JP2020518261A - C末端cdnf断片及びc末端manf断片、それらを含む医薬組成物、並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
に記載の配列、又は配列番号1の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなるC末端CDNF断片を提供することである。
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系(CNS)疾患を含む変性疾患又は障害の治療に使用するためのC末端MANF断片を提供することである。
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、1型又は2型糖尿病又は網膜疾患の治療に使用するためのC末端MANF断片を提供することである。
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
に記載の配列、又は配列番号1の配列と少なくとも90%相同である配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなるC末端CDNF断片を提供する。
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%相同である配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなるC末端MANF断片に関する。
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECXXCAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
(式中、Xは任意のアミノ酸)
の配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなる。
KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
の配列、又は配列番号4の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列を有する。
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系(CNS)疾患を含む変性疾患又は障害の治療に用いるためのC末端MANF断片に関する。
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%相同である配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、1型又は2型糖尿病の治療に用いるためのC末端MANF断片に関する。
QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCXXC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
(式中、Xは任意のアミノ酸)
の配列の少なくとも50個の連続しミノ酸残基からなる。
KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
の配列、又は配列番号5の配列と少なくとも90%相同である配列を有する。
KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
の配列、又は配列番号4の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列を有するC−CDNF断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
交感神経ニューロンの培養のため(非特許文献15、非特許文献25、非特許文献26、非特許文献27、非特許文献28)、出生後(P)0〜3日のマウスの上頸神経節をコラゲナーゼ(2.5mg/mL、ワージントン)、ディスパーゼ(5mg/mL、ロシュモレキュラーバイオケミカルズ)、及びトリプシン(10mg/mL、ワージントン)を用いて37°Cで45分間消化し、シリコン処理したガラスパスツールピペットで機械的に解離した。広範なプレプレーティングにより、非神経細胞を除去した。ほぼ純粋なニューロンを、ポリオルニチン/ラミニン(シグマ)でコーティングされた35mmプラスチックディッシュにおいて、ニューロベーサル培地及びB27サプリメント(インビトロジェン/ギブコ)中の小型標準マイクロアイランドで、30ng/mLのマウス神経成長因子(NGF)(プロメガ)の存在下で5〜6日間培養した。徹底的な洗浄と機能阻害抗NGF抗体(ロシュ)の添加によりNGFを除去した。ニューロンを、特別なニューロンマイクロインジェクション装置(非特許文献15、非特許文献25、非特許文献26、非特許文献27、非特許文献29)で圧力マイクロインジェクションした(非特許文献27、非特許文献30)。生存分析のため、マイクロアイランド上の全てのニューロンを実験の開始時(初期数)及び終了時(3日間)にカウントし、初期に対する割(%)で表した。
完全長(FL)又はカルボキシ末端(C)ドメインをコードする構築物を、TOPO/TAクローニングシステム(インビトロジェン)又は制限エンドヌクレアーゼを用いて、pCR3.1ベクター(インビトロジェン)に挿入した。pCR3.1ベクター中の完全長CDNFは、それぞれ537bp(179アミノ酸)及び561bp(187アミノ酸)のアミノ酸長であり、ERターゲティングのためのN末端シグナル配列を有する。C−CDNFは186bpの長さであり、FL−CDNFのアミノ酸127−187に相当する。
E811:シグナル配列を有するpCR3.1 hCDNF C−ヒトCDNF C末端配列。PCR及びインビトロジェンTAクローニングシステムによりクローニング。挿入サイズ207bp。DH5a細胞に形質転換。アンピシリン選択。シーケンシングにより検証済み。
ヒト組み換えCDNF(26アミノ酸長のシグナル配列と161アミノ酸長の成熟CDNF配列とを有する、187アミノ酸からなる完全長pre−CDNF)、ヒトN−CDNF(26アミノ酸のヒトCDNFシグナル配列と成熟CDNFのアミノ酸1〜アミノ酸100の部分とからなる)、及びヒトC−CDNF(アミノ酸101からアミノ酸161に及ぶ成熟CDNFのC末端ドメインと融合した26アミノ酸長のCDNFシグナル配列からなる)。
産生されたタンパク質は以下の配列を有した。
QEAGGRPGADCEVCKEFLNRFYKSLIDRGVNFSLDTIEKELISFCLDTKGKENRLCYYLGATKDAATKILSEVTRPMSVHMPAMKICEKLKKLDSQICELKYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL(配列番号7)
QEAGGRPGADCEVCKEFLNRFYKSLIDRGVNFSLDTIEKELISFCLDTKGKENRLCYYLGATKDAATKILSEVTRPMSVHMPAMKICEKLKKLDSQICEL(配列番号8)
KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL(配列番号4)
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL(配列番号9)
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICEL(配列番号10)
KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL(配列番号5)
ドーパミンニューロンを試験するため(非特許文献31、非特許文献32)、13.5日齢のNMRI系マウスの胚の腹側中脳から中脳底を切除した。組織を0.5%トリプシン(ICNバイオケミカル)を用いてインキュベートした後、大きな先端熱加工パスツールピペットを用いて機械的に解離した。ニューロンを、ポリ−L−オルニチン(シグマ))でコーティングされた96ウェル培養プレート上で、N2サプリメント(インビトロジェン)を含むDMEM/F12培地(インビトロジェン)を用い、GDNF(100ng/mL)の存在下又は非存在下で、又は種々の濃度のCDNF、MANF、C−CDNF、及びC−MANFポリペプチドと共に5日間成長させた。実験の開始時に、同量のニューロンを各ウェルにプレーティングした。神経栄養因子を添加しない培養物を、ネガティブコントロールとした。中脳培養物はいくつかのニューロン種を含むため、培養物を固定し、ドーパミン作動性ニューロンの特異的マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)(ミリポア)に対する抗体で免疫染色した。各ウェルの画像をCellInsight(商標)でスキャンし、免疫陽性ニューロンをCellProfiler及びCellProfiler解析ソフトウェアでカウントした。データを、GDNF保持TH陽性ニューロンに対する割合(%)として表す。全ての実験を、独立した培養で少なくとも3回繰り返した。結果を平均SEMで表し、有意性について一元配置分散分析及びTukeyの事後検定、又は2−両側Studentのt検定のいずれかによりテストした。帰無仮説はp≦0.05で棄却した。
ラクトペルオキシダーゼ法を用いて、CDNF、C−CDNF、及びC−MANFを125I−Naでヨウ素化した。問題のタンパク質を30μLの0.25Mリン酸緩衝液(pH7.5)に溶解し、125I−Na(1mCi/2.8μL、1mCi=37mBq、GEヘルスケア)と混合した。50μg/mLのラクトペルオキシダーゼ10μLと0.05%H2O2とを加えることにより、反応を開始した。混合物を室温で20分間インキュベートし、0.1M NaI、0.4M NaClを含む3容量の0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)を加えて反応を停止した後、25μLの2.5%BSAを加えた。Sephadex G−25カラム(PM10、GEヘルスケア)でのゲルろ過により、遊離ヨウ素とヨウ素化タンパク質とを分離した。カラムの平衡と溶出には、1%BSAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)を使用した。場合によっては、ヨウ素化成長因子をYM−10 Centriconカラム(ミリポア)を用いて濃縮した。125I標識CDNF、C−CDNF、N−CDNF、C-MANF、及びN-MANFの比活性を、Wizard3 1480自動ガンマカウンター(パーキンエルマー、ウォラック)で測定したところ、約108cpm/μgタンパク質であった。標識タンパク質を4°Cに保ち、標識後3週間以内に使用した。
24ウェルプレート上で成長させたマウスの培養El3.5ドーパミンニューロンを、ウェルあたり30,000cpmのヨウ素化CDNF又はC−CDNFと共に37℃で2時間インキュベートした。細胞を氷に移し、0.5mLの氷冷培地で1回洗浄した。次に、細胞をエッペンドルフチューブに移し、4℃で0.2M酢酸、0.5M NaCl(pH2.8)で1回洗浄した。1000gで10分間遠心分離した後、細胞を0.5mLの0.5N NaOHに溶解し、Wizard3 1480自動ガンマカウンター(パーキンエルマー、ウォラック)でカウントした。
125I-CDNF、125IC−CDNF、又は125IC−MANF(全てのタンパク質について10μL中106cpm)を、成体雄ウィスターラットに皮下注射した。2時間後に動物にPBSを灌流した。ガンマカウンターにより、種々の脳領域で放射能を分析した。データを平均±SEMで示す。群間の違いをANOVAで分析した後、Tukey−Kramer事後検定を行った。
ラットPC6.3褐色細胞腫細胞を、24ウェルプレート上で、10%FCS及び5%ウマ血清を含むDMEM培養液で成長させた。細胞をPBSで洗浄し、ウェルあたり30,000cpmのヨウ素化CDNF、C−CDNF、又はC−MANFと共に37℃で90分間インキュベートした。細胞を氷上に置き、0.5mLの氷冷培地で1回洗浄した。次に、細胞をエッペンドルフチューブに移し、0.2M酢酸、0.5M NaCl(pH2.8)で1回洗浄した。1000gで10分間遠心分離した後、細胞を0.5mLの0.5N NaOHに溶解し、Wizard3 1480自動ガンマカウンター(パーキンエルマー、ウォラック)でカウントした。
PDの神経修復モデルでは、前述のようにラットを6−OHDAで損傷させた(非特許文献4、非特許文献5、非特許文献33)。簡単に説明すれば、ラットに対し、イソフルラン麻酔下で、左線条体に3×2μgの6−OHDAを片側定位注射(10°の角度)した(ブレグマ及び硬膜に対する座標A/P +1.6;L/M −2.8;D/V −6、A/P 0.0:L/M −4.1;D/V −5.5、及びA/P −1.2;L/M −4.5;D/V −5.5)。2週間後、アンフェタミン誘発回転の結果(損傷のサイズ)に基づいて、ラットを群分けした。その後、CDNF(10μg)、C−CDNF(CDNF10μgと等モル)、及びN-CDNF(CDNF10μgと等モル)を、6−OHDAと同じ座標を使用してラットに線条体内注射した。ラットを群分けした後の参照実験では、浸透圧ミニポンプを皮下に挿入し、カニューレを損傷線条体に入れた。ミニポンプによりMANF4(即ち、MANFペプチドCKGC、特許文献4参照)、GDNF、又はビヒクル溶液を線条体へ2週間送達した後、ミニポンプとカニューレを取り除いた。ニューロン内部において、6−OHDAは相乗的に作用する以下の2つの作用を有する:1)サイトゾルに蓄積し、酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルを形成する、2)ミトコンドリア呼吸鎖複合体I及びIVの強力阻害剤である。ノルアドレナリン作動性ニューロンは、NAT阻害剤デシプラミンを用いて(15mg/kg、腹腔内投与、6−OHDA注射の30分前)、保護した。片側損傷のサイズ及び治療効果を、CDNF、C−CDNF、N−CDNF、及びPBS処理ラットを対象とした実験では損傷から2、4、6、及び8週間後に、MANF4及びGDNFを対象とした参照実験では1、4、8、10、及び12週後に、アンフェタミン誘発回転行動で測定した。アンフェタミンに誘発される(2.5mg/kg、腹腔内投与)完全な(360°)同側及び反対側への回転数を、30分間の馴化期間の後、120分間記録した。結果を損傷側への正味同側回転で表す。除外基準は、平均(正味回転数)±2×STDEVとした。
灌流及び組織処理。神経修復試験の直後、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与(90mg/kg、腹腔内投与、オリオンファーマ)によりラットに麻酔をかけ、PBSで、続いて0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒドで心内灌流した。脳を摘出し、後固定を4時間行い、20%スクロースを含むリン酸ナトリウム緩衝液に4℃で保存した。厚さ40μmの連続冠状凍結切片をスライド式ミクロトームで切り出した。他に記載されているように(非特許文献4)、免疫組織化学を行った。灌流した脳を、4℃で一晩、パラホルムアルデヒド中で後固定し、20%スクロース中で保存した。脳を、6つの連続した厚さ40μmの切片にカットした。浮動性切片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性を0.3%過酸化水素(シグマアルドリッチ)でクエンチした。抗体の非特異的結合をブロックするために、切片をブロッキング緩衝液(1×PBS中の4%ウシ血清アルブミン及び0.1%Triton X−100)で1時間インキュベートした。切片を、4°Cで、ブロッキング緩衝液中のマウスモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体(1:2,000、カタログ番号MAB318、RRID:AB_2201528、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州)で一晩インキュベートした後、ビオチン化二次抗体(1:200、抗ラット又は抗マウス、ベクター、バーリンゲーム、カリフォルニア州)でインキュベートした。アビジン−ビオチン−酵素複合体(ABCキット、ベクター)で染色を増強し、色素原としての3’,3’−ジアミノベンジジンを用いてシグナルを可視化した。
黒質緻密部(SNpc)のTH陽性細胞について、ブレグマに対しておよそA/P −4.5〜−6.0のSNpcにまたがる6つの切片から分析した。3DHistechスキャナーで得られた画像から、Matlab(RRID:nlx_153890、マスワークス、ネイティック、マサチューセッツ州)アルゴリズムを用いて細胞をカウントした。スキャナーの解像度は、×20NA0.8対物で0.24μm/ピクセルとした。
線条体のTH陽性神経突起の吸光度は、各ラットのブレグマに対しておよそA/P +2.2、+0.84、及び−0.12の3つの線条体切片で測定した。バックグラウンドシグナルを減らすために、切片を自動スキャナー(3DHistech、ブダペスト、ハンガリー;ヘルシンキ大学バイオテクノロジー研究所が提供するスキャンサービス)でスキャンし、画像を16ビットグレースケールに変換した。脳梁にはTHシグナルがないため、それを非特異的バックグラウンド染色の尺度として用いた。得られた画像から、面積当たりの総密度(integrated densities)をImageJ(NIH)で分析した。データを、健側に対する割合(%)で表す。
8週齢の雌の処女C57bl6Rccマウスから膵島を単離した。膵島を成長培地中で一晩回復させ、翌日、同数の膵島/ウェル(70/ウェル)を胎盤性ラクトゲン(PL 500ng/mL)、C−MANF、又はMANFで5日間処理した。培地の半分を、成長因子を含む新鮮な培地に毎日交換した。BrdUに代わるヌクレオシド類似体Edu(Click−iT(登録商標)Edu増殖キット、インビトロジェン)を、膵島採取の48時間前に添加した。膵島をトリプシンで破壊し、細胞遠心分離機のスライドガラス上に遠心分離した。サイトスピン及び増殖細胞をClick−iT AlexaFluorアジド発色試薬で染色した後、固定し、4℃で一晩インスリン染色(モルモット1:200、アブカム、ケンブリッジ、英国)してベータ細胞を検出した。細胞を洗浄し、Alexa Fluor(登録商標)488(1:400、モレキュラープローブス、ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国)と結合した二次抗体で染色した。スライドを、DAPI(ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国)を含むベクタシールドマウンティング媒体(Vectashield mounting medium)でマウントした。12個の画像(倍率10倍)を、40×/Plan−Apochromat/0.95 Corr M27、及び63×/Plan−Apochromat/1.40 Oil/M27、及び483 AxioCam HRmカメラを装備した蛍光Zeiss AxioImager M2 482落射蛍光顕微鏡で、AxioVision4ソフトウェアを用いて取得し、Image Pro Plusソフトウェア(メディアサイバネティクス、ベセスダ、メリーランド州、米国)により分析し、DAPI陽性核の数を定量した。増殖中のベータ細胞の相対数を定量し、3〜5反復/処理のウェルと比較した。
トランスジェニックSOD1 G93Aマウスを、この試験におけるALSのトランスジェニックマウスモデルとした。種々のヒトSOD1変異を含むトランスジェニックマウスは、進行性の神経変性及び運動ニューロン(MN)死を発症し、前臨床試験で一般的に使用され、FALSの病因の理解に大きく貢献している動物モデルを提供する(非特許文献34)。トランスジェニックSOD1マウスは、常染色体優性様式で伝染するALS様の臨床的特徴を示す。これらのマウスでは、後肢の脱力と振戦様運動が初期症状として8〜10週齢で現れ、その後、進行性の運動麻痺及び神経原性筋萎縮等の主要な症状が現れる(非特許文献35)。これらのマウスは、その後、歩行、飲食の障害を示し、数週間以内に、通常14〜16週齢で死亡する。グリシン93をアラニンに変異させたヒトSOD1を保有するトランスジェニックマウスは、元々The Jackson Laboratory(http://www.jax.org、バーハーバー、メイン州、系統B6SJL−TgN(SOD1−G93A)1Gur)から入手した。トランスジェニック発現は、DNAテールテスト及びPCRで、他者が以前行った特定のオリゴヌクレオチド及び条件を用いて(Jackson Labのホームページ参照)、分析した。全ての実験において、野生型B6SJL−TgN(SOD1)2Gurをコントロールとして含めた。
単回投与実験において、約13週齢のマウスに、イソフルラン麻酔下でPBS又はC−CDNF(PBSで希釈した、完全長CDNF10μgと等モルである3.75μg)を脳室内に単回注射した。その後、病気の徴候及び体重変化について、マウスを週2回評価した。評価は、マウスの運動活動を評価するように考案された、ロータロッド等のテストを含む一連の行動テストにより完了した。
ジャクソン研究所からの説明書を用いてSOD1マウスの臨床スコアリングを行った。マウスを、12週齢になった後、週に2回注意深く検査した。動物を尾の付け根でそっと持ち上げ、震え、こわばり、手足を伸ばす能力を観察することにより、採点した。臨床スコアリングは、ALSTDI(ALSセラピー開発研究所)の後肢神経スコアリングシステムに基づいた1〜5段階である。
ロータロッドでは、マウスを回転ロッド(加速度4〜40rpm/分)に置いた(ウゴバジレ、イタリア)。カットオフ時間を4分とした。ロータロッド試験は、マウスが12週齢になった後、週に2回行った。
オスのSprague Dawleyラット(体重230〜270g、エンヴィーゴ、オランダ)を実験に用いた。当該実験は、実験動物の管理と使用に関するEU指令2010/63/EUの3R原則(現地の法律及び規制)に従って実施し、フィンランド国立動物実験委員会により承認された。全ての実験を盲検法で行い、ラットを異なる治療群にランダムに割り当てた。ラットに抱水クロラール(0.4g/kg、腹腔内投与)で麻酔をかけた。皮質脳卒中を、上述ように(非特許文献36)、遠位中大脳動脈(dMCA)を両側総頸動脈(CCA)閉塞とともに60分間閉塞することにより誘発した。簡単に説明すれば、両側CCAを特定し、腹側正中頸部切開により単離した。ラットを定位固定装置に入れ、開頭術を右半球で行った。右(MCA)を10−0縫合糸で結紮し、両側総頸動脈(CCA)を非外傷性動脈クランプで60分間結紮した。虚血の60分後、MCAの周囲の縫合糸及びCCAの動脈クリップを取り外して、再灌流障害を誘導した。麻酔から回復後、ラットをホームケージに戻した。手術中及び手術後の体温を37℃に維持した。
野生型マウスに、3週間、週に2回C−CDNF(0.17mg/kg、1.77又は17.7mg/kg)を注射した。マウスの自発運動を、C−CDNF皮下注射の直後に週に1回、オープンフィールド試験で60分間測定した。C−CDNF皮下注射を繰り返しても体重の変化は見られなかった。コントロール群とC−CDNFの投与を受けた群との間で、行動パターンの統計的差異は検出されなかった。結果を図15に示す。
成体ウィスターラットに、座標:A/P +0.7;L/M +2.8;D/V −6.0へのキノリン酸(QA)225nmolの片側線条体内注射を単回投与した。キノリン酸は、興奮毒性プロセスにより線条体ニューロンの死を誘導する毒素である。2週間後、ラットに対し、同じ座標へPBS、CDNF(10マイクログラム)、C−CDNF(等モル量のCDNFに相当する量)の線条体内注射を単回投与した。処理を開始する前に、ラットを群にランダムに分けた。ロータロッド及び握力テストを毎週行った。
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引用特許文献:
欧州特許第58481号明細書
欧州特許第1969003号明細書
米国特許3773919号明細書
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国際公開第2009/133247号
国際公開第2013/034805号
国際公開第2014/191630号
国際公開第2016/057579号
Claims (45)
- 配列番号1:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
に記載の配列、又は配列番号1の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、細胞膜透過性ペプチドであり、神経細胞に対する保護効果を有する、医薬として使用するためのC末端CDNF断片。 - 変性疾患又は障害の治療における、請求項1に記載の使用のための断片。
- 前記変性疾患が神経変性疾患である、請求項2に記載の使用のための断片。
- 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病、外傷性脳損傷、薬物中毒、及び脳卒中からなる群から選択される中枢神経系(CNS)疾患である、請求項3に記載の使用のための断片。
- 前記CNS疾患がパーキンソン病である、請求項4に記載の使用のための断片。
- I型又はII型糖尿病の治療における、請求項2に記載の使用のための断片。
- 筋萎縮性側索硬化症の治療における、請求項3に記載の使用のための断片。
- 網膜色素変性症等の網膜障害の治療における、請求項2に記載の使用のための断片。
- 静脈内投与、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、経皮、脳内、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与されるか、又は、ウイルス発現ベクターを介して投与される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 前記静脈内投与が末梢投与である、請求項9に記載の使用のための断片。
- 配列番号1の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する前記配列が、配列番号3:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECXXCAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
(Xは任意のアミノ酸)
の配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用のための断片。 - 配列番号1の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する前記配列が、配列番号1の位置52〜55に配列CKGCを含む、請求項11に記載の使用のための断片。
- 配列番号4:
KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
の配列、又は配列番号4の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用のための断片。 - 配列番号1の位置81にC末端アミノ酸Lを含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 配列番号1の位置78〜81に相当するER残留シグナルKTELを欠く、請求項1〜13のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 好ましくはC末端のアミド化及びN末端のアセチル化からなる群から選択される酵素分解から前記断片を保護する修飾を更に含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 検出可能な化学的又は生化学的部分に更に結合している、請求項1〜16のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 細胞透過性ペプチドであり、ヒト血液脳関門を透過することができる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載のC末端CDNF断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、防腐剤、及び安定剤のうちの少なくとも1つとを含む、医薬組成物。
- 静脈内投与、好ましくは末梢投与、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、経皮、脳内、筋肉内、眼内、又は動脈内投与のための、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記C末端CDNF断片が、好ましくはC末端のアミド化及びN末端のアセチル化からなる群から選択される酵素分解から前記断片を保護する修飾を含む、請求項19又は20に記載の医薬組成物。
- 前記C末端CDNF断片が、検出可能な化学的又は生化学的部分に結合している、請求項19又は20に記載の医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項19〜22のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 変性疾患又は障害の治療における、請求項23に記載の使用のための医薬組成物。
- 前記変性疾患又は障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病、外傷性脳損傷、薬物中毒、及び脳卒中からなる群から選択される中枢神経系(CNS)疾患である、請求項24に記載の使用のための医薬組成物。
- I型又はII型糖尿病の治療に使用するための、請求項23に記載の医薬組成物。
- 網膜色素変性症等の網膜障害の治療に使用するための、請求項23に記載の医薬組成物。
- 配列番号2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内投与、好ましくは末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により好ましくは投与される、変性疾患又は障害の治療に使用するためのC末端MANF断片。 - 配列番号5:
KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
の配列、又は配列番号5の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列を有する、請求項28に記載の使用のための断片。 - 配列番号2の位置78にC末端アミノ酸Lを含む、請求項28又は29に記載の使用のための断片。
- 配列番号2の位置75〜78に相当するER残留シグナルRTDLを欠く、請求項28又は29に記載の使用のための断片。
- 好ましくはC末端のアミド化及びN末端のアセチル化からなる群から選択される酵素分解から前記断片を保護する修飾を更に含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 検出可能な化学的又は生化学的部分に更に結合している、請求項28〜32のいずれか一項に記載の使用のための断片。
用のための断片。 - 細胞透過性ペプチドであり、ヒト血液脳関門を透過することができる、請求項28〜32のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病、外傷性脳損傷、薬物中毒、及び脳卒中からなる群から選択される中枢神経系(CNS)疾患である、請求項28〜34のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 請求項28〜34のいずれか一項に記載のC末端MANF断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、防腐剤、及び安定剤のうちの少なくとも1つとを含み、前記断片が、静脈内投与、好ましくは末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系(CNS)疾患の治療に使用するための医薬組成物。
- 配列番号2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基からなり、1型又は2型糖尿病又は網膜疾患の治療に使用するためのC末端MANF断片。 - 配列番号5:
KYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
の配列、又は配列番号5の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列を有する、請求項37に記載の使用のための断片。 - 好ましくはC末端のアミド化及びN末端のアセチル化からなる群から選択される酵素分解から前記断片を保護する修飾を更に含む、請求項37又は38に記載の使用のための断片。
- 細胞透過性ペプチドであり、ヒト血液脳関門を透過することができる、請求項37〜39のいずれか一項に記載の使用のための断片。
- 請求項37又は38に記載のC末端MANF断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、防腐剤、及び安定剤のうちの少なくとも1つとを含み、1型又は2型糖尿病又は網膜疾患の治療に使用するための医薬組成物。
- 静脈内、好ましくは末梢投与のための、請求項41に記載の使用のための医薬組成物。
- 静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、経皮、脳内、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、請求項41に記載の使用のための医薬組成物。
- 配列番号1:
MPAMKICEKL KKLDSQICEL KYEKTLDLAS VDLRKMRVAE LKQILHSWGE ECRACAEKTD YVNLIQELAP KYAATHPKTE L
に記載の配列、又は配列番号1の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基を含む又はからなるC末端CDNF断片の有効量を患者に投与することを含む、変性疾患又は障害を治療する方法。 - 配列番号2:
ICEKLKKKDS QICELKYDKQ IDLSTVDLKK LRVKELKKIL DDWGETCKGC AEKSDYIRKI NELMPKYAPK AASARTDL
に記載の配列、又は配列番号2の配列と少なくとも90%の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも50個の連続アミノ酸残基を含む又はからなるC末端MANF断片の有効量を患者に投与することを含む、変性疾患、1型又は2型糖尿病、又は網膜疾患を治療する方法。
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