CZ20023892A3 - Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 a jejich použití - Google Patents

Description

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 a jejich použití

Oblast techniky

Tento vynález se týká oblasti rozpustných molekul CTLA4, které jsou mutovány ze standardního CTLA4 z důvodu udržení schopnosti vázat CD80 a/nebo CD86. V celém textu této přihlášky se odkazuje na různé publikace, které jsou v jejich celistvosti tímto zahrnuty do tohoto vynálezu z důvodu podrobnějšího popisu stavu techniky, kterého se tento vynález týká.

Dosavadní stav techniky

Antigen-nespecifické intercelulárni interakce mezi Tlymfocyty a buňkami představujícími antigen („antigen presenting cells - APC) vytváří kostimulační (spolustimulační) signály T-buněk, které dále vytváří odezvy T buněk na antigen (Jenkins and Johnson (1993), Curr. Opin. Immunol., 5: 361 - 367). Kostimulační signály určují velikost odezvy T buněk na antigen, a dále to, zda tato odezva aktivuje nebo inaktivuje následující odezvy na antigen (Mueller a kol., 1989, Annu. Rev. Immunol. 7: 445480.

Aktivace T buněk bez kostimulace má za následek nezdařilou nebo anergickou odezvu T-buněk (Schwartz, R.H., 1992, Cell 71:1065-1068). Jeden klíčový kostimulační signál vzniká interakcí povrchového receptoru CD28 T-buněk s B7 příbuznými molekulami na buňkách představujících antigen (například také známé jako B7-1 a B7-2 nebo CD80 a CD86)(P. Linsley and Ledbetter, 1993, Annu. Rev. Immunol., 191-212) .

Tato molekula nyní známá jako CD80 (B7-1) byla původně popsána jako lidský aktivační antigen B buněk • · • · ···· · · ···· • · · · ·

	— Z — · · · · · • · · · ·	• · · • · ·	• · · · • · · ·
(Yokochi, T. a kol.,	1981, J. Immunol.,	128 :	823-827;
Freeman, G.J. a kol.	, 1989, J. Immunol.	, 143:	2714-2722) a

později identifikována jako protireceptor pro příbuzné molekuly T buněk CD28 a CTLA4 (Linsley, P. a kol., 1990, Proč.

Nati. Acad. Sci., USA 87: 5031-5035; Linsley, P.S. a kol., 1991a, J.Exp. Med., 173: 721-730; Linsley, P.S. a kol., 1991b, J.Exp. Med., 174: 561-570).

Nedávno byl identifikován další protireceptor pro CTLA4 na buňkách představujících antigen (Azuma, N. a kol., 1993, Nátuře, 366:76-79; Freemann, 1993a, Science 262: 909-911; Freeman, G.J. a kol., 1993b, J.Exp.Med. 178: 2185-2192; Hathcock, K.L.S. a kol., 1994, J. Exp. Med., 180: 631-640; Lenschow, D.J. a kol.,1993, Proč. Nati. Sci. USA, 90:11054-11058; Ravi-Wolf, Z. a kol., 1993, Proč. Nati. Sci. USA, 90:11182-11186; Wu, Y. a kol., J. Exp. Med., 178:1789-1793). Tato molekula nyní známá jako CD86 (Caux, C. a kol., 1994, J.Exp. Med., 180:1841-1848), ale také nazývaná B7-0 (Azuma a kol., 1993, viz výše) nebo B72 (Freeman a kol., 1993a, viz výše) má společnou sekvenční identitu asi z 25 % s CD80 v její extracelulární oblasti (Azuma a kol., 1993, viz výše; Freeman a kol., 1993a, viz výše; 1993b, viz výše). CD86-transfekované buňky vyvolávají odezvy T buněk zprostředkované CD28 (Azuma a kol., 1993, viz výše; Freeman a kol., 1993a, 1993b, viz výše).

Srovnání exprese CD80 a CD86 bylo předmětem několika studií (Azuma a kol.,1993, viz výše; Hathcock a kol.,

1994, viz výše; Larsen, C.P. a kol., 1994), J. Immunol., 152: 5208-5219; Stack, R.M., a kol., 1994, J. Immunol., 152: 5723-5733). Současné údaje ukazují, že exprese CD80 a CD 86 jsou regulovány různě a naznačují, že exprese CD86 má tendenci předcházet expresi CD80 během imunitní odezvy.

·· · ·· ···· • · · · · · · • · · · * * • · · · · · · • · · · · · • · ··· ·· ·

Rozpustné formy CD28 a CTLA4 byly vytvořeny spojením variabilně příbuzných extracelulárních domén CD28 a CTLA4 s konstantními doménami imunoglobulinů (Ig) za vzniku CD28Ig a CTLA4Ig. CTLA4Ig váže jak CD80 pozitivní, tak i CD86 pozitivní buňky silněji než CD28Ig (Linsley, P. a kol., 1994, Immunity, 1:793-80). Mnoho imunitních odezev závislých na T buňkách je blokováno CTLA4 jak in vitro, tak i in vivo. (Linsley a kol., 1991b, viz výše; Linsley, P.S. a kol., 1992a, Science, 257:792-795; Linsley, P.S. a kol., 1992b, J. Exp. Med., 176:1595-1604; Lenschow, D.J. a kol., 1992, Science, 257:789-792; Tan, P. a kol., 1992, J. Exp. Med., 177:165-173; Turka, L.A., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci.USA, 89:11102-11105).

Peach a kol. (J.Exp. Med., 1994, 180:2049-2058) identifikovali oblasti v extracelulární doméně CTLA4, které jsou důležité pro silnou vazbu na CD80. Konkrétně hexapeptidový vzor (MYPPPY) v oblasti podobající se oblasti 3 určující komplementaritu (CDR3-like region) byl identifikován jako plně zachovaný u všech členů skupiny CD28 a CTLA4. Alaninová skenovací mutageneze prostřednictvím MYPPPY vzoru v CTLA4 a vybraných zbytcích CD28Ig snížila nebo zrušila vazbu na CD80.

Byly také vytvořeny chimérní molekuly vzájemně si vyměňující homologní oblasti CTLA4 a CD28. Molekuly HS4, HS4-A a HS4-B byly vytvořeny vložením oblastí CTLA4 podobajících se CDR-3, které také obsahovaly část karboxylového konce prodlouženého tak, aby obsahoval určité nezachované aminokyselinové zbytky na CD28Ig. Tyto homology mutantů vykazovaly vyšší vazebnou aviditu k CD80 než k CD28Ig.

V další skupině chimérních homologů mutantů, oblast CTLA4 podobající se CDR1, která není zachovaná v CD28 a předpokládá se, že prostorově sousedí s oblastí podobající se CDR3, byla vložena do HS4 a HS4-A. Tyto chimérní homology molekul mutantů (označené jako HS7 a HS8) vykazovaly dokonce větší vazebnou aviditu pro CD80 než

CD28lg.

Chimérní homology molekul mutantů byly také připraveny vložením oblasti CTLA4 podobající se CDR-2 do HS7 a HS8, ale tato kombinace dále nezlepšila vazebnou aviditu pro CD80. Bylo určeno, že MYPPPY vzor u CTLA4 a CD28 je rozhodující pro vazbu na CD80, ale určité nezachované aminokyselinové zbytky v oblastech CTLA4 podobajících se CDR-1 a CDR-3 byly také zodpovědné za zvýšenou vazebnou aviditu CTA4 k CD80.

Bylo ukázáno, že CTLA4Ig účinně blokuje kostimulaci T buněk spojenou s CD80, ale nebyl tak účinný při blokování odezev spojených s CD86. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4, zvláště ty mající vyšší aviditu pro CD86 než pro standardní typ CTLA4 byly vytvořeny, aby mohly co možná nejlépe blokovat aktivaci antigenem specificky aktivovaných buněk oproti CTLA4Ig.

Z výše uvedeného vyplývá, že existuje potřeba zlepšit molekuly CTLA4 tak, aby poskytovaly lepší farmaceutické prostředky pro imunitní supresi a léčbu rakoviny než dříve známé rozpustné formy CTLA4.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4, které se váží na CD80 a/nebo CD86. Mezi molekuly mutantu patří ty, které mohou rozpoznat a navázat se buď na CD80 nebo na CD86, nebo na oba. V některých provedeních molekuly mutantu se váží na CD80 a/nebo CD86 s větší aviditou než CTLA4.

Jedním příkladem molekuly mutantu CTLA4 je L104EA29YIg (obrázek 7), jak je popsáno v tomto vynálezu.

Dalším příkladem molekuly mutantu CTLA4 je L104EIg (obrázek 8), jak je popsáno v tomto vynálezu. LlO4EA29YIg a LlO4EIg se váží na CD80 a CD86 intenzivněji než CTLA4Ig.

• · · ·

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 zobrazuje rovnovážnou vazebnou analýzu

L104EA29YIg, LlO4EIg a standardního CTLA4Ig na CD86lg.

Obrázky 2A a 2B objasňují údaje z FACS zkoušek ukazujících vazbu L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské buňky CHO transfekované CD80 nebo CD86, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázky 3A a 3B znázorňují inhibicí proliferace CD80pozitivních a CD86-pozitivních CHO buněk, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázky 4A a 4B ukazují, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig při inhibicí proliferace primárních a sekundárních alostimulovaných T buněk, jak je popsáno dále v příkladu

2.

Obrázky 5 A-C ukazují, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig při inhibicí tvorby cytokinů IL-2 (obr. 5A), IL-4 (obr. 5B) a γ-interferonu (obr. 5C) v alostimulovaných lidských T buňkách, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázek 6 ukazuje, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig při inhibicí proliferace fytohemaglutininu -(PHA) stimulovaného opičími T buňkami, jak je popsáno dále v příkladu 2.

Obrázek 7 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci molekuly mutantu CTLA4 (L104EA29YIg) obsahující signální peptid; mutovanou extracelulární doménu CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo začínající alaninem v

poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124; a Ig oblast, jak je popsáno dále v příkladu 1.

Obrázek 8 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci molekuly mutantu CTLA4 (LlO4EIg) obsahující signální peptid; mutovanou extracelulární doménu CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124; a Ig oblast, jak je popsáno dále v příkladu 1.

Obrázek 9 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci CTLA4Ig mající signální peptid; standardní aminokyselinovou sekvenci extracelulární domény CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124; a Ig oblast.

Obrázky 10A-C:

Obrázek 10A je SDS gel: CTLA4Ig (pruh 1), L104EIg (pruh 2) a L104EA29YIg (pruh 3);

Obrázek 10B a 10C - vylučovací chromatografie chromatogramy: CTLA4Ig - obr. 10B a L104EA29YIg - obr.

10C.

Obrázky 11A a 11B zobrazují stužkový diagram CTLA4 extracelulárního Ig V-násobně vytvořeného ze struktury roztoku stanovené NMR spektroskopií. Obr. 11B zobrazuje detailní pohled na oblast S25-R33 a oblast MYPPPY označující umístění a orientaci postranního řetězce mutace, která zvyšuje aviditu L104 a A29.

Obrázek 12 popisuje schématický diagram vektoru, piLNLEA29Y, ve kterém je obsažen inzert L104EA29YIg.

• · * «· ·

Podrobný popis vynálezu

Definice

Dále bude specifikován význam slov nebo frází používaných v tomto popisu vynálezu.

„Standardní typ CTLA4 má aminokyselinovou sekvenci přirozeně se vyskytujícího, nezkráceného CTLA4 (U.S. patentové spisy č. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), nebo jeho extracelulární domény, který váže CD80 a/nebo CD86 a/nebo ruší vazbu CD80 a/nebo CD86 na jejich ligandy. V určitých provedeních extracelulární doména standardního typu CTLA4 začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124 nebo extracelulární doména standardního CTLA4 začíná alaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124. Standardní CTLA4 je buněčný povrchový protein, která má N-koncovou extracelulární doménu, transmembránovou doménu a Ckoncovou cytoplazmatickou doménu. Extracelulární doména se váže na cílové antigeny, jako je CD80 a CD86. V buňce přirozeně se vyskytující je standardní CTLA4 protein překládán translací jako nezralý polypeptid, který obsahuje signální peptid na N-konci. Nezralý polypeptid podléhá posttranslačnímu zpracování, které zahrnuje štěpení a odstranění signálního peptidu za vzniku štěpného produktu CTLA4, který má nově vytvořený N-konec, který se liší od N-konce v nezralé formě. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že k dalšímu posttranslačnímu zpracování může docházet po odstranění jedné nebo více aminokyselin z nově vytvořeného N-konce štěpného produktu CTLA4. Zralá forma molekuly CTLA4 obsahuje extracelulární doménu nebo jakoukoliv její část, která se váže na CD80 a/nebo CD86.

„CTLA4Ig je rozpustný fúzní protein obsahující extracelulární doménu standardního typu CTLA4 nebo její část, která se váže na CD80 a/nebo CD86, přičemž je • · · ·

napojen na konec Ig. Určité provedení obsahuje extracelulární doménu standardního typu CTLA4, která začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124; nebo začíná alaninem v poloze 1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124; napojení gluaminového kyselinového zbytku v poloze +125; a imunoglobulinovou část obsahující kyselinu glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357 (Obrázek 9).

„Fúzní protein je definován jako jedna nebo více aminokyselinových sekvencí spojených za použití způsobů dobře známých v oboru a jak je popsáno v U.S. patentovém spise č. 5,434,131 nebo 5,637,481. Spojené aminokyselinové sekvence tímto vytváří jeden fúzní protein.

„Molekula mutantu CTLA4 je molekula, kterou může být celá molekula CTLA4 nebo jejich části (deriváty nebo fragmenty), která mají mutaci nebo více mutací v CTLA4 (výhodně v extracelulární doméně CTLA4), takže je podobná, ale není identická se standardní molekulou CTLA4. Molekuly mutantu se váží buď na CD80 nebo na CD86, nebo na oba antigeny. Molekuly mutantu CTLA4 mohou obsahovat biologicky nebo chemicky aktivní cizí molekulu odlišnou od CTLA4, která je zabudována uvnitř nebo je připojena. Molekuly mutantu mohou být rozpustné (tj. cirkulující) nebo navázané na povrch. Molekuly mutantu CTLA4 mohou obsahovat celou extracelulární doménu CTLA4 nebo její části, jako jsou například fragmenty nebo deriváty. Molekuly mutantu CTLA4 mohou být připraveny synteticky nebo rekombinantně.

„Mutace je změna nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence standardního polypeptidu. V tomto případě to je změna standardní extracelulární domény CTLA4. Tato změna může být aminokyselinová změna jako jsou substituce, delece, adice nebo trunkace (zkomolení). Molekula mutantu může mít jednu nebo více mutací. Mutace v nukleotidové

sekvenci mohou, ale nemusí mít za následek mutaci v aminokyselinové sekvenci, jak je dobře známo odborníkům v oboru. Z tohoto hlediska určité nukleotidové kodony kódují stejnou aminokyselinu. Například nukleotidové kodony CGU, CGG, CGC a CGA kódují aminokyselinu arginin (R); nebo kodony GAU a GAC kódují aminokyselinu kyselinu asparagovou (D). Tak protein může být kódován jednou nebo více molekulami nukleové kyseliny, které se liší v jejich specifické nukleotidové sekvenci, ale přesto kódované molekuly proteinu mají identické sekvence. Sekvence kódující aminokyseliny jsou následující:

Aminokyselina	Symbol	Jednopísmenný	Kodony
Alanin	Ala	A	GCU, GCC, GCA, GCG
Cystein	Cys	C	UGU, UGC
Asparagová	Asp	D	GAU, GAC
Glutamová	Glu	E	GAA, GAG
Fenylalanin	Phe	F	UUU,UUC
Glycin	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Histidin	His	H	CAU, CAC
Isoleucin	Ile	I	AUU, AUC, AUA
Lysin	Lys	K	AAA, AAG
Leucin	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC,
Methionin	Met	M	AUG
Asparagin	Asn	N	AAU, AAC
Prolin	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamin	Gin	Q	CAA, CAG
Arginin	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG,
Serin	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG,
Threonin	Thr	T	ACU, ACC, ACA, ACG
Valin	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG

— · ·

Tryptofan	Trp	W	UGG
Tyrosin	Tyr	Y	UAU, UAC

„Extracelulární doména CTLA4 je část CTLA4, která rozpoznává a váže CD80 a/nebo CD86. Například extracelulární doména CTLA4 začíná methioninem v poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 9). Alternativně extracelulární doména začíná alaninem v poloze -1 a končí kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 9). Extracelulární doména obsahuje fragmenty nebo deriváty CTLA4, které váží CD80 a/nebo CD86.

Proteinová sekvence ne-CTLA4 nebo „molekula neCTLA4 je definována jako jakákoliv molekula, která neváže CD80 a/nebo CD86 a neinterferuje s vazbou CTLA4 na její cíl. Takovým neomezujícím příkladem je například konstantní oblast imunoglobulinu (Ig) nebo její část. Výhodně je konstantní oblastí Ig lidská nebo opičí konstantní oblast Ig, jako je například lidská C(gama)l, včetně oblastí pantové, CH2 a CH3. Tato konstantní oblast Ig může být mutována pro snížení jejich efektorových funkcí (U.S. patentové spisy 5, 637,481 a 6, 132,992) .

„Fragment molekuly mutantu CTLA4 je část molekuly mutantu CTLA4, výhodně extracelulární doména CTLA4 nebo její část, která rozpoznává a váže se na její cíl, jako je například CD80 a/nebo CD86.

„Derivát molekuly mutantu CTLA4 je molekula, která má alespoň 70% sekvenční podobnost a funkce jako extracelulární doména CTLA4, tj. že rozpoznává a váže CD80 a/nebo CD86.

„Část molekuly CTLA4 obsahuje fragmenty nebo deriváty molekuly CTLA4, která váže CD80 a/nebo CD86.

• · · · · · • · · — ·

Z důvodu lepšího pochopení tohoto vynálezu je dále uveden následující popis.

Kompozice podle vynálezu

Tento vynález poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4, které rozpoznávají a váží CD80 a/nebo CD86. V některých provedeních mají rozpustné mutanty CTLA4 vyšší aviditu k CD80 a/nebo CD86 než CTLA4Ig.

Mezi příklady molekul mutantu CTLA4 patří L104EA29YIg (obrázek 7). Aminokyselinová sekvence L104EA29YIg může začínat alaninem v aminokyselinové poloze -1 a končit lysinem v aminokyselinové poloze +357. Alternativně aminokyselinová sekvence LlO4EA29YIg může začínat methioninem v aminokyselinové poloze +1 a končit lysinem v aminokyselinové poloze +357. CTLA4 část LlO4EA29YIg začíná methioninem v aminokyselinové poloze +1 a končí kyselinou asparagovou v aminokyselinové poloze +124. L104EA29YIg obsahuje spojení aminokyselinového zbytku glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357 (obrázek 7). L104EA29YIg se váže přibližně 2 krát intenzivněji než standardní typ CTLA4Ig (dále označovaný jako CTLA4Ig) na CD80 a přibližně 4 krát intenzivněji na CD86. Tato silnější vazba L104EA29YIg způsobuje, že je účinnější než CTLA4Ig při blokování imunitních reakcí.

Molekuly mutantu CTLA4 obsahují alespoň extracelulární doménu CTLA4 nebo její části, které váží CD80 a/nebo CD86. Extracelulární část molekuly mutantu CTLA4 obsahuje aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 7 nebo 8). Alternativně extracelulární část CTLA4 může obsahovat aminokyselinovou • · · · · · • · · • · · ·* ···· • · · · · · · • · · · · · •· ·«· ·· · sekvenci začínající alaninem v poloze -1 končící kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 7 nebo 8).

V jednom provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 je fúzním proteinem obsahujícím extracelulární doménu CTLA4, která má jednu nebo více mutací v oblasti aminokyselinové sekvence začínající serinem v poloze +25 a končící argininem v poloze +33 (S25-R33). Například alanin v poloze +29 standardního CTLA4 může být substituován (nahrazen) tyrosinem (kodony UACJ, UAC). Alternativně alanin může být substituován leucinem (kodony: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), fenylalaninem (kodony: UUU, UUC), tryptofanem (kodon: UGG) nebo threoninem (kodony: ACU,

ACC, ACA, ACG). Odborníkovi v oboru je zřejmé, že uracilový nukleotid (CJ) sekvence RNA odpovídá thyminovému nukleotidu (T) sekvence DNA.

V dalším provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 je fúzním proteinem obsahujícím extracelulární doménu CTLA4, která má jednu nebo více mutací uvnitř nebo blízko oblasti aminokyselinové sekvence začínající methioninem v poloze +97 a končící glycinem v poloze +107 (M97-G107). Například leucin v poloze +104 standardního CTLA4 může být substituován kyselinou glutamovou (kodony: GAA, GAG). Molekula mutantu CTLA4 s touto substitucí je označována v tomto textu jako LlO4EIg (Obrázek 8).

V ještě dalším provedení rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 je fúzní protein obsahující extracelulární doménu CTLA4, která má jednu nebo více mutací v oblastech S25-R33 a M97-G107. Například v jednom provedení molekula mutantu CTLA4 obsahuje tyrosin v poloze +29 místo alaninu a kyselinu glutamovou v poloze +104 místo leucinu. Molekula mutantu CTLA4 s těmito substitucemi je označována v tomto textu jako LlO4EA29YIg (obrázek 7). Molekula nukleové kyseliny, která kóduje L104EA29YIg je obsažena v pD16L104EA29YIg a byla uložena 19. června 2000 do Americké •I · ·* ΦΦΦΦ φ* ····

Φ > · · Β φ φ ·Φ φ • φ · ΦΦΦ Φ · Φ Φ

Φ« ΦΦΦ ΦΦ Φ Φ· ·· sbírky typů kultur (American Type Culture Collection ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110 -2209 (ATCC č. PTA-2104). Vektor pDl6L104EA29YIg je odvozen z vektoru pcDNA3 (INVITROGEN).

Tento vynález dále poskytuje rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 obsahující extracelulární doménu mutantu CTLA4, jak je znázorněna na obrázku 7 nebo 8, nebo její část (i) a část, která mění rozpustnost, afinitu a/nebo mocenství molekuly mutantu CTLA4.

V souladu s aplikací tohoto vynálezu touto částí může být konstantní oblast imunoglobulinu nebo její část. Pro použití in vivo je výhodné, aby konstantní oblast imunoglobulinu nevyvolávala nežádoucí imunitní reakci v subjektu. Například v klinických zkouškách může být výhodné, aby molekuly mutantu obsahovaly konstantní oblasti lidského a opičího imunoglobulinu. Jedním příkladem vhodné oblasti imunoglobulinu je lidská C(gama)l, která obsahuje oblasti pantovou, CH2 a CH3.

Další ízotypy jsou možné. Dále jsou možné další konstantní oblasti imunoglobulinu (výhodně slabě nebo neimunogenní konstantní oblasti imunoglobulinu).

Další části obsahují polypeptitové značky („tags). Mezi vhodné značky například patří molekula p97, molekula env gpl20, molekula E7 a molekula ova (Dash, B., a kol., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1389-97; Ikeda, T., a kol., 1994, Gene, 138: 193-6; Falk, K., a kol., 1993, Cell. Immunol., 150: 447-52; Fujisaka, K. a kol., 1994, Virology, 204: 789-93). Další molekuly pro použití jako značky jsou možné (Gerard, C. a kol., 1994, Neuroscience, 62: 721-739; Byrn R. a kol., J. Virol., 1989, 63:4370-4375; Smith D. a kol., 1987, Science, 238: 1704-1707; Lásky, L., 1996, Science, 233:209-212) .

00 0 0 >· ·*r · *0 ·

9000 * · 0 0» · • ee 000 e · 0 > 0 0 * 0 00 0 * >0 0 000 0000

0· >00 00 0 0 · ··

Tento vynález dále poskytuje rozpustné fúzni proteiny mutantu CTLA4, které jsou výhodně reaktivnější s antigenem CD80 a/nebo 86 ve srovnání se standardním CTLA4. Jedním příkladem je L104EA29YIg, jak je znázorněno na obrázku 7.

V dalším provedení rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje spojovací aminokyselinový zbytek, který je umístěn mezi částí CTLA4 a imunoglobulinovou částí. Spojovací aminokyselinou může být jakákoliv aminokyselina včetně glutaminu. Tato spojovací aminokyselina může být zavedena způsoby molekulární nebo chemické syntézy, které jsou známy v oboru.

V dalším provedení rozpustná molekula mutantu obsahuje imunoglobulinovou část (například pantovou, CH2 a CH3 doménu), kde kterýkoliv nebo všechny cysteinové zbytky v pantové doméně imunoglobulínové části jsou substituovány serinem, například cysteiny v polohách +130, +136, +139 (obrázek 7 nebo 8). Tato molekula mutantu může také obsahovat prolin v poloze +148, který je substituován serinem, jak je znázorněno na obrázku 7 nebo 8.

Rozpustná molekula mutantu CTLA4 může obsahovat signální peptidovou sekvenci spojenou s N-koncem extracelulární domény CTLA4 části molekuly mutantu. Signálním peptidem může být jakákoliv sekvence, která umožní vylučování molekuly peptidu, jako je signální peptid z onkostatinu M (Malik, a kol., 1989, Molec. Cell Biol., 9: 2847-2853) nebo CD5 (Jones, N.H. a kol., 1986, Nátuře, 323: 346-349), nebo signální peptid z jakéhokoliv extracelulárního proteinu.

Molekula mutantu může obsahovat signální peptid onkostatin M spojený s N-koncem extracelulární domény CTLA4 a molekulu lidského imunoglobulinu (například panovou, CH2 a CH3) spojenou s C-koncem extracelulární domény CTLA4. Tato molekula obsahuje signální peptid • · · · · · ···· • · · · ·· · · • · · · ♦ · ->

onkostatin M s aminokyselinovou sekvencí začínající methioninem v poloze

-26 a končící alaninem v poloze -1, CTLA4 část obsahuje aminokyselinou sekvenci začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část obsahující aminokyselinovou sekvenci začínající kyselinu glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu mohou být připraveny molekulárními a chemickými způsoby syntézy. Molekulární způsoby mohou zahrnovat následující kroky: zavedení molekuly nukleové kyseliny do vhodné hostitelské buňky, kde se exprimuje a kóduje rozpustnou molekulu mutantu CTLA4; kultivaci hostitelské buňky za podmínek, které umožňují expresi molekul mutantu v hostitelské buňce; a izolaci exprimovaných molekul mutantu. Část signálního peptidu molekuly mutantu umožňuje, aby molekuly proteinu byly exprimovány na buněčném povrchu a byly vylučovány hostitelskou buňkou. Translací vytvořené molekuly mutantu mohou být posttranslačně modifikovány, jako je například odštěpení signálního peptidu za vzniku zralého proteinu majícího CTLA4 a imunoglobulinovou část. Ke štěpení může docházet za alaninm v poloze -1, čímž vzniká zralá molekula mutantu mající methionin v poloze +1 jako první aminokyselinu (obrázek 7 nebo 8). Alternativně ke štěpení může docházet za methioninem v poloze -2, čímž vzniká zralá molekula mutantu mající alanin v poloze -1 jako první aminokyselinu.

Ve výhodném provedení je rozpustná molekula mutantu CTLA4 mající extracelulární doménu lidského CTLA4 spojena s celou molekulou nebo částí molekuly lidského imunoglobulinu (například pantovou, CH2 a CH3). Tato • · ···· ♦ · ···«

výhodná molekula obsahuje CTLA4 část rozpustné molekuly složené z aminokyselinové sekvence začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulární doménu CTLA4 je mutovaná tak, že alanin v poloze +29 je substituován tyrosinem a leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou.

Imunoglobulinová část molekuly mutantu může být mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136 a +139 jsou substituovány serinem a prolin v poloze +148 je substituován serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EA29YIg (obrázek 7).

V dalším provedení má molekula mutantu LlO4EA29YIg aminokyselinovou sekvenci začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulární doménu CTLA4 je mutována tak, že alanin v poloze +29 je nahrazen tyrosinem a leucin v poloze +104 je nahrazen kyselinou glutamovou. Imunoglobulinová část molekuly mutantu je mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136 a +139 jsou nahrazeny serinem a prolin v poloze +148 je nahrazen serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EA29YIg (obrázek 7). Po odštěpení signální sekvence L104EA29YIg může buď začínat methioninem v poloze +1 nebo začíná alaninem v poloze -1.

Další molekulou mutantu podle tohoto vynálezu je rozpustná molekula mutantu CTLA4 mající extracelulární doménu lidského CTLA4 spojenou s molekulou lidského imunoglobulinu (například pant, CH2, CH3). Tato molekula

- 17 • «· ···· « « 9 9 9 9 • · » · · ·« • C · · · · · ····· ··» · • · · Γ· ···« • · * 9 ? · ', · · * obsahuje část aminokyselinové sekvence kódující CTLA4 začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část obsahující aminokyselinovou sekvenci začínající kyselinou glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulární doménu CTLA4 je mutována tak, že leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou. Pantová část molekuly mutantu je mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136, +139 jsou substituovány serinem a prolin v poloze +148 je substituován serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EIg (obrázek 8).

V alternativním provedení L104EIg je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 mající extracelulární doménu lidského CTLA4 spojenou s molekulou lidského proteinu (např. pant, CH2 a CH3). Tato výhodná molekula obsahuje CTLA4 část skládající se z aminokyselinové sekvence začínající alaninem v poloze -1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminu v poloze +125 a imunoglobulinovou část začínající kyselinu glutamovou v poloze +126 a končící lysinem v poloze +357. Část obsahující extracelulární doménu CTLA4 je mutována tak, že leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou. Pantová část molekuly mutantu je mutována tak, že cysteiny v polohách +130, +136 a +139 jsou substituovány serinem a prolin v poloze +148 je substituován serinem. Tato molekula mutantu je v tomto textu označena jako L104EIg (obrázek 8).

Dále tento vynález poskytuje rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 mající: a) první aminokyselinovou sekvenci membránového glykoproteinu, například CD28, CD86, CD80, CD40 a gp39, který blokuje proliferaci T buněk, fúzovanou s druhou aminokyselinovou sekvencí; b) druhá

aminokyselinová sekvence je fragmentem extracelulámí domény mutantu CTLA4, který blokuje proliferaci T buněk, jako je například molekula aminokyseliny začínající methioninem v poloze +1 a končící kyselinou asparagovou v poloze +124 (obrázek 7 nebo 8); a třetí aminokyselinovou sekvenci, která působí jako identifikační značka nebo zvyšuje rozpustnost molekuly. Například třetí aminokyselinová sekvence se může v podstatě skládat z aminokyselinových oblastí pantové, CH2 a CH3 neimunogenní molekuly imunoglobulinu. Mezi příklady vhodných molekul imunoglobulinu například patří lidský nebo opičí imunoglobulin, jako je C(gama)l. Další izotypy jsou také možné.

Tento vynález dále pokytuje molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence odpovídající rozpustným molekulám mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu. V jednom provedení je molekula nukleové kyseliny DNA (například cDNA) nebo její hybrid. Alternativně jsou molekulami nukleové kyseliny RNA nebo její hybridy.

Dále tento vynález poskytuje vektor, který obsahuje nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu. Také je poskytnut hostitelský vektorový systém. Hostitelský vektorový systém zahrnuje vektor podle tohoto vynálezu ve vhodné hostitelské buňce. Mezi příklady vhodných hostitelských buněk například patří prokaryotické a eukaryotické buňky.

Tento vynález poskytuje farmaceutické prostředky (kompozice) pro použití při léčbě nemocí imunitního systému, přičemž tyto prostředky obsahují farmaceuticky účinné množství rozpustných molekul mutantu CTLA4. V určitých provedeních jsou nemoci imunitního systému zprostředkovány interakcemi CD28- a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s pozitivními buňkami CD80 a/nebo CD86. Rozpustnými molekulami mutantu CTLA4 jsou výhodně molekuly CTLA4 mající jednu nebo více mutací v extracelulární oblasti CTLA4. Farmaceutický prostředek může obsahovat rozpustné proteinové molekuly mutantu CTLA4 a/nebo molekuly nukleové kyseliny a/nebo vektory kódující tyto molekuly. Ve výhodných provedeních rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mají aminokyselinovou sekvenci extracelulární domény CTLA4, jak je znázorněna na obrázku 7 a 8 (L104EA29Y nebo L104E). Výhodněji je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 L104EA29YIg, jak je popsáno v tomto textu. Tyto prostředky mohou dále obsahovat další terapeutická činidla, jako jsou například léčivé toxiny, enzymy, protilátky nebo konjugáty (bez omezení na tyto příklady).

Farmaceutické kompozice také výhodně obsahují nosiče a pomocné látky, což jsou jakékoliv látky, které po sloučení s molekulou podle tohoto vynálezu (například rozpustnou molekulou mutantu CTLA4, jako je L104EA29Y nebo L104E) zachovají molekulovou aktivitu a nereagují s imunitním systémem subjektu (pacienta). Mezi neomezující příklady vhodných nosičů a pomocných látek například patří lidský sérový albumin, iontoměniče, oxid hlinitý (alumina), lecithin, pufrovací látky, jako jsou fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný a soli nebo elektrolyty, jako je protaminsulfát. Mezi další příklady patří jakékoliv standardní farmaceutické nosiče, jako je fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, voda, emulze, jako je emulze olej/voda; a různé typy smáčedel. Dalšími nosiči mohou také být sterilní roztoky, tablety včetně potažených tablet a kapslí. Obvykle takové nosiče obsahují vehikula, jako je škrob, mléko, cukr, určité druhy jílu, želatina, kyseliny stearová nebo její soli, staerat hořečnatý nebo vápenatý, mastek, rostlinné tuky nebo oleje, gumy, glykoly nebo další známá vehikula. Takové nosiče mohou také zahrnovat aromatizační a barevná aditiva nebo jiné složky.

Prostředky obsahující takové nosiče jsou připraveny dobře známými konvenčními způsoby. Takové prostředky mohou také být zabudovány do různých tukových kompozic jako jsou například liposomy a rovněž i různých polymerních kompozic, jako jsou polymerní mikrokuličky.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být podávány běžnými subjektu způsoby podávání, jako je například intravenózní aplikace, intraperitoneální aplikace, intramuskulární aplikace, subkutánní aplikace, orální aplikace, podávání pomocí čípků, místní podávání nebo podávání implantačním zařízením pro pomalé uvolňovaní, jako je miniosmotická pumpa.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být v různých dávkovačích formách jako jsou například kapalné roztoky nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, čípky, polymerní mikrokapsle nebo mikrovezikuly, liposomy a injektovatelné nebo infuzní roztoky. Výhodná forma závisí na způsobu podávání a terapeutické aplikaci.

Nejúčinnější způsob podávání a dávkovači schéma prostředků podle tohoto vynálezu závisí na intenzitě a průběhu nemoci, pacientově zdravotním stavu, reakci na léčbu a posouzení ošetřujícím lékařem. Z tohoto důvodu by dávkování prostředků mělo být upravováno podle individuálního subjektu.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mohou být podávány subjektu v množství a čase (například časový interval a četnost) dostatečném pro blokování endogenních molekul B7 (jako je například CD80 a/nebo CD86) od vazby na jejich ligandy. Blokováním vazby endogenní B7/ligand dochází k inhibici interakcí mezi B7-pozitivními buňkami (jako jsou například CD80- a/nebo CD86-pozitivní buňky) a pozitivními buňkami CD28 a/nebo CTLA4. Dávkování terapeutického činidla je závislé na mnoho faktorech, jako je například

typ postižené tkáně, typ léčené autoimunitní nemoci, intenzitě nemoci, pacientově zdravotním stavu a pacientově reakci na léčbu těmito činidly. Proto se dávkování těchto činidel může lišit v závislosti na subjetku a způsobu podávání. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mohou být podávány v množství od 0,1 do 20,0 mg/kg hmotnosti pacienta/den, výhodně od 0,5 do 10,0 mg/kg/den. Podávání farmaceutických prostředků podle tohoto vynálezu může být prováděno v různých časových intervalech. V jednom provedení může být farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu podávána jednu či více hodin. Dále podávání může být opakováno v závislosti na intenzitě nemoci a rovněž i na dalších faktorech, které jsou známy odborníkovi v oboru.

Tento vynález dále poskytuje způsoby přípravy proteinu, které zahrnují růst hostitelského vektorového systému podle tohoto vynálezu za produkce proteinu v hostiteli a odebírání takto připraveného proteinu.

Dále tento vynález poskytuje způsoby regulace funkčních interakcí CTLA4- a CD28-pozitivních T buněk s CD80- a/nebo CD86-pozitivními buňkami. Tento způsob zahrnuje kontakt CD80- a/nebo CD86-pozitivních buněk s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu tak, aby byly vytvořeny komplex mutantu CTLA4/CD80 a/nebo komplex mutantu CTLA4/CD86, přičemž tyto komplexy interferují s reakcí endogenního antigenu CTLA4 s CD80 a/nebo CD86, a/nebo interferují s reakcí endogenního antigenu CD28 s CD80 a/nebo CD86. V jednom provedení tohoto vynálezu je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 fúzní protein, který obsahuje alespoň část extracelulární domény mutantu CTLA4. V dalším provedení rozpusná molekula mutantu CTLA4 obsahuje: první aminokyselinovou sekvenci zahrnující extracelulární doménu CTLA4 z aminokyselinové sekvence začínající methioninem v poloze +1 a končící • · · · ·>« kyselinou asparagovou v poloze +124, zahrnující alespoň jednu mutaci; a druhou aminokyselinovou sekvenci zahrnující oblasti pantové, CH2 a CH3 molekuly lidského imunoglobulinu gama 1 (obrázek 7 nebo 8) .

Při aplikaci tohoto vynálezu jsou CD80- nebo CD86pozitivní buňky kontaktovány s fragmenty nebo deriváty rozpustných molekul mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu. Alternativně je rozpustná molekula mutantu CTLA4 fúzním proteinem CD28Ig/CTLA4Ig majícím první aminokyselinovou sekvenci odpovídající části extracelulární domény receptoru CD28 spojenou s druhou aminokyselinovou sekvencí odpovídající části extracelulární domény receptoru mutantu CTLA4 a třetí aminokyselinovou sekvenci odpovídající oblastem pantové, CH2 a CH3 lidského imunoglobulinu Cgama-1.

Očekává se, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 budou vykazovat inhibíční vlastnosti in vivo. Za podmínek, kde dochází k interakcím T buňka/APC buňka, například interakcím T buňka/B buňka, jako výsledku kontaktu mezi T buňkami a APC buňkami, vazba zavedených molekul mutantu k reagování s CD80- a/nebo CD86- pozitivními buňkami, například B buňkami, může interferovat, t.j. inhibovat interakce T buňka/APC buňka, což má za následek regulaci imunitních odezev.

Tento vynález poskytuje způsoby snižování rozsahu imunitních odezev. Regulace směřující ke snižování imunitní odezvy rozpustnými molekulami CTLA4 může probíhat prostřednictvím inhibice nebo blokování imunitní odezvy již probíhající nebo může zahrnovat zabránění indukce imunitní odezvy. Rozpustné molekuly CTLA4 podle tohoto vynálezu mohou inhibovat funkce aktivovaných T buněk, jako je proliferace T lymfocytů a vylučování cytokinů, potlačením odezev T buněk nebo vyvoláním specifické tolerance u T buněk, čí oběma způsoby.

Tento vynález dále poskytuje způsoby léčby nemocí imunitního systému a vyvolání tolerance. V určitých případech jsou nemoci imunitního systému zprostředkovány interakcemi CD28- a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s CD80/CD8β-pozitivními buňkami. V dalším provedení jsou inhibovány interakce T buněk. Mezi nemoci imunitního systému například patří autoimunitní choroby, imunoproliferační nemoci, poruchy spojené s transplantací štěpu. Tyto způsoby zahrnují podávání rozpustných molekul mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu subjektu za účelem regulace interakcí T buněk s CD80- a/nebo CD86-pozitivními buňkami. Alternativně může být podáván hybrid mutantu CTLA4 mající membránový glykoprotein spojený s molekulou mutantu CTLA4. Mezi příklady nemocí spojených s transplantací štěpu patří transplantační reakce příjemce vůči štěpu (graft versus host disease GVHD)(například může být způsobena transplantací kostní dřeně nebo při vyvolání tolerance), imunitní poruchy spojené s odhojením transplantovaného štěpu, chronická odmítnutí a tkáňové nebo buněčné alo- nebo xenoimplantáty zahrnující pevné orgány, kůži, ostrůvky, svaly, hepatocyty, neurony. Mezi příklady imunoproliferačních nemocí například patří lupenka; T buněčný lymfom; T buněčná akutní lymfoblastická leukémie; testikulární angiocentrický T buněčný lymfom; benigní lymfocytická angiitída; a autoimunní choroby jako je lupus (například lupus erythematosus, lupus nefritis), Hashimotova thyroiditida, primární myxedém, Gravesova choroba, zhoubná anémie, autoimunitní atrofická gastritida, Addisonova choroba, cukrovka (například insulin dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I), syndrom dobrých pastvin, myastenie gravis, pemfigus, Crohnova choroba, sympatická oftalmie, autoimunitní uveitida, roztroušená skleróza, autoimunitní hemolytická anémie, idiopatická thrombocytopenie, primární biliární cirhóza, chronická hepatitida, ulcerativní kolitida, Sjogrenův syndrom, revmatické onemocnění (jako například revmatická artritida), polymyozitida, sklerodermie a smíšené onemocnění pojivové tkáně.

Tento vynález také poskytuje způsob inhibice transplantačního odmítnutí pevných orgánů a/nebo tkání subjektem, tímto subjektem je příjemce transplantované tkáně. Obvykle je odmítnutí štěpu u tkáňových transplantátů iniciováno prostřednictvím jeho rozpoznáním jako cizí T buňkami, potom následuje imunitní reakce, která zničí tento štěp. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu mohou inhibováním proliferace T lymfocytů a/nebo sekrece cytokinu snížit destrukci tkáně a vyvolat útlum antigen-specifických T buněk, což může mít za následek dlouhodobé přijetí štěpu bez nutnosti celkové imunosuprese. Dále mohou být podávány rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu s dalšími léčivými přípravky, jako jsou například kortikoidy, cyklosporin, rapamycin, mykofenolát, mofetil, azathioprin, takrolismus, baziliximab a/nebo další biologické látky.

Tento vynález také poskytuje způsoby inhibice transplantační reakce příjemce vůči štěpu u subjektu.

Tento způsob zahrnuje podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu subjektu, a to buď samostatně nebo společně s dalšími přídavnými ligandy reagujícími s IL-2, IL-4 nebo γ-interferonem. Například rozpustná molekula mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu může být podávána příjemci transplantátu kostní dřeně z důvodu inhibice aloreaktivity donorových T buněk. Alternativně může být způsobeno, aby dárcovské T buňky v kostní dřeni byly tolerovány aloantigeny příjemce ex vivo před transplantací.

Inhibice odezev T buněk rozpustnými molekulami mutantu CTLA4 může také být užitečná při léčbě autoimunitních poruch. Mnoho autoimunítních poruch vzniká

nevhodnou aktivací T buněk, které jsou reaktivní vůči autoantigenům, a které podporují produkci cytokinů a protilátek, které jsou zapojeny v patologii této nemoci. Podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 subjektu trpícímu nebo vnímavému na autoimunitní poruchu může zabránit aktivaci autoreaktivních T buněk a může snížit nebo eliminovat symptomy nemoci. Tento způsob také zahrnuje podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu subjektu, a to buď samotné nebo společně s dalšími přídavnými ligandy reagujícími s IL-2, IL-4 nebo γinterferonem.

Tento vynález dále poskytuje použití rozpustných molekul mutantu CTLA4 společně s dalšími imunosupresivními látkami, jako je například cyklosporin (viz Mathiesen: „Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats (1989), Cancer Lett., 44:

151-156), prednison, azathioprin a methotrexat (R.

Handschumacher „Chapter 53: Drugs Ušed for

Immunosuppression, s. 1264-1276). Další imunosupresivní látky jsou možné. Například při léčbě revmatické artritidy mohou být rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podávány společně s farmaceutickými látkami, jako jsou například kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá léčiva/Cox-2 inhibitory, methotrexat, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, infliximab, anakinra, azathioprin a/nebo další biologické látky jako je anti-TNF. Při léčbě systematického lupus eryhtematodes mohou být podávány rozpustné molekuly mutantu CTLA4 společně s farmaceutickými přípravky jako jsou například kortikosteroidy, cytoxan, azathioprin, hydroxychlorochin, mykofenolat mofetil a/nebo další biologické látky. Dále při léčbě systematické roztroušené sklerózy mohou být podávány rozpustné molekuly mutantu CTLA4 společně s

farmaceutickými přípravky, jako jsou například kortikosteroidy, interferon beta-la, interferon beta-lb, glatirameracetat, mitoxantronhydrochlorid a/nebo další biologické látky.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 (výhodně L104EA29YIg) mohou být také použity společně s jedním nebo více z následujících činidel pro regulaci imunitní odezvy: rozpustný gp39 (také známý jako CD40 ligand (CD40L),

CD154, T-BAM, TRAP), rozpustný CD29, rozpustný CD40, rozpustný CD80, rozpustný CD86, rozpustný CD28, rozpustný CD56, rozpustný Thy-1, rozpustný CD3, rozpustný TCR, rozpustný VLA-4, rozpustný VCAM-1, rozpustný LECAM-1, rozpustný ELAM-1, rozpustný CD44, protilátky reagující s gp39, protilátky reagující s CD40, protilátky reagující s B7, protilátky reagující s CD28, protilátky reagující s LFA-1, protilátky reagující s LFA-2, protilátky reagující s IL-2, protilátky reagující s IL-12, protilátky reagující s IFN-gama, protilátky reagující s CD2, protilátky reagující s CD48, protilátky reagující s ICAM (například ICAM-2), protilátky reagující s CTLA4, protilátky reagující s Thy-1, protilátky reagující s CD56, protilátky reagující s CD3, protilátky reagující s CD29, protilátky reagující s TCR, protilátky reagující s VLA-4, protilátky reagující s VCAM-1, protilátky reagující s LECAM-1, protilátky reagující s ELAM-1, protilátky reagující s CD44. V určitých provedeních jsou výhodné monoklonální protilátky. V jiných provedeních jsou výhodné fragmenty protilátek. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že tato kombinace může zahrnovat rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu a jedno další ímunosupresívní činidlo, rozpustné molekuly mutantu CTLA4 se dvěma dalšími imunosupresivními činidly, rozpustné molekuly mutantu CTLA4 se třemi dalšími imunosupresivními činidly, atd. Stanovení optimální kombinace a dávkování může být prováděno a optimalizováno s použitím způsobů dobře známých v oboru.

Mezi příklady specifických kombinací patří: L104EA29YIg a CD80 mAbs; LlO4EA29YIg a CD86 mAbs; L104EA29YIg a CD80 mAbs CD86 mAbs; L104EA29YIg a gp39 mAbs; L104EA29YIg a CD40 mAbs; L104EA29YIg a CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAbs a gp39 mAbs; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAbs a CD40 mAbs; a L104EA29YIg, anti-LFAl mAb, a anti-gp39 mAb. Specifickým příkladem gp39 mAb je MR1. Další kombinace jsou zřejmé a snadno zjistitelné odborníkem v oboru.

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu, například L104EA29YIg, mohou být podávány jako samostatná aktivní složka nebo společně s dalšími léčivy v imunomodulačních schématech nebo s dalšími protizánětlivými činidly, jako například při léčbě nebo prevenci akutního nebo chronického odmítnutí alo- nebo xenoimplantátů nebo při zánětlivých nebo autoimunitních poruchách, nebo pro vyvolání tolerance. Například mohou být použity v kombinaci s inhibitorem kalcineurinu, jako je například cyklosporin A nebo FK506; imunosupresivním makrolidem, jako je například rapamycin nebo jeho derivát, například 40-0-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin, lymfocytickým činidlem (homing), například FTY720 nebo jeho analogem; kortikoidy; cyklofosfamidem; azathioprenem; methotrexatem; leflunomidem nebo jeho analogem; mizoribinem; kyselinou mykofenolovou; mykofenolátem mofetilu; 15deoxyspergualinem nebo jeho analogem; imunosupresivními monoklonálními protilátkami, jako jsou například monoklonální protilátky k receptorům leukocytů, například MHC, CD2, CD3, CD4, CD lla/CD18, CD7, CD25, CD27, B7,

CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150(SLAM), 0X40, 4-1BB nebo jejich ligandy; nebo s jinými imunomodulačními sloučeninami, například CTLA4/CD28-Ig nebo jinými molekulami inhibitorů adheze, například mAbs nebo nízkomolekulární inhibitory včetně LEA-1 antagonistů, antagonistů Selektinu a antagonistů VLA-4. Tato sloučenina je zejména vhodná v kombinaci se sloučeninou, která interferuje s CD40 a jeho ligandy, například protilátkami CD40 a protilátkami k CD40-L, například při výše popsaných indikacích, jako je například vyvolání tolerance.

V případech, kdy rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu jsou podávány společně s dalšími imunosupresivními, imunomodulačními nebo protizánětlivými sloučeninami, jak je například uvedeno výše, dávkování těchto sloučenin se bude samozřejmě lišit v závislosti na typu současně podávaného léčiva, například zda to je steroid nebo cyklosporin, na specificky použitém léčivu, na léčeném zdravotním stavu atd.

V souladu s výše uvedeným tento vynález dále poskytuje způsoby, jak jsou definovány výše, které zahrnují společné podávání, například současně nebo po sobě, terapeuticky účinného množství rozpustných molekul mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu, L104EA29YIg, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, a druhého léčiva, přičemž tímto druhým léčivem je imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo, například jak je uvedeno výše. Dále jsou poskytnuty terapeutické kombinace, například soupravy, pro použití v jakémkoliv způsobu definovaném výše, zahrnující L104EA29YIg ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, pro současné nebo následné použití s alespoň jedním farmaceutickou kompozicí obsahující imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo. Tato souprava může obsahovat instrukce pro použití.

Způsoby produkce molekul podle vynálezu

Exprese molekul mutantu CTLA4 může být prováděna v prokaryotíckých buňkách. Prokaryotické buňky jsou nej častěji reprezentovány různými kmeny bakterií. Bakterie mohou být grampozitivní nebo gramnegativní. Obvykle jsou výhodné gramnegativní bakterie jako je E. coli. Další mikrobiální kmeny však mohou být také použity.

Sekvence kódující molekuly mutantu CTLA4 mohou být vloženy do vektoru určeného pro expresi cizí sekvence v prokaryotíckých buňkách, jako je E. coli. Tyto vektory mohou obsahovat běžně používané prokaryotické kontrolní sekvence, které jsou definovány v tomto textu, a obsahují promotory pro iniciaci transkripce, případně s operátorem, společně s sekvencemi ribozomálního vazebného místa, včetně běžně používaných promotorů, jako je beta-laktamasa (penicillinasa), laktózový (lac) promotorovy systém (Chang a kol., 1977, Nátuře 198:1056), tryptofanový (trp) promotorovy systém (Goeddel a kol., 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4057) a lambda derivovaný P_L promotor a ríbozomální vazebné místo N-genu (Shimatake, a kol., 1981, Nátuře, 292:128).

Takové expresní vektory budou také obsahovat počátky replikace a volitelné markéry, jako je beta-laktamasa nebo neomycinfosfotreansferasový gen zodpovědný za rezistencí k antibiotikům tak, aby se takové vektory mohly replikovat a selektovat v bakteriích nebo buňkách nesoucích tyto plazmidy při růstu v přítomnosti antibiotik, jako je ampicillín nebo kanamycin.

Tento expresní plazmid může být zaváděn do prokaryotíckých buněk řadou standardních způsobů, jako je například CaCl₂-šok (Cohen, 1972, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69: 2110, a Sambrook a kol., (eds.) „Molecular ♦ · · ·

Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd Edítion, Cold Spring Harbor Press, 1989) a elektroporace.

Při provádění tohoto vynálezu jsou eukaryotické buňky také vhodné hostitelské buňky. Mezi příklady eukaryotických buněk patří jakékoliv zvířecí buňky, ať primární nebo imortalízované, kvasinky (například Saccharomyces cerevisae, Schizosacharomyces pombe a Pichia pastoris) a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO buňky jsou příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelé. Neomezující příklady vhodných CHO buněk zahrnují DG 44 (Chasin, a kol., 1986, Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555556; Kolkekar, 1997, Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označené jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury,

Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genová, IT), CHO klon B (GEIMG, Genová, IT), CHO-K1/SF označené jako ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) a RR-CHOK1 označené jako ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Mezi příklady rostlinných buněk patří buňky tabáku (z celých rostlin, tkáňová kultura, kalus), kukuřice, sojových bobů a rýže. Buňky ze semen kukuřice, sóji a rýže jsou také přijatelné.

Sekvence nukleové kyseliny kódující molekuly mutantu CTLA4 mohou být také vloženy do vektoru určeného pro expresi cizí sekvence v eukaryotickém hostiteli. Regulační prvky tohoto vektoru se mohou lišit v závislosti na konkrétním eukaryotickém hostiteli.

Běžně používané eukaryotické řídící sekvence používané v expresívních vektorech obsahují promotory a řídící sekvence kompatibilní se savčími buňkami, jako je například CMV promotor (CDM8 vektor) a ptačí sarkornový virus (ASV) (jiLN vektor). Mezi další běžně používané promotory patří časné a pozdní promotory ze Simian viru 40 (SV40)(Fiers, a • ♦ ·· « * kol., 1973, Nátuře 273:113), nebo další virové promotory, jako jsou ty odvozené od polyomu, Adenoviru 2, a hovězího papilomového viru. Také může být použit indukovatelný promotor, jako je hMTII (Karin a kol., (1982), Nátuře, 299:

797-802.

Vektory pro expresi molekul mutantu CTLA4 v eukaryotických buňkách mohou také nést sekvence nazývané zesilovače transkripce. Ty jsou důležité při optimalizaci genové exprese a jsou umístěny v promotorové oblasti buď v protisměru transkripce nebo ve směru transkripce.

Mezi neomezující příklady expresních vektorů pro eukaryotické hostitelské buňky například patří vektory pro savčí hostitelské buňky (například BPV-1, pHYg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (například pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; vektory příbuzné Adenoviru, baculovirové vektory, kvasinkové vektory (například pESC vektory (Stratagene)).

Sekvence nukleové kyseliny kódující molekuly mutantu CTLA4 se mohou integrovat do genomu hostitelské eukaryotické buňky a replikují se jako hostitelské genomové replikéty. Alternativně vektor nesoucí molekuly mutantu CTLA4 může obsahovat počátky replikace umožňující extrachromozomální replikaci.

Při expresi sekvencí nukleové kyseliny v Saccharomyces cerevisia může být použit počátek replikace z endogenního kvasinkového plazmidu, 2μ kruhu. (Boach, 1983, Meth. Enz., 101:307). Alternativně mohou být použity sekvence z kvasinkového genomu, které jsou schopny podporovat autonomní replikaci (viz například Stinchcomb a kol., 1979,

Nátuře, 282:39); Tschemper a kol., 1980, Gene 10: 157; a

Clarke a kol., 1983, Meth. Enz., 101: 300).

ttif «

· • » • ·

Transkrípční řídící sekvence kvasinkových vektorů obsahují promotory pro syntézu glykolytíckých enzymů (Hess a kol., 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149; Holland a kol., 1978, Biochemistry, 17: 4900). Mezi další promotory známé v oboru patří CMV promotor umístěný ve vektoru CDM8 (Toyama a Okayama, 1990, FEBS, 268: 217 - 221); promotor pro 3fosfoglyceratkinasu (Hitzeman a kol., 1980, J.Biol.Chem., 255: 2073), a pro další glykolytické enzymy.

Další promotory jsou indukovatelné, neboť mohou být regulovány vnějšími podněty nebo růstovým prostředím buněk. Tyto indukovatelné promotory zahrnují promotory z genů pro proteiny tepelného šoku, alkoholdehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatasu, enzymy spojené s katabolísmem dusíku a enzymy zodpovědné za využití maltózy a galaktózy.

Regulační sekvence mohou také být umístěny na 3' konci kódující sekvence. Tyto sekvence mohou stabilizovat mediátorovou RNA. Takové terminátory se nachází v nepřeložené 3' oblasti, která je umístěna za kódujícími sekvencemi v několika savčích genech a odvozených genech odvozených od kvasinek.

Mezi neomezující příklady vektorů rostlin a rostliných buněk patří například Agrobacterium Ti plazmidy, květákový mozaikový virus (CaMV) a rajčatový zlatý mozaikový virus (TGMV).

Obecné aspekty transformací hostitelského systému savčích buněk jsou popsány Axelem (v US patentovém spise č. 4,399,216, vydaném 16. srpna 1983). Savčí buňky mohou být transformovány způsoby, jako je například transfekce za přítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekce, elektroporace nebo transdukce s virovými vektory.

v C ·· • < * φ · * • · · ·· ·«· φφφ* ·««%

Mezi způsoby zavádění cizích sekvencí DNA do rostlinných a kvasinkových genomů patří: 1) mechanické způsoby, jako je mikroinjekce DNA do jednotlivých buněk nebo protoplastů, mícháni buněk se skleněnými kuličkami za přítomnosti DNA nebo nastřelování wolframových nebo zlatých kuliček potažených DNA do buněk nebo protoplastů; 2) zavádění DNA po úpravě membránové permeability buňky vůči makromolekulám prostřednictvím polyethylenglykolu, nebo vystavení buňky vysokonapěťovým elektrickým pulzům (elektroporace); nebo 3) použití liposomů (obsahujících cDNA), které prostupují buněčnými membránami.

Exprese molekul mutantu CTLA4 může být detekována způsoby známými v oboru. Například molekuly mutantu mohou být detekovány Coomassie barvením SDS-PAGE gelů nebo imunovybarvováním (imunoblotováním) za použití protilátek, které váží CTLA4. Regenerace proteinu může být prováděna za použití standardních prostředků pro přečištění proteinů, jako je například afinitní chromatografie nebo iontoměníčová chromatografíe, za vzniku v podstatě čistého produktu (R. Scopes: Protein Purification, Principles and Practice, Third Edition, Sprínger-Verlag (1994).

Tento vynález dále poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4 připravené zde popsaným způsobem.

Mutageneze na kodonu CTLA4Ig

V jednom provedení byla použita bodová mutageneze a nová screeningová procedura pro zjištění několika mutací v extracelulární doméně CTLA4, které zlepšují vazebnou aviditu CD86. V tomto provedení byly prováděny mutace na zbytcích v oblastech extracelulární domény CTLA4 začínající serinem v poloze 25 a končící argininem v poloze 33, na C' řetězci (alanin 49 a threonin 51), na F řetězci (lysin 93, kyselina glutamová 95, leucin 96), a v oblastí od • · · · methioninu 97 přes tyrosin 102, tyrosin 103 přes glycin 107, a v G řetězci v polohách glutamin 111, tyrosin 113 a isoleucin 115. Tyto místa byla vybrána na základě studií chimerních CD28/CTLA4 fúzních proteinů (Peach a kol.,

J.Exp.Med., 1994, 180: 2049-2058) a na modelu předpovídajícím, které boční řetězce aminokyselinového zbytku by byly vystaveny rozpouštědlu a na nedostatku identity nebo homologie aminokyselinových zbytků v určitých polohách mezi CD28 a CTLA4. Také jakýkoliv zbytek, který je prostorově v blízkém sousedství (5 až 20 Angstromových jednotek) k identifikovaným zbytkům je považován za součást tohoto vynálezu.

Pro syntézu a screening rozpustných molekul mutantu CTLA4 se změněnými afinitami pro CD80 a/nebo CD86 byla použita dvoustupňová strategie. První experimenty byly vedeny k vytvoření knihovny mutací na specifickém kodonu extracelulární části CTLA4, potom byl prováděn screening prostřednictvím Biacore testovacího systému z důvodu určení mutantů se změněnou reaktivitou k CD80 nebo CD86. Biacore testovací systém (Pharmacia, Piscataway, NJ) používá povrchový plazmonový rezonanční detekční systém, který zahrnuje zejména kovalentní vazbu buď CD80Ig nebo CD86Ig na senzorový čip potažený dextranem, který je umístěn v detektoru. Testovaná molekula může potom být injektována do komůrky obsahující senzorový čip a množství navázaného komplementárního proteinu může být stanoveno na základě změny molekulové hmotnosti, která je fyzikálně spojena s dextranem potaženou stranou sensorového čipu; změna molekulové hmotnosti může být měřena detekčním systémem.

Výhody vynálezu

Protože vazba CTLA4 na CD80 a CD86 se vyznačuje velkými rychlostmi směrem ke vzniku (rychlost „on) a • · · · ··· · velkými disociačními rychlostmi (rychlost „off) a protože komplexy CTLA4Ig-CD86 disociují přibližně 5 až 8 krát rychleji než komplexy CTLA4Ig-CD80, bylo usouzeno, že zpomalení rychlosti disociace CTLA4Ig od CD80 a/nebo CD8 6 by mohlo mít za následek molekuly se silnějšími imunosupresivními vlastnostmi. Proto je očekáváno, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mající vyšší aviditu k CD80- nebo CD86-pozitivním buňkám ve srovnání se standardním typem CTLA4 nebo nemutovánými formami CTLA4Ig budou blokovat iniciaci antigen specifických aktivovaných buněk s vyšší účinností než standardní typ CTLA4 nebo nemutované formy CTLA4Ig.

Produkční náklady na CTLA4Ig jsou velmi vysoké. Molekuly mutantu CTLA4Ig s vysokou aviditou mající potenciálně vyšší imunosupresivní vlastnosti mohou být použity v klinické praxi ve značně nižších dávkách než nemutovaný CTLA4Ig k dosažení podobných hladin imunosuprese. Proto rozpustné molekuly mutantu CTLA4, například L104EA29YIg, mohou být nákladově velmi příznivé.

Následující příklady jsou uvedeny k objasnění tohoto vynálezu a napomáhají odborníkům v jeho aplikaci. Příklady nejsou zamýšleny, aby jakýmkoliv způsobem omezovaly rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad poskytuje popis použitých způsobů k vytvoření nukleotidových sekvencí kódujících rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle tohoto vynálezu. Byl vytvořen jednomístný mutant L104EIg, u kterého byla testována vazebná kinetika vůči CD80 a/nebo CD86. Nukleotidová sekvence L104EIg byla použita jako matrice pro vytvoření • ·

dvoumístné mutantní sekvence CTLA4, L104EAYIg, u které byla rovněž testována vazebná kinetika vůči CD80 a/nebo CD8 6.

ř · • · · · · · ·

Mutageneze na kodonu CTLA4

Byla vyvinuta mutageneze a screeningová strategie k identifikování molekul mutantu, které měly nižší rychlosti disociace („off rychlosti) z molekul CD80 a/nebo CD86. Jednomístné mutantní nukleotidové sekvence byly vytvořeny za použití CTLA4Ig jako matrice (US.patentové spisy č. 5,844,095; 5,851,795; a 5,885,796; ATCC číslo 68629). Mutagenní oligonukleotidové PCR primery byly určeny pro náhodnou mutagenezi specifického cDNA kodonu umožněním umístění jakékoliv báze v polohách 1 a 2 na kodonu, v poloze 3 mohl být umístěn pouze guanin nebo thymin (XXG/T; také označováno jako NNG/T). Tímto způsobem specifický kodon kódující aminokyselinu mohl být náhodně mutován, aby kódoval jednu z 20 aminokyselin. Z tohoto pohledu XXG/T mutageneze poskytuje 32 kodonů kódujících jednu z 20 aminokyselin. PCR produkty kódující mutace v blízkém sousedství oblasti -M97-G107 na CTLA4Ig (viz obrázek 7 nebo 8) byly štěpeny pomocí Sacl/Xbal a subklonovány do podobně upraveného expresního vektoru CTLA4Ig7tLN. Tento způsob byl· použít k vytvoření molekuly L104EIg, jednomístné molekuly mutantu CTLA4 (obr. 8).

Pří mutagenezi v blízkosti S25-R33 na CTLA4Ig bylo tiché Nhel restrikční místo nejdříve zavedeno do smyčky prostřednictvím PCR primerem vedené mutageneze. PCR produkty byly štěpeny Nhel/Xbal a subklonovány do podobně upravených CTLAIg nebo L104EIg expresních vektorů. Tento způsob byl použit k vytvoření dvoumístné CTLA4 mutantní molekuly L104EA29Ig (obrázek 7). Zejména molekula nukleové kyseliny kódující jednomístnou CTLA4 mutantní molekulu, L104EIg, byla použita jako matrice k vytvoření dvoumístné • · · ·

CTLA4 mutantní molekuly, L104EA29YIg. Vektor piLN mající

L104EA29YIg je znázorněn na obrázku 12.

Příklad 2

Tento příklad poskytuje popis použitých screeningových metod k identifikaci jedno- a dvoumístných mutantních CTLA4 polypeptidů, exprimovaných z konstruktů popsaných v příkladu 1, které vykazovaly vyšší vazebnou aviditu k CD80 a CD86 antigenům ve srovnání s nemutovanými molekulami CTLA4Ig.

Současné in vitro a in vivo studie ukazují, že samotný CTLA4lg není schopen úplně blokovat iniciaci antigen specifických aktivovaných T buněk. In vitro studie s CTLA4Ig a monokionální protilátkou specifickou buď pro CD80 nebo pro CD86 měřící inhibici proliferaci T buněk ukazují, že monokionální protilátka vůči CD80 nezvyšovala inhibici CTLA4Ig. Avšak monokionální protilátka vůči CD86 přesto zvyšovala inhibici, což ukazuje,že CTLA4Ig nebyl tak účinný při blokování CD86 interakcí. Tyto údaje podporují dřívější zjištění (Linsley a kol., Immunity, 1994, 1: 793-801), že inhibice buněčných odezev zprostředkovaných CD80 vyžadují přibližně 100 krát nižší koncentrace CTLA4Ig oproti odezvám zprostředkovaných CD-86. Na základě těchto zjištění bylo předpokládáno, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 mající vyšší aviditu k CD86 než standardní CTLA4 by měly být schopny lépe blokovat iniciaci antigen specifických aktivovaných buněk než CTLA4Ig.

Z tohoto úhlu pohledu byly rozpustné molekuly mutantu CTLA4 popsané v příkladu 1 kontrolovány za použití nového screeningové postupu k identifikaci několika mutací v extracelulární doméně CTLA4, která zlepšuje vazebnou aviditu k CD80 a CD86. Tato screeningová strategie poskytla účinný způsob pro přímou identifikaci mutantů se zřejmě

nižšími „off rychlostmi bez potřeby přečištění a kvantifikace proteinu, neboť „off rychlostní stanovení není závislé na koncentraci (0'Shannessy a kol., 1993,

Anal. Biochem., 212: 457-468).

COS buňky byly transfekovány jednotlivými minipreparativně přečištěnými plazmidy DNA a množeny po dobu několika dní. Tří dni kondicíonované kultivační médium bylo aplikováno do přístroje BIAcore biosensor chips (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) na biosensorové čipy potažené CD80Ig nebo CD86Ig. Specifická vazba a disociace mutantů proteinů byla měřena povrchovou plazmonovou rezonancí (0'Shannessy a kol., 1993, Anal. Biochem., 212:457-468). Všechny experimenty byly měřeny na přístrojích BIAcore™ a BIAcore™ 2000 za použití bíosensorů při teplotě 25 °C. Ligandy byly imobilizovány na sensorových čipech NCM5 pro vědecké účely (Pharmacia) za použití standardní kondenzace s N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl)karbodiímíd-N-hydroxysukcínimidu (Johnsson, B. a kol., 1991, Anal. Biochem., 198:268-277; Khilko,S.N., a kol., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5425-15434).

Screeningová metoda

COS buňky kultivované na 24-jamkové destičce pro tkáňové kultury byly dočasně transfekovány s DNA kódující mutantní CTLA4Ig. Kultivační medium obsahující vyloučený rozpustný mutant CTLA4Ig bylo odebíráno po 3 dnech.

Kondicíonované kultivační médium s COS buňkami bylo ponecháno protékat přes BIAcore biosensorové čipy derivátizované CD86Ig nebo CD80Ig (jak je popsáno v Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271: 26762-26771, a molekuly mutantu byly identifikovány s rychlostmi „off nižšími než které byly pozorovány u standardního CTLA4Ig. Nukleové kyseliny cDNA odpovídající vybraným vzorkům média byly sekvencovány a DNA byla připravena k provádění hromadné transfekce COS buněk, ze které byl připraven mutantní protein CTLA4Ig po přečištění proteinu A z kultivačního media.

Podmínky analýzy na přístroji BOAcore a analýza dat rovnovážné vazby byla prováděna způsobem popsaným v J. Greene a kol., 1996, J.Bíol. Chem., 271: 26762-26771 a jak je uvedeno v tomto textu.

Analýza údajů z přístroje BIAcore

Senosorgramové základní linie byly normalizovány na nulovou odezvu (response unit - RU) před analýzou. Vzorky byly vedeny přes srovnávací průtokové komůrky k stanovení odezvy pozadí z důvodu rozdílu indexu lomu v objemu mezi vzorky. Rovnovážné disociační konstanty byly vypočteny ze znázorněné grafické závislosti R_eq na C, kde R_eq je odezva v ustáleném stavu mínus odezva na srovnávacím čipu, a C je molární koncentrace analytu. Vazebné křivky byly analyzovány za použití komerčního software pro nelineární prokládání bodů regresní křivkou (Prísm, GraphPAD Software).

Experimentální údaje byly nejdříve vloženy do modelu jednoduché vazby ligandu na jednotlivý receptor (1-místný model, tj . jednoduchý Langmuirův systém, Ά+Βθ-ΑΒ) , a rovnovážné asociační konstanty (Ka= [A] · [Β] \ [AB] byly vypočteny z rovnice R-Rmax*C/ (K_d+C) . Následně byly údaje vloženy do nej jednoduššího dvoumístného modelu vazby ligandu (tj. na receptor mající 2 nezávislá vazebná místa bez interakcí, jak je popsáno rovnicí R=R_maxi*C/ (K_di+C) + Rmax2*C/ (K_d2 + C) ) .

Dobrá shoda těchto dvou modelů byla analyzována vizuelně srovnáním experimentálních údajů a statisticky F • · testem pomocí součtu čtverců. Jednodušší jednomístný model byl vybrán jako lepší, pokud dvoumístné proložení modelu nebylo významně lepší (p<0,l).

Asociační a disociační analýzy byla prováděny za použití softwaru BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Asociační rychlostní konstanty k_on byly vypočteny dvěma způsoby, zahrnutím jak homogenních jednomístných interakcí, tak i paralelních dvoumístných interakcí. Pro jednomístné interakce byly hodnoty k_on vypočteny podle rovnice R_t=R_eq(lexp'^ksít'^to) , kde Rt je odezva v daném čase t; Req je odezva v ustáleném stavu; to je čas na počátku nástřiku; a ks=dR/dt=kOn*Ckoff, kde C je koncentrace analytu vypočtené za předpokladu monomerních vazebných míst. Dvoumístné interakční hodnoty kon byly vypočteny podle rovnice Rt=Reqi (l^-exp’^ksl(t’^to)+Req2 (l^_exp^ks2(t_to) · Pro každý model byly hodnoty k_on stanoveny z vypočtené směrnice (k asi 70% maximální asociaci) grafického znázornění k_s vůči C.

Disociační data byla analyzována podle jednomístného (AB=A+B) nebo dvoumístného (AiBj=Ai+Bj) modelu a rychlostní konstanty (k_Off) byly vypočteny z nejlépe proložených křivek. Tento model vazebného místa byl použit s výjimkou případů, kdy odezva zbytků byla větší než pozadí přístroje (2-10Ru, podle přístroje, v těchto případech byl použit dvoumístný model. Poločasy obsazení receptoru byly vypočteny za použití vztahu ti/₂=0, 693/k_off.

Průtoková cytoxnetrie

Myší mAb L307.4 (anti-CD80) byl zakoupen od firmy Becton Dickinson (San Jose, California) a IT2.2 (anti-B70[také známý jako CD86] byl zakoupen od firmy Pharmingen (San Diego, California). Pro imunobarvení byly CD80pozitivní a/nebo CD86-pozitivní CHO buňky byly odebrány z jejich kultivačních nádob a byly inkubovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) obsahujícím 10 mM EDTA. CHO buňky (l-10x 10⁵) byly nejdříve inkubovány s mABs nebo s imunoglubulinovými fúzními proteiny v DMEM obsahujícím 10 % fetálního hovězího sérum (FBS), potom byly promyty a inkubovány s fluoresceinisothiokyanatanam konjugovaným s kozím anti-myším nebo anti-lidským imunoglobulinem (činidly 2. fáze)(Tágo, Burlingame,

Calífornia). Buňky byly naposledy promyty a byly analyzovány na přístroji FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE a vylučovací chromátografie

SDS-PAGE byla prováděna na Tris/glycin 4 - 20% akrylamidových gelech (Novex, San Diego, CA). Analytické gely byly barveny Coomassie Blue a zobrazení vlhkých gelů bylo získáno digitálním skenováním. CTLA4Ig (25 pg) a L104EA29YIg (25 pg) byly analyzovány vylučovací chromatografií za použití TSK-GEL G300 SW_XL kolony (7,8 x 300 mm), Tosohaas, Montgomeryville, PA) vyvážené fyziologickým roztokem tlumeným fosfátem obsahujícím 0,02 % NaN₃ při průtoku 1,0 ml/min.

CTLA4Xci20s a L1O4EA29YXci₂os

Jednořetězová CTLA4_cl2o_S byla připravena dříve popsaným způsobem (Linsley a kol., 1995, Biol. Chem., 270: 1541715424). Stručně, onkostatin M CTLA4 (0MCTLA4) expresivní vektor byl použit jako matrice, původní primer,

GGAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG byl vybrán pro spojení sekvencí ve vektoru; a reverzní primer,

GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC, • · • · · «

odpovídal posledním sedmi aminokyselinám (tj.

aminokyselinám 118 - 124) v extracelulární doméně CTLA4 a obsahoval restrikční enzymové místo a terminační kodon (TGA) (stop kodon). Reverzní primer specifikoval C120S mutaci (cystein - serin v poloze 120). Zejména nukleotidové sekvence GCA (nukleotidy 34-36) reverzního primerů uvedená výše je nahrazena jednou z následujících nukleotidových sekvencí: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT nebo GCT. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že nukleotidové sekvence GCA je zpětná komplementární sekvence kodonu TCG pro cystein. Podobně nukleotidové sekvence AGA, GGA, TGA, CGA, ACT nebo GCT jsou zpětné komplementární sekvence kodonů pro serin. Polymerasové řetězové reakční produkty byly štěpeny HindlII/Xbal a přímo subklonovány do expresivního vektoru tcLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ) .

L104EA2 9YX_Ci2os byl připraven stejným způsobem. Každý konstrukt byl ověřován sekvencováním DNA.

Identifikace a biochemická charakterizace mutantů s vysokou aviditou

Dvacet čtyři aminokyselin bylo vybráno pro mutagenezi a asi 2300 získaných mutantnich proteinů bylo zkoušeno na vazbu s CD86Ig pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR; jak je popsáno výše). Převládající účinky mutageneze na každém místě jsou shrnuty v tabulce II. Náhodná mutageneze některých aminokyselin v oblasti S25-R33 zřejmě neměnila vazbu ligandů. Mutageneze E31 a R33 a zbytků M97-Y102 zřejmě způsobily snížení vazby ligandů. Mutagenezi zbytků, S25, A29 a T30, K93, L96, Y103, L104 a G105 vznikly proteiny s malými „on a/nebo malými „off rychlostmi. Tyto výsledky potvrdily dřívější zjištění, že zbytky v oblasti S25-R33 a zbytky v nebo blízko M97-Y102 ovlivňují vazbu ligandů (Peach a kol., 1994, J. Exp. Med., 180: 2049-2058.

Mutageneze v místech S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 pomohla identifikovat některé mutantní proteiny, které měly menší „off rychlosti od CD86Ig. Avšak v těchto případech malá rychlost „off byla kompenzována malou rychlosti „on, čímž vznikly mutantní proteiny s výslednou aviditou pro CD86Ig, která byla zřejmě podobná aviditě pozorované u standardního typu CTLA4Ig. Dále mutageneze K93 měla za následek významnou agregaci, která byla možná odpovědná za pozorované kinetické změny.

Náhodnou mutagenezí L104 po transfekcí COS buněk a screeningem SPR vzorků kultivačního média přes imobilizovaný CD86Ig bylo získáno 6 vzorků média obsahujících mutantní proteiny s přibližně 2 krát menšími rychlostmi „off než u standardního CTLA4Ig. Když byly sekvencovány odpovídající cDNA těchto mutantu, bylo zjištěno, že každá kóduje mutaci leucinu na kyselinu glutamovou (L104E). Zřejmě substituce (náhrada) leucinu 104 za kyselinu asparagovou (L104D) neovlivnila vazbu CD86lg.

Metageneze byla potom opakována na každém místě uvedeném v tabulce II, tentokrát s použitím L104 jako matrice PCR místo standardního CTLA4Ig, jak je popsáno výše. SPR analýza, opět požívající imobilizovaný CD86lg, identifikovala 6 vzorků kultivačního média z mutageneze alaninu 29 s proteiny majícími přibližně 4 krát menší „off rychlosti než standardní CTLA4Ig. Dvě nejpomalejší představovaly substituce tyrosinu (L104EA29Y), 2 byly leucin (L104EA29L), jedna byla tryptofan (L104EA29W) a jedna byla threonin (L104EA29T). Zřejmě nebyly identifikovány žádné mutanty s malou rychlostí „off, kdy byl náhodně mutován v standardním CTLA4Ig samotný alanin.

Relativní molekulová hmotnost a agregátní stav přečištěného L104E a L104EA29YIg byly testovány pomocí SDS-PAGE a vylučovací chromatografií. L104EA29YIg (asi 1 •« · ·· ···· ·* · · · · « φ · * · · · · · · pg, pruh 3) a L104EIg (asi 1 pg, pruh 2) zřejmě měly stejnou elektroforetickou pohyblivost jako CTLAIg (asi 1 pg, pruh 1) za redukčních podmínek ( asi 50 kDa; +βΜΕ; plus

2-merkaptoethanol) a neredukčních podmínek ( asi 100 kDa; -βΜΕ) (obr. 10A) . Vylučovací chromatografie ukázala, že LlO4EA29YIg (obr. 10C) zřejmě měl stejnou mobilitu jako dimerní CTLAIg (obr. 10B). Hlavní píky představují proteinový dimer, zatímco nej rychleji vyplavovaný menší pík na obrázku 10B představuje agregáty s vyšší molekulovou hmotností. Asi 5,0 % CTLA4Ig bylo přítomno jako agregáty s vyšší molekulovou hmotností, ale nebyla pozorována žádná agregace L104EA29YIg nebo L104EIg. Proto silnější vazba na CD86lg pozorovaná u L104EIg a L104EA29YIg nemohla přispívat k agregaci vyvolané mutagenezi.

Rovnovážná a kinetická vazebná analýza

Rovnovážné a kinetická vazebná analýza byla prováděna na proteinu A purifikovaném CTLA4Ig, L104EIg a L104EA29YIg za použití povrchové plazmonové rezonance (SPR). Výsledky jsou shrnuty v tabulce I. Pozorované rovnovážné disociační konstanty (K_d; tabulka I) byly vypočteny z vazebných křivek vytvořených v rozsahu koncentrací (5,0 - 200 nM). L104EA29YIg se váže silněji na CD86lg než LlO4EIg nebo CTLA4Ig. Nižší hodnota K_d pro L104EA29YIg (3,21 nM) než pro Ll04EIg (6,06 nM) nebo pro CTLA4Ig (13,9 nM) ukazuje vyšší vazebnou aviditu LlO4EA29YIg k CD86lg. Nižší hodnota K_d pro L104EA29YIg (3,66 nM) než pro L104EIg (4,47 nM) nebo pro CTLA4Ig (6,51 nM) ukazuje vyšší vazebnou aviditu

LlO4EA29YIg k CD80lg.

Kinetická vazebná analýza zjistila, že srovnatelné „on rychlosti pro CTLAIg, L104EIg a L104EA29YIg vazby k CD80 byly podobné, stejně takové byly rychlosti „on pro CD86lg (tabulka I). Avšak rychlosti „off pro tyto molekuly nebyly stejné (tabulka I). Ve srovnání s CTLA4Ig měl L104EA29YIg přibližně 2 krát menší „off rychlost od CD80lg a přibližně 4 krát menší „off rychlost od CD86Ig. L104E měl „off rychlosti uprostřed mezi L104EA29YIg a CTLA4Ig. Protože zavedení těchto mutací významně neovlivnilo rychlosti „on, zvyšování avidity pro CD80Ig a CD86lg pozorované s L104EA29YIg bylo pravděpodobně primárně způsobeno poklesem rychlostí „off.

K určení, zda zvýšení avidity L104EA29YIg pro CD86Ig a CD80Ig bylo způsobeno mutacemi ovlivňující způsob každého monomeru asociovat se jako dimer nebo zda byly zavedeny do každého monomeru strukturální změny zvyšující aviditu byly připraveny jednořetězové konstrukty extracelulárních domén CTLA4 a L104EA29Y a poté byla provedena mutageneze cysteinu 120 na serin, jak je popsáno výše a v Linsley a kol., 1995.

J.Biol. Chem., 270: 15417-15424. Gelová permeační chromatografie prokázala, že přečištěné proteiny CTLA4_Ci₂os a Ll04EA29YX_Ci2os byly monomerní (Linsley a kol., 1995, víz výše), před tím než byly analyzovány SPR na jejich vazebné vlastnosti k ligandům. Výsledky ukázaly, že vazebná afinita obou monomerních proteinů pro CD86Ig byla přibližně 35 až 80 krát menší než avidita pozorovaná u jejich dimerů (tabulka I). Toto podporuje dříve publikované údaje konstatující, že dimerizace CTLA4 byla potřebná pro vysokou vazebnou aviditu k ligandům (Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem.,271:26762-26771).

LlO4EA29YX_ci2os se vázal s afinitou přibližně 2 krát vyšší než CTLA4_Ci2os jak na CD80Ig, tak i na CD86Ig. Zvýšená afinita byla způsobena přibližně 3-krát menší rychlostí disociace z obou ligandů. Proto silnější vazba ligandů u L104EA29Y byla nejpravděpodobněji způsobena strukturálními změnami zvyšujícími aviditu, které byly zavedeny do každého monomerního řetězce, spíše než změnami, při kterých molekula dimerizovala.

Polohová a strukturální analýza mutací zvyšujících aviditu

Struktura roztoku extracelulární Ig V-podobné doméně CTLA4 byla nedávno stanovena NMR spektroskopií (Metzler a kol., 1997, Nátuře Struct. Biol., 4: 527-531). To umožnila přesná poloha leucinu 104 a alaninu 29 v 3-rozměrné struktuře (obr. 11A-B). Leucin je umístěn blízko vysoce zachované aminokyselinové sekvence MYPPPY. Alanin 29 je umístěn blízko C-konce oblasti S25-R33, která prostorově přiléhá k oblasti MYPPPY. Zatímco je významná interakce mezi zbytky na začátku těchto dvou oblastí, neexistuje zřejmě žádná přímá interakce mezi L104 a A29, ačkoliv oba zahrnují část přiléhajícího hydrofóbního jádra v proteinu. Strukturální důsledky těchto dvou mutantů zvyšujících aviditu byly stanoveny modelováním. Mutace A29Y může být snadno umístěna ve štěrbině mezi oblastí S25-R33 a oblastí MYPPPY a může sloužit ke stabilizaci konformace oblasti MYPPPY. U standardní CTLA4 L104 vytváří extenzivní hydrofdbní interakce s L96 a V94 v blízkosti oblasti MYPPPY. Je vysoce nepravděpodobné, že mutace kyseliny glutamové zaujme konformaci podobající se L104 ze dvou důvodů. Za prvé, není dostatek prostoru pro umístění delšího postranního řetězce kyseliny glutamové ve struktuře bez významného narušení oblasti S25-R33. Za druhé, energetické nároky na pokrytí negativního náboje na postranním řetězci kyseliny glutamové v této hydrofdbní oblasti by byly značné. Místo toho modelové studie předpovídají, že postranní řetězec kyseliny glutamové se posune k povrchu, kde jeho náboj může být stabilizován solvatací. Taková konformační změna může být snadno provedena prostřednictvím G105 s minimální deformací dalších zbytků v těchto oblastech.

• ·

Vazba mutantů s vysokou aviditou na CHO buňky exprimující CD80 nebo CD86

FACS analýza CTLA4Ig (obrázek 2) a molekuly mutantu vázající se na trvale transfekované CD80+ a CD86+ CHO buňky byla prováděna způsobem popsaným v tomto popisu. CD80pozitivní a CD86-pozitivní CHO buňky byly inkubovány se vzrůstající koncentrací CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo L104EIg a potom byly promyty. Navázaný imunoglobulinový fúzní protein byl detekován za použití fluoresceinisothiokyanatanu konjugovaného s kozím anti-lidským (goat anti-human) imunoglobulinem.

Jak je znázorněno na obrázku 2, CD80-pozitivní nebo CD86-pozitivní CHO buňky (1,5 x 10⁵) byly inkubovány se známými koncentracemi CTLA4Ig (čtverec), L104EA29YIg (kruh) nebo L104EIg (trojúhelník) po dobu 2 hodin při teplotě 23 °C, potom byly promyty a inkubovány s fluoresceínísothiokyanatanem konjugovaným s kozí antilidskou imunoglobulinovou protilátkou. Vazba na celkově 5000 živých buněk byla analyzována (jedním stanovením) na přístroji FACScan a střední flurescenční intenzita (MFI) byla stanovena z histogramu dat za použití PC-LYSYS. Data byla korigována na pozadí fluorescence naměřené na buňkách inkubovaných pouze s činidlem druhého kroku (MFI=7). Kontrola L6 mAb (80 pg/ml) vykazovala MFI<30. Tyto výsledky reprezentují 4 nezávislá měření.

Vazba L104EA29YIg, Ll04EIg a CTLA4Ig na lidské CD80transfekované CHO buňky je přibližně ekvivalentní (obr.

2A). L104EA29YIg a L104EIg se váží silněji na CHO buňky trvale transfekované lidským CD86 než CTLA4Ig (obr. 2B) .

4 :

Funkční zkoušky

Lidské CD4-pozitivní T buňky byly izolovány imunomagnetickou negativní selekcí (Linsley a kol., 1992,

J. Exp. Med., 176: 1595-1604). Izolované CD4-pozitivní T buňky byly stimulovány phorbalmyristatacetatem (PMA) a dále CD80-pozitivními nebo CD86-pozitivními CHO buňkami za přítomnosti titračních koncentrací inhibitoru. CD4pozitivní T buňky (8-10 x 10⁴/jamku) byly kultivovány v přítomnosti 1 nM PMA s nebo bez ozářených stimulátorů CHO buněk. Proliferační odezvy byly měřeny po přidání 1 pCi/jamku [3H]thimidinu během posledních 7 hodin 72 hodinové kultivace. Inhibice PMA plus CD80-pozitivních CHO nebo CD86-pozitivních CHO stimulovaných T buněk byla prováděna prostřednictvím L104EA29YIg a CTLAIg. Výsledky jsou shrnuty v obr. 3. L104EA29YIg inhibuje více proliferaci CD80-pozitivních PMA stimulovaných CHO buněk než CTLA4Ig (obr. 3A). L104EA29YIg je také účinnější než CTLA4Ig při inhibování proliferaci CD86-pozitivních PMA stimulovaných CHO buněk (obr. 3B). Proto L104EA29YIg je silnější inhibitor než CD80-, tak i CD86-zprostředkovaných kostimulací T buněk.

Obrázek 4 ukazuje inhibici prostřednictvím L104EA29YIg a CTLA4Ig alostimulovaných lidských T buněk připravených výše a dále stimulovaných lidskou B lymfoblastoidní buněčnou linií (LCL nazývanou PM, která exprimuje CD80 a CD86 (T buňky při koncentraci 3,0 x 10⁴/jamka a PM při koncentraci 8,0 x 10³/jamku). Primární alostimulace trvala 6 dní, potom byly buňky pulzovány s ³H-thyminem po dobu 7 hodin a následně byla stanovena inkorporace radioaktivního izotopu.

Druhá alostimulace byla prováděna následovně. Sedm dní primárně alostimulované T buňky byly sklizeny pomocí lymfocytického separačního media (LSM)(ICN, Aurora, OH),

kde byly ponechány 24 hodin. Potom byly T buňky restimulovány (sekundárně) za přítomnosti titračního množství CTLA4Ig nebo LlO4EA29YIg přídavkem PM(A) ve stejném poměru jako výše. Stimulace probíhala 3 dny, potom byly buňky pulzně označeny radioaktivním izotopem a sklizeny, jak je uvedeno výše. Účinek LlO4EA29YIg na primárně alostimulované T buňky je zobrazen na obr. 4A. Účinek L104EA29YIg na sekundárně alostimulované T buňky je zobrazen na obr. 4B. L104EA29YIg inhibuje proliferační odezvy jak primárně tak i sekundárně stimulovaných T buněk lépe než CTLA4Ig.

Pro měření produkce cytokinů (obr. 5) byl připraven duplikát sekundárně alostimulovaných desek. Po 3 dnech bylo kultivační medium testováno pomocí ELISA souprav (Biosource, Camarilo, CA) za podmínek doporučených výrobcem. Bylo zjištěno, že L104EA29YIg je silnější než CTLA4Ig při blokování produkce T buněčného IL-2, IL-4 a γIFN cytokinů po sekundárním alostimulu. (obr. 5A-C)

Účinky L104EA29YIg a CTLA4Ig na smíšenou lymfocytickou odezvu u opic (MLR) jsou zobrazeny na obr. 6. Periferní krevní mononukleární buňky (PBMC; 3,5 x 10⁴ buněk/jamku od každé opice) od 2 opic byly přečištěny prostřednictvím lymfocytického separačního média (LSM) a smíchány s 2 pg/ml fytohemaglutíninu (PHA). Buňky byly stimulovány 3 dny, potom byly pulzně označeny radioaktivním izotopem po dobu 16 hodin. Po této době byly buňky sklizeny. L104EA29YIg inhiboval proliferací T buněk u opic lépe než CTLA4Ig.

·· · ·* ··»· ·· ·*·· • · · · · · ·· · ·· ··· ···· • · · · · · · · ·· · ·

Tabulka I:

Rovnovážné a zdánlivé kinetické konstanty jsou uvedeny v následující tabulce (hodnoty jsou ve tvaru: průměr ± směrodatná odchylka ze 3 rozdílných experimentů

Imobilizovaný protein	Analyt	kon (x 10s) K1 S'1	koff(x 10a) M1 S'1	Kd nM
CD80Ig	CTLA4Ig	3,44+0,29	2,21+0,18	6,51+1,08
CD80Ig	LlO4EIg	3,02+0,05	1,35+0,08	4,47+0,36
CD80Ig	L104EA29YIg	2,96+0,20	1,08+0,05	3,66+0,41
CD80Ig	CTLA4Xcl2os	12,0+1,0	230+10	195+25
CD80Ig	L1O4EA29YXc12os	8,3+0,26	71+5	85,0+2,5
CD86Ig	CTLA4Ig	5,95+0,57	8,16+0,52	13,9+2,27
CD86Ig	LlO4EIg	7,03+0,22	4,26+0,11	6,06+0,05
CD86Ig	L104EA29YIg	6,42+0,40	2,06+0,03	3,21+0,23
CD86Ig	CTLA4XCi2os	16,5+0,5	840+55	511+17
CD86Ig	L104EA29YXCi2os	11,4+1,6	300+10	267+29

Tabulka II

Účinek na vazbu CD86Ig prostřednictvím mutageneze CTLA4Ig v uvedených místech - stanovení SPR, jak bylo popsáno výše. Převládající účinek je označen značkou „+

Místo mutageneze

Žádný zjevný účinek

Účinky mutageneze

Malá rychlost „on/malá rychlost „off

Menší vazba ligandů

S25

P26

G27

K28

A29

T30

E31

R33

K93

L96

M97

Y98

P99

P100

P101

Y102

Y103

Y104

G105

1106

G107

Qlll

Y113

1115 +

+ +

+ +

+ • · • · · · 4 · · · · « 9 ·

Jak bude zřejmé odborníkovi v oboru, tento vynález může být prováděn i v jiných formách než které jsou výslovně popsány výše. Popsaná provedení vynálezu pouze vysvětlují, ale neomezují. Rozsah tohoto vynálezu je uveden v připojených patentových nárocích a není omezen na příklady v předcházejícím popisu.

ii ^!0r. Petr Kalenský advokát

' CELAR - K * U.EN5KÝ s í nsERi ''i 2. Málkova 2

-íOpdOiika ·· * «4 4444 49 ··♦

4 4 4 4 4 9 4 4 4

9 9 9 9 9 4 4 9 — —· * ····· 44» a '•S 4 9 · 9 4 9 444·

944 94 4 44 <4

Claims (66)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula mutantu CTLA4, která váže CD80 a/nebo CD86 obsahující extracelulární doménu CTLA4 tak, že v této extracelulární doméně: a) alanin v poloze +29 je substituován aminokyselinou vybranou ze skupiny sestávající z tyrosinu, leucinu, tryptofanu a threoninu, a b) leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou.
2. 2. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 1 dále obsahující aminokyselinovou sekvenci, která mění rozpustnost, afinitu nebo mocenství rozpustné molekuly mutantu CTLA4.
3. 3. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 2, kde aminokyselinová sekvence obsahuje konstantní oblast lidského imunoglobulinu.
4. 4. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 2 dále obsahující aminokyselinovou sekvenci, která umožňuje sekreci rozpustné molekuly mutantu CTLA4.
5. 5. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 4, kde aminokyselinová sekvence obsahuje signální peptid onkostatin M.
6. 6. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 1 obsahující methionin v poloze +1 a kyselinu asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7.
7. 7. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 1 obsahující alanin v poloze -1 a kyselinu asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7.

   99 99

   9 · —Λ 9 9 ·
8. 8. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 3, kde konstantní oblast lidského imunoglobulinu je mutována tak, aby byl cystein v poloze +130 substituován serinem, cystein v poloze +136 substituován serinem, cystein v poloze +139 substituován serinem a prolin v poloze +148 substituován serinem, jak je zobrazeno na obrázku 7.
9. 9. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, která se váže s větší aviditou na CD80 a/nebo QD86 než CTLA4 obsahující extracelulární doménu CTLA4, kde v této extracelulární doméně alanin v poloze +29 je substituován tyrosinem a leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou, jak je zobrazeno na obrázku 7.
10. 10. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 9 dále obsahující aminokyselinovou sekvencí, která mění rozpustnost, afinitu nebo mocenství rozpustné molekuly mutantu CTLA4.
11. 11. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 10, kde aminokyselinová sekvence obsahuje konstantní oblast lidského imunoglobulinu.
12. 12. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 10 dále obsahující aminokyselinovou sekvenci, která umožňuje sekreci rozpustné molekuly mutantu CTLA4.
13. 13. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 12, kde aminokyselinová sekvence obsahuje signální peptid onkostatin M.
14. 14. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 9 obsahující methionin v poloze +1 a kyselinu asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7.

    ·· v ·· ···· ·· ···· ··· ··· ···· • · ··· ·· * * · · ·
15. 15. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 9 obsahující alanin v poloze -1 a kyselinu asparagovou v poloze +124, jak je zobrazeno na obrázku 7.
16. 16. Molekula mutantu CTLA4 podle nároku 11, kde konstantní oblast lidského imunoglobulinu je mutována tak, aby byl cystein v poloze +130 substituován serinem, cystein v poloze +136 substituován serinem, cystein v poloze +139 substituován serinem a prolin v poloze +148 substituován serinem, jak je zobrazeno na obrázku 7.
17. 17. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, která se váže s větší aviditou na CD80 a/nebo CD86 než CTLA4 obsahující extracelulární doménu CTLA4, kde v této extracelulární doméně leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou, jak je zobrazeno na obrázku 8.
18. 18. Molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci odpovídající rozpustné molekule mutantu CTLA4 podle nároku 1.
19. 19. Molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci odpovídající rozpustné molekule mutantu CTLA4 podle nároku 9.
20. 20. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18 mající nukleotidovou sekvenci začínající adeninem v nukleotidové poloze +1 a končící adeninem v poloze +1071, jak je zobrazeno na obrázku 7 nebo 8.
21. 21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 19 mající nukleotidovou sekvenci začínající adeninem v nukleotidové poloze +1 a končící adeninem v poloze +1071, jak je zobrazeno na obrázku 7 nebo 8.

    β · · ·· ···· ·· ····
22. 22. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18 mající nukleotidovou sekvencí začínající guanidinem v poloze -3 a končící adeninem v poloze +1071, jak je zobrazeno na obrázku 7 nebo 8.
23. 23. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 19 mající nukleotidovou sekvenci začínající guanidinem v poloze -3 a končící adeninem v poloze +1071, jak je zobrazeno na obrázku 7 nebo 8.
24. 24. Vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 18 až 23.
25. 25. Vektor kódující L104EA29YIg označený jako pD16L104EA29YIg a uložený s ATCC jako ATCC č. PTA-2104.
26. 26. Hostitelský vektorový systém obsahující vektor podle nároku 24 nebo 25 ve vhodné hostitelské buňce.
27. 27. Hostitelský vektorový systém podle nároku 26, kde vhodnou hostitelskou buňkou je bakteriální buňka nebo eukaryotická buňka.
28. 28. Hostitelská buňka mající vektor podle nároku 24 nebo 25.
29. 29. Hostitelská buňka podle nároku 28, která je eukaryotřekou buňkou.
30. 30. Hostitelská buňka podle nároku 29, kde eukaryotickou buňkou je COS buňka.
31. 31. Hostitelská buňka podle nároku 29, kde eukaryotickou buňkou je vaječníková buňka čínského křečka (Chinese Hamster Ovary - CHO).
32. 32. Hostitelská buňka podle nároku 31, kde CHO buňka je vybrána ze skupiny sestávající z DG44, CHO-K1, CHO-K1 TetOn buněčné linie, CHO označené jako ECACC85050302, CHO klonu 13, CHO klonu B, CHO-K1/SF a RR-CHOK1.
33. 33. Způsob přípravy rozpustného proteinu mutantu CTLA4 zahrnující rostoucí hostitelský vektorový systém podle nároku 26 tak, aby byl vytvářen protein mutantu CTLA4 v hostitelské buňce, a odebírání takto vytvořeného proteinu.
34. 34. Způsob přípravy L104EA29YIg zahrnující rostoucí hostitelskou buňku podle nároku 28 tak, aby byl vytvářen L104EA29YIg v hostitelské buňce, a odebírání takto vytvořeného proteinu.
35. 35. Rozpustný protein mutantu CTLA4 připravený způsobem podle nároku 33.
36. 36. L104EA29YIg připravený způsobem podle nároku 34.
37. 37. Způsob regulace interakce T buňky s CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou zahrnující kontaktování CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňky s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podle nároku 1 tak, aby byl vytvořen komplex molekuly mutantu CTLA4/CD80 nebo molekuly mutantu CTLA4/CD86, přičemž tento komplex ruší interakci mezi T buňkou a CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou.
38. 38. Způsob regulace interakce T buňky s CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou zahrnující kontaktování CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňky s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podle nároku 9 tak, aby byl vytvořen komplex molekuly mutantu

    CTLA4/CD80 nebo molekuly mutantu CTLA4/CD86, přičemž tento komplex ruší interakci mezi T buňkou a CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou.
39. 39. Způsob podle nároku 37, kde rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje extracelulární doménu CTLA4, kde v této extracelulární doméně leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou, jak je znázorněno na obrázku 8.
40. 40. Způsob podle nároku buňka je kontaktována s molekuly mutantu CTLA4.
41. 41. Způsob podle nároku buňka je kontaktována s molekuly mutantu CTLA4.

    37, kde CD80 a/nebo CD86 pozitivní fragmentem nebo derivátem rozpustné

    38, kde CD80 a/nebo CD86 pozitivní fragmentem nebo derivátem rozpustné
42. 42. Způsob podle nároku 37, kde CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou je buňka představující antigen.
43. 43. Způsob podle nároku 38, kde CD80 a/nebo CD86 pozitivní buňkou je buňka představující antigen.
44. 44. Způsob podle nároku 37, kde interakce CTLA4-pozitivních T buněk s CD80 a CD86 pozitivními buňkami je inhibována.
45. 45. Způsob podle nároku 38, kde interakce CTLA4-pozitivních T buněk s CD80 a CD86 pozitivními buňkami je inhibována.
46. 46. Způsob léčby nemocí imunitního systému zprostředkovaných interakcemi T buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami zahrnující podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 1 subjektu za účelem regulace interakcí T buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami.
47. 47. Způsob léčby nemocí imunitního systému zprostředkovaných interakcemi T buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami zahrnující podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 9 subjektu za účelem regulace interakcí T buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami.
48. 48. Způsob podle nároku 46, kde rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje extracelulární doménu CTLA4, kde v této extracelulární doméně leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou, jak je znázorněno na obrázku 8.
49. 49. Způsob podle nároku 46, kde tyto interakce T buněk jsou inhibovány.
50. 50. Způsob podle nároku 47, kde tyto interakce T buněk jsou inhibovány.
51. 51. Způsob inhibice transplantační reakce příjemce vůči štěpu, který zahrnuje podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 1 a ligandu reagujícího s IL-4 subjektu.
52. 52. Způsob inhibice transplantační reakce příjemce vůči štěpu, který zahrnuje podávání rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 9 a ligandu reagujícího s IL-4 subjektu.
53. 53. Způsob podle nároku 51, kde rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje extracelulární doménu CTLA4, kde v této extracelulární doméně leucin v poloze +104 je substituován kyselinou glutamovou, jak je znázorněno na obrázku 8.
54. 54. Rozpustná molekula mutantu CTLA4 kódovaná molekulou nukleové kyseliny označenou jako ATCC č. PTA-2104.
55. 55. DNA sekvence kódující L104EA29YIg, která má ATCC č. PTA-2104.
56. 56. Rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 7.
57. 57. Molekula nukleové kyseliny kódující rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 podle nároku 56.
58. 58. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, která váže CD86 s větší aviditou než standardní typ CTLA4.
59. 59. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, která má menší disociační rychlost vazby CD80 a/nebo CD86 než standardní typ CTLA4.
60. 60. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, která má menší asociační a disociační rychlosti vazby CD80 a/nebo CD86 než standardní typ CTLA4.
61. 61. Část rozpustné molekuly mutantu CTLA4 kódované molekulou nukleové kyseliny označené jako ATCC č. PTA-2104, kde tato část obsahuje extracelulární doménu mutantu CTLA4.
62. 62. Část rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podle nároku 61 dále obsahující koncovou část Ig.
63. 63. Část molekuly nukleové kyseliny kódující rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 mající ATCC č. PTA-2104, kde tato část kóduje extracelulátní doménu molekuly mutantu CTLA4.
64. 64. Část molekuly nukleové kyseliny podle nároku 63 dále obsahující molekulu nukleové kyseliny, která kóduje koncovou část lg.
65. 65. Farmaceutická kompozice pro léčbu nemocí imunitního systému, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a rozpustnou molekulu mutantu CTLA4 podle nároku 1.
66. 66. Farmaceutická kompozice pro léčbu nemocí imunitního systému, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a rozpustnou molekulu mutantu CTI,A^posile nároku 9.