JP2008537736A - 抗原特異的t細胞の操作に有用な組換えmhc分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原結合およびT細胞受容体(TCR)認識を媒介する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子ドメインを含む組換えポリペプチド、ならびにこれらの組換えポリペプチドを組み入れかつ使用する関連の組成物および方法に関する。
本研究の局面は、米国立衛生研究所(第A143960号、第ESI0554号、第NS41965号、第5R42NS046877号、および第1R01NS047661号)、米国多発性硬化症協会(第RG3012A号および第RG3468号)、および米退役軍人局による助成金により支援された。米国政府は、本内容において一定の権利を有する。
本出願は、2005年3月18日に出願された米国仮特許出願第60/663,048号、2005年8月31日に出願された米国仮特許出願第60/713,230号、および代理人整理番号第OHSU-1-0403号において2006年3月10日に出願された「抗原特異的T細胞の操作に有用な組換えMHC分子(Recombinant MHC Molecules Useful For Manipulation Of Antigen-Specific T Cells)」という表題の米国本出願に関連すると同時に、これらの全優先権を主張し、これら優先出願はそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられる。
哺乳動物において特定の抗原に対する免疫反応は、主要組織適合(MHC)複合体によるT細胞へのその抗原の提示によって開始される。MHC複合体は抗原提示細胞(APC)の表面上にあり、MHCの3次元構造は提示される抗原がうまく納まる溝または裂け目を有する。T細胞上の適当な受容体が、必要な共刺激シグナルの存在下でAPC上のMHC/抗原複合体と相互作用すると、T細胞が刺激され、細胞傷害性T細胞の機能誘導、B細胞の機能誘導およびサイトカイン産生促進を含む、よく特徴付けられた免疫系活性化事象カスケードの様々な局面を誘発する。
本発明は、MHC分子の抗原を結合する裂け目を決定するドメインだけを含む組換えポリペプチドを用いることにより、ヒトのMHC機能を含むがそれに限定されない哺乳動物のMHC機能を模倣することができるという知見に基づいている。これらの分子は、抗原特異的T細胞の検出、定量および精製に有用である。本明細書において提供される分子はまた、臨床および検査上の応用例において、抗原特異的T細胞を検出、定量および精製するため、T細胞でアネルギーを誘導するため、またはTサプレッサー細胞を誘導するため、同様に、T細胞を刺激するため、および自己免疫疾患および神経変性疾患を含むがそれに限定されない抗原特異的T細胞が仲介する疾患を処置するためにも用いることができる。
本発明の様々な態様の検討を容易にするため、以下の用語の定義および略語の説明を提供する。
共有結合しているMHCクラスII分子のα1およびβ1ドメインを含む組換えポリペプチド。適切な高次構造を確実にするため、ポリペプチドは、β1ドメインのカルボキシ末端がα1ドメインのアミノ末端に共有結合するような配向をとる。1つの態様において、ポリペプチドはヒトβ1α1ポリペプチドであり、ヒトMHCクラスII分子のα1およびβ1ドメインを含む。ヒトβ1α1ポリペプチドの1つの特定の非限定的な例は、β1ドメインのカルボキシ末端がHLA-DR分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合している分子である。ヒトβ1α1ポリペプチドのさらなる特定の非限定的な例は、β1ドメインのカルボキシ末端がHLA-DR(AまたはBのいずれか)、HLA-DP(AおよびB)、およびHLA-DQ(AおよびB)分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合している分子である。1つの態様において、β1α1ポリペプチドはβ2ドメインを含まない。別の態様において、β1α1ポリペプチドはα2を含まない。さらなる別の態様において、β1α1ポリペプチドはα2ドメインもβ2ドメインも含まない。
β1α1ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター領域を含む組換え核酸配列。1つの態様において、β1α1ポリペプチドはヒトβ1α1ポリペプチドである。
共有結合しているMHCクラスI分子のα1およびα2ドメインを含むポリペプチド。ポリペプチドは、α1ドメインのカルボキシ末端がα2ドメインのアミノ末端に共有結合するような配向をとる。α1α2ポリペプチドはクラスIα鎖全体に満たないクラスIα鎖を含み、通常はα鎖のα3ドメインの大部分またはすべてを除外する。α1α2ポリペプチドの特定の非限定的な例は、α1ドメインのカルボキシ末端がHLA-A、-B、または-C分子のα2ドメインのアミノ末端に共有結合しているポリペプチドである。1つの態様において、α3ドメインはα1α2ポリペプチドから除外され、したがってα1α2ポリペプチドはα3ドメインを含まない。
α1α2ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター領域を含む組換え核酸配列。
動物に注射または吸収される組成物を含む、動物において抗体の産生またはT細胞応答を促進し得る化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、関連する抗原性エピトープおよび抗原決定基をすべて含む。
抗原性ペプチドを処理し、クラスII MHC分子と共同してこれを提示し、T細胞活性化に必要な共刺激シグナルを送達し得る任意の細胞。典型的な抗原提示細胞には、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、胸腺上皮細胞、および血管内皮細胞が含まれる。
免疫系が内在性抗原に対して免疫応答(例えば、B細胞またはT細胞応答)を生じ、結果として組織に対する損傷を生じる疾患。このような疾患には、これらに限定されないが、移植片拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、T細胞媒介性肺疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、肺線維症、または特発性肺線維症が含まれる。
CD8+ T細胞に対する抗原の提示により実行される免疫応答。
内部の非コード部分(イントロン)および転写を決定する制御配列を欠いたDNA断片。cDNAは実験室において、細胞から抽出したメッセンジャーRNAから逆転写によって合成される。
細胞によって作製される、リンパ球などの他の細胞の挙動に影響を及ぼすタンパク質。1つの態様において、サイトカインは、細胞輸送に影響する分子であるケモカインである。
ポリペプチドまたはタンパク質のドメインとは、特定の機能に一致し得るアミノ酸配列の独立した部分である。例えば、MHCクラスII分子を構成するαおよびβポリペプチドは、それぞれ2つのドメインα1、α2およびβ1、β2を有することがそれぞれ認められている。同様に、MHCクラスI分子のα鎖は、3つのドメインα1、α2、およびα3を有することが認められている。これら各分子の種々のドメインは典型的に、アミノ酸配列の連結により結合されている。本発明の1つの態様においては、リンカーまたは隣接ドメインのすべてまたは一部を含むように配列を伸長して、全ドメイン配列を組換え分子内に含める。例えば、HLA-DR Aのα1ドメインを選択する場合、選択する配列は一般にα鎖のアミノ酸残基1位から全α1ドメインにわたって伸長し、アミノ酸残基約76〜90(α1ドメインとα2ドメインの間に位置するα1ドメインのカルボキシ末端)に位置するリンカー配列のすべてまたは一部を含むことになる。種々のMHC分子ドメインの正確なアミノ酸番号は哺乳動物の種に応じて、および種内の遺伝子のクラス間で異なる。組換え分子に使用するための配列を選択する上で重要な局面は、アミノ酸番号に基づく正確な構造定義よりもむしろドメイン機能の維持である。当業者であれば、ドメイン機能は、選択したドメインの全アミノ酸配列よりも幾分少ないものを用いても維持され得ることを理解すると思われる。例えば、ドメイン機能に影響を及ぼすことなく、α1ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端でいくつかのアミノ酸を削除することができる。しかしながら典型的には、ドメイン配列のいずれかの末端で削除されるアミノ酸の数は10以下で、より典型的には5アミノ酸以下である。選択した特定ドメインの機能活性は、以下で詳述する通り抗原特異的T細胞増殖アッセイ法を用いて、本発明によって提供される2ドメインMHCポリペプチド(すなわち、クラスIIβ1α1またはクラスIα1α2ポリペプチド)の状況で評価することができる。例えば、特定のβ1ドメインを試験するには、β1α1分子が生成されるようにこのドメインを機能的なα1ドメインに連結し、次いで記載のアッセイ法で試験する。生物活性のあるβ1α1またはα1α2ポリペプチドは抗原特異的T細胞の増殖を少なくとも約50%阻害し、したがって成分ドメインが機能的であることが示される。典型的に、このようなポリペプチドは、このアッセイ系においてT細胞の増殖を少なくとも75%、場合によっては約90%を上回って阻害する。
神経終末を絶縁する白質中の物質であるミエリンの消失。ミエリンは、神経が最高速度で脳からメッセージを受け取りこれを解釈するのを助ける。神経終末はこの物質を失った場合、適切に機能することができず、所々に瘢痕または硬化が生じる。
抗原決定基。これらは、抗原性のある、すなわち特定の免疫応答を誘発する分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は特定の抗原性エピトープと結合する。
本明細書に記載する結果と同様の結果をもたらす、抗原エピトープまたはβ1α1もしくはα1α2ペプチドにおける配列変化。このような配列変化には、これらに限定されないが、保存的置換、欠失、変異、フレームシフト、および挿入が含まれ得る。
160アミノ酸の長さを有するサブユニットのホモ二量体タンパク質であるサイトカイン。ヒトIL-10は、マウスIL-10と73パーセントのアミノ酸相同性を有する。ヒトIL-10遺伝子は4つのエキソンを含み、第1染色体にマッピングされる(総説に関しては、de Waal-Malefyt R et al., Curr. Opin. Immunology 4:314-20, 1992;Howard and O'Garra, Immunology Today 13:198-200, 1992;Howard et al., J. Clin. Immunol. 12:239-47, 1992を参照されたい)。
刺激に対するB細胞またはT細胞などの免疫系細胞の応答。1つの態様において、応答は特定の抗原に特異的である(「抗原特異的応答」)。別の態様において、免疫応答はTh1、Th2、またはTh3応答などのT細胞応答である。さらなる別の態様において、免疫応答はサプレッサーT細胞の応答である。さらなる態様において、免疫応答は樹状細胞の応答である。
「単離された」核酸は、その核酸が天然に存在する生物の細胞中の他の核酸配列、すなわち他の染色体ならびに染色体外DNAおよびRNAから実質的に分離または精製されている。「単離された」という用語はしたがって、標準的な核酸精製法によって精製された核酸を包含する。この用語はまた、宿主細胞内で組換え発現によって調製された核酸および化学合成された核酸も包含する。
リンカー配列とは、2つのポリペプチドドメインを共有結合するアミノ酸配列である。リンカー配列を本発明の組換えMHCポリペプチド中に含めて、連結したポリペプチドドメインに回転自由を提供し、それにより適切なドメインの折り畳みならびにドメイン間およびドメイン内結合を促進することができる。一例として、Ag-β1-α1(Ag=抗原)を含む組換えポリペプチドにおいて、リンカー配列は、Agドメインとβ1ドメインとの間およびβ1ドメインとα1ドメインとの間に提供され得る。リンカー配列は一般に2〜25アミノ酸長であって当技術分野において周知であり、これにはChaudhary et al. (1989)によって記載されているグリシン(4)-セリンスペーサーが含まれるが、これに限定されるわけではない。他のリンカー配列は、以下の実施例の項に記載されている。
この用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、「患者」または「対象」という用語には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。
神経系の必須の細胞および/または組織成分の変質を引き起こす疾患。このような疾患には、これらに限定されないが、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症(PML)、播種性壊死性白質脳症(DNL)、急性播種性脳脊髄炎、シルダー病、橋中央ミエリン溶解(CPM)、放射線壊死、ビンスワンゲル病(SAE)、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、レーバー遺伝性視神経萎縮、およびHTLV関連脊髄症が含まれる。
第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係に置かれている場合に、第一核酸配列は第二核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は隣接しており、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、オープンリーディングフレームを整列させる。
終止コドンをもたない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット(コドン)。これらの配列は通常、ポリペプチドに翻訳可能である。
対象に適切に投与した場合に、所望の処置または予防効果を誘導できる化合物または組成物。
本明細書に記載のポリペプチドおよび核酸と共に有用な薬学的に許容される担体は、従来の担体である。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)には、本明細書に記載の融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
疾患を「予防する(防ぐ)」とは、例えば自己免疫疾患または神経変性疾患などの疾患になりやすい傾向にあることがわかっている人において、疾患の完全な発症を抑制することを指す。公知の素因を有する人の例は、家族に糖尿病歴のある者、または疾患の遺伝子マーカーを有する者、または対象を狼蒼もしくは関節リウマチなどの状態になりやすくする因子に曝露されたことのある者である。また「疾患を予防する(防ぐ)こと」により、公知の素因を有してまたは有さずに症状を表しているかまたは現時点で寛解期にある人において、疾患の進行を停止させるかまたは疾患の再発を阻止することができる。「処置」とは、疾患または病的状態の徴候または症状が発症し始めた後に、これを改善する治療的介入を指す。処置の有効性は、疾患の徴候もしくは症状の減少、または疾患の進行の抑止もしくは好転、症状の再発の予防、または長期寛解より評価することができる。
核酸プローブおよびプライマーは、本発明によって提供される核酸に基づき容易に調製することができる。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に結合された単離された核酸を含む。典型的な標識には、放射性同位体、リガンド、化学発光物質、および酵素が含まれる。標識法および様々な目的のために適当な標識を選択する際の手引きが、例えばSambrook et al. (1989)およびAusubel et al. (1987)に述べられている。
精製されたという用語は絶対的な純度を要求するものではない。むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された組換えMHCタンパク質調製物は、含まれる組換えMHCタンパク質が細胞内の元の環境にあるタンパク質に比べて純度が高いものである。組換えMHCタンパク質の調製物は一般には、組換えMHCタンパク質が調製物の全タンパク質含量の少なくとも50%を示すように精製される。しかし、特定の適用にはより高度に精製された調製物が要求されることもある。例えば、そのような適用例に対しては、MHCタンパク質が全タンパク質含量の少なくとも75%、または少なくとも90%を構成する調製物を用いることができる。
組換え核酸またはポリペプチドは、天然には生じない配列を有するもの、または2つ以上の本来は分離している配列セグメントの人工的連結によって作られた配列を有するものである。この人工的連結は化学的合成によって達成されることが多く、またはより一般的には核酸の単離セグメントの人工的操作、例えば遺伝子工学的方法によって達成される。
アミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性によって表され、配列同一性とも呼ばれる。配列同一性は、同一性(または類似性もしくは相同性)のパーセンテージによって評価されることが多い。パーセンテージが高いほど2つの配列の類似性が高い。MHCドメインポリペプチドの変異体は、標準的方法を用いてアラインメントした場合、比較的高度の配列同一性を有することになる。(「MHCドメインポリペプチド」とは、MHCクラスIIポリペプチドのβ1もしくはα1ドメインまたはMHCクラスIポリペプチドのα1もしくはα2ドメインを意味する)。
疾患の進行を防ぐかもしくは疾患の退行をもたらすのに十分な、またはこれらに限定されないが、疼痛、腫脹、しびれ、痙性、めまい、眩暈、視覚障害、運動調節障害、平衡もしくは協調障害、腸管機能不全、および失調を含む、疾患によって生じる症状を軽減できる用量。
抗原に対する特定の免疫応答を生成する能力の減少または欠如。寛容は多くの場合、本明細書に記載する2ドメインMHC分子の存在下において抗原と接触させた結果として生じる。1つの態様においては、B細胞応答が減少するかまたは起こらない。別の態様においては、T細胞応答が減少するかまたは起こらない。または、T細胞応答およびB細胞応答の両方が減少するかまたは起こらない。
ウイルスまたはベクターは、これが核酸を細胞内に伝達した場合に細胞を「形質導入する」。細胞ゲノム中への核酸の取り込みによるかまたはエピソーム複製により、DNAが細胞によって安定に複製される場合に、細胞は細胞内に形質導入された核酸によって「形質転換される」。本明細書で使用する形質転換という用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、および微粒子銃加速による裸のDNAの導入を含め、核酸分子をそのような細胞内に導入することのできるすべての技法を包含する。
宿主細胞内に導入され、それによって形質転換宿主細胞を生成する核酸分子。ベクターは、複製起点など、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、当技術分野において公知である1つまたは複数の選択マーカー遺伝子およびその他の遺伝子エレメントを含み得る。「ベクター」という用語には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターも含まれる。
哺乳動物MHCクラスIIαおよびβ鎖タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野において周知で、GenBankを含む多数の供給源から入手することができる。例示的配列は、全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるAuffray et al. (1984)(ヒトHLA DQα)、Larhammar et al. (1983)(ヒトHLA DQβ)、Das et al. (1983)(ヒトHLA DRα)、Tonnelle et al. (1985)(ヒトHLA DRβ)、Lawrance et al. (1985)(ヒトHLA DPα)、Kelly et al. (1985)(ヒトHLA DPβ)、Syha et al. (1989)(ラットRT1.Bα)、Syha-Jedelhauser et al. (1991)(ラットRT1.Bβ)、Benoist et al. (1983)(マウスI-Aα)、Estess et al. (1986)(マウスI-Aβ)に提示されている。本発明の1つの態様においては、MHCクラスIIタンパク質はヒトのMHCクラスIIタンパク質である。
哺乳動物MHCクラスIα鎖タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野において周知で、GenBankを含む多数の供給源から入手することができる。例示的配列は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるBrowning et al. (1995)(ヒトHLA-A)、Kato et al. (1993)(ヒトHLA-B)、Steinle et al. (1992)(ヒトHLA-C)、Walter et al. (1995)(ラットIa)、Walter et al. (1994)(ラットIb)、Kress et al. (1983)(マウスH-2-K)、Schepart et al. (1986)(マウスH-2-D)、およびMoore et al. (1982)(マウスH-2-I)に提示されている。1つの態様において、MHCクラスIタンパク質はヒトのMHCクラスIタンパク質である。
本発明のクラスIIβ1α1およびクラスIα1α2ポリペプチドは一般に抗原性ペプチドと共に用いられる。クラスIまたはクラスII MHC分子と共有結合し、T細胞によって認識されるいかなる抗原性ペプチドも、この目的のために用いることができる。ミツバチ毒アレルゲン、チリダニアレルゲン、細菌によって産生される毒素(破傷風毒素など)および自己免疫疾患に関与するヒト組織抗原に由来する抗原性ペプチドを含む、いくつかの原料由来の抗原性ペプチドが詳細に特徴付けられている。このようなペプチドについての詳細な考察が、それぞれKendrichら、Sharmaら、およびClarkらの米国特許第5,595,881号、第5,468,481号、および第5,284,935号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。例示的なペプチドには、これらに限定されないが、慢性関節リウマチ(II型コラーゲン)、重症筋無力症(アセチルコリン受容体)、糖尿病(インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ)、橋本甲状腺炎(サイログロブリン)、グレーブス病(サイロドキシン)、ぶどう膜炎(S抗原)、炎症性腸疾患(Ach(アセチルコリン)受容体)、セリアック病(シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、食餌性ニワトリ卵白リゾチーム)、神経炎(百日咳毒素)、多発性筋炎(ミオシンB、ロスリバーウイルス)、糸球体腎炎(抗GBM血清)、自己免疫性甲状腺疾患(組換えマウスTPO細胞外ドメイン)、アジソン病(クレブシエラ菌を伴う同質遺伝子的副腎抽出物)、自己免疫性ぶどう膜網膜炎(網膜抽出物)、自己免疫性膵炎(ポリイノシン:ポリシチジル酸)、原発性胆汁性肝硬変(サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)Re595由来リポ多糖)、および多発性硬化症(ミエリン塩基性タンパク質)の病因において同定されたものが含まれる。
本発明のMHCポリペプチドをコードする核酸は、その最も基本的な形において、A-Bの構造を有する第一および第二の領域を含むが、ただしクラスI分子の場合には領域AはクラスIα1ドメインをコードし、領域BはクラスIα2ドメインをコードする。クラスII分子では、AはクラスIIα1ドメインをコードし、BはクラスIIβ1ドメインをコードする。リンカー配列が含まれる場合、核酸はB-L2-Aと表すことができ、ただしL2はリンカーペプチドをコードする核酸配列である。抗原性ペプチドがMHCポリペプチドに共有結合している場合、この複合体をコードする核酸分子はP-B-Aと表すことができる。コード配列がP-L2-B-L1-Aで表されるように、第二のリンカー配列が抗原性タンパク質と領域Bのポリペプチドとの間に提供されてもよい。いずれの場合にも、MHCポリペプチド(すなわち、L1、L2、B、AおよびP)を含む様々な核酸配列は、エレメントが単一のリーディングフレームに位置するように、機能的に連結される。
β1α1およびα1α2分子を空の形(すなわち、抗原性ペプチドが結合していない状態)で発現および精製した場合、抗原性ペプチドを標準の方法を用いて分子にのせることができる。抗原性ペプチドをMHC分子にのせるための方法は、例えば、その全体が本明細書に組み入れられるSharmaらに対する米国特許第5,468,481号に記載されている。このような方法には、精製したMHC分子と精製した抗原調製物との単純な共インキュベーションが含まれる。
(a) 配列の変異
前述の記載は、天然のMHCクラスIおよびクラスII分子と、これらの分子の様々なドメインを例として用いているが、当業者であれば、これらの分子およびドメインの変異体を前述と同じ方法で作製し、使用できることを理解すると思われる。したがって、本明細書においてMHCポリペプチドまたは分子のドメイン(例えば、MHCクラスIIβ1ドメイン)への言及は、言及された分子の天然型、ならびに天然型アミノ酸配列に基づくが一つまたは複数のアミノ酸配列の変異を含む分子の両方を含む。このような変異ポリペプチドは、天然分子とのアミノ酸配列の同一性の程度においても定義することができる。一般に、MHCドメイン変異体は、天然のMHCドメインの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する。より高度に保存された変異体は、天然の配列と少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有する。MHCドメインポリペプチドの変異体はまた、天然のポリペプチドの生物活性も保持する。本発明の目的のために、下記に詳細に記載するとおり、変異ドメインを適当なβ1α1またはα1α2ポリペプチドに組み込み、得られたポリペプチドのインビトロにおける抗原特異的T細胞増殖を阻害する能力を調べることによって、その活性が簡便に評価される。
アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リジン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。(例えば、Creighton, Proteins(W. H. Freeman & Co., New York, N.Y. 1984)を参照されたい)。
一定のインビボおよびインビトロにおける適用のために、本発明のMHC分子を検出可能な標識に結合することができる。放射性核種(例えば、インジウム111などのγ放出線源)、常磁性同位体、蛍光マーカー(例えば、フルオレセイン)、酵素(アルカリ性ホスファターゼなど)、補助因子、化学発光化合物および生物発光化合物を含む、広範にわたる検出可能な標識が公知である。このような標識のMHCポリペプチドへの結合は、標準的方法を用いて達成される。米国特許第5,734,023号(参照により本明細書に組み入れられる)は、このような標識を用いたMHCポリペプチド誘導体の標識に関する広汎な考察を含む。検出可能マーカーを、方向を特定した様式で(すなわち、無作為に結合するのでなく)MHC分子に共有結合させようとする場合、マーカーは一般に、N末端に連結されたペプチド抗原による干渉を最小限にするために分子のC末端に連結することになる。
開示されるMHCポリペプチドの一定の使用、特に一定のT細胞集団の除去を意図したインビボでの治療への適用のために、このポリペプチドを毒性部分と結合させることができる。限定されないが、タンパク質毒素、化学療法剤、細胞毒性T細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、および「硬い」例えばβ放射線を放出する放射性同位体を含む、T細胞機能を破壊するのに適した多数の毒性部分が公知である。このような毒素、および毒素をMHC分子に結合させる方法の例が、米国特許第5,284,935号(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。タンパク質毒素には、リシン、ジフテリアおよびシュードモナス毒素が含まれる。化学療法剤には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、サイトトキシンおよびアンチセンスRNAが含まれる。イットリウム90、リン32、鉛212、ヨウ素131、またはパラジウム109などの放射性同位体も用いることができる。毒性部分を、方向を特定した様式で(すなわち、無作為に結合するのでなく)MHC分子に共有結合させようとする場合、毒性部分は一般に、N末端に連結されたペプチド抗原による干渉を最小限にするために分子のC末端に連結することになる。
本発明の精製MHCポリペプチドの適切な投与経路には、これらに限定されないが、経口、頬側、経鼻、エアロゾル、局所、経皮、経粘膜、注射、徐放、放出制御、イオン導入、超音波導入、ならびにその他の簡便な送達経路、装置、および方法が含まれる。注射送達法には、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、脊髄内、髄腔内、脳室内、動脈内、および皮下注射が含まれる。
本発明のクラスIIβ1α1およびクラスIα1α2ポリペプチドは、広範なインビトロおよびインビボでの適用例において有用である。事実、これらのポリペプチドの生物活性の結果、無傷の精製MHC分子またはMHC分子を発現する抗原提示細胞の代わりに、多くの適用において用いることができる。
β1α1分子のクローニング、発現およびインビトロでの折り畳み
MHCクラスIIα1ドメインのアミノ末端がMHCクラスIIβ1ドメインのカルボキシ末端に遺伝的に連結された一本鎖のポリペプチド鎖をコードする原型の核酸構築物を作製した。ラットRT1B−およびβ鎖cDNAから作製した、この原型構築物の配列を図1Aに示す(SEQ ID NO:1)。
(XhoI 5'プライマー)(SEQ ID NO:9);
(3'ライゲーションプライマー)(SEQ ID NO:10)であった。α1合成のために用いたプライマーは
(5'ライゲーションプライマー)(SEQ ID NO:11);
(KpnI 3'プライマー)(SEQ ID NO:12)であった。用いた他のプライマーは
(NcoI 5'プライマー)(SEQ ID NO:13);および
(XhoI 3'プライマー)(SEQ ID NO:14)であった。第1段階はβ1およびα1ドメインをコードするcDNAの産生であった。PCRはTaqポリメラーゼ(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を用い、鋳型としてβ118、プライマーとしてXhoI 5'プライマーおよび3'ライゲーションプライマー、ならびに鋳型としてα6 cDNA、プライマーとして5'ライゲーションプライマーおよびKpnI 3'プライマーを用い、94.5℃20秒間の変性、55℃1.5分間のアニーリング、および72℃1.5分間の伸長を28サイクル行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で単離し、Gene-Clean(Bio 101, Inc.、カリフォルニア州ラホヤ)を用いて精製した。
(3'-MBP-72-89/リンカーライゲーションプライマー)(SEQ ID NO:15)および鋳型として元の完全長β118 cDNAを用いて増幅した。ペプチド/リンカーカートリッジcDNAのアニーリングのために5'末端に突出部分を持つ559bpのcDNAを、プライマー
(5'ペプチド/リンカーライゲーションプライマー)(SEQ ID NO:16)、およびKpnI 3'プライマーおよび増幅用の鋳型として656bpのβ1α1 cDNAを用いて合成した。2つのcDNAのアニーリングおよび伸長を行った結果、完全長750bpのβ1a1/MBP-72-89構築物が得られた。NcoI 5'プライマーおよびXhoI 3'プライマーを用いたpET21d+(Novagen、ウィスコンシン州マディソン;Studier et al., 1990)にサブクローニングするために、β1α1およびβ1α1/MBP-72-89 cDNAの5'および3'末端の改変を行った。MBP-55-69/リンカーカートリッジを合成するために用いたプライマーは、
(5'MBP-55-69プライマー)(SEQ ID NO:17)および
(3'MBP-55-69プライマー)(SEQ ID NO:18)であった。これらをゲル精製し、アニーリングし、次いでNcoIおよびXhoIで消化したβ1α1/MBP-72-89へのライゲーションのためにNcoIおよびXhoIで切断して、β1α1/MBP-55-69共有結合構築物をコードするプラスミドを作製した。モルモットMBP-72-89/リンカーカートリッジを合成するために用いたプライマーは、
(5'Gp-MBP-72-89プライマー)(SEQ ID NO:28)および
(3'Gp-MBP-72-89プライマー)(SEQ ID NO:29)であった。これらをゲル精製し、アニーリングし、次いでNcoIおよびXhoIで消化したβ1α1/MBP-72-89へのライゲーションのためにNcoIおよびXhoIで切断して、β1α1/Gp-MBP-72-89共有結合構築物をコードするプラスミドを作製した。CM-2/リンカーカートリッジを生成させるために用いたプライマーは、
(5'CM-2プライマー)(SEQ ID NO:19)および
(3'CM-2プライマー)(SEQ ID NO:20)であった。これらをゲル精製し、アニーリングし、次いでNcoIおよびXhoIで消化したβ1α1/MBP-72-89へのライゲーションのためにNcoIおよびXhoIで切断して、β1α1/CM-2共有結合構築物をコードするプラスミドを作製した。
β1α1分子はエピトープ特異的にTリンパ球を結合する
前述のとおりに作製したβ1α1分子の有効性(T細胞結合特異性)を、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)システムを用いて調べた。EAEは、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)を含む中枢神経系ミエリン成分に特異的なCD4+ T細胞によって仲介される、麻痺性、炎症性で、時に脱髄性の疾患である。EAEはヒト脱髄性疾患MS(Paterson, 1981)と類似の免疫学的異常を示し、前臨床治療法を試験する有用なモデルである(Weiner et al., 1993;Vandenbark et al., 1989;Howell et al., 1989;Oksenberg et al., 1993;Yednock et al., 1992;Jameson et al., 1994;Vandenbark et al., 1994)。ルイスラットにおいて、優性の脳炎誘発MBPエピトープがペプチドの72〜89位に存在する(Bourdette et al., 1991)。EAEの臨床徴候は第10〜11日に発症し、侵襲性Tリンパ球の大部分がCNS中に局在する状態で、疾患は4〜8日間持続する。
、ラット-MBP-69-89ペプチド
、Gp-MBP-55-69ペプチド
、および心ミオシンペプチドCM-2
(Wegmann et al., 1994)を固相法(Hashim et al., 1986)によって調製した。Gp-MBPペプチドはウシMBP配列(Vandenbark et al., 1994;Martenson, 1984)にしたがって番号を付けた。ペプチドをβ1α1と室温で24時間混合することにより、タンパク質:ペプチドモル比1:10でβ1α1上にのせ、その後はすべての操作を4℃で実施した。次いで透析またはCentricon-10メンブレンを用いた遠心限外ろ過で、遊離ペプチド濃度が2μM未満になるまで連続して希釈・濃縮することにより、遊離ペプチドを除去した。
蛍光標識に結合したβ1α1分子
β1α1/ペプチド分子とTCR(上で用いたOX-6など)との相互作用を視覚化する際に二次抗体の使用を避けるために、発色団と直接結合したβ1α1分子を作製した。Alexa-488(商標)色素(A488:Molecular Probes、オレゴン州ユージーン)はフルオレセインと類似のスペクトルを有するが、フルオレセイン結合体よりも明るく、光安定性の高いタンパク質結合体を生成する。図4に示すとおり、MBP-69-89をのせた場合、A488結合β1α1(色素/タンパク質のモル比=1)は、A1ハイブリドーマに結合した(MCI=300ユニット)が、空のβ1α1は結合しなかった。
β1α1分子はインビトロでエピトープ特異的T細胞増殖を阻害する
T細胞増殖解析を、以前に記載されている(Vandenbark et al., 1985)とおり、96穴プレート中で実施した。簡単に言うと、ウェルごとに200μl中4x105個の細胞(臓器刺激解析)または2x104個のT細胞および1x106個の放射線照射APC(短期T細胞系統)を、刺激培地のみ、Con A、またはIL-2(20ユニット/ml)の追加あり、もしくは追加なしのウェル3つずつで、RPMIおよび1%ラット血清中、7%CO2、37℃でインキュベートした。培養液を3日間、最後の18時間は[3H]チミジン(0.5μCi/10μl/ウェル)存在下でインキュベートした。細胞をグラスファイバーフィルター上に回収し、液体シンチレーションにより[3H]チミジン]の取り込みを評価した。いくつかの実験においては、T細胞をβ1α1構築物(ペプチドをのせた、またはのせていない)で24時間予備処理し、洗浄し、次いで前述のIL-2存在下または不在下での増殖解析に用いた。3つのウェルから1分あたりの平均カウント±SDを計算し、群間の差をスチューデントのt検定によって求めた。
抗原をのせたβ1α1分子はEAEの誘導を抑制し、存在する徴候を処置する
8〜12週齢の雌のルイスラット(Harlan Sprague-Dawley, Inc.、インディアナ州インディアナポリス)を本試験の臨床実験に用いた。ラットをオレゴン州ポートランドの退役軍人医療センター動物管理施設(Veterans Affairs Medical Center Animal Care Facility)で、施設のガイドラインにしたがい、無菌状態で飼育した。25μgのモルモットミエリン塩基性タンパク質(GP-MBP)または200μgのGP-MBP-69-89ペプチドを、それぞれ100または400μgの結核菌株H37Ra(Difco、ミシガン州デトロイト)で補足した完全フロイントアジュバントに加えたものをラットに皮下注入することにより、活動性EAEを誘発した。2つの乳濁液によって誘発した臨床疾患の経過は本質的に同じで、発症日、持続期間、最大の重症度、および累積疾患指数が同じであった。下記の臨床評点スケールにしたがって、ラットの臨床徴候の変化を毎日評価した。すなわち、0, 徴候なし、1, 尾部弛緩、2, 後肢脱力、3, 対麻痺、および4, 前肢脱力を伴う対麻痺、瀕死状態。各罹患ラットについてEAEの経過中毎日の障害スコアを合計することによって累積疾患スコアを得、各実験群について平均累積疾患指数(CDI)を計算した。
aEAEはGp-BP/CFAまたはMBP-69-89/CFAのいずれかで誘発した。
b2つの実験から合わせた対照。
c値は平均±S.D.を表す。
*P 0.05
**P 0.01
HLA-DR2由来のヒト組換えT細胞受容体リガンドの設計、操作、および生成
実験手順
相同性モデリング
ヒト、ラット、およびマウス種由来のMHCクラスII分子の配列アライメントから、これらの研究の出発点がもたらされた(Burrows et al., 1999)。Brookhaven Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratories、ニューヨーク州アプトン)に寄託されている座標を用いて、プログラムSybyl(Tripos Associates、ミズーリ州セントルイス)およびO2ワークステーション(IRIX 6.5、Silicon Graphics、カリフォルニア州マウンテンビュー)によりグラフィック画像を作成した。構造に基づく相同性モデリングは、ヒトDR2(Smith et al., 1998;Li et al., 2000)およびDR1(Brown et al., 1996;Murthy et al., 1997)、マウスI-E k分子(Fremont et al., 1996)、ならびにサソリ毒(Zhao et al., 1992;Housset et al., 1994;Zinn-Justin et al., 1996)の微細な結晶座標に基づいた。ヒトDR2(PDBアクセッション番号1BX2)のアミノ酸残基を使用した。いくつかの残基が結晶データ中で欠けていた/存在していなかったため(Smith et al., 1998)、正確な側鎖を挿入し、構造の緻密化の過程で局所エネルギー最小化を用いてペプチド骨格を剛体としてモデル化した。
ヒトRTLを生成するため、RPMI培地で培養したL466.1細胞からmRNAを単離した(Oligotex Direct mRNAミニキット;Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア)。SuperScript II Rnase H逆転写酵素(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いて、第一鎖の合成を行った。
および
であった。α1を作製するために使用したプライマーは、
および
であった。
およびT7ターミネータープライマー
を用いて配列決定した。配列を確認したのち、huβ1α1ペプチド(RTL300)の発現用に単一クローンを選択した。
および
およびプライマー
を含むPCR「増幅混合液」50μlを次に「アニール伸長」反応液に直接添加し、全量をアニーリング温度55℃で25回サイクリングした。huMBP-85-99lig←プライマーの非相補的5'尾部は、ペプチド/リンカーカートリッジ全体をコードするDNAおよび挿入点から下流の領域を含んでいた。
および
を使用した。
大腸菌株BL21(DE3)細胞をpET21d+/RTLベクターで形質転換した。細菌を、カルベニシリン(50μg/ml)を含むLuria-Bertani(LB)ブロスの培養液1リットル中で、37℃で対数期中期(OD600=0.6〜0.8)まで培養した。0.5mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)の添加により、組換えタンパク質の産生を誘導した。3時間インキュベートした後、細胞を遠心分離により回収し、処理時まで-80℃で保存した。細胞のその後の操作はすべて4℃で行った。細胞ペレットを氷冷PBS、pH7.4に再懸濁し、細胞懸濁液を塩/氷/水浴中で冷却しながら20秒間4回超音波処理した。次いで、細胞懸濁液を遠心分離して上清画分を捨て、細胞ペレットを再懸濁してPBSで3回洗浄し、次いで20mMエタノールアミン/6M尿素、pH10に再懸濁して4時間放置した。遠心分離後、関心対象の可溶化組換えタンパク質を含む上清を回収し、精製するまで4℃で保存した。
IF-500デジタルインターフェース、およびペプチド濃度に応じた2、1、0.5、0.1、および0.05mm光路長のサーモスタット制御石英セル(Hellma、ドイツ、ミュールハイム)を備えたJASCO J-500A分光偏光計で、CDスペクトルを記録した。データは、平均残基重量楕円率として表す。較正は一定の間隔で、(+)-10-カンファースルホン酸(Sigma)を用いて、290.5nmおよび192.5nmでそれぞれモル楕円率7780および16,160deg.cm2/dmolになるよう行った(Chen et al., 1977)。一般にスペクトルは、4秒時定数でスキャン速度5nm/分で記録した260〜180nmの4〜5スキャンの平均であった。データは0.1nm間隔で収集した。Jascoプログラムの内蔵アルゴリズムを用いてスペクトルを平均化および平滑化し、緩衝液基準を減算した。プログラムCONTIN(Provencher et al., 1981)により二次構造を推定した。222nmの固定波長で熱遷移曲線を記録した。プログラム制御の循環水浴(Lauda PM350およびRCS20D)で5℃〜90℃または95℃の温度勾配を作成した。加熱および冷却速度は12〜18℃/hであった。サーミスタおよびデジタル温度計(Omega Engineering)でセル中の温度をモニターし、XYプロッタ(HP7090A、Hewlett Packard)で記録およびデジタル化し、ディスクに保存した。遷移曲線は、標準的な式:F=([U]−[U]u)/([U]n−[U]u)(式中、[U]nおよび[U]uはそれぞれ完全に折り畳まれたおよび完全にほどけた種の楕円率値を表し、[U]は222nmで観察される楕円率である)を用いて、折り畳まれたペプチドの比(F)に対して標準化した。
相同性モデリング
以前のタンパク質工学研究では、ラットMHCクラスII RT1.Bのα-1およびβ-1ドメインに由来する組換えT細胞受容体リガンド(RTL)について記載している(Burrows et al., 1999)。ヘテロ二量体MHCクラスIIタンパク質HLA-DR2、特に抗原結合ドメインを含むこの分子のα-1およびβ-1部分の相同性モデリング研究を、ヒトDRの結晶構造(Smith et al., 1998;Li et al., 2000;Brown et al., 1993;Murthy et al., 1997)に基づいて行った。本明細書に記載するモデリング研究では、供給源タンパク質の組織化および構造の3つの面に焦点をおいた:(1) βシートプラットフォームの膜近位面とα-2およびβ-2 Ig折り畳みドメインの膜遠位面との間の界面、(2) ペプチド結合/TCR認識ドメインを含むα-1およびβ-1ドメインの内部水素結合、および(3) TCRと相互作用すると考えられるRTLの表面。
RTLの発現および生成
HLA-DR2α-1ドメインのアミノ末端をコードする配列をβ-1ドメインのカルボキシ末端をコードする配列につなぎ合わせることにより、新規遺伝子を構築した。この設計を有するタンパク質にRTL(「組換えTCRリガンド」)という用語を使用した(米国特許第6,270,772を参照されたい)。ここに記載する研究では、天然配列を有する「空の」RTL(RTL302)、ヒトMBP-85-99抗原性ペプチドを含む共有結合構築物(RTL303)、および生物活性が排除された、フェニルアラニンからロイシンへの単一変化(F150L、RTL303の番号づけ)を有するこれら分子の変形(RTL300、「空」;RTL301、MBP-85-99を含む)を使用した実験を提示する(図13を参照されたい)。以前の研究から、6M尿素を含む緩衝液中で可溶化および精製した後にタンパク質が再度折り畳まれ、細菌封入体から物質の最大収量が容易に得られることが実証された(Burrows et al., 1999)。RTLの精製は正攻法で行い、イオン交換クロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを含めた(図14)。
ヒトRTLの生化学的特徴づけおよび構造解析
天然のジスルフィド結合を再構成するためのシステイン46および110(RTL303アミノ酸の番号づけ、DR2β鎖残基15および79に相当する)の酸化が、ゲルシフトアッセイにより実証された(図15)。このアッセイでは、還元剤β-メルカプトエタノール(β-ME)を含むまたは含まない同一試料を5分間煮沸してからSDS-PAGEに供した。β-MEの非存在下ではジスルフィド結合が保持され、タンパク質は典型的に、構造がより小型であるために電気泳動過程においてアクリルアミドゲル中でより高い移動度を示す。この解析の代表的な例を「空の」RTL300およびRTL302、ならびにMBP結合RTL301およびRTL303分子について示す(図15)。生成されたRTL分子はいずれもこのパターンを示し、天然の保存されたジスルフィド結合の存在が示される。これらのデータから、分子の高次構造的完全性が確認される。
aF150LはRTL303の番号づけに基づく(図2を参照)。
BRTL300のCDデータは、変数選択法を用いてフィッティングできなかった。
cβシートは、平行および逆平行βシートならびにβターン構造を含む。
aF150(RTL303の番号づけ)はDR2のβ鎖のF24である。距離は1BX2(Smith et al., 1998)による座標を用いて計算した。
b残基は図7に示す通りに番号づけし、括弧内に1BX2残基番号を示す。例えば、F150.CE2は、B:F24.CE2;ヘテロ二量体1BX2結晶構造のB鎖上の残基F24の原子CE2と等価である。C鎖は結合している抗原性ペプチドである。
TCRシグナル伝達
最小TCRリガンドが開発されたことで、TCRαおよびβ鎖へのMHC/ペプチド結合によって開始される情報カスケードの分析を複雑にする共刺激相互作用の非存在下で、初代T細胞およびT細胞クローンにおいてTCRシグナル伝達を研究することが可能になる。最小「T細胞受容体リガンド」は概念的に、TCRと相互作用するMHC分子の表面、およびTCRと相互作用するために外側に向いて溶媒に露出される、MHC分子の溝内に結合したペプチド内の3〜5アミノ酸残基からなる。MHCクラスIIに由来する組換えTCRリガンド(RTL)の生理化学的および生物物理学的特徴づけは、HLD-DR2のα-1およびβ-1ドメインの、抗原性ペプチドを含む種々のアミノ末端伸長を有する約200アミノ酸残基の単一エキソンとしての使用など、上記してある。これらのHLA-DR2由来RTLは折り畳まれて、天然MHCクラスII分子のペプチド結合/T細胞認識ドメインを形成する。
組み換えTCRリガンドは上記の通りに生成した。
MBP85-99ペプチド
および「CABL」、BCR-ABL b3a2ペプチド
(ten Bosch et al., 1995)は、fmoc固相合成によりApplied Biosystems 432A(カリフォルニア州フォスターシティー)ペプチド合成機で調製した。MBPペプチドは、ウシMBP配列に従って番号づけした(Martenson, 1984)。ペプチドはカルボキシ末端アミド基を有して調製し、トリフルオロ酢酸(TFA)中のチアニソール/1,2-エタンジチオール/dH2Oを用いて穏やかに振盪しながら室温で1.5時間かけて切断した。切断されたペプチドは、100%冷tert-ブチルメチルエーテルで6回洗浄して沈殿させ、凍結乾燥して、窒素下で-70℃で保存した。ペプチドの純度は、分析用Vydac C18カラムで逆相HPLCにより確認した。
標準的な血清学的方法によって決定され、さらに配列特異的プライマーを用いたPCR増幅(PCR-SSP)(Olerup et al., 1992)によって確認された、HLA-DRB1*1501にとってホモ接合性である多発性硬化症(MS)患者およびHLA-DRB1*07にとってホモ接合性であるMS患者の末梢血単核細胞(PBMC)から、ペプチド特異的T細胞クローンを選択した。ヒトMBP85-99およびCABLに特異的なT細胞の頻度は、限界希釈アッセイ法(LDA)により決定した。PBMCをフィコール勾配遠心分離により調製し、0.2ml培地(1%ヒトプールAB血清、2mM L-グルタミン、 1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/ml ペニシリンG、および100μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI 1640)中、50,000個PBMC/96ウェルU底プレートウェルおよび抗原提示細胞(APC)としての150,000個照射(2500ラド)PBMC/ウェルで、10μg/mlのMBP85-99またはCABLペプチドと共に5日間培養し、その後5ng/ml IL-2(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)を週に2回添加した。3週間後、視覚的顕微鏡観察により培養プレートを細胞凝集または「凝集塊形成」について調べ、各ペプチドAgにつき全部で200ウェルの中で凝集形成が「最大の」20〜30ウェルに由来する細胞を、5ng/ml IL-2中でさらに1〜2週間かけて拡大した。これらの細胞を増殖アッセイ法によりペプチド特異性について評価したが、このアッセイでは、50,000個T細胞/ウェル(3回洗浄)を、150,000個の新たに単離し照射したAPC/ウェルおよび培地のみ、10mg/ml MBP85-99、または10mg/ml CABLペプチドと共に3つ組で3日間培養し、最後の18時間は3H-Tdyを添加してインキュベートした。ペプチド添加ウェルの平均CPMを培地のみの対照ウェルの平均CPMで割って、刺激指標(S.I.)を計算した。特定のペプチド抗原について最も高いS.I.を有するT細胞単離体を選択し、5ng/ml IL-2を含む培地中で拡大したが、さらに刺激することなくクローンに応じて1〜6カ月生存した。
選択されたペプチド特異的T細胞単離体を、10ng/ml 抗CD3(Pharmingen、カリフォルニア州サンディゴ)を含む培地0.2ml中、0.5個T細胞/ウェルおよび100,000個APC/ウェルで限界希釈して3日間置き、その後1〜3週間にわたり5ng/ml IL-2を週に2回添加して、サブクローニングした。増殖T細胞を有するすべてのウェルを増殖アッセイ法によりペプチド特異的応答に関してスクリーニングし、最も高いS.I.を有するウェルを選択し、IL-2を加えた培地中で続けて培養した。クローンを単一のTCR Vβ遺伝子を使用するT細胞集団と定義して、細胞のクローン性をRT-PCRにより決定した。T細胞クローンを、10% ABプール血清(Bio-Whittaker、メリーランド州)中、25cm2フラスコ当たり5x106個の照射した(4500ラド)EBV形質転換B細胞系統および25x106個の照射(2500ラド)自己APCの存在下で、10ng/ml 抗CD3で刺激することにより5日間にわたり拡大し、その後洗浄し、5ng/ml IL-2を含む培地に細胞を再懸濁し、新鮮なIL-2を週に2回添加した。拡大したT細胞をペプチド特異的増殖について評価し、最も高い増殖S.I.を有する選択された拡大T細胞クローンを実験手順に使用した。
72時間目に細胞培養上清を回収し、使用時まで-80℃で凍結した。IL-2、IFN-γ、IL-4、およびIL-10のサイトカイン特異的捕獲抗体および検出抗体(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して、以前に記載されている通りに(Bebo et al., 1999)ELISAによりサイトカイン測定を行った。組換えサイトカイン(Pharmingen)を用いて各アッセイの検量線を作成し、細胞上清中のサイトカイン濃度を補間により決定した。
2カラー免疫蛍光解析を、CellQuest(商標)ソフトウェアを用いてFACScan装置(Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンンビュー)で行った。アイソタイプの一致する対照Abを用いて4領域を規定した。
400xgで10分間遠心分離して培養液からT細胞を回収し、洗浄し、新鮮なRPMIに再懸濁した。細胞を20μM最終濃度のRTLで、37℃にて様々な時間処置した。氷冷RPMIを添加して処置を停止し、遠心分離により細胞を回収した。上清を捨て、溶解緩衝液(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1mM AEBSF[4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフッ化物、HCl]、0.8μMアプロチニン、50μMベスタチン、20μMロイペプチン、10μMペプスタチンA、1mM活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、50mM NaF、0.25mM bpV[カリウムビスペルオキソ(1,10-フェナントロリン)オキソバナジン酸]、50μMフェニルアルシンオキシド)を直ちに添加した。4℃で15分間混合して細胞を溶解した後、試料を15分間遠心分離した。細胞溶解液を回収し、等量の試料泳動緩衝液と混合して5分間煮沸した後、15% SDS-PAGEにより分離した。ウェルタンブロット解析のため、タンパク質をPVDF膜に転写した。ウェスタンブロットブロッキング緩衝液:10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、0.1% Tween-20、1% BSA。一次抗体:抗ホスホチロシン、クローン4G10(Upstate Biotechnology、ニューヨーク州レークプラシッド)。二次および三次抗体:ECFウェスタンブロットキット(Amersham、ニュージャージー州ピスカタウェイ)による。乾燥させたブロットをStorm 840スキャナー(Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール)を用いてスキャンし、ImageQuantバージョン5.01(Molecular Dynamics)を用いて化学蛍光を定量化した。
ζホスホチロシンアッセイの場合と同様に、T細胞を回収しRTLで処置した。1:5000希釈した抗ホスホ-ERK(Promega、ウィスコンシン州マディソン)または1:1500希釈した抗ERKキナーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー)を用いてウェスタンブロット解析を行い、ECFウェスタンブロッティングキットを用いて可視化した。関心対象のバンドを、ζホスホチロシンアッセイについて記載した通りに定量化した。
ヒトT細胞をポリリジンコート35mmガラス底皿にプレーティングし、IL-2を含む培地中で12〜24時間培養した。CO2インキュベーター内で、培地に溶解したfura-2 AM(5mM)(Molecular Probes)を細胞に30分間負荷した。fura-2をリンスし、培地中でさらに15分間インキュベートした後、細胞をカルシウム測定に使用した。水浸対物レンズ(UmplanFL 60x/0.8、Olympus)を備えた正立顕微鏡(Axioskop FS、Zeiss)により、蛍光像を観察した。モノクロメータ(Polychrome 2、Till Photonics)により切り替えられる2波長の励起UV光(340nmまたは380nm)を、6秒間隔で73 m秒間露光した。380nm UV光の強度はバランシングフィルター(UG11、OMEGA Optical)により減衰させた。励起UV光を二色性ミラー(FT 395nm、Carl Zeiss)に反射させ、蛍光像をバンドパスフィルター(BP500-530、Carl Zeiss)に通し、画像増強管(C7039-02、Hamamatsu Photonics)により増幅し、複数フォーマット冷却CCDカメラ(C4880、Hamamatsu Photonics)に露光した。UV光露光、CCD制御、画像のサンプリングおよび取得は、デジタル画像化システム(ARGUS HiSCA、Hamamatsu Photonics)で行った。バックグラウンド蛍光を画像化システムにより減算した。記録中、細胞は、ステージヒーター(DTC-200、Dia Medical)により30℃に維持した培地中で保持した。薬物適用の量およびタイミングは、トリガー駆動性灌流システム(DAD-12、ALA Scientific instruments)により制御した。
ヒトT細胞クローンに及ぼすヒトRTLの効果
本研究では、2つの異なるMHCクラスII DR2由来RTL(HLA-DR2b:DRA*0101、DRB1*1501)を使用した(図19)。RTL303(β1α1/MBP85-99)およびRTL311(β1α1/CABL)は、単一エキソンRTLのアミノ末端において遺伝的にコードされる抗原のみが異なる。MBP85-99ペプチドはDR2患者における免疫優勢MBP決定基を表し(Martin et al., 1992)、C-ABLペプチド(ten Bosch et al., 1995)はDR2に結合するための適切なモチーフを含む。本研究で使用するヒトT細胞クローンは、DR2ホモ接合性患者およびDR7ホモ接合性MS患者から選択した。
RTL処置により誘導される初期シグナル伝達事象
DR2ホモ接合性T細胞クローンMR#3-1およびMR#2-87におけるζ鎖のリン酸化について試験した。MR#3-1はRTL303によって運搬されるMBP85-99に特異的であり、MR#2-87はRTL311によって運搬されるCABLペプチドに特異的である。RTLのアミノ末端における抗原性ペプチドが、2つの分子間の唯一の相違である。TCR-ζ鎖は静止T細胞において構成的にリン酸化されており、ζ鎖リン酸化のレベルの変化はTCRを介して処理される情報の最も早い指標の1つである。静止クローンにおいて、ζは、それぞれp21およびp23と称される21kDおよび23kDの一対のリン酸化タンパク質種としてリン酸化された。クローンMR#3-1を20μM RTL303で処置すると、p23/p21比の異なる変化を示し、10分の時点で最小に達した(図21)。これと同様のp23/p21比の異なる変化は、20μM RTL311で処置した場合にクローンMR#2-87でも観察された(図21)。クローンにとって特異的であるペプチドを含むRTLのみが、以前にアンタゴニストリガンドによってT細胞を活性化した後に観察された(27, 28)この種のζリン酸化を誘導した。
*可溶性RTL303またはRTL311は200,000個T細胞/200μl培地でT細胞クローンと共に48時間培養し、その後RPMI 1640で2回洗浄してからアッセイした。
**2x105個照射(2500ラド)自己PBMCを4:1(APC:T)の比で添加して3日間おき、最後の18時間は3H-チミジンを取り込ませた。p値は、「未処置」対照との比較に基づいた。
ワクチン接種により誘導される自己免疫疾患の処置のためのバイスタンダー抑制
アレルギー、移植片拒絶、移植拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、T細胞媒介性肺疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリウム症、および特発性肺線維症を含む種々のヒト疾患の病原は、抗原特異的CD4+ T細胞を含むと考えられる。
サイトカイン転換により実験的自己免疫性脳脊髄炎の再発率および重症度を軽減する単量体RTL
本明細書において上記したように、オリゴマー組換えTCRリガンド(RTL)は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の臨床徴候を処置するのに、および脳炎誘発性ペプチドに対する長期T細胞寛容を誘導するのに有用である。本実施例では、単量体I-As/PLP139-151ペプチド構築物(RTL401)を生成し、これが、CFA中のPLP139-151ペプチドの注射後に再発性EAEを発症するSJL/Jマウスにおいて自己免疫応答を軽減するのに有用であることを実証する。空のRTL400または遊離PLP139-151ペプチドではこのようなことはないが、静脈内または皮下投与したRTL401は、SJL/Jまたは(C57BL/6xSJL)F1マウスにおいてPLP139-151ペプチドにより誘発されるEAEの再発を防ぎ、その臨床的重症度を有意に軽減したが、SJL/JマウスにおいてPLP178-191またはMBP84-104ペプチドにより誘発されるEAEも、(C57BL/6xSJL/J)F1マウスにおいてMOG35-55ペプチドにより誘発されるEAEも阻害しなかった。EAEをRTLで処置すると、末梢において安定したまたは増強されたT細胞増殖およびIL-10の分泌が起こったが、炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌は減少した。中枢神経系(CNS)では、炎症細胞の適度な減少、超後期活性化(very late activation)Ag-4、リンパ球機能関連Ag-1、ならびに炎症性サイトカイン、ケモカイン、およびケモカイン受容体の発現の減少が起こったが、Th2関連因子、IL-10、TGF-β3、およびCCR3の発現が増強された。これらの結果から、単量体RTL治療は、PLP139-151特異的T細胞のCNSへの侵入を完全に妨げることなく、このT細胞の脳炎誘発能を抑制するサイトカイン転換を誘導し、このT細胞により炎症の重症度が軽減されることが示される。この機構は、他のEAEモデルにおいてオリゴマーRTL治療を用いて観察される機構とは異なる。これらの結果から、公知の脳炎誘発性ミエリンペプチドに対する集中的なT細胞応答を有する多発性硬化症患者における、この新たな種類のペプチド/MHCクラスII構築物の臨床的有用性が示される。
SJLおよび(C57BL/6xSJL)F1マウスは、6〜7週齢の時点でJackson Immunoresearch Laboratories(メイン州バーハーバー)から入手した。マウスは、施設の指針に従ってポートランド退役軍人医療センター動物資源施設(Animal Resource Facility at the Portland Veterans Affairs Medical Center)(オレゴン州ポートランド)に収容した。
マウスPLP139-151ペプチド
、PLP178-191ペプチド
、MOG35-55ペプチド
、およびMBP84-104ペプチド
は、スタンフォード大学、Beckman研究所(Beckman Institute)(カリフォルニア州パロアルト)において固相技法を用いて合成し、HPLCにより精製した。
RTLの設計、クローニング、および発現の一般的な方法は、本明細書に上記してあり、また他所に記載されている(例えば、Burrows et al., 1998;Burrows et al., 1999;Chang et al., 2001を参照されたい)。簡潔に説明すると、Oligotex Direct mRNAミニキット(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて、SJLマウスの脾細胞からmRNAを単離した。マウスI-As MHCクラスIIβ1およびα1鎖のAg結合/TCR認識ドメインのcDNAは、2対のPCRプライマーを用いてmRNAから導出した。β1鎖のアミノ末端およびα1鎖のカルボキシル末端にそれぞれNcoIおよびXhoI制限部位を付加して2段階PCRで2本の鎖を5-aaリンカー
により順次連結し、RTL400を形成した。リンカー
を有するPLP139-151ペプチドをRTL400のβ1ドメインの5'末端に共有結合して、RTL401を形成した。次いで、マウスI-Asβ1α1挿入物をpET21d(+)ベクターに連結し、陽性コロニーの選択および配列確認のために、Nova blue大腸菌宿主(Novagen Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。次に、RTL400およびRTL401プラスミド構築物を大腸菌株BL21(DL3)発現宿主(Novagen Inc.)に形質転換した。タンパク質の精製については、以前に記載されている(Chang et al., 2001)。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
光散乱実験は、DynaPro分子サイズ測定装置(Protein Solutions、バージニア州シャーロッツビル)で行った。pH8.5の20mM Tris-Cl緩衝液中のタンパク質試料を1.0mg/mlの濃度で100nm Anodisc膜フィルター(Whatman、ニュージャージー州クリフトン)を通して濾過し、濾過試料20μlを石英キュベットに入れ、488-nmレーザービームで解析した。4℃で50スペクトルを収集し、水溶液中のタンパク質の拡散係数および相対多分散性の推定値を得た。次いで、データをDynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions)で解析し、緩衝液基準を減算した。データは、単位としてナノメートルを使用して、試料の流体力学半径の平均値として表した。RTLの分子量は、DynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions)を用いて推定した。
CD解析は、Aviv Model 215 CD分光計(Aviv Associates、ニュージャージー州レークウッド)を用いて、組換えタンパク質がpH8.5のTris-Cl緩衝液中に存在すること以外は以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。内蔵アルゴリズムを用いてスペクトルを平均化および平滑化し、緩衝液基準を減算した。デコンボリューションソフトウェアパッケージ(CDNNバージョン2.1)および変数選択法(Compton et al., 1986)を用いて、二次構造を推定した。
SJLマウスの側腹部に、以前に記載されている通りに(Bebo et al., 2001)、PLP139-151ペプチド 150μgを含む乳濁液 0.2ml、および加熱殺菌した結核菌H37RA(M.Tb.;Difco、ミシガン州デトロイト) 150μgを含む等量のCFAを皮下接種した。(C57BL/6xSJL)F1マウスは、側腹部への皮下接種により、MOG35-55ペプチド 200μgまたはPLP139-151ペプチド 150μgを含む乳濁液 0.2ml、および加熱殺菌M.Tb. 200μgを含む等量のCFAで免疫化した。別の実験では、SJLマウスを、側腹部への皮下接種により、PLP139-151ペプチド 150μgもしくはPLP178-191ペプチド 150μgを含む乳濁液 0.2ml、またはMBP84-104ペプチド 200μgを含む乳濁液 0.1ml、および加熱殺菌した結核菌 200μgを含む等量のCFAで免疫化した。1週間後、MBP84-104ペプチドを免疫化したマウスに、CFA中の同じペプチドで追加免疫した。追加免疫した日およびその2日後に、マウスに百日咳毒素(Ptx;List Biological Laboratories、カリフォルニア州キャンベル) 200ngを腹腔内注射した。マウスは、以下の尺度に従ってEAEの徴候に関して毎日評価した;0、正常;1、尾部弛緩または軽度後肢脱力;2、中等度後肢脱力または軽度運動失調;3、準重度後肢脱力;4、重度後肢脱力または軽度前肢脱力または中等度運動失調;5、中等度以下の前肢脱力を伴う対麻痺;および6、重度前肢脱力もしくは重度運動失調を伴う対麻痺、または瀕死状態。
臨床疾患のピーク時にマウスから無傷の脊髄を摘出し、10%ホルマリンで固定した。脊髄は、固定しパラフィンに包埋してから切片を作製した後に精査した。脱髄および炎症性病変について評価するために、切片をルクソールファストブルー/過ヨウ素酸-シッフ-ヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡により解析した。炎症および脱髄の半定量的解析は、各マウスから少なくとも10枚の切片を調べることにより決定した。
表示の免疫化後の様々な時点で、媒体およびRTL処置マウスから流入領域リンパ節(LN)および脾臓を摘出した。細目スクリーンを通して組織をホモジナイズすることにより、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を、96ウェル平底組織培養プレートで、単独の(対照)または様々な濃度の被験Ag(PLP139-151、PLP178-191、およびMBP84-104ペプチド)を添加した刺激培地中、4x105個細胞/ウェルで培養した。細胞を7% CO2中で37℃で3日間インキュベートした。インキュベーションの最後の18時間は、細胞を[メチル-3H]チミジン(PerkinElmer、マサチューセッツ州ボストン) 0.5μCiでパルスした。ガラス繊維フィルター上に細胞を回収し、液体シンチレーションカウンターによりトリチウム標識チミジンの取り込みを測定した。3つ組ウェルから平均値および標準偏差(SD)を計算した。Ag誘導性cpmから対照cpmを減算することにより、正味のcpmを計算した。
LNおよび脾臓細胞を、24ウェル平底組織培養プレートで、2μg/ml PLP139-151ペプチドを添加した刺激培地中、4x106個細胞/ウェルで48時間培養した。次いで上清を回収し、サイトカインについて試験するまで-80℃で保存した。マウス炎症CBAキットを用いて、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-10、およびIL-6を同時に検出した(BD Biosciences、カリフォルニア州サンディゴ)。簡潔に説明すると、試料 50μlを混合捕獲ビーズ 50μlおよびマウスPE検出試薬 50μlと混合した。チューブを暗下で室温で2時間インキュベートし、続いて洗浄段階を行った。次に試料を洗浄緩衝液 300μlに再懸濁し、その後FACScanに取り込ませた。データはCBAソフトウェア(BD Biosciences)を用いて解析した。キット中に提供される混合ビーズ標準物質を用いて各サイトカインについて検量線を作成し、上清中のサイトカインの濃度を適切な検量線からの補間により決定した。
以前に記載されている通りに(Bourdette et al., 1991)、脳由来の単核細胞をパーコール密度勾配で単離した。次いで、1x106個細胞当たりAb 1μlを添加することにより、細胞をCD3 FITC(BD PharMingen、カリフォルニア州サンディゴ)およびVLA-4-PEまたはLFA-1-PE(Southern Biotechnology Associates、アラバマ州バーミングハム)発現で染色した。細胞を4℃で20分間インキュベートし、次いで染色培地(1xPBS、3%FBS、0.02%アジ化ナトリウム)で2回洗浄してから、CellQuestソフトウェア(BD Biosciences)を用いてFACScan装置(BD Biosciences)でFACS解析した。二重陽性T細胞を、解析した単核細胞全体に占める割合として算出した。
RNeasyミニキットプロトコル(Qiagen)を用いて脊髄から全RNAを単離し、次いでオリゴ(dT)、ランダムヘキサマー、およびSuperscript RT II酵素(Invitrogen、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてcDNAに変換した。Quantitect SYBR Green PCRマスターミックス(Qiagen)およびプライマー(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティーにより合成)を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応は、以下の遺伝子を検出するための記載のプライマー配列(5'から3')を用いて、ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)で行った。
CD解析から、ヒトRTLが、X線結晶学によって決定される天然ヒトMHCクラスII分子のTCR認識/ペプチド結合α1β1ドメインと類似した二次構造組成を有することが示される(Chang et al., 2001;Smit et al., 1998;Li et al., 2000)。本研究において観察されたCDデータから、マウスRTLが、すべてのマウスMHCクラスII Ag結合ドメインに共通した類似の逆平行βシートプラットフォームおよびαヘリックス二次構造(Fremond et al., 1998;He et al., 2002;Scott et al., 1998)を共有することが示された。サイズ排除クロマトグラフィーデータ(図26)およびDLSを用いる流体力学解析から、精製され再度折り畳まれたRTL400およびRTL401がTris-Cl緩衝液中で単分散分子であることが示された。サイズ排除カラムからの各ピークの画分を回収し、CDにより解析した。変数選択法(Compton et al., 1986)を用いる二次構造解析から、マウスRTLが、天然マウスI-AkおよびI-Au MHCクラスII分子に類似した非常に規則正しい二次構造(Fremont et al., 1998;He et al., 2002)を維持することが示された。
最初の前臨床試験では、EAEの確立された徴候を有するSJL/Jマウスを、PLP139-151ペプチドを含むRTL401 100μgの様々な回数の連日静脈内注射で処置した。図27に示すように、対照マウスは典型的に再発性EAEの疾患経過を表し、PLP139-151ペプチド/CFAの注射後11〜12日目に急性疾患の最初のエピソードを発症し、15日目にピーク臨床スコアを生じ、その後臨床的に改善して、この改善は20日目まで持続した。本質的にすべてのマウスにおいて、22目までに最初の再発が明白となり、27〜28日目に2次ピークに達した。マウスは一般的にその後寛解し、さらに再発したまたは慢性EAEを発症した可能性があるが、臨床経過におけるこれらの変動は個々のマウスにおいて散発的に起こった。
a対照と比較した有意差、p<0.05。
bペプチドと比較した有意差、p<0.05。
cRTL400と比較した有意差、p<0.05。
d抗ヒスタミンと比較した有意差、p<0.05。
a対照群と処置群との間の有意差、p<0.05。発症率:群内で発症したマウスの数。発症:EAEの最初の臨床徴候が認められた日。ピーク:最大EAEスコア。再発:48時間にわたるEAEスコアの1ポイントの減少、およびその後の48時間にわたるEAEスコアの増加を示すマウスの数。平均CDI:累積疾患指数;実験の全期間にわたる毎日のスコアの合計。
インビボにおけるRTL処置のペプチド特異性を評価するため、いずれもI-Asにより拘束される2つの異なる脳炎誘発性ペプチド、PLP178-191およびMBP84-104によりSJL/Jマウスで誘発したEAEを、RTL401を用いて処置した。RTL401 100μgの8日間の連日静脈内注射は、媒体処置対照マウスと比較して、いずれのペプチドにより誘発されるEAEの全体的重症度にも再発率にも有意に影響しなかったが(p>0.2)、各症例において累積疾患指数のわずかな減少が認められた。EAEを有するPLP178-191およびMBP84-104ペプチド免疫化マウスにおける42日目のLN応答は、免疫化ペプチドにのみ特異的であり、PLP139-151ペプチドに対して応答は認められず、エピトープ拡散の欠如が示された。
EAEを有する媒体対照およびRTL401処置(100μgの8日間の連日静脈内注射)SJL/Jマウスに由来するLNおよび脾細胞を、処置過程において、免疫化PLP139-151ペプチドに対する増殖応答およびサイトカイン応答について解析した。疾患発症の直後で処置の前(11日目)、処置開始の24時間後(13日目)、最初の臨床エピソードのピーク時(15日目)、最初の寛解の時点(18日目)、最初の再発の開始時(22日目)、最初の再発のピーク時(28日目)、および最初の再発の終了時(42日目)に、免疫細胞応答を評価した。DR2発現マウスにおける以前に公表された結果(Vandenbark et al., 2003)とは対照的に、EAEの経過中のいずれの時点においても、増殖応答に及ぼすRTL処置の有意な阻害効果は認められなかった。図29に例証するように、RTL401による処置により、LN培養物におけるPLP139-151ペプチドに対する増殖応答はわずかに阻害されたが、図29に示す42日目を含むいくつかの時点で脾細胞培養物の増殖は有意に増強された。対照的に、RTL401処置は、PLP139-151刺激脾細胞からのサイトカイン分泌に混合効果をもたらした(図30)。RTL401処置開始の1日後(13日目)には、対照マウスと比較してサイトカインの有意な変化は認められなかった。驚くべきことに、EAEの最初のエピソードのピーク時(15日目)に、対照マウスに対してRTL401処置マウス由来の脾細胞培養液において、炎症因子(TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6)および抗炎症因子(IL-10)の分泌の増強が認められた。しかしながら、EAEの最初のエピソードからの寛解期に(18日目)サイトカイン像は劇的に変化し、IFN-γレベルは強度に減少し、MCP-1レベルはなお増強されたが、RTL401処置マウスにおけるTNF-α、IL-6、およびIL-10に有意差は認められなかった。最初の再発の発症時には(22日目)、RTL401処置マウスにおいて分泌されたIFN-γの有意な減少が再度認められたが、他の炎症因子に有意差は認められなかった(図30)。全身制御にとって重要であり得ることには、最初の再発の発症時およびピーク時(それぞれ22日目および28日目)に、RTL401処置マウス由来のPLP139-151反応性脾細胞による分泌IL-10レベルの顕著な増加が認められた。EAEの過程中、IgG1およびIgG2a Abが血清中に検出されたが、そのレベルはRTL401処置の結果としてわずかな変動を示すにすぎなかった。
EAEに及ぼすRTL401処置の効果をさらに評価するため、組織学的切片を取得し、CNS細胞の表現型および機能解析を行った。46日目に採取した脊髄の組織学的切片から、対照マウスに対してRTL401処置マウスにおける炎症性病変の軽減および脱髄の減少が示された。より具体的には、RTL処置マウス由来の脊髄は、周囲の有髄組織においてごくわずかにミエリン染色を消失してまたは明らかな消失なしに、高密度の単核細胞浸潤を示した。対照非RTL処置マウス由来の脊髄は、高密度単核細胞浸潤の複数の領域を示し、単核細胞浸潤に隣接した領域にはミエリン染色の多大な散在性消失が存在した。RTL401処置マウスに見出される炎症活性のこの減少は、処置過程にわたる脳および脊髄組織から得られる炎症性単核細胞の数の減少に反映された(図31)。炎症細胞の減少は最初の臨床エピソードの発症時およびピーク時(13日目および15日目)ならびに最初の再発の発症時(22日目)に最も顕著であり、FACS解析によって決定されるCD4+ T細胞の全体的な減少(43%から23%)およびしかしCD11b+単核細胞/マクロファージの上昇(38%から60%)によって特徴づけられた。さらに、接着/ホーミングマーカー、VLA-4およびLFA-1を発現しているT細胞の数は、EAE誘発後の22日、28日、および42日目(脳のみ)に、RTL401処置マウス由来の脳および脊髄で一貫して減少していた(図32)。15日目の、RTL-401処置マウス由来の脊髄組織のRT-PCR解析から、炎症性サイトカイン(IFN-γ、TNF-α、およびIL-6)およびケモカイン(RANTES、MIP-2、およびIP-10)のmRNA発現の中程度から強度の減少、ならびにしかしこのサイトカインの防御的役割を示す他のデータと一致する(Matejuk et al., 2004)TGF-β3の発現の増強もまた示された(図33)。IL-10の発現は、RTL処置マウス由来の脊髄においてEAE疾患過程を通して非常に低く、最初の再発期(22日目)にRTL401処置マウスにおいてわずかに増強されるにすぎなかった(図33)。興味深いことに、大部分のケモカイン受容体(CCR1、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、およびCCR8)の発現は、RTL401処置マウス由来の脊髄組織において、最初のエピソードのピーク時(15日目)に始まって中程度から強度に減少していた(図34)。対照的に、CCR3(Th2関連)の発現は、最初の再発期(22日および28日目)に、対照マウスに対してRTL401処置マウスから回収された脊髄組織において独特に増強されるようであった(図34)。
別の実験において、RTL401を用いて、SL/JマウスにおけるPLP-139-151により誘発されるEAEを処置した。EAEの発症は11日目に明白となり、20日目にピークに達した。マウスに、20日目に開始する静脈内注射によるRTL401の連続5回の処置、および32日目に開始する皮下注射による連続3回の処置を施した。CO2吸入により60日目にマウスを屠殺した。吹送により脊髄を摘出し、10%ホルマリン/PBSで固定した。パラフィン切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。脊髄当たり10の横断面それぞれにおいて、神経病変を等級づけした。図43ならびに表9および10に見られる通り、RTL401による処置により、脊髄胸部の背側、外側、および腹側白質におけるミエリン損傷の量が有意に減少した。
実験的自己免疫性脳脊髄炎のCNSおよび末梢部位におけるT細胞生物学に及ぼすサイトカイン変換および関連のRTL効果
動物
雌SJLマウスは、7〜8週齢の時点でJackson Laboratory(メイン州バーハーバー)から入手した。マウスは、施設の指針に従ってポートランド退役軍人医療センター動物施設に収容した。
RTL401の設計、クローニング、および発現の方法は、実施例14に上記したものを利用した。次いで、マウスI-Asβ1α1挿入物をpET21d(+)ベクターに連結し、陽性コロニーの選択および配列確認のために、Nova blue大腸菌宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。次に、RTL400およびRTL401プラスミド構築物を大腸菌株BL21(DL3)発現宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。タンパク質の精製については、以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
光散乱実験は、DynaPro分子サイズ測定装置(Protein Solutions, Inc.、バージニア州シャーロッツビル)で行った。pH8.5の20mM Tris-Cl緩衝液中のタンパク質試料を1.0mg/mlの濃度で100nm Anodisc膜フィルター(Whatman、ニュージャージー州クリフトン)を通して濾過し、濾過試料20μlを石英キュベットに入れ、488nmレーザービームで解析した。4℃で50スペクトルを収集し、水溶液中のタンパク質の拡散係数および相対多分散性を決定した。次いで、データをDynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions、バージニア州シャーロッツビル)で解析し、緩衝液基準を減算した。データは、単位としてnmを使用して、試料の流体力学半径の平均値として表した。RTLの分子量は、DynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions、バージニア州シャーロッツビル)を用いて決定した。
CD解析は、Aviv Model 215 CD分光計(Aviv Associates、ニュージャージー州レークウッド)を用いて、組換えタンパク質がpH8.5のTris-Cl緩衝液中に存在すること以外は以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。内蔵アルゴリズムを用いてスペクトルを平均化および平滑化し、緩衝液基準を減算した。内蔵デコンボリューションソフトウェアパッケージ(CDNNバージョン2.1)および変数選択法(Compton et al., 1986)を用いて、二次構造を決定した。
SJLマウスを、完全フロイントアジュバント 200μg中のPLP139-151(ser) 150μgで免疫化した。免疫化の10日後に、リンパ節および脾臓を摘出し、2%ウシ胎仔血清を含む刺激培地中、10μg/ml PLP139-251の存在下でインビトロで48時間培養した。次いで細胞を洗浄し、1千500万個の活性化細胞(blasting cell)をSJLマウスに静脈内注射した。マウスは、以下の尺度に従ってEAEの徴候に関して毎日評価した;0=正常;1=尾部弛緩または軽度後肢脱力;2=中等度後肢脱力または軽度運動失調;3=準重度後肢脱力;4=重度後肢脱力または軽度前肢脱力または中等度運動失調;5=中等度以下の前肢脱力を伴う対麻痺;および6=重度前肢脱力もしくは重度運動失調を伴う対麻痺、または瀕死状態。累積疾患指数(CDI)は、実験の全期間にわたる各マウスの毎日のEAEスコアの合計である。CDIは各群の平均値±SDとして表す。EAEの臨床徴候の発症時にマウスを3群に分割し、対照として、または抗ヒスタミンを伴うRTL401 100mlの5日間の静脈内注射、もしくはRTL401 100mlの8日間の皮下注射で処置した。マウスは、エクスビボ解析のために屠殺するまで、疾患についてモニターした。
臨床疾患の19日目にマウスから無傷の脊髄を摘出し、10%ホルマリンで固定した。脊髄は、固定しパラフィンに包埋してから切片を作製した後に精査した。切片は、炎症性病変を評価するためにヘマトキシリン/エオシン(HE)で染色し、光学顕微鏡により解析した。炎症の半定量的解析は、各マウスに由来する頸部、胸部、および腰部切片の少なくとも10枚の複製物を調べることにより決定した。
手順は、Pitt et al. (2000)によって記載されている通りに実施した。PBS灌流脊髄を、氷冷RIPA+緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1mM NaCO3)およびプロテアーゼ阻害剤中でホモジナイズし、振盪しながら15分間インキュベートした。遠心分離(4℃で14,000xg、15分間)後に上清を回収し、タンパク質濃度を測定してRIPA+緩衝液で調整した。試料をサンプリング緩衝液中で70℃にて10分間変性させ、次いで10% SDS-PAGEにより分離し、PVDF膜にブロットした。転写後、膜を3% BSA中で1時間ブロッキングした。非リン酸化神経フィラメントに特異的な一次モノクローナル抗体SMI 32(3% BSAおよび0.05% Tween-20で1:5,000希釈、Sternberger Monoclonals、メリーランド州ルーサービルから購入)と共に4℃で一晩インキュベートすることにより、免疫検出を行った。洗浄した後、ブロットを、マウスIgGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗体(3% BSAおよび0.05% Tween-20で1:5,000希釈、Pierce Biotechnology, Inc.、イリノイ州ロックフォードから購入)と共に1時間インキュベートし、次いで洗浄した。ブロットは、SuperSignal West Pico Chemiluminescentキット(Pierce)により発色させた。のせたタンパク質の量を管理するため、この膜をRestore Western Blot Stripping Buffer(Pierce)を用いてストリッピング処理し、Chemicon(カリフォルニア州テメキュラ)から購入した、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対するモノクローナル抗体で再度検出した。発色後に、フィルムをスキャンし、Image Quantソフトウェア(Amersham、ニュージャージー州ピスカタウェイ)で定量化した。
PLP特異的T細胞を、培地のみ、PLP139-151(10μg/ml)、RTL401(原液)、またはRTL401(1:10)の存在下おいてインビトロで24時間インキュベートした。次いで細胞を徹底的に洗浄し、20,000個のT細胞を96ウェル平底プレートで、単独のまたは10μg/mlもしくは2μg/mlのPLP139-151を添加した刺激培地中、2x105個抗原提示細胞と共に培養した。次いで、細胞を7% CO2中で37℃で2日間インキュベートした。インキュベーションの最後の18時間は、細胞を[メチル-3H]チミジン(Perkin Elmer、マサチューセッツ州ボストン) 0.5μCiでパルスした。ガラス繊維フィルター上に細胞を回収し、液体シンチレーションカウンターによりトリチウム標識チミジンの取り込みを測定した。3つ組ウェルから平均値および標準偏差を計算した。対照cpmに対する抗原特異的cpmの比を計算することにより、刺激指数を決定した。
各群のマウス3匹から脳をプールし、細目スクリーンを通して処理した。次いで単核細胞を40%〜80%パーコール勾配で単離し、1x106個の脳細胞を24ウェルプレートで、10μg/ml PLP-139-151ペプチドの存在下で、3x106個の照射脾細胞(補充細胞(filler cell)として使用)と共に48時間培養した。脾臓および血液単核細胞は、24ウェル平底培養プレートで、2μg/ml PLP-139-151ペプチドを添加した刺激培地中、4x106個細胞/ウェルで48時間培養した。
免疫化後19日目に、対照、RTL(静脈内)、およびRTL(皮下)マウスから脾臓、血液、および脳を摘出し、4x106個細胞を刺激培地中、10μg/ml PLP139-151の存在下において48時間培養した。インビトロアッセイの場合には、細胞を、PLP139-151(2μg/ml)と共にまたはこれを伴わずに、APCの存在下で培養した。上清を回収し、さらなる試験まで-80℃で凍結した。96ウェルプレートを、1xPBSまたは炭酸水素ナトリウムコーティング緩衝液中の抗マウスIL-13またはIL-4捕獲抗体(4μg/ml) 100μlでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートした。次にプレートを洗浄緩衝液(1xPBS/0.05% Tween-20)で洗浄し、ブロッキング緩衝液(1xPBS、2% BSA)で室温で2時間ブロッキングした。次いでプレートを洗浄し、試料または標準物質100μlを各ウェルに添加した。Il-13プレートは室温で2時間インキュベートし、IL-4プレートは4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ビオチン化抗体(IL-13またはIL-4) 100μlを添加した。IL-13プレートは室温で2時間インキュベートし、IL-4プレートは室温で45分間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、100mlの1:200希釈HRPをIL-13プレートに添加し、1:400希釈HRPをIL-4プレートに添加した。プレートを室温で30分間インキュベートし、続いて洗浄段階を行った。その後、TMB色素原(KPL、メリーランド州ゲイサーズバーグ) 100μlを添加した。プレートを約30分間発色させ、停止溶液(KPL、メリーランド州ゲイサーズバーグ) 100μlを添加することにより反応を停止させた。続いて450nmで光学濃度を測定した。
RNeasyミニキットプロトコル(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて脊髄から全RNAを単離し、次いでオリゴdT、ランダムヘキサマー、およびSuperscript RT II酵素(Invitrogen、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてcDNAに変換した。Quantitect SYBR Green PCRマスターミックス(Qiagen)およびプライマー(ABIにより合成)を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応は、L32ハウスキーピング遺伝子を対照として含め、以下の遺伝子を検出するための従来の市販のプライマーを用いて、ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)で行った。
媒体群と処置群の間の統計的有意差は、マン・ホイットニー検定により決定した。サイトカインレベルの差は、スチューデントのt検定により評価した。P値≦0.05を有意とみなした。
SJLマウスに、1千500万個のPLP139-151特異的T細胞を注射した。EAEの臨床徴候の発症時(6日目)に、マウスを媒体、またはRTL401の5日間の静脈内注射、またはRTL401の8日間の皮下注射で処置した(図35A)。静脈内および皮下経路の投与はいずれも、疾患の臨床徴候の抑制に非常に効果的であった。媒体処置マウス(n=8)が累積疾患指数(CDI) 46±10.5を示したのに対し、静脈内処置マウス(n=8)はCDI 19.5±5.1を有し、皮下処置マウスではCDI 21.4±9.9であった。静脈内および皮下処置マウスではピーク疾患スコアもまた有意に低く(媒体4.5±0.9 対 皮下群2.3±1.0 対 静脈内群2.1±0.4)、p<0.01)、臨床スコアの持続した減少に先だつ、RTL401処置群におけるEAEのごく最小限の進行が示された。RTL401の著しい治療効果は、2回目の実験において高度に再現性があった(媒体群のCDI 50.5±4.4 対 RTL静脈内処置マウスのCDI 18.9±7.9、各群につきn=7、p<0.01、図35B)。疾患のピーク強度もまた、RTL静脈内処置後に顕著に抑制された(対照4.9±0.2 対 RTL処置マウス2.4±0.8)。
媒体処置マウスから19日目に摘出した脊髄の組織学的検査から、高密度でかつ限局性の単核細胞浸潤を伴う炎症性病変が示された(図40A)。対照的に、RTL401処置マウスの19日目の脊髄では、これらの病変の有意な軽減が認められた(図40B)。RTL401で処置すると、同様に、脳組織から回収される単核細胞が60%減少した(媒体から2x106個 対 RTL静脈内処置から8x105個)。
再発性および進行性EAEは、MSで認められる軸索消失と類似の軸索消失を引き起こす。EAE過程における軸索生存に及ぼすRTL治療の効果を評価するため、T細胞移植後19日目のRTL401および媒体処置マウス(静脈内経路)の脊髄でウェスタンブロットを行い、非リン酸化神経フィラメント(NPNFL)を評価した。処置を開始したEAEの発症時(6日目)には、NPNFLおよび対照マーカー、GAPDHの染色のシグナル強度は、無症候性の未処理マウスと比較して、臨床スコア2.0を有するマウスで変化はなかった(図41Aおよび41B)。しかしながら、19日目の処置の完了時に、臨床スコア4.0を有する媒体処置マウスでは、未処理もしくは処置前マウス、または明らかな軸索消失が見られない臨床スコア1.5を有するRTL401処置マウスと比較して、NPNFLの染色が60%増加していた(図41Aおよび41B)。この実験および2回の反復実験の結果から、RTL401による早期処置は、神経線維を保護し、EAEの進行によるさらなる軸索消失を防ぐことが示された。
19日目に、対照マウス、RTL静脈内処置マウス、およびRTL皮下処置マウスから、脾臓、血液、および脳を摘出した。単核細胞を単離して、10μg/ml PLP-139-151ペプチドの存在下で48時間培養し、次いで分泌されたサイトカインのレベルについて培養上清をアッセイした。EAEを有する媒体処置マウス由来の脾細胞では、PLP-139-151ペプチドにより誘導される優勢なサイトカインは、IFN-γおよびIL-13であった。RTL401の静脈内および皮下注射による処置により、Th1サイトカイン(TNF-α、IFN-γ、IL-6、図37)およびTh2サイトカイン(IL-13、IL-4、IL-10、図36)の産生の有意な増加が誘導された。EAEを有するマウス由来の血液細胞では、PLP-139-151ペプチドにより誘導されるサイトカインパターンは著しく異なり、IL-6の分泌が優勢であり、残りのTh1およびTh2サイトカインは低度から中程度レベルであった(図36および37)。RTL401の静脈内および皮下注射で処置すると、IL-6およびIL-4は50〜75%減少したが、IFN-γおよびIL-13産生は4倍を超えて増加した(図36および37)。TNF-αおよびIL-10レベルは最初から低く、RTL401による処置後も変化しなかった。
インビトロモデルを使用してRTLがどのようにしてT細胞応答に影響を及ぼすのかを実証するため、受動移植実験に使用したPLP-139-151ペプチド特異的T細胞を100または10μg/ml RTL401と共に24時間インキュベートし、その後照射脾細胞APCを添加し、さらに48時間インキュベートして、サイトカイン分泌プロファイルを評価した。対照として、T細胞を培地、またはRTL401構築物の100μg/ml用量中に含まれるペプチドのモル濃度等価物を表す10μg/ml遊離PLP-139-151ペプチドと共にプレインキュベートした。図42Aおよび42Bに示すように、培地と共にプレインキュベートしたPLP-139-151特異的T細胞は、無視できるレベル(<50pg/ml)の炎症性サイトカイン(TNF-α、IFN-γ、およびIL-6)および非炎症性サイトカイン(IL-13、IL-10、およびIL-4)を産生した。遊離PLP-139-151ペプチドと共にプレインキュベートしたT細胞では、すべてのサイトカイン、特にIL-13(1,000pg/ml)およびより低度にTNF-α(400pg/ml)の分泌が実質的に増加した。T細胞を100μg/ml RL401(原液)と共にプレインキュベートすると、アッセイしたすべてのサイトカインの分泌が著しく増加し、やはりIL-13に対して優勢な効果があり(12,000pg/ml、12倍の増加)、TNF-αに対してそれよりも低い効果があった(3,000pg/ml、7.5倍の増加)。T細胞を10μg/ml RTL401(1:10)と共にプレインキュベートすると、RTL401調製物中の結合ペプチドの濃度はわずかに〜1μg/mlであるにもかかわらず、10μg/ml遊離PLPペプチドと同様のサイトカイン応答が生じた。これらの結果から、PLP特異的T細胞をRTL401と共にプレインキュベートしてから、付加的なペプチドなしにAPCを添加することにより、PLPペプチドのモル濃度等価物よりも有意に高いサイトカイン分泌が誘導され、Th2サイトカイン、IL-13の優勢な分泌が起こることが実証された。EAEの防御に対するIL-13の重要性を考えると、これらのデータから、IL-13は、RTL治療によって媒介される疾患の重症度および進行の軽減に関与する主要な制御サイトカインとして意味づけられる。
サイトカインmRNAの遺伝子発現を、RTL401で処置した、19日目の受動的EAE罹患マウスの脾臓および脊髄で評価した。RTL処置マウスの脾臓では、RTL401静脈内処置マウス由来の脾細胞において、分泌タンパク質および炎症促進性サイトカイン、IFN-γおよびTNF-αの有意な増加、さらにまたTh2サイトカインであるIL-13、IL-4、およびIL-10(図38)、Tr1サイトカイン(IL-10)、ならびに以前にEAEに対する防御と関連づけられたTGF-β3(Matejuk et al., 2003)の劇的な増加が認められた(図38)。T-regマーカーであるFoxp3またはTGF-β1の発現に有意な変化は検出されず、T-reg細胞もTh3細胞もRTL処置機構に関与していないことが示唆された(図38)。これらの変化は、表11に示す、3回の別個の実験から平均化されたデータの代表的なものである。
能動的に誘発されたEAEを有するSJLマウスのミエリンおよび軸索損傷の処置におけるRTL401の有効性
動物
雌SJLマウスは、7〜8週齢の時点でJackson Laboratory(メイン州バーハーバー)から入手した。マウスは、施設の指針に従ってポートランド退役軍人医療センター動物施設に収容した。
RTL401の設計、クローニング、および発現の方法は、実施例14に上記したものを利用した。次いで、マウスI-Asβ1α1挿入物をpET21d(+)ベクターに連結し、陽性コロニーの選択および配列確認のために、Nova blue大腸菌宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。次に、RTL400およびRTL401プラスミド構築物を大腸菌株BL21(DL3)発現宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。タンパク質の精製については、以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
完全フロイントアジュバント 200μg中のPLP139-151(ser) 150μgを接種することにより、雌SJLマウス(8匹/群)において能動的EAEを誘発した。免疫化後の20日目から開始し、1群のマウスにRTL401 100μgの5日間の連日静脈内注射を施し、その後に32日目から開始するRTL401 100μgの連続3日間の連日皮下注射を施した。免疫化後、マウスを以下の尺度に従って接種後のEAEの徴候に関して毎日評価した:0=正常;1=尾部弛緩または軽度後肢脱力;2=中等度後肢脱力または軽度運動失調;3=準重度後肢脱力;4=重度後肢脱力または軽度前肢脱力または中等度運動失調;5=中等度以下の前肢脱力を伴う対麻痺;および6=重度前肢脱力もしくは重度運動失調を伴う対麻痺、または瀕死状態。媒体処置マウスは、11日目(EAEの発症)、20日目(EAEのピーク直後)、および60日目(実験終了)に屠殺した。図44に見られるように、RTL401の投与により、EAE誘発SJLマウスの平均臨床スコアが改善された。
免疫化後の20日目(ピーク)または60日目に、マウスにイソフルランで深く麻酔をかけ、ヘパリン処置し、0.1Mリン酸平衡緩衝液(pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒドで10秒間、次いで0.1Mリン酸平衡緩衝液(pH7.4)中の5%グルタルアルデヒド 100mlで灌流し、その後4℃で24時間保存した。脊柱から脊髄を分離し、頸髄、胸髄、および腰髄から1〜2mm長切片を試料採取した。トルイジンブルー染色および電子顕微鏡解析による病理組織診断のため、組織を0.1Mリン酸平衡緩衝液(pH7.4)中に置き、1%四酸化オスミウム(0.1Mリン酸緩衝液中)で2.5時間かけて後固定し、エタノール中で脱水し、プラスチック中に包埋した。半薄切片(0.5μm)をトルイジンブルーで染色した。デジタルカメラを備えた複合顕微鏡により、倍率25xで像を保存した。薄切片(80〜90nm)を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、JOEL 100CX電子顕微鏡を用いて検鏡した(BGGによる)。
処置状態の予備知識なしに、組織切片を解析した。損傷を示す脊髄の割合を、胸髄中部で決定した。脊髄全体のフォトモンタージュ(最終倍率x100)上で、損傷した線維を含む後柱および外側/腹側白質の領域を囲んだ。損傷領域を赤線で表示し、SummaSketch III(Summagraphics、コネチカット州セイモア)デジタル化タブレットおよびBIOQUANTソフトウェア(R&M Biometrics、テネシー州ナッシュビル)を用いて測定した。後柱および外側/腹側白質の総面積(損傷および非損傷)の測定も行った。累積パーセント病変領域を、各領域について、および各領域を合わせた全損傷について計算した。図45に示すように、RTL401処置マウスの脊髄におけるミエリン損傷は、60日目に安楽死させた媒体処置マウスと比較して大幅に減少していた。さらに、RTL処置マウスにおけるミエリン損傷の程度を、11日目、20日目、および60日目に安楽死させた媒体処置マウスのものと比較すると、RTL401処置により、EAEにおけるミエリン損傷の発生が逆転されることが認められた。
再発性および進行性EAEは、MSで認められる軸索消失と類似の軸索消失を引き起こす。EAEマウスにおける軸索損傷のレベルを決定するため、免疫化の60日後に、各群由来のさらなるマウス4匹の脊髄を切断して胸部および腰部切片を作製した。胸髄の4つを固定し、神経フィラメントの抗体であるSMI312による全軸索の、および非リン酸化神経フィラメント(NPNFL、軸索損傷のマーカー)の抗体であるSMI32による損傷軸索の組織化学的染色に供した。免疫細胞の浸潤は、核のヘマトキシリン染色で解析した。図46Aに示すように、軸索はSMI312で暗褐色に染色され、浸潤細胞はヘマトキシリンで明るい青色に染色された。治療的介入がない場合、軸索染色は浸潤免疫細胞の存在下で顕著に減少し、大部分の神経炎症が起こる白質の外側領域においてSMI312の染色が激しく消失した。これに対してRTL401処置マウスの脊髄中の軸索は、十分に保存されていた。ヘマトキシリンブルーで染色された免疫細胞は、RTL処置マウスの脊髄においてはるかに頻度が低かった(図46AおよびC)。媒体 対 RTL401処置マウスの背側および外側/腹側骨髄における軸索消失の領域は、それぞれ31.8%および27.6% 対 3.5%および1.3%であった。統計解析から、RTL401処置が、軸索損傷および神経炎症が進行的に発達する傾向を有意に逆転させることが示された(図46BおよびC、表II)。図46Dに示すように、軸索損傷の程度は、ピアソンの相関分析によって実証されるように(r=0.8636、P(両側)=0.0003)神経炎症と有意に相関した。この知見から、RTL401が、免疫細胞の脊髄への浸潤を減少させることによりCNS損傷を軽減し得ることが示唆される。
Claims (203)
- 第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まない、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量;および
抗原決定基
を含み、
該対象におけるT細胞の1つまたは複数の免疫応答または免疫調節活性を調節するのに有効である、
哺乳動物対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための組成物。 - 対象が哺乳動物細胞、組織、器官、または個体である、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドのβ1ドメインとα1ドメインとの間の共有結合がペプチドリンカー配列によって提供される、請求項1記載の組成物。
- 抗原決定基がペプチド抗原である、請求項1記載の組成物。
- 抗原決定基がMHCクラスIIポリペプチドの第一ドメインのアミノ末端に共有結合されている、請求項1記載の組成物。
- 抗原決定基が非共有結合性相互作用によりMHCクラスIIポリペプチドと会合している、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドが共有結合された検出マーカーまたは毒性部分をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DRタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DQタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DPタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスII MHC成分が、対応する天然MHCクラスII分子のCD4相互作用ドメインを除外する、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTL中に同定される自己会合界面に相当する標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失、または再編成によって改変され、それによって改変RTLが、a)またはb)に記載のMHC成分構造を有するが無傷の自己結合界面を有する天然MHCポリペプチドを組み入れた未改変対照RTLの示す凝集と比較して、溶液中における凝集の減少を示す、請求項1記載の組成物。
- MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム内の疎水性残基の存在によって特徴づけられる1つまたは複数の標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換または欠失によって改変される、請求項1記載の組成物。
- 1つまたは複数の標的部位が、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム中心コア内の自己結合モチーフを規定する、請求項13記載の組成物。
- 1つまたは複数の標的部位が、V102、I104、A106、F108、およびL110より選択されるβシートプラットフォームの中心コア部分の残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項13記載の組成物。
- 1つまたは組み合わせの残基が非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
- 1つまたは組み合わせの残基が極性または荷電アミノ酸との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
- 1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
- 1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
- βシートの中心コア部分の残基V102、I104、A106、F108、およびL110がそれぞれ非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
- 1つまたは複数の標的部位が、L9、F19、L28、F32、V45、V51、A133、V138、およびL141より選択されるβシートプラットフォームの残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項13記載の組成物。
- T細胞受容体(TCR)媒介性Ag特異的様式でT細胞活性を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- インビトロまたはインビボでT細胞増殖または炎症性サイトカイン産生を阻害するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 哺乳動物細胞または対象における自己免疫疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞の増殖を減少させるまたは防ぐのに有効である、請求項1記載の組成物。
- Tサプレッサー表現型を誘導するのに有効な組成物であり、それによって該組成物に曝露されたT細胞がT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞より選択される別の細胞の免疫活性を抑制する、請求項1記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- サイトカインがIFN-γである、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがTNF-αである、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがIL-2である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがIL-4である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがIL-6である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがIL-10である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがIL-13である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがMCP-1である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがTGFβ1である、請求項27記載の組成物。
- サイトカインがTGFβ3である、請求項27記載の組成物。
- 対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項27記載の組成物。
- 1つまたは複数のサイトカインの発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項27記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 接着/ホーミングマーカーがVLA-4である、請求項40記載の組成物。
- 接着/ホーミングマーカーがLFA-1である、請求項40記載の組成物。
- 対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項40記載の組成物。
- 1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項40記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- ケモカインがRANTESである、請求項45記載の組成物。
- ケモカインがMIP-2である、請求項45記載の組成物。
- ケモカインがIP-10である、請求項45記載の組成物。
- 対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項45記載の組成物。
- 1つまたは複数のケモカインの発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項45記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR1である、請求項51記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR2である、請求項51記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR3である、請求項51記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR5である、請求項51記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR6である、請求項51記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR7である、請求項51記載の組成物。
- ケモカイン受容体がCCR8である、請求項51記載の組成物。
- 対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項51記載の組成物。
- 1つまたは複数のケモカイン受容体の発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項51記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh1サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh2サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- T細胞による1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- T細胞制御性マーカーがFoxp3である、請求項63記載の組成物。
- T細胞制御性マーカーがTGFβ1である、請求項63記載の組成物。
- 対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞によるT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項63記載の組成物。
- 1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現の調節が、T細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項63記載の組成物。
- 対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による位置、遊走、走化性、および/または浸潤の変化を誘導するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- CNS区画中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項68記載の組成物。
- 対象の脊髄組織中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項69記載の組成物。
- CNS区画中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項68記載の組成物。
- 対象の脊髄組織中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項71記載の組成物。
- 第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まない、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドと、抗原決定基とを含む、対象におけるT細胞の1つまたは複数の免疫応答または免疫調節活性を調節するのに十分である組成物の免疫調節有効量を、該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための方法。 - 対象が哺乳動物細胞、組織、器官、または個体である、請求項73記載の方法。
- 抗原決定基がペプチド抗原である、請求項73記載の方法。
- 抗原決定基がMHCクラスIIポリペプチドの第一ドメインのアミノ末端に共有結合されている、請求項73記載の方法。
- 抗原決定基が非共有結合性相互作用によりMHCクラスIIポリペプチドと会合している、請求項73記載の方法。
- MHCクラスIIポリペプチドが共有結合された検出マーカーまたは毒性部分をさらに含む、請求項73記載の方法。
- MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DRタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項73記載の方法。
- MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DQタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項73記載の方法。
- MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DPタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項73記載の方法。
- MHCクラスII MHC成分が、対応する天然MHCクラスII分子のCD4相互作用ドメインを除外する、請求項73記載の方法。
- MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTL中に同定される自己会合界面に相当する標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失、または再編成によって改変され、それによって改変RTLが、a)またはb)に記載のMHC成分構造を有するが無傷の自己結合界面を有する天然MHCポリペプチドを組み入れた未改変対照RTLの示す凝集と比較して、溶液中における凝集の減少を示す、請求項73記載の方法。
- MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム内の疎水性残基の存在によって特徴づけられる1つまたは複数の標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換または欠失によって改変される、請求項73記載の方法。
- 1つまたは複数の標的部位が、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム中心コア内の自己結合モチーフを規定する、請求項84記載の方法。
- 1つまたは複数の標的部位が、V102、I104、A106、F108、およびL110より選択されるβシートプラットフォームの中心コア部分の残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項84記載の方法。
- 1つまたは組み合わせの残基が非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
- 1つまたは組み合わせの残基が極性または荷電アミノ酸との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
- 1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
- 1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
- βシートの中心コア部分の残基V102、I104、A106、F108、およびL110がそれぞれ非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
- 1つまたは複数の標的部位が、L9、F19、L28、F32、V45、V51、A133、V138、およびL141より選択されるβシートプラットフォームの残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項84記載の方法。
- 組成物が、T細胞受容体(TCR)媒介性Ag特異的様式で対象におけるT細胞活性を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞増殖または炎症性サイトカイン産生を阻害するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、対象における自己免疫疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞の増殖を減少させるまたは防ぐのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物がTサプレッサー表現型を誘導するのに有効であり、それによって該組成物に曝露されたT細胞が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞より選択される別の細胞の免疫活性を抑制する、請求項73記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- サイトカインがIFN-γである、請求項98記載の方法。
- サイトカインがTNF-αである、請求項98記載の方法。
- サイトカインがIL-2である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがIL-4である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがIL-6である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがIL-10である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがIL-13である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがMCP-1である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがTGFβ1である、請求項98記載の方法。
- サイトカインがTGFβ3である、請求項98記載の方法。
- 組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項98記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインの発現の調節が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項98記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 接着/ホーミングマーカーがVLA-4である、請求項111記載の方法。
- 接着/ホーミングマーカーがLFA-1である、請求項111記載の方法。
- 組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項111記載の方法。
- 1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現の調節が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項111記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- ケモカインがRANTESである、請求項116記載の方法。
- ケモカインがMIP-2である、請求項116記載の方法。
- ケモカインがIP-10である、請求項116記載の方法。
- 組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項116記載の方法。
- 1つまたは複数のケモカインの発現の調節が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項116記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR1である、請求項122記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR2である、請求項122記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR3である、請求項122記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR5である、請求項122記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR6である、請求項122記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR7である、請求項122記載の方法。
- ケモカイン受容体がCCR8である、請求項122記載の方法。
- 組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項122記載の方法。
- 1つまたは複数のケモカイン受容体の発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項122記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh1サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh2サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、対象におけるT細胞による1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
- T細胞制御性マーカーがFoxp3である、請求項134記載の方法。
- T細胞制御性マーカーがTGFβ1である、請求項134記載の方法。
- 組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞によるT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項134記載の方法。
- 1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現の調節が、T細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項134記載の方法。
- 組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による位置、遊走、走化性、および/または浸潤の変化を誘導するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、CNS区画中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項139記載の方法。
- 組成物が、対象の脊髄組織中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項140記載の方法。
- 組成物が、CNS区画中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項139記載の方法。
- 組成物が、対象の脊髄組織中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項142記載の方法。
- 第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まず、ポリペプチドは第一ドメインのアミノ末端に共有結合された抗原決定基をさらに含む、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量を、細胞もしくは組織と接触させるか、または該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物細胞、組織、または対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための方法。 - 請求項1記載の組成物の免疫修飾有効量を免疫調節細胞に投与する段階;および
その後抗原決定基を免疫調節細胞に提示し、抗原決定基の提示により免疫調節細胞が誘導されて、該免疫調節細胞により免疫修飾活性がもたらされる段階
を含む、抗原決定基に対する免疫調節細胞を誘導するための方法。 - その後免疫原性刺激とともに抗原が生じた場合に、免疫調節細胞により炎症および細胞動員が減少する、請求項145記載の方法。
- 抗原決定基が組織特異的抗原決定基である、請求項145記載の方法。
- 免疫調節細胞が対照と比較して誘導される、請求項145記載の方法。
- 免疫調節細胞がインビボにある、請求項145記載の方法。
- 免疫調節細胞がインビトロにある、請求項145記載の方法。
- T細胞を請求項1記載の組成物の有効量と接触させ、それによりT細胞によるサイトカインの発現が調節される段階を含む、哺乳動物T細胞におけるサイトカインの発現を調節するための方法。
- 細胞がインビボにある、請求項152記載の方法。
- 細胞がインビトロにある、請求項152記載の方法。
- 請求項1記載の精製MHCクラスIIポリペプチドをコードする核酸分子を含む、哺乳動物対象における免疫応答を誘発するための免疫修飾組成物。
- 核酸がプロモーターと機能的に連結されている、請求項154記載の免疫修飾組成物。
- 請求項1記載の組成物または請求項154記載の核酸の治療有効量を投与する段階;および
その後抗原決定基を対象に提示する段階
を含み、
対象において抗原決定基が提示された場合に、ポリペプチドまたは核酸の投与により免疫応答が減少する、
対象における抗原決定基に対する免疫応答を減少させるための方法。 - 免疫応答の減少が、T細胞、マクロファージ、B細胞、またはNK細胞の流入または増殖の減少である、請求項156記載の方法。
- 免疫応答の減少がサイトカイン発現の減少である、請求項156記載の方法。
- 免疫応答の減少がTサプレッサー細胞応答の誘導である、請求項156記載の方法。
- 請求項1記載の組成物の治療有効量を免疫調節細胞に投与する段階;および
その後抗原決定基を免疫調節細胞に提示する段階
を含み、
抗原決定基の提示により免疫調節細胞が誘導される、
抗原決定基に対する免疫調節細胞を誘導するための方法。 - その後免疫原性刺激とともに抗原が生じた場合に、免疫調節細胞により炎症および細胞動員が減少する、請求項160記載の方法。
- 抗原決定基が組織特異的抗原決定基である、請求項160記載の方法。
- 免疫調節細胞が対照と比較して誘導される、請求項160記載の方法。
- 免疫調節細胞がインビボにある、請求項160記載の方法。
- 免疫調節細胞がインビトロにある、請求項160記載の方法。
- T細胞によるサイトカインの発現を調節するのに十分である請求項1記載の組成物の有効量をT細胞と接触させる段階を含む、哺乳動物T細胞におけるサイトカインの発現を調節するための方法。
- 細胞がインビボにある、請求項166記載の方法。
- 細胞がインビトロにある、請求項166記載の方法。
- 請求項1記載の組成物または請求項154記載の核酸の治療有効量を対象に投与する段階を含み、
対象の免疫細胞に対する抗原決定基のその後の提示により免疫媒介性疾患が処置または予防される、
対象における免疫媒介性疾患を処置または予防する方法。 - 免疫媒介性疾患が、移植片拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、T細胞媒介性肺疾患、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、アレルギー、または特発性肺線維症である、請求項169記載の方法。
- 薬学的に許容される担体を含む請求項1記載の組成物を含む薬学的組成物。
- 請求項1記載の組成物を対象に投与し、それにより疾患を処置する段階を含む、哺乳動物対象における抗原特異的T細胞によって起こる疾患を処置する方法。
- 請求項1記載の組成物の免疫修飾有効量を対象に投与する段階を含む、哺乳動物対象におけるT細胞の免疫活性を調節するための方法。
- 第二治療剤を対象に投与する段階をさらに含む、請求項173記載の方法。
- 第二治療剤が請求項1記載の組成物との組み合わせ製剤として対象に投与される、請求項174記載の方法。
- 第二治療剤が、協調的投与プロトコルにおいて、請求項1記載の組成物の対象への投与と同時に、その前に、またはその後に対象に投与される、請求項174記載の方法。
- 第二治療剤が、免疫グロブリン;コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、およびコポリマー1またはコポリマー1関連ペプチドで処置したT細胞;阻止モノクローナル抗体、トランスフォーミング増殖因子-β、抗TNFα抗体;ステロイド剤;抗炎症剤;免疫抑制剤;アルキル化剤;代謝拮抗薬;抗生物質;コルチコステロイド;酢酸グラチラマー;組換えβインターフェロン;プロテオソーム(proteosome)阻害剤;ならびにジケトピペラジンより選択される、請求項174記載の方法。
- 軸索消失を改善するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 軸索消失を防ぐのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まず、ポリペプチドは第一ドメインのアミノ末端に共有結合された抗原決定基をさらに含む、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量を、細胞もしくは組織と接触させるか、または該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物細胞、組織、または対象における、抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答由来の軸索消失を改善するための方法。 - 第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まない、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドを含む、第一免疫修飾薬の免疫調節有効量;
抗原決定基;ならびに
免疫グロブリン;コポリマー1;コポリマー1関連ペプチド;およびコポリマー1またはコポリマー1関連ペプチドで処置したT細胞;阻止モノクローナル抗体、トランスフォーミング増殖因子-β、抗TNFα抗体;ステロイド剤;抗炎症剤;免疫抑制剤;アルキル化剤;代謝拮抗薬;抗生物質;コルチコステロイド;プロテオソーム阻害剤;酢酸グラチラマー;組換えβインターフェロン;およびジケトピペラジンより選択される第二免疫修飾薬
を含み、
該対象におけるT細胞の1つまたは複数の免疫応答または免疫調節活性を調節するのに有効である、
哺乳動物対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための組成物。 - 請求項1記載の組成物または請求項154記載の核酸の治療有効量を対象に投与する段階を含み、
対象の免疫細胞に対する抗原決定基のその後の提示により神経変性疾患が処置または予防される、
対象における神経変性疾患を処置または予防する方法。 - 神経変性疾患が、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症、播種性壊死性白質脳症、急性播種性脳脊髄炎、シルダー病、橋中央ミエリン溶解、放射線壊死、ビンスワンゲル病、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、レーバー遺伝性視神経萎縮、およびHTLV関連脊髄症である、請求項182記載の方法。
- 脱髄を改善するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 脱髄を防ぐのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 脱髄を処置するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 神経フィラメントを保護するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 再ミエリン化を刺激するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まず、ポリペプチドは第一ドメインのアミノ末端に共有結合された抗原決定基をさらに含む、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量を、細胞もしくは組織と接触させるか、または該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物細胞、組織、または対象における、抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答由来の脱髄を改善するための方法。 - 検出マーカーが放射性核種、常磁性同位体、蛍光マーカー、酵素、補助因子、化学発光化合物、または生物発光化合物である、請求項7記載の組成物。
- 毒性部分が、タンパク質毒素、化学療法剤、細胞傷害性T細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、または放射性同位体である、請求項7記載の組成物。
- 哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 哺乳動物細胞または対象における脱髄疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 哺乳動物対象の中枢神経系への活性化炎症細胞の浸潤を防ぐまたは阻害するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 哺乳動物細胞または対象における自己免疫疾患の再発を予防するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患の再発を予防するのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 哺乳動物細胞または対象における抗炎症因子の分泌を増加させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
- 組成物が、哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物細胞または対象における脱髄疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物対象の中枢神経系への活性化炎症細胞の浸潤を防ぐまたは阻害するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物細胞または対象における自己免疫疾患の再発を予防するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患の再発を予防するのに有効である、請求項73記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物細胞または対象における抗炎症因子の分泌を増加させるのに有効である、請求項73記載の方法。
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