WO2022039223A1 - 神経系血管バリアーの可逆的開口剤 - Google Patents

神経系血管バリアーの可逆的開口剤 Download PDF

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system vascular
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栄二 池田
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国立大学法人山口大学
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Definitions

  • the present invention relates to a drug that reversibly opens the nervous system vascular barrier.
  • adult nervous system tissues such as the brain and retina are barriers formed by tissue-specific differentiated blood vessels such as the blood-brain barrier (BBB) and blood-retinal barrier (BRB) (hereinafter, “nervous system”). It is separated from other tissues by a “systematic vascular barrier”), and the movement of substances between blood and nervous tissue parenchyma is strongly restricted.
  • BBB blood-brain barrier
  • BRB blood-retinal barrier
  • Such a nervous system vascular barrier is induced during ontogeny and is basically closed in adults, but the optimal tissue microenvironment for the normal functioning of neurons by finely regulating its barrier function. Is maintained.
  • neural tissue parenchyma which is a lesion, and is a disease. It also has the aspect of making it intractable.
  • Non-Patent Document 1 a method of opening with a proteinase such as matrix metalloproteinase (see Non-Patent Document 1) is also disclosed, but it destroys the nervous system vascular barrier forming molecule and causes the nervous system vascular barrier. Temporary and reversible openings were difficult.
  • the present inventors first narrowed down the analysis of the control mechanism of the nervous system vascular barrier to the mechanism by which the nervous system vascular barrier is opened by hypoxic stimulation. As a result, claudin-5 disappeared from the cell membrane of vascular endothelial cells by hypoxic stimulation, and as a result, a cascade in which the nervous system vascular barrier was opened was clarified and reported (see Non-Patent Document 2).
  • ADAM12 and ADAM17 are molecules that work relatively specifically in the process of opening the nervous system vascular barrier by hypoxic stimulation
  • basidin is a nervous system that is stimulated by various stimuli such as inflammatory stimulation as well as hypoxic stimulation. It was reported that it is a molecule that works in common in the process of opening the vascular barrier (see Patent Document 1, Non-Patent Documents 3 and 4).
  • CypA cyclophilin A
  • CypA is a substance specified as an intracellular molecule that binds to cyclosporin A, which is a drug that suppresses the activation of T lymphocytes.
  • CypA is also expressed in cell types other than T lymphocytes, is also a molecule that is secreted extracellularly and functions, and is secreted extracellularly and binds to basidin. .. CypA, which works extracellularly, has been shown to be involved in several biological phenomena such as modification of inflammatory processes.
  • Such cyclophilin A is conjugated with a compound that promotes transport across the blood-brain barrier such as transferrin receptor-binding antibody and used as a neuroprotective agent (see Patent Document 2), and the cyclophilin A / MMP9 pathway is based on apoE4. It has been reported that it is involved in the degradation of blood-brain barrier constituent molecules (see Non-Patent Document 5) and that cyclophilin A and transferrin (CD147) are involved in apoptosis during subepithelial hemorrhage (see Non-Patent Document 6). ing. However, it has not been known so far that cyclophilin A reversibly opens the nervous system vascular barrier.
  • An object of the present invention is to provide a reversible opening agent for a nervous system vascular barrier.
  • CypA cyclophilin A
  • the present invention is as follows.
  • the polypeptide ligand is (1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • [5] To be administered simultaneously or sequentially with at least one therapeutic agent selected from a therapeutic agent for neurodegenerative diseases, a therapeutic agent for retinal diseases, a therapeutic agent for mental diseases, a therapeutic agent for central nervous system tumors, and a therapeutic agent for epilepsy.
  • a therapeutic agent for neurodegenerative diseases selected from a therapeutic agent for neurodegenerative diseases, a therapeutic agent for retinal diseases, a therapeutic agent for mental diseases, a therapeutic agent for central nervous system tumors, and a therapeutic agent for epilepsy.
  • the reversible opening agent for a nervous system vascular barrier according to any one of the above [1] to [4] for use.
  • the subject includes a reversible opening agent for a nervous system vascular barrier containing a ligand having an agonistic action on basidin as an active ingredient, a therapeutic agent for neurodegenerative diseases, a therapeutic agent for retinal diseases, a therapeutic agent for mental diseases, and a central nervous system tumor.
  • a method comprising the step of simultaneously or sequentially administering at least one therapeutic agent selected from a therapeutic agent and an epilepsy therapeutic agent.
  • Use of a ligand having an agonistic action on basidin for producing a reversible opening agent for a nervous system vascular barrier.
  • the reversible opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention By using the reversible opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention, it becomes possible to reversibly open the nervous system vascular barrier.
  • FIG. 1a is a diagram showing the results of fluorescent immunostaining
  • FIG. 1b is a diagram showing the results of quantifying the claudin-5 signal on the cell membrane
  • FIG. 1c is a diagram showing the transdermal electrical resistance value (TEER) of the cell monolayer. It is a figure which shows the result of having measured. It is a figure which shows the result at the time of processing with CypA 300ng / ml with PPIase activity (CypA in the figure) or no PPIase activity (CypA / PPIase- in the figure) in Example 2.
  • FIG. 1a is a diagram showing the results of fluorescent immunostaining
  • FIG. 1b is a diagram showing the results of quantifying the claudin-5 signal on the cell membrane
  • FIG. 1c is a diagram showing the transdermal electrical resistance value (TEER) of the cell monolayer. It is a figure which shows the result of having measured. It is a figure which shows the result at the time of
  • FIG. 2a is a diagram showing the results of fluorescent immunostaining
  • FIG. 2b is a diagram showing the results of quantifying the claudin-5 signal on the cell membrane
  • FIG. 2c is a diagram showing the results of measuring the TEER of the cell monolayer. Is. It is a figure which shows the result at the time of processing with time with CypA 300ng / ml in Example 3.
  • FIG. 3a is a diagram showing the results of fluorescent immunostaining
  • FIG. 3b is a diagram showing the results of quantifying the claudin-5 signal on the cell membrane
  • FIG. 3c is a diagram showing the results of measuring the TEER of the cell monolayer. Is.
  • FIG. 4a is a diagram showing the results of fluorescent immunostaining
  • FIG. 4b is a diagram showing the results of dye leakage of an intravenously injected tracer.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of intravenous administration of doxorubicin to mice with or without CypA pretreatment in Example 5 and observing the uptake of doxorubicin into the cerebrum, liver and kidney with a laser confocal microscope.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of intravenous administration of doxorubicin to mice with or without CypA premedication in Example 5 to quantify the uptake of doxorubicin into the cerebrum, liver and kidney.
  • Vasidin in the present specification is a glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily localized in the cell membrane, and is EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer), CD147 (cluster of differentiation 147), HT7, OX-47, or for.
  • EMMPRIN extracellular matrix metalloproteinase inducer
  • CD147 cluster of differentiation 147
  • HT7 HT7
  • OX-47 OX-47
  • Basisdin is known to be a receptor for cyclophilin A (CypA), which is a member of cyclophilin having peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity.
  • CypA cyclophilin A
  • PPIase peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
  • the basingin is preferably human basingin, and the human basingin can be mentioned as SEQ ID NO: 2-4, respectively, in National Center for Biotechnology Information (NCBI), accession numbers NP_001719.2, NP_940991, NP_940992. It is published as 1.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the ligand having an agonistic action on basidin in the present specification is not particularly limited as long as it is a compound having an action of binding to basidin and reversibly opening the nervous system vascular barrier.
  • the ligand may be any of a polypeptide, antibody, protein, nucleic acid, and small molecule compound, but a polypeptide is preferred.
  • polypeptide ligand the following polypeptides or salts thereof can be more preferably mentioned.
  • Cyclophilin A is a substance identified as an intracellular molecule that binds to cyclosporin A, which is a drug that suppresses the activation of T lymphocytes.
  • the amino acid sequence of such cyclosporine is available from the NCBI website, and is published as Accession No. NP_066953.1 (SEQ ID NO: 1).
  • CypA may be CypA having peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity or CypA not having PPIase activity, but PPIase may be used from the viewpoint of further reducing side effects. CypA having no activity can be preferably mentioned.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, deleted and / or inserted is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 3, and even more preferably. Means an amino acid sequence in which one or two, most preferably one, any number of amino acids have been added, substituted, deleted and / or inserted.
  • amino acid sequence having at least 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 means that the sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 80% or more, preferably 90% or more. It is more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.
  • polypeptide may be a natural polypeptide or a modified polypeptide.
  • Modified polypeptides include, for example, D-form or L-form peptides; ⁇ -peptides, ⁇ -peptides, or ⁇ -peptides; N-methylpeptides; Azapeptides; one or more urea bonds, thiourea bonds, carbamate bonds, or sulfonyls. Examples include polypeptides having one or more amide (ie, peptide) bonds substituted with urea bonds, polypeptides modified by the addition of biochemical functional groups.
  • the C-terminal of the polypeptide may be any of a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH 2 ) or an ester (-COOR).
  • R in the ester includes C1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, C3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl, and C6-12aryl such as phenyl and ⁇ -naphthyl. Examples include phenyl-C1-2 alkyl groups such as groups, benzyls and phenethyl.
  • the salt in the "polypeptide or its salt” in the present specification is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt.
  • inorganic salts such as hydrochlorides, sulfates and phosphates; organic acid salts such as acetates and citrates; alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkalis such as magnesium salts and calcium salts.
  • An example can be an earth metal salt or the like.
  • the CypA may be commercially available, may be prepared by a known genetic engineering method based on the base sequence encoding CypA, or may be prepared by a known amino acid synthesis method based on the information of the amino acid sequence of CypA. You may.
  • the method for producing the polypeptide is not particularly limited, and the polypeptide can be produced according to a known peptide synthesis method based on the amino acid sequence information of the polypeptide.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the above-mentioned polypeptide is prepared by using the solid-phase synthesis method
  • the above-mentioned poly by using a solid-phase synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the above-mentioned polypeptide of interest can be prepared by condensing the peptide or amino acid that can constitute the peptide with the residual portion and removing the protecting group (if the product has a protecting group).
  • APEX396 manufactured by Advanced Chemtech
  • 433A manufactured by Applied Biosystems
  • PS3 manufactured by Protein Technologies
  • 9050 manufactured by Perceptive
  • PSSM-8 manufactured by Shimadzu
  • the resin used in the solid-phase synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include “Rink amide AM Resin”, “Fmoc-AA-Wang Resin”, and "AA-2-Cl-Trt Resin”.
  • the above-mentioned polypeptide when the above-mentioned polypeptide is prepared by the liquid phase synthesis method, the above-mentioned polypeptide can be prepared by a method of stepwise condensing N-protected amino acid derivatives one residue at a time. Depending on the presence or absence of a protecting group, a method such as a dicyclohexylcarbodiimide (DCC) method, an active ester method, or a mixed acid anhydride method can be used.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC ⁇ HCl 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • BOP 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DIPCDI diisopropyl.
  • DIPCDI carbodiimide
  • a commercially available product can be purchased and used.
  • the term "nervous system vascular barrier” as used herein means a mechanism that limits the exchange of substances between blood and interstitial fluid of the nervous system, such as the blood-brain barrier that restricts the exchange of substances between blood and interstitial fluid of the brain, and blood and retina.
  • the blood-brain barrier which limits the exchange of substances with tissue fluid, can be preferably mentioned.
  • the nervous system blood vessel is a blood vessel of the nervous system tissue, and does not include a blood vessel in a tissue other than the nervous system tissue.
  • reversible opening of the nervous system vascular barrier means that the mechanism for restricting substance exchange between the blood and the interstitial fluid of the nervous system does not function or is reduced, and the blood and the interstitial fluid of the nervous system It means that material exchange is possible temporarily and reversibly.
  • a reversible opening means that the nervous system vascular barrier does not remain open, but can be restored to a state in which the exchange of substances between blood and the tissue fluid of the nervous system is restricted after a lapse of a predetermined time. Means to open like.
  • the term "temporary" can be defined as an elapsed time of 0.2 to 24 hours after administration of the reversible opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention to a subject, and the lower limit is 0.2 to 24 hours.
  • 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, or 6 hours can be mentioned, and the upper limit is 20 hours, 18 hours, 16 hours, 12 hours, 10 hours, or 9 hours. Can be mentioned.
  • the reversible opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention comprises at least one therapeutic agent selected from a neurodegenerative disease therapeutic agent, a retinal disease therapeutic agent, a mental disease therapeutic agent, a central nervous system tumor therapeutic agent, and an epilepsy therapeutic agent. It may be intended to be administered in combination with each other or sequentially.
  • a therapeutic agent selected from a neurodegenerative disease therapeutic agent, a retinal disease therapeutic agent, a mental disease therapeutic agent, a central nervous system tumor therapeutic agent, and an epilepsy therapeutic agent. It may be intended to be administered in combination with each other or sequentially.
  • the term “ad in combination” means that two or more agents are simultaneously administered to the same subject.
  • administered in combination means that two or more agents are sequentially administered to the same subject, that is, sequentially or individually at regular intervals.
  • the reversible opening of the nervous system vascular barrier with a reversible opening agent is 12 hours, 11 hours, 10 hours, 9 hours, 8 hours, 6 hours, 4 hours, 3 hours, 2 hours, It lasts for 1 hour, 30 minutes, 15 minutes, 10 minutes, or 5 minutes.
  • the "fixed interval" when administered sequentially or individually at regular intervals can be 0.5 minutes to 10 hours, and the lower limit is, for example, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 5 minutes. Minutes, 10 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours and 3 hours can be mentioned, and the upper limit can be 8 hours, 6 hours, 5 hours, 4 hours and 3 hours.
  • the opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention may contain, as an active ingredient, a ligand having an agonistic action on basidin, and if necessary, a usual pharmaceutically acceptable carrier, binding agent, and stabilizing agent.
  • compounding ingredients include water, physiological saline, animal fats and oils, vegetable oils, lactose, starch, gelatin, crystalline cellulose, gum, talc, magnesium stearate, hydroxypropyl cellulose, and polyalkylene glycol.
  • Polyvinyl alcohol and glycerin can be mentioned.
  • the method for administering the opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention is not particularly limited as long as the desired opening effect of the nervous system vascular barrier of the present invention can be obtained, and is intravenous administration, oral administration, intravitreal administration, and intramuscular administration. Examples thereof include administration, subcutaneous administration, transdermal administration, nasal administration, and pulmonary administration.
  • the dose of the opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately adjusted depending on the physical condition, medical condition, body weight, age, sex, etc. of the subject or the subject animal.
  • the dose may be, for example, 0.01 ⁇ g to 100 g / kg body weight per day, more preferably 0.1 ⁇ g to 10 g / kg body weight, still more preferably 1 ⁇ g to 1 g / kg body weight, and simply per day. It may be administered in multiple doses or in multiple doses (eg, 2-4 doses).
  • the therapeutic agent is not particularly limited as long as it is at least one therapeutic agent selected from a neurodegenerative disease therapeutic agent, a retinal disease therapeutic agent, a psychiatric disorder therapeutic agent, a central nervous system tumor therapeutic agent, and an epilepsy therapeutic agent.
  • therapeutic agents for neurodegenerative diseases include nerves such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, muscle atrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, severe myasthenia, cerebral infarction, and vascular dementia.
  • Therapeutic agents for degenerative diseases can be mentioned.
  • Treatments for retinal diseases include diabetic retinopathy, age-related macular degeneration, retinal edema, retinal detachment, proliferative vitreous retinopathy, uveitis, eye infections, retinopathy of prematurity, neovascular macular degeneration or retinal choroidal membrane.
  • therapeutic agents for retinal diseases such as inflammation.
  • therapeutic agent for psychiatric disorders include therapeutic agents for psychiatric disorders such as depression, schizophrenia, and panic disorder.
  • Examples of the therapeutic agent for central nervous system tumors include therapeutic agents for central nervous system tumors such as glioma, central nervous system malignant lymphoma, polymorphic glioblastoma, and glioma.
  • Such therapeutic agents may include small molecule compounds, antisense oligonucleotides, ribozymes or proteins, polypeptides or peptides.
  • the administration target of the opening agent for the nervous system vascular barrier of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, dogs, cats, rats, mice, and hamsters. ..
  • Example 1 In vitro system analysis using a monolayer culture of a mouse cerebral vascular endothelial cell line (1)
  • the present inventors have previously clarified and reported the cascade that "the disappearance of claudin-5 from the cell membrane of vascular endothelial cells opens the vascular barrier" as described above. Therefore, the expression level of claudin-5 by administration of CypA was examined.
  • mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd. 3 cells (obtained from American Type Culture Collection) in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 4500 mg / L glucose (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) at 37 ° C. under 5% CO 2 . It was grown as a single layer in. Such a monolayer-cultured bEnd. CypA (200, 300, or 400 ng / ml: BioVendor receiver and diagnostic Products) was added to the culture supernatant of 3 cells and incubated for 3 hours. After that, bEnd.
  • CypA 200, 300, or 400 ng / ml: BioVendor receiver and diagnostic Products
  • Fluorescent immunostaining was performed by the following method. First, the cultured bEnd. The 3 cells were fixed in 100% methanol at room temperature for 5 minutes and incubated with 10% Non-Immune Goat Serum (Invitrogen) for 30 minutes to block non-specific binding of the antibody. The cells were then reacted with a rabbit polyclonal antibody against claudin-5 (1/25 diluted Invitrogen) at 4 ° C. overnight. Then, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), and the cells were incubated with Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (1/200 diluted Eugene) at room temperature for 1 hour under light protection.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the stained cells were mounted on a Fluoromount (Diagnostic BioSystems) and observed under a Zeiss LSM5 Pascal laser confocal microscope (Carl Zeiss).
  • the fluorescence intensity of claudin-5 on the plasma membrane was measured using the operation menu installed in LSM5 pascal6, 7.3.
  • the fields of the culture dish were randomly photographed and five straight lines were drawn on each photograph.
  • the fluorescence intensity at the point of the cell membrane intersecting the drawn straight line was quantified.
  • the average value of the fluorescence intensity was calculated at about 80 points as the expression level of claudin-5 on the cell membrane of each monolayer. All experiments were performed independently in 3 separate sessions.
  • FIG. 1a The results of fluorescent immunostaining are shown in FIG. 1a, and the results of quantifying the claudin-5 signal on the cell membrane are shown in FIG. 1b.
  • FIG. 1c The results of measuring the TEER of the 3-cell monolayer are shown in FIG. 1c.
  • FIGS. 1a and 1b showed that claudin-5 levels on the cell membrane were significantly reduced 3 hours after CypA administration.
  • CypA administration showed a correlation with claudin-5 levels on the cell membrane, and a significant decrease in barrier function occurred 3 hours after CypA administration. From these results, bEnd. It was confirmed that the barrier of the 3-cell monolayer was opened.
  • Example 2 In vitro system analysis using a monolayer culture of a mouse cerebral vascular endothelial cell line (2)) CypA is known to have PPIase activity. Therefore, whether or not PPIase activity is involved in the action of CypA to open the barrier was investigated using CypA lacking PPIase activity.
  • Example 3 In vitro system analysis using a monolayer culture of a mouse cerebral vascular endothelial cell line (3), the same experiment as in Example 1 was performed by changing the treatment time of CypA. That is, the concentration of CypA was set to 300 ng / ml, CypA was incubated for 1, 3, 6, 9, and 12 hours after administration, and then fluorescent immunostaining, quantification of claudin-5 signal on the cell membrane, bEnd. The TEER of a 3-cell monolayer was measured.
  • FIG. 3a The results of fluorescent immunostaining are shown in FIG. 3a, and the results of quantifying the claudin-5 signal on the cell membrane are shown in FIG. 3b.
  • the results of measuring the TEER of the 3-cell monolayer over time are shown in FIG. 3c.
  • 3a and 3b show that claudin-5 levels on the cell membrane were significantly reduced 3 hours after CypA administration, but restored to pre-CypA stimulation levels 6 hours later.
  • CypA administration showed an inverse correlation with claudin-5 levels on the cell membrane, a significant decrease in barrier function occurred 3 hours after CypA administration, and recovery to the state before CypA stimulation was performed 6 hours later. From these results, bEnd. It was confirmed that the barrier of the 3-cell monolayer was opened. Furthermore, it was also confirmed that the open barrier restored its barrier function after several hours in the form of self-limiting.
  • Example 4 In vivo system analysis using mouse retinal tissue
  • the retina is a tissue formed in the form of budding of the central nervous system during ontogeny, and is a part of the central nervous system like the brain. Since the vascular system of the retina can be observed and evaluated two-dimensionally over the entire length in the long axis direction, the retina was used as an analysis material as a representative of the central nervous system in this example.
  • CypA was injected once intravenously (200 ⁇ g / kg) into 7-week-old male C57B6 / N mice (Nippon SLC Co., Ltd.). Changes in the expression level of claudin-5 localized in the endothelial cell membrane of the retinal vasculature and the permeability of the retinal vasculature were measured 3, 6, or 24 hours after injection into the vitreous. Changes in claudin-5 expression were measured by fluorescent immunostaining with a rabbit polyclonal antibody against claudin-5 as in Example 1. The measurement of the permeability of the retinal vascular system was performed as follows.
  • PFA paraformaldehyde
  • the permeability of the retinal vasculature (an index of blood-retinal barrier function) can be measured. It was measured. The experiment was conducted 3 times or more independently.
  • the expression level of claudin-5 in the cell membrane of peripheral microvascular endothelial cells was found to decrease 3 hours after intravenous injection of CypA, but they were physiological levels at 24 hours. Recovered to.
  • the leakage of the dye of the tracer injected intravenously was enhanced 3 hours after the injection of CypA, and after 6 hours, the leakage was reduced as compared with 3 hours later, 24 hours later. It later returned to undetectable physiological levels.
  • Example 5 Analysis of drug uptake into neural tissue parenchyma
  • CypA and the therapeutic agent may be administered in combination to reversibly open the nervous system vascular barrier and allow the therapeutic agent to reach the parenchyma of the nervous tissue. I answered if there was any and conducted the following experiment.
  • Doxorubicin was intravenously administered to mice without CypA pretreatment and mice with pretreatment, and the uptake of doxorubicin into the cerebrum (Cerebrum), liver (Liver) and kidney (Kidney) was observed 3 hours later. In addition, the fluorescence emitted by doxorubicin was used to evaluate the uptake of doxorubicin into the cerebrum, liver and kidney.
  • Doxorubicin hydrochloride (6.25 mg / kg; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), an anticancer drug with low intracerebral transferability, was injected into the tail vein of mice with or without pre-injection of CypA (200 ⁇ g / kg). Was injected into. Pre-injection of CypA was performed intravenously 3 hours prior to injection of doxorubicin. Mice were sacrificed 3 hours after injection of doxorubicin hydrochloride, cerebrum, liver and kidneys were harvested and cryoembedded in OCT compound. Next, a frozen section having a thickness of 30 ⁇ m was prepared and observed under an LSM710 laser confocal microscope (Carl Zeiss). The fluorescence of doxorubicin was excited by an argon laser at 488 nm, and the emission was observed through a 530 nm long pass filter.
  • FIG. 5 shows the cerebrum, liver and kidney of mice without CypA pretreatment. Fluorescent findings.
  • the lower rows (e, f, g, h) are the cerebrum, liver, and kidney of mice pre-administered with CypA, where e is the HE staining findings of the cerebrum, and f, g, h are the cerebrum, liver, and kidney. Doxorubicin fluorescence findings.
  • FIG. 6 is a graph quantifying the uptake of doxorubicin in each of the cerebrum, liver and kidney in FIG. As is clear from FIG.
  • the present invention makes it possible to reach the nerve tissue with a drug that cannot reach the nerve tissue by the current medical / pharmaceutical technology. This means that the choice of drugs that can be used to treat neurological disorders has been greatly expanded, and that it can be used in the medical industry by removing the large barrier that has always been blocked during the drug discovery process, that is, the barrier of being unable to pass through the nervous system vascular barrier. Is.

Abstract

本発明の課題は、神経系血管バリアーの可逆的な開口剤を提供することにある。　解決手段としては、ベイシジンに対してアゴニスト作用を有するリガンドを有効成分として含む、神経系血管バリアーの可逆的開口剤を調製する。上記リガンドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド等又はその塩を有効成分として含有することや、ペプチジル－プロリル　シス－トランス　イソメラーゼ活性を失ったシクロフィリンＡであることが好ましい。

Description

神経系血管バリアーの可逆的開口剤
　本発明は神経系血管バリアーを可逆的に開口する薬剤に関する。
　ヒトを含む多細胞生物において、脳、網膜など成体の神経系組織は、血液脳関門（ＢＢＢ）、血液網膜関門（ＢＲＢ）等の組織特異的に分化した血管が形成するバリアー（以下、「神経系血管バリアー」ともいう）により他組織から区画されており、血液と神経組織実質との間での物質移動が強く制限されている。かかる神経系血管バリアーは個体発生過程において誘導され、成体においては基本的に閉じた状態にあるが、そのバリアー機能を巧妙に調節することにより神経細胞が正常に機能するための至適組織微小環境を維持している。このように、神経組織の機能にとって極めて重要な神経系血管バリアーではあるが、一方では、神経疾患等に対し全身投与される治療薬が病変部である神経組織実質に到達することを妨げ、疾患を難治化しているという側面も持ち合わせている。
　未だ有用な治療法のない多くの難治性神経疾患に対して、新規治療薬の開発（創薬）が進められているが、その創薬過程において最も大きな障壁の１つとなるのが神経系血管バリアーの存在である。いかにして神経系血管バリアーを通過させて薬剤を神経組織実質に到達させるかについて、多くの試みがなされてきた。その１つとして、高張液のマンニトールを血管内に投与し、脱水により脳血管内皮細胞を変形させ内皮細胞どうしを物理的に解離させた後に、目的とする治療薬剤を投与する手法があるが、細胞傷害をきたすため有用な手法とはいえない。また、神経系血管バリアーに関し、マトリックスメタロプロテイナーゼのようなプロテイナーゼによって開口する方法（非特許文献１参照）も開示されているが、神経系血管バリアー形成分子を破壊してしまい、神経系血管バリアーの一時的かつ可逆的な開口は難しかった。
　これまでの多くの研究にもかかわらず、神経系血管バリアーを通過させ薬剤を神経組織実質に到達させる有用な手法は確立されていない。したがって、閉じた状態にある神経系血管バリアーを人為的かつ副作用が少なく開口するための薬剤若しくは手法が開発されれば、神経疾患に対する創薬の大きな障壁が除かれ、患者の予後改善さらには完治に向けた有用な治療法確立へと繋がる。また、神経系血管バリアーを開口する薬剤は、多くの難治性神経疾患が共通して適応対象疾患となり、臨床医療に対する貢献範囲も極めて広いといえる。
　本発明者らは、神経系血管バリアーの制御機構解析を、まず低酸素刺激により神経系血管バリアーが開く機構に絞り解析を始めた。その結果、低酸素刺激により血管内皮細胞の細胞膜からのｃｌａｕｄｉｎ－５が消失し、その結果、神経系血管バリアーが開くというカスケードを明らかにし報告した（非特許文献２参照）。その後解析を進め、低酸素刺激による血管内皮細胞の細胞膜からのｃｌａｕｄｉｎ－５の消失に関与する分子として、神経系血管バリアーを形成する血管内皮細胞に発現している細胞膜分子であるａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＤＡＭ）１２、ＡＤＡＭ１７、ベイシジンを特定した。さらに、ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７は、低酸素刺激によって神経系血管バリアーが開く過程に比較的特化して働く分子であるのに対し、ベイシジンは、低酸素刺激のみならず炎症刺激など様々な刺激によって神経系血管バリアーが開く過程に共通して働く分子であることを報告した（特許文献１、非特許文献３、４参照）。
　ところで、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）はＴリンパ球の活性化を抑制する薬剤であるシクロスポリンＡと結合する細胞内分子として特定された物質である。その後の研究により、ＣｙｐＡは、Ｔリンパ球以外の細胞種においても発現すること、細胞外にも分泌されて機能する分子でもあること、細胞外に分泌されベイシジンと結合することが報告されている。そして、細胞外で働くＣｙｐＡは、炎症過程の修飾などのいくつかの生命現象に関与することが示された。
　かかるシクロフィリンＡは、トランスフェリン受容体結合抗体等の血液脳関門を越える輸送を促進する化合物とコンジュゲートされて神経保護剤として用いられること（特許文献２参照）や、シクロフィリンＡ／ＭＭＰ９経路がａｐｏＥ４による血液脳関門構成分子の分解に関与すること（非特許文献５参照）や、シクロフィリンＡとベイシジン（ＣＤ１４７）がくも膜下出血時のアポトーシスに関与していること（非特許文献６参照）が報告されている。しかしながら、シクロフィリンＡが神経系血管バリアーを可逆的に開口することはこれまで知られていなかった。
国際公開第２０１７／０７３２３２号パンフレット 特表２００８－５３００２９号公報
Neuroscience Letters Volume 649, 10 Pages 7-13, 2017 Am. J. Pathol. Volume 170, Issue 4, Pages 1389-1397, 2007 Scientific Report 5, 12796; doi: 10.1038/srep12796, 2015 Scientific Report 6, 38445; doi: 10.1038/srep38445, 2016 JAMA Neurol. September 1; 70(9): 1198-1200; doi:10.1001/jamaneurol.2013.3841 Critical Care Medicine, September 2015, Volume 43; Number 9 e369-381
　本発明の課題は、神経系血管バリアーの可逆的な開口剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、まず、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系解析において、ベイシジンのアゴニストとして知られているシクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）による脳微小血管内皮細胞の刺激が、脳微小血管内皮細胞における神経系血管バリアー特性の消失をもたらすこと、及びかかる神経系血管バリアー特性の消失が一時的かつ可逆的であることを見出した。さらに、ｉｎ　ｖｉｖｏ系解析として、マウスにＣｙｐＡを注射すると、ｉｎ　ｖｉｖｏでも一時的かつ可逆的に神経系血管バリアーを開口すること、及びＣｙｐＡの前注射により実際に全身的に投与された脳内移行性が低い薬剤であるドキソルビシンをマウスの神経組織へ送達することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ベイシジンに対してアゴニスト作用を有するリガンドを有効成分として含む、神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
［２］リガンドが、ポリペプチドリガンドであることを特徴とする上記［１］記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
［３］ポリペプチドリガンドが、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ神経系血管バリアーの可逆的開口作用を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経系血管バリアーの可逆的開口作用を有するポリペプチド、
からなる群から選択される１種又は２種以上のポリペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする上記［２］記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
［４］ポリペプチドリガンドが、ペプチジル－プロリル　シス－トランス　イソメラーゼ活性を失ったシクロフィリンＡであることを特徴とする上記［２］又は［３］記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
［５］神経変性疾患治療剤、網膜疾患治療剤、精神疾患治療剤、中枢神経系腫瘍治療剤、てんかん治療剤から選択される少なくとも一つの治療剤と同時併用又は逐次併用で投与されるように用いるための上記［１］～［４］のいずれか記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
　さらに、本発明の他の態様としては、以下のとおりである。
〈１〉対象の脳に神経変性疾患治療剤、網膜疾患治療剤、精神疾患治療剤、中枢神経系腫瘍治療剤、てんかん治療剤から選択される少なくとも一つの治療剤を送達するための方法であって、該対象に、ベイシジンに対するアゴニスト作用を有するリガンドを有効成分として含む、神経系血管バリアーの可逆的開口剤と、神経変性疾患治療剤、網膜疾患治療剤、精神疾患治療剤、中枢神経系腫瘍治療剤、てんかん治療剤から選択される少なくとも一つの治療剤とを同時併用又は逐次併用で投与する段階を含む、方法。
〈２〉神経系血管バリアーの可逆的開口剤を製造するための、ベイシジンに対するアゴニスト作用を有するリガンドの使用。
　本発明の神経系血管バリアーの可逆的開口剤を用いることにより、神経系血管バリアーを可逆的に開口することが可能性となる。
実施例１におけるＣｙｐＡ２００、３００、又は４００ｎｇ／ｍｌで処理した場合の結果を示す図である。図１ａは蛍光免疫染色の結果を示す図であり、図１ｂは細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルを定量化した結果を示す図であり、図１ｃは細胞単層の経皮内電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を測定した結果を示す図である。 実施例２におけるＰＰＩａｓｅ活性あり（図中ＣｙｐＡ）又はＰＰＩａｓｅ活性無し（図中ＣｙｐＡ／ＰＰＩａｓｅ－）のＣｙｐＡ３００ｎｇ／ｍｌで処理した場合の結果を示す図である。図２ａは蛍光免疫染色の結果を示す図であり、図２ｂは細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルを定量化した結果を示す図であり、図２ｃは細胞単層のＴＥＥＲを測定した結果を示す図である。 実施例３におけるＣｙｐＡ３００ｎｇ／ｍｌで経時的に処理した場合の結果を示す図である。図３ａは蛍光免疫染色の結果を示す図であり、図３ｂは細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルを定量化した結果を示す図であり、図３ｃは細胞単層のＴＥＥＲを測定した結果を示す図である。 実施例４におけるマウスの網膜組織を用いて、ＣｙｐＡ投与することによるバリアー機能の変化を調べた結果を示す図である。図４ａは蛍光免疫染色の結果を示す図であり、図４ｂは静脈内注射したトレーサーの色素の漏出の結果を示す図である。 実施例５における、ＣｙｐＡ前投与あり又は無しのマウスにドキソルビシンを静脈内投与してドキソルビシンの大脳、肝臓及び腎臓への取り込みをレーザー共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図である。ＣｙｐＡ前投与なしが上段、ＣｙｐＡ前投与ありが下段であり、ａ，ｅが大脳のＨＥ染色所見、ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈが大脳、肝臓及び腎臓のドキソルビシン蛍光所見である。 実施例５における、ＣｙｐＡ前投与あり又は無しのマウスにドキソルビシンを静脈内投与してドキソルビシンの大脳、肝臓及び腎臓への取り込みを定量化した結果を示す図である。
　本明細書におけるベイシジンは細胞膜に局在するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、ＥＭＭＰＲＩＮ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＣＤ１４７（ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　１４７）、ＨＴ７、ＯＸ－４７、又はｆｏｒｔｈ２２とも称されている。ベイシジンは、ペプチジル－プロリル　シス－トランス　イソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性を有するシクロフィリンの一員であるシクロフィリンＡ　（ＣｙｐＡ）の受容体であることが知られている。ベイシジンとしてはヒトのベイシジンであることが好ましく、ヒトのベイシジンは配列番号２－４を挙げることができ、それぞれＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）においてアクセッション番号ＮＰ＿００１７１９．２、ＮＰ＿９４０９９１．１、ＮＰ＿９４０９９２．１として公開されている。
　本明細書におけるベイシジンに対するアゴニスト作用を有するリガンドとしては、ベイシジンと結合して、かつ神経系血管バリアーを可逆的に開口する作用を有する化合物であれば特に制限されない。かかるリガンドとしてはポリペプチド、抗体、タンパク質、核酸、及び低分子化合物のいずれでもよいが、ポリペプチドであることが好ましい。
　かかるポリペプチドリガンドとしては、以下のポリペプチド又はその塩をより好適に挙げることができる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ神経系血管バリアーの可逆的開口作用を有するペプチド；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経系血管バリアーの可逆的開口作用を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド；
　さらに、上記ポリペプチドリガンドとしてシクロフィリンの一員であるシクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）を挙げることもできる。シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）は、Ｔリンパ球の活性化を抑制する薬剤であるシクロスポリンＡと結合する細胞内分子として特定された物質である。かかるシクロスポリンのアミノ酸配列は上記ＮＣＢＩのウェブサイトから入手可能であり、アクセッション番号ＮＰ＿０６６９５３．１（配列番号１）として公開されている。また、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）は、ペプチジル－プロリル　シス－トランス　イソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性を有するＣｙｐＡであっても、ＰＰＩａｓｅ活性を有さないＣｙｐＡであってもよいが、より副作用を低減する観点からＰＰＩａｓｅ活性を有さないＣｙｐＡを好適に挙げることができる。
　上記「１若しくは数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個、最も好ましくは１個の任意の数のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列を意味する。上記「配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。
　上記ポリペプチドは天然ポリペプチドであっても修飾ポリペプチドであってもよい。修飾ポリペプチドとしては、例えば、Ｄ体ペプチド若しくはＬ体ペプチド；αペプチド、βペプチド、若しくはγペプチド；Ｎ－メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバマート結合、若しくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド（すなわち、ペプチド）結合を有するポリペプチド、生化学的官能基の付加によって修飾されたポリペプチドを挙げることができる。また、上記ポリペプチドはＣ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）又はエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル若しくはｎ－ブチル等のＣ１－６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３－８シクロアルキル基、フェニル、α－ナフチル等のＣ６－１２アリール基、ベンジル、フェネチル等のフェニル－Ｃ１－２アルキル基を挙げることができる。
　本明細書における「ポリペプチド又はその塩」における塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではない。具体的には、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩；酢酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等を例示することができる。
　上記ＣｙｐＡは市販品を入手してもよく、ＣｙｐＡをコードする塩基配列に基づいて公知の遺伝子工学的手法によって作製してもよく、ＣｙｐＡのアミノ酸配列の情報に基づいて公知のアミノ酸合成手法によって作製してもよい。上記ポリペプチドの作製方法については特に制限なく、上記ポリペプチドのアミノ酸配列情報を基に、公知のペプチド合成法に従って作製することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、及び液相合成法のいずれであってもよい。固相合成法を用いて上記ポリペプチドを作製する場合、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の固相合成法を用い、上記ポリペプチドを構成し得るペプチド又はアミノ酸と、残余部分とを縮合し、（生成物が保護基を有する場合は）保護基を脱離することにより目的とする上記ポリペプチドを作製することができる。固相合成法のために、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ－８（島津製作所製）等の市販のペプチド合成機器を用いることができる。固相合成法において用いるレジンとしては、特に制限されず、例えば「Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＡＭ  Ｒｅｓｉｎ」、「Ｆｍｏｃ－ＡＡ－Ｗａｎｇ  Ｒｅｓｉｎ」、「ＡＡ－２－Ｃｌ－Ｔｒｔ  Ｒｅｓｉｎ」を挙げることができる。また、液相合成法を用いて上記ポリペプチドを作製する場合、Ｎ－保護アミノ酸誘導体を一残基ずつ段階的に縮合していく方法により、上記ポリペプチドを作製することができる。保護基の有無などによって、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、混合酸無水物法等の方法を用いることができる。また、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）試薬、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）などの縮合剤を用いる方法によっても、上記ポリペプチドを作製することができる。さらに、市販品を購入して用いることもできる。
　本明細書における神経系血管バリアーとは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構を意味し、血液と脳の組織液との物質交換を制限する血液脳関門や、血液と網膜の組織液との物質交換を制限する血液網膜関門を好適に挙げることができる。なお、神経系血管とは、神経系組織の血管であり、神経系組織以外の組織における血管は含まれない。
　本明細書において、「神経系血管バリアーの可逆的開口」とは、上記血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構が機能しない若しくは低下した状態となり、血液と神経系の組織液との物質交換が一時的かつ可逆的に可能となることを意味する。ここで、可逆的開口とは、神経系血管バリアーが開いたままとなるのではなく、所定の時間経過した後には、血液と神経系の組織液との物質交換が制限された状態に回復し得るように開くことを意味する。
　本明細書において、「一時的」とは、本発明の神経系血管バリアーの可逆的開口剤を対象に投与してからの経過時間が０．２～２４時間を挙げることができ、下限としては０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、又は６時間を挙げることができ、上限としては２０時間、１８時間、１６時間、１２時間、１０時間、又は９時間を挙げることができる。
　本発明の神経系血管バリアーの可逆的開口剤は、神経変性疾患治療剤、網膜疾患治療剤、精神疾患治療剤、中枢神経系腫瘍治療剤、てんかん治療剤から選択される少なくとも一つの治療剤と同時併用又は逐次併用で投与されるように用いるためのものであってもよい。ここで、用語「同時併用で投与」は、同じ対象に、２種以上の剤を同時に投与することを意味する。また、用語「逐次併用で投与」は、同じ対象に、２種以上の剤を逐次、すなわち一定の間隔を開けて順次に又は個別に投与されることを意味する。
　本発明による一実施形態において、神経系血管バリアーの可逆的開口剤による可逆的開口は、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、１５分間、１０分間、又は５分間持続する。
　一定の間隔を開けて順次に又は個別に投与される場合における「一定の間隔」としては０．５分～１０時間を挙げることができ、下限としては例えば１分、２分、３分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間を挙げることができ、上限としては８時間、６時間、５時間、４時間、３時間を挙げることができる。
　本発明の神経系血管バリアーの開口剤は、ベイシジンに対するアゴニスト作用を有するリガンドを有効成分として含有していればよく、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分がさらに添加されたものを挙げることができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを挙げることができる。
　本発明の神経系血管バリアーの開口剤の投与方法としては、所望の本発明の神経系血管バリアーの開口効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、硝子体内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を挙げることができる。また、本発明の神経系血管バリアーの開口剤の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別などによって適宜調整することができる。投与量としては、例えば１日あたり、０．０１μｇ～１００ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ～１０ｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１μｇ～１ｇ／ｋｇ体重を挙げることができ、一日あたり単回又は複数回（例えば、２～４回）に分けて投与してもよい。
　治療剤としては神経変性疾患治療剤、網膜疾患治療剤、精神疾患治療剤、中枢神経系腫瘍治療剤、てんかん治療剤から選択される少なくとも一つの治療剤であるかぎり特に制限されない。神経変性疾患治療剤としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、重症筋無力症、脳梗塞、血管性認知症等の神経変性疾患の治療剤を挙げることができる。網膜疾患の治療剤としては、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症、網膜浮腫、網膜剥離、増殖硝子体網膜症、ぶどう膜炎、眼感染症、未熟児網膜症、新生血管黄斑症又は網脈絡膜炎等の網膜疾患の治療剤を挙げることができる。精神疾患の治療剤としては、うつ病、統合失調症、パニック障害などの精神疾患の治療剤を挙げることができる。中枢神経系腫瘍の治療剤としては、神経膠腫、中枢神経系悪性リンパ腫、多形膠芽細胞腫、神経膠肉腫等の中枢神経系腫瘍の治療剤を挙げることができる。かかる治療剤としては、低分子化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを挙げることができる。
　本発明の神経系血管バリアーの開口剤の投与対象としては特に制限されないが、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター等の哺乳動物を挙げることができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］　（マウス脳血管内皮細胞株の単層培養を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ系解析（１））
　本発明者らは、上述のように「血管内皮細胞の細胞膜からのｃｌａｕｄｉｎ－５の消失により血管バリアーが開く」というカスケードを以前明らかにして報告した。そこで、ＣｙｐＡの投与によるｃｌａｕｄｉｎ－５の発現レベルについて検証した。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系において、マウス脳微小血管内皮細胞株ｂＥｎｄ．３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加した４５００ｍｇ／Ｌグルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社)を含むダルベッコ変法Ｅａｇｌｅ培地中で５％　ＣＯ２下に３７℃で単層として増殖させた。かかる単層培養したｂＥｎｄ．３細胞の培養上清にＣｙｐＡ（２００、３００、又は４００ｎｇ／ｍｌ：ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ　ｒｅｃｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｃｕｃｔｓ社）を加え、３時間インキュベートした。その後、ｂＥｎｄ．３細胞におけるｃｌａｕｄｉｎ－５の発現変化を蛍光免疫染色にて観察すると共に、その細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルを定量化した。さらに、血管バリアー機能の指標であるｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲを測定した。
　蛍光免疫染色は、次の方法で行った。まず、培養したｂＥｎｄ．３細胞を１００％メタノールで５分間室温で固定し、１０％　Ｎｏｎ－Ｉｍｍｕｎｅ　Ｇｏａｔ　Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と３０分間インキュベートし、抗体の非特異的結合を遮断した。次に、細胞をｃｌａｕｄｉｎ－５に対するウサギポリクローナル抗体（１/２５希釈　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と４℃で一晩反応させた。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞をＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２００希釈　Ｅｕｇｅｎｅ社）と共に、光からの保護下で室温で１時間インキュベートした。さらに、染色細胞をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）にマウントし、Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ５　Ｐａｓｃａｌレーザー共焦点顕微鏡(Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社)下で観察した。定量分析のために、ＬＳＭ５　ｐａｓｃａｌ６，７．３にインストールされたオペレーションメニューを用いて、原形質膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５の蛍光強度を測定した。培養皿のフィールドをランダムに撮影し、各写真に５本の直線を描いた。次に、引いた直線と交差する細胞膜の点での蛍光強度を定量した。蛍光強度の平均値は、約８０点で、各単層の細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５の発現レベルとして計算した。すべての実験は３回に分けて独立に行った。
　蛍光免疫染色結果を図１ａに、その細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルを定量化した結果を図１ｂに、ｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲを測定した結果を図１ｃに示す。図１ａ、図１ｂにより、ＣｙｐＡ投与３時間後に細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５レベルが有意に低下することが示された。さらに、図１ｃにより、ＣｙｐＡ投与は細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５レベルと相関を示し、ＣｙｐＡ投与３時間後にバリアー機能の有意な低下が生じた。これらの結果から、ＣｙｐＡの１回投与刺激により、ｂＥｎｄ．３細胞単層のバリアーが開くことが確認された。
［実施例２］　（マウス脳血管内皮細胞株の単層培養を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ系解析（２））
　ＣｙｐＡはＰＰＩａｓｅ活性を有していることが知られている。そこで、ＣｙｐＡによるバリアーを開く作用においてＰＰＩａｓｅ活性が関与するか否かを、ＰＰＩａｓｅ活性を欠くＣｙｐＡを用いて調べた。
　ＣｙｐＡとしてＰＰＩａｓｅ活性を失ったＣｙｐＡ（（３００ｎｇ／ｍｌ：ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ　ｒｅｃｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｃｕｃｔｓ社））を用いた以外は実施例１と同様の方法で蛍光免疫染色、細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルの定量化、ｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲの測定を行った。結果をそれぞれ図２ａ～図２ｃに示す。
　図２ａ～図２ｃから明らかなように、ＰＰＩａｓｅ活性を失ったＣｙｐＡを用いてもＰＰＩａｓｅ活性を有するＣｙｐＡを用いた場合と同様に細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルは低下し、バリアー機能の有意な低下が生じた。したがって、ＣｙｐＡによる神経系血管バリアーの開口は、ＰＰＩａｓｅ活性とは無関係であることが示された。
［実施例３］　（マウス脳血管内皮細胞株の単層培養を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ系解析（３））
　ＣｙｐＡによる神経系血管バリアーの開口作用を経時的に評価するために、ＣｙｐＡの処理時間を変えて、実施例１と同様の実験を行った。すなわち、ＣｙｐＡの濃度は３００ｎｇ／ｍｌとし、ＣｙｐＡを投与後１、３、６、９、１２時間インキュベートし、その後蛍光免疫染色、細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルの定量化、ｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲの測定を行った。
　蛍光免疫染色結果を図３ａに、その細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５シグナルを定量化した結果を図３ｂに、ｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲを経時的に測定した結果を図３ｃに示す。図３ａ、図３ｂにより、ＣｙｐＡ投与３時間後に細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５レベルが有意に低下するが、６時間後にはＣｙｐＡ刺激前のレベルまで回復することが示された。さらに、図３ｃにより、ＣｙｐＡ投与は細胞膜上のｃｌａｕｄｉｎ－５レベルと逆相関を示し、ＣｙｐＡ投与３時間後にバリアー機能の有意な低下が起こり、６時間後にはＣｙｐＡ刺激前の状態まで回復した。これらの結果から、ＣｙｐＡの１回投与刺激により、一時的かつ可逆的にｂＥｎｄ．３細胞単層のバリアーが開くことが確認された。さらに、開いたバリアーは、自然治癒（ｓｅｌｆ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ）の形で数時間後にバリアー機能が回復することも確認された。
［実施例４］　（マウスの網膜組織を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ系解析）
　実施例１の結果に基づき、マウスの網膜組織を用いて、ＣｙｐＡ投与することによるｉｎ　ｖｉｖｏにおけるバリアー機能の変化について検討した。なお、網膜は、個体発生の過程で中枢神経系が出芽する形で形成される組織であり、脳と同様に中枢神経系の一部である。網膜の血管系は、長軸方向に全長に渡って２次元的に観察・評価することが可能であるため、本実施例では中枢神経系の代表として網膜を解析材料として用いた。
　７週齢の雄Ｃ５７Ｂ６／Ｎマウス（日本エスエルシー社）に、ＣｙｐＡを１回静脈内注射（２００μg／ｋｇ）した。硝子体への注射から３、６、又は２４時間後に網膜血管系の内皮細胞膜に局在するｃｌａｕｄｉｎ－５の発現レベルの変化及び網膜血管系の透過性を測定した。ｃｌａｕｄｉｎ－５の発現の変化は実施例１と同様にｃｌａｕｄｉｎ－５に対するウサギポリクローナル抗体を用いた蛍光免疫染色によって測定した。上記網膜血管系の透過性の測定は、次のように行った。
　まず、トレーサーの色素として１００μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ染色Ｈ３３２５８（分子量５３４Ｄａ　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社)、及び１ｍｇ／ｍＬのテトラメチルローダミン抱合リジン固定性デキストラン(分子量１０，０００Ｄａ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＰＢＳ５００μＬを左心室に注入した。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色の注入後、眼球を摘出し、直ちに４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)で１５分間室温で光から保護しながら固定し、網膜平坦マウントを作製した。それらを蛍光実装媒体中に搭載し、Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ５１０　ＭＥＴＡレーザー共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社）の下で注入したトレーサーの漏出を観察することで網膜血管系の透過性（血液網膜関門機能の指標）を測定した。実験は３回以上独立して行った。
　図４ａに示すように、末梢微小血管内皮細胞の細胞膜におけるｃｌａｕｄｉｎ－５の発現レベルは、ＣｙｐＡの静脈内注射後３時間で減少することが見出されたが、それらは２４時間で生理学的レベルに回復した。また、図４ｂに示すように、静脈内注射したトレーサーの色素の漏出はＣｙｐＡの注射後３時間後で増強しており、６時間後には漏出が３時間後と比較して減少し、２４時間後には検出不可能な生理学的レベルに戻った。これらのデータにより、ＣｙｐＡの単回静脈内注射が網膜血管系の血管関門の一時的ならびに可逆的な開口をもたらすことが明らかとなった。
［実施例５］　（薬剤の神経組織実質への取り込み解析）
　上記実施例１～４の結果に基づき、ＣｙｐＡと治療剤とを併用して投与することにより、神経系血管バリアーが可逆的に開き、治療薬を神経組織の実質に到達させることができるのではないかと考えて以下の実験を行った。
　ＣｙｐＡ前投与なしのマウス及び前投与ありのマウスに、ドキソルビシンを静脈内投与し、３時間後にドキソルビシンの大脳(Cerebrum)、肝臓(Liver)及び腎臓(Kidney)への取り込みを観察した。また、ドキソルビシンの大脳、肝臓及び腎臓への取り込みの評価には、ドキソルビシンが放つ蛍光を利用した。
　脳内移行性が低い抗がん剤であるドキソルビシン塩酸塩（６．２５ｍｇ／ｋｇ；ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｉｏｎ社）を、ＣｙｐＡ（２００μｇ／ｋｇ）の前注射の有無にかかわらず、マウスの尾静脈に注射した。ＣｙｐＡの前注射は、ドキソルビシンの注射の３時間前に静脈内に実施した。ドキソルビシン塩酸塩の注射から３時間後にマウスを屠殺し、大脳、肝臓及び腎臓を採取し、ＯＣＴ化合物内に凍結包埋した。次に、厚さ３０μｍの凍結切片を調製し、ＬＳＭ７１０レーザー共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社）下で観察した。ドキソルビシンの蛍光を４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励起し、５３０ｎｍ長パスフィルターを通して発光を観察した。
　図５の上段（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）はＣｙｐＡ前投与なしのマウスの大脳、肝臓及び腎臓で、それぞれａが大脳のＨＥ染色所見、ｂ，ｃ，ｄが大脳、肝臓及び腎臓のドキソルビシン蛍光所見である。また、下段（ｅ，ｆ，ｇ，ｈ）はＣｙｐＡ前投与ありのマウスの大脳、肝臓及び腎臓で、それぞれｅが大脳のＨＥ染色所見であり、ｆ，ｇ，ｈが大脳、肝臓及び腎臓のドキソルビシン蛍光所見である。さらに、図６は図５における大脳、肝臓及び腎臓それぞれにおけるドキソルビシンの取り込みを定量化したグラフである。図５から明らかなように上段のＣｙｐＡ前投与なしのマウスの大脳ではドキソルビシン蛍光シグナルが検出されなかった。それに対し、下段のＣｙｐＡ前投与ありのマウスの大脳では有意なドキソルビシン蛍光シグナルが検出された。これらの結果は、ＣｙｐＡ前投与により、静脈内投与されたドキソルビシンが神経系血管バリアーを通過し神経組織実質に到達したことが示された。このことから、ＣｙｐＡを用いれば、内皮細胞への傷害が少なく一時的かつ可逆的に神経組織の血管バリアーを開き、薬剤を神経組織に到達させることで神経疾患を治療することが可能となる。なお、バリアー機能のない血管系を有する肝臓及び腎臓では、ＣｙｐＡの前注射の有無にかかわらず、マウスの実質においてドキソルビシンの強い蛍光シグナルが検出され、蛍光シグナル強度はＣｙｐＡの前注射によって有意に影響されなかった。
　難治性神経疾患に対する治療戦略のなかで、現在の医学・薬学技術では神経組織に到達させることができない薬剤を、本発明によって神経組織に到達させることが可能となる。つまり、神経疾患の治療に使用可能な薬剤の選択肢が大きく拡がり、また創薬の過程において常に立ち塞がっていた大きな障壁、すなわち神経系血管バリアーを通過できないという障壁を取り除くことで医療産業において利用可能である。

Claims (5)

  1. ベイシジンに対してアゴニスト作用を有するリガンドを有効成分として含む、神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
  2. リガンドが、ポリペプチドリガンドであることを特徴とする請求項１記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
  3. ポリペプチドリガンドが、
    （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ神経系血管バリアーの可逆的開口作用を有するポリペプチド、及び
    （３）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ神経系血管バリアーの可逆的開口作用を有するポリペプチド、
    からなる群から選択される１種又は２種以上のポリペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
  4. ポリペプチドリガンドが、ペプチジル－プロリル　シス－トランス　イソメラーゼ活性を失ったシクロフィリンＡであることを特徴とする請求項２又は３記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。
  5. 神経変性疾患治療剤、網膜疾患治療剤、精神疾患治療剤、中枢神経系腫瘍治療剤、てんかん治療剤から選択される少なくとも一つの治療剤と同時併用又は逐次併用で投与されるように用いるための請求項１～４のいずれか記載の神経系血管バリアーの可逆的開口剤。

     
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