BR112020019696A2

BR112020019696A2 - Fragmentos de cdnf e manf do terminal c, composições farmacêuticas que os compreendem e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020019696A2
Application number: BR112020019696-7A
Authority: BR
Inventors: Mart Saarma; Mikko Airavaara; Merja Voutilainen; Li Ying Yu; Maria Lindahl
Original assignee: Helsingin Yliopisto
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-01-05
Also published as: SG11202009341TA; KR20200138798A; AU2019244323A1; RU2020131433A; JP2024056762A; MX2020010301A; TW202003015A; EP3774858A1; IL277632A; US20210009645A1; WO2019185994A1; JP2021519578A; CA3094236A1; CN112616315A

Abstract

fragmentos de cdnf e manf do terminal c, composições farmacêuticas que os compreendem e usos dos mesmos. a presente invenção fornece um fragmento de cdnf c-terminal ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a dita sequência. o fragmento de cdnf c-terminal protege neurônios estressados de er, motoneurônios e neurônios dopaminérgicos e o fragmento é capaz de penetrar na membrana celular neuronal bem como na barreira hematoencefálica. a presente invenção fornece adicionalmente o dito fragmento e composições farmacêuticas que compreendem o dito fragmento para uso em tratamentos de doenças e distúrbios degenerativos incluindo doenças do sistema nervoso central, diabetes e retinopatias. a presente invenção também fornece uma sequência de fragmento de manf c-terminal ou uma sequência que tem pelo menos 80% de homologia ou identidade de sequência com a dita sequência e composições farmacêuticas que compreendem o dito fragmento de manf para uso no tratamento de doenças e distúrbios degenerativos incluindo doenças do sistema nervoso central, diabetes e retinopatias.

Description

“FRAGMENTOS DE CDNF E MANF DO TERMINAL C, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS COMPREENDEM E USOS DOS MESMOS” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Refere-se a presente invenção aos campos dos fragmentos de proteínas bioativas e peptídeos que penetram na membrana celular e também ao campo de fatores neurotróficos e proteínas localizadas no retículo endoplasmático (ER) e, mais particularmente, ao campo do tratamento de enfermidades ou distúrbios degenerativos, tais como enfermidades do sistema nervoso central, diabetes e distúrbios da retina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os fatores neurotróficos, fator neurotrófico da dopamina cerebral (CDNF) e fator neurotrófico derivado de astrócito mesencefálico (MANF) (Lindholm and Saarma, 2010; Lindahl et al., 2017) são atualmente as proteínas mais eficientes para o tratamento de ratos no modelo 6-OHDA da doença de Parkinson (PD). Os dois fatores previnem potencialmente os sintomas histológicos e comportamentais da doença de Parkinson, induzidos por 6-OHDA, quando aplicados antes da toxina (Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2009). Mais importante, o pós-tratamento (ou seja, tratamento após a indução de 6-OHDA) com qualquer um dos fatores restaurou eficientemente o comportamento motor normal e as inervações dopaminérgicas do estriado quando aplicado na fase em que os sintomas da doença de Parkinson induzidos por 6-OHDA já estão distantes (Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2011). O CDNF protege e repara os neurônios da dopamina também nos modelos MPTP de camundongos e macacos rhesus da doença de Parkinson. No modelo MPTP de macaco, bem como no modelo grave de roedores 6-OHDA, é mais eficiente que o fator neurotrófico derivado da linha celular glial (GDNF) na restauração de neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta (SNPc) e na restauração do comportamento motor (Voutilainen et al., 2011; Airavaara et al., 2012: Voutilainen et al., 2015). Os mecanismos por trás da proteção neuronal para esses fatores não são totalmente claros, mas foi sugerido que, além da ativação da sobrevivência clássica que promove vias anti- apoptóticas, elas regulam as vias da resposta proteica desdobrada (UPR), que visam aliviar a oxidação e O estresse por ER diminui a morte celular apoptótica induzida por estresse por ER (Lindahl et al., 2014; Lindahl et al., 2017, Voutilainen et al., 2017). Muitas condições fisiopatológicas e enfermidades degenerativas, incluindo diabetes mellitus e enfermidades neurodegenerativas, tais como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer (DA), a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a doença de Huntington (HD) estão associadas ao desdobramento e agregação de proteínas que desencadeiam o estresse ER e ativação dos caminhos UPR. Consequentemente, o efeito de CDNF e MANF foi demonstrado em várias enfermidades do sistema nervoso central (WO2009133247; WO2007068803; e Airavaara et al, 2009). Além disso, o CDNF e o MANF suprimem a neuro inflamação, que está envolvida na fisiopatologia da maioria, senão de todas as enfermidades e lesões do SNC (Nadella et al, 2014; Neves et al., 2016; Zhao et al, 2013).

[003] Além disso, o documento WO2014191630 expõe um animal não humano geneticamente modificado que compreende um alelo interrompido para o gene que codifica e expressa naturalmente um gene MANF funcional, em que o referido animal exibe uma redução pós-natal progressiva da massa de células beta pancreáticas devido ao gene do MANF interrompido e não funcional. Também é sugerido um vetor de terapia gênica que administra quantidade eficaz de um polipeptídeo de MANF ou CDNF ou um fragmento funcional para uso no tratamento intrapancreático de diabetes tipo 1 ou tipo 2. Além disso, Lindahl et al., 2014, divulgam que a proteína de MANF é indispensável para a proliferação e sobrevivência de células beta pancreáticas, constituindo assim um candidato terapêutico para a proteção e regeneração de células beta.

[004] O documento WO2013034805 expõe peptídeos de MANF ou CDNF que penetram nas células com o comprimento de 4-40 aminoácidos que compreendem a sequência CXXC para uso no tratamento da doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral, neuropatia periférica, epilepsia, diabetes ou dependência de drogas.

[005] Estudos estruturais de CDNF e MANF mostraram que essas proteínas consistem em dois domínios: um domínio N-terminal tipo saposina (Parkash et al., 2009) e um terminal C tipo SAP (Hellman et al., 2011). O motivo CXXC (resíduos 149-152 da MANF humana, sequência de referência da NCBI: NP_006001.3) está localizado no domínio de terminal C (C-MANF) na região do laço fora do núcleo helicoidal do domínio e as cisteínas são conectadas com a ligação dissulfeto (Hellman et al., 2011). O motivo correspondente de CDNF está localizado na mesma posição (Sequência de Referência NCBI: NP_001025125.2). Foi demonstrado que o C-MANF é potencialmente anti-apoptótico in vitro, quando expresso dentro dos neurônios simpáticos (Hellman et al., 2011). Em Lindström et al., 2013, encontra-se exposta a caracterização de determinantes estruturais e funcionais de MANF e CDNF.

[006] As membranas celulares com sua permeabilidade seletiva controlam as trocas moleculares entre o citosol e o ambiente extracelular de maneira semelhante à que as membranas intracelulares fazem dentro dos compartimentos internos. Por esse motivo, as membranas plasmáticas representam geralmente um obstáculo desafiador à distribuição intracelular de muitas moléculas, especialmente moléculas de alto peso molecular, como proteínas de comprimento total. O transporte ativo de moléculas de alto peso molecular através dessa barreira geralmente requer veículos específicos capazes de atravessar a bicamada lipídica. Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são geralmente peptídeos de 5 a 30 aminoácidos (ou motivos dentro de um peptídeo) que, por sua capacidade de atravessar as membranas celulares, são amplamente utilizados para proporcionar proteínas, DNA plasmídico, RNA, oligonucleotídeos, lipossomas e anti- medicamentos contra o câncer dentro das células (Borrelli et al., 2018; Bode & Löwik, 2017; Kalafatovic & Giralt, 2017; Kristensen et al., 2016).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Na presente invenção, foi descoberto surpreendentemente que um fragmento terminal C da proteína

CDNF protege os neurônios simpáticos e dopaminérgicos estressados por ER in vitro e in vivo, e em contraste com o CDNF completo, o fragmento é capaz de penetrar na membrana celular neuronal bem como na barreira hematoencefálica in vivo.

[008] Por essa razão, constitui um objetivo da presente invenção proporcionar um fragmento de CDNF de terminal C que compreende ou consiste em pelo menos o resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência nas posições 38-70 ou 25-57, conforme estabelecido na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que é dotada de pelo menos 80% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38-70 ou 25-57 na SEQ ID NO:1.

[009] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende um fragmento de CDNF do terminal C e pelo menos um dos seguintes: carreador, tampão, excipiente, conservante e estabilizador fisiologicamente aceitáveis.

[0010] Os resultados da presente invenção proporcionam ainda o referido fragmento de CDNF do terminal C para o uso no tratamento de uma enfermidade ou distúrbio degenerativo, incluindo uma enfermidade do sistema nervoso central (SNC), diabetes ou uma enfermidade da retina, em que a referida enfermidade do SNC é preferencialmente selecionada entre o grupo constituído por doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e outras enfermidades amilóides, atrofia de múltiplos sistemas, esclerose lateral amiotrófica, degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, lesão cerebral traumática, lesões nervosas periféricas, dependência e acidente vascular cerebral.

[0011] A presente invenção também demonstra que, em contraste com a proteína MANF madura, o fragmento de MANF do terminal C (C-MANF) é capaz de penetrar na membrana celular dos neurônios da dopamina e proteger os neurônios em cultura.

[0012] Dessa forma, um outro objetivo da presente invenção é fornecer um fragmento de MANF C- terminal, de preferência, com o comprimento de 36 a 78 aminoácidos, que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 33 a 68 ou 19 a 52 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que de preferência é dotada de pelo menos 80% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 33-68 ou 19-52 na SEQ ID NO:2 para o uso no tratamento de uma enfermidade degenerativa ou distúrbio que inclui enfermidades do sistema nervoso central (CNS), em que o referido fragmento é administrado por meio de administração intravenosa ou periférica, administração intraperitoneal, subcutânea, intranasal, transdérmica, intramuscular, intraocular, ou intra-arterial.

[0013] Também é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende o referido fragmento de MANF do terminal C e pelo menos um dos seguintes: carreador,

tampão, excipiente e estabilizador fisiologicamente aceitáveis, para uso no tratamento de uma enfermidade ou distúrbio degenerativo, incluindo enfermidades do sistema nervoso central (SNC), em que o referido fragmento é administrado por meio de administração intravenosa ou periférica, administração intraperitoneal, subcutânea, intranasal, transdérmica, intramuscular, intraocular ou intra-arterial.

[0014] Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer um fragmento de MANF C-terminal, de preferência, com o comprimento de 36 a 78 aminoácidos, que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 33 a 68 ou 19 a 52 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência dotada de pelo menos 80% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 33-68 ou 19-52 na SEQ ID NO:2 para o uso no tratamento de diabetes do tipo 1 ou tipo 2 ou uma enfermidade da retina.

[0015] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende o fragmento MANF do terminal C e pelo menos um dos seguintes: carreador, tampão, excipiente, conservante e estabilizador fisiologicamente aceitáveis para uso no tratamento de diabetes do tipo 1 ou tipo 2 ou uma enfermidade da retina.

[0016] As vantagens e benefícios mencionados anteriormente no presente caso e outras da presente invenção são alcançados da maneira descrita como características nas reivindicações expostas em anexo.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

[0017] Figura 1. (A) O CDNF é dotado de dois domínios: o domínio do terminal N e o domínio do terminal C. O domínio do terminal N pode se ligar aos fosfolipídios oxidados (e pelo menos o domínio do terminal N, MANF, também sulfatídeo de lipídico, também conhecido como 3-O- sulfogalactosilceramida, vide Bai et al., 2018) e é um domínio semelhante à saposina. O domínio do terminal C é dotado da sequência C-X-X-C e o sinal de retenção ER do terminal C, KTEL, e é um domínio do tipo SAPLIP. O CDNF pode ser clivado proteoliticamente in vitro produzindo esses dois domínios. (B) Visão esquemática das estruturas do MANF e CDNF. As barras verticais pretas mostram a localização de 8 resíduos de cisteína conservados.

[0018] Figura 2. CDNF e o fragmento do terminal C de CDNF expresso a partir de plasmídeos resgatam neurônios simpáticos de gânglios cervicais superiores (SCG) estressados por ER. Na experiência, neurônios SCG de ratos/camundongos com 7 dias de idade foram micro injetados com plasmídeos indicados como expressores de CDNF, o fragmento do terminal C de CDNF (C-CDNF), o plasmídeo de controle PCR3.1 e controle positivo quando o fator de crescimento nervoso (NGF sob 10 ng/ml) foi adicionado ao meio de cultura. No dia seguinte, adicionou-se tunicamicina (TM) sob 2 µM para desencadear a morte celular induzida por estresse de ER, depois de três dias os neurônios vivos e os neurônios fluorescentes foram contados e os resultados são divulgados como porcentagem de neurônios iniciais.

[0019] Figura 3. As proteínas dos fragmentos

CDNF e CDNF resgatam os neurônios SCG estressados por ER quando micro injetados no citoplasma. Na experiência, os neurônios SCG foram preparados a partir de camundongos com 1 dia de idade pós-natal, cultivados durante 7 dias e depois injetados com a proteína CDNF ou C-CDNF humana recombinante, respectivamente. No dia seguinte foi adicionada tunicamicina (2 µM) e após 3 dias os neurônios fluorescentes vivos foram contados. Os resultados são expostos como uma percentagem de neurônios iniciais.

[0020] Figura 4. O fragmento do terminal C de MANF (C-MANF) protege os neurônios dopaminérgicos em cultura. Culturas dissociadas do piso embrionário do cérebro do camundongo NMRI do dia 13 (E13) foram cultivadas em uma placa de 96 poços durante 5 dias com C-MANF, adicionado GDNF ao meio de cultura (controle positivo) ou sem fatores de crescimento como controle. As culturas foram posteriormente coradas para hidroxilase de tirosina (TH). As imagens foram escaneadas por meio do CellInsightTM e os neurônios imuno positivos foram contados por meio do software CellProfiler e CellProfiler de análise. Os dados são expressos como uma percentagem de neurônios positivos para TH mantidos por GDNF.

[0021] Figura 5. O fragmento do terminal C do CDNF (C-CDNF) protege os neurônios dopaminérgicos in vitro. Culturas dissociadas de pisos de cérebro médio de camundongo E13.5 NMRI foram cultivadas na placa de 96 poços durante 5 dias com fragmentos de CDNF ou CDNF adicionados ao meio de cultura em determinadas concentrações. Os neurônios da dopamina cultivados com GDNF (100 ng/ml) ou sem fatores neurotróficos serviram como controle. As culturas foram imuno coloridas para hidroxilase de tirosina (TH), as imagens foram digitalizadas por meio de CellInsightTM. Os neurônios de TH positivos foram contados por meio do software CellProfiler e CellProfiler de análise e expressos como uma percentagem de neurônios mantidos por GDNF.

[0022] Figura 6. O fragmento do terminal C de CDNF (C-CDNF) e o fragmento do terminal C de MANF (C-MANF) penetram na membrana celular dos neurônios da dopamina e nas células PC6. A. 125I-C-CDNF, mas não 125I-CDNF é internalizado eficientemente nos neurônios de dopamina E14 in vitro, mostrando propriedades de penetração celular do C-CDNF. Os neurônios de dopamina E14 em cultura foram incubados com 30.000 cpm de CDNF iodado ou C-CDNF sob 37ºC durante 2 horas. As células foram então colocadas em gelo e lavadas com ácido acético 0,2M, NaCl 0,5M, pH 2,8 e contadas em contador gama. A radioatividade no interior das células foi medida. B. 125I-C-CDNF e 125I-C-MANF, mas não CDNF iodado de comprimento total, penetram na membrana celular das células PC6 de rato. CDNF iodado ou C-CDNF e C- MANF foram aplicados a células PC6 tratadas com ou sem “thapsigargin” durante 3 horas antes da adição de fatores de crescimento. Deixou-se que a internalização ocorresse sob 37ºC durante 90 min. As células foram colocadas em gelo e depois lavadas com ácido acético 0,2M, NaCl 0,5M, pH 2,8 e a radioatividade no interior das células foi medida usando-se um contador gama.

[0023] Figura 7. Penetração de barreira 125 125 125 125 hematoencefálica de I-CDNF, I-C-CDNF e I-C-MANF. I- 125 125 CDNF, I-C-CDNF e I-C-MANF foram injetados por via subcutânea em ratos. Os ratos foram perfundidos com PBS 2 horas depois e o cérebro dissecado. A radioatividade no cérebro foi analisada por contador gama. Os dados são mostrados como a média ±SEM. P<0,05, teste t. *, p> 0,05

[0024] Figura 8. Rotações cumulativas em 2, 4, 6 e 8 semanas pós-lesão no modelo de rato 6-OHDA da DP. CDNF, de CDNF do terminal N (N-CDNF), C-CDNF ou veículo (PBS) foram injetados por via intrastriativa no cérebro de rato 2 semanas após a lesão com 6-OHDA. O C-CDNF é mais eficaz que o CDNF completo na restauração da função neuronal, uma vez que reduz de forma significativa a quantidade cumulativa de rotações induzidas por anfetamina em ratos lesionados com 6-OHDA. Os dados são ilustrados como média ± SEM. Análise post hoc de Tukey-Kramer após ANOVA unidirecional, **** p <0,0001.

[0025] Figura 9. O fragmento do terminal C curto e longo de 4 aminoácidos do MANF (MANF4) não é eficaz no modelo 6-OHDA de ratos da doença de Parkinson quando o peptídeo é infundido no estriado começando 2 semanas após lesões no 6-OHDA e rotações induzidas por anfetaminas medido em 1, 4, 6, 8, 10 e 12 semanas após a lesão (A) ou cumulativamente (B). GDNF foi usado como controle positivo.

[0026] Figura 10. O fragmento MANF do terminal C (C-MANF) estimula a proliferação de células beta de camundongo. A inclusão de Click EdU em células beta após cultura in vitro de ilhotas de camundongo durante 5 dias com lactogênio placentário, C-MANF ou MANF (n = 3 poços/ ponto). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

[0027] Figura 11. O tratamento com C-CDNF tem efeitos benéficos na contagem clínica do modelo de ALS

SOD1. Camundongos SOD1 receberam uma única injeção intracerebroventricular de C-CDNF (3,75 µg) ou PBS com 13 semanas de idade. (A) Situação clínica das fêmeas. O tratamento com C-CDNF retarda o início dos sintomas, uma vez que os ratos SOD1 tratados com C-CDNF apresentaram contagens clínicas estatisticamente significativamente melhores do que os ratos tratados com PBS. (B) O equilíbrio, a coordenação e a força muscular foram analisados com “RotaRod”. Velocidade acelerada 4-40 rpm, tempo de corte 4 min. A latência para queda(s) é ilustrada à esquerda. Fêmeas SOD1-G93A. O tratamento com C-CDNF melhora o comportamento motor de camundongos SOD1-G93A em comparação com camundongos tratados com PBS.

[0028] Figura 12. Efeito da infusão intracerebroventricular crônica de 4 semanas de C-CDNF sob 1,5 µg/24 h no modelo ALS de camundongo SOD1-G93A. (A) Mudanças relativas no peso corporal, sem classificação por gênero. A semana 12 (antes da instalação da mini-bomba) é ilustrada como linha de base. Diferenças significativas entre os tratamentos no peso corporal são detectadas nas semanas 18 e 19 (p <0,05, teste t não pareado bicaudal). (B) A infusão crônica intracerebroventricular de C-CDNF de quatro semanas melhora a coordenação motora medida pelo desempenho do RotaRod em camundongos SOD1-G93A. No teste do “RotaRod”, foi utilizada uma velocidade de aceleração 4-40 rpm com um tempo de corte de 4 min. A diferença entre os tratamentos C-CDNF e PBS foi significativa da semana 13 até a semana 19 (p <0,01, medidas repetidas ANOVA).

[0029] Figura 13. O C-CDNF injetado subcutaneamente diminui o volume do infarto em um modelo de isquemia cerebral em ratos. O C-CDNF (50 µg) foi administrado 30-50 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média distal e logo após a reperfusão em um volume de 100 µl. O tratamento com C-CDNF diminui o volume do infarto quando medido a partir da parte rostral do córtex cerebral (teste t de Student p <0,05). Os ratos tratados com C-CDNF apresentaram lesões cerca de 50% menores do que os ratos tratados com veículo. PBS foi usado como controle. * indica P <0,05. Os valores são expressos como média ± EPM como percentagem do PBS, n = 8-9.

[0030] Figura 14. Os peptídeos C-terminais projetados de CDNF (peptídeos 1 a 7, consultar a Tabela 5) resgatam neurônios SCG estressados de ER quando microinjetados no citoplasma. No experimento, Os neurônios SCG foram preparados a partir de camundongos pós-natais com 1 dia de idade, cultivados por 7 dias e, então, injetados com os peptídeos de CDNF ou C-CDNF humanos recombinantes. No dia seguinte, foi adicionada tunicamicina (2 µM) e, após 3 dias, os neurônios fluorescentes vivos foram contados. Os resultados são revelados como uma porcentagem de neurônios iniciais. Os dados são mostrados como a média ±SEM. Análise post hoc de Tukey-Kramer após ANOVA unilateral, *p< 0,05, **p <0,01, ***p <0,001.

[0031] Figura 15. Os peptídeos C-terminais projetados de CDNF (peptídeos 1 a 7, consultar a Tabela 5) protegem os neurônios dopaminérgicos in vitro. As culturas dissociadas de assoalhos de mesencéfalo de camundongo E13.5 NMRI foram desenvolvidas na placa de 96 poços por 5 dias com peptídeos de CDNF (peptídeos 1 a 7, consultar a Tabela 5) adicionados ao meio de cultura em determinadas concentrações. Neurônios dopaminérgicos cultivados com GDNF (100 ng/ml) ou sem fatores neurotróficos serviram como controles. As culturas foram imunocoradas para tirosina hidroxilase (TH), as imagens foram digitalizadas por CellInsightTM. Neurônios positivos para TH foram contados pelo software CellProfiler e analista CellProfiler e expressos como uma porcentagem de neurônios mantidos por GDNF. Os dados são mostrados como a média ±SEM. Análise post hoc de Tukey-Kramer após ANOVA unilateral, *p< 0,05, **p <0,01, ***p <0,001.

[0032] Figura 16. Microinjeção em neurônios SCG e teste de sobrevivência após tratamento com tunicamicina com peptídeos C-terminais projetados de CDNF (peptídeos 8 a 15, consultar a Tabela 6). Os peptídeos 8 (37 aa), 12 (49 aa com uma única substituição de aminoácido), 13 (49 aa com uma única substituição de aminoácido) e 15 (33 aa) resgatam neurônios SCG estressados de ER quando microinjetados no citoplasma. No experimento, Os neurônios SCG foram preparados a partir de camundongos pós-natais com 1 dia de idade, cultivados por 7 dias e, então, injetados com os peptídeos de CDNF ou C-CDNF humanos recombinantes. No dia seguinte, foi adicionada tunicamicina (2 µM) e, após 3 dias, os neurônios fluorescentes vivos foram contados. Os resultados são revelados como uma porcentagem de neurônios iniciais. Os dados são mostrados como a média ±SEM. Análise post hoc de Tukey-Kramer após ANOVA unilateral, *p< 0,05, **p <0,01.

[0033] Figura 17. As culturas dissociadas de assoalhos de mesencéfalo de camundongo E13.5 NMRI foram desenvolvidas na placa de 96 poços por 5 dias com peptídeos

C-terminais de CDNF (peptídeos 8 a 15, consultar a Tabela 6) adicionados ao meio de cultura em determinadas concentrações. Neurônios dopaminérgicos cultivados com GDNF (100 ng/ml) ou sem fatores neurotróficos serviram como controles. As culturas foram imunocoradas para tirosina hidroxilase (TH), as imagens foram digitalizadas por CellInsightTM. Neurônios positivos para TH foram contados pelo software CellProfiler e analista CellProfiler e expressos como uma porcentagem de neurônios mantidos por GDNF. Todos os peptídeos de C-CDNF mostraram atividade em comparação com proteína de CDNF não clivada, porém os peptídeos 8, 12, 13, 14 e 15 tiveram o melhor efeito protetor sobre os neurônios dopaminérgicos in vitro. Os dados são mostrados como a média ±SEM. Análise post hoc de Tukey-Kramer após ANOVA unilateral, *p< 0,05, **p <0,01, ***p <0,001.

[0034] Figura 18. Os peptídeos C-terminais modificados de CDNF (peptídeo 1, 61 aa, e peptídeo 15, 37 aa, consultar as Tabelas 5 e 6) com acetilação N-terminal e amidação C-terminal protegem os neurônios dopaminérgicos in vitro. As culturas dissociadas de assoalhos de mesencéfalo de camundongo E13.5 NMRI foram desenvolvidas na placa de 96 poços por 5 dias com os peptídeos adicionados ao meio de cultura em determinadas concentrações. Neurônios dopaminérgicos cultivados com GDNF (100 ng/ml) ou sem fatores neurotróficos serviram como controles. As culturas foram imunocoradas para tirosina hidroxilase (TH), as imagens foram digitalizadas por CellInsightTM. Neurônios positivos para TH foram contados pelo software CellProfiler e analista CellProfiler e expressos como uma porcentagem de neurônios mantidos por GDNF.

[0035] Figura 19. C-CDNF 33 aa (pep15, consultar a Tabela 6), fornecido como injeções subcutâneas repetidas, é eficaz na proteção contra o comprometimento induzido por 6-OHDA no desequilíbrio motor, conforme medido pelo comportamento rotacional induzido por anfetamina. 6- OHDA (3x2 μg) foi injetado no estriado. A partir de duas semanas após a lesão, os animais receberam injeções subcutâneas de C-CDNF 33 aa ou veículo (PBS) duas vezes por semana durante 4 semanas (nível de dose: 50 µg/injeção s.c., dose total após 8 injeções s.c.: 400 µg. (A) Testes de rotação induzida por anfetamina foram realizados 2, 4, 6, 8 , 10 e 12 semanas após a lesão. (B) Rotações cumulativas em 2, 4, 6, 8, 10 e 12 semanas. Os valores são expressos como média ± SEM, n=9. *** indica p<0,001 para C- CDNF (50 µg x 8 s.c.) vs grupo de controle tratado com veículo.

[0036] Figura 20. Os peptídeos de C-CDNF quimicamente sintetizados e expressos em células CHO (pep1, 61 aa) têm espectros de CD idênticos e retêm uma estrutura secundária bem definida com α hélices e laços. Medição de espectros de CD usando o instrumento JASCO J720. Concentração de peptídeos: 30µM. Veículo: 20mM de PB, pH 7. Volume: 300µl. Comprimento de onda: 260 a 195nm.

[0037] Figura 21. Os espectros de CD de peptídeos C-CDNF quimicamente sintetizados (pep1, pep8, pep9, pep12 e pep13, consultar as Tabelas 5 a 6). O peptídeo 8 de C-CDNF (pep8) preservou alguns elementos da estrutura secundária. O peptídeo 9 de C-CDNF definiu uma estrutura secundária similar a C-CDNF 61aa (pep1). O peptídeo 12 de C-CDNF (pep12) definiu uma estrutura secundária, porém perdeu algumas regiões -helicoidais em comparação com C-CDNF 61aa (pep1). O peptídeo 13 de C-CDNF (pep13) definiu uma estrutura secundária, porém perdeu algumas regiões -helicoidais em comparação com o peptídeo 12 (pep12). Medição de espectros de CD usando o instrumento JASCO J720. Concentração de peptídeos: 30 a 100 µM. Veículo: 20mM de PB, pH 8. Volume: 300µl. Comprimento de onda: 260 a 195nm.

[0038] Figura 22. O espectro de CD de peptídeo 15 de C-CDNF (pep15) mostra que o peptídeo preservou alguns elementos da estrutura secundária. Medição de espectros de CD usando o instrumento JASCO J720. Concentração do peptídeo: 50µM. Veículo: 20mM de PB, pH 8. Volume: 300µl. Comprimento de onda: 260 a 195nm.

[0039] Figura 23. Alinhamento de sequências e comparação entre C-CDNF (SEQ ID NO:4) e C-MANF (SEQ ID NO:5). A estrutura C-terminal de ambos os fatores neurotróficos compreende três motivos alfa-hélice (hélice 1, 2 e 3). Os peptídeos C-terminais de CDNF 5 e 6 (consultar a Tabela 5) contêm apenas dois dentre três motivos (hélice 2 e 3).

[0040] Figura 24. Previsão de sítio de clivagem de protease de fragmento C-terminal de CDNF (SEQ ID NO:1).

[0041] Figura 25. Previsão de sítio de clivagem de protease de fragmento C-terminal de MANF (SEQ ID NO:2).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0042] A presente invenção está relacionada a uma proteína de fator neurotrófico CDNF. Os polipeptídeos CDNF são o CDNF humano completo com um peptídeo de sinal com o comprimento total de 187 aminoácidos e o CDNF humano maduro sem o peptídeo de sinal com o comprimento total de 161 aminoácidos (vide Figura 1B).

[0043] A presente invenção também está relacionada à proteína fator neurotrófico MANF. Os polipeptídeos de MANF particularmente importantes são o MANF humano completo com um peptídeo de sinal com o comprimento total de 179 aminoácidos e o MANF humano maduro sem o peptídeo de sinal com o comprimento total de 158 aminoácidos (vide Figura 1B).

[0044] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo "fragmento de terminal C" quando aplicado a um polipeptídeo CDNF ou MANF, pode compreender normalmente pelo menos cerca de 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 or 57 aminoácidos contíguos ou consecutivos, tipicamente, pelo menos cerca de 43 ou 55 aminoácidos contíguos ou consecutivos, mais tipicamente, pelo menos cerca de 57 ou 60 aminoácidos contíguos ou consecutivos localizados no domínio do terminal C do tipo SAP dos referidos polipeptídeos (vide as figuras 1A e 1B). O fragmento terminal C também pode ser dotado de mais de 61 ou 65 aminoácidos contíguos ou consecutivos, em alguns casos mais de 70 aminoácidos contíguos ou consecutivos. Com maior preferência, o fragmento terminal C compreende 33-57, 33- 61, 33-81, 43-57, 43-61, 43-81, ou 60-65 aminoácidos contíguos ou consecutivos do domínio terminal C. Esses fragmentos terminais C são "fragmentos funcionais", retendo pelo menos parcialmente a atividade biológica do polipeptídeo intacto e podem até ter propriedades que o polipeptídeo intacto não possui.

[0045] Além das variantes alélicas de CDNF/MANF que ocorrem naturalmente, alterações podem ser introduzidas por mutação nas sequências de ácidos nucleicos CDNF/MANF que incorrem em alterações como alongamentos, inserções e deleções nas sequências de aminoácidos do polipeptídeo CDNF/MANF ou fragmento terminal C do mesmo. As substituições de nucleotídeos que levam a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos "não essenciais" podem ser feitas na sequência de um polipeptídeo CDNF/MANF e no seu domínio de terminal C.

[0046] Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser modificado nas seqüências do tipo silvestre de CDNF/MANF sem alterar sua atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para essa atividade biológica. Por exemplo, prevê-se que os resíduos de aminoácidos que são conservados entre as moléculas de CDNF/MANF da invenção sejam essenciais e particularmente não passíveis de alteração. Os aminoácidos para os quais podem ser feitas substituições conservativas são amplamente conhecidos na técnica.

[0047] Cada aminoácido pode ser um aminoácido natural ou não natural. O termo "aminoácido não natural" refere-se a um composto orgânico que é um congênere de um aminoácido natural, uma vez que possui uma estrutura semelhante a um aminoácido natural, de modo que imita a estrutura e a reatividade de um aminoácido natural. O aminoácido não natural pode ser um aminoácido modificado e/ou análogo de aminoácido, que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou os raros aminoácidos naturais de selenocisteína ou pirolisina. Aminoácidos não naturais também podem ser o isômero D dos aminoácidos naturais. Exemplos de aminoácidos adequados incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos, alanina, aloisoleucina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ciclo-hexilalanina, ácido 2,3- diaminopropiônico, 4-fluorofenilalanina, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, homoprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, naftilalanina, norleucina, fenilalanina, fenilglicina, ácido pipecólico, prolina, ácido piroglutâmico, sarcosina, serina, selenocisteína, treonina, triptofano, tirosina, valina, um derivado ou combinações dos mesmos.

[0048] Determinadas concretizações da invenção incluem fragmentos terminais C de CDNF -ou fragmentos terminais C de MANF em que pelo menos um, dois, três, quatro ou mais aminoácidos consecutivos possuem quiralidade alternada. Da forma que é usada no presente caso, quiralidade refere-se aos isômeros "D" e "L" dos aminoácidos. Em concretizações particulares da invenção, pelo menos um, dois, três, quatro ou mais aminoácidos consecutivos são dotados de quiralidade alternada e os aminoácidos restantes são aminoácidos L.

[0049] Na presente exposição, foi demonstrada a captação celular dos fragmentos CDNF dos terminais C e fragmentos MANF dos terminais C da invenção em células neuronais. Em determinadas concretizações, a captação é preferencialmente melhor pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11 ou 12 vezes em comparação com CDNF ou MANF de comprimento total e com peptídeos específicos 13 vezes melhores que CDNF ou MANF. De acordo com determinadas concretizações, a invenção demonstra eficiência aperfeiçoada de captação celular dos fragmentos de CDNF do terminal C da invenção em comparação com controles como CDNF humano completo. De acordo com determinadas concretizações, a invenção demonstra eficiência aperfeiçoada de captação celular dos fragmentos MANF dos terminais C da invenção em comparação com controles tais como MANF humano de comprimento pleno.

[0050] Da forma que é utilizado no presente caso, eficiência de captação celular refere-se à capacidade de um fragmento CDNF de terminal C ou fragmento MANF de terminal C atravessar uma membrana celular. A captação celular dos fragmentos CDNF de terminais C ou fragmentos MANF de terminais C da invenção não depende de um receptor ou de um tipo de célula.

[0051] Uma pessoa versada na técnica pode testar a eficiência de captação de um fragmento CDNF de terminal C e/ou fragmentos MANF de terminal C comparando- se (i) a quantidade de um peptídeo que penetra na célula, como os fragmentos CDNF do terminal C ou fragmentos MANF do terminal C internalizados por um tipo de célula (por exemplo, células neuronais, células endoteliais) com (ii) a quantidade de um peptídeo de controle tal como CDNF / MANF de corpo inteiro internalizado pelo mesmo tipo de célula. Para se medir a eficiência de captação celular, o tipo de célula pode ser incubado na presença de um peptídeo que penetra na célula tais como o fragmento CDNF do terminal C ou o fragmento MANF do terminal C durante um período de tempo específico (por exemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, e assim por diante) depois do qual a quantidade do peptídeo de penetração celular internalizado pela célula é quantificada. Separadamente, a mesma concentração do controle é incubada na presença do tipo de célula durante o mesmo período de tempo, e a quantidade do segundo peptídeo internalizado pela célula é quantificada. A quantificação pode ser alcançada marcando-se de forma fluorescente o peptídeo que penetra nas células, como os fragmentos CDNF do terminal C ou os fragmentos MANF do terminal C (por exemplo, com um corante FITC) e medindo-se a intensidade da fluorescência usando-se técnicas que são amplamente conhecidas no campo da técnica.

[0052] Os fragmentos de CDNF do terminal C e os fragmentos de MANF do terminal C da invenção também demonstram efeito de proteção para células, por exemplo, células neuronais em comparação com controles adequados (vide, por exemplo, Figuras 14 e 15). Da forma que é utilizado no presente caso, efeito de proteção refere-se à capacidade de um fragmento CDNF de terminal C ou fragmento MANF de terminal C da invenção promover a sobrevivência de, por exemplo, neurônios dopaminérgicos ou células neuronais estressadas por ER. Uma pessoa versada na técnica pode testar o referido efeito de proteção comparando (i) a dose de fragmentos CDNF de terminais C ou fragmentos MANF de terminais C da invenção à sobrevivência de um tipo de célula (por exemplo, células neuronais simpáticas ou neurônios dopaminérgicos) (ii) o nível de sobrevivência do peptídeo de controle pelo mesmo tipo de célula ou o nível de sobrevivência de nenhum fator neurotrófico adicionado pelo mesmo tipo de célula. Para medir a sobrevivência celular, o tipo de célula pode ser incubado na presença de fragmentos CDNF de terminais C ou fragmentos MANF de terminais C da invenção durante um período de tempo especificado (por exemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, e assim por diante) após o qual a sobrevivência celular da célula é quantificada. Separadamente, a mesma concentração de peptídeo de controle é incubada na presença do tipo de célula durante o mesmo período de tempo, e a sobrevivência celular do segundo peptídeo pela célula é quantificada. Alternativamente, o tipo de célula é incubado sem fatores neurotróficos durante o mesmo período de tempo, e a sobrevivência celular pela célula é quantificada.

[0053] De acordo com uma concretização, para se medir a sobrevivência celular, o tipo de célula pode ser injetado com fragmentos CDNF de terminais C ou fragmentos MANF de terminais C da invenção e incubado-se durante um período de tempo especificado (por exemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, e assim por diante) após o que a sobrevivência celular da célula é quantificada. As células de controle são injetadas com um tampão (ou seja, sem fatores neurotróficos) e as células de controle são incubadas durante o mesmo período de tempo, e a sobrevivência celular pela célula é quantificada.

[0054] Em determinadas modalidades, o efeito protetor (medido como sobrevivência celular) do fragmento de CDNF C-terminal da invenção é pelo menos 1,01 vez, pelo menos 1,02 vez, pelo menos 1,03 vez, pelo menos 1,04 vez, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,06 vez, pelo menos 1,07 vez, pelo menos 1,08 vez, pelo menos 1,09 vez, pelo menos 1,1 vez, pelo menos 1,11 vez, pelo menos 1,12 vez, pelo menos 1,13 vez, pelo menos 1,14 vez, pelo menos 1,15 vez, pelo menos 1,16 vez, pelo menos 1,17 vez, pelo menos 1,19 vez, pelo menos 1,2 vez, pelo menos 1,21 vez, pelo menos 1,23 vez, pelo menos 1,25 vez, pelo menos 1,26 vez, pelo menos 1,27 vez, pelo menos 1,28 vez, pelo menos 1,29 vez, pelo menos 1,3 vez, pelo menos 1,31 vez, pelo menos 1,32 vez, pelo menos 1,33 vez, pelo menos 1,34 vez, pelo menos 1,35 vez, pelo menos 1,37 vez, pelo menos 1,4 vez, pelo menos 1,42 vez, pelo menos 1,43 vez, pelo menos 1,45 vez, pelo menos 1,48 vez, pelo menos 1,49 vez, pelo menos 1.5 vez, pelo menos 1,55 vez, pelo menos 1,6 vez, pelo menos 1,65 vez, pelo menos 1,7 vez, pelo menos 1,75 vez, pelo menos 1,8 vez, pelo menos 1,85 vez, pelo menos 1,89 vez, pelo menos 1,9 vez, pelo menos 1,94 vez, pelo menos 1,95 vez, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,05 vezes, pelo menos 2,10 vezes, pelo menos 2,11 vezes, pelo menos 2,14 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,16 vezes, pelo menos 2,19 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,21 vezes, pelo menos 2,23 vezes, pelo menos 2,24 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,26 vezes, pelo menos 2,28 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,32 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,37 vezes, pelo menos 2,39 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,42 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,52 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,65 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,75 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,85 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3,0 vezes,

pelo menos 3,1 vezes, pelo menos 3,2 vezes, pelo menos 3,3 vezes, pelo menos 3,4 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 3,6 vezes, pelo menos 3,7 vezes, pelo menos 3,8 vezes, pelo menos 3,9 vezes ou pelo menos 4,0 vezes em comparação com as células incubadas na ausência de fatores de crescimento adicionados ou injetadas com um tampão sem fatores de crescimento.

[0055] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,01 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0056] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,02 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0057] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,03 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0058] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,04 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0059] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,05 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0060] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,05 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0061] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,06 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0062] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,07 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0063] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,08 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0064] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,09 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0065] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,1 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0066] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,11 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0067] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,12 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0068] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,13 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0069] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,14 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0070] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,15 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0071] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,16 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0072] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,17 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0073] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,19 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0074] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,2 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0075] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,21 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0076] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,23 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0077] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,25 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0078] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,26 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0079] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,27 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0080] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,28 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0081] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,29 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0082] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,3 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0083] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,31 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0084] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,32 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0085] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,33 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0086] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,34 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0087] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,35 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0088] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,37 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0089] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,4 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0090] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,42 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0091] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,43 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0092] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,45 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0093] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,48 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0094] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,49 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0095] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,5 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0096] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,55 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0097] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,6 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0098] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,65 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[0099] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,7 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00100] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,75 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00101] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,8 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00102] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,85 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00103] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,89 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00104] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,9 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00105] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,94 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00106] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 1,95 vez em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00107] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,0 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00108] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,05 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00109] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,10 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00110] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,11 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00111] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,14 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00112] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,15 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00113] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,16 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00114] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,19 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00115] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,2 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00116] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,21 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00117] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,23 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00118] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,24 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00119] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,25 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00120] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,26 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00121] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,28 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00122] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,3 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00123] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,32 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00124] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,35 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00125] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,37 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00126] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,39 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00127] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,4 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00128] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,42 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00129] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,45 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00130] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,5 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00131] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,52 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00132] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,55 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00133] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,6 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00134] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,65 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00135] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,7 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00136] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,75 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00137] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,8 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00138] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,85 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00139] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 2,9 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00140] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,0 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00141] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,1 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00142] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,2 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00143] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,3 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00144] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,4 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00145] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,5 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00146] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,6 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00147] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,7 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00148] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,8 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00149] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 3,9 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00150] Em uma modalidade, o efeito protetor é pelo menos 4,0 vezes em comparação com as células incubadas sem fatores de crescimento.

[00151] Em determinadas modalidades, o efeito protetor do fragmento de MANF C-terminal da invenção é pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,1 vez, pelo menos 1,2 vez, pelo menos 1,3 vez, pelo menos 1,4 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 1,6 vez, pelo menos 1,7 vez, pelo menos 1,8 vez,

pelo menos 1,9 vez, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,10 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,1 vezes, pelo menos 3,2 vezes, pelo menos 3,3 vezes, pelo menos 3,4 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 3,6 vezes, pelo menos 3,7 vezes, pelo menos 3,8 vezes, pelo menos 3,9 vezes ou pelo menos 4,0 vezes em comparação com as células incubadas na ausência de fatores de crescimento adicionados ou injetadas com um tampão sem fatores de crescimento.

[00152] Consequentemente, a presente invenção fornece um fragmento de CDNF C-terminal que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1, em que o dito fragmento é um peptídeo que penetra na membrana celular e tem um efeito protetor em células neuronais, de preferência, para uso como um medicamento. Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1.

[00153] Em uma modalidade preferencial, o fragmento, de preferência, com um comprimento de até 33 a 81 aminoácidos, compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1. O termo “sequência de flanqueamento” se refere a aminoácidos que alongam ambas ou pelo menos uma das extremidades terminais dos ditos resíduos de aminoácidos consecutivos. Em uma modalidade, a dita sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

[00154] Sem se limitar a qualquer teoria, os resultados da Figura 15 mostram que os motivos de sequência de aminoácidos importantes para a penetração na membrana celular e para efeito protetor em células neuronais estão situados entre os resíduos de aminoácidos nas posições cerca de 38 e cerca de 70 da SEQ ID NO:1. Esta área contém duas estruturas de hélice (hélice 2 e hélice 3) e o motivo CXXC entre as mesmas (consultar a Figura 23). Ademais, os resultados das Figuras 16 e 17 mostram que o peptídeo de C- CDNF 15 (33 aa) contendo as hélices 1 e 2 e o motivo CXXC tem efeito protetor em células neuronais.

Consequentemente, a presente invenção é direcionada a modalidades, em que o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70, 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70, 31 a 70, 38 a 73, 37 a 73, 36 a 73, 35 a 73, 34 a 73, 33 a 73, 32 a 73, 31 a 73, 25 a 57, 24 a 57, 23 a 57, 22 a 57, 21 a 57, 20 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70, 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70, 31 a 70, 38 a 73, 37 a 73, 36 a 73, 35 a 73, 34 a 73, 33 a 73, 32 a 73, 31 a 73, 25 a 57, 24 a 57, 23 a 57, 22 a 57, 21 a 57, 20 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70, 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70, 31 a 70, 38 a 73,

37 a 73, 36 a 73, 35 a 73, 34 a 73, 33 a 73, 32 a 73, 31 a 73, 25 a 57, 24 a 57, 23 a 57, 22 a 57, 21 a 57, 20 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 na SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos, se presente, tem, de preferência, pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

[00155] Em uma outra modalidade preferencial, o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 (peptídeo 6; SEQ ID NO: 15), 25 a 73 (peptídeo 4; SEQ ID NO: 13), 21 a 73 (peptídeo 3; SEQ ID NO: 12), 21 a 70 (peptídeo 7; SEQ ID NO: 16), 31 a 81 (peptídeo 5; SEQ ID NO: 14), 25 a 81 (peptídeo 2; SEQ ID NO: 11), 25 a 57 (peptídeo 15, SEQ ID NO:24), ou 37 a 73 (peptídeo 8, SEQ ID NO:17) da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73, 25 a 73, 21 a 73, 21 a 70, 31 a 81, 25 a 81, 25 a 57 ou 37 a 73 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %,

86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73, 25 a 73, 21 a 73, 21 a 70, 31 a 81, 25 a 81, 25 a 57 ou 37 a 73 na SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

[00156] Em uma outra modalidade preferencial, o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73 na SEQ ID NO:1 e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C- terminal compreende ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73 na SEQ ID NO:1.

[00157] Em uma outra modalidade preferencial, o fragmento de CDNF C-terminal compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições

25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 25 a 57 na SEQ ID NO:1 e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C- terminal compreende ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 25 a 57 na SEQ ID NO:1.

[00158] Em uma modalidade preferencial, a invenção é direcionada a um fragmento de CDNF C-terminal que consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que é pelo menos 90 % homóloga à sequência da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, a sequência é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% homóloga à sequência da SEQ ID NO:1.

[00159] A presente invenção também se refere a um fragmento de MANF C-terminal que consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que é pelo menos 90 % homóloga à sequência da SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, a sequência é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% homóloga à sequência da SEQ ID NO:2.

[00160] Como usado no presente documento no relatório descritivo e na seção de reivindicações abaixo, o termo “fragmento” inclui peptídeos nativos (produtos de degradação, peptídeos sinteticamente sintetizados ou peptídeos recombinantes) e peptídeos modificados, que podem ter, por exemplo, modificações tornando os peptídeos mais estáveis ou menos imunogênicos. Tais modificações incluem, porém sem limitação, ciclização, modificação de terminação N, modificação de terminação C, modificação de ligação peptídica, modificação de cadeia principal e modificação de resíduo. O fragmento pode compreender também alongamentos, deleções, substituições ou inserções adicionais.

[00161] Em uma modalidade, o fragmento é resistente à clivagem de protease. Em uma modalidade, o fragmento compreende um alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação de modo que o dito alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação suprima pelo menos um sítio de clivagem de protease.

[00162] Como usado no presente documento, “sítio de clivagem de protease” se refere a uma sequência de aminoácidos que é reconhecida e clivada por uma protease. Em algumas modalidades, o fragmento de CDNF C- terminal ou fragmento de MANF C-terminal inclui um ou mais sítios de clivagem de protease que podem ser clivados por uma cisteína protease, uma metaloprotease ou uma serina protease. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem de protease são os sítios de clivagem de protease conforme ilustrado, por exemplo, na Figura 24 ou na Figura 25 ou nas Tabelas 7 e 8.

[00163] Como usado no presente documento, o termo “fragmento resistente à protease” ou “fragmento é resistente à clivagem de protease” se refere a um fragmento de CDNF C-terminal ou fragmento de MANF C-terminal contendo uma sequência de aminoácido alterada que suprime pelo menos um sítio de clivagem de protease nativo ou muda uma sequência próxima ou adjacente a um sítio de clivagem de protease nativo de modo que a clivagem de protease seja impedida, inibida, reduzida ou desacelerada em comparação com o fragmento de CDNF C-terminal ou fragmento de MANF nativo correspondente.

[00164] Em algumas modalidades, uma alteração adequada suprime pelo menos um sítio de clivagem de protease.

[00165] Em algumas modalidades, uma alteração adequada suprime pelo menos dois sítios de clivagem de protease.

[00166] Em algumas modalidades, uma alteração adequada suprime pelo menos três sítios de clivagem de protease.

[00167] Em algumas modalidades, uma alteração adequada suprime pelo menos quatro ou mais sítios de clivagem de protease.

[00168] Em uma modalidade, todos os sítios de clivagem de cisteína protease foram suprimidos.

[00169] Em uma modalidade, todos os sítios de clivagem de metaloprotease foram suprimidos.

[00170] Em uma modalidade, todos os sítios de clivagem de serina protease foram suprimidos.

[00171] Uma alteração pode ser substituições, deleções, inserções, alongamentos ou modificações de aminoácidos.

[00172] Por exemplo, qualquer aminoácido dentro da região correspondente aos resíduos 1 a 75 (por exemplo, 1 a 8, 16 a 23, 26 a 33, 32 a 39, 37 a 44, 38 a 45, 43 a 50, 46 a 53, 57 a 64, 59 a 66, 60 a 67 e 68 a 75) da SEQ ID NO:1, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 11 a 24, pode ser substituído por qualquer outro aminoácido, deletado ou modificado. Por exemplo, as substituições nas posições adjacentes a um sítio de clivagem de protease podem afetar o reconhecimento de protease do sítio de clivagem. A substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos adicionais dentro de cada sítio de reconhecimento pode suprimir um ou mais sítios de clivagem de protease. A deleção de um ou mais resíduos nas posições degeneradas pode também suprimir ambos os sítios de clivagem de protease.

[00173] Em algumas modalidades, um fragmento resistente à protease contém substituições ou modificações de aminoácidos nas posições correspondentes a 46, 49, 35, 63, 4, 71, 19, 40, 41, 60, 62, 29 da SEQ ID NO:1, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 11 a 24.

[00174] Em algumas modalidades, o fragmento resistente à protease adequado para a invenção pode conter alterações adicionais. Por exemplo, até 20% ou mais dos resíduos da SEQ ID NO:1, NO:3, NO:4 ou NO: 11 a 24 pode ser alterado (por exemplo, até to 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou mais resíduos podem ser trocados ou alterados). Dessa forma, um fragmento resistente à protease adequado para a invenção pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, incluindo pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, idêntica à SEQ ID NO:1, NO:3, NO:4 ou NO:11 a 24.

[00175] Como usado no presente documento, o termo “sítio de clivagem de protease de cisteína protease” (também chamado de “sítio de clivagem de cisteína protease” ou “sequência de clivagem de cisteína protease”) se refere à sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína que serve como uma sequência de reconhecimento para clivagem de protease enzimática por cisteína protease. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de cisteína pode compreender QILH|SWGE ou HSWG|EECR na SEQ ID NO:1, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 11 a 24, em que o sítio de clivagem é mostrado como “|” na sequência.

[00176] Como usado no presente documento, o termo “sítio de clivagem de metaloprotease” (também chamado de “sítio de clivagem de metaloprotease” ou “sequência de clivagem de metaloprotease”) se refere à sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína que serve como uma sequência de reconhecimento para clivagem de protease enzimática por metaloprotease. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de metaloprotease pode compreender DLRK|MRVA, DYVN|LIQE, MPAM|KICE, QICE|LKYE, LAPK|YAAT, EKTD|YVNL ou RVAE|LKQI na SEQ ID NO:1, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 11 a 24, em que o sítio de clivagem é mostrado como “|” na sequência.

[00177] Como usado no presente documento, o termo “sítio de clivagem de serina protease” (também chamado de “sítio de clivagem de serina protease” ou “sequência de clivagem de serina protease”) se refere à sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína que serve como uma sequência de reconhecimento para clivagem de protease enzimática por serina protease. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de serina pode compreender VAEL|KQIL, LDLA|SVDL ou TDYV|NLIQ na SEQ ID NO:1, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 11 a 24, em que o sítio de clivagem é mostrado como “|” na sequência.

[00178] Em uma modalidade, a protease é selecionada do grupo que consiste em uma cisteína protease, uma metaloprotease e uma serina protease.

[00179] Em uma modalidade, a cisteína protease é catepsina K.

[00180] Em uma modalidade, a metaloprotease é MMP-9 ou MMP-3.

[00181] Em uma modalidade, a serina protease é quimotripsina A ou elastase-2.

[00182] Por exemplo, qualquer aminoácido dentro da região correspondente aos resíduos 11 a 70 (por exemplo, 11 a 18, 18 a 25, 21 a 28, 24 a 31, 33 a 40, 52 a 59, 54 a 61, 59 a 66 ou 63 a 70) da SEQ ID NO:2, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 5 ou 6, pode ser substituído por qualquer outro aminoácido, deletado ou modificado. Por exemplo, as substituições nas posições adjacentes a um sítio de clivagem de protease podem afetar o reconhecimento de protease do sítio de clivagem. A substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos adicionais dentro de cada sítio de reconhecimento pode suprimir um ou mais sítios de clivagem de protease. A deleção de um ou mais resíduos nas posições degeneradas pode também suprimir ambos os sítios de clivagem de protease.

[00183] Em algumas modalidades, um fragmento resistente à protease contém substituições de aminoácidos nas posições correspondentes a 62, 27, 14, 66, 36, 21, 55, 57 ou 24 da SEQ ID NO:2, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 5 ou 6.

[00184] Em algumas modalidades, o fragmento resistente à protease adequado para a invenção pode conter alterações adicionais. Por exemplo, até 20% ou mais dos resíduos da SEQ ID NO:2, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 5 ou 6, podem ser alterados (por exemplo, até to 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou mais resíduos podem ser trocados ou alterados). Dessa forma, um fragmento resistente à protease adequado para a invenção pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, incluindo pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, idêntica à SEQ ID No:2, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 5 ou 6.

[00185] Como usado no presente documento, o termo “sítio de clivagem de metaloprotease” (também chamado de “sítio de clivagem de metaloprotease” ou “sequência de clivagem de metaloprotease”) se refere à sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína que serve como uma sequência de reconhecimento para clivagem de protease enzimática por metaloprotease. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de metaloprotease pode compreender KINE|LMPK, KINE|LMPK, STVD|LKKL, QICE|LKYD, EKSD|YIRK ou LMPK|YAPK na SEQ ID NO:2, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 5 ou 6, em que o sítio de clivagem é mostrado como “|” na sequência.

[00186] Como usado no presente documento, o termo “sítio de clivagem de serina protease” (também chamado de “sítio de clivagem de serina protease” ou “sequência de clivagem de serina protease”) se refere à sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína que serve como uma sequência de reconhecimento para clivagem de protease enzimática por serina protease. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de serina pode compreender VKEL|KKIL, DKQI|DLST, SDYI|RKIN, IDLS|TVDL na SEQ ID NO:2, ou aminoácidos correspondentes nas SEQ ID NOs: 5 ou 6, em que o sítio de clivagem é mostrado como “|” na sequência.

[00187] Em uma modalidade, a protease é selecionada do grupo que consiste em uma metaloprotease e uma serina protease.

[00188] Em uma modalidade, a metaloprotease é MMP-9 ou MMP-2.

[00189] Em uma modalidade, a serina protease é quimotripsina A ou elastase-2.

[00190] Nas modalidades da invenção, o comprimento do fragmento está na faixa de 33 a 81, 43 a 81, 43 a 61 ou 50 a 81 aminoácidos. De preferência, o comprimento do fragmento está na faixa de 55 a 75, 55 a 70, 55 a 61, 61 a 65 ou 61 a 70 aminoácidos. Com mais preferência, o comprimento do fragmento está na faixa de 49 a 61, 50 a 61, 51 a 61, 53 a 61, 57 a 61, 55 a 69, 55 a 68, 55 a 67, 55 a 66, 56 a 69, 56 a 68, 56 a 67, 56 a 61, 57 a 69, 57 a 68, 57 a 67, 57 a 61, 58 a 69, 58 a 68, 58 a 67, 58 a 61, 59 a 69, 59 a 68, 59 a 67, 59 a 61, 60 a 69, 60 a 68, 60 a 67, 60 a 66, 60 a 64, 60 a 63, 61 a 62, 61 a 63, 61 a 64, 61 a 65, 61 a 66 ou 61 a 67 aminoácidos.

Por exemplo, os fragmentos preferenciais podem consistir em pelo menos 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ou 75 aminoácidos.

Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C-terminal consiste em 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 de 61 aminoácidos.

Em uma modalidade, o fragmento de MANF C-terminal consiste em 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 de 61 aminoácidos.

Os fragmentos podem compreender qualquer um dos aminoácidos de ocorrência natural como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina bem como aminoácidos não convencionais ou modificados.

De preferência, o fragmento tem pelo menos 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85% ou 80% de homologia ou identidade de sequência com a sequência do domínio C-terminal na proteína de CDNF ou MANF humana.

Com mais preferência, o fragmento tem pelo menos 80% de homologia ou identidade de sequência com a sequência do domínio C-terminal na proteína humana de CDNF ou MANF. “Homologia” como usado no presente documento, se refere à similaridade de sequência entre uma sequência de referência e pelo menos um fragmento de uma segunda sequência. Conforme descrito a seguir, BLAST irá comparar as sequências com base na porcentagem de identidade e similaridade.

[00191] De preferência, o CDNF C-terminal que é pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% homólogo à sequência da SEQ ID NO:1 compreende a sequência CXXC nas posições 52 a 55 da SEQ ID NO:1, em que X é qualquer aminoácido. Com mais preferência, a dita sequência que é pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% homóloga à sequência da SEQ ID NO:1 consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência da SEQ ID NO:3:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECXXCAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L em que X é qualquer aminoácido.

[00192] Em uma outra modalidade preferencial, a dita sequência que é pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% homóloga à sequência da SEQ ID NO:1 compreende a sequência CKGC nas posições 52 a 55 da SEQ ID NO:1

[00193] Na modalidade da máxima preferência, o dito fragmento tem a sequência da SEQ ID NO:4:

KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP

KYAATHPKTE L ou uma sequência que é pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99% homóloga à sequência da

SEQ ID NO:4.

[00194] Em uma modalidade, o fragmento de CDNF C-terminal não contém seus aminoácidos C-terminais naturais, ou seja, o sinal de retenção de ER. Consequentemente, em uma modalidade preferencial, o fragmento é desprovido do sinal de retenção de ER KTEL correspondente às posições 78 a 81 da SEQ ID NO:1.

[00195] A presente invenção também mostra que o fragmento pode ser conjugado com uma porção química ou bioquímica detectável, tal como um marcador de FITC. Da forma que é utilizado no presente caso, um "radical químico ou bioquímico detectável" significa um marcador que exibe uma sequência de aminoácidos ou um radical químico ou bioquímico detectável com o objetivo de facilitar a detecção do peptídeo; tal como uma molécula detectável selecionada entre: um corante visível, fluorescente, quimio luminescente ou outro corante detectável; uma enzima que é detectável na presença de um substrato, por exemplo, uma fosfatase alcalina com NBT mais BCIP ou uma peroxidase com um substrato adequado; uma proteína detectável, por exemplo, uma proteína verde fluorescente. De preferência, a etiqueta não impede ou dificulta a penetração do fragmento na célula alvo.

[00196] Também são preferidas modificações no terminal N e/ou C dos fragmentos CDNF do terminal C ou fragmentos MANF do terminal C para aumentar a estabilidade e/ou permeabilidade celular dos fragmentos. A acetilação - amidação dos terminais do fragmento CDNF ou MANF (por exemplo, acetilação no terminal N e amidação no terminal C) é uma das opções conhecidas na técnica (vide, por exemplo,

Marino et al. 2015, ACS Chem. Biol. 10: 1754-1764).

[00197] Uma vez que o fragmento CDNF do terminal C e o fragmento MANF do terminal C protegeram de forma potente os neurônios da dopamina da morte (vide Figuras 4 e 5), a técnica anterior, como WO2009133247 e EP1969003, mostra que os fragmentos podem ser utilizados no tratamento de enfermidades do sistema nervoso central (SNC), tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson (DP), atrofia de múltiplos sistemas, esclerose lateral amiotrófica (ELA), degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, doença de Huntington (HD), traumática lesão cerebral, dependência de drogas e derrame. Resultados adicionais que suportam a presente invenção são proporcionados na Figura 8, mostrando o efeito do C-CDNF em um modelo de PD e nas Figuras 11 e 12 mostrando o efeito do C-CDNF em um modelo de ALS. Também é notável que um peptídeo MANF curto (MANF4) não seja eficaz no modelo 6-OHDA de rato da doença de Parkinson quando testado em neurorestorativo, mais orientado clinicamente, isto é, quando adicionado após 6- OHDA (vide Figura 9).

[00198] Os efeitos do fragmento CDNF do terminal C ou do fragmento MANF do terminal C no SNC incluem neurônios-alvos, mas também outros tipos de células no SNC, tais como microglia, astrócitos e células-tronco neurais ou uma célula precursora neuronal, além de sobreviver também a qualquer outra propriedade, eles são dotados de migração, proliferação, diferenciação e maturação.

[00199] Os resultados dos presentes inventores mostrados na Figura 10 confirmam que o fragmento MANF do terminal C é eficaz no tratamento de diabetes tipo I e tipo II. Além disso, o documento WO2016057579 expõe que CDNF e MANF também são ativos em distúrbios da retina. Por conseguinte, a presente invenção é direcionada a um tratamento das referidas enfermidades do sistema nervoso central (SNC), diabetes e distúrbios da retina. A morte celular apoptótica induzida por estresse por ER também contribui para outras enfermidades degenerativas nas quais a função ou estrutura dos tecidos ou órgãos afetados se deteriorará progressivamente ao longo do tempo (para uma revisão, consulte Oakes e Papa, Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis 2015. 10: 173–94). Alguns exemplos adicionais de tais enfermidades degenerativas são compreendidos por degeneração macular relacionada à idade, doença de Stargardt, glaucoma, retinite pigmentosa e degeneração do nervo óptico; Doença de Niemann-Pick; aterosclerose; paralisia supra nuclear progressiva; Câncer; Doença de Tay- Sachs; ceratocone; doença inflamatória intestinal (DII); prostatite; osteoartrite; osteoporose; e artrite reumatóide, bem como condições mais agudas, tais como uma lesão cerebral traumática ou uma lesão de isquemia - reperfusão, por exemplo, lesão isquêmica do miocárdio, lesão isquêmica renal ou acidente vascular cerebral. A presente invenção é, portanto, também direcionada ao tratamento de uma doença ou distúrbio degenerativo.

[00200] De acordo com um método de tratamento, uma quantidade farmaceuticamente eficaz do fragmento do terminal C é administrada a um paciente. Em outras palavras, o fragmento de acordo com a presente invenção é para uso no tratamento de uma enfermidade ou distúrbio degenerativo, incluindo enfermidades do sistema nervoso central (SNC) e outros distúrbios neurológicos, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson (DP), sintomas não motores de DP (tais como constipação, depressão e alucinações), atrofia de múltiplos sistemas, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral isquêmico, neuropatia periférica, degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, doença de Huntington, epilepsia, lesão cerebral traumática, lesões do nervo periférico, acidente vascular cerebral hemorrágico ou dependência (por exemplo, abuso de cocaína, morfina, anfetamina ou álcool) e diabetes tipo I e tipo II ou distúrbios da retina. Com maior preferência, o fragmento é para o uso no tratamento da doença de Parkinson ou esclerose lateral amiotrófica.

[00201] A quantidade real de dosagem do fragmento do terminal C de CDNF ou MANF (por exemplo, uma quantidade eficaz) que é administrada a um paciente pode ser determinada por fatores físicos e fisiológicos, tais como peso corporal, gravidade da condição, o tipo de enfermidade que está sendo tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou simultâneas, idiopatia do paciente e via de administração. O profissional responsável pela administração pode determinar a concentração de ingrediente (s) ativo (s) em uma composição e dose (s) apropriada (s) para o indivíduo.

[00202] De acordo com uma concretização da presente invenção, o fragmento CDNF do terminal C ou fragmento MANF pode ser incluído em composições farmacêuticas. Tais composições da invenção são preparadas para armazenamento misturando-se o peptídeo com o grau de pureza desejado com portadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (tais como nano carreadores), excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences, 22ª edição, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012)), na forma de bolo liofilizado ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; alcoóis de açúcar como manitol ou sorbitol; contra-ions formadores de sal, como sódio; e/ou surfactantes não iônicos, como Tween, Pluronics ou polietileno glicol (PEG).

[00203] O fragmento também pode ser preso em micro cápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli (metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas de distribuição de medicamentos coloidais (por exemplo, lipossomas , micro esferas de albumina, micro emulsões, nanopartículas e nano cápsulas) ou em macro emulsões. Tais técnicas encontram-se expostas em Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

[00204] De acordo com uma concretização, as composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1% de um composto ativo. De acordo com outras modalidades, um composto ativo pode compreender entre cerca de 2% até cerca de 75% do peso da unidade, ou entre cerca de 25% até cerca de 60%, por exemplo, e qualquer faixa dele derivável.

[00205] De acordo com outro exemplo não limitativo, uma dose de uma composição ou formulação farmacêutica pode compreender de cerca de 1 ng/kg/peso corporal do fragmento CDNF do terminal C ou fragmento MANF do terminal C, cerca de 5 ng/kg/peso corporal, cerca de 10 ng/kg/peso corporal, cerca de 50 ng/kg/peso corporal, cerca de 100 ng/kg/peso corporal, cerca de 200 ng/kg/peso corporal, cerca de 350 ng/kg/peso corporal, cerca de 500 ng/kg/peso corporal, 1 μg/kg/peso corporal, cerca de 5 μg/kg/peso corporal, cerca de 10 μg/kg/peso corporal, cerca de 50 μg/kg/peso corporal, cerca de 100 μg/kg/peso corporal, cerca de 200 μg/kg/peso corporal, cerca de 350 μg/kg/peso corporal, cerca de 500 μg/kg/peso corporal, cerca de 1 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 5 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 10 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 50 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 100 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 350 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal, a cerca de 1000 mg/kg/peso corporal de fragmento CDNF do terminal C ou fragmento MANF do terminal C ou mais por administração, e qualquer faix derivável no mesmo. De acordo com exemplos não limitativos de uma faixa derivável a partir dos números listados no presente caso, uma faixa de cerca de 5 mg/kg/peso corporal a cerca de 100 mg/kg/peso corporal, cerca de 5 μg/kg/peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal do fragmento CDNF do terminal C ou fragmento MANF do terminal C, e assim por diante, pode ser administrada com base nos números descritos anteriormente neste contexto.

[00206] A invenção também caracteriza uma composição farmacêutica que pode incluir ainda uma célula neural. A célula neural pode ser, por exemplo, um neurônio, uma célula-tronco neural ou uma célula precursora neuronal.

[00207] De acordo com outra concretização, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de vetores recombinantes que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento do terminal C como definido anteriormente no presente caso, vetores virais recombinantes que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento do terminal C como definido anteriormente no presente caso, ou uma célula hospedeira que expressa um fragmento do terminal C tal como definido anteriormente neste contexto. O referido vetor viral é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em um adenovírus, um vírus adeno-associado, um retrovírus tal como um lentivírus, vírus do herpes e vírus do papiloma que compreende um polinucleotídeo que codifica um fragmento do terminal C como definido amteriormente no presente caso. Tipicamente, os vetores recombinantes e vetores virais recombinantes incluem sequências de controle de expressão, como promotores específicos de tecidos ou células, que direcionam a expressão do polinucleotídeo da invenção em vários sistemas, tanto in vitro quanto in vivo. Os vetores também podem ser vetores híbridos que contêm elementos reguladores necessários para a expressão em mais de um sistema. Os vetores que contêm esses vários sistemas reguladores estão disponíveis comercialmente e uma pessoa versada na técnica será capaz de clonar prontamente o fragmento do terminal C, conforme definido neste contexto, em tais vetores. A seleção de vetores virais recombinantes adequados para o uso na invenção, métodos para inserir sequências de ácidos nucleicos para expressar o fragmento do terminal C no vetor e métodos de administração do vetor viral para as células de interesse estão dentro da especialidade. Vide, por exemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310.

[00208] A via de administração está de acordo com métodos conhecidos, bem como as vias gerais de injeção ou infusão por administração intravenosa ou periférica, intraperitoneal, subcutânea, intratecal, intracerebroventricular, intranasal, transdérmica, intracerebral, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial ou intralesional, ou sistemas de liberação sustentada, conforme indicado mais adiante. O fragmento do terminal C ou uma composição farmacêutica que compreende o referido fragmento pode ser administrado continuamente por infusão ou por injeção em bolus. Geralmente, onde o distúrbio permite, deve-se formular e dosar o fragmento para administração específica ao local. A administração pode ser contínua ou periódica. A administração pode ser realizada por meio de uma bomba implantável de fluxo constante ou programável ou por meio de injeções periódicas. A administração periférica ou sistêmica é preferida, uma vez que a presente invenção mostra que os fragmentos MANF e CDNF do terminal C são capazes de penetrar na membrana celular neuronal, bem como na barreira hematoencefálica (vide Figuras 6 e 7). Outras vias de administração preferidas são compreendidas por administração subcutânea, intratecal, intracerebro ventricular, intranasal ou transdérmica. Na Figura 13, o efeito de uma injeção subcutânea da proteína C-CDNF é mostrado em ratos com derrame cerebral induzido.

[00209] Exemplos adequados de preparados para administração sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o fragmento, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis, conforme descritos por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) ou álcool polivinílico, polilácidos (U.S. Pat. Nº. 3,773,919, EP 58,481), ou acetato de etileno-vinil não degradável (Langer et al., supra).

[00210] Os vetores de terapia gênica podem ser administrados a um paciente usando-se modalidades de administração correspondentes, tais como definido anteriormente para o fragmento peptídico, preferencialmente por meio de, por exemplo, injeção intravenosa, ou por administração intraperitoneal, subcutânea, intratecal ou intracerebroventricular. O preparado farmacêutico de um vetor de terapia genética pode incluir um diluente aceitável ou pode compreender uma matriz de liberação lenta na qual o veículo de administração de genes está incluído.

[00211] O alinhamento de sequências da Figura 23 mostra a alta identidade de sequência de peptídeos de CDNF e MANF C-terminais. Consequentemente, os presentes inventores extrapolam a partir dos resultados apresentados no presente documento que também no fragmento de MANF C- terminal, os motivos de sequência de aminoácidos importantes para a penetração na membrana celular e para o efeito protetor nas células neuronais estão situados entre os resíduos de aminoácidos nas posições cerca de 33 e cerca de 68 da SEQ ID NO:2 correspondentes às posições 38 a 70 na SEQ ID NO:1 e cerca de 19 e 52 da SEQ ID NO:2 correspondentes às posições 25 a 57 na SEQ ID NO:1. Dessa forma, a presente invenção é direcionada a um fragmento de MANF C-terminal, de preferência, com o comprimento de 36 a 78 aminoácidos, que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 33 a 68 ou 19 a 52 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 33 a 68 ou 19 a 52 na SEQ ID NO:2 e a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:2, em que o dito fragmento é um peptídeo que penetra na membrana celular e tem um efeito protetor em células neuronais.

[00212] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção é direcionada a um fragmento de MANF C- terminal que consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que é pelo menos 90 % homóloga à sequência da SEQ ID NO:2 para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio degenerativo incluindo doenças do sistema nervoso central (SNC), em que o dito fragmento é administrado por administração intravenosa ou periférica, administração intraperitoneal, subcutânea, intranasal, transdérmica, intramuscular, intraocular ou intra-arterial.

[00213] Com base nos resultados expostos na Figura 10, a presente invenção é ainda direcionada a um fragmento MANF do terminal C que consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que é pelo menos 90% homólogo da sequência da SEQ ID NO: 2 para uso no tratamento de diabetes do tipo 1 ou do tipo 2.

[00214] Para todas as concretizações mencionadas anteriormente no presente caso, a referida sequência que é pelo menos 90% homóloga à sequência da SEQ ID NO: 2 compreende com maios preferência a sequência CXXC nas posições 47-50 da SEQ ID NO: 2, em que X é compreendido por qualquer aminoácido.

[00215] Com maior preferência, a referida sequência que é pelo menos 90% homóloga à sequência da SEQ ID NO: 2 consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência da SEQ ID NO: 6:

QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCXXC AEKSDYIRKI

NELMPKYAPK AASARTDL em que X é compreendido por qualquer aminoácido.

[00216] Com maior preferência, o referido fragmento de MANF é dotado da sequência da SEQ ID NO:5:

KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI

NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que é pelo menos 90% homóloga da sequência da SEQ ID NO:5.

[00217] De acordo,com uma concretização, o fragmento MANF do terminal C não contém seus aminoácidos naturais do terminal C, isto é, o sinal de retenção do ER. Por conseguinte, em uma concretização preferida, o fragmento não é dotado do sinal de retenção ER RTDL correspondente às posições 75-78 da SEQ ID NO: 2.

[00218] O fragmento MANF do terminal C pode ser modificado da mesma maneira que se encontra discutido anteriormente para o fragmento CDNF do terminal C.

[00219] A presente invenção é direcionada ainda a uma composição farmacêutica que compreende o fragmento MANF do terminal C e pelo menos um dos seguintes: carreador, tampão, excipiente e estabilizador fisiologicamente aceitável para uso no tratamento da enfermidade do sistema nervoso central (SNC), diabetes do tipo 1 ou tipo 2 ou um distúrbio da retina. A referida composição farmacêutica que compreende o fragmento MANF do terminal C é administrada de preferência a um paciente perifericamente e é, por essa razão, adequada de preferência para administração periférica.

[00220] A presente descrição também é direcionada a métodos para o tratamento de uma enfermidade ou distúrbio degenerativo, incluindo uma enfermidade do sistema nervoso central (SNC), diabetes tipo I ou tipo II ou distúrbio da retina, em que uma quantidade farmaceuticamente efetiva do fragmento CDNF do terminal C ou o fragmento MANF do terminal C tal como definido neste contexto é administrado a um paciente. De preferência, o referido fragmento é administrado perifericamente.

[00221] A presente descrição também é direcionada ao uso do fragmento CDNF do terminal C ou do fragmento MANF do terminal C, conforme definido no presente caso para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de uma enfermidade ou distúrbio degenerativo, que inclui uma enfermidade do sistema nervoso central (SNC) , diabetes do tipo I ou tipo II ou um distúrbio da retina.

[00222] A presente invenção também proporciona um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência nucleotídica que codifica o fragmento C-CDNF com a sequência da SEQ ID NO: 4:

KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP

KYAATHPKTE L ou uma sequência que é pelo menos 90% homóloga da identidade da sequência para a sequência da SEQ ID NO:4.

[00223] A invenção proporciona ainda um vetor de expressão que codifica o referido polinucleotídeo isolado e uma célula hospedeira transformada com o referido vetor. A seleção de vetores recombinantes adequados para expressar o referido polinucleotídeo isolado, métodos para inserir sequências de ácidos nucleicos para expressar o fragmento C-CDNF no vetor e métodos de distribuição do vetor recombinante para as células de interesse estão dentro da especialidade. Vide, por exemplo, Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448.

[00224] As publicações e outros materiais utilizados neste contexto para esclarecer os antecedentes da invenção e, em particular, para proporcionar detalhes adicionais em relação à sua prática, são incluídos no presente caso por referência. A presente invenção é ainda descrita nos exemplos expostos em seguida, que não devem ser considerados como limitativos do escopo da invenção.

SEÇÃO EXPERIMENTAL Estudos com células dos gânglios cervicais superiores

[00225] Para as culturas de neurônios simpáticos (Hellman et al., 2011; Hamner et al., 2001; Lindholm et al., 2002; Sun et al., 2001; Aalto et al., 2007) os gânglios cervicais superiores do dia pós-natal dos ratos (P) 0-3 foram digeridos com colagenase (2,5 mg/ml; Worthington), dispase (5 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals) e tripsina (10 mg/ml; Worthington) durante 45 minutos sob 37ºC e dissociados mecanicamente com uma pipeta Pasteur de vidro siliconizado. As células não neuronais foram removidas por meio de pré-revestimento extensivo. Os neurônios quase puros foram cultivados em placas plásticas de 35 mm revestidas com polornitina/laminina (Sigma) nas micro-ilhas padrão de tamanho pequeno no meio Neurobasal e suplemento B27 (Invitrogen/Gibco) na presença de fator de crescimento do nervo do camundongo de 30 ng/ml (NGF) (Promega) durante 5-6 dias. O NGF foi privado por lavagem extensa e adição de anticorpos anti-NGF de bloqueio de função (Roche). Os neurônios foram microinjetados por pressão com equipamento de microinjeção neuronal especial (Hellman et al., 2011; Hamner et al., 2001; Lindholm et al., 2002; Sun et al., 2001; Yu et al., 2003) (Sun et al. 2001; Sun et al., 2003). Para o ensaio de sobrevivência, todos os neurônios nas micro-ilhas foram contados no início (número inicial) e no final (três dias) da experiência e expressos como % de iniciação.

[00226] A microinjeção dos neurônios simpáticos foi realizada da forma que se descreveu anteriormente (Yu, LY, Jokitalo, E., Sun, YF, Mehlen, P., Lindholm, D., Saarma, M. e Arumäe, U. (2003) J. Cell Biol. 163, 987-997). Os plasmídeos para CDNF foram descritos anteriormente. Resumidamente, os neurônios SCG de camundongos recém-nascidos foram cultivados com NGF (Promega) durante 5 a 6 dias; em seguida, os núcleos foram micro-injetados com os plasmídeos de expressão para CDNF de comprimento pleno (FL)-CDNF e C-CDNF, juntamente com um plasmídeo repórter para aumentar a proteína fluorescente verde (EGFP), usando-se concentração vetorial de 10 ng/ul em cada experiência. Resultados semelhantes foram alcançados com concentrações plasmáticas de 50 ng/ul. Para microinjeção de proteínas, as proteínas recombinantes de comprimento pleno (FL) -CDNF, C-CDNF em PBS a 200 ng/ul foram micro injetadas diretamente no citoplasma, juntamente com o repórter fluorescente Dextran Texas Red (MW 70000 Da) (Invitrogen, Molecular Probes) que facilita a identificação dos neurônios injetados com sucesso. No dia seguinte foi adicionada tunicamicina (2 µM) e após 3 dias os neurônios fluorescentes vivos foram contados. Os neurônios fluorescentes vivos (expressores de EGFP ou que continham Dextran Texas Red) foram contados "cegamente" três dias depois e expressos como porcentagem dos neurônios fluorescentes vivos iniciais contados 2 a 3 horas após a microinjeção. As experiências com plasmídeos foram repetidas em culturas independentes 5 vezes para a experiência plasmídica, enquanto foram realizadas quatro experiências independentes de injeção de proteína. Em média, 50 a 80 neurônios foram injetados com sucesso por grupo experimental. Os resultados foram expressos como a média ± SEM. Os dados de cada grupo experimental foram comparados com o plasmídeo de controle PCR3.1 (vetor) ou PBS (nas experiências de injeção de proteínas) por ANOVA de uma via e teste t post hoc de Dunnett. A hipótese nula foi rejeitada em p <0,05.

Plasmídeos de expressão de CDNF

[00227] As construções que codificam domínios completos (FL) ou carboxi-terminais (C) foram inseridas no vetor pCR3.1 (Invitrogen) por meio do sistema de clonagem TOPO/TA (Invitrogen) ou usando-se endonucleases de restrição. O CDNF de comprimento pleno no vetor pCR3.1 tem 537 pb (179 aminoácidos) e 561 pb (187 aminoácidos) aminoácidos de comprimento, respectivamente, e possui em sua sequência de sinal do terminal N para direcionamento de

ER. O C-CDNF é dotado de 186 pb de comprimento, correspondendo aos aminoácidos 127-187 no FL-CDNF. E511 Human CDNF in pCR3.1/Bidirectional TOPO TA. Full- length cDNA with stop codon (No tags). Ampicillin selection. DH5α. Verified by sequencing. E811 pCR3.1 hCDNF C- human CDNF C terminal sequence with signal sequence. Cloned by PCR and Invitrogen TA cloning system. Insert size 207bp. Transformed into DH5a cells. Amp selection. Verified by sequencing.

Plasmídeos que expressam proteínas e fragmentos de peptídeo

[00228] CDNF recombinante humano (pré-CDNF de comprimento pleno constituído por 187 aminoácidos, com 26 sequências de sinal longas de aminoácidos e 161 sequências CDNF maduras de comprimento longo de 161 aminoácidos), N- CDNF humano (consistindo na sequência de sinal CDNF humano de 26 aminoácidos e a parte dos CDNF maduros do aminoácido 1-aminoácido 100) e C-CDNF humano (que consistiam em 26 aminoácidos de seqüência de sinal CDNF longa fundidos com o domínio C-terminal do CDNF maduro a partir do aminoácido 101 que se estende ao aminoácido 161).

[00229] MANF recombinante humano (pré-MANF de comprimento pleno que consiste nos 179 aminoácidos, com 21 sequências de sinal longas e 21 aminoácidos e sequência de MANF de 158 aminoácidos maduros), N-MANF humano (que consiste na sequência de sinal de MANF humano de 21 aminoácidos e na parte da MANF do aminoácido 1-aminoácido 95) e C-MANF humano (que consiste em 21 aminoácidos de sequência CDNF longa, fundidos com o domínio do terminal C do MANF maduro a partir do aminoácido 96 que se estende ao aminoácido 158).

[00230] A síntese de cDNA otimizada por códon para hMANF e hCDNF e seus domínios foram solicitados à Genewiz e construídos os respectivos vetores de expressão de pQMCF. As construções N-CDNF, C-CDNF, N-MANF e C-MANF tinham o marcador Histidina no terminal C. Os cDNA-s foram verificados por sequenciação nos vetores finais. As proteínas hMANF e hCDNF foram produzidas pela linha de células de suspensão derivadas de CHO CHOEBNALT85, foi utilizado meio isento de soro quimicamente definido para o cultivo das células.

[00231] As células CHOEBNALT85 foram transfectadas com 1 µg dos plasmídeos de expressão. 48 h após a transfecção, foram adicionados 700 μg/ml de G418 para selecionar a população de células que continham plasmídeo.

[00232] A expressão e secreção das proteínas foram analisadas 48 h após a transfecção em condições reduzidas em lisados celulares e sobrenadantes.

[00233] As proteínas hMANF e hCDNF foram purificadas por meio de cromatografia de troca iônica em duas etapas e filtradas em PBS, pH 7,4. Com base nas análises SDS-PAGE e transferência Western com anticorpos CDNF e MANF (MANF 4E12-HRP e CDNF-7D6-HRP, Icosagen Tartu, Estônia), as proteínas utilizadas foram puras em mais de 99%.

[00234] Os domínios CDNF e MANF foram purificados na coluna de afinidade de Ni e as proteínas também foram analisadas como SDS-PAGE e transferência Western usando-se anticorpo monoclonal de camundongo para o marcador His (Cat No. A00186; GeneScript).

[00235] As proteínas produzidas eram dotadas das sequências expostas em seguida: CDNF humano maduro:

QEAGGRPGADCEVCKEFLNRFYKSLIDRGVNFSLDTIEKELISFCLDTKGKENRLCYYL

GATKDAATKILSEVTRPMSVHMPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRV AELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL (SEQ ID NO:7) N-CDNF humano:

QEAGGRPGADCEVCKEFLNRFYKSLIDRGVNFSLDTIEKELISFCLDTKGKENRLCYYL GATKDAATKILSEVTRPMSVHMPAMKICEKLKKLDSQICEL (SEQ ID NO:8) C-CDNF humano:

KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKT EL (SEQ ID NO:4) MANF humano maduro:

LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDD

AATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKK ILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL (SEQ ID NO:9) N-MANF humano

LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDD AATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICEL (SEQ ID NO:10) C-MANF humano

KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASA RTDL (SEQ ID NO:5)

Estudos com neurônios dopaminérgicos

[00236] Para estudar os neurônios da dopamina (Yu et al., 2008; Yu e Arumae, 2008), os pisos do mesencéfalo foram dissecados do mesencéfalo ventral de embriões de camundongos NMRI de 13,5 d de idade. Os tecidos foram incubados com tripsina a 0,5% (ICN Biomedical), depois dissociados mecanicamente usando-se uma grande pipeta Pasteur polida a fogo. Os neurônios foram cultivados nas placas de cultura de 96 poços revestidas com poli-L- ornitina (Sigma) em meio DMEM/F12 (Invitrogen) contendo suplemento N2 (Invitrogen) na presença ou ausência de GDNF (100 ng/ml) ou com Polipeptídeos CDNF, MANF, C-CDNF e C- MANF em diferentes concentrações durante cinco dias. A mesma quantidade de neurônios foi colocada em cada poço no início das experiências. As culturas sem fatores neurotróficos adicionados serviram como controle negativo. Como as culturas do mesencéfalo contêm vários tipos neuronais, as culturas foram fixadas e imunocoloridas com os anticorpos contra a tirosina hidroxilase (TH) (Millipore), um marcador específico para os neurônios dopaminérgicos. As imagens de cada poço foram escaneadas pelo CellInsightTM e os neurônios imunopositivos foram contados pelo software CellProfiler e CellProfiler analista. Os dados são expressos como uma percentagem de neurônios positivos para TH mantidos por GDNF. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes nas culturas independentes. Os resultados foram expressos como a média do MEV e foram testados quanto à significância pelo teste ANOVA unidirecional e post hoc de Tukey ou pelo teste t de Student bicaudal. A hipótese nula foi rejeitada em P

≤0,05.

Iodação de CDNF, C-CDNF e C-MANF

[00237] CDNF, C-CDNF e C-MANF foram iodados com 125I-Na usando-se o método da lactoperoxidase. A proteína em questão foi dissolvida em 30 µl de tampão fosfato 0,25 M, pH 7,5, e misturada com 125I-Na (1 mCi/2,8 µl; 1 mCi = 37 mBq; GE Healthcare). A reação foi iniciada adicionando- se lactoperoxidase 10 µl de 50 µg/ml e H2O2 a 0,05%. A mistura foi incubada sob a temperatura ambiente durante 20 min. e a reação foi sustentada pela adição de 3 volumes de tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,5, contendo NaI 0,1 M, NaCl 0,42 M e, em seguida, foram adicionados 25 µL de BSA a 2,5%. O iodo livre e a proteína iodada foram separados por filtração em gel em colunas Sephadex G-25 (PM10; GE Healthcare). Para equilíbrio e eluição da coluna, foi utilizado tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,5, com BSA a 1%. Os fatores de crescimento iodados foram algumas vezes concentrados usando-se colunas YM-10 Centricon (Millipore). A atividade específica de CDNF, C-CDNF, e C-MANF marcado com 125I foi medida no contador gama automático Wizard 1480 (Perkin Elmer, Wallac) e foi de cerca de 108 cpm/μg de proteína. A proteína marcada foi mantida a 4ºC e usada dentro de 3 semanas após a marcação.

Experiência de internalização de neurônios dopaminérgicos E13.5

[00238] Os neurônios de dopamina E13.5 de camundongo cultivados na placa de 24 poços em cultura foram incubados com 30.000 cpm de CDNF iodado ou C-CDNF por poço a 37ºC durante 2 h. As células foram transferidas para gelo e lavadas uma vez com 0,5 ml do meio gelado. Em seguida, as células foram transferidas para tubos Eppendorf e lavadas a 4ºC uma vez com ácido acético 0,2M, NaCl 0,5M, pH 2,8. Após centrifugação a 1000g durante 10 min., as células foram dissolvidas em 0,5 ml de NaOH 0,5 N e contadas no contador gama.

Estudo da penetração da barreira hematoencefálica em ratos 125 125 125

[00239] I- CDNF, I C-CDNF ou I C-MANF (todas as proteínas sob 106 cpm em 10 µl) foram injetados subcutaneamente em ratos Wistar machos adultos. Os animais foram perfundidos com PBS 2 horas depois. A radioatividade foi analisada em diferentes regiões do cérebro por meio de contador gama. Os dados são mostrados como média ± SEM. As diferenças entre os grupos foram analisadas por ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey-Kramers.

Experiência de internalização em células PC6.3

[00240] As células de feocromocitoma PC6.3 de rato foram cultivadas na placa de 24 poços em cultura DMEM com 10% de FCS e 5% de soro de cavalo. As células foram lavadas com PBS e foram incubadas com 30.000 cpm de CDNF iodado ou C-CDNF por poço a 37oC 90 min. As células foram colocadas em gelo, lavadas uma vez com 0,5 ml do meio gelado. Em seguida, as células foram transferidas para tubos Eppendorf e lavadas uma vez com ácido acético 0,2M, NaCl 0,5M, pH 2,8. Após centrifugação a 1000 g por 10 min., as células foram dissolvidas em 0,5 ml de NaOH 0,5 N e contadas no contador gama Wallac.

Estudo de neurorestauração no modelo 6-OHDA da DP em ratos

[00241] No modelo de neurorestabelecimento da DP, os ratos foram lesionados com 6-OHDA tal como se descreveu anteriormente (Voutilainen et al., 2009; Voutilainen et al., 2011, Penttinen et al., 2016). Resumidamente, os ratos receberam sob anestesia com isoflurano injeções estereotáxicas unilaterais de 3x2 µg 6- OHDA (em ângulo de 10 graus) no estriado esquerdo (coordenadas em relação ao bregma e dura A/P +1,6; L/M-2,8; D/V-6, A/P 0,0: L/M-4,1; D/V-5,5 e A/P-1,2; L/M:-4,5; D/V- 5,5). Duas semanas depois, os ratos foram divididos em grupos com base nos resultados de rotação induzida por anfetamina (tamanho da lesão). Posteriormente, CDNF (10 µg), C-CDNF (equimolar a CDNF 10 µg) e N-CDNF (equimolar a CDNF 10 µg) foram injetados por via intrastriativa em ratos usando-se as mesmas coordenadas do 6-OHDA. Na experiência de referência após a divisão dos ratos em grupos, foram inseridas mini bombas osmóticas por via subcutânea e a cânula foi colocada no estriado lesionado. A mini bomba administrou MANF4 (isto é, peptídeo CKGC de MANF, vide WO2013034805), GDNF ou solução de veículo no estriado durante duas semanas após as quais a mini bomba e a cânula foram removidas. Dentro dos neurônios, o 6-OHDA possui duas formas de ação que atuam sinergicamente: 1) acumula-se no citosol e forma radicais livres, causando estresse oxidativo; 2) é um potente inibidor dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial I e IV. Os neurônios noradrenérgicos foram protegidos usando-se um inibidor de

NAT desipramina (15 mg/kg, i.p., 30 minutos antes da injeção de 6-OHDA). O tamanho da lesão unilateral e o efeito dos tratamentos foram medidos com o comportamento rotacional induzido por anfetaminas 2, 4, 6 e 8 semanas após a lesão no experimento envolvendo ratos tratados com CDNF, C-CDNF, N-CDNF e PBS, e em 1,4,8,10 e 12 semanas na experiência de referência envolvendo MANF4 e GDNF. O número de voltas ipsi- e contralaterais induzidas por anfetamina (2,5 mg/kg, i.p.) pleno (360º) foi registrado durante 120 minutos após um período de habituação de 30 minutos. Os resultados são expressos como curvas ipsilaterais líquidas para o lado da lesão. O critério de exclusão foi Média (rotações líquidas) ± 2 × STDEV.

Tirosina hidroxilase (TH) -Imuno-histoquímica

[00242] Perfusão e processamento de tecidos. Imediatamente após os estudos de neurorestoração, os ratos foram anestesiados com uma overdose de pentobarbital sódico (90 mg/kg, i.p.; Orion Pharma) e perfundidos intracardialmente com PBS seguido de 4% de paraformaldeído em tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4. Os cérebros foram removidos, pós-fixados durante 4 h e armazenados em tampão de fosfato de sódio contendo 20% de sacarose a 4ºC. Cortes em série coronais congelados com profundidade de 40 µm foram cortados em um micrótomo deslizante. A imuno- histoquímica foi realizada conforme descrito em outros lugares (Voutilainen et al., 2009). Os cérebros perfundidos foram pós-fixados durante a noite em paraformaldeído a 4ºC e armazenados em sacarose a 20%. Os cérebros foram cortados em seções de 40 μm de espessura em séries de seis. As seções de flutuação livre foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e a atividade da peroxidase endógena foi extinta com peróxido de hidrogênio a 0,3% (Sigma Aldrich). Para bloquear a ligação inespecífica dos anticorpos, as seções foram incubadas durante 1 hora em tampão de bloqueio (albumina sérica bovina a 4% e Triton X- 100 a 0,1% em 1 × PBS). As seções foram incubadas durante a noite em anticorpo monoclonal anti-tirosina hidroxilase (TH) de camundongo (1: 2.000; número de catálogo MAB318; RRID: AB_2201528; Millipore, Billerica, MA) em tampão de bloqueio a 4ºC, seguido de incubação no secundário biotinilado anticorpo (1: 200; anti-rato ou anti-rato; Vector, Burlingame, CA). A coloração foi aumentada com o complexo avidina-biotina-enzima (kit ABC; Vector) e o sinal foi visualizado com 3',3'-diaminobenzidina como um cromogênio.

Contagem de células TH-positivas da substância negra

[00243] As células positivas para TH na substância negra pars compacta (SNpc) foram analisadas em seis seções abrangendo o SNpc, de aproximadamente A/P –4,5 a –6,0 em relação ao bregma. As células foram contadas com o algoritmo Matlab (RRID: nlx_153890; MathWorks, Natick, MA) a partir das imagens obtidas com o digitalizador (scanner) 3DHistech. A resolução do digitalizador foi de 0,24 μm/pixel com uma objetiva × 20 NA 0,8.

Análise da densidade óptica de neurites TH-positivas no estriado

[00244] As densidades ópticas das neurites TH-

positivas no estriado foram determinadas a partir de três seções estriadas, de aproximadamente A/P + 2,2, + 0,84 e – 0,12 em relação ao bregma de cada rato. Para diminuir o sinal de fundo, as seções foram digitalizadas com um digitalizador (3DHistech, Budapeste, Hungria, com serviço de digitalização proporcionado pelo Institute of Biotechnology, University of Helsinki) e as imagens foram convertidas em escala de cinza de 16 bits. Como o corpo caloso era desprovido de sinal de TH, ele foi utilizado como uma medida de coloração inespecífica do fundo. As densidades integradas divididas por área das imagens obtidas foram analisadas no ImageJ (NIH). Os dados são apresentados como porcentagem do lado intacto.

Ensaio de proliferação de células beta

[00245] Ilhotas de camundongos C57bl6Rcc fêmeas, virgens, com 8 semanas de idade foram isoladas. As ilhotas foram recuperadas o/n em meio de crescimento e no dia seguinte, um número igual de ilhotas/poço (70/poço) foi tratado durante 5 dias com lactogênio placentário (PL 500ng/ml), C-MANF ou MANF. Metade do meio foi mudada diariamente para meio fresco com fatores de crescimento. Edu, um análogo de nucleosídeo alternativamente ao BrdU (kit de proliferação Click-iT®Edu, Invitrogen) foi adicionado 48 horas antes da colheita das ilhotas. As ilhotas foram quebradas com tripsina e centrifugadas em lâminas de vidro em cito centrífuga. As células foram fixadas após citosinas e células proliferativas coloridas com o reagente Click-iT AlexaFluor azida, seguido de coloração com insulina (porquinho-da-índia 1: 200, Abcam,

Cambridge, Reino Unido) o/n a + 4 ° C para detectar células beta. As células foram lavadas e coloridas com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor® 488 (1: 400, Molecular Probes, Life Technologies, CA, EUA). As lâminas foram montadas com meio de montagem Vectashield contendo DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA). Doze imagens (ampliação de 10 x) foram obtidas com o microscópio de epifluorescência Zeiss AxioImager M2 482 Fluorescence equipado com câmera 40x/Plan-Apochromat/0,95 Corr M27 e 63x/Plan-Apochromat/1,40 Oil/M27 e Ax3Cam HRm usando-se o software AxioVision4 e analisado por Image Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA) para quantificar o número de núcleos positivos para DAPI. Os números relativos de células beta em proliferação foram quantificados e comparados com poços de três a cinco repetições/tratamento.

O modelo de camundongo do ALS

[00246] Camundongos transgênicos SOD1 G93A serviram como modelo de camundongo transgênico para ALS neste estudo. Camundongos transgênicos contendo várias mutações humanas no SOD1 desenvolvem neurodegeneração progressiva e morte por motoneurônio (MN), proporcionando um modelo de animal que tem sido comumente usado em ensaios pré-clínicos e que contribuiu muito para o entendimento da patogênese da FALS (Gurney et al., 1994). Camundongos transgênicos SOD1 exibem características clínicas semelhantes a ALS que são transmitidas de maneira autossômica dominante. Nestes camundongos, a fraqueza dos membros posteriores e o movimento trêmulo aparecem como sintomas iniciais entre 8 e 10 semanas de idade, seguidos por sintomas principais, como paralisia motora progressiva e amiotrofia neurogênica (Shibata 2001). Esses camundongos mostram subsequentemente incapacidade de andar, comer e beber e morrem dentro de algumas semanas, geralmente entre 14 e 16 semanas de idade. Os camundongos transgênicos carregando o SOD1 humano com a glicina93 a alanina mutada foram originalmente obtidos no The Jackson Laboratory (http:/www.jax.org), Bar Harbor, ME; Estirpe B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur). A expressão transgênica foi analisada por testes de cauda de DNA e PCR, usando-se oligonucleotídeos e condições específicas, tal como realizado anteriormente por outros (consulte-se a página inicial do Jackson Lab). Em todas as experiências, o B6SJL- TgN (SOD1) 2Gur do tipo silvestre foi incluído como controle. Configurações experimentais em camundongos ALS

[00247] Na experiência de administração única, camundongos com cerca de 13 semanas de idade receberam uma única injeção intra cerebroventricular de PBS ou C-CDNF (3,75 µg que é equimolar a CDNF de 10 µg completo diluído em PBS) sob anestesia com isofluorano. Os camundongos foram então avaliados quanto a sinais de enfermidade e alterações corpóreas do peso duas vezes por semana. A avaliação foi concluída com uma bateria de testes comportamentais projetados para avaliar a atividade motora nos camundongos; a bateria compreende testes, por exemplo, “RotaRod”.

[00248] Na experiência de infusão crônica, camundongos SOD1 de 12 semanas foram inseridos em uma cânula de infusão cerebral (conectada por tubo de cateter a uma mini bomba osmótica Alzet) ao ventrículo lateral direito sob anestesia com isoflurano. O C-CDNF (1,5 µg/24 h) foi infundido durante 28 dias. O comportamento motor foi avaliado com “RotaRod”. Os ratos foram avaliados quanto a sinais clínicos e alterações corporais do peso.

Pontuação clínica de camundongos ALS

[00120] A pontuação clínica para camundongos SOD1 foi realizada usando-se instruções do laboratório Jackson. Os camundongos foram cuidadosamente examinados 2 vezes por semana após as 12 semanas de idade. Os animais foram pontuados levantando-os gentilmente pela base de suas caudas e observando-os quanto a tremores, rigidez e capacidade de estender seus membros. A pontuação clínica está em uma escala de 1 a 5, com base no sistema de pontuação neurológica dos membros posteriores da ALSTDI (ALS therapy Development Institute). RotaRod

[00249] No RotaRod, os camundongos foram colocados em uma haste rotativa (velocidade de aceleração 4-40 rpm/minuto), (Ugo Basile, Itália). O tempo de corte foi de 4 minutos. O teste do RotaRod foi realizado 2 vezes por semana após os ratos terem 12 semanas de idade.

Oclusão distal da artéria cerebral média como modelo de acidente vascular cerebral

[00250] Ratos Sprague Dawley machos (peso 230- 270 g, Envigo, Holanda) foram utilizados para as experiências conduzidas de acordo com os princípios 3R da diretiva da UE 2010/63/UE sobre cuidados e uso de animais experimentais, leis e regulamentos locais, e foram aprovados pelo Conselho Nacional de Experimentação Animal da Finlândia. Todas as experiências foram realizadas de maneira cega e os ratos foram divididos em diferentes grupos de tratamento aleatoriamente. Os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral (0,4 g/kg, i.p). Um acidente vascular cerebral cortical foi induzido obstruindo a artéria cerebral média distal (dMCA) juntamente com uma oclusão bilateral da artéria carótida comum (ACC) durante 60 minutos, como descrito anteriormente (Chen, et al., 1986). Sucintamente, os ACC bilaterais foram identificados e isolados através de uma incisão cervical na linha média ventral. Os ratos foram colocados em aparelho estereotáxico e uma craniotomia foi realizada no hemisfério direito. A direita (ACM) foi ligada com uma sutura 10-0 e as carótidas comuns bilaterais (ACC) foram ligadas com pinças arteriais não traumáticas durante 60 minutos. Após sessenta minutos de isquemia, a sutura ao redor da ACM e os clipes arteriais nos CCAs foram removidos para introduzir uma lesão reperfusional. Após a recuperação da anestesia, os ratos foram devolvidos à sua gaiola. A temperatura corporal durante e após a cirurgia foi mantida a 37ºC.

[00251] Para se testar o efeito neuroprotetor do C-CDNF subcutâneo, 50 µg de C-CDNF foram administrados 30-50 minutos antes da oclusão do dMCA e imediatamente após a reperfusão em volume de 100 µl s.c . Utilizou-se solução salina tamponada com fosfato (PBS) como controle do veículo. Os ratos foram sacrificados 2 dias após dMCAo para se medir o volume do infarto por coloração com 2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Os ratos foram decapitados e os cérebros foram removidos e fatiados em seções de 2,0 mm de espessura usando-se um bloco cerebral acrílico de rato. As fatias do cérebro foram incubadas em uma solução de TTC a 2% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante 15 min sob a temperatura ambiente e depois transferidas para uma solução de paraformaldeído a 4% para fixação. A área de infarto em cada fatia foi medida com um digitalizador digital e um software ImageJ. O volume de infarto em cada animal foi obtido a partir do produto com espessura média da fatia (2 mm) e soma das áreas de infarto nas fatias do cérebro rostral examinadas. O teste t de Student foi utilizado para análise estatística.

Determinação do comprimento mínimo para o fragmento de C-CDNF ativo

[00252] Os peptídeos de C-CDNF com deleções N- terminais e/ou C-terminais (consultar as Tabelas 5 e 6) foram produzidos por síntese peptídica customizada (Stawikowski and Fields, Curr Protoc Protein Sci.; Fevereiro de 2002 CAPÍTULO: Unidade–18.1.). Os bioensaios conforme descrito acima foram realizados com cada um dos peptídeos. Os resultados são mostrados nas Tabelas 1 a 4 e Figuras 14 a 18 Tabela 1. Dados das Figuras 14 (A) e 16 (B). Os dados são neurônios sobreviventes como % em comparação com os neurônios desenvolvidos na presença de NGF. A. % de NGF CDNF (400) pep1 pep2 pep3 pep4 pep5 pep6 pep7 PBS exp1 85,71 78,87 79,71 83,08 81,25 86,36 81,94 76,67 34,29 exp2 90,36 89,87 75,32 87,84 77,05 77,19 75,00 84,85 39,71 AVG 88,04 84,37 77,52 85,46 79,15 81,78 78,47 80,76 37,00

B. % de CDNF pep8 pep9 pep10 pep11 pep12 pep13 pep14 pep15 PBS NGF (400) exp1 86,00 77,94 41,23 42,46 46,25 86,74 77,41 55,76 70,17 43,02 exp2 71,23 65,57 44,00 45,16 48,61 86,15 72,46 34,32 61,81 35,93 exp3 83,33 73,91 44,44 40,35 44,64 70,17 80,39 48,43 71,42 41,53 Tabela 2. Alteração em vezes dos neurônios sobreviventes em comparação com os neurônios injetados com PBS (dados da Tabela 1 divididos por valores de PBS). Vezes para CDNF(400 pep1 pep2 pep3 pep4 pep5 pep6 pep7 PBS

PBS exp1 2,30 2,32 2,42 2,37 2,52 2,39 2,24 1,00 exp2 2,26 1,90 2,21 1,94 1,94 1,89 2,14 1,00 AVG 2,28 2,11 2,32 2,16 2,23 2,14 2,19 Tabela 3. Dados das Figuras 15 (A) e 17 (B). Os dados são neurônios sobreviventes como % em comparação com os neurônios desenvolvidos na presença de GDNF. A. pep1 pep1 pep1 pep1 pep2 pep2 pep2 pep2 % de (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/

GDNF ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) exp1 62,96 81,68 91,48 75,02 81,18 74,74 81,00 83,01 exp2 67,36 80,97 65,28 61,07 52,61 58,93 47,98 52,95 exp3 61,59 79,42 74,30 73,98 69,28 75,80 77,95 62,94 AVG 63,97 80,69 77,02 70,02 67,69 69,82 68,98 66,30 pep3 pep3 pep3 pep3 pep4 pep4 pep4 pep4 % de (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ GDNF ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) exp1 73,87 74,30 85,15 84,53 61,71 64,44 69,02 68,35 exp2 62,76 64,35 58,79 80,59 79,99 81,47 73,24 83,39 exp3 62,58 82,16 78,46 80,86 65,71 65,71 68,14 77,07 AVG 66,40 73,60 74,14 81,99 69,14 70,54 70,14 76,27 pep5 pep5 pep5 pep5 pep6 pep6 pep6 pep6 % de (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/

GDNF ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) exp1 65,24 61,71 59,82 59,11 62,89 66,29 71,71 63,01 exp2 59,23 82,61 75,53 58,84 77,34 83,75 71,86 67,06 exp3 70,31 84,24 86,17 77,44 57,68 77,81 76,97 82,17 AVG 64,92 76,19 73,84 65,13 65,97 75,95 73,52 70,75 pep7 pep7 pep7 % de GDNF pep7 (100ng/ml) GDNF100 sem fator (1ng/ml) (10ng/ml) (1000ng/ml) exp1 67,76 63,47 62,89 64,02 100 57,16 exp2 73,36 83,50 79,82 86,37 100 63,04 exp3 69,24 81,41 74,38 86,80 100 64,75 AVG 70,12 76,13 72,36 79,07 100 61,65 B. pep8 pep8 pep8 pep8 pep9 pep9 pep9 pep9 % de 1ng/ 10ng/ 100ng/ 1000ng/ 1ng/ 10ng/ 100ng/ 1000ng/

GDNF ml ml ml ml ml ml ml ml AVG 64,02 75,69 85,95 81,43 62,74 69,29 71,62 67,12 pep10 pep10 pep10 pep10 pep11 pep11 pep11 pep11 % de 1ng/ 10ng/ 100ng/ 1000ng/ 1ng/ 10ng/ 100ng/ 1000ng/

GDNF ml ml ml ml ml ml ml ml AVG 54,25 63,09 68,97 69,16 59,60 60,76 69,28 70,22 pep12 pep12 pep12 pep12 pep13 pep13 pep13 pep13 % de 1ng/ 10ng/ 100ng/ 1000ng/ 1ng/ 10ng/ 100ng/ 1000ng/

GDNF ml ml ml ml ml ml ml ml AVG 68,57 83,1 87,93 84,16 71,07 86,81 88,07 85,36 % de pep14 pep14 pep14 pep14 GDNF 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 1000ng/ml MÉDIA 71,49 84,24 85,71 82,81 % de pep15 pep15 pep15 pep15 GDNF100 sem fator GDNF 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 1000ng/ml AVG 73,72 87,03 93,53 86,15 100 59,18 Tabela 4. Alteração em vezes de neurônios sobreviventes em comparação com neurônios desenvolvidos sem fatores de crescimento (os dados da Tabela 3 foram divididos por valores de “sem fator”). pep1 pep2 pep2 vezes para pep1 pep1 (10ng/ pep1 (100ng/ pep2 pep2 (10ng/ (1000ng/ (100ng/ (1000ng/ "sem fator" (1ng/ml) ml) ml) (1ng/ml) ml) ml) ml) ml) exp1 1,10 1,43 1,60 1,31 1,42 1,31 1,42 1,45 exp2 1,07 1,28 1,04 0,97 0,83 0,93 0,76 0,84 exp3 0,95 1,23 1,15 1,14 1,07 1,17 1,20 0,97 AVG 1,04 1,31 1,26 1,14 1,11 1,14 1,13 1,09 pep3 pep3 pep3 pep4 pep4 pep4 vezes para pep3 (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ pep4 (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ "sem fator" ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) exp1 1,29 1,30 1,49 1,48 1,08 1,13 1,21 1,20 exp2 1,00 1,02 0,93 1,28 1,27 1,29 1,16 1,32 exp3 0,97 1,27 1,21 1,25 1,01 1,01 1,05 1,19 AVG 1,08 1,20 1,21 1,34 1,12 1,14 1,14 1,24 vezes para pep5 pep5 pep5 pep5 pep6 pep6 pep6 pep6 "sem (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ fator" ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml) exp1 1,14 1,08 1,05 1,03 1,10 1,16 1,25 1,10 exp2 0,94 1,31 1,20 0,93 1,23 1,33 1,14 1,06 exp3 1,09 1,30 1,33 1,20 0,89 1,20 1,19 1,27 AVG 1,06 1,23 1,19 1,05 1,07 1,23 1,19 1,15 vezes para pep7 pep7 pep7 "sem pep7 (1ng/ (10ng/ (100ng/ (1000ng/ fator" ml) ml) ml) ml) exp1 1,19 1,11 1,10 1,12 exp2 1,16 1,32 1,27 1,37 exp3 1,07 1,26 1,15 1,34 AVG 1,14 1,23 1,17 1,28 Tabela 5. Peptídeos de CDNF C-terminais projetados com ponte S-S na sequência de CRAC. Peptídeo 1 (pep1; 61 aa):

KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKT EL (SEQ ID NO:4) Peptídeo 2 (pep2; 57 aa):

TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL (SEQ ID NO:11) Peptídeo 3 (pep3; 53 aa): KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:12) Peptídeo 4 (pep4; 49 aa): TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:13) Peptídeo 5 (pep5; 51 aa): VDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL (SEQ ID NO:14) Peptídeo 6 (pep6; 43 aa): VDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:15) Peptídeo 7 (pep7; 50 aa):

KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELA P (SEQ ID NO: 16. Tabela 6. Peptídeos de CDNF C-terminais projetados 8 a 15. Os peptídeos 9 a 11 têm uma sequência de CRAC interrompida (os aminoácidos mutados estão em negrito). Os peptídeos 12 a 14 contêm substituições de aminoácidos (os aminoácidos mutados estão em negrito). Peptídeo 8 (pep8, 37 aa): RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:17) Peptídeo 9 (pep9, 49aa): TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEESRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:18) Peptídeo 10 (pep10, 49aa): TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRASAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:19) Peptídeo 11 (pep11, 51aa):

TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRARACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:20) Peptídeo 12 (pep12, 49aa): TLDLASVDLRKMRVAEPKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (SEQ ID NO:21) Peptídeo 13 (pep13, 49aa): TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQEPAPKYA (SEQ ID NO:22) Peptídeo 14 (pep14, 49aa): TLDLASVDLRKMRVAEPKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQEPAPKYA (SEQ ID NO:23) Peptídeo 15 (pep15, 33aa): TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAE (SEQ ID NO:24) Tabela 7. Sítios de clivagem previstos de proteases individuais da SEQ ID NO:1. Protease Pos. sítio P4-P4' catepsina K 46 QILH|SWGE catepsina K 49 HSWG|EECR MMP-9 35 DLRK|MRVA MMP-9 63 DYVN|LIQE MMP-9 4 MPAM|KICE MMP-9 71 LAPK|YAAT MMP-9 19 QICE|LKYE MMP-3 40 RVAE|LKQI quimotrps A 41 VAEL|KQIL elastase-2 62 TDYV|NLIQ elastase-2 29 LDLA|SVDL Tabela 8. Sítios de clivagem previstos de proteases individuais da SEQ ID NO:2. Nome de Protease Posição sítio P4-P4’

[00253] A previsão de sítio de clivagem de protease de fragmento de CDNF C-terminal e fragmento de MANF C-terminal foi realizada com software PROSPER em https://prosper.erc.monash.edu.au/home.html. Os sítios de clivagem de protease previstos são mostrados nas Tabelas 7 e 8 e nas Figuras 20 e 21.

[00254] Ensaio de Protease in vitro para projetar fragmentos de CDNF C-terminais e/ou fragmentos de MANF C-terminais resistentes à protease

[00255] Uma biblioteca de fragmentos, a partir de fragmentos de CDNF C-terminais e/ou fragmentos de MANF C-terminais, pode ser projetada com base nas informações do banco de dados de clivagem de protease, por exemplo, usando o banco de dados MEROPS em https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml e substituindo um ou mais aminoácidos nativos, por exemplo, nas posições P4- P3-P2-P1-P1’ ou P2-P1-P1', por aminoácidos que são menos usados, são conhecidos por inibir a protease ou são modificados. A biblioteca de fragmentos pode ser sintetizada em um formato de 96 poços ou 384 poços, por exemplo. O fragmento para o ensaio de protease pode consistir em, por exemplo, 4 a 14 aminoácidos (dependendo da protease e do formato do ensaio) em que o aminoácido C- terminal está ligado a um corante fluorescente, por exemplo, 7-amino-4- metilcumarina ou amino-4- trifluorometila (AMC ou AFC). Os modelos dos fragmentos podem ser: P6-P5-P4-P3-P2-P1, P5-P4-P3-P2-P1-, P4-P3-P2-P1, P3-P2-P1- ou P2-P1- combinado com P1’-P2’-P3’-P4’-P5’-P6’- AMC, P1’-P2’-P3’-P4’-P5’-AMC, P1’-P2’-P3’-P4’-AMC, P1’-P2’- P3’-AMC, P1’-P2’-AMC ou P1’-AMC, em que os resíduos de aminoácidos são consecutivamente numerados fora do sítio de clivagem e a ligação peptídica está situada entre as posições P1 e P1'. As proteínas MMP-2, MMP-3, MMP-9 e elastase-2 humanas recombinantes são adquiridas, por exemplo, de R&D Systems. Para testar e ativar a protease, as instruções fornecidas pelo fabricante são seguidas. Os fragmentos sintetizados são dissolvidos em tampão adequado a uma concentração adequada. As reações de protease são realizadas em misturas de reação contendo o fragmento e a protease no tampão específico para protease. As reações são realizadas a +37 °C e alíquotas da mistura de reação são tomadas em pontos de tempo diferentes para determinar a atividade de clivagem da protease. Os fragmentos são analisados, por exemplo, com MALDI-MS ou HPLC e as taxas de clivagem da protease são determinadas.

[00256] Em ensaios de protease in vitro alternativos, os fragmentos acima podem ser anexados a um suporte sólido da terminação N ou C, opcionalmente marcado com uma etiqueta cromogênica, exposto a proteases recombinantes e fragmentos resultantes analisados como acima.

REFERÊNCIAS Aalto, A.P., L.P. Sarin, A.A. van Dijk, M. Saarma, M.M. Poranen, U. Arumae, and D.H. Bamford. 2007. Large-scale production of dsRNA and siRNA pools for RNA interference utilizing bacteriophage phi6 RNA-dependent RNA polymerase. RNA. 13:422-429. Airavaara, M., H. Shen, C.C. Kuo, J. Peranen, M. Saarma, B. Hoffer, and Y. Wang. 2009. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor reduces ischemic brain injury and promotes behavioral recovery in rats. J.Comp.Neurol. 515 (1): 116-124. Airavaara M, Harvey BK, Voutilainen MH, Shen H, Chou J, Lindholm P, Lindahl M, Tuominen RK, Saarma M, Hoffer B, and Wang Y. CDNF protects the nigrostriatal dopamine system and promotes recovery after MPTP treatment in mice. Cell Transplant. 2012;21(6):1213-23. doi:

10.3727/096368911X600948. Bai M, Vozdek R, Hnízda A, Jiang C, Wang B, Kuchar L, Li T, Zhang Y, Wood C, Feng L, Dang Y, and Ma DK. Conserved roles of C. elegans and human MANFs in sulfatide binding and cytoprotection. Nat Commun. 2018 Mar 1;9(1):897. doi:

10.1038/s41467-018-03355-0. Bode & Löwik, Constrained cell penetrating peptides. Drug Discovery Today: Technologies; 2017, Vol. 26, pages 33-42 Borrelli A, Tornesello AL, Tornesello ML, Buonaguro FM. Cell Penetrating Peptides as Molecular Carriers for Anti- Cancer Agents. Molecules. 2018 Jan 31;23(2). pii: E295. doi: 10.3390/molecules23020295.

Chen ST, Hsu CY, Hogan EL, Maricq H, Balentine JD. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 1986;17(4):738–743. Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310. Gurney, ME., Cutting, FB., Zhai, P., Doble, A., Taylor, CP., Andrus, PK. and Hall, ED. 1996 Benefit of vitamin E, riluzole, and gabapentin in a transgenic model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 39 (2) 147-57 Hamner, S., U. Arumae, Y. Li-Ying, Y.F. Sun, M. Saarma, and D. Lindholm. 2001. Functional characterization of two splice variants of rat bad and their interaction with Bcl-w in sympathetic neurons. Mol.Cell.Neurosci. 17:97-106. Hellman, M., U. Arumae, L.Y. Yu, P. Lindholm, J. Peranen, M. Saarma, and P. Permi. 2011. Mesencephalic astrocyte- derived neurotrophic factor (MANF) has a unique mechanism to rescue apoptotic neurons. J.Biol.Chem. 286:2675-2680. Kalafatovic & Giralt, Cell-Penetrating Peptides: Design Strategies beyond Primary Structure and Amphipathicity. Molecules. 2017 Nov 8;22(11). pii: E1929. doi:

10.3390/molecules22111929. Mie Kristensen, Ditlev Birch and Hanne Mørck Nielsen. Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 185; doi:10.3390/ijms17020185 Lindahl M, Saarma M, Lindholm P, M. 2017 Unconventional neurotrophic factors CDNF and MANF: structure, physiological functions and therapeutic potential. Neurobiology of Disease, 97, 90–102. Lindahl M, Danilova T, Palm E, Pulkkila P, Voikar V,

Hakonen E, Ustinov J, Andressoo J-O, Harvery B, Otonkoski T, Rossi J and Saarma M. 2014. MANF is indispensable for the proliferation and survival of pancreatic β-cells. Cell Reports, 7(2):366-75. Lindholm, D., E.A. Mercer, L.Y. Yu, Y. Chen, J. Kukkonen, L. Korhonen, and U. Arumae. 2002. Neuronal apoptosis inhibitory protein: Structural requirements for hippocalcin binding and effects on survival of NGF-dependent sympathetic neurons. Biochim. Biophys. Acta. 1600:138-147. Lindholm, P., and M. Saarma. 2010. Novel CDNF/MANF family of neurotrophic factors. Dev. Neurobiol. 70:360-371. Lindholm, P., M.H. Voutilainen, J. Lauren, J. Peranen, V.M. Leppanen, J.O. Andressoo, M. Lindahl, S. Janhunen, N. Kalkkinen, T. Timmusk, R.K. Tuominen, and M. Saarma. 2007. Novel neurotrophic factor CDNF protects and rescues midbrain dopamine neurons in vivo. Nature. 448:73-77. Lindström, R., P. Lindholm, J. Kallijärvi, Y. Li-ying, T.P. Piepponen, U. Arumäe, M. Saarma and T.I. Heino, 2013. Characterization of the Structural and Functional Determinants of MANF/CDNF in Drosophila In Vivo Model. PLoS One 8(9),e73928. Marino, Giada, Ulrich Eckhard, and Christopher M. Overall, Protein Termini and Their Modifications Revealed by Positional Proteomics. 2015, ACS Chem. Biol. 10:1754−1764 Nadella R, Voutilainen MH, Saarma M, Gonzalez-Barrios JA, Leon-Chavez BA, Jiménez JM, Jiménez SH, Escobedo L, Martinez-Fong D. Transient transfection of human CDNF gene reduces the 6-hydroxydopamine-induced neuroinflammation in the rat substantia nigra. J. Neuroinflammation. 11: 209,

2014.

Neves J, Zhu J, Sousa-Victor P, Konjikusic M, Riley R, Chew S, Qi Y, Jasper H, Lamba DA, Immune modulation by MANF promotes tissue repair and regenerative success in the retina. Science 2016 Jul 1;353(6294). Oakes and Papa, Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2015. 10:173–

94. Parkash, V., P. Lindholm, J. Peranen, N. Kalkkinen, E. Oksanen, M. Saarma, V.M. Leppanen, and A. Goldman. 2009. The structure of the conserved neurotrophic factors MANF and CDNF explains why they are bifunctional. Protein Eng.Des.Sel. 22:233-241. Penttinen AM, I. Suleymanova, K Albert, J Anttila, MH Voutilainen, M Airavaara. 2016 Characterization of a new low-dose 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease in rat. J Neurosci Res. Jan 13. doi: 10.1002/jnr.23708 SHIBATA, N. 2001. TRANSGENIC MOUSE MODEL FOR FAMILIAL AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS WITH SUPEROXIDE DISMUTASE-1 MUTATION. NEUROPATHOLOGY 21(1):82-92 Sun, Y.F., L.Y. Yu, M. Saarma, and U. Arumae. 2003. Mutational analysis of N-Bak reveals different structural requirements for antiapoptotic activity in neurons and proapoptotic activity in nonneuronal cells. Mol.Cell.Neurosci. 23:134-143. Sun, Y.F., L.Y. Yu, M. Saarma, T. Timmusk, and U. Arumae.

2001. Neuron-specific Bcl-2 homology 3 domain-only splice variant of Bak is anti-apoptotic in neurons, but pro- apoptotic in non-neuronal cells. J.Biol.Chem. 276:16240-

16247. Voutilainen, M.H., S. Back, J. Peranen, P. Lindholm, A. Raasmaja, P.T. Mannisto, M. Saarma, and R.K. Tuominen.

2011. Chronic infusion of CDNF prevents 6-OHDA-induced deficits in a rat model of Parkinson's disease. Exp.Neurol. 228:99-108. Voutilainen, M.H., S. Back, E. Porsti, L. Toppinen, L. Lindgren, P. Lindholm, J. Peranen, M. Saarma, and R.K. Tuominen. 2009. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor is neurorestorative in rat model of Parkinson's disease. J.Neurosci. 29:9651-9659. doi:

10.1523/JNEUROSCI.0833-09.2009. Voutilainen, MH, Arumäe U, Airavaara M, Saarma M. 2015 Therapeutic potential of the endoplasmic reticulum located and secreted CDNF/MANF family of neurotrophic factors in Parkinson's disease. FEBS letters 589 3739–3748. Voutilainen MH, De Lorenzo F, Stepanova P, Bäck S, Yu LY, Lindholm P, Pörsti E, Saarma M, Männistö PT, Tuominen RK 2017 Evidence for an Additive Neurorestorative Effect of Simultaneously Administered CDNF and GDNF in Hemiparkinsonian Rats: Implications for Different Mechanism of Action. eNeuro. Mar 13;4(1) Yu, L.Y., and U. Arumae. 2008. Survival assay of transiently transfected dopaminergic neurons. J.Neurosci.Methods. 169:8-15. Yu, L.Y., E. Jokitalo, Y.F. Sun, P. Mehlen, D. Lindholm, M. Saarma, and U. Arumae. 2003. GDNF-deprived sympathetic neurons die via a novel nonmitochondrial pathway. J.Cell Biol. 163:987-997. Yu, L.Y., M. Saarma, and U. Arumae. 2008. Death receptors and caspases but not mitochondria are activated in the GDNF- or BDNF-deprived dopaminergic neurons. J.Neurosci. 28:7467-7475.

Zhao H, Liu Y, Cheng L, Liu B, Zhang W, Guo YJ, Nie L. 2013 Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor inhibits oxygen-glucose deprivation-induced cell damage and inflammation by suppressing endoplasmic reticulum stress in rat primary astrocytes. J. Mol. Neurosci. 51(3): 671-8,

2013.

Publicações de patentes citadas: EP58481 EP1969003 US3773919 WO2007068803 WO2009133247 WO2013034805 WO2014191630 WO2016057579

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Fragmento de CDNF C-terminal que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1, em que o dito fragmento é um peptídeo que penetra na membrana celular e tem um efeito protetor em células neuronais, para uso como um medicamento.

2. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 1, no tratamento de uma doença ou distúrbio degenerativo.

3. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 2, em que a dita doença degenerativa é uma doença neurodegenerativa.

4. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 3, em que a dita doença neurodegenerativa é uma doença do sistema nervoso central (SNC) selecionada do grupo que consiste em: doença de Alzheimer, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, esclerose lateral amiotrófica, degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, doença de Huntington, lesão cerebral traumática, dependência de drogas e acidente vascular cerebral.

5. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 4, em que a dita doença do SNC é doença de

Parkinson.

6. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 2, no tratamento de diabetes tipo I ou tipo II.

7. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 3, no tratamento de esclerose lateral amiotrófica.

8. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 2, no tratamento de retinopatias como retinite pigmentosa.

9. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o dito fragmento é administrado por administração intravenosa, administração intraperitoneal, subcutânea, intratecal, intracerebroventricular, intranasal, transdérmica, intracerebral, intramuscular, intraocular ou intra-arterial ou o dito fragmento é administrado por meio de um vetor de expressão viral.

10. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 9, em que a administração intravenosa é administração periférica.

11. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, de preferência com um comprimento de até 33 a 81 aminoácidos, em que o dito fragmento compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

12. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 11, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70 ou 31 a 70 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70 ou 31 a 70 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

13. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 11, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 25 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 25 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

14. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 (peptídeo 6; SEQ ID NO: 15), 25 a 73 (peptídeo 4; SEQ ID NO: 13), 21 a 73 (peptídeo 3; SEQ ID NO: 12), 21 a 70 (peptídeo 7; SEQ ID NO: 16), 31 a 81 (peptídeo 5; SEQ ID NO: 14), 25 a 81 (peptídeo 2; SEQ ID NO: 11), 25 a 57 (peptídeo 15, SEQ ID NO:24), ou 37 a 73 (peptídeo 8, SEQ ID NO:17) da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73, 25 a 73, 21 a 73, 21 a 70, 31 a 81, 25 a 81, 25 a 57 ou 37 a 73 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

15. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 14, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1 e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

16. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, com um comprimento de até 43 a 81, de preferência, 43 a 61 aminoácidos.

17. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os terminais do fragmento compreendem modificações adicionais que protegem o fragmento contra degradação enzimática.

18. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito fragmento de CDNF C-terminal consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:1.

19. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 18, em que a dita sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:1 compreende a sequência CXXC nas posições 52 a 55 da SEQ ID NO:1, em que X é qualquer aminoácido.

20. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 19, em que a dita sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:1 consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência da SEQ ID NO:3:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECXXCAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L em que X é qualquer aminoácido.

21. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 19, em que a dita sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:1 compreende a sequência CKGC nas posições 52 a 55 da SEQ ID NO:1.

22. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, em que o dito fragmento compreende o aminoácido L C-terminal na posição 81 da SEQ ID NO:1.

23. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 ou 20, em que o dito fragmento é desprovido do sinal de retenção de ER KTEL correspondente às posições 78 a 81 da SEQ ID NO:1.

24. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, em que o fragmento compreende a amidação da terminação C‐ e a acetilação da terminação N‐ como modificação adicional.

25. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, adicionalmente conjugado a uma porção química ou bioquímica detectável.

26. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito fragmento é um peptídeo penetrante na célula e é capaz de penetrar na barreira hematoencefálica humana.

27. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito fragmento é resistente à clivagem de protease.

28. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27, em que o dito fragmento compreende um alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação de modo que o dito alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação suprima pelo menos um sítio de clivagem de protease.

29. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, em que a protease é selecionada do grupo que consiste em uma cisteína protease, uma metaloprotease e uma serina protease.

30. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 a 29, em que a cisteína protease é catepsina K.

31. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 a 29, em que a metaloprotease é MMP-9.

32. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 a 29, em que a metaloprotease é MMP-3.

33. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 a 29, em que a serina protease é quimotripsina A ou elastase-2.

34. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 a 33, em que qualquer aminoácido dentro da região correspondente aos resíduos 1 a 8, 16 a 23, 26 a 33, 32 a 39, 37 a 44, 38 a 45, 43 a 50, 46 a 53, 57 a 64, 59 a 66, 60 a 67 ou 68 a 75 da SEQ ID NO:1 é substituído, deletado ou modificado.

35. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 27 a 34, em que qualquer aminoácido na posição correspondente a 46, 49, 35, 63, 4, 71, 19, 40, 41, 62 ou 29 da SEQ ID NO:1 é substituído ou modificado.

36. Composição farmacêutica que compreende o fragmento de CDNF C-terminal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 11 a 35, e pelo menos um dos seguintes: veículo, tampão, excipiente, conservante e estabilizante fisiologicamente aceitável.

37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 36, para administração intravenosa, de preferência, administração periférica, administração intraperitoneal, subcutânea, intratecal, intracerebroventricular, intranasal, transdérmica, intracerebral, intramuscular, intraocular ou intra-arterial ou a dita composição é administrada por meio de um vetor de expressão viral.

38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, para uso como um medicamento.

39. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 38, no tratamento de uma doença ou distúrbio degenerativo.

40. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 39, em que a dita doença ou distúrbio degenerativo é uma doença do sistema nervoso central (SNC) selecionada do grupo que consiste em: doença de Alzheimer, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, esclerose lateral amiotrófica, degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, doença de Huntington, lesão cerebral traumática, dependência de drogas e acidente vascular cerebral.

41. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 40, em que a dita doença do SNC é doença de Parkinson.

42. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 40, em que a dita doença do SNC é esclerose lateral amiotrófica.

43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, para uso no tratamento de diabetes tipo I ou tipo II.

44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, para uso no tratamento de retinopatias como retinite pigmentosa.

45. Fragmento de CDNF C-terminal que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE

ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1, em que o dito fragmento é um peptídeo que penetra na membrana celular e tem um efeito protetor em células neuronais.

46. Fragmento, de acordo com a reivindicação 45, com um comprimento de até 57, 53, 51, 50, 49, 43, 37 ou 33 aminoácidos, em que o dito fragmento compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1, e a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

47. Fragmento, de acordo com a reivindicação 46,

em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70 ou 31 a 70 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 37 a 70, 36 a 70, 35 a 70, 34 a 70, 33 a 70, 32 a 70 ou 31 a 70 na SEQ ID NO:1.

48. Fragmento, de acordo com a reivindicação 46, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 25 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 25 a 57, 25 a 58, 25 a 59, 25 a 60, 25 a 61, 25 a 62, 25 a 63, 25 a 64, 25 a 65, 25 a 66, 25 a 67, 25 a 68, 25 a 69 ou 25 a 70 na SEQ ID NO:1, e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:1.

49. Fragmento, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 (peptídeo 6), 25 a 73 (peptídeo 4), 21 a 73 (peptídeo 3), 21 a 70 (peptídeo 7), 31 a 81 (peptídeo 5), 25 a 81 (peptídeo 2), 25 a 57 (peptídeo 15) ou 37 a 73 (peptídeo 8) da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73, 25 a 73, 21 a 73, 21 a 70, 31 a 81, 25 a 81, 25 a 57 ou 37 a 73 na SEQ ID NO:1.

50. Fragmento, de acordo com a reivindicação 49, em que o dito fragmento compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73 na SEQ ID NO:1.

51. Fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 50 com um comprimento de até 57, 53, 51, 50, 49, 43, 37 ou 33 aminoácidos.

52. Fragmento de MANF C-terminal, de preferência, com o comprimento de 36 a 78 aminoácidos, que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 33 a 68 ou 19 a 52 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

53. Fragmento, de acordo com a reivindicação 52,

com o comprimento de 36 a 59 aminoácidos.

54. Fragmento, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, para uso como um medicamento.

55. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 54, no tratamento de uma doença ou distúrbio degenerativo, em que o dito fragmento é, de preferência, administrado por administração intravenosa, com mais preferência, periférica, administração intraperitoneal, subcutânea, intranasal, transdérmica, intramuscular, intraocular, ou intra-arterial.

56. Fragmento de MANF C-terminal para uso, de acordo com a reivindicação 55, que consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:2.

57. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 56, em que o dito fragmento tem a sequência da SEQ ID NO:5:

KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI

NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:5.

58. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, em que o dito fragmento compreende o aminoácido L C-terminal na posição 78 da SEQ ID NO:2.

59. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, em que o dito fragmento é desprovido do sinal de retenção de ER RTDL correspondente às posições 75 a 78 da SEQ ID NO:2.

60. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 59, em que o fragmento compreende modificações adicionais que protegem o fragmento contra degradação enzimática, de preferência, selecionada do grupo que consiste em amidação da terminação C‐ e acetilação da terminação N‐.

61. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 60, em que o dito fragmento é resistente à clivagem de protease.

62. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 61, em que o dito fragmento compreende um alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação de modo que o dito alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação suprima pelo menos um sítio de clivagem de protease.

63. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, em que a protease é selecionada do grupo que consiste em uma metaloprotease e uma serina protease.

64. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 63, em que a metaloprotease é MMP-9 ou MMP-2.

65. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 63, em que a serina protease é quimotripsina A ou elastase-2.

66. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 52 a 65, em que qualquer aminoácido dentro da região correspondente aos resíduos 11 a 18, 18 a 25, 21 a 28, 24 a 31, 33 a 40, 52 a 59, 54 a 61, 59 a 66 ou 63 a 70 da SEQ ID NO:2 é substituído, deletado ou modificado.

67. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 52 a 66, em que um aminoácido na posição correspondente a 62, 27, 14, 66, 36, 21, 55, 57 ou 24 da SEQ ID NO:2 é substituído ou modificado.

68. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 67, adicionalmente conjugado a uma porção química ou bioquímica detectável.

69. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 68, em que o dito fragmento é um peptídeo penetrante na célula e é capaz de penetrar na barreira hematoencefálica humana.

70. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 69, em que a dita doença degenerativa é uma doença do sistema nervoso central (SNC) selecionada do grupo que consiste em: doença de Alzheimer, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, esclerose lateral amiotrófica, degeneração lobar frontotemporal, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, doença de Huntington, lesão cerebral traumática, dependência de drogas e acidente vascular cerebral.

71. Composição farmacêutica que compreende o fragmento de MANF C-terminal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 69, e pelo menos um dos seguintes: veículo, tampão, excipiente, conservante e estabilizante fisiologicamente aceitável, para uso no tratamento de uma doença do sistema nervoso central (SNC) em que o dito fragmento é administrado por administrada intravenosa, de preferência, periférica, administração intraperitoneal, subcutânea, intranasal, transdérmica, intramuscular, intraocular ou intra-arterial.

72. Fragmento de MANF C-terminal, de preferência, com o comprimento de 36 a 78 aminoácidos, que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 33 a 68 ou 19 a 52 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 33 a 68 ou 19 a 52 na SEQ ID NO:2 e a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:2, em que o dito fragmento é um peptídeo que penetra na membrana celular, para uso no tratamento de diabetes tipo 1 ou tipo 2 ou uma retinopatia.

73. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 72, com o comprimento de 36 a 59 aminoácidos.

74. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 73, que consiste em pelo menos 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência da SEQ

ID NO:2.

75. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 74, em que o dito fragmento tem a sequência da SEQ ID NO:5:

KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI

76. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 75, em que o fragmento compreende modificações adicionais que protegem o fragmento contra degradação enzimática, de preferência, selecionada do grupo que consiste em amidação da terminação C‐ e acetilação da terminação N‐.

77. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 76, em que o dito fragmento é resistente à clivagem de protease.

78. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 77, em que o dito fragmento compreende um alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação de modo que o dito alongamento, deleção, inserção, substituição ou modificação suprima pelo menos um sítio de clivagem de protease.

79. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 77 ou 78, em que a protease é selecionada do grupo que consiste em uma metaloprotease e uma serina protease.

80. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 79, em que a metaloprotease é MMP-9 ou MMP-2.

81. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 79, em que a serina protease é quimotripsina A ou elastase-2.

82. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 72 a 81, em que qualquer aminoácido dentro da região correspondente aos resíduos 11 a 18, 18 a 25, 21 a 28, 24 a 31, 33 a 40, 52 a 59, 54 a 61, 59 a 66 ou 63 a 70 da SEQ ID NO:2 é substituído, deletado ou modificado.

83. Fragmento para uso, de acordo com a reivindicação 72 a 82, em que um aminoácido na posição correspondente a 62, 27, 14, 66, 36, 21, 55, 57 ou 24 da SEQ ID NO:2 é substituído ou modificado.

84. Fragmento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 83, em que o dito fragmento é um peptídeo penetrante na célula e é capaz de penetrar na barreira hematoencefálica humana.

85. Composição farmacêutica que compreende o fragmento de MANF C-terminal ,de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 84, e pelo menos um dos seguintes: veículo, tampão, excipiente, conservante e estabilizante fisiologicamente aceitável para uso no tratamento de diabetes tipo 1 ou tipo 2 ou uma retinopatia.

86. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 85, para administração periférica.

87. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 86, em que a dita composição é administrada por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intratecal, intracerebroventricular, intranasal, transdérmica, intracerebral, intramuscular, intraocular ou intra-arterial ou o dito fragmento é administrada por meio de um vetor de expressão viral.

88. Polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de CDNF C-terminal que consiste nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 31 a 73 (peptídeo 6), 25 a 73 (peptídeo 4), 21 a 73 (peptídeo 3), 21 a 70 (peptídeo 7), 31 a 81 (peptídeo 5) ou 25 a 81 (peptídeo 2), 25 a 57 (peptídeo 15) ou 37 a 73 (peptídeo 8) da sequência apresentada na SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 31 a 73, 25 a 73, 21 a 73, 21 a 70, 31 a 81, 25 a 81, 25 a 57 ou 37 a 73 na SEQ ID NO:1.

89. Vetor de expressão que codifica o polinucleotídeo isolado, conforme definido na reivindicação

88.

90. Célula hospedeira transformada com o vetor, de acordo com a reivindicação 89.

91. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio degenerativo que compreende administrar uma quantidade eficaz de fragmento de CDNF C-terminal que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 38 a 70 ou 25 a 57 da sequência apresentada na SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE

LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 25 a 57 na SEQ ID NO:1.

92. Método de tratamento de uma doença degenerativa, diabetes tipo 1 ou tipo 2 ou uma retinopatia que compreende administrar uma quantidade eficaz de fragmento de MANF C-terminal, de preferência, com o comprimento de 36 a 78 aminoácidos, que compreende ou consiste pelo menos nos resíduos de aminoácidos consecutivos nas posições 33 a 68 ou 19 a 52 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC

AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência de posições 38 a 70 ou 19 a 52 na SEQ ID NO:2 e, se presente, a sequência que flanqueia os ditos resíduos de aminoácidos consecutivos tem, de preferência, pelo menos 80 % de homologia ou identidade de sequência com a sequência nas posições correspondentes na SEQ ID NO:2.

Domínio semelhante à SAP Domínio semelhante à saposina

Sequência de sinal Retenção de ER

% de sobrevivência não injetado não injetado

% de sobrevivência não injetado não injetado sem fator

Radioatividade

Tapsigargina

Radioatividade no cérebro

Completo

Rotações cumulativas (rotações em 2, 4, 6 e 8 semanas após a lesão)

Petição 870200121536, de 28/09/2020, pág. 129/151 CDNF Completo

Rotações cumulativas (rotações em 4, 6, 8, 10 e 12 Rotações ipsilaterais / semanas após a lesão) 120 min (netto)

Petição 870200121536, de 28/09/2020, pág. 130/151 cumulativo

Tratamento 9/25

Semanas após a lesão

EdU (% de insulina + células)

Controle MANF Lactogênio C-terminal placentário 30ng/ml 500 ng/ml

Pontuação clínica

Idade (semanas)

e Latência de queda

Idade (semanas)

Alterações de peso corporal (% de linha de base)

Idade (semanas) Latência de queda

Idade (semanas)

% de Volume de infração de controle de PBS

% de sobrevivência neuronal de linha de base não injetado não injetado

Tunicamicina concentração sem fator (ng/ml)

% de sobrevivência neuronal de linha de base não injetado não injetado

Tunicamicina sem fator concentração (ng/ml)

Proteína sem fator de C-CDNF

Reações ipsilaterais por 120 min

Rotações cumulativas Semanas

Sobreposição dos espectros do CD de C-CDNF quimicamente sintetizado, pep1, 61 aa, e C-CDNF expresso em células CHO, pep1, 61 aa

Comprimento de onda C-CDNF expresso em células CHO C-CDNF quimicamente sintetizado

Comprimento de onda

Hidrofobicidade Média hélice Hélice Hélice Hélice

Sítios de clivagem previstos de múltiplas famílias de protease

Clivado por Cisteína protease após este resíduo (posição P1)

Clivado por Metaloprotease após este resíduo (posição P1)

Clivado por Serina protease após este resíduo (posição P1)

Sítios de clivagem previstos de múltiplas famílias de protease

Clivado por Metaloprotease após este resíduo (posição P1)

Clivado por Serina protease após este resíduo (posição P1)