KR20170085595A - 혈뇌 장벽 수용체 항체 및 사용 방법 - Google Patents

혈뇌 장벽 수용체 항체 및 사용 방법 Download PDF

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라이안 제이. 와츠
조이 유 쯔체로
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제넨테크, 인크.
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Abstract

명은 혈뇌 장벽상에서 발현되는 수용체에 결합하는 항체 및 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

혈뇌 장벽 수용체 항체 및 사용 방법{BLOOD BRAIN BARRIER RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 USC §119(e) 하에 하기 미국 출원의 우선권을 주장한다. 가출원 번호 제62/090295호, 2014년 12월 10일자로 출원됨 그리고 가출원 번호 제62/251983호, 2015년 11월 6일자로 출원됨(이의 전문은 본원에 참조로 인용됨).
기술 분야
본 발명은 혈뇌 장벽상에서 발현되는 수용체에 결합하는 항체 및 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
대형 분자 약물의 뇌 침투는 상당한 불침투성의 혈뇌 장벽 (BBB)에 의해 크게 제한된다. 상기 장벽을 극복하기 위한 한가지 전략은 뇌 모세관 내피에서 발현되는 내인성 수용체의 통과세포외 배출 추적 경로를 활용하는 것이다. 단클론 항체와 같은 재조합 단백질은 대형 분자의 뇌로의 수용체 매개된 전달을 가능하도록 상기 수용체에 대항하여 고안되었다. 이들 수용체는 필수 아미노산, 글루코오스 및 뇌에서 요구되는 다른 자원의 수송과 같은 중요한 생물학적 기능을 수행하기 때문에, 상기 분자의 수송이 상기 표적화 항체에 의해 차단되지 않는 것이 중요하다. 추가로, BBB 상에 발현된 수용체는 또한 흔히 다른 구획에서 발현되기 때문에 또한, 상기 항체가 위험한 표적외 효과를 갖지 않는 것이 중요하다.
요약
수용체 매개된 수송 (RMT) 기반 이중특이적 표적화 기술은 CNS 질환에 대한 광범위한 잠재적 치료제를 위한 문을 열수 있는 잠재력을 갖는다. 과거 연구는 트랜스페린 수용체에 대한 항체가 항체 및 소분자를 포함하는 치료제를 마우스에서 단일 전신 주사 후 미량 및 치료학적 관련 용량 둘다에서 BBB를 거쳐 전달할 수 있음을 보여주었다(예를 들면, 하기 문헌을 참조한다: WO 2012/075037). 상기 논의된 바와 같이, 이들 기술을 디자인하는 경우 중요한 고려 사항은 표적 BBB 수용체 (BBB-R)의 수송 기능 및 안전성 프로파일의 보존을 포함한다. 본원의 개시내용은 이들 표적에 특이적인 항체뿐만 아니라 RMT-기반 표적화 기술에 대한 새로운 표적을 제공한다.
예를 들어, 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 신규한 BBB-R 표적은 BBB에서높은 발현 수준 및 표적에 특이적 항체를 BBB를 거쳐 수송하는 능력을 기반으로 동정하였다. 추가로, 이들 BBB-R 표적에 대한 단일특이적 및 다중특이적 항체를 생성하였다. 이들 항체를 사용하였을 때, 바시긴(basigin), Glut1 및 CD98hc는 제제(예를 들어, 치료제 및/또는 조영제)를 BBB를 거쳐 수송하기 위한 BBB 상의 후보 표적인 것으로 나타났다.
본원의 개시내용의 하나의 측면에서, 본원에서는 제제를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) 혈뇌 장벽 수용체 (BBB-R)에 결합하고 (ii) 제제와 커플링되는 항체에 혈뇌 장벽을 노출시킴을 포함할 수 있고 상기 항체는 BBB-R 수용체에 결합하는 즉시 여기에 커플링된 제제를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송한다. 일부 측면에서, BBB-R은 CD98 중쇄 (CD98hc)이다. 일부 측면에서, BBB-R은 바시긴이다. 상기 방법의 일부 측면에서, BBB-R은 글루코오스 수송체 1형(Glut1)이다. 상기 방법의 일부 측면에서, 상기 혈뇌 장벽은 포유동물 중에 있다. 상기 방법의 일부 측면에서, 포유동물은 신경학적 질환 또는 장애를 갖는다.
본원 개시내용의 또 다른 측면에서, 본원에서는 포유동물에서 신경학적 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) BBB-R에 결합하고; (ii) 신경학적 질환 또는 장애를 치료하기 위해 효과적인 치료학적 제제에 커플링된 항체를 포유동물에게 투여함을 포함할 수 있다. 상기 치료 방법의 일부 측면에서, BBB-R은 CD98hc이다. 상기 치료 방법의 일부 측면에서, BBB-R은 바시긴이다. 상기 치료 방법의 일부 측면에서, BBB-R은 Glut1이다. 상기 치료 방법의 일부 측면에서, 상기 신경학적 질환 또는 장애는 알츠하이머 질환 (AD), 뇌졸중, 치매, 근위축증 (MD), 다발성 경화증 (MS), 근위축성 측색 경화증 (ALS), 낭성 섬유증, 앙겔만 증후군, 리들(Liddle) 증후군, 파킨슨 질환, 픽 (Pick) 질환, 파제트(Paget) 질환, 암, 및 외상성 뇌 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 방법의 특정 측면에서, 포유동물은 인간일 수 있다. 상기 방법의 특정 측면에서, 제제는 조영제일 수 있다. 상기 임의의 측면에서, 상기 제제는 신경학적 장애 약물일 수 있다. 상기 방법의 특정 측면에서, 항체의 BBR-R로의 결합은 이의 본래의 하나 이상의리간드의 결합을 손상시키지 않는다. 상기 방법의 특정 측면에서, 상기 항체의 존재하에 BBB-R의 이의 하나 이상의 본래의 리간드로의 결합은 항체의 부재하에 결합량의 적어도 80%이다. 상기 방법의 특정 측면에서, 항체의 BBB-R로의 결합은 혈뇌 장벽에 걸친 BBB-R의 임의의 본래의 리간드의 수송을 손상시키지 않는다. 상기 방법의 특정 측면에서, 혈뇌 장벽에 걸친 BBB-R의 임의의 본래의 리간드의수송은 항체의 부재하에 수송량의 적어도 80%이다.
상기 방법의 특정 측면에서, 항체는 낮은 결합 친화성을 갖도록 가공되었다. 상기 방법의 특정 측면에서, 상기 항체는 세포 증식, 세포 분열 및/또는 세포 접착을 억제하지 않는다. 상기 방법의 특정 측면에서, 상기 항체는 세포 사멸을 유도하지 않는다. 상기 방법의 특정 측면에서, 항체는 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 100 μM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 5 nM 내지 약 100 μM, 약 50 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 100 μM의 IC50을 갖는다.
상기 방법의 특정 측면에서, 항체는 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 10 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 1 nM 내지 약 500 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 1 nM 내지 약 100 μM의 친화성을 갖는다.
상기 방법의 특정 측면에서, 항체는 치료학적 용량으로 포유동물에게 투여된다. 일부 측면에서, 치료학적 용량은 BBB-R-포화이다.
상기 방법의 특정 측면에서, 항체는 다중특이적이고, 이에 커플링된 제제는 뇌 항원에 결합하는 다중특이적 항체의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 이중특이적이다. 일부 측면에서, 뇌 항원은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 베타-세크레타제 1 (BACE1), 아베타, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 상피성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지질단백질 (예를 들어, 아포지질단백질 E4 (ApoE4)), 알파-시누클레인, CD20, 훈틴그틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), 및 카스파제 6. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 CD98hc 및 BACEI 둘다에 결합한다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 CD98hc 및 아베타 둘다에 결합한다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 바시긴 및 BACEI 둘다에 결합한다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 바시긴 및 아베타 둘다에 결합한다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 Glut1 및 BACEI 둘다에 결합한다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 Glut1 및 아베타 둘다에 결합한다. 일부 측면에서, BBB-R은 CD98hc이다. 일부 측면에서, BBB-R은 바시긴이다.
하나의 측면에서, 본원의 개시내용은 본원에 제공된 바와 같이 혈뇌 장벽에 걸쳐제제를 수송하는 방법에 사용하기에 적합한 항-바시긴 (항-Bsg) 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 상기 항체의 Bsg로의 결합은바시긴의 이의 본래의 하나 이상의 리간드로의 결합을 손상시키지 않는다. 특정 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 상기 항체의 존재하에 Bsg의이의 본래의 하나 이상의 리간드로의 결합량은 상기 항체의 부재하에 Bsg의 하나 이상의 리간드로의 결합량의 적어도 80%이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 상기 항체의 Bsg로의 결합은혈뇌 장벽에 걸친 Bsg 본래의 리간드 하나 이상의 수송을 손상시키지 않는다. 특정 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 상기 항체의 존재하에 혈뇌 장벽에 걸친 Bsg의 본래의 하나 이상의 리간드의 수송량은 항체의 부재하에 혈뇌 장벽에 걸친 본래의 하나 이상의 리간드의 수송량의 적어도 80%이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 하나 이상의 종 기원의 바시긴에 특이적이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Bsg 항체는 쥐 Bsg(mBsg)에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Bsg 항체는 인간 Bsg(hBsg)에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Bsg 항체는 hBsg 및 mBsg에 특이적으로 결합할 수 있다.
하기에 추가로 기재된 바와 같이, 공지된 다수의 Bsg 이소형이 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 이소형 특이적이다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 hBsg의 이소형, 예를 들어, hBsg 이소형 1 (hBsg1), hBsg 이소형 2 (hBsg2)에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 항-hBsg2 항체이다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 mBsg의 이소형에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 Bsg의 세포외 도메인내 에피토프에 결합한다.
일부 측면에서, 본원의 개시내용은 상보성 결정 영역 (CDR), 골격 영역 (FR), 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-Bsg 항체를 제공한다. 일부 구현예에서,
특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Bsg 항체는 서열번호: 3, 19, 35, 51, 및 67로부터 선택된 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 4, 20, 36, 52, 및 68로부터 선택되는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 5, 21, 37, 53, 및 69로부터 선택되는 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 6, 22, 38, 54, 및 70으로부터 선택되는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 7, 23, 39, 55, 및 71로부터 선택되는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 8, 24, 40, 56, 및 72로부터 선택되는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 추가로 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인 골격 영역을 포함한다: FR1에 대해 서열번호: 9, 25, 41, 57, 및 73 으로부터 선택되는 아미노산 서열, FR2에 대해 서열번호: 10, 26, 42, 58, 및 74로부터 선택되는 아미노산 서열, FR3에 대해 서열번호: 11, 27, 43, 59, 및 75로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 FR4에 대해 서열번호: 12, 28, 44, 60, 및 76으로부터 선택되는 아미노산 서열.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인 골격 영역을 추가로 포함한다: FR1에 대해 서열번호: 13, 29, 45, 61, 및 77로부터 선택되는 아미노산 서열, FR2에 대해 서열 번호: 14, 30, 46, 62, 및 78로부터 선택되는 아미노산 서열, FR3에 대해 서열번호: 15, 31, 47, 63, 및 79로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 FR4에 대해 서열번호: 16, 32, 48, 64, 및 80로부터 선택되는 아미노산 서열.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 1, 17, 33, 49, 및 65로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 1, 17, 33, 49 및 65로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 2, 18, 34, 50, 및 66으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 2, 18, 34, 50, 및 66으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 1, 17, 33, 49, 및 65로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 2, 18, 34, 50, 및 66으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 1에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgA이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 17에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 18에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgB이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 33에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 34에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgC이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 49에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 50에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체 항-BsgD이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 65에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 66에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgE이다.
하나의 측면에서, 본원의 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 혈뇌 장벽에 걸쳐제제를 수송하는 방법에 사용하기에 적합한 항-Glut1 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-Glut1 항체가 본원에 제공되고, 상기 항체가 Glut1에 결합하는 것은 Glut1이 하나 이상의 그것의 본래 리간드에 결합하는 것을 손상시키지 않는다. 특정 구현예에서, 항-Glut1 항체가 본원에 제공되고, 여기서, 항체의 존재하에 Glut1이 하나 이상의 그것의 본래 리간드에 결합하는 양이 항체의 부재하에 Glut1이 하나 이상의 그것의 본래 리간드에 결합하는 양의 적어도 80%이다.
일부 구현예에서, 항-Glut1 항체가 제공되고, 상기 항체가 Glut1에 결합하는 것은 혈뇌 장벽에 걸친 하나 이상의 Glut1의 본래 리간드의 수송을 손상시키지 않는다. 특정 구현예에서, 항-Glut1 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 존재하에 혈뇌 장벽에 걸친 하나 이상의 Glut1의 본래 리간드의 수송량은 항체의 부재하에 혈뇌 장벽에 걸친 하나 이상의 본래 리간드의 수송량의 적어도 80%이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 항-Glut1 항체는 하나 이상의 종 기원의 바시긴에 특이적이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Glut1 항체는 쥐 Glut1(mGlut1)에 특이적으로결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Glut1 항체는 인간 Glut1(hGlut1)에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Glut1 항체는 hGlut1 및 mGlut1에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 83을 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 84를 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열 및 서열번호: 85를 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열 및/또는 서열번호: 86을 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 87을 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열 및 서열번호: 88을 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 하기 서열번호에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 골격 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: FR1에 대해 서열번호: 89, FR2에 대해 서열번호: 90, FR3에 대해 서열번호: 91, 및 FR4에 대해 서열번호: 92.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 하기 서열번호에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 골격 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다: FR1에 대해 서열번호: 93, FR2에 대해 서열번호: 94, FR3에 대해 서열번호: 95, 및 FR4에 대해 서열번호: 96.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 81에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 82에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 본원의 개시내용은 BBB-R에 결합할 수 있는 다중특이적 항체를제공한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 본원에 기재된 임의의 항-BBB-R 항체로부터 제1 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 뇌항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 뇌 항원은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: BASCE1, 아베타, EGFR, HER2, 타우(Tau), 아포지질단백질 (예를 들어, ApoE4), 알파-시누클레인, CD20, 훈틴그틴, PrP, LRRK2, 파르킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, DR6, APP, p75NTR, 및 카스파제.
또 다른 측면에서, 본원의 개시내용은 제공된 임의의 항체를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원의 개시내용은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포 및 본원에 기재된 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 따라서, 본원에서는 본원의 개시내용의 항체를 생산하기 위해 숙주 세포를 배양함을 포함하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원의 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 잠재적 수용체 매개 수송 표적의 성공을 결정하기 위해 사용되는 스크리닝 케스케이드를 도시한다.
도 1b는 순수 파지 라이브러리-유래된 항-Lrp1 및 항-인슐린 수용체 (InsR) 항체의, HEK293 세포에서 형질감염된 이들의 상응하는 쥐 수용체로의 결합을 유동 세포측정에 의해 도시한다(각각의 히스토그램에서 좌측에 대한 피크는 대조군 항체(“2nd Ab-PE”)이고 우측에 대한 피크는 항-Lrp1 (좌측 히스토그램) 또는 항-InsR (우측 히스토그램) 항체이다).
도 1c는 뇌 조직의 그램 당 평균 ± SEM % 주사된 용량(그룹 및 시점 당 n=3)으로서 정량된, 야생형 마우스에서 정맥내 투여 후 용량 투여 후 다양한 시점에서 미량의 I125-표지된 항체(항-트랜스페린 수용체 (TfRA), 항-Lrp1, 및 항-InsR)의 뇌 흡수를 정량하는 라인 그래프이다.
도 1d는 20mg/kg의 지정된 항체 용량 투여 1시간 및 24시간 후에 뇌에서 항체 농도를 정량하는 막대 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다(그룹 및 시점 당 n= 6; *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001).
도 1e는 면역조직화학 염색 후 마우스 피질 조직 섹션의 사진을 포함하고, 지정된 항체의 5mg/kg의 정맥내 주사 1시간 후 항체 위치를 도시한다. 축척 막대, 50 μm.
도 2a는 FACS-정제된 BBB 및 야생형 마우스 기원의 간/폐 내피 세포의 마이크로어레이 발현 프로파일링을 사용하여 결정된 바와 같이 BBB에서 풍부한 유전자를 도시한다(문헌참조: Tam 등, Dev Cell. 2012 Feb 14; 22(2): 403-17).
도 2b는 항-Lrp8, 항-Ldlrad3 및 항-CD320 항체의 유동 세포측정 분석을 도시하고 HEK293 세포에서 발현되는 이들의 상응하는 항원으로의 항체의 결합을 보여준다. 각각의 히스토그램에서 좌측에 대한 피크는 대조군 항체에 상응하고 우측에 대한피크는 항-Lrp8, 항-Ldlrad3 및 항-CD320 항체(좌측에서 우측으로의 히스토그램)에 상응한다.
도 2c는 야생형 마우스에서 지정된 항체의 정맥내 투여 후 용량 투여 후 다양한 시점에서 미량의 I125-표지된 항체의 뇌 흡수를 정량하는 라인 그래프이다. 상기 데이터는 뇌 조직의 그램 당 (그룹 및 시점 당 n=3) 평균 ± SEM % 주사된 용량으로서 정량한다.
도 2d 및 2e는 지정된 항체의 20mg/kg의 용량 투여 1시간및 24시간 후 뇌에서 항체 농도를 정량하는 막대 그래프를 보여준다. 막대 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 6; ****P≤ 0.001, *P ≤ 0.05)을 나타내고; “n.s.”, 통계학적으로 유의적이지 않음.
도 2f는 면역조직화학 염색 후 마우스 피질 조직 섹션의 사진을 포함하고 지정된 항체의 5mg/kg의 정맥내 주사 1시간 후 항체 위치를 도시한다. 축척 막대, 50 μm.
도 2g는 RMT에 대해 통상적으로 연구된 수용체에 대한 정제된 내피 세포의 RNA-seq 데이터로부터 생성된 평균 RPKM 값 (유전자 발현)을 정량하는 막대 그래프이고(즉, Tfrc, Lrp1, Insr) 및 마이크로어레이에 의해 동정된 BBB-강화된 유전자(즉, Lrp8, Ldlrad3, CD320). 상기 데이터세트는 뇌 내피 세포 상의 Lrp8, Ldlrad3, 및 CD320의 낮은 절대 mRNA 발현을 밝혔다.
도 3a는 이전에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 야생형 마우스로부터 CD31-양성 및 CD45-음성 뇌 내피 세포 (BEC) 를 단리하기 위해 사용되는 방법을 도시한다(문헌참조: Tam 등, 2012, 상기). 단리된 BEC는 질량 분광측정기 (MS)에 의해 분석하고 상기 결과는 도 3b 및 3c에 나타낸다.
도 3b는 비-BEC와 비교되는 뇌 내피 세포 (BEC)에서의 다른 뇌 세포-특이적 단백질(Fasn, Aldoc, Glul, Plp1)과 비교하여, 각각의 내피 세포 단백질(PgP, Glut1, ZO-1, Esam, Claudin5)에 대하여 MS에 의해 결정된 바와 같은 상위 3개의 최대 풍부 펩타이드 히트에 대한 통합된 강도를 정량하는 막대 그래프이다.
도 3c는 표시된 RMT 표적에 대한 상위 3개의 최대 풍부 펩타이드 히트에 대한 통합된 강도를 정량하는 막대 그래프이다.
도 3d는 문헌, 마이크로어레이, RNA-seq 및 질량 분광측정기에 의해 동정된 잠재적 RMT 표적을 요약하는 표이다.
도 4a는 쥐 바시긴으로 형질감염된 HEK293 세포에의 항-BsgA 및 항-BsgB 결합의 유동 세포측정 분석에 의해 결정된 바와 같은 결합을 정량하는 히스토그램을 포함한다. 각각의 히스토그램에서, 좌측 피크는 대조군 항체에 상응하고 우측에 대한 피크는 항-바시긴 항체에 상응한다.
도 4b는 면역조직화학 염색 후 마우스 피질 조직의 사진을 포함하고 항-BsgA 또는 항-BsgB의 5mg/kg의 정맥내 주사 1시간 후 항체 위치를 도시한다. 축척 막대, 50 μm.
도 4c는 정맥내 투여 후, 용량 투여 후 지정된 시점 (시간(hr))에서 야생형 마우스에서 표시된 I125-표지된 항-바시긴 항체의 뇌 흡수를 정량하는 라인 그래프이고, 뇌 조직의 그램 당 평균 ± SEM % 주사된 용량 (그룹 및 시점 당 n=3)으로서 정량된다.
도 4d 및 도 4e는 20mg/kg의 지정된 항체의 용량 투여 1시간 및 24시간 후 각각 뇌 및 혈장에서 지정된 항체의 수준을 정량하는 막대 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 6; *P≤ 0.05, **P≤ 0.01, ****P≤ 0.0001)을 나타낸다.
도 4f는 2가(단일특이적) 항-Bsg (실선(solid)) 대 이중특이적 (1가 항-Bsg) 항-Bsg/BACE 1 항체(점선)의 쥐 바시긴으로의 결합의 경쟁적 ELISA 비교 결과를 도시한다 (IC50: 항-BsgA- 7.1nM, 항-BsgA/BACE1- 105.5nM, 항-BsgB- 17.5nM, 항-BsgB/BACE1- 126.6nM).
도 4g- 4i 는 항-Bsg/BACE1 항체 또는 대조군 IgG의 50mg/kg의 정맥내 투여 24시간 후 각각 뇌 항체 농도(nM), 뇌 Aβ 농도(pg/g) 및 혈장 항체 농도(μM)를 정량하는 막대 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 6; **P ≤ 0.01, ****P≤ 0.0001)을 나타내고, “n.s.”, 통계학적으로 유의적이지 않음.
도 5a는 Glut1을 안정하게 발현하는 HEK293 세포로의 항-Glut1 결합을 도시하는 유동 세포측정 히스토그램이다. 최좌측 피크는 대조군 항체에 상응한다.
도 5b 는 면역조직화학 염색 후 마우스 피질 조직 섹션의 사진이고 항-Glut1 항체의 5mg/kg의 정맥내 주사 1시간 후 항체 위치를 도시한다. 축척 막대, 50 μm.
도 5c는 야생형 마우스에서 정맥내 투여 후, 용량 투여 후 다양한 시점에서 미량의 I125-표지된 항-Glut1의 뇌 흡수를 정량하는 라인 그래프이고, 뇌 조직의 그램 당 평균 ± SEM % 주사된 용량(그룹 및 시점 당 n=3)으로서 정량된다.
도 5d 및 도 5e는 지정된 항체의 20mg/kg의 용량 투여 수일 후 각각 뇌 및 혈장에서 항체 수준을 정량하는 라인 그래프이다.
도 5F는 2가 (단일특이적) 항-Glut1(실선) 대 이중특이적 (1가 항-Glut1) 항-Glut1/BACE1(점선)의 Glut1을 안정하게 발현하는 HEK293 세포로의 결합의 유동 세포측정 분석에 의해 결정되는 평균 형광 강도(MFI)를 정량하는 라인 그래프이다. (EC50: 항-Glut1- 0.6 μg/mL, 항-Glut1/BACE1- >10 μg/mL).
도 5g, 5h, 5i, 및 5j는 항-Glut11/BACE1 또는 대조군 IgG의 단일 50mg/kg의 정맥내 투여 수일 후 각각 혈장 항체 농도, 뇌 항체 농도, 뇌 Aβ 수준 및 혈장 Aβ 수준을 정량하는 라인 그래프이다.
도 5k 및 5l 은 지정된 항체의 20mg/kg의 용량 투여 1시간 및 24시간후 뇌에서 뇌 그램 당 퍼센트 (%) 주사된 용량 (도 5k) 또는 뇌 항체 농도(도 5l)로서 표현되는, 항체의 양을 정량하는 막대 그래프를 포함한다. 동일한 시점에서 대조군 IgG와 비교되는 *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001).
도 6a는 CD98hc를 안정하게 발현하는 HEK293 세포로의 항-CD98hc 항체 결합의 유동 세포측정 분석이다. 각각의 히스토그램에서, 대조군 항체 (2nd Ab-PE)는 최좌측 피크에 상응하고 항-CD98hc 항체는 최우측 피크에 상응한다.
도 6b는 면역조직화학 염색 후 마우스 피질 조직 단면의 사진을 포함하고 항-CD98hcA 또는 항-CD98hcB의 5 mg/kg 정맥내 주사 1시간 후 항체의 위치를 도시한다. 축척 막대, 50 μm.
도 6c는 야생형 마우스에서 정맥내 투여 후, 용량 투여 후 다양한 시점에서 미량의 I125-표지된 항-CD98hc 항체 (또는 IgG 대조군 또는 항 -TfR 항체)의 뇌 흡수 (% 주사된 용량/그램 뇌)을 정량하는 라인 그래프이고, 조직 뇌의 그램 당 평균 ± SEM 퍼센트 주사된 용량(그룹 및 시점 당 n=3)으로서 정량된다.
도 6d 및 6e는 지정된 항체의 20mg/kg 용량 투여 1시간 및 24시간 후 각각 뇌에서의 항체 수준(% 주사된 용량/그램 뇌) 및 뇌 대 혈장 비를 정량하는 막대 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 6; ****P≤ 0.0001)을 나타내고, “n.s.”, 통계학적으로 유의적이지 않다.
도 6f는 쥐 CD98hc를 발현하는 HEK293 세포와 함께 유동 세포 측정에 의해 측정된 바와 같이 항-CD98hc/BACE1 이중특이적 항체와 비교하여 모 2가 (단일특이적) 항-CD98hc 항체의 친화성 (정상화된 OD650으로서 표현되는)을 정량하는 라인 그래프이다 (IC50: 항-CD98hcA-1.5nM, 항-CD98hcA/BACE1-4.0nM 항-CD98hcB- 4.6nM, 항-CD98hcB/BACE1- 164.4nM).
도 6g, 6h, 6i, 및 6j는 50 mg/kg의 지정된 항-CD98hc/BACE1 항체 또는 대조군 IgG의 정맥내 투여 후 용량 투여 후 지정된 일수에서 각각 혈장 항체 농도, 뇌 항체 농도, 뇌 Aβ 수준 및 혈장 Aβ 수준을 정량하는 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 5, **P≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001; “n.s”, 통계학적으로 유의적이지 않음)을 나타낸다. 도 6i에서, 좌측에서 우측 순서로 각각의 시점 (용량 투여 후 1일 및 4일)에서의 컬럼은 다음에 상응한다: 대조군 IgG, 항-CD98hcA/BACE1, 및 항-CD98hcB/BACE1.
도 6k는 야생형 마우스에서 정맥내 투여 후, 용량 투여 후 다양한 시점(시간(hr))에서 미량의 지정된 I125-표지된 항체의 뇌 흡수를 보여주는 라인 그래프이고, 뇌 조직 그램 당 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 3) 퍼센트 주사된 용량으로서 정량된다.
도 6l은 항-CD98hc/BACE1 항체, 항-TfRA 항체, 또는 대조군 IgG의 50 mg/kg 정맥내 투여 후, 용량 투여 후 지정된 시점(1 또는 24시간)에서 뇌 항체 농도를 정량하는 막대 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 5, **P≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001; “n.s”, 통계학적으로 유의적이지 않음)을 나타낸다.
도 6m 및 6n은 지정된 항-CD98hc/BACE1 항체 또는 대조군 IgG의 50mg/kg의 정맥내 투여 후, 용량 투여후 지정된 일수에서 대조군 IgG(도 6m) 및 뇌에서 Aβx -40 농도 (도 6n)와 비교되는 퍼센트(%)Aβx -40 감소를 정량하는 그래프이다.
도 6o 및 6p는 50 mg/kg의 지정된 항-CD98hc/BACE1 항체 또는 대조군 IgG의 정맥내 투여 후, 용량 투여 후 지정된 일수에서 혈장 항체 농도(도 6o) 및 뇌 항체 농도(도 6p)를 정량하는 그래프이다. 오차 막대는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 5)을 나타낸다.
도 7a는 웨스턴 블롯의 사진이다. 야생형 IMCD3 세포는 24시간 동안 지정된 항체 및 농도 (μM)로 처리하였다. 용해물은 로딩 대조군으로서 내인성 CD98hc 및 액틴에 대해 탐지하였다.
도 7b는 도 7a에 나타낸 웨스턴 블롯 데이터를 정량하는 막대 그래프이다. 웨스턴 블롯 데이터는 각각 3회 수행된 3개의 독립적 실험으로 평균치이다. 막대는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 7c는 37 ℃에서 1시간 동안 1 μM의 지정된 항체로 처리된 마우스 CD98hc를 안정하게 과발현하는 IMCD3 세포의 사진을 포함한다. 세포를 고정시키고, 인간 IgG, 마우스 CD98hc, 및 리소좀성 마커, Lamp1에 대해 염색하였다. 상기 이미지는 Lamp1으로 동시 염색되는 대조군 IgG, 항-CD98hcA/BACE1, 및 항-CD98hcB/BACE1의 세포 흡수를 나타낸다. 축척 막대 = 5 μm.
도 7d는 CD98hc 반점를 정량하는 막대 그래프이다. 반점는 Lamp1을 사용한 동시-위치 특정을 위해 분석되고 정량한다. 막대는 평균 ± SEM (n=5)을 나타낸다.
도 7e-h는 웨스턴 블롯 결과의 사진이다. 상기 블롯은 용량 투여 후 다양한 일자에서 단일의 50mg/kg의 지정된 항체의 용량 투여 후 뇌 용해물에서 CD98hc 발현에 대해 분석하였다(그룹 및 시점 당 n=5).
도 7i는 도 7e-7h에서 나타낸 웨스턴 블롯에서 CD98hc 수준을 정량하는 막대 그래프이다. 모든 그래프는 평균 ± SEM (그룹 및 시점 당 n= 5)을 나타낸다.
도 7j는 퍼센트(%) 아미노산 흡수 활성을 정량하는 막대 그래프이다. 마우스 CD98hc 세포를 안정하게 과발현하는 IMCD3 세포는 24시간 동안 1 μM의 지정된 항체로 처리하고 아미노산 흡수 활성은 메티오닌 유사체인 총 내재화된 HPG의 양에 의해 평가하였다. 시스템 L 아미노산 수송체의 억제제인 BCH (2-아미노-2-노르보르난-카복실산)은 양성 대조군으로서 사용하였다. 메티오닌 흡수는 대조군 IgG의 백분율로서 표현되고 각각의 데이터 점에 대해 플롯팅하였다. 막대는 평균 ± SEM (n=12)을 나타낸다.
도 8은 지정된 항체가 주사된 마우스의 뇌내 총 단백질 mg 당 유조직 항체 농도(ng/ml)를 정량하는 막대 그래프이다. 유조직 용해물로부터 항체 농도는 인간 IgG ELISA에 의해 평가하고 총 단백질 농도로 표준화하였다. 그룹 당 n=5, 나타낸 막대 그래프는 평균 ± SEM이다. ANOVA 대 대조군 IgG (두넷 포스트-혹 시험에 의해)에 의해 **p<0.01 및 ****p<0.0001.
도 9는 지정된 RMT 항체의 친화성을 요약하는 표이다. 모든 친화성은 FACS 분석을 사용하여 평가되는 항-Glut1 항체를 제외하고는 Biacore에 의해 결정하였다.
도 10은 CD98hc 준세포 위치 특정 및 트래픽킹을 평가하기 위해 촬영된 현미경 이미지를 포함한다. 마우스 1차 뇌 내피 세포는 고정시키고 준세포 소포 마커 (좌측 패널) 및 항-마우스 CD98hc (중앙 패널)로 염색하였다. 내인성 CD98hc는 혈장막에 위치하였고 (화살표) 또한 세포내 반점 (화살촉)에서 발견되었다. 동시 위치 특정은 항-카베올린1 (A), 항-TfR (B), 또는 항-EEA1 (C)을 사용한 동시-염색에 의해 조사하였다. 혈장 막 상에서, CD98hc의 서브세트는 카베올린1과 함께 동시 위치 특정된다 (병합 패널 A에서 화살표). 일부 세포내 반점는 카베올린1과 함께 동시 위치 특정된다(패널 A에서 화살촉). 매우 소수의 반점는 (B) 및 병합 이미지에 나타낸 바와 같이 TfR과 함께 동시 위치 특정된다. 일부 CD98hc 세포내 반점는 EEA1과 함께 동시 위치 특정된다(병합 패널C에서 화살촉). 축척 막대 = 5μM.
발명의 구현예의 상세한 설명
I. 정의
“혈뇌 장벽” 또는 “BBB”는 분자, 심지어 우레아 (60 돌턴)와 같은 매우 작은 분자의 뇌로의 수송을 제한하는 밀착 장벽을 생성하는 뇌 모세관 내피 혈장막 내 밀착연접에 의해 형성되는 말초 순환과 뇌 및 척수(즉 CNS) 사이의 생리학적 장벽을 지칭한다. 뇌 내 혈뇌 장벽, 척수 내 혈액-척수 장벽 및 망막 내 혈액-망막 장벽은 CNS 내연속 모세관 장벽이고 본원에서는 총체적으로 혈뇌 장벽 또는 BBB로서 언급된다. 상기 BBB는 또한 혈액-CSF 장벽(맥락총)을 포함하고, 상기 장벽은 모세관 내피 세포 보다는 차라리 뇌실막 세포로 구성된다.
“혈뇌 장벽 수용체” (본원에서 “BBB-R”로 약칭됨)는 분자들을 혈뇌 장벽을 거쳐 수송할 수 있는 뇌 내피 세포상에서 발현되는 막관통 수용체 단백질이다. 상기 논의된 바와 같이, 큰 분자 약물의 뇌 침투를 증가시키기 위한 한가지 전략은 BBB-R의 통과세포외배출 트래픽킹 경로를 활용하는 것, 예를 들어, 상기 수용체를 표적화하는 항체를 사용하는 것이다. 본원의 개시내용은 신규한 BBB-R 표적, 및 상기 BBB-R에 대한 단클론 항체를 사용하여 BBB를 거쳐 뇌로 제제를 수송하는 방법을 제공한다. 상기 BBB-R은 CD98 중쇄 (CD989hc), 글루코스 수송체 1 (Glut1), 및 바시긴 (Bsg)을 포함한다.
“개체” 또는 “대상체”는 포유동물이다. 포유동물은 애완 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 몽키와 같은 비-인간 영장류), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체가 투여될 수 있고/있거나 치료될 수 있는 개체는 암으로 진단되지 않은 개체이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체가 투여될 수 있고/있거나 치료될 수 있는 개체는 뇌암으로 진단되지 않은 개체이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체가 투여될 수 있고/있거나 치료될 수 있는 개체는 암을 갖지 않는 개체이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체로 치료될 수 있고/있거나 투여될 수 있는 개체는 뇌암을 갖지 않는 개체이다. “중추신경계” 또는 “CNS”는 신체 기능을 조절하는 신경 조직들의 복합체를 언급하고 뇌 및 척수를 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 “아밀로이드 베타,” “베타-아밀로이드,” “아베타,” “아밀로이드 β,” 및 “Aβ”는 Aβ1-40, 및 Aβ1-42를 포함하지만 이에 국한되지 않는 변형, 단편 및 이의 임의의 기능성 등가물뿐만 아니라 APP의 β 세크레타제 1 (“BACE1”) 절단 시 생성되는 아밀로이드 전구체 단백질(“APP”)의 단편을 지칭한다. Aβ는 단량체 형태로 존재하는 것뿐만 아니라 연합하여 아밀로이드 플라크의 구성원으로서 발견될 수 있는 올리고머 및 섬유 구조물을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 상기 Aβ 펩타이드의 구조 및 서열은 당업자에게 널리 공지되어 있고 상기 펩타이드를 생성하거나 이들을 뇌 및 다른조직으로부터 추출하는 방법은 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있다: Glenner 및 Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129: 885-890 (1984). 더욱이, Aβ 펩타이드는 또한 다양한 형태로 시판되고 있다.
용어 “뇌 혈관성 부종”은 뇌의 세포내 또는 세포외 공간에서 혈관내 유체 또는 단백질의 과도한 축적을 지칭한다. 뇌 혈관성 부종은 예를 들어, FLAIR MRI를 포함하지만 이에 국한되지 않는 뇌 MRI에 의해 검출가능하고 무증상(“무증상 혈관성 부종”)일 수 있거나 혼란, 어지럼증, 구토 및 무기력(“증상 혈관성 부종”)과 같은 신경학적 증상과 연관될 수 있다(문헌참조: Sperling 등 Alzheimer’s & Dementia, 7: 367, 2011).
용어 “뇌 미세출혈”은 직경이 약 1cm 미만인 영역의 두개내 출혈 또는 뇌에서의 출혈을 지칭한다. 뇌 미세출혈은 예를 들어, T2*-칭량 GRE MRI를 포함하지만 이에 국한되지 않는 뇌 MRI에 의해 검출가능하고, 무증상(“무증상 미세출혈”)일 수 있거나 잠재적으로 일시적 또는 영구적 중심 모터 또는 감각 손상, 운동실조, 실어증 및 구음장애 (“증상 미세출혈”)와 같은 증상과 연관될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Greenberg, 등, 2009, Lancet Neurol. 8: 165-74.
용어 “열구 유출”은 뇌의 주름 또는 열구에서 유체의 유출을 지칭한다. 열구 유출은 예를 들어, FLAIR MRI을 포함하지만 이에 국한되지 않는 뇌 MRI에 의해 검출가능하다. 하기 문헌을 참조한다: Sperling 등 Alzheimer’s & Dementia, 7: 367, 2011.
용어 “중추 신경계의 표면적 철침착증”은 뇌의 지주막하 공간으로의 출혈 (bleeding) 또는 출혈(hemorrhage)을 언급하고 예를 들어, T2*-칭량 GRE MRI를 포함하지만 이에 국한되지 않는 뇌 MRI에 의해 검출가능하다. 중추신경계의 표면적 철침착증을 나타내는 증상은 감각신경난청, 소뇌 운동실조, 및 추체로징후를 포함한다. 하기 문헌을 참조한다: Kumara-N, Am J Neuroradiol. 31: 5, 2010.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “아밀로이드증”은 아밀로이드 또는 아밀로이드형 단백질에 유발되거나 연관된 질환 및 장애 그룹을 언급하고 아밀로이드 플라크에 의한 것을 포함하는, 단량체성, 섬유 또는 중합체성 상태, 또는 상기 3개의 조합에서 아밀로이드형 단백질의 존재 또는 활성에 의해 유발되는 질환 및 장애를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 상기 질환은 2차 아밀로이드증 및 연령 관련 아밀로이드증, 예를 들어, 신경학적 장애, 예를 들어, 알츠하이머 질환 (“AD”), 인식 기억능 손실을 특징으로 하는 질환 또는 병태, 예를 들어, 경증 인지 손상(MCI), 루이소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증 (네덜란드 형)을 갖는 유전성 뇌 출혈, 구암 파킨슨-치매 합병증(Guam Parkinson-Demential complex) 및 아밀로이드형 단백질을 기반으로 하거나 이와 연합된 다른 질환, 예를 들어, 진행성 핵상안근 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트-야콥 질환, 파킨슨 질환, HIV-관련 치매, ALS (근육위축성측색경화증), 봉입체 근염 (IBM), 성인 발병 당뇨병, 내분비 종양 및 노인성 심장 아밀로이드증, 및 황반 퇴화, 드루젠-관련 시각 신경병증, 녹내장 및 베타-아밀로이드 침적으로 인한 백내장을 포함하는 다양한 안구 질환을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
녹내장은 시각 신경병증의 특징적 패턴에서 망막 결절종 세포(RGC)의 손실을 포함하는 시각 신경의 질환 그룹이다. RGC는 눈에서 뇌로 가시적 신호를 전송하는 신경 세포이다. 아폽토시스 과정에서 2개의 주요 효소인 카스파제-3 및 카스파제-8은 RGC의 아폽토시스를 유도하는 과정에서 활성화된다. 카스파제-3은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)를 절단하여 아베타를 포함하는 신경독성 단편을 생성한다. APP의 보호 효과 없이, 망막 결절종 세포층 내 아베타 축적은 RGC의 사멸 및 비가역적 시력 상실을 유발한다.
녹내장은 항상은 아니지만 흔히 증가된 안압을 수반하고 이것은 수성 또는 이의배수의 순환 차단 결과일 수 있다. 상승된 안내 압력이 녹내장을 발병하는 상당한 위험 인자이긴 하지만, 안내 압력의 어떠한 역치도 한정될 수 없어 녹내장을 유발하는데 결정적일 것이다. 상기 손상은 또한 필수적 시신경 섬유로의 불량한 혈액 공급, 신경 구조의 쇠약및/또는 신경 섬유 자체의 보건 문제에 의해 유발될 수 있다. 비처리된 녹내장은 시신경의 영구적 손상 및 이로 인한 시야 상실을 유도하고 이는 진행하여 눈을 멀게 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “경증 알츠하이머 질환” 또는 “경증 AD” (예를 들어, “경증 AD로 진단된 환자”)는 20 내지 26의 MMSE 스코어를 특징으로 하는 AD 단계를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “경증 내지 중등도의 알츠하이머 질환” 또는 “경증 내지 중등도의 AD”는 경증과 중등도의 AD 둘다를 포함하고 18 내지 26의 MMSE 스코어를 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “중등도의 알츠하이머 질환” 또는 “중등도의 AD”(예를 들어, 중등도의 AD를 갖는 것으로 진단된 환자”는 18 내지 19의 MMSE 스코어를 특징으로 하는 AD 단계를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 “신경학적 장애”는 CNS에 영향을 주고/주거나 CNS에병인을 갖는 질환 또는 장애를 지칭한다. 예시적 CNS 질환 또는 장애는 신경병증, 아밀로이드증, 암, 안 질환 또는 장애, 바이러스 또는 미생물 감염, 염증, 허혈, 신경퇴행성 질환, 발작, 행동 장애, 및 리소좀 저장 질환을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 본원의 목적을 위해, CNS는 혈액-망막 장벽에 의해 신체 나머지로부터 정상적으로 격리되어 있는 눈을 포함하는 것으로 이해된다. 신경학적 장애의 특정 예는 신경퇴행성 질환(루이소체 질환, 후소아마비 증후군, 샤이-드래거 증후군, 올리브교소뇌위축증, 파킨슨 질환, 다계통 위축증, 대뇌바닥핵의 변성, 타우병증 (알츠하이머 질환 및 핵상 마비를 포함하지만 이에 국한되지 않는다), 프리온 질환(소의 해면상뇌증, 스크래피, 크로이츠펠트-야콥증구훈, 쿠루, 게르스트만슈트로이슬러샤잉커 질환, 만성 소모성 질환 및 치명적 가계 불면증을 포함하지만 이에 국한되지 않는다), 구마비, 운동 뉴런 질환, 및 신경계 이종퇴행성 장애 (카나반 질환, 헌팅톤 질환, 신경 세포이드 지질갈색소증, 알렉산더 질환, 투렛 증후군, 멘케스 킨키 모발 증후군, 코카인 증후군, 할레보르덴-스파츠 증후군, 라포라 질환, 레트 증후군, 간렌즈핵 퇴행, 레슈-니한 증후군 및 운베리크트-룬드보그 증후군을 포함하지만 이에 국한되지 않는다), 치매 (픽 질환 및 유전성 실조증을 포함하지만 이에 국한되지 않는다), 암(예를 들어, 신체 다른 곳의 암으로부터 유발되는 간 전이를 포함하는 CNS의 암)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
“신경학적 장애 약물”은 하나 이상의 신경학적 장애(들)를 치료하는 약물 또는 치료제이다. 본 발명의 신경학적 장애 약물은 항체, 펩타이드, 단백질, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 변형된 버전의 천연 리간드, 압타머, 억제 핵산 (예를 들어, 소형 억제 RNA (siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)), 리보자임, 및 소분자, 또는 이전에 기재된 분자 중 활성 단편을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 예시적 신경학적 장애 약물은 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 항체, 압타머, 단백질, 펩타이드, 억제 핵산 및 소분자 및 이전에 기재된 것의 임의의 단편 자체 또는 CNS 항원 또는 표적 분자, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만 아밀로라이드 전구체 단백질 또는 이의 부분, 아밀로라이드 베타, 베타-세크레타제, 감마-세크레타제, 감마-세크레타제, 타우, 알파-시누클레인, 파킨, 헌팅톤, DR6, 프레세닐린, ApoE, 글리오마 또는 다른 CNS 암 마커 및 뉴로트로핀을 특이적으로 억제하고/하거나 이에 작용하는 (예를 들어, 억제하거나, 활성화시키거나 검출한다) 단편. 신경학적 장애 약물 및 이들이 치료하기 위해 사용될 수 있는 장애의 비제한적인 예는 하기 표 A에 제공된다:
표 A: 신경학적 장애 약물 및 이들이 치료하기 위해 사용될 수 있는 상응하는 장애의 비제한적인 예
Figure pct00001
본원에 사용된 바와 같은 “제제”, 예를 들어, 본원에 기재된 BBB-R 특이적 항체(예를 들어, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체)에 의해 혈뇌 장벽을 걸쳐 전달되는 제제)는 치료학적 제제 또는 조영제이다. 특정 측면에서, 치료학적 제제는 항체(예를 들어, CNS 또는 뇌 항원에 특이적인)이다. 특정 측면에서, 치료학적 제제는 약물, 예를 들어, 신경학적 장애 약물, 예를 들어, 상기된 바와 같은 약물이다. 특정 측면에서, 치료학적 제제는 세포독성 제제이다. 특정 측면에서, 치료학적 제제는 항체(예를 들어, 상기 제제(항체)는 다중특이적항체의 하나의 아암이다)이다.
본원에 사용된 바와 같은 “조영제”는 화합물의 존재 및/또는 위치가 직간접적으로 검출되도록 하는 하나 이상의 성질을 갖는 화합물이다. 상기 조영제의 예는 검출을 가능하게 하는 표지된 모이어티가 혼입된 단백질및 소분자 화합물을 포함한다.
“CNS 항원” 또는 “뇌 항원”은 상기 항체 또는 소분자로 표적화될 수 있는 뇌를 포함하는 CNS에서 발현되는 항원이다. 상기 항원의 예는 제한 없이 다음을 포함한다: 베타-세크레타제 1 (BACE1), 아밀로이드 아베타 (Abeta), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우(tau), 아포지질단백질, 예를 들어, 아포지질단백질 E4 (ApoE4), 알파-시누클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), 인터류킨 6 수용체 (IL6R), TNF 수용체 1 (TNFR1), 인터류킨 1 베타 (IL1β), 및 카스파제 6.특정 구현예에서, 항원은 BACE1이다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 광범위한 의미로 사용되고 다양한 항체 구조물을 포함하고, 이는 단클론 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 이들이 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 “특이적으로 결합하는” 또는 “에 특이적으로 결합한다”는 항원에 선택적으로 및 우선적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 결합 친화성은 일반적으로 표준검정, 예를 들어, 스캐트챠드 검정, 또는 표면 플라스몬 공명 기술 (예를 들어, BIACORE®을 사용하는)을 사용하여 결정된다.
“항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 당업계에 널리 공지되어 있고(문헌참조: 예를 들어, Nelson, MAbs (2010) 2(1): 77-83) Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2, 및 Fv; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 가변 단편 (scFv), 링커의 존재 또는 부재하의 경쇄 및/또는 중쇄 항원 결합 도메인의 융합부(및 임의로 반복적 형태)를 포함하지만 이에 국한되지 않는 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 단일특이적 또는 다중특이적 항원-결합 분자(Fc 영역이 없는 다중 가변 도메인으로부터 작제된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고, 즉., 상기 집단을 포함하는 개별 항체들은 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하고, 예를 들어, 천연 돌연변이를 함유하거나 단클론 항체의 생성 동안에 발생할 수 있는 가능한 변이체는 제외되고 상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정인자들(에피토프들)에 향해진 상이한 항체들을 통상적으로 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 향해진다. 수식어 “단클론”은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 지적하고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 하기의 방법을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다: 하이브리도마 방법(문헌참조, 예를 들어, Kohler 등, Nature, 256: 495 (1975)), 재조합 DNA 방법 (문헌참조: 예를 들어, 미국특허 번호 4,816,567), 파지-디스플레이 방법 (예를 들어, 다음 문헌에 기재된 기술을 사용하여: Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks 등, J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991)), 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전부 또는 일부를 포함하는유전자전이 동물을 사용하는 방법, 본원에 기재된 단클론 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 예시적 방법. 본원에서 단클론 항체의 특정 예는 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 인간 항체를 포함한다.
본원에서의 단클론 항체는 구체적으로 “키메라” 항체 (면역글로불린)를 포함하고, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 상기 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체, 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체들의 단편 내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(미국특허 번호 4,816,567; Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
용어 “다중특이적 항체”는 광범위한 의미로 사용되고 구체적으로 다중에피토프 특이성 (즉, 하나의 생물학적 분자 상에 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 또는 2개 이상의 상이한 생물학적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는)을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항체를 커버한다.
“이중특이적 항체”는 하나의 생물학적 분자 상에 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 2개의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 구체적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 본원에서 “이원 특이성”을 갖는 것으로서 또는 “이원 특이적”인 것으로서 본원에 언급될 수 있다.
표준 항체와 “동일한 에피토프에 결합하는 항체”는 경쟁 검정에서 50% 초과로 상기 표준 항체의 이의 항원으로의 결합을 차단하는 항체를 언급하고, 역으로, 표준 항체는 경쟁 검정에서 50% 초과로 항체의 이의 항원으로의 결합을 차단한다. 예시적 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
본원에서의 목적을 위한 “수용체 인간 골격”은 하기 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격”으로부터 유래된” 수용체 인간골격은 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이것은 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7이하, 6이하, 5 이하, 4 이하, 3이하, 또는 2 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는인간 컨센서스 골격 서열과 서열에 있어서 동일하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “세포독성제”는 세포 기능을 억제하거나 차단하고/하거나 세포사 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 하기를 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 방사능활성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 방사능활성 동위원소); 화학치료학적 제제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 중격제(intercalating agent)); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예를 들어, 핵산용해 효소; 항생제; 독소, 예를 들어, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 이의 단편 및/또는 변이체를 포함함, 및 하기된 다양한 항종양 또는 항암제.
“효과기 기능”은 항체 이소형과 함께 다양한 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 상기 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수요체의 하향 조절 (예를 들어, B 세포 수용체); 및 B 세포 활성화.
제제, 예를 들어, 약제학적 제형의 “유효량”은 목적하는 치료학적 또는 예방학적결과를 성취하기 위해 필요한 투여시 및 시기 동안의 유효량을 지칭한다.
본원에서 “고유 서열” 단백질은 단백질의 천연 변이체를 포함하는, 천연에서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어는 이의 천연 공급원으로부터 단리되거나 재조합적으로 생산되는 단백질을 포함한다.
본원에서 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 한 부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하기 위해 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실 말단으로 연장한다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않는 경우, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기들의 넘버링은 또한 하기 문헌에 기재된 바와 같이 EU 지수로서 불리우는 EU 넘버링 시스템에 따른다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “FcRn 수용체” 또는 “FcRn”은 인간 또는 영장류 태반 또는 난황낭 (토끼)을 통해 모계 IgG의 태아로의 전달 및 소장을 통해 초유로부터 신생아로의 전달에 관여하는 것으로 공지된 Fc 수용체(“n”은 신생아를 지적한다)를 지칭한다. 또한, FcRn은 IgG 분자에 결합하고 이들을 형성으로 재순환시킴에 의해 불변 혈청 IgG 수준의 유지에 관여하는 것으로 공지되어 있다. “FcRn 결합 영역” 또는 “FcRn 수용체 결합 영역”은 FcRn 수용체와 상호작용하는 항체 부분을 지칭한다. 항체의 FcRn 결합 영역내 특정 변형은 FcRn에 대해 항체 또는 이의 단편의 친화성을 증가시키고 또한 분자의 생체내 반감기를 증가시킨다. 하기의 아미노산 위치 251 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434 및 436 중 하나 이상에서 아미노산 치환은 FcRn 수용체와의 항체의 상호작용을 증가시킨다. 하기의 위치에서 치환은 또한 FcRn 수용체 238, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434와 항체의 상호작용을 증가시키고, 예를 들어, 하기의 치환이 있다(문헌참조: 미국 특허 번호 7,371,826).
“골격” 또는 “FR”은 초가변 영역 (HVR) 잔기와 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 “전장 항체”, “온전한 항체” 및 “전체 항체”는 고유 항체와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주” 및 “숙주 세포 배양물”은 상호교환적으로 사용되고 외인성 핵산이 도입된 세포를 언급하고 이는 상기 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함하고, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 수와 무관하게 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수 있고 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래에 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다. 재조합 항체를 생산하기 위한 “숙주 세포”의 예는 다음을 포함한다: (1) 포유동물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), COS, 골수종 세포 (Y0 및 NS0 세포를 포함하는), 베이비 햄스터 신장 (BHK), Hela 및 Vero 세포; (2) 곤충 세포, 예를 들어, sf9, sf21 및 Tn5; (3) 식물 세포, 예를 들어, 하기 속 니코티아나 ( Nicotiana ) 에 속하는 식물(예를 들어, 니코티아나 타바쿰 ( Nicotiana tabacum )); (4) 효모 세포, 예를 들어, 하기 속 사카로마이세스(Saccharomyces)에 속하는 것들 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae )) 또는 속 아스퍼질러스 ( Aspergillus ) (예를 들어, 아스퍼질러스 나이거 ( Aspergillus niger)); (5) 세균 세포, 예를 들어 에스케리치아 콜라이 ( Escherichia coli ) 세포 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 세포 등.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 성되거나 인간 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 암호화 서열을 활용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
“인간 컨센서스 골격”은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에서 가장 통상의 아미노산 잔기를 제공하는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의서열의 서브그룹 기원이다. 일반적으로 서열의 서브그룹은 하기 문헌에 기재된 바와 같은 서브그룹이다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. 하나의 구현예에서, VL에 대해, 상기 서브그룹은 하기 문헌에 기재된 바와 같은서브그룹 카파 I이다: Kabat 등, 상기. 하나의 구현예에서, VH에 대해, 상기 서브그룹은 하기 문헌에 기재된 바와 같은서브그룹 III이다: Kabat 등, 상기.
“인간화된” 항체는 비-인간 HVR 기원의 아미노산 잔기 및 인간 FR 기원의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 “인간화된 형태”는 인간화를 진행한 항체를 지칭한다.
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 ”인간화된” 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 항체(수용자 항체)이고, 여기서, 수용자의 초가변 영역 기원의 잔기들은 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역 기원의 잔기들에 의해 대체된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 골격 영역(FR)은 인간 항체의 것들에 상응한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 통상적으로2개의 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 항체의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 주지된 바와 같은 FR 치환체(들)을 제외하고는 인간 항체의 것들이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 항체 불변 영역의 적어도 일부, 통상적으로 인간 항체의 일부를 포함한다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 “인간화된 형태”는 인간화를 진행한 항체를 지칭한다. 추가의 세부 사항에 대해서는 다음을 참조한다: Jones 등, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr .Op. Struct . Biol . 2: 593-596 (1992).
본원에서 “인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 암호화 서열을 활용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열 구조와 상응하는 아미노산 서열 구조를 포함하는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다. 상기 항체는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 동정되거나 제조될 수 있다: 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 면역화시 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 전이 동물 (예를 들어, 마우스)에 의한 생산(문헌참조: 예를 들면, Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in Immuno ., 7: 33 (1993); 및 US 특허 번호 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807)); 인간 항체 또는 인간 항체 단편을 발현하는파지 디스플레이 라이브러리로부터의 선택 (문헌참조: 예를 들어, McCafferty 등, Nature 348: 552-553 (1990); Johnson 등, Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993); Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1991); Griffith 등, EMBO J. 12: 725-734 (1993); US 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905); 시험관내 활성화된 B 세포를 통한 생성 (문헌참조: US 특허 5,567,610 및 5,229,275); 및 인간 항체-생산 하이브리도마로부터의 단리.
본원에서의 항체는 변형된 항원-결합 또는 생물학적 활성을 갖는 “아미노산 서열변이체”를 포함한다. 상기 아미노산 변화의 예는 항원에 대해 증진된 친화성을 갖는 항체를 포함한다: (예를 들어, “친화성 성숙된” 항체), 및 변화된 Fc 영역을 갖는 항체, 존재하는 경우, 예를 들어, 변화된 (증가되거나 감소된) 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)를 갖는 항체(문헌참조: 예를 들어, WO 00/42072, Presta, L. 및 WO 99/51642, Iduosogie 등); 및/또는 증가되거나 감소된 혈청 반감기(문헌참조: 예를 들어, WO 00/42072, Presta, L.).
“친화성 변형된 변이체”는 친화성을 변화시키는 (증가시키거나 감소시킨다) 모 항체의 하나 이상의 치환된 초가변 영역 또는 골격 잔기들 (예를 들어, 모 키메라, 인간화된 또는 인간 항체의 잔기들)을 갖는다. 상기 치환성 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용한다. 간략하게, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어,6-7개 부위)는 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이와 같이 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내 팩키징된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합부로서 필라멘트성 파지 입자로부터의 1가 양상으로 나타난다. 파지-디스플레이된 변이체는 이어서 이들의 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역을 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기들을 동정하기 우해 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 이의표적 간의 접촉점을 동정하는 것이 이로울 수 있다. 상기 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기들은 본원에서 고안된 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 상기 변이체가 생성되면, 변이체 패널은 스크리닝에 적용하고 변화된 친화성을 갖는 항체는 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.
본원에서 항체는 예를 들어, “이종성 분자”와 접합시켜 반감기 또는 안전성을 증가시키거나 또한 항체를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 다양한 비-단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 하나 이상의 PEG 분자에 연결된 Fab’와 같은 항체 단편은 본 발명의 예시적 구현예이다. 또 다른 예에서, 이종성 분자는 치료학적 화합물 또는 가시화제(예를 들어, 검출가능한 표지)이고, 상기 항체는 상기 이종성 분자를 BBB를 거쳐 수송하기 위해 사용된다. 이종성 분자의 예는 화학적 화합물, 펩타이드, 중합체, 지질, 핵산 및 단백질을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본원에서의 항체는 “당화 변이체”일 수 있고 존재하는 경우 Fc 영역으로 부착된임의의 탄수화물은 변화되고, 존재/부재하에 변형되거나 유형이 변형된다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 없는 성숙한 탄수화물 구조를 갖는 항체는 문헌[참조: US Pat Appl No US 2003/0157108 (Presta, L.)]에 기재되어 있다. 또한 다음 문헌을 참조한다: US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에서 이등분 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 다음 문헌에 기재되어 있다: WO 2003/011878, Jean-Mairet 등 및 미국 특허 번호 6,602,684, Umana 등 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체는 다음 문헌에 보고되어 있다: WO 1997/30087, Patel 등 또한 다음 문헌을 참조한다: 이의 Fc 영역에 부착된 변화된 탄수화물을 갖는 항체에 관한 WO 1998/58964 (Raju, S.) 및 WO 1999/22764 (Raju, S.). 또한 다음 문헌을 참조한다: US 2005/0123546 (Umana 등) 변형된 당화를 갖는 항체를 기재하고 있는 Fc 영역에서 컨센서스 당화 서열의 돌연변이 (위치 297 내지 299에서 Asn-X-Ser/Thr, 여기서, X는 프롤린이 아닐 수 있다)는 예를 들어, 상기 서열의 Asn을 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이시킴에 의해, Pro를 위치 298에 위치시킴에 의해 또는 위치 299를 Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산으로 변형시킴에 의해 수행되고 이는 상기 위치에서의 당화를 폐지시켜야만 한다(문헌참조: 예를 들어, Fares Al-Ejeh 등, Clin. Cancer Res. (2007) 13: 5519s-5527s; Imperiali 및 Shannon, Biochemistry (1991) 30(18): 4374-4380; Katsuri, Biochem J. (1997) 323(Pt 2): 415-419; Shakin-Eshleman 등, J. Biol. Chem. (1996) 271: 6363-6366).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변성(“상보성 결정 영역” 또는 “CDR”)이고/이거나 구조적으로 한정된 루프(“초가변 루프”)를 형성하고/하거나 항원 접촉 잔기 (“항원 접촉”)를 함유하는 항체 가변 도메인 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH (H1, H2, H3)에서 3개, 및 VL (L1, L2, L3)에서 3개. 본원에서 예시적 HVR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재하는 초가변 루프 (Chothia 및 Lesk, J. Mol . Biol. 196: 901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에 존재하는 CDR (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에 존재하는 항원 접촉 (문헌참조: MacCallum 등 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)을 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
일부 구현예에서, HVR 잔기는 하기 표 B에 서열번호에 의해 동정된 것들을 포함한다 (각각의 컬럼은 별도의 클론이다).
표 B: HVR 서열
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달리 지적되지 않는 경우, 가변 도메인에서 HVR 잔기 및 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 다음 문헌에 따라 본원에서 넘버링한다: Kabat 등, 상기.
“면역접합체”는 표지 또는 세포독성제를 포함하지만 이에 국한되지 않는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다. 임의로 상기 접합은 링커를 통해서이다.
본원에 사용된 바와 같은 “링커”는 항체를 이종성 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결시키는 구조이다. 특정 구현예에서, 링커는 펩타이드이다. 다른 구현예에서, 링커는 키메라 링커이다.
“표지”는 본원에서 항체와 커플링된 마커이고 검출 또는 영상을 위해 사용된다. 상기 표지의 예는 다음을 포함한다: 방사능표지, 형광단, 발색단, 또는 친화성 태그. 하나의 구현예에서, 상기 표지는 의학적 영상을 위해 사용되는 방사능표지, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상(또한 자기 공명 영상, 또는 mri로서 공지된)를 위한 스핀 표지이거나, 예를 들어, 다음으로 국한되지 않는다: 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간, 및 철.
“단리된” 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 하나이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 전기 영동에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99%의 순도로 정제된다(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC). 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토를 위해 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Flatman 등, J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “BACE1”은 달리 지적되지 않는 경우, 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원 기원의 임의의 고유 베타-세크레타제 1(또한, β-부위 아밀로이드 전구체 단백질 절단 효소 1, 막-연합된 아스파르트산 프로테아제 2, 메마프신 2, 아스파르틸 프로테아제 2 또는 Asp2로 불리우는)을 지칭한다. 상기 용어는 세포에서 프로세싱으로부터 비롯되는 임의의 형태의 BACE1뿐만 아니라 “전장”의 프로세싱되지 않는 BACE1을 포함한다. 상기 용어는 또한 BACE1의 천연의 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 예시적 BACE1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기 서열번호에 나타내고: 하기 서열번호: 111, 다음 문헌에 보고된 바와 같은 이소형 A인 인간 BACE1에 대한 서열이다: Vassar 등, Science 286: 735-741 (1999), 이는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다:
MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWCCLRCLRQQHDDFADDISLLK (서열번호: 111).
인간 BACE1의 여러 다른 이소형은 이소형 B, C 및 D를 포함한다. 다음 문헌을 참조한다: UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817, 이는 이의전문이 본원에 참조로 인용된다. 이소형 B는 아미노산 190-214이 결실되어 있다는 점에서 이소형 A와 상이하다(즉 하기 서열번호의 아미노산 190 내지 214의 결실: 111). 이소형 C는 아미노산 146-189이 결실되어 있다는 점에서 이소형 A와 상이하다(즉 하기 서열번호의 아미노산 146 내지 189의 결실: 111). 이소형 D는 아미노산 146 내지 189 및 190 내지 214가 결실되어 있다는 점에서 이소형 A와 상이하다(즉 서열번호: 111의 아미노산 146-189 및 190-214의 결실).
“친화성”은 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 달리 명시되지 않는 경우, “결합 친화성”은 다수의 결합 쌍(예를 들어, 항체와 항원)간의 1: 1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 결합 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예증적 및 예시적 구현예는 하기에 기재되어있다.
“친화성 성숙된” 항체는 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 변화를 갖지 않는 모 항체와 비교하여, 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변화를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 “항-Bsg 항체”, “항-바시긴 항체”, “바시긴에 결합하는 항체” 및 “Bsg에 결합하는 항체”는 바시긴의 이의 고유 리간드 중 하나 이상으로의 결합을 손상시키는 것 없이 바시긴에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 구현예에서, 관련없는 비-Bsg 단백질로의 항-Bsg 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 항체의 Bsg로의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, Bsg에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 결합 상수(Kd)를 갖는다(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M). 특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 상이한 종(예를 들어, 인간 Bsg 및 쥐 Bsg) 기원의 Bsg 중에서 보존된 Bsg의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 상이한 Bsg 이소형 (예를 들어, 2개 이상의 인간 Bsg 이소형) 중에 보존되는 Bsg의 에피토프에 결합한다.
용어 “항-Glut1 항체” 및 “Glut1에 결합하는 항체”는 이의 하나 이상의 고유 리간드로의 Glut1의 결합을 손상시키는 것 없이 Glut1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 구현예에서, 관련 없는 비-Glut1 단백질로의 항-Glut1 항체의 결합 정도는예를 들어, 방사능면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 Glut1으로의 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, Glut1에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 결합 상수 (Kd)를 갖는다 (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M). 특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 상이한 종 (예를 들어, 인간 Glut1 및 쥐 Glut1) 기원의 Glut1 중에서 보존된 Glut1의 에피토프에 결합한다.
본 발명에 따라, “저친화성” 항-BBB-R (예를 들어, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1) 항체는 예를 들어 항체 친화성을 측정하기 위한 다양한 검정에 의해 동정될 수 있고 제한 없이, 스캐챠드 검정 및 표면 플라스몬 공명 기술(예를 들어, BIACORE®을 사용하는)이 있다. 본 발명의 하나의 구현예에 따라, 상기 항체는 BBB-R 항원에 대해 (예를 들어, CD98hc, Bsg, 또는 Glut1에 대해) 약 5nM로부터, 또는 약 20 nM로부터, 또는 약 100 nM로부터, 약 10 μM까지, 또는 약 1 μM까지, 또는 약 500 nM까지의 친화성을 갖는다. 따라서, 상기 친화성은 예를 들어, 스캐챠드 분석 또는 BIACORE®에 의해 측정된 바와 같이 약 5 nM 내지 약 10 μM의 범위, 또는 약 20 nM 내지 약 1 μM의 범위, 또는 약 100 nM 내지 약 500 nM의 범위일 수 있다.
“단리된 핵산”은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 함유하지만 상기 핵산 분자는 염색체외에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, “항체를 암호화하는 단리된 핵산” (예를 들어, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체)는 단일 벡터 또는 분리된 벡터 내 핵산 분자(들) 및 숙주 세포내 하나 이상의 분자에 존재하는 상기 핵산 분자(들)을 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
“노출된 항체”는 이종성 모이어티(예를 들어, 세포독성 모이어티 또는 방사능표지)에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 노출된 항체는 약제학적 제형 중에 존재할 수 있다.
항체 “효과기 기능”은 보체 경로를 활성화 보다는 다른 면역계의 활성화를 유도하는 항체의 생물학적 활성을 지칭한다. 상기 활성은 대부분 항체의 Fc 영역(고유 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에서 발견된다. 항체 효과기 기능의 예는 예를 들어, Fc 수용체 결합 및 항체 의존성 세포-매개된세포독성(ADCC)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에서의 항체는 필수적으로 효과기 기능이 없다. 또 다른 구현예에서, 본원에서의 항체는 최소 효과기 기능을 보유한다. 효과기 기능을 변형시키거나 제거하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 효과기 기능에 관여하는 Fc 영역 모두 또는 일부 (예를 들어, 제한되는 것 없이 Fab 단편, 단일쇄 항체 및 본원에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같은 것들과 같은 Fc 영역의 전부 또는 일부가 부재인 포맷의 항체 또는 항체 단편을 사용하는)를 제거하고; 효과기 기능을 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 Fc 영역을 변형시키는 것을 포함하지만 이에 국한되지 않는다(Fc 결합-영향: 위치 234, 235, 238, 239, 248, 249, 252, 254, 256, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 311, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 436, 437, 438, 및 439); 및 항체의 당화를 변형시킴을 포함하지만 이에 국한되지 않는다(야생형 포유동물 당화를 허용하지 않는 환경에서 항체를 생산하고, 이미 당화된 항체로부터 하나 이상의 탄수화물 그룹을 제거하고, 상기 위치에서 당화될 항체의 능력을 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 항체를 변형시킴을 포함하지만 이에 국한되지 않는다(N297G 및 N297A 및 D265A를 포함하지만 이에 국한되지 않는다).
“보체 경로의 활성화”를 가능하게 하거나 유도할 수 있는 항체의 “보체 활성화” 기능 또는 성질은 상호교환적으로 사용되고, 대상체에서 면역계의 보체 경로에 관여하거나 자극하는 항체의 생물학적 활성을 지칭한다. 상기 활성은 예를 들어, 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), 그리고 항체의 Fc 부분 및 비-Fc 부분 둘다에 의해 매개될 수 있다. 보체 활성화 기능을 변형시키거나 제거하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 보체 활성화에 관여하는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 제거하고(예를 들어, 이에 국한되지 않지만 Fab 단편, 단일쇄 항체 및 본원에 기재되고 당업계에 공지된 것들 과 같은 Fc 영역의 전부 또는 일부가 없는 포맷의 항체 또는 항체 단편을 사용하거나 보체 성분과의 상호작용을 제거하거나 감소시키기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 Fc 영역을 변형시키거나 C1q 결합에 관여하는 것으로 공지된 위치 270, 322, 329 및 321과 같은 보체 성분을 활성화시키는 능력을 변형시키는), 보체 활성화에 관여하는 비-Fc 영역의 일부를 변형시키거나 제거시킴(예를 들어, 위치 132에서 CH1 영역을 변형시키는)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다 (문헌참조: 예를 들어, Vidarte 등, (2001) J. Biol. Chem. 276(41): 38217-38223)).
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 전장 항체는 상이한 “부류”로 할당될 수 있다. 5개 주요 부류의 전장 항체가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들 중 여러 개는 추가로 “아부류” (이소형)로 추가로 분류될 수 있다: 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤(mu)로 불리운다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 구성은 당업계에 널리공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “재조합 항체”는 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 항체(예를 들어, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 지칭한다.
“고유 항체”는 다양한 구조를 갖는 천연의 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 고유 IgG 항체는 디설파이드 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 돌턴의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 또한 가변 중쇄 또는 중쇄 가변 도메인으로 불리우는 가변 영역(VH)에 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불리우는 가변 영역 (VL)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리우는 2개 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 “포장 삽지”은 통상적으로 치료 제품의 상업적 패키지에 포함되는 지침서를 언급하기 위해 사용되고, 이는 지시, 용법, 투여, 병용 치료요법, 상기 치료 제품의 사용에 관한 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함한다.
표준 폴리펩타이드 서열과 관련된 “퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성”은 최대 퍼센트 서열 동일성을 성취하기 위해 필요하다면 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 표준 폴리펩타이드 서열내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기들의 %로서 정의되고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는다. % 아미노산 서열 동일성을 결정할 목적을 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중에게 가용한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술내에 있는 다양한 방식으로 성취될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 성취하기 위해 요구되는 임의의 알고리듬을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 그러나, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제조원(Genentech, Inc.)이 저작권을 소유하고, 공급원 코드는 하기의 사용자 문서로 제출되었다: 미국Copyright Office, Washington D.C., 20559, 여기서, 하기와 같이 미국에 등록되어 있고저작권 등록 번호.TXU510087.ALIGN-2 프로그램은 하기 제조원으로부터 일반인들이 구입할 수 있거나: Genentech, Inc., South San Francisco, California, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야만 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 각기 다르지 않다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와 함께 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이는 대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대해, 이와 함께 또는 이에 대항한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 구입될 수 있는)은 다음과 같이 계산된다:
100 x 분획 X/Y
여기서, X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일성 일치로서 스코어링되는 아미노산 잔기들의 수이고, 여기서 Y는 B 내 아미노산 잔기들의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 % 아미노산 서열 동일성은 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것으로 평가될 것이다. 구체적으로 달리 진술되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전의 문단에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 “약제학적 제형”은 본원에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 있고 제형이 투여되는 대상체에게 허용가능하지 않게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
“약제학적으로 허용되는 담체”는 대상체에게 비독성인 활성 성분외의 다른 약제학적 제형 중 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 “치료” (및 “치료하다” 또는 “치료하는”과 같은 이의 문법적 변형어구)는 치료받는 개체의 천연 과정을 변화시킬 시도에서의 임상적 중재를 언급하고 임상적 병리을 예방하거나 이 과정 동안에 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 상기 질환의 직간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행율의 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 완화 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을서행시키기 위해 사용된다.
용어 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체의 항원으로의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한구조를 갖고 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (문헌참조: 예를 들어, Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. FReeman and Co., page 91 (2007).)단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 추가로, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인을 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체 기원의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, Portolano 등, J. Immunol . 150: 880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352: 624-628 (1991).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “벡터”는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 증폭시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈으로 혼입된 벡터뿐만 아니라 자가 복제핵산 구조물로서 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 “발현 벡터”로서 언급된다.
CD98 중쇄
본원에 사용된 바와 같은 용어 “CD98 중쇄” 또는 “CD98hc”는 달리 지적되지 않는 경우 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원 기원의 임의의 고유 CD98hc를 지칭한다. CD98hc는 또한 명칭, 특히, SLC3A2, 4F2, 4F2hc, Mdu1, Ly10, Mdv1, Frp1, Mgp2, Mgp2hc, NACAE, 4T2, 4T2hc, 및 TROP4로 공지되어 있다. 용어 CD98hc는 세포내 프로세싱으로부터 비롯된 임의의 형태의 CD98hc뿐만 아니라 “전장” 프로세싱되지 않은 CD98hc를 포괄한다. 상기 용어는 또한 CD98hc의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. CD98hc는 80 kDa II형 막관통 단백질이고 6개의 상이한 경쇄 (“lc”) 구성원 또는 디설파이드 결합에 의해 약 40 kDa (LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, Asc)의 L형 아미노 수송체 계열의 “결합 파트너”와 쌍을 이루어 이종이량체 복합체를 형성한다(문헌참조: Yanagida, 등 Biochim . Biophys . Acta 1514: 291-302(2001); Torrents 등 J. Biol . Chem . 273: 32437-32445(1998); Broeer 등 BioChem . J. 349: 787-795(2000); Broeer 등 BioChem . J. 355: 725-731(2001); Sato 등 Antioxid Redox Signal.2000 Winter; 2(4): 665-71). 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 “CD98 이종이량체 복합체”는 CD98 중쇄를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다(예를 들어, LAT1/CD98hc, LAT2/CD98hc, y+LAT1/CD98hc, y+LAT2/CD98hc, xCT/CD98hc, 및/또는 Asc/CD98hc). CD98 이종이량체 복합체는 아미노산 수송체로서 기능한다. CD98hc는 양극화된 상피 세포에서 아미노산 수송체 복합체의 표면 발현 및 기저외측 위치화를 위해 요구된다(문헌참조: Okubo 등 J Neurooncol (2010) 99: 217-225; Palacin 및 Kanai. Pflugers Archiv; February 2004, 447(5): 490-494). CD98hc는 또한 베타 1 인테그린과 상호작용하고 세포질 도메인 및 막관통 영역을 통해 이들의 활성화를 조절한다. 연구는 CD98hc의 과발현이 인테그린 시그날 전달을 조절함에 의해 세포 성장 및 생존에 기여할 수 있고 따라서 종양형성에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 연구는 CD98hc 발현이 세포 증식에 밀접하게 연결되어있고 CD98hc에 대한 특정 항체가 세포 성장을 억제하거나 특정 세포 유형에서 아폽토시스를 유도할 수 있음을 보여주었다(문헌참조: Yagita H. 등 (1986) Cancer Res. 46: 1478-1484; Warren A.P., 등 (1996) Blood 87: 3676-3687).
인간 CD98hc의 엑토도메인의 구조는 각각 2.1 및 2.8 에서 단사정 (단백질 데이터 뱅크 코드 2DH2) 및 방사정 (단백질 데이터 뱅크 코드 2DH3) 결정 형태를 사용하여 해명되었다. 이것은 세균 알파-글리코시다제와 관련된 (베타알파)(8) 배럴 및 역평행 베타(8) 샌드위치로 이루어지지만, 주요 촉매 잔기가 없고 결과적으로 촉매 활성이 없다. 2DH3은 계면에서 Zn(2+) 배위를 갖는 이량체이다. CD98hc는 표면에서 어떠한 상당한 소수송 패치를 갖지 않는다. CD98hc 단량체 및 동종이량체는 양극화된 하전 표면을 갖는다. 막관통 도메인으로부터 4개 잔기 이격되어 위치한 Cys109 잔기의 위치를 포함하는 해명된 구조의 N 말단은 엑토도메인의 양성 표면에 인접해 있다. N 말단 및 Cys(109)-중재 디설파이드 브릿지의 상기 위치는 막 인지질과 CD98hc 엑토도메인의 정전기 상호작용을 위한 모델을 지지하기에 충분한 공간 제한을 부여한다(문헌참조: Fort 등 J Biol Chem. 2007 Oct 26; 282(43): 31444-52). Cys109는 CD98hc의 막관통 도메인 근처에 있고 막관통 도메인 3과 4 사이에 경쇄의 세포외 루프에서 시스테인과 디설파이드 브릿지를 유도한다. Cys109 및 Cys330의 돌연변이는 경쇄와의 공유 결합을 파괴하지만 인테그린과의 상호작용 또는 이에 대한 효과를 손상시키지 않았다. 그러나, C109S 돌연변이체는 경쇄의 표면 발현을 지지하고감소된 비율로 수송 특성을 나타내는 것으로 보고되었다(문헌참조: Pfeiffer R., 등 (1998) FEBS Lett. 439: 157-162).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD98hc는 하기 서열번호로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD98hc (“hCD98hc”)이다: 하기 GenBank® 승인 번호에 상응하는 서열번호: 97, 99, 101, 또는 103. 각각 NP_001012680.1 (이소형 b), NP_002385.3 (이소형 c), NP_001012682.1 (e), 및 NP_001013269.1 (이소형 f). 이소형 b, c, e, 및 f는 하기 GenBank® 승인 번호를 갖는 핵산에 의해 암호화된다: 각각 NM_001012662.2 (서열번호: 98), NM_002394.5 (서열번호: 100), NM_001012664.2 (서열번호: 102), 및 NM_001013251.2 (서열번호: 104). 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 CD98hc는 하기 GenBank® 서열번호에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 영장류 CD98hc (“pCD98hc”)이다: NP_001272171.1 (서열번호: 109), 이는 하기 GenBank® 승인 번호에 제시된 바와 같은 핵산 서열에 의해 암호화되어 있다: NM_001285242.1 (서열번호: 110). 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 CD98hc는 하기 GenBank® 승인 번호에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 쥐 CD98hc (“mCD98hc”)이고: NP_001154885.1 (이소형 a) (서열번호: 105), 이는 하기 GenBank® 승인 번호에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되어 있고: NM_001161413.1 (서열번호: 106). 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 쥐 CD98hc는 GenBank® 승인 번호에 제시된 아미노산 서열을 포함하고: NP_032603.3 (이소형 b) (서열번호: 107), 이는 하기 GenBank® 승인 번호에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되어 있고: NM_008577.4 (서열번호: 108).
특정 구현예에서, 상기 CD98hc는 당화된다. 특정 구현예에서, 상기 CD98hc는 인산화된다.
특정 구현예에서, CD98hc의 막관통 도메인은 하기 서열번호의 아미노산 잔기 185 내지 205로 이루어지고: 서열번호: 97 (이소형 b), hCD98hc의 세포외 도메인은 하기 서열번호의 아미노산 잔기 206 내지 630으로 이루어지고: 서열번호: 97 (이소형 b), CD98hc의 세포질 도메인은 하기 서열번호의 아미노산 잔기 102 내지 184로 이루어지고: 서열번호: 97 (이소형 b). 특정 구현예에서, CD98hc의 세포외 도메인은 하기 서열번호의 아미노산 잔기 105 내지 529로 이루어져 있고: 서열번호: 103 (이소형 f).
용어 “항-CD98hc 항체” 및 “CD98hc에 결합하는 항체”는 CD98hc에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 관련 없는 비-CD98hc 단백질로의 항-CD98hc 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사능면역검정(RIA)에 의한 측정시 CD98hc로의 항체의 결합의 약 10% 미만이다.
바시긴
본원에 사용된 바와 같은 용어 “Bsg”는 달리 지적되지 않는 경우 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 고유 바시긴(또한 CD147 또는 EMMPRIN으로서 공지된)을 언급하고, 이는 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한다. Bsg에 대한 다른 동의어는 5F7, OK, TCSF, HT7, 5A11, gp42, 뉴로텔린, OX-47, 및 HAb18을 포함한다. 상기 용어는 세포에서 프로세싱으로부터 비롯되는 임의의 형태의 Bsg뿐만 아니라 “전장” 프로세싱되지 않는 Bsg를 포괄한다. 용어는 또한 Bsg의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 천연 변이체의 예는 인간 Bsg1 (176개 아미노산), Bsg2 (269개 아미노산), Bsg3 (385개 아미노산), 및 Bsg4 (205개 아미노산)을 포함하고, 이들의 Bsg2는 인간에서 발견되는 미리 결정된 형태이다. 예시적 인간 Bsg2의 아미노산 서열은 서열번호: 112로 나타낸다. 예시적 쥐 Bsg의 아미노산 서열은 하기 서열번호로 나타낸다: 서열번호: 113.
Glut1
본원에 사용된 바와 같은 용어 “Glut1”은 달리 지적되지 않는 경우 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 고유 글루코스 수송체 1을 지칭한다. Glut1에 대한 다른 동의어는 글루코스 수송체 1형, 용질 캐리어 패밀리 2, 구성원 1, SLC2A1, HTLVR, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 수용체를 포함한다. 상기 용어는 세포내 프로세싱으로부터 비롯되는 임의의 형태의 Glut1뿐만 아니라 “전장” 프로세싱되지 않은 Glut1을 포괄한다. 상기 용어는 또한 Glut1의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예시적 인간 Glut1의 아미노산 서열은 하기 서열번호로 나타낸다: 서열번호: 114.
II. 조성물 및 방법
특정 양상에서, 본 발명은 혈뇌 장벽을 거쳐 제제를 수송하기 위한 조성물 및/또는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 제제는 CD98hc, Glut1 또는 바시긴에 대한 항체를 사용하여 혈뇌 장벽을 거쳐 수송된다. 일부 구현예에서, 항-바시긴/BACE1 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 항-Glut1/BACE1 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 혈뇌 장벽을 거쳐 제제를 수송하는 방법에 사용하기 위한 항-CD98hc/BACE1 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 고려된 항체는 인간 및/또는 영장류 CD98hc, 바시긴 또는 Glut1에 결합한다. 본 발명의 항체는 또한 예를 들어, CNS (예를 들어, 뇌)에 영향을 주는 질환 또는 장애의 치료를 위해 유용하다.
A. 항-BBB-R 항체 및 이의 접합체의 생산
본 발명의 제조 방법 및 제품은 BBB-R에 결합하는 항체를 사용하거나 혼입한다. 항체의 생산 또는 항체의 스크리닝을 위해 사용될 BBB-R 항원은 목적하는 에피토프를 함유하는, 예를 들어, 가용성 형태 또는 이의 일부(예를 들어, 세포외 도메인)일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 이들의 세포 표면에서 BBB-R을 발현하는 세포는 항체를 생성하거나 이에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 항체를 생성하기 위해 유용한 BBB-R의 다른 형태는 당업자에게 자명하다. 본원에서 BBB-R의 예는 CD98hc, Glut1 및 바시긴을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포 성장을 억제하지 않기 때문에 BBB-R에 대한항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제 (예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 이것은 아폽토시스를 유도하지 않기 때문에 BBB-R에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 이것은 BBB-R의 하나 이상의 공지된 기능을 억제하지 않기 때문에 BBB-R에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 이것은 공지된 BBB-R의 기능 중 하나 이상을 억제하지 않기 때문에 BBB-R에 대한 항체 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수용하기 위해 유용한 항체의 제조 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 CD98hc에 결합하고 CD98 이종이량체성 복합체에 의한 아미노산 수송을 억제하지 않는다. CD98hc에 의해 아미노산 수송을 검출하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 검정 (예를 들어, CD98 경쇄와의 이종이량체 복합체 내 (예를 들어, LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, 및 asc-1)은 공지되어 있고 하기 문헌에 기재되어 있다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, Fenczik, C.A등 (2001) J. Biol. Chem. 276, 8746-8752; 또한, US 2013/0052197. 또 다른 양상에서, 본 발명은 이것은 하나 이상의 이의 결합 파트너와 BBB-R의상호작용을 억제하지 않기 때문에 (예를 들어, 하기 경쇄 결합 파트너와 CD98hc의 상호작용을 억제하지 않는), BBB-R에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 이지화제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다(예를 들어, LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, 및 Asc-1).
또 다른 양상에서, 본 발명은 항체의 존재하에 이의 하나 이상의 고유 리간드로의 BBB-R의 결합이 적어도 10%이기 때문에 BBB-R에 대한 항체 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제 (예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다(예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이는 항-BBB-R 항체의 부재하에 결합량이다. 특정 구현예에서, BBB-R은 CD98hc이다. 또 다른 특정 구현예에서, BBB-R은 Glut1이다. 또 다른 특정 구현예에서, BBB-R은 바시긴이다. 고유 리간드로의 결합을 결정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 면역침전 검정, ELISA, 등).
또 다른 양상에서, 본 발명은 항체의 존재하에 혈뇌 장벽을 거쳐 BBB-R의 하나 이상의 고유 리간드의 수송이 적어도 10%이기 때문에 BBB-R에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제 (예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다(예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항체의 부재하의 수송량이다. 또 다른 특정 구현예에서, BBB-R은 CD98hc이다. 또 다른 특정 구현예에서, BBB-R은 Glut1이다. 또 다른 특정 구현예에서, BBB-R은 바시긴이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 CD98hc에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항-CD98hc 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합(예를 들어, LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, 또는 Asc-1)이 항체의 존재하에 적어도 10% (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항체의 부재하에 결합량이다. 특정 구현예에서, CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합량은 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합량은 적어도 90%이다. 특정 구현예에서, CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합량은 적어도 95%이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 CD98hc에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽을 거쳐 수송하기 위해 유용한 항-CD98hc 항체를 제조하는 방법을 제공하고 항체의 존재하에 BBB의 전역에 걸친 아미노산 수송량은 적어도 10% (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)이기 때문이고 이의 양은 항체의 부재하에 BBB의 전역에 걸친 아미노산 수송량이다. 특정 구현예에서, BBB의 전역에 걸친 아미노산 수송량은 항체의 부재하에 BBB를 건너가는 아미노산 수송량의 적어도 80%이다. 또 다른 특정 구현예에서, BBB를 건너가는 아미노산 수송량은 항체의 부재하에 BBB 의 전역에 걸친 아미노산 수송량의 적어도 90%이다. 또 다른 특정 구현예에서, CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합량은 항체의 부재하에 BBB 의 전역에 걸친 아미노산 수송량의 적어도 95%이다. 또 다른 특정 구현예에서, CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합량은 항체의 부재하에 BBB 의 전역에 걸친 아미노산 수송량의 적어도 99%이다. 또 다른 특정 구현예에서, CD98hc의 이의 경쇄 결합 파트너로의 결합량은 항체의 부재하에 BBB 의 전역에 걸친 아미노산 수송량의 100%이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 이것은 약 5nM에서, 또는 약 20 nM에서, 또는 약 100 nM에서, 약 10 μM까지, 또는 약 1 μM까지, 또는 약 500 mM까지 범위인 BBB-R에 대한 친화성을 갖기 때문에 혈뇌 장벽 수용체(BBB-R)에 대한 항체의 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 혈뇌 장벽에 걸쳐 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 친화성은 예를 들어, 스캐챠드(Scatchard) 분석 또는 BIACORE®에 의한 측정시 약 5 nM 내지 약 10 μM 의 범위 또는 약 20 nM 내지 약 1 μM의 범위, 또는 약 100 nM 내지 약 500 nM의 범위일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이종성 분자/화합물의 항체로의 접합은 상기 항체가 항체의 본래의 표적과는 상이한 항원으로 결합하는 하나 이상의 아암을 갖는 다중 특이성으로 제조되는 경우, 흔히 예를 들어, 입체 장애로 인해 또는 심지어 하나의 결합 아암의 제거로 인해 이의 표적에 대한 항체의 친화성을 감소시킨다.
B. 치료학적 방법 및 조성물
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD98hc, 항-Bsg, 및 항-Glut1 항체는 치료학적 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체는 약물로서 유용하다. 일부 양상에서, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체는 예를 들어, 치료학적 제제(예를 들어, 치료학적 약물, 예를 들어, 항체)를 CNS 부위(예를 들어, 뇌)로 전달함에 의해 신경학적 질환 또는 장애를 치료하기 위해 유용하다. 본원에 기재된 용도 및 방법에 의해 포괄되는 신경학적 질환 또는 장애의 비제한적인 예는 예를 들어, 다음을 포함한다: 알츠하이머 질환 (AD), 뇌졸중, 치매, 근위축증 (MD), 다발성 경화증 (MS), 근위축성 측삭경화증 (ALS), 낭성 섬유증, 앙겔만 증후군, 리들(Liddle) 증후군, 파킨슨 질환, 픽 질환, 파젯 질환, 암 (예를 들어, 뇌암, 예를 들어, 신경교종, 예를 들어, 다형교모세포종), 및 외상 뇌 손상.
특정 구현예에서, 본 발명은 신경학적 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체의 유효량을 개체에게 투여함을 포함하고, 상기 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체는 치료제를 혈뇌 장벽의 전역에 걸처 전달한다. 특정 구현예에서, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체의 유효량은 BBB 의 전역에 걸쳐 치료제를 수송하기 위해 효과적인 양이다. 하나의 상기 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 적어도하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여함을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 암으로 진단되지 않았다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 뇌암으로 진단되지 않았다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 뇌암을 갖지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 BBB 의 전역에 걸쳐 제제를 수송하는데 사용하기 위한 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 BBB의 전역에 걸쳐 제제를 수송하기 위해 유효량의 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체를 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 BBB 의 전역에 걸쳐 제제를 수송하는 방법에 사용하기 위한 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체를 제공한다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 본원에서 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체는다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)일 수 있고 목적하는 뇌 항원 (예를 들어, 표적)에 특이적인 치료학적 아암을 포함할 수 있다. 임의의 하나의 특정 이론 또는 작용 기전에 의해 제한하고자 하는 것 없이, 다중특이적 항체의 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체 부분은 BBB 상의 표적 수용체에 결합하고 BBB의 아블루미날 측면으로 수송되는 것으로 예상된다. 항체의 치료학적 아암 (예를 들어, 뇌 항원에 특이적인 부분)은 이어서 표적 뇌 항원에 결합할 수 있다.
특정 예에서, CD98hc/BACE1 이중특이적 항체는 BBB상에 CD98hc에 결합하고 이어서 BBB의 아블루미날 측면으로 수송되고 이어서 BACE1 항체 부분은 뇌에서 BACE1에 결합한다. 또 다른 특정 예에서, CD98hc/BACE1 이중특이적 항체는 BBB 상의 CD98hc에 결합하고 이어서 CD98 아미노산 수송체를 통해 BBB의 아블루미날 측면으로 수송되고 이어서 BACE1 항체 부분은 BACE1에 결합한다. 이것은 예를 들어, BACE1을 억제하기 위해 유용하고, 이것은 가용성 아베타수준을 감소시킨다.
또 다른 특정 예에서, 바시긴/BACE1 이중특이적 항체는 BBB 상의 바시긴에 결합하고 이어서 바시긴을 통해 BBB의 아블루미날 측면으로 수송되고 이어서 BACE1 항체 부분은 BACE1에 결합한다. 이것은 예를 들어, BACE1을 억제하기 위해 유용하고, 이것은 가용성 아베타수준을 감소시킨다.
또 다른 특정 예에서, Glut1/BACE1 이중특이적 항체는 BBB 상의 Glut1에 결합하고, 이어서 Glut1을 통해 BBB의 아블루미날 측면으로 수송되고 이어서 BACE1 항체 부분은 BACE1에 결합한다. 이것은 예를 들어, BACE1을 억제하기 위해 유용하고, 이것은 가용성 아베타수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항체의 Glut1-특이적 부분은 Glut1에 의한 뇌로의 글루코스 수송을 억제하지 않는다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약물의 제조 또는 생산에서 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약물은 신경학적 질환 또는 장애의 치료를 위한 것이다(예를 들어, 알츠하이머 질환 (AD), 뇌졸중, 치매, 근위축증 (MD), 다발성 경화증 (MS), 근위축성 측색 경화증 (ALS), 낭성 섬유증, 앙겔만 증후군, 리들(Liddle) 증후군, 파킨슨 질환, 픽 (Pick) 질환, 파제트(Paget) 질환, 암(예를 들어, 뇌암, 예를 들어, 신경교종, 예를 들어, 다형교모세포종), 및 외상성 뇌 손상). 추가의 구현예에서, 약물은 유효량의 약물을 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 투여함을 포함하는 신경학적 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 상기 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치료제의 유효량을 개체에게 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 약물은 예를 들어, 하기와 같이 BACE1, 아베타, EGFR, HER2, 타우, 아포지질단백질과 같은 단백질 수준을 감소시키기 위한 것이다 (예를 들어, ApoE4), 알파-시누클레인, CD20, 헌팅틴, PrP, LRRK2, 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, DR6, APP, p75NTR, 및 카스파제 6.추가의 구현예에서, 약물은 제제를 BBB의 전역에 걸쳐 수송하기 위해 유효량의 약물을개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 BBB의 전역에 걸쳐 제제를 수송하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
상기된 치료학적 방법 및 용도의 일부 양상에서, 상기 방법에 사용되는 항-CD98hc 항체는 CD98hc (예를 들어, 아미노산 수송체)의 정상적이고/이거나 보고된 기능을 손상시키지 않는다. 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 CD98hc의 하나 이상의 고유 리간드로의 결합을 손상시키지 않는다. 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 CD98 이종이량체성 복합체(CD98hc 및 경쇄결합 파트너로 이루어진)의 결합을 손상시키지 않고(예를 들어, LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, 및 Asc-1)) 이종이량체 복합체의 하나 이상의 고유 리간드로의 결합을 손상시키지 않는다. 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 CD98hc와 경쇄 결합 파트너의 쌍 형성을 억제하지 않는다(예를 들어, LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, 및 Asc-1).
치료학적 방법의 일부 양상에서, CD98hc 항체의 존재하에 CD98hc 및/또는 CD98 이종이량체 복합체의 하나 이상의 고유 리간드로의 결합은 적어도 10%이고 (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항-CD98hc 항체의 부재하의 결합량이다.
치료학적 방법의 일부 양상에서, CD98hc 항체의 존재하에 혈뇌 장벽에 걸친 CD98 이종이량체 복합체의 하나 이상의 고유 리간드의 수송은 적어도 10%이고 (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항-CD98hc 항체의 부재하의 수송량이다.
치료학적 방법의 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포사 및/또는 아폽토시스를유도하지 않는다. 또 다른 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포 증식을 억제하지 않는다. 또 다른 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포 분열을 억제하지 않는다. 또 다른 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포 접착을 억제하지 않는다. 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포사 또는 아폽토시스를 유도하지 않고 세포 증식을 억제하지 않는다. 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포사 또는 아폽토시스를 유도하지 않고 세포 증식, 세포 분열 또는 세포 접착을 억제하지 않는다.
치료학적 방법의 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 CD98hc의 세포외 도메인내영역에 결합한다(예를 들어, 하기 서열번호의 아미노산 잔기들 105 내지 529번에 걸쳐 있는 영역내 에피토프에 결합한다: 서열번호: 103). 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포외 시스테인 Cys109를 포함하지 않는 에피토프에 결합한다. 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 세포외 시스테인 Cys210을 포함하지 않는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-CD98hc 항체는 하기의 정식 630개 아미노산 CD98hc 서열의 세포외 시스테인 Cys330을 포함하지 않는 에피토프에 결합한다(이소형 c, 서열번호: 99).
일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 충분한 친화성으로 CD98hc에 결합하여 상기 항체는 치료학적 제제를 BBB의 전역에 걸쳐 수송하기 위해 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 방법에 사용하기 위한 항-CD98hc 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M). 특정 구현예에서, 항-CD98hc 항체는 상이한 종 기원의 CD98hc 중에서 보존된CD98hc의 에피토프에 결합한다.
임의의 상기 양상에서, 항-CD98hc 항체는 인간화된 항체일 수 있다.
치료학적 방법의 일부 양상에서, 본원에 기재된 항-Bsg 항체의 존재하에 혈뇌 장벽에 걸친 바시긴의 하나 이상의 고유 리간드의 수송은 적어도 10%이고 (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항-Bsg 항체의 부재하에 수송량이다.
임의의 상기 구현예에서, 항-Bsg 항체는 인간화된 항체일 수 있다.
치료학적 방법의 일부 양상에서, 본원에 기재된 항-Glut1 항체의 존재하에 혈뇌 장벽에 걸친 Glut1의 하나 이상의 고유 리간드의 수송은 적어도 10%이고(예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항-Glut1 항체의 부재하의 수송량이다.
임의의 상기 구현예에서, 항-Glut1 항체는 인간화된 항체일 수 있다.
상기된 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 뇌 및/또는 CNS의 질환 및 장애를 치료하는 방법을 포함한다 S.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 신경병증 장애는 치료학적 방법에 따라 그리고 본원에 기재된 조성물로 치료될 수 있다. 신경병증 장애는 부적당하거나 비조절된 신경 신호 전달 또는 이의 부재를 특징으로 하는 신경계의 질환 또는 비정상이고 만성 통증 (통각수용 통증을 포함하는), 신체 조직에 대한 손상에 의해 유발되는 통증을 포함하지만 이에 국한되지 않고, 암 관련 통증, 신경병증성 통증, (신경, 척수 또는 뇌에서 비정상에 의해 유발되는 통증), 및 심인성 통증 (전반적으로 또는 대부분 심리적 장애와 관련된), 두통, 편두통, 신경병증, 및 증상 및 흔히 현기증 또는 구역질과 같은 상기 신경병증 장애를 흔히 수반하는 증상을 포함한다.
신경병증 장애에 대해, 진통제인 신경학적 약물이 선택될 수 있고 진정제/오피오이드 진통제(예를 들어, 모르핀, 펜타닐, 하이드로코돈, 메페리딘, 메타돈, 옥시모르폰, 펜타조신, 프로폭시펜, 타마돌, 코데인 및 옥시코돈), 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID) (예를 들어, 이부프로펜, 나프록센, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 인도메타신, 케토롤락, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 옥사프로진, 피록시캄, 설린닥, 및 톨메틴), 코르티코스테로이드(예를 들어, 코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론 및 트리암시놀론), 항-편두통 제제 (예를 들어, 수마트립틴, 알모트립탄, 프로바트립탄, 수마트립탄, 리자프립탄, 엘레트립탄, 졸미트립탄, 디하이드로에르고타민, 엘레트립탄 및 에르고타민), 아세트아미노펜, 살리실레이트 (예를 들어, 아스피린, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 및 살살레이트), 항-경련제(예를 들어, 카바마제핀, 클로나제팜, 가바펜틴, 라모트리긴, 프레가발린, 티아가빈 및 토피라메이트), 마취제 (예를 들어, 이소플루란, 트리클로로에틸렌, 할로탄, 세보플루란, 벤조카인, 클로로프로카인, 코카인, 사이클로메티카인, 디메토카인, 프로폭시카인, 프로카인, 노보카인, 프로파라카인, 테트라카인, 아티카인, 부피바카인, 카티카인, 신코카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 피페로카인, 프릴로카인, 로피바카인, 트리메카인, 삭시톡신 및 테트로도톡신), 및 콕스-2-억제제(cox-2-inhibitor) (예를 들어, 셀렉콕시브, 로페콕시브, 및 발데콕시브)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 현기증이 포함된 신경병증 장애에 대해, 항-현기증 제제인 신경학적 약물이 선택될 수 있고, 이는 메클리진, 디펜하이드라민, 프로메타진 및 디아제팜을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 구역질이 관여된 신경병증 장애에 대해, 항-구역질 제제인 신경학적 약물이 선택될 수 있고 이는 프로메타진, 클로르프로마진, 프로클로르페라진, 트리메토벤자미드 및 메토클로프라미드를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 아밀로이드증은 치료학적 방법에 따라 그리고 본원에 기재된 조성물에 따라 치료될 수 있다. 아밀로이드증은 CNS에서 세포외 단백질성 침적과 관련된 질환 및 장애 그룹이고, 2차 아밀로이드증, 연령 관련 아밀로이드증, 알츠하이머 질환 (AD), 경증 인지 손상(MCI), 루이소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증(네덜란드 형)을 갖는 유전성 뇌 출혈, 구암 파킨슨-치매 합병증(Guam Parkinson-Demential complex), 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 헌팅톤 질환, 진행성 핵상안근 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트-야콥 질환, 파킨슨 질환, 전염성 해면양뇌증, HIV-관련 치매, 근육위축성측색경화증(ALS), 봉입체 근염 (IBM), 및 베타 아밀로이드 침적과 관련된 눈 질환(예를 들어, 황반 퇴화, 드루젠-관련 시각 신경병증 및 백내장)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
아밀로이드증에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고, 이는 하기로부터 선택되는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 결합 분자 (소분자, 펩타이드, 압타머, 또는 다른 단백질 결합제를 포함지만 이에 국한되지 않는다)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 베타 세크레타제, 타우, 프레세닐린, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 이의 일부, 아밀로이드 베타 펩타이드 또는 올리고머 또는 이의 섬유, 사멸 수용체 6 (DR6), 최종 당화 산물에 대한 수용체 (RAGE), 파킨, 및 헌팅틴; 콜린에스테라제 억제제 (예를 들어, 갈란타민, 도네페질, 리바스티그민 및 타크린); NMDA 수용체 길항제 (예를 들어, 메만틴), 모노아민 고갈제 (예를 들어, 테트라베나진); 에르골로이드 메실레이트; 항콜린성 항파킨슨 제제 (예를 들어, 프로사이클리딘, 디펜하이드라민, 트리헥실페니딜, 벤즈트로핀, 비페리덴 및 트리헥시페니딜); 도파민성 항파킨슨 제제 (예를 들어, 엔타카폰, 셀레길린, 프라미펙솔, 브로모크립틴, 로티고틴, 셀레길린, 로피니롤, 라사길린, 아포모르핀, 카비도파, 레보도파, 페르골리드, 톨카폰 및 아만타딘); 테트라베나진; 소염제 (비스테로이드성 소염 약물(예를 들어, 인도메티신 및 상기 열거된 다른 화합물)을 포함하지만 이에 국한되지 않음); 호르몬 (예를 들어, 에스트로겐, 프로게스테론 및 류프롤리드); 비타민 (예를 들어, 폴레이트 및 니코틴아미드); 디메볼린; 호모타우린 (예를 들어, 3-아미노프로판설폰산; 3APS); 세로토닌 수용체 활성 조절제 (예를 들어, 살리프로덴); 인터페론 및 글루코코르티코이드.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 암은 치료학적 방법 그리고 본원에 기재된 조성물에 따라 치료될 수 있다. CNS의 암은 하나 이상의 CNS 세포(예를 들어, 신경 세포)의 비정상적 증식을 특징으로 하고 신경교종, 다형신경모세포종, 뇌수막종, 성상세포종, 청신경종, 척삭종, 핍지교종, 수아세포종, 신경절교종, 신경초종, 신경섬유종, 신경아세포종, 및 경막외, 척수내 또는 경막내 종양을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
암에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고(예를 들어, 그리고 항-CD98hc, Glut1 또는 Bsg 항체에 접합되거나 이와 동시투여되는) 이는 화학치료제이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포르-아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴, 및 라니무스틴; 에네디인 항생제와 같은 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마 1I 및 칼리케아미신 오메가 I1 (문헌참조: 예를 들어, Agnew, Chem Intl.Ed.Engl., 33: 183-186 (1994)); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 에스페라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2”트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바진; 마노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신 아라비노사이드 (“Ara-C”); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J. ),ABRAXANETM 크레모포르-부재, 파클리탁셀의 알부민-가공된 나노입자 형성 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트펙세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 상기 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기 중 2개 이상의 조합, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 조합된 치료제에 대한 약어인 CHOP 및, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATINTM)과의 치료 용법을 위한 약어인 FOLFOX을 포함한다.
또한, 화학치료제의 정의에 포함되는 것은 항-호르몬제이고, 이는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나, 감소시키거나, 차단시키거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제이고 흔히 전신성 또는 전체 신체 치료 형태로 있다. 이들은 자체가 호르몬일 수 있다. 이의 예는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM)를 포함하고, 이는 예를 들어, 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜을 포함하는), EVISTA® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시아목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON® 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 난소를 억제하거나 셧 다운시키는 기능을 하는 제제, 예를 들어, 황체 호르몬 방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예를 들어, LUPRON® 및 ELIGARD® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학치료제의 상기 정의는 비스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), DIDROCAL® 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA® 졸레드론산 /졸레드로네이트, FOSAMAX® 알레드로네이트, AREDIA® 파미드로네이트, SKELID® 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL® 리세드로네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상 세포 증식에 연루된 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE® 백신 및 유전자 치료요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 라파티니브 디토실레이트 (GW572016으로서 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이원 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
암 치료 또는 예방을 위한 신경학적 약물로서 선택될 수 있는 또 다른 그룹의 화합물은 항암 면역글로불린(트라스투주맙, 페르투주맙, 베바시주맙, 알렘툭수맙, 세툭시맙, 젬투주맙 오조가미신, 이브리투모맙 티욱세탄, 파니투무맙 및 리툭시맙을 포함하지만 이에 국한되지 않는다)이다. 일부 경우에, 독성 표지 또는 접합체와 연계된 항체는 목적하는 세포(예를 들어, 암 세포)를 표적화하고 사멸시키기 위해 사용될 수 있고, 131I 방사능표지를 갖는 토시투모맙, 또는 트라스투주맙 엠탄신을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 안 질환 및 장애는 치료학적 방법 그리고 본원에 기재된 화합물에 따라 치료될 수 있다. 안 질환 또는 장애는 본원의 목적을 위해 BBB에 의해 격리된 CNS 기관으로 고려되는 눈의 질환 또는 장애이다. 안 질환 또는 장애는 공막, 각막, 홍채 및 모양체의 장애 (예를 들어, 공막염, 각막염, 각막 궤양, 각막찰과상, 설맹, 광각막염, 티제슨 표층점상 각막병증, 각막 신생혈관화, 폭스 영양 실조, 원추각막, 건성각결막염, 홍채염 및 포도막염), 렌즈 장애(예를 들어, 백내장), 맥락막 및 망막의 장애 (예를 들어, 망막 탈리, 망막 분리, 고혈압 망막병증, 당뇨병 망막병증, 망막병증, 영구적 망막병증, 노화 황반 퇴화, 반점 퇴화 (습윤 또는 건조), 망막 전막, 망막색소변성증 및 황반 부종), 녹내장, 부유물, 시신경 및 시각 경로의 장애 (예를 들어, 레버 유전적 시각 신경병증 및 시각 유두드루젠), 안 근육/양안 운동 수용/굴절의장애(예를 들어, 사시, 안외 근육의 마비, 진행성 외부 안근마비, 내사시, 외사시, 원시, 근시, 난시, 부동시, 노안 및 안근마비), 시각적 혼란 및 맹목 (예를 들어, 약시, 레버 선천성 흑내장, 암점, 색맹, 색맹(achromatopsia), 야맹증, 맹목, 사상충증 및 미세 안염/결손), 적색 눈, 아가일로버트슨동공, 각맥진균증, 안구건조증 및 안다니리디아(andaniridia)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
안 질환 또는 장애에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고 이는 항-혈관형성 안과 제제 (예를 들어, 베바시주맙, 라니비주맙 및 페갑타니브), 안과 녹내장 제제 (예를 들어, 카바콜, 에피네프린, 데메카리움 브로마이드, 아프라클로니딘, 브리모니딘, 브린졸라미드, 레보부놀올, 티몰올, 베탁솔올, 도르졸라미드, 비마토프로스트, 카테올롤, 메티프라놀올, 디피베프린, 트라보프로스트 및 라타노프로스트), 카보닉 안하이드라제 억제제 (예를 들어, 메타졸라미드 및 아세타졸라미드), 안과 항히스타민(예를 들어, 나파졸린, 페닐에프린 및 테트라하이드로졸린), 안 윤활제, 안과 스테로이드 (예를 들어, 플루오로메톨론, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 덱사메타손, 디플루프레드네이트, 리멕솔론, 플루오시놀론, 메드리손 및 트리암시놀론), 안과 마취제 (예를 들어, 리도카인, 프로파라카인 및 테트라카인), 안과 항-감염제 (예를 들어, 레보플록사신, 가티플록사신, 시프로플록사신, 목시플록사신, 클로르암페니콜, 바시트라신/폴리믹신 b, 설파세타미드, 토브라마이신, 아지트로마이신, 베시플록사신, 노르플록사신, 설피속사졸, 젠타미신, 요독스우리딘, 에리트로마이신, 나타마이신, 그라미시딘, 네오마이신, 오플록사신, 트리플루리딘, 간시클로비르, 비다라빈), 안과 소염제(예를 들어, 네파페낙, 케토롤락, 플러비프로펜, 수프로펜, 사이클로스포린, 트리암시놀론, 디클로페낙 및 브롬페낙), 및 안과 항히스타민 또는 충혈제거제 (예를 들어, 케토티펜, 올로파타딘, 에피나스틴, 나파졸린, 크로몰린, 테트라하이드로졸린, 페미롤라스트, 베포타스틴, 나파졸린, 페닐에프린, 네도크로밀, 로독사미드, 페닐에프린, 에메다스틴 및 아젤라스틴)이다.
CNS의 바이러스 또는 미생물 감염은 하기에 의한 감염을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 바이러스(예를 들어, 인플루엔자, HIV, 폴리오바이러스, 루벨라), 세균(예를 들어, 나이세리아 종(Neisseria sp.),스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.),슈도모나스 종(Pseudomonas sp.),프로테우스 종(Proteus sp.),이 콜라이(E. coli), 에스. 아우레우스(S. aureus), 뉴모코커스 종(Pneumococcus sp.),메닝고코커스 종(Meningococcus sp.),해모필러스 종(Haemophilus sp.), 및 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)) 및 다른 미생물, 예를 들어, 진균류(예를 들어, 효모, 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)), 기생충 (예를 들어, 톡소플라스마 곤디(toxoplasma gondii)) 또는 급성 또는 만성일 수 있는, 급뇌수막염, 뇌염, 척수염, 혈관염 및 부스럼을 포함하지만 이에 국한되지 않는 CNS 병리생리학을 유도하는 아메바.
바이러스 또는 미생물 질환에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고 이는 항바이러스 화합물 (아다만탄 항바이러스 (예를 들어, 리만타딘 및 아만타딘을 포함하지만 이에 국한되지 않음), 항바이러스 인터페론 (예를 들어, 페긴테르페론 알파-2b), 케목킨 수용체 길항제(예를 들어, 마라비록), 인테그라제 가닥 전달 억제제 (예를 들어, 랄테그라비르), 뉴라미니다제 억제제 (예를 들어, 오셀타미비르 및 자나미비르), 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제 (예를 들어, 에파비렌즈, 에트라비린, 델라비르딘 및 네비라핀), 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제 (테노포비르, 아바카비르, 라미부딘, 지도부딘, 스타부딘, 엔테카비르, 엠트리시타빈, 아데포비르, 잘시타빈, 텔비부딘 및 디나노신), 프로테아제 억제제 (예를 들어, 다루나비르, 아타자나비르, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 리토나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 인디나비르 및 사퀴나비르), 퓨린 뉴클레오사이드 (예를 들어, 발라사이클로비르, 팜시클로비르, 아사이클로비르, 리바비린, 강시클로비르, 발간시클로비르 및 시도포비르), 및 다양한 항바이러스(예를 들어, 엔푸비르티드, 포스카네트, 팔리비주맙 및 포미비르센)), 항생제 (아미노페니실린 (예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 옥사실린, 나프실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루콕사실린, 테모실린, 아즐로실린, 카베니실린, 티카실린, 메즐로실린, 피페라실린 및 바캄피실린을 포함하지만 이에 국한되지 않음), 세팔로스포린 (예를 들어, 세파졸린, 세팔렉신, 세팔로틴, 세파만돌, 세프트리악손, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세파드록실, 세프라딘, 로라카베프, 세포테탄, 세푸록심, 세프프로질, 세파클로르, 및 세폭시틴), 카바페넴/페넴 (예를 들어, 이미페넴, 메로페넴, 에르타페넴, 파로페넴 및 도리페넴), 모노박탐(예를 들어, 아즈트레오남, 티게모남, 노르카디신 A 및 타브톡시닌-베타-락탐, 또 다른 베타-락탐 항생제와 연계된 베타-락타마제 억제제 (예를 들어, 클라불란산, 타조박탐 및 설박탐), 아미노글리코사이드 (예를 들어, 아미카신, 젠타미신, 가나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 토브라마이신 및 파로모마이신), 안사마이신 (예를 들어, 겔다나마이신 및 허비마이신), 카바세펨 (예를 들어, 로라카베프), 글리코펩타이드 (예를 들어, 테이코폴라닌 및 반코마이신), 마크롤리드 (예를 들어, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리트로마이신 및 스펙티노마이신), 모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남), 퀴놀론 (예를 들어, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 그레파플록사신, 스파르폴록사신 및 테마플록사신),설폰아미드 (예를 들어, 마페니드, 설폰아미도크리소이딘, 설파세타마이드, 설파디아진, 설파메티졸, 설파닐아미드, 설파살라진, 설피속사졸, 트리메토프림, 트리메토프림 및 설파메톡사졸), 테트라사이클린 (예를 들어, 테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린 및 옥시테트라사이클린), 항신생물 또는 세포독성 항생제 (예를 들어, 독소루비신, 미톡산트론, 블레오마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 플리카마이신, 미토마이신, 펜토스타틴 및 발루비신) 및 다양한 항세균 화합물 (예를 들어, 바시트라신, 콜리스틴 및 폴리믹신 B)), 항진균류 (예를 들어, 메트로니다졸, 니타족사니드, 티니다졸, 클로로퀸, 요오도퀴놀 및 파로모마이신), 및 항기생충(퀴닌, 클로로퀸, 아모디아퀸, 피리메타민, 설파독신, 프로구아닐, 메플로퀸, 아토바쿠온, 프리마퀸, 아르테메시닌, 할로판트린, 독시사이클린, 클린다마이신, 메벤다졸, 피란텔 파모에이트, 티아벤다졸, 디에틸카바마진, 이베르멕틴, 리팜핀, 암포테리신 B, 멜라르소프롤, 에포르니틴 및 알벤다졸)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
CNS 염증은 또한 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있다. CNS의 염증은 CNS에 의해 유발되는 염증을 포함하지만 이에 국한되지 않고, 이는 물리적 손상(예를 들어, 사고, 수술, 뇌 외상, 척수 손상, 뇌진탕) 및 CNS의 하나 이상의 다른 질환 또는 장애 (예를 들어, 부스럼, 암, 바이러스 또는 미생물 감염)로 인한 또는 이와 관련된 손상일 수 있다.
CNS 염증에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고 이는 염증 자체를 해소시키는 약물 (예를 들어, 비스테로이드성 소염제, 예를 들어, 이부프로펜 또는 나프록센)이거나 염증의 기본 원인을 치료하는 약물(예를 들어, 항바이러스 또는 항암제)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 CNS의 허혈은 뇌에서 비정상적 혈류 또는 혈관 거동또는 이에 대한 원인과 관련된 장애 그룹을 언급하고 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 국소 뇌 허혈, 전체적 뇌 허혈, 뇌졸중 (예를 들어, 지주막하 출혈 및 대뇌내 출혈) 및 동맥류.
허혈에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고 이는 혈전용해 (예를 들어, 우로키나제, 알테플라제, 레테플라제 및 테넥테플라제), 혈소판 응집 억제제 (예를 들어, 아스피린, 실로스타졸, 클로피도그렐, 프라수그렐 및 디피리다몰), 스타틴(예를 들어, 로바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 로수바스타틴, 아토바스타틴, 심바스타틴, 세리바스타틴 및 피타바스타틴), 및 예를 들어, 혈압 약물을 포함하는 혈류 또는 혈관 유동성을 개선시키는 화합물을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
신경퇴행성 질환은 CNS에서 신경 세포 기능 상실 또는 사멸과 관련된 질환 및장애 그룹이고 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 부신백질이영양증, 알렉산더 질환, 알파병, 근위축성 측색 경화증, 모세혈관확장 운동실조, 배턴 질환, 콕카인 증후군, 피질기저 퇴행, 아밀로이드증에 의해 유발되거나 연합된 퇴행, 프리드리히 운동실조, 전측두엽 변성, 케네디 질환, 다계통 위축, 다발성 경화증, 1차 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 척수성 근위축, 횡단척수염, 레프섬 질환, 및 유전성 실조증.
신경퇴행성 질환에 대해 신경학적 약물이 선택될 수 있고 이는 성장 호르몬 또는 신경영양 인자이고; 이의 예는 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀-4/5, 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-2 및 다른 FGF, 뉴로트로핀 (NT)-3, 에리트로포이에틴 (EPO), 간세포 성장 인자 (HGF), 상피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 (TGF)-알파, TGF-베타, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨-1 수용체 길항제 (IL-1ra), 섬모 신경 영양 인자 (CNTF), 신경교 유래된 신경 영양 인자 (GDNF), 뉴르투린, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 헤레굴린, 뉴레굴린, 아르테민, 퍼세핀, 인터류킨, 신경교 세포주 유래된 신경 영양 인자 (GFR), 과립구-콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구-대식세포-CSF, 네트린, 카디오트로핀-1, 고슴도치, 백혈병 억제 인자 (LIF), 미드카인, 플레이오트로핀, 골 형태형성 단백질 (BMPs), 네트린, 사포신, 세마포린, 및 줄기 세포 인자 (SCF)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
CNS의 발작 질환 및 장애는 CNS에서 부적당하고/하거나 비정상적 전기 전도를포함하고, 뇌전증 (예를 들어, 결신 발작, 무긴장 발작, 양성 롤란딕 뇌전증, 소아 소발작, 클론성 발작, 복합 부분 발작, 전두엽 뇌전증, 과열성 발작, 영아 연축, 소아 근간대성 뇌전증, 청소년기 소발작 뇌전증, 레녹스-가스타우트 증후군, 란다우-클레프너 증후군, 드라베트 증후군, 오타하라 증후군, 웨스트 증후군, 근간대 발작, 미토콘드리아 장애, 진행성 근간대 뇌전증, 정신성 발작, 반사간질, 라스무센 증후군, 단순 부분 발작, 2차 일반화된 발작, 일시적 엽 뇌전증, 토니클로닉 발작, 토닉 발작, 정신운동성 발작, 변연계 뇌전증, 부분 개시 발작, 일반화된 개시 발작, 중첩 발작, 복부 뇌전, 무동성 발작, 자율 발작, 거대한 양측성 근간대성 발작, 월경 뇌전증, 드랍 발작, 감정 발작, 초점 발작, 겔라틱 발작, 잭소니안 마치, 라포라 질환, 모터 발작, 다초점 발작, 야간 발작, 감광성 발작, 가정 발작, 감막 발작, 민감한 발작, 실반 발작, 금단 발작, 및 가시적 반사 발작)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
발작 장애에 대해, 신경학적 약물이 선택될 수 있고, 이는 항경련성 또는 항발작성 약물이고, 이는 바비투레이트 항경련제 (예를 들어, 프리미돈, 메트아비탈, 메포바비탈, 알로바비탈, 아모바비탈, 아프로바비탈, 알펜성, 바비탈, 브랄로바비탈 및 페노바비탈), 벤조디아제핀 항경련제 (예를 들어, 디아제팜, 클로나제팜, 및 로라제팜), 카바메이트 항경련제 (예를 들어, 펠바메이트), 카본 언하이드라제 억제제 항경련제 (예를 들어, 아세타졸아미드, 토피라메이트 및 조니스아미드), 디벤즈아제핀 항경련제 (예를 들어, 루핀아미드, 카바마제핀, 및 옥스카바제핀), 지방산 유도체 항경련제 (예를 들어, 디발프로엑스 및 발프론산), 감마-아미노부티르산 유사체 (예를 들어, 프레가발린, 가바펜틴 및 비가바트린), 감마-아미노부티르산 재흡수 억제제 (예를 들어, 티아가빈), 감마-아미노부티르산 트랜스아미나제 억제제 (예를 들어, 비가바트린), 하이단토인 항경련제 (예를 들어, 페니토인, 에토토인, 포스페니토인 및 메페니토인), 다양한 항경련제 (예를 들어, 라코스아미드 및 황산마그네슘), 프로게스틴 (예를 들어, 프로게스테론), 옥사졸리딘디온 항경련제 (예를 들어, 파라메타디온 및 트리메타디온), 피롤리딘 항경련제(예를 들어, 레베티라세탐), 숙신이미드 항경련제 (예를 들어, 에토석스이미드 및 메트석스이미드), 트리아진 항경련제 (예를 들어, 라모트리긴), 및 우레아 항경련제 (예를 들어, 페나세미드 및 페네투리드)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
거동 장애는 이에 걸린 대상체 부분에 대한 비정상적 거동을 특징으로 하는CNS 장애이고 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 수면 장애 (예를 들어, 불면증, 반응소실증, 야간 공포, 일주기율동 수면장애, 및 기면증), 분위기 장애 (예를 들어, 우울증, 자살 우울증, 근심, 만성 정동 장애, 공포증, 공황 발작, 강박 장애, 주의력 결핍 과다활동 장애 (ADHD), 주의력 결핍 장애 (ADD), 만성 피로 증후군, 광장공포증, 외상후 스트레스 장애, 양극성 장애), 섭식 장애 (예를 들어, 식욕부진 또는 식욕 이상 항진증), 정신병, 발달성 거동 장애 (예를 들어, 자폐증, 레트 증후군, 아스프버거 증후군), 성격 장애 및 정신 장애 (예를 들어, 조현병, 망상 장애 등).
거동 장애에 대해, 신경학적 약물은 비전형적 정신병 약물(예를 들어, 리스페리돈, 올란자핀, 아프리피라졸, 퀴에티아핀, 팔리페리돈, 아세나핀, 일로페리돈 및 지프라시돈), 페노티아진 항정신병 약물 (예를 들어, 프로클로르페라진, 클로르프로마진, 플루페나진, 퍼페나진, 트리플루오페라진, 티오리다진 및 메소리다진), 티옥산텐 (예를 들어, 티오틱센), 다양한 항정신병 약물(예를 들어, 피모지드, 리튬, 몰린돈, 할로페리돌 및 록사핀), 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (예를 들어, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 파록세틴, 플루옥세틴 및 세르트랄린), 세로토닌-노레피네프린 재흡수 억제제 (예를 들어, 둘록세틴, 벤라팍신, 데스벤라팍신, 트리사이클릭 항우울제 (예를 들어, 독세핀, 클로미프라민, 아목사핀, 노르트리프틸린, 아미트리프틸린, 트리미프라민, 이미프라민, 프로트립틸린 및 데시프라민), 테트라사이클릭 항우울제(예를 들어, 미르타자핀 및 마프로틸린), 페닐피페라진 항우울제 (예를 들어, 트라조돈 및 네파조돈), 모노아민 옥시다제 억제제 (예를 들어, 이소카복사지드, 페넬진, 셀레길린 및 트라닐사이프로민), 벤조디아제핀 (예를 들어, 알프라졸람, 에스타졸람, 플루라제프탐, 클로나제팜, 로라제팜 및 디아제팜), 노르에피네프린-도파민 재흡수 억제제 (예를 들어, 부프로피온), CNS 자극제 (예를 들어, 펜테르민, 디에틸프로피온, 메탐페타민, 덱스트로암페타민, 암페타민, 메틸페니데이트, 덱스메틸페니데이트, 리스덱스암페타민, 모다피닐, 페몰린, 펜디메트라진, 벤즈페타민, 펜디메트라진, 아모다피닐, 디에틸프로피온, 카페인, 아토목세틴, 독사프람 및 마진돌), 불안/진정제/최면술 (바비투레이트 (예를 들어, 세코바비탈, 페노바비탈 및 메포바비탈), 벤조디아제핀 (상기된 바와 같이), 및 다양한 근심/전정제/최면제(예를 들어, 디펜하이드라민, 나트륨 옥시베이트, 잘레플론, 하이드록시진, 클로랄 수화물, 아올피뎀, 부스피론, 독세핀, 에스조피클론, 라멜테온, 메프로바메이트 및 에트클로르비놀)을 포함하지만 이에 국한되지 않음), 세크레틴을 포함하지만 이에 국한되지 않는 거동-변형 화합물로부터 선택될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ratliff-Schaub 등 Autism 9: 256-265 (2005)), 오피오이드 펩타이드 (참고, 예를 들면, Cowen 등, J. NeuroChem . 89: 273-285 (2004)), 및 뉴로펩타이드 (참고, 예를 들면, Hethwa 등 Am. J. Physiol. 289: E301-305 (2005)).
리소좀 저장 장애는 일부 경우에 CNS와 관련되거나 CNS-특이적 증상을 갖는 대사장애이고; 상기 장애는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 타이-사쉬(Tay-Sach) 질환, 가우처(Gaucher’s) 질환, 파브리(Fabry) 질환, 점액성다당류증(I, II, III, IV, V, VI 및 VII형), 글리코겐 저장 질환, GM1-강글리오시드축적증, 이염백색질장애, 파버(Farber’s) 질환, 카나반(Canavan’s) 백질이영양증, 및 신경원 세로이드 지방갈색소증 1형 및 2형, 니만-픽(Niemann-Pick) 질환, 펌프 질환, 및 크라베(Krabbe’s) 질환.
리소좀 저장 질환에 대해, 질환에서 손상된 효소의 활성 자체이거나 이를 모방하는 신경학적 약물이 선택될 수 있다. 리소좀 저장 장애의 치료를 위한 예시적 재조합 효소는 다음 문헌에 제시된 것들 을 포함하지만 이에 국한되지 않는다” 예를 들어, 미국특허원 공보 번호2005/0142141 (예를 들어, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제, N-설파타제, 알파-N-아세틸글루코스아미니다제, N-아세틸-갈락토사민-6-설파타제, 베타-갈락토시다제, 아릴설파타제 B, 베타-글루쿠로니다제, 산 알파-글루코시다제, 글루코세레브로시다제, 알파-갈락토시다제 A, 헥소스아미니다제 A, 산 스핑고마엘리나제, 베타-갈락토세레브로시다제, 베타-갈락토시다제, 아릴설파타제 A, 산 세라미다제, 아스파르토아실라제, 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 및 트리펩티딜 아미노 펩티다제 1).
하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 증상의 개시 전 신경학적 장애를 검출하고/하거나 질환 또는 장애의 중증성 또는 지속성을 평가하기 위해 사용된다. 하나의 양상에서, 항체는 방사선촬영, 단층촬영 또는 자기 공명 영상(MRI)에 의한 영상을 포함하는, 신경학저 장애의 검출 및/또는 영상을 허용한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 치료요법에서 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가의 치료제와 동시 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 화학치료제이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 상기된 바와 같은 하나 이상의 신경학적 장애와 함께 투여된다.
상기된 병용 치료요법은 병용 투여(여기서, 2개 이상의 치료제는 동일하거나 별도의 제형에 포함된다) 및 별도의 투여(이 경우에, 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 또는 치료제들의 투여 전, 이와 동시 및 투여 후 수행될 수 있다)를 포괄한다. 하나의 구현예에서, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체의 투여 및 추가의 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내 또는 약 1, 2 또는 3주 이내 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일내에 일어난다. 본 발명의 항체는 또한 방사능 치료요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)가 투여될 수 있거나 본 발명의 방법은 비경구 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의한 투여 및 경우에 따라 국소 치료, 병변내 투여를 포함할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 부분적으로 투여가 간단하거나 만성적인지에 따라 정맥내 또는 피하내 주사와 같은 주사에 의한 것일 수 있다. 다양한 투여 스케줄은 다양한 시점에 대한 단일 또는 다중 투여를 포함하지만 이에 국한되지 않고 볼루스 투여 및 펄스 주입이 본원에 고려된다.
본 발명의 항체는 양호한 의학적 수행과 일관된 양상으로 제형화되고, 복용되고 투여된다. 본원에서 고려하기 위한 인자는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개체 환자의 임상적 조건, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 담당자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체는 제형화될 필요는 없지만 임의로 미지의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 제형화된다. 상기 다른 제제의 유효량은 제형 중에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 동일한 용량 및 투여 경로, 또는 약1 내지 99%의 용량 또는 경험적으로/임상적으로 적당한 것으로 결정된 임의의 용량으로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적당한 용량 (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 병용되는 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 상기 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료 요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당의 판단에 따라 다양하다. 상기 항체는 하나의 시점에서 또는 일련의 치료 동안에 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입 여부에 따라 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 일회의 통상적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 수일 또는 그 이상 동안의 반복적인 투여를 위해, 상기 병태에 따라, 치료는 일반적으로 목적하는 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 하나의 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의 조합)의 일회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 1주 1회 또는 3주 1회 (예를 들어, 상기 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6 용량의 항체를 투여받도로 하는) 투여될 수 있다. 초기에 보다 높은 로딩 용량에 이어서 일회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적 투여 용법은 다음의 투여를 포함한다: 예를 들어, “약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량에 이어서 항체의 약 2mg/kg의 주간 유지 용량. 그러나, 다른 투여 용법이 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
상기 임의의 제형 또는 치료 방법은 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체 대신 또는 이에 추가로 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
C. 예시적 항체
1. 예시적 항- 바시긴 항체
일부 구현예에서, 혈뇌 장벽을 거쳐 제제를 수송하기 위해 본원에 제공된 방법은상기 혈뇌 장벽을 바시긴(Bsg)에 결합하는 항체에 노출시킴을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 바시긴에 결합하는 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에 상세하게 기재된다. 따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 Bsg에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 바시긴의 세포외 도메인 내 영역에 결합하는 항-Bsg 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 쥐 Bsg 및/또는 인간 Bsg에 결합하는 항-Bsg가 제공된다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 바시긴으로의 결합은바시긴의 하나 이상의 이의 고유 리간드, 예를 들어, 인테그린 알파3, 인테그린 알파6, 인테그린 베타 1, 사이클로필린 A, 사이클로필린 B, 어넥신 II 및 카베올린 1과 바시긴의 결합을 손상시키지 않고/않거나 혈뇌 장벽을 거치는 BBB-R의 임의의 고유 리간드의 수송을 손상시키지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 “손상시키지 않는다”는 하나 이상의 고유 리간드가 어떠한 항체가 존재하지 않는 것처럼(즉, 임의의 결합 성질의 무변화) 동일한 방식으로 결합하고/하거나 BBB를 거쳐 수송됨을 의미한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 존재하에 Bsg의 하나 이상의 이의 고유 리간드로의 결합은 적어도 10%이고 (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항체의 부재하에 결합량이다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 존재하에 혈뇌 장벽을 거치는 Bsg의 임의의 고유 리간드의 수송은 적어도 10%이고(예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항체의 부재하의 수송량이다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 3, 19, 35, 51, 및 67로부터 선택되는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 4, 20, 36, 52, 및 68로부터 선택되는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 5, 21, 37, 53, 및 69로부터 선택되는 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 6, 22, 38, 54, 및 70로부터 선택되는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 7, 23, 39, 55, 및 71로부터 선택되는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 8, 24, 40, 56, 및 72로부터 선택되는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 3를 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 4를 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 서열번호: 5를 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호: 6을 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 7을 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 8를 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 20을 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호: 22를 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 23를 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 24를 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 35를 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 36을 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 서열번호: 37을 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호: 38을 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 39를 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 40을 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 51를 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 52를 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 53를 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호: 54를 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 55를 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 56를 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 67로부터 선택되는 경쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 68를 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 69를 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호: 70를 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 71을 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 72를 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 추가로 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 골격 영역을 포함하고, FR1에 대해 서열번호: 9, 25, 41, 57, 및 73, 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열 서열번호: 10. FR2에 대해 서열번호: 26, 42, 58, 및 74, 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열 FR3에 대해 서열번호: 11, 27, 43, 59, 및 75, 및 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열 FR4에 대해 서열번호: 12, 28, 44, 60, 및 76을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 골격 영역을 추가로 포함하고 FR1에 대해 서열번호: 13, 29, 45, 61, 및 77, 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열 서열번호: 14. FR2에 대해 서열번호: 30, 46, 62, 및 78, 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열 FR3에 대해 서열번호: 15, 31, 47, 63, 및 79, 및 FR4에 대해 서열번호: 16, 32, 48, 64, 및 80으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다: 서열번호: 1, 17, 33, 49, 및 65. 일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 하기 서열번호로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: 서열번호: 1, 17, 33, 49, 및 65.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 2, 18, 34, 50, 66, 및 66으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 2, 18, 34, 50, 및 66으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 1, 17, 33, 49, 및 65부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열번호: 2, 18, 34, 50, 및 66로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다:.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 1에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 서열번호: 2에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgA이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 17에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 하기 서열번호: 18에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgB이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 33에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 하기 서열번호: 34에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgC이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 49에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 서열번호: 50에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgD이다.
일부 구현예에서, 항-Bsg 항체는 서열번호: 65에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 서열번호: 66에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-Bsg 항체는 항-BsgE이다.
2. 예시적 항-Glut 항체
일부 구현예에서, 혈뇌 장벽에 걸쳐 제제를 수송하기 위해 본원에 제공된 방법은혈뇌 장벽을 Glut1에 결합하는 항체에 노출시킴을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, Glut1에 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에 상세하게 기재되어 있다(예를 들어, 하기 섹션 C에 참조). 하나의 양상에서, 본 발명은 Glut1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 인간 Glut1에 결합하는 항-Glut1이 제공된다. 특정 구현예에서, 쥐 Glut1(mGlut1)에 결합하는 항-Glut1 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 인간 Glut1(hGlut1)에 결합하는 항-Glut1 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, hGlut1 및 mGlut1에 결합하는 항-Glut1 항체가 제공된다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 Glut1으로의 결합은Glut1의 하나 이상의 이의 고유 리간드로의 결합을 손상시키기지 않고/않거나 혈뇌 장벽에 걸쳐 BBB-R의 임의의 고유 리간드의 수송을 손상시키지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 “손상시키지 않는다”는 하나 이상의 고유 리간드가 어떠한 항체가 존재하지 않는 것처럼(즉, 임의의 결합 성질에서 무변화) 동일한 방식 (예를 들어, 이의 양, 비율 등)으로 결합하고/하거나 BBB의 전역에 걸쳐 수송됨을 의미한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 존재하에 Glut1의하나 이상의 이의 고유 리간드로의 결합은 적어도 10%이고 (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항체의 부재하에 결합량이다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체가 제공되고, 여기서, 항체의 존재 하에 혈뇌 장벽에 걸친 BBB-R의 임의의 고유 리간드의 수송은 적어도 10%이고(예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 양은 항체의 부재하의 수송량이다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 83를 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열 포함하고, 서열번호: 84를 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 85를 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 86를 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 87를 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 88를 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 83를 포함하는 경쇄 CDR1 아미노산 서열 포함하고, 서열번호: 84를 포함하는 경쇄 CDR2 아미노산 서열, 서열번호: 85를 포함하는 경쇄 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호: 86를 포함하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열, 서열번호: 87를 포함하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호: 88를 포함하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 하기 서열번호에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 골격 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고: FR1에 대해 서열번호: 89, FR2에 대해 서열번호: 90, FR3에 대해 서열번호: 91, 및 FR4에 대해 서열번호: 92를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 FR1에 대해 서열번호: 93, FR2에 대해 서열번호: 94, FR3에 대해 서열번호: 95, 및 FR4에 대해 서열번호: 96에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 골격 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 81에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호: 82에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 81과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-Glut1 항체는 서열번호: 82와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
D. 항체의 특징
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 임의의 구현예에 따른 항-CD98hc, 항-바시긴, 또는 항-Glut1 항체는 키메라, 인간화되거나 인간 항체를 포함하는 단클론 항체이다. 하나의 구현예에서, 항-CD98hc, 항-바시긴, 또는 항-Glut1 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab’, scFv, 디아바디, 또는 F(ab’)2 단편이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 전장 항체, 예를 들어, 온전한 IgG1 항체 또는 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가의 양상에서, 상기 임의의 구현예에 따른 항-CD98hc, 항-Bsg 또는 항-Glut1 항체는 하기 섹션 1 내지 7에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 이의 조합된 임의의 특성을 혼입할 수 있다:
1. 항체 친화성
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd) (예를 들어, , 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지0-13 M)이다
하나의 구현예에서, Kd는 방사능표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 하나의 구현예에서, RIA는 목적하는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원과 함께 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 적정 계열의 비표지된 항원의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원 과 Fab를 평형화시킴에 이어서 항-Fab 항체 코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포집시킴에 의해 측정된다 (문헌참조: 예를 들어, Chen 등, J. Mol . Biol . 293: 865-881(1999)). 상기 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅하고 이어서 실온 (대략 23°C)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단시켰다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 목적하는 Fab의 연속 희석물과 혼합한다(예를 들어, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함, 문헌참조: Presta 등, Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). 이어서 목적하는 Fab는 밤새 배양하고; 그러나, 상기 배양은 보다 긴 기간 동안 (예를 들어, 약 65시간) 계속하여 평형에 확실히 도달하도록 할 수 있다. 이후, 상기 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 배양 동안 포획 플레이트로 전달된다. 이어서 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트가 건조된 경우, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20 TM; Packard)를 첨가하고, 상기 플레이트는 10분 동안 TOPCOUNT TM 감마 계수기 (Packard)상에서 계수한다. 20% 이하의 최대 결합을 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택된다.
또 다른 구현예에 따라, Kd는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000을 사용한 검정 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)은 ~10 반응 유닛 (RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 25°C에서 수행한다. 하나의 구현예에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N’- (3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시켰다. 항원은 5 μl/분의 유속으로 주사 전에 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8, 내지 5 μg/ml (~0.2 μM)으로 희석시켜 대략 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 성취하였다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민은 미반응된 그룹을 차단하기 위해 주사한다. 력학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)은 25°C에서 대략 25 μl/분의 유속으로 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에서 주사한다. 연합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순히 1 대 1 랭무이르 결합 모델 (BIACORE ® 방정식 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 방정식 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산한다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, Chen 등, J. Mol . Biol . 293: 865-881 (1999). 온-레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s- 1 을 초과하는 경우, 이어서 온-레이트는 25oC에서 PBS, pH 7.2에서 교반된 큐벳과 함께 정지-유동 장착된 분광측정기 (Aviv 장비) 또는 8000 시리즈의 SLM-AMINCO TM 분광측정기 (ThermoSpectronic)와 같은 분광측정기에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재하에 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기된 바와 같은 다른 단편을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해 하기 문헌을 참조한다: Hudson 등 Nat. Med . 9: 129-134 (2003). scFv 단편의 검토를 위해, 하기 문헌을 참조한다: 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); 또한 하기 문헌을 참조한다: WO 93/16185; 및 미국특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해, 하기 문헌을 참조한다: 미국특허 번호 5,869,046.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 문헌참조: 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디는 또한 하기 문헌에 기재되어 있다: Hudson 등, Nat. Med. 9: 129-134 (2003).
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 모두 또는 일부 또는 항체의 경쇄가변 도메인 모두 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 다음을 참조한다: 예를 들어, 미국특허 번호 6,248,516 B1).
항체 단편은 하기 재조합 숙주 세포에 의한 제조뿐만 아니라 온전한 항체의 단백질 분해를 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지), 본원에 기재된 바와 같이.
3. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: 미국특허 번호 4,816,567; 및 Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)). 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 비-인간 영장류, 예를 들어, 몽키로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 “부류 스위칭된” 항체이고, 상기 부류 또는아부류는 모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 통상적으로, 비-인간 항체는 인간에서 면역원성을 감소시키기 위해 인간화되고, 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하고, 여기서, HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부)은 비-인간 항체로부터 유래하고, FR (또는 이의 일부)은 인간 항체 서열로부터 유래한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기들은 비-인간 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체) 기원의 상응하는 잔기들로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복구하거나 개선시킨다.
인간화된 항체 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, 하기 문헌에서 검토되고(Almagro 및 Fransson, Front. Biosci . 13: 1619-1633 (2008)), 예를 들어, 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: Riechmann 등, Nature 332: 323-329 (1988); Queen 등, Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 86: 10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 등, Methods 36: 25-34 (2005) (특이성 결정 영역(SDR) 그래프팅을 기재하는); Padlan, Mol . Immunol. 28: 489-498 (1991) (“재표면화”를 기재하는); Dall’Acqua 등, Methods 36: 43-60 (2005) (“FR 셔플링”을 기재하는); 및 Osbourn 등, Methods 36: 61-68 (2005) 및 Klimka 등, Br.J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 “가이드된 선택” 방식을 기재하는).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: “베스트-피트” 방법을 사용하여 선택된 골격 영역(문헌참조: 예를 들어, Sims 등 J. Immunol . 151: 2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격 영역(문헌참조: 예를 들어, Carter 등 Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4285 (1992); 및 Presta 등 J. Immunol.,151: 2623 (1993)); 인간 성숙한 (체세포적으로 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간생식선 골격 영역 (문헌참조: 예를 들어, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 골격 영역 (문헌참조: 예를 들어, Baca 등, J. Biol . Chem . 272: 10678-10684 (1997) 및 Rosok 등, J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).
4. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 하기 문헌에 기재되어 있다: van Dijk 및 van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol .5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20: 450-459 (2008).
인간 항체는 항원 유발반응검사에 응답하여 온전한 인간 항체, 또는 인간 가변 영역을 갖는 항체를 제조하도록 변형된 유전자전이 동물에 면역원을 투여함에 의해 제조될 수 있다. 상기 동물은 통상적으로 인간 면역글로불린 유전자좌 모두 또는 일부를 함유하고이는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체 외적으로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합되어 있다. 상기 유전자전이 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 유전자전이 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 검토를 위해 하기 문헌을 참조한다: Lonberg, Nat. Biotech . 23: 1117-1125 (2005). 또한 참고, 예를 들면, 미국특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSETM 기술을 기재하는); 미국특허 번호 5,770,429 (HuMAB® 기술을 기재하는); 미국특허 번호 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술을 기재하는), 및 미국특허 출원 공보 번호US 2007/0061900, (VELOCIMOUSE® 기술을 기재하는)). 상기 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터 기원하는 인간 가변 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마 기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 보고되어 있다. (문헌참조: 예를 들어, Kozbor J. Immunol.,133: 3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등, J. Immunol.,147: 86 (1991).)인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 다음 문헌에 기재되어 있다: 문헌참조: Li 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103: 3557-3562 (2006). 추가 방법은 예를 들어, 다음 문헌에 기재된 것들을 포함한다: 미국특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 제조를 기재하는) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 기재하는). 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 또한 하기 문헌에 기재되어 있다: Vollmers 및 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) 및 Vollmers 및 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
인간 항체는 또한 인간 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함에 의해 생성될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재되어 있다.
5. 라이브러리- 유래된 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 다양한 방법은 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위해 그리고 목적하는 결합 특성을 소유하는 항체에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝하기 위해 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법은 예를 들어, 다음 문헌에 검토되어 있고: Hoogenboom 등 in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 추가로 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: the McCafferty 등, Nature 348: 552-554; Clackson 등, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks 및 Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 등, J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004).
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고, 다음 문헌에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있는 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합된다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 파지는 통상적으로 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원으로 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 순수 레퍼토리는 (예를 들어, 인간)으로부터 클로닝되어 하기 문헌에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 단일 공급원의 항체를 제공하기 위해 클로닝될 수 있다: Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734 (1993). 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 하기 문헌에 기재된 바와 같이 줄기 세포 기원의 비재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도의 가변 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내, 재배열을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992). 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어, 다음을 포함한다 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공보 번호2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.
6. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 CD98hc에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 바시긴에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 Glut1에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 특이적 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 항원-결합 도메인은 2개의 VH/VL 유닛을 포함하고, 여기서, 제1 VH/VL 유닛은 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고 제2 VH/VL 유닛은 제2 에피토프에 구체적으로 결합하고, 여기서, 각각의 VH/VL 유닛은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 상기 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디와 같은 항체 단편, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 항체 단편을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 중쇄 가변 영역의 적어도 일부 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 일부를 추가로 포함하는 VH/VL 유닛은 또한 “아암” 또는 “헤미머” 또는 “절반 항체”로서 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤미머는 제2 헤미머와 함께 형성될 분자내 디설파이드 결합하도록 중쇄 가변 영역의 충분한 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤미머는 예를 들어, 제2 헤미머 또는 상보적 홀 돌연변이 또는 마디 돌연변이를 포함하는 절반 항체와 이종이량체화를 가능하게 하는 마디 돌연변이 또는 홀 돌연변이를 포함한다. 마디 돌연변이 및 홀 돌연변이는 하기에서 추가로 논의된다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현을 포함하지만 이에 국한되지 않고(문헌참조: Milstein 및 Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker 등, EMBO J. 10: 3655 (1991)), “마디-인-홀” 가공(문헌참조: 예를 들어, 미국특허 번호 5,731,168)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “마디-인투-홀” 또는 “KnH” 기술은 돌기(마디)를 하나의 폴리펩타이드에 도입하고 공간(홀)을 이들이 상호작용하는 계면에서 다른 폴리펩타이드로 도입함에 의해 시험관내 또는 생체내에서 함께 2개의 폴리펩타이드의 쌍 형성을 지시하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc: Fc 결합 계면, CL: CH1 계면 또는 VH/VL 계면에 도입되었다(문헌참조: 예를 들어, US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, 및 Zhu 등, 1997, Protein Science 6: 781-788). 일부 구현예에서, KnH는 다중특이적 항체의 제조 동안에 함께 2개의 상이한 중쇄의 쌍 형성을 구동한다. 예를 들어, 이들의 Fc 영역에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각각의 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있거나 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍을 형성하는 상이한 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. KnH 기술은 또한 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인을 함께 상이한 표적 인지 서열 (예를 들어, 아피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합을 포함하는)을 포함하는 임의의 다른 폴리펩타이드 서열을 쌍 형성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “마디 돌연변이”는 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드와 상호작용하는 계면에서 돌기(마디)를 폴리펩타이드에 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 다른 폴리펩타이드는 홀 돌연변이를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “홀 돌연변이”는 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드와 상호작용하는 계면에서 공간(홀)을 폴리펩타이드에 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 다른 폴리펩타이드는 마디 돌연변이를 갖는다.
다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자 (WO 2009/089004A1)를 제조하기 위한 정전기 조정 효과를 가공하고; 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합함에 의해 제조될 수 있다 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan 등, Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 제조하기 위해 류신 지퍼를 사용하고 (문헌참조: 예를 들어, Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5): 1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 “디아바디” 기술을 사용하고(문헌참조: 예를 들어, Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 6444-6448 (1993)); 및 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하고 (문헌참조: 예를 들어, Gruber 등, J. Immunol ., 152: 5368 (1994)); 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 삼특이적 항체를 제조한다: 문헌참조: Tutt 등 J. Immunol. 147: 60 (1991).
“옥토퍼스 항체”를 포함하는, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체는 또한 본원에 포함된다(문헌참조: 예를 들어, US 2006/0025576A1).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 또 다른 상이한 항원뿐만 아니라 CD98hc, 바시긴 또는 Glut1에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이원 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다(문헌참조: US 2008/0069820, 예를 들어).
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체, 예를 들어, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체는 “CNS 항원” 또는 “뇌 항원”에 특이적인 치료학적 아암을 포함하는 다중특이적 항체이다. 예를 들어, 본원에 기재된 다중특이적 항체는 CD98hc, 또는 Bsg, 또는 Glut1에 특이적인 제1 아암, 및 뇌 항원에 대해 특이적인 제2 아암을 갖는다. 상기 항원의 예는 제한 없이 다음을 포함한다: BACE1, 아베타, EGFR, HER2, 타우, Apo, 예를 들어, ApoE4, 알파-시누클레인, CD20, 헌팅틴, PrP, LRRK2, 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, DR6, APP, p75NTR, IL6R, TNFR1, IL1β, 및 카스파제 6. 하나의 구현예에서, 항원은 BACE1이다. 또 다른 구현예에서, 항원은 아베타이다.
따라서, 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 CD98hc에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 바시긴에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 Glut1에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 CD98hc의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 바시긴의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 Glut1의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 추가로, 다중특이적 항체는 또한 세포독성제를 CD98hc, Glut1 및/또는 바시긴을 발현하는 세포로 국소화하기 위해 사용될 수 있다.
뇌 항원, 예를 들어, 상기 예시된 것들에 특이적인 항체는 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, 항-BACE1 항체는 공지되어 있고 예시적 항체 서열은 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌참조: 국제 특허 공보 번호 WO 2012/075037. 하나의 구현예에서, 항-BACE1 항체의 비관련된 비-BACE1 단백질로의 결합 정도는 예를 들어, 방사능면역검정(RIA)에 의한 측정시 항체의 BACE1으로의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, BACE1에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수(Kd)를 갖는다 (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M). 특정 구현예에서, 항-BACE1 항체는 상이한 종 및 이소형으로부터 기원하는BACE1 중에 보존된 BACE1의 에피토프에 결합한다.
하나의 구현예에서, 항-BACE1 항체 YW 412.8.31에 의해 결합된 BACE1 상의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 다른 구현예에서, BACE1의 촉매 도메인에 위치한 BACE1내 엑소부위에 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 하기 문헌에 동정된 펩타이드와 경쟁하는 항체가 제공된다: Kornacker 등, BioChem . 44: 11567-11573 (2005), 이는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다(즉, 펩타이드 1, 2, 3, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 2-12, 3-12, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12, 8-12, 9-12, 10-12, 4, 5, 6, 5-10, 5-9, 스크램블된, Y5A, P6A, Y7A, F8A, I9A, P10A 및 L11A), BACE1에 결합하는 것에 대해.
추가로 예를 들어, 인간 아베타에 특이적으로 결합하는 항-항베타 항체는 공지되어 있다. 항-아베타 항체의 비제한적인 예는 크레네주맙이다. 항-아베타 항체의 다른 비제한적인 예는 솔라네주맙, 바피네우주맙, 간테네루맙, 아두카누맙, 포네주맙, 및 하기의 공보에 기재된 임의의 항-아베타 항체이다: WO 2000162801, WO 2002046237, WO 2002003911, WO 2003016466, WO 2003016467, WO 2003077858, WO 2004029629, WO 2004032868, WO 2004032868, WO 2004108895, WO 2005028511, WO 2006039470, WO 2006036291, WO 2006066089, WO 2006066171, WO 2006066049, WO 2006095041, WO 2009027105.
7. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 변형을 항체를 암호화하는 핵산 서열로 도입함에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실 및. 또는 여기로의 삽입 및/또는 상기 서열 내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하기 위해 만들어질 수있고, 단, 최종 작제물은 목적하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 갖는다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 목적하는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존성 치환은 “바람직한 치환”의 표제 하에 표 C에 나타낸다. 보다 치환적 변화는 “예시적 치환”의 표제하에 표 C에 제공되고 하기에 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하기에 추가로 기재되어 있다. 아미노산 치환은 목적하는 항체 및 목적하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된 생성물로 도입될 수 있다.
표 C: 보존성 아미노산 치환
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아미노산은 통상의 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하게 한다.
치환 변이체의 하나의 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 수득한 변이체(들)는 모 항체와 상대적으로 특정 생물학적 성질 (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들어, 개선)을 갖고/갖거나 모 항체의 실질적으로 보유된 특정 생물학적 성질을 갖는다. 예시적 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이고 이는 예를 들어, 본원에 기재된 것들과 같은 파지 디스플레이 기반 친화성 성숙화 기술을 사용하여 간편하게 제조될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기들은 돌연변이되고 변이체 항체는 파지상에 나타나고 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.
변형(예를 들어, 치환)은 HVR에서 만들어질 수 있고 예를 들어 항체 친화성을 개선시킨다. 상기 변형은 HVR “핫스팟”, 즉 체세포 성숙화 과정 동안에 높은 빈도수로 돌연변이를 진행하는 코돈에 의해 암호화된 잔기들에 만들어질 수 있고(문헌참조: 예를 들어, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207: 179-196 (2008)), 및/또는 항원을 결합 친화성에 대해 시험된 수득한 변이체VH 또는 VL과 접촉시키는 잔기들에 만들어질 수 있다. 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의한 친화성 성숙화는 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있다: Hoogenboom 등 in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)친화성 성숙화의 일부 구현예에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 경향 PCR, 연쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙화를 위해 선택된 가변 유전자들로 도입된다. 이어서 2차 라이브러리가 제조된다. 이어서 라이브러리는 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 동정하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 HVR-지시된 방법을 포함하고, 여기서, 여러 HVR 잔기들 (예를 들어, 한번에 4 내지 6개 잔기들)은 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기들은 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 동정될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특히 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 변화가 항체가 항원에 결합하는능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존성 변형(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존성 치환)은 HVR에서 만들어질 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, HVR 내 항원 접촉 잔기들의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR은 변형되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이 유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기들 또는 영역들의 동정을 위해 유용한 방법은 하기 문헌에 의해 기재된 바와 같은 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 불리운다: Cunningham 및 Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. 상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들 그룹 (예를 들어, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu와 같은 하전된 잔기들)은 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 동정되고 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향받는지를 결정한다. 추가 치환은 아미노산 위치에서 도입되어 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정하기 우한 항원-항체복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들은 치환을 위한 후보물로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 성질을 함유하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기들의 서열내 삽입뿐만 아니라 1개의 잔기로부터, 100개 이상의 잔기들을 함유하는 폴리펩타이드들의 길이 범위에 있는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합부를 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는, 효소 (예를 들어, ADEPT에 대해) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합부를 포함한다.
b) 당화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 당화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변화된다. 항체에 당화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변화시킴에 의해 간편하게 성취될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변화될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 고유 항체는 통상적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의Asn297로의 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분기된 바이안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, Wright 등 TIBTECH 15: 26-32 (1997). 올리고사카라이드는 바이안테나 올리고사카라이드 구조의 “줄기”에서 GlcNAc에 부착된 푸코스뿐만 아니라 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하도록 만들어질 수 있다.
하나의 구현예에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 상기 항체내 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어, WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정기에 의한 측정시 Asn 297에 부착된 모든 당구조의 합에 상대적으로 Asn297에서 당 쇄 내 푸코스의 평균양을 계산함에 의해 결정된다. Asn297은 Fc 영역 (Fc 영역 잔기들의 Eu 넘버링)에서 약 297번 위치에 위치된 아스파라긴 잔기를 언급하지만; Asn297은 또한 항체 내 최소 서열 변형으로 인해 즉, 위치 294와 300 사이에 위치 297의 업스트림 또는 다운스트림 약 ± 3 아미노산 위치에 있을 수 있다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, 미국 특허 공보 번호US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). “탈푸코실화된” 또는 “푸코스-결힙” 항체의 변이체의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki 등 J. Mol . Biol . 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 등 Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec 13 CHO 세포를 포함하고(문헌참조: Ripka 등 Arch. BioChem . Biophys . 249: 533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams 등, 특히 실시예 11에서), 및 알파-1,6-푸코실트랜스페라제 유전자, FUT8 , 녹아웃 CHO 세포와 같은 녹아웃 세포주 (문헌참조: 예를 들어, Yamane-Ohnuki 등 Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda, Y. 등, Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); 및 WO 2003/085107).
항체 변이체는 추가로 예를 들어 양분된 올리고사카라이드와 함께 제공되고, 여기서, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나 올리고사카라이드는 GlcNAc 의해 양분되어 있다. 상기 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체의 예는 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있다: WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana 등); 및 US 2005/0123546 (Umana 등). Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있다: WO 1997/30087 (Patel 등); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역으로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역) 을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 모두는 아니지만 일부 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려하고, 이에 의해 그 항체 변이체는 생체내 항체의 반감기가 여전히 중요하지만 특정 효과기 기능(보체 및 ADCC와 같은)이 불필요하거나 해로운 용도에 쓰이는 바람직한 후보물질이 된다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해 시행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여 상기 항체가 FcγR 결합이 없지만 (따라서 또한 ADCC 활성이 없는) FcRn 결합 능력을 확실히 보유하도록 할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 하기 문헌의 제464면 상의 표 3에 요약한다: Ravetch 및 Kinet, Annu.Rev.Immunol. 9: 457-492 (1991). 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 다음 문헌에 기재되어 있다: 미국특허 번호 5,500,362 (문헌참조: 예를 들어, Hellstrom, I. 등 Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 83: 7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I 등, Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 82: 1499-1502 (1985); 5,821,337 (문헌참조: Bruggemann, M. 등, J. Exp . Med . 166: 1351-1361 (1987)). 대안적으로, 비-방사능활성 검정 방법이 사용될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, Madison, WI). 상기 검정을 위해 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다: Clynes 등 Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 95: 652-656 (1998). C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 ELISA에 결합하는 C1q 및 C3c. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다: (문헌참조: 예를 들어, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol . Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. 등, Blood 101: 1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Petkova, S.B. 등, Int’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 번호 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하고, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 “DANA” Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR로의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (문헌참조: 예를 들어, 미국특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 등, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 치환 (잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 변화는 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 변화된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하는 Fc 영역에 만들어진다: 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie 등 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
모계 IgG의 태아로의 전달에 관여하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)으로의 증가된 반감기 및 개선된 결합을 갖는 항체(Guyer 등, J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim 등, J. Immunol . 24: 249 (1994))은 US2005/0014934A1 (Hinton 등)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 영역의 FcRn으로의 결합을 개선시키는 본원에서의 하나 이상의치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기의 하나 이상에서 치환을 갖는 것들을 포함한다: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환 (미국 특허 번호 7,371,826). FcRn 결합 도메인 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E (YTE)는 FcRn 결합을 증가시키고 따라서 항체의 반감기를 증가시키는 것으로 보고되었다. 하기 문헌을 참조한다: 미국Published Patent Application No.2003/0190311 및 Dall’Acqua 등, J. Biol . Chem. 281: 23514-23524 (2006). 추가로, FcRn 결합 도메인 돌연변이 N434A 및 Y436I (AI)는 또한 FcRn 결합을 증가시키는 것으로 보고되었다. 문헌참조: Yeung 등, J. Immunol . 182: 7663-7671 (2009). 또한 하기 문헌을 참조한다: Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); 미국특허 번호 5,648,260; 미국특허 번호 5,624,821; 및 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 WO 94/29351.
d) 시스테인 가공된 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인 가공된 항체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있고, 예를 들어, “thioMAbs,” 여기서, 항체의 하나 이상의 잔기들은 시스테인 잔기들로 치환되어 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위로 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴에 의해, 반응성 티올 그룹은 이에 의해 항체의 접근가능한 부위에 위치되고 본원에서 추가로 기재된 바와 같이 면역접합체를 생성하기 위해 상기 항체를, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티로 접합시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기들의 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (캐뱃 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체들은 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다: 미국특허 번호 7,521,541.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 가용한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화를 위해 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/플로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이의 혼합물을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서 이의 안정성으로 인한 제조에서 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고 분기되거나 분기되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있고 하나 이상의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료요법에 사용되는지의 여부 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는 고려 사항을 기준으로 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 방사선으로의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 하나의 구현예에서 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌참조: Kam 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고 통상의 세포를 손상시키지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체 비단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도로 가열시키는 파장을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
E. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다: 미국특허 번호 4,816,567. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 상기 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들어, 다음으로 형질전환시켰다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 구현예에서, 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항체의 발현을 위해 적합한 조건하에서 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수함을 포함한다.
항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터로 삽입된다. 상기 핵산은 통상의 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해) 용이하게 단리되고 서열 분석될 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 요구되지 않는 경우 세균에서 생성될 수 있다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해, 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: 미국특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523.(문헌참조: 또한Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기재함.)발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵 세포뿐만 아니라, 진핵 세포 미생물, 예를 들어, 필라멘트 진균류 또는 효모는 항체-암호화 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 이는 진균류 및 효모 종을 포함하고, 이들의 당화 경로는 “인간화”되었고 부분적으로 또는 완전히 인간 당화 패턴을 갖는 항체의 생성을 유도한다. 하기 문헌을 참조한다: Gerngross, Nat. Biotech . 22: 1409-1414 (2004), 및 Li 등, Nat. Biotech . 24: 210-215 (2006).
당화된 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물및 척추동물)로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바쿨로바이러스 종이 동정되었고 이는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 연계하여 사용될 수 있다.
식물 세포 배양은 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 하기 문헌을 참조한다: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (유전자전이 식물에서 항체를 제조하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재하는).
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에 성장하도록 순응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주 (예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포, Graham 등, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 TM4 세포, Mather, Biol . Reprod .23: 243-251 (1980); 몽키 신장 세포 (CV1); 아프리칸 그린 몽키 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같은 TRI 세포: Mather 등, Annals N.Y . Acad . Sci . 383: 44-68 (1982); MRC 5 세포; 및 FS4 세포.다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하고, 이는 DHFR- CHO 세포를 포함하고(Urlaub 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77: 4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 다음을 참조한다: Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003).
F. 검정
본원에 제공된 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 동정되거나, 스크리닝되거나 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, FACS 등과같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 양상에서, 경쟁 검정은 Bsg에 결합하는 것에 대해 본원에 기재된 항-바시긴 항체 (예를 들어, 항-BsgAc 항-BsgB, 항-BsgC, 항-BsgD, 및 항-BsgE)와 경쟁하는 항체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 항-BsgA와 경쟁한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 항-BsgB와 경쟁한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 항-BsgC와 경쟁한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 항-BsgD와 경쟁한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 항-BsgC 및 항-BsgD와 경쟁한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 항-BsgE와 경쟁한다.
특정 구현예에서, 상기 경쟁 항체는 본원에 기재된 항-Bsg, A 항-BsgB, 항-BsgC, 항-BsgD, 및 항-BsgE 중 하나에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다.
또 다른 양상에서, 경쟁 검정은 본원에 기재된 항-Glut1 항체와 경쟁하는 항체를 동정하기 위해 사용될 수 있고 (예를 들어, 하기 서열번호의 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항-Glut1 항체: 서열번호: 81, 및 하기 서열번호의 중쇄 가변 영역 서열: 서열번호: 82), Glut1으로의 결합을 위해.
특정 구현예에서, 상기 경쟁 항체는 본원에 기재된 Glut1 항체에 의해 결합되는동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다(예를 들어, 하기 서열번호의 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항-Glut1 항체서열번호: 81, 및 하기 서열번호의 중쇄 가변 영역 서열: 서열번호: 82).
항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위해 세부적인 예시적 방법이 하기의문헌에 제공된다: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
예시적 경쟁 검정에서, 고정화된 Bsg는 Bsg에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항-Bsg,A 항-BsgB, 항-BsgC, 항-BsgD, 및 항-BsgE) 및 Bsg에 결합하는 것에 대해 제1 항체와 경쟁하는 이의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 Bsg는 제2 비표지된 항체가 아니라 제1 표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 제1 항체의 Bsg로의 결합을 위해 허용되는 조건하에서 배양한 후, 과량의 비결합된 항체는 제거되고 고정화된 Bsg와 연합된 표지의 양이 측정된다. 고정화된 Bsg와 관련된 표지의 양이 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플 중에서 실질적으로 감소되는 경우, 이는 제2 항체가 Bsg로의 결합을 위해 제1 항체와 경쟁함을 지적한다. 다음 문헌을 참조한다: Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
예시적 경쟁 검정에서, 고정화된 Glut1은 본원에서 Glut1에 결합하는 제1 표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다(예를 들어, 하기 서열번호의 경쇄 가변 영역을 갖는 항-Glut 항체서열번호: 81, 및 하기 서열번호의 중쇄 가변 영역 서열: 서열번호: 82) 및 Glut1에 결합하는 것에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 Glut1은 제2 비표지된 항체는 아니고 제1 표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. Glut1으로의 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후, 과량의 미결합된 항체가 제거되고, 고정화된 Glut1과 연합된 표지의 양이 측정된다. 고정화된 Glut1과 연합된 표지의 양이 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이것은 제2 항체가 Glut1에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁함을 지적한다. 다음 문헌을 참조한다: Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. 활성 검정
하나의 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-CD98hc를 동정하기 위해 제공된다. 하나의 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-Bsg 항체를 동정하기 위해 제공된다. 하나의 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-Glut1 항체를 동정하기 위해 제공된다.
CD98hc 활성 검정
생물학적 활성은 예를 들어, CD98hc에 대한 아미노산 수송을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내 상기 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 상기 생물학적 활성을 위해 시험될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 항체(예를 들어, 항-CD98hc 항체를 사용하는)는 세포 증식 또는 분열을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 항체 (예를 들어, 항-CD98hc 항체)는 세포 접착을 억제하지 않는다. 세포 증식, 세포 분열, 아폽토시스 및 세포 접착에 대한 CD98hc-결합 항체의 효과를 측정하기 위한 검정은 예를 들어 제한 없이 하기 문헌에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다: 미국특허 출원 공보 번호2013/0052197. 또한 하기 문헌을 참조한다: Yagita H. 등 (1986) Cancer Res. 46: 1478-1484; 및 Warren A.P., 등 (1996) Blood 87: 3676-3687. 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 방법은 또한 CD98hc-결합 항체의 활성을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD98hc 항체는 아미노산 수송을 억제하지 않는다. CD98hc에 의해 아미노산 수송을 검출하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 검정 (예를 들어, CD98 경쇄와의 이종이량체 복합체 내 (예를 들어, LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT, 및 Asc-1)은 공지되어 있고 하기의 문헌에 기재되어 있다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, Fenczik, C.A등 (2001) J. Biol. Chem. 276, 8746-8752; 또한, US 2013/0052197.
특정 구현예에서, 항-CD98hc 항체의 존재하에 혈뇌 장벽에 걸친 CD98 이종이량체 복합체의 임의의 고유 리간드의 아미노산 수송의 역학은 적어도 10% 이고(예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%), 이의 역학은 항체의 부재하에 수송 역학이고 여기서, 항체의 부재하에 역학은 하기 중 하나 이상이다:
글루타민에 대해 KM=295 μM (NaCl의 존재하에);
류신에 대해 KM=236 μM (NaCl의 존재하에);
아르기닌에 대해 KM=120 μM (NaCl의 존재하에); 및
아르기닌에 대해 KM=138 μM (NaCl의 부재하에).
CD98 아미노산 안티포터의 아미노산 수송 역학은 예를 들어, 하기에 의해 기재된 바와 같은 검정에서 측정될 수 있다: Broer 등 Biochem J. 2000 Aug 1; 349 Pt 3: 787-95.
하나의 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-CD98hc/BACE1 다중특이적 항체를 동정하기 위해 제공된다. 또 다른 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-Bsg/BACE1 다중특이적 항체를 동정하기 위해 제공된다. 또 다른 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-Glut1/BACE1 다중특이적 항체를 동정하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어, BACE1 아스파르틸 프로테아제 활성의 억제를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내 상기 생물학적 활성을 갖는 항체는 또한 예를 들어, 합성 기질 펩타이드를 사용한 균일한 시간-분리된 형광 HTRF 검정 또는 미세유동 모세관 전기영동 (MCE) 검정에 의해 또는 APP와 같은 BACE1 기질을 발현하는 생체내 세포주에서 평가된 바와 같이 제공된다.
또 다른 양상에서, 검정은 본원에 기재된 항체 (예를 들어, 항-CD98hc, Bsg, 또는 Glut1 항체)의 뇌 흡수를 측정하기 위해 제공된다. 상기 검정은 예를 들어, 하기 실시예에서 기재된다.
또 다른 양상에서, 검정은 뇌 아밀로이드 베타에서 증가 또는 감소 및 혈장 아밀로이드 베타에서 증가 또는 감소를 결정하기 위한 검정을 포함하는, 뇌 및 혈장에서 아밀로이드 베타를 측정하기 위해 제공된다. 상기 검정은 예를 들어, 하기 실시예에서 본원에 기재되어 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 항체는 조영제에 의해 접합될 수 있다. 항체 접합체의 투여 후, 조영제는 예를 들어, 단리된 뇌 조직에서 및/또는 생체내 뇌 영상 기술을 사용하여(예를 들어, 생물발광 또는 형광을 사용하여) 검출될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, J. R.Martin. J Neurogenet. 2008; 22(3): 285-307).
3. 친화성 검정
특정 구현예에서, 본 발명은 BBB-R에 대한 항체 패널로부터 항체를 선택함을 포함하는, 혈뇌 장벽을 거쳐 제제(예를 들어, 신경학적 장애 약물 또는 조영제)를 수송하기 위해 유용한 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 BBB-R에 대한 낮은 친화성, 예를 들어, 약 5nM으로부터, 또는 약 20 nM로부터, 또는 약 100 nM으로부터, 약 10 μM까지, 또는 약 1 μM 까지, 또는 약 500 mM까지의 범위에 있는 BBB-R에 대한 친화성을 갖기 때문이다. 따라서, 친화성은 예를 들어, 스캐챠드 분석 또는 BIACORE®에 의한 측정시 약 5 nM 내지 약 10 μM의 범위, 또는 약 20 nM 내지 약 1 μM의 범위, 또는 약 100 nM 내지 약 500 nM의 범위일 수 있다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 이종성 분자/화합물의 항체로의 접합은 예를 들어, 항체가 항체의 본래의 표적과는 상이한 항원에 결합하는 하나 이상의 아암과 함께 다중특이적인 것으로 제조되는 경우 하나의 결합 아암의 입체 장애 또는 심지어 제거로 인해 표적에 대한 항체의 친화성을 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, CD98hc, 바시긴, 또는 Glut1에 특이적인 본 발명의 낮은 친화성 항체는 BACE1에 접합되고 BIACORE에 의한 측정시 CD98hc, 바시긴 또는 Glut1에 대해 약 30nM의 Kd를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CD98hc, 바시긴, 또는 Glut1에 대해 특이적인 본 발명의 낮은 친화성 항체는 BACE1에 접합되고 BIACORE에 의한 측정시 CD98hc, 바시긴, 또는 Glut1에 대해 약 600nM의 Kd를 갖는다.
항체 친화성을 평가하기 위한 하나의 예시적 검정음 스캐챠드 분석에 의한 것이다. 예를 들어, 목적하는 항-BBB-R 항체는 락토퍼옥시다제 방법을 사용하여 요오드화될 수 있다(문헌참조: Bennett 및 Horuk, Methods in Enzymology 288 pg. 134-148 (1997)). 방사능표지된 항-BBB-R 항체는 NAP-5 컬럼을 사용한 겔 여과에 의해 유리된 125I-Na로부터 정제하고 이의 특이성 활성을 측정한다. 고정된 농도의 요오드화된 항체 및 감소하는 농도의 연속으로 희석된 비표지된 항체를 함유하는 50 μl의 경쟁 반응 혼합물은 96-웰 플레이트에 위치시킨다. BBB-R을 일시적으로 발현하는 세포는 성장 배지에서 5% CO2에서 37 ℃에서 배양하고 상기 배지는 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 1 x 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 듈베코 변형 이글 배지(DMEM) (Genentech)로 이루어진다. 세포는 시그마 세포 해리 용액을 사용하여 접시로부터 탈착시키고 결합 완충액 (1% 소 혈청 알부민, 50 mM HEPES, pH 7.2, 및 0.2% 아지드화나트륨을 갖는 DMEM)으로 세척하였다. 상기 세척된 세포는 0.2 mL의 결합 완충액 중에서 대략 200,000 세포의 밀도로 50 μl 경쟁 반응 혼합물을 함유하는 96웰 플레이트에 첨가한다. 세포와의 경쟁 반응에서 비표지된 항체의 최종 농도는 1000 nM에서 시작하여 다양하고 이어서 10개 농도에 대해 1: 2배 희석으로 감소하고 제로-첨가된 완충액 유일 함유 샘플을 포함한다. 비표지된 항체의 각각의 농도에 대해 세포와의 경쟁 반응은 3회 분석한다. 세포와의 경쟁 반응은 실온에서 2시간 동안 배양한다. 2시간 배양 후, 경쟁 반응물을 여과 플레이트로 전달하고 결합된 요오드화된 항체로부터 분리하기 위해 결합 완충액으로 4회 세척하였다. 여과기는 감마 계수기로 계수하고 결합 데이터는 문손 및 로드바드(Munson 및 Rodbard) (1980)의 피팅 알고리듬을 사용하여 평가하여 항체의 결합 친화성을 측정한다.
또 다른 구현예에 따라, Kd는 BIACORE®-2000 장치를 갖는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정하고 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 항-인간 Fc 키트를 사용하여 25°C에서 측정한다(BiAcore Inc., Piscataway, NJ). 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항-인간 Fc 항체는 5 μl/분의 유속으로 주사 전에 10mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0을 사용하여 50 μg/ml로 희석시켜 커플링된 단백질의 대략 10000 반응 유닛(RU)을 성취하였다. 항체의 주사 후, 1 M 에탄올아민은 미반응된 그룹을 차단하기 위해 주사한다. 역학 측정을 위해, 항-BBB-R 항체 변이체는 HBS-P와 함께 주사하여 약 220RU에 도달하도록 하고 이어서 BBB-R-His의 2배 연속 희석물 (0.61 nM 내지 157 nM)을 대략 30 μl/분의 유속으로 25°C에서 HBS-P로 조사한다. 연합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 결합과 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑그무이르 결합 모델 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산한다. 다음 문헌을 참조한다: 예를 들어, Chen 등, J. Mol. Biol 293: 865-881 (1999).
BBB-R에 대한 하나 이상의 항체의 친화성에 대한 대용 측정은 이의 절반 최대 억제 농도 (IC50)이고, 이는 공지된 BBB-R 리간드의 BBB-R로의 결합을 50%까지 억제하는데 얼마나 많은 항체가 요구되는지에 대한 측정값이다. 소정의 화합물의 IC50을 결정하는 다수의 방법은 당업계에 공지되어 있고; 통상의 방법은 경쟁 결합 검정을 수행하는 것이다. 일반적으로, 높은 IC50는 보다 많은 항체가 공지된 리간드의 결합을 억제하는데 요구되고 따라서 상기 리간드에 대한 항체의 친화성이 비교적 낮음을 지적한다. 역으로, 낮은 IC50는 보다 적은 항체가 공지된 리간드의 결합을 억제하는 요구되고 따라서 상기 리간드에 대한 항체의 친화성이 비교적 높음을 지적한다.
IC50을 측정하기 위한 예시적 경쟁 ELISA 검정은 증가하는 농도의 항-CD98hc 또는 항-CD98hc/뇌 항원 (예를 들어, 항-CD98hc/BACEl, 항-CD98hc/아베타 등) 변이체 항체가 CD98hc에 결합하는 것에 대해 비이티닐화된 항-CD98hc 항체에 대항하여 경쟁하기 위해 사용되는 검정이다. 항-CD98hc 경쟁 ELISA는 4 ℃ 에서 밤새 PBS 중에서 2.5 μg/ml의 정제된 쥐 CD98hc 세포외 도메인으로 코팅된 Maxisorp 플레이트(Neptune, N.J. )에서 수행한다. 플레이트는 PBS/0.05%> Tween 20으로 세척하고 PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH)중에서 슈퍼블록 차단 완충액을 사용하여 차단하였다. 각각의 개별 항-CD98hc 또는 항-CD98hc/뇌 항원 (예를 들어, 항-CD98hc/BACEl 또는 항-CD98hc/아베타)의 적정액 (1: 3 연속 희석물)은 비오티닐화된 항-CD98hc (0.5 nM 최종 농도)와 배합되어 실온에서 1시간 동안 플레이트에 첨가될 수 있다. 플레이트는 PBS/0.05% Tween 20으로 세척하고, HRP-스트렙타비딘 (Southern Biotech, Birmingham)은 상기 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트는 PBS/0.05% Tween 20으로 세척하고, 플레이트에 결합된 비오티닐화된항-CD98hc는 TMB 기질 (BioFX Laboratories, Owings Mills)을 사용하여 검출한다. 동일한 유형의 검정은 예를 들어, 항-Glut1 및 항-바시긴 항체에 대해 수행할 수 있다.
G. 면역접합체
본 발명은 또한 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사능활성 동위원소와 같은 하나 이상의 세포독성제와 접합된, 본원에 기재된 항-CD98hc 항체, 또는 항-Bsg 항체, 또는 항-Glut1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본원에서 항체는 약물, 화학치료제 및/또는 조영제를 BBB를 거쳐 보다 효율적으로 수송하기 위해 신경학적 장애 약물, 화학치료제 및/또는 조영제와 커플링된다.
공유 접합은 직접적으로 또는 링커를 통한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 직접적인 접합은 단백질 융합부의 작제(예를 들어, 항체 및 예를 들어, 신경학적 장애 약물을 암호화하는 2개의 유전자의 유전학적 융합에 의해 및 단일 단백질로서의 발현에 의해)에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 직접적인 접합은 항체의 2개의 부분 중 하나 상의 반응성 그룹과 예를 들어, 신경학적 약물 상의 상응하는 그룹 또는 수용체 간의 공유 결합 형성에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 직접적인 접합은 적당한 조건하에서 접합되도록 다른 분자로의공유 결합을 형성하는 반응성 그룹(비제한적인 예로서, 설프하이드릴 그룹 또는 카복실 그룹)을 포함하도록 접합될 2개의 분자 중 하나의 변형(예를 들어, 유전학적 변형)에 의한 것이다. 하나의 비제한적인 예로서, 목적하는 반응성 그룹(예를 들어, 시스테인 잔기)과의 분자 (예를 들어, 아미노산)는 항체로 도입될 수 있고 디설파이드 결합은 예를 들어, 신경학적 약물과 형성된다. 핵산의 단백질로의 공유 접합을 위한 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 광가교 결합, 예를 들어, 다음을 참조한다: Zatsepin 등 Russ. Chem. Rev.74: 77-95 (2005)).
비-공유 접합은 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이 소수성 결합. 이온결합, 정전기 상호작용을 포함하는 임의의 비-공유 접착 수단에 의한 것일 수 있다.
접합은 또한 다양한 링커를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 신경학적 약물은 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 서버레이트), 알데하이드 (예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 접합될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다: 문헌참조: Vitetta 등, Science 238: 1098 (1987). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사능뉴클레오타이드의 항체로의 접합을 위한 예시적 킬레이팅제이다. 하기 문헌을 참조한다: WO 94/11026.펩타이드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커가 또한 사용될 수 있다. 특정 상기 구현예에서, 아미노산은 20개의 천연 아미노산으로부터 선택된다. 특정 다른 상기 구현예에서, 아미노산 중 하나 이상은 글라이신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 라이신으로부터 선택된다. 상기 링커는 뇌로의 전달 시 신경학적 약물의 방출을 촉진시키는 “절단가능한 링커”일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제 민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드 함유 링커 (Chari 등, Cancer Res. 52: 127-131 (1992); 미국특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명은 명백하게 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이에 국한되지 않는 가교-결합제 시약으로 제조된 접합체를 고려하지만 이에 국한되지 않고, 상기 시약은 시판되고 있다(문헌참조: 예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).
하나의 구현예에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체(ADC)이고, 여기서, 항체는 메이탄시노이드를 포함하지만 이에 국한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합되고 (문헌참조: 미국특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽특허 EP 0 425 235 B1); 아우리스타틴, 예를 들어, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF)에 접합되고(문헌참조: 미국특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체에 접합되고(문헌참조: 미국특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman 등, Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); 및 Lode 등, Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)); 다우노마이신 또는 독소루비신과 같은 안트라사이클린 (문헌참조: Kratz 등, Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey 등, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov 등, Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000); Dubowchik 등, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King 등, J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); 및 미국특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트’ 빈데신; 탁산, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소n A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사 기원), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제r, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신. 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이에 국한되지 않는 효소적 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된, 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 면역접합체는 방사능접합체를 형성하기 위해 방사능활성 원자에 접합된, 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사능활성 동위원소는 방사능접합체의 제조를 위해 가용하다. 이의 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사능활성 동위원소를 포함한다. 방사능접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 이것은 섬광조영술 연구를 위한 방사능활성 원자, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상을 위한 스핀 표지 (또한 자기 공명 영상, mir로서 공지된), 예를 들어, 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
H. 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 양상에서, 혈뇌 장벽 상의 CD98hc를 검출하는 방법이 제공된다. 따라서, 일부 양상에서, 항-CD98hc 항체는 CD98hc에 결합하고 이는 항체가CD98hc를 표적화하는데 검출제로서 유용하기에 충분한 친화성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항-CD98hc 항체는 생물학적 샘플에서 CD98hc의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 특정 양상에서, 본원에 제공된 임의의 항-Bsg 항체는 생물학적 샘플에서 Bsg의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-Glut1 항체는 생물학적 샘플에서 Glut1의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “검출하는”은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 뇌 세포, 예를 들어, 뇌 모세혈관 내피 세포와같은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 구현예에서, 검출 방법에 사용하기 위한 항-CD98hc 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플에서 CD98hc의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 항-CD98hc 항체의 CD98hc로의 결합을 가능하게 하는조건하에서 본원에 기재된 바와 같은 항-CD98hc 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키고, 복합체가 항-CD98hc 항체와 CD98hc 간에 형성되는지의 여부를 검출함을 포함한다.
하나의 구현예에서, 검출 방법에 사용하기 위한 항-Bsg 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플 중에 Bsg의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 항-Bsg 항체의 Bsg로의 결합을 허용하는 조건하에서 본원에 기재된 바와 같은 항-Bsg 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키고 복합체가 항-Bsg 항체와 Bsg간에 형성되는지의 여부를 검출함을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
하나의 구현예에서, 검출 방법에 사용하기 위한 항-Glut1 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플에서 Glut1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 항-Glut1 항체의 Glut1으로의 결합을 가능하게 하는 조건하에서 본원에 기재된 바와 같은 항-Glut1 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키고 복합체가 항-Glut1 항체와 Glut1간에 형성되는지의 여부를 검출함을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
하나의 구현예에서, 온전한 항체는 효과기 기능이 없다. 또 다른 구현예에서, 온전한 항체는 효과기 기능을 감소시켰다. 또 다른 구현예에서, 온전한 항체는 감소된 효과기 기능을 갖도록 가공된다. 하나의 양상에서, 항체는 Fab이다. 또 다른 양상에서, 항체는 효과기 기능을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 Fc 돌연변이를 갖는다. 또 다른 양상에서, 항체는 예를 들어, 정상 인간 당화 효소가 없는 시스템에서 항체를 제조함으로 인해 변형된 당화를 갖는다. 또 다른 양상에서, Ig 골격은 천연적으로 제한된 효과기 기능을 갖거나 효과기 기능이 없는 하나로 변형된다.
다양한 기술이 항체의 CD98hc, Bsg, 및/또는 Glut1로의 결합을 결정하는 데 이용할 수 있다. 하나의 상기 검정은 인간 CD98hc, Bsg, 및/또는 Glut1에 결합하는 능력을 확인하기 위한 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)이다. 상기 검정에 따라, 항원(예를 들어, 재조합 CD98hc, Bsg 또는 Glut1)으로 코팅된 플레이트는 항체를 포함하는 샘플과 배양하고 항체의 목적하는 항원으로의 결합이 결정된다.
전신 투여된 항체의 흡수 및 항체 다른 생물학적 활성을 평가하기 위한 검정은 실시예에 기재된 바와 같이 수행될 수 있거나 목적하는 항-CNS 항원 항체에 대해 공지된 바와 같이 수행될 수 있다.
하나의 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-CD98hc/BACE1 다중특이적 항체를 동정하기 위해 제공된다. 또 다른 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-Bsg/BACE1 다중특이적 항체를 동정하기 위해 제공된다. 또 다른 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-Glut1/BACE1 다중특이적 항체를 동정하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어, BACE1 아스파르틸 프로테아제 활성의 억제를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내 상기 생물학적 활성을 갖는 항체는 또한 예를 들어, 합성 기질 펩타이드를 사용한 균일한 시간-분리된 형광 HTRF 검정 또는 미세유동 모세관 전기영동 (MCE) 검정에 의해 또는 APP와 같은 BACE1 기질을 발현하는 생체내 세포주에서 평가된 바와 같이 제공된다.
또 다른 양상에서, 검정은 본원에 기재된 항체 (예를 들어, 항-CD98hc, Bsg, 또는 Glut1 항체)의 뇌 흡수를 측정하기 위해 제공된다. 상기 검정은 하기 실시예에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 표지된 항-CD98hc 항체는 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 표지된 항-Bsg 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 표지된 항-Glut1 항체가 제공된다. 표지는 간접적으로 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티뿐만 아니라 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예를 들어, 형광, 발색단, 전자-밀집, 화학발광 및 방사능활성 표지)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 예시적 표지는 방사능동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 댄실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제를 포함하지만 이에 국한되지 않고(미국특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제를 포함하지만 이에 국한되지 않고 이는 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등과 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된다.
I. 약제학적 제형
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료학적 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에 제공된 임의의 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 본원에 기재된 치료학적 방법에 사용하기 위한)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 항-CD98hc 항체, 및 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에 제공된 임의의 항-Bsg 또는 항-Glut1 항체 및 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 항-CD98hc, 항-Glut1, 또는 항-Bsg 항체 (예를 들어, 다중특이적 항체 또는 항체 접합체)의 약제학적 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함에 의해 제조되고(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 일반적으로 사용되는용량및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드,디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적 약제학적으로 허용되는 담체는 사이질 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 천연 활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 다음 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 공보 번호2005/0260186 및 2006/0104968. 하나의 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 배합된다.
예시적 동결건조된 항체 제형은 다음 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 6,267,958. 수성 항체 제형은 다음 문헌에 기재된 것들을 포함한다: 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908, 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원에서 상기 제형은 또한 치료될 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게 서로에 역으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 신경병증 장애, 신경퇴행성 질환, 암, 눈 질환 장애, 발작 장애, 리소좀 저장 질환, 아밀로이드증, 바이러스 또는 미생물 질환, 허혈, 거동 장애 또는 CNS 염증을 치료하기 위한 하나 이상의 활성 성분을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적 상기 약물은 하기의 본원에서 논의된다. 상기 활성 성분은 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 배합되어 존재한다.
활성 성분은 예를 들어, 코악서베이션 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조되는 미세캡슐에 포집될 수 있고, 예를 들어, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 미세유제, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 거대유제 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐이 있다. 상기 기술은 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980). 하나 이상의 활성 성분은 본원에 기재된 항체에 커플링된 리포좀내 캡슐화될 수 있다 (문헌참조: 예를 들어, 미국특허 출원 공보 번호20020025313).
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐 형태로 있다. 서방성 매트릭스의 비제한적인 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리 (2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드를 포함하고 (미국특허번호3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여용으로 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취될 수 있다.
J. 제품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 이와 연합된 표지 또는 포장 삽지를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이엘, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체이거나 병태를 치료하고, 예방하고/하거나 진단하기 위해 효과적인 또 다른 조성물과 배합된 조성물을 보유하고 멸균성 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 스토퍼를 갖는 바이엘일 수 있다). 상기 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽지는 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시한다. 더욱이, 제품은 (a) 여기에 함유된 조성물을 갖는 제1 용기; 및 (b) 여기에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있고, 상기 조성물은 추가의 세포독성 또는 다르게는 치료제를 포함한다. . 본 발명의 구현예에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수있음을 지적하는 포장 삽지를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 주사용 세균억제수(BWFI), 인산 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 견지 및 사용자 견지로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있고, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함한다.
상기 임의의 제품은 항-CD98hc, 항-Bsg, 또는 항-Glut1 항체 대신 또는 이에 추가로 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 다양한 다른 구현예가 상기 제공된 일반 기재에 따라 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
A. 재로 및 방법
하기의 실시예에 사용된 재료 및 방법은 하기되어 있다.
1. 항체 생성
Lrp1 세포외 도메인 (ECD)은 His-태그된 재조합 단백질로서 이. 콜라이에서 발현시켰다. His-태그된 CD320 ECD 및 CD98hc ECD는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현시켰고 쥐 바시긴(mBsg)의 ECD는 CHO 세포에서 쥐 Fc 태그된 단백질로서 발현되었다. 모든 이들 재조합 단백질은 이어서 니켈 또는 단백질 A 컬럼 상에서 정제하였다. 재조합 Lrp8 및 InsR은 제조원(R&D systems™)으로부터 구입하였다(catalog #3520-AR-050 및 #1544-IR-050, 각각). 재조합 Ldlrad3은 또한 제조원(Novus Biologicals LLC (Littleton, CO))으로부터 구입하였다(catalog #H00143458-P01). 항-Lrp1, 항-InsR, 항-Lrp8 및 항-Ldlrad3 항체는 순수 파지 라이브러리 분류방법(하기된 바와 같이)을 통해 제조하였다. 항-CD320, 항-Bsg, 및 항-CD98hc 항체 는 표준 프로토콜을 사용하여 마우스, 래트 또는 햄스터를 면역화시키기 위해 상응하는 단백질의 쥐 세포외 도메인을 사용하여 제조하였다. 상기 항-Glut1 항체는 전장 Glut를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 마우스에서 DNA 면역화에 의해 제조하였다. 제조된 하이브리도마는 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 그리고 HEK 세포 상에서 일시적으로 발현되는 항원의 인지를 위한 유동 세포측정에 의해 스크리닝하였다. 모든 항체는 모든 연구를 위해 인간 Fc를 함유하는 키메라로서 재포맷팅하였다. 친화성은 도 9에 나타낸다. 항-Bsg 항체 A-E는 실시예에 기재되어 있다.
2. 순수 파지 라이브러리 분류
10 μg/mL의 재조합 항원은 밤새 NUNC 96 웰 Maxisorp 면역플레이트 상에 밤새 코팅시키고 PBST [PBS 및 1% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% Tween 20]으로 미리 차단시켰다. 천연 합성 다양성 파지 항체 라이브러리(문헌참조: C.V.Lee, 등 J. Mol. Biol. 340, 1073-1093 (2004); 및 W. C. Liang, 등 J. Mol. Biol. 366, 815-829 (2007))는 PBST로 예비 차단되고 후속적으로 플레이트에 첨가하고 실온에서 밤새 배양하였다,. 상기 플레이트는 PBST로 세척하고 결합된 파지는 30분 동안 50 mM HCl 및 500 mM NaCl로 용출시키고 1M 트리스 염기로 중화시켰다. 회수된 파지 입자는 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). 후속적 선택 라운드 동안에, 배양 시간은 2 내지 3시간으로 감소시키고 세척의 엄중성은 점진적으로 증가하였다. 항원에 특이적으로 결합하는 독특한 파지 항체를 선택하고 개별 클론의 VL 및 및 VH 영역을 각각 LPG3 및 LPG4 벡터로 클로닝함에 의해 전장 IgG로 재포맷팅하고 포유동물 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
3. RMT 표적에 대한 항체의 개발
Balb/c 마우스 (Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA), 루이스 래트 (Charles River, Hollister, CA), 또는 아메리칸 햄스터 (Cytogen Research and Development, Inc., West Roxbury, MA)는 수력학적 꼬리 정맥 전달(HTV)를 통해 주당 주사에 의해 링거 용액 중에 희석된 GM-CSF의 존재하에 전장 항원을 암호화하는 플라스미드 DNA 또는 Ribi 보조제(Sigma) 중에서 3 내지 4일 간격으로 폿패드 또는 복강내를 통해 Glut1의 경우에 인간 항원을 암호화하는 DNA 또는 정제된 항원 세포외 도메인으로 면역화시켰다. 6 내지 12회 주사 후, 면역계 역가는 일시적으로 형질감염된 293 세포에 결합하는 직접적 ELISA 및 FACS에 의해 평가하였다. FACS 결합을 입증하는 동물로부터 비장세포 및/또는 림프구는 전기 융합에 의해 마우스 골수종 세포와 융합시켰다(X63.Ag8.653; American Type Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA, USA) (Hybrimmune™; Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA). 10 내지 14일 후, 하이브리도마 상등액을 수거하고 직접적인 ELISA 또는 FACS에 의한 IgG 분비에 대해 스크리닝하였다. FACS 결합을 입증하는 최종 하이브리도마 클론은 인간 IgG1 또는 효과기부재의카파 골격으로 재포맷팅하였다. 상기 재포맷팅된 항체를 발현시키고 상등액은 MabSelect SuRe™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 50mM 인산, pH 3.0 + 20X PBS, pH 11로 용출시키고 4 ℃에서 저장하였다.
4. 유동 세포측정 분석
정제된 항체는 상응하는 항원으로 형질감염된 293 세포상에서 스크리닝하였다. 세포는 플라스크/디쉬로부터 수거하고, 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고 웰당1,000,000 세포로 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD Falcon 353077, BD, Franklin Lakes, NJ)에 첨가하였다. 샘플은 세포에 첨가하고 (100 μL/웰) 30 내지 60분 동안 4 ℃에서 배양하였다. 이어서 플레이트는 원심분리하고 (1200 rpm, 5분, 4 ℃) PBS/1% FBS (200 μl/웰)로 2회 세척하였다. R-피코에리트린-접합된 Ziege 항-인간 IgG Fc (Jackson ImmunoReseach Laboratories Inc. (West Grove, PA); 109-116-098; PBS 중에서 100 μl로 희석됨)을 이어서 첨가하고 플레이트는 30분 동안 4 ℃ (커버됨)에서 배양하였다. 최종 세척 후, 세포는 1% 포르말린을 함유하는 PBS 중에서 고정화시키고, FACSCalibur™ 유동 세포측정기 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 판독하였다. 각각의 샘플의 평균 형광 강도 (MFI)는 이어서 FlowJo software를 사용하여 측정하였다 (Treestar, Inc., Ashland, OR).
5. 경쟁 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)
Nunc 96-웰 Maxisorp 면역플레이트는 4 ℃에서 항원 (2 μg/ml)으로 밤새 코팅시키고 차단 완충액 PBST로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 2가 또는 이중특이적 항체의 연속 희석물은 후속적으로 실온에서 1시간 동안 준포화 농도의 비오티닐화된 이중특이적 항체와 함께 플레이트에 첨가하였다. 플레이트는 세척 완충액(0.05% Tween 20을 갖는 PBS)으로 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 스트렙타비딘과 30분 동안 배양하였고, 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질과 함께 전개하였다. 흡광도는 650nm에서 분광학적으로 측정하였다.
6. 방사능표지 미량의 투여
방사능요오드화. 상기 연구에 사용된 모든 항체는 이전에 기재된 바와 같은 간접적 요오도겐 첨가방법을 사용하여 요오드-125(125I)로 방사능요오드화시켰다 (Chizzonite 등, J Immunol, 1991; 147(5): 1548-56). 방사능표지된 단백질은 PBS 중에서 사전 평형화된 NAP5TM 컬럼을 사용하여 정제하였다. 이들은 크기-배척 HPLC로 온전한 것으로 나타났다.
7. C57BL /6 암컷 마우스에서 생체내 생분포 .
모든 생체내 프로토콜, 하우징 및 마취는 하기의 규제 기관(Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Laboratory Animal Resources, Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care regulations에 따라)에 의해 승인되었다. 약 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (17-22 g)는 기관(Charles River Laboratories (Hollister, CA))으로부터 수득하였다. 이들은 IV 볼루스를 통해 5 μCi의 방사능요오드화된 항체를 투여하였다. 투여 후 1, 4, 24, 및 48시간 째에, 혈액 (혈장을 위해 프로세싱됨), 뇌, 간, 폐, 비장, 골수 및 근육 (비복근)을 수거하고 (n=3/항체)\감마 계수기 (2480 Wizard2® Automatic Gamma Counter, PerkinElmer, Waltham, MA) 상에서 총 방사능활성에 대해 분석될때까지 동결 저장하였다. 각각의 샘플에서 방사능활성 수준을 계산하고 샘플 그램 또는 밀리리터(%ID/g 또는 %ID/mL) 당 주사된 용량의 %로서 나타냈다. %ID/g-시간 데이터는 GraphPad Prism® (버젼 6.05)을 사용하여 플롯팅하고 농도시간 곡선(AUC) 하의 면적을 측정하였다. AUC 평가를 위한 표준 오차 (SD)는 하기 문헌에 기재된 방법을 사용하여 계산하였다: 문헌참조: Bailer (Bailer, Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, 1988; 16 (3): 303-309).
8. 면역조직화학
야생형 마우스에 5 mg/kg의 항체를 정맥내 주사하고 이어서 투여 1시간 후 PBS를 관류시켰다. 뇌는 4 ℃ 에서 밤새 4% 파라포름알데하이드 (PFA) 중에 적가 고정시키고 이어서 4 ℃ 에서 밤새 30% 슈크로스로 고정시켰다. 뇌 조직 샘플은 슬라이딩 마이크로톰 상에서 35 μm 두께로 절개하고, 5% BSA, 0.3% Triton 중에서 1 내지 3시간 동안 차단시키고, 실온에서 2시간 동안 1% BSA, 0.3% Triton 중에서 1: 200 Alexa Fluor® 488 항-인간 2차 항체(Life Technologies, Grand Island, NY)와 배양하였다. 탑재된 슬라이드는 후속적으로 Leica 형광 현미경에 의해 분석하였다 (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL).
9. 뇌 및 혈장에서 항체 농도 및 마우스 Aβ x - 40 를 측정한다
동물 케어는 Genentech IACUC 가이드라인에 따라 수행하였다. 치료학적 용량 연구에 사용된 모든 마우스는 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 야생형 마우스였다. 마우스에 항체를 정맥내 주사하고 주사 후 지정된 시간에 채취하였다. PBS를 사용한 관류 전, 전혈을 ??ㄹ장 마이크로테이너 튜브 (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ)에 수거하고 2분 동안 14000 rpm에서 회전 하강시켰다. 혈장 상등액은 적절한 경우 항체 및 마우스 Aβx -40 측정을 위해 단리하였다. 뇌는 추출하고 조직을 완전한 소형 EDTA-부재 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 함유하는 PBS 중에서 1% NP-40 (Cal-Biochem, Billerica, MA) 중에서 파쇄시켰다. 파쇄된 샘플은 20분 동안 14000rpm에서 회전시키기 전에 1시간 동안 4 ℃에서 회전시켰다. 상등액은 뇌 항체 측정을 위해 단리하였다. PK/PD 연구를 위해, 하나의 절반-뇌는 Aβx -40 측정을 위해 단리하였고 5M 구아니딘 하이드로클로라이드 완충액 중에서 파쇄시켰다. 샘플은 새롭게 첨가된 아프로티닌 (20 μg/mL) 및 류펩틴 (10 μg/mL)을 함유하는 PBS 중에서 0.25% 카제인, 5 mM EDTA (pH 8.0) 내 희석 (1: 10) 전에 실온에서 3시간 동안 회전시켰다. 희석된 파쇄물을 20분 동안 14000 rpm에서 회전시키고, 상등액은 마우스 Aβx-40 측정을 위해 단리하였다.
10. PK 검정
마우스 혈청 및 뇌 샘플 중 항체 농도는 ELISA를 사용하여 측정하였다. NUNC 384 웰 Maxisorp™ 면역플레이트 (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ)는 당나귀 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적 다클론성 항체의 F(ab’)2 단편으로 코팅시켰다(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). 플레이트를 차단시킨 후, 각각의 항체는 각각의 항체 농도를 정량하기 위한 표준물로서 사용하였다. 표준품 및 샘플은 약한 진탕과 함께 실온에서 2시간 동안 플레이트 상에 배양하였다. 결합된 항체는 HRP-접합된 F(ab’)2 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 다클론성 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc)로 검출하였다. 농도는 4-파라미터 비-선형 회귀 프로그램을 사용하여 표준 곡선으로부터 결정하였다. 상기 검정은 혈청 중 3.12 ng/ml의 하한치 정량 (LLOQ) 값 및 뇌에서 1.56 ng/ml의 하한치를 가졌다. 항-CD98hc 뇌 샘플에 대해, 마우스 혈청 및 뇌 샘플 중 항체 농도는 GYROS 플랫폼 (Gyros Ab, Sweden) 상에서 ELISA를 사용하여 측정하였다. Gyros 비드는 먼저 당나귀 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적 다클론성 항체의 비오틴 접합된 F(ab’)2 단편으로 코팅시켰다 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc). 각각의 항체는 각각의 항체 농도를 정량하기 위한 표준물로서 사용하였다. 표준품 및 샘플은 제조 제안된 프로토콜에 따라 실온에서 비드 상에서 배양하였다. 결합된 항체는 Alexa 647-접합된 F(ab’)2 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 다클론성 항체 (Jackson ImmunoResearch)로 검출하였다. 농도는 4-파라미터 비-선형 회귀 프로그램을 사용하여 표준 곡선으로부터 결정하였다. 상기 검정은 혈청 중 5ng/ml 및 뇌에서 5ng/ml의 하한치 정량(LLOQ) 값을 가졌다.
11. PD 검정
마우스 신경세포 배양 상등액, 혈장 및 뇌 샘플 중 βx -40 농도는 상기 PK 분석을 위한 방법과 유사한 ELISA를 사용하여 측정하였다. 간략하게, Aβ40 (Millipore, Bedford, MA)의 C 말단에 특이적인 토끼 다클론성 항체는 플레이트상으로 코팅시키고 비오티닐화된 항-마우스 Aβ 단클론 항체 M3.2 (Covance®, Dedham, MA)는 검출을 위해 사용하였다. 상기 검정은 혈장에서 1.96 pg/ml 및 뇌에서 39.1 pg/g의 LLOQ 값을 가졌다.
12. 1차 마우스 뇌 내피 세포 단리
뇌 내피 세포 (BEC; CD31+/CD45-)는 FACS에 의해 40마리 성숙한 암컷 C57Bl6 마우스 (6 내지 8주령)으로부터 단리하였다. 음으로 분류된 집단 (CD31-/CD45-)은 비교를 비해 병용하여 수거하였다. 종합적으로, 대략적으로 5 x 105 세포는 ~92%의 순도를 갖는 BEC 집단을 획득하기 위해 분류하였다. 단리된 BEC 및 음으로 선택된 대조군 세포는 프로테아제 억제제의 존재하에 RIPA 완충액 중에서 용해시키고 4-12% 비스-트리스 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. BEC 용해물 중에서, 10%는 실버 염색된 겔에 대해 사용하고, 10%는 웨스턴 블롯 트랜스페린 수용체 (TfR)에 대해 사용하고, 나머지는 단일 레인에 로딩하고 SimplyBlue™ SafeStain Coomassie® (Life Technologies)으로 염색시켰다. BEC 용해물에 인접한 병행 레인에서, 음으로 선택된 집단으로부터 ~5000 CD31+/CD45- 및 ~40000 CD31-/CD45- 세포로부터 기원하는 용해물은 각각 실버 염색, 항-TfR 웨스턴 블롯, 및 Coomassie® 염색을 위해 전개하였다.
13. 질량 분광측정
질량 분광측정 분석을 위해, BEC 용해물 (CD31+/CD45-) 및 음성 대조군 (CD31-/CD45-) 용해물에 상응하는 Coomassie® 염색된 겔 레인을 각각 상부에서 하부로 15개 단면으로 절단하였다. 각각의 겔 레인은 필수적으로 하기 문헌에 기재된 바와 같이 인-겔 트립신 분해에 적용하였다: 문헌참조: Zhang, 등, 2014, Sci Trans Med 34(36): 11929-11947; 및 in Phu 등, 2011, Mol Cell Proteomics, 10(5): M110.겔 슬라이스는 1mm 정육면체로 절단하고 각각 15분 동안 10x 겔 용적의 50mM 중탄산나트륨, 50% 아세토니트릴 (pH 8.0)에 이어서 10X 겔 용적의 용적 100% ACN으로 연속 세척하여 탈색시켰다. 인-겔 감소 및 알킬화는 각각 25 mM 디티오트레이톨/100 mM 중탄산암모늄 (30분, 50 ℃), 및 50 mM 요오도아세트아미드/100 mM 중탄산암모늄 (각각 암실에서 20분, 실온)으로 수행하였다. 겔 조각은 후속적으로 세척하고 추가의 10X 겔 용적의 100% 아세토니트릴로 탈수시켰다. 트립신 용액은 5% 아세토니트릴과 함께 50mM 중탄산암모늄 pH 8.0 중에서 10 ng/μL 트립신의 농도로 제조하고 빙상에서 겔 조각에 첨가하였다. 겔 조각은 빙상에서 1시간 동안 트립신 용액 중에 적시고 인-겔 분해는 37℃에서 밤새 수행하였다). 분해된 펩타이드를 수거하고 겔 조각은 50% 아세토니트릴/5% 포름산으로 추가의 시간 동안 추출하였다. 샘플은 SpeedVac™에서 완전히 건조시키고 이어서 분석을 위해 3% 아세토니트릴/5% 포름산 중에 재현탁시켰다.
펩타이드는 나노ACQUITY UPLC 컬럼 (Waters)을 사용하여 10분 동안 1.5 μl/분의 유속으로 1.7 μm BEH-130 수지 (Waters, Milford MA)이 팩킹된 0.1 mm x 100 cm C18 컬럼상에 주입하였다. 펩타이드는 2단계 선형 농도 구배를 사용하여 분리하고, 여기서, 용매 B (98% 아세토니트릴/2% 물/0.1% 포름산)는 20분에 걸쳐 5%에서 25%로 구배하고 이어서 2분에 걸쳐 25%에서 50%로 구배한다. 완충액 A는 98% 물/2% 아세토니트릴/0.1% 포름산으로 구성되었다. 펩타이드는 ADVANCE 포획 분무 이온화 공급원 (Microm-Bruker, Auburn, CA)을 사용하여 오비트랩 벨로스 하이브리드 이온 포집-오비트랩 질량 분광측정기(ThermoFisher Scientific, San Jose, CA)로 도입하였다. 오비트랩 완전한-MS (MS1) 스펙트럼은 60,000-분리능에서 수거하고 상부 8개 최강도 이온 상에서 선형 이온 포집에서 데이터 의존성 MS2 스캔을 유도하기 위해 사용하였다. MS2 스펙트럼은 제조원(UniProt)으로부터의 마우스 단백질의 연쇄 표적-데코이 데이터베이스에 대한 마스코트(Mascot)를 사용하여 조사하였다. 펩타이드 스펙트럼 일치물을 선형 판별 분석을 사용한 5% 펩타이드 거짓 발견 비율(pepFDR)로 연속으로 여과하고 연속으로 2% 단백질 거짓 발견 비율 (최종 pepFDR < 0.5%)로 여과하였다. AUC (곡선 이하 면적)는 이전에 기재된 바와 같이 상위 3개의 가장 풍부한 펩타이드 히트의 통합 강도에 대한 2개의 기술적 복제물의 평균값을 나타낸다(문헌참조: Ahrne 등, 2013; Proteomics.17, 2567-2578).
14. 생체내 2-광자 현미경
혼합 성별의 2 내지 4개월령 야생형 마우스에 이전에 기재된 바와 같이 우측 반구체 상에 두개골 윈도우를 이식하고 (Holtmaat 등, 2009; Nat Protoc.2009; 4(8): 1128-44) 수술 ≥ 2주 후 영상화하였다. 마우스는 영상화 하는 동안에 세보플루란 (0.7L/분에서 2.5-3%)으로 마취시켰다. 100 μL의 AngioSense® IVM 680 (Perkin Elmer, Waltham, MA)를 꼬리 정맥 카테터를 통해 주사하여 혈관형성을 가시화하고 예비-항체 이미지는 2-광자 현미경에 의해 획득하였다. 50 mg/kg의 Alexa Fluor® 594 표지된 CD98hc/BACE1 항체는 꼬리 정맥 카테터를 통해 주사하고 이미지는 즉시 (시간 0) 및 6, 24, 및 48시간 후 획득하였다. 2-광자 레이져-스캐닝 현미경 시스템 (Ultima In Vivo Multiphoton Microscopy System, Prairie Technologies)은 ~15 mW를 60x NA 1.1 물 침지 대상의 백-초점(back-focal) 플레인으로 전달하는 860nm로 맞춰진 Ti: 사파이어 레이져 (MaiTai® DeepSee™ Spectra Physics)를 사용한다. 레이져 파워는 각각의 동물에 대해 영상화 일수에 걸쳐 일정하게 유지시켰다. 1 μm z-단계 크기 중 512 x 512 픽셀 분리 스택의 35-65 μm 용적을 각각의 면적에 대해 수거하였다.
15. 바쿨로바이러스 ( BV ) ELISA
세부적인 방법은 이전에 기재되었다 (문헌참조: I.Hotzel, 등 mAbs, 4: 6, 753-760 (2012)). 간략하게, 정제된 BV 입자는 4 ℃에서 밤새 384-웰 ELISA 플레이트(Nunc Maxisorp™)에 고정화시켰다. 웰은 실온에서 1시간 동안 차단 완충액(0.5% BSA를 함유하는 PBS)으로 차단시켰다. 상기 플레이트를 PBS로 세정한 후, 정제된 항체는 차단 완충액에서 연속으로 희석시키고, 25 μl의 적정액은 2회 ELISA 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다제 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)에 접합된 10 ng/mL 염소 항-인간 IgG, (Fcγ-단편-특이적) 를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 배양하고, 세척하고 이어서 TMB 기질은 각각의 웰에 첨가하였다. 반응은 1 M 인산을 각각의 웰에 첨가함에 의해 15분 후 정지시켰다. 흡광도는 450nm에서 판독하고 620nm에서 표준화하였다. BV 스코어는 6개의 광학 밀도 측정치의 평균값으로부터 계산하고, 상기 측정치각각은 비-코팅된 웰에 대해 관찰된 평균 신호에 의해 나누어 표준화하였다.
16. 면역세포조직학
마우스 CD98hc를 안정하게 과발현하는 IMCD3 세포는 384웰 광학 플레이트 (Perkin Elmer®) 중에 분주하고 컨플루언스 후 1 내지 2일 동안 성장시켰다. 세포는 1시간 동안 1 μM에서 항-CD98hc 이중특이적 항체로 처리하고, PBS로 세척하고, 실온(RT)에서 5 내지 10분 동안 4% PFA/4% 슈크로스/PBS로 고정화시킴에 이어서 20분 동안 빙냉 100% 메탄올 고정화시켰다. 세포는 실온 (RT)에서 30분 동안 PBS 중에서 1% 당나귀 혈청, 2% BSA, 0.1% 트리톤-X100으로 차단시켰다. 사용된 1차 항체는 마우스 항-램프1 (BD, 1: 200) 및 염소 항-CD98hc (Santa Cruz 1: 200)이고, 차단 중에 희석시키고, 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 하기의 2차 항체를 사용하였다: 당나귀 항-인간 IgG Alexa Fluor® 405, 당나귀 항-염소 Cy3, 및 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor® 647 (Jackson Immunoresearch).
17. 이미지 획득 및 컬코컬라이제이션 ( colocalization ) 분석
이미지는 공초점 모드에서 40X NA1.1 물 렌즈를 갖는 오페라 Phenix™ 고함량 시스템 (Perkin Elmer®) 상에서 촬영하였다. 레이져 라인 375, 488, 550, 및 640을 사용하였다. 웰당 4개의 이미지를 촬영하고 각각의 이미지에서 150 내지 200개 세포가 있다. 조건 당 5개의 웰을 영상화하였고 따라서 3000개 세포가 처리 당 분석한다. 이미지는 분석을 위해 ImageXpress® 5.1로 이전시켰다. 분석될 각각의 개별 채널에 대해, 백그라운드는 TopHat 함수를 사용하여 제거하고 이어서 “순응된 역치” 함수를 사용하여 분석을 위한 본래의 채널 이미지상에서 염색된 대상 마스크를 생성하였다. 단지 염색된 세포내 반점을 정량하기 위해, CD98hc 막 염색은 크기를 기반으로 하는 분석으로부터 배제하였다. CD98hc 반점의 총수는 약 150 내지 200개 세포로 이루어진 전체 이미지로부터 정량하였다. 램프 1과 함께 동시 국소화된 내재화된 CD98hc 염색을 동정하기 위해, “키프 마킹된 대상” 함수를 사용하여 2개의 상이한 채널로부터 충첩 대상을 동정하였다. 동시 국소화된 CD98hc 반점의 총 수는 전체 이미지로부터 정량하였고 각각의 웰의 합은 프로그램에 의해 보고하고 마이크로소프트 엑셀에 발송하였다. 동시 국소화된 % CD98hc 반점은 램프 1로 동시국소화된 CD98hc 반점의 수를 총CD98hc 반점의 총수로 나누어 계산하였다. 5개의 웰로부터의 평균값을 계산하고 GraphPad Prism (GraphPad, La Jolla, CA)에서 그래프화하였다.
18. 아미노산 흡수 검정
CD98hc를 안정하게 과발현하는 IMCD3 세포는 하루 전날 384웰 플레이트 (Perkin Elmer®)에 분주하였다. 항체는 다음날 아침에 세포에 첨가하고 성장 배지에서 1 μM로 24시간 동안 배양하였다. 조건 당 4개의 웰을 사용하고 실험은 3회 반복하였다. 24시간 후, 세포는 37 ℃에서 30분 동안 Met-부재 DMEM와 평형화시켰다. 세포에 의한 아미노산 흡수를 측정하기 위해, 아미노산 메티오닌 유사체, 호모프로파르길글라이신 (HPG, Life Technolgies C10186)은 50 μM 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 10 mM BCH (Sigma)는 양성 대조군으로 사용하였고 동시에 HPG로서 첨가하였다. 37 ℃에서 30분 배양 후, 추가의 성장 배지는 또 다른 30분 동안 첨가하였다. 이어서 세포는 PBS로 세척하고 cOmplete™ 프로테아제 억제제 (Roche)를 갖는 RIPA 완충액 중에서 용해시켰다. 모든 액체 취급은 Agilent 브라보 자동화 시스템 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)과 함께 384 팁 헤드를 사용하여 수행하였다. 세포 용해물은 384웰 플레이트로 이전시키고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 수송된 메티오닌은 HPG 상에서 클릭 태그를 통해 비오티닐화에 의해 검출하였다. 플레이트는 3회 세척하고 클릭 반응은 제조업자의 지침 (Life Technologies, Grand Island, NY, B10184)에 따라 수행하였다. 비오티닐화된 메티오닌의 총량은 ELC 검출을 사용하여 검출하였다. 결과는 GraphPad Prism®으로 플롯팅하였다.
19. 웨스턴 블롯 분석
마우스 뇌 조직은 PBS 관류 후 단리시키고 상기된 바와 같이 프로테아제 억제제를 갖는 1% NP-40 중에서 파쇄시켰다(뇌 및 혈장 중 항체 농도 및 마우스 Aβx -40 측정). 대략 20 μg의 단백질을 4-12% 비스-트리스노벡스 겔 (Life Technologies)상으로 로딩하였다. 겔은 iBlot 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 니트로셀룰로스 막 상으로 이전시키고 웨스턴 블롯팅은 Odyssey® 차단 완충액 시약 및 2차 항체 (LI-COR®, Lincoln, NE)를 사용하여 수행하였다. 마우스 교차-반응성 염소 항-CD98hc (Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX), M-20, 1: 200)을 사용하여 뇌 용해물에서 CD98hc를 검출하였다. 토끼 항-βactin (abcam® abcam8227, 1: 2000)은 로딩 대조군으로 사용하였다. 웨스턴 막을 영상화하고 제조업자의 공급된 소프트웨어 및 시스템 (Odyssey®/LI-COR®)을 사용하여 정량하였다.
야생형 IMCD3 세포는 밤새 48웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 항체로 배양하고, PBS로 세척하고, 이어서 cOmplete® 프로테아제 억제제 (Roche)가 보충된 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 조건 당 3개의 웰을 사용하고 실험은 3회 반복하였다. 용해물은 상기된 바와 같은 웨스턴 블롯에 의해 염소 항-CD98hc (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 및 액틴 (abcam®)을 사용하여 CD98hc에 대해 탐지하였다.
20. 통계학적 분석
모든 값은 달리 지적되지 않는 경우 평균 ± SEM으로서 나타내고 p-값은 듀넷 다중 비교 시험과 함께 통상의 원-웨이 ANOVA에 의해 평가하였다. 뇌 TfR과 항체 간의 상관 분석은 GraphPad Prism® 버젼 6을 사용하여 수행하였다.
B. Lrp1 및 InsR의 수용체- 매개된 트랜스사이토시스 스크리닝은 상당한 뇌 흡수의 부재를 밝혔다
이 실시예는 BBB에 걸친 항체의 수용체 매개된 수송에 대해 보다 광범위하게 연구된 수용체 (TfR, Lrp1 및 InsR) 중에서, TfR에 대한 항체만이 상당한 뇌 흡수를 보여주었음을 입증한다.
BBB 통과에 대한 잠재적 RMT 표적에 대한 항체를 쳬계적으로 스크리닝하기 위해, 일반적인 스크리닝 캐스케이드를 디자인하고 이는 전신 생체내 투여 약리역학 연구 전에 쥐 항원 결합의 시험관내 확인을 포함한다(도 1a). 이 방법은 먼저 2개의 통상적으로 연구된 RMT 표적, 저-밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1 (Lrp1) 및 인슐린 수용체 (InsR)에 대한 항체가 BBB를 통과할 수 있고 마우스 뇌에 상당히 축적되는지의 여부를 확인하기 위해 사용하였다. Lrp1 및 InsR에 대한 단클론 인간 항-쥐 항체는 순수 항체 파지 라이브러리로부터 제조하였다. 쥐 Lrp1 또는 쥐 InsR을 발현하는 HEK293 세포를 사용한 유동 세포측정 분석은막-디스플레이된 표적으로의 이들 항체의 양성 결합을 확인하였다 (도 1b).
전신 투여된 항-Lrp1 및 항-InsR이 뇌로 수송될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 본원 발명자는 미량 및 치료학적 용량을 사용하여 항체의 뇌 농도를 평가하였다. 미량 및 치료학적 용량 둘다가 조사되었고 이는 미량 및 치료학적 용량과 BBB-R TfR에 대한 결 친화성의 역 관계가 이전에 입증되었기 때문이다. 구체적으로, TfR에 대한 높은 친화성 결합은 미량의 투여를 통해 강한 흡수를 보여주었지만 치료학적 용량 투여를 통한 감소된 흡수를 보여주었다. 그 반대는 낮은 친화성 TfR 항체에 대해 입증되었다. 이와 같이, RMT 표적에 대한 항체가 미량 또는 치료학적 용량 투여를 통해 작동해야만 하고 또한 표적은 BBB를 거치는 수송체로서 가시적이지 않을 가능성이 있는 것으로 결론지어졌다.
TfR은 강한 RMT 표적이고, TfR에 대한 항체는 BBB를 통과할 수 있고 전신 투여후 뇌에서 축적한다. 따라서, 고친화성의 항-TfR 항체 (항-TfRA) 은 후속적 미량 및 치료학적 용량 투여 연구 동안 뇌 흡수에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다 (문헌참조: Yu 등, Sci Transl Med. 2011 May 25; 3(84): 84ra44; Couch 등, Sci Transl Med. 2013 May 1; 5(183): 183ra57, 1-12; Yu 등, Sci Transl Med. 2014 Nov 5; 6(261): 261ra154). 단일 방사능표지된 미량 용량의 I125-대조군 IgG, I125-항-TfRA, I125-항-Lrp1, 또는 I125-항-InsR은 야생형 마우스에 정맥내 주사하였고 뇌에서 방사능활성은 용량 투여 후 다양한 시점에 측정하였다. 뇌 조직 그램 당 주사된 용량의 %에 측정된 바와 같이 뇌 흡수에서 상당한 증가는 I125-항-TfRA에 대해 관찰되었고, 반면, I125-항-Lrp1 및 I125-항-InsR 둘다의 뇌 흡수는 I125-대조군 IgG과 유사하였다 (도 1c).
이들 항체의 치료학적 용량이 뇌 흡수를 유도하는지의 여부가 이어서 조사되었다. 야생형 마우스에 20 mg/kg (보다 높은 치료학적으로 적절한 용량의 대조군 IgG, 항-TfRA, 항-Lrp1, 또는 항-InsR에 주사하고 항체의 뇌 농도는 PBS로 관류한 후 용량 투여 1 및 24시간 후 측정하였다. 이전의 관찰과 일관되게, 뇌에서 항체의 흡수를 관찰하였지만 대조군 IgG와 비교하여 용량 투여 1 및 24시간 후 둘다에서 항-TfRA에 대해서는 약한 것으로 관찰되었다(도 1d). 대조적으로, 항-Lrp1의 뇌 축적은 관찰되지 않았다. 항-InsR은 양 시점에서 뇌 흡수에 있어서 상당하지만 약간의 증가를 나타냈다.
5 mg/kg 용량 투여 1시간 후 마우스 피질 조직의 면역조직화학적 염색은 항-TfRA의 현저한 혈관 국소화를 나타내었고, 반면, 어떠한 항체 국소화도 항-Lrp1 또는 항-InsR에 대해서는 관찰되지 않았고, 이는 뇌 상피 세포 상의 Lrp1 및 InsR을 표적화하는 전신 투여된 항체의 국소화 부재를 지적한다(도 1e). 이들 결과는 이들 광범위하게 연구된 수용체 중 TfR에 대한 항체만이 강한 뇌 흡수를 나타냈음을 보여준다.
C. BBB에서 유전자 ( mRNA ) 집적은 CNS로의 항체 수송을 위해 충분하지 않다.
이 실시예는 BBB에서의 유전자 (mRNA) 집적이 뇌 내피 세포상에서 발현된 혈장막 수용체가 BBB에 걸친 성공적인 RMT 표적인지의 여부를 결정하기 위해 충분한 표준이 아님을 입증한다.
이상적으로, RMT 표적은 BBB에서 고도로 발현되지만 말초 기관에서 보다 낮은 발현을 갖는다. 상기 성질은 뇌 이외의 다른 기관에서 표적 매개된 제거를 감소시킴에 의해 안전성 및 항체 약리역학을 개선시킬 수 있다. 이전에, BBB에 집적된 유전자는 야생형 마우스로부터 간 및 폐 내피 세포와 비교하여 FACS-정제된 내피 세포의 마이크로어레이 발현 프로파일링을 사용하여 동정하였다(문헌참조: Tam 등, 2012, Devt. Cell 22: 403-417). 단일-통과 막관통 수용체를 암호화하는 여러 후보 유전자는 BBB에서 이들의 높은 집적을 기준으로 잠재적 RMT 표적으로서 동정되었다: Lrp8, Ldlrad3, 및 CD320 (도 2a). 흥미롭게도, BBB에서 보다 높은 mRNA 발현이 Tfrc에 대해 관찰되었지만 Lrp1 및 Insr에 대해서는 간 및 폐 내피 세포와 비교하여 보다 높은 BBB 발현을 나타내지 않았고 이는 이들 통상적으로 연구된 RMT 표적이 BBB에서 집적되지 않음을 시사한다.
BBB에서 집적되는 유전자의 항체 표적화 생성물이 상당한 항체 흡수를 유도하는지의 여부를 결정하기 위해, Lrp8, Ldlrad3, 및 CD320에 대한 단클론 항-쥐 항체를 생성하였다. 쥐 항원을 발현하는 HEK293 세포를 사용한 유동 세포측정 분석은 모든 3개의 항체에 대한 양성 결합을 확인시켜 주었다 (도 2b). 단일 방사능표지 미량 용량의 I125-대조군 IgG, I125-항-TfRA, I125-항-Lrp8, I125-항-Ldlrad3, 또는 I125-항-CD320은 야생형 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사된 항체 중에서, 단지 I125-항-TfRA이 뇌에서 상당한 흡수를 나타내었고 반면 I125-항-Lrp8, I125-항-Ldlrad3, 및 I125-항-CD320은 I125-대조군 IgG와 유사한 뇌 수준을 보여주었다(도 2c). 야생형 마우스에 치료학적으로 적절한 용량 20mg/kg이 정맥내 투여되는 경우 유사한 결과가 관찰되었다 (도 2d 및 2e). 5 mg/kg 용량투여 1시간 후 피질 뇌 조직의 면역조직학적 염색은 항-Lrp8 및 항-CD320에 대하여 BBB에서 항체 국소화의 부재를 밝히고, 항-Ldlrad3은 약간의 면역반응성을 나타내었다 (도 2f).
마이크로어레이 분석이 뇌 내피 세포 상에 고도로 집적된 Lrp8, Ldlrad3, 및 CD320 mRNA 발현을 동정하였지만, 이들 막관통 수용체에 대한 항체는 임의의 인지가능한 양으로 BBB를 통과하는데 실패한다. 최근에 창 (Zhang 등(2014, 상기 참조)은 마우스 뇌에서 독특한 세포 집단의 포괄적 RNA-seq 전사체 분석과의 데이터 세트를 가용하게 하였고, 상기 뇌의 세포는 정량적 mRNA 발현 데이터 (accessible at web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.hmtl)를 제공하는 뇌 혈관 내피 세포를 포함한다. 데이터세트 내 실패된 RMT 표적 후보물의 출원의 조사는 뇌 내피 세포 상의 Lrp8, Ldlrad3, 및 CD320의 낮은 절대 mRNA 발현을 밝혔고(도 2g) Lrp1 및 Insr는 상기 세포 집단에서 매우 낮은 mRNA 발현을 보여주었다. 대조적으로, Tfrc의 전사체 수준은 뇌 내피 세포에서 다른 후보물 유전자 보다 약 12배(Lrp8과 비교하여) 내지 약 500배 (Lrp1과 비교하여) 높다 (도 2g). 이러한 분석은 항체 뇌 흡수 실험의 부재하에 단독의 mRNA 발현 데이터가 적합한 RMT 표적을 동정하기에는 불충분함을 보여준다.
D. BBB에서 고도로 발현된 막관통 단백질의 단백체 동정
이 실시예는 BBB에서 고도로 발현되고 잠재적 신규 RMT 표적일 수 있는 세포질 막 단백질의 단백체 방법을 사용한 동정을 기재한다.
Ldlrad3 및 CD320의 상대적 전사체 수준이 뇌 내피 세포 (BEC)에서 선택적으로 집적되어 있지만, BBB에서 이들의 절대 단백질 발현 수준은 불량한 뇌 면역조직화학적 염색에 의해 제안된 바와 같이 BBB를 거친 임의의 잠재적 항체 흡수를 방해하는 제한 인자일 수 있는 것으로 추정되었다. 절대 단백질 수준이 양호한 잠재적 RMT 수용체를 예측하는지의 여부를 조사하기 위해, 단백체 방법을 사용하여 뇌 내피 세포에서 고도로 발현되는 막관통 단백질을 동정하였다.
BBB 혈관형성의 유전자 발현 프로파일링에 대해 이전에 기재된 방법과 유사하게 (Tam 등 2012, 상기), 유동 세포 측정을 사용하여 야생형 마우스로부터 CD31-양성 및 CD45-음성 뇌 내피 세포(BEC)를 단리하였다 (도 3a). 유동 세포측정 정제된 BEC의 질량 분광측정 (MS) 분석은 이전에 특징 분석된 Pg-p, Glut1, ZO-1, 및 Esam과 같은 내피 세포 특이적 단백질의 동정에 의해 입증되었다 (도 3b). 음성으로 선택된 비-BEC 용해물로부터의 펩타이드 계수(즉, CD31-음성/CD45-음성)은 신경교 특이적 단백질 (Fasn, Aldoc, Glul, Plp1)의 풍부성을 밝혔다.
이의 강한 RMT 성질과 일관되게, TfR은 BEC 집단에서 풍부하게 발현되는 것으로 밝혀졌다 (도 3c). 사실, 펩타이드 계수는 BEC 집단에서 TfR이 최고의 단일-통과 막관통 단백질임을 밝혔다. mRNA 발현과 일관되게, Lrp1, InsR, Lrp8, Ldlrad3, 및 CD320의 단백질 수준은 검출 미만이었지만 Lrp1의 일부 펩타이드 계수는 비-BEC 집단에서 검출되었다 (도 3c).
이들 결과는 따라서 이전에 기재된 RMT 표적 (Lrp1 및 InsR), 및 간/폐 mRNA와 비교하여 뇌 내피 세포에서 우선적 유전자 발현을 갖는 표적 (Lrp8, Ldlrad3 및 CD320)을 표적화하는 항체의 상당 흡수 결여를 입증하는 상기 결과와 일치한다.
중요하게, 이러한 단백체 분석은 BBB를 관통하는 RMT에 대한 항체 표적으로서이전에 연구되지 않았던 여러 고도로 풍부한 막관통 단백질을 밝혔다. 이들은 글루코스 수송체 Glut1 (도 3b), 세포외 매트릭스 메탈로프로테이나제 유도제 바시긴 (CD147) (도 3c), 및 용질 캐리어 CD98 중쇄를 포함한다 (도 3c). 이들 RMT 표적은 또한 마이크로어레이 발현 및 RNA 서열분석 프로파일링 데이터를 기준으로 BBB에 집적되고(도 3d) 따라서 추가의 조사를 위한 잠재적 새로운 RMT 후보 표적으로서 선택되었다.
E. 바시긴에 대한 항체의 뇌 흡수
이 실시예는 야생형 마우스의 뇌로의 항-바시긴 항체 흡수의 특징 분석을 기재한다.
바시긴에 대한 단클론 항체는 쥐 바시긴 단백질의 세포외 도메인과의 마우스면역화를 통해 생성되었고 일현의 항체 클론은 본원에서 항-BsgA, 항-BsgB, 항-BsgC, 항-BsgD, 및 항-BsgE로서 정제되고 동정되었다. 항-BsgA 및 항-BsgB의 표적으로의 결합은 쥐 바시긴을 일시적으로 발현하는 HEK293 세포를 사용하는 유동 세포측정기에 의해 확인되었다 (도 4a). 이들 항체가 생체내 바시긴에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해, 야생형 마우스에 5 mg/kg의 항-BsgA 또는 항-BsgB을 정맥내 주사하였다. 용량 투여 후 1시간에 마우스 피질 조직의 면역조직화학적 염색은 항-BsgA 및 항-BsgB 둘다의 현저한 혈관 국소화를 밝혔고, 이는 항-TfRA과 함께 이전에 관찰된 것과 유사하다 (도 4b, 도 1e와 비교하여). 3개의 추가의 클론, 항-BsgC, 항-BsgD, 및 항-BsgE가 또한 시험되었고, 항-BsgA 및 항-BsgB과 유사한 결과를 나타내었다.
이들 항체가 미량 및 치료학적 용량 투여 패러다임 둘다를 시험함에 의해 뇌로 흡수될 수 있는지의 여부가 이어서 연구되었다. 단일 방사능표지 미량 용량의 I125-대조군 IgG, I125-항-BsgA, 또는 I125-항-BsgB는 야생형 마우스에 전신 투여하였다. I125-항-BsgA의 상당한 증가는 연구 지속 기간 동안 뇌에서 관찰되었고, I125-대조군 IgG와 비교하여 I125-항-BsgB에서 약간의 증가가 있었다(도 4c). 3개의 추가 클론, BsgC, BsgD, 및 BsgE은 또한 시험되었다. 미량의 용량 투여에 의한 유의적 뇌 흡수는 추가의 클론에 대해 관찰되지 않았다.
이어서, 20 mg/kg의 보다 치료학적으로 관련된 용량을 사용하여 바시긴 항체가 뇌에 충적될 수 있는지를 시험하였다. 야생형 마우스에 20 mg/kg의 대조군 IgG, 항-TfRA, 항-BsgA, 또는 항-BsgB를 정맥내 주사하고, 혈장 및 뇌 중 항체 농도는 용량 투여 후 1 및 24시간째에 결정하였다. 대조군 IgG와 비교하여, Bsg 항체 둘다의 뇌 농도는 양 시점에서 상당히 보다 높았다 (도 4d). 항-Bsg 클론의 뇌 흡수는 항-TfRA의 흡수와 비교하였다. 항-BsgB의 뇌 농도는 항-TfRA과 유사하였지만, 항-BsgA의 농도는 항-TfRA의 뇌 농도와 비교하여 용량 투여 24시간 후 상당히 높았다.
BBB를 거치는 뇌 실질로의 항-Bsg의 수송을 추가로 조사하기 위해, Bsg 및 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 절단 효소 베타-세크레타제 (BACE1) 둘다에 결합하는 이중특이적 항-Bsg/BACE1 항체를 제조하였다(문헌참조: Atwal 등, Sci Transl Med. 2011 May 25; 3(84): 84ra43). BACE1는 알츠하이머 질환 환자의 뇌에서 플라크에 발견되는 아밀로이드 베타 (Aβ) 형성의 1차 기여자인 것으로 고려된다 (문헌참조: Vassar 등, Science. 1999 Oct 22; 286(5440): 735-41). 항-TfR/BACE1을 사용한 출원인의 이전의 방법과 유사하게, 이중특이적 항- Bsg/BACE1은 뇌 실질로 BBB를 통과하는 항체의 약동력학적 판독을 가능하게 한다 (문헌참조: Yu 등 2011, 상기 ; Atwal 등 2011, 상기). 2가 (단일특이적) 항-Bsg 및 이중특이적 (1가 항-Bsg) 항-Bsg/BACE1 항체에 대한 친화성은 경쟁 ELISA에 의해 결정하였다. 모든 항체는 이중특이적 (1가) 포맷에서 바시긴 결합 친화성에서 감소를 보여주었다. 도 4f를 참조한다.
이들 이중특이적 항체의 뇌 흡수를 평가하기 위해, 야생형 마우스에 단일 50 mg/kg 용량의 대조군 IgG, 항-BsgA/BACE1, 또는 항-BsgB/BACE1을 정맥내 주사하였다. 용량 투여 후 24시간 째에, 대조군 IgG와 비교하여 항-BsgA/BACE1이 주사된 마우스의 뇌에서 상당한 항체 농도 증가가 있었다 (도 4g). 항-BsgA/BACE1의 뇌 농도에서 상기 증가는 뇌 Aβ 수준에서 약 23% 감소와 서로 관련되었다 (도 4h). 대조적으로, 항-BsgB/BACE1로 치료받은 마우스는 뇌에서 항체 농도의 증가를 보여주지 않았고 예상된 바와 같이 어떠한 Aβ 감소도 관찰되지 않았다. 항-BsgD/BACE1는 또한 상당한 흡수를 보여주었지만, BsgC /BACE1 및 BsgE/BACE1의 상당한 흡수는 관찰되지 않았다.
항-BsgA/BACE1 및 항-BsgB/BACE1은 유사한 1가 결합 친화성을 갖고, 2가 (단일특이적) Bsg 항체는 미량 및 치료학적 용량 투여 패러다임에서 뇌 흡수 정도에서 상이하였다 (도 4c 및 4d). 이들 항체는 경쟁 데이터를 기준으로 독특한 에피토프에 결합하고 이는 BBB에서Bsg 트래픽킹 및 수송에 역할을 수행하고 뇌 흡수에서의 관찰된 차이를 설명한다. 임의의 항체가 표적 독립적 조직 흡수에 기여할 수 있는 세포막으로의 비특이적결합을 보여주는지의 여부를 결정하기 위해, ELISA 검정을 사용하여 바쿨로바이러스 (BV) 입자로의 오프-표적 결합을 결정하였다(문헌참조: Hotzel 등, MAbs. 2012 Nov-Dec; 4(6): 753-60). 항-BsgB는 항-BsgC, 항-BsgD, 및 항-BsgE에서와 같이 정상 범위내 BV 스코어를 갖고, 항-BsgA는 높은 BV 입자 결합을 나타냈다. 추가로, 훨씬 신속한 제거는 항-BsgB와 비교하여 2가 및 이중특이적 항-BsgA 둘다에서 관찰되었다 (도 4e 및 4i).
F. Glut1에 대한 항체의 뇌 흡수
이 실시예는 1가 및 이중특이적 항체로서 BBB에서 항-Glut 항체 흡수의 특징 분석을 기재한다.
다중 통과 수용체가 RMT에 대해 통상적으로 고려되지는 않지만, BBB에서 글루코스 수송체 Glut1의 높은 집적 및 단백질 발현 둘다 (도 3b 및 3d 참조)는 잠재적 수송 표적으로서 상기 세포질 막 단백질의 평가를 이롭게 하였다. Glut1에 대한 단클론 항체는 hGlut1 cDNA와의 면역화를 통해 제조하였다. 양성 항원 결합은 쥐 Glut1을 일시적으로 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 유동 세포 측정에 의해 확인하였다(도 5a).
상기 항체가 생체내에서 Glut1에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해, 야생형 마우스에 5 mg/kg의 항-Glut1을 정맥내 주사하였다. 용량 투여 1시간 후 마우스 피질 조직의 면역조직학적 염색은 항-Glut1의 혈관 국소화를 밝혔다(도 5b).
항-Glut1이 미량 및 치료학적 용량 투여 패러다임 둘다에서 뇌에서 흡수될 수 있는지를 조사하였다. 단일 방사능표지된 미량 용량의 I125-대조군 IgG 또는 I125-항-Glut1은 야생형 마우스로 정맥내 주사하였다. I125-항-Glut1의 상당한 증가는 용량 투여 후 모든 시점에서 I125-대조군 IgG와 비교하여 뇌에서 관찰하였다 (도 5c). I125-항-Glut1의 뇌 농도는 미량의 용량 투여 연구에서 시간 경과에 따라 일정하게 증가하는 것으로 나타났기 때문에, 용량 투여 2일 및 4일 시점을 포함하도록 치료학적 용량 투여 연구의 시간 과정을 연장하기로 결정하였다. 20 mg/kg으로 용량 투여되는 경우, 항-Glut1의 뇌 농도는 용량 투여 1일 및 2일째에 항-TfRA에 상응하였지만, 용량 투여 4일째에 보다 높은 뇌 농도에 도달하였다(도 5d). 20mg/kg 용량의 항-Glut1을 사용하는 유사한 실험에서, 항-Glut1의 뇌 농도는 대조군 IgG 보다 약 1.5-3배 높았고 2개의 시점에서 항-TfRA에 상응하였다(도 5k 및 도 5l).
2개의 미량 및 치료학적 용량 투여 패러다임 둘다에서, 명백한 차이는 항-TfRA과 비교하여 뇌에서 항-Glut1 흡수의 약리역학에서 관찰되었다. 반면에, 항-TfRA의 농도는 수시간 (미량 용량 투여, 도 1c 및 도 2c 참조) 또는 용량 투여 후 약 1일 (치료학적 용량)에 피크에 도달하였고, 항-Glut1의 농도는 시간 경과에 따라 증가하였다(도 5c 및 5d). 이것은 적어도 부분적으로 항-TfRA과 비교하여 말초에서 항-Glut1의 보다 느린 제거율에 기인할 수 있고(도 5e), 이는 말초 조직과 비교하여 BBB에서 Glut1 발현의 집적과 일치한다(도 3c). 이들 데이터는 종합적으로 전신 주사 후 항-Glut1의 상당한 뇌 흡수가 있을뿐만아니라 또한 목적하는 약력학적 성질을 가짐을 시사한다.
항-Glut1이 BBB를 거쳐 뇌 유조직으로 수송되는지의 여부를 결정하기 위해, 이중특이적 항-Glut1/BACE1 항체를 제조하였다. Glut1 결합 친화성은 유동 세포측정에 의해 평가된 바와 같이 1가/이중특이적 항-Glut1/BACE1 항체에서 상당히 감소하였다 (도 5f). 1가 항-Glut1은 대조군 IgG의 것과 유사한 말초 약제역학을 보여주기 때문에 (도 5e), 이중특이적 항체와 함께 보다 광범위한 PK/PD 연구를 수행하였다.
야생형 마우스에 단일 50 mg/kg 용량의 대조군 IgG 또는 항-Glut1/BACE1을 정맥내 주사하였고 항체의 뇌 및 혈장 농도는 용량 투여 1, 2, 4 및 7일째에 결정하였다. 항-Glut1/BACE1은 2가 항체를 사용하여 관찰된 것과 유사하게, 대조군 IgG와 비교하여 상응하는 약리역학을 보여주었다(도 5g). 항-Glut1/BACE1의 뇌 흡수에서 약간의 증가는 용량 투여 후 모든 시점에서 관찰되었다 (도 5h).
뇌에서 제한된 항체 축적 정도와 일관되게, 아베타의 소량 감소가 관찰되었다 (도 5i). 항-BACE1 아암의 완전한 기능은 혈장 아베타의 상당한 감소에 의해 확인되었다 (도 5j). 종합적으로 이들 데이터는 2가 항-Glut1이 BBB를 통과하고 뇌에서 상당히 축적될 수 있다는 증거를 제공한다.
G. CD98hc에 대한 항체의 뇌 흡수
이 실시예는 2가 (다일특이적)로서 및 이중특이적 항체로서 BBB에서 항-CD98hc 항체 흡수의 특징 분석을 기재한다.
단백체 데이터세트로부터 최고 단일 통과 막관통 단백질 히트 중 하나는 용질 캐리어 CD98hc였다. BBB에서 CD98hc의 높은 발현이 큰 분자를 수송할 수 있는지를 결정하기 위해, 2개의 CD98hc 항체 (항-CD98hcA 및 항-CD98hcB)를 제조하였다.
쥐 CD98hc를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 사용한 유동 세포측정 분석은 2개의 항체가 쥐 CD98hc에 결합되어 있음을 확인시켰다(도 6a). 항-CD98hcA 및 항-CD98hcB 둘다의 5mg/kg 정맥내 주사는 마우스의 뇌 조직에서 현저한 혈관 염색을 유도하였다(도 6b). CD98hc 항체의 결합 친화성은 도 9에 나타낸다.
이어서 이들 항체가 뇌로 흡수될 수 있는지를 연구하였다. 단일 방사능표지 미량 용량의 I125-대조군 IgG, I125-항-TfRA, I125-항-CD98hcA, 또는 I125-항-CD98hcB은 야생형 마우스에 정맥내 주사하였다. 확실히 보다 높은 뇌 수준은 대조군 IgG 및 I125-항-TfRA와 비교하여 I125-항-CD98hcA 및 I125-항-CD98hcB 둘다에 대해 관찰되었다 (도 6c). 현저하게, 미량 용량의 I125-항-CD98hc에서 뇌 흡수 정도는 피크 농도에서 I125-항-TfRA 보다 약 4 내지 5배 높았다. 20 mg/kg의 치료학적 용량으로 투여되는 경우, 상당한 뇌 흡수가 또한 용량 투여후 24시간 째에 항-TfRA을 사용하여 관찰된 것에 상응하게 항-CD98hcA 및 항-CD98hcB 둘다에 대해 관찰되었다(도 6d).
항체의 혈장 농도는 용량 투여 후 24시간 째에 항-CD98hcA의 증진된 제거 및 항-CD98hcB의 약간의 제거를 보여주었다(도 6e). 표적 독립적 제거는 바쿨로바이러스 입자 결합에 의해 평가된 바와 같이 보다 신속한 제거에 기여하는 것처럼 보이지 않고 대신 말초 세포상의 CD98hc의 발현 때문일 가능성이 높다 (문헌참조: Parmacek 등, Nucleic Acids Res. 1989 Mar 11; 17(5): 1915-31; Nakamura 등, J Biol Chem. 1999 Jan 29; 274(5): 3009-16).
3개의 RMT 후보물 (CD98hc, Glut1 및 Bsg) 중, CD98hc 항체의 전신 주사는 최고 뇌 농도를 밝혔다. 항-CD98hcA 및 항-CD98hcB의 뇌 농도는 용량 투여 후 24시간째에 대조군 IgG의 것 보다 약 9 및 약 11배 초과였다(도 6d 및 6l). 추가로, 24시간째에, 항-CD98hcA의 뇌 수준은 항-TfRA의 것 보다 매우 높았다. 모든 3개의 RMT 후보물은 미량 및 치료학적 용량 투여에 의해 뇌 흡수를 보여주었지만, 이들 생체내 연구는 미량 및 치료학적 용량 투여 패러다임 둘다에서 성취된 보다 높은 뇌 농도를 기준으로 Bsg 및 Glut1에 비해 CD98hc가 가장 강력한 RMT 후보물임을 밝힌다.
용량 투여된 항체가 확실히 BBB를 통과하고 유조직을 침투하는지를 추가로 확인하기 위해, 뇌 파쇄물의 미세혈관 고갈 후 유조직 분획물 중 항체의 양은 ELISA에 의해 평가하였다. 용량 투여된 항체는 대조군 항체에 비해 모든 3개의 표적에 대해서 명백하게 검출되었고 이는 유조직 단리물에 결합된 BBB를 거쳐 항체가 상당히 통과함을 시사한다(도 8). 미량 및 치료학적 용량 투여 연구와 일치하여, 유조직 분획에서 항-CD98hc 항체는 최고 뇌 농도를 보여주었다(도 8). 항-Glut1의 최소 흡수는 뇌 내피 세포에서 Glut1(Slc2a1)의 특정 발현 결과일 수 있다. 미세아교세포 및 성상세포에서 또한 발현되는 CD98hc (Slc3a2)와 같지 않게, 미세혈관을 고갈시키는 프로토콜은 어떠한 항원이 발현되지 않는 유조적 분획 중 나머지 항체의 정확한 정량을 허용하지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, CD98hc에 대한 항체는 뇌에서 가장 강력한 흡수를 보여주는 다수의 증거 결과로서 이중특이적 항체로서 추가의 생체내 확증을 위해 선택되었다.
H. 이중특이적 항- CD98hc / BACE1 항체의 생성
이 실시예는 CD98hc 및 BACE1에 결합하는 이중특이적 항체의 생성 및 특징 분석을 기재한다.
항-CD98hc가 BBB를 거쳐 뇌 유조직으로 수송되는지를 결정하기 위해, 2개의 이중특이적 항-CD98hc/BACE1 항체를 제조하였다. 이중특이적 항체는 하나의 아암 상에 CD98hc에 결합하고 다른 아암 상에 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 절단 효소 β-세크레타제 (BACE1)에 결합한다. BACE1는 알츠하이머 질환 환자 중 플라크에서 발견되는 뇌 β-아밀로이드 (Aβ)의 1차 생성자인 것으로 고려되는 효소이다. BACE1에 대한 항체는 효소적 활성을 억제하여 Aβ 생성을 감소시키도록 디자인되었다(문헌참조: Atwal 등, 2011). 그러나, 이 항체는 불량한 BBB 침투를 갖고 따라서 매우 높은 농도로 투여되거나 이중특이적 항체로서 항-TfR와 쌍을 이루지 못하는 경우 뇌 Aβ를 감소시키는데 비효과적이다. 항-CD98hcA 및 항-CD98hcB 둘다는 이중특이적 항체로서 재포맷팅하여 뇌 Aβ 수준의 측정을 통해 BBB의 전역에 걸쳐 유조직으로의 CD98hc 매개된 수송의 결과로서 뇌에서 항체 축적의 약동력학적 측정을 가능하게 한다. 2가 항-CD98hc 및 이중특이적 항-CD98hc/BACE1 항체에 대한 친화성은 경쟁ELISA에 의해 결정되었다. 항-CD98hcA 결합 친화성에서의 약간의 손실은 1가 (즉, 이중특이적) 포맷에서 관찰되었고, 친화성의 보다 상당한 변화는 항-CD98hcB에 대해서 관찰되었다 (도 6f). 항-CD98hcA의 친화성은 약 2배 감소하지만, 항-CD98hcB의 친화성은 약 100배 감소하였고, 이는 결합 활성이 특정 항체의 2가 결합에 중요한 역할을 수행함을 지적한다. 방사능표지 미량의 용량 투여는 대조군 IgG 및 항-TfRA/BACE1 둘다와 비교하여 항-CD98hcA/BACE1의 용량 투여 1시간째에 상당히 보다 높은 피크 뇌 흡수를 밝혔다 (도 6k, P< 0.0001). 보다 낮은 친화성의 항-CD98hcB/BACE1는 대조군 IgG와 비교하여 증가된 뇌 흡수로 나타냈지만 항-CD98hcA/BACE1의 것 미만이고, 이는 이중특이적 항체로서 CD98hc에 대한 결합 친화성이 상당히 감소하였기 때문일 수 있다. 항-CD98hc/BACE1 뇌 흡수 및 약동력학적 반응의 정도 및 지속성을 결정하기 위해, 대조군 IgG 또는 항-CD98hc/BACE1의 단일 50mg/kg의 정맥내 주사는 야생형 마우스에 적용하였다. 표적 매개된 제거의 결과로서, 보다 높은 친화성의 항-CD98hcA/BACE1의 약리역학은 혈장에서 보다 낮은 친화성의 항-CD98B/BACE1과 비교하여 보다 신속하였다 (도 6g 및 도 6o).
뇌에서, 용량 투여 후 1, 2, 및 4일째에 대조군 IgG와 비교하여 CD98hc/BACE1 항체 둘다의 흡수에서 상당한 증가가 있었다 (도 6h 및 도 6p). 용량 투여 후 7일째에, 보다 낮은 친화성의 항-CD98hcB/BACE1의 뇌 농도는 상승된 채로 유지되는 반면, 보다 높은 친화성 항-CD98hcA/BACE1의 뇌 농도는 대조군 IgG와 상응하였고, 추측컨대 이는 말초에서 노출 상실로인 것일 수 있다. 이를 종합해 보면, 보다 낮은 친화성의 항-CD98hcB/BACE1은 보다 높은 친화성의 항-CD98hcA/BACE1과 비교하여 시간 경과에 따라 우수한 말초 및 뇌 노출을 생성하였다 (도 6g 및 6h). 흥미롭게도, 항체 친화성과 뇌 노출의 지속성 간의 상기 역 관계는 또한 이전에 항-TfR/BACE1 항체에 대해 관찰되었다 (Couch 등, 2013, 상기 참조). CD98hc/BACE1 이중특이적 항체는 용량 투여 후 1일째에 뇌 Aβ 수준을 상당히 감소시켰고, 이는 항-CD98hcB/BACE1 치료와 함께 용량 투여 후 4일째에 감소된 채로 유지되었고 (도 6i), 이는 이들 항체의 뇌 유조직으로의 성공적인 수송을 지적하였다(또한 도 6m 및 도 6n 참조). 유지된 혈장 Aβ는 모든 시점에서 상당히 감소하였다(도 6j). 이들 데이터를 종합하면 BBB를 거치는 항체의 치료제의 뇌 흡수에 대한 신규RMT로서 CD98hc에 대한 강력한 증거를 제공한다.
생체내 2-광자 현미경을 또한 수행하여 실시간으로 치료학적으로 투여받은 마우스의 유조직 및 피질 하부 혈관 형성내 형광 표지된 CD98hc/BACE1 이중특이적 변이체의 트래픽킹을 실시간으로 가시화하였다. 대조군 IgG 및 항-CD98hcB/BACE1을 투여받은 마우스와 비교하여, 항-CD98hcA/BACE1의 혈관 제거에서의 명백한 차이는 보다 높은 친화성 변이체의 보다 신속한 혈장 약리역학에 의해 예측된 바와 같이 검출되었다. 또한, 형광 표지된 항-CD98hcB/BACE1을 투여받은 마우스의 유조직 내 48시간까지 보다 큰 확산 신호가 관찰되었고 보다 드문 정도로 항-CD98hcA/BACE1가 관찰되었고, 이는 BBB를 통한 항체의 증진된 통과를 지적한다.
I. 항체 치료는 내인성 CD98hc 발현 및 기능을 변화시키지 않는다
이 실시예는 CD98hc가 CD98hc 생물학을 교란시키는 것 없이 BBB를 거쳐 항체 치료제를 전달할 수 있는 신규한 고능력의 RMT 경로임을 입증한다.
1차 마우스 뇌 내피 세포에 대한 면역조직화학은 대다수의 CD98hc가 카베올린1- 및 EEA1-양성 반점과 함께 일부 동시 국소화로 세포질 막으로 국소화됨을 밝혔다 (도 10). 매우 적은 반점은 재순환 엔도좀의 마커인 TfR과함께 동시 국소화된다. TfR에 대한 항체가 친화성 의존 방식으로 TfR의 리소좀 분해를 구동하여 시험관내 및 생체내 둘다에서 감소된 TfR 수준을 유도하는 것으로 이전에 관찰되었다. 따라서, CD98hc의 내인성 수준은 대조군 항체 또는 항- CD98hc 이중특이적 변이체로 치료된 IMCD3 세포(균일한 CD98hc 발현 수준을 갖는 장벽 형성 마우스 신장 상피세포)에서 조사되었다. 증가하는 농도의 항-CD98hc 이중특이적 항체와의 배양은 CD98hc의 발현 수준 또는 안정성을 변화시키지 않았다 (도 7a 및 7b). 추가로, 또한 항체 치료가 CD98hc의 세포내 국소화에서 변화를 유도하는지가 조사되었다. 웨스턴 블롯 결과와 일치하여, 대다수의 CD98hc가 세포질 막 상에 잔류하였고 CD98hc의 Lamp1-양성 리소좀으로의 증가된 트래픽킹은 관찰되지 않았다 (도 7c 및 7d). 더욱이, CD98hc 이중특이적 친화성 변이체는 1일 내지 7일의 50 mg/kg의 항-CD98hc/BACE1을 투여받았던 마우스 기원의 뇌 용해물에서 총 뇌 CD98hc 발현에 영향을 주지 않았다 (도 7e-7i).
항-CD98hc 항체의 존재 또는 부재하에 CD98hc 아미노산 수송 수준을 또한 평가하였다. 양성 대조군으로서, 시스템-L-특이적 기질 BCH (2-아미노-2-노르보난-카복실산)에 의한 수송 억제가 관찰되었다. 항-CD98hc 항체 치료를 사용하여 어떠한 억제도 관찰되지 않았다 (도 7j). 이를 종합해 보면, 이들 데이터는 CD98hc가 CD98hc 생물학적 기능을 교란시키는 것 없이 BBB를 거친 항체 치료제를 전달할 수 있는 신규한 고능력의 RMT 경로임을 지적한다. 혈장 Aβ는 모든 시점에서 상당히 감소된 채로 유지되었다(도 7j).
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하기의 표는 본원에 언급된 서열을 제공한다.
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이전의 발명은 설명 및 이해를 명백히 하기 위해 일부 상세하게 기재되었지만 하기 기재사항 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 기재 내용은 이들의 전문이 명백하게 참조로 인용된다.
<110> GENENTECH, INC., ET AL. <120> BLOOD BRAIN BARRIER RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P32473-WO <150> 62/251,983 <151> 2015-11-06 <150> 62/090,295 <151> 2014-12-10 <160> 114 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Pro Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Glu Val Gln Leu Val 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Synthetic peptide" <400> 77 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser 20 25 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 79 Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu Lys 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 81 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 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tcattcttgg ctgagtggca aaatatcacc aagggcttca 960 gtgaagacag gctcttgatt gcggggacta actcctccga ccttcagcag atcctgagcc 1020 tactcgaatc caacaaagac ttgctgttga ctagctcata cctgtctgat tctggttcta 1080 ctggggagca tacaaaatcc ctagtcacac agtatttgaa tgccactggc aatcgctggt 1140 gcagctggag tttgtctcag gcaaggctcc tgacttcctt cttgccggct caacttctcc 1200 gactctacca gctgatgctc ttcaccctgc cagggacccc tgttttcagc tacggggatg 1260 agattggcct ggatgcagct gcccttcctg gacagcctat ggaggctcca gtcatgctgt 1320 gggatgagtc cagcttccct gacatcccag gggctgtaag tgccaacatg actgtgaagg 1380 gccagagtga agaccctggc tccctccttt ccttgttccg gcggctgagt gaccagcgga 1440 gtaaggagcg ctccctactg catggggact tccacgcgtt ctccgctggg cctggactct 1500 tctcctatat ccgccactgg gaccagaatg agcgttttct ggtagtgctt aactttgggg 1560 atgtgggcct ctcggctgga ctgcaggcct ccgacctgcc tgccagcgcc agcctgccag 1620 ccaaggctga cctcctgctc agcacccagc caggccgtga ggagggctcc cctcttgagc 1680 tggaacgcct gaaactggag cctcacgaag ggctgctgct ccgcttcccc tacgcggcct 1740 gacttcagcc tgacatggac 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aataaacatt ttttgtatga ag 2572 <210> 109 <211> 529 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 109 Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu Val Glu Leu Asn Glu 1 5 10 15 Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala Ser Gly Ala Ala Met 20 25 30 Ala Val Val Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Lys Val Ala 35 40 45 Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser 50 55 60 Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr 65 70 75 80 Arg Trp Val Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu 85 90 95 Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu 100 105 110 Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp 115 120 125 Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ser Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys 130 135 140 Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu 145 150 155 160 Gly Pro Leu His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu 165 170 175 Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu Asp Phe Asp Asn Leu 180 185 190 Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr 195 200 205 Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Leu Trp Phe Ser Thr Gln Val Asp Ser 210 215 220 Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly 225 230 235 240 Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser 245 250 255 Ser Phe Leu Ala Glu Trp Glu Asn Ile Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp 260 265 270 Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Val 275 280 285 Ser Pro Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu 290 295 300 Ser Asp Ser Ser Phe Thr Gly Glu His Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln 305 310 315 320 Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln 325 330 335 Ala Gly Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr 340 345 350 Gln Leu Met Leu Ser Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly 355 360 365 Asp Glu Ile Gly Leu Lys Ala Ala Ala Leu Pro Gly Gln Pro Val Glu 370 375 380 Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly 385 390 395 400 Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly 405 410 415 Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Gln Leu Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu 420 425 430 Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Thr Phe Ser Ser Gly Pro Gly 435 440 445 Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val 450 455 460 Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser 465 470 475 480 Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Thr Lys Ala Asp Pro Val Leu 485 490 495 Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro Leu Glu Leu Glu Arg 500 505 510 Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu Arg Phe Pro Tyr Val 515 520 525 Ala <210> 110 <211> 1922 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 110 agatgcagta gccgaagctg cgcggaggca cacaggccgg gagaccgttc tgggtccgag 60 ggtccgggca ggggttgagc caccatctga cctcaagctt cgtcgtgtcg ccggttctgc 120 aggcaccatg agccaggaca ccgaggtgga tatgaaggag gtggagctga atgagttaga 180 acccgagaag cagccgatga acgcggcgtc tggggctgcc atggccgtgg tgggagccga 240 gaagaatggt ctggtgaaga tcaaggtggc ggaagacgag gcggaggcag cagccgccgc 300 taagttcacg ggcctgtcca aggaggagct gctgaaggtg gcgggcagtc ccggctgggt 360 acgtacccgc tgggtgctgc tgctgctctt ctggctcggc tggcttggca tgctggcggg 420 tgccgtggtc ataatcgtgc gggcgccgcg ctgtcgcgag ctgccggcgc agaagtggtg 480 gcacacgggc gccctctacc gcatcggcga ccttcaggcc ttccagggcc acggctcggg 540 caacttggcg ggtctgaagg ggcgtctcga ttacctgagc tctctgaagg tgaagggcct 600 tgtgctgggc ccacttcaca agaaccagaa ggacgatgtc gctcagaccg acttgctgca 660 gatcgacccc aattttggct ccaaggaaga ttttgacaat ctcttgcaat cggctaaaaa 720 aaagagcatc cgtgtcattc tggacctcac tcccaactac cggggtgaga acttgtggtt 780 ctccacccag gttgacagtg tggccaccaa ggtgaaggat gctctggagt tttggctgca 840 agctggcgtg gatgggttcc aggttcggga catagagaat ctgaaggatg catcctcatt 900 cttggctgag tgggaaaaca tcaccaaggg cttcagtgaa gataggctct tgattgcagg 960 gactaactcc tccgaccttc agcagatcgt gagcccactc gaatccaaca aagacttgct 1020 gttgaccagc tcatacctgt ctgattccag ctttactggg gagcatacaa aatccctagt 1080 cacacagtat ttgaatgcca ctggcaatcg ctggtgcagc tggagtttgt ctcaggcagg 1140 gctcctgact tccttcttgc cggctcaact tctccgactc taccagctga tgctctccac 1200 cctgccaggg acccctgtgt tcagctacgg ggatgagatt ggcctgaagg cagctgccct 1260 tcctggacag cctgtggagg ctccagtcat gctgtgggat gagtccagct tccctgacat 1320 cccaggggct gtaagtgcca acatgactgt gaagggccag agtgaagacc ctggctccct 1380 cctttccttg ttccggcagc tgagtgacca gcggagtaag gagcgctccc tattgcatgg 1440 ggacttccat acgttctcct ctgggcctgg actcttctcc tatatccgcc actgggacca 1500 gaatgagcgt tttctggtag tgcttaactt tggggatgtg ggcctctcgg ctgggctgca 1560 ggcctccgac ctgcccgcca gcgccagcct gccaaccaag gctgaccctg tgctcagcac 1620 ccagccaggc cgtgaggagg gctccccgct tgagctggaa cgcctgaaac tggagcctca 1680 cgaagggctg ctgctccgct tcccctatgt ggcctgaccc cagcctgacg tggacccact 1740 gccctccttt ccttcctaga ccctttgggt tctggttttt ctctttttcc ccctttttta 1800 aaaaacaaca acaaaacggt tgcagattat aaatgaaccc ccaaataggg tgttttctgc 1860 cttcaaataa aagtcacccc tgcctggtga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aa 1922 <210> 111 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45 Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60 Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80 Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95 Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 100 105 110 Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val 115 120 125 Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp 130 135 140 Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 145 150 155 160 Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175 Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp 180 185 190 Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro 195 200 205 Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln 210 215 220 Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile 225 230 235 240 Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg 245 250 255 Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln 260 265 270 Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val 275 280 285 Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala 290 295 300 Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp 305 310 315 320 Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr 325 330 335 Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val 340 345 350 Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg 355 360 365 Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380 Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala 405 410 415 Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu 420 425 430 Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro 435 440 445 Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala 450 455 460 Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp 465 470 475 480 Cys Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp 485 490 495 Ile Ser Leu Leu Lys 500 <210> 112 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr 1 5 10 15 His Gly Ala Ser Gly Ala Ala Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp 20 25 30 Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr 35 40 45 Glu Val Thr Gly His Arg Trp Leu Lys Gly Gly Val Val Leu Lys Glu 50 55 60 Asp Ala Leu Pro Gly Gln Lys Thr Glu Phe Lys Val Asp Ser Asp Asp 65 70 75 80 Gln Trp Gly Glu Tyr Ser Cys Val Phe Leu Pro Glu Pro Met Gly Thr 85 90 95 Ala Asn Ile Gln Leu His Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser 100 105 110 Ser Glu His Ile Asn Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser 115 120 125 Glu Ser Val Pro Pro Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp 130 135 140 Ser Glu Asp Lys Ala Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val 145 150 155 160 Ser Ser Ser Gln Gly Arg Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met 165 170 175 Glu Ala Asp Pro Gly Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly 180 185 190 Ser Asp Gln Ala Ile Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser Val Leu Val Leu 195 200 205 Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val 210 215 220 Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln 225 230 235 240 His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser 245 250 255 <210> 113 <211> 454 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Met Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ala Phe Thr Leu Leu Ser Gly 1 5 10 15 Gln Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ile Gln Thr Ser Val Gln Glu 20 25 30 Val Asn Ser Lys Thr Gln Leu Thr Cys Ser Leu Asn Ser Ser Gly Val 35 40 45 Asp Ile Val Gly His Arg Trp Met Arg Gly Gly Lys Val Leu Gln Glu 50 55 60 Asp Thr Leu Pro Asp Leu His Thr Lys Tyr Ile Val Asp Ala Asp Asp 65 70 75 80 Arg Ser Gly Glu Tyr Ser Cys Ile Phe Leu Pro Glu Pro Val Gly Arg 85 90 95 Ser Glu Ile Asn Val Glu Gly Pro Pro Arg Ile Lys Val Gly Lys Lys 100 105 110 Ser Glu His Ser Ser Glu Gly Glu Leu Ala Lys Leu Val Cys Lys Ser 115 120 125 Asp Ala Ser Tyr Pro Pro Ile Thr Asp Trp Phe Trp Phe Lys Thr Ser 130 135 140 Asp Thr Gly Glu Glu Glu Ala Ile Thr Asn Ser Thr Glu Ala Asn Gly 145 150 155 160 Lys Tyr Val Val Val Ser Thr Pro Glu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser 165 170 175 Asn Leu Asp Val Asn Val Asp Pro Gly Thr Tyr Val Cys Asn Ala Thr 180 185 190 Asn Ala Gln Gly Thr Thr Arg Glu Thr Ile Ser Leu Arg Val Arg Ser 195 200 205 Arg Gly Asn Ser Arg Ala Gln Val Thr Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg 210 215 220 Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp 245 250 255 Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn 275 280 285 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys 355 360 365 Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile 370 375 380 Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn 385 390 395 400 Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys 420 425 430 Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe 435 440 445 Ser Arg Thr Pro Gly Lys 450 <210> 114 <211> 492 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val 20 25 30 Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp 35 40 45 Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met 85 90 95 Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe 100 105 110 Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile 115 120 125 Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val 130 135 140 Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His 145 150 155 160 Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu 165 170 175 Asp Ser Ile Met Gly Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Ile 180 185 190 Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Val Leu Pro Phe Cys Pro 195 200 205 Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala 210 215 220 Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr His Asp 225 230 235 240 Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys 245 250 255 Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile 260 265 270 Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn 275 280 285 Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln 290 295 300 Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe 305 310 315 320 Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu 325 330 335 His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr 340 345 350 Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser 355 360 365 Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly 370 375 380 Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg 385 390 395 400 Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe 405 410 415 Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr 420 425 430 Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr 435 440 445 Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala 450 455 460 Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu 465 470 475 480 Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val 485 490

Claims (122)

  1. 혈뇌 장벽을 거쳐 제제를 수송하는 방법으로서, 상기 방법은 (i) 혈뇌 장벽 수용체(BBB-R)에 결합하고; (ii) 상기 제제와 커플링된 항체에 상기 혈뇌 장벽을 노출시킴을 포함하고; 여기서:
    항체는 상기 BBB-R에 결합 즉시 여기에 커플링된 상기 제제를 혈뇌 장벽을 걸쳐 수송하고;
    상기 BBB-R은 CD98 중쇄 (CD98hc), 바시긴, 및 글루코스 수송체 1형 (Glut1)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 구성원인, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 혈뇌 장벽이 포유동물에 있는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 포유동물은 신경학적 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
  4. 포유동물에서 신경학적 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 (i) CD98hc, 바시긴(basigin), 및 Glut1으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 BBB-R에 결합하고; (ii) 상기 신경학적 질환 또는 장애를 치료하기에 효과적인 치료제에 커플링된 항체를 포유동물에게 투여함을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 신경학적 질환 또는 장애가 알츠하이머 질환 (AD), 뇌졸중, 치매, 근위축증 (MD), 다발성 경화증 (MS), 근위축성측색경화증 (ALS), 낭성 섬유증, 앙겔만(Angelman) 증후군, 리들(Liddle) 증후군, 파킨슨 질환, 픽 질환, 파젯 질환, 암 및 외상 뇌 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  6. 청구항 2 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제제가 조영제인, 방법.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제제가 신경학적 장애 약물인, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체의 상기 BBB-R로의 결합이 상기 BBB-R의 이의 고유 리간드의 하나 이상으로의 결합을 손상시키지 않는 방법.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체의 존재하에 상기 BBB-R의 이의 고유 리간드의 하나 이상으로의 결합이 상기 항체의 부재하에 결합량의 적어도 80%인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체의 상기 BBB-R로의 결합이 상기 BBB-R의 하나 이상의 고유 리간드의 상기 혈뇌 장벽에 걸친 수송을 손상시키지 않는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 BBB-R의 하나 이상의 고유 리간드의 혈뇌 장벽에 걸친 수송이 항체의 부재하의 수송량의 적어도 80%인, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 낮은 결합 친화성을 갖도록 가공된, 방법.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 세포 증식 및/또는 세포 분열 및/또는 세포 접착을 억제하지 않는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 세포사를 유도하지 않는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 100 μM의 IC50을 갖는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 IC50가 약 1 nM 내지 약 10 nM인, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 IC50가 약 5 nM 내지 약 100 μM인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 IC50이 약 50 nM 내지 약 100 μM인, 방법.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 IC50이 약 100 nM 내지 약 100 μM인, 방법.
  21. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 상기 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 10 μM의 친화성을 갖는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 항체가 상기 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 1 μM의 친화성을 갖는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 항체가 상기 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 500 nM의 친화성을 갖는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 항체가 상기 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 50 nM의 친화성을 갖는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 상기 BBB-R에 대해 약 1 nM 내지 약 100 μM의 친화성을 갖는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 치료학적 용량으로 상기 포유동물에게 투여되는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 치료학적 용량이 BBB-R-포화인, 방법.
  28. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다중 특이적이고, 여기에 커플링된 상기 제제가 뇌 항원에 결합하는 다중 특이적 항체의 항원-결합 부위를 포함하는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 이중특이적인, 방법.
  30. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 뇌 항원이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법: 베타-세크레타제 1 (BACE1), 아베타, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 상피성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지질단백질 (예를 들어, 아포지질단백질 E4 (ApoE4)), 알파-시누클레인, CD20, 훈틴그틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), 및 카스파제 6.
  31. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 CD98hc 및 BACEI 둘다에 결합하는, 방법.
  32. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 CD98hc 및 아베타 둘다에 결합하는, 방법.
  33. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 바시긴 및 BACEI 둘다에 결합하는, 방법.
  34. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 바시긴 및 아베타 둘다에 결합하는, 방법.
  35. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 Glut1 및 BACEI 둘다에 결합하는, 방법.
  36. 청구항 28 또는 29에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 Glut1 및 아베타 둘다에 결합하는, 방법.
  37. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 BBB-R이 CD98hc인, 방법.
  38. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 BBB-R이 바시긴인, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 6, 7, 및 8 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정영역(CDR) 1, 2 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 3, 4, 및 5 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 9의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 10의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 11의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 12의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  41. 청구항 39 또는 40에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 13의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 14의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 15의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 16의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  42. 청구항 38 내지 41 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH) 서열; (b) 서열번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) 서열; 또는 (c) (a)서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  43. 청구항 38 내지 42 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 2의 VH 서열 및 서열번호: 1의 VL 서열을 포함하는, 항체.
  44. 청구항 38에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 22, 23, 및 24 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 19, 20, 및 21 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 25의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 26의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 27의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 28의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  46. 청구항 44 또는 45에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 29의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 30의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 31의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 32의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  47. 청구항 38 및 44 내지 46 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법: (a) 서열번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 항체가 하기 서열번호: 18의 VH 서열 및 서열번호: 17의 VL 서열을 포함하는. 항체.
  49. 청구항 38에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 38, 39, 및 40 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 35, 36, 및 37 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 41의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 42의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 43의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 44의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  51. 청구항 49 또는 50에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는, 방법: (a) 서열번호: 45의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열; (b) 서열번호: 46의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열; (c) 서열번호: 47의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는 (d) 서열번호: 48의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  52. 청구항 38 및 49 내지 51 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열번호: 33의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  53. 청구항 38 및 49 내지 51 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 34의 VH 서열 및 서열번호: 33의 VL 서열을 포함하는, 항체.
  54. 청구항 38에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 54, 55, 및 56 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 51, 52, 및 53 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는, 방법: (a) 서열번호: 57의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열; (b) 서열번호: 58의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열; (c) 서열번호: 59의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는 (d) 서열번호: 60의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  56. 청구항 54 또는 55에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는 방법:
    (a) 서열번호: 61의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 62의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 63의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 64의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  57. 청구항 38 및 54 내지 56 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 (b)에서와 같은 VL 서열.
  58. 청구항 38 및 54 내지 57 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 50의 VH 서열 및 서열번호: 49의 VL 서열을 포함하는 항체.
  59. 청구항 38에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 70, 71, 및 72 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열, 및/또는
    (b) 서열번호: 67, 68, 및 69 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 73의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 74의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 75의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 76의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  61. 청구항 59 또는 60에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 77의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 78의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 79의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 80의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  62. 청구항 38 및 59 내지 61 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  63. 청구항 38 및 59 내지 61 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 66의 VH 서열 및 서열번호: 65의 VL 서열을 포함하는, 항체.
  64. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 BBB-R이 Glut1인, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 86, 87 및 88 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 83, 84 및 85 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  66. 청구항 64 또는 65에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 89의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 90의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 91의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 92의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  67. 청구항 64 내지 66 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 93의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 94의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 95의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 96의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  68. 청구항 64 내지 67 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 서열번호: 82의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 81의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  69. 서열번호: 64 내지 67 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 82의 VH 서열 및 서열번호: 81의 VL 서열을 포함하는 항체.
  70. 바시긴에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 서열번호: 6, 7, 및 8 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정영역(CDR) 1, 2 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 3, 4, 및 5 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  71. 청구항 70에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 9의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 10의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 11의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및
    (d) 서열번호: 12의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  72. 청구항 70 또는 71에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 13의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 14의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 15의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및
    (d) 서열번호: 16의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  73. 청구항 70 내지 72 중 어느 한 청구항에 있어서, 다음을 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열 또는 (c) (a)서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  74. 청구항 70 내지 73 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 2의 VH 서열 및 서열번호: 1의 VL 서열을 포함하는, 항체.
  75. 바시긴에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 서열번호: 22, 23, 및 24 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 19, 20, 및 21 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  76. 청구항 75에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 25의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 26의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 27의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및
    (d) 서열번호: 28의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  77. 청구항 75 또는 76에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 29의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 30의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 31의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및
    (d) 서열번호: 32의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  78. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 청구항에 있어서, 다음을 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  79. 청구항 75 내지 77 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 18의 VH 서열 및 서열번호: 17의 VL 서열을 포함하는. 항체.
  80. 바시긴에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 서열번호: 38, 39, 및 40 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 35, 36, 및 37 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  81. 청구항 80에 있어서, 상기 항체가 다음을 추가로 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 41의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 42의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 43의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 44의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  82. 청구항 80 또는 81에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 45의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 46의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 47의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 48의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  83. 청구항 80 내지 82 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열번호: 33의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  84. 청구항 80 내지 82 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 34의 VH 서열 및 서열번호: 33의 VL 서열을 포함하는, 항체.
  85. 바시긴에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 서열번호: 54, 55, 및 56 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 51, 52, 및 53 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 57의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 58의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 59의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 60의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  87. 청구항 85 또는 86에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 61의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 62의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 63의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 64의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  88. 청구항 85 내지 87 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 (b)에서와 같은 VL 서열.
  89. 청구항 85 내지 87 중 어느 한 청구항에 있어서, 서열번호: 50의 VH 서열 및 서열번호: 49의 VL 서열을 포함하는 항체.
  90. 바시긴에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 서열번호: 70, 71, 및 72 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열, 및/또는
    (b) 서열번호: 67, 68, 및 69 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 73의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 74의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 75의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 76의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  92. 청구항 90 또는 91에 있어서, 상기 항체가 하기를 추가로 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 77의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 78의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 79의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 서열번호: 80의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  93. 청구항 90 내지 92 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는, 항체:
    (a) 서열번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  94. 청구항 90 내지 92 중 어느 한 청구항에 있어서, 서열번호: 66의 VH 서열을 및 서열번호: 65의 VL 서열을 포함하는, 항체.
  95. Glut1에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 하기를 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 86, 87, 및 88 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 83, 84, 및 85 각각의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 CDR 1, 2, 및 3 서열.
  96. 청구항 95에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 89의 경쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 90의 경쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 91의 경쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및
    (d) 서열번호: 92의 경쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  97. 청구항 95 또는 96에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 93의 중쇄 가변 도메인 골격 FR1 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 94의 중쇄 가변 도메인 골격 FR2 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 95의 중쇄 가변 도메인 골격 FR3 아미노산 서열; 및
    (d) 서열번호: 96의 중쇄 가변 도메인 골격 FR4 아미노산 서열.
  98. 청구항 95 내지 97 중 어느 한 청구항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    (a) 서열번호: 82의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 81의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열.
  99. 청구항 95 내지 97 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 82의 VH 서열 및 서열번호: 81의 VL 서열을 포함하는 항체.
  100. 청구항 1 내지 99 중 어느 한 청구항에 있어서, 단클론 항체인, 항체.
  101. 청구항 1 내지 100 중 어느 한 청구항에 있어서, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체인, 항체.
  102. 청구항 1 내지 101 중 어느 한 청구항에 있어서, 전장 IgG1 또는 IgG4 항체인, 항체.
  103. 청구항 1 내지 101 중 어느 한 청구항에 있어서, Fab 단편인, 항체.
  104. 청구항 1 내지 103 중 어느 한 청구항의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  105. 청구항 104의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  106. 청구항 105의 숙주 세포를 상기 항체가 생산되도록 배양함을 포함하는 항체를 제조하는 방법.
  107. 청구항 70 내지 103 중 어느 한 청구항에 따른 항체, 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  108. 청구항 70 내지 103 중 어느 한 청구항의 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 제1 아암을 포함하는 다중특이적 항체.
  109. 청구항 108에 있어서, 뇌 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 아암을 추가로 포함하는 다중특이적 항체.
  110. 청구항 109에 있어서, 상기 뇌 항원이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 다중특이적 항체: BACE1, 아베타, EGFR, HER2, 타우, 아포지질단백질(예를 들어, ApoE4), 알파-시누클레인, CD20, 헌팅틴, PrP, LRRK2, 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, DR6, APP, p75NTR, 및 카스파제 6.
  111. 청구항 110에 있어서, 상기 뇌 항원이 BACE1인, 다중특이적 항체.
  112. 청구항 110에 있어서, 상기 뇌 항원이 아베타인, 다중특이적 항체.
  113. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항의 항체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형.
  114. 청구항 113에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 제형.
  115. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 항체.
  116. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, 신경학적 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항체.
  117. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, 혈뇌 장벽을 거쳐 제제를 수송하는데 사용하기 위한 항체로서, 상기 용도가 상기 혈뇌 장벽을 항체에 노출시킴을 포함하는, 항체.
  118. 신경학적 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 제조에서 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항의 항체의 용도.
  119. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 신경학적 질환 또는 장애가 AD, 뇌졸중, 치매, MD, MS, ALS, 낭성 섬유증, 앙겔만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨 질환, 픽 질환, 파제트 질환, 암, 및 외상 뇌 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  120. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, BBB-R에 결합함을 통해 혈뇌장벽을 걸쳐 제제를 수송하는데 사용하기 위한 항체.
  121. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 BBB-R이 인간 BBB-R인, 항체.
  122. 청구항 70 내지 112 중 어느 한 청구항에 있어서, 신경학적 장애 약물과 커플링된 항체.
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