KR20200138798A

KR20200138798A - C-말단 cdnf 단편, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그 용도

Info

Publication number: KR20200138798A
Application number: KR1020207031336A
Authority: KR
Inventors: 마르트 사아르마; 미꼬 아이라바아라; 메르야 부틸라이넨; 리 잉 유; 마리아 린달
Original assignee: 헬싱인 일리오피스토
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-12-10
Also published as: TW202003015A; IL277632A; SG11202009341TA; EP3774858A1; BR112020019696A2; CA3094236A1; JP2024056762A; MX2020010301A; RU2020131433A; JP2021519578A; CN112616315A; WO2019185994A1; AU2019244323A1; US20210009645A1

Abstract

본 발명은 C-말단 CDNF 단편 서열 또는 상기 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 제공한다. C-말단 CDNF 단편은 ER 스트레스 뉴런, 운동뉴런 및 도파민성 뉴런을 보호하고, 이 단편은 혈액-뇌-장벽뿐만 아니라 뉴런 세포막을 관통할 수 있다. 본 발명은 또한, 중추 신경계 질환, 당뇨병 및 망막 장애를 포함하는 퇴행성 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위한, 상기 단편 및 상기 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, C-말단 MANF 단편 서열 또는 상기 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열, 및 중추 신경계 질환, 당뇨병 및 망막 장애를 포함하는 퇴행성 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위한 상기 MANF 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

C-말단 CDNF 단편, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그 용도

본 발명은 생활성 단백질 단편 및 세포막-침투 펩타이드 분야에 관한 것이고, 또한 신경영양 인자 및 소포체 (ER) 위치 단백질 분야, 및 보다 구체적으로는 중추 신경계 질환, 당뇨병 및 망막 장애와 같은 퇴행성 질환 또는 장애의 치료 분야에 관한 것이다.

신경영양 인자들, 뇌 도파민 신경영양 인자 (CDNF) 및 중뇌 성상세포-유래 신경영양 인자 (MANF) (Lindholm and Saarma, 2010; Lindahl et al., 2017)는 현재 파킨슨 병 (PD)의 6-OHDA 모델에서 래트 치료에 가장 효율적인 단백질이다. 두 인자 모두 그 독소보다 미리 적용될 때 파킨슨 병의 6-OHDA 유발성 행동 및 조직학적 증상을 강력하게 예방한다 (Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2009). 더 중요한 것은, 파킨슨 병의 6-OHDA-유발성 증상이 이미 상당히 진행된 (far-reaching) 단계에서 적용될 때, 어느 하나의 인자를 사용한 후-치료 (즉, 6-OHDA 유도 후 치료)가 정상적인 운동 거동 및 선조체의 도파민성 신경지배를 효과적으로 회복시켰다는 것이다 (Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2011). CDNF는 파킨슨 병의 마우스 및 붉은 털 원숭이 MPTP 모델에서도 도파민 뉴런을 보호하고 복구한다. 원숭이 MPTP 모델 뿐 아니라 중증 설치류 6-OHDA 모델에서, 이는 흑질치밀부 (substantia nigra pars compacta, SNPc)에서의 도파민 뉴런 복원 및 운동 거동 복원에 있어서 신경아교세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF)보다 더 효율적이다 (Vboutilainen et al., 2011; Airavaara et al., 2012 : Voutilainen et al., 2015). 이들 인자들에 대한 뉴런 보호 뒤에 숨은 메카니즘은 명확하지는 않지만 고전적인 생존 촉진 항-아폽토시스 경로의 활성화에 더하여, 이들은 미폴딩 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR) 경로를 조절한다고 제시되었는데, 이는 ER-스트레스-유발성 아폽토시스 세포 사멸을 억제하는 산화적- 및 ER 스트레스의 완화를 목적으로 한다 (Lindahl et al., 2014; Lindahl et al., 2017, Voutilainen et al., 2017). 당뇨병 및 신경 퇴행성 질환, 예컨대 파킨슨 병, 알츠하이머 병 (AD), 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 헌팅턴병 (HD)을 포함한 많은 병리생리학적 상태 및 퇴행성 질환은 단백질 미스폴딩 및 ER 스트레스 및 UPR 경로 활성화를 촉발하는 응집과 관련되어 있다. 따라서, CDNF 및 MANF의 효과는 다양한 중추 신경계 질환에서 보여졌다 (WO2009133247; WO2007068803; 및 Airavaara et al, 2009). 또한, CDNF 및 MANF는 신경 염증을 억제하는데, 이는 모든 CNS 질환 및 상해는 아니지만 대부분의 병리 생리에 관여되어 있다 (Nadella et al, 2014; Neves et al., 2016; Zhao et al, 2013).

또한, WO2014191630은 기능적 MANF 유전자를 자연적으로 인코딩하고 발현하는 유전자에 대하여 파괴된 대립 유전자를 포함하는 유전자-변형된 비-인간 동물을 개시하며, 여기서 상기 동물은 상기 파괴되고 비-기능적인 MANF 유전자로 인한 췌장 베타 세포 질량의 점진적인 산후 감소를 나타낸다. 제1 형 또는 제2 형 당뇨병의 췌장내 치료에 사용하기 위한 유효량의 MANF 또는 CDNF 폴리펩타이드 또는 그 기능적 단편을 전달하는 유전자 요법 벡터 또한 제안된다. 또한, Lindahl et al., 2014는 MANF 단백질이 췌장 베타 세포의 증식 및 생존에 필수적이고 그로써 베타 세포 보호 및 재생을 위한 치료적 후보자를 구성한다고 개시한다.

WO2013034805는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 근위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 말초 신경병증, 간질, 당뇨병 또는 약물 중독의 치료에 사용하기 위한 서열 CXXC를 포함하는 4-40 개 아미노산 길이의 세포-침투성 MANF 또는 CDNF 펩타이드를 개시한다.

CDNF와 MANF에 대한 구조 연구는 이들 단백질이 두 가지 도메인으로 구성됨을 보여주었다: 사포신-유사 N-말단 도메인 (Parkash et al., 2009) 및 SAP-유사 C-말단 (Hellman et al., 2011). CXXC 모티프 (인간 MANF의 잔기 149-152, NCBI 레퍼런스 서열: NP_006001.3)는 도메인의 나선형 코어 외부의 루프 영역에서 C-말단 도메인 (C-MANF)에 위치하고, 시스테인들은 이황화 결합으로 연결된다 (Hellman et al., 2011). CDNF의 대응 모티프가 동일한 위치에 자리한다 (NCBI 레퍼런스 서열: NP_001025125.2). C-MANF는, 교감 뉴런 내부에서 발현될 때 시험관 내에서 (in vitro) 강력하게 항-아폽토시스성인 것으로 나타났다 (Hellman et al., 2011). Lindstrom et al., 2013에서는, MANF 및 CDNF의 구조적 및 기능적 결정자의 특성이 기술되어 있다.

선택적 투과성을 갖는 세포막은, 세포 내 막이 내부 구획 내에서 하는 것과 유사한 방식으로 세포질과 세포 외 환경 사이의 분자 교환을 제어한다. 이러한 이유로, 원형질 막은 종종 많은 분자들, 특히 전장 단백질과 같은 고분자량 분자의 세포 내 전달에 대표적인 도전적 장애물이다. 이러한 장벽을 통한 고분자량 분자의 능동 수송은 종종 지질 이중층을 통과할 수 있는 특정 캐리어를 필요로 한다. 세포 침투 펩타이드 (CPP)는 일반적으로 5-30 개 아미노산 길이의 펩타이드 (또는 펩타이드 내 모티프)이고, 세포막을 통과하는 그들의 능력에 있어서, 단백질, 플라스미드 DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 리포좀 및 항암 약물을 세포 내로 전달하는데 널리 사용된다 (Borrelli et al., 2018; Bode & Lowik, 2017; Kalafatovic & Giralt, 2017; Kristensen et al., 2016).

본 발명에서, CDNF 단백질의 C-말단 단편이 놀랍게도 ER 스트레스 교감 및 도파민성 뉴런을 시험관 내 및 생체 내에서 보호하고, 전장 CDNF와 대조적으로, 그 단편이 생체 내에서 뉴런 세포막 및 혈액-뇌-장벽을 관통할 수 있다는 것이 발견되었다.

따라서, SEQ ID NO:1:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L

에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 CDNF 단편을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명은 또한 C-말단 CDNF 단편 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다: 생리학적으로 허용되는 캐리어, 완충제, 부형제, 보존제 및 안정 화제.

본 발명의 결과는 또한 중추 신경계 (CNS) 질환, 당뇨병 또는 망막 질환을 포함하는 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 상기 C-말단 CDNF 단편을 제공하는데, 여기서 상기 CNS 질환은 좋기로는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병 및 기타 아밀로이드 질환, 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 변성, 루이소체 치매, 경도 인지 장애, 외상성 뇌 손상, 말초 신경 손상, 중독 및 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 성숙한 MANF 단백질과 달리, MANF의 C-말단 단편 (C-MANF)이 도파민 뉴런의 세포막을 관통하여 배양시 뉴런을 보호할 수 있음을 보여준다.

따라서, 본 발명의 다른 목적은 중추 신경계 (CNS) 질환을 포함하는 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 SEQ ID NO:2:

ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL

에 제시된 바와 같은 서열의 적어도 위치 33-68 또는 19-52의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 좋기로는 SEQ ID NO:2의 위치 33-68 또는 19-52의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 좋기로는 36-78 개 아미노산 길이를 갖는, C-말단 MANF 단편을 제공하는 것이고 여기서 상기 단편은 정맥 내 또는 말초 투여, 복강 내, 피하, 비강 내, 경피, 근육 내, 안내 또는 동맥 내 투여에 의하여 투여된다.

또한, 상기 C-말단 MANF 단편, 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물이 중추 신경계 (CNS)를 포함한 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한하여 제공되고: 생리학적으로 허용되는 캐리어, 완충제, 부형제 및 안정화제, 여기서 상기 단편은 정맥 내 또는 말초 투여, 복강 내, 피하, 비강 내, 경피, 근육 내, 안 내 또는 동맥 내 투여에 의해 투여된다.

본 발명의 다른 목적은 제1 형 또는 제2 형 당뇨병 또는 망막 질환의 치료에 사용하기 위한 SEQ ID NO:2:

에 제시된 바와 같은 서열의 적어도 위치 33-68 또는 19-52의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:2의 위치 33-68 또는 19-52의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 좋기로는 36-78 개 아미노산 길이를 갖는, C-말단 MANF 단편을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, C-말단 MANF 단편 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 제1 형 또는 제2 형 당뇨병 또는 망막 질환의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다: 생리학적으로 허용되는 캐리어, 완충제, 부형제, 보존제 및 안정화제.

본 발명의 전술한 및 다른 장점 및 이점은 동반된 청구범위의 특징으로서 설명되는 방식으로 달성된다.

도 1. (a) CDNF는 두 도메인을 갖는다: N-말단 도메인 및 C-말단 도메인. N-말단 도메인은 산화된 인지질 (및 적어도 MANF N-말단 도메인, 또한 3-O-술포갈락토실세라마이드로도 알려진 지질 술파타이드, Bai et al., 2018 참조)에 결합할 수 있으며 사포신-유사 도메인이다. 상기 C-말단 도메인은 C-X-X-C 서열 및 C-말단 ER 보유 신호 KTEL을 가지며 SAPLIP-유사 도메인이다. CDNF는 시험관 내에서 단백질 분해적으로 절단되어 이들 두 도메인을 생산할 수 있다. (b) MANF 및 CDNF의 구조에 대한 개략도. 흑색 세로 막대는 8 개의 보존된 시스테인 잔기의 위치를 보여준다.
도 2. 플라스미드로부터 발현된 CDNF 및 CDNF의 C-말단 단편은 ER 스트레스 상경신경절 (SCG) 교감 뉴런을 구조한다. 실험에서, 7 일령 래트/마우스로부터의 SCG 뉴런에, CDNF, CDNF의 C-말단 단편 (C-CDNF)를 발현하는 지시된 플라스미드, 대조군 플라스미드 PCR3.1 및 신경 성장 인자 (10 ng/ml의 NGF)가 배양 배지에 첨가되었을 때 양성인 대조군을 미세주사하였다. 다음 날, 2 μM의 튜니카마이신 (TM)을 첨가하여 ER 스트레스-유발 세포 사멸을 촉발시킨 후, 3 일 후에 생존 및 형광 뉴런을 계수하였고, 결과는 초기 뉴런의 백분율로서 표시된다.
도 3. CDNF 및 CDNF 단편 단백질은, 세포질에 미세주사시 ER 스트레스 SCG 뉴런을 구조한다. 실험에서, SCG 뉴런은 생후 1 일령 마우스로부터 얻어서, 7 일 동안 배양한 후, 각각 재조합 인간 CDNF 또는 C-CDNF 단백질과 함께 주사되었다. 다음 날, 튜니카마이신 (2 μM)을 첨가하고, 3 일 후에 생존 형광 뉴런을 계수하였다. 결과는 초기 뉴런의 백분율로서 표시된다.
도 4. MANF의 C-말단 단편 (C-MANF)은 배양시 도파민성 뉴런을 보호한다. 배아 제13 일 (E13) NMRI 마우스 중뇌 층의 단리시킨 배양물을, 배양 배지에 첨가되는 C-MANF, GDNF를 이용하여 (양성 대조군), 또는 대조군으로서 성장 인자 없이 5 일 동안 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 그 후, 배양물을 티로신 하이드록실라아제 (TH)로 염색하였다. CellInsight^TM으로 이미지를 스캔하고 CellProfiler 및 CellProfiler 분석 소프트웨어로 면역 양성 뉴런을 계수하였다. 데이터는 GDNF-유지된 TH-양성 뉴런의 백분율로서 표현된다.
도 5. CDNF의 C-말단 단편 (C-CDNF)은 시험관 내에서 도파민성 뉴런을 보호한다. E13.5 NMRI 마우스 중뇌 층의 단리시킨 배양물을, 주어진 농도로 배양 배지에 첨가되는 CDNF 또는 CDNF 단편을 이용하여 5 일 동안 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. GDNF (100 ng/ml)을 이용하거나 신경영양 인자없이 배양된 도파민 뉴런을 대조군으로 사용하였다. 배양물을 티로신 하이드록실라아제 (TH)로 면역염색하고, 이미지를 CellInsight^TM으로 스캔하였다. TH-양성 뉴런을 CellProfiler 및 CellProfiler 분석 소프트웨어에 의해 계수하고 GDNF-유지 뉴런의 백분율로 표현 하였다.
도 6. CDNF의 C-말단 단편 (C-CDNF) 및 MANF의 C- 말단 단편 (C-MANF)은 도파민 뉴런 및 PC6 세포의 세포막을 관통한다. a. ¹²⁵I-C-CDNF는, C-CDNF의 세포 투과 특성을 보여주며 시험관 내에서 E14 도파민 뉴런 내로 효율적으로 내재화되나, ¹²⁵I-CDNF는 그러하지 아니하다. 배양시 E14 도파민 뉴런은 30,000 cpm의 요오드화 CDNF 또는 C-CDNF로 37℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 그 후, 세포를 얼음 위에 두고 0.2 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 2.8로 수세하고 감마 카운터에서 계수하였다. 세포 내부의 방사능을 측정하였다. b.¹²⁵I-C-CDNF 및 ¹²⁵I-C-MANF는 래트 PC6 세포의 세포막을 관통하지만, 전장 요오드화 CDNF는 그러하지 아니하다. 요오드화 CDNF 또는 C-CDNF 및 C-MANF를, 성장 인자를 첨가하기 전 3 시간 동안 탑시가르긴으로 처리하거나 처리하지 않은 PC6 세포에 적용시켰다. 37℃에서 90 분 동안 내재화가 일어나도록 두었다. 세포를 얼음 위에 둔 후 0.2 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 2.8로 수세하고 감마 계수기를 사용하여 세포 내부의 방사능을 측정하였다.
도 7. ¹²⁵I-CDNF, ¹²⁵I-C-CDNF 및 ¹²⁵I-C-MANF의 혈액-뇌-장벽 침투. ¹²⁵I-CDNF, ¹²⁵I-C-CDNF 및 ¹²⁵I-C-MANF를 래트에게 피하 주사하였다. 2 시간 후에 래트를 PBS 관류하고 뇌를 적출하였다. 뇌의 방사능은 감마 카운터로 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. p<0.05 t-테스트. *, p>0.05.
도 8. PD의 래트 6-OHDA 모델에서 병변-후 2, 4, 6 및 8 주에 누적 회전. 6-OHDA 병변 2 주 후, CDNF, N-말단 CDNF (N-CDNF), C-CDNF 또는 비히클 (PBS)을, 선조체 안으로 (intrastriatally) 래트 뇌 내로 주사하였다. C-CDNF는, 6-OHDA 병변 래트에서 암페타민-유발된 회전의 누적량을 크게 감소시키므로, 신경 기능을 회복시키는 데 있어서 전장 CDNF보다 더 효과적이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 일원 ANOVA 후 Tukey-Kramer 사후 분석, **** p<0.0001.
도 9. MANF의 짧은 4-아미노산 길이의 C-말단 단편 (MANF4)은, 6-OHDA 병변 2 주 후에 상기 펩타이드가 선조체에 주입된 경우 파킨슨 병의 래트 6-OHDA 모델에서 효과적이지 않고, 병변 1, 4, 6, 8, 10 및 12 주에 (a), 또는 누적적으로 (b), 암페타민-유발된 회전이 측정되었다. GDNF가 양성 대조군으로 사용되었다.
도 10. C-말단 MANF 단편 (C-MANF)은 마우스 베타 세포 증식을 자극한다. 마우스 아일렛 (mouse islets)을 5 일 동안 태반 락토겐, C-MANF 또는 MANF를 이용하여 시험관 내 배양한 후 베타 세포에서의 Click EdU의 혼입 (n=3 웰/포인트). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 11. C-CDNF을 이용한 치료는 ALS의 SOD1 마우스 모델에서 임상 점수에 유리한 영향을 미친다. SOD1 마우스는 13 주령에 C-CDNF (3.75㎍) 또는 PBS를 뇌실 내 (intracerebroventricular) 단일 주사 (single injection) 받았다. (a) 암컷 동물의 임상 상태. C-CDNF 처리 SOD1 마우스가 PBS-처리 마우스보다 통계적으로 유의하게 더 우수한 임상 점수를 가짐에 따라, C-CDNF 처리는 증상 개시를 늦추는 것이다. (b) 균형, 조정력 및 근력을 행동평가 (rotarod)로 분석하였다. 가속 속도 4-40 rpm, 컷-오프 시간 4 분. 좌측에 대기 시간 (Latency to fall)(s)이 표시된다. SOD1-G93A 암컷. C-CDNF 처리는, PBS 처리된 마우스와 비교시 SOD1-G93A 마우스의 운동 거동을 개선시킨다.
도 12. SOD1-G93A 마우스 ALS 모델에서 1.5 ㎍/24시간으로 C-CDNF를 4-주 만성 뇌실 내 주입한 효과. (a) 성별 분류 없는, 체중의 상대적 변화. 12 주 (미니 펌프 설치 전)가 기준선으로 표시된다. 체중에 있어 치료들 간 유의미한 차이는 18 주 및 19 주에 검출되었다 (p<0.05, 양측 비(非)페어링 t- 검정). (b) 4-주의 만성 뇌실 내 C-CDNF 주입은 SOD1-G93A 마우스에서 행동평가 성능에 의해 측정되었을 때 운동 조정력을 향상시킨다. 행동평가 시험에서, 컷 오프 시간 4 분인 가속 속도 4-40 rpm이 사용되었다. C-CDNF와 PBS 처리간 차이는 13 주부터 19 주까지 유의미했다 (p <0.01, 반복 측정 ANOVA).
도 13. 피하 주사된 C-CDNF는 뇌 허혈 래트 모델에서 경색 부피를 감소시킨다. C-CDNF (50 ㎍)는 말초 중간 대뇌 동맥 폐색 30 - 50 분 전 및 재관류 직후에 100 ㎕의 부피로 투여되었다. C-CDNF 처리는 대뇌 피질의 전측부에서 측정될 때 경색 부피를 감소시킨다 (스튜던트 t- 검정 p <0.05). C-CDNF 처리된 래트는 비히클 처리된 래트보다 약 50% 더 작은 병변을 가졌다. PBS를 대조군으로 사용하였다. *는 P <0.05를 나타낸다. 수치는 PBS로부터의 백분율로서 평균 ± SEM으로 표시된다, n = 8-9.
도 14. 설계된 CDNF의 C-말단 펩타이드 (펩타이드 1-7, 표 5 참조)는, 세포질에 미세주입시 ER 스트레스 받은 SCG 뉴런을 구조한다. 본 실험에서, SCG 뉴런은 생후 1 일령 마우스로부터 얻어서, 7 일 동안 배양한 후, 재조합 인간 CDNF 또는 C-CDNF 펩타이드 주입되었다. 다음 날, 튜니카마이신 (2 μM)을 첨가하고 3 일 후에 생존 형광 뉴런을 계수하였다. 결과는 초기 뉴런의 백분율로서 표시된다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 일원 ANOVA 후 Tukey-Kramer 사후 분석, *p< 0.05, **p <0.01, ***p <0.001.
도 15. 설계된 CDNF의 C-말단 펩타이드 (펩타이드 1-7, 표 5 참조)는 시험관 내에서 도파민성 뉴런을 보호한다. El 3.5 NMRI 마우스 중뇌 층의 단리시킨 배양물을, 주어진 농도로 배양 배지에 첨가되는 CDNF 펩타이드 (펩타이드 1-7, 표 5 참조)를 이용하여 5 일 동안 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. GDNF (100 ng/ml)를 이용하거나 신경영양 인자없이 배양된 도파민 뉴런을 대조군으로 사용하였다. 배양물을 티로신 하이드록실라아제 (TH)로 면역염색하고, 이미지를 CellInsight^TM으로 스캔하였다. TH-양성 뉴런을 CellProfiler 및 CellProfiler 분석 소프트웨어에 의해 계수하고 GDNF-유지 뉴런의 백분율로 표현하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 일원 ANOVA 후 Tukey-Kramer 사후 분석, *p< 0.05, **p <0.01, ***p <0.001.
도 16. SCG 뉴런으로의 미세주입 및 설계된 CDNF의 C-말단 펩타이드 (펩타이드 8-15, 표 6 참조)와 함께 튜니카마이신 처리 후 생존 시험. 펩타이드 8 (37 aa), 12 (단일 아미노산 치환을 갖는 49 aa), 13 (단일 아미노산 치환을 갖는 49 aa) 및 15 (33 aa)는 세포질에 미세주입시 ER 스트레스를 받은 SCG 뉴런을 구조한다. 본 실험에서, SCG 뉴런은 생후 1 일령 마우스로부터 얻어서, 7 일 동안 배양한 후, 재조합 인간 CDNF 또는 C-CDNF 펩타이드 주입되었다. 다음 날, 튜니카마이신 (2 μM)을 첨가하고 3 일 후에 생존 형광 뉴런을 계수하였다. 결과는 초기 뉴런의 백분율로서 표시된다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 일원 ANOVA 후 Tukey-Kramer 사후 분석, *p< 0.05, **p <0.01.
도 17. El 3.5 NMRI 마우스 중뇌 층의 단리시킨 배양물을, 주어진 농도로 배양 배지에 첨가되는 CDNF의 C-말단 펩타이드 (펩타이드 8-15, 표 6 참조)를 이용하여 5 일 동안 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. GDNF (100 ng/ml)를 이용하거나 신경영양 인자없이 배양된 도파민 뉴런을 대조군으로 사용하였다. 배양물을 티로신 하이드록실라아제 (TH)로 면역염색하고, 이미지를 CellInsight^TM으로 스캔하였다. TH-양성 뉴런을 CellProfiler 및 CellProfiler 분석 소프트웨어에 의해 계수하고 GDNF-유지 뉴런의 백분율로 표현하였다. 모든 C-CDNF 펩타이드는 절단되지 않은 CDNF 단백질에 비해 활성을 나타냈지만, 펩타이드 8, 12, 13, 14 및 15가 시험관 내에서 도파민 뉴런에 대해 최고의 보호 효과를 나타내었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 일원 ANOVA 후 Tukey-Kramer 사후 분석, *p< 0.05, **p <0.01, ***p <0.001.
도 18. N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화를 갖는 CDNF의 변형된 C-말단 펩타이드 (펩타이드 1, 61 aa 및 펩타이드 15, 37 aa, 표 5 및 6 참조)는 시험관 내에서 도파민성 뉴런을 보호한다. El 3.5 NMRI 마우스 중뇌 층의 단리시킨 배양물을, 주어진 농도로 배양 배지에 첨가되는 상기 펩타이드를 이용하여 5 일 동안 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. GDNF (100 ng/ml)를 이용하거나 신경영양 인자없이 배양된 도파민 뉴런을 대조군으로 사용하였다. 배양물을 티로신 하이드록실라아제 (TH)로 면역염색하고, 이미지를 CellInsight^TM으로 스캔하였다. TH-양성 뉴런을 CellProfiler 및 CellProfiler 분석 소프트웨어에 의해 계수하고 GDNF-유지 뉴런의 백분율로 표현하였다.
도 19. 반복적 피하 주사로 주어진 C-CDNF 33 aa (pep l5, 표 6 참조)는, 암페타민-유발된 회전 거동에 의해 측정된 바와 같이, 운동 불균형에 있어 6-OHDA-유도된 손상에 대한 보호에 효과적이다. 6-OHDA (3x2 ㎍)를 선조체에 주입하였다. 병변 2 주 후부터 시작하여, 동물은 4 주 동안 주 2 회 C-CDNF 33 aa 또는 비히클 (PBS)의 피하 주사를 받았다 (용량 수준 : 50 ㎍/s.c. 주사, 8 s.c. 주사 후 총 용량: 400 ㎍). (A) 암페타민-유발 회전 시험은 병변 2, 4, 6, 8, 10 및 12 주 후에 수행되었다. (B) 2, 4, 6, 8, 10 및 12 주에 누적 회전. 수치는 평균 ± SEM으로 표현된다, n = 9. ***는 C-CDNF (50 ㎍ x 8 s.c.) 대 비히클-처리된 대조군에 대해 p <0.00l를 나타낸다.
도 20. 화학적으로 합성된 및 CHO 세포 발현된 C-CDNF 펩타이드 (pep l, 61 aa)는 동일한 CD 스펙트럼을 가지며, 이들은 α-나선과 루프를 갖는 잘 정의된 2차 구조를 보유한다. JASCO J720 기기를 사용한 CD 스펙트럼 측정. 펩타이드의 농도: 30 μM. 비히클: 20 mM PB, pH 7. 부피: 300 μl. 파장: 260-l95 nm.
도 21. 화학적으로 합성된 C-CDNF 펩타이드 (pepl, pep8, pep9, pepl2 및 pepl3, 표 5-6 참조)의 CD 스펙트럼. C-CDNF 펩타이드 8 (pep8)은 2차 구조의 일부 요소를 보존하였다. C-CDNF 펩타이드 9는 C-CDNF 6laa (pepl)와 유사한 2차 구조를 정의하였다. C-CDNF 펩타이드 12 (pepl2)는 2차 구조를 정의하였지만 C-CDNF 6laa (pepl)에 비해 일부 α-나선 영역이 손실되었다. C-CDNF 펩타이드 13 (pepl3)은 2차 구조를 정의하였지만 펩타이드 12 (pepl2)에 비해 일부 α-나선 영역이 손실되었다. JASCO J720 기기를 사용한 CD 스펙트럼 측정. 펩타이드의 농도: 30-100 μM. 비히클: 20 mM PB, pH 8. 부피: 300 μl. 파장: 260-l95 nm.
도 22. C-CDNF 펩타이드 15 (pep 15)의 CD 스펙트럼은 상기 펩타이드가 2차 구조의 일부 요소를 보존하였음을 보여준다. JASCO J720 기기를 사용한 CD 스펙트럼 측정. 펩타이드의 농도: 50 μM. 비히클: 20 mM PB, pH 8. 부피: 300 μl. 파장: 260-l95 nm.
도 23. C-CDNF (SEQ ID NO : 4) 및 C-MANF (SEQ ID NO : 5)의 서열 정렬 및 비교. 두 신경 영양 인자의 C- 말단 구조는 3 개의 알파-나선 모티프 (나선 1, 2 및 3)를 포함합니다. 두 영양 인자 모두의 C-말단 구조는 3 개의 알파-나선 모티프 (나선 1, 2 및 3)를 포함한다. C-말단 CDNF 펩타이드 5 및 6 (표 5 참조)은 이들 모티프 중 오로지 2 개 (나선 2 및 3)만 함유한다.
도 24. C-말단 CDNF 단편 (SEQ ID NO:1)의 프로테아제 (protease) 절단 부위 예측.
도 25. C-말단 MANF 단편 (SEQ ID NO: 2)의 프로테아제 절단 부위 예측.

본 발명은 신경영양 인자 단백질 CDNF에 관한 것이다. CDNF 폴리펩타이드는 총 길이가 187 개 아미노산인, 신호 펩타이드를 갖는 전장 인간 CDNF이고, 신호 펩타이드가 없는 성숙한 인간 CDNF는 총 길이가 161 개 아미노산이다 (도 1b 참조).

본 발명은 또한 신경영양 인자 단백질 MANF에 관한 것이다. 특히 중요한 MANF 폴리펩타이드는 총 길이가 179 개 아미노산인, 신호 펩타이드를 갖는 전장 인간 MANF이고, 신호 펩타이드가 없는 성숙한 인간 MANF는 총 길이가 158 개 아미노산이다 (도 1b 참조).

본원에 사용되는 바, CDNF 또는 MANF 폴리펩타이드에 적용되는 용어 "C-말단 단편"은 통상적으로, 상기 폴리펩타이드의 C-말단 SAP-유사 도메인에 위치하는, 약 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57 개 이상의 인접하거나 연속적인 아미노산, 통상, 약 43 개 또는 55 개 이상의 인접하거나 연속적인 아미노산, 더 통상적으로, 약 57 개 또는 60 개 이상의 인접하거나 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다 (도 1a 및 1b 참조). C-말단 단편은 또한 길이가 61 개 또는 65 개 이상인 인접하거나 연속적인 아미노산일 수 있고, 일부 경우에 70 개 이상의 인접하거나 연속적인 아미노산일 수 있다. 가장 좋기로는, C-말단 단편은 C-말단 도메인의 33-57, 33-61, 33-81, 43-57, 43-61, 43-81, 또는 60-65 개의 인접하거나 연속적인 아미노산을 포함한다. 이러한 C-말단 단편은 온전한 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 보유하는 "기능적 단편"이고 상기 온전한 폴리펩타이드가 갖지 않는 특성을 가질 수도 있다.

CDNF/MANF의 자연 발생적 대립 유전자 변이체에 더하여, 인코딩되는 CDNF/MANF 폴리펩타이드 또는 이의 C-말단 단편의 아미노산 서열에서의 연장, 삽입 및 결실과 같은 변경을 발생시키는 CDNF/MANF 핵산 서열 내로의 돌연변이에 의해 변화가 도입될 수 있다. "비(非)-필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환으로 이어지는 뉴클레오타이드 치환이 CDNF/MANF 폴리펩타이드 및 그의 C-말단 도메인의 서열에서 이루어질 수 있다.

"비-필수" 아미노산 잔기는 그 생물학적 활성을 변경하지 않고 CDNF/MANF의 야생형 서열에서 변형될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 이러한 생물학적 활성에 필요하다. 예를 들어, 본 발명의 CDNF/MANF 분자들 간에 보존된 아미노산 잔기는 필수적이며 특히 변형이 불가능한 것으로 예측된다. 보존적 치환이 이루어질 수 있는 아미노산들은 당업계에 잘 알려져 있다.

각각의 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산일 수 있다. 용어 "비-천연 아미노산"은, 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지므로 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방한다는 점에서 천연 아미노산의 동질물인 유기 화합물을 지칭한다. 비-천연 아미노산은, 20 가지 일반적인 자연 발생적 아미노산 또는 희귀 천연 아미노산인 셀레노시스테인이나 피로리신 중 하나가 아닌, 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체일 수 있다. 비-천연 아미노산은 또한 천연 아미노산의 D-이성질체일 수 있다. 적합한 아미노산의 예는 알라닌, 알로이소류신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시클로헥실알라닌, 2,3-디아미노프로피온산, 4-플루오로페닐알라닌, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 호모프롤린, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 나프틸알라닌, 노르류신, 페닐알라닌, 페닐글리신, 피페콜산, 프롤린, 피로글루탐산, 사르코신, 세린, 셀레노시스테인, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 이들의 유도체 또는 조합을 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 특정 구체예는, 적어도 1, 2, 3, 4 개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산이 교차적인 키랄성을 갖는 것인 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 키랄성은 아미노산의 "D" 및 "L" 이성질체를 지칭한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 4 개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산은 교차적인 키랄성을 가지며 나머지 아미노산은 L-아미노산이다.

본 명세서에서, 본 발명의 C-말단 CDNF 단편 및 C-말단 MANF 단편의 뉴런 세포 내로의 세포 흡수가 입증되었다. 특정 구체예에서, 흡수는, 전장 CDNF 또는 MANF와 비교하여 좋기로는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 배 더 우수하고, 특정 펩타이드는 전장 CDNF 또는 MANF보다 심지어 13 배 더 우수하다. 특정 구체예에서, 본 발명은, 전장 인간 CDNF와 같은 대조군과 비교하여, 본 발명의 C-말단 CDNF 단편의 개선된 세포 흡수 효율을 입증한다. 특정 구체예에서, 본 발명은, 전장 인간 MANF와 같은 대조군과 비교하여, 본 발명의 C-말단 MANF 단편의 개선된 세포 흡수 효율을 입증한다.

본원에 사용된 바, 세포 흡수 효율은 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 세포막을 가로지르는 능력을 지칭한다. 본 발명의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 세포 흡수는 수용체 또는 세포 유형에 의존하지 않는다.

이 기술 분야의 숙련자는 (i) 세포 유형 (예를 들어, 뉴런 세포, 내피 세포)마다 내재화된 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편과 같은 세포-침투 펩타이드의 양과, (ii) 상기 동일한 세포 유형마다 내재화된 전장 CDNF/MANF와 같은 대조군 펩타이드의 양을 비교함으로써 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 흡수 효율을 시험할 수 있다. 세포 흡수 효율을 측정하기 위해, 상기 세포 유형은 특정 시간 (예를 들어, 30 분, 1 시간, 2 시간 등) 동안 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편과 같은 세포-침투 펩타이드의 존재 하에서 배양될 수 있고, 그 시간 후에 상기 세포에 의하여 내재화된 상기 세포-침투 펩타이드의 양이 정량화된다. 별도로, 동일한 농도의 대조군을 동일한 시간 동안 상기 세포 유형의 존재 하에서 배양하고, 상기 세포에 의해 내재화된 제 2 펩타이드의 양이 정량화된다. 정량화는 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편과 같은 세포-침투 펩타이드를 형광 표지하고 (예를 들어, FITC 염료로), 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 형광 강도를 측정함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 C-말단 CDNF 단편 및 C-말단 MANF 단편은 또한 적절한 대조군과 비교할 때, 세포, 예를 들어 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 나타낸다 (예컨대, 도 14 및 15 참조). 본원에 사용된 바, 보호 효과는 본 발명의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의, 예를 들어 도파민성 뉴런 또는 ER 스트레스 뉴런 세포의 생존을 촉진하는 능력을 지칭한다. 당업자는 (i) 세포 유형 (예를 들어, 교감 뉴런 세포 또는 도파민 뉴런) 생존에 대한 본 발명의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 용량과 (ii) 동일한 세포 유형에 의한 대조군 펩타이드의 생존 수준 또는 동일한 세포 유형에 의한 신경영양 인자가 무첨가된 생존 수준을 비교함으로써 상기 보호 효과를 시험할 수 있다. 세포 생존을 측정하기 위해, 상기 세포 유형은 특정 시간 (예를 들어, 30 분, 1 시간, 2 시간 등) 동안 본 발명의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 존재 하에서 배양될 수 있고, 그 시간 후 상기 세포의 세포 생존이 정량화된다. 별도로, 동일한 농도의 대조군 펩타이드를 동일한 시간 동안 상기 세포 유형의 존재 하에서 배양하고, 상기 세포에 의한 제2 펩타이드의 세포 생존이 정량화된다. 또는, 상기 세포 유형은 동일한 시간에 걸쳐 신경영양 인자 없이 배양되고, 상기 세포에 의한 세포 생존이 정량화된다.

한 구체예에서, 세포 생존을 측정하기 위해, 상기 세포 유형에 본 발명의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편을 주사하고 특정 시간 동안 (예를 들어, 30 분, 1 시간, 2 시간 등) 배양할 수 있고, 그 시간 후 상기 세포의 세포 생존이 정량화된다. 대조군 세포는 완충제로 (즉, 신경영양 인자 없이) 주사되고 대조군 세포는 동일한 시간에 걸쳐 배양되고, 상기 세포에 의한 세포 생존이 정량화된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 C-말단 CDNF 단편의 보호 효과 (세포 생존율로서 측정됨)는, 성장 인자 무첨가 상태에서 배양되거나 성장 인자 없이 완충액을 주사한 세포에 비하여 1.01-배 이상, 1.02-배 이상, 1.03-배 이상, at least1.04-배 이상, 1.05-배 이상, 1.05-배 이상, 1.06-배 이상, 1.07-배 이상, 1.08-배 이상, 1.09-배 이상, 1.1-배 이상, 1.11 -배 이상, 1.12-배 이상, 1.13-배 이상, 1.14-배 이상, 1.15-배 이상, 1.16-배 이상, 1.17-배 이상, 1.19-배 이상, 1.2-배 이상, 1.21-배 이상, 1.23-배 이상, 1.25-배 이상, 1.26-배 이상, 1.27-배 이상, 1.28-배 이상, 1.29-배 이상, 1.3-배 이상, 1.31-배 이상, 1.32-배 이상, 1.33-배 이상, 1.34-배 이상, 1.35-배 이상, 1.37-배 이상, 1.4-배 이상, 1.42-배 이상, 1.43-배 이상, 1.45-배 이상, 1.48-배 이상, 1.49-배 이상, 1.5-배 이상, 1.55-배 이상, 1.6-배 이상, 1.65-배 이상, 1.7-배 이상, 1.75-배 이상, 1.8-배 이상, 1.85-배 이상, 1.89-배 이상, 1.9-배 이상, 1.94-배 이상, 1.95-배 이상, 2.0-배 이상, 2.05-배 이상, 2.10-배 이상, 2.11-배 이상, 2.14-배 이상, 2.15-배 이상, 2.16-배 이상, 2.19-배 이상, 2.2-배 이상, 2.21-배 이상, 2.23-배 이상, 2.24-배 이상, 2.25-배 이상, 2.26-배 이상, 2.28-배 이상, 2.3-배 이상, 2.32-배 이상, 2.35-배 이상, 2.37-배 이상, 2.39-배 이상, 2.4-배 이상, 2.42-배 이상, 2.45-배 이상, 2.5-배 이상, 2.52-배 이상, 2.55-배 이상, 2.6-배 이상, 2.65-배 이상, 2.7-배 이상, 2.75-배 이상, 2.8-배 이상, 2.85-배 이상, 2.9-배 이상, 3.0-배 이상, 3.1-배 이상, 3.2-배 이상, 3.3-배 이상, 3.4-배 이상, 3.5-배 이상, 3.6-배 이상, 3.7-배 이상, 3.8-배 이상, 3.9-배 이상, 또는 4.0-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.01-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.02-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.03-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.04-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.05-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.06-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.07-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.08-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.09-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.1-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.11-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.12-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.13-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.14-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.15-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.16-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.17-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.19-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.2-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.21-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.23-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.25-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.26-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.27-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.28-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.29-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.3-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.31-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.32-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.33-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.34-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.35-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.37-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.4-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.42-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.43-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.45-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.48-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.49-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.5-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.55-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.6-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.65-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.7-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.75-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.8-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.85-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.89-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.9-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.94-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 1.95-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.0-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.05-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.10-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.11-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.14-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.15-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.16-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.19-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.2-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.21-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.23-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.24-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.25-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.26-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.28-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.3-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.32-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.35-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.37-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.39-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.4-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.42-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.45-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.5-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.52-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.55-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.6-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.65-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.7-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.75-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.8-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.85-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 2.9-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.0-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.1-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.2-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.3-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.4-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.5-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.6-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.7-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.8-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 3.9-배 이상이다.

한 구체예에서, 상기 보호 효과는 성장 인자없이 배양된 세포에 비하여 4.0-배 이상이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 C-말단 MANF 단편의 보호 효과는 성장 인자 무첨가 상태에서 배양되거나 성장 인자 없이 완충액을 주사한 세포와 비교하여 1.05-배 이상, 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배 이상, 1.4-배 이상, 1.5-배 이상, 1.6-배 이상, 1.7-배 이상, 1.8-배 이상, 1.9-배 이상, 2.0-배 이상, 2.10-배 이상, 2.2-배 이상, 2.3-배 이상, 2.4-배 이상, 2.5-배 이상, 2.6-배 이상, 2.7-배 이상, 2.8-배 이상, 2.9-배 이상, 3.0-배 이상, 3.1-배 이상, 3.2-배 이상, 3.3-배 이상, 3.4-배 이상, 3.5-배 이상, 3.6-배 이상, 3.7-배 이상, 3.8-배 이상, 3.9-배 이상, 또는 4.0-배 이상이다.

따라서, 본 발명은 SEQ ID NO:1:

에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 CDNF 단편을 제공하고, 여기서 상기 단편은 세포막 침투 펩타이드이고 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 가지면, 좋기로는 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

바람직한 구체예에서, 바람직하게는 33-81 개 아미노산 길이를 갖는 상기 단편은, SEQ ID NO:1에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 (flanking) 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 용어 "측면의 (flanking) 서열"은 상기 연속적인 아미노산 잔기의 말단 양자 모두 또는 적어도 하나의 말단을 연장하는 아미노산을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 상기 서열은 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 바람직하게는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다.

어떠한 이론에 국한되지 않고, 도 15의 결과는 세포막 침투 및 뉴런 세포에 대한 보호 효과에 중요한 아미노산 서열 모티프가 SEQ ID NO:1의 약 38번 및 약 70번 위치의 아미노산 잔기 사이에 위치 함을 보여준다. 이 영역은 두 개의 나선 구조 (나선 2 및 나선 3)와 그 사이의 CXXC 모티프를 함유한다 (도 23 참조). 또한,도 16 및 17의 결과는 나선 1 및 2 및 CXXC 모티프를 함유하는 C-CDNF 펩티드 15 (33 aa)가 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 가짐을 보여준다. 따라서, 본 발명은, C-말단 CDNF 단편이 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 38-70, 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70, 31-70, 38-73, 37-73, 36-73, 35-73, 34-73, 33-73, 32-73, 31-73, 25-57, 24-57, 23-57, 22-57, 21-57, 20-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:의 위치 38-70, 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70, 31-70, 38-73, 37-73, 36-73, 35-73, 34-73, 33-73, 32-73, 31-73, 25-57, 24-57, 23-57, 22-57, 21-57, 20-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는, 구체예에 관한 것이다. 한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 38-70, 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70, 31-70, 38-73, 37-73, 36-73, 35-73, 34-73, 33-73, 32-73, 31-73, 25-57, 24-57, 23-57, 22-57, 21-57, 20-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 한 구체예에서, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은, 존재한다면, SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 좋기로는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다.

또 다른 바람직한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은, SEQ ID NO:1에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 31-73 (펩타이드 6; SEQ ID NO: 15), 25-73 (펩타이드 4; SEQ ID NO: 13), 21-73 (펩타이드 3; SEQ ID NO: 12), 21-70 (펩타이드 7; SEQ ID NO: 16), 31-81 (펩타이드 5; SEQ ID NO: 14), 25-81 (펩타이드 2; SEQ ID NO: 11), 25-57 (펩타이드 15, SEQ ID NO:24), 또는 37-73 (펩타이드 8, SEQ ID NO:17)의 연속적인 아미노산 잔기 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73, 25-73, 21-73, 21-70, 31-81, 25-81, 25-57, 또는 37-73의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 좋기로는 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 31-73, 25-73, 21-73, 21-70, 31-81, 25-81, 25-57, 또는 37-73의 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 한 구체예에서, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 좋기로는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다.

또 다른 바람직한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 31-73의 연속적인 아미노산 잔기 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 좋기로는 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 31-73의 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

또 다른 바람직한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 25-57의 연속적인 아미노산 잔기 또는 SEQ ID NO:1의 위치 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 좋기로는 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 25-57의 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:1:

로 제시되는 바와 같은 서열, 또는 SEQ ID NO:1의 서열과 90% 이상 상동성인 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 C-말단 CDNF 단편에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 서열은 SEQ ID NO:1의 서열과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성이다.

본 발명은 또한, SEQ ID NO:2:

에 제시되는 바와 같은 서열, 또는 SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상의 상동성인 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 C-말단 MANF 단편에 관련된 것이다. 한 구체예에서, 서열은 SEQ ID NO:2의 서열과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성이다.

본 명세서 및 하기 청구 범위에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단편"은 천연 펩타이드 (분해 산물, 합성적으로 합성된 펩타이드 또는 재조합 펩타이드 중 하나) 및 변형된 펩타이드를 포함하며, 이는, 예를 들어 상기 펩타이드들을 보다 안정적으로 또는 보다 덜 면역원성으로 만드는 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형은 고리화, N-말단 변형, C-말단 변형, 펩타이드 결합 변형, 백본 변형 및 잔기 변형을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 단편은 또한 추가적인 연장, 결실, 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 단편은 프로테아제 절단에 내성이다. 한 구체예에서, 단편은 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함하고, 그로써 상기 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위를 없앤다.

본 명세서에서 사용되는 바, "프로테아제 절단 부위"는 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편은 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제 또는 세린 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 도 24 또는 도 25 또는 표 7 및 8에 예시된 바와 같은 프로테아제 절단 부위이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "프로테아제-내성 단편" 또는 "단편은 프로테아제 절단에 내성이다"는 적어도 하나의 천연 (native) 프로테아제 절단 부위를 없애거나 천연 프로테아제 절단 부위에 가깝거나 인접한 서열을 변화시켜, 상응하는 천연 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편과 비교하여 상기 프로테아제 절단이 방지, 억제, 감소 또는 느려진, 변경된 아미노산 서열을 함유하는 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편을 지칭한다.

일부 구체예에서, 적합한 변경은 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위를 없앤다.

일부 구체예에서, 적합한 변경은 적어도 2 개의 프로테아제 절단 부위를 없앤다.

일부 구체예에서, 적합한 변경은 적어도 3 개의 프로테아제 절단 부위를 없앤다.

일부 구체예에서, 적합한 변경은 적어도 4 개 이상의 프로테아제 절단 부위를 없앤다.

한 구체예에서, 모든 시스테인 프로테아제 절단 부위가 없어진다.

한 구체예에서, 모든 메탈로프로테아제 절단 부위가 없어진다.

한 구체예에서, 모든 세린 프로테아제 절단 부위가 없어진다.

변경은 아미노산 치환, 결실, 삽입, 연장 또는 변경일 수 있다.

예컨대, SEQ ID NO:1의 잔기 1-75 (예컨대, 1-8, 16-23, 26-33, 32-39, 37-44, 38-45, 43-50, 46-53, 57-64, 59-66, 60-67 및 68-75)에 대응하는 영역 내의 임의의 한 아미노산, 또는 SEQ ID NOs:3, 4 및 11-24의 대응하는 아미노산은 임의의 다른 아미노산으로 치환, 결실 또는 변형될 수 있다. 예컨대, 프로테아제 절단 부위에 인접한 위치에서의 치환은 절단 부위의 프로테아제 인식에 영향을 미칠 수 있다. 각 인식 부위 내에서 하나 이상의 추가적인 아미노산의 치환 또는 삽입은 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 없앨 수 있다. 축퇴 위치에서의 하나 이상의 잔기의 결실 또한 두 프로테아제 절단 부위를 모두 없앨 수 있다.

일부 구체예에서, 프로테아제-내성 단편은 SEQ ID NO:1의 46, 49, 35, 63, 4, 71, 19, 40, 41, 60, 62, 29에 해당하는 위치, 또는 SEQ ID NO: 3, 4, 및 11-24의 대응하는 아미노산에서 아미노산 치환 또는 변형을 함유한다.

일부 구체예에서, 본 발명을 위하여 적합한 프로테아제-내성 단편은 추가적인 변경을 함유할 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO:1, NO:3, NO:4 또는 NO: 11-24의 잔기들의 최대 20% 또는 그 이상이 변할 수 있다 (예컨대, 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 그 이상의 잔기들이 변하거나 변경될 수 있다). 따라서, 본 발명에 적합한 프로테아제-내성 단편은 SEQ ID NO:1, NO:3, NO:4, 또는 NO:11-24와 80% 이상, 예컨대 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "시스테인 프로테아제 프로테아제 절단 부위" ("시스테인 프로테아제 절단 부위" 또는 "시스테인 프로테아제 절단 서열"이라고도 함)는 시스테인 프로테아제에 의한 효소적 프로테아제 절단을 위한 인식 서열 역할을 하는 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, 시스테인 절단 부위는 SEQ ID NO:1의 QILH｜SWGE 또는 HSWG｜EECR, 또는 SEQ ID NO: 3, 4 및 11-24의 대응하는 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 절단 부위는 서열 내에서 "｜" 로 보여진다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "메탈로프로테아제 절단 부위" ("메탈로프로테아제 절단 부위" 또는 "메탈로프로테아제 절단 서열"이라고도 함)는 메탈로프로테아제에 의한 효소적 프로테아제 절단을 위한 인식 서열 역할을 하는 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, 메탈로프로테아제 절단 부위는 SEQ ID NO:1의 DLRK｜MRVA, DYVN｜LIQE, MPAM｜KICE, QICE｜LKYE, LAPK｜YAAT, EKTD｜YVNL 또는 RVAE｜LKQI, 또는 SEQ ID NO: 3, 4 및 11-24의 대응하는 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 절단 부위는 서열 내에서 "｜" 로 보여진다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "세린 프로테아제 절단 부위" ("세린 프로테아제 절단 부위" 또는 "세린 프로테아제 절단 서열"이라고도 함)는 세린 프로테아제에 의한 효소적 프로테아제 절단을 위한 인식 서열 역할을 하는 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, 세린 프로테아제 절단 부위는 SEQ ID NO:1의 VAEL｜KQIL, LDLA｜SVDL 또는 TDYV｜NLIQ, 또는 SEQ ID NO: 3, 4 및 11-24의 대응하는 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 절단 부위는 서열 내에서 "｜" 로 보여진다.

한 구체예에서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 시스테인 프로테아제는 카텝신 K이다.

한 구체예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-9 또는 MMP-3이다.

한 구체예에서, 세린 프로테아제는 키모트립신 A 또는 엘라스타제-2이다.

예컨대, SEQ ID NO:2의 잔기 11-70 (예컨대, 11-18, 18-25, 21-28, 24-31, 33-40, 52-59, 54-61, 59-66, 또는 63-70)에 대응하는 영역 내 임의의 한 아미노산, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 6의 대응하는 아미노산은 임의의 다른 아미노산으로 치환, 결실 또는 변형될 수 있다. 예컨대, 프로테아제 절단 부위에 인접한 위치에서의 치환은 절단 부위의 프로테아제 인식에 영향을 미칠 수 있다. 각 인식 부위 내에서 하나 이상의 추가적인 아미노산의 치환 또는 삽입은 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 없앨 수 있다. 축퇴 위치에서의 하나 이상의 잔기의 결실 또한 두 프로테아제 절단 부위를 모두 없앨 수 있다.

일부 구체예에서, 프로테아제-내성 단편은 SEQ ID NO:2의 62, 27, 14, 66, 36, 21, 55, 57, 또는 24 에 대응하는 위치, 또는 SEQ ID NO:5 또는 6의 대응하는 아미노산에서의 아미노산 치환을 함유한다.

일부 구체예에서, 본 발명에 적합한 프로테아제-내성 단편은 추가적인 변경을 함유할 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO:2의 최대 20% 또는 그 이상의 잔기들, 또는 SEQ ID NO:5 또는 6의 대응하는 아미노산이 변할 수 있다 (예컨대, 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 그 이상의 잔기들이 변하거나 변경될 수 있다). 따라서, 본 발명에 적합한 프로테아제-내성 단편은 SEQ ID NO:2와 80% 이상, 예컨대 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:5 또는 6의 대응하는 아미노산을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "메탈로프로테아제 절단 부위" ("메탈로프로테아제 절단 부위" 또는 "메탈로프로테아제 절단 서열"이라고도 함)는 메탈로프로테아제에 의한 효소적 프로테아제 절단을 위한 인식 서열 역할을 하는 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, 메탈로프로테아제 절단 부위는 SEQ ID NO:2의 KINE｜LMPK, KINE｜LMPK, STVD｜LKKL, QICE｜LKYD, EKSD｜YIRK 또는 LMPK｜YAPK, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 6의 대응하는 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 절단 부위는 서열 내에서 "｜" 로 보여진다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "세린 프로테아제 절단 부위" ("세린 프로테아제 절단 부위" 또는 "세린 프로테아제 절단 서열"이라고도 함)는 세린 프로테아제에 의한 효소적 프로테아제 절단을 위한 인식 서열 역할을 하는 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구체예에서, 세린 프로테아제 절단 부위는 SEQ ID NO:2의 VKEL｜KKIL, DKQI｜DLST, SDYI｜RKIN, IDLS｜TVDL, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 6의 대응하는 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 절단 부위는 서열 내에서 "｜" 로 보여진다.

한 구체예에서, 프로테아제는 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 메탈로프로테아제는 MMP-9 또는 MMP-2이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단편의 길이는 33-81, 43-81, 43-61, 또는 50-81 개 아미노산의 범위이다. 좋기로는, 상기 단편의 길이는 55-75, 55-70, 55-61, 61-65 또는 61-70 개 아미노산의 범위이다. 보다 좋기로는, 상기 단편의 길이는 49-61, 50-61, 51-61, 53-61, 57-61, 55-69, 55-68, 55-67, 55-66, 56-69, 56-68, 56-67, 56-61, 57-69, 57-68, 57-67, 57-61, 58-69, 58-68, 58-67, 58-61, 59-69, 59-68, 59-67, 59-61, 60-69, 60-68, 60-67, 60-66, 60-64, 60-63, 61-62, 61-63, 61-64, 61-65, 61-66 또는 61-67 개 아미노산의 범위이다. 예를 들어, 양호한 상기 단편은 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75 개 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, C-말단 CDNF 단편은 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 또는 61 개 아미노산으로 구성된다. 한 구체예에서, C-말단 MANF 단편은 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 개 61 아미노산으로 구성된다. 상기 단편은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린과 같은 임의의 자연 발생적 아미노산 뿐 아니라, 비-전통적이거나 변형된 아미노산도 포함할 수 있다. 좋기로는, 상기 단편은 인간 CDNF 또는 MANF 단백질의 C-말단 도메인의 서열과 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 또는 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 보다 좋기로는, 상기 단편은 인간 CDNF 또는 MANF 단백질의 C-말단 도메인의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 본원에 사용되는 "상동성"은, 레퍼런스 서열과 적어도 제2 서열의 단편 사이에 서열 유사성을 지칭한다. 후술하는 바와 같이, BLAST는 백분율 동일성 및 유사성에 기초하여 서열을 비교할 것이다.

2 이상의 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은 동일한 2 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 아래의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동으로 정렬 및 육안 검사로 측정한 최대 대응으로 비교되고 정렬될 때, 2 개의 서열이 동일한 아미노산 잔기들로 이루어지는 특정 백분율을 갖는 경우 (즉, 특정 영역에 걸쳐, 또는, 특정되지 않은 경우 전 서열에 걸쳐, 29% 동일성, 임의로 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성), 2 개의 서열은 "실질적으로 동일"하다. 임의로, 상기 동일성은 길이가 약 10 개 이상의 아미노산인 영역, 또는 보다 좋기로는 길이가 10, 15, 20, 25, 30 개 또는 그 이상의 아미노산인 영역에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 통상 하나의 서열이, 시험 서열들이 비교될 레퍼런스 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때 시험 및 레퍼런스 서열들은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 프로그램 기본 파라미터가 사용되거나, 대체 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은, 프로그램 파라미터에 기초하여 레퍼런스 서열에 대한 시험 서열들의 상대적인 서열 동일성 백분율을 계산한다. 동일성에 대하여 2 개 서열을 비교할 때, 서열들이 연속적일 필요는 없지만, 임의의 갭은 전체 백분율 동일성을 감소시킬 페널티를 수반할 것이다.

본원에 사용되는 "비교 창"은, 2 개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 하나의 서열이 레퍼런스 서열과 비교될 수 있는 임의의 연속 위치들의 수 중 하나의 분절에 대한 지칭을 포함하고, 상기 레퍼런스 서열은 상기 연속 위치들과 동일한 수의 연속 위치로 이루어지는 것이다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 ClustalW 또는 FASTA와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.

서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 두 가지 예는 각각 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402] 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410]에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 기본값으로 단어 길이 3, 기대값 (E) 10을 사용하고, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 ([Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89 (22):10915-10919] 참조)는 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 짧은 아미노산 서열의 경우, PAM30 스코어링 매트릭스가 적용될 수 있다.

BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, [Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 (12):5873-5877] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 가장 작은 확률의 합 (P(N))이며, 이는 두 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 확률에 표시를 제공한다.

좋기로는, SEQ ID NO:1의 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성인 C-말단 CDNF는 SEQ ID NO:1의 위치 52-55에 서열 CXXC를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 더욱 좋기로는, SEQ ID NO:1의 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성인 상기 서열은, SEQ ID NO:3:

MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE EC XX CAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L

의 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.

또 다른 양호한 구체예에서, SEQ ID NO:1의 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성인 상기 서열은 SEQ ID NO:1의 위치 52-55에 서열 CKGC를 포함한다.

가장 양호한 구체예에서, 상기 단편은 SEQ ID NO:4:

KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L

의 서열 또는 SEQ ID NO:4의 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성인 서열을 갖는다.

한 구체예에서, 상기 C-말단 CDNF 단편은 그의 천연 C-말단 아미노산들, 즉 ER 보유 신호를 함유하지 않는다. 따라서, 양호한 구체예에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 78-81에 해당하는 CR 보유 신호 KTEL을 결여한다.

본 발명은 또한 상기 단편이 FITC-표지와 같은 검출 가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티에 결합될 수 있음을 보여준다. 본원에 사용되는 바, "검출 가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티"는 펩타이드의 검출을 용이하게 하기 위한 목적의 아미노산 서열 또는 검출 가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티를 나타내는 태그를 나타내고; 예컨대 가시성, 형광성, 화학 발광성 또는 다른 검출 가능한 염료 중에서 선택되는 검출 가능한 분자; 기질의 존재 하에서 검출 가능한 효소, 예를 들어 NBT + BCIP와 함께 알칼리성 포스파타아제 또는 적합한 기질과 함께 퍼옥시다아제; 검출 가능한 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질이다. 좋기로는, 상기 태그는 상기 단편이 표적 세포 내로 침투하는 것을 방지하거나 방해하지 않는다.

단편의 안정성 및/또는 세포 투과성을 증가시키기 위한 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 N- 및/또는 C-말단 변형도 또한 양호하다. CDNF 단편 또는 MANF 단편의 말단 아세틸화-아미드화 (즉, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화)는 당업계에 공지된 옵션 중 하나이다 (예를 들어, [Marino et al., 2015, ACS Chem. Biol. 10:1754-1764] 참조).

C-말단 CDNF 단편 및 C-말단 MANF 단편 양자 모두가 도파민 뉴런을 사멸로부터 강력하게 보호하였기 때문에 (도 4 및 5 참조), WO2009133247 및 EP1969003과 같은 선행 기술은 단편이 중추 신경계 (CNS) 질환, 예컨대 알츠하이머 병, 파킨슨 병 (PD), 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 전측두엽 변성, 루이소체 치매, 경도 인지 장애, 헌팅턴 병 (HD), 외상성 뇌 손상, 약물 중독 및 뇌졸중의 치료에 사용될 수 있음을 보여준다. 본 발명을 지지하는 추가 결과는, PD 모델에서 C-CDNF의 효과를 나타내는 도 8 및 ALS 모델에서 C-CDNF의 효과를 나타내는 도 11 및 12에 제공된다. 또한, 짧은 MANF 펩타이드 (MANF4)가, 신경 복원적인, 보다 임상 적으로 지향되는 셋업에서 시험될 때, 즉 6-OHDA 후에 첨가시, 파킨슨 병의 래트 6-OHDA 모델에서 효과적이지 않다는 것도 주목할 만하다 (도 9 참조).

CNS에서 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 효과는 뉴런뿐만 아니라 미세 아교 세포, 성상 세포 및 신경 줄기 세포 또는 뉴런 전구체 세포와 같은 CNS의 다른 세포 유형도 표적으로 함을 포함하고, 더하여 생존 및 그들이 갖는 다른 특성, 예컨대 이동, 증식, 분화 및 성숙을 포함한다.

도 10에 나타난 결과는 C-말단 MANF 단편이 제1 형 및 제2 형 당뇨병의 치료에 효과적임을 확인하여 준다. 또한, WO2016057579는 CDNF 및 MANF가 망막 장애에서 활성이라는 것을 개시하고 있다. 따라서, 본 발명은 상기 중추 신경계 (CNS) 질환, 당뇨병 및 망막 장애의 치료에 관한 것이다. ER-스트레스-유발성 아폽토시스 세포 사멸 또한, 그 영향을 받는 조직 또는 기관의 기능 또는 구조가 시간이 지남에 따라 점차 악화되는, 다른 퇴행성 질환의 원인이다 (검토를 위해, [Oakes and Papa, Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2015. 10:173-94] 참조). 이러한 퇴행성 질환의 몇 가지 다른 예로는, 연령-연관 황반 변성, 스타가르트 병, 녹내장, 망막 색소 변성증 및 시신경 변성; 니만-픽 병; 죽상동맥경화증; 진행성 핵상 마비; 암; 테이-삭스 병; 원추각막; 염증성 장 질환 (IBD); 전립선염; 골관절염; 골다공증; 및 류마티스 관절염 뿐만 아니라 보다 급성인 상태, 예컨대 외상성 뇌 손상 또는 허혈-재관류 손상, 예를 들어, 심근 허혈성 손상, 신장 허혈성 손상 또는 뇌졸중을 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 관한 것이다.

치료 방법에서는, 약학적 유효량의 C-말단 단편이 환자에게 투여된다. 즉, 본 발명에 따른 단편은 퇴행성 질환 또는 장애, 예컨대 중추 신경계 (CNS) 질환 및 기타 신경계 질환, 예컨대 알츠하이머 병, 파킨슨 병 (PD), PD의 비-운동성 증상 (예컨대, 변비, 우울증 및 환각), 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증, 허혈성 뇌졸중, 말초 신경병증, 전측두엽 변성, 루이소체 치매, 경도 인지 장애, 헌팅턴 병, 뇌전증, 외상성 뇌 손상, 말초 신경 손상, 출혈성 뇌졸중 또는 중독 (예컨대, 코카인, 모르핀, 암페타민 또는 알코올 남용), 제1 형 및 제2 형 당뇨병 또는 망막 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다. 보다 좋기로는, 상기 단편은 파킨슨 병 또는 근위축성 측삭 경화증의 치료에 사용하기 위한 것이다.

환자에게 투여되는 CDNF 또는 MANF의 C-말단 단편의 실제 투여량 (예를 들어, 유효량)은 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동시의 치료적 개입, 환자의 특발증과 같은 물리적 및 생리학적 인자들 및 투여 경로에 의하여 결정될 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 각 대상체에 대하여 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 투여량(들)을 결정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, C-말단 CDNF 단편 또는 MANF 단편은 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 본 발명의 이러한 조성물은 원하는 순도를 갖는 상기 펩타이드를 임의적인 생리학적으로 허용되는 캐리어 (예컨대, 나노 캐리어), 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012)), 동결 건조 케이크 또는 수용액 형태로, 저장용으로 제조된다. 허용되는 캐리어, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대 소듐; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 들 수 있다.

상기 단편은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의하여 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 매크로에멀젼 내에 가둬질 수 있다. 이러한 기술은 상기한 Remington 's Pharmaceutical Sciences에 개시되어 있다.

한 구체예에서, 약학적 조성물은 예를 들어 약 0.1% 이상의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 예를 들어 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위일 수 있다.

다른 비-제한적 예에서, 약학적 조성물 또는 제형의 투여량은, 투여당 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편 약 1 ng/kg/체중, 약 5 ng/kg/체중, 약 10 ng/kg/체중, 약 50 ng/kg/체중, 약 100 ng/kg/체중, 약 200 ng/kg/체중, 약 350 ng/kg/체중, 약 500 ng/kg/체중, 1 μg/kg/체중, 약 5 μg/kg/체중, 약 10 μg/kg/체중, 약 50 μg/kg/체중, 약 100 μg/kg/체중, 약 200 μg/kg/체중, 약 350 μg/kg/체중, 약 500 μg/kg/체중, 약 1 mg/kg/체중, 약 5 mg/kg/체중, 약 10 mg/kg/체중, 약 50 mg/kg/체중, 약 100 mg/kg/체중, 약 200 mg/kg/체중, 약 350 mg/kg/체중, 약 500 mg/kg/체중부터, 약 1000 mg/kg/체중 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편 또는 그 이상까지, 그리고 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 여기서 나열된 숫자로부터 유도될 수 있는 비-제한적 예로, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 μg/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 범위의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편 등이, 전술한 숫자에 기초하여 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 신경 세포를 추가로 포함할 수 있는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 신경 세포는 예를 들어 뉴런, 신경 줄기 세포 또는 뉴런 전구체 세포일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 약학적 조성물은, 치료적 유효량의, 상기 정의된 바와 같은 C-말단 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 정의된 바와 같은 C-말단 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터, 또는 상기 정의된 바와 같은 C-말단 단편을 발현하는 숙주 세포를 포함한다. 상기 바이러스 벡터는, 좋기로는, 상기 정의된 바와 같은 C-말단 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로 바이러스, 예컨대 렌티 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 파필로마바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 통상, 상기 재조합 벡터 및 재조합 바이러스 벡터는 시험관 내 및 생체 내 양자 모두에서 다양한 시스템으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 조직- 또는 세포-유형 특이적 프로모터와 같은 발현 제어 서열을 포함한다. 벡터는 또한 하나 이상의 시스템에서 발현에 필요한 조절 요소를 함유하는 하이브리드 벡터일 수 있다. 이들 다양한 조절 시스템을 함유하는 벡터는 상업적으로 입수 가능하고 당업자는 본원에 정의된 바와 같은 C-말단 단편을 이러한 벡터 내로 쉽게 클로닝할 수 있을 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터의 선택, C-말단 단편을 발현시키기 위한 핵산 서열을 상기 벡터 내로 삽입하는 방법, 및 바이러스 벡터를 관심 세포에 전달하는 방법은 이 기술 분야의 기술 범위 내이다. 예를 들어, [Dornburg R (1995), Gene Therap. 2:301-310] 참조.

투여 경로는 공지된 방법 뿐만 아니라 정맥 내 또는 말초 투여, 복강 내, 피하, 척수강 내, 뇌실 내, 비강 내, 경피, 뇌 내, 근육 내, 안 내, 동맥 내 또는 병변 내 수단에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 명시되는 대로의 서방형 시스템의 일반적인 경로에 따른다. C-말단 단편 또는 상기 단편을 포함하는 약학적 조성물은 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 장애가 허용하는 경우라면, 부위-특이적 전달을 위해 상기 단편을 제형화하고 투여해야 한다. 투여는 연속적이거나 주기적일 수 있다. 투여는 일정한- 또는 프로그램 가능한-유동 삽입 가능 펌프에 의하여 또는 주기적 주사에 의하여 달성될 수 있다. 본 발명이 C-말단 MANF 및 CDNF 단편 양자 모두가 뉴런 세포막 및 혈액-뇌-장벽을 침투할 수 있다는 것을 보여주기 때문에, 말초 또는 전신 투여가 양호하다 (도 6 및 7 참조). 다른 양호한 투여 경로는 피하, 척수강 내, 뇌실내, 비강 내 또는 경피 투여이다. 도 13에서, C-CDNF 단백질의 피하 주사의 효과는 뇌졸중 유발된 래트로 나타난다.

서방성 제조물의 적합한 예는 상기 단편을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)] 및 [Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]에 기재된 폴리에스테르, 하이드로겔 또는 폴리비닐 알코올, 폴리락타이드 (U.S. Pat. No. 3,773,919, EP 58,481), 또는 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (상기 Langer et al.)를 포함한다.

유전자 요법 벡터는 상기 펩타이드 단편에 대해 상기 정의된 바와 같은 상응하는 투여 방식을 사용하여 대상체에게 전달될 수 있으며, 좋기로는, 예를 들어 정맥 내 주사에 의하여, 또는 복강 내, 피하, 척수강 내 또는 뇌실 내 투여에 의할 수 있다. 상기 유전자 요법 벡터의 약학적 제조물은 허용 가능한 희석제를 포함할 수 있고 또는, 유전자 전달 비히클이 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다.

도 23의 서열 정렬은 C-말단 CDNF 및 MANF 펩타이드의 높은 서열 동일성을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은, 여기 제시된 결과로부터, C-말단 MANF 단편에서도 역시 세포막 침투 및 뉴런 세포에 대한 보호 효과에 중요한 아미노산 서열 모티프가, SEQ ID NO:1의 위치 38-70에 대응하는 SEQ ID NO:2의 약 33 및 약 68 위치의, 그리고 SEQ ID NO:1의 위치 25-57에 대응하는 SEQ ID NO:2의 약 19 및 52 위치의 아미노산 잔기들 사이에 위치한다고 추정한다. 따라서, 본 발명은, 중추 신경계 (CNS) 질환을 포함하는 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, SEQ ID NO:2:

에 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 33-68 또는 19-52의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:2의 위치 33-68 또는 19-52의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 좋기로는 36-78 개 아미노산 길이를 갖는, C-말단 MANF 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:2의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖고, 상기 단편은 세포막 침투 펩타이드이고 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 갖는다.

양호한 구체예에서, 본 발명은 중추 신경계 (CNS) 질환을 포함하는 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, SEQ ID NO:2:

로 제시되는 바와 같은 서열 또는 SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상 상동성인 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기들로 구성되는 C-말단 MANF 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 단편은 정맥 내 또는 말초 투여, 복강 내, 피하, 비강 내, 경피, 근육 내, 안 내 또는 동맥 내 투여에 의해 투여된다.

도 10에서 보여지는 결과에 기초하여, 본 발명은 또한, 제1 형 또는 제2 형 당뇨병의 치료에 사용하기 위한, SEQ ID NO:2:

에 제시되는 바와 같은 서열 또는 SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상 상동성인 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 C-말단 MANF 단편에 관한 것이다.

상기 언급된 모든 구체예에 대하여, SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상 상동성인 상기 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:2의 위치 47-50에 서열 CXXC를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.

더욱 좋기로는, SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상 상동성인 상기 서열은 SEQ ID NO:6:

QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETC XX C AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL

가장 좋기로는, 상기 MANF 단편은 SEQ ID NO:5:

KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL

의 서열 또는 SEQ ID NO:5의 서열과 90% 이상 상동성인 서열을 갖는다.

한 가지 구체예에서, 상기 C-말단 MANF 단편은 그 천연의 C-말단 아미노산들, 즉 ER 보유 신호를 함유하지 않는다. 따라서, 양호한 구체예에서, 상기 단편은 SEQ ID NO:2의 위치 75-78에 대응하는 ER 보유 신호 RTDL을 결여한다.

C-말단 MANF 단편은 상기 C-말단 CDNF 단편에 대하여 앞서 논의된 바와 같은 동일한 방식으로 변형될 수 있다.

본 발명은 또한 중추 신경계 (CNS) 질환, 제1 형 또는 제2 형 당뇨병 또는 망막 장애의 치료에 사용하기 위한, C- 말단 MANF 단편 및 하기 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다: 생리학적으로 허용되는 캐리어, 완충제, 부형제 및 안정화제. C-말단 MANF 단편을 포함하는 상기 약학적 조성물은 좋기로는 환자에게 말초 투여되므로, 따라서 좋기로는 말초 투여에 적합하다.

본 명세서는 또한, 중추 신경계 (CNS) 질환, I 형 또는 II 형 당뇨병 또는 망막 장애를 포함하는 퇴행성 질환 또는 장애의 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 여기서 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 유효량의 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편이 환자에게 투여된다. 좋기로는, 상기 단편은 말초 투여된다.

본 명세서는 또한, 중추 신경계 (CNS) 질환, I 형 또는 II 형 당뇨병 또는 망막 장애를 포함하는 퇴행성 질환 또는 장애의 치료용 의약의 제조를 위한, 본원에서 정의된 바와 같은 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:4:

KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L

의 서열 또는 SEQ ID NO:4의 서열과 90% 이상 상동성인 서열을 갖는 C-CDNF 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기에 적합한 재조합 벡터, C-CDNF 단편을 발현시키기 위한 핵산 서열을 상기 벡터에 삽입하는 방법 및 상기 재조합 벡터를 관심 세포에 전달하는 방법의 선택은 당업계의 기술 범위 내이다. 예를 들어, [Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448] 참조.

본 발명의 배경을 밝히고, 특히 그 실시와 관련하여 추가적인 세부 사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 사용된 간행물 및 기타 자료는 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

실험 섹션

상경수신경절 세포를 이용한 연구

교감 뉴런의 배양을 위하여 (Hellman et al., 2011; Hamner et al., 2001; Lindholm et al., 2002; Sun et al., 2001; Aalto et al., 2007) 생후 (P) 0-3일령 마우스의 상경수신경절을 37℃에서 45 분 동안 콜라게나아제 (2.5 mg/ml; Worthington), 디스파아제 (5 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals), 및 트립신 (10 mg/ml; Worthington)으로 분해하고, 실리콘화 유리 파스퇴르 피펫으로 기계적으로 분리하였다. 비-뉴런 세포는 강한 프리플레이팅에 의해 제거되었다. 거의 순수한 뉴런이, 폴리오르니틴/라미닌 (Sigma)-코팅된 35-mm 플라스틱 디쉬에서, 5-6 일간 30 ng/ml 마우스 신경 성장 인자 (NGF)(Promega)의 존재하에 Neurobasal 배지 및 B27 보충제 (Invitrogen/Gibco) 내에서 작은 크기의 표준 마이크로아일랜드로 배양되었다. 강한 수세에 의하여 NGF를 제거하였고, 기능-차단 항-NGF 항체 (Roche)를 첨가하였다. 뉴런은 특수한 뉴런 미세 주입 장비로 가압-미세 주사되었다 (Hellman et al., 2011; Hamner et al., 2001; Lindholm et al., 2002; Sun et al., 2001; Yu et al., 2003)(Sun et al. al., 2001; Sun et al., 2003). 생존 분석을 위해, 마이크로아일랜드 상의 모든 뉴런을 실험의 시작 (초기 숫자) 및 종료 (3 일)에서 계수하고 초기의 %로 표시하였다.

교감 뉴런의 미세 주사를 앞서 기술한 대로 수행하였다 (Yu, LY, Jokitalo, E., Sun, YF, Mehlen, P., Lindholm, D., Saarma, M. and Arumae, U. (2003) J. Cell Biol. 163, 987-997). CDNF에 대한 플라스미드는 앞서 기술되었다. 간략하게, 신생 마우스 SCG 뉴런을 5-6 일 동안 NGF (Promega)로 성장시킨 후, 각 실험에서 10 ng/ul의 벡터 농도로 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP)에 대한 리포터 플라스미드와 함께, 전장 (FL)-CDNF 및 C-CDNF에 대한 발현 플라스미드를 핵에 미세 주사하였다. 플라스미드 농도 50 ng/ul로 유사한 결과가 달성되었다. 단백질 미세 주입을 위하여, 200 ng/ul의 PBS 내 재조합 전장 (FL)-CDNF, C-CDNF 단백질은 성공적으로 주입된 뉴런의 확인을 용이하게 할 형광 리포터 Dextran Texas Red (MW 70000 Da)(Invitrogen, Molecular Probes)와 함께 세포질 내로 직접 미세 주사되었다. 다음날 튜니카마이신 (2 μM)을 첨가하고 3 일 후에 살아있는 형광 뉴런을 계수하였다. 살아있는 형광 (EGFP-발현 또는 Dextran Texas Red-함유) 뉴런은 3 일 후에 "맹검 (blindly)" 계수되었고, 미세 주사 후 2 내지 3 시간 후에 계수된 초기의 살아있는 형광 뉴런에 대한 백분율로 표시되었다. 플라스미드 실험은 플라스미드 실험을 위해 독립 배양물에서 5 회 반복된 반면, 4 개의 독립적인 단백질 주사 실험이 수행되었다. 평균적으로, 실험 군당 평균 50-80 개의 뉴런이 성공적으로 주입되었다. 결과를 평균 ± SEM으로 표시하였다. 각 실험군의 데이터를, 일원 ANOVA 및 사후 Dunnett t 테스트로 대조군 플라스미드 PCR3.1 (벡터) 또는 PBS (단백질 주입 실험에서)와 비교하였다. 귀무 가설은 p<0.05에서 기각되었다.

CDNF 발현 플라스미드

전장 (FL) 또는 카르복시-말단 (C) 도메인을 코딩하는 컨스트럭트가 TOPO/TA 클로닝 시스템 (Invitrogen) 또는 제한효소 엔도뉴클레아제 중 어느 하나를 사용하여 pCR3.1 벡터 (Invitrogen)에 삽입되었다. pCR3.1 벡터 내 전장 CDNF는 각각 537 bp (179 아미노산) 및 561 bp (187 아미노산) 길이이며, N-말단에 ER 표적화를 위한 신호 서열을 갖는다. C-CDNF는 186 bp 길이이며, FL-CDNF에서 아미노산 127-187에 해당한다.

E511 pCR3.1 내 인간 CDNF/양방향 TOPO TA. 정지 코돈이 있는 전장 cDNA (태그 없음). 앰피실린 선별. DH5α. 시퀀싱으로 확인.

E811 pCR3 . 1 hCDNF C - 신호 서열을 갖는 인간 CDNF C 말단 서열. PCR 및 Invitrogen TA 클로닝 시스템에 의해 클로닝됨. 인서트 크기 207 bp. DH5a 세포 내로 형질전환. Amp 선별. 시퀀싱으로 확인.

단백질 및 펩타이드 단편을 발현하는 플라스미드

인간 재조합 CDNF (26 개 아미노산 길이의 신호 서열 및 161 개 아미노산 길이의 성숙 CDNF 서열을 갖는, 187 개 아미노산으로 구성된 전장 프리-CDNF), 인간 N-CDNF (26 개 아미노산의 인간 CDNF 신호 서열로 구성되고, 아미노산 1 - 아미노산 100의 성숙 CDNF의 일부) 및 인간 C-CDNF (아미노산 101에서 출발하여 아미노산 161에 이르는 성숙 CDNF의 C-말단 도메인과 융합된 26 개 아미노산 길이의 CDNF 신호 서열로 구성됨).

인간 재조합 MANF (21 개 아미노산 길이의 신호 서열 및 158 개 아미노산 길이의 성숙 MANF 서열을 갖는, 179 개 아미노산으로 구성된 전장 프리-MANF), 인간 N-MANF (21 개 아미노산의 인간 MANF 신호 서열로 구성되고, 아미노산 1 - 아미노산 95의 성숙 MANF의 일부) 및 인간 C-MANF (아미노산 96에서 출발하여 아미노산 158에 이르는 성숙 MANF의 C-말단 도메인과 융합된 21 개 아미노산 길이의 CDNF 신호 서열로 구성됨) .

hMANF 및 hCDNF 및 그들의 도메인에 대한 코돈 최적화된 cDNA 합성을 Genewiz에 주문하고 각각의 pQMCF 발현 벡터를 구축하였다. N-CDNF, C-CDNF, N-MANF 및 C-MANF 컨스트럭트는 C-말단에 히스티딘 태그를 가졌다. cDNA는 최종 벡터에서 서열 분석에 의해 확인되었다. hMANF 및 hCDNF 단백질은 CHO-유래 현탁 세포주 CHOEBNALT85에 의해 생산되었으며, 화학적으로 정의된 무-혈청 배지를 사용하여 세포를 배양하였다.

CHOEBNALT85 세포를 1 μg의 발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48 시간 후 700 μg/ml의 G418을 첨가하여 세포 집단을 함유하는 플라스미드를 선별하였다.

단백질의 발현 및 분비는, 트랜스펙션 48 시간 후 세포 용해물 및 상청액에서, 환원 조건에서 분석되었다.

hMANF 및 hCDNF 단백질을 2-단계 이온-교환 크로마토그래피로 정제하고 pH 7.4의 PBS로 겔 여과하였다. CDNF 및 MANF 항체 (MANF 4E12-HRP 및 CDNF-7D6-HRP, Icosagen Tartu, Estonia)를 이용한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석에 기초하여, 사용된 단백질은 99%를 초과하는 순도였다.

CDNF 및 MANF 도메인을 Ni-친화 컬럼에서 정제하고, 단백질을 또한 His 태그에 대한 마우스 단일 클론 항체 (Cat No. A00186; GeneScript)를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

생성된 단백질은 다음의 서열을 가졌다:

성숙 인간 CDNF:

QEAGGRPGADCEVCKEFLNRFYKSLIDRGVNFSLDTIEKELISFCLDTKGKENRLCYYLGATKDAATKILSEVTRPMSVHMPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL (SEQ ID NO:7)

인간 N-CDNF:

QEAGGRPGADCEVCKEFLNRFYKSLIDRGVNFSLDTIEKELISFCLDTKGKENRLCYYLGATKDAATKILSEVTRPMSVHMPAMKICEKLKKLDSQICEL (SEQ ID NO:8)

인간 C-CDNF:

KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL (SEQ ID NO:4)

성숙 인간 MANF:

LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL(SEQ ID NO:9)

인간 N-MANF

LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICEL (SEQ ID NO:10)

인간 C-MANF

KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL (SEQ ID NO:5)

도파민 뉴런 연구

도파민 뉴런을 연구하기 위해 (Yu et al., 2008; Yu and Arumae, 2008), 중뇌 층을 13.5-d-령 NMRI 스트레인 마우스 배아의 배쪽 중뇌개 (mesencephali)에서 분리하였다. 조직을 0.5% 트립신 (ICN Biomedical)으로 배양한 후, 큰 화염-연마 파스퇴르 피펫을 사용하여 기계적으로 분해하였다. 뉴런을, 폴리-L-오르니틴-코팅된 (Sigma) 96-웰 배양 플레이트 상에서, N2 보충제 (Invitrogen)를 함유하는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen)에서, GDNF (100 ng/ml)의 존재 또는 부재하에, 또는 여러 농도의 CDNF, MANF, C-CDNF 및 C-MANF 폴리펩타이드와 함께 5 일 동안 성장시켰다. 실험 초기에 동일한 양의 뉴런이 각 웰에 도말되었다. 신경영양 인자를 추가하지 않은 배양물이 음성 대조군으로 사용되었다. 중뇌 배양물은 여러 뉴런 유형을 함유하므로, 배양물을 고정시키고, 도파민성 뉴런에 대한 특이적 마커인 티로신 하이드록실라아제 (TH)(Millipore)에 대한 항체로 면역 염색시켰다. 각 웰의 이미지를 CellInsightTM로 스캔하고 면역 양성 뉴런을 CellProfiler 및 CellProfiler 분석 소프트웨어로 계수하였다. 데이터는 GDNF-유지된 TH-양성 뉴런의 백분율로 표시된다. 모든 실험은 독립적인 배양에 대하여 적어도 세 번 반복되었다. 결과는 평균 SEM으로 표현되었으며, 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 시험에 의하여 또는 양측 스튜던트 t-검정으로 유의성을 시험하였다. 귀무 가설은 P≤0.05에서 기각되었다.

CDNF , C- CDNF 및 C- MANF의 요오드화

CDNF, C-CDNF 및 C-MANF는 락토퍼옥시다아제 방법을 사용하여 ¹²⁵I-Na로 요오드화되었다. 해당 단백질을 30 μl의 0.25 M 포스페이트 완충액, pH 7.5에 용해시키고 ¹²⁵I-Na (1 mCi/2.8 μl; 1 mCi= 37 mBq; GE Healthcare)와 혼합하였다. 50 ㎍/ml의 락토퍼옥시다아제 10 ㎕의 및 0.05% H₂O₂를 첨가하자 반응이 시작되었다. 혼합물을 실온에서 20 분 동안 반응시키고, 0.1 M NaI, 0.42 M NaCl을 함유하는 3 부피의 0.1 M 포스페이트 완충제, pH 7.5를 첨가하여 반응을 중지시킨 다음, 25 ㎕의 2.5% BSA를 첨가하였다. 유리 요오드 및 요오드화된 단백질을 Sephadex G-25 컬럼 (PM10; GE Healthcare) 상에서 겔 여과에 의해 분리하였다. 컬럼 평형 및 용리를 위해, 1% BSA를 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충액, pH 7.5를 사용하였다. 요오드화된 성장 인자는 때때로 YM-10 Centricon 컬럼 (Millipore)을 사용하여 농축되었다. ¹²⁵I-표지된 CDNF, C-CDNF, 및 C-MANF의 특이적 활성은 Wizard 3 1480 Automatic Gamma Counter (Perkin Elmer, Wallac)에서 측정하였으며 약 10⁸ cpm/μg단백질이었다. 표지된 단백질을 4℃로 유지하고 표지한 후 3 주 이내에 사용하였다.

E13.5 도파민 뉴런에 대한 내재화 실험

배양시 24 웰 플레이트에서 성장한 마우스 E13.5 도파민 뉴런을 37℃에서 2 시간 동안 웰당 30,000 cpm의 요오드화 CDNF 또는 C-CDNF와 배양시켰다. 세포를 얼음으로 옮기고 0.5 ml의 빙냉 배지로 1 회 수세하였다. 이어서, 세포를 에펜도르프 튜브로 옮기고 0.2 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 2.8로 4℃에서 1 회 수세하였다. 10 분 동안 1000 g에서 원심 분리한 후 세포를 0.5 ml의 0.5 N NaOH에 용해시키고 감마 카운터에서 계수하였다.

래트에서 혈액-뇌 장벽 침투 연구

¹²⁵I-CDNF, ¹²⁵I C-CDNF 또는 ¹²⁵I C-MANF (모든 단백질은 10 μl에 10⁶ cpm)를 성인 수컷 Wistar 래트에게 피하 주사하였다. 2 시간 후에, 동물은 PBS로 관류되었다. 방사능은 감마 카운터에 의해 여러 뇌 영역에서 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 그룹 간의 차이는 ANOVA에 이어 Tukey-Kramers 사후 테스트로 분석되었다.

PC6.3 세포에 대한 내재화 실험

래트 PC6.3 크롬친화세포종 세포를 10% FCS 및 5% 말 혈청을 함유하는 DMEM 배양에서 24 웰 플레이트 상에서 성장시켰다. 세포를 PBS로 세척하고 37℃에서 90 분 동안 웰당 요오드화된 CDNF 또는 C-CDNF 30,000 cpm으로 배양하였다. 세포를 얼음 위에 두고, 0.5 ml의 빙냉 배지로 1 회 수세하였다. 이어서 세포를 에펜도르프 튜브로 옮기고 0.2 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 2.8로 1 회 수세하였다. 10 분 동안 1000 g에서 원심 분리한 후 세포를 0.5 ml의 0.5 N NaOH에 용해시키고 Wallac 감마 카운터에서 계수하였다.

래트에서 PD의 6- OHDA 모델에서의 신경 복원 연구

PD의 신경 복원 모델에서, 래트는 전술한 바와 같이 6-OHDA로 병변되었다 (Voutilainen et al., 2009; Voutilainen et al., 2011, Penttinen et al., 2016). 간단히, 래트는 이소플루란 마취 하에 좌측 선조체 내로 3x2 μg 6-OHDA의 일측 정위성 주사 (10 도 각도)를 받았다 (브레그마 및 듀라에 대한 좌표 A/P +1.6; L/M -2.8; D/V -6, A/P 0.0: L/M -4.1; D/V -5.5 및 A/P -1.2; L/M: -4.5; D/V -5.5). 2 주 후, 래트를 암페타민-유발성 회전 결과 (병변의 크기)를 기준으로 그룹으로 나누었다. 이후 6-OHDA와 동일한 좌표를 사용하여 CDNF (10 μg), C-CDNF (CDNF 10 μg와 균등몰) 및 N-CDNF (CDNF 10 μg와 균등몰)를 래트에게 선조체 내 주사하였다. 래트를 그룹으로 나눈 후 레퍼런스 실험에서, 삼투압 미니 펌프를 피하로 삽입하고 캐뉼라를 병변된 선조체 내에 위치시켰다. 미니 펌프는 MANF4 (즉, MANF 펩타이드 CKGC, WO2013034805 참조), GDNF 또는 비히클 용액을 2 주 동안 선조체에 전달한 후, 미니 펌프와 캐뉼라가 제거되었다. 뉴런 내에서, 6-OHDA는 시너지적으로 작용하는 두 가지 작용 방식을 갖는다: 1) 6-OHDA는 세포질에 축적되어 산화 스트레스를 야기하는 자유 라디칼을 형성하고; 2) 6-OHDA는 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I 및 IV의 강력한 억제제이다. 노르아드레날린성 뉴런은 NAT-억제제 데시프라민 (15 mg/kg, i.p., 6-OHDA-주사 30 분 전)을 사용하여 보호되었다. 일측 병변의 크기 및 치료 효과는, CDNF, C-CDNF, N-CDNF 및 PBS 처리된 래트를 포함하는 실험에서 병변 후 2, 4, 6 및 8 주에, 및 MANF4 및 GDNF를 포함하는 레퍼런스 실험에서 1, 4, 8, 10 및 12 주에, 암페타민 유발성 회전 거동으로 측정되었다. 30 분의 습관화 시간 (habituation period) 후 120 분 동안 암페타민-유발성 (2.5 mg/kg, i.p.) 완전 (360°) 동측성 및 대측성 회전의 수를 120 분 동안 기록하였다. 결과는 병변 면에 대한 동측성 순-회전으로 표현된다. 제외 기준은 평균 (순-회전) ± 2 × STDEV였다.

티로신 하이드록실라아제 ( TH )-면역 조직 화학

관류 및 조직 처리. 신경 복원 연구 직후, 래트를 과량의 소듐 펜토바르비탈 (90 mg/kg, i.p .; Orion Pharma)로 마취시키고, PBS로 심장 내로 관류한 후, pH 7.4의 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액 중 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 뇌를 제거해 내어, 4 시간 동안 후-고정시키고, 4℃의 20% 수크로오스를 함유 소듐 포스페이트 완충액에 저장하였다. 40 μm 깊이의 순차적 동결 관상면 절편을 슬라이딩 마이크로톰에서 절단하였다. 면역 조직 화학은 문헌에 기재된 대로 수행되었다 (Voutilainen et al., 2009). 관류된 뇌를 밤새 파라포름알데히드 고정시키고 20% 수크로오스에 보관하였다. 뇌를 6 개 시리즈로 40-μm 두께 절편으로 절단하였다. 프리-플로팅 절편 (free-floating sections)을 포스페이트-완충 염용액 (PBS)로 세척하고, 내인성 퍼옥시다아제 활성을 0.3% 과산화수소 (Sigma Aldrich)로 퀀칭하였다. 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해, 절편을 블로킹 완충액 (1 x PBS 중의 4% 소 혈청 알부민 및 0.1% 트리톤 X-100)에서 1 시간 동안 배양하였다. 절편을 4℃에서 블로킹 완충액 내 마우스 모노클로날 항-티로신 하이드록실라아제 (TH) 항체 (1:2,000; catalog No. MAB318; RRID:AB_2201528; Millipore, Billerica, MA)와 밤새 반응시킨 다음, 비오틴화 2 차 항체와 반응시켰다 (1:200; 항-래트 또는 항-마우스; Vector, Burlingame, CA). 염색은 아비딘-비오틴-효소 복합체 (ABC 키트; Vector)로 강화되었고, 신호는 발색체로서 3',3'-디아미노벤지딘으로 가시화되었다.

흑질의 TH -양성 세포 계수

흑질 치밀부 (substantia nigra pars compacta, SNpc)의 TH-양성 세포가, 브레그마에 대해 대략 A/P -4.5 내지 -6.0의, SNpc에 걸친 6 개 절편으로부터 분석되었다. 3DHistech 스캐너로 얻은 이미지로부터 Matlab (RRID:nlx_153890; MathWorks, Natick, MA) 알고리즘으로 세포를 계수하였다. 스캐너의 해상도는 Х 20 NA 0.8 대물 렌즈를 이용하여 0.24 μm/픽셀이었다.

선조체에서 TH -양성 신경 돌기의 광학 밀도 분석

선조체 내의 TH-양성 신경 돌기의 광학 밀도는, 각각의 래트로부터, 브레그마에 대해 대략 A/P + 2.2, + 0.84 및 -0.12의, 3 개의 선조체 절편으로부터 결정되었다. 배경 신호를 줄이기 위하여, 절편을 자동화 스캐너 (3DHistech, Budapest, Hungary, University of Helsinki의 생명 공학 연구소에서 제공하는 스캔 서비스)로 스캔하고 이미지를 16 비트 그레이 스케일로 변환하였다. 뇌량 (corpus callosum)에는 TH 신호가 없기 때문에, 비특이적 배경 염색의 척도로 사용되었다. 얻어진 이미지로부터, 면적으로 나눈 통합 밀도를 ImageJ (NIH)로 분석하였다. 데이터는 무손상 면의 백분율로 표시된다.

베타 세포 증식 분석

암컷 버진 8 주령 C57bl6Rcc 마우스의 아일렛 (islets)을 단리하였다. 아일렛을 성장 배지에서 o/n으로 회복시키고, 다음 날 동일한 수의 아일렛/웰 (70/웰)을 태반 락토겐 (PL 500 ng/ml), C-MANF 또는 MANF로 5 일 동안 처리하였다. 배지의 절반은 성장 인자를 갖는 신선한 배지로 매일 교체되었다. BrdU 대안인 뉴클레오사이드 유사체 Edu (Click-iT®Edu 증식 키트, Invitrogen)를 아일렛 수확 48 시간 전에 첨가하였다. 아일렛을 트립신으로 분해하고 세포 원심분리기에서 유리 슬라이드로 원심 분리하였다. 세포는 사이트스핀 후 고정되었고, 증식성 세포는 Click-iT Alexa Fluor 아자이드 색 시약으로 염색된 후, 베타 세포를 검출하기 위해 + 4℃에서 o/n 인슐린 염색되었다 (기니피그 1:200, Abcam, Cambridge, UK). 세포를 수세하고, Alexa Fluor® 488과 결합된 2차 항체로 염생하였다 (1:400, Molecular Probes, Life Technologies, USA, USA). 슬라이드를 DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)를 함유하는 Vectashield 봉입제로 봉입하였다. AxioVision4 소프트웨어를 사용하는 40x/Plan-Apochromat/0.95 Corr M27 alc 63x/Plan-Apochromat/1.40 Oil/M27 alc 483 AxioCamHRm 카메라가 장착된 Fluorescence Zeiss AxioImager M2 482 형광 현미경 (epifluorescence microscope)으로 12 개의 이미지 (10 x 배율)를 획득하고 Image Pro Plus software (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)로 분석하여 DAPI-양성 핵을 수를 정량화하였다. 증식 베타 세포의 상대적인 수를 정량화하고, 3 내지 5 회 반복/처리의 웰과 비교 하였다.

ALS의 마우스 모델

트랜스제닉 SOD1 G93A 마우스가 이 연구에서 ALS에 대한 트랜스제닉 마우스 모델로서 제공되었다. 다양한 인간 SOD1 돌연변이를 함유하는 트랜스제닉 마우스는 진행성 신경퇴행 및 운동 뉴런 (MN) 사멸을 발생시켜, 전임상 시험에 흔히 사용되어 왔고, FALS 병인의 이해에 크게 기여해 온 동물 모델을 제공한다 (Gurney et al., 1994). SOD1 마우스는 상염색체 우성 방식으로 전달되는 ALS-유사 임상 특징을 나타낸다. 이들 마우스에서 뒷다리의 약화와 떨리는 움직임은 8-10 주령에 초기 증상으로 나타난 후, 진행성 운동 마비 및 신경성 근위축증과 같은 주요 증상이 나타난다 (Shibata 2001). 이들 마우스는 이어서 보행 장애, 음식 장애를 나타내며 몇 주 내에, 보통 14-16 주령에 사망한다. 글리신93의 알라닌으로 돌연변이된 인간 SOD1을 보유하는 트랜스제닉 마우스는 원천적으로 The Jackson Laboratory (http://www.jax.org), Bar Harbor, ME에서 얻어졌다 (Strain B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur). 트랜스제닉 발현은 DNA 테일 시험 및 PCR에 의해 분석되었고, 특정 올리고뉴클레오타이드 및 이전에 이미 다른 이들에 의하여 이용된 조건을 사용하였다 (Jackson Lab 홈페이지 참조). 모든 실험에서 야생형 B6SJL-TgN (SOD1) 2Gur을 대조군으로 포함시켰다.

ALS 마우스에서의 실험 셋업

단일 투여 실험에서, 약 13 주령의 마우스가 이소플루오란 마취 하에 PBS 또는 C-CDNF (PBS에 희석된, 전장 CDNF 10 ㎍과 균등몰인 3.75 ㎍)을 뇌실 내 단일 주사로 받았다. 이어서, 마우스를 주 2 회 질병 및 체중 변화의 징후에 대해 평가하였다. 마우스에서의 운동 활성을 평가하도록 설계된 일련의 행동 테스트로 평가를 완료하였다; 상기에는 시험, 예컨대, 행동평가가 포함된다.

만성 주입 실험에서, 이소플루란 마취 하에 12 주령 SOD1 마우스의 우 측뇌실에 캐뉼라 (Alzet 삼투압 미니 펌프에 카테터 튜빙을 통하여 연결)를 삽입하였다. C-CDNF (1.5 μg/24 h)를 28 일 동안 주입하였다. 운동 거동은 행동평가로 평가되었다. 임상 징후 및 체중 변화에 대해 마우스를 평가하였다.

ALS 마우스의 임상 점수

SOD1 마우스의 임상 점수는 Jackson 실험실의 지침을 사용하여 이루어졌다. 마우스는 12 주령 이후 주 2 회 세심하게 검사되었다. 동물들은 꼬리의 기저부로 부드럽게 들어올려져 떨림, 강성 및 사지를 확장할 수 있는 능력이 있는지 관찰하여 점수를 매겼다. 임상 점수는 ALSTDI (ALS 요법 개발 연구소) 뒷다리 신경학적 점수 시스템에 기초하여, 1 내지 5 점 스케일이다.

행동평가

행동평가에서, 마우스는 회전 막대에 놓였다 (가속 속도 4-40 rpm/분),(Ugo Basile, Italy). 컷 오프 시간은 4 분이었다. 마우스가 12 주령된 후 주 2 회 행동평가 시험을 수행하였다.

대뇌 뇌졸중의 모델로서 중뇌 동맥의 원위 폐색

수컷 Sprague Dawley 래트 (중량 230-270 g, Envigo, Netherlands)를 실험 동물의 관리 및 이용에 관한 EU 지침 2010/63/EU의 3R 원칙, 지역 법률 및 규칙에 따라 수행되고, 핀란드 국립 동물 실험위원회 (National Animal Experiment Board of Finland)의 승인을 받은 실험에 사용하였다. 모든 실험은 맹검 방식으로 수행되었고, 래트는 여러 처리 그룹으로 무작위로 할당되었다. 래트를 클로랄 하이드레이트 (0.4 g/kg, i.p)로 마취시켰다. 대뇌 피질의 뇌졸중은 앞서 기술한 대로 60 분 동안 상호 총경동맥 (CCA) 폐색과 함께 원위 중뇌 동맥 (dMCA)을 폐색시켜 유발되었다 (Chen, et al., 1986). 간단히, 상호 CCA는 배쪽 중심선 경부 절개 (ventral midline cervical incision)를 통해 확인되고 분리되었다. 래트를 정위 장치에 두고 우측 반구에서 개두술을 수행하였다. 우측 (MCA)은 10-0 봉합사로 결찰되었고, 상호 총경동맥 (CCA)은 비-외상성 동맥 클램프로 60 분간 결찰되었다. 허혈 60 분 후, MCA 주위의 봉합사 및 CCA 상의 동맥 클립을 제거하여 재관류 손상을 도입하였다. 마취로부터 회복된 후, 래트를 주거 케이지로 돌려 보냈다. 수술 중 및 수술 후 체온은 37℃로 유지되었다.

피하 C-CDNF의 신경 보호 효과를 시험하기 위해, 50 μg의 C-CDNF를 100 μl s.c. 부피로 dMCA 폐색 전 30-50 분 및 재관류 직후에 제공하였다. 포스페이트-완충 염 용액 (PBS)을 비히클 대조군으로 사용 였다. dMCAo 2 일 후 래트를 안락사시켜 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC; Sigma Aldrich, MO, St. Louis, MO) 염색으로 경색 부피를 측정하였다. 래트를 희생시키고 뇌를 제거해 내어 아크릴 래트 뇌 블록을 사용하여 2.0-mm-두께의 절편으로 슬라이스하였다. 뇌 슬라이스를 2% TTC 용액 (Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 15 분 동안 실온에서 배양시킨 다음 고정을 위해 4% 파라포름알데히드 용액으로 옮겼다. 각 슬라이스의 경색 영역은 디지털 스캐너 및 ImageJ 소프트웨어로 측정되었다. 각 동물의 경색의 부피는 평균 슬라이스 두께 (2 mm)와 검사된 전측 (rostral) 뇌 절편에서의 경색 영역의 합을 곱한 값으로부터 얻어졌다. 통계 분석에는 스튜던트 t-검정이 사용되었다.

활성 C-CDNF 단편의 최소 길이 결정

N-말단 및/또는 C-말단 결실을 갖는 C-CDNF 펩타이드 (표 5 및 6 참조)를 맞춤형 펩타이드 합성 (Stawikowski and Fields, Curr Protoc Protein Sci .; 2002 년 2 월 CHAPTER : Unit-l 8.1.)으로 생산하였다. 전술한 바와 같은 바이오분석은 각각의 펩타이드로 수행되었다. 결과는 표 1-4 및 도 14-18에 나타나 있다.

표 1. 도 14 (A) 및 도 16 (B)의 데이터. 데이터는 NGF의 존재하에 성장시킨 뉴런과 비교한 생존 뉴런의 %이다.

표 2. PBS가 주입된 뉴런과 비교한 생존 뉴런의 배수 (fold) 변화 (표 1의 데이터를 PBS 값으로 나눔).

표 3. 도 15 (A) 및 도 17 (B)의 데이터. 데이터는 GDNF의 존재하에 성장시킨 뉴런과 비교한 생존 뉴런의 %이다.

표 4. 성장 인자없이 성장시킨 뉴런과 비교한 생존 뉴런의 배수 변화 (표 3의 데이터를 "인자 없음" 값으로 나눔).

표 5. CRAC 서열에서 S-S 브리지를 갖는 설계된 C-말단 CDNF 펩타이드.

표 6. 설계된 C-말단 CDNF 펩타이드 8-15. 펩타이드 9-11은 파괴된 (disrupted) CRAC 서열을 갖는다 (돌연변이된 아미노산은 굵게 표시됨). 펩타이드 12-14는 아미노산 치환을 함유한다 (돌연변이된 아미노산은 굵게 표시됨).

표 7. SEQ ID NO:1의 각각의 프로테아제의 예측된 절단 부위.

표 8. SEQ ID NO:2의 각각의 프로테아제의 예측된 절단 부위.

프로테아제 절단 부위 예측

C-말단 CDNF 단편 및 C-말단 MANF 단편의 프로테아제 절단 부위 예측은 PROSPER 소프트웨어를 사용하여,

https://prosper.erc.monash.edu.au/home.html에서 수행되었다. 예측된 프로테아제 절단 부위는 표 7과 8과 도 20과 21에 나타나 있다.

프로테아제 내성 C-말단 CDNF 단편 및/또는 C-말단 MANF 단편을 설계하기 위한 프로테아제 시험관내 분석

C-말단 CDNF 단편 및/또는 C-말단 MANF 단편의, 단편 라이브러리는, 프로테아제 절단 데이터베이스의 정보를 기반으로, 예를 들어 https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml의 MEROPS 데이터베이스를 사용하고, 천연 아미노산 중 하나 이상을 치환하여, 예를 들어 위치 P4-P3-P2-P1-P1' 또는 P2-P1-P1'에서, 천연 아미노산 중 하나 이상을 보다 덜 사용되거나, 프로테아제를 억제하는 것으로 알려지거나 또는 변형된 아미노산으로 치환하여 설계될 수 있다. 단편 라이브러리는 예를 들어 96-웰 또는 384-웰 포맷으로 합성될 수 있다. 프로테아제 분석을 위한 단편은 예를 들어 4-14 개의 아미노산 (프로테아제 및 분석 포맷에 따라 다름)으로 구성될 수 있으며, 여기서 C-말단 아미노산은 형광 염료, 예를 들어 7-아미노-4-메틸쿠마린 또는 아미노-4-트리플루오로메틸 (AMC 또는 AFC)에 연결된다. 단편의 디자인은: P1'-P2'-P3'-P4'-P5'-P6'-AMC, P1'-P2'-P3'-P4'-P5'-AMC, P1'-P2'-P3'-P4'-AMC, P1'-P2'-P3'-AMC, P1'-P2'-AMC, 또는 P1'-AMC와 조합된, P6-P5-P4-P3-P2-P1, P5-P4-P3-P2-P1-, P4-P3-P2-P1, P3-P2-P1-, 또는 P2-P1- 일 수 있고, 여기서 아미노산 잔기는 절단 부위로부터 바깥쪽으로 연속적으로 번호가 매겨지고, 시즐 결합 (scissile bond)은 Pl 및 P1' 위치 사이에 위치한다. 재조합 인간 MMP-2, MMP-3, MMP-9 및 엘라스타제-2 단백질은, 예를 들어, R & D Systems에서 구입한다. 프로테아제를 시험하고 활성화시키기 위해 제조업체의 지침을 따른다. 합성된 단편은 적절한 농도로 적절한 완충액에 용해된다. 프로테아제 반응은 프로테아제 특이적 완충액에 상기 단편과 프로테아제를 함유하는 반응 혼합물 내에서 수행된다. 반응은 +37℃에서 수행되고 반응 혼합물의 앨리쿼트는 여러 시점에서 취해져 프로테아제 절단 활성을 결정한다. 단편은, 예를 들어, MALDI-MS 또는 HPLC로 분석되고, 프로테아제 절단 속도가 측정된다.

대안의 시험관내 프로테아제 분석에서, 상기 단편은 N- 또는 C- 말단에서 고체 지지체에 부착될 수 있고, 임의로 발색성 태그로 표지될 수 있고, 재조합 프로테아제에 노출될 수 있고, 상기와 같이 분석된 결과 단편일 수 있다.

참고문헌

인용된 특허 문헌:

EP58481

EP1969003

US3773919

WO2007068803

WO2009133247

WO2013034805

WO2014191630

WO2016057579

SEQUENCE LISTING <110> Helsingin yliopisto <120> C-terminal CDNF and MANF fragments, pharmaceutical compositions comprising same and uses thereof <130> HY18APCT <150> FI20185304 <151> 2018-03-29 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ala Met Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Asp Ser Gln 1 5 10 15 Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp 20 25 30 Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp 35 40 45 Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu 50 55 60 Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu 65 70 75 80 Leu <210> 2 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 1 5 10 15 Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg 20 25 30 Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys 35 40 45 Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 50 55 60 Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 65 70 75 <210> 3 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Met Pro Ala Met Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Asp Ser Gln 1 5 10 15 Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp 20 25 30 Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp 35 40 45 Gly Glu Glu Cys Xaa Xaa Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu 50 55 60 Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu 65 70 75 80 Leu <210> 4 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 5 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 6 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6 Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val 1 5 10 15 Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp 20 25 30 Trp Gly Glu Thr Cys Xaa Xaa Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg 35 40 45 Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala 50 55 60 Arg Thr Asp Leu 65 <210> 7 <211> 161 <212> PRT <213> Homno sapiens <400> 7 Gln Glu Ala Gly Gly Arg Pro Gly Ala Asp Cys Glu Val Cys Lys Glu 1 5 10 15 Phe Leu Asn Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Ile Asp Arg Gly Val Asn Phe 20 25 30 Ser Leu Asp Thr Ile Glu Lys Glu Leu Ile Ser Phe Cys Leu Asp Thr 35 40 45 Lys Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Leu Gly Ala Thr Lys Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Lys Ile Leu Ser Glu Val Thr Arg Pro Met Ser Val His 65 70 75 80 Met Pro Ala Met Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Asp Ser Gln 85 90 95 Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp 100 105 110 Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp 115 120 125 Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu 130 135 140 Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu 145 150 155 160 Leu <210> 8 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Glu Ala Gly Gly Arg Pro Gly Ala Asp Cys Glu Val Cys Lys Glu 1 5 10 15 Phe Leu Asn Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Ile Asp Arg Gly Val Asn Phe 20 25 30 Ser Leu Asp Thr Ile Glu Lys Glu Leu Ile Ser Phe Cys Leu Asp Thr 35 40 45 Lys Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Leu Gly Ala Thr Lys Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Lys Ile Leu Ser Glu Val Thr Arg Pro Met Ser Val His 65 70 75 80 Met Pro Ala Met Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Asp Ser Gln 85 90 95 Ile Cys Glu Leu 100 <210> 9 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile 20 25 30 Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg 100 105 110 Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys 115 120 125 Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 130 135 140 Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 145 150 155 <210> 10 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile 20 25 30 Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu 85 90 95 <210> 11 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu Leu 50 55 <210> 12 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala 50 <210> 13 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 14 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His 1 5 10 15 Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val 20 25 30 Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys 35 40 45 Thr Glu Leu 50 <210> 15 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His 1 5 10 15 Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val 20 25 30 Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr Ala 35 40 <210> 16 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 35 40 45 Ala Pro 50 <210> 17 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 1 5 10 15 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 20 25 30 Ala Pro Lys Tyr Ala 35 <210> 18 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-CDNF peptide with single amino acid substitution <400> 18 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Ser Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 19 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-CDNF peptide with single amino acid substitution <400> 19 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 20 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated C-CDNF peptide <400> 20 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Arg Ala 20 25 30 Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro 35 40 45 Lys Tyr Ala 50 <210> 21 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated C-CDNF peptide <400> 21 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Pro Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 22 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated C-CDNF peptide <400> 22 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Pro Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 23 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated C-CDNF peptide <400> 23 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Pro Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Pro Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 24 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu

Claims

의약으로서 사용하기 위한,
SEQ ID NO:1:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAPKYAATHPKTE L
로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 CDNF 단편으로서,
상기 단편은 세포막 침투성 펩타이드이고 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 갖는 단편.
제1항에 있어서, 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 용도의 단편.
제2항에 있어서, 상기 퇴행성 질환은 신경퇴행성 질환인 것인 용도의 단편.
제3항에 있어서, 상기 퇴행성 질환은: 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 변성, 루이소체 치매, 경도 인지 장애, 헌팅턴 병, 외상성 뇌 손상, 약물 중독 및 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추 신경계 (CNS) 질환인 것인 용도의 단편.
제4항에 있어서, 상기 CNS 질환은 파킨슨 병인 것인 용도의 단편.
제2항에 있어서, I 형 또는 II 형 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 용도의 단편.
제3항에 있어서, 근위축성 측삭 경화증의 치료에 사용하기 위한 용도의 단편.
제2항에 있어서, 망막 색소 변성증과 같은 망막 장애의 치료에 사용하기 위한 용도의 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 정맥 내 투여, 복강 내, 피하, 척수강 내, 뇌실 내, 비강 내, 경피, 뇌 내, 근육 내, 안 내, 또는 동맥 내 투여에 의하여 투여되거나 또는 상기 단편은 바이러스 발현 벡터를 통해 투여되는 것인 용도의 단편.
제9항에 있어서, 상기 정맥 내 투여는 말초 투여인 것인 용도의 단편.
이전 항들 중 어느 하나의 항에 있어서,
좋기로는 최대 33-81 개 아미노산 길이를 갖고,
상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 용도의 단편.
제11항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70 또는 31-70의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70 또는 31-70의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 것이고,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 용도의 단편.
제11항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 25-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 25-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 것이고,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 용도의 단편.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 31-73 (펩타이드 6; SEQ ID NO: 15), 25-73 (펩타이드 4; SEQ ID NO: 13), 21-73 (펩타이드 3; SEQ ID NO: 12), 21-70 (펩타이드 7; SEQ ID NO: 16), 31-81 (펩타이드 5; SEQ ID NO: 14), 25-81 (펩타이드 2; SEQ ID NO: 11), 25-57 (펩타이드 15, SEQ ID NO:24), 또는 37-73 (펩타이드 8, SEQ ID NO:17)의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73, 25-73, 21-73, 21-70, 31-81, 25-81, 25-57, 또는 37-73의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 용도의 단편.
제14항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 31-73 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 용도의 단편.
이전 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 최대 43-81 개, 좋기로는 43-61 개 아미노산을 갖는 것인 용도의 단편.
이전 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편의 말단은 상기 단편을 효소적 분해로부터 보호하는 추가적인 변형을 포함하는 것인 용도의 단편.
이전 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 C-말단 CDNF 단편은 SEQ ID NO:1:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
로 제시되는 바와 같은 서열, 또는 SEQ ID NO:1의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 것인 용도의 단편.
제18항에 있어서, SEQ ID NO:1의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 상기 서열은 SEQ ID NO:의 위치 52-55의 서열 CXXC를 포함하는 것인 용도의 단편.
제19항에 있어서, SEQ ID NO:1의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 상기 서열은 SEQ ID NO:3:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE EC XX CAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
의 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 X는 임의의 아미노산인 것인 용도의 단편.
제19항에 있어서, SEQ ID NO:1의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 상기 서열은, SEQ ID NO:1의 위치 52-55의 서열 CKGC를 포함하는 것인 용도의 단편.
제17항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 81의 C-말단 아미노산 L을 포함하는 것인 용도의 단편.
제17항, 제18항 또는 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1의 위치 78-81에 해당하는 ER 보유 신호 KTEL을 결여하는 것인 용도의 단편.
제17항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은, 추가적인 변형으로서 C-말단의 아미드화 및 N-말단의 아세틸화를 포함하는 것인 용도의 단편.
전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티에 더 결합되는 것인 용도의 단편.
전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 세포-침투성 펩타이드이고 인간 혈액-뇌 장벽에 침투할 수 있는 것인 용도의 단편.
전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 프로테아제 절단에 내성인 것인 용도의 단편.
제27항에 있어서, 상기 단편은 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함하고, 그로써 상기 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위를 없애는 것인 용도의 단편.
제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 및 세린 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도의 단편.
제27항 내지 제29항에 있어서, 상기 시스테인 프로테아제는 카텝신 K인 것인 용도의 단편.
제27항 내지 제29항에 있어서, 상기 메탈로프로테아제는 MMP-9인 것인 용도의 단편.
제27항 내지 제29항에 있어서, 상기 메탈로프로테아제는 MMP-3인 것인 용도의 단편.
제27항 내지 제29항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 키모트립신 A 또는 엘라스타제-2인 것인 용도의 단편.
제27항 내지 제33항에 있어서, SEQ ID NO:1의 잔기 1-8, 16-23, 26-33, 32-39, 37-44, 38-45, 43-50, 46-53, 57-64, 59-66, 60-67 또는 68-75에 대응하는 영역 내 임의의 한 아미노산이 치환, 결실 또는 변형된 것인 용도의 단편.
제27항 내지 제34항에 있어서, SEQ ID NO:1의 46, 49, 35, 63, 4, 71, 19, 40, 41, 62, 또는 29에 대응하는 위치의 임의의 아미노산이 치환 또는 변형된 것인 용도의 단편.
제1항 및 제11항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 기재된 C-말단 CDNF 단편, 및
생리학적으로 허용 가능한 캐리어, 완충제, 부형제, 보존제 및 안정화제 중 하나 이상
을 포함하는 약학적 조성물.
제36항에 있어서, 정맥 내 투여, 좋기로는 말초 투여, 복강 내, 피하, 척수강 내, 뇌실 내, 비강 내, 경피, 뇌 내, 근육 내, 안 내 또는 동맥 내 투여를 위한 것이거나, 또는 상기 조성물은 바이러스 발현 벡터를 통하여 투여되는 것인 약학적 조성물.
제36항 또는 제37항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
제38항에 있어서, 퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것인 용도의 약학적 조성물.
제39항에 있어서, 상기 퇴행성 질환 또는 장애는: 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 변성, 루이소체 치매, 경도 인지 장애, 헌팅턴 병, 외상성 뇌 손상, 약물 중독 및 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추 신경계 (CNS) 질환인 것인 용도의 약학적 조성물.
제40항에 있어서, 상기 CNS 질환은 파킨슨 병인 것인 용도의 약학적 조성물.
제40항에 있어서, 상기 CNS 질환은 근위축성 측삭 경화증인 것인 용도의 약학적 조성물.
제40항에 있어서, I 형 또는 II 형 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
제40항에 있어서, 망막 색소 변성증과 같은 망막 장애의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
SEQ ID NO:1:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 CDNF 단편으로서,
상기 단편은 세포막 침투성 펩타이드이고 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 갖는 단편.
제45항에 있어서, 최대 57, 53, 51, 50, 49, 43, 37 또는 33 개 아미노산 길이를 갖고, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 31-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:의 위치 31-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 단편.
제46항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70 또는 31-70의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:의 위치 37-70, 36-70, 35-70, 34-70, 33-70, 32-70 또는 31-70의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 것인 단편.
제46항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1으로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 25-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:의 위치 25-57, 25-58, 25-59, 25-60, 25-61, 25-62, 25-63, 25-64, 25-65, 25-66, 25-67, 25-68, 25-69 또는 25-70의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:1의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 단편.
제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1로 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 31-73 (펩타이드 6; SEQ ID NO: 15), 25-73 (펩타이드 4; SEQ ID NO: 13), 21-73 (펩타이드 3; SEQ ID NO: 12), 21-70 (펩타이드 7; SEQ ID NO: 16), 31-81 (펩타이드 5; SEQ ID NO: 14), 25-81 (펩타이드 2; SEQ ID NO: 11), 25-57 (펩타이드 15, SEQ ID NO:24), 또는 37-73 (펩타이드 8, SEQ ID NO:17)의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73, 25-73, 21-73, 21-70, 31-81, 25-81, 25-57, 또는 37-73의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 것인 단편.
제49항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:1로 제시되는 바와 같은 서열의 적어도 위치 31-73의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 것인 단편.
제45항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 최대 57, 53, 51, 50, 49, 43, 37 또는 33 개 아미노산 길이를 갖는 것인 단편.
좋기로는 36-78 개 아미노산 길이를 갖고,
SEQ ID NO:2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 33-68 또는 19-52의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:2의 위치 33-68 또는 19-52의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 MANF 단편으로서,
상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:2의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖고,
상기 단편은 세포막 침투성 펩타이드이고 뉴런 세포에 대한 보호 효과를 갖는 단편.
제52항에 있어서, 36-59 개 아미노산 길이를 갖는 것인 단편.
제52항 또는 제53항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 것인 단편.
제54항에 있어서,
퇴행성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것이고,
상기 단편은 좋기로는 정맥 내, 더욱 좋기로는 말초 투여, 복강 내, 피하, 비강 내, 경피, 근육 내, 안 내 또는 동맥 내 투여에 의하여 투여되는 단편.
제55항에 있어서,
SEQ ID NO:2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
로 제시되는 바와 같은 서열, 또는 SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 것인 용도의 C-말단 MANF 단편.
제56항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:5:
KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
의 서열 또는 SEQ ID NO:5의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 것인 용도의 단편.
제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:2의 위치 78의 C-말단 아미노산 L을 포함하는 것인 용도의 단편.
제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:2의 위치 75-78에 해당하는 ER 보유 신호 RTDL을 결여하는 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 효소적 분해로부터 상기 단편을 보호하는 추가적인 변형, 좋기로는 C-말단의 아미드화 및 N-말단의 아세틸화로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가적인 변형을 포함하는 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 프로테아제 절단에 내성인 것인 용도의 단편.
제61항에 있어서, 상기 단편은 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함하고, 그로써 상기 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위를 없애는 것인 용도의 단편.
제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 프로테아제는 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도의 단편.
제63항에 있어서, 상기 메탈로프로테아제는 MMP-9 또는 MMP-2인 것인 용도의 단편.
제63항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 키모트립신 A 또는 엘라스타제-2인 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제65항에 있어서, SEQ ID NO:2의 잔기 11-18, 18-25, 21-28, 24-31, 33-40, 52-59, 54-61, 59-66, 또는 63-70에 대응하는 영역 내 임의의 한 아미노산이 치환, 결실 또는 변형되는 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제66항에 있어서, SEQ ID NO:2의 62, 27, 14, 66, 36, 21, 55, 57, 또는 24에 대응하는 위치의 아미노산이 치환되거나 변형된 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제67항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티에 더 결합되는 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 세포-침투성 펩타이드이고 인간 혈액-뇌 장벽을 침투할 수 있는 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제69항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 퇴행성 질환은: 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 변성, 루이소체 치매, 경도 인지 장애, 헌팅턴 병, 외상성 뇌 손상, 약물 중독 및 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추 신경계 (CNS) 질환인 것인 용도의 단편.
제52항 내지 제69항 중 어느 하나의 항에 기재된 C-말단 MANF 단편, 및
생리학적으로 허용 가능한 캐리어, 완충제, 부형제, 보존제 및 안정화제 중 하나 이상
을 포함하는, 중추 신경계 (CNS) 질환의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
상기 단편은 정맥 내, 좋기로는 말초 투여, 복강 내, 피하, 비강 내, 경피, 근육 내, 안 내 또는 동맥 내 투여에 의하여 투여되는 약학적 조성물.
제1 형 또는 제2 형 당뇨병 또는 망막 질환의 치료에 사용하기 위한,
좋기로는 36-78 개 아미노산 길이를 갖는,
SEQ ID NO:2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 33-68 또는 19-52의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:2의 위치 33-68 또는 19-52의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 MANF 단편으로서,
상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:2의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖고,
상기 단편은 세포막 침투성 펩타이드인 C-말단 MANF 단편.
제72항에 있어서, 36-59 개 아미노산 길이를 갖는 용도의 단편.
제73항에 있어서,
SEQ ID NO:2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
로 제시되는 바와 같은 서열, 또는 SEQ ID NO:2의 서열과 90% 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열 중 50 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 것인 용도의 단편.
제74항에 있어서, 상기 단편은 SEQ ID NO:5:
KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
의 서열 또는 SEQ ID NO:5의 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 것인 용도의 단편.
제72항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 효소적 분해로부터 상기 단편을 보호하는 추가적인 변형, 좋기로는 C-말단의 아미드화 및 N-말단의 아세틸화로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가적인 변형을 포함하는 것인 용도의 단편.
제76항에 있어서, 상기 단편은 프로테아제 절단에 내성인 것인 용도의 단편.
제77항에 있어서, 상기 단편은 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함하고, 그로써 상기 연장, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 적어도 하나의 프로테아제 절단 부위를 없애는 것인 용도의 단편.
제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 프로테아제는 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도의 단편.
제79항에 있어서, 상기 메탈로프로테아제는 MMP-9 또는 MMP-2인 것인 용도의 단편.
제79항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 키모트립신 A 또는 엘라스타제-2인 것인 용도의 단편.
제72항 내지 제81항에 있어서, SEQ ID NO:2의 잔기 11-18, 18-25, 21-28, 24-31, 33-40, 52-59, 54-61, 59-66, 또는 63-70에 대응하는 영역 내 임의의 한 아미노산이 치환, 결실 또는 변형되는 것인 용도의 단편.
제72항 내지 제82항에 있어서, SEQ ID NO:2의 62, 27, 14, 66, 36, 21, 55, 57, 또는 24에 대응하는 위치의 아미노산이 치환되거나 변형된 것인 용도의 단편.
제72항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단편은 세포-침투성 펩타이드이고 인간 혈액-뇌 장벽을 침투할 수 있는 것인 용도의 단편.
제72항 또는 제84항에 기재된 C-말단 MANF 단편, 및
생리학적으로 허용 가능한 캐리어, 완충제, 부형제, 보존제 및 안정화제 중 하나 이상
을 포함하는, 제1 형 또는 제2 형 당뇨병 또는 망막 질환의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
제85항에 있어서, 말초 투여용인 것인 용도의 약학적 조성물.
제86항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 내, 복강 내, 피하, 척수강 내, 뇌실 내, 비강 내, 경피, 뇌 내, 근육 내, 안 내, 또는 동맥 내 투여에 의하여 투여되거나 또는 상기 단편은 바이러스 발현 벡터를 통하여 투여되는 것인 용도의 약학적 조성물.
SEQ ID NO:1로 제시되는 바와 같은 서열의 위치 31-73 (펩타이드 6), 25-73 (펩타이드 4), 21-73 (펩타이드 3), 21-70 (펩타이드 7), 31-81 (펩타이드 5), 25-81 (펩타이드 2), 25-57 (펩타이드 15), 또는 37-73 (펩타이드 8)의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 31-73, 25-73, 21-73, 21-70, 31-81, 25-81, 25-57, 또는 37-73의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 C-말단 CDNF 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
제88항에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 발현 벡터.
제89항에 기재된 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
SEQ ID NO:1:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAPKYAATHPKTE L
로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 38-70 또는 25-57의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:1의 위치 38-70 또는 25-57의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 CDNF 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
좋기로는 36-78 개 아미노산 길이를 갖고,
SEQ ID NO:2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
로 제시되는 바와 같은 서열의 최소한 위치 33-68 또는 19-52의 연속적인 아미노산 잔기, 또는 SEQ ID NO:2의 위치 38-70 또는 19-52의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 C-말단 MANF 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 퇴행성 질환, 제1 형 또는 제2 형 당뇨병 또는 망막 질환을 치료하는 방법으로서,
존재한다면, 상기 연속적인 아미노산 잔기 측면의 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:2의 대응하는 위치의 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것인 방법.