ID NO: 32 Amino acid sequence of light chain L1 of hLA212 antibody (FIG. 47)
  • SEQ ID NO: 33 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain L2 of hLA212 antibody (FIG. 48)
  • SEQ ID NO: 34 Amino acid sequence of light chain L2 of hLA212 antibody (FIG. 49)
  • SEQ ID NO: 35 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain L3 of hLA212 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 36 Amino acid sequence of light chain L3 of hLA212 antibody (FIG. 51)
  • SEQ ID NO: 37 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain L4 of hLA212 antibody (FIG. 52)
  • SEQ ID NO: 38 Amino acid sequence of light chain L4 of hLA212 antibody (FIG. 53)
  • SEQ ID NO: 39 Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of light chain L5 of hLA212 antibody (FIG. 54)
  • SEQ ID NO: 40 Amino acid sequence of light chain L5 of hLA212 antibody (FIG. 55)
  • SEQ ID NO: 42 Amino acid sequence of heavy chain CDRH2 of rLA204 antibody (FIG. 57)
  • SEQ ID NO: 43 amino acid sequence of heavy chain CDRH3 of rLA204 antibody
  • SEQ ID NO: 44 Amino acid sequence of light chain CDRL1 of rLA204 antibody (FIG. 59)
  • SEQ ID NO: 45 Amino acid sequence of light chain CDRL2 of rLA204 antibody (FIG. 60)
  • SEQ ID NO: 47 amino acid sequence of heavy chain CDRH1 of rLA212 antibody (FIG.
  • SEQ ID NO: 48 amino acid sequence of heavy chain CDRH2 of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 49 amino acid sequence of heavy chain CDRH3 of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 50 Amino acid sequence of light chain CDRL1 of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 51 amino acid sequence of light chain CDRL2 of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 52 Amino acid sequence of light chain CDRL3 of rLA212 antibody
  • SEQ ID NO: 53 amino acid sequence of heavy chain CDRH1 of rLA225 antibody
  • SEQ ID NO: 54 amino acid sequence of heavy chain CDRH2 of rLA225 antibody (FIG. 69)
  • SEQ ID NO: 55 amino acid sequence of heavy chain CDRH3 of rLA225 antibody
  • SEQ ID NO: 56 Amino acid sequence of light chain CDRL1 of rLA225 antibody (FIG. 71)
  • SEQ ID NO: 57 Amino acid sequence of light chain CDRL2 of rLA225 antibody (FIG. 72)
  • SEQ ID NO: 58 amino acid sequence of light chain CDRL3 of rLA225 antibody (FIG. 73)
  • SEQ ID NO: 60 amino acid sequence of heavy chain CDRH2 of rLA869 antibody (FIG. 75)
  • SEQ ID NO: 61 Amino acid sequence of heavy chain CDRH3 of rLA869 antibody (FIG. 76)
  • SEQ ID NO: 62 Amino acid sequence of light chain CDRL1 of rLA869 antibody (FIG. 77)
  • SEQ ID NO: 63 Amino acid sequence of light chain CDRL2 of rLA869 antibody (FIG. 78)
  • SEQ ID NO: 65 amino acid sequence of heavy chain CDRH1 of rLA1264 antibody (FIG. 80)
  • SEQ ID NO: 66 amino acid sequence of heavy chain CDRH2 of rLA1264 antibody (FIG. 81)
  • SEQ ID NO: 67 amino acid sequence of heavy chain CDRH3 of rLA1264 antibody (FIG. 82)
  • SEQ ID NO: 68 Amino acid sequence of light chain CDRL1 of rLA1264 antibody (FIG. 83)
  • SEQ ID NO: 71 Primer RG2AR3
  • SEQ ID NO: 72 Primer RKR5
  • SEQ ID NO: 73 Primer 3.3-F1
  • SEQ ID NO: 74 Primer 3.3-R1
  • SEQ ID NO: 75 Primer 212H-F
  • SEQ ID NO: 76 Primer 212H-R
  • SEQ ID NO: 77 Primer 212L-F
  • Figure 93 SEQ ID NO: 79: oligonucleotide LAG-3-H1 (FIG.
  • SEQ ID NO: 80 oligonucleotide LAG-3-H2 (FIG. 95)
  • SEQ ID NO: 81 oligonucleotide LAG-3-H3 (FIG. 96)
  • SEQ ID NO: 82 oligonucleotide LAG-3-H4 (FIG. 97)
  • SEQ ID NO: 83 oligonucleotide LAG-3-H5 (FIG. 98)
  • SEQ ID NO: 84 oligonucleotide LAG-3-H6 (FIG. 99)
  • SEQ ID NO: 86 Amino acid sequence of human LAG-3 (FIG. 101)

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Abstract

新規組成物を提供すること。下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物： （ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する； （ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、 （ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。

Description

細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物
　本発明は、抗体、その結合断片等を含む細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のための抗体、その結合断片等の使用、抗体、その結合断片等を投与する工程を含む傷害性細胞Ｔ細胞の枯渇方法等に関する。
　Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答において中心的な役割を果たしている細胞であり、多様な抗原に対処するため、生体内には１０００万ないし１０億クローンともいわれる種々の抗原特異性を持ったＴ細胞が存在している。体内に抗原が侵入すると、そのような膨大なＴ細胞のレパートリーのうちのごく限られた抗原特異的なクローンのみが増殖・活性化し、サイトカイン産生や細胞傷害活性などを介して生体防御に働く。自己免疫疾患においては、何らかの自己の抗原に対する異常な免疫応答が引き金となって、種々の病態が形成されると考えられている。このような状況においても、抗原特異性を有さない大部分の他のクローンは、増殖・活性化されず休止状態にある。そのため、活性化Ｔ細胞のみを選択的に除去することができれば、他の抗原特異性を有する大部分のＴ細胞に影響を与えることなく、特異的に免疫を抑制することが可能になり、自己免疫疾患、移植物の拒絶、アレルギー性疾患等に対する有用な治療法あるいは予防法となりうる。一方、制御性Ｔ細胞など免疫系を負に制御するＴ細胞が主に活性化している状況では、これを除去することで、悪性腫瘍、慢性感染症等に対する有用な治療法あるいは予防法となりうる。
　ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する１回膜貫通型の分子であり、活性化Ｔ細胞にほぼ選択的に発現することが知られている分子である(非特許文献１)。ラット同種異系心臓移植モデルに、ラットＬＡＧ－３分子に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有するウサギ抗血清を投与すると、移植片中のＬＡＧ－３陽性細胞が減少し、移植片が拒絶されるまでの期間が若干延長することが報告されている(非特許文献２)。また、ヒヒに交差性を有し、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す抗ヒトＬＡＧ－３キメラ抗体Ａ９Ｈ１２が、その用量反応性は不明確ながら、ヒヒの遅延型過敏反応を抑制すること（非特許文献３）、そのヒト化体が作製されたこと（特許文献２）も報告されている。
　ＬＡＧ－３は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合することで、Ｔ細胞に何らかの抑制性のシグナルを伝達し、Ｔ細胞の機能を負に制御することが知られている(非特許文献１)。ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合には、ＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうち、Ｎ末端のドメイン１および２が重要であると考えられており(非特許文献４)、またこのＬＡＧ－３を介したＴ細胞機能の抑制は、ＰＤ－１分子などを介した他のＴ細胞機能を抑制するシグナルと協同的に発揮されることも報告されている(非特許文献５)。実際、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能を阻害することによって免疫細胞の働きを活発にし、がん細胞を攻撃する新たながん治療法の開発が近年盛んに行われている(非特許文献６および７)。そのため、ＡＤＣＣ活性などによりＬＡＧ－３陽性細胞を除去するＬＡＧ－３抗体、言い換えれば、ＬＡＧ－３陽性細胞を枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）させるＬＡＧ－３抗体を自己免疫疾患に適用する場合、ＬＡＧ－３本来のＴ細胞抑制機能を阻害する活性を有さない抗体である方が、免疫系が異常に活性化されて自己免疫疾患がかえって悪化してしまうリスクがなく、より望ましいと考えられる。上述のＣＤＣ活性を有する抗ラットＬＡＧ－３ウサギ抗血清およびＡＤＣＣ活性を示す抗ヒトＬＡＧ－３キメラ抗体Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１：特許文献１及び２）はいずれも、ＬＡＧ－３陽性細胞の除去は完全ではなく(非特許文献２および３)、除去され残ったＴ細胞の異常な反応による副反応の可能性及び自己免疫疾患の抑制に対する負の影響が想定される。
　Ｔ細胞サブセットのうち、ＣＤ４＋（陽性）ＣＤ２８－（陰性）Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞はパーフォリン、グランザイムＢなどを高発現する細胞傷害性のＴ細胞群である（非特許文献１２、非特許文献１３）。ステロイド薬剤は免疫系疾患の治療に広く用いられているが、喘息や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような免疫系疾患ではステロイド難治性の患者集団が存在する（非特許文献１４）。近年、ある種の自己免疫疾患においては、前述のような細胞傷害性Ｔ細胞が病態に関与する主な炎症系細胞のひとつとして報告されている（非特許文献１２, 非特許文献１５）。細胞傷害性Ｔ細胞は高い細胞傷害作用を有する一方、ステロイド処置による抗炎症作用あるいはアポトーシス誘導への耐性が報告されている（非特許文献１６）。
米国特許出願公開２０１１／００７０２３８Ａ１号 国際公開２０１４／１４０１８０号
トリーベル、エフ（Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｆ．）、ラグ３：・レビュレーター・オブーティー・セル・アンド・ディーシー・レスポンシズ・アンド・イッツ・ユース・イン・セラピューティック・ヴァクシネーション（ＬＡＧ－３：　ａ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ＤＣ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．）、トレンズ・イン・イムノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２００３年１２月刊；２４巻（１２号）：６１９－２２ページ ハウデブルグ，ティー他（Ｈａｕｄｅｂｏｕｒｇ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．）、ディプリーション・オブ・ラグ３・ポジティブ・セルズ・イン・カーディアック・アログラフト・リヴィール・ゼア・ロール・イン・リジェクション・アンド・トレランス（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ＬＡＧ－３　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．）、トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、２００７年１２月刊；８４巻（１１号）：１５００－０６ページ ハウデブルグ，ティー他（Ｈａｕｄｅｂｏｕｒｇ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．）、アンチボディー－メディエイテッド・ディプリーション・オブ・リンフォサイト－アクティベーション・ジーン－３（ラグ３（＋））－アクティベーテッド・Ｔ・リンフォサイツ・プリベンツ・ディレイータイプ・ハイパーセンシティティヴィティ・イン・ノン・ヒューマン・プライメイティーズ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ－３　（ＬＡＧ－３（＋）　）－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ｄｅｌａｙｅｄ－ｔｙｐｅ　ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ　ｐｒｉｍａｔｅｓ）、クリニカル・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２０１１年５月刊；１６４巻（２号）：２６５－７４ページ ヒュアード，ビー他（Ｈｕａｒｄ，　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．）、キャラクタリゼーション・オブ・ザ・メイジャー・ヒストコンパティビリティー・コンプレックス・クラス・ツー・バインディング・サイト・オン・ラグ３・プロテイン（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｏｎ　ＬＡＧ－３　ｐｒｏｔｅｉｎ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、１９９７年５月２７日刊；９４巻（１１号）：５７４４－４９ページ オカザキ，ティー他（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．）、ピーディー１・アンド・ラグ３・インヒビトリー・コーレセプター・アクト・シナージスチカリー・トゥ・プリベント・オートイミュニティ・イン・マイス（ＰＤ－１　ａｎｄ　ＬＡＧ－３　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｃｔ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、２０１１年２月７日刊；２０８巻（２号）：３９５－４０７ページ ニューイン，エル・ティー（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｔ．）及びオハシ，ピー・エス（Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．Ｓ．）、クリニカル・ブロッケード・オブ・ピーディー１・アンド・ラグ３――ポテンシャル・メカニズムス・オブ・アクション（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｏｆ　ＰＤ１　ａｎｄ　ＬＡＧ３－－ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ）、ネイチャー・レビュー・オブ・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０１５　年１月刊;１５巻（１号）：４５－５６ページ ターニス，エム・イー他（Ｔｕｒｎｉｓ，Ｍ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．）、インヒビトリ・レセプターズ・アズ・ターゲッツ・フォー・キャンサー・イミュノセラピー（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｓ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、ヨーロピアン・ジャ＾ナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０１５年７月刊；４５巻（７号）：１８９２－９０５ページ ヒュアード，ビー他（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．ｅｔ　ａｌ．）、ティー・セル・メイジャー・ヒストコンパティビリティー・コンプレックス・クラスＩＩ・モレキュールズ・ダウン－レギュレート・シーディー４ポジティブ・ティーセル・クローン・レスポンシズ・フォロウィング・ラグ３・バインディング（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅ　ＣＤ４＋　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ＬＡＧ－３　ｂｉｎｄｉｎｇ）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９６年５月；２６巻（５号）：１１８０－０６ページ メソン－レメトレ，エル（Ｍａｃｏｎ－Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｌ）及びトリーベル，エフ（Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｆ）、ザ・ネガティブ・レギュラトリー・ファンクション・オブ・ザ・リンフォサイト－アクティベーション３・ジーン・コーレセプター（シーディー３３４）オン・ヒューマン・ティー・セルズ（Ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ－３　ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（ＣＤ２２３）　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ）、イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００５年６月刊；１１５巻（２号）：１７０－０８ページ リ，エム他（Ｌｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．）、リコンスティテューション・オブ・ヒューマン・エフシー・ガンマ・アールスリー・セル・タイプ・スペシフィシティー・イン・トランスジェニック・マイス（Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｆｃ　ｇａｍｍａ　ＲＩＩＩ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１９９６年５月１日刊；１８３巻（３号）：１２５９－６３ページ ミラー，スティーブン・ディー他（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｄ．ｅｔ　ａｌ．）、エクスペリメンタル・オートイミューン・エンセファロミエリティス・イン・ザ・マウス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ）、カレント・プロトコールズ・イン・イミュノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、チャプター１５（ＵＮＩＴ　１５．１）、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、２０１０年刊：１５．１．１－１５．１．２０ページ ストリオガ、エム他（ＳＴＲＩＯＧＡ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ.）、シーディー８ポジティブ・シーディー２８ネガティブ・アンド・シーディー８ポジティブ・シーディー５７ポジティブ・ティー・セルズ・アンド・ゼア・ロール・イン・ヘルス・アンド・ディズイーズ（ＣＤ８＋　ＣＤ２８－　ａｎｄ　ＣＤ８＋　ＣＤ５７＋　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ）、イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、 ２０１１年；１３４巻（１号）：１７－３２ページ マリー、ケー及びシルマー、Ｍ（Ｍａｌｙ　Ｋ，Ｓｃｈｉｒｍｅｒ　Ｍ）、ザ・ストーリー・オブ・シーディー４ポジティブ・シーディー２８ネガティブ・チー・セルズ・リビジッティッド：ソルブド・オア・スティル・オンゴーイング？（Ｔｈｅ　ｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ＣＤ４＋　ＣＤ２８－　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：　ｓｏｌｖｅｄ　ｏｒ　ｓｔｉｌｌ　ｏｎｇｏｉｎｇ?）、ジャーナル・オブ・イミュノロジー・リサーチ（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｒｅｓ．）、２０１５年；２０１５巻：記事番号３４８７４６. バーンズ、ピージェー（Ｂａｒｎｅｓ，Ｐ.）、コルチコステロイド・レジスタンス・イン・ペイシャンツ・ウィズ・アズマ・アンド・クロニック・オブストラクティブ・パルモナリー・ディズイーズ（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｓｔｈｍａ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ）、ジャーナル・オブ・アレジー・アンド・クリニカルイミュノロジー（Ｊ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２０１３年；１３１巻（３号）：６３６－６４５ページ ブラウクス、ビー他（Ｂｒｏｕｘ，Ｂ，ｅｔ　ａｌ.）、パソジェニック・フィーチャーズ・オブ・シーディー４ポジティブシーディー２８ネガティブ・ティー・セルズ・イン・イミューン・ディスオーダーズ（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２８－　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、トレンズ・イン・モレキュラー・メデイシン（Ｔｒｅｎｄｓ．　Ｍｏｌ．　Ｍｅｄ．） ２０１２年；第１８巻（８号）：４４６－４５３ページ ホッジ、ジー及びホッジ、エス（Ｈｏｄｇｅ，Ｇ.　ａｎｄ　Ｈｏｄｇｅ，Ｓ.）、ステロイド・レジスタント・シーディー８ポジティブシーディーヌル・エヌケーティーライク・プロインフラマトリー・サイトトキシック・セルズ・イン・クロニック・オブストラクティブ・パルモナリー・ディズイーズ（Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ＣＤ８＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ　ＮＫＴ－Ｌｉｋｅ　Ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ）、フロンティアズ・イン・イミュノロジー（Ｆｒｏｎｔ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ.）２０１６年；７巻：６１７ページ
　細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させるための組成物等を提供すること。
　本発明は、
（１）
　下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２）
　細胞傷害性Ｔ細胞が、パーフォリン陽性Ｔ細胞、グランザイムＢ陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞よりなる群から選択される、（１）記載の組成物、
（３）
　細胞傷害性Ｔ細胞がＬＡＧ－３陽性である、（１）又は（２）に記載の組成物、
（４）
　抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片が、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合し、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の組成物：
（ｉ）低フコース形態で、イン・ビボで実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；及び
（ｉｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する、
（５）
　免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防に使用される、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の組成物、
（６）
　免疫抑制剤がステロイドである、（５）記載の組成物、
（７）
　免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、（５）又は（６）記載の組成物、
（８）
　該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の組成物、
（９）
　該抗体又はその結合断片が、配列番号５０又は図６５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１又は図６６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２又は図６７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７又は図６２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８又は図６３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９又は図６４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、（４）記載の組成物、
（１０）
　該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、（９）記載の組成物、
（１１）
　該抗体又はその結合断片が、配列番号２８又は図４３で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２又は図４７で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、（１０）記載の組成物、
（１２）
　該抗体又はその結合断片の、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸を含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸を含む、（１０）又は（１１）記載の組成物、
（１３）
　該抗体又はその結合断片の、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸を含む、（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組成物、
（１４）
　該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される、（１０）乃至（１３）のいずれか一つに記載の組成物：
［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片、
（１５）
　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列と、それぞれ９５％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（１４）記載の組成物、
（１６）
　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域アミノ酸配列、および、該抗体又はその結合断片の有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第３の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第４の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域アミノ酸配列、を含む抗体又はその結合断片を含んでなる、（１４）記載の組成物、
（１７）
　下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（１４）記載の組成物：
（ｉ）該抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する、
（１８）
　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載の組成物、
（１９）
　該抗体又はその結合断片が、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子若しくは該核酸分子を含むベクターを含む細胞、又は、該抗体又はその結合断片を生産する細胞を培養する工程を含んでなる、該抗体又はその結合断片の製造方法により得られる、（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載の組成物、
（２０）
　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏しない、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の組成物、
（２１）
　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合しない、（１）乃至（３）及び（２０）のいずれか一つに記載の組成物、
（２２）
　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（２０）又は（２１）に記載の組成物、
（２３）
　細胞傷害性Ｔ細胞枯渇に使用される、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２４）
　細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のための、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片の使用：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２５）
　下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を投与することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させる方法：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２６）
　他の医薬と組み合わせて使用される、（１）乃至（２２）のいずれか一つに記載の組成物、
（２７）
　下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、　パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療用又は予防用医薬組成物：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２８）
パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性が、細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて判定されることを特徴とする、（２７）記載の医薬組成物、
（２９）
　該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来することを特徴とする、（２８）記載の医薬組成物、
（３０）
細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、バセドウ病、強直性脊椎炎、扁平部炎、喘息、関節リウマチ、多発性筋炎・皮膚筋炎、封入体筋炎、急性冠症候群、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、２型糖尿病、宿主対移植片反応、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は、サルコイドーシスである、（２７）乃至（２９）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３１）
　細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患がＬＡＧ－３陽性である、（２７）乃至（３０）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３２）
　抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片が、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合し、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する、（２７）乃至（３１）のいずれか一つに記載の医薬組成物：
（ｉ）低フコース形態で、イン・ビボで実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；及び
（ｉｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する、
（３３）
　細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が免疫抑制剤抵抗性である、（２７）乃至（３２）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３４）
　免疫抑制剤がステロイドである、（３３）記載の医薬組成物、
（３５）
　免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、（３３）又は（３４）記載の医薬組成物、
（３６）
　該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、（２７）乃至（３５）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３７）
　該抗体又はその結合断片が、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、（２７）乃至（３６）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３８）
　該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、（３７）記載の医薬組成物、
（３９）
　該抗体又はその結合断片が、配列番号２８で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、（３８）記載の医薬組成物、
（４０）
　該抗体又はその結合断片の、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸を含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸を含む、（３８）又は（３９）記載の医薬組成物、
（４１）
　該抗体又はその結合断片の、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸を含む、（３８）乃至（４０）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４２）
　該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される、（３８）乃至（４１）のいずれか一つに記載の医薬組成物：
［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片、
（４３）
　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列と、それぞれ９５％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（４２）記載の医薬組成物、
（４４）
　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域アミノ酸配列、および、該抗体又はその結合断片の有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第３の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第４の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域アミノ酸配列、を含む抗体又はその結合断片を含んでなる、（４２）記載の医薬組成物、
（４５）
　下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（４２）記載の医薬組成物：
（ｉ）該抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する、
（４６）
　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（２７）乃至（４５）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４７）
　該抗体又はその結合断片が、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子若しくは該核酸分子を含むベクターを含む細胞、又は、該抗体又はその結合断片を生産する細胞を培養する工程を含んでなる、該抗体又はその結合断片の製造方法により得られる、（２７）乃至（４６）のいずれか一つに記載の医薬組成物。
（４８）
　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏しない、（２７）乃至（３１）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４９）
　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合しない、（２７）乃至（３１）及び（４８）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（５０）
　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（４８）又は（４９）に記載の医薬組成物、
（５１）
他の医薬と組み合わせて使用される、（２７）乃至（５０）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（５２）
パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に（１）乃至（２２）のいずれか一つに記載の組成物、又は（２７）乃至（５１）のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患を治療又は予防する方法、
（５３）
細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、免疫抑制剤抵抗性である、（５２）記載の方法、
（５４）
　免疫抑制剤がステロイドである、（５３）記載の方法、
（５５）
　免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、（５３）又は（５４）記載の方法、
（５６）
細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性か否かを判定する工程を含む、（５２）乃至（５５）のいずれか一つに記載の方法、
（５７）
　該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来する、（５６）記載の方法、
等に関する。
　本発明の提供する組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させるので、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患（後述）の治療及び／又は予防に使用され得る。
ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＬＡＧ－３を発現するヒトＰＨＡ　ｂｌａｓｔに対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。 ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＡＤＣＣ活性を示した図。ヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞を標的細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。 図３Ａは、ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験における阻害活性を示した図。Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとしてはラットＩｇＧ２ｂを、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとしては別途作製したＬＡＧ－３のドメイン１を認識するラット抗ＬＡＧ－３抗体をそれぞれ用いた。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。図３Ｂは、公知の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１がＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験において阻害活性を示すことを表した図。市販のマウス抗ヒトＬＡＧ－３抗体である１７Ｂ４も、阻害活性を示した。 ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）の２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験における阻害活性を示した図。Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとしてはラットＩｇＧ２ｂを、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとしては実施例２）－６で作製したＬＡＧ－３のドメイン１を認識するラット抗ＬＡＧ－３抗体（クローン６Ｄ７）をそれぞれ用いた。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。 図５Ａは、ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２およびｒＬＡ２２５）のヒトＬＡＧ－３結合エピトープをフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた抗ＦＬＡＧ抗体の結合もあわせて示す。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。　図５Ｂは、先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１のヒトＬＡＧ－３結合エピトープをフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。Ａｎｔｉｓｅｒｕｍは、実施例１）－１の免疫したラットから得た抗血清を５００倍希釈で使用した。他の抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。６Ｄ７は、実施例２）－６で作製したＬＡＧ－３のドメイン１を認識するラット抗ＬＡＧ－３抗体である。 ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。 ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体の結合能を解離定数として示す図。 １０種類のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体およびヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。 １０種類のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体およびヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のＡＤＣＣ活性を示した図。ヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞を標的細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。 ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２およびヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１のＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に対する影響を検討した図。各々の抗体存在下でヒトＰＢＭＣをＳＥＢで４日間刺激した際の培養上清へのＩＬ－２産生を測定した。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。 ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。 ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のＡＤＣＣ活性を示した図。ヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞を標的細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。 ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにおけるヒトＬＡＧ－３の発現が、マウスＬＡＧ－３の発現と一致していることを示す図。ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウス（Ｔｇ）およびコントロールの野生型マウス（Ｎｏｎ－Ｔｇ）の末梢血から得た白血球をＣｏｎ　Ａで刺激して得た活性化Ｔ細胞におけるヒトおよびマウスＬＡＧ－３の発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトおよびマウスＬＡＧ－３に対する染色抗体を含まないサンプルを用いて設定した。 ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＬＡＧ－３発現細胞に対するｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性を示した図。縦軸は、ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスに抗体およびＣｏｎ　Ａを投与した２日後の末梢血のＴ細胞におけるヒトＬＡＧ－３陽性率を表す。抗体は３０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｃｏｎ　Ａ投与の直前に腹腔内投与した。 ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２がｉｎ　ｖｉｖｏにおいて自己免疫疾患モデルを抑制する活性を有することを示す図。ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにＥＡＥを誘導し、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２あるいはコントロール抗体を投与したマウスにおけるＥＡＥの臨床スコアを経時的に示す。抗体はいずれも３０ｍｇ／ｋｇの用量で感作日およびその７日後に静脈内投与した。 ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１） ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２） ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３） ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４） ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号５） ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６） ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号７） ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８） ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号９） ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０） ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１） ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２） ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３） ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４） ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５） ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６） ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７） ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８） ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９） ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２０） ヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２１） ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２） ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２３） ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２４） ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２５） ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６） ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７） ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列（配列番号２８） ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９） ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号３０） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号３２） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３３） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号３４） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３５） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列（配列番号３６） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３７） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列（配列番号３８） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９） ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列（配列番号４０） ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４１） ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４２） ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４３） ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号４４） ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号４５） ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号４６） ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４７） ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４８） ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４９） ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５０） ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号５１） ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号５２） ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号５３） ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号５４） ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号５５） ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５６） ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号５７） ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号５８） ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号５９） ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６０） ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６１） ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６２） ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６３） ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６４） ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号６５） ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６６） ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６７） ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６８） ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６９） ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号７０） プライマーＲＧ２ＡＲ３（配列番号７１） プライマーＲＫＲ５（配列番号７２） プライマー３．３－Ｆ１（配列番号７３） プライマー３．３－Ｒ１（配列番号７４） プライマー２１２Ｈ－Ｆ（配列番号７５） プライマー２１２Ｈ－Ｒ（配列番号７６） プライマー２１２Ｌ－Ｆ（配列番号７７） プライマー２１２Ｌ－Ｒ（配列番号７８） オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ１（配列番号７９） オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ２（配列番号８０） オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ３（配列番号８１） オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ４（配列番号８２） オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ５（配列番号８３） オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ６（配列番号８４） ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号８５） ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列（配列番号８６） ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞において、ヒトＬＡＧ－３の発現がパーフォリンの発現と相関していることを示す図。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した細胞におけるＬＡＧ－３およびパーフォリンの発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトＬＡＧ－３およびヒトパーフォリンに対する染色抗体を含まないサンプル（左端の図）を用いて設定した。 ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞において、ＣＤ２８陰性細胞の多くがＬＡＧ－３を発現していることを示す図。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した細胞におけるＬＡＧ－３およびＣＤ２８の発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトＬＡＧ－３およびヒトＣＤ２８に対する染色抗体を含まないサンプル（左端の図）を用いて設定した。 ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞において、ＣＤ５７陽性細胞の多くがＬＡＧ－３を発現していることを示す図。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した細胞におけるＬＡＧ－３およびＣＤ５７の発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトＬＡＧ－３およびヒトＣＤ５７に対する染色抗体を含まないサンプル（左端の図）を用いて設定した。 ＬＡＧ－３抗体がパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞を選択的にｄｅｐｌｅｔｅすることを示す図。ヒトＰＢＭＣを、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、タクロリムス（Ｔａｃ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間刺激し、得られた細胞をフローサイトメトリー法（多重染色）により解析した。二人のドナー由来のＰＢＭＣを用いた結果を示す（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。図１０５ＡはトータルのＴ細胞数を、図１０５Ｂはパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞数をそれぞれ示す。 ＬＡＧ－３抗体がＣＤ２８陰性Ｔ細胞をｄｅｐｌｅｔｅすることを示す図。ヒトＰＢＭＣを、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０、１、０．１μｇ／ｍＬ）、コントロール抗体（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｔａｃ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間刺激し、得られた細胞をフローサイトメトリー法（多重染色）により解析した。二人のドナー由来のＰＢＭＣを用いた結果を示す（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。図１０６ＡはＣＤ２８陰性ＣＤ４Ｔ細胞数を、図１０６ＢはＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞数をそれぞれ示す。 ＬＡＧ－３抗体がＣＤ５７陽性Ｔ細胞をｄｅｐｌｅｔｅすることを示す図。ヒトＰＢＭＣを、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０、１、０．１μｇ／ｍＬ）、コントロール抗体（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｔａｃ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間刺激し、得られた細胞をフローサイトメトリー法（多重染色）により解析した。二人のドナー由来のＰＢＭＣを用いた結果を示す（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。図１０７ＡはＣＤ５７陽性ＣＤ４Ｔ細胞数を、図１０７ＢはＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞数をそれぞれ示す。
１．定義
　本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれる核酸分子またはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列またはその配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「ＬＡＧ－３遺伝子」としては、例えば、ＬＡＧ－３蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等をあげることができる。
　本発明において、「ヌクレオチド」と「核酸」及び「核酸分子」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等もそれらの意味に含まれる。かかるヌクレオチドは一本鎖、二本鎖又は三本以上の鎖からなるヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本以上の鎖の会合体も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。
　本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は同義である。
　本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。
　本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。
　本発明においては、ＬＡＧ－３と結合する抗体及びＬＡＧ－３を認識する抗体を、いずれも「抗ＬＡＧ－３抗体」と表記するか又は「ＬＡＧ－３抗体」と略記することがある。抗ＬＡＧ－３抗体には、モノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体等が含まれる。
　本発明における「抗体の結合断片」とは、元の抗体が奏する機能の少なくとも一部を奏する抗体断片を意味する。「抗体の結合断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の結合断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
　本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。抗ＬＡＧ－３抗体が結合又は認識するＬＡＧ－３蛋白質上の部位としては、ＬＡＧ－３蛋白質上の部分ペプチド又は部分高次構造等を例示することができる。
　抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。重鎖可変領域アミノ酸配列中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３以外の部分をフレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　Ｒｅｇｉｏｎ：以下ＦＲ）と呼び、アミノ末端からＣＤＲＨ１の手前まで、ＣＤＲＨ１の次からＣＤＲＨ２の手前まで、ＣＤＲＨ２の次からＣＤＲＨ３の手前まで、及び、ＣＤＲＨ３の次からカルボキシル末端までを、それぞれＦＲＨ１乃至ＦＲＨ４と呼ぶ。同様に、軽鎖可変領域アミノ酸配列中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３以外の部分もＦＲであり、アミノ末端からＣＤＲＬ１の手前まで、ＣＤＲＬ１の次からＣＤＲＬ２の手前まで、ＣＤＲＬ２の次からＣＤＲＬ３の手前まで、及び、ＣＤＲＬ３の次からカルボキシル末端までを、それぞれＦＲＬ１乃至ＦＲＬ４と呼ぶ。すなわち、重鎖及び軽鎖の可変領域（のアミノ酸配列）においては、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４及びＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４の順でアミノ末端側からカルボキシル末端に向けて連続的に並んでいる。
　本発明において、「抗体変異体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つＬＡＧ－３蛋白質に結合するポリペプチドを意味する。かかる抗体変異体における変異アミノ酸の数は、１個、１乃至２個、１乃至３個、１乃至４個、１乃至５個、１乃至６個、１乃至７個、１乃至８個、１乃至９個、１乃至１０個、１乃至１２個、１乃至１５個、１乃至２０個、１乃至２５個、１乃至３０個、１乃至４０個又は１乃至５０個である。かかる抗体変異体も本発明の「抗体」に包含される。　
　本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
　本発明においてＬＡＧ－３抗体が奏する活性・性質としては、例えば、生物的活性、理化学的性質等を挙げることができ、具体的には、各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等をあげることができる。
　本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、ならびに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
　本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。
　本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。
　本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞等が抗体を介して標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
　本発明において、「宿主対移植片反応」とは、臓器移植後に観察される被移植者の免疫亢進状態およびこれによる移植臓器の傷害をいう。　　
　本発明において、「移植片対宿主病」とは、造血細胞移植後の移植細胞による被移植者への免疫的攻撃によって発症する症状をいう。
　本発明において、「ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ」、「枯渇」および「除去」は同義であり、相互に置き換え可能であり、細胞傷害活性等により、特定の細胞群に含まれる細胞の数が減少した状態又は増加していない状態をいう。同様に「ｄｅｐｌｅｔｅ」、「枯渇させる」および「除去する」は同義であり、相互に置き換え可能であり、細胞傷害活性等により、特定の細胞群に含まれる細胞の数を減少させるか又は増加させないことをいう。
　本発明において、「細胞傷害性Ｔ細胞」とは、特定の細胞群に含まれる細胞に対し細胞傷害性を有するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＤ４＋（陽性）ＣＤ２８－（陰性）Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞、パーフォリン＋Ｔ細胞、グランザイムＢ＋Ｔ細胞等のＴ細胞サブセットをあげることができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、喘息及び重症喘息（以下まとめて「喘息」という）や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の免疫系疾患や自己免疫疾患に関与する主要な炎症系細胞の一つとして報告されており（非特許文献１２, 非特許文献１５）、高い細胞傷害作用を有する一方、ステロイド処置による抗炎症作用あるいはアポトーシス誘導への耐性が報告されている（非特許文献１６）
２．抗原蛋白質
（２－１）特性
　ＬＡＧ－３蛋白質（以下単に「ＬＡＧ－３」とも記す）は膜貫通型受容体蛋白質で、免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１乃至４）から成るリガンド結合部位を含む細胞外領域、Ｉ型１回膜貫通領域、および細胞内領域から構成されている。ＬＡＧ－３はＣＤ２２３と同義である。
　本発明において、ＬＡＧ－３は脊椎動物由来、好適には哺乳動物由来であり、より好適にはヒト由来である。
ＬＡＧ－３蛋白質は以下の性質を有する。
（ｉ）抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合する。
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、当該分子を発現するＴ細胞に抑制性のシグナルを伝達し、該Ｔ細胞の機能を負に制御する。
（ｉｉｉ）本発明においてＬＡＧ－３蛋白質は、次の（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列（以下、「ＬＡＧ－３アミノ酸配列」という）を含んでなるか、ＬＡＧ－３アミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、またはＬＡＧ－３アミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列と８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を示し且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなり且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；及び、
（ｄ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（核酸分子）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（核酸分子）の有するヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
　（ｂ）乃至（ｄ）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性に加え、ＬＡＧ－３の有する他の活性を有していてもよい。
（ｉｖ）ＬＡＧ－３蛋白質は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適にはマウス、ラット等のげっ歯類及びヒト、より一層好適にはヒト、ラット又はマウスの、ＬＡＧ－３を発現している細胞、組織又は癌組織、かかる組織由来の細胞、かかる細胞の培養物等より得ることができる。
ＬＡＧ－３は、生体内では炎症部位の活性化Ｔ細胞等に発現が認められ、正常組織の細胞においてはほとんど発現していないか又は発現レベルが非常に低い。
　ＬＡＧ－３蛋白質は天然型（非組換型）及び組換え型のいずれであってもよい。また、担体やタグなど他のペプチドや蛋白質との融合物もＬＡＧ－３蛋白質の意味に含まれる。さらに、ＰＥＧ等のポリマー付加を含む化学修飾、及び／又は、糖鎖修飾を含む生物学的修飾がなされたものもＬＡＧ－３蛋白質の意味に含まれる。また、ＬＡＧ－３蛋白質断片もＬＡＧ－３蛋白質の意味に含まれる。ＬＡＧ－３蛋白質断片のうち上記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）記載の性質を具備したものをＬＡＧ－３蛋白質結合断片と呼ぶ。
（２－２）抗原遺伝子
　本発明においてＬＡＧ－３遺伝子は、次の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「ＬＡＧ－３遺伝子配列」という）を含んでなるか、ＬＡＧ－３遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、またはＬＡＧ－３遺伝子配列からなる：
（ａ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（核酸分子）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（核酸分子）が有するヌクレオチド配列；及び
（ｃ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個の塩基が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
　（ｂ）又は（ｃ）記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性に加え、ＬＡＧ－３の有する他の活性を有していてもよい。
　ＬＡＧ－３遺伝子の発現及び発現量の測定は、ＬＡＧ－３遺伝子の転写産物及びＬＡＧ－３蛋白質のいずれを指標としてもよく、前者はＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロット・ハイブリダーゼーション法等により、後者はフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング法、免疫組織染色法等の免疫アッセイ法等により、それぞれ測定することができる。
（２－３）抗原蛋白質の調製
　ＬＡＧ－３蛋白質は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
（２－３－１）非組換型ＬＡＧ－３の精製、単離
　非組換型ＬＡＧ－３蛋白質は、ＬＡＧ－３を発現している細胞より精製、単離することができる。ＬＡＧ－３を発現している細胞としては（２－１）の（ｉｖ）記載のものを例示することができるが、非組換型ＬＡＧ－３蛋白質の由来はそれらに限定されるものではない。
　かかる組織、細胞、細胞培養物等からの精製・単離は当業者に周知の分画、クロマトグラフィー等の手法を組み合わせることにより行うことができる。
（２－３－２）組換型ＬＡＧ－３蛋白質の調製
　ＬＡＧ－３蛋白質は、組換型としても調製することができる。すなわち、ＬＡＧ－３蛋白質又はＬＡＧ－３蛋白質断片のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、かかる細胞の培養物からＬＡＧ－３蛋白質を回収することができる。また、アミノ末端（Ｎ末）及び／又はカルボキシ末端（Ｃ末）が天然型と同一の分子のみならず、分泌シグナル、細胞内局在化シグナル、アフィニティー精製用タグ、パートナーペプチドとの融合蛋白質として発現させることもできる。かかる組換え細胞培養物からのＬＡＧ－３蛋白質の精製、単離は、（２－３－１）記載の非組換型ＬＡＧ－３蛋白質の精製、単離に記載の分画、クロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせることにより行うことができる。また、ＬＡＧ－３蛋白質含有溶液は、ゲルろ過やＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ等の濃縮装置でバッファー交換及び／又は濃縮することができる。
（２－３－３）インビトロ翻訳
　ＬＡＧ－３蛋白質はインビトロ翻訳によっても調製することができる。かかる翻訳法としては、転写及び翻訳に必要な酵素、基質並びにエネルギー物質を含む無細胞翻訳系を利用した方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を利用する方法をあげることができる。
（２－３－４）化学合成
　ＬＡＧ－３蛋白質は化学合成によっても調製することができる。化学合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などのペプチド固相合成法をあげることができる。
　３．抗体
（３－１）抗体の分類
　本発明においてＬＡＧ－３抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。モノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト由来の抗体（ヒト抗体）、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体等をあげることができる。
　非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体等をあげることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体等げっ歯類由来の抗体等をあげることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等をあげることができる。抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体としては、例えば、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、４ＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４等をあげることができるが、それらに限定されない。
　キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体等をあげることができるが、それに限定されるものではない。非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体定常領域が結合してなるキメラ化抗体としては、前述のラットモノクローナル抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、４ＬＡ８６９又はｒＬＡ１２６４由来の重鎖及び軽鎖可変領域、ならびに、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を有するもの（それぞれ「ｃＬＡ２０４」、「ｃＬＡ２１２」、「ｃＬＡ２２５」、「ｃＬＡ８６９」又は「ｃＬＡ１２６４」と呼ぶ）等をあげることができる。
　ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のＦＲの配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型又は他のアミノ酸で置換したもの等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲとしては、前述のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９又はｒＬＡ１２６４由来の重鎖可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖可変領域中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を例示することができ、ｒＬＡ２１２由来の重鎖可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖可変領域中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含むヒト化抗体としては、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２等をあげることができる。
　ヒト抗体としては、ＬＡＧ－３蛋白質を認識する抗体であれば特に限定されるものではないが、ＬＡＧ－３抗体のＣＤＲを有する抗体と同一の部位に結合するヒト抗体、前述の非ヒト動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等のいずれか一つとＬＡＧ－３上で同一の部位に結合するヒト抗体、かかるいずれかの抗体とＬＡＧ－３への結合において競合する抗体等を例示することができる。
　本発明における抗体は、ＬＡＧ－３に結合する活性を有していれば、複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体であってもよく、例えば、複数の異なる抗体間で重鎖及び／又は軽鎖を交換したもの、重鎖及び／又は軽鎖の全長を交換したもの、可変領域のみ又は定常領域のみを交換したもの、ＣＤＲの全部又は一部のみを交換したもの等をあげることができる。キメラ化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、異なるＬＡＧ－３抗体に由来してもよい。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上のＬＡＧ－３抗体に由来してもよい。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上のＬＡＧ－３抗体が有するＣＤＲの組合せであってもよい。そのような複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体又はその結合断片は、以下に記される（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　モノクローナル抗体のアイソタイプは特に限定されるものではないが、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等をあげることができ、好適にはＩｇＧおよびＩｇＭを挙げることができる。モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、例えば、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ：以下、「ＥＬＩＳＡ」という)法、Ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（以下、「ＲＩＡ」という）法等で決定することができる、市販の同定用のキット（マウスタイパーキット：バイオラッド社製、ＲＡＴ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ　ＴＥＳＴ　ＫＩＴ：ｓｅｒｏｔｅｃ社　等）も利用することができる。
（３－２）抗体の結合特異性
　本発明においてＬＡＧ－３抗体はＬＡＧ－３蛋白質を認識する。言い換えれば、ＬＡＧ－３抗体はＬＡＧ－３蛋白質に結合する。かかる抗体は「抗ＬＡＧ－３抗体」とも表記される。また、本発明に使用される好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質を特異的に認識する。言い換えれば、本発明に使用される好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質に特異的に結合する（以上、まとめて抗体の「ＬＡＧ－３結合活性という）。さらに、本発明に使用されるより好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質の細胞外領域に特異的に結合し、より一層好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質の有する免グロブリン様ドメイン（以下、「Ｉｇ様ドメイン」という）に特異的に結合し、さらにより一層好適な抗体はかかるＩｇ様ドメイン３に特異的に結合する。
　本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｓｉｔａｎｔ：以下、「ＫＤという」）をあげることができる。本発明に使用される好適な抗体のＬＡＧ－３蛋白質に対するＫＤ値は１×１０－５以下、５×１０－６以下、２×１０－６以下または１×１０－６以下、より好適には５×１０－７以下、２×１０－７以下または１×１０－７以下、より一層好適には５×１０－８以下、２×１０－８以下または１×１０－８以下、さらにより一層好適には５×１０－９以下、２×１０－９以下または１×１０－９以下、最適には５×１０－１０以下、２×１０－１０以下または１×１０－１０以下である。
　本発明における抗原と抗体の結合は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（以下、「ＳＰＲ」という）解析法等により測定または判定することができる。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ（ＧＥヘルスケア社製）、ＰｒｏｔｅＯｎＴＭ（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＰＲ－ＮａｖｉＴＭ（ＢｉｏＮａｖｉｓ社製）、ＳｐｒｅｅｔａＴＭ（Ｔｅｘａｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳＰＲｉ－ＰｌｅｘＩＩＴＭ（ホリバ社製）、Ａｕｔｏｌａｂ　ＳＰＲＴＭ（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）等を例示することができる。細胞表面上に発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法、Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ法等により測定することができる。
（３－３）抗体の細胞傷害活性
　本発明に使用される抗ＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有し、好適にはイン・ビトロでＡＤＣＣ活性を有し、より好適にはＬＡＧ－３を発現するＴ細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する。本発明に使用される抗ＬＡＧ－３抗体は、ＡＤＣＣ活性に加え、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び／又は抗体依存性細胞媒介食活性（ＡＤＣＰ）活性を有していてもよい。本発明においては「イン・ビトロのＡＤＣＣ活性」を単に「ＡＤＣＣ活性」ということがある。
　ＡＤＣＣ活性は公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣ活性の測定には、目的とする抗原を発現する細胞（標的細胞）と、その標的細胞を殺傷するエフェクター細胞が用いられる。エフェクター細胞はＦｃγ受容体を介して、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域を認識する。Ｆｃγ受容体から伝達されるシグナルにより、エフェクター細胞が標的細胞を殺傷する。ヒト由来のＦｃ領域を有する抗体のＡＤＣＣ活性を測定する場合、エフェクター細胞としてヒトＮＫ細胞が用いられる。ヒトＮＫ細胞はヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ)から公知の方法により調製することができる。あるいはＰＢＭＣをそのままエフェクター細胞として用いることもできる。
（３－４）抗体のイン・ビボＬＡＧ－３陽性細胞数低減活性
　本発明においてＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、ＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させ、好適にはイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させ、より好適には低フコース形態で、イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる。
　ＬＡＧ－３陽性細胞には、ＬＡＧ－３を強制発現させた細胞、刺激によりＬＡＧ－３発現が誘導された細胞等が含まれるが、ＬＡＧ－３を発現している細胞であればそれらに限定されない。
　ＬＡＧ－３陽性細胞数は定法、例えば、フローサイトメトリーによりカウントすることができる。
　本発明において「低フコース形態」とは、（ｉ）ある抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量が、元（親）の抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量より少い形態、（ｉｉ）ある抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量が、天然において抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量より少ない形態、又は（ｉｉｉ）ある抗体若しくはその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）又はフコース（フコース残基）を含む糖鎖が、物理的又は化学的な分析（好適には質量分析）において検出限界以下である形態、を意味する。ある改変された抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量が、かかる改変前と比較して少ない場合、かかる改変された抗体又はその結合断片は「低フコース形態」にあると解される。後述するヒト化抗体の修飾体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２も、低フコース形態にある抗体の一態様である。低フコース形態にある抗体又は結合断片は、低フコース形態にないものに比して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩＡに対する親和性が高く、ＡＤＣＣ活性が強い。
（３－５）抗体のイン・ビボ実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性
　本発明においてＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、脳脊髄炎抑制活性を有し、好適にはイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性を有し、より好適には低フコース形態で、イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性を有する。
　本発明において、実験的自己免疫性脳脊髄炎は、中枢神経のミエリン構成タンパク質の１つであるＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ　Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）由来のペプチドをＦｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔと共にマウスに注射することにより惹起する脳脊髄炎を意味する　。
　実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性は、麻痺の程度を反映した臨床スコアを経日的に観察することで測定することができる。臨床スコアは、例えば以下のように設定することができる：　スコア０：無症状、スコア１：尾の脱力、スコア２：歩行異常・正向反射消失、スコア３：後肢麻痺、スコア４：前肢の部分麻痺、スコア５：死亡または安楽殺。
（３－６）抗体のヒト活性化Ｔ細胞結合活性
　本発明においてＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、ヒト活性化Ｔ細胞に結合し、好適にはＬＡＧ－３陽性ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
抗体と活性化ヒト活性化Ｔ細胞の結合は、例えば、フローサイトメトリー法により測定又は検出することができる。
（３－７）抗体の存在下でヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は結合する
　本発明のある態様では、抗体の存在下において、ヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は結合することができるか、又は、本発明においてＬＡＧ－３抗体は、ヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子の結合を阻害しない。
　ＬＡＧ－３分子の細胞外領域とＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質の、内因性にＭＨＣクラスＩＩ分子を高発現するＲａｊｉ細胞への結合は、例えば、フローサイトメトリー法により測定又は検出することで評価することができる。
（３－８）抗体の存在下でヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する
　また他の態様において、本発明におけるＬＡＧ－３抗体の存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する。
　本発明において「Ｔ細胞抑制機能」とは、Ｔ細胞を刺激した際に産生されるサイトカイン量の減少又は抑制を意味する。
　ヒトＬＡＧ－３によるＴ細胞抑制機能は、例えばヒトＴ細胞を刺激してＬＡＧ－３発現を誘導した際に産生されるサイトカインを定量することにより測定することができる。
　本発明において、ヒトＴ細胞の刺激は、特に限定されないが、例えば、特異抗原、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の組合せ、スーパー抗原、別のドナー由来の細胞による刺激、好適にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｂ、ＭＨＣの異なる別のドナー由来の細胞による刺激等をあげることができる。
サイトカインとしては、例えば、活性化Ｔ細胞から産生されるサイトカイン、好適には各種インターローキンおよびインターフェロン、より好適にはインターロイキン２（ＩＬ－２）およびインターフェロンγ等をあげることができる。
（３－９）モノクローナル抗体
　本発明は抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体及びその結合断片を提供する。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、魚類抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの結合断片、それらの修飾体等が含まれる。このうち、ラットモノクローナル抗体の例としては、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４等をあげることができる。
　ｒＬＡ２０４は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ２０４の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１（図１６）に、アミノ酸配列は配列番号２（図１７）に記載されている。ｒＬＡ２０４の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号３（図１８）に、アミノ酸配列は配列番号４（図１９）に記載されている。ｒＬＡ２０４のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号４１（図５６）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号４２（図５７）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号４３（図５８）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号４４（図５９）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号４５（図６０）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号４６（図６１）にそれぞれ記載されている。
　ｒＬＡ２１２は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ２１２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号５（図２０）に、アミノ酸配列は配列番号６（図２１）に記載されている。ｒＬＡ２１２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号７（図２２）に、アミノ酸配列は配列番号８（図２３）に記載されている。ｒＬＡ２１２のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号４７（図６２）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号４８（図６３）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号４９（図６４）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号５０（図６５）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号５１（図６６）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号５２（図６７）にそれぞれ記載されている。
　ｒＬＡ２２５は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ２２５の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号９（図２４）に、アミノ酸配列は配列番号１０（図２５）に記載されている。ｒＬＡ２２５の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１１（図２６）に、アミノ酸配列は配列番号１２（図２７）に記載されている。ｒＬＡ２２５のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号５３（図６８）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号５４（図６９）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号５５（図７０）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号５６（図７１）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号５７（図７２）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号５８（図７３）に記載されている。
　ｒＬＡ８６９は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ８６９の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１３（図２８）に、アミノ酸配列は配列番号１４（図２９）に記載されている。ｒＬＡ８６９の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１５（図３０）に、アミノ酸配列は配列番号１６（図３１）に記載されている。ｒＬＡ８６９のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号５９（図７４）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号６０（図７５）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号６１（図７６）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号６２（図７７）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号６３（図７８）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号６４（図７９）に記載されている。
　ｒＬＡ１２６４は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ１２６４の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１７（図３２）に、アミノ酸配列は配列番号１８（図３３）に記載されている。ｒＬＡ１２６４の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１９（図３４）に、アミノ酸配列は配列番号２０（図３５）に記載されている。ｒＬＡ１２６４のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号６５（図８０）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号６６（図８１）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号６７（図８２）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号６８（図８３）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号６９（図８４）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号７０（図８５）に記載されている。
　他の抗ヒトＬＡＧ－３モノクローナル抗体としては、抗ヒトＬＡＧ－３マウス抗体Ａ９Ｈ１２（ＷＯ２００８／１３２６０１参照）等を例示することができる。
　本発明において、抗体変異体には、好適には、蛋白質の分解もしくは酸化に対する感受性の低下、生物活性の改善、抗原結合能の改善、又は理化学的性質もしくは機能的性質の付与等がなされている。そのような抗体変異体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において１又は２以上、好適には１乃至数個のアミノ酸が保存的アミノ酸置換されたアミノ酸配列を有する抗体をあげることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。
　好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる抗体変異体におけるアミノ酸置換は、元（親）の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
　蛋白質中に含まれるアスパラギン酸は、そのＣ末側に連結するアミノ酸が小さい側鎖を有する場合は異性化によりイソアスパラギン酸に変換され易く、一方で、アスパラギンの場合は脱アミド化によりアスパラギン酸に変換され易く、さらに異性化によりイソアスパラギン酸に変換される可能性がある。そのような異性化や脱アミド化が進めば、蛋白質の安定性に影響が生じ得る。そこで、かかる異性化や脱アミド化を回避するために、蛋白質中のアスパラギン酸やアスパラギンあるいはそれらに隣接するアミノ酸等を他のアミノ酸で置換することができる。かかるアミノ酸置換がなされた抗体変異体は、元の抗体が有する抗原結合活性を保持していることが好ましい。
　本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４又はＡ９Ｈ１２が有するアミノ酸配列において保守的アミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を有する抗体変異体、ならびに、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ＬＡ１２６４又はＡ９Ｈ１２は由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保守的アミノ酸変異がなされたアミノ酸配列を有する該ＣＤＲを含むマウス抗体、ラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等も本発明に包含される。
　本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４又はＡ９Ｈ１２由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれか１つ又は２つ以上のアミノ酸配列において１乃至数個、好適には１乃至３個、より好適には１又は２個、最適には１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む抗体の変異体であって、且つヒトＬＡＧ－３に結合するものは、本発明における抗体の変異体に包含される。
また、複数の抗体に由来するＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有する抗体も、抗体変異体に含まれる。そのような変異体の例として、ＣＤＲＨ３のみある抗体に由来し、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２ならびにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は別の抗体に由来する抗体変異体をあげることができる。
本発明においては抗体変異体も「抗体」に包含される。
本発明における抗体の定常領域としては、特に限定されるものではないが、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のためのＬＡＧ－３抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等をあげることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等をあげることができる。
（３－１０）キメラ抗体
本発明に使用される抗ＬＡＧ－３キメラ化抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
本発明のラット－ヒトキメラ化抗体として例示されるｃＬＡ２１２の重鎖ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列ならびに軽鎖ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号２３、２４、２５及び２６（図３８、３９、４０及び４１）にそれぞれ示される。重鎖のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド番号１乃至５７、ならびに、重鎖のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１乃至１９は、シグナル配列であり、通常大部分の成熟重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列にはそれぞれ含まれない。同様に、軽鎖のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド番号１乃至６０、ならびに、軽鎖のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１乃至２０は、シグナル配列であり、通常大部分の成熟軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列にはそれぞれ含まれない。
　ラット－ヒトキメラ抗体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９及びｃＬＡ１２６４については他の箇所に記載されている。
　本発明の他のキメラ抗体としては、抗ヒトＬＡＧ－３マウス抗体Ａ９Ｈ１２のマウス－ヒト・キメラ体であるＩＭＰ７３１（キメラ型Ａ９Ｈ１２：ＷＯ２００８／１３２６０１参照）等を例示することができる。
（３－１１）抗体の結合断片
　本発明に使用される抗体は一つの態様として、抗ＬＡＧ－３抗体の結合断片であってよい。抗体の結合断片とは、該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持する断片を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性等を挙げることができる。本発明に使用される好適な抗ＬＡＧ－３抗体の結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　抗体の結合断片としては、該抗体の有する活性の少なくとも一部を保持している該抗体の断片であれば特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦｖのように、抗体の断片以外の部分を含む分子も、抗体の結合断片の意味に包含される。
　抗体蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸が１乃至数個又はそれ以上を欠失してなり、且つ該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持している分子も、抗体の結合断片の意味に包含される。例えば、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）には影響を及ぼさない。そのような抗体の結合断片の修飾体も、抗体もしくはその結合断片、又はその修飾体（後述）に包含される。
　本発明において、抗体又はその結合断片は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、２種類の異なる抗原に結合する二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）に限定されず、３種以上の異なる抗原に対して特異性を有する抗体も本発明の「多特異性抗体」の意味に包含される。
　本発明の多特異性抗体は、全長抗体又はその結合断片であってもよい（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできる。また、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを２種類以上融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、得ることができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。多特異的抗体も同様の方法により調製することができる。
　本発明におけるＬＡＧ－３抗体の一つの態様は、一本鎖抗体（以下、「ｓｃＦｖ」という）である。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖを二重特異性抗体として使用することができる。さらに３つ以上のｓｃＦｖよりＭｕｌｔｉｓｃＦｖも多特異性抗体として使用することができる。
　本発明では、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結した一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が含まれる（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明において、抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であってもよい。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ　Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ　Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。これらの抗体も、抗体の機能性断片の意味に包含される。
（３－１２）ヒト化抗体およびヒト抗体
　本発明はその一つの態様において、ヒト化抗体又はその結合断片を提供する。
　本発明に使用される好適なヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　本発明に使用される好適なヒト化抗体の例としては、以下のＡ乃至Ｆに記載するように、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、Ａ９Ｈ１２又はＨ５Ｌ７の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体等をあげることができる。
（Ａ．ｒＬＡ２０４抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
　本発明のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号４１（図５６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４２（図５７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４３（図５８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号４４（図５９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４５（図６０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４６（図６１）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。
（Ｂ．ｒＬＡ２１２抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
　また、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号４７（図６２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８（図６３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９（図６４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号５０（図６５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５１（図６６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号５２（図６７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。
（Ｃ．ｒＬＡ２２５抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
　さらに、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号５３（図６８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５４（図６９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号５５（図７０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号５６（図７１）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５７（図７２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号５８（図７３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。
（Ｄ．ｒＬＡ８６９抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
　さらに、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号５９（図７４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０（図７５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６１（図７６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号６２（図７７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６３（図７８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号６４（図７９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。
（Ｅ．ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
　さらに、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号６５（図８０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６６（図８１）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６７（図８２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号６８（図８３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６９（図８４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号７０（図８５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。
（Ｆ．Ａ９Ｈ１２抗体又はＨ５Ｌ７抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
　Ａ９Ｈ１２抗体又はＨ５Ｌ７抗体に含まれるＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含み、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。
　本発明に使用される好適なヒト化抗体には、上記Ａ乃至Ｆ記載のものが含まれ、より好適なヒト化抗体の例としてはｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５及びｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（下の［ｉ］乃至［ｘ］参照）並びにＩＭＰ７３１のヒト化体であるＨ５Ｌ７、Ｈ１Ｌ７、Ｊ７Ｌ７、Ｈ４Ｌ７、Ｊ１１Ｌ７、Ｈ２Ｌ７、Ｊ１３Ｌ７、Ｈ７Ｌ７、Ｊ０Ｌ７、Ｈ０Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷ（特許文献２）等を挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、例えば、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つのヒト化抗体の重鎖可変領域を含む重鎖、ならびに、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つのヒト化抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含んでなる抗体も、本発明に使用されるより好適なヒト化抗体に含まれる。
［ｉ］
［ｉの１］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３３（図４８）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法、治療又は予防のための使用等に適した物性（データ示さず）、（３－２）、及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し且つ（３－８）記載の性質すなわち該抗体存在下でヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－７）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｉの２］ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、実施例８において得られた、糖鎖修飾が調節されたヒト化抗体であり、低フコース形態にあるｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２の一つである。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３３（図４８）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法、治療又は予防のための使用等に適した物性（データ示さず）、（３－２）乃至（３－６）記載のＬＡＧ－３結合活性、イン・ビトロＡＤＣＣ活性、ＬＡＧ３－陽性細胞数低減活性、実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性及びヒト活性化Ｔ細胞結合活性を有し且つ（３－７）記載の性質すなわち該抗体の存在下でヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は結合し（実施例参照）、（３－８）記載の性質すなわち該抗体存在下でヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏することは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３１（図４６）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｉｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３５（図５０）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｉｖ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３３（図４８）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｖ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３５（図５０）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｖｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３７（図５２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｖｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３９（図５４）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｖｉｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３１（図４６）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｉｘ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３７（図５２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
［ｘ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３９（図５４）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ３－結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。
　上記［ｉ］乃至［ｘ］等において、（３－４）及び（３－５）記載の活性は、好適には低フコース形態において評価することができる。
本発明において「物性」とは、本発明に使用される抗体及びその結合断片等のモノとしての安定性を意味し、公知の指標を用いて評価することができる。モノとしての安定性として熱安定性、保存安定性等をあげることができ、それらの指標としてはサーモグラムから導き出されるＴｍ値、保存条件下又は加速劣化条件下での抗原結合活性の変化又は経時的変化等をあげることができる。
　また、ｈＬＡ２１２抗体＿Ｈ４／Ｌ２を実施例１０のヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスに単回投与したところ、体重減少、その他の顕著な毒性所見は認められなかった。このように本発明に使用される抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患（他の箇所で定義されている）の治療または予防等に適した安全性を具備していることが望ましい。
上述の、本発明に使用される好適なヒト化抗ＬＡＧ－３抗体及びその結合断片のうち、より一層好適なものはｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ６、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７およびＨ５Ｌ７ＢＷである。
　本発明に使用されるより好適なヒト化抗ＬＡＧ－３抗体の範囲に含まれるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷ等は、重鎖のアミノ酸配列のうちＦＲＬ１乃至ＦＲＬ４において、１乃至数個、好適には１又は２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなる重鎖、並びに、軽鎖のアミノ酸配列のうちＦＲＨ１乃至ＦＲＨ４において、１個以上、好適には１乃至１４個のうち任意の個数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなる軽鎖、を含むことができる。　
　かかるヒト化抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２等のより好適な軽鎖においては、ＦＲＬ１の第１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第２１番の位置に相当するアミノ酸）がＡｓｐ又はＡｓｎであり、ＦＲＬ１の第１１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１１番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第３１番の位置に相当するアミノ酸）がＬｅｕ又はＭｅｔであり、ＦＲＬ１の第１３番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１３番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第３３番の位置に相当するアミノ酸）がＡｌａ又はＩｌｅであり、ＦＲＬ１の第２１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第２１番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第４１番の位置に相当するアミノ酸）がＩｌｅ又はＭｅｔであり、ＦＲＬ２の第４番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第３８番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第５８番の位置に相当するアミノ酸）がＧｌｎ又はＬｙｓであり、ＦＲＬ２の第９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第４３番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第６３番の位置に相当するアミノ酸）がＡｌａ又はＳｅｒであり、ＦＲＬ３の第４番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第６０番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第８０番の位置に相当するアミノ酸）がＳｅｒ又はＡｓｐであり、ＦＲＬ３の第９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第６５番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第８５番の位置に相当するアミノ酸）がＳｅｒ又はＧｌｙであり、ＦＲＬ３の第１１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第６７番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第８７番の位置に相当するアミノ酸）がＳｅｒ又はＴｙｒであり、ＦＲＬ３の第２２番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第７８番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第９８番の位置に相当するアミノ酸）がＬｅｕ又はＶａｌであり、ＦＲＬ３の第２７番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第８３番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１０３番の位置に相当するアミノ酸）がＰｈｅ又はＡｌａであり、ＦＲＬ３の第２９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第８５番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１０５番の位置に相当するアミノ酸）がＴｈｒ又はＰｈｅであり、ＦＲＬ４の第７番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１０４番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１２４番の位置に相当するアミノ酸）がＶａｌ又はＬｅｕであり、ＦＲＬ４の第９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１０６番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１２６番の位置に相当するアミノ酸）がＩｌｅ又はＬｅｕである。
　かかるヒト化抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２等のより好適な重鎖においては、ＦＲＨ２の第１４番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第４９番アミノ酸（配列番号２８又は図４３の第６８番の位置に相当するアミノ酸）がＧｌｙ又はＡｌａであり、ＦＲＨ３の第２５番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第８４番アミノ酸（配列番号２８又は図４３の第１０３番の位置に相当するアミノ酸）がＡｓｎ又はＡｓｐである。
　本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、ｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４及びＡ９Ｈ１２、並びに、ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は可変領域のアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上の同一なアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含み、且つＬＡＧ－３に結合する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。かかる配列同一性は、好適には９４％以上、より好適には９６％以上、より一層好適には９８％以上、最適には９９％以上である。また、それらの抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　二種類のアミノ酸配列間の同一性あるいは相同性は、Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ，　Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，　Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、例えば、インターネットでhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/にアクセスすることによっても使用することができる。
　本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、ｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びＡ９Ｈ１２、並びに、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は可変領域のアミノ酸配列においてそれぞれ１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなるアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含み、且つＬＡＧ－３に結合する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。かかるアミノ酸変異は好適には置換であり、変異されるアミノ酸の個数は好適には１乃至５個、より好適には１乃至４個、より一層好適には１乃至３個、さらにより一層好適には１乃至２個、最適には１個である。また、それらの抗体又はその結合断片は、（３－２）、および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、ｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びＡ９Ｈ１２、並びに、ｈｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含み、且つＬＡＧ－３に結合する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。それらの抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　本発明は別の一つの態様において、ヒト抗体又はその結合断片を提供する。ヒト抗体又はその結合断片は、ＬＡＧ－３に結合するヒト由来の抗体又はその結合断片であれば特に限定されるものではないが、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
（３－１３）エピトープに結合する抗体
　本発明に使用される抗体と「同一の部位に結合する抗体」も本発明に使用することができる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。さらに、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合し、且つ第一抗体がＡＤＣＣ活性などの効果を有する場合、第二抗体も同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。従って、第一の抗ＬＡＧ－３抗体の結合する部位に第二の抗ＬＡＧ－３抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体がＬＡＧ－３蛋白質上の同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一の抗ＬＡＧ－３抗体のＬＡＧ－３蛋白質への結合に対して第二の抗ＬＡＧ－３抗体が競合することを確認できれば、第一抗体と第二抗体がＬＡＧ－３蛋白質上の同一の部位に結合する抗体と判定することができる。
　本発明においては、モノクローナル抗体が認識するＬＡＧ－３蛋白質上の部位に結合する抗体も、本発明に使用可能な抗体に含まれる。そのような抗体及びその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　抗体の結合部位は、免疫アッセイ法など当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、抗原のアミノ酸配列をＣ末またはＮ末から適宜削ってなる一連のペプチドを作製し、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。抗原断片ペプチドは、遺伝子組換、ペプチド合成等の技術を用いて調製することができる。
　抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体の結合部位は、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片および抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８Å以下であり、好適には６Å以下であり、より好適には４Å以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つまたはそれ以上で抗体の抗原結合部位（エピトープ）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。
　本発明におけるＬＡＧ－３抗体のエピトープは、ヒトＬＡＧ－３又はそのアミノ酸配列中に存在する。かかるエピトープに結合するか、かかるエプトープへの結合において本発明に使用される抗体と競合するか、または、かかるアミノ酸残基と相互作用距離を有する抗体、その結合断片またはその修飾体も、本発明に使用可能な抗体、その結合断片またはその修飾体に包含される。
（３－１４）抗体の修飾体
　本発明は、抗体又はその結合断片の修飾体を含む組成物を提供する。抗体又はその結合断片の修飾体とは、抗体又はその結合断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合またはＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合またはＯ－結合　への糖鎖付加、Ｎ末またはＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりＮ末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、抗体または抗原の検出または単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような抗体又はその結合断片の修飾物は、元の抗体又はその結合断片の安定性および血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
　化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。　
　生物学的な修飾体としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、ならびに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等をあげることができる。
　抗体又はその結合断片に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、例えば、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０等に記載された方法が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明においては、抗体の修飾体には当該糖鎖修飾が調節された抗体も含まれる。
　かかる修飾は、抗体またはその結合断片における任意の位置に、または所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。
　本発明において「抗体断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」をもその意味に含むものである。
　本発明においては抗体の修飾体、その結合断片の修飾体を、単に「抗体」、「抗体の結合断片」と呼ぶことがある。
前述の通り、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は実施例８において得られた、糖鎖修飾が調節されたヒト化抗体である。該ヒト化抗体も、本発明に使用可能な抗体に包含される。
　以上のような本発明に使用可能な抗体、その結合断片、及びその修飾体は、好適には、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法、治療又は予防のための使用等に適した物性、体内動態、血中滞留性、安全性等を有する。
（３－１５）細胞傷害性Ｔ細胞に対するｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性
　細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用に供し得るＬＡＧ－３抗体は、好適には、ＬＡＧ－３発現細胞に対してＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性などの細胞傷害活性を示す抗体であり、より好適には、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性が増強されたＬＡＧ－３抗体である。低フコース化、脱フコース化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）等によりＡＤＣＣ活性が増強されたＬＡＧ－３抗体、すなわち低フコース形態にあるＬＡＧ－３抗体としては、例えば、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７ＢＷ等をあげることができる。
　ＬＡＧ－３抗体が奏する細胞傷害性Ｔ細胞に対するｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性は、当該分野で公知のアッセイに基づいて評価することができ、イン・ビトロのアッセイとしては実施例１３及び１４記載のもの、イン・ビボのアッセイとしては実施例１１－１）記載のものを、それぞれ例示することができるが、それらに限定されない。
４．抗体の製造方法
（４－１）ハイブリドーマを用いる方法
　抗ＬＡＧ－３抗体は、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＬＡＧ－３蛋白質又はその可溶型フォームで免疫した動物の脾臓より抗ＬＡＧ－３抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することができる。
（４－１－１）抗原の調製
　抗ＬＡＧ－３抗体を作製するための抗原は、本発明の他の部分に記載された天然型または組換え型のＬＡＧ－３蛋白質の調製法等に従って、取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、ＬＡＧ－３蛋白質若しくはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列を含むことからなるＬＡＧ－３蛋白質断片、またはそれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体等（以下、まとめて「ＬＡＧ－３抗原」とよぶ：「ＬＡＧ－３蛋白質」と同義）を挙げることができる。
　組換え型ＬＡＧ－３抗原は、ＬＡＧ－３抗原の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞の培養物から該抗原を回収することにより、調製することができる。かかる組換型抗原は、免疫グロブリンのＦｃ領域など他の蛋白質との融合蛋白質であってもよい。また、ＬＡＧ－３抗原のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる遺伝子をイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳系により無細胞系において得られるＬＡＧ－３抗原も組換え型ＬＡＧ－３抗原に含まれる。非組換型ＬＡＧ－３抗原は、ＬＡＧ－３を発現している細胞等から精製、単離することができる。　
　その存在下でもＬＡＧ－３のＴ細胞機能抑制機能が発揮される、あるいはＬＡＧ－３のＴ細胞機能抑制機能を抑制又は阻害しない抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体を取得するために、好適な免疫原として、例えば、免疫グロブリン様ドメイン１及び２を欠失させたＬＡＧ－３変異体を用いることができる。
（４－１－２）抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体の製造
　モノクローナル抗体の製造は、通常、下記のような工程を経る。
（ａ）抗原を調製する工程、
（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）を調製する工程、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとを融合させる工程、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程、及び
（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）。
　必要に応じてさらに、（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程等、（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程等が加わる。
　以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞を使用することもできる。
（ａ）抗原の精製
　前記（２－３）記載のＬＡＧ－３蛋白質の調製法に準ずる。
（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程
　工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
　また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、例えば、Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ　ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、ラットの場合には、例えば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
　これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ－ルスリバー、等実験動物飼育販売業者より入手することができる。
　このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
　また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
　なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５乃至１２週齢、さらに好ましくは６乃至８週齢である。
　ＬＡＧ－３蛋白質で動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，　Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ　Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）　等の方法を用いることができる。
　抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫アッセイを挙げることができるが、それらの方法に限定されるものではない。
　免疫された動物から分離された脾臓細胞又はリンパ球に由来する抗体産生細胞は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５，）等の公知の方法に従って調製することができる。
　脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）等に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
（ｃ）ミエローマを調製する工程
　細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｉｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株、すなわちマウス由来のＸ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１－ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１－４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ－００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ－Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９－６、ＬＩＣＲ－ＬＯＷ－ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４－１（ＮＰ４１）等を用いるのが好ましい。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
　これらの細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地［ＲＰＭＩ－１６４０培地にグルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８－アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％　ＦＢＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合させる工程
　抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ　Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ　Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブロドーマ群を選別する工程
　細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）
　ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができるが（例えば、Ｂａｒｂａｒａ，　Ｂ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｓｔａｎｌｅｙ，　Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）、好適には限界希釈法である。
（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程
　選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。
　かかるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、該ハイブリドーマの培養物から回収することができる。また、該モノクローナル抗体遺伝子が導入された細胞の培養物から組換え抗体として回収することもできる。さらに、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド－マを増殖させることにより、その腹水から回収することもできる。
（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程
　各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。
（４－２）細胞免疫法
　天然型のＬＡＧ－３蛋白質を発現する細胞、組換え型ＬＡＧ－３蛋白質またはその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗ＬＡＧ－３抗体を調製することができる。
ＬＡＧ－３を発現している細胞は、1×１０５乃至1×１０９個、好適には1×１０6乃至1×１０8個、より好適には０．５乃至２×１０7個、より一層好適には１×１０７個を１回の免疫に用いるが、ＬＡＧ－３蛋白質の発現量に応じて免疫に供する細胞数を変えることができる。かかる免疫源は、一般的には腹腔内に投与するが、皮内等に投与することもできる。ハイブリドーマの作製手法としては（４－１－２）記載の方法を適用することができる。
（４－３）遺伝子組換え
　本発明に使用される抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（重鎖ヌクレオチド）及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（軽鎖ヌクレオチド）、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
　宿主細胞としては、原核細胞又は真核細胞を用いることができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
　動物細胞としては、例えば、哺乳類由来の細胞、すなわち、サル由来のＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、マウスＮＳ０細胞株（ＥＣＡＣＣ）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、そのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯｄｈｆｒ－：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ニワトリ等鳥類由来の細胞、昆虫由来の細胞等を挙げることができる。
　また、抗体等の蛋白質の糖鎖修飾を調節するよう改変された細胞も宿主として用いることができる。例えば、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ－アセチルグルコサミンに結合しているフコースを減らすかまたは無くすよう改変されたＣＨＯ細胞を用いて抗体等を発現させれば、低フコース化又は脱フコース化した抗体（抗体の修飾体とも呼ぶ）を調製することが可能である（ＷＯ００／６１７３９号、ＷＯ０２／３１１４０号等）。
　真核微生物としては、例えば、酵母等をあげることができる。
　原核細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等をあげることができる。
　抗体（各種動物由来のモノクローナル抗体、ラット抗体、マウス抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等）を分泌させるためのシグナルペプチドとしては、当該抗体と同種、同タイプ及び同サブタイプの抗体の分泌シグナル、ならびに、当該抗体自体の分泌シグナルに限定されるものではなく、他のタイプもしくはサブタイプの抗体の分泌シグナル、または、他の真核生物種もしくは原核生物由来の蛋白質の分泌シグナルであれば、任意のものを選択して利用することができる。
（４－４）ヒト化抗体のデザイン法および調製法
　ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のＣＤＲのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によりＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１号、ＵＳ６９７２３２３号公報参照）、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の１つまたは２つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
（４－５）ヒト抗体の調製法
　本発明に使用可能な抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＬＡＧ－３ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗ＬＡＧ－３抗体を意味する。抗ＬＡＧ－３ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，；　Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，　Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。
　ヒト抗体産生動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された組換え動物、それらの動物同士を掛け合わせることにより作り出された組換え動物のいずれであってもよい。
　また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
　ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
　また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ　ｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。
　例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。
　抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
　抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。
（４－６）抗体の結合断片の調製法
　一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
　可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２乃至１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
　ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を常法に従って調製することができ、また、その宿主細胞を培養することにより、常法に従ってかかる培養物から該ｓｃＦｖを回収することができる。
　その他の抗体の結合断片も、前記の方法に準じて該結合断片をコードする遺伝子を取得して細胞に導入し、該細胞の培養物から該結合断片を回収することにより、得ることができる。
　抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ　ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックス－ターン－へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
　抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＬＡＧ－３抗体の混合物、すなわちポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体としては、例えば、ＣＤＲの一部又は全部が異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体は、異なる抗体の産生細胞を混合培養し、該培養物から回収することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４号）。また、別個に調製した抗体を混合することも可能である。さらに、ポリクローナル抗体の一つの態様である抗血清は、動物を所望の抗原で免疫し、定法に従って、該動物から血清を回収することにより調製することができる。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
　抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。
　なお、（３－１１）、（３－１４）、（４－６）等に例示又は記載されるような抗体、その結合断片、それらの修飾物は、「抗体又はその結合断片を含む分子」とも呼ばれる。
（４－７）抗体の精製
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
　例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
　クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。
　これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗原カラム等をあげることができる。
　プロテインＡカラムとしては、例えば、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ（ポール社製、，ＰＯＲＯＳ（アプライドシステムズ社製），Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。
　また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
(４－８)抗体をコードするヌクレオチド・組換ベクター・組換細胞
　抗体もしくはその結合断片またはその修飾体をコードするヌクレオチド（「抗体遺伝子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又はベクターが導入された細胞（「抗体遺伝子導入細胞」という）、その他抗体もしくは結合断片またはその修飾体を産生する細胞（「抗体産生細胞」という）も本発明の組成物を調製するために使用される。
　抗体遺伝子は、好適には、次の（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「抗体遺伝子配列」という）を含んでなるか、抗体遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、または抗体遺伝子配列からなる：
（ａ）ラット抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５，ｒＬＡ８６９、及びｒＬＡ１２６４並びにマウス抗体Ａ９Ｈ１２、それらの重鎖及び軽鎖の定常領域をヒト抗体のもので置き換えたキメラ体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びキメラ型Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１）、ならびに、それらのヒト化体であるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つの抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｂ）ラット抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５，ｒＬＡ８６９及びｒＬＡ１２６４並びにマウス抗体Ａ９Ｈ１２、それらの重鎖及び軽鎖の定常領域をヒト抗体のもので置き換えたキメラ体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びキメラ型Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１）、ならびに、それらのヒト化体であるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つの抗体のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３を含む重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｃ）ラット抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５，ｒＬＡ８６９及びｒＬＡ１２６４並びにマウス抗体Ａ９Ｈ１２、それらの重鎖及び軽鎖の定常領域をのヒト抗体のもので置き換えたキメラ体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９及びｃＬＡ１２６４及びキメラ型Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１）、ならびに、それらのヒト化体であるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列コードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｄ）（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＬＡＧ－３に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、
（ｅ）（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＬＡＧ－３に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）又は（ｅ）記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する抗体は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
　ただし、抗体遺伝子は、上記（ａ）乃至（ｅ）記載のものに限定されない。
　本発明における抗体もしくはその結合断片又はその修飾体は、（４－３）記載のように、抗体遺伝子導入細胞を培養する工程、および、その培養物から抗体もしくはその結合断片又はその修飾体を回収する工程、を含む、抗体もしくはその結合断片又はその修飾体の製造方法により得ることができる。
５．組成物
　本発明は抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体を含む細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物を提供する。
　本発明の組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞の関わる疾患（以下、「細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患」という）に対する医療において、好適には、免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に対する医療において、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させることにより、臨床上のベネフィットをもたらし得る。かかる疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：非特許文献１６）、多発性硬化症（非特許文献１５）、バセドウ病 (Ｓｕｎ，Ｚ.　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００８年；第２８巻（５号）：４６４－４７２ページ)、強直性脊椎炎（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｍ.　ｅｔ　ａｌ.、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｅｓ.、２００２年；第４巻（１号）：７１－７６ページ）,、扁平部炎 (Ｐｅｄｒｏｚａ－Ｓｅｒｅｓ，Ｍ.　ｅｔ　ａｌ,、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ.、２００７年； 第９１巻（１０号）：１３９３－１３９８ページ)、喘息（Ｈａｍｚａｏｕｉ，Ａ.　ｅｔ　ａｌ.、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ.、２００５年；３号：１６０－１６６ページ）、関節リウマチ（Ｗａｎｇ，ＥＣ. ｅｔ　ａｌ.、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．、１９９７年；第４０巻（２号）：２３７－２４８ページ：Ｓｃａｒｓｉ，Ｍ.　ｅｔ ａｌ.、Ｊ．　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ.、２０１０年；第３７巻（５号）：９１１－９１６ページ）、多発性筋炎・皮膚筋炎（Ｆａｓｔｈ，ＡＥ.　ｅｔ　ａｌ.、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００９年；第１８３号（７巻）：４７９２－４７９９ページ）、封入体筋炎（Ｋｅｌｌｅｒ, ＣＷ. ｅｔ ａｌ.、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ.、２０１７年；第４巻（６号）：４２２－４４５ページ）、急性冠症候群（非特許文献１５）、全身性エリテマトーデス（Ｚａｂｉｎｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１６，　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｓ．１０５８１６５）、ループス腎炎（Ｚａｂｉｎｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１６，　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｓ．１０５８１６５）、強皮症（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７，　Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　１３７（５）：１０４２－１０５０）、クローン病（Ｄａｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７，　Ｃｌｉｎ　Ｒｅｓ　Ｈｅｐａｔｏｌ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．　４１（６）：６９３－７０２）、潰瘍性大腸炎（Ｄａｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７，　Ｃｌｉｎ　Ｒｅｓ　Ｈｅｐａｔｏｌ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．　４１（６）：６９３－７０２）、再生不良性貧血（Ｋｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．　２００１，　Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ．　２９（１１）：１２７０－７）、骨髄異形成症候群（Ｋｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．　２００１，　Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ．　２９（１１）：１２７０－７）、シェーグレン症候群（Ｓｍｏｌｅｎｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１２，　Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２７８（１－２）：１４３－５１）、ヴェゲナー肉芽腫症（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．　２００１，　Ｔｈｏｒａｘ．　５６（１０）：７５１－７）、乾癬（Ｌｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１５，　Ｂｒ　Ｊ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　１７３（４）：９９８－１００５）、２型糖尿病（Ｇｉｕｂｉｌａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　２０１１，　Ｅｕｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．　３２（１０）：１２１４－２６）、宿主対移植片反応（Ｍｅｎｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　２００８，　Ｃｌｉｎｉｃｓ　（Ｓａｏ　Ｐａｕｌｏ）．　６３（５）：６６７－７６）、慢性Ｂ型肝炎（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　２００９，　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｎｖｅｓｔ．　２００９；３８（５）：４３４－４６）、サルコイドーシス（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．　２００５，　Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ　Ｖａｓｃ　Ｄｉｆｆｕｓｅ　Ｌｕｎｇ　Ｄｉｓ．　２２（１）：１３－９）等を例示することができる。すなわち、本発明の組成物は、好適には、免疫抑制剤抵抗性のＣＯＰＤ、免疫抑制剤抵抗性のバセドウ病、免疫抑制剤抵抗性の強直性脊椎炎、免疫抑制剤抵抗性の扁平部炎、免疫抑制剤抵抗性の喘息、免疫抑制剤抵抗性の関節リウマチ、免疫抑制剤抵抗性の多発性筋炎・皮膚筋炎、免疫抑制剤抵抗性の封入体筋炎、免疫抑制剤抵抗性の急性冠症候群、免疫抑制剤抵抗性の全身性エリテマトーデス、免疫抑制剤抵抗性のループス腎炎、免疫抑制剤抵抗性の強皮症、免疫抑制剤抵抗性のクローン病、免疫抑制剤抵抗性の潰瘍性大腸炎、免疫抑制剤抵抗性の再生不良性貧血、免疫抑制剤抵抗性の骨髄異形成症候群、免疫抑制剤抵抗性のシェーグレン症候群、免疫抑制剤抵抗性のヴェゲナー肉芽腫症、免疫抑制剤抵抗性の乾癬、免疫抑制剤抵抗性の２型糖尿病、免疫抑制剤抵抗性の宿主対移植片反応、免疫抑制剤抵抗性の慢性Ｂ型肝炎、免疫抑制剤抵抗性のサルコイドーシス等（以下まとめて「免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患」という）の治療又は予防に有用である。
　細胞傷害性Ｔ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患については、例えば、次の報告がなされている：特発性肺線維症では、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数と予後悪化の間に相関が報告されている（Ｇｉｌａｎｉ　ｅｔ．ａｌ．、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　２０１０、５（１）：ｅ８９５９）；強直性脊椎炎では、疾患重症度と血中ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数に相関がある（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｍ.　ｅｔ　ａｌ.、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｅｓ.、２００２年；第４巻（１号）：７１－７６ページ）；全身性エリテマトーデスとループス腎炎については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が増悪に関与することが示唆された（Ｚａｂｉｎｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１６，　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｓ．１０５８１６５）；強皮症については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が初期ステージ病態に関与することが示唆された（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７，　Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　１３７（５）：１０４２－１０５０）；多発性筋炎・皮膚筋炎については、ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｆａｓｔｈ，ＡＥ.　ｅｔ　ａｌ.、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００９年；第１８３号（７巻）：４７９２－４７９９ページ）；封入体筋炎については、ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｐａｎｄｙａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１０，　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．　６２（１１）：３４５７－６６）；クローン病及び潰瘍性大腸炎は、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞割合が増加すると予後不良（Ｄａｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７，　Ｃｌｉｎ　Ｒｅｓ　Ｈｅｐａｔｏｌ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．　４１（６）：６９３－７０２）；再生不良性貧血及び骨髄異形成症候群では、患者のＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数が増加している（Ｋｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．　２００１，　Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ．　２９（１１）：１２７０－７）；多発性硬化症については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数が予後の予測因子となる（Ｐｅｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７，　Ｆｒｏｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１１６０）；シェーグレン症候群については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数と重症度に相関が見られる（Ｓｍｏｌｅｎｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１２，　Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２７８（１－２）：１４３－５１）；ヴェゲナー肉芽腫症については、ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．　２００１，　Ｔｈｏｒａｘ．　５６（１０）：７５１－７）；乾癬については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｌｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１５，　Ｂｒ　Ｊ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　１７３（４）：９９８－１００５）；２型糖尿病については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｇｉｕｂｉｌａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　２０１１，　Ｅｕｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．　３２（１０）：１２１４－２６）；バセドウ病 においては、ＣＤ２８－Ｔ細胞数が増加している(Ｓｕｎ，Ｚ.　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００８年；第２８巻（５号）：４６４－４７２ページ)；宿主対移植片反応については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数と発症に相関が見られる（Ｍｅｎｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　２００８，　Ｃｌｉｎｉｃｓ　（Ｓａｏ　Ｐａｕｌｏ）．　６３（５）：６６７－７６）；喘息においては、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数が増加している（Ｈａｍｚａｏｕｉ，Ａ.　ｅｔ　ａｌ.、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ.、２００５年；３号：１６０－１６６ページ）；慢性Ｂ型肝炎については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　２００９，　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｎｖｅｓｔ．　２００９；３８（５）：４３４－４６）；サルコイドーシスにおいては、ＣＤ４＋ＣＤ２８－　Ｔ　ｃｅｌｌ数が増加している（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．　２００５，　Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ　Ｖａｓｃ　Ｄｉｆｆｕｓｅ　Ｌｕｎｇ　Ｄｉｓ．　２２（１）：１３－９）。
　免疫抑制剤抵抗性については、例えば、次の報告がなされている：Ａｂａｔａｃｅｐｔ抵抗性の関節リウマチではＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が多い（Ｓｃａｒｓｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０１１，　Ｊ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．　３８（１０）：２１０５－１１）；ＣＯＰＤでは、ステロイド耐性にＣＤ８＋ＣＤ２８－　Ｔ細胞が関与している（非特許文献１６）。
　本発明において、免疫抑制剤とは、自己免疫疾患の治療等に用いられる、免疫系に対して抑制的に作用する薬剤を意味し、葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤（単に「ステロイド」ともいう）、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を含む。具体的には、葉酸代謝拮抗剤であるＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、カルシニューリン阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ、副腎皮質ステロイド剤であるＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、核酸合成阻害剤であるＣｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ、抗胸腺細胞グロブリン剤であるＺｅｔｂｕｌｉｎ、Ｌｙｍｐｈｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、核酸代謝拮抗剤であるＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ　ｍｏｆｅｔｉｌ、細胞表面抗原を標的とする生物製剤であるＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、サイトカインあるいはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤であるＡｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、Ｓ１ＰＲ１（スフィンゴシン－１－リン酸受容体１つ）アゴニストであるフィンゴリモド等を例示することができる。
　本発明において、免疫抑制剤抵抗性とは、上記のような免疫抑制剤による治療によっても疾患のコントロールが十分にできていない状態を指し、上記のような免疫抑制剤による治療で、無効あるいは効果不十分の場合、疾患の再発を起こす場合、副作用によって当該薬剤による治療が困難になる場合、等を含む。
本発明において、疾患の治療または予防には、かかる疾患、好適にはＬＡＧ－３蛋白質を発現している個体におけるかかる疾患の発症の予防、増悪化又は進行の抑制又は阻害、かかる疾患に罹患した個体が呈する一つ又は二つ以上の症状の軽減、増悪化若しくは進行の抑制または寛解、二次性疾患の治療又は予防等が含まれるが、それらに限定されるものではない。
　本発明は抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適には、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療及び／又は治療に適用され得、より好適には、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性であり、より一層好適には、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性が、細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて判定されることを特徴とし、さらにより一層好適には、該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来するか又は該個体に由来することを特徴とする。かかる生物学的サンプルは、好適には、病変部位に由来するか又は病変部位から採取された、細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルであり、より好適には、病変部位に浸潤している細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルである。
　本発明の医薬組成物により治療又は予防され得る細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患は、好適には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、バセドウ病、強直性脊椎炎、扁平部炎、喘息、関節リウマチ、多発性筋炎・皮膚筋炎、封入体筋炎、急性冠症候群、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、２型糖尿病、宿主対移植片反応、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は、サルコイドーシスである。
　また、本発明の医薬組成物により治療又は予防され得る細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患は、好適には、ＬＡＧ－３陽性であり、より好適には、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来する生物学的サンプルについてＬＡＧ－３陽性と判定された該疾患である。かかる生物学的サンプルは、好適には、病変部位に由来するか又は病変部位から採取された、細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルであり、より好適には、病変部位に浸潤している細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルである。
　さらに、本発明の組成物又は医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法において、個体に投与され得る。すなわち本発明は、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に、本発明の組成物又は医薬組成物を投与する工程を含む、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患を治療又は予防する方法をも提供する。「罹患を回避することが望ましい」の範囲には、予防又は予防的処置の対象となる、予防又は予防的処置を施されるべき、予防又は予防的処置が予定される、も含まれる。「予防」の範囲には、発症、再発又は症状悪化の予防等が含まれ、治療等により症状が改善されたか又は寛解した個体に、その状態の維持又は再発予防の目的で、本発明の組成物又は医薬組成物を投与する場合を例示することができる。また、本発明においては、疾患、病態又は症状の悪化又は進行を遅らせることも「治療又は予防」の範囲に包含される。
　本発明の組成物又は医薬組成物には、治療または予防に有効な量の抗ＬＡＧ－３抗体又は該抗体の結合断片と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
　「治療または予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態および投与径路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
　本発明の組成物又は医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれる抗体の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
　製剤用の物質として、例えば、以下のものをあげることができるが、これらに限定されるものではない；　グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等ポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
　これらの製剤用の物質の添加量は、抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
　抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体をリポソーム中に含有せしめたイムノリポソーム、抗体とリポソームとが結合してなる抗体修飾体（米国特許第６２１４３８８号等）を含有する組成物又は医薬組成物も、本発明の組成物又は医薬組成物に含まれる。
　賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等をあげることができる。
　緩衝剤としては、組成物又は医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
　本発明の組成物又は医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。凍結乾燥製剤をあげることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
　本発明の組成物又は医薬組成物の投与径路としては、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等をあげることができる。
　かかる組成物又は医薬組成物の組成は、投与方法、抗体のＬＡＧ－３蛋白質結合親和性等に応じて決定することができる。抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体のＬＡＧ－３蛋白質に対する親和性が高いほど（ＫＤ値が低いほど）、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
　抗ＬＡＧ－３抗体の投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該抗体のＬＡＧ－３蛋白質結合親和性又はその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
　組成物又は医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
　抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体を有効成分として含む組成物又は医薬組成物は、他の医薬と同時に又は別個に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に抗ＬＡＧ－３抗体又は該抗体の結合断片を有効成分として含む組成物又は医薬組成物を投与するか、かかる組成物又は医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、または、当該組成物又は医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。
　本発明の組成物又は医薬組成物と組み合わせて使用される他の医薬としては、例えば、葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を挙げることができ、それらは自己免疫疾患及び／又は移植物の拒絶の治療又は予防のために好適である。それら他の医薬としては、葉酸代謝拮抗剤であるＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、カルシニューリン阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ、副腎皮質ステロイド剤であるはＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、核酸合成阻害剤であるＣｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ、抗胸腺細胞グロブリン剤であるＺｅｔｂｕｌｉｎ、Ｌｙｍｐｈｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、核酸代謝拮抗剤であるＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ　ｍｏｆｅｔｉｌ、細胞表面抗原を標的とする生物製剤であるＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、サイトカインあるいはサイトカイン受容体等を標的とする生物製剤であるＡｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、抗Ｏｒａｉ１抗体等を例示することができる。また、本発明の組成物又は医薬組成物は、大量免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩｇ）、血漿交換療法などと併用して自己免疫疾患及び／又は移植物の拒絶の治療又は予防に使用することもできる。それら他の医薬及び療法は、自己免疫疾患及び移植物の拒絶以外の疾患の治療又は予防においても本発明の組成物と組み合わせることができる。
　悪性腫瘍の治療又は予防において本発明の組成物又は医薬組成物と組み合わせることができる医薬及び療法としては、抗がん剤、例えば、各種分子標的薬、化学療法剤、放射線療法、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体をはじめとする各種がん免疫療法剤等を挙げることができる。
　これらの他の医薬及び療法は、１種類の場合もあり、２、３あるいはそれ以上の種類を投与するか又は受けることもできる。それらをまとめて本発明の医薬組成物と「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」と呼び、ＬＡＧ－３抗体、その結合断片若しくはその修飾体に加えて他の医薬を含むか又は他の療法と組み合わせて使用される本発明の組成物も「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」の態様として本発明に含まれる。
　本発明は細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させる方法、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させるための若しくは細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物又は医薬組成物を調製するためのＬＡＧ－３抗体の使用、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療または予防のためのＬＡＧ－３抗体の使用、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療または予防のためのＬＡＧ－３抗体、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療または予防に使用されるＬＡＧ－３抗体、をも提供する。ＬＡＧ－３抗体を含む細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用キット、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療用または予防用キットも本発明に含まれる。
　以下、実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。
実施例１．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体の作製
１）－１　免疫
　ヒトＬＡＧ－３（配列番号８６：図１０１）の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうちＮ末端から１および２番目（２３－２６２番の領域）を欠失させた変異体をｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にクローニングした発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４を、ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｇｉｇａ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い大量調製した。ＷＫＹ/Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）にて前処理後、同部位にｐｃＤＮＡ３．１－ｈＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４を筋注した。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、２ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボエレクトロポレーションを合計３あるいは５回繰り返した後、ラットのリンパ節を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
１）－２　ハイブリドーマ作製
　リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０－ａｇ１４細胞とをＨｙｂｒｉｍｕｎｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ　Ｐｕｌｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて電気細胞融合し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗ＬＡＧ－３抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
１）－３　Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法による抗体スクリーニング
　　ＨＥＫ２９３細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１にヒトあるいはカニクイザルのＬＡＧ－３をクローニングして作製した発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＬＡＧ－３およびｐｃＤＮＡ３．１／ｃｙｎｏＬＡＧ－３）もしくはコントロールのプラスミドを導入し、９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。培養上清を除去後、ハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ　ＩｇＧ－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５　Ｍ　クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ　リン酸水素２ナトリウム・１２水　ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を２５μＬ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ　ＨＣｌを２５μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ＬＡＧ－３遺伝子を含まないコントロールのプラスミドを導入したＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＬＡＧ－３発現ベクター導入ＨＥＫ２９３細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ＬＡＧ－３抗体産生陽性として選択した。
１）－４　フローサイトメトリーによる抗体スクリーニング
実施例１）－３のＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体が、より生理的なＬＡＧ－３発現細胞であるＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性化ヒトＴ細胞（ＰＨＡ　ｂｌａｓｔ）に結合することを、フローサイトメトリー法によりさらに確認した。ヒトＰＢＭＣを２μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ社製）で３日間刺激した細胞に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ　ＩｇＧ　ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）等の二次抗体を加えて懸濁し、４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１ないし２％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製あるいはＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞の蛍光強度のヒストグラムを作成した。
１）－５　ＡＤＣＣアッセイによるスクリーニング
１）－５－１  標的細胞の作製
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ、およびＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を添付プロトコールに従って２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフェクションすることにより、β－ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する組み換えレンチウイルスを作製した。得られた組み換えレンチウイルスをＶｉｒａＰｏｗｅｒ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプロトコールに従って２９３Ｔ細胞に感染させ、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でウイルス感染細胞を選択することにより、β－ガラクトシダーゼの安定発現株を取得した。このβ－ラクトシダーゼを安定発現する２９３Ｔ細胞（以下２９３Ｔ-ｌａｃＺと表記）に、ヒトＬＡＧ－３全長の発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入し、１日間培養した後、ＴｒｙｐＬＥｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて剥離・回収した。５％　ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（以下「ＡＤＣＣ用培地」と略す）にて２回洗浄し、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測し、ＡＤＣＣ用培地で１×１０５ 細胞／ｍｌになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
１）－５－２  エフェクター細胞の調製
　ヒト末梢血からフィコール遠心分離にてＰＢＭＣを分離し、ＡＤＣＣ用培地にて生細胞密度で１．２×１０６ 細胞／ｍＬになるように懸濁したものを、エフェクター細胞として使用した。
１）－５－３  ＡＤＣＣアッセイ
　ハイブリドーマ培養上清５０μＬ／ウェルを含む９６穴Ｕ底マイクロプレートに、１）－５－１の標的細胞を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で３０分間静置した。ＡＤＣＣ用培地１５０μＬ／ウェルを添加して撹拌した後、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心し、上清２００μＬ／ウェルを除いた。そこに、１)－５－２のエフェクター細胞を１２５μＬ／ウェル添加し、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心の後、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清５０μＬを黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、β－Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液５０μＬを添加し、発光量をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント
Ｂ：自然放出（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時およびエフェクター細胞添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬおよび７５μＬそれぞれ添加した。測定時には、細胞を含むウェルに１７５μｌのβ－Ｇｌｏアッセイシステム溶液を添加して混和し、そのうち１００μｌ分を黒色プレートに加えて測定を実施した。
１）－６　ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験によるスクリーニング
　既報（非特許文献８）に準じて実施した。すなわち、９６穴Ｕ底マイクロプレートに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で２５ｎＭに希釈したＬＡＧ－３－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を２０μＬ／ウェル加え、そこにハイブリドーマ培養上清２０μＬ／ウェルを加えて撹拌し、４℃で２０分間静置した。そこに内因性にＭＨＣクラスＩＩ分子を高発現するＲａｊｉ細胞を１０μＬ／ウェル（２．５×１０５ 細胞／ウェル）添加して撹拌し、４℃でさらに３０分間静置した。細胞をＰＢＳもしくはＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加えて懸濁し、４℃で２０分間静置した。細胞をＰＢＳもしくはＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１ないし２％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製あるいはＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行い、阻害率は次式で算出した。
阻害率（％）＝１００－（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルの平均蛍光強度
Ｂ：バックグラウンドの平均蛍光強度。ＬＡＧ－３－Ｆｃおよび抗体添加時に培地をそれぞれ２０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大結合の平均蛍光強度。抗体添加時に培地を２０μＬ添加した。
１）－７　モノクローナル抗体の精製
ラット抗ヒトＬＡＧ－３モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。すなわち、まずＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）にハイブリドーマの培養上清をアプライした。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、０．１　Ｍグリシン/塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分に１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０～７．５に調製した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）にてＰＢＳへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例２．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
２）－１　取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のヒト活性化Ｔ細胞への結合性
実施例１）－７に記載の方法により、精製したラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４の、ヒト活性化Ｔ細胞への結合性を検討した。図１に示すとおり、これらのラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体はいずれもｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性化ヒトＴ細胞として調製したＰＨＡ　ｂｌａｓｔに濃度依存的に結合した。
２）－２　取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＡＤＣＣ活性
　精製したラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４のＡＤＣＣ活性を、以下の方法により検討した。抗体溶液５０μＬ／ウェルを含む９６穴Ｕ底マイクロプレートに、実施例１）－５－１の標的細胞（以下、２９３Ｔ－ｌａｃＺ／ｈＬＡＧ－３細胞と記載）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で３０分間静置した。そこに、実施例１)－５－２のように調製したエフェクター細胞（ただし、２×１０６ 細胞／ｍＬになるように懸濁したもの）を７５μＬ／ウェル添加し、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心の後、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清５０μＬを黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、β－Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液５０μＬを添加し、発光量をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント
Ｂ：自然放出（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時およびエフェクター細胞添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬおよび７５μＬそれぞれ添加した。測定時には、細胞を含むウェルに１７５μｌのβ－Ｇｌｏアッセイシステム溶液を添加して混和し、そのうち１００μｌ分を黒色プレートに加えて測定を実施した。
　図２に示すとおり、これらのラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体はいずれも、ヒトＬＡＧ－３発現細胞に対して濃度依存的なｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣＣ活性を示した。これに対して、ヒトＬＡＧ－３遺伝子をトランスフェクトしてない２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に対しては、これらの抗体はＡＤＣＣ活性を示さず、作用は特異的であった。
２）－３　取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験における阻害活性の検討
　実施例１）－６に記載のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験により、精製した抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）が、ＬＡＧ－３とそのリガンドと報告されているＭＨＣクラスＩＩ分子の結合を阻害する活性を有するか検討した。その結果、図３Ａに示すとおりこれら５クローンの抗体はいずれも、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験においてほとんど阻害活性を示さず、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能発揮に必要と考えられているＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に影響を与えないことが明らかになった。これに対して図３Ｂに示すとおり、先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１（特許文献１）は、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験において濃度依存的に強力な阻害活性を示した。
２）－４　取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）の２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験における阻害活性の検討
　実施例２）－３に記載のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験においては、ＬＡＧ－３－Ｆｃへの抗ＬＡＧ－３抗体の結合に伴う立体障害によって、Ｒａｊｉ細胞へのＬＡＧ－３－Ｆｃの結合を検出するための二次抗体Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅの結合が阻害され、実際には抗体がＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合を直接阻害していないにも関わらず見かけ上、低い蛍光強度を示す可能性を完全には排除できない。そこで検出用の二次抗体を使用しない評価系として、以下のような２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験系を構築し、抗体の評価を行った。
　２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ヒトＬＡＧ－３発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｈＬＡＧ－３を導入し、ＢｉｏＣｏａｔ　Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅコート９６穴マイクロプレート（ＢＤ社製）に播種して一晩培養した。一方、Ｒａｊｉ細胞を培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）中で蛍光色素のＢＣＥＣＦ－ＡＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製、１０μＭで使用）で３７℃にて１時間標識し、洗浄後、１．６×１０６ 細胞／ｍＬになるように培地に懸濁した。トランスフェクション後一晩培養した細胞（２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３細胞）の培地を除去し、５０μＬ／ウェルの培地および２５μＬ／ウェルの抗体溶液を加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。その後、ＢＣＥＣＦ－ＡＭ標識したＲａｊｉ細胞を２５μＬ／ウェル加えて、９００ｒｐｍで３０秒間遠心した後、３７℃で１時間インキュベーションした。反応後、培地で２ないし３回ウェルを洗浄して非接着細胞を除き、０．１％ＮＰ－４０を含むＴｒｉｓバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ８．０）１００μＬ／ウェルで細胞を溶解し、ウェルの蛍光強度をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。阻害率は次式で算出した。
阻害率（％）＝１００－（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルの蛍光強度
Ｂ：バックグラウンドの蛍光強度。Ｒａｊｉ細胞および抗体添加時に培地を添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大結合の蛍光強度。抗体添加時に培地を添加した。
　その結果、図４に示すとおり精製ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４はいずれも、２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験においてほとんど阻害活性を示さず、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能発揮に必要と考えられているＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に影響を与えないことがさらに支持された。これに対して先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１（特許文献１）は、本試験において１０μｇ／ｍＬの濃度で阻害率９０％と強力な阻害活性を示した。
２）－５　取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のエピトープの同定
　ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４は、ＬＡＧ－３の細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちＮ末端から１および２番目（以下、それぞれドメイン１および２と表記）を欠失させた変異体を免疫原として作製した抗体であることから、残るＮ末端から３および４番目（以下、それぞれドメイン３および４と表記）のいずれのドメインにこれらの抗体が結合するのかを明らかにする目的で、ドメイン３と４、あるいはドメイン４のみを発現させた細胞に対する取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体の結合をフローサイトメトリーにより検討した。
　Ｎ末端にＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したヒトＬＡＧ－３のドメイン３以下（２６３－５２５）あるいはドメイン４以下（３５３－５２５）の発現プラスミド（いずれもｐｃＤＮＡ３．１にクローニング）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、１日間培養した後に回収して、実施例１）－４に記載の方法でフローサイトメトリーにより、抗体の結合性を検討した。その結果、図５Ａに示すとおり、精製ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２およびｒＬＡ２２５はいずれも、ドメイン３および４を含むコンストラクトを発現させた細胞には結合したのに対し、ドメイン４のみを含むコンストラクトを発現させた細胞には結合しなかった。これら結果から、取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２およびｒＬＡ２２５はいずれも、ＬＡＧ－３細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちドメイン３に結合することが明らかになった。
　ハイブリドーマ培養上清を用いた同様の実験から、取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４も、ドメイン３に結合することが明らかになっている。
　同様の方法で先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１の結合ドメインを検討した結果を図５Ｂに示す。図５Ａの２種類のコンストラクトに加えて、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したヒトＬＡＧ－３のドメイン２以下（ヒトＬＡＧ－３アミノ酸配列／配列番号８６、図１０１のアミノ酸番号１７３－５２５）、およびヒトＬＡＧ－３の全長の発現プラスミドも用いた（いずれもｐｃＤＮＡ３．１を用いて構築；ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号８５、図１００に記載されている）。ＩＭＰ７３１および実施例２）－６で作製したラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体クローン６Ｄ７はいずれも、全長のヒトＬＡＧ－３を発現した細胞には結合したものの、ドメイン１を欠いた変異体（ＦＬＡＧ－Ｄ２Ｄ３Ｄ４、ＦＬＡＧ－Ｄ３Ｄ４、ＦＬＡＧ－Ｄ４）には結合せず、ドメイン１に結合することが明らかになった。すなわち、ＬＡＧ－３細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちドメイン３に結合する取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４は、ドメイン１に結合するＩＭＰ７３１とは異なるエピトープを認識することが明らかになった。
２）－６　精製ＬＡＧ－３タンパク質を免疫原としたラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体の取得
　実施例１）－１とは別の免疫方法として、精製ＬＡＧ－３タンパク質を免疫原としてラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体の取得を行った。ヒトＬＡＧ－３の細胞外領域（１－４５０）のＣ末端にＨｉｓタグを付加したタンパク質をＦｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）と混合（体積比で１：２）してエマルジョンにしたものを８週齢のＷＫＹ/Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）の尾根部に１匹あたり２００μｇ投与した。３週間後に抗原タンパク質のみを尾根部に１匹あたり２００μｇ投与し、さらにその２週間後にリンパ節を採取し、実施例１）－２の方法によりハイブリドーマを作製した。実施例１）－３および１）－４などの方法でスクリーニングを行い、得られたモノクローナル抗体のエピトープを実施例２）－５の方法によって解析したところ、評価したクローンの５８％がＬＡＧ－３細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちドメイン１に、２６％がドメイン２に結合し、Ｎ末端に近い部分に対するモノクローナル抗体が優先的に取得されたことが明らかになった。その中で、フローサイトメトリーでヒト活性化Ｔ細胞（ＰＨＡ　ｂｌａｓｔ）に強く結合するクローンの多くは、クローン６Ｄ７を含め、ＬＡＧ－３のドメイン１に結合し、それらはいずれも実施例２）－３に記載のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験で強い阻害活性を示した。この結果は、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合には、ＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうち、Ｎ末端のドメイン１および２が重要であるというこれまでの知見(非特許文献４)とよく一致するものであり、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合を阻害しない、すなわちＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能を阻害しない抗体を取得するためには、実施例１）－１のような免疫方法の工夫をしてモノクローナル抗体を作製する必要があることを示している。
実施例３．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１　ｒＬＡ２０４の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１－１　ｒＬＡ２０４産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　ｒＬＡ２０４の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、ｒＬＡ２０４産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－１－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）－１－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの約１μｇを用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。
３）－１－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるｒＬＡ２０４の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　ｒＬＡ２０４の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ　（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）、及び
５’－ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ－３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号７１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ３はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。
　このプライマーの組み合わせと、実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりｒＬＡ２０４の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　シークエンスプライマーとして、データベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した
　５’－ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ－３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号７１）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ　（Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）を用いた。
　決定されたｒＬＡ２０４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
３）－１－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるｒＬＡ２０４の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　ｒＬＡ２０４の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ　（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）、及び
５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ＲＫＲ５；配列番号７２）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
　このプライマーの組み合わせと、実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりｒＬＡ２０４の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　シークエンスプライマーとして、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した
　５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ＲＫＲ５；配列番号７２）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ　（Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）を用いた。
　決定されたｒＬＡ２０４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示した。
３）－２　ｒＬＡ２１２の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
　実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。
　決定されたｒＬＡ２１２の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示した。
３）－３　ｒＬＡ２２５の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
　実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。
　決定されたｒＬＡ２２５の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号９に示し、アミノ酸配列を配列番号１０に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、アミノ酸配列を配列番号１２に示した。
３）－４　ｒＬＡ８６９の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
　実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。
　決定されたｒＬＡ８６９の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５に示し、アミノ酸配列を配列番号１６に示した。
３）－５　ｒＬＡ１２６４の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
　実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。
　決定されたｒＬＡ１２６４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１７に示し、アミノ酸配列を配列番号１８に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示した。
実施例４．ヒトキメラ化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｃＬＡ２１２）の作製
４）－１　キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
　プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号２１に示すヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
　ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒト軽鎖定常領域を持つ、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’－ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ－３’（３．３－Ｆ１；配列番号７３）
５’－ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ－３’（３．３－Ｒ１；配列番号７４）
４）－２　キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築
　ｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号２２に示すヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を構築した。
４）－３　ｃＬＡ２１２重鎖発現ベクターの構築
　実施例３）－２で得られたｒＬＡ２１２の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＬＡ２１２重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＬＡ２１２」と命名した。ｃＬＡ２１２重鎖のヌクレオチド配列を配列番号２３に示し、アミノ酸配列を配列番号２４に示した。
ｃＬＡ２１２重鎖用プライマーセット
５’－ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧ－３’（２１２Ｈ－Ｆ；配列番号７５）
５’－ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ－３’（２１２Ｈ－Ｒ；配列番号７６）
４）－４　ｃＬＡ２１２軽鎖発現ベクターの構築
　実施例３）－２で得られたｒＬＡ２１２の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＡＮ断片を増幅し、キメラ及びヒト化軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＬＡ２１２の軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＬＡ２１２」と命名した。ｃＬＡ２１２の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号２５に示し、アミノ酸配列を配列番号２６に示した。
ｃＬＡ２１２軽鎖用プライマーセット
５’－ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣ－３’（２１２Ｌ－Ｆ；配列番号７７）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣＣＡＧＣ－３’（２１２Ｌ－Ｒ；配列番号７８）
４）－５　ｃＬＡ２１２の生産
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ　Ｆｅｒｎｂａｃｈ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５）１．８ｍｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製したＨ鎖発現ベクター（０．２４ｍｇ）及びＬ鎖発現ベクター（０．３６ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ－ＣＥＬＬ　ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ　Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍｌのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　（Ａｄｖａｎｔｅｃ　＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過した。
　ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＬＡ２１２とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＬＡ２１２との組合せによって取得されたｒＬＡ２１２のヒトキメラ抗体を「ｃＬＡ２１２」と命名した。
４）－６　ｃＬＡ２１２の精製
　実施例４）－５で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃下）で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４－６℃下で実施した。最初に培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社製）が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ　ヒスチジン／５％　ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を２ｍｇ／ｍｌ以上に調製し精製サンプルとした。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
４）－７　ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体（ｃＬＡ２１２）の抗原結合活性
　２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞（実施例１）－５－１に記載）に対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒトＬＡＧ－３の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＬＡＧ－３を導入し、一日間培養した後、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーは、実施例１）－４に記載の方法に準じて行い、ただし二次抗体はＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。図６に示すように、ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２は、濃度依存的にヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に結合し、キメラ化によっても結合活性を保持していることが明らかになった。
実施例５．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２１２）のヒト化バージョン（ｈＬＡ２１２）の設計
５－１　ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２１２のヒト化体デザイン
５）－１－１　ｒＬＡ２１２の可変領域の分子モデリング
　ｒＬＡ２１２の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されているヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、実施例３）－２で決定されたｒＬＡ２１２の可変領域と比較した。結果として２ＧＨＷと２ＡＲＪがｒＬＡ２１２の重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、ｒＬＡ２１２の重鎖及び軽鎖に対応する２ＧＨＷと２ＡＲＪの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。最後に、エネルギーの点でｒＬＡ２１２の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて行った。
５）－１－２　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２に対するアミノ酸配列の設計
　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
　ｒＬＡ２１２のフレームワーク領域の配列を、ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．　（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列やＧｅｒｍｌｉｎｅ配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、重鎖についてはヒトｇａｍｍａ鎖サブグループ３のコンセンサス配列が、軽鎖についてはヒトｋａｐｐａ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。アクセプターについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、ｒＬＡ２１２についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、実施例５）－１－１で構築されたｒＬＡ２１２の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈＬＡ２１２の配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
５）－２　ｒＬＡ２１２重鎖のヒト化
５）－２－１　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＬＡ２１２の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１６目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号１９目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号４２目のスレオニンをグリシンに、アミノ酸番号４３目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号４９目のアラニンをグリシンに、アミノ酸番号８４目のアスパラギン酸をアスパラギンに、アミノ酸番号８８目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１５目のバリンをスレオニンに、アミノ酸番号１１６目のメチオニンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２重鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に記載されている。配列番号２８のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７に記載されている。配列番号２７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２７のヌクレオチド配列及び配列番号２８のアミノ酸配列は、それぞれ図４２及び４３にも記載されている。
５）－２－２　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＬＡ２１２の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１６目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号１９目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号４２目のスレオニンをグリシンに、アミノ酸番号４３目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号８８目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１５目のバリンをスレオニンに、アミノ酸番号１１６目のメチオニンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２重鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に記載されている。配列番号３０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９に記載されている。配列番号２９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２９のヌクレオチド配列及び配列番号３０のアミノ酸配列は、それぞれ図４４及び４５にも記載されている。
５）－３　ｒＬＡ２１２軽鎖のヒト化
５）－３－１　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１３目のイソロイシンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号３８目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号４３目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６５目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号６７目のチロシンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に記載されている。配列番号３２のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１に記載されている。配列番号３１のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３１のヌクレオチド配列及び配列番号３２のアミノ酸配列は、それぞれ図４６及び４７にも記載されている。
５）－３－２　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１３目のイソロイシンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号３８目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６５目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に記載されている。配列番号３４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３に記載されている。配列番号３３のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３３のヌクレオチド配列及び配列番号３４のアミノ酸配列は、それぞれ図４８及び４９にも記載されている。
５）－３－３　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１３目のイソロイシンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に記載されている。配列番号３６のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５に記載されている。配列番号３５のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３５のヌクレオチド配列及び配列番号３６のアミノ酸配列は、それぞれ図５０及び５１にも記載されている。
５）－３－４　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６５目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号６７目のチロシンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に記載されている。配列番号３８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７に記載されている。配列番号３７のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３７のヌクレオチド配列及び配列番号３８のアミノ酸配列は、それぞれ図５２及び５３にも記載されている。
５）－３－５　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に記載されている。配列番号４０のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９に記載されている。配列番号３９のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３９のヌクレオチド配列及び配列番号４０のアミノ酸配列は、それぞれ図５４及びｂ５５にも記載されている。
５）－４　重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＬＡ２１２の設計
　ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例６に準じて作製し、実施例７及び実施例８に準じて評価することができる。
実施例６．ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のヒト化抗体（ｈＬＡ２１２）の発現および精製
６）－１　ｈＬＡ２１２の重鎖発現ベクターの構築
６）－１－１　ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号２７に示すｈＬＡ２１２＿Ｈ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＬＡ２１２＿Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。合成したＤＮＡ断片を、キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりｈＬＡ２１２＿Ｈ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２」と命名した。
６）－１－２　ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号２９に示すｈＬＡ２１２＿Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＬＡ２１２＿Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－１－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３」と命名した。
６）－２　ｈＬＡ２１２の軽鎖発現ベクターの構築
６）－２－１　ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３１に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。合成したＤＮＡ断片を、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりｈＬＡ２１２＿Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ１」と命名した。
６）－２－２　ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３３に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ２」と命名した。
６）－２－３　ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３５に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ３」と命名した。
６）－２－４　ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３７に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ４」と命名した。
６）－２－５　ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３９に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ５のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ５の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ５」と命名した。
６）－３　ｈＬＡ２１２抗体の調製
６）－３－１　ｈＬＡ２１２抗体の生産
　実施例４）－５と同様の方法で生産した。すなわち、ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ１との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ２との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ３の組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ４との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ５との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ１との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ２との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ３の組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ４との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ５との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５を取得した。
６）－３－２　ｈＬＡ２１２抗体の精製
　６）－３－１で得られた培養上清を、実施例４）－６と同様の方法で精製した。　
実施例７．ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
７）－１　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のＢｉａｃｏｒｅによる抗原結合活性測定
　ヒトＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうちＮ末端から３および４番目（２６３－４５０番の領域）の部分のＣ末端にＨｉｓタグを付加したタンパク質ＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４－Ｈｉｓを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に発現させた。得られた培養上清をバッファー置換（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）し、ＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ヒトＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４－Ｈｉｓタンパク質を精製した。最終バッファーはＰＢＳとした。
　抗体と抗原（ＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４－Ｈｉｓ）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を使用し、固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社）に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体は、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社）へアミンカップリング法にて約１０００ＲＵを目標に共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したチップ上に、抗体を約１分間添加した後、抗原の希釈系列溶液（０．０６－２０ｎＭ）を流速９０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ塩化マグネシウム溶液を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。解離定数は図７に示されている。
７）－２　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のフローサイトメトリーによるヒトＬＡＧ－３発現細胞への結合性の検討
　２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞（実施例１）－５－１に記載）に対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒトＬＡＧ－３の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｈＬＡＧ－３を導入し、一日間培養した後、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーは、実施例１）－４に記載の方法に準じて行い、ただし二次抗体はＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。図８に示すように、１０クローンのヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４、およびｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５）はいずれも、ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２と同程度に、濃度依存的なヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に対する結合性を示し、ヒト化によっても結合活性を保持していることが明らかになった。
７）－３　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のＡＤＣＣ活性
　実施例２）－２に記載の方法により、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のＡＤＣＣ活性を検討した。その結果、図９に示すように、１０クローンのヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４、およびｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５）はいずれも、ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２とほぼ同程度に、濃度依存的なヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示し、ヒト化によってもＡＤＣＣ活性を保持していることが明らかになった。
７）－４　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２のＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に対する影響の検討
　ＬＡＧ－３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することで、Ｔ細胞に何らかの抑制性のシグナルを伝達し、Ｔ細胞の機能を負に制御することが知られている(非特許文献１)。ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合には、ＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうち、Ｎ末端のドメイン１および２が重要であると考えられている(非特許文献４)。実施例１の方法で取得した５クローンのラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）はいずれもドメイン３を認識し、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験および２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験で阻害活性を示さなかったのに対し、先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１はドメイン１を認識し、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験および２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験で強力な阻害活性を示したことを実施例２において明らかにした。これらの結果から、実施例１の方法で取得したクローンおよびそれに由来するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体はＬＡＧ－３本来のＴ細胞抑制機能に影響を与えないのに対し、ＩＭＰ７３１はそれを阻害することが想定された。このことを実験的に確かめるために、既報（非特許文献９）に準じて、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２の、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に対する影響を検討した。ヒト末梢血からフィコール遠心分離にて分離したＰＢＭＣを、２×１０５ 細胞／ウェルで９６穴マイクロプレートに播種し、抗体を添加した後、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。そこにＳＥＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）を最終濃度1 ng/mLになるように加え、４日間培養したときの培養上清中のＩＬ－２濃度をＨｕｍａｎ　ＩＬ－２　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により定量した。その結果、図１０に示すように、作製したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２はほとんどＩＬ－２産生に影響を与えなかったのに対し、ＩＭＰ７３１はＩＬ－２産生を増加させた。すなわち、当初の予測どおり、作製したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２はＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に影響を与えないのに対し、ＩＭＰ７３１はこれを阻害することで、逆に免疫系を活性化してしまうリスクがあることが明らかになった。
実施例８．糖鎖修飾が調節されたヒト化抗体の調製
　配列番号３０（図４５）で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２０乃至４７０を含む重鎖、および、配列番号３４（図４９）で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至２３４を含む軽鎖を含んでなるヒト化抗体を、公知の方法に従って、該抗体蛋白質に結合する糖鎖修飾を脱フコース化することにより調節し、得られた抗体をｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２と命名した。当該修飾体を質量分析に供したところ、フコースを含有するＨ鎖のピークは検出限界以下であった。本発明においては、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のように糖鎖修飾が調節された抗体も「抗体」または「抗体の修飾体」と呼ぶ。
実施例９．ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
９）－１　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のＬＡＧ－３発現細胞に対する結合活性
　実施例７）－２に記載の方法によりヒトＬＡＧ－３を発現させた２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の結合をフローサイトメトリーにより検討した。その結果、図１１に示すように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の濃度依存的な結合が観察された。
９）－２　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣＣ活性
　実施例７）－２に記載の方法により、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣＣ活性を評価した。その結果、図１２に示すように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２はヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性を示した。これに対し、ヒトＬＡＧ－３を発現させていない２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対しては、ＡＤＣＣ活性を示さなかった。
実施例１０．ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの作製
　ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、実施例９に示すようにヒトＬＡＧ－３には結合するものの、げっ歯類のＬＡＧ－３には交差しないことが明らかになっている。そこでｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ　ｖｉｖｏでの評価を可能にするため、ヒトＬＡＧ－３をマウスＬＡＧ－３の発現調節機構を利用して生理的に発現させたＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｔｒｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）トランスジェニックマウスを作製することとした。また、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のような糖鎖修飾の調節によってＡＤＣＣ活性が増強されるためには、ヒトＦｃγＩＩＩＡが必要であり（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７０（Ｎｏ．１１）：ｐｐ４４８１－９（２０１０））、既報（非特許文献１０）に準じてヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含むＢＡＣもあわせて導入することとした。
１０）－１　Ｒｅｄ／ＥＴ反応を用いた組換えＢＡＣ発現ベクターのコンストラクション
　大腸菌内での能動型相同組み換え反応 であるＲｅｄ／ＥＴ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｚｈａｎｇ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ，　Ａ　ｎｅｗ　ｌｏｇｉｃ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ．Ｃｏｌｉ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２０　（１９９８）　１２３－１２８） を利用して、ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣの組換えＢＡＣクローンを構築した。
　ヒトＬＡＧ－３およびマウスＬＡＧ－３遺伝子座をそれぞれ含むＢＡＣゲノムクローン、ＲＰ１１－１０１Ｆ２１およびＲＰ２３－３０Ｏ１を入手した。下の表に示したように、ヒトＬＡＧ－３遺伝子のイントロン５の配列、ヒトＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから終止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列の両端の配列、およびマウスＢＡＣクローンのＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから終止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列の３’側末端、５’側末端を大腸菌内での能動型相同組み換え反応のためのキー配列とした。
ＬＡＧ－３－Ｈ１　ヒトＬＡＧ－３遺伝子の開始コドン付近の配列
［５’］ＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＣ［３’］（配列番号７９）
ＬＡＧ－３－Ｈ２　ヒトＬＡＧ－３遺伝子の終止コドン付近の配列
［５’］ＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡ［３’］（配列番号８０）
ＬＡＧ－３－Ｈ３　Ｒｐｓｌ－ｋａｎ挿入サイト、５’側
［５’］ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧ［３’］（配列番号８１）
ＬＡＧ－３－Ｈ４　Ｒｐｓｌ－ｋａｎ挿入サイト、３’側
［５’］ＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣ　［３’］（配列番号８２）
ＬＡＧ－３－Ｈ５　マウスＬＡＧ－３遺伝子の５’ＵＴＲ
［５’］ＣＡＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＡＧ［３’］（配列番号８３）
ＬＡＧ－３－Ｈ６　マウスＬＡＧ－３遺伝子の３’ＵＴＲ
［５’］ＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣ［３’］（配列番号８４）
　まず、ヒトＢＡＣクローンのＬＡＧ－３遺伝子のイントロン５にポジティブ／ネガティブセレクションマーカーカセット（Ｒｐｓｌ－ｋａｎ）を挿入するために、ＬＡＧ－３－Ｈ３配列、Ｒｐｓｌ－ｋａｎ、およびＬＡＧ－３－Ｈ４配列をタンデムにつないだＤＮＡフラグメントを、ＬＡ－Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲにより構築した（ＬＡＧ－３　Ｒｐｓｌ－Ｋａｎブレークインフラグメント）。Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有した大腸菌株に、ＬＡＧ－３遺伝子座を含むヒトＢＡＣクローンとＬＡＧ－３　Ｒｐｓｌ－Ｋａｎブレークインフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導し、クロラムフェニコール耐性、かつカナマイシン耐性のコロニーをピックアップすることにより、ＬＡＧ－３　Ｒｐｓｌ－ｋａｎブレークインフラグメントをＬＡＧ－３遺伝子座のイントロン５に挿入した組み換えＢＡＣクローンをスクリーニングした（ヒトＬＡＧ－３　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）。そして、このヒトＬＡＧ－３　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　から、Ｒｐｓｌ－ｋａｎカセットを挿入したヒトＬＡＧ－３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をプラスミドベクターにサブクローニングするため、Ｈ２－Ｈ６－ＳａｃＢｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－Ｈ５－Ｈ１をタンデムにつないだＤＮＡカセットを構築した（ＬＡＧ－３　プレトランスファープラスミド）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有する大腸菌株に、ヒトＬＡＧ－３　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅとともに、直鎖化したＬＡＧ－３プレトランスファープラスミドを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導してアンピシリンおよびカナマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、Ｒｐｓｌｋａｎカセットを挿入したヒトＬＡＧ－３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を持つプラスミドをスクリーニングした（ヒトＬＡＧ－３　トランスファープラスミド）。
　次に、制限酵素反応により、このヒトＬＡＧ－３　トランスファープラスミドから、マウスゲノム配列に由来するＨ５配列とＨ６配列を両端に持ち、Ｒｐｓｌ－ｋａｎカセットを挿入したヒトＬＡＧ－３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をプラスミドベクターから切り出した（ヒトＬＡＧ－３　トランスファーフラグメント）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有する大腸菌株に、マウスＬＡＧ－３ＢＡＣクローンとともに、ヒトＬＡＧ－３　トランスファーフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導してクロラムフェニコール、およびカナマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、マウスＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＬＡＧ－３　トランスファーフラグメントの翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列と正確に置換したマウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３遺伝子の組換えＢＡＣクローンをスクリーニングした（マウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）。
　最後に、ヒトＬＡＧ－３遺伝子座のイントロン５配列をＰＣＲで増幅し、ネガティブセレクションによりヒトＬＡＧ－３遺伝子のイントロン５に挿入したＲｐｓｌ－Ｋａｎを除去するためのＤＮＡ配列とした（ヒトＬＡＧ－３　リペアーフラグメント）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有する大腸菌株にマウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅとともに、ヒトＬＡＧ－３　リペアーフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導してクロラムフェニコール、およびストレプトマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、マウスＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列と正確に置換したマウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３遺伝子の組換えＢＡＣクローンの構築を行なった（ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ）。シークエンス解析により、Ｒｅｄ／ＥＴ反応で接合したＨ１～Ｈ６のゲノムＤＮＡ配列を確認した。
１０）－２　高純度ＢＡＣ　ＤＮＡフラグメントの精製
　ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ遺伝子発現コンストラクトである組換えＢＡＣクローンにより形質転換したＤＨ１０Ｂセルを、クロラムフェニコールを含むＬＢアガー培地上でクローニングし、そのシングルコロニーをピックアップして液体培地で一昼夜震盪培養した。
　ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ遺伝子発現コンストラクトを、一部改変した阿部らの方法（Ｅｘｐ　Ａｎｉｍ．　２００４　５３（４）：３１１－２０．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＢＡＣ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ　ｌｏｃｕｓ．　Ａｂｅ　Ｋ，　Ｈａｚａｍａ　Ｍ，　Ｋａｔｏｈ　Ｈ，　Ｙａｍａｍｕｒａ　Ｋ，　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｍ．）に従い、ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ組換えＢＡＣクローンをプラスミド抽出キット（マッキリーナーゲル社、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ　ＢＡＣ１００キット）を用いて精製し、ＰＩ－ＳｃｅＩを加えて３７℃、１６時間反応させてダイジェスチョンを行った。
　直鎖化したヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ組換えＢＡＣクローンを１％ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　アガロースゲル（タカラバイオ）にアプライし、パルスフィールド電気泳動装置（バイオラッド、ＣＨＥＦ　ＤＲ－ＩＩ）により、６　ｖ／ｃｍ、０．１－４０　ｓｅｃ、１５ｈｒ、１４℃の条件で電気泳動を行った。サンプルの一部をガイドマーカーとしてＵＶトランスイルミネーターにより可視化することによって、アガロースゲル中に分離した直鎖化したヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ組換えＢＡＣクローンをＵＶ照射することなく、カミソリで切り出した。得られた長鎖ＤＮＡ断片を電気溶出法によりアガロースゲルから抽出し、マイクロインジェクション用に調製したＴＥバッファーで、４℃、２時間透析した。精製したＤＮＡ断片をパルスフィールド電気泳動にアプライして、より長鎖ＤＮＡ断片が分断することなく高度に精製されていることを確認するとともに、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（旭テクノグラス社）によりそのＤＮＡ濃度を決定した。このＤＮＡ断片の溶液を０．５　ｎｇ／μｌになるように希釈してトランスジェニックマウス作出用の発現コンストラクトの溶液を調製した。
１０－３）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　マウス胚マイクロインジェクション
　雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　マウスにＰＭＳＧおよびｈＣＧを投与して過排卵を誘起し、同系統の雄性マウスと交配した後、受精卵を採取した。
　マイクロマニュピレーターを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　マウスの前核期胚の雄性核に、精製したヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ　ＢＡＣ発現コンストラクトを直接注入した。このＤＮＡ注入胚を偽妊娠誘起した受胚雌マウスの卵管に移植した。
１０－４）ファウンダーのサザンスクリーニング
　ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ　ＢＡＣ発現コンストラクトを注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊ　マウス受精卵から自然分娩により得た産子を、離乳まで保育した。ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ　ＢＡＣトランスジェニックマウス、ファウンダー候補個体を３週令で離乳し、個体識別のための耳標をつけた後に、尾部組織を生検して解析に供するまで－８０℃に保管した。
　－８０℃で保存しておいたヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ　ＢＡＣトランスジェニックマウスの候補個体の尾部組織を室温で融解し、１％ＳＤＳ（和光純薬）、１　ｍｇ／ｍｌアクチナーゼＥ（科研製薬）および０．１５　ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（メルク）を含むライシスバッファーを加え、５５℃で１６時間震盪して組織を可溶化した。フェノール抽出、およびフェノール／クロロフォルム抽出を行って、組織から可溶化したゲノムＤＮＡに結合するタンパク質を除去した。ゲノムＤＮＡに混在するＲＮＡをＲＮａｓｅ　Ａ（Ｓｉｇｍａ社）により分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムＤＮＡを析出した。析出したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄して風乾した後、５０μｌのＴＥに再溶解した。
　各検体から調製したゲノムＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を吸光法により決定し、各検体のＤＮＡ濃度の値からＤＮＡ５μｇに相当するゲノムＤＮＡ溶液の容量を算出した。
　各検体から調製したゲノムＤＮＡ、陽性対照ＤＮＡ（マイクロインジェクションに使用した発現コンストラクトを加えたコントロールマウスのゲノムＤＮＡ）、および陰性対照ＤＮＡ（コントロールマウスのゲノムＤＮＡ）に制限酵素を加えて、３７℃、１６時間の反応を行った。生成したゲノムＤＮＡの断片をイソプロパノール沈澱により析出し、７０％エタノールで洗浄して風乾した後、ＴＥに再溶解した。これらのゲノムＤＮＡ断片を１．２％のアガロースゲルにアプライして電気泳動し、アガロースゲル中に分離したゲノムＤＮＡ断片をＵＶトランスイルミネーターにより可視化し、スケールとともに写真撮影した。
　このアガロースゲルを０．２５Ｎ塩酸に浸して１０分間緩やかに震盪した後、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに浸してさらに１０分間緩やかに震盪した。０．４Ｎ水酸化ナトリウムを用いたキャピラリー法により、アガロースゲル中に分離したゲノムＤＮＡ断片を、室温で１６時間、ナイロンメンブレン　（Ｈｙｂｏｎｄ－ＸＬ；ＧＥヘルスケア社）にトランスファーした。ゲノムＤＮＡ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンを２×ＳＳＣに浸して１０分間緩やかに震盪した後に風乾し、ハイブリダイゼーションに用いるまで室温で保存した。
　ＤＮＡラベル化キット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ；ＧＥヘルスケア社）を用いて、ランダムプライム法によりＤＮＡフラグメントを　［３２Ｐ］ラベルした。セファデックススピンカラム（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ　Ｇ－５０　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏｌｕｍｎｓ；ＧＥヘルスケア社）を用いて［３２Ｐ］ラベル化したフラグメントを精製し、［３２Ｐ］ラベル化プローブとした。
　ゲノムＤＮＡ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッファーに入れて、６５℃で１時間プレインキュベートした。その後、９５℃、５分間加熱し、直後に５分間氷冷し変性した［３２Ｐ］ラベル化プローブを加えて、６５℃で４時間インキュベートした。インキュベーション終了後にナイロンメンブレンを取り出し、０．１％　ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣで６５℃で約１５分間洗浄した。サーベイメーターでメンブレンに結合したプローブに由来する放射活性をモニターし、放射活性がほぼ一定になるまでこの洗浄を繰り返した。
　洗浄したメンブレンをサランラップ（登録商標）で覆い、暗室内でＸ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ　ＭＳ；　コダック）を重ねてオートラジオグラフィーカセットに入れた。４℃で１週間感光した後にＸ線フィルムを現像した。ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ　ＢＡＣ発現コンストラクトに由来する特異的なシグナルをオートラジオグラフィーで検出し、［３２Ｐ］ラベル化プローブとのハイブリダイゼーションによる特異的なシグナルをもたらす個体を、ヒトＬＡＧ－３　ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ　ＢＡＣトランスジェニックマウス、ファウンダー個体として同定した。
１０－５）Ｆ１マウスの作出および繁殖
　ファウンダー個体の後代動物を得てジェノタイピングを行ない、Ｔｇマウスの系統化をおこなった。サザン解析で同定したＴｇマウス・ファウンダーと野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを体外受精または自然交配し、Ｆ１個体を作出した。ジェノタイピングによりＦ１個体にトランスジーンを伝達し、系統化できたラインを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの体外受精または自然交配による繁殖に供し、ジェノタイピングによりヒトＬＡＧ－３およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡがいずれもヘテロで導入されているマウスを実験に使用した。
１０－６）ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスのフェノタイプの確認
　取得したヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにおける導入した遺伝子の発現をフローサイトメトリー法により検討した。マウスの尾静脈から末梢血をヘパリン処理ヘマトクリット毛細管に採血し、ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）により赤血球を溶血して白血球を得た。その一部をフローサイトメトリー法によるヒトＦｃγＲＩＩＩＡの発現解析に使用し、残りについてはＬＡＧ－３の発現を誘導するため２μｇ／ｍＬ　Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ（Ｃｏｎ　Ａ：Ｓｉｇｍａ社）を含む培地で３日間刺激して活性化Ｔ細胞を得た。後者について、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体（ＢＤ社製）、ＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３抗体（ＢＤ社製）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて懸濁し、４℃で３０分間静置した。なお、ネガティブ集団の位置の同定に使用するために、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体およびＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体を含まないコントロールも作製し、同様に処理した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞を解析対象とした。その結果、図１３に示すとおり、コントロールの野生型マウス由来のＣｏｎ　Ａ活性化Ｔ細胞には、マウスＬＡＧ－３の発現のみが認められヒトＬＡＧ－３の発現は認められなかったのに対し、ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウス由来のＣｏｎ　Ａ活性化Ｔ細胞にはマウスＬＡＧ－３およびヒトＬＡＧ－３の発現がいずれも認めら、しかも個々の細胞を表すドットプロットのドットはほぼ対角線上に分布していた。なお、活性化させていない休止状態のＴ細胞にはマウスＬＡＧ－３およびヒトＬＡＧ－３いずれの発現もほとんど認められなかった。これらの結果から、作製したヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにおいては、ＢＡＣトランスジェニックという手法を用いることで当初計画したように、ヒトＬＡＧ－３が内因性のマウスＬＡＧ－３の発現パターンにしたがって発現することが明らかになった。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡについては、作製したヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの末梢血ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＤＸ５＋）の約４７％に発現が認められ、既報（非特許文献１０）と同様の結果が確認された。
実施例１１．ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ　ｖｉｖｏ評価
１１－１）ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のＬＡＧ－３陽性細胞除去活性
　実施例１０のヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスを用いて、取得したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２がｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＬＡＧ－３陽性細胞を除去する活性を有するかを検討した。ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの腹腔内にヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（３０ｍｇ／ｋｇ）あるいは溶媒を投与した直後に、ポリクローナルなＴ細胞活性化作用を有するＣｏｎ　Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。その２日後に採血した血液からＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）により赤血球を溶血して白血球を得、フローサイトメトリーに使用した。白血球をＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ社製）と反応させた後、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体（ＢＤ社製）、ＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３抗体（ＢＤ社製）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて懸濁し、４℃で３０分間静置した。なお、ネガティブ集団の位置の同定に使用するために、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体およびＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体を含まないコントロールも作製し、同様に処理した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞を解析対象とした。ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるヒトＬＡＧ－３陽性率を算出したところ、図１４に示すとおり、無処置のヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの末梢血Ｔ細胞においてはヒトＬＡＧ－３陽性細胞がほとんど認められなかったのに対し、ポリクローナルなＴ細胞活性化作用を有するＣｏｎ　Ａ投与により、抗体非投与群では末梢血Ｔ細胞のうち平均２４％がヒトＬＡＧ－３陽性となった。これに対し、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２を投与したＣｏｎ　Ａ投与マウスでは、末梢血Ｔ細胞におけるヒトＬＡＧ－３陽性率が著明に低下していた。同様の傾向は、脾臓におけるＴ細胞、およびＣｏｎ　Ａを投与した翌日の末梢血Ｔ細胞でも認められており、またマウスＬＡＧ－３および他の活性化マーカーであるＣＤ６９の陽性率でみても同様の結果であった。これらの結果から、取得したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２がｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＬＡＧ－３陽性細胞を除去する活性を有することが明らかになった。
１１－２）Ｔ細胞依存性自己免疫疾患モデルに対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の活性
　ＬＡＧ－３陽性細胞をｉｎ　ｖｉｖｏにおいて除去する活性を有するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２が、自己免疫疾患の治療に有用であるかどうかを明らかにする目的で、代表的なＴ細胞依存性の自己免疫疾患（多発性硬化症）モデルであるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデル（非特許文献１１）に対する薬効を検討した。
　中枢神経のミエリンを構成するタンパク質の１つであるＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ　Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）由来のペプチド（アミノ酸３５－５５、ペプチド研究所）を４ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解したものを、８ｍｇ／ｍＬのＫｉｌｌｅｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７Ｒａ（ＢＤ社製）を添加したＦｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）と等量混合してエマルジョンにした。これをＤａｙ０に、ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの両わき腹に５０μＬずつ皮下注射し、さらに生理食塩水で希釈した百日咳毒素０．２μｇを静脈内投与することでＥＡＥを誘導した。その後、ＥＡＥの臨床スコアを以下のように経日的に観察した。すなわち、スコア０：無症状、スコア１：尾の脱力、スコア２：歩行異常・正向反射消失、スコア３：後肢麻痺、スコア４：前肢の部分麻痺、スコア５：死亡または安楽殺。ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２およびコントロール抗体は、Ｄａｙ０および７にそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。その結果、図１５に示すように、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２投与群ではコントロール抗体投与群に比べて、ＥＡＥの臨床スコアの平均値が観察期間中５０％以下に抑制されていた。さらに、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２投与群ではＥＡＥ進行に伴う体重減少も抑制されていた。これらの結果から、ＬＡＧ－３陽性細胞をｉｎ　ｖｉｖｏにおいて除去する活性を有するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、代表的なＴ細胞依存性の自己免疫疾患モデルであるＥＡＥを抑制することが明らかになり、ヒトの自己免疫疾患の治療薬となりうることが示された。
実施例１２．ヒト活性化Ｔ細胞におけるＬＡＧ－３とパーフォリン、ＣＤ２８、およびＣＤ５７の発現の関係
　ヒト末梢血からフィコール遠心分離にてＰＢＭＣを分離し、９６穴Ｕ底マイクロプレートに４×１０５細胞／ウェル添加した。ヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、４×１０５個／ウェル）を加えて４日間培養し、Ｔ細胞を活性化した。得られた細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）に懸濁した後、Ｈｕｍａｎ　ＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ社）と室温で１０分間反応させた。続いてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＦＡＣＳバッファーで希釈した蛍光標識抗体と４℃で３０分間反応させて細胞表面の染色を行った後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。蛍光標識抗体としては、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ３抗体、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ２８抗体、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ標識抗ヒトＣＤ５７抗体（いずれもＢＤ社）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、ＰＥ標識キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて標識した抗ヒトＬＡＧ－３抗体およびアイソタイプコントロール抗体を種々の組み合わせで使用した。一部のサンプルについてはさらに、ＢＤ　Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢＤ社）およびＡＰＣ標識抗ヒトパーフォリン抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、細胞内のパーフォリンの染色も行った。洗浄後の細胞は、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ社製ＣａｎｔｏＩＩあるいはＭｉｌｔｅｎｙｉ社製ＭＡＣＳＱｕａｎｔＸ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のみについてさらにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性のＣＤ８Ｔ細胞にゲートをかけて解析した。
　ＬＡＧ－３と細胞内のパーフォリンの発現の関係を解析した結果を図１０２に示す。右端の図において細胞集団がほぼ対角線上に分布していることから、ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞においては、ＬＡＧ－３と細胞内のパーフォリンの発現はほぼパラレルになっていることが明らかになった。なおこのとき、ＰＥ標識したＬＡＧ－３抗体のアイソタイプコントロール（中央の図）では非標識のサンプル（左端の図）とほとんど変わらない横軸方向の蛍光強度の分布を示していたことから、ヒトＬＡＧ－３の染色の特異性が確認された。
　図１０３は、ＬＡＧ－３とＣＤ２８の発現の関係を解析した結果を示す。右端の図において、ＣＤ２８陽性の細胞ではＬＡＧ－３陽性の細胞は５０％未満であったのに対し、ＣＤ２８陰性の細胞ではＣＤ２８陽性の細胞に比べて細胞集団が全体的にＬＡＧ－３陽性側にシフトしておりかつ割合としては２／３の細胞がＬＡＧ－３陽性となっていたことから、ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞においては、ＣＤ２８陽性細胞に比較するとＣＤ２８陰性細胞でよりＬＡＧ－３の発現が認められることが明らかになった。
　図１０４は、ＬＡＧ－３とＣＤ５７の発現の関係を解析した結果を示す。右端の図において、ＣＤ５７陰性の細胞のうち４２％の細胞がＬＡＧ－３陽性であったのに対し、ＣＤ５７陽性の細胞ではＣＤ５７陰性細胞に比べて細胞集団が全体的にＬＡＧ－３陽性側に大きくシフトしておりかつ割合としては７９％の細胞がＬＡＧ－３陽性となっていたことから、ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞においては、ＣＤ５７陰性細胞に比較するとＣＤ５７陽性細胞でよりＬＡＧ－３の発現が認められることが明らかになった。
実施例１３．ＬＡＧ－３抗体のパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞に対する作用
　実施例１２の実験系における、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、カルシニューリン阻害薬であるタクロリムス、コルチコステロイドであるデキサメタゾンの作用を検討した。ヒトＰＢＭＣを、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、コントロールヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｆｏｃｕｓ社、最終濃度１０　ｎＭ）、およびデキサメタゾン（ＥＮＺＯ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、最終濃度１　μＭ）と３７℃で３０分間プレインキュベーションした後、実施例１２のようにＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間培養し、得られた細胞をフローサイトメトリーに供した。なお、これらの抗体および化合物の濃度は、既報（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ＤＪ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年；第７３巻（３号）：３１６－３２１ページ：Ｂｒｕｎｅｔｔｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９８年；第２８５巻（２号）：９１５－９１９ペーシ゛）等に基づき、最大の薬効を示すと考えられる濃度に設定した。
　結果を図１０５に示す。図１０５Ａのように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２およびタクロリムスを添加した場合はコントロールと比較して、培養後のトータルのＴ細胞数はわずかに減少しており、デキサメタゾンを添加した場合はコントロールとほとんど変わらなかった。当アッセイは二人のドナー由来のＰＢＭＣで実施し、同様の傾向が見られた（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。
　これに対しパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞数については、図１０５Ｂに示すように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によってコントロールと比較して著明に減少していた。一方、タクロリムスを添加した場合はコントロールとほとんど差がなく、デキサメタゾンを添加した場合は、ＰＢＭＣ１ではコントロールよりも増加しており、ＰＢＭＣ２ではコントロールと同レベルであった。これらの結果から、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、Ｔ細胞全体への影響に比べてパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞を選択的にｄｅｐｌｅｔｉｏｎすること、およびカルシニューリン阻害薬であるタクロリムスならびにコルチコステロイドであるデキサメタゾンにはそのような作用が認められないことが明らかになった。なお、データは示さないが、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、グランザイム陽性ＣＤ８Ｔ細胞数も減少させた。
実施例１４．ＬＡＧ－３抗体のＣＤ２８陰性Ｔ細胞およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞に対する作用
　実施例１３のアッセイ系におけるＣＤ２８陰性Ｔ細胞およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞に対する、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、カルシニューリン阻害薬であるタクロリムス、コルチコステロイドであるデキサメタゾンの作用を検討した。ヒトＰＢＭＣを、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０、１、および０．１μｇ／ｍＬ）、コントロールヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｆｏｃｕｓ社、最終濃度１０　ｎＭ）、およびデキサメタゾン（ＥＮＺＯ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、最終濃度１　μＭ）と３７℃で３０分間プレインキュベーションした後、実施例１２のようにＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間培養し、得られた細胞をフローサイトメトリーに供した。なお、生細胞のうち、ＣＤ３陽性ＣＤ８陰性の画分をＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ３陽性ＣＤ８陽性の画分をＣＤ８Ｔ細胞とそれぞれして解析した。
　ＣＤ２８陰性Ｔ細胞に対する作用を解析した結果を図１０６に示す。ＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞については、図１０６Ｂのように、実施例１３のパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞の場合と同様に、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によって著明にその数が低下していた。この作用はｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の濃度依存的であり、二人のドナー由来のいずれのＰＢＭＣを用いた場合にも同様の結果であった。これに対し、タクロリムスおよびデキサメタゾンを添加した場合には、ＬＡＧ－３抗体で認められたような著明なＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞数の低下は認められなかった。また図１０６Ａのように、ＣＤ２８陰性ＣＤ４Ｔ細胞についても、ＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞ほど顕著ではないものの、ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によりその細胞数の低下が認められ、タクロリムスおよびデキサメタゾンはほとんど効果を示さないかむしろ増加させた。
　ＣＤ５７陽性Ｔ細胞に対する作用を解析した結果を図１０７に示す。ＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞については、図１０７Ｂのように、実施例１３のパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞および上記のＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞の場合と同様に、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によって著明にその数が低下していた。この作用はｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の濃度依存的であり、二人のドナー由来のいずれのＰＢＭＣを用いた場合にも同様の結果であった。これに対し、タクロリムスおよびデキサメタゾンを添加した場合には、ＬＡＧ－３抗体で認められたような著明なＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞数の低下は認められなかった。また図１０７Ａのように、ＣＤ５７陽性ＣＤ４Ｔ細胞についても、ＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞ほど顕著ではないものの、ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によりその細胞数の低下が認められ、タクロリムスおよびデキサメタゾンにはそのような効果はほとんど認められなかった。
　また、低フコース形態にはないヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、抗ヒトＬＡＧ－３マウス－ヒトキメラ抗体Ａ９Ｈ１２、および抗ヒトＬＡＧ－３ラット－ヒトキメラ化抗体ｃＬＡ２１２は、低フコース形態にあるｈＬＡ２１２＿Ｈ４　／Ｌ２と比較して弱いものの、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞数およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞数を低下させる傾向を示した（データ示さず）。
　これらの結果から、抗ＬＡＧ－３抗体は、細胞傷害性で免疫系疾患におけるステロイド抵抗性に関わるとされるＣＤ２８陰性Ｔ細胞およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞を枯渇させること、並びに、かかるＴ細胞枯渇活性は低フコース化により増強されることが明らかになり、免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の医療における有望な細胞傷害性Ｔ細胞枯渇薬となる可能性が示された。
　本発明の組成物は細胞傷害性Ｔ細胞枯渇に有用である。
　配列番号１：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図１６）
　配列番号２：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７）
　配列番号３：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図１８）
　配列番号４：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１９）
　配列番号５：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２０）
　配列番号６：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２１）
　配列番号７：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２２）
　配列番号８：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３）
　配列番号９：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２４）
　配列番号１０：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２５）
　配列番号１１：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２６）
　配列番号１２：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２７）
　配列番号１３：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２８）
　配列番号１４：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２９）
　配列番号１５：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３０）
　配列番号１６：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図３１）
　配列番号１７：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図３２）
　配列番号１８：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図３３）
　配列番号１９：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３４）
　配列番号２０：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図３５）
　配列番号２１：ヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３６）
　配列番号２２：ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３７）
　配列番号２３：ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３８）
　配列番号２４：ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列（図３９）
　配列番号２５：ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４０）
　配列番号２６：ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列（図４１）
　配列番号２７：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４２）
　配列番号２８：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列（図４３）
　配列番号２９：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４４）
　配列番号３０：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列（図４５）
　配列番号３１：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４６）
　配列番号３２：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列（図４７）
　配列番号３３：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４８）
　配列番号３４：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列（図４９）
　配列番号３５：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図５０）
　配列番号３６：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列（図５１）
　配列番号３７：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図５２）
　配列番号３８：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列（図５３）
　配列番号３９：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図５４）
　配列番号４０：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列（図５５）
　配列番号４１：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図５６）
　配列番号４２：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図５７）
　配列番号４３：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図５８）
　配列番号４４：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図５９）
　配列番号４５：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図６０）
　配列番号４６：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図６１）
　配列番号４７：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図６２）
　配列番号４８：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図６３）
　配列番号４９：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図６４）
　配列番号５０：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図６５）
　配列番号５１：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図６６）
　配列番号５２：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図６７）
　配列番号５３：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図６８）
　配列番号５４：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図６９）
　配列番号５５：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図７０）
　配列番号５６：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図７１）
　配列番号５７：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図７２）
　配列番号５８：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図７３）
　配列番号５９：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図７４）
　配列番号６０：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図７５）
　配列番号６１：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図７６）
　配列番号６２：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図７７）
　配列番号６３：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図７８）
　配列番号６４：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図７９）
　配列番号６５：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図８０）
　配列番号６６：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図８１）
　配列番号６７：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図８２）
　配列番号６８：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図８３）
　配列番号６９：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図８４）
　配列番号７０：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図８５）
　配列番号７１：プライマーＲＧ２ＡＲ３（図８６）
　配列番号７２：プライマーＲＫＲ５（図８７）
　配列番号７３：プライマー３．３－Ｆ１（図８８）
　配列番号７４：プライマー３．３－Ｒ１（図８９）
　配列番号７５：プライマー２１２Ｈ－Ｆ（図９０）
　配列番号７６：プライマー２１２Ｈ－Ｒ（図９１）
　配列番号７７：プライマー２１２Ｌ－Ｆ（図９２）
　配列番号７８：プライマー２１２Ｌ－Ｒ（図９３）
　配列番号７９：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ１（図９４）
　配列番号８０：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ２（図９５）
　配列番号８１：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ３（図９６）
　配列番号８２：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ４（図９７）
　配列番号８３：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ５（図９８）
　配列番号８４：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ６（図９９）
　配列番号８５：ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図１００）
　配列番号８６：ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列（図１０１）

Claims (57)

  1. 　下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物：
    （ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
    （ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
    （ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
  2. 　細胞傷害性Ｔ細胞が、パーフォリン陽性Ｔ細胞、グランザイムＢ陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞よりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
  3. 　細胞傷害性Ｔ細胞がＬＡＧ－３陽性である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片が、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合し、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の組成物：
    （ｉ）低フコース形態で、イン・ビボで実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制する；
    （ｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；及び
    （ｉｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する。
  5. 　免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防に使用される、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の組成物。
  6. 　免疫抑制剤がステロイドである、請求項５記載の組成物。
  7. 　免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、請求項５又は６記載の組成物。
  8. 　該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、請求項１乃至７のいずれか一つに記載の組成物。
  9. 　該抗体又はその結合断片が、配列番号５０又は図６５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１又は図６６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２又は図６７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７又は図６２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８又は図６３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９又は図６４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、請求項４記載の組成物。
  10. 　該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、請求項９記載の組成物。
  11. 　該抗体又はその結合断片が、配列番号２８又は図４３で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２又は図４７で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、請求項１０記載の組成物。
  12. 　該抗体又はその結合断片の、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸を含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸を含む、請求項１０又は１１記載の組成物。
  13. 　該抗体又はその結合断片の、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸を含む、請求項１０乃至１２のいずれか一つに記載の組成物。
  14. 　該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される、請求項１０乃至１３のいずれか一つに記載の組成物：
    ［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
    ［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片。
  15. 　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列と、それぞれ９５％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項１４記載の組成物。
  16. 　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域アミノ酸配列、および、該抗体又はその結合断片の有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第３の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第４の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域アミノ酸配列、を含む抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項１４記載の組成物。
  17. 　下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項１４記載の組成物：
    （ｉ）該抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
    （ｉｉ）該抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する。
  18. 　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、請求項１乃至１７のいずれか一つに記載の組成物。
  19. 　該抗体又はその結合断片が、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子若しくは該核酸分子を含むベクターを含む細胞、又は、該抗体又はその結合断片を生産する細胞を培養する工程を含んでなる、該抗体又はその結合断片の製造方法により得られる、請求項１乃至１８のいずれか一つに記載の組成物。
  20. 　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏しない、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の組成物。
  21. 　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合しない、請求項１乃至３及び２０のいずれか一つに記載の組成物。
  22. 　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、請求項２０又は２１に記載の組成物。
  23. 　細胞傷害性Ｔ細胞枯渇に使用される、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片：
    （ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
    （ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
    （ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
  24. 　細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のための、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片の使用：
    （ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
    （ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
    （ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
  25. 　下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を投与することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させる方法：
    （ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
    （ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
    （ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
  26. 　他の医薬と組み合わせて使用される、請求項１乃至２２のいずれか一つに記載の組成物。
  27. 　下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、　パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療用又は予防用医薬組成物：
    （ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
    （ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
    （ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
  28. 　パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性が、細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて判定されることを特徴とする、請求項２７記載の医薬組成物。
  29. 　該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来することを特徴とする、請求項２８記載の医薬組成物。
  30. 　細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、バセドウ病、強直性脊椎炎、扁平部炎、喘息、関節リウマチ、多発性筋炎・皮膚筋炎、封入体筋炎、急性冠症候群、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、２型糖尿病、宿主対移植片反応、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は、サルコイドーシスである、請求項２７乃至２９のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  31. 　細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患がＬＡＧ－３陽性である、請求項２７乃至３０のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  32. 　抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片が、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合し、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する、請求項２７乃至３１のいずれか一つに記載の医薬組成物：
    （ｉ）低フコース形態で、イン・ビボで実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制する；
    （ｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；及び
    （ｉｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する。
  33. 　細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が免疫抑制剤抵抗性である、請求項２７乃至３２のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  34. 　免疫抑制剤がステロイドである、請求項３３記載の医薬組成物。
  35. 　免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、請求項３３又は３４記載の医薬組成物。
  36. 　該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、請求項２７乃至３５のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  37. 　該抗体又はその結合断片が、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、請求項２７乃至３６のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  38. 　該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、請求項３７記載の医薬組成物。
  39. 　該抗体又はその結合断片が、配列番号２８で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、請求項３８記載の医薬組成物。
  40. 　該抗体又はその結合断片の、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸を含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸を含む、請求項３８又は３９記載の医薬組成物。
  41. 　該抗体又はその結合断片の、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸を含む、請求項３８乃至４０のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  42. 　該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される、請求項３８乃至４１のいずれか一つに記載の医薬組成物：
    ［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
    ［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
    ［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片。
  43. 　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列と、それぞれ９５％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項４２記載の医薬組成物。
  44. 　該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域アミノ酸配列、および、該抗体又はその結合断片の有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第３の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第４の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域アミノ酸配列、を含む抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項４２記載の医薬組成物。
  45. 　下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項４２記載の医薬組成物：
    （ｉ）該抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
    （ｉｉ）該抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する。
  46. 　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、請求項２７乃至４５のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  47. 　該抗体又はその結合断片が、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子若しくは該核酸分子を含むベクターを含む細胞、又は、該抗体又はその結合断片を生産する細胞を培養する工程を含んでなる、該抗体又はその結合断片の製造方法により得られる、請求項２７乃至４６のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  48. 　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏しない、請求項２７乃至３１のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  49. 　該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合しない、請求項２７乃至３１及び４８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  50. 　該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、請求項４８又は４９に記載の医薬組成物。
  51. 　他の医薬と組み合わせて使用される、請求項２７乃至５０のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  52. 　パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に請求項１乃至２２のいずれか一つに記載の組成物、又は請求項２７乃至５１のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患を治療又は予防する方法。
  53. 　細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、免疫抑制剤抵抗性である、請求項５２記載の方法。
  54. 　免疫抑制剤がステロイドである、請求項５３記載の方法。
  55. 　免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、請求項５３又は５４記載の方法。
  56. 　細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性か否かを判定する工程を含む、請求項５２乃至５５のいずれか一つに記載の方法。
  57. 　該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来する、請求項５６記載の方法。
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US16/651,531 US20200262917A1 (en) 2017-10-05 2018-10-04 Composition for cytotoxic t cell depletion
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JP2023191228A JP2024010208A (ja) 2017-10-05 2023-11-09 細胞傷害性ｔ細胞枯渇用組成物

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CA (1) CA3078436A1 (ja)
TW (1) TW201927336A (ja)
WO (1) WO2019070013A1 (ja)

Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2000061739A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules produisant des compositions d'anticorps
WO2004061104A2 (en) 2003-01-07 2004-07-22 Symphogen A/S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
US6972323B1 (en) 1997-04-01 2005-12-06 Sankyo Company, Limited Anti-Fas antibodies
WO2008132601A1 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Immutep Cytotoxic anti-lag-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US20110070238A1 (en) 2007-04-30 2011-03-24 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-lag-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
JP2012500006A (ja) * 2008-08-11 2012-01-05 メダレックス インコーポレーティッド リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）へ結合するヒト抗体およびその使用
WO2014140180A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-lag-3 binding proteins
JP2015527880A (ja) * 2012-07-02 2015-09-24 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）へ結合する抗体の最適化およびその使用
JP2017516489A (ja) * 2014-03-14 2017-06-22 ノバルティス アーゲー Ｌａｇ−３に対する抗体分子およびその使用
WO2018047894A1 (ja) * 2016-09-08 2018-03-15 第一三共株式会社 自己免疫疾患治療用抗体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101088178B1 (ko) 2009-12-18 2011-12-02 한국과학기술원 멀티 라디오 모바일 애드 혹 네트워크 환경에서의 라우팅 방법
US10633704B2 (en) * 2010-07-23 2020-04-28 Raymond M. Johnson Diagnostic and immunotherapy compositions and methods for disease states mediated by inhibitor-resistant CD8 T-cells
KR102081232B1 (ko) 2013-05-28 2020-02-25 에스케이플래닛 주식회사 태그 정보를 이용한 컨텐츠 생성 지원을 위한 장치
TWI773646B (zh) * 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法

Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5455030A (en) 1986-09-02 1995-10-03 Enzon Labs, Inc. Immunotheraphy using single chain polypeptide binding molecules
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US6972323B1 (en) 1997-04-01 2005-12-06 Sankyo Company, Limited Anti-Fas antibodies
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2000061739A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules produisant des compositions d'anticorps
WO2004061104A2 (en) 2003-01-07 2004-07-22 Symphogen A/S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
WO2008132601A1 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Immutep Cytotoxic anti-lag-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US20110070238A1 (en) 2007-04-30 2011-03-24 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-lag-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
JP2012500006A (ja) * 2008-08-11 2012-01-05 メダレックス インコーポレーティッド リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）へ結合するヒト抗体およびその使用
JP2015527880A (ja) * 2012-07-02 2015-09-24 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）へ結合する抗体の最適化およびその使用
WO2014140180A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-lag-3 binding proteins
JP2016516681A (ja) * 2013-03-15 2016-06-09 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗ｌａｇ−３結合タンパク質
JP2017516489A (ja) * 2014-03-14 2017-06-22 ノバルティス アーゲー Ｌａｇ−３に対する抗体分子およびその使用
WO2018047894A1 (ja) * 2016-09-08 2018-03-15 第一三共株式会社 自己免疫疾患治療用抗体

Non-Patent Citations (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual", 1996, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ABE KHAZAMA MKATOH HYAMAMURA KSUZUKI M: "Establishment of an efficient BAC transgenesis protocol and its application to functional characterization of the mouse Brachyury locus", EXP ANIM., vol. 53, no. 4, 2004, pages 311 - 20
ALTSCHUL, STEPHEN F.THOMAS L. MADDENALEJANDRO A. SCHAFFERJINGHUI ZHANGZHENG ZHANGWEBB MILLERDAVID J. LIPMAN: "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402, XP002905950, DOI: 10.1093/nar/25.17.3389
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 360, 2007, pages 75 - 83
ANNU. REV. IMMUNOL, vol. 12, 1994, pages 433 - 455
BARNES, P.: "Corticosteroid resistance in patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease", J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL., vol. 131, no. 3, 2013, pages 636 - 645
BROUX, B ET AL.: "Pathogenic features of CD4+CD28- T cells in immune disorders", TRENDS. MOL. MED., vol. 18, no. 8, 2012, pages 446 - 453
BRUNETTI, M. ET AL., PHARMACOL. EXP. THER., vol. 285, no. 2, 1998, pages 915 - 919
CARMEN, S., BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS, vol. 1, no. 2, 2002, pages 189 - 203
DAI ET AL., CLIN RES HEPATOL GASTROENTEROL., vol. 41, no. 6, 2017, pages 693 - 702
FASTH, AE. ET AL., J. IMMUNOL., vol. 183, no. 183, 2009, pages 4792 - 4799
GILANI ET AL., PLOS ONE, vol. 5, no. 1, 2010, pages e8959
GIUBILATO ET AL., EUR HEART J., vol. 32, no. 10, 2011, pages 1214 - 26
GLUZMAN, Y., CELL, vol. 23, 1981, pages 175 - 182
HAMERS-CASTERMAN C. ET AL., NATURE, vol. 363, no. 6428, 1993, pages 446 - 8
HAMZAOUI, A. ET AL., MEDIATORS. INFLAMM., vol. 3, 2005, pages 160 - 166
HAUDEBOURG, T. ET AL.: "Antibody-mediated depletion of lymphocyte-activation gene-3 (LAG-3 (+))-activated T lymphocytes prevents delayed-type hypersensitivity in non-human primates", CLIN. EXP. IMMUNOL., vol. 164, no. 2, May 2011 (2011-05-01), pages 265 - 74, XP055055512, DOI: 10.1111/j.1365-2249.2011.04329.x
HAUDEBOURG, T. ET AL.: "Depletion of LAG-3 positive cells in cardiac allograft reveals their role in rejection and tolerance.", TRANSPLANTATION, vol. 84, no. 11, December 2007 (2007-12-01), pages 1500 - 06, XP002495209
HENDERSON, DJ ET AL., IMMUNOL., vol. 73, no. 3, 1991, pages 316 - 321
HODGE, G.HODGE, S.: "Steroid Resistant CD8+CD28null NKT-Like Pro-inflammatory Cytotoxic Cells in Chronic Obstructive Pulmonary Disease", FRONT. IMMUNOL., vol. 7, 2016, pages 617
HUARD, B. ET AL.: "Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein", PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 94, no. 11, 27 May 1997 (1997-05-27), pages 5744 - 49, XP002037067, DOI: 10.1073/pnas.94.11.5744
HUARD, B. ET AL.: "T cell major histocompatibility complex class II molecules down-regulate CD4+ T cell clone responses following LAG-3 binding", EUR. J. IMMUNOL., vol. 26, no. 5, May 1996 (1996-05-01), pages 1180 - 06, XP000672293, DOI: 10.1002/eji.1830260533
HUSTON, J.S. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 85, 1988, pages 5879 - 5883
JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 705, 1995, pages 129 - 134
JUNTTILA, T.T. ET AL., CANCER RES., vol. 70, no. 11, 2010, pages 4481 - 9
KABAT, E. A.MAYER, M. M.: "Experimental Immunochemistry", 1964, CHARLES C THOMAS PUBLISHER
KELLER, CW. ET AL., ANN. CLIN. TRANSL. NEUROL., vol. 4, no. 6, 2017, pages 422 - 445
KOHLER ET AL., EUR. J. IMMNOL., vol. 6, 1977, pages 511
KOHLER ET AL.: "Nature", vol. 256, 1975, pages: 495
KOHLERMILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 497
KOOK ET AL., EXP HEMATOL., vol. 29, no. 11, 2001, pages 1270 - 7
KUROIWA, Y., NUC. ACIDS RES., vol. 26, 1998, pages 3447 - 3448
LAMPRECHT ET AL., THORAX, vol. 56, no. 10, 2001, pages 751 - 7
LEE, H-S ET AL., MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 36, 1999, pages 61 - 71
LI ET AL., J INVEST DERMATOL., vol. 137, no. 5, 2017, pages 1042 - 1050
LI, M. ET AL.: "Reconstitution of human Fc gamma RIII cell type specificity in transgenic mice", J. EXP. MED., vol. 183, no. 3, 1 May 1996 (1996-05-01), pages 1259 - 63, XP055552594, DOI: 10.1084/jem.183.3.1259
LIMA ET AL., BR J DERMATOL., vol. 173, no. 4, 2015, pages 998 - 1005
MACON-LEMAITRE, LTRIEBEL, F: "The negative regulatory function of the lymphocyte-activation gene-3 co-receptor (CD223) on human T cells", IMMUNOLOGY, vol. 115, no. 2, June 2005 (2005-06-01), pages 170 - 08, XP002453818, DOI: 10.1111/j.1365-2567.2005.02145.x
MALY KSCHIRMER M: "The story of CD4+ CD28- T cells revisited: solved or still ongoing?", J. IMMUNOL. RES., vol. 2015, 2015
MATSUJAKI, JUNKO: "Basic Biology and Clinical Application of LAG-3", SAISHIN IGAKU [=LATEST MEDICINE], vol. 70, no. 3, 28 February 2015 (2015-02-28), pages 36 (360) - 41 (365), XP009513842, ISSN: 0370-8241 *
MENDES ET AL., CLINICS (SAO PAULO, vol. 63, no. 5, 2008, pages 667 - 76
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 203, 1991, pages 121 - 153
MILLER, STEPHEN D. ET AL.: "Current Protocols in Immunology", 2010, WILEY, article "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Mouse", pages: 15.1.1 - 15.1.20
MILLSTEIN ET AL., NATURE, vol. 305, 1983, pages 537 - 539
MILSTEIN ET AL., NATURE, vol. 266, 1977, pages 495
MUYLDERMANS S. ET AL., PROTEIN ENG., vol. 113, no. 9, 1994, pages 1129 - 315
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 23, no. 9, 2005, pages 1137 - 1146
NATURE, vol. 321, 1986, pages 522 - 525
NGUYEN, L.T.OHASHI, P.S.: "Clinical blockade of PD1 and LAG3--potential mechanisms of action", NAT. REV. IMMUNOL., vol. 15, no. 1, January 2015 (2015-01-01), pages 45 - 56, XP055216541, DOI: 10.1038/nri3790
NUC.ACID RES., vol. 35, 2007, pages D301 - D303
OKAZAKI, T. ET AL.: "PD-1 and LAG-3 inhibitory co-receptors act synergistically to prevent autoimmunity in mice", J. EXP. MED., vol. 208, no. 2, 7 February 2011 (2011-02-07), pages 395 - 407, XP055676267, DOI: 10.1084/jem.20100466
PANDYA ET AL., ARTHRITIS RHEUM., vol. 62, no. 11, 2010, pages 3457 - 66
PEDROZA-SERES, M. ET AL., BR. J. OPHTHALMOL., vol. 91, no. 10, 2007, pages 1393 - 1398
PEETERS ET AL., FRONT IMMUNOL., vol. 8, 2017, pages 1160
QUEEN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 86, 1989, pages 10029 - 10033
ROBERTS ET AL., SARCOIDOSIS VASE DIFFUSE LUNG DIS., vol. 22, no. 1, 2005, pages 13 - 9
SCARSI ET AL., J RHEUMATOL., vol. 38, no. 10, 2011, pages 2105 - 11
SCARSI, M. ET AL., J. RHEUMATOL., vol. 37, no. 5, 2010, pages 911 - 916
SCHIRMER, M. ET AL., ARTHRITIS. RES., vol. 4, no. 1, 2002, pages 71 - 76
SCHIRRMANN, T. ET AL., MABS, vol. 2, no. 1, 2010, pages 73 - 76
See also references of EP3693012A4
SIRIWARDENA, D., OPTHALMOLOGY, vol. 109, no. 3, 2002, pages 427 - 431
SMOLENSKA ET AL., CELL IMMUNOL., vol. 278, no. 1-2, 2012, pages 143 - 51
STRIOGA, M. ET AL.: "CD8+ CD28-and CD8+ CD57+ T cells and their role in health and disease", IMMUNOLOGY, vol. 134, no. 1, 2011, pages 17 - 32
SUN, Z. ET AL., J. CLIN. IMMUNOL., vol. 28, no. 5, 2008, pages 464 - 472
TOMIZUKA, K. ET AL., NATURE GENETICS, vol. 16, 1997, pages 133 - 143
TOMIZUKA, K., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 722 - 727
TRIEBEL, F.: "LAG-3: a regulator of T-cell and DC responses and its use in therapeutic vaccination.", TRENDS IMMUNOL., vol. 24, no. 12, December 2003 (2003-12-01), pages 619 - 22, XP004476041, DOI: 10.1016/j.it.2003.10.001
TURNIS, M.E. ET AL.: "Inhibitory receptors as targets for cancer immunotherapy", EUR. J. IMMUNOL., vol. 45, no. 7, July 2015 (2015-07-01), pages 1892 - 905, XP055577562, DOI: 10.1002/eji.201344413
URLAUB, G.CHASIN, L.A., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 77, 1980, pages 4126 - 4220
WANG ET AL., IMMUNOL INVEST. 2009, vol. 38, no. 5, 2009, pages 434 - 46
WANG, EC ET AL., ARTHRITIS. RHEUM., vol. 40, no. 2, 1997, pages 237 - 248
WEIR, D. M.: "Handbook of Experimental Immunology", vol. I. II. III., 1987, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS
WORMSTONE, I. M., INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 43, no. 7, 2002, pages 2301 - 2308
YOSHIDA, H.: "Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects", vol. 10, 1999, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, pages: 69 - 73
ZABINSKA ET AL., J IMMUNOL RES., 2016, pages 1058165
ZHANG Y ET AL.: "A new logic for DNA engineering using recombination in E. Coli.", NATURE, vol. 20, 1998, pages 123 - 128, XP002225129, DOI: 10.1038/2417

Also Published As

Publication number Publication date
EP3693012A4 (en) 2021-07-21
JP7384668B2 (ja) 2023-11-21
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