TWI818916B - 抗ｃｄ１４７抗體、及其用途與製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供顯示優異的抗腫瘤活性且安全性優異的新穎抗CD147抗體。本發明之另一課題係提供包含此種抗體的醫藥品。本發明之另一課題係提供使用該抗體或醫藥品的腫瘤之治療方法等。
依據本發明，而提供將CD147活性化，並顯示高抗腫瘤效果的CD147特異的抗體。依據本發明，而提供不依存於效應子(effector)機能而顯示高抗腫瘤效果的抗CD147抗體。依據本發明，而提供包含此種抗CD147抗體的醫藥組成物。依據本發明，而提供使用了此種抗CD147抗體及/或醫藥組成物的腫瘤之治療方法。

Description

抗CD147抗體、及其用途與製造方法
本發明係關於顯示優異的抗腫瘤效果之抗CD147抗體、該抗CD147抗體之製造方法及包含該抗CD147抗體的抗腫瘤劑等。
已知由於癌症治療法、治療藥的進展，曾被認為是不治之症的癌有治療可能，並能根治。作為顯示特別優異的藥物安定性及特異性的抗體醫藥而開發的CTLA4抗體、PD1抗體，係藉由以T細胞為首的免疫細胞之活性化，而對黑色素瘤、一部分的固形癌產生高反應率，或有治癒之情形，成為對癌患者而言的福音。此等治療藥雖已被嘗試用於以許多難治性固形癌作為對象的治療，但於胰臟癌、肝癌等中，大多數癌症對藥物並不顯示敏感性，且即使在以利用手術的摘除或以往的抗癌劑為基本的治療，亦觀察到高頻度的復發，切確需要能帶來根治的治療法及治療藥。
CD147係具有2~3個免疫球蛋白樣結構域(immunoglobulin-like domain)的1次跨膜蛋白(transmembrane protein)，已知藉由CD147彼此的相互作用、與CD44、整合素(Integrin)家族分子、CD98、VEGFR、CypA/B、MCT1/3/4等參與增殖、浸潤、炎症的細胞外及細胞膜表面分子的相互作用，而使下游訊息相關分子、FAK、MEK、Erk、JAK/STAT、AKT、MAPK家族分子活性化，促進以MMP為首的蛋白酶產生、癌之增殖、轉移、浸潤。又於上述之肝癌、胰臓癌之患者，已有報告若CD147表現高，則生存期間短且預後差，被認為是癌症的治療標的分子之一。
就以CD147作為標的之抗體而言，ABX-CBL、利卡汀(licartin)已於臨床上實際投予至人類。ABX-CBL不僅是抑制CD147與親環蛋白A(cyclophilin A)的結合，抑制T細胞的活性，而且血中之補體依賴性地對以CD147陽性之T細胞為首的正常細胞顯示殺細胞活性。雖以GVHD為對象疾病而進行了臨床試驗，但藥效並不充分，觀察到嚴重的肌肉疼痛，且迄今尚未獲得作為藥的認可(專利文獻1、非專利文獻1)。
利卡汀係對HAb18抗體之Fab’2部分附加了放射性同位素碘I 131的生物製劑，於中國已被認可將肝癌作為適應癌症種類(非專利文獻2、非專利文獻3)。利卡汀欠缺使免疫細胞或補體活性化的抗體之Fc部分，雖沒有報告免疫媒介性之毒性，但亦無所謂於臨床上根治了肝癌的報告。
又，就以其他之CD147作為標的的抗體而言，已知會遮斷血管新生、VEGF產生基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)等之與CD147有關的生物活性之抗CD147單株抗體(專利文獻2)；抑制T細胞之活 性化的抗CD147單株抗體(非專利文獻4)；及以具有ADCC活性及CDC活性為特徵之與CD147分子特異性結合的抗體(專利文獻3)。然而，並未知悉不具有效應子(effector)機能且顯示抗腫瘤效果的CD147抗體。又，未知悉透過CD147的細胞訊息傳達系統之活性化與抗腫瘤效果的關連。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 WO1999/045031
專利文獻2 WO2010/036460
專利文獻3 WO2017/061602
非專利文獻
非專利文獻1 Deeg H, et al., J. Blood., 2052-2058, 2001
非專利文獻2 Chen Z, et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 435-444, 2006
非專利文獻3 Xu J, et al., Hepatology, 269-276, 2007
非專利文獻4 Koch C, et al., International Immunology, 777-786, 1999
發明概要
本發明之課題係提供：具有新穎藥理作用，安全性優異，且具有高抗腫瘤效果的新穎抗CD147抗體；含該抗體的醫藥品；及使用該抗體或醫藥品的腫瘤之治療方法等。
本發明者等為了達成上述課題而深入檢討，首次發現了：透過CD147的關連訊息分子之活性化與抗腫瘤效果有關連。而且，本發明者等成功取得將CD147活性化，且顯示高抗腫瘤效果的CD147特異性抗體。本發明之抗體具有所謂不依存於效應子機能而顯示高抗腫瘤效果的特徵。又，迄今雖有報告依存於效應子機能而顯示抗腫瘤效果的抗體，但本發明之抗體係具有不對T細胞及PBMC作用，且亦不依存於效應子機能而顯示高抗腫瘤效果的特徵，為作為醫藥品之安全性被期待之優異的抗體。本發明之抗體，係於肝癌細胞，顯示比作為肝癌之標準治療藥中之一者使用的索拉非尼(sorafenib)還顯著強的藥效。本發明之抗體，係於胰臓癌細胞，顯示比作為胰臓癌之標準治療藥中之一者使用的吉西他濱(gemcitabine)還顯著強的藥效。又，本發明之抗體，係於慢性骨髓性白血病細胞，顯示比作為慢性骨髓性白血病之標準治療藥中之一者使用的伊馬替尼(imatinib)還顯著強的藥效。本發明等發現了，本發明之CD147抗體係對於癌細胞，將p38MAPK及SMAD訊息傳達系統活性化。又，本發明者等人發現了，本發明之CD147抗體係於SMAD4陽性細胞顯示優異的抗腫瘤效果。
本案發明包含以下之發明。
[1]一種人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：與選自包含以下之(A)~(F)的群組的至少一種之抗體對於對人類CD147之結合競爭，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(A)包含由序列識別號71所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號69所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(B)包含由序列識別號51所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號49所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(C)包含由序列識別號61所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號59所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(D)包含由序列識別號81所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號79所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(E)包含由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號8所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、及(F)包含由序列識別號20所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號18所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體。
[2]一種人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：與選自包含以下之(A)~(F)的群組的至少 一種之抗體所結合的抗原決定位(epitope)結合，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(A)包含由序列識別號71所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號69所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(B)包含由序列識別號51所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號49所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(C)包含由序列識別號61所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號59所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(D)包含由序列識別號81所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號79所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、(E)包含由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號8所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體、及(F)包含由序列識別號20所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號18所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗體。
[3]如[1]或[2]記載之人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其ADCC活性為降低或缺失。
[4]如[1]~[3]中任一項記載之人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其CDC活性為降低或缺失。
[5]如[1]~[4]中任一項記載之人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其ADCP活性為降低或缺失。
[6]如[1]~[5]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其與包含自序列識別號3之第106號之精胺酸(Arg)至第165號之甘胺酸(Gly)之殘基的抗原決定位結合。
[7]如[1]~[6]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其與包含下列之抗原決定位結合：序列識別號3記載之胺基酸序列中之第106號之精胺酸(Arg)、第108號之離胺酸(Lys)、第109號之丙胺酸(Ala)、第110號之纈胺酸(Val)、第127號之離胺酸(Lys)、第128號之絲胺酸(Ser)、第129號之麩胺酸(Glu)、第130號之絲胺酸(Ser)、第131號之纈胺酸(Val)、第132號之脯胺酸(Pro)、第133號之脯胺酸(Pro)、第134號之纈胺酸(Val)、第164號之麩醯胺酸(Gln)及第165號之甘胺酸(Gly)之各殘基。
[8]如[1]~[7]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號75所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號76所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號77所示的胺基酸序列所構成；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號72所示的胺基酸 序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成。
[9]如[1]~[5]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其與包含序列識別號143記載之胺基酸序列、或於序列識別號143之序列中有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的抗原決定位結合。
[10]如[1]~[5]或9中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為：重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號55所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號56所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3由序列識別號57所示的胺基酸序列所構成；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號52所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號53所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號54所示的胺基酸序列所構成。
[11]如[1]~[5]或9中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為：重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號65所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成；及 輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號62所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號64所示的胺基酸序列所構成。
[12][1]~[5]或9中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為：重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號85所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號86所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號87所示的胺基酸序列所構成；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號82所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號83所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號84所示的胺基酸序列所構成。
[13]如[1]~[12]中任一項記載之抗體之抗原結合片段，其選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv的群組。
[14]如[1]~[12]中任一項記載之抗體，其特徵為其係scFv。
[15][1]~[12]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為其係嵌合抗體。
[16]如[1]~[12]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為其係經人化。
[17]如[1]~[16]中任一項記載之抗體，其中重鏈為包含人類免疫球蛋白G1重鏈、人類免疫球蛋白G2重鏈或人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，且輕鏈包含人類免疫球蛋白κ輕鏈之恆定區域。
[18]如[17]記載之抗體，其重鏈包含人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域。
[19]如[18]記載之抗體，其中於人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，由EU索引(EU index)所示的第228號之絲胺酸(Ser)經脯胺酸(Pro)取代。
[20]如[18]之抗體，其於人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，由EU索引所示的第234號之苯丙胺酸(Phe)被取代為丙胺酸(Ala)，且第235號之白胺酸(Leu)被取代為丙胺酸(Ala)。
[21]如[18]之抗體，其於人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，由EU索引所示的第228號之絲胺酸(Ser)被取代為脯胺酸(Pro)，第234號之苯丙胺酸(Phe)被取代為丙胺酸(Ala)，第235號之白胺酸(Leu)被取代為丙胺酸(Ala)。
[22]如[17]記載之抗體，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G2重鏈之恆定區域。
[23]一種人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：具有以下之(c)及(d)，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(c)選自包含以下之(c1)~(c4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域： (c1)由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(c2)由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(c3)於(c1)或(c2)之序列，對各CDR序列以外之框架(framework)區域之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(c4)(於(c1)~(c3)之任一項記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及(d)選自包含以下之(d1)~(d5)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(d1)由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d2)由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d3)由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d4)於(d1)~(d3)之任一者記載之序列，對各CDR序列以外之框架區域之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(d5)於(d1)~(d4)之任一者記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
[24]如[23]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
[25]如[23]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
[26]如[23]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
[27]如[23]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
[28]如[23]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
[29]如[23]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
[30]一種人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：具有以下之(a)及(b)，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(a)選自包含以下之(a1)~(a4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(a1)由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(a2)由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(a3)於(a1)或(a2)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(a4)於(a1)~(a3)之任一者記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及(b)選自包含以下之(b1)~(b3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(b1)由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域； (b2)於(b1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(b3)於(b1)或(b2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
[31]如[30]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域或由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
[32]如[30]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20~466號之胺基酸殘基所構成的重鏈或由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20~467號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
[33]一種人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：具有以下之(e)及(f)，且將透過CD147的訊息傳導活性化， (e)選自包含以下之(e1)~(e4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(e1)由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(e2)由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(e3)於(e1)或(e2)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(e4)於(e1)~(e3)之任一者記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及(f)選自包含以下之(f1)~(f3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(f1)由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(f2)於(f1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(f3)於(f1)或(f2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
[34]如[33]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含： 由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域或由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
[35]如[33]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈或由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20~464號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
[36]一種人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其特徵為：具有以下之(g)及(h)，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(g)選自包含以下之(g1)~(g3)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(g1)由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(g2)於(g1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(g3)於(g1)或(g2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及 (h)選自包含以下之(h1)~(h3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(h1)由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(h2)於(h1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(h3)於(h1)或(h2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
[37]如[36]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域、及由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
[38]如[36]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~464號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
[39]如[23]~[38]中任一項記載之人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其ADCC活性為降低或缺失。
[40]如[23]~[39]中任一項記載之人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其CDC活性為降低或缺失。
[41]如[23]~[40]中任一項記載之人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段，其ADCP活性為降低或缺失。
[42]一種醫藥組成物，其特徵為含有如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段之至少任一者。
[43]如[42]記載之醫藥組成物，其為抗腫瘤劑。
[44]如[43]記載之醫藥組成物，其中腫瘤為表現CD147的腫瘤。
[45]如[43]或[44]記載之醫藥組成物，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腦腫瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
[46]如[43]~[45]中任一項記載之醫藥組成物，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
[47]如[43]~[46]中任一項記載之醫藥組成物，其中腫瘤為SMAD4陽性的腫瘤或KLF5之表現降下或缺失的腫瘤。
[48]如[42]~[47]中任一項記載之醫藥組成物，其其進一步含有其他抗腫瘤劑。
[49]一種腫瘤之治療方法，其特徵為將如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段或如[42]~[48]中任一項記載之醫藥組成物投予患者。
[50]如[49]記載之治療方法，其中腫瘤為表現CD147的腫瘤。
[51]如[49]或[50]中任一項記載之治療方法，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腦腫瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
[52]如[49]~[51]記載之治療方法，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
[53]如[49]~[52]中任一項記載之治療方法，其中腫瘤為SMAD4陽性的腫瘤或KLF5之表現降低或缺失的腫瘤。
[54]如[49]~[53]中任一項記載之治療方法，其與另外的抗腫瘤劑組合而投予。
[55]一種多核苷酸，其編碼如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段。
[56]如[55]記載之多核苷酸，其包含選自包含以下之(j1)~(j3)的群組的任一者記載之多核苷酸：(j1)編碼由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號76記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號77記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸，以及編碼由序列識別號72記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號73記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號74記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸；(j2)與(j1)記載之核苷酸序列具有至少95%之序列同一性的多核苷酸；及(j3)於(j1)或(j2)記載之多核苷酸，有1~數個之核苷酸被取代、刪除或添加的多核苷酸。
[57]如[55]記載之多核苷酸，其包含選自包含以下之(i1)~(i3)的群組的任一者之多核苷酸：(i1)編碼由序列識別號55記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號56記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號57記載之胺基酸序列所構成 的CDRH3的多核苷酸，以及編碼由序列識別號52記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號53記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號54記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸；(i2)與(i1)記載之核苷酸序列具有至少95%之序列同一性的多核苷酸；及(i3)於(i1)或(i2)記載之多核苷酸，有1~數個之核苷酸被取代、缺欠或添加的多核苷酸。
[58]如[55]記載之多核苷酸，其包含選自包含以下之(k1)~(k3)的群組的任一者記載之多核苷酸：(k1)編碼由序列識別號65記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號66記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號67記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸，以及編碼由序列識別號62記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號64記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸；(k2)與(k1)記載之核苷酸序列具有至少95%之序列同一性的多核苷酸；及(k3)於(k1)或(k2)記載之多核苷酸，有1~數個之核苷酸被取代、刪除或添加的多核苷酸。
[59]如[55]記載之多核苷酸，其包含選自包含如以下之(m1)~(m3)的群組的任一者記載之多核苷酸：(m1)編碼由序列識別號85記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號86記載之胺基酸序列所構 成的CDRH2及由序列識別號87記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸，以及編碼由序列識別號82記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號83記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號84記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸；(m2)與(m1)記載之核苷酸序列具有至少95%之序列同一性的多核苷酸；及(m3)於(m1)或(m2)記載之多核苷酸，有1~數個之核苷酸被取代、刪除或添加的多核苷酸。
[60]一種表現載體，其含有如[55]~[59]中任一項記載之多核苷酸。
[61]一種宿主細胞，其係藉由如[60]記載之表現載體轉形。
[62]一種如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段之製造方法，其包含培養如[61]記載之宿主細胞，自培養產物採取目的之抗體或該抗體之機能性片段的步驟。
[63]如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其中透過CD147的訊息傳達之活性化係p38之活性化及/或SMAD4之活性化。
[64]如[63]記載之抗體或該抗體之機能性片段，其中p38MAPK之活性化及/或SMAD4之活性化係p38MAPK之表現量之增加、p38MAPK之磷酸化、HSP27之磷酸化、CXCL8表現量之增加、rhoB表現量之增加、KLF5 mRNA之降低或KLF5蛋白質表現量之降低。
[65]一種腫瘤之治療方法，其特徵為投予如[63]或[64]記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段。
[66]一種預測對於癌症治療的反應性的方法，其包含使用源自癌患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中所含的SMAD4之表現或KLF5之表現，將檢測出SMAD4的患者或檢測出KLF5的表現降低或缺失的患者，判定為對於利用如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段或如[42]~[48]中任一項記載之醫藥組成物的癌症治療有反應性。
[67]一種篩選癌症治療對象的方法，其包含使用源自癌患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中的SMAD4之表現的有無或檢測KLF5之表現，將檢測出SMAD4的患者或檢測出KLF5之表現降低或缺失的患者，篩選來作為利用如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段或如[42]~[48]中任一項記載之醫藥組成物的癌症治療之對象者。
[68]一種癌症治療方法，其包含使用源自癌患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中所含的SMAD4之表現的有無或檢測KLF5之表現，對檢測出SMAD4的患者或檢測出KLF5之表現降低或缺失的患者，投予如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段或如[42]~[48]中任一項記載之醫藥組成物。
[69]一種套組，其係用以判定利用如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段或如[42]~[48]中任一項記載之醫藥組成物之對於癌症治療的反應性，其至 少包含檢測源自癌患者的生物學的試料中之SMAD4之表現或KLF5之表現的手段。
[70]一種抗體藥物複合體，其係如[1]~[41]中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合片段與其他藥物結合。
[71]一種雙特異性抗體(bispecific antibody)，其包含如[1]~[41]中任一項記載之抗體之抗原結合片段、及與CD147以外之抗原結合的抗原結合片段。
本發明之抗體係會特異性地辨識CD147的抗體，其特徵為將透過CD147的相關訊息分子活性化，且具有高抗腫瘤活性。CD147不僅於腫瘤細胞中表現，亦於血液細胞中表現，但本發明之抗體，由於對T細胞及PBMC不作用且亦不依存於效應子機能，因而於作為抗腫瘤劑之開發上，具有所謂安全性的擔憂少的優點。又，本發明之抗體係顯示極高抗腫瘤活性。本發明之抗體，係於肝癌細胞，顯示比作為肝癌之標準治療藥中之一者使用的索拉非尼還顯著強的藥效。本發明之抗體，係於胰臓癌細胞，顯示比作為胰臓癌之標準治療藥中之一者使用的吉西他濱還顯著強的藥效。又，本發明之抗體，係於慢性骨髓性白血病細胞，顯示比作為慢性骨髓性白血病之標準治療藥中之一者使用的伊馬替尼還顯著強的藥效。
圖1係(a)~(c)：PANC-1異種移植(xenograft)模型中的腫瘤體積之變化。
圖2-1係對人類CD147或猴CD147的結合性。
圖2-2係對人類CD147或猴CD147的結合性。
圖2-3係對人類CD147或猴CD147的結合性。
圖3係人類CD147與食蟹猴CD147之胺基酸序列之序列比較及mu1~mu9之位置。
圖4-1係LN22R8之輕鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及LN22R8輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3之胺基酸序列。
圖4-2係LN22R8之重鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及LN22R8重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列。
圖5-1係2P10F2之輕鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及2P10F2輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3之胺基酸序列。
圖5-2係2P10F2之重鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及2P10F2重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列。
圖6係人類嵌合抗體之ADCC活性。
圖7係人類嵌合抗體之CDC活性。
圖8係人類嵌合抗體之ADCP活性。
圖9-1係(a)~(d)：使用了NOD-scid小鼠的MIA PaCa-2皮下移植模型中的各抗體之抗腫瘤效果。
圖9-2係(e)~(g)：使用了NOD-scid小鼠的MIA PaCa-2皮下移植模型中的各抗體之抗腫瘤效果。
圖10係使用了NOG小鼠的MIA PaCa-2皮下移植模型中的LN22R8chIgG4P之抗腫瘤效果。
圖11係(a)~(d)：使用了NOD-scid小鼠的MIA PaCa-2皮下移植模型中的r#84、r#101、r#110或r#131之抗腫瘤效果。
圖12係2P10F2與r#84、r#101、r#110或r#131之競爭測定。
圖13-1係(a)~(d)：MIA PaCa-2皮下移植模型中的各嵌合抗體之抗腫瘤效果。
圖13-2係(e)~(h)：MIA PaCa-2皮下移植模型中的各嵌合抗體之抗腫瘤效果。
圖13-3係(i)~(l)：MIA PaCa-2皮下移植模型中的各嵌合抗體之抗腫瘤效果。
圖13-4係(m)及(n)：MIA PaCa-2皮下移植模型中的各嵌合抗體之抗腫瘤效果。
圖14係(a)人類化抗體重鏈#84H1h及(b)人類化抗體輕鏈#84L2h之各可變區域之設計。
圖15係(a)人類化抗體重鏈#101H1h及(b)人類化抗體輕鏈#101L2h之各可變區域之設計。
圖16係(a)人類化抗體重鏈#110H1h、(b)人類化抗體重鏈#110H13h、(c)人類化抗體輕鏈#110L4h、(d)人類化抗體輕鏈#110L2h及(e)人類化抗體輕鏈#110L12h之各可變區域之設計。
圖17係(a)人類化抗體重鏈#131H2h及(b)人類化抗體輕鏈#131L2h之各可變區域之設計。
圖18係(a)~(d)：MIA PaCa-2皮下移植模型中的各人類化抗體之抗腫瘤效果
圖19係抗人類CD147人類嵌合抗體所致的p38MAPK磷酸化。
圖20係(a)及(b)：抗人類CD147人類嵌合抗體所致的HSP27之磷酸化。
圖21係(a)~(c)：抗人類CD147人類嵌合抗體所致的腫瘤內p38MAPK磷酸化。
圖22係(a)~(c)：抗人類CD147人類嵌合抗體所致的cxc18及rhoB之表現。
圖23係(a)~(c)：抗人類CD147大鼠抗體與其人類嵌合抗體化所致的cxcl8及rhoB之表現。
圖24係使用SMAD4陰性胰臓癌細胞BxPC-3而評價了抗CD147抗體及吉西他濱之抗腫瘤效果的結果。
圖25係(a)~(c)：使用安定表現SMAD4的BxPC-3而評價了抗CD147人類嵌合抗體之抗腫瘤效果的結果。
圖26係(a)及(b)：評價了對使SMAD4表現的胰臓癌細胞BxPC-3投予抗CD147人類嵌合抗體的情形之p38MAPK的磷酸化。
圖27係吉西他濱耐性胰臓癌腫瘤模型中的抗CD147人類嵌合抗體之抗腫瘤效果。
圖28係(a)Hep G2細胞的CD147之利用流式細胞儀的表現確認；(b)肝癌細胞中的人類化CD147抗體所致的p38MAPK活性化。
圖29係(a)~(d)：肝癌中的CD147抗體之與索拉非尼的抗腫瘤效果之比較。
圖30係CD3、CD4陽性之細胞及CD3、CD8陽性之細胞中的CD147-APC之結合。
圖31係誘導了人類末梢血單核球增殖之際的抗人類CD147抗體之影響之評價。
圖32係抗人類CD147抗體對人類末梢血淋巴球之細胞介素產生之影響之評價。
圖33-1係rat_CD147_#84之輕鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#84之輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3之胺基酸序列。
圖33-2係rat_CD147_#84之重鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#84之重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列。
圖34-1係rat_CD147_#101之輕鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#101之輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3之胺基酸序列。
圖34-2係rat_CD147_#101之重鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#101之重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列。
圖35-1係rat_CD147_#110之輕鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#110之輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3之胺基酸序列。
圖35-2係rat_CD147_#110之重鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#110之重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列。
圖36-1係rat_CD147_#131之輕鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#131之輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3之胺基酸序列。
圖36-2係rat_CD147_#131之重鏈可變區域之核苷酸序列及胺基酸序列，以及rat_CD147_#131之重鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3之胺基酸序列。
圖37-1係#84H1hIgG2之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖37-2係#84H1hIgG4P之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖37-3係#84L2h之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖38-1係#101H1hIgG2之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖38-2係#101H1hIgG4P之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖38-3係#101L2h之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖39-1係#110H1hIgG4P之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖39-2係#110H13hIgG4P之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖39-3係#110L4h之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖39-4係#110L2h之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖39-5係#110L12h之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖40-1係#131H2hIgG2之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖40-2係#131L2h之胺基酸序列及核苷酸序列。
圖41係表示了非對稱單位所包含的2個複合體的帶狀圖。CD147以黑色表示，抗體之重鏈(H CHAIN)及輕鏈(L CHAIN)以灰色表示。
圖42係CD147與抗體之相互作用面。抗體附近的CD147之胺基酸以棒模型表示，並以文字標識。CD147之除此以外的部位以黑色的絲帶模型。另一方面，CD147附近的抗體之胺基酸以細線模型表示，除此以外之部位以灰色之絲帶模型表示。
圖43係胃癌模型中的嵌合及人類化CD147抗體之抗腫瘤效果。
圖44係慢性骨髓性白血病(CML)模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果。
圖45係大腸癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果。
圖46係腎臓癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果。
圖47係急性骨髓性白血病(AML)模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果。
圖48係胰臓癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果。
圖49係競合ELISA之結果。
圖50係(a)MIA PaCa-2細胞及(b)使用了使KLF5表現之MIA PaCa-2細胞的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果之比較。
用以實施發明之形態
以下，針對用以實施本發明之適合形態，一邊參照圖面一邊加以說明。又，以下說明的實施形態係表示本發明之代表性的實施形態之一例，並未藉此例而狹義地解釋本發明之範圍。
(定義)
本說明書中，「癌」與「腫瘤」係以相同意義被使用，各自只要未特別限定，用於意圖指固體癌、非固體癌或彼等之兩者的情形。
本說明書中，所謂「基因」之用語不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA、及其cRNA。
本說明書中，「多核苷酸」或「核苷酸」係以與核酸相同的意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
本說明書中，「多肽」與「蛋白質」係不區別地使用。
本說明書中，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。
本說明書中，「CD147」係以與CD147蛋白質相同的意義使用。
本說明書中，「抗體之機能性片段」亦稱為「抗體之抗原結合片段」，意指具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙 價抗體(diabody)、線狀抗體及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，將F(ab’)2在還原條件下進行了處理的抗體之可變區域的一價片段的Fab’，亦包含於抗體之抗原結合片段。惟，只要具有與抗原的結合能力，則並不被限定於此等之分子。又，於此等之抗原結合片段，不僅是將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素進行了處理者，亦包含使用基因工程學上被改變的抗體基因而於適當宿主細胞中所產生的蛋白質。
本說明書中，「效應子活性」係指抗體依賴性細胞毒殺(Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity，以下，ADCC)活性、補體依賴性細胞毒殺(Complement-dependent cytotoxicity，以下，CDC)活性、或抗體依賴性細胞吞噬(Antibody-dependent cellular phagocytosis，以下，ADCP)活性中之任一者以上。
本說明書中，「效應子機能」係指各「效應子活性」被發揮。
抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性可以測定具有效應子活性的免疫細胞、抗體及51Cr標識的標的細胞接觸的情形所產生的細胞死亡的51Cr釋放分析之方法來測定。本發明之人類CD147抗體之ADCC活性係如下方式被測定。針對評價的人類CD147抗體之ADCC活性，使用人類之末梢血單核球(PBMC)作為效應子細胞，使用CD147陽性之人類癌細胞株(例如，胰臓癌株MIA PaCa-2)作為ADCC標的細胞。將經放射線同位素51Cr標識的癌細胞與評價對象之抗體，以0.5或5μg/ml 之濃度，於4℃、30分鐘處理後，以癌細胞之20倍的比率添加自人類末梢血液分離的PBMC，於37度、5%CO2存在下培養4小時。使用TopCount NXT v2.53測定在上清液中被放出的51Cr，而獲得總釋放值。將以Triton-100處理經51Cr標識的癌細胞而被釋放出的51Cr之測定值設為最大釋放值，將自未添加PBMC的抗體處理細胞處理而被釋放出的51Cr之測定值設為自發釋放值，自下述式算出特異性釋放%。作為陰性對照樣品，而使用人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)。測定係實施3次，並算出平均值、標準偏差。
特異性釋放%=(總釋放-自發釋放)最大釋放
補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性，可以藉由測定使血液中所含的補體、抗體及標的細胞接觸的情形所產生的細胞死亡來評價。本發明之人類CD147抗體之CDC活性係如下列方式測定。將評價的人類CD147抗體所致的補體依賴性的殺細胞活性(CDC活性)，使用人類胰臓株MIA PaCa-2作為標的細胞來評價。使用市售之兔補體(Low Tox-M Rabbit Complement、CEDARLANE LABORATORIES LIMITED、Cat.CL3051)作為補體。使用人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)作為CDC活性陰性之對照抗體。評價的抗體及陰性之對象抗體，各自以0、0.1、1或、10μg/ml之濃度，於4℃處理1小時後，添加兔補體使終濃度成為7.5%，於37℃、 5%CO2存在下，加溫3小時後，使用CellTiter-Glo Lumimescent Cell Viability Assay(Promega公司，Cat.G7572)測定活細胞所含的細胞內ATP。使用CellTiter-Glo Lumimescent Cell Viability Assay而獲得的發光訊號，使用EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmr公司)定量。測定係實施3次，算出平均值及標準偏差。將自無處理之細胞獲得的發光訊號設為100%，將抗體與補體依賴性減少的發光訊號作為CDC活性。
抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)活性，係可將藉由使具有吞噬作用的免疫細胞、抗體及標的細胞接觸而發生的吞噬以2重螢光標識法來測定。
本發明之人類CD147抗體之ADCP活性係如下列方式測定。已報告人類IgG抗體係通過與小鼠之Fcγ受體的相互作用，藉由誘導抗體依賴性的單球、巨噬細胞所致的吞噬作用(ADCP)，而顯示對癌細胞的殺細胞活性(Overdijk et al.,Journal of Immunology,1-9,2012)。關於本發明之人類嵌合抗體之ADCP活性，使用RAW264.7(ATCC，TIB-71)作為效應子細胞，使用人類胰臓株PANC-1或MIA PaCa-2作為ADCP標的細胞來評價。將經PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit for General Cell Membrane Labeling(SIGMA,Cat.MINI67-1KIT)標識的ADCP標的細胞與評價的抗體，以20μg/ml之濃度之評價的抗體於4℃處理1小時後，以ADCP標的細胞5倍量添加以PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Lit for General Cell Membrane Labeling(SIGMA,Cat.PKH26GL-1KT)標識的RAW264.7細胞，於37℃、5% CO2存在下，加溫3小時。使用流式細胞儀(BD公司，CantoII)，測定藉由吞噬作用移行至PKH67訊號陽性的PKH26陽性細胞的比率。作為陰性對照樣品，而對於經處理人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)的樣品，同樣地實施測定。測定係實施3次，並算出平均值、標準偏差。
本說明書中，「實質上不具有效應子活性」或「效應子活性為降低或缺失」係指該抗體係ADCC活性、CDC活性或ADCP活性中之至少一者不顯示活性，或者為低到彼等之機能未充分發揮的程度之活性。「效實質上不具有效應子活性」或「效應子活性為降低或缺失」係指，例如，於上述之活性評價方法中，評價的抗體之活性為與陰性對照相同程度的活性。
本說明書中，「ADCC活性為降低或缺失」係指評價的抗體不顯示ADCC活性，或者為低到彼等之機能未充分發揮的程度之活性。「ADCC活性為降低或缺失」係指，例如，於上述之活性評價方法中，評價的抗體之活性為與陰性對照相同程度的活性。
本說明書中，「CDC活性為降低或缺失」係指評價的抗體不顯示CDC活性，或者為低到彼等之機能未充分發揮的程度之活性。「CDC活性為降低或缺失」係指，例如，於上述之活性評價方法中，評價的抗體之活性為與陰性對照相同程度的活性。
本說明書中，「ADCP活性為降低或缺失」係指評價的抗體不顯示ADCP活性，或者低到彼等之機能未充分發揮的程度之活性。「ADCP活性為降低或缺失」係指，例如，於上述之活性評價方法中，評價的抗體之活性為與陰性對照相同程度的活性。
「ADCC活性為降低或缺失」、「CDC活性為降低或缺失」或「ADCP活性為降低或缺失」係指，例如，於各自上述之活性評價方法中，評價的抗體之活性為與陰性對照相同程度的活性。
本說明書中，「將透過CD147的訊息傳導活性化」、「透過CD147的相關訊息分子之活性化」、「CD147之活性化」或「將CD147活性化」係指透過CD147的細胞訊息傳達系統之活性化，係使CD147之下游相關訊息分子中之至少一者活性化。透過CD147的訊息傳達之活性化，係指於CD147訊息的下游的基因之表現亢進或降低，或蛋白質之表現亢進或降低，或者，蛋白質之磷酸化亢進或降低。就CD147之下游的相關訊息分子而言，可列舉例如，FAK、MEK、Erk、JAK/STAT、AKT或MAP激酶(MAPK)、或者此等之更下游的訊息分子之活性化。就MAPK而言，可列舉例如，ERK1/2、JNK或p38MAPK，更佳為p38MAPK。就MAPK之更下游的訊息分子而言，可列舉例如，HSP27、cxc18或SMAD(例如，SMAD2、SMAD3及/或SMAD4)。就「CD147之活性化」而言，可列舉例如，p38MAPK之mRNA表現量之增加、p38MAPK之蛋白質表現量之增加、p38MAPK之 磷酸化、HSP27之磷酸化(例如，HSP27之Ser82的磷酸化或HSP27之Ser15的磷酸化)、cxcl8 mRNA表現量之增加、cxcl8蛋白質表現量之增加、透過SMAD訊息活性化的rhoB mRNA表現量之增加或rhoB蛋白質表現量之增加、或者，KLF5 mRNA之降低或KLF5蛋白質表現量的降低。
本說明書中，「抗原決定位」意指特定之抗CD147抗體會結合的CD147的部分肽或部分立體構造。前述之CD147的部分肽的抗原決定位，可藉由免疫分析法等本項技術領域中具通常知識者熟知的方法來決定。首先，製作抗原之各式各樣的部分構造。關於部分構造之製作，係可使用周知之寡核苷酸合成技術。例如，使用本項技術領域中具通常技術者周知之基因重組技術，製作由自CD147之C末端或N末端以適當長度依序縮短的一連串多肽後，檢討抗體對於彼等的反應性，且在決定大略的辨識部位後，合成更短的胜肽而檢討與彼等之胜肽的反應性，藉此而可決定抗原決定位。又，於與包含複數個細胞外功能域的膜蛋白質結合的抗體以包含複數個功能域的立體構造作為抗原決定位的情形，可藉由改變特定之細胞外功能域之胺基酸序列，而改變立體構造，藉以決定與哪個功能域結合。為特定之抗體會結合的抗原之部分立體構造的抗原決定位，亦可藉由以X射線構造解析來特定與前述之抗體鄰接的抗原之胺基酸殘基而決定。
若第二抗體結合於第一抗體會結合的部分肽或部分立體構造，則可判定第一抗體與第二抗體具有共通的抗原決定位。又，藉由確認第二抗體對於第一抗體之對抗原的結合為交差競合(即，第二抗體會妨礙第一抗體與抗原之結合)，而即使未決定具體的抗原決定位之序列或構造，亦可判定第一抗體與第二抗體結合於相同之抗原決定位。第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定位，且第一抗體具有抗腫瘤活性等之特殊效果的情形，可期待第二抗體亦具有相同的活性。
已知於抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處的互補性決定區(CDR：Complementarity determining region)。互補性決定區亦稱為超可變區(hypervariable domain)，係於抗體之重鏈及輕鏈之可變區域內，為一次構造的變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次構造上，各自分離於3處。於本說明書中，關於抗體之互補性決定區，將重鏈之互補性決定區自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之互補性決定區自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體構造上相互接近，而決定對所結合之抗原的特異性。
於本說明書中，於有「1至數個」及「1或數個」記載的情形之「數個」，係表示2至10個。較佳為10個以下，更佳為5或6個以下，進一步較佳為為2或3個。
(CD147)
CD147係已知為具有2~3個免疫球蛋白樣結構域的1次跨膜蛋白，藉由CD147彼此之相互作用、與CD44、整合素家族分子、CD98、VEGFR、CypA/B、MCT1/3/4等會參與增殖、浸潤、炎症的細胞外及細胞膜表面之分子相互作用，而使下游訊息相關分子、FAK、MEK、Erk、JAK/STAT、AKT、MAPK家族分子活性化，會促進以MMP為首的蛋白酶產生、癌之增殖、轉移、浸潤。
人類CD147已知3種變異體。變異體1係於網膜特異性表現，具有3個免疫球蛋白樣結構域(各自於本說明書中，有時稱為D0、D1及D2)的1次跨膜蛋白；變異體2係於T細胞或各式各樣正常細胞中表現，且具有在各式各樣癌組織中被報告表現增加之2個免疫球蛋白樣結構域(D1、D2)的1次跨膜蛋白；變異體3係具有1個免疫球蛋白樣結構域的1次跨膜蛋白。
人類CD147之變異體1之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NP_001719.2、NM_001728.3而取得，本說明書中，胺基酸序列亦揭示為序列識別號1，核苷酸序列亦揭示為序列識別號2。變異體1之3個免疫球蛋白樣結構域，就序列識別號1而言，各自為胺基酸編號22~138(D0)、胺基酸編號140~218(D1)及胺基酸編號223~323(D2)(Redzic,J.,J.Mol.Biol.,2011,68-82)(Grass et al.,Biosol.Rep,2016,1-16)。又，變異體1之膜貫通區域，就序列識別號1而言，為胺基酸編號324~344。
人類CD147之變異體2之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NP_940991.1、NM_198589.2而取得，本說明書中，胺基酸序列亦揭示為序列識別號3，核苷酸序列揭示為序列識別號4。變異體2之2個免疫球蛋白樣結構域(D1、D2)，就序列識別號3而言，各自為胺基酸編號24~102(D1)及胺基酸編號107~207(D2)。又，變異體2之膜貫通區域，就序列識別號3而言，為胺基酸編號208~228(Grass et al.,Biosol.Rep,2016,1-16)。
人類CD147之變異體3之胺基酸序列及核苷酸序列藉由參照GenBank登錄號NP_940992.1、NM_198590.2而取得。又，人類CD147基因亦可由商業來源取得。
食蟹猴CD147(本說明書中，亦有記載為猴CD147的情形)之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號XP_005587354.1、XM_005587297.1而取得。又，猴CD147基因亦可由商業來源取得。小鼠CD147之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NP_001070652.1、NM_001077184.1而取得。又，小鼠CD147基因亦可由商業來源取得。
於本發明所使用的CD147，係可於活體外合成，或可藉由基因操作使於宿主細胞中產生而獲得。具體而言，可藉由將CD147 cDNA併入可表現的載體後，於含有轉錄及轉譯上必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成，或使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形以使CD147表現，而獲得該蛋白質。
CD147之cDNA，可藉由例如，以表現CD147之cDNA的cDNA庫作為模板，而使用特異性增幅CD147之cDNA的引子，進行聚合酶連鏈反應(以下稱為「PCR」)(Saiki，R.K.，et al.，Science，(1988)239，487-49)之所謂的PCR法來取得。
又，與包含與編碼人類、猴或小鼠之CD147的核苷酸序列為互補的核苷酸序列的多核苷酸於嚴格條件下雜交，且編碼具有與CD147同等之生物活性的蛋白質的多核苷酸，亦包含於CD147之cDNA。再者，自人類、猴或小鼠CD147基因座所轉錄的剪接變異體(splicing variant)或與其於嚴格條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有與CD147同等之生物活性的蛋白質的多核苷酸，亦包含於CD147之cDNA。
又，由人類、猴或小鼠之CD147之胺基酸序列、或自此等之序列去除了訊息序列的胺基酸序列中有1或數個胺基酸被取代、刪除、或添加的胺基酸序列所構成，且具有與CD147同等之生物活性的蛋白質，亦包含於CD147。再者，由自人類、猴或小鼠CD147基因座所轉錄的剪接變異體所編碼的胺基酸序列、或該胺基酸序列中有1或數個之胺基酸被取代、刪除、或添加的胺基酸序列所構成，且具有與CD147同等之生物活性的蛋白質，亦包含於CD147。
(抗CD147抗體之製造)
本發明之抗CD147的抗體，係以目的抗原將非人類動物免疫，自免疫成立後的動物採取淋巴液、淋巴組織、血球試料或源自骨髓的細胞，按照周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，使產生抗CD147的抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，藉以建立融合瘤，且可獲得單株抗體。此種方法之具體例記載於WO2009/48072(2009年4月16日公開)及WO2010/117011(2010年10月14日公開)。就如此進行而獲得的單株抗體之例而言，可列舉例如，LN22R8、2P10F2、rat_CD147_#84、rat_CD147_#101、rat_CD147_#110或rat_CD147_#131。然而，取得單株抗體的方法為已確立的領域，並不受限於前述之具體例。
本發明之抗體，除了上述抗CD147的單株抗體，亦包含以降低對人類的異種抗原性等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等之抗體可使用已知方法來製造。
就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區域與恆定區域彼此為異種的抗體，例如，將源自小鼠或大鼠的抗體之可變區域接合於源自人類的恆定區域的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。作為源自LN22R8的嵌合抗體之一例，可舉出下述抗體：其包含具有由序列表的序列識別號33之第20至471號的胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、 具有由序列識別號35之第20至467號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈或具有由序列識別號37之第20至468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、及具有由序列識別號31之第21至234號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之輕鏈。作為源自2P10F2之嵌合抗體之一例，可舉出下述抗體：其包含具有由序列表的序列識別號43之第20至466號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、具有由序列表的序列識別號45之第20至462號的胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈或具有由序列識別號47之第20至463號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、及具有由序列識別號41之第21至234號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之輕鏈。
作為源自rat_CD147_#84的嵌合抗體之一例，可舉出下述抗體：其包含具有由序列表的序列識別號92之第20至470號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、具有由序列表的序列識別號94之第20至466號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、具有由序列識別號96之第20至467號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、具有由序列識別號98之第20至470號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈或具有由序列識別號100之第20至467號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、及具有由序列識別號90之第21至234號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之輕鏈。
作為源自rat_CD147_#101的嵌合抗體之一例，可舉出下述抗體：其包含具有由序列表的序列識別 號104之第20至463號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、具有由序列表的序列識別號106之第20至464號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈或具有由序列識別號108之第20至464號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、及具有由序列識別號102之第21至234號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之輕鏈。
作為源自rat_CD147_#110的嵌合抗體之一例，可舉出下述抗體：其包含具有由序列表的序列識別號112之第20至462號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、具有由序列表的序列識別號114之第20至463號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈或具有由序列識別號116之第20至463號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、及具有由序列識別號110之第21至234號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之輕鏈。
作為源自rat_CD147_#131之嵌合抗體之一例，可舉出下述抗體：其包含具有由序列表的序列識別號120之第20至464號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈或具有由序列識別號122之第20至465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之重鏈、及具有由序列識別號118之第21至234號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列之輕鏈。
就人類化抗體而言，可列舉僅將CDR併入源自人類的抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)、利用CDR移植法而於CDR之序列以外還將一部分框架之胺基酸殘基亦移植至人類抗體的抗體(國際公開第WO90/07861號小冊)。
就源自rat_CD147_#84抗體的人類化抗體而言，只要是保持rat_CD147_#84之6種全部的CDR序列，具有對CD147的結合活性，且將CD147活性化的抗體，則為本發明之抗體所包含。又，rat_CD147_#84抗體之重鏈可變區域，係保有由序列識別號55所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號56所示的胺基酸序列所構成的CDRH2、及由序列識別號57所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。又，rat_CD147_#84抗體之輕鏈可變區域，係保有由序列識別號52所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號53所示的胺基酸序列所構成的CDRL2、及由序列識別號54所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rat_CD147_#84抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域之胺基酸序列及核苷酸序列、CDR之胺基酸序列亦記載於圖33-1及圖33-2。
作為源自rat_CD147_#101抗體之人類化抗體，只要是保持rat_CD147_#101之6種全部的CDR序列，具有對CD147的結合活性，且將CD147活性化的抗體，則為本發明之抗體所包含。又，rat_CD147_#101抗體之重鏈可變區域，係保有由序列識別號65所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成的CDRH2、及由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。又，rat_CD147_#101抗體之輕鏈可變區域，係保有由序列識別號62所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成的CDRL2、及由序列識別號64所示的胺基酸 序列所構成的CDRL3。rat_CD147_#101抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域之胺基酸序列及核苷酸序列、CDR之胺基酸序列亦記載於圖34-1及圖34-2。
作為源自rat_CD147_#110抗體之人類化抗體，只要是保持rat_CD147_#110之6種全部之CDR序列，具有對CD147的結合活性，且將CD147活性化的抗體，則為本發明之抗體所包含。又，rat_CD147_#110抗體之重鏈可變區域，係保有由序列識別號75所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號76所示的胺基酸序列所構成的CDRH2、及由序列識別號77所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。又，rat_CD147_#110抗體之輕鏈可變區域，係保有由序列識別號72所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成的CDRL2、及由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rat_CD147_#110抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域之胺基酸序列及核苷酸序列、CDR之胺基酸序列亦記載於圖35-1及圖35-2。
作為源自rat_CD147_#131抗體之人類化抗體，只要是保持rat_CD147_#131之6種全部的CDR序列，具有對CD147的結合活性，且將CD147活性化的抗體，則為本發明之抗體所包含。又，rat_CD147_#131抗體之重鏈可變區域，係保有由序列識別號85所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號86所示的胺基酸序列所構成的CDRH2、及由序列識別號87所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。又，rat_CD147_#131抗體之 輕鏈可變區域，係保有由序列識別號82所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號83所示的胺基酸序列所構成的CDRL2、及由序列識別號84所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rat_CD147_#131抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域之胺基酸序列及核苷酸序列、CDR之胺基酸序列亦記載於圖36-1及圖36-2。
又，進一步將各CDR中之1至3個之胺基酸殘基取代為另外的胺基酸殘基的CDR改變人類化抗體，亦只要是具有對CD147的結合活性，且將CD147活性化的抗體，則為本發明之抗體所包含。
就源自rat_CD147_#84抗體之人類化抗體而言，可列舉具有以下之(a)及(b)的人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段：(a)選自包含以下之(a1)至(a4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(a1)由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(a2)由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(a3)於(a1)或(a2)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(a4)於(a1)至(a3)之任一者記載之序列中各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及 (b)選自包含以下之(b1)至(b3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(b1)由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(b2)於(b1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(b3)於(b1)或(b2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
就源自rat_CD147_#84抗體之人類化抗體之較佳例而言，可列舉包含由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體；或包含由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體。
就源自rat_CD147_#84抗體之人類化抗體之更佳例而言，可列舉包含由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20至467號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號127所示的胺基酸序列之21至第234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體；或包含由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20至466號之胺基酸殘基所構成 的重鏈及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
就源自rat_CD147_#101抗體的人類化抗體而言，可列舉具有以下之(e)及(f)的人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段：(e)選自包含以下之(e1)至(e4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(e1)由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(e2)由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(e3)於(e1)或(e2)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(e4)於(e1)至(e3)之任一者記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及(f)選自包含以下之(f1)至(f3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(f1)由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(f2)於(f1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及 (f3)於(f1)或(f2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
就源自rat_CD147_#101抗體的人類化抗體之較佳例而言，可列舉包含由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體、或包含由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20至137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體。
就源自rat_CD147_#101抗體之人類化抗體之更佳例而言，可列舉包含由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20至463號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體；或包含由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20至464號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
就源自rat_CD147_#110抗體之人類化抗體而言，可列舉具有以下之(c)及(d)的人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段：(c)選自包含以下之(c1)~(c4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域： (c1)由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(c2)由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(c3)於(c1)或(c2)之序列，對各CDR序列以外之框架(framework)區域之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(c4)(於(c1)~(c3)之任一項記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及(d)選自包含以下之(d1)~(d5)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(d1)由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d2)由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d3)由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d4)於(d1)~(d3)之任一者記載之序列，對各CDR序列以外之框架區域之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(d5)於(d1)~(d4)之任一者記載之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
就源自rat_CD147_#110抗體之人類化抗體之較佳例而言，可列舉包含由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體；包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體；或包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體。
就源自rat_CD147_#110抗體之人類化抗體之更佳例而言，可列舉包含由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20至463號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體；包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體；或包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈、及由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
就源自rat_CD147_#131抗體之人類化抗體而言，可列舉具有以下之(g)及(h)的人類CD147抗體或該抗體之抗原結合片段：(g)選自包含以下之(g1)~(g3)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(g1)由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；(g2)於(g1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(g3)於(g1)或(g2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，以及(h)選自包含以下之(h1)~(h3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(h1)由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(h2)於(h1)之序列，對各CDR序列以外之框架區域的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(h3)於(h1)或(h2)之序列中的各CDR序列以外之框架區域之序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
就源自rat_CD147_#131抗體之人類化抗體之較佳例而言，可列舉包含由序列識別號139所示的胺 基酸序列之第20至138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域及由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21至128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域的抗體。
就源自rat_CD147_#131抗體之人類化抗體之更佳例而言，可列舉包含由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20至464號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
源自上述之rat_CD147_#84抗體之人類化抗體、源自rat_CD147_#101抗體之人類化抗體、源自rat_CD147_#110抗體之人類化抗體或源自rat_CD147_#131抗體之人類化抗體，較佳為將透過CD147的p38MAPK訊息傳達及/或SMAD4之訊息傳達活性化。
就本發明之抗體而言，進一步可列舉人類抗體。抗CD147人類抗體，係意指僅具有源自人類染色體的抗體之基因序列的人類抗體。抗CD147人類抗體，例如，可藉由使用具有包含人類抗體之重鏈及輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143；Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999；Tomizuka,K.et.al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)而取得。
此種人類抗體產生小鼠，具體而言，可藉由基因剔除動物(knockout animal)及基因轉殖動物(transgenic animal)的製作、及使此等動物彼此交配，而製作出基因重組動物，該基因重組動物係內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座被破壞，並以透過人類人工染色體(Human artificial chromosome，HAC)載體或小鼠人工染色體(Mouse artificial chromosome，MAC)載體等之載體而導入有人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座來取代。
又，藉由基因重組技術，利用各自編碼該種人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA，較佳為利用包含該cDNA的載體而將真核細胞轉形，培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此而亦可自培養上清液中獲得此抗體。其中，就宿主而言，例如可使用真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球、骨髓瘤等之哺乳動物細胞。
又，亦已知自人類抗體庫篩選的源自噬菌體展示之人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
例如，可使用將人類抗體之可變區域作為單鏈抗體(scFv)，使於噬菌體表面表現，選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體展示法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。可藉由解析與抗原結合而選擇的噬菌體之基因，而決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區域的DNA序列。若清楚與抗原結合的scFv之DNA序列，則可製作具有該序列的表現載體，導入至適當宿主使其表現以取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
具有與本發明所提供之抗體相同的抗原決定位的抗體，亦包含於本發明之抗體。可列舉例如，具有與LN22R8、2P10F2、rat_CD147_#84、rat_CD147_#101、rat_CD147_#110或rat_CD147_#131中至少一者相同的抗原決定位的抗體。
本發明之LN22R8及2P10F2係辨識圖3之mu3所表示的抗原決定位(人類CD147v1：DALPGQKTEFKVDSDDQ(序列識別號143)、猴CD147：DTLPGQKTDFEVDSDDL(序列識別號144))。於本發明之抗體，可辨識或結合於序列識別號143或序列識別號144、或序列識別號143或序列識別號144之序列中包含有1或數個、較佳為1~3個、更佳為1或2個胺基酸刪除、取代或添加的胺基酸序列之序列的抗體，亦包含於 其範圍。此抗體較佳為會將透過CD147的訊息傳導活性化。
又，於本發明之抗體，包含rat_CD147_#110，較佳為辨識與人類化#110H1L4相同抗原決定位的抗體。此抗體較佳為會將透過CD147的訊息傳導活性化。人類化#110H1L4之抗原決定位解析之結果係示於實施例17。
適合的抗體，係可藉由評價對所屬技術領域中具通常知識者周知之抗原的結合性來篩選。抗體與抗原(CD147)之解離常數，係可使用以表面電漿共振(SPR)作為檢測原理的Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司)來測定。例如，可藉由使對於作為配位體(ligand)而固相化的抗原設定為適當濃度的抗體與分析物進行反應，測量其結合及解離，而獲得結合速度定數ka1、解離速度定數kd1及解離定數(KD；KD=kd1/ka1)。
對CD147的結合性評價並未限定於Biacore T200之使用，亦能夠藉由以表面電漿共振(SPR)作為檢測原理的機器、以結合平衡除外法(Kinetic Exclusion Assay)作為檢測原理的KinExA(Sapidyne Instruments公司)、以生物薄層干涉法(Bio-Layer Interferometry)作為檢測原理的BLItz系統(Pall公司)或ELISA(酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))法等。
就比較抗體之性質之際的其他指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。差示掃描量熱法(DSC)係可快 速、或正確地測量可成為蛋白質的相對構造安定性之優良指標的熱變性中點(Tm)的方法。可藉由使用DSC來測量Tm值並比較其值，而比較熱安定性的不同。已知抗體之保存安定性係顯示與抗體之熱安定性有某程度的相關(Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，可將熱安定性作為指標而篩選出適合的抗體。就用以篩選抗體之其他指標而言，可列舉適當的宿主細胞中之產量高、及在水溶液中的凝集性低。例如由於產量最高的抗體並不一定會顯示最高熱安定性，故有必要基於以上所述的指標作綜合地判斷，來選擇最適於對人類投予的抗體。
又，亦已知使用適當連結子將抗體之重鏈及輕鏈的全長序列連結，而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白，係能夠藉由二聚物化而保持與原本為四聚物的抗體類似的結構及活性。又，本發明之抗體亦可為具有單一之重鏈可變區域，而不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體被稱為單一功能域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，已報告實際上於駱駝或駱馬中可見，且抗原結合能力被保持(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述之抗體，亦可解釋為本發明中的抗體之抗原結合片段之一種。
又，能夠藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾，而增強抗體依賴性細胞損害活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，雖已知WO99/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等，但並未限定於此等。
於一旦將抗體基因單離之後，導入至適當宿主而製作抗體的情形，係可使用適當的宿主與表現載體之組合。
就抗體基因之具體例而言，可列舉將編碼本說明書所記載的抗體之重鏈序列的基因、及編碼輕鏈序列的基因組合者。於將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因能夠被插入同一表現載體，亦能夠被插入至各別之表現載體。使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴之細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞的情形，可列舉例如，大腸菌、枯草菌。於此等之細胞藉由轉形而導入作為目的的抗體基因，且將經轉形的細胞於活體外培養，藉此而可獲得抗體。於以上之培養法中，有因抗體序列而產量不同的情形，能夠自具有同等結合活性的抗體之中以產量作為指標而選出作為醫藥之生產為容易者。
作為本發明所使用的抗體之同型(isotype)並無限制，可列舉例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，但較佳為IgG或IgM，進一步較佳為IgG。
人類IgG1，係於5種存在的人類IgG亞群中，透過補體結合的CDC活性、抗體依賴的細胞損害活性等效應子機能非常強(Bruggemann et al.,J.Exp.Med.,1351-1361,1987)，且於在治療用抗體以於癌中高表現的分子為標的的情形，作為IgG型式(曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)等)被利用，其係藉由促進透過效應子機能的細胞損害所致的癌細胞之細胞死亡誘導顯示治療效果而。於將HLA-DR作為標的的人類IgG1抗體，已報告依賴於人類IgG1所具備的抗體之CDC活性，且投予後之食蟹猴死亡，而於將即使正常臓器亦表現的分子作為標的之抗體醫藥，係有效應子機能會引起嚴重副作用的疑慮(Tawara,T.,J.Immunology,2008,2294-2298)。作為本發明之抗體之同型而使用IgG1的情形，IgG1抗體可具有變異，能夠藉由將恆定區域之胺基酸殘基的一部分作取代，而調整效應子機能(參照WO88/007089、WO94/28027、WO94/29351)。就使效應子機能減弱的IgG1之變異體而言，可列舉IgG1 LALA(IgG1-L234A、L235A)、1gG1 LAGA(IgG1-L235A、G237A)等。
人類IgG2，係5種存在的人類IgG亞群中，透過補體結合的CDC活性、抗體依賴的細胞損害活性等 效應子機能非常弱(Bruggemann et al.,J.Exp.Med.,1351-1361,1987)，被利用作為在治療用抗體且將於正常臓器中表現的分子作為標的的情形，用以迴避透過效應子機能的細胞損害所致的毒性的IgG型式之一(地諾單抗(denosumab)、維諾卡單抗(evolocumab)、伯達單抗(brodalumab))。
人類IgG4係5種存在的人類IgG亞群中，透過補體結合的CDC活性、抗體依賴的細胞損害活性等效應子機能非常弱(Bruggemann et al.,J.Exp.Med.,1351-1361,1987)，被利用作為在治療用抗體且將於正常臓器中表現的分子作為標的的情形，用以迴避通過效應子機能的細胞損害所致的毒性的IgG型式之一(OPDIVO®)。作為本發明之抗體之同型而使用IgG4的情形，係藉由將恆定區域之胺基酸殘基之一部份取代，而IgG4特有之分割被抑制，能夠延長半衰期(參照Molecular Immunology,30,1 105-108(1993))。
作為本發明之抗體之同型而使用IgG4的情形，IgG4抗體可具有變異。就IgG4之變異體而言，可列舉依EU索引(Proc Natl Acad Sci US A.1969,63(1)、78-85；Kabat et.al.,Sequences of proteins of immunological interest,1991 Fifth edition)所示的234位之苯丙胺酸取代為丙胺酸(F234A)及235位之白胺酸取代為丙胺酸(L235A)(Parekh et al.,mAbs,310-318,2012)。將此種抗體之變異稱為FALA變異。IgG4PFALA係藉由與存在於CH2功能域的FcγRs(例 如，FcγRI、FcγRII或FcγRIII等)的相互作用上2個必要的胺基酸殘基取代為丙胺酸，進一步使效應子機能減弱。
又，IgG4由於抗體重鏈間的SS鍵的形成不安定，為了提高安定性，導入促進抗體重鏈間之SS鍵形成的變異。作為此種變異，而可列舉依EU索引所示的228位之絲胺酸取代為脯胺酸(S228P)(ANGAL et.al.,Molecular Immunology,105-108,1993)。將此抗體之變異稱為Pro變異。於本發明之抗體之恆定區域，可同時導入上述之FALA變異及Pro變異(Vafa et.al.,Methods,65,114-126,2014)。將具有FALA變異的IgG4重鏈稱為「IgG4FALA」型重鏈，將具有Pro變異的IgG4重鏈稱為「IgG4P」型重鏈，將具有FALA變異及Pro變異兩者的變異的IgG4重鏈稱為「IgG4PFALA」型重鏈。
抗體重鏈恆定區域係包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3區域，CH1係定義為EU索引118至215，鉸鏈係定義為EU索引216至230，CH2係定義為EU索引231至340，CH3係定義為EU索引341至446。依EU索引所示的自228位之絲胺酸取代的脯胺酸、自234位之苯丙胺酸取代的丙胺酸及自235位之白胺酸取代的丙胺酸，係各自相當於於表示人類嵌合rat_CD147_#84重鏈IgG4PFALA之胺基酸序列的序列識別號100中第248號之脯胺酸、第254號之丙胺酸及第255號之丙胺酸；於表示人類嵌合rat_CD147_#101重鏈IgG4PFALA之胺基酸序列的序列識別號108中第245號之脯胺酸、第251號之丙胺酸及第252號之丙胺酸；於表示人類嵌合 rat_CD147_#110重鏈IgG4PFALA之胺基酸序列的序列識別號108中第244號之脯胺酸、第250號之丙胺酸及第251號之丙胺酸。
就本發明之抗體之較佳的同型而言，可列舉IgG1、IgG2、IgG4、IgG4P或、IgG4PFALA，特佳可列舉IgG2、IgG4P或、IgG4PFALA，進一步較佳可列舉IgG2或IgG4P。
又本發明之抗體可為具有抗體之抗原結合部位的抗體之抗原結合片段或其修飾物。將抗體以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素處理，或將抗體基因藉由基因工程手法而改變，且使於適當培養細胞表現，藉此而可獲得該抗體之片段。於此種抗體片段中，可將保持抗體全長分子所具有的機能之全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合片段。就抗體之機能而言，可列舉與抗原有關連的訊息傳達之活性化。
CD147因亦於以紅血球為首的血液細胞或生存必須的正常臓器中表現(Spring,et al.,Eur.J.Immunol.,1997,891-897)，而利用附隨抗體的效應子機能的抗腫瘤效果被認為副作用的風險高。已有報告實際上紅血球對於抗體結合產生的效應子機能(ADCC、CDC、ADCP)有感受性(Flegel,W.,Transfusion,2015,S47-S58)，已知抗紅血球的抗體於體內增加而成為自體免疫性溶血性貧血(Gibson,J.,Aust.N.Z.J.Med.,1988.625-637)。本發明之抗體係以亦於正常細胞表現的CD147為標的之治療用抗體，特徵為會成為嚴重副作用之原因 的ADCC活性、ADCP活性或CDC活性之任一者或全部皆為低的或幾乎未檢測出。
本發明者等首次發現，無論抗體之效應子機能為何，藉由將CD147之細胞訊息傳達活性化，而顯示抗腫瘤活性的人類CD147抗體。本發明中的抗體所保持的機能為對CD147的結合活性及/或將CD147活性化的機能。本發明之抗體係較佳為將透過CD147的下游之相關訊息分子活性化，例如，將FAK、MEK、Erk、JAK/STAT、AKT或MAP激酶(MAPK)或此等之更下游的相關訊息分子活性化。本發明之抗體更佳為將MAPK或MAPK之下游之分子活性化。作為MAPK，較佳可列舉p38MAPK。就MAPK之更下游之訊息分子而言，可列舉例如，HSP27、cxcl8或SMAD(例如，SMAD2、SMAD3或SMAD4，較佳為SMAD4)。就「CD147之活性化」而言，可列舉例如，p38MAPK之mRNA表現量之增加、p38MAPK之蛋白質表現量之增加、p38MAPK之磷酸化、HSP27之磷酸化(例如，HSP27之Ser82之磷酸化或HSP27之Ser15之磷酸化)、cxcl8 mRNA表現量之增加、cxcl8蛋白質表現量之增加或透過SMAD訊息活性化的rhoBmRNA表現量之增加或rhoB蛋白質表現量之增加。作為「CD147之活性化」，較佳為p38MAPK之蛋白質表現量之增加、p38MAPK之磷酸化、HSP27之磷酸化(例如，HSP27之Ser82之磷酸化或HSP27之Ser15之磷酸化)、cxcl8 mRNA表現量之增加或藉由SMAD訊息活性化的rhoB mRNA表現量之增加。
已知SMAD2或SMAD3係TGFβ與TGFβ受體(TGFBR1/2)結合之際，藉由TGFβ受體而被磷酸化，與SMAD4形成雜三聚體，移行至核內，與染色體上之具有SMAD DNA結合序列(Smad binding element：SBE)的轉錄調節區域結合，正向或負向控制下游基因之mRNA表現(宮園，日老醫誌，1999,162-166)。因此，於SMAD4之活性化，認為SMAD2或SMAD3之存在係有必要。SMAD2、SMAD3及SMAD4係負向控制TGFb依賴性KLF5之表現量(David et al.,Cell,2016,164(5),1015-1030)。於SMAD4缺失的胰臓癌細胞中，經KLF5基因之SMAD2、SMAD3及SMAD4抑制訊號被解除，而有KLF5蛋白質表現。已知SMAD4缺失，KLF5表現時，TGFb依賴性的細胞死亡的訊息(SOX4依賴的)被抑制(上述David et al、Cell)。
本發明者等發現，本發明之人類CD147抗體將p38MAPK磷酸化(圖21)、將HSP27磷酸化(圖20)、使cxcl8之表現增加(圖22(b)及圖23(b))。因此，藉由確認於本發明之抗體投予前後，此等分子中之至少一者之基因表現或蛋白質表現、或磷酸化的狀態有變化，可確認本發明之抗體是否涉及CD147之活性化。
又，本發明者等發現，本發明之人類CD147抗體對有SMAD4之蛋白質表現的胰臓癌模型顯示藥效(圖25)；本發明之人類CD147抗體係於SMAD4有基因變異，於未表現SMAD4的BxPC-3等之胰臓癌模型，抗腫瘤效果為部分的(~30%左右)(圖24)；以及，於投予本 發明之人類CD147抗體後之腫瘤，SMAD2、SMAD3及SMAD4之下游的分子(rhoB、圖22(c)及圖23(c))被誘導。因此，藉由本發明之抗體投予前後，rhoB之基因表現或蛋白質表現是否有變化，可確認本發明之抗體是否透過CD147之活性化。又，使用所屬技術領域中具通常知識者周知之方法測定患者樣品中的SMAD4之基因體序列、基因表現或蛋白質表現，選擇表現SMAD4的患者作為投予本發明之抗體的對象患者，可投予本發明之抗體。
又，於BxPC-3等之SMAD4陰性之模型，已知KLF5的表現高(David et al.，Cell，2016，164(5)，1015-1030)。本發明之人類CD147抗體，於表現KLF5的MIA PaCa-2之模型，感受性為91%至低至20%(實施例26)。由此，本發明者等認為，藉由有KLF5表現，由CD147抗體所誘導的SMAD2、SMAD3及SMAD4依賴的細胞死亡訊息被抑制。肝癌、ALL、淋巴瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、皮膚癌、肉瘤、AML或腎臓癌係KLF5之表現量低，預計本發明之人類CD147抗體為有效的患者為多的。又，可使用所屬技術領域中具通常知識者周知之方法測定患者樣品中的KLF5之基因表現或蛋白質表現，選擇KLF5之表現降低或缺失的患者作為投予本發明之抗體的對象患者，投予本發明之抗體。此情形之KLF5表現的降低程度係可藉由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法及適當臨床試驗之實施而決定，例如，比較有獲得效果的患者及未獲得效果的患者中的KLF5之表現量，而設定適當的閾值。
例如，就抗體之片段而言，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或將重鏈及輕鏈之Fv以適當連結子連結的單鏈Fv(scFv)、雙價抗體(diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，於還原條件下處理F(ab’)2的抗體之可變區域之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
再者，本發明之抗體可為對至少2種類之不同抗原具有特異性的多特異性抗體。通常此種分子為與2種類之抗原結合者(即，雙特異性抗體(bispecific antibody))，本發明中的「多特異性抗體」包含對於其以上(例如，3種類)之抗原具有特異性的抗體。
本發明之多特異性抗體亦可為由全部長度所構成的抗體或此種抗體的片段(例如，F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體亦可使2種類之抗體之重鏈與輕鏈(HL對)結合而製作，亦可藉由使產生不同單株抗體的融合瘤融合，製作雙特異性抗體產生融合細胞而製作(Millstein et al.，Nature(1983)305，p.537-539)。
本發明之抗體亦可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可藉由以多肽之連接子來連接抗體之重鏈可變區域與輕鏈可變區域而獲得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編；Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)；Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，亦可將以多肽連接子使2個scFv結合所製作之BiscFv片段作為雙特異性抗體使用。
製作單鏈抗體之方法為本技術領域周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。於此scFv，重鏈可變區域與輕鏈可變區域係透過不形成共軛的連接子而連接，較佳為透過多肽連接子而連接(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中的重鏈可變區域及輕鏈可變區域可來自同個抗體，亦可來自不同個抗體。作為連接可變區之多肽連接子，可使用例如由12~19個殘基所構成之任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA可藉由以下方式而得：於編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區域的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區域的DNA中，將編碼彼等之序列中的全部或所望之胺基酸序列的DNA部分作為模板，使用規定該兩端的引子對而藉由PCR法增幅，接著，進一步將編碼多肽連接子部分的DNA、及以其兩端分別與重鏈、輕鏈連結的方式規定的引子對組合，增幅而獲得。
又，一旦製作編碼scFv之DNA，則可依據通常方法獲得含有彼等之表現載體、及由該表現載體轉形的宿主，又，藉由使用該宿主，可按照通常方法獲得scFv。此等之抗體片段，係可與前述同樣地進行而取得基因，並使其表現，藉由宿主而使其產生。
本發明之抗體可為進行多量化而提高對抗原之親和性者。作為多量化之抗體，可為1種類之抗體，亦可為辨識相同抗原的複數抗原決定位的複數之抗體。 作為將抗體進行多量化的方法，可列舉IgG CH3域與2個seFv之結合、與鏈黴親和素(streptavidin)之結合、螺旋-轉折-螺旋模體(helix-turn-helix motif)的導入等。
本發明之抗體可為胺基酸序列不同之複數種類的抗CD147抗體之混合物，即多株抗體。就多株抗體之一例而言，可列舉CDR不同的複數種類之抗體之混合物。作為該種多株抗體，可將產生不同抗體的細胞的混合物進行培養，而使用自該培養物純化的抗體(參照WO2004/061104)。
本發明之抗體可為與上述之抗體之重鏈及/或輕鏈比較而具有80%至99%同一性(或相同性)的抗體。藉由組合顯示與上述之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列高相同性的序列，可選擇具有與上述之各抗體相等之抗原結合能、CD147之活性化，較佳為MAPK之活性化、MAPK之下游訊息分子之活性化的抗體。此種相同性，一般而言為80%以上之相同性，較佳為90%以上之相同性，更佳為95%以上之相同性，最佳為99%以上之相同性。又，亦藉由組合於重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基被取代、刪除及/或添加的胺基酸序列，可選擇具有與上述之各抗體同等之各種作用的抗體。經取代、刪除及/或添加的胺基酸殘基數，一般而言，10個胺基酸殘基以下，較佳為5至6個胺基酸殘基以下，更佳為2至3個胺基酸殘基以下，最佳為1個胺基酸殘基。
又，已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端之離胺酸殘基有缺失(Tsubaki et.al.,Int.J.Biol.Macromol,139-147,2013)。然而，此等之重鏈序列之缺失及修飾，對於抗體之抗原結合能及效應子機能(補體之活性化或抗體依賴性細胞障害作用等)未帶來影響。因此，本發明亦包含接受該修飾的抗體、重鏈羧末端有1或2個胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能及將CD147之下游相關訊息分子活性化的機能，與本發明有關的抗體之重鏈之羧基末端的缺失體並未被限定於上述之種類。構成與本發明有關的抗體的雙股重鏈可為選自包含完全長度及上述之缺失體的群組的重鏈之任一種，亦可為組合任二種者。各缺失體之量比雖可受到產生與本發明有關的抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但就與本發明有關的抗體之主成分而言，可列舉雙股之重鏈之雙方，羧基末端之1個胺基酸殘基有缺失的情形。
二種類之胺基酸序列間之相同性，可藉由使用Blast algorithm 2.2.2版(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之預設參數(default parameter)而決定。Blast algorithm亦可藉由在網際網路之 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast存取而使用。又，依上述之Blast algorithm，計算同一性(Identity(或Identities))及正向(Positivity(或Positivities))之2種類的百分比的值。前者係於應求得相同性的二種類之胺基酸序列之間，胺基酸殘基為一致的情形的值，後者為亦考慮化學構造之類似的胺基酸殘基的數值。於本說明書，將具有胺基酸殘基為一致的情形之Identity(同一性)之值設為相同性之值。
作為抗體之修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等之各種分子結合的抗體。
本發明之抗體，進一步亦可為此等抗體與其他藥劑形成結合物者(Immunoconjugate)。作為此種抗體的例，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物結合的物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
獲得的抗體可純化至成均一。抗體之分離、純化只要使用於通常之蛋白質使用的分離、純化方法即可。例如，若適宜選擇、組合管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等，可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但並不限定於此等。
就層析而言，可列舉親和力層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等。
此等層析可使用HPLC、FPLC等之液體層析而進行。
就親和力層析所使用的管柱而言，可列舉蛋白質A(Protein A)管柱、蛋白質G(Protein G)管柱。
例如，作為使用蛋白質A管柱之管柱，可列舉Hyper D，POROS，Sepharose F.F.(GE HEALTHCARE)等。
又使用將抗原固定化的載體，利用對抗原的結合性，亦可純化抗體。
(含有抗CD147抗體的醫藥)
自上述之「抗CD147抗體之製造」之項目中記載的方法所獲得的抗CD147抗體之中，可獲得本發明之抗CD147抗體。如此而獲得的抗體可使用作為腫瘤及/或癌症治療及/或預防劑。
本發明之抗CD147抗體具有優異的抗腫瘤活性，有用於作為腫瘤或癌症治療藥。本發明之抗CD147抗體即使對吉西他濱耐性癌細胞或索拉非尼低感受性癌細胞，亦顯示優異的抗腫瘤效果。本發明之抗CD147抗體係於慢性骨髓性白血病細胞，顯示較伊馬替尼更顯著強的藥效。
就可藉由本發明之抗CD147抗體或含有該抗體的醫藥來治療的腫瘤而言，只要為表現CD147的腫瘤，則未特別限定，但較佳可列舉胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腦腫瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、或慢性淋巴性白血病(CLL)或急性淋巴性白血病(ALL))、淋巴瘤或惡性淋巴瘤(例如，B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma、DLBCL))，更佳可列舉胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
又，就可藉由本發明之抗體或含有該抗體的醫藥來治療的腫瘤而言，可列舉表現SMAD陽性之CD147的腫瘤，就表現SMAD陽性之CD147的腫瘤而言，可列舉例如，表現SMAD陽性之CD147的肝癌或胰臓癌。本發明之抗CD147抗體或含有該抗體的醫藥係較佳為被投予至已確認有CD147及/或SMAD表現的患者。就SMAD而言，較佳可列舉SMAD2、SMAD3及/或SMAD4，更佳可列舉SMAD4。較佳為根據SMAD4之表現的確認，確認SMAD2或SMAD3中之至少一者表現。
或者，就可藉由本發明之抗體或含有該抗體的醫藥來治療的腫瘤而言，可列舉KLF5之表現降低或缺失的腫瘤，就KLF5之表現降低或缺失的腫瘤而言，可列舉肝癌、ALL、淋巴瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、皮膚癌、肉瘤、AML或腎臓癌。本發明之抗CD147抗體或含有該抗體的醫藥較佳被投予至確認有KLF5之表現降低或缺失的患者。
本發明之抗CD147抗體，依治療之目的，亦可投予2、3或其以上之其他治療劑，可藉由將彼等之其他治療劑封入相同製劑之中而同時投予。其他之治療劑與抗CD147抗體可藉由封入相同製劑之中而同時投予。又，亦可將抗CD147抗體與其他之治療劑封入各別製劑而同時投予。再者，亦可使其他藥劑與抗CD147抗體前後而各別投予。即，可於投予其他治療劑後，投予作為有效成分而含有抗CD147抗體或該抗體之抗原結合片段的治療劑，或者亦可於投予作為有效成分而含有抗CD147抗體或該抗體之抗原結合片段的治療劑後，投予其他治療劑。
本發明亦提供含有治療及/或預防上有效量之抗CD147抗體及藥學上可容許的稀釋劑、載體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑的醫藥組成物。
本發明亦提供含有治療及/或預防上有效量之抗CD147抗體及治療及/或預防上有效量之至少一種之抗腫瘤治療劑與藥學上可容許的稀釋劑、載體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑的醫藥組成物。
就於本發明之醫藥組成物可容許的製劑所使用的物質而言，較佳為對於投予量或投予濃度，對被投予醫藥組成物者為非毒性者。
本發明之醫藥組成物可含有用以改變或保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、緩釋率、吸收率、浸透率的製劑用之物質。作為製劑用之物質，可列舉以下，但並未限制於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、Tris-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等之錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單糖類、二糖類等之其他碳水化物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶媒、甘露醇或山梨糖醇等之糖醇、懸浮劑、山梨糖醇酐酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等之聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、三羥基氨基甲烷(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀、甘露醇‧山梨糖醇等之彈性增強 劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。此等之製劑用之物質的添加量，相對於抗CD147抗體之重量，為0.01~100倍，特別是添加0.1~10倍者較佳。製劑中之適合的醫藥組成物之組成，可依所屬技術領域中具通常知識者，因應適用疾病、適用投予路徑等而適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載體可為液體亦可為固體。適當賦形劑或載體可為注射用之水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或非經口投予上通常使用的其他物質。於載體亦可使用中性之生理食鹽水或含有血清白蛋白的生理食鹽水。於醫藥組成物，可含有pH7.0-8.5之Tris緩衝液、pH4.0-5.5之乙酸緩衝液、pH3.0-6.2之檸檬酸緩衝液。又，於此等之緩衝液中亦可含有山梨糖醇或其他之化合物。本發明之醫藥組成物可列舉含抗CD147抗體的醫藥組成物，以及含抗CD147抗體及至少一種之抗腫瘤治療劑的醫藥組成物，本發明之醫藥組成物，係作為具有所選擇的組成及必要純度的藥劑，而準備作為冷凍乾燥品或液體。含抗CD147抗體的醫藥組成物以及含抗CD147抗體及至少一種之抗癌劑治療劑的醫藥組成物亦可被成型為使用了如蔗糖的適當賦形劑之冷凍乾燥品。
本發明之醫藥組成物可調製成非經口投予用，亦可調製成經口的消化道吸收用。製劑之組成及濃度可依投予方法而決定。將本發明之抗體對人類投予之際，只要將約0.1~100mg/kg於1~180日間1次或複數次投予即可。然而，投予量、投予次數，一般而言，由於 應考慮患者之性別、體重、年齡、症狀、嚴重度、副作用等而決定，不限於上述之用量、用法。
就本發明之醫藥組成物之形態而言，可列舉包含點滴的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。投予路徑為經口路徑或非經口路徑，非經口路徑可列舉例如，靜脈內、動脈內、肌肉內、直腸內、經黏膜內、皮內等之路徑。
本發明之抗體或該抗體之抗原結合片段、含有此等之藥物複合體、含有此等之雙特異性抗體或含有此等之醫藥組成物，係可與用以選出被投予此等的患者之生物標記組合來提供。此等之抗體或醫藥組成物，係可與檢測生物標記的手段組合而作為套組提供，而抗體或醫藥組成物之提供及生物標記之提供亦可分別進行。藉由使用生物標記，而本發明之抗體或醫藥組成物可被投予至可期待本發明之抗體之效果為更高的患者群。
本發明係關於：一種預測對於癌症治療的反應性的方法，其包含使用源自癌患者的生物學的試料，測定該生物學的試料中所含的SMAD4之表現或KLF5之表現，將檢測出SMAD4的患者或檢測出KLF5之表現降低或缺失的患者，判定為對於利用本發明之抗體或該抗體之機能性片段或本發明之醫藥組成物之癌症治療有反應性；一種篩選癌症治療對象的方法，其包含使用源自癌患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中的SMAD4之表現或KLF5之表現，將檢測出SMAD4的患者或檢測出KLF5之表現降低或缺失的患者，篩選 來作為利用本發明之抗體或該抗體之機能性片段或本發明之醫藥組成物的癌症治療之對象者；一種癌症治療方法，其包含使用源自癌患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中所含的SMAD4之表現或KLF5之表現，對檢測出SMAD4的患者或檢測出KLF5之表現降低或缺失的患者，投予本發明之抗體或該抗體之機能性片段或本發明之醫藥組成物；或者，一種套組，其係用以判定對於利用本發明之抗體或該抗體之機能性片段或本發明之醫藥組成物之癌症治療的反應性之套組，其至少包含檢測源自癌患者的生物學的試料中之SMAD4的表現或KLF5的表現的手段。
於本說明書，「生物學的試料」係指自個體單離的組織、液體、細胞、及彼等之混合物，可列舉例如腫瘤生檢、髓液、胸腔內液、腹腔內液、淋巴液、皮膚切片、血液、尿、糞便、痰、呼吸器官、腸道、尿生殖器道、唾液、乳、消化器官、及自此等採取的細胞，但未限定於此等。「生物學的試料」較佳可例示包含癌細胞的試料，更佳可例示自切除或生檢獲得的組織或細胞、或源自胸腔內液或腹腔內液的細胞。進一步較佳的生物學的試料係包含癌細胞或癌組織的試料。
「SMAD4之表現」的檢出或測定係可使用所屬技術領域中具通常知識者周知之方法，實施SMAD4之基因體定序、基因表現或蛋白質表現，可列舉例如，RNA定序、微陣列、基因體定序、免疫分析。
「KLF5之表現」的檢出或測定係可使用所屬技術領域中具通常知識者周知之方法，檢測KLF5之基因體序列、基因表現或蛋白質表現，可列舉例如，IHC、RNA定序、微陣列、基因體定序、免疫分析。「KLF5之表現降低」係指，與對照(例如，健康者或同一患者之非癌組織的表現程度)之比較，較其之表現程度為低的。或者，可判定為對於利用本發明之抗體或醫藥組成物之癌症治療有反應性的KLF5表現之降低程度，係可由所屬技術領域中具通常知識者周知之方法及適當臨床試驗的實施而決定，例如，比較有獲得效果的患者及無獲得效果的患者中的KLF5之表現量，設定適當閾值。因此，「KLF5之表現降低」係指例如，較如此設定的閾值更低下。
[實施例]
以下藉由實施例而具體地說明本發明，但本發明並不限定於此等。又，此等亦未於任何意義被限定解釋。又，於下述實施例，有關基因操作之各操作只要未被特別明示，則依據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法及其他之所屬技術領域中具通常知識者所使用的實驗書記載之方法而進行，或於使用市售之試藥或套組的情形，按照市售品之說明書而進行。又，於本說明書，未特別記載之試藥、溶媒及起始材料係可自市售之供給源 容易地取得。於本實施例，人類胰臓株MIA PaCa-2係使用ATCC，Cat.CRL-1420，人類胰臓癌細胞株PANC-1係使用ATCC，Cat.CRL-1469。
(實施例1)利用細胞免疫之小鼠‧大鼠抗體之製作 1)-1 CD147表現載體之製作
使用Gateway LR Clonase使市售之人類CD147基因(BSG variant2/CD147v2)之選殖株IOH3378(Invitrogen公司)與哺乳類細胞用表現載體pcDNA-DEST40(Invitrogen公司)反應，製作人類CD147v2表現載體(pcDNA-DEST40-CD147v2)。
購入市售之人類CD147基因(BSG variant1/CD147v1)之哺乳類細胞用表現載體pCMV6-XL5-hBSGv1(Origene公司，Cat.SC303059)，作為人類CD147v1表現載體。
作為食蟹猴CD147表現載體，購入pCMV3-cynoBSG(Sino Biological Inc.，Cat.CG90636-UT)。
作為小鼠CD147v2表現載體，購入pCMV3-mBSGv2(Sino Biological Inc.，Cat.MG50332-UT)。
1)-2小鼠融合瘤之製作
使用4~6週齡之BALB/cAnNCrlCrlj小鼠(日本Charles River公司)。於第0日、第7日、第15日及第24日，以Versene(Thermo Fisher Scientific公司)剝離的5×106個之LNCaP細胞(ATCC，CRL-1740)懸浮於PBS並投予至背部皮下。第31日將相同細胞5×106個靜脈投 予，於同日採取脾臓並使用於融合瘤製作。將脾臓細胞及小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1細胞(ATCC，CRL-1597)，使用PEG4000(IBL公司)而細胞融合，製作融合瘤。融合瘤之單離、培養，係使用ClonaCell-HY MediumD(STEMCELL TECHNOLOGIES公司)、ClonaCell-HY MediumE(STEMCELL TECHNOLOGIES公司)。
1)-3大鼠融合瘤之製作
使用7週齡之WKY/Izm(日本SLC股份有限公司)。將1×107個人類胰臓癌細胞株PANC-1於臀部進行免疫並於13日後採取腸骨淋巴節細胞，用於融合瘤製作。使用LF301細胞融合裝置(BEX CO.,LTD.)，將大鼠脾臓細胞及小鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14細胞(ATCC，CRL-1581)作細胞融合，而製作融合瘤。融合瘤之單離、培養，係使用ClonaCell-HY MediumD(STEMCELL TECHNOLOGIES公司)、ClonaCell-HY MediumE(STEMCELL TECHNOLOGIES公司)。
1)-4利用ELISA之抗原鑑定
使用人類CD147Fc融合蛋白質(Sino Biological公司，Cat.10186-H02H)及小鼠CD147Fc融合蛋白質(Sino Biological公司，Cat.50332-M03H)。人類CD147Fc融合蛋白質及小鼠CD147Fc融合蛋白質係添加PBS緩衝液，於冰上溶解，調製成1μg/ml。將相同蛋白質溶解液添加 100μl於96井盤(NUNC公司，Cat.442404)，於4℃保存一晚，井以CD147Fc融合蛋白質塗覆。去除蛋白質溶解液，以含1%BSA(Research Organics公司，Cat.1334A)的PBS緩衝液，將井於4℃封阻2小時。以含0.05%Tween20(ATTO公司，Cat.WSE-7235)的PBS緩衝液將井洗淨3次後，將實施例1)-2、1)-3所調製的融合瘤培養上清液以PBS緩衝液稀釋20倍，添加於各井，並於室溫加熱1小時。以含0.05%Tween20(ATTO公司，Cat.WSE-7235)的PBS緩衝液將井洗淨3次後，添加100μl以含1%BSA的PBS緩衝液稀釋50000倍的anti-rat-Fab2-igG-HRP(Jackson ImmunoResearch公司，Cat.112-036-072)30分鐘，於室溫振盪。以含0.05%Tween20(ATTO公司，Cat.WSE-7235)的PBS緩衝液將井洗淨5次後，添加100μ1之HRP酵素顯色試藥(eBioscience公司，Super AquaBlue ELISA substrate，Cat.00-4203)，以10~20分鐘於室溫升溫，以平盤讀取器(Envision、PerkinElmer公司)測定405nm之吸光度。針對2~3井之吸光度之測定值，算出平均值，於無1次抗體的對照井中觀察到測定值之2倍以上之吸光度的抗體，判定為有結合性(+)，低於2倍者判定為無結合性(-)，並整理於表1。於LN22R8、2P1A6、2P3A9、2P3G8、2P8C12、2P10F2、2P2D7、2P2D10、2P1B7之培養上清液，確認人類CD147Fc融合蛋白質塗覆井特異的顯色。於LN24R7、2P5F5、2P6A2、2P3G8，確認編碼人類及小鼠CD147Fc融合蛋白質塗覆井有特異的顯色。
Figure 107125910-A0202-12-0083-365
1)-5單株抗體之調製及抗體同型之決定
以於實施例1)-4確認有抗人類CD147抗體產生的融合瘤，於可安定培養者，使用市售之Isotyping套組，決定培養上清液所含的抗體之同型並示於表2。使用CL-1000燒瓶(日本Becton．Dickinson股份有限公司)，培養此等之融合瘤，調製含有單株抗體的融合瘤培養上清液。
Figure 107125910-A0202-12-0084-366
1)-6單株抗體之純化
自實施例1)-5製作的培養上清液純化抗體。對於抗人類CD147小鼠單株抗體，以rProtein A親和性層析(4~6℃下)1階段步驟純化。rProtein A親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。首先將培養上清液施加於經PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製)所填充的管柱中。培養液全部置入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集含有抗體的級份。將該級份藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對HBSor(25mM Histidine/5% Sorbitol/pH6.0)的溶液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K， Sartorius公司，4℃下)濃縮，將IgG濃度調製成4.9mg/ml。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
對於抗人類CD147大鼠單株抗體，以Protein G親和性層析(4~6℃下)1階段步驟純化。Protein G親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。首先，將融合瘤之培養上清液施加於經PBS平衡化的ProteinG(GE Healthcare Bioscience公司)所填充的管柱中。培養上清液全部置入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)溶出，收集含有抗體的級份。於收集的級份中添加1M Tris-HCl(pH9.0)，調整為pH7.0~7.5後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF30K、Sartorius公司，4~6℃下)進行對HBSor(25mM Histidine/5% Sorbitol/pH6.0)之緩衝液取代同時進行濃縮，將抗體濃度調製為1mg/mL以上。最後以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
1)-7藉由活體內抗腫瘤活性測定的抗體篩選
將1×107個之人類胰臓株PANC-1以PBS懸浮，移植至NOD-scid小鼠(日本Charles River公司，NOD.CB17-Prkdc<scid>/J)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積分群，移植之27、34、41日後，將小鼠抗CD147抗體(LN22R8)、大鼠抗CD147抗體(2P1A6、2P1B7、2P3G8、2P2D10、2P8C12、2P10F2)以10mg/kg投予至負載癌小 鼠的腹腔內(n=6)。移植之27、34日後，將大鼠抗CD147抗體(2P2D6)以10mg/kg投予至担癌小鼠之腹腔內(n=6)。移植腫瘤之長徑及短徑，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)，於1週測量2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖1(a)~(c)。於圖中，對於腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。將2P2D6抗體、2P3G8抗體及2P2D10抗體之結果示於圖1(a)。為最終測定日的移植48日後的腫瘤增殖抑制率，係以10mg/kg投予組，各自為10%、45%及40%。將LN22R8抗體、2P1A6抗體及2P1B7抗體之結果示於圖1(b)。為最終測定日的移植48日後的腫瘤增殖抑制率，於10mg/kg投予組，各自為50%、26%及24%。將2P8C12抗體及2P10F2抗體之結果示於圖1(c)。為最終測定日的移植48日後的腫瘤增殖抑制率，於10mg/kg投予組，各自為-2%及62%。
1)-8 CD147抗體之種交叉性之解析
於CHO-K1細胞(ATCC、CCL-61)，使用Lipofectamine 2000(Thermofishers scientific公司，Cat.11668-019)，導入實施例1)-1所製作的pcDNA-DEST40-CD147v2、或pCMV3-cynoBSG，1日後，小鼠抗人類CD147抗體(LN22R8)、或大鼠抗人類CD147 抗體(2P1A6、2P1B7、2P3G8、2P2D10、2P8C12、2P10F2、2P2D6)，以10μg/ml處理，使用抗小鼠IgG-FITC(MP Biomedical公司，Cat.554936)或抗大鼠IgG-PE(BD Biosciences公司，Cat.550767)，可螢光檢測各抗體之對CD147表現CHO-K1細胞的結合。CHO-K1細胞之人類與食蟹猴CD147表現，藉由市售之抗CD147抗體(MEM-M6/1、Ab serotec公司，Cat.MCA28822)之結合而可螢光檢出。對於上述之細胞，實施流式細胞儀(CantoII、BD Bioscience公司)之測定，將結果整理於圖2-1~3。圖之縱軸表示細胞數，橫軸表示螢光訊號的強度。
市售之抗CD147抗體(MEM-M6/1)、小鼠抗人類CD147抗體(LN22R8)、大鼠抗CD147抗體(2P1A6、2P1B7、2P3G8、2P2D10、2P8C12、2P10F2、2P2D6)，任一者之抗CD147抗體皆顯示對人類CD147表現CHO-K1細胞的結合性(圖2-1~3)。
市售之抗CD147抗體(MEM-M6/1)雖於食蟹猴CD147表現CHO-K1細胞顯示結合性，但小鼠抗人類CD147抗體(LN22R8)、大鼠抗人類CD147抗體(2P1A6、2P1B7、2P3G8、2P2D10、2P8C12、2P10F2、2P2D6)，任一者之CD147抗體皆未對食蟹猴CD147表現CHO-K1細胞顯示結合性(圖2-1~3)。
又，任一者之抗CD147抗體皆未對小鼠CD147表現CHO-K1細胞顯示結合性(資料未記載)。
1)-9抗原決定位解析 抗原決定位解析用之人類CD147異體表現載體之製作
BLAST檢索(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)之結果，食蟹猴與人類之CD147之胺基酸序列係81%相同，假設有限的胺基酸不同對CD147抗體結合性之抗原決定位辨識有直接影響，使用部分移植於種間不同的胺基序列的變異體進行抗腫瘤抗原決定位的假設。將hCD147v1、v2共通包含的胺基酸序列作為對象，實施食蟹猴與人類之CD147的序列比較，分類為於種間不同胺基酸區域之9區域，設為mu1~mu9(圖3)。人工合成於CD147變異體表現載體製作及細胞膜上之表現確認用於N末端導入FLAG序列的人類CD147變異體2之cDNA序列，導入pcDNA3.1載體的質體，製作Signal-N-Flag-hCD147v2_pcDNA3.1(於Genscript公司製作)。再於相同質體之人類CD147基因，針對食蟹猴之CD147胺基酸序列mu1~mu9，作為藉由DNA取代的胺基酸取代變異所導入的人類-食蟹猴嵌合CD147表現載體9種，製作hCD147-mu1_pcDNA3.1、hCD147-mu2_pcDNA3.1、hCD147-mu3_pcDNA3.1、hCD147-mu4_pcDNA3.1、hCD147-mu5_pcDNA3.1、hCD147-mu6_pcDNA3.1、hCD147-mu7_pcDNA3.1、hCD147-mu8_pcDNA3.1、hCD147-mu9_pcDNA3.1(於Genscript公司製作)。
1)-10使用變異體的抗腫瘤抗原決定位(epitope)區域之特定
將人類CD147、食蟹猴CD147或人類-食蟹猴嵌合CD147表現載體9種之表現載體，使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scienftific公司，Cat.11668-019)導入CHO-K1細胞(ATCC、CCL-61)，1日後，以10μg/ml處理抗人類CD147小鼠抗體(LN22R8)、大鼠抗人類CD147抗體(2P1A6、2P1B7、2P3G8、2P2D10、2P8C12、2P10F2、2P2D6)，使用抗小鼠IgG-PE(DAKO公司，Cat.R480)、抗大鼠IgG-PE(BD公司，#550767)，調查抗CD147抗體之對CD147表現CHO-K1細胞的結合。CD147蛋白質之表現係使用市售之抗FLAG抗體(anti-Flag M2，SIGMA公司，Cat.F4049-.2MG)來確認。實施流式細胞儀(CantoII、BD Bioscience公司)之測定，將結果整理於表3。與1次抗體未處理之對照細胞比較，對於觀察到10倍以上之螢光訊號之增加的樣品，判定為結合陽性(+)。對於觀察到低於10倍之部分的螢光訊號之增加的樣品，判定為結合弱陽性(±)。與1次抗體未處理之對照細胞比較，對於未觀察到螢光訊號增加的樣品，判定為結合陰性(-)。
於實施例1)-7觀察到40%以上之抗腫瘤效果的抗體2P3G8、2P10F2、2P2D10、LN22R8之抗體係任一者皆喪失對具有mu3之變異的CD147的結合性。暗示抗腫瘤效果上重要的抗原決定位為m3區域。
Figure 107125910-A0202-12-0090-367
1)-11編碼LN22R8及2P10F2抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定 1)-11-1編碼LN22R8抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定 1)-11-1-1 LN22R8抗體生產融合瘤之總RNA之調製
為了增幅編碼LN22R8抗體之可變區域的cDNA，自LN22R8抗體產生融合瘤，使用TRIzol Reagent(Ambion公司)，調製總RNA。
1)-11-1-2利用5’-RACE PCR之編碼LN22R8抗體之輕鏈可變區域的cDNA之增幅及序列之決定
編碼輕鏈可變區域的cDNA之增幅係使用於實施例1)-11-1-1所調製的總RNA之約1μg及使用SMARTer RACE 5’/3’ Kit(Clontech公司)而實施。作為用以PCR增幅編碼LN22R8抗體之輕鏈基因的可變區域的cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE 5’/3’套組)、及自周知之小鼠輕鏈之恆定區域之序列所設計的引子。
將以5’-RACE PCR增幅的編碼輕鏈之可變區域的cDNA選殖於質體，其次實施編碼輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列之序列解析。
將經決定的編碼LN22R8抗體之輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號7，將胺基酸序列示於序列識別號8。將LN22R8抗體之輕鏈可變區域之CDRL1、CDRL2及CDRL3各自示於序列識別號11、12及13。
1)-11-1-3藉由5’-RACE PCR之編碼LN22R8抗體之重鏈可變區域的cDNA之增幅及序列之決定
編碼重鏈可變區域的cDNA之增幅係使用實施例1)-11-1-1所調製的總RNA之約1μg及SMARTer RACE 5’/3’ Kit(Clontech公司)而實施。作為用以PCR增幅編碼LN22R8抗體之重鏈基因的可變區域的cDNA之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE 5’/3’套組)、及自周知之小鼠重鏈之恆定區域之序列所設計的引子。
將以5’-RACE PCR增幅的編碼重鏈之可變區域的cDNA選殖至質體，接著實施編碼重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列之序列解析。
將經決定的編碼LN22R8抗體之重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號9，將胺基酸序列示於序列識別號10。將LN22R8抗體之重鏈可變區域之CDRH1、CDRH2及CDRH3各自示於序列識別號14、15及16。
1)-11-2編碼2P10F2抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定
以與實施例1)-11-1相同之方法實施。惟，作為以PCR增幅編碼輕鏈基因之可變區域的cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE 5’/3’套組)、及自周知之大鼠輕鏈之恆定區域之序列所設計的引子，作為以PCR增幅編碼重鏈基因之可變區域的 cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE 5’/3’套組)、及自周知之大鼠重鏈之恆定區域之序列所設計的引子。
將經決定的編碼2P10F2抗體之輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號17，將胺基酸序列示於序列識別號18。將2P10F2抗體之輕鏈可變區域之CDRL1、CDRL2及CDRL3，各自示於序列識別號21、22及23。將編碼重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號19，將胺基酸序列示於序列識別號20。將2P10F2抗體之重鏈可變區域之CDRH1、CDRH2及CDRH3，各自示於序列識別號24、25及26。
1)-12 LN22R8之人類嵌合抗體表現載體之製作 1)-12-1人類嵌合及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)以限制酵素XbaI及PmeI消化而獲得的約5.4kb之片段，及包含序列識別號27所示的編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區域的DNA序列的DNA片段加以結合，製作pcDNA3.3/LK。
藉由自pcDNA3.3/LK去除新黴素(neomycin)表現單元，構築pCMA-LK。
1)-12-2人類嵌合及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築
使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區域的DNA片段、及包含序列識別號28所示的編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區域之胺基酸的DNA序列的DNA片段加以結合，構築pCMA-G1。
1)-12-3人類嵌合及人類化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2之構築
使用序列識別號29所示的編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG2恆定區域之胺基酸的DNA序列的DNA片段，以與實施例1)-12-2同樣之方法，構築pCMA-G2。
1)-12-4人類嵌合LN22R8之輕鏈表現載體之構築
將實施例1)-11-1-2所獲得的編碼LN22R8之輕鏈之可變區域的cDNA作為模板，以於In-fusion選殖用所設計的引子，藉由進行PCR，將包含編碼輕鏈之可變區域的cDNA的DNA片段加以增幅。於pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷之處，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入增幅的DNA片段，而構築人類嵌合LN22R8之輕鏈表現載體。將人類嵌合LN22R8之輕鏈之核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列，各自示於序列識別號30及序列識別號31。
1)-12-5人類嵌合LN22R8之IgG1型重鏈表現載體之構築
將1)-11-1-3所獲得的編碼LN22R8重鏈之可變區域的cDNA作為模板，藉由以In-fusion選殖用所設計的引子進行PCR，增幅含有編碼重鏈之可變區域的cDNA的DNA片段。於將pCMA-G1以限制酵素BlpI切斷之處，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入增幅的DNA片段，構築人類嵌合LN22R8之IgG1型重鏈表現載體。將人類嵌合LN22R8之IgG1型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號32及序列識別號33。
1)-12-6人類嵌合LN22R8之IgG2型重鏈表現載體之構築
將實施例1)-11-1-3所獲得的編碼LN22R8重鏈之可變區域的cDNA作為模板，藉由以In-fusion選殖用所設計的引子進行PCR，將含有編碼重鏈之可變區域的cDNA的DNA片段增幅。於將pCMA-G2以限制酵素BlpI切斷之處，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入增幅的DNA片段，構築人類嵌合LN22R8之IgG2型重鏈表現載體。將人類嵌合LN22R8之IgG2型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號34及序列識別號35。
1)-12-7人類嵌合LN22R8之IgG4P型重鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號36所示的編碼人類嵌合LN22R8之IgG4P型重鏈之胺基酸序列的DNA序列的DNA片段(GENEART公司)。使用合成的DNA片段，以與實施例1)-12-2相同之方法，構築人類嵌合LN22R8之IgG4P型重鏈表現載體。將人類嵌合LN22R8之IgG4P型重鏈之胺基酸序列示於序列識別號37。
1)-13 2P10F2之人類嵌合抗體表現載體之製作 1)-13-1人類嵌合及人類化IgG1LALA型重鏈表現載體pCMA-G1LALA之構築
使用含有序列識別號38所示的編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1LALA恆定區域之胺基酸的DNA序列的DNA片段，以與實施例1)-12-2相同之方法，構築pCMA-G1LALA。
1)-13-2人類嵌合及人類化IgG4P型重鏈表現載體pCMA-G4P之構築
使用含有序列識別號39所示的編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG4P恆定區域之胺基酸的DNA序列的DNA片段，以與實施例1)-12-2相同之方法，構築pCMA-G4P。
1)-13-3人類嵌合2P10F2之輕鏈表現載體之構築
將實施例1)-11-2所獲得的編碼2P10F2之輕鏈之可變區域的cDNA作為模板使用，以與實施例1)-12-4相同之方法，構築人類嵌合2P10F2之輕鏈表現載體。將人類嵌合2P10F2之輕鏈之核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號40及序列識別號41。
1)-13-4人類嵌合2P10F2之IgG1LALA型重鏈表現載體之構築
將實施例1)-11-2所獲得的編碼2P10F2之重鏈之可變區域的cDNA作為模板使用，藉由以In-fusion選殖用所設計的引子進行PCR，增幅包含編碼重鏈之可變區域的cDNA的DNA片段。於將pCMA-G1LALA以限制酵素B1pI切斷之處，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入增幅的DNA片段，構築人類嵌合2P10F2之IgG1LALA型重鏈表現載體。將人類嵌合2P10F2之IgG1LALA型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號42及序列識別號43。
1)-13-5人類嵌合2P10F2之IgG2型重鏈表現載體之構築
將實施例1)-11-2所獲得的編碼2P10F2之重鏈之可變區域的cDNA作為模板使用，以與實施例1)-12-6相同之方法，構築人類嵌合2P10F2之IgG2型重鏈表現載體。將人類嵌合2P10F2之IgG2型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號44及序列識別號45。
1)-13-6人類嵌合2P10F2之IgG4P型重鏈表現載體之構築
將實施例1)-11-2所獲得的編碼2P10F2之重鏈之可變區域的cDNA作為模板使用，藉由以In-fusion選殖用所設計的引子進行PCR，增幅含有編碼重鏈之可變區域的cDNA的DNA片段。於將pCMA-G4P以限制酵素BlpI切斷之處，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入增幅的DNA片段，構築人類嵌合2P10F2之IgG4P型重鏈表現載體。將人類嵌合2P10F2之IgG4P型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號46及序列識別號47。
1)-14 LN22R8、2P10F2之人類嵌合抗體之生產及調製 1)-14-1 LN22R8、2P10F2之人類嵌合抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係依據手冊實施繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109個之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)稀釋而調製成2.0×106細胞/ml。於40ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中添加0.24mg之重鏈表現載體及0.36mg之輕鏈表現載體及1.8mg之聚伸乙亞胺(Polyscience#24765)並緩緩攪拌，再放置5分鐘後，添加於FreeStyle 293F細胞。於37℃、8%CO2培養箱中以 90rpm振盪培養4小時後，添加600ml之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18mL之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30mL之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，於37℃、8%CO2培養箱中，以90rpm振盪培養7日而獲得的培養上清液，以Disposable Capsule Filter(Advantec#CCS-045-E1H)過濾。
將人類嵌合LN22R8之IgG1型重鏈表現載體與人類嵌合LN22R8之輕鏈表現載體之組合而取得的LN22R8之人類嵌合抗體命名為「LN22R8chIgG1」。將人類嵌合LN22R8之IgG2型重鏈表現載體與人類嵌合LN22R8之輕鏈表現載體之組合而取得的LN22R8之人類嵌合抗體命名為「LN22R8chIgG2」。將人類嵌合LN22R8之IgG4P型重鏈表現載體與人類嵌合LN22R8之輕鏈表現載體之組合而取得的LN22R8之人類嵌合抗體命名為「LN22R8chIgG4P」。將人類嵌合2P10F2之IgG1LALA型重鏈表現載體與人類嵌合2P10F2之輕鏈表現載體之組合而取得的L2P10F2之人類嵌合抗體命名為「2P10F2chIgG1LALA」。將人類嵌合2P10F2之IgG2型重鏈表現載體與人類嵌合2P10F2之輕鏈表現載體之組合而取得的L2P10F2之人類嵌合抗體命名為「2P10F2chIgG2」。將人類嵌合2P10F2之IgG4P型重鏈表現載體與人類嵌合2P10F2之輕鏈表現載體之組合而取得的L2P10F2之人類嵌合抗體命名為「2P10F2chIgG4P」。
1)-14-2 LN22R8、2P10F2之人類嵌合抗體之純化
自實施例1)-14-1所獲得的培養上清液，以rProtein A親和性層析之1階段步驟純化抗體。將培養上清液供應至經PBS平衡化的填充有MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱清洗。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集包含抗體的級分。將該級分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)的緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製成1mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
1)-15人類嵌合抗體之ADCC活性
對於人類嵌合抗體之ADCC活性，使用人類之末梢血液單核球(PBMC)作為效應子細胞，使用人類胰臓株MIA PaCa-2作為ADCC標的細胞而評價。經放射線同位素51Cr標識的MIA PaCa-2細胞與小鼠抗體(LN22R8)、大鼠抗體(2P10F2)、或與人類嵌合抗體(LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2、LN22R8chIgG4P、2P10F2chIgG1LALA、2P10F2chIgG4P)，以0.5或5μg/ml之濃度，於4℃處理30分鐘後，將自人類之末梢血液分離的PBMC以MIA PaCa-2細胞之20倍的比率添加，於37度、5%CO2存在 下培養4小時。將上清液中放出的51Cr，使用TopCount NXT v2.53加以測定，獲得總釋放值。將經51Cr標識的MIA PaCa-2細胞以Triton-100處理而放出的51Cr之測定值設為最大釋放值，將自未添加PBMC的抗體處理細胞處理而釋放的51Cr之測定值設為自發釋放值，自下述之式，算出特異性釋放%，整理於圖6。作為陰性對照樣品，於將人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)處理的樣品，同樣地實施測定，合併呈示。測定係實施3份，算出平均值、標準偏差而合併呈示。
特異性釋放%=(總釋放-自發釋放)/最大釋放
相對於人類IgG(hIgG)與LN22R8之小鼠抗體未顯示ADCC活性，LN22R8chIgG1係於0.5μg/ml，為17.4%，於5μg/ml為18.1%，而顯示ADCC活性。LN22R8chIgG2、LN22R8chIgG4P之ADCC活性係較LN22R8chIgG1為低，即使於5μg/ml亦各自為3.0%、2.2%。
2P10F2大鼠抗體，於0.5μg/ml為4.8%，於5μg/ml為8.4%而顯示ADCC活性。2P10F2chIgG1LALA，於0.5μg/ml為4.7%，於5μg/ml為2.9%而顯示ADCC活性。2P10F2chIgG4P，於0.5μg/ml為3.4%，於5μg/ml為1.1%而顯示較2P10F2大鼠抗體、2P10F2chIgG1LALA為低的ADCC活性。如文獻(Bruggemann et al.,J.Exp.Med.,1351-1361,1987)報告，利用IgG1亞型的人類嵌合抗體顯示最高的ADCC活性。
1)-16人類嵌合抗體之CDC活性
使用作為標的細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2，評價抗人類CD147抗體所致的補體依賴性的殺細胞活性(CDC活性)。使用市售之兔補體(Low Tox-M Rabbit Complement、CEDARLANE LABORATORIES LIMITED、Cat.CL3051)作為補體。作為抗人類CD147抗體，使用小鼠抗體(LN22R8)、大鼠抗體(2P10F2)、或人類嵌合抗體(LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2、LN22R8chIgG4P、2P10F2chIgG1LALA、2P10F2chIgG4P)。使用人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)作為CDC活性陰性之對照抗體。將上述抗體以0、0.1、1或、10μg/ml之濃度，於4℃處理1小時後，添加兔補體成為終濃度7.5%，於37℃、5%CO2存在下，加溫3小時後，使用CellTiter-Glo Lumimescent Cell Viability Assay(Promega公司，Cat.G7572)測定含於活細胞的細胞內ATP。對於使用CellTiter-Glo Lumimescent Cell Viability Assay而獲得的發光訊號，使用EnVision 2104 Multilabel Reader(Perkin Elmer公司)加以定量。測定係實施3份，算出平均值及標準偏差。將自無處理之細胞獲得的發光訊號設為100%，將與抗體補體依賴性減少的發光訊號作為CDC活性，整理於圖7。
僅於小鼠抗體(LN22R8)、大鼠抗體(2P10F2)觀察到相對於陰性對照之hIgG為濃度依賴性的CDC活性，於LN22R8，於10μg/ml，活細胞降低至最大41.1%。於2P10F2，於10μg/ml，活細胞降低至最大53.5%。
於人類嵌合抗體(LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2、LN22R8chIgG4P、2P10F2chIgG1LALA、2P10F2chIgG4P)，未觀察到相對於陰性對照之hIgG為明確的CDC活性。
1)-17人類嵌合抗體之ADCP活性
已報告人類IgG抗體係藉由與小鼠之Fcγ受體的相互作用，誘導抗體依賴的單核球、巨噬細胞所致的吞噬作用(ADCP)，而顯示對癌細胞的殺細胞活性(Overdijk et al.,Journal of Immunology,1-9,2012)。對於人類嵌合抗體之ADCP活性，使用RAW264.7(ATCC，TIB-71)作為效應子細胞，使用人類胰臓株PANC-1或MIA PaCa-2作為ADCP標的細胞而評價。將經PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit for General Cell Membrane Labeling(SIGMA，Cat.MINI67-1KIT)標識的ADCP標的細胞及人類嵌合抗體(LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2、LN22R8chIgG4P)，於20μg/ml之濃度，4℃處理1小時後，經PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Lit for General Cell Membrane Labeling(SIGMA，Cat.PKH26GL-1KT)標識的RAW264.7細胞，添加ADCP標的細胞的5倍，於37℃、5% CO2存在下加溫3小時。使用流式細胞儀(BD公司，CantoII)，測定藉由吞噬作用而移行至PKH67訊號陽性的PKH26陽性細胞的比率。作為陰性對照樣品，對於處理人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)的樣品，同樣地實施測定。測定係實施3次，算出平均值、 標準偏差，將圖8(a)PANC-1之結果各自示於圖8(b)MIA PaCa-2之結果。
將PANC-1細胞作為ADCP之標的情形，LN22R8chIgG1為9.2%，LN22R8chIgG4P為9.0%，相對於人類IgG(5.5%)，顯示高的ADCP活性。LN22R8chIgG2為5.9%，ADCP活性陰性。
將MIA PaCa-2細胞作為ADCP之標的的情形，顯示同樣的傾向，LN22R8chIgG1為6.6%，LN22R8chIgG4P為6.1%，相對於人類IgG(3.6%)，顯示高的ADCP活性。LN22R8chIgG2為3.6%，ADCP活性陰性。
1)-18人類嵌合抗體之活體內抗腫瘤活性測定
將5×106細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含有50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至4~5週齡雌之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植之5~7日後實施分組，將抗人類CD147抗體LN22R8之小鼠抗體(LN22R8)、人類嵌合抗體3種(LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2、LN22R8chIgG4P)以1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將抗人類CD147抗體2P10F2之大鼠抗體(2P10F2)、人類嵌合抗體2種(2P10F2chIgG2，2P10F2chIgG4P)以10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5~6)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖9-1(a)~(d)、圖9-2(e)~(g)。於圖中對於腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
LN22R8、小鼠抗體、3種之人類嵌合抗體亦顯示用量依存的抗腫瘤效果。於人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P10mg/kg投予組，於移植後18日後，於5隻中5隻小鼠觀察到腫瘤的完全退縮，即使於實驗結束時之移植後41日後，亦未見腫瘤的再增殖。於其他之LN22R8抗體投予組，於一部分或全部的小鼠中觀察到腫瘤的再增殖。
於2P10F2、大鼠抗體、2種之人類嵌合抗體，確認抗腫瘤效果。於2P10F2chIgG4P 10mg/kg投予組，移植21日後於6隻中6隻小鼠觀察到腫瘤的完全退縮。
辨識相同抗原決定位部分的抗人類CD147抗體的小鼠抗體LN22R8與大鼠抗體2P10F2，不僅為具有依存於ADCC活性、ADCP、CDC活性等的小鼠免疫系統的效應子機能的人類嵌合抗體chIgG1或具有ADCP活性的人類嵌合抗體chIgG4P，由於即使幾乎未顯示任何效應子機能的人類嵌合抗體chIgG2亦有90%以上之抗腫瘤效果被保持，暗示不依存於小鼠之免疫，顯示藉由對CD147作用的新穎作用機序的抗腫瘤效果。
1)-19於NOG小鼠之CD147人類嵌合抗體之抗腫瘤效果
於NOG(NOD/Shi-scid，IL-2Rγnull)小鼠，於欠缺小鼠T細胞、B細胞的NOD-scid小鼠，藉由與為細胞介素 受體共通域的IL-2受體γ鏈剔除鼠交配，除了欠缺小鼠T、B細胞，亦使NK細胞、補體活性欠缺，可見巨噬細胞或樹狀細胞的機能降低，而為極重度的免疫不全狀態(Ito，Blood，3175-3182，2002)。於此等小鼠免疫系統之重度不全狀態，以MIA PaCa-2之皮下移植模型驗證CD147抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含有50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至7週齡雌性之NOG小鼠(NOD/Shi-scid，IL-2RγKO Jic、購自In-Vivo Science公司)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植之6日後實施分組，將抗CD147人類嵌合抗體(LN22R8chIgG4P)以10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖10。於圖中對於腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
於圖10所示的人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P之結果，移植17日後的腫瘤增殖抑制率係於10mg/kg投予組為99%，於5隻中3隻小鼠觀察到腫瘤的完全退縮。
抗CD147人類嵌合抗體(LN22R8chIgG4P)，由於對除了小鼠T、B細胞缺失，且NK細胞、補體活性亦缺失的NOG小鼠形成的胰臓癌腫瘤，顯示強的抗腫瘤效果， 暗示不依存於小鼠之免疫細胞而顯示抗腫瘤效果的可能性。
(實施例2)CD147蛋白之免疫所致的猴交叉性大鼠抗體之製作
顯示實施例1所獲得的強抗腫瘤效果的抗人類CD147抗體，對小鼠、大鼠、食蟹猴之CD147未顯示交叉性。使用實施例1所獲得的抗體試圖取得顯示食蟹猴CD147交叉性的CD147抗體。
2)-1免疫
於免疫，使用WKY/Izm雌性大鼠(日本SLC公司)。採取Recombinant Human BSG，His tagged(CREATIVE BIOMART公司製)抗原蛋白與弗氏完全佐劑(Freund‘s Comple te Adjuvant)(和光純藥公司製)混合者投予至尾根部的大鼠之淋巴節及脾臓而用於融合瘤製作。
2)-2融合瘤之製作
使用LF301 Cell Fusion Unit(BEX公司)，將淋巴節細胞或脾臓細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC，No.CRL-1581)進行電氣細胞融合，稀釋於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司)而培養。藉由回收出現的融合瘤群落，製作單株融合瘤。培養經回收的各融合瘤群落，使用獲得的融合瘤培養上清液，進行抗CD147抗體產生融合瘤的篩選。
2)-3利用流式細胞術法之抗體篩選
為了選擇與人類癌細胞結合，且顯示對人類CD147、食蟹猴CD147之結合性的抗體產生融合瘤，實施使用流式細胞儀的抗體結合性篩選。使用CD147陽性之人類胰臓株MIA PaCa-2作為人類癌細胞。與實施例1)-8同樣地，將表現人類、或食蟹猴之CD147的CHO-K1細胞(CHO-K1-hCD147v2、CHO-K1-cynoCD147)用於對人類、或食蟹猴CD147之結合性確認。等量添加融合瘤培養上清液至MIA PaCa-2、CHO-K1-hCD147v2、CHO-K1-cynoCD147之懸浮液中，於4℃使反應1小時以上後，以含5%FBS的PBS將細胞洗淨，使用抗大鼠IgG-PE(BD Biosciences公司，Cat.550767)，各抗體之對細胞的結合成為可螢光檢測。使用流式細胞儀(CantoII、BD Bioscience公司)，實施細胞螢光之訊號的測定，算出相對於陰性對照樣品(未添加融合瘤培養液的細胞)的螢光訊號的比，將結果之一部分整理於表2。
使用市售之大鼠抗體Isotyping套組(Bio-Rad Laboratories公司，RMT1)，決定並合併培養上清液所含抗體之同型(Isotype)，示於表4。
於實施例1取得的2P10F2顯示對MIA PaCa-2、CHO-K1-hCD147v2的結合性，於CHO-K1-cynoCD147未顯示結合性。rat_CD147_#84(本說明書中，亦有標示為r#84的情形)、rat_CD147_#131(本說明書中，亦有標示為r#131的情形)、rat_CD147_#110(本說明書中，亦有標示為r#110的情形)、rat_CD147_#101(本說明書中，亦有 標示為r#101的情形)，顯示對MIA PaCa-2、CHO-K1-hCD147v2、CHO-K1-cynoCD147的結合性，可取得顯示食蟹猴交叉性的抗人類CD147大鼠抗體。
Figure 107125910-A0202-12-0109-368
2)-4使用低IgG血清的大鼠單株抗體之調製
顯示食蟹猴交叉性的抗人類CD147單株抗體係純化自融合瘤培養上清液。首先，以ClonaCell-HY Selection Med ium E使rat_CD147_#131之抗體產生融合瘤增殖至充分量後，與添加20%之Ultra Low IgG FBS(Life Technologies公司)的Hybridoma SFM(Life Technologies公司)作培養基交換，培養7日。回收本培養上清液，通過0.45μm之過濾器滅菌。
2)-5高密度培養所致的大鼠單株抗體之調製
使用CL-1000燒瓶(日本Becton.Dickinson股份有限公司)，培養rat_CD147_#84、rat_CD147_#101、rat_CD147_#110融合瘤，調製含有單株抗體的融合瘤培養上清液。
2)-6單株抗體之純化
自實施例2)-4及實施例2)-5所製作的培養上清液，以與實施例1)-6同樣的方法，純化抗體。
2)-7活體內抗腫瘤活性測定所致的抗體篩選
5×106個細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含有50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植之6~8日後實施分組，將食蟹猴交叉性抗CD147大鼠抗體#84、#101或#110，移植後於8日後、15日後，以10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。於對照組的小鼠中，同樣地將PBS投予至腹腔內。移植食蟹猴交叉性抗CD147大鼠抗體#131後，6日後以10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖11(a)~(d)。於圖中，對於腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。r#84，移植28日後的腫瘤增殖抑制率，於10mg/kg投予組為95%(圖11(a))。r#101，移植15日後的腫瘤增殖抑制率，於10mg/kg投予組為37%，但移植28日後可見腫瘤的再增 殖(圖11(b))。r#110，移植15日後的腫瘤增殖抑制率於10mg/kg投予組為51%，移植28日後可見腫瘤之再增殖(圖11(c))。r#131，移植16日後的腫瘤增殖抑制率，於10mg/kg投予組為50%(圖11(d))。獲得強烈抑制MIA PaCa-2之腫瘤增殖的大鼠抗體、r#84，部分抑制的r#101、r#110、r#131。
將結果示於圖11(a)~(d)。於圖中對於腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。r#84，移植28日後的腫瘤增殖抑制率於10mg/kg投予組為95%(圖11(a))。r#101，移植15日後的腫瘤增殖抑制率於10mg/kg投予組為37%，於移植28日後可見腫瘤之再增殖(圖11(b))。r#110，移植15日後的腫瘤增殖抑制率為10mg/kg投予組為51%，移植28日後可見腫瘤之再增殖(圖11(c))。r#131，移植16日後的腫瘤增殖抑制率於10mg/kg投予組為50%(圖11(d))。
2)-8抗原決定位解析：2P10F2-競爭性ELISA
以猴交叉性大鼠CD147抗體之抗原決定位解析為目的，藉由競爭性ELISA調查2P10F2chIgG4P之對CD147重組蛋白質的結合性。將人類CD147-Fc融合蛋白質(Sino Biological Inc.，10186-H02H)以PBS溶解，調製為20μg/ml，添加50μl於96井盤(Thermofisher公司，Cat.43454)並於4℃保管。去除蛋白溶液，添加300μl之含有1%BSA的PBS，於室溫加熱1小時。於96井盤添加以含有1%BSA的PBS稀釋的25μl之20或60μg/ml 之CD147大鼠抗體r#84、r#101、r#110、r#131或2P10F2、或含有1%BSA的PBS作為競爭抗體，添加於96井盤，於室溫加溫2小時。添加25μl以含有1%BSA的PBS稀釋的20ng/ml之2P10F2chIgG4P於96井盤，於室溫加溫2小時。以含0.05% Tween 20(BIO RAD，Cat.170-6531)的PBS洗淨96井2次。添加50μl之以含有1%BSA的PBS稀釋2000倍的Mouse monoclonal HP6025 Anti-Human IgG4 Fc(HRP)(Abcam公司，Cat.ab99823)於96井盤，於室溫加溫1小時。以含有0.05% Tween 20(BIO RAD，Cat.170-6531)的PBS洗淨96井3次。將50μl之Super AquaBlue ELISA Substrate(eBioscience公司，00-4203-58)添加於96井盤，於室溫加溫20分鐘。以EnVision 2104 Multilabel Reader(Perkin Elmer公司)，測定96井盤之405nm之吸光度。將於不含競爭抗體的井的測定值作為對照，將藉由競合抗體而降低的吸光度以%算出，示於圖12。測定係於3井實施，表示平均值。
r#84、r#101、r#131係與2P10F2大鼠抗體同樣地，90%以上抑制2P10F2chIgG4P之結合性，暗示抗體辨識部位近似2P10F2。r#110未抑制2P10F2大鼠抗體之結合。因抗體認識部位與2P10F2分離、或結合性弱，認為有無法抑制2P10F2大鼠抗體之結合的可能性。
(實施例3)猴交叉性大鼠抗體之選殖及人類嵌合抗體之製作 3)-1編碼大鼠抗CD147抗體之可變區域的cDNA之選殖核苷酸序列之決定 3)-1-1編碼rat_CD147_#84抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定
以與實施例1)-11-2同樣的方法實施。將決定的編碼rat_CD147_#84抗體之輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號48，將胺基酸序列示於序列識別號49。將編碼重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號50，將胺基酸序列示於序列識別號51。將rat_CD147_#84抗體之輕鏈可變區域之CDRL1、CDRL2及CDRL3各自示於序列識別號52、53及54。將rat_CD147_#84抗體之重鏈可變區域之CDRH1、CDRH2及CDRH3各自示於序列識別號55、56及57。
3)-1-2編碼rat_CD147_#101抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定
以與實施例1)-11-2同樣的方法實施。將編碼經決定的rat_CD147_#101抗體之輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號58，將胺基酸序列示於序列識別號59。將編碼重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號60，將胺基酸序列示於序列識別號61。將rat_CD147_#101抗體之輕鏈可變區域之CDRL1、CDRL2及CDRL3各自示於序列識別號62、63及64。將rat_CD147_#101抗體之重鏈可變區域之CDRH1、CDRH2及CDRH3各自示於序列識別號65、66及67。
3)-1-3編碼rat_CD147_#110抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定
以與實施例1)-11-2同樣的方法實施。將編碼經決定的rat_CD147_#110抗體之輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號68，將胺基酸序列示於序列識別號69。將編碼重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號70，將胺基酸序列示於序列識別號71。將rat_CD147_#110抗體之輕鏈可變區域之CDRL1、CDRL2及CDRL3各自示於序列識別號72、73及74。將rat_CD147_#110抗體之重鏈可變區域之CDRH1、CDRH2及CDRH3各自示於序列識別號75、76及77。
3)-1-4編碼rat_CD147_#131抗體之可變區域的cDNA之核苷酸序列之決定
以與實施例1)-11-2同樣的方法實施。將編碼經決定的rat_CD147_#131抗體之輕鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號78，將胺基酸序列示於序列識別號79。將編碼重鏈之可變區域的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號80，將胺基酸序列示於序列識別號81。將rat_CD147_#131抗體之輕鏈可變區域之CDRL1、CDRL2及CDRL3各自示於序列識別號82、83及84。將rat_CD147_#131抗體之重鏈可變區域之CDRH1、CDRH2及CDRH3各自示於序列識別號85、86及87。
3)-2人類嵌合抗體表現載體之製作 3)-2-1 rat_CD147_#84之人類嵌合抗體表現載體之製作 3)-2-1-1人類嵌合及人類化IgG4PFALA型重鏈表現載體pCMA-G4PFALA之構築
使用序列識別號88所示的包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG4PFALA恆定區域之胺基酸的DNA序列的DNA片段，以與實施例1)-12-2同樣的方法，構築pCMA-G4PFALA。
3)-2-1-2人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體之構築
將實施例3)-1-1所獲得的編碼rat_CD147_#84之輕鏈之可變區域的cDNA作為模板而使用，以與實施例1)-12-4同樣之方法構築人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈之核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號89及序列識別號90。
3)-2-1-3人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-1所獲得的編碼rat_CD147_#84之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-5同樣的方法構築人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號91及序列識別號92。
3)-2-1-4人類嵌合rat_CD147_#84之IgG2型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-1所獲得的編碼rat_CD147_#84之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-6同樣的方法，構築人類嵌合rat_CD147_#84之IgG2型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#84之IgG2型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號93及序列識別號94。
3)-2-1-5人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4P型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-1所獲得的編碼rat_CD147_#84之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-13-6同樣的方法，構築人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4P型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4P型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號95及序列識別號96。
3)-2-1-6人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1LALA型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-1所獲得的編碼rat_CD147_#84之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-13-4同樣的方法，構築人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1LALA型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#84之 IgG1LALA型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號97及序列識別號98。
3)-2-1-7人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4PFALA型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-1所獲得的編碼rat_CD147_#84之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，藉由以In-fusion選殖用所設計的引子進行PCR，增幅包含編碼重鏈之可變區域的cDNA的DNA片段。於將pCMA-G4PFALA以限制酵素B1pI切斷之處，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入增幅的DNA片段，構築人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4PFALA型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4PFALA型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號99及序列識別號100。
3)-2-2 rat_CD147_#101之人類嵌合抗體表現載體之製作 3)-2-2-1人類嵌合rat_CD147_#101之輕鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-2所獲得的編碼rat_CD147_#101之輕鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-4同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#101之輕鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#101之輕鏈之核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號101及序列識別號102。
3)-2-2-2人類嵌合rat_CD147_#101之IgG2型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-2所獲得的編碼rat_CD147_#101之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-6同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#101之IgG2型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#101之IgG2型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號103及序列識別號104。
3)-2-2-3人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4P型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-2所獲得的編碼rat_CD147_#101之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-13-6同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4P型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4P型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號105及序列識別號106。
3)-2-2-4人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4PFALA型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-2所獲得的編碼rat_CD147_#101之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例3)-2-1-7同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4PFALA型重鏈表現載體。將人類嵌合 rat_CD147_#101之IgG4PFALA型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號107及序列識別號108。
3)-2-3 rat_CD147_#110之人類嵌合抗體表現載體之製作 3)-2-3-1人類嵌合rat_CD147_#110之輕鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-3所獲得的編碼rat_CD147_#110之輕鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-4同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#110之輕鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#110之輕鏈之核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號109及序列識別號110。
3)-2-3-2人類嵌合rat_CD147_#110之IgG2型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-3所獲得的編碼rat_CD147_#110之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-6同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#110之IgG2型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#110之IgG2型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號111及序列識別號112。
3)-2-3-3人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4P型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-3所獲得的編碼rat_CD147_#110之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-13-6同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4P型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4P型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號113及序列識別號114。
3)-2-3-4人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4PFALA型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-3所獲得的編碼rat_CD147_#110之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例3)-2-1-7同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4PFALA型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4PFALA型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號115及序列識別號116。
3)-2-4 rat_CD147_#131之人類嵌合抗體表現載體之製作 3)-2-4-1人類嵌合rat_CD147_#131之輕鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-4所獲得的編碼rat_CD147_#131之輕鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-4同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#131之輕鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#131之輕鏈之核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列，各自示於序列識別號117及序列識別號118。
3)-2-4-2人類嵌合rat_CD147_#131之IgG2型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-4所獲得的編碼rat_CD147_#131之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-12-6同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#131之IgG2型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#131之IgG2型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號119及序列識別號120。
3)-2-4-3人類嵌合rat_CD147_#131之IgG4P型重鏈表現載體之構築
使用實施例3)-1-4所獲得的編碼rat_CD147_#131之重鏈之可變區域的cDNA作為模板，以與實施例1)-13-6同樣之方法，構築人類嵌合rat_CD147_#131之IgG4P型重鏈表現載體。將人類嵌合rat_CD147_#131之IgG4P型重鏈之核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列識別號121及序列識別號122。
3)-3人類嵌合抗體之調製 3)-3-1猴交叉性大鼠抗體之人類嵌合抗體之生產
以與實施例1)-14-1同樣之方法生產。
將以人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#84之人類嵌合抗體命名為 「#84chIgG1」。將以人類嵌合rat_CD147_#84之IgG2型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#84之人類嵌合抗體命名為「#84chIgG2」。將人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4P型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#84之人類嵌合抗體命名為「#84chIgG4P」。將以人類嵌合rat_CD147_#84之IgG1LALA型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#84之人類嵌合抗體命名為「#84chIgG1LALA」。將以人類嵌合rat_CD147_#84之IgG4PFALA型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#84之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#84之人類嵌合抗體命名為「#84chIgG4PFALA」。
將以人類嵌合rat_CD147_#101之IgG2型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#101之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#101之人類嵌合抗體命名為「#101chIgG2」。將人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4P型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#101之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#101之人類嵌合抗體命名為「#101chIgG4P」。人類嵌合rat_CD147_#101之IgG4PFALA型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#101之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#101之人類嵌合抗體命名為「#101chIgG4PFALA」。
將以人類嵌合rat_CD147_#110之IgG2型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#110之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#110之人類嵌合抗體命名為「#110chIgG2」。將人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4P型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#110之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#110之人類嵌合抗體命名為「#110chIgG4P」。將以人類嵌合rat_CD147_#110之IgG4PFALA型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#110之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#110之人類嵌合抗體命名為「#110chIgG4PFALA」。
將以人類嵌合rat_CD147_#131之IgG2型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#131之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#131之人類嵌合抗體命名為「#131chIgG2」。將人類嵌合rat_CD147_#131之IgG4P型重鏈表現載體與人類嵌合rat_CD147_#131之輕鏈表現載體之組合而取得的rat_CD147_#131之人類嵌合抗體命名為「#131chIgG4P」。
3)-3-2猴交叉性大鼠抗體之人類嵌合抗體之純化
自實施例3)-3-1所獲得的培養上清液，以與實施例1)-14-2同樣之方法純化。
(實施例4)人類嵌合抗體之活體內抗腫瘤活性
將5×106個細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至5~6週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植之5~6日後實施分組，將食蟹猴交叉性抗CD147人類嵌合抗體(#84chIgG1、#84chIgG1LALA、#84chIgG2、#84chIgG4P、#84chIgG4PFALA)於分組後當日，以1、3、或10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將食蟹猴交叉性抗CD147人類嵌合抗體(#101chIgG2、#101chIgG4P、#101chIgG4PFALA、#110chIgG2、#110chIgG4P、#110chIgG4PFALA、#131chIgG2、#131chIgG4P)於分組後當日，以3、或10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖13-1(a)~(d)、圖13-2(e)~(h)、圖13-3(i)~(l)、圖13-4(m)及(n)。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
人類嵌合抗體#84係任一IgG亞型皆顯示用量依存的抗腫瘤效果。於確認有最強的抗腫瘤效果的#84chIgG4P 10mg/kg投予組，於移植20日後，於5例中5例之小鼠中確認腫瘤完全退縮。
人類嵌合抗體#101係任一IgG亞型皆顯示用量依存的抗腫瘤效果。於確認有最強的抗腫瘤效果的101chIgG4P 10mg/kg投予組，於移植20日後5例中4例之小鼠確認腫瘤完全退縮。
人類嵌合抗體#110係任一IgG亞型皆顯示用量依存的抗腫瘤效果。於確認有最強的抗腫瘤效果的110chIgG4P 10mg/kg投予組，移植22日後於5例中3例之小鼠中確認腫瘤完全退縮。
人類嵌合抗體#131係於IgG4P亞型顯示用量依存的抗腫瘤效果。於#131chIgG2，於3mg/kg、10mg/kg投予組中觀察到的抗腫瘤效果並無差異。
任一人類嵌合抗體皆不依存於抗體之人類IgG亞型，於10mg/kg之投予量，顯示68~100%之腫瘤增殖抑制效果。對於食蟹猴交叉性抗人類CD147人類嵌合抗體#084、#101、#110、#131，亦與自細胞免疫取得的抗人類CD147抗體、LN22R8或2P10F2同樣地，不依存於小鼠之免疫系統，暗示藉由作用於CD147的新穎之作用機序而顯示抗腫瘤效果。
(實施例5)人類嵌合抗體之CD147結合性評價
對實施例3)-3-1所製作的#84chIgG1、#84chIgG2、#84chIgG4P、#84chIgG1LALA、#84chIgG4PFALA、#101chIgG4P、#110chIgG4P之人類CD147的解離常數測定係使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司製)，將使用Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare Bioscience公司製)而固定化的抗-人類IgG(Fc)抗體將抗體作為配位體而捕捉(capture)，進行將抗原作為分析物而測定的捕捉法。作為運行(running)緩衝液，使用HBS-EP+(GE Healthcare Bioscience公司製)、作為感應器晶片，使用CM5(GE Healthcare Bioscience公司製)。晶片上以以10μL/分鐘添加1μg/mL或2μg/mL之人類嵌合抗體60秒鐘後，將作為抗原之CD147蛋白質之稀釋系列溶液(對#131chIgG4P為0.25~4μg/mL，對#84chIgG1、#84chIgG2、#84chIgG4P、#84chIgG1LALA、#84chIgG4PFALA、#101chIgG4P、#110chIgG4P為0.5~8μg/mL)以流速30μL/分鐘添加120秒鐘，接著，偵測120秒、300秒或600秒之解離相。其中，CD147蛋白質係使用使於大腸菌中表現，以Ni affinity，SEC之2步驟純化後，標籤切斷純化者。作為再生溶液，以流速20μL/分鐘添加3M氯化鎂(GE Healthcare Bioscience公司製)30秒鐘。於資料之解析，使用1：1結合模型，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。將結果示於表5。
Figure 107125910-A0202-12-0126-369
(實施例6)人類化抗體之製作 6)-1人類化抗體之設計 6)-1-1可變區域之分子模擬(molecular modeling)
作為同源性模擬，利用周知之方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))。使用市售之蛋白質立體構造解析程式Discovery Studio(Dassault Systèmes公司製)，檢索登錄於對於可變區域具有高序列同一性的蛋白質資料庫(Nuc.Acids Res.35，D301-D303(2007))的構造。將鎖定的重鏈、輕鏈及重鏈輕鏈介面構造作為模板，作成三維模型。
6)-1-2人類化抗體之設計方法
藉由CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而人類化。rat_CD147_#84之框架區域，與於KABAT等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))中已確定的人類kappa鏈亞群1之一致(consensus)序列、及人類gamma鏈亞群3之一致序列具有高相同性，因而彼等各自被選擇作為rat_CD147_#84之輕鏈及重鏈之接受者。rat_CD147_#101之框架區域係於KABAT et al.中已確定的人類kappa鏈亞群1之一致序列、及人類gamma鏈亞群及於IMGT(THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM®)規定的 人類gamma鏈之IGHV3-30＊05與IGHJ3＊01，因具有高相同性，各自被選擇作為rat_CD147_#101之輕鏈及重鏈之接受者。rat_CD147_#110之框架區域，係於IMGT規定的人類kappa鏈之IGKV1-39＊01與IGKJ4＊01與、於人類gamma鏈之IGHV1-2＊02與IGHJ6＊01，具有高相同性，因而彼等各自被選擇作為rat_CD147_#110之輕鏈及重鏈之接受者。rat_CD147_#131之框架區域，於IMGT所規定的人類kappa鏈之IGKV1-39＊01及IGKJ2＊01、及於人類gamma鏈之IGHV3-30＊05及IGHJ6＊01，具有高相同性，因而各自選擇作為rat_CD147_#131之輕鏈及重鏈之接受者。應移入至接受者上的供予體殘基係參考由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))給予的基準等，藉由分析三維模型而選擇。
6)-1-3 rat_CD147_#84重鏈之人類化
對於rat_CD147_#84重鏈之可變區域，藉由將圖14(a)所示的接受者的胺基酸殘基，設計人類化抗體重鏈#84H1h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之IgG2及IgG4P之gamma鏈恆定區域的人類化抗體重鏈被設計，並各自命名為#84H1hIgG2、#84H1hIgG4P。將#84H1hIgG2之全長胺基酸序列記載於序列識別號123。將編碼序列識別號123之胺基酸序列的核苷酸序列示於序列識別號124。將#84H1hIgG4P之全長胺基酸序列記載於序列識別 號125。將編碼序列識別號125之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號126。
6)-1-4 rat_CD147_#84輕鏈之人類化
對於rat_CD147_#84輕鏈之可變區域，藉由移入圖14(b)所示的接受者的胺基酸殘基，設計人類化抗體輕鏈#84L2h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之κ鏈恆定區域的人類化抗體輕鏈被設計，並命名為#84L2h。將#84L2h之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號127。將編碼序列識別號127之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號128。
6)-1-5 #84人類化抗體
組合由上述設計的重鏈#84H1hIgG2及輕鏈#84L2h，設計人類化抗體#84H1L2hIgG2。又，組合重鏈#84H1hIgG4P及輕鏈#84L2h，設計人類化抗體#84H1L2hIgG4P。
6)-1-6 rat_CD147_#101重鏈之人類化
對於rat_CD147_#101重鏈之可變區域，藉由移入圖15(a)所示的接受者之胺基酸殘基，設計人類化抗體重鏈#101H1h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之IgG2及IgG4P之gamma鏈恆定區域的人類化抗體重鏈被設計，各自命 名為#101H1hIgG2、#101H1hIgG4P。將#101H1hIgG2之全長胺基酸序列示於序列識別號129。將編碼序列識別號129之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號130。將#101H1hIgG4P之全長胺基酸序列記載於序列識別號131。將編碼序列識別號131之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號132。
6)-1-7 rat_CD147_#101輕鏈之人類化
對rat_CD147_#101輕鏈之可變區域，藉由移入圖15(b)所示的接受者之胺基酸殘基，設計人類化抗體輕鏈#101L2h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之κ鏈恆定區域的人類化抗體輕鏈被設計，且命名為#101L2h。將#101L2h之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號133。將編碼序列識別號133之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號134。
6)-1-8 #101人類化抗體
組合由上述設計的重鏈#101H1hIgG2及輕鏈#101L2h，而設計人類化抗體#101H1L2hIgG2。又，組合重鏈#101H1hIgG4P及輕鏈#101L2h，而設計人類化抗體#101H1L2hIgG4P。
6)-1-9 rat_CD147_#110重鏈之人類化
對rat_CD147_#110重鏈之可變區域，藉由移入圖16(a)、(b)所示的接受者之胺基酸殘基，設計人類化抗體重鏈#110H1h、#110H13h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續IgG4P之gamma鏈恆定區域的人類化抗體重鏈被設計，且各自命名為#110H1hIgG4P、#110H13hIgG4P。將#110H1hIgG4P之全長胺基酸序列記載於序列識別號135，將#110H13hIgG4P之全長胺基酸序列記載於序列識別號147。將編碼序列識別號135之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號136，將編碼序列識別號147之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號148。
6)-1-10 rat_CD147_#110輕鏈之人類化
對rat_CD147_#110輕鏈之可變區域，藉由移入圖16(c)、(d)、(e)所示的接受者之胺基酸殘基，設計人類化抗體輕鏈#110L4h、#110L2h、#110L12h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之κ鏈恆定區域的人類化抗體輕鏈被設計，並各自命名為#110L4h、#110L2h、#110L12h。將#110L4h之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號137，將#110L2h之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號149，將#110L12h之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號151。將編碼序列識別號137之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號138，將編碼序列識別號149之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號150，將編碼序列識別號151之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號152。
6)-1-11 #110人類化抗體
組合由上述所設計的重鏈#110H1hIgG4P及輕鏈#110L4h，而設計人類化抗體#110H1L4hIgG4P。又，組合重鏈#110H13hIgG4P與輕鏈#110L2h，設計人類化抗體#110H13L2hIgG4P，組合重鏈#110H13hIgG4P及輕鏈#110L12h，設計人類化抗體#110H13L12hIgG4P。
6)-1-12 rat_CD147_#131重鏈之人類化
對rat_CD147_#131重鏈之可變區域，藉由移入圖17(a)所示的接受者之胺基酸殘基，設計人類化抗體重鏈#131H2h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之IgG2之gamma鏈恆定區域的人類化抗體重鏈被設計，命名為#131H2hIgG2。將#131H2hIgG2之全長胺基酸序列記載於序列識別號139。將編碼序列識別號139之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號140。
6)-1-13 rat_CD147_#131輕鏈之人類化
對rat_CD147_#131輕鏈之可變區域，藉由移入圖17(b)所示的接受者之胺基酸殘基，設計人類化抗體輕鏈#131L2h之可變區域。
於設計的可變區域，使接續人類之κ鏈之恆定區域的人類化抗體輕鏈被設計，且命名為#131L2h。將#131L2h之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號141。將編碼 序列識別號141之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號142。
6)-1-14 #131人類化抗體
組合由上述所設計的重鏈#131H2hIgG2及輕鏈#131L2h，設計人類化抗體#131H2L2hIgG2。
6)-2人類化抗體之輕鏈表現載體之構築 6)-2-1 #84L2h表現載體之構築
合成序列識別號128所示的#84L2h之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由於將pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷處插入合成的DNA片段，構築#84L2h表現載體。
6)-2-2 #101L2h表現載體之構築
合成序列識別號134所示的#101L2h之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-2-1同樣之方法，構築#101L2h表現載體。
6)-2-3 #110L4h、#110L2h及#110L12h表現載體之構築
合成序列識別號138、序列識別號150及序列識別號152所示的#110L4h、#110L2h及#110L12h之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART 公司)。藉由以與實施例6)-2-1同樣之方法，構築#110L4h、#110L2h及#110L12h表現載體。
6)-2-4 #131L2h表現載體之構築
合成序列識別號142所示的#131L2h之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-2-1同樣之方法，構築#131L2h表現載體。
6)-3人類化抗體之重鏈表現載體之構築 6)-3-1 #84H1hIgG2表現載體之構築
合成序列識別號124所示的#84H1hIgG2之核苷酸序列之核苷酸編號36至437所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由於將pCMA-G2以限制酵素B1pI切斷處插入合成的DNA片段，構築#84H1hIgG2表現載體。
6)-3-2 #84H1hIgG4P表現載體之構築
合成序列識別號126所示的#84H1hIgG4P之核苷酸序列之核苷酸編號36至437所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由於將pCMA-G4P以限制酵素B1pI切斷處插入合成的DNA片段，構築#84H1hIgG4P表現載體。
6)-3-3 #101H1hIgG2表現載體之構築
合成序列識別號130所示的101H1hIgG2之核苷酸序列之核苷酸編號36至428所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-1同樣之方法，構築#101H1hIgG2表現載體。
6)-3-4 #101H1hIgG4P表現載體之構築
合成序列識別號132所示的101H1hIgG4P之核苷酸序列之核苷酸編號36至428所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-2同樣之方法，構築#101H1hIgG4P表現載體。
6)-3-5 #110H1hIgG4P及#110H13hIgG4P表現載體之構築
合成序列識別號136及序列識別號148所示的110H1hIgG4P及#110H13hIgG4P之核苷酸序列之核苷酸編號36至425所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-2同樣之方法，構築#110H1hIgG4P及#110H13hIgG4P表現載體。
6)-3-6 #131H2hIgG2表現載體之構築
合成序列識別號140所示的131H2hIgG2之核苷酸序列之核苷酸編號36至431所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-1同樣之方法，構築#131H2hIgG2表現載體。
6)-4人類化抗體之調製 6)-4-1人類化抗體之生產
以與實施例1)-14-1同樣之方法生產。藉由對應實施例6)-1-5、實施例6)-1-8、實施例6)-1-11、及實施例6)-1-14所示的H鏈及L鏈之組合的H鏈表現載體及L鏈表現載體之組合，取得各種人類化抗體。
6)-4-2人類化抗體之1階段純化
自實施例6)-4-1所獲得的培養上清液將抗體以rProtein A親和性層析之1階段步驟純化。將培養上清液施加於填充有PBS平衡化的MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量之2倍以上的PBS將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集含有抗體之級份。將該級份藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對PBS的緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製成1mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
6)-4-3人類化抗體之2階段純化
將實施例6)-4-1所獲得的培養上清液以rProtein A親和性層析及陶瓷羥基磷灰石(ceramic hydroxy apatite)之2階段步驟純化。將培養上清液施加於填充有經PBS 平衡化的MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量之2倍以上之PBS將管柱洗淨。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)將抗體溶出。將含有抗體的級份藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對PBS的緩衝液取代，以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液稀釋5倍後，施加於以5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷羥基磷灰石管柱(日本Bio-Rad，Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。實施利用氯化鈉的直線濃度梯度溶出，收集含有抗體的級份。該級份藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)之緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製為25mg/mL。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
(實施例7)人類化抗體之活性測定 7)-1人類化抗體之CD147抗體結合性評價
實施例6)-4-3所製作的人類化抗人類CD147抗體#84H1L2hIgG2、#84H1L2hIgG4P、#101H1L2hIgG2、#101H1L2hIgG4P、#110H1L4hIgG4P及#131H2L2hIgG2與人類CD147之解離常數測定係使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司製)，於使用Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare Bioscience公司製)而固定化的抗-人類IgG(Fc)抗體將抗體作為配位體而捕捉(capture)，進行將抗原作為分析物而測定的捕捉法。使用HBS-EP+(GE Healthcare Bioscience公司製)作為運行(running)緩衝液，使用CM5(GE Healthcare Bioscience公司製作為感應器晶片。於晶片上將1μg/mL之人類化抗體以10μL/分鐘添加60秒後，對實施例5)所使用的抗原之稀釋系列溶液(對#101H1L2hIgG2及#101H1L2hIgG4P，為0.0625~1μg/mL；對#84H1L2hIgG2、#84H1L2hIgG4P、#110H1L4hIgG4P、#110H13L2hIgG4P、#110H13L12hIgG4P及#131H2L2hIgG2，為0.25~4μg/mL)，以流速30μL/分鐘添加120秒，接著監測300秒鐘之解離相。以流速20μL/分鐘添加30秒之再生溶液之3M氯化鎂(GE Healthcare Bioscience公司製)。於資料之解析，使用1：1結合模型，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。
將結果示於表6。
Figure 107125910-A0202-12-0138-370
7)-2胰臓癌負載癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果
將5×106個細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含有50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至4週齡雌之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積進行分組，於移植之7日後以3mg/kg、10mg/kg投予實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#84H1L2hIgG2、#84H1L2Ig4P、#101H1L2hIg2、#101H1L2hIg4P、#110H1L4hIg4P、#131H2L2hIg2)於負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。於移植之7、14日後，以400mg/k投予作為對照藥之胰臓癌之治療藥的吉西他濱(購自日本Eli Lilly公司)至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
將結果示於圖18(a)~(d)。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
對照藥之腫瘤增殖抑制率為71%，相對於腫瘤之消失未被觀察，於3或10mg/kg投予組，任一者之人類化CD147抗體皆顯示較吉西他濱更優異的抗腫瘤效果。於#84H1L2hIg4P、#101H1L2hIg2、#101H1L2hIg4P、#110H1L4hIg4P之10mg/kg投予組，確認伴隨腫瘤消失的強抗腫瘤效果。
(實施例8)CD147抗體之活體外p38MAPK訊號之活性化 8)-1胰臓癌細胞PANC-1中的抗人類CD147人類嵌合抗體所致的p38MAPK磷酸化之誘導
已報告CD147藉由活性化而促進p38MAPK之磷酸化(Lim et al.，FEBS Letters、88-92，1998)(Li et.，al.J.Hepatology，1378-1389，2015)。顯示抗腫瘤效果的抗CD147，為了調查對p38MAPK之訊號的影響，於以10μg/ml之CD147人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P處理15分鐘的PANC-1細胞，p38MAPK磷酸化使用Simple Western assays法(Protein Simple Japan股份有限公司，Wes)而評價。將作為對照樣品之PANC-1細胞以人類IgG(Jackson ImmunoResearch公司，009-000-003)10μg/ml同樣地處理而供予解析。於p38MAPK之檢測，使用p38 MAPK rabbit mAb(Cell signaling technology公司，Cat.#9212)。於磷酸化p38MAPK之檢測，使用P-p38 MAPK(T180/Y182)(D3F9)XP rabbit mAb(Cell signaling technology公司，#4511S)。將檢測出的磷酸化p38MAPK訊號相對於p38MAPK訊號的比示於圖19。抗體處理樣品實施2分，於圖式中呈示平均值。
於LN22R8chIgG4P抗體處理組，觀察到磷酸化MAPK訊號的增加。
8)-2 CD147抗體之活體外p38訊號下游分子之HSP27之磷酸化
已報告p38MAPK藉由活性化而將HSP27磷酸化(Landry et al.，Biochem.Cell Biol.，703-707，1995)。經CD147人類嵌合抗體LN22R8誘導的p38之磷酸化，為了確認促進實際之p38訊號活性化，於8)-1之抗體處理樣品，使用Simple Western assays法(Protein Simple Japan股份有限公司，Wes)評價磷酸化。於HSP27之檢出，使用HSP27抗體(R&D systems公司，Cat.AF15801)。於磷酸化HSP27之檢出，使用Phospho-HSP27(Ser82)antibody(Cell signaling technology公司，2401S)、或Anti-HSP27(phospho Ser15)抗體(Abcam公司，Cat.ab76313)。
將Ser82或Ser15磷酸化HSP27訊號相對於檢出的HSP27訊號的比各自示於圖20(a)或圖20(b)。抗體處理樣品實施2份，於圖中呈示平均值。
於LN22R8chIgG4P抗體處理組，觀察到磷酸化HSP27訊號之增加。由於藉由CD147人類嵌合抗體所誘導的p38之磷酸化而誘導下游之HSP27之磷酸化活性化，判斷抗人類CD147人類嵌合抗體LN22R8IgG4P誘導p38MAPK訊號的活性化。又，於胰臓癌細胞MIA PaCa-2亦同樣地，確認p38MAPK訊號之活性化。
(實施例9)CD147抗體之腫瘤內p38訊號之活性化
於活體外觀察到的CD147抗體所致的p38MAPK訊號之活性化是否於小鼠皮下形成的腫瘤內亦發生，以MIA PaCa-2之小鼠皮下腫瘤調查。將5×106個細胞之人 類胰臓株MIA PaCa-2以含50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至5週齡雌之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植5日後實施分組，於分組後當日，以10mg/kg將抗人類CD147人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P投予至負載癌小鼠之腹腔內。抗體投予後之6、24、48、72小時後採取腫瘤材料，以乾冰冷凍後，冷凍保存。於自冷凍的腫瘤組織之樣品調製(n=3)，使用gentleMACS Octo Dissociator with Heaters(Miltenyi公司)。對經調製的腫瘤溶胞產物(lysate)，使用Simple Western assays法(Protein Simple Japan股份有限公司，Wes)解析。
將檢測出的p38MAPK訊號之平均值與標準誤差一起示於圖21(a)。將檢測出的磷酸化p38MAPK訊號之平均值與標準誤差一起示於圖21(b)。將磷酸化p38MAPK訊號對p38MAPK訊號的比之平均值與標準誤差一起示於圖21(c)。LN22R8chIgG4P係於投予後6小時至72小時，使磷酸化P38MAPK之比率增加。於24小時至72小時，藉由增加p38MAPK，磷酸化p38MAPK之訊號係於6小時到峰值時減少。
於小鼠之皮下腫瘤內，亦觀察到CD147嵌合抗體投予所致的p38磷酸化之上升、HSP27磷酸化之增加，得知發生p38訊號之活性化。
(實施例10)p38MAPK下游之分子CXCL8之誘導
已報告藉由p38MAPK之活性化，而透過CXCL8之mRNA安定化的誘導(Hoffmann et al.，J.Leukoc.Biol.，847-855，2002)、SMAD3/4訊號之活性化(Leovonen et al.，PLOS ONE，e57474，2013)。在MIA PaCa-2腫瘤內，於抗體投予後是否CXCL8之基因表現被誘導，係將自抗體投予後之小鼠皮下腫瘤抽出的RNA，藉由定量的PCR法進行了調查。同樣地，對於已報告藉由SMAD訊號活性化所誘導的RHOB基因(Vasilaki et al.，FASEB Journal，891-905，2010)，亦調查CD147抗體投予所致的變動。測定作為內在對照基因之importin(ipo8)基因及TATA box binding protein(tbp)基因的表現。投予抗人類CD147人類嵌合抗體，採取於72小時後之MIA PaCa-2腫瘤作為材料，以RNA later(QIAGEN公司，Cat.76104)處理後，使用RNeasy Mini Kit(250)(QIAGEN公司，Cat.74106)，提取RNA。作為抗人類CD147人類嵌合抗體，使用實施例1)-14所製作的LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2或LN22R8chIgG4P。於定量的RT-PCR，使用EXPRESS One-Step SuperScript qRT-PCR kit Universal(Thermofisher scienticic，Cat.11781-01K)，作為基因定量探針，各自使用importin(ipo8)(Thermo Fisher Scientific，Cat.Hs00183533_m1)，TATA box binding protein(tbp)(Thermo Fisher Scientific，Cat.Hs00427621_m1)，rashomolog family member B(rhoB)(Thermo Fisher Scientific，Cat.hs00269660_s1)， interleukin 8(Thermo Fisher Scientific，Cat.Hs00174103_m1)。使用ABIPrism7500(Applied Biosystems公司)測定伴隨PCR反應的基因特異的螢光訊號之增加。
於圖22(a)，將ipo8/tbp基因之表現比的平均值(n=3)與標準偏差一起呈示。
於圖22(b)將cxcl8/tbp基因之表現比之平均值(n=3)與標準偏差一起呈示。
於圖22(c)將rhoB/tbp基因之表現比之平均值(n=3)與標準偏差一起呈示。
於LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2或LN22R8chIgG4P投予後，相對於ipo8基因之表現為未變動，於抗人類CD147人類嵌合抗體投予組之cxcl8、rhoB之表現誘導被確認。cxcl8、rhoB之表現誘導，依據實施例1)-18所示的人類嵌合抗體之抗腫瘤效果之強度，暗示兩基因之表現誘導有與抗腫瘤效果相關的可能性。
(實施例11)抗人類CD147大鼠抗體之人類嵌合抗體化所致的抗腫瘤效果之增強中的cxcl8、rhoB基因之誘導
抗人類CD147大鼠抗體rat_CD147_#110係如實施例2、實施例7所示，藉由人類嵌合化而抗腫瘤效果增強。於人類嵌合抗體LN22R8chIgG1、LN22R8chIgG2或LN22R8chIgG4P投予後之腫瘤中觀察到的cxcl8、rhoB之誘導，與14)-2同樣地，比較rat_CD147_#110與嵌合抗體#110chIgG4P。
於圖23(a)將ipo8/tbp基因之表現比之平均值(n=3)與標準偏差合併表示。
於圖23(b)將cxcl8/tbp基因之表現比之平均值(n=3)與標準偏差合併表示。
於圖23(c)將rhoB/tbp基因之表現比之平均值(n=3)與標準偏差合併表示。
ipo8基因之表現並未藉由抗體投予而變動。cxcl8基因、rhoB基因之表現藉由rat_CD147_#110之投予，與抗體未投予組同樣地未觀察到變化，而於#110chIgG4P之cxcl8，rhoB之誘導被確認。暗示兩基因之誘導係與CD147抗體所致的抗腫瘤效果相關的參數。
(實施例12)利用SMAD4陰性胰臓癌負載癌模型的評價
作為於SMAD訊號之活性化上重要的分子之一者，已知有轉錄因子、SMAD4(Zang，et al.，Current Biology，270-276，1997)。已知於一部分之胰臓癌，藉由SMAD4之基因缺損，SMAD訊號受到部分的阻礙(Hahn,et al.,Science,350-353,1996)。對於SMAD4缺損，並有SMAD訊號部分的被阻礙的胰臓癌細胞株BxPC-3Yasutome et al.,Clin.Exp.Metastasis,461-473,2005)，調查CD147抗體是否顯示抗腫瘤效果。將2.5×106個細胞之人類胰臓株BxPC-3(ATCC，Cat.CRL-1687)以含100%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)的PBS懸浮，移植至6週齡雌性之BALB/c-nu小鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrli、購自日本Charles River)之 腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植後8日後實施分組，於移植之8、15、22日後，以10mg/kg投予小鼠抗人類CD147抗體LN22R8R8、或大鼠抗人類CD147抗體2P10F2至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。於移植之8、15、22日後，以200mg/kg投予作為對照藥之胰臓癌的治療藥的吉西他濱(日本Eli Lilly公司，Gemzar(註冊商標))投予至負載癌小鼠之尾靜脈內(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
示於圖24。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。BxPC-3腫瘤係對LN22R8抗體、2P10F2抗體及吉西他濱為耐性。
(實施例13)SMAD4導入所致的CD147抗體感受性之獲得
已報告藉由於複數之胰臓癌細胞株中導入SMAD4，而SMAD訊號回復。藉由SMAD4之導入所致的回復的SMAD訊號，調查CD147抗體之感受性是否增加。
13)-1SMAD4安定表現細胞之製作
利用Retro-XTM Q載體套組，製作BxPC-3之SMAD4安定表現株。作為反轉錄病毒載體(TAKARA BIO公司， Retro-XTM Q Vector Set，Cat.631516)，於套組所含的pQCXIP之選殖部位導入藉由人工合成製作的人類SMAD4基因，作為SMAD4表現反轉錄病毒載體。利用Retro-X Universal Packaging System(TAKARA BIO公司，Cat.631530)，於BxPC-3中導入SMAD4表現反轉錄病毒載體，藉由嘌呤黴素(puromycin)(TAKARA BIO公司，Cat.631306)，藉由病毒感染，反轉錄病毒被併入染色體中，選擇成為嘌呤黴素耐性、SMAD4陽性的BxPC-3細胞，作為SMAD4陽性BxPC-3細胞、BxPC-3-SMAD4。同樣地使感染反轉錄病毒載體pQCXIP，將成為嘌呤黴素耐性的BxPC-3細胞作為BxPC-3-mock。反轉錄病毒感染實驗實施2次，於BxPC-3-mock、BxPC-3-SMAD4，製作批次1、批次2。
13)-2 CD147及SMAD4表現之確認
於BxPC-3(ATCC，Cat.CRL-1687)、實施例13)-1製作的BxPC-3-mock、BxPC-3-SMAD4，使用Simple Western assays法(Protein Simple Japan股份有限公司，Wes)作解析。作為SMAD4陽性對照樣品，利用MIA PaCa-2。於SMAD4之檢測，利用抗SMAD4抗體(R&D systems，Cat.AF2097)。於GAPDH之檢測，利用抗GAPDH抗體(Abfrontier，Cat.LF-MA0026)。於CD147之檢測，利用抗CD147抗體(Abcam，Cat.Ab108317)。
將結果示於圖25(a)。MIA PaCa-2係SMAD4陽性、CD147陽性。BxPC-3係SMAD4陰性、CD147陽性。 BxPC-3-mock未觀察到反轉錄病毒感染所致的影響，為SMAD4陰性、CD147陽性。導入SMAD4表現反轉錄病毒載體的BxPC-3-SMAD4，批次1、批次2之任一者皆為SMAD4陽性。批次2之SMAD4表現為高的，且於之後的實驗，利用批次2作為BxPC-3-SMAD4。
13)-3 SMAD4安定表現的BxPC-3腫瘤之對CD147人類嵌合抗體的感受性
將2.5×106個細胞之BxPC-3-mock、或BxPC-3-SMAD4以含有100%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)的PBS懸浮，移植至5週齡雌性之BALB/c-nu小鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，各自於BxPC-3-mock移植後6日後，BxPC-3-SMAD4於移植後3日後，實施分組，於實施分組當日、7、14、21、28日後，以10mg/kg投予人類嵌合抗人類CD147抗體LN22R8R8chIgG2、或LN22R8R8chIgG4P至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖25(b)、圖25(c)。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。BxPC-3-mock腫瘤係對LN22R8R8chIgG2或LN22R8R8chIgG4P抗體顯 示耐性或低感受性。BxPC-3-SMAD4腫瘤係對LN22R8R8chIgG2或LN22R8R8chIgG4P抗體顯示部分的感受性。
13)-4 SMAD4表現所致的腫瘤中p38訊號之變化
已報告於SMAD4陰性之胰臓癌細胞，藉由使SMAD4表現，有p38訊號增強(Chen et al.，B.M.C.，1471-2407，2014)。對於BxPC-3-SMAD4腫瘤中之p38MAPK與磷酸化p38MAPK，於抗人類CD147人類嵌合抗體投予(抗體投予後72小時後)所致的變動，與實施例13)-1同樣地，使用Simple Western assays法(Protein Simple Japan股份有限公司，Wes)而解析。與實施例1)-18之項目同樣地，作為抗人類CD147人類嵌合抗體，以10mg/kg投予LN22R8chIgG4P至長有MIA PaCa-2皮下腫瘤的小鼠。於自腫瘤組織之樣品調製(n=3)，使用gentleMACS Octo Dissociator with Heaters(Miltenyi公司)。
於圖26(a)，對於p38 MAPK測定值，合併3個腫瘤樣品之測定值之平均值及標準誤差而記載於圖中。於圖26(b)，對於磷酸化p38 MAPK測定值，合併3個腫瘤樣品之測定值之平均值及標準誤差而記載於圖中。
於BxPC-3-SMAD4腫瘤中，p38及磷酸化p38增加2倍以上。CD147人類嵌合抗體投予後72小時後，觀察到p38之部分的減少、磷酸化p38之部分的增加。
於胰臓癌細胞BxPC-3之腫瘤，得知藉由SMAD4之表現，而會發生p38訊號之增強。認為SMAD4依存的p38訊號之增強可能有助於CD147人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P之感受性增加。
(實施例14)吉西他濱耐性胰臓癌中的嵌合CD147抗體之抗腫瘤效果
調查於吉西他濱耐性之胰臓癌腫瘤模型的CD147抗體之抗腫瘤效果。將5×106個細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含有50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、日本Charles River)之腋窩部皮下。於移植之6日後，以400mg/kg腹腔內投予為胰臓癌之治療藥的吉西他濱(日本Eli Lilly公司)，於1週後，將增殖之經確認的形成吉西他濱耐性腫瘤的小鼠，基於腫瘤的大小實施分組，於對照組(n=5)，於移植後第13日(分組日)、第20日以400mg/kg腹腔內投予吉西他濱。作為CD147抗體及吉西他濱併用投予組(n=5)，除了移植後第13日(分組日)、第20日以400mg/kg腹腔內投予吉西他濱之外，於移植後第13日(分組日)、第20日以10mg/kg腹腔內投予CD147人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
將結果示於圖27，於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。合併記載未投予吉西他濱及抗體的未投予組(non treatment)之腫瘤增殖(n=5)。
對照藥之吉西他濱之投予組的腫瘤平均大小，移植後28日後為1269mm3，相對於未觀察到退縮的腫瘤，併用投予CD147人類嵌合抗體LN22R8chIgG4P的組之腫瘤的平均大小為15mm3，觀察到5例中於3例之腫瘤之退縮。由此結果顯示，對吉西他濱呈現耐性的增殖的胰臓癌腫瘤，亦顯示有對CD147抗體之感受性的可能性。
(實施例15)肝癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果 15)-1 Hep G2細胞中的CD147與SMAD4之表現
與實施例13)-2同樣地，確認關於肝癌細胞株HepG2細胞(ATCC，Cat.HB-8065)之CD147及SMAD4表現。作為CD147陽性之對照檢體，使用MIA PaCa-2、BxPC-3(ATCC，Cat.CRL-1687)。各自使用MIA PaCa-2作為SMAD4陽性之對照檢體，BxPC-3作為SMAD4陰性之對照檢體。
針對檢測出的訊號，求得訊號相對於GAPDH的比，整理於下。得知Hep G2細胞為CD147、SMAD4陽性。
CD147/GAPDH之訊號比
Figure 107125910-A0202-12-0151-371
SMAD4/GAPDH之訊號比
Figure 107125910-A0202-12-0152-372
15)-2 Hep G2細胞中的CD147之利用流式細胞儀的表現確認
利用流式細胞儀解析於HepG2細胞(ATCC，Cat.HB-8065)之細胞表面表現的CD147。於人類CD147之表現確認，作為市售之抗人類CD147抗體，使用經APC標示的抗人類CD147小鼠IgG1抗體MEM-M6/1-APC(Thermofisher，Cat.MA1-10104)。作為小鼠IgG1同型對照抗體，使用mIgG1-APC(Miltenyi Bio公司，Cat.130-092-214)。於HepG2細胞之懸浮液，添加1/10量之MEM-M6/1-APC，於4℃處理30分鐘。以含5%FBS的PBS緩衝液將細胞洗淨後，實施流式細胞儀(CantoII，BD Bioscience公司)之測定，將結果整理於圖28(a)。
得知經MEM-M6/1-APC處理的Hep G2細胞顯示強的螢光訊號，表現CD147。
15)-3肝癌細胞中的人類化CD147抗體所致的p38活性化
於肝癌細胞HepG2，為了調查抗CD147抗體對p38MAPK的影響，以10μg/ml之抗人類CD147人類嵌合 抗體(LN22R8chIgG4P)或實施例6)-4-2所製作的抗人類CD147人類化抗體(#84H1L2hIgG2、#84H1L2hIg4P、#101H1L2hIgG2、#101H1L2hIgG4P、#110H1L4hIg4P、#131H2L2hIgG2)處理HepG2細胞(ATCC，Cat.HB-8065)15分鐘，使用Simple Western assays法(Protein Simple Japan股份有限公司，Wes)評價P38磷酸化。作為對照樣品，將HepG2細胞同樣地以人類IgG(hIgG，Jackson ImmunoResearch公司009-000-003)10μg/ml處理而供予解析。於p38MAPK之檢測，使用p38 MAPK rabbit mAb(Cell signaling technology公司，Cat.#9212)。於磷酸化p38MAPK之檢測，使用P-p38 MAPK(T180/Y182)(D3F9)XP rabbit mAb(Cell signaling technology公司，#4511S)。將經檢測的磷酸化p38MAPK訊號相對於p38MAPK訊號的比示於圖28(b)。
藉由LN22R8chIgG4P、#84H1L2hIgG2、#84H1L2hIg4P、#101H1L2hIgG2、#101H1L2hIgG4P、#110H1L4hIg4P或#131H2L2hIgG2之處理，觀察到較人類IgG處理組2倍以上之磷酸化p38 MAPK訊號之增加，得知於肝癌細胞亦與胰臓癌細胞同樣地藉由抗人類CD147抗體而誘導p38MAPK之磷酸化。
15)-4肝癌中的人類化CD147抗體與索拉非尼之抗腫瘤效果之比較
對於為CD147及SMAD4陽性，抗人類CD147抗體所致的p38之磷酸化被確認的人類肝臓株HepG2(ATCC，Cat.HB-8065)，檢討抗人類CD147人類嵌合抗體及人類化抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之人類肝臓株HepG2以含50%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)的PBS懸浮，移植至4週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本Charles River)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積，於移植後9日後實施分組，以1mg/kg、10mg/kg將人類嵌合CD147抗體(LN22R8chIgG4P)、實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#84H1L2hIgG2、#84H1L2hIg4P、#110H1L4hIg4P)投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將作為對照藥之肝癌之治療藥的索拉非尼(Nexavar錠200mg，Bayern藥品股份有限公司公司)按照Nexavar錠所附說明書的參考文獻(Chang et.al.，Cancer Chem.Thera.Pharm.，2007)，溶解於PEG-35蓖麻油(Cremophor EL、Nakarai Tesque公司，Cat.09727-14)乙醇溶媒，於移植之9、10、11、12、13、16、17、18日後，以30mg/kg、90mg/kg經口投予至負載癌小鼠(n=5)。將移植腫瘤之長徑及短徑，每週2次，使用電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司製)作測定，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於表7及圖29(a)~(d)。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
索拉非尼投予觀察到腫瘤增殖之部分的抑制，但未觀察到腫瘤消失。LN22R8chIgG4P、#84H1L2hIgG2、#84H1L2hIg4P、#110H1L4hIg4P係任一者皆呈現伴隨腫瘤消失的優異抗腫瘤效果。
(實施例16)對T細胞及PBMC的作用
已報告CD147係伴隨T細胞的活性化，於CD4陽性、CD8陽性之T細胞中表現上升(Hu et al.，J.Cell.Mol Med.，2132-2143，2010)，於一部分之CD147抗體，有抑制T細胞之活性化誘導能力及增殖的效果(Koch et al.，Int.Immunology，777-786，1999；Chiampanichayakul et al.，Immunology 167-178，2006)。調查不依存於效應子機能且顯示強的抗腫瘤效果的抗人類CD147抗體對包含T細胞的末梢血液淋巴球(PBL)的影響。
16)-1 PBMC之CD3/CD28刺激所致的CD147之表現上升
使用人類PBMC調查CD147之表現是否伴隨T細胞之活性化而上升。將人類PBMC以含有10%FBS的PMI1640培養基，於37℃、5%CO2存在下培養。培養時添加Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(CD3/CD28珠，Thermofishers scientific公司，Cat.1131D)而誘導增殖，4日後實施流式細胞儀之解析，調查CD147之表現是否變化。於人類CD147之表現確認，使用市售之作為抗人類CD147抗體的經APC標示的抗人類CD147小鼠IgG1抗體MEM-M6/1-APC(CD147-APC，Thermofisher，Cat.MA1-10104)。使用mIgG1-APC(Miltenyi Bio公司，Cat.130-092-214)作為小鼠IgG1同型對照抗體。為了檢測含於人類PBMC的T細胞之CD3、CD4、CD8，使用APC/FireTM 750抗人類CD3抗體(BioLegend公司製，Cat.344840)、PerCP/Cy5.5抗人類CD4(BioLegend公司製，Cat.344608)、Brilliant Violet 510抗人類CD8(BioLegend公司製，Cat.344732)。
將CD3、CD4陽性之細胞及CD3、CD8陽性之細胞中的CD147-APC之結合整理於圖30。關於CD3、CD4陽性之細胞及CD3、CD8陽性之細胞，於CD3/CD28珠刺激的情形，確認CD147之表現上升，且確認伴隨T細胞之活性化的CD147之T細胞膜表面上的表現上升。
16)-2人類末梢血單核球之增殖中的抗人類CD147抗體作用之評價
解析人類末梢血單核球(PBMC)之增殖中的抗人類CD147抗體作用。使用2P10F2chIgG4P作為抗人類CD147抗體。使用CellVue Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Kit(sigma、Cat.MIDCLARET-1KT)，將PBMC作螢光標示後，以含10%FBS的RPMI1640培養基，於37℃、5%CO2存在下培養。培養時，添加IL-2、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(CD3/CD28珠，Thermofishers scientific公司，Cat.1131D)，誘導增殖之際，添加2P10F2chIgG4P(10μg/ml)，調查對增殖的影響。於培養第3日、第5日，對由於細胞分裂所致減少的PBMC細胞螢光訊號，實施使用流式細胞儀(CantoII、BD Bioscience公司)的測定，將結果整理於圖31。
藉由CD3/CD28珠之添加，於培養3日後、5日後觀察到細胞分裂所致的減少的PBMC細胞螢光訊號。培養時添加IL-2、2P10F2chIgG4P、或IL-2及2P10F2chIgG4P的情形，於螢光訊號的減少未見到變化。暗示於實施例1)-18所示的人類胰臓癌之小鼠腫瘤模型顯示強的抗腫瘤效果的抗人類CD147人類嵌合抗體2P10F2chIgG4P，於PBMC之增殖並未影響。
16)-3人類末梢血淋巴球之細胞介素產生中的抗人類CD147抗體之評價
使用人類嵌合抗體#84chIgG1、#84chIgG2、#84chIgG4P、#84chIgG1LALA、#84chIgG4PFALA、#101chIgG4P或#110chIgG4P作為抗人類CD147抗體。使用來自人類末梢血液的Ficoll-Paque PLUS(GE HEALTHCARE‧Japan股份有限公司)，調查PBL。於96井盤中塗布10μg/ml之人類嵌合抗體。使用人類IgG(hIgG，Jackson ImmunoResearch公司，009-000-003)作為陰性對照抗體，使用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(CD3/CD28珠，Thermofishers scientific公司，Cat.1131D)作為誘導T細胞之活性化或細胞介素誘導的陽性對照抗體。於塗布抗體的井中添加1x106個PBL，24小時後，測定培養基中之細胞介素(IL2、TNFα、INFγ)。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28係直接添加於添加PBL的井中，同樣地，24小時，測定培養基中之細胞介素(IL2、TNFα、INFγ)。於IL2之測定，使用Quantikine ELISA Human IL-2(R&D systems，Cat.D2050)。於TNFα之測定，使用Amersham TNF-αHuman，Biotrak Easy ELISA(GE HEALTHCARE‧Japan股份有限公司，Cat.RPN5967)。於INFγ之測定，使用Human IFN-γ ELISA development kit(MABTECH公司，Cat.3420-1H-6)。測定係實施3組，算出檢測的吸光度之平均值及標準偏差，整理於圖32。
測定之由PBL所產生的細胞介素(IL2、TNFα、INFγ)係任一者皆於僅添加為陽性對照的CD3/CD28-珠的井中培養確認上升，任一者之塗布抗人類CD147人類嵌合抗 體的井中之培養皆未觀察到與陰性對照的hIgG同樣地細胞介素之上升。
(實施例17)人類化#110Fab’-CD147複合體之X射線結晶構造解析 17)-1複合體之結晶化
將人類化#110H1L4hIgG4P藉由胃蛋白酶切斷而獲得的Fab’2，以二硫蘇糖醇還原後，藉由碘乙醯胺進行烷基化，取得Fab’片段。將此Fab’片段及實施例5)所使用的hCD147v2(22-205)之混合物，供予至使用Superdex 10/300GL Increase管柱(GE Healthcare)的過濾層析，取得複合體級份。複合體係以AmiconUltra15 MWCO 10K(Millipore公司製)取代緩衝液(10mM Tris HClpH7.5、50mM NaCl)，濃縮成13g/L。經複合體溶液藉由蒸氣擴散法加以結晶化。將於蛋白質溶液0.5μL中等量添加沉澱劑溶液(0.1M NaMalonate pH 7.0、12%(w/v)聚乙二醇3350)的溶液，收入至已放入0.05mL之沉澱劑溶液的密閉容器中而使兩溶液彼此不接觸，於25℃靜置。將於約1週後獲得的0.15mm×0.15mm×0.3mm之結晶，浸漬於添加聚乙二醇400使成為30%(w/v)的沉澱劑溶液後，以液體氮冷凍。以同步加速器光子工廠(Synchrotron Facility Photon Factory)(茨城縣、日本)之光束PF-BL17A收集X射線繞射資料。自獲得的繞射像，使用軟體mosflm(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)，將繞強度加以數值化，求得結晶構造因 子。結晶之空間群係P21，結晶之單位格子係(a=64.96Å，b=93.37Å，c=98.31Å、alpha=gamma=90、beta=90.89)。
17)-2複合體之構造解析
使用獲得的構造因子及Fab’片段之同源模型及人類CD147之已知構造(PDBID：3b5h)之三維構造座標，進行分子取代法，並決定位相。計算使用軟體phaser(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)。結晶係於非對稱單位包含2個複合體。使用軟體Refmac5(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)，進行構造之精密化，使用軟體coot而進行模型之修正。重複進行此操作，以2.3Å分解能獲得最終之R值23%、free R值28%。最終之模型包含2個之人類化#110H1L4之Fab’片段及與其各自結合的hCD147v2。又，於一者之hCD147v2，觀察到相當於胺基酸殘基23-203的電子密度，但於另一者，相當於域(domain)1的電子密度並不明瞭，僅觀察到相當於胺基酸殘基103-202的電子密度。
17)-3抗原決定位之特定
包含於非對稱單位的2個之複合體共通而離人類化#110H1L4之Fab’片段的結合面4Å以內的hCD147v2之胺基酸殘基係如以下：Arg106、Lys108、Ala109、Val110、Lys127、Ser128、Glu129、Ser130、Val131、Pro132、Pro133、Val134、Gln164、Gly165。於圖41呈示複合體 全體之絲帶模型及表面，於圖42呈示hCD147v2及人類化#110H1L4之相互作用。
(實施例18)胃癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果
對於藉由流式細胞儀確認CD147陽性的人類胃癌細胞株KATO III細胞(ATCC，Cat.HTB-103)，檢討抗人類CD147人類嵌合抗體及人類化抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之人類胃癌株KATO III以100%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本CLEA)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積於移植後3日實施分組，將人類嵌合CD147抗體(LN22R8chIgG4P)、實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#110H1L4hIg4P)，以10mg/kg分組後各7日投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=6)。移植腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司)於1週測定2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖43。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
相對於未處理組之小鼠腫瘤之平均體積係自移植24日後為290mm3，LN22R8chIgG4p投予組為199mm3，#110H1L4hIgG4P投予組為134mm3，算出的抗腫瘤效果 係於LN22R8chIgG4p投予組為31%，#110H1L4hIgG4P投予組為54%。
(實施例19)慢性骨髓性白血病模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果
對於藉由流式細胞儀確認CD147陽性的人類慢性骨髓性白血病細胞株KU812細胞(ATCC，Cat.CRL-2099)，檢討抗人類CD147人類化抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之慢性骨髓性白血病細胞株KU812以含50%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)的PBS懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本CLEA)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積於移植後3日實施分組，將實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#110H1L4hIg4P)，以10mg/kg分組後各7日投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。將作為對照藥之慢性骨髓性白血病之治療藥的伊馬替尼(ASTATECH公司，Cat.#63168)以蒸餾水調製成9mg/ml溶液，以90mg/kg經口投予至負載癌小鼠(周六及周日停藥連投、於移植後4、7、8、9、10、11、14、15、16、17、18、21、22、23、24日後投予)。移植腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司)於1週測定2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖44。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
相對於未處理組之小鼠腫瘤之平均體積係自移植25日後為627mm3，伊馬替尼投予組為328mm3，#110H1L4hIgG4P投予組為6mm3，算出的抗腫瘤效果係伊馬替尼投予組為48%，#110H1L4hIgG4P投予組為97%。僅於#110H1L4hIgG4P投予組中觀察到5例中4例之腫瘤的完全縮退。
(實施例20)大腸癌模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果
對於藉由流式細胞儀確認CD147陽性的人類大腸癌細胞株SW620細胞(ATCC，Cat.CCL-227)，檢討人類化抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之人類大腸癌株SW620以100%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本CLEA)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積於移植後3日實施分組，將人類嵌合CD147抗體(LN22R8chIgG4P)、實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#084H1L2hIg4P或#110H1L4hIg4P)分組後每7日以10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內(n=5)。移植腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司)於1週測定2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖45。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
相對於未處理組之小鼠腫瘤之平均體積係自移植21日後為1302mm3，#084H1L2hIg4P投予組為709mm3，#110H1L4hIgG4P投予組為403mm3，算出的抗腫瘤效果係於#084H1L2hIg4P投予組為46%，於#110H1L4hIgG4P投予組為69%。
(實施例21)腎臓癌786-O模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果
對於藉由流式細胞儀確認CD147陽性的人類腎臓癌786-O，檢討人類化抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之人類腎臓癌786-O以50%Matrigel(Corning公司，Cat.354234)懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本CLEA)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積於移植後3日實施分組，將人類嵌合CD147抗體(LN22R8chIgG4P)、實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#084H1L2hIg4P或#110H1L4hIg4P)，於分組後每7日以10mg/kg投予至負載癌小鼠之腹腔內，共計4次(n=6)。移植腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司)於1週測定2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖46。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
未處理組之小鼠腫瘤之平均體積，相對於自移植31日後為918mm3，於#084H1L2hIg4P投予組為224mm3，於#110H1L4hIgG4P投予組為379mm3，算出的抗腫瘤效果係#084H1L2hIg4P投予組為76%，#110H1L4hIgG4P投予組為59%。
(實施例22)急性骨髓性白血病(AML)模型中的人類化CD147抗體之抗腫瘤效果
對於由流式細胞儀確認CD147陽性的人類AML細胞株OCI-AML3細胞(DSMZ，Cat.ACC 582)，檢討人類化抗體之抗腫瘤效果。
將5×106個細胞之人類AML細胞株OCI-AML3細胞以50% GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)懸浮，移植至5週齡雌性之NOD-scid小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J、購自日本CLEA)之腋窩部皮下。基於腫瘤體積於移植後3日實施分組，於負載癌小鼠分組(n=6)後每7日自尾靜脈注射投予10mg/kg之實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#110H1L4hIg4P)。移植腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司)於1週測定2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×短徑(mm)×短徑(mm)×長徑(mm)
將結果示於圖47。於圖中，針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
未處理組之小鼠腫瘤之平均體積，相對於自移植21日後為1533mm3，#110H1L4hIgG4P投予組為394mm3，算出的抗腫瘤效果係於#110H1L4hIgG4P投予組為74%。
(實施例23)結合性不同的人類化抗CD147抗體之活性測定
將5×106個細胞之人類胰臓株MIA PaCa-2以含有50%GFR-Matrigel(Corning公司，Cat.354230)的PBS懸浮，移植至4週齡雌性之Nude小鼠(BALB/c Slc-nu/nu、購自日本SLC(股))之腋窩部皮下。基於腫瘤體積進行分組，於移植7日後，以10mg/kg尾靜脈投予實施例6)-4-2所製作的對CD147蛋白質的結合性不同的3種之人類化CD147抗體(#110H1L4hIgG4P、#110H13L02hIgG4P及#110H13L12hIgG4P，於表6記載結合性)至負載癌小鼠(n=6)。於移植之3、10日後將作為對照藥之為胰臓癌之治療藥的吉西他濱(購自日本Eli Lilly公司)以400mg/kg尾靜脈投予至負載癌小鼠(n=6)。移植腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(Mitutoyo股份有限公司)於1週測定2次，由以下所示的計算式算出腫瘤體積。
將結果示於圖48。圖中針對腫瘤體積之變化，合併記載平均值及標準誤差。
相對於對照藥之吉西他濱之腫瘤增殖抑制率為66%，任一人類化CD147抗體皆於10mg/kg投予組顯示較吉西他濱更優異的抗腫瘤效果。
(實施例24)CD147抗體之比較 24)-1現有之抗CD147抗體之抗原結合性評價
作為競爭抗體，基於WO2010/036460之4A5、5F6抗體、WO2017/061602之PPAT-082-03之專利記載序列，調製純化抗體。與CD147蛋白質之解離常數測定，使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司製)，於使用Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare Bioscience公司製)而固定化的Anti-Human IgG(Fc)antibody將抗體作為配位體而捕捉(capture)，進行將抗原作為分析物而測定的捕捉法。作為運行(running)緩衝液，使用HBS-EP+(GE Healthcare Bioscience公司製)，作為感應器晶片，使用CM5(GE Healthcare Bioscience公司製)。晶片上以10μL/分鐘添加1μg/mL之競爭抗體60秒後，將實施例2)-5所使用的抗原之稀釋系列溶液(0.5~8μg/mL)以流速30μL/分鐘添加120秒，接著，偵測300秒之解離相。作為再生溶液，以流速20μL/分鐘添加3M氯化鎂(GE Healthcare Bioscience公司製)30秒鐘。於資料之解析，使用1：1結合模型，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。人類化CD147抗體(#084H1L2hIgG4P或#110HlL4hIgG4P)之解離常數係以實施例7)-1之方法算出。
於表8呈示算出的解離常數、效應子機能、關於抗原決定位區域的情報。
Figure 107125910-A0202-12-0168-373
24)-2與現有之CD147抗體之競爭性ELISA
使用實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#084H1L2hIg4P或#110H1L4hIg4P)，以競合ELISA評價對重組人類CD147/Fc(Sino Biological公司，Cat.10186-H02H)的結合性。作為競爭抗體，使用於24)-1調製的4A5、5F6抗體、PPAT-082-03抗體。作為競爭陰性對照抗體，使用人類IgG(JACKSON公司，Cat.130093)。作為競爭陽性對照抗體，對於#084H1L2hIg4P抗體，使用#84H1L2hIgG2抗體，對於#110H1L4hIg4P，使用#110chIgG2抗體。
於96井盤(Thermo Scientific公司，Cat.43454)中以2ug/ml、50ul/井添加經PBS稀釋的重組人類CD147/Fc，於4℃保存一晚。去除蛋白溶液後，添加300ul含1%BSA的PBS，於室溫加溫1小時。去除溶液，添加25u 之現有之抗體液(0、0.2、2、20ug/ml)，於室溫加溫2小時。於各井中添加20ng/ml之濃度之25ul人類化CD147抗體(#084H1L2hIg4P或#110H1L4hIg4P)，於室溫加溫2小時。以含0.05%Tween20(BIO RAD公司，Cat.170-6531)的PBS洗淨2次後，添加50ul之以含1%BSA的PBS經2000倍稀釋的抗人類IgG4-HRP(Abcam公司，Cat.ab99823)，於室溫加溫1小時。以含0.05%Tween20(BIO RAD公司，Cat.170-6531)的PBS洗淨3次後，充分去除洗淨液，添加50ul之HRP基質液(eBioscience公司，Cat.00-4203-58)，於室溫加溫15~20分鐘後，以平盤讀取器測定405nm之吸光度(PerkinElmer公司，模型名EnVision2104)。
將結果示於表8及圖49(a)、(b)。
#084H1L2hIg4P之對重組人類CD147/Fc的結合，係於hIgG存在下，於1~10ug/ml之現有CD147抗體存在下被抑制。#110H1L4hIg4P之對重組人類CD147/Fc的結合，hIgG存在、0.1~10ug/ml之現有之CD147抗體存在下未被抑制，#110chIgG2抗體之存在下被抑制。得知#084H1L2hIg4P之抗原決定位雖由於現有之抗CD147抗體之結合而遭受競爭，但#110H1L4hIg4P之抗原決定位未受到現有之抗CD147抗體之結合的影響。
將實施例17)-3所示的H110H1L4h抗體之抗原決定位資訊記載於表8。由以使用實施例1)-9之CD147變異體的解析而與抗原決定位被推定的2P10F2抗體之結合競爭性試驗結果(實施例2)-8)，推定#084H1L2h之抗原決定位區域，記載於表8。
24)-3抗CD147抗體之ADCC評價
按照實施例1)-15之手法，評價抗CD147抗體之ADCC活性。作為與實施例1)-15之手法不同的條件，使用HepG2細胞(ATCC，Cat.HB-8065)作為ADCC標的細胞，使用#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P、4A5、5F6、PPAT-082-03作為CD147抗體，以1μg/ml之濃度加以評價。測定係實施3組，算出平均值、標準偏差。於有5%以上之細胞之51Cr被檢測的情形，作為ADCC陽性(+)。將低於5%的情形作為ADCC活性陰性(-)。將結果示於表8。
#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P係未檢測出ADCC活性，判定為ADCC(-)。4A5、5F6、PPAT-082-03係有5%以上之細胞之51Cr被檢測出，設為ADCC陽性(+)。#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P為ADCC陰性，對於人類之活體內表現CD147的血液細胞等之正常細胞雖有誘導細胞死亡的可能性，但預測較ADCC活性陽性之4A5、5F6、PPAT-082-03更低。
24)-4抗CD147抗體之CDC評價
按照實施例1)-16之手法，評價抗人類CD147抗體所致的補體依賴性的殺細胞活性(CDC活性)。作為與實施例1)-16之手法不同的條件，使用人類肝臓株HepG2細胞(ATCC，Cat.HB-8065)作為標的細胞，使用#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P、4A5、5F6及 PPAT-082-03作為抗人類CD147抗體，添加兔補體至終濃度成為8%而測定。測定係實施3組，算出平均值及標準偏差。對於觀察到30%以上之抗體依賴的CDC活性的抗體，設為CDC活性陽性，於表中記載為CDC(+)。將結果示於表8。抗人類CD147抗體係僅4A5顯示CDC活性陽性。#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P、5F6、PPAT-082-03為CDC陰性，對於人類之活體內表現CD147的血液細胞等之正常細胞雖有誘導細胞死亡的可能性，但預測較CDC活性陽性之4A5更低。
24)-5抗CD147抗體之ADCP評價
按照實施例1)-17之手法，測定抗CD147抗體之ADCP活性。作為與實施例1)-17之手法不同的條件，使用人類肝臓株HepG2細胞(ATCC，Cat.HB-8065)作為標的細胞，使用#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P、4A5、5F6、PPAT-082-03作為抗CD147抗體，以1μg/ml之濃度添加，經標識的RAW264.7細胞係等量添加ADCP標的細胞，測定ADCP活性。測定係實施3組，算出平均值、標準偏差，將較人類IgG處理組低於10%的ADCP活性上升設為弱陽性(±)，將10%以上之活性上升設為陽性(+)，而示於表8。
#110H1L4hIgG4P之ADCP活性係低於10%，判定為ADCC活性±。#084H1L2hIgG4P、4A5、5F6、PPAT-082-03抗體之ADCP活性為10%以上，判定為ADCP活性+。辨識CD147-D2的#110H1L4hIgG4P係較 辨識CD147-D1的其他CD147抗體更低的ADCP活性。ADCP，CD147抗體與CD147結合後，藉由於巨噬細胞或單核球細胞上表現的Fcγ受體，雖有必要辨識抗體之FC部分，但#110抗體之抗原決定位接近細胞表面，與為抗原的CD147結合的抗體之FC部分較辨識其他之CD147-D1的抗體更難辨識Fcγ受體，有ADCP活性為低的可能性。#110H1L4hIgG4P、ADCP活性為弱陽性，對於人類之活體內表現CD147的血液細胞等之正常細胞，雖有誘導細胞死亡的可能性，但預測較ADCP活性陽性之#084H1L2hIg4P、4A5、5F6、PPAT-082-03更低。
(實施例25) 25)-1抗CD147抗體所致的血液系細胞凝集
已報告一部分之抗CD147抗體誘導血球系細胞之凝集(Kasinrerk等人，Immunology 1999，96(2)p184-192)。血球系細胞之凝集有引起嚴重的血液毒性的可能性(Doll，C.，et al.，1994，Curr.Opin.Oncol.，345-350)，為作為治療用抗體所不希望的性質。針對抗CD147抗體，調查細胞累積之活性的不同。作為CD147抗體，評價#110H1L4hIgG4P、#084H1L2hIg4P、4A5、5F6、PPAT-082-03。作為陰性之對照抗體，使用人類IgG(hIgG，ChromPure Human IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，Cat.009-000-003)。將HEL92.1.7細胞(更自ATCC，Cat.#TIB-180)，於96井U底盤(Sumitomo Bakelite股份有限公司， Cat.MS-9096U)每1井添加1600細胞/80uL含10%FBS(HyClone公司，Cat.SH30084.03)的RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific公司，Cat.11875-093)，於5%CO2、濕度95%、37度之條件下培養4小時。於各井中，添加20ul之抗CD147抗體溶液(150ug/ml，50ug/ml)，作成終濃度30、10ug/ml。於5%CO2、濕度95%、37度之條件下培養2日，實施顯微鏡觀察。
相對於人類IgG、#110H1L4hIgG4P之添加所致的細胞累積未被觀察，於#084H1L2hIg4P、4A5、5F6、PPAT-082-03抗體之存在下，觀察到細胞累積，且於盤中央折疊的細胞塊。辨識CD147-D2的#110H1L4hIgG4P係與辨識CD147-D1域的其他之CD147抗體不同，顯示無血液細胞之凝集活性。以#084為首之有細胞凝集活性的CD147抗體，對人類投予的情形，有藉由血液細胞之凝集而發生血栓等之毒性的緣故，冀望藉由血栓之治療所使用的用量之肝素或低分子肝素之皮下注射、或抗血小板藥之併用等，而迴避或減輕副作用。
25)-2細胞介素釋放症候群之風險評價
藉由治療用抗體之投予，OKT3、TGN1412等一部分之抗體，藉由使免疫細胞活性化，血中之細胞介素上升，引起嚴重的細胞介素釋放症候群(Gaston,R.,Kidney International,1991,141-148；Suntharalingam,G.,et al.,N.Engl.J.Med.2006,1018-1028)。已報告一部分之CD147抗體，對免疫細胞作用，干擾素γ、介白素-4之 產生增加的作用(Hu,J.,et al.,J.Cell.Mol.Med.,2010,2132-2143)。此細胞介素釋放症候群所致的抗體醫藥之毒性，可由使用末梢血液的細胞介素釋放分析而預測(Vessillier,S.et al.,J.Immunolol.Methods,2015,43-52)。由同樣之人類末梢血細胞介素釋放分析評價細胞介素釋放症候群之風險。作為CD147抗體，使用#110H1L4hIgG4P、#110chIgG4ProFALA、#084H1L2hIg4P、#084H1L2hIg2，作為比較抗體，使用貝伐單抗(bevacizumab)(Genentech，Inc.)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(Roche Pharma AG)、阿崙單抗(alemtuzumab)(Sanofi股份有限公司)、抗人類CD3抗體(BioLegend Cat.No317326)。對於評價的全部CD147抗體，對於人類末梢血單核球(各評價6個捐贈者)，未觀察到細胞增殖之亢進，對細胞介素之釋放(TNFα、INF-γ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、MIP-1α)的影響，較細胞介素釋放症候群之風險為低的貝伐單抗更弱。於抗人類CD3抗體(OKT3)，觀察到細胞增殖之亢進、細胞介素之釋放(TNFα、INF-γ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、MIP-1α)之亢進。#110H1L4hIgG4P、#110chIgG4ProFALA、#084H1L2hIg4P、#084H1L2hIg2係顯示未誘導成為細胞介素釋放症候群之可能性的細胞介素釋放。
25)-3抗CD147抗體之猴之安全性評價
已報告一部分之抗小鼠CD147抗體，對小鼠投予之際，藉由抑制CD147之機能，誘導於脾臓之紅血球之累 積，抑制末梢血液中之紅血球量，引起貧血(Coste，I.et al.，Blood，2001，3984-3988)。於本發明中取得的#110H1L4hIgG4P等之CD147抗體，因未顯示與小鼠之CD147結合，於小鼠之安全性評價並非適當。因此，作為由使用流式細胞儀的實驗確認對人類及猴CD147的結合性的抗CD147抗體，將#110H1L4hIgG4P投予至食蟹猴，評價安全性。於食蟹猴(雌雄各1例)，以投予可能最大量的99.2mg/kg單次靜脈內投予#110H1L4hIgG4P的結果，於至投予後15日為止之觀察期間及觀察期間結束時之病理組織學的檢查，未觀察到嚴重的毒性(體重及攝餌量之變化、病理組織學的變化)。#110H1L4hIgG4P對食蟹猴未顯示毒性，且顯示可利用於人類之癌症治療的可能性。
(實施例26)KLF5之對CD147抗體感受性的影響
於癌細胞，已知Lethal EMT訊號作為SMAD2/SMAD3/SMAD4依存的細胞死亡的訊號，已報告此Lethal EMT訊號，於SMAD4陰性之癌細胞，通常藉由SMAD訊號而被抑制的轉錄因子KLF5蛋白質之表現會增加，並抑制致死性之訊號(David，C.Cell，2016，1015-1030)。本發明之CD147抗體因將SMAD訊號活性化，於SMAD4陽性之細胞顯示抗腫瘤效果，而被認為誘導SMAD訊號依賴性的細胞死亡。調查KLF5是否參與CD147抗體依賴性的抗腫瘤效果之感受性。
26)-1 KLF5表現株之製作
按照實施例13之方法，製作MIA PaCa-2細胞之KLF5安定表現株。將人類KLF5之胺基酸序列及核苷酸序列各自示於序列識別號145及146。作為KLF5基因，製作將含於(Genscript公司，Cat.OHu21278C)的序列(Ref seq.ID：NM_001730.4)併入的反轉錄病毒載體pQCXIP，用於製作反轉錄病毒。藉由病毒感染而於染色體中併入反轉錄病毒，選擇成為嘌呤黴素(puromycin)耐性、KLF5陽性的MIA PaCa-2細胞，作為KLF5陽性MIA PaCa-2細胞、MIA PaCa-2-KLF5。使同樣地感染反轉錄病毒載體pQCXIP，將成為嘌呤黴素耐性的MIA PaCa-2細胞作為MIA PaCa-2-mock。
26)-2 CD147及SMAD4表現之確認
依據流式細胞儀，確認MIA PaCa-2-mock及MIA PaCa-2-KLF5之CD147之表現。按照實施例13-2之方法，確認MIA PaCa-2-KLF5之KLF5之表現量自MIA PaCa-2-mock增加。KLF5之檢測，使用KLF5抗體(CST公司，Cat.#51586)。
26)-3表現KLF5的MIA PaCa-2腫瘤之對人類化CD147抗體的感受性
按照實施例7)-2之方法，比較MIA PaCa-2-KLF5及MIA PaCa-2-mock之腫瘤之對人類化CD147抗體#110H1L4hIgG4P的感受性。於細胞移植之3日後，以1 mg/kg對負載癌小鼠尾靜脈投予實施例6)-4-2所製作的人類化CD147抗體(#110H1L4hIg4P)(n=6)。7日後同樣地投予抗體。於對照組之負載癌小鼠，同樣地將PBS緩衝液作尾靜脈投予(n=6)。將結果示於圖50。
投予人類化CD147抗體，而於14日後，MIA PaCa-2-mock之腫瘤係腫瘤之平均體積減少至對照組之9%，對CD147抗體顯示感受性。MIA PaCa-2-KLF5之腫瘤之平均體積係成為對照組之80%，顯示對CD147抗體為低感受性。可知CD147抗體所致的SMAD訊號依賴的抗腫瘤效果係由於KLF5之表現而被抑制。
產業上之利用可能性
依據本發明，提供將CD147活性化，並顯示高抗腫瘤效果的CD147特異性抗體。依據本發明，提供不依存於效應子機能而顯示高抗腫瘤效果的抗體。本發明之抗體係於肝癌細胞，顯示較作為肝癌之標準治療藥中之一者所使用的索拉非尼更顯著強的藥效。本發明之抗體係於胰臓癌細胞，顯示較作為胰臓癌之標準治療藥中之一者所使用的吉西他濱更顯著強的藥效。又，本發明之抗體係於慢性骨髓性白血病細胞，顯示較作為慢性骨髓性白血病之標準治療藥中之一者所使用的伊馬替尼更顯著強的藥效。本發明之抗體，其抗腫瘤效果並不依存於效應子機能，且於其他安全性評價項目亦疑慮少且安全性優異的抗CD147抗體被提供。CD147雖不僅於腫瘤細胞表現，亦於血液細胞中表現，但因本發明之抗體並未對T細胞及PBMC作用且亦不依存於效應子機 能，因而於作為抗腫瘤劑之開發，具有所謂安全性之擔憂少的優點。依據本發明，提供含有上述抗體的醫藥組成物，以及使用該抗體及/或該醫藥組成物的腫瘤之治療方法。
[序列表非關鍵詞文字]
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序列識別號143：人類CD147v1之mu3區域
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序列識別號146：人類KLF5之核苷酸序列
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序列識別號150：#110L2h之核苷酸序列
序列識別號151：#110L12h之胺基酸序列
序列識別號152：#110L12h之核苷酸序列
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<213> 小鼠
<400> 8
Figure 107125910-A0202-12-0197-26
Figure 107125910-A0202-12-0198-29
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 9
Figure 107125910-A0202-12-0198-30
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 10
Figure 107125910-A0202-12-0198-31
Figure 107125910-A0202-12-0199-108
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
Figure 107125910-A0202-12-0199-109
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 12
Figure 107125910-A0202-12-0199-110
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Figure 107125910-A0202-12-0199-111
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
Figure 107125910-A0202-12-0199-112
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
Figure 107125910-A0202-12-0200-113
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
Figure 107125910-A0202-12-0200-114
<210> 17
<211> 324
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 17
Figure 107125910-A0202-12-0200-116
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 18
Figure 107125910-A0202-12-0200-117
Figure 107125910-A0202-12-0201-118
<210> 19
<211> 351
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 19
Figure 107125910-A0202-12-0201-119
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 20
Figure 107125910-A0202-12-0201-120
Figure 107125910-A0202-12-0202-121
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 21
Figure 107125910-A0202-12-0202-122
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 22
Figure 107125910-A0202-12-0202-123
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 23
Figure 107125910-A0202-12-0202-124
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 24
Figure 107125910-A0202-12-0202-125
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 25
Figure 107125910-A0202-12-0203-126
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 26
Figure 107125910-A0202-12-0203-127
<210> 27
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類kappa鏈一致區域的DNA序列的DNA
<400> 27
Figure 107125910-A0202-12-0203-128
<210> 28
<211> 1132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1一致區域之胺基酸的DNA序列的DNA
<400> 28
Figure 107125910-A0202-12-0203-129
Figure 107125910-A0202-12-0204-130
<210> 29
<211> 1114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG2一致區域之胺基酸的DNA序列的DNA
<400> 29
Figure 107125910-A0202-12-0204-132
Figure 107125910-A0202-12-0205-133
<210> 30
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_輕鏈
<400> 30
Figure 107125910-A0202-12-0205-134
Figure 107125910-A0202-12-0206-135
<210> 31
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_輕鏈
<400> 31
Figure 107125910-A0202-12-0206-136
Figure 107125910-A0202-12-0207-137
<210> 32
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_重鏈_IgG1
<400> 32
Figure 107125910-A0202-12-0207-138
Figure 107125910-A0202-12-0208-139
<210> 33
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_重鏈_IgG1
<400> 33
Figure 107125910-A0202-12-0208-140
Figure 107125910-A0202-12-0209-141
Figure 107125910-A0202-12-0210-142
<210> 34
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_重鏈_IgG2
<400> 34
Figure 107125910-A0202-12-0210-143
Figure 107125910-A0202-12-0211-144
<210> 35
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_重鏈_IgG2
<400> 35
Figure 107125910-A0202-12-0211-145
Figure 107125910-A0202-12-0212-146
Figure 107125910-A0202-12-0213-147
<210> 36
<211> 1454
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類嵌合LN22R8_重鏈_IgG4P型之胺基酸序列之DNA序列的DNA
<400> 36
Figure 107125910-A0202-12-0213-148
Figure 107125910-A0202-12-0214-149
<210> 37
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合LN22R8_重鏈_IgG4P
<400> 37
Figure 107125910-A0202-12-0214-150
Figure 107125910-A0202-12-0215-151
Figure 107125910-A0202-12-0216-152
<210> 38
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1LALA一致區域之胺基酸序列的DNA序列的DNA
<400> 38
Figure 107125910-A0202-12-0217-153
<210> 39
<211> 1117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG4P一致區域之胺基酸之DNA序列的DNA
<400> 39
Figure 107125910-A0202-12-0217-154
Figure 107125910-A0202-12-0218-155
<210> 40
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_輕鏈
<400> 40
Figure 107125910-A0202-12-0218-156
Figure 107125910-A0202-12-0219-157
<210> 41
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_輕鏈
<400> 41
Figure 107125910-A0202-12-0219-158
Figure 107125910-A0202-12-0220-159
<210> 42
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_重鏈_IgG1LALA
<400> 42
Figure 107125910-A0202-12-0220-161
Figure 107125910-A0202-12-0221-162
<210> 43
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_重鏈_IgG1LALA
<400> 43
Figure 107125910-A0202-12-0221-165
Figure 107125910-A0202-12-0222-166
Figure 107125910-A0202-12-0223-167
<210> 44
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_重鏈_IgG2
<400> 44
Figure 107125910-A0202-12-0223-168
Figure 107125910-A0202-12-0224-169
<210> 45
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_重鏈_IgG2
<400> 45
Figure 107125910-A0202-12-0224-170
Figure 107125910-A0202-12-0225-171
Figure 107125910-A0202-12-0226-172
<210> 46
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_重鏈_IgG4P
<400> 46
Figure 107125910-A0202-12-0226-174
Figure 107125910-A0202-12-0227-175
<210> 47
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合2P10F2_重鏈_IgG4P
<400> 47
Figure 107125910-A0202-12-0227-176
Figure 107125910-A0202-12-0228-177
Figure 107125910-A0202-12-0229-178
<210> 48
<211> 324
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 48
Figure 107125910-A0202-12-0229-179
<210> 49
<211> 108
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 49
Figure 107125910-A0202-12-0230-180
<210> 50
<211> 363
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 50
Figure 107125910-A0202-12-0230-181
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 51
Figure 107125910-A0202-12-0231-182
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 52
Figure 107125910-A0202-12-0231-183
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 53
Figure 107125910-A0202-12-0231-184
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 54
Figure 107125910-A0202-12-0232-185
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 55
Figure 107125910-A0202-12-0232-186
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 56
Figure 107125910-A0202-12-0232-187
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 57
Figure 107125910-A0202-12-0232-190
<210> 58
<211> 324
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 58
Figure 107125910-A0202-12-0232-189
Figure 107125910-A0202-12-0233-191
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 59
Figure 107125910-A0202-12-0233-192
<210> 60
<211> 354
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 60
Figure 107125910-A0202-12-0233-194
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 61
Figure 107125910-A0202-12-0234-195
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 62
Figure 107125910-A0202-12-0234-196
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 63
Figure 107125910-A0202-12-0234-197
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 64
Figure 107125910-A0202-12-0235-198
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 65
Figure 107125910-A0202-12-0235-199
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 66
Figure 107125910-A0202-12-0235-200
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 67
Figure 107125910-A0202-12-0235-203
<210> 68
<211> 324
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 68
Figure 107125910-A0202-12-0235-202
Figure 107125910-A0202-12-0236-204
<210> 69
<211> 108
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 69
Figure 107125910-A0202-12-0236-205
<210> 70
<211> 351
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 70
Figure 107125910-A0202-12-0236-206
<210> 71
<211> 117
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 71
Figure 107125910-A0202-12-0237-207
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 72
Figure 107125910-A0202-12-0237-208
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 73
Figure 107125910-A0202-12-0237-209
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 74
Figure 107125910-A0202-12-0238-210
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 75
Figure 107125910-A0202-12-0238-211
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 76
Figure 107125910-A0202-12-0238-212
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 77
Figure 107125910-A0202-12-0238-213
<210> 78
<211> 324
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 78
Figure 107125910-A0202-12-0238-215
Figure 107125910-A0202-12-0239-216
<210> 79
<211> 108
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 79
Figure 107125910-A0202-12-0239-217
<210> 80
<211> 357
<212> DNA
<213> 褐鼠
<400> 80
Figure 107125910-A0202-12-0239-219
<210> 81
<211> 119
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 81
Figure 107125910-A0202-12-0240-220
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 82
Figure 107125910-A0202-12-0240-221
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 83
Figure 107125910-A0202-12-0240-222
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 84
Figure 107125910-A0202-12-0241-223
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 85
Figure 107125910-A0202-12-0241-224
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 86
Figure 107125910-A0202-12-0241-225
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 87
Figure 107125910-A0202-12-0241-226
<210> 88
<211> 1117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人重鏈訊息序列及人類IgG4PFALA一致區域之胺基酸的DNA序列之DNA
<400> 88
Figure 107125910-A0202-12-0241-227
Figure 107125910-A0202-12-0242-228
<210> 89
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_輕鏈
<400> 89
Figure 107125910-A0202-12-0242-229
Figure 107125910-A0202-12-0243-230
<210> 90
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_輕鏈
<400> 90
Figure 107125910-A0202-12-0243-231
Figure 107125910-A0202-12-0244-232
<210> 91
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG1
<400> 91
Figure 107125910-A0202-12-0244-233
Figure 107125910-A0202-12-0245-234
<210> 92
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG1
<400> 92
Figure 107125910-A0202-12-0245-235
Figure 107125910-A0202-12-0246-236
Figure 107125910-A0202-12-0247-237
<210> 93
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG2
<400> 93
Figure 107125910-A0202-12-0247-239
Figure 107125910-A0202-12-0248-240
<210> 94
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG2
<400> 94
Figure 107125910-A0202-12-0248-241
Figure 107125910-A0202-12-0249-242
Figure 107125910-A0202-12-0250-243
<210> 95
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG4P
<400> 95
Figure 107125910-A0202-12-0250-245
Figure 107125910-A0202-12-0251-246
<210> 96
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG4P
<400> 96
Figure 107125910-A0202-12-0251-247
Figure 107125910-A0202-12-0252-248
Figure 107125910-A0202-12-0253-249
<210> 97
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG1LALA
<400> 97
Figure 107125910-A0202-12-0254-250
<210> 98
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG1LALA
<400> 98
Figure 107125910-A0202-12-0255-251
Figure 107125910-A0202-12-0256-252
Figure 107125910-A0202-12-0257-253
<210> 99
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG4PFALA
<400> 99
Figure 107125910-A0202-12-0257-254
Figure 107125910-A0202-12-0258-255
<210> 100
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠84_重鏈_IgG4PFALA
<400> 100
Figure 107125910-A0202-12-0258-256
Figure 107125910-A0202-12-0259-257
Figure 107125910-A0202-12-0260-258
<210> 101
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_輕鏈
<400> 101
Figure 107125910-A0202-12-0260-259
<210> 102
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_輕鏈
<400> 102
Figure 107125910-A0202-12-0261-260
Figure 107125910-A0202-12-0262-261
<210> 103
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_重鏈_IgG2
<400> 103
Figure 107125910-A0202-12-0262-262
Figure 107125910-A0202-12-0263-263
<210> 104
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_重鏈_IgG2
<400> 104
Figure 107125910-A0202-12-0263-264
Figure 107125910-A0202-12-0264-265
Figure 107125910-A0202-12-0265-266
<210> 105
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_重鏈_IgG4P
<400> 105
Figure 107125910-A0202-12-0265-267
Figure 107125910-A0202-12-0266-268
<210> 106
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_重鏈_IgG4P
<400> 106
Figure 107125910-A0202-12-0266-269
Figure 107125910-A0202-12-0267-270
Figure 107125910-A0202-12-0268-271
<210> 107
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_重鏈_IgG4PFALA
<400> 107
Figure 107125910-A0202-12-0268-272
Figure 107125910-A0202-12-0269-273
<210> 108
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠101_重鏈_IgG4PFALA
<400> 108
Figure 107125910-A0202-12-0269-274
Figure 107125910-A0202-12-0270-275
Figure 107125910-A0202-12-0271-276
<210> 109
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_輕鏈
<400> 109
Figure 107125910-A0202-12-0271-277
<210> 110
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_輕鏈
<400> 110
Figure 107125910-A0202-12-0272-278
Figure 107125910-A0202-12-0273-279
<210> 111
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_重鏈_IgG2
<400> 111
Figure 107125910-A0202-12-0273-280
Figure 107125910-A0202-12-0274-281
<210> 112
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_重鏈_IgG2
<400> 112
Figure 107125910-A0202-12-0274-282
Figure 107125910-A0202-12-0275-283
Figure 107125910-A0202-12-0276-284
<210> 113
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_重鏈_IgG4P
<400> 113
Figure 107125910-A0202-12-0276-285
Figure 107125910-A0202-12-0277-286
<210> 114
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_重鏈_IgG4P
<400> 114
Figure 107125910-A0202-12-0277-287
Figure 107125910-A0202-12-0278-288
Figure 107125910-A0202-12-0279-289
<210> 115
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_重鏈_IgG4PFALA
<400> 115
Figure 107125910-A0202-12-0279-290
Figure 107125910-A0202-12-0280-291
<210> 116
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠110_重鏈_IgG4PFALA
<400> 116
Figure 107125910-A0202-12-0280-292
Figure 107125910-A0202-12-0281-293
Figure 107125910-A0202-12-0282-294
<210> 117
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠131_輕鏈
<400> 117
Figure 107125910-A0202-12-0282-295
Figure 107125910-A0202-12-0283-296
<210> 118
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠131_輕鏈
<400> 118
Figure 107125910-A0202-12-0283-297
Figure 107125910-A0202-12-0284-298
<210> 119
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠131_重鏈_IgG2
<400> 119
Figure 107125910-A0202-12-0284-299
Figure 107125910-A0202-12-0285-300
<210> 120
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠131_重鏈_IgG2
<400> 120
Figure 107125910-A0202-12-0285-301
Figure 107125910-A0202-12-0286-302
Figure 107125910-A0202-12-0287-303
<210> 121
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠131_重鏈_IgG4P
<400> 121
Figure 107125910-A0202-12-0287-304
Figure 107125910-A0202-12-0288-305
<210> 122
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類嵌合大鼠131_重鏈_IgG4P
<400> 122
Figure 107125910-A0202-12-0288-306
Figure 107125910-A0202-12-0289-307
Figure 107125910-A0202-12-0290-308
<210> 123
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #84H1hIgG2
<400> 123
Figure 107125910-A0202-12-0290-309
Figure 107125910-A0202-12-0291-310
Figure 107125910-A0202-12-0292-311
<210> 124
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #84H1hIgG2
<400> 124
Figure 107125910-A0202-12-0292-312
Figure 107125910-A0202-12-0293-313
<210> 125
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #84H1hIgG4P
<400> 125
Figure 107125910-A0202-12-0293-314
Figure 107125910-A0202-12-0294-315
Figure 107125910-A0202-12-0295-316
<210> 126
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #84H1hIgG4P
<400> 126
Figure 107125910-A0202-12-0296-317
<210> 127
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #84L2h
<400> 127
Figure 107125910-A0202-12-0297-318
Figure 107125910-A0202-12-0298-319
<210> 128
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #84L2h
<400> 128
Figure 107125910-A0202-12-0298-320
<210> 129
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #101H1hIgG2
<400> 129
Figure 107125910-A0202-12-0298-321
Figure 107125910-A0202-12-0299-322
Figure 107125910-A0202-12-0300-323
<210> 130
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #101H1hIgG2
<400> 130
Figure 107125910-A0202-12-0301-324
<210> 131
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #101H1hIgG4P
<400> 131
Figure 107125910-A0202-12-0302-325
Figure 107125910-A0202-12-0303-326
<210> 132
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #101H1hIgG4P
<400> 132
Figure 107125910-A0202-12-0304-327
<210> 133
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #101L2h
<400> 133
Figure 107125910-A0202-12-0305-328
Figure 107125910-A0202-12-0306-329
<210> 134
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #101L2h
<400> 134
Figure 107125910-A0202-12-0306-330
<210> 135
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #110H1hIgG4P
<400> 135
Figure 107125910-A0202-12-0306-331
Figure 107125910-A0202-12-0307-332
Figure 107125910-A0202-12-0308-333
<210> 136
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #110H1hIgG4P
<400> 136
Figure 107125910-A0202-12-0309-334
<210> 137
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #110L4h
<400> 137
Figure 107125910-A0202-12-0310-335
Figure 107125910-A0202-12-0311-336
<210> 138
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #110L4h
<400> 138
Figure 107125910-A0202-12-0311-337
<210> 139
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #131H2hIgG2
<400> 139
Figure 107125910-A0202-12-0311-338
Figure 107125910-A0202-12-0312-339
Figure 107125910-A0202-12-0313-340
<210> 140
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #131H2hIgG2
<400> 140
Figure 107125910-A0202-12-0313-341
Figure 107125910-A0202-12-0314-342
<210> 141
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #131L2h
<400> 141
Figure 107125910-A0202-12-0314-343
Figure 107125910-A0202-12-0315-344
<210> 142
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #131L2h
<400> 142
Figure 107125910-A0202-12-0316-345
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Figure 107125910-A0202-12-0316-346
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 144
Figure 107125910-A0202-12-0316-348
<210> 145
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Figure 107125910-A0202-12-0317-349
Figure 107125910-A0202-12-0318-350
Figure 107125910-A0202-12-0319-351
<210> 146
<211> 1374
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
Figure 107125910-A0202-12-0319-353
<210> 147
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #110H13hIgG4P
<400> 147
Figure 107125910-A0202-12-0320-354
Figure 107125910-A0202-12-0321-355
Figure 107125910-A0202-12-0322-356
<210> 148
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #110H13hIgG4P
<400> 148
Figure 107125910-A0202-12-0322-357
Figure 107125910-A0202-12-0323-358
<210> 149
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #110L2h
<400> 149
Figure 107125910-A0202-12-0323-359
Figure 107125910-A0202-12-0324-360
<210> 150
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #110L2h
<400> 150
Figure 107125910-A0202-12-0324-361
<210> 151
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #110L12h
<400> 151
Figure 107125910-A0202-12-0325-362
Figure 107125910-A0202-12-0326-363
<210> 152
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> #110L12h
<400> 152
Figure 107125910-A0202-12-0326-364

Claims (70)

  1. 一種抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈序列及輕鏈序列，其中：(A)在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號75所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號76所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號77所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號72所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成；(B)在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號55所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號56所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號57所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號52所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號53所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號54所示的胺基酸序列所構成；(C)在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號 65所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號62所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號64所示的胺基酸序列所構成；或(D)在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號85所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號86所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號87所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號82所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號83所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號84所示的胺基酸序列所構成。
  2. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其ADCC活性降低或缺失。
  3. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其CDC活性降低或缺失。
  4. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其ADCP活性降低或缺失。
  5. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段， 其與包含自序列識別號3之第106號之精胺酸(Arg)至第165號之甘胺酸(Gly)之殘基的抗原決定位結合。
  6. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其與包含序列識別號3記載之胺基酸序列中之第106號之精胺酸(Arg)、第108號之離胺酸(Lys)、第109號之丙胺酸(Ala)、第110號之纈胺酸(Val)、第127號之離胺酸(Lys)、第128號之絲胺酸(Ser)、第129號之麩胺酸(Glu)、第130號之絲胺酸(Ser)、第131號之纈胺酸(Val)、第132號之脯胺酸(Pro)、第133號之脯胺酸(Pro)、第134號之纈胺酸(Val)、第164號之麩醯胺酸(Gln)及第165號之甘胺酸(Gly)之各殘基的抗原決定位結合。
  7. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其中在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號75所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號76所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號77所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號72所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號73所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號74所示的胺基酸序列所構成。
  8. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其與包含序列識別號143記載之胺基酸序列、或於序 列識別號143之序列中有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的抗原決定位結合。
  9. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合性片段，其中在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，且前述CDRH1係由序列識別號55所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號56所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號57所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號52所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號53所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號54所示的胺基酸序列所構成。
  10. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合性片段，其中在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號65所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號66所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號67所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號62所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號63所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序 列識別號64所示的胺基酸序列所構成。
  11. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合性片段，其中在重鏈序列中，其包含具有CDRH1、CDRH2及CDRH3的可變區域，前述CDRH1係由序列識別號85所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號86所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號87所示的胺基酸序列所構成；及在輕鏈序列中，其包含具有CDRL1、CDRL2及CDRL3的可變區域，前述CDRL1係由序列識別號82所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號83所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號84所示的胺基酸序列所構成。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其係選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv的群組。
  13. 如請求項1至11中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其為scFv。
  14. 如請求項1至11中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其為嵌合抗體。
  15. 如請求項1至11中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其為經人化。
  16. 如請求項1至11中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其重鏈包含人類免疫球蛋白G1重鏈、人類免疫球蛋白G2重鏈或人類免疫球蛋白G4重鏈之 恆定區域，輕鏈包含人類免疫球蛋白κ輕鏈之恆定區域。
  17. 如請求項16之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其重鏈包含人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域。
  18. 請求項17之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其中於人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，由EU索引(EU index)所示的第228號之絲胺酸(Ser)經脯胺酸(Pro)取代。
  19. 如請求項17之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其於人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，由EU索引所示的第234號之苯丙胺酸(Phe)被取代為丙胺酸(Ala)，第235號之白胺酸(Leu)被取代為丙胺酸(Ala)。
  20. 如請求項17之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其於人類免疫球蛋白G4重鏈之恆定區域，由EU索引所示的第228號之絲胺酸(Ser)被取代為脯胺酸(Pro)，第234號之苯丙胺酸(Phe)被取代為丙胺酸(Ala)，第235號之白胺酸(Leu)被取代為丙胺酸(Ala)。
  21. 如請求項16之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其中重鏈包含人類免疫球蛋白G2重鏈之恆定區域。
  22. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其具有以下之(c)及(d)，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(c)選自包含以下之(c1)~(c2)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(c1)由序列識別號135所示的胺基酸序列之第 20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及(c2)由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域，以及(d)選自包含以下之(d1)~(d3)的群組的任一者記載之輕鏈可變區域：(d1)由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；(d2)由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域；及(d3)由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  23. 如請求項22之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  24. 如請求項22之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含由序列識別號135所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈；及由序列識別號137所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
  25. 如請求項22之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含 由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  26. 如請求項22之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈；及由序列識別號149所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
  27. 如請求項22之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~136號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  28. 如請求項22之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含由序列識別號147所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈；及由序列識別號151所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
  29. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其具有以下之(a)及(b)，且將透過CD147的訊息傳導活性化， (a)選自包含以下之(a1)~(a4)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(a1)由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及(a2)由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域，以及(b)由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  30. 如請求項29之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含：由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域或由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20~140號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  31. 如請求項29之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含：由序列識別號123所示的胺基酸序列之第20~466號之胺基酸殘基所構成的重鏈或由序列識別號125所示的胺基酸序列之第20~467號之胺基酸殘基所構成的重鏈；及由序列識別號127所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
  32. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其具有以下之(e)及(f)，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(e)選自包含以下之(e1)~(e2)的群組的任一者記載之重鏈可變區域：(e1)由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及(e2)由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域，以及(f)由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  33. 如請求項32之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含：由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域或由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20~137號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  34. 如請求項32之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含：由序列識別號129所示的胺基酸序列之第20~463號之胺基酸殘基所構成的重鏈或由序列識別號131所示的胺基酸序列之第20~464號之胺基酸殘基所構成的 重鏈；及由序列識別號133所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
  35. 如請求項1之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其具有以下之(g)及(h)，且將透過CD147的訊息傳導活性化，(g)由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域，及(h)由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  36. 如請求項35之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含：由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區域；及由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~128號之胺基酸殘基所構成的輕鏈可變區域。
  37. 如請求項35之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其包含：由序列識別號139所示的胺基酸序列之第20~464號之胺基酸殘基所構成的重鏈；及由序列識別號141所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基所構成的輕鏈。
  38. 如請求項22至37中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其ADCC活性為降低或缺失。
  39. 如請求項22至37中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其CDC活性為降低或缺失。
  40. 如請求項22至37中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其ADCP活性為降低或缺失。
  41. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段之至少任一者。
  42. 如請求項41之醫藥組成物，其為抗腫瘤劑。
  43. 如請求項42之醫藥組成物，其中腫瘤為表現CD147的腫瘤。
  44. 如請求項42或43之醫藥組成物，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腦腫瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
  45. 如請求項42或43之醫藥組成物，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞 型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
  46. 如請求項42或43之醫藥組成物，其中腫瘤為SMAD4陽性的腫瘤或KLF5之表現降低或KLF5之表現缺失的腫瘤。
  47. 如請求項42或43之醫藥組成物，其進一步含有其他抗腫瘤劑。
  48. 一種如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段或如請求項41至47中任一項之醫藥組成物之用途，其係用於製造腫瘤之治療用藥劑。
  49. 如請求項48之用途，其中腫瘤為表現CD147的腫瘤。
  50. 如請求項48或49之用途，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腦腫瘤、消化道間質腫瘤(GIST)、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
  51. 如請求項48或49之用途，其中腫瘤為胰臓癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病(ALL)、惡性淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
  52. 如請求項48或49之用途，其中腫瘤為SMAD4陽性的腫瘤或KLF5之表現為降低或缺失的腫瘤。
  53. 如請求項48或49之用途，其中前述腫瘤之治療用藥劑係與另外的抗腫瘤劑組合而投予。
  54. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段。
  55. 如請求項54之多核苷酸，其包含：編碼由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號76記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號77記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸；及編碼由序列識別號72記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號73記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號74記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸。
  56. 如請求項54之多核苷酸，其包含：編碼由序列識別號55記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號56記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號57記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸；及編碼由序列識別號52記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號53記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號54記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸。
  57. 如請求項54之多核苷酸，其包含： 編碼由序列識別號65記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號66記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號67記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸；及編碼由序列識別號62記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號64記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸。
  58. 如請求項54之多核苷酸，其包含：編碼由序列識別號85記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號86記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號87記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的多核苷酸；及編碼由序列識別號82記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號83記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號84記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的多核苷酸。
  59. 一種表現載體，其含有如請求項54至58中任一項之多核苷酸。
  60. 一種宿主細胞，其係藉由如請求項59之表現載體而轉形。
  61. 一種如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段之製造方法，其包含培養如請求項60之宿主細胞，自培養產物採取目的之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段的步驟。
  62. 如請求項1、4、22至37中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其中透過CD147的訊息傳導之活性化係p38MAPK之活性化及/或SMAD4之活性化。
  63. 如請求項62之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段，其中p38MAPK之活性化及/或SMAD4之活性化係p38MAPK之表現量之增加、p38MAPK之磷酸化、HSP27之磷酸化、CXCL8表現量之增加、rhoB表現量之增加、KLF5 mRNA之降低或KLF5蛋白質表現量之降低。
  64. 一種如請求項62或63之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製造腫瘤之治療用藥劑。
  65. 一種預測對於癌症治療的反應性的方法，其包含檢測在源自癌患者的生物學的試料中SMAD4之表現或KLF5之表現；及將檢測出SMAD4表現的患者或檢測出KLF5的表現降低或缺失的患者，判定為對於利用如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段或如請求項41至47中任一項之醫藥組成物的癌症治療有反應性。
  66. 一種篩選癌症治療對象的方法，其包含檢測在源自癌患者的生物學的試料中SMAD4之表現或KLF5之表現；及將檢測出SMAD4表現的患者或檢測出KLF5之表現降低或KLF5之表現缺失的患者，篩選來作為利用如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原 結合片段或如請求項41至47中任一項之醫藥組成物的癌症治療之對象者。
  67. 一種如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段或如請求項41至47中任一項之醫藥組成物之用途，其係用於製造癌症治療用藥劑，該治療用藥劑係用於以下患者：使用源自癌患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中所含的SMAD4之表現的有無或檢測KLF5之表現，而檢測出SMAD4表現的患者或檢測出KLF5之表現降低或KLF5之表現缺失的患者。
  68. 一種套組，其係用以判定對於利用如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段或如請求項41至47中任一項之醫藥組成物的癌症治療之反應性的套組，該套組至少包含檢測在源自癌患者的生物學的試料中SMAD4之表現或KLF5之表現的手段。
  69. 一種抗體藥物複合體，其包含與其他藥物結合之如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段。
  70. 一種雙特異性抗體(bispecific antibody)，其包含如請求項1至40中任一項之抗人類CD147抗體或其抗原結合片段中的抗原結合片段、及與CD147以外之抗原結合的抗原結合片段。
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