BRPI0111191B1 - moléculas mutantes de ctla4 solúveis, método para sua produção e seus usos - Google Patents

Abstract

"moléculas mutantes de ctla4 solúveis e seus usos". a presente invenção fornece moléculas mutantes de ctla4 solúveis que ligam com maior afinidade ao antígeno cd80 e/ou cd86 do que ctla4 tipo selvagem ou ctla4ig não-mutada. as moléculas de ctla4 solúveis têm uma primeira seqüência de aminoácidos que compreende o domínio extracelular de ctla4, onde certos resíduos de aminoácido dentro da região s25r33 e da região m97-g1o7 são mutados. as moléculas mutantes da invenção podem também incluir segunda seqüência de aminoácidos que aumenta a solubilidade da molécula mutante.

Description

"MOLÉCULAS MUTANTES DE CTLA4 SOLÚVEIS, MÉTODO PARA SUA PRODUÇÃO E SEUS USOS" Neste pedido de patente são referenciadas várias publicações. As descrições dessas publicações estão aqui incorporadas na sua íntegra como referência neste pedido de patente a fim de descrever de forma mais abrangente a tecnologia atual a qual esta invenção diz respeito.

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito ao campo de moléculas de CTLA4 solúveis que são mutadas a partir de CTLA4 tipo selvagem para reter a capacidade de ligar CD80 e\ou CD86.

Antecedentes da Invenção As interações intercelulares antígeno não-específicas entre linfócitos-T e células apresentadoras de antígenos (APC) geram sinais coestimulatórios de células T que geram respostas de célula T ao antígeno (Jenkins e Johnson (1993) Curr. Qpin. Imunol. 5:361-367). Sinais coestimulatórios determinam a magnitude de uma resposta de célula T ao antígeno e se esta resposta ativa ou inativa respostas subsequentes ao antígeno (Mueller et. al, (1989) Annu. Rev. Imunol. 7:445-480). A ativação da célula T na ausência de coestímulo resulta em uma resposta da célula T abortada ou anérgica (Schwartz, R.H. (1992) Cell 71:1065-1068). Um sinal coesti-mulatório chave é fornecido pela interação do receptor de superfície de célula T CD28 com moléculas relacionadas B7 nas células apresentadoras do antígeno (por exemplo, também conhecidas como B7-1 e B7-2, ou CD80 e CD86, respectivamente) (P. Linsley e J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Imunol. 11:191-212). A molécula conhecida como CD80 (B7-1) foi originalmente descrita como um antígeno de ativação associado à célula B humana (Yokochi, T. et. al. (1981) J. Imunol. 128:823-827; Freeman, G.J. et. al. (1989) J. Imunol. 143:2714-2722), e subsequentemente identificada como um con-tra-receptor para as moléculas de células T CD28 e CTLA4 relacionadas (Linsley, P., et. al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5031-5035; Linsley, P.S. et. al. (1991a) J. Exp. Med. 173:721-730; Linsley, P.S. et. al. (1991b) J. Exp. Med. 174:561-570) .

Mais recentemente, um outro contra-receptor para CTLA4 foi identificado nas células apresentadoras de antígeno (Azuma, N. et. al. (1993) Nature 366:76-79; Freeman (1993a) Science 262:909-911; Freeman, G.J. et. al. (1993b) J. Exp. Med. 178:2185-2192; Hathcock, K.L.S., et. al. (1994) J. Exp. Med. 180:631-640; Lenschow, D. J. et. al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11054-11058; Ravi-Wolf, Z. , et. al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1118211186; Wu, Y. et. al. (1993) J. Exp. Med. 178:1789-1793). Esta molécula, agora conhecida como CD86 (Caux, C., et. al. (1994) J. Exp. Med. 180:1841-1848), mas também chamada B7-0 (Azuma et. al.f (1993), supra) ou B7-2 (Freeman et. al. , (1993a), supra) , compartilha cerca de 25% de identidade da sequência com CD80 na sua região extracelular (Azuma et. al., (1993), supra; Freeman et. al., (1993a), supra, (1993b), supra). Cé- lulas transfectadas com CD86 disparam respostas de célula T mediada por CD28 (Azuma et. al., (1993), supra; Freeman et. al., (1993a), (1993b), supra).

Comparações das expressões de CD80 e CD86 foram objeto de diversos estudos (Azuma et. al. (1993), supra; Hathcock et. al., (i.994) supra; Larsen, C.P., et. al. (1994) J. Imunol. 152:5208-5219; Stack, R.M., et. al., (1994) J. Imunol. 152:5723-5733). Dados atuais indicam que a expressão de CD80 e CD86 são reguladas diferentemente, e sugerem que a expressão de CD86 tenta preceder a expressão de CD80 durante uma resposta imune.

Formas solúveis de CD28 e CTLA4 foram construídas fundindo domínios extracelulares tipo-v variáveis de CD28 e CTLA4 em domínios constantes de imunoglobulina (Zg), resultando em CD28Ig e CTLA4Ig. CTLA4Ig liga tanto células CD80 como CD86 positivas mais fortemente do que CD28Ig (Linsley, P. et. al. (1994) Immuni 1:793-80). Diversas respostas imune de célula T dependente são bloqueadas por CTLA4Ig tanto in vitro como in vivo (Linsley, et. al. , (1991b), supra; Lms-ley, P.S. et. al., (1992a) Science 257:792-795; Linsley, P. S. et. al. , (1992b) J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, D.J. et. al. (1992), Science X57:789-792; Tan, P. et. al., (1992) J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L.A., (1992) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105) .

Peach et. al., (J. Exp. Med. (1994) 180:2049-2058) identificaram regiões no domínio extracelular CTLA4 que são importantes para ligação forte a CD80. Especificamente, um motivo hexapeptídeo (MYPPPY (SEQ ID NO:9)) na região 3 se- melhante a(CDR3) da região que determina complementariedade foi identificada como completamente conservada em todos os membros da família CD28 e CTLA4. Mutagênese de varredura de alanina através do motivo MYPPPY (SEQ ID NO:9) em CTLA4 e em resíduos selecionados em CD28Ig reduziu ou aboliu a ligação a CD80.

Moléculas quiméricas que intercambiam regiões homólogas de CTLA4 e CD28 foram também construídas. As moléculas HS4, HS4-A e HS4-B foram construídas enxertando-se regiões semelhantes a CDR-3 de CTLA4, que também incluíram uma parte carbóxi- terminal estendida para incluir certos resíduos de aminoácidos não-conservados em CD28Ig. Esses mutan-tes homólogos apresentaram maior afinidade de ligação ao CD80 do que ao CD28Ig.

Em um outro grupo de mutantes homólogos quiméri-cos, a região tipo CDR1 de CTLA4, que não é conservada em CD28 e que se prevê que seja espacialmente adjacente à região semelhante a CDR3, foi enxertada em HS4 e HS4-A. Essas moléculas mutantes homólogas quiméricas (designadas como HS7 e HS8) demonstraram afinidade de ligação ainda maior pelo CD80 do que pelo CD28Ig.

Moléculas mutantes homólogas quiméricas foram também feitas pelo enxerto em HS7 e HS8 da região semelhante a CDR2 de CTLA4, mas esta combinação não melhorou ainda mais a afinidade de ligação por CD80. Assim, o motivo MYPPPY de CTLA4 e CD28 foi determinado como sendo crítico para ligação ao CD80, porém certos resíduos de aminoácidos não-conservados nas regiões semelhante a CDR3 de CTLA4 foram também responsáveis pela maior afinidade da xigação de CbLAl com CCD80. O CTLA41g demonstrou bloquear efetivamente o coes-tímulô de células T associadas a CD80, porém nao for efetivo no bloqueio de respostas associadas a CD86 , Moléculas mutantes de GTLA4 solúveis, especialmente as com uma maior afinidade pelo CDS6 do que CTLA4 tipo selvagem, foram construídas possivelmente mais capazes de bloquear a sensibilização {wprímingff) de células ativadas por antígenos específicos do que CTX4A4lg.

Existe ainda uma necessidade de moléculas de CTLA4 melhoradas para fornecer melhores composições farmacêuticas para supressão imune e tratamento de câncer do que as formas solúveis previamente conhecidas de CTUA4 .

Sumário da Invenção Dessa forma, a invenção fornece moléculas mutantes de CTLA4 solúveis que ligam CD80 e/ou CDS6. Moléculas mutantes da invenção incluem as que podem reconhecer e ligar tanto CD8Q como CDS6, como ambos. Em algumas modalidades, moléculas mutantes ligam CD80 e/ou CD36 com maior afinidade do que CTIA4.

Um exemplo de molécula mutante de CTLA4 é LlG4EA29YIg (Figura 7), conforme aqui descrito, Um outro exemplo de molécula mutante de CTLÃ4 é L104EIg (Figura 8), conforme aqui descrito. blO4SA29Ylg e L104EXg ligam CD80 e CD8Ê mais avidamente do que CTLA41g.

Descrição Resumida das Figuras A figura 1 mostra a análise de ligação de equilíbrio de L104EA29YIg, L104EIg e CTLA4Ig do tipo selvagem a CD86Ig.

As figuras 2A e 2B ilustram dados de ensaios que mostram a ligação de L104EA29YIg, L104Eig e CTLA4Ig a células CHO transfectadas com CD80 ou CD86 humanas, conforme descrito no exemplo 2, infra.

As figuras 3A e 3B representam a inibição de proliferação de células CHO CD80-positiva e CD86-positiva, conforme descrito no Exemplo 2, infra.

As figuras 4A e 4B mostram que L104EA29YIg é mais efetivo do que CTLA4Ig na inibição da proliferação de células T aloestimuladas primárias e secundárias, conforme descrito no Exemplo 2, infra.

As figuras 5A-C ilustram que L104EA29YIg é mais efetivo do que CTLA4Ig na inibição de produção das citocinas IL-2 (FIG. 5A) , IL-4 (FIG. 5B) e interferon-γ (FIG. 5C) de células T humanas aloestimuladas, conforme descrito no Exemplo 2, infra. A figura 6 demonstra que L104EA29YIg é mais efetiva do que CTLA4Ig na inibição da proliferação de células T de macacos estimuladas com fitoemaglutinina (PHA)-estimulada, conforme descrito no exemplo 2, infra. A figura 7 representa uma sequência de nucleotídeos e de aminoácidos (SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente) de uma molécula mutante de CTLA4 (L104EA29YIg) que compreende um peptídeo sinal; um domínio extracelular mutado de CTLA4 que começa na metionina na posição +1 e termina no ácido aspártico na posição +124, ou que começa na alanina na posição -1 e termina no ácido aspártico na posição +124; e uma região de Ig, conforme descrito no exemplo 1, infra. A figura 8 representa uma sequência de nucleotí-deos e de aminoácidos (SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente) de uma molécula mutante de CTLA4 (L104EIg) que compreende um peptídeo sinal; um domínio extracelular mutado de CTLA4 que começa em metionina na posição +1 e que termina em ácido aspártico na posição +124, ou que começa em alanina na posição -1 e que termina em ácido aspártico na posição +124; e uma região de Ig, conforme descrito no exemplo 1, infra. A figura 9 representa uma seqüência de nucleotí-deos e aminoácidos (SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente) de um CTLA4Ig com um peptídeo sinal; uma seqüência de aminoácidos tipo selvagem do domínio extracelular de CTLA4 que começa em metionina na posição +1 até o ácido aspártico na posição +124, ou que começa em alanina na posição -1 até o ácido aspártico na posição +124; e uma região Ig.

As figuras 1QA-C são um gel SDS (FIG. 10A) para CTLA4Ig ("slot" 1), L104EIg ("slot” 2), e L104EA29YIg ("slot” 3A) ; e cromatografia de exclusão por tamanho de CTLA4Ig (figura 10B) e L104EA29YIg (figura 10C).

A figura 11 ilustra um diagrama de fita (lado esquerdo) do CTLA4 extracelular do Ig similar a V citado gerado a partir da estrutura de solução determinada por espec-troscopia de RMN. 0 lado direito da figura 11 mostra uma vista ampliada da região S25-R33 e da região MYPPPY (SEQ ID NO: 9), que indica a localização e orientação de cadeia lateral das mutações que melhoram a atividade, L104 e A29. A figura 12 representa um diagrama esquemático de um vetor, piLN-LEA29Y, com o L104EA29YIg inserido.

Descrição Detalhada da Invenção Definições Na forma usada neste pedido de patente, as palavras ou frases seguintes têm os significados especificados.

Na forma aqui usada, "CTLAê tipo selvagem" tem a sequência de aminoácidos de CTLA4 de ocorrência natural de comprimento total (patentes U.S. No. 5.434.131, 5.844.095, 5.851.795), ou seu domínio extracelular, que liga CD80 e/ou CD86, e/ou interfere na ligação de CD80 e/ou CD86 aos seus ligantes. Em modalidades particulares, o domínio extracelular de CTLA4 tipo selvagem começa com metionina na posição +1 e termina no ácido aspártico na posição +124, ou o domínio extracelular de CTLA4 tipo selvagem começa com alanina na posição -1 e termina em ácido aspártico na posição +124. CTLA4 tipo selvagem é uma proteína de superfície de célula, com um domínio extracelular N-terminal, um domínio de trans-membrana, e um domínio citoplãsmico C-terminal. O domínio extracelular liga antígenos alvo, tal como CD80 e CD86. Em uma célula, a proteína CTLA4 tipo selvagem de ocorrência natural é traduzida como um polipeptídeo imaturo, que inclui um peptídeo sinal na terminação N-terminal. O polipeptídeo imaturo passa por processamento pós-traducional, que inclui divagem e remoção do peptídeo sinal para gerar um produto de divagem CTLA4 com uma extremidade N-terminal recém- gerada que difere da N-terminal na forma imatura. Técnicos habilitados perceberão que pode ocorrer processamento pós-traducional adicional, que remove um ou mais dos aminoácidos da extremidade N-terminal recém-gerada do produto da divagem do CTLA4. A forma madura da molécula de CTLA4 inclui o domínio extracelular de CTLA4, ou qualquer porção sua, que liga ao CD80 e/ou CD86. "CTLAêlg" é uma proteína de fusão solúvel que compreende um domínio extracelular de CTLA4 tipo selvagem, ou uma porção sua que liga CD80 e/ou CD86, unida a uma cauda de Ig. Uma modalidade particular compreende o domínio extracelular de CTLA4 tipo selvagem que começa em metionina na posição +1 e que termina em ácido aspártico na posição + 124; ou que começa em alanina na posição -1 até ácido aspártico na posição +124; uma glutamina do resíduo de aminoãcido de junção na posição +125; e uma porção do imunoglobulma que engloba ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição + 357 (Figura 9; SEQ ID NO: 8) .

Na forma aqui usada, a "proteína de fusão'' é definida como uma ou mais sequências de aminoácidos unidas entre si por métodos bem conhecidos na tecnologia, e conforme descrita na patente U. S. no. 5.434.131 ou 5.637.481. A seqüência unida de aminoácidos portanto forma uma proteína de fusão .

Na forma aqui usada, a "molécula mutante de CTLA4" é uma molécula que pode ser CTLA4 de comprimento completo ou suas porções (derivados ou fragmentos) que teve uma mutação ou múltiplas mutações em CTLA4 (preferivelmente, no domínio extracelular de CTLA4), de maneira tal que ela seja similar, porém não mais idêntica, à molécula de CTLA4 tipo selvagem. Moléculas mutantes de CTLA4 ligam tanto CD80 como CD86, ou ambos. Moléculas mutantes de CTLA4 podem incluir uma molécula biológica ou quimicamente ativa não CTLA4 nela ou anexa a ela. As moléculas mutantes podem ser solúveis (isto é, circulantes) ou ligadas a uma superfície. As moléculas mutantes de CTLA4 podem incluir todo o domínio extracelular de CTLA4 ou porções suas, por exemplo, fragmentos ou derivados. Moléculas mutantes de CTLA4 podem ser feitas sinteticamente ou recombinantemente.

Na forma aqui usada, o termo "mutação" é uma alteração na seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos de um polipeptídeo tipo selvagem. Neste caso, é uma alteração no domínio extracelular de CTLA4 tipo selvagem. A alteração pode ser uma alteração de aminoácido que inclui substituições, deleções, adições ou truncamentos. Uma molécula mutante pode ter uma ou mais mutações. Mutações em uma seqüência de nucleotídeos podem ou não resultar em uma mutação na seqüência de aminoácidos, conforme é bem conhecido na tecnologia. Com relação a isto, certos códons de nucleotídeos codificam o mesmo aminoácido. Exemplos incluem códons de nucleotídeos CGU, CGG, CGC e CGA que codificam o aminoácido, argi-nina (R) ; ou códons GAU, e GAC que codificam o aminoácido, ácido aspártico (D) . Assim, a proteína pode ser codificada por uma ou mais das moléculas de ácido nucléico que diferem nas suas sequências específicas de nucleotídeos, mas que ainda codificam moléculas de proteína com sequências idênticas. A sequência de códigos dos aminoácidos é a seguinte: Na forma aqui usada, "o domínio extracelular de CTLA4” é uma porção de CTLA4 que reconhece e liga CD80 e/ou CD86. Por exemplo, um domínio extracelular de CTLA4 compreende metionina na posição +1 até ácido aspártico na posição +124 (figura 9; SEQ ID NO: 8). Alternativamente, um domínio extracelular de CTLA4 compreende alanina na posição -1 até ácido aspártico na posição +124 (figura 9; SEQ ID NO: 8}. O domínio extracelular inclui fragmentos ou derivados de CTLA4 que ligam CD80 e/ou CD86.

Na forma aqui usada, uma "sequência de proteínas não-CTLA4n ou "molécula não-CTLA4" é definida como qualquer molécula que não liga CD80 e/ou CD86 e não interfere com a ligação de CTLA4 ao seu alvo. Um exemplo inclui, apesar de não se limitarem, uma região constante de imunoglobulina (Ig) ou parte dela. Preferivelmente, a região constante de Ig é uma região constante de Ig de humano ou macaco, por exemplo, C(gama)l humano, incluindo a articulação, regiões CH2 e CH3 . A região constante de Ig pode ser mutada para reduzir suas funções efetoras (patentes U.S. no. 5.637.481 e 6.132.992).

Na forma aqui usada, um "fragmento de uma molécula mutante de CTLA4" é uma parte de uma molécula mutante de CTLA4, preferivelmente o domínio extracelular de CTLA4 ou uma parte do mesmo, que reconhece e liga seu alvo, por exemplo, CD80 e/ou CD86.

Na forma aqui usada, um "derivado de uma molécula mutante de CTLA4" é uma molécula que compartilha, pelo menos, 70% de similaridade da sequência e que funciona como o domínio extracelular de CTLA4, isto é, ela reconhece e liga CD80 e/ou CD86.

Na forma aqui usada, a "porção da molécula de CTLA4" inclui fragmentos e derivados de uma molécula de CTLA4 que liga CD80 e/ou CD86. A fim de que a invenção aqui descrita possa ser mais bem entendida, é apresentada a descrição seguinte.

Composições da Invenção A presente invenção fornece moléculas mutantes solúveis de CTLA4 que reconhecem e ligam CD80 e/ou CD86. Em algumas modalidades, os mutantes CTLA4 solúveis têm uma afinidade maior pelo CD80 e/ou CD86 do que pelo CTLA4Ig.

Exemplos de moléculas mutantes de CTLA4 incluem L104EA29YIg (figura 7; SEQ ID NOs: 3 e 4). A seqüência de aminoácidos de L104EA29YIg pode começar na alanina na posição de aminoácido -1 e terminar em lisina na posição de aminoãcido +357. Alternativamente, a seqüência de aminoácidos de L104EA29YIg pode começar na metionina na posição de aminoácido +1 e terminar na lisina na posição de aminoácido +357. A porção CTLA4 de L104EA29YIg engloba metionina na posição de aminoãcido +1 até ácido aspártico na posição de aminoãcido +124. L104EA29YIg compreende uma junção do resíduo de aminoácido glutamina na posição +125 e uma porção de imunoglobulina que engloba ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição +357 (Figura 7; SEQ ID NO-. 4) . L104EA29YIg liga aproximadamente 2-vezes mais avidamente do que CTLA4Ig tipo selvagem (doravante referida como CTLA4Ig) até CD80 e aproximadamente 4 vezes mais ativamente ao CD86.

Esta ligação mais forte resulta em L104EA29YIg mais efetiva do que CTLA4Ig no bloqueio de respostas imune.

Moléculas mutantes de CTLA4 compreendem pelo menos o domínio extracelular de CTLA4, ou porções da mesma que ligam CD80 e/ou CD86. A porção extracelular da molécula mutante de CTLA4 compreende uma seqüência de aminoácidos que começa com metionina na posição +1 até ácido aspártico na posição +124 (Figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou Figura 8 (SEQ ID NO: 6) ) . Alternativamente, a porção extracelular da CTLA4 pode compreender uma seqüência de aminoácidos que começa com ala-nina na posição -1 até ácido aspártico na posição +124 (Figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou 8 (SEQ ID NO: 6)).

Em uma modalidade, a molécula mutante de CTLA4 solúvel é uma proteína de fusão que compreende o domínio extracelular de CTLA4 com uma ou mais mutações em uma região de uma seqüência de aminoácidos iniciando com senna na +2 5 e terminando com arginina em +33 (S25-R33; . Por exemplo, a alanina na posição +29 de CTLA4 tipo selvagem pode ser substituída com tirosina (códons: UAU, UAC). Alternativamente, a alanina pode ser substituída com leucina (códons: UUA, UUG, CUU, GUG, CUA, CUG), fenilalanina (códons: UUU, UUC), trip-tofan (códon: UGG), ou treonina (códons: ACU, ACC, ACA, ACG) . Técnicos habilitados entenderão facilmente que o nu-cleotídeo uracil (U) da seqüência de RNA corresponde ao nu-cleotídeo timina (T) da seqüência de DNA.

Em uma outra modalidade, a molécula mutante de CTLA4 solúvel é uma proteína de fusão que compreende o domínio extracelular de CTLA4 com uma ou mais mutações na ou próximo à região de uma sequência de aminoácidos que começa com metionina em +97 e que termina com glicina em +107 (M97-G107) . Por exemplo, a leucina na posição +104 de CTLA4 tipo pode ser substituída com ácido glutâmico (códons: GAA, GAG) . A molécula mutante de CTLA4 com esta substituição é referida aqui como L104EIg (Figura 8; SEQ ID NOs5 e 6) .

Em ainda uma outra modalidade, a molécula mutante de CTLA4 solúvel é uma proteína de fusão que compreende o domínio extracelular de CTLA4 com uma ou mais mutações nas regiões S25R33 e M97-G107. Por exemplo, em uma modalidade, a molécula mutante de CTLA4 compreende tirosina na posição +29 em vez de alanina; e ácido glutâmico na posição +104 em vez de leucina. A molécula mutante de CTLA4 com essas substituições é aqui referida L104EA29YIg (Figura 7; (SEQ ID NO: 3 e 4). O molécula de ácido nucléico que codifica L104EA29YIg está contida em pD16 L104EA29YIg, e foi depositado em 19 de junho de 2000 com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104) . 0 vetor pD16 L104EA29YIg é um derivado do vetor pcDNA3 (INVITROGEN). A invenção fornece ainda uma molécula mutante de CTLA4 solúvel que compreende um domínio extracelular da CTLA4 mutante, conforme mostrado nas Figuras 7 (SEQ ID NOs: 3 e 4) ou Figura 8 (SEQ ID NOs: 5 e 6), ou porção(s) da mesma, e a parte que altera a solubilidade, afinidade e/ou va-lência de uma molécula mutante de CTLA4.

De acordo com uma prática da invenção, a parte pode ser uma região constante de imunoglobulina ou porção da mesma. Para uso in vivo, é preferível que a região constante de imunoglobulina não elicite uma resposta imune detrimental no indivíduo. Por exemplo, em protocolos clínicos, pode ser preferível que moléculas mutantes incluam regiões constantes de imunoglobulina de humanos ou macacos. Um exemplo de uma região de imunoglobulina adequada é a C(gama)l humano, que compreende regiões da articulação, CH2 e CH3 . Outros isoti-pos são possíveis. Além do mais, outras regiões constantes de imunoglobulina são possíveis (preferivelmente, outras regiões constantes de imunoglobulina não-imunogênicas ou fracamente imunogênicas).

Outras partes incluem marcadores de polipeptídeo. Exemplos de marcadores adequados incluem, apesar de não se limitarem, a molécula p97, molécula env gpl20, molécula E7 e a molécula ova (Dash, B., et. al. (1994) J. Gen. Virol . 75:13 89-97; Ikeda, T., et. al. (1994) Gene 13 8:193-6; Falk, K, et. al. (1993) Cell. Imunol. 150:447-52; Fujisaka, K. et. al. (1994) Virology 204:789-93) . Outras moléculas para uso como marcadores são possíveis (Gerard, C. et. al. (1994) NeuroScience 62:721-739; Byrn, R. et. al. J. Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D. et. al . , (1987) Science 238:1704-1707; Lasky, L·., (1996) Science 233:209-212). A invenção fornece ainda proteína de fusão CTLA4Ig mutante solúvel, preferivelmente, mais reativa com antígeno CD80 e/ou CD86, comparada com CTLA4 do tipo selvagem. Um exemplo é L104EA29Yig, conforme mostrado na Figura 7 (SEQ ID NOs: 3 e 4).

Em uma outra modalidade, a molécula mutante de CTLA4 solúvel inclui um resíduo de aminoácido de junção, que fica localizado entre a porção CTLA4 e a porção de imunoglobulina. O aminoácido de junção pode ser qualquer aminoácido, incluindo glutamina. O aminoácido de junção pode ser introduzido por métodos de síntese molecular ou química conhecidos na tecnologia.

Em uma outra modalidade, a molécula mutante de CTLA4 solúvel inclui a porção de imunoglobulina (por exemplo, dobradiça, domínios CH2 e CH3), onde qualquer um ou todos os resíduos de cisteína, dentro do domínio dobradiça de uma porção de imunoglobulina, são substituídos com serina, por exemplo, as cisteínas nas posições +130, +136, ou +139 (Figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou Figura 8 (SEQ ID NO: 6)). A molécula mutante pode também incluir a prolina na posição +148 substituída com uma serina, conforme mostrado na figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou Figura 8 (SEQ ID NO: 6). A molécula mutante de CTLA4 solúvel pode incluir uma seqüência de peptídeo sinal ligado à extremidade N-terminal do domínio extracelular da porção CTLA4 da molécula mutante. 0 peptídeo sinal pode ser qualquer seqüência que permita secreção de uma molécula mutante, incluindo o peptídeo sinal da oncostatina M (Malik, et. al., (1989) Mo-lec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), ou CD5 (Jones, N. H. et. al. , (1986) Nature 323:346-349), ou o peptídeo sinal de qualquer proteína extracelular. A molécula mutante pode incluir o peptídeo sinal M oncostatina M ligado na extremidade N-terminal do domínio extracelular de CTLA4, e a molécula de imunoglobulina humana (por exemplo, articulação, CH2 e CH3} ligada à extremidade C-terminal do domínio extracelular de CTLA4. Esta molécula incluí o peptídeo sinal oncostatina M que engloba uma sequência de aminoácidos com metionina na posição -26 até alanina na posição -1, a porção CTLA4 englobando um seqüência de aminoácidos com metionina na posição +1 até ácido aspár-tico na posição +124, o resíduo de amínoácído de junção glu-tamina na posição +125, e uma porção de imunoglobulina englobando uma seqüência de aminoácidos com ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição +357.

As moléculas mutantes CTLA4 solúveis da invenção podem ser obtidas por métodos de síntese molecular ou química. Os métodos moleculares podem incluir as seguintes etapas: introduzir uma célula hospedeira adequada com uma molécula de ácido nucléico que expresse e codifique uma molécula mutante de CTLA4 solúvel; cultivar a célula hospedeira assim introduzida sob condições que permitam que a célula hospedeira expresse as moléculas mutantes; e isolar as moléculas mutantes expressas. A porção de peptídeo sinal da molécula mutante permite que as moléculas de proteína sejam expressas na superfície da célula e que sejam secretadas pela célula hospedeira. As moléculas mutantes traduzidas podem passar por modificação pós-traducional, envolvendo divagem do peptídeo sinal para produzir uma proteína madura com as porções CTLA4 e as imunoglobulina. A divagem pode ocorrer depois da alanina na posição -1, resultando numa molécula mutante madura com metionina na posição +1 como o primeiro amínoácído (Figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou Figura 8 (SEQ ID NO: 6)). Alternativamente, a divagem pode ocorrer depois da me-tíonina na posição -2, resultando num molécula mutante madura com alanina na posição -1 como o primeiro aminoãcido.

Uma modalidade preferida é um molécula mutante de CTLA4 solúvel com o domínio extracelular de CTLA4 humano ligado a toda ou a uma porção da molécula de imunoglobulina humana ou a uma porção dela (por exemplo, articulação, CH2 e CH3). Esta molécula preferida inclui a porção CTLA4 da molécula solúvel que engloba uma seqüência de aminoácidos com metionina na posição +1 até ácido aspártico na posição +124, resíduo de aminoãcido de junção glutamina na posição +125, e uma porção imunoglobulina que engloba ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição +357. A porção com o domínio extracelular de CTLA4 é mutada de maneira tal que alani-na na posição +29 seja substituída com tirosina e leucina na posição +104 seja substituída com ácido glutâmico. A porção de imunoglobulina da molécula mutante pode ser mutada, de maneira tal que as cisternas na posições +130, +136, e +139 sejam substituídas com serina, e uma prolina na posição +148 seja substituída com serina. Esta molécula mutante está aqui designada como L104EA29YIg (Figura 7 (SEQ ID NOs: 3 e 4)).

Uma outra modalidade de L104EA29YIg é uma molécula mutante com uma seqüência de aminoácidos com alanina na posição -1 até ácido aspártico na posição +124, um resíduo de aminoácido de junção glutamina de na posição +125, e a porção de imunoglobulina que engloba ácido glutâmico na posição +126 (por exemplo, +126 até lisina na posição +357). A porção com o domínio extracelular de CTLA4 é mutada de maneira tal que alanina na posição +29 seja substituída com tirosi- na; e leucina na posição +104 é substituída com ácido glutâ-mico. A porção imunoglobulina da molécula mutante é mutada de maneira tal que as cisteínas nas posições +130, +136 e +139 seja substituída com serina. Esta molécula mutante está aqui designada como L104EA29YIg (Figura 7 (SEQ ID NOs; 3 e 4) ) . Depois de a seqüência sinal ter sido clivada, L104EA29YIg pode tanto começar com uma metionina na posição +1, como começar com alanina na posição -1.

Uma outra molécula mutante da invenção é uma molécula mutante de CTLA4 solúvel com o domínio extracelular de CTLA4 humano ligado à molécula de imunoglobulina humana (por exemplo, articulação, CH2 e CH3) . Esta molécula inclui a porção da seqüência de aminoácidos que codifica CTLA4 que começa com metionina na posição +1 até ácido aspártico na posição +124, resíduo de aminoácido de junção o glutamina na posição +125, e a porção de imunoglobulina que engloba uma seqüência de aminoácidos com ácido glutamicc na posição +126 até lisina na posição +357. A porção com o domínio extracelular de CTLA4 é mutada de maneira tal que leucina na posição +104 seja substituída com ácido glutâmico. A porção da articulação da molécula mutante é mutada de maneira tal que as cisteínas nas posições +130, +136, e +139 sejam substituídas com serina, e uma prolina na posição +148 seja substituída com serina. Esta molécula mutante está aqui designada como as L104EIg (Figura 8 (SEQ ID NOs : 5 e 6)).

Alternativamente, uma modalidade de L104EIg é uma molécula mutante de CTLA4 solúvel com um domínio extracelular de CTLA4 humano ligado uma molécula de imunoglobulina humana (por exemplo, articulação, CH2 e CH3) . Esta molécula preferida inclui a porção CTLA4 que engloba uma seqüência de aminoácidos que começa com alanina na posição -1 até ácido aspártico na posição +124, um resíduo de amínoácído de junção glutamina na posição +125, e a porção de imunoglobulina que engloba ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição +357. A porção com o domínio extracelular de CTLA4 é mutada de maneira tal que a leucina na posição +104 seja substituída com ácido glutâmico. A porção da articulação da molécula mutante é mutada de maneira tal que as cisteínas das posições +130, +136 e +139 sejam substituídas com seri-na, e uma prolina da posição +148 seja substituída com sen-na. Esta molécula mutante está aqui designada como L104EIg (Figura 8 (SEQ ID NOs : 5 e 6)).

Além disso, a invenção fornece uma molécula mutante de CTLA4 solúvel com: (a) uma primeira seqüência de aminoácidos de uma glicoproteína de membrana, por exemplo, CD28, CD86, CD80, CD40 e gp39, que bloqueia a proliferação de células T, fundida numa segunda seqüência de aminoácidos; (b) a segunda seqüência de aminoácidos sendo um fragmento do domínio extracelular do mutante CTLA4 que bloqueia a proliferação de células T, tal como, por exemplo, uma molécula de aminoácido que compreende metionina na posição +1 até ácido aspártico na posição +124 (Figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou 8 (SEQ ID NO: 6)); e (c) uma terceira seqüência de aminoácidos que age como um marcador de identificação ou que melhora a solubilidade da molécula. Por exemplo, a terceira seqüência de aminoácidos pode consistir essencialmente resíduos de aminoácido das regiões de articulação, CH2 e CH3 de uma molécula de imunoglobulina não-imunogênica. Exemplos de moléculas de imunoglobulínas adequadas incluem, apesar de não se limitarem, imunoglobulina de humanos ou de macacos, por exemplo, C(gama)l. Outros isotipos são também possíveis. A invenção fornece ainda moléculas de ácido nucléico que compreendem as sequências de nucleotídeos que codificam a seqüência de aminoácidos correspondente a moléculas mutantes CTLA4 solúveis da invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico é um DNA (por exemplo, cDNA) ou um híbrido do mesmo. Alternativamente, as moléculas de ácido nucléicos são RNA ou seus híbridos.

Adicionalmente, a invenção fornece um vetor, o qual compreende a sequências de nucleotídeo da invenção. Um sistema de vetor hospedeiro é também provido. O sistema de vetor hospedeiro compreende o vetor da invenção em uma célula hospedeira adequada. Exemplos células T hospedeiras adequadas incluem, apesar de não se limitarem, células procari-óticas e eucarióticas. A invenção inclui composições farmacêuticas para uso no tratamento de doenças do sistema imune que compreendem quantidades farmaceuticamente efetivas de moléculas mutantes CTLA4 solúveis. Em certas modalidades, as doenças do sistema imune são mediadas por interações de células CD28-e/ou CTLA4-positivas com células CD80 e/ou CD86 positivas. Moléculas mutantes de CTLA4 solúveis são preferivelmente molécula de CTLA4 com uma ou mais mutações no domínio extracelular de CTLA4. A composição farmacêutica pode incluir moléculas protéicas mutantes de CTLA4 solúveis e/ou molécula de ácido nucléicos, e/ou vetores que codificam as moléculas. Em modalidades preferidas, a moléculas mutantes CTLA4 solúveis tem a seqüência de aminoácidos do domínio extracelular de CTLA4 conforme mostrado tanto na Figura 7 (SEQ ID NO: 4) como 8 (SEQ ID NO: 6) (L104EA29Y ou L104E, respectivamente). Ainda mais preferivelmente, a molécula mutante de CTLA4 solúvel é L104EA29YIg conforme aqui descrita. As composições podem adicionalmente incluir outros agenies terapêuticos, incluindo, apesar de não se limitarem, drogas toxinas, enzimas, anticorpos, ou conjugados.

As composições farmacêuticas também, preferivelmente, incluem veículos e adjuvantes adequados que incluem qualquer material que, quando combinado com a molécula da invenção (por exemplo, uma molécula mutante de CTLA4 solúvel, tal como L104EA29Y ou L104E), retém a atividade da molécula, e não é reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos de veículos e adjuvantes adequados incluem, apesar de não se limitarem, albumina sérica humana; trocadores de íons; alumina; lecitina; substâncias tampão, tais como fosfatos; glicina; ácido sórbico; sorbato de potássio; e sais ou eletrólitos, tal como sulfato de protamma. Outros exemplos incluem qualquer um dos veículos farmacêuticos padrões, tal como uma solução salina tamponada de fosfato; água; emulsões, tal como emulsão óleo/água; e vários tipos de agentes molhantes. Outros veículos podem também incluir soluções estéreis; comprimidos, incluindo comprimidos revestidos e cápsulas. Tipicamente, tais veículos contêm excipientes, tais como amido, leite, açúcar, certos tipos de argila, gelatina, ácido esteárico ou seus sais, estearato de magnésio ou cálcio, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis, ou outros excipientes conhecidos. Tais carreadores podem também incluir aditivos de sabor e cor ou outros ingredientes. Composições que compreendem tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Tais composições podem também ser formuladas dentro de várias composições de lipídicas, tais como, por exemplo, liposomas, bem como em várias composições poliméricas, tais como mi-crosferas de polímero.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas usando formas convencionais de administração que incluem, apesar de não se limitarem, administração in-travenosa (iv), administração intraperitoneal (ip), administração intramuscular (im), administração subcutânea, administração oral, administração na forma de um supositório, na forma de um contato tópico, ou a implantação do dispositivo de liberação lenta, tal como uma bomba miniosmótica, no indivíduo.

As composições farmacêuticas da invenção podem ter uma variedade de formas de dosagem, que incluem, apesar de não se limitarem, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas poliméricas ou microvesículas, liposomas e soluções injetáveis ou infu-síveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica. 0 modo de administração e regime de dosagem mais efetivos para as composições desta invenção dependem da severidade e curso da doença, da saúde do paciente e da resposta ao tratamento e do julgamento do médico clínico. Dessa forma, as dosagens das composições devem ser prescritas a cada paciente individualmente.

As moléculas mutantes de CTLA4 solúveis podem ser administradas a um indivíduo em uma quantidade e por um tempo (por exemplo tempo prolongado e/ou várias vezes) suficiente para bloquear a ligação de moléculas endógenas B7 (por exemplo, CD80 e/ou CD86) aos seus respectivos ligantes, no indivíduo. 0 bloqueio da ligação de B7/ligante endógenos, portanto, inibe interações entre células B7 positivas (por exemplo, células CD80- e/ou CD86-positivas) e células CD28-e/ou CTLA4 positivas. A dose do agente terapêutico depende de vários fatores, incluindo, apesar de não se limitarem, o tipo de tecido afetado, o tipo de doença autoimune que está sendo tratada, a severidade da doença, a saúde do indivíduo e a resposta do indivíduo ao tratamento com os agentes. Dessa maneira, as doses dos agentes podem variar dependendo do indivíduo e do modo de administração. A moléculas mutantes de CTLA4 solúveis pode ser administrada em uma quantidade entre 0,1 e 20,0 mg/kg de peso do paciente/dia, preferivelmente entre 0,5 e 10,0 mg/kg/dia. A administração das composições farmacêuticas da invenção pode ser realizada várias vezes. Em uma modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por uma ou mais horas. Além do mais, a administração pode ser repetida, dependendo da severidade da doença, bem como de outro fatores conhecidos na tecnologia. A invenção fornece ainda métodos para produzir uma proteína que compreende crescer o sistema de vetor hospedei- ro da invenção de maneira a produzir a proteína no hospedeiro e recuperar a proteína assim produzida.

Adicionalmente, a invenção fornece méoodos para regular interações funcionais de célula T CTLA4- e CD28-positivas com células CD80- e/ou CD86-positivas. Os métodos compreendem colocar em contato as células CD80- e/ou CD86-positivas com uma molécula mutante de CTLA4 solúvel da invenção de maneira a formar complexos CTLA4/CD80 mutantes e/ou complexos CTLA4/CD86 mutantes, os complexos interferem com a reação de antígeno endógeno CTLA4 com CD80 e/ou CD86, e/ou os complexos interferem com reação de antígeno endógeno CD28 com CD80 e/ou CD86. Em um modalidade da invenção, a molécula mutante de CTLA4 solúvel é uma proteína de fusão que contém, pelo menos, uma porção do domínio extracelular de mutante CTLA4. Em uma outra modalidade, a molécula mutante de CTLA4 solúvel compreende: uma primeira seqüência de aminoácidos incluindo o domínio extracelular de CTLA4 da seqüência de aminoácidos com metionina na posição +1 até ácido aspártico na posição +124, incluindo, pelo menos, uma mutação; e uma segunda seqüência de aminoácidos incluindo as regiões da articulação, CH2, e CH3 da molécula gama 1 imunoglobulina humana (Figura 7 (SEQ ID NO: 4) ou Figura 8 (SEQ ID NO: 6) ) .

De acordo com a prática da invenção, as células CD80- ou CD86-positivas são contatadas com fragmentos ou derivados das moléculas mutantes CTLA4 solúveis da invenção. Alternativamente, a molécula mutante de CTLA4 solúvel é uma proteína de fusão CD28Ig/CTLA4Ig, com uma primeira seqüência de aminoácidos correspondente a uma porção do domínio extra- celular do receptor CD28 fundido a uma segunda seqüência de aminoácido correspondente a uma porção do domínio extracelular do receptor mutante CTLA4, e uma terceira seqüência de aminoácidos correspondente às regiões de articulação, CH2 e CH3 da C-gama-1 imunoglobulina humana.

Espera-se que as moléculas mutantes de CTLA4 solúveis apresentem propriedades inibitórias in vivo. Sob condições em que interações de célula T/APC, por exemplo, interações de célula T/célula B, estejam ocorrendo em decorrência do contato entre células T e APC, a ligação das moléculas mutantes de CTLA4 introduzidas para reagir com células CD80-e/ou CD86-positivas, por exemplo, células B, pode interferir, isto é, inibir, as interações de célula T/APC, resultando em regulação de respostas imune. A invenção fornece métodos para infra-regular ("downregulating") respostas imune. A infra-regulação da resposta imune pelas moléculas mutantes CTLA4 solúveis pode ser por meio de inibição ou bloqueio de uma resposta imune já em progresso ou pode envolver a prevenção da indução de resposta imune. As moléculas solúveis CTLA4 da invenção podem inibir as funções de células T ativadas, tais como proliferação de linfócito e secreção de citocina, pela supressão de respostas de célula T ou pela indução específica de tolerância em células T, ou ambos. A presente invenção fornece ainda métodos para tratar doenças do sistema imune e indução de tolerância. Em modalidades particulares, as doenças do sistema imune são mediadas por interações de células CD28- e/ou CTLA4-positivas com células CD80/CD86-positivas. Em mais uma modalidade, interações de célula T são inibidas. Doenças do sistema imune incluem, apesar de não se limitarem, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas, e desordens relacionadas a enxertos. Esses métodos compreendem administrar a um indivíduo moléculas mutantes de CTLA4 solúveis da invenção para regular interações de célula T com as células CD80-e/ou CD86-positivas. Alternativamente, a CTLA4 mutante híbrida com a glicoproteína de membrana ligada a uma molécula mutante de CTLA4 pode ser administrada. Exemplos de doenças relacionadas a enxerto incluem doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD "graft versus host disease") (por exemplo, tal como o que pode resultar de transplantes da medula óssea, ou na indução de tolerância), desordens imunes associadas com rejeição ao transplante de enxerto, rejeição crônica, e alo- ou xenoenxertos de tecido ou célula, incluindo órgãos sólidos, pele, ilhotas, músculos, hepatócitos e neurônios. Exemplos de doenças imunoproliferativas incluem, apesar de não se limitarem, psoríase; linfoma de célula T; leucemia linfoblástica aguda de célula T; linfoma de célula T testicular angiocêntrica; angite linfocítica benigna e doenças autoimunes, tais como lupus (por exemplo, lupus erite-matoso, lupus nefrite), tiroidite de Hashimoto, mixedema primário, doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, diabetes (por exemplo diabetes melito dependente de insulina, diabetes melito tipo I), síndrome de Goodpasture, miastenia grave, pênfigo, doença de Crohn, oftalmia simpatética, uveite autoimune, es- clerose múltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitope-nia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulceratis, síndrome de Sjogren, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatóide), polimiosite, esclerodermia e doenças de tecido conectivo misto. A presente invenção fornece ainda um método para inibir rejeições de transplante de tecidos ou órgãos sólidos por um indivíduo, o indivíduo sendo um recipiente transplante de tecido. Tipicamente, em transplantes de tecidos, a rejeição do enxerto se inicia pelo seu reconhecimento como estranho pelas células T, seguido por uma resposta imune que destrói o enxerto. As moléculas mutantes de CTLA4 solúveis desta invenção, pela inibição de proliferação de linfócito T e/ou de secreção de citocina, podem resultar em menor destruição do tecido e indução de uma célula T antíge-no-específica não responsiva pode resultar na aceitação do enxerto a longo prazo sem a necessidade de imunossupressão generalizada. Além do mais, a moléculas mutantes de CTLA4 solúveis da invenção podem ser administradas com outros fár-macos, incluindo, apesar de não se limitarem, corticosterói-des, ciclosporina, rapamicina, micofenolato de mofetila, azatioprina, tacrolismus, basiliximab e/ou outros biológicos . A presente invenção também fornece métodos for doença do enxerto contra o hospedeiro em um indivíduo. Este método compreende administrar ao sujeito uma molécula mutante de CTLA4 solúvel da invenção, só ou juntamente com mais ligantes adicionais, reativos com IL-2, IL-4 ou interferon- γ. Por exemplo, uma molécula mutante de CTLA solúvel desta invenção pode ser administrada a um recipiente de transplante de medula óssea para inibir a alorreatividade de células T do doador. Alternativamente, as células T do doador em um enxerto de medula óssea podem ser tolerizadas a aloantígenos do recipiente ex vivo antes do transplante. A inibição de respostas de célula T por moléculas mutantes CTLA4 solúveis pode também ser usada para tratar desordens autoimunes. Diversas desordens autoimunes resultam de ativação imprópria de células T que são reativas contra autoantígenos, e que promovem a produção de citocinas e au-toanticorpos que são envolvidos na patologia da doença. A administração da molécula mutante de CTLA4 solúvel em um indivíduo que sofre ou que é suscetível· a uma desordem autoi-mune pode prevenir a ativação de células T autorreativas e pode reduzir ou eliminar sintomas de doença. Este método pode também compreender administrar ao indivíduo uma molécula mutante de CTLA4 solúvel da invenção, só ou junta com mais ligantes adicionais, reativa com IL-2, IL-4 ou interfe- ron-γ. A invenção compreende ainda o uso de moléculas mutantes de CTLA4 solúveis, juntamente com outros imunossupressores, por exemplo, ciclosporina (ver Mathiesen, em: "Prolonged Survival e Vascularization of Xenoenxertoed Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclos-porin A-Treated Rats" (1989) Câncer Lett., 44:151-156), prednisone, azathioprine, e metotrexate (R. Handschumacher "Chapter 53: Drugs Used for Imunosuppression" paginas 1264-1276). Outros imunosupressores são possíveis. Por exemplo, para o tratamento de artrite reumatóide, moléculas mutantes de CTLA4 solúveis podem ser administradas com fárma-cos, incluindo, apesar de não se limitarem a, corticosterói-des, fármacos antiinflamatórios não-esteroidais/inibidores da Cox-2, metotrexato, hidroxicloroquina, sulfassalazoprii-na, sais de ouro, etanercept, infliximab, anakinra, azatio-prina e/ou outros biológicos, como anti-TNF. Para o tratamento de lupus eritematoso sistêmico, moléculas mutantes de CTLA4 solúveis podem ser administradas com fármacos, incluindo, apesar de não se limitarem, corticosteroides, citoxa-na, azatioprina, hidroxicloroquina, micofenolato mofetil e/ou outros biológicos. Ainda, para o tratamento de esclero-se múltipla, moléculas mutantes de CTLA4 solúveis podem ser administradas com fármacos, incluindo, apesar de não se li-mitarema, corticosteroides, interferon beta-la, interferon beta-lb, acetato de glatiramer, hidrocloreto de mitoxantrona e/ou outros biológicos.

As moléculas mutantes de CTLA4 solúveis (preferivelmente, L104EA29YIg) pode ser também usadas em combinação com um ou mais dos agentes seguintes para regular uma resposta imune: gp39 solúvel (também conhecido como CD40-ligante (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), CD29 solúvel, CD40 solúvel, CD80 solúvel, CD86 solúvel, CD28 solúvel, CD56 solúvel, Thy-1 solúvel, CD3 solúvel, TCR solúvel, VLA-4 solúvel, VCAM-1 solúvel, LECAM-1 solúvel, ELAM-1 solúvel, CD44 solúvel, anticorpos reativos com gp39, anticorpos reativos com CD40, anticorpos reativos com B7, anticorpos reativos com CD28, anticorpos reativos com LFA-1, anticorpos reativos com LFA-2, anticorpos reativos com IL-2, anticorpos reativos com IL-12, anticorpos reativos com IFN-gama anticorpos reativos com CD2, anticorpos reativos com CD48, anticorpos reativos com qualquer ICAM (por exemplo, ICAM-2), anticorpos reativos com CTLA4, anticorpos reativos com Thy-1, anticorpos reativos com CD56, anticorpos reativos com CD3, anticorpos reativos com CD29, anticorpos reativos com TCR, anticorpos reativos com VLA-4, anticorpos reativos com VCAM-1, anticorpos reativos com LECAM-1, anticorpos reativos com ELAM-1, anticorpos reativos com CD44. Em certas modalidades, anticorpos monoclonais são preferidos. E outras modalidades, fragmentos de anticorpos são preferidos. Conforme técnicos habilitados entenderão prontamente, a combinação pode incluir as moléculas mutantes de CTLA4 solúveis da invenção e um outro agente imunossupressor, as moléculas mutantes de CTLA4 solúveis com dois outros agentes imunossuspressor, moléculas mutantes CTLA4 solúveis com três outros agentes imunossupressores, etc. A determinação da combinação e doses ideais pode ser determinada e otimizada com uso de métodos bem conhecidos na tecnologia.

Algumas combinações específicas incluem as seguintes: L104EA29YIg e CD80 mAbs; L104EA29YIg e CD86 mAbs; L104EA29YIg, CD80 mAbs, e CD86 anticorpos (abs); L104EA29YIg e gp39 mAbs; L104EA29YIg e CD40 mAbs; L104EA29YIg e CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD80 e CD86 mAbs, e gp39 mAbs;, L104EA29YIg, CD80 e CD86 mAbs e CD40 mAbs; e L104EA29YIg, anti-LFAl mAb, e antigp39 mAb. Um exemplo específico de um gp39 mAb é MR1. Outras combinações serão prontamente percebidas e entendidas pelos técnicos habilitados.

As moléculas mutantes de CTLA4 solúveis da invenção, por exemplo L104EA29Y, podem ser administradas como ingrediente ativo só ou juntamente com outros fármacos em regimes de imunomodulação ou outros agentes anti-inflamatórios, por exemplo para o tratamento ou prevenção de rejeição de alio- ou xenoenxerto aguda ou crônica ou desordens inflamatórias ou autoimunes, ou para induzir tolerância. Por exemplo, pode ser usado em combinação com um inibidor de calcineurina, por exemplo ciclosporina A ou FK506; um macrolídeo imunossupressor, por exemplo rapamicina ou seu derivado; por exemplo 40-0-(2--hidróxi)etil-rapamicina, um agente endereçador de linfócito, por exemplo FTY720 ou análogo seu; corticosteróides; ciclo-fosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida ou um seu análogo; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofe-til; 15-deoxispergualina ou um análogo seu; anticorpos mono-clonais imunossupressores, por exemplo, anticorpos monoclo-nais a receptores de leucócitos, por exemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11 a/CD 18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40, 4-1BB ou seus ligantes; ou outros compostos imunomoduladores, por exemplo CTLA4/CD28-Ig, ou outros inibidores de molécula de adesão, por exemplo inibidores de mAbs ou de baixo peso molecular, incluindo antagonistas de LFA-1, antagonistas de seletina e antagonistas de VLA-4. 0 composto é particularmente usado em combinação com um composto que interfere com CD40 e seu li- gante, por exemplo, anticorpos para CD40 e anticorpos para CD40-L, por exemplo, nas indicações supradescritas, por exemplo, a indução de tolerância.

No caso das moléculas mutantes de CTLA4 solúveis da invenção serem administradas em combinação com outra terapia imunossupressora/ imunomodulatória ou terapia an-ti-inflamatória, por exemplo, na forma anteriormente especificada, doses do composto imunossupressor, imunomodulador ou anti-inflammatório co-administrado podem certamente variar, dependendo do tipo de co-fármaco empregado, por exemplo, se ele é um esteróide ou uma ciclosporina, do fármaco específico empregado, da condição que está sendo tratada, e assim por diante.

De acordo com exposto, a presente invenção fornece em ainda mais um aspecto métodos na forma supradefinida que compreendem co-administração, por exemplo concomitantemente ou em seqüência, da quantidade terapeuticamente efetiva de moléculas mutantes de CTLA4 solúveis da invenção, L 104EA29YIg, numa forma livre ou em forma de um sal farmaceuticamente aceitável, e uma segunda substância do fármaco, a dita Segunda substância do fármaco sendo um fármaco imunossupressor, imunomodulador ou anti-inflammatório, por exemplo na forma supraindicada. São providas também combinações terapêuticas, por exemplo, um kit, por exemplo, para uso em qualquer método na forma supradefinida, que compreende L104EA29YIg, na forma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, a ser usado concomitantemente ou em seqüência com, pelo menos, uma composição farmacêutica que compreende um fármaco imunossupressor, imunomodulador ou an-ti-inflammatório. O kit pode compreender instruções para sua administração. Métodos para Produzir as Moléculas da Invenção A expressão de moléculas mutantes de CTLA4 pode ser em células procarióticas. As procarióticas mais frequentemente são representadas por várias cepas de bactéria. A bactéria pode ser uma gram positiva ou uma gram negativa. Tipicamente, bactéria gram-negativa, tal como E. coli, são preferidas. Outras cepas microbianas podem também ser usadas .

Seqüências que codificam moléculas mutantes de CTLA4 podem ser inseridas em um vetor designado para expressar seqüências estranhas em células procarióticas tal como E. coli. Esse vetores podem incluir seqüências de controle procarióticas normalmente usadas, que são aqui definidas de forma a incluir promotores para iniciação de transcrição, opcionalmente, com um operador, juntamente com seqüências de sítios de ligação a ribossomo, inclusive tais promotores normalmente usados como os sistemas promotores de beta-lactamase (penicilinase) e lactose (lac) (Chang, et. al., (1977) Nature 198:1056), o sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, et. al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) e o promotor PL lambda derivado e o sítio de ligação ribossomo N-gene (Shimatake, et. al., (1981) Nature 292:128).

Tais vetores de expressão incluirão também origens de replicação e marcadores selecionáveis, tais como um gene de beta-lactamase ou neomicina fosfotransferase, que confe- rem resistência ao antibiótico, de maneira tal que os vetores possam replicar em bactérias, e células que levam os plasmídeos possam ser selecionadas, quando crescidas na presença de antibióticos, tais como ampicilina ou canamicina. O plasmídeo de expressão pode ser introduzido em células procarióticas via uma variedade de métodos padrões, incluindo, apesar de não se limitarem a choque com CaCL·, (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110, e Sambrook et. al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) e eletroporação.De acordo com a prática da invenção, células eucarióticas são também células hospedeiras adequadas. Exemplos de células eucarióticas incluem qualquer célula animal, tanto primária como imortalizada, levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, e Pi-chia pastoris), e células de planta. Células de mieloma, COS e CHO são exemplos de células animais que pode ser usadas como hospedeiros. Células CHO particulares incluem, apesar de não se limitarem, DG44 (Chasin, et. al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biocheraistry 36:10901-10909) , CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), linhagem celular CHO-K1 Tet-Ativa (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) , CHO clone 13 (GEIMG, Gênova, IT), CHO clone B (GEIMG, Gênova, IT) , CHO-K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) , e RR-CHOK1 designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Células de planta exemplares incluem células de tabaco (todas as plantas, cultura de célula, ou calo), mi- lho, soja, e arroz. Sementes de milho, soja e arroz são também aceitáveis.

Seqüências de ácido nucléico que codificam as moléculas mutantes de CTLA4 podem ser também inseridas em a vetor designado para expressar seqüências estranhas em um hospedeiro eucariótico. Os elementos regulatórios do vetor podem variar de acordo com o hospedeiro eucariótico particular.

Seqüências de controle eucarióticas normalmente usadas para vetores de expressão incluem seqüências promotoras e de controle compatíveis com células de mamíferos, tais como, por exemplo, promotor CMV (vetor CDM8) e vírus de sar-coma avícola (ASV) (vetor πΕΝ). Outros promotores normalmente usados incluem o primeiros e últimos promotores do vírus Simian 40 (SV40) (Fiers, et. al., (1973) Nature 273:113), ou outros promotores virais, tais como os derivados da polioma, Adenovirus 2, e vírus papiloma bovino. Um promotor induzí-vel, tal como hMTII (Karin, et. al., (1982) Nature 299:797-802), pode também ser usado.

Vetores para expressar moléculas mutantes de CTLA4 em eucariotos podem também levar seqüências denominadas regiões intensificadoras (enhancer). Esses são importantes na otimização da expressão do gene e são encontrados tanto a montante como a jusante da região promotora.

Exemplos de vetores de expressão para células hospedeiras eucarióticas incluem, apesar de não se limitarema, vetores para células hospedeiras de mamíferos (por exemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV 1 (Life Technologies); Vetores pVPakc, vetores pCMV, vetores pSG5 (Stratagene)), vetores retrovirais (por exemplo, vetores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ou suas formas modificadas, vetores adenovi-rais; vetores de vírus adeno-associados, vetores de baculo-virus, vetores de levedura (por exemplo, vetores pESC (Stratagene) ) .

Seqüências de ácido nucléico que codificam moléculas mutantes de CTLA4 podem integrar no genoma das células eucarióticas hospedeiras e replicar como o genoma do hospedeiro replica. Alternativamente, o vetor que leva as moléculas mutantes de CTLA4 pode conter origens de replicação, permitindo a replicação extracromossomal.

Para expressar o ácido nucléico em seqüências Sac-charomyces cerevisiae, a origem de replicação do plasmídeo de levedura endógeno, o círculo de 2 μ pode ser usado. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternativamente, seqüências do genoma de levedura capazes de promover replicação autônoma podem ser usadas (ver, por exemplo, Stinchcomb et. al., (1979) Nature 282:39); Tschemper et. al., (1980) Gene 10:157; e Clarke et. al., (1983) Meth. Enz. 101:300).

Seqüências de controle transcricional para vetores de levedura incluem promotores para a síntese de enzimas glicolíticas (Hess et. al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et. al., (1978) Biochemistry 17:4900). Promotores adicionais conhecidos na tecnologia incluem promotor CMV provido no vetor CDM8 (Toyama e Okayama, (1990) FEBS 268:217221); o promotor para 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et. al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), e aqueles para outras enzimas glicolíticas.

Outros promotores são induzíveis, em virtude de que eles podem ser regulados por estimulo ambientais ou pelo meio de crescimento das células. Esses promotores induzíveis incluem aqueles dos genes de proteínas de choque térmico, álcool dehidrogenase 2, isocitociromo C, ácido fosfa-tase, enzimas associadas com catabolismo de nitrogênio, e enzimas responsáveis por utilização de maltose e galactose.

Seqüências reguladoras podem também se colocadas na terminação 3' das seqüências de codificação. Essas seqüências podem agir para estabilizar o RNA mensageiro. Tais terminadores são encontrados na região 3' não traduzida, seguindo as seqüências de codificação em diversos genes derivados de levedura e de mamíferos.

Vetores exemplares para plantas e células de planta incluem, apesar de não se limitarem, plasmídeos de Agro-bacterim Tí; vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), e vírus do mosaico dourado do tomateiro (TGMV).

Aspectos gerais de sistema hospedeiro de célula de mamífero foram descritos por Axel (patente U.S. no 4.399.216, depositada em 16 de agosto de 1983). Células de mamífero podem ser transformadas por métodos que incluem, apesar de não se limitarem, transfecção na presença de fosfato de cálcio, microinjeção, eletroporação, ou via transdu-çao com vetores virais. Métodos para introduzir seqüências de DNA estranhas em genomas de plantas e leveduras incluem (1) métodos mecânicos, tais como microinjeçao de DNA em células únicas ou protoplastos, turbilhonamento de células com contas de vidro na presença de DNA, ou bombardeamento com esferas de tungstênio ou ouro revestidas de DNA nas células ou protoplastos; (2) introduzir DNA, tornando as membranas da célula permeáveis a macromoléculas por meio de tratamento de polietileno glicol, ou sujeição a pulsos elétricos de alta tensão (eletroporação) ; ou (3) o uso de lipossomas (contendo cDNA) que se fundem às membranas da célula. A expressão de moléculas mutantes de CTLA4 pode ser detectada por métodos conhecidos na tecnologia. Por exemplo, as moléculas mutantes podem ser detectadas por géis SDS-PAGE corados por Coomassie e imunoblotting por meio de anticorpos que ligam CTLA4. A recuperação de proteína pode ser feita com uso de mecanismos de purificação de proteína padrão, por exemplo, cromatografia de afinidade ou cromatografia de troca iônica, para produzir um produto substancialmente puro (R. Scopes in: "Protein Purification, Principies and Practice", Third Edition, Springer-Verlag (1994)). A invenção fornece ainda moléculas mutantes CTLA4 solúveis produzidas da forma supradescrita.

Mutagênese baseada no códon de CTLA4Ig Em uma modalidade, mutagênese direcionada ao sítio e um novo procedimento de seleção foram usados para identificar diversas mutações no domínio extracelular de CTLA4 que melhoram a afinidade de ligação por CD86. Nesta modalidade, as mutações foram realizadas em resíduos nas regiões do domínio extracelular de CTLA4 a partir de serina 25 até argi- nina 33, a fita C' (alanina 49 e treonina 51) , a fita F (lisina 93, ácido glutâmico 95 e leucina 96), e na região a partir da metionina 97 até tirosina 102, tirosina 103 até glicina 107 e na fita G nas posições glutamina 111, tirosina 113 e isoleucina 115. Esses sítios foram escolhidos com base em estudos de proteínas de fusão CD28/CTLA4 quiméricas (Pe-ach et. al., J. Exp. Med, 1994, 180:2049-2058), e em um modelo de previsão de quais cadeias laterais de resíduos de aminoácidos seriam expostas ao solvente, e uma falta de identidade ou homologia de resíduo de aminoácido em certas posições entre CD28 e CTLA4. Também, qualquer resíduo que esteja espacialmente em estreita proximidade (5 a 20 unidades de Angstrom) aos resíduos identificados é considerado parte da presente invenção.

Para sintetizar e selecionar moléculas mutantes de CTLA4 com afinidades alteradas por CD80 e/ou CD86, foi adotada uma estratégia de duas etapas. Os experimentos requerem primeiro a geração de uma biblioteca de mutações em um códon específico de uma porção extracelular de CTLA4 e em seguida, seleção desses por análise BIAcore para identificar mutantes com reatividade alterada para CD80 ou CD86. 0 sistema de ensaio Biacore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) usa um sistema detetor de ressonância por plasmon de superfície que essencialmente envolve ligação covalente tanto de CD80Ig como de CD86Ig a uma chip sensor revestido com dextrana que fica localizado em um detetor. A molécula de teste pode então ser injetada na câmara que contém o chip sensor e a quantidade de proteína complementar que liga pode ser avaliada com base na troca de massa molecular que está fisicamente associada com o lado revestido de dextrana do chip sensor; a alteração na massa molecular pode ser medida pelo sistema detetor.

Vantagens da Invenção Em virtude da ligação CTLA4 a CD80 e CD86 ser caracterizada por altas taxas de "ligação" ("ligado")e altas taxas de dissociação ("desligado"), e em virtude de complexos de CTLA4Ig-CD86 dissociarem aproximadamente de 5 a 8 vezes mais rapidamente que complexos CTLA4Ig-CD80, foi considerado lógico que reduzindo-se a taxa de dissociação de CTLA4Ig de CD80 e/ou CD86 resultaria em moléculas com propriedades imunossupressoras mais potentes. Assim, espera-se que moléculas mutantes de CTLA4 solúveis com uma maior avidez por células CD80/ ou CD86 positivas comparadas como CTLA4 tipo selvagem, ou formas não mutadas de CTLA4Ig bloqueiem a sensibilização ("priming") de células ativadas an-tígeno específicas com mais eficiência do que CTLA4 do tipo selvagem ou formas não mutadas de CTLA4Ig.

Além do mais, os custos de produção do CTLA4Ig são muito altos. As moléculas de CTLA4Ig mutantes de alta avidez com propriedades imunossupressoras mais potentes podem ser usadas na clínica, em doses consideravelmente mais baixas do que CTLA4Ig não mutado, para se conseguirem níveis similares de imunossupressão. Assim, moléculas mutantes de CTLA4, por exemplo, L104EA29Yig, podem ter custo muito em conta.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar a presente invenção e para auxiliar técnicos habilitados na fabricação e uso da mesma. Os exemplos não se destina de nenhuma maneira a limitar de outra forma o escopo da invenção .

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Este exemplo fornece a descrição dos métodos usados para gerar a seqüência de nucleotídeos que codifica as moléculas mutantes CTLA4 solúveis da invenção. Um mutante de sítio único de L104EIg foi gerado e testado com relação à cinética de ligação por CD80 e/ou CD86. A seqüência de nucleotídeos L104EIg foi usada como um modelo para gerar a seqüência mutante de sítio duplo de CTLA4, L104EA29YIg, que foi testada com relação à cinética de ligação por CD80 e/ou CD86.

Mutagênese com base no códon de CTLA4Ig: Uma estratégia de mutagênese e de seleção foi desenvolvida para identificar moléculas de CTLA4Ig mutantes que apresentaram taxas de dissociação mais baixas {taxas de "off") de moléculas de CD80 e/ou CD86. Seqüências de nucleotídeos mutantes em único sítio foram geradas por meio de CTLA4Ig (patentes U.S. no. 5.844.095, 5.851.795 e 5.885.796; acesso ATCC no. 68629) com um modelo. Primers (iniciadores) de PCR oligonucleotídeos mutagênicos foram desenhados para mutagênese aleatória do códon de cDNA específico, permitindo-se qualquer base nas posições 1 e 2 do códon, mas somente guanina ou timina na posição 3 (XXG/T; também conhecido como NNG/T). Desta maneira, um códon específico que codifica um aminoácido poderia ser mutado aleatoriamente para codificar cada um dos 20 aminoácidos. Com relação a isto, a mutagênese XXG/T leva a 32 códons potenciais que codificam cada um dos 20 aminoácidos. Os produtos de PCR que codificam! mutações em estreita proximidade a -M37-G107 de CTLA4Ig (ver Figura 7 (SEQ ID NOs: 3 e 4) ou 8 (SEQ ID NOs: 5 e 6)), foram digeridos com Sacl/Xbal e subclonados no vetor de expressão de CTLA4Ig kLN similarmente cortado (também conhecido como piLNí. Este método foi usado para gerar uma molécula L104Ig, mutante de CTLA4 em um único sítio (Figura 8 (SEQ ID NOs: 5 e 6)).

Para mutagênese nas proximidades de S25-R33 de CTLA4Ig, uma restrição Nhel silenciosa foi primeiro introduzida 5' neste laço, por mutagênese direcionada por primer (iniciador) de PCR. Os produtos PCR foram digeridos com Nhel/Xbal e subclonados em vetores de expressão de CTLA4Ig ou L104EIg cortados similarmente. Este método foi usado para gerar a molécula mutante de CTLA4 de duplo sítio L104EA29YIg (Figura 7 (SEQ ID NOs: 3 e 4)). Em particular, a molécula de ácido nucléico que codifica a molécula mutante de CTLA4, L104EIg, de sítio único foi usada como um molde para gerar a molécula mutante de CTLA4, L104EA29YIg de duplo sítio. 0 vetor piLN com LlO4EA29YIg está mostrado na Figura 12. EXEMPLO 2 A seguir é feita uma descrição dos métodos de seleção usados para identificar os polipeptídeos de CTLA4 mutantes de sitio único e duplo, expressos a partir dos cons-trutos descritos no Exemplo 1, que apresentam uma maior avidez de ligação pelos antígenos CD80 e CD86, comparado com moléculas de CTLA4Ig não mutadas.

Estudos atuais in vitro e in vivo indicam que CTLA4Ig por si própria é incapaz de bloquear completamente a sensibilização ("priming") de células T ativadas específicas para o antígeno. Estudos in vitro com CTLA4Ig e tanto anticorpo específico monoclonal para CD80 como CD86 medindo inibição de proliferação de célula T indicam que anticorpo monoclonal anti-CD80 não aumentou a inibição, indicando que CTLA4Ig não foi tão efetivo no bloqueio de interações de CD86. Esses dados dão suporte às observações anteriores de Linsley et. al. (Immunity, (1994), 1:793-801) que mostram que a inibição de respostas celulares mediadas por CD80 requereu aproximadamente 100 vezes menos concentrações de CTLA4Ig do que respostas mediadas por CD-86. Com bases nessas observações, resumiu-se que as moléculas mutantes de CTLA4 com uma maior avidez por CD86 do que CTLA4 do tipo selvagem devem ser bem mais capazes de bloquear a sensibilização ("priming") de células ativadas específicas para o antígeno do que CTLA4Ig.

Com esta finalidade, as moléculas mutantes CTLA4 solúveis descritas no exemplo 1 anterior foram selecionadas por meio de um procedimento de seleção novo para identificar diversas mutações no domínio extracelular de CTLA4 que melhoram a atividade de ligação para CD80 e CD86. Esta estratégia de seleção forneceu um método efetivo para identificar diretamente mutantes com taxas de "inativação" aparentemente menores sem a necessidade de purificação ou quantificação de proteína uma vez que a determinação da taxa de "inativação1 é independente da concentração (O'Shannessy et. al., (1993) Anal. Biochem,, 212:457-468).

As células COS foram transfectadas com DNA plasmi-dial purificado por um minipreparação ("miniprep") individual e propagado por vários dias. 0 meio de cultura condicionado três dias foi aplicado nos chips do biossensor BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) revestidos com CD80Ig ou CD86Ig solúvel. A ligação e dissociação específica de proteínas mutantes foram medidas por ressonância por plasmon de superfície (01Shannessy, D. J., et. al., (1993) Anal. Biochem. 212:457-468). Todos os experimentos foram feitos em biossensores BIAcore™ ou BIAcore™ 2000 a 25°C. Os ligantes foram imobilizados nos chips do sensor NCM5 grau pesquisa (Pharmacia) utilizando-se acoplamento de N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimidN-hidroxissuccinimida padrão (Johnsson, B., et. al. (1991) Anal, Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N., et. al. (1993) CD Biol. Chem 268:5425-15434). Método de Seleção Células COS crescidas em placas de cultura de tecido de 24 poços foram transfectadas transientemente com DNA que codifica o mutante CTLA4Ig. O meio de cultura contendo o mutante secretado CTLA4Ig solúvel foi coletado 3 dias depois . 0 meio de cultura de células COS condicionado foi deixado escoar sobre os chips do biossensor BIAcore deriva-tizada com CD86Ig ou CD80Ig (conforme descrito em Greene et. al., 1996 J. Biol, Chem. 271:26762-26771), e as molécula mutantes foram identificadas com taxas de desligamento mais baixas do que as observadas para CTLA4Ig tipo selvagem. Os cDNA correspondentes às amostras do meio selecionado foram seqüenciadas e DNA preparado para realizar transfecção tran-siente de célula COS em maior escala, a partir do que a proteína CTLA4Ig mutante foi preparada seguindo a purificação de proteína A do meio de cultura.

As condições de análise BIAcore e a análise dos dados de ligação de equilíbrio foram realizadas na forma descrita em J. Greene et. al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771, e conforme aqui descrito.

Análise dos Dados BIAcore Linhas de base de sensosorgrama foram normalizadas em unidades de resposta zero (RU) antes da análise. As amostras foram processadas sobre células de fluxo falso-derivatizadas para determinar valores da unidade de resposta de fundo (RU) por causa das diferenças no índice de refração de volume entre soluções. As constantes de dissociação de equilíbrio (Ka) foram calculadas a partir dos gráficos de Req versus C, em que Req é a resposta de estado estacionário menos a resposta em um chip falso-derivatizada, e C é a concentração molar do analito. Curvas de ligação foram analisadas por meio de programa de computador para ajuste de curvas nao-lineares comerciais (Prism, GraphPAD Software).

Os dados experimentais foram primeiro ajustados a um modelo para uma ligação de ligante único a um receptor único (modelo 1-sítio, isto é, um sistema Langmuir simples, A+B θ AB) , e as constantes de associação de equilíbrio (Ka= [A] - [B] / [AB] ) foram calculadas a partir da equação R=Rmax C/ (Ka+C) . Subsequentemente, os dados foram ajustados ao mo- delo de dois sítios mais simples de ligação de ligante (isto é, a um receptor com dois sítios de ligação independentes não-interagentes, na forma descrita pela equação R=Rraax · C/ (Kd+C) +Rmax2 .C/ (Kd2+C) ) . A validade dos ajustes desses dois modelos foi analisada visualmente pela comparação com dados experimentais e estatisticamente pelo teste F da soma dos quadrados. O modelo de um sítio mais simples foi escolhido como o melhor ajuste, a menos que o modelo de dois sítios se ajuste significativamente melhor (P<0,l).

Análises de associação e dissociação foram realizadas pelo programa de computador BIA de avaliação 2.1 (Pharmacia) . As constantes de taxa de associação kngado foram calculadas de duas maneiras, assumindo-se tanto interação de sítio único homogênea como interação de dois sítios paralelas. Para interação de sítio único, os valores kngado foram calculados de acordo com a equação Rt-Reqi (l-exp"ksl(t’t0), em que Rt é uma resposta a um dado tempo, t; Req é a resposta do estado estacionário, t0 é o tempo no início da injeção; e ks dR/dt=kiigado-Ckdesiigado, e em que C é uma concentração de ana-lito, calculada em termos de sítios de ligações monoméricas. Para interações de dois sítios, os valores de kligado foram calculados de acordo com a equação Rt=Reqi (l-exp"ksl(t' t0)+Req2 (l-expks2(t_t0) . Para cada modelo, os valores de kiigado foram determinados pela inclinação calculada (a cerca de 70% de associação máxima) no gráfico de ks versus C.

Os dados de dissociação foram analisados por modelos de um sítio (AB=A+B) ou de dois sítios (AiBj=Ai+Bj), e taxas constantes (kdeSii9ado) foram calculadas a partir de curvas de melhor ajuste. 0 modelo de sítio de ligação foi usado, exceto quando os resíduos eram maiores do que o fundo ("background") da máquina (2-10 RU, de acordo com a máquina) , em cujo caso o modelo de sítios de duas ligações foi empregado. Os semi tempos da ocupação do receptor foram calculados pelo relação ti/2=0,693/kinativo<

Citometria de Fluxo MAb L307.4 (anti-CD80) murino foi obtido da Becton Dickinson (San Jose, Califórnia) e IT2.2 (anti-B7-0 (também conhecida como CD86]), da Pharmingen (San Diego, Califórnia) . Para imunocoloração, células CHO CD80-positivas e/ou CD86-positivas foram removidas de seus recipientes de cultura por incubação em salina tamponada com fosfato (PBS) contendo lOmM EDTA. Células CHO (1-10 χ 105) foram primeiro incubadas com proteínas de fusão de imunoglobulina ou mAbs em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) , e em seguida lavadas e incubadas com reagentes da segunda etapa, imunoglobulina de cabra anti-rato ou anti-humano conjugado com isotíocianato de fluoresceína dos (Tago, Burlingame, Califórnia) . Foi feita uma lavagem final nas células e elas foram analisadas em um FACScan (Becton Dickinson). SDS-PAGE e Cromatografia de exclusão por tamanho SDS-PAGE foi realizada em géis de acrilamida Tris/glicina 4-20% (Novex, San Diego, CA). Os géis analíticos foram corados com Coomassie Blue, e as imagens de géis molhados foram obtidas por varredura digital. CTLA4Ig (25 μ9) e L104EA29YIg (25 μg) foram analisados por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando-se um TSK-GEL 300 SWxL, coluna (7,8 x 300mm, Tosohaas, Montgomeryvílle, PA) equilibrada em salina tamponada com fosfato contendo 0,02% NAN3 a uma vazão de 1,0 ml/min.

CTLA4XC12O5 e L104EA29YXC120S CTLA4Xci2os de cadeia simples foi preparado conforme previamente descrito (Linsley et. al., (1995) J. Biol.

Chem., 270:15417-15424). Resumidamente, um plasmídeo de expressão de oncostatina M CTLA4 (OMCTLA4) foi usado como um molde, o iniciador de avanço (forward primer), GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG í SEQ ID NO: 1) foi escolhido para combinar com as seqüências no vetor; e o iniciador reverso (reverse primer), GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO: 2) correspondeu aos últimos sete aminoácidos (isto é aminoácidos 118-124) no domínio extracelular de CTLA4, e apresentaram um sítio de enzima de restrição, e um códon de "stop" (terminação) primer (TGA). O primer reverso especificou uma mutação C 120S (cisteína em serina na posição 120). Em particular, a seqüência de nucleotídeos GCA (nucleotídeos 34-36) do primer reverso mostrado anteriormente é substituída com uma das seqüência de nucleotídeos seguintes: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, ou GCT. Técnicos habilitados perceberão que a seqüência de nucleotídeos GCA é uma seqüência complementar reversa do códon TGC para cisteína. Símilarmente, as seqüências de nucleotídeos AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, ou GCT são as seqüências reversas complementares dos códons para serina. O produtos da reação em cadeira de polimerase ÍPCR) foram digeridos com HindIII/Xbal e direcicnalmente subclona-dos no vetor de expressão 7tELN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ) , L1O4EA29YXc12os foi preparado de uma maneira idêntica. Cada construto foi verificado por seqüen- ciamento de DNA.

Identificação e Caracterização Bioquímica de Mutantes de Alta Avidez Vinte e quatro aminoácidos foram escolhidos para mutagênese e as aproximadamente 2300 proteínas mutantes resultantes ensaiadas por ligação a CD86Ig por ressonância por plasmon de superfície (SPR; conforme supradescrito). Os efeitos predominantes de mutagênese em cada sítio estão su-marizados na tabela II. Mutagênese aleatória de alguns aminoácidos no S25-R33 aparentemente não altera a ligação do ligante. A mutagênese de E31 e R33 e resíduos M97-Y102 aparentemente resultaram em menor ligação do ligante. As muta-gêneses dos resíduos, S25, A29, e T3Q, K93, L96, Y103, L 104, e G 105, resultaram em proteínas com taxas de "ligação" baixas e/ou "desligamento" baixas. Esses resultados confirmam as observações prévias de que resíduos na região S25-R33 e resíduos em ou próximos a M97-Y102 influenciam a ligação do ligante (Peach et. al., (1994) J, Exp. Med., 180:2049-2058 . A mutagênese de sítios S25, T30, K93, L96, Y103 e 6105 resultou na identificação de algumas proteínas mutantes que apresentaram taxas "de desligamento" inferiores do CD86Ig. Entretanto, nesses casos, a baixa taxa "desligamento" foi comprometida por uma baixa taxa "ligação" que resul- tou em proteínas mutantes com uma avidez total por CD86Ig que foi aparentemente similar à observada com CTLA4Ig tipo selvagem. Além do mais, a mutagênese de K93 resultou numa agregação significativa que pode ter sido responsável pelas alteração cinéticas observadas.

Mutagênese aleatória de L104 seguida por transfec-ção e seleção de célula COS por SPR de amostras do meio de cultura sobre CD86Ig imobilizado rendeu seis amostras do meio contendo proteínas mutantes com taxas "desligamento" aproximadamente 2-vezes mais baixas do que CTLA4Ig tipo selvagem. Quando os cDNAS correspondente desses mutantes foram seqüenciado, observou-se que cada um codifica a mutação de leucina para ácido glutâmico (L104E). Aparentemente, a substituição de leucina 104 por ácido aspártico (L104D) não afeta a ligação CD86Ig. A mutagênese foi então repetida em cada sítio listado na tabela II, desta vez usando L104E como a molde de PCR em vez de CTLA4Ig tipo selvagem, conforme supradescrito. Análise SPR, novamente com utilização de CD86Ig imobilizado, identificou seis amostras de meio de cultura a partir da mutagênese de alanina 29 com proteínas com taxas "de desligamento" aproximadamente 4-vezes mais baixas do que CTLA4Ig tipo selvagem. As duas mais baixas foram substituições de tirosina (L104EA29Y), duas foram leucina (L104EA29L), uma foi triptofano (L104EA29W), e uma foi treonina (L104EA29T). Aparentemente, nenhum mutante de taxa "de desligamento" baixa foi identificado, quando alanina 29 foi mutada aleatoriamente, sozinha, em CTLA4Ig tipo selvagem. A massa molecular relativa e o estado de agregação de L104E e L104EA29YIg purificados foram avaliados por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão por tamanho. L104EA29YIg (aprox. 1 μ9; fig; slot 3) e L104EIg (aprox. 1 μg; slot 2) aparentemente apresentaram a mesma mobilidade eletroforética de CTLA4Ig (aprox. 1 μ9; slot 1) sob condições redutoras (aprox. 50kDa; +βΜΕ; mais 2-mercaptoetanol) e não-redutoras (aprox. lOOkDa; -βΜΕ) (FIG. 10A) . Cromatografia de exclusão por tamanho demonstrou que L104EA29YIg (FIG. 10C) aparentemente apresentou a mesma mobilidade de CTLA4Ig dimérico (FIG. 10B) . Os maiores picos representam proteína dímera, enquanto que o mais rápido que elui o menor pico na FIG. 10B representa agregados de maior peso molecular. Aproximadamente 5,0% de CTLA4Ig estiveram presentes como agregados de maior peso molecular mas não houve nenhuma evidência de agregação de L104EA29YIg ou L104EIg. Portanto, a ligação mais forte ao CD86Ig observada com L104EIg e L104EA29YIg não pode ser atribuída à agregação induzida pela mutagênese.

Análise de Ligação em Equilíbrio e Cinética A análise de ligação em equilíbrio e cinética foi realizada em proteína A purificada CTLA4Ig, L104EIg, e L104EA29YIg por meio ressonância por plasmônio de superfície (SPR) . Os resultados estão mostrados na tabela I. As constantes de dissociação de equilíbrio observadas (Ka; Tabela I) foram calculadas a partir das curvas de ligação geradas numa faixa de concentrações (5,0-200 nM) . O L104EA29YIg se liga mais fortemente a CD86Ig do que o L104EIg ou CTLA4Ig. A Ka de L104EA29YIg (3,21 nM) menor do que de L104EIg (6,06 nM) ou de CTLA4Ig (13,9 nM) indica maior avidez de ligação de L104EA29YIg a CD86Ig. A Kd de L104EA29YIg (3,66 nM) menor do que de L104EIg (4,47 nM) ou CTLA4Ig (6,51 nM) indica maior afinidade de ligação de L104EA29YIg a CD80Ig.

Análise de ligação cinética revelou que as taxas de "ligação" para ligação de CTLA4Ig, L104EIg, e L104EA29YIg a CD80 foram similares à taxas "de ligação" para CD86Ig (Tabela I) . Entretanto, as taxas "de desligamento" para essas moléculas não foram equivalentes (Tabela I) . Comparado com CTLA4Ig, L104EA29YIg apresentou uma taxa "de desligamento" aproximadamente 2-vezes mais baixa do que do que CD8QIg, e taxa "de desligamento" aproximadamente 4-vezes menor do que CD86Ig. L104E apresentou taxas "de desligamento" intermediárias a L104EA29YIg e CTLA4Ig. Uma vez que a introdução dessas mutações não afetaram significativamente as taxas "de ligação", o aumento na afinidade para o CD80Ig e CD86Ig observado com L104EA29YIg provavelmente foi basicamente por causa de um aumento nas taxas "de desligamento".

Para determinar se o aumento na avidez de L104EA29YIg por CD86Xg e CD80Ig foi por causa das mutações que afetam a maneira de cada monômero associado como um dí-mero, ou se houve alterações estruturais introduzidas que melhoram a avidez em cada monômero, construtos de cadeia simples de domínios extracelulares de CTLA4 e LI04EA29Y foram preparados seguindo mutagênese de cisteína 120 a serina na forma supradescrita e descrita por Linsley et. al.t (1995) J. Biol, Chem., 270:15417-15424. As proteínas CTLA4Xci2os e L104EA29YXci2os purificadas se apresentaram como monoméricas por cromatografia de permeação em gel (Linsley et. al.,. (1995), supra), antes que suas propriedades de ligação do ligante fossem analisadas por SPR. Os resultados mostraram que a afinidade de ligação de ambas as proteínas monoméricas por CD86Ig foi aproximadamente 35-80-vezes menor do que a observada para seus respectivos dímeros (Tabela I). Isto sustenta os dados prevíamente publicados que estabelecem que a dimerização de CTLA4 foi necessária para alta avidez de ligação do ligante (Greene et. al. , (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

LlO4EA29YXCi2os ligado com afinidade aproximadamente 2-vezes maior do que CTLA4XCi2os tanto a CD80Ig como CD86Ig. A maior afinidade se deveu à taxa aproximadamente 3-vezes menor de dissociação de ambos os ligantes. Porcanto, a ligação de ligante mais forte por L104EA29Y foi mais provável por causa de alteração estruturais que melhoram a avidez que foram introduzidas na cadeia monomérica em vez de alterações nas quais uma molécula é dimerizada.

Análise Posicionai e Estrutural de Mutações que Melhoram a Afinidade A estrutura em solução do domínio extracelular tipo IgV de CTLA4 foi recentemente determinado por espec-troscopia RMN (Metzler et. al., (1997) Nature Struct. Biol·., 4:527-531. Isto permitiu um posicionamento correto de leucina 104 e alanina 29 em dobramento em três dimensões (FIG. 11) . A leucina 104 fica situada próximo à seqüência de aminoácidos altamente conservada MYPPPY (SEQ ID NO: 9). Alanina 29 fica situada próximo à terminação C-terminal da região S25-R33 região, que fica espacialmente adjacente à região MYPPPY (SEQ ID NO: 9). Embora não exista nenhuma interação significativa entre resíduos na base dessas duas regiões, não existe aparentemente nenhuma interação direta entre L104 e A29, embora as duas compreendam parte do núcleo hidrofóbi-co contíguo na proteína. As consequências estruturais dos dois mutantes que melhoram a avidez foram avaliadas por modelagem. A mutação A29Y pode ser facilmente acomodada na fenda entre a região S25-R33 e a região MYPPPY (SEQ ID NO: 9) , e pode servir para estabilizar a conformação da região MYPPPY (SEQ ID NO: 9) . Em CTLA4 tipo selvagem, L104 forma interações hidrofóbicas extensas com L96 e V94 próximo à região MYPPPY (SEQ ID NO: 9). É altamente improvável que a mutação de ácido glutâmico adote um conformação similar à do de L104 por duas razões. Primeiro, existe espaço insuficiente para acomodar a cadeia lateral de ácido glutâmico mais comprida na estrutura sem perturbação significativa na região S25-R33 região. Segundo, os custos energéticos de isolar a carga negativa da cadeia lateral do ácido glutâmico na região hidrofóbica seriam maiores. Por outro lado, estudos de modelagem indicam que a cadeia lateral de ácido glutâmico gira-se para fora da superfície onde sua carga pode ser estabilizada por solvatação. Uma alteração conformacional como essa pode ser facilmente acomodada por G105, com mínima distorção a outros resíduos nas regiões.

Ligação de Mutantes de Alta Afinidade a Células CHQ que Expressam CD8Q ou CD86 Análise FACS (Fig. 2) de CTLA4Ig e de ligação de moléculas mutantes a células CHO CD80+ e CD86+ estavelmente transfectadas foi realizada conforme aqui descrito. Células CHO CD80-positivas e CD86-positivas foram incubadas com concentrações crescentes de CTLA4Ig, L104EA29YIg, ou L104EIg, e em seguida, lavadas. Proteína de fusão com imunoglobulina ligada foi detectada por meio imunoglobulina de cabra anti-humana conjugada com isotiocianato de fluoresceína.

Conforme mostrado na figura 2, Células CHO CD80-positivas ou CD86-positivas (l,5xl05) foram incubadas com as concentrações indicadas de CTLA4Ig (quadrados fechados) , L104EA29YIg (círculos), ou L104EIg (triângulos) por 2 horas a 23°C, lavadas, e incubadas com anticorpo imunoglobulina de cabra anti-humano conjugado com isotiocianato de fluoresceína. A ligação num total de 5.000 células viáveis foi analisada (determinação simples) em um FACScan, e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi determinada a partir de histogramas de dados usando PC-LYSYS. Os dados foram corrigidos pela fluorescência de fundo medida em células incubadas somente o reagente da segunda etapa (MFI = 7) . 0 controle L6 mAb (80 ug/ml) deu MFI < 30. Esses resultados são representativos de quatro experimentos independentes. A ligação de L104EA29YIg, L104EIg, e CTLA4Ig a células CHO transfectadas com CD80 é aproximadamente equivalente (FIG. 2A). L104EA29YIg e L104EIg ligam mais fortemente a células CHO estavelmente transfectadas com CD86 humano do que CTLA4Ig (FIG. 2B).

Ensaios Funcionais: Células T CD4-positivas humanas foram isoladas por seleção imunomagnética negativa (Linsley et. al. , (1992) J.

Exp. Med. 176:1595-1604). Células T CD4-positivas isoladas foram estimuladas com forbol acetato de miristila (PMA) mais células CHO CD80-positivas ou CD86-positivas na presença de concentrações de titulação de inibidor. Células T CD4-positivas (8-10 x 104/poço) foram cultivadas na presença de 1 nM PMA com ou sem estimuladores de célula CHO irradiadas. Respostas proliferativas foram medidas pela adição de ^Ci/poço de [3H]timidina durante as 7 horas finais da cultura de 72 horas. A inibição de PMA mais Células T CHO estimuladas CD80-positivas, ou CD86-positivas, por L 104EA29YIg e CTLA4Ig foi realizada. Os resultados estão mostrados na FIG. 3. L104EA29YIg inibe a proliferação de Células CHO CD80-positivas PMA tratadas mais do que CTLA4Ig (FIG. 3A) . L104EA29YIg é também mais efetivo do que CTLA4Ig na inibição de proliferação de Células CHO CD86-positivas tratadas com PMA (FIG. 3B). Portanto, L104EA29YIg é um inibidor mais potente de coestímulo de células T mediadas tanto por CD80- como de CD86. A figura 4 mostra a inibição por L104EA29YIg e CTLA4Ig de células T humanas aloestimuladas preparadas conforme supradescrito, e ainda mais aloestimuladas com uma linhagem celular linfoblastóide humana B (LCL) denominada PM que expressou CD80 e CD86 (Células T a 3,0xl04/poço e PM a 8,0xl03/poço) . 0 aloestímulo primário ocorreu por 6 dias e, em seguida, as células foram pulsadas com 3H-timidina por 7 horas, antes que a incorporação de rádio-rótulo fosse determinada . O aloestímulo secundário foi realizado da seguinte maneira. Células T aloestimuladas primárias de sete dias foram colhidas sobre meio de separação de linfócitos (LSM) (ICN, Aurora, OH) e deixadas descansar por 24 horas. As células T foram então reestimuladas (secundárias), na presença de quantidades de titulação de CTLA4Ig ou L104EA29YIg, adicionando-se PM na mesma proporção supradescrita. A estimulação ocorreu por 3 dias, e em seguida as células foram pulsadas com radiomarcador e colhidas da maneira supradescrita. O efeito de L104EA29YIg nas células T aloestimuladas primárias está mostrado na figura 4A. 0 efeito de L104EA29YIg em Células T aloestimuladas secundárias está mostrado na figura 4B. L104EA29YIg inibe melhor tanto respostas proliferativas de células T primária como secundária do que CTLA4Ig.

Para medir a produção de citocina (figura 5), placas de aloestímulo secundárias em duplicata foram montadas. Depois de 3 dias, o meio de cultura foi ensaiado com utilização de kits de ELISA (Biosource, Camarillo, CA) sob condições recomendadas pelo fabricante. Observou-se que o L104EA29YIg é mais potente do que CTLA4Ig no bloqueio de produção de célula de citocinas IL-2, IL-4, e IFN-γ por células T, após um estímulo alogeneico secundário (figuras 5A-C).

Os efeitos de L104EA29YIg e CTLA4Ig na resposta de linfócito misto de macaco (MLR) estão mostrados na figura 6. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC; 3,5xl04 células/poço de cada macaco) de 2 macacos foram purificadas sobre meio de separação de limfócitos (LSM) e misturadas com 2 μ9/ηι1 de fitoemaglutinina (PHA) . As células foram estimuladas 3 dias e em seguida pulsadas com radiofármaco 16 horas antes da colheita. L104EA29YIg inibiu a proliferação de célula T de macaco melhor do que CTLA4Ig.

Tabela I: As constantes de equilíbrio de cinética aparente estão dadas na tabela seguinte (valores são médias ± desvio padrão de três experimentos diferentes): Tabela II 0 efeito na ligação CD86Ig por mutagênese de CTLA4Ig nos sítios listados foi determinado por SPRZ supra-descrito. 0 efeito predominante está indicado com um sinal «n Conforme ficará aparente aos técnicos habilitados aos quais esta invenção diz respeito, a presente invenção pode ser concebida em outras formas além das especificamente aqui descritas, sem fugir do espírito ou características essenciais da invenção. As modalidades particulares da inven- ção supradescritas, devem, portanto, ser consideradas como ilustrativas, e não restritivas. 0 escopo da presente invenção é da maneira apresentada nas reivindicações em anexo, em vez de serem limitadas aos exemplos contidos na descrição exposta.

REIVINDICAÇÕES

Claims (20)

1. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, CARACTERIZADA por compreender um domínio extracelular de CTLA4, em que o domínio extracelular de CTL4 começa com metionina na posição 27 ou com alanina na posição 26 e termina com ácido aspártico na posição 150 como mostrado na SEQ ID NO: 8 e em que a leucina na posição 130 é substituída por um ácido glutâmico.

2. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que uma alanina na posição 55 é substituída com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em tirosina, leucina, triptofano e treonina.

3. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a alanina na posição 55 é substituída com uma tirosina.

4. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por compreender metionina na posição 27 para ácido aspártico na posição 150 como mostrado na SEQ ID NO: 4.

5. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por compreender alanina na posição 26 para ácido aspártico na posição 150 como mostrado na SEQ ID NO: 4.

6. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADA por adicionalmente compreender uma região constante de imunoglobulina humana que começa com ácido glutâmico na posição 152 e termina com lisina na posição 383, como mostrado na SEQ ID NO: 4, em que a região constante de imunoglobulina humana é mutada para incluir uma cisteína na posição 156 substituída por uma serina, uma cisteína na posição 162 substituída por uma serina, uma cisteína na posição 165 substituída por uma serina, e uma prolina na posição 174 substituída por serina.

7. Molécula mutante de CTLA4 solúvel, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA por compreender: a) uma sequência de aminoácidos começando com metionina na posição 27 e terminando com lisina na posição 383 da SEQ ID NO:4; ou b) uma sequência de aminoácidos começando com alanina na posição 26 e terminando com lisina na posição 383 da SEQ ID NO: 4.

8. Molécula mutante de CTLA4 solúvel CARACTERIZADA por compreender uma porção de uma molécula mutante de CTLA4 solúvel codificada pela molécula de ácido nucléico designada pelo ATCC No. PTA-2104.

9. Molécula de ácido nucléico CARACTERIZADA por compreender a sequência de nucleotídeos que começa com adenina na posição de nucleotídeo 79 e termina com adenina na posição 1152 como mostrado na SEQ ID NO: 3.

10. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA por ter a sequência de nucleotídeos que começa com guanidina na posição de nucleotídeo 76 e termina com adenina na posição 1152 como mostrado na SEQ ID NO: 3.

11. Vetor CARACTERIZADO por compreender a sequência de ácidos nucléicos conforme definida nas reivindicações 9 ou 10.

12. Micro-organismo transgênico CARACTERIZADO por ter o vetor conforme definido na reivindicação 11.

13. Micro-organismo transgênico, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO por ser uma célula eucariótica.

14. Método para produzir uma proteína mutante CTLA4 solúvel conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO por compreender crescer o micro-organismo transgênico conforme definido na reivindicação 12 para produzir a proteína mutante de CTLA4, e recuperar a proteína assim produzida.

15. Método in vitro para regular uma interação de célula T com uma célula CD80 e/ou CD86 positiva CARACTERIZADO por compreender colocar em contato a célula CD80 e/ou CD86 positiva com a molécula mutante de CTLA4 solúvel, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para formar um complexo de molécula mutante de CTLA4/CD80 ou um complexo de molécula mutante de CTLA4/CD86, o complexo interferindo com a interação entre a célula T e a célula CD80 e/ou CD86 positiva.

16. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato da célula CD80 e/ou CD86 positiva ser uma célula apresentadora de antígenos.

17. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato da interação de células T CLA4-positivas com células CD80 e CD86 positivas ser inibida.

18. Uso da molécula mutante de CTLA4 solúvel, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO por ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar doenças do sistema imune compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e a molécula mutante de CTL4 solúvel.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO por adicionalmente compreender um ligante reativo com IL-4 para preparar uma composição farmacêutica para inibir a doença do enxerto versus hospedeiro.

20. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender uma molécula mutante de CTLA4 solúvel, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.