SK15702002A3 - Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 a ich použitie - Google Patents

Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 a ich použitie Download PDF

Info

Publication number
SK15702002A3
SK15702002A3 SK1570-2002A SK15702002A SK15702002A3 SK 15702002 A3 SK15702002 A3 SK 15702002A3 SK 15702002 A SK15702002 A SK 15702002A SK 15702002 A3 SK15702002 A3 SK 15702002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ctla4
mutant molecule
cell
ctla4 mutant
molecule
Prior art date
Application number
SK1570-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK288131B6 (sk
Inventor
Robert J. Peach
Joseph R. Naemura
Peter S. Linsley
Jurgen Bajorath
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of SK15702002A3 publication Critical patent/SK15702002A3/sk
Publication of SK288131B6 publication Critical patent/SK288131B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa týka oblasti rozpustných molekúl CTLA4, ktoré sú mutované zo štandardného CTLA4 z dôvodu udržania schopnosti viazať CD80 a/alebo CD86. V celom texte tejto prihlášky sa odkazuje na rôzne publikácie, ktoré sú celé týmto zahrnuté do tohto vynálezu z dôvodu podrobnejšieho opisu stavu techniky, ktorého sa tento vynález týka.
Doterajší stav techniky
Antigén-nešpecifické intercelulárne interakcie medzi T-lymfocytmi a bunkami predstavujúcimi antigén („antigén presenting cells - APC“) vytvárajú kostimulačné (spolustimulačné) signály T-buniek, ktoré ďalej vytvárajú odozvy T buniek na antigén (Jenkins and Johnson (1993), Curr. Opin. Immunol., 5: 361367). Kostimulačné signály určujú veľkosť odozvy T buniek na antigén a ďalej to, či táto odozva aktivuje alebo inaktivuje nasledujúce odozvy na antigén (Mueller a kol., 1989, Annu. Rev. Immunol. 7: 445 - 480).
Aktivácia T buniek bez kostimulácie má za následok nevydarenú alebo anergickú odozvu T-buniek (Schwartz, R.H., 1992, Celí 71: 1065-1068). Jeden kľúčový kostimulačný signál vzniká interakciou povrchového receptora CD28 Tbuniek s B7 príbuznými molekulami na bunkách predstavujúcich antigén (napríklad tiež známe ako B7-1 a B7-2 alebo CD80 a CD86) (P. Linsley and Ledbetter, 1993, Annu. Rev. Immunol., 191-212).
Táto molekula teraz známa ako CD80 (B7-1) bola pôvodne opísaná ako ľudský aktivačný antigén B buniek (Yokochi, T. a kol., 1981, J. Immunol., 128: 823-827); Freeman, G.J. a kol., 1989, J. Immunol., 143: 2714-2722) a neskôr identifikovaná ako protireceptor pre príbuzné molekuly T buniek CD28 a CTLA4 (Linsley, P. a kol., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 5031-5035; Linsley,
P.S. a kol., 1991a, J.Exp. Med., 173: 721-730; Linsley, P.S. a kol., 1991b, J.Exp. Med., 174: 561-570).
Nedávno bol identifikovaný ďalší protireceptor pre CTLA4 na bunkách predstavujúcich antigén (Azuma, N. a kol., 1993, Náture, 366: 76-79; Freemann, 1993a, Science 262: 909-911; Freeman, G.J. a kol., 1993b, J.Exp. Med. 178: 2185-2192; Hathcock, K.L.S. a kol., 1994, J.Exp. Med., 180: 631640; Lenschow, D.J. a kol., 1993, Proc. Natl. Sci. USA, 90: 11054-11058; RaviWolf, Z. a kol., 1993, Proc. Natl. Sci. USA, 90: 11182-11186; Wu, Y. a kol., J.Exp. Med., 178: 1789-1793). Táto molekula teraz známa ako CD86 (Caux, C. a kol., 1994, J.Exp. Med., 180: 1841-1848), ale tiež nazývaná B7-0 (Azuma a kol., 1993, pozri vyššie) alebo B7-2 (Freeman a kol., 1993a, pozri vyššie) má spoločnú sekvenčnú identitu asi z 25 % s CD80 v jej extracelulárnej oblasti (Azuma a kol., 1993, pozri vyššie; Freeman a kol., 1993a, pozri vyššie; 1993b, pozri vyššie). CD86-transfekované bunky vyvolávajú odozvy T buniek sprostredkované CD28 (Azuma a kol., 1993, pozri vyššie; Freeman a kol., 1993a, 1993b, pozri vyššie).
Porovnanie expresie CD80 a CD86 bolo predmetom niekoľkých štúdií (Azuma a kol., 1993, pozri vyššie; Hathcock a kol., 1994, pozri vyššie; Larsen, C.P. a kol., 1994), J. Immunol., 152: 5208-5219; Stack, R.M., a kol., 1994, J. Immunol., 152: 5723-5733). Súčasné údaje ukazujú, že expresie CD80 a CD86 sú regulované rôzne a naznačujú, že expresia CD86 má tendenciu predchádzať expresii CD80 v priebehu imunitnej odozvy.
Rozpustné formy CD28 a CTLA4 boli vytvorené spojením variabilné príbuzných extracelulárnych domén CD28 a CTLA4 s konštantnými doménami imunoglobulínov (Ig) za vzniku CD28lg a CTLA4lg. CTLA4lg viaže ako CD80 pozitívne, tak aj CD86 pozitívne bunky silnejšie ako CD28lg (Linsley, P. a kol., 1994, Immunity, 1: 793-80). Veľa imunitných odoziev závislých od T buniek je blokovaných CTLA4 ako in vitro, tak aj in vivo. (Linsley a kol., 1991b, pozri vyššie; Linsley, P.S. a kol., 1992a, Science, 257: 792-795; Linsley, P.S. a kol.,
1992b, J.Exp. Med., 176: 1595-1604; Lenschow, D.J. a kol., 1992, Science, 257: 789-792; Tan, P. a kol., 1992, J.Exp. Med., 177: 165-173; Turka, L.A., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11102-11105).
Peach a kol. (J.Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058) identifikovali oblasti v extracelulárnej doméne CTLA4, ktoré sú dôležité pre silnú väzbu na CD80. Konkrétne hexapeptidový vzor (MYPPPY) v oblasti podobajúcej sa oblasti 3 určujúcej komplementaritu (CDR3-like región) bol identifikovaný ako úplne zachovaný pri všetkých členoch skupiny CD28 a CTLA4. Alanínová skenovacia mutagenéza prostredníctvom MYPPPY vzoru v CTLA4 a vybraných zvyškoch CD28lg znížila alebo zrušila väzbu na CD80.
Boli tiež vytvorené chimérne molekuly vzájomne si vymieňajúce homológne oblasti CTLA4 a CD28. Molekuly HS4, HS4-A a HS4-B boli vytvorené vložením oblastí CTLA4 podobajúcich sa CDR-3, ktoré tiež obsahovali časť karboxylového konca predĺženého tak, aby obsahoval určité nezachované aminokyselinové zvyšky na CD28lg. Tieto homológy mutantov vykazovali vyššiu väzbovú aviditu k CD80 ako k CD28lg.
V ďalšej skupine chimérnych homológov mutantov, oblasť CTLA4 podobajúca sa CDR1, ktorá nie je zachovaná v CD28 a predpokladá sa, že priestorovo susedí s oblasťou podobajúcou sa CDR3, bola vložená do HS4 a HS4-A. Tieto chimérne homológy molekúl mutantov (označené ako HS7 a HS8) vykazovali dokonca väčšiu väzbovú aviditu pre CD80 ako CD28lg.
Chimérne homológy molekúl mutantov boli tiež pripravené vložením oblasti CTLA4 podobajúcej sa CDR-2 do HS7 a HS8, ale táto kombinácia ďalej nezlepšila väzbovú aviditu pre CD80. Bolo určené, že MYPPPY vzor pri CTLA4 a CD28 je rozhodujúci pre väzbu na CD80, ale určité nezachované aminokyselinové zvyšky v oblastiach CTLA4 podobajúcich sa CDR-1 a CDR-3 boli tiež zodpovedné za zvýšenú väzbovú aviditu CTLA4 k CD80.
Ukázalo sa, že CTLA4lg účinne blokuje kostimuláciu T buniek spojenú s CD80, ale nebol tak účinný pri blokovaní odoziev spojených s CD86. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4, najmä tie majúce vyššiu aviditu pre CD86 ako pre štandardný typ CTLA4 boli vytvorené, aby mohli čo možno najlepšie blokovať aktiváciu antigénom špecificky aktivovaných buniek oproti CTLA4lg.
Z vyššie uvedeného vyplýva, že existuje potreba zlepšiť molekuly CTLA4 tak, aby poskytovali lepšie farmaceutické prostriedky pre imunitnú supresiu a liečbu rakoviny ako skôr známe rozpustné formy CTLA4.
Podstata vynálezu
Tento vynález poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4, ktoré sa viažu na CD80 a/alebo CD86. Medzi molekuly mutantu patria tie, ktoré môžu rozpoznať a naviazať sa buď na CD80 alebo na CD86 alebo na obidva. V niektorých uskutočneniach sa molekuly mutantu viažu na CD80 a/alebo CD86 s väčšou aviditou ako CTLA4.
Jedným príkladom molekuly mutantu CTLA4 je L104EA29Ylg (obrázok 7), ako je opísané v tomto vynáleze. Ďalším príkladom molekuly mutantu CTLA4 je L104Elg (obrázok 8), ako je opísané v tomto vynáleze. L104EA29Ylg a L104Elg sa viažu na CD80 a CD86 intenzívnejšie ako CTLA4lg.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 zobrazuje rovnovážnu väzbovú analýzu L104EA29Ylg, L104Elg a štandardného CTLA4lg na CD86lg.
Obrázky 2A a 2B objasňujú údaje z FACS skúšok ukazujúcich väzbu
L104EA29Ylg, L104Elg a CTLA4lg na ľudské bunky CHO transfekované CD80 alebo CD86, ako je opísané ďalej v príklade 2.
Obrázky 3A a 3B znázorňujú inhibíciu proliferácie CD80-pozitívnych a CD86pozitívnych CHO buniek, ako je opísané ďalej v príklade 2.
Obrázky 4A a 4B ukazujú, že L104EA29Ylg je účinnejšie ako CTLA4lg pri inhibícii proliferácie primárnych a sekundárnych alostimulovaných T buniek, ako je opísané ďalej v príklade 2.
Obrázky 5 A-C ukazujú, že L104EA29Ylg je účinnejší ako CTLA4lg pri inhibícii tvorby cytokínov IL-2 (obr. 5A), IL-4 (obr. 5B) a γ-interferónu (obr. 5C) v alostimulovaných ľudských T bunkách, ako je opísané ďalej v príklade 2.
Obrázok 6 ukazuje, že L104EA29Ylg je účinnejší ako CTLA4lg pri inhibícii proliferácie fytohemaglutinínu - (PHA) stimulovaného opičími T bunkami, ako je opísané ďalej v príklade 2.
Obrázok 7 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu molekuly mutantu CTLA4 (L104EA29Ylg) obsahujúcu signálny peptid; mutovanú extracelulárnu doménu CTLA4 začínajúcu metionínom v polohe +1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124 alebo začínajúcu alanínom v polohe -1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124; a Ig oblasť, ako je opísané ďalej v príklade 1.
Obrázok 8 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu molekuly mutantu CTLA4 (L104Elg) obsahujúcu signálny peptid; mutovanú extracelulárnu doménu CTLA4 začínajúcu metionínom v polohe +1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124 alebo začínajúcu alanínom v polohe -1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124; a Ig oblasť, ako je opísané ďalej v príklade 1.
Obrázok 9 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu CTLA4lg majúcu signálny peptid; štandardnú aminokyselinovú sekvenciu extracelulárnej domény CTLA4 začínajúcu metionínom v polohe +1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124 alebo začínajúcu alanínom v polohe -1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124; a Ig oblasť.
Obrázky 10A-C:
Obrázok 10A je SDS gél: CTLA4lg (pruh 1), L104Elg (pruh 2) a L104EA29Ylg (pruh 3);
Obrázok 10B a 10C - vylučovacia chromatografia - chromatogramy: CTLA4lg obr. 10B a L104EA29Ylg - obr. 10C.
Obrázky 11A a 11B zobrazujú stužkový diagram CTLA4 extracelulárneho Ig Vnásobne vytvoreného zo štruktúry roztoku stanovené NMR spektroskopiou. Obr. 11B zobrazuje detailný pohľad na oblasť S25-R33 a oblasť MYPPPY označujúcu umiestnenie a orientáciu bočného reťazca mutácie, ktorá zvyšuje aviditu L104 a A29.
Obrázok 12 opisuje schematický diagram vektora, piLNLEA29Y, v ktorom je obsiahnutý inzert L104EA29Ylg.
Podrobný opis vynálezu
Definície
Ďalej bude špecifikovaný význam slov alebo fráz používaných v tomto opise vynálezu.
„Štandardný typ CTLA4“ má aminokyselinovú sekvenciu prirodzene sa vyskytujúceho, neskráteného CTLA4 (U.S. patentové spisy č. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795) alebo jeho extracelulárnej domény, ktorý viaže CD80 a/alebo CD86 a/alebo ruší väzbu CD80 a/alebo CD86 na ich ligandy. V určitých uskutočneniach extracelulárna doména štandardného typu CTLA4 začína metionínom v polohe +1 a končí kyselinou asparágovou v polohe +124 alebo extracelulárna doména štandardného typu CTLA4 začína alanínom v polohe -1 a končí kyselinou asparágovou v polohe +124. Štandardná CTLA4 je bunkový povrchový proteín, ktorá má N-koncovú extracelulárnu doménu, transmembránovú doménu a C-koncovú cytoplazmatickú doménu. Extracelulárna doména sa viaže na cieľové antigény, ako je CD80 a CD86. V bunke prirodzene sa vyskytujúcej je štandardný CTLA4 proteín prekladaný transláciou ako nezrelý polypeptid, ktorý obsahuje signálny peptid na N-konci. Nezrelý polypeptid podlieha posttranslačnému spracovaniu, ktoré zahŕňa štiepenie a odstránenie signálneho peptidu za vzniku štiepeného produktu CTLA4, ktorý má novo vytvorený N-koniec, ktorý sa líši od N-konca v nezrelej forme. Odborníkovi v odbore je zrejmé, že k ďalšiemu posttranslačnému spracovaniu môže dochádzať po odstránení jednej alebo viacerých aminokyselín z novo vytvoreného N-konca štiepeného produktu CTLA4. Zrelá forma molekuly CTLA4 obsahuje extracelulárnu doménu alebo akúkoľvek jej časť, ktorá sa viaže na CD80 a/alebo CD86.
„CTLA4lg“ je rozpustný fúzny proteín obsahujúci extracelulárnu doménu štandardného typu CTĽA4 alebo jej časť, ktorá sa viaže na CD80 a/alebo CD86, pričom je napojený na koniec Ig. Určité uskutočnenie obsahuje extracelulárnu doménu štandardného typu CTLA4, ktorá začína metionínom v polohe +1 a končí kyselinou asparágovou v polohe +124; alebo začína alanínom v polohe -1 a končí kyselinou asparágovou v polohe +124; napojenie glutamínového kyselinového zvyšku v polohe +125; a imunoglobulínovú časť obsahujúcu kyselinu glutámovú v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357 (Obrázok 9).
„Fúzny proteín“ je definovaný ako jedna alebo viacero aminokyselinových sekvencií spojených s použitím spôsobov dobre známych v odbore a ako je opísané v U.S. patentovom spise č. 5,434,131 alebo 5,637,481. Spojené aminokyselinové sekvencie týmto vytvárajú jeden fúzny proteín.
„Molekula mutantu CTLA4“ je molekula, ktorou môže byť celá molekula CTLA4 alebo jej časti (deriváty alebo fragmenty), ktoré majú mutáciu alebo viacej mutácii v CTLA4 (výhodne v extracelulárnej doméne CTLA4), takže je podobná, ale nie je identická so štandardnou molekulou CTLA4. Molekuly mutantu sa viažu buď na CD80 alebo na CD86 alebo na obidva antigény. Molekuly mutantu CTLA4 môžu obsahovať biologicky alebo chemicky aktívnu cudziu molekulu odlišnú od CTLA4, ktorá je zabudovaná vo vnútri alebo je pripojená. Molekuly mutantu môžu byť rozpustné (t.j. cirkulujúce) alebo naviazané na povrch. Molekuly mutantu CTLA4 môžu obsahovať celú extracelulárnu doménu CTLA4 alebo jej časti, ako sú napríklad fragmenty alebo deriváty. Molekuly mutantu CTLA4 môžu byť pripravené synteticky alebo rekombinantné.
„Mutácia“ je zmena nukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencie štandardného polypeptidu. V tomto prípade to je zmena štandardnej extracelulárnej domény CTLA4. Táto zmena môže byť aminokyselinová zmena ako sú substitúcia, delécia, adícia alebo trunkacia (skomolenie). Molekula mutantu môže mať jednu alebo viacej mutácii. Mutácie v nukleotidovej sekvencií môžu, ale nemusia mať za následok mutáciu v aminokyselinovej sekvencií, ako je dobre známe odborníkom v odbore. Z tohto hľadiska určité nukleotidové kodóny kódujú rovnakú aminokyselinu. Napríklad nukleotidové kodóny CGU, CGG, CGC a CGA kódujú aminokyselinu arginín (R); alebo kodóny GAU a GAC kódujú aminokyselinu kyselinu asparágovú (D). Tak proteín môže byť kódovaný jednou alebo viacerými molekulami nukleovej kyseliny, ktoré sa líšia v ich špecifickej nukleotidovej sekvencií, ale napriek tomu kódované molekuly proteínu majú identické sekvencie. Sekvencie kódujúce aminokyseliny sú nasledujúce:
Aminokyselina Symbol Jednopísmenný Kodóny
Alanín Ala A GCU, GCC, GCA, GCG
Cysteín Cys C UGU, UGC
Asparágová Asp D GAU, GAC
Glutámová Glu E GAA, GAG
Fenylalanín Phe F UUU, UUC
Gly cín Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
Histidín His H C AU, CAC
Izoleucín lle I ÄUU, AUC, AUA
Lyzín Lys K AAA, AAG
Leucín Leu L UUA, UUG, CUU, CUC
Metionín Met M AUG
Asparagín Asn N AAU, AAC
Prolín Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamín Gin Q CAA, CAG
Arginín Arg R CGU, CGC, CGA, CGG
Serín Ser S UCU, UCC, UCA, UCG
Treonín Thr T ACU, ACC, ACA, ACG
Valín Val V GUU, GUC, GUA, GUG
Tryptofán Trp W UGG
Tyrozín Tyr Y UAU, UAC
„Extracelulárna doména CTLA4“ je časť CTLA4, ktorá rozpoznáva a viaže CD80 a/alebo CD86. Napríklad extracelulárna doména CTLA4 začína metionínom v polohe +1 a končí kyselinou asparágovou v polohe +124 (obrázok 9). Alternatívne extracelulárna doména začína alanínom v polohe -1 a končí kyselinou asparágovou v polohe +124 (obrázok 9). Extracelulárna doména obsahuje fragmenty alebo deriváty CTLA4, ktoré viažu CD80 a/alebo CD86.
„Proteínová sekvencia ne-CTLA4“ alebo „molekula ne-CTLA4“ je definovaná ako akákoľvek molekula, ktorá neviaže CD80 a/alebo CD86 a neinterferuje s väzbou CTLA4 na jej cieľ. Takým neobmedzujúcim príkladom je napríklad konštantná oblasť imunoglobulínu (Ig) alebo jej časť. Výhodne je konštantnou oblasťou Ig ľudská alebo opičia konštantná oblasť Ig, ako je napríklad ľudská C (gama) 1, vrátane oblasti pantovej, CH2 a CH3. Táto konštantná oblasť Ig môže byť mutovaná na zníženie jej efektorových funkcií (U.S. patentové spisy 5,637,481 a 6,132,992).
„Fragment molekuly mutantu CTLA4“ je časť molekuly mutantu CTLA4, výhodne extracelulárna doména CTLA4 alebo jej časť, ktorá rozpoznáva a viaže sa na jej cieľ, ako je napríklad CD80 a/alebo CD86.
„Derivát molekuly mutantu CTLA4“ je molekula, ktorá má aspoň 70 % sekvenčnú podobnosť a funkcie ako extracelulárna doména CTLA4, t.j. že rozpoznáva a viaže CD80 a/alebo CD86.
„Časť molekuly CTLA4“ obsahuje fragmenty alebo deriváty molekuly CTLA4, ktorá viaže CD80 a/alebo CD86.
Z dôvodu lepšieho pochopenia tohto vynálezu je ďalej uvedený nasledujúci opis.
Kompozície podľa vynálezu
Tento vynález poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4, ktoré rozpoznávajú a viažu CD80 a/alebo CD86. V niektorých uskutočneniach majú rozpustné mutanty CTLA4 vyššiu aviditu k CD80 a/alebo CD86 ako CTLA4lg.
Medzi príklady molekúl mutantu CTLA4 patria L104EA29Ylg (obrázok 7). Aminokyselinová sekvencia L104EA29Ylg môže začínať alanínom v aminokyselinovej polohe -1 a končiť lyzínom v aminokyselinovej polohe +357. Alternatívne aminokyselinová sekvencia L104EA29Y,g môže začínať metionínom v aminokyselinovej polohe +1 a končiť lyzínom v aminokyselinovej polohe +357. CTLA4 časť L104EA29Ylg začína metionínom v aminokyselinovej polohe +1 a končí kyselinou asparágovou v aminokyselinovej polohe +124. L104EA29Ylg obsahuje spojenie aminokyselinového zvyšku glutamínu v polohe +125 a imunoglobulínovú časť začínajúcu kyselinou glutámovou v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357 (obrázok 7). L104EA29Ylg sa viaže približne 2 krát intenzívnejšie ako štandardný typ CTLA4lg (ďalej označovaný ako CTLA4lg) na CD80 a približne 4 krát intenzívnejšie na CD86. Táto silnejšia väzba L104EA29Ylg spôsobuje, že je účinnejšia ako CTLA4lg pri blokovaní imunitných reakcií.
Molekuly mutantu CTLA4 obsahujú aspoň extracelulárnu doménu CTLA4 alebo jej časti, ktoré viažu CD80 a/alebo CD86. Extracelulárna časť molekuly mutantu CTLA4 obsahuje aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu metionínom v polohe +1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124 (obrázok 7 alebo 8). Alternatívne extracelulárna časť CTLA4 môže obsahovať aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu alanínom v polohe -1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124 (obrázok 7 alebo 8).
V jednom uskutočnení rozpustná molekula mutantu CTLA4 je fúznym proteínom obsahujúcim extracelulárnu doménu CTLA4, ktorá má jednu alebo viac mutácií v oblasti aminokyselinovej sekvencie začínajúcu serínom v polohe +25 a končiacu arginínom v polohe +33 (S25-R33). Napríklad alanín v polohe +29 štandardného CTLA4 môže byť substituovaný (nahradený) tyrozínom (kodóny UAU, UAC). Alternatívne alanín môže byť substituovaný leucínom (kodóny: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), fenylalanínom (kodóny: UUU, UUC), tryptofánom (kodón: UGG) alebo treonínom (kodóny: ACU, ACC, ACA, ACG). Odborníkovi v odbore je zrejmé, že uracilový nukleotid (U) sekvencie RNA zodpovedá tymínovému nukleotidu (T) sekvencie DNA.
V ďalšom uskutočnení rozpustná molekula mutantu CTLA4 je fúznym proteínom obsahujúcim extracelulárnu doménu CTLA4, ktorá má jednu alebo viac mutácií vo vnútri alebo blízko oblasti aminokyselinovej sekvencie začínajúcej metionínom v polohe +97 a končiacej glycínom v polohe +107 (M97-G107). Napríklad leucín v polohe +104 štandardného CTLA4 môže byť substituovaný kyselinou glutámovou (kodóny: GAA, GAG). Molekula mutantu
CTLA4 s touto substitúciou je označovaná v tomto texte ako L104Elg (obrázok 8).
V ešte ďalšom uskutočnení rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 je fúzny protein obsahujúci extracelulárnu doménu CTLA4, ktorá má jednu alebo viac mutácií v oblastiach S25-R33 a M97-G107. Napríklad v jednom uskutočnení molekula mutantu CTLA4 obsahuje tyrozín v polohe +29 namiesto alanínu a kyselinu glutámovú v polohe +104 namiesto leucínu. Molekula mutantu CTLA4 s týmito substitúciami je označovaná v tomto texte ako L104EA29Ylg (obrázok 7). Molekula nukleovej kyseliny, ktorá kóduje L104EA29Ylg je obsiahnutá v pD16L104EA29Ylg a bola uložená 19. júna 2000 do Americkej zbierky typov kultúr (American Type Culture Collection - ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (ATCC č. PTA-2104). Vektor pD16L104EA29Ylg je odvodený z vektora pcDNA3 (INVITROGEN).
Tento vynález ďalej poskytuje rozpustnú molekulu mutantu CTLA4 obsahujúcu extracelulárnu doménu mutantu CTLA4, ako je znázornená na obrázku 7 alebo 8 alebo jej časť(i) a časť, ktorá mení rozpustnosť, afinitu a/alebo mocenstvo molekuly mutantu CTLA4.
V súlade s aplikáciou tohto vynálezu touto časťou môže byť konštantná oblasť imunoglobulínu alebo jej časť. Na použitie in vivo je výhodné, aby konštantná oblasť imunoglobulínu nevyvolávala nežiaducu imunitnú reakciu v subjekte. Napríklad v klinických skúškach môže byť výhodné, aby molekuly mutantu obsahovali konštantné oblasti ľudského a opičieho imunoglobulínu. Jedným príkladom vhodnej oblasti imunoglobulínu je ľudská C (gama) 1, ktorá obsahuje oblasti pantovú, CH2 a CH3. Sú možné ďalšie izotypy. Ďalej sú možné ďalšie konštantné oblasti imunoglobulínu (výhodne slabo alebo neimunogénne konštantné oblasti imunoglobulínu).
Ďalšie časti obsahujú polypeptidové značky („tags“). Medzi vhodné značky napríklad patrí molekula p97, molekula env gp120, molekula E7 a molekula ova (Dash, B., a kol., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1389-97; Ikeda, T., a kol., 1994, Gene, 138: 193-6; Falk, K., a kol., 1993, Celí. Immunol., 150: 44752; Fujisaka, K. a kol., 1994, Virology, 204: 789-93). Ďalšie molekuly na použitie ako značky sú možné (Gerard, C. a kol., 1994, Neuroscience, 62: 721739; Bym R. a kol., J. Virol., 1989, 63: 4370-4375; Smith D. a kol., 1987, Science, 238: 1704-1707; Lásky, L., 1996, Science, 233: 209-212).
Tento vynález ďalej poskytuje rozpustné fúzne proteíny mutantu CTLA4, ktoré sú výhodne reaktívnejšie s antigénom CD80 a/alebo 86 v porovnaní so štandardným CTLA4. Jedným príkladom je L104EA29Ylg, ako je znázornené na obrázku 7.
V ďalšom uskutočnení rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje spojovací aminokyselinový zvyšok, ktorý je umiestnený medzi časťou CTLA4 a imunoglobulínovou časťou. Spojovacou aminokyselinou môže byť akákoľvek aminokyselina vrátane glutamínu. Táto spojovacia aminokyselina môže byť zavedená spôsobmi molekulárnej alebo chemickej syntézy, ktoré sú známe v odbore.
V ďalšom uskutočnení rozpustná molekula mutantu obsahuje imunoglobulínovú časť (napríklad pantovú, CH2 a CH3 doménu), kde ktorýkoľvek alebo všetky cysteínové zvyšky v pantovej doméne imunoglobulínovej časti sú substituované serínom, napríklad cysteíny v polohách +130, +136, +139 (obrázok 7 alebo 8). Táto molekula mutantu môže tiež obsahovať prolín v polohe +148, ktorý je substituovaný serínom, ako je znázornené na obrázku 7 alebo 8.
Rozpustná molekula mutantu CTLA4 môže obsahovať signálnu peptidovú sekvenciu spojenú s N-koncom extracelulárnej domény CTLA4 časti molekuly mutantu. Signálnym peptidom môže byť akákoľvek sekvencia, ktorá umožní vylučovanie molekuly peptidu, ako je signálny peptid z onkostatínu M (Malik, a kol., 1989, Molec. Celí Biol., 9: 2847-2853) alebo CD5 (Jones, N.H. a kol., 1986, Náture, 323: 346-349), alebo signálny peptid z akéhokoľvek extracelulárneho proteínu.
Molekula mutantu môže obsahovať signálny peptid onkostatín M spojený s N-koncom extracelulárnej domény CTLA4 a molekulu ľudského imunoglobulínu (napríklad pantovú, CH2 a CH3) spojenú s C-koncom extracelulárnej domény CTLA4. Táto molekula obsahuje signálny peptid onkostatín M s aminokyselinovou sekvenciou začínajúcou metionínom v polohe -26 a končiacou alanínom v polohe -1, CTLA4 časť obsahuje aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu metionínom v polohe +1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamínu v polohe +125 a imunoglobulínovú časť obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu kyselinou glutámovou v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357.
Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu môžu byť pripravené molekulárnymi a chemickými spôsobmi syntézy. Molekulárne spôsoby môžu zahrňovať nasledujúce kroky: zavedenie molekuly nukleovej kyseliny do vhodnej hostiteľskej bunky, kde sa exprimuje a kóduje rozpustnou molekulou mutantu CTLA4; kultiváciu hostiteľskej bunky za podmienok, ktoré umožňujú expresiu molekúl mutantu v hostiteľskej bunke; a izoláciu exprimovaných molekúl mutantu. Časť signálneho peptidu molekuly mutantu umožňuje, aby molekuly proteínu boli exprimované na bunkovom povrchu a boli vylučované hostiteľskou bunkou. Transláciou vytvorenej molekuly mutantu môžu byť posttranslačne modifikované, ako je napríklad odštiepenie signálneho peptidu za vzniku zrelého proteínu majúceho CTLA4 a imunoglobulínovú časť. K štiepeniu môže dochádzať za alanínom v polohe -1, čím vzniká zrelá molekula mutantu majúca metionín v polohe +1 ako prvú aminokyselinu (obrázok 7 alebo 8). Alternatívne k štiepeniu môže dochádzať za metionínom v polohe -2, čím vzniká zrelá molekula mutantu majúca alanín v polohe -1 ako prvú aminokyselinu.
Vo výhodnom uskutočnení je rozpustná molekula mutantu CTLA4 majúca extracelulárnu doménu ľudského CTLA4 spojená s celou molekulou alebo časťou molekuly ľudského imunoglobulínu (napríklad pantovú, CH2 a CH3). Táto výhodná molekula obsahuje CTLA4 časť rozpustnej molekuly zloženej z aminokyselinovej sekvencie začínajúcej metionínom v polohe +1 a končiacej kyselinou asparágovou v polohe +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamínu v polohe +125 a imunoglobulínovú časť začínajúcu kyselinou glutámovou v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357. Časť obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 je mutovaná tak, že alanín v polohe +29 je substituovaný tyrozínom a leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou. Imunoglobulínová časť molekuly mutantu môže byť mutovaná tak, že cysteíny v polohách +130, +136 a +139 sú substituované serínom a prolín v polohe +148 je substituovaný serínom. Táto molekula mutantu je v tomto texte označená ako L104EA29Ylg (obrázok 7).
V ďalšom uskutočnení má molekula mutantu L104EA29Ylg aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu alanínom v polohe -1 a končiacu kyselinou asparágovou v polohe +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamínu v polohe +125 a imunoglobulínovú časť začínajúcu kyselinou glutámovou v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357. Časť obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 je mutovaná tak, že alanín v polohe +29 je nahradený tyrozínom a leucín v polohe +104 je nahradený kyselinou glutámovou. Imunoglobulínová časť molekuly mutantu je mutovaná tak, že cysteíny v polohách +130, +136 a +139 sú nahradené serínom a prolín v polohe +148 je nahradený serínom. Táto molekula mutantu je v tomto texte označená ako L104EA29Ylg (obrázok 7). Po odštiepení signálnej sekvencie L104EA29Ylg môže buď začínať metionínom v polohe +1 alebo začína alanínom v polohe -1.
Ďalšou molekulou mutantu podľa tohto vynálezu je rozpustná molekula mutantu CTLA4 majúca extracelulárnu doménu ľudského CTLA4 spojenú s molekulou ľudského imunoglobulínu (napríklad pánt, CH2, CH3). Táto molekula obsahuje časť aminokyselinovej sekvencie kódujúcej CTLA4 začínajúcej metionínom v polohe +1 a končiacej kyselinou asparágovou v polohe +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamínu v polohe +125 a imunoglobulínovú časť obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu začínajúcu kyselinou glutámovou v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357. Časť obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 je mutovaná tak, že leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou. Pantová časť molekuly mutantu je mutovaná tak, že cysteíny v polohách +130, +136, +139 sú substituované serínom a prolín v polohe +148 je substituovaný serínom. Táto molekula mutantu je v tomto texte označená ako L104Elg (obrázok 8).
V alternatívnom uskutočnení L104Elg je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 majúca extracelulárnu doménu ľudského CTLA4 spojenú s molekulou ľudského proteínu (napr. pánt, CH2 a CH3). Táto výhodná molekula obsahuje CTLA4 časť skladajúcu sa z aminokyselinovej sekvencie začínajúca alanínom v polohe -1 a končiaca kyselinou asparágovou v polohe +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamínu v polohe +125 a imunoglobulínovú časť začínajúcu kyselinou glutámovou v polohe +126 a končiacu lyzínom v polohe +357. Časť obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 je mutovaná tak, že leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou. Pantová časť molekuly mutantu je mutovaná tak, že cysteíny v polohách +130, +136 a +139 sú substituované serínom a prolín v polohe +148 je substituovaný serínom. Táto molekula mutantu je v tomto texte označená ako L104Elg (obrázok 8).
Ďalej tento vynález poskytuje rozpustnú molekulu mutantu CTLA4 majúcu: a) prvú aminokyselinovú sekvenciu membránového glykoproteínu, napríklad CD28, CD86, CD80, CD40 a gp39, ktorý blokuje proliferáciu T buniek, fúzovanú s druhou aminokyselinovou sekvenciou: b) druhá aminokyselinová sekvencia je fragmentom extracelulárnej domény mutantu CTLA4, ktorý blokuje proliferáciu T buniek, ako je napríklad molekula aminokyseliny začínajúca metionínom v polohe +1 a končiaca kyselinou asparágovou v polohe +124 (obrázok 7 alebo 8); a tretiu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá pôsobí ako identifikačná značka alebo zvyšuje rozpustnosť molekuly. Napríklad tretia aminokyselinová sekvencia sa môže v podstate skladať z aminokyselinových oblastí pantovej, CH2 a CH3 neimunogénnej molekuly imunoglobulínu. Medzi príklady vhodných molekúl imunoglobulínu napríklad patrí ľudský alebo opičí imunoglobulín, ako je C(gama)1. Ďalšie izotypy sú tiež možné.
Tento vynález ďalej poskytuje molekuly nukleovej kyseliny obsahujúce nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce rozpustným molekulám mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu. V jednom uskutočnení je molekula nukleovej kyseliny DNA (napríklad cDNA) alebo jej hybrid. Alternatívne sú molekulami nukleovej kyseliny RNA alebo jej hybridy.
Ďalej tento vynález poskytuje vektor, ktorý obsahuje nukleotidové sekvencie podľa tohto vynálezu. Tiež je poskytnutý hostiteľský vektorový systém. Hostiteľský vektorový systém zahŕňa vektor podľa tohto vynálezu vo vhodnej hostiteľskej bunke. Medzi príklady vhodných hostiteľských buniek napríklad patria prokaryotické a eukaryotické bunky.
Tento vynález poskytuje farmaceutické prostriedky (kompozície) na použitie pri liečbe ochorení imunitného systému, pričom tieto prostriedky obsahujú farmaceutický účinné množstvá rozpustných molekúl mutantu CTLA4. V určitých uskutočneniach sú ochorenia imunitného systému sprostredkované interakciami CD28- a/alebo CTLA4-pozitívnych buniek s pozitívnymi bunkami CD80 a/alebo CD86. Rozpustnými molekulami mutantu CTLA4 sú výhodne molekuly CTLA4 majúce jednu alebo viac mutácií v extracelulárnej oblasti CTLA4. Farmaceutický prostriedok môže obsahovať rozpustné proteínové molekuly mutantu CTLA4 a/alebo molekuly nukleovej kyseliny a/alebo vektory kódujúce tieto molekuly. Vo výhodných uskutočneniach rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 majú aminokyselinovú sekvenciu extracelulárnej domény CTLA4, ako je znázornená na obrázku 7 a 8 (L104EA29Y alebo L104E). Výhodnejšie je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 L104EA29Ylg, ako je opísané v tomto texte. Tieto prostriedky môžu ďalej obsahovať ďalšie terapeutické činidlá, ako sú napríklad liečivé toxíny, enzýmy, protilátky alebo konjugáty (bez obmedzenia na tieto príklady).
Farmaceutické kompozície tiež výhodne obsahujú nosiče a pomocné látky, čo sú akékoľvek látky, ktoré po zlúčení s molekulou podľa tohto vynálezu (napríklad rozpustnou molekulou mutantu CTLA4, ako je L104EA29Y alebo L104E) zachovajú molekulovú aktivitu a nereagujú s imunitným systémom subjektu (pacienta). Medzi neobmedzujúce príklady vhodných nosičov a pomocných látok napríklad patrí ľudský sérový albumín, iónomeniče, oxid hlinitý (alumina), lecitín, pufrovacie látky, ako sú fosfáty, glycín, kyselina sorbová, sorbát draselný a soli alebo elektrolyty, ako je protamínsulfát. Medzi ďalšie príklady patria akékoľvek štandardné farmaceutické nosiče, ako je fýziologický roztok pufrovaný fosfátom, voda, emulzia, ako je emulzia olej/voda; a rôzne typy zmáčadiel. Ďalšími nosičmi môžu tiež byť sterilné roztoky, tablety vrátane potiahnutých tabliet a kapsúl. Zvyčajne takéto nosiče obsahujú vehikulá, ako je škrob, mlieko, cukor, určité druhy ílu, želatína, kyselina steárová alebo jej soli, stearát horečnatý alebo vápenatý, mastenec, rastlinné tuky alebo oleje, gumy, glykoly alebo ďalšie známe vehikulá. Takéto nosiče môžu tiež zahrňovať aromatizačné a farebné aditíva alebo iné zložky. Prostriedky obsahujúce takéto nosiče sú pripravené dobre známymi konvenčnými spôsobmi. Takéto prostriedky môžu tiež byť zabudované do rôznych tukových kompozícií ako sú napríklad lipozómy a taktiež aj rôznych polymérnych kompozícií, ako sú polymérne mikroguľôčky.
Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu byť podávané subjektu bežnými spôsobmi podávania, ako je napríklad intravenózna aplikácia, intraperitoneálna aplikácia, intramuskulárna aplikácia, subkutánna aplikácia, orálna aplikácia, podávanie pomocou čapíkov, miestne podávanie alebo podávanie implantačným zariadením na pomalé uvoľňovanie, ako je miniosmotická pumpa.
Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu byť v rôznych dávkovacích formách ako sú napríklad kvapalné roztoky alebo suspenzie, tablety, pilulky, prášky, čapíky, polymérne mikrokapsuly alebo mikrovezikuly, lipozómy a injektovateľné alebo infúzne roztoky. Výhodná forma závisí od spôsobu podávania a terapeutickej aplikácie.
Najúčinnejší spôsob podávania a dávkovacia schéma prostriedkov podľa tohto vynálezu závisí od intenzity a priebehu ochorenia, pacientovho zdravotného stavu, reakcie na liečbu a posúdenia ošetrujúcim lekárom. Z tohto dôvodu by dávkovanie prostriedkov malo byť upravované podľa individuálneho subjektu.
Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 môžu byť podávané subjektu v množstve a čase (napríklad časový interval a početnosť) dostatočnom na blokovanie endogénnych molekúl B7 (ako je napríklad CD80 a/alebo CD86) od väzby na ich ligandy. Blokovaním väzby endogénny B7/ligand dochádza k inhibícii interakcií medzi B7-pozitívnymi bunkami (ako sú napríklad CD80a/alebo CD86-pozitívne bunky) a pozitívnymi bunkami CD28 a/alebo CTLA4. Dávkovanie terapeutického činidla je závislé od mnohých faktorov, ako je napríklad typ postihnutého tkaniva, typ liečeného autoimunitného ochorenia, intenzita ochorenia, pacientov zdravotný stav a pacientova reakcia na liečbu týmito činidlami. Preto sa dávkovanie týchto činidiel môže líšiť v závislosti od subjektu a spôsobu podávania. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 môžu byť podávané v množstve od 0,1 do 20,0 mg/kg hmotnosti pacienta/deň, výhodne od 0,5 do 10,0 mg/kg/deň. Podávanie farmaceutických prostriedkov podľa tohto vynálezu môže byť uskutočňované v rôznych časových intervaloch. V jednom uskutočnení môže byť farmaceutická kompozícia podľa tohto vynálezu podávaná jednu alebo viac hodín. Ďalej podávanie môže byť opakované v závislosti od intenzity ochorenia a taktiež aj od ďalších faktorov, ktoré sú známe odborníkovi v odbore.
Tento vynález ďalej poskytuje spôsoby prípravy proteínu, ktoré zahŕňajú rast hostiteľského vektorového systému podľa tohto vynálezu za produkcie proteínu v hostiteľovi a odoberaní takto pripraveného proteínu.
Ďalej tento vynález poskytuje spôsoby regulácie funkčných interakcií CTLA4- a CD28-pozitívnych T buniek s CD80- a/alebo CD86-pozitívnymi bunkami. Tento spôsob zahŕňa kontakt CD80- a/alebo CD86-pozitívnych buniek s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu tak, aby bol vytvorený komplex mutantu CTLA4/CD80 a/alebo komplex mutantu CTLA4/CD86, pričom tieto komplexy interferujú s reakciou endogénneho antigénu CTLA4 s CD80 a/alebo CD86 a/alebo interferujú s reakciou endogénneho antigénu CD28 s CD80 a/alebo CD86. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 fúzny proteín, ktorý obsahuje aspoň časť extracelulárnej domény mutantu CTLA4. V ďalšom uskutočnení rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje: prvú aminokyselinovú sekvenciu zahrňujúcu extracelulárnu doménu CTLA4 z aminokyšelinovej sekvencie začínajúcej metionínom v polohe +1 a končiacej kyselinou asparágovou v polohe +124, zahrňujúcu aspoň jednu mutáciu; a druhú aminokyselinovú sekvenciu zahrňujúcu oblasti pantové, CH2 a CH3 molekuly ľudského imunoglobulínu gama 1 (obrázok 7 alebo 8).
Pri aplikácii tohto vynálezu sú CD80- alebo CD86-pozitívne bunky kontaktované s fragmentmi alebo derivátmi rozpustných molekúl mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu. Alternatívne je rozpustná molekula mutantu CTLA4 fúznym proteínom CD28lg/CTI_A4lg majúcim prvú aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu časti extracelulárnej domény receptora CD28 spojenú s druhou aminokyselinovou sekvenciou zodpovedajúcou časti extracelulárnej domény receptora mutantu CTI_A4 a tretiu aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu oblastiam pantovým, CH2 a CH3 ľudského imunoglobulínu C-gama-1.
Očakáva sa, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 budú vykazovať inhibičné vlastnosti in vivo. Za podmienok, kde dochádza k interakciám T bunka/APC bunka, napríklad interakciám T bunka/B bunka, ako výsledok kontaktu medzi T bunkami a APC bunkami, väzba zavedených molekúl mutantu k reagovaniu s CD80- a/alebo CD86-pozitívnymi bunkami, napríklad B bunkami, môže interferovať, t.j. inhibovať interakcie T bunka/APC bunka, čo má za následok reguláciu imunitných odoziev.
Tento vynález poskytuje spôsoby znižovania rozsahu imunitných odoziev. Regulácia smerujúca na znižovanie imunitnej odozvy rozpustnými molekulami CTLA4 môže prebiehať prostredníctvom inhibície alebo blokovania imunitnej odozvy už prebiehajúcej alebo môže zahrňovať zabránenie indukcie imunitnej odozvy. Rozpustné molekuly CTLA4 podľa tohto vynálezu môžu inhibovať funkcie aktivovaných T buniek, ako je proliferácia T lymfocytov a vylučovanie cytokínu, potlačením odoziev T buniek alebo vyvolaním špecifickej tolerancie u T buniek, alebo obidvoma spôsobmi.
Tento vynález ďalej poskytuje spôsoby liečby ochorení imunitného systému a vyvolanie tolerancie. V určitých prípadoch sú ochorenia imunitného systému sprostredkované interakciami CD28- a/alebo CTLA4-pozitívnych buniek s CD80/CD86-pozitívnymi bunkami. V ďalšom uskutočnení sú inhibované interakcie T buniek. Medzi ochorenia imunitného systému napríklad patria autoimunitné ochorenia, imunoproliferačné ochorenia, poruchy spojené s transplantáciou štepu. Tieto spôsoby zahŕňajú podávanie rozpustných molekúl mutantu CTI_A4 podľa tohto vynálezu subjektu s cieľom regulácie interakcií T buniek s CD80- a/alebo CD86-pozitívnymi bunkami. Alternatívne môže byť podávaný hybrid mutantu CTLA4 majúci membránový glykoproteín spojený s molekulou mutantu CTLA4. Medzi príklady ochorení spojených s transplantáciou štepu patrí transplantačná reakcia príjemcu voči štepu (graft versus host disease GVHD) (napríklad môže byť spôsobená transplantáciou kostnej drene alebo pri vyvolaní tolerancie), imunitné poruchy spojené s odhojením transplantovaného štepu, chronické odmietnutia a tkanivové alebo bunkové alo- alebo xenoimplantáty zahrňujúce pevné orgány, kožu, ostrovčeky, svaly, hepatocyty, neuróny. Medzi príklady imunoproliferačných ochorení napríklad patria lupienka; T bunkový lymfóm; T bunková akútna lymfoblastická leukémia; testikulárny angiocentrický T bunkový lymfóm; benígna lymfocytická angiitída; a autoimúnne ochorenia ako je lupus (napríklad lupus erythematosus, lupus nefritis), Hashimotova tyroiditída, primárny myxedém, Gravesova choroba, zhubná anémia, autoimunitná atrofická gastritída, Addisonova choroba, cukrovka (napríklad inzulín dependentný diabetes melitus, diabetes melitus typu I), syndróm dobrých pastvín, myastenia gravis, pemfigus, Crohnova choroba, sympatická oftalmia, autoimunitná uveitída, roztrúsená skleróza, autoimunitná hemolytická anémia, idiopatická trombocytopénia, primárna biliárna cirhóza, chronická hepatitída, ulceratívna kolítída, Sjogrenov syndróm, reumatické ochorenie (ako napríklad reumatická artritída), polymyozitída, sklerodermia a zmiešané ochorenie spojivového tkaniva.
Tento vynález tiež poskytuje spôsob inhibície transplantačného odmietnutia pevných orgánov a/alebo tkanív subjektom, týmto subjektom je príjemca transplantovaného tkaniva. Zvyčajne je odmietnutie štepu pri tkanivových transplantátoch iniciované prostredníctvom jeho rozpoznania ako cudzieho T bunkami, potom nasleduje imunitná reakcia, ktorá zničí tento štep. Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu môžu inhibovaním proliferácie T lymfocytov a/alebo sekrécie cytokínu znížiť deštrukciu tkaniva a vyvolať útlm antigén-špecifických T buniek, čo môže mať za následok dlhodobé prijatie štepu bez nutnosti celkovej imunosupresie. Ďalej môžu byť podávané rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu s ďalšími liečivými prípravkami, ako sú napríklad kortikoidy, cyklosporín, rapamycín, mykofenolát, mofetil, azatioprin, takrolizmus, baziliximab a/alebo ďalšie biologické látky.
Tento vynález tiež poskytuje spôsoby inhibície transplantačnej reakcie príjemca voči štepu u subjektu. Tento spôsob zahŕňa podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu subjektu, a to buď samostatne alebo spoločne s ďalšími prídavnými ligandmi reagujúcimi s IL-2, IL-4 alebo γinterferónom. Napríklad rozpustná molekula mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu môže byť podávaná príjemcovi transplantátu kostnej drene z dôvodu inhibície aloreaktivity donorových T buniek. Alternatívne môže byť spôsobené, aby darcovské T bunky v kostnej dreni boli tolerované aloantigénmi príjemcu ex vivo pred transplantáciou.
Inhibícia odoziev T buniek rozpustnými molekulami mutantu CTLA4 môže tiež byť užitočná pri liečbe autoimunitných porúch. Veľa autoimunitných porúch vzniká nevhodnou aktiváciou T buniek, ktoré sú reaktívne voči autoantigénom a ktoré podporujú produkciu cytokínov a protilátok, ktoré sú zapojené v patológii tohto ochorenia. Podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 subjektu trpiacemu alebo vnímavému na autoimunitnú poruchu môže zabrániť aktivácii autoreaktívnych T buniek a môže znížiť alebo eliminovať symptómy ochorenia. Tento spôsob tiež zahŕňa podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu subjektu, a to buď samotnej alebo spoločne s ďalšími prídavnými ligandmi reagujúcimi s IL-2, IL-4 alebo γinterferónom.
Tento vynález ďalej poskytuje použitie rozpustných molekúl mutantu CTLA4 spoločne s ďalšími imunosupresívnymi látkami, ako je napríklad cyklosporín (pozri Mathiesen: „Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Celíš in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats“ (1989), Cancer Lett., 44: 151-156), prednison, azatioprin a metotrexat (R. Handschumacher „Chapter 53: Drugs Used for Immunosuppression“, s. 1264-1276). Ďalšie imunosupresivne látky sú možné. Napríklad pri liečbe reumatickej artritídy môžu byť rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podávané spoločne s farmaceutickými látkami, ako sú napríklad kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové liečivá/Cox-2 inhibítory, metotrexat, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, infliximab, anakinra, azatioprin a/alebo ďalšie biologické látky ako je anti-TNF. Pri liečbe systematického lupus erytematosus môžu byť podávané rozpustné molekuly mutantu CTLA4 spoločne s farmaceutickými prípravkami ako sú napríklad kortikosteroidy, cytoxan, azatioprin, hydroxychlorochin, mykofenolát mofetil a/alebo ďalšie biologické látky. Ďalej pri liečbe systematickej roztrúsenej sklerózy môžu byť podávané rozpustné molekuly mutantu CTLA4 spoločne s farmaceutickými prípravkami, ako sú napríklad kortikosteroidy, interferón beta1a, interferón beta-1b, glatirameracetat, mitoxantronhydrochlorid a/alebo ďalšie biologické látky.
Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 (výhodne L104EA29Ylg) môžu byť tiež použité spoločne s jedným alebo viacerými z nasledujúcich činidiel na reguláciu imunitnej odozvy: rozpustný gp39 (tiež známy ako CD40 ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), rozpustný CD29, rozpustný CD40, rozpustný CD80, rozpustný CD86, rozpustný CD28, rozpustný CD56, rozpustný Thy-1, rozpustný CD3, rozpustný TCR, rozpustný VLA-4, rozpustný VCAM-1, rozpustný LECAM-1, rozpustný ELAM-1, rozpustný CD44, protilátky reagujúce s gp39, protilátky reagujúce s CD40, protilátky reagujúce s B7, protilátky reagujúce s CD28, protilátky reagujúce s LFA-1, protilátky reagujúce s LFA-2, protilátky reagujúce s IL-2, protilátky reagujúce s IL-12, protilátky reagujúce s IFN-gama, protilátky reagujúce s CD2, protilátky reagujúce s CD48, protilátky reagujúce s ICAM (napríklad ICAM-2), protilátky reagujúce s CTLA4, protilátky reagujúce s Thy-1, protilátky reagujúce s CD56, protilátky reagujúce s CD3, protilátky reagujúce s CD29, protilátky reagujúce s TCR, protilátky reagujúce s VLA-4, protilátky reagujúce s VCAM-1, protilátky reagujúce s LECAM-1, protilátky reagujúce s ELAM-1, protilátky reagujúce s CD44. V určitých uskutočneniach sú výhodné monoklonálne protilátky. V iných uskutočneniach sú výhodné fragmenty protilátok. Odborníkovi v odbore je zrejmé, že táto kombinácia môže zahrňovať rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu a jedno ďalšie imunosupresívne činidlo, rozpustné molekuly mutantu CTLA4 s dvoma ďalšími imunosupresívnymi činidlami, rozpustné molekuly mutantu CTLA4 s troma ďalšími imunosupresívnymi činidlami, atď. Stanovenie optimálnej kombinácie a dávkovanie môže byť uskutočnené a optimalizované s použitím spôsobov dobre známych v odbore.
Medzi príklady špecifických kombinácií patrí: L104EA29Ylg a CD80 mAbs; L104EA29Ylg a CD86 mAbs; L104EA29Ylg a CD80 mAbs CD86 mAbs;
L104EA29Ylg a gp39 mAbs; L104EA29Ylg a CD40 mAbs; L104EA29Ylg a CD28 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 a CD86 mAbs a gp39 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 a CD86 mAbs a CD40 mAbs; a L104EA29Ylg, anti-LFA1 mAb a antigp39 mAb. Špecifickým príkladom gp39 mAb je MR1. Ďalšie kombinácie sú zrejmé a ľahko zistiteľné odborníkom v odbore.
Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu, napríklad L104EA29Ylg, môžu byť podávané ako samostatná aktívna zložka alebo spoločne s ďalšími liečivami v imunomodulačných schémach alebo s ďalšími protizápalovými činidlami, ako napríklad pri liečbe alebo prevencii akútneho alebo chronického odmietnutia alo- alebo xenoimplantátov alebo pri zápalových alebo autoimunitných poruchách alebo na vyvolanie tolerancie. Napríklad môžu byť použité v kombinácii s inhibítorom kalcineurínu, ako je napríklad cyklosporín A alebo FK506; imunosupresívnym makrolidom, ako je napríklad rapamycín alebo jeho derivát, napríklad 40-O-(2-hydroxy)etyl-rapamycín, lymfocytickým činidlom (homing), napríklad FTY720 alebo jeho analógom; kortikoidmi; cyklofosfamidom; azatioprenom; metotrexatom; leflunomidom alebo jeho analógom; mizoribinom; kyselinou mykofenolovou; mykofenolátom mofetilu; 15deoxyspergualínom alebo jeho analógom; imunosupresívnymi monoklonálnymi protilátkami, ako sú napríklad monoklonálne protilátky k receptorom leukocytov, napríklad MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLÁM), 0X40, 4-1BB alebo ich ligandy; alebo s inými imunomodulačnými zlúčeninami, napríklad CTLA4/CD28-lg alebo inými molekulami inhibítorov adhézie, napríklad mAbs alebo nízkomolekulárne inhibítory vrátane LFA-1 antagonistov, antagonistov Selektinu a antagonistov VLA-4. Táto zlúčenina je najmä vhodná v kombinácii so zlúčeninou, ktorá interferuje s CD40 a jeho ligandmi, napríklad protilátkami CD40 a protilátkami k CD40-L, napríklad pri vyššie opísaných indikáciách, ako je napríklad vyvolanie tolerancie.
V prípadoch, keď rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu sú podávané spoločne s ďalšími imunosupresívnymi, imunomodulačnými alebo protizápalovými zlúčeninami, ako je napríklad uvedené vyššie, sa dávkovanie týchto zlúčenín bude samozrejme líšiť v závislosti od typu súčasne podávaného liečiva, napríklad či to je steroid alebo cyklosporín, od špecificky použitého liečiva, od liečeného zdravotného stavu atď.
V súlade s vyššie uvedeným tento vynález ďalej poskytuje spôsoby, ako sú definované vyššie, ktoré zahŕňajú spoločné podávanie, napríklad súčasne alebo po sebe, terapeuticky účinného množstva rozpustných molekúl mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu, L104EA29Ylg, vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli a druhého liečiva, pričom týmto druhým liečivom je imunosupresívne, imunomodulačné alebo protizápalové liečivo, napríklad ako je uvedené vyššie. Ďalej sú poskytnuté terapeutické kombinácie, napríklad súpravy, na použitie v akomkoľvek spôsobe definovanom vyššie, zahrňujúce L104EA29Ylg vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, na súčasné alebo následné použitie s aspoň jednou farmaceutickou kompozíciou obsahujúcou imunosupresívne, imunomodulačné alebo protizápalové liečivo. Táto súprava môže obsahovať inštrukcie na použitie.
Spôsoby produkcie molekúl podľa vynálezu
Expresia molekúl mutantu CTLA4 môže byť uskutočnená v prokaryotických bunkách. Prokaryotické bunky sú najčastejšie reprezentované rôznymi kmeňmi baktérií. Baktérie môžu byť grampozitívne alebo gramnegatívne. Zvyčajne sú výhodné gramnegatívne baktérie ako je E. coli. Ďalšie mikrobiálne kmene však môžu byť tiež použité.
Sekvencie kódujúce molekuly mutantu CTLA4 môžu byť vložené do vektora určeného na expresiu cudzej sekvencie v prokaryotických bunkách, ako je E. coli. Tieto vektory môžu obsahovať bežne používané prokaryotické kontrolné sekvencie, ktoré sú definované v tomto texte a obsahujú promótory na iniciáciu transkripcie, prípadne s operátorom, spoločne so sekvenciami ribozomálneho väzbového miesta, vrátane bežne používaných promótorov, ako je beta-laktamáza (penicilináza), laktózový (lac) promótorový systém (Chang a kol., 1977, Náture 198:1056), tryptofánový (trp) promótorový systém (Goeddel a kol., 1980, Nucleic Acids Res. 8:4057) a lambda derivovaný Pl promótor a ribozomálne väzbové miesto N-génu (Shimatake a kol., 1981, Náture, 292:128).
Takéto expresné vektory budú tiež obsahovať počiatky replikácie a voliteľné markery, ako je beta-laktamáza alebo neomycinfosfotransferázový gén zodpovedný za rezistenciu voči antibiotikám tak, aby sa takéto vektory mohli replikovať a selektovať v baktériách alebo bunkách nesúcich tieto plazmidy pri raste v prítomnosti antibiotík, ako je ampicilín alebo kanamycín.
Tento expresný plazmid môže byť zavádzaný do prokaryotických buniek radom štandardných spôsobov, ako je napríklad CaCI2-šok (Cohen, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 a Sambrook a kol., (eds.) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) a elektroporácia.
Pri uskutočňovaní tohto vynálezu sú eukaryotické bunky tiež vhodné ako hostiteľské bunky. Medzi príklady eukaryotických buniek patria akékoľvek zvieracie bunky, či primárne alebo imortalizované, kvasinky (napríklad Saccharomyces cerevisae, Schizosacharomyces pombe a Pichia pastoris) a rastlinné bunky. Myelómové, COS a CHO bunky sú príklady živočíšnych buniek, ktoré môžu byť použité ako hostiteľské. Neobmedzujúce príklady vhodných CHO buniek zahŕňajú DG 44 (Chasin, a kol., 1986, Som. Celí. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar, 1997, Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On bunková línia (Clontech), CHO označené ako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO kloň 13 (GEIMG, Génová, IT), CHO kloň B (GEIMG, Génová, IT), CHO-K1/SF označené ako ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) a RRCHOK1 označené ako ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK).
Medzi príklady rastlinných buniek patria bunky tabaku (z celých rastlín, tkanivová kultúra, kalus), kukurice, sójových bôbov a ryže. Bunky zo semien kukurice, sóje a ryže sú tiež prijateľné.
Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce molekuly mutantu CTLA4 môžu byť tiež vložené do vektora určeného na expresiu cudzej sekvencie v eukaryotickom hostiteľovi. Regulačné prvky tohto vektora sa môžu líšiť v závislosti od konkrétneho eukaryotického hostiteľa.
Bežne používané eukaryotické riadiace sekvencie používané v expresných vektoroch obsahujú promótory a riadiace sekvencie kompatibilné s cicavčími bunkami, ako je napríklad CMV promótor (CDm8 vektor) a vtáčí sarkómový vírus (ASV) (πΙ_Ν vektor). Medzi ďalšie bežne používané promótory patria skoré a neskoré promótory zo Simian vírusu 40 (SV40) (Fiers a kol., 1973, Náture 273:113) alebo ďalšie vírusové promótory, ako sú tie odvodené od polyómu, Adenovírusu 2 a hovädzieho papilomového vírusu. Tiež môže byť použitý indukovateľný promótor, ako je hMTII (Karin a kol., (1982), Náture, 299: 797-802.
Vektory na expresiu molekúl mutantu CTLA4 v eukaryotických bunkách môžu tiež niesť sekvencie nazývané zosilňovače transkripcie. Tie sú dôležité pri optimalizácii génovej expresie a sú umiestnené v promótorovej oblasti buď v protismere transkripcie alebo v smere transkripcie.
Medzi neobmedzujúce príklady expresných vektorov pre eukaryotické hostiteľské bunky napríklad patria vektory pre cicavčie hostiteľské bunky (napríklad BPV-1, pHYg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene), retrovírusové vektory (napríklad pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) alebo ich modifikované formy, adenovírusové vektory; vektory príbuzné Adenovírusu, baculovírusové vektory, kvasinkové vektory (napríklad pESC vektory (Stratagene)).
Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce molekuly mutantu CTLA4 sa môžu integrovať do genómu hostiteľskej eukaryotickej bunky a replikujú sa ako hostiteľské genómové replikáty. Alternatívne vektor nesúci molekuly mutantu CTLA4 môže obsahovať počiatky replikácie umožňujúce extrachromozomálnu replikáciu.
Pri expresii sekvencií nukleovej kyseliny v Saccharomyces cerevisia môže byť použitý počiatok replikácie z endogénneho kvasinkového plazmidu, 2μ kruhu. (Boách, 1983, Meth. Enz., 101: 307). Alternatívne môžu byť použité sekvencie z kvasinkového genómu, ktoré sú schopné podporovať autonómne replikácie (pozri napríklad Stinchcomb a kol., 1979, Náture, 282:39); Tschemper a kol., 1980, Gene 10: 157; a Čiarke a kol., 1983, Meth. Enz., 101: 300).
Transkripčné riadiace sekvencie kvasinkových vektorov obsahujú promótory na syntézu glykolytických enzýmov (Hess a kol., 1968, J. Adv. Enzýme Reg., 7: 149; Holland a kol., 1978, Biochemistry, 17: 4900). Medzi ďalšie promótory známe v odbore patria CMV promótor umiestnený vo vektore CDM8 (Toyama a Okayama, 1990, FEBS, 268: 217-221); promótor pre 3fosfoglycerátkinázu (Hitzeman a kol., 1980, J. Biol. Chem., 255: 2073), a pre ďalšie glykolytické enzýmy.
Ďalšie promótory sú indukovateľné lebo môžu byť regulované vonkajšími podnetmi alebo rastovým prostredím buniek. Tieto indukovateľné promótory zahŕňajú promótory z génov pre proteíny tepelného šoku, alkoholdehydrogenázu 2, izocytochróm C, kyslú fosfatázu, enzýmy spojené s katabolizmom dusíka a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy.
Regulačné sekvencie môžu tiež byť umiestnené na 3' konci kódujúcej sekvencie. Tieto sekvencie môžu stabilizovať mediátorovú RNA. Takéto terminátory sa nachádzajú v nepreloženej 3' oblasti, ktorá je umiestnená za kódujúcimi sekvenciami v niekoľkých cicavčích génoch a odvodených génoch odvodených od kvasiniek.
Medzi neobmedzujúce príklady vektorov rastlín a rastlinných buniek patria napríklad Agrobacterium T, plazmidy, karfiolový mozaikový vírus (CaMV) a paradajkový zlatý mozaikový vírus (TGMV).
Všeobecné aspekty transformácie hostiteľského systému cicavčích buniek sú opísané Axelom (v US patentovom spise č. 4,399,216, vydanom 16. augusta 1983). Cicavčie bunky môžu byť transformované spôsobmi, ako je napríklad transfekcia za prítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekcia, elektroporácia alebo transdukcia s vírusovými vektormi.
Medzi spôsoby zavádzania cudzích sekvencií DNA do rastlinných a kvasinkových genómov patria: 1) mechanické spôsoby, ako je mikroinjekcia DNA do jednotlivých buniek alebo protoplastov, miešanie buniek so sklenenými guľôčkami za prítomnosti DNA alebo nastreľovanie volfrámových alebo zlatých guľôčok potiahnutých DNA do buniek alebo protoplastov; 2) zavádzanie DNA po úprave membránovej permeability bunky voči makromolekulám prostredníctvom polyetylénglykolu alebo vystavenie bunky vysokonapäťovým elektrickým pulzom (elektroporácia); alebo 3) použitie lipozómov (obsahujúcich cDNA), ktoré prestupujú bunkovými membránami.
Expresia molekúl mutantu CTLA4 môže byť detegovaná spôsobmi známymi v odbore. Napríklad molekuly mutantu môžu byť detegované Coomassie farbením SDS-PAGE gélov alebo imunovyfarbovaním (imunoblotovaním) s použitím protilátok, ktoré vážia CTLA4. Regenerácia proteínu môže byť uskutočnená s použitím štandardných prostriedkov na prečistenie proteínov, ako je napríklad afinitná chromatografia alebo iónomeničová chromatografia, za vzniku v podstate čistého produktu (R. Scopes: Protein Purification, Principles and Practice“, Third Edition, SpringerVerlag (1994).
Tento vynález ďalej poskytuje rozpustné molekuly mutantu CTLA4 pripravené tu opísaným spôsobom.
Mutagenéza na kodóne CTLA4lg
V jednom uskutočnení bola použitá bodová mutagenéza a nová skríningová procedúra na zistenie niekoľkých mutácií v extracelulárnej doméne CTLA4, ktoré zlepšujú väzbovú aviditu CD86. V tomto uskutočnení boli uskutočnené mutácie na zvyškoch v oblastiach extracelulárnej domény CTLA4 začínajúce serínom v polohe 25 a končiace arginínom v polohe 33, na C' reťazci (alanín 49 a treonín 51), na F reťazci (lyzín 93, kyselina glutámová 95, leucín 96) a v oblasti od metionínu 97 cez tyrozín 102, tyrozín 103 cez glycín 107 a v G reťazci v polohách glutamín 111, tyrozín 113 a izoleucín 115. Tieto miesta boli vybrané na základe štúdií chimérnych CD28/CTLA4 fúznych proteínov (Peach a kol., J. Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058) a na modeli predpovedajúcom, ktoré bočné reťazce aminokyselinového zvyšku by boli vystavené rozpúšťadlu a na nedostatku identity alebo homológie aminokyselinových zvyškov v určitých polohách medzi CD28 a CTLA4. Tiež akýkoľvek zvyšok, ktorý je priestorovo v blízkom susedstve (5 až 20 Angstrómových jednotiek) k identifikovaným zvyškom je považovaný za súčasť tohto vynálezu.
Na syntézu a skríning rozpustných molekúl mutantu CTLA4 so zmenenými afinitami pre CD80 a/alebo CD86 bola použitá dvojstupňová stratégia. Prvé experimenty boli vedené na vytvorenie knižnice mutácií na špecifickom kodóne extracelulárnej časti CTLA4, potom bol uskutočnený skríning prostredníctvom Biacore testovacieho systému z dôvodu určenia mutantov so zmenenou reaktivitou k CD80 alebo CD86. Biacore testovací systém (Pharmacia, Piscataway, NJ) používa povrchový plazmónový rezonančný detekčný systém, ktorý zahŕňa najmä kovalentnú väzbu buď CD80lg alebo CD86lg na senzorový čip potiahnutý dextránom, ktorý je umiestnený v detektore. Testovaná molekula môže potom byť injektovaná do komôrky obsahujúcej senzorový čip a množstvo naviazaného komplementárneho proteínu môže byť stanovené na základe zmeny molekulovej hmotnosti, ktorá je fyzikálne spojená s dextránom potiahnutou stranou senzorového čipu; zmena molekulovej hmotnosti môže byť meraná detekčným systémom.
Výhody vynálezu
Pretože väzba CTLA4 na CD80 a CD86 sa vyznačuje veľkými rýchlosťami smerom ku vzniku (rýchlosť „on“) a veľkými disociačnými rýchlosťami (rýchlosť „off“) a pretože komplexy CTLA4lg-CD86 disociujú približne 5 až 8 krát rýchlejšie ako komplexy CTLA4lg-CD80, bolo usúdené, že spomalenie rýchlosti disociácie CTLA4lg od CD80 a/alebo CD86 by mohlo mať za následok molekuly so silnejšími imunosupresívnymi vlastnosťami. Preto sa očakáva, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 majúce vyššiu aviditu k CD80alebo CD86-pozitívnym bunkám v porovnaní so štandardným typom CTLA4 alebo nemutovanými formami CTLA4lg, budú blokovať iniciáciu antigén špecifických aktivovaných buniek s vyššou účinnosťou ako štandardný typ CTLA4 alebo nemutované formy CTLA4lg.
Produkčné náklady na CTLA4 sú veľmi vysoké. Molekuly mutantu CTLA4lg s vysokou aviditou majúce potenciálne vyššie imunosupresívne vlastnosti môžu byť použité v klinickej praxi v značne nižších dávkach ako nemutovaný CTLA4lg na dosiahnutie podobných hladín imunosupresie. Preto rozpustné molekuly mutantu CTLA4, napríklad L104EA29Ylg, môžu byť nákladovo veľmi priaznivé.
Nasledujúce príklady sú uvedené na objasnenie tohto vynálezu a napomáhajú odborníkom v jeho aplikácii. Príklady nie sú zamýšľané, aby akýmkoľvek spôsobom obmedzovali rozsah tohto vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Tento príklad poskytuje opis použitých spôsobov na vytvorenie nukleotidových sekvencií kódujúcich rozpustné molekuly mutantu CTLA4 podľa tohto vynálezu. Bol vytvorený jednomiestny mutant L104Elg, pri ktorom bola testovaná väzbová kinetika voči CD80 a/alebo CD86. Nukleotidová sekvencia L104Elg bola použitá ako matrica na vytvorenie dvojmiestnej mutantnej sekvencie CTLA4, L104EAYIg, pri ktorej bola taktiež testovaná väzbová kinetika voči CD80 a/alebo CD86.
Mutagenéza na kodóne CTLA4
Bola vyvinutá mutagenéza a skríningová stratégia na identifikovanie molekúl mutantu, ktoré mali nižšie rýchlosti disociácie („off‘ rýchlosti) z molekúl CD80 a/alebo CD86. Jednomiestne mutantné nukleotidové sekvencie boli vytvorené s použitím CTLA4lg ako matrice (US. patentové spisy č. 5,844,095; 5,851,795; a 5,885,796; ATCC číslo (68629). Mutagénne oligonukleotidové PCR priméry boli určené pre náhodnú mutagenézu špecifického cDNA kodónu umožnením umiestnenia akejkoľvek bázy v polohách 1 a 2 na kodóne, v polohe 3 mohol byť umiestnený iba guanín alebo tymín (XXG/T; tiež označované ako NNG/T). Týmto spôsobom špecifický kodón kódujúci aminokyselinu mohol byť náhodne mutovaný, aby kódoval jednu z 20 aminokyselín. Z tohto pohľadu XXG/T mutagenéza poskytuje 32 kodónov kódujúcich jednu z 20 aminokyselín. PCR produkty kódujúce mutácie v blízkom susedstve oblasti -M97-G107 na CTLA4lg (pozri obrázok 7 alebo 8) boli štiepené pomocou Sacl/Xbal a subklonované do podobne upraveného expresného vektora CTLA4lgnLN. Tento spôsob bol použitý na vytvorenie molekuly L104Elg, jednomiestnej molekuly mutantu CTLA4 (obr. 8).
Pri mutagenéze v blízkosti S25-R33 na CTl_A4lg bolo tiché Nhel reštrikčné miesto najskôr zavedené do slučky prostredníctvom PCR primérom vedenej mutagenézy. PCR produkty boli štiepené Nhel/Xbal a subklonované do podobne upravených CTLAIg alebo L104Elg expresných vektorov. Tento spôsob bol použitý na vytvorenie dvojmiestnej CTLA4 mutantnej molekuly L104EA29lg (obrázok 7). Najmä molekula nukleovej kyseliny kódujúcej jednomiestnu CTLA4 mutantnú molekulu, L104Elg, bola použitá ako matrica na vytvorenie dvojmiestnej CTLA4 mutantnej molekuly, L104EA29Ylg. Vektor piLN majúci L104EA29Ylg je znázornený na obrázku 12.
Príklad 2
Tento príklad poskytuje opis použitých skríningových metód na identifikáciu jedno- a dvojmiestnych mutantných CTLA4 polypeptidov, exprimovaných z konštruktov opísaných v príklade 1, ktoré vykazovali vyššiu väzbovú aviditu k CD80 a CD86 antigénom v porovnaní s nemutovanými molekulami CTLA4lg.
Súčasné in vitro a in vivo štúdie ukazujú, že samotný CTLA4lg nie je schopný úplne blokovať iniciáciu antigén špecifických aktivovaných T buniek. In vitro štúdie s CTLA4lg a monoklonálnou protilátkou špecifickou buď pre CD80 alebo pre CD86 meriace inhibíciu proliferácie T buniek ukazujú, že monoklonálna protilátka voči CD80 nezvyšovala inhibíciu CTLA4lg. Avšak monoklonálna protilátka voči CD86 napriek tomu zvyšovala inhibíciu, čo ukazuje, že CTLA4lg nebol tak účinný pri blokovaní CD86 interakciou. Tieto údaje podporujú skoršie zistenia (Linsley a kol., Immunity, 1994, 1: 793-801), že inhibície bunkových odoziev sprostredkovaných CD80 vyžadujú približne 100 krát nižšie koncentrácie CTLA4lg oproti odozvám sprostredkovaných CD86. Na základe týchto zistení sa predpokladalo, že rozpustné molekuly mutantu CTLA4 majúce vyššiu aviditu k CD86 ako štandardné CTLA4 by mali byť schopné lepšie blokovať iniciáciu antigén špecifických aktivovaných buniek ako CTLA4lg.
Z tohto uhla pohľadu boli rozpustné molekuly mutantu CTLA4 opísané v príklade 1 kontrolované s použitím nového skríningového postupu na identifikáciu niekoľkých mutácií v extracelulárnej doméne CTLA4, ktoré zlepšujú väzbovú aviditu k CD80 a CD86. Táto skríningová stratégia poskytla účinný spôsob na priamu identifikáciu mutantov so zrejme nižšími „off“ rýchlosťami bez potreby prečistenia a kvantifikácie proteínu, lebo „off“ rýchlostné stanovenie nie je závislé od koncentrácie (O'Shannessy a kol., 1993, Anál. Biochem., 212: 457- 468).
COS bunky boli transfekované jednotlivými minipreparatívne prečistenými plazmidmi DNA a množené počas niekoľkých dní. Tri dni kondicionované kultivačné médium sa aplikovalo do prístroja BIAcore biosensor chips (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) na biosenzorové čipy potiahnuté CD80lg alebo CD86lg. Špecifická väzba a disociácia mutantov proteínov bola meraná povrchovou plazmónovou rezonanciou (O' Shannessy a kol., 1993, Anál. Biochem., 212: 457- 468). Všetky experimenty boli merané na prístrojoch BIAcore™ a BIAcore™ 2000 s použitím biosenzorov pri teplote 25 °C. Ligandy boli imobilizované na senzorových čipoch NCM5 pre vedecké účely (Pharmacia) s použitím štandardnej kondenzácie s N-etyl-N'(dimetylaminopropyl)karbodiimid-N-hydroxysukcínimidu (Johnsson, B. a kol., 1991, Anál. Biochem., 198: 268-277; Khilko, S.N., a kol., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5425-5434).
Skríningová metóda
COS bunky kultivované na 24-jamkovej doštičke pre tkanivové kultúry boli dočasne transfekované s DNA kódujúcou mutantné CTLA4lg. Kultivačné médium obsahujúce vylúčený rozpustný mutant CTLA4lg bolo odobrané po 3 dňoch.
Kondicionované kultivačné médium s COS bunkami sa ponechalo pretekať cez BIAcore biosenzorové čipy derivatizované CD86lg alebo CD80lg (ako je opísané v Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271: 26762-26771 a molekuly mutantu boli identifikované s rýchlosťami „off“ nižšími ako ktoré boli pozorované pri štandardnom CTLA4lg. Nukleové kyseliny cDNA zodpovedajúce vybraným vzorkám média boli sekvencované a DNA bola pripravená na uskutočnenie hromadnej transfekcie COS buniek, z ktorej bol pripravený mutantný proteín CTLA4lg na prečistenie proteínu A z kultivačného média.
Podmienky analýzy na prístroji BIAcore a analýza dát rovnovážnej väzby bola uskutočnená spôsobom opísaným v J. Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271: 26762-26771 a ako je uvedené v tomto texte.
Analýza údajov z prístroja BIAcore
Senzorgramové základné línie boli normalizované na nulovú odozvu (response unit - RU) pred analýzou. Vzorky boli vedené cez porovnávacie prietokové komôrky na stanovenie odozvy pozadia z dôvodu rozdielu indexu lomu v objeme medzi vzorkami. Rovnovážne disociačné konštanty boli vypočítané zo znázornenej grafickej závislosti Req na C, kde Req je odozva v ustálenom stave mínus odozva na porovnávacom čipe a C je molárna koncentrácia analytu. Väzbové krivky boli analyzované s použitím komerčného softwaru na nelineárne prekladanie bodov regresnou krivkou (Prism, GraphPAD Software).
Experimentálne údaje boli najskôr vložené do modelu jednoduchej väzby ligandu na jednotlivý receptor (1-miestny model, t.j. jednoduchý Langmuirov systém, Α+ΒθΑΒ) a rovnovážne asociačné konštanty (Kd=[A]*[B]/[AB] boli vypočítané z rovnice R=Rmax*C/(Kd+C). Následne boli údaje vložené do najjednoduchšieho dvojmiestneho modelu väzby ligandu (t.j. na receptor majúci 2 nezávislé väzbové miesta bez interakcií, ako je opísané rovnicou R=Rmax1*C/(Kdi+C)+Rmax2*G/(Kd2+C)).
Dobrá zhoda týchto dvoch modelov bola analyzovaná vizuálne porovnaním experimentálnych údajov a štatisticky F testom pomocou súčtu štvorcov. Jednoduchší jednomiestny model bol vybraný ako lepší, pokiaľ dvojmiestne preloženie modelu nebolo významne lepšie (p < 0,1).
Asociačné a disociačné analýzy boli uskutočnené s použitím softwaru BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Asociačné rýchlostné konštanty kon boli vypočítané dvoma spôsobmi, zahrnutím ako homogénnych jednomiestnych interakcií, tak aj paralelných dvojmiestnych interakcií. Pre jednomiestne interakcie boli hodnoty kon vypočítané podľa rovnice Rt=Req (1-exp'ks(t'o), kde Rt je odozva v danom čase t; Req je odozva v ustálenom stave; t0 je čas na počiatku nástreku; a ks=dR/dt=:kOn,Ckoff, kde C je koncentrácia analytu vypočítaná za predpokladu monomérnych väzbových miest. Dvojmiestne interakčné hodnoty kon boli vypočítané podľa rovnice Rt=Reqi(1-exp'ks1(t' to)+Req2(1-expks2(t'to)· Pre každý model boli hodnoty kon stanovené z vypočítanej smernice (k asi 70 % maximálnej asociácie) grafického znázornenia ks voči C.
Disociačné dáta boli analyzované podľa jednomiestneho (AB=A+B) alebo dvojmiestneho (AiBj=Ai+Bj) modelu a rýchlostné konštanty (kOff) boli vypočítané z najlepšie preložených kriviek. Tento model väzbového miesta bol použitý s výnimkou prípadov, keď odozva zvyškov bola väčšia ako pozadie prístroja (2-1 ORu, podľa prístroja, v týchto prípadoch bol použitý dvojmiestny model. Polčasy obsadenia receptora boli vypočítané s použitím vzťahu ti/2=0,693/kOff.
Prietoková cytometria
Myší mAb L307.4 (anti-CD80) bol zakúpený od firmy Becton Dickinson (San Jose, California) a IT2.2 (anti-B7-0[tiež známy ako CD86] bol zakúpený od firmy Pharmingen (San Diego, California). Na imunofarbenie boli CD80pozitívne a/alebo CD86-pozitívne CHO bunky odobrané z ich kultivačných nádob a boli inkubované vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS) obsahujúcom 10 mM EDTA. CHO bunky (1-1 Οχ 105) boli najskôr inkubované s mABs alebo s imunoglobulínovými fúznymi proteínmi v DMEM obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS), potom boli premyté a inkubované s fluoresceínizotiokyanatanom konjugovaným s kozím anti-myším alebo antiľudským imunoglobulínom (činidlami 2. fázy) (Tágo, Burlingame, California). Bunky boli naposledy premyté a boli analyzované na prístroji FACScan (Becton Dickinson).
SDS-PAGE a vylučovacia chromatografia
SDS-PAGE bola uskutočnená na Tris/glycín 4-20 % akrylamidových géloch (Novex, San Diego, CA). Analytické gély boli farbené Coomassie Blue a zobrazenie vlhkých gélov sa získalo digitálnym skenovaním. CTLA4lg (25 pg) a L104EA29Ylg (25 pg) boli analyzované vylučovacou chromatografiou s použitím TSK-GEL G300 SWxL kolóny (7,8 x 300 mm), Tosohaas, Montgomeryville, PA) vyvážené fyziologickým roztokom tlmeným fosfátom obsahujúcim 0,02 % NaN3 pri prietoku 1,0 ml/min.
CTLA4Xci2os a L104EA29YXCi2os
Jednoreťazová CTLA4Ci2os bola pripravená skôr opísaným spôsobom (Linsley a kol., 1995, Biol. Chem., 270: 15417-15424). Stručne, onkostatín M CTLA4 (OMCTLA4) expresívny vektor bol použitý ako matrica, pôvodný primér, GGAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG bol vybraný na spojenie sekvencií vo vektore; a reverzný primér,
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC, zodpovedal posledným siedmim aminokyselinám (t.j. aminokyselinám 118 124) v extracelulárnej doméne CTLA4 a obsahoval reštrikčné enzýmové miesto a terminačný kodón (TGA) (stop kodón). Reverzný primér špecifikoval C120S mutáciu (cysteín - serín v polohe 120). Najmä nukleotidová sekvencia GCA (nukleotidy 34-36) reverzného priméru uvedená vyššie je nahradená jednou z nasledujúcich nukleotidových sekvencií: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT alebo GCT. Odborníkovi v odbore je zrejmé, že nukleotidová sekvencia GCA je spätná komplementárna sekvencia kodónu TCG pre cysteín. Podobne nukleotidové sekvencie AGA, GGA, TGA, CGA, ACT alebo GCT sú spätné komplementárne sekvencie kodónov pre serín. Polymerázové reťazové reakčné produkty boli štiepené Hindlll/Xbal a priamo subklonovaná do expresívneho vektora πΙ_Ν (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L1O4EA29YXCi2os bol pripravený rovnakým spôsobom. Každý konštrukt bol overovaný sekvencovaním DNA.
Identifikácia a biochemická charakterizácia mutantov s vysokou aviditou
Dvadsať štyri aminokyselín bolo vybraných na mutagenézu a asi 2300 získaných mutantných proteínov bolo skúšaných na väzbu s CD86lg pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR; ako je opísané vyššie). Prevládajúce účinky mutagenézy na každom mieste sú zhrnuté v tabuľke II. Náhodná mutagenéza niektorých aminokyselín v oblasti S25-R33 zrejme nemenila väzbu ligandov. Mutagenézy E31 a R33 a zvyškov M97-Y102 zrejme spôsobili zníženie väzby ligandov. Mutagenézou zvyškov, S25, A29 a T30, K93, L96, Y103, L104 a G105 vznikli proteíny s malými „on“ a/alebo malými „off“ rýchlosťami. Tieto výsledky potvrdili skoršie zistenia, že zvyšky v oblasti S25R33 a zvyšky v alebo blízko M97-Y102 ovplyvňujú väzbu ligandov (Peach a kol., 1994, J. Exp. Med., 180: 2049-2058.
Mutagenéza v miestach S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 pomohla identifikovať niektoré mutantné proteíny, ktoré mali menšie „off“ rýchlosti od CD86lg. Avšak v týchto prípadoch malá rýchlosť „off“ bola kompenzovaná malou rýchlosťou „on“ čím vznikli mutantné proteíny s výslednou aviditou pre CD86lg, ktorá bola zrejme podobná avidite pozorovanej pri štandardnom type CTLA4lg. Ďalej mutagenéza K93 mala za následok významnú agregáciu, ktorá bola možno zodpovedná za pozorované kinetické zmeny.
Náhodnou mutagenézou L104 po transfekcii COS buniek a skríningom
SPR vzoriek kultivačného média cez imobilizovaný CD86lg sa získalo 6 vzoriek média obsahujúcich mutantné proteíny s približne 2 krát menšími rýchlosťami „off ako pri štandardnom CTLA4lg. Keď boli sekvencované zodpovedajúce cDNA týchto mutantov, bolo zistené, že každá kóduje mutáciu leucínu na kyselinu glutámovú (L104E). Zrejme substitúcia (náhrada) leucínu 104 za kyselinu asparágovú (L104D) neovplyvnila väzbu CD86lg.
Mutagenéza bola potom opakovaná na každom mieste uvedenom v tabuľke II, tentokrát s použitím L104 ako matrice PCR namiesto štandardného CTLA4lg, ako je opísané vyššie. SPR analýza, opäť používajúca imobilizovaný CD86lg, identifikovala 6 vzoriek kultivačného média z mutagenézy alanínu 29 s proteínmi majúcimi približne 4 krát menšie „off“ rýchlosti ako štandardné CTLA4lg. Dve najpomalšie predstavovali substitúcie tyrozínu (L104EA29Y), 2 boli leucín (L104EA29L), jedna bola tryptofán (L104EA29W) a jedna bola treonín (L104EA29T). Zrejme neboli identifikované žiadne mutanty s malou rýchlosťou „off“, keď bol náhodne mutovaný v štandardnom CTLA4lg samotný alanín.
Relatívna molekulová hmotnosť a agregátny stav prečisteného L104E a L104EA29Ylg boli testované pomocou SDS-PAGE a vylučovacou chromatografíou. L104EA29Ylg (asi 1 pg, pruh 3) a L104Elg (asi 1pg, pruh 2) zrejme mali rovnakú elektroforetickú pohyblivosť ako CTLAIg (asi 1 pg, pruh 1) za redukčných podmienok (asi 50 kDa; +βΜΕ; plus 2-merkaptoetanol) a neredukčných podmienok (asi 100 kDa; -βΜΕ) (obr. 10A). Vylučovacia chromatografia ukázala, že L104EA29Ylg (obr. 10C) zrejme mal rovnakú mobilitu ako dimérny CTLAIg (obr. 10B). Hlavné piky predstavujú proteínový dimér, zatiaľ čo najrýchlejšie vyplavovaný menši pík na obrázku 10B predstavuje agregáty s vyššou molekulovou hmotnosťou. Asi 5,0 % CTLA4lg bolo prítomné ako agregáty s vyššou molekulovou hmotnosťou, ale nebola pozorovaná žiadna agregácia L104EA29Ylg alebo L104Elg. Preto silnejšia väzba na CD86lg pozorovaná pri L104Elg a L104EA29Ylg nemohla prispievať k agregácii vyvolanej mutagenézou.
Rovnovážna a kinetická väzbová analýza
Rovnovážna a kinetická väzbová analýza bola uskutočnená na proteíne A purifikovanom CTI_A4lg, L104Elg a L104EA29Ylg s použitím povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR). Výsledky sú zhrnuté v tabuľke I. Pozorované rovnovážne disociačné konštanty (Kdl tabuľka I) boli vypočítané z väzbových kriviek vytvorených v rozsahu koncentrácie (5,0 - 200 nM). L104EA29Ylg sa viaže silnejšie na CD86lg ako L104Elg alebo CTLA4lg. Nižšia hodnota Kd pre L104EA29Ylg (3,21 nM) ako pre L104Elg (6,06 nM) alebo pre CTLA4lg (13,9 nM) ukazuje vyššiu väzbovú aviditu L104EA29Ylg k CD86lg. Nižšia hodnota Kd pre L104EA29Ylg (3,66 nM) ako pre L104Elg (4,47 nM) alebo pre CTLA4lg (6,51 nM) ukazuje vyššiu väzbovú aviditu L104EA29Ylg k CD80lg.
Kinetická väzbová analýza zistila, že porovnateľné „on“ rýchlosti pre CTLAIg, L104Elg a L104A29Ylg väzby k CD80 boli podobné, rovnako takéto boli rýchlosti „on“ pre CD86lg (tabuľka I). Avšak rýchlosti „off“ pre tieto molekuly neboli rovnaké (tabuľka i). V porovnaní s CTLA4lg mal L104EA29Ylg približne 2 krát menšiu „off“ rýchlosť od CD80lg a približne 4 krát menšiu „off“ rýchlosť od CD86lg. L104E mal „off“ rýchlosti uprostred medzi L104EA29Ylg a CTl_A4lg. Pretože zavedenie týchto mutácií významne neovplyvnilo rýchlosti „on“, zvyšovanie avidity pre CD80lg a CD86lg pozorované s L104EA29Ylg bolo pravdepodobne primárne spôsobené poklesom rýchlostí „off*.
Na určenie, či zvýšenie avidity L104EA29Ylg pre CD86lg a CD80lg bolo spôsobené mutáciami ovplyvňujúcimi spôsob každého monoméru asociovať sa ako dimér alebo či boli zavedené do každého monoméru štrukturálne zmeny zvyšujúce aviditu boli pripravené jednoreťazové konštrukty extracelulárnych domén CTLA4 a L104EA29Y a potom bola uskutočnená mutagenéza cysteínu 120 na serín, ako je opísané vyššie a v Linsley a koľ, 1995. J. Biol. Chem., 270: 15417-15424. Gélová permeačná chromatografia preukázala, že prečistené proteíny CTLA4ci2os a L1O4EA29YXCi2os boli monomérne (Linsley a kol., 1995, pozri vyššie), pred tým ako boli analyzované SPR na ich väzbové vlastnosti k ligandom. Výsledky ukázali, že väzbová afinita obidvoch monomérnych proteínov pre CD86lg bola približne 35 až 80 krát menšia ako avidita pozorovaná pri ich diméroch (tabuľka I). Toto podporuje skôr publikované údaje konštatujúce, že dimerizácia CTLA4 bola potrebná na vysokú väzbovú aviditu k ligandom (Greene a kol., 1996, J. Biol. Chem., 271: 26762-26771).
L1O4EA29YXci2os sa viazal s afinitou približne 2 krát vyššou ako CTLA4ci2os ako na CD80lg, tak aj na CD86lg. Zvýšená afinita bola spôsobená približne 3-krát menšou rýchlosťou disociácie z obidvoch ligandov. Preto silnejšia väzba ligandov pri L104EA29Y bola najpravdepodobnejšie spôsobená štrukturálnymi zmenami zvyšujúcimi aviditu, ktoré boli zavedené do každého monomérneho reťazca, skôr ako zmenami, pri ktorých molekula dimerizovala.
Polohová a štrukturálna analýza mutácie zvyšujúcich aviditu
Štruktúra roztoku extracelulárnej Ig V-podobnej doméne CTLA4 bola nedávno stanovená NMR spektroskopiou (Metzler a kol., 1997, Náture Struct. Biol., 4: 527-531). To umožnila presná poloha leucínu 104 a aianínu 29 v 3rozmernej štruktúre (obr. 11A-B). Leucín je umiestnený blízko vysoko zachovanej aminokyselinovej sekvencie MYPPPY. Alanín 29 je umiestnený blízko C-konca oblasti S25-R33, ktorá priestorovo prilieha k oblasti MYPPPY. Zatiaľ čo je významná interakcia medzi zvyškami na začiatku týchto dvoch oblastí, neexistuje zrejme žiadna priama interakcia medzi L104 a A29, aj keď obidva zahŕňajú časť priliehajúceho hydrofóbneho jadra v proteíne. Štrukturálne dôsledky týchto dvoch mutantov zvyšujúcich aviditu boli stanovené modelovaním. Mutácia A29Y môže byť ľahko umiestnená v štrbine medzi oblasťou S25-R33 a oblasťou MYPPPY a môže slúžiť na stabilizáciu konformácie oblasti MYPPPY. Pri štandardnej CTLA4 L104 vytvára extenzívne hydrofóbne interakcie s L96 a V94 v blízkosti oblasti MYPPPY. Je vysoko nepravdepodobné, že mutácia kyseliny glutámovej zaujme konformáciu podobajúcu sa L104 z dvoch dôvodov. Po prvé, nie je dostatok priestoru na umiestnenie dlhšieho bočného reťazca kyseliny glutámovej v štruktúre bez významného narušenia oblasti S25-R33. Po druhé, energetické nároky na pokrytie negatívneho náboja na bočnom reťazci kyseliny glutámovej v tejto hydrofóbnej oblasti by boli značné. Namiesto toho modelové štúdie predpovedajú, že bočný reťazec kyseliny glutámovej sa posunie k povrchu, kde jeho náboj môže byť stabilizovaný solvatáciou. Takáto konformačná zmena môže byť ľahko uskutočnená prostredníctvom G105 s minimálnou deformáciou ďalších zvyškov v týchto oblastiach.
Väzba mutantov s vysokou aviditou na CHO bunky exprimujúce CD80 alebo CD86
FACS analýza CTLA4lg (obrázok 2) a molekuly mutantu viažuce sa na trvalé transfekované CD80+ a CD86+ CHO bunky bola uskutočňovaná spôsobom opísaným v tomto opise. CD80-pozitívne a CD86-pozitívne CHO bunky boli inkubované so vzrastajúcou koncentráciou CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo L104Elg a potom boli premyté. Naviazaný imunoglobulínový fúzny proteín bol detegovaný s použitím fluoresceínizotiokyanatanu konjugovaného s kozím anti-ľudským (goat anti-human) imunoglobulínom.
Ako je znázornené na obrázku 2, CD80-pozitívne alebo CD86-pozitívne CHO bunky (1,5 x 105) boli inkubované so známymi koncentráciami CTLA4lg (štvorec), L104EA29Ylg (kruh) alebo L104Elg (trojuholník) počas 2 hodín pri teplote 23 °C, potom boli premyté a inkubované s fluoresceínizotiokyanatanom konjugovaným s kozou anti-fudskou imunoglobulínovou protilátkou. Väzba na celkovo 5000 živých buniek bola analyzovaná (jedným stanovením) na prístroji FACScan a stredná flurescenčná intenzita (MFI) bola stanovená z histogramu dát s použitím PC-LYSYS. Dáta boli korigované na pozadí fluorescencie nameranej na bunkách inkubovaných iba s činidlom druhého kroku (MFI=7). Kontrola L6 mAb (80 pg/ml) vykazovala MFI<30. Tieto výsledky reprezentujú 4 nezávisle merania.
Väzba L104EA29Ylg, L104Elg a CTLA4lg na ľudské CD80transfekované CHO bunky je približne ekvivalentná (obr. 2A). Ľ104EA29Ylg a
L104Elg sa viažu silnejšie na CHO bunky trvalé transfekované ľudským CD86 ako CTLA4lg (obr. 2B).
Funkčné skúšky
Ľudské CD4-pozitívne T bunky boli izolované imunomagnetickou negatívnou selekciou (Linsley a kol., 1992, J. Exp. Med., 176: 1595-1604). Izolované CD4-pozitívne T bunky boli stimulované phorbalmyristátacetátom (PMA) a ďalej CD80-pozitívnymi alebo CD86-pozitívnymi CHO bunkami za prítomnosti titračných koncentrácií inhibítora. CD4-pozitívne T bunky (8-10 x 104/jamka) boli kultivované v prítomnosti 1 nM PMA s alebo bez ožiarených stimulátorov CHO buniek. Proliferačné odozvy boli merané po pridaní 1 pCi/jamka [3H]timidínu v priebehu posledných 7 hodín 72 hodinovej kultivácie. Inhibícia PMA plus CD80-pozitívnych CHO alebo CD86-pozitívnych CHO stimulovaných T buniek bola uskutočnená prostredníctvom L104EA29Ylg a CTLAlg. Výsledky sú zhrnuté v obr. 3. L104EA29Ylg inhibuje viaceré proliferácie CD80-pozitívnych PMA stimulovaných CHO buniek ako CTLA4lg (obr. 3A). L104EA29Ylg je tiež účinnejšie ako CTLA4lg pri inhibovaní proliferácie CD86-pozitívnych PMA stimulovaných CHO buniek (obr. 3B). Preto L104EA29Ylg je silnejší inhibítor ako CD80-, tak aj CD86-sprostredkovaných kostimuláciou T buniek.
Obrázok 4 ukazuje inhibíciu prostredníctvom L104EA29Ylg a CTLA4lg alostimulovaných ľudských T buniek pripravených vyššie a ďalej stimulovaných ľudskou B lymfoblastoidnou bunkovou líniou (LCL nazývanou PM, ktorá exprimuje CD80 a CD86 (T bunky pri koncentrácii 3,0 x 104/jamka a PM pri koncentrácii 8,0 x 103/jamka). Primárna alostimulácia trvala 6 dní, potom boli bunky pulzované s 3H-tymínom počas 7 hodín a následne bola stanovená inkorporácia rádioaktívneho izotopu.
Druhá alostimulácia bola uskutočňovaná nasledovne. Sedem dní primárne alostimulované T bunky boli získané pomocou lymfocytického separačného média (LSM) (ICN, Aurora, OH), kde boli ponechané 24 hodín. Potom boli T bunky restimulované (sekundárne) za prítomnosti titračného množstva CTLA4lg alebo L104EA29Ylg prídavkom PM (A) v rovnakom pomere ako vyššie. Stimulácia prebiehala 3 dni, potom boli bunky pulzne označené rádioaktívnym izotopom a zberané, ako je uvedené vyššie. Účinok L104EA29Ylg na primárne alostimulované T bunky je zobrazený na obr. 4A. Účinok L104EA29Ylg na sekundárne alostimulované T bunky je zobrazený na obr. 4B. L104EA29Ylg inhibuje proliferačné odozvy ako primárne, tak aj sekundárne stimulovaných T buniek lepšie ako CTLA4lg.
Na meranie produkcie cytokínov (obr. 5) bol pripravený duplikát sekundárne alostimulovaných dosiek. Po 3 dňoch bolo kultivačné médium testované pomocou ELISA súprav (Biosource, Camarilo, CA) za podmienok odporúčaných výrobcom. Bolo zistené, že L104EA29Ylg je silnejšie ako CTLA4lg pri blokovaní produkcie T bunkového IL-2, IL-4 a γ-IFN cytokínov po sekundárnom alostimule. (obr. 5A-C)
Účinky L104EA29Ylg a CTLA4lg na zmiešanú lymfocytickú odozvu u opíc (MLR) sú zobrazené na obr. 6. Periférne krvné mononukleárne bunky (PBMC; 3,5 x 104 buniek/jamka od každej opice) od 2 opíc boli prečistené prostredníctvom lymfocytického separačného média (LSM) a zmiešané s 2 pg/ml fytohemaglutinínu (PHA). Bunky boli stimulované 3 dni, potom boli pulzne označené rádioaktívnym izotopom počas 16 hodín. Po tomto čase boli bunky zberané. L104EA29Ylg inhiboval proliferáciu T buniek u opíc lepšie ako CTLA4lg.
Tabuľka I
Rovnovážne a zdanlivé kinetické konštanty sú uvedené v nasledujúcej tabuľke (hodnoty sú v tvare: priemer ± smerodajná odchýlka z 3 rozdielnych experimentov
Imobilizovaný proteín Analyt kon(x10b) M'1 S'1 kOff(x10J) M'1 S'1 Kd nM
CD80lg CTLA4lg 3,44±0,29 2,21+0,18 6,51±1,08
CD80lg L104Elg 3,02±0,05 1,35±0,08 4,47±0,36
CD80lg L104EA29Ylg 2,96±0,20 1,08±0,05 3,66±0,41
CD80lg CTLA4Xci2os 12,0±1,0 230±10 195±25
CD80lg L104EA29YXci2os 8,3+0,26 71±5 85,0±2,5
CD86lg CTLA4lg 5,95±0,57 8,16±0,52 13,9±2,27
CD86lg L104Elg 7,03±0,22 4,26±0,11 6,06±0,05
CD86lg L104EA29Ylg 6,42±0,40 2,06±0,03 3,21±0,23
CD86lg CTLA4Xci2os 16,5+0,5 840±55 511±17
CD86lg L104EA29YXci2os 11,4±1,6 300±10 267±29
Tabuľka II
Účinok na väzbu CD86lg prostredníctvom mutagenézy CTLA4lg v uvedených miestach - stanovenie SPR, ako bolo opísané vyššie. Prevládajúci účinok je označený značkou „+“
Miesto Účinky mutagenézy mutagenézy
Žiadny zjavný účinok Malá rýchlosť „on“/ malá rýchlosť „off“ Menšia väzba ligandov
S25 +
P26 +
G27 +
K28 +
A29 +
T30 +
E31 +
R33 +
K93 +
L96 +
M97 +
Y98 +
P99 +
P100 +
P101 +
Y102 +
Y103 +
Y104 +
G105 +
1106 +
G107 +
Q111 +
Y113 +
1115 +
Ako bude zrejmé odborníkovi v odbore, tento vynález môže byť
uskutočnený aj v iných formách ako tých, , ktoré sú výslovne opísané vyššie.
Opísané uskutočnenia vynálezu iba vysvetľujú, ale neobmedzujú. Rozsah tohto vynálezu je uvedený v pripojených patentových nárokoch a nie je obmedzený na príklady v predchádzajúcom opise.
h* y Zoznam sekvencií <110> Peach, Róbert.'J.
Naemura, Joseph R Linsley, Peter S. ·
Bajorath, Jurgen Bristol-Myers Squibb Company <120> Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 a ich použitie <130> D0028PCT/30436.57WOU1 <140> PCT/US01/17139 <141> 2001-05-23 <150> 09/579,927 <151> 2000-05-26 <Í50> 60/214,065 <151> 2000-06-26 <160> 7 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oncostatín M CTLA4 (OMCTLA4) Forward Primér <400> 1 gaggtgataa agcttcacca ätgggtgtac tgctcacaca g, 41 <210> 2 <211> 42 .
<212> DNA . .
<213> .
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Oncostatín M CTLA4 (OMCTLA4) Reverse Primér <400> 2 gtggtgtatt ggtctágatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42.
<210> 3 <211> .1152 <212> DNA <213> Umelá sekvencia • <220>
ty <223> Opis umelej sekvencie '· L104EA29YIg i;400> 3 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag acatccccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc cgtccccagc äggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta .gcaagctcac tgcatgaggc ga gaggacgctg gcacgtggcc tgagtätgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactácgag agattctgat aCctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctgcacgg atggacačgg ggcataggca caggagccca čtggggggat cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgč agcaggtggc cactacacgc tccttgcact tggtactggc aatatactga gtgcggcaac gcäcCtccag gactctacat acggaaccca aatcttc'tga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccáaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gätttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggagg.tg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1152 <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie í : L104EA29YIg'
<400> 4 Met Gly 1 Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu 15 Ala
Leu Leu Phe Pro 20 Ser Met Ala Ser Met 25 Ala Met His Val Ala 30 Gin Pro
Ala Val Val 35 Leu Ala Ser Ser Arg 40 Gly íle Ala Ser Phe 45 Val Cys Glu
Tyr Ala 50 Ser Pro Gly Lys Tyr. 55 . Thr Glu Val Arg Val 60 Thr Val Leu Arg
Gin 65 Ála Asp, , Ser Gin Val 70 Thr .Glu Val Cys Ala 75 Ala Thr Tyr Met Met 80
Gly Asn Glu Leu Thr 85 Phe Leu Asp Asp Ser 90 íle Cys Thr Gly Thr 95 ' Ser
Ser Gly Asn Gin 100 Val Asn Leu Thr íle 105 Gin Gly Leu Arg Ala 110 Met Asp
Thr Gly Leu 115 Tyr íle Cys Lys Val 120 Glu Leu Met Tyr Pro 125 Pro Pro Tyr
z-
Tyr Glu Gly Ile 130 Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glú
135 140
Pro Cys Pro Asp Šer Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro' Pro Ser' Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
155 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro GLu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Glri Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 . 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr Ile
250 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly' Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 .300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Äsp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser .Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
34 0 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 5
<211> 1152
<212> DNA
<213>
Umelá sekvencia
<22 0>
<223> Opis umelej sekvencie : LlO4EIg
<400> 5 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tcctťgcact cctgtttcca 60· agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cag'cagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtčt gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcč atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggaca.cgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcq atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaačtcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct cätgátctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc ačgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccg tgtggťcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccaťcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat- 960 gggcagccgg agaacaacta caagacčacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacácgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 6 <211> 383 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie · L104EIg <400> 6
Met 1 Gly Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu 15 Ala
Leu Leu Phe Pro 20 Ser Met Ala Ser Met 25 Ala Met His Val Ala 30 Gin Pro
Ala Val Val 35 Leu Ala Ser Ser Arg 40 Gly íle Ala Ser Phe 45 Val Cys Glu
Tyr Ala 50 Ser Pro Gly Lys Ala 55 Thr Glu Val Arg Val 60 Thr Val Leu. Arg
Gin 65 Ala Asp Ser Gin Val 70 Thr Glu Val Cys Ala 75 Ala Thr Tyr Met Met 80
Gly Asri Glu Leu Thr 85 Phe Leu Asp Asp Ser 90 íle Cys Thr Gly Thr 95 Ser
Šer Gly Asn Gin 100 Val Ásn Leu Thr íle 105 Gin Gly Leu Arg Ala 110 Met Asp
Thr Gly Leu 115 Tyr íle Cys Lys Val 120 Glu Leu Met Tyr Pro 125 Pro Pro Tyr
Tyr Glu 130 Gly íle .Gly Asn Gly 135 Thr Gin íle Tyr Val 140 íle Asp Pro Glu
Pro 145 Cys Pro Asp Ser Asp 150 Gin Glu Pro Lys Ser 155 Ser Asp Lys Thr His 160
Thr Ser Pro Pro Ser 165 Pro Ala Pro Gíu Leu 170 Leu Gly Gly Ser Ser 175 Val
Phe Leu Phe Pro 180 Pro Lys Pro Lys Asp 185 Thr Leu Met íle Ser 190 Arg Thr
Pro Glu Val 195 Thr Cys Val Val Val 200 Asp Val Ser His Glu 205 Asp Pro Glu
Val Lys 210 Phe Asn Trp Tyr Val 215 Asp Gly Val Glu Val 220 His Asn Ala Lys
Thr 225 Lys Pro Arg Glu Glu 230 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240
Val Leu Thr Val Leu 245 His Gin Asp Trp Leu 250 Asn Gly Lys Glu Tyr 255 Lys
Cys Lys Val Ser 260 Asn Lys Ala Leu Pro 265 Ala Pro íle. Glu Lys 270. Thr Il-e
Ser Lys Ala 275 Lys Gly Gin Pro Arg 280 Glu Pro Gin Val Tyr 285 Thr Leu Pro
Pro Ser 290 Arg Asp Glu Leu Thr 295 Lys Asn Gin Val Ser 300 Leu Thr Cys Leu
Val 305· Lys Gly Phe Tyr Pro 310 Ser Asp íle Ala Val 315 Glu Trp Glu Ser Asn 320
Gly Gin Pro Glu Asn 325 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Val Leu Asp 335 Ser
Asp Gly Ser Phe 340 Phe Leu Tyr Ser Lys 345 Leu Thr Val Asp Lys 350 Ser Arg
Trp Gin Gin 355 Gly Asn Val Phe Ser 360 Cys Ser Val Met His 365 Glu Ala Leu
His Asn HiS Tyr Thr GÍn Lys. Ser Leu. Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380

Claims (66)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula mutantu CTLA4, ktorá viaže CD80 a/alebo CD86 obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 tak, že v tejto extracelulárnej doméne: a) alanín v polohe +29 je substituovaný aminokyselinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z tyrozínu, leucínu, tryptofánu a treonínu a b) leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou.
  2. 2. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 1 ďalej obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu, ktorá mení rozpustnosť, afinitu alebo mocenstvo rozpustnej molekuly mutantu CTLA4.
  3. 3. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 2, kde aminokyselinová sekvencia obsahuje konštantnú oblasť ľudského imunoglobulínu.
  4. 4. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 2 ďalej obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu, ktorá umožňuje sekréciu rozpustnej molekuly mutantu CTLA4.
  5. 5. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 4, kde aminokyselinová sekvencia obsahuje signálny peptid onkostatín M.
  6. 6. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 1 obsahujúca metionín v polohe +1 a kyselinu asparágovú v polohe +124, ako je zobrazené na obrázku 7.
  7. 7. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 1 obsahujúca alanín v polohe -1 a kyselinu asparágovú v polohe +124, ako je zobrazené na obrázku 7.
  8. 8. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 3, kde konštantná oblasť ľudského imunoglobulínu je mutovaná tak, aby bol cysteín v polohe +130 substituovaný serínom, cysteín v polohe +136 substituovaný serínom, cysteín v polohe +139 substituovaný serínom a prolín v polohe +148 substituovaný serínom, ako je zobrazené na obrázku 7.
    y?
  9. 9. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, ktorá sa viaže s väčšou aviditou na CD80 a/alebo CD86 ako CTLA4 obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4, kde v tejto extracelulárnej doméne alanín v polohe +29 je substituovaný tyrozínom a leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou, ako je zobrazené na obrázku 7.
  10. 10. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 9 ďalej obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu, ktorá mení rozpustnosť, afinitu alebo mocenstvo rozpustnej molekuly mutantu CTLA4.
  11. 11. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 10, kde aminokyselinová sekvencia obsahuje konštantnú oblasť ľudského imunoglobulínu.
  12. 12. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 10 ďalej obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu, ktorá umožňuje sekréciu rozpustnej molekuly mutantu CTLA4.
  13. 13. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 12, kde aminokyselinová sekvencia obsahuje signálny peptid onkostatín M.
  14. 14. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 9 obsahujúca metionín v polohe +1 a kyselinu asparágovú v polohe +124, ako je zobrazené na obrázku 7.
  15. 15. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 9 obsahujúca alanín v polohe -1 a kyselinu asparágovú v polohe +124, ako je zobrazené na obrázku 7.
  16. 16. Molekula mutantu CTLA4 podľa nároku 11, kde konštantná oblasť ľudského imunoglobulínu je mutovaná tak, aby bol cysteín v polohe +130 substituovaný serínom, cysteín v polohe +136 substituovaný serínom, cysteín v polohe +139 substituovaný serínom a prolín v polohe +148 substituovaný serínom, ako je zobrazené na obrázku 7.
    se x
  17. 17. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, ktorá sa viaže s väčšou aviditou na CD80 a/alebo CD86 ako CTLA4 obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4, kde v tejto extracelulárnej doméne leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou, ako je zobrazené na obrázku 8.
  18. 18. Molekula nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúca aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu rozpustnej molekule mutantu CTLA4 podľa nároku 1.
  19. 19. Molekula nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúca aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu rozpustnej molekule mutantu CTI_A4 podľa nároku 9.
  20. 20. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 18 majúca nukleotidovú sekvenciu začínajúcu adenínom v nukieotidovej polohe +1 a končiacu adenínom v polohe +1071, ako je zobrazené na obrázku 7 alebo 8.
  21. 21. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 19 majúca nukleotidovú sekvenciu začínajúcu adenínom v nukieotidovej polohe +1 a končiacu adenínom v polohe +1071, ako je zobrazené na obrázku 7 alebo 8.
  22. 22. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 18 majúca nukleotidovú sekvenciu začínajúcu guanidínom v polohe -3 a končiacu adenínom v polohe +1071, ako je zobrazené na obrázku 7 alebo 8.
  23. 23. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 19 majúca nukleotidovú sekvenciu začínajúcu guanidínom v polohe -3 a končiacu adenínom v polohe +1071, ako je zobrazené na obrázku 7 alebo 8.
  24. 24. Vektor obsahujúci nukleotidovú sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 23.
  25. 25. Vektor kódujúci L104EA29Ylg označený ako pD16L104EA29Ylg a uložený s ATCC ako ATCC č. PTA-2104.
  26. 26. Hostiteľský vektorový systém obsahujúci vektor podľa nároku 24 alebo 25 vo vhodnej hostiteľskej bunke.
  27. 27. Hostiteľský vektorový systém podľa nároku 26, kde vhodnou hostiteľskou bunkou je bakteriálna bunka alebo eukaryotická bunka.
  28. 28. Hostiteľská bunka majúca vektor podľa nároku 24 alebo 25.
  29. 29. Hostiteľská bunka podľa nároku 28, ktorá je eukaryotickou bunkou.
  30. 30. Hostiteľská bunka podľa nároku 29, kde eukaryotickou bunkou je COS bunka.
  31. 31. Hostiteľská bunka podľa nároku 29, kde eukaryotickou bunkou je vaječníková bunka čínskeho škrečka (Chinese Hamster Ovary - CHO).
  32. 32. Hostiteľská bunka podľa nároku 31, kde CHO bunka je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z DG44, CHO-K1, CHO-K1 Tet-On bunkovej línie, CHO označené ako ECACC85050302, CHO klonu 13, CHO klonu B, CHOK1/SF a RR-CHOK1.
  33. 33. Spôsob prípravy rozpustného proteínu mutantu CTLA4 zahrňujúci rastúci hostiteľský vektorový systém podľa nároku 26 tak, aby bol vytváraný proteín mutantu CTLA4 v hostiteľskej bunke a odoberanie takto vytvoreného proteínu.
  34. 34. Spôsob prípravy L104EA29Ylg zahrňujúci rastúcu hostiteľskú bunku podľa nároku 28 tak, aby bol vytváraný L104EA29Ylg v hostiteľskej bunke a odoberanie takto vytvoreného proteínu.
    $% ϊ7
  35. 35. Rozpustný proteín mutantu CTLA4 pripravený spôsobom podľa nároku 33.
  36. 36. L104EA29Ylg pripravený spôsobom podľa nároku 34.
  37. 37. Spôsob regulácie interakcie T bunky s CD80 a/alebo CD86 pozitívnou bunkou zahrňujúci kontaktovanie CD80 a/alebo CD86 pozitívnej bunky s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podľa nároku 1 tak, aby bol vytvorený komplex molekuly mutantu CTLA4/CD80 alebo molekuly mutantu CTI-A4/CD86, pričom tento komplex ruší interakciu medzi T bunkou a CD80 a/alebo CD86 pozitívnou bunkou.
  38. 38. Spôsob regulácie interakcie T bunky s CD80 a/alebo CD86 pozitívnou bunkou zahrňujúci kontaktovanie CD80 a/alebo CD86 pozitívnej bunky s rozpustnou molekulou mutantu CTLA4 podľa nároku 9 tak, aby bol vytvorený komplex molekuly mutantu CTLA4/CD80 alebo molekuly mutantu CTLA4/CD86, pričom tento komplex ruší interakciu medzi T bunkou a CD80 a/alebo CD86 pozitívnou bunkou.
  39. 39. Spôsob podľa nároku 37, kde rozpustná molekula mutantu CTI_A4 obsahuje extracelulárnu doménu CTLA4, kde v tejto extracelulárnej doméne leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou, ako je znázornené na obrázku 8.
  40. 40. Spôsob podľa nároku 37, kde CD80 a/alebo CD86 pozitívna bunka je kontaktovaná s fragmentom alebo derivátom rozpustnej molekuly mutantu CTLA4.
  41. 41. Spôsob podľa nároku 38, kde CD80 a/alebo CD86 pozitívna bunka je kontaktovaná s fragmentom alebo derivátom rozpustnej molekuly mutantu CTLA4.
  42. 42. Spôsob podľa nároku 37, kde CD80 a/alebo CD86 pozitívnou bunkou je bunka predstavujúca antigén.
  43. 43. Spôsob podľa nároku 38, kde CD80 a/alebo CD86 pozitívnou bunkou je bunka predstavujúca antigén.
  44. 44. Spôsob podľa nároku 37, kde interakcia CTLA4-pozitívnych T buniek s CD80 a CD86 pozitívnymi bunkami je inhibovaná.
  45. 45. Spôsob podľa nároku 38, kde interakcia CTLA4-pozitívnych T buniek s CD80 a CD86 pozitívnymi bunkami je inhibovaná.
  46. 46. Spôsob liečby ochorení imunitného systému sprostredkovaných interakciami T buniek s CD80 a/alebo CD86 pozitívnymi bunkami zahrňujúci podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa nároku 1 subjektu za účelom regulácie interakcií T buniek s CD80 a/alebo CD86 pozitívnymi bunkami.
  47. 47. Spôsob liečby ochorení imunitného systému sprostredkovaných interakciami T buniek s CD80 a/alebo CD86 pozitívnymi bunkami zahrňujúci podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa nároku 9 subjektu za účelom regulácie interakcií T buniek s CD80 a/alebo CD86 pozitívnymi bunkami.
  48. 48. Spôsob podľa nároku 46, kde rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje extracelulárnu doménu CTLA4, kde v tejto extracelulárnej doméne leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou, ako je znázornené na obrázku 8.
  49. 49. Spôsob podľa nároku 46, kde tieto interakcie T buniek sú inhibované.
  50. 50. Spôsob podľa nároku 47, kde tieto interakcie T buniek sú inhibované.
    GO
  51. 51. Spôsob inhibície transplantačnej reakcie príjemcu voči štepu, ktorý zahŕňa podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa nároku 1 a ligandu reagujúceho s IL-4 subjektu.
  52. 52. Spôsob inhibície transplantačnej reakcie príjemcu voči štepu, ktorý zahŕňa podávanie rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa nároku 9 a ligandu reagujúceho s IL-4 subjektu.
  53. 53. Spôsob podľa nároku 51, kde rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahuje extracelulárnu doménu CTLA4, kde v tejto extracelulárnej doméne leucín v polohe +104 je substituovaný kyselinou glutámovou, ako je znázornené na obrázku 8.
  54. 54. Rozpustná molekula mutantu CTLA4 kódovaná molekulou nukleovej kyseliny označenou ako ATCC č. PTA-2104.
  55. 55. DNA sekvencia kódujúca L104EA29Ylg, ktorá má ATCC č. PTA-2104.
  56. 56. Rozpustná molekula mutantu CTLA4 obsahujúca aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázku 7.
  57. 57. Molekula nukleovej kyseliny kódujúca rozpustnú molekulu mutantu CTLA4 podľa nároku 56.
  58. 58. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, ktorá viaže CD86 s väčšou aviditou ako štandardný typ CTLA4.
  59. 59. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, ktorá má menšiu disociačnú rýchlosť väzby CD80 a/alebo CD86 ako štandardný typ CTLA4.
  60. 60. Rozpustná molekula mutantu CTLA4, ktorá má menšie asociačné a disociačné rýchlosti väzby CD80 a/alebo CD86 ako štandardný typ CTLA4.
  61. 61. Časť rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 kódovanej molekulou nukleovej kyseliny označenej ako ATCC č. PTA-2104, kde táto časť obsahuje extracelulárnu doménu mutantu CTLA4.
  62. 62. Časť rozpustnej molekuly mutantu CTLA4 podľa nároku 61 ďalej obsahujúca koncovú časť Ig.
  63. 63. Časť molekuly nukleovej kyseliny kódujúca rozpustnú molekulu mutantu CTLA4 majúca ATCC č. PTA-2104, kde táto časť kóduje extracelulárnu doménu molekuly mutantu CTLA4.
  64. 64. Časť molekuly nukleovej kyseliny podľa nároku 63 ďalej obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje koncovú časť Ig.
  65. 65. Farmaceutická kompozícia na liečbu ochorenia imunitného systému, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a rozpustnú molekulu mutantu CTLA4 podľa nároku 1.
  66. 66. Farmaceutická kompozícia na liečbu ochorenia imunitného systému, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a rozpustnú molekulu mutantu CTLA4 podľa nároku 9.
SK1570-2002A 2000-05-26 2001-05-23 CTLA4 mutant molecule or nucleic acid molecule, vector and host vector system, host cell, CTLA4 mutant protein, method for producing and use thereof, pharmaceutical composition and regulation method SK288131B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57992700A 2000-05-26 2000-05-26
US21406500P 2000-06-26 2000-06-26
PCT/US2001/017139 WO2001092337A2 (en) 2000-05-26 2001-05-23 Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK15702002A3 true SK15702002A3 (sk) 2004-01-08
SK288131B6 SK288131B6 (sk) 2013-10-02

Family

ID=26908652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1570-2002A SK288131B6 (sk) 2000-05-26 2001-05-23 CTLA4 mutant molecule or nucleic acid molecule, vector and host vector system, host cell, CTLA4 mutant protein, method for producing and use thereof, pharmaceutical composition and regulation method

Country Status (41)

Country Link
EP (3) EP1536234B1 (sk)
JP (1) JP4328525B2 (sk)
KR (2) KR100889887B1 (sk)
CN (2) CN101255192A (sk)
AR (1) AR031699A1 (sk)
AT (1) ATE271066T1 (sk)
AU (2) AU2001263466C1 (sk)
BE (1) BE2011C041I2 (sk)
BR (1) BRPI0111191B8 (sk)
CA (1) CA2409748C (sk)
CY (2) CY2011019I1 (sk)
CZ (1) CZ304451B6 (sk)
DE (2) DE60104282T2 (sk)
DK (1) DK1248802T3 (sk)
EC (1) ECSP024365A (sk)
EE (2) EE05458B1 (sk)
EG (1) EG24459A (sk)
ES (2) ES2225549T3 (sk)
FR (1) FR11C0053I2 (sk)
GE (1) GEP20053658B (sk)
HK (2) HK1048126B (sk)
HU (2) HU228137B1 (sk)
IL (1) IL152315A (sk)
LT (1) LT5133B (sk)
LU (1) LU91902I2 (sk)
LV (1) LV12994B (sk)
MX (1) MXPA02011534A (sk)
MY (1) MY136113A (sk)
NO (2) NO330797B1 (sk)
PE (1) PE20011338A1 (sk)
PL (1) PL206267B1 (sk)
PT (1) PT1248802E (sk)
RU (1) RU2283847C2 (sk)
SI (1) SI1248802T1 (sk)
SK (1) SK288131B6 (sk)
TR (1) TR200402703T4 (sk)
TW (2) TWI319405B (sk)
UA (1) UA87432C2 (sk)
UY (1) UY26723A1 (sk)
WO (1) WO2001092337A2 (sk)
ZA (1) ZA200208944B (sk)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
MY137552A (en) * 2000-07-03 2009-02-27 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
HU229680B1 (hu) 2001-05-23 2014-04-28 Bristol Myers Squibb Co Eljárások allogén sziget átültetés védelmére oldható CTLA4 mutáns molekulák alkalmazásával
AU2003243152A1 (en) * 2002-04-19 2003-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid
DE10232697A1 (de) * 2002-07-15 2004-02-05 Universitätsklinikum Charité, Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin Verwendung von CD152 zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und Entzündungen
CN101044239B (zh) * 2002-12-23 2010-12-08 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 用于蛋白质生产的哺乳动物细胞培养方法
AU2003303394B2 (en) * 2002-12-23 2009-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
EP1684791A4 (en) 2003-10-27 2009-07-01 Amgen Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF IMMUNE REACTION TO AN IMMUNOGENIC THERAPEUTIC AGENT
TWI423986B (zh) 2005-12-20 2014-01-21 必治妥美雅史谷比公司 組合物及製造組合物之方法
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
US7510844B2 (en) 2006-01-24 2009-03-31 Bristol-Myers Squibb Company CD86 and CD80 receptor competition assays
WO2008005290A2 (en) 2006-06-29 2008-01-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for testing anti-thrombotic agents
GB0620934D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
CA2673725C (en) 2006-12-20 2016-01-12 Mmr Information Systems, Inc. Antibodies and methods for making and using them
CN101998965B (zh) 2007-11-01 2014-03-12 安斯泰来制药有限公司 免疫抑制性多肽与核酸
DK2344540T3 (da) * 2008-10-02 2018-01-29 Aptevo Res & Development Llc Cd86-antagonist multimål bindingsproteiner
US9540426B2 (en) * 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
CN102822198B (zh) 2010-03-12 2016-08-31 艾伯维生物医疗股份有限公司 Ctla4蛋白和其用途
CA2827492A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Amgen Inc. Cell culture media for uvc exposure and methods related thereto
WO2013010537A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
WO2013148049A1 (en) * 2012-03-29 2013-10-03 The General Hospital Corporation Recombinant cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla4)
US9884902B2 (en) * 2012-05-11 2018-02-06 Medimmune Limited CTLA-4 variants
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
CA2877986A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Orban Biotech Llc Ctla4 fusion proteins for the treatment of diabetes
US20140112958A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 Mwm Biomodels Gmbh Pancreatic islets of transgenic LEA29Y animals for treating diabetes
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
WO2015105609A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Amgen Inc. Regulating ornithine metabolism to manipulate the high mannose glycoform content of recombinant proteins
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
SG10202113019XA (en) 2014-06-04 2021-12-30 Amgen Inc Methods for harvesting mammalian cell cultures
WO2016089919A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Amgen Inc. Process for manipulating the level of glycan content of a glycoprotein
US10590457B2 (en) 2015-02-11 2020-03-17 Bristol Myers-Squibb Company Compositions for cell culture and methods of using the same
KR20180012260A (ko) 2015-04-17 2018-02-05 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
EP3347486A4 (en) 2015-09-09 2019-06-19 The Trustees of Columbia University in the City of New York REDUCTION OF ER-MAM-LOCALIZED APP-C99 AND METHOD FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER DISEASE
WO2017083224A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods to manipulate quality attributes of polypeptides produced in cho cells
CN109715210B (zh) * 2016-09-19 2023-05-30 昂科医药 Cd80和cd86结合蛋白组合物及其用途
CN107987153A (zh) * 2016-10-27 2018-05-04 广东香雪精准医疗技术有限公司 高亲和力的可溶性pd-1分子
JP2020536552A (ja) 2017-10-10 2020-12-17 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｔｌａ−４変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用
CN109453383A (zh) * 2018-11-12 2019-03-12 陈慧慧 免疫检查点的抑制剂在制备治疗青光眼及其他眼部免疫损伤机制相关疾病药物中的应用
AU2020338947A1 (en) 2019-08-27 2022-03-31 Tonix Pharma Limited Modified TFF2 polypeptides
SG11202110968VA (en) 2019-12-06 2021-10-28 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
EP4168807A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy peptide approach to accurately measure unprocessed c-terminal lysine
AU2021315939A1 (en) 2020-07-28 2023-02-23 Seagen Inc. Methods and systems for producing polypeptides
WO2023115027A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Detergent for viral inactivation
WO2023167863A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing process for high titer antibody

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ES2123001T5 (es) * 1991-06-27 2009-04-16 Bristol-Myers Squibb Company Receptor ctl4a, proteinas de fusion que lo contienen y sus usos.
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
JP3521382B2 (ja) * 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
GB9809280D0 (en) * 1998-04-30 1998-07-01 Rpms Technology Ltd Immunosupression
WO2000019988A1 (en) * 1998-10-07 2000-04-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. NOVEL Th2-SPECIFIC MOLECULES AND USES THEREOF
MY137552A (en) * 2000-07-03 2009-02-27 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule

Also Published As

Publication number Publication date
NO330797B1 (no) 2011-07-18
CY2011019I2 (el) 2016-12-14
EP1248802A2 (en) 2002-10-16
IL152315A0 (en) 2003-05-29
HK1048126A1 (en) 2003-03-21
HUP0302201A2 (hu) 2003-10-28
NO20025656D0 (no) 2002-11-25
ES2225549T3 (es) 2005-03-16
CA2409748A1 (en) 2001-12-06
ES2571852T3 (es) 2016-05-27
HK1071931A1 (zh) 2005-08-05
EE05458B1 (et) 2011-08-15
CN101255192A (zh) 2008-09-03
NO2011027I2 (sk) 2011-12-15
TW200906857A (en) 2009-02-16
GEP20053658B (en) 2005-11-10
EP1536234A3 (en) 2009-06-03
JP4328525B2 (ja) 2009-09-09
EP1248802B9 (en) 2005-05-11
CN1441810A (zh) 2003-09-10
DE60104282D1 (de) 2004-08-19
AR031699A1 (es) 2003-10-01
KR100889887B1 (ko) 2009-03-24
CY1117625T1 (el) 2017-04-26
HU228137B1 (en) 2012-12-28
RU2283847C2 (ru) 2006-09-20
WO2001092337A3 (en) 2002-05-10
CZ304451B6 (cs) 2014-05-14
UY26723A1 (es) 2001-12-28
SK288131B6 (sk) 2013-10-02
DE122011100063I1 (de) 2012-06-14
MY136113A (en) 2008-08-29
AU2001263466C1 (en) 2006-10-26
NO20025656L (no) 2002-11-25
TWI314933B (en) 2009-09-21
KR100895134B1 (ko) 2009-05-04
FR11C0053I1 (sk) 2012-01-13
LT2002114A (en) 2003-12-29
DE60104282T2 (de) 2005-10-13
LV12994B (en) 2003-08-20
ZA200208944B (en) 2004-02-13
AU2001263466B2 (en) 2006-04-27
BRPI0111191B1 (pt) 2019-12-31
PT1248802E (pt) 2004-11-30
EP3029062A1 (en) 2016-06-08
CZ20023892A3 (cs) 2003-09-17
ECSP024365A (es) 2003-03-31
NO2011027I1 (no) 2012-01-09
LT5133B (lt) 2004-05-25
MXPA02011534A (es) 2004-08-12
TR200402703T4 (tr) 2004-11-22
EP1248802B1 (en) 2004-07-14
EE05557B1 (et) 2012-08-15
EE200200659A (et) 2004-06-15
EP1536234B1 (en) 2016-03-16
PE20011338A1 (es) 2002-01-13
HUP0302201A3 (en) 2010-01-28
KR20070094019A (ko) 2007-09-19
LU91902I2 (fr) 2012-01-16
ATE271066T1 (de) 2004-07-15
CN1309735C (zh) 2007-04-11
BRPI0111191B8 (pt) 2021-05-25
TWI319405B (en) 2010-01-11
EE201100050A (et) 2011-10-17
PL366231A1 (en) 2005-01-24
BE2011C041I2 (sk) 2020-08-20
CY2011019I1 (el) 2016-12-14
HUS1300012I1 (hu) 2016-08-29
EP1536234A2 (en) 2005-06-01
WO2001092337A2 (en) 2001-12-06
CA2409748C (en) 2008-09-16
UA87432C2 (uk) 2009-07-27
JP2004511213A (ja) 2004-04-15
IL152315A (en) 2010-04-15
HK1048126B (zh) 2005-03-04
BR0111191A (pt) 2004-07-06
PL206267B1 (pl) 2010-07-30
SI1248802T1 (en) 2005-02-28
FR11C0053I2 (fr) 2013-01-11
EG24459A (en) 2009-07-16
DK1248802T3 (da) 2004-11-15
KR20030009502A (ko) 2003-01-29
AU6346601A (en) 2001-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210115107A1 (en) Methods of treatment using ctla4 molecules
JP4328525B2 (ja) 可溶性ｃｔｌａ４突然変異体分子およびその用途
CA2447921C (en) Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble ctla4 mutant molecules
SK287940B6 (sk) Soluble CTLA4 fusion molecule, pharmaceutical composition comprising thereof and its use
DK1536234T3 (en) SOLUBLE MUTANT CTLA4 MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
AU2006203199A1 (en) Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
BG107210A (bg) Разтворими ctla4 мутантни молекули и тяхното използване
NZ542231A (en) Soluble CTLA4 mutant fusion molecules and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
SPCF Filing of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: BELATACEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/11/694/001 - EU/1/11/694/002 20110617

Spc suppl protection certif: 5004-2014

Filing date: 20140210

SPCG Grant of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: BELATACEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/11/694/001 - EU/1/11/694/002 20110617

Spc suppl protection certif: 152 5004-2014

Filing date: 20140210

Extension date: 20260524

MK4A Patent expired

Expiry date: 20210523