CN104105503A

CN104105503A - 部分mhc构建体及使用方法

Info

Publication number: CN104105503A
Application number: CN201380004958.1A
Authority: CN
Inventors: A·A·范登巴克; G·G·伯罗斯; R·梅萨-罗梅罗; G·贝内德克; S·安德鲁; J·穆尼
Original assignee: U S GOVERNMENT AS REPRESENTED; Oregon Health Science University
Current assignee: U S GOVERNMENT AS REPRESENTED; Oregon Health Science University; US Department of Veterans Affairs VA
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2014-10-15
Also published as: AU2013207489A8; CA2860678A1; MX2014008146A; AU2013207489A1; EP2800582A1; BR112014016652A2; US20150044245A1; WO2013103816A1; JP6364352B2; JP2015505315A; RU2014132426A; WO2013103816A8; KR20140114859A

Abstract

本文公开了分离的主要组织相容性复合物(MHC)II类α1结构域多肽和使用方法。在一些实施方案中，所述分离的多肽包含MHC II类α1结构域多肽(或其一部分)或由其组成，并且不包含MHC II类α2、β1和β2结构域。所公开的MHC II类α1结构域多肽用于治疗或抑制受试者中的疾病，例如炎性和/或自身免疫性疾病。还公开了评估使用多肽治疗受试者的功效或优化所述治疗的方法，所述多肽包含MHC II类α1结构域多肽(或其一部分)或包含MHC II类α1结构域和β1结构域的多肽(例如β1α1RTL)。

Description

部分MHC构建体及使用方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2012年1月6日提交的美国临时申请No.61/584,045的优先权，该临时申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开涉及部分主要组织相容性复合物多肽和使用方法，特别是在治疗或抑制炎性或自身免疫性疾病中的使用方法。

政府资助的声明

本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号NS47661、AI43960和DK0688861以及由退伍军人事务部授予的Merit Review和研究增强奖励计划基金(Research EnhancementAward Program grants)的美国政府资助下完成。美国政府在本发明中享有某些权利。

背景技术

哺乳动物中针对特异性抗原的免疫应答的起始是通过将所述抗原呈递至T细胞引起的。在主要组织相容性复合物(MHC)的背景下抗原被呈递至T细胞。MHC位于抗原呈递细胞(APC)表面上；MHC的三维结构包括适合所呈递的抗原进入的沟(groove)或裂隙(cleft)。当在存在必需的共刺激信号的情况下T细胞上的适当受体与APC上的MHC/抗原复合物相互作用时，所述T细胞被刺激，触发充分表征的免疫系统激活事件的级联的多个方面，包括诱导细胞毒性T细胞功能、诱导B细胞功能和刺激细胞因子产生。

多发性硬化的病理学特征在于针对中枢神经系统的异常免疫应答。具体地，认为对髓磷脂抗原具有反应性的T淋巴细胞在中枢神经系统内起始炎症应答。所产生的炎症应答包括募集T淋巴细胞，活化巨噬细胞、B淋巴细胞和浆细胞。由这些炎症细胞释放的可溶性介质导致脱髓鞘并且在较轻的程度上导致轴突变性。类似地，许多自身免疫性疾病中的炎症应答导致常常会不断加重的组织损伤。尽管最近有一些进展，但是仍需要对自身免疫性和炎性疾病有效的疗法。

发明内容

本文公开的是分离的主要组织相容性复合物(MHC)II类α1结构域多肽和使用方法。在一些实施方案中，所述分离的多肽包含MHC II类α1结构域多肽(或其一部分)或由其组成，并且不包含MHC II类α2、β1和β2结构域。在一些实例中，所述MHC II类α1结构域与抗原决定簇共价连接，例如通过肽接头、化学接头或直接的共价键。

所公开的MHC II类α1结构域多肽用于治疗或抑制受试者中的疾病，所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，给予患有炎性和/或自身免疫性疾病或病症的受试者对治疗或抑制所述疾病有效的量的所述MHC II类α1结构域多肽(例如α1多肽或具有抗原肽的α1多肽)或其一部分。在一些实例中，所述MHC II类α1结构域多肽降低CD74的表达和/或活性。

还公开了确定或评估使用多肽治疗受试者的功效或优化所述治疗的方法，所述多肽包含MHC II类α1结构域或包含MHC II类α1结构域(或其部分)和β1结构域(例如β1α1多肽)。在一些实施方案中，所述方法包括确定来自所述受试者的样品中的CD74表达或活性，将所述CD74表达或活性与对照进行比较，以及基于CD74表达和/或活性水平确定所述治疗的功效或确定是否应该调整所述多肽的剂量。

从参照附图进行的以下详细描述中，本公开的上述和其他特征将变得更加清楚。

附图说明

在附图和整个说明书中，以下术语互换使用：pDR2/mMOG-35-55与RTL342M互换使用；pDR2/无肽与RTL302-5D互换使用；pDR2/MBP-85-99与RTL340互换使用；pDR2/hMOG35-55与RTL1000互换使用。

图1A的两幅图示出了用mMOG-35-55肽/弗氏完全佐剂(CFA)/Ptx免疫的DR*1501-Tg小鼠的平均临床EAE每日得分(左)或累积疾病指数(CDI；右)。当疾病发作时(临床EAE得分≥2)，使用指示的载体、pDR2/mMOG-35-55、pDR2/无肽或pDR2/MBP-85-99治疗小鼠。箭头指示对小鼠进行治疗的日期。对于pDR2/mMOG-35-55相对于载体、pDR2/MBP-85-99和pDR2/无肽，*p<0.003。

图1B的两幅图示出了用hMOG-35-55肽/CFA/Ptx免疫的DR*1502-Tg小鼠的平均临床EAE每日得分(左)或CDI(右)。当疾病发作时(临床EAE得分≥2)，使用指示的载体、pDR2/mMOG-35-55、pDR2/无肽或pDR2/MBP-85-99治疗小鼠。箭头指示对小鼠进行治疗的日期。对于pDR2/hMOG-35-55相对于载体、pDR2/MBP-85-99和pDR2/无肽，*p<0.0023。

图2A的两幅流式细胞术散点图示出了用于鉴定单核细胞的单核细胞门的设置。当细胞落入左图所示的前向散射/侧向散射散点图中的圆圈所示的区域中时，就将其鉴定为单核细胞，并且如右图中所示排除碘化丙啶(PI)阳性的死细胞。

图2B示出了在注射500μg的标记的pDR2之前和注射15分钟后从首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠采集的血液的流式细胞术散点图，根据所述单核细胞门和用于观察CD11b(首行)、CD19(第二行)、CD11c(第三行)和CD3(底端行)的表达的藻红蛋白染色和用于观察标记的pDR2衍生物的结合的FITC染色(x-轴)来进行分选。左图示出了无RTL对照的结合，中间图出了RTL342M(pDR2/mMOG-35-55)的结合，右图示出了RTL1000(单体pDR2/hMOG-35-55)的结合。

图2C示出了采集自首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠并与500μg的标记的pDR2体外孵育的血液的流式细胞术散点图，根据单核细胞门和用于观察CD11b(首行)、CD19(第二行)、CD11c(第三行)和CD3(底端行)表达的藻红蛋白染色和用于观察标记的pDR2衍生物的结合的FITC染色(x-轴)来进行分选。左图示出了无RTL的对照的结合，中间图示出了RTL342M的结合，右图示出了RTL1000的结合。

图2D为来自用10μg/ml标记有Alexa-546的RTL342M治疗40分钟的DR*1501/GFP转基因小鼠的GFP+CD11b+细胞并通过荧光显微术进行评估所得的数字图像。

图3A的两幅散点图示出了通过前向散射和侧向散射分析的淋巴细胞门的设置。当细胞落入左图所示的前向散射/侧向散射散点图中的圆圈所示的区域中时，就将其鉴定为单核细胞，并且如右图所示排除碘化丙啶(PI)阳性的死细胞。

图3B示出了在注射500μg的标记的RTL之前和注射后15分钟从首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠采集的血液的流式细胞术散点图，根据淋巴细胞门和用于观察CD11b(首行)、CD19(第二行)、CD11c(第三行)和CD3(底端行)表达的藻红蛋白(PE)染色和用于观察标记的pDR2衍生物的结合的FITC染色(x-轴)来进行分选。左图示出了无RTL对照的结合，中间图示出了RTL342M的结合，右图示出了RTL1000的结合。

图3C示出了采集自首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠并与500μg的标记的RTL体外孵育的血液的流式细胞术散点图，根据所述淋巴细胞门和用于观察CD11b(首行)、CD19(第二行)、CD11c(第三行)和CD3(底端行)表达的藻红蛋白(PE)染色和用于观察标记的RTL衍生物的结合的FITC染色(x-轴)来进行分选。左图示出了无RTL对照的结合，中间图示出了RTL342M的结合，右图示出了RTL1000的结合。

图4A包括一组从首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠采集的外周血单核细胞(PBMC)的流式细胞术散点图(左)和条状图(右)。所述流式细胞术散点图根据图2A的单核细胞门来进行设门，在将所述外周血单核细胞与单独的载体(左图)、所述pDR特异的Fab1b11(中间图)或所述对照FabD2(右图)孵育90分钟后进行染色用于观察CD11b的表达和FITC-DR2构建体的结合。所述条状图代表被归一化为不存在Fab的情况下pDR2/mMOG-35-55的结合的百分数的pDR2/mMOG-35-55的结合。***p<0.0001。

图4B的两幅图示出了在疾病发作时每天使用如图所示的载体、RTL342M、RTL342M+Fab1b11、RTL342M+FabD2或单独的Fab1b11治疗3天的患有EAE的DR*1501-Tg小鼠的每日平均临床EAE得分(上图)和CDI(下图)。在治疗之前将Fab片段与pMHC进行孵育。*p<0.05；***p<0.0001；#p<0.0005。

图4C，上图为将RTL342M与Fab1B11或与对照FabD2进行预孵育后，或不使用RTL或者使用单独的Fab1B11的CD74的平均荧光强度(MFI)的直方图。下图为对来自所述上图的数据进行总结的条状图。*p<0.05；**p<0.005，***p<0.0005。

图4D左图为在临床体征发作时每天静脉注射100μg RTL342M(pDR2/mMOG-35-55)、等摩尔(10μg)游离mMOG-35-55多肽或载体治疗5天的患有mMOG-35-55/CFA/Ptx诱导的EAE的DR*1501-Tg小鼠的临床EAE得分的线图。右图为示出了所述相同动物的累积疾病指数的条状图。相对于载体治疗的组或游离mMOG35-55治疗的组，*p<0.05(每日得分)**p<0.01(CDI得分)。

图5A为RTL1000与脾细胞的结合的线图。将首次用于实验的脾细胞与指示浓度的Alexa Fluor标记的RTL1000进行孵育。将细胞裂解于6M尿素中，通过SDS PAGE分离所述蛋白，并通过荧光光密度测定法对所述蛋白进行定量。所述数据最佳拟合2个结合位点的模型(R²＝0.998)。所述两个结合位点的K_D值，对于较高亲和力的位点为2.65nM，对于较低亲和力的位点为131.0nM。

图5B的线图示出了在量递增的所指示的未标记竞争物的存在下标记的RTL1000与分离自DR*1501-Tg小鼠的全细胞的结合。

图5C的线图示出了在量递增的所指示的未标记竞争物的存在下标记的RTL1000与分离自敲除MHC II类的小鼠的全细胞的结合。

图6为两幅与pDR2结合的蛋白的免疫沉淀物印迹的数字图像。对来自DR*1501-Tg小鼠的脾细胞进行表面生物素化，然后用含有CHAPS的缓冲液进行裂解。将裂解物与RTL1000进行孵育，然后向所述裂解物中加入DR2特异的单克隆抗体TU39。洗涤免疫复合物以去除未结合的物质，通过在还原性电泳样品缓冲液中煮沸8-10分钟而将所述结合蛋白从所述免疫复合物中分离。将从免疫沉淀物中回收的蛋白通过SDS-PAGE分离，印迹至滤膜上，然后用链亲和素PE(左)或Quantum-Red标记的DR2HK14抗体(右)进行探测。

图7的曲线图示出了通过表面等离子体共振测量的RTL1000与组蛋白复合物的结合。通过胺偶联使组蛋白复合物与CD5传感芯片结合，并将所述指示浓度的RTL1000与所述复合物结合。结合曲线拟合具有漂移基线的1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型(Ka＝5.74×10³M^-1s^-1；Kd＝3.3×10^-3s^-1；RMax＝223RU；Chi²＝9.89)，产生的近似亲和力常数KD为575nM。

图8A为与CD74结合的蛋白的免疫沉淀物的蛋白质印迹的数字图像。对来自DR*1501-Tg小鼠的脾细胞进行表面生物素化并裂解。将裂解物与缀合至CD74抗体的蛋白L微珠混合。将这些在4℃下孵育过夜。将蛋白从所述免疫复合物中回收并印迹，并使用链亲和素-PE进行可视化。M指示分子量标记物；T指示总裂解物；CD74IP指示免疫沉淀的CD74。

图8B为两幅CD74蛋白复合物的SDS-PAGE凝胶的数字图像，从表面生物素化的DR*1501-Tg脾细胞中免疫沉淀出所述CD74蛋白复合物，然后将所述CD74蛋白复合物与25纳摩尔的指示的FITC标记的RTL分子进行孵育。对所述凝胶进行扫描以鉴定FITC的存在。

图9A为CD74蛋白复合物的SDS-PAGE凝胶的数字图像，从表面生物素化的DR*1501-Tg脾细胞中免疫沉淀出所述CD74蛋白复合物，然后在存在未标记的DR-α1和DR2-β1的情况下将所述CD74蛋白复合物与FITC标记的RTL1000分子进行孵育。

图9B的图示出了DR-α1以剂量依赖的方式抑制RTL1000的结合。使用Bio-Rad Imager扫描仪检测聚丙烯酰胺凝胶上的FITC标记的RTL1000条带，接着通过光密度测定法使用Quantity软件对所述RTL1000条带进行定量。将数据进行归一化并相对于DR-α1的浓度进行标绘，使用GraphPad软件将所述曲线拟合一个位点或两个位点的竞争模型。最佳拟合为一个位点的竞争方程，EC₅₀为447nM，R²为0.956。

图10A的曲线图示出了当与免疫吸附的CD74进行孵育时，递增量的FITC标记的RTL1000、RTL342M、RTL340(pDR2/MBP-85-99)、RTL302-5D(单体pDR2/无肽)和DR-α1的结合情况。使用GraphPad软件对数据进行一个位点或两个位点结合的分析，对于所有结合配体来说R²>0.95。

图10B的曲线图示出了当与富集的MHC II类进行孵育时，递增量的FITC标记的RTL1000、RTL342M、RTL340、RTL302-5D和DR-α1的结合情况，所述MHC II类是通过缀合至L243单克隆抗体的蛋白-L微珠从CD74耗尽的裂解物中免疫吸附出来的。

图11A的直方图示出了相对于首次用于实验的小鼠，EAE小鼠中单核细胞上的CD74的表达。插图示出了来自首次用于实验的小鼠(n＝4)和mMOG-35-55免疫的患有EAE的小鼠(n＝4)的单核细胞中CD74表达的平均荧光强度的平均值。**p<0.01。

图11B的条状图示出了用载体或RTL342M(100μg)治疗的患有EAE的小鼠的血液和脾中CD74表达。*p<0.05。

图11C的两幅散点图示出了使用载体(左)或RTL342M(100μg；右)治疗的小鼠的脊髓中的单核细胞中CD74表达。

图12A的一组散点图示出了用指示浓度的RTL1000处理的CD11b+单核细胞中的RTL1000FITC结合(上)和CD74表达(下)。

图12B的一组线图示出了CD74表达和指示的RTL的结合百分数。右下图是所有所述构建体的线性回归分析，示出了RTL结合与CD74表达之间的逆相关。

图13A的一组散点图示出了使用载体处理(无pMHC处理)的CD11b+人单核细胞上的RTL结合(上)和CD74表达(下)。

图13B的一组散点图示出了CD11b+人单核细胞上的1μgRTL342M的结合(上)和CD74表达(下)。

图13C的一组散点图示出了CD11b+人单核细胞上的1μgRTL1000的结合(上)和CD74表达(下)。

图13D的一组散点图示出了CD11b+人单核细胞上的5μgRTL1000的结合(上)和CD74表达(下)。

图13E的一组散点图示出了CD11b+人单核细胞上的5μg RTL340的结合(上)和CD74表达(下)。

图13F的线图示出了在分析之前在培养物中用不同浓度的RTL1000处理的人单核细胞中的RTL1000的结合相对于CD74表达的线性回归。原始数据示于图13A-E。

图14A的线图示出了通过使用MBP-85-99免疫而诱导了EAE的小鼠的平均临床EAE每日得分(左)，条状图示出了所述小鼠的CDI(右)。疾病发作后(图上由箭头所指示)使用载体、RTL342M、RTL1000、RTL340或RTL302-5D对MBP-TCR/DR2-Tg小鼠进行5天的治疗。对于EAE每日平均得分和峰值疾病(左图)，对于RTL342M相对于载体*p<0.02，对于RTL340和RTL1000相对于载体，***p<0.002。对于CDI(右图)，对于RTL342M相对于载体**p<0.0014，对于RTL340和RTL1000相对于载体，***p<0.001。

图14B的线图示出了通过使用mMOG-35-55免疫而诱导了EAE的小鼠的平均临床EAE每日得分(左)，条状图示出了所述小鼠的CDI(右)。在发作时使用RTL340(100μg)、RTL342M(100μg)、RTL302-5D(100μg，5次每日治疗)，或RTL302-5D(1mg)或RTL342M(100μg，2次每日治疗)对患有EAE的DR*1501小鼠进行治疗。所述载体组和未治疗组彼此之间没有显著差异而被合并。对于EAE每日平均得分和峰值疾病(左图)，相对于载体/未治疗，*p<0.04，RTL302-5D(1mg×2)，***p<0.0001，RTL342M(100μg×5)，#p<0.01，RTL342M(100μg×2)；对于CDI，相对于载体/未治疗，***p<0.0001。RTL342M(100μg×2，5次每日治疗)，p<0.013，RTL302-5D(1mg×2次每日治疗)。

图14C的图示出了图14B中所示的小鼠组的CD11b+细胞上的CD74水平与平均CDI之间的关系。

图15的线图示出了使用具有共价连接的mMOG-35-55的pDR2(100μg)、不具有肽的pDR2(1000μg)、DR-α1(750μg)或单独的载体治疗的小鼠的临床EAE得分(上)，条状图示出了所述小鼠的CDI(下)。每个治疗组由三只小鼠组成。*p<0.05pDR2mMOG-35-55相对于未治疗；#p<0.05pDR2/无肽相对于未治疗；φp<0.05DR-α1相对于未治疗。

图16的线图示出了使用载体(未治疗)、修饰的不具有肽的pDR2(RTL302-5D)、修饰的具有共价结合的mMOG-35-55的pDR2(RTL342M)或DR-α1治疗的小鼠的临床EAE得分(上部)，条状图示出了所述小鼠的CDI(下部)。每个治疗组由三只小鼠组成。

图17的一系列条状图示出了在来自按指示治疗的EAE DR2-Tg小鼠的脊髓的CD11b+单核细胞上的CD74(图17A)、ICAM(图17B)和CD80(图17C)的表达。

图18A的图示出了通过实时PCR测量的在分离自三只首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠的脾细胞中的ICAM-1的相对表达，所述小鼠是用10μg/ml RTL342M或缓冲液治疗1小时，接着在使用或不使用100ng/ml MIF的情况下进行10ng/ml LPS刺激持续1小时所得到的。*p<0.05。

图18B是来自用50μg/ml RTL342M治疗的DR*1501/GFP-Tg小鼠的GFP+CD11b+细胞的持续2个小时的平均追轨迹速度的条状图。通过实时荧光显微术对10个慢速拍摄区域(5个未治疗的区域，5个治疗的区域)进行成像。***p<0.0005。

图18C是如图18B所述分离和治疗的细胞的平均轨迹位移长度的条状图。***p<0.0005。

图18D的两幅图示出了来自4个有代表性的区域的单个细胞(每个区域中9-11个细胞)的轨迹。细胞是如图18B所述分离和治疗所得到的。

图19的MHC II类α链氨基酸序列的一部分的示例性比对示出了所述DRAα1氨基酸第38-58位区域(加框)。所述序列如下：DR2(SEQID NO:110)、DR4(SEQ ID NO:111)、DP2(SEQ ID NO:112)、DQ2(SEQ ID NO:113)、IAs(SEQ ID NO:114)、IAg7(SEQ ID NO:115)和RT1.B(SEQ ID NO:116)。

图20的蛋白质印迹的图像，它证实了RTL构建体不干扰CD74抗体与CD74的结合。将DR*1501裂解物与无配体、15μg的RTL342M或DR-α1在4℃下进行预孵育15小时。将所述裂解物加入到吸附至蛋白/微珠的ln-1Ab中。对免疫复合物用1％CHAPS/TEN缓冲液洗涤4次，然后用TEN洗涤4次。通过在含有2％SDS的样品缓冲液中煮沸7-9分钟而将物质从微珠上洗脱。然后将样品在10-20％聚丙烯酰胺凝胶中进行分析，转到PVDF，再用抗-CD74mAb In-1FITC探测以检测CD74。

图21是一组三幅散点图，X轴为CD74表达，Y轴为CD11b表达。在临床体征发作时，每天使用100μg RTL342M,500μg DR2-β1或载体治疗患有mMOG35-55/CFA/Ptx诱导的EAE的DR*1501-Tg小鼠持续三天。*p<0.05。

图22左图的线图示出了如图21所述进行治疗的小鼠的临床EAE得分。右图的条状图为所述相同小鼠的的累积疾病指数。**p<0.01，***p<0.001。

图23左图的线图示出了在临床体征发作时使用载体、DR2-β1(500μg)、DR-α1(100μg)、DR-α1(300μg)、DR-α1(500μg)、DR-α1(1000μg)或RTL342M(100μg)治疗的患有mMOG-35-55/CFA/Ptx诱导的EAE的DR*1501-Tg小鼠的临床EAE得分。*p<0.05DRα1相对于载体；δp<0.04RTL342M、DR-α1(300μg)、DR-α1(500μg)、DR-α1(1000μg)相对于DR2-β1；#p<0.0003RTL342M、DR-α1(300μg)、DR-α1(500μg)、DR-α1(1000μg)相对于载体；DR-α1(100μg)相对于DR2-β1。右图的条形图示出了所述相同动物的累积疾病指数。*p<0.05；**p<0.005DR-α1(100μg)相对于载体vehicle；***p<0.0005相对于载体。

序列表

本文及所附序列表中列出的任何核酸和氨基酸序列都用如37C.F.R.§1.822所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码来显示。至少在一些情况下，只显示了每个核酸序列一条链，但是应该理解为任何对所显示的链提及均包含了互补链。

SEQ ID NO:1-49为示例性MHC II类α链多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:50-85为示例性抗原决定簇肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:86-108为来自与pDR2/hMOG35-55结合的蛋白的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:109为MHC DRA38-58位残基片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:110-116为MHC II类α链氨基酸序列的部分氨基酸序列。

具体实施方式

先前已经证明了包含共价连接的MHC II类β1和α1结构域的有两个结构域的MHC构建体(β1α1多肽，也称为重组T细胞受体配体(RTL))能够在不存在共刺激分子的情况下直接与同源T细胞受体相互作用(McMahan et al.,J.Biol.Chem.278:30961-30970,2003)，充当部分T细胞受体激动剂，并触发欠佳的下游信号传导和细胞因子改变(Burrows et al.,J.Immunol.167:4386-4395,2001；Wang et al.,J.Immunol.171:1934-1940,2003)。参见，例如，美国专利No.6,270,772；美国专利公开No.2005/0142142和2009/0280135；这些文献以引用的方式纳入本文。以前已经成功地利用RTL——包含系在一起的髓磷脂肽——来治疗患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠(Burrows,Curr.Drug Targets Inflamm.Allergy4:185-193,2005)，也在多发性硬化患者中进行的I期试验中利用了所述RTL(Yadav et al.,Neurol.74:A293-294,2010；Offner et al.,J.Neuroimmunol.231:7-14,2011)。

如本文所公开的，目前已经意外地发现所述两个结构域的RTL与复合物结合，所述复合物包含MHC II类不变链(CD74)、细胞表面组蛋白和MHC II类本身。具体地，与CD74的结合涉及MHC II类α1结构域与CD74之间的相互作用，所述相互作用导致单核细胞上CD74的快速的剂量依赖性的下调。这种下调是由两个结构域的RTL和单独的α1结构域引起的。此外，已经出乎意料地发现，单独使用MHC II类α1结构域进行的治疗降低了小鼠中EAE的严重程度，表明所述α1结构域可用作例如用于炎性和/或自身免疫性疾病的治疗组合物。

包含MHC II类α1结构域而不包含其他MHC II类结构域的治疗剂的一个优点是减少了在治疗之前对患者进行HLA亚型归类的需求。在HLA-DR的情况下尤其如此，所述HLA-DR具有单个α链多肽，该α链多肽与所有DRβ链多肽相互作用。因此，认为可将DRα1结构域多肽给予所有个体而不需要进行HLA分型，而目前使用含有DRβ1结构域的多肽的治疗则需要进行HLA分型。对于其他HLA亚型，只需要对所述α结构域等位基因进行亚型归类，而不需要对α和β等位基因都进行亚型归类。并且，由于所公开的MHC II类α1结构域多肽的大小比包含β1结构域的多肽(例如β1α1多肽)更小，因此可以更加快速和低价地大量生产所公开的MHC II类α1结构域多肽，并且可以以合成肽的形式生产所述α1结构域的片段，甚至进一步提高生产的简便性和速度。

发现MHC II类β1α1多肽和α1结构域多肽在治疗小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的功效与其意想不到的下调CD74的能力紧密相关，如下文的实施例中所示。因此，可以利用CD74水平(例如CD74表达或活性)作为在受试者中使用MHC II类β1α多肽或MHCII类α1结构域多肽进行治疗的治疗功效的标记物。类似地，可以使用CD74水平来优化使用MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1结构域多肽对受试者进行的治疗(例如优化或调整剂量)。

I.缩写

APC 抗原呈递细胞

CDI 累积疾病指数

EAE 实验性自身免疫性脑脊髓炎

HLA 人白细胞抗原

MBP 髓磷脂碱性蛋白

MIF 巨噬细胞游走抑制因子

MHC 主要组织相容性复合物

MOG 髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白

PBMC 外周血单核细胞

pMHC 部分MHC(β1α1)多肽

PLP 蛋白脂质蛋白

RTL 重组T细胞受体配体

II.术语

除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,genes V,由Oxford UniversityPress出版,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(eds.),TheEncyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)和Robert A.Meyers(ed.),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。

除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同。除非上下文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。类似地，除非上下文中另有明确说明，词语“或”意欲包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A或B，或A和B。还应该理解，给出的核酸或多肽的全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值，并用于表述目的。下文描述了适合的方法和材料，但是与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开的实施或测试。

本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。本文提到的所有GenBank登录号以引用的方式全文纳入本文，如同在2012年1月6日存在于GenBank中一样。如果出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，材料、方法和实例仅是示例性的，不意欲进行限制。

为了便于阅读本公开的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：

抗原：可在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源免疫原诱导的那些。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出应答的的位点。在一个实施方案中，当表位与MHC分子一同呈递时，T细胞对表位作出应答。表位可以由连续的氨基酸或由于蛋白质的三级折叠而并排的不连续的氨基酸形成。由连续的氨基酸形成的表位暴露在变性溶剂后通常仍然存在，而三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理后通常不再存在。表位在独特的空间构象中一般包括至少3个并且更常见地至少8个氨基酸(例如约8-50或8-23个氨基酸)。确定表位空间构象的方法包括，例如X-射线晶体法和二维核磁共振。

抗原可为组织特异性抗原，或疾病特异性抗原。这些术语不是排他性的，因为组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限量的组织例如单个组织中表达。组织特异性抗原可由多于一种组织表达，例如，但不限于，在中枢神经系统或周围神经系统中表达的抗原。

CD74：也称为CD74分子，主要组织相容性复合物、II类不变链或Ii。CD74是为免疫应答调节抗原呈递的伴侣分子。其还是巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的细胞表面受体。

CD74的核酸和蛋白质序列是公众可得的。例如，GenBank登录号NM_001025158、NM_004355和NM_001025159公开了示例性的人CD74核酸序列，GenBank登录号NP_001020329、NP_004346和NP_001020330公开了示例性人CD74氨基酸序列。类似地，GenBank登录号NM_001042605和NM_010545公开了示例性小鼠Cd74核酸序列，GenBank登录号NP_001036070和NP_034675公开了示例性小鼠Cd74氨基酸序列。这些序列各自以引用的方式纳入本文，如同在2012年1月6日存在于GenBank中一样。

保守变体：氨基酸残基被具有类似生物化学性质的另一个氨基酸残基置换。“保守的”氨基酸置换为那些基本上不影响或不降低MHC II类多肽(例如MHC II类α1多肽)的活性的置换。多肽可以包括一个或多个氨基酸置换，例如1-10个保守置换、2-5个保守置换、4-9个保守置换，例如1、2、5或10个保守置换。保守置换的具体非限制性实例包括以下实例：

对照：“对照”是指用于与实验样品进行比较的样品或标准品。在一些实施方案中，对照为从健康受试者或健康受试者群体获得的样品。在其他实施方案中，对照为历史对照或标准参考值或值域(例如以前测试的对照样品，例如代表基线或正常值的样品组，例如健康受试者中CD74表达或活性的水平)。在其他实例中，对照来自接受治疗前的受试者(例如在使用MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1结构域多肽进行治疗之前的CD74表达水平或活性水平)。

结构域：多肽或蛋白质的氨基酸序列的不连续部分。其可等同于特定功能。例如，组成MHC II类分子的α和β多肽各自都被认为具有2个结构域，分别为α1、α2和β1、β2。各个结构域一般通过连接氨基酸序列(linking amino acid sequence)来连接。在一个实施方案中，通过将序列延伸以包括全部或部分接头或相邻结构域，而将整个结构域序列包括在重组分子中。例如，当选择MHC II类分子的α1结构域时，所选择序列可从所述α链的第1位氨基酸残基延伸，通过整个α1结构域并包括位于约第76-90位氨基酸残基的接头序列(在α1结构域的羧基末端，α1和α2结构域之间)的全部或一部分。各个MHC分子结构域中的氨基酸的精确数目根据哺乳动物的物种而有所不同，以及在种内不同类基因之间也有所不同。选择用于重组分子中的序列的关键方面是保持结构域功能，而不是基于氨基酸数目进行精确结构定义。本领域普通技术人员应理解，即使使用了略少于所选择结构域全长氨基酸序列的序列，也可以保持结构域功能。例如，可以删除α1结构域氨基或羰基末端的一些氨基酸，而不会影响结构域功能。

可以在本公开提供的MHC II类多肽(例如α1或β1α1多肽)的背景下评估所具体选择的结构域的功能活性，例如T细胞增殖和/或CD74结合测定。

有效量：指定的化合物足以抑制疾病或病症的进展，或引起疾病或病症的消退，或者能够缓解由疾病或病症引起的症状的剂量或量。例如，有效量可为治疗或抑制疾病例如炎性疾病和/或自身免疫性疾病所必需的公开的MHC分子的量或剂量。在一个实施方案中，有效量为单独或与一种或多种额外的治疗剂一起在受试者中诱导所期望的应答(例如治疗或抑制炎性疾病或自身免疫性疾病或其他疾病或病症)的量。

炎症：由组织损伤引起的局部保护性应答，其起到隔绝致炎因子(inflammatory agent)的作用。炎症是由血管组织对有害刺激物产生的复杂生物学应答所精细安排的，所述有害刺激物例如病原体、损伤细胞或刺激剂(irritant)。炎症是生物体为组织去除有害刺激物以及起始愈合过程所作出的保护性努力。炎症应答由白细胞在全身或在炎症部位的局部累积来表征。可通过许多本领域熟知的方法测量炎症应答，所述方法例如白细胞的数目、多形核中性白细胞(PMN)的数目、PMN激活程度的测量例如鲁米那(luminal)增强的化学发光法，或细胞因子存在量的测量。原发性炎症疾病是由所述炎症自身引起的疾病。继发性炎症疾病是由另一疾病引起的炎症。炎症可导致许多炎性疾病，所述炎性疾病包括但不限于风湿性关节炎、骨关节炎、炎性肺病(包括慢性阻塞性肺病)、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、牙周病、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮、系统性硬化病、肖格伦综合征(Sjogren's Syndrome)、哮喘、变应性鼻炎和皮肤病(包括皮肌炎和银屑病)等等。包括炎性部分的自身免疫性疾病(包括但不限于多发性硬化)也可被认为是炎性疾病。

抑制或治疗疾病：“抑制”疾病是指抑制疾病的充分发展，例如在已知易患上疾病(例如炎性疾病或自身免疫性疾病)的人中。抑制疾病的范围可从部分抑制疾病到基本上完全抑制(预防)疾病，例如在患有疾病或病症或具有患上疾病或病症的风险的受试者中。在一些实例中，术语“抑制”是指减轻或推迟疾病的发生和发展。待给予有效量的药物化合物以抑制或治疗疾病或病症的受试者可通过这类病症的标准诊断技术(例如基本家族史、或患上所述疾病或病症的风险因素)来鉴定。与之不同，“治疗”是指在疾病或病理状态开始出现之后减轻其征兆或症状的治疗性介入。

分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、肽或蛋白质)已被从该组分存在的生物体的细胞中的其他生物组分基本上分离开、单独产生或纯化出来，所述其他生物组分例如染色体DNA和RNA和染色体外DNA和RNA以及蛋白质。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。

接头：共价连接两个分子(例如2个多肽)的分子。接头(例如肽接头或化学接头)可包含在本公开的重组MHC多肽中，例如在α1结构域与抗原肽之间。通常长度为2-25个氨基酸的肽接头序列是本领域公知的，并且包括但不限于Chaudhary et al.(Nature339:394-397,1989)描述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔物。类似地，化学接头(例如巯基键或交联剂)是本领域公知的。

MHC II类：MHC II类分子由2个非共价连接的蛋白质——α链和β链形成。所述α链包含α1和α2结构域，所述β链包含β1和β2结构域。通过α1和β1结构域的相互作用形成适合抗原进入的裂隙。α2和β2结构域是跨膜的免疫球蛋白(Ig)折叠样结构域，其将α链和β链锚定到APC细胞膜中。当MHC II类复合物与抗原连接时(并且在适当的共刺激信号的存在下)，MHC II类复合物刺激CD4T细胞。CD4T细胞的主要功能是起始炎性应答，以调节免疫系统中的其他细胞，以及帮助B细胞进行抗体合成。

可药用载体：用于本公开的可药用载体是常规的。Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,The University of the Sciences inPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21^st Edition(2005)描述了适用于本文所公开的蛋白质的药物递送的组合物和剂型。

多肽：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体，优选L-异构体。本文使用的术语“多肽”、“蛋白质”或“肽”意欲涵盖任何氨基酸序列，包括修饰的序列，例如糖蛋白。术语“多肽”或“蛋白质”或“肽”特别地意欲包括天然存在的蛋白质以及那些通过重组或合成产生的蛋白质。应该注意的是，术语“多肽”或“蛋白质”包括天然存在的修饰形式的蛋白质，例如糖基化形式、磷酸化形式或泛素化形式。

纯化的：术语纯化的不需要绝对纯，而是意图用作相对的术语。因此，例如纯化的肽制备物是其中所述肽或蛋白比所述肽或蛋白在其环境中(例如细胞中或制备物中)更富集的制备物。优选地，制备物被纯化，以使所述蛋白或肽占所述制备物中总肽或蛋白含量的至少50％。在一些实施方案中，纯化的制备物含有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的所述蛋白或肽。

重组的：重组的核酸或多肽是指具有非天然存在的序列或具有通过人工结合两个或多个原本分离的序列片段来制造的序列的核酸或多肽。所述人工结合通常通过化学合成来实现或者更常见地通过对分离的核酸片段进行人工操作例如通过遗传工程技术来实现。

样品：从受试者中获得的含有核酸(例如，DNA或RNA(包括mRNA))、蛋白质或它们的组合的生物样品。实例包括但不限于外周血、细针抽吸物(fine needle aspirate)、尿、唾液、组织活检、手术标本和尸体剖检材料。在一个实例中，样品包括血液样品(例如血液；血液的衍生物和血液的一部分，例如血清)或分离的或纯化的细胞群(例如，T细胞、B细胞、PBMC、淋巴细胞等，包括部分分离的或部分纯化的细胞群)。

序列同一性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，也被称为序列同一性。序列同一性通常根据百分比同一性(或相似性或同源性)来度量；百分比越高，两个序列越相似。

比对序列以进行比较的方法是本领域公知的。多种程序和比对算法描述于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-244,1988；Higgins&Sharp,Comput.Appl.Biosci.5:151-153,1989；Corpetet al.,Nucl.Acids Res.16,10881-90,1988；Huang et al.,Comput.Appl.Biosci.8,155-65,1992；和Pearson,Methods Mol.Biol.24:307-331,1994。Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)提出了对序列比对方法和同源性计算的详细见解。NCBI的基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)可以从几个来源获得，所述来源包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。

由于遗传密码的简并性，未表现出高度序列同一性的核酸序列却可以编码相似的氨基酸序列。应理解，使用这种简并性可以改变核酸序列，以产生都基本上编码相同蛋白质的多种核酸分子。

受试者：活的多细胞脊椎生物——一个包括人和非人哺乳动物的类别。

III.MHC II类α1多肽

本文公开的是包括MHC II类α1结构域或其片段并且不包括MHCII类α2、β1或β2结构域的分离的多肽。哺乳动物MHC II类α和β链蛋白的氨基酸序列以及编码这些蛋白的核酸是本领域公知的，并可获自很多来源(包括GenBank)。示例性序列提供于Auffray et al.(Nature308:327-333,1984)(人HLA DQα)；Larhammar et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:7313-7317,1983)(人HLA DQβ)；Das et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3543-3547,1983)(人HLA DRα)；Tonnelle et al.(EMBO J.4:2839-2847,1985)(人HLA DRβ)；Lawrance et al.(Nucl.Acids Res.13:7515-7528,1985)(人HLA DPα)；Kelly and Trowsdale(Nucl.Acids Res.13:1607-1621,1985)(人HLA DPβ)；Syha et al.(Nucl.Acids Res.17:3985,1989)(大鼠RT1.Bα)；Syha-Jedelhauser etal.(Biochim.Biophys.Acta1089:414-416,1991)(大鼠RT1.Bβ)；Benoistet al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:534-538,1983)(小鼠I-Aα)；Estesset al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:3594-3598,1986)(小鼠I-Aβ)中，所有这些参考文献以引用的方式纳入本文。本领域普通技术人员可从公共数据库鉴定其他MHC II类α和β链多肽，所述数据库例如IMGT/HLA数据库(可在万维网ebi.ac.uk/imgt/hla/上得到)。

在一些实施方案中，公开的多肽包括MHC II类α1结构域，例如DR-α1、DP-α1、DQ-α1、DM-α1或DO-α1结构域，或其一部分。在具体的实施方案中，所述MHC II类α1结构域是人HLA-DRA多肽。所述α1结构域是在哺乳动物MHC II类α链蛋白中是明确定义的。在一些实例中，MHC II类α链包括前导序列，所述前导序列参与运输所述多肽，并且经过蛋白水解而被去除以产生成熟的α多肽。通常认为所述α1结构域包含所述成熟(经蛋白水解处理的)α链的约第1-90位残基。所述MHC II类蛋白中α1和α2结构域之间的天然肽接头区的范围为从所述成熟α链的约第76位氨基酸至约第93位氨基酸，这取决于具体考虑的α链。本文提供了示例性的MHC II类α多肽(例如SEQ ID NO:1-49)。因此，α1结构域可包括所述成熟α链的约第1-90位氨基酸残基，但本领域普通技术人员应理解，没有必要精确界定该结构域的C末端界限(cut-off)，并且，例如，该界限可能存在于所述成熟α链的第70-100位氨基酸残基之间的任意一点。在一个实例中，所述α1结构域包括成熟的MHC II类α结构域的第1-70、1-71、1-72、1-73、1-74、1-75、1-76、1-77、1-78、1-79、1-80、1-81、1-82、1-83、1-84、1-85、1-86、1-87、1-88、1-89、1-90、1-91、1-92、1-93、1-94、1-95、1-96、1-97、1-98、1-99或1-100位氨基酸。在其他实例中，α1结构域包括全长MHCII类α多肽(例如本文公开的SEQ ID NO:1-49)的约第20-120位残基(例如约第20-110、24-110、24-109、25-100、25-109、26-110、26-109、30-120、32-120、32-115、26-90、26-85、26-84位残基，或其他重叠区域)。在一些实例中，所述MHC II类α1结构域不包括N末端甲硫氨酸；然而，可以存在N末端甲硫氨酸，例如由于在细菌、酵母或哺乳动物系统中表达。

在其他实例中，所述α1结构域可包括在5’-和/或3’-末端缺失或添加少许氨基酸，例如从5’-或3’-末端添加或缺失约1-10个氨基酸，例如添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，或它们的组合(例如从一个末端缺失并且在另一末端添加)。所述α1结构域的组成还可在这些参数之外变化，这取决于哺乳动物物种和考虑的具体α链。本领域普通技术人员应理解，所述氨基酸序列的精确个数参数不如结构域功能(例如，CD74结合或下调)的保持重要。

在其他实例中，所述α1结构域多肽包含所述α1结构域的一部分或由所述α1结构域的一部分组成，例如能够结合CD74和/或降低CD74的表达或活性的所述α1结构域的一部分。例如，所述MHC II类α1多肽可包含或由以下组成：成熟HLA-DRA多肽的第38-58位氨基酸(例如，KKETVWRLEEFGRFASFEAQG；SEQ ID NO:109)或其一部分(例如其5个或更多个连续氨基酸，例如，5-16、8-15、8-10或12-15个连续氨基酸)，或HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DM或HLA-DO多肽的同源区。示例性比对示于图19中。本领域普通技术人员可鉴定其他MHC II类α结构域多肽的同源区，例如利用多序列比对工具。

在一些实施方案中，MHC II类α多肽包含SEQ ID NO:1-49所示的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，MHC II类α多肽的序列具有与SEQ ID NO:1-49之一所示的氨基酸序列或其片段至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，所述多肽的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1-49所示的氨基酸序列之一或其片段至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可使用可在互联网上容易得到的计算机程序和本文示出的氨基酸序列获得示例性序列。在一些实例中，所述多肽保持所述MHC II类α1多肽的功能，例如结合CD74。示例性MHC II类α1结构域多肽包括表1所示的那些序列。

表1.示例性MHC II类α1结构域多肽

MHC II类α链	α1结构域残基
		DRA*0101	SEQ ID NO:1的第26-109位
DRA*010202	SEQ ID NO:2的第26-109位
		DQA1*010101	SEQ ID NO:3的第24-110位
DQA1*010201	SEQ ID NO:4的第24-110位
		DQA1*010301	SEQ ID NO:5的第24-110位
DQA1*010401	SEQ ID NO:6的第24-110位
		DQA1*0105	SEQ ID NO:7的第24-110位
DQA1*0106	SEQ ID NO:8的第1-82位
		DQA1*0107	SEQ ID NO:9的第24-110位
DQA1*0201	SEQ ID NO:10的第24-109位
		DQA1*030101	SEQ ID NO:11的第24-110位
DQA1*0302	SEQ ID NO:12的第24-110位
		DQA1*0303	SEQ ID NO:13的第24-110位
DQA1*040101	SEQ ID NO:14的第24-109位
		DQA1*040102	SEQ ID NO:15的第1-81位
DQA1*0402	SEQ ID NO:16的第1-81位
		DQA1*0404	SEQ ID NO:17的第1-81位
DQA1*050101	SEQ ID NO:18的第24-109位

MHC II类α链	α1结构域残基
		DQA1*050102	SEQ ID NO:19的第1-86位
DQA1*0502	SEQ ID NO:20的第1-74位
		DQA1*0503	SEQ ID NO:21的第24-109位
DQA1*0504	SEQ ID NO:22的第1-81位
		DQA1*0505	SEQ ID NO:23的第24-109位
DQA1*060101	SEQ ID NO:24的第24-109位
		DQA1*060102	SEQ ID NO:25的第1-75位
DQA1*0602	SEQ ID NO:26的第1-81位
		DPA1*010301	SEQ ID NO:27的第32-115位
DPA1*010302	SEQ ID NO:28的第1-74位
		DPA1*010303	SEQ ID NO:29的第1-81位
DPA1*0104	SEQ ID NO:30的第1-75位
		DPA1*0105	SEQ ID NO:31的第1-75位
DPA1*010601	SEQ ID NO:32的第1-81位
		DPA1*0107	SEQ ID NO:33的第1-80位
DPA1*0108	SEQ ID NO:34的第1-81位
		DPA1*0109	SEQ ID NO:35的第1-81位
DPA1*020101	SEQ ID NO:36的第1-84位
		DPA1*020102	SEQ ID NO:37的第1-81位
DPA1*020104	SEQ ID NO:38的第1-74位
		DPA1*020106	SEQ ID NO:39的第1-84位
DPA1*020201	SEQ ID NO:40的第1-77位
		DPA1*020202	SEQ ID NO:41的第1-81位
DPA1*020203	SEQ ID NO:42的第1-79位
		DPA1*0203	SEQ ID NO:43的第1-81位
DPA1*0301	SEQ ID NO:44的第1-75位
		DPA1*0302	SEQ ID NO:45的第1-81位
DPA1*0303	SEQ ID NO:46的第1-81位
		DPA1*0401	SEQ ID NO:47的第1-81位
DOA*010101	SEQ ID NO:49的第26-84位

对MHC II类α1多肽的一级氨基酸序列进行小的修饰，可产生与本文描述的未修饰的对应多肽相比具有基本上等价活性的肽。这类修饰可以是蓄意的，如通过定点诱变，或者可以是自发的。本文包括通过这些修饰产生的所有多肽。因此，MHC II类α1多肽的具体的、非限制性的实例是α1多肽的保守变体(例如保守氨基酸置换，例如，一个或多个保守氨基酸置换，例如1-10个保守置换，2-5个保守置换，4-9个保守置换，例如1、2、5或10个保守置换)。上文提供了示例性保守置换的列表。基于该列表可对氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1-49所示的那些序列或其片段)进行置换。

可通过标准方法产生编码所述α1结构域的核酸分子，所述方法例如通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。可采用用于设计用于扩增编码所述α1结构域的开放阅读框的引物的标准方法。适用于扩增所述α1结构域的文库包括，例如，从考虑的哺乳动物物种制备的cDNA文库；这类文库是可商购的，或者可以通过常规方法制备。因此，例如，可通过PCR使用对应于所述α1结构域编码区的5’和3’末端的引物来产生编码α1结构域多肽的构建体。进行PCR扩增之后，可将扩增的核酸分子克隆至常规克隆载体中。在一些实施方案中，例如为了有助于便于克隆或连接抗原决定簇(下文论述)，用于扩增α1结构域的一条或两条引物可包括合适的限制性内切酶位点，使得在扩增和用选择的限制性内切酶消化之后，所述编码α1结构域的片段可容易地与另一核酸连接。

在一些实施方案中，所述MHC II类α1结构域多肽在原核细胞或真核细胞中由核酸构建体表达。表达所述MHC II类α1结构域多肽的核酸构建体还可包含调控元件例如启动子、增强子和3’调控区，基于待在其中表达蛋白的细胞的类型来确定所述调控元件的选择。将所述构建体引入适用于在所选择细胞类型中表达所述MHC II类α1结构域多肽的载体中。

已知很多原核和真核系统可用于多肽的表达和纯化。例如，可通过将强的调控启动子和高效核糖体结合位点置于所述编码多肽的构建体的上游，在原核细胞中产生异源多肽。合适的启动子序列包括β-内酰胺酶、色氨酸(trp)、噬菌体T7和λP_L启动子。用于在细菌或哺乳动物细胞中产生异源蛋白的方法和质粒载体描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989；Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates,1992(和2000年副刊)；和Ausubel et al.,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology,4th ed.,Wiley&Sons,1999中。

适用于表达大量蛋白的原核细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通常，以高水平表达的蛋白存在于不可溶的包涵体中；例如Sambrook et al(2001，参见第15章)描述了用于从这些聚集体中提取蛋白的方法。或者可使用为融合蛋白的优化表达和纯化所设计的商业化系统，而方便地实现MHC II类α1结构域多肽在原核细胞中的重组表达。这类融合蛋白一般包含有助于纯化的标签。这类系统的实例包括：pMAL蛋白融合和纯化系统(New EnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA)；GST基因融合系统(Amersham PharmaciaBiotech,Inc.,Piscataway,NJ)；和pTrcHis表达载体系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)。另外的系统包括His6-tag(例如，Roche Applied Science,Mannheim,Germany)或链亲和素结合肽(例如，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。例如，pMAL表达系统利用将麦芽糖结合蛋白添加至表达蛋白的载体。在大肠杆菌中表达所述融合蛋白，并且使用直链淀粉柱从粗细胞提取物中纯化所述融合蛋白。必要时，可通过用适当的蛋白酶(例如Xa因子)进行处理，将所述麦芽糖结合蛋白结构域从所述融合蛋白上切割下来。然后可通过经过第二个直链淀粉柱，将所述麦芽糖结合片段从制备物中除去。

所述MHC II类α1结构域多肽还可在原核表达系统(包括毕氏酵母(Pichia pastoris))、果蝇(Drosophila)、杆状病毒(Baculovirus)和Invitrogen(Carlsbad,CA)生产的Sindbis表达系统中表达。真核细胞例如中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster ovary)(CHO)、猴肾(COS)、HeLa、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)也可用于表达所述MHC II类α1结构域多肽。适合在这些细胞中使用的调控区包括，对于哺乳动物细胞，病毒启动子例如来自CMV、腺病毒或SV40的那些启动子，对于酵母细胞，用于3-磷酸甘油酸酯激酶或醇脱氢酶的启动子。

将DNA转入真核细胞是常规的。通过例如使用磷酸钙或磷酸锶的沉淀、电穿孔、脂转染、DEAE葡聚糖、显微注射、原生质体融合或基因枪(microprojectile gun)，将载体作为纯DNA引入受体细胞中(转染)。或者，可通过用病毒载体进行感染来引入所述核酸分子。开发了使用例如反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒的系统。

可将在哺乳动物细胞中产生的MHC II类α1结构域多肽释放到上清液中之后提取所述蛋白，并可使用用MHC抗体制备的免疫亲和柱来纯化所述蛋白。或者，所述MHC多肽可表达为具有例如β-球蛋白的嵌合蛋白。此后将β-球蛋白抗体用于纯化所述所述嵌合蛋白。然后使用在所述β-球蛋白基因与编码所述MHC II类α1结构域多肽的核酸序列之间设计的相应蛋白酶切割位点来在翻译后使所述2个多肽片段彼此分离。一个有用的用于生成β-球蛋白嵌合蛋白的表达载体是pSG5(Stratagene,La Jolla,CA)。

所述MHC多肽在原核细胞中的表达将生成未被糖基化的多肽。可通过在适当的真核表达系统例如哺乳动物细胞中表达所述多肽，来实现所述多肽在天然存在的糖基化靶位点上的糖基化。在其他实例中，可以对所述MHC II类α1结构域进行修饰(例如，利用定点诱变)，以使其包含所期望的翻译后修饰位点，例如一个或多个用于N-连接的糖基化、磷酸化或其他修饰的位点。

所述表达蛋白的纯化通常在含有6M尿素的碱性溶液(通常约pH10)中进行。然后通过在中性pH的缓冲溶液(通常约pH7.4的磷酸盐缓冲液)下进行透析，来实现所述纯化蛋白的折叠。

IV.抗原决定簇

在一些实施方案中，所述公开的方法利用包含共价连接的抗原决定簇的MHC II类分子(例如MHC II类α1结构域)。如本领域所公知的(参见例如美国专利No.5,468,481)，抗原在APC表面上的MHC复合物中的呈递通常不涉及整条抗原肽。更恰当地说，位于β1和α1结构域之间(在MHC II的情况下)或α1和α2结构域之间(在MHC I的情况下)的沟中的肽通常为所述整条抗原肽的小片段。如Janeway&Travers(Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,1997)所论述的，位于MHC I类分子的肽沟中的肽受到结合口袋(binding pocket)大小的限制，并且通常长度为8-15个氨基酸(例如8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)，更通常长度为8-10个氨基酸(但对于可能的例外，参见Collins et al.,Nature371:626-629,1994)。相反，位于MHC II类分子的肽沟中的肽不以这种方式受到限制，并且常常更大，通常长度为至少3-50个氨基酸(例如长度为8-30、10-25或15-23个氨基酸)。在一些实例中，位于MHC II类分子的肽沟中的肽的长度约为15-23个氨基酸。在一些实例中，所述公开的组合物包含抗原肽，例如与MHC II类α1结构域共价连接的抗原肽。可以通过常规方法例如使用合成性肽合成装置。

在一些实例中，抗原决定簇包含来自神经元蛋白或中枢神经系统蛋白的肽，所述蛋白例如髓磷脂蛋白(例如，髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP))。在其他实例中，抗原决定簇为来自视网膜蛋白的肽，所述视网膜蛋白例如感光细胞间维生素A类结合蛋白(IRBP)、抑制蛋白、光传感因子(phosducin)或恢复蛋白。另外的抗原决定簇包括来自II型胶原蛋白(胶原蛋白II)、纤维蛋白原-α、波形蛋白、α-烯醇化酶、人软骨糖蛋白-39、α2麦醇溶蛋白或胰岛素的肽。在一些实例中，抗原决定簇包括翻译后修饰，例如磷酸化、糖基化或瓜氨酸化。示例性抗原肽提供于表2中。本领域普通技术人员可以鉴定另外的与具体疾病或病症相关的抗原决定簇。

表2.示例性抗原决定簇

在一些实例中，通过将编码所选择抗原的核酸序列可操作地连接至编码所述MHC II类α1多肽的构建体的5’末端，而将所述抗原肽与所述MHC II类α1多肽共价连接，使得在所述表达的肽中，所述抗原肽被连接至所述α1结构域的氨基末端。在其他实例中，通过将编码所选择抗原的核酸序列可操作地连接至编码所述MHC II类α1多肽的构建体的3’末端，而将所述抗原肽与所述MHC II类α1多肽共价连接，使得在所述表达的肽中，所述抗原肽被连接至所述α1结构域的羧基末端。获得该结果的一个方便的方法是将编码所述抗原的序列纳入到用于扩增所述MHC II类α1结构域编码区的PCR引物中。在一些实施例中，在所述抗原肽和所述MHC II类α1多肽之间包含编码接头肽序列的序列。然而，不必要将所述抗原肽精确地连接到所述MHC II类α1结构域编码区的5’末端(或3’末端)。例如，可将所述抗原编码区插入所述编码MHC II类α1结构域的序列的5’或3’末端的前几个密码子中(通常在前10个中)。

在一些实施方案中，用于将所述抗原肽连接至所述MHC II类α1结构域的这类遗传体系在待产生大量具有不同抗原肽的MHC II类α1结构域的情况下特别有用。所述体系允许构建这样的表达载体：其中独特的限制酶切位点包含在所述MHC II类α1结构域中(例如在所述α1结构域的5’或3’末端)。与这类构建体一起，制备编码抗原肽的序列的文库，每个抗原编码区侧翼有用于所选择限制性内切酶的位点。然后简单地通过(a)使用所选择限制性内切酶释放所述抗原编码区，(b)使用所述相同的限制性内切酶切割所述MHC II类α1结构域构建体，和(c)将所述抗原编码区连接至所述MHC II类α1结构域构建体中，来将具体的抗原包含在所述MHC II类α1结构域中。以这种方式，可制备大量的MHC II类α1结构域-肽抗原构建体，并可在短时间内使其表达。

在一些实例中，所述抗原通过二硫键与所述MHC II类α1结构域多肽共价连接。在一些实例中，利用所述MHC II类α1结构域多肽中天然存在的半胱氨酸残基(例如所述MHC II类α1结构域中的半胱氨酸残基)形成所述二硫键。本领域普通技术人员可以在MHC II类α1结构域多肽中鉴定合适的半胱氨酸残基。在其他实例中，利用所述MHCII类α1结构域多肽中非天然存在的半胱氨酸残基形成所述二硫键，例如通过诱变引入所述MHC II类α1结构域多肽中的半胱氨酸残基。在其他实例中，利用所述肽抗原中天然存在的半胱氨酸残基形成所述二硫键。仍在其他实例中，利用所述肽抗原中非天然存在的半胱氨酸残基形成所述二硫键，例如通过诱变引入所述肽抗原中的半胱氨酸残基。

V.治疗或抑制疾病的方法

本文公开了治疗或抑制受试者中的疾病的方法，所述疾病包括，但不限于炎性和/或自身免疫性疾病。所述公开的方法包括将MHC II类α1结构域多肽(例如α1结构域多肽或与抗原共价连接的α1结构域多肽)给予受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括选择患有用于治疗的疾病的受试者，和将有效量的MHC II类α1结构域多肽或编码MHC II类α1结构域多肽的核酸给予所述受试者。在一些实例中，所述MHC II类α1结构域与抗原决定簇或肽共价连接(例如上文论述的那些)。

在一些实施方案中，所述受试者患有炎性和/或自身免疫性疾病或病症，包括但不限于，系统性红斑狼疮、肖格伦综合征、风湿性关节炎、I型糖尿病、韦格纳肉芽肿病、炎性肠炎、多肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特综合征、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻病、阿狄森氏病(Addison’s disease)、肾上腺炎、格雷夫斯病、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、自身免疫性甲状腺病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、类狼疮性肝炎、动脉粥样硬化、早老性痴呆、脱髓鞘疾病、多发性硬化、亚急性皮肤红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)、重症肌无力、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃(alopecia arcata)、类天疱疮、硬皮病、进行性系统性硬化病、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏现象(Raynaud’sphenomenon)、食管运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)、成年型糖尿病(II型糖尿病)、男性和女性自身免疫性不育症、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎(polyarteritis nedosa)、系统性坏死性血管炎、幼年类风湿性关节炎(juvenile onset rheumatoid arthritis)、肾小球肾炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、肺出血性肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、查加斯病、结节病、风湿热、哮喘、习惯性流产、抗磷脂综合征、农民肺(farmer’slung)、多形红斑、心切开术后综合征、库欣综合征、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟人肺(bird-fancier’s lung)、变应性疾病、变应性脑脊髓炎、中毒性表皮坏死松解症、脱发、奥尔波特综合征、肺泡炎、变应性肺泡炎、纤维化肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、高安动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉菌病、Sampter综合征、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、贝赫切特病(Behcet’s disease)、卡普兰综合征(Caplan’s syndrome)、川崎病(Kawasaki’s disease)、登革热、脑脊髓炎、内心膜炎、心内膜心肌纤维化症、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、银屑病、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、舒尔曼综合征、费尔蒂综合征(Felty’s syndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异色性睫状体炎(heterochronic cyclitis)、弗斯睫状体炎(Fuch’s cyclitis)、IgA肾病、亨诺-许兰氏紫癜、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、移植排斥、人类免疫缺陷病毒感染、埃可病毒感染、心肌症、阿尔茨海默病、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征(post vaccination syndromes)、先天性风疹感染、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、伊顿-兰伯特综合征、复发性多软骨炎、恶性黑素瘤、冷球蛋白血症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulemia)、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎病毒(rubulavirus)和埃文综合征(Evan’ssyndrome)。另外的炎性疾病包括骨关节炎、炎性肺病(包括慢性阻塞性肺病)、牙周病、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、系统性硬化病、变应性鼻炎和皮肤病(包括皮肌炎和银屑病)等。

在其他实施方案中，所述受试者患有视网膜疾病，例如视网膜变性，例如视网膜色素变性、锥杆体营养不良(cone-rod dystrophy)、利伯先天性黑蒙症，或者黄斑病变(例如老年性黄斑变性、Stargardt样黄斑变性、卵黄状黄斑营养不良(贝斯特病)、Malattia Leventinese(多恩蜂巢状视网膜营养不良(Doyne’s honeycomb retinal dystrophy)、糖尿病性斑丘疹病、隐匿性黄斑营养不良和透明纸样黄斑病)。在其他实例中，视网膜疾病包括视网膜病变，例如自身免疫性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变或血管原性视网膜病变。仍在其他实例中，视网膜疾病包括视网膜脱离或青光眼。视网膜疾病可以是进行性的(例如，视网膜变性或青光眼)或急性的(例如，视网膜脱离)。在另外的实例中，所述受试者是患有葡萄膜炎或视神经炎的受试者。在其他实施方案中，所述受试者已经患有中风(例如缺血性中风或出血性中风)。仍在其他实例中，所述受试者为患有物质成瘾的受试者，例如，所述受试者有由物质成瘾引起的认知损伤或神经精神损伤。

在一些实施方案中，受试者被给予有效量的的组合物，所述组合物包含MHC II类α1结构域或其一部分(例如α1结构域中能够结合CD74或降低CD74的表达和/或活性的部分)。取决于所选择的具体给药模式，包含一种或多种本文公开的MHC II类α1结构域(例如2、3、4、5或更多种MHC II类α1结构域)的药物组合物可用适当的固体或液体载体配制。在本公开中使用的可药用载体和赋形剂是常规的。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，The University of theSciences in Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21^st Edition(2005)。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的液体，该液体是药物和生理学上可接受的液体载体，例如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如，药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性的载体之外，待给予的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。可包含的赋形剂为，例如，其他蛋白质，例如人血清白蛋白或血浆制剂。

将由所选择的给药模式确定所述药物组合物的剂型。例如，除了可注射的液体之外，可采用局部用制剂、吸入制剂、口服制剂和栓剂制剂。局部用制剂可包括滴眼剂、软膏剂、喷雾剂、贴剂等。吸入制剂可为液体(例如，溶液或混悬剂)并包括合剂(mist)、喷雾剂等。口服制剂可为液体(例如，糖浆剂、溶液或混悬剂)，或固体(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂)。栓剂制剂也可为固体、凝胶或悬液形式。对于固体组合物，常规的无毒固体载体可包括药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。制备这类剂型的现行方法对本领域技术人员是已知的，或者是显而易见的。

在一些实例中，可通过任何能够实现其预期目的的方法给予所述药物组合物。给予所选择MHC II类α1结构域多肽或其一部分(或编码这类多肽的核酸)的量和服药方案由主治医生确定。对治疗性应用的有效剂量根据待治疗的病症的性质和严重性、具体选择的MHC II类α1结构域或其一部分、患者的年龄和状况以及其他临床因素而有所不同。通常，剂量范围为约0.1μg/kg体重至约100mg/kg体重。其他合适的范围包括以下剂量：约100μg/kg至约50mg/kg体重，约500μg/kg至约10mg/kg体重，或约1mg/kg至约5mg/kg体重。所述给药方案可根据许多临床因素(例如所述受试者对所述蛋白质的敏感性)从每周一次至每天一次之间变化。给药方案的实例为，每月一次，每两周一次，每周一次，每周两次，每周三次或每天给药约1mg/kg；每周一次，每周两次，每周三次或每天约2.5mg/kg的剂量；每周一次，每周两次，每周三次或每天约5mg/kg的剂量；每周一次，每周两次，每周三次或每天约10mg/kg的剂量；或每周一次，每周两次，每周三次或每天约30mg/kg的剂量。

可以将包含一种或多种所公开的MHC II类α1结构域分子的药物组合物配制成适用于精确剂量单独给药的单位剂型。在一个具体的非限制性的实例中，单位剂量可含有约1ng-约5g的MHC II类α1结构域(例如约10μg-1g或约10mg-100mg)。给予的一种或多种活性化合物的量取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性和给药方式，并最好留给处方医生来判断。在这些限制内，待给予的制剂以在被治疗的受试者中有效实现所需效应的量含有大量的所述活性化合物。

可以以多种方式将本公开的化合物给予人或其他动物，所述化合物对所述人或其他动物的组织有效，所述方式例如局部、口服、静脉、肌肉内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内、皮下、眼内、通过吸入或通过栓剂。在一个实例中，将所述化合物经皮下给予所述受试者。在另一实例中，将所述化合物经静脉给予所述受试者。考虑到病理的细节(例如，受试者、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)，具体的给药模式和给药方案由主治医生来选择。治疗可包括在几天至几个月甚至几年的时间内，每月、每两月、每周、每天或每天多次的剂量的一种或多种化合物。

在一些实施方案中，所公开的MHC II类α1结构域分子可被包含在惰性基质中用于局部应用。在一些实例中，所述制剂可被注射到眼内，例如用于玻璃体内注射。作为惰性基质的一个实例，脂质体可由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)例如卵磷脂酰胆碱(PC)制备。可使用本领域技术人员已知的标准程序制造脂质体，所述脂质体包括阳离子和阴离子脂质体。包含一种或多种MHC II类α1结构域的脂质体可以以滴剂的形式或作为基于水的乳剂局部应用，或可以眼内注射。在用于局部应用的制剂中，所述脂质体胶囊因来自眼睛表面的磨损而降解，因此所述MHC II类α1结构域随着时间的推移而被缓慢释放。在用于眼内注射的制剂中，所述脂质体胶囊由于细胞消化而降解。这两种制剂都提供了缓慢释放药物递送系统的优势，允许所述受试者随着时间的推移暴露于浓度基本不变的所述MHC II类α1结构域中。在一个实例中，所述MHCII类α1结构域可溶于有机溶剂例如DMSO或前文所述的醇中，并含有聚酐、聚(乙醇)酸、聚(乳)酸或聚已酸内酯聚合物。所述MHC II类α1结构域可包含在递送系统中，根据植入物的大小、形状和制剂以及移植方法的类型，可将所述递送系统植入眼中的不同部位。合适的部位包括但不限于前房、前段、后房、后段、玻璃体腔、脉络膜周隙、结膜下、巩膜上、角膜内、上角膜(epicorneal)和巩膜。

在一些实例中，所公开的MHC II类α1结构域多肽的有效量(例如，治疗有效量)可以为治疗或抑制受试者中的疾病(例如炎性和/或自身免疫性疾病)所必需的MHC II类α1结构域多肽的量或包含抗原(例如髓磷脂蛋白抗原、视网膜抗原，或其他抗原，例如上文论述的那些)的MHC II类α1结构域多肽的量。在其他实例中，所公开的MHCII类α1结构域多肽的治疗有效量可以为治疗或抑制视网膜疾病、中风或与物质成瘾相关的疾病(例如由物质成瘾引起的认知损伤或神经精神损伤)所必需的MHC II类α1结构域多肽的量或包含抗原的MHC II类α1结构域多肽的量。

本公开还包括一种或多种所公开的MHC II类α1结构域与一种或多种在所述疾病的治疗中有用的其他试剂的结合物。在一些实例中，本公开的化合物可以与有效剂量的一种或多种用于炎性或自身免疫性疾病的疗法一起给予，所述疗法包括但不限于非甾体抗炎药、皮质甾醇、氨甲喋呤、抗-TNF化合物、麦考酚酯(mycopheonlate)、氨基水杨酸盐(aminoslicylate)、抗生素、干扰素、格拉默乙酸盐(glatiramer acetate)、抗体疗法(例如利妥昔单抗(rituximab)或milatuzumab)、或者免疫抑制剂或免疫调节剂化合物。在另一实例中，本公开的化合物可与有效剂量的一种或多种用于视网膜疾病的疗法联合给予，所述疗法包括但不限于，基因疗法、维生素或矿物质补充物(例如维生素A、C和/或E，或锌和/或铜)、抗血管生成疗法(例如雷珠单抗(ranibizumab)或贝伐单抗(bevacizumab))、光凝固法、光动力学疗法、叶黄素或玉米黄质、皮质甾醇或免疫抑制剂。用于具体疾病的适当的联合疗法可由本领域普通技术人员来选择。术语“联合给药”或“共同给药”是指活性试剂的同时和序贯给药。

VI.评估或优化治疗的方法

本文公开了用于评估或优化治疗受试者中的疾病或病症(包括但不限于炎性或自身免疫性疾病)的功效的方法。所述方法包括确定CD74表达水平或活性水平，并基于所述CD74表达水平或活性水平确定使用多肽的治疗的功效或调整所述治疗(例如增加或减少剂量)，所述多肽包含MHC II类α1结构域(或其一部分)、MHC II类β1结构域或它们的组合。在一些实例中，(例如，与未患有炎性或自身免疫性疾病的受试者相比，)CD74表达在患有所述炎性或自身免疫性疾病的受试者中有所增加。

在一些实施方案中，所述方法包括确定用多肽治疗的受试者中治疗疾病(例如上文中第V部分论述的那些)的功效，所述多肽包含MHCII类α1结构域(或其一部分)、MHC II类β1结构域或它们的组合(例如β1α1多肽)。所述方法包括确定来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平。将所述CD74表达水平或活性水平与对照进行比较，并确定治疗的功效。在一些实例中，如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照低或与所述对照相等，那么认为所述治疗是有效的。在其他实例中，如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照高，那么认为所述治疗不是最有效的或是无效的。

在其他实施方案中，所述方法包括优化治疗受试者中的疾病(例如上文中第V部分论述的那些)的功效。所述方法包括将多肽给予患有所述疾病的受试者，和确定来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平，所述多肽包含MHC II类α1结构域(或其一部分)、MHCII类β1结构域、或它们的组合(例如β1α1多肽)。将所述CD74表达水平或活性水平与对照进行比较，并确定随后待给予至所述受试者的所述多肽的剂量。在一些实例中，如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照高，那么可增加所述多肽的剂量。在其他实例中，如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照低或与所述对照相等，那么可以保持或减少所述多肽的剂量。

在其他实施方案中，所述方法包括通过将多肽给予患有疾病的受试者来治疗或抑制所述受试者中的疾病，所述多肽包含MHC II类α1结构域(或其一部分)、MHC II类β1结构域、或它们的组合(例如β1α1多肽)，并且如果来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平比对照高，那么就增加所述多肽的剂量，或者如果来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平比对照低或与对照相等，那么就保持或减少所述多肽的剂量。

在一些实例中，高于对照(例如统计学上显著高于对照)的CD74表达水平或活性水平表明需要增加随后给予所述受试者的所述MHC II类多肽(例如MHC II类α1结构域多肽或其一部分或MHC II类β1α1多肽)的量或剂量。在其他实例中，低于对照(例如统计学上显著低于对照)的CD74表达水平或活性水平表明需要保持或减少随后给予所述受试者的所述MHC II类多肽(例如MHC II类α1结构域多肽或其一部分或MHC II类β1α1多肽)的量或剂量。在一些实例中，调整所述MHC II类多肽(例如MHC II类α1结构域多肽或MHC II类β1α1多肽)的剂量，以产生约等于对照的CD74表达水平或活性水平。本领域普通技术人员可基于所确定的CD74表达或活性、疾病或病症、受试者的状况和其他因素来调整剂量(例如，增加或减少剂量)。在一些实例中，调整了剂量，并在给予所述调整的剂量之后(例如，给予所述调整的剂量后约1、2、3、4、5、6、7、10、14或更多天)确定CD74表达水平或活性水平。还可基于所述CD74表达水平或活性水平，保持或调整所述剂量。这可以根据需要多次重复以达到所预期的CD74表达水平或活性水平，以及所期望的对所述疾病或病症的抑制(例如减轻所述疾病或病症的症状)。

所述对照是用于CD74表达水平或活性水平的任何合适的对照。在一些实施方案中，所述对照是获得自健康受试者或健康受试者群体的样品。在其他实施方案中，所述对照是历史对照或标准参考值或值域(例如以前测试的对照样品，例如代表基线或正常值的样品组，例如健康受试者中的CD74表达水平或活性水平)。在一些实例中，所述对照是CD74表达水平，例如来自健康受试者的样品中的CD74RNA(例如CD74mRNA)或CD74蛋白水平或量，或健康受试者群体中CD74RNA或蛋白水平或量的参考值(例如健康受试者群体中的平均CD74水平)。在其他实例中，所述对照是CD74活性水平，例如来自健康受试者的样品中的CD74活性或健康受试者群体中的CD74活性的参考值(例如健康受试者群体中的平均CD74活性水平)。在其他实例中，所述对照是未经治疗的受试者或开始用MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1结构域多肽治疗之前的受试者(例如同一受试者或患有相同疾病的不同受试者)的样品中的CD74表达水平或活性水平。在其他实例中，对照是一群健康受试者(例如年龄、性别、疾病或其他临床因素中的一种或多种匹配的一群受试者)中的CD74表达水平或活性水平。

在一些实施方案中，所述样品来自已经被给予包含MHC α1结构域、MHC II类β1结构域、或它们的组合的MHC II类多肽的受试者或者正在被给予这种MHC II类多肽的受试者。在一些实例中，所述多肽包含MHC II类α1结构域并且不包含MHC II类α2、β1或β2结构域(例如，本文公开的MHC II类α1结构域多肽)。在其他实例中，所述多肽包含MHC II类β1结构域和MHC II类α1结构域，其中所述α1结构域的氨基末端与所述β1结构域的羧基末端共价连接(例如直接或通过肽接头)(β1α1多肽)。MHC II类β1α1多肽之前已经被描述过。参见，例如，美国专利No.6,270,772；美国专利申请公开No.2005/0142142、2009/0280135、2011/0262479、2011/0008382、2011/0217308，这些参考文献各自以引用的方式全文纳入本文。在一些实例中，所述MHC II类α1结构域多肽或所述MHC II类β1α1多肽也包含抗原决定簇，例如与所述MHC II类多肽共价或非共价连接的抗原决定簇。

确定CD74表达水平或活性水平

确定CD74表达水平或活性水平的方法是本领域普通技术人员已知的。在一些实例中，确定CD74表达包括确定CD74核酸或蛋白的表达(例如存在、不存在或量)。在一些实例中，所述方法包括确定CD74的1种、2种、3中或更多种同种型(例如任选地剪切的同种型)的存在或量。在其他实例中，确定CD74活性包括确定CD74蛋白活性，例如由CD74活性所介导或修饰的细胞或分子事件。

适用于确定CD74表达水平或活性水平的样品包括获得自受试者的含有核酸(例如，DNA或RNA(包括mRNA))、蛋白质或它们的组合的生物样品。实例包括，但不限于，外周血、细针抽吸物、尿、唾液、组织活检、手术标本和尸体剖检材料。在一个实例中，样品包括血液样品(例如血液；血液的衍生物或血液的一部分，例如血清)或者分离或纯化的细胞群(例如，T细胞、B细胞、PBMC、淋巴细胞等，包括部分分离或部分纯化的细胞群)。在一些实例中，所述样品包含B细胞、CD11b⁺细胞、CD34⁺细胞、CD4⁺细胞、CD19⁺细胞、CD74⁺细胞或其中的两种或多种的组合，基本上由其组成，或由其组成。

CD74表达

可通过检测编码CD74的RNA(例如mRNA)来评估基因表达。可使用本领域技术人员公知的方法(包括可商购的试剂盒)从来自受试者的样品(例如血液样品)中分离RNA。RNA提取的一般方法是本领域公知的，并且公开在分子生物学的常规教科书中，所述常规教科书包括Ausubel et al.,Current Protocols of Molecular Biology,John Wileyand Sons(1997)。公开了用于从石蜡包埋的组织中提取RNA的方法，例如在Rupp and Locker,Biotechniques6:56-60(1988)和De Andres etal.,Biotechniques18:42-44(1995)中。

确定基因表达的方法包括基于多核苷酸的杂交分析的方法、基于多核苷酸的测序的方法和基于蛋白质组学的方法。本领域普通技术人员可获得在确定CD74基因表达的方法中使用的合适的引物和/或探针。在一些实例中，使用以下方法对样品中的mRNA表达进行定量：RNA印迹法或原位杂交(Parker&Barnes,Methods in Molecular Biology106:247-283,1999)；核糖核酸酶保护测定(Hod,Biotechniques13:852-4,1992)；和基于PCR的方法，例如反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(Weis et al.,Trends in Genetics8:263-4,1992)、定量RT-PCT或TaqMan RT-PCR。或者，可采用能够识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。用于基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)和通过大规模平行信号测序(MPSS)进行的基因表达分析。在一个实例中，可使用RT-PCR来比较不同样品中(例如来自受试者和对照的样品中)的mRNA水平，以确定CD74表达。

为了使误差和样品与样品之间的差异造成的影响降到最低，可使用内标进行RP-PCR。理想的内标在不同的组织中以不变的水平表达，并且不受实验治疗的影响。通常用于使基因表达谱归一化的RNA为持家基因GAPDH、β-肌动蛋白和18S核糖体RNA的mRNA。

原位杂交(ISH)是另一种用于检测和比较目的基因的表达的方法。ISH应用了核酸杂交技术，并将该技术延伸到单细胞水平，并且该技术与细胞化学、免疫细胞化学和免疫组织化学领域相结合，使得能够维持待维持的形态并鉴定待鉴定的细胞标记物，并且使得序列定位于群体(例如组织和血样)中的特定细胞。ISH是一种类型的杂交，其使用互补的核酸将一种或多种特定的核酸序列定位于组织的一部分(protionor section)中(原位)，或者，如果所述组织足够小，定位于整个组织中(整体ISH(whole mount ISH))。RNA ISH可用于测定组织中的表达谱，例如癌症存活因子相关基因的表达。

在所述检测方法的一些实施方案中，也可以评估一种或多种“持家”基因或“内部对照”的表达。这些术语包括任何组成型表达或全局表达的基因(或蛋白，如下文所论述的)，所述基因(或蛋白)的存在使得能够评估CD74基因(或蛋白)水平。这类评估包括确定基因转录的整体组成性水平和用于RNA(或蛋白)回收中的差异的对照。

在一些实例中，分析了CD74蛋白的表达。可以通过很多本领域公知的免疫测定方法(例如Harlow和Lane(Antibodies,A LaboratoryManual,CSHL,New York,1988)中所示的那些方法)中的一种将对CD74特异的抗体用于蛋白质表达的检测和定量。构建这类抗体的方法是本领域已知的。此外，这类抗体可以是可商购的。示例性的可商购抗体包括来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)的目录编号sc-70781、sc-166047、sc-81626和sc-65272的产品；来自Abcam(Cambridge,MA)的目录编号ab9514、ab22603、ab64772和ab108402的产品，和来自R&D Systems(Minneapolis,MN)的目录编号MAB35901和AF3590的产品。

任何常规免疫测定方式(例如ELISA、蛋白质印迹法、流式细胞术或RIA测定)可用于检测蛋白水平。因此，在一个实例中，可使用这些方法容易地评估样品中CD74蛋白的多肽水平。免疫组织化学技术也可用于CD74检测和定量。关于这类技术的一般性指导可见于Bancroft和Stevens(Theory and Practice of Histological Techniques,ChurchillLivingstone,1982)和Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,1998)中。

CD74活性

CD74(不变链、Ii)是一种II类跨膜糖蛋白，其含有侧翼有两个高度非结构化区域的三聚结构域(Jasanoff et al.,Immunity10:761-768,1999)。CD74的一个作用是伴随新合成的MHC II类通过胞吞途径到达APC的细胞表面(Cresswell,Cell84:505-507,1996)。CD74，与CD44、CXCR2和CXCR4联合，还是巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的受体(Leng et al.,J.Exp.Med.197:1467-1479,2003；Naujokas et al.,Cell74:257-268,1993)。通过CD74的MIF信号转导包括胞外信号调节激酶(ERK)1/2的激活、NF-κB激活、Bcl-2表达和IL-8分泌(例如，Lenget al.,J.Exp.Med.197:1467-1476,2003；Starlets et al.,Blood107:4807-4816,2006；Binsky et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:13408-13413,2007；Gore et al.,J.Biol.Chem.283:2784-2792,2008)。通过MIF-激活的CD74的信号激活的一个结果是细胞增殖或存活增加，或细胞凋亡减少。

本领域普通技术人员能够鉴定和确定CD74活性的水平。在一些实例中，间接确定CD74活性，例如通过确定CD74的一种或多种下游效应物的活性，或由CD74调节的一种或多种细胞表现型(phenotype)(例如细胞增殖、存活或迁移)。在其他实例中，通过MIF结合或MHC II类多肽的结合来确定CD74活性，所述MHC II类多肽例如MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1多肽，例如下文实施例3中描述的多肽。

在一些实施方案中，在来自受试者(例如患有炎性和/或自身免疫性疾病的受试者或对照)的样品中确定CD74活性，例如包含单核细胞、B细胞、CD11b⁺细胞、CD34⁺细胞、CD4⁺细胞、CD19⁺细胞、CD74⁺细胞、或其中两种或多种细胞的组合的样品。在一些实例中，通过将所述样品与MIF接触并测量CD74的下游效应物的活性来确定CD74活性，所述CD74的下游效应物的活性例如ERK1/2活性(例如，磷酸化)、NF-κB激活(例如，由pp65/RelA介导的转录)、Bcl-2表达、ICAM-1表达、和/或IL-8分泌。在一些实例中，将所述样品与MIF接触导致CD74的至少一种下游效应物的活性增加。可以将该CD74活性水平与已经与MIF接触过的对照进行比较，所述对照例如来自健康受试者或未经治疗的患有所述疾病的受试者的样品。用于确定这些活性的方法(例如，利用蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA、报告基因测定(reporter assay)、或基于PCR的方法)是本领域普通技术人员公知的。示例性测定法示于Leng et al.,J.Exp.Med.197:1467-1476,2003；Starlets et al.,Blood107:4807-4816,2006；Binsky et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:13408-13413,2007；和Gore et al.,J.Biol.Chem.283:2784-2792,2008中；这些参考文献各自以引用的方式全文纳入本文。

在其他实例中，通过将所述样品与MIF接触并在过了足以观察到表现型的时间之后确定所述细胞表现型来确定CD74活性，所述细胞表现型例如细胞增殖、细胞迁移和/或细胞凋亡。测量细胞增殖的方法是本领域公知的。例如，纳入DNA标记物(例如5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)、[³H]胸苷或荧光标记物)、MTT或XTT测定，或细胞计数。测量细胞凋亡的方法是本领域公知的。例如，凋亡性细胞死亡的特征在于细胞皱缩、膜起泡和染色质凝聚并最终以细胞破裂告终。处于凋亡过程中的细胞还表现出核小体间DNA断裂的特征性模式。测量细胞迁移的方法(例如博伊登室测定(Boyden chamber assay))是本领域普通技术人员公知的。可将所述CD74活性水平与已经与MIF接触过的对照进行比较，所述对照例如来自健康受试者的样品或来自未经治疗的患有所述疾病的受试者的样品。示例性测定法示于Leng et al.,J.Exp.Med.197:1467-1476,2003；Starlets et al.,Blood107:4807-4816,2006；Binskyet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:13408-13413,2007；和Gore et al.,J.Biol.Chem.283:2784-2792,2008；这些参考文献各自以引用的方式全文纳入本文。

提供如下实施例来说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制为所描述的具体特征或实施方案。

实施例

实施例1

材料和方法

小鼠：将DR*1501-Tg、DR*1502-Tg和MBP-TCR/DR2-Tg室内饲养在波特兰退伍军人医疗中心的兽医医疗部门(Veterinary MedicalUnit,Portland Veterans Affairs Medical Center)中，并在8-12周龄时使用。所有程序都获得了批准，并依照惯例指南进行。

在DR2-Tg和MBP-TCR/DR2-Tg小鼠中诱导EAE：通过FACS筛选表达所述HLA转基因的HLA-DR2小鼠(McMahan et al,J Biol Chem278:30861-30970,2003)。使用0.2ml乳状液在身体两侧的四个部位皮下免疫8-12周龄的HLA-DR2阳性的雄性和雌性小鼠，所述0.2ml乳状液是200μg免疫原性肽与含有400μg的热灭活的结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA的弗氏完全佐剂(Difco,Detroit,MI)的乳状液(Vandenbark et al,J Immunol171:127-133,2003；Buenafeet al,Immunology130:114-124,2010)。此外，在免疫后的第0天和第2天给予小鼠来自List Biological Laboratories(Campbell,CA)的百日咳毒素(Ptx)(分别为每只小鼠75ng和200ng)。以结合后肢和前肢瘫痪得分的6分量表每天评估经免疫的小鼠的EAE临床体征。对于后肢得分：0＝正常；0.5＝跛行尾或轻度后肢无力(例如，在90°翻转尾巴的根部后，小鼠无法抵抗翻转)；1＝跛行尾和轻度后肢无力；2＝跛行尾和中度后肢无力(例如小鼠在翻转后自己不能快速恢复平稳)；3＝跛行尾和中重度后肢无力(例如，小鼠在翻转后自己不能恢复平稳，和行走时后肢向任一侧发生明显倾斜)；4＝跛行尾和重度后肢无力(后足能移动但是与朝前移动相比更频繁地被拖动向前移动)；5＝跛行尾和瘫痪(后肢不能移动)。前肢瘫痪得分为0.5(对于正常移动明显受限)或1(对于前肢完全瘫痪)。组合得分为所述后肢得分与所述前肢得分之和。

罕见地，存在患有重度EAE的HLA-DR2的死亡，在这种情况下，对于实验的剩余部分，将小鼠得分计为6。在整个实验过程中，每天计算并加和根据RTL或载体治疗的开始而分组的小鼠的平均EAE得分和标准偏差(累积疾病指数，CDI，代表总的疾病负荷)。通过用于载体和pDR2治疗组之间的非参数比较的双尾曼-惠特尼U检验(two-tailedMann Whitney U test)来分析每天的平均得分。通过具有图基事后检验(Tukey post-test)的单向ANOVA，和具有邓肯氏多重比较事后检验(Dunn’s multiple comparisons post-test)的非参数单向Kruskal-Wallis ANOVA来分析平均CDI，以确定所有组之间的显著性。

DR2-Tg小鼠中EAE的pMHC治疗：每天以指示的剂量皮下注射pDR2构建体(表3)，持续5天，以治疗HLA-DR2-Tg和MBP-TCR/DR2-Tg小鼠中诱导的EAE，并如上文所述对临床体征进行评分。对于中和实验，使用载体(含有5％w/v D-葡萄糖的20mMTris-HCl(pH8.0))、20μg RTL342M(pDR2/mMOG-35-55)、或以1:1(40μg)或1:2(80μg)的摩尔比与Fab1B11(对两个结构域的DR2构建体特异)或FabD2(对pDR4/GAD-555-567构建体特异)进行预孵育的20μg RTL342M，处理DR*1501-Tg小鼠(皮下)。将单独在载体中的Fab1B11作为阴性对照。Dahan et al.,Eur.J.Immunol.41:1465-1479,2011中以前描述了这些方法。

表3.pDR2构建体

流式细胞术：使用四色(异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶、别藻蓝蛋白)流式细胞术对首次用于实验的DR2PBMC亚型进行分析。通过心脏放血从首次用于实验的DR2小鼠中将血液收集到1×PBS/EDTA中。在1×PBS中洗涤血液之后，用1×RBC裂解缓冲液(eBioscience,Inc.,San Diego,CA)裂解红细胞，接着在RPMI中洗涤2次。将1百万个细胞在RPMI中与1μg未标记的pDR2、1μg pDR2FITC或lμg Fab中和的pDR2FITC在37℃下孵育1小时。对于评估Fab中和pDR2结合的样品，将pDR2与Fab1B11或FabD2以1:1的摩尔比在室温下孵育2小时，然后与细胞进行孵育。pDR2孵育之后立即与CD3PE(ebioscience,Inc.,San Diego,CA)、CD74PE(Santa CruzBiotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)、或CD11b PE、CD11b别藻蓝蛋白、CD11c别藻蓝蛋白、CD19别藻蓝蛋白(BD Pharmingen,San Diego,CA)在4℃下孵育30分钟。通过在1×PBS/0.5％BSA染色介质中进行两次额外的洗涤而彻底去除抗体和pDR2。将细胞重悬于含有碘化丙啶的染色介质中，并立即使用FACSCALIBUR^TM用FCS EXPRESS^TM软件(BD Biosciences,San Jose,CA)进行分析。数据代表100,000设门(gated)的活的单核细胞和淋巴细胞(体内分析)或10,000设门的活的单核细胞(体外分析)。

pDR2结合的显微镜检查和成像：通过小鼠单核细胞富集试剂盒(Mouse Monocye Enrichment Kit)(Stem Cell Technologies,Vancouver,Canada)从DR*1501/GFP-Tg小鼠中阴性地(negatively)分离出CD11b+细胞，并使用10mg/ml标记有Alexa546的RTL342M(在RPMI中)处理40分钟。利用封闭在人工气候室中的有专用XYZ平台的Olympus IX71倒置显微镜(微分干涉相差(DIC)透射光和固态荧光模块)在高分辨率宽视野CoreDV显微镜系统上(Applied Precision,Issaquah,WA)采集图像。当光轴为2色(FITC和TRITC)60×(数值孔径，1.42)Plan Apo N物镜时，使用Coolsnap ES2HQ照相机来采集图像。像素为0.10704微米。使用10次迭代的迭代算法用适当的OTF(光传递函数)对图像进行反卷积。优化结果最好的图像的直方图，并将所述直方图用于所有其他图像以保持一致性，然后将图像保存为24位合并的TIFF。对数据进行可视化，并使用(Bitplane)和(Mathworks,Natick,MA)分析数据。

蛋白纯化和标记：pDR2蛋白(来自大肠杆菌中生成的包涵体)的克隆、表达和纯化如Chang et al.,J.Biol.Chem.276:24170-24176,2001中所描述的。

细胞表面蛋白的生物素化和细胞裂解：在RPMI中收集来自DR*1501-Tg或MHC II类-敲除的小鼠的脾细胞，并在用于实验之前将其一直放在冰上。将细胞用pH8.0的冷PBS进行彻底洗涤，并用Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce Biotechnology,Cat No.21335)进行生物素化，在冰上持续15分钟以防止过度标记。通过用pH7.4的TEN(50mM Tris，2mM EDTA，150mM NaCl)缓冲液将所述生物素化的细胞悬液稀释5倍而结束反应。随后使用TEN缓冲液进行洗涤以去除生物素化试剂，使片状沉淀物保持冷冻的状态直至裂解。将细胞片状沉淀物在冰上解冻，并在除了存在1μM PMSF(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)之外还存在蛋白酶抑制剂(Halt Protease Inhibitor Cocktail,Pierce Biotechnology)的情况下，在含有1％的Triton X-100(TEN-TX100)或1％CHAPS(TEN-CHAPS)的TEN缓冲液中裂解30-60分钟。裂解后，将细胞在4℃，14,000RPM下离心15分钟，收集上清液用于进一步分析。

直接和竞争性结合测定：

将2百万个来自DR*1501-Tg小鼠的脾细胞在RPMI中与浓度渐增的488标记的pDR2/hMOG-35-55(RTL1000)在冰中孵育1小时(以使通过吞噬性机制进行的细胞内摄作用降到最低)。然后在100μl的6M尿素中裂解所述细胞，以分离和溶解结合标记的配体用于后续分析。将裂解物离心以去除不溶性的物质(细胞核、细胞器)，然后在10-20％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE电泳以对上清液进行分离。然后扫描所述凝胶用于观察标记的pDR2。将条带荧光强度通过光密度法使用Quantity软件(BioRad)进行定量，并且相对于标记的RTL1000浓度进行标绘。使用GraphPad软件分析数据，并使数据拟合1个或2个结合位点的数学模型。

在浓度渐增的未标记的pDR2构建体(0-8μM)的存在下，使用2百万个脾细胞和恒定浓度的标记的RTL1000(280nM)进行竞争性结合。然后，如上文所述对细胞进行洗涤、裂解和分析，用于在全细胞中进行饱和度测定。将结果表示为EC50，竞争掉一半的特异性结合所需的竞争物的浓度。

CD74和MHC II类分子的免疫沉淀以及直接和竞争性结合测定：对于免疫沉淀实验，在冰冷的TEN-TX100或TEN-CHAPS中使抗体TU39(BD Pharmingen)与微珠缀合的蛋白A预结合2小时，接着RTL与这些复合物结合。向管中加入裂解物(之前用微珠缀合的蛋白A预清除过)，然后使用软轨道振荡在4℃下过夜结合。将样品用TEN缓冲液和适当的去污剂进行彻底洗涤。对于CD74免疫沉淀，如上文所述将ln-1mAb吸附到微珠缀合的蛋白L上并向该混合物中加入预清除的裂解物。必要时，通过煮沸电泳样品缓冲液中的所述免疫复合物来洗脱结合的物质并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法进行分析。

对于RTL构建体的直接结合，如上文所述制备蛋白-L/ln-1/CD74复合物。将标记的配体构建体在1％CHAPS(在TEN缓冲液中)中4℃下孵育4小时，并通过彻底洗涤而去除游离配体。如上文所述进行结合蛋白的洗脱，并通过SDS-PAGE分析所述洗脱物。在TEN-CHAPS缓冲液中在500μl反应体积中使用2:1的标记的RTL1000与“冷的”竞争物的摩尔比在4℃下进行竞争实验，持续3-4小时。通过在0.5ml的总反应体积中使用0.160nmol(4μg)的标记的RTL1000和浓度渐增(0、0.032、0.096、0.320和0.960nmol)的DR-αl结构域，完成RTL1000与所述DR-αl结构域之间对结合CD74的竞争。在这些条件下，RTL1000的终浓度为320nM。在所有涉及荧光标记的测定中，都使用MolecularFX扫描仪(Bio-Rad)通过在适当的波长下进行扫描来检测生色团，并且使用与所述成像仪相关的Quantity软件(Bio-Rad)确定荧光强度。

为了测试与所述RTL受体的单独组分相结合的配体，对DR*1501-Tg脾细胞进行生物素化并如上文所述对其进行裂解，然后将CD74与CD74单克隆抗体In-1在4℃下进行免疫沉淀过夜。通过使用浓度渐增的所述不同构建体(0-10nM)进行直接结合饱和度测定，而对免疫复合物(蛋白L-微珠/ln-1/CD74)结合FITC标记的pDR2RTL构建体的能力进行分析。在1％CHAPS(在TEN缓冲液中)的存在下在4℃下温和振荡结合4小时。然后，用1％CHAPS/TEN彻底洗涤，并仅用TEN缓冲液洗涤一次以去除过量的去污剂。在90℃下在2％SDS电泳样品缓冲液中洗脱结合的蛋白6-8分钟，并沉淀微珠。收集上清液并使用10-20％SDS-PAGE分离蛋白后，扫描凝胶的FITC生色团并通过光密度法进行定量。相对于条带的荧光强度来标绘配体浓度，并且使用GraphPad软件使产生的曲线拟合1个或2个结合位点。同样地，使用所述CD74-耗尽的裂解物用与蛋白L微珠缀合的L243单克隆抗体来纯化来自DR*1501-Tg小鼠的MHC II类。在这些条件下，分离来自DR*1501-Tg小鼠的MHC II类的均一制剂。如上所述进行与饱和浓度的所述pDR2构建体的直接结合，并进行分析。

电泳、蛋白质印迹法和LC-MS/MS：从免疫沉淀物中洗脱后，蛋白用10-20％SDS-PAGE进行分离并通过考马斯亮蓝染色使其可见，或者将它们印迹到PVDF上并用链亲和素缀合的PE检测。将通过PE染色检测的相关蛋白定位于用考马斯亮蓝染色的复制凝胶中，然后将凝胶条带切下，用胰蛋白酶消化并通过LC-MS/MS表征。

表面等离子体共振：通过常规的胺偶联，在pH6.0的10mM NaOAc中将组蛋白复合物(Sigma)偶联至CM5生物传感芯片，所得的最终共振为6597个共振单元(RU)。将乙醇胺在单独的流动池中偶联作为阴性对照。在Biacore3000上在HBS-EP缓冲液中(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20)以20μl/min的流速进行动力学测量，没有任何证据表明传质效应的存在。注射一系列浓度的pDR2/hMOG-35-55，并且在每次注射前用50mM NaOH再生所述表面。使用Biaevaluation3.0软件(GE Healthcare,Piscataway,NJ)进行动力学数据与具有基线漂移的1:1结合模式的拟合。

RTL342M(pDR2/mMOG-35-55)抑制MIF-增强的ICAM-1表达：将脾细胞从DR*1501-Tg小鼠中分离，并将其在含有2％热灭活的FCS的完全RPMI培养基1640(存在或不存在10μg/ml RTL342M的情况下)中5％CO₂中37℃下培养1小时。收集之前将细胞使用10ng/ml LPS(大肠杆菌(E.coli)血清型055:B5，Sigma-Aldrich)和100ng/ml重组MIF(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)激活1小时。依照制造商的说明书使用培养细胞试剂盒从脾细胞中分离总RNA，所述方法包括DNA酶(DNase)步骤(Qiagen，Valencia，CA，USA)。对于ICAM-1(测定ID：Mm00516023_m1)使用ABI7000序列检测系统用所需基因测定产物(Applied Biosystems)进行实时定量PCR。扩增GADPH持家基因作为内源性对照。依照制造商的说明书使用引物。

实施例2

使用pMHC构建体在DR2-Tg小鼠中进行EAE的治疗

该实施例描述了在DR2转基因小鼠中pMHC构建体和肽对EAE的效应。

在两种不同品系的DR2-Tg小鼠中评估EAE的pDR2治疗的特异性，所述小鼠包括DR*1501-Tg小鼠(只有在注射小鼠(m)MOG-35-55肽之后患上EAE的DRA:DRβ1*1501品系(Link et al.,Clin.Immunol.123:95-104,2007))和DR*1502-Tg小鼠(在注射人(h)MOG-35-55肽之后患上EAE的I-E^b：DRβ1*1502品系(Chou et al.,J.Neurosci.Res.77:670-680,200))。在疾病发病之后使用拴系到(tether to)pDR2上的同源mMOG-35-55多肽(SEQ ID NO:50)能够有效地治疗DR*1501-Tg小鼠(图1A，表4)。使用拴系到相同pDR2平台上的同源hMOG-35-55多肽(SEQ ID NO:51)能够有效地治疗DR*1502-Tg小鼠(图1B，表5)，但使用含有非同源的致脑炎肽(与用于疾病诱导的肽不同)的pDR2/MBP-85-99(SEQ ID NO:56)或不带有拴系的肽的pDR2(pDR2/无肽，图1A和1B；表4和5)则不能有效治疗DR*1502-Tg小鼠。

表4.在使用所示构建体进行治疗的DR*1501-Tg小鼠中EAE进展的总结

组	发病率	发作	峰	死亡率	CDI
						载体	14/14	11.6±1.0	3.5±0.5	0	47.0±7.9
RTL342M	14/14	11.3±0.6	2.2±0.3	0	17.1±9.6*
						RTL302-5D	9/9	11.7±1.1	3.3±0.9	0	42.9±10.7
RTL340	14/14	11.0±0.0	3.9±0.5	0	51.2±6.2

相对于载体、RTL340和RTL302-5D，*p＜0.03

表5.在使用所示构建体进行治疗的DR*1502-Tg小鼠中EAE进展的总结

相对于载体、RTL340和RTL302-5D，*p＜0.0023

实施例3

pDR2结合位点

该实施例描述了PBMC上pDR2结合位点的鉴定。

用拴系到RTL342M-FITC或RTL1000-FITC上的pDR2静脉注射首次用于实验的DR*1501-Tg小鼠。使用流式细胞术在单核细胞设门中对有活力的PBMC亚型的pMHC结合进行评估。使用前向散射和侧向散射鉴定单核细胞群，并使用前向散射和碘化丙啶染色的组合来鉴定活的单核细胞(图2A)。

体外检测的主要的RTL-结合细胞群是CD11b⁺单核细胞(图2B，首行；注意右上象限中PE和FITC染色均为阳性的细胞的累积)，而与CD19+B细胞、CD3+T细胞和CD11c+DC的结合不太多。对mMOG和hMOG肽的结合基本上类似(图2C)。在淋巴细胞设门中仅检测到最低限度地这些PBMC亚群分别与RTL的结合(图3A-C)。

将RTL342M和RTL1000与来自DR*1501-Tg小鼠的PBMC孵育1小时后，对所述RTL342M和RTL1000的这种细胞结合的方式进行体外验证。与图2B中所示的结果类似，体外与所述pMHC复合物结合最多的群为CD11b+单核细胞，而极少量与CD19+B细胞、CD3+T细胞和CD11c+DC结合(图2C)。通过色彩增强的荧光显微术使标记的RTL342M与GFP^-标记的CD11b⁺单核细胞的直接结合可视化(图2D)并显示出了细胞表面的以及内化的RTL复合物。

所述1B11抗体的Fab片段与所述两个结构域的pMHC分子结合。在所述EAE模型中，测试了Fab1B11抑制细胞结合和中和RTL治疗效果的能力。还使用结合pDR/GAD555-567(Dahan et al.,Eur.J.Immunol.41:1465-1479,2011)的来自D2抗体的对照Fab片段。在Fab1B11的存在下pDR2/mMOG-35-55与CD11b⁺单核细胞的结合被抑制了约60％(p<0.0001)(图4A)。在FabD2的存在下pDR2/mMOG-35-55与CD11b+单核细胞的结合被增加了约20％，但是该结果统计学上不显著。类似地，在将pDR2/mMOG-35-55注射到患有EAE的DR*1501-Tg小鼠中之前将pDR2/mMOG-35-55与Fab1B11(而不是FabD2)进行孵育，这导致pDR2/mMOG-35-55的保护性活性被中和了约60％(p<0.0001，图4B)。

还测试了所述Fab1B11抗体对RTL诱导的CD74下调的阻断能力。将RTL342M与Fab1B11(而不是FabD2)以1:1或1:2的摩尔比孵育2小时，这导致CD11b+单核细胞上RTL342M诱导的CD74表达下调在体外被阻断了60％(p<0.01)(图4C)。

在相关研究中，与RTL342M相比，每天以与RTL342M等摩尔的浓度(游离mMOG-35-55肽和RTL342M分别为10μg和100μg)注射游离mMOG-35-55肽(持续5天)未产生对EAE的显著抑制(图4D和表6)，因此证实了所述抑制活性不是由MOG肽介导的，以及Fab1B11的中和效应针对DR2-β1α1部分而非mMOG-35-55。Fab1B11相对于FabD2的这些组合的选择性效应证明了RTL和DRα1的结合以及CD74的下调是其治疗活性所必需的。

表6.使用游离mMOG-35-55肽(无RTL)的EAE的治疗

使用2百万个脾细胞建立饱和结合曲线，将所述脾细胞与浓度渐增的Alexa-488-标记的RTL1000在冰上孵育1小时，接着进行彻底洗涤。对带有捕获的RTL1000的细胞进行离心，将所述细胞片状沉淀物溶于6M尿素中，通过SDS-PAGE分离蛋白质组分，并在凝胶电泳后对提取的Alexa-488-标记的RTL1000的荧光强度进行定量。如图5A所示，饱和数据最拟合双曲线的两个位点结合曲线(R²＝0.998)，一个对RTL1000的结合位点表现出高亲和力的结合和快速饱和(K_D为2.65nM)，另一个结合位点对RTL1000表现出较低亲和力的结合(K_D为131nM)。

然后进行竞争实验，在所述实验中将Alexa488-标记的RTL1000和浓度渐增的未标记的RTL1000组合的混合物与固定数量的脾细胞进行孵育。这些竞争实验还证明了pDR2/hMOG35-55与DR*1501-Tg脾细胞的两个位点的结合方式(图5B)。低亲和力的位点的EC₅₀为11nM，表明替换标记的RTL1000需要相对低浓度的未标记的RTL1000。相反，高亲和力的位点的EC₅₀为4,000nM，表明替换标记的RTL1000需要>350倍浓度的未标记的RTL1000。

使用与浓度渐增的其他pDR2构建体混合的A488标记的RTL1000进行另外的竞争研究，以评估pDR2/肽的所述MHC II类β1α1以及肽部分的结合情况。虽然RTL1000、RTL342M和RTL340(pDR2/MBP-85-99)全部都能够竞争所述低亲和力的结合位点和高亲和力的结合位点(图5B和表7)，但是“空的”pDR2/无肽只能与pDR2/hMOG-35-55竞争所述低亲和力的位点。这些数据清楚地表明，对RTL的低亲和力的结合位点与所述β1α1部分相互作用(甚至在不存在共价拴系的肽的情况下)，而所述高亲和力的结合位点更可能在当所述RTL包含抗原肽部分(所述抗原肽部分包括共价拴系的抗原肽部分)时与RTL结合。

表7.pDR2/肽与pDR2/hMOG-35-55竞争性结合DR*1501-Tg脾细胞的EC₅₀值

ND，未确定；NA，不可用(只检测低亲和力的结合位点)

还使用来自MHC II类缺陷的小鼠的脾细胞进行上文所述的竞争研究。如图5C和表7所示，只有低亲和力的结合位点存在于MHC II类-KO脾细胞上。这些结果暗示了细胞表面表达的MHC II类自身作为RTL的高亲和力的结合位点。

将单独的TU39单克隆抗体或缀合至蛋白A的结合TU39的RTL1000与生物素化的全脾细胞在1％CHAPS缓冲液中孵育过夜。将结合的膜蛋白洗脱下来，通过电泳和蛋白质印迹法进行分析。使用链亲和素-PE使生物素化的蛋白可见。使用抗-DR的mAb HK14使RTL1000可见。该分析揭示出，与不含RTL1000的情况下进行孵育的样品相比，除了RTL1000之外，还有至少4条不同的条带，这些条带在不含RTL1000的情况下是不存在的(31kD和72kD)或比其更加富集(15kD和18kD)条带(图6)。将平行条带从未染色的样品中洗脱出来，并通过LC-MS/MS对其进行测序(表8)。

表8.从DR*1501-Tg小鼠脾细胞中免疫纯化出的结合pDR2/hMOG35-55的蛋白的肽序列

主要的pDR2结合蛋白被鉴定为是H4组蛋白(14kD)、H2A、H2B和H3组蛋白(18kD)、CD74(31kD)和MHC II类(72kD)。p72kDII类序列被鉴定为是H-2Eα2结构域，其来自表达的DR2-转基因(Madsen et al.,Nature Genetics23:343-347,1999)，而不是来自pDR2构建体。使用表面等离子体共振测量结果进行的进一步评估证实RTL1000与所述组蛋白复合物之间的低亲和力的结合相互作用(图7)。

为了证实CD74参与作为所述pMHC受体的主要组分，使用缀合有蛋白-L的CD74单克隆抗体(In-1)从生物素化的DR*1501-Tg脾细胞膜制备物中免疫沉淀出CD74，并使用链亲和素-PE将所述CD74可视化(图8A)。免疫沉淀的CD74以与p72和p130蛋白形成复合物的形式存在。未鉴定出全长MHC II类分子。然而，将FITC标记的RTL与微珠-免疫纯化的CD74进行孵育之后，RTL1000和RTL342都容易地与CD74形成免疫共沉淀。RTL340和RTL302-5D“空的”pDR2也与CD74形成免疫共沉淀，但是水平低的多(图8B)。

包含单独的DR-α1结构域(不包含DR2-β1结构域或肽)的构建体与CD74形成免疫共沉淀(图8B)。该结果得到了竞争性结合实验的支持，该实验表明单独的DR-α1结构域与pDR2/hMOG-35-55竞争结合CD74(图9A)。DR2-β1结构域(不含有DR-α1结构域或肽)不与CD74形成免疫共沉淀，也不与pDR2/hMOG-35-55竞争结合CD74(图8B，图9A)。这些实验证实了CD74上具有对于DR-α1结构域(不含有DR2-β1结构域或肽)的单个结合位点(图9B)。

浓度渐增的FITC标记的RTL构建体与免疫纯化的CD74的直接结合(图10A)表明RTL1000、RTL-342M和DR-α1(但不是其他RTL构建体)与CD74的结合，并且所述结合是剂量依赖的、可饱和的，还涉及约2.9-4.5nM的单个结合位点(表9)。在相同的膜制备物中(耗尽CD74之后)FITC标记的pDR2构建体与四个结构域的MHC II类分子的结合证实了RTL1000和RTL342M的结合，而不是DR-α1或其他pDR2构建体(图10B)。所述检测到的结合是剂量依赖的、可饱和的，并且也涉及约1.1-2.0nM的单个结合位点(表9)。

表9.pMHC复合物与CD74和MIC II类的结合的解离常数

NB，未结合

对于与CD74和MHC II类结合的配体，R²为≥0.95。

这些数据表明，在CD74上存在针对所述pDR2分子的DR-α1部分中的决定簇的单个结合位点，和在4-结构域II类上存在单独的、稍微较高亲和力的结合位点，该结合位点在DR-α1结构域上不存在，所述DR-α1结构域自身可包含共价拴系的肽的或者替代地，在当存在抗原肽例如共价拴系的抗原肽时形成的pDR2上的结构敏感的结合位点。

这些数据进一步表明，分离并纯化的不含DR2-β1结构域或肽的DR-α1可与CD74结合。

实施例4

CD74表达水平

该实施例描述了pMHC结合对CD74表达的效应

活体外研究证明相对于未患EAE的对照，患有EAE的小鼠中CD11b⁺单核细胞上的CD74的表达有所增加(图11A)。在临床体征发作时使用RTL342M治疗EAE小鼠，在48小时内产生CD74表达的显著下调。这个结果在分离自血液、脾和脊髓的CD11b⁺细胞上被观察到(图11B和11C)。使用pDR2/mMOG-35-55的治疗未改变MHC II类的细胞表面表达情况。这与暗示在单核细胞表面上MHC II类通常与CD74不相关的文献(Roche et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8581-8595,1993；Eynon et al.,J.Biol.Chem.274:26266-26271,1999)相反。CD74表达的下调不能归因于抗-CD74结合位点的封闭(该结合位点正被RTL封闭)，这是因为使用蛋白L缀合的抗-CD74的In-1mAb可以从与RTL342M或DR-α1预孵育过的生物素化的DR*1501-Tg脾细胞膜制备物中免疫沉淀出CD74(图20)。

将首次用于实验的CD11b⁺单核细胞与浓度渐增的RTL构建体在37℃下孵育1小时，然后通过FACS评估RTL结合和CD74的细胞表面表达，如RTL1000所示(图12A)。从五个不同构建体得到的结果(图12B)证实了降低的CD74表达作为增加的RTL结合的函数。当结合所有构建体的数据点时，这种关系是统计学上显著的(p<0.001，图12B右下图)。注意对于单独的DR-α1，pMHC浓度和CD74表达之间呈逆相关。

还评估了RTL1000与人单核细胞的结合。从DR2⁺人捐赠者中分离人CD11b⁺单核细胞，并将其用1μg RTL342M、1μg RTL1000、5μgRTL1000、5μg RTL340和单独的载体进行处理(图13A-E)。图13F中示出了来自全部处理条件的关于处理后表达CD74的细胞的百分数和结合FITC-RTL1000的细胞的百分数的结果的回归分析。表达CD74的细胞的百分数和与结合标记的RTL1000的细胞的百分数呈逆相关。

实施例5

RTL构建体对EAE的效应

该实施例描述了pMHC构建体对EAE的效应，包括单独的DR-α1的效应。

将RTL1000或RTL342M与RTL340、pDR2/无肽或载体的治疗由非同源肽诱导的EAE的能力进行比较。使用MBP-85-99肽/CFA/Ptx在MBP-TCR/DR2-Tg小鼠中诱导EAE。如图14A和表10所示，RTL1000和RTL342M均表现出对EAE的效应，所述效应比得上pDR2/MBP-85-99(含有所述同源肽但对CD74的调节能力没那么强)对EAE的效应。相反，“空的”pDR2/无肽在治疗EAE方面无效，并且对CD74表达具有微弱效应。

表10.pMHC构建体对由MBP-85-99诱导的EAE的效应

组	发病率	发作	峰	死亡率	CDI
						载体	16/16	14.8±4.6	3.7±0.7	0	46.9±7.5
RTL302-5D	6/6	17.5±5.0	3.7±0.8	0	43.3±12.0
						RTL340	17/17	14.3±3.8	2.3±0.5	0	17.0±9.0
RTL342M	9/9	16.3±2.0	2.5±1.0	0	22.6±15.6
						RTL1000	6/6	19.7±4.0	2.0±0.0	0	13.3±5.3

为了进一步探究pDR2构建体对EAE的可能的不依赖于肽的抑制效应，与pDR2/无肽、pDR2/mMOG-35-55和载体的标准剂量和治疗方案(100μg×5)相比，测试10倍剂量pDR/无肽(显示出显著的CD74结合和CD74的调节(1mg×2，持续5天)在患有mMOG-35-55诱导的EAE的DR2-Tg小鼠中的治疗活性。如图14B和表11所示，与使用载体的治疗相比，使用1mg剂量的pDR2/无肽的EAE治疗确实导致每日EAE得分和累积EAE得分的显著降低。每天使用标准剂量的RTL342M持续2天或5天的治疗导致甚至更有效的EAE抑制。

评估来自首次用于实验的DR2-Tg小鼠(CD74的本底水平，不患有临床EAE)和mMOG-35-55免疫并在诱导EAE后的15天使用RTL342M(100μg pMHC每天×2)、“空的”RTL302-5D(1mg×2)或载体(CD74的最大疾病诱导水平，无治疗效应)治疗的DR2-Tg小鼠(DR*1501Tg)的CNS-衍生的CD11b⁺细胞上的CD74水平。如图14C所示，不同组小鼠的CD11b+细胞上的CD74水平与平均CDI之间存在显著关联(p＝0.035)。

图11.pMHC构建体对由mMOG-35-55诱导的EAE的效应

通过使用mMOG-35-55进行免疫而在小鼠中诱导EAE。疾病发作时，用以下构建体之一对所述小鼠进行治疗：(i)具有共价结合的mMOG-35-55(100μg)的pDR2，(ii)不具有肽的pDR2(1000μg)，(iii)DR-α1(750μg)或(iv)单独的载体。连续2天皮下给予所述构建体。免疫后的第15天，处死小鼠并收集脊髓，合并每组的脊髓。对分离的细胞进行染色以观察CD74、CD11b、CD80、ICAM和HLA-DR表达，并通过FACS进行分析。使用不具有肽的pDR2和使用DR-α1治疗的小鼠的临床得分低于使用单独的载体治疗的小鼠的临床得分(图15)。在使用载体、RTL302-5D(具有5个氨基酸置换的pDR2，在溶液中具有降低的聚集作用)、RTL342M(具有mMOG35-55的RTL302-5D)或DR-α1治疗的小鼠中获得了类似结果(图16)。虽然所述结果并未上升到显著水平，但是这些结果暗示了可以使用更大的样本量或通过改变剂量和/或给药参数以获得使用pDR2(无肽)或DR-α1治疗EAE的最佳治疗方案，而获得统计学上显著的结果。

CD74表达在来自用pDR2/mMOG-35-55治疗的小鼠的脊髓的CD11b+单核细胞中有所降低(图17A)。CD80表达在用pDR2/无肽和pDR2/mMOG-35-55治疗的小鼠中有所降低(图17B)。与未治疗对照相比，ICAM表达在任何治疗组都没有显著的变化(图17C)。

为了证实pMHC结合是否直接抑制MIF诱导的信号传导，在用MIF和LPS刺激之前将首次用于实验的脾细胞与pDR2/mMOG-35-55孵育1小时，然后对ICAM-1的表达进行评估。如图18A所示，pDR2/mMOG-35-55显著地将MIF增强的ICAM-1信息的诱导降低至LPS本底水平，证实了完全抑制了所述MIF依赖性的效应，但是没有进一步的对LPS依赖性的激活的效应。

已知MIF与CD74的结合能够抑制巨噬细胞的随机迁移。为了确定由pDR2/mMOG-35-55结合所介导的CD74细胞表面表达降低是否能够改变单核细胞的迁移方式，在加入或不加入pDR2/mMOG-35-55的情况下，使用实时成像显微术体外追踪分离自首次用于实验的DR*1501/GFP-Tg小鼠的GFP⁺CD11b⁺细胞的移动，持续2个小时。如图18B-D所示，在存在pDR2/mMOG-35-55的情况下，在测量的速度(p<0.0005，图18B)、方均位移(p<0.0005，图18C)和随机迁移路径(图18D)方面观察到显著的增加。这些数据暗示了由pDR2/mMOG-35-55诱导CD74细胞表面表达的降低与ICAM-1的表达降低和CD11b+单核细胞的随机迁移的增加相关，这与MIF效应的阻断一致。

实施例7

EAE中DRα1的剂量反应

用mMOG-35-55免疫在小鼠中诱导EAE。疾病发作时，使用以下中的一种治疗所述小鼠：(i)单独的载体，(ii)500μg的DR2-β1，(iii)100μg的DR-α1，(iv)300μg的DR-α1(v)500μg的DR-α1，(vi)1000μg的DR-α1，和100μg的RTL342M(DR2/mMOG35-55)。所有剂量为每日2次。结果示于图23和表12中。

表12.不同剂量的DRα1构建体对EAE的效应

组	发病率	发作	峰	死亡率	CDI
						载体	22/22	10.9±2.3	3.5±0.6	0	45.3±6.2
DR2-β1 500μg	5/5	9.0±0.0	3.6±8.2	0	46.5±10.2
						DR-α1 100μg	4/4	10.0±1.2	2.6±0.5	0	32.9±7.8
DR-α1 300μg	11/11	9.5±0.8	2.3±0.6	0	24.1±10.3
						DR-α1 500μg	10/10	9.6±0.7	2.5±0.7	0	20.7±12.7
DR-α1 1000μg	6/6	10.7±1.0	2.3±0.4	0	21.1±9.9
						RTL342M100μg	18/18	10.4±1.7	2.1±0.2	0	14.2±8.4

此外，用单独的DR2-β1治疗的小鼠的既未下调CD74，也未治疗EAE。在临床体征发作时每天使用100μg RTL342M、500μg DR2-β1或载体治疗患有mMOG35-55/CFA/Ptx诱导的EAE的DR*1501-TG小鼠持续3天。数据总结于图21和图22和表13中。

表13.DR2-β1对由mMOG-35-55诱导的EAE的效应

组	发病率	发作	峰	死亡率	CDI
						载体	5/5	9.0±0.7	4.0±0.7	0	33.2±5.4
RTL342M100μg	5/5	9.2±0.4	2.1±0.2	0	12.0±5.1
						DR2-β1 500μg	5/5	9.0±0.0	3.4±0.8	0	30.1±7.0

实施例8

治疗或抑制受试者中的多发性硬化的方法

该实施例描述了用于治疗或抑制受试者中的多发性硬化的示例性方法。然而，本领域普通技术人员应理解，也可使用衍生自这些具体方法的方法也可用来治疗或抑制受试者中的多发性硬化。本领域普通技术人员还可修改这些方法以治疗患有不同疾病(例如不同的自身免疫性疾病)的受试者。

选择患有多发性硬化的受试者。每周以0.1mg/kg-50mg/kg的剂量使用MHC II类α1结构域多肽(或其一部分)或与髓磷脂抗原(例如MOG35-55、MBP85-99或PLP139-151)共价连接的MHC II类α1多肽(或其一部分)(例如通过皮下注射)治疗受试者。在治疗开始之前、治疗期间周期性地、和/或疗程结束时，评估受试者中多发性硬化的测量报告，所述多发性硬化的测量报告包括以下的一种或多种：MRI测量报告(例如T₂病变负载、T₁低信号(hypointensities)的体积、NAA水平和全脑萎缩)；临床测量报告(例如EDSS的改变、SRS的改变(Scripps神经评定量表)、复发率和9孔插棒测验(9-hole peg test)和免疫学的测量报告(例如Th1和Th2T细胞系的标记物、多种T细胞标记物的FACS分析、T细胞在体外产生的细胞因子和T细胞的增殖)。

可通过多发性硬化(或其他自身免疫性疾病)的一种或多种症状的改善或进展变慢(例如与对照相比)来证明使用MHC II类α1结构域多肽的疗法治疗或抑制受试者中的所述疾病的功效，所述对照例如未治疗的受试者、治疗之前的患有所述疾病的受试者(例如，治疗之前的同一受试者)或用安慰剂(例如，仅载体)治疗的患有所述疾病的受试者。

实施例9

确定治疗在受试者中的功效的方法

该实施例描述了用于确定使用MHC II类多肽的治疗在受试者中的功效的示例性方法。然而本领域普通技术人员应理解，也可使用衍生自这些具体方法的方法也可用来确定受试者中的治疗功效。

选择已经使用至少一个剂量的MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1结构域多肽(或其一部分)治疗的受试者。从所述受试者获得样品(例如血液样品)。在一些实例中，在所述样品中确定CD74的表达，例如通过从所述样品中提取核酸并通过RT-PCR测量CD74表达，或通过通过ELISA或流式细胞术来确定CD74蛋白表达。在其他实例中，确定了CD74活性，例如通过将所述样品与MIF接触并测量ERK1/2活性、NF-κB激活、Bcl-2表达、IL-8分泌、细胞增殖或细胞凋亡中的一种或多种。将CD74表达和/或活性的水平与对照(例如参考值或在使用所述MHC II类多肽治疗之前在来自所述受试者的样品中确定的CD74表达水平或活性水平)进行比较。

如果所述CD74表达和/或活性水平比所述对照低或与所述对照相等，那么就将所述治疗确定为有效。如果所述CD74表达和/或活性水平比所述对照高，那么就将所述治疗确定为有效性欠佳。如果将所述治疗确定为有效，那么就可以保持(或减少)所述MHC II类多肽的剂量。如果将所述治疗确定为有效性欠佳，那么就可以增加所述MHC II类多肽的剂量。本领域普通技术人员可以基于CD74表达水平或活性水平、正在治疗的疾病、所述受试者的状况或其他因素来选择适当的剂量(例如递增性地增加或减少剂量)。

实施例10

优化治疗在受试者中的功效的方法

该实施例描述了用于优化使用MHC II类多肽的治疗在受试者中的的功效的示例性方法。然而，本领域普通技术人员应理解，可以使用衍生自这些具体方法的方法来优化治疗在受试者中的功效。

选择患有自身免疫性或炎性疾病(例如多发性硬化)的受试者。给予所述受试者一定剂量的MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1结构域多肽(或其一部分)。从所述受试者获得样品(例如血液样品)。在一些实例中，在所述样品中确定CD74的表达，例如通过从所述样品中提取核酸并通过RT-PCR测量CD74表达，或通过ELISA或流式细胞术来确定CD74蛋白表达。在其他实例中，确定了CD74活性，例如通过将所述样品与MIF接触并测量ERK1/2活性、NF-κB激活、Bcl-2表达、IL-8分泌、细胞增殖或细胞凋亡中的一种或多种。将CD74表达和/或活性的水平与对照(例如参考值或在使用所述MHC II类多肽治疗之前在来自所述受试者的样品中确定的CD74表达水平或活性水平)进行比较。然后确定待随后给予所述受试者的所述多肽的剂量。如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照高，那么可以增加所述MHC II类多肽的剂量以改善治疗功效。

如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照低或与所述对照相等，那么可以保持或减少所述MHC II类多肽的剂量。本领域普通技术人员可以基于CD74表达水平或活性水平、正在治疗的疾病、所述受试者的状况或其他因素来选择适当的剂量(例如递增性地增加或减少剂量)。

考虑到本公开的原理可以应用于许多可能的实施方案，应当理解举例的实施方案仅是实施例，不应该被认为是对本发明范围的限制。更确切地说，本发明的范围由以下权利要求界定。所以发明人要求其发明处于这些权利要求书所限定的范围和精神内。

Claims

1.一种分离的多肽，包含：

主要组织相容性复合物(MHC)II类α1结构域，其中所述多肽不包含MHC II类α2、β1或β2结构域；或

MHC II类α1结构域的一部分，其中所述MHC II类α1结构域的一部分能够与CD74结合或降低CD74的表达或活性。

2.权利要求1的分离的多肽，其中所述α1结构域包括人MHC II类α1结构域。

3.权利要求2的分离的多肽，其中所述α1结构域包括DR-α1、DQ-α1、DP-α1、DM-α1或DO-α1结构域。

4.权利要求1-3任一项的分离的多肽，其中所述MHC II类α1结构域包含成熟MHC II类α链的第1-75位氨基酸残基，或其至少5个连续的氨基酸。

5.权利要求1-5任一项的分离的多肽，其中所述α1结构域包含来自α链的α1结构域，所述α链包含SEQ ID NO:1-49的任一条序列所示的氨基酸序列。

6.权利要求1的分离的多肽，其中所述MHC II类α1结构域的一部分包含成熟DR-α链的第38-58位氨基酸残基或其一部分，或者DPα或DQα的同源区。

7.权利要求1-6任一项的分离的多肽，还包含抗原决定簇。

8.权利要求7的分离的多肽，其中所述抗原决定簇与所述α1结构域共价连接。

9.权利要求6的分离的多肽，其中所述共价连接包括肽接头或化学交联剂。

10.权利要求7-9任一项的分离的多肽，其中所述抗原决定簇包括髓磷脂蛋白肽抗原、乳糜泻病相关的肽抗原、风湿性关节炎相关的肽抗原、葡萄膜炎相关的肽抗原或I型糖尿病相关的肽抗原。

11.权利要求10的分离的多肽，其中所述抗原决定簇为包括髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽或蛋白脂质蛋白(PLP)肽的髓磷脂蛋白肽抗原。

12.权利要求11的分离的多肽，其中所述髓磷脂蛋白肽抗原包括MOG35-55、MBP85-99、MBP149-171或PLP139-151。

13.权利要求10的分离的多肽，其中所述抗原决定簇为包含胰岛素B:16-23的I型糖尿病相关的肽抗原。

14.编码权利要求1-13任一项的多肽的分离的核酸分子。

15.一种载体，包含可操作地与启动子连接的权利要求14的分离的核酸分子。

16.一种药物组合物，包含权利要求1-13任一项的分离的多肽或权利要求14或权利要求15的分离的核酸分子和可药用载体。

17.治疗或抑制受试者中的疾病的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-13任一项的分离的多肽、权利要求14或权利要求15的分离的核酸分子、或权利要求16的药物组合物给予所述受试者，从而治疗或抑制所述疾病。

18.权利要求17的方法，其中所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病。

19.权利要求18的方法，其中所述炎性和/或自身免疫性疾病包括多发性硬化、乳糜泻病、风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病、强直性脊柱炎、肺出血性肾炎综合征、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、银屑病、葡萄膜炎、视神经炎。

20.权利要求17的方法，其中所述疾病包括视网膜疾病、中风或物质成瘾。

21.权利要求20的方法，其中所述物质成瘾包括安非他明滥用。

22.权利要求17-21任一项的方法，其中所述多肽、核酸或药物组合物是经胃肠外给予或口服给予的。

23.权利要求17-22任一项的方法，其中所述受试者被给予约10μg-约1g的所述多肽、核酸或药物组合物。

24.权利要求17-22任一项的方法，其中所述治疗或抑制所述疾病包括与对照相比时降低CD74的表达或活性。

25.权利要求17-24任一项的方法，还包括确定来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平。

26.权利要求24或25的方法，其中所述CD74表达水平包括CD74RNA和/或蛋白表达水平。

27.权利要求24或权利要求25的方法，其中所述CD74活性水平包括NFκB活性、细胞增殖、细胞凋亡、或其中两种或多种的组合。

28.权利要求25-27任一项的方法，其中来自所述受试者的样品包括单核细胞、B细胞、CD11b⁺细胞、CD34⁺细胞、CD4⁺细胞、CD19⁺细胞、CD74⁺细胞、或其中两种或多种的组合。

29.权利要求25-28任一项的方法，还包括将所述CD74表达水平或活性水平与对照进行比较，并且如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照高，那么就增加所述分离的多肽、所述分离的核酸或所述药物组合物的剂量或频率。

30.确定使用多肽治疗受试者中的疾病的功效的方法，所述多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类β1结构域、或它们的组合，其中所述多肽不包含α2结构域或β2结构域，所述方法包括：

确定来自所述受试者的样品中的CD74表达或活性；

将所述CD74表达水平或活性水平与对照进行比较；和

确定治疗的功效，其中如果所述CD74表达水平或活性水平比所述对照低或与所述对照相等，那么就认为所述治疗是有效的。

31.优化治疗受试者中的疾病的功效的方法，所述方法包括：

给予患有所述疾病的受试者多肽，所述多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类β1结构域、或它们的组合，其中所述多肽不包含α2结构域和β2结构域；

确定来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平；

将所述CD74表达水平或活性水平与对照进行比较；和

确定随后给予所述受试者的多肽的剂量，其中比所述对照高的CD74表达水平或活性水平表明应该增加所述多肽的剂量，其中比所述对照低或与所述对照相等的CD74表达水平或活性水平表明应该减少所述多肽的剂量，从而优化治疗所述受试者中的所述疾病的功效。

32.治疗或抑制受试者中的疾病的方法，所述方法包括：

给予患有所述疾病的受试者一定剂量的多肽，所述多肽包含MHCII类α1结构域、MHC II类β1结构域、或它们的组合，其中所述多肽不包含α2结构域和β2结构域，其中如果来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平比对照高，那么就增加所述多肽的剂量，或者，如果来自所述受试者的样品中的CD74表达水平或活性水平比对照低或与对照相等，那么就减少所述多肽的剂量。

33.权利要求30-32任一项的方法，其中所述CD74表达水平包括CD74RNA和/或蛋白表达水平。

34.权利要求30-32任一项的方法，其中所述CD74活性水平包括NFκB活性、细胞增殖、细胞凋亡、或它们的组合。

35.权利要求30-34任一项的方法，其中所述多肽包含：

主要组织相容性复合物(MHC)II类α1结构域，其中所述多肽不包含MHC II类α2、β1和β2结构域；或

36.权利要求30-34的方法，其中所述多肽包含MHC II类β1和MHC II类α1结构域，其中所述α1结构域的氨基末端与所述β1结构域的羧基末端共价连接，并且其中所述多肽不包含α2和β2结构域。

37.权利要求35或权利要求36的方法，其中所述α1结构域包括人MHC II类α1结构域。

38.权利要求37的方法，其中所述α1结构域包括DR-α、DQ-α1、DP-α1、DM-α1、或DO-α1结构域。

39.权利要求35-38任一项的方法，其中所述MHC II类α1结构域包含所述MHC II类α链的第1-75位氨基酸残基，或其至少5个连续的氨基酸。

40.权利要求37-39任一项的方法，其中所述α1结构域包含来自α链的α1结构域，所述α链包含SEQ ID NO:1-49的任一条序列所示的氨基酸序列。

41.权利要求37的方法，其中所述MHC II类α1结构域的一部分包含所述DR-α链的第38-58位氨基酸残基，或者DP-α或DQα的同源区。

42.权利要求41的方法，其中所述β1结构域包括DR、DQ或DPβ1结构域。

43.权利要求30-42任一项的方法，其中所述多肽还包含抗原决定簇。

44.权利要求43的方法，其中所述抗原决定簇是与所述α1结构域共价连接的。

45.权利要求44的方法，其中所述共价连接包括肽接头或化学交联剂。

46.权利要求43-45任一项的方法，其中所述抗原决定簇包括髓磷脂蛋白肽抗原、乳糜泻病相关的肽抗原、风湿性关节炎相关的肽抗原、葡萄膜炎相关的肽抗原或I型糖尿病相关的肽抗原。

47.权利要求46的方法，其中所述抗原决定簇为包括髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽、或蛋白脂质蛋白(PLP)肽的髓磷脂蛋白肽抗原。

48.权利要求47的方法，其中所述髓磷脂蛋白肽抗原包括MOG35-55、MBP85-99、MBP149-171、或PLP139-151。

49.权利要求47的方法，其中所述抗原决定簇是包括胰岛素B:16-23的I型糖尿病相关的肽抗原。

50.权利要求30-49任一项的方法，其中来自所述受试者的样品包括单核细胞、B细胞、CD11B+细胞、CD34+细胞、CD4+细胞、CD19+细胞、CD74+细胞、或它们的组合。

51.权利要求30-50任一项的方法，其中所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病。

52.权利要求51的方法，其中所述炎性和/或自身免疫性疾病包括多发性硬化、乳糜泻病、风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病、强直性脊柱炎、肺出血性肾炎综合征、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、银屑病、葡萄膜炎、视神经炎。

53.权利要求30-50任一项的方法，其中所述疾病包括视网膜疾病、中风或物质成瘾。

54.权利要求30-53任一项的方法，还包括将后续剂量的所述多肽给予所述受试者，其中所述剂量基于所述CD74表达水平或活性水平进行调整。

55.降低细胞中的CD74表达水平或活性水平的方法，所述方法包括将所述细胞与多肽接触，所述多肽包含：

56.权利要求1-13任一项的分离的多肽、权利要求14或权利要求15的分离的核酸分子、或所述药物组合物在治疗或抑制受试者中的疾病中的用途。

57.权利要求56的用途，其中所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病、视网膜疾病、中风或物质成瘾。