RU2781148C2

RU2781148C2 - Антитело для лечения аутоиммунных заболеваний

Info

Publication number: RU2781148C2
Application number: RU2019110133A
Authority: RU
Inventors: Рюта МУКАСА; Кенсуке НАКАМУРА; Сумие МУРАМАЦУ; Наоюки МАКИТА
Original assignee: Дайити Санкио Компани, Лимитед
Priority date: 2016-09-08
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2022-10-06

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, которые связываются с доменом 3 человеческого LAG-3, которые обладают: in vitro активностью ADCC, связываются с активированными Т-клетками человека, где человеческий LAG-3 связывается с молекулами главного комплекса гистосовместимости человека класса II в присутствии антитела или его связывающего фрагмента, при этом присутствие антитела или его связывающего фрагмента позволяет человеческому LAG-3 осуществлять функцию подавления Т-клеток человека. Также раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии, клетка для получения антитела или его связывающего фрагмента, способ получения антитела или его связывающего фрагмента, композиции для лечения и профилактики заболевания, связанного с LAG-3-положительными клетками, способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания у пациента и способ лечения или профилактики отторжения трансплантатов у пациента. Изобретение позволяет получить новое моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, которые обладают высокой аффиностью к домену 3 человеческого LAG-3. 12 н. и 29 з.п. ф-лы, 101 ил., 11 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителу, его связывающему фрагменту, молекуле, содержащей антитело или его связывающий фрагмент, полинуклеотиду, вектору, клетке, способу получения антитела или его связывающего фрагмента, антителу или связывающему фрагменту, полученным способом получения, к композиции, содержащей антитело или его связывающий фрагмент, к фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его связывающий фрагмент, фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболеваний, связанных с LAG-3-положительными клетками, таких как аутоиммунные заболевания, к применению антитела или его связывающего фрагмента для лечения или профилактики таких заболеваний и к способу лечения таких заболеваний, причем способ включает стадию введения антитела или его связывающего фрагмента.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Т-лимфоциты (Т-клетки) представляют собой клетки, которые играют центральную роль в иммунном ответе, и поэтому Т-клетки, обладающие различными антигенными специфичностями, которые, как считается, насчитывают от 10 миллионов до 10 миллиардов клонов, присутствуют in vivo, чтобы иметь дело с разнообразными антигенами. Когда антиген проникает в организм, то из таких огромных Т-клеточных репертуаров пролиферирует и активируется только очень ограниченное число клонов, специфичных для антигена, чтобы функционировать для защиты организма посредством продуцирования цитокинов и цитотоксической активности и тому подобное. Считается, что при аутоиммунных заболеваниях различные патологические состояния вызваны аномальными иммунными реакциями на некоторые аутоантигены. Даже в таких ситуациях большинство других клонов, которые не обладают такой антигенной специфичностью, не пролиферирует и не активируется, а вместо этого остается в состоянии покоя. Следовательно, селективное удаление только активированных Т-клеток может специфически подавлять иммунитет, не затрагивая большинство Т-клеток, обладающих другими антигенными специфичностями, и, таким образом, может представлять собой полезный метод лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний, отторжение трансплантатов, аллергических заболеваний и тому подобное. Между тем, в ситуации, когда Т-клетки, которые участвуют в отрицательной регуляции иммунной системы, такие как регуляторные Т-клетки, в основном активируются, удаление таких клеток может представлять собой полезный метод лечения или профилактики злокачественных опухолей, хронических инфекций и тому подобное.

LAG-3 (CD223) представляет собой трансмембранную молекулу, пронизывающую мембрану дин раз, которая принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и, как известно, избирательно экспрессируется в активированных Т-клетках (непатентная литература 1). Сообщается, что, когда кроличью антисыворотку, обладающую комплемент-зависимой цитотоксической (CDC) активностью в отношении молекулы крысиного LAG-3, вводят крысиной модели аллогенного трансплантата сердца, то количество LAG-3-положительных клеток в трансплантате уменьшается, так что период отторжения трансплантата слегка увеличивается (непатентная литература 2). Также сообщается, что химерное антитело A9H12 против человеческого LAG-3, обладающее перекрестной реактивностью с бабуинами и проявляющее антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксическую (ADCC) активность, подавляет реакцию гиперчувствительности замедленного типа у бабуинов, хотя его дозозависимый эффект неясен (Непатентная литература 3), и также были получены их гуманизированные антитела (Патентная литература 2).

Известно, что LAG-3 связывается с молекулами главного комплекса гистосовместимости (или главного комплекса генов гистосовместимости) (МНС) класса II, тем самым передавая некоторые ингибирующие сигналы Т-клеткам для отрицательной регуляции функции Т-клеток (Непатентная литература 1). Для связывания LAG-3 с молекулами MHC класса II N-концевые домены 1 и 2 из четырех внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов LAG-3 считаются важными (Непатентная литература 4), и также сообщается, что такое подавление функции Т-клеток через LAG-3 одновременно демонстрируется с другими сигналами, которые подавляют функцию Т-клеток через молекулу PD-1 и тому подобное. (Непатентная литература 5). Фактически, в последние годы активно разрабатываются новые способы противоопухолевой терапии для активации функции иммунных клеток путем ингибирования функции LAG-3 по подавлению Т-клеток для воздействия на опухолевые клетки (Непатентная литература 6 и 7). Следовательно, в случае применения антитела LAG-3, которое истощает LAG-3-положительные клетки за счет активности ADCC и тому подобное, к аутоиммунным заболеваниям, антитело, не обладающее активностью ингибирования функции подавления Т-клеток, присущей LAG-3, считается более желательным, поскольку, таким образом, нет риска того, что произойдет ухудшение аутоиммунных заболеваний из-за аномальной активации иммунной системы. Как в кроличьей антисыворотке против крысиного LAG-3, обладающей активностью CDC, так и в отношении химерного антитела A9H12 против человеческого LAG-3, проявляющего активность ADCC (IMP731: Патентная литература 1 и 2), описанного выше, LAG-3-положительные клетки истощаются не полностью (Непатентная литература 2 и 3), и, таким образом, предполагается возможность побочных реакций из-за аномальной реакции оставшихся Т-клеток, которые не были истощены, и негативного влияния на подавление аутоиммунных заболеваний.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Патентная литература

Патентная литература 1: США 2011/0070238 А1

Патентная литература 2: WO 2014/140180

Непатентная литература

Непатентная литература 1: Triebel, F., LAG-3: a regulator of T-cell and DC responses and its use in therapeutic vaccination., Trends Immunol., Dec. 2003; Vol. 24 (No. 12): p. 619-22

Непатентная литература 2: Haudebourg, T. et al., Depletion of LAG-3 positive cells in cardiac allograft reveals their role in rejection and tolerance., Transplantation, Dec. 2007; Vol. 84 (No. 11): p. 1500-06

Непатентная литература 3: Poirier, N. et al., Antibody-mediated depletion of lymphocyte-activation gene-3 (LAG-3 (+))-activated T lymphocytes prevents delayed-type hypersensitivity in non-human primates, Clin. Exp. Immunol., May 2011; Vol. 164 (No. 2): p. 265-74

Непатентная литература 4: Huard, B. et al., Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., May 27, 1997; Vol. 94 (No. 11): p. 5744-49

Непатентная литература 5: Okazaki, T. et al., PD-1 and LAG-3 inhibitory co-receptors act synergistically to prevent autoimmunity in mice, J. Exp. Med., Feb. 7, 2011; Vol. 208 (No. 2): p. 395-407

Непатентная литература 6: Nguyen, L.T. and Ohashi, P.S., Clinical blockade of PD1 and LAG3--potential mechanisms of action, Nat. Rev. Immunol., Jan. 2015; Vol. 15 (No. 1): p. 45-56

Непатентная литература 7: Turnis, M.E. et al., Inhibitory receptors as targets for cancer immunotherapy, Eur. J. Immunol. Jul. 2015; Vol. 45 (No. 7): p. 1892-905

Непатентная литература 8: Huard, B.et al., T cell major histocompatibility complex class II molecules down-regulate CD4+ T cell clone responses following LAG-3 binding, Eur. J. Immunol., May 1996; Vol. 26 (No. 5): p. 1180-06

Непатентная литература 9: Macon-Lemaitre, L and Triebel, F, The negative regulatory function of the lymphocyte-activation gene-3 co-receptor (CD223) on human T cells, Immunology, Jun. 2005; Vol. 115 (No. 2): p. 170-08

Непатентная литература 10: Li, M. et al., Reconstitution of human Fc gamma RIII cell type specificity in transgenic mice, J. Exp. Med., May 1, 1996; Vol. 183 (No. 3): p. 1259-63

Непатентная литература 11: Miller, Stephen D. et al., Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Mouse, Current Protocols in Immunology, UNIT 15.1, Wiley, 2010: p. 15.1.1-15.1.20

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

Настоящее изобретение предназначено для создания нового антитела против LAG-3 и тому подобное, где улучшены различные свойства или устранены или уменьшены риски по сравнению с известными антителами против LAG-3.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

Настоящее изобретение относится к:

(1) моноклональному антителу или его связывающему фрагменту, которые связываются с доменом 3 человеческого LAG-3 и обладают одним или более свойствами, описанными в (ii)-(v), и свойствами, описанными в (i) и (vi) ниже:

(i) обладают активностью ADCC in vitro;

(ii) уменьшают количество LAG-3-положительных клеток in vivo в форме с низким содержанием фукозы;

(iii) подавляют экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит in vivo в форме с низким содержанием фукозы;

(iv) связываются с активированными Т-клетками человека;

(v) человеческий LAG-3 связывается с молекулами главного комплекса комплекса гистосовместимости человека класса II в присутствии антитела или его связывающего фрагмента; и

(vi) присутствие антитела или его связывающего фрагмента, позволяет человеческому LAG-3 осуществлять функцию подавления Т-клеток человека;

(2) антитело или его связывающий фрагмент по (1), обладающие свойствами, описанными в (ii) и/или (iii),

(3) антитело или его связывающий фрагмент по (1) или (2), обладающие всеми свойствами, описанными в (ii)-(v);

(4) антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(3), представляющие собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;

(5) антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(4), содержащие легкую цепь, содержащую CDRL1c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50 или на Фигуре 65, CDRL2, имеющую аминокислоту последовательность, представленная SEQ ID NO:51 или на Фигуре 66, и CDRL3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52 или на Фигуре 67, и тяжелую цепь, содержащую CDRH1c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:47 или на Фигуре 62, CDRH2c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48 или на Фигуре 63, и CDRH3c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 или на Фигуре 64;

(6) антитело или его связывающий фрагмент по (4) или (5), являющиеся гуманизированным антителом;

(7) антитело или его связывающий фрагмент по (6), содержащие тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28 или на Фигуре 43, где аминокислота, соответствующая положению 68, является либо Gly, либо замещена на Ala, а аминокислота, соответствующая положению 103, является либо Asn, либо замещена на Asp, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47, где аминокислота, соответствующая положению 21, является либо Asp, либо замещена на Asn, аминокислота, соответствующая положению 31, является либо Leu, либо замещена на Met, аминокислота, соответствующая положению 33, является либо Ala, либо замещена на Ile, аминокислота, соответствующая положению 41, является либо Ile, либо замещена на Met, аминокислота, соответствующая положению 58, является либо Gln, либо замещена на Lys, аминокислота, соответствующая положению 63, является либо Ala, либо замещена на Ser, аминокислота, соответствующая положению 80, является либо Ser, либо замещена на Asp, аминокислота, соответствующая положению 85, является либо Ser, либо замещена на Gly, аминокислота, соответствующая положению 87, является либо Ser, либо замещена на Tyr, и аминокислота, соответствующая положению 98, является либо Leu, либо замещена на Val, аминокислота, соответствующая положению 103, является либо Phe, либо замещена на Ala, аминокислота, соответствующая положению 105, является либо Thr, либо замещена на Phe, аминокислота, соответствующая положению 124, является либо Val, либо замещена на Leu, и аминокислота, соответствующая положению 126, является либо Ile, либо замещена на Leu.;

(8) антитело или его связывающий фрагмент по (6) или (7), содержащие

аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислоты 21-129 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 и 40, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислоты 20-140 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:28 и 30;

(9) Антитело или его связывающий фрагмент по любому из (6)-(8), содержащие

аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую аминокислоты 21-234 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 и 40, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую аминокислоты 20-470 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:28 и 30;

(10) антитело или его связывающий фрагмент по любому из (6)-(9), выбранные из группы, состоящей из [i]-[x] ниже:

[i] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:34 (Фигура 49);

[ii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:32 (Фигура 47);

[iii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:36 (Фигура 51);

[iv] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:34 (Фигура 49);

[v] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:36 (Фигура 51);

[vi] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:38 (Фигура 53);

[vii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:40 (Фигура 55);

[viii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:32 (Фигура 47);

[ix] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:38 (Фигура 53); и

[x] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45), и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот положений 21-234 SEQ ID NO:40 (Фигура 55);

(11) антитело или его связывающий фрагмент по (1), содержащие

вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, имеющие идентичность 95% или выше, соответственно, с аминокислотными последовательностями вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи антитела или его связывающего фрагмента по (10);

(12) антитело или его связывающий фрагмент по (1), содержащие

аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью второй молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с первой молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или его связывающего фрагмента по п.10, или нуклеотидную последовательность, комплементарную ей, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью четвертой молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с третьей молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его связывающего фрагмента по (10), или нуклеотидную последовательность, комплементарную ей;

(13) антитело или его связывающий фрагмент по (1), обладающие свойством, описанным в (i) или (ii) ниже:

(i) связывание с сайтом в домене 3 человеческого LAG-3, распознаваемом антителом или его связывающим фрагментом по (10); или

(ii) конкуренция с антителом или его связывающим фрагментом по (10) за связывание с доменом 3 человеческого LAG-3;

(14) антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(13), представленные в форме с низким содержанием фукозы;

(15) молекула, содержащая антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(14);

(16) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность антитела или его связывающего фрагмента по любому из (1)-(14);

(17) вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по (16);

(18) клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по (16) или вектор по (17);

(19) клетка, продуцирующая антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(14);

(20) способ получения антитела или его связывающего фрагмента по любому из (1)-(14), включающий стадию культивирования клетки по (18) или (19);

(21) антитело или его связывающий фрагмент, полученные способом по (20);

(22) композиция, содержащая антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(14) и (21) или молекулу по (15);

(23) фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его связывающий фрагмент по любому из (1)-(14) и (21) или молекулу по (15);

(24) фармацевтическая композиция по (23) для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания;

(25) фармацевтическая композиция по (24), отличающаяся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания соединительной ткани/опорно-двигательного аппарата, аутоиммунного заболевания системы крови, аутоиммунных заболеваний органов пищеварения, аутоиммунного заболевания нервной системы, аутоиммунного заболевания зрительной системы, аутоиммунного заболевания сосудистой системы, аутоиммунного заболевания эпидермальной системы, аутоиммунного заболевания дыхательной системы, аутоиммунного заболевания эндокринной системы, аутоиммунного гепатита, и нефрита, вызванного иммунным расстройством;

(26) фармацевтическая композиция по (25), отличающаяся тем, что аутоиммунное заболевание соединительной ткани/костно-мышечной системы представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, системной красной волчанки, склеродермии, полимиозита, дерматомиозита, миозита с включенными тельцами и идиопатических воспалительных миопатий, таких как иммуноопосредованная некротическая миопатия; аутоиммунное заболевание системы крови представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из апластической анемии и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры; аутоиммунное заболевание пищеварительной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из болезни Крона и язвенного колита; аутоиммунное заболевание нервной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из рассеянного склероза и миастении гравис; аутоиммунное заболевание зрительной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из увеита, кератита и синдрома Шегрена; аутоиммунное заболевание сосудистой системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из болезни Бехчета и гранулематоза Вегенера; аутоиммунное заболевание системы эпидермиса представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из псориаза, пузырчатки, синдрома Стивенса-Джонсона и витилиго; аутоиммунное заболевание дыхательной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из хронической обструктивной болезни легких и интерстициальной пневмонии; аутоиммунное заболевание эндокринной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из диабета 1 типа, аутоиммунного тиреоидита, болезни Грейвса и тиреоидита Хашимото;

(27) фармацевтическая композиция по (23), предназначенная для лечения или профилактики отторжения трансплантатов;

(28) фармацевтическая композиция по (27), отличающаяся тем, что отторжение трансплантатов представляет собой отторжение и реакцию хозяина против трансплантата при трансплантации органа, выбранного из группы, состоящей из сердца, почки, печени, костного мозга и кожи или их ткани, и/или заболевание трансплантат против хозяина, вызванное трансплантацией гемопоэтических клеток, выбранной из группы, состоящей из: трансплантации костного мозга; трансплантации периферической крови; и трансплантации пуповинной крови;

(29) фармацевтическая композиция по любому из (24)-(28), объединенная с одним или двумя или более из следующих, выбранных из группы, состоящей из антифолатов, ингибиторов кальциневрина, кортикостероидов, антитимоцитарных глобулинов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот, биопрепаратов, нацеленных на антигены клеточной поверхности, биопрепаратов, нацеленных на цитокины или цитокиновые рецепторы, внутривенного иммуноглобулина и плазмафереза;

(30) фармацевтическая композиция по (23), предназначенная для лечения или профилактики аллергических заболеваний, злокачественных опухолей и/или хронических инфекций.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитело, его связывающий фрагмент, содержащая их молекула, содержащая их фармацевтическая композиция и тому подобное, которые обеспечиваются настоящим изобретением, имеют такие особенности, как обеспечение возможности человеческому LAG-3 связываться с молекулами главного комплекса гистосовместимости человека класса II и обеспечение возможности человеческому LAG-3 осуществлять функцию подавления Т-клеток человека даже в их присутствии, при этом они обладают активностью ADCC, активностью по уменьшению количества LAG-3-положительных клеток, активностью по ингибированию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, активностью связывания активированных Т-клеток человека и тому подобное и, таким образом, может использоваться для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с LAG-3-положительными клетками, таких как аутоиммунные заболевания, предпочтительно, когда антитело находится в форме с низким содержанием фукозы.

Краткое описание чертежей

[Фигура 1] Фигура 1 представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты тестирования с помощью проточной цитометрии активности связывания крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) с бластами PHA человека, экспрессирующими LAG-3. Вертикальная ось представляет среднюю интенсивность флуоресценции, измеренную с помощью проточной цитометрии.

[Фигура 2] Фигура 2 представляет собой диаграмму, демонстрирующую активность ADCC крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264). Клетки 293T-lacZ, экспрессирующие LAG-3 человека, использовали в качестве клеток-мишеней, а PBMC человека использовали в качестве эффекторных клеток.

[Фигура 3] Фигура 3А представляет собой диаграмму, демонстрирующую ингибирующую активность крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) в тесте на связывание LAG-3/MHC класса II. Крысиный IgG2b использовали в качестве отрицательного контроля, а крысиное антитело против LAG-3, которое было разработано отдельно и распознает домен 1 LAG-3, использовали в качестве положительного контроля, соответственно. Каждое антитело оценивали при 10 мкг/мл.

Фигура 3В представляет собой диаграмму, демонстрирующую, что человеческое химерное антитело против LAG-3, IMP731, которое является известным антителом, проявляет ингибирующую активность в тесте на связывание LAG-3/МНС класса II. 17B4, которое является коммерчески доступным мышиным антителом против человеческого LAG-3, также проявляло ингибирующую активность.

[Фигура 4] Фигура 4 представляет собой диаграмму, демонсрирующую ингибирующую активность крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) в тесте адгезии клеток 293T-hLAG-3/Raji. Крысиный IgG2b использовали в качестве отрицательного контроля, а крысиное антитело против LAG-3 (клон 6D7), которое было разработано в Примере 2)-6, и которое распознает домен 1 LAG-3, использовали в качестве положительного контроля, соответственно. Каждое антитело оценивали при 10 мкг/мл.

[Фигура 5] Фигура 5А представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты тестирования человеческого LAG-3-связывающего эпитопа крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212 и rLA225) с помощью проточной цитометрии. Вертикальная ось представляет среднюю интенсивность флуоресценции, измеренную с помощью проточной цитометрии. Связывание анти-FLAG антитела, используемого в качестве положительного контроля, также представлено. Каждое антитело оценивали при 10 мкг/мл.

Фигура 5В представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты тестирования человеческого LAG-3-связывающего эпитопа химерного человеческого антитела IMP731 против LAG-3, которое является обычным антителом в Списке цитирования, методом проточной цитометрии. Вертикальная ось представляет среднюю интенсивность флуоресценции, измеренную с помощью проточной цитометрии. Антисыворотку, полученную от крысы, иммунизированной в Примере 1)-1, использовали при 500-кратном разведении в качестве антисыворотки. Каждое из других антител оценивали при 10 мкг/мл. 6D7 представляет собой крысиное антитело против LAG-3, которое было разработано в Примере 2)-6 и распознает домен 1 LAG-3.

[Фигура 6] Фигура 6 представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты тестирования активности связывания химерного человеческого антитела cLA212 против LAG-3 с клетками 293T-lacZ, экспрессирующими человеческий LAG-3, с помощью проточной цитометрии. Вертикальная ось представляет среднюю интенсивность флуоресценции, измеренную с помощью проточной цитометрии.

[Фигура 7] Фигура 7 представляет собой таблицу, демонстрирующую способность связывания гуманизированных антител против LAG-3 в виде констант диссоциации.

[Фигура 8] Фигура 8 представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты тестирования активности связывания 10 типов гуманизированных антител против LAG-3 и человеческих химерных антител против LAG-3 с клетками cLA212-293T-lacZ, экспрессирующими человеческий LAG-3, с помощью проточной цитометрии. Вертикальная ось представляет среднюю интенсивность флуоресценции, измеренную с помощью проточной цитометрии.

[Фигура 9] Фигура 9 представляет собой диаграмму, демонстрирующую активность ADCC 10 типов гуманизированных антител против LAG-3 и человеческого химерного антитела cLA212 против LAG-3. Клетки 293T-lacZ, экспрессирующие человеческий LAG-3, использовали в качестве клеток-мишеней, а PBMC человека использовали в качестве эффекторных клеток.

[Фигура 10] Фигура 10 представляет собой диаграмму, исследующую влияние гуманизированного антитела против LAG-3, hLA212_H3/L2, и человеческого химерного антитела против LAG-3, IMP731, на функцию подавления Т-клеток с помощью LAG-3. Продуцирование IL-2 в культуральных супернатантах измеряли, когда PBMC человека стимулировали SEB в течение 4 дней в присутствии каждого антитела. Каждое антитело оценивали при 10 мкг/мл.

[Фигура 11] Фигура 11 представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты тестирования активности связывания гуманизированного антитела против LAG-3, hLA212_H4/L2, с клетками 293T-lacZ, экспрессирующими человеческий LAG-3, с помощью проточной цитометрии. Вертикальная ось представляет среднюю интенсивность флуоресценции, измеренную с помощью проточной цитометрии.

[Фигура 12] Фигура 12 представляет собой диаграмму, демонстрирующую активность ADCC гуманизированного антитела hLA212_H4/L2 против LAG-3. Клетки 293T-lacZ, экспрессирующие человеческий LAG-3, использовали в качестве клеток-мишеней, а PBMC человека использовали в качестве эффекторных клеток.

[Фигура 13] Фигура 13 представляет собой диаграмму, демонстрирующую, что экспрессия человеческого LAG-3 в дважды трансгенных мышах по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA согласуется с экспрессией мышиного LAG-3. Экспрессию человеческого и мышиного LAG-3 на активированных Т-клетках, полученных путем стимулирования лейкоцитов, полученных из периферической крови дважды трансгенных мышей (Tg) по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA, и контрольных мышей дикого типа (Non-Tg) с помощью Con А, исследовали методом проточной цитометрии (множественное окрашивание). Представлены результаты, когда для анализа были гейтированы CD3-положительные Т-клетки. Квадранты графика были установлены с использованием образцов, свободных от окрашивающих антител против LAG-3 человека и мыши.

[Фигура 14] Фигура 14 представляет собой диаграмму, демонстрирующую in vivo-активность гуманизированного антитела hLA212_H4/L2 против LAG-3 по истощению клеток, экспрессирующих LAG-3. Вертикальная ось представляет положительность по человеческому LAG-3 Т-клеток периферической крови дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA через два дня после введения антитела и Con А. Антитело вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг непосредственно перед введением Con A.

[Фигура 15] Фигура 15 представляет собой диаграмму, демонстрирующую, что гуманизированное антитело hLA212_H4/L2 против LAG-3 обладает активностью подавления модели аутоиммунного заболевания in vivo. Клинические баллы EAE в дважды трансгенных мышах по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA, у которых индуцировали EAE и которым вводили гуманизированное антитело против LAG-3, hLA212_H4/L2, или контрольное антитело, показаны в зависимости от времени. Каждое антитело вводили внутривенно в дозе 30 мг/кг в день сенсибилизации и через семь дней после этого.

[Фигура 16] Фигура 16 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:1).

[Фигура 17] Фигура 17 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:2).

[Фигура 18] Фигура 18 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:3).

[Фигура 19] Фигура 19 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:4).

[Фигура 20] Фигура 20 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:5).

[Фигура 21] Фигура 21 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:6).

[Фигура 22] Фигура 22 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:7).

[Фигура 23] Фигура 23 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:8).

[Фигура 24] Фигура 24 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:9).

[Фигура 25] Фигура 25 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:10).

[Фигура 26] Фигура 26 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:11).

[Фигура 27] Фигура 27 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:12).

[Фигура 28] Фигура 28 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:13).

[Фигура 29] Фигура 29 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:14).

[Фигура 30] Фигура 30 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:15).

[Фигура 31] Фигура 31 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:16).

[Фигура 32] Фигура 32 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:17).

[Фигура 33] Фигура 33 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:18).

[Фигура 34] Фигура 34 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:19).

[Фигура 35] Фигура 35 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:20).

[Рисунок 36] Фигура 36 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности сигнала секреции легкой цепи человека и константную область человеческой κ цепи (SEQ ID NO:21).

[Фигура 37] Фигура 37 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности сигнала секреции тяжелой цепи человека и константной области человеческого IgG1 (SEQ ID NO:22).

[Фигура 38] Фигура 38 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела cLA212 (SEQ ID NO:23).

[Фигура 39] Фигура 39 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела cLA212 (SEQ ID NO:24).

[Фигура 40] Фигура 40 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи антитела cLA212 (SEQ ID NO:25).

[Фигура 41] Фигура 41 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела cLA212 (SEQ ID NO:26).

[Фигура 42] Фигура 42 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи Н2 антитела hLA212 (SEQ ID NO:27).

[Фигура 43] Фигура 43 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи Н2 антитела hLA212 (SEQ ID NO:28).

[Фигура 44] Фигура 44 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи H3 антитела hLA212 (SEQ ID NO:29).

[Фигура 45] Фигура 45 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи H3 антитела hLA212 (SEQ ID NO:30).

[Фигура 46] Фигура 46 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи L1 антитела hLA212 (SEQ ID NO:31).

[Фигура 47] Фигура 47 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи L1 антитела hLA212 (SEQ ID NO:32).

[Фигура 48] Фигура 48 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи L2 антитела hLA212 (SEQ ID NO:33).

[Фигура 49] Фигура 49 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи L2 антитела hLA212 (SEQ ID NO:34).

[Фигура 50] Фигура 50 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи L3 антитела hLA212 (SEQ ID NO:35).

[Фигура 51] Фигура 51 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи L3 антитела hLA212 (SEQ ID NO:36).

[Фигура 52] Фигура 52 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи L4 антитела hLA212 (SEQ ID NO:37).

[Фигура 53] Фигура 53 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи L4 антитела hLA212 (SEQ ID NO:38).

[Фигура 54] Фигура 54 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи L5 антитела hLA212 (SEQ ID NO:39).

[Фигура 55] Фигура 55 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи L5 антитела hLA212 (SEQ ID NO:40).

[Фигура 56] Фигура 56 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:41).

[Фигура 57] Фигура 57 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:42).

[Фигура 58] Фигура 58 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:43).

[Фигура 59] Фигура 59 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:44).

[Фигура 60] Фигура 60 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:45).

[Фигура 61] Фигура 61 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA204 (SEQ ID NO:46).

[Фигура 62] Фигура 62 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:47).

[Фигура 63] Фигура 63 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:48).

[Фигура 64] Фигура 64 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:49).

[Фигура 65] Фигура 65 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:50).

[Фигура 66] Фигура 66 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:51).

[Фигура 67] Фигура 67 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA212 (SEQ ID NO:52).

[Фигура 68] Фигура 68 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:53).

[Фигура 69] Фигура 69 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:54).

[Фигура 70] Фигура 70 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:55).

[Фигура 71] Фигура 71 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:56).

[Фигура 72] Фигура 72 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:57).

[Фигура 73] Фигура 73 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA225 (SEQ ID NO:58).

[Фигура 74] Фигура 74 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:59).

[Фигура 75] Фигура 75 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:60).

[Фигура 76] Фигура 76 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:61).

[Фигура 77] Фигура 77 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:62).

[Фигура 78] Фигура 78 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:63).

[Фигура 79] Фигура 79 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA869 (SEQ ID NO:64).

[Фигура 80] Фигура 80 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:65).

[Фигура 81] Фигура 81 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:66).

[Фигура 82] Фигура 82 представляет собой аминокислотную последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:67).

[Фигура 83] Фигура 83 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:68).

[Фигура 84] Фигура 84 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:69).

[Фигура 85] Фигура 85 представляет собой аминокислотную последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA1264 (SEQ ID NO:70).

[Фигура 86] Фигура 86 представляет собой праймер RG2AR3 (SEQ ID NO:71).

[Фигура 87] Фигура 87 представляет собой праймер RKR5 (SEQ ID NO:72).

[Фигура 88] Фигура 88 представляет собой праймер 3.3-F1 (SEQ ID NO:73).

[Фигура 89] Фигура 89 представляет собой праймер 3.3-R1 (SEQ ID NO:74).

[Фигура 90] Фигура 90 представляет собой праймер 212H-F (SEQ ID NO:75).

[Фигура 91] Фигура 91 представляет собой праймер 212H-R (SEQ ID NO:76).

[Фигура 92] Фигура 92 представляет собой праймер 212L-F (SEQ ID NO:77).

[Фигура 93] Фигура 93 представляет собой праймер 212L-R (SEQ ID NO:78).

[Фигура 94] Фигура 94 представляет собой олигонуклеотид LAG-3-H1 (SEQ ID NO:79).

[Фигура 95] Фигура 95 представляет собой олигонуклеотид LAG-3-H2 (SEQ ID NO:80).

[Фигура 96] Фигура 96 представляет собой олигонуклеотид LAG-3-H3 (SEQ ID NO:81).

[Фигура 97] Фигура 97 представляет собой олигонуклеотид LAG-3-H4 (SEQ ID NO:82).

[Фигура 98] Фигура 98 представляет собой олигонуклеотид LAG-3-H5 (SEQ ID NO:83).

[Фигура 99] Фигура 99 представляет собой олигонуклеотид LAG-3-H6 (SEQ ID NO:84).

[Фигура 100] Фигура 100 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность человеческого LAG-3 (SEQ ID NO:85).

[Фигура 101] Фигура 101 представляет собой аминокислотную последовательность человеческого LAG-3 (SEQ ID NO:86).

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Определение

В настоящем изобретении термин «ген» означает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты белка или, ее комплементарную цепь. Предполагается, что «ген» включает, например, полинуклеотид, олигонуклеотид, ДНК, мРНК, кДНК и кРНК, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты белка, или нуклеотидную последовательность, комплементарную ей. Такой ген представляет собой одноцепочечный, двухцепочечный нуклеотид или нуклеотид, содержащий три или более цепи. Термин «ген» также включает ассоциацию цепей ДНК и РНК, смесь рибонуклеотидов (РНК) и дезоксирибонуклеотидов (ДНК) на одной нуклеотидной цепи и двухцепочечный или трехцепочечный, или содержащий больше цепей нуклеотид, содержащий такую нуклеотидную цепь. Примеры «гена LAG-3» по настоящему изобретению могут включать ДНК, мРНК, кДНК и кРНК, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность белка LAG-3.

В настоящем изобретении термин «нуклеотид» имеет то же значение, что и «нуклеиновая кислота» и «молекула нуклеиновой кислоты», и также подразумевает включение, например, ДНК, РНК, зонда, олигонуклеотида, полинуклеотида и праймера. Такой нуклеотид представляет собой одноцепочечный, двухцепочечный или нуклеотид, содержащий три или более цепи. Термин «нуклеотид» также включает ассоциацию цепей ДНК и РНК, смесь рибонуклеотидов (РНК) и дезоксирибонуклеотидов (ДНК) на одной цепи нуклеотидов и ассоциацию двух цепей или трех или более цепей, содержащих такую цепь нуклеотидов.

В настоящем изобретении термины «полипептид», «пептид» и «белок» имеют одинаковое значение.

В настоящем изобретении термин «антиген» имеет то же значение, что и «иммуноген».

В настоящем изобретении термин «клетка» также включает, например, различные клетки, полученные от отдельных животных, субкультивированные клетки, первичные культивируемые клетки, клеточные линии, рекомбинантные клетки и микробные клетки.

В настоящем изобретении каждое из антител, которые связываются с LAG-3, и антител, которые распознают LAG-3, может упоминаться как «антитело против LAG-3» или сокращенно как «LAG-3-антитело». Антитело против LAG-3 включает моноклональные антитела, химеризованные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, химерные антитела и тому подобное.

Термин «связывающий фрагмент антитела» в настоящем изобретении означает фрагмент антитела, который выполняет, по меньшей мере, часть функций, выполняемых исходным антителом. Примеры «связывающего фрагмента антитела» могут включать, но не ограничиваются ими, Fab, F(ab')2, scFv, Fab' и одноцепочечный иммуноглобулин. Такой связывающий фрагмент антитела может быть получен обработкой полноразмерной молекулы белка антитела ферментом, таким как папаин или пепсин, или может представлять собой рекомбинантный белок, продуцируемый в соответствующей клетке-хозяине с использованием рекомбинантного гена.

В настоящем изобретении «сайт», с которым связывается антитело, то есть «сайт», распознаваемый антителом, означает неполный пептид или неполную конформацию на антигене, связанном или распознаваемом антителом. В настоящем изобретении такой сайт также называют эпитопом или сайтом связывания антитела. Примеры сайта на белке LAG-3, связанного или распознаваемого антителом против LAG-3 по настоящему изобретению, могут включать неполный пептид или неполную конформацию на белке LAG-3.

Известно, что каждая тяжелая и легкая цепи молекулы антитела имеет три области, определяющие комплементарность, (CDR). Области, определяющие комплементарность, также называют гипервариабельными доменами. Эти области расположены в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела. Эти сайты обладают особенно сильно вариабельной первичной структурой и обычно разделены на три положения на соответствующих первичных структурах полипептидов тяжелой и легкой цепи. В настоящем изобретении области, определяющие комплементарность антитела, обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3 от N-конца аминокислотной последовательности тяжелой цепи для областей, определяющих комплементарность, тяжелой цепи, и обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3 от N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи для областей, определяющих комплементарность, легкой цепи. Эти сайты проксимальны друг к другу на трехмерной структуре и определяют специфичность связываемого антигена. Части, отличные от CDRH1-CDRH3 в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, называются каркасами (каркасные области: далее FR), а участки от N-конца до CDRH1, но не включая ее, сразу после CDRH1 до CDRH2, но не включая ее, сразу после CDRH2 до CDRH3, но не включая ее, и сразу после CDRH3 до С-конца, соответственно, называют FRH1-FRH4. Аналогичным образом, части, отличные от CDRL1-CDRL3 в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, также представляют собой FR, и области от N-конца до CDRL1, но не включая ее, сразу после CDRL1 до CDRL2, но не включая ее, сразу после CDRL2 до CDRL3, но не включая ее, и сразу после CDRL3 до С-конца, соответственно, называют FRL1-FRL4. То есть в (аминокислотной последовательности) вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 и FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 в этом порядке непрерывно выровнены от N-конца к C-концу.

В настоящем изобретении термин «мутант антитела» означает полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности исходного антитела, путем замены, делеции, добавления и/или вставки (далее совместно обозначают «мутация») аминокислоты (аминокислот), и который связывается с белком LAG-3 по настоящему изобретению. Количество мутантных аминокислот в мутанте антитела составляет от 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-12, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 1-40 или 1-50. Мутант антител также охвачен термином «антитело» по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении термин «несколько» при обозначении «от 1 до нескольких» относится к 3-10.

Примеры активностей или свойств, проявляемых антителом по настоящему изобретению, могут включать биологические активности или физико-химические свойства и могут, в частности, включать различные биологические активности, связывающую активность против антигена или эпитопа, стабильность во время производства или хранения и термостабильность.

В настоящем изобретении, выражение «гибридизация в жестких условиях» означает гибридизацию в условиях, включающих гибридизацию при 65°С в растворе, содержащем 5×SSC, с последующей промывкой при 65°С в течение 20 минут в водном растворе, содержащем 2×SSC-0,1%SDS, при 65°С в течение 20 минут в водном растворе, содержащем 0,5×SSC-0,1%SDS, и при 65°С в течение 20 минут в водном растворе, содержащем 0,2×SSC-0,1%SDS, или гибридизации в условиях, эквивалентных этим. SSC означает водный раствор 150 мМ NaCl-15 мМ цитрата натрия, а n×SSC означает SSC с n-кратной концентрацией.

В настоящем изобретении термин «цитотоксичность» относится к некоторым патологическим изменениям, вызванным клетками, и означает не только прямое повреждение, но и любой тип структурного или функционального повреждения клеток, включая расщепление ДНК, образование базовых димеров, хромосомный разрыв, повреждение митотического аппарата и снижение активности различных ферментов.

В настоящем изобретении термин «цитотоксическая активность» означает активность, которая вызывает цитотоксичность, упомянутую выше.

В настоящем изобретении термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксическая активность», также называемая «антитело-зависимой клеточной цитотоксической активностью» или «ADCC-активностью», означает эффект или активность повреждения клеток-мишеней NK-клетками или тому подобное с помощью антител.

В настоящем изобретении термин «реакция хозяина против трансплантата» означает гипериммунное состояние реципиента, наблюдаемое после трансплантации органа, и повреждение трансплантированного органа в таком состоянии.

В настоящем изобретении термин «болезнь трансплантат против хозяина» означает симптомы, вызванные иммунологической атакой трансплантированных клеток в отношении реципиента после трансплантации гемопоэтических клеток.

2. Антигенный белок

(2-1) Свойства

Белок LAG-3 (который в дальнейшем может называться просто «LAG-3») представляет собой белок трансмембранного рецептора и состоит из внеклеточной области, состоящей из иммуноглобулин-подобных доменов (IgD1-4), которые содержат сайт связывания лиганда, трансмембранной области типа I, пронизывающей мембрану один раз, и внутриклеточной области. LAG-3 имеет то же значение, что и CD223.

В настоящем изобретении LAG-3 получен из позвоночных животных, предпочтительно получен из млекопитающих, более предпочтительно получен от людей.

Белок LAG-3 обладает следующими свойствами:

(i) связывание с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II на антигенпрезентирующих клетках;

(ii) связывание с молекулами МНС класса II и передача ингибирующих сигналов Т-клеткам, экспрессирующим такие молекулы, для отрицательной регуляции функции Т-клеток;

(iii) белок LAG-3 по настоящему изобретению, содержащий аминокислотную последовательность (которая в дальнейшем будет обозначаться как «аминокислотная последовательность LAG-3») по любому из пунктов (а)-(d) ниже, состоящую из аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность LAG-3, или состоящую из аминокислотной последовательности LAG-3:

(а) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:86 (Фигура 101);

(b) аминокислотная последовательность, которая имеет 80% или выше, 82% или выше, 84% или выше, 86% или выше, 88% или выше, 90% или выше, 92% или выше, 94% или выше, 96 % или выше, 98% или выше, или 99% или выше идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:86 (Фигура 101), и которая содержится в полипептиде, обладающем активностью связывания молекулы МНС класса II;

(c) аминокислотная последовательность, полученная из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:86 (Фигура 101), путем замены, делеции, добавления или вставки 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1 или 2 или 1 аминокислоты, и которая содержится в полипептиде, обладающем активностью связывания молекулы МНС класса II; и

(d) аминокислотная последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью полинуклеотида (молекулы нуклеиновой кислоты), гибридизующегося в жестких условиях с полинуклеотидом (молекулой нуклеиновой кислоты), имеющим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:86 (Фигура 101), и которая содержится в полипептиде, обладающем активностью связывания молекулы МНС класса II.

Полипептид по любому из (b)-(d) может иметь другие активности LAG-3 в дополнение к активности связывания молекулы МНС класса II.

(iv) Белок LAG-3 по настоящему изобретению может быть получен из LAG-3-экспрессирующих клеток, тканей или опухолевых тканей, клеток, полученных из тканей, культур клеток и тому подобного, позвоночных, предпочтительно из млекопитающих, более предпочтительно, грызунов, таких как мышь или крыса, и человека, еще более предпочтительно, из человека, крысы или мыши.

Экспрессия LAG-3 наблюдается в активированных Т-клетках, участках воспаления и тому подобном in vivo, и почти нет экспрессии или наблюдается очень низкий уровень экспрессии в клетках нормальных тканей.

Белок LAG-3 по настоящему изобретению может быть нативным (нерекомбинантным) или рекомбинантным белком. Также предполагается, что белок LAG-3 включает продукты слияния с другим пептидом или белком, таким как носитель или метка. Также предполагается, что белок LAG-3 включает формы, снабженные химической модификацией, включающей добавление полимера, такого как ПЭГ, и/или биологической модификацией, включая модификацию сахарной цепи. Кроме того, предполагается, что белок LAG-3 по настоящему изобретению включает фрагмент белка LAG-3. Из фрагментов белка LAG-3 те, которые обладают свойствами, описанными в (i) и/или (ii) выше, называются связывающими фрагментами белка LAG-3.

(2-2) Ген антигена

Ген LAG-3 по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность (которая в дальнейшем будет называться «последовательностью гена LAG-3») по любому из (a)-(c) ниже, состоит из нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность гена LAG-3, или состоит из последовательности гена LAG-3:

(а) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:86 (Фигура 101);

(b) нуклеотидная последовательность полинуклеотида (молекулы нуклеиновой кислоты), которая гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом (молекулой нуклеиновой кислоты), состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:86 (Фигура 101), и кодирует аминокислотную последовательность полипептида, обладающего активностью связывания молекулы МНС класса II; и

(c) нуклеотидная последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:86 (Фигура 101) путем замены, делеции, добавления или вставки 1-50, 1-45, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15,1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1 или 2 или 1 основания, и которая кодирует аминокислотную последовательность полипептида, обладающего активностью связывания молекулы МНС класса II.

Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью согласно (b) или (c), может иметь другие активности LAG-3 в дополнение к активности связывания молекулы МНС класса II.

Экспрессию и уровень экспрессии гена LAG-3 можно анализировать либо с использованием транскрипта гена LAG-3, либо белка LAG-3 в качестве показателя. Первый показатель может быть определен с помощью ОТ-ПЦР, Нозерн-блот-гибридизации или тому подобного, тогда как второй показатель может быть определен с помощью иммуноанализа, такого как проточная цитометрия, Вестерн-блот-анализ, иммуногистохимическое окрашивание или тому подобное, соответственно.

(2-3) Получение белка антигена

Белок LAG-3 по настоящему изобретению может быть получен путем очистки или выделения из тканей животных (включая жидкости организма), клеток, полученных из тканей, или культур клеток, рекомбинации генов, трансляции in vitro, химического синтеза и тому подобное.

(2-3-1) Очистка или выделение нерекомбинантного LAG-3

Нерекомбинантный белок LAG-3 может быть очищен или выделен из клеток, экспрессирующих LAG-3. Примеры клеток, экспрессирующих LAG-3, могут включать клетки, описанные в (iv) из (2-1), но происхождение нерекомбинантного белка LAG-3 этим не ограничивается.

Очистка или выделение из таких тканей, клеток, клеточных культур или тому подобного может выполняться комбинацией подходов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как фракционирование и хроматография.

(2-3-2) Получение рекомбинантного белка LAG-3

Белок LAG-3 по настоящему изобретению также может быть получен в рекомбинантной форме. В частности, клетки-хозяева трансфицируют геном, кодирующим аминокислотную последовательность белка LAG-3 или фрагмента белка LAG-3, и белок LAG-3 может быть выделен из культур клеток. Кроме того, белок LAG-3 может быть экспрессирован не только в виде молекулы, имеющей тот же амино-конец (N-конец) и/или карбокси-конец (С-конец), что и у нативной молекулы, но также в виде слитого белка с секреторным сигналом, внутриклеточным сигналом локализации, меткой для аффинной очистки или с пептидом-партнером. Белок LAG-3 может быть очищен или выделен из таких рекомбинантных клеточных культур с помощью соответствующей комбинации методов, таких как фракционирование и хроматография, описанных в (2-3-1) «Очистка или выделение нерекомбинантного белка LAG-3». Кроме того, раствор, содержащий белок LAG-3, может быть подвергнут замене буфера и/или концентрированию с использованием гель-фильтрации или концентратора, такого как Centriprep.

(2-3-3) In vitro трансляция

Белок LAG-3 по настоящему изобретению также можно получить трансляцией in vitro. Такой способ трансляции конкретно ничем не ограничен, если в нем используется бесклеточная система трансляции, включающая ферменты, необходимые для транскрипции и трансляции, субстраты и энергетические вещества. Примеры могут включать способ с использованием системы быстрой трансляции (RTS) производства Roche Diagnostics KK.

(2-3-4) Химический синтез

Белок LAG-3 по настоящему изобретению также может быть получен химическим синтезом. Примеры способов химического синтеза могут включать способы твердофазного пептидного синтеза, такие как способы синтеза Fmoc и Boc.

3. Антитело

(3-1) Классификация антител

Антитела по настоящему изобретению могут быть либо моноклональными, либо поликлональными антителами. Примеры моноклонального антитела по настоящему изобретению могут включать не являющиеся человеческими антитела животного происхождения (животные антитела, не являющиеся человеческими), антитела человеческого происхождения (человеческие антитела), химеризованные антитела (химерные антитела) и гуманизированные антитела.

Примеры не являющегося человеческим животного антитела могут включать антитела, полученные из позвоночных, таких как млекопитающие и птицы. Примеры антител млекопитающих могут включать антитела грызунов, такие как антитела мыши и антитела крысы. Примеры антител, полученных из птиц, могут включать куриные антитела. Примеры крысиного моноклонального антитела против человеческого LAG-3 могут включать rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264.

Примеры химеризованного антитела могут включать, но не ограничиваются этим, антитело, содержащее вариабельные области, полученные из антител животного, не являющегося человеком, связанные с константными областями человеческого антитела (человеческого иммуноглобулина). Примеры химеризованного антитела, содержащего вариабельные области, полученные из антител животного, не являющегося человеком, связанные с константными областями человеческого антитела, могут включать такие, которые имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепи, полученные из крысиного моноклонального антитела rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 или rLA1264, и имеющие константные области тяжелой и легкой цепи человека (которые обозначаются как «cLA204», «cLA212», «cLA225», «cLA869» или «cLA1264», соответственно).

Примеры гуманизированного антитела могут включать, но не ограничиваются этим, человеческое антитело (вариабельные области человеческого иммуноглобулина), трансплантированное CDR вариабельных областей животного антитела, не являющегося человеческим, человеческое антитело, трансплантированное CDR, а также неполными последовательностями FR животного антитела, не являющегося человеческим, и антитело, содержащее аминокислоты человеческого антитела или другие аминокислоты, замещенные одной или двумя или более аминокислотами, полученными из животного антитела, не являющегося человеческим, в любом из этих человеческих (гуманизированных) антител. Примеры CDR в вариабельных областях животного антитела, не являющегося человеческим, могут включать CDRH1-CDRH3 в вариабельной области тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 в вариабельной области легкой цепи, полученных из rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 или rLA1264, упомянутых выше. Примеры гуманизированных антител, содержащих CDRH1-CDRH3 в вариабельной области тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 в вариабельной области легкой цепи, полученных из rLA212, могут включать hLA212_H2/L1-H2/L5, hLA212_H3/L1-H3/L5 и hLA212_H4/L2.

Антитело человека конкретно ничем не ограничено при условии, что антитело распознает антиген по настоящему изобретению, но его примеры могут включать человеческое антитело, связывающееся с тем же сайтом, что и антитело, имеющее CDR антитела по настоящему изобретению, и человеческое антитело, связывающееся с тем же сайтом на LAG-3, что и любое из животных антител, не являющихся человеческими, химерных антител, гуманизированных антител и тому подобного, и антитело, конкурирующее с любым из таких антител за связывание с LAG-3.

Антитело по настоящему изобретению может состоять из частей, полученных из множества различных антител, при условии, что антитело обладает активностью связывания LAG-3. Примеры такого антитела могут включать антитело, содержащее тяжелые и/или легкие цепи, обмениваемые между множеством различных антител, антитело, содержащее полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи, обмениваемые между ними, антитело, содержащее вариабельные или константные области, обмениваемые между ними, и антитело, содержащее все или несколько CDR, обмениваемых между ними. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи химерного антитела могут быть получены из различных антител по настоящему изобретению. CDRH1-CDRH3 и CDRL1-CDRL3 в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи гуманизированного антитела могут быть получены из двух или более различных антител по настоящему изобретению. CDRH1-CDRH3 и CDRL1-CDRL3 в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи человеческого антитела могут представлять собой комбинацию CDR, которые несут на себе два или более различных антитела по настоящему изобретению. Антитело или его связывающий фрагмент, состоящий из таких частей, полученных из множества различных антител, обладает следующими свойствами, функциями, активностями и тому подобное, описанными в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одной или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеуказанному, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеуказанному, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение к вышеуказанному, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеуказанному, оптимально все из (3-2)-(3-8).

Примеры изотипа моноклонального антитела по настоящему изобретению могут включать, но не ограничиваются этим, IgG, такой как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgM, IgA, такой как IgA1 и IgA2, IgD и IgE, и могут предпочтительно включать IgG и IgM. Изотип и подкласс моноклонального антитела могут быть определены, например, с помощью теста Оухтерлони, ферментно-связанного иммуно-сорбентного анализа (далее называемого «ИФА») или радиоиммунологического анализа (далее называемого «РИА»). Также можно использовать имеющийся в продаже набор для идентификации (например, набор для мышей Typer; Bio-Rad Laboratories, Inc. и RAT MONOCLONAL ANTBODY ISOTYPING TEST KIT: AbD Serotec).

(3-2) Специфичность связывания антитела

Антитело по настоящему изобретению распознает белок LAG-3. Другими словами, антитело по настоящему изобретению связывается с белком LAG-3. Такое антитело также выражается в виде «антитела против LAG-3». Предпочтительно антитело по настоящему изобретению специфически распознает белок LAG-3. Другими словами, антитело по настоящему изобретению предпочтительно специфически связывается с белком LAG-3 (вышеуказанные свойства будут совместно обозначаться как «активность связывания LAG-3» антитела). Более предпочтительно, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с внеклеточной областью (областями) белка LAG-3, еще более предпочтительно, антитело специфически связывается с иммуноглобулиноподобными доменами (которые в дальнейшем будут называться «Ig-подобными доменами») белка LAG-3, еще более предпочтительно, антитело специфически связывается с Ig-подобным доменом 3.

В настоящем изобретении «специфическое распознавание», то есть «специфическое связывание», означает связывание, которое не является неспецифической адсорбцией. Примеры критериев для определения того, является ли связывание специфическим или нет, могут включать в себя константу диссоциации (далее называемую «KD»). Предпочтительно антитело по настоящему изобретению имеет значение KD, равное 1×10^-5 или ниже, 5×10^-6 или ниже, 2×10^-6 или ниже, or 1×10^-6 или ниже, более предпочтительно, 5×10^-7 или ниже, 2×10^-7 или ниже, or 1×10^-7 или ниже, еще более предпочтительно, 5×10^-8 или ниже, 2×10^-8 или ниже, or 1×10^-8 или ниже, еще более предпочтительно, 5×10^-9 или ниже, 2×10^-9 или ниже, or 1×10^-9 или ниже, наиболее предпочтительно, 5×10^-10 или ниже, 2×10^-10 или ниже, или 1×10^-10 или ниже для белка LAG-3.

В настоящем изобретении связывание антитела с антигеном можно анализировать или определять с помощью ИФА, РИА, анализа поверхностного плазмонного резонанса (далее называемого «SPR») или тому подобного. Примеры оборудования, используемого в анализе SPR, могут включать BIAcore (TM) (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), ProteOn (TM) (производства Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi (TM) (производства BioNavis Oy Ltd.), Spreeta (TM) (производства Texas Instruments Inc.), SPRi-Plex II (TM) (производства Horiba, Ltd.) и Autolab SPR (TM) (производства Metrohm Japan Ltd.). Связывание антитела с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки, можно анализировать с помощью проточной цитометрии, клеточного ИФА или тому подобного.

(3-3) Цитотоксическая активность антитела

Согласно одному аспекту антитело против LAG-3 по настоящему изобретению обладает активностью антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), предпочтительно обладает ADCC-активностью in vitro, более предпочтительно обладает ADCC-активностью против LAG-3-экспрессирующих Т-клеток. Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению может обладать активностью комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и/или антитело-зависимого клеточного фагоцитоза (ADCP) в дополнение к активности ADCC.

Активность ADCC можно оценить известным методом. Клетки, экспрессирующие интересующий антиген (клетки-мишени), и эффекторные клетки, способные убивать клетки-мишени, используют в анализе активности ADCC. Эффекторные клетки распознают Fc-области связывания антител с клетками-мишенями через рецепторы Fcγ. Эффекторные клетки убивают клетки-мишени с помощью сигналов, передающихся от рецептором Fcγ. В случае оценки активности ADCC антитела, имеющего человеческую Fc-область, человеческие NK-клетки используют в качестве эффекторных клеток. Человеческие NK-клетки могут быть получены из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC) способом, известным в данной области. Альтернативно, РВМС могут быть использованы непосредственно в качестве эффекторных клеток.

(3-4) In vivo активность антитела, уменьшающая количество LAG-3-положительных клеток

Согласно одному аспекту антитело по настоящему изобретению уменьшает количество LAG-3-положительных клеток, предпочтительно уменьшает количество LAG-3-положительных клеток in vivo и более предпочтительно уменьшает количество LAG-3-положительных клеток in vivo в форме с низким содержанием фукозы.

LAG-3-положительные клетки включают клетки, вынужденные экспрессировать LAG-3, и клетки, в которых экспрессия LAG-3 индуцирована стимулированием, но не ограничиваются этим, при условии, что они являются клетками, экспрессирующими LAG-3.

Количество LAG-3-положительных клеток можно подсчитать с помощью обычного метода, такого как проточная цитометрия.

В настоящем изобретении «форма с низким содержанием фукозы» означает состояние, в котором (i) количество фукозы (остатков фукозы), связывающейся с антителом или его связывающим фрагментом в N-гликозид-связанных сахарных цепях сложного типа, меньше, чем количество фукозы (остатков фукозы), связывающейся с исходным (родительским) антителом или его связывающим фрагментом в N-гликозид-связанных сахарных цепях сложного типа, (ii) количество фукозы (остатков фукозы), связывающейся с антителом или его связывающим фрагментом в N-гликозид-связанных сахарных цепях сложного типа меньше, чем количество фукозы (остатков фукозы), естественным образом связывающейся с антителом или его связывающим фрагментом в N-гликозид-связанных сахарных цепях сложного типа, или (iii) количество фукозы (остатков фукозы) или сахарных цепей, содержащих фукозу (остатки фукозы), связывающихся с антителом или его связывающим фрагментом в N-гликозид-связанных сахарных цепях сложного типа, находится на уровне предела обнаружения или ниже в физическом или химическом анализе (предпочтительно в масс-спектрометрии). В случае, когда количество фукозы (остатков фукозы), связывающейся с модифицированным антителом или его связывающим фрагментом в N-гликозид-связанных сахарных цепях сложного типа меньше, чем до модификации, то подразумевается, что модифицированное антитело или его связывающий фрагмент представлены в «форме с низким содержанием фукозы». Описанная ниже модифицированная форма hLA212_H4/L2, которая представляет собой гуманизированное антитело по настоящему изобретению, относится к аспекту антитела в форме с низким содержанием фукозы. Антитело или его связывающий фрагмент в форме с низким содержанием фукозы имеют более высокую аффинность к рецепторам FcγIIIA и обладают более сильной активностью ADCC, чем когда они представлены не в форме с низким содержанием фукозы.

(3-5) Экспериментальная активность антител против аутоиммунного энцефаломиелита in vivo.

Согласно одному аспекту антитело по настоящему изобретению обладает активностью, ингибирующей энцефаломиелит, предпочтительно обладает in vivo активностью, ингибирующей экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, более предпочтительно обладает in vivo активностью, ингибирующей экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, в форме с низким содержанием фукозы.

В настоящем изобретении экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит означает энцефаломиелит, индуцированный введением пептида, полученного из MOG (миелин-олигодендроцитарный гликопротеин), который является одним из белков миелинового компонента центральной нервной системы, мышам вместе с адъювантом Фрейнда.

Активность, ингибирующая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, можно оценить путем ежедневного наблюдения клинических показателей, отражающих степень паралича. Клиническая оценка может быть установлена, например, следующим образом:

Оценка 0: бессимптомно;

Оценка 1: слабый хвост;

Оценка 2: аномальная походка или потеря рефлекса выправления;

Оценка 3: паралич задних конечностей;

Оценка 4: Частичный паралич передних конечностей; и

Оценка 5: Смерть или эвтаназия.

(3-6) Активность связывания антителом человеческих активированных Т-клеток.

Согласно одному аспекту антитело по настоящему изобретению связывается с человеческими активированными Т-клетками, предпочтительно связывается с LAG-3-положительными человеческими активированными Т-клетками. Связывание антитела с активированными человеческими Т-клетками можно проанализировать или обнаружить, например, с помощью проточной цитометрии.

(3-7) Присутствие антитела, позволяющее человеческому LAG-3 связываться с молекулами MHC класса II человека

Согласно одному аспекту настоящего изобретения человеческий LAG-3 может связываться с молекулами МНС класса II человека в присутствии антитела, или антитело по настоящему изобретению не ингибирует связывание человеческого LAG-3 с молекулами МНС класса II человека.

Связывание слитых белков внеклеточной области молекулы LAG-3 и Fc-части IgG с клетками Raji, которые эндогенно высоко экспрессируют молекулы МНС класса II, можно оценить, например, путем анализа или обнаружения с помощью проточной цитометрии.

(3-8) Присутствие антитела, позволяющее человеческому LAG-3 проявлять функцию подавления человеческих Т-клеток

Согласно другому аспекту человеческий LAG-3 проявляет функцию подавления человеческих Т-клеток в присутствии антитела по настоящему изобретению.

Термин «функция подавления Т-клеток» в настоящем изобретении означает уменьшение или подавление количества цитокина, продуцируемого при стимулировании Т-клеток.

Функцию подавления Т-клеток человеческим LAG-3 можно оценить, например, путем количественного определения цитокинов, продуцируемых, когда человеческие Т-клетки стимулированы для индукции экспрессии LAG-3.

В настоящем изобретении стимулирование человеческих Т-клеток конкретно ничем не ограничено, но его примеры могут включать стимулирование специфическими антигенами, антителами против CD3, комбинациями антител против CD3 и антител против CD28, супер-антигенами, клетками, полученными из других доноров, предпочтительно стимулирование стафилококковым энтеротоксином В, клетками, полученными из других доноров, имеющих разные МНС, и тому подобное.

Примеры цитокинов могут включать цитокины, продуцируемые активированными Т-клетками, предпочтительно различные интерлейкины и интерфероны, более предпочтительно интерлейкин 2 (IL-2) и интерферон γ.

(3-9) Моноклональное антитело

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против LAG-3 и его связывающему фрагменту. Моноклональное антитело включает моноклональные антитела, полученные из животных, но не человека, такие как антитела крысы, антитела мыши, антитела кролика, антитела курицы и антитела рыб, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, их связывающие фрагменты и их модифицированные формы. Из них примеры крысиных моноклональных антител могут включать rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264.

rLA204 представляет собой крысиное моноклональное антитело против LAG-3 человека, полученное способом, описанным в Примере 1. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи rLA204 описана в SEQ ID NO:1 (Фигура 16), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:2 (Фигура 17). Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи rLA204 описана в SEQ ID NO:3 (Фигура 18), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:4 (Фигура 19). Аминокислотная последовательность CDRH1 rLA204 описана в SEQ ID NO:41 (Фигура 56), аминокислотная последовательность CDRH2 описана в SEQ ID NO:42 (Фигура 57), аминокислотная последовательность CDRH3 описана в SEQ ID NO:43 (Фигура 58), аминокислотная последовательность CDRL1 описана в SEQ ID NO:44 (Фигура 59), аминокислотная последовательность CDRL2 описана в SEQ ID NO:45 (Фигура 60) и аминокислотная последовательность CDRL3 описана в SEQ ID NO:46 (Фигура 61), соответственно.

RLA212 представляет собой крысиное моноклональное антитело против LAG-3 человека, полученное в соответствии со способом, описанным в Примере 1. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи rLA212 описана в SEQ ID NO:5 (Фигура 20), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:6 (Фигура 21). Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи rLA212 описана в SEQ ID NO:7 (Фигура 22), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:8 (Фигура 23). Аминокислотная последовательность CDRH1 rLA212 описана в SEQ ID NO:47 (Фигура 62), аминокислотная последовательность CDRH2 описана в SEQ ID NO:48 (Фигура 63), аминокислотная последовательность CDRH3 описана в SEQ ID NO:49 (Фигура 64), аминокислотная последовательность CDRL1 описана в SEQ ID NO:50 (Фигура 65), аминокислотная последовательность CDRL2 описана в SEQ ID NO:51 (Фигура 66), и аминокислотная последовательность CDRL3 описана в SEQ ID NO:52 (Фигура 67), соответственно.

RLA225 представляет собой крысиное моноклональное антитело против LAG-3 человека, полученное в соответствии со способом, описанным в Примере 1. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи rLA225 описана в SEQ ID NO:9 (Фигура 24), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:10 (Фигура 25). Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи rLA225 описана в SEQ ID NO:11 (Фигура 26), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:12 (Фигура 27). Аминокислотная последовательность CDRH1 rLA225 описана в SEQ ID NO:53 (Фигура 68), аминокислотная последовательность CDRH2 описана в SEQ ID NO:54 (Фигура 69), аминокислотная последовательность CDRH3 описана в SEQ ID NO:55 (Фигура 70), аминокислотная последовательность CDRL1 описана в SEQ ID NO:56 (Фигура 71), аминокислотная последовательность CDRL2 описана в SEQ ID NO:57 (Фигура 72), и аминокислотная последовательность CDRL3 описана в SEQ ID NO:58 (Фигура 73).

RLA869 представляет собой крысиное моноклональное антитело против LAG-3 человека, полученное в соответствии со способом, описанным в Примере 1. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи rLA869 описана в SEQ ID NO:13 (Фигура 28), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:14 (Фигура 29). Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи rLA869 описана в SEQ ID NO:15 (Фигура 30), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:16 (Фигура 31). Аминокислотная последовательность CDRH1 rLA869 описана в SEQ ID NO:59 (Фигура 74), аминокислотная последовательность CDRH2 описана в SEQ ID NO:60 (Фигура 75), аминокислотная последовательность CDRH3 описана в SEQ ID NO:61 (Фигура 76), аминокислотная последовательность CDRL1 описана в SEQ ID NO:62 (Фигура 77), аминокислотная последовательность CDRL2 описана в SEQ ID NO:63 (Фигура 78), и аминокислотная последовательность CDRL3 описана в SEQ ID NO:64 (Фигура 79).

RLA1264 представляет собой крысиное моноклональное антитело против LAG-3 человека, полученное в соответствии со способом, описанным в Примере 1. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи rLA1264 описана в SEQ ID NO:17 (Фигура 32), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:18 (Фигура 33). Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи rLA1264 описана в SEQ ID NO:19 (Фигура 34), а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:20 (Фигура 35). Аминокислотная последовательность CDRH1 rLA1264 описана в SEQ ID NO:65 (Фигура 80), аминокислотная последовательность CDRH2 описана в SEQ ID NO:66 (Фигура 81), аминокислотная последовательность CDRH3 описана в SEQ ID NO:67 (Фигура 82), аминокислотная последовательность CDRL1 описана в SEQ ID NO:68 (Фигура 83), аминокислотная последовательность CDRL2 описана в SEQ ID NO:69 (Фигура 84) и аминокислотная последовательность CDRL3 описана в SEQ ID NO:70 (Фигура 85).

Мутант антитела по настоящему изобретению предпочтительно проявляет, например, пониженную чувствительность к деградации белка или к окислению, улучшенную биологическую активность, улучшенную способность связываться с антигеном или физико-химические или функциональные свойства, присущие ему. Примеры такого мутанта антитела могут включать антитело, имеющее аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности исходного антитела путем консервативной аминокислотной замены 1 или 2 или более, предпочтительно от 1 до нескольких аминокислот. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, которая относится к группе аминокислот, имеющих родственные аминокислотные боковые цепи.

Предпочтительными группами аминокислот являются следующие: кислотная группа, включающая аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; основная группа, включающая лизин, аргинин и гистидин; неполярная группа, включающая аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан; и незаряженное полярное семейство, включающее глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин и тирозин. Другими предпочтительными группами аминокислот являются следующие: алифатическая гидроксигруппа, включающая серин и треонин; амидосодержащая группа, включающая аспарагин и глутамин; алифатическая группа, включающая аланин, валин, лейцин и изолейцин; и ароматическая группа, включающая фенилаланин, триптофан и тирозин. Такую аминокислотную замену у мутанта антитела предпочтительно проводят без снижения антигенсвязывающей активности исходного (родительского) антитела.

Аспарагиновая кислота, содержащаяся в белке, легко превращается в изоаспарагиновую кислоту путем изомеризации, когда аминокислота, связанная с ней со стороны С-конца, имеет небольшую боковую цепь. С другой стороны, аспарагин легко превращается в аспарагиновую кислоту путем дезамидирования и может быть далее превращен в изоаспарагиновую кислоту путем изомеризации. Прогрессирование такой изомеризации или дезамидирования может влиять на стабильность белка. Соответственно, аспарагиновая кислота или аспарагин в белке или, например, соседняя с ним аминокислота может быть заменена другой аминокислотой, чтобы обойти такую изомеризацию или дезамидирование. Предпочтительно, мутант антитела, имеющий такую аминокислотную замену, сохраняет антигенсвязывающую активность исходного антитела.

Настоящее изобретение также охватывает, например: мутант антитела, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 или rLA1264 по настоящему изобретению путем консервативной аминокислотной замены; и антитело мыши, антитело крысы, химеризованное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, содержащее CDR, имеющую аминокислотную последовательность, в которой консервативная аминокислотная мутация введена в аминокислотную последовательность любой из CDRH1-CDRH3, и CDRL1-CDRL3, полученных из rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 или rLA1264.

Мутант антитела по настоящему изобретению охватывает мутант антитела, связывающийся с человеческим LAG-3, содержащий CDRH1-CDRH3 и CDRL1-CDRL3, имеющие аминокислотные последовательности, где от 1 до нескольких, предпочтительно от 1 до 3, более предпочтительно от 1 до 2, наиболее предпочтительно 1 аминокислота (аминокислоты) заменена другой аминокислотой (аминокислотам) в аминокислотных последовательностях любой одной или двух или более из CDRH1-CDRH3 и CDRL1-CDRL3, полученных из rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 или rLA1264 по настоящему изобретению.

Мутант антитела также включает антитело, имеющее CDRH1-CDRH3 и CDRL1-CDRL3, полученные из множества антител. Примеры таких мутантов могут включать мутант антитела, содержащий CDRH3, полученную из определенного антитела, и CDRH1, CDRH2 и CDRL1-CDRL3, полученные из другого антитела.

«Антитело» в соответствии с настоящим изобретением также охватывает эти мутанты антител.

Константные области антитела по настоящему изобретению конкретно ничем не ограничены. Предпочтительно константные области, полученные из человеческого антитела, используют в антителе по настоящему изобретению для лечения или профилактики заболевания у человека. Примеры константной области тяжелой цепи антитела человека могут включать в себя Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2 ,и Cε. Примеры константной области легкой цепи антитела человека могут включать в себя Cκ и Cλ.

(3-10) Химерное антитело

Химеризованное антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению обладают свойствами, функциями, активностями и тому подобное, описанными в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5), и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все (3-2)-(3-8).

Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность тяжелой цепи cLA212, представленные в качестве примера химерного антитела крыса-человек по настоящему изобретению, и нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность его легкой цепи, соответственно, представлены в SEQ ID NO:23, 24, 25 и 26 (Фигуры 38, 39, 40 и 41). Положения нуклеотидов 1-57 в нуклеотидной последовательности тяжелой цепи и положения аминокислот 1-19 в аминокислотной последовательности тяжелой цепи представляют собой сигнальную последовательность, которая обычно не содержится в нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях большинства зрелых тяжелых цепей. Аналогично, положения нуклеотидов 1-60 в нуклеотидной последовательности легкой цепи и положения аминокислот 1-20 в аминокислотной последовательности легкой цепи представляют сигнальную последовательность, которая обычно не содержится в нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях наиболее зрелых легких цепей.

Химерные антитела крысы-человека cLA204, cLA225, cLA869 и cLA1264 описаны и в других местах.

(3-11) Связывающий фрагмент антитела

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к связывающему фрагменту антитела против LAG-3 по настоящему изобретению. Связывающий фрагмент антитела означает фрагмент, который сохраняет, по меньшей мере, часть функций антитела. Примеры таких функций антитела могут, как правило, включать антигенсвязывающую активность, активность, регулирующую активность антигена, и активность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Предпочтительно, связывающий фрагмент антитела против LAG-3 по настоящему изобретению имеет свойства, функции, активности и тому подобное, описанные в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5), и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все (3-2)-(3-8).

Связывающий фрагмент антитела конкретно ничем не ограничен, пока фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере часть активностей антитела. Его примеры могут включать, но не ограничиваются этим, Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечный Fv (scFv), содержащий Fv тяжелой и легкой цепи, связанные через соответствующий линкер, диатела, линейные антитела, мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антитела, и Fab', который представляет собой одновалентный фрагмент вариабельной области антитела, полученный обработкой F(ab')2 в восстанавливающих условиях. Также подразумевается, что связывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению включает молекулу, содержащую фрагмент антитела по настоящему изобретению, а также другие части, такие как scFv, сохраняющие линкерную часть.

Молекула, полученная из белка антитела путем делеции от 1 до нескольких или более аминокислот на его аминоконце и/или карбоксиконце и сохраняющая, по меньшей мере, часть функций антитела, также включена в значение связывающего фрагмента антитела. Например, известно, что тяжелая цепь антитела, продуцируемого культивируемыми клетками млекопитающих, не имеет остатка лизина на карбоксиконце (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). Также известно, что в тяжелой цепи такого антитела отсутствуют два аминокислотных остатка (глицин и лизин) на карбоксиконце и вместо этого имеется амидированный пролиновый остаток на карбоксиконце (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Однако делеция и модификация в этих последовательностях тяжелых цепей не влияют на способность антитела связываться с антигеном или на его эффекторные функции (активация комплемента, антитело-зависимые клеточные цитотоксические эффекты и тому подобное). Такая модифицированная форма связывающего фрагмента антитела также охватывает антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению или его модифицированную форму (описанную ниже).

Антитело по настоящему изобретению или его связывающий фрагмент может представлять собой полиспецифичное антитело, обладающее специфичностью по меньшей мере для 2 типов различных антигенов. Полиспецифичное антитело не ограничивается биспецифичным антителом, которое связывается с 2 типами различных антигенов, и антитело, обладающее специфичностью к 3 или более типам различных антигенов, также включено в значение «полиспецифичное антитело» по настоящему изобретению.

Полиспецифичное антитело по настоящему изобретению может представлять собой полноразмерное антитело или его связывающий фрагмент (например, биспецифичное антитело F(ab')2). Биспецифичное антитело также может быть получено путем связывания тяжелых и легких цепей (пар HL) двух типов антител. Альтернативно, биспецифичное антитело может быть получено слиянием двух или более типов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, для получения слитых клеток, продуцирующих биспецифичное антитело (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539). Полиспецифичное антитело также может быть получено таким же образом, как описано выше.

Согласно одному аспекту антитело по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечное антитело (одноцепочечный Fv; в дальнейшем, обозначаемый как «scFv»). ScFv получают путем связывания V-областей тяжелой и легкой цепей антитела через полипептидный линкер (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, Rosenburg and Moore, ed., Springer Verlag, New York, p. 269-315 (1994); и Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136). Кроме того, в качестве биспецифичного антитела можно использовать bi-scFv, включающий два scFv, связанных через полипептидный линкер. Альтернативно, поли-scFv, включающий три или более scFv, можно использовать в качестве полиспецифичного антитела.

Настоящее изобретение включает одноцепочечный иммуноглобулин, содержащий полноразмерные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, связанные через соответствующий линкер (Lee, HS, et al., Molecular Immunology (1999), 36, p. 61-71; и Shirrmann T. et al., MAbs (2010), 2 (1), стр. 1-4). Такой одноцепочечный иммуноглобулин может быть димеризован, чтобы тем самым сохранить структуру и активности, сходные с активностью антитела, которое первоначально было тетрамером. Также антитело по настоящему изобретению может представлять собой антитело, которое имеет одну вариабельную область тяжелой цепи и не имеет последовательности легкой цепи. Сообщалось, что такое антитело, называемое однодоменным антителом (sdAb) или нанотелом, сохраняет способность связываться с антигеном (Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994), 7 (9), 1129- 35 и Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993), 363 (6428), 446-8). Эти антитела также включены в значение функционального фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением.

(3-12) Гуманизированное антитело и человеческое антитело

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его связывающему фрагменту.

Предпочтительно гуманизированное антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению обладают свойствами, функциями, активностями и тому подобное, описанными в (3-2), (3-3) и (3-8) предпочтительно одним или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеуказанному, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеуказанному, еще более предпочтительно (3- 4) и (3-5) в дополнение к вышеуказанному, еще более предпочтительно, (3-4) и (3-5), и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеуказанному, оптимально все из (3-2)-(3-8).

Предпочтительные примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению могут включать гуманизированные антитела, имеющие CDRH1-CDRH3 тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 легкой цепи rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 или rLA1264, как описано ниже в А-Е.

(А. Гуманизированное антитело, имеющее тяжелую цепь CDRH1-CDRH3 и легкую цепь CDRL1-CDRL3 антитела rLA204)

Примеры гуманизированного антитела против LAG-3 или его связывающего фрагмента по настоящему изобретению могут включать гуманизированное антитело, которое состоит из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:41 (Фигура 56), CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:42 (Фигура 57), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:43 (Фигура 58), и легкой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:44 (Фигура 59), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:45 (Фигура 60), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:46 (Фигура 61), и распознает белок LAG-3 по настоящему изобретению, его связывающий фрагмент или его мутант.

(B. Гуманизированное антитело, имеющее CDRH1-CDRH3 тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 легкой цепи антитела rLA212)

Альтернативные примеры гуманизированного антитела против LAG-3 или его связывающего фрагмента могут включать гуманизированное антитело, которое состоит из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47 (Фигура 62) CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48 (Фигура 63), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49 (Фигура 64), и легкой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRL1 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50 (Фигура 65), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:51 (Фигура 66), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID No:52 (Фигура 67), и распознает белок LAG-3 по настоящему изобретению, его связывающий фрагмент или его мутант.

(C. Гуманизированное антитело, имеющее CDRH1-CDRH3 тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 легкой цепи антитела rLA225)

Альтернативные примеры гуманизированного антитела против LAG-3 или его связывающего фрагмента могут включать гуманизированное антитело, которое состоит из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:53 (Фигура 68) CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:54 (Фигура 69), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:55 (Фигура 70), и легкой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRL1 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:56 (Фигура 71), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:57 (Фигура 72), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:58 (Фигура 73), и распознает белок LAG-3 по настоящему изобретению, его связывающий фрагмент или его мутант.

(D. Гуманизированное антитело, имеющее CDRH1-CDRH3 тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 легкой цепи антитела rLA869)

Альтернативные примеры гуманизированного антитела против LAG-3 или его связывающего фрагмента могут включать гуманизированное антитело, которое состоит из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:59 (Фигура 74) CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60 (Фигура 75), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:61 (Фигура 76), и легкой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRL1 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:62 (Фигура 77), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63 (Фигура 78), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64 (Фигура 79), и распознает белок LAG-3 по настоящему изобретению, его связывающий фрагмент или его мутант.

(E. Гуманизированное антитело, имеющее CDRH1-CDRH3 тяжелой цепи и CDRL1-CDRL3 легкой цепи антитела rLA1264)

Альтернативные примеры гуманизированного антитела против LAG-3 или его связывающего фрагмента могут включать гуманизированное антитело, которое состоит из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:65 (Фигура 80) CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:66 (Фигура 81), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:67 (Фигура 82), и легкой цепи, имеющей вариабельную область, содержащую CDRL1 состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:68 (Фигура 83), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:69 (Фигура 84), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:70 (Фигура 85), и распознает белок LAG-3 по настоящему изобретению, его связывающий фрагмент или его мутант.

Предпочтительные примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению включают те, что описаны в пунктах А-Е выше. Более предпочтительные примеры гуманизированного антитела могут включать, но не ограничиваются ими, hLA212_H2/L1-hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1-hLA212_H3/L5 и hLA212_H4/L2 (см. [i]-[x] ниже). Например, более предпочтительные примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению также включают антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи любого из гуманизированных антител hLA212_H2/L1 - hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 - hLA212_H3/L5 и hLA212_H4/L2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи любого из гуманизированных антител hLA212_H2/L1 - hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 - hLA212_H3/L5 и hLA212_H4/L2.

[i]

[i-1] hLA212_H3/L2 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:29 (Фигура 44) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а ее аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:33 (Фигура 48) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), и его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:34 (Фигура 49) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и активностью ADCC in vitro, описанной в (3-2) и (3-3), свойством, описанным в (3-8), то есть присутствие антитела, позволяющего человеческому LAG-3 проявлять функцию подавления Т-клеток человека (см. Примеры) и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-7).

[i-2] hLA212_H4/L2 представляет собой гуманизированное антитело, которое было получено в Примере 8 и модификация сахарной цепи которого регулируется, и является формой с низким содержанием фукозы для hLA212_H3/L2. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:29 (Фигура 44) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность ее легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:33 (Фигура 48) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), и его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:34 (Фигура 49) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны) обладает активностью связывания LAG-3, активностью ADCC in vitro, активностью снижения количества LAG-3-положительных клеток in vivo и ингибирующей активностью экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита in vivo, описанной в (3-2)-(3-5) (см. примеры), обладает активностью связывания активированных Т-клеток человека, описанной в (3-6), и обладает свойствами, описанными в (3-7) и (3-8), то есть присутствие антитела, позволяющего LAG-3 человека проявлять свои имеющиеся активности.

[ii] hLA212_H2/L1 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:27 (Фигура 42) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:31 (Фигура 46) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:32 (Фигура 47) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и активностью ADCC in vitro, описанной в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[iii] hLA212_H3/L3 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:29 (Фигура 44) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:35 (Фигура 50) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:36 (Фигура 51) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и активностью ADCC in vitro, описанной в (3-2) и (3-3) (см. примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[iv] hLA212_H2/L2 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:27 (Фигура 42) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:33 (Фигура 48) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), и его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:34 (Фигура 49) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и активностью ADCC in vitro, описанной в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[v] hLA212_H2/L3 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:27 (Фигура 42) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:35 (Фигура 50) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:36 (Фигура 51) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и активностью ADCC in vitro, описанной в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[vi] hLA212_H2/L4 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:27 (Фигура 42) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:37 (Фигура 52) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:38 (Фигура 53) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и in vitro активностью ADCC, описанной в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[vii] hLA212_H2/L5 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:27 (Фигура 42) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:28 (Фигура 43) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:39 (Фигура 504) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:40 (Фигура 55) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и in vitro активностью ADCC, описанной в (3-2) и (3-3) (см. примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[viii] hLA212_H3/L1 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:29 (Фигура 44) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:31 (Фигура 46) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:32 (Фигура 47) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и in vitro активностью ADCC, описанной в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[ix] hLA212_H3/L4 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:29 (Фигура 44) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:37 (Фигура 52) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:38 (Фигура 53) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и in vitro активностью ADCC, описанной в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

[x] hLA212_H3/L5 представляет собой гуманизированное антитело, полученное в Примере 6. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи этого антитела содержит нуклеотиды положений 58-1410 SEQ ID NO:29 (Фигура 44) (где вариабельная область соответствует положениям 58-420), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 20-470 SEQ ID NO:30 (Фигура 45) (где вариабельная область соответствует положениям 20-140). Нуклеотидная последовательность его легкой цепи содержит нуклеотиды положений 61-702 SEQ ID NO:39 (Фигура 54) (где вариабельная область соответствует положениям 61-387), а его аминокислотная последовательность содержит аминокислоты положений 21-234 SEQ ID NO:40 (Фигура 55) (где вариабельная область соответствует положениям 21-129). Методами, описанными в Примерах, можно оценить, что антитело обладает физическими свойствами, подходящими для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению (данные не показаны), обладает активностью связывания LAG-3 и in vitro активностью ADCC, описанными в (3-2) и (3-3) (см. Примеры), и обладает активностями, свойствами и тому подобное, описанными в (3-4)-(3-8).

В [i]-[x] выше, активности, описанные в (3-4) и (3-5), предпочтительно могут быть оценены в форме с низким содержанием фукозы. Термин «физические свойства» в настоящем изобретении означает стабильность антитела и его связывающего фрагмента по настоящему изобретению в качестве физического тела, которая может быть оценена с использованием известного показателя. Примеры стабильности в качестве физического тела могут включать термостабильность и стабильность при хранении, а примеры их показателей могут включать значения Tm, полученные из термограмм, и изменения антигенсвязывающей активности в условиях хранения или при ускоренном ухудшении условий или изменения во времени.

Кроме того, hLA212 антитело_H4/L2, вводили дважды трансгенным мышам по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA, описанным в Примере 10, в виде разовой дозы, в результате чего, не наблюдали потери веса и других заметных токсичных событий. Таким образом, гуманизированное антитело по настоящему изобретению обладает безопасностью, подходящей для способов лечения или профилактики заболеваний, связанных с LAG-3-положительными клетками (определенные в другом месте), для применений для такого лечения или профилактики, для фармацевтических композиций для лечения или профилактики и тому подобное. Из более предпочтительных примеров гуманизированного антитела против LAG-3 и его связывающего фрагмента по настоящему изобретению, описанных выше, hLA212_H3/L2, hLA212_H2/L1, hLA212_H3/L3, hLA212_H3/L6 и hLA212_H4/L2 являются еще более предпочтительными.

HLA212_H2/L1-H2/L5, hLA212_H3/L1-H3/L5, hLA212_H4/L2 и тому подобное, включенные в более предпочтительный диапазон гуманизированных антител против LAG-3 по настоящему изобретению, могут включать тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до нескольких, предпочтительно 1 или 2 аминокислоты заменены другими аминокислотами в FRH1-FRH4 аминокислотной последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, в которой 1 или более предпочтительно любое количество аминокислот, выбранных из 1-14, заменены другими аминокислотами в FRL1-FRL4 аминокислотной последовательности легкой цепи.

Более предпочтительно, в легкой цепи гуманизированного антитела аминокислота 1 FRL1, то есть аминокислота 1 в зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 21 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47), представляет собой Asp или Asn, аминокислота 11 из FRL1, то есть аминокислота 11 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 31 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47), представляет собой Leu или Met, аминокислота 13 из FRL1, то есть аминокислота 13 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 33 в SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Ala или Ile, аминокислота 21 из FRL1, то есть аминокислота 21 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 41 в SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47), представляет собой Ile или Met, аминокислота 4 из FRL2, то есть аминокислота 38 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 58 в SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Gln или Lys, аминокислота 9 из FRL2, то есть аминокислота 43 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая в положении 63 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Ala или Ser, аминокислота 4 из FRL3, то есть аминокислота 60 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 80 SEQ ID NO:32, или на Фигуре 47) представляет собой Ser или Asp, аминокислота 9 из FRL3, то есть аминокислота 65 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 85 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Ser или Gly, аминокислота 11 из FRL3, то есть аминокислота 67 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 87 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47), представляет собой Ser или Tyr, аминокислота 22 из FRL3, то есть аминокислоту 78 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 98 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Leu или Val, аминокислота 27 из FRL3, то есть аминокислота 83 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая в положении 103 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Phe или Ala, аминокислота 29 из FRL3, то есть аминокислота 85 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая в положении 105 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47) представляет собой Thr или Phe, аминокислота 7 из FRL4, то есть аминокислота 104 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 124 SEQ ID NO:32, или на Фигуре 47) представляет собой Val или Leu, а аминокислота 9 из FRL4, то есть аминокислота 106 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 126 SEQ ID NO:32 или на Фигуре 47), представляет собой Ile или Leu.

Более предпочтительно в тяжелой цепи гуманизированного антитела аминокислота 14 из FRH2, то есть аминокислота 49 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 68 SEQ ID NO:28 или на Фигуре 43), представляет собой Gly или Ala, и аминокислота 25 из FRH3, то есть аминокислота 84 зрелой вариабельной области (аминокислота, соответствующая положению 103 SEQ ID NO:28 или на Фигуре 43), представляет собой Asn или Asp.

Настоящее изобретение также охватывает антитело, которое содержит тяжелую цепь и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую 80% или выше, 82% или выше, 84% или выше, 86% или выше, 88% или выше, 90 % или выше, 92% или выше, 94% или выше, 96% или выше, 98% или выше, или 99% или выше идентичности с полноразмерной аминокислотной последовательностью или вариабельными областями тяжелой цепи и/или легкой цепи любого из антител rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 и cLA1264, а также гуманизированных hLA212_H2/L1 к hLA212_H2/h2L2/h1/h2L2 hLA212_H4/L2 антител по настоящему изобретению, и которое связывается с LAG-3 или его связывающим фрагментом. Такая идентичность последовательности предпочтительно составляет 94% или выше, более предпочтительно 96% или выше, еще более предпочтительно 98% или выше, оптимально 99% или выше. Кроме того, антитело или его связывающий фрагмент имеют свойства, функции, активности и тому подобное, описанные в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4) - (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение выше, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все от (3-2) до (3-8).

Идентичность или гомологию между двумя типами аминокислотных последовательностей можно определить с помощью параметров по умолчанию алгоритма Blast версии 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), «Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Алгоритм Blast также доступен, например, через доступ в Интернет по адресу http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.

Настоящее изобретение также охватывает антитело, которое содержит тяжелую цепь и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая получена из полноразмерной аминокислотной последовательности или вариабельной области тяжелой цепи и/или легкой цепи любого одного из антител rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 и cLA1264, а также антител cLA1264 и hLA212_H2/L1 - hLA212_H2/L5, hLA212_H3/L1 - hLA212_H3/L5 и hLA212_H4/L2 по настоящему изобретению путем замены, удаления, добавления и/или вставки от 1 до 50 аминокислот, от 1 до 45, от 1 до 40, от 1 до 35, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты, и которое связывается с LAG-3 или его связывающим фрагментом. Такая аминокислотная мутация предпочтительно является заменой. Количество мутированных аминокислот предпочтительно составляет от 1 до 5, более предпочтительно от 1 до 4, еще более предпочтительно от 1 до 3, еще более предпочтительно от 1 до 2, наиболее предпочтительно 1. Кроме того, антитело или его связывающий фрагмент имеют свойства, функции, активности и тому подобное, описанные в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все (3-2)-(3-8).

Настоящее изобретение также охватывает антитело, которое содержит тяжелую цепь и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью нуклеотида, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи и/или легкой цепи любого одного из антител rLA204, rLA212, rLA225, rLA869, rLA1264, cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 и cLA1264, и hLA212_H2 к hLA212_H2/L5, от hLA212_H3/L1 до hLA212_H3/L5 и hLA212_H4/L2 антител по настоящему изобретению, и которое связывается с LAG-3 или его связывающим фрагментом. Кроме того, антитело или его связывающий фрагмент имеют свойства, функции, активности и тому подобное, описанные в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение выше, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все от (3-2) до (3-8).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к человеческому антителу или его связывающему фрагменту. Человеческое антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению конкретно ничем не ограничены, при условии, что оно является антителом человеческого происхождения, которое связывается с LAG-3 или его связывающим фрагментом, но которое обладает свойствами, функциями, активностями и тому подобное, описанными в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5), и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все (3-2)-(3-8).

(3-13) Связывание антитела с эпитопом

«Связывание антитела с тем же сайтом», что и в случае антитела, предложенного настоящим изобретением, также включено в понятие антитела по настоящему изобретению. «Связывание антитела с тем же сайтом», что и определенное антитело, означает другое антитело, которое связывается с сайтом на молекуле антигена, распознаваемого антителом. Если второе антитело связывается с неполным пептидом или с неполной трехмерной структурой на молекуле антигена, связанной первым антителом, то первое и второе антитела определяются как связывающиеся с одним и тем же сайтом. Альтернативно, первое и второе антитела определяются как связывающиеся с одним и тем же сайтом, подтверждая, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном, то есть второе антитело препятствует связыванию первого антитела с антигеном, даже если пептидная последовательность или трехмерная структура конкретного сайта связывания не определены. Когда первое и второе антитела связываются с одним и тем же сайтом, а первое антитело обладает эффектом, характерным для одного аспекта антитела по настоящему изобретению, таким как его присутствие, позволяющее LAG-3 проявлять функцию подавления Т-клеток, второе антитело также имеет чрезвычайно высокую вероятность того, чтобы иметь такую же активность. Таким образом, если второе антитело против LAG-3 связывается с сайтом, связанным первым антителом против LAG-3, то первое и второе антитела определяются как связывающиеся с одним и тем же сайтом белка LAG-3. Альтернативно, первое и второе антитела против LAG-3 определяют как связывающие с одним и тем же сайтом белка LAG-3, подтверждая, что второе антитело против LAG-3 конкурирует с первым антителом против LAG-3 за связывание с белок LAG-3.

Настоящее изобретение также охватывает связывание антитела с сайтом белка LAG-3, распознаваемым моноклональным антителом по настоящему изобретению. Кроме того, антитело или его связывающий фрагмент имеют свойства, функции, активности и тому подобное, описанные в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одно или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все от (3-2) до (3-8).

Сайт связывания антитела может быть определен способом, хорошо известным специалистам в данной области, таким как иммуноанализ. Например, серию пептидов получают путем соответствующего последовательного отщепления аминокислотной последовательности антигена от его С-конца или N-конца, и реактивность антитела к нему изучают, чтобы приблизительно определить сайт распознавания. Затем синтезируют более короткие пептиды, и тем самым можно изучить реактивность антитела к этим пептидам, чтобы определить сайт связывания. Пептиды антигенных фрагментов могут быть получены с использованием методики, такой как рекомбинация генов или синтез пептидов.

Когда антитело связывается или распознает неполную конформацию антигена, сайт связывания для антитела может быть определен путем идентификации аминокислотных остатков на антигене, смежном с антителом, с использованием рентгеноструктурного анализа. Например, антитело или его фрагмент и антиген или его фрагмент могут быть связаны друг с другом и кристаллизованы с последующим структурным анализом для идентификации каждого аминокислотного остатка на антигене, имеющего расстояние взаимодействия с антителом. Расстояние взаимодействия составляет 8 Ангстрем или короче, предпочтительно 6 Ангстрем или короче, более предпочтительно 4 Ангстрем или короче. Один или более таких аминокислотных остатков, имеющих расстояние взаимодействия с антителом, могут составлять сайт (эпитоп) на антигене, с которым связывается антитело. Два или более таких аминокислотных остатка могут не быть смежными друг с другом в первичной последовательности.

Эпитоп антитела по настоящему изобретению присутствует в человеческом LAG-3 или его аминокислотной последовательности. Антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению или его модифицированная форма также охватывает антитело, связывающееся с этим эпитопом, конкурирующее с антителом по настоящему изобретению за связывание с эпитопом или имеющее расстояние взаимодействия с этими аминокислотными остатками, его связывающий фрагмент или его модифицированную форму.

(3-14) Модифицированная форма антитела

Настоящее изобретение относится к модифицированной форме антитела или его связывающего фрагмента. Модифицированная форма антитела или его связывающего фрагмента по настоящему изобретению означает антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению, обеспеченные химической или биологической модификацией. Химически модифицированная форма включает, например, форму, имеющую аминокислотный скелет, конъюгированный с химическим фрагментом, и форму, имеющую химически модифицированную N-связанную или О-связанную углеводную цепь. Биологически модифицированная форма включает, например, форму, которая подверглась посттрансляционной модификации (например, N-связанное или O-связанное гликозилирование, N-концевая или С-концевая обработка, дезамидирование, изомеризация аспарагиновой кислоты или окисление метионина) и форму, содержащую остаток метионина, добавленный к N-концу при экспрессии с использованием прокариотических клеток-хозяев. Предполагается, что такая модифицированная форма также включает форму, меченную для обнаружения или выделения антитела или антигена по настоящему изобретению, например, меченую ферментом форму, флуоресцентно меченную форму или аффинно-меченную форму. Такая модифицированная форма антитела или его связывающего фрагмента по настоящему изобретению полезна для улучшения стабильности или удержания в крови исходного антитела по настоящему изобретению или его исходного связывающего фрагмента, снижения антигенности, для детектирования или выделения антитела или антигена и тому подобное.

Примеры химического фрагмента, содержащегося в химически модифицированной форме, могут включать водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран и поливиниловый спирт.

Примеры биологически модифицированной формы могут включать форму, модифицированную ферментативной обработкой, обработкой клеток или тому подобным, форму, слитую с другим пептидом, таким как метка, добавленная рекомбинацией генов, и форму, полученную из клеток-хозяев, экспрессирующих эндогенный или экзогенный фермент, модифицирующий сахарную цепь.

Активность антитело-зависимой клеточной цитотоксичности антитела или его связывающего фрагмента по настоящему изобретению может быть повышена путем регулирования модификации (гликозилирование, дефукозилирование и тому подобное) сахарной цепи, связанной с антителом или связывающим фрагментом. Например, способы, описанные в WO 99/54342, WO 00/61739 и WO 02/31140, известны в качестве метода регулирования модификации в сахарной цепи антитела, хотя этот способ не ограничивается этим. Модифицированная форма антитела по настоящему изобретению также включает антитело, которое подверглось модификации сахарной цепи, регулируемой таким образом.

Такая модификация может быть осуществлена в произвольном положении или в желаемом положении антитела или его связывающего фрагмента. Одни и те же или две или более разных модификаций могут быть осуществлены в одном или двух или более их положениях.

В настоящем изобретении «модифицированная форма фрагмента антитела» также подразумевает включение даже «фрагмента модифицированной формы антитела».

В настоящем изобретении модифицированную форму антитела или модифицированную форму его связывающего фрагмента также просто обозначают как «антитело» или «связывающий фрагмент антитела».

Как описано выше, hLA212_H4/L2 представляет собой гуманизированное антитело, которое было получено в Примере 8, и модификация сахарной цепи которого была отрегулирована. Гуманизированное антитело также охватывается антителом по настоящему изобретению.

Антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению и его модифицированные формы, как описано выше, предпочтительно имеют физические свойства, фармакокинетику, задержку в крови, безопасность и тому подобное, которые подходят для фармацевтической композиции, способа лечения или профилактики, применения для лечения или профилактики и тому подобное по настоящему изобретению.

4. Способ получения антитела

(4-1) Способ с использованием гибридомы

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению может быть получено в соответствии со способом Kohler и Milstein (Kohler and Milstein, Nature (1975), 256, p. 495-497; and Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)). Таким образом, клетки, продуцирующие антитело против LAG-3, выделяют из селезенки животных, иммунизированных белком LAG-3 или его растворимой формой, и клетки сливают с клетками миеломы, тем самым создавая гибридомы. Моноклональные антитела могут быть получены из культур этих гибридом.

(4-1-1) Получение антигена

Антиген для получения антитела против LAG-3 может быть получен согласно, например, способу получения нативного или рекомбинантного белка LAG-3, описанному в других параграфах настоящего изобретения. Примеры антигена, который может быть получен таким образом, могут включать белок LAG-3, фрагмент белка LAG-3, содержащий неполную последовательность по меньшей мере с 6 последовательными аминокислотами белка LAG-3, и их производные, дополнительно содержащие произвольную аминокислотную последовательность или носитель, добавленный к ней (далее коллективно обозначают как «LAG-3-антиген»).

Рекомбинантный антиген LAG-3 может быть получен путем трансфекции клеток-хозяев геном, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность антигена LAG-3, и путем извлечения антигена из культур клеток. Такой рекомбинантный антиген может представлять собой слитый белок с другим белком, таким как Fc-область иммуноглобулина. Антиген LAG-3, полученный в бесклеточной системе трансляции in vitro из гена, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность антигена LAG-3, также включен в понятие рекомбинантного антигена LAG-3. Нерекомбинантный антиген LAG-3 может быть очищен и выделен из клеток, экспрессирующих LAG-3, или тому подобное.

Для того чтобы получить моноклональное антитело против LAG-3, присутствие которого позволяет LAG-3 оказывать функцию подавления функции Т-клеток или не подавляет или не ингибирует функцию LAG-3 по подавлению функции Т-клеток, мутант LAG-3, в котором иммуноглобулиноподобные домены 1 и 2 удаляются, например, может быть использован в качестве предпочтительного иммуногена.

(4-1-2) Получение моноклонального антитела против LAG-3

Моноклональное антитело обычно получают посредством следующих стадий:

(а) получение антигена,

(b) получение антителопродуцирующих клеток,

(c) получение клеток миеломы (далее называемых «миеломами»),

(d) слияние антителопродуцирующих клеток с миеломами,

(e) скрининг группы гибридом, продуцирующих интересующее антитело, и

(f) получение клонов одиночных клеток (клонирование).

Этот способ получения дополнительно включает стадии (g) культивирования гибридом, выращивания животных с трансплантированной гибридомой и тому подобное и (h) анализа или определения биологической активности моноклонального антитела и тому подобное, если это необходимо.

Далее способ получения моноклонального антитела будет подробно описан со ссылкой на эти стадии. Однако способ получения антитела не ограничивается этими стадиями, и можно использовать клетки, продуцирующие антитело, отличные например, от клеток селезенки.

(а) Очистка антигена

Эту стадию осуществляют в соответствии со способом получения белка LAG-3, описанным выше в (2-3).

(b) Стадия получения антителопродуцирующей клетки.

Антиген, полученный на стадии (а), смешивают с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или сульфат калия-алюминия, и лабораторных животных иммунизируют полученным иммуногеном. Любое лабораторное животное, используемое в способе получения гибридомы, известном в данной области, можно использовать без ограничений. Конкретно, например, могут быть использованы мыши, крысы, козы, овцы, крупный рогатый скот или лошади. С точки зрения легкодоступных клеток миеломы для слияния с выделенными антителопродуцирующими клетками и тому подобное иммунизируемыми животными предпочтительно являются мыши или крысы.

Используемая линия мышей или крыс конкретно ничем не ограничена. В случае мышей, например, можно использовать A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB или 129. В случае крыс, например, можно использовать Wistar, Low, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN или Fischer.

Эти мыши и крысы доступны от разводчиков или дистрибьюторов лабораторных животных, например, CLEA Japan, Inc. или Charles River Laboratories Japan Inc.

Из этих мышей и крыс линия мышей BALB/c или линии крыс Wistar и Low особенно предпочтительны в качестве животных, которые должны быть иммунизированы с учетом совместимости слияния с клетками миеломы, описанными ниже.

Кроме того, принимая во внимание гомологию между человеческими и мышиными антигенами, также предпочтительно используют мышей, чей биологический механизм удаления аутоантител был ослаблен, то есть мышей с аутоиммунным заболеванием.

В этом контексте возраст этих мышей или крыс во время иммунизации предпочтительно составляет от 5 до 12 недель, более предпочтительно от 6 до 8 недель.

Животных можно иммунизировать белком LAG-3, используя, например, метод Weir, DM, Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964).

Примеры способов определения титров антител могут включать, но не ограничиваются ими, иммуноанализы, такие как РИА и ИФА.

Антителообразующие клетки, полученные из клеток селезенки или лимфоцитов, выделенных от иммунизированных животных, могут быть получены в соответствии со способом, известным в данной области, например, Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Kohler et al., Eur.J. Immnol. (1977) 6, p.511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495.

В случае клеток селезенки может быть принят общий метод, который включает в себя измельчение селезенки, фильтрацию клеток через сито из нержавеющей стали, а затем суспендирование полученных клеток в минимальной необходимой среде Игла (MEM) или тому подобном для выделения антителопродуцирующих клеток.

(c) Стадия получения миелом

Клетки миеломы, используемые при слиянии клеток, конкретно ничем не ограничены и могут быть соответствующим образом выбраны для использования из клеточных линий, известных в данной области. Например, линия, дефицитная по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (HGPRT), то есть ведущая происхождение из мышей X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45,6TG), FO, S149/5XXO или BU.1, из крыс 210RSY3. Ag.1.2.3 (Y3) или человека U266AR (SKO-007), GM1500-GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2) или 8226AR/NIP4-1 (NP41) и тому подобное, процедуры скрининга которых уже были разработаны, предпочтительно используется с учетом удобства выбора гибридом из слитых клеток. Эти HGPRT-дефицитные линии доступны, например, из Американской коллекции типовых культур (ATCC).

Эти клеточные линии субкультивировали в подходящей среде, например, в среде 8-азагуанина [среда RPMI-1640, дополненная глутамином, 2-меркаптоэтанолом, гентамицином и фетальной бычьей сывороткой (далее именуемой «FBS»), и дополнительно дополненная 8-азагуанином], модифицированная по Искову среда Дульбекко (в дальнейшем именуемая «IMDM»), или модифицированная Дульбекко среда Игла (далее называемая «DMEM») и субкультивировали в нормальной среде [например, среде ASF104 (производства Ajinomoto Co., Inc.), содержащей 10% FBS] от 3 до 4 дней до слияния клеток, чтобы обеспечить число клеток, равное или больше чем 2×10⁷ клеток в день слияния клеток.

(d) Стадия слияния антителопродуцирующей клетки с клеткой миеломы.

Антителопродуцирующие клетки могут быть слиты с клетками миеломы в условиях, которые препятствуют чрезмерному снижению жизнеспособности клеток, в соответствии с любым способом, известным в данной области (например, Weir, DM, Handbook of Experimental Immunology, Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), и Kabat, E.A .and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964)). Например, может быть использован химический метод, который включает смешивание антителопродуцирующих клеток с клетками миеломы в высококонцентрированном растворе полимера, такого как полиэтиленгликоль, или физический метод с использованием электростимуляции.

(e) Стадия скрининга гибридомной группы, продуцирующей антитело.

Способ селекции гибридом, полученных путем слияния клеток, особо ничем не ограничен, и, как правило, используют способ отбора по гипоксантин-аминоптерин-тимидину (HAT) (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550). Этот метод эффективен для получения гибридом с использованием HGPRT-дефицитной клеточной линии миеломы, которая не может выжить в присутствии аминоптерина. В частности, не слитые клетки и гибридомы можно культивировать в среде HAT, чтобы, таким образом, только гибридомы, устойчивые к аминоптерину, могли селективно выживать и расти.

(f) Стадия получения клона одной клетки (клонирование)

Гибридомы могут быть клонированы с использованием любого метода, известного в данной области, например, с использованием метилцеллюлозы, мягкой агарозы или метода лимитирующего разбавления (см., например, Barbara, BM and Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Метод лимитирующего разбавления является предпочтительным.

(g) Стадия культивирования гибридомы и стадия выращивания животного с трансплантированной гибридомой

Отобранные гибридомы можно культивировать, чтобы тем самым продуцировать моноклональные антитела. Предпочтительно желаемые гибридомы клонируют и затем подвергают продуцированию антител.

Моноклональное антитело, продуцируемое такой гибридомой, может быть выделено из культур гибридомы. Также рекомбинантное антитело может быть выделено из культур клеток, в которые введен ген моноклонального антитела. Альтернативно, гибридома может быть инъецирована внутрибрюшинно мышам той же линии (например, BALB/cAnNCrj, описанным выше) или мышам Nu/Nu и им дается возможность для роста. Затем моноклональное антитело может быть извлечено из их асцитов.

(h) Стадия оценки или определения биологической активности моноклонального антитела.

Различные биологические тесты могут быть выбраны и применены к ним в соответствии с назначением.

(4-2) Способ клеточной иммунизации

Клетки, экспрессирующие нативный белок LAG-3, клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок LAG-3 или его фрагмент, или тому подобное, можно использовать в качестве иммуногенов, с получением посредством этого антитела против LAG-3 гибридомным способом, описанным выше.

Эти LAG-3-экспрессирующие клетки используют в количестве от 1×10⁵ до 1×10⁹ клеток, предпочтительно от 1×10⁶ до 1×10⁸ клеток, более предпочтительно от 0,5 до 2×10⁷ клеток, еще более предпочтительно 1×10⁷ клеток, на инъекцию для иммунизаци. Количество клеток, используемых для иммунизации, может быть изменено в соответствии с уровнем экспрессии белка LAG-3. Иммуногены обычно вводят внутрибрюшинно, а также могут вводить внутрикожным путем или тому подобное. Гибридомы могут быть получены путем применения метода, описанного в параграфе (4-1-2).

(4-3) Рекомбинация генов

Чтобы получить антитело по настоящему изобретению, нуклеотид (нуклеотид тяжелой цепи), содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность его тяжелой цепи, и нуклеотид (нуклеотид легкой цепи), содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность его легкой цепи, или вектор, имеющий вставку из нуклеотида тяжелой цепи, и вектор, имеющий вставку из нуклеотида легкой цепи, вводят в клетки-хозяева, а затем клетки культивируют, и антитело может быть выделено из культур. Нуклеотид тяжелой цепи и нуклеотид легкой цепи могут быть встроены в один вектор.

В качестве клеток-хозяев можно использовать прокариотические или эукариотические клетки. В случае использования эукариотических клеток-хозяев можно использовать клетки животных, растительные клетки или эукариотические микробы.

Примеры клеток животных могут включать клетки, полученные из млекопитающих, то есть клетки COS, полученные из обезьян (Gluzman, Y. Cell (1981), 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), фибробласты мыши NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), клеточную линию мышиных NS0 (ECACC), клетки яичника китайского хомяка (клетки CHO, ATCC CCL-61), их дефицитные по дигидрофолатредуктазе линии (CHOdhfr; Urlaub G. and Chasin, LA Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. (1980), 77, p. 4126-4220), CHOK1SV (Lonza Biologics), клетки, полученные из птиц, таких как курица, и клетки, полученные из насекомых.

Кроме того, в качестве хозяев могут быть использованы клетки, модифицированные для корректировки модификации сахарной цепи белков, таких как антитела. Например, клетки СНО, модифицированные так, что фукоза, связанная с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающих концах сахарных цепей, восстанавливается или удаляется из связанных с N-гликозидом сахарных цепей сложного типа, связывающихся с Fc-областью антитела, могут быть использованы при экспрессии антител, так чтобы получить антитело с низким содержанием фукозы или дефукозилированное антитело (также называемое модифицированной формой антитела) (WO00/61739, WO02/31140 и тому подобное).

Примеры эукариотических микробов могут включать дрожжи.

Примеры прокариотических клеток могут включать E.coli и Bacillus subtilis.

Сигнальный пептид для секреции антитела по настоящему изобретению (моноклональное антитело, полученное от любого животного, крысиное антитело, мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело и т.д.) не ограничивается секреторным сигналом антитела того же вида, того же типа и того же подтипа, что и антитело по настоящему изобретению или собственным сигналом секреции антитела по настоящему изобретению. Любой секреторный сигнал антитела другого типа или подтипа из него или любой секреторный сигнал белка, полученного из другого эукариотического вида или прокариотического вида, может быть выбран и использован.

(4-4) Способы конструирования и получения гуманизированных антител

Примеры гуманизированного антитела могут включать, но не ограничиваются этим, антитело человеческого происхождения, имеющее CDR, замененные на CDR антитела животного, не являющегося человеком (см. Nature (1986), 321, p. 522-525), человеческое антитело с трансплантированными последовательностями CDR и некоторыми аминокислотными остатками каркасных областей с помощью трансплантации CDR (см. WO90/07861 и US6972323), и любое из указанных гуманизированных антител, где одна или две или более аминокислот, полученных из антитела животного, не являющегося человеком, были заменены аминокислотами, полученными из антител человека.

(4-5) Способ получения человеческого антитела

Дополнительные примеры антител по настоящему изобретению могут включать человеческое антитело. Антитело против LAG-3 человека означает антитело против LAG-3, состоящее из аминокислотной последовательности антитела человеческого происхождения. Человеческое антитело против LAG-3 может быть получено способом с использованием мышей, продуцирующих человеческие антитела, несущих фрагменты геномной ДНК человека, содержащие гены тяжелой и легкой цепи человеческого антитела (см., например, Tomizuka, K.et al., Nature Genetics (1997). 16, p.133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; and Tomizuka, K.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, с.722-727).

В частности, такими животными, продуцирующими человеческие антитела, могут быть любые рекомбинантные животные, которые получают путем разрушения локусов эндогенного гена тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина млекопитающих, не являющихся человеком, и вместо этого вводят в них локусы генов тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина посредством векторов на основе искусственной дрожжевой хромосомы (YAC) или тому подобное, и рекомбинантные животные, которые созданы путем скрещивания этих животных.

Альтернативно, эукариотические клетки могут быть трансфецированы (трансформированы) кДНК, кодирующими тяжелые и легкие цепи, соответственно, такого человеческого антитела, предпочтительно векторами, содержащими кДНК, методом рекомбинации генов. Трансфецированные (трансформированные) клетки, продуцирующие рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, можно культивировать. Это антитело может быть получено из супернатанта культуры.

В этом контексте, например, эукариотические клетки, предпочтительно клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, лимфоциты или миеломы, могут быть использованы в качестве хозяев.

Кроме того, известен способ получения человеческого антитела, полученного с использованием фагового дисплея, выбранного из библиотеки антител человека (см., например, Wormstone, IM et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; and Siriwardena, D.et al., Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431).

Например, может быть использован метод фагового дисплея (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116), который включает обеспечение возможности экспрессии вариабельных областей человеческого антитела в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага и отбор фага, связывающегося с антигеном.

Фаг, отобранный на основе его способности связываться с антигеном, может быть подвергнут генному анализу, чтобы таким образом определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области человеческого антитела, связывающиеся с антигеном.

Если определяется последовательность ДНК scFv, связывающегося с антигеном, может быть получен экспрессирующий вектор, содержащий эту последовательность, и введен в соответствующих хозяев, чтобы получить возможность экспрессии человеческого антитело (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu.Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455 и Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).

(4-6) Способ получения связывающего фрагмента антитела

Способ получения одноцепочечного антитела хорошо известен в данной области (см., например, патенты США № 4946778, 5260203, 5091513 и 5455030). В этом scFv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны через линкер, который предотвращает образование ими конъюгата, предпочтительно через полипептидный линкер (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p. 5879-5883). Вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи в scFv могут быть получены из одного и того же антитела или могут быть получены из разных антител.

Например, произвольный одноцепочечный пептид, состоящий из 12-19 остатков, используется в качестве полипептидного линкера, который связывает эти вариабельные области.

Чтобы получить scFv-кодирующую ДНК, из последовательностей ДНК, кодирующих тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела, и ДНК, кодирующей легкую цепь или вариабельную область легкой цепи, каждая часть ДНК, кодирующая полную или желаемую аминокислотную последовательность, используется в качестве матрицы и амплифицируется с помощью ПЦР с использованием пары праймеров, фланкирующих оба конца матрицы. Впоследствии ДНК, кодирующая полипептидный линкерный фрагмент, дополнительно амплифицируется в комбинации с парой праймеров, фланкирующих оба конца ДНК, так что полученный фрагмент может быть связан на своих концах с ДНК тяжелой и легкой цепи, соответственно.

Таким образом, ДНК, кодирующая scFv, может быть использована для получения в соответствии с обычным способом экспрессирующего вектора, содержащего ДНК и клетки-хозяева, трансформированные экспрессирующим вектором. Кроме того, клетки-хозяева можно культивировать, а scFv можно извлечь из культур в соответствии с обычным методом.

Также для того, чтобы получить любой другой связывающий фрагмент антитела, ген, кодирующий связывающий фрагмент, получают по методике, описанной выше, и вводят в клетки. Интересующий связывающий фрагмент может быть извлечен из культур клеток.

Антитело по настоящему изобретению может быть мультимеризовано таким образом, чтобы увеличить его аффинность к антигену. В этом случае антитела одного типа могут быть мультимеризованы, или множество антител, распознающих множество эпитопов, соответственно, одного и того же антигена, могут быть мультимеризованы. Примеры способов мультимеризации этих антител могут включать в себя связывание двух scFv с доменом IgG CH3, их связывание со стрептавидином и введение мотива спираль-поворот-спираль.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой смесь нескольких типов антител против LAG-3, различающихся по аминокислотной последовательности, то есть поликлональное антитело. Примеры поликлонального антитела могут включать смесь нескольких типов антител, различающихся по части или по всей их CDR. Такое поликлональное антитело может быть выделено из смешанных культур клеток, продуцирующих различные антитела (WO 2004/061104). Альтернативно, могут быть смешаны отдельно приготовленные антитела. Антисыворотка, которая является одним из воплощений поликлонального антитела, может быть получена путем иммунизации животных желаемым антигеном и путем выделения сыворотки от животных в соответствии со стандартным способом.

Антитела, конъюгированные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), также могут быть использованы в качестве модифицированных форм антитела.

Антитело по настоящему изобретению может дополнительно представлять собой любой из конъюгатов, образованных этими антителами с другими лекарственными средствами (иммуноконъюгатами). Примеры такого антитела могут включать антитело, конъюгированное с радиоактивным материалом, или соединение, обладающее фармакологическим действием (Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1137-1146).

Антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению, а также его модифицированные формы, приведенные в качестве примеров или описанные в (3-11), (3-14), (4-6) и тому подобное, также называют «антителом по настоящему изобретению или молекулами, содержащими его связывающий фрагмент».

(4-7) Очистка антитела

Полученное антитело может быть очищено до гомогенного состояния. Обычные способы разделения и очистки белка могут быть использованы для разделения и очистки антитела.

Антитело может быть отделено и очищено подходящим образом выбранным или комбинированным подходом (подходами), например, с помощью хроматографических колонок, фильтров, ультрафильтрации, высаливания, диализа, препаративного электрофореза в полиакриламидном геле и/или изоэлектрического фокусирования (Strategies for Protein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); and Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), хотя способы разделения и очистки не ограничены этим.

Примеры хроматографии включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой и адсорбционную хроматографию.

Эти хроматографические подходы могут быть выполнены с использованием жидкофазной хроматографии, такой как HPLC или FPLC.

Примеры колонок, используемых в аффинной хроматографии, могут включать колонки с протеином A, протеином G и антигеном.

Примеры колонок с протеином А включают Hyper D (производства Pall Corp.), POROS (производства Applied Biosystems, Inc.) и Sepharose FF (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).

Кроме того, антитело может быть очищено с использованием его активности связывания против антигена с использованием антиген-иммобилизованного носителя.

(4-8) Нуклеотиды, кодирующие антитело, рекомбинантный вектор и рекомбинантная клетка

Настоящее изобретение также относится к нуклеотиду, кодирующему антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению, или его модифицированную форму (далее этот нуклеотид обозначается как «ген антитела»), к рекомбинантному вектору, содержащему вставку гена, к клетке, содержащей ген или вектор (далее эта клетка называется «клетка, трансфецированная геном антитела»), и к клетке, продуцирующей антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению, или его модифицированную форму (далее эта клетка обозначается как «клетка, продуцирующая антитело»).

Предпочтительно, ген антитела по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, описанную в любом из пунктов (а)-(е) ниже (далее обозначаемую как «последовательностью гена антитела»), состоит из нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность гена антитела, или состоит из последовательности гена антитела:

(a) комбинация нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи любого из антител крысы rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, их химерных антител cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 и cLA8664, в которых константные области тяжелой цепи и легкой цепи заменены таковыми человеческих антител, и их гуманизированных антител hLA212_H2/L1 - hLA212_H2/L5 и LA212_H3/L1 - hLA212_H3/L5, и нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность их легких цепей;

(b) комбинация нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащей CDRH1 - CDRH3 любого из антител крысы rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, их химерных антител cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 и cLA8664, в которых константные области тяжелой цепи и легкой цепи заменены таковыми человеческих антител, и их гуманизированных антител hLA212_H2/L1 - hLA212_H2/L5 и LA212_H3/L1 - hLA212_H3/L5, и нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность их легких цепей;

(с) комбинация нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи любого из антител крысы rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, их химерных антител cLA204, cLA212, cLA225, cLA869 и cLA8664, в которых константные области тяжелой цепи и легкой цепи заменены таковыми человеческих антител, и их гуманизированных антител hLA212_H2/L1 - hLA212_H2/L5 и LA212_H3/L1 - hLA212_H3/L5, и нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи;

(d) нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности по любому из пунктов (а)-(с), и кодирует аминокислотную последовательность антитела, связывающегося с LAG- 3; и

(е) нуклеотидная последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности по любому из (а)-(с) путем замены, делеции, добавления и/или вставки от 1 до 50, от 1 до 45, от 1 до 40, от 1 до 30,1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15,1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2, или 1 основания, и кодирует аминокислотную последовательность антитела, связывающегося с LAG-3, где антитело, имеющее аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью согласно (d) или (e), обладает свойствами, функциями, активностями и т.д., описанными в (3-2), (3-3) и (3-8), предпочтительно одним или более из (3-4)-(3-7) в дополнение к вышеупомянутому, более предпочтительно (3-4 ) и/или (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5) в дополнение к вышеупомянутому, еще более предпочтительно (3-4) и (3-5), и (3-6) и/или (3-7) в дополнение к вышеупомянутому, оптимально все от (3-2) до (3-8), но ген антитела по настоящему изобретению не ограничивается вышеупомянутыми (а)-(е).

Настоящее изобретение также относится к способу получения антитела или его связывающего фрагмента или его модифицированной формы, включающему стадии культивирования клеток, трансфецированных геном антитела по настоящему изобретению и выделения антитела или его связывающего фрагмента или его модифицированной формы из культуры, как описано в (4-3). Антитело или его связывающий фрагмент или его модифицированная форма, полученные этим способом получения, также включены в настоящее изобретение.

5. Фармацевтическая композиция

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент, или его модифицированную форму.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению полезна для лечения и/или профилактики различных заболеваний (которые в дальнейшем будут называться «заболеваниями, ассоциированными с LAG-3-положительными клетками»), инициированными или усугубленными LAG-3-положительными активированными Т-клетками, то есть, эффекторными T-клетками, T-клетками памяти или регуляторными T-клетками, особенно такими заболеваниями, как аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантатов, аллергические заболевания, злокачественные опухоли и хронические инфекции.

Примеры причин возникновения или обострения таких заболеваний, подлежащих лечению или профилактике, могут включать различные генетические факторы и факторы окружающей среды (включая фармацевтические агенты, питание, световое облучение и тому подобное) или комбинированное воздействие этих факторов.

Примеры таких аутоиммунных заболеваний могут включать в себя ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, системную красную волчанку, склеродермию, полимиозит, дерматомиозит, миозит с включенными тельцами и идиопатическую воспалительную миопатию, включая иммуноопосредованную некротизирующую миопатию в качестве аутоиммунных заболеваний соединительной ткани/опорно-двигательного аппарата, апластическую анемию и идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру в качестве аутоиммунных заболеваний системы крови, болезнь Крона и язвенный колит в качестве аутоиммунных заболеваний пищеварительной системы, рассеянный склероз и миастению гравис в качестве аутоиммунных заболеваний нервной системы, увеит, кератит и синдром Шегрена в качестве аутоиммунных заболеваний зрительной система, болезнь Бехчета и гранулематоз Вегенера в качестве аутоиммунных заболеваний сосудистой системы, псориаз, пузырчатку, синдром Стивенса-Джонсона и витилиго в качестве аутоиммунных заболеваний эпидермальной системы, хроническую обструктивную болезнь легких и интерстициальную пневмонию в качестве аутоиммунных заболеваний респираторной системы, диабет 1 типа, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса и тиреоидит Хашимото в качестве аутоиммунных заболеваний эндокринной системы и другие аутоиммунные заболевания, такие как аутоиммунный гепатит и нефрит, вызванные иммунным расстройством, предпочтительно такие заболевания, ассоциированные с присутствием LAG-3-положительных клеток в местах заболеваний и/или в лимфоидных тканях.

Примеры отторжения трансплантатов могут включать отторжение и реакцию хозяина против трансплантата при трансплантации таких органов, как сердце, почка, печень, костный мозг и их кожа или ткани, а также заболевание трансплантат против хозяина, вызванное путем трансплантации гемопоэтических клеток в костном мозге, периферической крови и пуповинной крови и т.д., предпочтительно, такие реакции, симптомы и заболевания ассоциированы с присутствием LAG-3-положительных клеток в месте отторжения и/или в лимфоидных тканях, связанных с отторжением.

Примеры аллергических заболеваний могут включать атопический дерматит, астму, анафилаксию, анафилактоидную реакцию, пищевую аллергию, ринит, средний отит, реакцию на лекарства, реакции на укус насекомого, реакцию на растения, аллергию на латекс, конъюнктивит, крапивницу и контактный дерматит, предпочтительно, такие заболевания ассоциированы с присутствием LAG-3-положительных клеток в местах заболеваний и/или в лимфоидных тканях.

Примеры злокачественных опухолей могут включать рак молочной железы, рак легкого, рак кожи (включая меланому), лейкоз, лимфому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, глиому, рак печени, колоректальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак простаты, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичников, остеосаркому, саркому мягких тканей и желудочно-кишечную стромальную опухоль, предпочтительно, такие онкологические заболевания и такие злокачественные опухоли ассоциированы с присутствием LAG-3-положительных клеток.

Примеры хронических инфекций могут включать инфекции бактериями, вирусами, грибами и другими микроорганизмами, предпочтительно такие заболевания ассоциированы с присутствием LAG-3-положительных клеток.

В настоящем изобретении лечение или предотвращение заболевания включает, но не ограничивается этим, предотвращение начала заболевания, предпочтительно заболевания у индивидуума, клетки которого экспрессируют белок LAG-3, подавление или ингибирование обострения или прогрессирования, ослабление одного или двух или более симптомов, проявляемых индивидуумом, подверженным заболеванию, подавление или ремиссия обострения или его прогрессирования, лечение или предотвращение вторичного заболевания и тому подобное.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против LAG-3 или связывающего фрагмента антитела и фармацевтически приемлемые разбавители, носители, солюбилизаторы, эмульгаторы, консерванты и/или добавки.

«Терапевтически или профилактически эффективное количество» означает количество, которое оказывает терапевтическое или профилактическое воздействие на конкретное заболевание посредством конкретной лекарственной формы и пути введения, и имеет то же значение, что и «фармакологически эффективное количество».

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать материалы для изменения, поддержания или сохранения pH, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, стерильности или стабильности, растворимости, замедленного высвобождения, абсорбции, проницаемости, лекарственной формы, свойств прочности, формы и тому подобное композиции или содержащегося в ней антитела (далее обозначаются как «фармацевтические материалы»). Фармацевтические материалы конкретно ничем не ограничены, если материалы являются фармакологически приемлемыми. Например, отсутствие или низкая токсичность является свойством, которым предпочтительно обладают эти фармацевтические материалы.

Примеры фармацевтических материалов могут включать, но не ограничиваются ими, аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, антибактериальные агенты, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия или бисульфит натрия, буферы, такие как фосфатные, цитратные, боратные буферы, раствор бикарбоната натрия и трис-соляной кислоты (Трис-HCl), наполнители, такие как маннит и глицин, хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), комплексообразующие агенты, такие как кофеин, поливинил пирролидин, β-циклодекстрин и гидроксипропил-β-циклодекстрин, расширители, такие как глюкоза, манноза или декстрин, моносахариды, дисахариды, другие углеводы, такие как глюкоза, манноза и декстрин, красители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, консерванты, такие как в качестве гидрофильного полимера, например, поливинилпирролидин, низкомолекулярный полипептид, солеобразующий противоион, хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода, растворители, такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, сахарные спирты, такие как маннит или сорбит, суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества, такие как ПЭГ, эфир сорбитана, полисорбаты, например, полисорбат 20 и полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин или холестерин, усилители стабильности, такие как сахароза и сорбит, усилители эластичности, такие как хлорид натрия, хлорид калия, маннит и сорбит, транспортные агенты, разбавители, вспомогательные вещества и/или фармацевтические добавки.

Количество этих добавленных фармацевтических материалов составляет от 0,001 до 1000 частей, предпочтительно от 0,01 до 100 частей, более предпочтительно от 0,1 до 10 частей веса антитела против LAG-3 или его связывающего фрагмента или его модифицированной формы.

Иммунолипосома, содержащая антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент, или модифицированную форму антитела или связывающего фрагмента, инкапсулированные в липосому, или модифицированная форма антитела, содержащая антитело, конъюгированная с липосомой (Патент США № 6214388 и тому подобное) также включены в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.

Вспомогательные вещества или носители обычно являются жидкими или твердыми и не имеют особых ограничений, если они представляют собой материалы, используемые для перорального или парентерального введения, такие как вода для инъекций, физиологический раствор, искусственные спинномозговые жидкости и тому подобное. Примеры физиологического раствора могут включать нейтральный физиологический раствор и сывороточный альбуминсодержащий физиологический раствор.

Примеры буферов могут включать Трис-буфер, отрегулированный для доведения конечного рН фармацевтической композиции до 7-8,5, ацетатный буфер, отрегулированный для доведения конечного рН до 4-5,5, цитратный буфер, отрегулированный для доведения конечного рН до 5-8, и гистидиновый буфер, отрегулированный для доведения конечного рН до 5-8.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой твердое вещество, жидкость, суспензию или тому подобное. Другой пример фармацевтической композиции по настоящему изобретению может включать лиофилизированные препараты. Лиофилизированные препараты могут быть получены с использованием такого вспомогательного вещества, как сахароза.

Способ введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть любым из энтерального введения, местного введения и парентерального введения. Их примеры могут включать внутривенное введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, внутрибрюшинное введение, трансдермальное введение, внутрикостное введение, внутрисуставное введение и тому подобное.

Состав фармацевтической композиции может быть определен в соответствии со способом введения, аффинностью связывания антитела с белком LAG-3 и тому подобное. Антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению или его модифицированная форма, имеющая более высокую аффинность (более низкое значение KD) к белку LAG-3, может проявлять свою эффективность при более низкой дозе.

Доза антитела против LAG-3 по настоящему изобретению не ограничена, при условии, что доза представляет собой фармакологически эффективное количество. Доза может быть надлежащим образом определена в зависимости от вида индивидуума, типа заболевания, симптомов, пола, возраста, ранее существовавших состояний, аффинности связывания антитела с белком LAG-3 или его биологической активности и других факторов. Дозу от 0,01 до 1000 мг/кг, предпочтительно от 0,1 до 100 мг/кг, обычно можно вводить один раз в день, каждые 180 дней, два раза, три или более раз в день.

Примеры формы фармацевтической композиции могут включать инъекции (включая лиофилизированные препараты и капли), суппозитории, трансназальные абсорбционные препараты, трансдермальные абсорбционные препараты, сублингвальные составы, капсулы, таблетки, мази, гранулы, аэрозоли, пилюли, порошки, суспензии, эмульсии, глазные капли и составы биологических имплантатов.

Фармацевтическую композицию, содержащую антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент или его модифицированную форму в качестве активного ингредиента, можно вводить одновременно с дополнительным лекарственным средством или отдельно от него. Например, фармацевтическая композиция, содержащая антитело против LAG-3 или его связывающий фрагмент в качестве активного ингредиента, может быть введена после введения дополнительного лекарственного средства, или дополнительное лекарственное средство может быть введено после введения фармацевтической композиции. Альтернативно, фармацевтическую композицию и дополнительное лекарственное средство можно вводить одновременно.

Примеры дополнительного лекарственного средства, которое используют в комбинации с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, могут включать антифолаты, ингибиторы кальциневрина, кортикостероиды, антитимоцитарные глобулины, антиметаболиты нуклеиновых кислот, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, биологические препараты, направленные на антигены клеточной поверхности, и биологические препараты, направленные на цитокины или цитокиновые рецепторы, и они являются предпочтительными для лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний и/или отторжения трансплантатов. Примеры дополнительного лекарственного средства могут включать метотрексат, который представляет собой антифолат, циклоспорин и такролимус, которые являются ингибиторами кальциневрина, метилпреднизолон и преднизолон, которые являются кортикостероидами, циклофосфамид и азатиоприн, которые являются ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот, цетбулин, лимфоглобулин и тимоглобулин, которые являются антитимоцитарными глобулинами, микофенолат мофетил, который представляет собой антиметаболит нуклеиновой кислоты, алемтузумаб, ритуксимаб, абатацепт и деносумаб, которые являются биологическими препаратами, нацеленными на антигены клеточной поверхности, и адалимумаб, инфликсимаб, этанерцепт и тоцилизумаб, которые являются биологическими препаратами, нацеленными на цитокины или рецепторы цитокинов. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована также для лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний и/или отторжения трансплантатов в комбинации с внутривенным введением иммуноглобулина (IVIg), плазмаферезом и тому подобное. Такие дополнительные лекарственные средства и методы лечения можно комбинировать с фармацевтической композицией по настоящему изобретению также для лечения или профилактики заболеваний, отличных от аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

Примеры лекарственных средств и способов лечения, которые можно комбинировать с фармацевтической композицией по настоящему изобретению для лечения или профилактики злокачественных опухолей, могут включать противоопухолевые средства, такие как различные направленные на молекулы лекарственные средства, химиотерапевтические средства, лучевая терапия и различные противоопухолевые иммунотерапевтические агенты, типичными для которых являются антитело против PD-1, антитело против PD-L1 и антитело против CTLA-4.

Одно из этих дополнительных лекарственных средств и методов лечения, или два, три или более из них могут быть введены или получены. Все вместе они обозначаются как «комбинированное использование дополнительного лекарственного средства» или «комбинация с дополнительным лекарственным средством». Настоящее изобретение также охватывает фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, содержащую такое дополнительное лекарственное средство или используемую в комбинации с другой терапией, в дополнение к антителу или его связывающему фрагменту по настоящему изобретению или его модифицированной форме, в качестве аспекта «комбинированного использования дополнительного лекарственного средства» или «комбинации с дополнительным лекарственным средством».

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболеваний, связанных с LAG-3-положительными клетками, таких как аутоиммунные заболевания, к применению антитела по настоящему изобретению для приготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболеваний и к применению антитела по настоящему изобретению для лечения или профилактики заболеваний. Настоящее изобретение также охватывает набор для лечения или профилактики, включающий антитело по настоящему изобретению.

6. Реагент

Антитело или его связывающий фрагмент по настоящему изобретению или его модифицированная форма также могут быть использованы в качестве реагента. Такой реагент используется для тестирования или диагностики, как указано выше, для исследований и для любого другого использования.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на Примеры. Однако подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается ими.

Процедуры, связанные с манипуляциями с генами в приведенных ниже Примерах, выполняли в соответствии со способами, описанными в «Molecular Cloning» (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или способами, описанными в других экспериментальные руководства, используемые специалистами в данной области техники, или с использованием коммерчески доступных реагентов или наборов в соответствии с инструкциями, если не указано иное.

Пример 1. Получение крысиного антитела против LAG-3 человека

1) -1 Иммунизация

Мутант, дефицитный по 1-му и 2-му доменам (область положений 23-262) от N-конца из четырех внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов человеческого LAG-3 (SEQ ID NO:86: Фигура 101), был клонирован в pcDNA3.1 (Life Technologies Corp.) для приготовления большого количества экспрессирующей плазмиды pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4 с использованием набора EndoFree Plasmid Giga (Qiagen NV). После предварительной обработки обеих нижних конечностей самки крысы WKY/Izm (Japan SLC, Inc.) гиалуронидазой (Sigma-Aldrich) pcDNA3.1-hLAG-3_D3D4 вводили внутримышечно в те же участки. Впоследствии, используя ECM830 (BTX Global Logistics), эти же сайты подвергали электропорации in vivo с использованием двухигольного электрода. Один раз в две недели ту же самую электропорацию in vivo повторяли в общей сложности 3 или 5 раз, и после этого собирали лимфатические узлы крысы для использования для развития гибридом.

1)-2 Получение гибридомы

Клетки лимфатического узла или клетки селезенки электрически сливали с клетками мышиной миеломы SP2/0-ag14 с использованием системы для получения гибридом Hybrimune Hybridoma Production System (производства Cyto Pulse Sciences, Inc.). Слитые клетки разводили с помощью среды ClonaCell-HY Selection Medium D (производства StemCell Technologies Inc.) и культивировали. Появившиеся гибридомные колонии извлекали для получения моноклональных гибридом. Каждую колонию гибридомы, полученную таким образом, культивировали, и полученный супернатант культуры гибридомы использовали для скрининга гибридомы, продуцирующей антитело против LAG-3.

1)-3 скрининг антител с помощью клеточного ИФА

Экспрессирующие плазмиды (pcDNA3.1/hLAG-3 и pcDNA3.1/cynoLAG-3), сконструированные путем клонирования LAG-3 человека или яванской макаки в pcDNA3.1 или контрольную плазмиду вводили в клетки HEK293 с использованием Липофектамина 2000 (производства Life Technologies). Corp.), и клетки культивировали в 96-луночном микропланшете (производства Corning Inc.) в течение ночи в условиях 37°С и 5% CO₂ в среде DMEM, содержащей 10% FBS. После удаления супернатанта культуры, добавляли каждый супернатант гибридомной культуры, и планшет оставляли стоять при 4°С в течение 1 часа. Клетки в лунках промывали один раз PBS, содержащим 5% FBS. Затем конъюгат кроличьих антител против крысиного IgG и пероксидазы, (производства Sigma-Aldrich Corp.), разбавленного в 500 раз PBS, содержащим 5% FBS, добавляли к нему, и планшет оставляли стоять при 4°С в течение 1 часа. Клетки в лунках 5 раз промывали PBS, содержащим 5% FBS. Затем хромогенный раствор OPD, (приготовленный растворением дигидрохлорида О-фенилендиамина (производства Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) и H₂O₂ в концентрациях 0,4 мг/мл и 0,6% (об./об.), соответственно, в растворителе OPD (0,05 М тринатрийцитрата и 0,1 М динатрийгидрофосфата додекагидрата, рН 4,5)) добавляли туда при 25 мкл/на лунку. Цветную реакцию проводили при периодическом перемешивании и останавливали добавлением 25 мкл/налунку 1 М HCl. Затем измеряли оптическую плотность при 490 нм с использованием планшет-ридера (ENVISION; PerkinElmer, Inc.). Чтобы отобрать гибридомы, продуцирующие антитело, которое специфически связывается с LAG-3, экспрессируемым на поверхности клеточной мембраны, гибридомы, которые давали культуральный супернатант, проявляющий более высокое поглощение для клеток HEK293, трансфецированных вектором, экспрессирующим LAG-3, чем для клеток HEK293, трансфецированных контрольной плазмидой, свободных от гена LAG-3, были отобраны в качестве гибридом, положительных по отношению к антителам против LAG-3.

1)-4 Скрининг антител методом проточной цитометрии

Далее с помощью проточной цитометрии было подтверждено, что антитело, продуцируемое гибридомами, определенное как положительное с помощью клеточного ИФА в примере 1)-3, связывается с активированными PHA (фитогемагглютинином) человеческими T-клетками (бластами PHA) больше физиологических клеток, экспрессирующих LAG- 3. К человеческим PBMC, стимулированных 2 мкг/мл PHA (производства Sigma-Aldrich), в течение трех дней добавляли супернатант гибридомной культуры для получения суспензии, с последующей реакцией при 4°С в течение 30 минут. После промывания буфером FACS (PBS, 0,1% BSA и 0,1% азида натрия) вторичное антитело, такое как конъюгат антител против крысиного IgG и PE (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разведенное в 200 раз буфером FACS, содержащим флуоресцентно реактивный краситель LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR (производства Invitrogen Corp.), добавляли туда для получения суспензии, с последующим выдерживанием при 4°С в течение 30 минут. После промывания буфером FACS клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 1-2% параформальдегида, с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (CantoII: производства Becton, Dickinson and Company или FC500: производства Beckman Coulter Inc). Данные анализировали с использованием FlowJo (производства Tree Star Inc). После удаления мертвых клеток, положительных по флуоресцентно реактивному красителю LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR путем гейтирования, строили гистограмму интенсивности флуоресценции живых клеток.

1)-5 Скрининг с помощью анализа ADCC

1)-5-1 Получение клеток-мишеней

Клетки 293FT (Invitrogen Corp.) трансфецировали pLenti6/V5-GW/lacZ и упаковочной смесью ViraPowerTM (Invitrogen Corp.) в соответствии с прилагаемыми протоколами для получения рекомбинантного лентивируса для экспрессии гена β-галактозидазы. Клетки 293T инфицировали полученным рекомбинантным лентивирусом в соответствии с протоколом ViraPower Lentiviral Expression Systems (Invitrogen Corp). Инфицированные вирусом клетки отбирали с использованием 10 мкг/мл бластицидина (Invitrogen Corp.), чтобы получить линию, стабильно экспрессирующую β-галактозидазу. Экспрессирующую плазмиду полноразмерного человеческого LAG-3 вводили в клетки 293T, стабильно экспрессирующие β-галактозидазу (далее именуемые 293T-lacZ), с использованием Липофектамина 2000 (производства Invitrogen Corp.), и клетки культивировали в течение 1 дня, а затем подвергали диссоциации и извлекали с использованием TrypLExpress (производства Invitrogen Corp). Клетки дважды промывали RPMI1640, не содержащей фенолового красного, содержащей 5% FBS (далее обозначали «средой для ADCC»). Количество живых клеток подсчитывали с помощью теста на исключение с использованием красителя трипанового синего. Клетки ресуспендировали до 1×10⁵ клеток/мл в среде для ADCC и использовали в качестве клеток-мишеней.

1)-5-2 Получение эффекторных клеток

РВМС отделяли от периферической крови человека центрифугированием в фиколле, и суспензию, доведенную до плотности живых клеток 1,2×10⁶ клеток/мл в среде для ADCC, использовали в качестве эффекторных клеток.

1)-5-3 анализ ADCC

К 96-луночному микропланшету с U-образным дном, содержащим 50 мкл/лунку супернатанта гибридомной культуры, добавляли 50 мкл/лунку клеток-мишеней из 1)-5-1, с последующим выдерживанием при 4°С в течение 30 минут. После добавления 150 мкл/на лунку среды для ADCC с последующим перемешиванием планшет центрифугировали при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 5 минут для удаления 200 мкл/на лунку супернатанта. Затем туда добавляли 125 мкл/на лунку эффекторных клеток 1)-5-2 с последующим центрифугированием при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 5 минут. После этого клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂. На следующий день 50мкл супернатанта извлекали в черный планшет (производства Corning Inc.). Добавляли к нему 50 мкл раствора системы анализа β-Glo (производства Promega Corp.). Интенсивность люминесценции измеряли с использованием планшет-ридера (ENVISION; производства PerkinElmer, Inc). Процент клеток, лизированных активностью ADCC, рассчитывали по следующей формуле.

Процент лизированных клеток (%)=(A-B)/(C-B)×100

A: Подсчет каждой лунки с образцом

B: Среднее количество спонтанного высвобождения (лунки без добавления антител) (n=3)

При добавлении антитела к нему добавляли 50 мкл среды для ADCC. Кроме того, была выполнена та же операция, что и в лунке с образцом.

C: Среднее максимальное высвобождение (лунки, содержащие клетки-мишени лизировали поверхностно-активным веществом) (n=3)

При добавлении антитела и добавлении эффекторных клеток 50 мкл и 75 мкл среды для ADCC, соответственно. Для анализа, 175 мкл раствора аналитической системы β-Glo добавляли в каждую лунку, содержащую клетки - мишени, и смешивали с ним. Аликвоты 100 мкл добавляли на черную чашку для проведения анализа.

1)-6 Скрининг с помощью теста связывания LAG-3/MHC класса II

Он был проведен в соответствии с предыдущим сообщением (Непатентная литература 8). То есть 20 мкл/на лунку LAG-3-Fc (производства R & D Systems, Inc.), разбавленной RPMI1640, содержащей от 10% FBS до 25 нМ, добавляли в 96-луночный U-образный микропланшет и 20 мкл/на лунку супернатанта гибридомной культуры добавляли к нему, после чего перемешивали и выдерживали при 4°С в течение 20 минут. Затем, 10 мкл/на лунку (2,5×10⁵ клеток/на лунку) клеток Raji, которые эндогенно высоко экспрессируют молекулу МНС класса II, добавляли к ним, с последующим перемешиванием и выдерживанием при 4°С в течение еще 30 минут. Клетки дважды промывали PBS или буфером FACS, затем туда добавляли конъюгат антитела против человеческого IgG и PE (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разбавленный в 200 раз буфером FACS для суспензии, с последующим выдерживанием при 4°С 20 минут. После промывания PBS или буфером FACS клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 1-2% параформальдегида, с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (CantoII: производства Becton, Dickinson and Company или FC500: производства Beckman Coulter Inc). Данные анализировали с использованием FlowJo (производства Tree Star Inc.), и процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле.

Процент ингибирования (%)=100-(A-B)/(C-B)×100

A: Средняя интенсивность флуоресценции каждой лунки с образцом

B: Средняя интенсивность флуоресценции фона

При добавлении LAG-3-Fc и антитела каждый раз добавляли 20 мкл среды. Кроме того, была выполнена та же операция, что и в лунке с образцом.

C: средняя интенсивность флуоресценции максимального связывания

При добавлении антитела к нему добавляли 20 мкл среды.

1)-7 Очистка моноклонального антитела

Моноклональное крысиное антитело против человеческого LAG-3 очищали из супернатанта гибридомной культуры. То есть супернатант гибридомной культуры сначала наносили на колонку ProteinG (производства GE Healthcare), уравновешенную PBS. После промывки колонки с PBS, содержащие антитело фракции собирали путем элюирования 0,1 М водным раствором глицина/соляной кислоты (рН 2,7). К собранным фракциям добавляли 1M Трис-HCl (pH 9,0) для доведения до pH 7-7,5, и после этого центрифужное устройство с UF-фильтром VIVASPIN20 (фракция с молекулярной массой UF30K, производства Sartorius AG) использовали для замены буфера на PBS и концентрирования антитела для регуляции концентрации до 2 мг/мл или более. Наконец, фильтрование с помощью фильтра Minisart-Plus (производства Sartorius AG) проводили для получения очищенного образца.

Пример 2. In vitro оценка крысиного антитела против LAG-3 человека (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264)

2)-1 Связывающая активность полученных крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) с активированными Т-клетками человека

Исследовали активность связывания крысиных антител против человеческого LAG-3, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, очищенных способом, описанным в Примере 1)-7, в отношении активированных Т-клеток человека. Как показано на Фигуре 1, все крысиные антитела против человеческого LAG-3 связывались с PHA-бластами, полученные в виде in vitro активированных человеческие Т-клеток зависимым от концентрации образом.

2)-2 ADCC-активность полученных крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264)

Активность ADCC очищенных крысиных антител против человеческого LAG-3, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, исследовали следующим способом. К 96-луночному микропланшету с U-образным дном, содержащему 50 мкл/на лунку раствора антител, добавляли 50 мкл/на лунку клеток-мишеней (которые в дальнейшем будут называться клетками 293T-lacZ/hLAG-3) из Примера. 1) -5-1, с последующим выдерживанием при 4°С в течение 30 минут. Затем туда добавляли 75 мкл/на лунку эффекторных клеток, полученных, как в Примере 1)-5-2 (которые, однако, суспендировали до 2×10⁶ клеток/мл), с последующим центрифугированием при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 5 минут, и затем клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂. На следующий день, 50 мкл супернатанта извлекали в черный планшет (производства Corning Inc). Раствор аналитической системы β-Glo (производства Promega Corp.) добавляли к нему при 50 мкл/на лунку. Интенсивность люминесценции измеряли с использованием планшет-ридера (ENVISION; производства PerkinElmer, Inc). Процент клеток, лизированных с помощью активности ADCC, рассчитывали по следующей формуле.

Процент лизированных клеток (%)=(A-B)/(C-B)×100

A: Подсчет каждой лунки с образцом

B: Подсчет среднего спонтанного высвобождения (лунки без добавления антител) (n=3)

C: Подсчет среднего максимального высвобождения (лунки, содержащие клетки-мишени, лизированные поверхностно-активным веществом), (n = 3)

При добавлении антитела и добавлении эффекторных клеток добавляли к ним 50 мкл и 75 мкл среды для ADCC, соответственно. Для анализа, 175 мкл раствора аналитической системы β-Glo добавляли в каждую лунку, содержащую клетки-мишени, и смешивали с ним. Аликвоты 100 мкл добавляли в черный планшет для проведения анализа.

Как показано на Фигуре 2, все крысиные антитела против человеческого LAG-3 проявляли зависимую от концентрации активность ADCC in vitro на клетках, экспрессирующих человеческий LAG-3. Напротив, эти антитела не проявляли активности ADCC на клетках 293T-lacZ, в которые ген LAG-3 человека не трансфицировался, поэтому действие было специфическим.

2)-3 Исследование ингибирующей активности полученных крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) в тесте на связывание LAG-3/MHC класса II

С помощью теста связывания LAG-3/MHC класса II согласно Примеру 1)-6 было исследовано, обладают ли очищенные антитела против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) ингибирующей активностью в отношении связывания LAG-3 и молекул MHC класса II, которые, как сообщалось, являются его лигандами. Как показано на Фигуре 3А, результаты обнаружили, что все 5 клонов антител практически не проявляли ингибирующей активности в тесте на связывание LAG-3/МНС класса II и не влияли на связывание с молекулами МНС класса II, которое считается необходимым для LAG-3 для осуществления функции подавления Т-клеток. Напротив, как показано на Фигуре 3В, человеческое химерное антитело против LAG-3, IMP731 (Патентная литература 1), которое является обычным антителом в списке цитирования, продемонстрировало сильную ингибирующую активность в зависимости от концентрации в тесте на связывание LAG-3/МНС класса II.

2)-4 Исследование ингибирующей активности полученных крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264) в тесте адгезии клеток 293T-hLAG-3/Raji

В тесте на связывание LAG-3/MHC класса II в соответствии с Примером 2)-3 связывание конъюгата вторичного антитела против человеческого IgG и PE для детектирования связывания LAG-3-Fc с клетками Raji, может быть ингибировано стерическим затруднением, вызванным связыванием антитела против LAG-3 с LAG-3-Fc, и, таким образом, нельзя полностью исключить возможность явно низкой интенсивности флуоресценции, несмотря на то, что антитело фактически непосредственно не ингибирует связывание LAG-3/MHC класса II. Следовательно, в качестве системы оценки без использования вторичного антитела для детектирования была разработана следующая система тестирования адгезии клеток 293T-hLAG-3/Raji для оценки антитела.

Плазмида, экспрессирующая человеческий LAG-3, pcDNA3.1/hLAG-3 была введена в клетки 293T с использованием Липофектамина 2000 (производства Life Technologies Corp.), и клетки были инокулированы на покрытый поли-D-лизином BioCoat 96-луночный микропланшет (производства Becton, Dickinson and Company) и культивировались в течение ночи. В то же время клетки Raji метили в среде (RPMI 1640, содержащей 10% FBS) с флуоресцентным красителем BCECF-AM (производства DOJINDO LABORATORIES, используемой при 10 мкМ) при 37°С в течение 1 часа, с последующей промывкой и затем суспендированием в среда до 1,6×10⁶ кл/мл. После трансфекции среду клеток (клеток 293T-hLAG-3), культивированных в течение ночи, удаляли и добавляли 50 мкл/на лунку среды и 25 мкл/на лунку раствора антител с последующей предварительной инкубацией при 37°С в течение 30 минут. После этого, 25 мкл/на лунку BCECF-АМ меченных Raji клеток добавляли к ней, с последующим центрифугированием при 900 об/минуту в течение 30 секунд и инкубации при 37°С в течение 1 часа. После реакции лунку промывали средой два-три раза для удаления неприкрепленных клеток, и клетки лизировали в 100 мкл/лунку трис-буфера (25 мМ, рН 8,0), содержащего 0,1% NP-40, для измерения интенсивность флуоресценции лунки с помощью планшет-ридера (ENVISION: производства PerkinElmer Inc).Процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле.

Процент ингибирования (%)=100-(A-B)/(C-B)×100

A: Интенсивность флуоресценции каждой лунки с образцом

B: интенсивность флуоресценции фона

При добавлении клеток Raji и антитела к ним добавляли среду. Кроме того, была выполнена та же операция, что и в лунке с образцом.

C: интенсивность флуоресценции максимального связывания

При добавлении антитела к нему добавляли среду.

Как показано на Фигуре 4, результаты обнаружили, что все очищенные крысиные антитела против LAG-3, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, практически не проявляли ингибирующей активности в тесте адгезии клеток 293T-hLAG-3/Raji, что также подтверждает представление о том, что антитела не влияют на связывание с молекулами МНС класса II, что считается необходимым для того, чтобы LAG-3 проявлял функцию подавления Т-клеток. Напротив, химерное человеческое антитело против LAG-3, IMP731, (Патентная литература 1), которое представляет собой обычное антитело в Списке цитирования, показало мощную ингибирующую активность с процентом ингибирования 90% при концентрации 10 мкг/мл в этом тесте.

2)-5 Идентификация эпитопа полученных крысиных антител против LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264)

На основании того факта, что крысиные антитела против LAG-3, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, являются антителами, разработанными с использованием мутанта, дефицитного по 1-ому и 2-ому доменам (которые в дальнейшем будут обозначаться соответственно как домены 1 и 2) с N-конца из четырех иммуноглобулиноподобных доменов, присутствующих во внеклеточной области LAG-3 в качестве иммуногена, чтобы выявить, какой из оставшихся 3-его и 4-ого доменов (которые в дальнейшем будут обозначаться соответственно как домены 3 и 4) от N-конца, связывается с этими антителами, связывание полученных крысиных антител против LAG-3 с клетками, экспрессирующими домены 3 и 4 или только домен 4, исследовали методом проточной цитометрии.

Каждую плазмиду (клонированную в pcDNA3.1), экспрессирующую либо домен 3 и далее (263-525), либо домен 4 и далее (353-525) человеческого LAG-3 с последовательностью метки FLAG (DYKDDDDK), добавленной к N-концу, вводили в клетки HEK293T с использованием Липофектамина 2000 (производства Life Technologies Corp.), и клетки культивировали в течение 1 дня и затем извлекали, чтобы исследовать активность связывания антител с помощью проточной цитометрии в соответствии со способом, описанным в примере 1)-4. В результате все очищенные крысиные антитела против LAG-3, rLA204, rLA212 и rLA225, связывались с клетками, экспрессирующими конструкцию, содержащую домены 3 и 4, тогда как ни одно из них не связывалось с клетками, экспрессирующими конструкцию, содержащую только домен 4, как показано на Фигуре 5А. Эти результаты показали, что все полученные крысиные антитела против LAG-3, rLA204, rLA212 и rLA225, связывались с доменом 3 из четырех иммуноглобулиноподобных доменов, присутствующих во внеклеточной области LAG-3.

Эксперимент того же типа с использованием супернатанта гибридомной культуры показал, что полученные крысиные антитела против LAG-3, rLA869 и rLA1264, также связывались с доменом 3.

На Фигуре 5В показаны результаты исследования тем же способом связывающего домена человеческого химерного антитела IMP731 против человеческого LAG-3, являющегося обычным антителом в списке цитирования. В дополнение к двум типам конструкций на Фигуре 5А были использованы плазмиды, экспрессирующие домен 2 и далее (положения аминокислот 173-525 аминокислотной последовательности LAG-3 человека в SEQ ID NO:86, Фигура 101) человеческого LAG-3 с последовательностью метки FLAG (DYKDDDDK), добавленной к N-концу, и полноразмерный человеческий LAG-3 (оба были сконструированы с использованием pcDNA3.1; нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность человеческого LAG-3, описана в SEQ ID № 85, Фигура 100). И IMP731, и клон 6D7 крысиного антитела против человеческого LAG-3, полученные в примере 2)-6, связывались с клетками, экспрессирующими полноразмерный человеческий LAG-3, но не связывались с мутантами (FLAG-D2D3D4, FLAG-D3D4 и FLAG-D4), дефицитными по домену 1, что свидетельствует о том, что они связываются с доменом 1. То есть, обнаружено, что полученные крысиные антитела против LAG-3, rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264, связывающиеся с доменом 3 из четырех иммуноглобулин-подобных доменов, присутствующих во внеклеточной области LAG-3, распознают эпитоп, отличный от IMP731, который связывается с доменом 1.

2)-6 Получение крысиного антитела против человеческого LAG-3 с использованием очищенного белка LAG-3 в качестве иммуногена

В качестве альтернативного способа иммунизации по Примеру 1)-1 крысиные антитела против человеческого LAG-3 получали с использованием очищенного белка LAG-3 в качестве иммуногена. Эмульсия, образованная при смешивании белка с His-меткой, добавленной к С-концу внеклеточной области (1-450) человеческого LAG-3, с полным адъювантом Фрейнда (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (в объемном соотношении 1:2) вводили в основания хвостов 8-недельных самок крыс WKY/Izm (Japan SLC, Inc.), в количестве 200 мкг на мышь. Через три недели, только белковый антиген вводили основания хвостов в количестве 200 мкг на мышь, и еще две недели спустя собирали лимфатические узлы для разработки гибридом по способу Примера 1)-2. Скрининг по методам примеров 1)-3 и 1)-4 и тому подобное и анализ полученного эпитопа моноклонального антитела по методу примера 2)-5 выявили, что из четырех иммуноглобулиноподобных доменов, присутствующих во внеклеточной области LAG-3, 58% протестированных клонов связывались с доменом 1, и 26% из них связывались с доменом 2, так что преимущественно были получены моноклональные антитела против участков, близких к N-концу. Среди них большинство клонов, которые сильно связывались с активированными Т-клетками человека (бласты PHA) в проточной цитометрии, включая клон 6D7, связывались с доменом 1 LAG-3, и все они продемонстрировали сильную ингибирующую активность в тесте связывания LAG-3/МНС класса II, описанном в Примере 2)-3. Эти результаты полностью согласуются с общепринятым открытием (Непатентная литература 4), что домены 1 и 2 N-конца из четырех внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов LAG-3 важны для связывания LAG-3 с молекулами МНС класса II и указывают, что для получения антитела, которое не ингибирует связывание LAG-3 с молекулами MHC класса II, то есть функцию подавления Т-клеток LAG-3, необходимо разработать моноклональное антитело путем разработки такого метод иммунизации, как в примере 1)-1.

Пример 3. Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельные области крысиного антитела против человеческого LAG-3 (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264)

3)-1 Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область rLA204

3)-1-1 Получение суммарной РНК из гибридомы, продуцирующей rLA204

Для амплификации кДНК, содержащей вариабельные области rLA204, получали суммарную РНК из гибридомы, продуцирующей rLA204, с использованием реагента TRIzol (Ambion/Thermo Fisher Scientific Inc.).

3)-1-2 Синтез кДНК (5'-RACE-Ready кДНК)

КДНК (5'-RACE-Ready кДНК) синтезировали с использованием примерно 1 мкг суммарной РНК, полученной в Примере 3)-1-1, и набора для амплификации SmarTer RACE кДНК Amplification Kit (Clontech Laboratories, Inc).

3)-1-3 5'-RACE ПЦР-амплификация и секвенирование кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rLA204

Праймеры, использованные для ПЦР-амплификации кДНК, кодирующей вариабельную область гена тяжелой цепи rLA204, представляли собой олигонуклеотиды, имеющие последовательности UPM (микс Универсального Праймера A; прилагаемый к набору для амплификации SMARTer RACE cDNA Amplification Kit) и 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3: SEQ ID NO:71). Используемый UPM прилагался к набору для амплификации кДНК SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.), тогда как RG2AR3 был сконструирован на основе последовательностей константных областей тяжелой цепи крысы в базе данных.

кДНК, содержащую вариабельную область тяжелой цепи rLA204, амплифицировали с помощью 5'-RACE ПЦР, используя этот набор праймеров, и кДНК (5'-RACE-Ready кДНК), синтезированную в примере 3)-1-2 в качестве матрицы. Эту ПЦР проводили в программе ПЦР Touchdown в соответствии с руководством набора SMARTer RACE Kit для амплификации кДНК (Clontech Laboratories, Inc.) с использованием полимеразы KOD-Plus - (Toyobo Co., Ltd.).

КДНК, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, амплифицированную с помощью 5'-RACE ПЦР, очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR (Qiagen NV) и затем клонировали с использованием набора для клонирования Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen Corp.). Клонированную кДНК, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, анализировали секвенированием.

Используемые праймеры для секвенирования представляли собой олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3; SEQ ID NO:71), сконструированный из последовательностей константных областей тяжелой цепи крысы в базе данных, и NUP (Вложенный универсальный праймер A: прилагаемый к набору для амплификации кДНК SMART RACE).

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи rLA204, представлена в SEQ ID NO:1, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2.

3)-1-4 5'-RACE ПЦР-амплификация и секвенирование кДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи rLA204

Праймеры, использованные для ПЦР-амплификации кДНК, кодирующей вариабельную область гена легкой цепи rLA204, представляли собой UPM (микс Универсального Праймера A; прилагаемый к набору для амплификации кДНК SMARTer RACE), и олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5: SEQ ID NO:72). Используемый UPM прилагался к набору для амплификации кДНК SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.), тогда как RKR5 был сконструирован из последовательностей константных областей легкой цепи крысы в базе данных.

кДНК, содержащую вариабельную область легкой цепи rLA204, амплифицировали с помощью 5'-RACE ПЦР с использованием этого набора праймеров и кДНК (5'-RACE-Ready кДНК), синтезированной в примере 3)-1-2 в качестве матрицы. Эту ПЦР проводили в программе ПЦР Touchdown в соответствии с руководством набора SMARTer RACE Kit для амплификации кДНК (Clontech Laboratories, Inc.) с использованием полимеразы KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.).

КДНК, содержащую вариабельную область легкой цепи, амплифицированную с помощью 5'-RACE ПЦР, очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR (Qiagen NV) и затем клонировали с использованием набора для клонирования Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen Corp.). Клонированную кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, анализировали секвенированием.

Используемые праймеры для секвенирования представляли собой олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (RKR5; SEQ ID NO:72), сконструированный из последовательностей константных областей легкой цепи крысы в базе данных, и NUP (вложенный универсальный праймер A: прилагаемый к набору для амплификации кДНК SMART RACE).

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи rLA204, представлена в SEQ ID NO:3, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:4.

3)-2 Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область rLA212

Последовательность определяли так же, как в примере 3)-1.

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rLA212, представлена в SEQ ID NO:5, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:6. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:7, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:8.

3)-3 Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область rLA225

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rLA225, представлена в SEQ ID NO:9, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:10.Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:11, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:12.

3)-4 Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область rLA869

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rLA869, представлена в SEQ ID NO:13, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:14. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:15, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:16.

3)-5 Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область rLA1264

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rLA1264, представлена в SEQ ID NO:17, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:18. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:19, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:20.

Пример 4. Разработка человеческого химерного антитела против человеческого LAG-3 (cLA212)

4)-1 Конструкция вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела

Плазмиду pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) гидролизовали рестриктазами XbaI и PmeI. Полученный фрагмент длиной примерно 5,4 т.п.н. лигировали с ДНК-фрагментом, содержащим ДНК-последовательность, представленную в SEQ ID NO:21 и кодирующую человеческий секреторный сигнал легкой цепи и константную область человеческой κ-цепи с помощью In-Fusion Advantage ПЦР-набора для клонирования (Clontech Laboratories, Inc.), чтобы получить pcDNA3.3/LK.

ПЦР проводили с использованием pcDNA3.3/LK в качестве матрицы и с использованием набора праймеров, представленных ниже. Полученный фрагмент размером приблизительно 3,8 т.п.н. фосфорилировали и затем самолигировали для конструирования вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела, содержащего сигнальную последовательность, сайт клонирования и константную область легкой цепи человека, в 3'-области от промотора CMV.

Набор праймеров

5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3.3-F1: SEQ ID NO:73)

5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3.3-R1: SEQ ID NO:74)

4)-2 Конструирование вектора pCMA-G1, экспрессирующего тяжелую цепь химерного и гуманизированного антитела IgG1 типа

Полученный ДНК-фрагмент, из которого был удален секреторный сигнал легкой цепи и константная область человеческой κ-цепи путем гидролиза PCMA-LK с помощью XbaI и PmeI, был связан с фрагментом ДНК, содержащим ДНК-последовательность, представленную в SEQ ID NO:22 и кодирующую аминокислоты сигнальной последовательности тяжелой цепи человека и константной области человеческого IgG1 с использованием набора для клонирования In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) для конструирования вектора, экспрессирующего тяжелую цепь химерного и гуманизированного антитела типа IgG1, pCMA-G1, содержащего сигнальную последовательность, сайт клонирования и константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 в 3'-области промотора CMV.

4)-3 Конструирование вектора, экспрессирующего тяжелую цепь cLA212

Фрагмент ДНК, содержащий кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, амплифицировали с помощью KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) и набора праймеров, представленного ниже, с использованием кДНК, полученной в примере 3)-2 и содержащей вариабельную область тяжелой цепи rLA212 в качестве матрицы, и амплифицированный фрагмент ДНК вставляли в сайт расщепления рестриктазой BlpI сайта вектора, экспрессирующего тяжелую цепь химерного и гуманизированного антитела IgG1 типа, pCMA-G1, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) для конструирования вектора, экспрессирующего тяжелую цепь cLA212. Полученный экспрессирующий вектор был обозначен как «pCMA-G1/cLA212». Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи cLA212 представлена в SEQ ID NO:23, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:24.

Набор праймеров для тяжелой цепи cLA212

5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG-3' (212H-F; SEQ ID NO:75)

5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (212H-R; SEQ ID NO:76)

4)-4 Конструирование вектора, экспрессирующего легкую цепь cLA212

Фрагмент ДНК, содержащий кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, амплифицировали с помощью KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) и набора праймеров, представленного ниже, с использованием кДНК, полученной в примере 3)-2, и содержащей вариабельную область легкой цепи rLA212 в качестве матрицы, и амплифицированный фрагмент ДНК вставляли в сайт расщепления рестриктазой BsiWI общего вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела с использованием набора для клонирования In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.) для конструирования вектора, экспрессирующего легкую цепь cLA212. Полученный экспрессирующий вектор был обозначен как «pCMA-LK/cLA212». Нуклеотидная последовательность легкой цепи cLA212 представлена в SEQ ID NO:25, а ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:26.

Набор праймеров для легкой цепи cLA212.

5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCAACATTGTGATGACCCAGTCTCCCAAATCC-3' (212L-F; SEQ ID NO:77)

5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTCGGTCCCAGC-3' (212L-R; SEQ ID NO:78)

4)-5 Продуцирование cLA212

Клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) субкультивировали и культивировали в соответствии с руководством. 1,2×10⁹ клеток FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) в логарифмической фазе роста инокулировали в 3-литровую колбу Фернбаха-Эрленмейера (Corning Inc.), доведенную до 2×10⁶ клеток/мл путем разбавления средой экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.), а затем культивировали со встряхиванием при 90 оборотах в минуту при 37°С в течение 1 ч в 8% СО₂ - инкубаторе. 1,8 мг полиэтиленимина (Polysciences # 24765) растворяли в 20 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Затем каждый вектор экспрессии Н-цепи (0,24 мг) и каждый вектор экспрессии L-цепи (0,36 мг), полученный с использованием NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.), добавляли к 20 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). 20 мл смешанного раствора вектора экспрессии/Opti-Pro SFM добавляли к 20 мл смешанного раствора полиэтиленимин/Opti-Pro SFM, и смесь осторожно перемешивали, оставляли на 5 минут и затем добавляли к клеткам FreeStyle 293F. Клетки культивировали со встряхиванием при 90 оборотах в минуту при 37°С в течение 4 часов в 8% СО₂-инкубаторе. Затем к ним добавляли 600 мл среды EX-CELL VPRO (SAFC Biosciences), 18 мл GlutaMAX I (GIBCO/Thermo Fisher Scientific Inc.) и 30 мл ультрафильтрата Yeastolate (GIBCO/Thermo Fisher Scientific Inc.). Клетки культивировали со встряхиванием при 90 оборотах в минуту при 37°С в течение 7 дней в 8% СО₂-инкубаторе, и полученный супернатант культуры фильтровали через одноразовый фильтр Capsule (ADVANTEC # CCS-045-E1H).

Химерное антитело rLA212 человека, полученное комбинацией pCMA-G1/cLA212 и pCMA-LK/cLA212, было обозначено как «cLA212».

4)-6 Очистка cLA212

Антитела очищали из супернатанта культуры, полученного в примере 4)-5 путем аффинной хроматографии с рПротеином А (при 4-6°С). Стадию замены буфера после аффинной хроматографической очистки на рПротеине A проводили при 4-6°С. Сначала культуральный супернатант наносили на колонку, заполненную MabSelectSuRe (производства GE Healthcare), уравновешенную PBS. После ввода всего культурального раствора в колонку, колонку промывали PBS в количестве, по меньшей мере, в два раза превышающем объем колонки. Затем содержащие антитело фракции собирали путем элюирования 2 М раствором гидрохлорида аргинина (рН 4). Во фракциях заменяли буфер на HBSor (25 мМ гистидин и 5% сорбит, pH 6) путем диализа (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer диализная кассета). Наконец, фракции концентрировали и доводили до концентрации IgG 25 мг/мл или выше, с использованием центрифужного устройства UF фильтра Vivaspin 20 (порог по молекулярной массе: UF10K, Sartorius AG, при 4°С), и использовали в качестве очищенного образца. Наконец, фильтрование с помощью фильтра Minisart-Plus (Sartorius AG) проводили для получения очищенного образца.

4)-7 Антигенсвязывающая активность химерного антитела человека против LAG-3 (cLA212)

Плазмиду экспрессии pcDNA3.1-hLAG-3 человеческого LAG-3 вводили в клетки 293T-lacZ (описанные в Примере 1) -5-1), используя Липофектамин 2000 (производства Invitrogen Corp.), и клетки культивировали в течение 1 дня и затем использовали для проточной цитометрии. Проточную цитометрию выполняли в соответствии со способом, описанным в Примере 1)-4, за исключением того, что в качестве вторичного антитела использовали конъюгат антитела к человеческому IgG и PE (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разведенный в 200 раз буфером FACS. Как показано на Фигуре 6, было обнаружено, что человеческое химерное антитело против LAG-3, cLA212, связывалось с клетками 293T-lacZ, экспрессирующими человеческий LAG-3 зависимым от концентрации образом и, таким образом, также сохраняло связывающую активность после химеризации.

Пример 5. Конструирование гуманизированной версии (hLA212) крысиного антитела против человеческого LAG-3 (rLA212)

5-1. Конструирование гуманизированного крысиного антитела против человеческого LAG-3 rLA212.

5)-1-1 Молекулярное моделирование вариабельных областей rLA212

Молекулярное моделирование вариабельных областей rLA212 проводили методом, известным как гомологическое моделирование (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Вариабельные области rLA212, определенные в Примере 3)-2, сравнивали с первичными последовательностями (доступны трехмерные структуры, полученные из рентгенокристаллических структур) вариабельных областей человеческого иммуноглобулина, зарегистрированных в белковой базе данных (Nuc.Acid Res.35, D301-D303 (2007)). В результате 2GHW и 2ARJ были выбраны как имеющие самую высокую гомологию последовательности с вариабельными областями тяжелой и легкой цепей rLA212. Трехмерные структуры каркасных областей были разработаны путем получения «каркасных моделей» путем объединения координат 2GHW и 2ARJ, соответствующих тяжелой цепи и легкой цепи rLA212. Впоследствии типичные конформации CDR были включены в каркасные модели. Наконец, был проведен расчет энергии для исключения неблагоприятного межатомного контакта, чтобы получить возможные молекулярные модели вариабельных областей rLA212 с точки зрения энергии. Эти процедуры выполняли с использованием коммерчески доступной программы трехмерного структурного анализа белков Discovery Studio (производства Accelrys, Inc).

5)-1-2 Конструирование аминокислотных последовательностей гуманизированного антитела против человеческого LAG-3 hLA212

Гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212, было сконструировано способом, обычно известным как трансплантация CDR (Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Акцепторное антитело было выбрано на основе идентичности аминокислот в каркасных областях.

Последовательности каркасных областей rLA212 сравнивали с каркасными областями консенсусных последовательностей человеческих подгрупп и последовательностей зародышевой линии, определенных в KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). В результате консенсусная последовательность подгруппы 3 гамма-цепи человека для тяжелой цепи и консенсусная последовательность подгруппы 1 каппа-цепи человека для легкой цепи были соответственно выбраны в качестве акцепторов из-за высокой идентичности последовательности в каркасных областях. Аминокислотные остатки в каркасных областях для акцепторов выравнивали с аминокислотными остатками для rLA212, чтобы идентифицировать положения, где использовались разные аминокислоты. Положения этих остатков анализировали с использованием трехмерной модели rLA212, сконструированной в Примере 5)-1-1. Затем донорные остатки, которые должны быть трансплантированы на акцепторы, были отобраны в соответствии с критериями, предоставленными Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Некоторые отобранные таким образом донорные остатки переносили в акцепторные антитела для конструирования гуманизированных последовательностей hLA212, как описано в приведенных ниже примерах.

5)-2 Гуманизация тяжелой цепи rLA212

5)-2-1 Гуманизированная тяжелая цепь hLA212_H2 типа

Гуманизированную тяжелую цепь hLA212 конструировали путем замены аргинина в аминокислотном положении 16 глицином, лизина в аминокислотном положении 19 аргинином, треонина в аминокислотном положении 42 глицином, аргинина в аминокислотном положении 43 лизином, аланина в аминокислотном положении 49 глицином, аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 84 аспарагином, серина в аминокислотном положении 88 аланином, треонина в аминокислотном положении 93 валином, валина в аминокислотном положении 115 треонином и метионина в аминокислотном положении 116 лейцином в вариабельной области тяжелой цепи химерного cLA212, представленного в SEQ ID NO:24, обозначали как «гуманизированная тяжелая цепь типа hLA212_H2» (которая может также упоминаться как «hLA212_H2»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи hLA212_H2-типа описана в SEQ ID NO:28 списка последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 19, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 20 по 140, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 141 по 470, соответственно, соответствует сигнальной последовательности, вариабельной области тяжелой цепи и константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, описана в SEQ ID NO:27 списка последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:27 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 57, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 58 по 420, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 421 по 1410, соответственно, кодируют сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:27 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:28 также описаны на Фигурах 42 и 43, соответственно.

5)-2-2 Гуманизированная тяжелая цепь hLA212_H3-типа

Гуманизированную тяжелую цепь hLA212, сконструированная заменой аргинина в аминокислотном положении 16 глицином, лизином в аминокислотном положении 19 аргинином, треонина в аминокислотном положении 42 глицином, аргинина в аминокислотном положении 43 лизином, серина в аминокислотном положении 88 аланином, треона в аминокислотном положении 93 валином, валина в аминокислотном положении 115 треонином и метионина в аминокислотном положении 116 лейцином в вариабельной области тяжелой цепи химерного cLA212, представленной в SEQ ID NO:24, обозначали как «гуманизированная тяжелая цепь hLA212_H3-типа» (которая также может обозначаться как «hLA212_H3»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи hLA212_H3-типа описана в SEQ ID NO:30 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 19, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 20 по 140, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 141 по 470, соответственно, соответствуют сигнальной последовательности, вариабельной области тяжелой цепи и константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30, описана в SEQ ID NO:29 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:29 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 57, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 58 по 420, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 421 по 1410, соответственно, кодирует сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:29 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:30 также описаны на Фигурах 44 и 45, соответственно.

5)-3 Гуманизация легкой цепи rLA212

5)-3-1 Гуманизированная легкая цепь hLA212_L1-типа

Гуманизированная легкая цепь hLA212, сконструированная путем замены аспарагина в аминокислотном положении 1 аспарагиновой кислотой, валина в аминокислотном положении 3 глутамином, лизина в аминокислотном положении 9 серином, метионина в аминокислотном положении 11 лейцином, изолейцина аминокислотном положении 13 аланином, метионин в аминокислотном положении 21 изолейцином, аспарагина в аминокислотном положении 22 треонином, лизина в аминокислотном положении 38 глутамином, серина в аминокислотном положении 43 аланином, аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 60 серином, треонина в аминокислотном положении 63 серином, глицина в аминокислотном положении 65 серином, тирозина в аминокислотном положении 67 серином, аспарагина в аминокислотном положении 76 серином, валина в аминокислотном положении 78 лейцином, аланина в аминокислотном положении 80 пролином, аланина в аминокислотном положении 83 фенилаланином, фенилаланина в аминокислотном положении 85 треонином, аланина в аминокислотном положении 100 глутамином, глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 103 лизином, лейцина в аминокислотном положении 104 валином, лейцина в аминокислотном положении 106 изолейцином и аланина в аминокислотном положении 109 треонином, в вариабельной области легкой цепи химерного cLA212, представленного в SEQ ID NO:26, обозначали как «гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L1» (которая может также упоминаться как «hLA212_L1»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L1 описана в SEQ ID NO:32 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 20, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 21 по 129, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 130 по 234 соответственно, соответствуют сигнальной последовательности, вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32, описана в SEQ ID NO:31 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:31 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 60, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 61 по 387, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 388 по 702, соответственно, кодирует сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области легкой цепи и последовательность константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:31 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:32 также описаны на Фигурах 46 и 47, соответственно.

5)-3-2 Гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L2

Гуманизированная легкая цепь hLA212, сконструированная путем замены аспарагина в аминокислотном положении 1 на аспарагиновую кислоту, валина в аминокислотном положении 3 на глутамин, лизина в аминокислотном положении 9 на серин, метионина в аминокислотном положении 11 на лейцин, изолейцина аминокислотном положении 13 аланином, метионина в аминокислотном положении 21 изолейцином, аспарагина в аминокислотном положении 22 треонином, лизина в аминокислотном положении 38 глутамином, аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 60 серином, треонина в аминокислотном положении 63 серином, глицина в аминокислотном положении 65 серином, аспарагина в аминокислотном положении 76 серином, валина в аминокислотном положении 78 лейцином, аланина в аминокислотном положении 80 пролином, аланина в аминокислотном положении 83 фенилаланином, фенилаланина в аминокислотном положении 85 треонином, аланина в аминокислотном положении 100 глутамином, глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 103 лизином, лейцина в аминокислотном положении 104 валином, лейцина в аминокислотном положении 106 изолейцином и аланина в аминокислотном положении 109 треонином в вариабельной области легкой цепи химерного cLA212, представленного в SEQ ID NO:26, обозначено как «гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L2» (которая также может упоминаться как «hLA212_L2»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L2 описана в SEQ ID NO:34 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 20, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 21 по 129, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 130 по 234 соответственно, соответствуют сигнальной последовательности, вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, описана в SEQ ID NO:33 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:33 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 60, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 61 по 387, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 388 по 702, соответственно, кодирует сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области легкой цепи и последовательность константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:33 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:34 также описаны на Фигурах 48 и 49, соответственно.

5)-3-3 Гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L3

Гуманизированную легкую цепь hLA212, сконструированную путем замены валина в аминокислотном положении 3 глутамином, лизина в аминокислотном положении 9 серином, метионина в аминокислотном положении 11 лейцином, изолейцина в аминокислотном положении 13 аланином, метионина в аминокислоте в положении 21 изолейцином, аспарагина в аминокислотном положении 22 треонином, треонина в аминокислотном положении 63 серином, аспарагина в аминокислотном положении 76 серином, валина в аминокислотном положении 78 лейцином, аланина в аминокислотном положении 80 пролином, аланина в аминокислотном положении 83 фенилаланином, аланина в аминокислотном положении 100 глутамином, глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 103 лизином, лейцина в аминокислотном положении 104 валином, лейцина в аминокислотном положении 106 изолейцином и аланина в аминокислотном положении 109 треонином в вариабельной области легкой цепи химерного cLA212, представленного в SEQ ID NO:26, обозначали как «гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L3» (которая также может упоминаться как «hLA212_L3»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L3 описана в SEQ ID NO:36 списка последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:36 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 20, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 21 по 129, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 130 по 234 соответственно, соответствуют сигнальной последовательности, вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, описана в SEQ ID NO:35 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:35 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 60, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 61 по 387, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 388 по 702, соответственно, кодируют сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области легкой цепи и последовательность константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:35 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:36 описаны также на Фигурах 50 и 51, соответственно.

5)-3-4 гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L4

Гуманизированную легкую цепь hLA212, сконструированную заменой аспарагина в аминокислотном положении 1 аспарагиновой кислотой, валина в аминокислотном положении 3 глутамином, лизина в аминокислотном положении 9 серином, аспарагина в аминокислотном положении 22 треонином, аспарагиновой кислотой в аминокислотном положении 60 серином, треонина в аминокислотном положении 63 серином, глицина в аминокислотном положении 65 серином, тирозина в аминокислотном положении 67 серином, аспарагина в аминокислотном положении 76 серином, аланина в аминокислотном положении 80 пролином, аланина в аминокислотном положении 83 фенилаланином, фенилаланина в аминокислотном положении 85 треонином, аланина в аминокислотном положении 100 глутамином, глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 103 лизином и аланина в аминокислотном положении 109 треонином, в вариабельной областм легкой цепи химерного cLA212, представленного в SEQ ID NO:26, обозначали как «гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L4» (которая также может упоминаться как «HLA212_L4»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L4 описана в SEQ ID NO:38 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 20, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 21 по 129, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 130 по 234, соответственно, соответствуют сигнальной последовательности, вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, описана в SEQ ID NO:37 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:37 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 60, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 61 по 387, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 388 по 702, соответственно, кодируют сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области легкой цепи и последовательность константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:37 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:38 описаны также на Фигурах 52 и 53, соответственно.

5)-5-5 гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L5

Гуманизированную легкую цепь hLA212, сконструированную заменой валина в аминокислотном положении 3 глутамином, лизина в аминокислотном положении 9 серином, аспарагином в аминокислотном положении 22 треонином, треонином в аминокислотном положении 63 серином, аспарагина в аминокислотном положении 76 с серином, аланина в аминокислотном положении 80 пролином, аланина в аминокислотном положении 100 глутамином, глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 103 лизином и аланина в аминокислотном положении 109 треонином в вариабельной области легкой цепи химерного cLA212, представленного в SEQ ID NO:26, обозначали как «гуманизированная легкая цепь типа hLA212_L5» (которая также может упоминаться как «hLA212_L5»).

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L5 описана в SEQ ID NO:40 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:40 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 20, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 21 по 129, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 130 по 234, соответственно, соответствует сигнальной последовательности, вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40, описана в SEQ ID NO:39 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:39 последовательность, состоящая из нуклеотидов с 1 по 60, последовательность, состоящая из нуклеотидов с 61 по 387, и последовательность, состоящая из нуклеотидов с 388 по 702, соответственно, кодируют сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области легкой цепи и последовательность константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:39 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:40 описаны также на Фигурах 54 и 55, соответственно.

5)-4 Конструирование гуманизированного hLA212 путем комбинации тяжелой цепи и легкой цепи

Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H2 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L1, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H2/L1» (которое также может упоминаться как «hLA212_H2/L1»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H2 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L2, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H2/L2» (которое также может упоминаться как «hLA212_H2/L2»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H2 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L3, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H2/L3» (которое также может упоминаться как «hLA212_H2/L3»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H2 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L4, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H2/L4» (которое также может упоминаться как «hLA212_H2/L4»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H2 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L5, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H2/L5» (которое также может упоминаться как «hLA212_H2/L5»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H3 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L1, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H3/L1» (которое также может упоминаться как «hLA212_H3/L1»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H3 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L2, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H3/L2» (которое также может упоминаться как «hLA212_H3/L2»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H3 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L3, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H3/L3» (которое также может упоминаться как «hLA212_H3/L3»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H3 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L4, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H3/L4» (которое также может упоминаться как «hLA212_H3/L4»). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа hLA212_H3 и гуманизированной легкой цепи типа hLA212_L5, было сконструировано и обозначено как «гуманизированное hLA212_H3/L5» (которое также может упоминаться как «hLA212_H3/L5»). Антитела, сконструированные как указано выше, могут быть изготовлены в соответствии с Примером 6 и оценены в соответствии с Примером 7 и Примером 8.

Пример 6. Экспрессия и очистка гуманизированного антитела (hLA212) химерного человеческого антитела cLA212 против LAG-3

6)-1 Конструирование вектора экспрессии тяжелой цепи hLA212

6)-1-1 Конструирование вектора экспрессии тяжелой цепи типа hLA212_H2

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_H2, представленные в положениях нуклеотидов с 36 по 437 нуклеотидной последовательности hLA212_H2 SEQ ID NO:27 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Синтезированные фрагменты ДНК встраивали в сайт экспрессирующего вектора тяжелой цепи химерного и гуманизированного антитела типа IgG1, pCMA-G1, расщепленный рестриктазой BlpI, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.) для конструирования вектора экспрессии hLA212_H2. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_H2».

6)-1-2 Конструирование вектора экспрессии тяжелой цепи типа hLA212_H3

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_H2, представленные в положениях нуклеотидов с 36 по 437 нуклеотидной последовательности hLA212_H3 SEQ ID NO:29 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Таким же образом, как в примере 6)-1-1, конструировали вектор экспрессии hLA212_H3. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_H3».

6)-2 Конструирование экспрессирующих векторов легкой цепи hLA212

6)-2-1 Конструирование вектора экспрессии легкой цепи типа hLA212_L1

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_L1, представленные в положениях нуклеотидов с 37 по 402 нуклеотидной последовательности hLA212_L1 SEQ ID NO:31 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Синтезированные фрагменты ДНК встраивали в сайт экспрессирующего вектора легкой цепи химерного и гуманизированного антитела, pCMA-LK, расщепленного рестриктазой BsiWI, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.) для конструирования вектора экспрессии hLA212_L1. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_L1».

6)-2-2 Конструирование вектора экспрессии легкой цепи типа hLA212_L2

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_L2, представленные в положениях нуклеотидов 37-402 нуклеотидной последовательности hLA212_L2 SEQ ID NO:33 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Таким же образом, как в Примере 6)-2-1, конструировали вектор экспрессии hLA212_L2. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_L2».

6)-2-3 Конструирование вектора экспрессии легкой цепи типа hLA212_L3

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_L3, представленные в положениях нуклеотидов 37-402 нуклеотидной последовательности hLA212_L3 SEQ ID NO:35 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Таким же образом, как в Примере 6)-2-1, конструировали вектор экспрессии hLA212_L3. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_L3».

6)-2-4 Конструирование вектора экспрессии легкой цепи типа hLA212_L4

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_L4, представленные в положениях нуклеотидов 37-402 в нуклеотидной последовательности hLA212_L4 SEQ ID NO:37 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Таким же образом, как в Примере 6)-2-1, конструировали вектор экспрессии hLA212_L4. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_L4».

6)-2-5 Конструирование вектора экспрессии легкой цепи типа hLA212_L5

Были синтезированы фрагменты ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области hLA212_L5, представленные в положениях нуклеотидов 37-402 в нуклеотидной последовательности hLA212_L5 SEQ ID NO:39 (Strings DNA Fragments, Geneart AG). Таким же образом, как в Примере 6) -2-1, конструировали вектор экспрессии hLA212_L5. Полученный вектор экспрессии обозначали как «pCMA/hLA212_L5».

6)-3 Получение антител к hLA212

6)-3-1 Продуцирование антител к hLA212.

Продуцирование осуществляли так же, как в Примере 4)-5. То есть, hLA212_H2/L1 получали комбинацией pCMA/hLA212_H2 и pCMA/hLA212_L1; hLA212_H2/L2 получали комбинацией pCMA/hLA212_H2 и pCMA/hLA212_L2; hLA212_H2/L3 получали комбинацией pCMA/hLA212_H2 и pCMA/hLA212_L3; hLA212_H2/L4 получали комбинацией pCMA/hLA212_H2 и pCMA/hLA212_L4; hLA212_H2/L5 получали комбинацией pCMA/hLA212_H2 и pCMA/hLA212_L5; hLA212_H3/L1 получали комбинацией pCMA/hLA212_H3 и pCMA/hLA212_L1; hLA212_H3/L2 получали комбинацией pCMA/hLA212_H3 и pCMA/hLA212_L2; hLA212_H3/L3 получали комбинацией pCMA/hLA212_H3 и pCMA/hLA212_L3; hLA212_H3/L4 получали комбинацией pCMA/hLA212_H3 и pCMA/hLA212_L4; и hLA212_H3/L5 получали комбинацией pCMA/hLA212_H3 и pCMA/hLA212_L5.

6)-3-2 Очистка антитела к hLA212

Культуральный супернатант, полученный в 6)-3-1, применяли для очистки таким же образом, как в примере 4)-6.

Пример 7. In vitro оценка гуманизированного антитела против LAG-3 человека (hLA212)

7)-1 Анализ антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела против LAG-3 человека (hLA212) с использованием Biacore

Клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) применяли для экспрессии меченного на С-конце His-меткой белка LAG-3_D3D4-His, содержащего 3-ий и 4-ый (область положений 263-450) домены от N-конца из четырех внеклеточных иммуноглобулино-подобных доменов человеческого LAG-3. Полученный супернатант культуры подвергали замене буфера (20 мМ HEPES, 300 мМ NaCl и pH 7,5) для очистки белка LAG-3_D3D4-His человека с использованием колонки HisTrap HP (GE Healthcare) и колонки Superdex75 (GE Healthcare). Конечный буфер был PBS.

Антитело оценивали по его константе диссоциации для антигена (LAG-3_D3D4-His), используя Biacore T200 (GE Healthcare), методом захвата, который включает захват антитела в качестве лиганда с помощью иммобилизованного антитела против человеческого IgG (Fc) (Набор для захвата антител человека, GE Healthcare) и оценивали с использованием антигена в качестве аналита. Антитело против человеческого IgG (Fc) ковалентно связывалось с сенсорным микрочипом CM5 (GE Healthcare) с помощью аминоконденсации, направленно воздействуя приблизительно на 1000 RU. Аналогично, это антитело было иммобилизовано на контрольной ячейке. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP + (10 мМ HEPES (рН 7,4), 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,05% поверхностно-активного вещества Р20). После того как каждое антитело добавляли в течение приблизительно 1 минуты на чип с иммобилизованным антителом против человеческого IgG(Fc), добавляли туда последовательные разведения антигена (от 0,06 до 20 нМ) со скоростью потока 90 мкл/мин в течение 300 секунд и затем фазу диссоциации контролировали в течение 3600 секунд. Раствор хлорида магния 3М добавляли туда в качестве регенерирующего раствора при скорости потока 10 мкл/мин в течение 30 секунд. Данные анализировали с использованием модели связывания 1:1 в аналитическом программном обеспечении (Biacore T200 Evaluation Software, версия 1.0) для расчета константы скорости ассоциации ka, константы скорости диссоциации kd и константы диссоциации (KD; KD=kd/ka). На Фигуре 7 показана константа диссоциации.

7)-2 Исследование активности связывания гуманизированного антитела против человеческого LAG-3 (hLA212) с клетками, экспрессирующими человеческий LAG-3, методом проточной цитометрии.

Плазмиду экспрессии LAG-3 человека pcDNA3.1/hLAG-3 вводили в клетки 293T-lacZ (описанные в Примере 1)-5-1) с использованием Липофектамина 2000 (производства Invitrogen Corp.), и клетки культивировали в течение 1 дня и затем использовали для проточной цитометрии. Проточную цитометрию выполняли в соответствии со способом, описанным в Примере 1)-4, но в качестве вторичного антитела использовали конъюгат антитела к человеческому IgG и PE (производства Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разбавленный в 200 раз буфером FACS. Как показано на Фигуре 8, было выявлено, что все 10 клонов гуманизированных антител против LAG-3 человека (hLA212_H2/L1, hLA212_H2/L2, hLA212_H2/L3, hLA212_H2/L4, hLA212_H2/L5, hLA212_HL/2/hL2 L2, hLA212_H3/L3, hLA212_H3/L4 и hLA212_H3/L5) проявляли зависимую от концентрации активность связывания с клетками 293T-lacZ, экспрессирующими человеческий LAG-3, сравнимую с человеческим химерным антителом против LAG-3, cLA212, и поэтому поддерживали связывающую активность даже после гуманизации.

7)-3 ADCC-активность гуманизированного антитела против LAG-3 человека (hLA212)

Активность ADCC гуманизированных антител против LAG-3 человека (hLA212) исследовали способом, описанным в примере 2)-2. Как показано на Фигуре 9, результаты выявили, что все 10 клонов гуманизированных антител против LAG-3 человека (hLA212_H2/L1, hLA212_H2/L2, hLA212_H2/L3, hLA212_H2/L4, hLA212_H2/L5, hLA212_HL/2/hL2 L2, hLA212_H3/L3, hLA212_H3/L4 и hLA212_H3/L5) проявляли зависимую от концентрации активность ADCC против клеток 293T-lacZ, экспрессирующих человеческий LAG-3, почти сравнимую с человеческим химерным антителом против LAG-3 cLA212, и поэтому поддерживали активность ADCC даже после гуманизации.

7)-4 Исследование влияния гуманизированного антитела против человеческого LAG-3 hLA212_H3/L2 на функцию LAG-3 по подавлению Т-клеток

Известно, что LAG-3 связывается с молекулами МНС класса II, передавая тем самым некоторые ингибирующие сигналы Т-клеткам для отрицательной регуляции функции Т-клеток (Непатентная литература 1). Для связывания LAG-3 с молекулами MHC класса II важны N-концевые домены 1 и 2 из четырех внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов LAG-3 (непатентная литература 4). В Примере 2 было обнаружено, что все 5 клонов крысиного антитела против LAG-3 человека (rLA204, rLA212, rLA225, rLA869 и rLA1264), полученных способом по Примеру 1, распознают домен 3 и не проявляют ингибирующей активности в тесте связывания LAG -3/МНС класса II и тесте адгезии клеток 293T-hLAG-3/Raji, тогда как человеческое химерное антитело против человеческого LAG-3, IMP731, которое является обычным антителом в Списке цитирования, распознало домен 1 и продемонстрировало сильную ингибирующую активность в тесте связывания LAG-3/MHC класса II и тесте адгезии клеток 293T-hLAG-3/Raji. На основании этих результатов предположили, что клоны, полученные способом по примеру 1, и гуманизированные антитела против LAG-3 человека, полученные из них, не влияют на функцию подавления Т-клеток, присущую LAG-3, тогда как IMP731 ингибирует ее. Чтобы подтвердить это экспериментально, влияние гуманизированного антитела против человеческого LAG-3 hLA212_H3/L2 на функцию LAG-3 по подавлению Т-клеток исследовали в соответствии с предыдущим сообщением (непатентная литература 9). РВМС, выделенные из периферической крови человека с помощью центрифугирования с Фиколом, были распределены в 96-луночный микропланшет в количестве 2×10⁵ клеток/лунку, и к ним добавляли антитело, с последующей пре-инкубацией при 37°С в течение 30 минут. Концентрацию IL-2 в супернатанте культуры при добавлении к нему конечной концентрации 1 нг/мл SEB (стафилококковый энтеротоксин B, производства Sigma-Aldrich) и культивирования клеток в течение 4 дней определяли с помощью человеческого IL-2 (Набор для иммуноанализа производства PerkinElmer Inc). В результате, разработанное гуманизированное антитело против человеческого LAG-3 hLA212_H3/L2 практически не влияло на продуцировавние IL-2, тогда как IMP731 увеличивал продуцирование IL-2, как показано на Фигуре 10. То есть как первоначально предсказывалось, было обнаружено, что разработанное гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212_H3/L2, не оказывало влияния на функцию LAG-3 по подавлению Т-клеток, тогда как IMP731 ингибировало ее, таким образом имея неблагоприятный риск активации иммунной системы.

Пример 8. Получение гуманизированного антитела, в котором модифицирована его сахарная цепь

Гуманизированное антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислоты положений от 20 до 470 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:30 (Фигура 45), и легкую цепь, содержащую аминокислоты положений от 21 до 234 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:34 (Фигура 49) дефукозилировали в соответствии с известным способом для регуляции модификации связывания сахарной цепи с белком антитела, и полученное антитело обозначали как hLA212_H4/L2. Эту модифицированную форму подвергали масс-спектрометрии. В результате пик (и), полученный из фукозосодержащей Н-цепи, был равен или ниже, чем предел обнаружения. В настоящем изобретении антитело, в котором регулировали модификацию сахарной цепи, такое как hLA212_H4/L2, также обозначают «антителом» или «модифицированной формой антитела».

Пример 9. In vitro оценка гуманизированного антитела против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2

9)-1 Активность связывания гуманизированного антитела против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, с клетками, экспрессирующими LAG-3.

Связывание гуманизированного антитела против LAG-3 человека hLA212_H4/L2 с клетками 293T-lacZ, экспрессирующими LAG-3 человека, исследовали методом проточной цитометрии в соответствии со способом, описанным в примере 7)-2. В результате наблюдается зависимое от концентрации связывание hLA212_H4/L2, как показано на Фигуре 11.

9)-2 in vitro активность ADCC гуманизированного антитела против LAG-3 человека, hLA212_H4/L2

in vitro активность ADCC гуманизированного антитела против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, оценивали по методу, описанному в Примере 7)-2. В результате hLA212_H4/L2 проявляло зависимую от концентрации активность ADCC против клеток 293T-lacZ, экспрессирующих человеческий LAG-3, как показано на Фигуре 12. Напротив, оно не проявляло активности ADCC на клетках 293T-lacZ, не экспрессирующих человеческий LAG-3.

Пример 10 Разработка дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA

Было обнаружено, что гуманизированное антитело против человеческого LAG-3 hLA212_H4/L2 связывается с человеческим LAG-3, как показано в Примере 9, но не реагирует перекрестно с LAG-3 грызунов. Следовательно, для обеспечения возможности оценки in vivo hLA212_H4/L2 были разработаны трансгенные мыши BAC (бактериальная искусственная хромосома), у которых была возможность физиологически экспрессировать человеческий LAG-3 с использованием механизма регуляции экспрессии мышиного LAG-3. Кроме того, человеческий FcγIIIA необходим для повышения ADCC-активности за счет регуляции модификации сахарной цепи, как в hLA212_H4/L2 (Junttila, T.T., et al., Cancer Res., Vol.70 (No.11): pp4481-9 (2010)), и, таким образом, BAC, содержащую человеческий ген FcγRIIIA, дополнительно вводили в соответствии с предыдущим сообщением (Непатентная литература 10).

10)-1 Конструирование рекомбинантного вектора экспрессии BAC с использованием реакции Red/ET

Рекомбинантный клон BAC человеческого RecAGAC LAG-3 был сконструирован с использованием технологии рекомбинации Red/ET (Zhang Y et al, A new logic for DNA engineering using recombination in E.Coli., Nature 20 (1998) 123-128), которая представляет собой активную реакцию гомологичной рекомбинации в Escherichia coli.

Были получены клоны генома ВАС, RP11-101F21 и RP23-3001, каждый из которых содержит локус гена LAG-3 человека или мыши LAG-3. Как показано в приведенном ниже списке, последовательность интрона 5 гена человеческого LAG-3, последовательности на обоих концах последовательности геномной ДНК от старт-кодона трансляции до стоп-кодона гена человеческого LAG-3 и 3'-конец и 5'-конец последовательности геномной ДНК от старт-кодона трансляции до стоп-кодона гена LAG-3 мышиного BAC-клона использовали в качестве ключевых последовательностей для активной реакции гомологичной рекомбинации в Escherichia coli.

LAG-3-H1: последовательность около старт-кодона гена LAG-3 человека

[5'] ATGTGGGAGGCTCAGTTCCTGGGCTTGCTGTTTC [3'] (SEQ ID NO:79)

LAG-3-H2: последовательность около стоп-кодона гена LAG-3 человека

[5'] GCCCGAGCCCGAGCCCGAGCCGGAGCAGCTCTGA [3'] (SEQ ID NO:80)

LAG-3-H3: сайт вставки Rpsl-kan, 5'-область

[5'] GAGTATGTGTTGACTGGTTGATAACTATCG [3'] (SEQ ID NO:81)

LAG-3-H4: сайт вставки Rpsl-kan, 3'-область

[5'] GCCATGACAGATTAGCCATGTCTGCAGCAC [3'] (SEQ ID NO:82)

LAG-3-H5: 5'UTR мышиного гена LAG-3

[5'] CAGGACCTTTTTCTAACCTCCCTTGGAGGGCTGGGGAGGCCCGGGCCATAGAGGAG [3'] (SEQ ID NO:83)

LAG-3-H6: 3'UTR мышиного гена LAG-3

[5'] CCTGGAGCCGAGGCAGCCAGCAGGTCTCAGCAGCTCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCC [3'] (SEQ ID NO:84)

Во-первых, для того, чтобы вставить кассету с маркером положительной/отрицательной селекции (Rpsl-kan) в интрон 5 гена LAG-3 клона ВАС человека, фрагмент(ы) ДНК, соединяющий последовательность LAG-3-H3, Rpsl- kan, и последовательность LAG-3-H4 в тандеме были сконструированы с помощью ПЦР с использованием LA-Taq (Takara Bio Inc.) (Фрагмент для разреза LAG-3 Rpsl-Kan). Человеческий BAC-клон, содержащий локус гена LAG-3 и фрагмент для разреза LAG-3 Rpsl-Kan вводили в штаммы Escherichia coli, обладающие способностью реакции Red/ET, вызывать реакцию Red/ET в хозяине Escherichia coli, и колонии с устойчивостью к хлорамфениколу и устойчивостью к канамицину отбирали, таким образом, скринируя рекомбинантный клон ВАС, в котором фрагмент для разреза LPS-3 Rpsl-kan был вставлен в интрон 5 локуса гена LAG-3 (промежуточный продукт человеческого LAG-3). Затем для субклонирования последовательности геномной ДНК гена LAG-3 человека с вставленной в него кассетой Rpsl-kan в плазмидный вектор из промежуточного продукта LAG-3 человека, конструировали ДНК-кассету, соединяющую H2-H6-SacBpBluescript-H5-H1 в тандем (LAG-3 пред-плазмида для переноса). Таким же образом, как указано выше, линеаризованную LAG-3 пред-плазмиду для переноса вводили в штаммы Escherichia coli, обладающие способностью к реакции Red/ET, вместе с промежуточным продуктом LAG-3 человека для индукции реакции Red/ET в хозяине Escherichia coli, и отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и колонии, устойчивые к канамицину, скринируя таким образом, плазмиду, имеющую последовательность геномной ДНК гена LAG-3 человека с вставленной в нее кассетой Rpslkan (плазмида для переноса LAG-3 человека).

Затем последовательность геномной ДНК человеческого гена LAG-3, имеющая последовательность H5 и последовательность H6, полученную из последовательности генома мыши на обоих концах с вставленной в нее кассетой Rpsl-kan, вырезали из плазмидного вектора переноса LAG-3 человека с помощью реакция фермента рестрикции (фрагмент человеческого LAG-3 для переноса). Таким же образом, как указано выше, фрагмент (фрагменты) человеческого LAG-3 для переноса вводили в штаммы Escherichia coli, обладающие способностью к реакции Red/ET, вместе с клоном BAC мыши LAG-3, чтобы индуцировать реакцию Red/ET в хозяине Escherichia. coli, и отбирали колонии, устойчивые к хлорамфениколу и канамицину, скринируя, таким образом, рекомбинантный клон BAC мышиного гена LAG-3/человеческого гена LAG-3, в котором последовательность геномной ДНК от старт-кодона трансляции до стоп-кодона мышиного гена LAG-3 была точно заменена последовательностью геномной ДНК от старт-кодона трансляции до стоп-кодона фрагментов человеческого LAG-3 для переноса (мышиный LAG-3/человеческий LAG-3 RecBAC промежуточный продукт).

Наконец, последовательность интрона 5 локуса гена человеческого LAG-3 амплифицировали с помощью ПЦР и использовали в качестве последовательности ДНК для удаления Rpsl-Kan, встроенного в интрон 5 гена человеческого LAG-3, путем отрицательной селекции (фрагменты репарации человеческого LAG-3). Таким же образом, как указано выше, фрагмент (фрагменты) репарации человеческого LAG-3 вводили в штаммы Escherichia coli, обладающие способностью к реакции Red/ET, вместе с промежуточным продуктом клоном RecBAC мышиный LAG-3/человеческий LAG-3, чтобы индуцировать реакцию Red/ET в хозяине Escherichia. coli, и отбирали колонии, устойчивые к хлорамфениколу и стрептамицину, конструируя, таким образом, рекомбинантный клон BAC мышиного гена LAG-3/человеческого гена LAG-3, в котором последовательность геномной ДНК от старт-кодона трансляции до стоп-кодона мышиного гена LAG-3 была точно заменена последовательностью геномной ДНК от старт-кодона трансляции до стоп-кодона человеческого гена LAG-3 (человеческий LAG-3 RecBAC). Последовательности геномной ДНК с Н1-Н6, связанные реакцией Red/ET, проверяли с помощью анализа последовательностей.

10)-2 Очистка высокочистых фрагментов ДНК ВАС

Клетки DH10B, трансформированные рекомбинантным клоном BAC, который представляет собой конструкцию для экспрессии человеческого гена RecBAC LAG-3, клонировали на среде LB-агара, содержащей хлорамфеникол, и одну колонию собирали и культивировали при встряхивании в жидкой среде всю ночь и все день.

Рекомбинантный рекомбинантный клон BAC человеческого LAG-3 RecBAC очищали с использованием набора для экстракции плазмиды (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, набор Nucleobond BAC100) в соответствии с методом Abe et al., с частичной модификацией (Exp Anim. 2004 53 (4): 311-20. Establishment of an efficient BAC transgenesis protocol and its application to functional characterization of the mouse Brachyury locus. Abe K, Hazama M, Katoh H, Yamamura K, Suzuki M), с последующим добавлением PI-SceI, тем самым давая возможность реакции гидролиза при 37°С в течение 16 часов.

Линеаризованной рекомбинантный ВАС-клон человеческого LAG-3 RecBAC наносили на 1% SeaKem GTG агарозный гель (Takara Bio Inc.), и электрофорез проводили в условиях 6 В/см, от 0,1 до 40 сек, 15 ч, и 14°С использованием аппарата для электрофореза в пульсирующем поле (CHEF DR-II, Bio-Rad Laboratories, Inc). При визуализации части образца в качестве направляющего маркера с использованием УФ-трансиллюминатора линеаризованный рекомбинантный ВАС-клон человеческого LAG-3 RecBAC, разделенный в агарозном геле, вырезали скальпелем без УФ-облучения. Полученный фрагмент ДНК с длинной цепью экстрагировали из агарозного геля метода электроэлюирования и подвергали диализу с ТЕМ-буфером, подготовленным для микроинъекции при 4°С в течение 2 часов. Очищенный фрагмент ДНК применяли для электрофореза в пульсирующем поле, чтобы подтвердить, что фрагмент ДНК с длинной цепью был высоко очищен без сегментации, и определить концентрацию его ДНК с использованием спектрофотометра NanoDrop (AGC TECHNO GLASS CO., LTD). Раствор фрагмента ДНК разбавляли до 0,5 нг/мкл с получением раствора экспрессирующего конструкта для создания трансгенной мыши.

10-3) Эмбриональная микроинъекция мышей C57BL/6J

PMSG и hCG вводили самкам мышей C57BL/6J для индукции суперовуляции с последующим спариванием с самцами мышей того же штамма, а затем собирали оплодотворенные яйцеклетки.

С использованием микроманипулятора, очищенный экспрессирующий конструкт человеческого LAG-3 RecBAC/человеческого FcγR BAC непосредственно инъецировали в ядра эмбрионов на стадии пронуклеусов самцов мышей C57BL/6J. Эмбрионы с инъекцией ДНК трансплантировали в маточные трубы самок мышей-реципиентов с индуцированной псевдобеременностью.

10-4) Скрининг по Саузерну основателей

Потомство, полученное в результате спонтанной доставки из оплодотворенных яицеклеток C57BL/6J мышей с инъецированными экспрессирующими конструктами человеческого LAG-3 RecBAC/человеческого, FcγR BAC кормили до отлучения. Трансгенных мышей по человеческому LAG-3 RecBAC/человеческому FcγR BAC, являющихся кандидатами-основателями, отлучали от кормления в возрасте 3 недель и помечали уши для идентификации особей. После этого, делали биопсию их хвостовых тканей и хранили при -80°C до анализа.

Хвостовые ткани кандидатов-особей трансгенных мышей по человеческому LAG-3 RecBAC/человеческому FcγR BAC, которые были сохранены при -80°С оттаивали при комнатной температуре, и добавляли лизирующий буфер, содержащий 1% SDS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd), 1 мг/мл актиназы Е (Kaken PHARMACEUTICAL CO., LTD) и 0,15 мг/мл протеиназы к (Merck KGaA) с последующим встряхиванием при 55°С в течение 16 часов, чтобы растворить ткани. Белки, связывающиеся с геномной ДНК и солюбилизированные из тканей, удаляли экстракцией фенолом и экстракцией фенолом/хлороформом. РНК, смешанная с геномной ДНК, разлагали РНКазой A (Sigma-Aldrich), и после этого полимер геномной ДНК осаждали осаждением изопропанолом. Осажденную геномную ДНК промывали 70% этанолом, сушили на воздухе и затем ее растворяли в 50 мкл ТЕ.

Концентрацию ДНК раствора геномной ДНК, полученной из каждого образца, определяли методом абсорбционной спектроскопии, а объем раствора геномного ДНК, эквивалентный 5 мкг ДНК рассчитывали из значения концентрации ДНК каждого образца.

К геномной ДНК, полученной из каждого образца, ДНК положительного контроля (геномную ДНК контрольных мышей, к которой была добавлена экспрессирующая конструкция, используемая для микроинъекции) и ДНК отрицательного контроля (геномная ДНК контрольных мышей) добавляли рестриктазы, с последующей реакцией при 37°С в течение 16 часов. Полученные фрагменты геномной ДНК осаждали изопропанолом, промывали 70% этанолом, сушили на воздухе и затем снова растворяли в ТЕ. Фрагменты геномной ДНК наносили на 1,2% агарозный гель для электрофореза, а фрагменты геномной ДНК, выделенные в агарозном геле, визуализировали с использованием УФ-трансиллюминатора и фотографировали в масштабе.

Агарозный гель погружали в 0,25 Н соляную кислоту и осторожно встряхивали в течение 10 минут. После этого его дополнительно погружали в 0,4 Н гидроксид натрия и осторожно встряхивали в течение 10 минут. Фрагменты геномной ДНК, выделенные в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану (Hybond-XL; GE Healthcare) при комнатной температуре в течение 16 часов капиллярным методом с использованием 0,4 Н гидроксида натрия. Нейлоновую мембрану с перенесенными на нее фрагментами геномной ДНК погружали в 2 SSC, осторожно встряхивали в течение 10 минут, затем сушили на воздухе и хранили при комнатной температуре до использования для гибридизации.

С использованием набора для мечения ДНК (Megaprime DNA Labeling System; GE Healthcare) фрагменты ДНК были помечены [³²P] методом случайной затравки. С использованием центрифужных колонок Sephadex (ProbeQuant G-50 Micro Columns; GE Healthcare) фрагменты, меченные [³²P], очищали с получением зондов, меченных [³²P].

Нейлоновую мембрану с перенесенными на нее фрагментами геномной ДНК помещали в буфер гибридизации с последующей преинкубационной при 65°С в течение 1 часа. После этого [³²P] - меченый зонд, денатурированный нагреванием при 95°С в течение 5 минут и немедленного охлаждения на льду в течение 5 минут добавляли к ней, после чего инкубировали при 65°С в течение 4 часов. Нейлоновую мембрану вынимали после завершения инкубации и промывает 0,1% SDS и 0,5×SSC при 65°С в течение примерно 15 минут. Радиоактивность, полученную от зонда, связанного с мембраной, контролировали с помощью контрольного измерителя, и промывку повторяли до тех пор, пока радиоактивность не становилась приблизительно постоянной.

Промытую мембрану покрывали пленкой Saran Wrap, сверху покрывали рентгеновской пленкой (BioMax MS; Eastman Kodak Company) в темной комнате и помещали в кассету для радиоавтографии. После выдержки при 4°С в течение 1 недели, рентгеновскую пленку проявляли. Специфичные сигналы, полученные от экспрессирующих конструктов человеческого LAG-3 RecBAC/человеческого FcγR BAC были обнаружены с помощью радиоавтографии, и индивидуумы, дающие сигналы, специфичные для гибридизации с [³²Р]-мечеными зондами идентифицировали в качестве особей-основателей трансгенных мышей по человеческому LAG-3 RecBAC/человеческому FcγR BAC.

10-5) Создание и пролиферация мышей F1

Получали потомство животных особей-основателей и генотипировали для получения стабильных линий мышей Tg. Tg-мыши-основатели, идентифицированные с помощью Саузерн-анализа, и мыши C57BL/6J дикого типа были оплодотворены in vitro или спарены естественным путем для создания особей F1. Стабильные линии, где передача трансгенов к F1-особям была подтверждена генотипированием, размножали путем in vitro оплодотворения или естественного спаривания с мышами дикого типа C57BL /6J, и для экспериментов использовали мышей, как с введенным гетерозиготно человеческим LAG-3, так и человеческим FcγRIIIA, которые были выявлены генотипированием.

10-6) Подтверждение фенотипов дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA

Экспрессию введенных генов у полученных дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA исследовали с помощью проточной цитометрии. Периферическую кровь собирали из хвостовой вены каждой мыши в гепаринизированный гематокритный капилляр, и эритроциты гемолизировали с помощью PharmLyse (производства Becton, Dickinson and Company) для получения лейкоцитов. Лейкоциты частично использовали для анализа экспрессии человеческого FcγRIIIA с помощью проточной цитометрии, а остаток стимулировали в течение 3 дней в среде, содержащей 2 мкг/мл конканавалина A (Con А: Sigma-Aldrich) для индукции экспрессия LAG-3 для получения активированных Т-клеток. К последним клеткам добавляли меченное PE антитело против LAG-3 мыши (производства Becton, Dickinson and Company), меченное ATTO647 антитело против LAG-3 человека (производства Enzo Life Sciences, Inc.), FITC меченное антитело против CD3 мыши (производства Becton, Dickinson и Company), и флуоресцентно реактивный краситель LIVE/DEAD набора Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR (производства Invitrogen Corp.) для приготовления суспензии, с последующим выдерживанием при 4°C на 30 минут. Для использования для идентификации положений отрицательных популяций, контрольный образец, свободный от меченного РЕ антитела против LAG-3 мыши и меченного ATTO647 антитела против LAG-3 человека также получали и обрабатывали таким же образом. После промывания буфером FACS клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 1% параформальдегида, с последующим обнаружением с использованием проточного цитометра (CantoII: изготовлено Becton, Dickinson and Company). Данные были проанализированы с использованием FlowJo (производства Tree Star Inc). После удаления мертвых клеток, положительных по флуоресцентно реактивному красителю LIVE/DEAD набора Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR путем гейтирования, анализировали живые клетки. В результате была обнаружена только экспрессия мышиного LAG-3, а экспрессия человеческого LAG-3 не была обнаружена на активированных Con A Т-клетках, полученных от контрольных мышей дикого типа, тогда как экспрессия обоих мышиного LAG-3 и человеческого LAG-3 была обнаружена на Con А активированные Т-клетках, полученных дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA, и точки на точечной диаграмме, представляющей отдельные клетки, были распределены почти по диагонали, как показано на Фигуре 13. Почти не было экспрессии как мышиного LAG-3, так и человеческого LAG-3 на покоящихся Т-клетках, которые не были активированы. Эти результаты показали, что в полученных дважды трансгенных мышах по человеческому LAG-3 /человеческому FcγRIIIA человеческий LAG-3 экспрессировался в соответствии с эндогенным характером экспрессии мышиного LAG-3, как это первоначально планировалось, с помощью трансгенного подхода BAC. Кроме того, для человеческого FcγRIIIA, результаты, сравнимые с предыдущим сообщением (Непатентная литература 10) были подтверждены, в котором экспрессия наблюдалась примерно на 47% NK-клеток периферической крови (CD3-DX5+) полученных дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA.

Пример 11. in vivo оценка гуманизированного антитела против LAG-3 человека, hLA212_H4/L2

11-1) Активность гуманизированного антитела против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, по истощению LAG-3-положительных клеток

С использованием дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA Примера 10, было исследовано, имеют ли гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, активность истощения LAG-3 положительных клеток в in vivo. Сразу же после внутрибрюшинного введения гуманизированного антитела против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2 (30 мг/кг), или растворителя дважды трансгенным мышам по человеческму LAG-3/человеческому FcγRIIIA, Con А (производства Sigma-Aldrich) обладающий функцией активации поликлональных Т-клеток, вводили внутривенно в дозе 15 мг/кг. Эритроциты были гемолизированы из крови, собранной через 2 дня с помощью PharmLyse (производства Becton, Dickinson and Company) для получения лейкоцитов, и лейкоциты были использованы для проточной цитометрии. Лейкоцитам давали возможность реагировать с FcBlock (производства Becton, Dickinson и Company), а затем добавляли меченное PE антитело против LAG-3 мыши (производства Becton, Dickinson and Company), меченное ATTO647 антитело против LAG-3 человека (производства Enzo Life Sciences, Inc.), FITC меченное антитело против CD3 мыши (производства Becton, Dickinson и Company), и флуоресцентно реактивный краситель LIVE/DEAD набора Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR (производства Invitrogen Corp.) для приготовления суспензии, с последующим выдерживанием при 4°C в течение 30 минут. Для использования для идентификации положений отрицательных популяций, контрольный образец, свободный от меченного РЕ антитела против LAG-3 мыши и меченного ATTO647 антитела против LAG-3 человека также получали и обрабатывали таким же образом. После промывания буфером FACS клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 1% параформальдегида, с последующим обнаружением с использованием проточного цитометра (CantoII: производства Becton, Dickinson and Company). Данные были проанализированы с использованием FlowJo (производства Tree Star Inc). После удаления мертвых клеток, положительных по флуоресцентно реактивному красителю LIVE/DEAD набора Fixable Dead Cell Stain Kit-near-IR путем гейтирования, анализировали живые клетки. В результате расчета положительных результатов по человеческому LAG-3 в CD3 положительных Т-клетках, как показано на Фигуре 14, почти не обнаружено клеток, положительных по человеческому LAG-3 в Т-клетках периферической крови не обработанных дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA, тогда как в среднем 24% Т-клеток периферической крови в группе, не получавшей антитела, стали положительными в отношении человеческого LAG-3 при введении Con A, обладающего активирующим действием в отношении поликлональных Т-клеток. Напротив, положительный результат человеческого LAG-3 в Т-клетках периферической крови мышей, которым вводили Con A, которым вводили hLA212_H4/L2, заметно снижался. Аналогичная тенденция наблюдалась в Т-клетках селезенки и в Т-клетках периферической крови, полученных через один день после введения Con A, и аналогичные результаты были также получены в отношении положительного результата для мышиных LAG-3 и CD69, который является другим маркером активации. Эти результаты показали, что полученное гуманизированное антитело против человеческого LAG-3 hLA212_H4/L2 обладает активностью истощения LAG-3-положительных клеток in vivo.

11-2) Активность гуманизированного антитела против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, на модели Т-клеточно-зависимого аутоиммунного заболевания

Чтобы выяснить, является ли гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, обладающее активностью истощения LAG-3-положительных клеток in vivo, полезным для лечения аутоиммунных заболеваний, исследовали эффективность в отношении модели EAE (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) (Непатентная литература 11), которая является типичной моделью Т-клеточно-зависимого аутоиммунного заболевания (рассеянного склероза).

Раствор, полученный при растворении пептида (аминокислота 35-55, PEPTIDE INSTITUTE, INC.), Полученного из MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein), который является одним из белков миелинового компонента центральной нервной системы, в нормальном физиологическом растворе в концентрации 4 мг/мл, смешивали со смесью 8 мг/мл Killed Mycobacterium Tuberculosis H37Ra (производства Becton, Dickinson and Company) и неполного адъюванта Фрейнда (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в равных количествах, получая эмульсию. Эту эмульсию инъецировали подкожно в день 0 в оба бока дважды трансгенных мышей по человеческому LAG-3/человеческому FcγRIIIA в количестве 50 мкл каждая, и 0,2 мкг коклюшного токсина, разведенного физиологическим раствором, дополнительно вводили им внутривенно, чтобы вызвать EAE. После этого клинические показатели EAE наблюдали ежедневно следующим образом. То есть оценка 0: бессимптомно; Оценка 1: слабый хвост; Оценка 2: аномальная походка и потеря рефлекса выправления; Оценка 3: паралич задних конечностей; Оценка 4: Частичный паралич передних конечностей; и оценка 5: смерть или эвтаназия. Гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, и контрольное антитело вводили внутривенно каждое в дозе 30 мг/кг в дни 0 и 7. В результате средняя клиническая оценка EAE в группе, получавшей гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, была снижена до 50% или менее в течение периода наблюдения по сравнению со средней группой, которой вводили контрольное антитело, как показано на Фигуре 15. Кроме того, в группе, которой вводили hLA212_H4/L2, потеря веса с прогрессированием EAE также подавлялась. Эти результаты показали, что гуманизированное антитело против человеческого LAG-3, hLA212_H4/L2, обладающее активностью по истощению LAG-3-положительных клеток in vivo, подавляет EAE, который является типичной моделью Т-клеточно-зависимых аутоиммунных заболеваний, и оно может быть терапевтическим лекарственным средством для человеческих аутоиммунных заболеваний.

Промышленная применимость

Антитело, его связывающий фрагмент и тому подобное по настоящему изобретению применимы для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с LAG-3-положительными клетками, таких как аутоиммунные заболевания.

Список последовательностей в свободной форме

SEQ ID NO:1: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA204 (Фигура 16)

SEQ ID NO:2: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA204 (Фигура 17)

SEQ ID NO:3: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA204 (Фигура 18)

SEQ ID NO:4: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA204 (Фигура 19)

SEQ ID NO:5: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA212 (Фигура 20)

SEQ ID NO:6: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA212 (Фигура 21)

SEQ ID NO:7: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA212 (Фигура 22)

SEQ ID NO:8: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA212 (Фигура 23)

SEQ ID NO:9: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA225 (Фигура 24)

SEQ ID NO:10: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA225 (Фигура 25)

SEQ ID NO:11: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA225 (Фигура 26)

SEQ ID NO:12: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA225 (Фигура 27)

SEQ ID NO:13: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA869 (Фигура 28)

SEQ ID NO:14: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA869 (Фигура 29)

SEQ ID NO:15: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA869 (Фигура 30)

SEQ ID NO:16: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA869 (Фигура 31)

SEQ ID NO:17: нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA1264 (Фигура 32)

SEQ ID NO:18: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rLA1264 (Фигура 33)

SEQ ID NO:19: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA1264 (Фигура 34)

SEQ ID NO:20: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rLA1264 (Фигура 35)

SEQ ID NO:21: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотные последовательности сигнала секреции легкой цепи человека и константной области κ цепи человека (Фигура 36)

SEQ ID NO:22: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотные последовательности сигнала секреции тяжелой цепи человека и константной области человеческого IgG1 (Фигура 37)

SEQ ID NO:23: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела cLA212 (Фигура 38)

SEQ ID NO:24: аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела cLA212 (Фигура 39)

SEQ ID NO:25: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела cLA212 (Фигура 40)

SEQ ID NO:26: аминокислотная последовательность легкой цепи антитела cLA212 (Фигура 41)

SEQ ID NO:27: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность тяжелой цепи Н2 антитела hLA212 (Фигура 42)

SEQ ID NO:28: аминокислотная последовательность тяжелой цепи H2 антитела hLA212 (Фигура 43)

SEQ ID NO:29: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность тяжелой цепи H3 антитела hLA212 (Фигура 44)

SEQ ID NO:30: аминокислотная последовательность тяжелой цепи H3 антитела hLA212 (Фигура 45)

SEQ ID NO:31: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность легкой цепи L1 антитела hLA212 (Фигура 46)

SEQ ID NO:32: аминокислотная последовательность легкой цепи L1 антитела hLA212 (Фигура 47)

SEQ ID NO:33: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность легкой цепи L2 антитела hLA212 (Фигура 48)

SEQ ID NO:34: аминокислотная последовательность легкой цепи L2 антитела hLA212 (Фигура 49)

SEQ ID NO:35: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность легкой цепи L3 антитела hLA212 (Фигура 50)

SEQ ID NO:36: аминокислотная последовательность легкой цепи L3 антитела hLA212 (Фигура 51)

SEQ ID NO:37: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность легкой цепи L4 антитела hLA212 (Фигура 52)

SEQ ID NO:38: аминокислотная последовательность легкой цепи L4 антитела hLA212 (Фигура 53)

SEQ ID NO:39: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность легкой цепи L5 антитела hLA212 (Фигура 54)

SEQ ID NO:40: аминокислотная последовательность легкой цепи L5 антитела hLA212 (Фигура 55)

SEQ ID NO:41: аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA204 (Фигура 56)

SEQ ID NO:42: аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA204 (Фигура 57)

SEQ ID NO:43: аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA204 (Фигура 58)

SEQ ID NO:44: аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA204 (Фигура 59)

SEQ ID NO:45: аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA204 (Фигура 60)

SEQ ID NO:46: аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA204 (Фигура 61)

SEQ ID NO:47: аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA212 (Фигура 62)

SEQ ID NO:48: аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA212 (Фигура 63)

SEQ ID NO:49: аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA212 (Фигура 64)

SEQ ID NO:50: аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA212 (Фигура 65)

SEQ ID NO:51: аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA212 (Фигура 66)

SEQ ID NO:52: аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA212 (Фигура 67)

SEQ ID NO:53: аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA225 (Фигура 68)

SEQ ID NO:54: аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA225 (Фигура 69)

SEQ ID NO:55: аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA225 (Фигура 70)

SEQ ID NO:56: аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA225 (Фигура 71)

SEQ ID NO:57: аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA225 (Фигура 72)

SEQ ID NO:58: аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA225 (Фигура 73)

SEQ ID NO:59: аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA869 (Фигура 74)

SEQ ID NO:60: аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA869 (Фигура 75)

SEQ ID NO:61: аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA869 (Фигура 76)

SEQ ID NO:62: аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA869 (Фигура 77)

SEQ ID NO:63: аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA869 (Фигура 78)

SEQ ID NO:64: аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA869 (Фигура 79)

SEQ ID NO:65: аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи антитела rLA1264 (Фигура 80)

SEQ ID NO:66: аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи антитела rLA1264 (Фигура 81)

SEQ ID NO:67: аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи антитела rLA1264 (Фигура 82)

SEQ ID NO:68: аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи антитела rLA1264 (Фигура 83)

SEQ ID NO:69: аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи антитела rLA1264 (Фигура 84)

SEQ ID NO:70: аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи антитела rLA1264 (Фигура 85)

SEQ ID NO:71: Праймер RG2AR3 (Фигура 86)

SEQ ID NO:72: Праймер RKR5 (Фигура 87)

SEQ ID NO:73: Праймер 3.3-F1 (Фигура 88)

SEQ ID NO:74: Праймер 3.3-R1 (Фигура 89)

SEQ ID NO:75: праймер 212H-F (Фигура 90)

SEQ ID NO:76: праймер 212H-R (Фигура 91)

SEQ ID NO:77: Праймер 212L-F (Фигура 92)

SEQ ID NO:78: праймер 212L-R (Фигура 93)

SEQ ID NO:79: олигонуклеотид LAG-3-H1 (Фигура 94)

SEQ ID NO:80: олигонуклеотид LAG-3-H2 (Фигура 95)

SEQ ID NO:81: олигонуклеотид LAG-3-H3 (Фигура 96)

SEQ ID NO:82: олигонуклеотид LAG-3-H4 (Фигура 97)

SEQ ID NO:83: олигонуклеотид LAG-3-H5 (Фигура 98)

SEQ ID NO:84: олигонуклеотид LAG-3-H6 (Фигура 99)

SEQ ID NO:85: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность LAG-3 человека (Фигура 100)

SEQ ID NO:86: аминокислотная последовательность LAG-3 человека (Фигура 101)

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДАЙИТИ САНКИО КОМПАНИ, ЛИМИТЕД

<120> АНТИТЕЛО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

<130> FP1712

<150> JP2016-175491

<151> 2016-09-08

<160> 86

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 366

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(366)

<400> 1

gag gta gag ctg gtg gag tct ggg ggc ggc tta gtg cag cct gga agg 48

Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

tcc atg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act ttc aga acc tat 96

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

ggc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc 144

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gca tcc att agt act ggt ggt ggt agc act tac tat cgc gac tcc gtg 192

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa agc acc cta tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

aca aca gat cta att aac tac ccg ggt ata ggg ggg ttt gct ttc tgg 336

Thr Thr Asp Leu Ile Asn Tyr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Ala Phe Trp

100 105 110

ggc caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 366

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 122

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 2

Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Asp Leu Ile Asn Tyr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Ala Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(327)

<400> 3

aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc ata tca gta gga 48

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

gac agg gtc acc atg aac tgc aag gcc agt cag aat gtg tat aat aat 96

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn

20 25 30

ata gcc tgg tat caa cag aag cca ggg aaa tct cct aaa ctg ttg atc 144

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tac tat gca tct aac cgg tac act ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

agt ggc tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc cat agt gtg caa gct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt ctt tac aat tct cct ccg 288

Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Pro

85 90 95

acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ttg aaa cgg gct 327

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 4

<211> 109

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 4

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 5

<211> 363

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(363)

<400> 5

gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act tac cgt agc tat 96

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Ser Tyr

20 25 30

gtc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg agg ggt ctg gag tgg gtc 144

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gca tcc att agt act ggt ggt ggt aac act tac tat cga gac tcc gtg 192

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aag aac acc cta tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

cta caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca gaa gac atg agt aat tcg gga tac ggg ctc ttt gat tac tgg ggc 336

Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 363

Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 121

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(327)

<400> 7

aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc ata tca gta gga 48

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

gac agg gtc acc atg aac tgc aag gcc ggt cag aat gtg gat aat aat 96

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asp Asn Asn

20 25 30

ata gcc tgg tat caa aag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ttg atc 144

Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tac tat gca tct aac cgg aac act ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

ggt gga tat ggg aca gat ttc act ctc acc atc aat agt gtg caa gct 240

Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt att tcc aat tct ccg tac 288

Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser Asn Ser Pro Tyr

85 90 95

acg ttt ggc gct ggg acc gag ctg gaa ctg aaa cgg gct 327

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 8

<211> 109

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asp Asn Asn

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser Asn Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 9

<211> 363

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(363)

<400> 9

gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

tcc atg aaa ctc tcc tgt gta gcc tca gga ttc act ttc agt aac tat 96

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

tac atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc 144

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gca tcc att agt act ggt ggt ggt aac act tac tat cga gac tcc gtg 192

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa agc acc cta tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca aga ccc cca tat ggc tat aac tac ggt tgg ttt act tac tgg ggc 336

Ala Arg Pro Pro Tyr Gly Tyr Asn Tyr Gly Trp Phe Thr Tyr Trp Gly

100 105 110

caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 363

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Pro Tyr Gly Tyr Asn Tyr Gly Trp Phe Thr Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(327)

<400> 11

gac atc cag atg aca cag tct cca gct tcc ctg tct gca tct ctg gga 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

gaa act gtc acc atc gaa tgt cga gca agt gag gac att cac aat ggt 96

Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Asn Gly

20 25 30

tta gta tgg tat cag cag aag cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg atc 144

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

tat aat gca aat agt atg cat act ggg gtc cca tca cgg ttc agt ggc 192

Tyr Asn Ala Asn Ser Met His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tct ggt aca cag tat tct ctc aag ata aac agc ctg cag tct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

gaa gat gtc gca agt tat ttc tgt caa cag tat tac aat tat cct cgg 288

Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg

85 90 95

acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ttg aaa cgg gct 327

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 12

<211> 109

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Glu Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Asn Gly

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Asn Ser Met His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 13

<211> 369

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(369)

<400> 13

gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act tat cgt acc tat 96

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Thr Tyr

20 25 30

gtc atg gcc tgg gtc cgc cag ggt cca acg cag ggt ctg gag tgg gtc 144

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Gly Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gca tcc att agt act ggt ggt gtt agc act tat tat cga gac tcc gtg 192

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa aac acc cta tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

ttg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca aaa gac atg ttg aat ggt tat aac tct cag ggg ctt ttt gat tac 336

Ala Lys Asp Met Leu Asn Gly Tyr Asn Ser Gln Gly Leu Phe Asp Tyr

100 105 110

tgg ggc caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 369

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 123

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Thr Tyr

20 25 30

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Gly Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Met Leu Asn Gly Tyr Asn Ser Gln Gly Leu Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(327)

<400> 15

aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc ata tca gtg gga 48

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

gac agg gtc acc atg aac tgc agg gcc agt cag aat gtg gat aat act 96

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Thr

20 25 30

ata gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ttg atc 144

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tac ttt gca tct gac cgg tac act ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192

Tyr Phe Ala Ser Asp Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

ggt gga tat ggg aca gat ttc act ctc acc atc aat agt gtg caa gct 240

Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt att tac aat tct cca ctc 288

Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Tyr Asn Ser Pro Leu

85 90 95

acg ttc ggt tct ggg acc aag ctg gag atc aga cgg gct 327

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala

100 105

<210> 16

<211> 109

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 16

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Thr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Ala Ser Asp Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Tyr Asn Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala

100 105

<210> 17

<211> 357

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(357)

<400> 17

gag gtg cag ctg gtg gaa tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act ttc agt tcc tat 96

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

tac atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc 144

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gca tac atc agt aat ggt ggt tat agc act tac tat cga gac tcc gtg 192

Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc cga ttc act atc tcc aga gaa aat gca aaa agc acc ctt tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

aca atc aca gat cat tcg ggg tac agg ttt act tac tgg ggc caa ggc 336

Thr Ile Thr Asp His Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

act ctg gtc act gtc tct tca 357

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 119

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Thr Asp His Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 324

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(324)

<400> 19

gac atc cag atg acc cag tct cct tca ctc ctg tca gca tct gtg gga 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

gac aga gtc act ctc agc tgc aaa gca agt cag agt att tac aac agc 96

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Ser

20 25 30

tta gcc tgg tat cag caa aaa ctt gga gaa gct ccc aaa ctc ctc ata 144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tat gat gca aac agt ttg caa acg ggc atc cca tca agg ttc agt ggc 192

Tyr Asp Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tct ggt aca gat ttc aca ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

gaa gat gtt gcc aca tat ttc tgc cag aag tat tat agc ggg aac acg 288

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Lys Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr

85 90 95

ttt gga gct ggg acc aag ctg gaa ctg aaa cgg gct 324

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 20

<211> 108

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Ser

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Lys Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 21

<211> 449

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 21

gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60

gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120

cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180

cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240

gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300

cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360

cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420

ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449

<210> 22

<211> 1132

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 22

gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60

tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120

ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420

aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780

cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900

gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080

tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132

<210> 23

<211> 1410

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> химерная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(1410)

<400> 23

atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

gtg ctg agc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag 96

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

cct gga agg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act tac 144

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr

35 40 45

cgt agc tat gtc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca acg agg ggt ctg 192

Arg Ser Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Arg Gly Leu

50 55 60

gag tgg gtc gca tcc att agt act ggt ggt ggt aac act tac tat cga 240

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

gac tcc gtg aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aag aac 288

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

acc cta tac cta caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act 336

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

tat tac tgt gca gaa gac atg agt aat tcg gga tac ggg ctc ttt gat 384

Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

tac tgg ggc caa gga gtc atg gtc aca gtc agc tca gcc tcc acc aag 432

Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc 480

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc 528

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc 576

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg 624

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac 672

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc 720

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa 768

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac 960

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa 1104

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac 1152

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc 1248

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc 1344

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc 1392

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

tcc ctg tct ccc ggc aaa 1410

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 24

<211> 470

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr

35 40 45

Arg Ser Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Arg Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 25

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> химерная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(702)

<400> 25

atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

ggc gcg tac ggc aac att gtg atg acc cag tct ccc aaa tcc atg tcc 96

Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser

20 25 30

ata tca gta gga gac agg gtc acc atg aac tgc aag gcc ggt cag aat 144

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

gtg gat aat aat ata gcc tgg tat caa aag aaa cca ggg cag tct cct 192

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

aaa ctg ttg atc tac tat gca tct aac cgg aac act ggg gtc cct gat 240

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

cgc ttc aca ggc ggt gga tat ggg aca gat ttc act ctc acc atc aat 288

Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

85 90 95

agt gtg caa gct gaa gat gca gcc ttt tat tac tgt cag cgt att tcc 336

Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

aat tct ccg tac acg ttt ggc gct ggg acc gag ctg gaa ctg aaa cgg 384

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

gct gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432

Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 26

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser

20 25 30

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

85 90 95

Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 27

<211> 1410

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(1410)

<400> 27

atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

gtg ctg agc gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag 96

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

cct ggc gga tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc acc tac 144

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr

35 40 45

cgg tct tac gtg atg gcc tgg gtg cgc cag gcc cct gga aaa gga ctg 192

Arg Ser Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

gaa tgg gtg gga tcc atc agc acc ggc gga ggc aac acc tac tac cgg 240

Glu Trp Val Gly Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

gat agc gtg aag ggc cgg ttc acc atc agc cgg gac aac gcc aag aac 288

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

acc ctg tac ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg 336

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

tac tat tgc gcc gag gat atg agc aac agc ggc tac ggc ctg ttc gac 384

Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

tac tgg ggc cag gga acc ctc gtg acc gtc agc tca gcc tcc acc aag 432

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc 480

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc 528

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc 576

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg 624

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac 672

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc 720

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa 768

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac 960

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa 1104

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac 1152

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc 1248

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc 1344

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc 1392

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

tcc ctg tct ccc ggc aaa 1410

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 28

<211> 470

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr

35 40 45

Arg Ser Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Gly Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 29

<211> 1410

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(1410)

<400> 29

atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

gtg ctg agc gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag 96

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

cct ggc gga tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc acc tac 144

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr

35 40 45

cgg tct tac gtg atg gcc tgg gtg cgc cag gcc cct gga aaa gga ctg 192

Arg Ser Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

gaa tgg gtg gcc agc atc agc acc ggc gga ggc aac acc tac tac cgg 240

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

gat agc gtg aag ggc cgg ttc acc atc agc cgg gac aac gcc aag aac 288

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

acc ctg tac ctg cag atg gac agc ctg cgg gcc gag gat acc gcc gtg 336

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

tac tac tgt gcc gag gac atg agc aac agc ggc tac ggc ctg ttc gac 384

Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

tac tgg ggc cag gga acc ctc gtg acc gtc agc tca gcc tcc acc aag 432

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc 480

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc 528

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc 576

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg 624

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac 672

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc 720

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa 768

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac 960

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa 1104

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac 1152

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc 1248

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc 1344

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc 1392

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

tcc ctg tct ccc ggc aaa 1410

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 30

<211> 470

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr

35 40 45

Arg Ser Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Glu Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 31

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(702)

<400> 31

atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

ggc gcg tac ggc gac atc cag atg acc cag agc cct agc agc ctg agc 96

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

gcc agc gtg ggc gac aga gtg acc atc acc tgt aaa gcc ggc cag aac 144

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

gtg gac aac aat atc gcc tgg tat cag cag aag ccc ggc cag gcc cct 192

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

aag ctg ctg atc tac tac gcc agc aac cgg aac acc ggc gtg ccc agc 240

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

aga ttt tct ggc agc ggc tcc ggc acc gac ttc acc ctg aca atc agc 288

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag aga atc agc 336

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

aac agc ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 384

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 32

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 33

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(702)

<400> 33

atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

ggc gcg tac ggc gac atc cag atg acc cag agc cct agc agc ctg agc 96

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

gcc agc gtg ggc gac aga gtg acc atc acc tgt aaa gcc ggc cag aac 144

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

gtg gac aac aat atc gcc tgg tat cag cag aag ccc ggc cag agc ccc 192

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

aag ctg ctg atc tac tac gcc agc aac cgg aac acc ggc gtg ccc agc 240

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

aga ttt tcc ggc agc ggc tac ggc acc gac ttc acc ctg aca atc agc 288

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag aga atc agc 336

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

aac agc ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 384

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 34

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 35

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(702)

<400> 35

atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

ggc gcg tac ggc aac atc cag atg acc cag agc ccc agc agc ctg tct 96

Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

gcc agc gtg ggc gac aga gtg acc atc aca tgc aag gcc ggc cag aac 144

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

gtg gac aac aat atc gcc tgg tat cag aag aag ccc ggc cag tcc ccc 192

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

aag ctg ctg atc tac tac gcc agc aac cgg aac acc ggc gtg ccc gac 240

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

aga ttt tcc ggc gga ggc tac ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc 288

Arg Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

tcc ctg cag ccc gag gac ttc gcc ttc tac tac tgt cag cgg atc agc 336

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

aac agc ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 384

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 36

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 37

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(702)

<400> 37

atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

ggc gcg tac ggc gac atc cag atg acc cag agc ccc agc agc atg agc 96

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser

20 25 30

atc agc gtg ggc gac aga gtg acc atg acc tgc aag gcc ggc cag aac 144

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

gtg gac aac aat atc gcc tgg tat cag aag aag ccc ggc cag tcc ccc 192

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

aag ctg ctg atc tac tac gcc agc aac cgg aac acc ggc gtg ccc agc 240

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

aga ttt tct ggc agc ggc tcc ggc acc gac ttc acc ctg aca atc agc 288

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

agc gtg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag aga atc agc 336

Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

aac agc ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag ctg gaa ctg aag cgt 384

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 38

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser

20 25 30

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 39

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(702)

<400> 39

atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

ggc gcg tac ggc aac atc cag atg acc cag agc ccc agc agc atg agc 96

Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser

20 25 30

atc agc gtg ggc gac aga gtg acc atg acc tgc aag gcc ggc cag aac 144

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

gtg gac aac aat atc gcc tgg tat cag aag aag ccc ggc cag tcc ccc 192

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

aag ctg ctg atc tac tac gcc agc aac cgg aac acc ggc gtg ccc gac 240

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

aga ttt tcc ggc gga ggc tac ggc acc gac ttc acc ctg aca atc agc 288

Arg Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

agc gtg cag ccc gag gac gcc gcc ttc tac tac tgt cag cgg atc agc 336

Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

aac agc ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag ctg gaa ctg aag cgt 384

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 40

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser

20 25 30

Ile Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn

35 40 45

Val Asp Asn Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Ser

100 105 110

Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 41

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 41

Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 42

<211> 17

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 42

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 13

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 43

Asp Leu Ile Asn Tyr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Ala Phe

1 5 10

<210> 44

<211> 11

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 44

Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn Ile Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 7

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 45

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 46

Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 47

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 47

Gly Phe Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Met Ala

1 5 10

<210> 48

<211> 17

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 48

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 12

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 49

Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 11

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 50

Lys Ala Gly Gln Asn Val Asp Asn Asn Ile Ala

1 5 10

<210> 51

<211> 7

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 51

Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 52

Gln Arg Ile Ser Asn Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 53

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 53

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ala

1 5 10

<210> 54

<211> 17

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 54

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 55

<211> 12

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 55

Pro Pro Tyr Gly Tyr Asn Tyr Gly Trp Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 56

<211> 11

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 56

Arg Ala Ser Glu Asp Ile His Asn Gly Leu Val

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 57

Asn Ala Asn Ser Met His Thr

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 58

Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 59

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 59

Gly Phe Thr Tyr Arg Thr Tyr Val Met Ala

1 5 10

<210> 60

<211> 17

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 60

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 14

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 61

Asp Met Leu Asn Gly Tyr Asn Ser Gln Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 62

Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Asn Thr Ile Ala

1 5 10

<210> 63

<211> 7

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 63

Phe Ala Ser Asp Arg Tyr Thr

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 64

Gln Arg Ile Tyr Asn Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 65

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 65

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ala

1 5 10

<210> 66

<211> 17

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 66

Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 67

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 67

Thr Asp His Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 68

<211> 11

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 68

Lys Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Ser Leu Ala

1 5 10

<210> 69

<211> 7

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 69

Asp Ala Asn Ser Leu Gln Thr

1 5

<210> 70

<211> 8

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 70

Gln Lys Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 71

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 71

ctccagagtt ccaggtcacg gtgactggc 29

<210> 72

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 72

tcagtaacac tgtccaggac accatctc 28

<210> 73

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 73

tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30

<210> 74

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 74

gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30

<210> 75

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 75

ccagatgggt gctgagcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggagg 46

<210> 76

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 76

cttggtggag gctgagctga ctgtgaccat gactccttgg ccccag 46

<210> 77

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 77

atctccggcg cgtacggcaa cattgtgatg acccagtctc ccaaatcc 48

<210> 78

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 78

ggagggggcg gccacagccc gtttcagttc cagctcggtc ccagc 45

<210> 79

<211> 34

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 79

atgtgggagg ctcagttcct gggcttgctg tttc 34

<210> 80

<211> 34

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 80

gcccgagccc gagcccgagc cggagcagct ctga 34

<210> 81

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 81

gagtatgtgt tgactggttg ataactatcg 30

<210> 82

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 82

gccatgacag attagccatg tctgcagcac 30

<210> 83

<211> 56

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 83

caggaccttt ttctaacctc ccttggaggg ctggggaggc ccgggccata gaggag 56

<210> 84

<211> 56

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 84

cctggagccg aggcagccag caggtctcag cagctccgcc cgcccgcccg cccgcc 56

<210> 85

<211> 1575

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (1)..(1575)

<400> 85

atg tgg gag gct cag ttc ctg ggc ttg ctg ttt ctg cag ccg ctt tgg 48

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

gtg gct cca gtg aag cct ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg 96

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

tgg gcc cag gag ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc 144

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

ccc ctc cag gat ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag 192

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

cat cag cca gac agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg 240

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

gcc ccc ggc cct cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc 288

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

cgc cgc tac acg gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg 336

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

agg ctg ccc ctg cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag 384

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

cgc ggg gac ttc tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc 432

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

ggc gag tac cgc gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc 480

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

cgc ctc cgt ctg cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca 528

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

gga tct ctc aga gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc 576

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

cgc cct gac cgc cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag 624

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

ggc cga gtc cct gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc 672

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

ttc ctc ttc ctg ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc 720

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

tgc atc ctc acc tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac 768

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

ctc act gtt ctg ggt ctg gag ccc cca act ccc ttg aca gtg tac gct 816

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

gga gca ggt tcc agg gtg ggg ctg ccc tgc cgc ctg cct gct ggt gtg 864

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

ggg acc cgg tct ttc ctc act gcc aag tgg act cct cct ggg gga ggc 912

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

cct gac ctc ctg gtg act gga gac aat ggc gac ttt acc ctt cga cta 960

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

gag gat gtg agc cag gcc cag gct ggg acc tac acc tgc cat atc cat 1008

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

ctg cag gaa cag cag ctc aat gcc act gtc aca ttg gca atc atc aca 1056

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

gtg act ccc aaa tcc ttt ggg tca cct gga tcc ctg ggg aag ctg ctt 1104

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

tgt gag gtg act cca gta tct gga caa gaa cgc ttt gtg tgg agc tct 1152

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

ctg gac acc cca tcc cag agg agt ttc tca gga cct tgg ctg gag gca 1200

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

cag gag gcc cag ctc ctt tcc cag cct tgg caa tgc cag ctg tac cag 1248

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

ggg gag agg ctt ctt gga gca gca gtg tac ttc aca gag ctg tct agc 1296

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

cca ggt gcc caa cgc tct ggg aga gcc cca ggt gcc ctc cca gca ggc 1344

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

cac ctc ctg ctg ttt ctc atc ctt ggt gtc ctt tct ctg ctc ctt ttg 1392

His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu

450 455 460

gtg act gga gcc ttt ggc ttt cac ctt tgg aga aga cag tgg cga cca 1440

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

aga cga ttt tct gcc tta gag caa ggg att cac cct ccg cag gct cag 1488

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

agc aag ata gag gag ctg gag caa gaa ccg gag ccg gag ccg gag ccg 1536

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

gaa ccg gag ccc gag ccc gag ccc gag ccg gag cag ctc 1575

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu

515 520 525

<210> 86

<211> 525

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 86

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro

465 470 475 480

Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln

485 490 495

Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

500 505 510

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu

515 520 525

<---

Claims

1. Моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с доменом 3 LAG-3 человека и не связываются с доменами 1 и 2 LAG-3 человека и обладают свойствами, описанными в (i)-(iv) ниже:

(i) обладают in vitro активностью ADCC;

(ii) связываются с активированными Т-клетками человека;

(iii) LAG-3 человека связывается с молекулами главного комплекса гистосовместимости человека класса II в присутствии антитела или его связывающего фрагмента; и

(iv) присутствие антитела или его связывающего фрагмента позволяет LAG-3 человека осуществлять функцию подавления Т-клеток человека,

где антитело или его связывающий фрагмент содержат:

легкую цепь, содержащую

CDRL1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50,

CDRL2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51, и

CDRL3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52, и

тяжелую цепь, содержащую

CDRH1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:47,

CDRH2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48, и

CDRH3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49.

2. Антитело или его связывающий фрагмент по п.1, которые обладают следующими дополнительными свойствами:

(v) уменьшает количество LAG-3-положительных клеток in vivo в форме с низким содержанием фукозы;

(vi) подавляет экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит in vivo в форме с низким содержанием фукозы.

3. Антитело или его связывающий фрагмент по п.1, представляющие собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.

4. Антитело или его связывающий фрагмент по п.3, представляющее собой гуманизированное антитело.

5. Антитело или его связывающий фрагмент по п.4, содержащие:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28,

с аминокислотой, соответствующей положению 68, которая представляет собой либо Gly, либо заменена на Ala,

и с аминокислотой, соответствующей положению 103, которая представляет собой либо Asn, либо заменена на Asp, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,

с аминокислотой, соответствующей положению 21, которая представляет собой либо Asp, либо заменена на Asn,

с аминокислотой, соответствующей положению 31, которая представляет собой либо Leu, либо заменена на Met,

с аминокислотой, соответствующей положению 33, которая представляет собой либо Ala, либо заменена на Ile,

с аминокислотой, соответствующей положению 41, которая представляет собой либо Ile, либо заменена на Met,

с аминокислотой, соответствующей положению 58, которая представляет собой либо Gln, либо заменена на Lys,

с аминокислотой, соответствующей положению 63, которая представляет собой либо Ala, либо заменена на Ser,

с аминокислотой, соответствующей положению 80, которая представляет собой либо Ser, либо заменена на Asp,

с аминокислотой, соответствующей положению 85, которая представляет собой либо Ser, либо заменена на Gly,

с аминокислотой, соответствующей положению 87, которая представляет собой либо Ser, либо заменена на Tyr,

с аминокислотой, соответствующей положению 98, которая представляет собой либо Leu, либо заменена на Val,

с аминокислотой, соответствующей положению 103, которая представляет собой либо Phe, либо заменена на Ala,

с аминокислотой, соответствующей положению 105, которая представляет собой либо Thr, либо заменена на Phe,

с аминокислотой, соответствующей положению 124, которая представляет собой либо Val, либо заменена на Leu, и

с аминокислотой, соответствующей положению 126, которая представляет собой либо Ile, либо заменена на Leu.

6. Антитело или его связывающий фрагмент по п.4, содержащие

аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислоты 21-129 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 и 40, и

аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислоты 20-140 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:28 и 30.

7. Антитело или его связывающий фрагмент по п.4, содержащие

аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую аминокислоты 21-234 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 и 40, и

аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую аминокислоты 20-470 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:28 и 30.

8. Антитело или его связывающий фрагмент по п.4, выбранное из группы, состоящей из нижеприведенных [i]-[x]:

[i] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:30, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:34;

[ii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:28, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:32;

[iii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:30, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:36;

[iv] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:28, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:34;

[v] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:28, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:36;

[vi] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:28, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:38;

[vii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:28, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:40;

[viii] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:30, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:32;

[ix] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:30, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:38; и

[x] антитело или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 20-470 SEQ ID NO:30, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот в положениях 21-234 SEQ ID NO:40.

9. Антитело или его связывающий фрагмент по п.1, содержащие

вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, каждая область содержит области, определяющие комплементарность (CDR) и каркасные области, где каркасные области содержат аминокислотные последовательности, которые на 95% или более идентичны, соответственно, аминокислотным последовательностям каркасной области вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи антитела или его связывающего фрагмента по п.8.

10. Антитело или его связывающий фрагмент по п.1, содержащие:

аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью второй молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с первой молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или его связывающего фрагмента по п.8, или нуклеотидную последовательность, комплементарную ей, и

аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью четвертой молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с третьей молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его связывающего фрагмента по п.9, или нуклеотидную последовательность, комплементарную ей.

11. Антитело или его связывающий фрагмент по п.1, обладающее свойством, описанным ниже в (i) или (ii):

(i) связыванием с сайтом в домене 3 LAG-3 человека, распознаваемом антителом или его связывающим фрагментом по п.8; или

(ii) конкуренцией с антителом или его связывающим фрагментом по п.8 за связывание с доменом 3 LAG-3 человека.

12. Антитело или его связывающий фрагмент по любому из пп.1-11, представленные в форме с низким содержанием фукозы.

13. Молекула для специфического связывания с доменом 3 LAG-3 человека, содержащая антитело или его связывающий фрагмент по любому из пп.1-12.

14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотную последовательность антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-10.

15. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.14.

16. Клетка для получения антитела или его связывающего фрагмента, где клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.14 или вектор по п.15.

17. Способ получения антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-12, включающий стадию культивирования клетки по п.16.

18. Композиция для лечения заболевания, связанного с LAG-3-положительными клетками, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-12 или молекулу по п.13.

19. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с LAG-3-положительными клетками, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-12 или молекулу по п.13.

20. Фармацевтическая композиция по п.19 для лечения аутоиммунного заболевания.

21. Фармацевтическая композиция по п.20, где аутоиммунное заболевание представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания соединительной ткани/опорно-двигательного аппарата, аутоиммунного заболевания системы крови, аутоиммунных заболеваний органов пищеварения, аутоиммунного заболевания нервной системы, аутоиммунного заболевания зрительной системы, аутоиммунного заболевания сосудистой системы, аутоиммунного заболевания эпидермальной системы, аутоиммунного заболевания дыхательной системы, аутоиммунного заболевания эндокринной системы, аутоиммунного гепатита, и нефрита, вызванного иммунным расстройством.

22. Фармацевтическая композиция по п.21, где

аутоиммунное заболевание соединительной ткани/костно-мышечной системы представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, системной красной волчанки, склеродермии, полимиозита, дерматомиозита, миозита с включенными тельцами и идиопатических воспалительных миопатий, таких как иммуноопосредованная некротическая миопатия;

аутоиммунное заболевание системы крови представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из апластической анемии и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры;

аутоиммунное заболевание пищеварительной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из болезни Крона и язвенного колита;

аутоиммунное заболевание нервной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из рассеянного склероза и миастении гравис;

аутоиммунное заболевание зрительной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из увеита, кератита и синдрома Шегрена;

аутоиммунное заболевание сосудистой системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из болезни Бехчета и гранулематоза Вегенера;

аутоиммунное заболевание системы эпидермиса представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из псориаза, пузырчатки, синдрома Стивенса-Джонсона и витилиго;

аутоиммунное заболевание дыхательной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из хронической обструктивной болезни легких и интерстициальной пневмонии;

аутоиммунное заболевание эндокринной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из диабета 1 типа, аутоиммунного тиреоидита, болезни Грейвса и тиреоидита Хашимото.

23. Фармацевтическая композиция по п.19 для лечения отторжения трансплантатов.

24. Фармацевтическая композиция по п.23, где отторжение трансплантатов представляет собой отторжение и реакцию «хозяин против трансплантата» при трансплантации органа, выбранного из группы, состоящей из сердца, почки, печени, костного мозга и кожи или их ткани, и/или реакцию «трансплантат против хозяина», вызванное трансплантацией гемопоэтических клеток, выбранной из группы, состоящей из: трансплантации костного мозга; трансплантации периферической крови; и трансплантации пуповинной крови.

25. Фармацевтическая композиция по любому из пп.20-24, объединенная с одним или двумя или более из следующих соединений, выбранных из группы, состоящей из антифолатов, ингибиторов кальциневрина, кортикостероидов, антитимоцитарных глобулинов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот, биопрепаратов, нацеленных на антигены клеточной поверхности, биопрепаратов, нацеленных на цитокины или цитокиновые рецепторы, внутривенного иммуноглобулина и плазмафереза.

26. Фармацевтическая композиция по п.19, предназначенная для лечения аллергических заболеваний, злокачественных опухолей и/или хронических инфекций.

27. Композиция для профилактики заболевания, связанного с LAG-3-положительными клетками, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-12 или молекулу по п.13.

28. Фармацевтическая композиция для профилактики заболевания, связанного с LAG-3-положительными клетками, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-12 или молекулу по п.13.

29. Фармацевтическая композиция по п.28 для профилактики аутоиммунного заболевания.

30. Фармацевтическая композиция по п.29, где аутоиммунное заболевание представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания соединительной ткани/опорно-двигательного аппарата, аутоиммунного заболевания системы крови, аутоиммунных заболеваний органов пищеварения, аутоиммунного заболевания нервной системы, аутоиммунного заболевания зрительной системы, аутоиммунного заболевания сосудистой системы, аутоиммунного заболевания эпидермальной системы, аутоиммунного заболевания дыхательной системы, аутоиммунного заболевания эндокринной системы, аутоиммунного гепатита, и нефрита, вызванного иммунным расстройством.

31. Фармацевтическая композиция по п.30, где

32. Фармацевтическая композиция по п.28, для профилактики отторжения трансплантатов.

33. Фармацевтическая композиция по п.32, где отторжение трансплантатов представляет собой отторжение и реакцию «хозяин против трансплантата» при трансплантации органа, выбранного из группы, состоящей из сердца, почки, печени, костного мозга и кожи или их ткани, и/или реакцию «трансплантат против хозяина», вызванное трансплантацией гемопоэтических клеток, выбранной из группы, состоящей из: трансплантации костного мозга; трансплантации периферической крови; и трансплантации пуповинной крови.

34. Фармацевтическая композиция по любому из пп.29-33, объединенная с одним или двумя или более из следующих соединений, выбранных из группы, состоящей из антифолатов, ингибиторов кальциневрина, кортикостероидов, антитимоцитарных глобулинов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот, биопрепаратов, нацеленных на антигены клеточной поверхности, биопрепаратов, нацеленных на цитокины или цитокиновые рецепторы, внутривенного иммуноглобулина и плазмафереза.

35. Фармацевтическая композиция по п.28, предназначенная для профилактики аллергических заболеваний, злокачественных опухолей и/или хронических инфекций.

36. Способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.19 или 28.

37. Способ по п.36, где

аутоиммунное заболевание представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания соединительной ткани/костно-мышечной системы, аутоиммунного заболевания системы крови, аутоиммунных заболеваний системы пищеварения, аутоиммунного заболевания нервной системы, аутоиммунного заболевания зрительной системы, аутоиммунного заболевания сосудистой системы, аутоиммунного заболевания системы эпидермиса, аутоиммунного заболевания дыхательной системы, аутоиммунного заболевания эндокринной системы, аутоиммунного гепатита и нефрита, вызванного расстройством иммунитета.

38. Способ по п.37, где

аутоиммунное заболевание соединительной ткани/костно-мышечной системы представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, системной красной волчанки, склеродермии, полимиозита, дерматомиозита, миозита с включенными тельцами, и идиопатических воспалительных миопатий, таких как иммуноопосредованная некротическая миопатия;

аутоиммунное заболевание пищеварительной системы представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из болезни Крона и язвенного колита;

аутоиммунное заболевание нервной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из рассеянного склероза и миастении;

аутоиммунное заболевание дыхательной системы представляет собой одно, два или более, выбранных из группы, состоящей из хронической обструктивной болезни легких и интерстициальной пневмонии; и

аутоиммунное заболевание эндокринной системы представляет собой одно или два или более, выбранных из группы, состоящей из диабета 1 типа, аутоиммунного тиреоидита, болезни Грейвса и тиреоидита Хашимото.

39. Способ лечения или профилактики отторжения трансплантатов у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.19 или 28.

40. Способ по п.39, где отторжение трансплантатов представляет собой отторжение и реакцию «хозяина против трансплантата» при трансплантации органа, выбранного из группы, состоящей из сердца, почки, печени, костного мозга и кожи или тканей, и/или реакцию «трансплантат против хозяина», вызванное трансплантацией гемопоэтических клеток, выбранных из группы, состоящей из: трансплантации костного мозга; трансплантации периферической крови; и трансплантации пуповинной крови.

41. Способ по любому из пп.36-40, где фармацевтическую композицию комбинируют с одним, двумя или более, выбранными из группы, состоящей из антифолатов, ингибиторов кальциневрина, кортикостероидов, антитимоцитарных глобулинов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот, биологических препаратов, нацеленных на антигены клеточной поверхности, биологических препаратов, нацеленных на цитокины или рецепторы цитокинов, внутривенного иммуноглобулина и плазмафереза.