TW202003015A

TW202003015A - Ｃ端腦部多巴胺神經滋養因子（ｃｄｎｆ）及中腦星狀細胞－衍生之神經滋養因子（ｍａｎｆ）片段、包含彼之醫藥組成物及其用途

Info

Publication number: TW202003015A
Application number: TW108111334A
Authority: TW
Inventors: 瑪特薩瑪; 米可艾拉法拉; 梅加佛提萊恩; 俞利英; 瑪莉亞林達爾
Original assignee: 赫爾辛基大學
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-01-16
Also published as: JP2021519578A; JP2024056762A; KR20200138798A; IL277632A; SG11202009341TA; CN112616315A; US20210009645A1; MX2020010301A; EP3774858A1; RU2020131433A; WO2019185994A1; BR112020019696A2; CA3094236A1; AU2019244323A1

Abstract

本發明提供C端腦部多巴胺神經滋養因子(CDNF)片段序列或與該序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。C端CDNF片段保護經ER應激之神經元、運動神經元及多巴胺神經元，且該片段能夠穿透神經元細胞膜以及血腦障壁。本發明進一步提供該片段及包含該片段之醫藥組成物，彼等係用於治療退化性疾病及包括中樞神經系統疾病、糖尿病和視網膜失調之失調。本發明亦提供C端中腦星狀細胞-衍生之神經滋養因子(MANF)片段序列或與該序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列及包含該MANF片段之醫藥組成物，彼等係用於治療退化性疾病及包括中樞神經系統疾病、糖尿病和視網膜失調之失調。

Description

Ｃ端腦部多巴胺神經滋養因子（ＣＤＮＦ）及中腦星狀細胞－衍生之神經滋養因子（ＭＡＮＦ）片段、包含彼之醫藥組成物及其用途

本發明關於生物活性蛋白質片段及細胞膜穿透肽之領域，且亦關於神經滋養因子及內質網(ER)定位蛋白之領域，且更特別關於治療退化性疾病或失調之領域，諸如中樞神經系統疾病、糖尿病和視網膜失調。

神經滋養因子腦部多巴胺神經滋養因子(CDNF)及中腦星狀細胞-衍生之神經滋養因子(MANF)(Lindholm和Saarma, 2010; Lindahl等人，2017)為目前用於治療6-OHDA模式中的帕金森氏症(Parkinson’s disease; PD)大鼠之最有效的蛋白質。當在毒素前施予時，該兩種因子有效力地防止經6-OHDA誘發之帕金森氏症行為和組織學症狀(Lindholm等人，2007；Voutilainen等人，2009)。更重要地，當在經6-OHDA誘發之帕金森氏症的症狀已達影響深遠的階段施予時，以任一因子的後治療(亦即在6-OHDA誘發後進行治療)有效地恢復正常的運動行為及紋狀體的多巴胺神經分佈(Lindholm等人，2007；Voutilainen等人，2011)。CDNF亦於小鼠及恆河猴MPTP模式中保護及修復帕金森氏症之多巴胺神經元。在猴子MPTP模式中以及在嚴重的齧齒動物6-OHDA模式中，CDNF在恢復黑質緻密部(substantia nigra pars compacta)(SNPc)中的多巴胺神經元及恢復運動行為比神經膠細胞系-衍生之神經滋養因子(GDNF)更有效(Voutilainen等人，2011；Airavaara等人，2012；Voutilainen等人，2015)。支持該等因子的神經元保護作用之機制尚不完全清楚，但除了激活傳統的促進存活之抗細胞凋亡途徑外，亦曾提出該等因子調節未折疊蛋白反應(UPR)途徑，旨在減輕氧化-及抑制ER應激之經ER應激誘發之凋亡性細胞死亡(Lindahl等人，2014；Lindahl等人，2017；Voutilainen等人，2017)。許多病理生理學症狀及退化性疾病係與觸發UPR途徑之ER應激及激活的蛋白質錯誤折疊及聚集相關聯，包括糖尿病和神經退行性疾病，諸如帕金森氏症、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)(AD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和亨汀頓氏症(Huntington’s disease)(HD)。據此，CDNF及MANF之效應已顯示於各種中樞神經系統疾病中(WO2009133247；WO2007068803；及Airavaara等人，2009)。另外，CDNF及MANF抑制神經發炎，其涉及大多數(若不是全部)的CNS疾病及損傷之病理生理學(Nadella等人，2014；Neves等人，2016；Zhao等人，2013)。再者，WO2014191630揭示經遺傳修飾之非人類動物，其包含天然編碼及表現功能性MANF基因之基因的經破壞之對偶基因，其中該動物係由於經破壞及非功能性MANF基因而顯現進行性出生後減少的胰臟β細胞質量。亦提出基因治療載體，其遞送有效量的MANF或CDNF多肽或其功能性片段用於第1型或第2型糖尿病之胰臟內治療。再者，Lindahl等人，2014揭示MANF蛋白質為胰臟β細胞增生及存活必不可少的，由此構成β細胞保護及再生的治療候選物。 WO2013034805揭示包含序列CXXC之具有4至40個胺基酸長度的細胞穿透MANF或CDNF肽，其係用於治療阿茲海默氏症、帕金森氏症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、中風、周邊神經病變、癲癇、糖尿病或藥物成癮。 CDNF及MANF之結構研究顯示該等蛋白質係由兩個結構域所組成：鞘脂激活蛋白樣(saposin-like)N端結構域(Parkash等人，2009)及SAP樣C端結構域(Hellman等人，2011)。CXXC模體(motif)(人類MANF之殘基149至152，NCBI參考序列：NP_006001.3)係位於結構域之螺旋核心外部的環區域之C端結構域(C-MANF)中且以二硫化物鍵連接半胱胺酸(Hellman等人，2011)。CDNF之相應模體係位於相同的位置上(NCBI參考序列：NP_001025125.2)。已顯示當C-MANF表現在交感神經元內部時，其於試管內具有效力的抗細胞凋亡(Hellman等人，2011)。MANF及CDNF的結構及功能決定因子之特徵揭示於Lindström等人，2013中。具有選擇滲透性的細胞膜係與細胞內膜在內部隔室內相似的方式控制細胞溶質與細胞外環境之間的分子交換。出於此原因，漿膜通常代表許多分子之細胞內遞送的挑戰障礙，尤其為高分子量分子，諸如全長蛋白質。高分子量分子通過此障壁的主動運輸時常需要能夠穿過脂質雙層的特定載體。細胞穿透肽(CPP)通常為5至30個胺基酸長度的肽(或在肽內的模體)，出於彼等穿過細胞膜的能力而被廣泛地用於細胞內部遞送蛋白質、質體DNA、RNA、寡核苷酸、脂質體及抗癌藥物(Borrelli等人，2018；Bode & Löwik, 2017；Kalafatovic & Giralt, 2017；Kristensen等人，2016)。

在本發明中，已發現CDNF蛋白質的C端片段驚訝地於試管內及活體內保護經ER應激之交感神經及多巴胺神經元，且與全長CDNF相反，該片段能夠於活體內穿透神經元細胞膜以及血腦障壁。據此，本發明之目標係提供C端CDNF片段，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。本發明亦提供醫藥組成物，其包含C端CDNF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑、保存劑和安定劑。本發明之結果進一步提供用於治療退化性疾病或包括中樞神經系統(CNS)疾病、糖尿病或視網膜疾病之失調的該C端CDNF片段，其中該CNS疾病較佳地選自由下列者所組成之群組：阿茲海默氏症、帕金森氏症、亨汀頓氏症和其他的澱粉樣疾病、多發性系統萎縮症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、額顳葉退化症、路易氏體型失智症(dementia with Lewy bodies)、輕度認知障礙、創傷性腦損傷、周邊神經損傷、成癮及中風。與成熟的MANF蛋白質相反，本發明亦顯示MANF之C末端片段(C-MANF)能夠穿透多巴胺神經元的細胞膜且保護在培養物中的神經元。本發明之另一目標因此係提供用於治療退化性疾病或失調(包括中樞神經系統(CNS)疾病)之C端MANF片段，其較佳地具有36至78個胺基酸長度，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的位置33至68或19至52之至少連續的胺基酸殘基：

或較佳地與SEQ ID NO：2的位置33至68或19至52之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，其中該片段係經靜脈內或周邊投予、腹膜內、皮下、鼻內、透皮、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予。亦提供用於治療退化性疾病或失調(包括中樞神經系統(CNS)疾病)之醫藥組成物，其包含該C端MANF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑和安定劑，其中該片段係經靜脈內或周邊投予、腹膜內、皮下、鼻內、透皮、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予。本發明之另外目標係提供用於治療第1型或第2型糖尿病或視網膜疾病之C端MANF片段，其較佳地具有36至78個胺基酸長度，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的位置33至68或19至52之至少連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：2的位置33至68或19至52之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。本發明亦提供用於治療第1型或第2型糖尿病或視網膜疾病之醫藥組成物，其包含該C端MANF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑、保存劑和安定劑。本發明之上述及其他優點和好處係以所附申請專利範圍中的特徵所描述之方式達成。

本發明之詳細說明本發明關於神經滋養因子蛋白CDNF。CDNF多肽為具有187個胺基酸總長度的有訊號肽之全長人類CDNF及具有161個胺基酸總長度的沒有訊號肽之成熟的人類CDNF(參見圖1B)。本發明亦關於神經滋養因子蛋白MANF。特別重要的MANF多肽為具有179個胺基酸總長度的有訊號肽之全長人類MANF及具有158個胺基酸總長度的沒有訊號肽之成熟的人類MANF(參見圖1B)。如本文所使用之適用於CDNF或MANF多肽的術語「C端片段」一般地可包含至少約33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57個鄰接的或連續的胺基酸，通常至少約43或55個鄰接的或連續的胺基酸，更通常至少約57或60個鄰接的或連續的胺基酸位於該多肽之C端SAP樣結構域中(參見圖1A和1B)。C端片段亦可具有比61或65個鄰接的或連續的胺基酸更長的長度，在一些例子中超過70個鄰接的或連續的胺基酸。C端片段最佳地包含C端結構域的33至57、33至61、33至81、43至57、43至61、43至81或60至65個鄰接的或連續的胺基酸。該等C端片段為保留完整多肽之至少部分生物活性的「功能性片段」，且甚至可能具有完整多肽不具有的性質。除了CDNF/MANF的天然生成之對偶基因變體以外，可藉由突變引入改變至CDNF/MANF核酸序列中，其引起經編碼之CDNF/MANF多肽或其C端片段之胺基酸序列的變更，諸如伸長、插入及缺失。導致「非必需」胺基酸殘基上的胺基酸取代之核苷酸取代可在CDNF/MANF多肽及其C端結構域之序列中進行。「非必需」胺基酸殘基為可在CDNF/MANF之野生型序列中修飾而不變更其生物活性的殘基，而此等生物活性為「必需」胺基酸殘基必要的。例如，預測在本發明之CDNF/MANF分子中保守的胺基酸殘基為必需的且特別不肯順從變更。可進行保守取代之胺基酸為此項技術中所熟知。各胺基酸可為天然或非天然胺基酸。術語「非天然胺基酸」係指為天然胺基酸的同類物之有機化合物，因為其具有類似於天然胺基酸的結構，使得其呈現像天然胺基酸的結構及反應性。非天然胺基酸可為經修飾之胺基酸及/或胺基酸類似物，其不為20種常見的天然生成胺基酸中之一者或稀有的天然胺基酸硒代半胱胺酸或焦離胺酸(pyro lysine)。非天然胺基酸亦可為天然胺基酸之D-異構物。適合的胺基酸之實例包括但不限於丙胺酸、別異白胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、環己基丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、4-氟苯基丙胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、高脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、萘基丙胺酸、正白胺酸、苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、哌啶甲酸(pipecolic acid)、脯胺酸、焦麩胺酸、肌胺酸、絲胺酸、硒代半胱胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、衍生物或彼之組合。本發明之特定的實施態樣包括C端CDNF片段或C端MANF片段，其中至少一、二、三、四或更多個連續的胺基酸具有交替的手性。如本文所使用之手性係指胺基酸之「D」及「L」異購物。在本發明特別的實施態樣中，至少一、二、三、四或更多個連續的胺基酸具有交替的手性及剩餘的胺基酸為L-胺基酸。在本發明中，已證明細胞攝取本發明之C端CDNF片段及C端MANF片段至神經元細胞中。在特定的實施態樣中，該攝取與全長CDNF或MANF相比而更好至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍，且特定的肽比全長CDNF或MANF甚至更好13倍。在特定的實施態樣中，與對照物(諸如全長人類CDNF)相比，本發明證明本發明之C端CDNF片段的改進之細胞攝取效率。在特定的實施態樣中，與對照物(諸如全長人類MANF)相比，本發明證明本發明之C端MANF片段改進細胞攝取效率。如本文所使用之細胞攝取效率係指C端CDNF片段或C端MANF片段穿過細胞膜的能力。本發明之C端CDNF片段或C端MANF片段的細胞攝取不依賴於接受體或細胞類型。熟習此項技術領域者可藉由如下測試C端CDNF片段及/或C端MANF片段之攝取效率：比較(i)以細胞類型(例如神經元細胞、內皮細胞)內化之細胞穿透肽(諸如C端CDNF片段或C端MANF片段)的量與(ii)以相同的細胞類型內化之對照肽(諸如全長CDNF/MANF)的量。為了測量細胞攝取效率，可將細胞類型在細胞穿透肽(諸如C端CDNF片段或C端MANF片段)的存在下經一段特定的期間(例如30分鐘、1小時、2小時等)培育，然後定量以細胞內化之細胞穿透肽的量。分開地將相同濃度的對照物在細胞類型的存在下經相同的期間培育，且定量以細胞內化之第二肽的量。定量可藉由螢光標記(例如以FITC染料)細胞穿透肽(諸如C端CDNF片段或C端MANF片段)及使用此項技術熟知的技術測量螢光強度而達成。與適合的對照物相比，本發明之C端CDNF片段及C端MANF片段亦證明對細胞(例如神經元細胞)的保護效應(參見例如圖14和15)。如本文所使用之保護效應係指本發明之C端CDNF片段或C端MANF片段促進例如多巴胺神經元或經ER應激之神經元細胞存活的能力。熟習此項技術領域者可藉由如下測試該保護效應：比較(i)本發明之C端CDNF片段或C端MANF片段對細胞類型(例如交感神經元細胞或多巴胺神經元)存活的劑量與(ii)對照肽以相同的細胞類型之存活水平或無添加之神經滋養因子以相同的細胞類型之存活水平。為了測量細胞存活率，可將細胞類型在本發明之C端CDNF片段或C端MANF片段的存在下經一段特定的期間(例如30分鐘、1小時、2小時等)培育，然後定量細胞的細胞存活率。分開地將相同濃度的對照肽在細胞類型的存在下經相同的期間培育，且以細胞定量第二肽的細胞存活率。另一選擇地，將細胞類型以無神經滋養因子經相同的期間培育，且以細胞定量細胞存活率。在一實施態樣中，為了測量細胞存活率，可將細胞類型以本發明之C端CDNF片段或C端MANF片段注射且經一段特定的期間(例如30分鐘、1小時、2小時等)培育，然後定量細胞的細胞存活率。將對照細胞以緩衝劑(亦即無神經滋養因子)注射且將對照細胞經相同的期間培育，且以細胞定量細胞存活率。在特定的實施態樣中，與在無添加之生長因子的存在下培育或以無生長因子的緩衝劑注射之細胞相比，本發明之C端CDNF片段的保護效應(以細胞存活率測量)為至少1.01倍、至少1.02倍、至少1.03倍、至少1.04倍、至少1.05倍、至少1.05倍、至少1.06倍、至少1.07倍、至少1.08倍、至少1.09倍、至少1.1倍、至少1.11倍、至少1.12倍、至少1.13倍、至少1.14倍、至少1.15倍、至少1.16倍、至少1.17倍、至少1.19倍、至少1.2倍、至少1.21倍、至少1.23倍、至少1.25倍、至少1.26倍、至少1.27倍、至少1.28倍、至少1.29倍、至少1.3倍、至少1.31倍、至少1.32倍、至少1.33倍、至少1.34倍、至少1.35倍、至少1.37倍、至少1.4倍、至少1.42倍、至少1.43倍、至少1.45倍、至少1.48倍、至少1.49倍、至少1.5倍、至少1.55倍、至少1.6倍、至少1.65倍、至少1.7倍、至少1.75倍、至少1.8倍、至少1.85倍、至少1.89倍、至少1.9倍、至少1.94倍、至少1.95倍、至少2.0倍、至少2.05倍、至少2.10倍、至少2.11倍、至少2.14倍、至少2.15倍、至少2.16倍、至少2.19倍、至少2.2倍、至少2.21倍、至少2.23倍、至少2.24倍、至少2.25倍、至少2.26倍、至少2.28倍、至少2.3倍、至少2.32倍、至少2.35倍、至少2.37倍、至少2.39倍、至少2.4倍、至少2.42倍、至少2.45倍、至少2.5倍、至少2.52倍、至少2.55倍、至少2.6倍、至少2.65倍、至少2.7倍、至少2.75倍、至少2.8倍、至少2.85倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍或至少4.0倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.01倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.02倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.03倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.04倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.05倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.05倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.06倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.07倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.08倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.09倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.1倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.11倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.12倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.13倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.14倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.15倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.16倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.17倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.19倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.2倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.21倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.23倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.25倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.26倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.27倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.28倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.29倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.3倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.31倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.32倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.33倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.34倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.35倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.37倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.4倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.42倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.43倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.45倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.48倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.49倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.5倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.55倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.6倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.65倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.7倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.75倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.8倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.85倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.89倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.9倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.94倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少1.95倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.0倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.05倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.10倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.11倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.14倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.15倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.16倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.19倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.2倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.21倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.23倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.24倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.25倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.26倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.28倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.3倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.32倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.35倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.37倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.39倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.4倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.42倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.45倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.5倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.52倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.55倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.6倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.65倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.7倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.75倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.8倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.85倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少2.9倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.0倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.1倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.2倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.3倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.4倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.5倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.6倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.7倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.8倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少3.9倍。在一實施態樣中，與無生長因子培育之細胞相比，保護效應為至少4.0倍。在特定的實施態樣中，與在無添加之生長因子的存在下培育或以無生長因子的緩衝劑注射之細胞相比，本發明之C端MANF片段的保護效應為至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.10倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍或至少4.0倍。據此，本發明提供C端CDNF片段，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，其中該片段為細胞膜穿透肽且對神經元細胞具有保護效應，較佳地用作為藥劑。在一實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性的序列。在較佳的實施態樣中，片段(較佳地具有至多33至81個胺基酸長度)包含在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列同一性。術語「側翼序列」係指使該連續的胺基酸殘基之兩個或至少一個末端伸長之胺基酸。在一實施態樣中，該連續的胺基酸殘基之側翼的該序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性。不想受到任何理論的限制，圖15的結果顯示對細胞膜穿透及神經元細胞之保護效應重要的胺基酸序列模體係位於SEQ ID NO：1的位置約38及約70之胺基酸殘基之間。此區域含有兩個螺旋結構(螺旋2和螺旋3)及在彼等之間的CXXC模體(參見圖23)。再者，圖16和17的結果顯示含有螺旋1和2及CXXC模體之C-CDNF肽15(33 aa)對神經元細胞具有保護效應。據此，本發明係指向其中C端CDNF片段包含下述或由下述所組成之實施態樣：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70、37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70、31至70、38至73、37至73、36至73、35至73、34至73、33至73、32至73、31至73、25至57、24至57、23至57、22至57、21至57、20至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置38至70、37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70、31至70、38至73、37至73、36至73、35至73、34至73、33至73、32至73、31至73、25至57、24至57、23至57、22至57、21至57、20至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。在一實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：與SEQ ID NO：1的位置38至70、37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70、31至70、38至73、37至73、36至73、35至73、34至73、33至73、32至73、31至73、25至57、24至57、23至57、22至57、21至57、20至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之序列具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性的序列。在一實施態樣中，若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性。在另一較佳的實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73(肽6；SEQ ID NO：15)、25至73(肽4；SEQ ID NO：13)、21至73(肽3；SEQ ID NO：12)、21至70(肽7；SEQ ID NO：16)、31至81(肽5；SEQ ID NO：14)、25至81(肽2；SEQ ID NO：11)、25至57(肽15；SEQ ID NO：24)或37至73(肽8；SEQ ID NO：17)之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73、25至73、21至73、21至70、31至81、25至81、25至57或37至73之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。在一實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：與SEQ ID NO：1的位置31至73、25至73、21至73、21至70、31至81、25至81、25至57或37至73之序具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性的序列。在一實施態樣中，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性。在另一較佳的實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。在一實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：與SEQ ID NO：1的位置31至73具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性的序列。在另一較佳的實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置25至57之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。在一實施態樣中，C端CDNF片段包含下述或由下述所組成：與SEQ ID NO：1的位置25至57之序列具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性或序列同一性的序列。在較佳的實施態樣中，本發明係指向C端CDNF片段，其係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：1之序列具有90%之同源性的序列。在一實施態樣中，該序列與SEQ ID NO：1之序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性。本發明亦關於C端MANF片段，其係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：2之序列具有90%之同源性的序列。在一實施態樣中，該序列與SEQ ID NO：2之序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性。如說明書及以下的申請專利範圍章節中所使用之術語「片段」包括原生肽(降解產物、經合成方式合成之肽或重組肽)及可具有例如使得肽更安定或較低的免疫性之修飾的修飾肽。此等修飾包括但不限於環化、N端修飾、C端修飾、肽鍵修飾、主鏈修飾及殘基修飾。片段亦可包含另外的伸長、缺失、取代或插入。在一實施態樣中，片段抵抗蛋白酶切割。在一實施態樣中，片段包含伸長、缺失、插入、取代或修飾，使得該伸長、缺失、插入、取代或修飾取消至少一個蛋白酶切割位點。如本文所使用之「蛋白酶切割位點」係指以蛋白酶辨識且切割之胺基酸序列。在一些實施態樣中，C端CDNF片段或C端MANF片段包括一或多個可以半胱胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶或絲胺酸蛋白酶切割之蛋白酶切割位點。在一些實施態樣中，蛋白酶切割位點為如以例如圖24或圖25或表7和8例證之蛋白酶切割位點。如本文所使用之術語「蛋白酶抗性片段」或「片段抵抗蛋白酶切割」係指含有經變更之胺基酸序列的C端CDNF片段或C端MANF片段，與相應的原生C端CDNF片段或C端MANF片段相比，其取消至少一個原生蛋白酶切割位點或改變接近或鄰近於原生蛋白酶切割位點之序列，使得阻止、抑制、減少或減慢蛋白酶切割。在一些實施態樣中，適合的變更為取消至少一個蛋白酶切割位點。在一些實施態樣中，適合的變更取消至少兩個蛋白酶切割位點。在一些實施態樣中，適合的變更取消至少三個蛋白酶切割位點。在一些實施態樣中，適合的變更取消至少四或更多個蛋白酶切割位點。在一實施態樣中，已取消所有的半胱胺酸蛋白酶切割位點。在一實施態樣中，已取消所有的金屬蛋白酶切割位點。在一實施態樣中，已取消所有的絲胺酸蛋白酶切割位點。變更可為胺基酸取代、缺失、插入、伸長或修飾。例如，在相應於SEQ ID NO：1的殘基1至75(例如 1至8、16至23、26至33、32至39、37至44、38至45、43至50、46至53、59至66、60至67和68至75)之區域內的任何一種胺基酸可經任何其他的胺基酸取代、缺失或修飾。例如，在鄰近於蛋白酶切割位點的位置之取代可影響切割位點的蛋白酶辨識。在各辨識位點內的一或多個額外的胺基酸之取代或插入可取消一或多個蛋白酶切割位點。在簡併位置(degenerate position)的殘基中之一或多者的缺失亦可取消兩個蛋白酶切割位點。在一些實施態樣中，蛋白酶抗性片段在相應於SEQ ID NO：1之46、49、35、63、4、71、19、40、41、62、29的位置上含有胺基酸取代或修飾。在一些實施態樣中，適合於本發明之蛋白酶抗性片段可含有額外的變更。例如，可改變SEQ ID NO：1之至多20%或更多的殘基(例如可改變或變更至多1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或更多的殘基)。因此，適合於本發明之蛋白酶抗性片段可與SEQ ID NO：1具有至少80%相同的胺基酸序列，包括至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%。如本文所使用之術語「半胱胺酸蛋白酶之蛋白酶切割位點」(亦稱為「半胱胺酸蛋白酶切割位點」或「半胱胺酸蛋白酶切割序列」)係指當作為以半胱胺酸蛋白酶進行酵素蛋白酶切割之辨識序列的肽或蛋白質之胺基酸序列。在一些實施態樣中，半胱胺酸切割位點可包含在SEQ ID NO：1中的QILH|SWGE或HSWG|EECR，其中切割位點係以「|」顯示於序列中。如本文所使用之術語「金屬蛋白酶切割位點」(亦稱為「金屬蛋白酶切割位點」或「金屬蛋白酶切割序列」)係指當作為以金屬蛋白酶進行酵素蛋白酶切割之辨識序列的肽或蛋白質之胺基酸序列。在一些實施態樣中，金屬蛋白酶切割位點可包含在SEQ ID NO：1中的DLRK|MRVA、DYVN|LIQE、MPAM|KICE、QICE|LKYE、LAPK|YAAT或RVAE|LKQI，其中切割位點係以「|」顯示於序列中。如本文所使用之術語「絲胺酸蛋白酶切割位點」(亦稱為「絲胺酸蛋白酶切割位點」或「絲胺酸蛋白酶切割序列」)係指當作為以絲胺酸蛋白酶進行酵素蛋白酶切割之辨識序列的肽或蛋白質之胺基酸序列。在一些實施態樣中，絲胺酸切割位點可包含在SEQ ID NO：1中的VAEL|KQIL、LDLA|SVDL或TDYV|NLIQ，其中切割位點係以「|」顯示於序列中。在一實施態樣中，蛋白酶係選自由半胱胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶所組成之群組。在一實施態樣中，半胱胺酸蛋白酶為組織蛋白酶K。在一實施態樣中，金屬蛋白酶為MMP-9或MMP-3。在一實施態樣中，絲胺酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶A(牛型)或彈性蛋白酶-2。例如，在相應於SEQ ID NO：2的殘基11至70(例如 11至18、18至25、21至28、24至31、33至40、54至61、59至66或63至70)之區域內的任何一種胺基酸可經任何其他的胺基酸取代、缺失或修飾。例如，在鄰近於蛋白酶切割位點的位置之取代可影響切割位點的蛋白酶辨識。在各辨識位點內的一或多個額外的胺基酸之取代或插入可取消一或多個蛋白酶切割位點。在簡併位置的殘基中之一或多者的缺失亦可取消兩個蛋白酶切割位點。在一些實施態樣中，蛋白酶抗性片段在相應於SEQ ID NO：2之62、27、14、66、36、21、57或24的位置上含有胺基酸取代。在一些實施態樣中，適合於本發明之蛋白酶抗性片段可含有額外的變更。例如，可改變SEQ ID NO：2之至多20%或更多的殘基(例如可改變或變更至多1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或更多的殘基)。因此，適合於本發明之蛋白酶抗性片段可與SEQ ID NO：2具有至少80%相同的胺基酸序列，包括至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%。如本文所使用之術語「金屬蛋白酶切割位點」(亦稱為「金屬蛋白酶切割位點」或「金屬蛋白酶切割序列」)係指當作為以金屬蛋白酶進行酵素蛋白酶切割之辨識序列的肽或蛋白質之胺基酸序列。在一些實施態樣中，金屬蛋白酶切割位點可包含在SEQ ID NO：2中的KINE|LMPK、KINE|LMPK、STVD|LKKL、QICE|LKYD或LMPK|YAP，其中切割位點係以「|」顯示於序列中。如本文所使用之術語「絲胺酸蛋白酶切割位點」(亦稱為「絲胺酸蛋白酶切割位點」或「絲胺酸蛋白酶切割序列」)係指當作為以絲胺酸蛋白酶進行酵素蛋白酶切割之辨識序列的肽或蛋白質之胺基酸序列。在一些實施態樣中，絲胺酸切割位點可包含在SEQ ID NO：2中的VKEL|KKIL、DKQI|DLST、SDYI|RKIN、IDLS|TVDL，其中切割位點係以「|」顯示於序列中。在一實施態樣中，蛋白酶係選自由金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶所組成之群組。在一實施態樣中，金屬蛋白酶為MMP-9或MMP-2。在一實施態樣中，絲胺酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶A(牛型)、彈性蛋白酶-2或類囊體(thylakoidal)加工肽酶。在本發明之實施態樣中，片段長度係在33至81、43至81、43至61或50至81個胺基酸的範圍內。片段長度較佳地在55至75、55至70、55至61、61至65或61至70個胺基酸的範圍內。片段長度更佳地在49至61、50至61、51至61、53至61、57至61、55至69、55至68、55至67、55至66、56至69、56至68、56至67、56至61、57至69、57至68、57至67、57至61、58至69、58至68、58至67、58至61、59至69、59至68、59至67、59至61、60至69、60至68、60至67、60至66、60至64、60至63、61至62、61至63、61至64、61至65、61至66或61至67個胺基酸的範圍內。例如，較佳的片段可由至少33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75個胺基酸所組成。在一實施態樣中，C端CDNF片段係由33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61個胺基酸所組成。在一實施態樣中，C端MANF片段係由33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61個胺基酸所組成。片段可包含天然生成胺基酸中任一者，諸如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸，以及非常規或經修飾之胺基酸。片段較佳地與人類CDNF或MANF蛋白質中的C端結構域之序列具有至少100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%之同源性或序列同一性。片段更佳地與人類CDNF或MANF蛋白質中的C端結構域之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。如本文所使用之「同源性」係指在參考序列與第二序列的至少一個片段之間的序列相似性。如下文所述，BLAST係基於同一性及相似性百分比來比較序列。在二或更多個胺基酸序列的上下文中，術語「相同的」或百分比「同一性」係指二或更多個相同的序列或子序列。當比較及比對在比較窗口或選定區域內根據使用下列的序列比較演算法或藉由人工比對及視覺檢查中之一者所測量之最大相應性時，若兩個序列具有特定百分比之相同的胺基酸殘基時(亦即在指定區域內或當未指定時於整個序列內具有29%之同一性，隨意地為30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%之同一性)，則兩個序列為「實質上相同的」。隨意地，同一性係存在於具有至少約10個胺基酸長度或更長的區域內，更佳地在具有10、15、20、25、30或更多個胺基酸長度的區域內。關於序列比較，通常以一個序列充當為參考序列，與試驗序列進行比較。當使用序列比較演算法時，將試驗序列及參考序列輸入電腦中，若必要時，選定子序列坐標，且選定序列演算法程式參數。可使用預設程式(Default program)參數或可選定替代參數。序列比較演算法接著基於程式參數計算相對於參考序列之試驗序列的序列同一性百分比。當比較兩個序列的同一性時，序列不必為鄰接的，但是任何間隙會為其帶來可能降低總體同一性百分比的損失。如本文所使用之「比較窗口」包括對鄰接的位置數目中任一者之區段的引用，其中在最優地比對兩個序列後，可將序列與相同數目的鄰接位置之參考序列進行比較。用於比較的序列比對之方法為此項技術中所熟知，諸如ClustalW或FASTA。適合於測定序列同一性及序列相似性百分比之演算法的兩個實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別說明於Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402及Altschul等人，(1990)J. Mol Biol 215(3)-403-410中。用於胺基酸序列之BLASTP程式係使用3之字長與10之期望值(E)作為預設值及使用50之BLOSUM62評分矩陣[參見Henikoff和Henikoff, (1992)Proc Natl Acad Sci USA 89(22): 10915-10919]比對值(B)、10之期望值(E)、M=5、N=-4及雙股比較。PAM30評分矩陣亦可適用於短的胺基酸序列。 BLAST演算法亦執行在兩個序列之間的相似性之統計學分析(參見例如Karlin和Altschul, (1993)Proc Natl Acad Sci USA 90(12): 5873-5877)。以BLAST演算法提供的一種相似性度量為最小和概率(P(N))，其提供兩個胺基酸序列之間的匹配會偶然發生的概率之指標。與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性的C端CDNF較佳地包含在SEQ ID NO：1的位置52至55之序列 CXXC，其中X為任何胺基酸。與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性的該序列更佳地由下述所組成：在SEQ ID NO：3之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：

其中X為任何胺基酸。在另一較佳的實施態樣中，與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性的該序列包含在SEQ ID NO：1的位置52至55之序列CKGC。在最佳的具體實例中，該片段具有SEQ ID NO：4之序列：

或與SEQ ID NO：4之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99之同源性的序列。在一實施態樣中，C端CDNF片段不含有其天然C端胺基酸，亦即ER滯留訊號。據此，在較佳的實施態樣中，片段缺乏相應於SEQ ID NO：1的位置78至81之ER滯留訊號KTEL。本發明亦顯示片段可與可檢測的化學或生化部分(諸如FITC-標記物)共軛。如本文所使用之「可檢測的化學或生化部分」意指以容易檢測肽為目的而展現胺基酸序列或可檢測的化學或生化部分之標籤；諸如選自下列之可檢測的分子：可見光、螢光、化學發光或其他可檢測的染料；在受質的存在下可檢測的酵素，例如具有NBT加上BCIP之鹼性磷酸酶或具有適合的受職之過氧化酶；可檢測的蛋白質，例如綠螢光蛋白質。標籤較佳地不阻止或妨礙片段穿透至靶細胞中。亦較佳的是以C端CDNF片段或C端MANF片段之N端及/或C端修飾來增加片段的安定性及/或細胞穿透性。CDNF片段或MANF片段之端點的乙醯化-醯胺化(亦即N端乙醯化及C端醯胺化)為此項技術中已知的選擇之一(參見例如Marino等人，2015, ACS Chem. Biol. 10:1754-1764)。因為C端CDNF片段及C端MANF片段二者有效力地保護多巴胺神經元免於死亡(參見圖4和5)，所以先前技術(諸如WO2009133247及EP1969003)顯示片段可用於治療中樞神經系統(CNS)疾病，諸如阿茲海默氏症、帕金森氏症(PD)、多發性系統萎縮症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉退化症、路易氏體型失智症、輕度認知障礙、亨汀頓氏症(HD)、創傷性腦損傷、藥物成癮及中風。支持本發明的更多結果提供在以PD模式顯示出C-CDNF效應的圖8中及以ALS模式顯示出C-CDNF效應的圖11和12中。亦值得注意的是當在神經修復的更臨床定向之設置中測試時，亦即當在6-OHDA後添加時，短的MANF肽(MANF4)在6-OHDA模式的帕金森氏症大鼠中無效(參見圖9)。 C端CDNF片段或C端MANF片段在CNS中的效應包括靶向神經元，但亦靶向CNS中的其他細胞類型，諸如小神經膠質細胞、星狀細胞和神經元幹細胞或神經元前驅細胞，且除了存活以外，彼等亦具有任何其他的性質，諸如遷移、增生、分化及突變。在圖10中顯示的吾等結果確認C端MANF片段有效治療第I型和第II型糖尿病。再者，WO2016057579揭示CDNF及MANF亦在視網膜失調中具有活性。據此，本發明係指向治療該等中樞神經系統(CNS)疾病、糖尿病和視網膜失調。經ER應激誘發之凋亡性細胞死亡亦促成其他的退化性疾病，其中受影響的組織或器官的功能或結構隨時間進行性地惡化(綜述參見Oakes和Papa，Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2015. 10:173-94)。此等退化性疾病的一些其他實例為年齡相關性黃斑部病變、斯特格病(Stargardt disease)、青光眼、色素沉著性視網膜炎和視神經退化；尼曼-匹克二氏症(Niemann-Pick disease)；動脈粥樣硬化；進行性上眼神經核麻痺症；癌症；泰-薩二氏症(Tay-Sachs disease)；圓錐角膜；發炎性腸疾病(IBD)；前列腺炎；骨關節炎；骨質疏鬆症；及類風濕性關節炎；以及更多的急性症狀，諸如創傷性腦損傷或缺血性再灌注損傷，例如心肌缺血性損傷、腎缺血性損傷或中風。本發明因此亦指向治療退化性疾病或失調。在治療方法中，將醫藥有效量的C端片段投予患者。換言之，根據本發明之片段係用於治療退化性疾病或失調，包括中樞神經系統(CNS)疾病及其他的神經性失調，諸如阿茲海默氏症、帕金森氏症(PD)、PD之非運動症狀(諸如便秘、抑鬱和幻覺)、多發性系統萎縮症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、缺血性中風、周邊神經病變、額顳葉退化症、路易氏體型失智症、輕度認知障礙、亨汀頓氏症、癲癇、創傷性腦損傷、周邊神經損傷、出血性中風或成癮(例如濫用古柯鹼、嗎啡、安非他命或酒精)及第I型和第II型糖尿病或視網膜失調。片段更佳地用於治療帕金森氏症或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症。投予患者的CDNF或MANF之C端片段的實際劑量(例如有效量)可由身體及生理因素決定，諸如體重、症狀的嚴重性、欲治療之疾病類型、先前或同時的治療干預、患者的特發病及投予途徑。負責投予的醫師可決定組成物中的活性成分濃度及適合於個別個體的劑量。在本發明之一個實施態樣中，可將C端CDNF片段或MANF片段併入醫藥組成物中。本發明之此等組成物係藉由將具有所欲純度的肽與隨意的生理上可接受之載劑(諸如奈米載劑)、賦形劑或安定劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed.,(2012))而製備，以冷凍乾燥餅或水性溶液儲存。可接受之載劑、賦形劑或安定劑在所使用的劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他的有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣類、雙醣類和其他醣類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；形成鹽之相對離子，諸如鈉；及/或非離子性界面活性劑，諸如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。片段亦可包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合而製備之微膠囊中(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球，微乳液，奈米粒子和奈米膠囊)或在巨乳液中。此等技術揭示於同上的Remington's Pharmaceutical Sciences中。在一實施態樣中，醫藥組成物可包含例如至少約0.1%之活性化合物。在其他的實施態樣中，活性化合物可包含介於單元重量的約2%至約75%之間或介於約25%至約60%之間，以及例如在其中可導出的任何範圍。在其他的非限制性實例中，醫藥組成物或調配物的劑量可包含每一投予約1 ng/kg/體重之C端CDNF片段或C端MANF片段、約5 ng/kg/體重、約10 ng/kg/體重、約50 ng/kg/體重、約100 ng/kg/體重、約200 ng/kg/體重、約350 ng/kg/體重、約500 ng/kg/體重、1 μg/kg/體重、約5 μg/kg/體重、約10 μg/kg/體重、約50 μg/kg/體重、約100 μg/kg/體重、約200 μg/kg/體重、約350 μg/kg/體重、約500 μg/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重至約1000 mg/kg/體重之C端CDNF片段或C端MANF片段或更多，以及其中可導出的任何範圍。在自本文所列數量可導出的範圍之非限制性實例中，可基於上述數量投予約5 mg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 μg/kg/體重至約500毫克/kg/體重之C端CDNF片段或C端MANF片段的範圍等。本發明亦以可進一步包括神經細胞之醫藥組成物為特徵。神經細胞可為例如神經元、神經幹細胞或神經元前驅細胞。在另一實施態樣中，醫藥組成物包含治療有效量的包含編碼如上文定義之C端片段的核苷酸序列之重組載體、包含編碼如上文定義之C端片段的核苷酸序列之重組病毒載體或表現如上文定義之C端片段的宿主細胞。該病毒載體較佳地選自由下列者所組成之群組：腺病毒、腺相關病毒、反轉錄酶病毒(諸如慢病毒)、皰疹病毒和乳頭狀瘤病毒，其包含編碼如上文定義之C端片段的多核苷酸。重組載體及重組病毒載體通常包括表現控制序列，如組織型或細胞型特異性啟動子，其於試管內及活體內二者引導本發明之多核苷酸在各種系統中的表現。載體亦可為雜合載體，其含有在超過一個系統中表現所必需的調節元件。含有該等各種調節系統的載體可於市場上取得，且熟習此項技術領域者輕易地能夠選殖如本文所定義之C端片段至此等載體中。適合於本發明使用之重組病毒載體的選擇、插入用於表現C端片段之核酸序列至載體中的方法及遞送病毒載體至關注細胞之方法係在此項技術之範圍內。參見例如Dornburg R(1995), Gene Therap. 2: 301-310。投予途徑係依照已知的方法，以及藉由如下述之靜脈內或周邊投予、腹膜內、皮下、鞘內、腦室內、鼻內、透皮、腦內、肌肉內、眼內、動脈內或病變內裝置或持續釋放型系統之注射或輸注的一般途徑。C端片段或包含該片段之醫藥組成物可藉由輸注或快速濃注而連續投予。通常在失調允許的情況下，應調配且給藥用於位點特異性遞送之片段。投予可為連續的或定期的。投予可藉由恆定或可程式化流動的可植入泵或藉由定期注射來完成。以周邊或全身性投予較佳，因為本發明顯示C端MANF及CDNF片段二者能夠穿透神經元細胞膜以及血腦障壁(參見圖6和7)。其他較佳的投予途徑為皮下、鞘內、腦室內、鼻內或透皮投予。在圖13中，C-CDNF蛋白質之皮下注射在患有誘發性腦中風之大鼠中顯示出效應。持續釋放型製劑的適合實例包括含有片段之固體疏水性聚合物的半透性基質，該基質具有特型製品的形式，例如膜或微膠囊。持續釋放型基質的實例包括聚酯、水凝膠(如以Langer等人，J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982)所述)或聚乙烯醇、聚交酯(美國專利第3,773,919號、EP 58,481)或不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(同上的Langer等人)。基因治療載體可使用如上文用於肽片段所定義之相應投予模式遞送至個體，較佳地藉由例如靜脈內注射或藉由腹膜內、皮下、鞘內或腦室內投予。基因治療載體之醫藥製劑可包括可接受之稀釋劑或可包含其中包埋基因遞送媒劑之緩釋基質。圖23之序列比對顯示C端CDNF及MANF肽之高序列同一性。據此，本發明人自本文呈現的結果推斷亦在C端MANF片段中對細胞膜穿透及神經元細胞之保護效應重要的胺基酸序列模體係位於相應於SEQ ID NO：1的位置38至70之SEQ ID NO：2的位置約33及約68之胺基酸殘基之間及相應於SEQ ID NO：1的位置25至57之SEQ ID NO：2的位置約19及52之胺基酸殘基之間。本發明因此指向較佳地具有36至78個胺基酸長度的C端MANF片段，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的位置33至68或19至52之至少連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：2的位置33至68或19至52之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：2的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列同一性，其中該片段為細胞膜穿透肽且對神經元細胞具有保護效應。在較佳的實施態樣中，本發明係指向用於治療退化性疾病或失調(包括中樞神經系統(CNS)疾病)之C端MANF片段，其係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：2之序列具有至少90%之同源性的序列，其中該片段係經靜脈內或周邊投予、腹膜內、皮下、鼻內、透皮、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予。基於圖10所示之結果，本發明進一步指向用於治療第1型或第2型糖尿病之C端MANF片段，其係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：

或與SEQ ID NO：2之序列具有至少90%之同源性的序列。關於所有上述之實施態樣，與SEQ ID NO：2之序列具有至少90%之同源性的該序列較佳地包含在SEQ ID NO：2的位置47至50之序列CXXC，其中X為任何胺基酸。與SEQ ID NO：2之序列具有至少90%之同源性的該序列更佳地由下述所組成：SEQ ID NO：6之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：

其中X為任何胺基酸。該MANF片段最佳地具有SEQ ID NO：5之序列：

或與SEQ ID NO：5之序列具有至少90%之同源性的序列。在一實施態樣中，C端MANF片段不含有含有其天然C端胺基酸，亦即ER滯留訊號。據此，在較佳的實施態樣中，片段缺乏相應於SEQ ID NO：2的位置75至78之ER滯留訊號RTDL。 C端MANF片段可與上文以C端CDNF片段所討論的相同方式修飾。本發明進一步指向用於治療中樞神經系統(CNS)疾病、第1型或第2型糖尿病或視網膜失調之醫藥組成物，其包含C端MANF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑和安定劑。包含C端MANF片段之該醫藥組成物較佳地經周邊投予患者且因此較佳地適合於周邊投予。本說明書亦指向用於治療退化性疾病或包括中樞神經系統(CNS)疾病、第I型或第II型糖尿病或視網膜失調的失調之方法，其中將醫藥有效量的如本文定義之C端CDNF片段或C端MANF片段投予患者。該片段較佳地經周邊投予。本說明書亦指向如本文定義之C端CDNF片段或C端MANF片段用於製造藥劑之用途，該藥劑係用於治療退化性疾病或包括中樞神經系統(CNS)疾病、第I型或第II型糖尿病或視網膜失調之失調。本發明亦提供單離之多核苷酸，其包含編碼C-CDNF片段之核苷酸序列，該片段具有SEQ ID NO：4之序列：

或與SEQ ID NO：4之序列具有至少90%之同源性的序列。本發明進一步提供編碼該單離之多核苷酸的表現載體及以該載體變形之宿主細胞。適合於表現該單離之多核苷酸的重組載體的選擇、插入用於表現C-CDNF片段之核酸序列至載體中的方法及遞送重組載體至關注細胞之方法係在此項技術之範圍內。參見例如Tuschl, T.(2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448。將本文用於例證本發明之背景且特別用於提供有關其實施的額外細節之出版物及其他材料併入本文以供參考。本發明進一步說明於下列的實施例中，不意欲以其限制本發明之範圍。實驗章節以上頸神經節細胞研究關於交感神經元培養物(Hellman等人，2011；Hamner等人，2001；Lindholm等人，2002；Sun等人，2001；Aalto等人，2007)，將來自出生後(P)0至3天小鼠的上頸神經節以膠原酶(2.5 mg/ml；Worthington)、中性蛋白酶(dispase) (5 mg/ml；Roche Molecular Biochemicals)及胰蛋白酶(10 mg/ml；Worthington)在37 ℃下消化45分鐘，且以矽化玻璃Pasteur吸管經機械式解離。以擴大的預電鍍移除非神經元細胞。將幾乎純的神經元在經聚鳥胺酸/層黏連蛋白(laminin)(Sigma)塗佈之小型標準微島(microisland)的35-mm塑膠盤中在神經基礎培養基(Neurobasal medium)及B27補充物(Invitrogen/Gibco)中於30 ng/ml之小鼠神經生長因子(NGF)(Promega)的存在下培養5至6天。NGF係以大量的清洗及添加功能性阻斷抗NGF抗體(Roche)而喪失。將神經元以特殊的神經元微注射設備經壓力微注射(Hellman等人，2011；Hamner等人，2001；Lindholm等人，2002；Sun等人，2001；Yu等人，2003)(Sun等人，2001；Sun等人，2003)。在實驗開始(初始數目)及結束(三天)時計數在微島上所有的神經元以進行存活檢定且以初始之%表示。如先前所述執行交感神經元微注射(Yu, L. Y., Jokitalo, E., Sun, Y. F., Mehlen, P., Lindholm, D., Saarma, M.和Arumäe, U.(2003)J. Cell Biol. 163, 987-997)。已於先前說明用於CDNF之質體。簡言之，將新出生小鼠SCG神經元以NGF (Promega)生長5至6天，接著將核以用於全長(FL)-CDNF及C-CDNF之表現質體與用於增強之綠螢光蛋白質(EGFP)的報導子質體一起微注射，每一實驗使用10 ng/ul之載體濃度。類似的結果係以50 ng/ul之質體濃度達成。將用於蛋白質微注射之重組全長(FL)-CDNF、C-CDNF蛋白質於PBS中以200 ng/ul與有助於鑑定成功注射之神經元的螢光報導子葡聚糖德克薩斯紅(Dextran Texas Red) (MW 70000 Da) (Invitrogen, Molecular Probes)一起直接微注射至細胞質中。隔天添加衣黴素(2 µM)，且在3天後計數活的螢光神經元。活的螢光(表現EGFP或含有葡聚糖德克薩斯紅之)神經元係在三天後「盲目地」計數且以微注射後2至3小時計數之初始活的螢光神經元之百分比表示。以質體的實驗對用於質體實驗的獨立培養物重複5次，而執行四次獨立的蛋白質注射實驗。每一實驗組成功地注射平均50至80個神經元。將結果以平均±SEM表示。將每一實驗組的數據與對照質體PCR3.1(載體)或PBS(在蛋白質注射實驗中)以單因子變異數分析及事後比較杜納氏(Dunnett’s)t檢驗比較。在p ＜ 0.05時拒絕虛無假設。 CDNF表現質體用於全長(FL)或羧基端(C)結構域編碼之構築體係藉由TOPO/TA選殖系統(Invitrogen)或藉由使用限制性核酸內切酶插入pCR3.1載體(Invitrogen)中。在pCR3.1載體中的全長CDNF分別為537 bp(179個胺基酸)及561 bp(187個胺基酸)胺基酸長度且在彼等N端具有對ER靶向之訊號序列。C-CDNF為186bp長度，相應於FL-CDNF中的胺基酸127至187。 E511 在pCR3.1/雙向(Bidirectional)TOPO TA中的人類CDNF。具有終止密碼子(無標籤)的全長cDNA。安比西林(Ampicillin)選擇。DH5α。以測序驗證。 E811 pCR3.1 hCDNF C-具有訊號序列的人類CDNF C端序列。以PCR及Invitrogen TA選殖系統選殖。插入大小207bp。轉形成DH5a細胞。Amp選擇。以測序驗證。質體表現蛋白質及肽片段人類重組CDNF(由187個胺基酸所組成之全長pre-CDNF，具有26個胺基酸長度的訊號序列及161個胺基酸長度的成熟CDNF序列)、人類N-CDNF(由26個胺基酸之人類CDNF訊號序列及自胺基酸1至胺基酸100之成熟CDNF的部分所組成)及人類C-CDNF(由26個胺基酸長度的CDNF訊號序列與起自胺基酸101跨越至胺基酸161之成熟CDNF的C端結構域融合所組成)。人類重組MANF(由179個胺基酸所組成之全長pre-MANF，具有21個胺基酸長度的訊號序列及158個胺基酸長度的成熟MANF序列)、人類N-MANF(由21個胺基酸之人類MANF訊號序列及自胺基酸1至胺基酸95之成熟MANF的部分所組成)及人類C-MANF(由21個胺基酸長度的CDNF訊號序列與起自胺基酸96跨越至胺基酸158之成熟MANF的C端結構域融合所組成)。用於hMANF及hCDNF與彼等結構域的密碼子優化之cDNA合成係自Genewiz有序化且構築各自的pQMCF表現載體。N-CDNF、C-CDNF、N-MANF及C-MANF構築體在C端具有組胺酸標籤。cDNA係藉由定序最終載體來驗證。hMANF及hCDNF蛋白質係由CHO-衍生之懸浮細胞株CHOEBNALT85產生，使用化學界定之無血清培養基培養細胞。將CHOEBNALT85細胞以1 μg表現質體轉染。在轉染後48小時添加700 μg/ml之G418以選擇含有細胞群體的質體。在轉染後48小時，在還原條件下分析在細胞溶解物及上清液中的蛋白質表現及分泌。 hMANF及hCDNF蛋白質係以兩步驟離子交換層析術純化及凝膠過濾至PBS，pH 7.4中。基於以CDNF及MANF抗體(MANF 4E12-HRP及CDNF-7D6-HRP，愛沙尼亞(Estonia)之Icosagen Tartu)之SDS-PAGE及西方墨點法分析，所使用之蛋白質具有超過99%之純度。 CDNF及MANF結構域係在Ni親和性管柱上純化，且蛋白質亦藉由SDS-PAGE及西方墨點法使用針對His標籤的小鼠單株抗體(目錄編號A00186；GeneScript)來分析。所生產之蛋白質具有下列序列：成熟人類CDNF：

人類N-CDNF：

人類C-CDNF：

成熟人類MANF：

人類N-MANF

人類C-MANF

以多巴胺神經元研究為了研究多巴胺神經元(Yu等人，2008；Yu和Arumae, 2008)，自13.5天齡NMRI品系小鼠胚胎之中腦腹側解剖出中腦底層。將組織以0.5%之胰蛋白酶(ICN Biomedical)培育，接著使用大火拋光之Pasteur吸管經機械式解離。將神經元在經聚-L-鳥胺酸(Sigma)塗佈之96孔培養盤上於含有N2補充物(Invitrogen)之DMEM/F12培養基(Invitrogen)中在GDNF(100 ng/ml)的存在或不存在下或以不同濃度的CDNF、MANF、C-CDNF及C-MANF多肽生長5天。將相同量的神經元在實驗開始時鋪置在各孔中。無添加之神經滋養因子的培養物當作為陰性對照物。因為中腦培養物含有許多神經元類型，所以將培養物固定且以針對酪胺酸羥化酶(TH)之抗體(Millipore)(多巴胺神經元之特異性標誌物)進行免疫染色。以CellInsight^TM 掃描各孔的影像且以CellProfiler及CellProfiler分析軟體計數免疫陽性神經元。將數據以經GDNF維持之TH陽性神經元的百分比表示。所有的實驗以獨立的培養物重複至少三次。將結果以平均SEM表示且以單因子ANOVA及杜凱氏事後比較檢驗或雙尾司徒登氏t-檢驗測試顯著性。在P ≤0.05時拒絕虛無假設。 CDNF、C-CDNF及C-MANF之碘化將CDNF、C-CDNF及C-MANF使用乳過氧化酶方法以¹²⁵ I-Na碘化。將討論中的蛋白質溶解在30 µl之0.25 M磷酸鹽緩衝液，pH 7.5中且與¹²⁵ I-Na(1 mCi /2.8 µl；1 mCi=37 mBq；GE Healthcare)混合。反應係藉由添加10 µl之50 µg/ml之乳過氧化酶及0.05%之H₂ O₂ 開始。將混合物在室溫下培育20分鐘且將反應以添加含有0.1 M NaI、0.42 M NaCl之3體積的0.1 M磷酸鹽緩衝液，pH 7.5終止，且接著添加25 µl之2.5%BSA。將游離碘及碘化蛋白質在Sephadex G-25管柱(PM10；GE Healthcare)上以凝膠過濾法分離。以具有1%之BSA的0.1 M磷酸鹽緩衝液，pH 7.5用於管柱平衡及溶析。碘化生長因子有時藉由使用YM-10 Centricon管柱(Millipore)濃縮。經¹²⁵ I-標記之CDNF、C-CDNF及C-MANF的特異性活性係在Wizard 3 1480自動化γ計數器(Perkin Elmer，Wallac)上測量且為約10⁸ cpm/μg之蛋白質。將經標記之蛋白質保持在4℃下且在標記後3週內使用。對E13.5多巴胺神經元之內化實驗將在24孔盤上的培養物中生長之小鼠E13.5多巴胺神經元在37℃下每一孔以30,000 cpm之碘化CDNF或C-CDNF培育2小時。將細胞轉移至冰上且以0.5 ml冰冷的培養基清洗一次。接著將細胞轉移至Eppendorf試管中且在4℃下以0.2 M乙酸、0.5 M NaCl，pH 2.8清洗一次。在1000g下離心10分鐘後，將細胞溶解在0.5 ml之0.5 N NaOH中且在γ計數器上計數。在大鼠中的血腦障壁穿透研究將¹²⁵ I- CDNF、¹²⁵ I C-CDNF或¹²⁵ I C-MANF(所有的蛋白質均以10⁶ cpm於10 µl中)經皮下注射至成年雄性Wistar大鼠中。在2小時後以PBS灌注動物。以γ計數器分析在不同的腦區域之放射活性。數據係以平均±SEM顯示。在群組之間的差異係以ANOVA，繼而以杜凱-克雷馬氏事後比較檢驗分析。對PC6.3細胞之內化實驗將大鼠PC6.3嗜鉻細胞瘤細胞在24孔盤上於具有10%之FCS及5%之馬血清的DMEM培養物中生長。將細胞以PBS清洗且在37℃下每一孔以30,000 cpm之碘化CDNF或C-CDNF培育90分鐘。將細胞放在冰上，以0.5 ml冰冷的培養基清洗一次。接著將細胞轉移至Eppendorf試管中且以0.2 M乙酸、0.5 M NaCl，pH 2.8清洗一次。在1000g下離心10分鐘後，將細胞溶解在0.5 ml之0.5 N NaOH中且在Wallac γ計數器中計數。在大鼠中於PD的6-OHDA模式中之神經修復研究在PD之神經修復模式中，使大鼠以6-OHDA發生病變，如先前所述(Voutilainen等人，2009；Voutilainen等人，2011；Penttinen等人，2016)。簡言之，大鼠在異氟醚麻醉下接受3x2 µg 6-OHDA之單側立體定位注射(以10度角)至左紋狀體(相對於前囪與硬腦膜之坐標A/P +1.6；L/M -2.8；D/V -6，A/P 0.0：L/M -4.1；D/V -5.5及A/P -1.2；L/M：-4.5；D/V -5.5)。在兩週後，將大鼠基於彼等經安非他命誘發之旋轉結果(病變程度)分組。然後將CDNF(10 µg)、C-CDNF(與10 µg CDNF等莫耳量)及N-CDNF(與10 µg CDNF等莫耳量)使用與6-OHDA相同的座標經紋狀體內注射至大鼠中。在大鼠分組後的參考實驗中，將滲透性小型泵插入皮下且將導管放入病變之紋狀體中。小型泵遞送MANF4(亦即MANF肽CKGC，參考WO2013034805)、GDNF或媒劑溶液至紋狀體中歷經兩週，隨後移出小型泵及導管。6-OHDA在神經元內部有兩種以協同見效的作用方式：1)其累積在細胞溶質中且形成引起氧化應激之游離基；2)其為粒線體呼吸鏈複合物I和IV之有效力的抑制劑。正腎上腺素神經元係使用NAT抑制劑去甲丙咪嗪(desipramine)(15 mg/kg，i.p.，在6-OHDA注射前30分鐘)予以保護。單側病變的程度及治療效果係在涉及經CDNF、C-CDNF、N-CDNF及PBS治療之大鼠的實驗中以病變後2、4、6和8週及在涉及MANF4及GDNF的參考實驗中以1、4、8、10和12週經安非他命誘發之旋轉行為測量。在30分鐘的適應期後，記錄120分鐘經安非他命(2.5 mg/kg，i.p.)誘發之完全(360^o )同側和對側轉向的次數。結果係以相對於病變側之淨同側轉向表示，排除標準(Exclusion criterion)為平均(淨旋轉)± 2 × STDEV。酪胺酸羥化酶(TH)-免疫組織化學灌注及組織處理。在神經修復研究後立即將大鼠以過量的戊巴比妥鈉(sodium pentobarbital)(90 mg/kg，i.p.；Orion Pharma)麻醉，且以PBS，繼而以0.1 M磷酸鈉緩衝液，pH 7.4中的4%之三聚甲醛經心內灌注。將腦移出、後固定(postfixed)4小時且在4℃下儲存在含有20%之蔗糖的磷酸鈉緩衝液中。在滑動式切片機上切割40 µm深度的連續冠狀冷凍切片。免疫組織化學係如別處所述方式進行(Voutilainen等人，2009)。經灌注之腦在三聚甲醛中於4℃下經隔夜後固定且儲存在20%之蔗糖中。將腦切割成40 μm厚的切片，每組6個。將自由漂浮的切片以磷酸鹽緩衝之食鹽水(PBS)清洗，且將內源性過氧化酶活性以0.3%之過氧化氫(Sigma Aldrich)淬滅。為了阻斷抗體的非特異性結合，將切片在阻斷緩衝液(在1 × PBS中的4%之牛血清白蛋白及0.1%之Triton X-100)中培育1小時。將切片在4℃下於阻斷緩衝液中的小鼠單株抗酪胺酸羥化酶(TH)抗體(1:2,000；目錄編號MAB318；RRID:AB_2201528；Millipore, Billerica, MA)中經隔夜培育，繼而在生物素化二級抗體(1:200；抗大鼠或抗小鼠；Vector, Burlingame, CA)中培育。以抗生物素蛋白-生物素-酵素複合物(ABC套組；Vector)增強染色且以3’,3’-二胺基聯苯胺作為色素原來顯現訊號。來自黑質之TH陽性細胞計數在黑質緻密部(SNpc)中的TH陽性細胞係以來自相對於前囪的約A/P -4.5至-6.0之跨越SNpc的六個切片進行分析。細胞係以3DHistech掃描器獲得的影像經Matlab (RRID:nlx_153890；MathWorks，Natick，MA)演算法計數。以×20 NA 0.8物鏡之掃描器的解析度為0.24 μm/像素。在紋狀體中的TH陽性軸突之光學密度分析在紋狀體中的TH陽性軸突之光學密度係以來自各大鼠相對於前囪的約A/P + 2.2、+ 0.84及-0.12之三個紋狀體切片測定。為了降低背景訊號，以自動化掃描器(3DHistech，匈牙利之Budapest，由University of Helsinki之Institute of Biotechnology提供的掃描服務)掃描切片，且將影像轉換成16位元灰階(gray scale)。因為胼胝體沒有TH訊號，所以其被用作為非特異性背景染色的度量。將積分密度除以自影像獲得的面積以ImageJ(NIH)分析。數據係以完整面的百分比表示。 β細胞增生檢定法自雌性未配種的8週齡C57bl6Rcc小鼠分離出胰島。在生長培養基中回收o/n胰島，且隔天將相等數量的胰島/孔(70個/孔)以胎盤生乳素(PL 500 ng/ml)、C-MANF或MANF處理5天。將一半的培養基每天以具有生長因子的新鮮培養基更換。在收穫胰島前48小時添加Edu(代替BrdU之核苷類似物)(Click-iT®Edu增生套組，Invitrogen)。將胰島以胰蛋白酶破碎且在細胞離心機中離心至載玻片上。在細胞離心片(cytospin)及增生細胞以Click-iT AlexaFluor疊氮化物顯色劑染色，繼而在+4℃下以胰島素染色(天竺鼠1:200，Abcam, Cambridge, UK)o/n後，將細胞固定以檢測β細胞。將細胞清洗且以與Alexa Fluor® 488共軛之二級抗體(1:400，Molecular Probes, Life Technologies, CA, USA)染色。將載玻片以含有DAPI之Vectashield封固介質(mounting medium)(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)封固。以配備有40x/Plan-Apochromat/0.95 Corr M27和63x/Plan-Apochromat/1.40 Oil/M27的Fluorescence Zeiss AxioImager M2 482落射螢光顯微鏡及483 AxioCam HRm照相機使用AxioVision4軟體擷取12個影像(10倍放大率)，且以Image Pro Plus軟體(Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)分析以定量DAPI陽性細胞核數量。定量相對的增生β細胞數量且與三至五次重複/處理之孔比較。 ALS的小鼠模式基因轉殖SOD1 G93A小鼠當作為此研究中用於ALS之基因轉殖小鼠模式。含有各種人類SOD1突變之基因轉殖小鼠發展出進行性神經退化及運動神經元(MN)死亡，提供常用於臨床前試驗且對理解FALS發病機制有很大幫助的動物模式(Gurney等人，1994)。基因轉殖SOD1小鼠展現以體染色體顯性方式傳播的ALS樣臨床特徵。在該等小鼠中，在8至10週齡出現後肢無力和震顫移動的初始症狀，繼而出現主要症狀，諸如進行性運動麻痺和神經源性肌肉萎縮(Shibata 2001)。該等小鼠隨後顯示步態、進食和飲食失能且在幾週內死亡，通常在14至16週齡。攜帶具有突變之甘胺酸93至丙胺酸的人類SOD1之基因轉殖小鼠最初係自The Jackson Laboratory((http://www.jax.org), Bar Harbor, ME；品系B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur)獲得。基因轉殖表現係以DNA尾部試驗及PCR使用特異性寡核苷酸及如先前由其他人實行的條件進行分析(參見homepage Jackson Lab)。在所有的實驗中，將野生型B6SJL-TgN(SOD1)2Gur納入為對照物。在ALS小鼠中的實驗設置在單一投予實驗中，約13週齡小鼠在異氟醚麻醉下接受PBS或C-CDNF(3.75 µg，其與在PBS中稀釋的10 µg全長CDNF為等莫耳量)之單一腦室內注射。接著每週兩次評估小鼠的疾病徵兆及體重變化。評估係以一系列經設計以評定小鼠的活動能力之行為試驗來完成，該系列包含試驗例如旋轉棒。在長期輸注實驗中，將腦輸注插管(經由導管管線至Alzet滲透性小型泵連接)插入在異氟烷麻醉下的12週齡SOD1小鼠之右側腦室中。輸注C-CDNF(1.5 μg/24h)28天。以旋轉棒評估運動行為。以臨床徵兆及體重變化評估小鼠。 ALS小鼠之臨床評分 SOD1小鼠之臨床評分係使用Jackson實驗室的指示進行。小鼠在12週齡後每週仔細檢查2次。動物係藉由將其尾巴的基部輕輕地抬起且觀察其震顫、僵硬及其伸展其肢體的能力來評分。臨床評分係基於ALSTDI(ALS治療發展研究所(ALS therapy Development Institute))後肢神經學評分系統而在1至5的範圍內。旋轉棒在旋轉棒中，將小鼠放入旋轉棒中(加速速度4至40 rpm/分鐘)(Ugo Basile，義大利)。截止時間為4分鐘。在小鼠12週齡後，每週進行2次旋轉棒試驗。作為腦部中風模式之中腦部動脈遠端閉塞使用雄性Sprague Dawley大鼠(體重230至270 g，Envigo，荷蘭)進行實驗，該實驗係根據對實驗動物的護理及使用之EU指令2010/63/EU的3R原則、當地的法律和法規來進行，且由芬蘭國家動物實驗委員會批准。所有的實驗均以盲法執行且大鼠隨機分配至不同的治療組。將大鼠以水合氯醛(0.4 g/kg，i.p)麻醉。皮質中風係藉由閉塞遠端中腦部動脈(dMCA)連同雙側頸總動脈(CCA)閉塞60分鐘而誘發，如先前所述(Chen等人，1986)。簡言之，雙側CCA係通過腹側中線頸部切口識別及單離。將大鼠放入立體定位裝置中且在右半球進行顱骨切開術。將右側(MCA)以10-0縫合線結紮且將雙側總頸動脈(CCA)以非創傷性動脈夾閉合60分鐘。在缺血60分鐘後，移除MCA周圍的縫合線及在CCA上的動脈夾以引進再灌注損傷。在自麻醉恢復後，將大鼠送回其家籠中。在手術期間及手術後的體溫維持在37℃。為了測試皮下C-CDNF之神經保護效應，在dMCA閉塞前30至50分鐘及再灌注100 µl s.c.體積後立即給予50 µg C-CDNF。經磷酸鹽緩衝之食鹽水(PBS)被用作為媒劑對照物。大鼠係在dMCAo後2天安樂死，以2%之氯化2,3,5-三苯基四唑鎓鹽(TTC; Sigma Aldrich, St. Louis, MO)染色以測量梗塞體積。將大鼠斬首及取出腦，且使用丙烯酸大鼠腦塊切成2.0-mm厚的切片。將腦切片在室溫下在2%之TTC溶液(Sigma, St. Louis, MO, USA)中培育15分鐘且接著轉移至4%之三聚甲醛溶液中固定。在各切片中的梗塞面積係以數位式掃描器及ImageJ軟體測量。在各動物中的梗塞體積係自平均切片厚度(2 mm)與所檢查之前額腦切片中的梗塞面積總和之乘積而獲得。使用司徒登氏t-檢驗進行統計分析。測定活性C-CDNF片段的最小長度具有N端及/或C端缺失之C-CDNF肽(參見表5和6)係以慣例的肽合成法產生(Stawikowski和Fields, Curr Protoc Protein Sci.; 2002 February CHAPTER: Unit-18.1.)。以每一種肽進行如上述之生物檢定法。結果顯示於表1至4及圖14至18中。

圖1. (A)CDNF具有兩個結構域：N端結構域及C端結構域。N端結構域可結合經氧化之磷脂(及至少MANF N端結構域，以及脂質硫酸腦苷脂(sulfatide)，亦稱為3-O-硫酸半乳糖苷基神經醯胺，參見Bai等人，2018)且為鞘脂激活蛋白樣結構域。C端結構域具有C-X-X-C序列及C端ER滯留訊號KTEL且為SAPLIP樣結構域。CDNF可於試管內經蛋白分解切割以得到該兩個結構域。(B)MANF及CDNF之結構的示意圖。黑色垂直條顯示8個保守型半胱胺酸殘基的位置。圖2. 自質體表現之CDNF及CDNF之C端片段拯救經ER應激之上頸神經節(SCG)交感神經元。在實驗中，當神經生長因子(以10 ng/ml之NGF)添加至培養基時，將來自7天齡大鼠/小鼠之SCG神經元以表現CDNF之指定質體、CDNF之C端片段(C-CDNF)、對照質體PCR3.1及陽性對照物微注射。隔天添加2 µM之衣黴素(tunicamycin)(TM)以觸發經ER應激誘發之細胞死亡，接著在三天後計數活及螢光神經元，且將結果以初始神經元的百分比揭示。圖3. 當微注射至細胞質時，CDNF及CDNF片段蛋白質拯救經ER應激之SCG神經元。在實驗中，SCG神經元係自出生後1天齡小鼠製備，培養7天且接著分別以重組人類CDNF或C-CDNF蛋白質注射。隔天添加衣黴素(2 µM)，且在3天後計數活的螢光神經元。將結果以初始神經元的百分比揭示。圖4. MANF之C端片段(C-MANF)保護培養物中的多巴胺神經元。將胚胎第13天(E13)NMRI小鼠中腦底層(midbrain floor)之解離培養物在96孔盤上與添加至培養基(陽性對照物)的C-MANF、GDNF或作為對照物的無生長因子生長5天。然後針對酪胺酸羥化酶(TH)進行培養物染色。以CellInsight^TM 掃描影像且以CellProfiler及CellProfiler分析軟體計數免疫陽性神經元。將數據以經GDNF維持之TH陽性神經元的百分比表示。圖5. CDNF之C端片段(C-CDNF)於試管內保護多巴胺神經元。將E13.5 NMRI小鼠中腦底層之解離培養物在96孔盤上與給出之濃度添加至培養基的CDNF或CDNF片段生長5天。將多巴胺神經元與GDNF(100 ng/ml)或當作為對照物的無神經滋養因子培養。針對酪胺酸羥化酶(TH)進行培養物免疫染色，以CellInsight^TM 掃描影像。將TH-陽性神經元以CellProfiler及CellProfiler分析軟體計數且以經GDNF維持之神經元的百分比表示。圖6. CDNF之C端片段(C-CDNF)及MANF之C端片段(C-MANF)穿透多巴胺神經元及PC6細胞之細胞膜。A.¹²⁵ I-C-CDNF，但不是¹²⁵ I-CDNF於試管內有效地內化至E14多巴胺神經元中，顯示C-CDNF之細胞穿透性質。將培養物中E14多巴胺神經元在37℃下以30,000 cpm之碘化CDNF或C-CDNF培育2小時。接著將細胞置於冰上，且以0.2 M乙酸、0.5 M NaCl，pH 2.8清洗及以γ計數器計數。測量細胞內部的放射活性。B.¹²⁵ I-C-CDNF及¹²⁵ I-C-MANF，但不是全長碘化CDNF穿透大鼠PC6細胞之細胞膜。在添加生長因子前，將碘化CDNF或C-CDNF及C-MANF施予以或不以毒胡蘿蔔素(thapsigargin)處理3小時之PC6細胞。使內化在37℃進行90分鐘。將細胞置於冰上，且接著以0.2 M乙酸、0.5 M NaCl，pH 2.8清洗及使用γ計數器測量細胞內部的放射活性。圖7.¹²⁵ I-CDNF、¹²⁵ I-C-CDNF及¹²⁵ I-C-MANF之血腦障壁穿透。將¹²⁵ I-CDNF、¹²⁵ I-C-CDNF及¹²⁵ I-C-MANF經皮下注射至大鼠。在2小時後以PBS灌注大鼠且解剖出腦。以γ計數器分析腦中的放射活性。數據係以平均±SEM顯示。P＜0.05 t-檢驗。*，p＞ 0.05。圖8. 在PD的大鼠6-OHDA模式中於病變後2、4、6和8週的累積旋轉。在6-OHDA病變後2週，將CDNF、N端CDNF(N-CDNF)、C-CDNF或媒劑(PBS)經紋狀體內注射至大鼠腦中。C-CDNF比全長CDNF更有效恢復神經元功能，因為其顯著地減少在6-OHDA病變之大鼠中經安非他命誘發之旋轉的累積量。數據係以平均±SEM顯示。在單因子變異數分析(one-way ANOVA)後以杜凱-克雷馬氏(Tukey-Kramer)事後比較(post hoc )分析，****p ＜0.0001。圖9. 當肽係在6-OHDA病變後2週開始輸注至紋狀體時，MANF之短的4個胺基酸長度之C端片段(MANF4)在帕金森氏症大鼠6-OHDA模式中沒有效，且在病變後1、4、6、8、10和12週(A)或累積地(B)測量到經安非他命誘發之旋轉。GDNF被用作為陽性對照物。圖10. C端MANF片段(C-MANF)刺激小鼠β細胞增生。在以胎盤生乳素、C-MANF或MANF於試管內培養小鼠胰島5天後(n=3個孔/點)，將Click EdU併入β細胞中。*p＜ 0.05，**p ＜0.01，***p ＜0.001。圖11. 以C-CDNF治療對ALS的SOD1小鼠模式之臨床評分具有利的效應。對13週齡的SOD1小鼠給予C-CDNF (3.75 µg)或PBS的單次腦室內(intracerebroventricular)注射。(A)雌性動物的臨床狀態。C-CDNF治療減慢症狀發作，因為經C-CDNF治療之SOD1小鼠在統計學上具有比經PBS治療之小鼠顯著更好的臨床評分。(B)以旋轉棒檢定平衡、協調性及肌肉強度。4至40 rpm加速度，4分鐘截止時間。左側顯示跌落潛伏期(Latency to fall)(s)。SOD1-G93A雌性。與經PBS治療之小鼠相比，C-CDNF治療改進SOD1-G93A小鼠之運動行為。圖12. 在SOD1-G93A小鼠ALS模式中以1.5 µg/24h之C-CDNF的4週長期腦室內輸注之效果。(A)相對的體重變化，無性別分類。第12週(在小型泵安裝前)顯示為基線。在第18及19週檢測出在治療之間顯著的體重差異(p＜0,05，雙尾未配對之t-檢驗)。(B)4週長期腦室內C-CDNF輸注改進運動協調性，如以SOD1-G93A小鼠之旋轉棒性能測量。在旋轉棒試驗中，使用4至40 rpm加速度與4分鐘截止時間。在C-CDNF與PBS治療之間的差異顯著地起自第13週起，直到第19週(p＜0.01，重複測量ANOVA)。圖13. 經皮下注射之C-CDNF降低在腦部缺血的大鼠模式中之梗塞體積。C-CDNF(50 µg)係在遠端中腦部動脈閉塞前30至50分鐘及在再灌注100 µl體積後立即投予。當自腦部皮層的吻側部位測量時，C-CDNF治療降低梗塞體積(司徒登氏(Student)t-檢驗p＜0.05)。經C-CDNF治療之大鼠具有比經媒劑治療之大鼠少約50%之病變。PBS被用作為對照物。*表示P＜0.05。將值以來自PBS之百分比的平均 ± SEM表示，n=8-9。圖14. 經設計的CDNF之C端肽(肽1至7，參見表5)在微注射至細胞質時拯救經ER應激之SCG神經元。在實驗中，SCG神經元係自出生後1天齡小鼠製備，培養7天且接著以重組人類CDNF或C-CDNF肽注射。隔天添加衣黴素(2 µM)，且在3天後計數活的螢光神經元。將結果以初始神經元的百分比揭示。圖15. 經設計的CDNF之C端肽(肽1至7，參見表5)於試管內保護多巴胺神經元。將E13.5 NMRI小鼠中腦底層之解離培養物在96孔盤上以給出之濃度添加至培養基的CDNF之肽(肽1至7，參見表5)生長5天。將多巴胺神經元與GDNF(100 ng/ml)或當作為對照物的無神經滋養因子培養。針對酪胺酸羥化酶(TH)進行培養物免疫染色，以CellInsight^TM 掃描影像。將TH-陽性神經元以CellProfiler及CellProfiler分析軟體計數且以經GDNF維持之神經元的百分比表示。圖16. 以經設計的CDNF之C端肽(肽8至15，參見表6)微注射至SCG神經元且在衣黴素處理後測試存活率。肽8(37 aa)、12(經單一胺基酸取代之49 aa)、13(經單一胺基酸取代之49 aa)及15(33 aa)在微注射至細胞質時拯救經ER應激之SCG神經元。在實驗中，SCG神經元係自出生後1天齡小鼠製備，培養7天且接著以重組人類CDNF或C-CDNF肽注射。隔天添加衣黴素(2 µM)，且在3天後計數活的螢光神經元。將結果以初始神經元的百分比揭示。圖17. 將E13.5 NMRI小鼠中腦底層之解離培養物在96孔盤上與給出之濃度添加至培養基的CDNF之C端肽(肽8至15，參見表6)生長5天。將多巴胺神經元與GDNF(100 ng/ml)或當作為對照物的無神經滋養因子培養。針對酪胺酸羥化酶(TH)進行培養物免疫染色，以CellInsight^TM 掃描影像。將TH-陽性神經元以CellProfiler及CellProfiler分析軟體計數且以經GDNF維持之神經元的百分比表示。與未切割之CDNF蛋白質相比，所有的C-CDNF肽顯示出活性，但是肽8、12、13、14和15於試管內對多巴胺神經元具有最好的保護效果。圖18. 經N端乙醯化及C端醯胺化修飾的CDNF之C端肽(肽1、61 aa和肽15、37 aa，參見表5和6)於試管內保護多巴胺神經元。將E13.5 NMRI小鼠中腦底層之解離培養物在96孔盤上與給出之濃度添加至培養基的肽生長5天。將多巴胺神經元與GDNF(100 ng/ml)或當作為對照物的無神經滋養因子培養。針對酪胺酸羥化酶(TH)進行培養物免疫染色，以CellInsight^TM 掃描影像。將TH-陽性神經元以CellProfiler及CellProfiler分析軟體計數且以經GDNF維持之神經元的百分比表示。圖19. 以重複的皮下注射給出之C-CDNF 33 aa(pep15，參見表6)有效保護免於經6-OHDA-誘發之運動失衡損傷，如以安非他命誘發之旋轉行為所測量。將6-OHDA(3x2 μg)注射至紋狀體中。自病變後兩週開始，使動物接受每週兩次C-CDNF 33 aa或媒劑(PBS)的皮下注射達4週(劑量水平：50 µg/s.c.注射，在8次s.c.注射後的總劑量：400 µg。(A)在病變後2、4、6、8、10和12週進行經安非他命誘發之旋轉試驗。(B)在2、4、6、8、10和12週的累積旋轉。將值以平均 ± SEM表示，n=9。***表示C-CDNF(50 µg x 8 s.c.)相對於經媒劑治療之對照組的p＜0.001。圖20. 經化學合成及CHO細胞表現之C-CDNF肽(pep1，61 aa)具有相同的CD光譜且彼等保留具有α-螺旋和環的明確界定之二級結構。使用JASCO J720儀器測量CD光譜。肽之濃度：30 µM。媒劑：20 mM PB，pH 7。體積：300 µl。波長：260至195 nm。圖21. 經化學合成之C-CDNF肽(pep1、pep8、pep9、pep12和pep13，參見表5至6)的CD光譜。C-CDNF肽8 (pep8)保存二級結構的一些元件。C-CDNF肽9具有類似於C-CDNF 61aa(pep1)的界定之二級結構。C-CDNF肽12 (pep12)具有界定之二級結構，但與C-CDNF 61aa(pep1)相比，失去一些α-螺旋區。C-CDNF肽13(pep13)具有界定之二級結構，但與肽12(pep12)相比，失去一些α-螺旋區。使用JASCO J720儀器測量CD光譜。肽之濃度：30至100 µM。媒劑：20 mM PB，pH 8。體積：300 µl。波長：260至195 nm。圖22. C-CDNF肽15(pep15)之CD光譜顯示肽保存二級結構的一些元件。使用JASCO J720儀器測量CD光譜。肽之濃度：50 µM。媒劑：20 mM PB，pH 8。體積：300 µl。波長：260至195 nm。圖23. C-CDNF(SEQ ID NO：4)及C-MANF(SEQ ID NO：5)之序列比對及比較。兩種神經滋養因子之C端結構包含三個α-螺旋模體(螺旋1、2和3)。C端CDNF肽5和6(參考表5)僅含有該等模體中之二者(螺旋2和3)。圖24. C端CDNF片段(SEQ ID NO：1)之蛋白酶切割位點預測。圖25. C端MANF片段(SEQ ID NO：2)之蛋白酶切割位點預測。

Claims

一種C端腦部多巴胺神經滋養因子(CDNF)片段，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，其中用於作為藥劑之該片段為細胞膜穿透肽且對神經元細胞具有保護效應。
根據申請專利範圍第1項之使用片段，其係用於治療退化性疾病或失調。
根據申請專利範圍第2項之使用片段，其中該退化性疾病為神經退化性疾病。
根據申請專利範圍第3項之使用片段，其中該神經退化性疾病為選自由下列者所組成之群組的中樞神經系統(CNS)疾病：阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、多發性系統萎縮症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、額顳葉退化症、路易氏體型失智症(dementia with Lewy bodies)、輕度認知障礙、亨汀頓氏症(Huntington’s disease)、創傷性腦損傷、藥物成癮及中風。
根據申請專利範圍第4項之使用片段，其中該CNS疾病為帕金森氏症。
根據申請專利範圍第2項之使用片段，其係用於治療第I型或第II型糖尿病。
根據申請專利範圍第3項之使用片段，其係用於治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症。
根據申請專利範圍第2項之使用片段，其係用於治療視網膜失調，諸如色素沉著性視網膜炎。
根據申請專利範圍第1至8項中任一項之使用片段，其中該片段係經靜脈內投予、腹膜內、皮下、鞘內、腦室內(intracerebroventricular)、鼻內、透皮、腦內、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予，或該片段係經由病毒表現載體投予。
根據申請專利範圍第9項之使用片段，其中該靜脈內投予為周邊投予。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其較佳地具有至多33至81個胺基酸長度，其中該片段包含在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列同一性。
根據申請專利範圍第11項之使用片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70或31至70之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70或31至70之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。
根據申請專利範圍第11項之使用片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置25至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置25至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列同一性。
根據申請專利範圍第12或13項之使用片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73(肽6；SEQ ID NO：15)、25至73(肽4；SEQ ID NO：13)、21至73(肽3；SEQ ID NO：12)、21至70(肽7；SEQ ID NO：16)、31至81(肽5；SEQ ID NO：14)、25至81(肽2；SEQ ID NO：11)、25至57(肽15；SEQ ID NO：24)或37至73(肽8；SEQ ID NO：17)之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73、25至73、21至73、21至70、31至81、25至81、25至57或37至73之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列同一性。
根據申請專利範圍第14項之使用片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73或25至57之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列同一性。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其具有至多43至81個，較佳為43至61個胺基酸長度。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其中該片段的端點包含保護該片段免於酵素降解的另外修飾。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其中該C端CDNF片段係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第18項之使用片段，其中與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的該序列包含在SEQ ID NO：1的位置52至55之序列CXXC，其中X為任何胺基酸。
根據申請專利範圍第19項之使用片段，其中與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的該序列係由SEQ ID NO：3之序列的至少50連續的胺基酸殘基所組成：
其中X為任何胺基酸。
根據申請專利範圍第19項之使用片段，其中與SEQ ID NO：1之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的該序列包含在SEQ ID NO：1的位置52至55之序列CKGC。
根據申請專利範圍第17至21項中任一項之使用片段，其中該片段包含在SEQ ID NO：1的位置81之C端胺基酸L。
根據申請專利範圍第17、18或20項中任一項之使用片段，其中該片段缺乏相應於SEQ ID NO：1的位置78至81之ER滯留訊號KTEL。
根據申請專利範圍第17至23項中任一項之使用片段，其中該片段包含C端之醯胺化及N端之乙醯化作為另外修飾。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其進一步與可檢測的化學或生化部分共軛。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其中該片段為細胞穿透肽且能夠穿透人類血腦障壁。
根據前述申請專利範圍中任一項之使用片段，其中該片段抵抗蛋白酶切割。
根據申請專利範圍第27項之使用片段，其中該片段包含伸長、缺失、插入、取代或修飾，使得該伸長、缺失、插入、取代或修飾取消至少一個蛋白酶切割位點。
根據申請專利範圍第27或28項之使用片段，其中該蛋白酶係選自由半胱胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶所組成之群組。
根據申請專利範圍第27至29項之使用片段，其中該半胱胺酸蛋白酶為組織蛋白酶K。
根據申請專利範圍第27至29項之使用片段，其中該金屬蛋白酶為MMP-9。
根據申請專利範圍第27至29項之使用片段，其中該金屬蛋白酶為MMP-3。
根據申請專利範圍第27至29項之使用片段，其中該絲胺酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶A(牛型)或彈性蛋白酶-2。
根據申請專利範圍第27至33項之使用片段，其中在相應於SEQ ID NO：1的殘基1至8、16至23、26至33、32至39、37至44、38至45、43至50、46至53、59至66、60至67或68至75之區域內的任一胺基酸經取代、缺失或修飾。
根據申請專利範圍第27至34項之使用片段，其中在相應於SEQ ID NO：1的46、49、35、63、4、71、19、40、41、62或29之位置的任何胺基酸經取代或修飾。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1及11至35項中任一項所定義之C端CDNF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑、保存劑和安定劑。
根據申請專利範圍第36項之醫藥組成物，其係用於靜脈內投予(較佳為周邊投予)、腹膜內、皮下、鞘內、腦室內、鼻內、透皮、腦內、肌肉內、眼內或動脈內投予，或該組成物係經由病毒表現載體投予。
根據申請專利範圍第36或37項之醫藥組成物，其係用於作為藥劑。
根據申請專利範圍第38項之使用醫藥組成物，其係用於治療退化性疾病或失調。
根據申請專利範圍第39項之使用醫藥組成物，其中該退化性疾病或失調為選自由下列者所組成之群組的中樞神經系統(CNS)疾病：阿茲海默氏症、帕金森氏症、多發性系統萎縮症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、額顳葉退化症、路易氏體型失智症、輕度認知障礙、亨汀頓氏症、創傷性腦損傷、藥物成癮及中風。
根據申請專利範圍第40項之使用醫藥組成物，其中該CNS疾病為帕金森氏症。
根據申請專利範圍第40項之使用醫藥組成物，其中該 CNS疾病為肌肉萎縮性脊髓側索硬化症。
根據申請專利範圍第40項之醫藥組成物，其係用於治療第I型或第II型糖尿病。
根據申請專利範圍第40項之醫藥組成物，其係用於治療視網膜失調，諸如色素沉著性視網膜炎。
一種C端CDNF片段，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，其中該片段為細胞膜穿透肽且對神經元細胞具有保護效應。
根據申請專利範圍第45項之片段，其具有至多57、53、51、50、49、43、37或33個胺基酸長度，其中該片段包含在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且該連續的胺基酸殘基之側翼的序列與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。
根據申請專利範圍第46項之片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70或31至70之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置37至70、36至70、35至70、34至70、33至70、32至70或31至70之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第46項之片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置25至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置25至57、25至58、25至59、25至60、25至61、25至62、25至63、25至64、25至65、25至66、25至67、25至68、25至69或25至70之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：1的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。
根據申請專利範圍第47或48項之片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73(肽6)、25至73(肽4)、21至73(肽3)、21至70(肽7)、31至81(肽5)、25至81(肽2)、25至57(肽15)或37至73(肽8)之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73、25至73、21至73、21至70、31至81、25至81、25至57或37至73之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第49項之片段，其中該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73之至少連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第45至50項中任一項之片段，其具有至多57、53、51、50、49、43、37或33個胺基酸長度。
一種C端MANF片段，其較佳地具有36至78個胺基酸長度，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的位置33至68或19至52之至少連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：2的位置33至68或19至52之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：2的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性，其中該片段為細胞膜穿透肽且對神經元細胞具有保護效應。
根據申請專利範圍第52項之片段，其具有36至59個胺基酸長度。
根據申請專利範圍第52或53項之片段，其係用於作為藥劑。
根據申請專利範圍第54項之使用片段，其係用於治療退化性疾病或失調，其中該片段較佳地經靜脈內(更佳為周邊投予)、腹膜內、皮下、鼻內、透皮、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予。
根據申請專利範圍第55項之使用C端MANF片段，其係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的至少50個連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：2之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第56項之使用片段，其中該片段具有SEQ ID NO：5之序列：
或與SEQ ID NO：5之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第56或57項之使用片段，其中該片段包含在SEQ ID NO：2的位置78之C端胺基酸L。
根據申請專利範圍第56或57項之使用片段，其中該片段缺乏相應於SEQ ID NO：2的位置75至78之ER滯留訊號RTDL。
根據申請專利範圍第52至59項中任一項之使用片段，其中該片段包含保護該片段免於酵素降解的另外修飾，較佳地選自由C端之醯胺化及N端之乙醯化所組成之群組。
根據申請專利範圍第52至60項中任一項之使用片段，其中該片段抵抗蛋白酶切割。
根據申請專利範圍第61項之使用片段，其中該片段包含伸長、缺失、插入、取代或修飾，使得該伸長、缺失、插入、取代或修飾取消至少一個蛋白酶切割位點。
根據申請專利範圍第61或62項之使用片段，其中該蛋白酶係選自由金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶所組成之群組。
根據申請專利範圍第63項之片段，其中該金屬蛋白酶為MMP-9或MMP-2。
根據申請專利範圍第63項之使用片段，其中該絲胺酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶A(牛型)、彈性蛋白酶-2或類囊體(thylakoidal)加工肽酶。
根據申請專利範圍第52至65項之使用片段，其中在相應於SEQ ID NO：2的殘基11至18、18至25、21至28、24至31、33至40、54至61、59至66或63至70之區域內的任一胺基酸經取代、缺失或修飾。
根據申請專利範圍第52至66項之使用片段，其中在相應於SEQ ID NO：2的62、27、14、66、36、21、57或24之位置的胺基酸經取代或修飾。
根據申請專利範圍第52至67項中任一項之使用片段，其進一步與可檢測的化學或生化部分共軛。
根據申請專利範圍第52至68項中任一項之使用片段，其中該片段為細胞穿透肽且能夠穿透人類血腦障壁。
根據申請專利範圍第52至69項中任一項之使用片段，其中該退化性疾病為選自由下列者所組成之群組的中樞神經系統(CNS)疾病：阿茲海默氏症、帕金森氏症、多發性系統萎縮症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、額顳葉退化症、路易氏體型失智症、輕度認知障礙、亨汀頓氏症、創傷性腦損傷、藥物成癮及中風。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第52至69項中任一項之C端MANF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑、保存劑和安定劑，其係用於治療中樞神經系統(CNS)疾病，其中該片段係經靜脈內(較佳為周邊投予)、腹膜內、皮下、鼻內、透皮、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予。
一種C端MANF片段，其較佳地具有36至78個胺基酸長度，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的位置33至68或19至52之至少連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：2的位置33至68或19至52之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：2的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性，其中該片段為細胞膜穿透肽，其係用於治療第1型或第2型糖尿病或視網膜疾病。
根據申請專利範圍第72項之使用片段，其具有36至59個胺基酸長度。
根據申請專利範圍第73項之使用片段，其係由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的至少50連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：2之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第74項之使用片段，其中該片段具有SEQ ID NO：5之序列：
或與SEQ ID NO：5之序列具有至少90%之同源性或序列同一性的序列。
根據申請專利範圍第72至75項中任一項之使用片段，其中該片段包含保護片段免於酵素降解的另外修飾，較佳地選自由C端之醯胺化及N端之乙醯化所組成之群組。
根據申請專利範圍第76項之使用片段，其中該片段抵抗蛋白酶切割。
根據申請專利範圍第77項之使用片段，其中該片段包含伸長、缺失、插入、取代或修飾，使得該伸長、缺失、插入、取代或修飾取消至少一個蛋白酶切割位點。
根據申請專利範圍第77或78項之使用片段，其中該蛋白酶係選自由金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶所組成之群組。
根據申請專利範圍第79項之使用片段，其中該金屬蛋白酶為MMP-9或MMP-2。
根據申請專利範圍第79項之使用片段，其中該絲胺酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶A(牛型)、彈性蛋白酶-2或類囊體加工肽酶。
根據申請專利範圍第72至81項之使用片段，其中在相應於SEQ ID NO：2的殘基11至18、18至25、21至28、24至31、33至40、54至61、59至66或63至70之區域內的任一胺基酸經取代、缺失或修飾。
根據申請專利範圍第72至82項之使用片段，其中在相應於SEQ ID NO：2之62、27、14、66、36、21、57或24之位置的胺基酸經取代或修飾。
根據申請專利範圍第72至83項中任一項之使用片段，其中該片段為細胞穿透肽且能夠穿透人類血腦障壁。
一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第72至84項中任一項之C端MANF片段及下列中之至少一者：生理上可接受之載劑、緩衝劑、賦形劑、保存劑和安定劑，其係用於治療第1型或第2型糖尿病或視網膜疾病。
根據申請專利範圍第85項之使用醫藥組成物，其係用於周邊投予。
根據申請專利範圍第86項之使用醫藥組成物，其中該組成物係經靜脈內、腹膜內、皮下、鞘內、腦室內、鼻內、透皮、腦內、肌肉內、眼內或動脈內投予來投予，或該片段係經由病毒表現載體投予。
一種經單離之多核苷酸，其包含編碼C端CDNF片段之核苷酸序列，係由在列於SEQ ID NO：1之序列的位置31至73(肽6)、25至73(肽4)、21至73(肽3)、21至70(肽7)、31至81(肽5)、或25至81(肽2)、25至57(肽15)、或37至73(肽8)之連續的胺基酸殘基或與SEQ ID NO：1的位置31至73、25至73、21至73、21至70、31至81、25至81、25至57或37至73之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列所組成。
一種表現載體，其編碼根據申請專利範圍第88項之經單離之多核苷酸。
一種以根據申請專利範圍第89項之載體轉形之宿主細胞。
一種治療退化性疾病或失調之方法，其包含投予有效量的C端CDNF片段，該片段包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：1之序列的位置38至70或25至57之至少連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：1的位置38至70或25至57之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列。
一種治療退化性疾病、第1型或第2型糖尿病或視網膜疾病之方法，其包含投予有效量的C端MANF片段，較佳地具有36至78個胺基酸長度，其包含下述或由下述所組成：在列於SEQ ID NO：2之序列的位置33至68或19至52之至少連續的胺基酸殘基：
或與SEQ ID NO：2的位置38至70或19至52之序列具有至少80%之同源性或序列同一性的序列，且若存在，該連續的胺基酸殘基之側翼的序列較佳地與SEQ ID NO：2的相應位置之序列具有至少80%之同源性或序列一致性。