CN107921085B - 用于治疗衰老相关病症的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供了治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方法。该方法的多个方面包括以足以治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方式增强哺乳动物的TIMP活性，例如TIMP2活性。还提供了用于实施本发明的方法的组合物。可以通过实施所述方法来治疗多种衰老相关病症，所述病症包括认知损伤。

Description

用于治疗衰老相关病症的方法和组合物

政府权益

本发明在政府的支持下按照由国家卫生研究院授予的AG045034合同进行。政府拥有本发明的某些权益。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.第119(e)条，本申请要求享有于2015年6月15日提交的第62/175,981号美国临时专利申请的申请日的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。

引言

有机体的衰老伴随着随时间推移的变化的积累。在神经系统中，衰老伴随着导致健康个体中认知衰退和易感退行性疾病的结构和神经生理学变化。(Heeden&Gabrieli,"Insights into the ageing mind:a view from cognitive neuroscience,"Nat.Rev.Neurosci.(2004)5:87-96；Razet al.,"Neuroanatomical correlates ofcognitive aging:evidence from structural magnetic resonance imaging,"Neuropsychology(1998)12:95-114；Mattson&Magnus,"Ageing and neuronalvulnerability,"Nat.Rev.Neurosci.(2006)7:278-294；和Rapp&Heindel,"Memorysystems in normal and pathological aging,"Curr.Opin.Neurol.(1994)7:294-298)。包括在这些变化中的是突触损失和由其导致的神经元功能丧失。因此，虽然在自然衰老过程中通常不会观察到明显的神经元死亡，但是衰老的脑中的神经元容易受到结构、突触完整性以及在突触处的分子加工的亚致死年龄相关改变的影响，所有这些都损害认知功能。

除了在自然衰老期间的正常突触损失之外，突触损失是许多神经退行性病症中常见的早期病理学事件，并且与这些病症相关的神经元损伤和认知损伤的相关性最好。事实上，衰老仍然是与诸如阿尔茨海默氏病(AD)的痴呆相关的神经退行性疾病的一个最主要的风险因素(Bishop et al.,"Neural mechanisms of ageing and cognitive decline,"Nature(2010)464:529-535(2010)；Heeden&Gabrieli,"Insights into the ageing mind:a view from cognitive neuroscience,"Nat.Rev.Neurosci.(2004)5:87-96；Mattson&Magnus,"Ageing and neuronal vulnerability,"Nat.Rev.Neurosci.(2006)7:278-294)。

随着人类寿命的增加，更多的人类患有衰老相关的认知损伤，这使得阐明通过拮抗或甚至消除衰老的影响来维持认知完整性的手段是至关重要的(Hebert et al.,"Alzheimer disease in the US population:prevalence estimates using the2000census,"Arch.Neurol.(2003)60:1119-1122；Bishop et al.,"Neural mechanismsof ageing and cognitive decline,"Nature(2010)464:529-535)。

金属蛋白酶2组织抑制剂(TIMP-2)是基质金属蛋白酶的一组特异性抑制剂中的一员。这些蛋白的抑制剂调节基质金属蛋白酶(MMP)，在包括生长、伤口愈合、组织修复以及细胞发育和体内平衡在内的多种生理过程中发挥作用。MMP的广义类别包括胶原酶、明胶酶、间质溶解素、基质溶解因子、膜型MMP(MT-MMP)等。因为对MMP活性失去控制可能会导致关节炎、癌症、动脉粥样硬化、动脉瘤、肾炎、组织溃疡、纤维化和其他组织损伤，所以这些酶必须被精确地调节(Visse and Nagase,“Matrix Metalloproteinases and TissueInhibitors of Metalloproteinases,”Circulation Research(2003)92:827-39)。已经在脊椎动物中鉴定出4种TIMP(1-4)。

发明内容

提供了用于治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方法。该方法的多个方面包括以足以治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方式增强哺乳动物的TIMP活性，例如TIMP2活性。还提供给了用于实施本发明的方法的组合物。可以通过实施所述方法来治疗多种衰老相关病症，所述病症包括认知损伤。

附图说明

图1A示出了分离自老年野生型小鼠的脑切片的结果，所述老年野生型小鼠用重组TIMP2(腹腔注射，50μg/kg)(下)或对照(上)处理。图1B提供了图1A示出的PSA的维持期的量化。

图2示出了抗TIMP2抗体治疗在对象识别方面的结果。

具体实施方式

提供了用于治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方法。所述方法的多个方面包括以足以治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方式增强哺乳动物的TIMP活性，例如TIMP2活性。还提供了用于实施本发明的方法的组合物。可以通过实施所述方法来治疗多种衰老相关病症，所述病症包括认知损伤。

在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体方法或组合物，因为所述方法和组合物无疑是可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中两个限值中的一个、零个或两个被包括在较小范围内的每个范围也包括在本发明中，属于该规定范围中任何特别排除的限值。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除这些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试中，但是本发明现描述一些潜在的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，如果存在矛盾之处，本发明将取代所引用的出版物的任何公开内容。

在阅读本公开后，对于本领域技术人员而言将显而易见的是，本文描述和示出的各个实施方案中的每一个都具有分离的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与其他几个实施方案中任何一个的特征分离或与其他几个实施方案中任何一个的特征组合，而不背离本发明的范围或精神。可以按照所描述的事件的顺序或以逻辑上可行的任何其他顺序来实施任何所描述的方法。

应注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个提及物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，提及“肽”包括提及一个或更多个肽及其等价物，例如本领域技术人员已知的多肽等。

提供本文所讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于先前发明而无权早于这类出版物。此外，提供的公开日期可以不同于实际公开日期，可能需要独立确认实际公开日期。

方法

如上所述，本发明的多个方面包括治疗成年哺乳动物中衰老相关病症的方法。衰老相关病症可以以许多不同的方式呈现，例如，呈现为衰老相关的认知损伤和/或生理损伤，例如形式为对身体的中枢器官或外周器官的损伤，例如但不限于：细胞损伤、组织损伤、器官功能障碍、衰老相关的寿命缩短和癌变，其中感兴趣的特定器官和组织包括但不限于：皮肤、神经元、肌肉、胰腺、脑、肾、肺、胃、肠、脾、心脏、脂肪组织、睾丸、卵巢、子宫、肝和骨；形式为神经可塑性降低等。

在一些实施方案中，衰老相关病症是在个体认知能力方面的衰老相关的损伤，即衰老相关的认知损伤。认知能力或“认知”是指心理过程，其包括注意力和集中力、学习复杂任务和概念、记忆(短期和/或长期获取、保留和找回新信息)、信息处理(处理由五官感觉收集的信息)、视觉空间功能(视觉感知、深度感知、使用心理意象、复制图像、构建对象或形状)、产生和理解语言、言语流畅(词汇找取)、解决问题、作出决定和执行职能(规划和优先排序)。“认知衰退”是指这些能力中的一种或更多种进行性衰退，例如记忆、语言、思维、判断力等方面的衰退。“认知能力受损”和“认知损伤”是指相对于健康个体(例如，年龄匹配的健康个体)或相对于个体在较早时间点(例如，2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、5年，或10年或更早之前)的能力的认知能力的降低。衰老相关的认知损伤包括通常与衰老相关的认知能力的损伤，包括例如与自然衰老过程相关的认知损伤如轻度认知损伤(M.C.I.)；以及与衰老相关疾病相关的认知损伤，即被认为随着衰老的进行而频率增加的疾病，例如神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、肌肉萎缩症、血管性痴呆等。

“治疗”是指实现至少改善与成年哺乳动物患有的衰老相关病症有关的一种或更多种症状，其中使用的改善在广义上是指至少减小参数的大小，所述症状例如与正在治疗的损伤相关的症状。因此，治疗还包括其中病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制(例如，阻止其发生)或停止(例如终止)使得成年哺乳动物不再遭受该损伤或至少表征该损伤的症状的折磨的情况。在一些情况下，“治疗”、“进行治疗”以及类似的词是指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的，并且/或者，该效果在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用方面可以是治疗性的。“治疗”可以是对哺乳动物疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的个体中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即导致疾病消退。治疗可以导致各种不同的身体表现，例如基因表达的调节、突触效能增加、神经发生增加、组织或器官的恢复等。在一些实施方案中出现了对正在发作的疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减轻患者的不期望的临床症状。可以在受影响的组织功能完全丧失之前实施这种治疗。可以在疾病的症状阶段之前或者在疾病的症状阶段期间施用该治疗，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用该治疗。

在其中衰老相关病症是与衰老相关的认知衰退的某些情况下，通过本发明的方法进行的治疗会减慢或减少衰老相关的认知衰退的进展。换言之，与用所公开的方法进行治疗之前或没有用所公开的方法进行治疗相比，在用所公开的方法进行治疗之后(如果有的话)，个体的认知能力衰退更缓慢。在一些情况下，通过本发明的方法进行的治疗稳定个体的认知能力。例如，在通过所公开的方法进行治疗之后，在患有衰老相关的认知衰退的个体中，认知衰退的进展停止。另一个实例是，在通过所公开的方法进行治疗后，预防了预计会患有衰老相关的认知衰退的个体(例如40岁或更老的个体)中的认知衰退。换言之，没有观察到(进一步的)认知损伤。在一些情况下，通过本公开的方法进行的治疗减轻或逆转认知损伤，例如通过提高患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力所观察到的。换言之，在通过所公开的方法进行治疗后，患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力比通过所公开的方法进行治疗之前要好，即认知能力在治疗后得到了改善。在一些情况下，通过本公开的方法进行的治疗消除了认知损伤。换言之，例如，如通过改善患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力而证实的，通过所公开的方法进行治疗之后，患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力得到恢复，例如，恢复至该个体在约40岁或小于40岁时的认知能力水平。

在一些情况下，根据该方法治疗成年哺乳动物导致中枢器官(例如中枢神经系统器官，如脑、脊髓等)发生变化，其中所述变化可以以多种不同的方式呈现，例如，如下文所更详细地描述的，变化包括但不限于分子、结构和/或功能变化，例如形式为增强的突触可塑性。在一些情况下，根据该方法治疗受试者会导致外周器官(例如肝脏，肌肉，心脏，血液等)的变化，其中所述变化可以以多种不同方式呈现，例如，如下文所更详细地描述的。

如上所述，本文描述的方法是治疗成年哺乳动物的衰老相关病症(例如，如上所述的疾病)的方法。成年哺乳动物是指已经达到成熟的哺乳动物，即完全发育的哺乳动物。因此，成年哺乳动物不是幼年动物。可以用本发明的方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物；马类；牛科动物；绵羊等；以及灵长类动物，包括人类。本发明的方法、组合物和试剂也可以应用于动物模型，包括例如在实验研究中的小哺乳动物，例如鼠科动物、兔类等。下面的讨论将重点关注本发明的方法、组合物、试剂、装置和试剂盒对人类的应用，但是本领域普通技术人员将会理解，可以基于现有技术将这样的描述容易地修改为其他感兴趣的哺乳动物。

成年哺乳动物的年龄可能会有所不同，具体取决于正在治疗的哺乳动物的类型。如果成年哺乳动物是人类，则人类的年龄通常为18岁或更老。在一些情况下，成年哺乳动物是患有或有风险患上衰老相关的损伤(例如衰老相关的认知损伤)的个体，其中成年哺乳动物可以是已经被确定(例如以接受诊断的形式)为患有或有风险患上衰老相关的损伤(如衰老相关的认知损伤)的哺乳动物。短语“患有或有风险患上衰老相关的认知损伤的个体”是指约50岁或更老的个体，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老，以及有时候不超过100岁，如90岁，即年龄在约50岁至100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85或约90岁。个体可以患有衰老相关病症，例如与自然衰老过程相关的认知损伤，例如M.C.I。可选择地，个体可以是50岁或更老，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、90岁或更老，有时不超过100岁，即年龄在约50岁和100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100岁，并且个体尚未开始表现出衰老相关病症的症状，例如，认知损伤。在其他实施方案中，个体可以是因为衰老相关的疾病(例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、青光眼、肌肉萎缩症、痴呆等)而患有认知损伤的任何年龄的个体。在某些情况下，个体是已经被诊断患有衰老相关疾病(该疾病通常伴有认知损伤)的任何年龄的个体，所述衰老相关疾病例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、多发性硬化症、多系统萎缩、青光眼、共济失调、肌肉萎缩症、痴呆等，其中个体尚未开始表现出认知损伤的症状。

如上所概述的，该方法的多个方面包括以足以治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方式增强哺乳动物的TIMP活性，例如全身性TIMP活性。增强TIMP活性是指增加受试者的一种或更多种靶TIMP活性。在一些情况下，增强的TIMP活性是全身性TIMP活性，全身性TIMP活性是指哺乳动物循环系统中的TIMP活性。增加的幅度可以变化，其中在一些情况下，增加幅度是2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大，例如15倍或更大、20倍或更大、25倍或更大(与合适的对照相比)。通过实施该方法增加的TIMP活性是TIMP介导的过程，该过程有利于治疗衰老相关病症。换言之，增强的TIMP活性是导致如上所述的对受试者中衰老相关病症的治疗的活性。

增强的靶TIMP活性可以不同。在一些情况下，靶TIMP活性是TIMP2活性，即由TIMP2蛋白表现出的活性。因此，TIMP2活性是指感兴趣的TIMP2蛋白活性，即导致治疗例如如上所述的衰老相关病症的活性。感兴趣的是哺乳动物TIMP2蛋白，例如但不限于：灵长类动物(例如人类)、犬科动物、猫科动物、马类、牛科动物、绵羊、鼠科动物、兔类等。人TIMP2的序列为：

在一些情况下，靶TIMP活性是TIMP1活性，即由TIMP1蛋白表现出的活性。因此，TIMP1活性是指感兴趣的TIMP1蛋白活性，即导致治疗例如如上所述的衰老相关病症的活性。感兴趣的是哺乳动物TIMP1蛋白，例如但不限于：灵长类动物(例如人类)、犬科动物、猫科动物、马类、牛科动物、绵羊、鼠科动物、兔类等。人TIMP1的序列为：

在一些情况下，靶TIMP活性是TIMP3活性，即由TIMP3蛋白表现出的活性。因此，TIMP3活性是指感兴趣的TIMP3蛋白活性，即导致治疗例如如上所述的衰老相关病症的活性。感兴趣的是哺乳动物TIMP3蛋白，例如但不限于：灵长类动物(例如人类)、犬科动物、猫科动物、马类、牛科动物、绵羊、鼠科动物、兔类等。人TIMP3的序列为：

在一些情况下，靶TIMP活性是TIMP4活性，即由TIMP4蛋白表现出的活性。因此，TIMP4活性是指感兴趣的TIMP4蛋白活性，即导致治疗例如如上所述的衰老相关病症的活性。感兴趣的是哺乳动物TIMP4蛋白，例如但不限于：灵长类动物(例如人类)、犬科动物、猫科动物、马类、牛科动物、绵羊、鼠科动物、兔类等。人TIMP4的序列为：

可以使用任何便利的方案来增强靶TIMP活性或感兴趣的活性。在一些情况下，通过增加哺乳动物的TIMP活性剂的全身水平来增强靶TIMP活性。全身水平是指哺乳动物循环系统中TIMP活性剂的水平(例如浓度或量)。增加的幅度可以变化，其中在一些情况下，增加的幅度是2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大，例如15倍或更大、20倍或更大、25倍或更大(与合适的对照相比)。

在这些实施方案中，可以使用任何便利的方案来增强感兴趣的TIMP活性剂的全身水平。在一些情况下，通过向受试者施用TIMP活性剂来增加全身水平。在这种情况下，TIMP活性剂可以不同。可以用于本发明的这些实施方案中的TIMP活性剂包括TIMP多肽和编码其的核酸。

TIMP多肽是在施用于受试者后表现出所需的TIMP衰老相关病症治疗活性的多肽，例如如上所述。本文使用的术语“多肽”是指显示出所需的TIMP活性的全长蛋白及其部分或片段。在这个术语中还包括天然存在的蛋白的变体，其中这种变体与天然存在的蛋白同源或基本上相似，如下文所更详细地描述的，所述天然存在的蛋白是人类蛋白、小鼠蛋白或来自天然表达TIMP蛋白的一些其他物种的蛋白。在以下描述中，术语TIMP不仅是指人类形式的TIMP蛋白，而且也指其在非人类物种中表达的同源物。

感兴趣的TIMP多肽的氨基酸序列长度和分子量可以变化。在一些情况下，TIMP多肽的长度范围为175-350，例如200-250，所述多肽包括约200-225个氨基酸残基，并且仅基于蛋白中氨基酸残基数目并且假定平均分子量为110道尔顿，所述多肽具有范围为19-39kDa，例如22-28kDa，包括22-25kDa的预计分子量，其中实际分子量可以根据蛋白糖基化的量而变化，表观分子量由于凝胶上的SDS结合而会明显更小。如本文所述的TIMP多肽可以根据需要从天然来源获得，例如通过纯化技术、化学合成或使用重组方案产生。

在一些情况下，施用于受试者的TIMP多肽是人TIMP2蛋白，其中人TIMP2蛋白具有包含与SEQ ID NO：01所示序列基本上相同或相同的区域的氨基酸序列。“基本上相同”是指具有如下区域的蛋白：如使用默认设置通过BLAST确定的，该区域具有与SEQ ID NO：01的序列有60％或更高，例如75％或更高，例如90％或更高(包括98％或更高)的序列同一性的序列。在一些情况下，施用于受试者的TIMP多肽是人TIMP1蛋白，其中人TIMP1蛋白具有包含与SEQ ID NO：02所示序列基本上相同或相同的区域的氨基酸序列。“基本上相同”是指具有如下区域的蛋白：如使用默认设置通过BLAST确定的，该区域具有与SEQ ID NO：02的序列有60％或更高，例如75％或更高，例如90％或更高(包括98％或更高)的序列同一性的序列。在一些情况下，施用于受试者的TIMP多肽是人TIMP3蛋白，其中人TIMP3蛋白具有包含与SEQID NO：03所示序列基本上相同或相同的区域的氨基酸序列。“基本上相同”是指具有如下区域的蛋白：如使用默认设置通过BLAST确定的，该区域具有与SEQ ID NO：03的序列有60％或更高，例如75％或更高，例如90％或更高(包括98％或更高)的序列同一性的序列。在一些情况下，施用于受试者的TIMP多肽是人TIMP4蛋白，其中人TIMP4蛋白具有包含与SEQ ID NO：04所示序列基本上相同或相同的区域的氨基酸序列。“基本上相同”是指具有如下区域的蛋白：如使用默认设置通过BLAST确定的，该区域具有与SEQ ID NO：04的序列有60％或更高，例如75％或更高，例如90％或更高(包括98％或更高)的序列同一性的序列。

除了上述特定的TIMP蛋白之外，来自其他物种(例如其他动物物种)的同源物或蛋白(或其片段)也可以用于该方法的实施方案中，其中这类同源物或蛋白可以来自多种不同类型的物种，包括动物，例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠；家养动物，例如马、牛、狗、猫等。同源物是指与SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：04所示的特定TIMP蛋白具有35％或更高，例如40％或更高(包括60％或更高)的氨基酸序列同一性的蛋白，如在默认设置下使用BLAST确定的。

除了例如如上所述的天然存在的TIMP蛋白之外，与天然存在的TIMP蛋白不同的TIMP多肽也可以用于实施本发明的方法。可以存在不同的变异，包括但不限于取代、插入和/或缺失、突变，以及例如如下所示的其他类型的非氨基酸序列变异。可以使用的TIMP多肽包括具有由TIMP基因的开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列的蛋白，包括全长TIMP蛋白及其片段，例如生物活性片段和/或对应于功能结构域的片段；并且包括本发明的多肽与其他蛋白或蛋白部分的融合物。感兴趣的片段的长度可以变化，在一些情况下长度是10个氨基酸或更长，例如50个氨基酸或更长，并且包括100个氨基酸或更长，并且在一些情况下，长度不超过150个氨基酸，其中给定的片段将具有一段氨基酸，该段氨基酸与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4中任一个中存在的子序列基本相同或相同；其中子序列的长度可以变化并且在一些情况下是10个氨基酸或更长，例如15个氨基酸或更长，多达50个氨基酸或甚至更长。

在一些情况下，用于本发明方法中的TIMP多肽包括一种或更多种修饰。可存在的修饰可以变化，并且包括但不限于：酰胺键取代、氨基酸取代、纳入半胱氨酸残基/类似物、环化、聚乙二醇化等。现在更详细地描述用于本发明方法的TIMP多肽中可存在的修饰的实例。

在一些情况下，TIMP多肽包括除肽键以外的一个或更多个键，例如至少两个相邻氨基酸通过除酰胺键以外的键连接。例如，为了减少或消除不期望的蛋白水解或其他降解方式，和/或提高血清稳定性，和/或限制或增加构象的灵活性，TIMP多肽骨架内的一个或更多个酰胺键可以被取代。在另一个实例中，TIMP多肽中的一个或更多个酰胺键(-CO-NH-)可以被作为酰胺键的电子等排体的键取代，例如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-或-CH₂SO-。TIMP多肽中的一个或更多个酰胺键还可以被例如被还原的电子等排体伪肽键(pseudopeptide bond)取代。

可以在TIMP多肽中进行一个或多个氨基酸取代。以下是非限制性实例：a)烷基取代的疏水性氨基酸的取代，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸，或被C₁-C₁₀碳的脂族侧链取代(包括支链、环状和直链烷基、烯基或炔基取代)的其他简单α-氨基酸；b)芳族取代的疏水性氨基酸的取代，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸，包括上面列出的芳族氨基酸的氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(C₁-C₄)-取代形式，这类取代的示例性实例是：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸，2-、3-或4-氯苯丙氨酸；2-，3-或4-甲基苯丙氨酸；2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸；5-氨基、5-氯、5-甲基-或5-甲氧基色氨酸；2'-、3'-或4'-氨基-，2'-、3'-或4'-氯-，2-、3-或4-二苯基丙氨酸；2'-、3'-或4'-甲基-，2-、3-或4-二苯基丙氨酸；以及2-或3-吡啶丙氨酸；c)含有碱性侧链的氨基酸的取代，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括上述氨基酸的烷基、烯基或芳基取代的(C₁-C₁₀支链、直链或环状)的衍生物，无论取代基位于杂原子上(例如位于α氮上)，或是位于远端的一个或更多个氮上，或位于α碳上，例如在pro-R位中。作为示例性实例的化合物包括：N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括例如以下的化合物：α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸，其中烷基占据α-碳的pro-R位。还包括由以下形成的酰胺：烷基、芳族、杂芳族(其中杂芳族基团具有一个或更多个单独或组合的氮、氧或硫原子)，羧酸或多种众所周知的活化衍生物例如酰氯、活性酯、活性唑啉和相关衍生物中的任一种以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸；d)酸性氨基酸的取代，包括天冬氨酸，谷氨酸，高谷氨酸，酪氨酸，2,3-二氨基丙酸的烷基、芳基、芳烷基和杂芳基磺酰胺，鸟氨酸或赖氨酸，以及四唑取代的烷基氨基酸；e)侧链酰胺残基的取代，包括天冬酰胺、谷氨酰胺以及天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳族取代衍生物；和f)含羟基氨基酸的取代，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸以及丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳族取代衍生物。

在一些情况下，TIMP多肽包括一种或更多种天然存在的非遗传编码的L-氨基酸，合成L-氨基酸，或氨基酸的D-对映异构体。例如，TIMP多肽可以仅包含D-氨基酸。例如，TIMP多肽可以包括一个或多个以下残基：羟脯氨酸、β-丙氨酸、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、间氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘丙氨酸、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、蛋氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、rho-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基十四酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。

可以将半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物引入TIMP多肽中以通过二硫键与另一个肽连接或使TIMP多肽环化。TIMP多肽可以被环化。可以将一个或更多个半胱氨酸或半胱氨酸类似物引入TIMP多肽中，其中引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物可以与第二引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物形成二硫键。其他环化方法包括引入肟连接基团或羊毛硫氨酸连接基团；例如参见第8,044,175号美国专利。可以使用和/或引入能够形成环化键的氨基酸(或非氨基酸部分)的任何组合。环化键可以用氨基酸的任何组合产生(或用氨基酸和-(CH2)_n-CO-或-(CH2)_n-C₆H₄-CO-产生)，所述氨基酸具有允许引入桥键的官能团。一些实例是二硫化物，二硫化物模拟物，例如-(CH2)_n-碳桥键、硫缩醛、硫醚桥键(胱硫醚或羊毛硫氨酸)和含有酯和醚的桥键。在这些实例中，n可以是任何整数，但通常小于十。

其他修饰包括，例如，N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])或主链交联以构建内酰胺和其他环状结构。其他衍生物包括C-端羟甲基衍生物、邻位修饰衍生物(例如C-端羟甲基苄基醚)、包括取代的酰胺(如烷基酰胺和酰肼)的N-端修饰衍生物。

可以存在改进TIMP多肽的一种或更多种物理性质的修饰。物理性质的改进包括，例如，调节免疫原性；增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物学活性。这种修饰的实例包括但不限于：聚乙二醇化，糖基化(N-连接和O-连接)；聚唾液酸化(polysialylation)；包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子；通过例如缀合的脂肪酸链(酰化)进行的白蛋白结合；和Fc-融合蛋白。

聚乙二醇化：蛋白疗法的临床有效性可能受限于短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性。对各种治疗性蛋白(例如非格司亭)的研究已经显示，可以通过各种修饰来克服此类困难，修饰包括将多肽序列缀合或连接至多种非蛋白聚合物(例如聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇或聚氧化烯)中的任一种。这通常通过与蛋白和非蛋白聚合物(例如PEG)两者共价结合的连接部分来实现。已经显示这种PEG-缀合的生物分子具有临床上有用的性质，包括更好的物理稳定性和热稳定性、防止遭受酶促降解、增加的溶解度、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、降低的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。除了聚乙二醇化对药代动力学参数的有益作用之外，聚乙二醇化本身可以增强活性。适合与多肽序列缀合的PEG通常在室温下可溶于水，并具有通式R(O-CH₂-CH₂)_nO-R，其中R为氢或保护基团如烷基或烷醇基，并且其中n是1至1000的整数。当R是保护基时，其通常具有1至8个碳。与多肽序列缀合的PEG可以是线型或分支型的。本发明涵盖了分支型PEG衍生物、“星形-PEG”和多臂PEG。本发明中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围，在本文其他地方阐述了实例；举例来说，某些实施方案具有5kDa至20kDa之间的分子量，而其他实施方案具有4kDa至10kDa之间的分子量。聚乙二醇化的TIMP多肽可以是缀合物，其中PEG具有不同的n值，并且因此以特定的比例存在各种不同的PEG。例如，一些组合物包含缀合物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，当n＝1时缀合物的百分比是18-25％，当n＝2时缀合物的百分比是50-66％，当n＝3时缀合物的百分比是12-16％，并且当n＝4时缀合物的百分比达到5％。可以通过任何方便的反应条件和纯化来生产这种组合物。聚乙二醇化最经常出现在多肽N端的α氨基、赖氨酸残基侧链的ε氨基和组氨酸残基侧链上的咪唑基。由于大多数重组多肽具有一个α和多个ε氨基和咪唑基，所以可以根据连接化学反应产生多种位置异构体。可以在此应用一般的聚乙二醇化策略，例如本领域已知的那些策略。PEG可以经由末端反应性基团(“间隔基”)与本发明的多肽结合，该末端反应性基团介导一个更或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键。具有可以与游离氨基结合的间隔基的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，其可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。可以与游离氨基结合的另一种活化的聚乙二醇是2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可以通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应而制备。与游离羧基结合的活化的聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。一个或更多个多肽序列与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法进行。例如，缀合反应可以如下进行：使用摩尔比为4：1至30：1的试剂与蛋白，在4℃至室温的温度下，在pH 5至10的溶液中进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以指导反应朝着主要产生所需的取代度的方向进行。通常，低温、低pH(例如，pH＝5)和短的反应时间倾向于减少连接的PEG的数量，而高温、中性至高pH(例如，pH≥7)和更长的反应时间倾向于增加连接的PEG的数量。可以使用本领域已知的各种手段来终止反应。在一些实施方案中，通过酸化反应混合物并在例如-20℃下冷冻来终止反应。各种分子的聚乙二醇化在例如第5,252,714；5,643,575；5,919,455；5,932,462；和5,985,263号美国专利中论述。本发明还涵盖使用PEG模拟物。已经开发了重组PEG模拟物，其保留了PEG的属性(例如增加的血清半衰期)，同时赋予了若干其他有利的特性。举例来说，可以重组产生能够形成类似于PEG的延伸构象的简单多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)，其已经与感兴趣的肽或蛋白质药物融合。这避免了在制造过程中需要额外的缀合步骤。而且，成熟的分子生物学技术能够控制多肽链的侧链组成，从而允许优化免疫原性和制备特性。

糖基化：出于本发明的目的，“糖基化”广义上是指将聚糖连接至蛋白、脂质或其他有机分子的酶促过程。本发明中使用的术语“糖基化”通常旨在表示添加或除去一个或更多个碳水化合物部分(通过用化学和/或酶促手段除去潜在的糖基化位点或除去糖基化)和/或添加可以存在或不存在于天然序列中的一个或更多个糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白的糖基化的质变，涉及存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。糖基化能显著影响多肽如TIMP多肽的物理性质(例如溶解性)，并且也可能在蛋白稳定性、分泌和亚细胞定位中是重要的。糖基化的多肽还可以表现出增强的稳定性或者可以改善一种或更多种药代动力学性质，例如半衰期。另外，与包含非糖基化多肽的制剂相比，溶解度改善可以例如能够产生更适于药物施用的制剂。糖基化位点的添加可以通过改变氨基酸序列来完成。例如，多肽的改变可以通过添加一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(用于N-连接的糖基化位点)或者被一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(用于N-连接的糖基化位点)取代来进行。N-连接的寡糖和O-连接的寡糖的结构以及在每种类型中发现的糖残基可以不同。在两种中都通常会发现的一种糖是N-乙酰神经氨酸(以下称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的寡糖和O-连接的寡糖的末端残基，并且由于其负电荷而赋予糖蛋白酸性质。本公开的具体实施方案包括N-糖基化变体的产生和使用。本公开的多肽序列可以任选地通过在核酸水平上的改变而改变，特别是通过在预选碱基处突变编码多肽的核酸从而产生会翻译成所需氨基酸的密码子。增加多肽上碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。碳水化合物的去除可以通过化学或酶促方式完成，或通过取代编码被糖基化的氨基酸残基的密码子来实现。化学去糖基化技术是已知的，并且可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶切割。二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是用于生产重组糖蛋白的常用宿主细胞。这些细胞不表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶，因此不会以α-2,6键将唾液酸添加到在这些细胞中产生的糖蛋白的N-连接的寡糖。

在一些实施方案中，多肽是非天然糖基化的。非天然糖基化是指多肽具有糖基化模式(如果存在的话)，该糖基化模式与相应的天然存在的蛋白中发现的糖基化模式不同。例如，用于该具体实施方案的本发明方法中的人TIMP2的特征在于：如果被完全糖基化的话，其具有与天然存在的人TIMP2的糖基化模式不同的糖基化模式。因此，该实施方案的非天然糖基化TIMP多肽包括非糖基化TIMP多肽，即不具有共价结合的糖基的蛋白。

聚唾液酸化：本公开还考虑使用聚唾液酸化(即将多肽缀合至天然存在的生物可降解的α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”))以改善多肽的稳定性和体内药代动力学。PSA是可生物降解的无毒天然聚合物，具有高度亲水性，使其在血液中具有高表观分子量，从而延长其血清半衰期。另外，一系列肽和蛋白治疗剂的聚唾液酸化已导致显著降低的蛋白水解、体内活性的保留以及降低的免疫原性和抗原性(参见例如G.Gregoriadis et al.,Int.J.Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。如同用其他缀合物(例如PEG)进行修饰一样，用于位点特异性聚唾液酸化的各种技术是可用的(参见例如T.Lindhout et al.,(2011)PNAS108(18)7397-7402)。

白蛋白融合：用于缀合的其他合适的组分和分子包括白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。成熟的HSA是具有约20天的血清半衰期的585个氨基酸的多肽(约67kDa)，主要负责胶体渗透血压、血液pH的维持以及许多内源和外源配体的运输和分布。该蛋白具有三个结构上同源的结构域(结构域I、II和III)，几乎全部是α-螺旋构象，并且被17个二硫键高度稳定化。白蛋白的三个主要药物结合区位于三个结构域的每一个上，在亚结构域IB、IIA和IIIA内。白蛋白合成发生在肝脏，肝脏产生短寿命的初级产物前白蛋白原。因此，全长HSA具有18个氨基酸的信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS；SEQID NO：5)，接着是6个氨基酸的pro-结构域(RGVFRR；SEQ ID NO：6)；该具有24个氨基酸残基的肽可以被称为pre-pro结构域。HSA可以利用其内源信号肽作为pre-pro结构域来表达和分泌。可选择地，HSA可以利用与成熟构建体融合的IgK信号肽来表达和分泌。在内质网腔中，前白蛋白原的氨基末端被快速地共翻译切割，从而产生稳定的609-氨基酸前体多肽，白蛋白原。然后白蛋白原转移到高尔基体，在高尔基体中，通过弗林蛋白酶依赖的氨基末端切割而转化为585个氨基酸的成熟白蛋白。白蛋白的主要氨基酸序列、结构和功能在物种间高度保守，白蛋白合成和分泌的过程也是如此。例如，在食蟹猴、牛、狗、兔和大鼠中发现与HSA相当的白蛋白血清蛋白。在非人类物种中，牛血清白蛋白(BSA)与HSA在结构上最相似(参见例如Kosa et al.,Nov 2007J Pharm Sci.96(11):3117-24)。本公开涵盖来自非人类物种的白蛋白，包括但不限于上述那些，在例如药物开发过程中的使用。根据本公开，白蛋白可以在羧基末端、氨基末端、羧基末端和氨基末端两者以及内部与药物分子(例如本文所述的多肽)缀合(参见例如USP 5,876,969和USP 7,056,701)。在本公开涵盖的HSA-TIMP缀合物中，可以使用各种形式的白蛋白，诸如白蛋白分泌前序列及其变体、其片段及变体以及HSA变体。这种形式通常具有一种或更多种所需的白蛋白活性。在另外的实施方案中，本公开涉及包含直接或间接与白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等融合的多肽药物分子的融合蛋白，其中融合蛋白比未融合的药物分子具有更高的血浆稳定性，和/或融合蛋白保留未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，间接融合是通过连接基团实现的，如肽连接基团或其修饰形式。可以通过例如弗林蛋白酶或半胱天冬酶酶促地进行细胞内切割。细胞表达低水平的这些内源酶，这些内源酶能够在细胞内切割融合分子的一部分；因此，一些多肽由细胞分泌而不与HSA缀合，而一些多肽以包含HSA的融合分子的形式被分泌。本公开的实施方案涵盖各种弗林蛋白酶融合构建体的使用。例如，可以设计包含序列RGRR、RKRKKR、RKKR或RRRKKR的构建体。本公开还涵盖细胞外切割(即，体外切割)，由此融合分子由细胞分泌，进行纯化，然后切割。应理解，切除可以使整个HSA-连接基团复合物与成熟TIMP多肽解离，或者解离整个HSA--连接基团复合物的部分。如上所述，例如，白蛋白与本公开的一种或多种多肽的融合可以通过基因操作实现，使得编码HSA的核酸或其片段与编码该一种或更多种多肽序列的核酸连接。此后，合适的宿主可以用例如合适的质粒形式的融合核苷酸序列进行转化或转染，从而表达融合多肽。该表达可以在例如原核或真核细胞的体外进行，或在例如转基因生物体的体内进行。在本公开的一些实施方案中，融合蛋白的表达在哺乳动物细胞系例如CHO细胞系中进行。本文中广泛使用的转化是指由通过细胞膜直接摄取、外源遗传物质(外源核酸)的并入和表达而引起的细胞的遗传改变。转化天然地发生在一些细菌种类中，但在其他细胞中也可以通过人工方法进行转化。此外，可以修饰白蛋白本身以延长其循环半衰期。修饰的白蛋白与TIMP多肽的融合可以通过上述的基因操作技术或通过化学缀合获得；所得到的融合分子的半衰期超过未改性白蛋白的融合分子的半衰期。感兴趣的TIMP2-白蛋白融合蛋白包括在第7,163,805号美国专利中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。

已经开发了几种白蛋白结合策略作为直接融合的替代方案，包括通过缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合。由于血清白蛋白是脂肪酸的转运蛋白，因此这些具有白蛋白结合活性的天然配体已被用于小蛋白治疗剂的半衰期延长。例如，地特胰岛素(LEVEMIR)是经批准的糖尿病产品，其包含与基因修饰的胰岛素缀合的肉豆蔻基链，得到长效胰岛素类似物。本公开还涵盖包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和本文所述的一种或更多种多肽的序列的融合蛋白。文献中描述的任何ABD多肽序列可以是融合蛋白的组分。融合蛋白的组分可以任选地通过连接基团(如本文所述的那些连接基团)共价键合。在本公开的一些实施方案中，融合蛋白包含作为N-末端部分的ABD多肽序列和作为C-末端部分的本文所述的多肽。本公开还涵盖包含白蛋白结合多肽的片段(该片段基本保留了白蛋白结合)的融合蛋白或者涵盖包含白蛋白结合多肽或其片段的多聚体的融合蛋白所述片段包括至少两个白蛋白结合多肽或其作为单体单元的片段。

与其他分子缀合：用于缀合的其他合适的组分和分子包括，例如，甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；诸如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)的聚氨基酸；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白；钥孔血蓝蛋白(KLH)；和乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述的任何组合。因此，本公开涵盖在多肽序列的N端和/或C端缀合一个或更多个其他组分或分子，例如另一多肽(例如，具有与本发明的多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此，示例性的多肽序列可以作为与另一组分或分子的缀合物提供。缀合物修饰可以产生多肽序列，该多肽序列保留了具有其他功能或互补功能的活性或者源自第二分子的活性。例如，可以将多肽序列缀合至分子，例如以促进溶解性、储存、体内或保存半衰期或稳定性、免疫原性的降低、体内延迟或控制释放等。其他功能或活性包括相对于未缀合的多肽序列毒性降低的缀合物；比未缀合的多肽序列更有效地靶向一种细胞或器官的缀合物，或者进一步抵抗与本文所述的疾病、障碍或病症(例如癌症)有关的病因或作用的药物。TIMP多肽也可以与以下缀合：大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白；多糖，如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠；聚合氨基酸，如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，例如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子；灭活的细菌；和树突状细胞。如果需要，这样的缀合形式可以用于产生针对本公开的多肽的抗体。用于缀合的其他候选组分和分子包括适于分离或纯化的那些。具体的非限制性实例包括结合分子，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，固体支持物包括例如塑料或聚苯乙烯珠、板或珠、磁珠、测试条和膜。如阳离子交换层析的纯化方法可以用于通过电荷差来分离缀合物，其有效地将缀合物分离成其各种分子量。例如，可以装载阳离子交换柱，然后用pH～4的～20mM乙酸钠洗涤，然后用在pH为约3至5.5(例如，pH～4.5)下缓冲的线性(0M至0.5M)NaCl梯度洗脱。可以使用常规方法，例如质谱法、SDS-PAGE或其他已知的通过分子量分离分子实体的方法来用分子量确定通过阳离子交换层析获得的级分的含量。

Fc-融合分子：在某些实施方案中，本公开的多肽序列的氨基端或羧基端可以与免疫球蛋白Fc区(例如人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已经证明Fc融合缀合物增加生物药物的全身性半衰期，因此生物药物产品可能需要较不频繁的施用。Fc与沿血管排列的内皮细胞中的新生儿Fc受体(FcRn)结合，并且在结合后，Fc融合分子被保护免于降解和重新释放到循环中，从而使该分子循环更长时间。该Fc结合被认为是内源IgG用来保持其长的血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，最新的Fc-融合技术将生物药物的单个拷贝连接到抗体的Fc区以优化该生物药物的药代动力学和药效动力学性质。

其他修饰：本公开涵盖使用TIMP多肽的当前已知的修改或以后将开发出来的其他修饰来改善一种或更多种性质。一种用于延长本公开的多肽的循环半衰期、增加其稳定性、降低清除率或改变其免疫原性或变应原性的这类方法包括通过羟乙基淀粉化(hesylation)修饰多肽序列，羟乙基淀粉化利用与其他分子连接的羟乙基淀粉衍生物以修饰多肽序列的特征。

连接基团：连接基团及其使用已在上面描述过。用于修饰本公开的多肽序列的前述组分和分子中的任一种可以任选地经由连接基团缀合。合适的连接基团包括“柔性连接基团”，其通常具有足够的长度以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间的一些移动。连接基团分子通常长约6-50个原子。例如，连接基团分子还可以是芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或它们的组合。合适的连接基团可以容易地选择并且可以具有任何合适的长度，例如1个氨基酸(例如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50个氨基酸或超过50个氨基酸。示例性柔性连接基团包括甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GS)_n、GSGGS_n、GGGS_n、(G_mS_o)_n、(G_mS_oG_m)_n、(G_mS_oG_mS_oG_m)_n、(GSGGS_m)_n、(GSGS_mG)_n和(GGGS_m)_n及它们的组合，其中m和o各自独立地选自至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性连接基团。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对无结构的，因此可以作为组分之间的中性链(neutral tether)。示例性的柔性连接基团包括但不限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG，GGGSG和GSSSG。

在一些情况下，通过在足以使核酸编码序列在受试者中表达的条件下向受试者施用所述编码序列来增加全身TIMP多肽水平。取决于所需的TIMP多肽，核酸编码序列可以变化。感兴趣的核酸包括编码上文提供的TIMP多肽的核酸。感兴趣的特定核酸包括但不限于：人TIMP2(NCBI参考序列：NM_003255.4)；人TIMP1(NCBI参考序列：NM_003254.2)；人TIMP3(NCBI参考序列：NM_000362.4)和人TIMP4(NCBI参考序列：NM_003256.3)。

核酸组合物是指包含具有开放阅读框的DNA序列的组合物，所述开放阅读框编码感兴趣的TIMP多肽，即TIMP编码序列，并且能够在合适的条件下表达为TIMP多肽。此术语还包括与上述特定核酸同源、基本相似或相同的核酸。除了上述特定的核酸组合物之外，感兴趣的还有上述序列的同源物。在某些实施方案中，同源物之间的序列相似性是20％或更高，例如25％或更高，包括30％、35％、40％、50％、60％、70％或更高，包括75％、80％、85％、90％和95％或更高。基于参考序列来计算序列相似性，参考序列可以是较大序列的子集，诸如保守基序、编码区、侧翼区等。参考序列可以是18nt长或更长，诸如30nt长，并且可以扩展到正在进行比较的全序列。用于序列分析的算法在本领域是已知的，例如Altschul et al.(1990),J.Mol.Biol.215:403-10中描述的BLAST(使用默认设置，即参数w＝4和T＝17)。在某些实施方案中特别感兴趣的是与上述特定的人TIMP1至TIMP4核酸具有基本上相同的长度的核酸，其中基本上相同的长度是指，长度的任何差异不超过约20数量％，通常不超过约10数量％，更通常不超过约5数量％；并且在核酸的整个长度上，与这些序列中的任何一个具有90％或更高的序列同一性，例如95％或更高，包括99％或更高。在一些实施方案中，核酸具有与上述特定序列基本相似或相同的序列。基本相似是指序列同一性为60％或更高，例如75％或更高，包括80％、85％、90％或甚至95％或更高。感兴趣的核酸还包括编码由上述核酸编码的蛋白的核酸，但由于遗传密码的简并性而与上述核酸在序列上存在不同。

如本文所述的核酸可以存在于载体中。根据本发明，可以使用各种载体(例如，病毒载体、细菌载体或能够在真核和原核宿主中复制的载体)。可以在真核和原核宿主中复制的许多载体是本领域已知的并且可商购获得。在一些情况下，根据本发明使用的这种载体由细菌复制起点和与感兴趣的DNA可操作连接的真核启动子组成。

根据本发明使用的病毒载体可以由源自天然存在的病毒的病毒颗粒组成，所述天然存在的病毒已经被遗传改变以造成病毒复制缺陷并表达根据本发明的重组基因。一旦病毒将其遗传物质递送给细胞，它就不会产生额外的感染性病毒，但确实将外源重组基因导入细胞，优选导入细胞的基因组中。许多病毒载体在本领域中是众所周知的，包括例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、牛痘和脊髓灰质炎病毒载体。

感兴趣的DNA可以使用非病毒载体而被施用，例如作为DNA-或RNA-脂质体复合物制剂。这样的复合物包含与遗传物质(DNA或RNA)结合的脂质的混合物，从而提供允许遗传物质递送到细胞中的疏水包衣。可以根据本发明使用的脂质体包括DOPE(二油基磷脂酰乙醇胺)、CUDMEDA(N-(5-cholestrum-3-β-醇3-尿烷基)-N',N'-二甲基乙二胺)。当使用脂质体引入感兴趣的DNA时，在某些情况下，首先在体外确定DNA：脂质比以及DNA和脂质的绝对浓度的最佳值以作为待转化的具体类型的细胞的细胞死亡和转化效率的函数。然后可以将这些值用于或推测用于体内转化。这些值的体外测定可以使用本领域公知的技术容易地进行。

根据本发明也可以使用其他非病毒载体。这些包括与载体分子(例如，抗体或受体配体)偶联的DNA或RNA的化学制剂，其促进递送至宿主细胞中，目的是改变宿主细胞的生物学性质。术语“化学制剂”是指允许核酸化合物与载体分子如蛋白或脂质或其衍生物偶联的核酸的修饰。示例性的蛋白载体分子包括对靶向的分泌腺的细胞或受体配体有特异性的抗体，即能够与与靶向的分泌腺的细胞相关的受体相互作用的分子。

DNA构建体可以包括促进感兴趣的DNA在靶细胞内表达的启动子，例如强的真核生物启动子。示例性的真核生物启动子包括来自巨细胞病毒(CMV)、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和腺病毒的启动子。更具体地，示例性启动子包括来自人CMV的即刻早期基因的启动子(Boshart et al.,Cell 41:521-530,1985)和来自RSV的长末端重复序列(LTR)的启动子(Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777-6781,1982)。

受试者中的全身性TIMP活性剂水平可以通过刺激体内TIMP多肽的内源性产生和/或释放而增强，而不是施用例如如上所述的TIMP多肽。

还感兴趣的是TIMP活性的增效剂。TIMP增效剂是指起作用以提高正在接受治疗的受试者中存在的内源TIMP多肽的所需TIMP活性的药剂或药剂组合。增加的幅度可以变化，其中在一些情况下，增加的幅度是2倍或更高，例如5倍或更高，包括10倍或更高，例如15倍或更高、20倍或更高、25倍或更高(与合适的对照相比)。感兴趣的TIMP增效剂可以通过多种不同的机制发挥作用，例如通过增强TIMP多肽与所需靶标之间的结合相互作用；通过增加内源池(pool)的生物利用度，例如通过隔离不需要的竞争性结合靶标等。

在其他实施方案中，所述药剂是显示所需TIMP活性的小分子药剂。天然存在或合成的感兴趣的小分子化合物包括许多化学类别，例如有机分子，如分子量大于50且小于约2,500道尔顿的小的有机化合物。候选药剂包含用于与蛋白进行结构相互作用的官能团，特别是氢键，并且通常至少包含胺、羰基、羟基或羧基，优选所述官能化学基团中的至少两个。候选药剂可以包括被一个或更多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。在包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合的生物分子中也发现有候选药剂。在其他方式中，可以通过采用下面描述的筛选方案来鉴定这样的分子。

在实施本发明的方法中，可以使用能够产生所需活性的任何方便的施用方案将一种或多种活性剂施用给成年哺乳动物。因此，可以将活性剂纳入各种制剂中，例如药学上可接受的载体，以用于治疗性施用。更具体地说，本发明的活性剂可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏(例如护肤霜)、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。因此，可以以各种方式实现活性剂的施用，包括口服、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、透皮、气管内施用等。

在药物剂型中，所述活性剂可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独使用或以适当的结合形式使用，以及与其他药学活性化合物组合使用。以下方法和辅料仅仅是示例性的，绝不是限制性的。

对于口服制剂，活性剂可以单独使用或与合适的添加剂组合使用以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如与常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁组合；如果需要的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合。

通过将活性剂溶解、混悬或乳化在水性或非水性溶剂如植物油或其他类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂族酸或丙二醇的酯中，活性剂可以被配制成注射用制剂；如果需要的话，用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、混悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制。

活性剂可以用于气溶胶制剂中以通过吸入施用。本发明的化合物可以配制至加压的、可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

此外，可以通过与各种基质如乳化基质或水溶性基质混合而将活性剂制成栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂经直肠施用。栓剂可以包括在体温下熔化但在室温下固化的赋形剂(vehicle)，例如可可脂、碳蜡和聚乙二醇。

可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位(例如茶匙、汤匙、片或栓剂)含有预定量的含有一种或更多种抑制剂的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以包含组合物中的抑制剂，所述组合物为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体的溶液的形式。

如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的、物理上分离的单位，每个单位含有预定量的本发明化合物，预定量被计算为与药学上可接受的稀释剂、载体(carrier)或赋形剂(vehicle)联合足以产生所需的效果的量。本发明的新单位剂型的规格取决于所使用的具体化合物、要实现的效果以及在宿主中与每种化合物相关的药效动力学。

药学上可接受的辅料如赋形剂、佐剂、载体或稀释剂是公众容易获得的。而且，药学上可接受的辅助性物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂(tonicity adjustingagent)、稳定剂、润湿剂等也是公众容易获得的。

当活性剂为多肽、多核苷酸、其类似物或模拟物时，可以通过多种途径将其引入至组织或宿主细胞中，所述途径包括病毒感染、显微注射或囊泡融合。喷射注射也可以用于肌内施用，如Furth et al.,Anal Biochem.(1992)205:365-368所述。可以将DNA涂覆到金微粒上，并通过如文献(参见例如Tang et al.,Nature(1992)356:152-154)中所述的粒子轰击装置或“基因枪”进行皮内递送，其中金微弹用DNA涂覆，然后被轰击至皮肤细胞中。对于核酸治疗剂，可使用多种不同的运输载体，包括本领域已知的病毒和非病毒载体系统。

本领域技术人员将容易地理解，剂量水平可以根据具体化合物的作用、运输载体的性质等变化。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方式容易地确定。

在那些将有效量的活性剂施用给成年哺乳动物的实施方案中，当施用合适的时间段(例如1周或更长，包括2周或更长，如3周或更长、4周或更长、8周或更长等)时，所述量或剂量是有效的，以证明成年哺乳动物中诸如认知衰退的损伤减轻和/或认知改善。例如，有效剂量是这样的剂量，即当施用合适的时间段(例如至少约1周，可能约2周或更长，长达约3周、4周、8周或更长时间)时，所述剂量将减慢(例如，停止)例如约20％或更多，例如30％或更多，40％或更多，或50％或更多，在一些情况下，减慢60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多的患有自然衰老或患有衰老相关疾病的患者中的认知衰退。在一些情况下，活性剂的有效量或有效剂量将不仅减慢或停止病情的进展，而且还会引发疾病的逆转，即会引起认知能力的提高。例如，在一些情况下，有效量是这样的量，即当施用合适的时间段(通常至少约1周，可能约两2周或更长，长达约3周、4周、8周或更长的时间)时，所述量会提高患有衰老相关的认知损伤的个体的认知能力，例如相对于施用血液制品前的认知能力提高1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍，在一些情况下，提高6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多。

在需要时，可以使用任何方便的方案评估治疗的有效性。用于测量认知能力(例如，注意力和集中力、学习复杂任务和概念的能力、记忆、信息处理、视觉空间功能、产生和理解语言的能力、解决问题和做出决定的能力以及履行执行功能的能力)的认知测试和智商测试在本领域中是众所周知的，其中的任何一种都可以用于测量在用本发明的血液制品治疗前和/或治疗期间以及治疗后的个体的认知能力，例如以确认已经施用了有效的量。这些测试包括例如全科医师认知评估(GPCOG)测试、记忆损伤筛选、简易精神状态检查(MMSE)、加州语言学习测验(第二版，简表，测试记忆)、Delis-Kaplan执行功能系统测试、阿尔茨海默氏病评估量表(ADAS-Cog)、精神病评估量表(PAS)等。功能性脑改善的进展可以通过脑成像技术如磁共振成像(MRI)或正电子发射断层扫描(PET)等来检测。可以应用各种各样的其他功能评估来监测日常生活活动、执行功能、活动度等。在一些实施方案中，所述方法包括测量认知能力和检测降低的认知衰退速率、认知能力的稳定化和/或与施用血液制品前个体的认知能力相比施用血液制品后认知能力的增强的步骤。这样的测量可以在施用血液制品后的一周或更久来进行，例如1周、2周、3周，或更久，例如4周、6周或8周或更久，例如3个月、4个月、5个月或6个月或更久。

在生物化学上，活性剂的“有效量”或“有效剂量”是指这样的活性剂的量，即将抑制、拮抗、降低、减轻或压制(suppress)约20％或更多，例如30％或更多，40％或更多，或50％或更多，在一些情况下，抑制、拮抗、降低、减轻或压制60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多，在一些情况下，抑制、拮抗、降低、减轻或压制约100％(即抑制、拮抗、降低、减轻或压制至可忽略的量)，并且在一些情况下，是指使在自然衰老过程期间或衰老相关疾病的发展期间发生的突触可塑性的降低和突触丧失逆转的活性剂的量。换言之，根据本发明的方法治疗的成年哺乳动物中存在的细胞将更积极地响应于促进突触的形成和维持的线索，例如活性线索。

例如如上所述，本发明的方法的实施可以表现为所观察到的突触可塑性的改善，在体外和体内都作为对长时程增强作用的诱导。例如，在清醒的个体中可以观察到神经回路中LTP的诱导，例如通过对清醒个体实施非侵入性刺激技术以诱导局部化神经活动的LTP样长期变化(Cooke SF,Bliss TV(2006)Plasticity in the human central nervoussystem.Brain.129(Pt 7):1659-73)；例如通过使用正电子发射断层摄影术、功能性磁共振成像和/或经颅磁刺激来成像个体中的可塑性和增加的中枢回路活动(Cramer和Bastings,"Mapping clinically relevant plasticity after stroke,"Neuropharmacology(2000)39:842-51)；以及例如通过测定再现相关的脑活动来检测学习之后的神经可塑性，即，记忆的改善(Buchmann et al.,"Prion protein M129Vpolymorphism affects retrieval-related brain activity,"Neuropsychologia.(2008)46:2389-402)；或者例如通过在用熟悉以及不熟悉的对象进行重复启动之后通过功能磁共振成像(fMRI)来对脑组织进行成像(Soldan et al.,"Global familiarity ofvisual stimuli affects repetition-related neural plasticity but notrepetition priming,"Neuroimage.(2008)39:515-26；Soldan et al.,"Aging does notaffect brain patterns of repetition effects associated with perceptualpriming of novel objects,"J.Cogn.Neurosci.(2008)20:1762-76)。在一些实施方案中，所述方法包括测量突触可塑性以及检测突触可塑性丧失的降低的速率、突触可塑性的稳定化和/或与施用血液制品前个体的突触可塑性相比施用血液制品后突触可塑性的增强的步骤。这样的测量可以在施用血液制品后的一周或更久来进行，例如1周、2周、3周或更久，例如4周、6周或8周或更久，例如3个月、4个月、5个月或6个月或更久。

在一些情况下，所述方法导致宿主一个或更多个组织中一个或更多个基因的表达水平的变化，例如与合适的对照(例如下面的实验部分中所描述的)相比。给定基因的表达水平的变化可以是0.5倍或更多，例如1.0倍或更多，包括1.5倍或更多。组织可以变化，在一些情况下，组织是神经系统组织，例如中枢神经系统组织，包括脑组织，例如海马组织。在一些情况下，海马基因表达的调节表现为增强的海马可塑性，例如与合适的对照相比。在一些情况下，表达被调节(例如增强)的一个或更多个基因是编码产物(为可塑性相关信号传导途径的成员)的基因(即突触可塑性调节基因)，例如Tlr4、Gria1、Kcnj10、Kdr、Ncam、Sdfr1、Egr1、Fos蛋白如c-Fos、Drd1a、Stxbp1、Mef2c、Cntn2、Junb、Bdnf和CamK2a等。在一些情况下，海马基因表达的调节表现为增强的海马可塑性，例如与合适的对照相比。在一些情况下，表达被调节(例如增强)的一个或更多个基因是编码产物(为与突触可塑性以及学习和记忆有关的网络的成员)的基因，例如但不限于：RELN、NTRK3、EPHA4等。

在一些情况下，治疗导致宿主一个或更多个组织中一种或更多种蛋白的水平的提高，例如与合适的对照(例如下文实验部分中所描述的)相比。给定蛋白的蛋白水平的变化可以是0.5倍或更多，例如1.0倍或更多，包括1.5倍或更多，其中在一些情况下，该水平可以接近健康野生型水平的水平，例如是健康野生型水平的50％或更少，例如25％或更少，包括10％或更少，例如5％或更少。组织可以变化，在一些情况下，组织是神经系统组织，例如中枢神经系统组织，包括脑组织，例如海马组织。

在一些情况下，这些方法导致一个或更多个组织中的一个或更多个结构变化。组织可以变化，在一些情况下，组织是神经系统组织，例如中枢神经系统组织，包括脑组织，例如海马组织。感兴趣的结构变化包括海马齿状回(DG)中成熟神经元的树突棘密度的增加，例如与合适的对照相比。在一些情况下，海马结构的调节表现为增强的突触形成或功能，例如与合适的对照相比。在一些情况下，这些方法可以导致长时程增强作用的增强，例如与合适的对照相比。

在一些情况下，这些方法的实施(例如如上所述的)导致成年哺乳动物中神经发生的增加。该增加可以以多种不同的方式来鉴定，例如，如下面的实验部分中所描述的。在一些情况下，神经发生的增加表现为Dcx-阳性未成熟神经元的量的增加，例如该增加可以是1.5倍或更多。在一些情况下，神经发生的增加表现为BrdU/NeuN阳性细胞数量的增加，其中该增加可以是1.5倍或更多。

在一些情况下，这些方法导致学习和记忆的增强，例如与合适的对照相比。学习和记忆的增强可以以多种不同的方法进行评估，例如在下面的实验部分中描述的场景性恐惧条件化、巴恩斯迷宫和/或径向臂水迷宫(RAWM)模式。当通过场景性恐惧条件化进行测量时，在一些情况下，治疗会导致场景性(contextual)记忆测试中而非线索性记忆测试中的僵直增加。当通过巴恩斯迷宫进行测量时，在一些情况下，治疗会导致在任务的任一天的任务测试阶段期间对逃脱孔位置的学习和记忆增强。当通过RAWM进行测量时，在一些情况下，治疗会导致在任务的测试阶段期间对平台定位的学习和记忆增强。在一些情况下，治疗表现为海马依赖性学习和记忆的认知改善的增强，例如与合适的对照相比。

在一些实施方案中，这些方法可以与具有适于治疗衰老相关的认知损伤的活性的活性剂联合使用。例如，许多活性剂已经被证明在治疗阿尔茨海默氏病的认知症状(例如，记忆丧失、混淆以及思考和推理方面的问题)方面具有一定功效，例如，胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐(Donepezil)、利凡斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)、他克林(Tacrine))，美金刚(Memantine)和维生素E。作为另一个实例，许多活性剂已经被证明在治疗阿尔茨海默氏病的行为或精神病症状方面具有一定功效，例如，西酞普兰(citalopram)(Celexa)、氟西汀(fluoxetine)(Prozac)、帕罗西汀(paroxeine)(Paxil)、舍曲林(sertraline)(Zoloft)、曲唑酮(trazodone)(Desyrel)、劳拉西泮(lorazepam)(Ativan)、奥沙西泮(oxazepam)(Serax)、阿立哌唑(aripiprazole)(Abilify)、氯氮平(clozapine)(Clozaril)、氟哌啶醇(haloperidol)(Haldol)、奥氮平(olanzapine)(Zyprexa)、喹硫平(quetiapine)(Seroquel)、利培酮(risperidone)(Risperdal)和齐拉西酮(ziprasidone)(Geodon)。

在一些情况下，这些方法与一种或更多种其他非TIMP多肽活性剂联合使用，其中这种非TIMP多肽活性剂显示出例如如上所述的所需的抗衰老相关病症活性。这种非TIMP多肽活性剂的实例包括但不限于：趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)(即，MCP1)和C-C基序趋化因子11(即，趋化蛋白或嗜酸性粒细胞趋化因子-1)及其激动剂/模拟物(如在已公开的第20130040844号的申请中描述的，其公开内容在此通过引用并入)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(即，集落刺激因子2或CSF2))等。在这种情况下，活性剂可以是任何类型的常规活性剂，包括上面结合TIMP活性剂(例如，其多肽和模拟物/片段、小分子、核酸，增效剂等)讨论的那些类型的活性剂。

在本发明方法的一些方面，该方法还包括测量治疗后的认知能力和/或突触可塑性(例如使用本文所述的或本领域已知的方法)以及确定认知衰退或突触可塑性丧失的速率已经降低和/或确定个体的认知能力或突触可塑性已经得到提高的步骤。在一些这样的情况下，通过将认知或突触可塑性测试的结果与在较早时间(例如，2周前、1个月前、2个月前、3个月前、6个月前、1年前、2年前、5年前或10年前或更早以前)对同一个体实施的测试的结果进行比较来进行确定。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括在施用本发明的包含血浆的血液制品之前，将个体诊断为具有认知损伤(例如，使用本文所述的或本领域已知的用于测量认知和突触可塑性的方法)。在一些情况下，诊断会包括测量认知和/或突触可塑性并将认知或突触可塑性测试的结果与一个或更多个参照(例如，阳性对照和/或阴性对照)进行比较。例如，参照可以是通过经受衰老相关的认知损伤(即，阳性对照)或不经受衰老相关的认知损伤(即，阴性对照)的一个或更多个年龄匹配的个体进行的测试的一个或更多个结果。作为另一个实例，参照可以是通过同一个体在较早的时间进行的测试的一个或更多个结果，例如2周前、1个月前、2个月前、3个月前、6个月前、1年前、2年前、5年前或10年前或更早之前。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将个体诊断为患有衰老相关的疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、多发性硬化症、多系统萎缩症、青光眼、共济失调、肌肉萎缩症、痴呆等。用于诊断这种衰老相关的疾病的方法是本领域众所周知的，普通技术人员可以使用它们中的任何一种来诊断个体。在一些实施方案中，本发明的方法还包括将个体诊断为患有衰老相关的疾病并且将个体诊断为患有认知损伤。

实用性

本发明的方法用于治疗(包括预防)衰老相关的损伤和与之相关的病症，如个体认知能力方面的损伤。患有衰老相关的认知损伤或有风险患上衰老相关的认知损伤的个体包括年龄为约50岁或更老的个体，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、90岁或更老并且通常不超过100岁，即在约50和100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100岁，以及正患有与自然衰老过程相关的认知损伤，例如轻度认知损伤(MCI)的个体；以及尚未开始表现出认知损伤的症状的年龄为约50岁或更老的个体，例如60岁或更老、70岁或更老、80岁或更老、90岁或更老并且通常不超过100岁，即在约50和100岁之间，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100岁的个体。由自然衰老导致的认知损伤的实例包括以下：

轻度认知损伤(M.C.I.)是一种轻度的认知破坏，表现为记忆或其他精神功能(如计划、遵从指示或做出决定)随着时间的推移而恶化的问题，而整体的精神功能和日常活动则未受损害。因此，虽然明显的神经元死亡通常不会发生，但是衰老的大脑中的神经元容易受到结构、突触完整性和突触处分子加工的亚致死-年龄相关的改变的影响，所有这些改变都损害认知功能。

例如通过本文所公开的方法，将从使用本发明的包含血浆的血液制品的治疗中受益的患有或有风险患上衰老相关的认知损伤的个体，还包括患有由衰老相关疾病导致的认识损伤的任何年龄的个体；以及已经被诊断为患有通常伴有认知损伤的衰老相关疾病的任何年龄的个体，其中所述个体尚未开始表现出认知损伤的症状。这种衰老相关的疾病的实例包括以下：

阿尔茨海默氏病(AD)。阿尔茨海默氏病是与大脑皮质和皮质下灰质中过多数量的老年斑相关的进行性的、无法改变的认知功能丧失，大脑皮质和皮质下灰质中还包含β-淀粉样蛋白和由tau蛋白组成的神经原纤维缠结。常见形式影响>60岁的人，其发病率随年龄增长而增加。阿尔茨海默氏病占老年人中痴呆症的65％以上。

阿尔茨海默氏病的病因尚不清楚。约有15％至20％的病例发生在家族中。其余的所谓散发病例有一些遗传决定因素。该病在大多数早发性病例和一些迟发性病例中具有常染色体显性遗传模式，但具有可变的晚期外显率。环境因素是主动研究的重点。

在该疾病的过程中，大脑皮层、海马和皮质下结构(包括Meynert基底核的选择性细胞丧失)、蓝斑以及中缝背核(Nucleus raphae dorsalis)内的突触以及最终的神经元丧失。在脑的一些区域(早期疾病的顶叶和颞皮质，晚期疾病的前额叶皮质)中脑的葡萄糖的使用和灌注减少。神经炎性斑或老年斑(由淀粉样蛋白核周围的神经突、星形胶质细胞和神经胶质细胞组成)和神经原纤维缠结(由成对的螺旋形细丝组成)在阿尔茨海默氏病的发病机理中起作用。老年斑和神经原纤维缠结伴随正常衰老而发生，但是它们在阿尔茨海默氏病患者中更普遍。

帕金森病。帕金森病(PD)是一种特发性、缓慢发展的退行性中枢神经系统疾病，其特征在于运动缓慢和减少、肌肉强直、静止性震颤和姿势不稳。原本认为PD主要为运动障碍，现在认为PD也影响认知、行为、睡眠、自主神经功能和感觉功能。最常见的认知损伤包括注意力和集中力、工作记忆、执行功能、产生语言和视觉空间功能方面的损伤。

在原发性帕金森病中，黑质、蓝斑和其他脑干多巴胺能细胞群的色素神经元丧失。原因尚不清楚。投射到尾状核和尾壳核的黑质神经元的丧失导致这些区域中神经递质多巴胺的耗尽。发病一般在40岁以后，在更老的人群中发病率增加。

继发性帕金森病是由基底节中多巴胺作用的丧失或被干扰所致，所述丧失或干扰是由其他特发性退行性疾病、药物或外源毒素导致的。继发性帕金森病最常见的原因是摄入抗精神病药物或利血平(reserpine)，它们通过阻断多巴胺受体而导致帕金森病。不那么常见的原因包括一氧化碳或锰中毒、脑积水、结构性病变(肿瘤，影响中脑或基底节的梗塞)、硬膜下血肿和退行性疾病，包括纹状体黑质变性。

额颞痴呆。额颞痴呆(FTD)是大脑额叶的进展性恶化所导致的一种病症。随着时间的推移，退化可以进展到颞叶。患病率仅次于阿尔茨海默氏病(AD)，FTD占早老性痴呆病例的20％。根据受影响的额叶和颞叶的功能，症状分为三类：行为变异型FTD(bvFTD)，症状一方面包括嗜睡和缺乏自发性(aspontaneity)，另一方面是解除抑制；进行性非流行性失语症(PNFA)，其中观察到由发音困难、语音和/或语法错误而导致的对言语流畅性的破坏，但保留词语理解；以及语义性痴呆(SD)，其中患者保持正常语音和语法的流利性，但在命名和词语理解方面的难度增加。所有FTD患者常见的其他认知症状包括执行功能和注意力损害。其他认知能力(包括知觉、空间技能、记忆和实践能力)通常保持不变。可以通过在结构性MRI扫描中观察额叶和/或前颞叶萎缩来诊断FTD。

存在许多形式的FTD，其中任何一种均可以使用本发明的方法和组合物进行治疗或预防。例如，额颞痴呆的一种形式是语义性痴呆(SD)。SD的特征在于是在口头和非口头领域中都丧失语义记忆。SD患者经常表现出抱怨找词困难。临床症状包括流畅性失语、忘名、对词义的理解能力受损，以及联想性视觉失认(无法匹配与语义相关的图片或对象)。随着疾病的发展，尽管病例因几乎没有后期行为症状而被描述为“纯粹的”语义性痴呆，但经常观察到行为和性格改变与额颞痴呆相似。结构性MRI成像显示颞叶中萎缩(主要在左侧)的特征性模式，下方受累高于上方受累(superior involvement)，且前方颞叶萎缩高于后方。

作为另一个实例，额颞痴呆的另一种形式是皮克病(PiD，也称PcD)。该疾病的一个明确特征是神经元中tau蛋白的累积，积聚成称为“皮克体(Pick bodies)”的银染色的球形聚集体。症状包括言语丧失(失语症)和痴呆。具有眶额叶功能障碍的患者可变得具有攻击性且不适于社交。他们可能会偷窃或表现出强迫性的或重复的刻板行为。具有背内侧或背外侧额叶功能障碍的患者可能表现为漠不关心、冷漠或自发性下降。患者可表现出没有自我监控、自我意识异常和无法体会含义。在双侧后外侧眶额叶皮质和右前脑岛中具有灰质丧失的患者可能表现出进食行为的变化，例如病态性喜食甜食。具有前外侧眶额叶皮质中更多病灶性灰质丧失的患者可能发展成食欲过盛。虽然一些症状最初可以得到缓解，但是该疾病继续发展并且患者经常在两到十年内死亡。

亨廷顿病。亨廷顿病(HD)是一种遗传性、进行性、神经退行性疾病，其特征在于情绪、行为和精神异常的发展；智力或认知功能丧失；以及运动异常(运动障碍)。HD的典型症状包括舞蹈症-可能影响面部、手臂、腿或躯干的不自主的、快速的、不规则的、生涩的运动-的发展以及认知衰退(包括逐渐丧失思维加工和后天的智力能力)。可能有记忆、抽象思维和判断力的损害；对时间、地点或身份的不正确感知(方向障碍)；增强躁动；以及性格变化(人格分裂)。虽然症状通常在生命的四五十岁期间变得明显，但是发病年龄是可变的，范围从幼儿早期到成年晚年(例如，70或70多岁，或者80或80多岁)。

HD在家族内以常染色体显性遗传传播。该疾病发生是由染色体4上的基因(4p16.3)内编码指令的序列或“重复”异常地长所致。与HD有关的神经系统功能的进行性丧失是由大脑某些区域(包括基底神经节和大脑皮层)中的神经元丧失造成的。

肌萎缩性侧索硬化症。肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种快速进行性的且必然致命的神经系统疾病，其攻击运动神经元。最初最常在手中注意到、其次在脚中注意到肌无力和萎缩以及前角细胞功能障碍的体征。发病部位是随机的，而且进展是不对称的。抽筋是常见的，并且可能先于无力。很少有病人能存活30年，50％死于发病3年内，20％存活5年，10％存活10年。诊断特征包括在成年中期或晚期发病，以及进行性的、广泛的运动受累(motorinvolvement)而没有感觉异常。神经传导速度正常，直到疾病晚期。最近的研究记录也出现认知损伤，尤其是即时言语记忆、视觉记忆、语言和执行功能的减弱。

已经报道，甚至在ALS患者的表现正常的神经元中出现细胞体面积、突触数量和总突触长度的减小。有人提出，当活动区的可塑性达到其极限时，突触的持续损失可导致功能损伤。促进形成新突触或预防突触丧失可以维持这些患者的神经元功能。

多发性硬化症。多发性硬化症(MS)的特征在于中枢神经系统功能障碍的各种症状和体征，伴有缓解及复发加重。最常表现的症状是在一个或多个肢体、在躯干，或在面部一侧的感觉异常；腿或手无力或笨拙；或视觉障碍，例如，一只眼睛部分失明和疼痛(眼球后视神经炎)，视力模糊或暗点。常见的认知损伤包括在记忆(获得、保留和再找回新信息)、注意力和集中力(特别是注意力分散)、信息处理、执行功能、视觉空间功能和言语流畅性方面的损伤。常见的早期症状是导致重影(复视)的眼肌麻痹，一肢或多肢的短暂性无力，肢体轻微僵硬或异常易疲劳，轻微步态功能障碍，膀胱控制困难，眩晕和轻度情绪障碍；这些均表明分散的中枢神经系统受累，并且经常在疾病被确认之前数月或数年发生。过热会加重症状和体征。

这个过程是高度可变的，不可预测的，并且在大多数患者中是间歇性的。起初，数月或数年的缓解可以将发作隔开，尤其是当疾病从后眼球视神经炎开始时。然而，一些患者经常发作，并且迅速丧失活力；对为数不多的患者，该过程可以是快速发展的。

青光眼。青光眼是影响视网膜神经节细胞(RGC)的常见神经退行性疾病。有证据支持在突触和树突中(包括在RGC中)存在分隔的退化程序(compartmentalizeddegeneration program)。最近的证据还表明老年人认知损伤与青光眼之间存在相关性(Yochim BP,et al.Prevalence of cognitive impairment,depression,and anxietysymptoms among older adults with glaucoma.J Glaucoma.2012；21(4):250-254)。

强直性肌营养不良。强直性肌营养不良(DM)是一种常染色体显性多系统疾病，其特征在于营养不良性肌无力和肌强直。分子缺陷是在染色体19q上肌强直-蛋白激酶基因的3'非翻译区中的扩增的三核苷酸(CTG)重复。症状可发生在任何年龄，临床严重程度的范围是广泛的。肌强直在手部肌肉中是突出的，即使在轻度病例中，上睑下垂也是常见的。在重度病例中，会出现明显的外周肌无力，通常伴有白内障、过早脱发、脸部消瘦、心律失常、睾丸萎缩和内分泌异常(例如糖尿病)。智力迟钝在严重的先天性形式中是常见的，而衰老相关的额叶和颞叶认知功能(特别是语言和执行功能)衰退在该疾病的较轻度的成年形式中被观察到。被严重影响的人在五十出头死亡。

痴呆。痴呆描述了具有严重影响思维和社交能力、足以干扰日常功能的症状的一类疾病。除了在上述讨论的衰老相关疾病的晚期阶段中观察到的痴呆以外，痴呆的其他实例还包括下文所述的血管性痴呆和路易体痴呆。

在血管性痴呆或“多发梗塞性痴呆”中，认知损伤是由向大脑供应血液的问题引起的，通常通过一系列的轻度中风引起，或者有时在一次大中风之前或之后的其他较小中风引起。血管病变可以是弥漫性脑血管疾病的结果，如小血管疾病或局灶性病变，或两者兼而有之。患有血管性痴呆的患者在急性脑血管事件后表现出急性或亚急性认知损伤，其后观察到进行性认知衰退。认知损伤与阿尔茨海默氏病中观察到的类似，包括语言、记忆、复杂的视觉加工或执行功能方面的损伤，但是大脑中的相关变化不是由AD病理学所致，而是由脑部血流长期减少所致，并最终导致痴呆。单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)神经成像可以与包括精神状态检查的评估结合用来确认多发梗塞性痴呆的诊断。

路易体痴呆(DLB，也有多个其他名称，包括路易氏体痴呆、弥漫性路易体病、皮层路易体病，以及老年性路易体型痴呆)是一种痴呆，其解剖学上的特征在于神经元中存在路易体(α-突触核蛋白和泛素蛋白的团块)，在死后脑组织学分析中可检测到。其主要特征是认知衰退，特别是执行功能衰退。警觉性和短期记忆将提高和减弱。伴有生动且详细的图案的持续的或反复发生的幻视往往是早期的诊断症状。DLB在其早期阶段通常与阿尔茨海默氏病和/或血管性痴呆混淆，但是，阿尔茨海默氏病通常相当缓慢地开始，而DLB通常具有快速或急性的发作。DLB症状还包括类似于帕金森病的运动症状。DLB与帕金森病中有时出现的痴呆的区别在于，痴呆症状相对于帕金森症状出现的期限。当痴呆发作在帕金森病发作后的一年以上时，诊断结果为帕金森病痴呆(PDD)。当认知症状与帕金森症状同时开始或者在帕金森症状一年内开始时，诊断为DLB。

进行性核上性麻痹。进行性核上性麻痹(PSP)是一种脑部疾病，其导致步态和平衡控制方面严重的和进行性的问题，伴随有复杂的眼球运动和思维问题。这种疾病的典型症状之一是眼睛无法正确瞄准，这是由大脑中协调眼球运动的区域中的损伤所致。有些个体把这种影响描述为模糊不清。受影响的个体经常表现出情绪和行为的改变，包括抑郁和冷漠以及进行性轻度痴呆。该疾病的长名称表明疾病缓慢开始并持续恶化(进行性)，并且通过损害控制眼睛运动的在称为核的、豌豆大小的结构上方(核上)的某些大脑部分而引起无力(麻痹)。PSP在1964年首次被描述为一种独特的疾病，当时有三位科学家发表了一篇论文，该论文将该病症与帕金森病区分开。它有时被称为Steele-Richardson-Olszewski综合征，反映了定义该疾病的科学家的名字组合。虽然PSP进行性地恶化，但没有人死于PSP本身。

共济失调。患有共济失调的人有协调问题，因为控制运动和平衡的神经系统部分受到影响。共济失调可影响手指、手、手臂、腿、身体、言语和眼球运动。“共济失调”这个词经常被用来描述与感染、损伤、其他疾病或中枢神经系统的退行性改变有关的不协调症状。共济失调也被用来表示称为遗传性和散发性共济失调的一组特定的神经系统退行性疾病，该疾病是国家共济失调基金会的主要重点。

多系统萎缩。多系统萎缩(MSA)是一种退行性神经障碍。MSA与大脑特定区域中神经细胞的退化有关。这种细胞退化引起身体的运动、平衡和其他自主功能方面如膀胱控制或血压调节的问题。MSA的原因是未知的，并且尚未确定具体的风险因素。约有55％的病例发生在男性中，典型的发病年龄在50多岁的后几年至60岁出头。MSA经常表现出与帕金森病相同的一些症状。然而，MSA患者一般对用于帕金森病的多巴胺药物表现最低限度的反应(如果有的话)。

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于减缓衰老相关的认知损伤的进展。换言之，在用所公开的方法治疗之后，与在用所公开的方法治疗之前或没有用所公开的方法进行治疗相比，个体的认知能力将更缓慢地衰退。在一些这样的情况下，本发明的治疗方法包括测量治疗后认知衰退的进展，并确定认知衰退的进展得到减缓。在一些这样的情况下，通过与参考进行比较来进行确定，所述参考例如治疗前个体的认知衰退速率，例如通过在施用本发明的血液制品前的两个或更多个时间点测量认知来确定。

本发明的方法和组合物还可用于稳定个体(例如，患有衰老相关的认知衰退的个体或有风险患上衰老相关的认知衰退的个体)的认知能力。例如，个体可以表现出一些衰老相关的认知损伤，并且在用所公开的方法进行治疗之前观察到的认知损伤的进展将会在用所公开的方法进行治疗之后停止。作为另一个实例，个体可能处于发展衰老相关的认知衰退的风险中(例如，个体的年龄可以是50岁更大，或者个体可能已经被诊断为患有衰老相关的疾病)，并且个体的认知能力基本上没有变化，即，与在用所公开的方法进行治疗之前相比，在用所公开的方法进行治疗之后，没有检测到认知衰退。

本发明的方法和组合物还可用于减轻患有衰老相关的认知损伤的个体的认知损伤。换言之，用本发明的方法进行治疗后，个体的认知能力提高。例如，相对于用本发明的方法进行治疗之前在个体中观察到的认知能力，在用本发明的方法进行治疗之后，个体的认知能力提高了例如2倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、15倍或更多、20倍或更多、30倍或更多或者40倍或更多，包括50倍或更多、60倍或更多、70倍或更多、80倍或更多、90倍或更多、或100倍或更多。在一些情况下，用本发明的方法和组合物进行的治疗恢复了患有衰老相关的认知衰退的个体的认知能力，例如恢复至个体大约40岁或更小时的认知能力水平。换言之，认知损伤消除。

组合疗法

本发明的活性剂可单独施用于受试者或与其他活性剂(即第二活性剂)组合施用。这样，在一些情况下，本发明的方法还包括给受试者施用至少一种其他化合物。可以使用任何便利的药剂。例如，TIMP活性剂可以单独提供或与一种或更多种其他药物组合提供，例如用于治疗衰老相关病症的药物，如胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、卡巴斯汀、加兰他敏、他克林)、美金刚、维生素E、西酞普兰(Celexa)、氟西汀(Prozac)、帕罗西汀(Paxil)、舍曲林(Zoloft)，、曲唑酮(Desyrel)、劳拉西泮(Ativan)、奥沙西泮(Serax)、阿立哌唑(Abilify)、氯氮平(Clozaril)、氟哌啶醇(Haldol)、奥氮平(Zyprexa)、喹硫平(Seroquel)、利培酮(Risperdal)和齐拉西酮(Geodon)；非TIMP多肽活性剂；例如趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)(即MCP1)；C-C基序趋化因子11(即趋化蛋白或嗜酸细胞激活趋化因子-1)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(即集落刺激因子2或CSF2)等。

术语“共同施用”和“与...组合”包括在没有特定的时间限制内同时(simultaneously)、同步(concurrently)或依次施用两种或更多种治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂同时存在于细胞内或受试者体内或同时发挥其生物学效果或治疗效果。在一个实施方案中，治疗剂在同一组合物或单位剂型中。在其他实施方案中，治疗剂在分开的组合物或单位剂型中。在某些实施方案中，可以在施用第二治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、伴随施用第二治疗剂或施用第二治疗剂之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一药剂。

已知的治疗药物与本发明的药物组合物的“伴随施用”是指在已知的治疗药物和本发明的组合物两者都具有治疗效果的时候施用药物和核苷类药剂。这种伴随施用可以包括相对于施用本发明的核苷类药剂而同步(即，同时)、优先或随后施用所述药物。两种药剂的施用途径可以不同，其中代表性的施用途径在下面更详细地描述。本领域普通技术人员不难确定施用特定药物和本发明的核苷类药剂的适当时机、顺序和剂量。

在一些实施方案中，在相对于彼此的24小时内，诸如在相对于彼此的12小时内、在相对于彼此的6小时内、在相对于彼此的3小时内或在相对于彼此的1小时内，将化合物施用给受试者。在某些实施方案中，在相对于彼此的1小时内施用化合物。在某些实施方案中，基本上同时施用化合物。基本上同时施用是指在相对于彼此约10分钟或更短，如相对于彼此5分钟或更短，或1分钟或更短的时间内给受试者施用化合物。

药物制剂

还提供了本发明的化合物的药物制剂。可将本发明的化合物纳入各种制剂中以施用给受试者。更具体地，本发明化合物可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。这些制剂可以被设计用于经由许多不同的途径施用，包括口服、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、透皮、气管内施用等。

在药物剂型中，化合物可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独地施用或与其它药学活性化合物以适当缔合的形式施用，以及组合施用。以下方法和赋形剂仅仅是示例性的，而绝不是限制性的。

含有活性成分的药物组合物可以是适于口服使用的形式，例如片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂或者糖浆剂或酏剂。旨在口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，这样的组合物可以含有一种或更多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以提供药学上优良可口的制剂。片剂含有与适用于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者它们可以用已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。片剂也可以用第4,256,108、4,166,452和4,265,874号美国专利中所描述的技术来包衣，从而形成控制释放的渗透性治疗片剂。

用于口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者作为软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

水性混悬剂含有与适于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性物质。这样的赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七亚乙基氧代鲸蜡醇(heptadecaethylene-oxycetanol)，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可含有一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙基酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或更多种着色剂；一种或更多种调味剂以及一种或更多种甜味剂，如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。

油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮于植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可以添加如上所述的甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存。

适用于通过加水制备水性混悬剂的可分散粉剂和颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、助悬剂以及一种或更多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂以上面已经提到的那些为例。其他赋形剂如甜味剂、调味剂和着色剂也可以存在。

本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油，或矿物油如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的磷脂如大豆卵磷脂，以及源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯如山梨糖醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。

糖浆剂和酏剂可以用甜味剂如甘油、丙二醇，山梨醇或蔗糖配制。这样的制剂还可以含有缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射的水性或油性混悬剂的形式。该混悬剂可以根据已知技术使用上面已经提到的那些合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如为在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中，可以使用水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌的不挥发性油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸用于制备注射剂。

可通过将化合物溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂如植物油或其他类似的油、合成的脂族酸甘油酯、高级脂族酸或丙二醇的酯中而将其配制成注射用制剂；如果需要的话，用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

化合物可以以气雾剂形式用于吸入施用。本发明的化合物可以配制至加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

此外，通过将化合物与各种基质如乳化基质或水溶性基质混合，可以将其制成栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂经直肠施用。栓剂可以包括诸如可可脂、碳蜡和聚乙二醇的赋形剂，所述赋形剂在体温下熔化，但在室温下固化。

本发明的化合物及其在局部施用时具有活性的药学上可接受的盐可以配制成透皮组合物或透皮递送装置(“贴剂”)。这样的组合物包括例如背衬、活性化合物储库、控制膜、衬里和接触粘合剂。这种透皮贴剂可以用于以受控的量连续或不连续地输注本发明的化合物。用于递送药剂的透皮贴剂的构建和使用在本领域是公知的。参见，例如，1991年6月11日授权的第5,023,252号美国专利，其全部内容通过引用在此并入本文。这样的贴剂可以被构建用于药剂的连续递送、脉冲式递送或按需递送。

任选地，药物组合物可以含有其他药学上可接受的成分，例如缓冲剂、表面活性剂、抗氧化剂、粘度调节剂、防腐剂等。这些组分中的每一种在本领域都是众所周知的。参见，例如第5,985,310号美国专利，其公开内容通过引用并入本文。

适用于本发明制剂的其他组分可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版(1985)中找到。在一个实施方案中，水性环糊精溶液还包含右旋葡萄糖，例如约5％右旋葡萄糖。

量级为每天每千克体重约0.01mg至约140mg的剂量水平在代表性实施方案中是有用的，或者可选地为每天每位患者约0.5mg至约7g。例如，可以通过每天每千克体重约0.01至50mg化合物，或者可选地每天每位患者约0.5mg至约3.5g的施用来有效治疗炎症。技术人员将容易理解，剂量水平可以根据具体化合物的作用、症状的严重程度和受试者对副作用的敏感性而变化。给定化合物的剂量由本领域技术人员通过各种手段容易地确定。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和具体的施用模式而变化。例如，旨在用于人类口服施用的制剂可以含有0.5mg至5g的活性剂，所述活性剂与合适且适当的量的载体材料混合，所述载体材料可以在总组合物的约5％至约95％之间变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg的活性成分，通常为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1000mg。

然而，应该理解，用于任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合和正在进行治疗的特定疾病的严重程度。

因此，可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位(例如茶匙、汤匙、片或栓)含由预定量的含有一种或更多种抑制剂的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以在组合物中包含抑制剂，所述组合物为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液的形式。本文使用的术语“单位剂型”是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理上分离的单位，每个单位含有预定量的本发明的化合物，所述预定量以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂联合足以产生所需效果的量来计算。本发明的新型单位剂型的规格取决于所用的具体拟肽化合物和要达到的效果，以及在宿主中与每种化合物相关的药效动力学。

试剂盒和系统

还提供了用于实施所述方法的实施方案(例如如上所述的那些实施方案)的试剂盒和系统。本文使用的术语“系统”是指存在于单一组合物或不同组合物中的两种或更多种不同活性剂的集合，所述两种或更多种不同的活性剂为了实施本发明的方法的目的而被集合在一起。术语“试剂盒”是指包装起来的一种或更多种活性剂。例如，用于实施本发明的方法的试剂盒和系统可以包括一种或更多种药物制剂。这样，在某些实施方案中，试剂盒可以包括作为一个或多个单位剂量存在的单一药物组合物，其中组合物可以包含一种或更多种表达抑制剂/活性抑制剂化合物。在其他实施方案中，试剂盒可以包括两种或更多种不同的药物组合物，每种药物组合物含有不同的活性化合物。

同样令人感兴趣的是用于本发明的试验中的试剂盒和系统，例如如上所述。这样的试剂盒和系统可以包括试验的一个或多个组分，例如编码融合蛋白的载体、酶底物、缓冲液等。

除了上述组分之外，本发明的试剂盒还包括实施本发明的方法的说明书。这些说明书可以以各种形式存在于本发明的试剂盒中，一个或更多个说明书可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是在合适的介质或基底上印刷的信息(例如其上印刷有信息的一张或多张纸)，在试剂盒的包装中的印刷信息，在包装插页中的印刷信息等。另一种方式是其上记录了信息的计算机可读介质，例如软盘、CD、便携式闪存驱动器等。另一个可以存在的方式是网站地址，可以通过互联网使用该网站地址来访问在远程站点上的信息。任何方便的方式均可以出现在试剂盒中。

提供以下实施例是为了说明而不是进行限制。

实验

一周内四次通过腹膜内注射将重组TIMP2蛋白以50μg/kg的浓度递送到老年野生型(C57Bl/6J)小鼠中。经处理的小鼠的大脑显示升高水平的活性神经元，即在海马齿状回亚区中表达即刻早期基因c-Fos的那些。在巴恩斯迷宫、筑巢和恐惧条件化评估之前，对老年野生型小鼠每隔一天给予八次(长期)TIMP2的腹膜内注射(50μg/kg)。行为测试显示，在TIMP2处理的小鼠中，所有三项任务中的表现均有显著改善。对老年野生型小鼠每隔一天单独地或与另一种认知促进因子CSF2一起给予七次(长期)TIMP2的腹膜内注射(50μg/kg)。TIMP2和TIMP2+CSF2小鼠的大脑显示齿状回中c-Fos+(活性)神经元的水平显著升高。

结果表明，TIMP2足以提高老年小鼠海马中表达c-Fos细胞的数量。当在更长的时间内进行全身施用时，TIMP2足以增加表达c-Fos的细胞的数量、逆转若干行为模式中的学习和记忆缺失、修复筑巢能力的损伤。上述结果表明，TIMP2适合为患有年龄相关认知损伤或降低突触功能的神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的患者提供认知(学习和记忆)益处。发明人的发现代表了对蛋白(TIMP2)的首次描述，这种蛋白随着年龄的增长而在血液中减少并且可以用来逆转突触可塑性方面的损伤以及年龄相关的学习和记忆缺失。当TIMP2全身性施用仅仅约2周时间时，TIMP2能够赋予增强的可塑性以及记忆和学习功能，而不需要直接递送到大脑。

老年小鼠中的全身TIMP2治疗强有力地改善了长时程增强效应，其是学习和记忆的细胞相关物。与对照(赋形剂)相比，从用重组TIMP2(腹膜内，50μg/kg)处理的老年野生型小鼠中分离的脑切片显示增强的长时程增强效应(LTP)。图1A中显示的是在刺激海马的穿通纤维后齿状回内的群体峰电位振幅(PSA)。图1B提供了图1A中所示的PSA的维持期的量化。(平均值+/-SEM；Student's t检验；*P<0.05)。

如在新位置识别任务中所评估的，全身TIMP2是海马依赖性空间记忆所必需的。在训练后24小时评估对象位置移动辨别之前，使用抗体介导的中和方法(60μg/kg)靶向年轻野生型小鼠中的TIMP2水平，持续大约一个月。(平均值±SEM；两因素ANOVA，随后Tukey事后检验；****P<0.0001)。结果显示在图2中。

目前还没有针对与正常脑衰老或神经变性有关的突触可塑性、学习/记忆以及其他认知能力显著降低的有效治疗。发明人鉴定了一种源自年轻的蛋白TIMP2，其具有很强复活活性。全身性施用TIMP2相对较短的疗程时，TIMP2能够赋予增强的可塑性以及记忆和学习功能，而不需要直接递送至大脑。TIMP2不是生长因子，也不是典型的免疫信号分子，这突显了一个额外的优势，即TIMP2提供了靶向大脑衰老过程的能力，而不提供可能损害其他器官系统的潜在致瘤或促炎分子。此外，与传统的小分子药物设计相比，利用血液中天然产生和发现的蛋白来限制认知功能障碍不太可能产生有害的副作用。

不存在有效的治疗剂以治疗CNS衰老导致的年龄相关的后果。发明人的方法允许对老年患者或那些患有认知损伤的其他患者使用TIMP2(一种通常由身体产生的蛋白)进行简便的全身治疗。

尽管附有条款(clauses)，本发明还由以下条款定义：

1.一种治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方法，所述方法包括：

以足以治疗成年哺乳动物的衰老相关病症的方式增强哺乳动物的TIMP活性。

2.根据条款1所述的方法，其中所述TIMP活性是TIMP1、TIMP2、TIMP3或TIMP4活性。

3.根据条款2所述的方法，其中所述TIMP活性是TIMP2活性。

4.根据条款1-3中任一项所述的方法，其中所述方法包括增强全身TIMP活性。

5.根据条款1-4中任一项所述的方法，其中所述方法包括增加所述哺乳动物的TIMP活性剂的全身水平。

6.根据条款5所述的方法，其中通过向所述哺乳动物施用TIMP活性剂来增加TIMP活性剂的全身水平。

7.根据条款6所述的方法，其中所述TIMP活性剂是TIMP多肽或其类似物。

8.根据条款7所述的方法，其中所述TIMP活性剂是TIMP多肽。

9.根据条款8所述的方法，其中所述TIMP多肽具有与SEQ ID NO：1-4中的任一个至少60％相同的序列。

10.根据条款1-5中任一项所述的方法，其中所述方法包括增强内源性TIMP编码序列的表达。

11.根据条款1-4中任一项所述的方法，其中所述方法包括增强受试者中的TIMP。

12.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

13.根据条款12所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。

14.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述成年哺乳动物是老年哺乳动物。

15.根据条款14所述的方法，其中所述老年哺乳动物是60岁或更老的人。

16.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述衰老相关病症包括认知损伤。

17.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述成年哺乳动物患有衰老相关病状。

18.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述衰老相关病症是认知衰退病症。

前面仅仅说明了本发明的原理。应该理解的是，本领域的技术人员将能够设计各种布置，所述各种布置尽管在本文中并没有明确地描述或示出，但它们体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及发明人为推进本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体描述的实例和条件。此外，本文中记载本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有描述均旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，这样的等同物旨在包括当前已知的等同物和未来将开发的等同物，即，执行相同功能而开发的任何成分，而不管其结构如何。因此，本发明的范围不旨在限于本文所示出和描述的示例性实施方案。确切地说，本发明的范围和精神由所附的权利要求来体现。

序列表

<110> 小利兰·斯坦福大学托管委员会

安东·怀斯科雷

约瑟夫·M .·卡斯特利亚诺

<120> 用于治疗衰老相关病症的方法和组合物

<130> STAN-1227WO

<150> US 62/175,981

<151> 2015-06-15

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Thr Leu Leu Arg Pro Ala Asp Ala Cys Ser Cys Ser Pro Val

20 25 30

His Pro Gln Gln Ala Phe Cys Asn Ala Asp Val Val Ile Arg Ala Lys

35 40 45

Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly Asn Asp Ile Tyr Gly Asn

50 55 60

Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys

65 70 75 80

Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile

100 105 110

Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met His Ile Thr Leu Cys Asp

115 120 125

Phe Ile Val Pro Trp Asp Thr Leu Ser Thr Thr Gln Lys Lys Ser Leu

130 135 140

Asn His Arg Tyr Gln Met Gly Cys Glu Cys Lys Ile Thr Arg Cys Pro

145 150 155 160

Met Ile Pro Cys Tyr Ile Ser Ser Pro Asp Glu Cys Leu Trp Met Asp

165 170 175

Trp Val Thr Glu Lys Asn Ile Asn Gly His Gln Ala Lys Phe Phe Ala

180 185 190

Cys Ile Lys Arg Ser Asp Gly Ser Cys Ala Trp Tyr Arg Gly Ala Ala

195 200 205

Pro Pro Lys Gln Glu Phe Leu Asp Ile Glu Asp Pro

210 215 220

<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His Pro Gln

20 25 30

Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly

35 40 45

Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys

50 55 60

Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp

65 70 75 80

Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe

85 90 95

His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu

100 105 110

Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp

115 120 125

Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr

130 135 140

Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys

145 150 155 160

Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln

165 170 175

Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg

180 185 190

Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala

195 200 205

<210> 3

<211> 211

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Thr Pro Trp Leu Gly Leu Ile Val Leu Leu Gly Ser Trp Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Trp Gly Ala Glu Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln

20 25 30

Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly

35 40 45

Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile

50 55 60

Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln

65 70 75 80

Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu

85 90 95

Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys

100 105 110

Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr

115 120 125

Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn

130 135 140

Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys

145 150 155 160

Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly

165 170 175

Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys

180 185 190

Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala

195 200 205

Thr Asp Pro

210

<210> 4

<211> 224

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Pro Gly Ser Pro Arg Pro Ala Pro Ser Trp Val Leu Leu Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Gly Leu Gly Glu Ala Cys Ser Cys

20 25 30

Ala Pro Ala His Pro Gln Gln His Ile Cys His Ser Ala Leu Val Ile

35 40 45

Arg Ala Lys Ile Ser Ser Glu Lys Val Val Pro Ala Ser Ala Asp Pro

50 55 60

Ala Asp Thr Glu Lys Met Leu Arg Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met

65 70 75 80

Phe Lys Gly Phe Glu Lys Val Lys Asp Val Gln Tyr Ile Tyr Thr Pro

85 90 95

Phe Asp Ser Ser Leu Cys Gly Val Lys Leu Glu Ala Asn Ser Gln Lys

100 105 110

Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Gln Val Leu Ser Asp Gly Lys Val Phe Ile

115 120 125

His Leu Cys Asn Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Asp Leu Ser Leu Val Gln

130 135 140

Arg Glu Ser Leu Asn His His Tyr His Leu Asn Cys Gly Cys Gln Ile

145 150 155 160

Thr Thr Cys Tyr Thr Val Pro Cys Thr Ile Ser Ala Pro Asn Glu Cys

165 170 175

Leu Trp Thr Asp Trp Leu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala

180 185 190

Gln His Tyr Val Cys Met Lys His Val Asp Gly Thr Cys Ser Trp Tyr

195 200 205

Arg Gly His Leu Pro Leu Arg Lys Glu Phe Val Asp Ile Val Gln Pro

210 215 220

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Arg Gly Val Phe Arg Arg

1 5

Claims (10)

1.金属蛋白酶2组织抑制剂（TIMP2）多肽、或编码所述TIMP2多肽的核酸在制备用于减轻成年哺乳动物的衰老相关的认知障碍或衰退的药物中的用途，所述药物的使用包括：

向所述成年哺乳动物施用所述TIMP2多肽、或编码所述TIMP2多肽的核酸，从而足够增强哺乳动物的TIMP活性，以减轻所述成年哺乳动物的衰老相关的认知障碍或衰退。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述使用包括增强全身TIMP2活性。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述使用包括增加所述哺乳动物的TIMP2活性剂的全身水平。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，所述衰老相关的认知障碍或衰退是阿尔茨海默氏病。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述TIMP2多肽具有与SEQ ID NO：1至少80%相同的序列。

6.根据权利要求1或2所述的用途，所述核酸包括增强TIMP2多肽表达的核酸。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述成年哺乳动物是老年哺乳动物。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述灵长类动物是人类。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述灵长类动物大于50岁。

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